KR102005983B1 - 재조합 탄산무수화효소를 이용한 이산화탄소의 포집 또는 고정화 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 재조합 탄산무수화효소를 이용한 이산화탄소의 포집 또는 고정화에 관한 것으로, 보다 상세하게는 해양 미세조류의 탄산무수화효소의 아미노산 서열 중에서 활성 부위의 Zn2 + 결합부위가 잘 보존되어 있는 N-말단 쪽 하프-도메인과 C-말단 쪽 하프-도메인을 각각 클로닝 하여 생산함으로써 탄산무수화효소 활성을 높이고, 대량 생산이 가능하며, 효과적으로 CO2를 포집 및 고정화 할 수 있고, 바이카보네이트 화합물 제조에 사용할 수 있다. 또한, 유용 대사 산물 합성 시 촉매로 사용되어 합성 수율을 높일 수 있다.
Description
본 발명은 재조합 탄산무수화효소를 이용한 이산화탄소의 포집 또는 고정화에 관한 것이다.
탄산무수화효소(carbonic anhydrase, CA)는 하기 반응식과 같은 반응을 촉매하는 효소로 척추동물의 적혈구를 비롯하여 많은 동물의 여러 조직, 식물의 잎 등에서 관찰되고 실물에서는 광합성에 관계한다고 알려져 있으며, 현재 알려져 있는 효소 가운데 분자 활성이 가장 커서 효소 1분자당 3.6×107개의 기질을 변화시킬 수 있는 능력을 가지고 있다.
[반응식]
해양 미세조류를 이용한 CO2 고정에는 CO2의 농도가 높을 경우 CA의 발현이 이루어지지 않기 때문에 CO2 농도와는 무관하게 CA를 대량 생산할 수 있는 시스템을 구성하며, CO2와의 반응 친화도 및 반응성을 향상시켜 대기 중 CO2 농도를 낮추는데 더욱 효과적으로 작용할 수 있다. 그러나 현재 국내에서 CA를 대상으로 CO2 고정화에 대한 연구는 거의 이루어지지 않고 있으며, 해외에서조차 많은 연구가 진행되지 않고 있다.
따라서, CO2의 농도와 상관없이 높은 활성을 유지하는 변형 탄산무수화효소 개발을 통해 효과적으로 CO2를 포집 및 고정화하여 저감하는 기술이 요구된다.
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5. W.B. Frommer, Science 327 (2010) 275
6. J.D. Figueroa et al. Int. J. Green-house Gas Control 2 (2008) 9
이에, 본 발명자들은 해양 미세조류의 탄산무수화효소를 대상으로 대량 생산할 수 있는 발현 시스템을 개발하고, 이로부터 발현된 재조합 탄산무수화효소의 우수한 활성과 CO2와의 반응성 증가를 확인함으로써 본 발명을 완성하게 되었다.
따라서, 본 발명의 목적은 우수한 활성을 갖는 재조합 탄산무수화효소의 대량 생산 시스템과 이를 이용한 효과적인 이산화탄소의 포집 및 고정화 기술을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 탄산무수화효소를 매개로 한 탄소 광화를 통한 바이카보네이트 화합물을 제조하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 탄산무수화효소를 촉매로 사용하여 유용 대사 산물을 제조하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위해, 본 발명은 효소 도메인의 중복 서열(duplicate form)을 함유하는 탄산무수화효소(carbonic anhydrase)의 C-말단 쪽 하프-도메인 또는 N-말단 쪽 하프-도메인의 코딩 서열을 포함하는 재조합 벡터를 제조하는 단계를 포함하는 탄산무수화효소의 대량 생산 방법을 제공한다.
본 발명은 또한 효소 도메인의 중복 서열(duplicate form)을 함유하는 탄산무수화효소(carbonic anhydrase)의 C-말단 쪽 하프-도메인 및 N-말단 쪽 하프-도메인을 혼합하는 단계를 포함하는 탄산무수화효소의 효소 활성을 증가하는 방법을 제공한다.
본 발명은 또한 효소 도메인의 중복 서열(duplicate form)을 함유하는 탄산무수화효소(carbonic anhydrase)의 C-말단 쪽 하프-도메인 및 N-말단 쪽 하프-도메인을 포함하는 이산화탄소의 포집(capture) 또는 고정(fixation) 용 조성물을 제공한다.
본 발명은 또한 본 발명에 따른 이산화탄소의 포집(capture) 또는 고정(fixation) 용 조성물을 포함하는 이산화탄소의 포집 및 고정 장치를 제공한다.
본 발명은 또한 본 발명에 따른 이산화탄소의 포집(capture) 또는 고정(fixation) 용 조성물이 고정화(immobilization) 된 이산화탄소의 포집 및 고정용 센서를 제공한다.
본 발명은 또한 이산화탄소 포화 용액과 본 발명에 따른 이산화탄소의 포집(capture) 또는 고정(fixation) 용 조성물을 반응시키는 단계를 포함하는 이산화탄소의 포집 또는 고정 방법을 제공한다.
본 발명은 또한 본 발명에 따른 이산화탄소의 포집(capture) 또는 고정(fixation) 용 조성물을 포함하는 바이카보네이트 또는 카보네이트 화합물 제조용 키트를 제공한다.
본 발명은 또한 이산화탄소 포화 용액과 본 발명에 따른 이산화탄소의 포집(capture) 또는 고정(fixation) 용 조성물을 반응시키는 단계; 및
상기에서 얻은 반응물과 알칼리 양이온염을 반응시켜 비정질의 바이카보네이트 또는 카보네이트 화합물을 제조하는 단계를 포함하는 바이카보네이트 또는 카보네이트 화합물의 제조방법을 제공한다.
본 발명은 또한 본 발명에 따른 이산화탄소의 포집(capture) 또는 고정(fixation) 용 조성물을 포함하는 바이카보네이트 또는 이산화탄소를 이용한 대사 산물 생산용 키트를 제공한다.
본 발명은 또한 바이카보네이트 또는 이산화탄소를 이용한 C4 대사 또는 지질 대사에서 촉매로 본 발명에 따른 이산화탄소의 포집(capture) 또는 고정(fixation) 용 조성물을 사용하여 대사 산물을 생산하는 방법을 제공한다.
본 발명은 internally duplicate form을 갖는 탄산무수화효소의 재조합을 통해 효소 활성이 우수하고 총 생산량을 높일 수 있는 새로운 기술을 제공하는 효과가 있다.
본 발명은 개량된 탄산무수화효소로부터 효율적인 이산화탄소의 포집 또는 고정화 시스템을 제공하고, 이산화탄소에서 전환된 바이카보네이트는 알칼리 양이온 처리로 바이카보네이트 또는 카보네이트 화합물로 회수되어 건자재 또는 제지용 재료 등 다양한 산업용 원료로 활용될 수 있다.
본 발명은 또한 바이카보네이트 또는 이산화탄소를 이용한 C4 대사 또는 지질 대사 중 촉매로 효소 활성이 개선된 재조합 탄산무수화효소를 사용하여 유용 대사 산물을 생산할 수 있다.
도 1은 듀나리엘라 종(Dunaliella)의 탄산무수화효소의 아미노산 서열을 나타내며, 1번부터 54번 아미노산은 리더 서열(파란색). Dsp-aCA-n은 55번부터 317번 아미노산까지, Dsp-aCA-c는 318번부터 589번 아미노산까지이며, 각 도메인에 이황화 결합에 관여하는 시스테인 잔기(적색)와 Zn2 +이 결합하는 히스티딘 잔기(블럭)이다.
도 2는 본 발명에 따른 재조합 탄산무수화효소의 재조합 단백질의 발현 확인 및 정제 결과를 나타내는 사진도로, (A)는 미정제 세포용해물의 SDS-PAGE 결과이고, (B)는 미정제 세포용해물의 항 His-tag 항체를 이용한 웨스턴 블랏 결과이며, (C)는 어피니티 크로마토그래피를 통한 정제 결과이며, 각 사진도에서 M은 단백질 크기 마커, 레인 1은 Dsp-aCA, 레인 2는 Dsp-aCA-n, 및 레인 3은 Dsp-aCA-c이다.
도 3은 본 발명에 따른 재조합 탄산무수화효소의 에스터레이즈 활성을 비교한 결과이다.
도 4는 본 발명에 따른 재조합 탄산무수화효소의 CO2 탈수 활성을 측정한 결과로, (A) 각 CA의 CO2 탈수 활성 비교, (B) CA 촉매에 의한 CO2 탈수에 따른 pH 감소 속도이다.
도 5는 본 발명에 따른 Dsp-aCA-c (A) 및 Dsp-aCA-n과의 1:1 혼합물 (B)에 의해 촉매된 탄산칼슘 침전물의 X-선 회절 패턴 분석 결과이며 붉은 선은 칼사이트 표준 패턴 피크를 나타낸 것이다.
도 2는 본 발명에 따른 재조합 탄산무수화효소의 재조합 단백질의 발현 확인 및 정제 결과를 나타내는 사진도로, (A)는 미정제 세포용해물의 SDS-PAGE 결과이고, (B)는 미정제 세포용해물의 항 His-tag 항체를 이용한 웨스턴 블랏 결과이며, (C)는 어피니티 크로마토그래피를 통한 정제 결과이며, 각 사진도에서 M은 단백질 크기 마커, 레인 1은 Dsp-aCA, 레인 2는 Dsp-aCA-n, 및 레인 3은 Dsp-aCA-c이다.
도 3은 본 발명에 따른 재조합 탄산무수화효소의 에스터레이즈 활성을 비교한 결과이다.
도 4는 본 발명에 따른 재조합 탄산무수화효소의 CO2 탈수 활성을 측정한 결과로, (A) 각 CA의 CO2 탈수 활성 비교, (B) CA 촉매에 의한 CO2 탈수에 따른 pH 감소 속도이다.
도 5는 본 발명에 따른 Dsp-aCA-c (A) 및 Dsp-aCA-n과의 1:1 혼합물 (B)에 의해 촉매된 탄산칼슘 침전물의 X-선 회절 패턴 분석 결과이며 붉은 선은 칼사이트 표준 패턴 피크를 나타낸 것이다.
이하, 본 발명의 구성을 구체적으로 설명한다.
본 발명은 효소 도메인의 중복 서열(duplicate form)을 함유하는 탄산무수화효소(carbonic anhydrase)의 C-말단 쪽 하프-도메인 또는 N-말단 쪽 하프-도메인의 코딩 서열을 포함하는 재조합 벡터를 제조하는 단계를 포함하는 탄산무수화효소의 대량 생산 방법에 관한 것이다.
본 발명은 탄산무수화효소(CA)의 아미노산 서열이 N-말단 쪽에서 절반에 해당하는 하프-도메인과 C-말단 쪽에서 절반에 해당하는 하프-도메인이 중복으로 이중 서열로 존재하고 있고, 각 도메인에서 CA 활성 부위의 Zn2 + 결합부위가 잘 보존되어 있다는 점에서 착안하여 N-말단 쪽에서 절반 부분에 해당하는 하프-도메인과, C-말단 쪽에서 절반 부분에 해당하는 하프-도메인을 각각 별도로 클로닝하고, 대량 생산할 수 있는 숙주세포에 형질전환 시켜 상기의 재조합 탄산무수화효소를 대량 생산하는 것을 특징으로 한다.
본 명세서에서, "C-말단 쪽 하프-도메인 또는 N-말단 쪽 하프-도메인"이란 효소 활성을 나타내는 효소 도메인이 중복 서열로 존재하는 탄산무수화효소의 아미노산 서열에서 C-말단 쪽에서 절반 부분 또는 N-말단 쪽에서 절반 부분에 해당하는 아미노산 서열을 의미하는 것으로, C-절반 부분 또는 N-절반 부분" 또는 "Dsp-aCA-c 또는 Dsp-aCA-n"이 같은 의미로 사용된다.
구체적으로는, 상기 C-말단 쪽 하프-도메인 또는 N-말단 쪽 하프-도메인은 탄산무수화효소에서 각각 이황화 결합부위 및 Zn2 + 결합부위를 함유하는 도메인들로서, 예컨대 서열번호 1에 기재된 아미노산 서열을 갖는 탄산무수화효소의 N-말단 쪽에서 절반 부분 또는 C-말단 쪽에서 절반 부분에 해당하는 아미노산 서열일 수 있다. 더 구체적으로는, C-말단 쪽 하프-도메인은 서열번호 1에 기재된 아미노산 서열 중 318-589번까지의 아미노산 서열인 서열번호 2에 기재된 아미노산 서열을 포함할 수 있고, N-말단 쪽 하프-도메인은 서열번호 1에 기재된 아미노산 서열 중 리더 서열을 제외한 55-317번까지의 아미노산 서열인 서열번호 3에 기재된 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
상기 C-말단 쪽 하프-도메인 또는 N-말단 쪽 하프-도메인은 탄산무수화효소의 효소 활성 부위인 이황화 결합에 관여하는 시스테인 잔기(도 1에서 붉은색 표시 참조)와 Zn2 +가 결합하는 히스티딘 잔기(도 1에서 블럭 표시 참조)를 포함하고 있다.
또한, C-말단 쪽 하프-도메인 또는 N-말단 쪽 하프-도메인은 서열번호 2 또는 3에 기재된 아미노산 서열뿐만 아니라 상기 서열과 서열 상동성이 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 93% 이상, 94% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상 및 99% 이상인 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
본 발명에서 C-말단 쪽 하프-도메인 또는 N-말단 쪽 하프-도메인이 또 다른 서열에 대하여 특정 비율 (예컨대, 80%, 85%, 90%, 95%, 또는 99%)의 서열 동일성을 가진다는 것은, 상기 두 서열을 정렬시킬 때, 상기 서열들의 비교 시 상기 비율의 아미노산 잔기가 동일함을 의미한다. 상기 정렬 및 백분율 상동성 또는 동일성은, 당업계에 공지된 임의의 적당한 소프트웨어 프로그램, 예를 들어 문헌[CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY (F. M. Ausubel 등 (eds) 1987 Supplement 30 section 7.7.18)]에 기재된 것들을 사용하여 결정할 수 있다. 바람직한 프로그램으로는, GCG Pileup 프로그램, FASTA(Pearson 등 1988 Proc. Natl Acad . Sci USA 85:2444-2448), 및 BLAST (BLAST Manual, Altschul 등, Natl. Cent. Biotechnol. Inf., Natl Lib. Med. (NCIB NLM NIH), Bethesda, MD, 및 Altschul 등 1997 NAR25:3389-3402)이 있다. 또 다른 바람직한 정렬 프로그램은 ALIGN Plus(Scientific and Educational Software, PA)로서, 바람직하게는 기본 매개변수를 사용하는 것이다. 사용 가능한 또 다른 서열 소프트웨어 프로그램은 Sequence Software Package Version 6.0 (Genetics Computer Group, University of Wisconsin, Madison, WI) 에서 이용 가능한 TFASTA Data Searching Program 이다.
상기 C-말단 쪽 하프-도메인 또는 N-말단 쪽 하프-도메인은 해양 미세조류인 듀나리엘라 종(Dunaliella)의 효소 도메인의 중복 서열(duplicate form)을 함유하는 알파-타입의 탄산무수화효소 유래일 수 있으나, 이에 특별히 제한하는 것은 아니다.
상기 C-말단 쪽 하프-도메인 또는 N-말단 쪽 하프-도메인은 효소의 코딩 영역 전 및 후의 영역뿐만 아니라 개별 코딩 분절 사이의 개재 서열이 포함된 펩타이드를 생산하는데 연관된 DNA 분절, 즉 코딩 유전자를 통해 전사 및 번역될 수 있다.
상기 C-말단 쪽 하프-도메인 또는 N-말단 쪽 하프-도메인은 유전자 재조합과 단백질 발현 시스템을 통하여 시험관내에서 합성하는 방법에 의하여 제조할 수 있다.
즉, C-말단 쪽 하프-도메인 또는 N-말단 쪽 하프-도메인의 유전자 삽입물이 발현되도록 작동가능하게 연결된 필수적인 조절 요소를 포함하는 재조합 벡터를 사용할 수 있다.
상기 벡터는 플라스미드 벡터, 코즈미드 벡터, 박테리오파아지 벡터 및 바이러스 벡터 등을 포함하나 이에 제한되지 않는다. 적합한 발현 벡터는 프로모터, 오퍼레이터, 개시코돈, 종결코돈, 폴리아데닐화 시그널 및 인핸서 같은 발현 조절 엘리먼트 외에도 막 표적화 또는 분비를 위한 시그널 서열 또는 리더 서열을 포함하며, 목적에 따라 다양하게 제조될 수 있다. 벡터의 프로모터는 구성적 또는 유도성일 수 있다. 또한, 발현벡터는 벡터를 함유하는 숙주세포를 선택하기 위한 선택마커를 포함하고, 복제가능한 발현벡터인 경우 복제 기원을 포함한다.
본 발명의 재조합 벡터는 바람직하게는 일반적인 대장균 균주 발현용 벡터, pGEM-T Easy vector에 상기 C-말단 쪽 하프-도메인 또는 N-말단 쪽 하프-도메인을 코딩하는 핵산을 삽입함으로써 제조될 수 있다. 본 발명의 일 구체예에서는 대장균 발현용 벡터로 pGEM-T Easy vector를 사용하였지만 반드시 이에 한정되는 것은 아니며, 일반적으로 사용할 수 있는 모든 대장균주 발현용 벡터가 제한 없이 사용될 수 있다.
본 발명의 일 구체예에서는 대장균 균주 발현용 벡터인 pGEM-T Easy vector를 사용하여 본 발명의 탄산무수화효소에 대해 C-말단 쪽에서 절반 부분과 N-말단 쪽에서 절반 부분에 해당하는 서열이 증폭되도록 PCR 후 증폭 산물을 pGEM-T Easy vector에 서브클로닝한 후 제한 효소 처리된 pET42b+ vector에 라이게이션 시켜 재조합 벡터, pET-Dsp-aCA-c 또는 pET-Dsp-aCA-n을 제조할 수 있다.
상기 재조합 벡터를 형질전환시켜 재조합 Dsp-aCA-c 또는 Dsp-aCA-n을 생산하는 형질전환체를 확보할 수 있다.
상기 형질전환은 핵산을 유기체, 세포, 조직 또는 기관에 도입하는 어떤 방법도 포함되며, 당 분야에서 공지된 바와 같이 숙주세포에 따라 적합한 표준 기술을 선택하여 수행할 수 있다. 이런 방법에는 전기충격유전자전달법(electroporation), 원형질 융합, 인산 칼슘(CaPO4) 침전, 염화 칼슘(CaCl2) 침전, 실리콘 카바이드 섬유 이용한 교반, 아그로박테리아 매개된 형질전환, PEG, 덱스트란 설페이트, 리포펙타민 등이 포함되나 이로 제한되지 않는다.
또한, 숙주세포에 따라서 단백질의 발현량과 수식 등이 다르게 나타나므로, 목적에 가장 적합한 숙주세포를 선택하여 사용하면 된다.
숙주세포로는 대장균(Escherichia coli), 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis), 스트렙토마이세스(Streptomyces), 슈도모나스(Pseudomonas), 프로테우스 미라빌리스(Proteus mirabilis) 또는 스타필로코쿠스(Staphylococcus)와 같은 원핵 숙주 세포가 있으나 이로 제한되는 것은 아니다. 또한, 진균(예를 들어, 아스페르길러스(Aspergillus)), 효모(예를 들어, 피치아 파스토리스(Pichia pastoris), 사카로마이세스 세르비시애(Saccharomyces cerevisiae), 쉬조사카로마세스(Schizosaccharomyces), 뉴로스포라 크라사(Neurospora crassa))등과 같은 하등 진핵 세포, 곤충 세포, 식물 세포, 포유동물 등을 포함하는 고등 진핵생물 유래의 세포를 숙주세포로 사용할 수 있다. 상기 형질전환체는 상기 재조합 벡터를 임의의 숙주세포에 도입시킴으로써 용이하게 제조될 수 있다.
본 발명의 일 구체예에 따르면, 알파-타입 탄산무수화효소(C-말단 쪽 하프-도메인 또는 N-말단 쪽 하프-도메인)를 발현하는 재조합 벡터 pET-Dsp-aCA-c 또는 pET-Dsp-aCA-n를 대장균 균주 BL21(DE3)에 도입하여 형질전환체를 제조할 수 있다.
상기 C-말단 쪽 하프-도메인 또는 N-말단 쪽 하프-도메인을 발현하는 형질전환체는 통상의 배양방법에 따라 배양하여 분리 정제함으로써 대량 생산이 가능하다. 특별히 제한하지는 않으나, 통상의 TB(terrific broth)에서 배양하고, 배양물로부터 가용성 분획만을 회수하여 크로마토그래피법을 통해 정제할 수 있다.
일 구체예에 따르면, 상기 형질전환체에서 분리 정제된 C-말단 쪽 하프-도메인 또는 N-말단 쪽 하프-도메인은 SDS-PAGE 결과, 각각 약 30 kDa, 31 kDa일 수 있다.
또한, 상기 C-말단 쪽 하프-도메인은 대장균 발현 시스템에서 전장 아미노산 서열을 갖는 탄산무수화효소 대비 약 2배 정도의 발현 증가량을 나타낼 수 있고, N-말단 쪽 도메인은 약 4배 정도의 발현 증가량을 나타낼 수 있다.
상기 C-말단 쪽 하프-도메인 또는 N-말단 쪽 하프-도메인은 탄산무수화효소에서 유래하는 재조합 효소로서 에스터레이즈 활성과 CO2 탈수 활성을 가지는 특징이 있다.
더 구체적으로, 상기 C-말단 쪽 하프-도메인은 전장 아미노산 서열을 갖는 탄산무수화효소 대비 대략 70% 정도의 에스터레이즈 비활성 및 약 50% 정도의 CO2 탈수 비활성을 나타낼 수 있고, N-말단 쪽 하프-도메인은 전장 아미노산 서열을 갖는 탄산무수화효소 대비 효소 활성은 낮은 편이다.
흥미롭게도, C-말단 쪽 하프-도메인 및 N-말단 쪽 하프-도메인을 적절한 몰비로 혼합할 경우, 효소 활성은 전장 아미노산 서열을 갖는 탄산무수화효소 보다 현저히 상승하는 결과를 나타낸다. 이는 단독으로는 활성이 낮은 N-말단 쪽 하프-도메인이 C-말단 쪽 하프-도메인에 의해 활성회복이 유도됨을 알 수 있다. 바람직하게는, C-말단 쪽 하프-도메인 및 N-말단 쪽 하프-도메인을 1:0.1~2 몰비로 혼합하여 사용할 수 있다.
따라서, 본 발명은 효소 도메인의 중복 서열(duplicate form)을 함유하는 탄산무수화효소(carbonic anhydrase)의 C-말단 쪽 하프-도메인 및 N-말단 쪽 하프-도메인을 혼합하는 단계를 포함하는 탄산무수화효소의 효소 활성을 증가하는 방법을 제공한다.
본 발명은 또한 효소 도메인의 중복 서열(duplicate form)을 함유하는 탄산무수화효소(carbonic anhydrase)의 C-말단 쪽 하프-도메인 및 N-말단 쪽 하프-도메인을 포함하는 이산화탄소의 포집(capture) 또는 고정(fixation) 용 조성물에 관한 것이다.
전술한 바와 같이, 본 발명의 C-말단 쪽 하프-도메인 및 N-말단 쪽 하프-도메인을 적절한 몰비로 혼합할 경우, 효소 활성은 전장 아미노산 서열을 갖는 탄산무수화효소 보다 현저히 상승하는 결과를 나타내어 이들의 혼합은 이산화탄소의 포집 및 고정화에 효과적인 것을 특징으로 한다.
본 발명의 이산화탄소의 포집 또는 고정용 조성물은 펩타이드를 합성하는 당해 분야의 공지된 방법에 의하여 제조된 C-말단 쪽 하프-도메인 및 N-말단 쪽 하프-도메인을 포함할 수 있다. 예를 들어 유전자 재조합과 단백질 발현 시스템 또는 펩타이드 합성기 등을 통하여 시험관내에서 합성하는 방법에 의하여 제조할 수 있다.
또한, 본 발명의 이산화탄소의 포집 또는 고정용 조성물은 C-말단 쪽 하프-도메인 및 N-말단 쪽 하프-도메인을 발현하는 형질전환체의 배양물 형태로 포함할 수 있다.
본 발명은 또한 본 발명에 따른 이산화탄소의 포집(capture) 또는 고정(fixation) 용 조성물을 포함하는 이산화탄소의 포집 및 고정 장치에 관한 것이다.
본 발명의 이산화탄소의 포집 및 고정 장치는 공기로부터 이산화탄소를 추출하여 바이카보네이트로 전환시켜 고정하는 통상의 장치일 수 있다.
예컨대, 이산화탄소의 포집 및 고정 장치는 업라이트 타워(upright towers), 챔버(chamber), 및 물 공급부(source of water)를 포함하고, 상기 업라이트 타워는 하부에 적어도 하나의 공기 투입부(air inlet)를 포함하고 타워의 상부에 적어도 하나의 공기 배출부(air outlet)를 포함하고, 상기 챔버는 적어도 하나의 공기 투입구(air inlet)와 적어도 하나의 공기 배출구(air outlet) 사이에 위치하고 이산화탄소를 포집하기 위한 수집기를 포함하며, 상기 물 공급부에서 수지를 습윤하여 이산화탄소를 방출시키는 구조를 가질 수 있고, 상기 이산화탄소를 포집하기 위한 수집기에 본 발명의 재조합 탄산무수화효소, 즉, 효소 도메인의 중복 서열(duplicate form)을 함유하는 탄산무수화효소(carbonic anhydrase)의 C-말단 쪽 하프-도메인 및 N-말단 쪽 하프-도메인의 혼합물을 포함할 수 있다.
다른 구체예에서, 본 발명의 이산화탄소의 포집 및 고정 장치는 실내 공기정화 장치일 수 있다. 상기 실내 공기정화 장치는 기존 분수장치 내에 효소가 포함된 담체를 고정한 것으로, 이산화탄소 저감기능 및 가습기능을 겸비하고, 효소가 지속적으로 그 기능을 할 수 있도록 수용액 저장소의 수용액에 잠기도록 구성할 수 있다. 따라서, 상기 효소가 포함된 담체에 포함된 효소는 용해된 이산화탄소를 바이카보네이트로 빠르게 전환하도록 하는 촉매기능을 가져 지속적으로 공기 중 이산화탄소를 저감할 수 있다. 상기 효소로 본 발명의 재조합 탄산무수화효소, 즉, 효소 도메인의 중복 서열(duplicate form)을 함유하는 탄산무수화효소(carbonic anhydrase)의 C-말단 쪽 하프-도메인 및 N-말단 쪽 하프-도메인의 혼합물을 포함할 수 있다.
본 발명은 또한 본 발명에 따른 이산화탄소의 포집(capture) 또는 고정(fixation) 용 조성물이 고정화(immobilization) 된 이산화탄소의 포집 및 고정용 센서에 관한 것이다.
본 발명의 이산화탄소의 포집 및 고정용 센서에 있어서, 효소 고정 방법은 흡착법, 이온결합법, 가교법, 포획법 또는 공유결합법으로 고정할 수 있으나, 이에 특별히 제한하는 것은 아니다.
본 발명은 또한 이산화탄소 포화 용액과 본 발명에 따른 이산화탄소의 포집(capture) 또는 고정(fixation) 용 조성물을 반응시키는 단계를 포함하는 이산화탄소의 포집 또는 고정 방법에 관한 것이다.
상기 이산화탄소 포화 용액은 이산화탄소 가스를 녹여 탄산수용액에 녹여 제조한 것일 수 있으나, 이에 특별히 제한하는 것은 아니다.
본 발명에 따른 알파-타입 탄산무수화효소 효소 활성을 갖는 C-말단 쪽 하프-도메인과 N-말단 쪽 하프-도메인의 혼합물은 이산화탄소를 빠른 속도로 탈수시켜 바이카보네이트로 전환시킬 수 있다.
본 발명은 또한 본 발명에 따른 이산화탄소의 포집(capture) 또는 고정(fixation) 용 조성물을 포함하는 바이카보네이트 또는 카보네이트 화합물 제조용 키트를 제공한다.
또한, 본 발명은 이산화탄소 포화 용액과 본 발명에 따른 이산화탄소의 포집(capture) 또는 고정(fixation) 용 조성물을 반응시키는 단계; 및
상기에서 얻은 반응물과 알칼리 양이온염을 반응시켜 비정질의 바이카보네이트 또는 카보네이트 화합물을 제조하는 단계를 포함하는 바이카보네이트 또는 카보네이트 화합물의 제조방법을 제공한다.
탄산무수화효소는 가역반응성이 있어 기질로 이산화탄소뿐만 아니라 바이카보네이트를 사용할 수 있다. 따라서, 이산화탄소 고정 과정에서 이산화탄소에서 전환된 바이카보네이트는 알칼리 양이온의 처리 시 비정질의 바이카보네이트 또는 카보네이트 화합물로 전환될 수 있다.
상기 바이카보네이트 화합물은 소듐 바이카보네이트(Na2HCO3), 포타슘 바이카보네이트(KHCO3), 마그네슘 바이카보네이트(Mg(HCO3)2), 칼슘 바이카보네이트(Ca(HCO3)2) 또는 암모늄 바이카보네이트((NH4)HCO3) 등일 수 있다.
상기 카보네이트 화합물은 카본산(H2CO3), 리튬 카보네이트(Li2CO3), 소듐 카보네이트(Na2CO3), 포타슘 카보네이트(K2CO3), 루비듐 카보네이트(Rb2CO3), 세슘 카보네이트(Cs2CO3), 베릴륨 카보네이트(BeCO3), 마그네슘 카보네이트(MgCO3), 칼슘 카보네이트(CaCO3), 스트론튬 카보네이트(SrCO3), 바륨 카보네이트(BaCO3), 망간 카보네이트(MnCO3), 철 카보네이트(FeCO3), 코발트 카보네이트(CoCO3), 니켈 카보네이트(NiCO3), 구리 카보네이트(CuCO3), 실버 카보네이트(Ag2CO3), 징크 카보네이트(ZnCO3), 카드뮴 카보네이트(CdCO3), 알루미늄 카보네이트(Al2(CO3)3), 탈륨 카보네이트(Tl2CO3), 리드 카보네이트(PbCO3) 또는 란타늄 카보네이트(La2(CO3)3) 등일 수 있다.
상기 알칼리 양이온염은 Mg, K, Na, NH4, Ca, Li, Rb, Cs, Be, Sr, Ba, Mn, Fe, Co, Ni, Cu, Zn, Cd, Ag, Al, Tl, Pb 또는 La의 염 등일 수 있다. 예컨대, 염화칼슘(CaCl2), 황산칼슘(CaSO4), 중탄산칼슘(Ca(HCO3)2), 산화칼슘(CaO), 수산화칼슘(Ca(OH)2) 등을 사용할 수 있으나, 이에 특별히 제한하는 것은 아니다.
상기 비정질의 바이카보네이트 또는 카보네이트 화합물은 침전 반응을 통해 상전이를 거쳐 결정상의 바이카보네이트 또는 카보네이트 화합물로 전환될 수 있다.
상기 침전은 pH 8 내지 10 에서 0 내지 50 ℃의 온도 조건에서 실시할 수 있으나, 이에 특별히 제한하는 것은 아니다.
상기 결정상의 바이카보네이트 또는 카보네이트 화합물은 칼사이트(calcite), 아라고나이트(aragonite) 또는 베터라이트(veterite)일 수 있다.
본 발명은 또한 본 발명에 따른 이산화탄소의 포집(capture) 또는 고정(fixation) 용 조성물을 포함하는 바이카보네이트 또는 이산화탄소를 이용한 대사 산물 생산용 키트에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 바이카보네이트 또는 이산화탄소를 이용한 C4 대사 또는 지질 대사에서 촉매로 본 발명에 따른 이산화탄소의 포집(capture) 또는 고정(fixation) 용 조성물을 사용하여 대사 산물을 생산하는 방법을 제공한다.
상기 대사 산물은 C4 대사 또는 지질 대사 산물로서, C4 대사에서, PEP(phosphoenol pyruvate)에 CO2를 붙여서 옥살로아세테이트(Oxaloacetate)로 진행하는 PEP carboxylase 반응에서 탄산무수화효소가 촉매(또는 보조 효소)로 연동하여 C4 화합물을 효과적으로 합성할 수 있는 특징이 있다.
또한, 지질 대사에서, Acetyl CoA에서 bicabonate(HCO3 -)를 붙여서 Malonyl CoA로 진행하는 Acetyl CoA carboxylase 반응에서 탄산무수화효소가 촉매(또는 보조 효소)로 연동하여 Malonyl CoA를 효과적으로 합성할 수 있는 특징이 있다.
따라서, 본 발명은 유용 대사 산물 합성에 유용한 시스템을 제공한다.
이하, 본 발명을 실시예를 통해 상세히 설명한다. 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 범위가 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
<실시예 1> 재조합 카보닉 하이드레이즈의 생산
듀나리엘라 종(Dunaliella)이 생산하는 탄산무수화효소(carbonic anhydrase, CA) 중 N-말단 쪽에서 절반 부분과 C-말단 쪽에서 절반 부분이 각각의 완전한 알파-타입 CA 형태로 이루어진 duplicate form의 Dsp-aCA는 약 60 kDa 크기를 갖는다(도 1). 이에 N-말단 쪽에서 절반 부분과 C-말단 쪽에서 절반 부분을 각각 클로닝하여 2개의 알파-타입 CA를 생산하고자 실험을 진행하였다.
또한 Dsp-aCA는 진핵세포인 녹조류 단백질이므로 원핵세포인 대장균에서 재조합 단백질로 발현시 같은 아미노산을 생산하는 코돈 사용에 약간의 차이가 있으므로 대장균에서 발현이 어렵다. 이에 Dsp-aCA를 암호화하는 유전자 서열을 대장균에서 사용빈도가 높은 코돈으로 최적화시킨 후 유전자 서열을 합성하여 이를 클로닝에 사용하였다.
N-말단 쪽에서 절반 부분에서 생산된 CA를 Dsp-aCA-n라 명명하였고, C-말단 쪽에서 절반 부분에서 생산된 CA를 Dsp-aCA-c로 명명하였다.
(1) Dsp-aCA의 클로닝 및 발현
Dsp-aCA 단백질을 암호화하는 유전자 중 리더 서열을 제외한 부분을 EcoRI 제한효소 자리가 5‘ 말단에 첨가된 정방향 프라이머(5’- GAATTCGATGGTGAGCGAACCGCATGAT-3’)와 5’말단에 HindIII 제한효소 자리가 첨가된 역방향 프라이머(5’- AAGCTTTCACGCCGCCGCGCCGTTATAG-3’)를 이용하여 증폭시킨 후 (PCR 조건; 94 ℃, 3분, ×1; 94℃, 30초, 50℃, 1분 및 72℃, 1분을 1사이클로 하여 30 사이클; 72℃, 6분, ×1).
pGEM-T Easy vector(Promega co., Madison, WI)에 PCR 단편을 서브클로닝한 후 상기 각 제한효소를 처리하여 잘린 PCR 단편을 같은 제한효소로 처리된 pETDuet 벡터에 라이게이션시켜 E. coli XL1-Blue에 형질전환 시켜 Dsp-aCA 생산 유전자가 클로닝 된 벡터인 pET Duet-Dsp-aCA를 제조하였다. E. coli BL21 (DE3)에 생산 벡터를 형질전환 시켜 재조합 CA을 생산 균주를 확보하였다. 단백질 생산 균주를 50 ㎍/mL 농도의 암피실린이 첨가된 TB(terrific broth; 1.2% 펩톤, 2.4% 효모 추출물, 72 mM K2HPO4, 17 mM KH2PO4 및 0.4% 글리세롤) 배지에 접종하여 37℃에서 배양액의 흡광도가 600 nm에서 0.4~0.6에 이를 때까지 키운 후 0.5 mM 농도의 IPTG 첨가 후 20℃에서 20~24시간 키워 재조합 단백질 발현을 유도하였다. 발현 단백질 확인은 SDS-PAGE 전기영동을 실시하여 확인하였다(도 2A 및 2B).
(2) Dsp-aCA-n의 클로닝 및 발현
Dsp-aCA-n 단백질을 암호화하는 유전자 중 리더 서열을 제외한 부분을 NdeI 제한 효소 자리가 5‘ 말단에 첨가된 정방향 프라이머(5’- CATATGGATGGTGAGCGAACCGCATGAT-3’)와 5’말단에 HindIII 제한 효소 자리가 첨가된 역방향 프라이머(5’- AAGCTTACCTTTGTATTCGTAAACTTTACG-3’)를 이용하여 증폭시킨 후 pGEM-T Easy vector 벡터에 PCR 단편을 서브클로닝한 후 상기 각 제한 효소를 처리하여 잘린 PCR 단편을 같은 제한 효소로 처리된 pET42b+ 벡터에 라이게이션 시켜 E. coli XL1-Blue에 형질전환 시켜 Dsp-aCA-n 생산 유전자가 클로닝 된 벡터인 pET-Dsp-aCA-n을 제조하였다. E. coli BL21 (DE3)에 생산 벡터를 형질 전환 시켜 재조합 Dsp-aCA-n 생산 균주를 확보하였다. 단백질 생산 균주를 25 ㎍/mL 농도의 카나마이신이 첨가된 TB 배지에 접종하여 37℃에서 배양액의 흡광도가 600 nm에서 0.4~0.6에 이를 때까지 키운 후 0.5 mM 농도의 IPTG 첨가 후 20℃에서 20~24시간 키워 재조합 단백질 발현을 유도하였다. 발현 단백질 확인은 SDS-PAGE 전기영동을 실시하여 확인하였다(도 2A 및 2B).
(3) Dsp-aCA-c의 클로닝 및 발현
Dsp-aCA-c 단백질을 암호화하는 유전자 부분을 NdeI 제한효소 자리가 5‘ 말단에 첨가된 정방향 프라이머(5’- CATATGGAACCGAACGACAAATACAA-3’)와 5’말단에 HindIII 제한효소 자리가 첨가된 역방향 프라이머(5’- AAGCTTAGCAGCAGCACCGTTGTAACCG-3’)를 이용하여 증폭시킨 후 pGEM-T Easy vector 벡터에 PCR 단편을 서브클로닝한 후 상기 각 제한 효소를 처리하여 잘린 PCR 단편을 같은 제한 효소로 처리된 pET42b+ 벡터에 라이게이션 시켜 E. coli XL1-Blue에 형질전환 시켜 Dsp-aCA-c 생산 유전자가 클로닝 된 벡터인 pET-Dsp-aCA-c을 제조하였다. E. coli BL21 (DE3)에 생산 벡터를 형질 전환 시켜 재조합 Dsp-aCA-c생산 균주를 확보하였다. 단백질 생산 균주를 25 ㎍/mL 농도의 카나마이신이 첨가된 TB 배지에 접종하여 37℃에서 배양액의 흡광도가 600 nm에서 0.4~0.6에 이를 때까지 키운 후 0.5 mM 농도의 IPTG 첨가 후 20℃에서 20~24시간 키워 재조합 단백질 발현을 유도하였다. 발현 단백질 확인은 SDS-PAGE 전기영동을 실시하여 확인하였다(도2A 및 2B).
(4) 발현 단백질의 정제
IPTG로 단백질 발현을 유도한 후 20℃에서 20~24시간 배양 한 배양균 100 mL를 4℃, 5000 rpm에서 20분간 원심분리 후 침전된 균체를 회수하여 -10℃에서 냉동 보관한 후 20 mL의 라이시스 버퍼(50 mM NaH2PO4-NaOH, 0.3 M NaCl, 1% 글리세롤, 프로테아제 인히비터 칵테일(protease inhibitor cocktail), 1 mM PMSF, 0.1 mg/mL 에그 화이트 라이소자임(egg white lysozyme) 및 2.5 U/mL DNase)에 부유시킨 후 상온에서 30분간 반응시킨 후 초음파 처리(Branson Digital Sonifer-250; Danbury, CT, USA) 로 세포를 파쇄하였다. 4℃, 14000 × g에서 20분간 원심분리하여 불용성물질을 제거하고 가용성분획 만을 회수하여 평형화 버퍼(50 mM NaH2PO4-NaOH, 0.3 M NaCl, 1% 글리세롤, pH8.0)로 미리 평형화시켜 놓은 HisPurTM Cobalt resin (Thermo Fisher Scientific Inc.) 과 섞어 1시간 동안 얼음에서 20~30 rpm으로 흔들어 주며 반응시켰다. 세포가용액과 레진 혼합액을 크로마토그래피 컬럼에 채우고 자연낙하로 레진이 충진 되게 한 후 레진에 붙지 않는 단백질들은 컬럼의 10배 부피의 와싱 버퍼(50 mM NaH2PO4-NaOH, 0.3 M NaCl, 1% 글리세롤, 10 mM 이미다졸, pH8.0)를 통해 제거하고 레진에 결합된 His-tag을 갖는 재조합 단백질은 용출 버퍼(50 mM NaH2PO4-NaOH, 0.3 M NaCl, 1% 글리세롤, 100 mM 이미다졸, pH8.0)로 용출시켰다. 용출된 단백질은 SDS-PAGE 전기영동을 통해 정제 정도와 단백질의 분자량을 확인하였다.
확인 결과 Dsp-aCA, Dsp-aCA-n 그리고 Dsp-aCA-c는 각각 60, 31, 그리고 30 kDa 크기의 단백질이었고, 이를 회수 하였다. 용액 내의 이미다졸을 제거하기 위해 Amicon Ultra-0.5 device (Millipore Co., Billerica, MA, USA)를 이용하여 용출 버퍼를 50 mM Tris-SO4 버퍼(pH 7.6)로 교환하면서 단백질도 농축하였다.
전기영동 결과 Dsp-aCA 전장 서열로 발현시키는 것 보다 각 단위체로 발현 시 발현양이 증가함을 확인할 수 있었다(도 2C).
<실험예 1> 발현 단백질의 에스터레이즈 활성 측정
CA의 에스터레이즈 활성은 para-nitrophenyl acetate (p-NPA)를 기질로 가수분해 되어 생성되는 p-nitrophenol (p-NP)의 양을 분광광도계를 이용하여 348nm에서의 흡광도를 측정하여 구하였다.
반응 조건은 25°C, 반응 버퍼는 50 mM Tris-SO4 버퍼(pH7.6)를 사용하였다. 효소 활성 1 unit (U)은 분당 1 nmoles의 p-NP를 생산하는 필요한 효소 양으로 정의하였다.
Dsp-aCA-n과 Dsp-Ca-c의 에스터레이즈 활성을 측정한 결과, Dsp-aCA-n은 발현양은 가장 우수하였으나 활성은 거의 나타내지 않았다. Dsp-aCA-c는 Dsp-aCA의 발현에 비해 2배 정도의 발현 증가량을 나타내었고 비활성은 Dsp-aCA의 약 70% 활성을 나타내었다. Dsp-aCA-n과 Dsp-aCA-c를 일정 비율로 혼합한 후 활성을 측정하였을 때 비활성이 증가함을 확인할 수 있었다(도 3A).
Dsp-aCA-c 만이 활성을 나타내었지만 혼합 시 단독으로는 활성을 나타내지 않던 Dsp-aCA-n의 활성이 회복된 것처럼 보였고 Dsp-CA-c 2배의 농도 보다는 Dsp-aCA-n과 1:1로 혼합 시 비활성이 Dsp-aCA 활성에 거의 근접하였다(도 3B).
이는 이 두 도메인이 1:1로 적당한 구조를 이룰 때 최대 활성을 나타내는 것으로 사료되었다.
<실험예 2> 발현 단백질의 CO2 탈수 활성 측정
20 mM Tris-SO4 버퍼(pH 8.3) 0.6 mL에 발현된 각 CA 단백질을 2 내지 10 ㎕를 첨가한 후 여기에 얼음 상태에서 탈이온 3차 증류수에 1시간 동안 CO2 가스를 녹여 CO2로 포화된 탄산수 0.4 mL를 넣는 즉시 바로 pH 변화를 측정하여 pH가 8.3에서 7.3으로 내려가는 데 필요한 시간을 계산하였다.
CA 활성은 CA에 의한 촉매반응 없이 자연적으로 탈수되는 데 필요한 시간을 t0로 계산하고 각 종류의 CA에 의해 촉매된 탈수에 필요한 시간 t를 계산하여 활성은 WAU (Wilbur-Andersion unit)로 표현하고 다음의 공식에 따라 구하였다.
CO2 탈수 활성에서도 에스터레이즈 활성에서와 마찬가지로 Dsp-aCA-c만이 Dsp-aCA에 60~70% 정도의 비활성을 나타내었고 Dsp-aCA-n은 거의 활성을 나타내지 않았다. Dsp-aCA-c와 Dsp-aCA-n의 혼합시 에스터레이즈 활성과는 달리 비활성이 Dsp-aCA에 비해 50% 정도를 나타내었다(도 4). 그러나 Dsp-aCA-n 단독이 전혀 활성이 없지만 다량의 단백질을 생산한다는 점과 혼합시 활성회복에 관여한다는 점을 고려할 때 Dsp-aCA 또는 Dsp-aCA-c 단독보다는 혼합을 통한 효과가 크다고 할 수 있을 것이다(표 1).
| 단위 | α-CA source | ||||
| Dsp-CA | Dsp-CA-n | Dsp-CA-c | Dsp-CA-n/ Dsp-CA-cc |
||
| 단백질 수율 | mg/L | 49 | 264 | 100 | 200c |
| 에스터레이즈a | U/L | 3875 | 1009 | 5419 | 14578c |
| CO2 탈수b | WAU/L | 34854 | 2560 | 45150 | 77600c |
a pNPA hydrolytic activity. One enzyme unit is defined as formation of 1 nmole of p-NP per min
bEnzyme units are defined as WAU.
cThe cases of mixing of Dsp-CA-n and Dsp-CA-c at the molar ratio of 1:1.
표 1에 나타난 바와 같이, 60 kDa의 Dsp-aCA를 전장 서열로 발현하는 것에 비해 비교적 작은 크기의 30 kDa의 Dsp-aCA-n과 Dsp-aCA-c로 발현시켰을 경우 1:1로 혼합 시 거의 Dsp-aCA 활성에 100%에 근접한 에스터레이즈 활성 및 50%의 CO2 탈수 활성을 나타내었다. duplicat form에 비해 Dsp-aCA-n은 약 4배 정도, Dsp-aCA-c는 약 2배 정도의 발현증가를 보이므로 분자 수로 볼 때 혼합을 통해 duplicate form 유사 구조를 4배 얻게 된다. 비록 intact form에 비해 비활성이 감소하는 경향은 있었으나 총 활성은 증가하였다.
<실험예 3> 재조합 단백질의 칼사이트 형성
CO2에서 전환된 바이카보네이트는 Ca2 + 처리로 탄산칼슘으로 전환되어 칼사이트, 아라고나이트, 베터라이트의 세 가지 결정 구조로 결정화될 수 있다. CA 매개의 탄소 광화를 통한 탄소 고정법은 CA에 의한 CO2의 바이카보네이트로의 빠른 전환속도를 이용하여 Ca2 + 존재 하에서 신속하게 CO2를 제거하면서 동시에 유용한 탄산염 무기성 원료를 생산하는 기술이다.
상기 실시예 1에서 생산된 재조합 Dsp-aCA-c와 Dsp-aCA-n과 이의 혼합물에 의한 칼사이트 형성 반응은 먼저 pH8.5 완충용액에 CA를 넣은 후 CO2로 포화된 기질 용액을 섞어 CO2를 바이카보네이트로 전환시킨 후 10 mM CaCl2 용액과 반응 시킨 후 pH를 9.5로 증가시켜 CaCO3 침전 반응을 유도한 후 35℃와 45℃에서 각각 5분씩 반응 후 결정체를 60℃에서 말린 후 다목적 X-선 회절분석기(XRD)를 이용하여 탄산칼슘의 결정 분포 변화를 확인하였다.
도 5에 나타난 바와 같이, Dsp-aCA-c (도5A)와 Dsp-aCA-n과의 혼합물 (도 5B) 모두에서 칼사이트 형성을 확인할 수 있었고 Dsp-aCA-n과의 혼합물에서 증가된 강도를 나타내었다.
<110> Korea University Industrial & Academic Collaboration Foundation
<120> CO2 capture or fixation using recombinant carbonic anhydrase
<130> P120399
<160> 3
<170> KopatentIn 2.0
<210> 1
<211> 588
<212> PRT
<213> Carbonic anhydrase from Dunaliella sp.
<400> 1
Met Gly Ser Arg Arg Ile Thr Leu Leu Gly Ala Leu Phe Ala Val Leu
1 5 10 15
Ala Val Ala Ile Glu Gly Arg Thr Leu Leu Thr His Asn Leu Lys Ala
20 25 30
Glu Ala Ala Glu Thr Val Asp Ala Val Ser Ser Val Val Ala Gly Ser
35 40 45
Ala Gly Arg Gln Leu Leu Val Ser Glu Pro His Asp Tyr Asn Tyr Glu
50 55 60
Lys Val Gly Phe Asp Trp Thr Gly Gly Val Cys Val Asn Thr Gly Thr
65 70 75 80
Ser Lys Gln Ser Pro Ile Asn Ile Glu Thr Asp Ser Leu Ala Glu Glu
85 90 95
Ser Glu Arg Leu Gly Thr Ala Asp Asp Thr Ser Arg Leu Ala Leu Lys
100 105 110
Gly Leu Leu Ser Ser Ser Tyr Gln Leu Thr Ser Glu Val Ala Ile Asn
115 120 125
Leu Glu Gln Asp Met Gln Phe Ser Phe Asn Ala Pro Asp Glu Asp Leu
130 135 140
Pro Gln Leu Thr Ile Gly Gly Val Val His Thr Phe Lys Pro Val Gln
145 150 155 160
Ile His Phe His His Phe Ala Ser Glu His Ala Ile Asp Gly Gln Leu
165 170 175
Tyr Pro Leu Glu Ala His Met Val Met Ala Ser Gln Asn Asp Gly Ser
180 185 190
Asp Gln Leu Ala Val Ile Gly Ile Met Tyr Lys Tyr Gly Glu Glu Asp
195 200 205
Pro Phe Leu Lys Arg Leu Gln Glu Thr Ala Gln Ser Asn Gly Glu Ala
210 215 220
Ala Asp Lys Asn Val Glu Leu Asn Ser Phe Ser Ile Asn Val Ala Arg
225 230 235 240
Asp Leu Leu Pro Glu Ser Asp Leu Thr Tyr Tyr Gly Tyr Asp Gly Ser
245 250 255
Leu Thr Thr Pro Gly Cys Asp Glu Arg Val Lys Trp His Val Phe Lys
260 265 270
Glu Ala Arg Thr Val Ser Val Ala Gln Leu Lys Val Phe Ser Glu Val
275 280 285
Thr Leu Ala Ala His Pro Glu Ala Thr Val Thr Asn Asn Arg Val Ile
290 295 300
Gln Pro Leu Asn Gly Arg Lys Val Tyr Glu Tyr Lys Gly Glu Pro Asn
305 310 315 320
Asp Lys Tyr Asn Tyr Val Gln His Gly Phe Asp Trp Arg Asp Asn Gly
325 330 335
Leu Asp Ser Cys Ala Gly Asp Val Gln Ser Pro Ile Asp Ile Val Thr
340 345 350
Ser Thr Leu Gln Ala Gly Ser Ser Ser Asp Val Ser Ser Val Asn Leu
355 360 365
Asn Asp Leu Asn Thr Asp Ala Phe Thr Leu Thr Gly Asn Thr Val Asn
370 375 380
Ile Gly Gln Gly Met Gln Ile Asn Phe Gly Asp Pro Pro Ala Gly Asp
385 390 395 400
Leu Pro Val Ile Arg Ile Gly Thr Arg Asp Val Thr Phe Arg Pro Leu
405 410 415
Gln Val His Trp His Phe Phe Leu Ser Glu His Thr Val Asp Gly Val
420 425 430
His Tyr Pro Leu Glu Ala His Ile Val Met Lys Asp Asn Asp Asn Leu
435 440 445
Gly Asp Ser Ala Gly Gln Leu Ala Val Ile Gly Ile Met Tyr Lys Tyr
450 455 460
Gly Asp Ala Asp Pro Phe Ile Thr Asp Met Gln Lys Arg Val Ser Asp
465 470 475 480
Lys Ile Ala Ser Gly Ala Ile Thr Tyr Gly Gln Ser Gly Val Ser Leu
485 490 495
Asn Asn Pro Asp Asp Pro Phe Asn Val Asn Ile Lys Asn Asn Phe Leu
500 505 510
Pro Ser Glu Leu Gly Tyr Ala Gly Tyr Asp Gly Ser Leu Thr Thr Pro
515 520 525
Pro Cys Ser Glu Ile Val Lys Trp His Val Phe Leu Glu Pro Arg Thr
530 535 540
Val Ser Val Glu Gln Met Glu Val Phe Ala Asp Val Thr Leu Asn Ser
545 550 555 560
Asn Pro Gly Ala Thr Val Thr Thr Asn Arg Met Ile Gln Pro Leu Glu
565 570 575
Gly Arg Thr Val Tyr Gly Tyr Asn Gly Ala Ala Ala
580 585
<210> 2
<211> 271
<212> PRT
<213> C-half domain carbonic anhydrase from Dunaliella sp.
<400> 2
Glu Pro Asn Asp Lys Tyr Asn Tyr Val Gln His Gly Phe Asp Trp Arg
1 5 10 15
Asp Asn Gly Leu Asp Ser Cys Ala Gly Asp Val Gln Ser Pro Ile Asp
20 25 30
Ile Val Thr Ser Thr Leu Gln Ala Gly Ser Ser Ser Asp Val Ser Ser
35 40 45
Val Asn Leu Asn Asp Leu Asn Thr Asp Ala Phe Thr Leu Thr Gly Asn
50 55 60
Thr Val Asn Ile Gly Gln Gly Met Gln Ile Asn Phe Gly Asp Pro Pro
65 70 75 80
Ala Gly Asp Leu Pro Val Ile Arg Ile Gly Thr Arg Asp Val Thr Phe
85 90 95
Arg Pro Leu Gln Val His Trp His Phe Phe Leu Ser Glu His Thr Val
100 105 110
Asp Gly Val His Tyr Pro Leu Glu Ala His Ile Val Met Lys Asp Asn
115 120 125
Asp Asn Leu Gly Asp Ser Ala Gly Gln Leu Ala Val Ile Gly Ile Met
130 135 140
Tyr Lys Tyr Gly Asp Ala Asp Pro Phe Ile Thr Asp Met Gln Lys Arg
145 150 155 160
Val Ser Asp Lys Ile Ala Ser Gly Ala Ile Thr Tyr Gly Gln Ser Gly
165 170 175
Val Ser Leu Asn Asn Pro Asp Asp Pro Phe Asn Val Asn Ile Lys Asn
180 185 190
Asn Phe Leu Pro Ser Glu Leu Gly Tyr Ala Gly Tyr Asp Gly Ser Leu
195 200 205
Thr Thr Pro Pro Cys Ser Glu Ile Val Lys Trp His Val Phe Leu Glu
210 215 220
Pro Arg Thr Val Ser Val Glu Gln Met Glu Val Phe Ala Asp Val Thr
225 230 235 240
Leu Asn Ser Asn Pro Gly Ala Thr Val Thr Thr Asn Arg Met Ile Gln
245 250 255
Pro Leu Glu Gly Arg Thr Val Tyr Gly Tyr Asn Gly Ala Ala Ala
260 265 270
<210> 3
<211> 263
<212> PRT
<213> N-half domain carbonic anhydrase from Dunaliella sp.
<400> 3
Val Ser Glu Pro His Asp Tyr Asn Tyr Glu Lys Val Gly Phe Asp Trp
1 5 10 15
Thr Gly Gly Val Cys Val Asn Thr Gly Thr Ser Lys Gln Ser Pro Ile
20 25 30
Asn Ile Glu Thr Asp Ser Leu Ala Glu Glu Ser Glu Arg Leu Gly Thr
35 40 45
Ala Asp Asp Thr Ser Arg Leu Ala Leu Lys Gly Leu Leu Ser Ser Ser
50 55 60
Tyr Gln Leu Thr Ser Glu Val Ala Ile Asn Leu Glu Gln Asp Met Gln
65 70 75 80
Phe Ser Phe Asn Ala Pro Asp Glu Asp Leu Pro Gln Leu Thr Ile Gly
85 90 95
Gly Val Val His Thr Phe Lys Pro Val Gln Ile His Phe His His Phe
100 105 110
Ala Ser Glu His Ala Ile Asp Gly Gln Leu Tyr Pro Leu Glu Ala His
115 120 125
Met Val Met Ala Ser Gln Asn Asp Gly Ser Asp Gln Leu Ala Val Ile
130 135 140
Gly Ile Met Tyr Lys Tyr Gly Glu Glu Asp Pro Phe Leu Lys Arg Leu
145 150 155 160
Gln Glu Thr Ala Gln Ser Asn Gly Glu Ala Ala Asp Lys Asn Val Glu
165 170 175
Leu Asn Ser Phe Ser Ile Asn Val Ala Arg Asp Leu Leu Pro Glu Ser
180 185 190
Asp Leu Thr Tyr Tyr Gly Tyr Asp Gly Ser Leu Thr Thr Pro Gly Cys
195 200 205
Asp Glu Arg Val Lys Trp His Val Phe Lys Glu Ala Arg Thr Val Ser
210 215 220
Val Ala Gln Leu Lys Val Phe Ser Glu Val Thr Leu Ala Ala His Pro
225 230 235 240
Glu Ala Thr Val Thr Asn Asn Arg Val Ile Gln Pro Leu Asn Gly Arg
245 250 255
Lys Val Tyr Glu Tyr Lys Gly
260
Claims (23)
- 듀나리엘라 종(Dunaliella) 유래의 탄산무수화효소(carbonic anhydrase)의 C-말단 쪽 하프-도메인의 코딩 서열을 포함하는 재조합 벡터로 형질전환된 숙주 세포 및 듀나리엘라 종(Dunaliella) 유래의 탄산무수화효소의 N-말단 쪽 하프-도메인의 코딩 서열을 포함하는 재조합 벡터로 형질전환된 숙주 세포를 배양하는 단계; 및
상기 숙주세포들의 배양물로부터 수득된 C-말단 쪽 하프-도메인 및 N-말단 쪽 하프-도메인을 1:0.1~2 몰비로 혼합하는 단계를 포함하는 탄산무수화효소의 대량 생산 방법.
- 제1항에 있어서,
탄산무수화효소의 C-말단 쪽 하프-도메인은 서열목록 서열번호 2 및 N-말단 쪽 하프-도메인은 서열번호 3에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 탄산무수화효소의 대량 생산 방법.
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 듀나리엘라 종(Dunaliella) 유래의 탄산무수화효소(carbonic anhydrase)의 C-말단 쪽 하프-도메인 및 N-말단 쪽 하프-도메인을 1:0.1~2 몰비로 혼합한 혼합물을 포함하는 이산화탄소의 포집(capture) 또는 고정(fixation) 용 조성물.
- 제8항에 있어서,
탄산무수화효소의 C-말단 쪽 하프-도메인은 서열목록 서열번호 2 및 N-말단 쪽 하프-도메인은 서열번호 3에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 이산화탄소의 포집 또는 고정용 조성물.
- 삭제
- 제8항에 따른 이산화탄소의 포집(capture) 또는 고정(fixation) 용 조성물을 포함하는 이산화탄소의 포집 및 고정 장치.
- 제8항에 따른 이산화탄소의 포집(capture) 또는 고정(fixation) 용 조성물이 고정화(immobilization) 된 이산화탄소의 포집 및 고정용 센서.
- 이산화탄소 포화 용액과 제8항에 따른 이산화탄소의 포집(capture) 또는 고정(fixation) 용 조성물을 반응시키는 단계를 포함하는 이산화탄소의 포집 또는 고정 방법.
- 제8항에 따른 이산화탄소의 포집(capture) 또는 고정(fixation) 용 조성물을 포함하는 바이카보네이트 또는 카보네이트 화합물 제조용 키트.
- 제14항에 있어서,
바이카보네이트 화합물은 소듐 바이카보네이트(Na2HCO3), 포타슘 바이카보네이트(KHCO3), 마그네슘 바이카보네이트(Mg(HCO3)2), 칼슘 바이카보네이트(Ca(HCO3)2) 또는 암모늄 바이카보네이트((NH4)HCO3)인 바이카보네이트 또는 카보네이트 화합물 제조용 키트.
- 제14항에 있어서,
카보네이트 화합물은 카본산(H2CO3), 리튬 카보네이트(Li2CO3), 소듐 카보네이트(Na2CO3), 포타슘 카보네이트(K2CO3), 루비듐 카보네이트(Rb2CO3), 세슘 카보네이트(Cs2CO3), 베릴륨 카보네이트(BeCO3), 마그네슘 카보네이트(MgCO3), 칼슘 카보네이트(CaCO3), 스트론튬 카보네이트(SrCO3), 바륨 카보네이트(BaCO3), 망간 카보네이트(MnCO3), 철 카보네이트(FeCO3), 코발트 카보네이트(CoCO3), 니켈 카보네이트(NiCO3), 구리 카보네이트(CuCO3), 실버 카보네이트(Ag2CO3), 징크 카보네이트(ZnCO3), 카드뮴 카보네이트(CdCO3), 알루미늄 카보네이트(Al2(CO3)3), 탈륨 카보네이트(Tl2CO3), 리드 카보네이트(PbCO3) 또는 란타늄 카보네이트(La2(CO3)3)인 바이카보네이트 또는 카보네이트 화합물 제조용 키트.
- 이산화탄소 포화 용액과 제8항에 따른 이산화탄소의 포집(capture) 또는 고정(fixation) 용 조성물을 반응시키는 단계; 및
상기에서 얻은 반응물과 알칼리 양이온염을 반응시켜 비정질의 바이카보네이트 또는 카보네이트 화합물을 제조하는 단계를 포함하는 바이카보네이트 또는 카보네이트 화합물의 제조방법.
- 제17항에 있어서,
알칼리 양이온염은 Mg, K, Na, NH4, Ca, Li, Rb, Cs, Be, Sr, Ba, Mn, Fe, Co, Ni, Cu, Zn, Cd, Ag, Al, Tl, Pb 또는 La의 염인 바이카보네이트 또는 카보네이트 화합물의 제조방법.
- 제17항에 있어서,
비정질의 바이카보네이트 또는 카보네이트 화합물을 pH 8 내지 10 에서 0 내지 50 ℃의 온도 조건에서 침전시켜 결정상의 바이카보네이트 또는 카보네이트 화합물로 변화시키는 단계를 더 포함하는 바이카보네이트 또는 카보네이트 화합물의 제조방법.
- 제19항에 있어서,
결정상의 바이카보네이트 또는 카보네이트 화합물은 칼사이트(calcite), 아라고나이트(aragonite) 또는 베터라이트(veterite)인 바이카보네이트 또는 카보네이트 화합물의 제조방법.
- 제8항에 따른 이산화탄소의 포집(capture) 또는 고정(fixation) 용 조성물을 포함하는 바이카보네이트 또는 이산화탄소를 이용한 대사 산물 생산용 키트.
- 제21항에 있어서,
대사 산물은 C4 대사 또는 지질 대사 산물인 바이카보네이트 또는 이산화탄소를 이용한 대사 산물 생산용 키트.
- 바이카보네이트 또는 이산화탄소를 이용한 C4 대사 또는 지질 대사에서 촉매로 제8항에 따른 이산화탄소의 포집(capture) 또는 고정(fixation) 용 조성물을 사용하여 대사 산물을 생산하는 방법.
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| KR1020120051773A KR102005983B1 (ko) | 2012-05-16 | 2012-05-16 | 재조합 탄산무수화효소를 이용한 이산화탄소의 포집 또는 고정화 |
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Non-Patent Citations (2)
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|---|
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| THE JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY, Vol. 271, No. 45, pp. 28703-28709 (1996.11.08.)* |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
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