KR20130128663A

KR20130128663A - 탄산무수화 효소 및 포스포에놀피루브산 카르복실화 효소를 이용한 유기산 생산 시스템

Info

Publication number: KR20130128663A
Application number: KR1020120052556A
Authority: KR
Inventors: 진언선; 장광석; 전한철; 백승필; 구만복; 황이택; 기미란; 민기하; 정진양; 강해민; 윤현식; 김세경; 노용호; 이진원
Original assignee: 한양대학교 산학협력단
Priority date: 2012-05-17
Filing date: 2012-05-17
Publication date: 2013-11-27

Abstract

본 발명은 탄산무수화 효소 및 포스포에놀피루브산 카르복실화 효소를 이용한 유기산 생산 시스템에 관한 것으로서, 탄산무수화 효소(carbonic anhydrase)의 존재 하에서 이산화탄소(CO₂)와 물(H₂O)을 반응시켜 바이카보네이트(bicarbonate)를 생산하는 단계; 및 상기 바이카보네이트를 포스포에놀피루브산 카르복시화 효소(phosphoenolpyruvate carboxylase)의 존재 하에서 포스포에놀피루브산(phosphoenolpyruvate)과 반응시켜 옥살로아세테이트(oxaloacetate)를 생산하는 단계를 포함하는 옥살로아세트산(oxaloacetic acid) 생산 방법 및 탄산무수화 효소(carbonic anhydrase, CA) 및 포스포에놀피루브산 카르복시화 효소(phosphoenolpyruvate carboxylase, PEPCase)를 포함하는 발현벡터가 숙주세포에 형질전환된, 옥살로아세트산(oxaloacetic acid) 생산용 형질전환체를 제공한다. 본 발명의 유기산 생성 시스템은 탄산무수화 효소 및 포스포에놀피루브산 카르복시화 효소를 동시에 사용함으로써, 향상된 수율로 유기산을 대량생산할 수 있고, 유기산을 지속적으로 생산할 수 있는 효과가 있으며, 이산화탄소의 저감 기술에도 접목될 수 있는 장점이 있다.

Description

탄산무수화 효소 및 포스포에놀피루브산 카르복실화 효소를 이용한 유기산 생산 시스템{Organic acid synthetic system using carbonic anhydrase and phosphoenolpyruvate carboxylase}

본 발명은 유기산 생산 시스템에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 탄산무수화 효소 및 포스포에놀피루브산 카르복실화 효소를 이용한 유기산 생산 시스템에 관한 것이다.

해양 미세조류는 해양 표면뿐만 아니라 심해에 이르기까지 무기 탄소의 유기화합물로의 고정 역할을 하는 매우 중요한 기능을 수행하고 있다. 해양 미생조류는 대기 중의 이산화탄소를 바이카보네이트(bicarbonate)로 전환할 수 있는 탄산무수화 효소(carbonic anhydrase, CA)를 생체촉매로 이용하고, 이렇게 생성된 바이카보네이트는 식물보다 광합성과 이산화탄소 고정 효율이 훨씬 높은 포스포에놀피루브산 카르복실화 효소(phosphoenolpyruvate carboxylase, PEPCase)의 작용을 거쳐 다양한 종류의 유기산으로 합성된다.

상기 CA는 대기 중에 존재하는 이산화탄소를 물과 결합시켜 수소이온과 바이카보네이트로 전환시키는 효소로서, 생체 내에서 이산화탄소를 1차적으로 고정하는 역할을 한다. 상기와 같이 CA에 의하여 이산화탄소가 고정되어 형성된 바이카보네이트는 PEPCase의 기질이 된다.

상기 PEPCase는 이산화탄소의 고정으로 생성되는 바이카보네이트와 포스포에놀피루브산(phosphoenolpyruvate, PEP)을 이용하여 다양한 유기산의 전구체가 되는 옥살로아세트산(oxaloacetic acid, OAA)를 생성하는 효소이다. 상기 효소의 반응을 통해 흡수된 이산화탄소가 최종적으로 OAA로 고정된다. 상기 OAA는 C3 화합물로서, 다양한 종류의 C4 화합물이 합성됨에 있어 전구 물질이 된다. 특히, 상기 OAA로부터 합성되는 대표적인 C4 화합물로서 숙신산(succinic acid)이 대표적이다. 상기 숙신산은 테트라하이드로퓨란(Tertahydrofuran, THF), 1,4-부탄디올(1,4-butanediol, 1,4-BDO), 감마부틸로 락톤(γ-Butyrolactone, GBL), N-메틸피롤리돈(N-methylpyrolidone, NMP) 아디프산(adipic acid) 등의 용매 및 고분자의 중간체 물질(intermediate material)로 전환되어 이용될 수 있다.

상기 CA와 PEPCase는 탄소 고정 생물 반응의 중요한 열쇠로서 탄소 고정 효율을 높혀 유용한 유기산의 생성 효율을 향상시키려는 연구 목표와 잘 부합된다. 그러나 이산화탄소의 고정과 관련된 종래의 연구는 CA에 국한되어 진행되어 왔고, 특히 CA의 작용에 의한 탄산칼슘의 생성이 잘 알려져 있을 뿐이다. 또한, PEPCase에 관한 연구도 유전자의 특성을 탐색하는 방향으로 연구가 진행되고 있을 뿐, 이를 이용한 유기산의 생성에 관한 연구는 진행된 바가 없다.

이에, 상기와 같은 단편적이고 개별적인 종래의 연구를 보완하여, 상기 두 효소를 하나의 시스템으로 묶어 이산화탄소의 고정 및 이를 이용한 유용한 유기산의 생성 효율을 하는 기술의 개발이 필요하다.

본 발명의 목적은 수율이 향상된 인비트로(in vitro) 및 인비보(in vivo) 유기산 생산 시스템을 제공하는 것이다.

상기의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명의 일 측면은 탄산무수화 효소(carbonic anhydrase)의 존재 하에서 이산화탄소(CO₂)와 물(H₂O)을 반응시켜 바이카보네이트(bicarbonate)를 생산하는 단계; 및 상기 바이카보네이트를 포스포에놀피루브산 카르복시화 효소(phosphoenolpyruvate carboxylase)의 존재 하에서 포스포에놀피루브산(phosphoenolpyruvate)과 반응시켜 옥살로아세테이트(oxaloacetate)를 생산하는 단계를 포함하는 옥살로아세트산(oxaloacetic acid) 생산 방법을 제공한다.

또한, 상기 목적을 달성하기 위하여 본 발명의 다른 측면은 탄산무수화 효소(carbonic anhydrase, CA)의 유전자 및 포스포에놀피루브산 카르복시화 효소(phosphoenolpyruvate carboxylase, PEPCase)의 유전자를 포함하는 발현벡터가 숙주세포에 형질전환된, 옥살로아세트산(oxaloacetic acid) 생산용 형질전환체를 제공한다

아울러, 상기 목절을 달성하기 위하여 본 발명의 또 다른 측면은 탄산무수화 효소(carbonic anhydrase, CA)의 유전자를 포함하는 제1 발현벡터 및 포스포에놀피루브산 카르복시화 효소(phosphoenolpyruvate carboxylase, PEPCase)의 유전자를 포함하는 제2 발현벡터가 숙주세포에 형질전환된, 옥살로아세트산(oxaloacetic acid) 생산용 형질전환체를 제공한다.

본 발명의 유기산 생성 시스템은 탄산무수화 효소 및 포스포에놀피루브산 카르복시화 효소를 동시에 사용함으로써, 향상된 수율로 유기산을 대량생산할 수 있고, 유기산을 지속적으로 생산할 수 있는 효과가 있다. 또한, 상기 시스템은 대기 중의 이산화탄소를 고정하여 유기산을 생성할 수 있는 바, 이산화탄소의 저감 기술에도 접목될 수 있는 장점이 있다.

다만, 본 발명의 효과는 상기에서 언급한 효과로 제한되지 아니하며, 언급되지 않은 또 다른 효과들은 하기의 기재로부터 당업자에게 명확히 이해될 수 있을 것이다.

도 1은 재조합 발현벡터 pET-28a::BCAⅡ_opt의 벡터맵을 나타내는 도면이다.
도 2는 BCAⅡ_opt 유전자가 성공적으로 삽입되었음을 확인한 결과이다.
도 3은 BCAⅡ_opt 단백질의 유도발현 여부를 확인한 결과이다.
도 4는 BCAⅡ_opt 단백질의 분리 및 정제를 확인한 결과이다.
도 5는 Dunaliella sp. 유래의 탄산무수화 효소 α의 N-말단 및 C-말단의 반복 서열을 확인한 결과이다.
도 6은 재조합 발현벡터 pET-44b::DspαCA-CO의 벡터맵을 나타내는 도면이다.
도 7은 DspαCA-CO 유전자가 성공적으로 삽입되었음을 확인한 결과이다.
도 8은 DspαCA-CO 단백질의 분리 및 정제를 확인한 결과이다.
도 9는 재조합 발현벡터 pMAL-c2x::PtmαCA3의 벡터맵을 나타내는 도면이다.
도 10은 PtmαCA3 유전자가 성공적으로 삽입되었음을 확인한 결과이다.
도 11은 PtmαCA3 단백질의 유도발현 여부를 확인한 결과이다.
도 12는 PtmαCA3 단백질의 분리 및 정제를 확인한 결과이다.
도 13은 재조합 발현벡터 pColdI::PtPEPCase1의 벡터맵을 나타내는 도면이다.
도 14는 PtPEPCase1 유전자가 성공적으로 삽입되었음을 확인한 결과이다.
도 15는 PtPEPCase1 단백질의 분리 및 정제를 확인한 결과이다.
도 16 및 도 17은 OAA의 생성 여부를 확인한 결과이다.
도 18은 재조합 발현벡터 pCDF-1b::DspγCA의 벡터맵을 나타내는 도면이다.
도 19는 DspγCA 유전자가 성공적으로 삽입되었음을 확인한 결과이다.
도 20은 재조합 발현벡터 pET-21a(+)::PtPEPCase2의 벡터맵을 나타내는 도면이다.
도 21은 PtPEPCase2 유전자가 성공적으로 삽입되었음을 확인한 결과이다.
도 22는 재조합 발현벡터 공형질전환된 재조합 발현벡터 pCDF-1b::DspγCA 및 pET-21a(+)::PtPEPCase2의 벡터맵을 나타내는 도면이다.
도 23은 DspγCA 및 PtPEPCase2 유전자가 성공적으로 삽입되었음을 확인한 결과이다.
도 24는 형질전환된 대장균을 배양하는 배양기의 개략도이다.
도 25는 DspγCA 및 PtPEPCase2 단백질의 유도발현 여부를 확인한 결과이다.
도 26은 pDspγCA 및 PtPEPCase2가 모두 도입된 대장균에 의하여 생성된 OAA를 확인한 결과로서,
blank는 oxaloacetate assay kit에서 OAA enzyme mix를 뺀 상태의 반응물;
control은oxaloacetate assay kit에 OAA enzyme mix가 포함된 반응물;
1은 E. coli BL21;
2는 DspγCA가 형질전환된 E. coli BL21;
3은 PtPEPCase2가 형질전환된 E. coli BL21;
4는 DspγCA-PtPEPCase2 단백질이 유도발현된 E. coli BL21; 및
5는 DspγCA-PtPEPCase2 단백질이 유도발현되지 않은 E. coli BL21이다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

1. 옥살로아세트산 생산 방법

본 발명의 일 측면은 탄산무수화 효소(carbonic anhydrase)의 존재 하에서 이산화탄소(CO₂)와 물(H₂O)을 반응시켜 바이카보네이트(bicarbonate)를 생산하는 단계; 및 상기 바이카보네이트를 포스포에놀피루브산 카르복시화 효소(phosphoenolpyruvate carboxylase)의 존재 하에서 포스포에놀피루브산(phosphoenolpyruvate)과 반응시켜 옥살로아세테이트(oxaloacetate)를 생산하는 단계를 포함하는 옥살로아세트산(oxaloacetic acid) 생산 방법을 제공한다.

본 발명의 옥살로아세트산 생산 방법은 탄산무수화 효소(carbonic anhydrase)의 존재 하에서 이산화탄소(CO₂)와 물(H₂O)을 반응시키는 단계 및 상기 바이카보네이트를 포스포에놀피루브산 카르복시화 효소(phosphoenolpyruvate carboxylase)의 존재 하에서 포스포에놀피루브산(phosphoenolpyruvate)과 반응시키는 단계를 포함한다.

상기 탄산무수화 효소(carbonic anhydrase, CA)는 이산화탄소(CO₂)와 물(H₂O)로부터 바이카보네이트(bicarbonate)가 생성되는 하기 반응식 1의 반응을 촉매하는 효소로서, 이산화탄소와 물을 기질로 한다.

[반응식 1]

CO₂ + H₂O → HCO₃ ^- + H⁺

상기 CA는 조류에서 유래한 것일 수 있고, 상기 조류는 두날리엘라(Dunaliella) 속 또는 패오닥틸룸(Phaeodactylum) 속일 수 있다. 특히, 상기 CA가 두날리엘라 속의 조류에서 유래한 것일 경우, 상기 CA는 Dunaliella sp. 유래일 수 있고, 서열번호 3으로 기재되는 아미노산 서열을 포함하는 단백질 또는 서열번호 4로 기재되는 핵산 서열에 의하여 암호화되는 단백질일 수 있으며, 서열번호 9로 기재되는 아미노산 서열을 포함하는 단백질 또는 서열번호 10으로 기재되는 핵산 서열에 의하여 암호화되는 단백질일 수 있다. 또한, 상기 CA가 패오닥틸룸 속의 조류에서 유래한 것일 경우, 상기 CA는 Phaeodactylum tricornutum 유래일 수 있고, 서열번호 5로 기재되는 아미노산 서열을 포함하는 단백질 또는 서열번호 6으로 기재되는 핵산 서열에 의하여 암호화되는 단백질일 수 있다.

또한, 상기 CA는 보스 타우루스(Bos taurus)에서 유래한 것일 수 있고, 서열번호 1로 기재되는 아미노산 서열을 포함하는 단백질 또는 서열번호 2로 기재되는 핵산 서열에 의하여 암호화되는 단백질일 수 있다.

상기 조류 또는 보스 타우루스 유래의 CA는 개체로부터 단백질을 직접 추출 및 정제하여 이용될 수 있으나, 상기 조류 또는 보스 타우루스 유래의 CA의 유전자를 포함하는 발현벡터로 형질전환된 형질전환체로부터 발현되어 대량생산된 것이 바람직하다.

상기 포스포에놀피루브산 카르복시화 효소(phosphoenolpyruvate carboxylase, PEPCase)는 바이카보네이트와 포스포에놀피루브산(phosphoenolpyruvate, PEP)로부터 옥살로아세테이트(oxaloactate)가 생성되는 하기 반응식 2의 반응을 촉매하는 효소로서, 바이카보네이트와 PEP를 기질로 한다.

[반응식 2]

HCO₃ ^- + PEP → oxaloacetate + P_i

상기 PEPCase는 조류에서 유래한 것일 수 있고, 상기 조류는 패오닥틸룸(Phaeodactylum) 속일 수 있다. 특히, 상기 PEPCase가 패오닥틸룸 속의 조류에서 유래한 것일 경우, 상기 PEPCase는 Phaeodactylum tricornutum 유래일 수 있고, 서열번호 7로 기재되는 아미노산 서열을 포함하는 단백질 또는 서열번호 8으로 기재되는 핵산 서열에 의하여 암호화되는 단백질일 수 있으며, 서열번호 11로 기재되는 아미노산 서열을 포함하는 단백질 또는 서열번호 12로 기재되는 핵산 서열에 의하여 암호화되는 단백질일 수 있다.

상기 조류 유래의 PEPCase도 상기 CA와 마찬가지로 개체로부터 단백질을 직접 추출 및 정제하여 이용될 수 있으나, 상기 조류 유래의 PEPCase의 유전자를 포함하는 발현벡터로 형질전환된 형질전환체로부터 발현되어 대량생산된 것이 바람직하다.

상기 옥살로아세트산 생산 방법은 상기 PEPCase에 의하여 생성된 상기 옥살로아세테이트를 양성자화(protonation)시키는 단계를 더 포함할 수 있다. 상기 옥살로아세테이트는 이온화된 음이온 상태로서, 추가적으로 양성자화(protonation)되는 단계를 거쳐 옥살로아세트산으로 된다. 상기 양성자화는 옥살로아세트산(oxaloacetic acid, OAA)에 비하여 pKa 값이 더 작은 강산의 첨가 등 당업계에 널리 알려진 방법에 의하여 수행될 수 있다.

상기 옥살로아세트산 생산 방법은 인 비트로(in vitro)에서 CA 및 PEPCase의 효소 활성을 이용하는 것이다. 다시 말해서, CA의 효소 활성을 이용하여 PEPCase의 기질 중의 하나인 바이카보네이트를 생성하고, 상기 CA에 의하여 생성된 바이카보네이트를 PEPCase가 이용하여 옥살로아세트산을 생성하는 것이다. 즉, CA를 이용하여 PEPCase의 기질 중의 하나인 바이카보네이트의 농도를 높혀줌으로써, 상기 반응식 2의 정반응을 더욱 촉진할 수 있게 되고, 따라서 최종 산물인 옥살로아세트산의 생성 효율 또한 향상시킬 수 있게 된다.

상기 CA는 대기 중의 이산화탄소를 이용할 수 있다. 즉, 상기 CA는 상기 CA 주변의 물 분자와 대기 중의 이산화탄소를 이용하여 바이카보네이트를 생성할 수 있다. 따라서, 상기 CA는 상기 PEPCase의 기질 중의 하나인 바이카보네이트를 지속적으로 제공할 수 있다. 다만, 보다 효율적인 바이카보네이트의 생성을 위하여 상기 CA가 존재하는 환경으로 이산화탄소를 주입해 줄 수도 있다.

상기 PEP는 외부에서 주입되는 것이 바람직하고, 상기 PEP는 목적하는 옥살로아세트산의 양에 맞추어 충분한 양이 주입되어야 한다. 또한, 상기 PEP의 주입은 연속적으로 수행될 수 있다. 특히 상기 PEP가 연속적으로 주입되는 경우, 상기 CA에 의하여 지속적으로 공급되는 바이카보네이트를 이용하여 옥살로아세트산을 지속적으로 생성할 수 있다.

본 발명의 구체적인 실시예에서는 보스 타우루스(Bos taurus), 두날리엘라(Dunaliella sp.) 및 패오닥틸룸 트리코르누툼(Phaeodactylum tricornutum)에서 각각 유래한 서열번호 1, 서열번호 3 및 서열번호 5의 아미노산 서열을 갖는 어느 하나의 CA 10 ㎍과, 패오닥틸룸 트리코르누툼(Phaeodactylum tricornutum)에서 유래한 서열번호 7의 아미노산 서열을 갖는 PEPCase 10 ㎍을 0.1 M의 포스포에놀피루브산(phosphoenolpyruvate, PEP) 3 ㎕와 함께 PEPCase 익스트랙션 버퍼(PEPCase extraction buffer)(50 mM Tris-HCl(pH 8.0), 1mM MgCl₂)에서 10분 동안 상온으로 반응시킴으로써, 약 10 ㎍의 OAA를 수득하였다(도 16 및 17 참조).

2. 옥살로아세트산(oxaloacetic acid) 생산용 형질전환체

본 발명의 다른 측면은 탄산무수화 효소(carbonic anhydrase, CA)의 유전자 및 포스포에놀피루브산 카르복시화 효소(phosphoenolpyruvate carboxylase, PEPCase)의 유전자를 포함하는 발현벡터가 숙주세포에 형질전환된, 옥살로아세트산(oxaloacetic acid) 생산용 형질전환체를 제공한다.

본 발명의 또 다른 측면은 탄산무수화 효소(carbonic anhydrase, CA)의 유전자를 포함하는 제1 발현벡터 및 포스포에놀피루브산 카르복시화 효소(phosphoenolpyruvate carboxylase, PEPCase)의 유전자를 포함하는 제2 발현벡터가 숙주세포에 형질전환된, 옥살로아세트산(oxaloacetic acid) 생산용 형질전환체를 제공한다.

본 발명의 상기 옥살로아세트산 생산용 형질전환체는 CA의 유전자 및 PEPCase의 유전자를 포함하는 발현벡터를 포함한다.

상기 발현벡터는 상기 CA 및 PEPCase가 삽입되어 상기 CA 및 PEPCase가 숙주세포 내에서 각각 발현될 수 있도록 하는 것으로서, 상용화된 발현벡터를 이용할 수 있고, 바람직하게는 pCDF-1b, pT7, pET/Rb, pGEX, pET28a(+), pET-21a(+), pET-22b(+) 및 pGEX로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나일 수 있다.

또한, 상기 발현벡터는 하나의 발현벡터에 상기 CA 유전자 및 상기 PEPCase 유전자가 모두 포함될 수도 있고, 제1 및 제2 발현벡터에 CA 유전자 및 PEPCase 유전자 중 어느 하나가 각각 포함될 수도 있다.

상기 숙주세포는 상기 발현벡터가 형질도입되고, 또는 CA 유전자 및 PEPCase 유전자가 각각 제1 및 제2 발현벡터에 하나씩 포함되어 있는 경우에는 제1 및 제2 발현벡터가 공형질도입되어 상기 CA 단백질과 PEPCase 단백질을 함께 발현시킬 수 있는 세포를 의미하는 것으로서, 대장균(Escherichia coli)일 수 있다.

상기 옥살로아세트산 생산용 형질전환체는 CA 및 PEPCase를 발현한다. 상기 형질전환체 내에서 발현된 CA는 외부의 이산화탄소와 숙주세포 내의 물을 이용하여 바이카보네이트를 생성하고, 상기 PEPCase는 상기 바이카보네이트와 숙주세포 내의 PEP를 이용하여 옥살로아세트산을 생산할 수 있다.

본 발명의 구체적인 실시예에서는 서열번호 10의 CA 유전자와 서열번호 12의 PEPCase 유전자를 pCDF-1b에 삽입하여 대장균(E. coli BL21(DE3))에 형질전환하였고, 상기 형질전환된 대장균에서 OAA가 대량 생산됨을 확인하였다(도 26 및 표 1 참조). 아울러, 상기 대장균을 혐기 배양시켜 상기 OAA의 후속 대사 생성물의 하나인 숙신산의 생산이 증가하는 것도 확인하였다(표 2 참조).

이하, 본 발명을 실시예에 의하여 상세히 설명한다.

단, 하기 실시예는 본 발명의 이해를 돕기 위한 것일 뿐, 본 발명이 하기의 실시예에 의하여 한정되는 것은 아니다.

탄산무수화효소(Carbonic Anhydrase, CA)의 분리

<1-1> 보스 타우루스( Bos taurus ) 유래 CA의 분리

<1-1-1> 보스 타우루스 ( Bos taurus ) 유래 CA 의 클로닝 및 형질전환

CA의 활성이 잘 알려진 Bos taurus 유래의 CAⅡ의 유전자 서열(NM_178572.2)을 기초로 대장균(E. coli)에 맞게 코돈 최적화(codon optimization)하여 서열번호 2로 기재되는 핵산 서열(이하, 'BCAⅡ_opt'이라 함)을 얻었다.

상기와 같이 얻어진 서열번호 2의 유전자를 발현벡터인 pET-28a(Novagen독일)에 넣어, 도 1과 같이 재조합 발현벡터인 pET-28a::BCAⅡ_opt를 제작하고, 서열번호 14 및 서열번호 15의 프라이머를 이용하여 중합효소연쇄반응(Polymerase chain reaction, PCR)을 수행함으로써, 상기 BCAⅡ_opt 유전자가 성공적으로 도입되었음을 확인하였다(도 2). 그런 다음, 상기 pET-28a::BCAⅡ_opt를 대장균(E. coli Origami 2)에 형질전환하였다.

<1-1-2> 보스 타우루스( Bos taurus ) 유래 CA의 발현유도

상기 실시예 <1-1-1>과 같이 제조된 형질전환체는 엠피실린(ampicillin)에 저항성을 보이는 바, 상기 형질전환체를 100 ㎍/㎖의 엠피실린이 포함된 LB배지에서 현탁하고 37 ℃에서 배양하였다. 상기와 같은 배양된 형질전환체의 배양액에 OD600을 기준으로 0.4 내지 0.5 사이의 단계에서 0.5 mM의 IPTG(isopropylthio-β-D-galactoside)(Sigma, 미국)를 처리하고 37 ℃에서 3시간 동안 현탁배양시켜, 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 BCAⅡ_opt 단백질의 발현을 유도하였다. 상기와 같이 BCAⅡ_opt 단백질이 유도발현된 대장균을 수확(harvest)하고, 20 mM의 Tris-SO₄(pH 8.3)로 재현탁한 다음, 소니케이션(sonication) 방법으로 세포를 파쇄하여 세포용해물(cell lysate)를 수득하였다. 상기와 같이 수득된 세포용해물을 20,000Xg에서 20분간 원심분리하여 상층액을 수득하였고, 상기 상층액을 수용성 분획과 불용성 분획으로 나누어 SDS-PAGE를 수행함으로써 상기 BCAⅡ_opt 단백질의 유도발현 여부를 확인하였다.

그 결과, 도 3에 나타난 바와 같이 상기 상층액의 수용성 분획에서 35 kDa 정도 크기의 BCAⅡ_opt 단백질이 검출되었고, 이로부터 BCAⅡ_opt 단백질이 성공적으로 유도발현되었음을 확인하였다.

<1-1-3> 보스 타우루스( Bos taurus ) 유래 CA의 정제(purification)

상기 실시예 <1-1-2>에서 수득한 상층액으로부터 His-Taq 컬럼인 Ni-NTA 아가로즈(agarose)(QIAGEN, 독일)을 이용하여 6X His-Taq이 융합된 BCAⅡ_opt 단백질을 분리하였다. 이 때, BCAⅡ_opt 단백질의 일루션(elution)은 일루션 버퍼(elution buffer)(20 mM Tris-SO₄(pH 8.3), 250 mM imidazol)를 이용하여 4회 수행하였고, 상기 각각의 일루션된 분획으로 SDS-PAGE를 수행하여 BCAⅡ_opt 단백질의 정제 여부를 확인하였다.

그 결과, 도 4에 나타난 바와 같이 수용성 분획에서 존재하던 38 kDa 정도 크기의 BCAⅡ_opt 단백질이 4개의 일루션 분획 모두에서 특이적으로 검출되었다. 상기와 같은 결과로부터, BCAⅡ_opt 단백질이 특이적으로 정제되었음을 확인하였다.

<1-2> 두날리엘라( Dunaliella sp. ) 유래 CA의 분리

<1-2-1> 두날리엘라( Dunaliella sp. ) 유래 CA의 클로닝 및 형질전환

서열번호 15의 핵산 서열을 갖는 Dunaliella sp. 유래의 탄산무수화 효소 α는 도 5에 도시된 바와 같이 N-말단 부위와 C-말단 부위가 반복되는 서열을 가지므로, C 말단 부위의 서열를 대장균(E. coli)에 맞게 코돈 최적화(codon optimization)하여 서열번호 4로 기재되는 핵산 서열(이하, 'DspαCA-CO'라 함)을 얻었다.

상기와 같이 얻어진 서열번호 4의 유전자를 발현벡터인 pET-44b(Novagen, 독일)에 넣어, 도 6과 같이 재조합 발현벡터인 pET-44b::DspαCA-CO를 제작한 후, 상기 pET-44b::DspαCA-CO를 제한효소(NdeI 및 HindⅢ)로 절단하여 아가로즈 젤 전기영동함으로써 상기 DspαCA-CO 유전자의 성공적인 삽입을 확인하였다(도 7). 그런 다음, 상기 pET-44b::DspαCA-CO를 대장균(E. coli BL21(DE3))에 형질전환하였다.

<1-2-2> 두날리엘라( Dunaliella sp. ) 유래 CA의 발현유도

상기 실시예 <1-2-1>과 같이 제조된 형질전환체는 카나마이신(kanamycin)에 저항성을 보이는 바, 상기 형질전환체를 50 ㎍/㎖의 카나마이신이 포함된 LB배지에서 현탁하고 37 ℃에서 배양하였다. 상기와 같은 배양된 형질전환체의 배양액에 OD600을 기준으로 0.4 내지 0.5 사이의 단계에서 30분간 15 ℃로 정치한 후, 1 mM의 IPTG(isopropylthio-β-D-galactoside)(Sigma, 미국)를 처리하고 15 ℃에서 24시간동안 현탁배양시켜, 서열번호 3의 아미노산 서열을 갖는 DspαCA-CO 단백질의 발현을 유도하였다.

<1-2-3> 두날리엘라( Dunaliella sp. ) 유래 CA의 정제(purification)

상기 실시예 <1-2-2>에서와 같이 DspαCA-CO 단백질이 유도발현된 대장균을 수확(harvest)하고, 25 mM의 Tris-SO₄(pH 7.6)로 재현탁한 다음, 소니케이션(sonication) 방법으로 세포를 파쇄하여 세포용해물(cell lysate)를 수득하였다. 상기와 같이 수득된 세포용해물을 20,000Xg에서 20분간 원심분리하여 상층액을 수득하였다. 상기와 같이 수득한 상층액으로부터 His-Taq 컬럼인 Ni-NTA 아가로즈(agarose)(QIAGEN, 독일)을 이용하여 6X His-Taq이 융합된 DspαCA-CO 단백질을 분리하였다. 이 때, DspαCA-CO 단백질의 일루션(elution)은 일루션 버퍼(elution buffer)(25 mM Tris-SO₄(pH 7.6), 250 mM imidazol)를 이용하여 3회 수행하였고, 상기 각각의 일루션된 분획으로 SDS-PAGE를 수행하여 DspαCA-CO 단백질의 정제 여부를 확인하였다.

그 결과, 도 8에 나타난 바와 같이 30 kDa 정도 크기의 DspαCA-CO 단백질이 3개의 일루션 분획 모두에서 특이적으로 검출되었다. 상기와 같은 결과로부터, DspαCA-CO 단백질이 특이적으로 정제되었음을 확인하였다.

<1-3> 패오닥틸룸 트리코르누툼( Phaeodactylum tricornutum ) 유래 CA의 분리

<1-3-1> 패오닥틸룸 트리코르누툼( Phaeodactylum tricornutum ) 유래 CA의 클로닝 및 형질전환

Phaeodactylum tricornutum CCMP 632 유래의 탄산무수화 효소 α의 유전자 서열(XM_002183864.1)을 기초로 신호펩티드(signal peptide)를 제거하여 서열번호 6으로 기재되는 핵산 서열(이하, 'PtmαCA3'이라 함)을 얻었다.

상기와 같이 얻어진 서열번호 6의 유전자를 발현벡터인 pMAL-c2x(NEB, 영국)에 넣어, 도 9와 같이 재조합 발현벡터인 pMAL-c2x::PtmαCA3를 제작하고, 서열번호 16 및 서열번호 17의 프라이머를 이용하여 중합효소연쇄반응(Polymerase chain reaction, PCR)을 수행함으로써, 상기 PtmαCA3 유전자가 성공적으로 도입되었음을 확인하였다(도 10). 그런 다음, 상기 pMAL-c2x::PtmαCA3를 대장균(E. coli Origami 2)에 형질전환하였다.

<1-3-2> 패오닥틸룸 트리코르누툼( Phaeodactylum tricornutum ) 유래 CA의 발현유도

상기 실시예 <1-3-1>과 같이 제조된 형질전환체는 엠피실린(ampicillin)에 저항성을 보이는 바, 상기 형질전환체를 100 ㎍/㎖의 엠피실린이 포함된 LB배지에서 현탁하고 37 ℃에서 배양하였다. 상기와 같은 배양된 형질전환체의 배양액에 OD600을 기준으로 0.4 내지 0.5 사이의 단계에서 0.3 mM의 IPTG(isopropylthio-β-D-galactoside)(Sigma, 미국)를 처리하고 37 ℃에서 4시간 동안 현탁배양시켜, 서열번호 5의 아미노산 서열을 갖는 PtmαCA3 단백질의 발현을 유도하였다. 상기와 같이 PtmαCA3 단백질이 유도발현된 대장균을 수확(harvest)하고, 20 mM의 Tris-SO₄(pH 8.3)로 재현탁한 다음, 소니케이션(sonication) 방법으로 세포를 파쇄하여 세포용해물(cell lysate)를 수득하였다. 상기와 같이 수득된 세포용해물을 20,000Xg에서 20분간 원심분리하여 상층액을 수득하였고, 상기 상층액을 수용성 분획과 불용성 분획으로 나누어 SDS-PAGE를 수행함으로써 상기 PtmαCA3 단백질의 유도발현 여부를 확인하였다.

그 결과, 도 11에 나타난 바와 같이 상기 상층액의 불용성 분획에 비하여 수용성 분획에서 현저하게 과발현된 70 kDa 정도 크기의 PtmαCA3 단백질이 검출되었고, 이로부터 PtmαCA3 단백질이 성공적으로 유도발현되었음을 확인하였다.

<1-3-3> 패오닥틸룸 트리코르누툼( Phaeodactylum tricornutum ) 유래 CA의 정제(purification)

상기 실시예 <1-3-2>에서 수득한 상층액으로부터 MBP(Maltose binding protein)-Taq 컬럼인 아밀로즈 아가로즈(amylose agarose)(NEB, 영국)를 이용하여 MBP-Taq이 융합된 PtmαCA3 단백질을 분리하였다. 이 때, PtmαCA3 단백질의 일루션(elution)은

일루션 버퍼(elution buffer)(20 mM Tris-SO₄(pH 8.3), 10 mM maltose)를 이용하여 2회 수행하였고, 상기 각각의 일루션된 분획으로 SDS-PAGE를 수행하여 PtmαCA3 단백질의 정제 여부를 확인하였다.

그 결과, 도 12에 나타난 바와 같이 수용성 분획에서 유독 현저하게 발현되었던 70 kDa 정도 크기의 PtmαCA3 단백질이 2개의 일루션 분획 모두에서 특이적으로 검출되었다. 상기와 같은 결과로부터, PtmαCA3 단백질이 특이적으로 정제되었음을 확인하였다.

포스포에놀피루브산 카르복실화효소(Phosphoenolpyruvate Carboxylase, PEPCase)의 분리

<2-1> 패오닥틸룸 트리코르누툼( Phaeodactylum tricornutum ) 유래 PEPCase의 클로닝 및 형질전환

서열번호 8의 Phaeodactylum tricornutum CCMP 632 유래의 포스포에놀피루브산 카르복실화 효소 1의 유전자(PtPEPCase1)(XM_002180991)를 5'쪽에 Nde I 과 3'쪽에 Pst I 제한효소를 이용하여 발현벡터인 pColdI(Takara, 일본)에 넣어, 도 13과 같이 재조합 발현벡터인 pColdI::PtPEPCase1을 제작하고, 서열번호 22 및 서열번호 23의 프라이머를 이용하여 중합효소연쇄반응(Polymerase chain reaction, PCR)을 수행함으로써, 상기 PtPEPCase1 유전자의 성공적인 삽입을 확인하였다(도 14). 그런 다음, 상기 pColdI::PtPEPCase1를 대장균(E. coli Origami 2)에 형질전환하였다.

<2-2> 패오닥틸룸 트리코르누툼( Phaeodactylum tricornutum ) 유래 PEPCase의 발현유도

상기 실시예 <2-1>과 같이 제조된 형질전환체는 엠피실린(ampicillin)에 저항성을 보이는 바, 상기 형질전환체를 50 ㎍/㎖의 엠피실린이 포함된 LB배지에서 현탁하고 37 ℃에서 배양하였다. 상기와 같은 배양된 형질전환체의 배양액에 OD600을 기준으로 0.4 내지 0.5 사이의 단계에서 30분 동안 15 ℃로 냉각(콜드(cold) 처리)시킨 후, 1 mM의 IPTG(isopropylthio-β-D-galactoside)(Sigma, 미국)를 처리하고 15 ℃에서 24시간 동안 현탁배양시켜, 서열번호 7의 아미노산 서열을 갖는 PtPEPCase1 단백질의 발현을 유도하였다.

<2-3> 패오닥틸룸 트리코르누툼( Phaeodactylum tricornutum ) 유래 PEPCase의 정제(purification)

상기 실시예 <2-2>에서와 같이 PtPEPCase1 단백질이 유도발현된 대장균을 수확(harvest)하고, 라이시스 버퍼(lysis buffer)(20 mM Tris-HCl (pH7.5), 0.5M NaCl, 10 mM imidazole, 5% glycerol, 20 mM KCl, 10 mM MgCl₂, 0.1% Triton X-100, 1 mM PMSF)로 재현탁한 다음, 소니케이션(sonication) 방법으로 세포를 파쇄하여 세포용해물(cell lysate)를 수득하였다. 상기와 같이 수득된 세포용해물을 10,000Xg에서 30분간 원심분리하여 상층액을 수득하였다. 상기와 같이 수득한 상층액으로부터 His-Taq 컬럼인 Ni-NTA 아가로즈(agarose)(QIAGEN, 독일)을 이용하여 6X His-Taq이 융합된 PtPEPCase1 단백질을 분리하였다. 이 때, PtPEPCase1 단백질의 일루션(elution)은 일루션 버퍼(elution buffer)(20 mM Tris-SO₄(pH 7.5), 0.5 M NaCl, 300 mM imidazole, 5% glycerol, 20 mM KCl, 10 mM MgCl₂)를 이용하여 5회 수행하였고, 상기 각각의 일루션된 분획으로 SDS-PAGE를 수행하여 PtPEPCase1 단백질의 정제 여부를 확인하였다.

그 결과, 도 15에 나타난 바와 같이 112 kDa 정도 크기의 PtPEPCase1 단백질이 첫 번째 및 두 번째 일루션 분획에서 특이적으로 검출되었다. 상기와 같은 결과로부터, PtPEPCase1 단백질이 특이적으로 정제되었음을 확인하였다.

In vitro 에서 옥살로아세트산(oxaloacetic acid, OAA)의 생산

<3-1> OAA의 생산

20 웰의 플레이트에 상기 실시예 <1-1> 내지 <1-3>에서 각각 정제한 Bos taurus, Dunaliella sp. 및 Phaeodactylum tricornutum CCMP 632 유래의 어느 한 CA와 상기 실시예 2에서 정제한 Phaeodactylum tricornutum CCMP 632 유래의 PEPCase를 각각 10 ㎍ 씩 첨가하고, 0.1 M의 포스포에놀피루브산(phosphoenolpyruvate, PEP)을 3 ㎕ 첨가하였다. 그런 다음, PEPCase 익스트랙션 버퍼(PEPCase extraction buffer)(50 mM Tris-HCl(pH 8.0), 1mM MgCl₂)를 첨가하여 반응물의 최종 부피를 50 ㎕로 맞추어 주고, 상온에서 10분간 반응시켰다. 일부 실험군에서는 각 효소(CA 또는 PEPCase)와 PEP를 첨가하지 않음으로써, 상기 효소 및 PEP가 OAA의 합성에 미치는 영향을 확인하였다.

<3-2> OAA의 정량

BioVison사의 옥살로아세트산 분석 시약를 이용하여, 상기 실시예 <3-1>의반응 결과 생성된 OAA를 정량하였다. 상기 OAA의 정량은 BioVison사에서 제시한 실험방법에 따라 수행되었다. 보다 상세하게는, 상기 실시예 <3-1>의 20 웰 플레이트에 상기 분석 시약 50 ㎕를 더 첨가하여 총 100 ㎕의 부피가 되도록 한 다음, 암소상태에서 약 1분 동안 반응을 진행시켰다. 그런 다음, 상기 반응 결과를 사진 및 570nm 파장의 흡광도값을 측정하여 정량화하였다.

그 결과, 도 16 및 도 17에서 나타난 바와 같이 PEPCase 및 PEP를 넣은 반응물에서 붉은색을 띄는 변색 반응이 일어나 OAA가 합성되었음을 확인할 수 있었다. 상기에서 생성된 OAA에서 측정된 흡광도 값은 10 ㎍의 OAA에서 측정되는 흡광도 값과 비슷하였다(도 16 및 도 17의 OAA). 또한, 상기 반응물에 CA가 첨가된 실험군에서 더 붉은색을 나타내는 변색 반응이 나타냈고, PEP 또는 PEPCase가 첨가되지 않은 실험군에서는 옥살로아세트산 합성이 되지 않았다.

상기와 같은 결과로부터, PEPCase에 의한 OAA가 합성되고, CA에 의해 OAA의 생산이 더욱 증가됨을 알 수 있다. 이는 CA에 의하여 PEPCase의 다른 기질인 바이카보네이트의 생성이 촉진되기 때문인 것으로 판단된다. 또한, 10 ㎍의 CA 및 PEPCase와 약 50 ㎍ 정도의 PEP를 반응시킴으로써 약 10 ㎍ 정도의 OAA를 생성할 수 있음을 알 수 있다.

In vivo 에서 옥살로아세트산(oxaloacetic acid, OAA)의 생산

<4-1> 두날리엘라( Dunaliella sp. ) 유래 CA의 클로닝 및 형질전환

Dunaliella sp.로부터 서열번호 9의 핵산 서열을 갖는 탄산무수화 효소 γ의 유전자(DspγCA)를 동정하여 발현벡터인 pCDF-1b(Merck, 독일)에 넣어 도 18과 같은 재조합 발현벡터인 pCDF-1b::DspγCA를 제작하고, 서열번호 18 및 서열번호 19의 프라이머를 이용하여 중합효소연쇄반응(Polymerase chain reaction, PCR)을 수행함으로써, 상기 DspγCA 유전자가 성공적으로 도입되었음을 확인하였다(도 19). 그런 다음, 상기 pCDF-1b::DspγCA를 대장균(E. coli BL21(DE3))에 형질전환하였다.

<4-2> 패오닥틸룸 트리코르누툼( Phaeodactylum tricornutum ) 유래 PEPCase의 클로닝 및 형질전환

Phaeodactylum tricornutum으로부터 서열번호 11의 핵산 서열을 갖는 포스포에놀피루브산 카르복실화 효소 2의 유전자(PtPEPCase2)(XM_002182793)를 동정하여 발현벡터인 pET-21a(+)(Novagen, 독일)에 넣어 도 20과 같은 재조합 발현벡터인 pET-21a(+)::PtPEPCase2를 제작하고, 서열번호 20 및 서열번호 21의 프라이머를 이용하여 중합효소연쇄반응(Polymerase chain reaction, PCR)을 수행함으로써, 상기 PtPEPCase2 유전자가 성공적으로 도입되었음을 확인하였다(도 21). 그런 다음, 상기 pET-21a(+)::PtPEPCase2를 대장균(E. coli BL21(DE3))에 형질전환하였다.

<4-3> CA 및 PEPCase의 대장균으로의 형질전환

상기 실시예 <4-1> 및 <4-2>에서 제조된 재조합 발현벡터 pCDF-1b::DspγCA 및 pET-21a(+)::PtPEPCase2를 각각 제한효소 SacI, KpnI와 제한효소 XhoI, EagI으로 절단하여 아가로즈 젤 전기영동함으로써 상기 DspγCA 및 PtPEPCase2 유전자의 성공적인 삽입을 다시 한번 확인하였다(도 23). 그런 다음, 상기 pCDF-1b::DspγCA-PtPEPCase2를 대장균(E. coli BL21(DE3))에 형질전환하였다.

<4-4> 형질전환된 대장균의 혐기 배양

상기 실시예 <4-1>, <4-2> 및 <4-3>에서 각각 형질전환된 대장균을 도 24와 같은 500 ㎖ 크기의 발효기에 200 ㎖의 액체 LB 배지를 담아, 진탕배양기에서 37 ℃, 150 rpm으로 배양하였다. 또한, 상기 형질전환된 대장균의 성장을 돕고 적절한 pH의 유지를 위하여 MgCO₃를 첨가하였다. 상기 대장균의 성장이 정체기(stationary phase)에 이르렀을 때, 재조합 발현벡터에 삽입된 CA 및 PEPCase의 유전자가 발현되게 1 mM의 IPTG를 첨가하였으며, 전체 배지가 10 g/ℓ의 농도가 되도록 포도당 용액을 첨가하였다. 그런 다음, 혐기 배양을 위해 배양기 내부를 이산화탄소로 충전하고, 배양기를 밀폐시켰다.

<4-5> OAA의 생산 및 분석

상시 실시예 <4-4>와 같이 ITPG를 첨가하여 대장균을 혐기 배양하되, 첨가된 ITPG의 농도가 0 mM, 0.2 mM 및 1mM이 되도록 각각 첨가하였고, 상기 대장균을 26 ℃에서 6시간 동안 배양한 다음 회수하였다. CA 및 PEPCase 단백질의 발현을 확인하기 위하여, 상기 회수된 대장균을 20 mM의 Tris-SO₄(pH 8.3)로 재현탁한 다음, 소니케이션(sonication) 방법으로 세포를 파쇄하여 세포용해물(cell lysate)를 수득하였다. 상기와 같이 수득된 세포용해물을 20,000Xg에서 20분간 원심분리하여 상층액을 수득하였고, 상기 상층액과 남은 침전물을 20 mM의 Tris-SO₄(pH 8.3)으로 재현탁한 다음 소니케이션(sonication)을 1회 재처리하였다. 상기 상층액에서 수득한 샘플(S, 수용성 단백질)과 재처리한 샘플(P, 비수용성 단백질)을 세포의 총 단백질(T)과 함께 SDS-PAGE를 수행함으로써 상기 CA 및 PEPCase 단백질의 유도발현 여부를 확인하였다.

그 결과, 도 25에서 나타난 바와 같이 형질전환 대장균에서 DspγCA와 PtPEPCase2가 성공적으로 유도발현되었음을 확인하였다. 또한, DspγCA는 비수용성 형태로, PtPEPCase 2는 수용성 형태로 발현되는 것을 확인하였다.

상기 실시예 <4-4>와 같은 혐기 배양에 의하여 생산된 OAA를 분석하기 위하여, oxaloacetate assay kit(abcam, 미국)를 이용한 변색 반응을 관찰하였다. 보다 구체적으로, 상기 실시예 <4-4>와 같은 혐기 배양 중인 대장균을 소니케이션(sonication) 방법으로 파쇄한 후, 제조사인 abcam에서 지시에 따라 실험을 수행하였고, 반응 후에는 Bioscreen C (Oy Growth Curves Ab Ltd., 핀란드)를 이용하여 580 nm 파장에서 흡광도를 측정하였다.

그 결과, 도 26 및 하기 표 1에서 나타난 바와 같이 IPTG에 의해 CA 및 PEPCase가 함께 유도발현된 실시예 <4-3>의 형질전환 대장균에서 가장 선명한 붉은색이 관찰되었고, 흡광도도 0.63으로 가장 높게 측정되었다. 상기와 같은 결과로부터, 상기 실시예 <4-3>에서 제조된 대장균이 가장 좋은 OAA 생산력을 나타냄을 알 수 있다.

<4-6> 유기산의 생산 및 분석

상기 실시예 <4-4>와 같은 혐기 배양동안, 대장균은 탄소원인 포도당을 이용하여 다양한 유기산을 생성한다. 상기 혐기 배양에 의하여 생성된 유기산의 생성량을 확인하기 위하여, 상기 실시예 <4-4>의 혐기 배양의 배양액을 회수하여 고압 액체크로마토그래피(HPLC)로 분석하였다. 분석에 사용된 검출기는 RI detector RID-10A(Shimadzu, 일본)이며, 컬럼은 aminex HPX-87H(Bio-Rad, 미국)를 사용하였다. 분석 시, 0.5 mM 황산용액을 이동상으로 사용하였으며, 유속은 0.6 ㎖/min, 컬럼의 온도는 50 ℃로 유지시켰다.

분석 결과는 하기 표 1과 같으며, DspγCA와 PtPEPCase2의 발현으로 인해 유기산의 생산량에 현저한 변화가 생겼다. 특히, 숙신산(succinic acid)의 생성량은 야생형 균주가 0.9694 g/ℓ, 상기 DspγCA와 PtPEPCase2 유전자의 발현이 유도되지 않은 경우 0.7202 g/ℓ의 생산을 보인 것과 비교해 상기 실시예 <4-3>에서 제조된 대장균에서 상기 DspγCA와 PtPEPCase2 유전자의 발현을 유도한 경우에 3.8384 g/L의 생산량을 나타내어, 약 4배 정도 향상되었다. 이러한 숙신산의 생성량 증가는 DspγCA와 PtPEPCase2의 유도발현으로 인해 상기 숙신산의 전구체인 OAA의 생성량이 증가되었기 때문인 것으로 판단된다.

상기에서는 본 발명의 바람직한 실시예를 예시적으로 설명하였으나, 본 발명의 범위는 상기와 같은 특정 실시예에만 한정되지 아니하며, 해당 분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 본 발명의 특허청구범위에 기재된 범주 내에서 적절하게 변경이 가능할 것이다.

<110> Industry-University Cooperation Foundation Hanyang University <120> Organic acid synthetic system using carbonic anhydrase and phosphoenolpyruvate carboxylase <130> HY120024N <160> 23 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 260 <212> PRT <213> Bos taurus <400> 1 Met Ser His His Trp Gly Tyr Gly Lys His Asn Gly Pro Glu His Trp 1 5 10 15 His Lys Asp Phe Pro Ile Ala Asn Gly Glu Arg Gln Ser Pro Val Asp 20 25 30 Ile Asp Thr Lys Ala Val Val Gln Asp Pro Ala Leu Lys Pro Leu Ala 35 40 45 Leu Val Tyr Gly Glu Ala Thr Ser Arg Arg Met Val Asn Asn Gly His 50 55 60 Ser Phe Asn Val Glu Tyr Asp Asp Ser Gln Asp Lys Ala Val Leu Lys 65 70 75 80 Asp Gly Pro Leu Thr Gly Thr Tyr Arg Leu Val Gln Phe His Phe His 85 90 95 Trp Gly Ser Ser Asp Asp Gln Gly Ser Glu His Thr Val Asp Arg Lys 100 105 110 Lys Tyr Ala Ala Glu Leu His Leu Val His Trp Asn Thr Lys Tyr Gly 115 120 125 Asp Phe Gly Thr Ala Ala Gln Gln Pro Asp Gly Leu Ala Val Val Gly 130 135 140 Val Phe Leu Lys Val Gly Asp Ala Asn Pro Ala Leu Gln Lys Val Leu 145 150 155 160 Asp Ala Leu Asp Ser Ile Lys Thr Lys Gly Lys Ser Thr Asp Phe Pro 165 170 175 Asn Phe Asp Pro Gly Ser Leu Leu Pro Asn Val Leu Asp Tyr Trp Thr 180 185 190 Tyr Pro Gly Ser Leu Thr Thr Pro Pro Leu Leu Glu Ser Val Thr Trp 195 200 205 Ile Val Leu Lys Glu Pro Ile Ser Val Ser Ser Gln Gln Met Leu Lys 210 215 220 Phe Arg Thr Leu Asn Phe Asn Ala Glu Gly Glu Pro Glu Leu Leu Met 225 230 235 240 Leu Ala Asn Trp Arg Pro Ala Gln Pro Leu Lys Asn Arg Gln Val Arg 245 250 255 Gly Phe Pro Lys 260 <210> 2 <211> 783 <212> DNA <213> Bos taurus <400> 2 atgtcccatc attgggggta cggcaagcat aacggccccg agcactggca taaagatttt 60 ccgattgcta atggcgaacg ccagtcaccg gtggatattg ataccaaagc cgtcgttcag 120 gatcctgcat taaaaccttt agcacttgtc tatggcgaag ccacgtcgcg gcgaatggtc 180 aataatggtc attcttttaa cgttgagtat gatgactccc aggacaaagc agtgctgaaa 240 gatggacctc ttacaggtac ttacagattg gttcagtttc attttcactg gggctcatct 300 gatgatcaag gtagtgagca caccgtggat cgcaagaagt atgcagcgga attacacctg 360 gtacattgga acaccaaata cggggatttt ggaacagctg cacaacagcc agacgggctg 420 gctgtagtgg gagttttttt aaaagttggt gatgctaatc cagccctgca gaaagtcttg 480 gatgcgctgg attctattaa aacaaaaggt aaaagtacag acttccccaa ctttgatccg 540 ggtagcctgc ttcctaacgt actagactat tggacgtatc ccggttcact gactacgcca 600 cctctcttag aaagcgtgac ttggatcgtg ttaaaagaac caatatctgt tagctcgcag 660 caaatgttga aattccgtac ccttaatttc aatgcggagg gcgaaccaga actcctgatg 720 ttagccaatt ggcgcccggc gcagccgctg aagaatcgtc aagtaagagg tttcccgaaa 780 taa 783 <210> 3 <211> 273 <212> PRT <213> Dunaliella <400> 3 Met Glu Pro Asn Asp Lys Tyr Asn Tyr Val Gln His Gly Phe Asp Trp 1 5 10 15 Arg Asp Asn Gly Leu Asp Ser Cys Ala Gly Asp Val Gln Ser Pro Ile 20 25 30 Asp Ile Val Thr Ser Thr Leu Gln Ala Gly Ser Ser Arg Ser Asp Val 35 40 45 Ser Ser Val Asn Leu Asn Asp Leu Asn Thr Asp Ala Phe Thr Leu Thr 50 55 60 Gly Asn Thr Val Asn Ile Gly Gln Gly Met Gln Ile Asn Phe Gly Asp 65 70 75 80 Pro Pro Ala Gly Asp Leu Pro Val Ile Arg Ile Gly Thr Arg Asp Val 85 90 95 Thr Phe Arg Pro Leu Gln Val His Trp His Phe Phe Leu Ser Glu His 100 105 110 Thr Val Asp Gly Val His Tyr Pro Leu Glu Ala His Ile Val Met Lys 115 120 125 Asp Asn Asp Asn Leu Gly Asp Ser Ala Gly Gln Leu Ala Val Ile Gly 130 135 140 Ile Met Tyr Lys Tyr Gly Asp Ala Asp Pro Phe Ile Thr Asp Met Gln 145 150 155 160 Lys Arg Val Ser Asp Lys Ile Ala Ser Gly Ala Ile Thr Tyr Gly Gln 165 170 175 Ser Gly Val Ser Leu Asn Asn Pro Asp Asp Pro Phe Asn Val Asn Ile 180 185 190 Lys Asn Asn Phe Leu Pro Ser Glu Leu Gly Tyr Ala Gly Tyr Asp Gly 195 200 205 Ser Leu Thr Thr Pro Pro Cys Ser Glu Ile Val Lys Trp His Val Phe 210 215 220 Leu Glu Pro Arg Thr Val Ser Val Glu Gln Met Glu Val Phe Ala Asp 225 230 235 240 Val Thr Leu Asn Ser Asn Pro Gly Ala Thr Val Thr Thr Asn Arg Met 245 250 255 Ile Gln Pro Leu Glu Gly Arg Thr Val Tyr Gly Tyr Asn Gly Ala Ala 260 265 270 Ala <210> 4 <211> 821 <212> DNA <213> Dunaliella <400> 4 atggaaccga acgacaaata caactacgtt cagcacggtt tcgactggcg tgacaacggt 60 ctggactctt gcgctggtga cgttcagtct ccgatcgaca tcgttacctc taccctgcag 120 gctggttctt ctcgttctga cgtttcttct gttaacctga acgacctgaa caccgacgct 180 ttcaccctga ccggtaacac cgttaacatc ggtcagggta tgcagatcaa cttcggtgac 240 ccgccggctg gtgacctgcc ggttatccgt atcggtaccc gtgacgttac cttccgtccg 300 ctgcaggttc actggcactt cttcctgtct gaacacaccg ttgacggtgt tcactacccg 360 ctggaagctc acatcgttat gaaagacaac gacaacctgg gtgactctgc tggtcagctg 420 gctgttatcg gtatcatgta caaatacggt gacgctgacc cgttcatcac cgacatgcag 480 aaacgtgttt ctgacaaaat cgcttctggt gctatcacct acggtcagtc tggtgtttct 540 ctgaacaacc cggacgaccc gttcaacgtt aacatcaaaa acaacttcct gccgtctgaa 600 ctgggttacg ctggttacga cggttctctg accaccccgc cgtgctctga aatcgttaaa 660 tggcacgttt tcctggaacc gcgtaccgtt tctgttgaac agatggaagt tttcgctgac 720 gttaccctga actctaaccc gggtgctacc gttaccacca accgtatgat ccagccgctg 780 gaaggtcgta ccgtttacgg ttacaacggt gctgctgcta a 821 <210> 5 <211> 297 <212> PRT <213> Phaeodactylum tricornutum <400> 5 Leu Asn Lys Thr Ala Phe Ser Tyr Asn Lys Lys Asp Glu Tyr Ser Pro 1 5 10 15 Asp Asn Trp Tyr Arg Leu Asp Ile Ala 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Dunaliella <400> 9 Met Leu Gln Ser Ser Phe Arg His Ala Gly Trp Ser Phe Pro Phe Arg 1 5 10 15 His Pro Pro Ala Ser Gly Ala Leu Glu Lys Thr Leu Ala Gly Val Gly 20 25 30 Ser Leu Phe Arg Val Leu Gly Ser Ala Ile Asp Gly Phe Gly Ala Thr 35 40 45 Leu Gln Gly Pro Gly Ala Leu Arg Glu Gln Val Gln Pro Asn Leu Ala 50 55 60 Trp Ala Pro Thr Lys Leu Asp Glu Arg Cys Pro Pro Ser Arg Gly Gln 65 70 75 80 Val Val Asn Leu Pro Ser Met Ala Ala Met Pro Ser Leu Lys His Val 85 90 95 Val Leu Pro Leu Lys Gly Asp Asn Val Phe Ile Ala Pro Asn Ala Asn 100 105 110 Val Met Gly Asp Val Lys Ile Gly Ala Asn Ser Ser Ile Trp Tyr Gly 115 120 125 Ala Val Leu Arg Gly Asp Val Asn Ser Ile Glu Val Gly Ser Asn Thr 130 135 140 Asn Ile Gln Asp Asn Ala Ile Ile His Val Ala Lys His Ser Ile Ser 145 150 155 160 Gly Asp Ala Lys Pro Thr Ile Ile Gly Asn Asn Val Thr Ile Gly His 165 170 175 Gly Ala Thr Val His Ala Ala Thr Ile Glu Asp Asn Val Leu Ile Gly 180 185 190 Met Gly Ala Thr Val Leu Asp Gly Cys Val Val Glu Ala Gly Ala Ile 195 200 205 Val 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Ile Glu Ser Leu Arg Ala Ile Pro Trp Thr 690 695 700 Phe Ala Trp Thr Gln Thr Arg Thr His Leu Ser Ala Trp Leu Gly Val 705 710 715 720 Gly Ala Gly Leu Thr Thr Thr Asp Gln Ser Glu Leu Lys Thr Leu Arg 725 730 735 Ala Met Tyr Ile Glu Trp Pro Trp Phe Arg Glu Thr Ile Asp Leu Ile 740 745 750 Ala Met Ile Val Ser Lys Thr Asp Phe Ser Ile Ser Lys Asn Tyr Asp 755 760 765 Asp Gln Leu Val Glu Lys Lys Glu Gly Leu Leu Lys Leu Gly Asp Glu 770 775 780 Val Arg Glu Lys Met Val Gln Thr Arg Gln Ala Val Leu Asp Val Thr 785 790 795 800 Glu Ser Thr Asp Val Ala Gly Ala His Val Ala Leu Met Arg Gly Ser 805 810 815 Ser Thr Ile Arg His Pro Tyr Val Asp Pro Val Asn Val Ile Gln Ala 820 825 830 Glu Leu Leu Lys Arg Leu Arg Val Met Asp Lys Lys Lys Ser Leu Ser 835 840 845 Ala Asp Glu Met Glu Glu Gln Glu Ile Leu Lys Asp Ala Leu Ile Ile 850 855 860 Ser Ile Asn Gly Ile Ala Gln Gly Met Arg Asn Ser Gly 865 870 875 <210> 12 <211> 2634 <212> DNA <213> Phaeodactylum tricornutum <400> 12 atgattgacg ccgccagcaa gctcaccgcg acggaagccc tgggcgtgac gcgcgtcttt 60 tccatcatgc tcaatctcgt caacgccgcc gaagtccagc accgcaaccg acagattcgg 120 gcacacgagt ccaccaagga cccctccggt ggccctctcc ccaaaacgga agattccatt 180 cgcggaacca tggagacgct gttggaatcg aaacaggcga caccggaaga aatatttgcc 240 cagctgcaga agcaaaaagt ggaaatcgtc ctgacggctc atccgactca agtccagcgc 300 aaatcgcttc tgcgcaagta ccgtcgcgtt tcggagatgc tcgcttattt ggagcgaccc 360 gatttggatg gttttgaaaa gtcgtccgcc caaacgagct tgcaaacaat cttgagcagc 420 atttggggag ctgacgaaat tcgaagacaa aaaccgacac cacaacaaga ggccgcaggg 480 ggtaacgcaa tattggagtc ggttttgtgg gacgcggtgc cagcctatct gcgcaaattg 540 gatcaacagt gccgacttac cctggggcag tcgctgcccg tggacgtatg ccccatcaag 600 tttgcttcct ggatcggtgg ggatcgcgat ggtaacccca acgtgacgcc cgaagttacc 660 cgcgaggttg ttctgcaaca acgattgcgg gctgctcgtt tgcttctcaa ggacatgtac 720 gatttgatct ccgaattggc aatttctagc cgcttttcgc ccgccatgga tgccttggca 780 gattccgtca aggactcgca gcataagcgt gaaaagtacc gtcgtgtgat tggacacttg 840 atcaaacgtc tcgtcaaaac ggcccgtgaa tgtgaattag aattgtcgaa actcaacacc 900 tcagctagta tggtcagtca gactctcgtt gaggaagcag tggatggttg gcaagacgtc 960 gatgctcttg acgatgcgac tgatttgatc aagcctttgc gcataatgta cgattcgttg 1020 gttgaaacgg gcttcggttt ggtggccgac ggtttattgg tcgatatcat tcgtcgattg 1080 tatgtgtttg gtatgtccct cgtgcccttg gatattcgcg aggagagtac caagcacacg 1140 gaagcgttag atgccattac gcgttggttg ggaattggct cctatagtga atggaccgaa 1200 gaggctcgtc tcagctggtt gacttctgag ctttccaaca aacgtccctt gtaccgaatt 1260 cgcgaattgc ccaagctggg tttcaatgac agtgtcttga agacgctcaa cgtattcggc 1320 accatagcta ccctacgacc atcttgtttg ggagcctacg tcattagtca ggcgcagacc 1380 gcaagtgatg tcttggccgt catgcttttg caaaagcagt acggtatgac ggacaagaac 1440 agaaacatga tgcgtgtggt tccgttgttt gagaccttga atgacttgac caacgcgccc 1500 gacaaactcg aacagctctt cagtattccg ctttacgtcg gcgccgtcaa agggaaacag 1560 gaagtaatgg tcgggtatag tgacagtgcc aaggatgccg gacgtctggc tgcctgctgg 1620 gcgcagtaca actcgcaaga acgaatggtg aaggtagcgg cgaagcacaa cattgaattg 1680 actttcttcc acggcaaagg gggtaccgta ggacgtggcg gtaacccatc cgtctatcgt 1740 gccattatga gccatccgcc caataccatt aatggccgtt tccgggtgac ggaacagggt 1800 gaaatgataa cgcaaaactt tggagctccg tccattgctg aacgaacttt ggacatttac 1860 acggctggcg tatgtcgcga agctttttct gagcgcgtgg aaccgtcgca agcatggcgt 1920 gaccagatgc aacggatctc cgatgtgagt tgtgccgagt accgccactt agtccgtgag 1980 gaaccgcggt ttgttcccta ctttcgccag gcgacaccgg agttggaact cggaagtttg 2040 aacataggca gtcgtccggc caaacgtaac ccgaaaggcg gtattgaaag tctccgcgcg 2100 attccgtgga cctttgcttg gacgcagacg cgcacacact tatcggcgtg gctgggagtt 2160 ggcgctggtc tcacaacgac agatcaaagc gaattgaaga cgcttcgagc aatgtacatt 2220 gaatggcctt ggtttcgtga aactattgat ctaattgcca tgattgtatc caagacagac 2280 ttttccatat ccaaaaatta tgacgatcaa ctggtggaaa agaaagaagg tttgttgaag 2340 ctgggagacg aggtcaggga gaaaatggtg caaactcgtc aagctgttct tgatgtgacc 2400 gagtctacgg atgttgctgg ggctcacgtc gcccttatgc gagggtcgtc gaccattcgt 2460 catccatacg tcgatccggt caacgttatt caagccgaat tgctcaagcg attgcgagtc 2520 atggacaaga aaaagtctct gtcggcggat gaaatggaag aacaagaaat tttaaaggat 2580 gccctgatta tcagtatcaa tggcatcgct cagggaatgc gaaacagtgg ataa 2634 <210> 13 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for BCAII_opt <400> 13 taatacgact cactataggg 20 <210> 14 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for BCAII_opt <400> 14 gctagttatt gctcagcgg 19 <210> 15 <211> 1770 <212> DNA <213> Dunaliella <400> 15 atgggatccc gccgcatcac cctcttgggg gctctgttcg ctgtcctggc ggtcgcaatc 60 gaagggcgta ccctgcttac acacaacctg aaggccgagg ctgctgagac agtggatgca 120 gtgagctctg tggtagctgg ttctgcaggc aggcagttgc tggtgagtga gcctcacgac 180 tacaactatg agaaagttgg ctttgattgg acgggggggg tctgcgtcaa taccgggacc 240 agcaagcaga gcccaatcaa cattgagact gacagcctgg ctgaggaatc agagaggctg 300 gggaccgcgg atgacacttc acgcctggcc ttgaagggcc tactgtcttc atcctaccag 360 ctgaccagcg aagtggcaat caacctggag caggatatgc agttttcttt taatgcgcct 420 gatgaagact tgcctcaact tactattggt ggggttgtcc acaccttcaa gcctgtgcaa 480 atccactttc accactttgc cagcgagcac gctattgacg gccagcttta tcctcttgag 540 gcccacatgg tgatggcatc ccagaatgac ggctctgacc agcttgctgt cattggcatc 600 atgtacaagt acggggaaga agatcctttc ctcaaaaggc tgcaagaaac tgcacagagc 660 aatggcgaag ctggcgacaa aaatgtggag ctgaactcgt tttccatcaa tgtggccagg 720 gatttgctgc ctgagtcaga cctgacctac tatggatatg atggtagctt gactaccccc 780 ggttgtgatg agcgagtgaa gtggcatgtg ttcaaggagg caaggactgt ctcagtggcg 840 cagctcaagg tgttttcaga ggtcacgctg gctgcccacc ctgaagctac ggttaccaac 900 aaccgtgtca ttcagccgct caatggcagg aaggtctacg agtacaaggg tgaacccaac 960 gacaagtaca actatgtcca gcatggcttt gactggcgcg ataatggctt ggatagctgt 1020 gctggcgacg tccagagccc tattgacatc gtgaccagca ctttgcaagc tggatcttct 1080 cggagtgatg tttctagtgt caacctgaat gacttgaaca ccgacgcgtt cacgctgacc 1140 ggcaacactg tgaatattgg gcaaggcatg caaatcaatt ttggtgaccc ccctgcgggt 1200 gacctgcccg tcatcagaat tggtactagg gacgtcactt tcaggcccct ccaggtgcac 1260 tggcacttct ttttgagtga gcacactgtg gatggagtgc actaccccct ggaagctcat 1320 attgttatga aggacaatga caaccttggt gattctgccg gccagcttgc tgtcatcggt 1380 attatgtaca agtacggcga tgcagacccc ttcattactg atatgcagaa gagggtgtca 1440 gataaaattg catcaggtgc catcacctat ggacaatcag gagtgtctct gaacaatcct 1500 gatgatccct tcaatgtcaa catcaagaat aatttcctgc cctctgagct tggatatgct 1560 ggctacgatg gcagcctgac cacccctcct tgctctgaga ttgtgaagtg gcatgtgttc 1620 ctggagccta ggactgtttc agtggagcag atggaggtct ttgcagatgt gactctgaac 1680 tctaatccag gtgcgaccgt gacaaccaac cgaatgatcc agccactgga gggtaggact 1740 gtgtacggat ataacggtgc tgctgcttaa 1770 <210> 16 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for PtmaCA3 <400> 16 cggaattcct gaacaagact gccttt 26 <210> 17 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for PtmaCA3 <400> 17 cccaagcttt tagacgggac aaatgcgg 28 <210> 18 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for DspgCA <400> 18 gtgggtacca tgttacagtc gtcatttcgc catgc 35 <210> 19 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for DspgCA <400> 19 tgggacctct tacttcttag gccttgttgc aagc 34 <210> 20 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for PtPEPCase2 <400> 20 cggccgatga ttgacgccgc cagcaagc 28 <210> 21 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for PtPEPCase2 <400> 21 ccgctcgagc ggttatccac tgtttcgcat tccct 35 <210> 22 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for PtPEPCase1 <400> 22 acgccatatc gccgaaagg 19 <210> 23 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for PtPEPCase1 <400> 23 ggcagggatc ttagattctg 20

Claims

탄산무수화 효소(carbonic anhydrase)의 존재 하에서 이산화탄소(CO₂)와 물(H₂O)을 반응시켜 바이카보네이트(bicarbonate)를 생산하는 단계; 및
상기 바이카보네이트를 포스포에놀피루브산 카르복시화 효소(phosphoenolpyruvate carboxylase)의 존재 하에서 포스포에놀피루브산(phosphoenolpyruvate)과 반응시켜 옥살로아세테이트(oxaloacetate)를 생산하는 단계를 포함하는 옥살로아세트산(oxaloacetic acid) 생산 방법.
제1항에 있어서, 상기 탄산무수화 효소는 조류에서 유래한 것을 특징으로 하는 옥살로아세트산 생산 방법.
제2항에 있어서, 상기 조류는 두날리엘라(Dunaliella) 속 또는 패오닥틸룸(Phaeodactylum) 속의 조류인 것을 특징으로 하는 옥살로아세트산 생산 방법.
제1항에 있어서, 상기 탄산무수화 효소는 보스 타우루스(Bos taurus)에서 유래한 것을 특징으로 하는 옥살로아세트산 생산 방법.
제1항에 있어서, 상기 탄산무수화 효소는 서열번호 1, 서열번호 3, 서열번호 5 및 서열번호 9로 구성되는 군에서 선택되는 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 옥살로아세트산 생산 방법.
제1항에 있어서, 상기 포스포에놀피루브산 카르복시화 효소는 패오닥틸룸(Phaeodactylum) 속의 조류에서 유래한 것을 특징으로 하는 특징으로 하는 옥살로아세트산 생산 방법.
제1항에 있어서, 상기 포스포에놀피루브산 카르복시화 효소는 서열번호 7 또는 서열번호 11의 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 옥살로아세트산 생산 방법.
제1항에 있어서, 상기 포스포에놀피루브산은 외부에서 주입되는 것을 특징으로 하는 옥살로아세트산 생산 방법.
탄산무수화 효소(carbonic anhydrase)의 유전자 및 포스포에놀피루브산 카르복시화 효소(phosphoenolpyruvate carboxylase)의 유전자를 포함하는 발현벡터가 숙주세포에 형질전환된, 옥살로아세트산(oxaloacetic acid) 생산용 형질전환체.
탄산무수화 효소(carbonic anhydrase)의 유전자를 포함하는 제1 발현벡터 및 포스포에놀피루브산 카르복시화 효소(phosphoenolpyruvate carboxylase)의 유전자를 포함하는 제2 발현벡터가 숙주세포에 형질전환된, 옥살로아세트산(oxaloacetic acid) 생산용 형질전환체.
제9항 또는 제10항에 있어서, 상기 탄산무수화 효소는 조류에서 유래한 것을 특징으로 하는 옥살로아세트산 생산용 형질전환체.
제11항에 있어서, 상기 조류는 두날리엘라(Dunaliella) 속의 조류인 것을 특징으로 하는 옥살로아세트산 생산용 형질전환체.
제9항 또는 제10항에 있어서, 상기 탄산무수화 효소는 서열번호 1, 서열번호 3, 서열번호 5 및 서열번호 9로 구성되는 군에서 선택되는 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 옥살로아세트산 생산용 형질전환체.
제9항 또는 제10항에 있어서, 상기 포스포에놀피루브산 카르복시화 효소는 패오닥틸룸(Phaeodactylum) 속의 조류에서 유래한 것을 특징으로 하는 옥살로아세트산 생산용 형질전환체.
제9항 또는 제10항에 있어서, 상기 포스포에놀피루브산 카르복시화 효소는 서열번호 7 또는 서열번호 11의 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 옥살로아세트산 생산용 형질전환체.
제9항에 있어서, 상기 발현벡터는 pCDF-1b, pT7, pET/Rb, pGEX, pET28a(+), pET-21a(+), pET-22b(+) 및 pGEX로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 하는 옥살로아세트산 생산용 형질전환체.
제10항에 있어서, 상기 제1 발현벡터 또는 제2 발현벡터는 pCDF-1b, pT7, pET/Rb, pGEX, pET28a(+), pET-21a(+), pET-22b(+) 및 pGEX로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 하는 옥살로아세트산 생산용 형질전환체.
제9항 또는 제10항에 있어서, 상기 숙주세포는 대장균(Escherichia coli)인 것을 특징으로 하는 옥살로아세트산 생산용 형질전환체.