KR101965210B1 - 신규 이소프렌 합성 효소 및 이를 이용한 이소프렌 생산 방법 - Google Patents

신규 이소프렌 합성 효소 및 이를 이용한 이소프렌 생산 방법 Download PDF

Info

Publication number
KR101965210B1
KR101965210B1 KR1020170124171A KR20170124171A KR101965210B1 KR 101965210 B1 KR101965210 B1 KR 101965210B1 KR 1020170124171 A KR1020170124171 A KR 1020170124171A KR 20170124171 A KR20170124171 A KR 20170124171A KR 101965210 B1 KR101965210 B1 KR 101965210B1
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
isoprene
seq
isoprene synthase
amino acid
leu
Prior art date
Application number
KR1020170124171A
Other languages
English (en)
Other versions
KR20190035204A (ko
Inventor
이승구
염수진
이대희
김문정
김성근
Original Assignee
한국생명공학연구원
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 한국생명공학연구원 filed Critical 한국생명공학연구원
Priority to KR1020170124171A priority Critical patent/KR101965210B1/ko
Publication of KR20190035204A publication Critical patent/KR20190035204A/ko
Application granted granted Critical
Publication of KR101965210B1 publication Critical patent/KR101965210B1/ko

Links

Images

Classifications

    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12NMICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/88Lyases (4.)
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12NMICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/70Vectors or expression systems specially adapted for E. coli
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12PFERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P5/00Preparation of hydrocarbons or halogenated hydrocarbons
    • C12P5/02Preparation of hydrocarbons or halogenated hydrocarbons acyclic
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12YENZYMES
    • C12Y402/00Carbon-oxygen lyases (4.2)
    • C12Y402/03Carbon-oxygen lyases (4.2) acting on phosphates (4.2.3)
    • C12Y402/03027Isoprene synthase (4.2.3.27)

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)

Abstract

본 발명은 신규한 이소프렌 합성 효소에 관한 것으로서, 메트로시데로스(Metrosideros) 속 미생물로부터 분리된 서열번호 1의 아미노산 서열, 또는 서열번호 1과 90% 이상의 상동성을 가지는 아미노산 서열을 포함하는 이소프렌 합성 효소, 및 이를 암호화 하는 유전자를 제공한다. 본 발명의 이소프렌 합성 효소는 수계에서도 디메틸알릴이인산을 이소프렌으로 변환시킬 수 있어서, 유기용매를 이용할 필요가 없는 등, 이소프렌의 생성 과정에서 독성물질이나, 환경오염 부산물이 발생하지 않는바, 친환경적으로 이소프렌을 제조할 수 있는 장점이 있다.

Description

신규 이소프렌 합성 효소 및 이를 이용한 이소프렌 생산 방법{Novel isoprene synthase, and method for preparing isoprene using the same}
본 발명은 신규한 이소프렌 합성 효소에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 메트로시데로스(Metrosideros) 속 미생물 유래의 이소프렌 합성 효소에 관한 것이다.
이소프렌(isoprene)은 천연고무의 주요 구성성분인 동시에, 타이어, 의료용품, 접착제 등을 만드는데 사용되는 합성고무를 생산하는데 기반이 되는 화합물이다. 또한, 이소프렌은 수송용 연료와 제트 연료로 사용이 가능하고, 다른 바이오 연료에 비해 에너지 효율이 높고 온실가스를 적게 배출하는 특징을 지니고 있어 드랍인(dropin) 바이오 연료로서 적합하다.
현재, 이러한 이소프렌은 석유의 정제 과정을 통해 얻어지는데, 지속적으로 증가하는 합성고무에 대한 수요에 반해, 석유 가격이 등락하고 석유의 정제 공정이 이소프렌이 배제된 연료물질의 생산에 초점을 맞추고 있어서, 이소프렌의 가격이 꾸준히 상승하고 있는 추세이다.
미생물을 이용한 이소프렌의 생산은 순도가 매우 높아 고도의 정제 과정이 필요 없고, 재생 가능한 자원과 단가가 낮은 원료로 생산이 가능하며 손쉽게 바이오연료와 바이오케미컬로 전환이 가능하다는 장점을 가지고 있다. 생물학적으로 이소프렌은 전구체인 디메틸알릴이인산(dimethylallyl diphosphate, DMAPP)으로부터 이소프렌 합성 효소(isoprene synthase)를 통해 생성된다. 포플러 종과 버드나무 종에서 이소프렌 생산과 방출에 대해서 처음 보고된 이후, 식물에서 이소프렌의 배출 기작과 관련 효소에 대한 연구는 꾸준히 이어졌지만, 미생물에서 이소프렌의 생산과 미생물을 숙주로 활용한 이소프렌의 생산에 대한 연구는 최근에서야 이루어지고 있다.
최근 세계적인 타이어 제조 기업과 발효 기업이 합작하여 석유 이외의 물질로부터 이소프렌을 대량 생산하는 방법에 대한 연구가 진행 중이다. 그 중 대표적인 그룹이 듀폰과 굿이어인데, 이들 두 기업이 합작하여 2008년부터 현재까지 미생물에서 이소프렌을 대량 생산해 내기 위한 연구를 수행 중이다. 이들은 다양한 포플러 종과 버드나무 종으로부터 이소프렌 합성 효소를 분리하여 효율을 비교하였으며, 전구체의 공급을 위한 다양한 대사경로를 조합하고 시험하였다. 현재 산업화의 80% 수준의 공정이 진행되었다고 보고되고 있으나, 아직 이소프렌의 생산을 위해서는 많은 양의 탄소원을 필요로 하기 때문에 생산 효율이 낮은 문제점이 있다.
이처럼 종래 연구·개발된 기술에 의해 미생물에서 얻어지는 이소프렌의 양은 상업적으로 이용하기에는 불충분하다는 점에서, 활성이 우수한 신규 이소프렌 합성 효소를 발굴하는 연구·개발이 여전히 필요한 실정이다.
본 발명의 목적은 메트로시데로스(Metrosideros) 속 식물인 메트로시데로스 폴리모파(Metrosideros polymorpha) 유래의 신규한 이소프렌 합성 효소 및 상기 이소프렌 합성 효소를 이용한 이소프렌의 생산 방법을 제공하는 것이다.
상기의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명의 일 측면은 서열번호 1의 아미노산 서열, 또는 서열번호 1과 90% 이상의 상동성을 가지는 아미노산 서열을 포함하는 이소프렌 합성 효소를 제공한다.
또한, 상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 다른 측면은 상기 이소프렌 합성 효소를 암호화하는 유전자를 제공한다.
또한, 상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 또 다른 측면은 상기 유전자가 포함된 재조합 발현벡터 및 상기 발현벡터가 도입된 형질전환체를 제공한다.
아울러, 상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명의 또 다른 측면은 상기 이소프렌 합성 효소를 포함하는 상기 이소프렌 생산용 조성물, 및 상기 이소프렌 합성 효소를 디메틸알릴이인산과 반응시키는 단계를 포함하는 이소프렌의 생산 방법을 제공한다.
본 발명의 이소프렌 합성 효소는 수계에서도 디메틸알릴이인산을 이소프렌으로 변환시킬 수 있어서, 유기용매를 이용할 필요가 없는 등, 이소프렌의 생성 과정에서 독성물질이나, 환경오염 부산물이 발생하지 않는바, 친환경적으로 이소프렌을 제조할 수 있다.
다만, 본 발명의 효과는 상기에서 언급한 효과로 제한되지 아니하며, 언급되지 않은 또 다른 효과들은 하기의 기재로부터 당업자에게 명확히 이해될 수 있을 것이다.
도 1은 형질전환체에서 과발현되어 정제 및 분리된 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 단백질을 SDS-PGAE로 확인한 사진이다.
도 2는 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 단백질의 이소프렌 합성 효소로서의 활성을 확인한 결과를 나타낸 GC 스펙트럼이다.
도 3은 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 단백질의 효소 활성에 영향을 미치는 금속 양이온의 종류(A)와 금속 양이온의 농도(B)를 확인한 그래프이다.
도 4는 온도가 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 단백질의 효소 활성에 미치는 영향을 확인한 그래프이다.
도 5는 pH가 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 단백질의 효소 활성에 미치는 영향을 확인한 그래프로서, ●은 시트르산나트륨 완충 용액, ○은 MOPS 완충 용액, ■는 HEPES 완충 용액, ◇는 EPPS 완충 용액을 나타낸다.
도 6 및 도 7은 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 단백질이 발현되는 형질전환체에 의해 생성된 생성물에서 GC를 통해 확인되는 신규 피크와, 상기 신규 피크를 GC-MS를 통해 확인한 결과를 나타내는 스펙트럼이다.
먼저, 본 발명의 명세서에서 이용된 용어를 설명한다.
본 발명에서 일컫는 '이소프렌 합성 효소'는 하기 반응식과 같이 디메틸알릴이인산(dimethylallyl diphosphate, DMAPP)을 이소프렌으로 변환시키는 활성을 가진 효소를 의미한다.
[반응식]
Figure 112017093951740-pat00001
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
1. 신규 이소프렌 합성 효소 및 그 유전자
본 발명의 일 측면은 서열번호 1의 아미노산 서열, 또는 서열번호 1과 90% 이상의 상동성을 가지는 아미노산 서열을 포함하는 이소프렌 합성 효소를 제공한다.
또한, 본 발명의 다른 측면은 상기 이소프렌 합성 효소를 암호화하는 이소프렌 합성 효소의 유전자를 제공한다.
본 발명의 이소프렌 합성 효소는 메트로시데로스(Metrosideros) 속 식물로부터 유래한 것일 수 있고, 특히 메트로시데로스 폴리모파(Metrosideros polymorpha)로부터 유래한 것이 바람직하다.
본 발명의 이소프렌 합성 효소는 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하고, 상기 이소프렌 합성 효소는 단백질의 기능에 영향을 미치지 않는 범위 내에서, 아미노산 잔기의 결실, 삽입, 치환 또는 이들의 조합에 의해서 상이한 서열을 가지는 아미노산의 변이체들, 또는 단편들일 수 있다. 상기 이소프렌 합성 효소의 활성을 전체적으로 변경시키지 않는 단백질 및 펩티드 수준에서의 아미노산 교환은 당해 분야에 공지되어 있다. 경우에 따라서는 인산화(phosphorylation), 황화(sulfation), 아크릴화(acrylation), 당화(glycosylation), 메틸화(methylation), 파네실화(farnesylation) 등으로 변형될 수 있다. 따라서 본 발명은 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 단백질과 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 갖는 단백질 및 이의 변이체 또는 이의 활성 단편을 포함한다. 상기 실질적으로 동일한 단백질이란 90% 이상, 바람직하게는 93% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 아미노산 서열의 상동성을 갖는 것들을 의미하나 이에 한정되지 않으며, 90% 이상의 아미노산 서열의 상동성을 가지며 동일한 효소 활성을 가진다면 본 발명의 범위에 포함된다.
상기 이소프렌 합성 효소의 유전자는 서열번호 2의 염기 서열로 이루어진 것이 바람직하다. 그러나 본 발명의 이소프렌 합성 효소 및 이의 변이체 또는 이의 활성 단편을 암호화하는 유전자는 암호화 영역으로부터 발현되는 상기 효소 및 이의 변이체 또는 이의 활성 단편의 아미노산 서열을 변화시키지 않는 범위 내에서 암호화 영역에 다양한 변형이 이루어질 수 있고, 암호화 영역을 제외한 부분에서도 유전자의 발현에 영향을 미치지 않는 범위 내에서 다양한 변이가 이루어질 수 있으며, 이러한 변이 유전자 역시 본 발명의 범위에 포함된다. 따라서 본 발명은 서열번호 2의 유전자와 실질적으로 동일한 염기 서열로 이루어진 유전자 및 상기 유전자의 단편을 포함한다. 상기 실질적으로 동일한 염기서열로 이루어진 유전자란 80% 이상, 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 갖는 것들을 의미하나, 이에 한정되는 것은 아니며, 80% 이상의 서열 상동성을 가지며 암호화된 단백질이 동일한 효소 활성을 가진다면 본 발명에 포함된다. 상기와 같이, 본 발명의 이소프렌 합성 효소의 유전자는 이와 동등한 활성을 갖는 단백질을 암호화하는 한, 하나 이상의 핵산 염기가 치환, 결실, 삽입 또는 이들의 조합에 의해 변이될 수 있으며, 이들 또한 본 발명의 범위에 포함된다.
상기 이소프렌 합성 효소에 포함되는 서열번호 1의 아미노산 서열은 바람직하게는 서열번호 2의 염기 서열로 이루어진 유전자에 의해 암호화되나, 본 발명은 이에 한정되지 않고, 동일 아미노산 서열을 갖는 본 발명의 단백질을 암호화할 수 있는 한, 서열번호 2의 염기 서열과 실질적으로 동일한 다른 염기 서열로 이루어진 유전자에 의해 암호화될 수도 있다. 이러한 염기 서열은 단일 가닥 또는 이중 가닥일 수 있으며, DNA 분자 또는 RNA 분자일 수 있다.
상기 이소프렌 합성 효소는 금속 양이온 의존성의 효소일 수 있다. 상기 금속 양이온은 2가 금속 양이온일 수 있고, 상기 2가 금속 양이온은 망간 양이온, 아연 양이온, 구리 양이온, 니켈 양이온, 코발트 양이온, 마그네슘 양이온, 칼슘 양이온 등일 수 있고, 망간 양이온, 아연 양이온, 구리 양이온, 니켈 양이온, 코발트 양이온인 것이 바람직하며, 망간 양이온, 아연 양이온, 구리 양이온인 것이 더욱 바람직하며, 가장 바람직하게는 망간 양이온일 수 있다.
본 발명의 바람직한 실시예에서, 본 발명자들은 메트로시데로스 폴리모파(Metrosideros polymorpha)에서 유래한 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 단백질의 기능을 규명하기 위하여 상기 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 단백질을 분리 및 정제하였고(도 1 참고), 그 활성을 연구한 결과 상기 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 단백질이 이소프렌 합성 효소로서의 활성을 가진다는 것을 확인하였다(도 2 참고).
2. 이소프렌 합성 효소의 발현 벡터 및 형질전환체
본 발명의 또 다른 측면은 본 발명의 이소프렌 합성 효소의 유전자가 포함된 재조합 발현 벡터 및 상기 발현 벡터가 도입된 형질전환체를 제공한다.
본 발명의 재조합 발현 벡터는 상기 이소프렌 합성 효소의 유전자를 포함한다.
상기 발현 벡터는 플라스미드 벡터, 코즈미드 벡터, 박테리오파이지 벡터 및 바이러스 벡터 등을 포함하나 이에 한정되지 않는다.
상기 재조합 발현 벡터는 본 발명의 이소프렌 합성 효소를 생산하고자하는 숙주 세포의 종류에 따라 프로모터(promoter), 터미네이터(terminator), 엔핸서(enhancer) 등과 같은 발현조절서열, 또는 분비를 위한 서열 등을 적절히 목적에 따라 조합할 수 있다.
상기 발현 벡터는 벡터가 도입된 숙주 세포를 선택하기 위한 선택 마커를 추가로 포함할 수 있고, 복제 가능한 발현 벡터인 경우 복제 기원을 포함할 수 있다.
또한, 상기 재조합 발현 벡터는 발현 단백질의 정제를 용이하게 하기 위한 서열을 포함할 수 있으며, 구체적으로 본 발명의 이소프렌 합성 효소를 암호화하는 유전자에 작동 가능하도록 분리정제용 태그를 암호화하는 유전자가 연결될 수 있다. 이때, 상기 분리정제용 태그는 GST, poly-Arg, FLAG, 히스티딘-태그(His-tag) 및 c-myc 등이 단독으로 사용되거나 이들 중 두 개 이상을 순차적으로 연결하여 사용할 수도 있다.
상기 이소프렌 합성 효소를 암호화하는 유전자는 제한효소 절단위치를 통해 클로닝될 수 있으며, 상기 벡터에 단백질 절단효소 인식부위를 암호화하는 유전자가 사용된 경우에는 상기 이소프렌 합성 효소의 유전자와 틀이 맞도록(in frame) 연결되어, 상기 효소를 수득한 후 단백질 절단 효소로 절단 시, 원래 형태의 이소프렌 합성 효소가 생산될 수 있도록 할 수 있다.
본 발명의 구체적인 실시예에서는, 본 발명의 이소프렌 합성 효소 유전자를 플라스미드 벡터인 pET28a(+)에 삽입함으로써 재조합 클로닝 벡터를 제조하였다. 상기의 클로닝 벡터의 제조에 이용된 pET28a(+) 이외에도 다양한 원핵세포용 벡터 또는 진핵세포용(pPIC 및 pPICZ 등) 벡터가 알려져 있으므로 발현의 목적에 따라 상기 벡터 이외의 다양한 발현 벡터를 이용할 수 있다.
본 발명의 상기 재조합 발현 벡터는 이소프렌 합성 효소 유전자가 포함되어 있어 이를 생산할 수 있는 벡터로서 유용하게 이용될 수 있다.
또한, 본 발명의 형질전환체에는 이소프렌 합성 효소를 암호화하는 유전자를 포함하는 재조합 발현 벡터가 도입된다.
본 발명에 따른 상기 재조합 발현 벡터를 발현 목적에 따라 박테리아, 효모, 대장균, 진균류, 식물 세포 및 동물 세포로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나의 적절한 숙주 세포에 형질전환시킴으로써 형질전환체를 제조할 수 있다. 예컨대, 상기 숙주 세포는 대장균(E. coli BL21(DE3), DH5α등) 또는 효모 세포 (Saccharomyces 속, Pichia 속 등) 등 일 수 있다. 이때, 숙주 세포의 종류에 따라 적절한 배양 방법 및 배지 조건 등은 당해 분야의 공지 기술로부터 당업자가 용이하게 선택할 수 있다.
본 발명의 형질전환체의 제조를 위한 재조합 발현 벡터의 도입 방법은 공지의 기술, 즉 열 충격법, 전기충격법 등을 사용할 수 있다.
본 발명의 구체적인 실시예에서, 대장균을 숙주 세포로 하여 본 발명의 이소프렌 합성 효소를 암호화하는 유전자를 포함하는 재조합 발현 벡터를 대장균에 형질전환시켜 형질전환체를 제조하였다.
상기 형질전환체로부터 발현된 단백질은 이소프렌 합성 효소는 효소 활성을 가지는 신규한 서열의 단백질이므로, 상기 형질전환체를 대량 배양하여 상기 유전자를 발현시킴으로써 상기 이소프렌 합성 효소의 대량생산을 용이하게 할 수 있다.
3. 이소프렌 합성 효소의 생산 방법
아울러, 본 발명의 또 다른 측면은 본 발명의 이소프렌 합성 효소를 암호화하는 유전자를 포함하는 재조합 발현 벡터가 도입된 형질전환체를 이용하여 이소프렌 합성 효소를 생산하는 방법을 제공한다.
본 발명의 이소프렌 합성 효소 생산 방법은 1) 본 발명의 이소프렌 합성 효소를 암호화하는 유전자를 포함하는 재조합 발현 벡터가 도입된 형질전환체를 배양하는 단계; 2) 상기 단계 1)에서 배양된 형질전환체에서 상기 이소프렌 합성 효소를 암호화하는 유전자의 발현을 유도하는 단계; 및 3) 상기 단계 2)에서 이소프렌 합성 효소 유전자의 발현이 유도된 형질전환체의 배양물로부터 이소프렌 합성 효소를 분리하는 단계를 포함한다.
상기 단계 1)의 이소프렌 합성 효소를 암호화하는 유전자의 N-말단에는 분리정제용 태그를 암호화하는 유전자 또는 단백질 절단효소 절단위치가 추가로 연결될 수 있고, 이로 인해 재조합 이소프렌 합성 효소의 정제 또는 원래 형태의 이소프렌 합성 효소의 수득이 가능할 수 있다.
상기 단계 1)의 형질전환체의 배양은 공지된 방법에 따라서 수행될 수 있고, 배양 온도, 배양 시간 및 배지의 pH 등의 조건은 적절하게 조절될 수 있다. 또한, 배양 방법에는 회분식 배양(batch culture), 연속식 배양(continuous culture) 및 유가식 배양(fed-batch culture)이 포함될 수 있다. 사용되는 배양 배지는 특정한 균주의 요구 조건을 적절하게 충족시켜야 한다.
상기 단계 3)의 상기 배양에 의해 생성된 배양물로부터 이소프렌 합성 효소의 분리는 원심분리, 여과 등 당해 분야에서 통상적으로 수행되는 방법을 실시할 수 있다. 또한, 상기 방법으로 분리된 이소프렌 합성 효소는 통상의 방식으로 정제될 수 있으며, 예를 들어, 염석(예를 들어 황산암모늄 침전, 인산나트륨 침전), 용매 침전(아세톤, 에탄올 등을 이용한 단백질 분획 침전), 투석, 겔 여과, 이온 교환, 역상 칼럼 크로마토그래피와 같은 크로마토그래피 및 한외여과 등의 기법을 단독 또는 조합하여 본 발명의 효소를 정제할 수 있다.
본 발명이 구체적인 실시예에서는 상기와 같이 정제된 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 단백질이 이소프렌 합성 효소의 활성을 나타냄을 확인하였다(도 2 참고). 상기와 같은 결과로부터, 본 발명의 생산 방법에 따라 이소프렌 합성 효소의 대량 생산이 가능함을 알 수 있다.
4. 이소프렌의 생산 방법 및 이소프렌 생산용 조성물
본 발명의 또 다른 측면은 본 발명의 이소프렌 합성 효소를 이용하여 디메틸알릴이인산으로부터 이소프렌을 인 비트로(in vitro)에서 생산하는 방법 및 인 비트로(in vitro)에서 이소프렌의 생산에 이용되는 이소프렌 생산용 조성물을 제공한다.
본 발명의 이소프렌 생산용 조성물은 본 발명의 이소프렌 합성 효소를 포함한다.
또한, 본 발명의 이소프렌의 인 비트로(in vitro) 생산 방법은 1) 본 발명의 이소프렌 합성 효소를 디메틸알릴이인산과 반응시키는 단계; 및 2) 상기 단계 1)에서의 반응 결과 생성된 반응 생성물로부터 이소프렌을 회수하는 단계를 포함한다.
상기 이소프렌의 생산 방법 및 이소프렌 생산용 조성물은 인 비트로(in vitro)에서 본 발명의 이소프렌 합성 효소의 효소 활성을 이용하는 것이므로, 상기 이소프렌 합성 효소를 이용하여 그 기질인 디메틸알릴이인산으로부터 이소프렌을 생성하는 것이다.
상기 단계 1)의 반응은 40℃ 내지 60℃의 온도 범위, 바람직하게는 45℃ 내지 55℃의 온도 범위, 더욱 바람직하게는 약 50℃의 온도에서 수행될 수 있으나, 이에 한정되지 아니한다. 또한, 상기 단계 1)의 반응은 5 내지 7의 pH 범위, 바람직하게는 6 내지 6.5의 pH 범위, 더욱 바람직하게는 6의 pH에서 수행될 수 있으나, 이에 한정되지 아니한다.
또한, 상기 단계 1)의 반응에는 상기 이소프렌 합성 효소의 활성을 향상시키기 위해 상기 이소프렌 합성 효소와 함께 금속 양이온이 함께 포함될 수 있다. 상기 금속 양이온은 2가 금속 양이온일 수 있고, 상기 2가 금속 양이온은 망간 양이온, 아연 양이온, 구리 양이온, 니켈 양이온, 코발트 양이온, 마그네슘 양이온, 칼슘 양이온 등일 수 있고, 망간 양이온, 아연 양이온, 구리 양이온, 니켈 양이온, 코발트 양이온인 것이 바람직하며, 망간 양이온, 아연 양이온, 구리 양이온인 것이 더욱 바람직하며, 가장 바람직하게는 망간 양이온일 수 있다.
상기 단계 1)의 반응에서, 상기 디메틸알릴이인산은 외부에서 주입되는 것이 바람직하고, 상기 디메틸알릴이인산은 목적하는 이소프렌의 양에 맞추어 충분한 양이 주입되어야 한다. 또한, 상기 디메틸알릴이인산의 주입은 연속적으로 수행될 수 있다. 특히 상기 디메틸알릴이인산이 연속적으로 주입되는 경우, 상기 이소프렌 합성 효소에 의하여 이소프렌을 지속적으로 생성할 수 있다.
본 발명의 구체적인 실시예에서는 상기와 같은 이소프렌 합성 효소에 의하여 디메틸알릴이인산으로부터 이소프렌이 생산됨을 확인하였고(도 2 참조), 이러한 이소프렌 합성 효소의 효소 활성이 50℃에 가까운 온도에서 반응을 수행할수록, 6에 가까운 pH에서 반응을 수행할수록 더욱 향상됨을 확인하였다(도 3 내지 5 참고).
본 발명의 또 다른 측면은 본 발명의 형질전환체를 이용하여 이소프렌을 인 비보(in vivo)에서 생산하는 방법을 제공한다.
또한, 본 발명의 이소프렌의 인 비보(in vivo) 생산 방법은 1) 상기 형질전환체를 디메틸알릴이인산이 공급되는 환경 하에서 배양하는 단계 및 2) 상기 단계 1)에서의 배양물로부터 이소프렌을 회수하는 단계를 포함한다.
상기 디메틸알릴이인산이 공급되는 환경은 외부에서 인위적으로 디메틸알릴이인산을 공급해 주거나 배양에 이용되는 배지 내에 디메틸알릴이인산을 첨가하여 함께 공급해 주는 것일 수도 있고, 상기 디메틸알릴이인산이 생산되는 환경을 제공해 주는 것일 수도 있다. 상기 디메틸알릴이인산이 생상되는 환경은 상기 디메틸알릴이인산의 생산에 관여하는 적어도 하나의 효소를 암호화하는 유전자들을 함께 형질전환시킴으로써 제공될 수 있다. 예를 들어, 상기 디메틸알릴이인산이 생산되는 메발론산 경로(mevalonate pathway)를 구성하는 적어도 하나의 효소를 암호화하는 유전자들을 함께 형질절환할 수 있는데, 상기 메발론산 경로를 구성하는 효소는 MvaE(bifunctional acetoacetyl-CoA thiolase and HMG-CoA reductase), MvaS(HMG-CoA synthase), MvaK1(mevalonate kinase), MvaK2(phosphomevalonate kinase), MvaD(diphosphomevalonate decarboxylase), Idi(IPP isomerase) 등일 수 있다. 상기와 같이 메발론산 경로를 구성하는 효소들이 모두 형질전환되어 있는 경우에는, 디메틸알릴이인산의 공급을 위해 글리세롤의 존재하에서 상기 형질전환체를 배양할 수 있다.
상기와 같은 형질전환체의 배양은 본 기술 분야에 알려진 적당한 배지와 배양 조건에 따라 이루어질 수 있다. 통상의 기술자라면 선택되는 형질전환체의 숙수세포의 종류에 따라 배지 및 배양조건을 용이하게 조정하여 사용할 수 있다. 배양 방법은 회분식, 연속식, 유가식, 또는 이들의 조합 배양을 포함할 수 있다.
상기 배지는 다양한 탄소원, 질소원 및 미량원소 성분을 포함할 수 있다.
상기 탄소원은, 예를 들면, 포도당, 자당, 유당, 과당, 말토오스, 전분, 셀룰로오스와 같은 탄수화물, 대두유, 해바라기유, 피마자유, 코코넛유와 같은 지방, 팔미트산, 스테아린산, 리놀레산과 같은 지방산, 글리세롤 및 에탄올과 같은 알코올, 아세트산과 같은 유기산, 또는 이들의 조합을 포함할 수 있다. 상기 배양은 글루코스를 탄소원으로 하여 수행될 수 있다. 상기 질소원은, 펩톤, 효모 추출물, 육즙, 맥아 추출물, 옥수수 침지액(CSL), 및 대두밀과 같은 유기 질소원 및 요소, 황산암모늄, 염화암모늄, 인산암모늄, 탄산암모늄 및 질산암모늄과 같은 무기 질소원, 또는 이들의 조합을 포함할 수 있다. 상기 배지는 인의 공급원으로서, 예를 들면, 인산이수소칼륨, 인산수소이칼륨 및 상응하는 소듐-함유 염, 황산마그네슘 또는 황산철과 같은 금속염을 포함할 수 있다.
또한, 아미노산, 비타민, 및 적절한 전구체 등이 배지에 포함될 수 있다. 상기 배지 또는 개별 성분은 배양액에 회분식 또는 연속식으로 첨가될 수 있다.
또한, 배양 중에 지방산 폴리글리콜 에스테르와 같은 소포제를 사용하여 기포 생성을 억제할 수 있다.
상기와 같은 형질전환체의 배양은 20℃ 내지 50℃에서 수행될 수 있고, 바람직하게는 25℃ 내지 45℃, 보다 바람직하게는 30℃ 내지 40℃에서 수행될 수 있다. 상기 형질전환체의 배양이 20℃ 미만 또는 50℃ 초과의 온도 범위에서 수행될 경우 충분한 양의 중간 생성물이 생성되지 않아, 결국 최종 생산물인 이소프렌의 생성량 또는 충분해지지 못하는 문제가 발생하게 된다.
또한, 상기와 같은 형질전환체의 배양은 pH 5 내지 pH 8에서 수행될 수 있고, 바람직하게는 pH 6 내지 pH 7에서, 더욱 바람직하게는 pH 6.3 내지 pH 6.7에서 수행될 수 있으나, 이에 한정하지 아니한다. 상기와 같은 형질 전환체의 배양 pH 조건은 형질전환체의 배양 배지에 수산화암모늄, 수산화칼륨, 암모니아, 인산 및 황산과 같은 화합물을 첨가함으로써 조정할 수 있다. 형질전환체의 배양 pH 조건이 상기 범위를 벗어나는 경우 형질전환체의 생장하기 어렵기 때문에 이소프렌의 발현이 용이하지 않아 이소프렌의 합성이 효율적으로 이루어지지 않는 문제점이 있다.
본 발명이 구체적인 실시예에서는 서열번호 2의 염기 서열이 클로닝된 벡터와 메발론산 경로를 발현하는 벡터가 함께 형질전환된 형질전환체에 글리세롤이 포함된 배지를 제공함으로써 상기 글리세롤이 메발론산 경로를 통해 디메틸알릴이인산으로 공급되는 환경에서 배양하였고, 그 결과 이소프렌이 대량 생성됨을 확인하였다(도 6 및 도 7 참고). 상기와 같은 결과로부터, 본 발명의 생산 방법에 따라 인 비보(in vivo)에서도 이소프렌의 대량 생산이 가능함을 알 수 있다.
이하, 본 발명을 실시예에 의하여 상세히 설명한다.
단, 하기 실시예는 본 발명을 구체적으로 예시하는 것이며, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 의해 한정되지 아니한다.
서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 단백질의 분리
[1-1] 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 단백질의 클로닝 및 형질전환
메트로시데로스 폴리모파(Metrosideros polymorpha)에서 유래한 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 단백질을 얻기 위하여, 서열번호 2의 염기 서열을 기초로, 다음 표 1과 같이 서열번호 3 내지 6의 프라이머를 각각 설계하였다.
서열번호 프라이머 쌍 서열
3 정방향 프라이머 5'-tggtgccgcgcggcagccatatgtgtagtgcttccacaca-3'
4 역방향 프라이머 5'-tggtggtggtggtgctcgagttaacgcggcgcaagactga-3'
5 정방향 프라이머 5'-tcagtcttgcgccgcgttaactcgagcaccaccaccacca-3'
6 역방향 프라이머 5'-tgtgtggaagcactacacatatggctgccgcgcggcacca-3'
㈜바이오니아에 의뢰하여 서열번호 2의 염기 서열의 유전자를 합성하였고, 상기 합성된 유전자를 주형으로 하여 상기와 같이 설계된 서열번호 3, 4의 프라이머 쌍을 이용하여 PCR을 수행함으로써, 상기 서열번호 2의 염기 서열을 증폭하였다. Gibson assembly (New England Biolabs, 미국)를 이용하여 상기와 같이 증폭된 서열번호 2의 염기 서열을 포함하는 PCR 산물을, 서열번호 5, 6의 프라이머 쌍을 이용하여 증폭한 플라스미드 벡터 pET28a(+) (Novagen, 미국)의 다중 클로닝 자리에 삽입하여 재조합 발현 벡터를 제작하였고, 염기 서열 분석(sequencing)(㈜마크로젠)을 통해 상기 서열번호 2의 염기 서열이 제대로 삽입되었음을 확인하였으며, 이를 대장균 ER2566 균주(Novagen, 미국)에 형질전환하였다. 상기와 같이 얻어진 형질전환체는 이용하기 전에 20% 글리세린 용액을 첨가하여 냉동 보관하였다.
[1-2] 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 단백질의 과발현 및 정제
상기 실시예 [1-1]에서 냉동 보관된 형질전환체를 5 ㎖의 LB 배지가 포함된 시험관(test tube)에 접종하고 600㎚에서 흡광도가 2.0이 될 때까지 37℃의 진탕 배양기로 종균 배양을 실시하였다. 그런 다음, 상기 종균 배양된 배양액을 500 ㎖의 LB 배지가 포함된 2000 ㎖ 플라스크에 첨가하여 본 배양을 실시하였고, 600㎚에서의 흡광도가 0.6이 될 때 최종 농도 0.1 mM이 되도록 IPTG(isopropyl-1-thio-β-D-galactopyranoside)를 첨가하여 상기 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 단백질의 과발현을 유도하였다. 상기와 같이 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 단백질의 과발현을 유도하는 과정에서, 교반 속도는 200 rpm이, 배양 온도는 37℃가 유지되도록 조정하였고, IPTG를 첨가 후에는 교반 속도를 150 rpm으로, 배양 온도를 16℃로 조정하여 16시간 동안 배양하였다.
또한, 상기와 같이 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 단백질의 과발현이 유도된 형질전환체의 배양액을 4℃에서 4000rpm으로 20분 동안 원심분리하고, 상등액을 분리해 낸 펠렛에 50mM의 제1인산나트륨(NaHPO4), 300mM의 NaCl, 10mM의 이미다졸(immidazole) 및 0.1mM의 PMSF(phenylmethylsulfonyl fluoride, 단백분해효소 저해제)를 첨가하고, 소니케이션(sonication) 방법으로 세포를 파쇄함으로써, 형질전환체의 세포 용해물(cell lysate)를 수득하였다.
상기와 같이 수득된 세포 용해물을 4℃에서 14000rpm으로 20분 동안 다시 원심분리하여 상층액을 수득하였고, IMAC Kit His tag 흡착 컬럼(Bio-Rad Laboratories, 미국)이 장착된 고속 단백질 액체 크로마토그라피(Fast Protein Liquid Chromatography)(Bio-Rad Laboratories, 미국)를 이용하여 상기와 같이 수득된 상층액으로부터 과발현된 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 단백질을 분리하였다.
이렇게 분리된 단백질을 SDS-PAGE를 통해 확인한 결과, 상기와 같은 일련의 과정에 의하여 His-Tag이 붙어 있는 65 kDa의 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 단백질이 과발현되고, 형질전환체의 세포 용해물로부터 정제 및 분리되었음을 확인하였다(도 1).
서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 단백질의 활성 확인 - 인 비트로( in vitro )
본 발명자들은 상기 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 단백질이 하기 반응식과 같은 '이소프렌 합성 효소'로서의 활성을 가질 것으로 예상하고, 이를 확인하였다.
[반응식]
Figure 112017093951740-pat00002
구체적으로, 상기 실시예 [1-2]에서 정제 및 분리한 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 단백질 0.06 ㎎/㎖와 디메틸알릴이인산 0.5mM을 50 mM의 MOPS 완충 용액(pH 6.0)에 첨가한 다음, 50 ℃에서 10분 동안 반응시키고, 상기 반응을 종료시키기 위해 100℃에서 10분 동안 중탕하였다. 그리고 상기와 같이 반응이 종료된 완충 용액에서 디메틸알릴이인산과 이소프렌의 농도를 측정하였다. 이때 상기 농도의 측정은 밀봉된 세럼 보틀의 헤드 스페이스에서 채취한 샘플을 FID(flame ionization detector)가 장착된 GC(gas chromatography)를 이용하여 분석하였다. 컬럼으로는 HP-5 칼럼(30㎜×0.320㎜×0.25㎛)가 사용되었고, 캐리어 가스로는 헬륨을 이용하였다(선속도 1㎖/min). 오븐의 시작 온도는 3분 동안 40℃를 유지하고 100℃까지 10℃/min의 속도로 증가시키고, 3분 동안 100℃를 유지하고, 다시 200℃까지 30℃/min의 속도로 증가시킨 다음, 다시 1분 동안 200 ℃에서 유지시켰다. 생성된 이소프렌을 정량화하기 위해 이소프렌(Sigma-Aldrich, 미국)을 스탠다드로 사용하였다.
그 결과, 상기와 같이 반응이 종료된 완충 용액에서는 디메틸알릴이인산과 이소프렌이 모두 검출되었고(도 2), 애초에 존재하지도 않았던 이소프렌이 위 반응 결과 생성된 결과로부터 상기 실시예 [1-2]에서 정제 및 분리한 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 단백질이 디메틸알릴이인산을 이소프렌으로 변환시키는, 이소프렌 합성 효소로서의 활성을 가짐을 확인하였다.
서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 단백질의 효소 활성에 영향을 미치는 조건에 관한 연구
본 발명자들은, 상기 실시예 2에서 확인된 바와 같이, 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 단백질이 이소프렌 합성 효소로서 작용함에 그 활성에 영향을 미치는 조건들에 대하여 연구를 진행하였고, 그로부터 상기 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 단백질의 최적 활성 조건을 도출하였다.
[3-1] 금속 양이온의 영향
상기 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 단백질의 효소의 활성에 금속 양이온의 종류가 미치는 영향을 확인하기 위하여, 상기 실시예 [1-2]에서 정제 및 분리한 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 단백질 0.06 ㎎/㎖와 디메틸알릴이인산 0.5mM을 50 mM의 MOPS 완충 용액(pH 6.0)에 10mM의 EDTA 또는 금속 양이온(Mn2+, Mg2+, Co2+, Zn2+, Cu2+, Ni2+, Ca2+, Fe2+)을 첨가하여 50 ℃에서 10분 동안 반응시키고, 상기 반응을 종료시키기 위해 100℃에서 10분 동안 중탕하였다. 그리고, 상기 실시예 2에서와 같은 방법으로, 상기와 같이 반응이 종료된 완충 용액에서 디메틸알릴이인산과 이소프렌의 농도를 측정하여 그 상대값을 비교하였다.
그 결과, 여러 종류의 금속 양이온 중 망간 양이온이 첨가된 경우에 이소프렌 합성 효소의 활성이 가장 우수한 것으로 나타났고, 아연 양이온, 구리 양이온, 니켈 양이온 및 코발트 양이온의 경우에도 망간 양이온이 첨가된 경우에 대비하여 약 75% 이상 활성이 향상되는 것으로 확인되었다(도 3의 (a)).
상기 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 단백질의 효소의 활성에 금속 양이온의 농도가 미치는 영향을 확인하기 위하여, 상기 실시예 [1-2]에서 정제 및 분리한 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 단백질 0.06 ㎎/㎖와 디메틸알릴이인산 0.5mM을 50 mM의 MOPS 완충 용액(pH 6.0)에 망간 양이온을 0mM, 0.1mM, 0.5mM, 1mM, 2mM, 5mM, 10mM 및 20mM의 함량으로 각각 첨가하여 50 ℃에서 10분 동안 반응시키고, 상기 반응을 종료시키기 위해 100℃에서 10분 동안 중탕하였다. 그리고, 상기 실시예 2에서와 같은 방법으로, 상기와 같이 반응이 종료된 완충 용액에서 디메틸알릴이인산과 이소프렌의 농도를 측정하여 그 상대값을 비교하였다.
그 결과, 5mM의 망간 양이온을 첨가할 때까지는 첨가되는 망간 양이온의 양이 증가할수록 이소프렌 합성 효소의 활성도 함께 증가하다가, 5mM의 망간 양이온을 첨가한 경우에 가장 우수한 이소프렌 합성 효소의 활성을 나타내었으나, 그 이상이 첨가된 경우에는 특별한 활성의 향상은 없는 것으로 확인되었다(도 3의 (b)).
[3-2] 온도의 영향
상기 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 단백질의 효소의 활성에 온도가 미치는 영향을 확인하기 위하여, 상기 실시예 [1-2]에서 정제 및 분리한 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 단백질 0.06 ㎎/㎖, 디메틸알릴이인산 0.5mM 및 5mM의 망간 양이온을 50 mM의 MOPS 완충 용액(pH 6.0)에 첨가한 다음, 20℃ 내지 60℃의 온도에서 각각 10분 동안 반응시키고, 상기 반응을 종료시키기 위해 100℃에서 10분 동안 중탕하였다. 그리고, 상기 실시예 2에서와 같은 방법으로, 상기와 같이 반응이 종료된 완충 용액에서 디메틸알릴이인산과 이소프렌의 농도를 측정하여 그 상대값을 비교하였다.
그 결과, 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 단백질의 효소 활성은 50℃에 가까울수록 점점 우수해지는 것으로 확인되었다(도 4).
[3-3] pH의 영향
상기 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 단백질의 효소의 활성에 pH가 미치는 영향을 확인하기 위하여, 상기 실시예 [1-2]에서 정제 및 분리한 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 단백질 단백질 0.06 ㎎/㎖, 디메틸알릴이인산 0.5mM 및 5mM의 망간 양이온을 50 mM의 각각 pH 4.5 내지 6의 시트르산나트륨 완충 용액, pH 6 내지 7.5의 MPOS 완충 용액, pH 7.5 내지 8의 HEPES 완충 용액 및 pH 8 내지 8.5의 EPPS 완충 용액에 각각 첨가하여, pH 4.5 내지 8.5의 범위에서 각각 반응시켰다. 상기 효소 반응은 50℃의 온도에서 10분 동안 수행한 뒤, 상기 반응을 종료시키기 위해 100℃에서 10분 동안 중탕하였다. 그리고, 상기 실시예 2에서와 같은 방법으로, 상기와 같이 반응이 종료된 완충 용액에서 디메틸알릴이인산과 이소프렌의 농도를 측정하여 그 상대값을 비교하였다.
그 결과, 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 단백질의 효소 활성은 pH가 6에 가까울수록 점점 우수해지는 것으로 확인되었다(도 5).
서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 단백질의 형질전환체 제조
pTRC99A 벡터를 NcoI과 XbaI으로 절단하고, Gibson assembly (New England Biolabs, 미국)를 이용하여, 상기 실시예 [1-1]에서 증폭한 서열번호 2의 염기 서열을 포함하는 PCR 산물을 상기 pTRC99A 벡터의 다중 클로닝 자리에 삽입하여 재조합 발현 벡터를 제작하였다. 그리고 염기 서열 분석(sequencing)(㈜마크로젠)을 통해 상기 서열번호 2의 염기 서열이 제대로 삽입되었음을 확인하였으며, 이를 대장균 DH5a 균주(Novagen, 미국)에 형질전환하였다.
상기와 같이 얻어진 형질전환체는 이용하기 전에 20% 글리세린 용액을 첨가하여 냉동 보관하였다.
서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 단백질의 활성 확인 - 인 비보( in vivo )
상기 실시예 4에서 얻어진 형질전환체에, 이소프렌의 전구체인 디메틸알릴이인산을 과량으로 공급하기 위하여, 메발론산 경로를 발현하는 pSEVA241-MVA2 (pBBR1) 플라스미드를 함께 형질전환하였다.
한편, 상기 서열번호 2의 염기 서열이 삽입되지 않은 pTRC99A 벡터(공벡터)와 pSEVA241-MVA2 (pBBR1) 플라스미드를 함께 대장균 DH5a 균주(Novagen, 미국)에 형질전환한 형질전환체를 제조하였고, 이를 대조군으로 이용하였다.
상기와 같이 서열번호 2의 염기 서열이 클로닝된 벡터와 상기 pSEVA241-MVA2 (pBBR1) 플라스미드가 함께 형질전환된 형질전환체 및 대조군 형질전환체 각각을, 10g/L의 트립톤(tryptone), 5g/L의 효모 추출물(yeast extract), 5g/L의 NaCl, 100μg/ml의 암피실린(ampicillin), 25μg/ml의 카나마이신(kanamycin)이 포함된 LB 배지에 접종하여 30℃, 200rpm으로 하룻밤 동안(overnight) 배양하였다. 상기와 같이 배양된 배양액 1%를, 12g/L의 효소 카제인 소화(Enzymatic casein digest), 24g/L의 효모 추출물, 9.4g/L의 K2HPO4, 2.2g/L의 KH2PO4, 3.5%(w/v)의 글리세롤, 0.025mM의 IPTG, 100μg/ml의 암피실린, 25μg/ml의 카나마이신이 포함된 TB 배지에 접종하고, 30℃, 200rpm으로 3일 동안 밀봉된 유리병에서 배양하였다.
상기와 같이 배양한 후, 헤드스페이스의 생성물을 GC(gas chromatography) 및 GC-MS(GC-mass spectrometry, Agilent 7890A, 미국)로 분석하였다. GC의 컬럼으로는 HP-5 칼럼(30㎜×0.320㎜×0.25㎛)가 사용되었고, 캐리어 가스로는 헬륨을 이용하였다(선속도 1㎖/min). 오븐의 시작 온도는 3분 동안 40℃를 유지하고 100℃까지 10℃/min의 속도로 증가시키고, 3분 동안 100℃를 유지하고, 다시 200℃까지 30℃/min의 속도로 증가시킨 다음, 다시 1분 동안 200 ℃에서 유지시켰다. GC-MS는 HP-5MS 컬럼(30㎜×0.250㎜×0.25㎛)을 사용하였고, 오븐의 시작 온도는 3분 동안 40℃를 유지하고 100℃까지 10℃/min의 속도로 증가시키고, 3분 동안 100℃를 유지하고, 다시 200℃까지 30℃/min의 속도로 증가시킨 다음, 다시 1분 동안 200 ℃에서 유지시켰다. 생성된 이소프렌을 정량화하기 위해 이소프렌(Sigma-Aldrich, 미국)을 스탠다드로 사용하였다.
그 결과, 서열번호 2의 염기 서열이 클로닝된 벡터가 형질전환된 형질전환체에서는 2.8분에 대조군 형질전환체에서 확인되지 않은 신규 피크가 나타났고(도 6), GC-MS 분석 결과 상기 신규 피크는 이소프렌인 것으로 확인되었다(도 7). 그리고 3일 동안 배양 후 밀봉된 유리병의 헤드스페이스에 존재하는 이소프렌을 GC로 정량한 결과 107uM의 이소프렌이 생산되었다.
상기에서는 본 발명의 바람직한 실시예를 예시적으로 설명하였으나, 본 발명의 범위는 상기와 같은 특정 실시예에만 한정되지 아니하며, 해당 분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 본 발명의 특허청구범위에 기재된 범주 내에서 적절하게 변경이 가능할 것이다.
<110> KOREA RESEARCH INSTITUTE OF BIOSCIENCE AND BIOTECHNOLOGY <120> NOVEL ISOPRENE SYNTHASE, AND METHOD FOR PREPARING ISOPRENE USING THE SAME <130> 2017-DPA-2232 <160> 6 <170> KopatentIn 3.0 <210> 1 <211> 560 <212> PRT <213> Metrosideros polymorpha <400> 1 Met Cys Ser Ala Ser Thr Gln Val Ser Asp Pro Gln Glu Gly Arg Arg 1 5 10 15 Ser Ala Asn Tyr Gln Pro Ser Val Trp Thr Tyr Asn Tyr Leu Gln Ser 20 25 30 Leu Val Ala Asp Glu Gly Arg Arg Ser His Arg Glu Val Glu Leu Gln 35 40 45 Arg Glu Lys Ala Gln Val Leu Glu Glu Glu Val Arg Gly Ala Leu Asn 50 55 60 Asp Glu Lys Ala Glu Pro Thr Thr Ile Phe Ala Leu Val Asp Asp Ile 65 70 75 80 Arg Arg Leu Gly Leu Gly His Gln Phe Glu Glu Asp Ile Ser Arg Ala 85 90 95 Leu Arg Arg Cys Leu Ser Pro Gly Ala Val Asn Lys Ser Leu Asp Lys 100 105 110 Ser Leu His Gly Thr Ala Leu Gly Phe Arg Ile Leu Arg Gln His Gly 115 120 125 Phe Ala Val Ser Gln Asp Val Leu Lys Ile Phe Met Asp Glu Ser Gly 130 135 140 Ser Phe Met Lys Thr Leu Gly Gly Asp Val Gln Gly Met Leu Ser Leu 145 150 155 160 Tyr Glu Ala Ser His Leu Ala Phe Glu Glu Glu Asp Ile Leu His Gln 165 170 175 Ala Lys Thr Phe Ser Ile Glu His Leu Lys Ser Leu Ser Arg Asp Ile 180 185 190 Ser Lys Asp Leu Gln Asp Leu Val Asn His Glu Leu Glu Leu Pro Leu 195 200 205 His Arg Arg Met Pro Leu Leu Glu Ala Arg Arg Ser Ile Glu Ala Tyr 210 215 220 Ser Lys Arg Gly Tyr Met Asn Asp Arg Ile Leu Lys Leu Ala Ala Thr 225 230 235 240 Asn Phe Asn Thr Ser Gln Ser Ile Leu Gln Arg Asp Leu Gln Glu Met 245 250 255 Leu Gly Trp Trp Asn Asn Val Ser Leu Ala Lys Arg Leu Ser Phe Ala 260 265 270 Arg Asp Arg Leu Met Glu Cys Phe Phe Trp Ala Val Gly Ile Ala Asn 275 280 285 Glu Pro Leu Leu Ser Asn Cys Arg Lys Gly Val Thr Lys Ala Phe Ala 290 295 300 Leu Ile Leu Val Leu Asp Asp Val Tyr Asp Val Phe Gly Thr Leu Asp 305 310 315 320 Glu Leu Glu Leu Phe Thr Asp Ala Val Arg Arg Trp Asp Leu Asn Ala 325 330 335 Val Glu Asp Leu Pro Ala Tyr Met Lys Leu Cys Tyr Leu Ala Leu Tyr 340 345 350 Asn Asn Val Asn Glu Met Ala Tyr Asp Thr Leu Lys Glu Thr Gly Glu 355 360 365 Asn Val Ile Leu Tyr Leu Ala Lys Ala Trp Tyr Asp Leu Cys Lys Ala 370 375 380 Phe Leu Gln Glu Ala Lys Trp Ser Tyr Asn Lys Ile Ile Pro Gly Val 385 390 395 400 Glu Glu Tyr Leu Asn Asn Gly Trp Met Ser Ser Ser Gly Gln Val Met 405 410 415 Leu Thr His Ala Tyr Phe Leu Ala Ser Pro Ser Met Arg Lys Glu Glu 420 425 430 Leu Glu Ser Leu Glu His Tyr His Asp Leu Leu Arg Leu Pro Ser Leu 435 440 445 Ile Phe Arg Leu Thr Asn Asp Leu Ala Ser Ser Ser Ala Glu Leu Glu 450 455 460 Arg Gly Glu Thr Thr Asn Ser Ile Gln Ser Tyr Met Gln Glu Asn Gly 465 470 475 480 Ile Ser Glu Ser Glu Ala Arg Glu Tyr Val Thr Glu Gln Ile Asp Thr 485 490 495 Ala Trp Lys Lys Met Asn Lys Tyr Leu Val Asp His Ser Thr Phe Asp 500 505 510 Gln Ser Phe Val Arg Met Ala Tyr Asn Leu Ala Arg Met Ala His Cys 515 520 525 Val Tyr Gln Asp Gly Asp Ala Ile Gly Ala Pro Asp Asp Gln Ser Trp 530 535 540 Asn Arg Val His Ser Leu Ile Ile Ser Pro Val Ser Leu Ala Pro Arg 545 550 555 560 <210> 2 <211> 1683 <212> DNA <213> Metrosideros polymorpha <400> 2 atgtgtagtg cttccacaca agtcagtgac ccgcaggaag gacgccgcag cgctaactac 60 caaccctcag tgtggaccta caactactta caatcccttg ttgctgacga gggtcgtcgt 120 agccaccgcg aagtagagtt gcagcgtgag aaagcacaag tcttggagga ggaagttcgt 180 ggtgcgctta acgacgaaaa ggcggagcca accactattt ttgcactggt agacgatatc 240 cgccgcttgg gtcttggtca tcagttcgag gaggatatca gtcgtgcgct tcgtcgttgt 300 ctgagtccgg gtgccgtaaa caagagcttg gataagtcgc ttcatgggac tgccttaggc 360 ttccgtattc tgcgtcaaca cggattcgca gttagccagg atgttcttaa aattttcatg 420 gatgagagcg gcagttttat gaagaccttg ggtggtgatg tccagggaat gctgagttta 480 tatgaggcgt cacatctggc atttgaggaa gaggatatct tacatcaggc aaaaacgttt 540 tccatcgaac acctgaagtc cttgtcgcgt gacatcagta aagatttaca agacctggtc 600 aatcacgaac ttgagcttcc ccttcatcgt cgcatgccac tgttggaagc ccgccgctcg 660 attgaggctt actctaagcg tggctatatg aatgatcgca tcttgaagtt agcagcgacc 720 aatttcaaca cgtctcaatc aattcttcaa cgcgatctgc aagaaatgct gggttggtgg 780 aacaatgtct ctttagcgaa acgtttgagt ttcgcacgcg atcgcctgat ggaatgcttt 840 ttctgggcgg ttggaattgc taacgagcca ttgctttcaa actgccgcaa aggagtgact 900 aaggcattcg cgctgatttt agtgttggat gatgtatatg atgttttcgg aaccctggat 960 gaacttgaac ttttcacaga tgcagtgcgc cgttgggatt tgaacgctgt agaggatctg 1020 ccagcataca tgaaactttg ttatctggcc ttgtataaca atgttaatga aatggcctat 1080 gatacactta aagaaacggg agagaatgtt atcttgtacc ttgcaaaggc gtggtacgat 1140 ctgtgtaagg cattcttaca ggaagcgaag tggagctaca acaaaatcat ccctggcgta 1200 gaagagtact tgaataatgg gtggatgtct tcttctggcc aggtaatgtt aacgcacgct 1260 tactttttgg cttccccctc catgcgtaag gaggagcttg agtctttaga acactatcac 1320 gaccttcttc gccttccatc cttaattttt cgtttaacta acgacctggc ctcttcttct 1380 gctgaacttg agcgtggcga gacgactaat tccattcaga gctatatgca ggaaaacggt 1440 atcagtgagt ctgaagcccg cgagtacgtc accgagcaga ttgacaccgc gtggaaaaag 1500 atgaacaagt acctggtgga tcactccaca ttcgatcaat cattcgttcg tatggcatat 1560 aacttagcac gtatggccca ttgtgtgtat caagatgggg atgccattgg agcgccagac 1620 gatcaatctt ggaaccgcgt acacagtttg atcatttcac ccgtcagtct tgcgccgcgt 1680 taa 1683 <210> 3 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for SEQ ID No. 2 <400> 3 tggtgccgcg cggcagccat atgtgtagtg cttccacaca 40 <210> 4 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for SEQ ID No. 2 <400> 4 tggtggtggt ggtgctcgag ttaacgcggc gcaagactga 40 <210> 5 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for pET28a(+) <400> 5 tcagtcttgc gccgcgttaa ctcgagcacc accaccacca 40 <210> 6 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for pET28a(+) <400> 6 tgtgtggaag cactacacat atggctgccg cgcggcacca 40

Claims (14)

  1. 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 이소프렌 합성 효소.
  2. 청구항 1에 있어서,
    상기 효소는 메트로시데로스(Metrosideros) 속 식물 유래인 것을 특징으로 하는 이소프렌 합성 효소.
  3. 청구항 2에 있어서,
    상기 메트로시데로스(Metrosideros) 속 식물은 메트로시데로스 폴리모파(Metrosideros polymorpha) 유래인 것을 특징으로 하는 이소프렌 합성 효소.
  4. 청구항 1의 이소프렌 합성 효소를 암호화하는 유전자.
  5. 청구항 4에 있어서,
    상기 유전자는 서열번호 2의 염기 서열로 이루어진 것을 특징으로 하는 유전자.
  6. 청구항 4의 유전자를 포함하는 재조합 발현벡터.
  7. 청구항 6의 재조합 발현벡터가 숙주세포에 도입된 형질전환체.
  8. 청구항 7에 있어서,
    상기 숙주세포는 대장균인 것을 특징으로 하는 형질전환체.
  9. 청구항 1의 이소프렌 합성 효소를 유효성분으로 포함하는 이소프렌 생산용 조성물.
  10. 청구항 8의 형질전환체를 배양하는 단계; 및
    상기 형질전환체의 배양물로부터 이소프렌 합성 효소를 분리하는 단계를 포함하는 이소프렌 합성 효소의 생산 방법.
  11. 청구항 1의 이소프렌 합성 효소를 디메틸알릴이인산과 반응시키는 단계;를 포함하는 이소프렌 생산 방법.
  12. 청구항 11에 있어서,
    상기 이소프렌 합성 효소와 디메틸알릴이인산의 반응 생성물로부터 이소프렌을 회수하는 단계;를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 이소프렌 생산 방법.
  13. 제8항의 형질전환체를 디메틸알릴이인산이 공급되는 환경 하에서 배양하는 단계;를 포함하는 이소프렌 생산 방법.
  14. 청구항 13에 있어서,
    상기 형질전환체된 배양물로부터 이소프렌을 회수하는 단계;를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 이소프렌 생산 방법.
KR1020170124171A 2017-09-26 2017-09-26 신규 이소프렌 합성 효소 및 이를 이용한 이소프렌 생산 방법 KR101965210B1 (ko)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020170124171A KR101965210B1 (ko) 2017-09-26 2017-09-26 신규 이소프렌 합성 효소 및 이를 이용한 이소프렌 생산 방법

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020170124171A KR101965210B1 (ko) 2017-09-26 2017-09-26 신규 이소프렌 합성 효소 및 이를 이용한 이소프렌 생산 방법

Publications (2)

Publication Number Publication Date
KR20190035204A KR20190035204A (ko) 2019-04-03
KR101965210B1 true KR101965210B1 (ko) 2019-04-04

Family

ID=66105305

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020170124171A KR101965210B1 (ko) 2017-09-26 2017-09-26 신규 이소프렌 합성 효소 및 이를 이용한 이소프렌 생산 방법

Country Status (1)

Country Link
KR (1) KR101965210B1 (ko)

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113603814B (zh) * 2021-08-23 2022-05-13 无锡安睿驰科技有限公司 一种修复轮胎气密层的方法

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2011518564A (ja) * 2008-04-23 2011-06-30 ダニスコ・ユーエス・インク 改良された微生物によるイソプレン産出用のイソプレンシンターゼ変異体

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Metabolic Engineering.,38:125-138(2016.7.14.)
Plant Physiol Biochem.,94:209-215(2015.6.12.)

Also Published As

Publication number Publication date
KR20190035204A (ko) 2019-04-03

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP5787756B2 (ja) 3−ヒドロキシアルカン酸の酵素的脱炭酸によるアルケンの製造法
JP6638086B2 (ja) フルクトースからアロースを生産する菌株およびこれを用いたアロース生産方法
CN113621593B (zh) 来自古柯的聚酮合酶EnPKS1和EnPKS2及其基因和应用
US20220112525A1 (en) Biosynthesis of vanillin from isoeugenol
KR101835164B1 (ko) 향상된 퓨트레신 생산능을 가지는 변이된 오르니틴 디카복실레이즈 단백질 및 이의 용도
KR101965210B1 (ko) 신규 이소프렌 합성 효소 및 이를 이용한 이소프렌 생산 방법
US8652815B2 (en) Transformant comprising gene coding for ws/dgat and method of producing fatty acid ethyl esters using the same
CN113980932B (zh) 一种定点突变的α-葡萄糖苷酶
CN110317765B (zh) 一种高产香叶醇葡萄糖苷的大肠杆菌表达菌株及其应用
KR102212488B1 (ko) 신규 d-트레오닌 생산 효소 및 이를 이용한 d-트레오닌의 입체특이적 생산 방법
KR101725454B1 (ko) 하프니아 알베이 유래의 라이신 디카르복실라아제를 코딩하는 유전자, 이를 포함하는 재조합 벡터, 숙주세포 및 이를 이용한 카다베린의 생산방법
KR20200045978A (ko) 신규 알코올 탈수소효소와 그 돌연변이체, 및 이를 이용한 알데히드 화합물의 생산 방법
KR102424603B1 (ko) 알코올 탈수소효소 변이체, 및 이를 이용한 알데히드 화합물의 생산 방법
KR102207688B1 (ko) 신규 d-트레오닌 생산 효소 및 이를 이용한 d-트레오닌의 생산 방법
KR102118898B1 (ko) 신규 d-입체특이적 아미노산 아미다아제와 그 돌연변이체, 및 이를 이용한 d-아미노산 생산 방법
JP6675759B2 (ja) マンノース転移酵素遺伝子、組換えベクター、形質転換体、1−O−β−マンノシルエリスリトールリピッドの製造方法
JP7216396B2 (ja) 新規メバロン酸経路を有する非古細菌生物
KR102126928B1 (ko) 4-하이드록시발레르산을 생산하는 형질전환 미생물
KR20160144258A (ko) 숙신산 합성 효소의 효소 복합체 및 이를 이용한 숙신산 생산 방법
KR102192800B1 (ko) 전자전달 체인으로 작동하는 Fe-S 융합단백질 및 이의 용도
KR101102460B1 (ko) 글리세롤을 발효원으로 하는 바이오 에탄올 생산능이 향상된 재조합벡터, 형질전환체 및 그 전환체를 이용한 에탄올 생산방법
KR101945925B1 (ko) 이소부틸렌 합성용 단백질 및 이를 이용한 이소부틸렌 제조방법
KR20230078865A (ko) 신규 벤잘아세톤 합성효소, 및 이를 이용한 진저론의 생산 방법
KR101785299B1 (ko) 최적화된 리보스 5-인산 이성화효소를 코딩하는 유전자 및 이를 포함하는 미생물 및 이를 이용한 알로스 제조 방법
KR101479136B1 (ko) 활성이 개선된 네우로스포라 크라사 유래의 신규한 돌연변이 l-아라비톨 탈수소효소

Legal Events

Date Code Title Description
E701 Decision to grant or registration of patent right
GRNT Written decision to grant