KR101945925B1 - 이소부틸렌 합성용 단백질 및 이를 이용한 이소부틸렌 제조방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 이소부틸렌 합성용 단백질 및 이를 이용한 이소부틸렌 제조방법에 관한 것이다.
본 발명에 따른 이소부틸렌 합성용 단백질은 이소부탄올을 탈수축합시켜 이소부틸렌으로 합성하는 것이 가능하다. 또한 본 발명에 따른 이소부틸렌 합성용 단백질을 이용하면 별도의 화학적 공정을 거치지 않고 친환경적인 공정으로 이소부틸렌을 제조하는 것이 가능하게 된다. 그리고 이렇게 생산된 이소부틸렌은 자동차 타이어, 플라스틱 또는 바이오 연료로 활용할 수 있다.

Description

이소부틸렌 합성용 단백질 및 이를 이용한 이소부틸렌 제조방법{Protein for isobutylene synthesis and isobutylene preparation method using the same}

본 발명은 이소부틸렌 합성용 단백질 및 이를 이용한 이소부틸렌 제조방법에 관한 것으로, 보다 구체적으로, 본 발명은 이소부틸렌을 합성하는 단백질, 상기 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현벡터, 상기 발현벡터가 도입된 형질전환체, 상기 형질전환체를 배양하는 단계를 포함하는 이소부틸렌의 제조방법 및 상기 단백질 등을 포함하는 이소부틸렌 제조용 조성물에 관한 것이다.

최근 우리나라뿐만 아니라 전 세계의 가장 큰 문제는 에너지와 환경의 문제로서 기후변화에 따른 지구온난화문제, 화석연료의 고갈에 따른 대체에너지 개발이 큰 화두가 되고 있다. 특히 화석연료를 대신할 수 있는 신재생 에너지의 개발에 선진국을 중심으로 연구가 활발히 진행되고 있으며, 그 중심에는 바이오매스 자원에 대한 관심이 집중되고 있다. 우리나라는 국가에너지 기본계획 및 신재생에너지 기본계획을 수립하여 2030년 기준 신재생에너지 중 65% 이상을 폐기물 및 바이오매스 에너지로 에너지 보급을 충당할 계획을 추진 중이다.

바이오매스란 인간의 활동에서 발생되는 음식물 등의 폐기물뿐만 아니라 곡물, 목재, 하수슬러지, 분뇨 등 모든 자연계에서 발생되는 유기물을 말하는 것으로 그 종류가 매우 다양하며, 그 양이 풍부하여 화석연료를 대체할 수 있는 최적의 자원으로 평가 받고 있다. 현재 우리나라의 경우 바이오매스를 활용한 바이오 고분자 소재 개발, 바이오매스를 이용한 바이오연료 제조기술, 음식물, 축산분뇨를 이용한 바이오가스화 기술, 바이오매스를 이용한 고형연료 제조기술 등의 연구가 활발히 진행 중에 있다. 또한 기존의 복잡한 화학공정을 효소나 미생물을 이용한 친환경 바이오 공정으로 대체하여 수율 향상 및 에너지 절감을 위한 연구가 진행 중에 있다. 이에 관한 예로서, 석유 정제 시에 C4 유분에 포함되어 가솔린, 부틸고무, 플라스틱 등의 원료로 사용되는 이소부틸렌을 생물학적 공정을 통해서 대량생산하는 기술에 관한 연구가 현재 활발하게 진행 중이다.

한편, 이소부틸렌은 자동차 타이어, 플라스틱 또는 수송용 연료 등의 원료로 사용될 수 있는데, 상기 자동차 타이어는 그 시장의 규모가 가파르게 증가하고 있으며, 플라스틱의 생산 규모도 연평균 20% 이상의 성장이 예상되고 있고, 수송용 연료도 바이오 에탄올과 바이오 디젤로는 바이오 연료의 수요를 충당하기 어려워 이소부틸렌의 생합성이 가능하면서 대량생산도 가능한 방법을 개발하는 것이 긴급히 요청되는 실정이다.

한편, 본 발명과 관련되는 선행기술문헌으로는 대한민국 공개특허 제10-2014-0023250호(특허문헌 1)가 개시되어 있으며, 상기 특허문헌 1에는 3-히드록시 알카노에이트 타입의 분자로부터 이소부틸렌과 같은 알켄을 제조하는 방법에 관한 내용이 개시되어 있을 뿐이다.

이러한 배경하에 본 발명자들은 대량생산이 가능하면서 보다 친환경적인 방법으로 이소부틸렌을 제조하는 것이 가능한 이소부틸렌의 제조방법을 개발하기 위하여 예의 연구 노력한 결과, 본 발명에 따른 이소부틸렌 합성용 단백질을 발견하여 본 발명을 완성하였다.

특허문헌 1. 대한민국 공개특허 제10-2014-0023250호

본 발명의 주된 목적은 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어지는 이소부틸렌 합성용 단백질을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 단백질을 코딩하는 서열번호 2의 염기서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현벡터를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 발현벡터를 포함하는 형질전환체를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 형질전환체를 배양하는 단계를 포함하는 이소부틸렌의 제조방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 단백질, 또는 상기 형질전환체, 및 이소부탄올을 포함하는 이소부틸렌 제조용 조성물을 제공하는 것이다.

상술한 목적을 달성하기 위한 일 실시양태로서, 본 발명은 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어지는 이소부틸렌 합성용 단백질을 제공한다.

본 발명의 용어 ‘이소부틸렌’이란 뷰틸렌 이성질체의 하나이며, 상기 이소부틸렌은 부틸고무, 연료첨가제, 폴리메틸메타크릴레이트 등의 다양한 제품의 원료로 사용될 수 있다.

상기 단백질은 마리노모나스(Marinomonas sp.) 균주로부터 유래된 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어지는 것일 수 있다. 또한 상기 단백질은 이소부탄올을 이소부틸렌으로 전환시키는 탈수소효소로서, 상기 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어지는 단백질은 전체적으로는 기존 마리노모나스(Marinomonas sp.) MWYL1 아미노산 서열과 100% 일치하나, 본 발명의 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 단백질이 이소부틸렌을 합성하는 용도는 아직까지 공지되지 않았으므로, 본 발명에서 제공하는 이소부틸렌 합성용 단백질은 본 발명자들에 의해 최초로 규명된 것이라 할 수 있다.

본 발명에 따른 이소부틸렌 합성용 단백질은 서열번호 1의 아미노산 서열 뿐만 아니라, 상기 서열과 80% 이상, 일 예로 90% 이상, 다른 일 예로 95% 이상, 또 다른 일 예로 98% 이상 또는 99% 이상의 상동성을 나타내는 아미노산 서열로서, 이소부틸렌 합성의 활성을 나타내는 단백질이라면 제한 없이 포함할 수 있다.

본 명세서에서 서열과 관련하여 사용된 용어 "상동성"은 주어진 아미노산 서열 또는 염기 서열과 일치하는 정도를 의미하며 백분율로 표시될 수 있다. 본 명세서에서, 주어진 아미노산 서열 또는 염기 서열과 동일하거나 유사한 활성을 갖는 그의 상동성 서열이 "% 상동성"으로 표시된다. 예를 들면, 점수(score), 동일성(identity) 및 유사도(similarity) 등의 매개 변수(parameter)들을 계산하는 표준 소프트웨어, 구체적으로 BLAST 2.0를 이용하거나, 정의된 엄격한 조건하에서 써던 혼성화 실험에 의해 서열을 비교함으로써 확인할 수 있으며, 정의되는 적절한 혼성화 조건은 해당 기술 범위 내이고(Sambrook et al., 1989, Infra), 당업자에게 잘 알려진 방법으로 결정될 수 있다.

아울러 종래의 마리노모나스 균주로부터 유래한 단백질 보다 대장균(E. coli)에서 효율적으로 발현될 수 있는 한, 상기 서열번호 1의 아미노산 서열의 N-말단 또는 C-말단에 다양한 아미노산 서열이 부가된 모든 펩타이드를 포함할 수 있다. 뿐만 아니라, 표적화 서열, 태그(tag), 표지된 잔기, 반감기 또는 펩타이드의 안정성을 증가시키기 위한 특정 목적으로 고안된 아미노산 서열을 추가로 포함할 수 있다.

아울러 종래의 마리노모나스 균주로부터 유래한 단백질 보다도 대장균(E. coli)에서 보다 효율적으로 발현될 수 있다면, 상기 서열번호 1의 아미노산 서열의 일부 아미노산이 부가, 치환, 결실 등의 방법으로 변이된 변이체 단백질도 본 발명에서 제공하는 이소부틸렌 합성용 단백질의 범주에 포함될 수 있다.

특히, 본 발명에서 제공하는 이소부틸렌 합성용 단백질은 서열번호 1의 아미노산 서열과 하나 이상의 아미노산 잔기가 상이한 서열을 가지는 폴리펩티드를 포함할 수 있다. 분자의 활성을 전체적으로 변경시키지 않는 단백질 및 폴리펩티드에서의 아미노산 교환은 당해 분야에 공지되어 있다. 가장 통상적으로 일어나는 교환은 아미노산 잔기 Ala/Ser, Val/Ile, Asp/Glu, Thr/Ser, Ala/Gly, Ala/Thr, Ser/Asn, Ala/Val, Ser/Gly, Thy/Phe, Ala/Pro, Lys/Arg, Asp/Asn, Leu/Ile, Leu/Val, Ala/Glu, Asp/Gly 간의 교환이다. 또한, 아미노산 서열상의 변이 또는 수식에 의해서 단백질의 열, pH 등에 대한 구조적 안정성이 증가하거나 단백질 활성이 증가한 단백질을 포함할 수 있다.

본 발명에서 제공하는 이소부틸렌 합성용 단백질은 당해 분야에서 공지된 화학적 펩티드 합성방법으로 제조되거나, 상기 이소부틸렌 합성용 단백질을 코딩하는 유전자를 PCR(polymerase chain reaction)에 의해 증폭하거나 공지된 방법으로 합성한 후 발현벡터에 클로닝하여 발현시켜서 제조할 수 있다.

상술한 목적을 달성하기 위한 다른 실시양태로서, 본 발명은 상기 이소부틸렌 합성용 단백질을 코딩하는 서열번호 2의 염기서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다.

본 발명에 있어서, 상기 폴리뉴클레오티드를 구성하는 염기서열은 상기 서열번호 1의 아미노산 서열을 코딩할 수 있는 염기서열 또는 상기 서열번호 1의 아미노산 서열의 N-말단 또는 C-말단에 부가될 수 있는 다양한 아미노산 서열을 코딩하는 염기서열이 상기 서열번호 1의 아미노산 서열을 코딩할 수 있는 염기서열의 염기서열의 5'-말단 또는 3'-말단에 부가된 형태가 될 수 있다. 구체적으로는 상기 서열번호 1의 아미노산 서열을 코딩할 수 있는 서열번호 2의 염기서열 또는 상기 서열번호 1의 아미노산 서열의 N-말단 또는 C-말단에 부가될 수 있는 다양한 아미노산 서열을 코딩하는 염기서열이 상기 서열번호 2의 염기서열의 5'-말단 또는 3'-말단에 부가된 형태가 될 수 있다.

상기 서열번호 2의 뉴클레오티드 서열을 종래의 마리노모나스(Marinomonas sp.) MWYL1의 뉴클레오티드 서열과 비교하면 전체적으로 80%의 상동성을 나타낸다.

본 발명에서 제공하는 폴리뉴클레오티드의 염기서열은 종래 폴리뉴클레오티드의 염기서열과 비교하여, 자연계에서는 이와 동일한 염기서열의 폴리뉴클레오티드가 아직까지 공지되지 않았으므로, 본 발명에서 제공하는 폴리뉴클레오티드는 본 발명자들에 의하여 최초로 규명된 것이라 할 수 있다.

또한 종래의 마리노모나스 균주로부터 유래한 단백질 보다도 대장균(E. coli)에서 보다 효율적으로 발현될 수 있는 단백질을 코딩할 수 있는 한, 상기 염기서열과 상동성을 나타내는 염기서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드 역시 본 발명에서 제공하는 폴리뉴클레오티드의 범주에 포함될 수 있는데, 구체적으로는 80% 이상의 상동성을 나타내는 염기서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드가 될 수 있고, 보다 구체적으로는 90% 이상의 상동성을 나타내는 염기서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드가 될 수 있으며, 가장 구체적으로는 95% 이상의 상동성을 나타내는 염기서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드가 될 수 있다.

한편, 상기 폴리뉴클레오티드는 하나 이상의 염기가 치환, 결실, 삽입 또는 이들의 조합에 의해 변이될 수 있다. 뉴클레오티드 서열을 화학적으로 합성하여 제조하는 경우, 당업계에 널리 공지된 합성법, 예를 들어 문헌(Engels and Uhlmann, Angew Chem IntEd Engl., 37:73-127, 1988)에 기술된 방법을 이용할 수 있으며, 트리에스테르, 포스파이트, 포스포르아미다이트 및 H-포스페이트 방법, PCR 및 기타 오토프라이머 방법, 고체 지지체 상의 올리고뉴클레오타이드 합성법 등을 들 수 있다.

상술한 목적을 달성하기 위한 또 다른 실시양태로서, 본 발명은 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현벡터를 제공한다.

본 발명의 용어 "발현벡터"란, 적절한 숙주세포에서 목적 단백질을 발현할 수 있도록 유전자 삽입물을 포함하고, 상기 유전자 삽입물이 발현되도록 작동가능하게 연결된 필수적인 조절 요소를 포함하는 유전자 제작물을 의미한다. 상기 발현벡터는 개시코돈, 종결코돈, 프로모터, 오퍼레이터 등의 발현조절 요소들을 포함하는데, 상기 개시 코돈 및 종결 코돈은 일반적으로 폴리펩타이드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열의 일부로 간주되며, 유전자 제작물이 투여되었을 때 개체에서 반드시 작용을 나타내야 하며 코딩 서열과 인프레임(in frame)에 있어야 한다. 벡터의 프로모터는 구성적 또는 유도성일 수 있다.

본 발명의 용어 "작동가능하게 연결(operably linked)"이란, 일반적 기능을 수행하도록 핵산 발현조절 서열과 목적하는 단백질 또는 RNA를 코딩하는 핵산 서열이 기능적으로 연결(functional linkage)되어 있는 상태를 의미한다. 예를 들어 프로모터와 단백질 또는 RNA를 코딩하는 핵산 서열이 작동가능하게 연결되어 코딩서열의 발현에 영향을 미칠 수 있다. 발현벡터와의 작동적 연결은 당해 기술분야에서 잘 알려진 유전자 재조합 기술을 이용하여 제조할 수 있으며, 부위-특이적 DNA 절단 및 연결은 당해 기술 분야에서 일반적으로 알려진 효소 등을 사용할 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 발현벡터는 본 발명에서 제공하는 신규한 이소부틸렌 합성용 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 대장균에 도입하여, 상기 대장균을 이소부틸렌 합성용 단백질을 생산할 수 있는 형질전환체로 변이시키는 역할을 수행할 수 있다.

이를 위하여, 상기 발현벡터는 세포 배양액으로부터 단백질의 분리를 촉진하기 위하여 단백질의 배출을 위한 시그널 영역을 포함할 수 있다. 특이적인 개시 시그널은 또한 삽입된 핵산 서열의 효율적인 번역에 필요할 수도 있다. 이들 시그널은 ATG 개시코돈 및 인접한 서열들을 포함한다. 어떤 경우에는, ATG 개시 코돈을 포함할 수 있는 외인성 번역 조절 시그널이 제공되어야 한다. 이들 외인성 번역 조절 시그널들 및 개시 코돈들은 다양한 천연 및 합성 공급원일 수 있다. 발현 효율은 적당한 전사 또는 번역 강화 인자의 도입에 의하여 증가될 수 있다.

아울러, 상기 발현벡터는 이소부틸렌 합성용 단백질의 검출을 용이하게 하기 위하여, 임의로 엔도펩티다아제를 사용하여 제거할 수 있는 단백질 태그를 추가로 포함할 수 있다.

본 발명의 용어 "태그(tag)"란, 정량 가능한 활성 또는 특성을 나타내는 분자를 의미하며, 플로오레세인과 같은 화학적 형광물질(fluoracer), 형광 단백질(GFP) 또는 관련 단백질과 같은 폴리펩타이드 형광물질을 포함한 형광분자일 수도 있고; Myc 태그, 플래그(Flag) 태그, 히스티딘 태그, 루신 태그, IgG 태그, 스트랩타비딘 태그 등의 에피톱 태그일 수도 있다. 특히, 에피톱 태그를 사용할 경우, 구체적으로는 6개 이상의 아미노산 잔기로 구성되고, 보다 구체적으로는 8개 내지 50개의 아미노산 잔기로 구성된 펩타이드 태그를 사용할 수 있다.

상술한 목적을 달성하기 위한 또 다른 실시양태로서, 본 발명은 상기 발현벡터를 포함하는 형질전환체를 제공한다.

본 발명에서 제공하는 형질전환체는 상기 본 발명에서 제공하는 발현벡터를 숙주세포에 도입하여 형질전환시켜서 제작되고, 상기 발현벡터에 포함된 폴리뉴클레오티드를 발현시켜서, 본 발명의 이소부틸렌 합성용 단백질을 생산하는데 사용될 수 있다.

본 발명에서 제공하는 상기 발현벡터가 도입될 수 있는 숙주세포는 상기 폴리뉴클레오티드를 발현시켜서 상기 펩타이드를 생산할 수 있는 한 특별히 이에 제한되지 않으나, 대장균(E. coli), 스트렙토마이세스, 살모넬라 티피뮤리움 등의 박테리아 세포; 사카로마이세스 세레비지애, 스키조사카로마이세스 폼베, 피키아 파스토리스 등의 효모 세포; 드로소필라, 스포도프테라 Sf9 세포 등의 곤충 세포; CHO, COS, NSO, 293, 보우 멜라노마 세포 등의 동물 세포; 또는 식물 세포가 될 수 있고, 구체적으로는 대장균(E. coli)일 수 있다.

아울러, 상기 형질전환은 다양한 방법에 의하여 수행될 수 있는데, 다양한 세포활성을 높은 수준으로 향상시킬 수 있는 효과를 나타내는 본 발명의 이소부틸렌 합성용 단백질을 생산할 수 있는 한, 특별히 이에 제한되지 않으나, CaCl₂ 침전법, CaCl₂ 침전법에 DMSO(dimethyl sulfoxide)라는 환원물질을 사용함으로써 효율을 높인 Hanahan 방법, 전기천공법(electroporation), 인산칼슘 침전법, 원형질 융합법, 실리콘 카바이드 섬유를 이용한 교반법, 아그로박테리아 매개된 형질전환법, PEG를 이용한 형질전환법, 덱스트란 설페이트, 리포펙타민 및 건조/억제 매개된 형질전환 방법 등이 사용될 수 있다.

한편, 본 발명에서 제공되는 형질전환체는 상기 발현벡터를 숙주세포인 대장균(E. coli)에 도입하여 제작되는데, 상기 제작된 형질전환체 중에서 본 발명에서 제공하는 이소부틸렌 합성용 단백질의 생산효율이 증대된 형질전환체를 스크리닝하는 단계를 추가로 수행하고, 이로부터 얻어진 형질전환체가 될 수 있다.

또한, 상기 스크리닝 방법은 특별히 이에 제한되지 않으나, 효소활성측정결과, 이소부틸렌 합성용 단백질의 생산량측정결과 등을 기준으로 수행될 수 있는데, 보다 효과적으로는 이소부틸렌 합성용 단백질을 생산할 수 있는 형질전환체를 수득하기 위하여는 효소활성측정결과 및 이소부틸렌 합성용 단백질의 생산량측정결과를 함께 측정기준으로 사용하여 스크리닝을 수행할 수 있다.

예를 들어, 상기 효소활성측정결과를 확인하기 위하여는, 상기 형질전환체에서 생산된 이소부틸렌 합성용 단백질을 포함하는 배양액에 기질을 가하고, 상기 기질내의 에스테르 결합을 분해하는 활성을 측정하는 방법을 사용할 수 있고; 상기 이소부틸렌 합성용 단백질의 생산량측정결과를 확인하기 위하여는 상기 형질전환체로부터 생산된 이소부틸렌 합성용 단백질을 정제하여 단위 배양액당 생산된 이소부틸렌 합성용 단백질의 양을 비교하는 방법을 사용할 수 있다.

상술한 목적을 달성하기 위한 또 다른 실시태양으로서, 본 발명은 상기 형질전환체를 배양하는 단계를 포함하는 이소부틸렌의 제조방법을 제공한다.

구체적으로 본 발명의 이소부틸렌 제조방법은 상기 형질전환체를 배양하는 단계를 포함하는 것으로서, 구체적으로 상기 형질전환체는 이소부탄올로부터 이소부틸렌을 합성하기 위해 이소부탄올을 포함하는 배지에서 배양될 수 있다.

또한 상기 이소부탄올의 농도는 예를 들어 30 내지 70부피%일 수 있으며, 더욱 구체적으로는 40 내지 60부피%일 수 있다. 상기 이소부탄올의 농도가 하한치 미만인 경우에는 이소부틸렌의 합성양을 극대화시키기 어려우며, 상기 이소부탄올의 농도가 상한치를 초과하는 경우에는 이소부틸렌 합성으로 전환되지 못한 이소부탄올이 잔류하게 된다.

또한 상기 형질전환체의 배양시간은 예를 들어 20 내지 120시간일 수 있으며, 더욱 구체적으로는 40 내지 100시간일 수 있다. 상기 배양시간이 하한치 미만인 경우에는 이소부틸렌을 합성하는 충분한 배양시간이 제공될 수 없으며, 상기 배양시간이 상한치를 초과하는 경우에는 이소부틸렌 합성에 충분한 시간이 제공되었음에도 추가 시간을 소요하는 것이 되어 비경제적이다.

본 발명의 용어 "배양"이란, 미생물을 적당히 인공적으로 조절한 환경조건에서 생육시키는 방법을 의미한다. 본 발명에 있어서, 상기 형질전환체를 배양하는 방법은 당업계에 널리 알려져 있는 방법을 이용하여 수행할 수 있다. 구체적으로 상기 배양은 본 발명의 이소부틸렌 합성용 단백질을 발현시켜서 생산할 수 있는 한 특별히 이에 제한되지 않으나, 배치 공정 또는 주입 배치 또는 반복 주입 배치 공정(fed batch or repeated fed batch process)에서 연속식으로 배양할 수 있다.

배양에 사용되는 배지는 적당한 탄소원, 질소원, 아미노산, 비타민 등을 함유한 통상의 배지 내에서 호기성 조건 하에서 온도, pH 등을 조절하면서 적절한 방식으로 특정 균주의 요건을 충족시킬 수 있다. 사용될 수 있는 탄소원으로는 글루코즈 및 자일로즈의 혼합당을 주 탄소원으로 사용하며 이외에 수크로즈, 락토즈, 프락토즈, 말토즈, 전분, 셀룰로즈와 같은 당 및 탄수화물, 대두유, 해바라기유, 피마자유, 코코넛유 등과 같은 오일 및 지방, 팔미트산, 스테아린산, 리놀레산과 같은 지방산, 글리세롤, 에탄올과 같은 알코올, 아세트산과 같은 유기산이 포함된다. 이들 물질은 개별적으로 또는 혼합물로서 사용될 수 있다. 사용될 수 있는 질소원으로는 암모니아, 황산암모늄, 염화암모늄, 초산암모늄, 인산암모늄, 탄산안모늄, 및 질산암모늄과 같은 무기질소원; 글루탐산, 메티오닌, 글루타민과 같은 아미노산 및 펩톤, NZ-아민, 육류 추출물, 효모 추출물, 맥아 추출물, 옥수수 침지액, 카세인 가수분해물, 어류 또는 그의 분해생성물, 탈지 대두 케이크 또는 그의 분해생성물 등 유기질소원이 사용될 수 있다. 이들 질소원은 단독 또는 조합되어 사용될 수 있다. 상기 배지에는 인원으로서 인산 제1칼륨, 인산 제2칼륨 및 대응되는 소듐-함유 염이 포함될 수 있다. 사용될 수 있는 인원으로는 인산이수소칼륨 또는 인산수소이칼륨 또는 상응하는 나트륨-함유 염이 포함된다. 또한, 무기화합물로는 염화나트륨, 염화칼슘, 염화철, 황산마그네슘, 황산철, 황산망간 및 탄산칼슘 등이 사용될 수 있다. 마지막으로, 상기 물질에 더하여 아미노산 및 비타민과 같은 필수 성장 물질이 사용될 수 있다.

또한, 배양 배지에 적절한 전구체들이 사용될 수 있다. 상기된 원료들은 배양과정에서 배양물에 적절한 방식에 의해 회분식, 유가식 또는 연속식으로 첨가될 수 있으나, 특별히 이에 제한되지는 않는다. 수산화나트륨, 수산화칼륨, 암모니아와 같은 기초 화합물 또는 인산 또는 황산과 같은 산 화합물을 적절한 방식으로 사용하여 배양물의 pH를 조절할 수 있다.

아울러, 배양물로부터 상기 이소부틸렌 합성용 단백질을 회수하는 단계는 당업계에 공지된 방법에 의해 수행될 수 있다. 구체적으로, 상기 회수 방법은 생산된 본 발명의 이소부틸렌 합성용 단백질을 회수할 수 있는 한, 특별히 이에 제한되지 않으나, 구체적으로는 원심분리, 여과, 추출, 분무, 건조, 증방, 침전, 결정화, 전기영동, 분별용해(예를 들면 암모늄 설페이트 침전), 크로마토그래피(예를 들면 이온 교환, 친화성, 소수성 및 크기배제) 등의 방법을 사용할 수 있다.

상술한 목적을 달성하기 위한 또 다른 실시태양으로서, 본 발명은 상기 이소부틸렌 합성용 단백질, 또는 상기 형질전환체, 및 이소부탄올을 포함하는 이소부틸렌 제조용 조성물을 제공한다.

상기 조성물은 상기 이소부틸렌 합성용 단백질 또는 상기 형질전환체의 표면에 발현된 이소부틸렌 합성용 단백질이 이소부탄올을 이소부틸렌으로 전환시킬 수 있다. 또한 상기 조성물을 포함하여 키트 형태로 제공함으로써, 상기 키트 내에서 이소부틸렌을 합성하는 것이 가능하다.

본 발명에 따른 이소부틸렌 합성용 단백질은 이소부탄올을 탈수축합시켜 이소부틸렌으로 합성하는 것이 가능하다. 또한 본 발명에 따른 이소부틸렌 합성용 단백질을 이용하면 별도의 화학적 공정을 거치지 않고 친환경적인 공정으로 이소부틸렌을 제조하는 것이 가능하게 된다. 그리고 이렇게 생산된 이소부틸렌은 자동차 타이어, 플라스틱 또는 바이오 연료로 활용할 수 있다.

도 1은 실시예의 OleH 유전자가 포함된 것으로서, 과발현용 재조합 벡터(도 1a) 및 세포 표면 발현용 재조합 벡터(도 1b)를 나타내는 그림이다.
도 2는 실시예의 OleH 단백질을 단계별로 분리/정제한 결과를 나타낸 사진이다.
도 3은 표면 발현 균주를 이용한 이소부틸렌 생합성능을 측정한 실험 결과를 나타내는 그림이다.
도 4는 이소부탄올의 농도에 따른 이소부틸렌 생합성능을 측정한 실험 결과를 나타내는 그림이다.
도 5는 반응 시간에 따른 이소부틸렌 생합성능을 측정한 실험 결과를 나타내는 그림이다.
도 6은 형질전환된 세포의 양을 2배 증가시킨 경우 이소부틸렌 생합성능을 측정한 실험 결과를 나타내는 그림이다.

이하 본 발명을 하기 예에 의해 상세히 설명한다. 다만, 하기 예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 하기 예에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것은 아니다.

실시예

< 실시예 1: OleH ( oleate hydratase ) 유전자 클로닝 >

마리노모나스(Marinomonas sp.) 유전체 서열로부터 얻어진 OleH 유전자 서열(유럽분자생물학연구소(EMBL) 염기서열데이터베이스 식별번호: CP000749)에 대한 정보를 기반으로 라이프테크놀로지 코리아에서 더모 피셔 사이언티픽(Thermo Fisher Scientific)의 진아트(GeneArt) 유전자 합성을 통해 대장균(E. coli) 과발현 시스템에 적합한 유전자 코돈을 가진 OleH 유전자 DNA를 합성하였다(서열번호 2).

한편, 합성된 OleH 단백질의 과발현과 미생물의 세포 표면 발현을 위하여 OleH 유전자를 기반으로 아래와 같은 올리고 뉴클레오티드를 제작하였다.

1) A6VRV1:

primer 1: 5` - GGC GGT GGT GGC GGC GGC ATG AGC CAC AAA - 3` (30mer) (서열번호 3)

Primer 2: 5` - GTT CTT CTC CTT TGC GCC CCT ATT AGC TTT TGT TTT ATT GCT CAG GC - 3` (47mer) (서열번호 4)

2) 세포 표면 발현 A6VRV1 (이하 CSD_A6VRV1):

primer 1: 5` - CGG TGT CGC GCC CAG CCA CAA AGA TAT TAG CAC CTT T - 3` (37mer) (서열번호 5)

Primer 2: 5` - CGG TCG TTG GCC CGC TTT TGT TTT TAT TGC TCA GGC T - 3` (37mer) (서열번호 6)

합성된 OleH DNA를 주형으로 A6VRV1 올리고 뉴클레오티드와 CSD_A6VRV1 올리고 뉴클레오티드를 프라이머로 사용하여 PCR을 통해 각각의 유전자를 증폭하였다. 또한 OleH 단백질의 과발현을 위해 A6VRV1 올리고 뉴클레오티드를 사용하였으며, 증폭된 합성 OleH DNA는 정제를 위해 N-말단 부분에 6개의 히스티딘 잔기를 암호화하는 유전자 서열을 포함한 변형된 pET21a(이하 pB)벡터에 LIC(Ligation Independent Cloning)방법을 사용하여 클로닝 하였다(도 1a). 또한 OleH 단백질이 형질전환체의 표면에서 발현되도록 CSD_A6VRV1 올리고 뉴클레오티드로부터 증폭한 합성 OleH DNA를 세포 표면 발현 시스템을 포함하고 있는 pATLIC 벡터에 LIC (Ligation Independent Cloning) 방법으로 클로닝하였다(도 1b). 그 후 OleH 단백질의 과발현을 위한 합성 재조합 A6VRV1/pB2 플라스미드를 E. coli BL21(DE3) 균주에 도입하여 형질전환시켰다. 또한 OleH 단백질을 형질전환체의 표면에 발현시키기 위한 재조합 A6VRV1/pATLIC 플라스미드는 E. coli BW25113 균주에 도입하여 형질전환시켰다.

< 실시예 2: OleH 단백질의 발현 및 정제>

2-1. 과발현용 OleH

상기 실시예 1에서 제조된 A6VRV1/pB2 벡터를 포함한 재조합 E. coli BL21(DE3) 균주는 50mg/L의 엠피실린 항생제가 들어있는 Luria-bertani (LB) 배지에 접종하고 37℃에서 OD600=0.5~1.0될 때까지 진탕 배양하였다. 그 후에 1mM/L의 농도로 이소프로필-β-D-티오갈락토프라노사이드(isopropyl-β-D-thiogalactopranoside, IPTG)를 사용하여 18℃에서 24시간 동안 발현을 유도하였다. 그후 배양액을 4,000rpm에서 20분 동안 원심 분리하고 완충용액(20mM 트리스-염산(Tris-HCl), pH 8.0, 500mM NaCl, 5 mM β-메르캡토에탄올(mercaptoethanol))에 현탁한 후, 초음파 파쇄기를 사용하여 균체로부터 조추출액을 제조하였다. 조추출액은 4℃에서 18,000rpm으로 60분 동안 원심 분리하여 조효소액과 침전물로 분리하였다. 조효소액은 0.45㎛ 여과지로 여과한 후, 단계별 단백질 분리과정을 통하여 순도 높은 OleH 단백질을 분리/정제하였다. 이때 1단계는 Ni^{2 +} 친화력 크로마토그래피 방법을, 2단계는 이온 교환 크로마토그래피 방법을, 3단계는 겔여과크로마토그래피 방법을 각각 사용하였다. 도 2는 정제된 OleH를 나타낸 것이다.

2-2. 세포표면발현 OleH

상기 실시예 1에서 제조된 E. coli BW25113 균주를 37℃, 200rpm, LB-암피실린 배지에서 전배양(5ml) 및 본배양(800ml)하였다.

본배양 후, O.D (600nm) 0.5 내지 0.8 일 때, L-아라비노스(arabinose) 0.02% 를 첨가 한 뒤, 16℃ 150 rpm으로 24 시간 동안 유도시켰다. 배양한 세포를 3000rpm, 15분 동안 원심분리하여 배지와 세포를 1차적으로 분리 회수한 뒤, 반응에 사용하기 위해 세포를 50mM 트리스-염산(Tris-HCl)(pH 6.5) 버퍼에 세척한 후 다시 3000rpm에서 15분 동안 원심분리하여 회수하여 반응에 사용하였다.

< 실시예 3: 이소부틸렌 생합성 반응>

상기 실시예 2-2에서 회수한 표면발현 세포를 이용하며, 이소부탄올을 탈수축합시켜 수득되는 이소부틸렌 생합성 반응을 진행하였다. 구체적으로 50ml 세럼 병(serum bottle)에 총 20ml 부피로 실시예 2-2에서 회수한 세포(O.D (600nm) 0.5 내지 0.8 일 때 0.02%)와 이소부탄올을 넣고 테프론/실리카/테프론(teflon/silica/Teflon) 격막(septum)으로 병을 막은 뒤, 알루미늄 캡을 씌워 혐기성(anaerobic) 상태가 되게 준비하였으며, 30℃, 100rpm 조건에서 반응을 수행하였다. 상기 이소부탄올의 농도는 3, 25, 50, 80 부피% 의 조건으로 이소부탄올의 농도에 따른 이소부틸렌 생합성능을 비교하기 위해 농도별로 반응을 수행하였다. 또한 시간에 따른 이소부틸렌 생합성능을 비교하기 위해 0, 12, 24, 48, 150 시간 경과 후 이소부틸렌 생합성 양을 측정하였다. 효소 프리 샘플(Enzyme-free sample)의 경우 세포만 첨가하지 않은 동일한 조건으로 실험을 수행하여 대조군으로 설정하였다.

< 실시예 4: GC 분석 조건(정량 및 정성 분석)>

가스 크로마토그래피(Gas Chromatography, 이하 ‘GC’라 함) 분석 시에는 반응 세럼 병(serum bottle)의 머리 공간에 있는 기체를 플런저 가스 시린지(plunger gas syringe)를 이용하여 500ul를 뽑아 낸 뒤, 수동으로 GC 인젝터(injector)에 주입한 뒤, FID(Flame Ionization Detector)를 이용해 정량, 정성 분석을 수행하였다. 이때 GC 분석 조건은 하기에 표시된 바와 같다.

Column: Agilent DB-FFAP, 30m X 0.250mm I.D., 0.25um (P/N: 122-3232)

Carrier: Helium at 1.0 ml/min

Oven: 100℃

Injector: Split 1:20, 250 ℃

Detector: FID, 300 ℃

실험예

< 실험예 1: 표면 발현 균주를 이용한 이소부틸렌 생합성 실험 결과>

3부피% 이소부탄올을 이용한 이소부틸렌 생합성 실험 결과(3부피% 이소부탄올 & 50mM 트리스-염산, pH6.5, 30℃, 150rpm, 18시간), 0.1 mg(1.8 umol, 18시간 기준)의 이소부틸렌이 생합성 되었으며, 효소 활성을 측정한 결과 0.135U/mg의 효소 활성을 확인하였다. 한편, 도 3은 이의 결과를 나타내는 것이며, 하기 반응식은 OleH 단백질로부터 이소부틸렌이 생합성되는 과정을 나타내는 것이다.

[반응식]

< 실험예 2: 다양한 조건별 이소부틸렌 생합성능 비교 실험>

2-1. 이소부탄올 농도에 따른 이소부틸렌 생합성능 측정

이소부탄올의 농도에 따른 이소부틸렌의 생합성능을 실험한 결과 도 4 와 같은 결과를 확인하였다. 구체적으로 50부피%의 이소부탄올에서 가장 많은 양의 이소부틸렌(1.23 mg(22.0 umol, 48hr 기준))이 생합성 되었으며, 효소 활성을 측정한 결과 0.41 U/mg으로 3부피% 이소부탄올 첨가시 보다 약 3배 높은 생합성능을 보이는 것을 확인하였다.

2-2. 반응 시간에 따른 이소부틸렌 생합성능 측정

50부피% 이소부탄올을 첨가하여 반응 시간에 따른 이소부틸렌 생합성능 실험 결과, 48 시간에 가장 많은 양의 이소부틸렌(1.23 mg, 22.0 umol)이 생합성 되었으며, 효소 활성을 측정한 결과 0.41 U/mg의 생합성능을 보이는 것을 확인하였다(도 5)

2-3. 세포의 양을 2배 증가시킨 경우 이소부틸렌 생합성능 측정

50% 이소부탄올을 첨가하여 이전 실험에 사용한 세포의 양(0.18 g/DCW)과 2배 높은 세포(0.37 g/DCW)를 첨가하여 48시간 동안 반응시킨 결과, 2.74 mg(48.9 umol, 48hr 기준)의 이소부틸렌이 생합성 되었으며(도 6), 효소 활성을 측정한 결과 0.92 U/mg으로 기존의 0.18 g/DCW 세포를 이용하였을 때 보다 약 2배 높은 생합성능을 보이는 것을 확인하였다.

이를 통해 본 발명에 따른 단백질을 이용하여 이소부틸렌을 효과적으로 생산할 수 있음을 확인하였다.

이상의 설명으로부터, 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자는 본 발명이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시 예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로서 이해해야만 한다. 본 발명의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.

<110> KOREA INSTITUTE OF INDUSTRIAL TECHNOLOGY <120> Protein for isobutylene synthesis and isobutylene preparation method using the same <130> KPA160587-KR <160> 6 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 667 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> Marinomonas sp. <400> 1 Met Ser His Lys Asp Ile Ser Thr Phe Thr Ile Ser Thr Thr Ala Pro 1 5 10 15 Glu Gly Phe Glu His Glu Pro Asp Ser Thr Arg Asp Tyr Trp His His 20 25 30 Gln Ala Leu Asn Thr Leu Pro Pro Tyr Asp Phe Ile Ala Pro Tyr Ala 35 40 45 Arg His Lys Thr Leu Pro Thr Pro Gly Ile Gln Asn Arg Lys Ala Trp 50 55 60 Ile Val Gly Ser Gly Ile Gly Gly Leu Ala Ala Ala Phe Tyr Leu Leu 65 70 75 80 Arg Asp Ala His Met Pro Ala Glu Asn Ile Thr Ile Leu Glu Glu Met 85 90 95 Thr Val Glu Gly Gly Ser Met Asp Gly Ala Gly Asn Pro Glu Glu Gly 100 105 110 Tyr Ile Ile Arg Gly Gly Arg Glu Met Asn Trp Asn Tyr Asp Thr Leu 115 120 125 Trp Asp Leu Phe Gln Asp Val Pro Ala Val Glu Leu Pro Glu Gly Tyr 130 135 140 Ser Ile Leu Asp Glu Tyr Arg Leu Ile Asn Asp Asn Asp Pro Asn Tyr 145 150 155 160 Ser Ala Ala Arg Leu Met His Lys Cys Gly Glu Leu Leu Asp Ala Lys 165 170 175 Asp Phe Gly Leu Ser Lys Ser Gln Gln Trp Glu Leu Ile Arg Leu Met 180 185 190 Leu Lys Arg Lys Glu Glu Leu Asp Asp Ile Ser Ile Glu Asp Tyr Phe 195 200 205 Ser Glu Gly Phe Leu Lys Thr Asn Phe Trp Phe Leu Phe Arg Ser Met 210 215 220 Phe Ala Phe Lys Asn Cys His Ser Leu Leu Glu Thr Lys Leu Tyr Leu 225 230 235 240 His Arg Phe Leu Asp Ser Ile Asp Gly Phe Ala Asp Met Ser Ala Leu 245 250 255 Val Phe Pro Lys Tyr Asn Gln Tyr Asp Thr Phe Ile Lys Pro Leu Ala 260 265 270 Asp Met Leu Arg Glu Lys Gly Val Thr Phe Gln Phe Gly Thr Arg Val 275 280 285 Glu Asp Leu Asp Ile Asn Phe Ser Gly Asp Lys Lys Thr Val Thr Gly 290 295 300 Ile Arg Ala Val Val Ile Lys Glu Gly Lys Glu Glu Ala Lys His Ile 305 310 315 320 His Val Gly Leu Gly Asp Leu Val Phe Thr Leu Thr Gly Ser Met Thr 325 330 335 Glu His Thr Ala Tyr Gly Asp Met Glu Asn Val Pro Glu Leu Thr Cys 340 345 350 Asp Lys His Asp Pro Gly Glu Lys Ser Gly Trp Thr Leu Trp Lys Asn 355 360 365 Leu Ala Lys Lys Ser Pro Val Phe Gly Lys Pro Glu Lys Phe Tyr Gly 370 375 380 Asn Val Asp Lys Ser Ile Trp Glu Ser Ala Thr Leu Thr Cys Lys Pro 385 390 395 400 Ser Pro Leu Ile Asp Lys Leu Lys Thr Leu Ser Val Asn Asp Pro Tyr 405 410 415 Ser Gly Arg Ser Val Thr Gly Gly Ile Ile Thr Ile Thr Asp Ser Asn 420 425 430 Trp Leu Leu Ser Val Thr Cys Asn Arg Gln Pro His Phe Pro Asp Gln 435 440 445 Pro Glu Asp Thr Leu Val Leu Trp Val Tyr Gly Leu Leu Met Asp Lys 450 455 460 Pro Gly Asn Arg Ile His Lys Thr Met Ala Gln Cys Thr Gly Lys Glu 465 470 475 480 Ile Leu Thr Glu Leu Cys His His Leu Gly Ile Glu Asp Gln Leu Asp 485 490 495 Glu Ile Val Ala Asn Thr Lys Ile Arg Leu Ala Leu Met Pro Tyr Ile 500 505 510 Thr Ala Gln Phe Met Thr Arg Ala Ala Gly Asp Arg Pro His Ala Val 515 520 525 Pro Glu Gly Cys Thr Asn Leu Gly Leu Ile Gly Gln Phe Val Glu Thr 530 535 540 Arg Asn Asp Ile Ile Phe Thr Met Glu Ala Ser Ile Arg Thr Ala Arg 545 550 555 560 Ile Gly Val Tyr Lys Leu Leu Asn Ile Pro Lys Gln Val Pro Asp Ile 565 570 575 Ser Pro Thr Gln Tyr Asp Ile Arg Asn Leu Ile Lys Gly Ala Arg Ala 580 585 590 Leu Asn Ser Gly Lys Pro Phe Met Gly Glu Arg Leu Leu His Arg Leu 595 600 605 Leu Asp Lys Thr Tyr Phe Ala His Ile Leu Pro Pro Leu Pro Glu Pro 610 615 620 Glu Glu Ser Lys Gln Ser Leu Phe Glu Glu Glu Met His Glu Leu Leu 625 630 635 640 Gly Lys Gly Ser Thr Val Met His Lys Phe Gly Gly Trp Ile Ser Ser 645 650 655 Leu Arg Glu Ser Leu Ser Asn Lys Asn Lys Ser 660 665 <210> 2 <211> 2004 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> enzyme for isobutanol synthesis <400> 2 atgagccaca aagatattag cacctttacc attagcacca ccgcaccgga aggttttgaa 60 catgaaccgg atagcacccg tgattattgg catcatcagg cactgaatac cctgcctccg 120 tatgatttca ttgcaccgta tgcacgtcat aaaaccctgc cgacccctgg tattcagaat 180 cgtaaagcat ggattgttgg tagcggtatt ggtggtctgg cagcagcatt ttatctgctg 240 cgtgatgcac acatgcctgc agaaaacatt accattctgg aagaaatgac cgttgaaggt 300 ggtagcatgg atggtgcagg taatccggaa gagggttata tcattcgtgg tggtcgtgaa 360 atgaactgga attatgatac cctgtgggac ctgtttcagg atgttccggc agtggaactg 420 cctgaaggtt atagcattct ggatgaatat cgcctgatca atgataacga tccgaattat 480 agcgcagcac gtctgatgca taaatgtggt gaactgctgg atgcaaaaga ttttggtctg 540 agcaaaagcc agcagtggga actgattcgc ctgatgctga aacgtaaaga agaactggac 600 gatatcagca tcgaagatta tttcagcgaa ggctttctga aaaccaactt ttggtttctg 660 tttcgcagca tgtttgcctt taaaaactgt catagcctgc tggaaaccaa actgtatctg 720 catcgttttc tggatagcat tgatggtttt gcagatatga gcgcactggt ttttccgaaa 780 tataaccagt atgatacctt tatcaaaccg ctggcagata tgctgcgcga aaaaggtgtt 840 acctttcagt ttggcacccg tgttgaagat ctggatatta actttagcgg tgacaaaaaa 900 accgtgaccg gtattcgtgc agttgtgatt aaagaaggca aagaagaggc caaacacatt 960 catgttggtc tgggtgatct ggtttttacc ctgaccggta gcatgaccga acataccgcc 1020 tatggtgata tggaaaatgt gccggaactg acctgtgata aacatgatcc gggtgaaaaa 1080 agcggttgga ccctgtggaa aaatctggca aaaaaaagtc cggtttttgg caaaccggaa 1140 aaattctatg gcaacgtgga taaaagcatt tgggaaagcg caaccctgac ctgtaaaccg 1200 agtccgctga ttgataaact gaaaaccctg agcgttaatg atccgtatag cggtcgtagc 1260 gttaccggtg gtattattac cattaccgat agcaattggc tgctgagtgt tacctgtaat 1320 cgtcagccgc attttccgga tcagccggaa gataccctgg ttctgtgggt ttatggtctg 1380 ctgatggaca aaccgggtaa tcgtattcat aaaacaatgg cacagtgcac cggtaaagaa 1440 attctgaccg aactgtgtca tcatctgggt attgaagatc agctggatga aattgttgcc 1500 aacaccaaaa ttcgtctggc actgatgccg tatattaccg cacagtttat gacccgtgca 1560 gccggtgatc gtccgcatgc agttccggaa ggctgtacca atctgggtct gattggtcag 1620 tttgttgaaa cccgtaacga tatcatcttt accatggaag caagcattcg taccgcacgt 1680 attggtgtgt ataaactgct gaatattccg aaacaggttc cggatattag cccgacccag 1740 tatgacattc gtaatctgat taaaggtgca cgtgccctga atagcggtaa accgtttatg 1800 ggtgaacgtc tgctgcaccg tctgctggat aaaacctatt ttgcacatat tctgcctccg 1860 ctgcctgaac cggaagaaag caaacagtct ctgtttgaag aagaaatgca cgagctgctg 1920 ggtaaaggta gcaccgttat gcacaaattt ggtggttgga ttagcagcct gcgtgaaagc 1980 ctgagcaata aaaacaaaag ctaa 2004 <210> 3 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> A6VRV1 primer 1 <400> 3 ggcggtggtg gcggcggcat gagccacaaa 30 <210> 4 <211> 47 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> A6VRV1 primer 2 <400> 4 gttcttctcc tttgcgcccc tattagcttt tgttttattg ctcaggc 47 <210> 5 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CSD_A6VRV1 primer 1 <400> 5 cggtgtcgcg cccagccaca aagatattag caccttt 37 <210> 6 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CSD_A6VRV1 primer 2 <400> 6 cggtcgttgg cccgcttttg tttttattgc tcaggct 37

Claims (11)

1. 삭제
2. 삭제
3. 마리노모나스(Marinomonas sp.) 균주로부터 유래한 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어지는 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현벡터를 포함하는, 이소부틸렌 합성용 형질전환체.
   
4. 제3항에 있어서,
   상기 폴리뉴클레오티드는 서열번호 2의 염기서열을 포함하는 것인, 형질전환체.
   
5. 삭제
6. 제3항에 있어서,
   상기 형질전환체는 대장균(E. coli)인 것을 특징으로 하는 형질전환체.
   
7. 제3항, 제4항 또는 제6항 중 어느 한 항의 형질전환체를 배양하는 단계를 포함하는 이소부틸렌의 제조방법.
   
8. 제7항에 있어서,
   상기 형질전환체는 이소부탄올을 포함하는 배지에서 배양되는 것인 이소부틸렌의 제조방법.
   
9. 제8항에 있어서,
   상기 이소부탄올의 농도는 30 내지 70부피%인 것을 특징으로 하는 이소부틸렌의 제조방법.
   
10. 제8항에 있어서,
    상기 형질전환체의 배양시간은 20 내지 120시간인 것을 특징으로 하는 이소부틸렌의 제조방법.
    
11. 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어지는 단백질; 또는 제3항, 제4항 또는 제6항 중 어느 한 항의 형질전환체; 및 이소부탄올을 포함하는 이소부틸렌 제조용 조성물.
    

Images