KR101785299B1

KR101785299B1 - 최적화된 리보스 5-인산 이성화효소를 코딩하는 유전자 및 이를 포함하는 미생물 및 이를 이용한 알로스 제조 방법

Info

Publication number: KR101785299B1
Application number: KR1020150164294A
Authority: KR
Inventors: 오덕근; 김경록; 박철순
Original assignee: 대상 주식회사
Priority date: 2015-11-23
Filing date: 2015-11-23
Publication date: 2017-11-15
Also published as: KR20170059828A

Abstract

본 발명은 최적화된 리보스 5-인산 이성화효소를 코딩하는 유전자 및 이를 포함하는 미생물 및 이를 이용한 알로스 제조 방법에 관한 것으로, 본 발명에 따르면, 알로스에 대해 기존 폴리뉴클레오티드 서열의 발현에 비해 우수한 발현과 알로스 전환활성을 보유하여 상대적으로 높은 수율로 알로스의 대량 생산이 가능하다.

Description

최적화된 리보스 5-인산 이성화효소를 코딩하는 유전자 및 이를 포함하는 미생물 및 이를 이용한 알로스 제조 방법{A optimized ribose 5 phosphate isomerase gene, a microorganism comprising the same, and a method for producing allose using the same}

본 발명은 최적화된 리보스 5-인산 이성화효소를 코딩하는 유전자 및 이를 포함하는 미생물 및 이를 이용한 알로스 제조 방법에 관한 것이다.

알로스 (D-allose)는 포도당 (D-glucose)과 유사한 알도헥소스의 일종이나 포도당과는 3번 탄소의 수산기 위치가 다른 에피머 (epimer)이며 알룰로스 (allulose) (또는 사이코스 (psicose))의 이성질체로 알려진 희소당 단당류이다. 알로스는 강력한 항산화능을 가지고 있으며 혈전 형성, 장기이식수술 환자의 자가 면역 반응 및 암세포의 증식을 억제하는 등의 생리활성이 알려져 있다. 또한 간과 뇌의 허혈 후 신경세포의 사멸을 연장시키는 효과도 있으며 백혈병 환자의 치료약으로도 연구가 진행되고 있다 (Hossain, M. A., Izuishi, K., and H., Maeta. 2003, J. Hepatobiliary Pancreat Surg., 10: 218225.;Hossain, M. A., Izuishi, K., Tokuda, M., Izumori, K., and H. Maeta. 2004, J. Hepatobiliary Pancreat Surg., 11: 181189.; Hossain, M. A., Wakabayashi, H., Izuishi, K., Okano, K., Yachida, S., Tokuda, M.,Izumori, K., and H., Maeta. 2006, J. Biosci. Bioeng., 101: 369371.).

상기와 같은 여러 특징으로 인해, 알로스는 의약 분야에서 차세대 핵심 소재로써의 높은 이용가치가 있으나, 자연계에 극히 드물게 존재하기 때문에 산업적으로 생산하기 위해서는 적절하고 효율적인 생산 공정을 개발하는 것이 필요하다. 특히, 식품 및 의약품으로서의 활성이 명백한 만큼 안전한 생산방법 또는 중요한 해결과제이다. 그러나 현재까지 알로스의 생산은 주로 화학적인 방법이나 일부 미생물에서만 연구되었다. 종래에 알로스는 화학적 합성 방법이 주종을 이루어 생산되었으나, 부가적인 당류의 생성 및 이로 인한 복잡한 정제 과정과 공정상에서 화학적 폐기물이 발생한다는 문제가 있었다. 이에, 미생물이 생산하는 효소를 이용하여 알로스를 대량 생산하는 방법이 제안되어 슈도모나스 슈체리 (Pseudomonas stutzeri) 유래의 람노스 이성화 효소 (L-rhamnose isomerase)를 사용하여 사이코스에서 알로스를 생산하는 것이 보고되었다 (Journal of Fermentation and Bioengineering , 85(5);539-541, 1998). 그러나 상기 효소는 알로스 생성시 부산물로 다량의 알트로스 (D-altrose)도 함께 생성시키는 단점이 있었다. 따라서 알트로스와 같은 부산물을 생성하지 않으면서, 산업화에 적합한 높은 열 안정성을 나타내며, 높은 수율로 알로스를 생산할 수 있는 효소를 이용할 필요성이 요구되고 있다.

현재까지의 고온균 유래의 알로스의 생산기술은 재조합 대장균에서 대량 발현된 재조합 효소 혹은 이를 포함한 숙주를 이용한 알룰로스 (allulose)에서 알로스 (allose)로의 이성화 반응공정 개발에만 머물러 있다. 그러나 이러한 재조합 대장균을 이용한 알로스의 생물공학적 생산은 식품안전성 측면에서 실질적으로 식품 소재로서의 알로스 생산에 부적합하며, 이에 GRAS 균주면서 산업적으로 대량 생산이 가능한 숙주에서 발현된 알룰로스 이성화효소 및 이를 포함한 숙주를 이용한 대량 생산이 필수적이다.

코리네형 세균은 L-라이신 등 아미노산과 각종 핵산을 포함한 사료, 의약품 및 식품 등의 분야에서 다양한 용도를 가지는 화학물질을 생산하는데 널리 사용되는 산업용 미생물이다. 이러한 코리네형 세균은 GRAS (Generally Recognized As Safe) 균주이며, 유전자 조작 및 대량 배양에 용이한 균주 특성을 가지고 있음이 증명되었다. 뿐만 아니라 다양한 공정 조건에서 높은 안전성을 가지는 균주이며, 다른 세균에 비하여 상대적으로 단단한 세포막 구조를 가지고 있어 높은 당 농도 등에 의한 높은 삼투압 하에서도 균체가 안정적인 상태로 존재하는 생물학적 특성을 가지고 있다.

[선행기술 문헌]

한국등록특허 제 1012176700000

본 발명은 상기의 필요성에 의하여 안출된 것으로서 본 발명의 목적은 고효율의 알로스 생성효율을 가지며, 높은 열 안정성를 가지는, 리보스 5 인산 이성화효소를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 안전하면서도 높은 효율로 알로스를 생산할 수 있는 알로스 생산방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 알룰로스로부터 알로스로 전환하는 활성을 가진 효소를 식품안전형 균주 내에서 발현을 최적화하여 효과적이고 안전한 방법으로 알로스를 생산하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 알로스를 제조하는데 있어 효과적인 방법 또는 다양한 요소들을 제공하는 것이다.

상기의 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 서열번호 1의 폴리뉴클레오티드로 이루어진 리보스 5-인산 이성화효소 유전자를 제공한다.

또 본 발명은 상기 서열번호 1의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 벡터에 의해 형질전환된 재조합 미생물을 제공한다.

본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 형질전환된 재조합 미생물은 코리네박테리움 글루타미쿰인 것이 바람직하고, 상기 코리네박테리움 글루타미쿰은 코리네박테리움 글루타미쿰 RPI2(수탁번호 : KACC 95131P)인 것이 더욱 바람직하나 이에 한정되지 아니한다.

또 본 발명은 상기 본 발명의 유전자를 유효성분으로 포함하는 알로스 생산용 조성물을 제공한다.

본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 조성물은 글리신을 추가적으로 포함하는 것이 바람직하고, 상기 글리신은 배양액 기준 1-10%(w/v) 포함하는 것이 더욱 바람직하나 이에 한정되지 아니한다.

본 발명의 다른 구현예에 있어서, 상기 조성물은 스판(Sorbitan alkyl ester), 트윈(Polyoxyethylene glycol sorbitan alkyl ester) 및 트리톤(Polyethylene glycol octylphenyl ether)으로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상의 화합물을 더욱 포함하는 것이 바람직하고, 상기 화합물은 배양액 기준 0.01-2%(w/v) 포함하는 것이 바람직하나 이에 한정되지 아니한다.

또 본 발명은 상기 본 발명의 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 형질전환된 미생물을 유효성분으로 포함하는 알로스 생산용 조성물을 제공한다.

또 본 발명은 상기 본 발명의 형질전환된 재조합 미생물에 알룰로스를 첨가하여 알룰로스로부터 알로스를 생산하는 방법을 제공한다.

본 발명에서 "재조합 벡터"란 적당한 숙주세포에서 목적 단백질을 발현할 수 있는 벡터로서, 유전자 삽입물이 발현되도록 작동 가능하게 연결된 필수적인 조절 요소를 포함하는 유전자 작제물을 말한다. 상기 벡터는 플라스미드 벡터, 코즈미드 벡터, 박테리오파아지 벡터 및 바이러스 벡터 등을 포함하나 이에 제한되지 않는다.적합한 발현 벡터는 프로모터, 오퍼레이터, 개시코돈, 종결코돈, 폴리아데닐화 시그널 및 인핸서 같은 발현조절 엘리먼트 외에도 막 표적화 또는 분비를 위한 시그널 서열 또는 리더 서열을 포함하며, 목적에 따라 다양하게 제조될 수 있다. 벡터의 프로모터는 구성적 또는 유도성일 수 있다. 또한, 발현벡터는 벡터를 함유하는 숙주세포를 선택하기 위한 선택마커를 포함하고, 복제 가능한 발현벡터인 경우 복제 기원을 포함한다.

또한, 재조합 벡터에는, 발현의 억제 또는 증폭, 또는 유도를 위한 각종의 기능을 가진 발현억제용의 단편이나, 형질전환체의 선택을 위한 마커나 항생물질에 대한 내성유전자, 또는, 균체 밖으로의 분비를 목적으로 한 시그널을 코딩하는 유전자 등을 추가로 가진 것도 가능하다.

본 발명의 형질전환은 핵산을 유기체, 세포, 조직 또는 기관에 도입하는 어떤 방법도 포함되며,

본 발명의 형질전환체를 배양하는 방법은, 숙주의 배양에 사용되는 통상의 배양 방법을 사용하면 된다.

상기 배양 방법은 배치(batch)식, 유동배치식, 연속배양, 리액터형식 등, 통상의 미생물의 배양에 사용하는 어떠한 방법도 사용할 수 있다. 대장균, 효모 등을 숙주로 해서 얻게 된 형질전환체를 배양하는 배지로서는,완전배지 또는 합성배지, 예를 들면 LB 배지, NB 배지 등을 들 수 있다. 또한, 배양온도는 25 내지 30 ℃에서배양함으로써 균체 내에 축적시키고, 회수한다.

탄소원은 미생물의 증식에 필요하고, 예를 들면 글루코스, 프럭토스, 수크로스, 말토스, 갈락토스, 전분 등의 당류; 에탄올, 프로판올, 부탄올 등의 저급알콜류; 글리세롤 등의 다가알콜류; 아세트산, 시트르산, 숙신산,타르타르산, 락트산, 글루콘산 등의 유기산; 프로피온산, 부탄산, 펜탄산, 헥산산, 헵탄산, 옥탄산, 노난산,데칸산, 운데칸산, 도데칸산 등의 지방산 등을 이용할 수 있다.

질소원으로서는, 예를 들면 암모니아, 염화암모늄, 황산암모늄, 인산암모늄등의 암모늄염 외에, 펩톤,고기즙, 효모엑기스, 맥아엑기스, 카제인분해물, 옥수수 침지액 등의 천연물 유래의 것을 들 수 있다.

또한,무기물로서는, 예를 들면 인산제 1칼륨, 인산제 2칼륨, 인산마그네슘, 황산마그네슘, 염화나트륨 등을 들 수 있다. 배양액에, 카나마이신, 암피실린, 테트라사이클린, 클로람페니콜, 스트렙토마이신 등의 항생물질을 첨가해도 된다.

또한, 프로모터가 유도성의 발현벡터를 사용해서 형질전환한 미생물을 배양하는 경우는, 프로모터의 종류에 적합한 유도물질을 배지에 첨가하면 된다. 예를 들면, 이소프로필-β-D-티오갈락토피라노시드(IPTG), 테트라사이클린, 인돌아크릴산(IAA) 등을 유도물질로서 들 수 있다.

본 발명의 효소의 취득은, 형질전환체의 배양물 중으로부터, 균체 또는 상청액을 원심 회수하여, 균체 파쇄, 추출, 친화성 크로마토그래피, 양이온 또는 음이온교환 크로마토그래피, 겔 여과 등 을 단독으로 또는 적당히 조합함으로써 행할 수 있다.

얻게 된 정제물질이 목적의 효소인 것의 확인은, 통상의 방법, 예를 들면 SDS-폴리아크릴아미드겔 전기영동,웨스턴블로팅 등에 의해 행할 수 있다.

이하 본 발명을 설명한다.

본 발명은 고효율의 알로스 생성효율을 가지며, 높은 열 안정성를 가지는, 리보스 5 인산 이성화효소를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 코리네박테리움을 제공한다.

본 발명은 그로부터 안전하면서도 높은 효율로 알로스를 생산할 수 있는 알로스 생산방법을 제공한다.

또 본 발명은 알룰로스로부터 알로스로 전환하는 활성을 가진 효소를 식품안전형 균주 내에서 발현을 최적화하여 효과적이고 안전한 방법으로 알로스를 생산하도록 하고, 알로스를 제조하는데 있어 효과적인 방법 또는 다양한 요소들을 제공한다.

본 발명의 발명자들은 기존 효소에서 클로닝한 특정 폴리뉴클레오티드의 변이체를 발현시켜 얻은 효소가 사이코스의 알로스로의 전환에 대한 높은 활성을 나타내나 발현이 좋지 않은 점을 코돈 최적화화 발현에 필요한 여러 요소를 개선함으로서 효과적으로 이를 개선할 수 있음을 발견하고, 본 발명을 완성하였다.

본 발명자들은 기존 리보스 5 인산 이성화효소를 코리네박테리움 글루타미쿰에 도입하여 확인한 결과 발현이 매우 저조함을 알 수 있었고 이는 적절한 코돈 사용이 이루어지지 않음을 알았다. 이에 codon-opimized 효소를 도입함으로서 상기효소의 적절한 반응이 가능함을 알 수 있었으며 적절한 프로모터를 이용함으로서 높은 수율의 생산이 가능함을 알게 되었다.

본 발명은 고온성 효소인 크로스트리디움 써모셀럼균 유래 라이보스-5-인산 이성화효소와 그 돌연변이체 효소를 지정하는 유전자 및 이의 코돈 최적화한 유전자를 포함하는 재조합 발현벡터, 및 이로 형질전환 된 GRAS 균주인 코리네박테리움 글루타미쿰을 이용하여 안전하게 리보스 5-인산 이성화효소를 대량으로 얻는 제조방법, 그리고 상기 라이보스-5-인산 이성화효소를 이용하여 알로스를 고수율로 얻는 생산방법에 관한 것으로, 본 발명의 코리네박테리움 글루타미쿰에서 발현최적화한 라이보스-5-인산 이성화효소를 이용하여 생산된 알로스는 안전한 방법으로 식품 및 의약품의 원료물질로 생산하도록 하는데 유용하게 사용될 수 있다.

본 발명의 미생물은 안전하면서도 높은 효율로 알룰로스로 부터 알로스를 대량 생산할 수 있다. 본 발명에 따른 식품 안전형 균주 내에서 알로스 생산하는 방법은 알로스에 대해 기존 폴리뉴클레오티드 서열의 발현에 비해 우수한 발현과 알로스 전환활성을 보유하여 상대적으로 높은 수율로 알로스의 대량 생산이 가능하다. 따라서, 본 발명에 따른 식품 안전형 균주에서 알로스를 식품분야 등의 산업적으로 제조하는데에 유리하고, 이렇게 생산된 알로스는 기능성 당 산업뿐만 아니라 이를 이용한 건강식품 소재, 의약용, 화장품용 소재 등 다양한 분야에 유용하게 사용될 수 있다.

도 1은 재조합 발현벡터인 pRPI2의 개열 지도,
도 2는 재조합 균주 코리네박테리움 글루타미쿰 RPI2에서의 발현최적화된 리보스 5-인산 이성화효소의 발현 양상에 대한 SDS-PAGE 분석(M: size marker, 1. 1mM IPTG로 induction한 codon-optimized ribose 5-phosphate isomerase, 2. No induction, 3. empty vector control),
도 3은 코리네박테리움 글루타미쿰 RPI2에 의해 생성된 알로스를 BIO-LC에 의해 검출한 크로마토그램,
도 4는 재조합 균주 코리네박테리움 글루타미쿰 RPI2와 RPI 및 RPI1에 대한 알로스 생산성을 상대활성으로 나타낸 비교,
도 5는 RFP 형광을 이용한 코리네박테리움 글루타미쿰 RPI2와 RPI 및 RPI1 내에서의 알로스전환 유전자의 발현강도 측정결과,
도 6은 글리신을 이용한 농도별 유도물질 투과율 향상에 의한 발현증대 효과이다 (■; 상대활성, ● 상대적인 균체성장),
도 7은 여러 디터전트에 의한 투과율 변화를 이용한 발현증대 방법이다 (■; 상대활성, ● 상대적인 균체성장,
도 8. 글리신과 Tween 80의 혼합에 의한 효과(G는 글리신, T는 Tween 80),
도 9. 글리신과 Tween80의 혼합처리로 투과율 향상에 따른 발현 유도물질인 IPTG에 의한 활성증대효과를 농도별로 측정한 것이다 (■; 무처리구, 회색 ■; 처리구).

이하 본 발명을 구체적인 실시예를 통해 더 상세히 설명하고자 한다. 하지만 본 발명은 하기 실시예에 한정된 것이 아니며, 본 발명의 사상과 범위 내에서 여러 가지 변형 또는 수정이 가능함은 이 분야에서 당업자에게 명백한 것이다. 따라서 첨부된 청구항들은 넓게 본 발명의 사상과 범위에 부합되게 해석되어야 한다.

실시예 1. 코돈 최적화된 리보스 5-인산 이성화 효소를 지정하는 유전자의 클로닝

코리네박테리움 글루타미쿰 (Corynebacterium glutamicum) 내에서 발현이 최적화되도록 클로스트리디움 써모셀럼 (Clostridium thermocellum) ATCC 27405 유래 리보스 5-인산 이성화효소의 돌연변이 염기서열로부터 유래된 서열번호 2의 아미노산 서열을 코리네박테리움 글루타미쿰에 발현이 최적화되도록 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 바이오니아 (Bioneer Co. Deajeon, Korea)에 의뢰하여 합성하였으며, 상기 최적화된 폴리뉴클레오티드 서열을 서열번호 1로 나타내었다.

합성된 서열번호 1은 pBHA T-vector (Bioneer, Daejeon, Korea)에 클로닝 되어 있으며 제한효소 PstI과 SalI (New England BioLab, UK)을 사용하여 절단하도록 고안되었다. 이 벡터를 대장균 E. coli DH5 alpha에 형질전환하여 ampicillin (50ug/㎖)이 포함된 LB agar에서 37℃에서 배양하여 키운 단일집락으로부터 ampicillin (50ug/㎖)이 포함된 LB 액체배지에서 하룻밤 교반 배양하여 균체를 수득하였다. 수득한 균체로부터 플라스미드 정제 키트 (plasmid purification kit; Intron, Daejeon, Korea)를 사용하여 플라스미드 DNA를 수득하였고 이 플라스미드 DNA를 PstI과 SalI 제한효소로 절단한 후 서열번호 1의 합성유전자 단편을 회수하였다.

코리네박테리움과 대장균에서 모두 사용가능하고 성능이 우수한 벡터로 알려진 pEKEx2에 PstI과 SalI 제한효소 절단한 동일 유전자 단편을 삽입하여 재조합 벡터 pEKEx2/코돈 최적화된 리보스 5-인산 이성화효소 (pRpi2)를 제조하였다 (도 1).

동시에 발현 정도를 측정하기 위해 적색형광단백질 (Red fluorescence protein, RFP)이 달려있는 pBbE1c-RFP (Lee TS, Krupa RA, Zhang F, Hajimorad M, Holtz WJ, Prasad N, Lee SK, Keasling JD. 2011, J Biol Eng 5:12)에도 동일한 방법으로 클로닝 하고 pBbE-RPI2로 하였다.

상기와 같이 얻은 재조합 발현 벡터들을 electroporation법 (van der Rest M. E., Lange C., Molenaar D., Applied Microbiology Biotechnology 1999 52 541-545)에 의하여 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC 13032 균주에 형질전환 한 후 kanamycin (25ug/㎖)이 포함된 선별배지 ( trypton 5 g/L, NaCl 5 g/L, yeast extract 2.5 g/L, Brain Heart Infusion powder (Difco) 18.5 g/L, agar 15 g/L, sorbitol 91 g/L)를 이용하여 30℃에서 배양하여 선별하였다. 유전자의 도입여부는 colony PCR에서 양성을 나타낸 집락을 kanamycin (25ug/㎖)이 포함된 LB 액체배지에서 배양한 균체로부터 플라스미드 정제 키트를 이용하여 플라스미드를 회수하고 이를 유전자 염기서열을 분석하여 확인하였다. 유전자가 온전히 도입된 상기 균주를 20% glycerol에 냉동 보관하여 사용하였다. 재조합 발현 벡터 pRPI2가 형질전환된 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC 13032를 ‘코리네박테리움 글루타미쿰 RPI2'로 명명하고, 동 균주를 2015년 10월 30일자로 농촌진흥청 농업유전자원정보센터 (KACC)에 수탁번호 KACC 95131P로 기탁하였다.

실시예 2. 리보스 5-인산 이성화 효소를 지정하는 유전자의 클로닝

실시예 1의 효과를 비교하기 위하여 코돈 최적화를 실시하지 않은 클로스트리디움 써모셀럼 ATCC 27405균 유래의 리보스 5-인산 이성화 효소와 그 돌연변이 효소를 지정하는 유전자서열을 동일한 방법으로 코리네박테리움 벡터인 pEKEx2에 클로닝하였다. 상기 효소들을 지정하는 유전자서열은 공히 pET-28a(+)에 클로닝 되어 각각 대장균 E. coli DH5 alpha에 형질전환되어 있으며 본 발명자들이 -80℃ 냉동고에 보존하고 있던 균주를 kanamycin (50ug/㎖)이 포함된 LB agar에서 37℃에서 배양하여 키운 단일집락으로부터 kanamycin (50ug/㎖)이 포함된 동일 액체 배지 3㎖로 37℃에서 교반 배양하여 균체를 수득하였다.

수득한 균체로부터 플라스미드 정제 키트 (plasmid purification kit; Intron, Daejeon, Korea)를 사용하여 플라스미드 DNA를 각각 수득하였고 이 플라스미드 DNA를 주형으로 각각 PstI과 SalI 제한효소 절단 염기서열이 도입된 올리고뉴클레오티드를 각각 서열번호 3 (GTCCTGCAGATGAAAATTGGAATTGGAAGCG)과 서열번호 4 (CGCGTCGACCTATTTGCTGTATTTTTTTTC)의 뉴클레오티드 프라이머를 사용하여 PCR을 수행하여 리보스 5-인산 이성화효소 및 그 돌연변이 효소 유전자를 포함하는 450bp 크기의 DNA를 각각 증폭하였다.

상기 증폭된 유전자가 코딩하고 있는 리보스 5-인산 이성화효소를 대량 발현하기 위하여, 제한효소 PstI과 SalI으로 절단한 셔틀벡터 pEKEx2에 PstI과 SalI으로 절단한 상기 증폭된 PCR 산물을 각각 삽입하여 pEKEx2/리보스 5-인산 이성화효소 및 pEKEx2/리보스 5-인산 이성화효소돌연변이로서 구성된 재조합 발현 벡터 pRPI 및 pRP1을 제조하였고 이들을 상기와 같은 방법으로 코리네박테리움 글루타미쿰 균주에 각각 형질 전환시켜 재조합 균주를 제조한 후 이를 각각 '코리네박테리움 글루타미쿰 RPI' 및 '코리네박테리움 글루타미쿰 RPI1'로 명명하였다. 또한 발현정도 측정을 위한 대조군으로서 동 유전자들을 pBbE1c-RFP에 동일한 방법으로 클로닝 한 후 pBbE-RPI 및 pBbE-RPI1으로 명명하였다.

실시예 3 : 코리네박테리움에서 리보스 5-인산 이성화 효소의 발현에 의한 활성 및 발현정도 비교

상기 효소들을 대량 생산하기 위하여, 재조합 균주 코리네박테리움 글루타미쿰 RPI2를 5ml LBG 배지 (LB broth, 2% glucose)또는 Brain heart infusion (Difco)에 kanamycin (25ug/mL)을 첨가하여 접종하고 600nm에서 흡광도가 2.0에 도달할 때까지 30℃, 200rpm에서 교반 배양 후, 이 배양액을 500ml의 동일배지에 O.D.600 = 0.1이 되도록 접종한 후 본 배양을 실시하였다. 600nm에서 흡광도가 1.0이 될 때, 0.1mM의 IPTG를 첨가하여 목적효소의 대량 발현을 유도하였다.

상기 과정 중 과발현 유도시점부터 배양조건은 동일조건에서 30시간 동안 배양하였다. 이후 4,000rpm에서 20분간 원심분리하여 균체만을 회수하고, 0.85% (w/v) NaCl로 세척한 다음 50mM Tris-HCl(pH 7.5) 버퍼용액에 재 현탁하고, 이 현탁액을 음파진동기 (Ultrasonic processor. Cole Parmer)를 사용하여 4℃에서 20분 동안 파쇄하였다. 파쇄액을 원심분리 후 회수한 상등액을 조효소액으로 수득하였다.

이 조효소액을 발현을 유도하지 않은 시료를 대조군으로 하여 발현정도를 SDS-PAGE(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gelelectrophoresis)를 통해 발현여부를 확인하였다. 그 결과 재조합 균주 코리네박테리움 글루타미쿰 RPI2에서 리보스 5-인산 이성화 효소가 잘 발현됨을 알 수 있다 (도 2).

또한 조효소액을 효소원으로 사용하여 디알룰로스 (D-allulose) 이성화 반응에 의해 알로스의 생성정도를 확인하였다. 알로스의 정량은 Bio-LC (Dionex ICS-3000, Sunnyvale, CA, USA)를 이용하여 CarboPac PA1 column을 통해 알로스와 알룰로스 표준품 (Carbosynths, Newbury, UK 또는 Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA)과 비교하였다. 알룰로스 이성화 반응은 10mM의 디알룰로스를 기질로서 포함한 0.2 ml의 효소액과 1 ml의 반응 버퍼 용액(50mM Tris-HCl, pH 7.5)을 혼합하여 사용하였다. 조효소 반응액 내의 단백질 정량은 브래포드 검정법(Braford assay kit, Biorad, U.S.A)을 사용하였으며, 그 결과 이성화효소 활성 (0.12mmol-allose/mg-protein·h)으로 알룰로스로부터 반응 산물인 알로스가 정상적으로 생성됨을 확인할 수 있었다 (도 3).

재조합 균주 RPI2의 효과를 보다 분명히 하기 위해 RPI2와 동일한 방법으로 발현최적화를 하지 않은 유전자를 포함한 재조합 균주 코리네박테리움 글루타미쿰 RPI 및 RPI1에 대해서도 상기와 동일한 방법으로 준비한 조효소액 반응을 실시하여 비교한 결과 RPI2는 재조합 균주 RPI 및 RPI1에서 발현된 효소의 활성에 비해 각각 1.8배 및 1.5배 높은 활성을 나타내었다 (도 4).

한편 재조합 균주 RPI2에서 발현된 효소의 알로스 생성 활성과 별도로 각 균주에서 실제 유전자의 발현정도를 형광단백질의 발현강도로 비교하였다. 상기 실시예 1에서 구성한 pBbE-RPI2와 실시예 2에서 pBbE-RPI 및 pBbE-RPI1을 각각 코리네박테리움 글루타미쿰에 상기와 동일한 방법으로 형질전한하여 선별한 각 재조합 균주를 BHI 배지에서 1 mM IPTG (isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside)로 유도하고 30 °C에서 200 rpm으로 5시간 추가배양 하였다. 배양액 200 μl를 96-well plate에 옮기고 30 °C, 200 rpm으로 추가배양하면서 24 시간 동안 추가배양하면서 발현정도를 시간별로 microplate reader(Tecan Infinite M200 pro, Tecan Group Ltd., Switzerland)를 이용하여 검출하였다. 형광의 강도는 excitation/emission 파장 535/620 nm이었으며 특이적 형광강도는 형광과 흡광도 값의 비율로 계산하였다. 그 결과 pBbE-RPI2에서의 형광발현이 가장 높게 나타났으며 이는 코돈 최적화를 수행하지 않는 것들에 비해 각각 2.5배 및 1.8배 향상된 발현 정도를 나타내었다 (도 5). 이는 코리네박테리움 글루타미쿰내에서 코돈 최적화를 통해 상대적으로 더욱 더 효율적으로 발현되고 있음을 알 수 있다.

실시예 4 : 재조합 균주의 대량 생산을 위한 투과성 향상

코리네박테리움은 단단한 세포벽을 가지고 있어 고농도의 기질을 이용한 반응에서도 삼투압에 의한 유출이 방지되어 여러 유용한 산물의 산업적 생산에 유용하다. 그러나 이러한 점은 코리네박테리움에서 강력한 프로모터에 의한 발현 유도를 위해 첨가되는 IPTG와 같은 유도물질이 세포 내로 유효하게 도입되는 것을 방해하여 발현을 충분하게 유도하지 못할 뿐 아니라 고가의 유도물질을 더 많이 사용함으로 인해 발생하는 과도한 비용 발생의 문제가 있다.

코리네박테리움에서 이런 문제 해결을 위해 라이소자임 (lysozyme)과 같은 세포벽을 분해할 수 있는 효소를 사용하거나 페니실린 (penicillin)과 같은 항생제를 사용한 바가 있으나 이들은 생육속도를 현저하게 저하시키거나 일부는 사멸을 초래하는 문제가 발생하였다.

본 발명자들은 이러한 문제없이 코리네박테리움에서 세포벽 투과성을 향상시켜 발현 유도물질이 세포 내부로 유효하게 전달되어 적절한 유전자 발현을 통해 생산성을 위해 아미노산류, 세포벽 합성효소 저해제류, 디테전트들을 사용하여 균체을 최소화하면서도 유전자발현을 증가시키고자 하였다.

도 6은 아미노산의 일종인 글리신 (glycine)을 이용한 투과성 증대를 통한 활성 비교결과이다. 본 처리는 세포벽을 구성하는 아미노산 알라닌의 유사체들인 글리신, 류신, 이소류신, 세린등을 시험한 결과로부터 사용한 다른 아미노산들은 거의 효과가 없으나 글리신이 투과성 증대에 유효한 효과가 있음을 발견하고 이용한 결과로 글리신 농도별로 무처리 군에 비해 특히 2, 3, 4%에서 각각 1.2, 1.3, 1.3배의 효과가 있을 뿐 아니라 균체량도 무처리구(100%) 대비 글리신 처리농도 각각 1, 2%, 3%, 4%(w/v)에서 각각 98.1, 96.9, 94.0, 91.2%를 나타내어 균체의 성장을 거의 저해하지 않음을 알 수 있다 (도 6). 이는 알라닌 대신 글리신이 발현 유도물질이 통과할 수 있는 공간 형성하여 이후 발현증대에 의한 활성 향상효과를 보이는 것이다.

도 7은 디터전트를 이용한 투과성 향상에 관련한 효과이다. Tween계열로 Tween 20, 40, 80, Span 20, 80과 Triton X-100과 SDS를 종류별로 0.02%(w/v)씩 처리해본 결과 무처리구 대비 0.02%(w/v) Tween 80이 1.3배의 활성증대효과가 있음을 보여 농도별로 활성과 균체량을 확인해본 결과 0.01, 0.02, 0.05, 0.1%(w/v)에서 각각 1.2, 1.3, 1.4, 1.6배의 활성 증대효과를 관찰하였고 무처리군 대비 균체량이 동일구간에서 각각 94.3, 92.1, 91.7. 90.1%를 나타내어 균체성장을 거의 저해하지 않음을 알 수 있다 (도 7).

이러한 효과에 상기 글리신과 Tween 80을 혼합하여 사용해 본 결과 혼합처리구에서 단독처리구들 보다 1.3-1.5배 유효한 효과를 관찰할 수 있다 (도 8).

도 9는 본 실시예의 효과를 보다 명확하게 하기 위해 도 6 및 도 7에서 제시한 처리를 처리하지 않은 것과 비교하여 발현 유도물질 농도별 발현증대효과 정도를 나타낸다. 투과성 향상을 위한 처리를 하지 않은 경우 고농도인 1mM을 처리해야 발현효과를 나타내나 투과성 처리를 3% 글리신과 0.1% Tween 80으로 실시한 경우 저농도에서도 상대적으로 명확한 발현 유도효과가 나타남을 알 수 있다 (도 9).

농업생명공학연구원

KACC95131P

20151123

<110> Konkuk University Industrial Cooperation Corp <120> A optimized ribose 5 phosphate isomerase gene, a microorganism comprising the same, and a method for producing allose using the same <130> HY151482 <160> 4 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 450 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Codon-optimized gene <400> 1 atgaagattg gcattggttc cgatcacggt ggctacaact tgaagcgtga gatcgccgat 60 ttcctgaaga agcggggtta cgaggtcatc gactttggaa cccacggcaa tgagtcggtg 120 gattatccag atttcggcct gaaagtggcg gaagctgtga aatctgggga atgtgaccgc 180 ggcatcgtaa tttgcggcac tggtcttggc atttccatcg ctgctaacaa ggttcctggt 240 atccgcgcgg ccgtctgcac caactcctac atggcgcgta tgtcccgaga gcacaacgac 300 gccaacatcc tcgcattggg agaacgcgtt gtgggccttg acctcgcact cgacatcgtt 360 gatacctggc tgaaggcaga attccagggg ggcgagcatg caacccgcgt cggaaagatc 420 ggcgagatcg aaaagaagta cagcaagtaa 450 <210> 2 <211> 149 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Mutant <400> 2 Met Lys Ile Gly Ile Gly Ser Asp His Gly Gly Tyr Asn Leu Lys Arg 1 5 10 15 Glu Ile Ala Asp Phe Leu Lys Lys Arg Gly Tyr Glu Val Ile Asp Phe 20 25 30 Gly Thr His Gly Asn Glu Ser Val Asp Tyr Pro Asp Phe Gly Leu Lys 35 40 45 Val Ala Glu Ala Val Lys Ser Gly Glu Cys Asp Arg Gly Ile Val Ile 50 55 60 Cys Gly Thr Gly Leu Gly Ile Ser Ile Ala Ala Asn Lys Val Pro Gly 65 70 75 80 Ile Arg Ala Ala Val Cys Thr Asn Ser Tyr Met Ala Arg Met Ser Arg 85 90 95 Glu His Asn Asp Ala Asn Ile Leu Ala Leu Gly Glu Arg Val Val Gly 100 105 110 Leu Asp Leu Ala Leu Asp Ile Val Asp Thr Trp Leu Lys Ala Glu Phe 115 120 125 Gln Gly Gly Glu His Ala Thr Arg Val Gly Lys Ile Gly Glu Ile Glu 130 135 140 Lys Lys Tyr Ser Lys 145 <210> 3 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 3 gtcctgcaga tgaaaattgg aattggaagc g 31 <210> 4 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 4 cgcgtcgacc tatttgctgt attttttttc 30

Claims

서열번호 1의 폴리뉴클레오티드로 이루어진 리보스 5-인산 이성화효소 유전자.
제 1항의 서열번호 1의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 벡터에 의해 형질전환된 재조합 미생물.
제 2항에 있어서, 상기 형질전환된 재조합 미생물은 코리네박테리움 글루타미쿰인 것을 특징으로 하는 재조합 미생물.
제 3항에 있어서, 상기 코리네박테리움 글루타미쿰은 코리네박테리움 글루타미쿰 RPI2(수탁번호 : KACC 95131P)인 것을 특징으로 하는 재조합 미생물.
제 1항의 유전자를 유효성분으로 포함하는 알로스 생산용 조성물.
제 5항에 있어서, 상기 조성물은 글리신을 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는 알로스 생산용 조성물.
제 6항에 있어서, 상기 글리신은 배양액 기준 1-10%(w/v) 포함하는 것을 특징으로 하는 알로스 생산용 조성물.
제 5항에 있어서, 상기 조성물은 소르비탄알킬에스테르(Sorbitan alkyl ester; 상품명 : Span), 폴리옥시에틸렌글리콜소르비탄알킬에스테르(Polyoxyethylene glycol sorbitan alkyl ester; 상품명 : Tween) 및 폴리옥시에틸렌글리콜옥틸페닐에테르(Polyethylene glycol octylphenyl ether; 상품명 : Triton X-100)로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상의 화합물을 더욱 포함하는 것을 특징으로 하는 알로스 생산용 조성물.
제 8항에 있어서, 상기 화합물은 배양액 기준 0.01-2%(w/v) 포함하는 것을 특징으로 하는 알로스 생산용 조성물.
제 1항의 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 형질전환된 미생물을 유효성분으로 포함하는 알로스 생산용 조성물.
제 10항에 있어서, 상기 조성물은 글리신을 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는 알로스 생산용 조성물.
제 11항에 있어서, 상기 글리신은 배양액 기준 1-10%(w/v) 포함하는 것을 특징으로 하는 알로스 생산용 조성물.
제 10항에 있어서, 상기 조성물은 소르비탄알킬에스테르(Sorbitan alkyl ester; 상품명 : Span), 폴리옥시에틸렌글리콜소르비탄알킬에스테르(Polyoxyethylene glycol sorbitan alkyl ester; 상품명 : Tween) 및 폴리옥시에틸렌글리콜옥틸페닐에테르(Polyethylene glycol octylphenyl ether; 상품명 : Triton X-100)로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상의 화합물을 더욱 포함하는 것을 특징으로 하는 알로스 생산용 조성물.
제 13항에 있어서, 상기 화합물은 배양액 기준 0.01-2%(w/v) 포함하는 것을 특징으로 하는 알로스 생산용 조성물.
제 2항 내지 제4항 중 어느 한 항의 형질전환된 재조합 미생물에 알룰로스를 첨가하여 알룰로스로부터 알로스를 생산하는 방법.
제 15항에 있어서, 상기 방법은 글리신을 추가적으로 첨가하는 것을 특징으로 하는 알룰로스로부터 알로스를 생산하는 방법.
제 15항에 있어서, 상기 방법은 소르비탄알킬에스테르(Sorbitan alkyl ester; 상품명 : Span), 폴리옥시에틸렌글리콜소르비탄알킬에스테르(Polyoxyethylene glycol sorbitan alkyl ester; 상품명 : Tween) 및 폴리옥시에틸렌글리콜옥틸페닐에테르(Polyethylene glycol octylphenyl ether; 상품명 : Triton X-100)로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상의 화합물을 추가적으로 첨가하는 것을 특징으로 하는 알룰로스로부터 알로스를 생산하는 방법.