KR101922792B1

KR101922792B1 - 플라노코쿠스 유래 신규한 스쿠알렌 합성효소 및 이의 용도

Info

Publication number: KR101922792B1
Application number: KR1020170002212A
Authority: KR
Inventors: 최종일; 전한성
Original assignee: 전남대학교산학협력단
Priority date: 2017-01-06
Filing date: 2017-01-06
Publication date: 2018-11-27
Also published as: KR20180081233A

Abstract

본 발명은 플라노코쿠스 유래 신규한 스쿠알렌 합성효소, 상기 스쿠알렌 합성효소를 코딩하는 핵산 분자, 상기 핵산 분자를 포함하는 재조합 벡터, 상기 재조합 벡터에 의해 형질전환된 세포, 스쿠알렌 제조방법 및 스쿠알렌 합성효소 유전자 증폭용 프라이머 세트를 제공한다. 스쿠알렌을 생산할 수 있는 재조합 미생물은 천연 물질의 채집이나 수확 없이 이용될 수 있고, 유전공학이나 대사공학을 이용한 생산성 증가에 대장균과 같은 숙주 세포는 다양한 장점은 지닌다. 따라서 본 발명에서 얻어진 스쿠알렌 합성 효소 및 스쿠알렌 생산 재조합 대장균은 스쿠알렌의 산업적 생산에 큰 도움이 될 것으로 기대된다.

Description

플라노코쿠스 유래 신규한 스쿠알렌 합성효소 및 이의 용도{Novel Squalene Synthase Derived from Planococcus and The Uses Thereof}

본 발명은 플라노코쿠스 유래 신규한 스쿠알렌 합성효소 및 이의 용도에 관한 것이다. 본 발명은 플라노코쿠스 동핸시스(Planococcus donghaensis ) 및 플라노코쿠스(Planococcus sp .) PAMC 21323에서 확인된 스쿠알렌 합성효소 및 스쿠알렌 합성효소의 염기서열과 상기 유전자를 발현하는 벡터를 도입하여 제조된 재조합 대장균 및 상기 재조합 대장균을 이용한 스쿠알렌의 생산 방법에 관한 것이다. 플라노코쿠스는 저온에서 생장할 수 있는 저온활성 미생물로 스쿠알렌 및 카로티노이드와 같은 고부가 가치 산물을 생산할 수 있다. 본 발명에서는 플라노코쿠스 동핸시스 및 플라노코쿠스 PAMC 21323 확인된 스쿠알렌 합성효소를 클로닝하고 이를 대장균에 형질전환하여 스쿠알렌 생산을 확인하며, 이를 산업적 스쿠알렌에 활용하는 것이다.

스쿠알렌(2,6,10,15,19,23-Hexamethyltetracosa-2,6,10,14,18,22-hexaene, squalene)은 트리터펜(triterpene)에 속하는 물질로써, C₃₀H₅₀의 화학식을 갖는 하이드로카본의 일종이다. 생체 내 생합성 경로를 통해 합성되는 지질로써 일부 박테리아에서는 카로티노이드나 호파노이드와 같은 물질생산에 이용되고, 사람의 경우 콜레스테롤, 비타민 D, 성 호르몬과 같은 물질의 전구체로 사용된다. 또한 인체에서는 낮은 점도 및 높은 지용성 물질 용해도로 체내의 중금속, 발암물질, 지용성 환경 호르몬과 같은 해로운 물질들을 배출하고 해독하는 역할을 갖는다.

쥐를 이용한 역학조사에서는 폐암, 대장암, 피부암에 대한 유효한 항암효과를 보였으며, 백신과 함께 주사되어 체내에서 항체 생산 및 세포성 면역 강화와 같은 면역효과를 높이는 아쥬반트(adjuvant)로써의 효과가 확인되어 사용되고 있다.

현재 스쿠알렌은 상어 간유 및 아마란스와 같은 일부 식물의 씨앗에서 추출 및 생산되고 있고, 슈도지마(Psedozyma)나 캔디다 파마타(Candida famata)와 같은 효모 또는 유글레나(Euglena)같은 원생동물에서의 생산도 보고되었다. 고등 생물에서 유래한 천연물질로부터의 추출은 정제 및 수율에 제한이 있고, 스쿠알렌 확보를 위한 심해 상어의 이용은 환경 보호 운동과 같은 윤리적 문제와 관련이 있다. 또한 상업적 공급을 위해 계절 및 환경적 요인으로 공급이 일정하지 못하며 생물 농축으로 인한 상어 체내의 중금속오염은 생산된 스쿠알렌의 품질 및 안정성에 악영향을 미친다. 미생물을 이용한 스쿠알렌 생산 역시 균체 배양 기간 및 세포 생산성에서 한계를 보이며 해당 미생물에 대한 유전자 정보가 제한적이라 대사공학 및 유전공학의 접목이 어려운 실정이다.

대장균은 대표적인 모델 생물(model organism)로써, 오랜 기간 동안 연구되어 유전 정보가 잘 알려져 있고, 유전공학적으로 이용할 수 있는 많은 도구들이 개발되었다. 짧은 배가시간(doubling time) 및 생장 조건은 산업적 수준의 생산에서도 장점을 지닌다.

본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.

본 발명자들은 종래의 미생물로부터 생산되어온 스쿠알렌의 대사공학 및 유전공학에의 접목에 어려운 문제를 해소하기 위해 저온활성 미생물인 플라노코쿠스 유래 신규한 스쿠알렌 합성효소를 규명하고 상기 신규한 스쿠알렌 합성효소가 형질전환된 재조합 대장균에서 스쿠알렌의 생성을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

따라서, 본 발명의 목적은 스쿠알렌 합성효소를 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적은 스쿠알렌 합성효소를 코딩하는 핵산 분자를 제공하는 데 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 핵산 분자를 포함하는 재조합 벡터를 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적은 상기 재조합 벡터에 의해 형질전환된 세포를 제공하는 데 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 스쿠알렌 제조방법을 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적은 스쿠알렌 합성효소 유전자 증폭용 프라이머 세트를 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.

본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 서열목록 제2서열에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 스쿠알렌 합성효소를 제공한다.

본 발명자들은 종래의 미생물로부터 생산되어온 스쿠알렌의 대사공학 및 유전공학에의 접목에 어려운 문제를 해소하기 위해 저온활성 미생물인 플라노코쿠스 유래 신규한 스쿠알렌 합성효소를 규명하고 상기 신규한 스쿠알렌 합성효소가 형질전환된 재조합 대장균에서 스쿠알렌의 생성을 확인하였다.

본 명세서 용어 “스쿠알렌 합성효소”는 소포체(endoplasmic reticulum)의 막에 위치하는 효소로, 파르네실피로인산(farnesyl pyrophsphate) 두 분자로부터 스쿠알렌 한 분자를 합성하는 반응을 촉매하는 효소이며, 파르네실-2인산:파르네실-2인산 파르네실 전환 효소(farnesyl-diphosphate:farnesyl-diphosphate farnesyl transferase)로도 불린다(https://en.wikipedia.org/wiki/Farnesyl-diphosphate_farnesyltransferase).

본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 스쿠알렌 합성효소는 미생물로부터 유래된 것이다. 본 발명의 다른 구현예에 따르면, 상기 스쿠알렌 합성효소는 플라노코쿠스 동핸시스(Planococcus donghaensis) 유래이다.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 서열목록 제2서열에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 스쿠알렌 합성효소를 코딩하는 핵산 분자를 제공한다.

본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 핵산 분자는 서열목록 제1서열에 기재된 뉴클레오타이드 서열을 갖는다.

본 명세서에서 용어 “핵산 분자”는 DNA(gDNA 및 cDNA) 그리고 RNA 분자를 포괄적으로 포함하는 의미를 갖으며, 핵산 분자에서 기본 구성 단위인 뉴클레오타이드는 자연의 뉴클레오타이드 뿐만 아니라, 당 또는 염기 부위가 변형된 유사체 (analogue)도 포함한다(Scheit, Nucleotide Analogs, John Wiley, New York(1980); Uhlman 및 Peyman, Chemical Reviews, 90:543-584(1990)).

뉴클레오타이드에서의 변이는 단백질에서 변화를 가져오지 않는 것도 있다. 이러한 핵산은 기능적으로 균등한 코돈 또는 동일한 아미노산을 코딩하는 코돈(예를 들어, 코돈의 축퇴성에 의해, 아르기닌 또는 세린에 대한 코돈은 여섯 개이다), 또는 생물학적으로 균등한 아미노산을 코딩하는 코돈을 포함하는 핵산분자를 포함한다.

또한, 뉴클레오타이드에서의 변이가 스쿠알렌 합성효소 자체에 변화를 가져올 수도 있다. 스쿠알렌 합성효소의 아미노산에 변화를 가져오는 변이인 경우에도 본 발명의 스쿠알렌 합성효소와 거의 동일한 활성을 나타내는 것이 얻어질 수 있다.

본 발명의 스쿠알렌 합성효소에 포함될 수 있는 생물학적 기능 균등물은 본 발명의 스쿠알렌 합성효소와 균등한 생물학적 활성을 발휘하는 아미노산 서열의 변이에 한정될 것이라는 것은 당업자에게 명확하다.

이러한 아미노산 변이는 아미노산 곁사슬 치환체의 상대적 유사성, 예컨대, 소수성, 친수성, 전하, 크기 등에 기초하여 이루어진다. 아미노산 곁사슬 치환체의 크기, 모양 및 종류에 대한 분석에 의하여, 아르기닌, 라이신과 히스티딘은 모두 양전하를 띤 잔기이고; 알라닌, 글라이신과 세린은 유사한 크기를 갖으며; 페닐알라닌, 트립토판과 타이로신은 유사한 모양을 갖는다는 것을 알 수 있다. 따라서, 이러한 고려 사항에 기초하여, 아르기닌, 라이신과 히스티딘; 알라닌, 글라이신과 세린; 그리고 페닐알라닌, 트립토판과 타이로신은 생물학적으로 기능 균등물이라 할 수 있다.

변이를 도입하는 데 있어서, 아미노산의 소수성 인덱스(hydropathic idex)가 고려될 수 있다. 각각의 아미노산은 소수성과 전하에 따라 소수성 인덱스가 부여되어 있다: 아이소루이신(+4.5); 발린(+4.2); 루이신(+3.8); 페닐알라닌(+2.8); 시스테인/시스타인(+2.5); 메티오닌(+1.9); 알라닌(+1.8); 글라이신(-0.4); 쓰레오닌(-0.7); 세린(-0.8); 트립토판(-0.9); 타이로신(-1.3); 프롤린(-1.6); 히스티딘(-3.2); 글루타메이트(-3.5); 글루타민(-3.5); 아스파르테이트(-3.5); 아스파라긴(-3.5); 라이신(-3.9); 및 아르기닌(-4.5).

단백질의 상호적인 생물학적 기능(interactive biological function)을 부여하는 데 있어서 소수성 아미노산 인덱스는 매우 중요하다. 유사한 소수성 인덱스를 가지는 아미노산으로 치환하여야 유사한 생물학적 활성을 보유할 수 있다는 것은 공지된 사실이다. 소수성 인덱스를 참조하여 변이를 도입시키는 경우, 바람직하게는 ± 2 이내, 보다 바람직하게는 ± 1 이내, 보다 더 바람직하게는 ± 0.5 이내의 소수성 인덱스 차이를 나타내는 아미노산 사이에 치환을 한다.

한편, 유사한 친수성 값(hydrophilicity value)을 가지는 아미노산 사이의 치환이 균등한 생물학적 활성을 갖는 단백질을 초래한다는 것도 잘 알려져 있다. 미국 특허 제4,554,101호에 개시된 바와 같이, 다음의 친수성 값이 각각의 아미노산 잔기에 부여되어 있다: 아르기닌(+3.0); 라이신(+3.0); 아스팔테이트(+3.0± 1); 글루타메이트(+3.0± 1); 세린(+0.3); 아스파라긴(+0.2); 글루타민(+0.2); 글라이신(0); 쓰레오닌(-0.4); 프롤린(-0.5 ± 1); 알라닌(-0.5); 히스티딘(-0.5); 시스테인(-1.0); 메티오닌(-1.3); 발린(-1.5); 루이신(-1.8); 아이소루이신(-1.8); 타이로신(-2.3); 페닐알라닌(-2.5); 트립토판(-3.4).

친수성 값을 참조하여 변이를 도입시키는 경우, 바람직하게는 ± 2 이내, 보다 바람직하게는 ± 1 이내, 보다 더 바람직하게는 ± 0.5 이내의 친수성 값 차이를 나타내는 아미노산 사이에 치환을 한다.

분자의 활성을 전체적으로 변경시키지 않는 단백질에서의 아미노산 교환은 당해 분야에 공지되어 있다(H. Neurath, R.L.Hill, The Proteins, Academic Press, New York, 1979). 가장 통상적으로 일어나는 교환은 아미노산 잔기 Ala/Ser, Val/Ile, Asp/Glu, Thr/Ser, Ala/Gly, Ala/Thr, Ser/Asn, Ala/Val, Ser/Gly, Thr/Phe, Ala/Pro, Lys/Arg, Asp/Asn, Leu/Ile, Leu/Val, Ala/Glu, Asp/Gly 간의 교환이다.

상술한 생물학적 균등 활성을 갖는 변이를 고려한다면, 본 발명의 스쿠알렌 합성효소 또는 이를 코딩하는 핵산 분자는 서열목록에 기재된 서열과 실질적인 동일성(substantial identity)을 나타내는 서열도 포함하는 것으로 해석된다. 상기의 실질적인 동일성은, 상기한 본 발명의 서열과 임의의 다른 서열을 최대한 대응되도록 얼라인하고, 당업계에서 통상적으로 이용되는 알고리즘을 이용하여 얼라인된 서열을 분석한 경우에, 예컨대 최소 99%의 상동성을 나타내는 서열을 의미한다. 서열비교를 위한 얼라인먼트 방법은 당업계에 공지되어 있다. 얼라인먼트에 대한 다양한 방법 및 알고리즘은 Smith and Waterman, Adv . Appl. Math. 2:482(1981); Needleman and Wunsch, J. Mol . Bio. 48:443(1970); Pearson and Lipman, Methods in Mol . Biol . 24: 307-31(1988); Higgins and Sharp, Gene 73:237-44(1988); Higgins and Sharp, CABIOS 5:151-3(1989); Corpet et al., Nuc . Acids Res. 16:10881-90(1988); Huang et al., Comp. Appl . BioSci. 8:155-65(1992) and Pearson et al., Meth . Mol . Biol . 24:307-31(1994)에 개시되어 있다. NCBI Basic Local Alignment Search Tool (BLAST)(Altschul et al., J. Mol . Biol . 215:403-10(1990))은 NCBI(National Center for Biological Information) 등에서 접근 가능하며, 인터넷 상에서 blastp, blastm, blastx, tblastn 및 tblastx와 같은 서열 분석 프로그램과 연동되어 이용할 수 있다. BLSAT는 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/에서 접속 가능하다. 이 프로그램을 이용한 서열 상동성 비교 방법은 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/blast_help.html에서 확인할 수 있다.

본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 스쿠알렌 합성효소를 코딩하는 상술한 본 발명의 핵산 분자를 포함하는 재조합 벡터를 제공한다.

본 발명의 벡터 시스템은 당업계에 공지된 다양한 방법을 통해 구축될 수 있으며, 이에 대한 구체적인 방법은 Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press(2001)에 개시되어 있으며, 이 문헌은 본 명세서에 참조로서 삽입된다.

본 발명의 벡터는 전형적으로 클로닝을 위한 벡터 또는 발현을 위한 벡터로서 구축될 수 있다. 또한, 본 발명의 벡터는 원핵 세포를 숙주로 하여 구축될 수 있다. 본 발명의 벡터는 전형적으로 클로닝을 위한 벡터 또는 발현을 위한 벡터로서 구축될 수 있다.

예를 들어, 본 발명의 벡터가 발현 벡터이고, 원핵 세포를 숙주로 하는 경우에는, 전사를 진행시킬 수 있는 강력한 프로모터(예컨대, tac 프로모터, lac 프로모터, lacUV5 프로모터, lpp 프로모터, p_L ^λ프로모터, p_R ^λ프로모터, rac5 프로모터, amp 프로모터, recA 프로모터, SP6 프로머터, trp 프로모터 및 T7 프로모터 등), 해독의 개시를 위한 라이보좀 결합 자리 및 전사/해독 종결 서열을 포함하는 것이 일반적이다. 숙주 세포로서 E. coli가 이용되는 경우, E. coli 트립토판 생합성 경로의 프로모터 및 오퍼레이터 부위(Yanofsky, C., J. Bacteriol ., 158:1018-1024(1984)) 그리고 파아지 λ의 좌향 프로모터(p_L ^λ프로모터, Herskowitz, I. and Hagen, D., Ann. Rev. Genet., 14:399-445(1980))가 조절 부위로서 이용될 수 있다.

한편, 본 발명에 이용될 수 있는 벡터는 당업계에서 종종 사용되는 플라스미드 (예: pET21s, pET, pSC101, ColE1, pBR322, pUC8/9, pHC79, pUC19 등), 파지(예: λgt4λB, λ-Charon, λΔz1 및 M13 등) 또는 바이러스(예: SV40 등)를 조작하여 제작될 수 있다.

한편, 본 발명의 벡터는 선택표지로서, 당업계에서 통상적으로 이용되는 항생제 내성 유전자를 포함하며, 예를 들어 암피실린, 겐타마이신, 카베니실린, 클로람페니콜, 스트렙토마이신, 카나마이신, 게네티신, 네오마이신 및 테트라사이클린에 대한 내성 유전자가 있다.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상술한 재조합 벡터를 포함하는 형질전환된 세포를 제공한다.

본 발명의 벡터를 안정되면서 연속적으로 클로닝 및 발현시킬 수 있는 숙주 세포는 당업계에 공지되어 어떠한 숙주 세포도 이용할 수 있으며, 예컨대, E. coli JM109, E. coli BL21(DE3), E. coli RR1, E. coli LE392, E. coli B, E. coli X 1776, E. coli W3110, 바실러스 서브틸리스, 바실러스 츄린겐시스와 같은 바실러스 속 균주, 그리고 살모넬라 티피무리움, 세라티아 마르세슨스 및 다양한 슈도모나스 종과 같은 장내균과 균주 등이 있다.

본 발명의 벡터를 숙주 세포 내로 운반하는 방법은, CaCl₂ 방법(Cohen, S.N. et al., Proc . Natl . Acac. Sci . USA, 9:2110-2114(1973)), 하나한 방법(Cohen, S.N. et al., Proc . Natl . Acac . Sci . USA, 9:2110-2114(1973); 및 Hanahan, D., J. Mol . Biol ., 166:557-580(1983)) 및 전기 천공 방법(Dower, W.J. et al., Nucleic. Acids Res., 16:6127-6145(1988)) 등에 의해 실시될 수 있다.

숙주 세포 내로 주입된 벡터는 숙주 세포 내에서 발현될 수 있으며, 이러한 경우에는 다량의 스쿠알렌 합성효소를 얻게 된다. 예를 들어, 상기 발현 벡터가 lac 프로모터를 포함하는 경우에는 숙주 세포에 IPTG를 처리하여 유전자 발현을 유도할 수 있다.

본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 형질전환된 세포는 이스케리치아(Eschericha) 속(genus)이다. 본 발명의 다른 구현예에 따르면, 상기 형질전환된 세포는 이스케리치아 콜라이(Escherichia coli)이다.

본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 상기 형질전환된 세포를 배양하는 단계를 포함하는 스쿠알렌 제조방법을 제공한다.

하기 실시예에서 입증된 바와 같이, 본 발명의 형질전환된 세포는 배지 기준 5.0 내지 6.0 mg/L의 스쿠알렌 생산능을 나타낸다.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 서열목록 제4서열에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 스쿠알렌 합성효소를 제공한다.

본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 스쿠알렌 합성효소는 플라노코쿠스 PAMC21323 유래이다.

본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 서열목록 제4서열에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 스쿠알렌 합성효소를 코딩하는 핵산 분자를 제공한다.

본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 핵산 분자는 서열목록 제3서열에 기재된 뉴클레오타이드 서열을 갖는다.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 상기 핵산 분자를 포함하는 재조합 벡터를 제공한다.

본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 상기 재조합 벡터에 의해 형질전환된 세포를 제공한다.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 상기 형질전환된 세포를 배양하는 단계를 포함하는 스쿠알렌 제조방법을 제공한다.

본 발명의 스쿠알렌 합성효소, 상기 스쿠알렌 합성효소를 코딩하는 핵산 분자, 상기 핵산 분자를 포함하는 재조합 벡터, 상기 재조합 벡터에 의해 형질전환된 세포 및 스쿠알렌 제조방법은 상기 기설명된 내용과 유사하기 때문에, 이 둘 사이에 공통된 내용은 본 명세서의 과도한 복잡성을 피하기 위하여, 그 기재를 생략한다.

본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 서열목록 제5서열 및 제6서열의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 스쿠알렌 합성효소 유전자 증폭용 프라이머 세트를 제공한다.

본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 프라이머 세트는 플라노코쿠스 속 미생물의 스쿠알렌 합성효소 유전자를 증폭할 수 있다.

상기 플라노코쿠스 속 미생물은 플라노코쿠스 동핸시스, 플라노코쿠스 할로크리오필러스(P. halocryophilus), 플라노코쿠스 코쿠리(P. kocurii), 플라노코쿠스 안타르크티커스(P. antarcticus) 이며 이에 한정되지 않는다.

하기 실시예에서 입증된 바와 같이, 상기 프라이머 세트는 플라노코쿠스 속 미생물의 지노믹 DNA 내 스쿠알렌 합성효소 유전자를 증폭시킬 수 있다.

본 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다:

(a) 본 발명은 플라노코쿠스 유래 신규한 스쿠알렌 합성효소, 상기 스쿠알렌 합성효소를 코딩하는 핵산 분자, 상기 핵산 분자를 포함하는 재조합 벡터, 상기 재조합 벡터에 의해 형질전환된 세포, 스쿠알렌 제조방법 및 스쿠알렌 합성효소 유전자 증폭용 프라이머 세트를 제공한다.

(b) 스쿠알렌을 생산할 수 있는 재조합 미생물은 천연 물질의 채집이나 수확 없이 이용될 수 있고, 유전공학이나 대사공학을 이용한 생산성 증가에 대장균과 같은 숙주 세포는 다양한 장점은 지닌다. 따라서 본 발명에서 얻어진 스쿠알렌 합성 효소 및 스쿠알렌 생산 재조합 대장균은 스쿠알렌의 산업적 생산에 큰 도움이 될 것으로 기대된다.

도 1은 플라노코쿠스 동핸시스 및 플라노코쿠스 PAMC 21323의 지노믹 DNA로부터 PCR하여 얻어진 스쿠알렌 합성효소 유전자의 전기영동(electrophoresis) 사진이다.
도 2는 스쿠알렌 합성효소가 재조합된 대장균의 지질 추출물에 대한 GC 및 GC/MS 결과이다.
도 3은 스쿠알렌 합성효소가 재조합된 대장균의 지질 추출물에 대한 HPLC 결과와 DAD로 측정한 스쿠알렌 피크의 스펙트럼 및 재조합 균주별 스쿠알렌 생산량이다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.

실험 방법

전기천공법(electroporation)은 Gene pulser(Bio-rad, Hercules, CA)를 이용하여 Cuvette gap 2 mm, Filed strength 15 kV/cm, Capacitor 50 μF, Resistor 100 Ω의 조건으로 실시하였다.

HPLC(high performance liquid chromatography)는 1600 infinity HPLC system(Agilent technology, Santa Clara, USA)을 이용하여 Injection volume 20.00 ul, Flow rate 1.5 ml(solvent acetonitrile 100%), Stop time 100분, Post time 5분, Column: Zorbax SB-C18 5 um 4.6×250 mm, temperature 25℃, Detector: DAD(191 nm, 287 nm)의 조건으로 실시하였다.

GC/MS는 QP2010(Shimadzu, Japan)를 이용하여 Injection volume 1 ul, Column: DB-5MS(30 m*0.25 mm*0.25 um), Injector temp 250℃, Detector temperature 250 ℃, Split ratio 20(squalene standard의 경우 100), Mass range 50 ~ 500 m/z, Solvent cut time 7분, Column flow 1 ml/분의 조건으로 실시하였다.

실시예 1: 플라노코쿠스 유래 스쿠알렌 합성효소의 클로닝

플라노코쿠스 동핸시스(Planococcus donghaensis)는 KCTC 생물자원센터(정읍, 대한민국)에서(KCTC 13050), 플라노코쿠스 PAMC 21323은 극지연구소(인천, 대한민국)에서 분양받았다. 플라노코쿠스 동핸시스의 배양은 LB 배지(Difco, Franklin Lakes, NJ)를 이용하였다. LB 배지의 조성은 물 1 L당 트립톤 10.0 g, 효모 추출물 5.0 g, 염화나트륨 10.0 g이다. 50 ㎖ LB 배지가 담긴 250 ㎖ 삼각 플라스크에 LB 아가(agar) 플레이트에서 키운 플라노코쿠스 동핸시스를 접종하여 25 ℃, 200 rpm에서 배양하였다. 플라노코쿠스 PAMC 21323의 배양은 마린 배지(Marine broth; Difco, Franklin Lakes, NJ)를 이용하였다. 마린 배지의 조성은 물 1 L당 펩톤 5.0 g, 효모 추출물 1.0 g, 구연산철 0.1 g, 염화나트륨 19.45 g, 염화마그네슘 5.9 g, 황산마그네슘 3.24 g, 염화칼슘 1.8 g, 염화칼륨 0.55 g, 중탄산나트륨 0.16 g, 브롬화칼륨 0.08 g, 염화스트론튬 34.0 mg, 붕산 22.0 mg, 규산나트륨 4.0 mg, 플루오르화나트륨 2.4 mg, 질산암모늄 1.6 mg, 인산(수소2)나트륨 8.0 mg이다. 50 ㎖ 마린 배지가 담긴 250 ㎖ 삼각 플라스크에 마린 배지 아가 플레이트에서 키운 플라노코쿠스 PAMC 21323을 접종하여 25℃, 200 rpm에서 배양하였다. 두 종의 플라노코쿠스를 흡광도(optical density. OD600)) 값이 1.0 때까지 배양하여 지노믹(genomic) DNA를 추출하였다. 지노믹 DNA 추출은 Purelink™ Genomic DNA mini kit(Invitrogen, Waltham, Massachusetts, USA)을 사용하였다.

추출한 지노믹 DNA로부터 스쿠알렌 합성효소를 클로닝하기 위해 표 1의 프라이머를 이용하여 PCR을 수행하였다. 사용된 PCR 키트는 Expand High Fidelity PCR System(Roche Diagnostics, Basel Switzerland)이고 Veriti 96-well thermal cycler)를 이용하였다. PCR 산물을 전기영동하여 결과 도 1과 같은 약 800 bp 크기의 DNA 밴드가 확인되었다.

-	방향	서열목록
정방향	5'-TAAGCAGAGCTCATGAGCAAAGTTTCGAATTTACA-3'	제5서열
역방향	5'-TAAGCAAAGCTTTTAACTTAAACGTTCTTCTTTTTTTAATT-3'	제6서열

PCR 산물을 벡터에 삽입하기 위하여 제한 효소 HindⅢ와 SacⅠ(promega, USA)를 처리하였으며, 벡터 pET21a에도 동일하게 처리하였다. 이후 라이게이스(ligase)를 이용하여 연결하였다. 재조합 플라스미드를 전기천공법을 이용하여 대장균에 형질전환하였고 앰피실린 항생제가 들어간 고체 배지를 이용하여 재조합 균주를 선별하였다. 이후 고체 배지에 나타난 균주를 콜로니 PCR과 해당 균주의 플라스미드의 이중절단(double digestion)을 통해 플라스미드 안의 삽입체(insert)를 확인하였고 이후 해당 플라스미드를 마크로젠에 시퀀싱 분석의뢰하여 염기서열을 확인하였다. 서열목록 제1서열 및 제3서열은 각각 플라노코쿠스 동핸시스 및 플라노코쿠스 PAMC 21323 유래 스쿠알렌 합성효소 유전자의 뉴클레오타이드 서열이다.

실시예 2: 스쿠알렌 합성효소가 재조합된 대장균으로부터 스쿠알렌 생산 및 확인

스쿠알렌 합성효소가 재조합된 대장균을 TB(Terrific broth) 배지에서 배양하였다. TB 배지의 조성은 물 1 L 당 트립톤 12 g, 효모 추출물 24 g, 글리세롤 4 ml, KH₂PO₄ 2.31 g, K₂HPO₄ 12.54 g 이다. 50 ㎖ TB 배지가 담긴 250 ㎖ 삼각 플라스크에 접종하여 30℃, 200 rpm에서 48시간 동안 배양하였다. 인덕션(Induction)을 위해서 배양 10시간 이후 IPTG(Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside)를 0.25 mM 농도로 첨가하였다.

균체를 수확하기 위해서 50 ㎖ 코니칼튜브(conical tube)에 옮기고 4,000 rpm에서 10분 동안 원심분리를 실시하였다. 지질을 추출하기 위해서 형성된 침전물(pellet)에 2 ㎖의 클로로포름과 4 ㎖의 메탄올을 첨가한 뒤 균체와 용매가 잘 섞이도록 볼텍싱하였다. 다시 동일한 조건에서 원심분리를 실시하여 용매와 나머지 균체를 분리해주고 상층액을 새로운 튜브에 옮긴 뒤 6 ㎖의 아세토니트릴과 12 ㎖의 헵탄(heptane)을 넣어주었다. 상층액에 존재하는 헵탄층을 새로운 튜브에 옮겨주고, 아세토니트릴를 넣어서 세척해 주었다. 헵탄층만을 다른 튜브에 옮기고 진공증발기를 이용하여 용매를 날려주었다. 용매가 제거된 튜브에 새로운 용매를 넣어주는데, GC/MS 분석의 경우 헥산(hexane)을 넣어주었고, HPLC 분석의 경우 헵탄과 아세토니드릴이 1:20 으로 섞인 용매를 넣어줬다.

GC/MS 분석의 결과 14.5 min에서 대조군에 해당하는, 공벡터가 재조합된 대장균과 다른 피크 양상을 보였다. 스쿠알렌 스탠다드의 분석결과도 동일하게 14.5 min에서 단일 피크를 확인할 수 있었다. 해당 피크의 mass 결과 역시 일치하는 것을 확인할 수 있었다. 도 2는 재조합 대장균 유래 지질 추출물 및 스쿠알렌 스탠다드의 GC 결과와 14.5 min에 검출된 피크의 mass 데이터에 관한 것이다.

HPLC 결과 역시 35.5 min에서 대조군에 해당하는, 공벡터가 재조합된 대장균과 다른 피크 양상을 보였다. 스쿠알렌 스탠다드의 분석결과도 동일하게 35.5 min에서 피크를 확인하였다. HPLC의 경우 스쿠알렌 스탠다드의 양을 다르게 하여 검정곡선을 작도할 수 있었으며, 이를 통해서 재조합 대장균 유래 스쿠알렌의 양을 확인할 수 있었다. 플라노코쿠스 동핸시스 유전자 유래 재조합 대장균의 스쿠알렌 생산량은 사용된 배지 기준 5.51 mg/L였고, 플라노코쿠스 PAMC 21323 유전자 유래 재조합 대장균의 스쿠알렌 생산량은 5.92 mg/L였다. 도 3는 재조합 대장균 유래 지질 추출물 및 스쿠알렌 스탠다드의 HPLC 결과이다.

이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

<110> INDUSTRY FOUNDATION OF CHONNAM NATIONAL UNIVERSITY <120> Novel Squalene Synthase Derived from Planococcus and The Uses Thereof <130> PN160473 <160> 6 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 831 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> Planococcus donghaensis <400> 1 atgagcaaag tttcgaattt acaaaaagag tccttaatca tgctaaaaga aactagccgg 60 acctttttca tcccaatcag ctttttagac tctactttaa agaaaactgt cggctcggct 120 tatctttgta tgcgagcgat tgatgaaatt gaagaccatc cagaactgga agaccaagct 180 aagattaaac tgttgagtac gattcaacaa atgctggaaa cggattttaa tgagcatgct 240 tacttggaac tcgttactcc ttataaagag tttctaccac ctgttactat gcgtttagcg 300 gactggctcc atgtttgtcc tgaagaaatt agagggaaag taatggaatc cacggcaatt 360 atggccggcg gaatgtccaa gtgggtagaa aagaattggg ttattcaaac acaagatgat 420 ttagatgaat atacgtatta cgtagctggt cttgttggca ccatgctgtc agacatttgg 480 cattggcatg acggaacggt cacagacccc gaccatgcga ttgcttttgg ccgtggattg 540 caagcagtca atatgctacg caattacgat gaagattttg agcgcggcgt cacttttgta 600 cctgaaggtt ggacacgtga agacatgttc 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Tyr Tyr Val Ala Gly Leu Val Gly Thr Met Leu Ser Asp Ile Trp 145 150 155 160 His Trp His Asp Gly Thr Val Thr Asp Pro Asp His Ala Ile Ala Phe 165 170 175 Gly Arg Gly Leu Gln Ala Val Asn Met Leu Arg Asn Tyr Asp Glu Asp 180 185 190 Phe Glu Arg Gly Val Thr Phe Val Pro Glu Gly Trp Thr Arg Glu Asp 195 200 205 Met Phe Asn Tyr Ala Lys Asn Asn Leu Ala Lys Ala Asp Leu Tyr Val 210 215 220 Gln Pro Ile Lys Asn Lys Arg Ile Leu Met Phe Cys Lys Val Pro Leu 225 230 235 240 Ala Leu Ala His Ser Thr Leu Lys Ala Leu Lys Ser Gly Lys Glu Lys 245 250 255 Met Ser Arg Val Glu Val Glu Gly Ile Val Glu Gln Leu Lys Lys Glu 260 265 270 Glu Arg Leu Ser 275 <210> 3 <211> 831 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> Planococcus PAMC 21323 <400> 3 atgagcaaag tttcgaattt acaaaaagag tccttaatca tgctaaaaga aactagccgg 60 acctttttca tcccaatcag ctttttagaa cctactttaa agaaaactgt cggttcggct 120 tacctttgta tgcgagcgat cgatgaaatt gaagatcatc cagaactaga ggatcaagct 180 aaaattaaat tgctaagcac gattcaaaaa atgcttgaaa cagattttga tgagcaggct 240 tatttagaac ttgttacacc ttataaagaa tttttgccac ctgttacaat gcgcttagcg 300 gattggatcc atgtttgtcc tgaagaaatt agagggaaag taatggaatc tactgctatt 360 atggctggtg gaatgtccaa gtgggtagaa aaaaattggg ttattcgaac aaaagaagat 420 cttgatgagt atacctatta cgtagctggc cttgtaggta caatgctttc agacatttgg 480 tattggcacg acggtacagt tacagatccg gatcacgcca tcgcttttgg tcgtggactg 540 caagcagtca atatgctacg aaattatgat gaagattttg agcgcggtgt cactttcgta 600 ccagaaggtt ggacacgtga agatttgttc gactatgcga aaaacaattt agcaaaagca 660 gacctttata taaaacccat taaaagcaaa cggattttga tgttctgtaa agttccattg 720 gcattagctc atagcacgct caaagccttg aagtcaggta aagaaaagat gagtcgagta 780 gaagttgaag gcatagtaga acaattaaaa aaagaagaac gtttaagtta a 831 <210> 4 <211> 276 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> Planococcus PAMC 21323 <400> 4 Met Ser Lys Val Ser Asn Leu Gln Lys Glu Ser Leu Ile Met Leu Lys 1 5 10 15 Glu Thr Ser Arg Thr Phe Phe Ile Pro Ile Ser Phe Leu Glu Pro Thr 20 25 30 Leu Lys Lys Thr Val Gly Ser Ala Tyr Leu Cys Met Arg Ala Ile Asp 35 40 45 Glu Ile Glu Asp His Pro Glu Leu Glu Asp Gln Ala Lys Ile Lys Leu 50 55 60 Leu Ser Thr Ile Gln Lys Met Leu Glu Thr Asp Phe Asp Glu Gln Ala 65 70 75 80 Tyr Leu Glu Leu Val Thr Pro Tyr Lys Glu Phe Leu Pro Pro Val Thr 85 90 95 Met Arg Leu Ala Asp Trp Ile His Val Cys Pro Glu Glu Ile Arg Gly 100 105 110 Lys Val Met Glu Ser Thr Ala Ile Met Ala Gly Gly Met Ser Lys Trp 115 120 125 Val Glu Lys Asn Trp Val Ile Arg Thr Lys Glu Asp Leu Asp Glu Tyr 130 135 140 Thr Tyr Tyr Val Ala Gly Leu Val Gly Thr Met Leu Ser Asp Ile Trp 145 150 155 160 Tyr Trp His Asp Gly Thr Val Thr Asp Pro Asp His Ala Ile Ala Phe 165 170 175 Gly Arg Gly Leu Gln Ala Val Asn Met Leu Arg Asn Tyr Asp Glu Asp 180 185 190 Phe Glu Arg Gly Val Thr Phe Val Pro Glu Gly Trp Thr Arg Glu Asp 195 200 205 Leu Phe Asp Tyr Ala Lys Asn Asn Leu Ala Lys Ala Asp Leu Tyr Ile 210 215 220 Lys Pro Ile Lys Ser Lys Arg Ile Leu Met Phe Cys Lys Val Pro Leu 225 230 235 240 Ala Leu Ala His Ser Thr Leu Lys Ala Leu Lys Ser Gly Lys Glu Lys 245 250 255 Met Ser Arg Val Glu Val Glu Gly Ile Val Glu Gln Leu Lys Lys Glu 260 265 270 Glu Arg Leu Ser 275 <210> 5 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for squalene synthase <400> 5 taagcagagc tcatgagcaa agtttcgaat ttaca 35 <210> 6 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer for squalene synthase <400> 6 taagcaaagc ttttaactta aacgttcttc tttttttaat t 41

Claims

서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 스쿠알렌 합성용 효소.
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서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 스쿠알렌 합성용 효소를 코딩하는 핵산 분자를 포함하는 재조합 벡터.
서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 스쿠알렌 합성용 효소를 코딩하는 핵산 분자를 포함하는 재조합 벡터에 의해 형질전환된 대장균.
서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 스쿠알렌 합성용 효소를 코딩하는 핵산 분자를 포함하는 재조합 벡터에 의해 형질전환된 대장균을 배양하는 단계를 포함하는 스쿠알렌 제조방법.
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