KR101501703B1

KR101501703B1 - 코리네박테리움 속 미생물의 내산성, 발효 생산성 또는 내산성과 발효 생산성을 증가시키는 방법

Info

Publication number: KR101501703B1
Application number: KR1020130048284A
Authority: KR
Inventors: 조영일; 박준석; 한재춘; 와찌 마사키
Original assignee: 대상 주식회사; 고쿠리츠다이가쿠호진 토쿄고교 다이가꾸
Priority date: 2013-04-30
Filing date: 2013-04-30
Publication date: 2015-03-11
Also published as: KR20140129685A

Abstract

본 발명은 (a) (i-1) 글루타메이트 디카복실라아제(glutamate decarboxylase)를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열 및 (i-2) 글루타메이트:감마-아미노부티르산 안티포터(glutamate:GABA antiporter)를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 재조합 벡터, 또는 (ii) 라이신 디카복실라아제(lysine decarboxylase) 및 라이신:카다베린 안티포터(lysine:cadaverine antiporter)를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 재조합 벡터를 제작하는 단계; 및 (b) 상기 재조합 벡터를 코리네박테리움 속 미생물에 형질전환시켜 내산성, 발효 생산성 또는 내산성과 발효 생산성을 증가시키는 단계를 포함하는 코리네박테리움 속(Corynebacterium sp.) 미생물의 내산성, 발효 생산성 또는 내산성과 발효 생산성을 증가시키는 방법에 관한 것이다. 본 발명에 따르면, 모균주보다 코리네박테리움 속 미생물의 내산성, 발효 생산성 또는 내산성과 발효 생산성을 현저하게 증가시키는 효과가 있다. 또한, 본 발명의 방법에 의하여 코리네박테리움 속 미생물의 내산성, 발효 생산성 또는 내산성과 발효 생산성을 증가시키는 경우, 코리네박테리움 속 미생물 배양 및 발효를 위한 중성조건 유지를 위하여 별도의 염기성 물질을 첨가하는 과정이 불필요하고, 이후 발효산물의 정제를 위한 산 물질의 사용 역시 불필요하게 되어 발효산물의 생산원가를 절감할 수 있는 이점이 있다.

Description

코리네박테리움 속 미생물의 내산성, 발효 생산성 또는 내산성과 발효 생산성을 증가시키는 방법{Method for Increasing Acid Tolerance and/or Fermentation Productivity of Corynebacterium sp. Microorganism}

본 발명은 코리네박테리움 속(Corynebacterium sp.) 미생물의 내산성, 발효 생산성 또는 내산성과 발효 생산성을 증가시키는 방법에 관한 것이다.

아미노산을 비롯한 많은 목적산물 발효에서 발효 중 pH가 산성으로 되는 것을 막기 위해 암모니아와 같은 알칼리성 물질을 사용하는데, 이의 절감을 위해 내산성을 가진 판토에아 아나나티스(Pantoea ananatis)로부터 글루탐산 생산이 가능하도록 한 바가 보고되어 있다(국제공개특허 제 2004/099426호).

대장균(Escherichia coli)에서 gad 및 cad 유전자가 산 내성 관련 유전자임이 밝혀져 있고(Marie-Pierre Castanie-Cornet et al., Journal of Bacteriology, 181(11):3525-3535(1999)), 이 gad 유전자는 리스테리아 모노사이토게네스(Listeria monocytogenes)에서도 산 내성에 기여하며(Kimon-Andreas G. Karatzas et al., Appl Environ Microbiol., 78(10):3571-9(2012)), 사카로마이세스 세레비지아에(Saccharomyces cerevisiae)에 gadB를 도입하여 산화 스트레스 내성(oxidative stress tolerance)을 부여함이 보고되어 있다(Coleman, S. T. et al., J Biol Chem., 276(1):244-50(2001)). 또한 엔테로박테리아세아에(Enterobacteriaceae)에 gad 유전자의 발현을 강화시킴으로써 라이신 또는 쓰레오닌의 생산성을 증가시켰다는 보고도 있다(국제공개특허 제 2008/044453호).

코리네박테리움(Corynebacterium), 특히 코리네박테리움 글루타미쿰 (Corynebacterium glutamicum)과 코리네박테리움 암모니아게네스(Corynebacterium ammoniagenes)는 L-아미노산 및 핵산 생산에 많이 이용되고 있는 그람 양성의 미생물이다.

코리네박테리움 균주에 gad 유전자를 도입하면 GABA 생산이 가능함이 보고되어 있으며(국제공개특허 제 2009/103547호), 코리네박테리움 글루타미쿰에 cadA 도입하면 카다베린(cadaverine)을 생성시킬 수 있음이 보고된 바 있다(Kind S et al., Metab Eng., 12(4):341-51(2010)).

그러나 아직 코리네박테리움 균주에 gad 또는 cad 시스템을 도입하여 내산성을 증가시켰다는 보고는 없으며, 코리네박테리움 균주에서 증가된 내산성을 이용하여 산성 조건에서의 발효를 한 예도 없다.

본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허 문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.

본 발명자들은 발효산물(fermentation product)을 생산하는 코리네박테리움 속 미생물에 있어 내산성 및/또는 발효 생산성을 향상시키기 위한 방법을 개발하고자 예의 연구 노력하였다. 그 결과, (i-1) 글루타메이트 디카복실라아제를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열 및 (i-2) 글루타메이트:감마-아미노부티르산 안티포터를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 재조합 벡터, 또는 (ii) 라이신 디카복실라아제 및 라이신:카다베린 안티포터를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 재조합 벡터로 코리네박테리움 속 균주를 형질전환시키는 경우 코리네박테리움 속 미생물의 내산성 및/또는 발효 생산성을 증가시킬 수 있다는 사실을 확인함으로써, 본 발명을 완성하게 되었다.

따라서 본 발명의 목적은 코리네박테리움 속(Corynebacterium sp.) 미생물의 내산성 및/또는 발효 생산성을 증가시키는 방법을 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적은 본 발명의 방법에 의하여 내산성 및/또는 발효 생산성이 증가된 형질전환 코리네박테리움 속 균주를 이용하여 발효산물을 생산하는 방법을 제공하는 데 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 라이신 디카복실라아제 및 라이신:카다베린 안티포터를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 재조합 벡터로 형질전환 되어 있고 모균주와 비교하여 내산성이 증가된 형질전환된 코리네박테리움 속 균주를 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.

본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 (a) (i-1) 글루타메이트 디카복실라아제(glutamate decarboxylase)를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열 및 (i-2) 글루타메이트:감마-아미노부티르산 안티포터(glutamate:GABA antiporter)를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 재조합 벡터, 또는 (ii) 라이신 디카복실라아제(lysine decarboxylase) 및 라이신:카다베린 안티포터(lysine:cadaverine antiporter)를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 재조합 벡터를 제작하는 단계; 및 (b) 상기 재조합 벡터를 코리네박테리움 속 미생물에 형질전환시켜 내산성, 발효 생산성 또는 내산성과 발효 생산성을 증가시키는 단계를 포함하는 코리네박테리움 속(Corynebacterium sp.) 미생물의 내산성, 발효 생산성 또는 내산성과 발효 생산성을 증가시키는 방법을 제공한다.

본 발명자들은 발효산물(fermentation product)을 생산하는 코리네박테리움 속 미생물에 있어 내산성 및/또는 발효 생산성을 향상시키기 위한 방법을 개발하고자 예의 연구 노력하였다. 그 결과, (i-1) 글루타메이트 디카복실라아제를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열 및 (i-2) 글루타메이트:감마-아미노부티르산 안티포터를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 재조합 벡터, 또는 (ii) 라이신 디카복실라아제 및 라이신:카다베린 안티포터를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 재조합 벡터로 코리네박테리움 속 균주를 형질전환시키는 경우 코리네박테리움 속 미생물의 내산성 및/또는 발효 생산성을 증가시킬 수 있다는 사실을 확인하였다.

본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명의 코리네박테리움 속 균주는 코리네박테리움 그라눌로숨(Corynebacterium granulosum), 코리네박테리움 글루쿠로노리티쿰(Corynebacterium glucuronolyticum), 코리네박테리움 글루타미쿰(Corynebacterium glutamicum), 코리네박테리 글리시노필룸(Coynebacterium glycinophilum), 코리네박테리움 디프테리애 (Corynebacterium diphtheriae), 코리네박테리움 릴리움(Corynebacterium lilium), 코리네박테리움 레나레(Corynebacterium renale), 코리네박테리움 멜라쎄콜라(Corynebacterium melassecola), 코리네박테리움 마트루코티이 (Corynebacterium matruchotii), 코리네박테리움 맥긴레이(Corynebacterium macginleyi), 코리네박테리움 미누티시멈(Corynebacterium minutissimum), 코리네박테리움 보비스(Corynebacterium bovis), 코리네박테리움 써모아미노게네스(Corynebacterium thermoaminogenes), 코리네박테리움 슈도디프테리티쿰(코리네박테리움 호프마니이)[Corynebacterium pseudodiphtheriticum(Corynebacterium hofmannii)], 코리네박테리움 슈도투베르큘로시스(Corynebacterium pseudotuberculosis), 코리네박테리움 스펙(Corynebacterium spec), 코리네박테리움 스트리아텀(Corynebacterium striatum), 코리네박테리움 아미콜라텀(Corynebacterium amycolatum), 코리네박테리움 아세토액시도필럼(Corynebacterium acetoacidophilum), 코리네박테리움 아세토글루타미쿰(Corynebacterium acetoglutamicum), 코리네박테리움 아콜렌스(Corynebacterium accolens), 코리네박테리움 아쿠아티컴(Corynebacterium aquaticum), 코리네박테리움 아퍼멘탄스(Corynebacterium afermentans), 코리네박테리움 아우리스(Corynebacterium auris), 코리네박테리움 알젠토라텐스(Corynebacterium argentoratense), 코리네박테리움 알카노리티쿰(Corynebacterium alkanolyticum), 코리네박테리움 암모니아게네스 (Corynebacterium ammoniagenes), 코리네박테리움 에피시엔스(Corynebacterium efficiens), 코리네박테리움 오비스(Corynebacterium ovis), 코리네박테리움 우리아리티쿰(Corynebacterium urealyticum), 코리네박테리움 울세란스(Corynebacterium ulcerans), 코리네박테리움 제로시스(Corynebacterium xerosis), 코리네박테리움 제이키움(Corynebacterium jeikeium), 코리네박테리움 칼루내(Corynebacterium callunae), 코리네박테리움 테누이스(Corynebacterium tenuis), 코리네박테리움 파리움(Corynebacterium parvum), 코리네박테리움 프로피큠(Corynebacterium propinquum), 코리네박테리움 플라베센스(Corynebacterium flavescens), 코리네박테리움 피오게네스(Corynebacterium pyogenes), 코리네박테리움 할로피티카(Corynebacterium halofytica), 코리네박테리움 해모리티쿰(Corynebacterium haemolyticum) 또는 코리네박테리움 헤르쿨리스(Corynebacterium herculis)이다.

본 발명의 다른 구현예에 따르면, 본 발명의 코리네박테리움 속 균주는 코리네박테리움 글루타미쿰(Corynebacterium glutamicum), 코리네박테리 글리시노필룸(Coynebacterium glycinophilum), 코리네박테리움 디프테리애 (Corynebacterium diphtheriae), 코리네박테리움 릴리움(Corynebacterium lilium), 코리네박테리움 멜라쎄콜라(Corynebacterium melassecola), 코리네박테리움 써모아미노게네스(Corynebacterium thermoaminogenes),코리네박테리움 아세토액시도필럼(Corynebacterium acetoacidophilum), 코리네박테리움 아세토글루타미쿰(Corynebacterium acetoglutamicum), 코리네박테리움 알카노리티쿰(Corynebacterium alkanolyticum), 코리네박테리움 암모니아게네스 (Corynebacterium ammoniagenes), 코리네박테리움 에피시엔스(Corynebacterium efficiens), 코리네박테리움 제이키움 (Corynebacterium jeikeium), 코리네박테리움 칼루내(Corynebacterium callunae) 또는 코리네박테리움 헤르쿨리스(Corynebacterium herculis)이다.

본 발명의 특정 구현예에 따르면, 본 발명의 코리네박테리움 속 균주는 코리네박테리움 글루타미쿰(Corynebacterium glutamicum) 또는 코리네박테리움 암모니아게네스(Corynebacterium ammoniagenes)이다.

본 명세서의 용어 "내산성"은 당업계의 통상적인 배지보다 산성 조건의 배지에서 모균주(parent strain)와 비교한 미생물의 상대 생존율을 의미한다.

본 명세서의 용어 "생존율"은 통상의 배지를 산성조건으로 만든 직후의 배양액을 카나마이신이 들어 있는 한천 배지에 도말하고 통상의 방법으로 배양한 경우 상기 한천 배지에 올라온 콜로니의 수(이하, 처리 전 생존균 수)에서, 통상의 배지를 산성조건으로 만든 후 통상의 종균배양 및 진탕배양한 배양액을 카나마이신이 들어 있는 한천 배지에 도말하여 통상의 방법으로 배양한 경우 상기 한천 배지에 올라온 콜로니의 수(이하, 처리 후 생존균 수)를 뺀 후, 이를 처리 전 생존균 수로 나눈 값의 백분율을 의미한다.

본 명세서의 용어 "상대 생존율"은 상기 생존율(%)을 기준 생존율(%)로 나눈 값의 백분율을 의미한다. 상기 기준 생존율(%)은 대조군 균주를 상기 '생존율'의 측정 시와 동일한 방법으로 배양하되 산성조건 대신 중성조건에서 얻은 생존율을 의미한다.

본 명세서의 용어 "발효 생산성"은 발효과정에 의하여 생산되는 발효산물(fermentation product)의 농도(g/L)를 의미한다.

본 명세서의 용어 "발효산물(fermentation product)"은 코리네박테리움 속 미생물의 발효과정에 의하여 생산되는 산물을 의미하며, 상기 "발효"는 탄소원 및 에너지원으로 사용된 포도당이 특정 물질로 전환되는 과정을 의미한다. 예컨대, 상기 발효는 배양하는 코리네박테리움 속 미생물의 종류에 따라 배지의 포도당이 감마-아미노부티르산, 아르기닌, 라이신 또는 5'-크산틸산으로 전환되는 과정을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.

본 발명의 방법을 각각의 단계 별로 상세하게 설명하면 다음과 같다:

단계 (a): 재조합 벡터를 제작하는 단계

본 발명에 따르면, 우선 (i-1) 글루타메이트 디카복실라아제를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열 및 (i-2) 글루타메이트:감마-아미노부티르산 안티포터를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 재조합 벡터, 또는 (ii) 라이신 디카복실라아제 및 라이신:카다베린 안티포터를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 재조합 벡터를 제작을 실시한다.

본 명세서에서 용어 "뉴클레오타이드"는 핵산 분자(예컨대, gDNA, cDNA 및 RNA 분자)의 기본 구성 단위를 의미하며, 본 발명의 뉴클레오타이드는 자연의 뉴클레오타이드뿐만 아니라, 당 또는 염기 부위가 변형된 유사체 (analogue)도 포함한다(Scheit, Nucleotide Analogs, John Wiley, New York(1980); Uhlman 및 Peyman, Chemical Reviews, 90:543-584(1990)).

본 발명의 글루타메이트 디카복실라아제, 글루타메이트:감마-아미노부티르산 안티포터, 라이신 디카복실라아제 및 라이신:카다베린 안티포터는 상기 효소 및 안티포터가 활성을 갖는 범위에서 첨부한 서열목록에 기재된 뉴클레오타이드 서열에 한정되지 않는다는 것은 당업자에게 명확하다.

뉴클레오타이드에서의 변이는 단백질에서 변화를 가져오지 않는 것도 있다. 이러한 핵산은 기능적으로 균등한 코돈 또는 동일한 아미노산을 코딩하는 코돈(예를 들어, 코돈의 축퇴성에 의해, 아르기닌 또는 세린에 대한 코돈은 여섯 개이다), 또는 생물학적으로 균등한 아미노산을 코딩하는 코돈을 포함하는 핵산분자를 포함한다.

또한, 뉴클레오타이드에서의 변이가 본 발명의 글루타메이트 디카복실라아제, 글루타메이트:감마-아미노부티르산 안티포터, 라이신 디카복실라아제 및 라이신:카다베린 안티포터 자체에 변화를 가져올 수도 있다. 글루타메이트 디카복실라아제, 글루타메이트:감마-아미노부티르산 안티포터, 라이신 디카복실라아제 및 라이신:카다베린 안티포터의 아미노산에 변화를 가져오는 변이인 경우에도 본 발명의 글루타메이트 디카복실라아제, 글루타메이트:감마-아미노부티르산 안티포터, 라이신 디카복실라아제 및 라이신:카다베린 안티포터와 거의 동일한 활성을 나타내는 것이 얻어질 수 있다.

본 발명의 글루타메이트 디카복실라아제, 글루타메이트:감마-아미노부티르산 안티포터, 라이신 디카복실라아제 및 라이신:카다베린 안티포터에 포함될 수 있는 생물학적 기능 균등물은 본 발명의 글루타메이트 디카복실라아제, 글루타메이트:감마-아미노부티르산 안티포터, 라이신 디카복실라아제 및 라이신:카다베린 안티포터와 균등한 생물학적 활성을 발휘하는 아미노산 서열의 변이에 한정될 것이라는 것은 당업자에게 명확하다.

이러한 아미노산 변이는 아미노산 곁사슬 치환체의 상대적 유사성, 예컨대, 소수성, 친수성, 전하, 크기 등에 기초하여 이루어진다. 아미노산 곁사슬 치환체의 크기, 모양 및 종류에 대한 분석에 의하여, 아르기닌, 라이신과 히스티딘은 모두 양전하를 띤 잔기이고; 알라닌, 글라이신과 세린은 유사한 크기를 갖으며; 페닐알라닌, 트립토판과 타이로신은 유사한 모양을 갖는다는 것을 알 수 있다. 따라서, 이러한 고려 사항에 기초하여, 아르기닌, 라이신과 히스티딘; 알라닌, 글라이신과 세린; 그리고 페닐알라닌, 트립토판과 타이로신은 생물학적으로 기능 균등물이라 할 수 있다.

변이를 도입하는 데 있어서, 아미노산의 소수성 인덱스(hydropathic idex)가 고려될 수 있다. 각각의 아미노산은 소수성과 전하에 따라 소수성 인덱스가 부여되어 있다: 아이소루이신(+4.5); 발린(+4.2); 루이신(+3.8); 페닐알라닌(+2.8); 시스테인/시스타인(+2.5); 메티오닌(+1.9); 알라닌(+1.8); 글라이신(-0.4); 쓰레오닌(-0.7); 세린(-0.8); 트립토판(-0.9); 타이로신(-1.3); 프롤린(-1.6); 히스티딘(-3.2); 글루타메이트(-3.5); 글루타민(-3.5); 아스파르테이트(-3.5); 아스파라긴(-3.5); 라이신(-3.9); 및 아르기닌(-4.5).

단백질의 상호적인 생물학적 기능(interactive biological function)을 부여하는 데 있어서 소수성 아미노산 인덱스는 매우 중요하다. 유사한 소수성 인덱스를 가지는 아미노산으로 치환하여야 유사한 생물학적 활성을 보유할 수 있다는 것은 공지된 사실이다. 소수성 인덱스를 참조하여 변이를 도입시키는 경우, 바람직하게는 ±2 이내, 보다 바람직하게는 ±1 이내, 보다 더 바람직하게는 ±0.5 이내의 소수성 인덱스 차이를 나타내는 아미노산 사이에 치환을 한다.

한편, 유사한 친수성 값(hydrophilicity value)을 가지는 아미노산 사이의 치환이 균등한 생물학적 활성을 갖는 단백질을 초래한다는 것도 잘 알려져 있다. 미국 특허 제4,554,101호에 개시된 바와 같이, 다음의 친수성 값이 각각의 아미노산 잔기에 부여되어 있다: 아르기닌(+3.0); 라이신(+3.0); 아스팔테이트(+3.0± 1); 글루타메이트(+3.0±1); 세린(+0.3); 아스파라긴(+0.2); 글루타민(+0.2); 글라이신(0); 쓰레오닌(-0.4); 프롤린(-0.5±1); 알라닌(-0.5); 히스티딘(-0.5); 시스테인(-1.0); 메티오닌(-1.3); 발린(-1.5); 루이신(-1.8); 아이소루이신(-1.8); 타이로신(-2.3); 페닐알라닌(-2.5); 트립토판(-3.4).

친수성 값을 참조하여 변이를 도입시키는 경우, 바람직하게는 ±2 이내, 보다 바람직하게는 ±1 이내, 보다 더 바람직하게는 ±0.5 이내의 친수성 값 차이를 나타내는 아미노산 사이에 치환을 한다.

분자의 활성을 전체적으로 변경시키지 않는 단백질에서의 아미노산 교환은 당해 분야에 공지되어 있다(H. Neurath, R.L.Hill, The Proteins, Academic Press, New York, 1979). 가장 통상적으로 일어나는 교환은 아미노산 잔기 Ala/Ser, Val/Ile, Asp/Glu, Thr/Ser, Ala/Gly, Ala/Thr, Ser/Asn, Ala/Val, Ser/Gly, Thr/Phe, Ala/Pro, Lys/Arg, Asp/Asn, Leu/Ile, Leu/Val, Ala/Glu, Asp/Gly 간의 교환이다.

상술한 생물학적 균등 활성을 갖는 변이를 고려한다면, 본 발명의 글루타메이트 디카복실라아제, 글루타메이트:감마-아미노부티르산 안티포터, 라이신 디카복실라아제 및 라이신:카다베린 안티포터 또는 이를 코딩하는 뉴클레오타이드는 서열목록에 기재된 서열과 실질적인 동일성(substantial identity)을 나타내는 서열도 포함하는 것으로 해석된다. 상기의 실질적인 동일성은, 상기한 본 발명의 서열과 임의의 다른 서열을 최대한 대응되도록 얼라인하고, 당업계에서 통상적으로 이용되는 알고리즘을 이용하여 얼라인된 서열을 분석한 경우에, 예컨대 최소 99%의 상동성을 나타내는 서열을 의미한다. 서열비교를 위한 얼라인먼트 방법은 당업계에 공지되어 있다. 얼라인먼트에 대한 다양한 방법 및 알고리즘은 Smith and Waterman, Adv. Appl. Math. 2:482(1981); Needleman and Wunsch, J. Mol. Bio. 48:443(1970); Pearson and Lipman, Methods in Mol. Biol. 24: 307-31(1988); Higgins and Sharp, Gene 73:237-44(1988); Higgins and Sharp, CABIOS 5:151-3 (1989); Corpet et al., Nuc. Acids Res. 16:10881-90(1988); Huang et al., Comp. Appl. BioSci. 8:155-65(1992) and Pearson et al., Meth. Mol. Biol. 24:307-31(1994)에 개시되어 있다. NCBI Basic Local Alignment Search Tool (BLAST)(Altschul et al., J. Mol . Biol . 215:403-10(1990))은 NBCI(National Center for Biological Information) 등에서 접근 가능하며, 인터넷 상에서 blastp, blasm, blastx, tblastn and tblastx와 같은 서열 분석 프로그램과 연동되어 이용할 수 있다. BLSAT는 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/에서 접속 가능하다. 이 프로그램을 이용한 서열 상동성 비교 방법은 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/blast_help.html에서 확인할 수 있다.

본 발명의 일 구현예에 따르면, (a) 본 발명의 글루타메이트 디카복실라아제는 박테리아로부터 유래된 GadA 또는 GadB이고; (b) 본 발명의 글루타메이트:감마-아미노부티르산 안티포터는 박테리아로부터 유래된 GadC이며; (c) 본 발명의 라이신 디카복실라아제는 박테리아로부터 유래된 CadA 이고; 그리고 본 발명의 라이신:카다베린 안티포터는 박테리아로부터 유래된 CadB이다. 본 발명의 특정 구현예에 따르면, 상기 박테리아는 대장균(Escherichia coli)이다. 상기 박테리아가 대장균인 경우 상기 GadA의 아미노산 서열은 서열목록 제3서열이고, GadB의 아미노산 서열은 서열목록 제1서열이며, GadC의 아미노산 서열은 서열목록 제5서열이고, CadA의 아미노산 서열은 서열목록 제9서열이며, CadB의 아미노산 서열은 서열목록 제11서열이다.

본 발명의 일 구현예에 따르면, (a) 본 발명의 글루타메이트 디카복실라아제를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열은 서열목록 제2서열 또는 서열목록 제4서열을 포함하고; (b) 본 발명의 글루타메이트:감마-아미노부티르산 안티포터를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열은 서열목록 제6서열을 포함하며; (c) 본 발명의 라이신 디카복실라아제를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열은 서열목록 제10서열을 포함하고; 그리고 (d) 본 발명의 라이신:카다베린 안티포터를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열은 서열목록 제12서열을 포함한다.

본 발명의 벡터 시스템은 당업계에 공지된 다양한 방법을 통해 구축될 수 있으며, 이에 대한 구체적인 방법은 Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press(2001)에 개시되어 있으며, 이 문헌은 본 명세서에 참조로서 삽입된다.

본 발명의 벡터는 전형적으로 클로닝을 위한 벡터 또는 발현을 위한 벡터로서 코리네박테리움 속 균주를 숙주로 하여 구축된다.

한편, 본 발명에 이용될 수 있는 벡터는 당업계에서 종종 사용되는 플라스미드 (예: pSC101, ColE1, pBR322, pUC8/9, pHC79, pUC19, pET 및 pECt 등), 파지(예: λgt4·λB, λ-Charon, λΔz1 및 M13 등) 또는 바이러스(예: SV40 등)를 조작하여 제작될 수 있다.

한편, 본 발명의 벡터는 선택표지로서, 당업계에서 통상적으로 이용되는 항생제 내성 유전자를 포함하며, 예를 들어 암피실린, 겐타마이신, 카베니실린, 클로람페니콜, 스트렙토마이신, 카나마이신, 게네티신, 네오마이신 및 테트라사이클린에 대한 내성 유전자가 있다. 본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 항생제 내성 유전자는 카나마이신이다.

본 발명의 벡터를 코리네박테리움 속 균주 내로 운반하는 방법은, CaCl₂ 방법(Cohen, S.N. et al., Proc. Natl. Acac. Sci. USA, 9:2110-2114(1973)), 하나한 방법(Cohen, S.N. et al., Proc . Natl . Acac . Sci . USA, 9:2110-2114(1973); 및 Hanahan, D., J. Mol . Biol ., 166:557-580(1983)) 및 전기 천공 방법(Dower, W.J. et al., Nucleic. Acids Res., 16:6127-6145(1988)) 등에 의해 실시될 수 있다. 본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 벡터를 코리네박테리움 속 균주 내로 운반하는 방법은 전기 천공 방법이다.

단계 (b): 재조합 벡터를 코리네박테리움 속 미생물에 형질전환시켜 내산성, 발효 생산성 또는 내산성과 발효 생산성을 증가시키는 단계

단계 (a) 실시 이후, 단계 (a)의 결과물인 재조합 벡터를 코리네박테리움 속 미생물에 형질전환시켜 내산성, 발효 생산성 또는 내산성과 발효 생산성을 증가시키는 단계를 실시한다.

본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명의 발효 생산성은 감마-아미노부티르산(GABA), 아르기닌, 5'-크산틸산 또는 이들 모두에 대한 발효 생산성이다.

본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명의 단계 (b)의 내산성은 pH 3.5-6.4 산성조건 배지에서 모균주(parent strain)와 비교하여 상대 생존율을 50-1000% 증가시키는 것이다.

본 발명의 다른 구현예에 따르면, 상기 산성조건 배지는 pH 3.8-6.4, pH 4.0-6.4, pH 4.2-6.4, pH 4.4-6.4 또는 pH 4.4-6.4이다.

본 발명의 다른 구현예에 따르면, 본 발명의 상기 산성조건 배지는 내산성만을 증가시킨 경우 pH 3.5-5.5, pH 4.0-5.5, pH 4.0-5.0, pH 4.2-4.8 또는 pH 4.4-4.6이다.

본 발명의 다른 구현예에 따르면, 상기 상대 생존율은 30-900%, 30-800%, 30-700%, 30-700%, 30-650%, 30-620% 또는 50-620% 증가시킨 것이다.

본 발명의 다른 구현예에 따르면, 본 발명의 재조합 벡터가 글루타메이트 디카복실라아제를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열 및 글루타메이트:감마-아미노부티르산 안티포터를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 경우, 상기 상대 생존율은 150-1000%, 150-900%, 150-800%, 200-800%, 200-700%, 200-650%, 250-650% 또는 250-620% 증가시킨 것이다.

본 발명의 다른 구현예에 따르면, 본 발명의 재조합 벡터가 라이신 디카복실라아제(lysine decarboxylase) 및 라이신:카다베린 안티포터(lysine: cadaverine antiporter)를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 경우, 상기 상대 생존율은 30-300%, 30-250%, 30-200%, 30-150% 또는 50-150%증가시킨 것이다.

본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명의 단계 (b)의 발효 생산성은 pH 3.5-6.4 산성조건 배지에서 모균주와 비교하여 발효산물(fermentation product) 농도를 5% 이상 증가시킨 것이다.

본 발명의 다른 구현예에 따르면, 상기 산성조건 배지는 pH 3.8-6.4, pH 4.0-6.4, pH 4.2-6.4 또는 pH 4.4-6.4이다.

본 발명의 다른 구현예에 따르면, 본 발명의 상기 산성조건 배지는 발효 생산성만을 증가시킨 경우 pH 4.0-6.4, pH 4.2-6.4 또는 pH 4.5-6.4이다.

본 발명의 다른 구현예에 따르면, 상기 발효산물 농도는 7%, 10%, 20%, 30% 또는 40% 이상 증가시킨 것이다.

본 발명의 다른 구현예에 따르면, 상기 발효산물 농도는 5-120000%, 7-120000%, 10-120000%, 20-120000%, 30-120000% 또는 40-120000% 증가시킨 것이다.

본 발명의 다른 구현예에 따르면, 상기 발효산물 농도는 발효산물이 감마-아미노부티르산인 경우 3000-120000%, 2800-120000%, 2800-118000%, 2800-115000% 또는 2500-115000% 증가시킨 것이다.

본 발명의 다른 구현예에 따르면, 상기 발효산물 농도는 발효산물이 아르기닌인 경우 5-150%, 7-150%, 10-150 %, 10-120%, 30-120%. 30-100% 또는 50-100% 증가시킨 것이다.

본 발명의 다른 구현예에 따르면, 상기 발효산물 농도는 발효산물이 5'-크산틸산인 경우 5-150%, 5-120%, 5-100%. 5-70%, 7-70%, 7-50% 또는 10-50% 증가시킨 것이다. 본 발명의 어떠한 구현예에 따르면, 상기 발효산물 농도는 발효산물이 5'-크산틸산인 경우 10-100%, 10-70%, 20-70%, 30-70% 또는 40-60% 증가시킨 것이다. 본 발명의 특정 구현예에 따르면, 상기 발효산물 농도는 발효산물이 5'-크산틸산인 경우 5-30%, 5-20%, 5-15%, 7-15% 또는 7-12% 증가시킨 것이다.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 본 발명의 코리네박테리움 속(Corynebacterium sp.) 미생물의 내산성, 발효 생산성 또는 내산성과 발효 생산성을 증가시키는 방법에 따라 내산성, 발효 생산성 또는 내산성과 발효 생산성이 증가된 형질전환 코리네박테리움 속 균주를 pH 3.5-6.4 산성조건 배지에서 배양하는 단계를 포함하는 발효산물의 생산방법을 제공한다.

본 발명에서 이용되는 배지는 당업계의 통상의 종균 배양 또는 진탕 배양에 이용되는 어떠한 배지도 포함한다. 예컨대, 상기 배지는 L 배지(폴리펩톤 5-15 g/L, 건조 효모 추출물 2-10 g/L, 염화나트륨 3-8 g/L, 포도당 0.5-1.5 g/L, 5 N 수산화나트륨 1.0-2.0 ml/L)를 포함하나 이에 한정되지 않는다.

본 발명에 천연배지 또는 합성배지를 사용할 수 있으며, 배지의 탄소원으로는 예를 들어, 글루코오스, 수크로오스, 덱스트린, 글리세롤, 녹말 등이 사용될 수 있고, 질소원으로는 펩톤, 육류 추출물, 효모 추출물, 건조된 효모, 대두 케이크, 우레아, 티오우레아, 암모늄염, 나이트레이트 및 기타 유기 또는 무기 질소-함유 화합물이 사용될 수 있으나, 이러한 성분에 한정되는 것은 아니다.

배지에 포함되는 무기염으로는 마그네슘, 망간, 포타슘, 칼슘, 철 등의 포스페이트, 나이트레이트, 카보네이트, 클로라이드 등이 사용될 수 있으나, 이들에 한정되는 것은 아니다.

상기 탄소원, 질소원 및 무기염의 성분 이외에 아미노산, 비타민, 핵산 및 그와 관련된 화합물들이 배지에 첨가될 수 있다.

본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 산성조건 배지는 pH 3.8-6.4, pH 4.0-6.4, pH 4.2-6.4, pH 4.4-6.4 또는 pH 4.4-6.4이다.

본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명의 상기 산성조건 배지는 내산성만이 증가한 경우 pH 3.5-5.5, pH 4.0-5.5, pH 4.0-5.0, pH 4.2-4.8 또는 pH 4.4-4.6이다.

본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명의 상기 산성조건 배지는 발효 생산성만이 증가한 경우 pH 4.0-6.4, pH 4.2-6.4 또는 pH 4.5-6.4이다.

본 발명의 배양은 코리네박테리움 속 미생물의 전배양 및 종배양이 포함되며, 공지된 배양 방법에 의해 배양할 수 있다.

본 발명의 생산방법은 상술한 코리네박테리움 속 미생물의 내산성, 발효 생산성 또는 내산성과 발효 생산성을 증가시키는 방법과 형질전환 코리네박테리움 속 균주를 공통으로 하는바, 클로닝 또는 발현을 위한 벡터, 숙주인 코리네박테리움 속 균주, 배지 및 발효산물 등을 공통으로 하기 때문에, 이 둘 사이의 공통된 내용은 본 명세서의 과도한 복잡성을 피하기 위하여 그 기재를 생략한다.

본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 라이신 디카복실라아제 및 라이신:카다베린 안티포터를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 재조합 벡터로 형질전환 되어 있고 모균주와 비교하여 내산성이 증가된 형질전환된 코리네박테리움 속 균주를 제공한다.

본 발명의 일 구현예에 따르면, (a) 본 발명의 라이신 디카복실라아제는 박테리아로부터 유래된 CadA이고, (b) 본 발명의 라이신:카다베린 안티포터는 박테리아로부터 유래된 CadB이다. 본 발명의 다른 구현예에 따르면, 상기 박테리아는 대장균(Escherichia coli)이다.

본 발명의 형질전환된 코리네박테리움 속 균주는 상술한 코리네박테리움 속 미생물의 내산성, 발효 생산성 또는 내산성과 발효 생산성을 증가시키는 방법과 클로닝 또는 발현을 위한 벡터, 숙주인 코리네박테리움 속 균주를 공통으로 하고, 모균주와 비교하여 내산성이 증가하기 때문에, 이 둘 사이의 공통된 내용은 본 명세서의 과도한 복잡성을 피하기 위하여 그 기재를 생략한다.

본 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다:

(a) 본 발명은 코리네박테리움 속 미생물의 내산성, 발효 생산성 또는 내산성과 발효 생산성을 증가시키는 방법을 제공한다.

(b) 본 발명은 본 발명의 코리네박테리움 속 미생물의 내산성, 발효 생산성 또는 내산성과 발효 생산성을 증가시키는 방법에 따라 형질전환 코리네박테리움 속 균주를 pH 3.5-6.2 산성조건 배지에서 배양하는 단계를 포함하는 발효산물의 생산방법을 제공한다.

(c) 본 발명은 라이신 디카복실라아제 및 라이신:카다베린 안티포터를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 재조합 벡터로 형질전환 되어 있고 모균주와 비교하여 내산성이 증가된 형질전환된 코리네박테리움 속 균주을 제공한다.

(d) 본 발명은 모균주보다 코리네박테리움 속 미생물의 내산성, 발효 생산성 또는 내산성과 발효 생산성을 현저하게 증가시키는 효과가 있다.

(e) 본 발명의 방법에 의하여 코리네박테리움 속 미생물의 내산성, 발효 생산성 또는 내산성과 발효 생산성을 증가시키는 경우, 코리네박테리움 속 미생물 배양 및 발효를 위한 중성조건 유지를 위하여 별도의 염기성 물질을 첨가하는 과정이 불필요하고, 이후 발효산물의 정제를 위한 산 물질의 사용 역시 불필요하게 되어 발효산물의 생산원가를 절감할 수 있는 이점이 있다.

도 1은 글루타메이트 디카복실라아제를 코딩하는 gadB 유전자 및 글루타메이트:감마-아미노부티르산 안티포터를 코딩하는 gadC 유전자를 발현하는 벡터 pECt-gadBC의 모식도를 나타낸다.
도 2은 라이신 디카복실라아제를 코딩하는 cadA 유전자 및 라이신:카다베린 안티포터를 코딩하는 cadB 유전자를 발현하는 벡터 pECt-cadBA의 모식도를 나타낸다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.

실시예

본 명세서 전체에 걸쳐, 특정 물질의 농도를 나타내기 위하여 사용되는 "%"는 별도의 언급이 없는 경우, 고체/고체는 (중량/중량) %, 고체/액체는 (중량/부피) %, 그리고 액체/액체는 (부피/부피) %이다.

실시예 1: 대장균( Escherichia coli )으로부터 글루타메이트 디카복실라아제(glutamate decarboxylase, 서열목록 제1서열)를 코딩하는 gadB 유전자(서열목록 제2서열)와 글루타메이트:감마-아미노부티르산 안티포터(glutamate:GABA antiporter, 서열목록 제5서열)를 코딩하는 gadC 유전자(서열목록 제6서열)의 클로닝 및 발현 벡터 제조

유전자 gadB와 gadC의 오페론은 대장균 K12 MG1655 균주의 염색체를 주형으로 PCR법(중합효소 연쇄반응법)을 통하여 증폭하였다. 구체적으로, 하기 표 1의 프라이머 GF(서열목록 제7서열)와 GR(서열목록 제8서열)을 이용하여 98℃에서 10초 동안 변성, 55℃에서 5초 동안 어닐링, 72℃에서 3분 20초 동안 중합하는 조건을 30회 반복하는 PCR법을 통하여 3265 염기쌍의 단편을 증폭하였다. 중합효소는 PrimeStar DNA 폴리머라아제(TAKARA, 일본)를 사용하였다. 프라이머 GF는 제한효소 Sac I 부위를 가지고 있고, 프라이머 GR은 BamH I 부위를 가지고 있다.

얻어진 폴리뉴클레오티드에 제한효소 Sac I 및 BamH I을 처리하고, 대장균과 코리네속 균주에서 복제 가능한 셔틀벡터인 pECt 벡터의 Sac I 및 BamH I 자리 사이에 클로닝하여 대장균 JM109에 형질전환한 후, L Km 고체배지(L + kanamycin agar plate)에 도말하였다. 클로닝 된 벡터들을 얻어진 콜로니로부터 통상에 알려진 플라스미드 미니프렙법을 이용하여 획득하였고, 이를 pECt-gadBC로 명명하였다. 벡터에 대한 모식도는 도 1에 나타내었다.

실시예 2: gadBC 유전자 발현 벡터의 코리네박테리움 속 균주( Corynebacterium sp. )에의 도입

코리네박테리움 글루타미쿰 I6(Corynebacterium glutamicum I6)에 도입

실시예 1에서 얻은 pECt-gadBC 벡터를 글루타메이트 생산능이 있는 코리네박테리움 글루타미쿰 I6에 도입하였다. pECt-gadBC 벡터를 코리네박테리움 글루타미쿰 I6 내로 전기 천공 방법을 이용하여 도입시켰고 형질전환체를 카나마이신-내성에 근거하여 선별하였다. 당해 플라스미드의 존재를 확인한 후, pECt-gadBC 플라스미드를 함유하는 균주는 DS-AR-G1로 명명하고, 대조군 pECt 함유 균주는 DS-p1로 명명하였다.

코리네박테리움 글루타미쿰 KCTC 10423BP(Corynebacterium glutamicum KCTC 10423BP)에 도입

실시예 1에서 얻은 pECt-gadBC 벡터를 아르기닌 생산능이 있는 코리네박테리움 글루타미쿰 KCTC 10423BP에 도입하였다. pECt-gadBC 벡터를 코리네박테리움 글루타미쿰 KCTC 10423BP 내로 전기펄스법을 이용하여 도입시켰고 형질전환체를 카나마이신-내성에 근거하여 선별하였다. 당해 플라스미드의 존재를 확인한 후, pECt-gadBC 플라스미드를 함유하는 균주는 DS-AR-G2로 명명하고, 대조군 pECt 함유 균주는 DS-p2로 명명하였다.

코리네박테리움 암모니아게네스 DS24(Corynebacterium ammoniagenes DS24)에 도입

실시예 1에서 얻은 pECt-gadBC 벡터를 5'-크산틸산(5'-XMP) 생산능이 있는 코리네박테리움 암모니아게네스 DS24에 도입하였다. pECt-gadBC 벡터를 코리네박테리움 암모니아게네스 내로 전기펄스법을 이용하여 도입시켰고 형질전환체를 카나마이신-내성에 근거하여 선별하였다. 당해 플라스미드의 존재를 확인한 후, pECt-gadBC 플라스미드를 함유하는 균주는 DS-AR-G3로 명명하고, 대조군 pECt 함유 균주는 DS-p3로 명명하였다.

실시예 3 : gadBC 유전자 발현 균주의 산성 pH에서의 생존율 조사

pECt-gadBC 플라스미드를 함유하는 균주와 대조군 pECt 함유 균주의 산성 pH에서의 생존율을 비교 조사하였다.

L 배지(폴리펩톤 10 g/L, 건조 효모 추출물 5 g/L, 염화나트륨 5 g/L, 포도당 1 g/L, 5 N 수산화나트륨 1.5 ml/L) 5 ml을 유리 튜브에 분주하여 각 균주를 접종하고 30℃ 에서 300 rpm으로 18시간 진탕 배양하여 종균 배양액으로 하였다. 이 종균 배양액을 L 배지(폴리펩톤 11 g/L, 건조 효모 추출물 5.5 g/L, 염화나트륨 5.5 g/L, 포도당 1.1 g/L, 5 N 수산화나트륨 1.5 ml/L) 4.5 ml이 들어있는 유리 튜브에 100 μl 접종하여 30℃에서 300 rpm으로 24시간 진탕 배양한 후 pH 4.5 완충용액(HOMOPIPES 1 M) 0.5 ml과 글루타민산 농축액(최종 농도 10 mM)을 넣은 직후의 액을 '처리 전 배양액'으로 하였다. 이 기준 배양액을 30℃ 에서 300rpm으로 24시간 배양한 것을 '처리 후 배양액'으로 하였다. 이 '처리 전 배양액'과 '처리 후 배양액'을 멸균수에 희석한 후 카나마이신이 들어 있는 한천 배지에 도말하고 30℃에서 배양하여 올라온 콜로니 수를 측정하여 각각 '처리 전 생존균 수'와 '처리 후 생존균 수'로 함으로써 생존율을 계산하였다.

생존율(%) = (처리 전 생존균 수 - 처리 후 생존균 수) / 처리 전 생존균 수 x 100

대조군 pECt 함유 균주를 위와 동일한 방법으로 배양하되 pH 4.5 완충용액 대신 pH 7.0 완충용액(MOPS 1 M)을 사용해서 얻은 생존율을 '기준 생존율'로 하여 상대 생존율을 계산하였다.

상대 생존율(%) = 생존율(%) / 기준 생존율(%) x 100

그 결과 표 2과 같이 pECt-gadBC 플라스미드를 함유하는 균주 DS-AR-G1, DS-AR-G2, DS-AR-G3는 각각 그 대조군 pECt 함유 균주인 DS-p1, DS-p2, DS-p3에 비하여 산성 pH에서의 상대 생존율이 크게 증가하였다.

실시예 4 : DS-AR-G1 균주의 산성 pH에서의 GABA 생산 배양 실험

L 배지(폴리펩톤 10 g/L, 건조 효모 추출물 5 g/L, 염화나트륨 5 g/L, 포도당 1 g/L, 5 N 수산화나트륨 1.5 ml/L) 5 ml를 유리 튜브에 분주하여 DS-AR-G1과 DS-p1 균주를 각각 접종하고 30℃ 에서 300 rpm으로 18시간 진탕 배양하였다. 이 배양액을 P 배지 5 ml(포도당 80 g/L, 황산암모늄 30 g/L , 인산제1칼륨 1 g/L, 대두박 추출물 0.48 g/L, 황산마그네슘 0.4 g/L, 황산망간 10 mg/L, 황산철 10 mg/L, 티아민염 200 μg/L, 5 N 수산화나트륨 15 ml/L)과 바이오틴 5 μg/L가 들어있는 유리튜브에 50 μl를 접종하고 30℃ 에서 300 rpm으로 24시간 진탕 배양하여 종균 배양액으로 하였다. P 배지(포도당 80 g/L, 황산암모늄 30 g/L, 인산제1칼륨 1 g/L, 대두박 추출물 0.48 g/L, 황산마그네슘 0.4 g/L, 황산망간 10 mg/L, 황산철 10 mg/L, 티아민염 200 μg/L, 5 N 수산화나트륨 15 ml/L) 5 ml과 배양 pH조건을 다르게 하기 위해 탄산칼슘(CaCO₃) 5% 또는 2%가 들어있는 각 유리튜브에 종균 배양액 250 μl를 접종하고 30℃ 에서 300 rpm으로 96시간 진탕 배양하였다.

그 결과 표 3과 같이 pECt만을 함유하는 DS-p1에 비해 pECt-gadBC를 도입한 DS-AR-G1이 pH가 낮은 조건에서 GABA 생산이 크게 증가하였다.

실시예 5 : DS-AR-G2 균주의 산성 pH에서의 아르기닌 생산 배양 실험

종배지는 포도당 5%, 효모추출물 1.0%, 요소 0.3%, CSL(옥수수침지액) 0.5%, 펩톤 1.0%, 식염 0.25% 및 바이오틴 50 μg/L(pH 7.2를 5 N 가성소오다 용액을 이용하여 조절)를 포함하는 배지를 사용하였다.

발효배지는 포도당 10%, 염화암모늄 4.0%, 글구타민산 0.07%, 요소 0.3%, 제1인산칼륨 0.1%, 제2인산칼륨 0.1%, 황산마그네슘7수염 0.025%, CSL(옥수수침지액) 2.0% 및 바이오틴 50 μg/L(pH 7.2)를 5 N 가성소오다 용액을 이용하여 조절)를 포함하는 배지를 사용하였다.

상기 종배지 50 ml를 500 ml 진탕 플라스크에 분주하여 121℃에서 20분간 가압 살균한 후 DS-AR-G2와 DS-p2 각 균주를 접종하고 30℃에서 24시간 진탕배양하여 종균배양액으로 하였다. 발효배지를 탄산칼슘 0.6g 이 담겨져 121℃에서 20분간 가압 살균한 500 ml 플라스크에 30 ml를 분주하고 미리 준비한 종균 배양액 1 ml를 접종하여 30℃에서 40시간 왕복 진탕 배양하였다. 배지의 최초 pH는 7.2이나 배양 중 pH가 하강하여 배양액 pH는 전체 발효시간의 대부분에서 pH 5.0-6.4를 나타내었다.

배양 결과 표 4와 같이 pECt만을 함유하는 DS-p2에 비해 pECt-gadBC를 도입한 DS-AR-G2에서 아르기닌 생산이 증가하였다.

실시예 6 : DS-AR-G3 균주의 산성 pH에서의 5'-크산틸산 생산 배양 실험

종배지는 포도당 40 g/L, 참치엑기스 10 g/L, 인산제1칼륨 0.5 g/L, 인산제2칼륨 1 g/L, 황산마그네슘 1 g/L, 요소 1.25 g/L, 황산망간 5 mg/L, 황산철 5 mg/L, 황산아연 1 mg/L, 니코티닌산 15 mg/L, 티아민염 5 mg/L, 바이오틴 50 μg/L, 베타알라닌 10 mg/L, 시스테인 15 mg/L, 염화칼슘 1 g/L, 아데닌 200 mg/L 및 구아닌 200 mg/L를 포함하는 배지(pH 7.4)를 사용하였다.

발효배지는 포도당 100 g/L, 인산 14 g/L, 수산화칼륨 7.1 g/L, 바이오틴 186 μg/L, 시스테인 35 mg/L, 베타알라닌 28 mg/L, NCA 5mg/L, 티아민염 5 mg/L, 히스티딘 10 mg/L, 염화칼슘 1 g/L, 황산마그네슘 6 g/L, 황산망간 20 mg/L, 황산아연 10 mg/L, 황산철 20 mg/L, 황산구리 0.7 mg/L, 요소 2 g/L, 황산암모늄 2.5 g/L, 아데닌 140 mg/L 및 구아닌 47 mg/L를 포함하는 배지(pH 7.4)를 사용하였다.

상기 종배지 50 ml을 500 ml 진탕 플라스크에 분주하여 121℃에서 20분간 가압 살균한 후 DS-AR-G3와 DS-p3 각 균주를 접종하고 30℃에서 24시간 160 rpm으로 진탕 배양하여 종균 배양액으로 하였다. 발효배지를 탄산칼슘 1 g 이 담겨져 121℃에서 20분 동안 가압 살균한 500 ml 플라스크에 50 ml를 분주하고 미리 준비한 종균 배양액 5 ml를 접종하여 30℃에서 180 rpm으로 72시간 진탕 배양하였다. 배지의 최초 pH는 7.4이나 배양 중 pH가 하강하여 배양액 pH는 전체 발효시간의 대부분에서 pH 4.6-6.2를 나타내었다.

배양 결과 표 5와 같이 pECt만을 함유하는 DS-p3에 비해 pECt-gadBC를 도입한 DS-AR-G3에서 5'-크산틸산의 생산이 증가하였다.

실시예 7: 대장균으로부터 라이신 디카복실라아제(lysine decarboxylase, 서열목록 제9서열)를 코딩하는 cadA 유전자(서열목록 제10서열)와 라이신:카다베린 안티포터(lysine:cadaverine antiporter, 서열목록 제11서열)를 코딩하는 cadB 유전자(서열목록 제12서열)의 클로닝 및 발현 벡터 제조

유전자 cadB와 cadA의 오페론은 대장균 K12 MG1655 균주의 염색체를 주형으로 PCR법을 통하여 증폭하였다. 구체적으로, 표 6의 프라이머 CF(서열목록 제13서열)와 CR(서열목록 제14서열)을 이용하여 98℃에서 10초 동안 변성, 55℃에서 5초 동안 어닐링, 72℃에서 3분 40초 동안 중합하는 조건을 30회 반복하는 중합효소 PCR 법을 통하여 3703 염기쌍의 단편을 증폭하였다. 중합효소는 PrimeStar DNA 폴리머라제(TAKARA, 일본)를 사용하였다. 프라이머 GF는 제한효소 Nco I 부위를 가지고 있고, 프라이머 GR은 BamH I 부위를 가지고 있다.

얻어진 폴리뉴클레오티드에 제한효소 Nco I 및 BamH I을 처리하고, 대장균과 코리네속 균주에서 복제 가능한 셔틀벡터인 pECt 벡터의 Nco I 및 BamH I 자리 사이에 클로닝하여 대장균 JM109에 형질전환한 후, L Km 고체배지(L + kanamycin agar plate)에 도말하였다. 클로닝 된 벡터들을 얻어진 콜로니로부터 통상에 알려진 플라스미드 미니프렙법을 이용하여 획득하였고, 이를 pECt-cadBA로 명명하였다. 벡터에 대한 모식도는 도 2에 나타내었다.

실시예 8: cadBA 유전자 발현 벡터의 코리네속 균주( Corynebacterium sp. )에의 도입

실시예 1에서 얻은 pECt-cadBA 벡터를 글루타메이트 생산능이 있는 코리네박테리움 글루타미쿰 I6에 도입하였다. pECt-cadBA 벡터를 코리네박테리움 글루타미쿰 I6 내로 전기펄스법을 이용하여 도입시켰고 형질전환체를 카나마이신-내성에 근거하여 선별하였다. 당해 플라스미드의 존재를 확인한 후, pECt-cadBA 플라스미드를 함유하는 균주는 DS-AR-C1로 명명하였다.

실시예 7에서 얻은 pECt-cadBA 벡터를 5'-크산틸산(5'-XMP) 생산능이 있는 코리네박테리움 암모니아게네스 DS24에 도입하였다. pECt-cadBA 벡터를 코리네박테리움 암모니아게네스 내로 전기펄스법을 이용하여 도입시켰고 형질전환체를 카나마이신-내성에 근거하여 선별하였다. 당해 플라스미드의 존재를 확인한 후, pECt- cadBA 플라스미드를 함유하는 균주는 DS-AR-C3로 명명하고, 대조군 pECt 함유 균주는 DS-p3로 명명하였다.

실시예 9 : cadBA 유전자 발현 균주의 산성 pH에서의 생존율 조사

pECt-cadBA 플라스미드를 함유하는 균주와 대조군 pECt 함유 균주의 산성 pH에서의 생존율을 실시예 3과 동일한 방법으로 비교 조사하였다.

그 결과 표 7과 같이 pECt-cadBA 플라스미드를 함유하는 균주 DS-AR-C1 및 DS-AR-C3는 각각 그 대조군 pECt 함유 균주인 DS-p1 및 DS-p3에 비하여 산성 pH에서의 상대 생존율이 증가하였다.

실시예 10 : DS-AR-C3 균주의 산성 pH에서의 5'-크산틸산 생산 배양 실험

pECt-cadBA 플라스미드를 함유하는 균주 DS-AR-C3 와 대조군 pECt 함유 균주 DS-p3의 산성 pH에서의 5'-크산틸산 생산능을 실시예 6과 동일한 방법으로 비교 조사하였다. 배지의 최초 pH는 7.4이나 배양 중 pH가 하강하여 배양액 pH는 전체 발효시간의 대부분에서 pH 4.6-6.2를 나타내었다.

배양 결과 표 8와 같이 pECt만을 함유하는 DS-p3에 비해 pECt-cadBA를 도입한 DS-AR-C3에서 5'-크산틸산의 생산이 증가하였다.

이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현 예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

<110> DAESANG CORPORATION <120> Method for Increasing Acid Tolerance and/or Fermentation Productivity of Corynebacterium sp. Microorganism <130> PN120571 <160> 14 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 466 <212> PRT <213> Escherichia coli K-12MG1655 GadB <400> 1 Met Asp Lys Lys Gln Val Thr Asp Leu Arg Ser Glu Leu Leu Asp Ser 1 5 10 15 Arg Phe Gly Ala Lys Ser Ile Ser Thr Ile Ala Glu Ser Lys Arg Phe 20 25 30 Pro Leu His Glu Met Arg Asp Asp Val Ala Phe Gln Ile Ile Asn Asp 35 40 45 Glu Leu Tyr Leu Asp Gly Asn Ala Arg Gln Asn Leu Ala Thr Phe Cys 50 55 60 Gln Thr Trp Asp Asp Glu Asn Val His Lys Leu Met Asp Leu Ser Ile 65 70 75 80 Asn Lys Asn Trp Ile Asp Lys Glu Glu Tyr Pro Gln Ser Ala Ala Ile 85 90 95 Asp Leu Arg Cys Val Asn Met Val Ala Asp Leu Trp His Ala Pro Ala 100 105 110 Pro Lys Asn Gly Gln Ala Val Gly Thr Asn Thr Ile Gly Ser Ser Glu 115 120 125 Ala Cys Met Leu Gly Gly Met Ala Met Lys Trp Arg Trp Arg Lys Arg 130 135 140 Met Glu Ala Ala Gly Lys Pro Thr Asp Lys Pro Asn Leu Val Cys Gly 145 150 155 160 Pro Val Gln Ile Cys Trp His Lys Phe Ala Arg Tyr Trp Asp Val Glu 165 170 175 Leu Arg Glu Ile Pro Met Arg Pro Gly Gln Leu Phe Met Asp Pro Lys 180 185 190 Arg Met Ile Glu Ala Cys Asp Glu Asn Thr Ile Gly Val Val Pro Thr 195 200 205 Phe Gly Val Thr Tyr Thr Gly Asn Tyr Glu Phe Pro Gln Pro Leu His 210 215 220 Asp Ala Leu Asp Lys Phe Gln Ala Asp Thr Gly Ile Asp Ile Asp Met 225 230 235 240 His Ile Asp Ala Ala Ser Gly Gly Phe Leu Ala Pro Phe Val Ala Pro 245 250 255 Asp Ile Val Trp Asp Phe Arg Leu Pro Arg Val Lys Ser Ile Ser Ala 260 265 270 Ser Gly His Lys Phe Gly Leu Ala Pro Leu Gly Cys Gly Trp Val Ile 275 280 285 Trp Arg Asp Glu Glu Ala Leu Pro Gln Glu Leu Val Phe Asn Val Asp 290 295 300 Tyr Leu Gly Gly Gln Ile Gly Thr Phe Ala Ile Asn Phe Ser Arg Pro 305 310 315 320 Ala Gly Gln Val Ile Ala Gln Tyr Tyr Glu Phe Leu Arg Leu Gly Arg 325 330 335 Glu Gly Tyr Thr Lys Val Gln Asn Ala Ser Tyr Gln Val Ala Ala Tyr 340 345 350 Leu Ala Asp Glu Ile Ala Lys Leu Gly Pro Tyr Glu Phe Ile Cys Thr 355 360 365 Gly Arg Pro Asp Glu Gly Ile Pro Ala Val Cys Phe Lys Leu Lys Asp 370 375 380 Gly Glu Asp Pro Gly Tyr Thr Leu Tyr Asp Leu Ser Glu Arg Leu Arg 385 390 395 400 Leu Arg Gly Trp Gln Val Pro Ala Phe Thr Leu Gly Gly Glu Ala Thr 405 410 415 Asp Ile Val Val Met Arg Ile Met Cys Arg Arg Gly Phe Glu Met Asp 420 425 430 Phe Ala Glu Leu Leu Leu Glu Asp Tyr Lys Ala Ser Leu Lys Tyr Leu 435 440 445 Ser Asp His Pro Lys Leu Gln Gly Ile Ala Gln Gln Asn Ser Phe Lys 450 455 460 His Thr 465 <210> 2 <211> 1401 <212> DNA <213> Escherichia coli K-12MG1655 GadB <400> 2 atggataaga agcaagtaac ggatttaagg tcggaactac tcgattcacg ttttggtgcg 60 aagtctattt ccactatcgc agaatcaaaa cgttttccgc tgcacgaaat gcgcgacgat 120 gtcgcattcc agattatcaa tgacgaatta tatcttgatg gcaacgctcg tcagaacctg 180 gccactttct gccagacctg ggacgacgaa aatgtccaca aattgatgga tttatccatt 240 aacaaaaact ggatcgacaa agaagaatat ccgcaatccg cagccatcga cctgcgttgc 300 gtaaatatgg ttgccgatct gtggcatgcg cctgcgccga aaaatggtca ggccgttggc 360 accaacacca ttggttcttc cgaggcctgt atgctcggcg ggatggcgat gaaatggcgt 420 tggcgcaagc gtatggaagc tgcaggcaaa ccaacggata aaccaaacct ggtgtgcggt 480 ccggtacaaa tctgctggca taaattcgcc cgctactggg atgtggagct gcgtgagatc 540 cctatgcgcc ccggtcagtt gtttatggac ccgaaacgca tgattgaagc ctgtgacgaa 600 aacaccatcg gcgtggtgcc gactttcggc gtgacctaca ctggtaacta tgagttccca 660 caaccgctgc acgatgcgct ggataaattc caggccgata ccggtatcga catcgacatg 720 cacatcgacg ctgccagcgg tggcttcctg gcaccgttcg tcgccccgga tatcgtctgg 780 gacttccgcc tgccgcgtgt gaaatcgatc agtgcttcag gccataaatt cggtctggct 840 ccgctgggct gcggctgggt tatctggcgt gacgaagaag cgctgccgca ggaactggtg 900 ttcaacgttg actacctggg tggtcaaatt ggtacttttg ccatcaactt ctcccgcccg 960 gcgggtcagg taattgcaca gtactatgaa ttcctgcgcc tcggtcgtga aggctatacc 1020 aaagtacaga acgcctctta ccaggttgcc gcttatctgg cggatgaaat cgccaaactg 1080 gggccgtatg agttcatctg tacgggtcgc ccggacgaag gcatcccggc ggtttgcttc 1140 aaactgaaag atggtgaaga tccgggatac accctgtatg acctctctga acgtctgcgt 1200 ctgcgcggct ggcaggttcc ggccttcact ctcggcggtg aagccaccga catcgtggtg 1260 atgcgcatta tgtgtcgtcg cggcttcgaa atggactttg ctgaactgtt gctggaagac 1320 tacaaagcct ccctgaaata tctcagcgat cacccgaaac tgcagggtat tgcccaacag 1380 aacagcttta aacatacctg a 1401 <210> 3 <211> 466 <212> PRT <213> Escherichia coli K-12MG1655 GadA <400> 3 Met Asp Gln Lys Leu Leu Thr Asp Phe Arg Ser Glu Leu Leu Asp Ser 1 5 10 15 Arg Phe Gly Ala Lys Ala Ile Ser Thr Ile Ala Glu Ser Lys Arg Phe 20 25 30 Pro Leu His Glu Met Arg Asp Asp Val Ala Phe Gln Ile Ile Asn Asp 35 40 45 Glu Leu Tyr Leu Asp Gly Asn Ala Arg Gln Asn Leu Ala Thr Phe Cys 50 55 60 Gln Thr Trp Asp Asp Glu Asn Val His Lys Leu Met Asp Leu Ser Ile 65 70 75 80 Asn Lys Asn Trp Ile Asp Lys Glu Glu Tyr Pro Gln Ser Ala Ala Ile 85 90 95 Asp Leu Arg Cys Val Asn Met Val Ala Asp Leu Trp His Ala Pro Ala 100 105 110 Pro Lys Asn Gly Gln Ala Val Gly Thr Asn Thr Ile Gly Ser Ser Glu 115 120 125 Ala Cys Met Leu Gly Gly Met Ala Met Lys Trp Arg Trp Arg Lys Arg 130 135 140 Met Glu Ala Ala Gly Lys Pro Thr Asp Lys Pro Asn Leu Val Cys Gly 145 150 155 160 Pro Val Gln Ile Cys Trp His Lys Phe Ala Arg Tyr Trp Asp Val Glu 165 170 175 Leu Arg Glu Ile Pro Met Arg Pro Gly Gln Leu Phe Met Asp Pro Lys 180 185 190 Arg Met Ile Glu Ala Cys Asp Glu Asn Thr Ile Gly Val Val Pro Thr 195 200 205 Phe Gly Val Thr Tyr Thr Gly Asn Tyr Glu Phe Pro Gln Pro Leu His 210 215 220 Asp Ala Leu Asp Lys Phe Gln Ala Asp Thr Gly Ile Asp Ile Asp Met 225 230 235 240 His Ile Asp Ala Ala Ser Gly Gly Phe Leu Ala Pro Phe Val Ala Pro 245 250 255 Asp Ile Val Trp Asp Phe Arg Leu Pro Arg Val Lys Ser Ile Ser Ala 260 265 270 Ser Gly His Lys Phe Gly Leu Ala Pro Leu Gly Cys Gly Trp Val Ile 275 280 285 Trp Arg Asp Glu Glu Ala Leu Pro Gln Glu Leu Val Phe Asn Val Asp 290 295 300 Tyr Leu Gly Gly Gln Ile Gly Thr Phe Ala Ile Asn Phe Ser Arg Pro 305 310 315 320 Ala Gly Gln Val Ile Ala Gln Tyr Tyr Glu Phe Leu Arg Leu Gly Arg 325 330 335 Glu Gly Tyr Thr Lys Val Gln Asn Ala Ser Tyr Gln Val Ala Ala Tyr 340 345 350 Leu Ala Asp Glu Ile Ala Lys Leu Gly Pro Tyr Glu Phe Ile Cys Thr 355 360 365 Gly Arg Pro Asp Glu Gly Ile Pro Ala Val Cys Phe Lys Leu Lys Asp 370 375 380 Gly Glu Asp Pro Gly Tyr Thr Leu Tyr Asp Leu Ser Glu Arg Leu Arg 385 390 395 400 Leu Arg Gly Trp Gln Val Pro Ala Phe Thr Leu Gly Gly Glu Ala Thr 405 410 415 Asp Ile Val Val Met Arg Ile Met Cys Arg Arg Gly Phe Glu Met Asp 420 425 430 Phe Ala Glu Leu Leu Leu Glu Asp Tyr Lys Ala Ser Leu Lys Tyr Leu 435 440 445 Ser Asp His Pro Lys Leu Gln Gly Ile Ala Gln Gln Asn Ser Phe Lys 450 455 460 His Thr 465 <210> 4 <211> 1401 <212> DNA <213> Escherichia coli K-12MG1655 GadA <400> 4 atggaccaga agctgttaac ggatttccgc tcagaactac tcgattcacg ttttggcgca 60 aaggccattt ctactatcgc ggagtcaaaa cgatttccgc tgcacgaaat gcgcgatgat 120 gtcgcatttc agattatcaa tgatgaatta tatcttgatg gcaacgctcg tcagaacctg 180 gccactttct gccagacctg ggacgacgaa aacgtccata aattgatgga tttgtcgatc 240 aataaaaact ggatcgacaa agaagaatat ccgcaatccg cagccatcga cctgcgttgc 300 gtaaatatgg ttgccgatct gtggcatgcg cctgcgccga aaaatggtca ggccgttggc 360 accaacacca ttggttcttc cgaggcctgt atgctcggcg ggatggcgat gaaatggcgt 420 tggcgcaagc gtatggaagc tgcaggcaaa ccaacggata aaccaaacct ggtgtgcggt 480 ccggtacaaa tctgctggca taaattcgcc cgctactggg atgtggagct gcgtgagatc 540 cctatgcgcc ccggtcagtt gtttatggac ccgaaacgca tgattgaagc ctgtgacgaa 600 aacaccatcg gcgtggtgcc gactttcggc gtgacctaca ccggtaacta tgagttccca 660 caaccgctgc acgatgcgct ggataaattc caggccgaca ccggtatcga catcgacatg 720 cacatcgacg ctgccagcgg tggcttcctg gcaccgttcg tcgccccgga tatcgtctgg 780 gacttccgcc tgccgcgtgt gaaatcgatc agtgcttcag gccataaatt cggtctggct 840 ccgctgggct gcggctgggt tatctggcgt gacgaagaag cgctgccgca ggaactggtg 900 ttcaacgttg actacctggg tggtcaaatt ggtacttttg ccatcaactt ctcccgcccg 960 gcgggtcagg taattgcaca gtactatgaa ttcctgcgcc tcggtcgtga aggctatacc 1020 aaagtacaga acgcctctta ccaggttgcc gcttatctgg cggatgaaat cgccaaactg 1080 gggccgtatg agttcatctg tacgggtcgc ccggacgaag gcatcccggc ggtttgcttc 1140 aaactgaaag atggtgaaga tccgggatac accctgtacg acctctctga acgtctgcgt 1200 ctgcgcggct ggcaggttcc ggccttcact ctcggcggtg aagccaccga catcgtggtg 1260 atgcgcatta tgtgtcgtcg cggcttcgaa atggactttg ctgaactgtt gctggaagac 1320 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Ile Tyr Leu His Ser Gly Ala Pro Val Ala Ile Glu Met Asp Ser Lys 180 185 190 Thr Phe Phe Pro Asp Phe Ser Lys Val Gly Thr Leu Val Val Phe Val 195 200 205 Ala Phe Ile Leu Ser Tyr Met Gly Val Glu Ala Ser Ala Thr His Val 210 215 220 Asn Glu Met Ser Asn Pro Gly Arg Asp Tyr Pro Leu Ala Met Leu Leu 225 230 235 240 Leu Met Val Ala Ala Ile Cys Leu Ser Ser Val Gly Gly Leu Ser Ile 245 250 255 Ala Met Val Ile Pro Gly Asn Glu Ile Asn Leu Ser Ala Gly Val Met 260 265 270 Gln Thr Phe Thr Val Leu Met Ser His Val Ala Pro Glu Ile Glu Trp 275 280 285 Thr Val Arg Val Ile Ser Ala Leu Leu Leu Leu Gly Val Leu Ala Glu 290 295 300 Ile Ala Ser Trp Ile Val Gly Pro Ser Arg Gly Met Tyr Val Thr Ala 305 310 315 320 Gln Lys Asn Leu Leu Pro Ala Ala Phe Ala Lys Met Asn Lys Asn Gly 325 330 335 Val Pro Val Thr Leu Val Ile Ser Gln Leu Val Ile Thr Ser Ile Ala 340 345 350 Leu Ile Ile Leu Thr Asn Thr Gly Gly Gly Asn Asn Met Ser Phe Leu 355 360 365 Ile Ala Leu Ala Leu Thr Val Val Ile Tyr Leu Cys Ala Tyr Phe Met 370 375 380 Leu Phe Ile Gly Tyr Ile Val Leu Val Leu Lys His Pro Asp Leu Lys 385 390 395 400 Arg Thr Phe Asn Ile Pro Gly Gly Lys Gly Val Lys Leu Val Val Ala 405 410 415 Ile Val Gly Leu Leu Thr Ser Ile Met Ala Phe Ile Val Ser Phe Leu 420 425 430 Pro Pro Asp Asn Ile Gln Gly Asp Ser Thr Asp Met Tyr Val Glu Leu 435 440 445 Leu Val Val Ser Phe Leu Val Val Leu Ala Leu Pro Phe Ile Leu Tyr 450 455 460 Ala Val His Asp Arg Lys Gly Lys Ala Asn Thr Gly Val Thr Leu Glu 465 470 475 480 Pro Ile Asn Ser Gln Asn Ala Pro Lys Gly His Phe Phe Leu His Pro 485 490 495 Arg Ala Arg Ser Pro His Tyr Ile Val Met Asn Asp Lys Lys His 500 505 510 <210> 6 <211> 1536 <212> DNA <213> Escherichia coli K-12MG1655 GadC <400> 6 atggctacat cagtacagac aggtaaagct aagcagctca cattacttgg attctttgcc 60 ataacggcat cgatggtaat ggctgtttat gaatacccta ccttcgcaac atcgggcttt 120 tcattagtct tcttcctgct attaggcggg attttatggt ttattcccgt gggactttgt 180 gctgcggaaa tggccaccgt cgacggctgg gaagaaggtg gtgtcttcgc ctgggtatca 240 aatactctgg ggccgagatg gggatttgca gcgatctcat ttggctatct gcaaatcgcc 300 attggtttta ttccgatgct ctatttcgtg ttaggggcac tctcctacat cctgaaatgg 360 ccagcgctga atgaagaccc cattaccaaa actattgcag cactcatcat tctttgggcg 420 ctggcattaa cgcagtttgg tggcacgaaa tacacggcgc gaattgctaa agttggcttc 480 ttcgccggta tcctgttacc tgcatttatt ttgatcgcat tagcggctat ttatctgcac 540 tccggtgccc ccgttgctat cgaaatggat tcgaagacct tcttccctga cttctctaaa 600 gtgggcaccc tggtagtatt tgttgccttc attttgagtt atatgggcgt agaagcatcc 660 gcaacccacg tcaatgaaat gagcaaccca gggcgcgact atccgttggc tatgttactg 720 ctgatggtgg cggcaatctg cttaagctct gttggtggtt tgtctattgc gatggtcatt 780 ccgggtaatg aaatcaacct ctccgcaggg gtaatgcaaa cctttaccgt tctgatgtcc 840 catgtggcac cagaaattga gtggacggtt cgcgtgatct ccgcactgct gttgctgggt 900 gttctggcgg aaatcgcctc ctggattgtt ggtccttctc gcgggatgta tgtaacagcg 960 cagaaaaacc tgctgccagc ggcattcgct aaaatgaaca aaaatggcgt accggtaacg 1020 ctggtcattt cgcagctggt gattacgtct atcgcgttga tcatcctcac caataccggt 1080 ggcggtaaca acatgtcctt cctgatcgca ctggcgctga cggtggtgat ttatctgtgt 1140 gcttatttca tgctgtttat tggctacatt gtgttggttc ttaaacatcc tgacttaaaa 1200 cgcacattta atatccctgg tggtaaaggg gtgaaactgg tcgtggcaat tgtcggtctg 1260 ctgacttcaa ttatggcgtt tattgtttcc ttcctgccgc cggataacat ccagggtgat 1320 tctaccgata tgtatgttga attactggtt gttagtttcc tggtggtact tgccctgccc 1380 tttattctct atgctgttca tgatcgtaaa ggcaaagcaa ataccggcgt cactctggag 1440 ccaatcaaca gtcagaacgc accaaaaggt cacttcttcc tgcacccgcg tgcacgttca 1500 ccacactata ttgtgatgaa tgacaagaaa cactaa 1536 <210> 7 <211> 49 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GF <400> 7 gcgagctcga aaggaataat tactctaatg gataagaagc aagtaacgg 49 <210> 8 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GR <400> 8 gagcagggat ccatatgtgc tggtttcc 28 <210> 9 <211> 715 <212> PRT <213> Escherichia coli K-12MG1655 CadA <400> 9 Met Asn Val Ile Ala Ile Leu Asn His Met Gly Val Tyr Phe Lys Glu 1 5 10 15 Glu Pro Ile Arg Glu Leu His Arg Ala Leu Glu Arg Leu Asn Phe Gln 20 25 30 Ile Val Tyr Pro Asn Asp Arg Asp Asp Leu Leu Lys Leu Ile Glu Asn 35 40 45 Asn Ala Arg Leu Cys Gly Val Ile Phe Asp Trp Asp Lys Tyr Asn Leu 50 55 60 Glu Leu Cys Glu Glu Ile Ser Lys Met Asn Glu Asn Leu Pro Leu Tyr 65 70 75 80 Ala Phe Ala Asn Thr Tyr Ser Thr Leu Asp Val Ser Leu Asn Asp Leu 85 90 95 Arg Leu Gln Ile Ser Phe Phe Glu Tyr Ala Leu Gly Ala Ala Glu Asp 100 105 110 Ile Ala Asn Lys Ile Lys Gln Thr Thr Asp Glu Tyr Ile Asn Thr Ile 115 120 125 Leu Pro Pro Leu Thr Lys Ala Leu Phe Lys Tyr Val Arg Glu Gly Lys 130 135 140 Tyr Thr Phe Cys Thr Pro Gly His Met Gly Gly Thr Ala Phe Gln Lys 145 150 155 160 Ser Pro Val Gly Ser Leu Phe Tyr Asp Phe Phe Gly Pro Asn Thr Met 165 170 175 Lys Ser Asp Ile Ser Ile Ser Val Ser Glu Leu Gly Ser Leu Leu Asp 180 185 190 His Ser Gly Pro His Lys Glu Ala Glu Gln Tyr Ile Ala Arg Val Phe 195 200 205 Asn Ala Asp Arg Ser Tyr Met Val Thr Asn Gly Thr Ser Thr Ala Asn 210 215 220 Lys Ile Val Gly Met Tyr Ser Ala Pro Ala Gly Ser Thr Ile Leu Ile 225 230 235 240 Asp Arg Asn Cys His Lys Ser Leu Thr His Leu Met Met Met Ser Asp 245 250 255 Val Thr Pro Ile Tyr Phe Arg Pro Thr Arg Asn Ala Tyr Gly Ile Leu 260 265 270 Gly Gly Ile Pro Gln Ser Glu Phe Gln His Ala Thr Ile Ala Lys Arg 275 280 285 Val Lys Glu Thr Pro Asn Ala Thr Trp Pro Val His Ala Val Ile Thr 290 295 300 Asn Ser Thr Tyr Asp Gly Leu Leu Tyr Asn Thr Asp Phe Ile Lys Lys 305 310 315 320 Thr Leu Asp Val Lys Ser Ile His Phe Asp Ser Ala Trp Val Pro Tyr 325 330 335 Thr Asn Phe Ser Pro Ile Tyr Glu Gly Lys Cys Gly Met Ser Gly Gly 340 345 350 Arg Val Glu Gly Lys Val Ile Tyr Glu Thr Gln Ser Thr His Lys Leu 355 360 365 Leu Ala Ala Phe Ser Gln Ala Ser Met Ile His Val Lys Gly Asp Val 370 375 380 Asn Glu Glu Thr Phe Asn Glu Ala Tyr Met Met His Thr Thr Thr Ser 385 390 395 400 Pro His Tyr Gly Ile Val Ala Ser Thr Glu Thr Ala Ala Ala Met Met 405 410 415 Lys Gly Asn Ala Gly Lys Arg Leu Ile Asn Gly Ser Ile Glu Arg Ala 420 425 430 Ile Lys Phe Arg Lys Glu Ile Lys Arg Leu Arg Thr Glu Ser Asp Gly 435 440 445 Trp Phe Phe Asp Val Trp Gln Pro Asp His Ile Asp Thr Thr Glu Cys 450 455 460 Trp Pro Leu Arg Ser Asp Ser Thr Trp His Gly Phe Lys Asn Ile Asp 465 470 475 480 Asn Glu His Met Tyr Leu Asp Pro Ile Lys Val Thr Leu Leu Thr Pro 485 490 495 Gly Met Glu Lys Asp Gly Thr Met Ser Asp Phe Gly Ile Pro Ala Ser 500 505 510 Ile Val Ala Lys Tyr Leu Asp Glu His Gly Ile Val Val Glu Lys Thr 515 520 525 Gly Pro Tyr Asn Leu Leu Phe Leu Phe Ser Ile Gly Ile Asp Lys Thr 530 535 540 Lys Ala Leu Ser Leu Leu Arg Ala Leu Thr Asp Phe Lys Arg Ala Phe 545 550 555 560 Asp Leu Asn Leu Arg Val Lys Asn Met Leu Pro Ser Leu Tyr Arg Glu 565 570 575 Asp Pro Glu Phe Tyr Glu Asn Met Arg Ile Gln Glu Leu Ala Gln Asn 580 585 590 Ile His Lys Leu Ile Val His His Asn Leu Pro Asp Leu Met Tyr Arg 595 600 605 Ala Phe Glu Val Leu Pro Thr Met Val Met Thr Pro Tyr Ala Ala Phe 610 615 620 Gln Lys Glu Leu His Gly Met Thr Glu Glu Val Tyr Leu Asp Glu Met 625 630 635 640 Val Gly Arg Ile Asn Ala Asn Met Ile Leu Pro Tyr Pro Pro Gly Val 645 650 655 Pro Leu Val Met Pro Gly Glu Met Ile Thr Glu Glu Ser Arg Pro Val 660 665 670 Leu Glu Phe Leu Gln Met Leu Cys Glu Ile Gly Ala His Tyr Pro Gly 675 680 685 Phe Glu Thr Asp Ile His Gly Ala Tyr Arg Gln Ala Asp Gly Arg Tyr 690 695 700 Thr Val Lys Val Leu Lys Glu Glu Ser Lys Lys 705 710 715 <210> 10 <211> 2148 <212> DNA <213> Escherichia coli K-12MG1655 CadA <400> 10 atgaacgtta ttgcaatatt gaatcacatg ggggtttatt ttaaagaaga acccatccgt 60 gaacttcatc gcgcgcttga acgtctgaac ttccagattg tttacccgaa cgaccgtgac 120 gacttattaa aactgatcga aaacaatgcg cgtctgtgcg gcgttatttt tgactgggat 180 aaatataatc tcgagctgtg cgaagaaatt agcaaaatga acgagaacct gccgttgtac 240 gcgttcgcta atacgtattc cactctcgat gtaagcctga atgacctgcg tttacagatt 300 agcttctttg aatatgcgct gggtgctgct gaagatattg ctaataagat caagcagacc 360 actgacgaat atatcaacac tattctgcct ccgctgacta aagcactgtt taaatatgtt 420 cgtgaaggta aatatacttt ctgtactcct ggtcacatgg gcggtactgc attccagaaa 480 agcccggtag gtagcctgtt ctatgatttc tttggtccga ataccatgaa atctgatatt 540 tccatttcag tatctgaact gggttctctg ctggatcaca gtggtccaca caaagaagca 600 gaacagtata tcgctcgcgt ctttaacgca gaccgcagct acatggtgac caacggtact 660 tccactgcga acaaaattgt tggtatgtac tctgctccag caggcagcac cattctgatt 720 gaccgtaact gccacaaatc gctgacccac ctgatgatga tgagcgatgt tacgccaatc 780 tatttccgcc cgacccgtaa cgcttacggt attcttggtg gtatcccaca gagtgaattc 840 cagcacgcta ccattgctaa gcgcgtgaaa gaaacaccaa acgcaacctg gccggtacat 900 gctgtaatta ccaactctac ctatgatggt ctgctgtaca acaccgactt catcaagaaa 960 acactggatg tgaaatccat ccactttgac tccgcgtggg tgccttacac caacttctca 1020 ccgatttacg aaggtaaatg cggtatgagc ggtggccgtg tagaagggaa agtgatttac 1080 gaaacccagt ccactcacaa actgctggcg gcgttctctc aggcttccat gatccacgtt 1140 aaaggtgacg taaacgaaga aacctttaac gaagcctaca tgatgcacac caccacttct 1200 ccgcactacg gtatcgtggc gtccactgaa accgctgcgg cgatgatgaa aggcaatgca 1260 ggtaagcgtc tgatcaacgg ttctattgaa cgtgcgatca aattccgtaa agagatcaaa 1320 cgtctgagaa cggaatctga tggctggttc tttgatgtat ggcagccgga tcatatcgat 1380 acgactgaat gctggccgct gcgttctgac agcacctggc acggcttcaa aaacatcgat 1440 aacgagcaca tgtatcttga cccgatcaaa gtcaccctgc tgactccggg gatggaaaaa 1500 gacggcacca tgagcgactt tggtattccg gccagcatcg tggcgaaata cctcgacgaa 1560 catggcatcg ttgttgagaa aaccggtccg tataacctgc tgttcctgtt cagcatcggt 1620 atcgataaga ccaaagcact gagcctgctg cgtgctctga ctgactttaa acgtgcgttc 1680 gacctgaacc tgcgtgtgaa aaacatgctg ccgtctctgt atcgtgaaga tcctgaattc 1740 tatgaaaaca tgcgtattca ggaactggct cagaatatcc acaaactgat tgttcaccac 1800 aatctgccgg atctgatgta tcgcgcattt gaagtgctgc cgacgatggt aatgactccg 1860 tatgctgcat tccagaaaga gctgcacggt atgaccgaag aagtttacct cgacgaaatg 1920 gtaggtcgta ttaacgccaa tatgatcctt ccgtacccgc cgggagttcc tctggtaatg 1980 ccgggtgaaa tgatcaccga agaaagccgt ccggttctgg agttcctgca gatgctgtgt 2040 gaaatcggcg ctcactatcc gggctttgaa accgatattc acggtgcata ccgtcaggct 2100 gatggccgct ataccgttaa ggtattgaaa gaagaaagca aaaaataa 2148 <210> 11 <211> 444 <212> PRT <213> Escherichia coli K-12MG1655 CadB <400> 11 Met Ser Ser Ala Lys Lys Ile Gly Leu Phe Ala Cys Thr Gly Val Val 1 5 10 15 Ala Gly Asn Met Met Gly Ser Gly Ile Ala Leu Leu Pro Ala Asn Leu 20 25 30 Ala Ser Ile Gly Gly Ile Ala Ile Trp Gly Trp Ile Ile Ser Ile Ile 35 40 45 Gly Ala Met Ser Leu Ala Tyr Val Tyr Ala Arg Leu Ala Thr Lys Asn 50 55 60 Pro Gln Gln Gly Gly Pro Ile Ala Tyr Ala Gly Glu Ile Ser Pro Ala 65 70 75 80 Phe Gly Phe Gln Thr Gly Val Leu Tyr Tyr His Ala Asn Trp Ile Gly 85 90 95 Asn Leu Ala Ile Gly Ile Thr Ala Val Ser Tyr Leu Ser Thr Phe Phe 100 105 110 Pro Val Leu Asn Asp Pro Val Pro Ala Gly Ile Ala Cys Ile Ala Ile 115 120 125 Val Trp Val Phe Thr Phe Val Asn Met Leu Gly Gly Thr Trp Val Ser 130 135 140 Arg Leu Thr Thr Ile Gly Leu Val Leu Val Leu Ile Pro Val Val Met 145 150 155 160 Thr Ala Ile Val Gly Trp His Trp Phe Asp Ala Ala Thr Tyr Ala Ala 165 170 175 Asn Trp Asn Thr Ala Asp Thr Thr Asp Gly His Ala Ile Ile Lys Ser 180 185 190 Ile Leu Leu Cys Leu Trp Ala Phe Val Gly Val Glu Ser Ala Ala Val 195 200 205 Ser Thr Gly Met Val Lys Asn Pro Lys Arg Thr Val Pro Leu Ala Thr 210 215 220 Met Leu Gly Thr Gly Leu 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Thr Ala Ser Asn Ala His 435 440 <210> 12 <211> 1335 <212> DNA <213> Escherichia coli K-12MG1655 CadB <400> 12 atgagttctg ccaagaagat cgggctattt gcctgtaccg gtgttgttgc cggtaatatg 60 atggggagcg gtattgcatt attacctgcg aacctagcaa gtatcggtgg tattgctatc 120 tggggttgga ttatctctat tattggtgca atgtcgctgg cgtatgtata tgcccgactg 180 gcaacaaaaa acccgcaaca aggtggccca attgcttatg ccggagaaat ttcccctgca 240 tttggttttc agacaggtgt tctttattac catgctaact ggattggtaa cctggcgatt 300 ggtattaccg ctgtatctta tctttccacc ttcttcccag tattaaatga tcctgttccg 360 gcgggtatcg cctgtattgc tatcgtctgg gtatttacct ttgtaaatat gctcggcggt 420 acttgggtaa gccgtttaac cactattggt ctggtgctgg ttcttattcc tgtggtgatg 480 actgctattg ttggctggca ttggtttgat gcggcaactt atgcagctaa ctggaatact 540 gcggatacca ctgatggtca tgcgatcatt aaaagtattc tgctctgcct gtgggccttc 600 gtgggtgttg aatccgcagc tgtaagtact ggtatggtta aaaacccgaa acgtaccgtt 660 ccgctggcaa ccatgctggg tactggttta gcaggtattg tttacatcgc tgcgactcag 720 gtgctttccg gtatgtatcc gtcttctgta atggcggctt ccggtgctcc gtttgcaatc 780 agtgcttcaa ctatcctcgg taactgggct gcgccgctgg tttctgcatt caccgccttt 840 gcgtgcctga cttctctggg ctcctggatg atgttggtag gccaggcagg tgtacgtgcc 900 gctaacgacg gtaacttccc gaaagtttat ggtgaagtcg acagcaacgg tattccgaaa 960 aaaggtctgc tgctggctgc agtgaaaatg actgccctga tgatccttat cactctgatg 1020 aactctgccg gtggtaaagc atctgacctg ttcggtgaac tgaccggtat cgcagtactg 1080 ctgactatgc tgccgtattt ctactcttgc gttgacctga ttcgttttga aggcgttaac 1140 atccgcaact ttgtcagcct gatctgctct gtactgggtt gcgtgttctg cttcatcgcg 1200 ctgatgggcg caagctcctt cgagctggca ggtaccttca tcgtcagcct gattatcctg 1260 atgttctacg ctcgcaaaat gcacgagcgc cagagccact caatggataa ccacaccgcg 1320 tctaacgcac attaa 1335 <210> 13 <211> 52 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CF <400> 13 gcccatggga aaggaataat tactctaatg agttctgcca agaagatcgg gc 52 <210> 14 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CR <400> 14 cagatttgga tccccacgat agtatatcg 29

Claims

다음 단계를 포함하는 코리네박테리움 속(Corynebacterium sp.) 미생물의 내산성, 발효 생산성 또는 내산성과 발효 생산성을 증가시키는 방법:
(a) (i-1) 글루타메이트 디카복실라아제(glutamate decarboxylase)를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열 및 (i-2) 글루타메이트:감마-아미노부티르산 안티포터(glutamate:GABA antiporter)를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 재조합 벡터, 또는 (ii) 라이신 디카복실라아제(lysine decarboxylase) 및 라이신:카다베린 안티포터(lysine:cadaverine antiporter)를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 재조합 벡터를 제작하는 단계; 및
(b) 상기 재조합 벡터를 코리네박테리움 속 미생물에 형질전환시켜 내산성, 발효 생산성 또는 내산성과 발효 생산성을 증가시키는 단계; 그리고, 상기 단계 (b)의 내산성은 pH 3.5-6.4 산성조건 배지에서 모균주(parent strain)와 비교하여 상대 생존율을 50-1000% 증가시키는 것을 특징으로 한다.
제 1 항에 있어서, 상기 코리네박테리움 속 미생물은 코리네박테리움 글루타미쿰(Corynebacterium glutamicum) 또는 코리네박테리움 암모니아게네스(Corynebacterium ammoniagenes)인 것을 특징으로 하는 방법.
제 1 항에 있어서, (a) 상기 글루타메이트 디카복실라아제는 박테리아로부터 유래된 GadA 또는 GadB이고; (b) 상기 글루타메이트:감마-아미노부티르산 안티포터는 박테리아로부터 유래된 GadC이며; (c) 상기 라이신 디카복실라아제는 박테리아로부터 유래된 CadA 이고; 그리고 (d) 상기 라이신:카다베린 안티포터는 박테리아로부터 유래된 CadB인 것을 특징으로 하는 방법.
제 1 항에 있어서, (a) 상기 글루타메이트 디카복실라아제를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열은 서열목록 제2서열 또는 서열목록 제4서열을 포함하고; (b) 상기 글루타메이트:감마-아미노부티르산 안티포터를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열은 서열목록 제6서열을 포함하며; (c) 상기 라이신 디카복실라아제를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열은 서열목록 제10서열을 포함하고; 그리고 (d) 상기 라이신:카다베린 안티포터를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열은 서열목록 제12서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 1 항에 있어서, 상기 발효 생산성은 감마-아미노부티르산(GABA), 아르기닌, 5'-크산틸산 또는 이들 모두에 대한 발효 생산성인 것을 특징으로 하는 방법.
삭제
제 1 항에 있어서, 상기 단계 (b)의 발효 생산성은 pH 3.5-6.4 산성조건 배지에서 모균주와 비교하여 발효산물(fermentation product) 농도를 5% 이상 증가시키는 것을 특징으로 하는 방법.
제 1 항 내지 제 5 항 및 제 7 항 중 어느 한 항에 따라 내산성, 발효 생산성 또는 내산성과 발효 생산성이 증가된 형질전환 코리네박테리움 속 균주를 pH 3.5-6.4 산성조건 배지에서 배양하는 단계를 포함하는 발효산물의 생산방법.
라이신 디카복실라아제 및 라이신:카다베린 안티포터를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 재조합 벡터로 형질전환 되어 있고 모균주와 비교하여 내산성이 증가된 형질전환된 코리네박테리움 속 균주.
제 9 항에 있어서, (a) 상기 라이신 디카복실라아제는 박테리아로부터 유래된 CadA이고, (b) 상기 라이신:카다베린 안티포터는 박테리아로부터 유래된 CadB인 것을 특징으로 하는 형질전환된 코리네박테리움 속 균주.