KR101933919B1 - 페룰릴-CoA 합성효소 및 에놀-CoA 수화효소/알돌라아제 과발현 대장균을 이용하는 멜라닌 생산 방법 - Google Patents

페룰릴-CoA 합성효소 및 에놀-CoA 수화효소/알돌라아제 과발현 대장균을 이용하는 멜라닌 생산 방법 Download PDF

Info

Publication number
KR101933919B1
KR101933919B1 KR1020170068357A KR20170068357A KR101933919B1 KR 101933919 B1 KR101933919 B1 KR 101933919B1 KR 1020170068357 A KR1020170068357 A KR 1020170068357A KR 20170068357 A KR20170068357 A KR 20170068357A KR 101933919 B1 KR101933919 B1 KR 101933919B1
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
ala
melanin
leu
gly
arg
Prior art date
Application number
KR1020170068357A
Other languages
English (en)
Other versions
KR20180131800A (ko
Inventor
최권영
장세영
Original Assignee
아주대학교 산학협력단
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 아주대학교 산학협력단 filed Critical 아주대학교 산학협력단
Priority to KR1020170068357A priority Critical patent/KR101933919B1/ko
Publication of KR20180131800A publication Critical patent/KR20180131800A/ko
Application granted granted Critical
Publication of KR101933919B1 publication Critical patent/KR101933919B1/ko

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P17/00—Preparation of heterocyclic carbon compounds with only O, N, S, Se or Te as ring hetero atoms
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/88—Lyases (4.)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/93—Ligases (6)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y402/00—Carbon-oxygen lyases (4.2)
    • C12Y402/01—Hydro-lyases (4.2.1)
    • C12Y402/01017—Enoyl-CoA hydratase (4.2.1.17), i.e. crotonase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y602/00—Ligases forming carbon-sulfur bonds (6.2)
    • C12Y602/01—Acid-Thiol Ligases (6.2.1)
    • C12Y602/01034—Trans-feruloyl-CoA synthase (6.2.1.34)

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

본 발명은 페룰릴-CoA 합성효소(FCS, feruloyl-CoA Synthetase) 및 에놀-CoA 수화효소/알돌라아제(ECH, enoyl-CoA hydratase/aldolase)를 공동 발현하는 재조합 대장균을 이용하여 카페익산 기반의 친환경 멜라닌 색소를 고속 생성하는 방법 및 상기 방법으로 생산된 멜라닌 색소에 관한 것이다.

Description

페룰릴-CoA 합성효소 및 에놀-CoA 수화효소/알돌라아제 과발현 대장균을 이용하는 멜라닌 생산 방법{Method of producing melanin using E.coli overexpressing feruloyl-CoA Synthetase and enoyl-CoA hydratase/aldolase}
본 발명은 페룰릴-CoA 합성효소(FCS, feruloyl-CoA Synthetase) 및 에놀-CoA 수화효소/알돌라아제(ECH, enoyl-CoA hydratase/aldolase)를 공동 발현하는 재조합 대장균을 이용하여 카페익산 기반의 친환경 멜라닌 색소를 고속 생성하는 방법 및 상기 방법으로 생산된 멜라닌 색소에 관한 것이다.
멜라닌(melanin)은 일반적으로 페놀 또는 인돌 화합물이 산화·중합된 고분자 화합물을 총칭하며, 갈색 또는 검은색을 띄는 특징이 있어 색소로 사용된다. 멜라닌은 동식물계에 널리 분포하며, 멜라닌 색소에 의해 사람 및 동물의 피부 및 모발 등의 색이 결정된다. 멜라닌은 불용성이며 무정형이고 그 형태가 일정하지 않기 때문에 현재는 정확한 구조를 분석하는데 어려움이 있는 것으로 알려져있다.
멜라닌이 인간을 비롯한 동식물 내에서 흔히 사용되는 색소인 만큼, 멜라닌을 색소로 사용하기 위한 방법 또한 개발되었다. 종래 멜라닌 생성 방법은 L-티로신으로부터 시작한다(도 2). 이후, 타이로시나제(tyrosinase)를 이용하여 DOPA(L-3,4-dihydroxyphenylalanine)을 합성한 이후 동일한 효소를 이용하여 도파퀴논(dopaquinone)의 오른쪽 말단의 아민기(-NH2) 및 엑시드기(-COOH)가 인돌(indole)의 고리 구조를 형성하게 되고, 동일한 화합물이 연속적으로 C-C 결합으로 결합되어 도 2에 나타난 바와 같은 멜라닌의 구조를 형성하게 된다. 즉, 종래 방법에서는 티로신을 기질로 하고 타이로시나제를 촉매 효소로 하여 반응을 유도하는 것을 기반으로 하나, 아민기(-NH2) 및 엑시드기(-COOH)가 인돌(indole)의 고리 구조를 형성하는 과정의 합성 속도가 느려 효율이 낮다는 한계가 있다.
이에 따라 멜라닌 합성경로에서 주된 효소인 타이로시나제 및 이의 관련 단백질의 발현 수준 또는 활성 수준을 조절하여 멜라닌 합성 효율을 증가시키고자 하는 연구가 진행되고 있다(Plonka, Przemyslaw M., and Maja Grabacka., Acta Biochimica Polonica 53.3 (2006): 429-443; KR 1993-7001589 A1; US 2004/0014700 A1). 이 외에도 타이로시나제가 아닌 효소 및 전구체를 이용하는 연구에 대하여도 공지된 바 있으나(US 2011-0158970 A1), 멜라닌 화합물의 구조에 따라 물성이 다양하게 변할 수 있어 용도에 맞는 멜라닌 화합물을 생산하기 위한 연구가 계속되고 있다.
이에, 본 발명자들은 종래 멜라닌 합성 방법보다 빠른 속도로 멜라닌 색소를 합성할 수 있는 방법을 개발하고자 노력한 결과, 버크홀데리아 글루마에(Burkholderia glumae) 유래의 페룰릴-CoA 합성효소(FCS, feruloyl-CoA Synthetase) 및 에놀-CoA 수화효소/알돌라아제(ECH, enoyl-CoA hydratase/aldolase)를 공동 발현하는 재조합 대장균을 카페익산 포함 배지에 접종하여 배양하였을 때, 종래 합성 과정보다 빠른 속도로 멜라닌을 합성할 수 있음을 확인하여, 본 발명을 완성하였다.
상술한 바와 같이, 종래 멜라닌의 합성 경로는 L-티로신으로부터 티로시나제를 이용하여 디올(diol) 구조를 도입하여 멜라닌 염료를 합성하는 것에 주안점을 두고 효율 및 생산량을 증가시키기 위한 연구가 계속되고 있다.
따라서, 본 발명의 목적은 생물학적인 방법으로 멜라닌 색소를 생산하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또다른 목적은 상기 방법으로 생산된 멜라닌 색소를 제공하는 것이다.
상기 목적으로 달성하기 위해서, 본 발명은 페룰릴-CoA 합성효소(FCS, feruloyl-CoA Synthetase) 및 에놀-CoA 수화효소/알돌라아제(ECH, enoyl-CoA hydratase/aldolase)를 공동 발현하는 재조합 대장균을 배지에 접종하는 단계를 포함하는, 멜라닌 색소의 생산 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 방법으로 생산된 멜라닌 색소를 제공한다.
본 발명의 바람직한 일실시예에서, 상기 FCS는 서열번호 1로 기재되는 아미노산 서열로 구성되며, 상기 ECH는 서열번호 2로 기재되는 아미노산 서열로 구성될 수 있다.
본 발명의 또다른 바람직한 일실시예에서, 상기 FCS 및 ECH는 버크홀데리아 글루마에(Burkholderia glumae) 유래의 단백질일 수 있다.
본 발명의 또다른 바람직한 일실시예에서, 상기 배지는 카페익산(caffeic acid)를 포함할 수 있다.
따라서, 본 발명은 멜라닌 색소의 고속 생산 방법을 제공한다. 본 발명의 재조합 대장균은 페룰릴-CoA 합성효소(FCS, feruloyl-CoA Synthetase) 및 에놀-CoA 수화효소/알돌라아제(ECH, enoyl-CoA hydratase/aldolase)를 공동 발현하는 것을 통해 카페익산(caffeic acid)을 기질로 하여 멜라닌을 생산할 수 있다. 종래 기술에 따른 멜라닌 생성 방법은 L-티로신으로부터 시작하여 도파퀴논(dopaguinone)을 형성하고, 이로부터 엑시드(-COOH) 작용기가 결합된 멜라닌 화합물을 형성하는 것에 비해, 본 발명의 멜라닌 생산 방법에서는 카페익산으로부터 FCS 및 ECH에 의해 아세틸-CoA기를 가지는 멜라닌 화합물을 형성하여, 이에 따라 종래 기술에 비해 약 1.5 배 빠른 속도로 멜라닌을 생산할 수 있어, 멜라닌 생산 공정에서 효과적으로 사용될 수 있다.
도 1은 본 발명에서 카페익산을 기질로 하여 FCS 및 ECH에 의해 멜라닌을 생산하는 과정을 나타내는 합성 경로를 나타낸다.
도 2는 L-티로신을 기질로 하고 티로시나제를 통해 멜라닌을 생산하는 종래 기술의 멜라닌 합성 경로를 나타낸다.
도 3은 본 발명의 FCS 및 ECH를 공동 발현하는 재조합 균주에 형질전환하기 위한 플라드미드의 지도를 나타낸다.
도 4는 재조합 대장균에서 발현한 FCS 및 ECH의 발현을 확인한 결과를 나타낸다.
도 5는 재조합 대장균에서 FCS 및 ECH의 과발현에 따른 멜라닌 합성 효과를 확인한 결과를 나타낸다:
도 5a는 카페익산이 포함된 배지에서 FCS 및 ECH의 과발현 유도(우)에 따라 멜라닌이 생산된 배지를 FCS 및 ECH의 발현하지 않은 배지(좌)와 비교한 결과이고;
도 5b는 시간에 따른 배지 내 생산된 멜라닌의 농도를 나타낸다.
도 6은 멜라닌 합성 억제제의 첨가 여부에 따른 멜라닌 생산 효과를 비교한 결과를 나타낸다:
도 6a는 5 mM 카페익산이 포함된 배지에서 멜라닌을 생산한 결과의 배지이고;
도 6b는 5 mM 카페익산이 포함된 배지에서 아스코르빅 산을 첨가하였을 때 멜라닌 생산 유도 반응 결과의 배지이다.
이하, 본 발명을 상세하게 설명한다.
상술한 바와 같이, 종래 멜라닌의 합성 경로는 L-티로신으로부터 티로시나제를 이용하여 디올(diol) 구조를 도입하여 멜라닌 염료를 합성하는 것에 주안점을 두고 효율 및 생산량을 증가시키기 위한 연구가 계속되고 있다.
본 발명의 멜라닌 합성 경로에서는 페룰릴-CoA 합성효소(FCS, feruloyl-CoA Synthetase) 및 에놀-CoA 수화효소/알돌라아제(ECH, enoyl-CoA hydratase/aldolase)를 공동 발현하는 것을 통해 카페익산(caffeic acid)을 기질로 하여 멜라닌을 생산할 수 있으며, 이는 종래 기술에 비해 약 1.5 배 빠른 속도로 멜라닌을 생산할 수 있어, 멜라닌 생산 공정에서 효과적으로 사용될 수 있다.
따라서, 본 발명은 페룰릴-CoA 합성효소(FCS, feruloyl-CoA Synthetase) 및 에놀-CoA 수화효소/알돌라아제(ECH, enoyl-CoA hydratase/aldolase)를 공동 발현하는 재조합 대장균을 배지에 접종하는 단계를 포함하는, 멜라닌 색소의 생산 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 방법으로 생산된 멜라닌 색소를 제공한다.
본 발명의 멜라닌 색소의 생산 방법에 있어서, “FCS”는 서열번호 1로 기재되는 아미노산 서열로 구성되는 것이 바람직하며, 서열번호 3의 DNA 염기서열로 암호화되는 단백질일 수 있다. 또한, “ECH”는 서열번호 2로 기재되는 아미노산 서열로 구성되는 것이 바람직하고, 서열번호 4의 DNA 염기서열로 암호화되는 단백질일 수 있다. 보다 구체적으로, 상기 “FCS” 및“ECH”는 버크홀데리아 글루마에(Burkholderia glumae) 유래일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 멜라닌 색소의 생산 방법에 있어서, 카페익산(cafferic acid)를 전구체로서 첨가하는 것이 바람직하다. 종래 멜라닌 합성 방법의 기질로 사용되는 티로신과 비교하였을 때, 상기 카페익산은 이미 디올(diol) 구조를 가지고 있어 디올 구조의 반대편을 아세틸-CoA로 변경하면서 합성 과정이 진행될 수 있다. 이후, 대장균의 산화효소(oxidase)에 의해 디올이 디케톤(diketone) 현태로 변환되면 검정색의 멜라닌 색소로 전환될 수 있다. 상기 카페익산을 배지 내에 첨가할 때, 3 mM 이상의 농도로 첨가하는 것이 바람직하며, 구체적으로 5 mM 이상의 농도로 첨가하는 것이 보다 바람직하나, 이에 한정되지 않고 재조합 대장균에 의해 효율적인 멜라닌 합성이 가능 것으로 예상되는 범위의 첨가 농도로 카페익산을 첨가할 수 있다.
본 발명의 멜라닌 색소의 생산 방법에 있어서, “재조합 대장균”의 배양은 20 내지 40℃ 온도에서 15 내지 40 시간 동안 수행하는 것이 바람직하고, 구체적으로 30 내지 37℃ 온도에서 20 내지 30 시간 동안 수행하는 것이 보다 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 구체적인 실시예에서, 본 발명자들은 카페익산으로부터 멜라닌을 생합성하는 반응의 촉매로 사용하고자(도 1), 버크홀데리아 글루마에 BGR1 균주 유래의 FCS 및 ECH를 발현하기 위한 벡터를 구축하여 이를 형질전환한 재조합 대장균을 제조하였다(도 3 및 도 4).
또한, FCS 및 ECH를 공동 발현하는 재조합 대장균을 카페익산 첨가 배지에서 배양하였을 때 멜라닌이 생성될 수 있는지 확인한 결과, FCS 및 ECH를 과발현함에 따라 카페익산으로부터 멜라닌이 효과적으로 합성되며, 이 때의 생성 속도가 14.2 mg/L/hr임을 확인하여 이는 종래 티로신을 기질로 하여 멜라닌을 생산하는 방법에 비해 빠른 속도로 멜라닌을 생산할 수 있음을 확인하였다(도 5 및 도 6).
따라서, 본 발명의 멜라닌 생산 방법에서는 카페익산으로부터 FCS 및 ECH에 의해 아세틸-CoA기를 가지는 멜라닌 화합물을 형성하여, 이에 따라 종래 기술에 비해 약 1.5 배 빠른 속도로 멜라닌을 생산할 수 있어, 멜라닌 생산 공정에서 효과적으로 사용될 수 있다. 또한, 본 발명의 방법으로 생산된 멜라닌 색소는 종래 방법에 의해 생산되는 멜라닌과는 다른 구조를 가지고 있어, 본 발명의 멜라닌 색소를 산업적으로 이용하기 위한 용도를 다양하게 가질 수 있다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.
FCS ( feruloyl - CoA Synthetase ) 및 ECH ( enoyl - CoA hydratase / aldolase )를 과발현하는 재조합 대장균의 제조
본 발명에서 카페익산(caffeic acid)으로부터 멜라닌(melanin)을 생합성하는 반응의 촉매로 사용하고자, 버크홀데리아 글루마에 BGR1(Burkholderia glumae BGR1) 균주 유래의 FCS 및 ECH를 발현하는 재조합 대장균을 제조하였다.
구체적으로, 버크홀데리아 글루마에 유래의 FCS의 DNA 염기 서열(서열번호 3) 및 ECH의 DNA 염기 서열(서열번호 4)은 공지된 염기서열을 사용하였으며, 버크홀데리아 글루마에 BGR1(KCTC 구입) 유전체로부터 PCR로 fcs 및 ech 유전자를 각각 증폭하고, 이를 pET duet-1 벡터에 삽입하여 도 3의 pETDuet ::FCS::ECH 플라스미드를 구축하였다. 구축한 pETDuet ::FCS::ECH 플라스미드는 E. coli BL21(DE3)에 형질전환하고, 형질전환체를 50 ㎍/㎖ 앰피실린을 포함하는 LB 배지 2 ㎖에 접종하여 37℃에서 하루밤동안 전배양(seed culture)하였다. 전배양한 세포는 다시 50 ㎍/㎖ 앰피실린을 포함하는 LB 배지 50 ㎖로 옮겨, 37℃에서 OD600이 0.8이 될 때까지 200 rpm으로 진탕 배양하였다. 배양 배지의 OD600이 0.8에 도달하면, 최종 농도가 0.25 mM이 되도록 IPTG를 배지에 첨가한 후, 30℃에서 밤새 진탕 배양하였다. 세포 배양 종료 후, 1.5 ㎖의 세포 배양액을 수득하여 재조합 대장균을 원심분리로 수득하였다.
FCS 및 ECH의 발현이 효과적으로 나타나는지 확인하기 위해서, 수득한 재조합 대장균을 파쇄하여 세포 추출물을 수득하고, 이를 원심분리하여 상층액을 수용성 단백질 층으로 사용하고 침전물(pellet)을 불용성 단백질층으로 사용하여 SDS-PAGE를 수행하였다.
그 결과, 도 4에서 나타난 바와 같이 재조합 대장균에서 FCS 및 ECH가 공동으로 과발현되는 것을 확인하였으며, 이들의 분자량은 각각 69 kDa 및 30 kDa임을 확인하였다(도 4).
FCS ( feruloyl - CoA Synthetase ) 및 ECH ( enoyl - CoA hydratase / aldolase ) 과발현에 따른 멜라닌 합성
본 발명에서는 종래 멜라닌 생성 방법의 단점을 극복하기 위해, 디올(diol) 구조를 가지는 카페익산을 기질로 하여 디올 구조의 반대편을 아세틸-CoA로 변경함으로써, 기존 멜라닌 생성 속도보다 월등히 높은 속도로 멜라닌을 합성하고자 하였다(도 1).
이를 확인하기 위해, 상기 <실시예 1>에서 제조한 재조합 대장균을 이용하여 멜라닌 생성 반응을 수행하였다. 상기 재조합 대장균을 50 ㎍/㎖ 앰피실린을 포함하는 LB 배지 2 ㎖에 접종하여 37℃에서 하루밤동안 전배양하였다. 전배양한 세포는 다시 50 ㎍/㎖ 앰피실린 및 5 mM 카페익산을 포함하는 LB 배지 50 ㎖로 옮겨, 37℃에서 OD600이 0.8이 될 때까지 200 rpm으로 진탕 배양하였다. 배양 배지의 OD600이 0.8에 도달하면, 최종 농도가 0.25 mM이 되도록 IPTG를 배지에 첨가한 후, 30℃에서 12간 동안 진탕 배양하여 전세포 반응(whole cell production)을 수행하였다. 반응 종료 후, 배지를 수득하여 13,200 rpm에서 10 분 동안 원심분리하여 침전된 대장균 세포를 제거하고 상층액만을 수득한 다음, 400 ㎚에서 흡광도를 측정하여 멜라닌 생산량을 확인하였다. OD400 값을 이용하여 정량 분석하기 위해, OD400 값이 1.0일 때 0.066 g/ℓ 멜라닌이 포함된 것으로 결정하였다. 음성 대조군으로는 동일한 재조합 대장균에서 FCS 및 ECH를 발현하지 않고 동일 조건에서 전세포 반응을 수행하였다. 또한, 멜라닌 합성 여부를 확인하기 위한 대조군으로서는 멜라닌 합성 저해제인 아스코빅산(ascorbic acid)을 배지에 처리하고 동일 조건으로 FCS 및 ECH를 발현하여 전세포 반응을 수행하였다.
그 결과 도 5에서 나타난 바와 같이, 음성 대조군으로 대장균에서 FCS/ECH를 발현하지 않고 배지 내 5 mM 카페익산을 첨가하는 경우에는 대장균의 게놈에 존재하는 산화효소에 의해서 카라멜 계열의 옅은 멜라닌을 합성하는 것을 확인한 반면, FCS/ECH를 과발현 유도한 실험군 배지에서는 5 mM 카페익산으로부터 멜라닌이 빠른 속도로 합성되어 배지의 색이 진한 검정색을 나타내는 것을 확인하였다(도 5). 시간에 따라 배지를 수득하여 멜라닌 생산량을 확인하였을 때, FCS 및 ECH를 과발현한 재조합 대장균은 14.2 ㎎/ℓ/hr 수준의 멜라닌 생성 속도를 나타내는 것을 확인하였다(도 5b).
이와 함께 멜라닌 합성 저해제인 아스코빅산을 처리하여 동일 조건에서 멜라닌 합성 반응을 수행하였을 때, 멜라닌 형성이 저해되어 배지 색이 유의적으로 변화하지 않는 것을 확인하였다(도 6).
<110> AJOU UNIVERSITY INDUSTRY-ACADEMIC COOPERATION FOUNDATION <120> Method of producing melanin using E.coli overexpressing feruloyl-CoA Synthetase and enoyl-CoA hydratase/aldolase <130> 1062305 <160> 4 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 627 <212> PRT <213> Burkholderia glumae <400> 1 Met Glu Thr Asp His Arg Leu Gly Leu Ala Asn Pro Ala Gly Tyr Arg 1 5 10 15 His Val Ala Ile Gln Ala Ser Ala Pro His Val Glu Arg Arg Gly Glu 20 25 30 Cys Trp Tyr Leu Arg Ala Ser Ala Pro Leu Gly Ala Tyr Pro Ser Arg 35 40 45 Phe Thr Asp Arg Leu Val Ser Gly Ala Gln Ala His Pro Asp Arg Leu 50 55 60 Leu Val Ala Gln Arg Asp Ala Gln Gly Ala Trp Arg Gly Val Ser Tyr 65 70 75 80 Ala Gln Met Leu Glu Asn Ala Arg Ala Ile Gly Glu Ala Leu Leu Gly 85 90 95 Arg Gly Leu Ser Ala Glu Arg Pro Leu Ala Ile Leu Ser Gly Asn Ser 100 105 110 Ile Glu His Leu Gln Met Ala Leu Gly Ala Met Trp Ala Gly Ile Pro 115 120 125 Tyr Ala Pro Val Ser Pro Ala Tyr Ser Leu Ile Ser Gly Asp Phe Gly 130 135 140 Lys Leu Arg His Val Phe Glu Leu Leu Thr Pro Gly Leu Val Phe Ala 145 150 155 160 Asp Asp Leu Ala Ala Tyr Ala Ala Gly Leu Asp Ala Ala Leu Pro Arg 165 170 175 Asp Val Glu Arg Val Gly Val Ala Pro Gly Ala Gly Gly Ala Thr Pro 180 185 190 Phe Ala Ala Leu Leu Asp Thr Leu Pro Arg Asp Val Asp Ala Ala His 195 200 205 Ala Arg Val Asp Gly Asp Thr Ile Ala Lys Phe Leu Phe Thr Ser Gly 210 215 220 Ser Thr Arg Leu Pro Lys Ala Val Pro Thr Thr His Arg Met Leu Cys 225 230 235 240 Ala Asn Gln Gln Met Leu Leu Glu Thr Phe Pro Gln Phe Gly Ile Glu 245 250 255 Pro Pro Val Leu Val Asp Trp Leu Pro Trp Asn His Thr Phe Gly Gly 260 265 270 Ser His Asn Val Gly Ile Val Leu Tyr Asn Gly Gly Thr Leu Tyr Ile 275 280 285 Asp Gly Gly Lys Pro Val Ala Gly Lys Phe Asp Glu Thr Val Arg Asn 290 295 300 Leu His Glu Ile Ala Pro Thr Val Phe Phe Asn Val Pro Lys Gly Trp 305 310 315 320 Glu Glu Leu Thr Ala Ala Leu Glu Ala Asp Ala Ala Leu Arg Glu Arg 325 330 335 Phe Phe Ser Arg Val Lys Leu Tyr Phe Phe Ala Gly Ala Gly Leu Ser 340 345 350 Gln Ala Ala Trp Asp Arg Leu Glu Arg Val Thr Leu Ala His Cys Gly 355 360 365 Glu Arg Ile Arg Ile Met Ala Gly Leu Gly Met Thr Glu Thr Ala Pro 370 375 380 Ser Cys Leu Phe Thr Thr Gly Pro Val Ser Gly Ala Gly Tyr Ile Gly 385 390 395 400 Leu Pro Ala Pro Gly Cys Glu Ala Lys Ile Ala Pro Val Asp Gly Lys 405 410 415 Phe Glu Val Arg Phe Arg Gly Pro Asn Val Met Arg Gly Tyr Trp Arg 420 425 430 Met Pro Thr Ala Asn Ala Glu Ile Phe Asp Asp Glu Gly Tyr Tyr Arg 435 440 445 Ser Gly Asp Ala Val Arg Phe Val Asp Ser Glu Arg Pro Glu Leu Gly 450 455 460 Leu Ala Phe Asp Gly Arg Ile Ala Glu Asp Phe Lys Leu Gly Ser Gly 465 470 475 480 Thr Phe Val Ser Val Gly Pro Met Arg Ala Arg Ile Ile Ser Glu Gly 485 490 495 Ala Pro Tyr Val Gln Asp Ala Val Ile Thr Gly Met Asn Arg Asp Glu 500 505 510 Val Gly Ala Met Val Phe Pro Arg Val Asp Ala Cys Arg Ser Leu Ala 515 520 525 Gly Leu Gly Arg Asp Ala Gly Val Ala Asp Val Leu Asn Ala Pro Ala 530 535 540 Val Arg Ala Phe Phe Ala Ala Leu Leu Asp Lys Leu Asn Gln His Ala 545 550 555 560 Thr Gly Ser Ala Thr Leu Ile Ala Arg Leu Arg Leu Leu Ala Val Pro 565 570 575 Pro Ser Leu Asp Leu Gly Glu Val Thr Asp Lys Gly Ser Ile Asn Gln 580 585 590 Arg Ala Val Leu Gln His Arg Ala Ala Leu Val Asp Ala Met His Asp 595 600 605 Gly Gly Asp Pro Glu Val Ile Glu Ala Arg Glu Arg Arg Gly Gln Ala 610 615 620 Ala Arg Pro 625 <210> 2 <211> 275 <212> PRT <213> Burkholderia glumae <400> 2 Met Ser Tyr Glu Gly Arg Trp Thr Thr Val Lys Val Thr Val Glu Ala 1 5 10 15 Gly Ile Gly Trp Val Val Leu Asn Arg Pro Glu Lys Arg Asn Ala Met 20 25 30 Ser Pro Thr Leu Asn Lys Glu Met Ile Asp Val Leu Glu Thr Leu Glu 35 40 45 Leu Asp Asp Glu Ala Gln Val Leu Val Leu Thr Gly Glu Gly Asp Ala 50 55 60 Trp Thr Ala Gly Met Asp Leu Lys Glu Tyr Phe Arg Glu Val Asp Ala 65 70 75 80 Ala Ser Asp Val Val Gln Glu Arg Ile Arg Arg Asp Ala Ser Arg Trp 85 90 95 Gln Trp Gln Leu Leu Arg Met Tyr Ser Lys Pro Thr Ile Ala Met Val 100 105 110 Asn Gly Trp Cys Phe Gly Gly Gly Phe Ser Pro Leu Val Ala Cys Asp 115 120 125 Leu Ala Ile Ala Ala Asp Glu Ala Thr Phe Gly Leu Ser Glu Ile Asn 130 135 140 Trp Gly Ile Pro Pro Gly Asn Leu Val Ser Lys Ala Met Ala Asp Thr 145 150 155 160 Val Gly His Arg Gln Ala Leu Tyr Tyr Ile Met Thr Gly Asp Thr Phe 165 170 175 Thr Gly Lys Gln Ala Ala Gln Met Gly Leu Val Asn Gln Ser Val Pro 180 185 190 Arg Ala Ala Leu Arg Glu Ala Thr Val Ala Leu Ala Ala Lys Leu Leu 195 200 205 Asp Lys Asn Pro Val Val Leu Arg Asn Ala Lys His Gly Phe Lys Arg 210 215 220 Ser Arg Glu Leu Thr Trp Glu Gln Asn Glu Asp Tyr Leu Tyr Ala Lys 225 230 235 240 Leu Asp Gln Ala Asn Tyr Arg Asp Lys Glu Gly Gly Arg Glu Lys Gly 245 250 255 Leu Lys Gln Phe Leu Asp Asp Lys Ser Ile Lys Pro Gly Leu Gln Ala 260 265 270 Tyr Lys Arg 275 <210> 3 <211> 1884 <212> DNA <213> Burkholderia glumae <400> 3 ttggaaacgg accaccgcct tggattggcg aacccagccg gataccggca tgtcgccatc 60 caggccagcg caccgcatgt cgagcgtcgc ggcgagtgct ggtacctgcg cgcgagcgcg 120 ccgctcggcg cttatccgtc gcgcttcacg gaccggctcg tcagtggcgc gcaagcgcac 180 cccgaccggc tgctggtggc gcagcgcgac gcgcaaggcg cctggcgcgg cgtgagctac 240 gcgcagatgc tcgagaatgc acgcgcgatc ggcgaggccc tgctcggccg cggcctgagc 300 gccgagcggc cgctcgcgat cctgtccggc aacagcatcg agcacctgca aatggcactg 360 ggcgcgatgt gggcgggcat cccctatgcg ccggtctcgc ccgcctattc gctgatctcg 420 ggcgatttcg gcaagctgcg ccacgtgttc gagctgctca cgccgggcct ggtgttcgcc 480 gacgacctcg cggcctatgc ggccggcctc gacgcggcct tgccgcgcga cgtcgagcgg 540 gtcggcgtgg cgcccggcgc gggcggcgcc acgccgtttg cggcgctgct cgacacgctc 600 ccgcgcgacg tcgatgcggc gcacgcacgg gtggatggcg acacgatcgc gaaatttctg 660 ttcacctccg gctcgacgcg tctgccgaaa gcggtgccga ccacgcaccg gatgctgtgc 720 gccaatcagc agatgctgct cgaaaccttt ccgcagttcg gtatcgagcc gccggtgctg 780 gtcgactggc tgccgtggaa ccacacgttc ggcggcagcc ataacgtcgg catcgtgctg 840 tacaacggcg gcacgctgta tatcgacggc ggcaagccgg tggcgggcaa gttcgacgag 900 acggtgcgca atctgcacga gatcgcgccc accgtgttct tcaacgtgcc caagggctgg 960 gaggaactga cggccgcgct ggaagccgat gcggcgctgc gcgagcgctt tttctcgcgc 1020 gtgaagctgt acttctttgc cggcgcgggc ttgtcccagg ccgcctggga ccggctcgag 1080 cgcgtgacgc tggcgcattg cggcgagcgc atccgcatca tggcggggct cggcatgacg 1140 gagaccgccc cctcgtgcct gttcaccacc ggcccggtat cgggcgcggg gtacatcggc 1200 ctgcccgcgc cgggctgcga ggcgaagatc gcgccggtcg acggcaagtt cgaggtgcgt 1260 ttccgcgggc cgaacgtgat gcgcggctac tggcgcatgc ccaccgccaa cgcggagatc 1320 ttcgacgacg aaggctacta ccgcagcggc gacgccgtgc gtttcgtcga cagcgagcgg 1380 ccggaactgg ggctcgcctt cgacgggcgc atcgccgagg acttcaagct cggctcgggc 1440 accttcgtga gcgtcgggcc gatgcgcgcg cgcatcatct cggagggcgc gccctatgtg 1500 caggacgcgg tcatcaccgg catgaatcgc gacgaagtgg gcgccatggt gtttccccgt 1560 gtcgacgcct gccgctcgct cgcgggcctg ggccgggacg cgggcgtggc ggacgtgctc 1620 aacgcgccgg cggtgcgggc gttcttcgcg gcgctgctcg acaagctcaa ccagcacgcc 1680 accggcagcg cgacgttgat tgccaggctg cggctgctgg cggtgccgcc ctcgctcgat 1740 ctcggcgagg tgaccgacaa aggctcgatc aaccagcgcg cggtgctcca gcatcgcgcc 1800 gcgctggtcg acgccatgca tgacggcggc gatccggagg tcatcgaggc gcgcgagcgc 1860 cgcggccagg cggcacgacc atga 1884 <210> 4 <211> 828 <212> DNA <213> Burkholderia glumae <400> 4 atgagctacg aaggtcgctg gacaacggtc aaggtcacgg tcgaggcggg catcggctgg 60 gtggtgctga atcgccccga gaagcgcaac gcgatgagcc cgacgctgaa caaggaaatg 120 atcgacgtgc tcgaaacgct cgagctcgac gacgaggcgc aggtgctggt actgaccggc 180 gaaggcgatg cgtggaccgc cggcatggac ctgaaggaat atttccgcga ggtggacgcg 240 gcctcggacg tggtgcagga gcgcattcgc cgcgacgcga gccgctggca atggcaactg 300 ctgcgcatgt attcgaagcc gaccatcgcg atggtcaacg gctggtgttt cggcggcggg 360 ttttcgccgc tcgtcgcctg cgatctcgcc atcgccgccg acgaggccac cttcggcctg 420 tccgaaatca actggggcat tccccccggc aacctggtga gcaaggccat ggcggacacc 480 gtcggccatc gccaggcgct ctactacatc atgaccggcg acaccttcac cggcaagcag 540 gccgcgcaga tgggcctggt caaccagagc gtgccgcgcg cggccttgcg cgaggcgacc 600 gtcgcgctcg cggccaagct gctcgacaag aacccggtgg tgctgcgcaa cgcgaagcac 660 ggcttcaagc gcagccgcga actgacctgg gagcagaacg aggactacct gtacgccaag 720 ctcgaccagg ccaattatcg cgacaaggaa ggcggccgcg aaaagggcct caagcagttt 780 ctcgacgaca agagcatcaa gccgggcctg caagcctaca agcgctga 828

Claims (5)

  1. 페룰릴-CoA 합성효소(FCS, feruloyl-CoA Synthetase) 및 에놀-CoA 수화효소/알돌라아제(ECH, enoyl-CoA hydratase/aldolase)를 공동 발현하는 재조합 대장균을 배지에 접종하는 단계를 포함하는, 멜라닌 색소의 생산 방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 FCS는 서열번호 1로 기재되는 아미노산 서열로 구성되며, 상기 ECH는 서열번호 2로 기재되는 아미노산 서열로 구성되는 것을 특징으로 하는, 멜라닌 색소의 생산 방법.
  3. 제 1항에 있어서, 상기 FCS 및 ECH는 버크홀데리아 글루마에(Burkholderia glumae) 유래의 단백질인 것을 특징으로 하는, 멜라닌 색소의 생산 방법.
  4. 제 1항에 있어서, 상기 배지는 카페익산(caffeic acid)를 포함하는 것을 특징으로 하는, 멜라닌 색소의 생산 방법.
  5. 카페익산 기반의 멜라닌 색소로서,
    페룰릴-CoA 합성효소(FCS, feruloyl-CoA Synthetase) 및 에놀-CoA 수화효소/알돌라아제(ECH, enoyl-CoA hydratase/aldolase)를 공동 발현하는 재조합 대장균에 의해, 기질인 카페익산으로부터 형성된 아세틸-CoA기를 포함하는 멜라닌 색소.
KR1020170068357A 2017-06-01 2017-06-01 페룰릴-CoA 합성효소 및 에놀-CoA 수화효소/알돌라아제 과발현 대장균을 이용하는 멜라닌 생산 방법 KR101933919B1 (ko)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020170068357A KR101933919B1 (ko) 2017-06-01 2017-06-01 페룰릴-CoA 합성효소 및 에놀-CoA 수화효소/알돌라아제 과발현 대장균을 이용하는 멜라닌 생산 방법

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020170068357A KR101933919B1 (ko) 2017-06-01 2017-06-01 페룰릴-CoA 합성효소 및 에놀-CoA 수화효소/알돌라아제 과발현 대장균을 이용하는 멜라닌 생산 방법

Publications (2)

Publication Number Publication Date
KR20180131800A KR20180131800A (ko) 2018-12-11
KR101933919B1 true KR101933919B1 (ko) 2018-12-31

Family

ID=64671996

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020170068357A KR101933919B1 (ko) 2017-06-01 2017-06-01 페룰릴-CoA 합성효소 및 에놀-CoA 수화효소/알돌라아제 과발현 대장균을 이용하는 멜라닌 생산 방법

Country Status (1)

Country Link
KR (1) KR101933919B1 (ko)

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2014106189A2 (en) 2012-12-31 2014-07-03 Conagen Inc. Methods of making vanillin via microbial fermentation utilizing ferulic acid provided by a modified caffeic acid 3-o-methyltransferase

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2014106189A2 (en) 2012-12-31 2014-07-03 Conagen Inc. Methods of making vanillin via microbial fermentation utilizing ferulic acid provided by a modified caffeic acid 3-o-methyltransferase

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Microbial Cell Factories, Vol. 12, pp. 108(1-12)
PLoS ONE, Vol. 8, pp. e67339 (2013.06.28.)

Also Published As

Publication number Publication date
KR20180131800A (ko) 2018-12-11

Similar Documents

Publication Publication Date Title
KR19990088053A (ko) 이소프레노이드의향상된생산방법
AU2018317127B2 (en) Microorganism For Producing A Mycosporine-Like Amino Acid And Method For Producing A Mycosporine-Like Amino Acid Using The Same
CN112292452B (zh) 生产霉孢菌素样氨基酸的微生物及利用其生产霉孢菌素样氨基酸的方法
KR101933919B1 (ko) 페룰릴-CoA 합성효소 및 에놀-CoA 수화효소/알돌라아제 과발현 대장균을 이용하는 멜라닌 생산 방법
CN115433728A (zh) 一种羽叶丁香倍半萜合酶及其应用
KR102343992B1 (ko) 신규 (-)-알파-비사볼올 합성효소 및 이를 이용한 (-)-알파 비사볼올 생산 방법
KR100984480B1 (ko) β-글루코시다아제를 코딩하는 유전자를 포함하는 형질전환미생물 및 그를 이용한 인디고 염료의 생산 방법
CN107109393B (zh) 用于生产冷杉醇的方法
KR102059269B1 (ko) 프로토카테츄알데히드 기반의 멜라닌 색소를 포함하는 코팅제 및 이의 응용
KR101941745B1 (ko) 아실전이효소의 활성을 갖는 미생물 및 이의 용도
CN109097315B (zh) 一种高产脂肽的基因工程菌及其构建方法和应用
KR102026836B1 (ko) 토양 메타게놈 유래 신규 리파아제 유전자 Lip-1420 및 이의 용도
KR101523516B1 (ko) 남세균 유래 자외선/녹색 광호변성 색소 단백질 및 이의 용도
CN109402188A (zh) 一种来自短小芽孢杆菌的ω-转氨酶及在生物胺化中的应用
KR100560621B1 (ko) 재조합 아릴설파타제를 이용한 고순도 아가로즈의 제조방법
KR20130128663A (ko) 탄산무수화 효소 및 포스포에놀피루브산 카르복실화 효소를 이용한 유기산 생산 시스템
CN102812125B (zh) 来自于稀脉萍的脂加氧酶
KR102093509B1 (ko) 알로스 제조용 조성물 및 알로스 제조방법
KR101071274B1 (ko) 미생물 유래의 사슬형 트랜스아미나제를 이용한 Ｌ-6-ｈｙｄｒｏｘｙｎｏｒｌｅｕｃｉｎｅ의 생산방법
In et al. Production of porphyra-334 in transgenic lines of Nannochloropsis salina by the expression of mycosporine-like amino acid biosynthetic genes of P. yezoensis
KR101891234B1 (ko) 신규 프로테아제
KR20150134779A (ko) 해수 소택지 박테리아 유래의 신규 재조합 티로시나아제
KR101715882B1 (ko) 신규 ε-카프로락탐 전환 효소 및 이를 이용한 ε-카프로락탐 생산 방법
JP4535812B2 (ja) フェノールオキシダーゼ遺伝子及びフェノールオキシダーゼの製造方法
KR101500952B1 (ko) 남세균 유래 자외선/녹색 광호변성 색소 단백질 및 이의 용도

Legal Events

Date Code Title Description
A201 Request for examination
E902 Notification of reason for refusal
E701 Decision to grant or registration of patent right
GRNT Written decision to grant