KR102059269B1 - 프로토카테츄알데히드 기반의 멜라닌 색소를 포함하는 코팅제 및 이의 응용 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 프로토카테츄알데히드 기반의 멜라닌 색소를 포함하는 코팅제 및 이의 응용에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 컨택트 렌즈 등의 코팅 소재로 활용 가능한 코팅제와 이의 응용 기술에 관한 것이다.
본 발명에 따르면, 페룰릴-CoA 합성효소(FCS, feruloyl-CoA Synthetase) 및 에놀-CoA 수화효소/알돌라아제(ECH, enoyl-CoA hydratase/aldolase)를 공동 발현하는 재조합 대장균을 적용함으로써, 종래 합성 과정보다 빠른 속도로 프로토카테츄알데히드 기반의 멜라닌 색소를 합성할 수 있다. 상기 멜라닌 색소는 컨택트 렌즈 등 다양한 기재의 코팅 소재로 활용 가능하다. 또한 상기 멜라닌 색소는 종래 컨택트 렌즈 코팅 소재에 비해 생체 적합성이 우수하며, 높은 UV 차단 효과, 함수율 및 산소 투과율을 높게 유지할 수 있어 기능성 코팅 소재로 활용할 수 있다.
본 발명에 따르면, 페룰릴-CoA 합성효소(FCS, feruloyl-CoA Synthetase) 및 에놀-CoA 수화효소/알돌라아제(ECH, enoyl-CoA hydratase/aldolase)를 공동 발현하는 재조합 대장균을 적용함으로써, 종래 합성 과정보다 빠른 속도로 프로토카테츄알데히드 기반의 멜라닌 색소를 합성할 수 있다. 상기 멜라닌 색소는 컨택트 렌즈 등 다양한 기재의 코팅 소재로 활용 가능하다. 또한 상기 멜라닌 색소는 종래 컨택트 렌즈 코팅 소재에 비해 생체 적합성이 우수하며, 높은 UV 차단 효과, 함수율 및 산소 투과율을 높게 유지할 수 있어 기능성 코팅 소재로 활용할 수 있다.
Description
본 발명은 프로토카테츄알데히드 기반의 멜라닌 색소를 포함하는 코팅제 및 이의 응용에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 컨택트 렌즈 등의 코팅 소재로 활용 가능한 코팅제와 이의 응용 기술에 관한 것이다.
멜라닌(melanin)은 일반적으로 페놀 또는 인돌 화합물이 산화ㅇ중합된 고분자 화합물을 총칭하며, 갈색 또는 검은색을 띠는 특징이 있어 색소로 사용된다. 멜라닌은 동식물계에 널리 분포하며, 멜라닌 색소에 의해 사람 및 동물의 피부 및 모발 등의 색이 결정된다. 멜라닌은 불용성이며 무정형이고 그 형태가 일정하지 않기 때문에 현재는 정확한 구조를 분석하는데 어려움이 있는 것으로 알려져 있다.
멜라닌이 인간을 비롯한 동식물 내에서 흔히 사용되는 색소인 만큼, 멜라닌을 색소로 사용하기 위한 방법 또한 개발되었다. 종래 멜라닌 생성 방법은 L-티로신으로부터 시작한다. 이후, 타이로시나제(tyrosinase)를 이용하여 DOPA(L-3,4-dihydroxyphenylalanine)을 합성한 이후 동일한 효소를 이용하여 도파퀴논(dopaquinone)의 오른쪽 말단의 아민기(-NH2) 및 엑시드기(-COOH)가 인돌(indole)의 고리 구조를 형성하게 되고, 동일한 화합물이 연속적으로 C-C 결합으로 결합되어 멜라닌의 구조를 형성하게 된다. 즉, 종래 방법에서는 티로신을 기질로 하고 타이로시나제를 촉매 효소로 하여 반응을 유도하는 것을 기반으로 하나, 아민기(-NH2) 및 엑시드기(-COOH)가 인돌(indole)의 고리 구조를 형성하는 과정의 합성 속도가 느려 효율이 낮다는 한계가 있다. 이에 따라 멜라닌 합성경로에서 주된 효소인 타이로시나제 및 이의 관련 단백질의 발현 수준 또는 활성 수준을 조절하여 멜라닌 합성 효율을 증가시키고자 하는 연구가 진행되고 있다(Plonka, Przemyslaw M., and Maja Grabacka., Acta Biochimica Polonica 53.3 (2006): 429-443; KR 1993-7001589 A1; US 2004/0014700 A1). 이 외에도 타이로시나제가 아닌 효소 및 전구체를 이용하는 연구에 대하여도 공지된 바 있으나(US 2011-0158970 A1), 멜라닌 화합물의 구조에 따라 물성이 다양하게 변할 수 있어 용도에 맞는 멜라닌 화합물을 생산하기 위한 연구가 계속되고 있다.
한편, 일반적으로 태양광에는 각종 유해광선이 포함되어 있으며, 특히 자외선의 경우 각막, 수정체를 통과하여 망막에까지 이르러, 지속적으로 노출될 경우 각막 손상이나 백내장, 망막염 등의 원인이 되기도 한다. 특히 눈은 그 구조상 태양광에 직접적으로 노출될 수밖에 없고 이를 차단하기 위해 이미 오래전부터 안경, 선글라스, 콘택트 렌즈 등의 형태로 시장에 선보이고 있었다. 이 중 콘택트렌즈는 안구로 들어오는 자외선을 차단하는 가장 효과적인 도구로써 건강에 대한 사람들의 관심이 점점 높아져 가는 추세에 맞추어 눈 건강을 위한 좋은 수단으로 인식시킬 수 있는 자외선 차단기능을 가진 콘택트렌즈의 개발은 필수적이라 할 수 있다.
이에 본 발명에서는 생합성한 프로토카테츄알데히드 기반의 멜라닌을 콘택트 렌즈 등의 코팅 소재로 활용한 기술을 제공하고자 한다.
본 발명은 페룰릴-CoA 합성효소(FCS, feruloyl-CoA Synthetase) 및 에놀-CoA 수화효소/알돌라아제(ECH, enoyl-CoA hydratase/aldolase)를 공동 발현하는 재조합 대장균을 이용한 멜라닌을 포함하는 코팅제와, 이를 이용한 코팅막 및 코팅막의 형성방법를을 제공한다.
아울러 상기 코팅제로 코팅된 컨택트 렌즈와 상기 코팅제를 적용하여 컨택트 렌즈를 코팅하는 방법을 제공한다.
본 발명은 페룰릴-CoA 합성효소(FCS, feruloyl-CoA Synthetase) 및 에놀-CoA 수화효소/알돌라아제(ECH, enoyl-CoA hydratase/aldolase)를 공동 발현하는 재조합 대장균을 배양하여 제조한 멜라닌 색소를 포함하는 코팅제를 제공한다.
상기 FCS는 서열번호 1로 기재되는 아미노산 서열로 구성될 수 있다.
상기 ECH는 서열번호 2로 기재되는 아미노산 서열로 구성될 수 있다.
상기 FCS 및 ECH는 버크홀데리아 글루마에(Burkholderia glumae) 유래의 단백질일 수 있다.
상기 배양은 카페익산(caffeic acid)을 포함하는 배지에서 수행할 수 있다.
또한 본 발명은, 페룰릴-CoA 합성효소(FCS, feruloyl-CoA Synthetase) 및 에놀-CoA 수화효소/알돌라아제(ECH, enoyl-CoA hydratase/aldolase)를 공동 발현하는 재조합 대장균을 배지에 접종하여 멜라닌 색소를 기재 상에 도포하여 제조한 코팅막을 제공한다.
상기 기재는 유리, 플라스틱 및 합성수지로 이루어진 군에서 선택될 수 있다.
또한 본 발명은, 페룰릴-CoA 합성효소(FCS, feruloyl-CoA Synthetase) 및 에놀-CoA 수화효소/알돌라아제(ECH, enoyl-CoA hydratase/aldolase)를 공동 발현하는 재조합 대장균을 배지에 접종하고 배양하여 멜라닌 색소를 생산하는 단계; 및 상기 멜라닌 색소를 기재 상에 도포하는 단계를 포함하는 코팅막의 형성방법을 제공한다.
또한 본 발명은, 페룰릴-CoA 합성효소(FCS, feruloyl-CoA Synthetase) 및 에놀-CoA 수화효소/알돌라아제(ECH, enoyl-CoA hydratase/aldolase)를 공동 발현하는 재조합 대장균을 배양하여 제조한 멜라닌 색소를 포함하는 코팅제가 도포된 컨택트 렌즈를 제공한다.
아울러 본 발명은, 페룰릴-CoA 합성효소(FCS, feruloyl-CoA Synthetase) 및 에놀-CoA 수화효소/알돌라아제(ECH, enoyl-CoA hydratase/aldolase)를 공동 발현하는 재조합 대장균을 배지에 접종하고 배양하여 멜라닌 색소를 생산하는 단계; 및 상기 멜라닌 색소를 컨택트 렌즈 상에 도포하는 단계를 포함하는 컨택트 렌즈의 코팅방법을 제공한다.
본 발명에 따르면, 페룰릴-CoA 합성효소(FCS, feruloyl-CoA Synthetase) 및 에놀-CoA 수화효소/알돌라아제(ECH, enoyl-CoA hydratase/aldolase)를 공동 발현하는 재조합 대장균을 적용함으로써, 종래 합성 과정보다 빠른 속도로 프로토카테츄알데히드 기반의 멜라닌 색소를 합성할 수 있다. 상기 멜라닌 색소는 컨택트 렌즈 등 다양한 기재의 코팅 소재로 활용 가능하다. 또한 상기 멜라닌 색소는 종래 컨택트 렌즈 코팅 소재에 비해 생체 적합성이 우수하며, 높은 UV 차단 효과, 함수율 및 산소 투과율을 높게 유지할 수 있어 기능성 코팅 소재로 활용할 수 있다.
도 1은 본 발명의 일 실시예에서, 카페익산을 기질로 하여 FCS 및 ECH에 의해 합성한 멜라닌 색소 컨택트 렌즈 코팅 소재로 적용하는 과정을 개략적으로 나타내는 것이다.
도 2는 비교예(대조군)로 사용하기 위한 합성 멜라닌(L-타이로신 멜라닌)과 천연 멜라닌을 나타내는 것이다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에서, FCS 및 ECH를 공동 발현하는 재조합 균주를 형질전환하기 위한 플라드미드의 지도를 나타내는 것이다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따른 재조합 대장균에서 발현한 FCS 및 ECH의 발현을 확인한 결과를 나타내는 것이다.
도 5는 본 발명의 일 실시예에 따른 재조합 대장균에서 FCS 및 ECH의 과발현에 따른 멜라닌 합성 효과를 확인한 결과를 나타내는 것이다:
도 5a는 카페익산이 포함된 배지에서 FCS 및 ECH의 과발현 유도(우)에 따라 멜라닌이 생산된 배지를 FCS 및 ECH의 발현하지 않은 배지(좌)와 비교한 결과이고; 도 5b는 시간에 따른 배지 내 생산된 멜라닌의 농도를 나타내는 것이다.
도 6은 멜라닌 합성 억제제의 첨가 여부에 따른 멜라닌 생산 효과를 비교한 결과를 나타내는 것이다: 도 6a는 5 mM 카페익산이 포함된 배지에서 멜라닌을 생산한 결과의 배지이고; 도 6b는 5 mM 카페익산이 포함된 배지에서 아스코르빅 산을 첨가하였을 때 멜라닌 생산 유도 반응 결과의 배지이다.
도 7은 본 발명의 실시예 및 비교예에 따른 멜라닌 색소의 컨택트 렌즈 코팅 성능을 비교한 결과를 나타내는 것이다.
도 8은 본 발명의 실시예 및 비교예에 따른 멜라닌 색소의 세포 독성을 비교한 결과를 나타내는 것이다.
도 9는 본 발명의 실시예 및 비교예에 따른 멜라닌 색소의 항산화 효능을 분석한 결과를 나타내는 것이다.
도 10은 본 발명의 실시예 및 비교예에 따른 멜라닌 색소의 세포 성장 저해 효과를 분석한 결과를 나타내는 것이다.
도 11은 본 발명의 실시예 및 비교예에 따른 멜라닌 색소의 착색 효과를 비교한 결과를 나타내는 것이다.
도 12는 본 발명의 실시예 및 비교예에 따른 멜라닌 색소의 색차 테스트 결과를 나타내는 것이다.
도 2는 비교예(대조군)로 사용하기 위한 합성 멜라닌(L-타이로신 멜라닌)과 천연 멜라닌을 나타내는 것이다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에서, FCS 및 ECH를 공동 발현하는 재조합 균주를 형질전환하기 위한 플라드미드의 지도를 나타내는 것이다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따른 재조합 대장균에서 발현한 FCS 및 ECH의 발현을 확인한 결과를 나타내는 것이다.
도 5는 본 발명의 일 실시예에 따른 재조합 대장균에서 FCS 및 ECH의 과발현에 따른 멜라닌 합성 효과를 확인한 결과를 나타내는 것이다:
도 5a는 카페익산이 포함된 배지에서 FCS 및 ECH의 과발현 유도(우)에 따라 멜라닌이 생산된 배지를 FCS 및 ECH의 발현하지 않은 배지(좌)와 비교한 결과이고; 도 5b는 시간에 따른 배지 내 생산된 멜라닌의 농도를 나타내는 것이다.
도 6은 멜라닌 합성 억제제의 첨가 여부에 따른 멜라닌 생산 효과를 비교한 결과를 나타내는 것이다: 도 6a는 5 mM 카페익산이 포함된 배지에서 멜라닌을 생산한 결과의 배지이고; 도 6b는 5 mM 카페익산이 포함된 배지에서 아스코르빅 산을 첨가하였을 때 멜라닌 생산 유도 반응 결과의 배지이다.
도 7은 본 발명의 실시예 및 비교예에 따른 멜라닌 색소의 컨택트 렌즈 코팅 성능을 비교한 결과를 나타내는 것이다.
도 8은 본 발명의 실시예 및 비교예에 따른 멜라닌 색소의 세포 독성을 비교한 결과를 나타내는 것이다.
도 9는 본 발명의 실시예 및 비교예에 따른 멜라닌 색소의 항산화 효능을 분석한 결과를 나타내는 것이다.
도 10은 본 발명의 실시예 및 비교예에 따른 멜라닌 색소의 세포 성장 저해 효과를 분석한 결과를 나타내는 것이다.
도 11은 본 발명의 실시예 및 비교예에 따른 멜라닌 색소의 착색 효과를 비교한 결과를 나타내는 것이다.
도 12는 본 발명의 실시예 및 비교예에 따른 멜라닌 색소의 색차 테스트 결과를 나타내는 것이다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세하게 설명한다. 본 발명의 목적, 특징, 장점은 이하의 실시예를 통하여 쉽게 이해될 것이다. 본 발명은 여기서 설명하는 실시예에 한정되지 않고, 다른 형태로 구체화될 수도 있다. 여기서 소개되는 실시예는 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 본 발명의 사상이 충분히 전달될 수 있도록 하기 위해 제공되는 것이다. 따라서 이하의 실시예에 의해 본 발명이 제한되어서는 안 된다.
이하, 본 발명을 보다 상세하게 설명한다.
상술한 바와 같이, 종래 멜라닌의 합성 경로는 L-티로신으로부터 티로시나제를 이용하여 디올(diol) 구조를 도입하여 멜라닌 염료를 합성하는 것에 주안점을 두고 효율 및 생산량을 증가시키기 위한 연구가 계속되고 있다.
본 발명의 멜라닌 합성 경로에서는 페룰릴-CoA 합성효소(FCS, feruloyl-CoA Synthetase) 및 에놀-CoA 수화효소/알돌라아제(ECH, enoyl-CoA hydratase/aldolase)를 공동 발현하는 것을 통해 카페익산(caffeic acid)을 기질로 하여 멜라닌을 생산할 수 있으며, 이는 종래 기술에 비해 약 1.5 배 빠른 속도로 멜라닌을 생산할 수 있어, 멜라닌 생산 공정에서 효과적으로 사용될 수 있다.
본 발명은 페룰릴-CoA 합성효소(FCS, feruloyl-CoA Synthetase) 및 에놀-CoA 수화효소/알돌라아제(ECH, enoyl-CoA hydratase/aldolase)를 공동 발현하는 재조합 대장균을 배양하여 제조한 멜라닌 색소를 포함하는 코팅제를 제공한다.
상기 "FCS"는 서열번호 1로 기재되는 아미노산 서열로 구성되는 것이 바람직하며, 서열번호 3의 DNA 염기서열로 암호화되는 단백질일 수 있다. 또한, "ECH"는 서열번호 2로 기재되는 아미노산 서열로 구성되는 것이 바람직하고, 서열번호 4의 DNA 염기서열로 암호화되는 단백질일 수 있다. 보다 구체적으로, 상기 "FCS" 및"ECH"는 버크홀데리아 글루마에(Burkholderia glumae) 유래일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
상기 멜라닌 색소를 제조하는 과정에 있어서, 카페익산(cafferic acid)을 전구체로서 첨가하는 것이 바람직하다. 종래 멜라닌 합성 방법의 기질로 사용되는 티로신과 비교하였을 때, 상기 카페익산은 이미 디올(diol) 구조를 가지고 있어 디올 구조의 반대편을 아세틸-CoA로 변경하면서 합성 과정이 진행될 수 있다. 이후, 대장균의 산화효소(oxidase)에 의해 디올이 디케톤(diketone) 현태로 변환되면 검정색의 멜라닌 색소로 전환될 수 있다. 상기 카페익산을 배지 내에 첨가할 때, 3 mM 이상의 농도로 첨가하는 것이 바람직하며, 구체적으로 5 mM 이상의 농도로 첨가하는 것이 보다 바람직하나, 이에 한정되지 않고 재조합 대장균에 의해 효율적인 멜라닌 합성이 가능한 것으로 예상되는 범위의 첨가 농도로 카페익산을 첨가할 수 있다.
상기 멜라닌 색소의 제조 과정에서, "재조합 대장균"의 배양은 20 내지 40℃ 온도에서 15 내지 40 시간 동안 수행하는 것이 바람직하고, 구체적으로 30 내지 37℃ 온도에서 20 내지 30 시간 동안 수행하는 것이 보다 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.
또한 본 발명은 페룰릴-CoA 합성효소(FCS, feruloyl-CoA Synthetase) 및 에놀-CoA 수화효소/알돌라아제(ECH, enoyl-CoA hydratase/aldolase)를 공동 발현하는 재조합 대장균을 배지에 접종하여 멜라닌 색소를 기재 상에 도포하여 제조한 코팅막을 제공할 수 있다.
상기 기재는 유리, 플라스틱 및 합성수지로 이루어진 군에서 선택될 수 있다.
상기 합성수지는 폴리메칠메타크릴레이트(PMMA), 실록사닐 메타크릴레이트(siloxanyl methacrylate) 및 HEMA (Hydroxyethyl)methacrylate)로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상을 포함할 수 있다.
상기 도포는 스프레이 코팅, 스핀코팅, 딥코팅 또는 슬롯다이 코팅의 방법으로 수행될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
또한 본 발명은 페룰릴-CoA 합성효소(FCS, feruloyl-CoA Synthetase) 및 에놀-CoA 수화효소/알돌라아제(ECH, enoyl-CoA hydratase/aldolase)를 공동 발현하는 재조합 대장균을 배지에 접종하고 배양하여 멜라닌 색소를 생산하는 단계; 및 상기 멜라닌 색소를 기재 상에 도포하는 단계를 포함하는 코팅막의 형성방법을 제공할 수 있다.
또한 본 발명은 페룰릴-CoA 합성효소(FCS, feruloyl-CoA Synthetase) 및 에놀-CoA 수화효소/알돌라아제(ECH, enoyl-CoA hydratase/aldolase)를 공동 발현하는 재조합 대장균을 배양하여 제조한 멜라닌 색소를 포함하는 코팅제가 도포된 컨택트 렌즈를 제공할 수 있다.
또한 본 발명은 페룰릴-CoA 합성효소(FCS, feruloyl-CoA Synthetase) 및 에놀-CoA 수화효소/알돌라아제(ECH, enoyl-CoA hydratase/aldolase)를 공동 발현하는 재조합 대장균을 배지에 접종하고 배양하여 멜라닌 색소를 생산하는 단계; 및 상기 멜라닌 색소를 컨택트 렌즈 상에 도포하는 단계를 포함하는 컨택트 렌즈의 코팅방법을 제공할 수 있다.
본 발명에 따른 멜라닌 색소의 경우 생체 적합성이 우수하며, 높은 UV 차단 효과, 함수율 및 산소 투과율을 높게 유지할 수 있어 컨택트 렌즈, 미세먼지 차단 필름, UV 차단 소재, 선글라스 렌즈, 자동차 선팅 필름, 고분자 코팅 필름 등의 기능성 코팅 소재로 활용이 가능하다.
본 발명의 구체적인 실시예에서, 본 발명자들은 카페익산으로부터 멜라닌을 생합성하는 반응의 촉매로 사용하고자(도 1), 버크홀데리아 글루마에 BGR1 균주 유래의 FCS 및 ECH를 발현하기 위한 벡터를 구축하여 이를 형질전환한 재조합 대장균을 제조하였다(도 3 및 도 4).
또한, FCS 및 ECH를 공동 발현하는 재조합 대장균을 카페익산 첨가 배지에서 배양하였을 때 멜라닌이 생성될 수 있는지 확인한 결과, FCS 및 ECH를 과발현함에 따라 카페익산으로부터 멜라닌이 효과적으로 합성되며, 이 때의 생성 속도가 14.2 mg/L/hr임을 확인하여 이는 종래 티로신을 기질로 하여 멜라닌을 생산하는 방법에 비해 빠른 속도로 멜라닌을 생산할 수 있음을 확인하였다(도 5 및 도 6).
따라서, 본 발명의 멜라닌 생산 방법에서는 카페익산으로부터 FCS 및 ECH에 의해 아세틸-CoA기를 가지는 멜라닌 화합물을 형성하여, 이에 따라 종래 기술에 비해 약 1.5 배 빠른 속도로 멜라닌을 생산할 수 있어, 멜라닌 생산 공정에서 효과적으로 사용될 수 있다. 또한, 본 발명의 방법으로 생산된 멜라닌 색소는 종래 방법에 의해 생산되는 멜라닌과는 다른 구조를 가지고 있어, 본 발명의 멜라닌 색소를 산업적으로 이용하기 위한 용도를 다양하게 가질 수 있다.
이하, 구체적인 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다.
실시예: 코팅제 제조
FCS(feruloyl-CoA Synthetase) 및 ECH(enoyl-CoA hydratase/aldolase)를 과발현하는 재조합 대장균의 제조
본 발명에서 카페익산(caffeic acid)으로부터 멜라닌(melanin)을 생합성하는 반응의 촉매로 사용하고자, 버크홀데리아 글루마에 BGR1(Burkholderia glumae BGR1) 균주 유래의 FCS 및 ECH를 발현하는 재조합 대장균을 제조하였다. 구체적으로, 버크홀데리아 글루마에 유래의 FCS의 DNA 염기 서열(서열번호 3) 및 ECH의 DNA 염기 서열(서열번호 4)은 공지된 염기서열을 사용하였으며, 버크홀데리아 글루마에 BGR1(KCTC 구입) 유전체로부터 PCR로 fcs 및 ech 유전자를 각각 증폭하고, 이를 pET duet-1 벡터에 삽입하여 도 3의 pETDuet ::FCS::ECH 플라스미드를 구축하였다. 구축한 pETDuet ::FCS::ECH 플라스미드는 E. coli BL21(DE3)에 형질전환하고, 형질전환체를 50 ㎍/㎖ 앰피실린을 포함하는 LB 배지 2 ㎖에 접종하여 37℃에서 하룻밤동안 전배양(seed culture)하였다. 전배양한 세포는 다시 50 ㎍/㎖ 앰피실린을 포함하는 LB 배지 50 ㎖로 옮겨, 37℃에서 OD600이 0.8이 될 때까지 200 rpm으로 진탕 배양하였다. 배양 배지의 OD600이 0.8에 도달하면, 최종 농도가 0.25 mM이 되도록 IPTG를 배지에 첨가한 후, 30℃에서 밤새 진탕 배양하였다. 세포 배양 종료 후, 1.5 ㎖의 세포 배양액을 수득하여 재조합 대장균을 원심분리로 수득하였다. FCS 및 ECH의 발현이 효과적으로 나타나는지 확인하기 위해서, 수득한 재조합 대장균을 파쇄하여 세포 추출물을 수득하고, 이를 원심분리하여 상층액을 수용성 단백질 층으로 사용하고 침전물(pellet)을 불용성 단백질층으로 사용하여 SDS-PAGE를 수행하였다. 그 결과, 도 4에서 나타난 바와 같이 재조합 대장균에서 FCS 및 ECH가 공동으로 과발현되는 것을 확인하였으며, 이들의 분자량은 각각 69 kDa 및 30 kDa임을 확인하였다(도 4).
FCS(feruloyl-CoA Synthetase) 및 ECH(enoyl-CoA hydratase/aldolase) 과발현에 따른 멜라닌의 합성
하기와 같은 방법으로 코팅제로 사용할 멜라닌 색소를 합성하였다.
본 발명에서는 종래 멜라닌 생성 방법의 단점을 극복하기 위해, 디올(diol) 구조를 가지는 카페익산을 기질로 하여 디올 구조의 반대편을 아세틸-CoA로 변경함으로써, 기존 멜라닌 생성 속도보다 월등히 높은 속도로 멜라닌을 합성하고자 하였다.
이를 확인하기 위해, 상기 제조한 재조합 대장균을 이용하여 멜라닌 생성 반응을 수행하였다. 상기 재조합 대장균을 50 ㎍/㎖ 앰피실린을 포함하는 LB 배지 2 ㎖에 접종하여 37℃에서 하룻밤동안 전배양하였다. 전배양한 세포는 다시 50 ㎍/㎖ 앰피실린 및 5 mM 카페익산을 포함하는 LB 배지 50 ㎖로 옮겨, 37℃에서 OD600이 0.8이 될 때까지 200 rpm으로 진탕 배양하였다. 배양 배지의 OD600이 0.8에 도달하면, 최종 농도가 0.25 mM이 되도록 IPTG를 배지에 첨가한 후, 30℃에서 12간 동안 진탕 배양하여 전세포 반응(whole cell production)을 수행하였다. 반응 종료 후, 배지를 수득하여 13,200 rpm에서 10 분 동안 원심분리하여 침전된 대장균 세포를 제거하고 상층액만을 수득한 다음, 400 ㎚에서 흡광도를 측정하여 멜라닌 생산량을 확인하였다. OD400 값을 이용하여 정량 분석하기 위해, OD400 값이 1.0일 때 0.066 g/ℓ 멜라닌이 포함된 것으로 결정하였다. 음성 대조군으로는 동일한 재조합 대장균에서 FCS 및 ECH를 발현하지 않고 동일 조건에서 전세포 반응을 수행하였다. 또한, 멜라닌 합성 여부를 확인하기 위한 대조군으로서는 멜라닌 합성 저해제인 아스코빅산(ascorbic acid)을 배지에 처리하고 동일 조건으로 FCS 및 ECH를 발현하여 전세포 반응을 수행하였다. 그 결과 도 5에서 나타난 바와 같이, 음성 대조군으로 대장균에서 FCS/ECH를 발현하지 않고 배지 내 5 mM 카페익산을 첨가하는 경우에는 대장균의 게놈에 존재하는 산화효소에 의해서 카라멜 계열의 옅은 멜라닌을 합성하는 것을 확인한 반면, FCS/ECH를 과발현 유도한 실험군 배지에서는 5 mM 카페익산으로부터 멜라닌이 빠른 속도로 합성되어 배지의 색이 진한 검정색을 나타내는 것을 확인하였다(도 5). 시간에 따라 배지를 수득하여 멜라닌 생산량을 확인하였을 때, FCS 및 ECH를 과발현한 재조합 대장균은 14.2 ㎎/ℓ/hr 수준의 멜라닌 생성 속도를 나타내는 것을 확인하였다(도 5b). 이와 함께 멜라닌 합성 저해제인 아스코빅산을 처리하여 동일 조건에서 멜라닌 합성 반응을 수행하였을 때, 멜라닌 형성이 저해되어 배지 색이 유의적으로 변화하지 않는 것을 확인하였다(도 6).
비교예
L-타이로신으로부터 합성한 합성 멜라닌과 스트렙토마이세스 글라우세스센(Streptomyces glaucescens) 균주 배양을 통해 확보한 천연 멜라닌을 각각 비교예(대조군) 1, 2로 사용하였다(도 2).
실험예 1: 코팅 성능 확인
기존의 멜라닌 색소와 본원 멜라민 색소의 코팅 성능을 비교하기 위하여, 스트렙토마이세스 글라우세스센(Streptomyces glaucescens) 균주 배양을 통해 확보한 천연 멜라닌과 L-타이로신으로부터 합성한 합성 멜라닌 및 프로토카테츄알데히드 기반의 멜라닌 색소를 이용하여 콘택트 렌즈를 코팅한 결과를 도 7에 나타내었다. 코팅은 멜라닌 색소 10mg을 0.2M 소듐바이카보네이트(Sodium bicarbonate) 2ml에 혼합하여 코팅액을 제조한 다음 컨택트 렌즈를 2시간 동안 60℃에서 쉐이킹(shaking)한 뒤 18시간 동안 100℃ 드라이 오븐(dry oven)에서 건조시켰다. 실험 결과, 프로토카테츄알데히드 기반의 멜라닌(실시예)을 이용할 경우 콘택트 렌즈의 코팅 성능이 증가되며 장기간 안정적으로 코팅이 유지되는 것으로 확인되었다.
실험예 2: 세포 독성 확인
콘택트 렌즈로 응용하기 위한 보충 실험으로 세포 생존능(cell viability) 실험을 수행하였다. 멜라닌 색소의 인간 각질세포(HaCaT cell)에 대한 세포 독성을 확인하기 위하여 MTT 어세이(assay)를 실시하였다. 실험 방법으로, 인간 각질세포(HaCaT cell)를 24 웰 플레이트(well plate)에 1.0×105 cells/well로 분주하고 37℃, 5% CO2 incubator에서 24시간 동안 배양하였다. 배양한 인간 각질세포(HaCaT cell)에 멜라닌 색소를 처리한 후, 6시간 더 배양하였다. 배양한 세포에 MTT 시약을 최종 농도가 0.5 mg/ml 되도록 각 웰(well)에 넣고 37℃, 5% CO2 인큐베이터에서 4시간 동안 배양하였다. 배양 후 배양액을 버리고 1M HCl과 이소프로판올(Isopropanol) 혼합액을 각 웰에 분주하고 생성된 포르마잔(formazan)을 용해시킨 후, ELISA reader로 570 nm에서 흡광도를 측정하였다. 실험 결과 신규로 합성한 프로토카테츄알데히드 기반의 멜라닌의 경우, 천연 멜라닌 및 타이로신 기반 멜라닌 대비 세포 생존능이 더 높은 것으로 확인되었는 바, 이는 컨택트 렌즈 코팅 소재로 활용할 경우 생체 적합성이 더 높다는 것을 의미한다.
실험예 3: 항산화 능력 비교
FCS/ECH로부터 합성한 프로토카테츄알데히드의 기반의 신규 멜라닌과, 기존 타이로신 기반 멜라닌 및 천연 멜라닌의 항산화 능력을 측정하여 비교하였다. 항산화 능력은 각각 0.0625 mg/ml부터 2 mg/ml의 멜라닌을 투여하였을 때 ABTS 라디칼을 제거할 수 있는 효율을 측정하는 방법으로 수행하였다. 측정 결과, 프로토카테츄알데히드 기반의 멜라닌(실시예)의 경우 0.0625 mg/ml에서 0.25 mg/ml의 저농도 구간에서 천연 멜라닌 대비 월등히 좋은 항산화 효능을 나타내는 것을 확인되었다. 또한 0.5 mg/ml이상의 고농도 구간에서는 타이로신 기반의 멜라닌 대비 우수한 항산화 능력을 나타내는 것으로 확인되었다(도 9). 결론적으로, 프로토카테츄알데히드의 기반의 신규 멜라닌의 경우 전 구간에서 가장 높은 항산화 능력을 나타내는 것으로 확인되었다.
실험예 4: 세포 성장 저해 효과 측정
항균 효과를 측정하고 그 결과를 도 10에 나타내었다. 대장균 (BL21) 균주를 멜라닌 없는 상태에서 배양할 경우 (BL21 line) 일반적인 세포 생장 곡선을 나타내었으나, FCSECH(protocagechualdehyde의 기반의 신규 멜라닌)을 처리 하였을 때 대장균 세포 생장을 저해하는 것으로 확인되었다(도 10).
실험예 5: 멜라닌 색소의 콘택트 렌즈 착색 효과 및 함수율 측정
프로토카테츄알데히드의 기반의 신규 멜라닌(실시예)을 합성하고, 본 기술 개발에서 핵심적으로 강조하고 있는 콘택트 렌즈 염색 효과를 측정하였다. 타이로신 기반 합성 멜라닌(비교예 1) 및 천연 멜라닌(비교예 2)과 비교하였을 때, 천연 멜라닌은 육안으로 관찰될 정도로 염색이 되지 않는 것으로 확인되었다. 타이로신 기반 멜라닌의 경우 염색이 가능하다는 것이 확인되었으나 프로토카테츄알데히드의 기반의 신규 멜라닌에 의한 염색 수준에 비해 육안으로도 낮은 염색 성능을 나타냈었다.(도 11, 표 2 참조)
또한, 프로토카테츄알데히드의 기반의 신규 멜라닌으로 염색한 콘택트 렌즈의 함수율을 측정하였으나, 각각 37.71268, 38.68831, 38.80012 수준으로 비교군과 크게 다른 함수율을 나타내지는 않았다.
비교예 1 | 비교예 2 | 실시예 | |
Mw | 574.576 | 630.896 | 460.57 |
Md | 357.888 | 386.813 | 286.474 |
MH2O | 37.71268 | 38.68831 | 37.80012 |
실험예 6: 색차 테스트
앞서 컨택트 렌즈 염색을 통해 프로토카테츄알데히드 기반의 신규 멜라닌의 우수한 염색 성능을 육안으로 측정할 수 있었으나, 구체적인 정량 방법을 통해 신규 멜라닌의 염색 성능에 대한 평가를 실시하였다.
색차 테스트 장비를 통하여 각각의 멜라닌으로 염색한 콘택트렌즈의 색차를 측정한 결과 위의 도 12와 같이 프로토카테츄알데히드의 기반의 신규 멜라닌의 경우 멜라닌으로 염색하지 않은 콘택트렌즈를 기준으로 색차 비교를 할 경우 타이로신 기반 멜라닌(비교예 1), 천연 멜라닌(비교예 2) 대비 각각 2.5배, 5배 수준으로 염색 성능이 우수하다는 점을 확인하였다.
샘플 | L* | a* | b* | dE |
untreated | 74.26 | 0.77 | -3.73 | 0 |
실시예 | 62.72 | 8.38 | 20.31 | 27.73 |
비교예1 | 75.3 | 1.21 | 6.49 | 10.28 |
비교예2 | 79.1 | -1.01 | -0.58 | 6.04 |
상기와 같은 실험 결과를 통해, 프로토카테츄알데히드 기반의 신규 멜라닌 색소는 콘택트 렌즈에 대한 착색 능력이 우수할 뿐 아니라, 기존 멜라닌 대비 우수한 항산화 능력, 항균 능력을 갖는다는 점이 확인되었으며, 따라서 프로토카테츄알데히드 기반의 신규 멜라닌 색소는 다양한 코팅 소재로 응용될 수 있다.
<110> AJOU UNIVERSITY INDUSTRY-ACADEMIC COOPERATION FOUNDATION
<120> COATING AGENT CONTAINING PROTOCATECHUALDEHYDE-BASED MELANIN
PIGMENTS AND APPLICATIONS THEREOF
<130> 1063979
<160> 4
<170> KopatentIn 2.0
<210> 1
<211> 627
<212> PRT
<213> Burkholderia glumae
<400> 1
Met Glu Thr Asp His Arg Leu Gly Leu Ala Asn Pro Ala Gly Tyr Arg
1 5 10 15
His Val Ala Ile Gln Ala Ser Ala Pro His Val Glu Arg Arg Gly Glu
20 25 30
Cys Trp Tyr Leu Arg Ala Ser Ala Pro Leu Gly Ala Tyr Pro Ser Arg
35 40 45
Phe Thr Asp Arg Leu Val Ser Gly Ala Gln Ala His Pro Asp Arg Leu
50 55 60
Leu Val Ala Gln Arg Asp Ala Gln Gly Ala Trp Arg Gly Val Ser Tyr
65 70 75 80
Ala Gln Met Leu Glu Asn Ala Arg Ala Ile Gly Glu Ala Leu Leu Gly
85 90 95
Arg Gly Leu Ser Ala Glu Arg Pro Leu Ala Ile Leu Ser Gly Asn Ser
100 105 110
Ile Glu His Leu Gln Met Ala Leu Gly Ala Met Trp Ala Gly Ile Pro
115 120 125
Tyr Ala Pro Val Ser Pro Ala Tyr Ser Leu Ile Ser Gly Asp Phe Gly
130 135 140
Lys Leu Arg His Val Phe Glu Leu Leu Thr Pro Gly Leu Val Phe Ala
145 150 155 160
Asp Asp Leu Ala Ala Tyr Ala Ala Gly Leu Asp Ala Ala Leu Pro Arg
165 170 175
Asp Val Glu Arg Val Gly Val Ala Pro Gly Ala Gly Gly Ala Thr Pro
180 185 190
Phe Ala Ala Leu Leu Asp Thr Leu Pro Arg Asp Val Asp Ala Ala His
195 200 205
Ala Arg Val Asp Gly Asp Thr Ile Ala Lys Phe Leu Phe Thr Ser Gly
210 215 220
Ser Thr Arg Leu Pro Lys Ala Val Pro Thr Thr His Arg Met Leu Cys
225 230 235 240
Ala Asn Gln Gln Met Leu Leu Glu Thr Phe Pro Gln Phe Gly Ile Glu
245 250 255
Pro Pro Val Leu Val Asp Trp Leu Pro Trp Asn His Thr Phe Gly Gly
260 265 270
Ser His Asn Val Gly Ile Val Leu Tyr Asn Gly Gly Thr Leu Tyr Ile
275 280 285
Asp Gly Gly Lys Pro Val Ala Gly Lys Phe Asp Glu Thr Val Arg Asn
290 295 300
Leu His Glu Ile Ala Pro Thr Val Phe Phe Asn Val Pro Lys Gly Trp
305 310 315 320
Glu Glu Leu Thr Ala Ala Leu Glu Ala Asp Ala Ala Leu Arg Glu Arg
325 330 335
Phe Phe Ser Arg Val Lys Leu Tyr Phe Phe Ala Gly Ala Gly Leu Ser
340 345 350
Gln Ala Ala Trp Asp Arg Leu Glu Arg Val Thr Leu Ala His Cys Gly
355 360 365
Glu Arg Ile Arg Ile Met Ala Gly Leu Gly Met Thr Glu Thr Ala Pro
370 375 380
Ser Cys Leu Phe Thr Thr Gly Pro Val Ser Gly Ala Gly Tyr Ile Gly
385 390 395 400
Leu Pro Ala Pro Gly Cys Glu Ala Lys Ile Ala Pro Val Asp Gly Lys
405 410 415
Phe Glu Val Arg Phe Arg Gly Pro Asn Val Met Arg Gly Tyr Trp Arg
420 425 430
Met Pro Thr Ala Asn Ala Glu Ile Phe Asp Asp Glu Gly Tyr Tyr Arg
435 440 445
Ser Gly Asp Ala Val Arg Phe Val Asp Ser Glu Arg Pro Glu Leu Gly
450 455 460
Leu Ala Phe Asp Gly Arg Ile Ala Glu Asp Phe Lys Leu Gly Ser Gly
465 470 475 480
Thr Phe Val Ser Val Gly Pro Met Arg Ala Arg Ile Ile Ser Glu Gly
485 490 495
Ala Pro Tyr Val Gln Asp Ala Val Ile Thr Gly Met Asn Arg Asp Glu
500 505 510
Val Gly Ala Met Val Phe Pro Arg Val Asp Ala Cys Arg Ser Leu Ala
515 520 525
Gly Leu Gly Arg Asp Ala Gly Val Ala Asp Val Leu Asn Ala Pro Ala
530 535 540
Val Arg Ala Phe Phe Ala Ala Leu Leu Asp Lys Leu Asn Gln His Ala
545 550 555 560
Thr Gly Ser Ala Thr Leu Ile Ala Arg Leu Arg Leu Leu Ala Val Pro
565 570 575
Pro Ser Leu Asp Leu Gly Glu Val Thr Asp Lys Gly Ser Ile Asn Gln
580 585 590
Arg Ala Val Leu Gln His Arg Ala Ala Leu Val Asp Ala Met His Asp
595 600 605
Gly Gly Asp Pro Glu Val Ile Glu Ala Arg Glu Arg Arg Gly Gln Ala
610 615 620
Ala Arg Pro
625
<210> 2
<211> 275
<212> PRT
<213> Burkholderia glumae
<400> 2
Met Ser Tyr Glu Gly Arg Trp Thr Thr Val Lys Val Thr Val Glu Ala
1 5 10 15
Gly Ile Gly Trp Val Val Leu Asn Arg Pro Glu Lys Arg Asn Ala Met
20 25 30
Ser Pro Thr Leu Asn Lys Glu Met Ile Asp Val Leu Glu Thr Leu Glu
35 40 45
Leu Asp Asp Glu Ala Gln Val Leu Val Leu Thr Gly Glu Gly Asp Ala
50 55 60
Trp Thr Ala Gly Met Asp Leu Lys Glu Tyr Phe Arg Glu Val Asp Ala
65 70 75 80
Ala Ser Asp Val Val Gln Glu Arg Ile Arg Arg Asp Ala Ser Arg Trp
85 90 95
Gln Trp Gln Leu Leu Arg Met Tyr Ser Lys Pro Thr Ile Ala Met Val
100 105 110
Asn Gly Trp Cys Phe Gly Gly Gly Phe Ser Pro Leu Val Ala Cys Asp
115 120 125
Leu Ala Ile Ala Ala Asp Glu Ala Thr Phe Gly Leu Ser Glu Ile Asn
130 135 140
Trp Gly Ile Pro Pro Gly Asn Leu Val Ser Lys Ala Met Ala Asp Thr
145 150 155 160
Val Gly His Arg Gln Ala Leu Tyr Tyr Ile Met Thr Gly Asp Thr Phe
165 170 175
Thr Gly Lys Gln Ala Ala Gln Met Gly Leu Val Asn Gln Ser Val Pro
180 185 190
Arg Ala Ala Leu Arg Glu Ala Thr Val Ala Leu Ala Ala Lys Leu Leu
195 200 205
Asp Lys Asn Pro Val Val Leu Arg Asn Ala Lys His Gly Phe Lys Arg
210 215 220
Ser Arg Glu Leu Thr Trp Glu Gln Asn Glu Asp Tyr Leu Tyr Ala Lys
225 230 235 240
Leu Asp Gln Ala Asn Tyr Arg Asp Lys Glu Gly Gly Arg Glu Lys Gly
245 250 255
Leu Lys Gln Phe Leu Asp Asp Lys Ser Ile Lys Pro Gly Leu Gln Ala
260 265 270
Tyr Lys Arg
275
<210> 3
<211> 1884
<212> DNA
<213> Burkholderia glumae
<400> 3
ttggaaacgg accaccgcct tggattggcg aacccagccg gataccggca tgtcgccatc 60
caggccagcg caccgcatgt cgagcgtcgc ggcgagtgct ggtacctgcg cgcgagcgcg 120
ccgctcggcg cttatccgtc gcgcttcacg gaccggctcg tcagtggcgc gcaagcgcac 180
cccgaccggc tgctggtggc gcagcgcgac gcgcaaggcg cctggcgcgg cgtgagctac 240
gcgcagatgc tcgagaatgc acgcgcgatc ggcgaggccc tgctcggccg cggcctgagc 300
gccgagcggc cgctcgcgat cctgtccggc aacagcatcg agcacctgca aatggcactg 360
ggcgcgatgt gggcgggcat cccctatgcg ccggtctcgc ccgcctattc gctgatctcg 420
ggcgatttcg gcaagctgcg ccacgtgttc gagctgctca cgccgggcct ggtgttcgcc 480
gacgacctcg cggcctatgc ggccggcctc gacgcggcct tgccgcgcga cgtcgagcgg 540
gtcggcgtgg cgcccggcgc gggcggcgcc acgccgtttg cggcgctgct cgacacgctc 600
ccgcgcgacg tcgatgcggc gcacgcacgg gtggatggcg acacgatcgc gaaatttctg 660
ttcacctccg gctcgacgcg tctgccgaaa gcggtgccga ccacgcaccg gatgctgtgc 720
gccaatcagc agatgctgct cgaaaccttt ccgcagttcg gtatcgagcc gccggtgctg 780
gtcgactggc tgccgtggaa ccacacgttc ggcggcagcc ataacgtcgg catcgtgctg 840
tacaacggcg gcacgctgta tatcgacggc ggcaagccgg tggcgggcaa gttcgacgag 900
acggtgcgca atctgcacga gatcgcgccc accgtgttct tcaacgtgcc caagggctgg 960
gaggaactga cggccgcgct ggaagccgat gcggcgctgc gcgagcgctt tttctcgcgc 1020
gtgaagctgt acttctttgc cggcgcgggc ttgtcccagg ccgcctggga ccggctcgag 1080
cgcgtgacgc tggcgcattg cggcgagcgc atccgcatca tggcggggct cggcatgacg 1140
gagaccgccc cctcgtgcct gttcaccacc ggcccggtat cgggcgcggg gtacatcggc 1200
ctgcccgcgc cgggctgcga ggcgaagatc gcgccggtcg acggcaagtt cgaggtgcgt 1260
ttccgcgggc cgaacgtgat gcgcggctac tggcgcatgc ccaccgccaa cgcggagatc 1320
ttcgacgacg aaggctacta ccgcagcggc gacgccgtgc gtttcgtcga cagcgagcgg 1380
ccggaactgg ggctcgcctt cgacgggcgc atcgccgagg acttcaagct cggctcgggc 1440
accttcgtga gcgtcgggcc gatgcgcgcg cgcatcatct cggagggcgc gccctatgtg 1500
caggacgcgg tcatcaccgg catgaatcgc gacgaagtgg gcgccatggt gtttccccgt 1560
gtcgacgcct gccgctcgct cgcgggcctg ggccgggacg cgggcgtggc ggacgtgctc 1620
aacgcgccgg cggtgcgggc gttcttcgcg gcgctgctcg acaagctcaa ccagcacgcc 1680
accggcagcg cgacgttgat tgccaggctg cggctgctgg cggtgccgcc ctcgctcgat 1740
ctcggcgagg tgaccgacaa aggctcgatc aaccagcgcg cggtgctcca gcatcgcgcc 1800
gcgctggtcg acgccatgca tgacggcggc gatccggagg tcatcgaggc gcgcgagcgc 1860
cgcggccagg cggcacgacc atga 1884
<210> 4
<211> 828
<212> DNA
<213> Burkholderia glumae
<400> 4
atgagctacg aaggtcgctg gacaacggtc aaggtcacgg tcgaggcggg catcggctgg 60
gtggtgctga atcgccccga gaagcgcaac gcgatgagcc cgacgctgaa caaggaaatg 120
atcgacgtgc tcgaaacgct cgagctcgac gacgaggcgc aggtgctggt actgaccggc 180
gaaggcgatg cgtggaccgc cggcatggac ctgaaggaat atttccgcga ggtggacgcg 240
gcctcggacg tggtgcagga gcgcattcgc cgcgacgcga gccgctggca atggcaactg 300
ctgcgcatgt attcgaagcc gaccatcgcg atggtcaacg gctggtgttt cggcggcggg 360
ttttcgccgc tcgtcgcctg cgatctcgcc atcgccgccg acgaggccac cttcggcctg 420
tccgaaatca actggggcat tccccccggc aacctggtga gcaaggccat ggcggacacc 480
gtcggccatc gccaggcgct ctactacatc atgaccggcg acaccttcac cggcaagcag 540
gccgcgcaga tgggcctggt caaccagagc gtgccgcgcg cggccttgcg cgaggcgacc 600
gtcgcgctcg cggccaagct gctcgacaag aacccggtgg tgctgcgcaa cgcgaagcac 660
ggcttcaagc gcagccgcga actgacctgg gagcagaacg aggactacct gtacgccaag 720
ctcgaccagg ccaattatcg cgacaaggaa ggcggccgcg aaaagggcct caagcagttt 780
ctcgacgaca agagcatcaa gccgggcctg caagcctaca agcgctga 828
Claims (10)
- 페룰릴-CoA 합성효소(FCS, feruloyl-CoA Synthetase) 및 에놀-CoA 수화효소/알돌라아제(ECH, enoyl-CoA hydratase/aldolase)를 공동 발현하는 재조합 대장균을 배양하여 제조한 멜라닌 색소를 포함하는 코팅제.
- 청구항 1에 있어서,
상기 FCS는 서열번호 1로 기재되는 아미노산 서열로 구성되는 것을 특징으로 하는 코팅제.
- 청구항 1에 있어서,
상기 ECH는 서열번호 2로 기재되는 아미노산 서열로 구성되는 것을 특징으로 하는 코팅제.
- 청구항 1에 있어서,
상기 FCS 및 ECH는 버크홀데리아 글루마에(Burkholderia glumae) 유래의 단백질인 것을 특징으로 하는 코팅제.
- 청구항 1에 있어서,
상기 배양은 카페익산(caffeic acid)을 포함하는 배지에서 수행되는 것을 특징으로 하는 코팅제.
- 페룰릴-CoA 합성효소(FCS, feruloyl-CoA Synthetase) 및 에놀-CoA 수화효소/알돌라아제(ECH, enoyl-CoA hydratase/aldolase)를 공동 발현하는 재조합 대장균을 배지에 접종하여 멜라닌 색소를 기재 상에 도포하여 제조한 코팅막.
- 청구항 6에 있어서,
상기 기재는 유리, 플라스틱 및 합성수지로 이루어진 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 코팅막.
- 페룰릴-CoA 합성효소(FCS, feruloyl-CoA Synthetase) 및 에놀-CoA 수화효소/알돌라아제(ECH, enoyl-CoA hydratase/aldolase)를 공동 발현하는 재조합 대장균을 배지에 접종하고 배양하여 멜라닌 색소를 생산하는 단계; 및
상기 멜라닌 색소를 기재 상에 도포하는 단계를 포함하는 코팅막의 형성방법.
- 페룰릴-CoA 합성효소(FCS, feruloyl-CoA Synthetase) 및 에놀-CoA 수화효소/알돌라아제(ECH, enoyl-CoA hydratase/aldolase)를 공동 발현하는 재조합 대장균을 배양하여 제조한 멜라닌 색소를 포함하는 코팅제가 도포된 컨택트 렌즈.
- 페룰릴-CoA 합성효소(FCS, feruloyl-CoA Synthetase) 및 에놀-CoA 수화효소/알돌라아제(ECH, enoyl-CoA hydratase/aldolase)를 공동 발현하는 재조합 대장균을 배지에 접종하고 배양하여 멜라닌 색소를 생산하는 단계; 및
상기 멜라닌 색소를 컨택트 렌즈 상에 도포하는 단계를 포함하는 컨택트 렌즈의 코팅방법.
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---|---|---|---|
KR1020180069251A KR102059269B1 (ko) | 2018-06-15 | 2018-06-15 | 프로토카테츄알데히드 기반의 멜라닌 색소를 포함하는 코팅제 및 이의 응용 |
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KR1020180069251A KR102059269B1 (ko) | 2018-06-15 | 2018-06-15 | 프로토카테츄알데히드 기반의 멜라닌 색소를 포함하는 코팅제 및 이의 응용 |
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Citations (3)
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---|---|---|---|---|
US5047447A (en) * | 1984-06-08 | 1991-09-10 | Photoprotecive Technologies Incorporated | Medium incorporating melanin as an absorbing pigment for protection against electromagnetic radiation |
KR930701589A (ko) | 1990-06-29 | 1993-06-12 | 데이비드 알. 맥지 | 형질전환된 미생물에 의한 멜라닌의 제조방법 |
US5252628A (en) * | 1989-12-07 | 1993-10-12 | Lions Eye Institute Of Western Australia, Inc. | Method of making photoprotective hydrophilic polymers and ocular devices thereof |
-
2018
- 2018-06-15 KR KR1020180069251A patent/KR102059269B1/ko active IP Right Grant
Patent Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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Title |
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