CN111511771A - 小麦研磨方法和gh8木聚糖酶 - Google Patents

Abstract

本发明涉及将小麦粉分离成包括面筋级分和淀粉级分的两种或更多种级分的方法，所述方法包括以下步骤：a)将小麦粉和水混合；b)添加一种或多种具有GH8木聚糖酶活性的多肽；c)将混合物孵育预先确定的一段时间；d)将混合物分离成包括富含面筋级分和富含淀粉级分的两种或更多种级分；以及e)回收包括富含面筋级分和富含淀粉级分的所述两种或更多种级分。

Description

小麦研磨方法和GH8木聚糖酶

对序列表的引用

本申请含有计算机可读形式的序列表。将所述计算机可读形式通过参考并入本文。

技术领域

本发明涉及一种处理作物籽粒的改进方法，以提供具有高品质的适于将淀粉转化为单糖和寡糖、乙醇、甜味剂等的淀粉产品。另外，本发明还涉及一种酶组合物并且涉及本发明的组合物的用途，该酶组合物包括一种或多种适于本发明的方法的酶活性。

发明背景

作为大部分作物(例如玉米、小麦、水稻、高粱大豆、大麦或果壳)籽粒的重要成分，在可以将淀粉用于将淀粉转化为糖(例如右旋糖、果糖)、醇(例如乙醇)和增甜剂之前，必须使淀粉可供使用并以一种提供高纯度淀粉的方式加以处理。如果淀粉包含多于0.5％的杂质(包括蛋白质)，则它不适于作为淀粉转化工艺的起始材料。为了从作物籽粒开始提供这样的纯的且高品质的淀粉产品，通常研磨籽粒，如将在下文进一步所描述。

通常使用湿磨将作物籽粒分离为其四种基本组分：淀粉、胚芽、纤维以及蛋白质，所有这些都是有价值的。

将小麦粉分离成包括面筋级分和淀粉级分的两种或更多种级分是熟知的工业方法，并且通常使用包括以下步骤的方法进行：

a)将水和小麦粉混合；

b)将混合物孵育一段时间以使面筋形成面筋网络；

c)将混合物分离成至少两种级分，即富含面筋级分和富含淀粉级分；以及

d)任选地进一步纯化所述级分。

已经建议将一些不同的酶用于作物籽粒的浸渍和/或湿磨方法。然而，仍然需要改进湿磨工艺以实现例如更高的蛋白质和淀粉产量，更低的工艺流体粘度等。

发明内容

发明人测试了八种糖基水解酶家族8(GH8)木聚糖酶降低小麦粉浆液(其代表作物籽粒湿磨方法的典型产物流)粘度的能力，并且他们惊奇地发现所有八种GH8木聚糖酶均能够显著降低浆液的粘度(图4)。

因此，在第一方面，本发明涉及将小麦粉分离成包括面筋级分和淀粉级分的两种或更多种级分的方法，所述方法包括以下步骤：

a)制作小麦粉和水的混合物；

b)添加一种或多种具有GH8木聚糖酶活性的多肽；

c)将混合物孵育预先确定的一段时间；

d)使用多个过筛和离心步骤将混合物分离成包括面筋级分和淀粉级分的两种或更多种级分；以及

回收包括面筋级分和淀粉级分的所述两种或更多种级分。

在第二方面，本发明涉及包含具有GH8木聚糖酶活性的多肽的酶组合物，其中

所述具有GH8木聚糖酶活性的多肽是如本文所定义的DPSY进化枝的成员；优选地所述具有GH8木聚糖酶活性的多肽是如本文所定义的以下进化枝中的至少一种的成员：SMDY进化枝、ALWNW进化枝、WFAAAL进化枝和DEAG进化枝。

a)在最后一个方面，本发明涉及具有GH8木聚糖酶活性的多肽在用于处理作物籽粒的方法中的用途，

b)制作小麦粉和水的混合物；

c)添加一种或多种具有GH8木聚糖酶活性的多肽；

d)将混合物孵育预先确定的一段时间；

e)使用多个过筛和离心步骤将混合物分离成包括面筋级分和淀粉级分的两种或更多种级分；以及

回收包括面筋级分和淀粉级分的所述两种或更多种级分。

附图

图1示出了如何将GH8木聚糖酶多肽分成多个不同的进化枝，其中每个进化枝基于其保守基序来命名。

图2示出了本发明的木聚糖酶多肽的系统发育树。

图3示出了本文测试的GH8木聚糖酶的比对。

图4示出了如上所定义的八个GH8木聚糖酶进化枝“DPSY”成员在ViPr测定中有效降低小麦浆液的粘度。

图5示出了通过GH8木聚糖酶使小麦浆液粘度的降低比可商购的GH10木聚糖酶产品(

，诺维信公司)使小麦浆液粘度的降低更好。

图6示出了芽孢杆菌属物种KK-1野生型GH8木聚糖酶与没有酶相比，使小麦浆液的粘度降低了约4倍。

图7示出了芽孢杆菌属物种KK-1野生型GH8木聚糖酶使蛋白质回收从约5％提高到25％-30％，即接近6倍的提高。

定义

等位基因变体：术语“等位基因变体”意指占据同一染色体基因座的基因的两种或更多种替代形式中的任一种。等位基因变异通过突变而自然产生，并且可以导致群体内部的多态性。基因突变可以是沉默的(所编码的多肽无变化)或可以编码具有改变的氨基酸序列的多肽。多肽的等位基因变体是由基因的等位基因变体编码的多肽。

cDNA：术语“cDNA”意指可以通过从成熟的剪接的mRNA分子逆转录制备的DNA分子，该mRNA分子是从真核细胞中获得。cDNA缺少可存在于相应基因组DNA中的内含子序列。初始的初级RNA转录物是mRNA的前体，其要通过一系列的步骤(包括剪接)进行加工，之后呈现为成熟的剪接的mRNA。

编码序列：术语“编码序列”意指直接指定多肽的氨基酸序列的多核苷酸。该编码序列的边界一般由开放阅读框决定，该开放阅读框通常以ATG起始密码子或替代起始密码子(如GTG和TTG)开始，并且以终止密码子(如TAA、TAG、和TGA)结束。编码序列可以是DNA、cDNA、合成、或重组的多核苷酸。

控制序列：术语“控制序列”意指表达编码本发明的成熟多肽的多核苷酸所必需的核酸序列。每个控制序列对于编码该多肽的多核苷酸来说可以是天然的(即，来自相同基因)或外源的(即，来自不同基因)，或相对于彼此是天然的或外源的。此类控制序列包括但不限于前导序列、多腺苷酸化序列、前肽序列、启动子、信号肽序列、以及转录终止子。最少，控制序列包括启动子、以及转录和翻译终止信号。出于引入有利于将控制序列与编码多肽的多核苷酸的编码区连接的特异性限制位点的目的，这些控制序列可以提供有多个接头。

表达：术语“表达”包括在多肽的生产中涉及的任何步骤，包括但不限于，转录、转录后修饰、翻译、翻译后修饰、以及分泌。

表达载体：术语“表达载体”是指包括编码多肽的多核苷酸并且可操作地与提供了其表达的额外的核苷酸相连接的线性或环状DNA分子。

片段：术语“片段”意指具有在成熟多肽的氨基和/或羧基末端缺失的一个或多个(例如若干个)氨基酸的多肽；其中该片段具有蛋白酶活性。在一个方面，一个片段包含至少330个氨基酸残基(例如，SEQ ID NO：2的氨基酸20至349)；在另一个方面，一个片段包含至少345个氨基酸残基(例如，SEQ ID NO：2的氨基酸10至354)；在一个另外的方面，一个片段包含至少355个氨基酸残基(例如，SEQ ID NO：2的氨基酸5至359)。

宿主细胞：术语“宿主细胞”意指对用包含本发明多核苷酸的核酸构建体或表达载体进行的转化、转染、转导等易感的任何细胞类型。术语“宿主细胞”涵盖由于复制期间出现的突变而与亲本细胞不完全相同的任何亲本细胞子代。

分离的多核苷酸：术语“分离的多核苷酸”意指被人工修饰的多核苷酸，相对于在自然中发现的多核苷酸。在一个方面，所述分离的多核苷酸是至少1％纯的，例如至少5％纯的、至少10％纯的、至少20％纯的、至少40％纯的、至少60％纯的、至少80％纯的、至少90％纯的、以及至少95％纯的，如通过琼脂糖电泳所确定的。多核苷酸可以是基因组、cDNA、RNA、半合成、合成来源的，或其任何组合。

分离的多肽：术语“分离的多肽”意指被人手修饰的多肽，相对于在自然中发现的多肽。在一个方面，所述多肽是至少1％纯的，例如至少5％纯的，至少10％纯的，至少20％纯的，至少40％纯的，至少60％纯的，至少80％纯的，以及至少90％纯的，如通过SDS-PAGE所确定的。

成熟多肽：术语“成熟多肽”意指在翻译和任何翻译后修饰如N-末端加工、C-末端截短、糖基化作用、磷酸化作用等之后处于其最终形式的多肽。在一个方面，基于使用具有N-末端HQ标记的成熟多肽的埃德曼(Edman)降解和整体分子量分析的测序，该成熟多肽是SEQ ID NO：2的编号中的氨基酸1至366。使用预测程序SignalP(Nielsen等人，1997，Protein Engineering[蛋白质工程]10：1-6)，预测SEQ ID NO：2的编号中的氨基酸-27至-1为信号肽。在本领域中已知的是，宿主细胞可以产生由相同多核苷酸表达的两种或更多种不同的成熟多肽(即，具有不同的C-末端和/或N-末端氨基酸)的混合物。

成熟多肽编码序列：术语“成熟多肽编码序列”意指编码具有蛋白酶活性的成熟多肽的多核苷酸。在一个方面，基于通过具有N-末端HQ标记的成熟多肽的埃德曼降解和整体分子量分析对所述成熟多肽的确定，所述成熟多肽编码序列是SEQ ID NO：1的编号中的核苷酸82至1302。此外，基于预测程序SignalP(Nielsen等人，1997，Protein Engineering[蛋白质工程]10∶1-6)，预测SEQ ID NO：1的编号中的核苷酸1至81编码信号肽。

核酸构建体：术语“核酸构建体”意指从天然存在的基因中分离的、或以自然界中不会另外存在的方式被修饰成含有核酸片段的、或合成的单链或双链的核酸分子。当核酸构建体含有表达本发明编码序列所需要的控制序列时，术语核酸构建体与术语“表达盒”是同义的。

可操作地连接：术语“可操作地连接”意指一种构型，在该构型中控制序列相对于多核苷酸的编码序列放置在适当位置处，这样使得控制序列指导编码序列的表达。

蛋白酶活性：术语“蛋白酶活性”意指蛋白质水解活性(EC 3.4)。存在若干种蛋白酶活性类型，例如在Arg和Lys残基的羧基末端侧切割的胰蛋白酶样蛋白酶以及在疏水性氨基酸残基的羧基末端侧切割的糜蛋白酶样蛋白酶。本发明的蛋白酶是具有酸性最适pH(最适pH＜pH 7)的丝氨酸内肽酶(EC3.4.21)。

可以使用任何测定来测量蛋白酶活性，其中采用一种底物，该底物包括与所讨论的蛋白酶的特异性相关的肽键。测定pH值和测定温度同样适用于所讨论的蛋白酶。测定pH的实例是pH 2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12。测定温度的实例是15℃、20℃、25℃、30℃、35℃、37℃、40℃、45℃、50℃、55℃、60℃、65℃、70℃、80℃、90℃、或95℃。普通蛋白酶底物的实例是酪蛋白、牛血清白蛋白以及血红蛋白。在经典的Anson和Mirsky方法中，将变性的血红蛋白用作底物并且在用所讨论的蛋白酶进行测定孵育后，确定三氯乙酸可溶的血红蛋白的量作为蛋白酶活性的量度(Anson，M.L.和Mirsky，A.E.，1932，J.Gen.Physiol.[普通生理学杂志]16：59以及Anson，M.L.，1938，J.Gen.Physiol.[普通生理学杂志]22：79)。

序列同一性：两个氨基酸序列之间或两个核苷酸序列之间的关联度通过参数“序列同一性”来描述。

出于本发明的目的，使用如在EMBOSS包(EMBOSS：The European MolecularBiology Open Software Suite[欧洲分子生物学开放软件套件]，Rice等人，2000，TrendsGenet.[遗传学趋势]16：276-277)(优选地3.0.0版或更新版本)的Needle程序中所实施的Needleman-Wunsch算法(Needleman和Wunsch，1970，J.Mol.Biol.[分子生物杂志]48：443-453)来确定两个氨基酸序列之间的序列同一性程度。使用6.1.0版本。所使用的任选参数是空位开放罚分10、空位延伸罚分0.5、以及EBLOSUM62(BLOSUM62的EMBOSS版本)取代矩阵。将标记为“最长同一性”的Needle的输出(使用非简化选项(nobrief option)获得)用作同一性百分比并且计算如下：

(相同的残基x 100)/(比对长度-比对中的空位总数)

出于本发明的目的，使用尼德曼-翁施算法(Needleman和Wunsch，1970，同上)来确定两个脱氧核糖核苷酸序列之间的序列同一性的程度，该算法如EMBOSS软件包(EMBOSS：欧洲分子生物学开放软件套件，Rice等人，2000，同上)(优选3.0.0版本或更新版本)的尼德尔程序所实施的。使用6.1.0版本。所使用的任选参数是空位开放罚分10、空位延伸罚分0.5、以及EDNAFULL(NCBI NUC4.4的EMBOSS版本)取代矩阵。将标记为“最长同一性”的Needle的输出(使用非简化选项(nobrief option)获得)用作同一性百分比并且计算如下：

(相同的脱氧核糖核苷酸x 100)/(比对长度-比对中的空位总数)

严格条件：不同的严格条件定义如下。

术语“非常低严格条件”意指对于长度为至少100个核苷酸的探针而言，遵循标准DNA印迹程序，在42℃、于5X SSPE、0.3％SDS、200微克/ml剪切并变性的鲑鱼精子DNA和25％甲酰胺中预杂交和杂交12至24小时。最后在45℃下使用2X SSC、0.2％SDS将载体材料洗涤三次，每次15分钟。

术语“低严格条件”意指对于长度为至少100个核苷酸的探针而言，遵循标准DNA印迹程序，在42℃、于5X SSPE、0.3％SDS、200微克/ml剪切并变性的鲑鱼精子DNA和25％甲酰胺中预杂交和杂交12至24小时。最后在50℃下使用2X SSC、0.2％SDS将载体材料洗涤三次，每次15分钟。

术语“中严格条件”意指对于长度为至少100个核苷酸的探针而言，遵循标准DNA印迹程序，在42℃、于5X SSPE、0.3％SDS、200微克/ml剪切并变性的鲑鱼精子DNA和35％甲酰胺中预杂交和杂交12至24小时。最后在55℃下使用2X SSC、0.2％SDS将载体材料洗涤三次，每次15分钟。

术语“中-高严格条件”意指对于长度为至少100个核苷酸的探针而言，遵循标准DNA印迹程序，在42℃、于5X SSPE、0.3％SDS、200微克/ml剪切并变性的鲑鱼精子DNA和35％甲酰胺中预杂交和杂交12至24小时。最后在60℃下使用2X SSC、0.2％SDS将载体材料洗涤三次，每次15分钟。

术语“高严格条件”意指对于长度为至少100个核苷酸的探针而言，遵循标准DNA印迹程序，在42℃在5X SSPE、0.3％SDS、200微克/ml剪切并变性的鲑鱼精子DNA和50％甲酰胺中预杂交和杂交12至24小时。最后在65℃下使用2X SSC、0.2％SDS将载体材料洗涤三次，每次15分钟。

术语“非常高严格条件”意指对于长度为至少100个核苷酸的探针而言，遵循标准DNA印迹程序，在42℃在5X SSPE、0.3％SDS、200微克/ml剪切并变性的鲑鱼精子DNA和50％甲酰胺中预杂交和杂交12至24小时。最后在70℃下使用2X SSC、0.2％SDS将载体材料洗涤三次，每次15分钟。

子序列：术语“亚序列”意指从成熟多肽编码序列的5′和/或3′端缺失一个或多个(几个)核苷酸的多核苷酸；其中该子序列编码具有蛋白酶活性的片段。在一个方面，子序列含有至少990个核苷酸(例如SEQ ID NO：1的核苷酸139至1128)，例如以及至少1035个核苷酸(例如SEQ ID NO：1的核苷酸109至1143)；例如，以及至少1065个核苷酸(例如，SEQ IDNO：1的核苷酸94至1158)。

基本上纯的多核苷酸：术语“基本上纯的多核苷酸”意指不含其他外部或不想要的核苷酸并且处在适用于基因程化多肽生产系统内的形式的多核苷酸制剂。因而，基本上纯的多核苷酸含有按重量计至多10％、至多8％、至多6％、至多5％、至多4％、至多3％、至多2％、至多1％和至多0.5％与该基本上纯的多核苷酸天然或重组相关的其他多核苷酸物质。然而，基本上纯的多核苷酸可以包括天然存在的5’和3’非翻译区，例如启动子和终止子。优选地，该多核苷酸是按重量计至少90％纯的，例如至少92％纯的、至少94％纯的、至少95％纯的、至少96％纯的、至少97％纯的、至少98％纯的、至少99％纯的、以及至少99.5％纯的。本发明的多核苷酸优选地处于基本上纯的形式。

基本上纯的多肽：术语“基本上纯的多肽”意指含有按重量计至多10％、至多8％、至多6％、至多5％、至多4％、至多3％、至多2％、至多1％和至多0.5％的与其天然或重组地相关的其他多肽材料的制剂。优选地，该多肽按存在于制剂中的总多肽材料的重量计是至少92％纯的，例如至少94％纯的、至少95％纯的、至少96％纯的、至少97％纯的、至少98％纯的、至少99％纯的、至少99.5％纯的以及100％纯的。本发明的多肽优选处于基本上纯的形式。例如，这可以通过采用熟知的重组方法或采用经典的纯化方法制备多肽来完成。

变体：术语“变体”意指在一个或多个(若干个)位置包含改变(即，一个或多个(若干个)氨基酸残基取代、插入和/或缺失)的具有蛋白酶活性的多肽。取代意指将占据一个位置的氨基酸用不同的氨基酸替换；缺失意指去除占据一个位置的氨基酸；并且插入意指邻近占据某一位置的氨基酸添加1-3个氨基酸。本发明的这些变体具有SEQ ID NO：5、SEQ IDNO：6的多肽或者SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：4的成熟多肽的至少20％，例如至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％或至少100％的蛋白酶活性。

在一个方面，该变体与如在此鉴定的SEQ ID NO：的成熟多肽相差多达10个(例如，1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个)氨基酸。在另一个实施例中，本发明涉及在一个或多个(例如，若干个)位置处包括取代、缺失和/或插入的在此的SEQ ID NO：的成熟多肽的变体。在一个实施例中，引入本文的SEQ ID NO：的成熟多肽中的氨基酸取代、缺失和/或插入的数目多达10个，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个。这些氨基酸改变可以具有微小性质，即，不会显著地影响蛋白质的折叠和/或活性的保守氨基酸取代或插入；典型地1至30个氨基酸的小缺失；小的氨基末端或羧基末端延伸，如氨基末端的甲硫氨酸残基；多达20-25个残基的小接头肽；或通过改变净电荷或另一功能，有利于纯化的小的延伸。

β-葡糖苷酶：术语“β-葡糖苷酶”意指β-D-葡糖苷葡糖水解酶(beta-D-glucosideglucohydrolase)(E.C.3.2.1.21)，其催化末端非还原β-D-葡萄糖残基的水解，并释放β-D-葡萄糖。出于本发明的目的，根据Venturi等人，2002，Extracellular beta-D-glucosidasefrom Chaetomium thermophilum var.coprophilum：production，purification and somebiochemical properties[来自嗜热毛壳菌嗜粪变种的胞外β-D-葡糖苷酶：产生、纯化以及一些生物化学特性]，J.Basic Microbiol.[基础微生物学杂志]42：55-66的程序，使用对硝基苯基-β-D-吡喃葡萄糖苷作为底物来确定β-葡糖苷酶活性。将一个单位的β-葡糖苷酶定义为在25℃、pH 4.8下，在含有0.01％

20的50mM柠檬酸钠中从作为底物的1mM对硝基苯基-β-D-吡喃葡萄糖苷每分钟产生1.0微摩尔的对硝基苯酚阴离子。

β-木糖苷酶：术语“β-木糖苷酶”意指β-D-木糖苷木糖水解酶(β-D-xylosidexylohydrolase)(E.C.3.2.1.37)，其催化短β(1→4)-低聚木糖的外切水解，以将连续的D-木糖残基从非还原端移除。出于本发明的目的，一个单位的β-木糖苷酶定义为在40℃、pH 5下，在含有0.01％

20的100mM柠檬酸钠中从作为底物的1mM对硝基苯基-β-D-木糖苷每分钟产生1.0微摩尔的对硝基苯酚阴离子。

纤维二糖水解酶：术语“纤维二糖水解酶”意指1，4-β-D-葡聚糖纤维二糖水解酶(E.C.3.2.1.91和E.C.3.2.1.176)，其催化纤维素、纤维寡糖、或任何含有β-1，4-连接葡萄糖的聚合物中的1，4-β-D-糖苷键的水解，从而从链的还原性末端或非还原性末端释放纤维二糖(Teeri，1997，Crystalline cellulose degradation：New insight into thefunction of cellobiohydrolases[结晶纤维素降解：对纤维二糖水解酶的功能的新认识]，Trends in Biotechnology[生物技术趋势]15：160-167；Teeri等人，1998.Trichoderma reesei cellobiohydrolases：why so efficient on crystallinecellulose[里氏木霉纤维二糖水解酶：对结晶纤维素为何如此有效]，Biochem.Soc.Trans.[生物化学学会会刊]26：173-178)。根据里弗(Lever)等人，1972，分析生物化学(Anal.Biochem.)47：273-279；范·帝伯赫(van Tilbeurgh)等人，1982，欧洲生化学会联合会快报(FEBS Letters)，149：152-156；范·帝伯赫和克莱森斯(Claeyssens)，1985，欧洲生化学会联合会快报，187：283-288；以及汤美(Tomme)等人，1988，欧洲生物化学杂志(Eur.J.Biochem.)170：575-581所描述的程序来测定纤维二糖水解酶活性。在本发明中，Tomme等的方法可用于确定纤维二糖水解酶活性。

纤维素分解酶或纤维素酶：术语“纤维素分解酶”或“纤维素酶”意指一种或多种(例如，若干种)水解纤维素材料的酶。此类酶包括一种或多种内切葡聚糖酶、一种或多种纤维二糖水解酶、一种或多种β-葡糖苷酶、或其组合。用于测量纤维素分解活性的两种基本方法包括：(1)测量总纤维素分解活性，和(2)测量单独的纤维素分解活性(内切葡聚糖酶、纤维二糖水解酶和β-葡糖苷酶)，如Zhang等人，Outlook for cellulase improvement：Screening and selection strategies[纤维素酶改进的展望：筛选和选择策略]，2006，Biotechnology Advances[生物技术进展]24：452-481中综述。通常使用不溶性底物，包括Whatman

滤纸、微晶纤维素、细菌纤维素、藻类纤维素、棉、预处理的木质纤维素等，测量总纤维素分解活性。最常见的总纤维素分解活性测定法是将Whatman

滤纸用作底物的滤纸测定法。所述测定是由国际纯粹与应用化学联合会(IUPAC)(Ghose，1987，Measurementof cellulase activities[纤维素酶活性的测量]，Pure Appl.Chem.[纯粹与应用化学]59：257-68)确立的。

纤维素材料：术语“纤维素材料”意指含有纤维素的任何材料。纤维素是脱水纤维二糖的均聚物，并且因此是线性β-(1-4)-D-葡聚糖，而半纤维素包括多种化合物，如具有一系列取代基以复杂支链结构存在的木聚糖、木葡聚糖、阿拉伯糖基木聚糖以及甘露聚糖。尽管纤维素一般为多形态的，但发现其在植物组织中主要作为平行葡聚糖链的不溶性晶体基质存在。半纤维素通常氢键结合至纤维素以及其他半纤维素，这有助于稳定细胞壁基质。

内切葡聚糖酶：术语“内切葡聚糖酶”意指内切-1，4-(1，3；1，4)-β-D-葡聚糖4-葡聚糖水解酶(E.C.3.2.1.4)，其催化纤维素、纤维素衍生物(如羧甲基纤维素和羟乙基纤维素)、地衣多糖中的1，4-β-D-糖苷键，混合β-1，3葡聚糖如谷类β-D-葡聚糖或木葡聚糖以及含有纤维素组分的其他植物材料中的β-1，4键的内切水解。可以通过测量底物粘度的降低或通过还原糖测定所确定的还原末端的增加来确定内切葡聚糖酶活性(张(Zhang)等人，2006，生物技术进展(Biotechnology Advances)24：452-481)。出于本发明的目的，根据Ghose，1987，Pure and Appl.Chem.[纯粹与应用化学]59：257-268的程序，在pH 5、40℃下，使用羧甲基纤维素(CMC)作为底物确定内切葡聚糖酶活性。

家族61糖苷水解酶：术语“家族61糖苷水解酶”或“家族GH61”或“GH61”意指属于根据Henrissat，1991，A classification of glycosyl hydrolases based on amino-acidsequence similarities[基于氨基酸序列的相似性的糖基水解酶的分类]，Biochem.J.[生物化学杂志]280：309-316，以及Henrissat B和Bairoch A，1996，Updating the sequence-based classification of glycosyl hydrolases[基于序列的糖基水解酶的分类的更新]，Biochem.J.[生物化学杂志]316：695-696的糖苷水解酶家族61的多肽。这个家族中的酶最初基于在一个家族成员中的非常弱的内切-1，4-β-D-葡聚糖酶活性的测量值而被分类为糖苷水解酶家族。这些酶的结构和作用模式是不规范的，并且它们不能被视为真正的糖苷酶。然而，基于它们在与纤维素酶或纤维素酶的混合物结合使用时增强木质纤维素分解的能力，它们被保留在CAZy分类中。

半纤维素分解酶或半纤维素酶：术语“半纤维素分解酶”或“半纤维素酶”意指可对半纤维素材料进行水解的一种或多种(例如，若干种)酶。参见例如，沙洛姆(Shallom)，D.和肖汉姆(Shoham)，Y.微生物半纤维素酶(Microbial hemicellulases)，微生物学新见(Current Opinion In Microbiology)，2003，6(3)：219-228)。半纤维素酶是植物生物质降解中的关键组分。半纤维素酶的实例包括但不限于：乙酰甘露聚糖酯酶、乙酰木聚糖酯酶、阿拉伯聚糖酶、阿拉伯呋喃糖苷酶、香豆酸酯酶、阿魏酸酯酶、半乳糖苷酶、葡糖醛酸糖苷酶、葡糖醛酸酯酶、甘露聚糖酶、甘露糖苷酶、木聚糖酶、以及木糖苷酶。这些酶的底物(半纤维素)是支链和线性多糖的异质群体，所述多糖经由氢与植物细胞壁中的纤维素微纤维键合，从而将它们交联成稳固网络。半纤维素还共价附接至木质素，从而与纤维素一起形成高度复杂的结构。半纤维素的可变结构和组织要求许多酶的协同作用以使其完全降解。半纤维素酶的催化模块是水解糖苷键的糖苷水解酶(GH)，或是水解乙酸或阿魏酸侧基团的酯键的碳水化合物酯酶(CE)。这些催化模块基于其一级序列的同源性，可以分配到GH和CE家族。一些家族，具有总体上类似的折叠，可进一步归类为宗族(clan)，以字母标记(例如，GH-A)。这些和其他碳水化合物活性酶的最具信息性和最新的分类可在碳水化合物活性酶(Carbohydrate-Active Enzymes)(CAZy)数据库中获得。可以根据高斯(Ghose)和比萨拉(Bisaria)，1987，纯粹与应用化学(Pure&AppI.Chem.)59：1739-1752，在适合的温度(例如50℃、55℃、或60℃)和pH(例如5.0或5.5)下测量半纤维素分解酶活性。

具有纤维素分解增强活性的多肽：术语“具有纤维素分解增强活性的多肽”意指催化具有纤维素分解活性的酶对纤维素材料的水解的增强的GH61多肽。在一个方面，使用在总蛋白质重量的2％-3％的米曲霉β-葡糖苷酶(根据WO 02/095014在米曲霉中重组产生)或总蛋白质重量的2％-3％的烟曲霉β-葡糖苷酶(如WO2002/095014中所描述在米曲霉中重组产生)的纤维素酶蛋白负载量存在的情况下

1.5L(诺维信公司，巴格斯瓦尔德，丹麦)的混合物作为纤维素分解活性的来源。

具有纤维素分解增强活性的GH61多肽通过降低达到相同水解水平所需的纤维素分解酶的量而增强由具有纤维素分解活性的酶催化的纤维素材料的水解，优选降低至少1.01倍，例如至少1.05倍，至少1.10倍，至少1.25倍，至少1.5倍，至少2倍，至少3倍，至少4倍，至少5倍，至少10倍，或至少20倍。

木聚糖酶：术语“木聚糖酶”意指1，4-β-D-木聚糖-木糖水解酶(1，4-β-D-xylan-xylohydrolase)(E.C.3.2.1.8)，其催化木聚糖中1，4-β-D-木糖苷键的内水解。就本发明而言，木聚糖酶活性是在37℃在0.01％

X-100和200mM磷酸钠缓冲液pH 6中用0.2％AZCL-阿拉伯木聚糖作为底物确定的。一个单位的木聚糖酶活性定义为在37℃、pH 6下，在200mM磷酸钠缓冲液(pH 6)中从作为底物的0.2％AZCL-阿拉伯糖基木聚糖中每分钟生成1.0微摩尔天青精。

作物籽粒：术语“作物籽粒”包括来自例如玉米(玉蜀黍)、水稻、大麦、高粱大豆、果壳以及小麦的籽粒。玉米籽粒是示例性的。已知多种玉米籽粒，包括例如马齿型玉米、硬粒玉米、有稃种玉米、具条纹玉米、甜玉米、糯玉米等。

在一个实施例中，该玉米籽粒是黄色马齿型玉米籽粒。黄色马齿型玉米籽粒具有称为“果皮(Pericarp)”的外部覆盖物，保护籽粒中的胚芽。它防水和水蒸气并且是昆虫和微生物所不希望的。

未被“果皮”覆盖的籽粒的唯一区域是“顶帽(Tip Cap)”，它是籽粒至穗轴的附着点。

胚芽：“胚芽”是玉米籽粒的唯一存活部分。它包含籽粒生长为玉米植株所必需的遗传信息、酶、维生素以及矿物质。在黄色马齿型玉米中，约25％的胚芽是玉米油。覆盖且包围胚芽的胚乳构成约82％的籽粒干重并且是种子萌发的能量(淀粉)和蛋白来源。存在两种类型的胚乳，软胚乳和硬胚乳。在硬胚乳中，淀粉被紧紧地堆积在一起。在软胚乳中，淀粉是松散的。

淀粉：术语“淀粉”意指由植物的复杂多糖构成、由广泛出现在植物组织中的呈贮藏粒形式的葡萄糖单元构成、由直链淀粉和支链淀粉组成且表示为(C6H10O5)n(其中n是任何数字)的任何材料。

研磨的：术语“研磨的”是指植物材料已经例如通过粉碎、分级、碾磨、磨碎等而被分解成更小的颗粒。

碾磨(grind或grinding)：术语“碾磨”意指破坏果皮并打开作物籽粒的任何方法。

浸渍(steep或steeping)：术语“浸渍”意指用水以及任选地SO₂浸泡作物籽粒。

干固体：术语“干固体”是在干重基础上的浆液的全固体(以百分比计)。

寡糖：术语“寡糖”是具有2至10个单糖单位的化合物。

湿磨益处：术语“湿磨益处”意指改进的淀粉产量和/或纯度，改进的面筋产量和/或纯度，改进的纤维纯度，或浸渍水过滤、脱水和蒸发，更容易地分离胚芽和/或更好的糖化后过滤及其过程能源节约中的一种或多种。

具体实施方式

小麦面筋淀粉分离

本发明涉及将小麦粉分离成包括面筋级分和淀粉级分的两种或更多种级分的方法，所述方法包括以下步骤：

a)将小麦粉和水混合；

b)添加一种或多种具有GH8木聚糖酶活性的多肽；

c)将混合物孵育预先确定的一段时间；

d)将混合物分离成包括富含面筋级分和富含淀粉级分的两种或更多种级分；以及

e)回收包括富含面筋级分和富含淀粉级分的所述两种或更多种级分；

其中一种或多种具有GHG8木聚糖酶活性的多肽选自具有脂肪酶活性并具有与SEQID NO：2之一具有至少60％序列同一性的序列的多肽。

原则上所述小麦粉可以是任何小麦粉，并且本发明不限于本领域中已知的任何特定小麦品种、品牌或研磨方法。

将小麦粉和水混合是本发明方法中的第一步，并且其目的是通过有效混合使小麦粉水合和面筋团聚。此步骤在本领域中所熟知的，并且有时也称为面团制备。此步骤通过在搅拌下将水和小麦粉混合来进行，从而形成混合物或面团。

添加到小麦粉中的水的量取决于以下因素，例如特定的加工条件，特定的小麦和所使用的小麦品种，并且本领域技术人员将容易确定。通常，添加的水的量是在0.1-3升/kg小麦粉，优选地0.5-2.5升/kg小麦粉，优选地1-2升/kg小麦粉的范围内。

所述条件(例如pH和温度)通常由成分决定，这意味着通常无需任何pH和温度调节即可进行混合，因此pH和温度由所使用的原材料确定。

根据本发明，将一种或多种具有GH8木聚糖酶活性的多肽添加至混合物。可以将一种或多种具有GH8木聚糖酶活性的多肽与小麦粉一起添加，或它可以在小麦粉和水已经混合后添加。当已添加一种或多种具有GH8木聚糖酶活性的多肽时，混合应持续至少足够的时间以确保其在混合物或面团中均匀分布。通常，一种或多种具有GH8木聚糖酶活性的多肽以0.1-500μg酶蛋白质/克小麦粉(μgEP/g小麦)的范围内(例如1-200μg EP/g小麦范围内，例如5-100μg EP/g小麦范围内)的量添加。

在一些实施例中，将一种或多种另外的酶与一种或多种具有GH8木聚糖酶活性的多肽一起添加。就此而言，“一起添加”旨在意指将一种或多种另外的酶与一种或多种具有GH8木聚糖酶活性的多肽同时或依次添加，使得将一种或多种另外的酶以及一种或多种具有GH8木聚糖的多肽混合，并且当混合过程完成时，其在混合物或面团中均匀地分布。因此，可以将一种或多种具有GH8木聚糖酶活性的多肽和一种或多种另外的酶作为单一组合物或作为两种或多种单独的组合物(每种包含一种或多种酶)添加。

一种或多种另外的酶可以选自纤维素酶、木聚糖酶、蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶和阿拉伯呋喃糖苷酶。

在一个优选的实施例中，将具有木聚糖酶活性多肽与具有脂肪酶活性的多肽一起添加。具有木聚糖酶活性多肽可以选自GH10或GH11木聚糖酶。

根据本发明，优选的木聚糖酶是在WO 97/021785中披露的GH10木聚糖酶。

根据本发明，优选地脂肪酶是在PCTR/CN2018/116692(通过引用并入本文)中披露的脂肪酶。

将混合物孵育预先确定的一段时间。混合完成时，将混合物或面团在预先确定的时间段孵育以使面筋形成面筋网络。此外，一种或多种具有脂肪酶活性的多肽在此期间将水解混合物或面团中的脂质，并且任选的另外的酶可在此孵育期间作用于它们的底物。这也称为面团成熟，并且其通常在熟化罐中进行。通常，孵育是在环境温度下进行的，即没有温度调节。因此，孵育通常在5℃-50℃的温度范围内进行，优选地在15℃-40℃的温度范围内进行，并且最优选地在20℃-35℃的温度范围内进行。

进行足够时间的孵育以形成面筋网络，并且本领域技术人员容易确定持续时间。混合物可以进行5分钟至8小时范围内的时间，例如15分钟至4小时范围内。

将混合物分离成包括富含面筋级分和富含淀粉级分的两种或更多种级分。孵育期后，将混合物分离成包括富含淀粉级分和富含面筋级分的两种或更多种级分。

在本申请中，富含淀粉级分旨在意指包含至少50％(w/w)淀粉的级分，优选至少60％(w/w)淀粉，优选至少70％(w/w)淀粉，优选至少80％(w/w)淀粉，优选至少90％(w/w)淀粉的级分，其基于级分的干物质计算。

在本申请中，富含面筋级分旨在意指包含至少50％(w/w)面筋的级分，优选至少60％(w/w)面筋，优选至少70％(w/w)面筋，优选至少80％(w/w)面筋，优选至少90％(w/w)面筋的级分，其基于级分的干物质计算。

可以使用本领域已知的方法和设备基于溶解度和密度的差异来进行分离步骤。

在一个优选的实施例中，使用三相分离器工艺进行分离步骤，将混合物或面团分离成富含淀粉级分；富含面筋级分；以及具有高纤维含量的戊聚糖级分，特别是戊聚糖(例如阿拉伯糖基木聚糖)。

在分离步骤将混合物/面团分离成包括富含面筋级分和富含淀粉级分的两种或更多种级分后，可以对这些级分中的每一种进行另外的分离步骤，以甚至进一步纯化所述级分并避免损失。这种操作在本领域中是已知的，是例如称为面筋洗涤、淀粉洗涤和纤维洗涤，并且通常使用本领域已知的许多倾析器、双锥筒体离心机(sedicanter)、离心机、筛网、水力旋流器等进行。

分离步骤已经完成，并且两种或更多种级分已经获得其预期的纯度，通常通过去除过量的水并获得呈干燥稳定形式的级分来回收级分。可替代地，可以将所获得的级分不进行干燥而立即加工。

另一方面，本发明涉及一种或多种具有GH8木聚糖酶活性的多肽的用途，其中所述具有GH8木聚糖酶活性的多肽是如本文所定义的DPSY进化枝的成员；优选地所述具有GH8木聚糖酶活性的多肽是如本文所定义的以下进化枝中的至少一种的成员：SMDY进化枝、ALWNW进化枝、WFAAAL进化枝和DEAG进化枝。

从本发明的方法中可以得到一些技术益处，包括改进的分离；优选地，所述方法提供了如本文所确定的降低的小麦粉浆液中的粘度和/或如本文所确定的较高的蛋白质回收。这已经反映出与之前的方法相比在第一分离步骤中将混合物或面团分离成包括富含淀粉级分和富含面筋级分的两种或更多种级分的能力。

具有GH8木聚糖酶活性的多肽

GH8木聚糖酶

糖苷水解酶E.C.3.2.1.是一组广泛的酶，这组酶水解两种或更多种碳水化合物之间或碳水化合物与非碳水化合物部分之间的糖苷键。基于序列相似性的糖苷水解酶分类系统已导致＞100个不同的家族的定义。此分类可在CAZy(http：//www.cazy.org/GH1.html)网站上找到，并且也可在CAZypedia(一种碳水化合物活性酶的在线百科全书)上进行讨论。

CAZY中的糖苷水解酶家族8，即GH8包含具有几种已知活性的转化酶，包括壳聚糖酶(EC 3.2.1.132)；纤维素酶(EC 3.2.1.4)；地衣多糖酶(EC 3.2.1.73)；内切-1，4-β-木聚糖酶(EC 3.2.1.8)；释放还原端木糖的外切-寡木聚糖酶(EC 3.2.1.156)。

本发明的第二方面涉及酶组合物，所述酶组合物包含具有GH8木聚糖酶活性的多肽，其中所述具有GH8木聚糖酶活性的多肽是如本文所定义的DPSY进化枝的成员；优选地所述具有GH8木聚糖酶活性的多肽是如本文所定义的以下进化枝中的至少一种的成员：SMDY进化枝、ALWNW进化枝、WFAAAL进化枝和DEAG进化枝。

在一个优选的实施例中，所述具有GH8木聚糖酶活性的多肽选自由以下组成的组：

A.与SEQ ID NO：5、11、14、17、20或23的多肽，或SEQ ID NO：6、12、15、18、21或24的成熟多肽具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或至少100％序列同一性的多肽；

B.由多核苷酸编码的多肽，所述多核苷酸在高严格条件或非常高严格条件下与以下各项杂交：

(i)SEQ ID NO：4、10、13、16、19或22的多肽编码序列；

(ii)SEQ ID NO 4、10、13、16、19或22的成熟多肽编码序列，

(iii)(i)或(ii)的全长互补链；

C.由多核苷酸编码的多肽，所述多核苷酸与SEQ ID NO：4、10、13、16、19或22的成熟多肽编码序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的序列同一性；

D.SEQ ID NO：5、11、14、17、20或23的多肽或SEQ ID NO：6、12、15、18、21或24的成熟多肽的变体，所述变体在一个或多个(若干个)位置处包含取代、缺失和/或插入；以及

E.A、B、C或D的多肽的具有GH8木聚糖酶活性的片段。

在一个优选的实施例中，所述具有GH8木聚糖酶活性的多肽是与SEQ ID NO：5、11、14、17、20或23的多肽，或SEQ ID NO：6、12、15、18、21或24的成熟多肽具有至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或至少100％序列同一性的多肽。

第二方面的另一个优选的实施例涉及，其中所述具有GH8木聚糖酶活性的多肽是由以下多核苷酸编码的多肽，所述多核苷酸与SEQ ID NO：4、10、13、16、19或22的成熟多肽编码序列具有至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或至少100％的序列同一性。

第二方面的又另一个优选的实施例涉及，其中所述具有GH8木聚糖酶活性的多肽包含SEQ ID NO：5、11、14、17、20或23，或SEQ ID NO：6、12、15、18、21或24的成熟多肽，或由其组成。

优选地，第二方面的组合物进一步包含一种或多种选自由以下组成的组的酶：β-木糖苷酶、纤维素酶、半纤维素酶、脂肪酶、内切葡聚糖酶、乙酰聚糖酯酶(acetylanesterase)、纤维二糖水解酶I、纤维二糖水解酶II、和GH61多肽。

在一个实施例中，在本发明的方法中使用的具有GH8木聚糖酶活性的多肽具有木聚糖酶蛋白酶活性，并且由以下多核苷酸编码，所述多核苷酸在高严格条件或非常高严格条件下与以下各项杂交：(i)SEQ ID NO 4、10、13、16、19或22的多肽编码序列，(ii)SEQ IDNO：4、10、13、16、19或22的成熟多肽编码序列，(iii)(i)或(ii)的全长互补链。(J.Sambrook，E.F.Fritsch，和T.Maniatis，1989，Molecular Cloning，A LaboratoryManual[分子克隆：实验室手册]，第2版，冷泉港，纽约)。

SEQ ID NO：4、10、13、16、19或22的全长或成熟多肽编码序列，或其子序列，以及SEQ ID NO：5、11、14、17、20或23的氨基酸序列；或SEQ ID NO：6、12、15、18、21或24的成熟多肽或其片段，可以用于设计核酸探针，用以根据本领域熟知的方法来鉴定并克隆对来自不同属或种的菌株的、具有蛋白酶活性的多肽进行编码的DNA。具体而言，根据标准的DNA印迹方法，可将这些探针用于与感兴趣的属或种的基因组或cDNA杂交，以鉴定和分离其中相应的基因。此类探针可明显短于完整序列，但是长度应为至少14个，例如至少25个、至少35个、或至少70个核苷酸。优选地，所述核酸探针长度为至少100个核苷酸，例如长度为至少200个核苷酸、至少300个核苷酸、至少400个核苷酸、至少500个核苷酸、至少600个核苷酸、至少700个核苷酸、至少800个核苷酸、或至少900个核苷酸。DNA和RNA探针两者都可使用。典型地将探针进行标记(例如，用³²P、³H、³⁵S、生物素、或抗生物素蛋白)，用于检测相应的基因。此类探针涵盖于本发明中。

可以筛选从此类其他菌株制备的基因组DNA或cDNA文库的与上述探针杂交并编码具有蛋白酶活性的多肽的DNA。来自此类其他菌株的基因组DNA或其他DNA可通过琼脂糖或聚丙烯酰胺凝胶电泳或其他分离技术来分离。可将来自文库的DNA或分离的DNA转移到并固定在硝化纤维素或其他适合的运载体材料上。为了鉴定与SEQ ID NO：4、10、13、16、19或22的全长或成熟多肽编码序列或其子序列同源的克隆或DNA，优选地在DNA印迹中使用载体材料。

出于本发明的一个目的，杂交表明多核苷酸在高至非常高严格条件下与被标记的核酸探针杂交，所述探针对应于SEQ ID NO：4、10、13、16、19或22的全长或成熟多肽编码序列、其互补链或其子序列。可以使用例如X-射线胶片或本领域已知的任何其他检测手段来检测在这些条件下核酸探针杂交的分子。

对于长度为至少100个核苷酸的长探针而言，高至非常高严格条件定义为最佳地遵循标准DNA印迹程序，在42℃下在5X SSPE、0.3％SDS、200微克/ml剪切并变性的鲑鱼精子DNA中，以及对于非常低和低严格条件在25％甲酰胺中，对于中和中-高严格条件在35％甲酰胺中，或对于高和非常高严格条件在50％甲酰胺中预杂交和杂交12至24小时。最后在65℃(高严格条件)和在70℃(非常高严格条件)下使用2X SSC、0.2％SDS将载体材料洗涤三次，每次15分钟。

对于长度为约15个核苷酸至约70个核苷酸的短的探针来说，严格度条件被定义为根据标准DNA印迹程序，在比使用根据博尔顿(Bolton)和麦卡锡(McCarthy)(1962，美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)48：1390)的计算计算的T_m低约5℃至约10℃下，在0.9M NaCl、0.09M Tris-HCl(pH 7.6)、6mM EDTA、0.5％NP-40、1X登哈特氏溶液(Denhardt′s solution)、1mM焦磷酸钠、1mM磷酸二氢钠、0.1mM ATP、以及每ml0.2mg的酵母RNA中预杂交和杂交持续最佳12至24小时。将载体材料最终在比所计算的T_m低5℃至10℃，在6X SCC加0.1％SDS中洗涤一次(持续15分钟)并且使用6X SSC洗涤两次(每次15分钟)。

在另一个实施例中，本发明涉及使用变体，所述变体在SEQ ID NO：6、12、15、18、21或24的成熟多肽或同源序列的一个或多个(或若干个)位置处包含取代、缺失和/或插入。这些氨基酸改变可以具有微小性质，即，不会显著地影响蛋白质的折叠和/或活性的保守氨基酸取代、插入或缺失；典型地为一个至约30个氨基酸的小缺失；小的氨基末端或羧基末端延伸，如氨基末端的甲硫氨酸残基；多至约20-25个残基的小接头肽；或小的延伸，其通过改变净电荷或另一官能(例如聚组氨酸标签或HQ标签、抗原表位或结合结构域)来促进纯化。

保守取代的实例在下组之内：碱性氨基酸(精氨酸、赖氨酸和组氨酸)、酸性氨基酸(谷氨酸和天冬氨酸)、极性氨基酸(谷氨酰胺和天冬酰胺)、疏水氨基酸(亮氨酸、异亮氨酸和缬氨酸)、芳族氨基酸(苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸)、以及小氨基酸(甘氨酸、丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸和甲硫氨酸)。一般不会改变比活性的氨基酸取代是本领域已知的并且例如由H.Neurath和R.L.Hill，1979，于The Proteins[蛋白质]，Academic Press[学术出版社]，纽约中描述。预期不会实质上改变比活性的最常发生的交换是Ala/Ser、Val/Ile、Asp/Glu、Thr/Ser、Ala/Gly、Ala/Thr、Ser/Asn、Ala/Val、Ser/Gly、Tyr/Phe、Ala/Pro、Lys/Arg、Asp/Asn、Leu/Ile、Leu/Val、Ala/Glu、以及Asp/Gly。

可替代地，这些氨基酸改变具有这样一种性质：改变多肽的物理化学特性。例如，氨基酸改变可以改善多肽的热稳定性、改变底物特异性、改变最适pH等。

亲本多肽中的必需氨基酸可以根据本领域中已知的程序来鉴定，如定点诱变或丙氨酸扫描诱变(坎宁安(Cunningham)和韦尔斯(Wells)，1989，科学(Science)244：1081-1085)。在后一项技术中，在该分子中的每个残基处引入单个丙氨酸突变，并且对所得突变体分子的蛋白酶活性进行测试以鉴定对于该分子的活性至关重要的氨基酸残基。还参见，Hilton等人，1996，J.Biol.Chem.[生物化学杂志]271：4699-4708。酶或其他生物学相互作用的活性部位还可通过对结构的物理分析来确定，如由下述技术确定：核磁共振、晶体学(crystallography)、电子衍射、或光亲和标记，连同对推定的接触位点(contract site)氨基酸进行突变。参见，例如，de Vos等人，1992，Science[科学]255：306-312；Smith等人，1992，J.Mol.Biol.[分子生物学杂志]224：899-904；Wlodaver等人，1992，FEBSLett.[欧洲生化学会联合会快报]309：59-64。还可以从与和亲本多肽相关的多肽的同一性分析推断必需氨基酸的身份。

使用已知的诱变、重组和/或改组方法，随后进行相关的筛选程序可以做出单或多氨基酸取代、缺失和/或插入并对其进行测试，所述相关的筛选程序例如由Reidhaar-Olson和Sauer，1988，Science[科学]241：53-57；Bowie和Sauer，1989，Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊]86：2152-2156；WO 95/17413；或WO 95/22625披露的那些。其他可以使用的方法包括易错PCR、噬菌体展示(例如Lowman等人，1991，Biochemistry[生物化学]30：10832-10837；美国专利号5,223,409；WO 92/06204)以及区域定向诱变(Derbyshire等人，1986，Gene[基因]46：145；Ner等人，1988，DNA 7：127)。

诱变/改组方法可以与高通量、自动化的筛选方法组合以检测由宿主细胞表达的克隆的、诱变的多肽的活性(Ness等人，1999，Nature Biotechnology[自然生物技术]17：893-896)。可从宿主细胞回收编码活性多肽的诱变的DNA分子，并使用本领域的标准方法快速测序。这些方法允许快速确定多肽中各个氨基酸残基的重要性。

SEQ ID NO：6、12、15、18、21或24的成熟多肽的氨基酸取代、缺失和/或插入的总数是不多于20个，例如是1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个。

所述多肽可为杂合多肽，其中一种多肽的一部分融合于另一种多肽的一部分的N末端或C末端。

该多肽可以是融合多肽或可切割的融合多肽，其中另一种多肽在本发明多肽的N-末端或C-末端处融合。通过将编码另一种多肽的多核苷酸与本发明多核苷酸融合而产生融合多肽。用于产生融合多肽的技术是本领域已知的，并包括连接编码多肽的编码序列，使得它们在阅读框中，并且使该融合多肽的表达在相同的一个或多个启动子和终止子的控制下。还可使用内含肽技术构建融合多肽，其中在翻译后产生融合物(Cooper等人，1993，EMBOJ.[欧洲分子生物学学会杂志]12：2575-2583；Dawson等人，1994，Science[科学]266∶776-779)。

融合多肽还可包含两个多肽之间的切割位点。在融合蛋白分泌之时，所述位点被切割，从而释放出这两种多肽。切割位点的实例包括但不限于在以下文献中披露的位点：Martin等人，2003，J.Ind.Microbiol.Biotechnol.[工业微生物生物技术杂志]3∶568-576；Svetina等人，2000，J.Biotechnol.[生物技术杂志]76：245-251；Rasmussen-Wilson等人，1997，Appl.Environ.Microbiol.[应用与环境微生物学]63：3488-3493；Ward等人，1995，Biotechnology[生物技术]13：498-503；和Contreras等人，1991，Biotechnology[生物技术]9：378-381；Eaton等人，1986，Biochemistry[生物化学]25∶505-512；Collins-Racie等人，1995，Biotechnology[生物技术]13∶982-987；Carter等人，1989，Proteins：Structure，Function，and Genetics[蛋白质：结构、功能以及遗传学]6：240-248；以及Stevens，2003，Drug Discovery World[世界药物发现]4：35-48。

所述多肽可以由含有对于His标签或HQ标签的编码的重组DNA序列来表达，以在任意翻译后修饰之后给出包含所述His标签或HQ标签的全部或部分的成熟多肽。所述HQ标签(具有序列-RHQHQHQ)可以在翻译后修饰过程中完全或部分切割掉，得到例如附接至成熟多肽的N-末端的另外的氨基酸-RHQHQ。

碳水化合物分子通常在翻译后修饰过程中附接至来自真菌来源的多肽。为了辅助质谱分析，该多肽可以用内切糖苷酶孵育以使各N-连接的位置去糖基化。对于每个去糖基化的N-连接位点，一个N-乙酰己糖胺仍然在该蛋白质主链上。

具有GH8木聚糖酶活性的多肽的来源

可以从任何属获得根据本发明所使用的具有GH8木聚糖酶活性的多肽。出于本发明的目的，如本文结合给定来源使用的术语“获得自”应当意指由多核苷酸编码的多肽是由该来源或由已经插入了来自该来源的多核苷酸的菌株产生的。在一个方面中，获得自给定来源的多肽是细胞外分泌的。

可以使用以上提到的探针从其他来源，包括从自然界(例如，土壤、堆肥、水等)分离的微生物或直接从天然材料(例如，土壤、堆肥、水等)获得的DNA样品鉴定和获得所述多肽CH8木聚糖酶。用于从天然生境中直接分离微生物和DNA的技术是本领域熟知的。然后可以通过类似地筛选另一微生物的基因组DNA或cDNA文库或混合的DNA样品来获得编码该多肽的多核苷酸。一旦已经用一种或多种探针检测到编码多肽的多核苷酸，则可以通过利用本领域普通技术人员已知的技术(参见例如，Sambrook等人，1989，同上)分离或克隆多核苷酸。

多核苷酸

用来分离或克隆编码多肽的多核苷酸的技术在本领域是已知的，并且包括从基因组DNA分离、从cDNA制备或其组合。可以例如通过使用熟知的聚合酶链式反应(PCR)或表达文库的抗体筛选来检测具有共有结构特征的克隆DNA片段，实现从这样的基因组DNA克隆多核苷酸。参见例如，Innis等人，1990，PCR：A Guide to Methods and Application[PCR：方法和应用指南]，Academic Press[学术出版社]，纽约。可以使用其他核酸扩增程序例如连接酶链式反应(LCR)、连接激活转录(LAT)和基于多核苷酸的扩增(NASBA)。可以从芽孢杆菌属的一种菌株或来自芽孢杆菌目的另一种或相关生物中克隆多核苷酸，并且因此，例如可以是多核苷酸的多肽编码区的等位基因变体或物种变体。

修饰编码本发明多肽的多核苷酸对于合成与所述多肽基本上类似的多肽可能是必需的。术语“基本上类似”于该多肽是指多肽的非天然存在的形式。这些多肽可以因某种工程化方式而与从其天然来源分离的多肽不同，例如在比活性、热稳定性、最适pH等方面不同的变体。对于核苷酸取代的一般描述，参见例如Ford等人，1991，Protein Expressionand Purification[蛋白质表达与纯化]2：95-107。

研磨方法

湿磨籽粒，以便打开结构并且允许进一步加工并且将籽粒分离成四种主要成分：淀粉、胚芽、纤维以及蛋白质。湿磨使纤维和/或胚芽与粗粉(淀粉颗粒和蛋白质)很好分离并且时常应用于平行生产糖浆的场所。

本发明的诸位发明人已经出人意料地发现，可以通过在如在此描述的方法中处理作物籽粒而改进淀粉和/或面筋终产物的品质。

本发明的方法与传统方法相比，产生了更高的淀粉和/或面筋产量和或品质，因为淀粉和面筋终产物更纯和/或获得了更高的产量和/或使用更少的加工时间。另一种优势可以是可以减少需要使用的化学品(例如SO₂和NaHSO₃)的量或甚至完全除去。就加工而言，非常有利的是降低了工艺流体的粘度。

本发明的一个方面涉及具有GH8木聚糖酶活性的多肽在用于处理作物籽粒的方法中的用途，所述用途包括以下步骤：

a)将小麦粉和水混合；

b)添加一种或多种具有GH8木聚糖酶活性的多肽；

c)将混合物孵育预先确定的一段时间；

d)将混合物分离成包括富含面筋级分和富含淀粉级分的两种或更多种级分；以及

e)回收包括富含面筋级分和富含淀粉级分的所述两种或更多种级分。

在一个优选的实施例中，所述具有GH8活性的多肽是如本文所定义的DPSY进化枝的成员；优选地所述具有GH8木聚糖酶活性的多肽是如本文所定义的以下进化枝中的至少一种的成员：SMDY进化枝、ALWNW进化枝、WFAAAL进化枝和DEAG进化枝。

优选地，所述GH8木聚糖酶多肽选自由以下组成的组：

A.与SEQ ID NO：2、5、8、11、14、17、20或23的多肽，或SEQ ID NO：3、6、9、12、15、18、21或24的成熟多肽具有至少80％序列同一性的多肽；

B.由多核苷酸编码的多肽，所述多核苷酸在高严格条件或非常高严格条件下与以下各项杂交：

(i)SEQ ID NO：1、4、7、10、13、16、19或22的多肽编码序列；

(ii)SEQ ID NO：1、4、7、10、13、16、19或22的成熟多肽编码序列；

(iii)(i)或(ii)的全长互补链；

C.由多核苷酸编码的多肽，所述多核苷酸与SEQ ID NO：1、4、7、10、13、16、19或22的成熟多肽编码序列具有至少80％序列同一性；

D.SEQ ID NO：2、5、8、11、14、17、20或23的多肽或SEQ ID NO：3、6、9、12、15、18、21或24的成熟多肽的变体，所述变体在一个或多个(若干个)位置处包含取代、缺失和/或插入；以及

E.A、B、C或D的多肽的具有GH8木聚糖酶活性的片段。

在一个优选的实施例中，所述具有GH8木聚糖酶活性的多肽是与SEQ ID NO：2、5、8、11、14、17、20或23的多肽，或SEQ ID NO：3、6、9、12、15、18、21或24的成熟多肽具有至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或至少100％序列同一性的多肽。

在另一个优选的实施例中，所述具有GH8木聚糖酶活性的多肽是由以下多核苷酸编码的多肽，所述多核苷酸与SEQ ID NO：1、4、7、10、13、16、19或22的成熟多肽编码序列具有至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或至少100％序列同一性。

可替代地，优选具有GH8木聚糖酶活性的多肽包含SEQ ID NO：2、5、8、11、14、17、20或23，或SEQ ID NO：3、6、9、12、15、18、21或24的成熟多肽，或由其组成。

在一个优选的实施例中，所述用途进一步包括在一种或多种选自由以下组成的组的另外的酶的存在下，处理浸泡的籽粒：β-木糖苷酶、纤维素酶、半纤维素酶、脂肪酶、内切葡聚糖酶、乙酰木聚糖酯酶、纤维二糖水解酶I、纤维二糖水解酶II、和GH61多肽。

最后，优选所述方法提供了改进的小麦分离；优选地，所述方法提供了如本文所确定的降低的小麦粉浆液中的粘度和/或如本文所确定的较高的蛋白质回收。

其他酶

下面描述的一种或多种酶和多肽有待以“有效量”用于本发明的方法中。下文应在上文的“定义”部分中的酶披露的背景下加以阅读。

具有蛋白酶活性的多肽

具有蛋白酶活性的多肽或蛋白酶有时还被指定为肽酶、朊酶、肽水解酶或蛋白水解酶。蛋白酶可以是始于任一端的水解肽的外切型蛋白酶或在多肽链内部发挥作用的内切型蛋白酶(内肽酶)。内肽酶对N-和C-封端的肽底物显示出活性，这些底物与所讨论的蛋白酶的特异性有关。

术语“蛋白酶”在本文中定义为水解肽键的酶。蛋白酶的定义也适用于如在此使用的术语“亲本蛋白酶”和“蛋白酶变体”的蛋白酶部分。术语“蛋白酶”包括属于EC 3.4酶组(包括其十八个亚类中的每一个)的任何酶。EC编号参考加利福尼亚州(California)的圣迭戈(San Diego)的NC-IUBMB，学术出版社(Academic Press)的1992年酶命名法，分别包括出版于以下中的增刊1-5：1994，Eur.J.Biochem.[欧洲生物化学杂志]，223：1-5；1995，Eur.J.Biochem.[欧洲生物化学杂志]，232：1-6；1996，Eur.J.Biochem.[欧洲生物化学杂志]，237：1-5；1997，Eur.J.Biochem.[欧洲生物化学杂志]，250：1-6；以及1999，Eur.J.Biochem.[欧洲生物化学杂志]，264：610-650。命名会定期得以增补和更新；参见例如万维网(WWW)于http：//www.chem.qmw.ac.uk/iubmb/enzyme/index.htm1。

可以在本发明的方法中使用的蛋白酶可以选自例如：

(a)属于EC 3.4.21酶组的蛋白酶；和/或

(b)属于EC 3.4.14酶组的蛋白酶；和/或

(c)肽酶S53家族的丝氨酸蛋白酶，其包含两种不同类型的肽酶：三肽基氨肽酶(外切型)和内切肽酶；如在1993，Biochem.J.[生物化学杂志]290：205-218和在MEROPS蛋白酶数据库，发行9.4(2011年1月31日)(www.merops.ac.uk)中所述的。该数据库描述于Rawlings，N.D.，Barrett，A.J.和Bateman，A.，2010，“MEROPS：the peptidase database[MEROPS：肽酶数据库]”，Nucl.Acids Res.[核酸研究]38：D227-D233中。

纤维素分解组合物

在一个实施例中，该纤维素分解组合物来源于木霉属的菌株，例如里氏木霉的菌株；腐质霉属的菌株，如特异腐质霉的菌株，和/或金孢子菌属的菌株，如卢克诺文思金孢子菌的菌株。

在一个优选的实施例中，该纤维素分解组合物来源于里氏木霉的菌株。

该纤维素分解组合物可以包括以下多肽(包括酶)中的一种或多种：具有纤维素分解增强活性的GH61多肽，β-葡糖苷酶，β-木糖苷酶，CBHI和CBHII，内切葡聚糖酶，木聚糖酶或其两种、三种或四种的混合物。

在一个实施例中，该纤维素分解组合物包括具有纤维素分解增强活性的GH61多肽以及β-葡糖苷酶。

在一个实施例中，该纤维素分解组合物包括具有纤维素分解增强活性的GH61多肽以及β-木糖苷酶。

在一个实施例中，该纤维素分解组合物包括具有纤维素分解增强活性的GH61多肽以及内切葡聚糖酶。

在一个实施例中，该纤维素分解组合物包括具有纤维素分解增强活性的GH61多肽以及木聚糖酶。

在一个实施例中，该纤维素分解组合物包括具有纤维素分解增强活性的GH61多肽、内切葡聚糖酶以及木聚糖酶。

在一个实施例中，该纤维素分解组合物包括具有纤维素分解增强活性的GH61多肽、β-葡糖苷酶以及β-木糖苷酶。在一个实施例中，该纤维素分解组合物包括具有纤维素分解增强活性的GH61多肽、β-葡糖苷酶以及内切葡聚糖酶。在一个实施例中，该纤维素分解组合物包括具有纤维素分解增强活性的GH61多肽、β-葡糖苷酶以及木聚糖酶。

在一个实施例中，该纤维素分解组合物包括具有纤维素分解增强活性的GH61多肽、β-木糖苷酶以及内切葡聚糖酶。在一个实施例中，该纤维素分解组合物包括具有纤维素分解增强活性的GH61多肽、β-木糖苷酶以及木聚糖酶。

在一个实施例中，该纤维素分解组合物包括具有纤维素分解增强活性的GH61多肽、β-葡糖苷酶、β-木糖苷酶以及内切葡聚糖酶。在一个实施例中，该纤维素分解组合物包括具有纤维素分解增强活性的GH61多肽、β-葡糖苷酶、β-木糖苷酶以及木聚糖酶。在一个实施例中，该纤维素分解组合物包括具有纤维素分解增强活性的GH61多肽、β-葡糖苷酶、内切葡聚糖酶以及木聚糖酶。

在一个实施例中，该纤维素分解组合物包括具有纤维素分解增强活性的GH61多肽、β-木糖苷酶、内切葡聚糖酶以及木聚糖酶。

在一个实施例中，该纤维素分解组合物包括一种具有纤维素分解增强活性的GH61多肽、一种β-葡糖苷酶、一种β-木糖苷酶、一种内切葡聚糖酶以及一种木聚糖酶。

在一个实施例中，该内切葡聚糖酶是一种内切葡聚糖酶I。

在一个实施例中，该内切葡聚糖酶是一种内切葡聚糖酶II。

在一个实施例中，该纤维素分解组合物包括具有纤维素分解增强活性的GH61多肽、内切葡聚糖酶I以及木聚糖酶。

在一个实施例中，该纤维素分解组合物包括具有纤维素分解增强活性的GH61多肽、内切葡聚糖酶II以及木聚糖酶。

在另一个实施例中，该纤维素分解组合物包括具有纤维素分解增强活性的GH61多肽、β-葡糖苷酶以及CBHI。

在另一个实施例中，该纤维素分解组合物包括具有纤维素分解增强活性的GH61多肽、β-葡糖苷酶、CBHI以及CBHII。

该纤维素分解组合物可以进一步包括一种或多种选自下组的酶，该组由以下组成：酯酶、棒曲霉素、漆酶、木质素分解酶、果胶酶、过氧化物酶、蛋白酶、膨胀蛋白以及植酸酶。

具有纤维素分解增强活性的GH61多肽

在一个实施例中，该纤维素分解组合物可以包括一种或多种具有纤维素分解增强活性的GH61多肽。

在一个实施例中，具有纤维素分解增强活性的GH61多肽来源于嗜热子囊菌属，例如橙色嗜热子囊菌的菌株，例如在WO 2005/074656中描述为序列号2的那种；或以下具有纤维素分解增强活性的GH61多肽，所述多肽与在WO 2005/074656中的序列号2具有至少80％，例如至少85％，例如至少90％，优选95％，例如至少96％、例如97％、例如至少98％、例如至少99％同一性。

在一个实施例中，具有纤维素分解增强活性的该GH61多肽来源于来自青霉属的菌株，例如埃默森青霉菌的菌株(例如在WO 2011/041397中披露的一种)，或以下具有纤维素分解增强活性的GH61多肽，该多肽与WO 2011/041397中的序列号2具有至少80％，例如至少85％、例如至少90％，优选95％，例如至少96％、例如97％、例如至少98％、例如至少99％同一性。

在一个实施例中，具有纤维素分解增强活性的GH61多肽来源于梭孢壳属，例如土生梭孢壳霉的菌株，例如在WO 2005/074647中描述为序列号7和序列号8的那些；或来源于曲霉属的菌株的多肽，例如烟曲霉的菌株，例如在WO 2010/138754中描述为序列号2的那种，或与其具有至少80％，例如至少85％，例如至少90％，优选95％，例如至少96％、例如97％、例如至少98％、例如至少99％同一性的具有纤维素分解增强活性的GH61多肽。

内切葡聚糖酶

在一个实施例中，所述纤维素分解组合物包括内切葡聚糖酶，例如内切葡聚糖酶I或内切葡聚糖酶II。

可以在本发明的方法中使用的细菌内切葡聚糖酶的实例包括但不限于解纤维热酸菌(Acidothermus cellulolyticus)内切葡聚糖酶(WO 91/05039；WO 93/15186；美国专利号5，275，944；WO 96/02551；美国专利号5,536,655；WO 00/70031；WO 05/093050)；褐色高温双歧菌(Thermobifida fusca)内切葡聚糖酶III(WO 05/093050)；以及褐色高温双歧菌内切葡聚糖酶V(WO 05/093050)。

可以用于本发明的真菌内切葡聚糖酶的实例包括但不限于：里氏木霉内切葡聚糖酶I(Penttila等人，1986，Gene[基因]45：253-263)，里氏木霉Cel7B内切葡聚糖酶I(GENBANK^TM登录号M15665)、里氏木霉内切葡聚糖酶II(Saloheimo等人，1988，Gene[基因]63：11-22)，里氏木霉Cel5A内切葡聚糖酶II(GENBANK^TM登录号M19373)、里氏木霉内切葡聚糖酶III(Okada等人，1988，Appl.Environ.Microbiol.[应用与环境微生物学]64：555-563，GENBANK^TM登录号AB003694)、里氏木霉内切葡聚糖酶V(Saloheimo等人，1994，MolecularMicrobiology[分子微生物学]13：219-228，GENBANK^TM登录号Z33381)、棘孢曲霉内切葡聚糖酶(Ooi等人，1990，Nucleic Acids Research[核酸研究]18：5884)、川地曲霉(Aspergilluskawachii)内切葡聚糖酶(Sakamoto等人，1995，Current Genetics[当代遗传学]27：435-439)、胡萝卜软腐欧文氏菌(Erwinia capotovara)内切葡聚糖酶(Saarilahti等人，1990，Gene[基因]90：9-14)、尖镰孢内切葡聚糖酶(GENBANK^TM登录号L29381)、灰腐质霉高温变种内切葡聚糖酶(GENBANK^TM登录号AB003107)、热白丝菌(Melanocarpus albomyces)内切葡聚糖酶(GENBANK^TM登录号MAL515703)、粗糙链孢菌内切葡聚糖酶(GENBANK^TM登录号XM_324477)、特异腐质霉内切葡聚糖酶V、嗜热毁丝霉CBS 117.65内切葡聚糖酶、担子菌纲(basidiomycete)CBS 495.95内切葡聚糖酶、担子菌纲CBS 494.95内切葡聚糖酶、土生梭孢壳霉NRRL 8126CEL6B内切葡聚糖酶、土生梭孢壳霉NRRL 8126 CEL6C内切葡聚糖酶、土生梭孢壳霉NRRL 8126 CEL7C内切葡聚糖酶、土生梭孢壳霉NRRL 8126 CEL7E内切葡聚糖酶、土生梭孢壳霉NRRL 8126 CEL7F内切葡聚糖酶、Cladorrhinum foecundissimum ATCC 62373CEL7A内切葡聚糖酶、以及里氏木霉菌株号VTT-D-80133内切葡聚糖酶(GENBANK^TM登录号M15665)。

在一个实施例中，所述内切葡聚糖酶是内切葡聚糖酶II，例如来源于木霉属(例如里氏木霉的菌株)的一种，例如在WO 2011/057140中描述为序列号22的那种；或以下内切葡聚糖酶，所述内切葡聚糖酶与WO 2011/057140中的序列号22具有至少80％，例如至少85％、例如至少90％，优选95％，例如至少96％、例如97％、例如至少98％、例如至少99％同一性。在一个方面，该蛋白酶与WO 2011/057140中的序列号22的成熟多肽相差多达10个(例如，1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个)氨基酸。在另一个实施例中，本发明涉及在一个或多个(例如，若干个)位置处包括取代、缺失和/或插入的WO 2011/057140中的序列号22的成熟多肽的变体。在一个实施例中，引入WO 2011/057140中的序列号22的成熟多肽中的氨基酸取代、缺失和/或插入的数目多达10个，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个。这些氨基酸改变可以具有微小性质，即，不会显著地影响蛋白质的折叠和/或活性的保守氨基酸取代或插入；典型地1至30个氨基酸的小缺失；小的氨基末端或羧基末端延伸，如氨基末端的甲硫氨酸残基；多达20-25个残基的小接头肽；或通过改变净电荷或另一功能，有利于纯化的小的延伸。

β-木糖苷酶

有用于本发明的方法的β-木糖苷酶的实例包括但不限于来自以下的β-木糖苷酶：粗糙链孢菌(SwissProt登录号Q7SOW4)、里氏木霉(UniProtKB/TrEMBL登录号Q92458)以及埃默森篮状菌(SwissProt登录号Q8X212)。

在一个实施例中，所述β-木糖苷酶来源于曲霉属，例如烟曲霉的菌株，例如在WO201 1/057140中描述为序列号206的那种；以下β-木糖苷酶，所述β-木糖苷酶与在WO 2011/057140中的序列号206具有至少80％，例如至少85％、例如至少90％，优选95％，例如至少96％、例如97％、例如至少98％、例如至少99％同一性。在一个方面，所述蛋白酶与在WO2011/057140中描述的SEQ ID NO：206的成熟多肽相差多达10个(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个)氨基酸。在另一个实施例中，本发明涉及在一个或多个(例如，若干个)位置处包括取代、缺失和/或插入的描述于WO 2011/057140中的SEQ ID NO：206的成熟多肽的变体。在一个实施例中，引入描述于WO 2011/057140中的SEQ ID NO：206的成熟多肽中的氨基酸取代、缺失和/或插入的数目多达10个，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个。这些氨基酸改变可以具有微小性质，即，不会显著地影响蛋白质的折叠和/或活性的保守氨基酸取代或插入；典型地1至30个氨基酸的小缺失；小的氨基末端或羧基末端延伸，如氨基末端的甲硫氨酸残基；多达20-25个残基的小接头肽；或通过改变净电荷或另一功能，有利于纯化的小的延伸。

在一个实施例中，该β-木糖苷酶来源于曲霉属的菌株，例如烟曲霉的菌株(例如在美国临时号61/526,833或PCT/US12/052163(实例16和17)中披露的一种)，或来源于木霉属的菌株，例如里氏木霉的菌株，例如WO 2011/057140中的序列号58的成熟多肽，或以下β-木糖苷酶，该β-木糖苷酶与其具有至少80％，例如至少85％、例如至少90％，优选95％，例如至少96％、例如97％、例如至少98％、例如至少99％同一性。

β-葡糖苷酶

在一个实施例中，该纤维素分解组合物可以包括一种或多种β-葡糖苷酶。在一个实施例中，该β-葡糖苷酶可以是来源于曲霉属的菌株的β-葡糖苷酶，例如来源于米曲霉的，例如披露于WO 2002/095014中的一种或在WO 2008/057637中披露的具有β-葡糖苷酶活性的融合蛋白，或来源于烟曲霉的，例如在WO 2005/047499中披露的一种或烟曲霉β-葡糖苷酶变体，例如披露于PCT申请PCT/US11/054185(或美国临时申请号61/388,997)中的一种，例如具有以下取代的一种：F100D、S283G、N456E、F512Y。

在一个实施例中，该β-葡糖苷酶来源于曲霉属，例如烟曲霉的菌株，例如在WO2005/047499中描述的一种，或以下β-葡糖苷酶，该β-葡糖苷酶与其具有至少80％，例如至少85％、例如至少90％，优选95％，例如至少96％、例如97％、例如至少98％、例如至少99％同一性。

在一个实施例中，该β-葡糖苷酶来源于曲霉属，例如烟曲霉的菌株，例如在WO2012/044915中描述的一种，或以下β-葡糖苷酶，该β-葡糖苷酶与其具有至少80％，例如至少85％、例如至少90％，优选95％，例如至少96％、例如97％、例如至少98％、例如至少99％同一性。

纤维二糖水解酶I

在一个实施例中，该纤维素分解组合物可以包括一种或多种CBH I(纤维二糖水解酶I)。在一个实施例中，所述纤维素分解组合物包括纤维二糖水解酶I(CBHI)，例如来源于曲霉属的菌株的一种，例如烟曲霉的菌株，例如披露于WO 2011/057140中的序列号2中的Cel7A CBHI，或来源于木霉属的菌株，例如里氏木霉的菌株。

在一个实施例中，该纤维二糖水解酶I来源于曲霉属，例如烟曲霉的菌株，例如在WO 2011/057140中描述的一种，或以下CBHI，该CBHI与其具有至少80％，例如至少85％、例如至少90％，优选95％，例如至少96％、例如97％、例如至少98％、例如至少99％同一性。

纤维二糖水解酶II

在一个实施例中，该纤维素分解组合物可以包括一种或多种CBH II(纤维二糖水解酶II)。在一个实施例中，该纤维二糖水解酶II(CBHII)，例如来源于曲霉属的菌株的纤维二糖水解酶II，例如烟曲霉的菌株；或木霉属的菌株，例如里氏木霉，或梭孢壳属的菌株，例如土生梭孢壳霉的菌株，例如来自土生梭孢壳霉的纤维二糖水解酶II CEL6A。

在一个实施例中，该纤维二糖水解酶II来源于曲霉属，例如烟曲霉的菌株，例如在WO 2011/057140中描述的一种，或以下CBHII，该CBHII与其具有至少80％，例如至少85％、例如至少90％，优选95％，例如至少96％、例如97％、例如至少98％、例如至少99％同一性。

示例性纤维素分解组合物

如以上提及的，该纤维素分解组合物可以包括多种不同的多肽(例如酶)。

在一个实施例中，该纤维素分解组合物包括一种里氏木霉纤维素酶制剂，该制剂包含米曲霉β-葡糖苷酶融合蛋白(例如WO 2008/057637中的SEQ ID NO：74或76)以及金黄色嗜热子囊菌GH61A多肽(例如，WO 2005/074656中的SEQ ID NO：2)。

在一个实施例中，该纤维素分解组合物包括棘孢曲霉GH10木聚糖酶(例如，WO 94/021785中的SEQ ID NO：5(XylII))和一种里氏木霉纤维素酶制剂的共混物，该制剂包含烟曲霉β-葡糖苷酶(例如，WO 2005/047499中的SEQ ID NO：2)和金黄色嗜热子囊菌GH61A多肽(例如，WO 2005/074656中的SEQ ID NO：2)。

在一个实施例中，该纤维素分解组合物包括烟曲霉GH10木聚糖酶(例如，WO 2006/078256中的SEQ ID NO：6(Xyl III))和烟曲霉β-木糖苷酶(例如，WO 2011/057140中的SEQID NO：206)与一种里氏木霉纤维素酶制剂的共混物，该制剂包含烟曲霉纤维二糖水解酶I(例如，WO 2011/057140中的SEQ ID NO：6)、烟曲霉纤维二糖水解酶II(例如，WO 2011/057140中的SEQ ID NO：18)、烟曲霉β-葡糖苷酶变体(例如，披露于WO 2012/044915中的具有F100D、S283G、N456E、F512Y取代的变体)以及青霉属(埃默森青霉菌)GH61多肽(例如，WO2011/041397中的SEQ ID NO：2)。

在一个实施例中，该纤维素分解组合物包括一种里氏木霉纤维素分解酶组合物，该里氏木霉纤维素分解酶组合物进一步包括具有纤维素分解增强活性的金黄色嗜热子囊菌GH61A多肽(例如，WO 2005/074656中的SEQ ID NO：2)以及米曲霉β-葡糖苷酶融合蛋白(例如，WO 2008/057637的SEQ ID NO：74或76)。

在另一个实施例中，该纤维素分解组合物包括一种里氏木霉纤维素分解酶组合物，该里氏木霉纤维素分解酶组合物进一步包括具有纤维素分解增强活性的金黄色嗜热子囊菌GH61A多肽(例如，WO 2005/074656中的SEQ ID NO：2)以及烟曲霉β-葡糖苷酶(例如，WO2005/047499的SEQ ID NO：2)。

在另一个实施例中，该纤维素分解组合物包括一种里氏木霉纤维素分解酶组合物，该里氏木霉纤维素分解酶组合物进一步包括例如在WO 2011/041397中披露为SEQ IDNO：2的具有纤维素分解增强活性的埃默森青霉菌GH61A多肽、烟曲霉β-葡糖苷酶(例如，WO2005/047499中的SEQ ID NO：2)或其具有以下取代的变体：F100D、S283G、N456E、F512Y。

本发明的酶组合物可以处于任何适于使用的形式，例如像除去或未除去细胞的粗发酵液、具有或不具有细胞碎片的细胞裂解液、半纯化或纯化的酶组合物、或作为酶的来源的宿主细胞(例如，木霉属宿主细胞)。

该酶组合物可以是干粉或颗粒、无粉尘的颗粒、液体、稳定化液体或稳定化受保护的酶。可以根据已建立的方法例如通过添加稳定剂(如糖、糖醇或其他多元醇)、和/或乳酸或另一种有机酸，将液体酶组合物稳定化。

酶量

在具体实施例中，所述GH8木聚糖酶以酶蛋白的总量的约5％w/w至约65％w/w的范围存在于酶组合物中。在其他实施例中，蛋白酶以约5％w/w至约60％w/w、约5％w/w至约50％w/w、约5％w/w至约40％w/w、约5％w/w至约30％w/w、约10％w/w至约30％w/w、或约10％w/w至约20％w/w存在。

可以按有效量添加酶，可以根据从业者和具体过程需要调节该有效量。通常，酶可以按以下量存在：0.0001-2.5mg总酶蛋白/g干固体(DS)籽粒，优选0.001-1mg酶蛋白/g DS籽粒，优选0.0025-0.5mg酶蛋白/g DS籽粒，优选0.025-0.25mg酶蛋白/g DS籽粒，优选0.05-0.125mg酶蛋白/g DS籽粒。在具体实施例中，该酶可以按以下量存在，例如2.5μg、12.5μg、25μg、50μg、75μg、100μg、125μg、150μg、175μg、200μg、250μg、500μg酶蛋白/g DS籽粒。

其他酶活性

根据本发明，以下活性中的一种或多种的有效量可以在处理籽粒的过程中存在或添加：戊聚糖酶、果胶酶、阿拉伯聚糖酶、阿拉伯呋喃糖苷酶(arabinofurasidase)、木葡聚糖酶、植酸酶活性。

据信在将籽粒分为更细的颗粒后，所述一种或多种酶可以更直接地作用于籽粒的细胞壁和蛋白质基质并且因此更有效。因而，在随后的步骤中，更加容易地将淀粉洗出。

实例

实例1.菌株和DNA

从丹麦和美国收集的土壤样品中分离的细菌菌株和环境细菌群落中分离出编码许多GH8木聚糖酶或GH8木聚糖酶结构域的基因(参见表1)。

将来自不同菌株和细菌群落的染色体DNA进行全基因组测序。针对糖基水解酶结构域(根据CAZY定义)分析基因组序列。鉴定了许多糖基水解酶家族8(GH8)木聚糖酶或木聚糖酶结构域编码序列。这些中的一些是具有例如一个或多个C末端碳水化合物结合结构域(CBM)的部分或较大的多结构域酶。出于本发明的目的，仅表达成熟GH8木聚糖酶结构域，但SEQ ID NO：6除外，其用其天然的C末端CBM表达并测试。

修饰了还披露于WO 2011/070101(诺维信公司)、来自芽孢杆菌属物种KK-1的一种编码野生型GH8木聚糖酶的基因，以编码在全长多肽(如SEQ ID NO：2所示)的位置82具有单一亮氨酸插入(N→NL)的变体GH木聚糖酶，所述全长多肽的位置82是成熟多肽(如SEQ IDNO：3所示)中的位置55。

表1.GH8木聚糖酶和其来源的列表。

实例2.GH8木聚糖酶的表达

将线性整合载体系统用于表1中所示的不同GH8木聚糖酶的表达克隆。线性整合构建体是PCR融合产物，所述PCR融合产物含有与强启动子可操作地连接的编码各自的木聚糖酶结构域的多核苷酸和位于两个枯草芽孢杆菌同源染色体区域之间侧翼的氯霉素抗性选择标记。通过SOE PCR进行融合(Horton，R.M.，Hunt，H.D.，Ho，S.N.，Pullen，J.K.和Pease，L.R.(1989)Engineering hybrid genes without the use of restriction enzymes，gene splicing by overlap extension Gene[不使用限制酶，使用重叠延伸剪接术工程化杂合基因]Gene[基因]77：61-68)。适合的强启动子描述于WO 1999/43835中。氯霉素乙酰转移酶抗性标记基因描述于例如Diderichsen，B.；Poulsen(波尔森)，G.B.；Joergensen，S.T.1993，Plasmid[质粒]A useful cloning vector for Bacillus subtilis[枯草芽孢杆菌的有用的克隆载体]30：312。在枯草芽孢杆菌染色体上通过同源重组将最终的基因构建体整合到果胶裂解酶位点中。

使用含有针对两个侧翼片段的突出的基因特异性引物，从染色体DNA扩增编码GH8木聚糖酶或结构域的基因。表达具有克劳氏芽孢杆菌分泌信号(具有以下氨基酸序列：MKKPLGKIVASTALLISVAFSSSIASA；SEQ ID NO：25)(替代天然分泌信号)和具有直接融合到所述蛋白质C末端的6x组氨酸标签来GH8木聚糖酶，以便后续蛋白质色谱柱纯化。

使这两个线性载体片段和所述基因片段通过重叠延伸(SOE)PCR反应经受剪接，以将这3个片段装配进用于每种基因的一个线性载体构建体中。然后将所述PCR产物的等分部分转化到枯草芽孢杆菌宿主细胞中。在每ml补充有6μg氯霉素的LB板上选择转化体。在30℃下在250rpm震荡下，将来自含有整合表达构建体的每个构建体的重组枯草芽孢杆菌克隆在3L烧瓶中培养3天，该烧瓶含有500ml基于酵母提取物的培养基。将每种培养液以20,000x g离心20分钟，并且将上清液小心地与丸粒化材料倾析分开。使用配备有0.2μm过滤器的过滤装置(乐基因公司(Nalgene))过滤每种上清液以去除任何细胞碎片。如实例3所述从过滤的上清液中纯化酶。

实例3.GH8木聚糖酶的纯化

以如下方式纯化GH8木聚糖酶：将上清液的pH用3M Tris调节至pH 8，静置1小时，并且然后使用配备有0.2μm过滤器的过滤装置(乐基因公司)过滤。将过滤的上清液应用到5ml HisTrap^TM Excel柱(GE医疗集团生命科学部(GE Healthcare Life Sciences))上，将该柱用5个柱体积(CV)的50mM Tris/HCl pH 8预平衡。通过用8CV的50mM Tris/HCl pH 8洗涤该柱来洗脱未结合的蛋白质。

用50mM HEPES pH 7-10mM咪唑洗脱木聚糖酶，并通过在280nm处的吸光度监测洗脱。将洗脱的木聚糖酶在HiPrep^TM 26/10脱盐柱(GE医疗集团生命科学部)上脱盐，将所述柱用3CV的50mM HEPES pH 7-100mM NaCl预平衡。使用相同的缓冲液，以10ml/分钟的流速从所述柱洗脱木聚糖酶。选择相关级分，并且使用4％-12％Bis-Tris凝胶(英杰公司(Invitrogen))和2-(N-吗啉代)乙磺酸(MES)SDS-PAGE运行缓冲液(英杰公司)，基于色谱图和SDS-PAGE分析进行合并。将凝胶用InstantBlue(诺韦新公司(Novexin))染色，并使用miliQ水脱色。通过在280nm处的吸光度确定纯化的酶的浓度。

实例4.GH8木聚糖酶系统发育树的构建

可以将GH8家族(包括本发明的木聚糖酶)细分为簇或进化枝。如CAZY(Carbohydrate Active Enzymes database[碳水化合物活性酶数据库]，http：// www.cazy.org/，Henrissat等人，2014，Nucleic Acids Res[核酸研究]42：D490-D495)所定义，构建含有GH8结构域的多肽序列的系统发育树。系统发育树是从包含至少一个GH8结构域的成熟多肽序列的多重比对构建。使用MUSCLE算法版本3.8.31(Edgar，2004.NucleicAcids Research[核酸研究]32(5)：1792-1797)对序列进行比对，并且使用FastTree版本2.1.8(Price等人，2010，PloS one[公共科学图书馆·综合]5(3))构建树并使用iTOL(Letunic和Bork，2007.Bioinformatics[生物信息学]23(1)：127-128)对树进行可视化。

GH8中的多肽可以分成多个不同的子簇或进化枝，其中我们表示了下面列出的进化枝。下面详细描述每个进化枝的不同基序，并在图1中示出。

(a)DPSY进化枝

(b)SMDY进化枝

(c)ALWNW进化枝

(d)WFAAAL进化枝

(e)DEAG进化枝

DPSY进化枝

GH8木聚糖酶包含一些保守良好的基序，一个实例是位于SEQ ID NO：2和3所示的木聚糖酶氨基酸序列的位置204-207、SEQ ID NO：8和9的位置203-206、SEQ ID NO：11和12的位置342-345、SEQ ID NO：14和15的位置342-345、SEQ ID NO：17和18位置194-197、以及SEQ ID NO：20和21的位置201-204的基序“[TS]D[PA]SY”或“(Thr/Ser)Asp(Pro/Ala)SerTyr”(SEQ ID NO：26)。我们将包含基序““[TS]D[PA]SY””或“(Thr/Ser)Asp(Pro/Ala)SerTyr”(SEQ ID NO：26)的GH8木聚糖酶的一个子簇或进化枝表示为DPSY进化枝。

SMDY进化枝

如上所定义的构建含有来自DPSY进化枝的GH8多肽的多肽序列的系统发育树。系统发育树是从包含至少一个GH8结构域的成熟多肽序列的多重比对构建。使用MUSCLE算法版本3.8.31(Edgar，2004.Nucleic Acids Research[核酸研究]32(5)：1792-1797)对序列进行比对，并且使用FastTree版本2.1.8(Price等人，2010，PloS one[公共科学图书馆·综合]5(3))构建树并使用汀OL(Letunic和Bork，2007.Bioinformatics[生物信息学]23(1)：127-128)对树进行可视化。DPSY进化枝的多肽可以分成不同的子簇，并且所述子簇中的一个我们表示为“SMDY”。此亚组的特征基序是基序“MN[FYVILM][GS]MDY”或“Met Asn(Phe/Tyr/Val/Ile/Leu/Met)(Gly/Ser)Met Asp Tyr”(SEQ ID NO：27)。此基序在SEQ ID NO：20和21所示的木聚糖酶氨基酸序列的位置277至283氨基酸中发现。

ALWNW进化枝

如上所定义的构建含有来自DPSY进化枝的GH8多肽的多肽序列的系统发育树。系统发育树是从包含至少一个GH8结构域的成熟多肽序列的多重比对构建。使用MUSCLE算法版本3.8.31(Edgar，2004.Nucleic Acids Research[核酸研究]32(5)：1792-1797)对序列进行比对，并且使用FastTree版本2.1.8(Price等人，2010，PloS one[公共科学图书馆·综合]5(3))构建树并使用汀OL(Letunic和Bork，2007.Bioinformatics[生物信息学]23(1)：127-128)对树进行可视化。DPSY进化枝的多肽可以分成不同的子簇，并且所述子簇中的一个我们表示为“ALWNW”。此亚组的特征基序是对应于SEQ ID NO：5和6所示的木聚糖酶氨基酸序列的位置101至105、以及对应于SEQ ID NO：23和24的位置101至105的基序“A[IL]WNW”或“Ala(Ile/Leu)Trp Asn Trp”(SEQ ID NO：28)。

WFAAAL进化枝

如上所定义的构建含有来自DPSY进化枝的GH8多肽的多肽序列的系统发育树。系统发育树是从包含至少一个GH8结构域的成熟多肽序列的多重比对构建。使用MUSCLE算法版本3.8.31(Edgar，2004.Nucleic Acids Research[核酸研究]32(5)：1792-1797)对序列进行比对，并且使用FastTree版本2.1.8(Price等人，2010，PloS one[公共科学图书馆·综合]5(3))构建树并使用汀OL(Letunic和Bork，2007.Bioinformatics[生物信息学]23(1)：127-128)对树进行可视化。DPSY进化枝的多肽可以分成不同的子簇，并且所述子簇中的一个我们表示为“WFAAAL”。此亚组的特征基序是对应于SEQ ID NO：2和3所示的木聚糖酶氨基酸序列的位置134至139、以及对应于SEQ ID NO：8和9的位置133至138的基序“W[IF]AAAL”或“Trp(Ile/Phe)Ala Ala Ala Leu”(SEQ ID NO：29)。

DEAG进化枝

如上所定义的构建含有来自WFAAAL进化枝的GH8多肽的多肽序列的系统发育树。系统发育树是从包含至少一个GH8结构域的成熟多肽序列的多重比对构建。使用MUSCLE算法版本3.8.31(Edgar，2004.Nucleic Acids Research[核酸研究]32(5)：1792-1797)对序列进行比对，并且使用FastTree版本2.1.8(Price等人，2010，PloS one[公共科学图书馆·综合]5(3))构建树并使用iTOL(Letunic和Bork，2007.Bioinformatics[生物信息学]23(1)：127-128)对树进行可视化。DPSY进化枝的多肽可以分成不同的子簇，并且所述子簇中的一个我们表示为“DEAG”。此亚组的特征基序是对应于SEQ ID NO：2和3所示的木聚糖酶氨基酸序列的位置264至267的基序“DEAG”或“Asp Glu Ala Gly”(SEQ ID NO：30)。

另一个基序是对应于SEQ ID NO：2和3所示的木聚糖酶氨基酸序列的位置354至360、以及SEQ ID NO：8和9的位置352至358的氨基酸的“AANAGGA”或“Ala Ala Asn Ala GlyGly Ala”(SEQ ID NO：31)。

本发明多肽的系统发育树示出于图2中。

GH8木聚糖酶氨基酸序列的比对示出于图3中。

实例5.确定木聚糖酶催化的小麦粉浆液的粘度变化

通过使用WO 2011/107472中披露的粘度-压力(ViPr)测定法来确定由本发明的GH8木聚糖酶催化的粘度降低。通过测量孵育期间或之后的粘度变化来鉴定那些水解或改变直接或间接有助于小麦粉浆液的粘度的成分的木聚糖酶。

底物制备

将80g小麦粉通过以下4次的连续筛分进行过筛：800μm、600μm、400μm和300μm。通过在连续和严格搅拌下将筛分的面粉混合到MilliQ水(0.76mM CaCl2)的溶液中以达到30％的干固形物浓度(DS)(通过添加1.6M HCl将pH调整至6)来制备小麦粉的浆液。

将5ml小麦浆液添加至24孔板的每个孔中(10ml体积/孔，圆底)。在室温下使用磁力搅拌棒(cross bar magnet)(9mm)搅拌分散体。将用MilliQ水制备的20μl稀释酶溶液等分试样添加至每个孔中，以达到4，4μg或1.95μg酶蛋白/g干物质(DS)的剂量。通过去除1ml吸头的下部的12cm，将硅胶管(外径8mm；长度2mm)滑至剩余吸头并推动宽口径吸头(Sartorius 791020)经硅胶管来生产适用于ViPr测量的移液管吸头。

每两分钟在Hamilton

液体处理器上用以下参数测量粘度；在第二个时间点粘度测量之后的刚好4分钟后，添加20μl酶或对照。

Hamilton

液体处理器设置：

时间点：30；间隔时间：120sec；重复：3，吸出高度：16mm，分配高度：16mm；液体类-流速吸出和分配：500μl/s

首先吸出200μl空气，然后将经调整的ViPr移液管吸头浸入浆液中，然后吸出800μl。将800μl的浆液在液体上方用吸头分配回剩余的浆液中，最后使用200μl的空气吹出剩余的液体。

从Hamilton TADM数据文件中提取压力读数，并将分配过程中压力曲线上的时间点1000ms用于进一步的数据分析。

粘度变化用酶处理的样品与对照样品相比的压力值的百分比变化表示。

图4示出了所有八个GH8木聚糖酶(如上所定义的所有DPSY进化枝成员)有效降低小麦浆液的粘度。

图5示出了通过两个GH8木聚糖酶进化枝“DPSY”成员降低了小麦浆液粘度；一个是来自芽孢杆菌属物种KK-1的亲本野生型GH8木聚糖酶，且另一个(在降低粘度方面甚至更好)是SEQ ID NO：3的单一亮氨酸插入变体。后者用来自两个独立生产批次的酶进行测试。亲本和变体GH8木聚糖酶两者在降低粘度方面均比可商购的GH10木聚糖酶(

诺维信公司)更好。

实例6.小麦蛋白质回收

分别将约250g小麦粉和150mL加热的自来水(如果适用，含有芽孢杆菌属物种KK-1野生型GH8木聚糖酶)转移到适当大小的混合用碗中，并用Kitchen Aid Ultra Power(最大值300瓦)立式搅拌器(装配有面团钩并将转速设置为4)混合4分钟。之后，将形成的面团静置8分钟，然后将250mL加热的自来水添加至混合用碗中。用平板式搅拌器将内容物在搅拌速度设置下再混合25分钟。去除约5mL所得浆液用于粘度评估。结果示出于图6中，很明显，芽孢杆菌属物种KK-1野生型GH8木聚糖酶使小麦浆液的粘度出人意料地降低了约4倍。

然后将1000mL加热的自来水添加至混合用碗中。将内容物再次搅拌35分钟，然后倒在425-um筛上。振动筛以使其分离。将约1000mL加热的自来水添加至混合用碗中以进行最终冲洗，然后倒在所述筛上并如之前一样振动。回收保留在筛顶部的材料，然后使用总氮分析仪(LECO公司型号FP628)分析蛋白质含量。结果示出于图7中，很明显，芽孢杆菌属物种KK-1野生型GH8木聚糖酶使蛋白质回收出人意料地从约5％提高到25％-30％，即接近6倍的提高。

Claims (20)

1.一种将小麦粉分离成包括面筋级分和淀粉级分的两种或更多种级分的方法，所述方法包括以下步骤：

a)将小麦粉和水混合；

b)添加一种或多种具有GH8木聚糖酶活性的多肽；

c)将混合物孵育预先确定的一段时间；

d)将混合物分离成包括富含面筋级分和富含淀粉级分的两种或更多种级分；以及

回收包括富含面筋级分和富含淀粉级分的所述两种或更多种级分。

2.根据权利要求1所述的方法，其中所述一种或多种具有GH8木聚糖酶活性的多肽是如本文所定义的DPSY进化枝的成员；优选地所述具有GH8木聚糖酶活性的多肽是如本文所定义的以下进化枝中的至少一种的成员：SMDY进化枝、ALWNW进化枝、WFAAAL进化枝和DEAG进化枝。

3.如权利要求1或2所述的方法，其中所述具有GH8木聚糖酶活性的多肽选自由以下组成的组：

A.与SEQ ID NO：2、5、8、11、14、17、20或23的多肽，或SEQ ID NO：3、6、9、12、15、18、21或24的成熟多肽具有至少80％序列同一性的多肽；

B.由多核苷酸编码的多肽，所述多核苷酸在高严格条件或非常高严格条件下与以下各项杂交：

(i)SEQ ID NO：1、4、7、10、13、16、19或22的多肽编码序列；

(ii)SEQ ID NO：1、4、7、10、13、16、19或22的成熟多肽编码序列；

(iii)(i)或(ii)的全长互补链；

C.由多核苷酸编码的多肽，所述多核苷酸与SEQ ID NO：1、4、7、10、13、16、19或22的成熟多肽编码序列具有至少80％序列同一性；

D.SEQ ID NO：2、5、8、11、14、17、20或23的多肽或SEQ ID NO：3、6、9、12、15、18、21或24的成熟多肽的变体，所述变体在一个或多个(若干个)位置处包含取代、缺失和/或插入；以及

E.A、B、C或D的多肽的具有GH8木聚糖酶活性的片段。

4.根据权利要求3所述的方法，其中所述具有GH8活性的多肽是与SEQ ID NO：2、5、8、11、14、17、20或23的多肽或SEQ ID NO：3、6、9、12、15、18、21或24的成熟多肽具有至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或至少100％序列同一性的多肽。

5.根据权利要求3所述的方法，其中所述具有GH8木聚糖酶活性的多肽是由以下多核苷酸编码的多肽，所述多核苷酸与SEQ ID NO：1、4、7、10、13、16、19或22的成熟多肽编码序列具有至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或至少100％序列同一性。

6.根据权利要求3所述的方法，其中所述具有GH8木聚糖酶活性的多肽包含SEQ ID NO：SEQ ID NO：2、5、8、11、14、17、20或23，或SEQ ID NO：3、6、9、12、15、18、21或24的成熟多肽，或由其组成。

7.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其进一步包括在一种或多种选自由以下组成的组的酶的存在下处理浸泡的籽粒：β-木糖苷酶、纤维素酶、半纤维素酶、脂肪酶、内切葡聚糖酶、乙酰聚糖酯酶、纤维二糖水解酶I、纤维二糖水解酶II、和GH61多肽。

8.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述多肽按以下量存在：优选0.0005至1.5mg酶蛋白/g DS籽粒，优选0.001至1mg酶蛋白/g DS籽粒，优选0.01至0.5mg酶蛋白/gDS籽粒，优选0.025至0.25mg酶蛋白/g DS籽粒。

9.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中在步骤a)中，将水和小麦粉以0.1-3升水/kg小麦粉，优选地0.5-2.5升水/kg小麦粉，优选地1-2升水/kg小麦粉的比例混合。

10.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中步骤c)中的孵育进行5分钟至8小时，优选地15分钟至4小时。

11.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中步骤d)在三相分离器中进行并且提供富含面筋级分、富含淀粉级分和富含戊聚糖/纤维级分。

12.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中提供了改进的小麦分离；优选地，所述方法提供了如本文所确定的降低的小麦粉浆液中的粘度和/或如本文所确定的较高的蛋白质回收。

13.具有GH8木聚糖酶活性的多肽在用于将小麦粉分离成包括面筋级分和淀粉级分的两种或更多种级分的方法中的用途，所述用途包括以下步骤：

a)将小麦粉和水混合；

b)添加一种或多种具有GH8木聚糖酶活性的多肽；

c)将混合物孵育预先确定的一段时间；

d)将混合物分离成包括富含面筋级分和富含淀粉级分的两种或更多种级分；以及

回收包括富含面筋级分和富含淀粉级分的所述两种或更多种级分。

14.根据权利要求13所述的用途，其中所述具有GH8活性的多肽是如本文所定义的DPSY进化枝的成员；优选地所述具有GH8木聚糖酶活性的多肽是如本文所定义的以下进化枝中的至少一种的成员：SMDY进化枝、ALWNW进化枝、WFAAAL进化枝和DEAG进化枝。

15.根据权利要求13或14所述的用途，其中所述GH8木聚糖酶多肽选自由以下组成的组：

A.与SEQ ID NO：2、5、8、11、14、17、20或23的多肽，或SEQ ID NO：3、6、9、12、15、18、21或24的成熟多肽具有至少80％序列同一性的多肽；

B.由多核苷酸编码的多肽，所述多核苷酸在高严格条件或非常高严格条件下与以下各项杂交：

(i)SEQ ID NO：1、4、7、10、13、16、19或22的多肽编码序列；

(ii)SEQ ID NO：1、4、7、10、13、16、19或22的成熟多肽编码序列；

(iii)(i)或(ii)的全长互补链；

C.由多核苷酸编码的多肽，所述多核苷酸与SEQ ID NO：1、4、7、10、13、16、19或22的成熟多肽编码序列具有至少80％序列同一性；

D.SEQ ID NO：2、5、8、11、14、17、20或23的多肽或SEQ ID NO：3、6、9、12、15、18、21或24的成熟多肽的变体，所述变体在一个或多个(若干个)位置处包含取代、缺失和/或插入；以及

E.A、B、C或D的多肽的具有GH8木聚糖酶活性的片段。

16.根据权利要求15所述的用途，其中所述多肽是与SEQ ID NO：2、5、8、11、14、17、20或23的多肽，或SEQ ID NO：3、6、9、12、15、18、21或24的成熟多肽具有至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或至少100％序列同一性的多肽。

17.根据权利要求15所述的用途，其中所述多肽是由以下多核苷酸编码的多肽，所述多核苷酸与SEQ ID NO：1、4、7、10、13、16、19或22的成熟多肽编码序列具有至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或至少100％序列同一性。

18.根据权利要求15所述的用途，其中所述具有GH8木聚糖酶活性的多肽包含SEQ IDNO：SEQ ID NO：2、5、8、11、14、17、20或23，或SEQ ID NO：3、6、9、12、15、18、21或24的成熟多肽，或由其组成。

19.根据权利要求13至18中任一项所述的用途，其进一步包括在一种或多种选自由以下组成的组的另外的酶的存在下处理浸泡的籽粒：β-木糖苷酶、纤维素酶、半纤维素酶、脂肪酶、内切葡聚糖酶、乙酰木聚糖酯酶、纤维二糖水解酶I、纤维二糖水解酶II、和GH61多肽。

20.如权利要求13至18中任一项所述的用途，其中所述方法提供了改进的小麦分离；优选地，所述方法提供了如本文所确定的降低的小麦粉浆液中的粘度和/或如本文所确定的较高的蛋白质回收。

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