BR112016021474B1

BR112016021474B1 - Composição compreendendo uma fosfatidilinositol fosfolipase c e um polipeptídeo de fosfolipase c específica para fosfatidilcolina e fosfatidiletanolamina e método para reduzir o teor de fosfolipídeos em uma composição de óleo

Info

Publication number: BR112016021474B1
Application number: BR112016021474-9A
Authority: BR
Inventors: Dorotea Raventos Segura; Robert Piotr Olinski; Kim Borch; Allan Noergaard; Jesper Brask; Rune Falkenberg Haller; Marianne Linde Damstrup
Original assignee: Novozymes A/S
Priority date: 2014-03-19
Filing date: 2015-03-19
Publication date: 2022-10-04
Also published as: WO2015140275A1; US20170096619A1; CN106103704A; US20210171860A1; US20190284503A1; US11851630B2; EP3119862A1; US10351795B2; BR112016021474A2; US10954469B2; EP4163354A2; US20240158718A1; EP3119862B1; EP4163354A3

Abstract

POLIPEPTÍDEOS TENDO ATIVIDADE DE FOSFOLIPASE C E POLINUCLEOTÍDEOS CODIFICANDO OS MESMOS. A presente invenção se relaciona com um método de reduzir o teor de fosfolipídeos em um óleo ou composição com gorduras e polipeptídeos possuindo atividade de fosfolipase C específica para PI, bem como polipeptídeos possuindo atividade de fosfolipase C específica para PC, PE e suas combinações capazes de catalisar essa redução. A invenção se relaciona também com polinucleotídeos codificando os polipeptídeos, construções de ácido nucleico, vetores, e células hospedeiras compreendendo os polinucleotídeos, bem como métodos de produção e uso dos polipeptídeos.

Description

Referência a uma Listagem de Sequências

[0001] Este pedido contém uma Listagem de Sequências em suporte informático legível, que é incorporada em este documento por referência.

Antecedentes da Invenção Área da Invenção

[0002] A presente invenção se relaciona com um método de reduzir o teor de fosfolipídeos em uma composição de óleo e polipeptídeos possuindo atividade de fosfolipase C capazes de catalisar esta redução. A invenção se relaciona também com polinucleotídeos codificando os polipeptídeos, construções de ácido nucleico, vetores e células hospedeiras compreendendo os polinucleotídeos bem como métodos de produção e uso dos polipeptídeos.

Descrição da Técnica Relacionada

[0003] São conhecidos vários tipos de fosfolipases que diferem na sua especificidade de acordo com a posição da ligação atacada na molécula de fosfolipídeo. A fosfolipase A1 (PLA1) remove o ácido graxo da posição 1 para produzir ácido graxo livre e 1-liso-2-acilfosfolipídeo. A fosfolipase A2 (PLA2) remove o ácido graxo da posição 2 para produzir ácido graxo livre e 1-acil-2-lisofosfolipídeo. O termo fosfolipase B (PLB) é usado para fosfolipases tendo atividade de A1 e A2. A fosfolipase C (PLC) remove a fração fosfato para produzir 1,2-diacilglicerol e éster de fosfato. A fosfolipase D (PLD) produz 1,2-diacilglicero-fosfato e grupo de base (ver a Figura 1).

[0004] Antes do consumo, os óleos comestíveis são degomados para proporcionar óleos vegetais estáveis no armazenamento refinados de sabor neutro e cor clara. O processo de degomagem compreende remoção dos componentes de fosfolipídeo (a goma) da fração de óleo rica em triglicerídeos. Os processos mais comummente usados na indústria são degomagem com água, refinação química/cáustica e refinação física, incluindo degomagem auxiliada por ácido e/ou degomagem auxiliada por enzimas. Devido às propriedades emulsificantes dos componentes de fosfolipídeo, o procedimento de degomagem tem resultado em uma perda de óleo, i.e., de triglicerídeos.

[0005] A degomagem enzimática reduz a perda de óleos devido a uma hidrólise enzimática dos fosfolipídeos que diminui as propriedades emulsificantes. Para uma revisão acerca de degomagem enzimática, ver Dijkstra 2010 Eur. J. Lipid Sci. Technol. 112, 1178. A utilização de fosfolipase A e/ou fosfolipase C na degomagem é por exemplo descrita em Clausen 2001 Eur J Lipid Sci Techno 103 333-340, WO 2003/089620 e WO 2008/094847. As soluções de fosfolipase A geram lisofosfolipídeos e ácidos graxos livres resultando em perda de óleo. A fosfolipase C, por outro lado, tem a vantagem de produzir diglicerídeos (Figura 2) que permanecerão no óleo e, como tal, reduzirão as perdas. Há quatro fosfolipídeos principais no óleo vegetal: fosfatidilcolina (PC), fosfatidiletanolamina (PE), ácido fosfatídico (PA) e fosfatidilinositol (PI). As enzimas da fosfolipase C têm especificidade diferentes em relação a estes fosfolipídeos. A única fosfolipase C disponível comercialmente conhecida é Purifine da Verenium/DSM (Dijkstra, 101st AOCS Annual Meeting 10. maio de 2010) que tem especificidade em relação a PC e PE. A WO07/059927 descreve uma PLC de Bacillus termoestável para degomagem. A WO 2012/062817 descreve uma PLC fúngica com especificidade em relação a todos os quatro fosfolipídeos. A WO 2011/046815 descreve uma fosfolipase C específica para PI.

Breve Descrição das Figuras

[0006] A Figura 1 ilustra onde diferentes fosfolipases clivam um fosfolipídeo, bem como os quatro principais grupos funcionais de fosfolipídeos.

[0007] A Figura 2 ilustra uma reação de um fosfolipídeo com uma fosfolipase C para formar diglicerídeo e um éster de fosfato ou ácido fosfórico.

Sumário da invenção

[0008] A presente invenção providencia um método para reduzir o teor de fosfolipídeos em uma composição de óleo, o método compreendendo a) providenciar uma composição de óleo contendo uma quantidade de fosfolipídeos, b) contactar a referida composição de óleo com uma fosfatidilinositol fosfolipase C e uma fosfolipase C específica para PC e PE sob condições suficientes para as enzimas reagirem com os fosfolipídeos para criar diglicerídeo e éster de fosfato, e c) separar o éster de fosfato da composição de óleo. Em particular, a referida fosfatidilinositol fosfolipase C é do gênero de Pseudomonas.

[0009] A invenção providencia ainda um polipeptídeo possuindo atividade de fosfatidilinositol fosfolipase C, selecionado de entre o grupo consistindo em: a) um polipeptídeo tendo pelo menos 91% de identidade de sequência com o polipeptídeo maduro da SEQ ID NO: 2; b) um polipeptídeo codificado por um polinucleotídeo que hibridiza sob condições de estringência média, com i) a sequência codificadora do polipeptídeo maduro da SEQ ID NO: 1, ou ii) o complemento de comprimento completo de (i); c) um polipeptídeo codificado por um polinucleotídeo tendo pelo menos 90% de identidade de sequência com a sequência codificadora do polipeptídeo maduro da SEQ ID NO: 1; d) uma variante do polipeptídeo maduro da SEQ ID NO: 2, compreendendo uma substituição, deleção, e/ou inserção em uma ou mais posições; e e) um fragmento do polipeptídeo de (a), (b), (c), ou (d) que tem atividade de fosfatidilinositol fosfolipase C.

[0010] Para além disso, a invenção providencia um polipeptídeo possuindo atividade de fosfolipase C específica para PC e PE, selecionado de entre o grupo consistindo em: a) um polipeptídeo tendo pelo menos 70% de identidade de sequência com o polipeptídeo maduro da SEQ ID NO: 19; b) um polipeptídeo codificado por um polinucleotídeo que hibridiza sob condições de estringência baixa, com i) a sequência codificadora do polipeptídeo maduro da SEQ ID NO: 18, ou ii) o complemento de comprimento completo de (i); c) um polipeptídeo codificado por um polinucleotídeo tendo pelo menos 70% de identidade de sequência com a sequência codificadora do polipeptídeo maduro da SEQ ID NO: 18; d) uma variante do polipeptídeo maduro da SEQ ID NO: 19, compreendendo uma substituição, deleção, e/ou inserção em uma ou mais posições; e e) um fragmento do polipeptídeo de (a), (b), (c), ou (d) que tem atividade de fosfolipase C específica para PC e PE.

[0011] Finalmente, a invenção providencia uma composição compreendendo uma mistura de uma fosfatidilinositol fosfolipase C do gênero de Pseudomonas e um polipeptídeo de fosfolipase C específica para PC e PE.

Definições

[0012] Atividade de fosfolipase C: O termo “atividade de fosfolipase C” ou “atividade de PLC” se relaciona com uma atividade enzimática que remove a fração de éster de fosfato de um fosfolipídeo para produzir um 1,2 diacilglicerol (ver a Figura 2). A maioria das enzimas PLC pertencem à família das hidrolases e fosfodiesterases e são geralmente classificadas como EC 3.1.4.3. Algumas enzimas PLC são classificadas em outras classes EC, por exemplo PLCs específicas de PI. A atividade de fosfolipase C pode ser determinada de acordo com o procedimento descrito no Exemplo 5 ou por um dos ensaios descritos na seção “Ensaio de atividade de fosfolipase”.

[0013] Especificidade de fosfolipase C: O termo “especificidade de fosfolipase C” se relaciona com um polipeptídeo possuindo atividade de fosfolipase C, em que a atividade é específica em relação a um ou mais fosfolipídeos, com os quatro mais importantes sendo fosfatidilcolina (PC), fosfatidiletanolamina (PE), ácido fosfatídico (PA) e fosfatidilinositol (PI) (ver a Figura 1). A especificidade de fosfolipase C pode ser determinada por RMN de 32P como descrito no Exemplo 5.

[0014] Fosfolipase C específica para PC e PE: O termo “fosfolipase C específica para PC e PE” ou “fosfolipase C específica para PC, PE” se relaciona com um polipeptídeo possuindo atividade em relação a fosfatidilcolina (PC) e fosfatidiletanolamina (PE). Para além da especificidade PC e PE pode também ter alguma atividade em relação a ácido fosfatídico (PA) e fosfatidilinositol (PI). De preferência, uma fosfolipase C específica para PC e PE remove pelo menos 30% de PC e pelo menos 30% de PE de um óleo ou gordura com pelo menos 100 ppm de PC e 100 ppm de PE ao usar o ensaio RMN de P do Exemplo 5 com o pH ótimo da enzima e uma dosagem de enzima de 10 mg/kg. Mais preferencialmente, remove 40%, 50%, 60%, 70% ou 80%, ainda mais preferencialmente remove 90% e muito preferencialmente remove entre 90% e 100% de PC no óleo ou gordura e 40%, 50%, 60%, 70% ou 80%, ainda mais preferencialmente remove 90% e muito preferencialmente remove entre 90% e 100% de PE no óleo ou gordura.

[0015] Fosfolipase C específica para PI: O termo “fosfolipase C específica para PI” ou “fosfatidilinositol fosfolipase C” se relaciona com um polipeptídeo possuindo atividade em relação a fosfatidilinositol (PI), significando que a sua atividade em relação a fosfatidilcolina (PC), fosfatidiletanolamina (PE), ácido fosfatídico (PA) é baixa em comparação com a atividade PI. Enzimas de fosfolipase C específica para PI podem pertencer à família das hidrolases e fosfodiesterases classificadas como EC 3.1.4.11 ou à família das liases classificadas como EC 4.6.1.13. A atividade de fosfolipase C específica para PI pode ser determinada de acordo com o procedimento descrito no Exemplo 5. De preferência, uma fosfolipase C específica para PI remove pelo menos 30% de PI de um óleo ou gordura com pelo menos 50 ppm de PI ao usar o ensaio RMN de P do Exemplo 5 com o pH ótimo da enzima e uma dosagem de enzimas de 10 mg/kg. Mais preferencialmente, remove 40%, 50%, 60%, 70% ou 80%, ainda mais preferencialmente remove 90% e muito preferencialmente remove entre 90% e 100% de PI no óleo ou gordura.

[0016] Preferencialmente, uma fosfolipase C específica para P remove pelo menos 20% mais PI do que quando comparada com a quantidade de PC, PE ou PA que pode remover, mais preferencialmente pelo menos 30%, 40%, ainda mais preferencialmente pelo menos 50% e muito preferencialmente pelo menos 60% mais PI em comparação com a quantidade de PC, PE ou PA que pode remover.

[0017] Variante alélica: O termo "variante alélica" significa qualquer uma de duas ou mais formas alternativas de um gene ocupando o mesmo lócus cromossômico. A variação alélica surge naturalmente através de mutação, e pode resultar em polimorfismo dentro de populações. As mutações de genes podem ser silenciosas (nenhuma mudança no polipeptídeo codificado) ou podem codificar polipeptídeos tendo sequências de aminoácidos alteradas. Uma variante alélica de um polipeptídeo é um polipeptídeo codificado por uma variante alélica de um gene.

[0018] Domínio catalítico: O termo "domínio catalítico" significa a região de uma enzima contendo a maquinaria catalítica da enzima.

[0019] cDNA: O termo "cDNA" significa uma molécula de DNA que pode ser preparada por transcrição reversa de uma molécula de mRNA madura, processada, obtida de uma célula eucariótica ou procariótica. O cDNA não tem sequências de íntron que possam estar presentes no correspondente DNA genômico. O transcrito de RNA primário, inicial, é um precursor de mRNA que é processado através de uma série de passos, incluindo processamento, antes de aparecer como mRNA maduro processado.

[0020] Sequência codificadora: O termo "sequência codificadora" significa um polinucleotídeo que especifica diretamente a sequência de aminoácidos de um polipeptídeo. As fronteiras da sequência codificadora são geralmente determinadas por uma grelha de leitura aberta, que começa com um códon de iniciação tal como ATG, GTG, ou TTG e termina com um códon de terminação tal como TAA, TAG, ou TGA. A sequência codificadora pode ser um DNA genômico, cDNA, DNA sintético, ou uma sua combinação.

[0021] Sequências de controle: O termo "sequências de controle" significa sequências de ácido nucleico necessárias para expressão de um polinucleotídeo codificando um polipeptídeo maduro da presente invenção. Cada sequência de controle pode ser nativa do (i.e., do mesmo gene) ou estranha (i.e., de um gene diferente) ao polinucleotídeo codificando o polipeptídeo ou nativa ou estranha entre si. Tais sequências de controle incluem, mas não estão limitadas a, um líder, sequência de poliadenilação, sequência de pró-peptídeo, promotor, sequência de peptídeo sinal, e terminador da transcrição. No mínimo, as sequências de controle incluem um promotor, e sinais de terminação da transcrição e tradução. As sequências de controle podem ser proporcionadas com ligantes para o propósito de introdução de locais de restrição específicos facilitando a ligação das sequências de controle à região codificadora do polinucleotídeo codificando um polipeptídeo.

[0022] Óleo em bruto: O termo “óleo em bruto” se refere a (também chamado um óleo não degomado) um óleo prensado ou extraído ou uma mistura deles de, por exemplo, origens vegetais, incluindo, mas não se limitando a, óleo de açaí, óleo de amêndoa, óleo de babaçu, óleo de semente de groselha negra, óleo de semente de borragem, óleo de canola, óleo de caju, óleo de rícino, óleo de coco, óleo de coentro, óleo de milho, óleo de semente de algodão, óleo de crambe, óleo de semente de linhaça, óleo de semente de uva, óleo de avelãs, óleo de semente de cânhamo, óleo de pinhão manso, óleo de jojoba, óleo de semente de linho, óleo de noz de macadâmia, óleo de caroço de manga, óleo de limnanto, óleo de mostarda, óleo de pata de boi, azeite, óleo de palma, óleo de palmiste, oleína de palma, óleo de amendoim, óleo de noz pecã, óleo de pinhão, óleo de pistacho, óleo de sementes de papoila, óleo de colza, óleo de farelo de arroz, óleo de cártamo, óleo de camélia sasanqua, óleo de sésamo, manteiga de karité, óleo de soja, óleo de girassol, óleo de tall, óleo de camélia tsubaki, óleo de noz, variedades de óleos “naturais” possuindo composições de ácido graxo alteradas por meio de Organismos Geneticamente Modificados (OGM) ou de filiação tradicional como óleos com alto teor de ácido oleico, baixo teor de ácido linolênico ou pouco saturados (óleo de canola com alto teor de ácido oleico, óleo de soja com baixo teor de ácido linolênico ou óleos de girassol com alto teor de ácido esteárico).

[0023] Óleo degomado: O termo “óleo degomado” se refere a um óleo obtido após a remoção de fosfolipídeos não hidratáveis, fosfolipídeos hidratáveis, e lecitinas (conhecidos coletivamente como “gomas”) do óleo para produzir um óleo degomado ou produto de gordura que pode ser usado para a produção de alimentos e/ou aplicações não alimentares, por exemplo biodiesel. Em certas formas de realização, o óleo degomado tem o teor de fosfolipídeos inferior a 200 ppm de fósforo, tal como inferior a150 ppm de fósforo, inferior a 100 ppm de fósforo, inferior a (ou inferior a cerca de) 50 ppm de fósforo, inferior a (ou inferior a cerca de) 40 ppm de fósforo, inferior a (ou inferior a cerca de) 30 ppm de fósforo, inferior a (ou inferior a cerca de) 20 ppm de fósforo, inferior a (ou inferior a cerca de) 15 ppm de fósforo, inferior a (ou inferior a cerca de) 10 ppm de fósforo, inferior a (ou inferior a cerca de) 7 ppm de fósforo, inferior a (ou inferior a cerca de) 5 ppm de fósforo, inferior a (ou inferior a cerca de) 3 ppm de fósforo ou inferior a (ou inferior a cerca de) 1 ppm de fósforo.

[0024] Expressão: O termo "expressão" inclui qualquer passo envolvido na produção de um polipeptídeo incluindo, mas não se limitando a, transcrição, modificação pós-transcricional, tradução, modificação pós- translacional, e secreção.

[0025] Vetor de expressão: O termo "vetor de expressão" significa uma molécula de DNA linear ou circular que compreende um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo e que está operacionalmente ligado a sequências de controle que proporcionam a sua expressão.

[0026] Fragmento: O termo "fragmento" significa um polipeptídeo tendo um ou mais (p.ex., vários) aminoácidos ausentes do terminal amino e/ou carboxila de um polipeptídeo maduro; em que o fragmento tem atividade de fosfolipase C. Os fragmentos de acordo com a invenção têm um tamanho de aproximadamente 200 resíduos de aminoácidos, de preferência mais de 210 resíduos de aminoácidos, mais preferencialmente mais de 220 resíduos de aminoácido, mais preferencialmente mais de 230 resíduos de aminoácido (por exemplo,aminoácidos 44 a 278 ou aminoácidos 34 a 268 da SEQ ID NO: 19), mais preferencialmente mais de 240 resíduos de aminoácidos (por exemplo, aminoácidos 39 a 278 ou aminoácidos 34 a 273 da SEQ ID NO: 19), mais preferencialmente mais de 250 resíduos de aminoácidos, mais preferencialmente mais de 260 resíduos de aminoácidos, mais preferencialmente mais de 270 resíduos de aminoácidos, e muito preferencialmente mais de 280 resíduos de aminoácidos. Em um aspeto, um fragmento contém pelo menos 290 resíduos de aminoácidos (p.ex., aminoácidos 33 a 322 ou aminoácidos 26 a 315 da SEQ ID NO: 2), pelo menos 294 resíduos de aminoácidos (por exemplo, aminoácidos 29 a 322 ou aminoácidos 26 a 319 da SEQ ID NO: 2), ou pelo menos 296 resíduos de aminoácidos (por exemplo, aminoácidos 27 a 322 ou aminoácidos 26 a 321 da SEQ ID NO: 2).

[0027] Condições de estringência elevada: O termo "condições de estringência elevada" significa, para sondas com pelo menos 100 nucleotídeos em comprimento, pré-hibridação e hibridação a 42 °C em 5X SSPE, SDS a 0,3%, 200 microgramas/ml de DNA de esperma de salmão cisalhado e desnaturado, e formamida a 50%, seguindo procedimentos de transferência de Southern padrão durante 12 a 24 horas. O material transportador é finalmente lavado três vezes, cada uma durante 15 minutos usando 2X SSC, SDS a 0,2% a 65 °C.

[0028] Célula hospedeira: O termo "célula hospedeira" significa qualquer tipo de célula que seja suscetível de transformação, transfecção, transdução, ou similares com um constructo de ácido nucleico ou vetor de expressão compreendendo um polinucleotídeo da presente invenção. O termo "célula hospedeira" engloba qualquer descendência de uma célula genitora que não é idêntica à célula genitora devido a mutações que ocorrem durante a replicação.

[0029] Isolado: O termo "isolado(a)" significa uma substância em uma forma ou ambiente que não ocorre na natureza. Exemplos não limitantes de substâncias isoladas incluem (1) qualquer substância que não ocorre naturalmente, (2) qualquer substância incluindo, mas não se limitando a, qualquer enzima, variante, ácido nucleico, proteína, peptídeo ou cofator, que é pelo menos parcialmente removida de um ou mais, ou de todos os, constituintes naturais, aos quais está associada na natureza; (3) qualquer substância modificada pelo homem em relação a essa substância encontrada na natureza; ou (4) qualquer substância modificada por aumento da quantidade da substância em relação a outros componentes aos quais está naturalmente associada (por exemplo, produção recombinante em uma célula hospedeira; múltiplas cópias de um gene que codifica a substância; e uso de um promotor mais forte do que o promotor naturalmente associado ao gene que codifica a substância).

[0030] Condições de estringência baixa: O termo "condições de estringência baixa" significa, para sondas com pelo menos 100 nucleotídeos em comprimento, pré-hibridação e hibridação a 42 °C em 5X SSPE, SDS a 0,3%, 200 microgramas/ml de DNA de esperma de salmão cisalhado e desnaturado, e formamida a 25%, seguindo procedimentos de transferência de Southern padrão durante 12 a 24 horas. O material transportador é finalmente lavado três vezes, cada uma durante 15 minutos usando 2X SSC, SDS a 0,2% a 50 °C.

[0031] Polipeptídeo maduro: O termo "polipeptídeo maduro" significa um polipeptídeo em sua forma final após tradução e quaisquer modificações pós-translacionais, tais como processamento N-terminal, truncação C-terminal, glicosilação, fosforilação, etc. Em um aspeto, o polipeptídeo maduro é os aminoácidos 26 a 322 da SEQ ID NO: 2 com base no programa Signal P versão 3 (Nielsen et al., 1997, Protein Engineering 10: 1-6) que prevê que os aminoácidos 1 a 25 da SEQ ID NO: 2 são um peptídeo de sinal. Quando expressado em Bacillus como descrito no Exemplo 1, é adicionada uma alanina adicional ao terminal N. A sequência de terminal N do polipeptídeo maduro (SEQ ID NO: 3) fo confirmada como sendo AQESPAF (ver Exemplo 3). Em outro aspeto, o polipeptídeo maduro é os aminoácidos 34 a 278 da SEQ ID NO: 19 com base no programa Signal P versão 3 (Nielsen et al., 1997, Protein Engineering 10: 1-6) que prevê que os aminoácidos 1 a 34 da SEQ ID NO: 19 são um peptídeo de sinal. Quando expressado em Bacillus como descrito no Exemplo 1, é adicionada uma alanina adicional ao terminal N. A sequência de terminal N do polipeptídeo maduro (SEQ ID NO: 20) fo confirmada como sendo AWSADAP (ver Exemplo 3). É conhecido na técnica que uma célula hospedeira pode produzir uma mistura de dois ou mais polipeptídeos maduros diferentes (i.e., com um aminoácido C-terminal e/ou N-terminal diferente) expressos pelo mesmo polinucleotídeo. É também conhecido na técnica que diferentes células hospedeiras processam polipeptídeos diferentemente, e, assim, uma célula hospedeira expressando um polinucleotídeo pode produzir um polipeptídeo maduro diferente (p.ex., tendo um aminoácido com C-terminal e/ou N-terminal diferente) em comparação com outra célula hospedeira expressando o mesmo polinucleotídeo. Em um aspeto, o polipeptídeo maduro da SEQ ID NO: 2 contém até pelo menos 300 resíduos de aminoácidos (p.ex., aminoácidos 23 a 322 da SEQ ID NO: 2), ou pelo menos 299 resíduos de aminoácidos (p.ex., aminoácidos 24 a 322 da SEQ ID NO: 2), ou pelo menos 298 resíduos de aminoácidos (p.ex., aminoácidos 25 a 322 da SEQ ID NO: 2), ou pelo menos 296 resíduos de aminoácidos (p.ex., aminoácidos 27 a 322 da SEQ ID NO: 2), ou pelo menos 295 resíduos de aminoácidos (p.ex., aminoácidos 28 a 322 da SEQ ID NO: 2). Em outro aspeto, o polipeptídeo maduro da SEQ ID NO: 19 contém até pelo menos 247 resíduos de aminoácidos (p.ex., aminoácidos 31 a 278 da SEQ ID NO: 19), ou pelo menos 246 resíduos de aminoácidos (p.ex., aminoácidos 32 a 278 da SEQ ID NO: 19), ou pelo menos 244 resíduos de aminoácidos (p.ex., aminoácidos 35 a 278 da SEQ ID NO: 19), ou pelo menos 243 resíduos de aminoácidos (p.ex., aminoácidos 36 a 278 da SEQ ID NO: 19).

[0032] Sequência codificadora de um polipeptídeo maduro: O termo "sequência codificadora de um polipeptídeo maduro" significa um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo maduro tendo atividade de fosfolipase. Em um aspeto, a sequência codificadora de um polipeptídeo maduro é os nucleotídeos 76 a 966 da SEQ ID NO: 1 com base em SignalP (Nielsen et al., 1997, supra) que prevê que os nucleotídeos 1 a 75 da SEQ ID NO: 1 codificam um peptídeo sinal. Em outro aspeto, a sequência codificadora de um polipeptídeo maduro é os nucleotídeos 100 a 837 da SEQ ID NO: 18 com base no SignalP (Nielsen et al., 1997, supra) que prevê que os nucleotídeos 1 a 99 da SEQ ID NO: 18 codificam um peptídeo sinal.

[0033] Condições de estringência média: O termo "condições de estringência média" significa, para sondas com pelo menos 100 nucleotídeos em comprimento, pré-hibridação e hibridação a 42 °C em 5X SSPE, SDS a 0,3%, 200 microgramas/ml de DNA de esperma de salmão cisalhado e desnaturado, e formamida a 35%, seguindo procedimentos de transferência de Southern padrão durante 12 a 24 horas. O material transportador é finalmente lavado três vezes, cada uma durante 15 minutos usando 2X SSC, SDS a 0,2% a 55 °C.

[0034] Condições de estringência média-elevada: O termo "condições de estringência média-elevada" significa, para sondas com pelo menos 100 nucleotídeos em comprimento, pré-hibridação e hibridação a 42 °C em 5X SSPE, SDS a 0,3%, 200 microgramas/ml de DNA de esperma de salmão cisalhado e desnaturado, e formamida a 35%, seguindo procedimentos de transferência de Southern padrão durante 12 a 24 horas. O material transportador é finalmente lavado três vezes, cada uma durante 15 minutos usando 2X SSC, SDS a 0,2% a 60 °C.

[0035] Construção de ácido nucleico: O termo "construção de ácido nucleico" significa uma molécula de ácido nucleico, de cadeia simples ou dupla, que é isolada de um gene ocorrendo naturalmente ou é modificada para conter segmentos de ácidos nucleicos de um modo que de outra maneira não existiria na natureza ou que é sintética, que compreende uma ou mais sequências de controle.

[0036] Operacionalmente ligado: O termo "operacionalmente ligado" significa uma configuração na qual uma sequência de controle é colocada em uma posição apropriada em relação à sequência codificadora de um polinucleotídeo, de modo que a sequência de controle dirija a expressão da sequência codificadora.

[0037] Identidade de sequência: A relação entre duas sequências de aminoácido ou entre duas sequências de nucleotídeo é descrita pelo parâmetro "identidade de sequência".

[0038] Para propósitos da presente invenção, a identidade de sequências entre duas sequências de aminoácidos é determinada usando o algoritmo de Needleman-Wunsch (Needleman e Wunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48: 443-453) como implementado no programa Needle do pacote EMBOSS (EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite, Rice et al., 2000, Trends Genet. 16: 276-277), preferencialmente a versão 5.0.0 ou posterior. Os parâmetros usados são penalidade de intervalo aberto de 10, penalidade de extensão de intervalo de 0,5, e a matriz de substituição EBLOSUM62 (versão EMBOSS de BLOSUM62). O resultado de Needle marcado "identidade mais longa" (obtido usando a opção -nobrief) é usado como a percentagem de identidade e é calculado como se segue: (Resíduos Idênticos x 100)/(Comprimento do Alinhamento - Número Total de Lacunas no Alinhamento)

[0039] Para propósitos da presente invenção, a identidade de sequência entre duas sequências de desoxirribonucleotídeos é determinada usando o algoritmo de Needleman-Wunsch (Needleman e Wunsch, 1970, supra) como implementado no programa Needle do pacote EMBOSS (EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite, Rice et al., 2000, supra), preferencialmente a versão 5.0.0 ou posterior. Os parâmetros usados são penalidade de intervalo aberto de 10, penalidade de extensão de intervalo de 0,5, e a matriz de substituição EDNAFULL (versão EMBOSS de NCBI NUC4.4). O resultado de Needle marcado "identidade mais longa" (obtido usando a opção -nobrief) é usado como a percentagem de identidade e é calculado como se segue: (Desoxirribonucleotídeos Idênticos x 100)/(Comprimento do Alinhamento - Número Total de Lacunas no Alinhamento).

[0040] Variante: O termo "variante" significa um polipeptídeo tendo atividade de fosfolipase C compreendendo uma alteração, i.e., uma substituição, inserção, e/ou deleção, em uma ou mais (p.ex., várias) posições. Uma substituição significa substituição do aminoácido ocupando uma posição por um aminoácido diferente; uma deleção significa remoção do aminoácido ocupando uma posição; e uma inserção significa adição de um aminoácido adjacente e imediatamente a seguir ao aminoácido ocupando uma posição.

[0041] Condições de estringência muito elevada: O termo "condições de estringência muito elevada" significa, para sondas com pelo menos 100 nucleotídeos em comprimento, pré-hibridação e hibridação a 42 °C em 5X SSPE, SDS a 0,3%, 200 microgramas/ml de DNA de esperma de salmão cisalhado e desnaturado, e formamida a 50%, seguindo procedimentos de transferência de Southern padrão durante 12 a 24 horas. O material transportador é finalmente lavado três vezes, cada uma durante 15 minutos usando 2X SSC, SDS a 0,2% a 70 °C. Sequências de Ácido Nucleico e Sequência de Aminoácidos SEQ ID NO: 1: PLC específica para PI, Pseudomonas sp.; sequência codificadora. SEQ ID NO: 2: PLC específica para PI, Pseudomonas sp.; sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 3: PLC específica para PI, Pseudomonas sp.; sequência de aminoácidos de polipeptídeo maduro com alanina de terminal N. SEQ ID NO: 4: PLC específica para PI, Pseudomonas chlorapsis; sequência codificadora. SEQ ID NO: 5: PLC específica para PI, Pseudomonas chlorapsis; sequência de aminoácidos. SEQ ID NO: 6: PLC específica para PI, Pseudomonas chlorapsis; sequência de aminoácidos de polipeptídeo maduro com alanina de terminal N. SEQ ID NO: 7: PLC específica para PI, Pseudomonas sp.; sequência codificadora. SEQ ID NO: 8: PLC específica para PI, Pseudomonas sp.; sequência de aminoácidos. SEQ ID NO: 9: PLC específica para PI, Pseudomonas sp.; sequência de aminoácidos de polipeptídeo maduro com alanina de terminal N. SEQ ID NO: 10: PLC específica para PI, Pseudomonas chlorapsis; sequência codificadora. SEQ ID NO: 11: PLC específica para PI, Pseudomonas chlorapsis; sequência de aminoácidos. SEQ ID NO: 12: PLC específica para PI, Pseudomonas chlorapsis; sequência de aminoácidos de polipeptídeo maduro com alanina de terminal N. SEQ ID NO: 13: PLC específica para PI, Pseudomonas protegens; sequência codificadora. SEQ ID NO: 14: PLC específica para PI, Pseudomonas protegens; sequência de aminoácidos. SEQ ID NO: 15: PLC específica para PI, Pseudomonas protegens; sequência de aminoácidos de polipeptídeo maduro com alanina de terminal N. SEQ ID NO: 16: PLC específica para PI, Pseudomonas protegens; sequência codificadora. SEQ ID NO: 17: PLC específica para PI, Pseudomonas protegens; sequência de aminoácidos. SEQ ID NO: 18: PLC específica para PC/PE, Bacillus sp., sequência codificadora. SEQ ID NO: 19: PLC específica para PC/PE, Bacillus sp., sequência de aminoácidos. SEQ ID NO: 20: PLC específica para PC/PE, Bacillus sp., sequência de aminoácidos de polipeptídeo maduro com alanina de terminal N. SEQ ID NO: 21: Bt-PLC de Bacillus thuringiensis; sequência codificadora. SEQ ID NO: 22: Bt-PLC de Bacillus thuringiensis; sequência de aminoácidos de polipeptídeo maduro. SEQ ID NO: 23: PLC específica para PC/PE, Bacillus pseudomycoides; sequência codificadora. SEQ ID NO: 24: PLC específica para PC/PE, Bacillus pseudomycoides; sequência de aminoácidos. SEQ ID NO: 25: PLC específica para PC/PE, Bacillus pseudomycoides, sequência de aminoácidos com alanina de terminal N. SEQ ID NO: 26: PLC específica para PC/PE, Bacillus mycoides; sequência codificadora. SEQ ID NO: 27: PLC específica para PC/PE, Bacillus mycoides; sequência de aminoácidos. SEQ ID NO: 28: PLC específica para PC/PE, Listeria innocua; sequência codificadora. SEQ ID NO: 29: PLC específica para PC/PE, Listeria innocua; sequência de aminoácidos. SEQ ID NO: 30: PLC específica para PC/PE, Listeria innocua; sequência de aminoácidos com alanina de terminal N. SEQ ID NO: 31: SEQ ID NO: 3 de WO2011/046812. SEQ ID NO: 32: SEQ ID NO: 4 de WO2011/046812. SEQ ID NO: 33: Peptídeo sinal heterólogo SEQ ID NO: 34: PLC específica para PI, Amycolatopsis azurea; sequência codificadora SEQ ID NO: 35: PLC específica para PI, Amycolatopsis azurea; sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 36: PLC específica para PC/PE, Amycolatopsis azurea; sequência de aminoácidos com alanina de terminal N. SEQ ID NO: 37: PLC específica para PC/PE, Bacillus macauensis; sequência codificadora SEQ ID NO: 38: PLC específica para PC/PE, Bacillus macauensis; sequência de aminoácidos.

Descrição Detalhada da Invenção

[0042] A presente invenção se relaciona com enzimas de fosfolipase C obtidas de várias estirpes pertencendo ao gênero pseudomonas que é um organismo não patogênico (classe 1) e como tal geralmente considerado seguro para manusear em laboratório. As enzimas de fosfolipase C derivadas de estirpes pseudomonas mostraram todas especificidade em relação a PI.

[0043] A presente invenção também se relaciona com enzimas de fosfolipase C específicas de PC, PE que são novas ou que nunca foram expressas e caracterizadas. É conhecida a utilização de fosfolipase C específica para PC, PE, PLC de Purifine, na degomagem, sendo ainda contudo relevante identificar enzimas de fosfolipase C específica para PC, PE adicionais que tenham um bom desempenho na degomagem. Em uma modalidade preferencial, as fosfolipases C específicas de PC, PE são obtidas a partir de estirpes pertencendo ao gênero Bacillus ou Listeria.

[0044] A presente invenção se relaciona para além disso com um método para reduzir o teor de fosfolipídeos em uma composição de óleo usando uma ou mais enzimas bacterianas de fosfolipase C. Em particular, quando uma enzima de fosfolipase C específica para PI é combinada com uma enzima de fosfolipase C específica para PC, PE, é observado um efeito benéfico em relação à remoção de fosfolipídeos de uma composição de óleo.

Polipeptídeos tendo Atividade de Fosfolipase C

[0045] Um aspeto da presente invenção se relaciona com um polipeptídeo possuindo atividade de fosfatidilinositol fosfolipase C selecionado de entre o grupo consistindo de; a) um polipeptídeo possuindo pelo menos 91% de identidade de sequência com o polipeptídeo maduro da SEQ ID NO: 2; (b) um polipeptídeo codificado por um polinucleotídeo que hibridiza, sob condições de estringência média, com i) a sequência codificadora do polipeptídeo maduro da SEQ ID NO: 1, ou ii) o seu complemento de comprimento total de (i); c) um polipeptídeo codificado por um polinucleotídeo tendo pelo menos 90% de identidade de sequência com a sequência codificadora do polipeptídeo maduro da SEQ ID NO: 1; d) uma variante do polipeptídeo maduro da SEQ ID NO: 2 compreendendo uma substituição, deleção, e/ou inserção em uma ou mais posições; e e) um fragmento do polipeptídeo de (a), (b), (c), ou (d) que tem atividade de fosfatidilinositol fosfolipase C.

[0046] Em uma modalidade, a presente invenção se relaciona com um polipeptídeo tendo uma identidade de sequência com o polipeptídeo maduro da SEQ ID NO: 2 de pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99%, ou 100%, que tem especificidade em relação a fosfatidilinositol. Em um aspeto, os polipeptídeos diferem em até 10 aminoácidos, p.ex., 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, ou 10, do polipeptídeo maduro da SEQ ID NO: 2. Em uma modalidade preferencial, o polipeptídeo maduro da SEQ ID NO: 2 corresponde aos aminoácidos 26 a 322 da SEQ ID NO: 2.

[0047] Em uma modalidade, o polipeptídeo foi isolado. Um polipeptídeo da presente invenção preferencialmente compreende a ou consiste na sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 2 ou uma sua variante alélica; ou é um seu fragmento tendo atividade de fosfatidilinositol fosfolipase C. Em um outro aspeto, o polipeptídeo compreende o, ou consiste no, polipeptídeo maduro da SEQ ID NO: 2. Em outro aspeto, o polipeptídeo compreende os ou consiste nos aminoácidos 26 a 322 da SEQ ID NO: 2 ou com os aminoácidos 1 a 298 da SEQ ID NO: 3.

[0048] Em particular, o polipeptídeo pode ter um comprimento de 280320 resíduos de aminoácidos, tal como um comprimento de 280-310 resíduos de aminoácidos, 280-305 resíduos de aminoácidos, 280-300 resíduos de aminoácidos, 295-298 resíduos de aminoácidos, 255-297 resíduos de aminoácidos, ou um comprimento de 295-296 resíduos de aminoácidos.

[0049] Em uma modalidade preferencial, a fosfatidilinositol fosfolipase C da invenção é capaz de reduzir o teor de PI em um óleo em bruto em pelo menos 30% quando aplicada em 10 mg de proteína enzimática/kg de óleo com o pH ótimo do polipeptídeo, mais preferencialmente pelo menos 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99% ou 100%. Em uma outra modalidade, a gama de pH ótima do polipeptídeo da presente invenção fica entre 4,5 a 8,5, mais preferencialmente de 5,0 a 8,0, ainda mais preferencialmente de 6,5 a 7,5.

[0050] De acordo com algumas modalidades, a fosfatidilinositol fosfolipase C da invenção tem uma temperatura de desnaturação térmica de pelo menos 60 °C, tal como 61 °C, 62°C, 63°C, 64°C, 65°C, 66°C, 67°C, 68°C, 69°C, 70°C, 71°C, 72°C, 73°C, 74°C, 75°C, 76°C, 77°C, 78°C, 79°C, 80°C, 81°C, 82°C, 83°C, 84°C, 85°C, 86°C, 87°C, 88°C, 89°C ou pelo menos 90 °C como determinado por Calorimetria Diferencial de Varredura (DSC).

[0051] A temperatura de desnaturação térmica, pode em particular ser determinada como o topo do pico de desnaturação (principal pico endotérmico) em termogramas (Cp vs. T) obtidos após aquecimento de uma solução de 1 mg/ml do polipeptídeo em tampão (50 mM de acetato de sódio, pH 5,5, ou 50 mM de Hepes com pH 7) a uma taxa de aquecimento programada constante de 200 K/hora.

[0052] De acordo com algumas modalidades, a fosfatidilinositol fosfolipase C da invenção pode ser capaz de reduzir o teor de fosfatidilinositol de óleo de soja em bruto em 50% ou mais, 50%, tal como em 55%, em 60%, em 65%, em 70%, em 75%, em 80%, em 85%, em 90% ou em 95% ou mais, a redução do teor de fosfatidilinositol sendo determinada por RMN de 31P após adição de 100 mg de proteína enzimática (EP)/kg de óleo e incubação do óleo e enzimas a 50 °C durante 2 horas com pH 5,5.

[0053] De preferência, a fosfatidilinositol fosfolipase C da invenção consegue reduzir o teor de fósforo de óleo de soja em bruto para 20 mg/kg de óleo como determinado por espectrometria de emissão ótica com plasma indutivamente acoplado (ICP-OES) após incubação de 4 mg de proteína enzimática/kg de óleo em um sistema pouco aquoso compreendendo 3% de água com base na quantidade de óleo a 50-60 °C durante 5 horas.

[0054] Para o propósito de determinar a capacidade do polipeptídeo reduzir fósforo, pode ser usado o referido óleo de soja em bruto compreendendo 80-140 ppm de fósforo presente como ácido fosfatídico (PA), 140-200 ppm de fósforo presente como fosfatidiletanolamina (PE), 70110 ppm de fósforo presente como ácido fosfatídico (PI) e 130-200 ppm de fósforo presente como fosfatidilcolina; o teor de fósforo sendo medido por RMN de 31P.

[0055] Em outras modalidades, a fosfatidilinositol fosfolipase C da invenção é robusta em relação a condições variáveis de pH e mostra bom desempenho na degomagem com água (sem ácido/base) bem como auxiliada por ácido seguido de neutralização com base com concentrações variáveis de NaOH (por exemplo, pré-tratamento com ácido/base por adição de ácido ortofosfórico em quantidades iguais a 0,05% (ácido ortofosfórico 100% puro) com base na quantidade de óleo seguido de neutralização com base com 0,5 eqv, 1,0 eqv ou 1,5 eqv de NaOH).

[0056] Para além disso, a redução de teor de fósforo pode ser obtida em um processo de degomagem de óleo compreendendo as etapas de: i) tratar opcionalmente óleo de soja em bruto com ácido/base adicionando uma solução a 85% de ácido ortofosfórico em quantidades correspondendo a 0,05% (ácido ortofosfórico 100% puro) com base na quantidade de óleo, misturar em banho ultrassônico por 5 minutos, seguido de incubação em rotor por 15 minutos e neutralização com base com 4 M de NaOH aplicado em equivalentes (de 0,5 a 0,15) para ácido ortofosfórico puro em banho ultrassônico por 5 minutos; ii) adicionar o polipeptídeo ao óleo em quantidades de 4 mg de proteína enzimática/kg de óleo em um sistema pouco aquoso compreendendo 3% de água com base na quantidade de óleo e submeter o óleo e o polipeptídeo a tratamento ultrassônico durante 5 minutos; iii) incubar o polipeptídeo e o óleo a 50-60 °C por 5 horas com agitação a 20 rpm; iv) centrifugar o óleo e o polipeptídeo a 700 g a 85 °C durante 15 minutos.

[0057] Homólogos de fosfolipase C específica para PI da presente invenção foram identificados de sequências anotadas em projetos de sequenciação de genoma. Quando alinhadas com a sequência madura da SEQ ID NO: 2, as identidades são como se segue: SEQ_ID_NO2_mat 100,00 J2E6B1 SEQ ID:5 83,11 J3EBR2 SEQ ID:8 82,78 I4Y4N5 SEQ ID:11 82,45 Q4K3U9 SEQ ID:14 90,07 R4TRF9 SEQ ID:17 90,73 M2NSV3 SEQ ID:35 20,00

[0058] Tanto quanto é do nosso conhecimento, nenhum destes homólogos foi alguma vez expressado e caracterizado e a sua utilização em degomagem ou em qualquer outra aplicação nunca foi descrita. Para o propósito de gerar construções de ácido nucléico, vetores de expressão e células hospedeiras, bem como composições e métodos de utilização de fosfolipase C específica para PI da SEQ ID NO: 2, bem como os homólogos da SEQ ID NO: 5, na SEQ ID NO: 8, na SEQ ID NO: 11, na SEQ ID NO: 14 e SEQ ID NO: 17 são polipeptídeos de fosfolipase C específica para PI da presente invenção e os polinucleotídeos que os codificam são polinucleotídeos da presente invenção.

[0059] Em outra modalidade, a presente invenção se relaciona com um polipeptídeo possuindo atividade de fosfolipase C específica para P codificada por um polinucleotídeo que hibrida sob condições de estringência média, condições de estringência média-elevada, condições de estringência elevada, ou condições de estringência muito elevada com (i) a sequência codificadora do polipeptídeo maduro da SEQ ID NO: 1, ou (ii) o complemento de comprimento total de (i) ou (ii) (Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2a edição, Cold Spring Harbor, Nova Iorque). Em uma modalidade, o polipeptídeo foi isolado.

[0060] Os polinucleotídeos da SEQ ID NO: 1, 4, 7, 10, 13 ou 16 ou uma sua subsequência, bem como o polipeptídeo da SEQ ID NO: 2, 5, 8, 11, 14 ou 17 ou um seu fragmento, podem ser usados para desenhar sondas de ácido nucleico para identificar e clonar DNA codificando polipeptídeos tendo atividade de fosfolipase C específica para PI a partir de estirpes de diferentes gêneros ou espécies de acordo com métodos bem conhecidos na técnica. Em particular, tais sondas podem ser usadas para hibridação com o DNA genômico ou cDNA de uma célula de interesse, seguindo procedimentos de transferência de Southern padrão, de modo a identificar e isolar o gene correspondente aí presente. Tais sondas podem ser consideravelmente mais curtas do que a sequência inteira, mas devem ter pelo menos 15, por exemplo, pelo menos 25, pelo menos 35, ou pelo menos 70 nucleotídeos de comprimento. Preferencialmente, a sonda de ácido nucleico tem pelo menos 100 nucleotídeos em comprimento, por ex., pelo menos 200 nucleotídeos, pelo menos 300 nucleotídeos, pelo menos 400 nucleotídeos, pelo menos 500 nucleotídeos, pelo menos 600 nucleotídeos, pelo menos 700 nucleotídeos, pelo menos 800 nucleotídeos, ou pelo menos 900 nucleotídeos de comprimento. Podem ser usadas sondas tanto de DNA como de RNA. As sondas são tipicamente marcadas para detectar o gene correspondente (por exemplo, com 32P, 3H, 35S, biotina ou avidina). Tais sondas são englobadas pela presente invenção.

[0061] Uma biblioteca de DNA genômico ou cDNA preparada a partir de tais outras estirpes pode ser rastreada quanto a DNA que hibrida com as sondas descritas acima e codifica um polipeptídeo tendo atividade de fosfolipase C específica para PI. O DNA genômico ou outro de tais outras estirpes pode ser separado por eletroforese em gel de agarose ou de poliacrilamida, ou por outras técnicas de separação. O DNA das bibliotecas ou o DNA separado pode ser transferido para, e imobilizado em, nitrocelulose ou outro material transportador adequado. De modo a identificar um clone ou DNA que hibrida com SEQ ID NO: 1 ou uma subsequência desta, o material transportador é usado em um Southern blot.

[0062] Para propósitos da presente invenção, hibridação indica que os polinucleotídios se hibridizam com uma sonda de ácido nucleico marcada correspondendo (i) à SEQ ID NO: 1, (ii) à sequência codificadora do polipeptídeo maduro da SEQ ID NO: 1; (iii) ao seu complemento de comprimento total; ou (iv) a uma sua subsequência; sob condições de estringência média a muito elevada. Moléculas com as quais a sonda de ácido nucleico hibrida sob estas condições podem ser detectadas usando, por exemplo, filme de raios X ou qualquer outro meio de detecção conhecido na técnica.

[0063] Em outra modalidade, a presente invenção se relaciona com um polipeptídeo tendo atividade de fosfolipase C específica para P codificado por um polinucleotídeo tendo uma identidade de sequência com a sequência codificadora do polipeptídeo maduro da SEQ ID NO: 1 de pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99%, ou 100%. Em uma modalidade adicional, o polipeptídeo fo isolado.

[0064] Em outra modalidade, a presente invenção se relaciona com variantes do polipeptídeo maduro da SEQ ID NO: 2 compreendendo uma substituição, deleção, e/ou inserção em uma ou mais (p.ex., várias) posições. Uma variante específica da SEQ ID NO: 2 é divulgada como SEQ ID NO: 3 contendo um A inserido em frente do Q na posição 26 da SEQ ID NO: 2. Em uma modalidade, o número de substituições, deleções e/ou inserções de aminoácidos introduzidas no polipeptídeo maduro da SEQ ID NO: 2 é até 10, p.ex., 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, ou 10. As mudanças de aminoácidos podem ser de uma natureza mínima, isto é, substituições ou inserções de aminoácidos conservativas que não afetam significativamente o dobramento e/ou atividade da proteína; pequenas deleções, tipicamente de 1-30 aminoácidos; pequenas extensões do terminal amino ou carboxila, tal como um resíduo de metionina amino-terminal; um pequeno peptídeo ligante de até 20-25 resíduos; ou uma pequena extensão que facilita a purificação por mudança da carga total ou outra função, tal como um trato de poli-histidina, um epítopo antigênico ou um domínio de ligação.

[0065] Outro aspeto da presente invenção se relaciona com um polipeptídeo possuindo atividade de fosfolipase C específica para PC e PE, selecionado de entre o grupo consistindo de; a) um polipeptídeo possuindo pelo menos 70% de identidade de sequência com o polipeptídeo maduro da SEQ ID NO: 19; (b) um polipeptídeo codificado por um polinucleotídeo que hibrida, sob condições de estringência baixa, com (i) a sequência codificadora do polipeptídeo maduro da SEQ ID NO: 18, ou ii) o seu complemento de comprimento total de (i); c) um polipeptídeo codificado por um polinucleotídeo tendo pelo menos 70% de identidade de sequência com a sequência codificadora do polipeptídeo maduro da SEQ ID NO: 18; d) uma variante do polipeptídeo maduro da SEQ ID NO: 19 compreendendo uma substituição, deleção, e/ou inserção em uma ou mais posições; e e) um fragmento do polipeptídeo de (a), (b), (c), ou (d) que tem atividade de fosfolipase C específica para PC e PE. Em uma modalidade, a presente invenção se relaciona com 98%, pelo menos 99%, ou 100%, que têm atividade de fosfolipase C específica para PC e PE. Em um aspeto, os polipeptídeos diferem em até 10 aminoácidos, p.ex., 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, ou 10, do polipeptídeo maduro da SEQ ID NO: 19.

[0066] Em uma modalidade, a presente invenção se relaciona com polipeptídeos tendo uma identidade de sequência com o polipeptídeo maduro da SEQ ID NO: 19 de pelo menos 60%, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99%, ou 100%, que têm atividade de fosfolipase C específica para PC e PE. Em um aspeto, os polipeptídeos diferem em até 10 aminoácidos, p.ex., 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, ou 10, do polipeptídeo maduro da SEQ ID NO: 19.

[0067] Em uma modalidade, o polipeptídeo foi isolado. Um polipeptídeo da presente invenção preferencialmente compreende a ou consiste na sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 19 ou uma sua variante alélica; ou é um seu fragmento tendo atividade de fosfolipase C. Em um outro aspeto, o polipeptídeo compreende o, ou consiste no, polipeptídeo maduro da SEQ ID NO: 19. Em outro aspeto, o polipeptídeo compreende os ou consiste nos aminoácidos 34 a 278 da SEQ ID NO: 19 ou resíduos de aminoácidos 1-246 da SEQ ID NO: 20.

[0068] Em outras modalidades, o polipeptídeo tem um comprimento de 220-280 resíduos de aminoácidos, tal como um comprimento de 220-270 resíduos de aminoácidos, 220-260 resíduos de aminoácidos, 220-250 resíduos de aminoácidos, 220-248 resíduos de aminoácidos 220-246 resíduos de aminoácidos, 220-244 resíduos de aminoácidos, 225-280 resíduos de aminoácidos, 225-270 resíduos de aminoácidos, 225-260 resíduos de aminoácidos, 225-250 resíduos de aminoácidos, 225-248 resíduos de aminoácidos 225-246 resíduos de aminoácidos, 225-244 resíduos de aminoácidos, 230-280 resíduos de aminoácidos, 230-270 resíduos de aminoácidos, 230-260 resíduos de aminoácidos, 230-250 resíduos de aminoácidos, 230-248 resíduos de aminoácidos, 230-246 resíduos de aminoácidos, 230-244 resíduos de aminoácidos, 235-280 resíduos de aminoácidos, 235-270 resíduos de aminoácidos, 235-260 resíduos de aminoácidos, 235-250 resíduos de aminoácidos, 235-248 resíduos de aminoácidos 235-246 resíduos de aminoácidos, 235-244 resíduos de aminoácidos, 240-280 resíduos de aminoácidos, 240-270 resíduos de aminoácidos, 240-260 resíduos de aminoácidos, 240-250 resíduos de aminoácidos, 240-248 resíduos de aminoácidos 240-246 resíduos de aminoácidos, 240-244 resíduos de aminoácidos, 242-280 resíduos de aminoácidos, 242-270 resíduos de aminoácidos, 242-260 resíduos de aminoácidos, 242-250 resíduos de aminoácidos, 242-248 resíduos de aminoácidos 242-246 resíduos de aminoácidos, 242-244 resíduos de aminoácidos, 243-280 resíduos de aminoácidos, 243-270 resíduos de aminoácidos, 243-260 resíduos de aminoácidos, 243-250 resíduos de aminoácidos, 243-248 resíduos de aminoácidos 243-246 resíduos de aminoácidos, 243-244 resíduos de aminoácidos.

[0069] O polipeptídeo tendo atividade de fosfolipase C específica para PC e PE pode ter em particular uma temperatura de desnaturação térmica de pelo menos 60 °C, tal como 61 °C, , 62°C, 63°C, 64°C, 65°C, 66°C, 67°C, 68°C, 69°C, 70°C, 71°C, 72°C, 73°C, 74°C, 75°C, 76°C, 77°C, 78°C, 79°C, 80°C, 81°C, 82°C, 83°C, 84°C, 85°C, 86°C, 87°C, 88°C, 89°C ou pelo menos 90 °C como determinado por Calorimetria Diferencial de Varredura (DSC).

[0070] A referida temperatura de desnaturação térmica pode ser determinada como o topo do pico de desnaturação (principal pico endotérmico) em termogramas (Cp vs. T) obtidos após aquecimento de uma solução de 1 mg/ml do polipeptídeo em tampão (50 mM de acetato de sódio, pH 5,5, ou 50 mM de Hepes com pH 7) a uma taxa de aquecimento programada constante de 200 K/hora.

[0071] Em uma modalidade preferencial, a fosfolipase C específica para PC e PE da invenção é capaz de reduzir o teor de PC e PE em um óleo em bruto. De preferência, o polipeptídeo da invenção é capaz de reduzir o teor de PC e PE em um óleo em bruto em pelo menos 30% cada quando aplicado em 10 mg de proteína enzimática/kg de óleo com o pH ótimo do polipeptídeo, mais preferencialmente pelo menos 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99% ou 100%. Em uma outra modalidade, a gama de pH ótima do polipeptídeo da presente invenção fica entre 5,0 e 8,5, mais preferencialmente entre 5,5 e 8,0, ainda mais preferencialmente entre 6,0 e 7,5. Em outras modalidades, o polipeptídeo tendo atividade de fosfolipase C específica para PC e PE é capaz de reduzir o teor de fosfatidiletanolamina e/ou fosfatidilcolina de óleo de soja em bruto em 50% ou mais de 50%, tal como em 55%, em 60%, em 65%, em 70%, em 75%, em 80%, em 85%, em 90% ou em 95% ou mais, a redução no teor de fosfatidiletanolamina e/ou fosfatidilcolina sendo determinada por RMN de 31P após adição de 10 mg de proteína enzimática(EP)/kg de óleo e incubação do óleo e enzimas a 50 °C durante 2 horas com pH 5,5.

[0072] Em outras modalidades ainda, o polipeptídeo tendo atividade de fosfolipase C específica para PC e PE consegue reduzir o teor de fósforo de óleo de soja em bruto para 20 mg/kg de óleo como determinado por espectrometria de emissão ótica com plasma indutivamente acoplado (ICP-OES) após incubação de 4 mg de proteína enzimática/kg de óleo em um sistema pouco aquoso compreendendo 3% de água com base na quantidade de óleo a 50-60 °C durante 5 horas.

[0073] A capacidade do polipeptídeo reduzir o teor de fósforo pode em particular ser determinada usando um óleo de soja em bruto que compreenda 80-140 ppm de fósforo presente como ácido fosfatídico (PA), 140-200 ppm de fósforo presente como fosfatidiletanolamina (PE), 70-110 ppm de fósforo presente como ácido fosfatídico (PI) e 130-200 ppm de fósforo presente como fosfatidilcolina; o teor de fósforo sendo medido por RMN de 31P.

[0074] Em particular, a redução de teor de fósforo e/ou redução de teor de fosfatidiletanolamina e/ou fosfatidilcolina pode ser obtida em um processo de degomagem de óleo compreendendo as etapas de: i) tratar opcionalmente óleo de soja em bruto com ácido/base adicionando uma solução a 85% de ácido ortofosfórico em quantidades correspondendo a 0,05% (ácido ortofosfórico 100% puro) com base na quantidade de óleo, misturar em banho ultrassônico por 5 minutos, seguido de incubação em rotor por 15 minutos e neutralização com base com 4 M de NaOH aplicado em equivalentes (de 0,5 a 0,15) para ácido ortofosfórico puro em banho ultrassônico por 5 minutos; ii) adicionar o polipeptídeo ao óleo em quantidades de 4 mg de proteína enzimática/kg de óleo em um sistema pouco aquoso compreendendo 3% de água com base na quantidade de óleo e submeter o óleo e o polipeptídeo a tratamento ultrassônico durante 5 minutos; iii) incubar o polipeptídeo e o óleo a 50-60 °C por 5 horas com agitação a 20 rpm; iv) centrifugar o óleo e o polipeptídeo a 700 g a 85 °C durante 15 minutos.

[0075] A sequência relacionada mais próxima da PLC específica para PC, PE da presente invenção é SEQ ID NO: 4 da WO2011/046812 (SEQ ID NO: 32 em esta aplicação) com 44,6% de identidade com a sequência madura da SEQ ID NO: 19 (aminoácidos 34 a 278). Esta, bem como as PLCs específicas de PC, PE identificadas pelo número UniProt, podem ser úteis no método da presente invenção ID19_mat 100,00 44,63 43,57 43,80 43,80 31,65 ID32 44,63 100,00 80,14 80,50 80,50 40,23 C3HDV6 ID22 43,57 80,14 100,00 88,69 88,34 40,44 P34B3F ID24 43,80 80,50 88,69 100,00 98,59 39,05 C3AHL7 ID27 43,80 80,50 88,34 98,59 100,00 39,05 E3Z3X0 ID29 31,65 40,23 40,44 39,05 39,05 100,00 I8AFV4 ID38 42,08

[0076] A sequência madura da SEQ ID NO: 22, correspondendo aos aminoácidos 39 a 283 também foi divulgada em relação a degomagem como SEQ ID NO: 5 na EP1788080. Tanto quanto sabemos, nenhuma das PLCs específica para PC, PE da SEQ ID NO: 24, 27 ou 29 foi alguma vez expressada e caracterizada e a sua utilização em degomagem ou em qualquer outra aplicação nunca foi descrita. Para o propósito de gerar construções de ácido nucléico, vetores de expressão e células hospedeiras, bem como composições e métodos de utilização de fosfolipase C específica para PC, PE da SEQ ID NO: 19, bem como os homólogos da SEQ ID NO: 24, na SEQ ID NO: 27 e SEQ ID NO: 29 são polipeptídeos de fosfolipase C específica para PC, PE da presente invenção e os polinucleotídeos que os codificam são polinucleotídeos da presente invenção.

[0077] Em outra modalidade, a presente invenção se relaciona com um polipeptídeo possuindo atividade de fosfolipase C específica para PC, PE codificada por um polinucleotídeo que hibrida sob condições de estringência baixa, condições de estringência média, condições de estringência média-elevada, condições de estringência elevada, ou condições de estringência muito elevada com (i) a sequência codificadora do polipeptídeo maduro da SEQ ID NO: 18, ou (ii) o complemento de comprimento total de (i) ou (ii) (Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2a edição, Cold Spring Harbor, Nova Iorque). Em uma modalidade, o polipeptídeo foi isolado.

[0078] O polinucleotídeo da SEQ ID NO: 18, ou uma sua subsequência, bem como o polipeptídeo da SEQ ID NO: 19 ou um seu fragmento, pode ser usado para desenhar sondas de ácido nucleico para identificar e clonar DNA codificando polipeptídeos tendo atividade de fosfolipase C a partir de estirpes de diferentes gêneros ou espécies de acordo com métodos bem conhecidos na técnica. Em particular, tais sondas podem ser usadas para hibridação com o DNA genômico ou cDNA de uma célula de interesse, seguindo procedimentos de transferência de Southern padrão, de modo a identificar e isolar o gene correspondente aí presente. Tais sondas podem ser consideravelmente mais curtas do que a sequência inteira, mas devem ter pelo menos 15, por exemplo, pelo menos 25, pelo menos 35, ou pelo menos 70 nucleotídeos de comprimento. Preferencialmente, a sonda de ácido nucleico tem pelo menos 100 nucleotídeos em comprimento, por ex., pelo menos 200 nucleotídeos, pelo menos 300 nucleotídeos, pelo menos 400 nucleotídeos, pelo menos 500 nucleotídeos, pelo menos 600 nucleotídeos, pelo menos 700 nucleotídeos, pelo menos 800 nucleotídeos, ou pelo menos 900 nucleotídeos de comprimento. Podem ser usadas sondas tanto de DNA como de RNA. As sondas são tipicamente marcadas para detectar o gene correspondente (por exemplo, com 32P, 3H, 35S, biotina ou avidina). Tais sondas são englobadas pela presente invenção.

[0079] Uma biblioteca de DNA genômico ou cDNA preparada a partir de tais outras estirpes pode ser rastreada quanto a DNA que hibrida com as sondas descritas acima e codifica um polipeptídeo tendo atividade de fosfolipase C específica para PC e PE. O DNA genômico ou outro de tais outras estirpes pode ser separado por eletroforese em gel de agarose ou de poliacrilamida, ou por outras técnicas de separação. O DNA das bibliotecas ou o DNA separado pode ser transferido para, e imobilizado em, nitrocelulose ou outro material transportador adequado. De modo a identificar um clone ou DNA que hibrida com SEQ ID NO: 18 ou uma subsequência desta, o material transportador é usado em um Southern blot.

[0080] Para propósitos da presente invenção, hibridação indica que os polinucleotídios se hibridizam com uma sonda de ácido nucleico marcada correspondendo (i) à SEQ ID NO: 18; (ii) a sequência codificadora do polipeptídeo maduro da SEQ ID NO: 18; (iii) ao seu complemento de comprimento total; ou (iv) a uma sua subsequência; sob condições de estringência baixa a muito elevada. Moléculas com as quais a sonda de ácido nucleico hibrida sob estas condições podem ser detectadas usando, por exemplo, filme de raios X ou qualquer outro meio de detecção conhecido na técnica.

[0081] Em outra modalidade, a presente invenção se relaciona com um polipeptídeo tendo atividade de fosfolipase C específica para PC e PE codificado por um polinucleotídeo tendo uma identidade de sequência com a sequência codificadora do polipeptídeo maduro da SEQ ID NO: 18 de pelo menos 60%, p.ex., pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99%, ou 100%. Em uma modalidade adicional, o polipeptídeo foi isolado.

[0082] Em outra modalidade, a presente invenção se relaciona com variantes do polipeptídeo maduro da SEQ ID NO: 19 compreendendo uma substituição, deleção, e/ou inserção em uma ou mais (p.ex., várias) posições. Uma variante específica da SEQ ID NO: 19 é divulgada como SEQ ID NO: 20 contendo um A inserido em frente do W na posição 34 da SEQ ID NO: 19. Em uma modalidade, o número de substituições, deleções e/ou inserções de aminoácidos introduzidas no polipeptídeo maduro da SEQ ID NO: 19 é até 10, p.ex., 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, ou 10. As mudanças de aminoácidos podem ser de uma natureza mínima, isto é, substituições ou inserções de aminoácidos conservativas que não afetam significativamente o dobramento e/ou atividade da proteína; pequenas deleções, tipicamente de 1-30 aminoácidos; pequenas extensões do terminal amino ou carboxila, tal como um resíduo de metionina aminoterminal; um pequeno peptídeo ligante de até 20-25 resíduos; ou uma pequena extensão que facilita a purificação por mudança da carga total ou outra função, tal como um trato de poli-histidina, um epítopo antigênico ou um domínio de ligação.

[0083] Em relação aos polipeptídeos da presente invenção, exemplos de substituições conservativas se encontram dentro dos grupos dos aminoácidos básicos (arginina, lisina e histidina), aminoácidos ácidos (ácido glutâmico e ácido aspártico), aminoácidos polares (glutamina e asparagina), aminoácidos hidrofóbicos (leucina, isoleucina e valina), aminoácidos aromáticos (fenilalanina, triptofano e tirosina), e pequenos aminoácidos (glicina, alanina, serina, treonina e metionina). Substituições de aminoácidos que não alteram geralmente a atividade específica são conhecidas na técnica e são descritas, por exemplo, por H. Neurath e R.L. Hill, 1979, Em, The Proteins, Academic Press, Nova Iorque. Substituições comuns são Ala/Ser, Val/Ile, Asp/Glu, Thr/Ser, Ala/Gly, Ala/Thr, Ser/Asn, Ala/Val, Ser/Gly, Tyr/Phe, Ala/Pro, Lys/Arg, Asp/Asn, Leu/Ile, Leu/Val, Ala/Glu, e Asp/Gly.

[0084] Outras abordagens possíveis para gerar variantes possuindo propriedades físico-químicas ou funcionais semelhantes ou substancialmente semelhantes à fosfolipase C específica para PI da SEQ ID NO: 2, (o polipeptídeo maduro da SEQ ID NO: 2) ou a fosfolipase C específica para PC, PE da SEQ ID NO: 19, (o polipeptídeo maduro da SEQ ID NO: 19) incluiriam introduzir alterações na sequência de aminoácidos dentro de regiões mostrando variabilidade média a elevada, identificadas alinhando o respectivo polipeptídeo com sequências relacionadas. Na fosfolipase C específica para PI da SEQ ID NO: 2, tais regiões podem ser identificadas por alinhamento para se ajustar o melhor possível com as sequências de aminoácidos da SEQ ID NOs: 8, (UniProtKB/TrEMBL: J3EBR2), 11 (UniProtKB/TrEMBL: I4Y4N5), 14 (UniProtKB/TrEMBL: Q4K3U9) e 17 (UniProtKB/TrEMBL: R4RTF9).

[0085] Através de tal alinhamento, as regiões que se seguem possuindo médio ou Variabilidade elevada podem ser identificadas em SEQ ID NO: 2 (usando a numeração de aminoácidos da SEQ ID NO: 2): Variabilidade aminoácidos 28-43 elevada Variabilidade aminoácido 59 elevada Variabilidade aminoácidos 82-88 elevada Variabilidade aminoácidos 130-131 elevada Variabilidade aminoácido 165 elevada Variabilidade aminoácidos 254-255 elevada Variabilidade aminoácido 266 elevada Variabilidade aminoácidos 298-301 elevada Variabilidade aminoácidos 311-314 elevada

[0086] Assim, em algumas modalidades da invenção, um polipeptídeo tendo uma identidade de sequência com o polipeptídeo maduro da SEQ ID NO: 2 de pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99%, ou 100%, que tem especificidade em relação a fosfatidilinositol, em que um ou mais resíduos de aminoácidos foram substituídos, deletados ou adicionados em uma ou mais das regiões definidas por aminoácidos 28-43, aminoácido 59, aminoácidos 82-88, aminoácidos 130-131, aminoácido 266, aminoácidos 298-301, aminoácidos 311314, usando a numeração de aminoácidos em SEQ ID NO: 2.

[0087] Em outras modalidades, estes polipeptídeos diferem em até 10 aminoácidos, p.ex., 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, ou 10 em relação ao polipeptídeo maduro da SEQ ID NO: 2.

[0088] Em modalidades correspondentes relacionadas com a fosfolipase C específica para PE/PC da SEQ ID NO: 19, tais regiões podem ser identificadas por alinhamento para se ajustar o melhor possível com as sequências de aminoácidos da SEQ ID NOs: 22, (UniProtKB/TrEMBL:C3HDV6), 24 (UniProtKB/TrEMBL:C3BG10), 27 (UniProtKB/TrEMBL:C3AHL7) e 29 (UniProtKB/TrEMBL: E3Z3X0).

[0089] Através de tal alinhamento, as regiões que se seguem possuindo médio ou Variabilidade elevada podem ser identificadas em SEQ ID NO: 19 (usando a numeração de aminoácidos da SEQ ID NO: 19): Variabilidade aminoácidos 3-72 elevada Variabilidade aminoácidos 74-123 média Variabilidade aminoácidos 129-142 elevada Variabilidade aminoácidos 145-147 média Variabilidade aminoácidos 154-155 média Variabilidade aminoácido 164-189 elevada Variabilidade aminoácidos 188-201 elevada Variabilidade aminoácidos 203-226 média Variabilidade aminoácidos 228-237 elevada Variabilidade aminoácidos 244-246 média Variabilidade aminoácidos 248-258 média Variabilidade aminoácidos 260-278 média

[0090] Em uma modalidade, a presente invenção se relaciona com polipeptídeos tendo uma identidade de sequência com o polipeptídeo maduro da SEQ ID NO: 19 de pelo menos 60%, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99%, ou 100%, que têm atividade de fosfolipase C específica para PC e PE, em que um ou mais resíduos de aminoácidos, tal como até 10 aminoácidos, por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, ou 10, foram substituídos, deletados ou adicionados em uma ou mais regiões definidas por aminoácidos 3-72, aminoácidos 74-123, aminoácidos 129-142, aminoácidos 145-147, aminoácidos 154-155, aminoácidos 164-189, aminoácidos 188-201, aminoácidos 203-226, aminoácidos 228-237, aminoácidos 244-246, aminoácidos 248-258, aminoácidos 260-278, usando a numeração de aminoácidos da SEQ ID NO: 19.

[0091] Em outras modalidades, estes polipeptídeos diferem em até 10 aminoácidos, p.ex., 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, ou 10 em relação ao polipeptídeo maduro da SEQ ID NO: 19.

[0092] Alternativamente, as mudanças de aminoácidos são de uma tal natureza que as propriedades físicoquímicas dos polipeptídeos são alteradas. Por exemplo, as mudanças de aminoácidos podem melhorar a estabilidade térmica do polipeptídeo, alterar a especificidade quanto ao substrato, mudar o pH ótimo, e similares.

[0093] Aminoácidos essenciais em um polipeptídeo podem ser identificados de acordo com procedimentos conhecidos na técnica, tais como mutagênese sítio-dirigida ou mutagênese de varredura da alanina (Cunningham e Wells, 1989, Science 244: 1081-1085). Em esta última técnica, mutações de alanina simples são introduzidas em todos os resíduos da molécula, e as moléculas mutantes resultantes são testadas quanto à atividade de fosfolipase C desejada para identificar resíduos de aminoácidos que são críticos para a atividade da molécula. Ver também, Hilton et al., 1996, J. Biol. Chem. 271: 4699-4708. O local ativo da enzima ou outra interação biológica podem ser também determinados por análise física da estrutura, tal como determinados por técnicas tais como ressonância magnética nuclear, cristalografia, difração de elétrons, ou marcação por fotoafinidade, em conjunto com mutação de aminoácidos de local de contato putativo. Ver, por exemplo, de Vos et al., 1992, Science 255: 306-312; Smith et al., 1992, J. Mol. Biol. 224: 899-904; Wlodaver et al., 1992, FEBS Lett. 309: 59-64. A identidade de aminoácidos essenciais pode ser também inferida a partir de um alinhamento com um polipeptídeo relacionado.

[0094] Prevê-se que os aminoácidos essenciais na sequência de aminoácidos 26 a 322 da SEQ ID NO: 2 estão localizados nas posições H50, N51, e D74. Acredita-se que estes aminoácidos estão envolvidos na coordenação de cálcio no local ativo. A previsão é suportada pelo seguinte artigo de Iwasaki et al., 1998, Biochimica et Biophysica Acta1391: 52-66 que mostra que quando o H correspondendo a H50 em SEQ ID NO: 2 é alterado, a PLC identificada como UniProt B3A043 ou PDB 3H4X morre. Em uma modalidade preferencial, um polipeptídeo da invenção mantém os aminoácidos correspondendo à posição 50, 51 e 74 quando alinhada com SEQ ID NO: 2.

[0095] Prevê-se que os aminoácidos essenciais na sequência de aminoácidos 34 a 278 da SEQ ID NO: 19 estão localizados nas posições W34, H47, D88, H102, H152, D156, H162, H177 e E181. Crê-se que estes aminoácidos estão envolvidos na coordenação dos três íons de Zn necessários para a atividade catalítica com base em um modelo de homologia da sequência. Em uma modalidade preferencial, um polipeptídeo da invenção mantém os aminoácidos correspondendo à posição 34, 47, 88, 102, 152, 156, 162, 177 e 181 quando alinhada com SEQ ID NO: 19.

[0096] Substituições, deleções, e/ou inserções simples ou múltiplas de aminoácidos podem ser feitas e testadas usando métodos conhecidos de mutagênese, recombinação, e/ou embaralhamento, seguidos por um procedimento de rastreio relevante, tal como aqueles divulgados por Reidhaar-Olson e Sauer, 1988, Science 241: 53-57; Bowie e Sauer, 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 2152-2156; WO 95/17413; ou WO 95/22625. Outros métodos que podem ser usados incluem PCR propensa a erros, exibição de fagos (p.ex., Lowman et al., 1991, Biochemistry 30: 1083210837; Patente dos E.U.A. No. 5,223,409; WO 92/06204), e mutagênese direcionada para região (Derbyshire et al., 1986, Gene 46: 145; Ner et al., 1988, DNA 7: 127).

[0097] Podem ser combinados métodos de mutagênese/embaralhamento com métodos de rastreio automatizados, de elevado rendimento, para detectar a atividade de polipeptídeos mutagenizados, clonados, expressos por células hospedeiras (Ness et al., 1999, Nature Biotechnology 17: 893-896). Moléculas de DNA mutagenizadas que codificam polipeptídeos ativos podem ser recuperadas das células hospedeiras e rapidamente sequenciadas usando métodos padrão na técnica. Esses métodos permitem a determinação rápida da importância de resíduos de aminoácidos individuais em um polipeptídeo.

[0098] O polipeptídeo pode ser um polipeptídeo híbrido no qual uma região de um polipeptídeo está fundida ao terminal N ou terminal C de uma região de outro polipeptídeo.

[0099] O polipeptídeo pode ser um polipeptídeo de fusão ou um polipeptídeo de fusão clivável ao qual outro polipeptídeo está fundido no terminal N ou terminal C do polipeptídeo da presente invenção. Um polipeptídeo de fusão é produzido por fusão de um polinucleotídeo codificando um outro polipeptídeo com um polinucleotídeo da presente invenção. Técnicas para produção de polipeptídeos de fusão são conhecidas na técnica, e incluem ligação das sequências codificadoras que codificam os polipeptídeos, de modo a que fiquem em grelha e a que a expressão do polipeptídeo de fusão esteja sob controle do(s) mesmo(s) promotor(es) e terminador. Polipeptídeos de fusão podem ser também construídos usando tecnologia de inteína na qual são criados polipeptídeos de fusão pós-translacionalmente (Cooper et al., 1993, EMBO J. 12: 25752583; Dawson et al., 1994, Science 266: 776-779).

[0100] Um polipeptídeo de fusão pode compreender adicionalmente um local de clivagem entre os dois polipeptídeos. Após secreção da proteína de fusão, o local é clivado liberando os dois polipeptídeos. Exemplos de locais de clivagem incluem os, mas não estão limitados aos, locais divulgados em Martin et al., 2003, J. Ind. Microbiol. Biotechnol. 3: 568-576; Svetina et al., 2000, J. Biotechnol. 76: 245-251; Rasmussen- Wilson et al., 1997, Appl. Environ. Microbiol. 63: 3488-3493; Ward et al., 1995, Biotechnology 13: 498-503; e Contreras et al., 1991, Biotechnology 9: 378-381; Eaton et al., 1986, Biochemistry 25: 505-512; Collins-Racie et al., 1995, Biotechnology 13: 982-987; Carter et al., 1989, Proteins: Structure, Function, and Genetics 6: 240-248; e Stevens, 2003, Drug Discovery World 4: 35-48.

Fontes de Polipeptídeos tendo Atividade de Fosfolipase C

[0101] Um polipeptídeo tendo atividade de fosfolipase C da presente invenção pode ser obtido de microrganismos de qualquer gênero. Para propósitos da presente invenção, o termo "obtido de" como usado aqui em conexão com uma dada fonte deve significar que o polipeptídeo codificado por um polinucleotídeo é produzido pela fonte ou por uma estirpe na qual o polinucleotídeo da fonte foi inserido. Em um aspeto, o polipeptídeo obtido de uma dada fonte é secretado extracelularmente.

[0102] O polipeptídeo pode ser um polipeptídeo bacteriano. Por exemplo, o polipeptídeo pode ser um polipeptídeo bacteriano Gram- positivo, tal como um polipeptídeo de Bacillus, Listeria ou Pseudomonas.

[0103] Em um aspeto, o polipeptídeo é um polipeptídeo de Bacillus alkalophilus, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus brevis, Bacillus cereus, Bacillus circulans, Bacillus clausii, Bacillus coagulans, Bacillus firmus, Bacillus lautus, Bacillus lentus, Bacillus licheniformis, Bacillus megaterium, Bacillus pseudomycoides, Bacillus pumilus, Bacillus stearothermophilus, Bacillus subtilis, ou Bacillus thuringiensis.

[0104] Em outro aspeto, o polipeptídeo é um polipeptídeo de Listeria innocua.

[0105] Em outro aspeto, o polipeptídeo é um polipeptídeo de Pseudomonas chlororaphis ou Pseudomonas protegens.

[0106] Será entendido que, para as espécies acima mencionadas, a invenção engloba tanto os estados perfeitos como imperfeitos, e outros equivalentes taxonômicos, por ex., anamorfos, independentemente do nome da espécie pelo qual sejam conhecidos. Os peritos na técnica prontamente reconhecerão a identidade de equivalentes apropriados.

[0107] Estirpes dessas espécies estão prontamente acessíveis ao público em um número de coleções de culturas, tais como a American Type Culture Collection (ATCC), Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DSMZ), Centraalbureau Voor Schimmelcultures (CBS), e Agricultural Research Service Patent Culture Collection, Northern Regional Research Center (NRRL).

[0108] O polipeptídeo pode ser identificado e obtido de outras fontes incluindo microrganismos isolados da natureza (p.ex., solo, compostos, água, etc.) ou amostras de DNA obtidas diretamente de materiais naturais (p.ex., solo, compostos, água, etc.) usando as sondas acima mencionadas. Técnicas para isolamento de microrganismos e DNA diretamente a partir de habitats naturais são bem conhecidas na técnica. Um polinucleotídeo codificando o polipeptídeo pode ser depois obtido por rastreio similar de uma biblioteca de DNA genômico ou cDNA de um outro microrganismo ou amostra de DNA misto. Uma vez detectado um polinucleotídeo codificando um polipeptídeo com a(s) sonda(s), o polinucleotídeo pode ser isolado ou clonado por utilização de técnicas que são conhecidas daqueles com perícia ordinária na técnica (ver, p.ex., Sambrook et al., 1989, supra).

Polinucleotídeos

[0109] A presente invenção se refere também a polinucleotídeos que codificam um polipeptídeo da presente invenção. Em uma modalidade, o polinucleotídeo codificando o polipeptídeo da presente invenção foi isolado.

[0110] As técnicas usadas para isolar ou clonar um polinucleotídeo são conhecidas na técnica e incluem isolamento a partir de DNA genômico ou cDNA, ou uma sua combinação. A clonagem dos polinucleotídeos a partir de DNA genômico pode ser efetuada, p.ex., usando a bem conhecida reação em cadeia da polimerase (PCR) ou rastreio com anticorpos de bibliotecas de expressão para detectar fragmentos de DNA clonados com características estruturais partilhadas. Ver, p.ex., Innis et al., 1990, PCR: A Guide to Methods and Application, Academic Press, Nova Iorque. Podem ser usados outros procedimentos de amplificação de ácidos nucleicos tais como reação em cadeia da ligase (LCR), transcrição ativada por ligação (LAT) e amplificação baseada em polinucleotídeos (NASBA). Os polinucleotídeos podem ser clonados a partir de uma estirpe de Bacillus ou Pseudomonas, ou um organismo relacionado, e, assim, por exemplo, podem ser uma variante alélica ou de espécies da região codificadora do polipeptídeo do polinucleotídeo.

[0111] A modificação de um polinucleotídeo codificando um polipeptídeo da presente invenção pode ser necessária para síntese de polipeptídeos substancialmente similares ao polipeptídeo. O termo "substancialmente similar" ao polipeptídeo se refere a formas do polipeptídeo que não ocorrem naturalmente. Esses polipeptídeos podem diferir, de algum modo manipulado, do polipeptídeo isolado de sua fonte nativa, por exemplo, variantes que diferem na atividade específica, termoestabilidade, pH ótimo, ou semelhantes. As variantes podem ser construídas com base no polinucleotídeo apresentado como a sequência codificadora do polipeptídeo maduro da SEQ ID NO: 1 ou SEQ ID NO: 18, p.ex., uma sua subsequência, e/ou por introdução de substituições de nucleotídeos que não resultem em uma mudança da sequência de aminoácidos do polipeptídeo, mas que correspondam ao uso de códons do organismo hospedeiro pretendido para produção da enzima, ou por introdução de substituições de nucleotídeos que podem dar origem a uma sequência de aminoácidos diferente. Para uma descrição geral de substituições de nucleotídeos ver, p.ex., Ford et al., 1991, Protein Expression and Purification 2: 95-107.

Construções de Ácidos Nucleicos

[0112] A presente invenção se refere também a construções de ácido nucleico compreendendo um polinucleotídeo da presente invenção operacionalmente ligado a uma ou mais sequências de controle que dirigem a expressão da sequência codificadora em um hospedeiro de expressão. De preferência a expressão é feita em uma célula hospedeira adequada sob condições compatíveis com as sequências de controle.

[0113] O polinucleotídeo pode ser manipulado de várias maneiras para proporcionar a expressão do polipeptídeo. A manipulação do polinucleotídeo antes da sua inserção em um vetor pode ser desejável ou necessária dependendo do vetor de expressão. As técnicas para modificação de polinucleotídeos utilizando métodos de DNA recombinante são bem conhecidas na técnica. Em uma modalidade preferencial, o polinucleotídeo codifica uma alanina em frente da sequência codificando uma fosfolipase C madura. Em uma outra modalidade, a fosfolipase C madura contém uma sequência de terminal N começando com os aminoácidos WSA e o polipeptídeo expressado do polinucleotídeo resultará em uma sequência de terminal N começando com aminoácido AWSA.

[0114] A sequência de controle pode ser um promotor, um polinucleotídeo que é reconhecido por uma célula hospedeira para expressão do polinucleotídeo codificando um polipeptídeo da presente invenção. O promotor contém sequências de controle transcricional que medeiam a expressão do polipeptídeo. O promotor pode ser qualquer polinucleotídeo que mostre atividade transcricional na célula hospedeira incluindo promotores mutantes, truncados, e híbridos, e pode ser obtido de genes codificando polipeptídeos extracelulares ou intracelulares homólogos ou heterólogos à célula hospedeira.

[0115] Exemplos de promotores adequados para direcionamento da transcrição das construções de ácido nucleico da presente invenção em uma célula hospedeira bacteriana são os promotores obtidos do gene da alfa-amilase (amyQ) de Bacillus amyloliquefaciens, gene da alfa-amilase (amyL) de Bacillus licheniformis, gene da penicilinase (penP) de Bacillus licheniformis, gene da amilase maltogênica (amyM) de Bacillus stearothermophilus, gene da levansucrase (sacB) de Bacillus subtilis, genes xylA e xylB de Bacillus subtilis, gene cryIIIA de Bacillus thuringiensis (Agaisse e Lereclus, 1994, Molecular Microbiology 13: 97-107), operon lac de E. coli, promotor trc de E. coli (Egon et al., 1988, Gene 69: 301-315), gene da agarase (dagA) de Streptomyces coelicolor, e gene da betalactamase procariótica (Villa-Kamaroff et al., 1978, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75: 3727-3731), bem como o promotor tac (DeBoer et al., 1983, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80: 21-25). Promotores adicionais são descritos em "Useful proteins from recombinant bacteria" em Gilbert et al., 1980, Scientific American 242: 74-94; e em Sambrook et al., 1989, supra. Exemplos de promotores tandem são divulgados em WO 99/43835.

[0116] A sequência de controle pode ser também um terminador da transcrição, que é reconhecido por uma célula hospedeira para terminar a transcrição. O terminador está operacionalmente ligado ao terminal 3' do polinucleotídeo que codifica o polipeptídeo. Qualquer terminador que seja funcional na célula hospedeira pode ser usado na presente invenção.

[0117] Terminadores preferenciais para células hospedeiras bacterianas são obtidos dos genes da protease alcalina (aprH) de Bacillus clausii, alfa-amilase (amyL) de Bacillus licheniformis, e RNA ribossômico (rrnB) de Escherichia coli.

[0118] A sequência de controle pode ser também uma região estabilizadora de mRNA a jusante de um promotor e a montante da sequência codificadora de um gene que aumenta a expressão do gene.

[0119] Exemplos de regiões estabilizadoras de mRNA adequadas são obtidos de um gene cryIIIA de Bacillus thuringiensis (WO 94/25612) e um gene SP82 de Bacillus subtilis (Hue et al., 1995, Journal of Bacteriology 177: 3465-3471).

[0120] A sequência de controle pode ser também um líder, uma região não traduzida de um mRNA que é importante para tradução pela célula hospedeira. O líder está operacionalmente ligado ao terminal 5' do polinucleotídeo que codifica o polipeptídeo. Pode ser usado qualquer líder que seja funcional na célula hospedeira.

[0121] A sequência de controle pode ser também uma sequência de poliadenilação; uma sequência operacionalmente ligada ao terminal 3' do polinucleotídeo e que, quando transcrita, é reconhecida pela célula hospedeira como um sinal para adicionar resíduos de poliadenosina ao RNAm transcrito. Pode ser usada qualquer sequência de poliadenilação que seja funcional na célula hospedeira.

[0122] A sequência de controle pode ser também uma região codificadora de peptídeo sinal que codifica um peptídeo sinal ligado ao terminal N de um polipeptídeo e que dirige o polipeptídeo para a via secretora da célula. A extremidade 5' da sequência codificadora do polinucleotídeo pode conter inerentemente uma sequência codificadora de peptídeo sinal naturalmente ligada em fase de leitura de tradução com o segmento da sequência codificadora que codifica o polipeptídeo. Alternativamente, a extremidade 5' da sequência codificadora pode conter uma sequência codificadora de um peptídeo sinal que é estranha à sequência codificadora. Uma sequência codificadora do peptídeo sinal estranha pode ser requerida onde a sequência codificadora não contém naturalmente uma sequência codificadora do peptídeo sinal. Alternativamente, uma sequência codificadora do peptídeo sinal estranha pode simplesmente substituir a sequência codificadora do peptídeo sinal natural de modo a intensificar a secreção do polipeptídeo. No entanto pode ser usada qualquer sequência codificadora do peptídeo sinal que dirija o polipeptídeo expresso para a via secretora de uma célula hospedeira.

[0123] Sequências codificadoras do peptídeo de sinal eficazes para células hospedeiras bacterianas são as sequências codificadoras do peptídeo de sinal obtidas dos genes da amilase maltogênica de Bacillus NCIB 11837, subtilisina de Bacillus licheniformis, beta-lactamase de Bacillus licheniformis, alfa-amilase de Bacillus stearothermophilus, proteases neutras (nprT, nprS, nprM) de Bacillus stearothermophilus, e prsA de Bacillus subtilis. Peptídeos sinal adicionais são descritos por Simonen e Palva, 1993, Microbiological Reviews 57: 109-137.

[0124] A sequência de controle pode ser também uma sequência codificadora de pró-peptídeos que codifica um pró-peptídeo posicionado no terminal N de um polipeptídeo. O polipeptídeo resultante é conhecido como uma pró-enzima ou pró-polipeptídeo (ou um zimogênio em alguns casos). Um pró-polipeptídeo está geralmente inativo e pode ser convertido em um polipeptídeo ativo por clivagem catalítica ou autocatalítica do pró-peptídeo a partir do pró-polipeptídeo. A sequência codificadora do pró-peptídeo pode ser obtida dos genes da protease alcalina (aprE) de Bacillus subtilis, protease neutra (nprT) de Bacillus subtilis, lacase de Myceliophthora thermophila (WO 95/33836), proteinase aspártica de Rhizomucor miehei, e fator alfa de Saccharomyces cerevisiae.

[0125] Onde estiverem presentes sequências do peptídeo sinal e pró- peptídeo, a região do pró-peptídeo está posicionada junto ao terminal N de um polipeptídeo e a sequência do peptídeo sinal está posicionada junto ao terminal N da sequência do pró-peptídeo.

[0126] Pode ser também desejável adicionar sequências reguladoras que regulem a expressão do polipeptídeo em relação ao crescimento da célula hospedeira. Exemplos de sequências reguladoras são aquelas que fazem com que a expressão do gene seja ligada ou desligada em resposta a um estímulo químico ou físico, incluindo a presença de um composto regulador. Sequências reguladoras em sistemas procarióticos incluem os sistemas operadores lac, tac, e trp. Outros exemplos de sequências reguladoras são aquelas que permitem amplificação do gene.

Vetores de Expressão

[0127] A presente invenção se relaciona também com vetores de expressão recombinantes compreendendo um polinucleotídeo da presente invenção, um promotor, e sinais de terminação transcricional e translacional. As várias sequências de nucleotídeos e de controle podem ser unidas para produzir um vetor de expressão recombinante que possa incluir um ou mais locais de restrição convenientes para permitir a inserção ou substituição do polinucleotídeo codificando o polipeptídeo em tais locais. Alternativamente, o polinucleotídeo pode ser expresso por inserção do polinucleotídeo ou uma construção de ácido nucleico compreendendo o polinucleotídeo em um vetor apropriado para expressão. Ao criar o vetor de expressão, a sequência codificadora está localizada no vetor de tal modo que a sequência codificadora esteja operacionalmente ligada às sequências de controle apropriadas para expressão.

[0128] O vetor de expressão recombinante pode ser qualquer vetor (por exemplo, um plasmídeo ou vírus) que possa ser convenientemente sujeito a procedimentos de DNA recombinante e possa provocar expressão do polinucleotídeo. A escolha do vetor dependerá tipicamente da compatibilidade do vetor com a célula hospedeira na qual o vetor é para ser introduzido. O vetor pode ser um plasmídeo linear ou circular fechado.

[0129] O vetor pode ser um vetor autonomamente replicante, i.e., um vetor que existe como uma entidade extracromossômica, cuja replicação é independente da replicação cromossômica, p.ex., um plasmídeo, um elemento extracromossômico, um minicromossomo, ou um cromossomo artificial. O vetor pode conter quaisquer meios para assegurar a autorreplicação. Alternativamente, o vetor pode ser um que, quando introduzido na célula hospedeira, seja integrado no genoma e replicado em conjunto com o(s) cromossomo(s) nos(s) qual(ais) foi integrado. Além disso, pode ser usado um único vetor ou plasmídeo ou dois ou mais vetores ou plasmídeos que contenham em conjunto o DNA total a ser introduzido no genoma da célula hospedeira, ou um transposon.

[0130] O vetor contém preferencialmente um ou mais marcadores selecionáveis que permitam seleção fácil de células transformadas, transfectadas, transduzidas, ou similares. Um marcador selecionável é um gene cujo produto proporciona resistência biocida ou viral, resistência a metais pesados, prototrofia a auxotrofos, e similares.

[0131] Exemplos de marcadores selecionáveis bacterianos são genes dal de Bacillus licheniformis ou Bacillus subtilis, ou marcadores que conferem resistência a antibióticos tal como resistência a ampicilina, cloranfenicol, canamicina, neomicina, espectinomicina, ou tetraciclina.

[0132] O marcador selecionável pode ser um sistema de marcador selecionável dual como descrito em WO 2010/039889. Em um aspeto, o marcador selecionável dual é um sistema de marcador selecionável dual hph-tk.

[0133] O vetor contém preferencialmente um elemento(s) que permita integração do vetor no genoma da célula hospedeira ou replicação autônoma do vetor na célula independente do genoma.

[0134] Para integração no genoma da célula hospedeira, o vetor pode se basear na sequência do polinucleotídeo codificando o polipeptídeo ou qualquer outro elemento do vetor para integração no genoma por recombinação homóloga ou não homóloga. Alternativamente, o vetor pode conter polinucleotídeos adicionais para direcionamento da integração por recombinação homóloga no genoma da célula hospedeira em um local(ais) específico(s) no(s) cromossomo(s). Para aumentar a probabilidade de integração em um local específico, os elementos de integração devem conter um número suficiente de ácidos nucleicos, tal como 100 a 10.000 pares de bases, 400 a 10.000 pares de bases, e 800 a 10.000 pares de bases, que têm um elevado grau de identidade de sequência com a sequência alvo correspondente para intensificar a probabilidade de recombinação homóloga. Os elementos de integração podem ser qualquer sequência que seja homóloga com a sequência alvo no genoma da célula hospedeira. Além disso, os elementos de integração podem ser polinucleotídeos não codificadores ou codificadores. Por outro lado, o vetor pode ser integrado no genoma da célula hospedeira por recombinação não homóloga.

[0135] Para replicação autônoma, o vetor pode compreender adicionalmente uma origem de replicação permitindo que o vetor se replique autonomamente na célula hospedeira em questão. A origem da replicação pode ser qualquer replicador de plasmídeo mediando a replicação autônoma que funcione em uma célula. O termo "origem da replicação" ou "replicador de plasmídeo" significa um polinucleotídeo que permite que um plasmídeo ou vetor se replique in vivo.

[0136] Exemplos de origens de replicação bacterianas são as origens de replicação dos plasmídeos pBR322, pUC19, pACYC177 e pACYC184 permitindo replicação em E. coli, e pUB110, pE194, pTA1060 e pAMβl permitindo replicação em Bacillus.

[0137] Pode ser inserida mais do que uma cópia de um polinucleotídeo da presente invenção em uma célula hospedeira para aumentar a produção de um polipeptídeo. Um aumento no número de cópias do polinucleotídeo pode ser obtido por integração de pelo menos uma cópia adicional da sequência no genoma da célula hospedeira ou por inclusão de um gene marcador selecionável amplificável com o polinucleotídeo onde células contendo cópias amplificadas do gene marcador selecionável, e desse modo cópias adicionais do polinucleotídeo podem ser selecionadas por cultivo das células na presença do agente selecionável apropriado.

[0138] Os procedimentos usados para ligar os elementos descritos acima para construir os vetores de expressão recombinantes da presente invenção são bem conhecidos de um perito na arte (ver, p.ex., Sambrook et al., 1989, supra).

Células Hospedeiras

[0139] A presente invenção se relaciona também com células hospedeiras recombinantes, compreendendo um polinucleotídeo da presente invenção operacionalmente ligado a uma ou mais sequências de controle que dirigem a produção de um polipeptídeo da presente invenção. De preferência, o polinucleotídeo é heterólogo, significando que não existe naturalmente na célula hospedeira. Uma construção ou vetor compreendendo um polinucleotídeo é introduzido em uma célula hospedeira tal que a construção ou vetor seja mantido como um integrante cromossômico ou como um vetor extracromossômico autorreplicante como descrito anteriormente. O termo "célula hospedeira" engloba qualquer descendência de uma célula genitora que não é idêntica à célula genitora devido a mutações que ocorrem durante a replicação. A escolha de uma célula hospedeira dependerá em grande medida do gene codificando o polipeptídeo e da sua fonte.

[0140] A célula hospedeira pode ser qualquer célula útil na produção recombinante de um polipeptídeo da presente invenção, p.ex., um procariota ou um eucariota. Em uma modalidade preferencial, a célula hospedeira é uma célula hospedeira recombinante que não existe na natureza.

[0141] A célula hospedeira procariótica pode ser qualquer bactéria Gram-positiva ou Gram-negativa. Bactérias Gram-positivas incluem, mas não estão limitadas a, Bacillus, Clostridium, Enterococcus, Geobacillus, Lactobacillus, Lactococcus, Oceanobacillus, Staphylococcus, Streptococcus, e Streptomyces. Bactérias Gram-negativas incluem, mas não estão limitadas a, Campylobacter, E. coli, Flavobacterium, Fusobacterium, Helicobacter, Ilyobacter, Neisseria, Pseudomonas, Salmonella, e Ureaplasma.

[0142] A célula hospedeira bacteriana pode ser qualquer célula de Bacillus incluindo, mas não se limitando a, células de Bacillus alkalophilus, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus brevis, Bacillus circulans, Bacillus clausii, Bacillus coagulans, Bacillus firmus, Bacillus lautus, Bacillus lentus, Bacillus licheniformis, Bacillus megaterium, Bacillus pumilus, Bacillus stearothermophilus, Bacillus subtilis, e Bacillus thuringiensis.

[0143] A célula hospedeira bacteriana também pode ser qualquer célula de Streptococcus, incluindo, mas não se limitando a, células de Streptococcus equisimilis, Streptococcus pyogenes, Streptococcus uberis e Streptococcus equi subsp. Zooepidemicus.

[0144] A célula hospedeira bacteriana pode ser também qualquer célula de Streptomyces incluindo, mas não limitada a, células de Streptomyces achromogenes, Streptomyces avermitilis, Streptomyces coelicolor, Streptomyces griseus, e Streptomyces lividans.

[0145] A introdução de DNA em uma célula de Bacillus pode ser efetuada por transformação de protoplastos (ver, p.ex., Chang e Cohen, 1979, Mol. Gen. Genet. 168: 111-115), transformação de células competentes (ver, p.ex., Young e Spizizen, 1961, J. Bacteriol. 81: 823-829, ou Dubnau e Davidoff-Abelson, 1971, J. Mol. Biol. 56: 209-221), eletroporação (ver, p.ex., Shigekawa e Dower, 1988, Biotechniques 6: 742-751), ou conjugação (ver, p.ex., Koehler e Thorne, 1987, J. Bacteriol. 169: 5271-5278). A introdução de DNA em uma célula de E. coli pode ser feita por transformação com protoplastos (ver, p.ex., Hanahan, 1983, J. Mol. Biol. 166: 557-580) ou eletroporação (ver, p.ex., Dower et al., 1988, Nucleic Acids Res. 16: 6127-6145). A introdução de DNA em uma célula de Streptomyces pode ser efetuada por transformação com protoplastos, eletroporação (ver, p.ex., Gong et al., 2004, Folia Microbiol. (Praha) 49: 399-405), conjugação (ver, p.ex., Mazodier et al., 1989, J. Bacteriol. 171: 3583-3585), ou transdução (ver, p.ex., Burke et al., 2001, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98: 6289-6294). A introdução de DNA em uma célula de Pseudomonas pode ser efetuada por eletroporação (ver, p.ex., Choi et al., 2006, J. Microbiol. Methods 64: 391-397), ou conjugação (ver, p.ex., Pinedo e Smets, 2005, Appl. Environ. Microbiol. 71: 51-57). A introdução de DNA em uma célula de Streptococcus pode ser efetuada por competência natural (ver, p.ex., Perry e Kuramitsu, 1981, Infect. Immun. 32: 1295-1297), transformação de protoplastos (ver, p.ex., Catt e Jollick, 1991, Microbios 68: 189-207), eletroporação (ver, p.ex., Buckley et al., 1999, Appl. Environ. Microbiol. 65: 3800-3804), ou conjugação (ver, p.ex., Clewell, 1981, Microbiol. Rev. 45: 409-436). No entanto, pode ser usado qualquer método conhecido na técnica para introdução de DNA em uma célula hospedeira.

Métodos de Produção

[0146] Com base na sequência de nucleotídeos identificada como SEQ ID NO: 1, na SEQ ID NO: 4, na SEQ ID NO: 7, na SEQ ID NO: 10, na SEQ ID NO: 13, na SEQ ID NO: 16, na SEQ ID NO: 18, na SEQ ID NO: 21, na SEQ ID NO: 23, na SEQ ID NO: 26, na SEQ ID NO: 28 ou SEQ ID NO: 31, um gene sintético pode ser obtido de um número de vendedores tais como Gene Art (GENEART AG BioPark, Josef-Engert-Str. 11, 93053, Regensburg, Alemanha) ou DNA 2.0 (DNA2.0, 1430 O'Brien Drive, Suite E, Menlo Park, CA 94025, EUA). O gene sintético pode ser concebido para incorporar sequências de DNA adicionais tais como locais de restrição ou regiões de recombinação homóloga para facilitar a clonagem em um vetor de expressão como acima descrito e expressado em uma célula hospedeira como acima descrito, por exemplo em Bacillus subtilis.

[0147] Um aspeto da presente invenção se relaciona com um método de produzir um polipeptídeo de fosfolipase C em um hospedeiro bacteriano, em particular um hospedeiro Bacillus, mais especificamente um hospedeiro Bacillus subtilis ou Bacillus licheniformis, em que a sequência de codificação de fosfolipase C codifica uma alanina em frente do aminoácido de terminal N previsto do polipeptídeo de fosfolipase C. De preferência, a fosfolipase C é um polipeptídeo de fosfolipase C específica para PC e PE. Isto resultará em um polipeptídeo de fosfolipase C maduro com uma alanina de terminal N como exemplificado em SEQ ID NO: 20 e SEQ ID NO: 30. De preferência, a sequência madura de tipo selvagem da fosfolipase C tem sequências de terminal N começando com WSA. Sem estarem presos à teoria, os inventores acreditam que esta alanina extra protege a sequência de terminal N da sequência de fosfolipase C madura, por exemplo aminoácidos WSA, de atividade de protease na célula hospedeira.

[0148] A presente invenção se relaciona também com métodos de produção de um polipeptídeo de fosfatidilinositol fosfolipase C da presente invenção, compreendendo (a) cultivo de uma célula que, na sua forma de tipo selvagem, produz o polipeptídeo, sob condições conducentes à produção do polipeptídeo; e, opcionalmente, (b) recuperação do polipeptídeo. Em um aspeto, a célula é uma célula de Pseudomonas.

[0149] A presente invenção se relaciona também com métodos de produção de um polipeptídeo de fosfolipase C específica para PC e PE da presente invenção, compreendendo (a) cultivo de uma célula que, na sua forma de tipo selvagem, produz o polipeptídeo, sob condições conducentes à produção do polipeptídeo; e, opcionalmente, (b) recuperação do polipeptídeo. Em um aspeto, a célula é uma célula de Bacillus.

[0150] A presente invenção se relaciona também com métodos de produção de um polipeptídeo da presente invenção, compreendendo (a) cultivo de uma célula hospedeira recombinante da presente invenção sob condições conducentes à produção do polipeptídeo; e, opcionalmente, (b) recuperação do polipeptídeo.

[0151] As células hospedeiras são cultivadas em um meio nutriente adequado para produção do polipeptídeo usando métodos conhecidos na técnica. Por exemplo, as células podem ser cultivadas por cultivo em frasco agitado, ou fermentação em pequena escala ou grande escala (incluindo fermentações contínuas, descontínuas, descontínuas alimentadas, ou em estado sólido) em fermentadores laboratoriais ou industriais, em um meio adequado e sob condições permitindo que o polipeptídeo seja expresso e/ou isolado. O cultivo é realizado com um meio nutriente adequado compreendendo fontes de carbono e nitrogênio e sais inorgânicos, usando procedimentos conhecidos na técnica. Meios adequados são disponibilizados por fornecedores comerciais ou podem ser preparados de acordo com composições publicadas (por exemplo, em catálogos da American Type Culture Collection). Se o polipeptídeo for secretado para o meio nutriente, o polipeptídeo pode ser recuperado diretamente do meio. Se o polipeptídeo não for secretado pode ser recuperado de lisados de células.

[0152] O polipeptídeo com atividade de fosfolipase C pode ser detectado usando métodos conhecidos na técnica, ver a seção em baixo “Ensaio de atividade de fosfolipase”. Estes métodos de detecção incluem, mas não se limitam a, utilização de anticorpos específicos, formação de um produto de enzimas, ou desaparecimento de um substrato de enzimas, por exemplo ensaio RMN de P descrito no exemplo 5, ou cromatografia líquida acoplada a espetrômetro de massa de quadrupolo triplo (LC/MS/MS) como descrito no Exemplo 7 ou ensaios de placas de lecitina.

[0153] O polipeptídeo pode ser recuperado usando métodos conhecidos na técnica. Por exemplo, o polipeptídeo pode ser recuperado do meio nutriente por procedimentos convencionais incluindo, mas não se limitando a, coleta, centrifugação, filtração, extração, secagem por pulverização, evaporação, ou precipitação. Em um aspeto é recuperado um caldo de fermentação compreendendo o polipeptídeo.

[0154] O polipeptídeo pode ser purificado por uma variedade de procedimentos conhecidos na técnica, incluindo, mas não se limitando a, cromatografia (p.ex., permuta iônica, afinidade, hidrofóbica, cromatofocagem, e exclusão por tamanho), procedimentos eletroforéticos (p.ex., focagem isoelétrica preparativa), solubilidade diferencial (p.ex., precipitação com sulfato de amônio), SDS-PAGE, ou extração (ver, p.ex., Protein Purification, Janson e Ryden, editores, VCH Publishers, Nova Iorque, 1989) para obter polipeptídeos substancialmente puros.

[0155] Em um aspeto alternativo, o polipeptídeo não é recuperado, mas ao invés uma célula hospedeira da presente invenção expressando o polipeptídeo é usada como uma fonte do polipeptídeo.

Ensaios de atividade de fosfolipase

[0156] A invenção providencia polipeptídeos isolados, sintéticos ou recombinantes (por exemplo, enzimas, anticorpos) tendo uma atividade de fosfolipase, ou qualquer combinação de atividades de fosfolipase, e ácidos nucléicos que os codificam. Pode ser usado qualquer um dos ensaios de atividade de fosfolipase conhecido na técnica para determinar se um polipeptídeo tem uma atividade de fosfolipase e está dentro do escopo da invenção. Protocolos de rotina para determinar fosfolipase A, B e C, são bem conhecidos na técnica.

[0157] Ensaios de atividade exemplificativos incluem ensaios de turbidez, ensaios de metilumbeliferil fosfocolina (fluorescente), ensaios de fosfolipase com Amplex Red (fluorescente), ensaios de cromatografia de camada delgada (TLC), ensaios citolíticos e ensaios de p- nitrofenilfosforilcolina. Usando estes ensaios, polipeptídeos, peptídeos ou anticorpos podem ser rapidamente rastreados quanto a atividade de fosfolipase.

[0158] Podem ser usados ensaios de placas com um substrato contendo ágar para determinar o ensaio de placa de atividade de fosfolipase. O ensaio pode ser conduzido da seguinte forma: Placas são preparadas misturando 5 ml de Agarose a 2% (Litex HSA 1000) preparado por mistura e cozimento em tampões (100 mM de HEPES e 100 mM de citrato com pH ajustado de pH 3,0 para pH 7,0) por 5 minutos seguido de arrefecimento para até aproximadamente 60°C e 5 ml de substrato (L-alfa fosfatidilcolina, 95% de soja (Avanti 441601) ou L-α-fosfatidilinositol de soja (Avanti 840044P) para especificidade PI ou L-α-fosfatidiletanolamina de soja (Avanti 840024P) dispersa em água (MilliQ) a 60°C durante 1 minuto com Ultra Turrax para especificidade PC) suavemente misturada em placas de Petri com o diâmetro de 7 cm e arrefecida até à temperatura ambiente antes de serem feitos furos por vácuo com um diâmetro de aproximadamente 3 mm. Dez microlitros de enzima purificada diluída para 0,4 mg/ml são adicionados em cada poço antes das placas serem seladas com parafilm e colocadas em um incubador a 55°C durante 48 horas. As placas foram retiradas para fotografia a intervalos regulares.

[0159] Ensaios de turbidez para determinar a atividade de fosfolipase são descritos em, por exemplo, Kauffmann (2001) "Conversion of Bacillus thermocatenulatus lipase into an efficient phospholipase with increased activity towards long-chain fatty acyl substrates by directed evolution and rational design," Protein Engineering 14:919-928; Ibrahim (1995) "Evidence implicating phospholipase as a virulence factor of Candida albicans," Infect. Immun. 63, 1993-1998.

[0160] Ensaios de metilumbeliferila (fluorescente) fosfocolina para determinar a atividade de fosfolipase são descritos em, por exemplo, Goode (1997) "Evidence for cell surface internal phospholipase activity in ascidian eggs," Develop. Growth Differ. 39:655-660; Diaz (1999) "Direct fluorescence-based lipase activity assay," BioTechniques 27:696-700.

[0161] Ensaios de fosfolipase com Amplex Red (fluorescente) para determinar a atividade de fosfolipase encontram-se disponíveis como kits, por exemplo, a detecção de fosfolipase específica para fosfatidilcolina usando um kit de ensaio de fosfolipase específica para fosfatidilcolina com Amplex Red da Molecular Probes Inc. (Eugene, OR), de acordo com as instruções do fabricante.

[0162] A fluorescência é medida em um leitor de microplacas de fluorescência usando excitação a 560 ± 10nm e detecção de fluorescência a 590 ± 10 nm. O ensaio é sensível a concentrações muito baixas de enzimas.

[0163] Ensaios de cromatografia de camada delgada (TLC) para determinar a atividade de fosfolipase são descritos, por exemplo em Reynolds (1991) Methods in Enzymol. 197:3-13; Taguchi (1975) "Phospholipase from Clostridium novyi type A.I," Biochim. Biophys. Acta 409:75-85. A cromatografia de camada delgada (TLC) é uma técnica amplamente usada para a detecção de atividade de fosfolipase. Foram usadas várias modificações deste método para extrair os fosfolipídeos das misturas de ensaios aquosas. Em alguns ensaios de PLC a hidrólise é interrompida por adição de clorofórmio/metanol (2: 1) à mistura reacional. O material inicial não reagido e o diacilglicerol são extraídos para a fase orgânica e podem ser fracionados por TLC, enquanto o produto do grupo principal permanece na fase aquosa. Para medição mais precisa da digestão de fosfolipídeos, podem ser usados substrato marcados com rádio (ver, por exemplo, Reynolds (1991) Methods in Enzymol. 197:3-13). Os rácios de produtos e reagentes podem ser usados para calcular o número real de moles de substrato hidrolisado por unidade de tempo. Se todos os componentes forem extraídos igualmente, quaisquer perdas na extração afetarão todos os componentes de forma igual. Pode ser alcançada a separação de produtos de digestão de fosfolipídeos por meio de TLC com sílica gel com clorofórmio/metanol/água (65:25:4) usado como sistema solvente (ver, por exemplo, Taguchi (1975) Biochim. Biophys. Acta 409:7585).

[0164] Ensaios de p-Nitrofenilfosforilcolina para determinar a atividade de fosfolipase são descritos em, por exemplo, Korbsrisate (1999) J. Clin. Microbiol. 37:3742-3745; Berka (1981) Infect. Immun. 34, 1071-1074. Este ensaio é baseado em hidrólise enzimática p-nitrofenilfosforilcolina análoga do substrato para liberar um composto cromogênico amarelo de p- nitrofenol, detectável a 405 nm. Este substrato é conveniente para elevado rastreio de elevada capacidade. Ensaios semelhantes usando substratos em relação aos outros grupos fosfolipídeos podem também ser aplicados por exemplo usando p-nitrofenilfosforilinositol ou p- nitrofenilfosforiletanolamina.

[0165] Um ensaio citolítico pode detectar fosfolipases com atividade citolítica com base na lise de eritrócitos. Fosfolipases tóxicas podem interagir com membranas de células eucarióticas e hidrolisam fosfatidilcolina e esfingomielina, conduzindo a lise celular. Ver, por exemplo, Titball (1993) Microbiol. Rev. 57:347-366.

[0166] Outros ensaios como RMN de 31P e cromatografia líquida acoplada a espetrômetro de massa de quadrupolo triplo (LC/MS/MS) são descritos na seção de exemplos desta aplicação.

Composições

[0167] A presente invenção também se relaciona com composições compreendendo um polipeptídeo de PLC específica para PI da presente invenção, de preferência com um componente adicional. Os polipeptídeos de PLC específica para PI da presente invenção incluem a) um polipeptídeo compreendendo uma sequência de aminoácidos selecionada de entre o grupo consistindo de: i) resíduos de aminoácidos 26-322 da SEQ ID NO: 2 ou resíduos de aminoácidos 1-298 da SEQ ID NO: 3; ii) resíduos de aminoácidos 26-323 da SEQ ID NO: 5 ou resíduos de aminoácidos 1-299 da SEQ ID NO: 6; iii) resíduos de aminoácidos 26-323 da SEQ ID NO: 8 ou resíduos de aminoácidos 1-299 da SEQ ID NO: 9; iv) resíduos de aminoácidos 26-323 da SEQ ID NO: 11 ou resíduos de aminoácidos 1-296 da SEQ ID NO: 12; v) resíduos de aminoácidos 26-322 da SEQ ID NO: 14 ou resíduos de aminoácidos 1-298 da SEQ ID NO: 15; vi) resíduos de aminoácidos 26-322 da SEQ ID NO: 17; e vii) resíduos de aminoácidos 28339 da SEQ ID NO: 35; ou b) um polipeptídeo compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 75% de identidade com uma ou mais das sequências de aminoácidos em a); ou c) um fragmento funcional de a) ou b).

[0168] A presente invenção também se relaciona com composições compreendendo um polipeptídeo de PLC específica para PC, PE da presente invenção, de preferência com um componente adicional.

[0169] A presente invenção também se relaciona com composições compreendendo uma mistura de uma PLC específica para PI da presente invenção com uma ou mais outras atividades de fosfolipase selecionadas de PLA1, PLA2, PLC e PLD.

[0170] A presente invenção também se relaciona com uma composição compreendendo uma mistura de uma fosfatidilinositol fosfolipase C do gênero de Pseudomonas e um polipeptídeo de fosfolipase C específica para PC e PE. Uma composição preferencial da invenção compreende um polipeptídeo de PLC específica para PI da presente invenção combinado com um polipeptídeo de PLC específica para PC, PE. De preferência, a PLC específica para PC e PE é selecionada de Purifine ou de um polipeptídeo maduro da SEQ ID NO: 19, 20, 22, 24, 25, 27, 29, 30 32 ou 38. A PLC específica para PC e PE pode também ser selecionada de uma sequência que é pelo menos 80%, 85%, 90%, 95% ou 98% idêntica a um polipeptídeo maduro da SEQ ID NO: 19, 20, 22, 24, 25, 27, 29, 30 32 ou 38 que tem especificidade PC e PE. Em modalidades alternativas da invenção, a composição compreende um polipeptídeo de PLC específica para PI da presente invenção combinado com uma PLC com especificidade em relação a PA ou PC ou PE, ou PE e PA; ou PC e PA; ou PC e PE e PA; ou uma qualquer sua combinação.

[0171] As fosfolipases da presente invenção podem ser formuladas com componentes selecionados do grupo consistindo de agentes tamponantes, sais inorgânicos, solventes, sólidos inertes e suas misturas. Sistemas de tampão apropriados, por exemplo, são feitos de soluções aquosas de sais ou ácidos orgânicos, aminoácidos, fosfato, aminas ou amônia em concentrações entre 0,01 M e 1 M com pH 2 a 10. De preferência, são usados sais de metais alcalinos de ácido cítrico, ácido acético, glicina e/ou cloridratos de tris(hidroximetil)amina e amônia a 0,1 M a 0,2 M com pH 4 a 8. De preferência, a fosfolipase é dissolvida em uma solução aquosa de tampão tal como tampão de glicina, tampão de ácido cítrico, etc. Tampões contendo citratos revelaram ser muito adequados, em particular tampões de citrato de sódio, de preferência com pH neutro.

[0172] As composições da invenção podem compreender fosfolipases da invenção imobilizadas em um suporte sólido. Suportes sólidos úteis em esta invenção incluem géis. Alguns exemplos de géis incluem Sepharose, gelatina, glutaraldeído, glutaraldeído tratado com quitosana, albumina- glutaraldeído, quitosana-xantana, gel toyopearl (gel polímero), alginato, alginato-polilisina, carragenano, agarose, glioxila agarose, agarose magnética, dextrano-agarose, hidrogel de poli(sulfonato de carbamoíla) , hidrogel de BSA-PEG, álcool polivinílico fosforilado (PVA), monoaminoetil- N-aminoetila (MANA), amino, ou qualquer combinação dos mesmos. Outro suporte sólido útil na presente invenção são resinas ou polímeros. Alguns exemplos de resinas ou polímeros incluem celulose, acrilamida, náilon, raiom, poliéster, resina de troca aniônica, AMBERLITE™ XAD-7, AMBERLITE™ XAD-8, AMBERLITE™ IRA-94, AMBERLITE™ IRC-50, polivinila, poliacrílico, polimetacrilato, ou qualquer sua combinação. Outro tipo de suporte sólido útil na presente invenção é a cerâmica. Alguns exemplos incluem cerâmica não porosa, cerâmica porosa, Si02, Ah03. Outro tipo de suporte sólido útil na presente invenção é o vidro. Alguns exemplos incluem vidro não poroso, vidro poroso, vidro de aminopropilo ou qualquer combinação dos mesmos. Outro tipo de suporte sólido que pode ser usado é um microelétrodo. Um exemplo é uma magnetita revestida com polietilenoimina. Podem ser usadas partículas grafíticas como suporte sólido. Outros suportes sólidos exemplificativos usados para colocar em prática a invenção compreendem produtos de terras diatomáceas e silicatos. Alguns exemplos incluem silicatos de cálcio sintético e de magnésio CELITE® KENITE®, DIACTIV®, PRIMISIL ®' DIAFIL ® diatomites e MICRO-CEL ®' CALFLO®, SILASORB ™, e CELKA TE® .

[0173] Alguns exemplos de métodos para imobilizar enzimas incluem, por exemplo, geração de gotícula eletrostática, meios eletroquímicos, via adsorção, via ligação covalente, via reticulação, via reação ou processo químico, via encapsulação, via aprisionamento, via alginato de cálcio ou via poli (2-hidroxietila metacrilato). Métodos semelhantes são descritos em Methods in Enzymology, Immobilized Enzymes and Cells, Part C. 1987. Academic Press. Editado por S. P. Colowick e N. 0. Kaplan. Volume 136; e Immobilization of Enzymes and Cells. 1997. Humana Press. Editado por G. F. Bickerstaff. Série: Methods in Biotechnology, editado por J. M. Walker.

[0174] Em uma outra modalidade preferencial, a composição pode compreender múltiplas atividades enzimáticas, tais como uma ou mais (p.ex., várias) enzimas selecionadas do grupo consistindo em hidrolase, isomerase, ligase, liase, oxidorreductase, ou transferase, p.ex., uma alfa- galactosidase, alfa-glucosidase, aminopeptidase, amilase, betagalactosidase, beta-glucosidase, beta-xilosidase, carboidrase, carboxipeptidase, catalase, celobioidrolase, celulase, quitinase, cutinase, ciclodextrina glicosiltransferase, desoxirribonuclease, endoglucanase, esterase, glucoamilase, invertase, lacase, lipase, manosidase, mutanase, oxidase, enzima pectinolítica, peroxidase, fitase, polifenoloxidase, enzima proteolítica, ribonuclease, transglutaminase, ou xilanase.

[0175] As composições podem ser preparadas de acordo com métodos conhecidos na técnica e podem estar na forma de uma composição líquida ou seca. As composições podem ser estabilizadas de acordo com métodos conhecidos na técnica.

[0176] São dados em baixo exemplos de usos preferenciais das composições da presente invenção. A dosagem da composição e outras condições sob as quais a composição é usada podem ser determinadas com base em métodos conhecidos na técnica.

Usos

[0177] As fosfolipases ou composições da invenção pode ser aplicadas em um processo para remover fosfolipídeos de um óleo, por exemplo um óleo vegetal, óleo animal ou gordura, sebo ou banha.

[0178] Aplicações nas quais a fosfolipase da invenção pode ser usada compreendem i) degomagem de óleo, por exemplo óleo vegetal, ou um óleo vegetal comestível, ou em um processo compreendendo hidrólise de fosfolipídeos na fração de goma de degomagem com água para liberar óleo triglicerídico aprisionado, ii) em um processo compreendendo hidrólise de fosfolipídeos para obter melhores emulsificantes de fosfolipídeos, em particular em que o referido fosfolipídeo é lecitina, iii) em um processo para melhorar a filtrabilidade de uma solução aquosa ou pasta de origem em carboidratos que contém fosfolipídeo, iv) em um processo para a extração de óleo, v) em um processo para a produção de um produto de ração animal, vi) em um processo para a produção de um biocombustível, por exemplo um biodiesel, vii) em um processo para a produção de um produto detergente, e/ou viii) em um processo para fazer um produto cozido, compreendendo adição da fosfolipase a uma massa, e cozimento da massa para fabricar o produto cozido.

[0179] As fosfolipases da invenção podem ser aplicadas em um processo compreendendo tratamento de um fosfolipídeo ou lisofosfolipídeo com as fosfolipases ou composições da invenção. As fosfolipases ou composições reagem com os fosfolipídeos ou lisofosfolipídeos para formar monoglicerídeo ou diglicerídeo e um éster de fosfato ou ácido fosfórico.

[0180] Degomagem: As fosfolipases da invenção e suas combinações podem ser usadas para degomagem de óleo, por exemplo óleo animal ou gordura, sebo, banha ou um óleo vegetal, ou seja, em um processo para reduzir o teor de fosfolipídeos no óleo. O processo de degomagem é aplicável à purificação de qualquer óleo comestível que contenha fosfolipídeo, p.ex., óleo vegetal tal como óleo de soja, óleo de colza ou óleo de girassol ou qualquer outro óleo mencionado sob a definição de óleos em bruto.

[0181] PLC específica para PI converte fosfatidilinositol (PI) em diglicerídeo e fosfoinositol. PLC específica para PC converte fosfatidilcolina (PC) em diglicerídeo e fosfocolina. PLC específica para PE converte fosfatidiletanolamina (PC) em diglicerídeo e fosfoetanolamina. O diglicerídeo permanece na fase oleosa (melhorando o rendimento de óleo) e as frações contendo fósforo separam-se para a fase aquosa onde são removidas como um componente da fase pesada durante centrifugação. A fase de goma (fase pesada) pode ser tratada posteriormente com uma fosfolipase ou composição da presente invenção para aumentar a hidrólise de fosfolipídeos na fração de goma de degomagem com água para liberar óleo triglicerídico aprisionado. Isto é particularmente útil quando o processo de degomagem ainda não aplicou fosfolipases. Fosfolipases da invenção, por exemplo uma PLC específica para PI e/ou PLC específica para PC, PE da invenção, podem ser incorporadas em degomagem com água ou em um processo de refinação de óleo químico ou físico. Em uma modalidade preferencial, as fosfolipases da invenção são incorporadas em um processo de degomagem com água com preferencialmente menos de 10%, 9%, 8%, 7%, 6% ou 5% de água, ainda mais preferencialmente menos de 4%,3% ou 2% de água, preferencialmente a 50 °C ou mais, ainda mais preferencialmente a 60 °C ou mais.

[0182] Em outra modalidade preferencial, as fosfolipases da invenção são incorporadas em um processo de refinação física aplicando ácido cítrico ou ácido fosfórico e hidróxido de sódio para facilitar a hidratabilidade de fosfolipídeos insolúveis e assegurar um ambiente adequado para a enzima com de preferência menos de 0,15% de ácido cítrico ou ácido fosfórico, ainda mais preferencialmente menos de 0,1%, 0,09%, 0,08%, 0,07%, 0,06% ou 0,05% ; e menos de 4%, 3% ou 2% de água, preferencialmente a 50 °C ou mais, ainda mais preferencialmente a 60 °C ou mais.

[0183] Em outras formas de realização, o processo de degomagem é um processo de refinação cáustica ou processo de degomagem ácida.

[0184] Um aspeto da presente invenção é um método para reduzir o teor de fosfolipídeos em uma composição de óleo, o método compreendendo a) providenciar uma composição de óleo contendo uma quantidade de fosfolipídeos, b) contactar a referida composição de óleo com uma fosfatidilinositol fosfolipase C (PLC específica para PI), e uma fosfolipase C específica para PC e PE sob condições suficientes para as enzimas reagirem com os fosfolipídeos para criar diglicerídeo e éster de fosfato, e c) separar o éster de fosfato da composição de óleo. Em uma modalidade preferencial, a fosfatidilinositol fosfolipase C é do gênero Pseudomonas. Em outras modalidades preferenciais, o óleo é submetido a tratamento com ácido/base antes de ser contactado com a ou as fosfolipases.

[0185] Em uma modalidade preferencial, a fosfatidilinositol fosfolipase C é a) um polipeptídeo compreendendo uma sequência de aminoácidos selecionada de entre o grupo consistindo de: i) resíduos de aminoácidos 26-322 da SEQ ID NO: 2 ou resíduos de aminoácidos 1-298 da SEQ ID NO: 3; ii) resíduos de aminoácidos 26-323 da SEQ ID NO: 5 ou resíduos de aminoácidos 1-299 da SEQ ID NO: 6; iii) resíduos de aminoácidos 26-323 da SEQ ID NO: 8 ou resíduos de aminoácidos 1-299 da SEQ ID NO: 9; iv) resíduos de aminoácidos 26-323 da SEQ ID NO: 11 ou resíduos de aminoácidos 1-296 da SEQ ID NO: 12; v) resíduos de aminoácidos 26-322 da SEQ ID NO: 14 ou resíduos de aminoácidos 1-298 da SEQ ID NO: 15; vi) resíduos de aminoácidos 26-322 da SEQ ID NO: 17; e vii) resíduos de aminoácidos 28-339 da SEQ ID NO: 35; ou b) um polipeptídeo compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 75% de identidade com uma ou mais das sequências de aminoácidos em a); ou c) um fragmento funcional de a) ou b).

[0186] Em algumas modalidades, a referida fosfatidilinositol fosfolipase C é um polipeptídeo tendo um comprimento de 280-320 resíduos de aminoácidos, tal como um comprimento de 280-310 resíduos de aminoácidos, 280-305 resíduos de aminoácidos, 280-300 resíduos de aminoácidos, 280-298 resíduos de aminoácidos 280-297 resíduos de aminoácidos, 280-296 resíduos de aminoácidos, 285-320 resíduos de aminoácidos, 285-315 resíduos de aminoácidos, 285-310 resíduos de aminoácidos, 285-305 resíduos de aminoácidos, 285-300 resíduos de aminoácidos, 285-298 resíduos de aminoácidos, 285-297 resíduos de aminoácidos, 285-296 resíduos de aminoácidos, 290-320 resíduos de aminoácidos, 290-315 resíduos de aminoácidos, 290-310 resíduos de aminoácidos, 290-305 resíduos de aminoácidos, 290-300 resíduos de aminoácidos, 290-298 resíduos de aminoácidos, 290-297 resíduos de aminoácidos, 290-296 resíduos de aminoácidos, 295-320 resíduos de aminoácidos, 295-315 resíduos de aminoácidos, 295-310 resíduos de aminoácidos, 295-305 resíduos de aminoácidos, 295-300 resíduos de aminoácidos, 295-298 resíduos de aminoácidos, 255-297 resíduos de aminoácidos, ou um comprimento de 295-296 resíduos de aminoácidos.

[0187] De acordo com outras modalidades, a referida fosfolipase C específica para PC e PE é um polipeptídeo tendo um comprimento de 220- 280 resíduos de aminoácidos, tal como um comprimento de 220-270 resíduos de aminoácidos, 220-260 resíduos de aminoácidos, 220-250 resíduos de aminoácidos, 220-248 resíduos de aminoácidos 220-246 resíduos de aminoácidos, 220-244 resíduos de aminoácidos, 225-280 resíduos de aminoácidos, 225-270 resíduos de aminoácidos, 225-260 resíduos de aminoácidos, 225-250 resíduos de aminoácidos, 225-248 resíduos de aminoácidos 225-246 resíduos de aminoácidos, 225-244 resíduos de aminoácidos, 230-280 resíduos de aminoácidos, 230-270 resíduos de aminoácidos, 230-260 resíduos de aminoácidos, 230-250 resíduos de aminoácidos, 230-248 resíduos de aminoácidos, 230-246 resíduos de aminoácidos, 230-244 resíduos de aminoácidos, 235-280 resíduos de aminoácidos, 235-270 resíduos de aminoácidos, 235-260 resíduos de aminoácidos, 235-250 resíduos de aminoácidos, 235-248 resíduos de aminoácidos 235-246 resíduos de aminoácidos, 235-244 resíduos de aminoácidos, 240-280 resíduos de aminoácidos, 240-270 resíduos de aminoácidos, 240-260 resíduos de aminoácidos, 240-250 resíduos de aminoácidos, 240-248 resíduos de aminoácidos 240-246 resíduos de aminoácidos, 240-244 resíduos de aminoácidos, 242-280 resíduos de aminoácidos, 242-270 resíduos de aminoácidos, 242-260 resíduos de aminoácidos, 242-250 resíduos de aminoácidos, 242-248 resíduos de aminoácidos 242-246 resíduos de aminoácidos, 242-244 resíduos de aminoácidos, 243-280 resíduos de aminoácidos, 243-270 resíduos de aminoácidos, 243-260 resíduos de aminoácidos, 243-250 resíduos de aminoácidos, 243-248 resíduos de aminoácidos 243-246 resíduos de aminoácidos, 243-244 resíduos de aminoácidos,

[0188] Em ainda outras modalidades, o óleo é contactado: com 0,5-200 mg de proteína enzimática (EP)/Kg de óleo da referida fosfatidilinositol fosfolipase C e com 0,5-200 mg de proteína enzimática (EP)/Kg de óleo da referida fosfolipase C específica para PC e PE; tal como com 0,5-100 mg de proteína enzimática (EP)/Kg de óleo da referida fosfatidilinositol fosfolipase C e com 0,5-100 mg de proteína enzimática (EP)/Kg de óleo da referida fosfolipase C específica para PC e PE; com 0,5-25 mg de proteína enzimática (EP)/Kg de óleo da referida fosfatidilinositol fosfolipase C e com 0,5-25 mg de proteína enzimática (EP)/Kg de óleo da referida fosfolipase C específica para PC e PE; com 0,5-15 mg de proteína enzimática (EP)/Kg de óleo da referida fosfatidilinositol fosfolipase C e com 0,5-15 mg de proteína enzimática (EP)/Kg de óleo da referida fosfolipase C específica para PC e PE, com 0,5-10 mg de proteína enzimática (EP)/Kg de óleo da referida fosfatidilinositol fosfolipase C e com 0,5-10 mg de proteína enzimática (EP)/Kg de óleo da referida fosfolipase C específica para PC e PE, com 0,5-5 mg de proteína enzimática (EP)/Kg de óleo da referida fosfatidilinositol fosfolipase C e com 0,5-5mg de proteína enzimática (EP)/Kg de óleo da referida fosfolipase C específica para PC e PE, com 1-200 mg de proteína enzimática (EP)/Kg de óleo da referida fosfatidilinositol fosfolipase C e com 1-200 mg de proteína enzimática (EP)/Kg de óleo da referida fosfolipase C específica para PC e PE; tal como com 1-100 mg de proteína enzimática (EP)/Kg de óleo da referida fosfatidilinositol fosfolipase C e com 1-100 mg de proteína enzimática (EP)/Kg de óleo da referida fosfolipase C específica para PC e PE; com 1-25 mg de proteína enzimática (EP)/Kg de óleo da referida fosfatidilinositol fosfolipase C e com 1-25 mg de proteína enzimática (EP)/Kg de óleo da referida fosfolipase C específica para PC e PE; com 1-15 mg de proteína enzimática (EP)/Kg de óleo da referida fosfatidilinositol fosfolipase C e com 1-15 mg de proteína enzimática (EP)/Kg de óleo da referida fosfolipase C específica para PC e PE, com 1-10 mg de proteína enzimática (EP)/Kg de óleo da referida fosfatidilinositol fosfolipase C e com 1-10 mg de proteína enzimática (EP)/Kg de óleo da referida fosfolipase C específica para PC e PE, com 1-5 mg de proteína enzimática (EP)/Kg de óleo da referida fosfatidilinositol fosfolipase C e com 1-5 mg de proteína enzimática (EP)/Kg de óleo da referida fosfolipase C específica para PC e PE, com 2-200 mg de proteína enzimática (EP)/Kg de óleo da referida fosfatidilinositol fosfolipase C e com 2-200 mg de proteína enzimática (EP)/Kg de óleo da referida fosfolipase C específica para PC e PE, com 2-100 mg de proteína enzimática (EP)/Kg de óleo da referida fosfatidilinositol fosfolipase C e com 2-100 mg de proteína enzimática (EP)/Kg de óleo da referida fosfolipase C específica para PC e PE, com 2-50 mg de proteína enzimática (EP)/Kg de óleo da referida fosfatidilinositol fosfolipase C e com 2-50 mg de proteína enzimática (EP)/Kg de óleo da referida fosfolipase C específica para PC e PE, com 2-25 mg de proteína enzimática (EP)/Kg de óleo da referida fosfatidilinositol fosfolipase C e com 2-25 mg de proteína enzimática (EP)/Kg de óleo da referida fosfolipase C específica para PC e PE, com 2-15 mg de proteína enzimática (EP)/Kg de óleo da referida fosfatidilinositol fosfolipase C e com 2-15 mg de proteína enzimática (EP)/Kg de óleo da referida fosfolipase C específica para PC e PE, com 2-10 mg de proteína enzimática (EP)/Kg de óleo da referida fosfatidilinositol fosfolipase C e com 2-10 mg de proteína enzimática (EP)/Kg de óleo da referida fosfolipase C específica para PC e PE, com 2-7 mg de proteína enzimática (EP)/Kg de óleo da referida fosfatidilinositol fosfolipase C e com 2-7 mg de proteína enzimática (EP)/Kg de óleo da referida fosfolipase C específica para PC e PE, ou com 2-5 mg de proteína enzimática (EP)/Kg de óleo da referida fosfatidilinositol fosfolipase C e com 2-5 mg de proteína enzimática (EP)/Kg de óleo da referida fosfolipase C específica para PC e PE.

[0189] Em uma outra modalidade, a fosfolipase C específica para PC e PE é a) um polipeptídeo compreendendo uma sequência de aminoácidos selecionada de entre o grupo consistindo de: i) resíduos de aminoácidos 34-278 da SEQ ID NO: 19 ou resíduos de aminoácidos 1-246 da SEQ ID NO: 20; ii) resíduos de aminoácidos 25-283 da SEQ ID NO: 22 ou resíduos de aminoácidos 39-283 da SEQ ID NO: 22; iii) resíduos de aminoácidos 25283 da SEQ ID NO: 24 ou resíduos de aminoácidos 39-283 da SEQ ID NO: 24 ou resíduos de aminoácidos 1-260 da SEQ ID NO: 25; iv) resíduos de aminoácidos 25-283 da SEQ ID NO: 27 ou resíduos de aminoácidos 39-283 da SEQ ID NO: 27; v) resíduos de aminoácidos 28-289 da SEQ ID NO: 29 ou resíduos de aminoácidos 52-289 da SEQ ID NO: 29 ou resíduos de aminoácidos 1-263 da SEQ ID NO: 30; vi) resíduos de aminoácidos 21-282 da SEQ ID NO: 32 ou resíduos de aminoácidos 38-282 da SEQ ID NO: 32; vii) resíduos de aminoácidos 25-280 da SEQ ID NO: 38 ou resíduos de aminoácidos 36-280 da SEQ ID NO: 38; ou vii) Purafine; ou b) um polipeptídeo compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 75% de identidade com uma ou mais das sequências de aminoácidos em a); ou c) um fragmento funcional de a) ou b).

[0190] Outros aspeto da presente invenção é um método para reduzir o teor de fosfolipídeos em uma composição de óleo, o método compreendendo: a) providenciar uma composição de óleo contendo uma quantidade de fosfolipídeos, b) contactar a referida composição de óleo com uma fosfolipase C específica para PC e PE selecionada de i) um polipeptídeo compreendendo uma sequência de aminoácidos selecionada de entre o grupo consistindo de: 1) resíduos de aminoácidos 34-278 da SEQ ID NO: 19 ou resíduos de aminoácidos 1-246 da SEQ ID NO: 20; 2) resíduos de aminoácidos 25-283 da SEQ ID NO: 24); resíduos de aminoácidos 39-283 da SEQ ID NO: 24 ou resíduos de aminoácidos 1-260 da SEQ ID NO: 25; 3) resíduos de aminoácidos 25-283 da SEQ ID NO: 27 ou resíduos de aminoácidos 39-283 da SEQ ID NO: 27; 4) resíduos de aminoácidos 28-289 da SEQ ID NO: 29, ou resíduos de aminoácidos 52289 da SEQ ID NO: 29 ou resíduos de aminoácidos 1-263 da SEQ ID NO: 30; ii) um polipeptídeo compreendendo uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 75% de identidade com uma das sequências de aminoácidos em i); ou iii) um fragmento funcional de i) ou ii) sob condições suficientes para as enzimas reagirem com os fosfolipídeos para criar diglicerídeo e éster de fosfato, e c) separar o éster de fosfato da composição de óleo.

[0191] Os fosfolipídeos são comummente medidos em óleo como “teor de fósforo” em partes por milhão. A tabela 1 apresenta as quantidades típicas de fosfolipídeos presentes nas principais culturas oleaginosas e a distribuição dos vários grupos funcionais como uma porcentagem dos fosfolipídeos presentes no óleo. Tabela 1: Níveis típicos e distribuições de fosfolipídeos em oleaginosas comuns

[0192] As enzimas e processos da invenção podem ser usados para alcançar uma degomagem mais completa de óleos com elevado teor de fósforo, por exemplo um óleo com mais de 200 ppm de fósforo, de preferência mais de 300 ppm, 400 ppm, 500 ppm, 600 ppm, 700 ppm, 800 ppm, 900 ppm, ainda mais preferencialmente o óleo contém mais de 1000 ppm de fósforo.

[0193] De preferência o óleo compreende fosfatidilcolina (PC), fosfatidiletanolamina (PE) e fosfatidilinositol (PI). De preferência o óleo contém mais de 50 ppm de fósforo originando de fosfatidilinositol (PI), mais preferencialmente contém mais de 75 ppm, 100 ppm, 125 ppm de PI, ainda mais preferencialmente contém mais de 150 ppm, muito preferencialmente contém mais de 175 ppm de fósforo originando de PI. De preferência o óleo contém mais de 100 ppm de fósforo originando de fosfatidilcolina (PC), mais preferencialmente contém mais de 150 ppm, 200 ppm, 250 ppm de PC, ainda mais preferencialmente contém mais de 300 ppm, muito preferencialmente contém mais de 400 ppm de fósforo originando de PC. De preferência o óleo contém mais de 75 ppm de fósforo originando de fosfatidiletanolamina (PE), mais preferencialmente contém mais de 100 ppm, 125 ppm, 150 ppm de PE, ainda mais preferencialmente contém mais de 200 ppm, muito preferencialmente contém mais de 300 ppm de fósforo originando de PE.

[0194] Em uma modalidade preferencial, o óleo é um óleo comestível. Mais preferencialmente, o óleo comestível é selecionado de entre óleos de farelo de arroz, colza, palma, amendoim e outras nozes, de soja, milho, canola e girassol. As fosfolipases da invenção podem ser usadas em qualquer procedimento de “degomagem”, incluindo degomagem com água, degomagem de óleo ALCON (por exemplo, para soja), degomagem de safinco, “super degomagem”, degomagem UF), degomagem TOP, uni- degomagem, degomagem a seco e degomagem ENZYMAX™. Ver, por exemplo, WO 2007/103005, US 2008/0182322, US 6,355,693, US 6,162,623, US 6,103,505, US 6,001,640, US 5,558,781 e US 5,264,367 para a descrição de processos de degomagem onde as fosfolipases da presente invenção podem ser aplicadas. Vários procedimentos de “degomagem” incorporados pelos métodos da invenção são descritos em Bockisch, M. (1998) em Fats and Oils Handbook, The extraction of Vegetable Oils (capítulo 5), 345-5 445, AOCS Press, Champaign, Illinois. As fosfolipases da invenção podem ser usadas na aplicação industrial de degomagem enzimática de óleos de triglicerídeos como descrito por exemplo em EP 513 709. Em uma outra modalidade, o óleo é selecionado de entre óleo em bruto, óleo degomado com água, óleo refinado cáustico e óleo degomado com ácido. A degomagem com água de um óleo em bruto ou gordura pode ser alcançada misturando cuidadosamente água quente e óleo ou gordura quente com uma temperatura de entre 50 °C a 90 °C durante 30 a 60 minutos. Este processo serve para remover parcialmente os fosfolipídeos hidratáveis. Igualmente, um tratamento ácido pode ser realizado antes da degomagem enzimática, em que o ácido usado é selecionado de entre o grupo consistindo de ácido fosfórico, ácido acético, ácido cítrico, ácido tartárico, ácido succínico e suas misturas, em particular sendo preferido um tratamento usando ácido cítrico ou ácido fosfórico. O tratamento ácido é de preferência seguido de uma etapa de neutralização para ajustar o pH entre cerca de 4,0 a 7,0, mais preferencialmente de 4,5 a 6,5, de preferência usando NaOH ou KOH. O tratamento ácido serve para quelar metais ligados aos fosfolipídeos, fazendo assim uma forma mais hidratável. De preferência, as fosfolipases como aqui descritas são adicionadas após degomagem com água ou tratamento ácido do óleo. Também é possível realizar a etapa de degomagem usando as fosfolipases como aqui descrito em uma gordura ou óleo em bruto, ou seja, um óleo ou gordura não previamente degomado com água ou tratado com ácido.

[0195] Em um aspeto, a invenção providencia métodos de degomagem enzimática sob condições de pouca água, na gama entre cerca de 0,1% a 20% de água ou 0,5% a 10% de água. Em um aspeto, isto resulta na separação melhorada de uma fase pesada da fase de óleo durante a centrifugação. A separação melhorada destas fases pode resultar na remoção mais eficiente de fosfolipídeos do óleo, incluindo tanto fosfolipídeos hidratáveis como não hidratáveis. Em um aspeto, isto pode produzir uma fração de goma que contém menos óleo neutro arrastado (triglicerídeos), melhorando assim o rendimento global do óleo durante o processo de degomagem. Em um aspeto, as fosfolipases da invenção, por exemplo PLC específica para PI e/ou PC, PLC específica para PE, são usadas para tratar óleos para reduzir a massa de goma e aumentar o ganho de óleo neutro através de aprisionamento de óleo reduzido. Em um aspeto, as fosfolipases da invenção, por exemplo um polipeptídeo tendo atividade PLC, são usadas para produção de diacilglicerol (DAG) e para contribuir para a fase de óleo.

[0196] O tratamento com fosfolipase pode ser conduzido por dispersão de uma solução aquosa da fosfolipase, preferencialmente como gotículas com um diâmetro médio abaixo de 10 microM. A quantidade de água é preferencialmente 0,5-5% em peso em relação ao óleo. Um emulsificante pode ser opcionalmente adicionado. Pode ser aplicada agitação mecânica para manter a emulsão. A agitação pode ser conduzida com um misturador de elevado cisalhamento com uma velocidade da ponta acima dos 1400 cm/s.

[0197] Em certas modalidades, um método de degomagem de óleo adequado compreende a) misturar um ácido aquoso com um óleo para obter uma mistura acídica tendo um pH de cerca de 1 a 4, b) misturar uma base com a mistura acídica para obter uma mistura reagida com um pH de cerca de 6-9, e c) degomar a mistura reagida com uma enzima da presente invenção para obter um óleo degomado. Em certas modalidades, a mistura nas etapas a) e/ou b) cria uma emulsão que compreende uma fase aquosa com tamanho de gotícula médio entre cerca de 15 microM a cerca de 45 microM. Em certas modalidades, a mistura nas etapas a) e/ou b) cria uma emulsão que compreende pelo menos cerca de 60% de uma fase aquosa por volume em tamanho de gotícula entre cerca de 15 microM a cerca de 45 microM de tamanho, em que a porcentagem da fase aquosa se baseia no volume total da fase aquosa. Qualquer ácido considerado adequado por um entendido na técnica pode ser usado nos métodos aqui providenciados. Em certas modalidades, o ácido é selecionado de entre o grupo consistindo de ácido fosfórico, ácido acético, ácido cítrico, ácido tartárico, ácido succínico e uma sua mistura. Qualquer ácido considerado adequado por um entendido na técnica pode ser usado nos métodos aqui providenciados. Em certas modalidades, a base é selecionada de entre o grupo consistindo de hidróxido de sódio, hidróxido de potássio, silicato de sódio, carbonato de sódio, carbonato de cálcio e uma sua combinação.

[0198] Em uma modalidade preferencial, o tratamento de fosfolipase pode ser conduzido a um pH entre cerca de 4,0 a 7,0, mais preferencialmente de 4,5 a 6,5. O pH é medido na emulsão ou na interfase entre o óleo intermédio e a solução aquosa. Uma temperatura adequada é geralmente 30-80 °C. Em uma modalidade preferencial, a temperatura do óleo é entre 50 e 70 °C, mais preferencialmente entre 55 e 65 °C e muito preferencialmente entre 50 e 60 °C. Em outras modalidades preferenciais, a temperatura do óleo é entre 60 e 80 °C, mais preferencialmente entre 65 e 75 °C e muito preferencialmente entre 67 e 72 °C.

[0199] O tempo de reação será tipicamente 1-12 horas (por exemplo, 1-6 horas, ou 1-3 horas, muito preferencialmente o tempo de reação é entre 1,5 e 4 horas, ainda mais preferencialmente entre 1,5 e 2 horas). Uma dosagem de enzima típica será normalmente 0,1-10 mg por litro (p.ex., 0,55 mg por litro). O tratamento com fosfolipase pode ser conduzido descontinuamente, p.ex., em um tanque com agitação, ou pode ser contínuo, p.ex., uma série de reatores de tanque agitado. O tratamento com fosfolipase pode ser seguido de separação de uma fase aquosa e uma fase de óleo. A separação pode ser realizada por meios convencionais, p.ex., centrifugação. Quando é usada uma lipase líquida, a fase aquosa conterá fosfolipase, e a enzima pode ser reusada para melhorar a economia do processo.

[0200] Em uma modalidade preferencial da presente invenção, o tratamento reduz o teor de fósforo total do óleo para menos de 200 ppm, de preferência para menos de 100 ppm, menos de 50 ppm, menos de 40 ppm, 30 ppm, 20 ppm, 15 ppm, mais preferencialmente menos de 10 ppm, menos de 9 ppm, menos de 8 ppm, menos de 7 ppm, menos de 6 ppm, muito preferencialmente menos de 5 ppm.

[0201] Adicionalmente às fosfolipases da presente invenção pode ser aplicada uma enzima adicional no processo de degomagem delineado acima. Em uma modalidade preferencial, a enzima adicional é um polipeptídeo tendo atividade de fosfolipase A1, A2 e/ou B. Um polipeptídeo adequado tendo atividade de fosfolipase A1 pode ser LECITASE ULTRA disponível da Novozymes A/S.

[0202] Emulsificantes de fosfolipídeos: A fosfolipase da invenção pode ser usada para hidrólise parcial de fosfolipídeos, de preferência lecitina, para obter emulsificantes de fosfolipídeos melhorados. Esta aplicação é adicionalmente descrita em Ullmann's Encyclopedia of Industrial Chemistry (editora: VCH Weinheim (1996)), patente JP 2794574 e JP-B 6-087751.

[0203] Filtração: A fosfolipase da invenção pode ser usada para melhorar a filtrabilidade de uma solução aquosa ou pasta de origem em carboidrato tratando-a com a fosfolipase. Isto é particularmente aplicável a uma solução de pasta contendo um hidrolisado de amido, especialmente um hidrolisado de amido de trigo, uma vez que este tende a ser difícil de filtrar e a dar filtrados baços. O tratamento pode ser feito em analogia com a EP 219,269 (CPC International).

[0204] Ração Animal: A fosfolipase da invenção pode ser usada em um processo para a produção de uma ração animal que compreende misturar a fosfolipase com substâncias de ração compreendendo pelo menos um fosfolipídeo. Isto pode ser feito em analogia com a EP 743 017.

[0205] Biodiesel: A fosfolipase da presente invenção pode ser usada em combinação com uma ou mais enzimas lipolíticas para converter gorduras e óleos em ésteres de alquila de ácido graxo ao mesmo tempo que se alcança degomagem no mesmo processo. Um tal processo é descrito, por exemplo, na US 8,012,724.

[0206] Detergente: A fosfolipase da invenção pode ser adicionada a, e assim ser usada como um componente de, uma composição detergente.

[0207] A composição detergente pode por exemplo ser formulada como uma composição detergente para lavagem de roupa manual ou à máquina, incluindo uma composição aditiva de lavagem de roupa adequada para pré-tratamento de tecidos manchados e uma composição de amaciador de tecidos adicionada para enxaguamento, ou ser formulada como uma composição detergente para uso em operações domésticas gerais de limpeza de superfícies duras, ou ser formulada para operações de lavagem de louça manual ou à máquina.

[0208] Cozimento: A fosfolipase da invenção pode ser usada para produção de massa e produtos cozidos a partir de massa, bem como para a produção de composições de cozimento e aditivos de cozimento.

[0209] A massa compreende geralmente sêmola de trigo ou farinha de trigo e/ou outros tipos de sêmola, farinha ou amido tal como farinha de milho, amido de milho, sêmola de centeio, farinha de centeio, farinha de aveia, sêmola de aveia, farinha de soja, sêmola de sorgo, farinha de sorgo, sêmola de batata, farinha de batata ou amido de batata.

[0210] A massa pode ser fresca, congelada ou parcialmente cozida e de seguida congelado.

[0211] A massa é normalmente massa levedada ou massa a ser submetida a levedação. A massa pode ser levedada de várias formas, tal como adicionando agentes levedantes, por exemplo bicarbonato de sódio ou adicionando um levedante (massa de fermentação), mas é preferencial levedar a massa adicionando uma cultura de fermento adequado, tal como uma cultura de Saccharomyces cerevisiae (levedura de panificação), por exemplo uma estirpe disponível comercialmente de S. cerevisiae.

[0212] A massa pode também compreender outros ingredientes de massa convencional, por exemplo: proteínas, tal como um leite em pó, glúten e soja; ovos (ovos inteiros, gemas de ovo ou claras de ovo); um oxidante como ácido ascórbico, bromato de potássio, iodato de potássio, azodicarbonamida (ADA) ou persulfato de amônio; um aminoácido como L- cisteína; um açúcar; um sal como cloreto de sódio, acetato de sódio, acetato de cálcio, sulfato de sódio ou sulfato de cálcio.

[0213] A massa pode compreender gordura (triglicerídeos) tal como gordura granulada ou gordura alimentar, mas a invenção aplica-se em particular a uma massa onde é adicionado menos de 1% em peso de gordura, e particularmente a uma massa que é feita sem adição de gordura.

[0214] A massa pode ainda compreender um emulsificante tal como mono- ou diglicerídeos, ésteres de ácido diacetil tartárico de mono- ou diglicerídeos, ésteres de açúcar de ácidos graxos, ésteres de poliglicerol de ácidos graxos, ésteres de ácido láctico de monoglicerídeos, ésteres de ácido acético de monoglicerídeos, estearatos de polioxietileno, ou lisolecitina.

[0215] A massa pode ser usada para qualquer tipo de produto cozido preparado a partir de massa, quer com um caráter macio ou estaladiço, quer de tipo branco, claro ou escuro. Exemplos de pão (em particular pão branco, integral ou de centeio), tipicamente na forma de pães ou pãezinhos, pão francês tipo baguete, pão pita, tortillas, bolos, panquecas, biscoitos, wafers, bolachas, massa para pasteis, tostas, pão cozido a vapor, piza e semelhantes.

[0216] A presente invenção é adicionalmente descrita pelos seguintes exemplos que não devem ser considerados como limitantes do escopo da invenção. Itens 1. Um método para reduzir o teor de fosfolipídeos em uma composição de óleo, o método compreendendo a) providenciar uma composição de óleo contendo uma quantidade de fosfolipídeos, b) contactar a referida composição de óleo com uma fosfatidilinositol fosfolipase C e uma fosfolipase C específica para PC e PE sob condições suficientes para as enzimas reagirem com os fosfolipídeos para criar diglicerídeo e éster de fosfato; e, c) separar o éster de fosfato da composição de óleo. 2. O método de acordo com o item 1, em que a referida fosfatidilinositol fosfolipase C é do gênero Pseudomonas. 3. O método de acordo com os itens 1 ou 1, em que o óleo é um óleo comestível. 4. O método de acordo com qualquer um dos itens anteriores, em que o óleo é selecionado de óleo em bruto, óleo degomado com água, óleo refinado cáustico e óleo degomado com ácido. 5. O método de acordo com qualquer um dos itens anteriores, em que o óleo compreende fosfatidilcolina (PC), fosfatidiletanolamina (PE) e fosfatidilinositol (PI). 6. O método de acordo com o item 5, em que o óleo compreende pelo menos 50 ppm de fósforo originando de fosfatidilinositol (PI). 7. O método de acordo com qualquer um dos itens anteriores, em que a fosfatidilinositol fosfolipase C é a) um polipeptídeo compreendendo uma sequência de aminoácidos selecionada de entre o grupo consistindo de: i) resíduos de aminoácidos 26-322 da SEQ ID NO: 2 ou resíduos de aminoácidos 1-298 da SEQ ID NO: 3; ii) resíduos de aminoácidos 26-323 da SEQ ID NO: 5 ou resíduos de aminoácidos 1-299 da SEQ ID NO: 6; iii) resíduos de aminoácidos 26-323 da SEQ ID NO: 8 ou resíduos de aminoácidos 1-299 da SEQ ID NO: 9; iv) resíduos de aminoácidos 26-323 da SEQ ID NO: 11 ou resíduos de aminoácidos 1-296 da SEQ ID NO: 12; v) resíduos de aminoácidos 26-322 da SEQ ID NO: 14 ou resíduos de aminoácidos 1-298 da SEQ ID NO: 15; vi) resíduos de aminoácidos 26-322 da SEQ ID NO: 17; e vii) resíduos de aminoácidos 28-339 da SEQ ID NO: 35; ou b) um polipeptídeo compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 75% de identidade com uma ou mais das sequências de aminoácidos em a); ou c) um fragmento funcional de a) ou b). 8. O método de acordo com qualquer um dos itens anteriores, em que a fosfolipase C específica para PC e PE é a) um polipeptídeo compreendendo uma sequência de aminoácidos selecionada de entre o grupo consistindo de: i) resíduos de aminoácidos 34-278 da SEQ ID NO: 19 ou resíduos de aminoácidos 1-246 da SEQ ID NO: 20; ii) resíduos de aminoácidos 25-283 da SEQ ID NO: 22 ou resíduos de aminoácidos 39-283 da SEQ ID NO: 22; iii) resíduos de aminoácidos 25-283 da SEQ ID NO: 24 ou resíduos de aminoácidos 39-283 da SEQ ID NO: 24 ou resíduos de aminoácidos 1-260 da SEQ ID NO: 25; iv) resíduos de aminoácidos 25-283 da SEQ ID NO: 27 ou resíduos de aminoácidos 39-283 da SEQ ID NO: 27; v) resíduos de aminoácidos 28-289 da SEQ ID NO: 29 ou resíduos de aminoácidos 52-289 da SEQ ID NO: 29 ou resíduos de aminoácidos 1-263 da SEQ ID NO: 30; vi) resíduos de aminoácidos 21-282 da SEQ ID NO: 32 ou resíduos de aminoácidos 38-282 da SEQ ID NO: 32; vii) resíduos de aminoácidos 25-280 da SEQ ID NO: 38 ou resíduos de aminoácidos 36-280 da SEQ ID NO: 38; e viii) Purifine; ou b) um polipeptídeo compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 75% de identidade com uma ou mais das sequências de aminoácidos em a); ou c) um fragmento funcional de a) ou b). 9. O método de acordo com qualquer um dos itens anteriores, em que a referida fosfatidilinositol fosfolipase C é um polipeptídeo tendo um comprimento de 280-320 resíduos de aminoácidos, tal como um comprimento de 280-310 resíduos de aminoácidos, 280-305 resíduos de aminoácidos, 280-300 resíduos de aminoácidos, 280-298 resíduos de aminoácidos 280-297 resíduos de aminoácidos, 280-296 resíduos de aminoácidos, 285-320 resíduos de aminoácidos, 285-315 resíduos de aminoácidos, 285-310 resíduos de aminoácidos, 285-305 resíduos de aminoácidos, 285-300 resíduos de aminoácidos, 285-298 resíduos de aminoácidos, 285-297 resíduos de aminoácidos, 285-296 resíduos de aminoácidos, 290-320 resíduos de aminoácidos, 290-315 resíduos de aminoácidos, 290-310 resíduos de aminoácidos, 290-305 resíduos de aminoácidos, 290-300 resíduos de aminoácidos, 290-298 resíduos de aminoácidos, 290-297 resíduos de aminoácidos, 290-296 resíduos de aminoácidos, 295-320 resíduos de aminoácidos, 295-315 resíduos de aminoácidos, 295-310 resíduos de aminoácidos, 295-305 resíduos de aminoácidos, 295-300 resíduos de aminoácidos, 295-298 resíduos de aminoácidos, 255-297 resíduos de aminoácidos, ou um comprimento de 295-296 resíduos de aminoácidos. 10. O polipeptídeo de acordo com qualquer um dos itens anteriores, em que a referida fosfolipase C específica para PC e PE é um polipeptídeo tendo um comprimento de 220-280 resíduos de aminoácidos, tal como um comprimento de 220-270 resíduos de aminoácidos, 220-260 resíduos de aminoácidos, 220-250 resíduos de aminoácidos, 220-248 resíduos de aminoácidos 220-246 resíduos de aminoácidos, 220-244 resíduos de aminoácidos, 225-280 resíduos de aminoácidos, 225-270 resíduos de aminoácidos, 225-260 resíduos de aminoácidos, 225-250 resíduos de aminoácidos, 225-248 resíduos de aminoácidos 225-246 resíduos de aminoácidos, 225-244 resíduos de aminoácidos, 230-280 resíduos de aminoácidos, 230-270 resíduos de aminoácidos, 230-260 resíduos de aminoácidos, 230-250 resíduos de aminoácidos, 230-248 resíduos de aminoácidos, 230-246 resíduos de aminoácidos, 230-244 resíduos de aminoácidos, 235-280 resíduos de aminoácidos, 235-270 resíduos de aminoácidos, 235-260 resíduos de aminoácidos, 235-250 resíduos de aminoácidos, 235-248 resíduos de aminoácidos 235-246 resíduos de aminoácidos, 235-244 resíduos de aminoácidos, 240-280 resíduos de aminoácidos, 240-270 resíduos de aminoácidos, 240-260 resíduos de aminoácidos, 240-250 resíduos de aminoácidos, 240-248 resíduos de aminoácidos 240-246 resíduos de aminoácidos, 240-244 resíduos de aminoácidos, 242-280 resíduos de aminoácidos, 242-270 resíduos de aminoácidos, 242-260 resíduos de aminoácidos, 242-250 resíduos de aminoácidos, 242-248 resíduos de aminoácidos 242-246 resíduos de aminoácidos, 242-244 resíduos de aminoácidos, 243-280 resíduos de aminoácidos, 243-270 resíduos de aminoácidos, 243-260 resíduos de aminoácidos, 243-250 resíduos de aminoácidos, 243-248 resíduos de aminoácidos 243-246 resíduos de aminoácidos, 243-244 resíduos de aminoácidos. 11. O método de acordo com qualquer um dos itens anteriores, em que o referido óleo é contactado: com 0,5-200 mg de proteína enzimática (EP)/Kg de óleo da referida fosfatidilinositol fosfolipase C e com 0,5-200 mg de proteína enzimática (EP)/Kg de óleo da referida fosfolipase C específica para PC e PE; tal como com 0,5-100 mg de proteína enzimática (EP)/Kg de óleo da referida fosfatidilinositol fosfolipase C e com 0,5-100 mg de proteína enzimática (EP)/Kg de óleo da referida fosfolipase C específica para PC e PE; com 0,5-25 mg de proteína enzimática (EP)/Kg de óleo da referida fosfatidilinositol fosfolipase C e com 0,5-25 mg de proteína enzimática (EP)/Kg de óleo da referida fosfolipase C específica para PC e PE; com 0,5-15 mg de proteína enzimática (EP)/Kg de óleo da referida fosfatidilinositol fosfolipase C e com 0,5-15 mg de proteína enzimática (EP)/Kg de óleo da referida fosfolipase C específica para PC e PE, com 0,5-10 mg de proteína enzimática (EP)/Kg de óleo da referida fosfatidilinositol fosfolipase C e com 0,5-10 mg de proteína enzimática (EP)/Kg de óleo da referida fosfolipase C específica para PC e PE, com 0,5-5 mg de proteína enzimática (EP)/Kg de óleo da referida fosfatidilinositol fosfolipase C e com 0,5-5mg de proteína enzimática (EP)/Kg de óleo da referida fosfolipase C específica para PC e PE, com 1-200 mg de proteína enzimática (EP)/Kg de óleo da referida fosfatidilinositol fosfolipase C e com 1-200 mg de proteína enzimática (EP)/Kg de óleo da referida fosfolipase C específica para PC e PE; tal como com 1-100 mg de proteína enzimática (EP)/Kg de óleo da referida fosfatidilinositol fosfolipase C e com 1-100 mg de proteína enzimática (EP)/Kg de óleo da referida fosfolipase C específica para PC e PE; com 1-25 mg de proteína enzimática (EP)/Kg de óleo da referida fosfatidilinositol fosfolipase C e com 1-25 mg de proteína enzimática (EP)/Kg de óleo da referida fosfolipase C específica para PC e PE; com 1-15 mg de proteína enzimática (EP)/Kg de óleo da referida fosfatidilinositol fosfolipase C e com 1-15 mg de proteína enzimática (EP)/Kg de óleo da referida fosfolipase C específica para PC e PE, com 1-10 mg de proteína enzimática (EP)/Kg de óleo da referida fosfatidilinositol fosfolipase C e com 1-10 mg de proteína enzimática (EP)/Kg de óleo da referida fosfolipase C específica para PC e PE, com 1-5 mg de proteína enzimática (EP)/Kg de óleo da referida fosfatidilinositol fosfolipase C e com 1-5mg de proteína enzimática (EP)/Kg de óleo da referida fosfolipase C específica para PC e PE, com 2-200 mg de proteína enzimática (EP)/Kg de óleo da referida fosfatidilinositol fosfolipase C e com 2-200 mg de proteína enzimática (EP)/Kg de óleo da referida fosfolipase C específica para PC e PE, com 2-100 mg de proteína enzimática (EP)/Kg de óleo da referida fosfatidilinositol fosfolipase C e com 2-100 mg de proteína enzimática (EP)/Kg de óleo da referida fosfolipase C específica para PC e PE, com 2-50 mg de proteína enzimática (EP)/Kg de óleo da referida fosfatidilinositol fosfolipase C e com 2-50 mg de proteína enzimática (EP)/Kg de óleo da referida fosfolipase C específica para PC e PE, com 2-25 mg de proteína enzimática (EP)/Kg de óleo da referida fosfatidilinositol fosfolipase C e com 2-25 mg de proteína enzimática (EP)/Kg de óleo da referida fosfolipase C específica para PC e PE, com 2-15 mg de proteína enzimática (EP)/Kg de óleo da referida fosfatidilinositol fosfolipase C e com 2-15 mg de proteína enzimática (EP)/Kg de óleo da referida fosfolipase C específica para PC e PE, com 2-10 mg de proteína enzimática (EP)/Kg de óleo da referida fosfatidilinositol fosfolipase C e com 2-10 mg de proteína enzimática (EP)/Kg de óleo da referida fosfolipase C específica para PC e PE, com 2-7 mg de proteína enzimática (EP)/Kg de óleo da referida fosfatidilinositol fosfolipase C e com 2-7 mg de proteína enzimática (EP)/Kg de óleo da referida fosfolipase C específica para PC e PE, com 2-5 mg de proteína enzimática (EP)/Kg de óleo da referida fosfatidilinositol fosfolipase C e com 2-5 mg de proteína enzimática (EP)/Kg de óleo da referida fosfolipase C específica para PC e PE. 12. Um polipeptídeo tendo atividade de fosfatidilinositol fosfolipase C, selecionado de entre o grupo consistindo em: a) (a) um polipeptídeo possuindo pelo menos 91% de identidade de sequência com o polipeptídeo maduro da SEQ ID NO: 2; b) um polipeptídeo codificado por um polinucleotídeo que hibrida sob condições de estringência média, com i) a sequência codificadora do polipeptídeo maduro da SEQ ID NO: 1, ou ii) o complemento de comprimento completo de (i); c) (c) um polipeptídeo codificado por um polinucleotídeo possuindo pelo menos 90% de identidade de sequência com a sequência codificadora do polipeptídeo maduro da SEQ ID NO: 1; d) (d) uma variante do polipeptídeo maduro da SEQ ID NO: 2, compreendendo uma substituição, deleção, e/ou inserção em uma ou mais posições; e e) um fragmento do polipeptídeo de (a), (b), (c), ou (d) que tem atividade de fosfatidilinositol fosfolipase C. 13. O polipeptídeo de acordo com o item 12, o referido polipeptídeo tendo uma temperatura de desnaturação térmica de pelo menos 60 °C, tal como 61 °C, 62°C, 63°C, 64°C, 65°C, 66°C, 67°C, 68°C, 69°C, 70°C, 71°C, 72°C, 73°C, 74°C, 75°C, 76°C, 77°C, 78°C, 79°C, 80°C, 81°C, 82°C, 83°C, 84°C, 85°C, 86°C, 87°C, 88°C, 89°C ou pelo menos 90 °C como determinado por Calorimetria Diferencial de Varredura (DSC). 14. O polipeptídeo de acordo com o item 12 ou 13, em que a referida temperatura de desnaturação é determinada como o topo do pico de desnaturação (principal pico endotérmico) em termogramas (Cp vs. T) obtidos após aquecimento de uma solução de 1 mg/ml do polipeptídeo em tampão (50 mM de acetato de sódio, pH 5,5, ou 50 mM de Hepes com pH 7) a uma taxa de aquecimento programada constante de 200 K/hora. 15. O polipeptídeo de acordo com qualquer um dos itens 1214, o referido polipeptídeo sendo capaz de reduzir o teor de fosfatidilinositol de óleo de soja em bruto em 50% ou mais, 50%, tal com em 55%, em 60%, em 65%, em 70%, em 75%, em 80%, em 85%, em 90% ou em 95% ou mais, a redução do teor de fosfatidilinositol sendo determinada por RMN de 31P após adição de 100 mg de proteína enzimática (EP)/kg de óleo e incubação do óleo e enzima a 50 °C durante 2 horas com pH 5,5. 16. O polipeptídeo de acordo com qualquer um dos itens 12- 15, o referido polipeptídeo sendo capaz de reduzir o teor de fósforo de óleo de soja em bruto para 20 mg/kg de óleo ou menos como determinado por espectrometria de emissão ótica com plasma indutivamente acoplado (ICP- OES) após incubação de 4 mg de proteína enzimática/kg de óleo em um sistema pouco aquoso compreendendo 3% de água com base na quantidade de óleo a 50-60 °C durante 5 horas. 17. O polipeptídeo de acordo com o item 16, em que o referido óleo de soja em bruto compreende 80-140 ppm de fósforo presente como ácido fosfatídico (PA), 140-200 ppm de fósforo presente como fosfatidiletanolamina (PE), 70-110 ppm de fósforo presente como ácido fosfatídico (PI) e 130-200 ppm de fósforo presente como fosfatidilcolina; o teor de fósforo sendo medido por RMN de 31P. 18. O polipeptídeo de acordo com o item 16 ou 17, em que a redução do teor de fósforo é obtida em um processo de degomagem de óleo compreendendo as etapas de: i) tratar opcionalmente óleo de soja em bruto com ácido/base adicionando uma solução a 85% de ácido ortofosfórico em quantidades correspondendo a 0,05% (ácido ortofosfórico 100% puro) com base na quantidade de óleo, misturar em banho ultrassônico por 5 minutos, seguido de incubação em rotor por 15 minutos e neutralização com base com 4 M de NaOH aplicado em equivalentes (de 0,5 a 0,15) para ácido ortofosfórico puro em banho ultrassônico por 5 minutos; ii) adicionar o polipeptídeo ao óleo em quantidades de 4 mg de proteína enzimática/kg de óleo em um sistema pouco aquoso compreendendo 3% de água com base na quantidade de óleo e submeter o óleo e o polipeptídeo a tratamento ultrassônico durante 5 minutos; iii) incubar o polipeptídeo e o óleo a 50-60 °C por 5 horas com agitação a 20 rpm; iv) centrifugar o óleo e o polipeptídeo a 700 g a 85 °C durante 15 minutos. 19. O polipeptídeo de acordo com qualquer um dos itens 1118, compreendendo, consistindo ou consistindo essencialmente da SEQ ID NO: 2 ou do polipeptídeo maduro da SEQ ID NO: 2 ou dos aminoácidos 26 a 322 da SEQ ID NO: 2 ou com os aminoácidos 1 a 298 da SEQ ID NO: 3. 20. O polipeptídeo de acordo com qualquer um dos itens 1219, tendo um comprimento de 280-320 resíduos de aminoácidos, tal como um comprimento de 280-310 resíduos de aminoácidos, resíduos de aminoácidos, 280-300 resíduos de aminoácidos, 280-298 resíduos de aminoácidos 280-297 resíduos de aminoácidos, 280-296 resíduos de aminoácidos, 285-320 resíduos de aminoácidos, 285-315 resíduos de aminoácidos, 285-310 resíduos de aminoácidos, 285-305 resíduos de aminoácidos, 285-300 resíduos de aminoácidos, 285-298 resíduos de aminoácidos, 285-297 resíduos de aminoácidos, 285-296 resíduos de aminoácidos, 290-320 resíduos de aminoácidos, 290-315 resíduos de aminoácidos, 290-310 resíduos de aminoácidos, 290-305 resíduos de aminoácidos, 290-300 resíduos de aminoácidos, 290-298 resíduos de aminoácidos, 290-297 resíduos de aminoácidos, 290-296 resíduos de aminoácidos, 295-320 resíduos de aminoácidos, 295-315 resíduos de aminoácidos, 295-310 resíduos de aminoácidos, 295-305 resíduos de aminoácidos, 295-300 resíduos de aminoácidos, 295-298 resíduos de aminoácidos, 255-297 resíduos de aminoácidos, ou um comprimento de 295-296 resíduos de aminoácidos. 21. Um polipeptídeo tendo atividade de fosfolipase C específica para PC e PE selecionado de entre o grupo consistindo em: a) um polipeptídeo possuindo pelo menos 70% de identidade de sequência com o polipeptídeo maduro da SEQ ID NO: 19; b) um polipeptídeo codificado por um polinucleotídeo que hibrida sob condições de estringência baixa, com i) a sequência codificadora do polipeptídeo maduro da SEQ ID NO: 18, ou ii) o complemento de comprimento completo de (i); c) um polipeptídeo codificado por um polinucleotídeo possuindo pelo menos 70% de identidade de sequência com a sequência codificadora do polipeptídeo maduro da SEQ ID NO: 18; d) uma variante do polipeptídeo maduro da SEQ ID NO: 19, compreendendo uma substituição, deleção, e/ou inserção em uma ou mais posições; e e) um fragmento do polipeptídeo de (a), (b), (c), ou (d) que tem atividade de fosfolipase C específica para PC e PE. 22. O polipeptídeo de acordo com o item 21, o referido polipeptídeo tendo uma temperatura de desnaturação térmica de pelo menos 60 °C, tal como 61 °C, 62°C, 63°C, 64°C, 65°C, 66°C, 67°C, 68°C, 69°C, 70°C, 71°C, 72°C, 73°C, 74°C, 75°C, 76°C, 77°C, 78°C, 79°C, 80°C, 81°C, 82°C, 83°C, 84°C, 85°C, 86°C, 87°C, 88°C, 89°C ou pelo menos 90 °C como determinado por Calorimetria Diferencial de Varredura (DSC). 23. O polipeptídeo de acordo com o item 22, em que a referida temperatura de desnaturação é determinada como o topo do pico de desnaturação (principal pico endotérmico) em termogramas (Cp vs. T) obtidos após aquecimento de uma solução de 1 mg/ml do polipeptídeo em tampão (50 mM de acetato de sódio, pH 5,5, ou 50 mM de Hepes com pH 7) a uma taxa de aquecimento programada constante de 200 K/hora. 24. O polipeptídeo de acordo com qualquer um dos itens 2123, o referido polipeptídeo sendo capaz de reduzir o teor de fosfatidiletanolamina e/ou fosfatidilcolina de óleo de soja em bruto em 50% ou mais, 50%, tal com em 55%, em 60%, em 65%, em 70%, em 75%, em 80%, em 85%, em 90% ou em 95% ou mais, a redução do teor de fosfatidiletanolamina e/ou fosfatidilcolina sendo determinada por RMN de 31P após adição de 100 mg de proteína enzimática (EP)/kg de óleo e incubação do óleo e enzimas a 50 °C durante 2 horas com pH 5,5. 25. O polipeptídeo de acordo com qualquer um dos itens 2124, o referido polipeptídeo sendo capaz de reduzir o teor de fósforo de óleo de soja em bruto para 20 mg/kg de óleo ou menos como determinado por espectrometria de emissão ótica com plasma indutivamente acoplado (ICP- OES) após incubação de 4 mg de proteína enzimática/kg de óleo em um sistema pouco aquoso compreendendo 3% de água com base na quantidade de óleo a 50-60 °C durante 5 horas. 26. O polipeptídeo de acordo com qualquer um dos itens 2425, em que o referido óleo de soja em bruto compreende 80-140 ppm de fósforo presente como ácido fosfatídico (PA), 140-200 ppm de fósforo presente como fosfatidiletanolamina (PE), 70-110 ppm de fósforo presente como ácido fosfatídico (PI) e 130-200 ppm de fósforo presente como fosfatidilcolina; o teor de fósforo sendo medido por RMN de 31P. 27. O polipeptídeo de acordo com qualquer um dos itens 2426, em que a redução de teor de fósforo e/ou redução de teor de fosfatidiletanolamina e/ou fosfatidilcolina é obtida em um processo de degomagem de óleo compreendendo as etapas de: i) tratar opcionalmente óleo de soja em bruto com ácido/base adicionando uma solução a 85% de ácido ortofosfórico em quantidades correspondendo a 0,05% (ácido ortofosfórico 100% puro) com base na quantidade de óleo, misturar em banho ultrassônico por 5 minutos, seguido de incubação em rotor por 15 minutos e neutralização com base com 4 M de NaOH aplicado em equivalentes (de 0,5 a 0,15) para ácido ortofosfórico puro em banho ultrassônico por 5 minutos; ii) adicionar o polipeptídeo ao óleo em quantidades de 4 mg de proteína enzimática/kg de óleo em um sistema pouco aquoso compreendendo 3% de água com base na quantidade de óleo e submeter o óleo e o polipeptídeo a tratamento ultrassônico durante 5 minutos; iii) incubar o polipeptídeo e o óleo a 50-60 °C por 5 horas com agitação a 20 rpm; iv) centrifugar o óleo e o polipeptídeo a 700 g a 85 °C durante 15 minutos. 28. O polipeptídeo de acordo com qualquer um dos itens 2127, compreendendo ou consistindo essencialmente da SEQ ID NO: 19 ou do polipeptídeo maduro da SEQ ID NO: 19 ou dos aminoácidos 34 a 278 da SEQ ID NO: 19 ou dos resíduos de aminoácidos 1-246 da SEQ ID NO: 20. 29. O polipeptídeo de acordo com qualquer um dos itens 2128, tendo um comprimento de 220-280 resíduos de aminoácidos, tal como um comprimento de 220-270 resíduos de aminoácidos, 220-260 resíduos de aminoácidos, 220-250 resíduos de aminoácidos, 220-248 resíduos de aminoácidos 220-246 resíduos de aminoácidos, 220-244 resíduos de aminoácidos, 225-280 resíduos de aminoácidos, 225-270 resíduos de aminoácidos, 225-260 resíduos de aminoácidos, 225-250 resíduos de aminoácidos, 225-248 resíduos de aminoácidos 225-246 resíduos de aminoácidos, 225-244 resíduos de aminoácidos, 230-280 resíduos de aminoácidos, 230-270 resíduos de aminoácidos, 230-260 resíduos de aminoácidos, 230-250 resíduos de aminoácidos, 230-248 resíduos de aminoácidos, 230-246 resíduos de aminoácidos, 230-244 resíduos de aminoácidos, 235-280 resíduos de aminoácidos, 235-270 resíduos de aminoácidos, 235-260 resíduos de aminoácidos, 235-250 resíduos de aminoácidos, 235-248 resíduos de aminoácidos 235-246 resíduos de aminoácidos, 235-244 resíduos de aminoácidos, 240-280 resíduos de aminoácidos, 240-270 resíduos de aminoácidos, 240-260 resíduos de aminoácidos, 240-250 resíduos de aminoácidos, 240-248 resíduos de aminoácidos 240-246 resíduos de aminoácidos, 240-244 resíduos de aminoácidos, 242-280 resíduos de aminoácidos, 242-270 resíduos de aminoácidos, 242-260 resíduos de aminoácidos, 242-250 resíduos de aminoácidos, 242-248 resíduos de aminoácidos 242-246 resíduos de aminoácidos, 242-244 resíduos de aminoácidos, 243-280 resíduos de aminoácidos, 243-270 resíduos de aminoácidos, 243-260 resíduos de aminoácidos, 243-250 resíduos de aminoácidos, 243-248 resíduos de aminoácidos 243-246 resíduos de aminoácidos, 243-244 resíduos de aminoácidos. 30. Um polinucleotídeo codificando um polipeptídeo de acordo com qualquer um dos itens 12 a 29. 31. Uma construção de ácido nucleico ou vetor de expressão compreendendo o polinucleotídeo do item 30 operacionalmente ligado a uma ou mais sequências de controle que dirigem a produção do polipeptídeo em um hospedeiro de expressão. 32. Uma célula hospedeira recombinante compreendendo o polinucleotídeo de acordo com o item 30 operacionalmente ligado a uma ou mais sequências de controle que dirigem a produção do polipeptídeo. 33. Um método de produção de um polipeptídeo de qualquer um dos itens 12 a 29, compreendendo o cultivo de uma célula que, na sua forma de tipo selvagem, produz o polipeptídeo, sob condições conducentes à produção do polipeptídeo. 34. Um método de produzir um polipeptídeo de fosfolipase C em um hospedeiro Bacillus, em que a sequência de codificação de fosfolipase C codifica uma alanina em frente do aminoácido de terminal N previsto do polipeptídeo de fosfolipase C. 35. O método do item 34, em que o polipeptídeo de fosfolipase C é um polipeptídeo de fosfolipase C específica para PC e PE. 36. Um método de produção de um polipeptídeo de acordo com qualquer um dos itens 12 a 29, compreendendo cultivar a célula hospedeira de acordo com o item 32 em condições conducentes à produção do polipeptídeo. 37. O método de acordo com qualquer um dos itens 33 a 37, compreendendo adicionalmente a recuperação do polipeptídeo. 38. Uma composição compreendendo o polipeptídeo de qualquer um dos itens 12-2013. 39. Uma composição compreendendo o polipeptídeo de qualquer um dos itens 21-29. 40. Uma composição compreendendo uma mistura de uma fosfatidilinositol fosfolipase C do gênero de Pseudomonas e um polipeptídeo de fosfolipase C específica para PC e PE. 41. A composição de acordo com o item 40, em que a fosfatidilinositol fosfolipase C é: a) um polipeptídeo compreendendo uma sequência de aminoácidos selecionada de entre o grupo consistindo de: i) resíduos de aminoácidos 26-322 da SEQ ID NO: 2 ou resíduos de aminoácidos 1-298 da SEQ ID NO: 3; ii) resíduos de aminoácidos 26-323 da SEQ ID NO: 5 ou resíduos de aminoácidos 1-299 da SEQ ID NO: 6; iii) resíduos de aminoácidos 26-323 da SEQ ID NO: 8 ou resíduos de aminoácidos 1-299 da SEQ ID NO: 9; iv) resíduos de aminoácidos 26-323 da SEQ ID NO: 11 ou resíduos de aminoácidos 1-296 da SEQ ID NO: 12; v) resíduos de aminoácidos 26-322 da SEQ ID NO: 14 ou resíduos de aminoácidos 1-298 da SEQ ID NO: 15; vi) resíduos de aminoácidos 26-322 da SEQ ID NO: 17; e vii) resíduos de aminoácidos 28-339 da SEQ ID NO: 35; ou b) um polipeptídeo compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 75% de identidade com uma ou mais das sequências de aminoácidos em a); ou c) um fragmento funcional de a) ou b). 42. A composição de acordo com o item 41, em que a fosfatidilinositol fosfolipase C é o polipeptídeo de qualquer um dos itens 12 a 20. 43. A composição de acordo com qualquer um dos itens 38 a 42, em que o polipeptídeo de fosfolipase C específica para PC e PE é: a) um polipeptídeo compreendendo uma sequência de aminoácidos selecionada de entre o grupo consistindo de: i) resíduos de aminoácidos 34-278 da SEQ ID NO: 19 ou resíduos de aminoácidos 1-246 da SEQ ID NO: 20; ii) resíduos de aminoácidos 25-283 da SEQ ID NO: 22 ou resíduos de aminoácidos 39-283 da SEQ ID NO: 22; iii) resíduos de aminoácidos 25-283 da SEQ ID NO: 24 ou resíduos de aminoácidos 39-283 da SEQ ID NO: 24 ou resíduos de aminoácidos 1-260 da SEQ ID NO: 25; iv) resíduos de aminoácidos 39-283 da SEQ ID NO: 27; v) resíduos de aminoácidos 52-289 da SEQ ID NO: 29 ou resíduos de aminoácidos 1-263 da SEQ ID NO: 30 vi) resíduos de aminoácidos 21-282 da SEQ ID NO: 32 ou resíduos de aminoácidos 38-282 da SEQ ID NO: 32; vii) resíduos de aminoácidos 25-280 da SEQ ID NO: 38 ou resíduos de aminoácidos 36-280 da SEQ ID NO: 38; e viii) Purafine; ou b) um polipeptídeo compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 75% de identidade com uma ou mais das sequências de aminoácidos em a); ou c) um fragmento funcional de a) ou b).

Exemplos Estirpes e DNA

[0217] O DNA codificando a PLC da SEQ ID NO: 2 foi clonado a partir de uma espécie Pseudomonas isolada de uma amostra de alga marinha recolhida na Dinamarca.

[0218] O DNA codificando a PLC da SEQ ID NO: 19 foi clonado a partir de um Bacillus sp obtido de uma amostra de solo recolhida na Austrália em 1990.

[0219] O DNA otimizado quanto a códons codificando as PLCs publicamente conhecidas foi encomendado das empresas Geneart (SEQ ID NO: 22, na SEQ ID NO: 27 e SEQ ID NO: 29) e Gen9 (SEQ ID NO: 5, na SEQ ID NO: 8 , SEQ ID NO: 11 , SEQ ID NO: 14).

[0220] Nos exemplos que se seguem, as enzimas de fosfolipase C da presente invenção são referidas pela SEQ ID NO. Se a SEQ ID NO contiver um peptídeo de sinal, subentende-se que é feita referência à sequência madura dessa SEQ ID NO.

Exemplo 1: Clonagem e expressão

[0221] Os genes codificando fosfolipase foram clonados por meio de técnicas convencionais a partir das estirpes indicadas em cima ou encomendadas como genes sintéticos e inseridos em um plasmídeo adequado. Os genes foram expressados com o sinal de secreção com a seguinte sequência de aminoácidos MKKPLGKIVASTALLISVAFSSSIASA (SEQ ID NO: 33) substituindo a sequência de sinal de secreção nativo por uma alanina extra no terminal C. Isto resulta em um polipeptídeo maduro recombinante com uma alanina na frente do terminal N da sequência de tipo selvagem madura. Os genes codificando SEQ ID NO: 22, 27 e SEQ ID NO: 38 foram clonados usando a mesma estratégia, contudo sem ser adicionada qualquer alanina extra ao terminal C do peptídeo de sinal. Assim, o polipeptídeo maduro recombinante não contém uma alanina na frente do terminal N da sequência de tipo selvagem madura.

[0222] Um clone com a sequência gênica recombinante correta fo selecionado e o plasmídeo correspondente foi integrado por recombinação homóloga no genoma da célula hospedeira de Bacillus subtilis (lócus da pectato liase) e a construção do gene foi expressada sob o controle de um sistema de promotor triplo como descrito em WO99/43835. O gene codificando cloranfenicol acetitransferase foi usado como marcador (como descrito em Diderichsen et al., 1993, Plasmid 30:312-315).

[0223] Os transformantes resistentes a cloranfenicol foram analisados por PCR para verificar o tamanho correto do fragmento amplificado. Um clone B. subtilis recombinante contendo a construção de expressão integrada foi selecionado e cultivado em uma mesa vibrante rotativa em frascos Erlenmeyer com chicanas de 500 mL, contendo cada um 100 mL de meio baseado em extrato de levedura. O clone foi cultivado durante 5 dias a 30 °C. Os sobrenadantes contendo enzima foram coletados e a enzima purificada como descrito no Exemplo 2.

Exemplo 2: Purificação de fosfolipase C Purificação do peptídeo maduro da SEQ ID NO 3:

[0224] O caldo de cultura sem células foi submetido a troca de tampão em 50 mM de MES com pH 6,5 usando um leito empacotado de resina Sephadex® G-25. As frações recolhidas foram carregadas em uma permuta catiônica Source 15S e eluídas usando um gradiente de 0-100% 50 mM de MES + 0,5 M de NaCl com pH 6,5 em 10 CV's. Frações foram analisadas por SDS-PAGE (condições redutoras) e agrupadas com base na pureza.

Purificação do polipeptídeo maduro da SEQ ID NO: 20:

[0225] Inicialmente, foi realizada uma etapa de captura de impurezas usando um leito empacotado de uma decilamina agarose (Acetyleret Decylaminagarose, Cat.no. CS76, UpFront Cromatography A/S, Lers0 Parkalle 42, 2100 Copenhaga 0, Dinamarca). Tampão de ligação: 25 mM de HEPES pH 7,5. Tampão de eluição: Tampão de ligação + 0,01% (p/v) Triton X-100. O fluxo e as frações de lavagem foram agrupados e submetidos a troca de tampão em 50 mM de MES com pH 6,0 por carregamento em um leito empacotado de resina Sephadex® G-25. As frações recolhidas foram carregadas em uma permuta aniônica Source 15Q e eluídas usando um gradiente de 0-100% 50 mM de MES + 0,5 M de NaCl com pH 6,0 em 10 CV's. Frações foram analisadas por SDS-PAGE (condições redutoras) e agrupadas com base na pureza. As frações agrupadas foram concentradas usando dispositivos de filtração centrífuga com 10 kDa MWCO e carregadas em uma coluna de filtração em gel HiLoad™ 26/60 Superdex 200 pg equilibrada usando 20 mM de MES + 125 mM de NaCl com pH 6,0. Frações foram analisadas por SDS-PAGE (condições redutoras) e agrupadas com base na pureza.

Exemplo 3: Peso molecular e sequências de terminal N de PLC Determinação do Peso Molecular:

[0226] As análises de peso molecular intacto foram realizadas usando um espectrômetro de massa de eletropulverização de foco Bruker microTOF (Bruker Daltonik GmbH, Bremen, Alemanha). As amostras foram diluídas para 1mg/ml em água MQ. As amostras diluídas foram lavadas online com uma coluna de dessalinização on-Line MassPREP (2,1x10mm Part no. 186002785 Waters) e introduzidas na fonte de eletropulverização com um fluxo de 200 ul/h por um sistema Agilent LC. A análise de dados é realizada com a versão 3.4 de DataAnalysis (Bruker Daltonik GmbH, Bremen, Alemanha). O peso molecular das amostras foi calculado por desconvolução dos dados em bruto na gama 10.000 a 40.000 Da.

[0227] O peso molecular da fosfolipase C específica para PI da SEQ ID NO: 3 foi 32,7 kDa

[0228] O peso molecular da fosfolipase específica para PC, PE da SEQ ID NO: 20 foi 27,6 kDa

Procedimento de Sequenciação de Terminal N:

[0229] As análises de sequenciação de terminal N foram realizadas usando um sistema de sequenciação de proteína Applied Biosystems Procise®. As amostras foram purificadas em um gel de poliacrilamida pré- fabricado 4-20% SDS da Novex® (Life Technologies). O gel foi usado de acordo com as instruções do fabricante e transferidas para uma membrana PVDF ProBlott® (Applied Biosystems). Para sequência de aminoácidos de terminal N, a banda de proteína principal foi cortada e colocada no cartucho de transferência do sistema de sequenciação de proteína Procise® . A sequenciação de terminal N foi realizada usando o método run file para amostras de membrana PVDF (PVDF de líquido pulsado) de acordo com as instruções do fabricante. A sequência de aminoácidos de terminal N pode ser deduzida dos 7 cromatogramas correspondendo a resíduos de aminoácidos 1 a 7 comparando o tempo de retenção dos picos nos cromatogramas com os tempos de retenção dos aminoácidos PTH no cromatograma padrão.

[0230] A sequência de terminal N do polipeptídeo maduro (SEQ ID NO: 3) foi confirmada como sendo AQESPAF.

[0231] A sequência de terminal N do polipeptídeo maduro (SEQ ID NO: 6) foi confirmada como sendo AQEAVGF

[0232] A sequência de terminal N do polipeptídeo maduro (SEQ ID NO: 9) foi confirmada como sendo AQEAVGF

[0233] A sequência de terminal N do polipeptídeo maduro (SEQ ID NO: 20) foi confirmada como sendo AWSADAP.

Exemplo 4: Termoestabilidade da fosfolipase C

[0234] A termoestabilidade de celobiohidrolases foi determinada por calorimetria diferencial de varredura (DSC) usando um calorímetro VP- Capillary DSC (MicroCal Inc., Piscataway, NJ, EUA). A temperatura de desnaturação térmica, Td (°C), foi tomada como o topo do pico de desnaturação (principal pico endotérmico) em termogramas (Cp vs. T) obtidos após aquecimento das soluções de enzima (aprox. 1 mg/mL) em tampão (50 mM de acetato de sódio a pH 5,5 ± 2mM de CaCl2, ou 50 mM de Hepes a pH 7± 2mM de CaCl2) a uma taxa de aquecimento programada constante de 200 K/hora.

[0235] Soluções de amostra e de referência (aprox. 0,2 mL) foram carregadas para o calorímetro (referência: tampão sem enzima) das condições de armazenamento a 10 °C e termicamente pré-equilibradas por 20 minutos a 20 °C antes da varredura DSC de 20 °C a 100 °C. As temperaturas de desnaturação foram determinadas com uma precisão de cerca de +/- 1 °C. Tabela 2: Temperaturas de desnaturação

Exemplo 5: Especificidade de fosfolipase C em relação a PC, PE, PI, PA de PLCs purificadas

[0236] A especificidade de substrato das enzimas de fosfolipase C da presente invenção e de Purifine foi determinada usando RMN de 31P. Este ensaio segue a conversão de fosfolipídeos individuais mostrados na Figura 1 em um ambiente de óleo e revela a especificidade de substrato e preferência da fosfolipase, e providencia uma indicação do pH ótimo das enzimas.

Substrato

[0237] Foram usados óleos de soja em bruto com o seguinte teor dos fosfolipídeos específicos medido por RMN de P. PA: 80-140 ppm de fósforo (P) PE: 140-200 ppm de P PI: 70-110 ppm de P PC: 130-200 ppm de P

[0238] Podem também ser aplicados outros óleos em bruto em este ensaio, por exemplo de colza, girassol, milho, semente de algodão, amendoim, farelo de arroz. O critério principal é que o óleo contenha no mínimo 300 ppm de cada um dos fosfolipídeos específicos (para ficar significativamente acima do limite de quantificação NMR). Assegurar a mistura antes do óleo em bruto ser pipetado (precipita ao longo do tempo).

Tampões e enzima

[0239] Solução de 0,2 M de Cs-EDTA pH 7,5: EDTA (5,85 g) é disperso em água MQ (50 mL). O pH é ajustado até 7,5 usando CsOH a 50% de p/p (aprox. 30 mL), que dissolverá o EDTA completamente. É adicionada água MQ até um volume total de 100 mL para dar uma concentração de 0,2 M. Padrão interno: solução de 2 mg/mL de fosfato de trifenila (TPP) em MeOH. Tampões pH: citrato de Na a 100 mM, pH 4,0 citrato de Na a 100 mM, pH 5,5 citrato de Na a 100 mM, pH 7,0 Enzima: Diluir para concentrações de 0,9, 0,27, e 0,09 mg de proteína enzimática (EP) / mL nos três tampões e manter frio para ser usado no mesmo dia.

Ensaio

[0240] 250 micro-L de óleo em bruto foram pesados e colocados em um tubo Eppendorf de 2 mL e foram adicionados 25 micro-L de enzimas no tampão de pH desejado. Isto resulta em 10, 30 e 100 mg EP/kg de óleo. A mistura foi incubada em um termoagitador a 50 °C durante 2 horas. □ Depois foi adicionada uma solução padrão de 0,500 mL de fosfato, 0,5 mL de clorofórmio-d (CDCl3) e 0,5 mL de tampão Cs-EDTA. Foi obtida separação de fase após 30 segundos de agitação seguida de centrifugação (centrífuga de bancada, 3 minutos, 13.400 rpm). A fase inferior foi transferida para um tubo NMR. Foi realizada RMN de 31P com 128 varrimentos com um tempo de atraso de 5 segundos. Foram integrados todos os sinais. Atribuições (aprox. ppm a 25 C): 1,7 (PA), -0,1 (PE), -0,5 (PI), -0,8 (PC). A posição dos sinais pode mudar significativamente de acordo com valor de pH, temperatura, concentração da amostra exatos, etc. A concentração de cada espécie é calculada como "ppm de P", i.e., mg de fósforo elementar por kg de amostra de óleo. Consequentemente, ppm de P = I/I(IS) * n(IS) * M(P) / m (óleo). A % remanescente de fosfolipídeos é calculada como o rácio de concentração de fosfolipídeos na amostra tratada com enzimas para a concentração em uma amostra em branco.

Resultados

[0241] Os resultados são resumidos nas tabelas 3 a 10 em baixo. Tabela 3: Especificidade de fosfolipase da SEQ ID NO: 3

Tabela 4: Especificidade de fosfolipase da SEQ ID NO: 20.

Tabela 5: Especificidade de fosfolipase da SEQ ID NO: 22 (aminoácidos 25-283).

Tabela 6: Especificidade de fosfolipase da SEQ ID NO: 27.

Tabela 7: Especificidade de fosfolipase da SEQ ID NO: 30.

Tabela 8: Especificidade de fosfolipase da SEQ ID NO: 36.

Tabela 9: Especificidade de fosfolipase da SEQ ID NO: 38 (aminoácidos 36-280).

Tabela 10: Especificidade de Purifine.

A concentração de Purifine é estimada como sendo 15 mg/mL.

Exemplo 6: Especificidade de fosfolipase C em relação a PC, PE, PI, PA de sobrenadantes de enzimas em bruto

[0242] Para além dos resultados de amostras de enzimas purificadas no Exemplo 5, a atividade de fosfolipase de vários homólogos PLC fo testada usando sobrenadante PLC não diluído em bruto em óleo de soja em bruto em um rácio de 1:10 (v/v). As concentrações de enzimas foram desconhecidas e não houve controle de pH, tendo de outro modo sido seguido o protocolo do Exemplo 5. Tabela 11: Hidrólise de fosfolipídeos com PLC não diluído em bruto contendo sobrenadante.

Exemplo 7: Ensaio de degomagem

[0243] O desempenho de enzimas de fosfolipase C da presente invenção e Purifine, bem como de combinações de enzimas de fosfolipase C específica para Pi e específica para PC, PE, foi testado em um ensaio de degomagem que mimetiza a degomagem à escala industrial. O ensaio mediu os seguintes parâmetros na fase de óleo após a degomagem: a) Teor de diglicerídeos por Cromatografia líquida de alto desempenho (HPLC) acoplada a Detetor de Dispersão de Luz Evaporativo (ELSD), ou Detector por Aerossol Carregado (Corona Veo). b) Quantificação das espécies de fosfolipídeos individuais: Fosfatidilcolina (PC); fosfatidilinositol (PI); fosfatidiletanolamina (PE); ácido fosfatídico (PA); por espectrômetro de massa de quadrupolo de cromatografia líquido por tempo de vôo (LC/TOF/MS) c) Redução de fósforo total por espectrometria de emissão ótica com plasma indutivamente acoplado (ICP-OES).

[0244] A composição fosfolipídica no óleo de soja em bruto 2 ou óleo 3, usada nos experimentos, é indicada na tabela 12. A composição fo medida por LC/MS como fósforo originando de espécies fosfolipídicas individuais. Tabela 12: Composição fosfolipídica de óleo em bruto (mg/kg de fósforo).

Ensaio de degomagem

[0245] Óleo de soja em bruto (75 g) foi inicialmente pré-tratado com ácido/base (ou não) para facilitar conversão de fosfolipídeos insolúveis em formas mais hidratáveis e assegurar um ambiente adequado para a enzima. Pré-tratamento ácido/base foi realizado por adição de ácido de ácido ortofosfórico (solução a 85%) aplicado em quantidades iguais a 0,05% (ácido ortofosfórico 100% puro) com base na quantidade de óleo e mistura em banho ultrassônico (BRANSON 3510) durante 5 minutos e incubação em rotor durante 15 minutos seguido de neutralização de base com 4 M NaOH aplicado em equivalentes (de 0,5 a 1,5) para ácido ortofosfórico puro em banho ultrassônico por 5 minutos. A reação de enzima fo conduzida em sistema aquoso baixo (3% de água total com base na quantidade de óleo) em tubos de centrifugação de 100 mL, cilíndricos, com fundo cônico. As amostras foram tratadas ultrassonicamente durante 5 minutos, seguido de incubação em uma câmara aquecida à temperatura selecionada (de 50 a 60 °C) com agitação a 20 rpm durante um tempo de incubação selecionado (de 1 a 5 horas). Para separar a mistura em uma fase de óleo e uma fase pesada de água/goma, as amostras foram centrifugadas a 700 g a 85 °C por 15 minutos (Koehler Instruments, centrífuga de óleo K600X2).

a) Medição de diglicerídeos

[0246] O método HPLC-ELSD ou HPLC- Corona Veo (usando equipamento DIONEX e coluna Lichrocart Si-60, 5 μm, Lichrosphere 250-4 mm, MERCK) foi baseado no princípio do Método Oficial AOCS Cd 11d-96 e quantifica o teor de diglicerídeos até 0,1% em peso.

b) Análise quantitativa de fosfolipídeos por LCMS/MS

[0247] Cromatografia líquida acoplada a espectrômetro de massa de quadruplo triplo (LC/MS/MS) ou acoplada a espectrômetro de massa de quadrupolo por tempo de vôo (LC/TOF/MS) foi usada para quantificar as espécies de fosfolipídeos individuais: fosfatidilcolina (PC); fosfatidilinositol (PI); fosfatidiletanolamina (PE) e ácido fosfatídico (fosfatidato) (PA). A sensibilidade do ensaio baixa para menos de 1 mg de fósforo/kg de óleo por PC, PE e PI (ppm) e menos de 10 mg de fósforo/kg por PA. A amostra de óleo foi dissolvida em clorofórmio. O extrato foi então analisado em LC- TOF-MS (ou em LC-MS/MS se forem necessários limites de detecção inferiores) usando as seguintes definições: Definição de LC Eluente A: Acetonitrila a 50%,água a 50%, ácido fórmico a 0,15% Eluente B: Ácido isopropiônico a 100%, ácido fórmico a 0,15% Tempo de processamento: 26,9 min Fluxo: 0,50 mL/min Temperatura da coluna: 50 °C Temperatura de autoamostrador: 15-25 °C Volume de injeção: 1 μL Material do tipo de coluna: Híbrido de superfície carregado, comprimento: 50 mm, tamanho:1,7μm, ID: 2,1 mm Definições de MS

[0248] Os dados foram processados usando software MassLynx versão 4.1. No exemplos em baixo, o método é apenas denominado LCMS.

c) Medição de fósforo/fosfolipídeo

[0249] O ICP-OES quantifica o teor de fósforo (P) e outros metais tais como Ca, Mg, Zn até 4 ppm com uma precisão de aproximadamente ± 1 ppm de P.

[0250] Os Exemplos 8 a 12 em baixo descrevem resultados obtidos usando o ensaio de degomagem de este exemplo.

Exemplo 8: Robustez de enzima a diferente acidez dos pré- tratamentos do óleo

[0251] A fosfolipase C específica para PI da SEQ ID NO: 3 foi aplicada no ensaio de degomagem testando diferentes pré-tratamentos ácido/base do óleo em bruto 3. Foi medido o teor de diglicerídeos após degomagem enzimática a 50 °C e 60 °C durante 1 e 3 horas. Os resultados são mostrados na tabela 13. Tabela 13. Aumento de diglicerídeo após tratamento com enzima de óleo de soja pré-tratado com ácido/base medido por HPLC- ELSD.

[0252] No ensaio de degomagem, a fosfolipase C específica para P da SEQ ID NO: 3 converte os fosfolipídeos PI em diglicerídeos em algumas horas. É alcançada conversão total após três horas com base no pressuposto de que 182 ppm de P originando de PI (medido por LCMS) é igual a 0,50% de fosfolipídeo PI (Mw PI~857 g/mol, Mw P~31 g/mol) igual a 0,40% de aumento de DG (80% da molécula de fosfolipídeo). A enzima mostrou bom desempenho na degomagem com água (sem ácido/base), bem como em degomagem auxiliada com ácido seguido de neutralização com base com concentrações variáveis de NaOH. Isto demonstrou robustez em relação a condições de pH variáveis no processo de degomagem.

Exemplo 9: Efeito da dosagem de enzimas

[0253] A fosfolipase C específica para PI da SEQ ID NO: 3 foi aplicada no ensaio de degomagem em várias dosagens de enzimas no óleo em bruto 3. Foi medido o teor de diglicerídeos após degomagem enzimática a 60 °C por 1, 2, 3 e 5 horas (óleo pré-tratado com 0,05% de ácido fosfórico/1,5 eqv. de NaOH). Os resultados são mostrados na tabela 14. Tabela 14: Aumento de diglicerídeo após tratamento com enzima de óleo de soja pré-tratado com ácido/base medido por HPLC- ELSD.

[0254] No ensaio de degomagem, a fosfolipase C específica para P da SEQ ID NO: 3 converteu fosfolipídeos PI em diglicerídeos em 1-5 horas com dosagem de enzimas de1 a 20 mg de EP/kg de óleo. Os dados demonstram um efeito de dose/resposta com conversão mais rápida de fosfolipídeo para diglicerídeo com maior dosagem de enzimas. O teor de P após degomagem foi reduzido para menos de 1 mg/kg de óleo em todos os casos (medido por LCMS) e mostra que a enzima ataca as espécies PI.

Exemplo 10: Combinação de PLC específica para PI e PLC específica para PC, PE a 50 °C

[0255] A fosfolipase C específica para PI da SEQ ID NO: 3 foi aplicada no ensaio de degomagem a 50 °C em combinação com as fosfolipases específicas de PC, PE, PLC de Purifine e a PLC da SEQ ID NO: 22 aplicando óleo em bruto 3 pré-tratado com 0,05% de ácido fosfórico/1,5 eqv. de NaOH. Foi medido o teor de diglicerídeos após degomagem enzimática por 1, 2, 3 e 5 horas, bem como o teor de metal. Os resultados são mostrados na tabela 15A + B. Tabela 15A: Aumento de diglicerídeos após tratamento de enzimas de óleo de soja pré-tratado com ácido fosfórico a 0,05%/1,5 eqv. de NaOH medido por HPLC-ELSD.

Tabela 15B: Composição de Ca, Mg, P (mg/kg de óleo) medida por ICP-OES após 5 horas de tratamento com enzimas.

[0256] Degomagem com a fosfolipase C específica para PI da SEQ ID NO: 3 combinada com PLC específica para PC, PE (Purifine PLC ou SEQ ID NO: 22) resultou em formação de diglicerídeo significativa a 50 °C. As misturas resultaram em um efeito combinado comparado com as soluções individuais visto por um maior aumento de DG. O teor de fósforo em óleo degomado foi reduzido para um nível final desejável abaixo de 5 mg/kg e é igual a conversão “total”.

Exemplo 11 Combinação de PLC específica para PI com PLC específica para PC, PE a 60 °C

[0257] A fosfolipase C específica para PI da SEQ ID NO: 3 foi aplicada no ensaio de degomagem a 60 °C sozinha ou em combinação com a PLC específica para PC, PE da SEQ ID NO: 22 em óleo em bruto 3 pré-tratado com ácido fosfórico a 0,05%/1,5 eqv. de NaOH. Foi medido o teor de diglicerídeos após degomagem enzimática durante 1, 2, 3 e 5 horas. Os resultados são mostrados na tabela 16. Tabela 16: Aumento de diglicerídeos após tratamento de enzimas de óleo de soja pré-tratado com ácido fosfórico a 0,05%/1,5 eqv. de NaOH medido por HPLC-ELSD.

[0258] Degomagem com a fosfolipase C específica para PI da SEQ ID NO: 3 combinada com a PLC específica para PC, PE da SEQ ID NO: 22 a 60 °C resultou em um efeito combinado comparado com o efeito das enzimas individuais, e converteu grande parte dos fosfolipídeos (até 87% nas condições testadas (60 °C, 5 horas). O cálculo se baseia no pressuposto de que 864 ppm de P total medido por LC/MS é igual a 2,15% em peso de fosfolipídeo (Mw médio ~772 g/mol) igual ao aumento máximo de 1,72% de DG obtenível (80% de molécula de fosfolipídeo). Os resultados LCMS mostram menos de 4 ppm de P de PI, PC, PE na amostra de óleo degomado e confirma que a mistura ataca a espécie de fosfolipídeos PC; PE; PI.

Exemplo 12: Combinação de PLC específica para PI com PLC específica para PC, PE a 60 °C

[0259] A fosfolipase C específica para PI da SEQ ID NO: 3 foi aplicada no ensaio de degomagem a 60 °C sozinha e em combinação com PLC de Purifine ou SEQ ID NO: 20 em óleo em bruto 2 pré-tratado com ácido fosfórico a 0,05%/1,5 eqv. de NaOH. Foi medido o teor de diglicerídeos após degomagem enzimática durante 3 e 5 horas. Os resultados são mostrados na tabela 17. Tabela 17: Aumento de diglicerídeos após tratamento de enzimas de óleo de soja pré-tratado com ácido fosfórico a 0,05%/1,5 eqv. de NaOH medido por HPLC-ELSD.

[0260] As espécies fosfolipídicas PI, PE e PC, que são as espécies hidrolisadas pelas enzimas aplicadas, perfazem 60% do total de 732 ppm de fosfolipídeos no óleo em bruto usado determinado por LC/MS, equivalendo ao aumento máximo de 0,86% de DG após hidrólise total. Degomagem com a fosfolipase C específica para PI da SEQ ID NO: 3 combinada com a PLC específica para PC, PE da SEQ ID NO: 20 ou PLC de Purifine resulta em um efeito combinado comparado com o efeito das enzimas individuais e converte até 51% dos fosfolipídeos totais a 60 °C, 5 horas. Isto corresponde a hidrólise da maioria do PI, PE e PC na amostra de óleo em bruto. Os cálculos se baseiam na média de fosfolipídeos MW de 772 g/mol.

Exemplo 13: Degomagem usando PLC específica para PI em combinação com PLC específica para PC, PE a 60 °C.

[0261] A fosfolipase C específica para PC, PE (SEQ ID NO: 22 (aminoácidos 25-283), SEQ ID NO: 25 e SEQ ID NO:27 foi aplicada no ensaio de degomagem a 60 °C sozinha e em combinação com fosfolipase C específica para PI da SEQ ID NO: 3 em óleo em bruto 5. As fosfolipases foram doseadas como caldo de fermentação filtrado por volume (2 ou 4 mL) por 50 g de óleo em bruto para além de Purifine doseada como 4 mg de proteína enzimática por kg de óleo. O aumento de diglicerídeos após degomagem enzimática durante 2 e 5 horas é mostrado na tabela 18. O óleo degomado com água foi pós-tratado com ácido fosfórico a 0,09%/0,5 eqv. NaOH antes de o teor de fósforo ser medido pelo método ICP. Tabela 18: Aumento de diglicerídeos após tratamento com enzimas medido por HPLC-Corona Veo e teor de fósforo medido por ICP após pós-tratamento do óleo com ácido fosfórico a 0,09%/0,5 eqv. NaOH.

[0262] As espécies fosfolipídicas PI, PE e PC, que são as espécies hidrolisadas pelas enzimas aplicadas, perfazem 81% do total de 583 ppm de fosfolipídeos no óleo em bruto usado determinado por LC/MS, equivalendo ao aumento máximo de 0,95% de DG após hidrólise total. Os cálculos se baseiam no fator de conversão de fósforo para fosfolipídeos de 0,0025 e em que os diglicerídeos constituem 80% da molécula do fosfolipídeo. Degomagem com a fosfolipase C específica para PI da SEQ ID NO: 3 combinada com a PLC específica para PC, PE da SEQ ID NO: 22 (aminoácidos 25-283), SEQ ID NO: 25 ou SEQ ID NO: 27 resulta em um efeito combinado comparado com o efeito das enzimas individuais e converte até 70% dos fosfolipídeos acessíveis totais a 60 °C, 5 horas.

Exemplo 14: Degomagem usando PLC específica para PI em combinação com PLC específica para PC, PE a 60 °C.

[0263] A fosfolipase C específica para PC, PE da SEQ ID NO: 22 (aminoácidos 25-283) foi aplicada no ensaio de degomagem a 60 °C sozinha e em combinação com fosfolipase C específica para PI (SEQ ID NO: 9 e SEQ ID NO: 15 usando óleo em bruto 5. As fosfolipases C específicas de PI foram doseadas como caldo de fermentação filtrado por volume (2ml) por 50 g de óleo em bruto enquanto as fosfolipases C específicas de PC, PE foram doseadas como mg de proteína enzimática purificada por kg de óleo (4 mg de EP/kg de óleo). O aumento de diglicerídeos após degomagem enzimática durante 2 e 5 horas é mostrado na tabela 19. O óleo degomado com água foi pós-tratado com ácido fosfórico a 0,09%/0,5 eqv. NaOH antes de o teor de fósforo ser medido pelo método ICP. Tabela 19: Aumento de diglicerídeos após tratamento com enzimas medido por HPLC-Corona Veo e teor de fósforo medido por ICP após pós-tratamento do óleo com ácido fosfórico a 0,09%/0,5 eqv. NaOH.

[0264] As espécies fosfolipídicas PI, PE e PC, que são as espécies hidrolisadas pelas enzimas aplicadas, perfazem 81% do total de 583 ppm de fosfolipídeos no óleo em bruto usado determinado por LC/MS, equivalendo ao aumento máximo de 0,95% de DG após hidrólise total. Degomagem com a fosfolipase C específica para PC; PE da SEQ ID NO: 22 (aminoácidos 25-283) combinada com a PLC específica para PI da SEQ ID NO: 9 e 15 resulta em um efeito combinado comparado com o efeito das enzimas individuais e converte até 70% dos fosfolipídeos acessíveis totais a 60 °C, 2 horas.

Exemplo 15: Degomagem com água usando PLC específica para PI em combinação com PLC específica para PC, PE a 60 °C.

[0265] A fosfolipase C específica para PI da SEQ ID NO: 3 foi aplicada no ensaio de degomagem a 60 °C sozinha e em combinação com fosfolipase C específica para PC, PE (SEQ ID NO: 22 (aminoácidos 25283), SEQ ID NO: 25 e SEQ ID NO:27 (aminoácidos 25-283) em óleo em bruto 4. Purifine e SEQ ID NO 22 (aminoácidos 25-283) foram doseados como mg de proteína enzimática purificada por kg de óleo enquanto o resto foi doseado como caldo de fermentação filtrado por volume por 40 g de óleo em bruto. O aumento de diglicerídeo após degomagem enzimática com água (sem tratamento do óleo com ácido/base) por 2 e 5 horas bem como o teor de fósforo medido por ICP são mostrados na tabela 20. Tabela 20: Aumento de diglicerídeos após tratamento com enzimas medido por HPLC-Corona Veo e teor de fósforo medido por ICP.

[0266] Degomagem com a fosfolipase C específica para PI da SEQ ID NO: 3 combinada com PLC específica para PC, PE (SEQ ID NO: 22 (aminoácidos 25-283), SEQ ID NO: 25 e SEQ ID NO: 27 (aminoácidos 25283)) resultou em formação significativa de diglicerídeos. As espécies fosfolipídicas PI, PE e PC, que são as espécies hidrolisadas pelas enzimas aplicadas, perfazem 98% do total de 974 ppm de fosfolipídeos no óleo em bruto usado determinado por LC/MS, equivalendo ao aumento máximo de 1,91% de DG após hidrólise total. Os cálculos se baseiam no fator de conversão de fósforo para fosfolipídeos de 0,0025 e em que os diglicerídeos constituem 80% da molécula do fosfolipídeo. Degomagem com a fosfolipase C específica para PI da SEQ ID NO: 3 combinada com a PLC específica para PC, PE da SEQ ID NO: 27 resulta em um efeito combinado comparado com o efeito das enzimas individuais e converte até 65% dos fosfolipídeos acessíveis totais a 60 °C, 5 horas. O teor de fósforo em óleo degomado foi reduzido para menos de 5 mg/kg. Exemplo 16: Degomagem com água usando PLC específica para PI em combinação com PLC específica para PC, PE a 60 °C.

[0267] A fosfolipase C específica para PC, PE da SEQ ID NO: 22 (aminoácidos 25-283) foi aplicada no ensaio de degomagem a 60 °C sozinha e em combinação com fosfolipase C específica para PI (SEQ ID NO: 9 e SEQ ID NO: 15 usando óleo em bruto 4. As fosfolipases C específicas de PI foram doseadas como caldo de fermentação filtrado de 2ml por 50 g de óleo em bruto enquanto as fosfolipases C específicas de PC, PE foram doseadas como 4 mg de proteína enzimática por kg de óleo. O aumento de diglicerídeo após degomagem enzimática com água (sem tratamento do óleo com ácido/base) por 2 e 5 horas, bem como o teor de fósforo medido por ICP, são mostrados na tabela 21. Tabela 21: Aumento de diglicerídeos após tratamento com enzimas medido por HPLC-Corona Veo e teor de fósforo medido por ICP.

[0268] Degomagem com a fosfolipase C específica para PC; PE da SEQ ID NO: 22 (aminoácidos 25-283) combinada com a fosfolipase C específica para PI da SEQ ID NO: 9 e 15 resultou em formação significativa de diglicerídeos. As espécies fosfolipídicas PI, PE e PC, que são as espécies hidrolisadas pelas enzimas aplicadas, perfazem 98% do total de 974 ppm de fosfolipídeos no óleo em bruto usado determinado por LC/MS, equivalendo ao aumento máximo de 1,91% de DG após hidrólise total. Degomagem com a PLC específica para PC, PE da SEQ ID NO: 22 (aminoácidos 25-283) combinada com a fosfolipase C específica para PI da SEQ ID NO: 9 e 15 combinadas resulta em um efeito combinado comparado com o efeito das enzimas individuais e converte até 69% dos fosfolipídeos acessíveis totais a 60 °C, 5 horas. O teor de fósforo em óleo degomado foi reduzido para menos de 5 mg/kg.

Exemplo 17: Degomagem com água usando PLC específica para PI em combinação com PLC específica para PC, PE a 60 °C.

[0269] A fosfolipase C específica para PC, PE da SEQ ID NO: 22 (aminoácidos 25-283) foi aplicada no ensaio de degomagem a 60 °C sozinha e em combinação com fosfolipase C específica para PI (SEQ ID NO: 3 e SEQ ID NO: 6 usando óleo em bruto 4. As fosfolipases foram doseadas como 4 ml de caldo de fermentação filtrado por 50 g de óleo em bruto. O aumento de diglicerídeo após degomagem enzimática com água (sem tratamento do óleo com ácido/base) por 2 e 5 horas bem como o teor de fósforo medido por ICP após 5 horas são mostrados na tabela 22. Tabela 22: Aumento de diglicerídeos após tratamento com enzimas medido por HPLC-Corona Veo e teor de fósforo medido por ICP.

[0270] Degomagem com a fosfolipase C específica para PC; PE da SEQ ID NO: 22 (aminoácidos 25-283) combinada com a fosfolipase C específica para PI da SEQ ID NO: 3 e 6 resultou em efeito combinado comparado com o efeito das enzimas individuais e converte até 65% dos fosfolipídeos de PI; PC; PE acessíveis totais a 60 °C, 5 horas. O teor de fósforo em óleo degomado foi reduzido para um nível final desejável abaixo de 5 mg/kg, igual a remoção/redução “total” de P.

Exemplo 18: Degomagem usando PLC específica para PI (SEQ ID NO: 38 aminoácidos 25-280) em ensaio de degomagem a 60 °C.

[0271] A fosfolipase C específica para PC, PE da SEQ ID NO: 38 (aminoácidos 25-280) foi aplicada no ensaio de degomagem a 60 °C usando óleo em bruto 5 (óleo diferente). O óleo em bruto 5 foi pré-tratado com ácido fosfórico a 0,09% e 1,5 de equivalentes molares de NaOH antes de incubação com enzimas. A fosfolipase foi doseada como 30 mg de proteína enzimática por kg de óleo. O aumento de diglicerídeo após degomagem enzimática por 2, 4, 6 e 24 horas medido por HPLC-Corona Veo, bem como o teor de fósforo medido por ICP após 24 horas, são mostrados na tabela 23. Tabela 23: Aumento de diglicerídeos após tratamento com enzimas medido por HPLC-Corona Veo e teor de fósforo medido por ICP.

As espécies fosfolipídicas PC e PE, que são as espécies hidrolisadas pelas enzimas aplicadas, perfazem 70% do total de 583 ppm de fosfolipídeos no óleo em bruto usado determinado por LC/MS, equivalendo ao aumento máximo de 0,82% de DG após hidrólise total. Os cálculos se baseiam no fator de conversão de fósforo para fosfolipídeos de 0,0025 e em que os diglicerídeos constituem 80% da molécula do fosfolipídeo. Degomagem com a fosfolipase C da SEQ ID NO: 38 (aminoácidos 25-280) converte até 53% dos fosfolipídeos totais acessíveis a 60 °C, 2 horas. Exemplo 19: SEQ ID NO: 22 (aminoácidos 39-283) e SEQ ID NO: 38 (aminoácidos 36-280) testadas em ensaio de degomagem a 60 °C. Pré-tratamento cítrico com ácido/base

[0272] A fosfolipase C específica para PC, PE da SEQ ID NO: 22 (aminoácidos 39-283) e a fosfolipase C específica para PC, PE da SEQ ID NO: 38 (aminoácidos 36-280) foram aplicadas no ensaio de degomagem a 60 °C usando óleo em bruto 5 (óleo diferente). O óleo em bruto 5 foi pré- tratado com ácido cítrico a 0,065% e 1,5 de equivalentes molares de NaOH antes de incubação com enzimas. A fosfolipase foi doseada como 4 ml de caldo de fermentação filtrado por 50 g de óleo em bruto. O aumento de diglicerídeo após degomagem enzimática por 2 e 5 horas, bem como o teor de fósforo medido por ICP após 2 horas, são mostrados na tabela 24. Tabela 24: Aumento de diglicerídeos após tratamento com enzimas medido por HPLC-Corona Veo e teor de fósforo medido por ICP.

[0273] A invenção descrita e reivindicada nesse documento não é para ser limitada no escopo pelos aspetos específicos aqui divulgados, uma vez que esses aspetos se pretendem como ilustrações de vários aspetos da invenção. É pretendido que quaisquer aspetos equivalentes estejam dentro do escopo da presente invenção. De fato, várias modificações da invenção adicionalmente àquelas mostradas e descritas aqui se tornarão aparentes àqueles peritos na técnica a partir da descrição acima mencionada. Tais modificações se destinam também a estar dentro do escopo das reivindicações anexas. Em caso de conflito, a presente divulgação, incluindo definições, imperará.

Claims

1. Composição caracterizada por compreender uma fosfatidilinositol fosfolipase C e um polipeptídeo de fosfolipase C específica para fosfatidilcolina ("PC") e fosfatidiletanolamina ("PE"), em que a fosfatidilinositol fosfolipase C é um polipeptídeo que consiste em uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo consistindo de resíduos de aminoácidos 26-322 da SEQ ID NO: 2 ou resíduos de aminoácidos 1-298 da SEQ ID NO: 3, e em que a polipeptídeo de fosfolipase C específica para PC e PE é um polipeptídeo que consiste em uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo consistindo de resíduos de aminoácidos 39-283 da SEQ ID NO: 24, que possui atividade de fosfolipase C específica para PC e PE.

2. Método para reduzir o teor de fosfolipídeos em uma composição de óleo caracterizado por o método compreender: a) fornecer uma composição de óleo contendo uma quantidade de fosfolipídeos, b) contatar a referida composição de óleo com uma fosfatidilinositol fosfolipase C e uma fosfolipase C específica para PC e PE sob condições suficientes para as enzimas reagirem com os fosfolipídeos para criar diglicerídeo e éster de fosfato; e, c) separar o éster de fosfato da composição de óleo, em que a fosfatidilinositol fosfolipase C e a fosfolipase C específica para PC e PE são os polipeptídeos conforme definidos na reivindicação 1.

3. Método, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado por o óleo ser um óleo comestível selecionado a partir de óleos de farelo de arroz, colza, palma, amendoim e outras nozes, de soja, milho, canola e girassol.

4. Método, de acordo com a reivindicação 2 ou 3, caracterizado por o óleo ser selecionado a partir de óleo em bruto, óleo degomado com água, óleo refinado cáustico e óleo degomado com ácido.

5. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores 2 a 4, caracterizado por o tratamento com fosfolipase ser conduzido por dispersão de uma solução aquosa da fosfolipase no óleo, em que o tratamento de fosfolipase é conduzido a um pH de 4,0 a 7,0, a temperatura está entre 30 e 80 °C, o tempo de reação é de 1 a 12 horas e o tratamento com fosfolipase é seguido de separação de uma fase aquosa e uma fase de óleo.

6. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores 2 a 5, caracterizado por o óleo compreender pelo menos 50 ppm de fósforo originando de fosfatidilinositol (PI).

7. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores 2 a 6, caracterizado por o referido óleo ser contatado: com 0,5-200 mg de proteína enzimática (EP)/Kg de óleo da referida fosfatidilinositol fosfolipase C e com 0,5200 mg de proteína enzimática (EP)/Kg de óleo da referida fosfolipase C específica para PC e PE.

8. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores 2 a 6, caracterizado por compreender as etapas de: i) tratar opcionalmente óleo de soja em bruto com ácido/base adicionando uma solução a 85% de ácido ortofosfórico em quantidades correspondendo a 0,05% (ácido ortofosfórico 100% puro) com base na quantidade de óleo, misturar em banho ultrassônico por 5 minutos, seguido de incubação em rotor por 15 minutos e neutralização com base com 4 M de NaOH aplicado em equivalentes (de 0,5 a 0,15) para ácido ortofosfórico puro em banho ultrassônico por 5 minutos; ii) adicionar o polipeptídeo ao óleo em quantidades de 4 mg de proteína enzimática/kg de óleo em um sistema pouco aquoso compreendendo 3% de água com base na quantidade de óleo e submeter o óleo e o polipeptídeo a tratamento ultrassônico durante 5 minutos; iii) incubar o polipeptídeo e o óleo a 50-60 °C por 5 horas com agitação a 20 rpm; iv) centrifugar o óleo e o polipeptídeo a 700 g a 85 °C durante 15 minutos.