BR112015013399B1 - Uso de polipeptídeo tendo atividade de fosfolipase c e método para redução do conteúdo de componentes contendo fósforo em um óleo comestível - Google Patents

Abstract

POLIPEPTÍDEO ISOLADO, COMPOSIÇÃO , USO DE UM POLIPEPTÍDEO OU DE UMA COMPOSIÇÃO, MÉTODOS PARA REDUÇÃO DO CONTEÚDO DE COMPONENTES CONTENDO FÓSFORO EM UM ÓLEO COMESTÍVEL E DE PRODUÇÃO DE UM POLIPEPTÍDEO, CONSTRUCTO DE ÁCIDO NUCLEICO OU VETOR DE EXPRESSÃO, CÉLULA HOSPEDEIRA RECOMBINANTE, E, PLANTA, PARTE DE PLANTA OU CÉLULA DE PLANTA TRANSGÉNICA TRANSFORMADA COM UM POLINUCLEOTÍDEO. São proporcionados polipeptídeos isolados tendo atividade de fosfolipase C e polinucleotídeos codificando os polipeptídeos. São também proporcionados constructos de ácido nucleico, vetores e células hospedeiras compreendendo os polinucleotídeos bem como métodos de produção e uso dos polipeptídeos.

Description

Referência a uma listagem de sequências

[001] Este pedido contém uma Listagem de Sequências em forma legível por computador, que é incorporada aqui por referência.

Antecedentes da invenção Área da invenção

[002] A presente invenção se relaciona com polipeptídeos tendo atividade de fosfolipase C e polinucleotídeos codificando os polipeptídeos. A invenção se relaciona também com constructos de ácido nucleico, vetores, e células hospedeiras compreendendo os polinucleotídeos bem como métodos de produção e uso dos polipeptídeos.

[003] Adicionalmente, a presente invenção se relaciona com um método para redução do conteúdo de componentes contendo fósforo em óleo comestível compreendendo uma elevada quantidade de fósforo não hidratável, pelo uso da enzima tendo atividade de fosfolipase C.

Descrição da técnica relacionada

[004] São conhecidos vários tipos de fosfolipases que diferem na sua especificidade de acordo com a posição da ligação atacada na molécula de fosfolípido. A fosfolipase A1 (PLA1) remove o ácido graxo na posição 1 para produzir ácido graxo livre e 1-liso-2-acilfosfolípido. A fosfolipase A2 (PLA2) remove o ácido graxo na posição 2 para produzir ácido graxo livre e 1-acil-2- lisofosfolípido. O termo fosfolipase B (PLB) é usado para fosfolipases tendo atividade de A1 e A2. A fosfolipase C (PLC) remove a fração fosfato para produzir 1,2-diacilglicerol e éster de fosfato. A fosfolipase D (PLD) produz 1,2-diacilglicero-fosfato e grupo de base.

[005] Os polipeptídeos tendo atividade de fosfolipase C podem ser aplicados em um processo industrial, p.ex., para refinação de óleos vegetais. Antes do consumo, os óleos comestíveis são degomados para proporcionar óleos vegetais estáveis no armazenamento refinados de sabor neutro e cor clara. O processo de degomação compreende remoção dos componentes de fosfolípido (a goma) da fração de óleo rica em triglicerídeos.

[006] Tradicionalmente, o processo de degomação tem sido baseado em extração de água, tratamento ácido ou cáustico seguido por um processo de separação. Devido às propriedades emulsificantes dos componentes de fosfolípido, o procedimento de degomação tem resultado em uma perda de óleo, i.e., de triglicerídeos.

[007] A degomação enzimática reduz a perda de óleos devido a uma hidrólise enzimática dos fosfolípidos que diminui as propriedades emulsificantes. Existe uma necessidade de enzimas adicionais tendo atividade de fosfolipase C e adequadas para aplicação na degomação enzimática de óleos comestíveis.

[008] Uma enzima tendo atividade de fosfolipase C e 88 % de identidade de sequência com a enzima da presente invenção é conhecida de WO2012062817.

Sumário da invenção

[009] Os inventores isolaram uma nova enzima tendo atividade de fosfolipase C de uma estirpe de Penicillium, ou mais especificamente de uma estirpe de Penicillium emersonii encontrada em 2007 na China. Conformemente, a presente invenção proporciona novos polipeptídeos tendo atividade de fosfolipase C e polinucleotídeos codificando os polipeptídeos.

[0010] A presente invenção se relaciona com polipeptídeos isolados tendo atividade de fosfolipase C selecionados do grupo consistindo em: (a) um polipeptídeo tendo pelo menos 90 % de identidade de sequência com o polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 2; (b) um polipeptídeo codificado por um polinucleotídeo que hibrida sob condições de muito elevada estringência com (i) a sequência codificante do polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 1, ou (ii) o complemento de comprimento total de (i); (c) um polipeptídeo codificado por um polinucleotídeo tendo pelo menos 90 % de identidade de sequência com a sequência codificante do polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 1; (d) uma variante do polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 2 compreendendo uma substituição, deleção, e/ou inserção em uma ou mais (p.ex., várias) posições; e (e) um fragmento do polipeptídeo de (a), (b), (c), ou (d) que tem atividade de fosfolipase C.

[0011] A presente invenção se relaciona também com polinucleotídeos isolados codificando os polipeptídeos da presente invenção; constructos de ácido nucleico, vetores de expressão recombinante; células hospedeiras recombinantes compreendendo os polinucleotídeos; e métodos de produção dos polipeptídeos.

[0012] A presente invenção se relaciona também com uma composição compreendendo os polipeptídeos da presente invenção.

[0013] A presente invenção se relaciona também com o uso do polipeptídeo acima mencionado ou da composição acima mencionada em um processo para hidrólise de fosfolípidos, tal como em um processo para reduzir o conteúdo de fosfolípidos em um óleo comestível.

[0014] A presente invenção se relaciona também com uma planta, parte de planta ou célula de planta transgênica transformada com um polinucleotídeo codificando os polipeptídeos da presente invenção.

Definições

[0015] Atividade de fosfolipase C: O termo "atividade de fosfolipase C" significa a atividade que catalisa a reação: Uma fosfatidilcolina + H2O = 1,2-sn-diacilglicerol + fosfato de colina. A atividade de fosfolipase C pode ser determinada de acordo com o procedimento descrito em "Materiais e Métodos". Uma enzima tendo "atividade de fosfolipase C" pode pertencer a EC 3.1.4.3.

[0016] Os polipeptídeos da presente invenção têm pelo menos 20 %, p.ex., pelo menos 40 %, pelo menos 50 %, pelo menos 60 %, pelo menos 70 %, pelo menos 80 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 %, e pelo menos 100 % da atividade de fosfolipase C do polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 2.

[0017] O termo "atividade de fosfolipase C" significa que um polipeptídeo tendo fosfolipase C terá atividade na direção de um ou mais de fosfatidilcolina (PC), fosfatidiletanolamina (PE), ácido fosfatídico (PA) e inositol de fosfatidila (PI).

[0018] Variante alélica: O termo "variante alélica" significa qualquer uma de duas ou mais formas alternativas de um gene ocupando o mesmo lócus cromossômico. A variação alélica surge naturalmente através de mutação, e pode resultar em polimorfismo dentro de populações. As mutações de genes podem ser silenciosas (nenhuma mudança no polipeptídeo codificado) ou podem codificar polipeptídeos tendo sequências de aminoácidos alteradas. Uma variante alélica de um polipeptídeo é um polipeptídeo codificado por uma variante alélica de um gene.

[0019] Domínio catalítico: O termo "domínio catalítico" significa a região de uma enzima contendo a maquinaria catalítica da enzima.

[0020] cDNA: O termo "cDNA" significa uma molécula de DNA que pode ser preparada por transcrição reversa de uma molécula de mRNA madura, processada, obtida de uma célula eucariótica ou procariótica. O cDNA não tem sequências de íntron que possam estar presentes no correspondente DNA genômico. O transcrito de RNA primário, inicial, é um precursor de mRNA que é processado através de uma série de passos, incluindo processamento, antes de aparecer como mRNA maduro processado.

[0021] Sequência codificante: O termo "sequência codificante" significa um polinucleotídeo, que especifica diretamente a sequência de aminoácidos de um polipeptídeo. As fronteiras da sequência codificante são geralmente determinadas por uma grelha de leitura aberta, que começa com um códon de iniciação tal como ATG, GTG, ou TTG e termina com um códon de terminação tal como TAA, TAG, ou TGA. A sequência codificante pode ser um DNA genômico, cDNA, DNA sintético, ou uma sua combinação.

[0022] Sequências de controle: O termo "sequências de controle" significa sequências de ácidos nucleicos necessárias para expressão de um polinucleotídeo codificando um polipeptídeo maduro da presente invenção. Cada sequência de controle pode ser nativa (i.e., do mesmo gene) ou estranha (i.e., de um gene diferente) ao polinucleotídeo codificando o polipeptídeo ou nativa ou estranha entre si. Tais sequências de controle incluem, mas não estão limitadas a, um líder, sequência de poliadenilação, sequência de pró- peptídeo, promotor, sequência de peptídeo sinal, e terminador da transcrição. No mínimo, as sequências de controle incluem um promotor, e sequências de terminação transcricional e translacional. As sequências de controle podem ser proporcionadas com ligantes para o propósito de introdução de locais de restrição específicos facilitando a ligação das sequências de controle à região codificante do polinucleotídeo codificando um polipeptídeo.

[0023] Expressão: O termo "expressão" inclui qualquer passo envolvido na produção do polipeptídeo incluindo, mas não se limitando a, transcrição, modificação pós-transcricional, tradução, modificação pós- translacional, e secreção.

[0024] Vetor de expressão: O termo "vetor de expressão" significa uma molécula de DNA linear ou circular que compreende um polinucleotídeo codificando um polipeptídeo e está operacionalmente ligado a sequências de controle que proporcionam a sua expressão.

[0025] Fragmento: O termo "fragmento" significa um polipeptídeo tendo um ou mais (p.ex., vários) aminoácidos ausentes do terminal amino e/ou carboxila de um polipeptídeo maduro; em que o fragmento tem atividade de fosfolipase C. Em um aspeto, um fragmento contém pelo menos 1700 resíduos de aminoácidos (p.ex., aminoácidos 1 a 1700 de SEQ ID NO: 2), pelo menos 1600 resíduos de aminoácidos (p.ex., aminoácidos 1 a 1600 de SEQ ID NO: 2), ou pelo menos 1500 resíduos de aminoácidos (p.ex., aminoácidos 1 a 1500 de SEQ ID NO: 2).

[0026] Célula hospedeira: O termo "célula hospedeira" significa qualquer tipo de célula que seja suscetível a transformação, transfecção, transdução, ou similares com um constructo de ácido nucleico ou vetor de expressão compreendendo um polinucleotídeo da presente invenção. O termo "célula hospedeira" engloba qualquer descendência de uma célula genitora que não seja idêntica à célula genitora devido a mutações que ocorrem durante a replicação.

[0027] Isolado: O termo "isolado" significa uma substância em uma forma ou ambiente que não ocorre na natureza. Exemplos não limitantes de substâncias isoladas incluem (1) qualquer substância não ocorrendo naturalmente, (2) qualquer substância incluindo, mas não se limitando a, qualquer enzima, variante, ácido nucleico, proteína, peptídeo ou cofator, que é pelo menos parcialmente removida de um ou mais ou todos os constituintes ocorrendo naturalmente aos quais está associada na natureza; (3) qualquer substância modificada pelo homem em relação a essa substância encontrada na natureza; ou (4) qualquer substância modificada por aumento da quantidade da substância em relação a outros componentes aos quais está naturalmente associada (p.ex., múltiplas cópias de um gene codificando a substância; uso de um promotor mais forte do que o promotor naturalmente associado ao gene codificando a substância). Uma substância isolada pode estar presente em uma amostra de caldo de fermentação.

[0028] Polipeptídeo maduro: O termo "polipeptídeo maduro" significa um polipeptídeo em sua forma final após tradução e quaisquer modificações pós-translacionais, tais como processamento N-terminal, truncação C- terminal, glicosilação, fosforilação, etc. Em um aspeto, o polipeptídeo maduro é os aminoácidos 1 a 594 de SEQ ID NO: 2. Os aminoácidos -16 a -1 de SEQ ID NO: 2 são um peptídeo sinal. É conhecido na técnica que uma célula hospedeira pode produzir uma mistura de dois ou mais polipeptídeos maduros diferentes (i.e., com um aminoácido C-terminal e/ou N-terminal diferente) expressos pelo mesmo polinucleotídeo.

[0029] Sequência codificante do polipeptídeo maduro: O termo "sequência codificante do polipeptídeo maduro" significa um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo maduro tendo atividade de fosfolipase C. Em um aspeto, a sequência codificante do polipeptídeo maduro é os nucleotídeos 49 a 1830 de SEQ ID NO: 1. Os nucleotídeos 1 a 48 de SEQ ID NO: 1 codificam um peptídeo sinal.

[0030] Constructo de ácido nucleico: O termo "constructo de ácido nucleico" significa uma molécula de ácido nucleico, de fita simples ou dupla, que é isolada de um gene ocorrendo naturalmente ou é modificada para conter segmentos de ácidos nucleicos de um modo que de outra maneira não existiria na natureza ou que é sintética, que compreende uma ou mais sequências de controle.

[0031] Operacionalmente ligado: O termo "operacionalmente ligado" significa uma configuração na qual uma sequência de controle é colocada em uma posição apropriada em relação à sequência codificante de um polinucleotídeo tal que a sequência de controle dirija a expressão da sequência codificante.

[0032] Identidade de sequência: A relação entre duas sequências de aminoácidos ou entre duas sequências de nucleotídeos é descrita pelo parâmetro "identidade de sequência".

[0033] Para propósitos da presente invenção, a identidade de sequência entre duas sequências de aminoácidos é determinada usando o algoritmo de Needleman-Wunsch (Needleman e Wunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48: 443-453) como implementado no programa Needle do pacote EMBOSS (EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite, Rice et al., 2000, Trends Genet. 16: 276-277), preferencialmente versão 5.0.0 ou posterior. Os parâmetros usados são penalidade de intervalo aberto de 10, penalidade de extensão de intervalo de 0,5, e a matriz de substituição EBLOSUM62 (versão EMBOSS de BLOSUM62). O resultado de Needle marcado "identidade mais longa" (obtido usando a opção -nobrief) é usado como a identidade percentual e é calculado como se segue: (Resíduos Idênticos x 100)/(Comprimento do Alinhamento - Número Total de Intervalos no Alinhamento)

[0034] Para propósitos da presente invenção, a identidade de sequência entre duas sequências de desoxirribonucleotídeos é determinada usando o algoritmo de Needleman-Wunsch (Needleman e Wunsch, 1970, supra) como implementado no programa Needle do pacote EMBOSS (EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite, Rice et al., 2000, supra), preferencialmente versão 5.0.0 ou posterior. Os parâmetros usados são penalidade de intervalo aberto de 10, penalidade de extensão de intervalo de 0,5, e a matriz de substituição EDNAFULL (versão EMBOSS de NCBI NUC4.4). O resultado de Needle marcado "identidade mais longa" (obtido usando a opção -nobrief) é usado como a identidade percentual e é calculado como se segue: (Desoxirribonucleotídeos Idênticos x 100)/(Comprimento do Alinhamento - Número Total de Intervalos no Alinhamento)

Condições de restringência:

[0035] Condições de muito baixa estringência: O termo "condições de muito baixa estringência" significa, para sondas com pelo menos 100 nucleotídeos em comprimento, pré-hibridação e hibridação a 42 °C em 5X SSPE, SDS a 0,3 %, 200 microgramas/mL de DNA de esperma de salmão cisalhado e desnaturado, e formamida a 25 %, seguindo procedimentos de transferência de Southern padrão durante 12 a 24 horas. O material transportador é finalmente lavado três vezes cada uma durante 15 minutos usando 2X SSC, SDS a 0,2 % a 45 °C.

[0036] Condições de baixa estringência: O termo "condições de baixa estringência" significa, para sondas com pelo menos 100 nucleotídeos de comprimento, pré-hibridação e hibridação a 42 °C em 5X SSPE, SDS a 0,3 %, 200 microgramas/mL de DNA de esperma de salmão cisalhado e desnaturado, e formamida a 25 %, seguindo procedimentos de transferência de Southern padrão durante 12 a 24 horas. O material transportador é finalmente lavado três vezes cada uma durante 15 minutos usando 2X SSC, SDS a 0,2 % a 50 °C.

[0037] Condições de média estringência: O termo "condições de média estringência" significa, para sondas com pelo menos 100 nucleotídeos em comprimento, pré-hibridação e hibridação a 42 °C em 5X SSPE, SDS a 0,3 %, 200 microgramas/mL de DNA de esperma de salmão cisalhado e desnaturado, e formamida a 35 %, seguindo procedimentos de transferência de Southern padrão durante 12 a 24 horas. O material transportador é finalmente lavado três vezes cada uma durante 15 minutos usando 2X SSC, SDS a 0,2 % a 55 °C.

[0038] Condições de média-elevada estringência: O termo "condições de média-elevada estringência" significa, para sondas com pelo menos 100 nucleotídeos de comprimento, pré-hibridação e hibridação a 42 °C em 5X SSPE, SDS a 0,3 %, 200 microgramas/mL de DNA de esperma de salmão cisalhado e desnaturado, e formamida a 35 %, seguindo procedimentos de transferência de Southern padrão durante 12 a 24 horas. O material transportador é finalmente lavado três vezes cada uma durante 15 minutos usando 2X SSC, SDS a 0,2 % a 60 °C.

[0039] Condições de elevada estringência: O termo "condições de elevada estringência" significa, para sondas com pelo menos 100 nucleotídeos em comprimento, pré-hibridação e hibridação a 42 °C em 5X SSPE, SDS a 0,3 %, 200 microgramas/mL de DNA de esperma de salmão cisalhado e desnaturado, e formamida a 50 %, seguindo procedimentos de transferência de Southern padrão durante 12 a 24 horas. O material transportador é finalmente lavado três vezes cada uma durante 15 minutos usando 2X SSC, SDS a 0,2 % a 65 °C.

[0040] Condições de muito elevada estringência: O termo "condições de muito elevada estringência" significa, para sondas com pelo menos 100 nucleotídeos em comprimento, pré-hibridação e hibridação a 42 °C em 5X SSPE, SDS a 0,3 %, 200 microgramas/mL de DNA de esperma de salmão cisalhado e desnaturado, e formamida a 50 %, seguindo procedimentos de transferência de Southern padrão durante 12 a 24 horas. O material transportador é finalmente lavado três vezes cada uma durante 15 minutos usando 2X SSC, SDS a 0,2 % a 70 °C.

[0041] Subsequência: O termo "subsequência" significa um polinucleotídeo tendo um ou mais (p.ex., vários) nucleotídeos ausentes da extremidade 5' e/ou 3' de uma sequência codificante do polipeptídeo maduro; em que a subsequência codifica um fragmento tendo atividade de fosfolipase C. Em um aspeto, uma subsequência contém pelo menos 1800 nucleotídeos (p.ex., nucleotídeos 1 a 1800 de SEQ ID NO: 1), pelo menos 1700 nucleotídeos (p.ex., nucleotídeos 1 a 1700 de SEQ ID NO: 1), ou pelo menos 1600 nucleotídeos (p.ex., nucleotídeos 1 a 1600 de SEQ ID NO: 1).

[0042] Variante: O termo "variante" significa um polipeptídeo tendo atividade de fosfolipase C compreendendo uma alteração, i.e., uma substituição, inserção, e/ou deleção, em uma ou mais (p.ex., várias) posições. Uma substituição significa substituição do aminoácido ocupando uma posição por um aminoácido diferente; uma deleção significa remoção do aminoácido ocupando uma posição; e uma inserção significa adição de um aminoácido adjacente e imediatamente a seguir ao aminoácido ocupando uma posição.

Descrição detalhada da invenção Polipeptídeos tendo atividade de fosfolipase C

[0043] Em uma forma de realização, a presente invenção se relaciona com polipeptídeos isolados tendo uma identidade de sequência com o polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 2 de pelo menos 90 %, pelo menos 91 %, pelo menos 92 %, pelo menos 93 %, pelo menos 94 %, pelo menos 95 %, pelo menos 96 %, pelo menos 97 %, pelo menos 98 %, pelo menos 99 %, ou 100 %, que têm atividade de fosfolipase C. Em um aspeto, os polipeptídeos diferem por não mais do que 10 aminoácidos, p.ex., 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, ou 9, do polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 2.

[0044] Um polipeptídeo da presente invenção preferencialmente compreende a ou consiste na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 2 ou uma sua variante alélica; ou é um seu fragmento tendo atividade de fosfolipase C. Em outro aspeto, o polipeptídeo compreende o ou consiste no polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 2. Em outro aspeto, o polipeptídeo compreende os ou consiste nos aminoácidos 1 a 594 de SEQ ID NO: 2.

[0045] Em outra forma de realização, a presente invenção se relaciona com um polipeptídeo isolado tendo atividade de fosfolipase C codificado por um polinucleotídeo que hibrida sob condições de muito baixa estringência, condições de baixa estringência, condições de média estringência, condições de média-elevada estringência, condições de elevada estringência, ou condições de muito elevada estringência com (i) a sequência codificante do polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 1, ou (ii) o complemento de comprimento total de (i) (Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2a edição, Cold Spring Harbor, Nova Iorque).

[0046] O polinucleotídeo de SEQ ID NO: 1, ou uma sua subsequência, bem como o polipeptídeo de SEQ ID NO: 2 ou um seu fragmento, pode ser usado para desenhar sondas de ácido nucleico para identificar e clonar DNA codificando polipeptídeos tendo atividade de fosfolipase C a partir de estirpes de diferentes gêneros ou espécies de acordo com métodos bem conhecidos na técnica. Em particular, tais sondas podem ser usadas para hibridação com o DNA genômico ou cDNA de uma célula de interesse, seguindo procedimentos de transferência de Southern padrão, de modo a identificar e isolar o gene correspondente aí. Tais sondas podem ser consideravelmente mais curtas do que a sequência inteira, mas devem ter pelo menos 15, p.ex., pelo menos 25, pelo menos 35, ou pelo menos 70 nucleotídeos em comprimento. Preferencialmente, a sonda de ácido nucleico tem pelo menos 100 nucleotídeos em comprimento, p.ex., pelo menos 200 nucleotídeos, pelo menos 300 nucleotídeos, pelo menos 400 nucleotídeos, pelo menos 500 nucleotídeos, pelo menos 600 nucleotídeos, pelo menos 700 nucleotídeos, pelo menos 800 nucleotídeos, ou pelo menos 900 nucleotídeos em comprimento. Podem ser usadas sondas tanto de DNA como de RNA. As sondas são tipicamente marcadas para detecção do gene correspondente (por exemplo, com 32P, 3H, 35S, biotina, ou avidina). Tais sondas são englobadas pela presente invenção.

[0047] Uma biblioteca de DNA genômico ou cDNA preparada a partir de tais outras estirpes pode ser rastreada quanto a DNA que hibrida com as sondas descritas acima e codifica um polipeptídeo tendo atividade de fosfolipase C. O DNA genômico ou outro de tais outras estirpes pode ser separado por eletroforese em gel de agarose ou de poliacrilamida, ou por outras técnicas de separação. O DNA das bibliotecas ou o DNA separado pode ser transferido para, e imobilizado em, nitrocelulose ou outro material transportador adequado. De modo a identificar um clone ou DNA que hibrida com SEQ ID NO: 1 ou uma sua subsequência, o material transportador é usado em uma transferência de Southern.

[0048] Para propósitos da presente invenção, hibridação indica que o polinucleotídeo hibrida com uma sonda de ácido nucleico marcada correspondendo a (i) SEQ ID NO: 1, (ii) a sequência codificante do polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 1; (iii) ao seu complemento de comprimento total; ou (iv) a uma sua subsequência; sob condições de muito baixa a muito elevada estringência. Moléculas com as quais a sonda de ácido nucleico hibrida sob estas condições podem ser detetadas usando, por exemplo, filme de raios X ou qualquer outro meio de detecção conhecido na técnica.

[0049] Em um aspeto, a sonda de ácido nucleico é os nucleotídeos 55 a 1900, nucleotídeos 100 a 1800, nucleotídeos 300 a 1200, ou nucleotídeos 500 a 1000 de SEQ ID NO: 1. Em outro aspeto, a sonda de ácido nucleico é um polinucleotídeo que codifica o polipeptídeo de SEQ ID NO: 2; o seu polipeptídeo maduro; ou um seu fragmento. Em outro aspeto, a sonda de ácido nucleico é SEQ ID NO: 1. Em outra forma de realização, a presente invenção se relaciona com um polipeptídeo isolado tendo atividade de fosfolipase C codificado por um polinucleotídeo tendo uma identidade de sequência com a sequência codificante do polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 1 de pelo menos 60 %, p.ex., pelo menos 65 %, pelo menos 70 %, pelo menos 75 %, pelo menos 80 %, pelo menos 80 %, pelo menos 90 %, pelo menos 91 %, pelo menos 92 %, pelo menos 93 %, pelo menos 94 %, pelo menos 95 %, pelo menos 96 %, pelo menos 97 %, pelo menos 98 %, pelo menos 99 %, ou 100 %.

[0050] Em outra forma de realização, a presente invenção se relaciona com variantes do polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 2 compreendendo uma substituição, deleção, e/ou inserção em uma ou mais (p.ex., várias) posições. Em uma forma de realização, o número de substituições, deleções e/ou inserções de aminoácidos introduzidas no polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 2 é não mais do que 10, p.ex., 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 ou 9. As mudanças de aminoácidos podem ser de uma natureza mínima, isto é, substituições ou inserções de aminoácidos conservativas que não afetam significativamente o dobramento e/ou atividade da proteína; pequenas deleções, tipicamente de 1- 30 aminoácidos; pequenas extensões do terminal amino ou carboxila, tal como um resíduo de metionina amino-terminal; um pequeno peptídeo ligante de até 20-25 resíduos; ou uma pequena extensão que facilita a purificação por mudança da carga total ou outra função, tal como um trato de poli-histidina, um epítopo antigênico ou um domínio de ligação.

[0051] Exemplos de substituições conservativas estão dentro dos grupos de aminoácidos básicos (arginina, lisina e histidina), aminoácidos ácidos (ácido glutâmico e ácido aspártico), aminoácidos polares (glutamina e asparagina), aminoácidos hidrofóbicos (leucina, isoleucina e valina), aminoácidos aromáticos (fenilalanina, triptofano e tirosina), e pequenos aminoácidos (glicina, alanina, serina, treonina e metionina). Substituições de aminoácidos que não alteram geralmente a atividade específica são conhecidas na técnica e são descritas, por exemplo, por H. Neurath e R.L. Hill, 1979, Em, The Proteins, Academic Press, Nova Iorque. Substituições comuns são Ala/Ser, Val/Ile, Asp/Glu, Thr/Ser, Ala/Gly, Ala/Thr, Ser/Asn, Ala/Val, Ser/Gly, Tyr/Phe, Ala/Pro, Lys/Arg, Asp/Asn, Leu/Ile, Leu/Val, Ala/Glu, e Asp/Gly.

[0052] Alternativamente, as mudanças de aminoácidos são de uma tal natureza que as propriedades físicoquímicas dos polipeptídeos são alteradas. Por exemplo, as mudanças de aminoácidos podem melhorar a estabilidade térmica do polipeptídeo, alterar a especificidade quanto ao substrato, mudar o pH ótimo, e similares.

[0053] Aminoácidos essenciais em um polipeptídeo podem ser identificados de acordo com procedimentos conhecidos na técnica, tais como mutagênese sítio-dirigida ou mutagênese de varredura da alanina (Cunningham e Wells, 1989, Science 244: 1081-1085). Em esta última técnica, mutações de alanina simples são introduzidas em todos os resíduos da molécula, e as moléculas mutantes resultantes são testadas quanto a atividade de fasfolipase C protease para identificar resíduos de aminoácidos que são críticos para a atividade da molécula. Ver também, Hilton et al., 1996, J. Biol. Chem. 271: 4699-4708. O local ativo da enzima ou outra interação biológica pode ser também determinado por análise física da estrutura, como determinado por tais técnicas como ressonância magnética nuclear, cristalografia, difração de elétrons, ou marcação por fotoafinidade, em conjunto com mutação de aminoácidos de local de contato putativo. Ver, por exemplo, de Vos et al., 1992, Science 255: 306-312; Smith et al., 1992, J. Mol. Biol. 224: 899-904; Wlodaver et al., 1992, FEBS Lett. 309: 59-64. A identidade de aminoácidos essenciais pode ser também inferida a partir de um alinhamento com um polipeptídeo relacionado.

[0054] Substituições, deleções, e/ou inserções simples ou múltiplas de aminoácidos podem ser feitas e testadas usando métodos conhecidos de mutagênese, recombinação, e/ou embaralhamento, seguidos por um procedimento de rastreio relevante, tal como aqueles divulgados por Reidhaar-Olson e Sauer, 1988, Science 241: 53-57; Bowie e Sauer, 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 2152-2156; WO 95/17413; ou WO 95/22625. Outros métodos que podem ser usados incluem PCR propensa a erros, exibição de fagos (p.ex., Lowman et al., 1991, Biochemistry 30: 1083210837; Patente dos E.U.A. No. 5,223,409; WO 92/06204) e mutagênese direcionada para região (Derbyshire et al., 1986, Gene 46: 145; Ner et al., 1988, DNA 7: 127).

[0055] Podem ser combinados métodos de mutagênese/embaralhamento com métodos de rastreio automatizados, de elevado rendimento, para detetar a atividade de polipeptídeos mutagenizados, clonados, expressos por células hospedeiras (Ness et al., 1999, Nature Biotechnology 17: 893-896). Moléculas de DNA mutagenizadas que codificam polipeptídeos ativos podem ser recuperadas das células hospedeiras e rapidamente sequenciadas usando métodos padrão na técnica. Estes métodos permitem a determinação rápida da importância de resíduos de aminoácidos individuais em um polipeptídeo.

Fontes de polipeptídeos tendo atividade de fosfolipase C

[0056] Um polipeptídeo tendo atividade de fosfolipase C da presente invenção pode ser obtido de microrganismos de qualquer gênero. Para propósitos da presente invenção, o termo "obtido de" como usado aqui em conexão com uma dada fonte deve significar que o polipeptídeo codificado por um polinucleotídeo é produzido pela fonte ou por uma estirpe na qual o polinucleotídeo da fonte foi inserido. Em um aspeto, o polipeptídeo obtido de uma dada fonte é secretado extracelularmente.

[0057] O polipeptídeo pode ser um polipeptídeo fúngico. Por exemplo, o polipeptídeo pode ser um polipeptídeo de levedura tal como um polipeptídeo de Candida, Kluyveromyces, Pichia, Saccharomyces, Schizosaccharomyces, ou Yarrowia; ou um polipeptídeo fúngico filamentoso tal como um polipeptídeo de Acremonium, Agaricus, Alternaria, Aspergillus, Aureobasidium, Botryospaeria, Ceriporiopsis, Chaetomidium, Chrysosporium, Claviceps, Cochliobolus, Coprinopsis, Coptotermes, Corynascus, Cryphonectria, Cryptococcus, Diplodia, Exidia, Filibasidium, Fusarium, Gibberella, Holomastigotoides, Humicola, Irpex, Kinochaeta, Lentinula, Leptospaeria, Magnaporthe, Melanocarpus, Meripilus, Metarhizium, Mucor, Myceliophthora, Neocallimastix, Neurospora, Paecilomyces, Penicillium, Phanerochaete, Piromyces, Poitrasia, Pseudoplectania, Pseudotrichonympha, Rhizomucor, Schizophyllum, Scytalidium, Talaromyces, Thermoascus, Thielavia, Tolypocladium, Trichoderma, Trichophaea, Verticillium, Volvariella, ou Xylaria.

[0058] Em outro aspeto, o polipeptídeo é um polipeptídeo de Saccharomyces carlsbergensis, Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces diastaticus, Saccharomyces douglasii, Saccharomyces kluyveri, Saccharomyces norbensis, ou Saccharomyces oviformis.

[0059] Em outro aspeto, o polipeptídeo é um polipeptídeo de Acremonium cellulolyticus, Aspergillus aculeatus, Aspergillus awamori, Aspergillus foetidus, Aspergillus fumigatus, Aspergillus japonicus, Aspergillus nidulans, Aspergillus niger, Aspergillus oryzae, Chrysosporium inops, Chrysosporium keratinophilum, Chrysosporium lucknowense, Chrysosporium merdarium, Chrysosporium pannicola, Chrysosporium queenslandicum, Chrysosporium tropicum, Chrysosporium zonatum, Fusarium bactridioides, Fusarium cerealis, Fusarium crookwellense, Fusarium culmorum, Fusarium graminearum, Fusarium graminum, Fusarium heterosporum, Fusarium negundi, Fusarium oxysporum, Fusarium reticulatum, Fusarium roseum, Fusarium sambucinum, Fusarium sarcochroum, Fusarium sporotrichioides, Fusarium sulphureum, Fusarium torulosum, Fusarium trichothecioides, Fusarium venenatum, Humicola grisea, Humicola insolens, Humicola lanuginosa, Irpex lacteus, Kinochaeta sp., Mucor miehei, Myceliophthora thermophila, Neurospora crassa, Metarhizium anisopliae, Penicillium emersonii, Aspergillus fumigates, Penicillium funiculosum, Penicillium oxalicum, Penicillium purpurogenum, Penicillium thomii, Phanerochaete chrysosporium, Thielavia achromatica, Thielavia albomyces, Thielavia albopilosa, Thielavia australeinsis, Thielavia fimeti, Thielavia microspora, Thielavia ovispora, Thielavia peruviana, Thielavia setosa, Thielavia spededonium, Thielavia subthermophila, Thielavia terrestris, Trichoderma harzianum, Trichoderma koningii, Trichoderma longibrachiatum, Trichoderma reesei, ou Trichoderma viride.

[0060] Em um aspeto preferencial, o polipeptídeo é um polipeptídeo de Penicillium emersonii.

[0061] Será entendido que, para as espécies acima mencionadas, a invenção engloba tanto os estados perfeitos como imperfeitos, e outros equivalentes taxonômicos, p.ex., anamorfos, independentemente do nome da espécie pelo qual sejam conhecidos. Aqueles peritos na técnica irão prontamente reconhecer a identidade de equivalentes apropriados.

[0062] Estirpes destas espécies estão prontamente acessíveis ao público em um número de coleções de culturas, tais como a American Type Culture Collection (ATCC), Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DSMZ), Centraalbureau Voor Schimmelcultures (CBS), e Agricultural Research Service Patent Culture Collection, Northern Regional Research Center (NRRL).

[0063] O polipeptídeo pode ser identificado e obtido a partir de outras fontes, incluindo microrganismos isolados da natureza (p.ex., solo, compostos, água, etc.) ou amostras de DNA obtidas diretamente de materiais naturais (p.ex., solo, compostos, água, etc.) usando as sondas acima mencionadas. Técnicas para isolamento de microrganismos e DNA diretamente a partir de habitats naturais são bem conhecidas na técnica. Um polinucleotídeo codificando o polipeptídeo pode ser depois obtido por rastreio similar de uma biblioteca de DNA genômico ou cDNA de um outro microrganismo ou amostra de DNA misto. Uma vez detetado um polinucleotídeo codificando um polipeptídeo com a(s) sonda(s), o polinucleotídeo pode ser isolado ou clonado por utilização de técnicas que são conhecidas daqueles com perícia ordinária na técnica (ver, p.ex., Sambrook et al., 1989, supra).

Polinucleotídeos

[0064] A presente invenção se relaciona também com polinucleotídeos isolados codificando um polipeptídeo da presente invenção, como descrito aqui.

[0065] As técnicas usadas para isolar ou clonar um polinucleotídeo são conhecidas na técnica e incluem isolamento a partir de DNA genômico ou cDNA, ou uma sua combinação. A clonagem dos polinucleotídeos a partir de DNA genômico pode ser efetuada, p.ex., usando a bem conhecida reação em cadeia da polimerase (PCR) ou rastreio com anticorpos de bibliotecas de expressão para detetar fragmentos de DNA clonados com características estruturais partilhadas. Ver, p.ex., Innis et al., 1990, PCR: A Guide to Methods and Application, Academic Press, Nova Iorque. Podem ser usados outros procedimentos de amplificação de ácidos nucleicos tais como reação em cadeia da ligase (LCR), transcrição ativada por ligação (LAT) e amplificação baseada em polinucleotídeos (NASBA). Os polinucleotídeos podem ser clonados de uma estirpe de Penicillium, ou de um organismo relacionado, e, assim, por exemplo, podem ser uma variante alélica ou de espécies da região codificante de polipeptídeo do polinucleotídeo.

[0066] A modificação de um polinucleotídeo codificando um polipeptídeo da presente invenção pode ser necessária para síntese de polipeptídeos substancialmente similares ao polipeptídeo. O termo "substancialmente similar" ao polipeptídeo se refere a formas do polipeptídeo não ocorrendo naturalmente. Estes polipeptídeos podem diferir de algum modo manipulado do polipeptídeo isolado de sua fonte nativa, p.ex., variantes que diferem na atividade específica, termoestabilidade, pH ótimo, ou similares. As variantes podem ser construídas com base no polinucleotídeo apresentado como a sequência codificante do polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 1, p.ex., uma sua subsequência, e/ou por introdução de substituições de nucleotídeos que não resultam em uma mudança da sequência de aminoácidos do polipeptídeo, mas que correspondem ao uso de códons do organismo hospedeiro pretendido para produção da enzima, ou por introdução de substituições de nucleotídeos que podem dar origem a uma sequência de aminoácidos diferente. Para uma descrição geral de substituições de nucleotídeos ver, p.ex., Ford et al., 1991, Protein Expression and Purification 2: 95-107.

Constructos de ácido nucleico

[0067] A presente invenção se relaciona também com constructos de ácido nucleico compreendendo um polinucleotídeo da presente invenção operacionalmente ligado a uma ou mais sequências de controle que dirigem a expressão da sequência codificante em uma célula hospedeira adequada sob condições compatíveis com as sequências de controle.

[0068] Um polinucleotídeo pode ser manipulado em uma variedade de modos para proporcionar expressão do polipeptídeo. A manipulação do polinucleotídeo antes da sua inserção em um vetor pode ser desejável ou necessária dependendo do vetor de expressão. As técnicas para modificação de polinucleotídeos utilizando métodos de DNA recombinante são bem conhecidas na técnica.

[0069] A sequência de controle pode ser um promotor, um polinucleotídeo que é reconhecido por uma célula hospedeira para expressão do polinucleotídeo codificando um polipeptídeo da presente invenção. O promotor contém sequências de controle transcricional que medeiam a expressão do polipeptídeo. O promotor pode ser qualquer polinucleotídeo que mostre atividade transcricional na célula hospedeira incluindo promotores mutantes, truncados, e híbridos, e pode ser obtido de genes codificando polipeptídeos extracelulares ou intracelulares homólogos ou heterólogos à célula hospedeira.

[0070] Exemplos de promotores adequados para direcionamento da transcrição dos constructos de ácidos nucleicos da presente invenção em uma célula hospedeira bacteriana são os promotores obtidos do gene da alfa- amilase (amyQ) de Bacillus amyloliquefaciens, gene da alfa-amilase (amyL) de Bacillus licheniformis, gene da penicilinase (penP) de Bacillus licheniformis, gene da amilase maltogênica (amyM) de Bacillus stearothermophilus, gene da levansucrase (sacB) de Bacillus subtilis, genes xylA e xylB de Bacillus subtilis, gene cryIIIA de Bacillus thuringiensis (Agaisse e Lereclus, 1994, Molecular Microbiology 13: 97-107), operon lac de E. coli, promotor trc de E. coli (Egon et al., 1988, Gene 69: 301-315), gene da agarase (dagA) de Streptomyces coelicolor, e gene da beta-lactamase procariótica (Villa-Kamaroff et al., 1978, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75: 3727-3731), bem como o promotor tac (DeBoer et al., 1983, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80: 21-25). Promotores adicionais são descritos em "Useful proteins from recombinant bacteria" em Gilbert et al., 1980, Scientific American 242: 74-94; e em Sambrook et al., 1989, supra. Exemplos de promotores tandem são divulgados em WO 99/43835.

[0071] Exemplos de promotores adequados para direcionamento da transcrição dos constructos de ácido nucleico da presente invenção em uma célula hospedeira fúngica filamentosa são os promotores obtidos dos genes da acetamidase de Aspergillus nidulans, alfa-amilase neutra de Aspergillus niger, alfa-amilase ácida estável de Aspergillus niger, glucoamilase (glaA) de Aspergillus niger ou Aspergillus awamori, amilase TAKA de Aspergillus oryzae, protease alcalina de Aspergillus oryzae, triose fosfato isomerase de Aspergillus oryzae, protease do tipo tripsina de Fusarium oxysporum (WO 96/00787), amiloglucosidase de Fusarium venenatum (WO 00/56900), Daria de Fusarium venenatum (WO 00/56900), Quinn de Fusarium venenatum (WO 00/56900), lipase de Rhizomucor miehei, proteinase aspártica de Rhizomucor miehei, beta-glucosidase de Trichoderma reesei, celobiohidrolase I de Trichoderma reesei, celobiohidrolase II de Trichoderma reesei, endoglucanase I de Trichoderma reesei, endoglucanase II de Trichoderma reesei, endoglucanase III de Trichoderma reesei, endoglucanase IV de Trichoderma reesei, endoglucanase V de Trichoderma reesei, xilanase I de Trichoderma reesei, xilanase II de Trichoderma reesei, beta-xilosidase de Trichoderma reesei, bem como o promotor NA2-tpi (um promotor modificado de um gene da alfa-amilase neutra de Aspergillus no qual o líder não traduzido foi substituído por um líder não traduzido de um gene da triose fosfato isomerase de Aspergillus; exemplos não limitantes incluem promotores modificados de um gene da alfa-amilase neutra de Aspergillus niger nos quais o líder não traduzido foi substituído por um líder não traduzido de um gene da triose fosfato isomerase de Aspergillus nidulans ou Aspergillus oryzae); e seus promotores mutantes, truncados, e híbridos.

[0072] Em um hospedeiro de levedura, promotores úteis são obtidos dos genes da enolase (ENO-1) de Saccharomyces cerevisiae, galactoquinase (GAL1) de Saccharomyces cerevisiae, álcool desidrogenase/gliceraldeído-3- fosfato desidrogenase (ADH1, ADH2/GAP) de Saccharomyces cerevisiae, triose fosfato isomerase (TPI) de Saccharomyces cerevisiae, metalotioneína (CUP1) de Saccharomyces cerevisiae, e 3-fosfoglicerato quinase de Saccharomyces cerevisiae. Outros promotores úteis para células hospedeiras de levedura são descritos por Romanos et al., 1992, Yeast 8: 423-488.

[0073] A sequência de controle pode ser também um terminador da transcrição, que é reconhecido por uma célula hospedeira para terminar a transcrição. O terminador está operacionalmente ligado ao terminal 3' do polinucleotídeo codificando o polipeptídeo. Na presente invenção pode ser usado qualquer terminador que seja funcional na célula hospedeira.

[0074] Terminadores preferenciais para células hospedeiras bacterianas são obtidos dos genes da protease alcalina (aprH) de Bacillus clausii, alfa-amilase (amyL) de Bacillus licheniformis, e RNA ribossômico (rrnB) de Escherichia coli.

[0075] Terminadores preferenciais para células hospedeiras fúngicas filamentosas são obtidos dos genes da antranilato sintase de Aspergillus nidulans, glucoamilase de Aspergillus niger, alfa-glucosidase de Aspergillus niger, amilase TAKA de Aspergillus oryzae e protease do tipo tripsina de Fusarium oxysporum.

[0076] Terminadores preferenciais para células hospedeiras de levedura são obtidos dos genes da enolase de Saccharomyces cerevisiae, citocromo C (CYC1) de Saccharomyces cerevisiae, e gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase de Saccharomyces cerevisiae. Outros terminadores úteis para células hospedeiras de levedura são descritos por Romanos et al., 1992, supra.

[0077] A sequência de controle pode ser também uma região estabilizadora de mRNA a jusante de um promotor e a montante da sequência codificante de um gene que aumenta a expressão do gene.

[0078] Exemplos de regiões estabilizadoras de mRNA adequadas são obtidos de um gene cryIIIA de Bacillus thuringiensis (WO 94/25612) e um gene SP82 de Bacillus subtilis (Hue et al., 1995, Journal of Bacteriology 177: 3465-3471).

[0079] A sequência de controle pode ser também um líder, uma região não traduzida de um mRNA que é importante para tradução pela célula hospedeira. O líder está operacionalmente ligado ao terminal 5' do polinucleotídeo codificando o polipeptídeo. Pode ser usado qualquer líder que seja funcional na célula hospedeira.

[0080] Líderes preferenciais para células hospedeiras fúngicas filamentosas são obtidos dos genes da amilase TAKA de Aspergillus oryzae e triose fosfato isomerase de Aspergillus nidulans.

[0081] Líderes adequados para células hospedeiras de levedura são obtidos dos genes da enolase (ENO-1) de Saccharomyces cerevisiae, 3- fosfoglicerato quinase de Saccharomyces cerevisiae, fator alfa de Saccharomyces cerevisiae e álcool desidrogenase/gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase (ADH2/GAP) de Saccharomyces cerevisiae.

[0082] A sequência de controle pode ser também uma sequência de poliadenilação, uma sequência operacionalmente ligada ao terminal 3' do polinucleotídeo e, quando transcrita, é reconhecida pela célula hospedeira como um sinal para adicionar resíduos de poliadenosina a mRNA transcrito. Pode ser usada qualquer sequência de poliadenilação que seja funcional na célula hospedeira.

[0083] Sequências de poliadenilação preferenciais para células hospedeiras fúngicas filamentosas são obtidas dos genes da antranilato sintase de Aspergillus nidulans, glucoamilase de Aspergillus niger, alfa-glucosidase de Aspergillus niger, amilase TAKA de Aspergillus oryzae e protease do tipo tripsina de Fusarium oxysporum.

[0084] Sequências de poliadenilação úteis para células hospedeiras de levedura são descritas por Guo e Sherman, 1995, Mol. Cellular Biol. 15: 5983-5990.

[0085] A sequência de controle pode ser também uma região codificante do peptídeo sinal que codifica um peptídeo sinal ligado ao terminal N de um polipeptídeo e que dirige o polipeptídeo para a via secretora da célula. A extremidade 5' da sequência codificante do polinucleotídeo pode conter inerentemente uma sequência codificante do peptídeo sinal naturalmente ligada em grelha de leitura de tradução ao segmento da sequência codificante que codifica o polipeptídeo. Alternativamente, a extremidade 5' da sequência codificante pode conter uma sequência codificante de um peptídeo sinal que é estranha à sequência codificante. Uma sequência codificante do peptídeo sinal estranha pode ser requerida onde a sequência codificante não contém naturalmente uma sequência codificante do peptídeo sinal. Alternativamente, uma sequência codificante do peptídeo sinal estranha pode simplesmente substituir a sequência codificante do peptídeo sinal natural de modo a intensificar a secreção do polipeptídeo. No entanto pode ser usada qualquer sequência codificante do peptídeo sinal que dirija o polipeptídeo expresso para a via secretora de uma célula hospedeira.

[0086] Sequências codificantes do peptídeo sinal eficazes para células hospedeiras bacterianas são as sequências codificantes do peptídeo sinal obtidas dos genes da amilase maltogênica de Bacillus NCIB 11837, subtilisina de Bacillus licheniformis, beta-lactamase de Bacillus licheniformis, alfa-amilase de Bacillus stearothermophilus, proteases neutras (nprT, nprS, nprM) de Bacillus stearothermophilus, e prsA de Bacillus subtilis. Peptídeos sinal adicionais são descritos por Simonen e Palva, 1993, Microbiological Reviews 57: 109-137.

[0087] Sequências codificantes do peptídeo sinal eficazes para células hospedeiras fúngicas filamentosas são as sequências codificantes do peptídeo sinal obtidas dos genes da amilase neutra de Aspergillus niger, glucoamilase de Aspergillus niger, amilase TAKA de Aspergillus oryzae, celulase de Humicola insolens, endoglucanase V de Humicola insolens, lipase de Humicola lanuginosa, e proteinase aspártica de Rhizomucor miehei.

[0088] Peptídeos de sinal úteis para células hospedeiras de levedura são obtidos dos genes do fator alfa de Saccharomyces cerevisiae e invertase de Saccharomyces cerevisiae. Outras sequências codificantes do peptídeo sinal úteis são descritas por Romanos et al., 1992, supra.

[0089] A sequência de controle pode ser também uma sequência codificante de pró-peptídeos que codifica um pró-peptídeo posicionado no terminal N de um polipeptídeo. O polipeptídeo resultante é conhecido como uma pró-enzima ou pró-polipeptídeo (ou um zimogênio em alguns casos). Um pró-polipeptídeo está geralmente inativo e pode ser convertido em um polipeptídeo ativo por clivagem catalítica ou autocatalítica do pró-peptídeo a partir do pró-polipeptídeo. A sequência codificante do pró-peptídeo pode ser obtida dos genes da protease alcalina (aprE) de Bacillus subtilis, protease neutra (nprT) de Bacillus subtilis, lacase de Myceliophthora thermophila (WO 95/33836), proteinase aspártica de Rhizomucor miehei, e fator alfa de Saccharomyces cerevisiae.

[0090] Onde estiverem presentes sequências do peptídeo sinal e pró- peptídeo, a região do pró-peptídeo está posicionada junto ao terminal N de um polipeptídeo e a sequência do peptídeo sinal está posicionada junto ao terminal N da sequência do pró-peptídeo.

[0091] Pode ser também desejável adicionar sequências reguladoras que regulem a expressão do polipeptídeo em relação ao crescimento da célula hospedeira. Exemplos de sistemas reguladores são aqueles que fazem com que a expressão do gene seja ligada ou desligada em resposta a um estímulo químico ou físico, incluindo a presença de um composto regulador. Sistemas reguladores em sistemas procarióticos incluem os sistemas operadores lac, tac e trp. Em levedura pode ser usado o sistema ADH2 ou sistema GAL1. Em fungos filamentosos podem ser usados o promotor de glucoamilase de Aspergillus niger, o promotor de alfa-amilase TAKA de Aspergillus oryzae, e o promotor de glucoamilase de Aspergillus oryzae. Outros exemplos de sequências reguladoras são aquelas que permitem amplificação do gene. Em sistemas eucarióticos, estas sequências reguladoras incluem o gene da diidrofolato reductase que é amplificado na presença de metotrexato, e os genes de metalotioneína que são amplificados com metais pesados. Em estes casos, o polinucleotídeo codificando o polipeptídeo estaria operacionalmente ligado à sequência reguladora.

Vetores de Expressão

[0092] A presente invenção se relaciona também com vetores de expressão recombinantes compreendendo um polinucleotídeo da presente invenção, um promotor, e sinais de terminação transcricional e translacional. As várias sequências de nucleotídeos e de controle podem ser unidas para produzir um vetor de expressão recombinante que possa incluir um ou mais locais de restrição convenientes para permitir a inserção ou substituição do polinucleotídeo codificando o polipeptídeo em tais locais. Alternativamente, o polinucleotídeo pode ser expresso por inserção do polinucleotídeo ou um constructo de ácido nucleico compreendendo o polinucleotídeo em um vetor apropriado para expressão. Na criação do vetor de expressão, a sequência codificante está localizada no vetor de modo que a sequência codificante esteja operacionalmente ligada às sequências de controle apropriadas para expressão.

[0093] O vetor de expressão recombinante pode ser qualquer vetor (p.ex., um plasmídeo ou vírus) que possa ser convenientemente sujeito a procedimentos de DNA recombinante e possa provocar expressão do polinucleotídeo. A escolha do vetor dependerá tipicamente da compatibilidade do vetor com a célula hospedeira na qual o vetor é para ser introduzido. O vetor pode ser um plasmídeo linear ou circular fechado.

[0094] O vetor pode ser um vetor autonomamente replicante, i.e., um vetor que existe como uma entidade extracromossômica, cuja replicação é independente da replicação cromossômica, p.ex., um plasmídeo, um elemento extracromossômico, um minicromossomo, ou um cromossomo artificial. O vetor pode conter quaisquer meios para assegurar a autorreplicação. Alternativamente, o vetor pode ser um que, quando introduzido na célula hospedeira, seja integrado no genoma e replicado em conjunto com o(s) cromossomo(s) nos(s) qual(ais) foi integrado. Além disso pode ser usado um único vetor ou plasmídeo ou dois ou mais vetores ou plasmídeos que contenham em conjunto o DNA total a ser introduzido no genoma da célula hospedeira, ou um transpóson.

[0095] O vetor contém preferencialmente um ou mais marcadores selecionáveis que permitem seleção fácil de células transformadas, transfectadas, transduzidas, ou similares. Um marcador selecionável é um gene cujo produto proporciona resistência biocida ou viral, resistência a metais pesados, prototrofia a auxotrofos, e similares.

[0096] Exemplos de marcadores selecionáveis bacterianos são genes dal de Bacillus licheniformis ou Bacillus subtilis, ou marcadores que conferem resistência a antibióticos tal como resistência a ampicilina, cloranfenicol, canamicina, neomicina, espectinomicina, ou tetraciclina. Marcadores adequados para células hospedeiras levedura incluem, mas não estão limitados a, ADE2, HIS3, LEU2, LYS2, MET3, TRP1, e URA3. Marcadores selecionáveis para uso em uma célula hospedeira fúngica filamentosa incluem, mas não estão limitados a, amdS (acetamidase), argB (ornitina carbamoíltransferase), bar (fosfinotricina acetiltransferase), hph (higromicina fosfotransferase), niaD (nitrato reductase), pyrG (orotidina-5’- fosfato descarboxilase), sC (sulfato adeniltransferase), e trpC (antranilato sintase), bem como seus equivalentes. Preferenciais para uso em uma célula de Aspergillus são genes amdS e pyrG de Aspergillus nidulans ou Aspergillus oryzae e um gene bar de Streptomyces hygroscopicus.

[0097] O vetor contém preferencialmente um elemento(s) que permite(m) a integração do vetor no genoma da célula hospedeira ou replicação autônoma do vetor na célula independente do genoma.

[0098] Para integração no genoma da célula hospedeira, o vetor pode se basear na sequência do polinucleotídeo codificando o polipeptídeo ou qualquer outro elemento do vetor para integração no genoma por recombinação homóloga ou não homóloga. Alternativamente, o vetor pode conter polinucleotídeos adicionais para direcionamento da integração por recombinação homóloga no genoma da célula hospedeira em um local(ais) preciso(s) no(s) cromossomo(s). Para aumentar a probabilidade de integração em uma localização precisa, os elementos de integração devem conter um número suficiente de ácidos nucleicos, tal como 100 a 10.000 pares de bases, 400 a 10.000 pares de bases, e 800 a 10.000 pares de bases, que têm um elevado grau de identidade de sequência com a sequência alvo correspondente para intensificar a probabilidade de recombinação homóloga. Os elementos de integração podem ser qualquer sequência que seja homóloga com a sequência alvo no genoma da célula hospedeira. Além disso, os elementos de integração podem ser polinucleotídeos não codificantes ou codificantes. Por outro lado, o vetor pode ser integrado no genoma da célula hospedeira por recombinação não homóloga.

[0099] Para replicação autônoma, o vetor pode compreender adicionalmente uma origem de replicação permitindo que o vetor se replique autonomamente na célula hospedeira em questão. A origem da replicação pode ser qualquer replicador de plasmídeo mediando a replicação autônoma que funcione em uma célula. O termo "origem da replicação" ou "replicador de plasmídeo" significa um polinucleotídeo que permite que um plasmídeo ou vetor se replique in vivo.

[00100] Exemplos de origens de replicação bacterianas são as origens de replicação de plasmídeos pBR322, pUC19, pACYC177 e pACYC184 permitindo replicação em E. coli, e pUB110, pE194, pTA1060 e pAMβl permitindo replicação em Bacillus.

[00101] Exemplos de origens de replicação para uso em uma célula hospedeira de levedura são origem de replicação de 2 mícrons, ARS1, ARS4, a combinação de ARS1 e CEN3, e a combinação de ARS4 e CEN6.

[00102] Exemplos de origens de replicação úteis em uma célula fúngica filamentosa são AMA1 e ANS1 (Gems et al., 1991, Gene 98: 61-67; Cullen et al., 1987, Nucleic Acids Res. 15: 9163-9175; WO 00/24883). O isolamento do gene AMA1 e a construção de plasmídeos ou vetores compreendendo o gene podem ser alcançados de acordo com os métodos divulgados em WO 00/24883.

[00103] Pode ser inserida mais do que uma cópia de um polinucleotídeo da presente invenção em uma célula hospedeira para aumentar a produção de um polipeptídeo. Um aumento no número de cópias do polinucleotídeo pode ser obtido por integração de pelo menos uma cópia adicional da sequência no genoma da célula hospedeira ou por inclusão de um gene marcador selecionável amplificável com o polinucleotídeo onde células contendo cópias amplificadas do gene marcador selecionável, e deste modo cópias adicionais do polinucleotídeo, podem ser selecionadas por cultivo das células na presença do agente selecionável apropriado.

[00104] Os procedimentos usados para ligar os elementos descritos acima para construir os vetores de expressão recombinantes da presente invenção são bem conhecidos de um perito na arte (ver, p.ex., Sambrook et al., 1989, supra).

Células Hospedeiras

[00105] A presente invenção se relaciona também com células hospedeiras recombinantes, compreendendo um polinucleotídeo da presente invenção operacionalmente ligado a uma ou mais sequências de controle que dirigem a produção de um polipeptídeo da presente invenção. Um constructo ou vetor compreendendo um polinucleotídeo é introduzido em uma célula hospedeira tal que o constructo ou vetor seja mantido como um integrante cromossômico ou como um vetor extracromossômico autorreplicante como descrito anteriormente. O termo "célula hospedeira" engloba qualquer descendência de uma célula genitora que não é idêntica à célula genitora devido a mutações que ocorrem durante a replicação. A escolha de uma célula hospedeira dependerá em grande medida do gene codificando o polipeptídeo e da sua fonte.

[00106] A célula hospedeira pode ser qualquer célula útil na produção recombinante de um polipeptídeo da presente invenção, p.ex., um procariota ou um eucariota.

[00107] A célula hospedeira procariótica pode ser qualquer bactéria Gram-positiva ou Gram-negativa. Bactérias Gram-positivas incluem, mas não estão limitadas a, Bacillus, Clostridium, Enterococcus, Geobacillus, Lactobacillus, Lactococcus, Oceanobacillus, Staphylococcus, Streptococcus, e Streptomyces. Bactérias Gram-negativas incluem, mas não estão limitadas a, Campylobacter, E. coli, Flavobacterium, Fusobacterium, Helicobacter, Ilyobacter, Neisseria, Pseudomonas, Salmonella, e Ureaplasma.

[00108] A célula hospedeira bacteriana pode ser qualquer célula de Bacillus incluindo, mas não se limitando a, células de Bacillus alkalophilus, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus brevis, Bacillus circulans, Bacillus clausii, Bacillus coagulans, Bacillus firmus, Bacillus lautus, Bacillus lentus, Bacillus licheniformis, Bacillus megaterium, Bacillus pumilus, Bacillus stearothermophilus, Bacillus subtilis, e Bacillus thuringiensis.

[00109] A célula hospedeira bacteriana pode ser também qualquer célula de Streptococcus incluindo, mas não se limitando a, células de Streptococcus equisimilis, Streptococcus pyogenes, Streptococcus uberis e Streptococcus equi subsp. Zooepidemicus.

[00110] A célula hospedeira bacteriana pode ser também qualquer célula de Streptomyces incluindo, mas não limitada a, células de Streptomyces achromogenes, Streptomyces avermitilis, Streptomyces coelicolor, Streptomyces griseus, e Streptomyces lividans.

[00111] A introdução de DNA em uma célula de Bacillus pode ser efetuada por transformação com protoplastos (ver, p.ex., Chang e Cohen, 1979, Mol. Gen. Genet. 168: 111-115), transformação com células competentes (ver, p.ex., Young e Spizizen, 1961, J. Bacteriol. 81: 823-829, ou Dubnau e Davidoff-Abelson, 1971, J. Mol. Biol. 56: 209-221), eletroporação (ver, p.ex., Shigekawa e Dower, 1988, Biotechniques 6: 742751), ou conjugação (ver, p.ex., Koehler e Thorne, 1987, J. Bacteriol. 169: 5271-5278). A introdução de DNA em uma célula de E. coli pode ser efetuada por transformação com protoplastos (ver, p.ex., Hanahan, 1983, J. Mol. Biol. 166: 557-580) ou eletroporação (ver, p.ex., Dower et al., 1988, Nucleic Acids Res. 16: 6127-6145). A introdução de DNA em uma célula de Streptomyces pode ser efetuada por transformação com protoplastos, eletroporação (ver, p.ex., Gong et al., 2004, Folia Microbiol. (Praha) 49: 399-405), conjugação (ver, p.ex., Mazodier et al., 1989, J. Bacteriol. 171: 3583-3585), ou transdução (ver, p.ex., Burke et al., 2001, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98: 6289-6294). A introdução de DNA em uma célula de Pseudomonas pode ser efetuada por eletroporação (ver, p.ex., Choi et al., 2006, J. Microbiol. Methods 64: 391-397) ou conjugação (ver, p.ex., Pinedo e Smets, 2005, Appl. Environ. Microbiol. 71: 51-57). A introdução de DNA em uma célula de Streptococcus pode ser efetuada por competência natural (ver, p.ex., Perry e Kuramitsu, 1981, Infect. Immun. 32: 1295-1297), transformação com protoplastos (ver, p.ex., Catt e Jollick, 1991, Microbios 68: 189-207), eletroporação (ver, p.ex., Buckley et al., 1999, Appl. Environ. Microbiol. 65: 3800-3804), ou conjugação (ver, p.ex., Clewell, 1981, Microbiol. Rev. 45: 409-436). No entanto pode ser usado qualquer método conhecido na técnica para introdução de DNA em uma célula hospedeira.

[00112] A célula hospedeira pode ser também um eucariota, tal como uma célula de mamífero, de inseto, de planta, ou fúngica.

[00113] A célula hospedeira pode ser uma célula fúngica. "Fungos" como usado aqui incluem os filos Ascomycota, Basidiomycota, Chytridiomycota, e Zygomycota bem como os Oomycota e todos os fungos mitospóricos (como definido por Hawksworth et al., Em, Ainsworth and Bisby’s Dictionary of The Fungi, 8a edição, 1995, CAB International, University Press, Cambridge, RU).

[00114] A célula hospedeira fúngica pode ser uma célula de levedura. "Levedura" como usado aqui inclui levedura ascosporógena (Endomycetales), levedura basidiosporógena, e levedura pertencendo aos Fungi Imperfecti (Blastomycetes). Uma vez que a classificação de leveduras pode mudar no futuro, para os propósitos desta invenção, a levedura deve ser definida como descrito em Biology and Activities of Yeast (Skinner, Passmore, e Davenport, editores, Soc. App. Bacteriol. Symposium Series No. 9, 1980).

[00115] A célula hospedeira de levedura pode ser uma célula de Candida, Hansenula, Kluyveromyces, Pichia, Saccharomyces, Schizosaccharomyces, ou Yarrowia, tal como uma célula de Kluyveromyces lactis, Saccharomyces carlsbergensis, Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces diastaticus, Saccharomyces douglasii, Saccharomyces kluyveri, Saccharomyces norbensis, Saccharomyces oviformis, ou Yarrowia lipolytica.

[00116] A célula hospedeira fúngica pode ser uma célula fúngica filamentosa. "Fungos filamentosos" incluem todas as formas filamentosas da subdivisão Eumycota e Oomycota (como definido por Hawksworth et al., 1995, supra). Os fungos filamentosos são geralmente caracterizados por uma parede micelial composta por quitina, celulose, glucana, quitosana, manana, e outros polissacarídeos complexos. O crescimento vegetativo é por alongamento de hifas e o catabolismo de carbono é obrigatoriamente aeróbico. Em contraste, o crescimento vegetativo por leveduras tais como Saccharomyces cerevisiae é por floração de um talo unicelular e o catabolismo de carbono pode ser fermentativo.

[00117] A célula hospedeira fúngica filamentosa pode ser uma célula de Acremonium, Aspergillus, Aureobasidium, Bjerkandera, Ceriporiopsis, Chrysosporium, Coprinus, Coriolus, Cryptococcus, Filibasidium, Fusarium, Humicola, Magnaporthe, Mucor, Myceliophthora, Neocallimastix, Neurospora, Paecilomyces, Penicillium, Phanerochaete, Phlebia, Piromyces, Pleurotus, Schizophyllum, Talaromyces, Thermoascus, Thielavia, Tolypocladium, Trametes, ou Trichoderma.

[00118] Por exemplo, a célula hospedeira fúngica filamentosa pode ser uma célula de Aspergillus awamori, Aspergillus foetidus, Aspergillus fumigatus, Aspergillus japonicus, Aspergillus nidulans, Aspergillus niger, Aspergillus oryzae, Bjerkandera adusta, Ceriporiopsis aneirina, Ceriporiopsis caregiea, Ceriporiopsis gilvescens, Ceriporiopsis pannocinta, Ceriporiopsis rivulosa, Ceriporiopsis subrufa, Ceriporiopsis subvermispora, Chrysosporium inops, Chrysosporium keratinophilum, Chrysosporium lucknowense, Chrysosporium merdarium, Chrysosporium pannicola, Chrysosporium queenslandicum, Chrysosporium tropicum, Chrysosporium zonatum, Coprinus cinereus, Coriolus hirsutus, Fusarium bactridioides, Fusarium cerealis, Fusarium crookwellense, Fusarium culmorum, Fusarium graminearum, Fusarium graminum, Fusarium heterosporum, Fusarium negundi, Fusarium oxysporum, Fusarium reticulatum, Fusarium roseum, Fusarium sambucinum, Fusarium sarcochroum, Fusarium sporotrichioides, Fusarium sulphureum, Fusarium torulosum, Fusarium trichothecioides, Fusarium venenatum, Humicola insolens, Humicola lanuginosa, Mucor miehei, Myceliophthora thermophila, Neurospora crassa, Penicillium purpurogenum, Phanerochaete chrysosporium, Phlebia radiata, Pleurotus eryngii, Thielavia terrestris, Trametes villosa, Trametes versicolor, Trichoderma harzianum, Trichoderma koningii, Trichoderma longibrachiatum, Trichoderma reesei, ou Trichoderma viride.

[00119] As células fúngicas podem ser transformadas por um processo envolvendo formação de protoplastos, transformações dos protoplastos, e regeneração da parede celular de uma forma conhecida per se. Procedimentos adequados para transformação de células hospedeiras de Aspergillus e Trichoderma são descritos em EP 238023, Yelton et al., 1984, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81: 1470-1474, e Christensen et al., 1988, Bio/Technology 6: 1419-1422. Métodos adequados para transformação de espécies de Fusarium são descritos por Malardier et al., 1989, Gene 78: 147-156, e WO 96/00787. A levedura pode ser transformada usando os procedimentos descritos por Becker e Guarente, Em Abelson, J.N. e Simon, M.I., editores, Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology, Methods in Enzymology, Volume 194, pp. 182-187, Academic Press, Inc., Nova Iorque; Ito et al., 1983, J. Bacteriol. 153: 163; e Hinnen et al., 1978, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75: 1920.

Métodos de Produção

[00120] A presente invenção se relaciona também com métodos de produção de um polipeptídeo da presente invenção, compreendendo (a) cultivo de uma célula, a qual na sua forma de tipo selvagem produz o polipeptídeo, sob condições conducentes à produção do polipeptídeo; e (b) recuperação do polipeptídeo. Em um aspeto preferencial, a célula é uma célula de Penicillium. Em um aspeto mais preferencial, a célula é uma célula de Penicillium emersonii.

[00121] A presente invenção se relaciona também com métodos de produção de um polipeptídeo da presente invenção, compreendendo (a) cultivo de uma célula hospedeira recombinante da presente invenção sob condições conducentes à produção do polipeptídeo; e (b) recuperação do polipeptídeo.

[00122] As células hospedeiras são cultivadas em um meio nutriente adequado para produção do polipeptídeo usando métodos conhecidos na técnica. Por exemplo, a célula pode ser cultivada por cultivo em frasco agitado, ou fermentação em pequena ou grande escala (incluindo fermentações contínua, descontínua, descontínua alimentada, ou em estado sólido) em fermentadores de laboratório ou industriais realizado em um meio adequado e sob condições permitindo que o polipeptídeo seja expresso e/ou isolado. O cultivo tem lugar em um meio nutriente adequado compreendendo fontes de carbono e nitrogênio e sais inorgânicos, usando procedimentos conhecidos na técnica. Meios adequados estão disponíveis de fornecedores comerciais ou podem ser preparados de acordo com composições publicadas (p.ex., em catálogos da American Type Culture Collection). Se o polipeptídeo for secretado para o meio nutriente, o polipeptídeo pode ser recuperado diretamente do meio. Se o polipeptídeo não for secretado pode ser recuperado de lisatos de células.

[00123] O polipeptídeo pode ser detetado usando métodos conhecidos na técnica que são específicos para os polipeptídeos. Estes métodos de detecção incluem, mas não estão limitados a, uso de anticorpos específicos, formação de um produto de enzima, ou desaparecimento de um substrato de enzima. Por exemplo pode ser usado um ensaio de enzimas para determinar a atividade do polipeptídeo.

[00124] O polipeptídeo pode ser recuperado usando métodos conhecidos na técnica. Por exemplo, o polipeptídeo pode ser recuperado do meio nutriente por procedimentos convencionais incluindo, mas não se limitando a, coleta, centrifugação, filtração, extração, secagem por pulverização, evaporação, ou precipitação.

[00125] O polipeptídeo pode ser purificado por uma variedade de procedimentos conhecidos na técnica, incluindo, mas não se limitando a, cromatografia (p.ex., permuta iônica, afinidade, hidrofóbica, cromatofocagem, e exclusão por tamanho), procedimentos eletroforéticos (p.ex., focagem isoelétrica preparativa), solubilidade diferencial (p.ex., precipitação com sulfato de amônio), SDS-PAGE, ou extração (ver, p.ex., Protein Purification, Janson e Ryden, editores, VCH Publishers, Nova Iorque, 1989) para obter polipeptídeos substancialmente puros.

[00126] Em um aspeto alternativo, o polipeptídeo não é recuperado, mas ao invés uma célula hospedeira da presente invenção expressando o polipeptídeo é usada como uma fonte do polipeptídeo.

Plantas

[00127] A presente invenção se relaciona também com plantas isoladas, p.ex., uma planta, parte de planta, ou célula de planta transgênica, compreendendo um polinucleotídeo da presente invenção de modo a expressarem e produzirem um polipeptídeo ou domínio em quantidades recuperáveis. O polipeptídeo pode ser recuperado da planta ou parte de planta. Alternativamente, a planta ou parte de planta contendo o polipeptídeo pode ser usada como tal para melhoria da qualidade de um alimento ou ração, p.ex., melhoria do valor nutricional, palatabilidade, e propriedades reológicas, ou para destruir um fator antinutritivo.

[00128] A planta transgênica pode ser dicotiledônea (uma dicot) ou monocotiledônea (uma monocot). Exemplos de plantas monocot são gramíneas, tais como gramíneas dos prados (poácea, Poa), gramíneas forrageiras tais como Festuca, Lolium, gramíneas temperadas, tais como Agrostis, e cereais, p.ex., trigo, aveia, centeio, cevada, arroz, sorgo, e maís (milho).

[00129] Exemplos de plantas dicot são tabaco, legumes, tais como tremoços, batata, beterraba-sacarina, ervilha, feijão e soja, e plantas crucíferas (família Brassicaceae), tais como couve-flor, colza, e o organismo modelo relacionado de perto Arabidopsis thaliana.

[00130] Exemplos de partes de plantas são caule, calo, folhas, raiz, frutos, sementes, e tubérculos, bem como os tecidos individuais compreendendo estas partes, p.ex., epiderme, mesófilo, parênquima, tecidos vasculares, meristemas. Compartimentos específicos de células de plantas, tais como cloroplastos, apoplastos, mitocôndrias, vacúolos, peroxissomos e citoplasma, são também considerados uma parte de planta. Além do mais, qualquer célula de planta, independentemente da origem do tecido, é considerada como sendo uma parte de planta. De igual modo, partes de plantas tais como tecidos e células específicos isolados para facilitar a utilização da invenção são também consideradas partes de plantas, p.ex., embriões, endospérmios, aleurona e revestimentos de sementes.

[00131] Também incluída dentro do escopo da presente invenção é a descendência de tais plantas, partes de plantas, e células de plantas.

[00132] A planta ou célula de planta transgênica expressando um polipeptídeo pode ser construída de acordo com métodos conhecidos na técnica. Em resumo, a planta ou célula de planta é construída por incorporação de um ou mais constructos de expressão codificando o polipeptídeo ou domínio no genoma da planta hospedeira ou genoma do cloroplasto e propagação da planta ou célula de planta modificada resultante em uma planta ou célula de planta transgênica.

[00133] A presente invenção se relaciona também com métodos de produção de um polipeptídeo da presente invenção compreendendo (a) cultivo de uma planta ou célula de planta transgênica compreendendo um polinucleotídeo codificando o polipeptídeo sob condições conducentes à produção do polipeptídeo; e (b) recuperação do polipeptídeo.

Composições

[00134] A presente invenção também se relaciona com composições compreendendo um polipeptídeo da presente invenção. A composição pode compreender um polipeptídeo da presente invenção como o principal componente enzimático, p.ex., uma composição monocomponente. Alternativamente, a composição pode compreender enzimas adicionais, tais como uma aminopeptidase, amilase, carboidrase, carboxipeptidase, catalase, celulase, quitinase, cutinase, ciclodextrina glicosiltransferase, desoxirribonuclease, esterase, alfa-galactosidase, beta-galactosidase, glucoamilase, alfa-glucosidase, beta-glucosidase, haloperoxidase, invertase, lacase, lipase, manosidase, oxidase, enzima pectinolítica, peptidoglutaminase, peroxidase, fitase, polifenoloxidase, enzima proteolítica, ribonuclease, transglutaminase, ou xilanase. A enzima adicional pode ser também um polipeptídeo tendo atividade de fosfolipase A1, A2, B e/ou D. A enzima(s) adicional(ais) pode(m) ser produzida(s), por exemplo, por um microrganismo pertencendo ao gênero Aspergillus, p.ex., Aspergillus aculeatus, Aspergillus awamori, Aspergillus foetidus, Aspergillus fumigatus, Aspergillus japonicus, Aspergillus nidulans, Aspergillus niger, ou Aspergillus oryzae; Fusarium, p.ex., Fusarium bactridioides, Fusarium cerealis, Fusarium crookwellense, Fusarium culmorum, Fusarium graminearum, Fusarium graminum, Fusarium heterosporum, Fusarium negundi, Fusarium oxysporum, Fusarium reticulatum, Fusarium roseum, Fusarium sambucinum, Fusarium sarcochroum, Fusarium sulphureum, Fusarium toruloseum, Fusarium trichothecioides, ou Fusarium venenatum; Humicola, p.ex., Humicola insolens ou Humicola lanuginosa; ou Trichoderma, p.ex., Trichoderma harzianum, Trichoderma koningii, Trichoderma longibrachiatum, Trichoderma reesei, ou Trichoderma viride.

[00135] As composições podem ser preparadas de acordo com métodos conhecidos na técnica e podem estar na forma de uma composição líquida ou seca. Por exemplo, a composição pode estar na forma de um granulado ou um microgranulado. O polipeptídeo pode ser estabilizado de acordo com métodos conhecidos na técnica.

Usos

[00136] A presente invenção está também dirigida a métodos para uso dos polipeptídeos tendo atividade de fosfolipase C, ou suas composições.

[00137] A fosfolipase da invenção pode ser aplicada em um processo compreendendo tratamento de um fosfolípido ou lisofosfolípido com a fosfolipase. Após contato com a fosfolipase C, o fosfolípido ou lisofosfolípido é hidrolisado para originar diglicerídeo e um éster de fosfato, ou monoglicerídeo e um éster de fosfato, respectivamente.

[00138] A fosfolipase da invenção pode ser aplicada em um processo compreendendo degomação de óleo vegetal, p.ex., um óleo vegetal comestível, em um processo compreendendo hidrólise de fosfolípidos para se obter emulsificantes de fosfolípidos melhorados, em particular em que o referido fosfolípido é lecitina, em um processo compreendendo hidrólise de fosfolípidos na fração de goma da degomação de água para liberar óleo de triglicerídeos aprisionado, em um processo para melhoria da filtrabilidade de uma solução aquosa ou pasta de origem em carboidratos que contém fosfolípido, e/ou em um processo para fabricação de uma produto cozido, compreendendo adição da fosfolipase a uma massa, e cozimento da massa para fabricar o produto cozido.

[00139] Um polipeptídeo da presente invenção pode ser usado para degomação de uma solução aquosa ou pasta de carboidratos para melhorar sua filtrabilidade, particularmente, um hidrolisado de amido, especialmente um hidrolisado de amido de trigo que é difícil de filtrar e origina filtrados turvos. O tratamento pode ser realizado usando métodos bem conhecidos na técnica. Ver, por exemplo, EP 219,269, EP 808,903.

[00140] Um polipeptídeo da presente invenção pode ser usado em um processo para reduzir o conteúdo de fosfolípidos em um óleo comestível. Ver, por exemplo, WO 2007/103005 e US 2008/0182322. Um tal processo é aplicável à purificação de qualquer óleo comestível que contenha fosfolípido, p.ex., óleo vegetal tal como óleo de soja, óleo de colza, e óleo de girassol.

[00141] O tratamento com fosfolipase pode ser levado a cabo diretamente no óleo em bruto ou após remoção do lodo (mucilagem), p.ex., por refinação a úmido. Após refinação a úmido, o óleo conterá tipicamente 50-250 ppm de fósforo como fosfolípido no início do tratamento com a fosfolipase, e o tratamento pode reduzir o valor de fósforo, preferencialmente até abaixo de 11 ppm, tal como até abaixo de 5-10 ppm.

[00142] O tratamento com fosfolipase é conduzido por dispersão de uma solução aquosa da fosfolipase, preferencialmente como gotículas com um diâmetro média abaixo de 10 microM. A quantidade de água é preferencialmente 0,5-5 % por peso em relação ao óleo. Um emulsificante pode ser opcionalmente adicionado. Pode ser aplicada agitação mecânica para manter a emulsão. O tratamento com fosfolipase pode ser conduzido a um pH na gama de cerca de 1,5 a cerca de 7,0, preferencialmente 3,5 a cerca de 6,0. Uma temperatura adequada é geralmente 30-70 °C (particularmente 40-60 °C, p.ex., 55-55 °C).

[00143] O tempo de reação será tipicamente 1-12 horas (p.ex., 1-6 horas, ou 1-3 horas). Uma dosagem de enzima típica será usualmente 0,1-10 mg por litro (p.ex., 0,5-5 mg por litro). O tratamento com fosfolipase pode ser conduzido descontinuamente, p.ex., em um tanque com agitação, ou pode ser contínuo, p.ex., uma série de reatores de tanque agitado. O tratamento com fosfolipase pode ser seguido por separação de uma fase aquosa e uma fase de óleo. A separação pode ser realizada por meios convencionais, p.ex., centrifugação. Quando é usada uma lipase líquida, a fase aquosa conterá fosfolipase, e a enzima pode ser reusada para melhorar a economia do processo.

[00144] Um polipeptídeo da presente invenção e outros tais polipeptídeos tendo atividade na direção de um ou mais de fosfatidilcolina (PC), fosfatidiletanolamina (PE), ácido fosfatídico (PA) e inositol de fosfatidila (PI) podem ser usados para degomação de uma composição de óleo. Conformemente, a invenção proporciona um método para degomação de uma composição de óleo, compreendendo o método (a) proporcionar uma composição de óleo contendo uma quantidade de fosfolípidos, (b) contato da referida composição de óleo com uma enzima fosfolipase C sob condições suficientes para que a enzima reaja com os fosfolípidos para criar diacilglicerol e éster de fosfato, e (c) separação do éster de fosfato da composição de óleo, obtendo deste modo uma composição de óleo degomada, em que a enzima fosfolipase C tem atividade na direção de um ou mais de fosfatidilcolina (PC), fosfatidiletanolamina (PE), ácido fosfatídico (PA) e inositol de fosfatidila (PI).

[00145] Adicionalmente à fosfolipase C da presente invenção pode ser aplicada uma enzima adicional no processo de degomação delineado acima. Em uma forma de realização preferencial, a enzima adicional é um polipeptídeo tendo atividade de fosfolipase A1, A2, B e/ou D. Um polipeptídeo adequado tendo atividade de fosfolipase A1 pode ser Lecitase Ultra disponível da Novozymes A/S. Um polipeptídeo adequado tendo atividade de fosfolipase D pode ser, p.ex., uma enzima derivada de Saccharomyces cerevisiae e tendo a sequência UniProt: P36126, ou uma enzima derivada de Dictyostelium discoideum e tendo a sequência UniProt: Q54Z25.

[00146] O processo de degomação pode compreender (a) proporcionar uma composição de óleo contendo uma quantidade de PC, PE, e/ou PI, (b) tratamento da referida composição de óleo com uma enzima fosfolipase D para converter PC, PE e/ou PI em PA, (c) tratamento da referida composição de óleo com uma enzima fosfolipase C para converter PA em diglicerídeo e ácido fosfórico. A fosfolipase D e fosfolipase C podem ser aplicadas em conjunto tal que os passos (b) e (c) ocorram substancialmente simultaneamente.

[00147] A imobilização da fosfolipase em um transportador adequado pode ser também aplicada usando qualquer método conhecido na técnica incl. por aprisionamento em matrizes naturais ou sintéticas, tais como polímeros hidrofóbicos, resinas de permuta iônica, sol-géis, alginato, e carragenano; por métodos de reticulação tais como em cristais de enzima reticulados (CLEC) e agregados de enzima reticulados (CLEA); ou por precipitação em cristais de sal tais como microcristais revestidos por proteína (PCMC).

[00148] Em certas formas de realização, a presente invenção se relaciona com um método de produção de um produto de éster de ácido graxo, em que o transportador é um transportador hidrofílico selecionado do grupo contendo: partículas inorgânicas porosas compostas por alumina, sílica e silicatos tais como vidro poroso, zeólitos, terra diatomácea, bentonita, vermiculita, hidrotalcite; e partículas orgânicas porosas compostas por polímeros de carboidrato tais como agarose ou celulose. Em outras formas de realização, a presente invenção se relaciona com um método de produção de um produto de éster de ácido graxo, em que o transportador é um transportador polimérico hidrofóbico, p.ex., polipropileno, polietileno, acrilato. Transportadores comerciais adequados são, p.ex., LEWATIT™, ACCUREL™, PUROLITE™ e AMBERLITE™.

[00149] A presente invenção é adicionalmente descrita pelos seguintes exemplos que não devem ser considerados como limitantes do escopo da invenção.

EXEMPLOS Exemplo 1:

[00150] Ensaio da atividade de fosfolipase C: Misturas reacionais compreendendo 10 microL de uma solução de colina de p-nitrofenila e fosforila (p-NPPC) a 100 mM em tampão Borax-HCl a 100 mM, pH 7,5 e 90 microL da solução de enzima são misturadas em um poço da placa de microtitulação à temperatura ambiente. A placa de microtitulação é depois colocada em um leitor de placas de microtitulação e o p-nitrofenol liberado é quantificado por medição da absorvância a 410 nm. As medições são registradas durante 30 min a intervalos de 1 min. Curvas de calibração na gama 0,01-1 microL/mL de p-nitrofenol são preparadas por diluição de uma solução de estoque de 10 micromol/mL de p-nitrofenol da Sigma em tampão Borax-HCl. Uma unidade liberará 1,0 micromol/minuto de p-NPPC à temperatura ambiente.

Exemplo 2

[00151] A termoestabilidade da fosfolipase C da presente invenção (EmPLC5) foi determinada a pH 4,0, pH 5,5 e pH 7,0 por Calorimetria Diferencial de Varrimento (DSC) usando um Calorímetro Diferencial de Varrimento VP-Capillary (MicroCal Inc., Piscataway, NJ, EUA) a uma concentração de proteína de aproximadamente 0,5 mg/mL. A temperatura de desnaturação térmica, Td (°C), foi tomada como o topo do pico de desnaturação (principal pico endotérmico) em termogramas (Cp vs. T) obtidos após aquecimento das soluções de enzima no tampão a uma taxa de aquecimento programada constante de 200 K/hr. Soluções de amostra e referência (aprox. 0,2 mL) foram carregadas no calorímetro (referência: tampão sem enzima) das condições de armazenamento a 10 °C e termicamente pré-equilibradas durante 20 minutos a 20 °C antes de rastreio por DSC de 20 °C a 100 °C. As temperaturas de desnaturação (Td) foram determinadas a uma precisão de aproximadamente +/- 1 °C (Tabela 1).

Exemplo 3 Especificidade quanto ao substrato:

[00152] Para assegurar um substrato uniforme com uma elevada concentração de quatro fosfolípidos relevantes (PC, PE, PI e PA), um substrato de teste é produzido a partir de óleo de soja enriquecido com lecitina comercial. Este substrato é depois incubado com enzima e tampão citrato. É usado citrato uma vez que algumas aplicações de degomação envolvem pré- condicionamento do óleo com ácido cítrico. Após o tempo de reação desejado, a mistura reacional é analisada por P-NMR. Isto envolve um passo de extração aquosa durante o qual as espécie de fósforo liberadas pelo PLC são removidas da fase de óleo. Consequentemente, apenas são detetadas espécies de P lipofílicas, incluindo fosfolípido não reagido.

[00153] O substrato é um óleo de soja completamente refinado com lecitina adicionada (uma razão 2:1 dos produtos da Sigma P6636 (PI, CAS 97281-52-2) e 61755 (PC, CAS 8002-43-5)) adicionado a uma concentração de óleo de 50 mg/mL. Esta mistura conterá também PA e PE. Dispersar 250 μL em tubos Eppendorf de 2 mL.

[00154] O ensaio é conduzido a três diferentes valores de pH, 4,0, 5,5 e 7,0 em tampão Na-citrato a 100 mM e uma concentração de enzima de 0,9 mg/mL. A quantidade de enzima aplicada é 100 mg de EP/kg de óleo.

[00155] Antes de análise por NMR são extraídas amostras com 100 mL de solução de Cs-EDTA a 0,2 M pH 7,5. Preparação desta solução: EDTA (5,85 g) é disperso em água (aprox. 50 mL). O pH é ajustado até 7,5 usando CsOH a 50 % p/p (aprox. 30 mL), que dissolverá o EDTA completamente. É adicionada água até 100 mL para dar uma concentração de EDTA de 0,2 M.

[00156] É igualmente usada uma solução padrão interna (IS) de trifenilfosfato (TPP) a 2 mg/mL em MeOH.

[00157] Ao Eppendorf com 250 μL de substrato em óleo são adicionados 25 μL de enzima diluída. O Eppendorf é incubado no termoagitador a 50 °C durante 2 h, seguido por análise por NMR como descrito em baixo.

[00158] À amostra de óleo são depois adicionados 0,500 mL de solução IS, seguido por 0,5 mL de CDCl3 e 0,5 mL de tampão Cs-EDTA. Agitar durante 30 s, depois efetuar centrifugação (centrífuga de bancada, 1 min, 13,400 rpm) para se obter separação de fases. A fase inferior é transferida para um tubo de NMR.

[00159] É realizada P-NMR com 128 rastreios e um tempo de atraso de 5 s. A referência de escala é definida de acordo com o sinal de IS (-17,75 ppm). Integrar todos os sinais. Atribuições (aprox. ppm @ 25 C): 1,7 (PA), - 0,1 (PE), -0,5 (PI), -0,8 (PC). A posição dos sinais pode mudar significativamente de acordo com valor de pH, temperatura, concentração da amostra exatos, etc. A concentração de cada espécie é calculada como "ppm de P", i.e., mg de P elementar por kg de amostra de óleo. Consequentemente, ppm de P = I/I(IS) * n(IS) * M(P) / m (óleo).

[00160] A fosfolipase da invenção EmPLC5 e a fosfolipase C comercial Purifine foram incubadas com o substrato de teste e analisadas como descrito acima. Os resultados são mostrados em baixo.

[00161] Os dados mostram que a fosfolipase C da presente invenção (EmPLC5) tem atividade em todos os quatro fosfolípidos em uma ampla gama de pH. Em contraste, Purifine tem atividade em PE e PC apenas a pH neutro.

Exemplo 4 Desempenho em ensaio de degomação

[00162] O desempenho/atividade da fosfolipase de P. emersonii (EmPLC5) em aplicação de degomação foi determinado em um ensaio (descrito em baixo) que mimetiza a degomação à escala industrial, seguida por medição em fase de óleo de a) conteúdo de diglicerídeos por Cromatografia líquida de elevado desempenho (HPLC) acoplada a Detetor de Dispersão de Luz Evaporativo (ELSD), e b) quantificação das espécies de fosfolípidos individuais: Fosfatidilcolina (PC); Fosfatidilinositol (PI); Fosfatidiletanolamina (PE); Ácido fosfatídico (PA); Fosfatidilserina (PS) por HPLC-espectrometria de massa (MS) e C) redução de fósforo total por Espectrometria de emissão ótica de plasma indutivamente acoplada (ICP- OES).

Ensaio de degomação

[00163] Óleo de soja em bruto (25-75 g) foi inicialmente pré-tratado com ácido/base (ou não) para facilitar conversão de fosfolípidos insolúveis em formas mais hidratáveis e assegurar um ambiente adequado para a enzima. O pré-tratamento com ácido/base foi feito por adição de ácido e mistura em banho ultrassônico (BRANSON 3510) durante 5 min e incubação em rotor durante 15 min seguido por neutralização com base em banho ultrassônico durante 5 min. A reação de enzima foi conduzida em sistema aquoso baixo (3 % de água total com base na quantidade de óleo) em tubos centrífuga. As amostras foram tratadas com ultrassons durante 5 min, seguido por mistura (rotor Stuart SB3) sob incubação em câmara aquecida à temperatura selecionada. A mistura óleo tratado com enzima + enzima + água foi depois aquecida/centrifugada a 85 °C, 15 min, 700 g (Koehler Instruments, centrífuga de óleo K600X2) para separar em uma fase de óleo e uma fase de água/goma pesada.

Medição de diglicerídeos

[00164] O método HPLC-ELSD (usando equipamento DIONEX e coluna Lichrocart Si-60, 5 μm, Lichrosphere 250-4 mm, MERCK) é baseado no princípio do Método Oficial AOCS Cd 11d-96 e quantifica o conteúdo de diglicerídeos até 0,1 % por peso.

Medição de fósforo/fosfolípido

[00165] O ICP-OES quantifica o conteúdo de fósforo (P) e outros metais tais como Ca, Mg, Zn até 4 ppm com uma precisão de aproximadamente ± 1 ppm de P.

EXEMPLO 5

[00166] A fosfolipase da invenção foi aplicada em uma experiência de degomação conduzida ao longo de 24 hrs a várias temperaturas aplicação de óleo de soja em bruto enriquecido com lecitina PI/PA a 1 %. Os tratamentos são mostrados na tabela 3 e os resultados na tabela 4.

[00167] A degomação com a fosfolipase C da invenção resultou em formação de diglicerídeos significativa em uma ampla gama de temperaturas de 55 °C a 80 °C, e a EmPLC5 parece muito adequada para uso a temperaturas elevadas de 70-80 °C. É observado bom desempenho em degomação com água bem como degomação auxiliada por ácido demonstrando robustez na direção de condições de pH variáveis.

EXEMPLO 6

[00168] A fosfolipase C EmPLC5 foi usada na degomação de um óleo de soja em bruto rico em fosfolípidos não hidratáveis (145 ppm de P de fosfolípidos não hidratáveis de 700 ppm de P total). A degomação foi realizada a uma quantidade de óleo de 75 g, a 70 °C durante 24 hrs usando níveis variáveis de acidez (0, 0,5, 1,0 e 1,5 eqv de NaOH).

[00169] A fosfolipase da invenção EmPLC5 demonstrou desempenho elevado e robusto em degomação auxiliada por ácido com preferência para um ambiente de degomação ácido apenas parcialmente neutralizado com hidróxido de sódio. A ácido fosfórico a 0,05 % + neutralização parcial com 0,5 equivalentes de NaOH (em comparação com dosagem de ácido) foi observado aumento de diglicerídeos significativo bem como redução de fósforo.

[00170] Não foi observado nenhum aumento de ácidos graxos livres no ensaio de degomação o que demonstra que EmPLC5 está ativa apenas no fosfatídeo da molécula de fosfolípido.

Exemplo 7

[00171] Com base na sequência de aminoácidos em SEQ ID NO:2 foi preparada uma variante EmPLC5.1 compreendendo as substituições K57A, C173A, K180N, I216V, V320I, D321E, T365L, I397E, Q399H, Q518K e A558S. Os dados preliminares mostraram que a estabilidade da variante foi substancialmente inalterada e a atividade de fosfolipase C foi mantida.

Exemplo 8

[00172] A fosfolipase de tipo selvagem EmPLC5 e a variante EmPLC5.1 aplicadas em degomação. O conteúdo de diglicerídeos e conteúdo total de fósforo após degomação enzimática com/sem pré-tratamento com ácido/base durante 24 hrs foram medidos. Os tratamentos são mostrados na tabela 7 e os resultados na tabela 8.

[00173] No ensaio de degomação, a fosfolipase C EmPLC5 bem como a variante EmPLC5.1 convertem fosfolípidos em diglicerídeos. Ambas as enzimas trabalham bem no ambiente ácido quando o óleo é pré-tratado com ácido/base.

[00174] Na degomação auxiliada por ácido conduzida, a fosfolipase da invenção EmPLC5 e a variante EmPLC5.1 reduzem todas as espécies de fosfolípidos (PA, PI, PC, PE).

[00175] O escopo da invenção descrita e reivindicada aqui não é para ser limitado pelos aspetos específicos aqui divulgados, uma vez que estes aspetos se pretendem como ilustrações de vários aspetos da invenção. É pretendido que quaisquer aspetos equivalentes estejam dentro do escopo desta invenção. De fato, várias modificações da invenção adicionalmente àquelas mostradas e descritas aqui tornar-se-ão aparentes àqueles peritos na técnica a partir da descrição acima mencionada. Tais modificações se destinam também a estar dentro do escopo das reivindicações anexas. Em caso de conflito, a presente divulgação, incluindo definições, imperará.

Claims (2)

1. Uso de polipeptídeo tendo atividade de fosfolipase C compreendendo a SEQ ID NO: 2 ou o polipeptídeo maduro da SEQ ID NO: 2, caracterizado pelo fato de ser em um processo para hidrólise de fosfolípidos, ou em um processo para reduzir o teor de fosfolipídios em um óleo comestível, em que o polipeptídeo maduro é os aminoácidos 1 ao 594 da SEQ ID NO: 2.

2. Método para redução do conteúdo de componentes contendo fósforo em um óleo comestível, caracterizado pelo fato de que compreende contato do referido óleo com uma solução aquosa com polipeptídeo tendo atividade de fosfolipase C compreendendo a SEQ ID NO: 2 ou o polipeptídeo maduro da SEQ ID NO: 2, cuja solução aquosa é emulsificada no óleo até o conteúdo de fósforo do óleo ser reduzido, e depois separação da fase aquosa do óleo tratado, em que o polipeptídeo maduro é os aminoácidos 1 ao 594 da SEQ ID NO: 2.