JP2023534693A - ウラシル安定化タンパク質並びにその活性断片及びバリアント並びに使用方法 - Google Patents

ウラシル安定化タンパク質並びにその活性断片及びバリアント並びに使用方法 Download PDF

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Abstract

標的化された核酸の編集のためのウラシル安定化ポリペプチドを含有する組成物及び方法が、提供される。組成物は、ウラシル安定化ポリペプチドを含有する。同じく、ｉ）ＤＮＡ結合ポリペプチド、ｉｉ）デアミナーゼ、及びｉｉｉ）ウラシル安定化ポリペプチド（ＵＳＰ）を含有する融合タンパク質も提供される。この融合タンパク質は、任意にガイドＲＮＡとの複合体において、デアミナーゼに融合され及び更にＵＳＰに融合されたＲＮＡガイド型ヌクレアーゼを含む。組成物はまた、ＵＳＰ又はこの融合タンパク質をコードしている核酸分子も含む。ＵＳＰ又はこの融合タンパク質をコードしている核酸分子を含むベクター及び宿主細胞も、提供される。

Description

関連出願の相互参照
本出願は、２０２０年７月１５日に出願された、米国特許仮出願第６３／０５２，１７５号の優先権を主張するものであり、これはその全体が引用により本明細書中に組み込まれている。
配列表に関する陳述
本出願に関連づけられた「配列表」は、書面の代わりにＡＳＣＩＩフォーマットで提供され、これにより本明細書に引用により組み込まれている。このＡＳＣＩＩコピーは、ファイル名L103438_1220WO_0106_5_SL.txtであり、サイズは６５８，５８６バイトであり、２０２１年７月１４日に作製され、ＥＦＳ－Ｗｅｂ経由により電子的に提出されている。
発明の技術分野
本発明は、分子生物学及び遺伝子編集の分野に関する。
発明の背景
標的化されたゲノムの編集又は改変は、急激に、基礎研究及び応用研究の重要なツールとなってきている。初期の方法は、各特定の標的配列に特異的な、操作され、プログラム可能な配列特異的ＤＮＡ結合ドメインを伴うキメラヌクレアーゼの作製を必要とする、メガヌクレアーゼ、ジンクフィンガー融合タンパク質又はＴＡＬＥＮなどのヌクレアーゼの操作に関与していた。ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ細菌システムの「クラスター化され規則的に間隔があいた短い回文構造の繰り返し」（ＣＲＩＳＰＲ）－関連（Ｃａｓ）タンパク質などの、ＲＮＡガイド型ヌクレアーゼ（ＲＧＮ）は、ヌクレアーゼを、特定の標的配列と特異的にハイブリダイズするガイドＲＮＡと複合体化することにより、特異的配列の標的化を可能にする。標的－特異的ガイドＲＮＡの作製は、各標的配列のキメラヌクレアーゼの作製よりも、コストがかからず、且つより効率的である。そのようなＲＮＡガイド型ヌクレアーゼは、特異的ゲノム位置へ変異を導入するのに、誤りがちな非相同性末端結合（ＮＨＥＪ）により修復される、配列特異的二本鎖切断の導入を通じて、ゲノムを編集するために使用することができる。
加えてＲＧＮは、標的化されたＤＮＡを編集するアプローチに有用である。ゲノムＤＮＡへ特異的改変の導入を可能にする核酸配列の標的化編集、例えば標的化切断は、遺伝子機能及び遺伝子発現を研究するための高度に僅かな差異のあるアプローチを可能にする。そのような標的化編集は、また、ヒトにおける遺伝疾患の標的化のため、又は作物のゲノムにおける農学的に恩恵のある変異の導入のためにも開発されてよい。ゲノム編集ツールの開発は、遺伝子編集－ベースの哺乳動物の治療及び農業バイオテクノロジーへの新規アプローチを提供する。
発明の簡単な概要
標的ＤＮＡ分子を改変する組成物及び方法が、提供される。これらの組成物は、関心対象の標的ＤＮＡ分子の改変において使用が認められる。提供された組成物は、ウラシル安定化ポリペプチドを含有する。また、ＤＮＡ結合ポリペプチド、デアミナーゼポリペプチド、及びウラシル安定化ポリペプチドを含む融合タンパク質も提供される。提供される組成物はまた、ウラシル安定化ポリペプチド又はこの融合タンパク質をコードしている核酸分子、並びにこれらの核酸分子を含むベクター及び宿主細胞も含む。本明細書において開示された方法には、関心対象の標的ＤＮＡ分子内の関心対象の標的配列を結合すること、及び関心対象の標的ＤＮＡ分子を改変することが、描かれる。
詳細な説明
本明細書に表記される本発明の多くの修飾及び他の実施形態が、先の説明において提示された内容の恩恵を有するこれらの発明が関連する業者には思い浮かぶであろう。従って本発明は、開示された特定の実施形態に限定されるものではなく、並びに添付された請求の範囲内に含まれる修飾及び他の実施形態が意図されることは理解されるものとする。具体的用語が本明細書において使用されるが、これらは、一般的及び説明的意味でのみ使用され、限定を目的としない。
Ｉ． 概要
本開示は、ＤＮＡ分子内のウラシル残基を安定化する、ウラシル安定化ポリペプチド（ＵＳＰ）、及びこれをコードしている核酸分子を提供する。
標的化された核酸塩基編集は、また塩基編集とも称され、これはＫｏｍｏｒら（２０１６）により、改変されたＲＮＡガイド型ヌクレアーゼ（ＳｐＣａｓ９）へ機能的に連結されたシトシンデアミナーゼ（ｒＡＰＯＢＥＣ１）を使用し、開発された（Ｎａｔｕｒｅ ５３３： ４２０－４２４）。Ｋｏｍｏｒらにより説明されたシステムにおいて、ガイドＲＮＡは、ｒＡＰＯＢＥＣ１－Ｃａｓ９融合タンパク質を、標的ＤＮＡ配列へガイドし、そこでｒＡＰＯＢＥＣ１は、標的シトシン（Ｃ）を、チミン（Ｔ）の塩基対形成特性を有するウラシル（Ｕ）へ脱アミノ化する。このシステムを使用し、標的化されたＣ＞Ｔ変異が、ＤＮＡ分子へ導入され得る。
インビボにおいてｒＡＰＯＢＥＣ１－Ｃａｓ９融合体を使用する塩基編集の主な欠点は、細胞ウラシルＤＮＡグリコシラーゼ（ＵＤＧ）は、Ｕ：Ｇヘテロ二重鎖ＤＮＡを認識し、且つＤＮＡからのウラシルの除去を触媒し、脱塩基部位を残し、これにより最も一般的な成果であるＵ：Ｇ対のＣ：Ｇ対への復帰による塩基除去修復を開始することであるが、インデル（挿入又は欠失）形成も認められた。ｒＡＰＯＢＥＣ１－Ｃａｓ９融合タンパク質へのウラシルＤＮＡグリコシラーゼインヒビター（ＵＧＩ）の取込みにより、残存するウラシルは、所望のＣ＞Ｔ変異を生じ且つ導入するための複製に充分な長さで存在する。
本発明は、脱アミノ化されたシトシンにより作製されたウラシルを安定化することにより、脱塩基部位の作出が妨げられることができ、且つ所望のＣ＞Ｔ変異が導入される可能性がより大きいことを発見した。これは、ウラシル安定化タンパク質（ウラシル安定化ポリペプチド、又はＵＳＰとも称される）の同定により達成された。
一部の実施形態において、ＵＳＰは、ＤＮＡ結合ポリペプチド、デアミナーゼポリペプチド、及びウラシル安定化ポリペプチドを含む融合タンパク質の一部として提供される。一部の実施形態において、ＤＮＡ結合ポリペプチドは、メガヌクレアーゼ、ジンクフィンガー融合タンパク質、又はＴＡＬＥＮであるか、又はこれらに由来する。一部の実施形態において、ＤＮＡ結合ポリペプチドは、ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡとも称される）へ結合し、次に標的核酸配列へ鎖ハイブリダイゼーションを介して結合する、Ｃａｓ９ポリペプチドなどの、ＲＮＡガイド型ヌクレアーゼである。他の実施形態において、ＵＳＰは単独で提供される。
一部の実施形態において、このデアミナーゼポリペプチドは、例えばシチジンなどの核酸塩基を脱アミノ化することができる、デアミナーゼドメインであってよい。デアミナーゼによる核酸塩基の脱アミノ化は、各残基での点変異に繋がり得、これをここでは「核酸編集」又は「塩基編集」と称す。従ってＲＮＡガイド型ヌクレアーゼ（ＲＧＮ）ポリペプチド及びデアミナーゼポリペプチドを含む融合タンパク質は、核酸配列の標的化された編集に使用することができる。
そのような融合タンパク質は、インビトロにおけるＤＮＡの標的化された編集に、例えば変異細胞の作製に有用である。これらの変異細胞は、植物又は動物におけるものであってよい。そのような融合タンパク質はまた、標的化された変異の導入に、例えば、エクスビボにおける、例として対象から得られその後同じ又は別の対象へ再導入される細胞におけるなど、哺乳動物細胞における遺伝子欠失の補正のために；並びに、例えば遺伝子欠失の補正、又は哺乳動物対象の疾患－関連遺伝子において失活している変異の導入など、インビボにおける標的化された変異の導入のために、有用であってよい。そのような融合タンパク質はまた、植物細胞における標的化された変異の導入のために、例えば有益であるかもしくは農学的に価値のある形質もしくはアレルの導入のためにも、有用であってよい。
用語「タンパク質」、「ペプチド」、及び「ポリペプチド」は、本明細書において互換的に使用され、且つペプチド（アミド）結合により一緒に連結されたアミノ酸残基の重合体を指す。これらの用語は、任意のサイズ、構造、又は機能のタンパク質、ペプチド、又はポリペプチドを指す。典型的には、タンパク質、ペプチド、又はポリペプチドは、長さが少なくとも３個のアミノ酸である。タンパク質、ペプチド、又はポリペプチドは、個別のタンパク質又はタンパク質の集合を指してよい。タンパク質、ペプチド、又はポリペプチド内の１又は複数のアミノ酸は、例えば、糖質基、ヒドロキシル基、リン酸基、ファルネシル基、イソファルネシル基、脂肪酸基、コンジュゲーション、官能基化、もしくは他の修飾のためのリンカーなど、化学実体の付加により、修飾されてよい。タンパク質、ペプチド、又はポリペプチドはまた、単独の分子であるか、又は複数の分子の複合体であってよい。タンパク質、ペプチド、又はポリペプチドは、天然のタンパク質又はペプチドの適正な断片であってよい。タンパク質、ペプチド、又はポリペプチドは、天然の、組換えの、もしくは合成のもの、又はそれらの任意の組合せであってよい。
本明細書に提供される任意のタンパク質は、当該技術分野において公知の任意の方法により生成されてよい。例えば本明細書に提供されるタンパク質は、ペプチドリンカーを含む融合タンパク質に特に適している、組換えタンパク質の発現及び精製により生成されてよい。組換えタンパク質の発現及び精製の方法は、周知であり、且つGreen及びSambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual(第4版, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (2012))に記載されたものを含み、この文献の内容全体は引用により本明細書中に組み込まれている。
ＩＩ． ウラシル安定化タンパク質
新規ウラシル－安定化ポリペプチド（ＵＳＰ）が、ここで明らかにされ、且つ配列番号：１－１６として表記される。本明細書記載のＵＳＰは、ＤＮＡ分子内のウラシルの安定化が望ましい適用において有用である。
本明細書において使用される用語「ウラシル安定化タンパク質」、「ウラシル安定化ポリペプチド」、及び「ＵＳＰ」は、ウラシル安定化活性を有するポリペプチドを指す。本明細書において使用される用語「ウラシル安定化活性」は、その分子（例えばウラシル安定化ポリペプチド）の非存在下でのデアミナーゼによる変異率と比べた、デアミナーゼによる核酸分子内の少なくとも１個のシチジン、デオキシシチジン、又はシトシンの、チミジン、デオキシチミジン、又はチミンへの変異率を増大するその分子（例えばポリペプチド）の能力を指す。作用の理論又は機序に結びつけられるものではないが、ここで開示されたＵＳＰは、所望のＣ＞Ｔ変異を生じ且つ導入するために複製を可能にするのに充分な時間をかけて、シチジン、デオキシシチジン、又はシトシン塩基の脱アミノ化を通じて生成される一本鎖ＤＮＡ内のウラシルの存在を維持することにより、機能することができると考えられる。ウラシル安定化活性は、ウラシルＤＮＡグリコシラーゼの阻害、塩基除去修復経路、又はミスマッチ対機序を通じて生じ得る。
一部の実施形態において、ここで開示されたウラシル安定化活性を維持するＵＳＰ又はその活性バリアントもしくは断片は、デアミナーゼによる核酸分子内の少なくとも１個のシチジン、デオキシシチジン、又はシトシンの、チミジン、デオキシチミジン、又はチミンへの変異率を、ＵＳＰ非存在下でのデアミナーゼによる変異率と比べ、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも１００％、少なくとも１５０％、少なくとも２００％、又はそれよりも多く、増大する。逆に、デアミナーゼによる核酸分子内の少なくとも１個のシチジン、デオキシシチジン、又はシトシンの、チミジン、デオキシチミジン、又はチミン以外の任意の核酸塩基（すなわち、グアノシン、デオキシグアノシン、グアニン、アデノシン、デオキシアデノシン、アデニン）への変異率は、ここで開示されたＵＳＰ又はその活性バリアントもしくは断片により、ＵＳＰの非存在下でのデアミナーゼによる変異率と比べ、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又はそれよりも多く減少される。シチジン、デオキシシチジン、又はシトシンの別の核酸塩基への変異率の増加又は減少は、ＵＳＰの存在下又は非存在下での、特定のデアミナーゼの特定の核酸塩基への変異の割合を比較することにより、測定することができる。デアミナーゼが、ＤＮＡ結合ポリペプチドとの融合を介して、核酸分子の特異的領域へ標的化されているこれらの実施形態において、ＤＮＡ結合ポリペプチドが結合する標的配列内又はこれに隣接するシチジン、デオキシシチジン、又はシトシンの変異率は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、制限断片長多型（ＲＦＬＰ）、又はＤＮＡシークエンシングを含む、当該技術分野において公知の方法を使用し、測定することができる。
ここで開示されたウラシル安定化活性を維持している新規ＵＳＰ又はその活性バリアントもしくは断片は、デアミナーゼ－ＤＮＡ結合ポリペプチド融合体の一部として細胞へ導入されてよいか、及び／又は標的ＤＮＡ分子内の所望のＣ＞Ｔ変異の導入効率を上昇するために、ＤＮＡ結合ポリペプチド－デアミナーゼ融合体と、もしくはＤＮＡ結合ポリペプチド－デアミナーゼ－ＵＳＰ融合体と、同時発現されてよい。ここで開示されたウラシル安定化活性を維持するＵＳＰは、配列番号：１－１６のいずれかのアミノ酸配列又はそれらのバリアントもしくは断片を有する。一部の実施形態において、ＵＳＰは、配列番号：１－１６のいずれかのアミノ酸配列と、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％の同一性を有するアミノ酸配列を有する。特定の実施形態において、ＵＳＰは、配列番号：１、２、４、５、及び７－１５のいずれか一つと少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。他の実施形態において、ＵＳＰは、配列番号：３又は１６と少なくとも８１％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。更に他の実施形態において、ＵＳＰは、配列番号：６と少なくとも８２％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
III. 融合タンパク質
本開示の一部の態様は、ＤＮＡ結合ポリペプチド及びデアミナーゼポリペプチドを、並びに一部の実施形態においてはＵＳＰポリペプチドを含む、融合タンパク質を提供する。そのような融合タンパク質は、インビトロ、エクスビボ又はインビボにおける、ＤＮＡの標的化された編集に有用である。
本明細書において使用される用語「融合タンパク質」は、少なくとも２種の異なるタンパク質に由来するタンパク質ドメインを含むハイブリッドポリペプチドを指す。融合タンパク質は、異なるドメイン、例えば、ＤＮＡ結合性ドメイン及びデアミナーゼを含んでよい。一部の実施形態において、融合タンパク質は、核酸、例えばＲＮＡとの複合体であるか、又はこれと会合している。
このデアミナーゼポリペプチドは、例えばシチジンなどの核酸塩基を脱アミノ化することができるデアミナーゼドメインを含む。デアミナーゼによる核酸塩基の脱アミノ化は、各残基での点変異に繋がり得、これは本明細書において「核酸編集」又は「塩基編集」と称される。従ってＲＧＮポリペプチドバリアント又はドメイン及びデアミナーゼドメインを含む融合タンパク質は、核酸配列の標的化された編集に使用することができる。一部の実施形態において、デアミナーゼは、配列番号：４７、４８及び７６－９４のいずれか一つと少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又はそれよりも多い同一性のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態において、デアミナーゼは、配列番号：４７、４８及び７６－９４のいずれか一つと少なくとも８０％同一のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態において、デアミナーゼは、配列番号：４７、４８及び７６－９４のいずれか一つと少なくとも８５％同一のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態において、デアミナーゼは、配列番号：４７、４８及び７６－９４のいずれか一つと少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態において、デアミナーゼは、配列番号：４７、４８及び７６－９４のいずれか一つと少なくとも９５％同一のアミノ酸配列を含む。他の実施形態において、デアミナーゼは、配列番号：４７、４８及び７６－９４のいずれか一つと少なくとも９９％同一のアミノ酸配列を含む。一部の具体的実施形態において、デアミナーゼは、配列番号：４７、４８及び７６－９４のいずれか一つで表記されるアミノ酸配列を含む。
ここで開示された融合タンパク質は、ＤＮＡ結合ポリペプチドを含む。本明細書において使用される用語「ＤＮＡ結合ポリペプチド」は、ＤＮＡに結合することが可能である任意のポリペプチドを指す。いくつかの実施形態において、ここで開示された融合タンパク質のＤＮＡ結合ポリペプチド部分は、二本鎖ＤＮＡに結合する。特定の実施形態において、ＤＮＡ結合ポリペプチドは、配列特異的様式でＤＮＡに結合する。本明細書において使用される用語「配列特異的」又は「配列特異的様式」は、特異的ヌクレオチド配列との選択的相互作用を指す。
２つのポリヌクレオチド配列は、その２つの配列がストリンジェント条件下で互いにハイブリダイズする場合に、実質的に相補的であると考えることができる。同様に、ＤＮＡ結合ポリペプチドが、ストリンジェント条件下で配列に結合するならば、このＤＮＡ結合ポリペプチドは、配列特異的様式で特定の標的配列に結合すると考えられる。「ストリンジェント条件」又は「ストリンジェントハイブリダイゼーション条件」により、その下で２つのポリヌクレオチド配列（又はその特異的標的配列に結合するポリペプチド）は、他の配列よりも検出可能により大きい程度に（例えば、バックグラウンドの少なくとも２倍）互いに結合する条件が意図される。ストリンジェント条件は、配列－依存性であり、且つ異なる状況においては異なるであろう。典型的には、ストリンジェント条件は、ｐＨ７．０～８．３で、塩濃度が、約１．５Ｍ未満のＮａイオン、典型的には約０．０１～１．０ＭのＮａイオン濃度（又は他の塩）であり、並びに温度が、短配列（例えば１０～５０ヌクレオチド）について少なくとも約３０℃、及び長配列（例えば５０ヌクレオチドを上回る）について少なくとも約６０℃である条件であろう。ストリンジェント条件はまた、ホルムアミドなどの不安定化剤の添加によっても達成され得る。低ストリンジェンシー条件の例は、３０～３５％ホルムアミド、１Ｍ ＮａＣｌ、１％ＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）の緩衝溶液中、３７℃でのハイブリダイゼーション、及び１×～２×ＳＳＣ（２０×ＳＳＣ＝３．０Ｍ ＮａＣｌ／０．３Ｍクエン酸三ナトリウム）中、５０～５５℃での洗浄を含む。中ストリンジェンシー条件の例は、４０～４５％ホルムアミド、１．０Ｍ ＮａＣｌ、１％ＳＤＳ中、３７℃でのハイブリダイゼーション、及び０．５×～１×ＳＳＣ中、５５～６０℃での洗浄を含む。高ストリンジェンシー条件の例は、５０％ホルムアミド、１Ｍ ＮａＣｌ、１％ＳＤＳ中、３７℃でのハイブリダイゼーション、及び０．１×ＳＳＣ中、６０～６５℃での洗浄を含む。任意に、洗浄緩衝液は、約０．１％～約１％のＳＤＳを含有してよい。ハイブリダイゼーションの期間は一般に、約２４時間未満、通常約４～約１２時間である。洗浄時間の期間は、少なくとも平衡に達するのに充分な時間であろう。
Ｔｍは、相補的標的配列の５０％が、完全にマッチした配列にハイブリダイズする温度（規定されたイオン強度及びｐＨで）である。ＤＮＡ－ＤＮＡハイブリッドに関して、Ｔｍは、以下のＭｅｉｎｋｏｔｈ及びＷａｈｌの式((1984) Anal. Biochem. 138:267-284)から概算され得る：Ｔｍ＝８１．５℃＋１６．６（ｌｏｇＭ）＋０．４１（％ＧＣ）－０．６１（％ｆｏｒｍ）－５００／Ｌ；式中、Ｍは、一価の陽イオンのモル濃度であり、％ＧＣは、そのＤＮＡ中のグアノシン及びシトシンヌクレオチドの割合であり、％ｆｏｒｍは、ハイブリダイゼーション溶液中のホルムアミドの百分率であり、並びにＬは、塩基対中のハイブリッドの長さである。一般に、ストリンジェント条件は、規定されたイオン強度及びｐＨでの特異的配列及びその相補体の融解温度（Ｔｍ）よりも約５℃低く選択される。しかし厳密なストリンジェント条件は、融解温度（Ｔｍ）よりも１、２、３、又は４℃低いハイブリダイゼーション及び／又は洗浄を利用することができ；中ストリンジェント条件は、融解温度（Ｔｍ）よりも６、７、８、９、又は１０℃低いハイブリダイゼーション及び／又は洗浄を利用することができ；低ストリンジェンシー条件は、融解温度（Ｔｍ）よりも１１、１２、１３、１４、１５、又は２０℃低いハイブリダイゼーション及び／又は洗浄を利用することができる。この式、ハイブリダイゼーション及び洗浄組成物、並びに所望のＴｍを使用し、当業者は、ハイブリダイゼーション及び／又は洗浄溶液のストリンジェンシーの変動は、本質的に説明されることを理解するであろう。核酸のハイブリダイゼーションの広範な指針は、Tijssen (1993) Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology-Hybridization with Nucleic Acid Probes, Part I, Chapter 2 (Elsevier, New York)；及び、Ausubelら編集、(1995) Current Protocols in Molecular Biology, Chapter 2 (Greene Publishing and Wiley-Interscience, New York)に認められる。Sambrookら、(1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2d ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Plainview, New York)を参照されたい。
いくつかの実施形態において、配列特異的ＤＮＡ結合ポリペプチドは、ＲＮＡガイド型ＤＮＡ結合ポリペプチド（ＲＧＤＢＰ）である。本明細書において使用される用語「ＲＮＡガイド型ＤＮＡ結合ポリペプチド」及び「ＲＧＤＢＰ」は、標的ＤＮＡ配列と会合したＲＮＡ分子のハイブリダイゼーションを通じて、ＤＮＡに結合することが可能であるポリペプチドを指す。
一部の実施形態において、融合タンパク質のＤＮＡ結合ポリペプチドは、配列特異的ヌクレアーゼなどの、ヌクレアーゼである。本明細書において使用される用語「ヌクレアーゼ」は、核酸分子内のヌクレオチド間のホスホジエステル結合の切断を触媒する酵素を指す。一部の実施形態において、ＤＮＡ結合ポリペプチドは、核酸分子内のヌクレオチド間のホスホジエステル結合を切断することが可能であるエンドヌクレアーゼである一方、他の実施形態においては、ＤＮＡ結合ポリペプチドは、核酸分子のいずれかの末端（５’又は３’）で、ヌクレオチドを切断することが可能であるエキソヌクレアーゼである。一部の実施形態において、配列特異的ヌクレアーゼは、メガヌクレアーゼ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、ＴＡＬ－エフェクタＤＮＡ結合ドメイン－ヌクレアーゼ融合タンパク質（ＴＡＬＥＮ）、及びそのヌクレアーゼ活性が低下又は阻害されているＲＮＡガイド型ヌクレアーゼ（ＲＧＮ）又はそれらのバリアントからなる群から選択される。
本明細書において使用される用語「メガヌクレアーゼ」又は「ホーミングエンドヌクレアーゼ」は、長さが１２～４０ｂｐである、二本鎖ＤＮＡ内の認識部位に結合するエンドヌクレアーゼである。メガヌクレアーゼの非限定的例は、保存されたアミノ酸モチーフＬＡＧＬＩＤＡＤＧ（配列番号：７５）を含む、ＬＡＧＬＩＤＡＤＧファミリーに属するものである。用語「メガヌクレアーゼ」は、二量体又は一本鎖のメガヌクレアーゼを指すことができる。
本明細書において使用される用語「ジンクフィンガーヌクレアーゼ」又は「ＺＦＮ」は、ジンクフィンガーＤＮＡ結合ドメイン及びヌクレアーゼドメインを含むキメラタンパク質を指す。
本明細書において使用される用語「ＴＡＬ－エフェクターＤＮＡ結合ドメイン－ヌクレアーゼ融合タンパク質」又は「ＴＡＬＥＮ」は、ＴＡＬエフェクターＤＮＡ結合ドメイン及びヌクレアーゼドメインを含むキメラタンパク質を指す。
本明細書において使用される用語「ＲＮＡガイド型ヌクレアーゼ」又は「ＲＧＮ」は、ヌクレアーゼ活性を有する、ＲＮＡガイド型ＤＮＡ結合ポリペプチドを指す。ガイドＲＮＡはＲＮＡガイド型ヌクレアーゼとの複合体を形成し、そのＲＮＡガイド型ヌクレアーゼが標的配列に結合し、及び一部の実施形態においては、その標的配列に一本鎖又は二本鎖の切断を導入するように指示するので、ＲＧＮは、「ＲＮＡガイド型」であると考えられる。
ここで開示された組成物及び方法において有用なＲＧＮの非限定的例は、公開公報WO 2020/139783、WO 2019/236566、WO 2021/030344、WO/2021/138247、並びに各々、２０２１年４月２３日及び２０２１年５月１１日に出願された、出願PCT/US2021/028843及びPCT/US2021/031794に明らかにされたものを含み、それらは各々その全体が引用により本明細書中に組み込まれている。一部の実施形態において、ここで開示された融合タンパク質は、配列番号：４０及び９５－１４２のいずれか一つと少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又はそれよりも多い同一性のアミノ酸配列を含むＲＧＮを含む。一部の実施形態において、ここで開示された融合タンパク質は、配列番号：４０及び９５－１４２のいずれか一つと少なくとも８０％同一のアミノ酸配列を有するＲＧＮを含む。一部の実施形態において、ここで開示された融合タンパク質は、配列番号：４０及び９５－１４２のいずれか一つと少なくとも８５％同一のアミノ酸配列を有するＲＧＮを含む。一部の実施形態において、ここで開示された融合タンパク質は、配列番号：４０及び９５－１４２のいずれか一つと少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を有するＲＧＮを含む。一部の実施形態において、ここで開示された融合タンパク質は、配列番号：４０及び９５－１４２のいずれか一つと少なくとも９５％同一のアミノ酸配列を有するＲＧＮを含む。他の実施形態において、ここで開示された融合タンパク質は、配列番号：４０及び９５－１４２のいずれか一つと少なくとも９９％同一のアミノ酸配列を有するＲＧＮを含む。一部の具体的実施形態において、ここで開示された融合タンパク質は、配列番号：４０及び９５－１４２のいずれか一つで表記されるアミノ酸配列を有するＲＧＮを含む。
本発明に従い、例えばｄＣａｓ９など、ヌクレアーゼ－不活化又は「死滅」するように変異されるＲＧＮタンパク質は、本明細書においてＲＮＡガイド型ＤＮＡ結合ポリペプチドと称される。好適なヌクレアーゼ－不活化Ｃａｓ９ドメインの一例は、Ｄ１０Ａ／Ｈ８４０Ａ Ｃａｓ９ドメイン変異体である(例えば、Qiら、Cell. 2013; 152(5): 1173-83を参照し、これは全内容が引用により本明細書中に組み込まれている)。加えて、他の公知のＲＮＡガイド型ヌクレアーゼ（ＲＧＮ）の好適なヌクレアーゼ－不活化Ｃａｓ９ドメインを決定することができる(例えば米国特許公開第2019/0367949号に開示されたＲＧＮ ＡＰＧ０８２９０．１のヌクレアーゼ－不活化バリアント、その全内容は引用により本明細書中に組み込まれている）。
用語「ＲＧＮポリペプチド」は、ニッカーゼと本明細書において称される、標的ヌクレオチド配列の一本鎖のみを切断するＲＧＮポリペプチドを包含している。そのようなＲＧＮは、単独の機能性ヌクレアーゼドメインを有する。ＲＧＮニッカーゼは、天然のニッカーゼであることができるか、又は追加のヌクレアーゼドメイン内で変異された二本鎖核酸分子の両方の鎖を天然に切断するＲＧＮタンパク質であることができ、その結果これらの変異されたドメインのヌクレアーゼ活性は低下又は除去され、ニッカーゼとなり始める。一部の実施形態において、本融合タンパク質のニッカーゼＲＧＮは、Ｄ１０Ａ変異を含み（例えば、ｎＡＰＧ０７４３３．１（配列番号：４１））、これはＲＧＮを、核酸二重鎖の塩基編集されない標的鎖（ＰＡＭを含み、且つｇＲＮＡと塩基対形成される鎖）のみを切断することを可能にする。一部の実施形態において、本融合タンパク質のニッカーゼＲＧＮは、配列番号：４０及び９５－１４２のいずれか一つにおけるＤ１０Ａ変異又はその同等変異を含む。一部の実施形態において、本融合タンパク質のニッカーゼＲＧＮは、Ｈ８４０Ａ変異を含み、これはＲＧＮを、核酸二重鎖の塩基編集された非－標的鎖（ＰＡＭを含まず、且つｇＲＮＡと塩基対形成されない鎖）のみの切断を可能にする。Ｈ８４０Ａ変異、又は同等変異を含むニッカーゼＲＧＮは、不活化されたＨＮＨドメインを有する。Ｄ１０Ａ変異、又は同等変異を含むニッカーゼＲＧＮは、不活化されたＲｕｖＣドメインを有する。このデアミナーゼは、非－標的鎖に作用する。Ｄ１０Ａ変異、又は同等変異を含むニッカーゼは、不活化ＲｕｖＣヌクレアーゼドメインを有し、且つＤＮＡの非－標的化された鎖、すなわち塩基編集が望まれる鎖を切断することができない。
他の追加の例証的好適なヌクレアーゼ不活化Ｃａｓ９ドメインは、Ｄ１０Ａ／Ｄ８３９Ａ／Ｈ８４０Ａ、及びＤ１０Ａ／Ｄ８３９Ａ／Ｈ８４０Ａ／Ｎ８６３Ａ変異体ドメインを含むが、これらに限定されるものではない(例えば、Ｍａｌｉら、Nature Biotechnology. 2013; 31(9): 833-838を参照し、その全内容は引用により本明細書中に組み込まれている)。ニッカーゼであるように変異された追加の好適なＲＧＮタンパク質は、本開示及び当該技術分野における知識(例えば、PCT公報WO 2019/236566に開示されたＲＧＮなど）を基に、当業者には明らかであり、且つ本開示の範囲内である。
一部の実施形態において、ニッカーゼ活性を保持するＲＧＮニッカーゼは、ｎＡＰＧ０７４３３．１（配列番号：４１）と少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は少なくとも９９．５％同一であるアミノ酸配列を含む。
ＰＣＲ－媒介型変異誘発及び部位特異的変異誘発などの、変異をアミノ酸配列へ導入する当該技術分野において公知の任意の方法は、ニッカーゼ又はヌクレアーゼ－死滅ＲＧＮを作出するために使用することができる。例えば、米国特許公開第２０１４／００６８７９７号及び米国特許第９，７９０，４９０号を参照し；その各々は、その全体が引用により本明細書中に組み込まれている。ＲＮＡガイド型ヌクレアーゼ（ＲＧＮ）は、ゲノム内の単独部位の標的化された操作を可能にし、且つ治療適用及び研究適用のための遺伝子標的化の状況において有用である。哺乳動物を含む様々な生物において、ＲＮＡガイド型ヌクレアーゼは、非相同性末端結合又は相同組換えのいずれかを刺激することによるゲノム操作に使用されている。ＲＧＮは、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓタンパク質を含み、これはクラスター化され規則的な間隔があいた短い回文構造の繰り返し（ＣＲＩＳＰＲ）ＲＮＡガイド型ヌクレアーゼシステムの一部としてのガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）、又はその活性バリアントもしくは断片により、標的配列に配向されたＲＮＡガイド型ヌクレアーゼである。
この開示の一部の態様は、ＲＮＡガイド型ＤＮＡ結合ポリペプチド、デアミナーゼポリペプチド、及びＵＳＰを含む、融合タンパク質を提供する。一部の実施形態において、ＲＮＡガイド型ＤＮＡ結合ポリペプチドは、ＲＮＡガイド型ヌクレアーゼである。更なる実施形態において、ＲＮＡガイド型ヌクレアーゼは、天然のＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓタンパク質又はその活性バリアントもしくは断片である。ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムは、クラスＩ又はクラスＩＩシステムに分類される。クラスＩＩシステムは、単独のエフェクターヌクレアーゼを含み、並びにＩＩ型、Ｖ型、及びＶＩ型を含む。各クラスは、更に型に分類され（Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶ、Ｖ、ＶＩ型）、一部の型は更に亜型に分類される（例えば、ＩＩ－Ａ型、ＩＩ－Ｂ型、ＩＩ－Ｃ型、Ｖ－Ａ型、Ｖ－Ｂ型）。
いくつかの実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓタンパク質は、天然のＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓタンパク質又はその活性バリアントもしくは断片である。本明細書において使用される用語「ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓタンパク質」、「ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓエフェクタータンパク質」又は「Ｃａｓ９」は、トランス活性化型ＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）を必要とし、且つ２つのヌクレアーゼドメイン（ＲｕｖＣ及びＨＮＨ）を含み、その各々は二本鎖ＤＮＡ分子の一本鎖を切断するのに寄与する、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓエフェクタータンパク質を指す。
他の実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓタンパク質は、天然のＶ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓタンパク質又はその活性バリアントもしくは断片である。本明細書において使用される用語「Ｖ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓタンパク質」、「Ｖ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓエフェクタータンパク質」又は「Ｃａｓ１２」は、ｄｓＤＮＡを切断し、且つ単独のＲｕｖＣヌクレアーゼドメイン又はスプリット(split)－ＲｕｖＣヌクレアーゼドメインを含み、及びＨＮＨドメインを欠く、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓエフェクタータンパク質を指す(Zetscheら、2015, Cell doi:10.1016/j.Cell.2015.09.038；Shmakovら、2017, Nat Rev Microbiol doi:10.1038/nrmicro.2016.184；Yanら、2018, Science doi:10.1126/science.aav7271；Harringtonら、2018, Science doi:10.1126/science.aav4294)。Ｃａｓ１２ａはまた、Ｃｐｆ１とも称され、ｔｒａｃｒＲＮＡを必要としないが、Ｃａｓ１２ｂなどの他のＶ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓタンパク質は、ｔｒａｃｒＲＮＡを必要とすることは注目される。ほとんどのＶ型エフェクターはまた、ｓｓＤＮＡ（一本鎖ＤＮＡ）も標的化することができ、ＰＡＭ必要要件を伴わないことが多い(Zetscheら、2015；Yanら、2018；Harringtonら、2018)。用語「Ｖ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓタンパク質」は、２０１９年１２月３０日に出願され、その内容が全体として引用により本明細書中に組み込まれている、米国特許仮出願第62/955,014号に開示されたもののような、スプリットＲｕｖＣヌクレアーゼドメインを含む独特なＲＧＮを包含する。
更に他の実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓタンパク質は、天然のＶＩ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓタンパク質、又はその活性バリアントもしくは断片である。本明細書において使用される用語「ＶＩ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓタンパク質」、「ＶＩ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓエフェクタータンパク質」又は「Ｃａｓ１３」は、ｔｒａｃｒＲＮＡを必要とせず、且つＲＮＡを切断する２つのＨＥＰＮドメインを含む、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓエフェクタータンパク質を指す。用語「ガイドＲＮＡ」は、標的配列とハイブリダイズし、及び会合したＲＧＮの標的ヌクレオチド配列への配列特異的結合を指示するのに充分な標的ヌクレオチド配列との相補性を有するヌクレオチド配列を指す。ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ ＲＧＮに関して、各ガイドＲＮＡは、１又は複数のＲＮＡ分子（一般に１又は２）であり、これはＲＧＮへ結合し、且つＲＧＮを、特定の標的ヌクレオチド配列へ結合するようにガイドすることができ、並びにＲＧＮがニッカーゼ又はヌクレアーゼ活性を有する場合には、また標的ヌクレオチド配列を切断する。ガイドＲＮＡは、ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）、及び一部の実施形態において、トランス活性化型ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）を含む。
ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡは、スペーサー配列及びＣＲＩＳＰＲ反復配列を含む。「スペーサー配列」は、関心対象の標的ヌクレオチド配列と、直接ハイブリダイズするヌクレオチド配列である。スペーサー配列は、関心対象の標的配列と完全に又は部分的に相補性であるように、操作される。様々な実施形態において、スペーサー配列は、約８ヌクレオチド～約３０ヌクレオチド又はそれよりも多くを含むことができる。例えば、スペーサー配列は、長さが約８、約９、約１０、約１１、約１２、約１３、約１４、約１５、約１６、約１７、約１８、約１９、約２０、約２１、約２２、約２３、約２４、約２５、約２６、約２７、約２８、約２９、約３０又はそれよりも多いヌクレオチドである。一部の実施形態において、スペーサー配列は、長さが約１０～約２６ヌクレオチド、又は長さが約１２～約３０ヌクレオチドである。特定の実施形態において、スペーサー配列は、長さが約３０ヌクレオチドである。一部の実施形態において、好適な整列化アルゴリズムを使用し最適に整列された場合、スペーサー配列とその対応する標的配列の間の相補性の程度は、ほぼ約５０％、約６０％、約７０％、約７５％、約８０％、約８１％、約８２％、約８３％、約８４％、約８５％、約８６％、約８７％、約８８％、約８９％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％又はそれよりも大きい。特定の実施形態において、スペーサー配列は、二次構造は自在であり、これは非限定的にｍＦｏｌｄ(例えば、Zuker及びStiegler (1981) Nucleic Acids Res. 9:133-148参照)及びＲＮＡｆｏｌｄ(例えば、Ｇｒｕｂｅｒら、(2008) Cell 106(1):23-24参照)を含む、当該技術分野において公知の好適なポリヌクレオチドフォールディングアルゴリズムを用いて推定することができる。
ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ反復配列は、それ自身で又はＲＧＮ分子により認識されるハイブリダイズされたｔｒａｃｒＲＮＡと協調してのいずれかで、構造を形成するヌクレオチド配列を含む。様々な実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ反復配列は、約８ヌクレオチド～約３０ヌクレオチド、又はそれよりも多くを含むことができる。例えば、ＣＲＩＳＰＲ反復配列は、長さが約８、約９、約１０、約１１、約１２、約１３、約１４、約１５、約１６、約１７、約１８、約１９、約２０、約２１、約２２、約２３、約２４、約２５、約２６、約２７、約２８、約２９、約３０又はそれよりも多いヌクレオチドであることができる。一部の実施形態において、好適な整列化アルゴリズムを使用し最適に整列された場合、ＣＲＩＳＰＲ反復配列とその対応するｔｒａｃｒＲＮＡ配列の間の相補性の程度は、ほぼ約５０％、約６０％、約７０％、約７５％、約８０％、約８１％、約８２％、約８３％、約８４％、約８５％、約８６％、約８７％、約８８％、約８９％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％又はそれよりも多い。
一部の実施形態において、ガイドＲＮＡは更に、ｔｒａｃｒＲＮＡ分子を含む。トランス活性化型ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ又はｔｒａｃｒＲＮＡ分子は、本明細書においてアンチリピート領域と称される、ｃｒＲＮＡのＣＲＩＳＰＲ反復配列にハイブリダイズするのに充分な相補性を有する領域を含むヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態において、ｔｒａｃｒＲＮＡ分子は更に、二次構造（例えばステムループ）を持つ領域を含むか、又はその対応するｃｒＲＮＡとのハイブリダイゼーション時に二次構造を形成する。特定の実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ反復配列と完全に又は部分的に相補的であるｔｒａｃｒＲＮＡの領域は、その分子の５’末端であり、及びｔｒａｃｒＲＮＡの３’末端は、二次構造を含む。二次構造のこの領域は一般に、ネクサスヘアピンを含む、いくつかのヘアピン構造を含み、これはアンチリピート配列に隣接して認められる。ｔｒａｃｒＲＮＡの３’末端には、末端ヘアピンが存在することが多く、これは構造及び数は変動し得るが、３’末端にＧＣ－リッチＲｈｏ－非依存的転写終結因子ヘアピン、それに続く一連のＵを含むことが多い。例えば、Ｂｒｉｎｅｒら、(2014) Molecular Cell 56:333-339、Briner及びBarrangou (2016) Cold Spring Harb Protoc; doi: 10.1101/pdb.top090902、並びに米国特許公開第2017/0275648号を参照し、その各々はその全体が引用により本明細書中に組み込まれている。
様々な実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ反復配列と完全又は部分的に相補的であるｔｒａｃｒＲＮＡのアンチリピート領域は、約６ヌクレオチド～約３０ヌクレオチド、又はそれよりも多くを含む。例えば、ｔｒａｃｒＲＮＡアンチリピート配列とＣＲＩＳＰＲ反復配列の間の塩基対形成する領域は、長さが約６、約７、約８、約９、約１０、約１１、約１２、約１３、約１４、約１５、約１６、約１７、約１８、約１９、約２０、約２１、約２２、約２３、約２４、約２５、約２６、約２７、約２８、約２９、約３０又はそれよりも多いヌクレオチドであることができる。特定の実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ反復配列に完全又は部分的に相補的であるｔｒａｃｒＲＮＡのアンチリピート領域は、長さが約１０ヌクレオチドである。一部の実施形態において、好適な整列化アルゴリズムを使用し最適に整列された場合、ＣＲＩＳＰＲ反復配列とその対応するｔｒａｃｒＲＮＡアンチリピート配列の間の相補性の程度は、ほぼ約５０％、約６０％、約７０％、約７５％、約８０％、約８１％、約８２％、約８３％、約８４％、約８５％、約８６％、約８７％、約８８％、約８９％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％又はそれよりも多い。
様々な実施形態において、全ｔｒａｃｒＲＮＡは、約６０ヌクレオチドから約２１０を超えるヌクレオチドを含むことができる。例えば、ｔｒａｃｒＲＮＡは、長さが約６０、約６５、約７０、約７５、約８０、約８５、約９０、約９５、約１００、約１０５、約１１０、約１１５、約１２０、約１２５、約１３０、約１３５、約１４０、約１５０、約１６０、約１７０、約１８０、約１９０、約２００、約２１０又はそれよりも多いヌクレオチドであることができる。特定の実施形態において、ｔｒａｃｒＲＮＡは、長さが約１００から約２０１ヌクレオチドであり、長さが約９５、約９６、約９７、約９８、約９９、約１００、約１０５、約１０６、約１０７、約１０８、約１０９、及び約１００ヌクレオチドを含む。
ガイドＲＮＡは、ＲＮＡガイド型ヌクレアーゼと複合体を形成し、ＲＮＡガイド型ヌクレアーゼを、標的配列と結合するように指示し、且つ標的配列に一本鎖又は二本鎖の切断を導入する。標的配列が切断された後、その切断は修復され、その結果標的配列のＤＮＡ配列は、修復プロセス時に改変される。宿主細胞のＤＮＡ中の標的配列を改変するためにデアミナーゼに連結されている、ヌクレアーゼ不活化又はニッカーゼのいずれかである、ＲＮＡガイド型ヌクレアーゼの変異体バリアントを使用する方法が、本明細書に提供される。ヌクレアーゼ活性が不活化されるか又は有意に減少されるＲＮＡガイド型ヌクレアーゼの変異体バリアントは、これらのポリペプチドは、標的配列に結合することは可能であるが、必ずしも切断しないので、ＲＮＡガイド型ＤＮＡ結合ポリペプチドと称されて良い。二本鎖核酸分子の一本鎖を切断することのみ可能であるＲＮＡガイド型ヌクレアーゼは、本明細書においてニッカーゼと称される。
標的ヌクレオチド配列は、ＲＧＮにより結合され、及びＲＧＮに会合されたガイドＲＮＡとハイブリダイズする。その後標的配列は、このポリペプチドが、ニッカーゼとしての活性を包含するヌクレアーゼ活性を持つ場合に、ＲＧＮにより引き続き切断されることができる。
ガイドＲＮＡは、シングルガイドＲＮＡ又はデュアル－ガイドＲＮＡシステムであることができる。シングルガイドＲＮＡは、ＲＮＡのシングル分子上にｃｒＲＮＡ及び任意にｔｒａｃｒＲＮＡを含むのに対し、デュアル－ガイドＲＮＡシステムは、ｃｒＲＮＡのＣＲＩＳＰＲ反復配列の少なくとも一部分、及びｃｒＲＮＡのＣＲＩＳＰＲ反復配列に完全又は部分的に相補的であってよいｔｒａｃｒＲＮＡの少なくとも一部分を通じて介して互いにハイブリダイズされている、２個の異なるＲＮＡ分子上に存在するｃｒＲＮＡ及びｔｒａｃｒＲＮＡを含む。ガイドＲＮＡがシングルガイドＲＮＡであるそれらの実施形態の一部において、ｃｒＲＮＡ及び任意にｔｒａｃｒＲＮＡは、リンカーヌクレオチド配列により隔てられている。
概して、このリンカーヌクレオチド配列は、その中に二次構造の形成を避けるために相補的塩基を含まないか、又はリンカーヌクレオチド配列のヌクレオチドを含むものである。一部の実施形態において、ｃｒＲＮＡとｔｒａｃｒＲＮＡの間のリンカーヌクレオチド配列は、長さが少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１２、又はより多いヌクレオチドである。特定の実施形態において、シングルガイドＲＮＡのリンカーヌクレオチド配列は、長さが少なくとも４ヌクレオチドである。
いくつかの実施形態において、ガイドＲＮＡは、ＲＮＡ分子として、標的細胞、細胞小器官もしくは胚へ導入されることができる。ガイドＲＮＡは、インビトロにおいて転写されるか、又は化学的に合成されることができる。他の実施形態において、ガイドＲＮＡをコードしているヌクレオチド配列は、細胞、細胞小器官もしくは胚へ導入される。これらの実施形態の一部において、ガイドＲＮＡをコードしているヌクレオチド配列は、プロモーター（例えばＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーター）へ機能的に連結される。このプロモーターは、未変性のプロモーターであるか、又はガイドＲＮＡをコードしているヌクレオチド配列に対し異種であることができる。
様々な実施形態において、ガイドＲＮＡは、本明細書に記載されたように、リボ核タンパク質複合体として、標的細胞、細胞小器官もしくは胚へ導入されることができ、ここでガイドＲＮＡは、ＲＮＡガイド型ヌクレアーゼポリペプチドに結合される。
このガイドＲＮＡは、標的ヌクレオチド配列へのガイドＲＮＡのハイブリダイゼーションを介して、会合したＲＮＡガイド型ヌクレアーゼを、関心対象の特定の標的ヌクレオチド配列に方向付ける。標的ヌクレオチド配列は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、又は両方の組合せを含むことができ、且つ一本鎖又は二本鎖であることができる。標的ヌクレオチド配列は、ゲノムＤＮＡ（すなわち染色体ＤＮＡ）、プラスミドＤＮＡ、又はＲＮＡ分子（例えばメッセンジャーＲＮＡ、リボソームＲＮＡ、転移ＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、低分子干渉ＲＮＡ）であることができる。標的ヌクレオチド配列は、インビトロ又は細胞において、ＲＮＡガイド型ヌクレアーゼにより、結合される（及び一部の実施形態においては切断される）ことができる。ＲＧＮにより標的化された染色体配列は、核、色素体又はミトコンドリア染色体配列であることができる。一部の実施形態において、標的ヌクレオチド配列は、標的ゲノムにおいて独自である。
一部の実施形態において、この標的ヌクレオチド配列は、プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）に隣接している。ＰＡＭは一般に、標的ヌクレオチド配列から、約１から約１０ヌクレオチド以内にあり、標的ヌクレオチド配列から約１、約２、約３、約４、約５、約６、約７、約８、約９、又は約１０ヌクレオチドにある。ＰＡＭは、標的配列の５’又は３’であることができる。一部の実施形態において、ＰＡＭは、標的配列の３’である。一般に、ＰＡＭは、約２～６ヌクレオチドのコンセンサス配列であるが、特定の実施形態においては、長さが１、２、３、４、５、６、７、８、９又はそれよりも多いヌクレオチドであることができる。
その対応するＰＡＭ配列の認識時に、ＲＧＮは、標的ヌクレオチド配列を、特異的切断部位において切断することができる。本明細書において使用される切断部位は、その間でヌクレオチド配列がＲＧＮにより切断される、標的ヌクレオチド配列内の２つの特定のヌクレオチドで構成されている。切断部位は、５’又は３’のいずれかの方向で、ＰＡＭ由来の第１及び第２、第２及び第３、第３及び第４、第４及び第５、第５及び第６、第７及び第８、又は第８及び第９のヌクレオチドを含む。ＲＧＮは、標的ヌクレオチド配列を切断し、付着末端を生じることができるので、一部の実施形態において、この切断部位は、そのポリヌクレオチドのプラス（＋）鎖上のＰＡＭからの２ヌクレオチドの距離、及びポリヌクレオチドのマイナス（－）鎖上のＰＡＭからの２ヌクレオチドの距離を基に規定される。
ＲＧＮを使用し、特定のゲノム位置に搭載された融合されたポリペプチド、ポリヌクレオチド、又は小型分子を送達することができる。一部の実施形態において、ヌクレアーゼ－不活化又はニッカーゼＲＧＮは、デアミナーゼへ、並びに同じく本発明のＵＳＰへ、機能的に連結される。
本明細書において使用される用語「デアミナーゼ」又は「デアミナーゼポリペプチド」は、脱アミノ化反応を触媒するポリペプチドを指す。デアミナーゼは、天然のデアミナーゼ酵素又はその活性断片もしくはバリアントであってよい。一部の実施形態において、デアミナーゼは、シチジン又はデオキシシチジンの、各々、ウラシル又はデオキシウラシルへの加水分解による脱アミノ化を触媒する、シチジンデアミナーゼである。シチジンデアミナーゼは、ＤＮＡ又はＲＮＡのいずれか一項に働き、並びに典型的には一本鎖核酸分子上で機能する。好ましい実施形態において、標的鎖に対しニッカーゼ活性を有するＲＧＮは、標的鎖に切れ目を入れる一方で、相補性のある非－標的鎖は、デアミナーゼにより改変される。細胞ＤＮＡ－修復機序は、鋳型として改変された非－標的鎖を使用し、切れ目の入った標的鎖を修復し、これによりＤＮＡに変異を導入する。
一部の実施形態において、シチジンデアミナーゼは、アポリポタンパクＢ－ｍＲＮＡ編集複合体（ＡＰＯＢＥＣ）ファミリーデアミナーゼである。これらの実施形態の一部において、デアミナーゼは、ＡＰＯＢＥＣｌファミリーデアミナーゼである。一部の実施形態において、シチジンデアミナーゼは、活性化－誘導されたシチジンデアミナーゼ（ＡＩＤ）である。一部の実施形態において、デアミナーゼは、ＡＣＦ１／ＡＳＥデアミナーゼである。いくつかの実施形態において、デアミナーゼは、アデノシンデアミナーゼである。これらの実施形態の一部において、デアミナーゼは、ＡＤＡＴファミリーデアミナーゼである。追加の好適なデアミナーゼ酵素又はドメインは、本開示を基に当業者には明らかであろう。
デアミナーゼポリペプチドの好適な型の一例は、例えばＡＰＯＢＥＣファミリーの、シチジンデアミナーゼである。シトシンデアミナーゼ酵素のアポリポタンパクＢ ｍＲＮＡ編集複合体（ＡＰＯＢＥＣ）ファミリーは、制御され且つ有益な様式で変異誘発を開始するために利用される１１種のタンパク質を包含している(Conticelloら、2008. Genome Biology, 9(6): 229)。１つのファミリーメンバーの活性化－誘導されたシチジンデアミナーゼ（ＡＩＤ）は、転写－依存型、鎖－偏った様式で、ｓｓＤＮＡ中のシトシンをウラシルへ変換することにより、抗体の成熟に寄与する(Reynaudら、2003. Nature Immunology, 4(7): 631-638)。アポリポタンパクＢ編集複合体３（ＡＰＯＢＥＣ３）酵素は、逆転写ウイルスｓｓＤＮＡにおけるシトシンの脱アミノ化を介し、ヒト細胞の、特定のＨＩＶ－１株に対する防御を提供する(Bhagwatら、2004. DNA Repair (Amst), 3(1): 85-9)。これらのタンパク質は全て、Ｚｎ２＋－配位モチーフ（ＨｉｓＸ－Ｇｌｕ－Ｘ２３－２６－Ｐｒｏ－Ｃｙｓ－Ｘ２－４－Ｃｙｓ）及び触媒活性のための結合した水分子を必要とする。Ｇｌｕ残基は、脱アミノ化反応における求核的攻撃のために、水分子を水酸化亜鉛に活性化するように、作用する。各ファミリーメンバーは、ｈＡＩＤに関するＷＲＣから（ここでＷはＡ又はＴであり、及びＲはＡ又はＧである）、ｈＡＰＯＢＥＣ３Ｆに関するＴＴＣまでの範囲にわたり、それ自身の特定の「ホットスポット」で、優先的に脱アミノ化する(Navaratnamら、2006. Intl J Hematol 83(3): 195-200)。ＡＰＯＢＥＣ３Ｇの触媒ドメインの最新の結晶構造は、６個のα－ヘリックスに隣接した５つの鎖β－シートコアで構成される二次構造を明らかにし、これは全ファミリーを超えて保存されると考えられる(Holdenら、2008. Nature 456(7218): 121-124)。この活性中心ループは、ｓｓＤＮＡ結合及び「ホットスポット」同一性の決定の両方に寄与することが示されている(Chelicoら、2009. J Biol Chem 284(41): 27761-27765)。これらの酵素の過剰発現は、ゲノム不安定性及び癌に結びつけられており、従って配列特異的標的化の重要性を強調している(Phamら、2005. Biochem 44(8): 2703-2715)。一部の実施形態において、デアミナーゼポリペプチドは、シチジンを脱アミノ化し、ウラシルを生じることができるデアミナーゼポリペプチドであってよい。デアミナーゼによる核酸塩基の脱アミノ化は、各残基での点変異に繋がり得、これによりＤＮＡ分子を改変する。この改変の作用はまた本明細書において、核酸編集、又は塩基編集と称される。従ってＣａｓ９バリアント又はドメイン、デアミナーゼドメイン、及びＵＳＰドメインを含む融合タンパク質は、核酸配列の標的化された編集に使用することができる。
一部の実施形態において、本発明のデアミナーゼ及びＵＳＰへ融合されたヌクレアーゼ不活化ＲＧＮ又はニッカーゼＲＧＮは、一部の実施形態において特定のゲノム座位である、核酸分子（すなわち標的核酸分子）の特定の位置に標的化され、所望の配列の発現を変更することができる。一部の実施形態において、融合タンパク質の標的配列への結合は、ヌクレオチド塩基の脱アミノ化を生じ、１個のヌクレオチド塩基の別のものへの変換を生じる。一部の実施形態において、この融合タンパク質の標的配列への結合は、標的配列に隣接しているヌクレオチド塩基の脱アミノ化を生じる。ここで開示された組成物及び方法を使用し脱アミノ化及び変異されている標的配列に隣接しているヌクレオチド塩基は、標的核酸分子内の標的配列（ｇＲＮＡにより結合された）の５’又は３’末端から、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、又は１００塩基対であってよい。この開示の一部の態様は、（ｉ）ヌクレアーゼ－不活化又はニッカーゼ ＲＧＮポリペプチド；（ｉｉ）デアミナーゼポリペプチド；及び、（ｉｉｉ）ウラシル安定化ポリペプチドを含む、融合タンパク質を提供する。
本開示は、様々な立体配置の融合タンパク質を提供する。一部の実施形態において、デアミナーゼポリペプチドは、ＲＧＮポリペプチドのＮ－末端に融合される。一部の実施形態において、デアミナーゼポリペプチドは、ＲＧＮポリペプチドのＣ－末端に融合される。
一部の実施形態において、ＵＳＰドメイン、デアミナーゼドメイン、及びＲＮＡガイド型ＤＮＡ結合ポリペプチドは、リンカーを介して、互いに融合される。具体的適用に関してデアミナーゼ活性について最適な長さを達成するために、この融合タンパク質の３種の機能性ドメイン間の様々なリンカーの長さ及び柔軟性を、利用することができる（例えば、型（ＧＧＧＧＳ）ｎ及び（Ｇ）ｎの非常に柔軟なリンカーから、型（ＥＡＡＡＫ）ｎ及び（ＸＰ）ｎのより剛直なリンカーまでの範囲）。本明細書において使用される用語「リンカー」は、例えばヌクレアーゼの結合ドメインと切断ドメインなど、２つの分子もしくは部分を連結する化学基又は分子を指す。一部の実施形態において、リンカーは、ＲＮＡガイド型ヌクレアーゼとデアミナーゼを結合する。一部の実施形態において、リンカーは、ｄＣａｓ９とデアミナーゼを結合する。典型的には、リンカーは、２つの基、分子、又は他の部分の間に、又は隣接して配置され、及び共有結合を介して互いに結合され、従ってこれら２つを連結する。一部の実施形態において、リンカーは、１個のアミノ酸又は複数のアミノ酸（例えば、ペプチド又はタンパク質）である。一部の実施形態において、リンカーは、有機分子、基、重合体、又は化学部分である。一部の実施形態において、リンカーは、長さが５～１００個のアミノ酸、例えば長さが５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３０～３５、３５～４０、４０～４５、４５～５０、５０～６０、６０～７０、７０～８０、８０～９０、９０～１００、１００～１５０、又は１５０～２００個のアミノ酸である。より長い又はより短いリンカーも、企図される。
一部の実施形態において、リンカーは、（ＧＧＧＧＳ）ｎ、（Ｇ）ｎ、（ＥＡＡＡＫ）ｎ、又は（ＸＰ）ｎモチーフ、又はこれらの任意の組合せを含み、ここでｎは、独立して１～３０の整数である。一部の実施形態において、ｎは、独立して１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、もしくは３０であるか、又は２以上のリンカー又は２以上のリンカーモチーフが存在する場合、それらの任意の組合せである。追加の好適なリンカーモチーフ及びリンカー立体配置は、当業者には明らかであろう。一部の実施形態において、好適なリンカーモチーフ及び立体配置は、Chenら、2013 (Adv Drug Deliv Rev. 65(10):1357-69、に説明されたものを含み、この全内容は引用により本明細書中に組み込まれている。追加の好適なリンカー配列は、当業者には明らかであろう。
一部の実施形態において、本明細書に提供される融合タンパク質の例の一般的構造は、以下の構造を含み：［ＮＨ２］－［デアミナーゼ］－［ＲＧＮポリペプチド］－［ＵＳＰ］－［ＣＯＯＨ］；［ＮＨ２］－［ＵＳＰ］－［デアミナーゼ］－［ＲＧＮポリペプチド］－［ＣＯＯＨ］；［ＮＨ２］－［ＵＳＰ］－［ＲＧＮポリペプチド］－［デアミナーゼ］－［ＣＯＯＨ］；［ＮＨ２］－［ＲＧＮポリペプチド］－［デアミナーゼ］－［ＵＳＰ］－［ＣＯＯＨ］；［ＮＨ２］－［ＲＧＮポリペプチド］－［ＵＳＰポリペプチド］－［デアミナーゼポリペプチド］－［ＣＯＯＨ］；又は、［ＮＨ２］－［デアミナーゼポリペプチド］－［ＵＳＰポリペプチド］－［ＲＧＮポリペプチド］－［ＣＯＯＨ］、ここでＮＨ２は、融合タンパク質のＮ－末端であり、及びＣＯＯＨは、融合タンパク質のＣ－末端である。
この開示の一部の態様は、ＵＳＰドメインを含まない類似の融合タンパク質と比べ、増大したＣ→Ｔ核酸塩基編集効率を伴う、デアミナーゼ－ＲＧＮ－ＵＳＰ融合タンパク質、デアミナーゼ－ヌクレアーゼ不活化ＲＧＮ－ＵＳＰ融合タンパク質、及びデアミナーゼ－ニッカーゼＲＧＮ－ＵＳＰ融合タンパク質を提供する。
一部の実施形態において、本融合タンパク質は、以下の構造を含む：［ＮＨ２］－［デアミナーゼ］－［ヌクレアーゼ－不活化ＲＧＮ］－［ＵＳＰ］－［ＣＯＯＨ］；［ＮＨ２］－［デアミナーゼポリペプチド］－［ＵＳＰ］－［ヌクレアーゼ－不活化ＲＧＮ］－［ＣＯＯＨ］；［ＮＨ２］－［ＵＳＰ］－［デアミナーゼ］－［ヌクレアーゼ－不活化ＲＧＮ］－［ＣＯＯＨ］；［ＮＨ２］－［ＵＳＰ］－［ヌクレアーゼ－不活化ＲＧＮ］－［デアミナーゼ］－［ＣＯＯＨ］；［ＮＨ２］－［ヌクレアーゼ－不活化ＲＧＮ］－［デアミナーゼ］－［ＵＳＰ］－［ＣＯＯＨ］；又は、［ＮＨ２］－［ヌクレアーゼ－不活化ＲＧＮ］－［ＵＳＰ］－［デアミナーゼ］－［ＣＯＯＨ］。「ヌクレアーゼ－不活化ＲＧＮ」は、ヌクレアーゼ－不活性であるように変異されている、任意のＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓタンパク質を含む、任意のＲＧＮを表すことは理解されなければならない。また「ＵＳＰ」は、１又は複数のＵＳＰポリペプチドを表すことも理解されなければならない。
他の実施形態において、本融合タンパク質は、以下の構造を含む：［ＮＨ２］－［デアミナーゼ］－［ＲＧＮニッカーゼ］－［ＵＳＰ］－［ＣＯＯＨ］；［ＮＨ２］－［デアミナーゼ］－［ＵＳＰ］－［ＲＧＮニッカーゼ］－［ＣＯＯＨ］；［ＮＨ２］－［ＵＳＰ］－［デアミナーゼ］－［ＲＧＮニッカーゼ］－［ＣＯＯＨ］；［ＮＨ２］－［ＵＳＰ］－［ＲＧＮニッカーゼ］－［デアミナーゼ］－［ＣＯＯＨ］；［ＮＨ２］－［ＲＧＮニッカーゼ］－［デアミナーゼ］－［ＵＳＰ］－［ＣＯＯＨ］；又は、［ＮＨ２］－［ＲＧＮニッカーゼ］－［ＵＳＰ］－［デアミナーゼ］－［ＣＯＯＨ］。「ＲＧＮニッカーゼ」は、ニッカーゼとして活性があるように変異されている、任意のＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓタンパク質を含む、任意のＲＧＮを表すことは理解されなければならない。また「ＵＳＰ」は、１又は複数のＵＳＰポリペプチドを表すことも理解されなければならない。
一部の実施形態において、本融合タンパク質は、配列番号：４７、４８及び７６－９４のいずれか一つと少なくとも８０％の配列同一性を有するシチジンデアミナーゼ、配列番号：４０、４１、９５－１４２のいずれか一つと少なくとも８０％の配列同一性を有するＲＧＮ（又はそのニッカーゼ）、及び配列番号：１－１６のいずれか一つと少なくとも８０％の配列同一性を有するＵＳＰを含む。
一部の実施形態において、本融合タンパク質は、配列番号：４７、４８及び７６－９４のいずれか一つと少なくとも８５％の配列同一性を有するシチジンデアミナーゼ、配列番号：４０、４１、９５－１４２のいずれか一つと少なくとも８５％の配列同一性を有するＲＧＮ（又はそのニッカーゼ）、及び配列番号：１－１６のいずれか一つと少なくとも８５％の配列同一性を有するＵＳＰを含む。
一部の実施形態において、本融合タンパク質は、配列番号：４７、４８及び７６－９４のいずれか一つと少なくとも９０％の配列同一性を有するシチジンデアミナーゼ、配列番号：４０、４１、９５－１４２のいずれか一つと少なくとも９０％の配列同一性を有するＲＧＮ（又はそのニッカーゼ）、及び配列番号：１－１６のいずれか一つと少なくとも９０％の配列同一性を有するＵＳＰを含む。
一部の実施形態において、本融合タンパク質は、配列番号：４７、４８及び７６－９４のいずれか一つと少なくとも９５％の配列同一性を有するシチジンデアミナーゼ、配列番号：４０、４１、９５－１４２のいずれか一つと少なくとも９５％の配列同一性を有するＲＧＮ（又はそのニッカーゼ）、及び配列番号：１－１６のいずれか一つと少なくとも９５％の配列同一性を有するＵＳＰを含む。
一部の実施形態において、本融合タンパク質は、配列番号：４７、４８及び７６－９４のいずれか一つで表記されるアミノ酸配列を有するシチジンデアミナーゼ、配列番号：４０、４１、９５－１４２のいずれか一つで表記されるアミノ酸配列を有するＲＧＮ（又はそのニッカーゼ）、及び配列番号：１－１６のいずれか一つで表記されるアミノ酸配列を有するＵＳＰを含む。
一部の実施形態において、先の一般的構造において使用される「－」は、任意のリンカー配列の存在を示す。一部の実施形態において、本明細書に提供される融合タンパク質は、リンカー配列を含まない。一部の実施形態において、任意のリンカー配列の少なくとも１つが存在する。
存在し得る他の例証的特徴は、核局在化配列、細胞質局在化配列などの局在化配列、核外搬出配列などの搬出配列、又は他の局在化配列、並びに融合タンパク質の可溶化、精製又は検出に有用な配列タグである。本明細書に提供される好適な局在化シグナル配列及びタンパク質タグの配列は、ビオチンカルボキシラーゼ担体タンパク質（ＢＣＣＰ）タグ、ｍｙｃ－タグ、カルモジュリン－タグ、ＦＬＡＧ－タグ、赤血球凝集素（ＨＡ）－タグ、ヒスチジンタグもしくはＨｉｓ－タグとも称されるポリヒスチジンタグ、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）－タグ、ｎｕｓ－タグ、グルタチオン－Ｓ－転移酵素（ＧＳＴ）－タグ、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）－タグ、チオレドキシン－タグ、Ｓ－タグ、Ｓｏｔａｇ（例えば、Ｓｏｆｔａｇ１、Ｓｏｆｔａｇ３）、ｓｔｒｅｐｔａｇ、ビオチンリガーゼタグ、ＦｌＡｓＨタグ、Ｖ５タグ、及びＳＢＰ－タグを含むが、これらに限定されるものではない。追加の好適な配列は、当業者には明らかであろう。
いくつかの実施形態において、ここで開示された融合タンパク質は、融合タンパク質の細胞取り込みを促進する少なくとも１つの細胞膜透過性ドメインを含む。細胞膜透過性ドメインは、当該技術分野において公知であり、且つ一般に正帯電したアミノ酸残基（すなわちポリカチオン性細胞膜透過性ドメイン）、交互の極性アミノ酸残基と非極性アミノ酸残基（すなわち両親媒性細胞膜透過性ドメイン）、又は疎水性アミノ酸残基（すなわち疎水性細胞膜透過性ドメイン）を含む(例えばMilletti F. (2012) Drug Discov Today 17:850-860参照)。細胞膜透過性ドメインの非限定的例は、ヒト免疫不全ウイルス１由来のトランス活性化する転写活性化因子（ＴＡＴ）である。
一部の実施形態において、本明細書に提供されるＵＳＰ又は融合タンパク質は、核局在化配列（ＮＬＳ）を更に含む。核局在化シグナル、色素体局在化シグナル、ミトコンドリア局在化シグナル、デュアル－標的化局在化シグナル、及び／又は細胞膜透過性ドメインは、この融合タンパク質のアミノ－末端（Ｎ－末端）、カルボキシル－末端（Ｃ－末端）、又は内部位置に配置されることができる。
一部の実施形態において、ＮＬＳは、融合タンパク質又はＵＳＰのＮ－末端に融合される。一部の実施形態において、ＮＬＳは、融合タンパク質又はＵＳＰのＣ－末端に融合される。一部の実施形態において、ＮＬＳは、融合タンパク質のＵＳＰのＮ－末端に融合される。一部の実施形態において、ＮＬＳは、融合タンパク質のＵＳＰのＣ－末端に融合される。一部の実施形態において、ＮＬＳは、融合タンパク質のＲＧＮポリペプチドのＮ－末端に融合される。一部の実施形態において、ＮＬＳは、融合タンパク質のＲＧＮポリペプチドのＣ－末端に融合される。一部の実施形態において、ＮＬＳは、融合タンパク質のデアミナーゼポリペプチドのＮ－末端に融合される。一部の実施形態において、ＮＬＳは、融合タンパク質のデアミナーゼポリペプチドのＣ－末端に融合される。一部の実施形態において、ＮＬＳは、１又は複数のリンカーを介して、融合タンパク質又はＵＰＳに融合される。一部の実施形態において、ＮＬＳは、リンカーを伴わずに、融合タンパク質又はＵＰＳに融合される。一部の実施形態において、ＮＬＳは、本明細書に提供されるか又は言及されるＮＬＳ配列のいずれか一つのアミノ酸配列を含む。一部の実施形態において、ＮＬＳは、配列番号：４２又は配列番号：４５で表記されるアミノ酸配列を含む。
一部の実施形態において、本明細書に提供される融合タンパク質は、例えば配列番号：１－１６のいずれか一つの、ウラシル安定化タンパク質の完全長配列を含む。しかし他の実施形態において、本明細書に提供される融合タンパク質は、ＵＳＰの完全長配列は含まないが、その断片のみを含む。例えば一部の実施形態において、本明細書に提供される融合タンパク質は、ＲＮＡガイド型ＤＮＡ結合性ドメイン、デアミナーゼドメイン、及びＵＳＰの活性断片を更に含む。
一部の実施形態において、本発明の融合タンパク質は、ＲＧＮ、デアミナーゼ、及びＵＳＰを含み、ここでＵＳＰは、配列番号：１－１６のいずれかと少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％同一のアミノ酸配列を有する。そのような融合タンパク質の例は、本明細書の「実施例」の項に説明されている。
一部の実施形態において、本融合タンパク質は、１個のＵＳＰポリペプチドを含む。一部の実施形態において、本融合タンパク質は、直接又はリンカーを介してのいずれかで機能的に連結された、少なくとも２個のＵＳＰポリペプチドを含む。一部の実施形態において、本融合タンパク質は、１個のＵＳＰポリペプチドを含み、及び２番目のＵＳＰポリペプチドは、この融合タンパク質と同時発現される。
本発明の別の実施形態は、本融合タンパク質、及びシングルガイドＲＮＡとして又はデュアルガイドＲＮＡとしてのいずれかのガイドＲＮＡ（集合的にｇＲＮＡと称される）を含む、リボ核タンパク質複合体である。
ＩＶ． ウラシル安定化ポリペプチド、融合タンパク質、及び／又はｇＲＮＡをコードしているヌクレオチド
本開示は、ここで明らかにされたウラシル安定化ポリペプチド（配列番号：１７－３２）をコードしているポリヌクレオチドを提供する。本開示は、デアミナーゼ及びＤＮＡ結合ポリペプチド、例えばメガヌクレアーゼ、ジンクフィンガー融合タンパク質、もしくはＴＡＬＥＮを含む、融合タンパク質をコードしているポリヌクレオチドを更に提供する。本開示は、ＵＳＰ、デアミナーゼドメイン、及びＲＮＡガイド型ＤＮＡ結合ポリペプチドを含む融合タンパク質をコードしているポリヌクレオチドを更に提供する。そのようなＲＮＡガイド型ＤＮＡ結合ポリペプチドは、ＲＧＮ又はＲＧＮバリアントであってよい。このタンパク質バリアントは、ヌクレアーゼ－不活化又はニッカーゼである。このＲＧＮは、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓタンパク質又はその活性バリアントもしくは断片であってよい。配列番号：４０及び４１は、各々、ＲＧＮ及びニッカーゼＲＧＮバリアントの非限定的例である。ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓヌクレアーゼの例は、当該技術分野において周知であり、且つ類似の対応する変異は、またニッカーゼであるか又はヌクレアーゼ不活化である変異体バリアントを作製することができる。
本発明の実施形態は、ＲＧＮ、デアミナーゼ、及び本明細書記載のＵＳＰ（配列番号：１－１６、又はそのバリアント）を含む、融合タンパク質をコードしているポリヌクレオチドを提供する。一部の実施形態において、第二のポリヌクレオチドは、関心対象のヌクレオチド配列を標的化するためにＲＧＮにより必要とされたガイドＲＮＡをコードしている。他の実施形態において、このガイドＲＮＡ及び本融合タンパク質は、同じポリヌクレオチドによりコードされる。
用語「ポリヌクレオチド」の使用は、本開示をＤＮＡを含むポリヌクレオチドに限定することを意図しない。当業者は、ポリヌクレオチドは、リボヌクレオチド（ＲＮＡ）及びリボヌクレオチドとデオキシリボヌクレオチドの組合せを含むことができることを認めるであろう。そのようなデオキシリボヌクレオチド及びリボヌクレオチドは、天然の分子及び合成アナログの両方を含む。本明細書において開示されたポリヌクレオチドはまた、非限定的に、一本鎖型、二本鎖型、ステム－ループ構造などを含む配列の全ての型も包含している。
本発明の実施形態は、配列番号：１７－３２のいずれかと少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％又は１００％同一の配列を含む核酸分子であり、ここでこの核酸分子は、ウラシル安定化活性を有するＵＳＰをコードしている。この核酸分子は更に、異種プロモーター又はターミネーターも含んでよい。この核酸分子は、融合タンパク質をコードし、ここでコードされたＵＳＰは、ＤＮＡ結合ポリペプチド、及び／又はデアミナーゼへ機能的に連結される。一部の実施形態において、この核酸分子は、融合タンパク質をコードし、ここでコードされたＵＳＰは、ＲＧＮ及び／又はデアミナーゼへ機能的に連結される。
本発明のＵＳＰをコードしているポリヌクレオチドを含む核酸分子は、関心対象の生物における発現のために最適化されたコドンであることができる。「コドン最適化された」コード配列は、好ましいコドン使用頻度又は特定の宿主細胞の転写条件を模倣するように設計された、そのコドン使用頻度を有するポリヌクレオチドコード配列である。特定の宿主細胞又は生物における発現は、翻訳されたアミノ酸配列は変化されないような、核酸レベルでの１又は複数のコドンの変更の結果として、増強される。核酸分子は、全体又は一部のいずれかが、最適化されたコドンであることができる。広範な生物にとって好ましい情報を提供するコドン表及び他の参考文献は、当該技術分野において入手可能である（例えば、植物－好ましいコドン使用の考察について、Campbell及びGowri, (1990) Plant Physiol. 92:1-11参照)。植物－好ましい遺伝子を合成する方法は、当該技術分野において入手できる。例えば、引用により本明細書中に組み込まれている、米国特許第5,380,831号、及び第5,436,391号、及びMurrayら、(1989) Nucleic Acids Res. 17:477-498を参照されたい。
本明細書記載のＵＳＰ、融合タンパク質、及び／又はｇＲＮＡをコードしているポリヌクレオチドは、インビトロ発現又は関心対象の細胞、細胞小器官、胚、もしくは生物における発現のために、発現カセットにおいて提供され得る。このカセットは、ＵＳＰ、並びに／又はＵＳＰ、ＲＮＡガイド型ＤＮＡ結合ポリペプチド及びデアミナーゼを含む融合タンパク質、並びに／又はポリヌクレオチドの発現を可能にする本明細書に提供されるｇＲＮＡをコードしているポリヌクレオチドへ機能的に連結される５’及び３’調節配列を含むであろう。このカセットは加えて、生物へ同時形質転換されるべき少なくとも１種の追加遺伝子又は遺伝的エレメントを含んでよい。追加の遺伝子又はエレメントが含まれる場合、これらの成分は、機能的に連結される。用語「機能的に連結される」は、２つ以上のエレメント間の機能的連鎖を意味することが意図される。例えば、プロモーターと関心対象のコード領域（例えば、ＵＳＰ、デアミナーゼ、ＲＮＡガイド型ＤＮＡ結合ポリペプチド、及び／又はｇＲＮＡをコードしている領域）の間の機能し得る連鎖は、関心対象のコード領域の発現を可能にする機能的連結である。機能的に連結されるエレメントは、連続又は不連続である。２つのタンパク質コード領域の結合に関して使用される場合、機能的に連結されるにより、これらのコード領域は、同じリーディングフレーム内であることが意図される。或いは、追加の遺伝子（複数可）又はエレメント（複数可）は、複数の発現カセット上に提供され得る。例えば、単独で又は融合タンパク質の構成成分としてのいずれかで、ここで開示されたウラシル安定化ポリペプチドをコードしているヌクレオチド配列は、１つの発現カセット上に存在することができるのに対し、ｇＲＮＡをコードしているヌクレオチド配列は、個別の発現カセット上であることができる。別の例は、第一の発現カセット上にここで開示されたＵＳＰ単独をコードしているヌクレオチド配列、ＵＳＰを含む融合タンパク質をコードしている第二の発現カセット、及び第三の発現カセット上にｇＲＮＡをコードしているヌクレオチド配列を有することができる。そのような発現カセットは、調節領域の転写制御下でポリヌクレオチドを挿入するための、複数の制限部位及び／又は組換え部位を備えている。選択マーカー遺伝子を含む発現カセットも、存在し得る。
この発現カセットは、５’－３’方向の転写において、関心対象の生物において機能する、転写（及び一部の実施形態において翻訳）開始領域（すなわちプロモーター）、本発明のＵＳＰ－コードしているポリヌクレオチド、並びに転写（及び一部の実施形態において翻訳）終結領域（すなわち終結領域）を含むであろう。本発明のプロモーターは、宿主細胞におけるコード配列の発現を指示又は駆動することが可能である。調節領域（例えば、プロモーター、転写制御領域、及び翻訳終結領域）は、内在性又は宿主細胞に対しもしくは互いに異種であることができる。本明細書において使用される配列に関して「異種」は、外来種に起源がある配列か、又は同じ種由来の場合は、故意のヒトの介入により、組成物及び／又はゲノム座位においてその未変性の形から実質的に改変されている配列である。本明細書において使用されるキメラ遺伝子は、コード配列に対し異種である転写開始領域へ機能的に連結されたコード配列を含む。
都合のよい終結領域は、オクトピン合成酵素及びノパリン合成酵素の終結領域など、アグロバクテリウム・ツメファシエンス(A. tumefaciens)のＴｉ－プラスミドから入手可能である。同じくＧｕｅｒｉｎｅａｕら、(1991) Mol. Gen. Genet. 262:141-144；Proudfoot (1991) Cell 64:671-674；Sanfaconら、(1991) Genes Dev. 5:141-149；Mogenら、(1990) Plant Cell 2:1261-1272；Munroeら、(1990) Gene 91:151-158；Ballasら、(1989) Nucleic Acids Res. 17:7891-7903；及び、Joshiら、(1987) Nucleic Acids Res. 15:9627-9639も参照されたい。
追加の調節シグナルは、転写開始部位、オペレーター、アクチベーター、エンハンサー、他の調節エレメント、リボソーム結合部位、開始コドン、終結シグナルなどを含むが、これらに限定されるものではない。例えば、米国特許第5,039,523号及び第4,853,331号；EPO 0480762A2；Ｓａｍｂｒｏｏｋら、(1992) Molecular Cloning: A Laboratory Manual、Maniatisら編集、(Cold Spring Harbor Laboratory Press、Cold Spring Harbor、N.Y.)、以後「Sambrook 11」と記す；Ｄａｖｉｓら編集、(1980) Advanced Bacterial Genetics (Cold Spring Harbor Laboratory Press)、Cold Spring Harbor、N.Y.、並びに本明細書に引用された参考文献を参照のこと。
発現カセットの調製において、適切な方向で、及び好適には適切なリーディングフレーム内に、ＤＮＡ配列を提供するように、様々なＤＮＡ断片が操作されてよい。この結末に向けてＤＮＡ断片を結合するためにアダプター又はリンカーが利用されるか、又は他の操作が、都合の良い制限部位を提供し、過剰なＤＮＡを除去し、制限部位を除去するなどのために関与され得る。この目的のために、インビトロにおける変異誘発、プライマー修復、制限、アニーリング、再置換、例えばトランジション及びトランスバージョンが、関与され得る。
数多くのプロモーターを、本発明の実践に使用することができる。これらのプロモーターは、所望の結果を基に選択され得る。これらの核酸は、関心対象の生物における発現のために、構成的、誘導性、成長段階－特異的、細胞型－特異的、組織選好性、組織特異的、又はその他のプロモーターと組合せることができる。例えばプロモーターは、WO 99/43838並びに米国特許第8,575,425号；第7,790,846号；第8,147,856号；第8,586832号；第7,772,369号；第7,534,939号；第6,072,050号；第5,659,026号；第5,608,149号；第5,608,144号；第5,604,121号；第5,569,597号；第5,466,785号；第5,399,680号；第5,268,463号；第5,608,142号；及び、第6,177,611号に表記され；これらは引用により本明細書中に組み込まれている。
植物における発現のために、構成的プロモーターはまた、ＣａＭＶ３５Ｓプロモーター(Odellら、(1985) Nature 313:810-812)；ライスアクチン(ＭｃＥｌｒｏｙら、(1990) Plant Cell 2:163-171)；ユビキチン(Christensenら、(1989) Plant Mol. Biol. 12:619-632及びＣｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎら、(1992) Plant Mol. Biol. 18:675-689)；ｐＥＭＵ(Lastら、(1991) Theor. Appl. Genet. 81:581-588)；及び、ＭＡＳ(Ｖｅｌｔｅｎら、(1984) EMBO J. 3:2723-2730)も含む。
誘導性プロモーターの例は、低酸素症又は低温ストレスにより誘導され得るＡｄｈ１プロモーター、ヒートストレスにより誘導され得るＨｓｐ７０プロモーター、両方共光により誘導され得るＰＰＤＫプロモーター及びＰＥＰカルボキシラーゼプロモーターである。セーフナー(safener)で誘導されるＩｎ２－２プロモーター(米国特許第5,364,780号)、オーキシン誘導され及びタペータム特異的であるがカルスにおいても活性があるＡｘｉｇ１プロモーター(PCT US01/22169)、ステロイド－反応性プロモーター（例えば、エストロゲン誘導性であるＥＲＥプロモーター、並びに糖質コルチコイド－誘導性プロモーター、これはSchenaら、(1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:10421-10425及びMcNellisら、(1998) Plant J. 14(2):247-257参照）、並びにテトラサイクリン－誘導性プロモーター及びテトラサイクリン－抑制性プロモーター(例えば、Gatzら、(1991) Mol. Gen. Genet. 227:229-237、及び米国特許第5,814,618号及び第5,789,156号参照)などの、化学的に誘導可能なプロモーターも、同じく有用であり、これらの文献は引用により本明細書中に組み込まれている。
組織特異的又は組織選好性プロモーターは、特定の組織内での発現構築体の発現を標的化するために利用されることができる。いくつかの実施形態において、組織特異的又は組織選好性プロモーターは、植物組織において活性がある。植物における発達制御下にあるプロモーターの例は、葉、根、果実、種子、もしくは花など、ある種の組織において優先的な転写を開始するプロモーターを含む。「組織特異的」プロモーターは、ある種の組織においてのみ転写を開始するプロモーターである。遺伝子の構成的発現とは異なり、組織特異的発現は、遺伝子制御のいくつかの相互作用のレベルの結果である。従って、相同な又は密接に関連した植物種に由来するプロモーターは、特定の組織における導入遺伝子の効率的且つ信頼できる発現を達成する用途に好ましい。一部の実施形態において、この発現は、組織選好性プロモーターを含む。「組織選好性」プロモーターは、ある種の組織において優先的に、しかし必ずしも全体的でも単独でもなく転写を開始する、プロモーターである。
一部の実施形態において、本明細書において説明されたＵＳＰをコードしている核酸分子は、細胞型－特異的プロモーターを含む。「細胞型特異的」プロモーターは、１又は複数の器管内のある種の細胞型において発現を主に起動するプロモーターである。植物において機能する細胞型特異的プロモーターが主に活性がある植物細胞のいくつかの例は、例えば、ＢＥＴＬ細胞、根、葉の維管束細胞、茎細胞、及び幹細胞を含む。これらの核酸分子はまた、細胞型選好性プロモーターも含むことができる。「細胞型選好性」プロモーターは、１又は複数の器管内のある種の細胞において大部分、しかし必ずしも全体的でも単独でもなく発現を主に駆動するプロモーターである。植物において機能する細胞型選好性プロモーターが主に活性がある植物細胞のいくつかの例は、例えば、ＢＥＴＬ細胞、根、葉の維管束細胞、茎細胞、及び幹細胞を含む。
ＵＳＰ、融合タンパク質、及び／又はｇＲＮＡをコードしている核酸配列は、例えばインビトロにおけるｍＲＮＡ合成のために、ファージＲＮＡポリメラーゼにより認識されるプロモーター配列に機能的に連結され得る。そのような実施形態において、インビトロ－転写ＲＮＡは、本明細書において説明された方法における使用のために精製され得る。例えば、このプロモーター配列は、Ｔ７、Ｔ３、もしくはＳＰ６プロモーター配列、又はＴ７、Ｔ３、もしくはＳＰ６プロモーター配列の変形であることができる。そのような実施形態において、発現されたタンパク質及び／又はＲＮＡは、本明細書において説明されたゲノム改変の方法において使用するために、精製され得る。
いくつかの実施形態において、ＵＳＰ、融合タンパク質、及び／又はｇＲＮＡをコードしているポリヌクレオチドはまた、ポリアデニル化シグナル（例えばＳＶ４０ポリＡシグナル及び植物において機能する他のシグナル）並びに／又は少なくとも１種の転写終結配列にも連結され得る。加えてデアミナーゼ又は融合タンパク質をコードしている配列はまた、本明細書の別所に記載されたような、少なくとも１種の核局在化シグナル、少なくとも１種の細胞膜透過性ドメイン、及び／もしくは特定の細胞下位置へタンパク質を運搬することが可能である少なくとも１種のシグナルペプチドをコードしている配列（複数可）へ連結され得る。
ＵＳＰ、融合タンパク質、及び／又はｇＲＮＡをコードしているポリヌクレオチドは、１つのベクター又は複数のベクター内に存在することができる。「ベクター」は、核酸を宿主細胞へ移行、送達、又は導入するためのポリヌクレオチド組成物を指す。好適なベクターは、プラスミドベクター、ファージミド、コスミド、人工／ミニ染色体、トランスポゾン、及びウイルスベクター（例えば、レンチウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、バキュロウイルスベクター）を含む。このベクターは、追加の発現制御配列（例えば、エンハンサー配列、コザック配列、ポリアデニル化配列、転写終結配列）、選択マーカー配列（例えば、抗生物質耐性遺伝子）、複製起点などを含むことができる。追加の情報は、「Current Protocols in Molecular Biology」 Ausubelら、John Wiley & Sons, New York, 2003、又は「Molecular Cloning: A Laboratory Manual」Sambrook及びRussell, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 第3版, 2001に認めることができる。
このベクターはまた、形質転換された細胞の選択のための選択マーカー遺伝子も含むことができる。選択マーカー遺伝子は、形質転換された細胞又は組織の選択に利用される。マーカー遺伝子は、抗生物質耐性をコードしている遺伝子、例えばネオマイシンリン酸基転移酵素ＩＩ（ＮＥＯ）及びヒグロマイシンリン酸基転移酵素（ＨＰＴ）をコードしている遺伝子など、並びにグルホシネートアンモニウム、ブロモキシニル、イミダゾリノン、及び２，４－ジクロロフェノキシ酢酸（２，４－Ｄ）などの、除草剤に対する耐性を付与する遺伝子を含む。
一部の実施形態において、ＲＧＮなどのＲＮＡガイド型ＤＮＡ結合ポリペプチドを含む融合タンパク質をコードしている配列を含む発現カセット又はベクターは、ｇＲＮＡをコードしている配列を更に含むことができる。ｇＲＮＡをコードしている配列（複数可）は、関心対象の生物又は宿主細胞における、ｇＲＮＡの発現のための少なくとも１つの転写制御配列へ、機能的に連結され得る。例えば、ｇＲＮＡをコードしているポリヌクレオチドは、ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩ（Ｐｏｌ ＩＩＩ）により認識されるプロモーター配列に機能的に連結され得る。好適なＰｏｌ ＩＩＩプロモーターの例は、哺乳動物Ｕ６、Ｕ３、Ｈ１、及び７ＳＬ ＲＮＡプロモーター並びにライスＵ６及びＵ３プロモーターを含むが、これらに限定されるものではない。
指摘されたように、ＵＳＰ、融合タンパク質、及び／又はｇＲＮＡをコードしているヌクレオチド配列を含む発現構築体は、関心対象の生物を形質転換するために使用することができる。形質転換の方法は、ヌクレオチド構築体の関心対象の生物への導入に関与している。「導入する」により、構築体が宿主細胞の内部へのアクセスを獲得する様式で、ヌクレオチド構築体を宿主細胞へ導入することが意図される。本発明の方法は、ヌクレオチド構築体が、宿主生物の少なくとも１つの細胞の内部へのアクセスを獲得する宿主生物へのみ、ヌクレオチド構築体を導入する特定の方法を必要としない。この宿主細胞は、真核細胞又は原核細胞であることができる。特定の実施形態において、真核宿主細胞は、植物細胞、哺乳動物細胞、又は昆虫細胞である。ヌクレオチド構築体を植物及び他の宿主細胞へ導入する方法は、当該技術分野において公知であり、安定した形質転換法、一過性形質転換法、及びウイルス－媒介法を含むが、これらに限定されるものではない。
これらの方法は、植物全体、並びに植物器管（例えば、葉、茎、根など）、種子、植物細胞、珠芽、その胚及び子孫を含む、植物などの形質転換された生物を生じる。植物細胞は、分化又は非分化（例えばカルス、懸濁培養細胞、プロトプラスト、葉細胞、根細胞、篩部細胞、花粉）であることができる。
「トランスジェニック生物」又は「形質転換された生物」又は「安定して形質転換された」生物もしくは細胞もしくは組織は、本発明のデアミナーゼをコードしているポリヌクレオチドが取込み又は組入れられた生物を指す。他の外因性又は内因性の核酸配列又はＤＮＡ断片もまた、宿主細胞へ取込まれてよいことが認められる。アグロバクテリウム－及び遺伝子銃－媒介型形質転換は、植物細胞の形質転換に主に利用される２種のアプローチであり続けている。しかし、宿主細胞の形質転換は、感染、トランスフェクション、微量注入、電気穿孔、マイクロプロジェクション、遺伝子銃又は微粒子銃、電気穿孔法、シリカ／炭素繊維、超音波媒介式、ＰＥＧ媒介式、リン酸カルシウム共沈殿、ポリカチオンＤＭＳＯ技術、ＤＥＡＥデキストラン手法、及びウイルス媒介式、リポソーム媒介式などにより、実行されてよい。デアミナーゼ、融合タンパク質及び／又はｇＲＮＡをコードしているポリヌクレオチドのウイルス媒介式導入は、レトロウイルス、レンチウイルス、アデノウイルス、及びアデノ随伴ウイルスが媒介した導入及び発現、並びにカリモウイルス（例えば、カリフラワーモザイクウイルス）、ジェミニウイルス（例えば、ビーンゴールデンイエローモザイクウイルス又はメイズストリークウイルス）、並びにＲＮＡ植物ウイルス（例えば、タバコモザイクウイルス）の使用を含む。
形質転換プロトコールに加え、ポリペプチドもしくはポリヌクレオチド配列の植物への導入のためのプロトコールは、形質転換のために標的化された宿主細胞の種類（例えば、単子葉又は双子葉植物細胞）により左右されてよい。形質転換の方法は、当該技術分野において公知であり、且つ米国特許：第8,575,425号；第7,692,068号；第8,802,934号；第7,541,517号に表記されたものを含み、これらの各々は引用により本明細書中に組み込まれている。同じく、Rakoczy-Trojanowska, M.、(2002) Cell Mol Biol Lett. 7:849-858；Jonesら、(2005) Plant Methods 1:5；Riveraら、(2012) Physics of Life Reviews 9:308-345；Bartlettら、(2008) Plant Methods 4:1-12；Bates, G.W.、(1999) Methods in Molecular Biology 111:359-366；Binns及びThomashow、(1988) Annual Reviews in Microbiology 42:575-606；Christou, P.、(1992) The Plant Journal 2:275-281；Christou, P.、(1995) Euphytica 85:13-27；Tzfiraら、(2004) TRENDS in Genetics 20:375-383；Yaoら、(2006) Journal of Experimental Botany 57:3737-3746；Zupan及びZambryski、(1995) Plant Physiology 107:1041-1047；Jonesら、(2005) Plant Methods 1:5も参照されたい。
形質転換は、核酸の細胞への安定した又は一過性の取込みを生じてもよい。「安定した形質転換」は、宿主細胞へ導入されたヌクレオチド構築体は、宿主細胞のゲノムに組入れられ、且つその後代に受け継がれることが可能であることを意味することが意図される。「一過性形質転換」は、ポリヌクレオチドは、宿主細胞へ導入され、及び宿主細胞のゲノムへは組入れられないことを意味することが意図される。
葉緑体の形質転換方法は、当該技術分野において公知である。例えば、Svabら、(1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:8526-8530；Svab及びMaliga、(1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:913-917；Svab及びMaliga、(1993) EMBO J. 12:601-606を参照されたい。この方法は、選択マーカーを含むＤＮＡの微粒子銃送達、及びこのＤＮＡを相同組換えを通じて色素体ゲノムに標的化することに頼っている。加えて色素体形質転換は、核－コードされ且つ色素体－方向付けられたＲＮＡポリメラーゼの組織選好性発現による、サイレント色素体－保有する導入遺伝子のトランス活性化により達成され得る。そのようなシステムは、McBrideら、(1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:7301-7305に報告されている。
形質転換された細胞は、常法に従い、トランスジェニック生物、例えば植物へ成長され得る。例えばMcCormickら、(1986) Plant Cell Reports 5:81-84を参照されたい。これらの植物は、その後生育され、同じ形質転換された株又は異なる株のいずれかと受粉され、且つ同定された所望の表現型特徴の構成性発現を有するハイブリッドを生じる。所望の表現型特徴の発現は、安定して維持され及び遺伝されることを確実にするために、２世代以上生育されてよく、その後所望の表現型特徴の発現が達成されることを確実にするために種子が収穫されてよい。この様式において、本発明は、それらのゲノムへ安定して取込まれた本発明のヌクレオチド構築体、例えば本発明の発現カセットを有する形質転換された種子（「トランスジェニック種子」とも称される）を提供する。
或いは形質転換された細胞は、生物へ導入されてよい。これらの細胞は、その生物に起源を有することができ、ここでこれらの細胞は、エクスビボアプローチで形質転換される。
本明細書に提供される配列は、非限定的に単子葉植物及び双子葉植物を含む、任意の植物種の形質転換に使用されてよい。関心対象の植物の例は、トウモロコシ（メイズ）、ソルガム、小麦、ヒマワリ、トマト、十字花植物、コショウ、ジャガイモ、綿、米、大豆、テンサイ、サトウキビ、タバコ、オオムギ、及びナタネ、アブラナ種、アルファルファ、ライ麦、キビ、ベニバナ、ピーナツ、サツマイモ、キャッサバ(cassaya)、コーヒー、ココナツ、パイナップル、柑橘類の木、ココア、茶、バナナ、アボカド、イチジク、グァバ、マンゴー、オリーブ、パパイヤ、カシュー、マカデミア、アーモンド、オート麦、野菜、観賞植物、及びコニファーを含むが、これらに限定されるものではない。
野菜は、トマト、レタス、緑豆、リマ豆、エンドウ、及びキュウリ属の一員、例えばキュウリ、カンタロープ、及びマスクメロンなどを含むが、これらに限定されるものではない。観賞植物は、ツツジ、アジサイ、ハイビスカス、バラ、チューリップ、ラッパスイセン、ペチュニア、カーネーション、ポインセチア、及びキクを含むが、これらに限定されるものではない。好ましくは、本発明の植物は、作物（例えば、メイズ、ソルガム、小麦、ヒマワリ、トマト、十字花植物、コショウ、ジャガイモ、綿、米、大豆、テンサイ、サトウキビ、タバコ、オオムギ、ナタネなど）である。
本明細書において使用される用語植物は、植物細胞、植物プロトプラスト、植物が再生され得る植物細胞組織培養物、植物カルス、植物クランプ、及び植物もしくは胚などの植物の一部において無傷である植物細胞、花粉、胚珠、種子、葉、花、枝、果実、仁、雌穂、穂軸、殻皮、茎、根、根端、葯などを含む。穀粒は、それらの種を生育するか又は再生する以外の目的で商業的栽培者により作製された成熟した種子を意味することが意図される。再生された植物の後代、バリアント、及び変異体も、これらの部分が導入されたポリヌクレオチドを含むならば、本発明の範囲内に含まれる。例えば大豆カスを含む、本明細書において開示された配列を維持する、加工された植物製品又は副産物も、更に提供される。
ＵＳＰ、融合タンパク質、及び／又はｇＲＮＡをコードしているポリヌクレオチドは、動物（例えば、哺乳動物、昆虫、魚類、鳥類、及び爬虫類）、真菌、アメーバ、藻類、及び酵母を含むが、これらに限定されるものではない、任意の真核細胞種の形質転換に使用され得る。ＵＳＰ、融合タンパク質、及び／又はｇＲＮＡをコードしているポリヌクレオチドはまた、古細菌及び細菌（例えば、バチルス菌種、クレブシエラ菌種、ストレプトマイセス菌種、リゾビウム菌種、エシェリキア菌種、シュードモナス菌種、サルモネラ菌種、赤痢菌種、ビブリオ菌種、エルシニア菌種、マイコプラズマ菌種、アグロバクテリウム菌種、及びラクトバチルス菌種）を含むが、これらに限定されるものではない、任意の原核細胞種の形質転換にも使用され得る。
従来のウイルス及び非ウイルスベースの遺伝子導入方法は、核酸を、哺乳動物細胞又は標的組織内へ導入するために使用することができる。そのような方法は、本発明の融合タンパク質及び任意にｇＲＮＡをコードしている核酸を、培養物中の、又は宿主生物中の細胞へ、投与するために使用することができる。非ウイルスベクター送達システムは、ＤＮＡプラスミド、ＲＮＡ（例えば、本明細書において説明されたベクターの転写物）、ネイキッド核酸、及びリポソームなどの送達ビヒクルと複合された核酸を含む。ウイルスベクター送達システムは、ＤＮＡウイルス及びＲＮＡウイルスを含み、これらは細胞への送達後、エピソームの又は組入れられたゲノムのいずれかを有する。非限定的例は、カリモウイルス（例えば、カリフラワーモザイクウイルス）、ジェミニウイルス（例えば、ビーンゴールデンイエローモザイクウイルス又はメイズストリークウイルス）、並びにＲＮＡ植物ウイルス（例えば、タバコモザイクウイルス）を利用するベクターを含む。遺伝子治療手法の検証に関しては、Anderson、Science 256: 808- 813 (1992)；Nabel及びFeigner、TIBTECH 11:211-217 (1993)；Mitani及びCaskey、TIBTECH 11:162-166 (1993)；Dillon、TIBTECH 11:167-175 (1993)；Miller、Nature 357:455-460 (1992)；Van Brunt、Biotechnology 6(10): 1149-1154 (1988)；Vigne、Restorative Neurology and Neuroscience 8:35-36 (1995)；Kremer及びPerricaudet、British Medical Bulletin 51(1):31-44 (1995)；Haddadaら、Current Topics in Microbiology and Immunology、Doerfler及びBohm(編集)(1995)；及び、Yuら、Gene Therapy 1:13-26 (1994)を参照されたい。
核酸の非ウイルス送達方法は、リポフェクション、アグロバクテリウム－媒介式形質転換、ヌクレオフェクション、微量注入、遺伝子銃、ビロソーム、リポソーム、イムノリポソーム、ポリカチオン又は脂質：核酸コンジュゲート、ネイキッドＤＮＡ、人工ビリオン、及び薬剤増強されたＤＮＡ取込みを含む。リポフェクションは、例えば、米国特許第5,049,386号、第4,946,787号；及び第4,897,355号に記載されており、リポフェクション試薬は市販されている(例えば、Transfectam(商標)及びLipofectin(商標))。ポリヌクレオチドの効率的受容体－認識リポフェクションに適しているカチオン性及び中性脂質は、FeignerのWO 91/17424；WO 91/16024記載のものを含む。送達は、細胞（例えばインビトロ又はエクスビボ投与）又は標的組織（例えばインビボ投与）であることができる。免疫脂質複合体などの、標的化されたリポソームを含む脂質：核酸複合体の調製は、当業者に周知である（例えば、Crystal、Science 270:404-410 (1995)；Blaeseら、Cancer Gene Ther. 2:291- 297 (1995)；Behrら、Bioconjugate Chem. 5:382-389 (1994)；Remyら、Bioconjugate Chem. 5:647-654 (1994)；Gaoら、Gene Therapy, 2:710-722 (1995)；Ahmadら、Cancer Res. 52:4817-4820 (1992)；米国特許第4,186,183号、第4,217,344号、第4,235,871号、第4,261,975号、第4,485,054号、第4,501,728号、第4,774,085号、第4,837,028号、及び第4,946,787号参照)。
核酸の送達のためのＲＮＡ又はＤＮＡウイルスベースのシステムの使用は、体内の特定の細胞へウイルスを標的化し、及び核へのウイルス搭載を媒介する高度に発展されたプロセスを利用する。ウイルスベクターは、患者へ直接投与される（インビボ）か、又はこれらは、細胞をインビトロにおいて処理するために使用され、この改変された細胞は、任意に患者へ投与される（エクスビボ）ことができる。従来のウイルスベースのシステムは、遺伝子導入のために、レトロウイルス、レンチウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴及び単純ヘルペスウイルスのベクターを含むことができる。宿主ゲノムにおける組入れは、レトロウイルス、レンチウイルス、及びアデノ随伴ウイルスの遺伝子導入法により可能であり、時には挿入された導入遺伝子の長期間発現を生じる。加えて、高い形質導入効率が、多くの様々な細胞型及び標的組織において認められている。
レトロウイルスの向性は、外来エンベロープタンパク質の取込み、標的細胞の可能性のある標的集団の増殖により変更され得る。レンチウイルスベクターは、非－分裂細胞を形質導入又は感染し、並びに典型的には高いウイルス力価を生じることができるレトロウイルスベクターである。従ってレトロウイルス遺伝子導入システムの選択は、標的組織に左右される。レトロウイルスベクターは、最大６～１０ｋｂの外来配列のパッケージング能を持つ、シス作動性の長末端反復配列で構成される。最小のシス作動性のＬＴＲが、ベクターの複製及びパッケージングに充分であり、これは次に治療的遺伝子を標的細胞へ組入れるのに使用され、永久的な導入遺伝子発現を提供する。広範に使用されるレトロウイルスベクターは、マウス白血病ウイルス（ＭｕＬＶ）、テナガザル白血病ウイルス（ＧａＬＶ）、サル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）を基にしたもの、及びそれらの組合せを含む(例えば、Buchscherら、J. Virol. 66:2731-2739 (1992)；Johannら、J. Virol. 66:1635-1640 (1992)；Sommnerfeltら、Virol. 176:58-59 (1990)；Wilsonら、J. Virol. 63:2374-2378 (1989)；Millerら、J. Virol. 65:2220-2224 (1991)；PCT/US94/05700参照)。
一過性発現が好ましい適用において、アデノウイルスベースのシステムが使用されてよい。アデノウイルスベースのベクターは、多くの細胞型において、非常に高い形質導入効率が可能であり、且つ細胞分裂を必要としない。そのようなベクターにより、高い力価及び発現レベルが得られる。このベクターは、比較的単純なシステムにおいて大量に作製され得る。アデノ随伴ウイルス（「ＡＡＶ」）ベクターも同じく、例えば核酸及びペプチドのインビトロ生成においてなど、標的核酸により細胞を形質導入するため、並びにインビボ及びエクスビボにおける遺伝子治療手法のために使用される(例えば、Westら、Virology 160:38-47 (1987)；米国特許第4,797,368号；WO 93/24641；Katin、Human Gene Therapy 5:793-801 (1994)；Muzyczka、J. Clin. Invest. 94:1351 (1994)参照)。組換えAAVベクターの構築は、多くの刊行物において説明されており、米国特許第5,173,414号；Tratschinら、Mol. Cell. Biol. 5:3251-3260 (1985)；Tratschinら、Mol. Cell. Biol. 4:2072-2081 (1984)；Hermonat及びMuzyczka、PNAS 81:6466-6470 (1984)；並びに、Samulskiら、J. Virol. 63:03822-3828 (1989)を含む。パッケージング細胞は典型的には、宿主細胞を感染することが可能であるウイルス粒子を形成するために使用される。そのような細胞は、アデノウイルスをパッケージングする２９３細胞、及びレトロウイルスをパッケージングするψＪ２細胞又はＰＡ３１７細胞を含む。
遺伝子治療に使用されるウイルスベクターは通常、核酸ベクターをウイルス粒子にパッケージングする細胞株を生成することにより作製される。これらのベクターは典型的には、パッケージング及びその後の宿主への組入れに必要とされる最小ウイルス配列、発現されるべきポリヌクレオチド（複数可）のための発現カセットにより置き換えられる他のウイルス配列を含む。喪失されたウイルス機能は典型的には、パッケージング細胞株によりトランスで補完される。例えば遺伝子治療に使用されるＡＡＶベクターは典型的には、パッケージング及び宿主ゲノムへの組入れに必要とされるＡＡＶゲノム由来のＩＴＲ配列のみ有する。ウイルスＤＮＡは、他のＡＡＶ遺伝子、すなわちｒｅｐ及びｃａｐををコードしているが、ＩＴＲ配列を欠いている、ヘルパープラスミドを含む細胞株中にパッケージングされる。
この細胞株はまた、ヘルパーとしてのアデノウイルスにより感染されてよい。このヘルパーウイルスは、ＡＡＶベクターの複製及びヘルパープラスミドからのＡＡＶ遺伝子の発現を促進する。このヘルパープラスミドは、ＩＴＲ配列を欠くために、著しい量でパッケージされない。アデノウイルスによる夾雑は、例えば、アデノウイルスがＡＡＶよりもより感受性である熱処理により、減少することができる。核酸を細胞へ送達する追加の方法は、当業者に公知である。例えば、US20030087817を参照し、これは引用により本明細書中に組み込まれている。
一部の実施形態において、宿主細胞は、本明細書において説明された１又は複数のベクターにより、一過性又は非一過性にトランスフェクションされる。一部の実施形態において、細胞は、対象においてそれが自然に生じるようにトランスフェクションされる。一部の実施形態において、トランスフェクションされる細胞は、対象から採取される。一部の実施形態において、細胞は、細胞株などの、対象から採取された細胞に由来する。一部の実施形態において、細胞又は細胞株は、原核細胞である。他の実施形態において、細胞又は細胞株は、真核細胞である。更なる実施形態において、細胞又は細胞株は、昆虫、鳥類、植物、又は真菌の種に由来する。一部の実施形態において、細胞又は細胞株は、例えば、ヒト、サル、マウス、ウシ、ブタ、ヤギ、ハムスター、ラット、ネコ、又はイヌなどの、哺乳動物であってよい。組織培養のための多種多様な細胞株が、当該技術分野において公知である。細胞株の例は、Ｃ８１６１、ＣＣＲＦ－ＣＥＭ、ＭＯＬＴ、ｍＩＭＣＤ－３、ＮＨＤＦ、ＨｅＬａＳ３、Ｈｕｈｌ、Ｈｕｈ４、Ｈｕｈ７、ＨＵＶＥＣ、ＨＡＳＭＣ、ＨＥＫｎ、ＨＥＫａ、ＭｉａＰａ細胞、Ｐａｎｅｌ、ＰＣ－３、ＴＦｌ、ＣＴＬＬ－２、ＣＩＲ、Ｒａｔ６、ＣＶＩ、ＲＰＴＥ、ＡｌＯ、Ｔ２４、１８２、Ａ３７５、ＡＲＨ－７７、Ｃａｌｕｌ、ＳＷ４８０、ＳＷ６２０、ＳＫＯＶ３、ＳＫ－ＵＴ、ＣａＣｏ２、Ｐ３８８Ｄｌ、ＳＥＭ－Ｋ２、ＷＥＨＩ－２３１、ＨＢ５６、ＴＩＢ５５、ｌｕｒｋａｔ、１４５．０１、ＬＲＭＢ、Ｂｃｌ－１、ＢＣ－３、ＩＣ２１、ＤＬＤ２、Ｒａｗ２６４．７、ＮＲＫ、ＮＲＫ－５２Ｅ、ＭＲＣ５、ＭＥＦ、Ｈｅｐ Ｇ２、ＨｅＬａ Ｂ、ＨｅＬａ Ｔ４、ＣＯＳ、ＣＯＳ－１、ＣＯＳ－６、ＣＯＳ－Ｍ６Ａ、ＢＳ－Ｃ－１サル腎上皮細胞、ＢＡＬＢ／３Ｔ３マウス胚線維芽細胞、３Ｔ３ Ｓｗｉｓｓ、３Ｔ３－Ｌｌ、１３２－ｄ５ヒト胎児線維芽細胞；１０．１マウス線維芽細胞、２９３－Ｔ、３Ｔ３、７２１、９Ｌ、Ａ２７８０、Ａ２７８０ＡＤＲ、Ａ２７８０ｃｉｓ、Ａ１７２、Ａ２０、Ａ２５３、Ａ４３１、Ａ－５４９、ＡＬＣ、Ｂ１６、Ｂ３５、ＢＣＰ－Ｉ細胞、ＢＥＡＳ－２Ｂ、ｂＥｎｄ．３、ＢＨＫ－２１、ＢＲ ２９３、ＢｘＰＣ３、Ｃ３Ｈ－１０Ｔｌ／２、Ｃ６／３６、Ｃａｌ－２７、ＣＨＯ、ＣＨＯ－７、ＣＨＯ－ＩＲ、ＣＨＯ－Ｋｌ、ＣＨＯ－Ｋ２、ＣＨＯ－Ｔ、ＣＨＯ Ｄｈｆｒ－／－、ＣＯＲ－Ｌ２３、ＣＯＲ－Ｌ２３／ＣＰＲ、ＣＯＲ－Ｌ２３５０１０、ＣＯＲＬ２３／Ｒ２３、ＣＯＳ－７、ＣＯＶ－４３４、ＣＭＬ Ｔｌ、ＣＭＴ、ＣＴ２６、Ｄ１７、ＤＨ８２、ＤＵ１４５、ＤｕＣａＰ、ＥＬ４、ＥＭ２、ＥＭ３、ＥＭＴ６／ＡＲ１、ＥＭＴ６／ＡＲ１０．０、ＦＭ３、Ｈ１２９９、Ｈ６９、ＨＢ５４、ＨＢ５５、ＨＣＡ２、ＨＥＫ－２９３、ＨｅＬａ、Ｈｅｐａｌｃｌｃ７、ＨＬ－６０、ＨＭＥＣ、ＨＴ－２９、ｌｕｒｋａｔ、ｌＹ細胞、Ｋ５６２細胞、Ｋｕ８１２、ＫＣＬ２２、ＫＧｌ、ＫＹＯｌ、ＬＮＣａｐ、Ｍａ－Ｍｅｌ １－４８、ＭＣ－３８、ＭＣＦ－７、ＭＣＦ－ｌ０Ａ、ＭＤＡ－ＭＢ－２３１、ＭＤＡ－ＭＢ－４６８、ＭＤＡ－ＭＢ－４３５、ＭＤＣＫＩＩ、ＭＤＣＫＩＩ、ＭＯＲ／０．２Ｒ、ＭＯＮＯ－ＭＡＣ６、ＭＴＤ－ｌＡ、ＭｙＥｎｄ、ＮＣＩ－Ｈ６９／ＣＰＲ、ＮＣＩ－Ｈ６９／ＬＸ１０、ＮＣＩ－Ｈ６９／ＬＸ２０、ＮＣＩ－Ｈ６９／ＬＸ４、ＮＩＨ－３Ｔ３、ＮＡＬＭ－１、ＮＷ－１４５、ＯＰＣＮ／ＯＰＣＴ細胞株、Ｐｅｅｒ、ＰＮＴ－ｌＡ／ＰＮＴ２、ＲｅｎＣａ、ＲＩＮ－５Ｆ、ＲＭＡ／ＲＭＡＳ、Ｓａｏｓ－２細胞、Ｓｆ－９、ＳｋＢｒ３、Ｔ２、Ｔ－４７Ｄ、Ｔ８４、ＴＨＰｌ細胞株、Ｕ３７３、Ｕ８７、Ｕ９３７、ＶＣａＰ、Ｖｅｒｏ細胞、ＷＭ３９、ＷＴ－４９、Ｘ６３、ＹＡＣ－１、ＹＡＲ、及びそれらのトランスジェニックバリアントを含むが、これらに限定されるものではない。細胞株は、当業者に公知の様々な給源から入手可能である（例えば、アメリカンタイプカルチャーコレクション（ＡＴＣＣ）(Manassas、Va.)参照)。
一部の実施形態において、本明細書において説明された１又は複数のベクターによりトランスフェクションされた細胞は、１又は複数のベクター－由来の配列を含む新規細胞株を確立するために使用される。一部の実施形態において、本発明の融合タンパク質及び任意にｇＲＮＡにより、又は本発明のリボ核タンパク質複合体により、一過性にトランスフェクションされ、及び融合タンパク質もしくはリボ核タンパク質複合体の活性を通じて改変された細胞は、この改変は含むが、いずれか他の外因性配列を欠く細胞を含む新規細胞株を確立するために使用される。一部の実施形態において、細胞は、本明細書において説明された１又は複数のベクターにより、一過性又は非一過性にトランスフェクションされた細胞、又はそのような細胞に由来した細胞株は、１又は複数の被験化合物の評価において使用される。
一部の実施形態において、本明細書において説明された１又は複数のベクターを使用し、非－ヒトトランスジェニック動物又はトランスジェニック植物を作製する。一部の実施形態において、このトランスジェニック動物は、昆虫である。更なる実施形態において、昆虫は、蚊又はダニなどの害虫である。他の実施形態において、この昆虫は、コーンルートワーム又はツマジロクサヨトウなどの、植物害虫である。一部の実施形態において、トランスジェニック動物は、ニワトリ、シチメンチョウ、ガチョウ、又はアヒルなどの、鳥類である。一部の実施形態において、トランスジェニック動物は、ヒト、マウス、ラット、ハムスター、サル、エイプ、ウサギ、ブタ、ウシ、ウマ、ヤギ、ヒツジ、ネコ、又はイヌなどの、哺乳動物である。
Ｖ． ポリペプチド及びポリヌクレオチドのバリアント及び断片
本開示は、そのアミノ酸配列が配列番号：１－１６として表記される、天然の（すなわち野生型の）ウラシル安定化ポリペプチドの活性バリアント及び断片、並びにそれをコードしているポリヌクレオチドを提供する。
バリアント又は断片の活性は、関心対象のポリヌクレオチド又はポリペプチドと比べ変更されてよいが、そのバリアント及び断片は、関心対象のポリヌクレオチド又はポリペプチドの機能を維持しなければならない。例えばバリアント又は断片は、関心対象のポリヌクレオチド又はポリペプチドと比較した場合に、増大した活性、減少した活性、異なる活性スペクトル、又は活性のいずれか他の変化を有してよい。
本明細書に開示されたものなどの、天然のＵＳＰの断片及びバリアントは、活性を維持し、その結果それらが、更にデアミナーゼもしくはその断片及び／又はＤＮＡ結合ポリペプチドもしくはその断片を更に含む融合タンパク質の一部である場合、該融合タンパク質は、ＵＳＰドメインを含まない類似の融合タンパク質と比較した場合に、増大したＣ→Ｔ核酸塩基編集効率を示すであろう。
用語「断片」は、本発明のポリヌクレオチド又はポリペプチド配列の一部を指す。「断片」又は「生物学的活性部分」は、生物活性（すなわち、核酸に対するデアミナーゼ活性）を維持するのに充分な数の連続ヌクレオチドを含むポリヌクレオチドを含む。「断片」又は「生物学的活性部分」は、その生物活性を維持するのに充分な数の連続アミノ酸残基を含むポリペプチドを含む。ＵＳＰの断片は、別の下流の開始部位の使用のために、完全長配列よりもより短いものを含む。ＵＳＰの生物学的活性部分は、配列番号：１－１６のいずれかの例えば、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０又はそれよりも多い連続アミノ酸残基を含むポリペプチド、又はそれらのバリアントであることができる。そのような生物学的活性部分は、組換え技術により調製され、且つ活性について評価され得る。
概して「バリアント」は、実質的に類似の配列を意味することが意図される。ポリヌクレオチドに関して、バリアントは、未変性のポリヌクレオチド内の１もしくは複数の内部部位での１もしくは複数のヌクレオチドの欠失及び／もしくは付加、並びに／又は未変性のポリヌクレオチドの１もしくは複数の位置での１もしくは複数のヌクレオチドの置換を含む。本明細書において使用される「未変性」又は「野生型」のポリヌクレオチド又はポリペプチドは、各々、天然のヌクレオチド配列又はアミノ酸配列を含む。ポリヌクレオチドに関して、保存的バリアントは、遺伝暗号の縮重のために、関心対象の遺伝子の未変性のアミノ酸配列をコードしているそれらの配列を含む。これらのような天然のアレルバリアントは、例えば以下に概略するポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）及びハイブリダイゼーション技術のような、周知の分子生物学技術を使用し、同定されることができる。バリアントポリヌクレオチドはまた、例えば部位特異的変異誘発を用いて作製されるが、関心対象のポリペプチド又はポリヌクレオチドを依然コードしているものなどの、合成により誘導されたポリヌクレオチドを含む。一般に、本明細書に開示された特定のポリヌクレオチドのバリアントは、本明細書の別所記載の配列整列化プログラム及びパラメータにより決定されたその特定のポリヌクレオチドに対し、少なくとも約４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又はそれよりも大きい配列同一性を有するであろう。
本明細書に開示された特定のポリヌクレオチド（すなわち参照ポリヌクレオチド）のバリアントもまた、バリアントポリヌクレオチドによりコードされたポリペプチドと参照ポリヌクレオチドによりコードされたポリペプチドの間の％配列同一性の比較により評価され得る。任意の２種のポリペプチド間の％配列同一性は、本明細書の別所記載の配列整列化プログラム及びパラメータを用いて、計算することができる。本明細書に開示されたポリヌクレオチドのいずれか所定の対が、それらがコードする２種のポリペプチドにより共有される％配列同一性の比較により評価される場合、これら２種のコードされたポリペプチド間の％配列同一性は、少なくとも約４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又はそれよりも大きい配列同一性である。
特定の実施形態において、ここで開示されたポリヌクレオチドは、配列番号：１－１６のいずれかのアミノ酸配列に対し少なくとも４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又はそれよりも大きい同一性を有するアミノ酸配列を含むＵＳＰをコードしている。
本発明のウラシル安定化ポリペプチドの生物学的活性バリアントは、わずか約１～１５個のアミノ酸残基、わずか約１～１０個、例えば約６～１０個、わずか５個、わずか４個、わずか３個、わずか２個、又はわずか１個のアミノ酸残基だけ異なってよい。具体的実施形態において、これらのポリペプチドは、Ｎ－末端又はＣ－末端の短縮化を有することができ、これはそのポリペプチドのＮ又はＣ末端のいずれかから、少なくとも５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０個のアミノ酸又はそれよりも多くの欠失を含むことができる。
改変が、本明細書に提供されるＵＳＰに成され、バリアントタンパク質及びポリヌクレオチドを作出することは認められる。人工的に設計された変化は、部位特異的変異誘発技術の適用を通じて導入されてよい。あるいは、本明細書に開示された配列に対し構造的及び／又は機能的に関連した、未変性の、依然不明の又は依然同定されないポリヌクレオチド及び／又はポリペプチドもまた、本発明の範囲内に収まることが確定されてよい。ウラシル安定化ポリペプチドの機能を変更しない保存的アミノ酸置換が、非保存領域に作製されてよい。あるいは、ウラシル安定化ポリペプチドの活性を改善する改変が成されてよい。
バリアントポリヌクレオチド及びタンパク質はまた、ＤＮＡシャッフリングなどの、変異誘発性及び組換え誘導性の手順に由来した配列及びタンパク質も包含している。そのような手順により、本明細書に開示された１又は複数の異なるＵＳＰ（例えば配列番号：１－１６）が、所望の特性を有する新規ＵＳＰを作出するように、操作される。この様式において、組換えポリヌクレオチドライブラリーが、実質的配列同一性を有し、且つインビトロ又はインビボにおいて相同組換えされ得る配列領域を含む関連した配列ポリヌクレオチドの集団から作製される。例えば、このアプローチを使用し、関心対象のドメインをコードしている配列モチーフが、本明細書に提供されるＵＳＰ配列と他の引き続き同定されたＵＳＰ遺伝子の間でシャッフルされ、酵素の場合の増大したＫｍなどの、改善された関心対象の特性を持つタンパク質をコードしている新規遺伝子を入手することができる。そのようなＤＮＡシャッフリングの戦略は、当該技術分野において公知である。例えば、Stemmer、(1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:10747-10751；Stemmer、(1994) Nature 370:389-391；Crameriら、(1997) Nature Biotech. 15:436-438；Mooreら、(1997) J. Mol. Biol. 272:336-347；Zhangら、(1997) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94:4504-4509；Crameriら、(1998) Nature 391:288-291；及び、米国特許第5,605,793号及び第5,837,458号を参照されたい。「シャッフルされた」核酸は、本明細書に表記される任意のシャッフリング手順などの、シャッフリング手順により作製された核酸である。シャッフルされた核酸は、例えば人工的、及び任意に再帰的(recursive)様式で、２種以上の核酸（又は特性のある鎖）の組換え（物理的又は仮想的）により作製される。一般に１又は複数のスクリーニング工程が、シャッフリングプロセスにおいて、関心対象の核酸を同定するために使用され；このスクリーニング工程は、任意の組換え工程の前又は後に実施され得る。一部の（しかし全てではない）シャッフリングの実施形態において、スクリーニングされるべきプールの多様性を増大するために、選択の前に、複数ラウンドの組換えを実施することが望ましい。組換え及び選択のプロセス全体は、任意に再帰的に反復される。状況に応じて、シャッフリングは、組換え及び選択のプロセス全体を指すか、又は代わりに、単純にこのプロセス全体の組換え部分を指すことができる。
２つのポリヌクレオチド配列又はポリペプチド配列の状況において、本明細書において使用される「配列同一性」又は「同一性」は、特定された比較ウインドウにわたり最大の対応で整列された場合に同じであるこれら２つの配列における残基に言及する。配列同一性の百分率が、タンパク質に関して使用される場合、同一でない残基位置は、保存的アミノ酸置換により異なることが多く、ここでアミノ酸残基は、類似の化学特性（例えば電荷又は疎水性）を伴う他のアミノ酸残基で置換されており、結果的にその分子の機能特性を変化しないことが認められる。保存的置換において配列が異なる場合、％配列同一性は、その置換の保存的性質の補正が上向くように調節されてよい。そのような保存的置換が異なる配列は、「配列類似性」又は「類似性」を有すると称される。この調節を行う意味は、当業者には周知である。典型的には、これは、完全ミスマッチよりむしろ部分的ミスマッチとしての保存的置換のスコア化に関与しており、これにより％配列同一性が増大する。従って例えば、同一アミノ酸がスコア１を与えられ、及び非保存的置換がスコア０を与えられる場合、保存的置換は、０と１の間のスコアを与えられる。保存的置換のスコア化は、例えばプログラムPC/GENE(Intelligenetics, Mountain View, California)に実装されたように、計算される。
本明細書において使用される「％配列同一性」は、比較ウインドウにわたり２つの最適に整列された配列を比較することにより、決定された値を意味し、ここでこれら２つの配列の最適な整列化に関して、比較ウインドウ中のポリヌクレオチド配列の一部は、参照配列（付加又は欠失を含まない）と比べ、付加又は欠失（すなわちギャップ）を含んでよい。この百分率は、マッチした位置の数を得るために、両方の配列中で同一の核酸塩基又はアミノ酸残基が生じる位置の数を決定し、このマッチした位置の数を、比較のウインドウ内の位置の総数で除算し、配列同一性の百分率を得るために、その結果に１００を掛けることにより、計算される。
特に指定しない限りは、本明細書に提供される配列同一性／類似性の値は、以下のパラメータを使用し、GAP Version 10を用い得られた値を指す：ヌクレオチド配列の％同一性及び％類似性に関して、ＧＡＰウェイト５０及びレングスウェイト３、及びnwsgapdna.cmp scoring matrixを使用；アミノ酸配列の％同一性及び％類似性に関して、ＧＡＰウェイト８及びレングスウェイト２、及びBLOSUM62 scoring matrixを使用；又は任意のそれらの同等のプログラム。「同等のプログラム」とは、問題のいずれか２つの配列に関して、GAP Version 10により作製された対応する整列化と比較した場合、同一のヌクレオチド又はアミノ酸残基のマッチ及び同一の％配列同一性を有する整列化を作製する、任意の配列比較プログラムが意図される。
２つの配列が、その配列の対に関して可能な最高スコアに達するように、規定されたアミノ酸置換マトリクス(例えばBLOSUM62)、ギャップイグジステンスペナルティ及びギャップイクステンションペナルティを使用し、類似性スコア化のために整列される場合に、それらは「最適に整列される」。アミノ酸置換マトリクス及び２つの配列の間の類似性の定量におけるそれらの使用は、当該技術分野において周知であり、且つ例えば、Dayhoffら、(1978) 「Atlas of Protein Sequence and Structure,」 第5巻補遺3(M. O. Dayhoff編集)中の「A model of evolutionary change in proteins.」、345-352頁. Natl. Biomed. Res. Found., Washington, D.C.、及びHenikoffら、(1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10915-10919に説明されている。BLOSUM62マトリクスは、配列整列化プロトコールにおけるデフォルトの置換マトリクスとして使用されることが多い。ギャップイグジステンスペナルティは、整列化した配列の一方における１個のアミノ酸ギャップの導入のために課され、及びギャップイクステンションペナルティは、既にオープンにされたギャップへ挿入された各追加のエンプティアミノ酸位置のために課される。最高の可能性のあるスコアを達成するために、この整列は、そこで整列が始まり且つ終わる各配列のアミノ酸位置により、並びに任意に一方又は両方の配列中の１つのギャップ又は複数のギャップの挿入により、規定される。最適整列及びスコア化は、手作業で遂行されることができるが、このプロセスは、コンピュータで実行される整列化アルゴリズム、例えば、Altschulら、(1997) Nucleic Acids Res. 25:3389-3402に記載され、且つ米国国立生物工学情報センター（ＮＣＢＩ）のウェブサイト(www.ncbi.nlm.nih.gov)で公に利用可能とされている、gapped BLAST 2.0の使用により、促進される。複数の整列を含む最適整列は、例えば、www.ncbi.nlm.nih.govを通じて利用可能であり、且つAltschulら、(1997) Nucleic Acids Res. 25:3389-3402により説明された、PSI-BLASTを使用し、調製することができる。
参照配列と最適に整列されているアミノ酸配列に関して、アミノ酸残基は、「その残基が、整列内で対形成される参照配列内の位置に「対応する」。この「位置」は、Ｎ－末端に対するその位置を基に参照配列中の各アミノ酸を順に同定する番号により示される。欠失、挿入、短縮化、融合などのために、それは、最適整列を決定する場合に考慮されなければならず、概してＮ－末端から単純にカウントすることにより決定される被験配列中のアミノ酸残基番号は、参照配列におけるその対応する位置の番号と必ずしも同じではない。例えば、整列化された被験配列に欠失が存在する場合、その欠失の部位に参照配列の位置に対応するアミノ酸は存在しないであろう。整列化された参照配列中に挿入が存在する場合、その挿入は、参照配列中のいずれのアミノ酸位置にも対応しないであろう。短縮化又は融合の場合、参照配列又は整列化された配列のいずれかの中に、対応する配列中のいずれのアミノ酸にも対応しない、アミノ酸の部分配列が存在することができる。
ＶＩ． 抗体
配列番号：１－１６として表記されるアミノ酸配列又はその活性バリアントもしくは断片を有するものを含む、ＵＳＰ、融合タンパク質、又は本発明のＵＳＰを含むリボ核タンパク質に対する抗体も、包含されている。抗体を産生する方法は、当該技術分野において周知である(例えば、 Harlow及びLane (1988) Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y.；及び、米国特許第4,196,265号参照)。これらの抗体は、ＵＳＰ又は融合タンパク質又は本明細書において説明されたＵＳＰを含むリボ核タンパク質の検出及び単離のためのキットにおいて、使用することができる。従ってこの開示は、例えば配列番号：１－１６のいずれかと少なくとも８５％の同一性を有する配列を含むポリペプチドを含む、本明細書において説明されたポリペプチド又はリボ核タンパク質に特異的に結合する抗体を備えるキットを提供する。
ＶＩＩ． 関心対象の標的配列への結合のためのシステム及びリボ核タンパク質複合体並びにその製造方法
本開示は、核酸配列を標的化し、且つ標的核酸配列を改変するシステムを提供する。一部の実施形態において、ＲＧＮ、及びｇＲＮＡなどの、ＲＮＡガイド型ＤＮＡ結合ポリペプチドは、リボ核タンパク質複合体を関心対象の核酸配列へ標的化することに寄与し；デアミナーゼポリペプチドは、Ｃ＞Ｕから標的化された核酸配列を改変することに寄与し；ウラシル安定化ポリペプチドは、ウラシルを、ＤＮＡ分子において持続することができ、その結果所望のＤＮＡ修復が生じ、これによりＣ＞Ｔ変異を導入する。このガイドＲＮＡは、関心対象の標的配列へハイブリダイズし、同じくＲＮＡガイド型ＤＮＡ結合ポリペプチドと複合体を形成し、これによりＲＮＡガイド型ＤＮＡ結合ポリペプチドを、標的配列に結合するように指示する。このＲＮＡガイド型ＤＮＡ結合ポリペプチドは、３－ドメイン融合タンパク質の１つのドメインであり；第二のドメインは、デアミナーゼであり、及び第三のドメインは、本明細書において説明されたＵＳＰである。一部の実施形態において、ＲＮＡガイド型ＤＮＡ結合ポリペプチドは、Ｃａｓ９などの、ＲＧＮである。他のＲＮＡガイド型ＤＮＡ結合ポリペプチドの例は、米国特許出願第2019/0367949号(その全体は引用により本明細書中に組み込まれている)に記載されたものなどのＲＧＮを含む。一部の実施形態において、ＲＮＡガイド型ＤＮＡ結合ポリペプチドは、ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓポリペプチド、又はその活性バリアントもしくは断片である。一部の実施形態において、ＲＮＡガイド型ＤＮＡ結合ポリペプチドは、Ｖ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓポリペプチド、又はその活性バリアントもしくは断片である。他の実施形態において、ＲＮＡガイド型ＤＮＡ結合ポリペプチドは、ＶＩ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓポリペプチドである。他の実施形態において、本融合タンパク質のＤＮＡ結合性ドメインは、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、ＴＡＬＥＮ、又はメガヌクレアーゼポリペプチドなどの、ＲＮＡガイドを必要としない。これらの実施形態の一部において、各々のヌクレアーゼ活性は、不活化されている。更なる実施形態において、ＲＮＡガイド型ＤＮＡ結合ポリペプチドは、ＡＰＧ０７４３３．１（配列番号：４０）と少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列などのＲＧＮのアミノ酸配列、又はニッカーゼＡＰＧ０７４３３．１（配列番号：４１）などのその活性バリアントもしくは断片を含む。更なる実施形態において、ＲＮＡガイド型ＤＮＡ結合ポリペプチドは、ＡＰＧ０７４３３．１（配列番号：４０）と少なくとも８５％の配列同一性を有するアミノ酸配列などのＲＧＮのアミノ酸配列、又はニッカーゼＡＰＧ０７４３３．１（配列番号：４１）などのその活性バリアントもしくは断片を含む。更なる実施形態において、ＲＮＡガイド型ＤＮＡ結合ポリペプチドは、ＡＰＧ０７４３３．１（配列番号：４０）と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列などのＲＧＮのアミノ酸配列、又はニッカーゼＡＰＧ０７４３３．１（配列番号：４１）などのその活性バリアントもしくは断片を含む。更なる実施形態において、ＲＮＡガイド型ＤＮＡ結合ポリペプチドは、ＡＰＧ０７４３３．１（配列番号：４０）と少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列などのＲＧＮのアミノ酸配列、又はニッカーゼＡＰＧ０７４３３．１（配列番号：４１）などのその活性バリアントもしくは断片を含む。更なる実施形態において、ＲＮＡガイド型ＤＮＡ結合ポリペプチドは、ＡＰＧ０７４３３．１（配列番号：４０）などのＲＧＮのアミノ酸配列、又はニッカーゼＡＰＧ０７４３３．１（配列番号：４１）などのその活性バリアントもしくは断片を含む。
本明細書に提供される関心対象の標的配列に結合するシステムは、リボ核タンパク質複合体であることができ、これは少なくとも１個のタンパク質に結合された少なくとも１個のＲＮＡの分子である。本明細書に提供されるリボ核タンパク質複合体は、ＲＮＡ成分として少なくとも１個のガイドＲＮＡ、並びにデアミナーゼ、本発明のＵＳＰ、及びタンパク質成分としてＲＮＡガイド型ＤＮＡ結合ポリペプチドを含む融合タンパク質を含む。本リボ核タンパク質複合体は、本融合タンパク質及びガイドＲＮＡをコードしているポリヌクレオチドにより形質転換された細胞又は生物から精製され、並びに本融合タンパク質及びガイドＲＮＡの発現を可能にする条件下で培養されることができる。従って、ＵＳＰ、融合タンパク質、又は融合タンパク質のリボ核タンパク質複合体を作製する方法が、提供される。そのような方法は、ＵＳＰ、融合タンパク質をコードしているヌクレオチド配列、及び一部の実施形態においてガイドＲＮＡをコードしているヌクレオチド配列を含む細胞を、そこでＵＳＰ又は融合タンパク質（及び一部の実施形態においては、ガイドＲＮＡ）が発現される条件下で培養することを含む。このＵＳＰ、融合タンパク質、又は融合リボ核タンパク質は、培養された細胞のライセートから精製され得る。
生物学的試料のライセートからＵＳＰ、融合タンパク質、又は融合リボ核タンパク質複合体を精製する方法は、当該技術分野において公知である（例えば、サイズ排除及び／又はアフィニティクロマトグラフィー、２Ｄ－ＰＡＧＥ、ＨＰＬＣ、逆相クロマトグラフィー、免疫沈降）。特定の方法において、このＵＳＰ又は融合タンパク質は、組換えにより作製され、且つその精製を助けるために、精製タグを含み、これはグルタチオン－Ｓ－転移酵素（ＧＳＴ）、キチン結合タンパク質（ＣＢＰ）、マルトース結合タンパク質、チオレドキシン（ＴＲＸ）、ポリ（ＮＡＮＰ）、タンデムアフィニティ精製（ＴＡＰ）タグ、ｍｙｃ、ＡｃＶ５、ＡＵ１、ＡＵ５、Ｅ、ＥＣＳ、Ｅ２、ＦＬＡＧ、ＨＡ、ｎｕｓ、Ｓｏｆｔａｇ １、Ｓｏｆｔａｇ ３、Ｓｔｒｅｐ、ＳＢＰ、Ｇｌｕ－Ｇｌｕ、ＨＳＶ、ＫＴ３、Ｓ、Ｓ１、Ｔ７、Ｖ５、ＶＳＶ－Ｇ、６ｘＨｉｓ、ビオチンカルボキシル担体タンパク質（ＢＣＣＰ）、及びカルモジュリンを含むが、これらに限定されるものではない。一般に、タグ付きＵＳＰ、融合タンパク質、又は融合リボ核タンパク質複合体は、免疫沈降又は当該技術分野において公知の他の類似の方法を用いて精製される。
「単離された」又は「精製された」ポリペプチド、又はその生物学的活性部分は、その天然の環境においてそのポリペプチドに通常随伴するか又は相互作用する成分を、実質的又は本質的に含まない。従って単離又は精製されたポリペプチドは、他の細胞物質、もしくは組換え技術により生成される場合は、培養培地を実質的に含まないか、又は化学的に合成される場合は、化学物質前駆体もしくは他の化学物質を実質的に含まない。細胞物質を実質的に含まないタンパク質は、夾雑しているタンパク質を約３０％、２０％、１０％、５％、又は１％（乾燥重量により）未満有するタンパク質の調製品を含む。本発明のタンパク質又はその生物学的活性部分が、組換えにより製造される場合、最適な培養培地は、化学物質前駆体又は非タンパク質の関心対象の化学物質の約３０％、２０％、１０％、５％、又は１％（乾燥重量により）未満を表す。
ＶＩＩＩ． 標的配列の改変方法
本開示は、関心対象の標的核酸分子（例えば、標的ＤＮＡ分子）を修飾する方法を提供する。これらの方法は、少なくとも１種のガイドＲＮＡ又はこれをコードしているポリヌクレオチド、並びに本発明のＵＳＰ、デアミナーゼ、及びＲＮＡガイド型ＤＮＡ結合ポリペプチドを含む少なくとも１種の融合タンパク質、又はこれをコードしているポリヌクレオチドを含むシステムを、標的配列又は標的配列を含む細胞、細胞小器官、もしくは胚へ送達することを含む。これらの実施形態の一部において、本融合タンパク質は、配列番号：１－１６のアミノ酸配列のいずれか一つ、又はその活性バリアントもしくは断片を含む。
一部の実施形態において、本方法は、ＤＮＡ分子を、（ａ）ＵＳＰ、デアミナーゼ、及び例えばヌクレアーゼ－不活化もしくはニッカーゼＣａｓ９ドメインなどの、ＲＮＡガイド型ＤＮＡ結合ポリペプチドを含む融合タンパク質；並びに、（ｂ）このＤＮＡ分子の標的ヌクレオチド配列へ、（ａ）の融合タンパク質を標的化するｇＲＮＡ：と接触させることを含み；ここで、このＤＮＡ分子は、この融合タンパク質及びｇＲＮＡと、有効量で、且つヌクレオチド塩基の脱アミノ化に適した条件下で、接触される。一部の実施形態において、この標的ＤＮＡ分子は、疾患又は障害に関連した配列を含み、ここでヌクレオチド塩基の脱アミノ化は、疾患又は障害に関連しない配列を生じる。一部の実施形態において、この疾患又は障害は、動物を罹患させる。更なる実施形態において、この疾患又は障害は、哺乳動物、例えばヒト、ウシ、ウマ、イヌ、ネコ、ヤギ、ヒツジ、ブタ、サル、ラット、マウス、又はハムスターなどを罹患させる。一部の実施形態において、この標的ＤＮＡ配列は、作物のアレル内に存在し、ここで関心対象の形質の特定のアレルは、農学的価値の低い植物を生じる。このヌクレオチド塩基の脱アミノ化は、形質を改善し、且つ植物の農学的価値を増大するアレルを生じる。
一部の実施形態において、所望の変異は、疾患又は障害に関連したＴ→Ｃ点変異を含み、ここで変異体Ｃ塩基の脱アミノ化は、疾患又は障害に関連しない配列を生じる。一部の実施形態において、脱アミノ化は、疾患又は障害に関連した配列における点変異を補正する。
一部の実施形態において、疾患又は障害に関連した配列は、タンパク質をコードし、ここで脱アミノ化は、この疾患又は障害に関連した配列へ、停止コドンを導入し、その結果コードされたタンパク質の短縮化を生じる。一部の実施形態において、この接触は、この疾患又は障害を有しやすい、有する、又は診断された対象において、インビボにおいて実施される。一部の実施形態において、この疾患又は障害は、ゲノムにおける、点変異、又は一塩基変異に関連した疾患である。一部の実施形態において、この疾患は、遺伝疾患、癌、代謝性疾患、又はリソソーム蓄積症である。
従ってここで開示された組成物及び方法は、疾患又は障害を治療するため又は疾患又は障害に関連した症状を軽減するために、変異されている配列（すなわち、この配列は、疾患又は障害の原因であるか、又は疾患又は障害に関連した症状の原因である）に関連した疾患又は障害の治療に使用することができる。本明細書において使用される用語「治療する」又は「治療」は、ＵＳＰ又は融合タンパク質を含有する本明細書に開示された医薬組成物の、疾患又は障害を有する対象への投与を指す。治療は、疾患又は障害に罹りやすい（例えば遺伝的素因がある）対象において、疾患又は障害に関連した症状の発生を防止することによる予防薬であることができる。治療の望ましい作用は、疾患の発生又は再発の防止、症状の軽減、疾患の直接又は間接の病理学的帰結の縮小、疾患進行速度の低下、疾患状態の改善又は緩和、及び寛解又は改善された予後を含むが、これらに限定されるものではない。
医薬組成物は、活性成分（すなわち、ＵＳＰもしくは融合タンパク質又はこれらをコードしている核酸分子）並びに医薬として許容し得る担体を含有する、疾患又は障害の予防、強度の軽減、治癒又は他の治療に利用される組成物である。医薬として許容し得る担体は、ヒト又は他の脊椎動物への投与に適している、１又は複数の適合可能な固体又は液体の充填剤、希釈剤又はカプセル封入物質を含む。一部の実施形態において、本医薬組成物は、非天然である医薬として許容し得る担体を含有する。
ここで開示された方法において使用される医薬組成物は、好適な担体、賦形剤、及び好適な移動、送達、耐性などを提供する他の物質と共に製剤化され得る。多数の適切な製剤が、当業者に公知である。非限定的例は、無菌の希釈剤、例えば注射用水、食塩水、固定油、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコール又は他の合成溶媒など；抗菌薬、例えばベンジルアルコール、メチルパラベンなど；抗酸化剤、例えばアスコルビン酸又は亜硫酸水素ナトリウムなど；キレート剤、例えばエチレンジアミン四酢酸など；緩衝剤、例えば酢酸塩、クエン酸塩又はリン酸塩、並びに張度を調節する物質、例えば塩化ナトリウム又はデキストロースなどを含む。静脈内投与される特定の担体は、生理食塩水又はリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）である。経口又は非経口使用のための医薬組成物は、活性成分の投与量にあわせて適するようにされた単位投与量の剤形へ調製されてよい。そのような単位投与量の剤形は、例えば、錠剤、丸剤、カプセル剤、注射剤（アンプル）、坐剤などを含む。これらの組成物はまた、保存剤、湿潤剤、乳化剤、及び分散剤を含む、アジュバントも含んでよい。微生物の作用の防止は、様々な抗菌剤及び抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸などにより、確実にされてよい。等張化剤、例えば、糖類、塩化ナトリウムなどを含むことも望ましい。注射用医薬剤形の延長された吸収は、吸収を遅延する物質、例えば、モノステアリン酸アルミニウム及びゼラチンなどの使用によりもたらされる。
ＵＳＰ又は融合タンパク質又はこれをコードしている核酸分子又はこれを含む細胞を含有する医薬組成物は、経口、口腔内、非経口、局所的、吸入又は吹送（すなわち口を通ってもしくは鼻を通って）、又は経直腸などの、任意の経路を介して対象へ投与されることができる。投与は、例えば、１回、複数回、及び／又は１もしくは複数の延長された期間にわたって行われることができる。
本発明の医薬組成物の有効量は、その目的（例えば、特定の配列により引き起こされる障害又は疾患の予防又は、部分的回復を含む回復、又は予防もしくは遅延）を達成するのに有効である任意の量である。通常ｍｇ／ｋｇで表現される有効量は、当業者により、前臨床試験及び臨床試験時に、慣習的方法により決定され得る。
方法が、ガイドＲＮＡ及び／又は融合タンパク質をコードしているポリヌクレオチドの送達を含むこれらの実施形態において、細胞又は胚は、次にガイドＲＮＡ及び／又は融合タンパク質が発現される条件下で培養することができる。様々な実施形態において、この方法は、標的配列を、ｇＲＮＡ及び融合タンパク質（これは、本発明のＵＳＰ、デアミナーゼ、及びＲＮＡガイド型ＤＮＡ結合ポリペプチドを含む）を含むリボ核タンパク質複合体と接触させることを含む。いくつかの実施形態において、本方法は、標的配列を含む細胞、細胞小器官もしくは胚へ、本発明のリボ核タンパク質複合体を導入することを含む。本発明のリボ核タンパク質複合体は、生物学的試料から精製され、組換えにより生成され且つ引き続き精製されるものか、又は本明細書において説明されたようにインビトロにおいて集成されているものであることができる。標的配列又は細胞、細胞小器官もしくは胚と接触されているリボ核タンパク質複合体がインビトロにおいて集成されるこれらの実施形態において、この方法は、この複合体のインビトロにおける集成、その後の標的配列の、細胞、細胞小器官もしくは胚との接触を、更に含むことができる。
精製された又はインビトロ集成された本発明のリボ核タンパク質複合体は、非限定的に、電気穿孔法を含む、当該技術分野において公知の方法を使用し、細胞、細胞小器官もしくは胚へ導入することができる。或いは、本発明のＵＳＰ、デアミナーゼ、及びＲＮＡガイド型ＤＮＡ結合ポリペプチド、及びガイドＲＮＡをコードするかもしくは含むポリヌクレオチドを含む融合タンパク質は、当該技術分野において公知の任意の方法（例えば電気穿孔法）を用いて、細胞、細胞小器官もしくは胚へ導入することができる。
標的配列又は標的配列を含む細胞、細胞小器官もしくは胚への送達又はそれとの接触時に、ガイドＲＮＡは、この融合タンパク質を、配列特異的様式で標的配列に結合するように指示する。この標的配列は、本融合タンパク質のデアミナーゼドメイン及びＵＳＰドメインを介して引き続き改変され得る。一部の実施形態において、この融合タンパク質の標的配列への結合は、標的配列に隣接するヌクレオチドの改変を生じる。標的配列に隣接するヌクレオチド塩基は、標的配列の５’又は３’末端から、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、又は１００塩基対であってよい。本発明のＵＳＰ、デアミナーゼ、及びＲＮＡガイド型ＤＮＡ結合ポリペプチドを含む融合タンパク質は、標的化されたＣ＞Ｔ変異を、デアミナーゼ及びＲＮＡガイド型ＤＮＡ結合ポリペプチドのみを含む融合タンパク質と比べ、より大きい効率で、導入することができる。
この融合タンパク質の標的配列への結合を測定する方法は、当該技術分野において公知であり、且つクロマチン免疫沈降アッセイ、ゲル移動度シフトアッセイ、ＤＮＡプルダウンアッセイ、レポーターアッセイ、マイクロプレート捕獲及び検出アッセイを含む。同様に、標的配列の切断又は改変を測定する方法も、当該技術分野において公知であり、且つ切断が、分解生成物の検出を促進するために標的配列への適切な標識（例えば放射性同位体、蛍光物質）の結合を伴う又は伴わない、ＰＣＲ、シークエンシング、もしくはゲル電気泳動を用いて確認されるような、インビトロ又はインビボにおける切断アッセイを含む。或いは、ニッキングトリガー指数増幅反応（ＮＴＥＸＰＡＲ）アッセイを、使用することができる(例えば、Zhangら、(2016) Chem. Sci. 7:4951-4957参照)。インビボ切断は、Surveyorアッセイを用い評価することができる(Guschinら、(2010) Methods Mol Biol 649:247-256)。
一部の実施形態において、本方法は、２種以上のガイドＲＮＡと複合された、本融合タンパク質の一部としての、ＲＮＡ－結合、ＤＮＡ－ガイド型ドメインの使用に関与している。２種以上のガイドＲＮＡは、単独の遺伝子の異なる領域を標的化することができるか、又は複数の遺伝子を標的化することができる。この複数の標的化は、本融合タンパク質のデアミナーゼドメインが、核酸を改変することを可能にし、これにより関心対象の標的核酸分子（例えばゲノム）に複数の変異を導入する。本融合タンパク質のＵＳＰドメインは、所望の変異の導入効率を増大する。
本方法が、ニッカーゼＲＧＮ（すなわち、二本鎖ポリヌクレオチドの一本鎖のみを切断することができる、例えばｎＡＰＧ０７４３３．１（配列番号：４１））などの、ＲＮＡガイド型ヌクレアーゼ（ＲＧＮ）の使用に関与しているこれらの実施形態において、本方法は、同一又は重複する標的配列を標的化し、及びこのポリヌクレオチドの異なる鎖を切断する２種の異なるＲＧＮ又はＲＧＮバリアントを導入することを含むことができる。例えば、二本鎖ポリヌクレオチドのプラス（＋）鎖のみを切断するＲＧＮニッカーゼは、二本鎖ポリヌクレオチドのマイナス（－）鎖のみを切断する第二のＲＧＮニッカーゼと共に、導入されることができる。或いは、２種の異なる融合タンパク質は、各融合タンパク質が異なるＰＡＭ認識配列を伴う異なるＲＧＮを含む場合に提供されてよく、その結果ヌクレオチド配列のより大きい多様性が、変異のために標的化され得る。
当業者は、ここで開示された任意の方法は、単独の標的配列又は複数の標的配列を標的化するために使用することができることを理解するであろう。従って方法は、シングルＲＮＡガイド型ＤＮＡ結合ポリペプチドを、単独の遺伝子及び／又は複数の遺伝子内で、複数の異なる配列を標的化することができる複数の異なるガイドＲＮＡと組合せて含む融合タンパク質の使用を含む。本融合タンパク質のデアミナーゼドメインはその後、標的化された配列の各々に変異を導入するであろう。本融合タンパク質のＵＳＰドメインは、所望の変異の導入効率を増大する。同じく複数の異なるガイドＲＮＡが、複数の異なるＲＮＡガイド型ＤＮＡ結合性ポリペプチドと組合されて導入される方法も、本明細書に包含される。そのようなＲＮＡガイド型ＤＮＡ結合ポリペプチドは、複数のＲＧＮ又はＲＧＮバリアントであってよい。これらのガイドＲＮＡ及びガイドＲＮＡ／融合タンパク質システムは、単独の遺伝子及び／又は複数の遺伝子内で、複数の異なる配列を標的化することができる。
ＩＸ． ポリヌクレオチド遺伝子改変を含む細胞
一部の実施形態は、本明細書に提供される融合タンパク質を使用する方法を提供する。一部の実施形態において、本融合タンパク質は、標的核酸塩基、例えばＣ残基を脱アミノ化することにより、標的核酸分子へ点変異を導入するために使用される。一部の実施形態において、標的核酸塩基の脱アミノ化は、遺伝子欠失の補正、例えば遺伝子産物における機能喪失につながる点変異の補正を生じる。一部の実施形態において、遺伝子欠失は、疾患又は障害、例えばリソソーム蓄積症又は代謝性疾患、例えば１型糖尿病などに関連している。一部の実施形態において、本明細書に提供される方法は、非活性化点変異を、疾患又は障害に関連している遺伝子産物をコードしている遺伝子又はアレルへ導入するために使用される。例えば一部の実施形態において、非活性化点変異を癌遺伝子へ導入するために（例えば増殖性疾患の治療において）融合タンパク質を利用する方法が、本明細書において提供される。非活性化変異は、一部の実施形態において、コード配列において未熟な停止コドンを作出することがあり、これは短縮型遺伝子産物、例えば完全長タンパク質の機能を欠いている短縮型タンパク質の発現を生じる。一部の実施形態において、本明細書に提供される方法の目的は、ゲノム編集により、機能不全遺伝子の機能を回復することである。本明細書に提供される融合タンパク質は、例えばヒト細胞培養物中で疾患関連した変異を補正することにより、インビトロにおいて遺伝子編集－ベースのヒト療法について検証されることができる。当業者により、本明細書に提供される融合タンパク質、例えばＲＮＡガイド型ＤＮＡ結合性ドメイン、デアミナーゼドメイン、及び本発明のＵＳＰを含む融合タンパク質は、任意の単独の点Ｃ＞Ｔ変異を補正するために使用することができることが、理解されるであろう。変異体ＣのＵへの脱アミノ化は、この変異の補正につながる。
一部の実施形態において、ＲＮＡガイド型ＤＮＡ結合性ドメイン、デアミナーゼドメイン、及び本発明のＵＳＰを含む融合タンパク質は、標的化された遺伝子又は関心対象の遺伝子の標的化された領域において変異を作出するために使用されてよい。一部の実施形態において、本発明の融合タンパク質は、標的化された遺伝子又は関心対象の標的化された遺伝子領域の部位飽和突然変異誘発、それに続く新たな変異及び／又は表現型を同定するための、ハイスループットフォワード遺伝子スクリーニングのために使用されてよい。他の実施形態において、本明細書において説明される融合タンパク質は、標的化されたゲノム位置に変異を作出するために使用されてよく、これはコードＤＮＡ配列を含んでも含まなくともよい。先に説明された標的化された変異誘発により作製された細胞株のライブラリーはまた、遺伝子機能又は遺伝子発現の研究にも有用であることができる。
本発明の融合タンパク質はまた、ナンセンス変異の標的化された挿入を通じて、ＫＯ系統の全ライブラリーを含む、ノックアウト（ＫＯ）系統を効率的に作製するためにも使用される。ＲＮＡガイド型ＤＮＡ結合性ドメイン、デアミナーゼドメイン、及び本発明のＵＳＰを含む融合タンパク質は、コードＤＮＡ鎖へ標的化された場合には、３種のコドン（ＣＡＡ、ＣＡＧ、及びＣＧＡ）を停止コドン（ＴＡＧ、ＴＡＡ、又はＴＧＡ）へ変換することができ、並びに非コードＤＮＡ鎖に標的化された場合には、ＴＧＧを停止コドンへ変換することができる。Billonら(2017, Mol Cell 67: 1068-1079；引用により本明細書中に組み込まれている)は、停止コドンの作製のために有用である８種の真核生物種における３４０万種を超えるガイドＲＮＡのデータベースを提供している。加えて、Kuscuら(2017, Nature Methods 14(7): 710-714；引用により本明細書中に組み込まれている)は、早期停止コドンを導入するために、ほぼ１７，０００種の遺伝子を標的化することができるヒトゲノムにおける、～２６０，０００種の独特なｉ－ｓｔｏｐ ｓｇＲＮＡを確定した。一部の実施形態において、これらのＫＯ系統は、真核生物細胞である。他の実施形態において、これらのＫＯ系統は、原核生物細胞である。一部の実施形態において、本発明の融合タンパク質を使用し作製されたＫＯ系統は、ヒト細胞株である。他の実施形態において、ＫＯ系統は、哺乳動物細胞株、例えば、マウス、ラット、サル、ネコ、イヌ、ウシ、ブタ、ヒツジ、又はウマの細胞株である。他の実施形態において、ＫＯ系統は、鳥類細胞である。他の実施形態において、ＫＯ系統は、昆虫細胞である。他の実施形態において、ＫＯ系統は、微生物細胞である。更に他の実施形態において、ＫＯ系統は、植物細胞である。更なる実施形態において、ＫＯ系統は、シロイヌナズナ、大豆、メイズ、綿、トマト、ジャガイモ、又は豆の細胞である。更なる実施形態において、細胞株は、植物種子である。
一部の実施形態において、本明細書に提供される融合タンパク質は、治療的ゲノム編集に有用であることができる。例えば、ＲＮＡガイド型ＤＮＡ結合性ドメイン、デアミナーゼドメイン、及び本発明のＵＳＰを含む融合タンパク質は、ＰＣＳＫ９（プロタンパク質転換酵素サブチリシン／ケキシン９型）の標的化されたナンセンス変異を作製するために使用されることができる。ＰＣＳＫ９は、リポタンパクホメオスタシスに関係づけられ、及びＰＣＳＫ９をブロックする物質は、血液中の低密度リポタンパク粒子（ＬＤＬ）濃度を低下することができる。個体中のＰＣＳＫ９の天然のナンセンスバリアントは、実質的に低下した血中コレステロールレベルを生じ、冠動脈性心臓病のリスクを低下する(Cohenら、(2006) N Engl J Med 354: 1264-1272)。Chadwickら(2017, Arteriscler Thromb Vasc Biol 37: 1741-1747；引用により本明細書中に組み込まれている)は、標的化されたＣ＞Ｔ変異を、ＰＣＳＫ９遺伝子へ巧く導入し、これによりマウスにおいてＰＣＳＫ９タンパク質レベル及び血漿コレステロールレベルを低下することができたことを、認めている。一部の実施形態において、同様のアプローチが、本発明の融合タンパク質により成されてよい。更に当業者は、ここで開示された融合タンパク質を使用し、他の点変異、並びに他の癌に及び他の増殖性疾患を含む癌以外の疾患に関連した変異を補正することができることを、理解するであろう。
任意に本明細書において説明されたｇＲＮＡを伴う、融合タンパク質により媒介されたプロセスを使用し改変された関心対象の標的核酸分子を含む細胞及び生物が、本明細書に提供される。これらの実施形態の一部において、本融合タンパク質は、配列番号：１－１６のいずれかのアミノ酸配列、又はその活性バリアントもしくは断片を含むＵＳＰを含む。一部の実施形態において、本融合タンパク質は、配列番号：１－１６のいずれかと少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％同一のアミノ酸配列を含むＵＳＰを含む。一部の実施形態において、本融合タンパク質は更に、デアミナーゼ及びＲＮＡガイド型ＤＮＡ結合ポリペプチドを含む。更なる実施形態において、本融合タンパク質は、デアミナーゼ及びＲＧＮ又はそのバリアント、例えばＡＰＧ０７４３３．１（配列番号：４０）又はそのニッカーゼバリアントｎＡＰＧ０７４３３．１（配列番号：４１）と少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列などを含む。更なる実施形態において、本融合タンパク質は、デアミナーゼ及びＲＧＮ又はそのバリアント、例えばＡＰＧ０７４３３．１（配列番号：４０）又はそのニッカーゼバリアントｎＡＰＧ０７４３３．１（配列番号：４１）と少なくとも８５％の配列同一性を有するアミノ酸配列などを含む。更なる実施形態において、本融合タンパク質は、デアミナーゼ及びＲＧＮ又はそのバリアント、例えばＡＰＧ０７４３３．１（配列番号：４０）又はそのニッカーゼバリアントｎＡＰＧ０７４３３．１（配列番号：４１）と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列などを含む。更なる実施形態において、本融合タンパク質は、デアミナーゼ及びＲＧＮ又はそのバリアント、例えばＡＰＧ０７４３３．１（配列番号：４０）又はそのニッカーゼバリアントｎＡＰＧ０７４３３．１（配列番号：４１）と少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列などを含む。更なる実施形態において、本融合タンパク質は、デアミナーゼ及びＲＧＮ又はそのバリアント、例えばＡＰＧ０７４３３．１（配列番号：４０）又はそのニッカーゼバリアントｎＡＰＧ０７４３３．１（配列番号：４１）などを含む。他の実施形態において、本融合タンパク質は、デアミナーゼ及びＣａｓ９又はそのバリアント、例えばｄＣａｓ９又はニッカーゼＣａｓ９などを含む。一部の実施形態において、本融合タンパク質は、ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓポリペプチドのヌクレアーゼ－不活化又はニッカーゼバリアントを含む。他の実施形態において、本融合タンパク質は、Ｖ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓポリペプチドのヌクレアーゼ－不活化又はニッカーゼバリアントを含む。更に他の実施形態において、本融合タンパク質は、ＶＩ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓポリペプチドのヌクレアーゼ－不活化又はニッカーゼバリアントを含む。
この改変された細胞は、真核細胞（例えば、哺乳動物、植物、昆虫、鳥類の細胞）又は原核細胞であることができる。本明細書において説明された融合タンパク質を利用するプロセスにより改変された、少なくとも１つのヌクレオチド配列を含む細胞小器官及び胚も提供される。遺伝的に改変された細胞、生物、細胞小器官、及び胚は、改変されたヌクレオチド配列についてヘテロ接合性又はホモ接合性であることができる。
本融合タンパク質のデアミナーゼドメインにより導入された変異（複数可）は、変更された発現（アップレギュレーション又はダウンレギュレーション）、不活化、又は変更されたタンパク質産物もしくは組入れられた配列の発現を生じることができる。変異（複数可）が、遺伝子の不活化又は非機能性タンパク質産物の発現のいずれかを生じるそれらの状況において、遺伝的に改変された細胞、生物、細胞小器官もしくは胚は、「ノックアウト」と称される。ノックアウト表現型は、欠失変異（すなわち少なくとも１個のヌクレオチドの欠失）、挿入変異（すなわち少なくとも１個のヌクレオチドの挿入）、又はナンセンス変異（すなわち結果的に停止コドンが導入されるような少なくとも１個のヌクレオチドの置換）の結果であることができる。
他の実施形態において、本融合タンパク質のデアミナーゼドメインにより導入される変異（複数可）は、バリアントタンパク質産物の生成を生じる。発現されたバリアントタンパク質産物は、少なくとも１個のアミノ酸置換及び／又は少なくとも１個のアミノ酸の付加もしくは欠失を有することができる。このバリアントタンパク質産物は、非限定的に変更された酵素活性又は基質特異性を含む、野生型タンパク質と比べた場合に、改変された特徴又は活性を発揮することができる。
更に別の実施形態では、本融合タンパク質のデアミナーゼドメインにより導入された変異（複数可）は、タンパク質の変更された発現パターンを生じることができる。非限定的例として、タンパク質産物の発現を制御する調節領域中の変異（複数可）は、タンパク質産物の過剰発現もしくはダウンレギュレーション又は変更された組織的もしくは時間的発現パターンを生じることができる。
この開示の一部の態様は、例えばヌクレアーゼ－不活化Ｃａｓ９ドメインなどの、ＲＧＮポリペプチドなどのＲＮＡガイド型ＤＮＡ結合ポリペプチド、及び本発明のデアミナーゼ、及び任意にＣａｓ９ドメインとデアミナーゼの間に配置されたリンカーを含む、融合タンパク質を備えるキットを提供する。加えて一部の実施形態において、キットは、好適な試薬、緩衝液、及び／又は例えばインビトロもしくはインビボにおけるＤＮＡもしくはＲＮＡ編集のための、本融合タンパク質の使用説明書を備える。一部の実施形態において、このキットは、核酸配列の標的化された編集のための、好適なｇＲＮＡの設計及び使用に関する説明書を備える。
Ｘ． ＵＳＰの追加適用
本明細書において説明されたＵＳＰはまた、ゲノム塩基編集を超える有用性も有する。概して、ＵＳＰは、ＤＮＡ分子内のウラシル核酸塩基を安定化することが望ましい適用において有用である。天然のプロセスを通じて又は人工的に、ウラシルは、活性酸素種、電離放射線、及び／又はアルキル化剤により引き起こされるＤＮＡ損傷により、ゲノムＤＮＡへ導入され得る。塩基除去修復（ＢＥＲ）経路などの、ＤＮＡ修復の機序の研究、又はＤＮＡ修復能を測定する研究は、ウラシルの修復を阻害するために、本発明のＵＳＰを使用することができる。
加えて本明細書において説明されたＵＳＰは、様々な癌の治療に有用であることができる。例えば、５－フルオロウラシル（５－ＦＵ）及びそのデオキシリボヌクレオシド代謝産物５－フルオロデオキシウリジン（５－ＦｄＵ）を含むフルオロピリミジンは、結腸直腸癌を含む様々な固形癌の治療において、広範に使用されている。５－ＦｄＵは、チミジル酸合成酵素の阻害を通じて活性があり、これは結果的に細胞のゲノムへ、ウラシル及び５－ＦＵ取込みを導入する。先に説明したように、ＵＤＧなどの塩基修復酵素は、ゲノムＤＮＡ内のウラシル核酸塩基を認識し、これらを除去する。Yanら(2016; Oncotarget 7 (37): 59299-59313)は、ＵＤＧ枯渇した細胞は停止され、５－ＦｄＵ処置後の持続されたＤＮＡ損傷を示し、このことはウラシル及び５－ＦＵの除去におけるＵＤＧの作用は、腫瘍の５－ＦｄＵ治療の有効性において役割を果たすことを指摘していることを認めた。フルオロピリミジンと組合せた本発明のＵＳＰの送達は、この腫瘍治療の有効性を増強することができる。従って、ここで開示されたＵＳＰ及びフルオロピリミジンを含有する医薬組成物が、有効量のそのような医薬組成物により癌を治療する方法と共に提供される。フルオロピリミジンは、カペシタビン、カルモフール、ドキシフルリジン、フルオロウラシル、５－フルオロデオキシウリジン、及びテガフルを含む、抗－癌性代謝拮抗薬のクラスである。
冠詞「ａ」及び「ａｎ」は、その冠詞の文法上の目的語の１又は２以上（すなわち少なくとも１）を指すように、本明細書において使用される。例として、「あるポリペプチド」は、１又は複数のポリペプチドを意味する。
本明細書において言及された全ての刊行物及び特許出願は、この開示が関係する技術分野の業者のレベルを示唆している。全ての刊行物及び特許出願は、個別の刊行物又は特許出願が各々、具体的且つ個別に引用により組み込まれていることが示される場合と同じ程度に、引用により本明細書中に組み込まれている。
前述の本発明は、理解を明確化する目的で例証及び実施例により一部詳細に説明されているが、ある種の変更及び修飾を、添付された請求項の範囲内で実践することができることは明らかであろう。
非限定的実施形態は、以下を含む：
１． ａ）配列番号：１、２、４、５、及び７－１５のいずれか一つと少なくとも８０％の配列同一性；
ｂ）配列番号：３もしくは１６と少なくとも８１％の配列同一性；又は
ｃ）配列番号：６と少なくとも８２％の配列同一性：を有するアミノ酸配列を含む、単離されたポリペプチドであって、
ここで該ポリペプチドは、ウラシル安定化活性を有し、及びここで該ポリペプチドが、異種アミノ酸配列を更に含む、単離されたポリペプチド。
２． 前記アミノ酸配列が、配列番号：１－１６のいずれか一つと少なくとも８５％の配列同一性を有する、実施形態１の単離されたポリペプチド。
３． 前記アミノ酸配列が、配列番号：１－１６のいずれか一つと少なくとも９０％の配列同一性を有する、実施形態１の単離されたポリペプチド。
４． 前記アミノ酸配列が、配列番号：１－１６のいずれか一つと少なくとも９５％の配列同一性を有する、実施形態１の単離されたポリペプチド。
５． 前記アミノ酸配列が、配列番号：１－１６のいずれか一つと１００％の配列同一性を有する、実施形態１の単離されたポリペプチド。
６． 前記ポリペプチドが、配列番号：３３－３９のいずれか一つの配列を有する、実施形態１の単離されたポリペプチド。
７． 非天然の医薬として許容し得る担体、並びに：
ａ）配列番号：１、２、４、５、及び７－１５のいずれか一つと少なくとも８０％の配列同一性；
ｂ）配列番号：３もしくは１６と少なくとも８１％の配列同一性；又は
ｃ）配列番号：６と少なくとも８２％の配列同一性：を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドを含有する医薬組成物であって、
ここで該ポリペプチドが、ウラシル安定化活性を有する、医薬組成物。
８． 前記ポリペプチドが、配列番号：１－１６のいずれか一つと少なくとも８５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、実施形態７の医薬組成物。
９． 前記ポリペプチドが、配列番号：１－１６のいずれか一つと少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、実施形態７の医薬組成物。
１０． 前記ポリペプチドが、配列番号：１－１６のいずれか一つと少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、実施形態７の医薬組成物。
１１． 前記ポリペプチドが、配列番号：１－１６のいずれか一つと１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、実施形態７の医薬組成物。
１２． 非天然の医薬として許容し得る担体、並びに：
ａ）配列番号：１、２、４、５、及び７－１５のいずれか一つと少なくとも８０％の配列同一性；
ｂ）配列番号：３もしくは１６と少なくとも８１％の配列同一性；又は
ｃ）配列番号：６と少なくとも８２％の配列同一性：を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドを含む核酸分子を含有する医薬組成物であって、
ここで該ポリペプチドが、ウラシル安定化活性を有する、医薬組成物。
１３． 前記ポリペプチドが、配列番号：１－１６のいずれか一つと少なくとも８５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、実施形態１２の医薬組成物。
１４． 前記ポリペプチドが、配列番号：１－１６のいずれか一つと少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、実施形態１２の医薬組成物。
１５． 前記ポリペプチドが、配列番号：１－１６のいずれか一つと少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、実施形態１２の医薬組成物。
１６． 前記ポリペプチドが、配列番号：１－１６のいずれか一つと１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、実施形態１２の医薬組成物。
１７． 前記ポリペプチドが、配列番号：３３－３９のいずれか一つの配列を有する、実施形態７又は１２の医薬組成物。
１８． 更にフルオロピリミジンを含有する、実施形態７－１７のいずれか一つの医薬組成物。
１９． ａ）配列番号：１、２、４、５、及び７－１５のいずれか一つと少なくとも８０％の配列同一性；
ｂ）配列番号：３もしくは１６と少なくとも８１％の配列同一性；又は
ｃ）配列番号：６と少なくとも８２％の配列同一性：を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドを含む核酸分子であって、
ここで該ポリペプチドが、ウラシル安定化活性を有し；並びに
ここで該核酸分子が、該ポリヌクレオチドへ機能的に連結された異種プロモーターを更に含む、核酸分子。
２０． 前記ポリペプチドが、配列番号：１－１６のいずれか一つと少なくとも８５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、実施形態１９の医薬組成物。
２１． 前記ポリペプチドが、配列番号：１－１６のいずれか一つと少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、実施形態１９の医薬組成物。
２２． 前記ポリペプチドが、配列番号：１－１６のいずれか一つと少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、実施形態１９の医薬組成物。
２３． 前記ポリペプチドが、配列番号：１－１６のいずれか一つと１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、実施形態１９の医薬組成物。
２４． 前記ポリペプチドが、配列番号：３３－３９のいずれか一つの配列を有する、実施形態１９の核酸分子。
２５． フルオロピリミジン、並びに：
ａ）配列番号：１、２、４、５、及び７－１５のいずれか一つと少なくとも８０％の配列同一性；
ｂ）配列番号：３もしくは１６と少なくとも８１％の配列同一性；又は
ｃ）配列番号：６と少なくとも８２％の配列同一性：を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドを含有する組成物であって、
ここで該ポリペプチドが、ウラシル安定化活性を有する、組成物。
２６． 前記ポリペプチドが、配列番号：１－１６のいずれか一つと少なくとも８５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、実施形態２５の組成物。
２７． 前記ポリペプチドが、配列番号：１－１６のいずれか一つと少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、実施形態２５の組成物。
２８． 前記ポリペプチドが、配列番号：１－１６のいずれか一つと少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、実施形態２５の組成物。
２９． 前記ポリペプチドが、配列番号：１－１６のいずれか一つと１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、実施形態２５の組成物。
３０． フルオロピリミジン、並びに：
ａ）配列番号：１、２、４、５、及び７－１５のいずれか一つと少なくとも８０％の配列同一性；
ｂ）配列番号：３もしくは１６と少なくとも８１％の配列同一性；又は
ｃ）配列番号：６と少なくとも８２％の配列同一性：を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードしている核酸分子を含有する組成物であって、
ここで該ポリペプチドが、ウラシル安定化活性を有する、組成物。
３１． 前記ポリペプチドが、配列番号：１－１６のいずれか一つと少なくとも８５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、実施形態３０の組成物。
３２． 前記ポリペプチドが、配列番号：１－１６のいずれか一つと少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、実施形態３０の組成物。
３３． 前記ポリペプチドが、配列番号：１－１６のいずれか一つと少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、実施形態３０の組成物。
３４． 前記ポリペプチドが、配列番号：１－１６のいずれか一つと１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、実施形態３０の組成物。
３５． 前記ポリペプチドが、配列番号：３３－３９のいずれか一つの配列を有する、実施形態２５又は３０の組成物。
３６． （ｉ）ＤＮＡ結合ポリペプチド；（ｉｉ）デアミナーゼ；及び（ｉｉｉ）配列番号：１－１６のいずれか一つと少なくとも８０％の配列同一性を有する、少なくとも1つのウラシル安定化ポリペプチド（ＵＳＰ）：を含む、融合タンパク質。
３７． 前記少なくとも１種のＵＳＰが、配列番号：１－１６のいずれか一つと少なくとも８５％の配列同一性を有する、実施形態３６の融合タンパク質。
３８． 前記少なくとも１種のＵＳＰが、配列番号：１－１６のいずれか一つと少なくとも９０％の配列同一性を有する、実施形態３６の融合タンパク質。
３９． 前記少なくとも１種のＵＳＰが、配列番号：１－１６のいずれか一つと少なくとも９５％の配列同一性を有する、実施形態３６の融合タンパク質。
４０． 前記少なくとも１種のＵＳＰが、配列番号：１－１６のいずれか一つと１００％の配列同一性を有する、実施形態３６の融合タンパク質。
４１． 前記ＵＳＰが、配列番号：３３－３９のいずれか一つの配列を有する、実施形態３６の融合タンパク質。
４２． 前記デアミナーゼが、シチジンデアミナーゼである、実施形態３６又は４１の融合タンパク質。
４３． 前記シチジンデアミナーゼが、活性化－誘導型シチジンデアミナーゼ（ＡＩＤ）、又はデアミナーゼのアポリポタンパクＢ－ｍＲＮＡ編集複合体（ＡＰＯＢＥＣ）ファミリーの一員である、実施形態４２の融合タンパク質。
４４． 前記シチジンデアミナーゼが、配列番号：４７、４８及び７６－９４のいずれか一つと少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、実施形態４３の融合タンパク質。
４５． 前記シチジンデアミナーゼが、配列番号：４７、４８及び７６－９４のいずれか一つと少なくとも８５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、実施形態４３の融合タンパク質。
４６． 前記シチジンデアミナーゼが、配列番号：４７、４８及び７６－９４のいずれか一つと少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、実施形態４３の融合タンパク質。
４７． 前記シチジンデアミナーゼが、配列番号：４７、４８及び７６－９４のいずれか一つと少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、実施形態４３の融合タンパク質。
４８． 前記シチジンデアミナーゼが、配列番号：４７、４８及び７６－９４のいずれか一つと１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、実施形態４３の融合タンパク質。
４９． 前記ＤＮＡ結合ポリペプチドが、メガヌクレアーゼ、ジンクフィンガー融合タンパク質、又はＴＡＬＥＮである、実施形態３６－４４のいずれか一つの融合タンパク質。
５０． 前記ＤＮＡ結合ポリペプチドが、ＲＮＡガイド型ＤＮＡ結合ポリペプチドである、実施形態３６－４４のいずれか一つの融合タンパク質。
５１． 前記ＲＮＡガイド型ＤＮＡ結合ポリペプチドが、ＲＮＡガイド型ヌクレアーゼポリペプチド（ＲＧＮ）である、実施形態５０の融合タンパク質。
５２． 前記ＲＧＮが、ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓポリペプチドである、実施形態５１の融合タンパク質。
５３． 前記ＲＧＮが、Ｖ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓポリペプチドである、実施形態５１の融合タンパク質。
５４． 前記ＲＧＮが、配列番号：４０及び９５－１４２のいずれか一つと少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、実施形態５１の融合タンパク質。
５５． 前記ＲＧＮが、配列番号：４０及び９５－１４２のいずれか一つと少なくとも８５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、実施形態５１の融合タンパク質。
５６． 前記ＲＧＮが、配列番号：４０及び９５－１４２のいずれか一つと少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、実施形態５１の融合タンパク質。
５７． 前記ＲＧＮが、配列番号：４０及び９５－１４２のいずれか一つと少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、実施形態５１の融合タンパク質。
５８． 前記ＲＧＮが、配列番号：４０及び９５－１４２のいずれか一つと１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、実施形態５１の融合タンパク質。
５９． 前記ＲＧＮが、ＲＧＮニッカーゼである、実施形態５１－５８のいずれか一つの融合タンパク質。
６０． 前記融合タンパク質が、ＲＧＮ、シチジンデアミナーゼ、及びＵＳＰを含む、実施形態５１－５９のいずれか一つの融合タンパク質。
６１． 前記融合タンパク質が、配列番号：４０、４１、及び９５－１４２のいずれか一つと少なくとも８０％の配列同一性を有するＲＧＮ、配列番号：４７、４８、及び７６－９４のいずれか一つと少なくとも８０％の配列同一性を有するシチジンデアミナーゼ、並びに配列番号：１－１６のいずれか一つと少なくとも８０％の配列同一性を有するＵＳＰを含む、実施形態６０の融合タンパク質。
６２． 前記融合タンパク質が、配列番号：４０、４１、及び９５－１４２のいずれか一つと少なくとも８５％の配列同一性を有するＲＧＮ、配列番号：４７、４８、及び７６－９４のいずれか一つと少なくとも８５％の配列同一性を有するシチジンデアミナーゼ、並びに配列番号：１－１６のいずれか一つと少なくとも８５％の配列同一性を有するＵＳＰを含む、実施形態６０の融合タンパク質。
６３． 前記融合タンパク質が、配列番号：４０、４１、及び９５－１４２のいずれか一つと少なくとも９０％の配列同一性を有するＲＧＮ、配列番号：４７、４８、及び７６－９４のいずれか一つと少なくとも９０％の配列同一性を有するシチジンデアミナーゼ、並びに配列番号：１－１６のいずれか一つと少なくとも９０％の配列同一性を有するＵＳＰを含む、実施形態６０の融合タンパク質。
６４． 前記融合タンパク質が、配列番号：４０、４１、及び９５－１４２のいずれか一つと少なくとも９５％の配列同一性を有するＲＧＮ、配列番号：４７、４８、及び７６－９４のいずれか一つと少なくとも９５％の配列同一性を有するシチジンデアミナーゼ、並びに配列番号：１－１６のいずれか一つと少なくとも９５％の配列同一性を有するＵＳＰを含む、実施形態６０の融合タンパク質。
６５． 前記融合タンパク質が、配列番号：４０、４１、及び９５－１４２のいずれか一つと１００％の配列同一性を有するＲＧＮ、配列番号：４７、４８、及び７６－９４のいずれか一つと１００％の配列同一性を有するシチジンデアミナーゼ、並びに配列番号：１－１６のいずれか一つと１００％の配列同一性を有するＵＳＰを含む、実施形態６０の融合タンパク質。
６６． 前記融合タンパク質が、少なくとも１つの核局在化シグナル（ＮＬＳ）を更に含む、実施形態３６－６６のいずれかの融合タンパク質。
６７． （ｉ）ＤＮＡ結合ポリペプチド；（ｉｉ）デアミナーゼ；及び、（ｉｉｉ）少なくとも１つのウラシル安定化ポリペプチド（ＵＳＰ）：を含む融合タンパク質をコードしているポリヌクレオチドを含む核酸分子であって、ここでＵＳＰは：
ａ）配列番号：１７－３２のいずれか一つと少なくとも８０％の配列同一性を有するか、
ｂ）配列番号：１７－３２のいずれか一つで表記されるか、
ｃ）配列番号：１－１６と少なくとも８０％同一のアミノ酸配列をコードし、且つ更に配列番号：３３－３９のいずれか一つの配列を有するか、
ｄ）配列番号：１－１６のいずれか一つで表記されるアミノ酸配列と少なくとも８０％同一のアミノ酸配列をコードしているか、又は
ｅ）配列番号：１－１６のいずれか一つで表記されるアミノ酸配列をコードしている：ヌクレオチド配列によりコードされた、核酸分子。
６８． 前記ＵＳＰが：
ａ）配列番号：１７－３２のいずれか一つと少なくとも８５％の配列同一性を有するか、
ｂ）配列番号：１７－３２のいずれか一つで表記されるか、
ｃ）配列番号：１－１６と少なくとも８５％同一のアミノ酸配列をコードし、且つ更に配列番号：３３－３９のいずれか一つの配列を有するか、
ｄ）配列番号：１－１６のいずれか一つで表記されるアミノ酸配列と少なくとも８５％同一のアミノ酸配列をコードしているか、又は
ｅ）配列番号：１－１６のいずれか一つで表記されるアミノ酸配列をコードしている：ヌクレオチド配列によりコードされた、実施形態６７の核酸分子。
６９． 前記ＵＳＰが：
ａ）配列番号：１７－３２のいずれか一つと少なくとも９０％の配列同一性を有するか、
ｂ）配列番号：１７－３２のいずれか一つで表記されるか、
ｃ）配列番号：１－１６と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列をコードし、且つ更に配列番号：３３－３９のいずれか一つの配列を有するか、
ｄ）配列番号：１－１６のいずれか一つで表記されるアミノ酸配列と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列をコードしているか、又は
ｅ）配列番号：１－１６のいずれか一つで表記されるアミノ酸配列をコードしている：ヌクレオチド配列によりコードされた、実施形態６７の核酸分子。
７０． 前記ＵＳＰが：
ａ）配列番号：１７－３２のいずれか一つと少なくとも９５％の配列同一性を有するか、
ｂ）配列番号：１７－３２のいずれか一つで表記されるか、
ｃ）配列番号：１－１６と少なくとも９５％同一のアミノ酸配列をコードし、且つ更に配列番号：３３－３９のいずれか一つの配列を有するか、
ｄ）配列番号：１－１６のいずれか一つで表記されるアミノ酸配列と少なくとも９５％同一のアミノ酸配列をコードしているか、又は
ｅ）配列番号：１－１６のいずれか一つで表記されるアミノ酸配列をコードしている：ヌクレオチド配列によりコードされた、実施形態６７の核酸分子。
７１． 前記ＵＳＰが：
ａ）配列番号：１７－３２のいずれか一つで表記されるか、
ｂ）配列番号：１－１６と１００％同一のアミノ酸配列をコードし、且つ更に配列番号：３３－３９のいずれか一つの配列を有するか、又は
ｃ）配列番号：１－１６のいずれか一つで表記されるアミノ酸配列をコードしている：ヌクレオチド配列によりコードされた、実施形態６７の核酸分子。
７２． 前記デアミナーゼが、シチジンデアミナーゼである、実施形態６７の核酸分子。
７３． 前記シチジンデアミナーゼが、活性化－誘導型シチジンデアミナーゼ（ＡＩＤ）、又はデアミナーゼのアポリポタンパクＢ－ｍＲＮＡ編集複合体（ＡＰＯＢＥＣ）ファミリーの一員である、実施形態７２の核酸分子。
７４． 前記シチジンデアミナーゼが、配列番号：４７、４８及び７６－９４のいずれか一つと少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、実施形態７３の核酸分子。
７５． 前記シチジンデアミナーゼが、配列番号：４７、４８及び７６－９４のいずれか一つと少なくとも８５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、実施形態７３の核酸分子。
７６． 前記シチジンデアミナーゼが、配列番号：４７、４８及び７６－９４のいずれか一つと少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、実施形態７３の核酸分子。
７７． 前記シチジンデアミナーゼが、配列番号：４７、４８及び７６－９４のいずれか一つと少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、実施形態７３の核酸分子。
７８． 前記シチジンデアミナーゼが、配列番号：４７、４８及び７６－９４のいずれか一つと１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、実施形態７３の核酸分子。
７９． 前記ＤＮＡ結合ポリペプチドが、メガヌクレアーゼ、ジンクフィンガー融合タンパク質、又はＴＡＬＥＮである、実施形態６７－７８のいずれか一つの核酸分子。
８０． 前記ＤＮＡ結合ポリペプチドが、ＲＮＡガイド型ＤＮＡ結合ポリペプチドである、実施形態６７－７８のいずれか一つの核酸分子。
８１． 前記ＲＮＡガイド型ＤＮＡ結合ポリペプチドが、ＲＮＡガイド型ヌクレアーゼポリペプチド（ＲＧＮ）である、実施形態８０の核酸分子。
８２． 前記ＲＧＮが、ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓポリペプチドである、実施形態８１の核酸分子。
８３． 前記ＲＧＮが、Ｖ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓポリペプチドである、実施形態８１の核酸分子。
８４． 前記ＲＧＮが、配列番号：４０及び９５－１４２のいずれか一つと少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、実施形態８１の核酸分子。
８５． 前記ＲＧＮが、配列番号：４０及び９５－１４２のいずれか一つと少なくとも８５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、実施形態８１の核酸分子。
８６． 前記ＲＧＮが、配列番号：４０及び９５－１４２のいずれか一つと少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、実施形態８１の核酸分子。
８７． 前記ＲＧＮが、配列番号：４０及び９５－１４２のいずれか一つと少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、実施形態８１の核酸分子。
８８． 前記ＲＧＮが、配列番号：４０及び９５－１４２のいずれか一つと１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、実施形態８１の核酸分子。
８９． 前記ＲＧＮが、ＲＧＮニッカーゼである、実施形態８１－８８のいずれか一つの核酸分子。
９０． 前記融合タンパク質が、ＲＧＮ、シチジンデアミナーゼ、及びＵＳＰを含む、実施形態８１－８９のいずれか一つの核酸分子。
９１． 前記融合タンパク質が、配列番号：４０、４１、及び９５－１４２のいずれか一つと少なくとも８０％の配列同一性を有するＲＧＮ、配列番号：４７、４８、及び７６－９４のいずれか一つと少なくとも８０％の配列同一性を有するシチジンデアミナーゼ、並びに配列番号：１－１６のいずれか一つと少なくとも８０％の配列同一性を有するＵＳＰを含む、実施形態９０の核酸分子。
９２． 前記融合タンパク質が、配列番号：４０、４１、及び９５－１４２のいずれか一つと少なくとも８５％の配列同一性を有するＲＧＮ、配列番号：４７、４８、及び７６－９４のいずれか一つと少なくとも８５％の配列同一性を有するシチジンデアミナーゼ、並びに配列番号：１－１６のいずれか一つと少なくとも８５％の配列同一性を有するＵＳＰを含む、実施形態９０の核酸分子。
９３． 前記融合タンパク質が、配列番号：４０、４１、及び９５－１４２のいずれか一つと少なくとも９０％の配列同一性を有するＲＧＮ、配列番号：４７、４８、及び７６－９４のいずれか一つと少なくとも９０％の配列同一性を有するシチジンデアミナーゼ、並びに配列番号：１－１６のいずれか一つと少なくとも９０％の配列同一性を有するＵＳＰを含む、実施形態９０の核酸分子。
９４． 前記融合タンパク質が、配列番号：４０、４１、及び９５－１４２のいずれか一つと少なくとも９５％の配列同一性を有するＲＧＮ、配列番号：４７、４８、及び７６－９４のいずれか一つと少なくとも９５％の配列同一性を有するシチジンデアミナーゼ、並びに配列番号：１－１６のいずれか一つと少なくとも９５％の配列同一性を有するＵＳＰを含む、実施形態９０の核酸分子。
９５． 前記融合タンパク質が、配列番号：４０、４１、及び９５－１４２のいずれか一つと１００％の配列同一性を有するＲＧＮ、配列番号：４７、４８、及び７６－９４のいずれか一つと１００％の配列同一性を有するシチジンデアミナーゼ、並びに配列番号：１－１６のいずれか一つと１００％の配列同一性を有するＵＳＰを含む、実施形態９０の核酸分子。
９６． 前記融合タンパク質をコードしているポリヌクレオチドが、その５’末端で、異種プロモーターに機能的に連結される、実施形態６７－９５のいずれかの核酸分子。
９７． 前記融合タンパク質をコードしているポリヌクレオチドが、その３’末端で、異種ターミネーターへ機能的に連結される、実施形態６７－９５のいずれかの核酸分子。
９８． 前記融合タンパク質が、１又は複数の核局在化シグナルを含む、実施形態６７－９７のいずれかの核酸分子。
９９． 前記融合タンパク質が、真核細胞における発現のために最適化されたコドンである、実施形態６７－９８のいずれかの核酸分子。
１００． 前記融合タンパク質が、原核細胞における発現のために最適化されたコドンである、実施形態６７－９９のいずれかの核酸分子。
１０１． 実施形態６７－１００のいずれか一つの核酸分子を含む、ベクター。
１０２． 標的配列にハイブリダイズすることが可能であるガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）をコードしている少なくとも１つのヌクレオチド配列を更に含む、実施形態８１－９５のいずれか一つの核酸分子を含むベクター。
１０３． 前記ｇＲＮＡが、シングルガイドＲＮＡである、実施形態１０２のベクター。
１０４． 前記ｇＲＮＡが、デュアルガイドＲＮＡである、実施形態１０２のベクター。
１０５． 実施形態３６－６６のいずれかの融合タンパク質を含む、細胞。
１０６． 前記細胞が、ガイドＲＮＡを更に含む、実施形態５１－６６のいずれか一つの融合タンパク質を含む、細胞。
１０７． 実施形態６７－１００のいずれかの核酸分子を含む、細胞。
１０８． 実施形態１０１～１０４のいずれかのベクターを含む、細胞。
１０９． 前記細胞が、原核細胞である、実施形態１０５－１０８のいずれか一つの細胞。
１１０． 前記細胞が、真核細胞である、実施形態１０５－１０８のいずれか一つの細胞。
１１１． 前記細胞が、昆虫、鳥類、又は哺乳動物の細胞である、実施形態１１０の細胞。
１１２． 前記細胞が、植物又は真菌の細胞である、実施形態１１０の細胞。
１１３． 医薬として許容し得る担体、並びに、実施形態１９－２４及び６７－１００のいずれか一つの核酸分子、実施形態２５－３５のいずれか一つの組成物、実施形態３６－６６のいずれか一つの融合タンパク質、実施形態１０１－１０４のいずれか一つのベクター、又は実施形態１０５－１１１のいずれか一つの細胞を含有する、医薬組成物。
１１４． 実施形態１０５－１１２のいずれか一つの細胞を、融合タンパク質が発現される条件下で培養することを含む、融合タンパク質の製造方法。
１１５． 実施形態６７－１００のいずれかの核酸分子、又は実施形態１０１－１０４のいずれか一つのベクターを、細胞へ導入し、並びにこの細胞を、融合タンパク質が発現される条件下で培養することを含む、融合タンパク質の製造方法。
１１６． 該融合タンパク質を精製することを更に含む、実施形態１１４又は１１５の方法。
１１７． 実施形態８１－９５のいずれか一つの核酸分子、及びガイドＲＮＡをコードしている発現カセットを含む核酸分子、又は実施形態１０２－１０４のいずれかのベクターを、細胞に導入し、並びに融合タンパク質及びｇＲＮＡが発現され、且つＲＧＮ融合リボ核タンパク質複合体を形成する条件下で、細胞を培養することを含む、ＲＧＮ融合リボ核タンパク質複合体の製造方法。
１１８． 該ＲＧＮ融合リボ核タンパク質複合体を精製することを更に含む、実施形態１１７の方法。
１１９． 標的ＤＮＡ配列を含む標的ＤＮＡ分子を改変するシステムであって、該システムが：
ａ）ＲＮＡガイド型ヌクレアーゼポリペプチド（ＲＧＮ）、シチジンデアミナーゼ、及び少なくとも１つのウラシル安定化ポリペプチド（ＵＳＰ）を含む融合タンパク質であって、ここでＵＳＰが、配列番号：１－１６のいずれか一つと少なくとも８０％同一である融合タンパク質か、又は該融合タンパク質をコードしているヌクレオチド配列；並びに
ｂ）該標的ＤＮＡ配列にハイブリダイズすることが可能な１又は複数のガイドＲＮＡ、もしくは１又は複数のガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）をコードしている１又は複数のヌクレオチド配列；を含み、
ここで１又は複数のガイドＲＮＡをコードしている及び融合タンパク質をコードしている該ヌクレオチド配列は、各々、該ヌクレオチド配列に対し異種のプロモーターへ機能的に連結され；並びに
ここで１又は複数のガイドＲＮＡは、該標的ＤＮＡ配列に結合し且つ標的ＤＮＡ分子を改変するよう該融合タンパク質に指示するために、融合タンパク質と複合体を形成することが可能である、システム。
１２０． 前記ＵＳＰが、配列番号：１－１６のいずれか一つと少なくとも８５％同一である、実施形態１１９のシステム。
１２１． 前記ＵＳＰが、配列番号：１－１６のいずれか一つと少なくとも９０％同一である、実施形態１１９のシステム。
１２２． 前記ＵＳＰが、配列番号：１－１６のいずれか一つと少なくとも９５％同一である、実施形態１１９のシステム。
１２３． 前記ＵＳＰが、配列番号：１－１６のいずれか一つと１００％同一である、実施形態１１９のシステム。
１２４． 前記ＵＳＰが、配列番号：３３－３９のいずれか一つで表記される配列を含む、実施形態１１９のシステム。
１２５． 前記標的ＤＮＡ配列が、ＲＧＮにより認識されるプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）に隣接して配置される、実施形態１１９－１２４のいずれか一つのシステム。
１２６． 前記標的ＤＮＡ分子が、細胞内にある、実施形態１１９－１２５のいずれか一つのシステム。
１２７． 前記細胞が、真核細胞である、実施形態１２６のシステム。
１２８． 前記真核細胞が、植物細胞である、実施形態１２７のシステム。
１２９． 前記真核細胞が、哺乳動物細胞である、実施形態１２７のシステム。
１３０． 前記真核細胞が、昆虫細胞である、実施形態１２７のシステム。
１３１． 前記細胞が、原核細胞である、実施形態１２６のシステム。
１３２． 前記融合タンパク質のＲＧＮが、ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓポリペプチドである、実施形態１１９－１３１のいずれか一つのシステム。
１３３． 前記融合タンパク質のＲＧＮが、Ｖ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓポリペプチドである、実施形態１１９－１３１のいずれか一つのシステム。
１３４． 前記融合タンパク質のＲＧＮが、配列番号：４０及び９５－１４２のいずれか一つと少なくとも８０％同一である、実施形態１１９－１３１のいずれか一つのシステム。
１３５． 前記融合タンパク質のＲＧＮが、配列番号：４０及び９５－１４２のいずれか一つと少なくとも８５％同一である、実施形態１１９－１３１のいずれか一つのシステム。
１３６． 前記融合タンパク質のＲＧＮが、配列番号：４０及び９５－１４２のいずれか一つと少なくとも９０％同一である、実施形態１１９－１３１のいずれか一つのシステム。
１３７． 前記融合タンパク質のＲＧＮが、配列番号：４０及び９５－１４２のいずれか一つと少なくとも９５％同一である、実施形態１１９－１３１のいずれか一つのシステム。
１３８． 前記融合タンパク質のＲＧＮが、配列番号：４０及び９５－１４２のいずれか一つと１００％同一である、実施形態１１９－１３１のいずれか一つのシステム。
１３９． 前記融合タンパク質のＲＧＮが、ＲＧＮニッカーゼである、実施形態１１９－１３８のいずれか一つのシステム。
１４０． 前記シチジンデアミナーゼが、配列番号：４７、４８及び７６－９４のいずれか一つと少なくとも８０％同一である、実施形態１１９－１３９のいずれかのシステム。
１４１． 前記シチジンデアミナーゼが、配列番号：４７、４８及び７６－９４のいずれか一つと少なくとも８５％同一である、実施形態１１９－１３９のいずれかのシステム。
１４２． 前記シチジンデアミナーゼが、配列番号：４７、４８及び７６－９４のいずれか一つと少なくとも９０％同一である、実施形態１１９－１３９のいずれかのシステム。
１４３． 前記シチジンデアミナーゼが、配列番号：４７、４８及び７６－９４のいずれか一つと少なくとも９５％同一である、実施形態１１９－１３９のいずれかのシステム。
１４４． 前記シチジンデアミナーゼが、配列番号：４７、４８及び７６－９４のいずれか一つと１００％同一である、実施形態１１９－１３９のいずれかのシステム。
１４５． 前記融合タンパク質が、配列番号：４０、４１、及び９５－１４２のいずれか一つと少なくとも８０％の配列同一性を有するＲＧＮ、配列番号：４７、４８、及び７６－９４のいずれか一つと少なくとも８０％の配列同一性を有するシチジンデアミナーゼ、並びに配列番号：１－１６のいずれか一つと少なくとも８０％の配列同一性を有するＵＳＰを含む、実施形態１１９－１４４のいずれかのシステム。
１４６． 前記融合タンパク質が、配列番号：４０、４１、及び９５－１４２のいずれか一つと少なくとも８５％の配列同一性を有するＲＧＮ、配列番号：４７、４８、及び７６－９４のいずれか一つと少なくとも８５％の配列同一性を有するシチジンデアミナーゼ、並びに配列番号：１－１６のいずれか一つと少なくとも８５％の配列同一性を有するＵＳＰを含む、実施形態１１９－１４４のいずれかのシステム。
１４７． 前記融合タンパク質が、配列番号：４０、４１、及び９５－１４２のいずれか一つと少なくとも９０％の配列同一性を有するＲＧＮ、配列番号：４７、４８、及び７６－９４のいずれか一つと少なくとも９０％の配列同一性を有するシチジンデアミナーゼ、並びに配列番号：１－１６のいずれか一つと少なくとも９０％の配列同一性を有するＵＳＰを含む、実施形態１１９－１４４のいずれかのシステム。
１４８． 前記融合タンパク質が、配列番号：４０、４１、及び９５－１４２のいずれか一つと少なくとも９５％の配列同一性を有するＲＧＮ、配列番号：４７、４８、及び７６－９４のいずれか一つと少なくとも９５％の配列同一性を有するシチジンデアミナーゼ、並びに配列番号：１－１６のいずれか一つと少なくとも９５％の配列同一性を有するＵＳＰを含む、実施形態１１９－１４４のいずれかのシステム。
１４９． 前記融合タンパク質が、配列番号：４０、４１、及び９５－１４２のいずれか一つと１００％の配列同一性を有するＲＧＮ、配列番号：４７、４８、及び７６－９４のいずれか一つと１００％の配列同一性を有するシチジンデアミナーゼ、並びに配列番号：１－１６のいずれか一つと１００％の配列同一性を有するＵＳＰを含む、実施形態１１９－１４４のいずれかのシステム。
１５０． 前記融合タンパク質が、１又は複数の核局在化シグナルを含む、実施形態１１９－１４９のいずれかのシステム。
１５１． 前記融合タンパク質が、真核細胞における発現のために最適化されたコドンである、実施形態１１９－１５０のいずれかのシステム。
１５２． １又は複数のガイドＲＮＡをコードしているヌクレオチド配列及び融合タンパク質をコードしているヌクレオチド配列が、１つのベクター上に配置される、実施形態１１９－１５１のいずれかのシステム。
１５３． 前記方法が、実施形態１１９－１５２のいずれか一つのシステムを、該標的ＤＮＡ分子又は標的ＤＮＡ分子を含む細胞へ、送達することを含む、標的ＤＮＡ配列を含む標的ＤＮＡ分子を改変する方法。
１５４． 前記改変された標的ＤＮＡ分子が、標的ＤＮＡ分子内の少なくとも１個のヌクレオチドのＣ＞Ｔ変異を含む、実施形態１５３の方法。
１５５． 前記改変された標的ＤＮＡ分子が、標的ＤＮＡ配列内の少なくとも１個のヌクレオチドのＣ＞Ｔ変異を含む、実施形態１５３の方法。
１５６． 標的配列を含む標的ＤＮＡ分子を改変する方法であって：
ａ）ＲＧＮ－デアミナーゼ－ＵＳＰリボヌクレオチド複合体の形成に適した条件下で；
ｉ）標的ＤＮＡ配列にハイブリダイズすることが可能である、１又は複数のガイドＲＮＡ；並びに
ｉｉ）ＲＮＡガイド型ヌクレアーゼポリペプチド（ＲＧＮ）、シチジンデアミナーゼ、及び少なくとも１つのウラシル安定化ポリペプチド（ＵＳＰ）を含む、融合タンパク質であって、ここでＵＳＰは、配列番号：１－１６のいずれか一つと少なくとも８０％同一である融合タンパク質：を組合せることにより、ＲＧＮ－デアミナーゼ－ＵＳＰリボヌクレオチド複合体をインビトロにおいて集成すること；並びに、
ｂ）該標的ＤＮＡ分子又は該標的ＤＮＡ分子を含む細胞を、インビトロにおいて－集成されたＲＧＮ－デアミナーゼ－ＵＳＰリボヌクレオチド複合体と接触させること；を含み、
ここで１又は複数のガイドＲＮＡは、標的ＤＮＡ配列にハイブリダイズし、これにより該融合タンパク質は、該標的ＤＮＡ配列に結合し、且つ標的ＤＮＡ分子の改変が生じるように指示される、方法。
１５７． 前記ＵＳＰが、配列番号：１－１６のいずれか一つと少なくとも８５％同一である、実施形態１５６の方法。
１５８． 前記ＵＳＰが、配列番号：１－１６のいずれか一つと少なくとも９０％同一である、実施形態１５６の方法。
１５９． 前記ＵＳＰが、配列番号：１－１６のいずれか一つと少なくとも９５％同一である、実施形態１５６の方法。
１６０． 前記ＵＳＰが、配列番号：１－１６のいずれか一つと１００％同一である、実施形態１５６の方法。
１６１． 前記ＵＳＰが、配列番号：３３－３９のいずれか一つの配列を含む、実施形態１５６の方法。
１６２． 前記改変された標的ＤＮＡ分子が、標的ＤＮＡ分子内に少なくとも１個のヌクレオチドのＣ＞Ｔ変異を含む、実施形態１５６－１６１のいずれか一つの方法。
１６３． 前記改変された標的ＤＮＡ分子が、標的ＤＮＡ配列内に少なくとも１個のヌクレオチドのＣ＞Ｔ変異を含む、実施形態１５６－１６１のいずれか一つの方法。
１６４． 前記融合タンパク質のＲＧＮが、ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓポリペプチドである、実施形態１５６－１６３のいずれか一つの方法。
１６５． 前記融合タンパク質のＲＧＮが、Ｖ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓポリペプチドである、実施形態１５６－１６３のいずれか一つの方法。
１６６． 前記融合タンパク質のＲＧＮが、配列番号：４０及び９５－１４２のいずれか一つと少なくとも８０％同一である、実施形態１５６－１６３のいずれかの方法。
１６７． 前記融合タンパク質のＲＧＮが、配列番号：４０及び９５－１４２のいずれか一つと少なくとも８５％同一である、実施形態１５６－１６３のいずれかの方法。
１６８． 前記融合タンパク質のＲＧＮが、配列番号：４０及び９５－１４２のいずれか一つと少なくとも９０％同一である、実施形態１５６－１６３のいずれかの方法。
１６９． 前記融合タンパク質のＲＧＮが、配列番号：４０及び９５－１４２のいずれか一つと少なくとも９５％同一である、実施形態１５６－１６３のいずれかの方法。
１７０． 前記融合タンパク質のＲＧＮが、配列番号：４０及び９５－１４２のいずれか一つと１００％同一である、実施形態１５６－１６３のいずれかの方法。
１７１． 前記融合タンパク質のＲＧＮが、ＲＧＮニッカーゼである、実施形態１５６－１７０のいずれかの方法。
１７２． 前記シチジンデアミナーゼが、配列番号：４７、４８及び７６－９４のいずれか一つと少なくとも８０％同一である、実施形態１５６－１７１のいずれかの方法。
１７３． 前記シチジンデアミナーゼが、配列番号：４７、４８及び７６－９４のいずれか一つと少なくとも８５％同一である、実施形態１５６－１７１のいずれかの方法。
１７４． 前記シチジンデアミナーゼが、配列番号：４７、４８及び７６－９４のいずれか一つと少なくとも９０％同一である、実施形態１５６－１７１のいずれかの方法。
１７５． 前記シチジンデアミナーゼが、配列番号：４７、４８及び７６－９４のいずれか一つと少なくとも９５％同一である、実施形態１５６－１７１のいずれかの方法。
１７６． 前記シチジンデアミナーゼが、配列番号：４７、４８及び７６－９４のいずれか一つと１００％同一である、実施形態１５６－１７１のいずれかの方法。
１７７． 前記融合タンパク質が、配列番号：４０、４１、及び９５－１４２のいずれか一つと少なくとも８０％の配列同一性を有するＲＧＮ、配列番号：４７、４８、及び７６－９４のいずれか一つと少なくとも８０％の配列同一性を有するシチジンデアミナーゼ、及び配列番号：１－１６のいずれか一つと少なくとも８０％の配列同一性を有するＵＳＰを含む、実施形態１５６－１７６のいずれか一つの方法。
１７８． 前記融合タンパク質が、配列番号：４０、４１、及び９５－１４２のいずれか一つと少なくとも８５％の配列同一性を有するＲＧＮ、配列番号：４７、４８、及び７６－９４のいずれか一つと少なくとも８５％の配列同一性を有するシチジンデアミナーゼ、及び配列番号：１－１６のいずれか一つと少なくとも８５％の配列同一性を有するＵＳＰを含む、実施形態１５６－１７６のいずれか一つの方法。
１７９． 前記融合タンパク質が、配列番号：４０、４１、及び９５－１４２のいずれか一つと少なくとも９０％の配列同一性を有するＲＧＮ、配列番号：４７、４８、及び７６－９４のいずれか一つと少なくとも９０％の配列同一性を有するシチジンデアミナーゼ、及び配列番号：１－１６のいずれか一つと少なくとも９０％の配列同一性を有するＵＳＰを含む、実施形態１５６－１７６のいずれか一つの方法。
１８０． 前記融合タンパク質が、配列番号：４０、４１、及び９５－１４２のいずれか一つと少なくとも９５％の配列同一性を有するＲＧＮ、配列番号：４７、４８、及び７６－９４のいずれか一つと少なくとも９５％の配列同一性を有するシチジンデアミナーゼ、及び配列番号：１－１６のいずれか一つと少なくとも９５％の配列同一性を有するＵＳＰを含む、実施形態１５６－１７６のいずれか一つの方法。
１８１． 前記融合タンパク質が、配列番号：４０、４１、及び９５－１４２のいずれか一つと１００％の配列同一性を有するＲＧＮ、配列番号：４７、４８、及び７６－９４のいずれか一つと１００％の配列同一性を有するシチジンデアミナーゼ、及び配列番号：１－１６のいずれか一つと１００％の配列同一性を有するＵＳＰを含む、実施形態１５６－１７６のいずれか一つの方法。
１８２． 前記融合タンパク質が、１又は複数の核局在化シグナルを含む、実施形態１５６－１８１のいずれかの方法。
１８３． 前記融合タンパク質が、真核細胞における発現のために最適化されたコドンである、実施形態１５６－１８２のいずれかの方法。
１８４． 前記標的ＤＮＡ配列が、プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）に隣接して配置される、実施形態１５６－１８３のいずれかの方法。
１８５． 前記標的ＤＮＡ分子が、細胞内にある、実施形態１５６－１８４のいずれかの方法。
１８６． 前記細胞が、真核細胞である、実施形態１８５の方法。
１８７． 前記真核細胞が、植物細胞である、実施形態１８６の方法。
１８８． 前記真核細胞が、哺乳動物細胞である、実施形態１８６の方法。
１８９． 前記真核細胞が、昆虫細胞である、実施形態１８６の方法。
１９０． 前記細胞が、原核細胞である、実施形態１８５の方法。
１９１． 更に該改変されたＤＮＡ分子を含む細胞を選択することを含む、実施形態１８５－１９０のいずれか一つの方法。
１９２． 実施形態１９１の方法に従い改変された標的ＤＮＡ配列を含む細胞。
１９３． 前記細胞が、真核細胞である、実施形態１９２の細胞。
１９４． 前記真核細胞が、植物細胞である、実施形態１９３の細胞。
１９５． 実施形態１９４の細胞を含む、植物。
１９６． 実施形態１９４の細胞を含む、種子。
１９７． 前記真核細胞が、哺乳動物細胞である、実施形態１９３の細胞。
１９８． 前記真核細胞が、昆虫細胞である、実施形態１９３の細胞。
１９９． 前記細胞が、原核細胞である、実施形態１９２の細胞。
２００． 遺伝性疾患に因果関係のある変異の補正により、遺伝子改変された細胞を作製する方法であって、この方法が：
ａ）ＲＮＡガイド型ヌクレアーゼポリペプチド（ＲＧＮ）、シチジンデアミナーゼ、及び少なくとも１つのウラシル安定化ポリペプチド（ＵＳＰ）を含む融合タンパク質であって、ここでＵＳＰは、配列番号：１－１６のいずれか一つと少なくとも８０％同一である融合タンパク質、又は該融合タンパク質をコードしているポリヌクレオチドであって、ここで融合タンパク質をコードしている該ポリヌクレオチドは、細胞における融合タンパク質の発現を可能にするため、プロモーターへ機能的に連結されているもの；並びに
ｂ）標的ＤＮＡ配列にハイブリダイズすることが可能である１又は複数のガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）、又は該ｇＲＮＡをコードしているポリヌクレオチドであって、ここでｇＲＮＡをコードしている該ポリヌクレオチドは、細胞におけるｇＲＮＡの発現を可能にするため、プロモーターへ機能的に連結されているもの；を、細胞へ導入することを含み、
これにより、融合タンパク質及びｇＲＮＡは、因果関係のある変異のゲノム位置を標的化し、且つゲノム配列を因果関係のある変異を除去するように改変する、方法。
２０１． 前記ＵＳＰが、配列番号：１－１６のいずれか一つと少なくとも８５％同一である、実施形態２００の方法。
２０２． 前記ＵＳＰが、配列番号：１－１６のいずれか一つと少なくとも９０％同一である、実施形態２００の方法。
２０３． 前記ＵＳＰが、配列番号：１－１６のいずれか一つと少なくとも９５％同一である、実施形態２００の方法。
２０４． 前記ＵＳＰが、配列番号：１－１６のいずれか一つと１００％同一である、実施形態２００の方法。
２０５． 前記融合タンパク質のＲＧＮが、ニッカーゼである、実施形態２００の方法。
２０６． 前記ＵＳＰが、配列番号：３３－３９のいずれか一つの配列を含む、実施形態２００又は２０５の方法。
２０７． 前記ゲノム改変が、標的ＤＮＡ配列内に少なくとも１個のヌクレオチドのＣ＞Ｔ変異を導入することを含む、実施形態２００－２０６のいずれかの方法。
２０８． 前記細胞が、動物細胞である、実施形態２００－２０７のいずれかの方法。
２０９． 前記動物細胞が、哺乳動物細胞である、実施形態２０８の方法。
２１０． 前記細胞が、イヌ、ネコ、マウス、ラット、ウサギ、ウマ、ヒツジ、ヤギ、ウシ、ブタ、又はヒトに由来する、実施形態２０９の方法。
２１１． 前述の因果関係のある変異の補正が、停止コドンを導入することを含む、実施形態２００－２１０のいずれかの方法。
２１２． ａ）（ｉ）ＤＮＡ結合ポリペプチド、及び（ｉｉ）デアミナーゼを含有する融合タンパク質；又は、この融合タンパク質をコードしている核酸分子；並びに
ｂ）配列番号：１－１６のいずれか一つと少なくとも８０％の配列同一性を有するウラシル安定化ポリペプチド（ＵＳＰ）；又は、このＵＳＰをコードしている核酸分子：を含有する、組成物。
２１３． 前記ＵＳＰが、配列番号：１－１６のいずれか一つと少なくとも８５％の配列同一性を有する、実施形態２１２の組成物。
２１４． 前記ＵＳＰが、配列番号：１－１６のいずれか一つと少なくとも９０％の配列同一性を有する、実施形態２１２の組成物。
２１５． 前記ＵＳＰが、配列番号：１－１６のいずれか一つと少なくとも９５％の配列同一性を有する、実施形態２１２の組成物。
２１６． 前記ＵＳＰが、配列番号：１－１６のいずれか一つと１００％の配列同一性を有する、実施形態２１２の組成物。
２１７． 前記融合タンパク質が、配列番号：１－１６のいずれか一つと少なくとも８０％の配列同一性を有するウラシル安定化ポリペプチド（ＵＳＰ）を更に含む、実施形態２１２の組成物。
２１８． 前記融合タンパク質が、配列番号：１－１６のいずれか一つと少なくとも８５％の配列同一性を有するウラシル安定化ポリペプチド（ＵＳＰ）を更に含む、実施形態２１２の組成物。
２１９． 前記融合タンパク質が、配列番号：１－１６のいずれか一つと少なくとも９０％の配列同一性を有するウラシル安定化ポリペプチド（ＵＳＰ）を更に含む、実施形態２１２の組成物。
２２０． 前記融合タンパク質が、配列番号：１－１６のいずれか一つと少なくとも９５％の配列同一性を有するウラシル安定化ポリペプチド（ＵＳＰ）を更に含む、実施形態２１２の組成物。
２２１． 前記融合タンパク質が、配列番号：１－１６のいずれか一つと１００％の配列同一性を有するウラシル安定化ポリペプチド（ＵＳＰ）を更に含む、実施形態２１２の組成物。
２２２． 前記ＤＮＡ結合ポリペプチドが、メガヌクレアーゼ、ジンクフィンガー融合タンパク質、又はＴＡＬＥＮである、実施形態２１２の組成物。
２２３． 前記ＤＮＡ結合ポリペプチドが、ＲＮＡガイド型ＤＮＡ結合ポリペプチドである、実施形態２１２の組成物。
２２４． 前記ＲＮＡガイド型ＤＮＡ結合ポリペプチドが、ＲＮＡガイド型ヌクレアーゼポリペプチド（ＲＧＮ）である、実施形態２２３の組成物。
２２５． 前記ＲＧＮが、ＲＧＮニッカーゼである、実施形態２２４の組成物。
２２６． 融合タンパク質をコードしている核酸分子及びウラシル安定化ポリペプチド（ＵＳＰ）をコードしている核酸分子を含むベクターであって、ここで該融合タンパク質が、ＤＮＡ結合ポリペプチド及びデアミナーゼを含み、並びにここで該ＵＳＰが、配列番号：１－１６のいずれか一つと少なくとも８０％の配列同一性を有する、ベクター。
２２７． 前記ＵＳＰが、配列番号：１－１６のいずれか一つと少なくとも８５％の配列同一性を有する、実施形態２２６のベクター。
２２８． 前記ＵＳＰが、配列番号：１－１６のいずれか一つと少なくとも９０％の配列同一性を有する、実施形態２２６のベクター。
２２９． 前記ＵＳＰが、配列番号：１－１６のいずれか一つと少なくとも９５％の配列同一性を有する、実施形態２２６のベクター。
２３０． 前記ＵＳＰが、配列番号：１－１６のいずれか一つと１００％の配列同一性を有する、実施形態２２６のベクター。
２３１． 前記融合タンパク質が、配列番号：１－１６のいずれか一つと少なくとも８０％の配列同一性を有するウラシル安定化ポリペプチド（ＵＳＰ）を更に含む、実施形態２２６のベクター。
２３２． 前記融合タンパク質が、配列番号：１－１６のいずれか一つと少なくとも８５％の配列同一性を有するウラシル安定化ポリペプチド（ＵＳＰ）を更に含む、実施形態２２６のベクター。
２３３． 前記融合タンパク質が、配列番号：１－１６のいずれか一つと少なくとも９０％の配列同一性を有するウラシル安定化ポリペプチド（ＵＳＰ）を更に含む、実施形態２２６のベクター。
２３４． 前記融合タンパク質が、配列番号：１－１６のいずれか一つと少なくとも９５％の配列同一性を有するウラシル安定化ポリペプチド（ＵＳＰ）を更に含む、実施形態２２６のベクター。
２３５． 前記融合タンパク質が、配列番号：１－１６のいずれか一つと１００％の配列同一性を有するウラシル安定化ポリペプチド（ＵＳＰ）を更に含む、実施形態２２６のベクター。
２３６． 前記ＤＮＡ結合ポリペプチドが、メガヌクレアーゼ、ジンクフィンガー融合タンパク質、又はＴＡＬＥＮである、実施形態２２６のベクター。
２３７． 前記ＤＮＡ結合ポリペプチドが、ＲＮＡガイド型ＤＮＡ結合ポリペプチドである、実施形態２２６のベクター。
２３８． 前記ＲＮＡガイド型ＤＮＡ結合ポリペプチドが、ＲＮＡガイド型ヌクレアーゼポリペプチド（ＲＧＮ）である、実施形態２３７のベクター。
２３９． 前記ＲＧＮが、ＲＧＮニッカーゼである、実施形態２３８のベクター。
２４０． 実施形態２２６－２３９のいずれか一つのベクターを含む細胞。．
２４１． ａ）（ｉ）ＤＮＡ結合ポリペプチド、及び（ｉｉ）デアミナーゼを含有する融合タンパク質；又は、この融合タンパク質をコードしている核酸分子；並びに
ｂ）配列番号：１－１６のいずれか一つと少なくとも８０％の配列同一性を有するウラシル安定化ポリペプチド（ＵＳＰ）；又は、このＵＳＰをコードしている核酸分子：を含む、細胞。
２４２． 前記ＵＳＰが、配列番号：１－１６のいずれか一つと少なくとも８５％の配列同一性を有する、実施形態２４１の細胞。
２４３． 前記ＵＳＰが、配列番号：１－１６のいずれか一つと少なくとも９０％の配列同一性を有する、実施形態２４１の細胞。
２４４． 前記ＵＳＰが、配列番号：１－１６のいずれか一つと少なくとも９５％の配列同一性を有する、実施形態２４１の細胞。
２４５． 前記ＵＳＰが、配列番号：１－１６のいずれか一つと１００％の配列同一性を有する、実施形態２４１の細胞。
２４６． 前記融合タンパク質が、配列番号：１－１６のいずれか一つと少なくとも８０％の配列同一性を有するウラシル安定化ポリペプチド（ＵＳＰ）を更に含む、実施形態２４１の細胞。
２４７． 前記融合タンパク質が、配列番号：１－１６のいずれか一つと少なくとも８５％の配列同一性を有するウラシル安定化ポリペプチド（ＵＳＰ）を更に含む、実施形態２４１の細胞。
２４８． 前記融合タンパク質が、配列番号：１－１６のいずれか一つと少なくとも９０％の配列同一性を有するウラシル安定化ポリペプチド（ＵＳＰ）を更に含む、実施形態２４１の細胞。
２４９． 前記融合タンパク質が、配列番号：１－１６のいずれか一つと少なくとも９５％の配列同一性を有するウラシル安定化ポリペプチド（ＵＳＰ）を更に含む、実施形態２４１の細胞。
２５０． 前記融合タンパク質が、配列番号：１－１６のいずれか一つと１００％の配列同一性を有するウラシル安定化ポリペプチド（ＵＳＰ）を更に含む、実施形態２４１の細胞。
２５１． 前記ＤＮＡ結合ポリペプチドが、メガヌクレアーゼ、ジンクフィンガー融合タンパク質、又はＴＡＬＥＮである、実施形態２４１の細胞。
２５２． 前記ＤＮＡ結合ポリペプチドが、ＲＮＡガイド型ＤＮＡ結合ポリペプチドである、実施形態２４１の細胞。
２５３． 前記ＲＮＡガイド型ＤＮＡ結合ポリペプチドが、ＲＮＡガイド型ヌクレアーゼポリペプチド（ＲＧＮ）である、実施形態２５２の細胞。
２５４． 前記ＲＧＮが、ＲＧＮニッカーゼである、実施形態２５３の細胞。
以下の実施例は、例証を目的として供され、限定を目的としていない。
実験
実施例１：ウラシル安定化ポリペプチド
本発明のウラシル安定化ポリペプチド（ＵＳＰ）のアミノ酸配列は、表１に示したように、配列番号：１－１６として提供される。明らかにされた全てのＵＳＰは、ブドウ球菌種に由来し、且つ長さが１１２～１１６個のアミノ酸の範囲である。本明細書において説明されたＵＳＰのポリペプチドは、１６．４％～２０．７％負帯電を有し、推定ｐＩは３．８６～４．５５であるが、ただＡＰＧ０５９６３に関する推定ｐＩの５．２６を除く。
ＵＳＰであるＡＰＧ０６３５１、ＡＰＧ０３３９９、ＡＰＧ０４６３８、ＡＰＧ０９２４２、ＡＰＧ０２４６３、ＡＰＧ０４０８０、ＡＰＧ０１７９１、ＡＰＧ０４００１、及びＡＰＧ０３３２７は、独特なコンセンサスＣ－末端配列“ＫＥＧＧＮＤＨＥ”（配列番号：３３）を共有している。ＵＳＰであるＡＰＧ０５１９８及びＡＰＧ０５７５６は、独特なＣ－末端配列“ＥＫＥＮＹＮＮＥ”（配列番号：３４）を共有している。ＡＰＧ０５９６３は、独特なＣ－末端配列“ＥＫＥＫＨＫＮＥ”（配列番号：３５）を持ち；ＡＰＧ０６７０２は、独特なＣ－末端配列“ＤＫＧＤＤＮＨＤ”（配列番号：３６）を持ち；ＡＰＧ０５３１６は、独特なＣ－末端配列“ＱＫＧＧＱ”（配列番号：３７）を持ち；ＡＰＧ０９２３０は、独特なＣ－末端配列“ＫＧＥＮＫＹＥ”（配列番号：３８）を持ち；及び、ＡＰＧ０４１００は、独特なＣ－末端配列“ＫＱＧＥＮＮＨＥ”（配列番号：３９）を持つ。
Figure 2023534693000001
実施例２：哺乳動物細胞において増大した塩基編集活性を示すＵＳＰ融合タンパク質
ＲＧＮ ＡＰＧ０７４３３．１（配列番号：４０；ＰＣＴ公報WO2019/236566、これは引用により本明細書中に組み込まれている）のＲｕｖＣドメインを非活性化すると推定された残基を確定し、且つこのＲＧＮを、ニッカーゼバリアント（ｎＡＰＧ０７４３３．１；配列番号：４１）へ改変した。シチジンデアミナーゼを含む融合タンパク質、すなわちＡＰＧ０９９８０（配列番号：４７；PCT/US2019/068079参照、これは引用により本明細書中に組み込まれている)又はＡＰＧ０７３８６ＣＴＤ（配列番号：４８；PCT/US2019/068079参照)を、作製した。表１のＵＳＰの中の３種、すなわちＡＰＧ０３３９９、ＡＰＧ０６７０２、及びＡＰＧ０５１９８を、融合タンパク質における活性についてアッセイするために選択した。発現のために最適化されたコドンのデアミナーゼ、ＵＳＰ、及びｎＲＧＮのヌクレオチド配列を、Ｎ－末端に核局在化タグを伴う融合タンパク質として合成し、且つpTwist CMV(Twist Biosciences)発現プラスミドへクローニングした。本発明のＵＳＰを欠く融合タンパク質は、アミノ末端から始まり、ＳＶ４０ ＮＬＳ（配列番号：４２）、これはＣ－末端で３ＸＦＬＡＧタグ（配列番号：４３）へ機能的に連結され、Ｃ－末端でデアミナーゼへ機能的に連結され、Ｃ－末端でペプチドリンカー（配列番号：４４）へ機能的に連結され、Ｃ－末端でｎＲＧＮ（例えばｎＡＰＧ０７４３３．１、これは配列番号：４１）へ機能的に連結され、最後にＣ－末端でヌクレオプラスミンＮＬＳ（配列番号：４５）へ機能的に連結されている。本発明のＵＳＰを含む融合タンパク質は、アミノ末端から始まり、ＳＶ４０ ＮＬＳ（配列番号：４２）、これはＣ－末端で３ＸＦＬＡＧタグ（配列番号：４３）へ機能的に連結され、Ｃ－末端でデアミナーゼへ機能的に連結され、Ｃ－末端でペプチドリンカー（配列番号：４４）へ機能的に連結され、Ｃ－末端でｎＲＧＮ（例えば配列番号：４１）へ機能的に連結され、Ｃ－末端で第二のリンカー配列（配列番号：４６）へ機能的に連結され、Ｃ－末端で本発明のＵＳＰへ機能的に連結され、最後にＣ－末端でヌクレオプラスミンＮＬＳ（配列番号：４５）へ機能的に連結されている。表２は、作製され且つ活性について試験された融合タンパク質を示す。全ての融合タンパク質は、先に説明されたように、少なくとも１個のＮＬＳ及び３ＸＦＬＡＧタグを含む。
Figure 2023534693000002
ｓｇＲＮＡをコードしている発現カセットを含む発現プラスミドも、作製した。ヒトゲノム標的配列及びこの融合タンパク質をゲノム標的へガイドするためのｓｇＲＮＡ配列を、表３に示している。各標的配列のゲノム座位も、示している。
Figure 2023534693000003
表２に示した融合タンパク質のコード配列を含む発現カセットを含むプラスミド５００ｎｇ、及び表３に示したｓｇＲＮＡをコードしている発現カセットを含むプラスミド５００ｎｇを、リポフェクタミン２０００試薬(Life Technologies)を使用し、２４－ウェルプレート中のＨＥＫ２９３ＦＴ細胞へ、集密度７５～９０％で同時－トランスフェクションした。次に細胞を、３７℃で７２ｈインキュベーションした。インキュベーション後、次にゲノムＤＮＡを、NucleoSpin 96 Tissue(Macherey-Nagel)を製造業者のプロトコールに従い用いて抽出した。標的化されたゲノム部位に隣接するゲノム領域を、ＰＣＲ増幅し、生成物を、ZR-96 DNA Clean and Concentrator(Zymo Research)を製造業者のプロトコールに従い用いて精製した。精製したＰＣＲ産物を次に、Illumina MiSeq上の次世代シークエンシング（２×２５０）へ送った。結果を、インデル形成又は＋３０ヌクレオチドでの特異的シトシン変異出現について分析し、ここで表３に記載した標的配列の３’端の最後のヌクレオチドは、＋１であり、ここで＋３０ヌクレオチドは、配列番号：５７－６２で表記される標的配列において、２９ヌクレオチド上流か、又は＋１ヌクレオチドの５’側であった（配列番号：５７－６２の標的配列は、各々、配列番号：６９－７４で表記されるゲノム座位配列内に小文字で記されている）。
表４から１５は、表２の融合タンパク質と表３のガイドＲＮＡの各組合せに関する、シチジン塩基編集を示している。融合タンパク質は、それらの配列番号により同定される。表４－１５のシチジン（Ｃ）の番号付けは、先の段落のように、標的配列の３’端の最後のヌクレオチドを＋１とし、番号付けを、標的配列及び対応するゲノム座位配列において３’から５’方向に進めた。興味深いことに、同じガイドＲＮＡを使用する、デアミナーゼ－ｎＲＧＮ融合タンパク質の活性を、対応するデアミナーゼ－ｎＲＧＮ＋ＵＳＰの活性と比較した場合、シチジンの所望のチミジンへの変換はより高く、アデノシン又はグアノシンへの変換はより少なかった。
Figure 2023534693000004
表４の結果は、Ｃ１０位置でのＣ＞Ｔ編集の割合は、ＵＳＰにより、試料中で増大したことを示している。
Figure 2023534693000005
表５の結果は、Ｃ１５位置でのＣ＞Ｔ編集の割合は、ＵＳＰにより、試料中で増大したことを示している。
Figure 2023534693000006
表６の結果は、Ｃ１３及びＣ１５位置でのＣ＞Ｔ形成の割合は、ＵＳＰの追加により増大したことを示している。
Figure 2023534693000007
表７の結果は、Ｃ１３及びＣ１５位置でのＣ＞Ｔ形成の割合は、ＵＳＰの追加により増大したことを示している。
Figure 2023534693000008
表８の結果は、Ｃ１７位置でのＣ＞Ｇ編集の割合は、Ｃ＞Ｔ変化に好ましいＵＳＰを伴う全ての試料において、減少したことを示している。
Figure 2023534693000009
表９の結果は、Ｃ１７位置でのＣ＞Ｇ編集は、Ｃ＞Ｔ変化に好ましいＵＳＰを伴う全ての試料において、減少したことを示している。
Figure 2023534693000010
表１０の結果は、Ｃ４、Ｃ７、Ｃ８、Ｃ１０、Ｃ１１、Ｃ１７及びＣ２０位置でのＣ＞Ｔ形成の割合は、ＵＳＰの追加により、増大したことを示している。
Figure 2023534693000011
表１１の結果は、Ｃ７、Ｃ８、Ｃ１１及びＣ１７位置でのＣ＞Ｔ形成の割合は、ＵＳＰの追加により、増大したことを示している。
Figure 2023534693000012
表１２の結果は、Ｃ２３位置でのＣ＞Ｔ形成の割合は、ＵＳＰの追加により、増大したことを示している。
Figure 2023534693000013
表１３の結果は、Ｃ６及びＣ２３位置でのＣ＞Ｔ形成の割合は、ＵＳＰの追加により、増大したことを示している。
Figure 2023534693000014
表１４の結果は、Ｃ１８位置でのＣ＞Ｔ形成の割合は、ＵＳＰの追加により、増大したことを示している。
Figure 2023534693000015
表１５の結果は、Ｃ１８位置でのＣ＞Ｔ形成の割合は、ＵＳＰの追加により、増大したことを示している。Ｃ１８位置でのＣ＞Ｇ変換の割合は、ＵＳＰの追加により、減少した。
表１６及び１７は、試験した各融合タンパク質／ガイドの組合せに関するインデル形成の割合を示している。この融合タンパク質は、配列番号により示されている。データは、本明細書において説明されたＵＳＰを含む融合タンパク質は、試験した全ての標的ゲノム位置でのインデル形成の割合を減少したことを示している。
Figure 2023534693000016
Figure 2023534693000017
実施例３：異なる送達様式の試験
塩基編集体(editor)は、異なる様式での送達が可能であるかどうかを決定するために、ｍＲＮＡ送達を、初代Ｔ細胞において試験した。精製したＣＤ３＋Ｔ細胞又はＰＢＭＣを解凍し、ＣＤ３／ＣＤ２８ビーズ(ThermoFisher)を用い３日間活性化し、その後Lonza 4D-Nucleofector Xユニット及びNucleocuvetteストリップを使用し、ヌクレオフェクションした。ｍＲＮＡ送達及びＲＮＰ送達の両方のために、Ｐ３初代細胞キットを使用した。細胞を、ｍＲＮＡ送達及びＲＮＰ送達のために、各々、ＥＯ－１１５及びＥＨ－１１５プログラムを用いて、トランスフェクションした。ヌクレオフェクション後、細胞を、ＩＬ－２、ＩＬ－７、及びＩＬ－１５(Miltenyi Biotec)を含有するCTS OpTimizer T細胞増殖培地(ThermoFisher)において、４日間培養し、その後Nucleospin組織ゲノムＤＮＡ分離キット(Machery Nagel)を用い収集した。
編集部位を取り囲むアンプリコンを、ＰＣＲにより作製し、２×２５０ｂｐペアエンドシークエンシングを用いる、Illumina Nexterraプラットフォームを使用する、ＮＧＳシークエンシングに供した。推定された塩基編集の割合を、各試料に関する全体の置換の割合を計算することにより決定した。試験した各ガイドに関する試料の平均及び数を、下記表１８及び１９に示している。
ＡＰＧ０９９８０－ｎＡＰＧ０７４３３．１－ＡＰＧ０３３９９及びＡＰＧ０５８４０－ｎＡＰＧ０７４３３．１－ＡＰＧ０３３９９は、ｍＲＮＡにより送達される場合、いくつかの標的として、高い塩基編集の割合を示している。塩基編集構築体におけるのＵＳＰ２の取込みのために、高い置換の割合にもかかわらず、非常に低いインデル形成の割合が存在している。
Figure 2023534693000018
Figure 2023534693000019

Claims (138)

  1. ａ）配列番号：１、２、４、５、及び７－１５のいずれか一つと少なくとも８０％の配列同一性、
    ｂ）配列番号：３もしくは１６と少なくとも８１％の配列同一性、又は
    ｃ）配列番号：６と少なくとも８２％の配列同一性、
    を有するアミノ酸配列を含む単離されたポリペプチドであって、
    ここで該ポリペプチドが、ウラシル安定化活性を有し、及びここで該ポリペプチドが、異種アミノ酸配列を更に含む、単離されたポリペプチド。
  2. 前記ポリペプチドが、配列番号：３３－３９のいずれか一つの配列を有する、請求項１に記載の単離されたポリペプチド。
  3. 非天然の医薬として許容し得る担体、並びに：
    ａ）配列番号：１、２、４、５、及び７－１５のいずれか一つと少なくとも８０％の配列同一性、
    ｂ）配列番号：３もしくは１６と少なくとも８１％の配列同一性、又は
    ｃ）配列番号：６と少なくとも８２％の配列同一性、
    を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドを含有する医薬組成物であって、
    ここで該ポリペプチドが、ウラシル安定化活性を有する、医薬組成物。
  4. 非天然の医薬として許容し得る担体、並びに：
    ａ）配列番号：１、２、４、５、及び７－１５のいずれか一つと少なくとも８０％の配列同一性、
    ｂ）配列番号：３もしくは１６と少なくとも８１％の配列同一性、又は
    ｃ）配列番号：６と少なくとも８２％の配列同一性、
    を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドを含む核酸分子を含有する医薬組成物であって、
    ここで該ポリペプチドが、ウラシル安定化活性を有する、医薬組成物。
  5. 前記ポリペプチドが、配列番号：３３－３９のいずれか一つの配列を有する、請求項３又は４に記載の医薬組成物。
  6. フルオロピリミジンを更に含有する、請求項３～５のいずれか一項に記載の医薬組成物。
  7. ａ）配列番号：１、２、４、５、及び７－１５のいずれか一つと少なくとも８０％の配列同一性、
    ｂ）配列番号：３もしくは１６と少なくとも８１％の配列同一性、又は
    ｃ）配列番号：６と少なくとも８２％の配列同一性、
    を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドを含む核酸分子であって、
    ここで該ポリペプチドが、ウラシル安定化活性を有し、並びに
    ここで該核酸分子が、該ポリヌクレオチドへ機能的に連結された異種プロモーターを更に含む、核酸分子。
  8. 前記ポリペプチドが、配列番号：３３－３９のいずれか一つの配列を有する、請求項７に記載の核酸分子。
  9. フルオロピリミジン、並びに：
    ａ）配列番号：１、２、４、５、及び７－１５のいずれか一つと少なくとも８０％の配列同一性、
    ｂ）配列番号：３もしくは１６と少なくとも８１％の配列同一性、又は
    ｃ）配列番号：６と少なくとも８２％の配列同一性、
    を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドを含有する組成物あって、
    ここで該ポリペプチドが、ウラシル安定化活性を有する、組成物。
  10. フルオロピリミジン、並びに：
    ａ）配列番号：１、２、４、５、及び７－１５のいずれか一つと少なくとも８０％の配列同一性、
    ｂ）配列番号：３もしくは１６と少なくとも８１％の配列同一性、又は
    ｃ）配列番号：６と少なくとも８２％の配列同一性、
    を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードしている核酸分子を含有する組成物であって、
    ここで該ポリペプチドが、ウラシル安定化活性を有する、組成物。
  11. 前記ポリペプチドが、配列番号：３３－３９のいずれか一つの配列を有する、請求項９又は１０に記載の組成物。
  12. 融合タンパク質であって、
    （ｉ）ＤＮＡ結合ポリペプチド、（ｉｉ）デアミナーゼ、及び（ｉｉｉ）配列番号：１－１６のいずれか一つと少なくとも８０％の配列同一性を有する少なくとも1つのウラシル安定化ポリペプチド（ＵＳＰ）、を含む融合タンパク質。
  13. 前記ＵＳＰが、配列番号：３３－３９のいずれか一つの配列を有する、請求項１２に記載の融合タンパク質。
  14. 前記デアミナーゼが、シチジンデアミナーゼである、請求項１２又は１３に記載の融合タンパク質。
  15. 前記シチジンデアミナーゼが、活性化－誘導型シチジンデアミナーゼ（ＡＩＤ）、又はデアミナーゼのアポリポタンパクＢ－ｍＲＮＡ編集複合体（ＡＰＯＢＥＣ）ファミリーの一員である、請求項１４に記載の融合タンパク質。
  16. 前記シチジンデアミナーゼが、配列番号：４７、４８及び７６－９４のいずれか一つと少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１５に記載の融合タンパク質。
  17. 前記ＤＮＡ結合ポリペプチドが、メガヌクレアーゼ、ジンクフィンガー融合タンパク質、又はＴＡＬＥＮである、請求項１２～１６のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
  18. 前記ＤＮＡ結合ポリペプチドが、ＲＮＡガイド型ＤＮＡ結合ポリペプチドである、請求項１２～１６のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
  19. 前記ＲＮＡガイド型ＤＮＡ結合ポリペプチドが、ＲＮＡガイド型ヌクレアーゼポリペプチド（ＲＧＮ）である、請求項１８に記載の融合タンパク質。
  20. 前記ＲＧＮが、ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓポリペプチドである、請求項１９に記載の融合タンパク質。
  21. 前記ＲＧＮが、Ｖ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓポリペプチドである、請求項１９に記載の融合タンパク質。
  22. 前記ＲＧＮが、配列番号：４０及び９５－１４２のいずれか一つと少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１９に記載の融合タンパク質。
  23. 前記ＲＧＮが、ＲＧＮニッカーゼである、請求項１９－２２のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
  24. 前記融合タンパク質が、ＲＧＮ、シチジンデアミナーゼ、及びＵＳＰを含む、請求項１９～２３のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
  25. 前記ＲＧＮが、配列番号：４０、４１、及び９５－１４２のいずれか一つと少なくとも８０％の配列同一性を有し、該シチジンデアミナーゼが、配列番号：４７、４８、及び７６－９４のいずれか一つと少なくとも８０％の配列同一性を有し、並びに該ＵＳＰが、配列番号：１－１６のいずれか一つと少なくとも８０％の配列同一性を有する、請求項２４に記載の融合タンパク質。
  26. 前記融合タンパク質が、少なくとも１つの核局在化シグナル（ＮＬＳ）を更に含む、請求項１２～２５のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
  27. （ｉ）ＤＮＡ結合ポリペプチド、（ｉｉ）デアミナーゼ、及び（ｉｉｉ）少なくとも１つのウラシル安定化ポリペプチド（ＵＳＰ）、を含む融合タンパク質をコードしているポリヌクレオチドを含む核酸分子であって、ここでＵＳＰは：
    ａ）配列番号：１７－３２のいずれか一つと少なくとも８０％の配列同一性を有するか、
    ｂ）配列番号：１７－３２のいずれか一つで表記されるか、
    ｃ）配列番号：１－１６と少なくとも８０％同一のアミノ酸配列をコードし、且つ配列番号：３３－３９のいずれか一つの配列を更に持つか、
    ｄ）配列番号：１－１６のいずれか一つで表記されるアミノ酸配列と少なくとも８０％同一のアミノ酸配列をコードしているか、又は
    ｅ）配列番号：１－１６のいずれか一つで表記されるアミノ酸配列をコードしている、
    ヌクレオチド配列によりコードされている、核酸分子。
  28. 前記デアミナーゼが、シチジンデアミナーゼである、請求項２７に記載の核酸分子。
  29. 前記シチジンデアミナーゼが、活性化－誘導型シチジンデアミナーゼ（ＡＩＤ）、又はデアミナーゼのアポリポタンパクＢ－ｍＲＮＡ編集複合体（ＡＰＯＢＥＣ）ファミリーの一員である、請求項２８に記載の核酸分子。
  30. 前記シチジンデアミナーゼが、配列番号：４７、４８及び７６－９４のいずれか一つと少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項２９に記載の核酸分子。
  31. 前記ＤＮＡ結合ポリペプチドが、メガヌクレアーゼ、ジンクフィンガー融合タンパク質、又はＴＡＬＥＮである、請求項２７～３０のいずれか一項に記載の核酸分子。
  32. 前記ＤＮＡ結合ポリペプチドが、ＲＮＡガイド型ＤＮＡ結合ポリペプチドである、請求項２７～３０のいずれか一項に記載の核酸分子。
  33. 前記ＲＮＡガイド型ＤＮＡ結合ポリペプチドが、ＲＮＡガイド型ヌクレアーゼポリペプチド（ＲＧＮ）である、請求項３２に記載の核酸分子。
  34. 前記ＲＧＮが、ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓポリペプチドである、請求項３３に記載の核酸分子。
  35. 前記ＲＧＮが、Ｖ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓポリペプチドである、請求項３３に記載の核酸分子。
  36. 前記ＲＧＮが、配列番号：４０及び９５－１４２のいずれか一つと少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項３３に記載の核酸分子。
  37. 前記ＲＧＮが、ＲＧＮニッカーゼである、請求項３３～３６のいずれか一項に記載の核酸分子。
  38. 前記融合タンパク質が、ＲＧＮ、シチジンデアミナーゼ、及びＵＳＰを含む、請求項３３～３６のいずれか一項に記載の核酸分子。
  39. 前記ＲＧＮが、配列番号：４０、４１、及び９５－１４２のいずれか一つと少なくとも８０％の配列同一性を有し、該シチジンデアミナーゼが、配列番号：４７、４８、及び７６－９４のいずれか一つと少なくとも８０％の配列同一性を有し、並びに該ＵＳＰが、配列番号：１－１６のいずれか一つと少なくとも８０％の配列同一性を有する、請求項３８に記載の核酸分子。
  40. 前記融合タンパク質をコードしているポリヌクレオチドが、その５’末端で、異種プロモーターに機能的に連結される、請求項２７～３９のいずれか一項に記載の核酸分子。
  41. 前記融合タンパク質をコードしているポリヌクレオチドが、その３’末端で、異種ターミネーターへ機能的に連結される、請求項２７～３９のいずれか一項に記載の核酸分子。
  42. 前記融合タンパク質が、１又は複数の核局在化シグナルを含む、請求項２９～４１のいずれか一項に記載の核酸分子。
  43. 前記融合タンパク質が、真核細胞における発現のために最適化されたコドンである、請求項２７～４２のいずれか一項に記載の核酸分子。
  44. 前記融合タンパク質が、原核細胞における発現のために最適化されたコドンである、請求項２７～４３のいずれか一項に記載の核酸分子。
  45. 請求項２７～４４のいずれか一項に記載の核酸分子を含む、ベクター。
  46. 標的配列にハイブリダイズすることが可能であるガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）をコードしている少なくとも１つのヌクレオチド配列を更に含む、請求項３３～３９のいずれか一項に記載の核酸分子を含むベクター。
  47. 前記ｇＲＮＡが、シングルガイドＲＮＡである、請求項４６に記載のベクター。
  48. 前記ｇＲＮＡが、デュアルガイドＲＮＡである、請求項４６に記載のベクター。
  49. 請求項１２～２６のいずれか一項に記載の融合タンパク質を含む、細胞。
  50. 前記細胞が、ガイドＲＮＡを更に含む、請求項１８～２５のいずれか一項に記載の融合タンパク質を含む、細胞。
  51. 請求項２７～４４のいずれか一項に記載の核酸分子を含む、細胞。
  52. 請求項４５～４８のいずれか一項に記載のベクターを含む、細胞。
  53. 前記細胞が、原核細胞である、請求項４９～５２のいずれか一項に記載の細胞。
  54. 前記細胞が、真核細胞である、請求項４９～５２のいずれか一項に記載の細胞。
  55. 前記細胞が、昆虫、鳥類、又は哺乳動物の細胞である、請求項５４に記載の細胞。
  56. 前記細胞が、植物又は真菌の細胞である、請求項５４に記載の細胞。
  57. 医薬として許容し得る担体、並びに、請求項７、８、２７～４４のいずれか一項に記載の核酸分子、請求項９～１１のいずれか一項に記載の組成物、請求項１２～２６のいずれか一項に記載の融合タンパク質、請求項４５～４８のいずれか一項に記載のベクター、又は請求項４９～５５のいずれか一項に記載の細胞を含有する、医薬組成物。
  58. 請求項４９～５６のいずれか一項に記載の細胞を、融合タンパク質が発現される条件下で培養することを含む、融合タンパク質の製造方法。
  59. 請求項２７～４４のいずれか一項に記載の核酸分子、又は請求項４５～４８のいずれか一項に記載のベクターを、細胞へ導入し、並びにこの細胞を、融合タンパク質が発現される条件下で培養することを含む、融合タンパク質の製造方法。
  60. 前記融合タンパク質を精製することを更に含む、請求項５８又は５９に記載の方法。
  61. 請求項３３～３９のいずれか一項に記載の核酸分子、及びガイドＲＮＡをコードしている発現カセットを含む核酸分子、又は請求項４６～４８のいずれか一項に記載のベクターを、細胞に導入し、並びに融合タンパク質及びｇＲＮＡが発現され且つＲＧＮ融合リボ核タンパク質複合体を形成する条件下で、細胞を培養することを含む、ＲＧＮ融合リボ核タンパク質複合体の製造方法。
  62. 前記ＲＧＮ融合リボ核タンパク質複合体を精製することを更に含む、請求項６１に記載の方法。
  63. 標的ＤＮＡ配列を含む標的ＤＮＡ分子を改変するシステムであって、該システムが：
    ａ）ＲＮＡガイド型ヌクレアーゼポリペプチド（ＲＧＮ）、シチジンデアミナーゼ、及び少なくとも１つのウラシル安定化ポリペプチド（ＵＳＰ）を含む融合タンパク質であって、ここでＵＳＰが、配列番号：１－１６のいずれか一つと少なくとも８０％同一である融合タンパク質、又は該融合タンパク質をコードしているヌクレオチド配列、並びに
    ｂ）該標的ＤＮＡ配列にハイブリダイズすることが可能な１又は複数のガイドＲＮＡ、もしくは１又は複数のガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）をコードしている１又は複数のヌクレオチド配列、を含み、
    ここで１又は複数のガイドＲＮＡをコードしている及び融合タンパク質をコードしている該ヌクレオチド配列は、各々、該ヌクレオチド配列に対し異種のプロモーターへ機能的に連結され、並びに
    ここで１又は複数のガイドＲＮＡは、該標的ＤＮＡ配列に結合し且つ標的ＤＮＡ分子を改変するよう該融合タンパク質に指示するために、融合タンパク質と複合体を形成することが可能である、システム。
  64. 前記標的ＤＮＡ配列が、ＲＧＮにより認識されるプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）に隣接して配置される、請求項６３に記載のシステム。
  65. 前記標的ＤＮＡ分子が、細胞内にある、請求項６３又は６４に記載のシステム。
  66. 前記細胞が、真核細胞である、請求項６５に記載のシステム。
  67. 前記真核細胞が、植物細胞である、請求項６６に記載のシステム。
  68. 前記真核細胞が、哺乳動物細胞である、請求項６６に記載のシステム。
  69. 前記真核細胞が、昆虫細胞である、請求項６６に記載のシステム。
  70. 前記細胞が、原核細胞である、請求項６５に記載のシステム。
  71. 前記融合タンパク質のＲＧＮが、ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓポリペプチドである、請求項６３～７０のいずれか一項に記載のシステム。
  72. 前記融合タンパク質のＲＧＮが、Ｖ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓポリペプチドである、請求項６３～７０のいずれか一項に記載のシステム。
  73. 前記融合タンパク質のＲＧＮが、配列番号：４０及び９５－１４２のいずれか一つと少なくとも８０％同一である、請求項６３～７０のいずれか一項に記載のシステム。
  74. 前記融合タンパク質のＲＧＮが、ＲＧＮニッカーゼである、請求項６３～７３のいずれか一項に記載のシステム。
  75. 前記シチジンデアミナーゼが、配列番号：４７、４８及び７６－９４のいずれか一つと少なくとも８０％同一である、請求項６３～７４のいずれか一項に記載のシステム。
  76. 前記ＵＳＰが、配列番号：３３－３９のいずれか一つの配列を含む、請求項６３～７５のいずれか一項に記載のシステム。
  77. 前記ＲＧＮが、配列番号：４０、４１、及び９５－１４２のいずれか一つと少なくとも８０％の配列同一性を有し、シチジンデアミナーゼが、配列番号：４７、４８、及び７６－９４のいずれか一つと少なくとも８０％の配列同一性を有し、並びにＵＳＰが、配列番号：１－１６のいずれか一つと少なくとも８０％の配列同一性を有する、請求項６３～７６のいずれか一項に記載のシステム。
  78. 前記融合タンパク質が、１又は複数の核局在化シグナルを含む、請求項６３～７７のいずれか一項に記載のシステム。
  79. 前記融合タンパク質が、真核細胞における発現のために最適化されたコドンである、請求項６３～７８のいずれか一項に記載のシステム。
  80. １又は複数のガイドＲＮＡをコードしているヌクレオチド配列及び融合タンパク質をコードしているヌクレオチド配列が、１つのベクター上に配置される、請求項６３～７９のいずれか一項に記載のシステム。
  81. 前記方法が、請求項６３～８０のいずれか一項に記載のシステムを、該標的ＤＮＡ分子又は標的ＤＮＡ分子を含む細胞へ、送達することを含む、標的ＤＮＡ配列を含む標的ＤＮＡ分子を改変する方法。
  82. 前記改変された標的ＤＮＡ分子が、標的ＤＮＡ分子内の少なくとも１個のヌクレオチドのＣ＞Ｔ変異を含む、請求項８１に記載の方法。
  83. 前記改変された標的ＤＮＡ分子が、標的ＤＮＡ配列内の少なくとも１個のヌクレオチドのＣ＞Ｔ変異を含む、請求項８１に記載の方法。
  84. 標的配列を含む標的ＤＮＡ分子を改変する方法であって、
    ａ）ＲＧＮ－デアミナーゼ－ＵＳＰリボヌクレオチド複合体の形成に適した条件下で、
    ｉ）標的ＤＮＡ配列にハイブリダイズすることが可能である、１又は複数のガイドＲＮＡ、及び
    ｉｉ）ＲＮＡガイド型ヌクレアーゼポリペプチド（ＲＧＮ）、シチジンデアミナーゼ、及び少なくとも1つのウラシル安定化ポリペプチド（ＵＳＰ）を含む、融合タンパク質であって、ここでＵＳＰは、配列番号：１－１６のいずれか一つと少なくとも８０％同一である融合タンパク質：を組合せることにより、ＲＧＮ－デアミナーゼ－ＵＳＰリボヌクレオチド複合体をインビトロにおいて集成すること、並びに、
    ｂ）該標的ＤＮＡ分子又は該標的ＤＮＡ分子を含む細胞を、インビトロにおいて－集成されたＲＧＮ－デアミナーゼ－ＵＳＰリボヌクレオチド複合体と接触させること、を含み、
    ここで１又は複数のガイドＲＮＡは、標的ＤＮＡ配列にハイブリダイズし、これにより該融合タンパク質は、該標的ＤＮＡ配列に結合し、且つ標的ＤＮＡ分子の改変が生じるように指示される、方法。
  85. 前記改変された標的ＤＮＡ分子が、標的ＤＮＡ分子内に少なくとも１個のヌクレオチドのＣ＞Ｔ変異を含む、請求項８４に記載の方法。
  86. 前記改変された標的ＤＮＡ分子が、標的ＤＮＡ配列内に少なくとも１個のヌクレオチドのＣ＞Ｔ変異を含む、請求項８４に記載の方法。
  87. 前記融合タンパク質のＲＧＮが、ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓポリペプチドである、請求項８４～８６のいずれか一項に記載の方法。
  88. 前記融合タンパク質のＲＧＮが、Ｖ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓポリペプチドである、請求項８４～８６のいずれか一項に記載の方法。
  89. 前記融合タンパク質のＲＧＮが、配列番号：４０及び９５－１４２のいずれか一つと少なくとも８０％同一である、請求項８４～８６のいずれか一項に記載の方法。
  90. 前記融合タンパク質のＲＧＮが、ＲＧＮニッカーゼである、請求項８４～８９のいずれか一項に記載の方法。
  91. 前記シチジンデアミナーゼが、配列番号：４７、４８及び７６－９４のいずれか一つと少なくとも８０％同一である、請求項８４～９０のいずれか一項に記載の方法。
  92. 前記ＵＳＰが、配列番号：３３－３９のいずれか一つの配列を含む、請求項８４～９１のいずれか一項に記載の方法。
  93. 前記ＲＧＮが、配列番号：４０、４１、及び９５－１４２のいずれか一つと少なくとも８０％の配列同一性を有し、シチジンデアミナーゼが、配列番号：４７、４８、及び７６－９４のいずれか一つと少なくとも８０％の配列同一性を有し、並びにＵＳＰが、配列番号：１－１６のいずれか一つと少なくとも８０％の配列同一性を有する、請求項８４～９２のいずれか一項に記載の方法。
  94. 前記融合タンパク質が、１又は複数の核局在化シグナルを含む、請求項８４～９３のいずれか一項に記載の方法。
  95. 前記融合タンパク質が、真核細胞における発現のために最適化されたコドンである、請求項８４～９４のいずれか一項に記載の方法。
  96. 前記標的ＤＮＡ配列が、プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）に隣接して配置される、請求項８４～９５のいずれか一項に記載の方法。
  97. 前記標的ＤＮＡ分子が、細胞内にある、請求項８４～９６のいずれか一項に記載の方法。
  98. 前記細胞が、真核細胞である、請求項９７に記載の方法。
  99. 前記真核細胞が、植物細胞である、請求項９８に記載の方法。
  100. 前記真核細胞が、哺乳動物細胞である、請求項９８に記載の方法。
  101. 前記真核細胞が、昆虫細胞である、請求項９８に記載の方法。
  102. 前記細胞が、原核細胞である、請求項９７に記載の方法。
  103. 該改変されたＤＮＡ分子を含む細胞を選択することを更に含む、請求項９７～１０２のいずれか一項に記載の方法。
  104. 請求項１０３に記載の方法に従い改変された標的ＤＮＡ配列を含む細胞。
  105. 前記細胞が、真核細胞である、請求項１０４に記載の細胞。
  106. 前記真核細胞が、植物細胞である、請求項１０５に記載の細胞。
  107. 請求項１０６に記載の細胞を含む、植物。
  108. 請求項１０６に記載の細胞を含む、種子。
  109. 前記真核細胞が、哺乳動物細胞である、請求項１０５に記載の細胞。
  110. 前記真核細胞が、昆虫細胞である、請求項１０５に記載の細胞。
  111. 前記細胞が、原核細胞である、請求項１０４に記載の細胞。
  112. 遺伝性疾患に因果関係のある変異の補正により、遺伝子改変された細胞を作製する方法であって、この方法が、
    ａ）ＲＮＡガイド型ヌクレアーゼポリペプチド（ＲＧＮ）、シチジンデアミナーゼ、及び少なくとも1つのウラシル安定化ポリペプチド（ＵＳＰ）を含む融合タンパク質であって、ここでＵＳＰは、配列番号：１－１６のいずれか一つと少なくとも８０％同一である融合タンパク質、又は該融合タンパク質をコードしているポリヌクレオチドであって、ここで融合タンパク質をコードしている該ポリヌクレオチドは、細胞における融合タンパク質の発現を可能にするため、プロモーターへ機能的に連結されているもの、
    ｂ）標的ＤＮＡ配列にハイブリダイズすることが可能である１又は複数のガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）、又は該ｇＲＮＡをコードしているポリヌクレオチドであって、ここでｇＲＮＡをコードしている該ポリヌクレオチドは、細胞におけるｇＲＮＡの発現を可能にするため、プロモーターへ機能的に連結されているもの、
    を細胞へ導入することを含み、
    これにより、融合タンパク質及びｇＲＮＡは、因果関係のある変異のゲノム位置を標的化し、且つゲノム配列を因果関係のある変異を除去するように改変する、方法。
  113. 前記融合タンパク質のＲＧＮが、ニッカーゼである、請求項１１２に記載の方法。
  114. 前記ＵＳＰが、配列番号：３３－３９のいずれか一つの配列を含む、請求項１１２又は１１３に記載の方法。
  115. 前記ゲノム改変が、標的ＤＮＡ配列内に少なくとも１個のヌクレオチドのＣ＞Ｔ変異を導入することを含む、請求項１１２～１１４のいずれか一項に記載の方法。
  116. 前記細胞が、動物細胞である、請求項１１２～１１５のいずれか一項に記載の方法。
  117. 前記動物細胞が、哺乳動物細胞である、請求項１１６に記載の方法。
  118. 前記細胞が、イヌ、ネコ、マウス、ラット、ウサギ、ウマ、ヒツジ、ヤギ、ウシ、ブタ、又はヒトに由来する、請求項１１７に記載の方法。
  119. 前述の因果関係のある変異の補正が、停止コドンを導入することを含む、請求項１１２～１１８のいずれか一項に記載の方法。
  120. ａ）（ｉ）ＤＮＡ結合ポリペプチド、及び（ｉｉ）デアミナーゼを含有する融合タンパク質、又は、この融合タンパク質をコードしている核酸分子、並びに
    ｂ）配列番号：１－１６のいずれか一つと少なくとも８０％の配列同一性を有するウラシル安定化ポリペプチド（ＵＳＰ）、又は、このＵＳＰをコードしている核酸分子、
    を含有する、組成物。
  121. 前記融合タンパク質が、配列番号：１－１６のいずれか一つと少なくとも８０％の配列同一性を有するウラシル安定化ポリペプチド（ＵＳＰ）を更に含む、請求項１２０に記載の組成物。
  122. 前記ＤＮＡ結合ポリペプチドが、メガヌクレアーゼ、ジンクフィンガー融合タンパク質、又はＴＡＬＥＮである、請求項１２０又は１２１に記載の組成物。
  123. 前記ＤＮＡ結合ポリペプチドが、ＲＮＡガイド型ＤＮＡ結合ポリペプチドである、請求項１２０又は１２１に記載の組成物。
  124. 前記ＲＮＡガイド型ＤＮＡ結合ポリペプチドが、ＲＮＡガイド型ヌクレアーゼポリペプチド（ＲＧＮ）である、請求項１２３に記載の組成物。
  125. 前記ＲＧＮが、ＲＧＮニッカーゼである、請求項１２４に記載の組成物。
  126. 融合タンパク質をコードしている核酸分子及びウラシル安定化ポリペプチド（ＵＳＰ）をコードしている核酸分子を含むベクターであって、ここで該融合タンパク質が、ＤＮＡ結合ポリペプチド及びデアミナーゼを含み、並びにここで該ＵＳＰが、配列番号：１－１６のいずれか一つと少なくとも８０％の配列同一性を有する、ベクター。
  127. 前記融合タンパク質が、配列番号：１－１６のいずれか一つと少なくとも８０％の配列同一性を有するウラシル安定化ポリペプチド（ＵＳＰ）を更に含む、請求項１２６に記載のベクター。
  128. 前記ＤＮＡ結合ポリペプチドが、メガヌクレアーゼ、ジンクフィンガー融合タンパク質、又はＴＡＬＥＮである、請求項１２６又は１２７に記載のベクター。
  129. 前記ＤＮＡ結合ポリペプチドが、ＲＮＡガイド型ＤＮＡ結合ポリペプチドである、請求項１２６又は１２７に記載のベクター。
  130. 前記ＲＮＡガイド型ＤＮＡ結合ポリペプチドが、ＲＮＡガイド型ヌクレアーゼポリペプチド（ＲＧＮ）である、請求項１２９に記載のベクター。
  131. 前記ＲＧＮが、ＲＧＮニッカーゼである、請求項１３０に記載のベクター。
  132. 請求項１２６～１３１のいずれか一項に記載のベクターを含む細胞。
  133. ａ）（ｉ）ＤＮＡ結合ポリペプチド、及び（ｉｉ）デアミナーゼを含有する融合タンパク質、又は、この融合タンパク質をコードしている核酸分子、並びに
    ｂ）配列番号：１－１６のいずれか一つと少なくとも８０％の配列同一性を有するウラシル安定化ポリペプチド（ＵＳＰ）、又は、このＵＳＰをコードしている核酸分子、
    を含む、細胞。
  134. 前記融合タンパク質が、配列番号：１－１６のいずれか一つと少なくとも８０％の配列同一性を有するウラシル安定化ポリペプチド（ＵＳＰ）を更に含む、請求項１３３に記載の細胞。
  135. 前記ＤＮＡ結合ポリペプチドが、メガヌクレアーゼ、ジンクフィンガー融合タンパク質、又はＴＡＬＥＮである、請求項１３４に記載の細胞。
  136. 前記ＤＮＡ結合ポリペプチドが、ＲＮＡガイド型ＤＮＡ結合ポリペプチドである、請求項１３４に記載の細胞。
  137. 前記ＲＮＡガイド型ＤＮＡ結合ポリペプチドが、ＲＮＡガイド型ヌクレアーゼポリペプチド（ＲＧＮ）である、請求項１３６に記載の細胞。
  138. 前記ＲＧＮが、ＲＧＮニッカーゼである、請求項１３７に記載の細胞。
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