ME00472B - Streptomyces avermitilis gen koji određuje odnos b2:b1 avermektina - Google Patents

Streptomyces avermitilis gen koji određuje odnos b2:b1 avermektina

Info

Publication number
ME00472B
ME00472B MEP-2008-730A MEP73008A ME00472B ME 00472 B ME00472 B ME 00472B ME P73008 A MEP73008 A ME P73008A ME 00472 B ME00472 B ME 00472B
Authority
ME
Montenegro
Prior art keywords
amino acid
avec
avermitilis
cyclohexyl
acid substitutions
Prior art date
Application number
MEP-2008-730A
Other languages
English (en)
Inventor
Engwall Kim Jonelle Stutzman
Claes Eric Daniel Gustafsson
Anke Krebber
Sun Ai Raillard
Jeremy Stephen Minshull
Seran Kim
Yan Chen
Original Assignee
Zoetis Services Llc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Zoetis Services Llc filed Critical Zoetis Services Llc
Publication of ME00472B publication Critical patent/ME00472B/me

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/88—Lyases (4.)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P33/00—Antiparasitic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P17/00—Preparation of heterocyclic carbon compounds with only O, N, S, Se or Te as ring hetero atoms
    • C12P17/18—Preparation of heterocyclic carbon compounds with only O, N, S, Se or Te as ring hetero atoms containing at least two hetero rings condensed among themselves or condensed with a common carbocyclic ring system, e.g. rifamycin
    • C12P17/181—Heterocyclic compounds containing oxygen atoms as the only ring heteroatoms in the condensed system, e.g. Salinomycin, Septamycin
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
    • C12P19/44—Preparation of O-glycosides, e.g. glucosides
    • C12P19/60—Preparation of O-glycosides, e.g. glucosides having an oxygen of the saccharide radical directly bound to a non-saccharide heterocyclic ring or a condensed ring system containing a non-saccharide heterocyclic ring, e.g. coumermycin, novobiocin
    • C12P19/62—Preparation of O-glycosides, e.g. glucosides having an oxygen of the saccharide radical directly bound to a non-saccharide heterocyclic ring or a condensed ring system containing a non-saccharide heterocyclic ring, e.g. coumermycin, novobiocin the hetero ring having eight or more ring members and only oxygen as ring hetero atoms, e.g. erythromycin, spiramycin, nystatin
    • C12P19/623—Avermectin; Milbemycin; Ivermectin; C-076

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Saccharide Compounds (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Detergent Compositions (AREA)

Abstract

Ovaj pronalazak se odnosi na polinukleotidne molekule koji sadrže nuklotidnu sekvencu koja kodira proizvod AveC gena, pri čemu polinukelotidni molekuli se mogu koristiti za moduliranje odnosa klase 2:1 avermecitina dobijenih fermentacijom kultura S.avermitilis.Ovaj pronalazak se dalje odnosi na vektore, transformisane ćelije domaćina i nove izrođene varijante (mutante) S.avermitilis u kojima je aveC gen inativiran ili tako mutiran da modulira odnos klasa 2:1 proizvedenog avermikitina.

Description

1.Oblast pronalaska
Ovaj pronalazak se odnosi na preparate i postupke za efikasno dobijanje avetmekitina kao stoje “doramectin” koji je prvenstveno koristan u oblasti zdravlja životinja. Detaljnije, ovaj pronalazak se odnosi na polinukleotidne molekule koji sadrže nuklotidnu sekvencu koja kodira proizvod AveC gena, koji se mogu koristiti za moduliranje odnosa klasa 2:1 avermecitina dobijenih fermentacijom kultura Strptomyces avermitilis. Ovaj pronalazak se dalje odnosi na vektore, transformisane ćelije domaćina i nove izrođene varijante (mutirane) S.Avermitilis u kojima je aveC gen tako mutiran da modulira odnos klasa 2:1 proizvodenog avermikitina.
2. Stanje tehnike
2,1 Avermektini
Streptomyces vrste proizvode različite vrste sekundarnih metabolita, uključujući avermektine, koji obuhvataju seriju osam srodnih šesnaesto-članih makrocikličnih laktona sa snažnim antihelminskim i insekticidnim dejstvom. Osam različitih ali srodnih jedinjenj a su označena kao Ala, Alb, A2a, A2b, Bla, Blb, B2a i B2b. Serija “a” jedinjenja se odnosi na prirodne avermektine gde je supstituent na C25 položaju, (S)-sek-butil i “b” serija se odnosi na gde je na C25 položaju supstituent izopropil. Oznake “A” i “B” odnose se na avermektine gde je na položaju C5 supstituent metoksi ili hidroksi. Brojevi “1” se odnose na avermektine gde je dvostruka veza prisutna na položaju C22,23, a broj “2” se odnosi na avermiktine gde je na položaju C22, vodonik i na položaju C23 je hidroksi. Među srodnim avermektinima, BI tip avermektina, kao što je doramektin, se smatra da ima najefikasnije antiparazitsko i pesticidno dejstvo, pa je prema tome, i najviše prodavan avermektin.
Avermektini i njihovo dobijanje aerobnom fermentacijom soja S.avermitilis su opisani u Patentnima Sjedninjenih Američkih Država br. 4,310,519 i 4,429,042. Pretpostavlja se daje biosinteza prirodnih avermektina inicirana endogeno od CoA tioestar analoga izobuteme kiseline i S-(+)-2-metil buteme kiseline.
Kombinacija oba soja poboljšani nasumičnom (“random”) mutagenezom i primena masnih kiselina iz egzogenih izvora vodi do efikasne proizvodnje analoga avermektina. Izrođene varijante S.avermitilis kojima nedostaju dehidrogenaze 2-okso kiselina razgranatog- lanca (bkd deficijentni mutanti) mogu samo daproizvedu avermektine kada su fermentacije dopunjene masnim kiselinama. Proveravanje i izolacija izrođenih vrsta kojima nedostaje aktvnost dehidrogenaza razgranatog-lanca (npr. S.avermitilis, ATCC 53567) su opisani u Evropskom Patentu (EP) 276103. Fermentacija ovih izrođenih vrsta u prisustvu masnih kiselina iz egzogenih izvoda rezultuje u proizvodnji samo četiri avermektina koji odgovaraju upoterbljenim masnim kiselinama. Tako, dodavanjem S(+)-2-metilbuteme kiseline fermetaciji S.avermitilis (ATCC 53567), za rezultat ima proizvodnju prirodnih avermektina Ala, A2a, Bla i B2a. Dodavanjem izobuteme kiseline fermentaciji dobijaju se prirodni avermektini A lb, A2b, Blb i B2b; a dodavanjem ciklopentankarboksilne kiseline, dobijaju se četiri nova ciklopentilavermektina A, A2, BI i B2.
Ukoliko se dodaju druge masne kiseline, dobijaju se novi avermektini. Proverevanjem oko 800 potrencijalnih prekursora, identifikovano je više od 60 novih avermektina. (videti, npr., Dutton et al., 1991, J. Antibot. 44:357-365; i Banks et al., 1994, Roy. Soc. Chem. 147: 16-26). Dalje, izrođene varijante S.avermitilis, kojima nedostaje aktivnost 5-0- metiltransferaze, proizvode u suštini samo B analoge avermektina. Shodno tome, izrođene varijante S.avermitilis-a kojima nedostaje i dehidrogenaza 2-okso kiseline razgranatog lansa i 5-O-metiltransferazna aktinost proizvode samo B avermektine odgovarajućih masnih kiselina kao dodatak fermentaciji. Tako, dodatkom S-(+)-2-metilbuteme kiseline ovim dvostrukim izrođenim vrstama dobijaju se samo prirodni avermektini Bla i B2a, dok dodavanje izobuteme kiseline ili ciklopentankarboskilne kiseline za rezultat ima dobij anje samo prirodnih avermektina Blb i B2b ili novih ciklopentil BI i B2 avermektina. Dodavanje cikloheksan karboksilne kiseline dvostrukim izrođenim vrstama je preferentan postupak dobijanja novog, komercijalno važnog avermektina, cikloheksilavermektina BI (doramektin). Izolovanje i karakterizacija ovih dvostrukih izrođenih vrsta, npr., S.avermitilis, (ATCC 53692) je opisana u EP 276103.
2.2 Geni koji su učestvuju u biosintezi avermektina
U mnogim slučajevima, geni koji učestvuju u sekundarnim metabolitima i genima koji kodiraju određen antibiotik su nađeni kao klasteri na hromozomima. Ovo je slučaj sa klasterom gena Streptomyces poliketid sintaze (PKS) (vidi Hopwood and Sherman, 1990, Ann.Rev.Genet. 24:37-66). Tako je strategija za kloniranje gena u biološkim putevima je izolovati gen otproan na lek, pa zatim testirati susedne regione hromozoma na ostale gene koji se odnose na biosintezu tog određenog antibiotika. Sledeća strategija za kloniranje gena koji učestvuju u sintezi važnih metabolita je komplementacija mutanata. Na primer, deo biblioteke DNK oraganizama koji mogu da proizvedu odgovarajuće metabolite su uvedeni u mutant koji ne proizvodi i tranformanti provereni na proizvodnju meabolita. Dalje, za identifikovanje i kloniranje gena iz biosintetiskih puteva korišćena je hibridizacija probama iz biblioteka drugih vrsta Streptomycesa.
Geni uključni u biosintezu avermektina (ave geni), kao geni poterbni za bisintezu drugih sekundarnih metabolita Streptomyces-a (npr. PKS), nađeni su kao klasteri na hromozomima. Uspešno su klonirani brojni ave geni pomoću evktora koji su komplementni S.avermitilis, mutantima blokiranim u sintezi averemktina. Kloniranje ovakvih gena je opisano u U.S: Patetnu Br. 5,252,474. Dalje, Ikeda et al., 1995, JAntibiot. 48: 532-534, opisuje lokalizaciju hrmozomalnog regiona koji obuhvata fazu dehidratacije C22,23 (aveC) na 4.82Kb BamHI fragmentu S.avermitilis, kao i mutacije u aveC genu pri čemu se dobija jedna komponenta proizvođača B2a. Pošto se ivermiktin, snažno antihelminsko jedinjenje, može hemijski dobiti od avermektina B2a, ovakav proizvođač jedne komponente avermektina B2a se smatra posebno korisnim za komercijalnu proizvodnju ivermiktina.
U.S.Patent Br. 6,248,579, Stuzman-Engwall et al., izdat 19 juna 2001, opisuje određene mutacije aveC gena S.avermitilis, koje vode do dmanjenja odnosa cikloheksil B2: cikloheksil B1 na oko 0.75:1.
PCT publikacija WO 01/12821, Pfyzer Products Ine., objavljene 22 februata 2001, opisuje određene dodatne mutacije aveC gena S.avermitilis koji vode do daljeg smanjenja odnosa cikloheksil B2: cikloheksil BI na oko 0.40:1.
Identifikacija dodatnih mutacija ili kombinacija mutacija u aveC genu koja dalje smanjuje kompleksnost proizvoda avermektina, kao što je npr., mutacija koja dalje smanjuje
odnos avermektina B2:B1, bi pojednostavilo dobijanje i prečišćavanje komercijano važnih avermektina.
3. Opis pronalaska
Ovaj pronalazak se odnosi na polinukleotidne molekule koji sadrže nukeotidne sekvence koje su inače iste kao aleli Streptomyces avermitilis aveC, sekvence S.avermitilis, aveC gena koja kodira proizvod plazmida pSEl 86(ATCC 209604) ili nukleotidne sekvence aveC, ORF S.avermitilis kao što je dato na SLICI 1 (SEQ ID NO: 1), ili njegove izrođene varijante, ali čija nukleotidna sekvenca dalje obuhvata mutacije koje kodiraju supstituciju amino kiselina na amino kiselinskim ostacima koji odgovaraju položajima amino kiselina u SEQ ID NO:2, kao recimo ćelije S.avermitilis lanca ATCC 53692 u kojem je divlji soj aveC alela inaktiviran i koji eksprimuje polinukleotidni molekul, koji sadrži mutirane nukleotidne sekvence, koji može proizvesti odnos klasa 2:1 avermektina koji je redukovan u odnosu na odnos dobijen ćelijama S.avermitilis lanca ATCC53692 koji eksprimuje samo divlji soj aveC alela, pri čemu kada su klase 2:1 avermetkina, cikloheksil B2:cikloheksil B1 avermektinima, odnos klasa 2:1 avermektina je 0.35:1 ili manje. U preferentnijem pristupu, odno cikloheksil B2: cikloheksil BI avermektinima je oko 0.301 ili manje. U još preferentnijem pristupu, odnos cikloheksil B2:cikloheksil BI avermektinima je oko 0.25:1 ili manje. U preferentnijem pristupu, odnos cikloheksil B2:cikloheksil BI avermektinima je oko 0.20: 1 ili manje.
U posebnom pristupu, kombinacija supstitucija amino kiselina obuhvata kombinaciju odabranu iz grupe koja se sastoji od:
(a) D48E,A61T,A89T,S 138T,A139T,G179S,A198G,P289L;
(b) G40S,D48E, L136P, G179S, E238D;
(c) D48E,L136P,R163Q,G179S;
(d) D48E, L136P, R163Q, G179S,E238D;
(e) D48E,L136P,R163Q,G179S,A200G,E238D;
(f) D48E,L136P,G179S,E238D;
(g) D48E,A61T,L136P,G179S,E238D;
(h) D48E,A61T, L136P, G179S;
(i) D48E,A89T,S138T,A139T,G179S;
G) D48E,A61T,L136P,G179S,A198G,P202S,E238D,P289L;
(k) D48E,A61T, L136P,S138T,A139F,G179S, E238D, P289L;
(l) D48E,L136P,G179S,A198G,E238D,P289L;
(m) D48E,A61T,S138T,A139F,G179S,A198G,P289L;
(n) D48E,L84P,G111V,S138T,A139T,G179S,A198G,P289L;
(o) Y28C,D48E,A61T,A89T,S138T,A139T,G179S, E238D;
(p) D48E,A61T,A107T,S 108G, L136P,G179S, S192A, E238D,P289L;
(q) D48E,L136P,G179S,R250W;
(r) D48E,A89T,S138T,A139T,R163Q,G179S;
(s) D48E,L136P,G179S,A198G,P289L;
(t) D48E,F78L,A89T,L136P,G179S;
(u) D48E,A89T,S 13 8T,A13 9T,G 179S,E23 8D,F278L;
(v) D48E,A89T, L136P, R163Q,G179S;
(w) D48E,A61T,A89T,G 111 V,S138T,A139F,G179S, E238D,P289L;
(x) D25G,D48E,A89T,L136P,S138T,A139T,V141A,I159T,R163Q,G179S;
(y) D48E,A89T,S90G,L136P, R163Q,G179S, E238D;
(z) D48E,A61T,A89T,G 111V, S138T,A139T, G179S, E238D,P289L;
(aa) D48E,A89T,S 13 8T, A13 9T,G 179S;
(ab) D48E,L136P,R163Q,G179S,S231L;
(ac) D48E,L136P,S138T,A139F,G179S,V196A,E238D;
(ad) D48E,A61T,A89T,F99S,S138T,A139T,G179S,E238D;
(ae) G35S,D48E,A89T,S138T,A139T,G179S,P289L;
(af) D48E,A61T,A89T,S138T,A 139T,G179S,V196A, E238D;
(ag) D48E,A89T,G i 11 V,S 138T, A139T,G 179S, A198G,E238D;
(ah) S41 G,D48E,A89T,L136P,G179S;
(ai) D48E,A89T,L 136P, R163Q,G179S,P252S;
(aj) D48E,A89T,L136P,G179S,F234S;
(ak) D48E,A89T;L136P,R163Q,G179S,E238D;
(al) Q36R,D48E,A89T,L136P,G179S,E238D;
(am) D48E,A89T,L136P,R163Q,G179S;
(an) D48E,A89T, S138T, G179S;
(ao) D48E,A89T,L136P,G179S,E238D;
(ap) D48E,A89T, L136P, K154E,G179S, E238D;
(aq) D48E,A89T,S 13 8T,A139T,K154R,G 179S, V196 A,P289L;
(ar) D48E,A89T,S138T,A139F,G179S,V196A,E238D;
(as) D48E, A61T, A89T, L136P, G179S, V196A, A198G, P289L;
(at) D48E, A61T, S138T, A139F, G179S, G196A, E238D, P289L;
(au) D48E,A89T,L136P,G179S;
(av) D48E, A89T, V120A, L 136P, G179S;
(aw) D48E,A61T,A89T,S138T,A139F,G179S,V196A,A198G,E238D;
(ax) D48E,A61T,A89T, G111 V,S138T,A139F, G179S, V196A,E238D;
(ay) D48E,A61T, A89T,S 138T,A139T,G179S,V196A,E238D,P289L;
(az) D48E,A61T,A89T, L136P, S138T,A139F, G179S,A198G, E238D;
(ba) D48E,A89T,S138T,A139F,G179S,A198G,V220A;
(bb) D48E,A61T,A89T,S138T,A139T,G179S,V196A,E238D,R239H,P289L;
(bc) D48E, A61T, A89T, L136P, G179S, P289L;
(bd) D48E,A89T,S138T,A139T,G179S,V196A,E238D,P289L; i
(be) D48E,A61T,A89T,S 138T,A139F,G179S,V196A,E238D.
Ovaj pronalazak se dalje odnosi na polinukleotidne molekule koji sadrže nukleotidne sekvence koje su inače iste kao aleli Streptomyces avermitilis aveC, sekvence S.avermitilis, aveC gena koja kodira proizvod plazmida pSE186(ATCC 209604) ili nukleotidne sekvence aveC , ORF S.avermitilis kao što je dato na SLICI 1 (SEQ ID NO:l), ili njegove izrođene varijante, ali čija nuklcotidna sckvcnca dalje sadiži mutacije koje kodiraju supstituciju amino kiselina na amino kiselinskim ostacima koji odgovaraju položajima amino kiselina u SEQ ID NO:2, kao recimo ćelije S.avermitilis lanca ATCC 53692 u kojem je divlji soj aveC alela inaktiviran i koji eksprimuje polinukleotidni molekul, koji sadrži mutirane nukleotidne sekvence, koji može proizvesti odnos klasa 2:1 avermektina koji je redukovan u odnosu na odnos dobijen ćelijama S.avermitilis lanca ATCC53692 koji eksprimuje samo divlji doj aveC alela, pri čemu kada su klase 2:1 avermetkina, cikloheksil B2:cikloheksil BI avermektinima,
odnos klasa 2:1 avermektina je 0.40:1 ili manje, i gde kombinacija supstitucija amino kiselina obuhvata kombinacije odabrane iz grupe koja se sastoji od:
(bf) D48E, S138T,A139T,G179S,E238D, i
(bg) Y28C,Q38R,D48E,L136P,G179S,E238D.
Ovaj pronalazak dalje obuhvata rekombinantne vektore kojisadrže polinukleotidne molekule ovog pronalaska.
Ovaj pronalazak dalje obezbeđuje ćelije domaćina koji sadrže polinukleotidne molekule ili rekombinantne vektore ovog pronalaska. U preferentnom pristupu, ćelija domaćin je Streptomyces ćelija. U preferentnom pristupu, ćelija domaćin je ćelija Streptomyces avermitilis.
Pronalazak dalje obezbeđuje postupak za dobijanje novih sojeva Streptomyces avermitilis, koji obuhvata (i) mutaciju aveC alela u ćelijskom soju S.avermitilis, čijom mutacijom se dobija kombinacija supstitucija amino kiselina u proizvodu aveC gena, ili (ii) uvođenjem u ćelijski soj S.avermitilis mutiran aveC ,alel ili njegovu degenerativnu varijantu koja kodira proizvod aveC gena koji sadržo kombinaciju supstitucija amino kiselina, gde su kombinacije supstitucija amino kiselina odabrane od (a) do (be) date u ranijem tekstu.
Ovaj pronalaza dalje obezbeđuje postupak za dobij anje novih sojeva Streptomyces avermitilis, koji obuhvata (i) mutiranje aveC alela u ćelijskom soju S.avermitilis, čijom mutacijom nastaje kombinacija aminokiselinskih supstitucija u proizvodu AveC gena ili (ii) uvođenjem u ćelijski soj S.avermitilis, mutirani aveC alel ili njegovu degenerativnu varijantu koja kodira proizvod aveC gena koji obuhvata kombinaciju aminokiselinskih supstitucija, pri čemu ćelije sadrže mutirani aveC alel ili njegovu degenerativnu varijantu koja može proizvesti cikloheksil B2:cikloheksil BI avermektinime u odnosu 0.35:1 ili manje. U ne- ograničavajućem pristupu, mutirani aveC alel ili njegova degenerativna varijanta kodira proizvod AveC gena koji obuhvata kombinaciju supstitucija amino kiselina odabranih iz grupe koja se sastoji od (a) do (be) date u ranijem tekstu.
U preferentnom pristupu, odnos cikloheksil B2:cikloheksil BI avermektina iznosi oko 0.30:1 ili manje. U ne-ograničavajućem pristupu, mutirani aveC alel ili njegova degenerativna varijanta kodira proizvod AveC gena koji obuhvata kombinaciju supstitucija amino kiselina odabranih iz grupe koja se sastoji od (f) do (be) date u ranijem tekstu.
U preferentnijem pristupu, odnos cikloheksil B2:cikloheksil BI avermektina je oko 0.25:1 ili manje. U ne-ograničavajućem pristupu, mutirani aveC alel ili njegova degenerativna varijanta kodira proizvod AveC gena koji obuhvata kombinaciju supstitucija amino kiselina odabranih iz grupe koja se sastoji od (w) do (be) date u ranijem tekstu.
U preferentnijem pristupu, odnos cikloheksil B2:cikloheksil BI avermektina je oko 0.20:1 ili manje. U ne-ograničavajućem pristupu, mutirani aveC alel ili njegova degenerativna varijanta kodira proizvod AveC gena koji obuhvata kombinaciju supstitucija amino kiselina odabranih iz grupe koja se sastoji od (ao) do (be) date u ranijem tekstu.
Pronalazak se dalje odnosi na postupak dobijanja novih sojeva sojeva Streptomyces avermitilis, koji obuhvata (i) mutiranje aveC alela u ćelijskom soju S.avermitilis, čijom mutacijom nastaje kombinacija aminokiselinskih supstitucija u proizvodu AveC gena ili (ii) uvođenjem u ćelijski soj S.avermitilis, mutirani aveC alel ili njegovu degenerativnu varijantu koja kodira proizvod AveC gena koji obuhvata kombinaciju aminokiselinskih supstitucija, pri čemu su kombincije supstitucija amino kiselina odabrane iz grupe koja se sastoji od (bf) i (bg) dati ranije. U preferentnom pristupu, ćelije sadrže mutirani aveC alel ili njegovu degenerativnu varijantu koja može proizvesti cikloheksil B2:cikloheksil BI avermektinime u odnosu 0.40:1 ili manje.
Pronalazak dalje obezbeđuje ćelije Streptomyces vrsta koje obuhvataju mutirane S.avermitilis aveC alele ili njihove izrođene varijante koje kodiraju proizvod AveC gena koji obuhvata kombinaciju supstitucije amino kiselina odabarane od (a) do (be) date u ranijem tekstu. U preferentnom pristupu, Streptomyces vrste su S.avermitilis.
Pronalazak dalje obezbeđuje ćelije Streptomyces avermitilis koje mogu proizvesti cikloheksil B2:cikloheksil BI avermektine u odnosu 0.35:1 ili manje. U ne-ograničavajućem pristupu, ćelije sadrže mutirani aveC alel ili njegovu degenerativnu varijantu koja kodira proizvod AveC gena koji obuhvata kombinaciju supstitucija amino kiselina odabranih iz grupe koja se sastoji od (a) do (be) date u ranijem tekstu.
U preferentnom pristupu, odnos cikloheksil B2:cikloheksil B1 avermektina iznosi oko 0.30:1 ili manje. U ne-ograničavajućem pristupu, ćelije sadrže mutirani aveC alel ili njegovu degenerativnu varijantu koja kodira proizvod AveC gena koji obuhvata kombinaciju supstitucija amino kiselina odabranih iz grupe koja se sastoji od (f) do (be) date u ranijem tekstu.
U preferentnijem pristupu, odnos cikloheksil B2:cikloheksil B1 avermektina iznosi oko 0.25:1 ili manje. U ne-ograničavajućem pristupu, ćelije sadrže mutirani aveC alel ili njegovu degenerativnu varijantu koja kodira proizvod AveC gena koji obuhvata kombinaciju supstitucija amino kiselina odabranih iz grupe koja se sastoji od (ao) do (be) date u ranijem tekstu.
Pronalazak dalje obezbeđuje ćelije Streptomyces vrsta koje sadrže mutirane S.avermitilis aveC alele ili njihove izrođene varijante koje kodiraju proizvod AveC gena koje sadrže kombinaciju supsitucija amino kiselina odabranim od (a) do (be) datim u ranijem tekstu. U preferentnom pristupu, vrste Streptomyces su S.avermitilis.
Pronalazak dalje obezbeđuje ćelije Streptomyces avermitilis koje mogu proizvesti cikloheksil B2:cikloheksil B1 avermektine u odnosu 0.35:1 ili manje. U ne-ograničavajućem pristupu, ćelije sadrže mutirani aveC alel ili njegovu degenerativnu varijantu koja kodira proizvod AveC gena koji obuhvata kombinaciju supstitucija amino kiselina odabranih iz grupe koja se sastoji od (a) do (be) date u ranijem tekstu.
U preferentnom pristupu, odnos cikloheksil B2:cikloheksil B1 avermektina iznosi oko 0.30:1 ili manje. U ne-ograničavajućem pristupu, ćelije sadrže mutirani aveC alel ili njegovu degenerativnu varijantu koja kodira proizvod AveC gena koji obuhvata kombinaciju supstitucija amino kiselina odabranih iz grupe koja se sastoji od (f) do (be) date u ranijem tekstu.
U još preferentnom pristupu, odnos cikloheksil B2:cikloheksil B1 avermektina iznosi oko 0.25:1 ili manje. U ne-ograničavajućem pristupu, ćelije sadrže mutirani aveC alel ili njegovu degenerativnu varijantu koja kodira proizvod AveC gena koji obuhvata kombinaciju supstitucija amino kiselina odabranih iz grupe koja se sastoji od (w) do (be) date u ranijem tekstu.
U preferentnom pristupu, odnos cikloheksil B2:cikloheksil B1 avermektina iznosi oko 0.20:1 ili manje. U ne-ograničavajućem pristupu, ćelije sadrže mutirani aveC alel ili njegovu degenerativnu varijantu koja kodira proizvod AveC gena koji obuhvata kombinaciju supstitucija amino kiselina odabranih iz grupe koja se sastoji od (ao) do (be) date u ranijem tekstu.
Pronalazak dalje obezbeđuje ćelije Streptomyces vrsta koje sadrže mutirane S.avermitilis aveC alele ili njihove izrođene varijante koje kodiraju proizvod AveC gena koje
sadrže kombinaciju supsitucija amino kiselina odabranim od (bf) do (bg) datim u ranijem tekstu. U preferentnom pristupu, vrste Streptomyces su S.avermitilis. U preferentnijem pristupu, ćelija je ćelija S.avermitilis koja može proizvesti cikloheksil B2:cikloheksil B1 avermektine u odnosu od oko 0.40:1 ili manje.
Ovaj pronalazak dalje obezbeđuje postupak za doijanje avermektina koji obuhvata gajenje kulture ćelijskog soja Streptomyces avermitilis ovog pronalaska u hranljivoj podlozi pod uslovima koji dozvoljavaju ili indukuju proizvodnju avermektina i regeneracije datih avermektina iz kulture.
Pronalazak dalje obezbeđuje preparate cikloheksil B2:cikloheksil B1 avermektine dobijene od ćelijaStreptomyces avermitilis, koji sadrže cikloheksil B2: cikloheksil B1 avermektine prisutne u podlozi gde su ćelije kultivisane, pri čemu odnos cikloheksil B2:cikloheksil BI avermektina prisutne u hranljivoj podlozi iznosi 0.35:1 ili manje, poželjno oko 0.30:1 ili manje, a još bolje 0.25:1 ili manje, a najbolje oko 0.20:1 ili manje. U posebnom pristupu, preparati Cikloheksil B2 : Cikloheksil BI avermektini su dobijeni od ćelijskog soja S.avermitilis i koji eksprimuje mutirane aveC alele ili njihove izrođene varijante koje kodiraju proizvod gena kod kojeg je smanjen odnos klasa 2:1 cikloheksil B2: cikooheksil B1 averemektina koje proizvode ćelije u poređenju sa istim sojem S.avermitilis koji ne eksprimuje mutirane aveC alele, već eksprimuje samo divlji soj aveC alela.
U preferentnom pristupu, gde je preparat cikloheksil B2:cikloheksil B1 avermektini u odnosu od 0.35:1 ili manje, preparat je dobijen od ćelija koje sadrže mutirane aveC alele ili njihovu degenerativnu varijantu koja kodira proizvod AveC gena koji obuhvata kombinaciju supstitucija amino kiselina odabranih iz grupe koja se sastoji od (a) do (be) datih ranije.
U sledećem preferentnom pristupu, gde je preparat cikloheksil B2: cikloheksil B1 avermektina u odnosu od oko 0.30:1 ili manje, pri čemu su preparat proizveli mutirani aveC aleli ili njegove izrođene varijante koje kodiraju proizvod AveC gena koji obuhvata kombinaciju supstitucija amino kiselina odabranih iz grupe koja se sastoji od (f) do (be) date u ranijem tekstu.
U sledećem preferentnom pristupu, gde je preparat cikloheksil B2: cikloheksil B1 avermektina u odnosu od oko 0.25:1 ili manje, pri čemu su preparat proizveli mutirani aveC aleli ili njegove izrođene varijante koje kodiraju proizvod AveC gena koji obuhvata
kombinaciju supstitucija amino kiselina odabranih iz grupe koja se sastoji od (w) do (be) date u ranijem tekstu.
U narednom preferentnom pristupu, gde je preparat cikloheksil B2: cikloheksil B1 avermektina u odnosu od oko 0.20:1 ili manje, pri čemu su preparat proizveli mutirani aveC aleli ili njegove izrođene varijante koje kodiraju proizvod AveC gena koji obuhvata kombinaciju supstitucija amino kiselina odabranih iz grupe koja se sastoji od (ao) do (be) date u ranijem tekstu.
Pronalazak dalje obezbeđuje preparate cikloheksil B2:cikloheksil BI avermektine dobijene od ćelija Streptomyces avermitilis, koji sadrže cikloheksil B2: cikloheksil B1 avermektine prisutne u podlozi gde su ćelije kultivisane, pri čemu odnos cikloheksil B2:cikloheksil B1 avermektina prisutne u hranljivoj podlozi iznosi 0.40:1 ili manje i dobijeni su od ćelija koje sadrže mutirane aveC alele ili njihove izrođene varijante koje kodiraju proizvod AveC gena koji obuhvata kombinaciju supstitucija amino kiselina odabranih iz grupe koja se sastoji od (bf) do (bg) date u ranijem tekstu.
4. Kratak opis slika
SLIKA 1. DNK sekvenca (SEQ ID NO: 1) koji sadrži S.avermitilis aveC ORF i izvedene amino kiselinske sekvence (SEQ ID NO.2).
SLIKA 2. Plazmidni vektor pSEl86 (ATCC209604) koji obuhvata ćelu ORF aveC gena S.avermitilis.
SLIKA 3. Vektor za zamenu gena pSE180(ATCC209605) koji obuhvata ermE gen Sacc. Erythraea ubačenu u aveC ORF S.avetmitlis.
SLIKA 4. Restrikciona mapa BamHI avermektin klastera poliketid gena sintaze od S.avermitilis sa pet identifikovanih preklapajućih kozmidnih klonova (i to., pSE65, pSE66, pSE67, pSE68, pSE69). Takođe je dat odnos pSEl 18 i pSEl 19.
SLIKA 5. HPLC analiza proizvoda fermentacije koji je proizveo soj S.acermitilis. Kvantitacijaje izvedena poređenjem sa standardnim količinama cikloheksilB 1. Retenciono vreme ciklohekisil B2 iznosi 7.4-7.7 min; retenciono vreme cikloheksil B1 iynosi 11.9- 12.3min. SLIKA 5A. S.avermitilis soj SE180-11 sa aktiviranom aveC ORF. SLIKA 5B. S.avermitilis soj SE180-11 transformisan sapSE188.
SLIKA 6A-M. Liste kombinacija supstitucija amino kiselina kodiranih mutacijama na aveC alelima stoje identifikovano drugim krugom mešanja gena (“gene shuffling”) i njihov efekat na odnos dobijenih cikloheksil B2:cikloheksil BI. Za svaki plazmid, u koloni sa nazivom “Mutacije”, u gornjem delu date su supstitucije amino kiselina, a u donjem delu date su promene nukleotidnih baza koje dovode do ovih supstitucija amino kiselina. Promene nukelotidnih baza u zagradama u tihe promene, tj. one ne dovode do promene sekvenci amino kiselina.
5. Detaljan opis pronalaska
Ovaj pronalazak se odnosi na identifikaciju i karakterizaciju polinukelotidnih molekula sa nukleotidnom sekvencom koja kodira proizvod AveC gena Streptomyces .avermitilis, obrazovanje novih sojeva S.avermitilis koji se mogu koristiti za posmatranje efekata imitiranih proizvoda AveC gena na proizvodnju avermiktina i otkriće da određeni mutirani proizvodi AveC gena mogu da smanje odnos B2:B1 avermektina dobijeih S.avermitilis-om. Ovaj pronalazak je kroz primere opisan u daljem tekstu i to polinukelotidni molekul sa ili nukeotidnom sekvencom koja je istakao kodirajuća sekvenca S.avermitilis AveC genskog proizvoda plazmida pSE186 (ATCC 209604) ili kao nukelotidnom sekvencom ORF sa SLIKE 1 (SEQ ID NO: 1) i za polinukleotidne molekule sa izvedenim imitiranim nukelotidnim sekvencama i njihove izrođene varijante. Mđutim, principi dati u ovom tekstu se mogu analogno primeniti na druge polinukleotidne molekula, uključujući homologe aveC gena drugih Streptomyces uključujući između ostalih npr., S.hygroscopicus i S.griseochromogenes.
5.1 Polinukelotidni molekuli koji kodiraju S.avermitilis proizvod AveC gena
Ovaj pronalazak se odnosi na izolovane polinukleotidne molekule koji sadrže kompletan aveC ORF S.avermitilis-a ili njegov veći deo, pri čemu izolovanom polinukleotidnom molekulu nedostaje kompletan ORF koji se nalazi posle aveC ORF in situ u hromozomu S.avermitilis.
Preferentno je da izolovani polinukleotidni molekul ovog pronalaska ima nukelotidnu sekvencu koja je ista kao ista kao kodirajuća sekvenca S.avermitilis AveC genskog proizvoda plazmida pSE 186 (ATCC 209604) ili kao nukelotidna sekvenca ORF sa SLIKE 1 (SEQ ID NO:l) ili njen glavni deo. Kao stoje ovde korišćen izraz “glavni deo” izolovanog
polinukelotidnog molekula sa nukleotidnom sekvencom koja kodira S.avermitilis proizvod AveC gena, odnosi se na izolovani polinukleotidni molekul koji sadrži najmanje70% kompletne aveC ORF sekvence datu na SLICI 1 (SEQ ID NO:l) i koja kodira funkcionalno ekvivalentan proizvod AveC gena. “Funkcionalno ekvivalentan” proizvod AveC gena je defmisan kao proizvod gena koji kada je eksprimovan u S.avermitilis soju ATCC 53692 gde je aktiviran nativni aveC alel, dovodi do proizvodnje avermektina u suštinski istom odnosu i količini kao što se dobija od S.avermitilis soja ATCC 53692 koji eksprimuje samo funkcionalni divlji sojaveC alela nativan S.avermitilis soju ATCC 53692.
Kao dodatak nukelotidnoj sekvenci aveC ORF, izolovani polinukelotidni molekul vog pronalaska može dalje da sadrži nukelotidne sekvence koje prirodno flankiraju aveC gen in situ u S.avermitilis, kao oni koji flankiraju nukleotidne sekvence date na SLICI 1 (SEQ ID NO:l).
Ovaj pronalazak se dalje odnosi i na izolovane polinukleotidne molekule sa nukleotidnom sekvencom SEQ ID NO:l ili njegove izrođene varijante, kao što se zasniva na poznatoj degenerativnosti genetskog koad.
Kao što su ovde korišćeni izrazi “polinukleotidni molekul”, “polinuleotidna sekvenca”, “kodirajuća sekvenca”, otvoreni okvir čitanja (“open-reading ffame”) i ORF odnose se i na DNK i na RNK molekule, koji mogu ili biti jedno-lančani ili dvostuko-lančani i koje mogu biti transkribovani ili prevedeni (DNK) ili prevedeni (RNK) i proizvod AveC gena ili u peptid koji je homolog AveC genskom proizvodu u odgovarajućem ekspresionom sistemu ćelija domaćina, kada su stavljeni pod kontrolu odgovaijućih regulatomih elemenata. Kodirajuća sekvenca može da obuhvati ali nije ograničena na prokariotske sekvence, cDNK sekvence, sekvene DNK genoma i hemijski sintetisani DNK i RNK sekvence.
Nukleotidna sekvenca date na SLICI 1 (SEQ ID NO:l) sadrži četiri različita GTG kodona na bp položaju 42, 174, 177 i 180. Kao što je prethodno opisano u U.S. patentu br. 6,248,579, višetruka uklanjanja (brisanja) 5’ regiona sa aveC ORF (SLIKA 1; SEQ ID NO:l) je tako konstruisano da pomažu u defmisanju koji od ovih kodona može da funkcioniše sa ORF aveC kao mestima početka ekspresije proteina. Brisanje prvog GT mesta na bp 42 nije eliminisala AveC aktivnost. Dodatno brisaje svih GTG kodona na bp položajima 174, 177 i 180 zajedno eliminišu aktivnost AveG, što ukazuje na to da je ova deo neophodan za ekspresiju gena. Ovaj pronalazak obuhvata različite dužine ORF-ova aveC.
Ovaj pronalzak se dalje odnosi na polinukleotidne molekule sa nukleotidnom sekvencom koja je homolga sekvenci koja kodira proizvod AveC genu S.avermitilis plazmida pSE186(ATCC 209604) ili na kuleotidne sekvence ORF aveiC datog na SLICI 1 (SEQ ID NO: 1) ili njgov veći deo. Izraz “homolog” kada se odnosi na polinukleotidni molekul koji je homolog sekvenci koja kodira proizvod AveC genu S.avermitilis-a označava polinukelotidni molekul sa nukelotidnom sekvencom: (a) koja kodira isti proizvod AveC gena kao homolga sekvenca koja kodira proizvod AveC genu S.avermitilis plazmida pSE186(ATCC 209604) ili koja kodira isti proizvod AveC gena kao nukleotidna sekvenca ORF aveC data na SLICI 1 (SEQ ID NO: 1), ali koja obuhvata jednu ili više tihih izmena na nukleotidnim sekvencama u skladu sa izrođenošću genetskog koda (t.j. izrođena varijanta); ili (b) koja hibiridizuje komlementaran polinukleotidan molkul koji ima nukelotidnu sekvencu koja kodira sekvencu amino kiselina koja je kodirana sekvencom koja kodira proizvod AveC gena plazmida pSE186(ATCC 209604) ili koja kodira sekvencu amino kiselina datu na SLICI 1 (SEQ ID NO:2) pod utvrđenim uslovima, tj. hibridazacijaDNK molekula vezanog za filter u 0.5M NaHP04, 7% natrijum dodecil sulfat (SDS) i lmM EDTA na 65°C i ispiranjem 2xSSCO/01%SDS na 42°C (vidi Ausbel et al. (eds.), 1989, Current Protocols in Molecular Biologv. Vol I, Green Publishing Associates, Ine. And John Wiley & Sons, Ine., New York na p. 2.10.3) i kodira funkcionalno ekvivalentan proizvod AveC gena kao stoje ranije defmisano. U preferentnom pristupu, homologi polinukleotidni molekul se hibridizuje u komplementarnu sekvencu koja kodira proizvod AveC gena plazmida pSEl 86(ATCC 209604) ili u komlement nukelotidnoj sekvenci ORF aveC datog na SLICI 1 (SEQ ID NO: 1) ili njegov veći deo pod strogo utvrđenim uslovima, tj.hibirdizacija DNK vezanog za filter u 0.5M NaHP04, 7% SDS, lmM EDTA na 65°C i ispiranjem 0.1xSSC/0.1% SDS na 68°C (Ausubel, etal., 1989, dat prethodno) i kodira funkcionalno ekvivalentan proizvod AveC gena kao stoje ranije definisano.
Aktivnost proizvoda AveC gena i njegovih potencijalnih funkcionalnih ekvivalenata, mogu se odrediti kroz HPLC analizu proizvoda fermentacije, kao stoje opisano u primerima u daljem tekstu. Polinkelotidan molekul sa nukleotidnom sekvencom koja kodira funkcionalne ekvivalente proizvod AveC gena S.avermitilis mogu da sadrže prirodne aveC gene prisutne u drugim sojevima S.avermitilis, homologne gene aveC prisutne u drugim vrstama Streptomyces i mutirani aveC aleli, bilo da su prirodni ili sintetisani.
Ovaj pronalazak se dalje odnosi na polinukelotidne molekule koji sadrže nukelotidne sekvence koje kodiraju polipeptid sa sekvencom amino kiselina koja je homologna aminokiselinskoj sekevnci koju kodira proizvod AveC gena plazmidapSE 186 (ATCC209604) ili aminokiselinska sekvenca data na SLICI 1 (SEQ ID NO:2) ili njen veći deo. Kao stoje ovde krišćeno “veći deo” aminokiselinske sekvence na SLICI 1 (SEQ ID NO:2) odnosi se na polipeptid koji sadrži najmanje oko 70% aminokiselinske sekvence date na SLICI 1 (SEQ ID NO:2) i koja sadrži funkcionalne ekvivalente proizvoda AveC gena, kao stoje ranije defmisano.
Izraz “homologan” koji je ovde korišćen tako da se odnosi na aminokiselinsku sekvencu koja je homologna aminokisleinskoj sekvenci proizvod AveC gena, odnosi se i na polipeptid koji ima aminokiselinsku sekvencu datu na SLICI 1 (SEQ ID NO:2), ali gde je jedan ili više aminokiselinskih ostataka supstitusan različitim amino kiselinskim ostacima, pri čemu data aminokiselinska sekvenca ima najmanj oko 70%, bolje oko 80%, a najbolje oko 90% aminokiselinsku sekvencu polipeptida koji je kodiran sekvencom koja kodira proizvod AveC gena plazmida pSE 186(ATCC 209604) ili aminokiselinsku sekvencu sa SLIKE 1 (SEQ ID NO:2) kao stoje određeno standardnim algoritmom određivanja aminokiselinskih sekvence, kao stoje BLASTP algoritam (GENEBANK, NCBI) i gde ova zamena amino kiselinama istih osobina (konzervativna supstitucija) daje funcionalno ekvivalentan proizvod gena, kao stoje ranije defmisano. Konzervativna supstitucija amino kiselina je dobro poznata u tehnici. Pravila za izvođenje ovih supstitucija između sotalih su dati i u Dayhof, M.D., 1978, Nat. Biomed. Res. Foud., Washington, D.C., Vol.5, Sup.3. Detaljnije, konzervativne supstitucije amino kiselina su one koje se dešavaju uokviru familije (klase) amino kiselina koje su slične po polaritetu i kiselosti. Genetski kodirane amino kiseline su generalno podeljene u četiri grupe: (1) kisele = aspartat, glutamat; (2)bazne= lizin, arginin, histidin; (3) ne-polame = alanin, valin, leucin, izoleucin, prolin, fenilalanin, metionin, triptofan; i (4) polarne nenaelektrisane = glicin, asparagin, glutamin, cistein, serin, teronin, tirozin. Fenilalanin, triptofan i tirozin su još zajedno označeni kao aromatične amino kiseline. Jedna ili više zamena u okviru određene grupe, npr., leucin, sa izoleucinom ili valinom, ili aspartat sa glutamatom ili treonin sa serinom ili bilo koji drugi aminokiselinski ostatak sa strukturno sličnim ostacima aminokiselina, npr., ostatak amino kiselina slične polamosti ili kiselosti ili
koje su slične po nekim svojim kombinacijama, će generalno imati beznačajan efekat na fimckionisanje polipeptida.
Proizvodnja i rukovanje ovde opisanim polinukleotidnim molekulima su u okviru znanja prosečnog stručnjaka i mogu se sprovesti prema tehnikama rekombinovanja opisnim u npr., Maniatis, et al., 1989, Molecular Cloning. A Laboratorv Manuah Cold Spring Harbor Laboratory press, Cold Sprig Harbor, NY; Ausubel et ah, 1989, Current Protocols in Molecular Biologv, Greene Publishing Associates & Wiley Interscience, NY; Sambrook, et ah, 1989, Molecular Cloning: a Laboratorv Manuah 2d, ed., Cold Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY; Innis et al (eds), 1995, PCR Strategies. Academic Press, Ine., San Diego; i erlich (ed), 1992, PCR Technologv. Oxfrod Univerity Press, Ney York, svi ovde dati referencom. Polunkleotidni molekuli koji kodiraju proizvod AveC gena ili proizvodi homolognih AveC gena mogu se identifikovati primenom postupaka poznatih u tehnici, uključujući i postupke date u Delu 7, datom u daljem tekstu, ali ne iograničvajući se njime.Biblioteke genomskih DNK su proveravane na ave C i homologne ave C kodirajuće sekvence primenom tehnika kao što su postupci dati u Benton and Daviš, 1977, Science 196:180, za bakteriofagnu biblioteku i u Grustein and Hogness, 1975, Proc. Natl. Acad.Sci. USA, 72: 3961-3965 za plazmidnu biblioteku. Polinukelotidni molekuli sa nukleotidnom sekvencom za koju se zna da sadrži ORG aveC, kao stoje prisutna u npr., plazmidnom pSEl 86 (ATCC 209604) ioi u plasmidnom pSEl 19(opisan u Delu 7, u daljem tekstu), se mogu korisititi kao testovi u ovim eksperimentima. Alternativno, oligonuklotidni testovi se mogu sintetisati tako da odgovaraju nekleotidnoj sekvenci izvedenoj iz parcijale ili kompletne aminokiselinske sekvenceprečišćenog proizvoda homogonog AveC gena.
5.2 Rekombinantni sistem 5.2.1. Kloniranje i ekspresioni vektori
Ovaj pronalazak se dalje odnosi na rekombinatne vektore kloniranja i ekspresione vektore koji su korisni za kloniranje ekspresionih polinukleotidnih molekula ovog pronalaska, npr., ORF aveC S.avermitilis ili drugi ORF homolog aveC. U neograničavajućem pristupu, ovaj pronalazak se odnosi na pazmidni pSE186(ATCC209604), koji obuhvata kompletan ORF aveC gena S.avermitilis.
regulatomim elementom i tako semšetenim daje eksprimovani epitop spojen u AveC polipeitd. Naprimer, nukleotidna koja kodira FLAG™ epitop tag (intemational Biotechnologies Ine.) koja je lipofilni marker peptid, može se ubaciti standardnim tehnikama u ekspresioni vektor na odgovarajućem mestu npr., karboksilnom kraju AveC polipeptida. Eksprimovan fuzionisani proizvod Ave C polipeptid-FLAG™ epitop se može detektovati i afinitetno prečistiti pomoću komercijalno dostupnih anti-FLAG™ antitela.
Ekspresioni vektor koji kodira AveC fuzionisani protein može se modifikovati tako da sadrži polilinker sekvence koje kodiraju specifična mesta sečenja za proteaze tako da se eksprimovan AveC polipeptid može osloboditi iz regiona nosača ili fuzionisanog partnera, dodatkom specifične proteaze. Na primer, vektor fuzionisanog proteina može da sadrži između ostalog DNK sekvencu koja kodira trombin ili mesta sečenja za faktor Xa.
Signalna sekvenca uzvodno od i u okviru čitanja sa, ORF aveC se može modifikovati u ekspresioni vektor poznatim postupcima za usmeravanje kretanja i sekrecije eksprimovanog proizvoda gena. Ne-ograničavajući primeri signalnih sekvenci su između ostalih i a-faktor, imunoglobulini, proteini spoljašnje membrane, penicilinaze i receptori T-ćelija.
Za pomoć u odabiru ćelija domaćina transformiranih ili transfektovanih kloniranjem ili ekspresionim vektorima ovog pronalaska, vektor se može modifikovati tako da dalje sadrži kodiraj uću sekvencu za proizvod gena reportera ili drugi selektibilni marker. Poželjno je daje ova kodirajuća sekvenca u operativnoj vezi sa kodirajućom sekvencom regulatomog elementa kao stoje ranije opisano. Geni reporteri koji su korisni u pronalasku su dobro poznati u tehnici i obuhvataju između ostalih one koji kodiraju yeleni fluorescentni protein, luciferazu, xylE i tirozinazu. Nukleotidne sekvence koje kodiraju selektibilne markere su dobro poznate u tehnici i obuhvataju između ostalih one koji kodiraju genski proizvod koji prensi otpornost na antibiotike ili anti-metabolite ili koji obezbeđuju auksotropne uslove. Na primer ovakva sekvena obuhvata one koji kodiraju rezistenciju, između ostalih, na eritormicin, tiostrepton ili kanamicin.
5.2.2. Transformacija ćelija domaćina
Ovaj pronalazak se dalje odnosi na transformisane ćelije domaćine koje sadrže polinukleotidne molekule ili rekombinantne vektore pronalaska, i nove vrste izvedenih ćelijskih linija. Ćelije domaćini korisni u primeni ovog pronalaska su Streptomyces ćelije,
amda se mogu koristiti i druge prokariotske ćelije ili eukariotske ćelije. Ovako transformisane ćelije domaćini obično obuhvataju, ali nisu i ograničeni na mikroorganizme, kao što su bakterije transformisane između ostalih rekombinantnim bakteriofagnim DNK, plazmidnom DNK ili kozmidnim DNK vektorom ili kvasac transformisan rekombinantnim vektorima.
Predviđeno je da polinukelotidni molekuli ovog pronalaska deluju u Streptomyces ćelijama, ali se takođe mogu transformisati u druge bakterijske ili eukariotske ćelij, npr., za kloniranje ili ekspresiju. Obično se može koristiti lanac E.coli, kao na primer, lanacDN5a lanac, nabavljen od American Type Culture Collection (ATCC), Rockville, MD, USA (Accession No. 31343) i iz drugih komercijalnih izvora (Stratagene). Preferentne eukariotske ćelije su ćelije kvasca, mada se efikasno mogu koristiti i ćelije sisara ili insekata
Rekombinantni ekspresioni vektor pronalaska je uveden, npr., transformisan ili transfektovan u jednu ili više ćelija domaćina homogene ćelijske kulture. Ekspresioni vektor je generalno uveden u ćeliju domaćina u skladu sa poznatim tehnikama, kao što, npr, tranformacija protoplasta, taloženje kalcijum fosfatom, tretiranje kalcijum hloridom, mikroinjekcije, elektroportacija, transfekcija kontaktom sa rekombinovanim virusom, transfekcija lipozomima, tranfekcija DEAE-dekstanom, trandukcija, konjugacija ili bombardovanje mikroprojektilima. Odabir tranformanta se može izvesti standardnim procedurama, kao što je odabir ćelija koje eksprimuju selektibilnimarker, npr., otpornost na antibiotik, povezan sa rekombinantnim vektorom, kao što je ranije opisano.
Kada se jednom uvede ekspresioni vektor u ćeliju domaćina, integracija i održavanje kodirajuće sekvence aveC ili u hromozomu ćeliji domaćina ili se epizomalno može potvrditi standardnim tehnikama, npr., Southem-ova hibridizaciona analoza, analiza restrikcionim enzimima, PCR analiza, uključujući reverznu transkriptazu PCR (rt-PCR) ili imunološkim esejima za detekciju očekivanog proizvoda gena. Ćelije domaćini koje sadrže i/ili eksprimuju sekvencu koja kodira rekombinantni aveC, može se identifikovati jednim od četiri opšta pristupa koji su poznati u tehnici, uključujući: (i) DNK-DNK, DNK-RNK ili RNK hibridizacija sa anti- RNK (ii) đetektovanje prisustva funkcija “marker” gena (iii) procenjivanje nivoa transkripcije merenog ekspresijom aveC-specifičnih mRNK-transkripta u ćeliji domaćinu; i (iv) đetektovanje prisustva zrelog polipeptidnog proizvoda kao što je izmereno npr., imunoesejem ili prisustvom biološki aktivnosg aveC (npr., proizvodnja
avermektina indikativne aktivnosti AveC gena u , npr., ćeliji domaćinu S.avermetilis, u specifičnom odnosu i količini).
5.2.3 Ekspresija i karakterizaciia Proizvoda rekombinantnoe aveC gena
Kada se prirodna ili mutirana sevenca koja kodira aveC uvede u odgvorajućućeliju domaćina, tranformisana ćelija domaćina je umožena kloniranjem i dobijene ćelije mogu rasti pod uslovima koji daju maksimalnu proizvodnju prirodnog ili mutiranog proizvoda AveC gena. Ovi uslovi obično uključuju ćelije koje rastu do velkie gustine. Kada ekspresioni vektor sadrži inducibilni promoter, primenjuju se sledeći uslovi kako bi se indukovala ekspresija: npr., promena temperature, iskorišćenjenje hranljivih materija, dodatak proizvoljnih indiktora (npr., analoga ugljenih hidrata, kao stoje izopropil-P-D-tiogalaktopiranozil (IPTG)), akumulacija viška metaboličkih sprednih proizvoda ili slično.
Kada je višak proizvoda AveC gena zaostao u unutršnjosti ćelije domaćina, ćelije se prikupe i liziraju i proizvod izoluje i prečisti iz lizata pod uslovima ekstrakcije poznate u tehnici za minimiziranje degradacije proteina kao što je npr., 4°C ili u prisustvu inhibitora proteaze ili oba. Kada je ekprimovan proizvod AveC gena iz ćelije domaćina, iskorišćen hranjivi medijum se jednostavno može prikupiti i iz njega izolovati proizvod.
Eksprimovan proizvod AveC gena se može izolovati ili prečistiti iz ćelijskih lizata ili medijuma ćelijske kulture, po potrebi, prema standardnim postupcima, uključujući, ali ne i ograničavajući se na bilo koju kombinaciju sledećih postupaka: taloženje amonijum sulfatom, frakcionisanje prema veličini, iono-izmenjivačka hromatografija, HPLC, centrifugiranje u gradijentu gustine i afinitetnom hromatografijom. Kada eksprimovan proizvod AveC gena pokazuje biološku aktivnost, povećavanje čistoće prilikom dobijanja se može pratiti u svakom koraku postupka prečišćavanja primenom odgovarajućeg eseja. Bilo da eksprimovan proizvod AveC gena pokazuje biološku aktivnost ili ne, može se detektovati na osnovu, npr., veličine, reaktivnosti sa antitelom specifičan za AveC ili prisustvom na fuzionisani marker. Kao što je ovde korišćen, proizvod AveC gena je “ pretežno prečišćen” kada se proizvod sastoji od više od oko 20 težinskih % proteina u datom preparatu. Takođe, kao što je ovde korišćen, proizvod AveC gena je “izolovan” kada se proizvod sastoji od oko 80tež% proteina u određenom preparatu.
Ovaj pronalazak dalje obezbeđuje rekombinantno-eksprimovan izolovan ili pretežno prečišćen proizvod AveC gena S.avermitils-a koji sadrži aminokiselinsku sekvencu kodiranu sekvencom koja kodira proizvod AveC gena plazmida pSE186(ATCC 209604) ili aminokiselinsku sekvencu na SLICI 1 (SEQ ID NO:2) ili njen veći seo i njegove mutirane i izrađene varijante.
Pronalazak se dalje odnosi na postupak za dobijanje proizvoda AveC gena, koji obuhvata kultivisanje ćelija domaćina transformisanih rekombinantnim ekspresionim vektorom, pri čemu dati vektor sadrži polinukeotidni molekul sa nukleotidnom sekvencom koja kodira proizvod AveC gena, a polinukleotidni molekul je u operativnoj vezi sa jednim ili više regulatomih elelmenata koji kontrolišu ekspresiju polinukleotidnog molekula u ćeliji domaćinu, pod uslovima koji doprinose dobijanju rekombinantnog proizvoda AveC gena i regeneraciju proizvoda AveC gena iz ćelijske kulture.
Rekombinantno eksprimovan proizvod AveC gena S.avermitilis-a se koristi u različite svrhe, uključujući proveravanje jedinjenja koja menjaju dunkciju proizvoda AveC gena i tako moduliraju biosintezu avermektina , kao i za povećanje antitela usmerenih protiv proizvoda AveC gena.
Kada se dobije proizvod AveC gena dovoljne čistoće, može se okarakterisati standardnim postupcima, uključujući SDS-PAGE, ekskluzionu hromatogradiju, analizu amino kiselinske sekvenca, biološka aktinost pri dobijanju odgovarajućih proizvoda u biosintetičkim putevima avermektina, itd. Na primer, aminokiselinska sekvenca proizvoda AveC gena se može odrediti korišćenjem standardnih tenhika sekvencioniranja peptida. Proizvod AveC gena se dalje može okarakterisati analizom hidrofilnosti (videti npr., Hopp and woods, 1981, Proc.Natl.Acad.Sci.LS4 78: 3824) ili analognim softverskim algoritmima, za identifikaciju hidrofobnih i hidrofilnih regiona proizvoda AveC gena. Strukturna analiza se može izvesti za identifikaciju regiona proizvoda AveC gena koji ima specifičnu sekundarnu strukturu. Biofizički postupci kao što je Rendgenografska kristalografija (Engstrom, 1974, Bichem.Exp.Biol. 11: 7-13), kompjutersko modeliranje (Fletterick and Zolleer (eds), 1986, u Current Communication in Molekular Biologv. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring harbor, NY) i nuklearna magnetna rezonanca (NMR) se mogu koristiti za mapiranje i isitivanja mesta interakcije proizvoda AveC gena i njegovog sustrata. Informacije dobijene iz
ovih isptitivanja mogu se koristiti za označavanje novih mesta za mutaciju ORF aveC ili kao pomoć za razvoj novih sojeva S.avermitilis sa više poželjnih karakteristika avermektina.
5.3 Sastav i primena mutanata AveC
Primem cilj ovog pronalaska je da identifikuje nove mutacije u aveC alelima S.avermitilis-a koje rezultuju u promeni, a još bolje u smanjenju odnosa B2:B 1 averemktina. Ovaj pronalazak tako obezbeđuje polinukleotidne molekule korisne za dobijanje novih sojeva ćelija S.avermitilis koje pokazuju promenu, koja se može detektovati, u proizvodnji avermektina u poređenju sa ćelijama istog soja, ali koja eksprimuje samo divlji soj aveC alela. U preferentnom pristupu, ovi polinukelotidni molekuli su korisni za dobijanje novih sojeva S.avermitilis ćelija koje proizvode avermektine u smanjenom odnosu klasa 2:1 u poređenju sa ćelijama istog soja koje eksprimuju samo divlji soj aveC alela. Ćelije ovog soja takođe obuhvataju dodatne mutacije za dobijanje povećanje količine avekrmektina u poređenju sa ćelijama istog soja koji eksprimuje samo jedanu vrstu divljeg soja aveC alela.
Mutacije aveC alela ili kodirajućih sekvenci obuhvataju sve mutacije koje uvode jednu ili više aminokiselinskih supstitucija, uklanjanje i/ili dodavanje u proizvod AveC gena ili koji rezultuju u skraćivanju proizvoda AveC gena ili bilo koje kombinacije i koja daje željeni rezultat. Ove mutirane sekvence aveC alela daju polinukleotidni molekul kojisa drži nukelotidnu sekvencu aveC alela ili njegovu izrođenu varijantu ili sekvenca koja kodira proizvod AveC gena plazmida pSE186(ATCC209604) ili njenu izrođenu varijantu ili nukelotidnu sekvencu ORF aveC S.avermitilis-a kao što je dato na SLICI 1 (SEQ ID NO:l) ili njenu izrođenu varijantu, ali da dalje sadrži mutacije koje kodiraju kombinaciju supstituciju amino kiselina na odabrani položajima proizvoda AveC gena. U neograničavajućem pristupu, ovakva supstitucija najednom ili više položaja amino kiselina u proizvodu AveC gena odgovara amino kiselinama na položajima 25, 28, 35, 36, 40, 41, 48, 55, 61, 78, 84, 89, 90, 99, 107, 108, 111, 120, 123, 136, 138, 139, 141, 154, 159, 153, 179, 192, 196, 198, 200, 202, 220, 228, 229, 230, 231, 234, 238, 239, 250, 252, 266, 275, 278, 289 ili 298 u SEQ ID NO:2. Preferentne kombinacije položaja amino kiselina koje se supstituišu, obuhvataju jednu ili više aminokiselinskih ostataka D48, A61, A89, L136, S138, A139, R163, G179, V196, A198 E238 i P289. Posebno su prefemtne kombinacije amino kiselinskih supstitucija koje obuhvataju supstitucije i na D48 i G179, odnosno D48E i G179S. Specifični primeri kombinacija
aminokiselinskih supstitucija koji rezultuju u smanjenju odnosa cikloheksil B2:cikloheksil BI su date na SLICI 6A-J.
Ovaj pronalazak se dalje odnosi na polinukleotidne molekule sa nukleotidnim sekvencama koje su iste kao u aveC alelima Streptomyces avermitilis, sekvenca koja kodira proizvod AveC gena S.avermitilis plazmida pSEl 86(ATCC209604) ili nukelotidnu sekvencu ORF aveC S.avermitilis- a kao stoje dato na SLICI 1 (SEQ ID NO:l) ili njenu izrođenu varijantu, ali čija nukleotidna sekvenca dalje obuhvata mutacije koja kodiraju kombinaciju supstitucija amino kiselina na aminokiselnskim krajevima koje odgovaraju amino kiselinama na položajima SEQ ID NO:2, kao što su S.avermitilis ćelije soja ATCC 53692 u kojima je divlji soj aveC alela neaktiviran i koji eksprimuje molekule polinukleotida koji sadrže mutiranu nukelotidnu sekvencu koje mogu proizvesti odnos klasa 2:1 avermektina koje je manji u poređenju sa odnosom dobijenim od S.avermitilis ćelija soj ATCC53692 koji eksprimuje samo aveC alele divljeg soja, gde odnos klasa 2:1 avermektina su cikloheksil B2: cikloheksil BI avermektini, odnos klasa 2:1 avermektina iznosi 0.35:1 ili manje. U preferentnom pristupu, odnos cikloheksil B2:sikloheksil BI avermektina iznosi oko 0.30:1 ili manje. U preferentnijem prustupu, odnos ciklohekcil B2: cikloheksilB 1 avermektina je oko 0.25:1 ili manje. U preferentnijem pristupu, odnos cikloheksilB2:cikloheksilBl avermektina je oko 0.20:1.
U posebno preferentnom pristupu, kombinacija supstitucija aminokiselina obuhvata kombinacije grupa (a): D48E, A61T, A89T, S138T, A139T, G179S, A198G, P289L. Ne- ograničavajući primer plazmida koji kodira ove supstitucije amino kiselina je pSE538 (vidi SLIKU 6).
U sledećem posebno preferentnom pristupu, kombinacije supstitucija amino kiselina obuhvata kombinaciju grupe (b): G40S, D48E, L136P, G179S, E238D. Ne-ograničavajući primer plazmida koji kodira ove supstitucije amino kiselina je pSE559.
U narednom posebno preferentnom pristupu, kombinacije supstitucija amino kiselina obuhvata kombinaciju grupe (c): D48E, L136P, R163Q, G179S. Ne-ograničavajući primer plazmida koji kodira ove supstitucije amino kiselina je pSE567.
U sledećem posebno preferentnom pristupu, kombinacije supstitucija amino kiselina obuhvata kombinaciju grupe (d): D48E, L136P, R163Q, G179S, E238D. Ne-ograničavajući primeri plazmida koji kodiraju ove supstitucije amino kiselina su pSE570 i pSE572.
U sledećem posebno preferentnom pristupu, kombinacije supstitucija amino kiselina obuhvata kombinaciju grupe (e): D48E, L136P, R163Q, G179S, A200G, E238D. Ne- ograničavajući primer plazmida koji kodira ove supstitucije amino kiselina je pSE571.
U narednom posebno preferentnom pristupu, kombinacije supstitucija amino kiselina obuhvata kombinaciju grupe (f): D48E, L136P, G179S, E238D. Ne-ograničavajući primeri plazmida koji kodiraju ove supstitucije amino kiselina su pSE501 i pSE546.
U sledećem posebno preferentnom pristupu, kombinacije supstitucija amino kiselina obuhvata kombinaciju grupe (g): D48E,A61T, L136P, G179S, E238D. Ne-ograničavajući primer plazmida koji kodira ove supstitucije amino kiselina je pSE510.
U narednom posebno preferentnom pristupu, kombinacije supstitucija amino kiselina obuhvata kombinaciju grupe (h): D48E, A61T, L136P, G179S. Ne-ograničavajući primer plazmida koji kodira ove supstitucije amino kiselina je pSE512.
U sledećem posebno preferentnom pristupu, kombinacije supstitucija amino kiselina obuhvata kombinaciju grupe (i): D48E, A89T, S138T, A139T, G179S. Ne-ograničavajući primer plazmida koji kodira ove supstitucije amino kiselina je pSE519.
U još jednom posebno preferentnom pristupu, kombinacije supstitucija amino kiselina obuhvata kombinaciju grupe (j): D48E,A61T, L136P, G179S, A198G, P202S, E238D, P289L. Ne-ograničavajući primer plazmida koji kodiraju ove supstitucije amino kiselina je pSE526.
U sledećem posebno preferentnom pristupu, kombinacije supstitucija amino kiselina obuhvata kombinaciju grupe (k): D48E, A61T, L136P, S138T, A139F, G179S, E238D, P289L. Ne-ograničavajući primer plazmida koji kodira ove supstitucije amino kiselina je pSE528.
U narednom posebno preferentnom pristupu, kombinacije supstitucija amino kiselina obuhvata kombinaciju grupe (1): D48E, L136P, G179S, A198G, E238D, P289L. Ne- ograničavajući primer plazmida koji kodira ove supstitucije amino kiselina je pSE530.
U narednom posebno preferentnom pristupu, kombinacije supstitucija amino kiselina obuhvata kombinaciju grupe (m): D48E,A61T, S138T, A139F, G179S, A198G, P289L. Ne- ograničavajući primer plazmida koji kodira ove supstitucije amino kiselina je pSE531.
U još jednom posebno preferentnom pristupu, kombinacije supstitucija amino kiselina obuhvata kombinaciju grupe (n): D48E, L48P, G11IV, S138T, A139T, G179S, A198G,
P289L. Ne-ograničavajući primer plazmida koji kodiraju ove supstitucije amino kiselina je pSE534.
U sledećem pristupu, kombinacije supstitucija amino kiselina obuhvata kombinaciju grupe (o): Y28C, A61T, A89T, S138T, A139T, G179S, E238D. Ne-ograničavajući primer plazmida koji kodira ove supstitucije amino kiselina je pSE535.
U narednom pristupu, kombinacije supstitucija amino kiselina obuhvata kombinaciju grupe (p): D48E, A61T, A107T, S108G, L136P, G179S, S192A, E238D, P289L. Ne- ograničavajući primer plazmida koji kodira ove supstitucije amino kiselina je pSE542.
U narednom pristupu, kombinacije supstitucija amino kiselina obuhvata kombinaciju grupe (q): D48E, L136P, G179S, R250W. Ne-ograničavajući primer plazmida koji kodira ove supstitucije amino kiselina je pSE545.
U sledećem posebno preferentnom pristupu, kombinacije supstitucija amino kiselina obuhvata kombinaciju grupe (r): D48E, A89T, S138T, A139T, R163Q, G179S. Ne- ograničavajući primer plazmida koji kodira ove supstitucije amino kiselina je pSE548.
U narednom pristupu, kombinacije supstitucija amino kiselina obuhvata kombinaciju grupe (s): D48E, L136P, G179S, A198G, P289L. Ne-ograničavajući primer plazmida koji kodira ove supstitucije amino kiselina je pSE552.
U još jednom pristupu, kombinacije supstitucija amino kiselina obuhvata kombinaciju grupe (t): D48E, F78L, A89T, L136P, G179S. Ne-ograničavajući primer plazmida koji kodira ove supstitucije amino kiselina je pSE557.
U narednom pristupu, kombinacije supstitucija amino kiselina obuhvata kombinaciju grupe (u): D48E, A89T, S138T, A139T, G179S, E238D, F278L. Ne-ograničavajući primeri plazmida koji kodiraju ove supstitucije amino kiselina su pSE564 i pSE565.
U sledećem pristupu, kombinacije supstitucija amino kiselina obuhvata kombinaciju grupe (v): D48E, A89T, L136P, R163Q, G179S. Ne-ograničavajući primer plazmida koji kodira ove supstitucije amino kiselina je pSE568.
U narednom pristupu, kombinacije supstitucija amino kiselina obuhvata kombinaciju grupe (w): D48E, A61T, A89T, G111V, S138T, A139T, G179S, E238D, P289L. Ne- ograničavajući primer plazmida koji kodira ove supstitucije amino kiselina je pSE543.
U još jednom pristupu, kombinacije supstitucija amino kiselina obuhvata kombinaciju grupe (x): D25G, D48E, A89T, L136P, S138T, A139T, V141A, I159T, R163Q, G179S. Ne- ograničavajući primer plazmida koji kodira ove supstitucije amino kiselina je Pse504.
U sledećem pristupu, kombinacije supstitucija amino kiselina obuhvata kombinaciju grupe (y): D48E, A89T, S90G, L136P, P163Q, G179S, E238D. Ne-ograničavajući primer plazmida koji kodira ove supstitucije amino kiselina je pSE508.
U narednom pristupu, kombinacije supstitucija amino kiselina obuhvata kombinaciju grupe (z): D48E, A61T, A89T, G11IV, S138T, A139T, G179S, E238D, P289L. Ne- ograničavajući primer plazmida koji kodira ove supstitucije amino kiselina je pSE511.
U još jednom posebno preferentnom pristupu, kombinacije supstitucija amino kiselina obuhvata kombinaciju grupe (aa): D48E, A89T, S138T, A139T, G179S, A198G. Ne- ograničavajući primer plazmida koji kodira ove supstitucije amino kiselina je pSE520.
U sledećem pristupu, kombinacije supstitucija amino kiselina obuhvata kombinaciju grupe (ab): D48E, L136P, R163Q, G179S, S231L. Ne-ograničavajući primer plazmida koji kodira ove supstitucije amino kiselina je pSE523.
U narednom pristupu, kombinacije supstitucija amino kiselina obuhvata kombinaciju grupe (ac): D48E, L136P, S138T, A139F, G179S, V196A, E238D. Ne-ograničavajući primer plazmida koji kodira ove supstitucije amino kiselina je pSE527.
U još jednom pristupu, kombinacije supstitucija amino kiselina obuhvata kombinaciju grupe (ad): D48E, A61T, A89T, F99S, S138T, A138T, G179S, E238D. Ne-ograničavajući primer plazmida koji kodira ove supstitucije amino kiselina je pSE539.
U sledećem pristupu, kombinacije supstitucija amino kiselina obuhvata kombinaciju grupe (ae): G35S, D48E, S138T, A138T, G179S, P289L. Ne-ograničavajući primer plazmida koji kodira ove supstitucije amino kiselinaje pSE540.
U narednom pristupu, kombinacije supstitucija amino kiselina obuhvata kombinaciju grupe (af): D48E, A61T, S138T, A138T, G179S, V196A, E238D. Ne-ograničavajući primer plazmida koji kodira ove supstitucije amino kiselinaje pSE547.
U još jednom pristupu, kombinacije supstitucija amino kiselina obuhvata kombinaciju grupe (ag): D48E, A89T, G11IV, S138T, A139T, G179S, A198G, E238D. Ne-ograničavajući primer plazmida koji kodira ove supstitucije amino kiselinaje pSE550.
U narednom pristupu, kombinacije supstitucija amino kiselina obuhvata kombinaciju grupe (ah): S41G, D48E, A89T, L136P, G179S. Ne-ograničavajući primer plazmida koji kodira ove supstitucije amino kiselina je pSE558.
U sledećem pristupu, kombinacije supstitucija amino kiselina obuhvata kombinaciju grupe (ai): D48E, A89T, L136P, R163Q, G179S, P179S. Ne-ograničavajući primer plazmida koji kodira ove supstitucije amino kiselina je pSE563.
U još jednom pristupu, kombinacije supstitucija amino kiselina obuhvata kombinaciju grupe (aj): D48E, A89T, L136P, G179S, F234S. Ne-ograničavajući primer plazmida koji kodira ove supstitucije amino kiselina je pSE566.
U sledećem pristupu, kombinacije supstitucija amino kiselina obuhvata kombinaciju grupe (ak): D48E, A89T, L136P, R163Q, E238D. Ne-ograničavajući primerl plazmida koji kodiraju ove supstitucije amino kiselina su pSE573 i pSE578.
U narednom pristupu, kombinacije supstitucija amino kiselina obuhvata kombinaciju grupe (al): Q36R, D48E, A89T, L136P, G179S, P238D. Ne-ograničavajući primer plazmida koji kodira ove supstitucije amino kiselina je pSE574.
U sledećem pristupu, kombinacije supstitucija amino kiselina obuhvata kombinaciju grupe (am): D48E, A89T, L136P, R163Q, G179S. Ne-ograničavajući primer plazmida koji kodiraju ove supstitucije amino kiselina su pSE575 i pSE576.
U još jednom pristupu, kombinacije supstitucija amino kiselina obuhvata kombinaciju grupe (an): D48E, A89T, S138T, G179S. Ne-ograničavajući primer plazmida koji kodira ove supstitucije amino kiselina je pSE577.
U narednom pristupu, kombinacije supstitucija amino kiselina obuhvata kombinaciju grupe (ao): D48E, A89T, L136P, G179S, E238D. Ne-ograničavajući primeri plazmida koji kodiraju ove supstitucije amino kiselina su pSE502 i pSE524.
U sledećem pristupu, kombinacije supstitucija amino kiselina obuhvata kombinaciju grupe (ap): D48E, A89T, L136P, K154E, G179S, E238D. Ne-ograničavajući primer plazmida koji kodira ove supstitucije amino kiselina je pSE503.
U još jednom pristupu, kombinacije supstitucija amino kiselina obuhvata kombinaciju grupe (aq): D48E, A89T, S138T, A139T, K154S, G179S, V196A, P289L. Ne-ograničavajući primer plazmida koji kodira ove supstitucije amino kiselina je pSE505.
U sledećem pristupu, kombinacije supstitucija amino kiselina obuhvata kombinaciju grupe (ar): D48E, A89T, S138T, A139F, G179S, V196A, E238D. Ne-ograničavajući primer plazmida koji kodira ove supstitucije amino kiselina je pSE506.
U narednom pristupu, kombinacije supstitucija amino kiselina obuhvata kombinaciju grupe (as): D48E, A61T, A89T, L136P, G179S, V179S, A198G, P289L. Ne-ograničavajući primer plazmida koji kodira ove supstitucije amino kiselina je pSE507.
U sledećem pristupu, kombinacije supstitucija amino kiselina obuhvata kombinaciju grupe (at): D48E, A61T, S138T, A139F, G179S, G196A, E238D, P289L. Ne-ograničavajući primer plazmida koji kodira ove supstitucije amino kiselina je pSE509.
U još jednom pristupu, kombinacije supstitucija amino kiselina obuhvata kombinaciju grupe (au): D48E, A89T, L136P, G179S. Ne-ograničavajući primeri plazmida koji kodiraju ove supstitucije amino kiselina su pSE514 i pSE525.
U narednom pristupu, kombinacije supstitucija amino kiselina obuhvata kombinaciju grupe (av): D48E, A89T, V120A, L136P, G179S. Ne-ograničavajući primer plazmida koji kodira ove supstitucije amino kiselina je pSE515.
U još jednom, kombinacije supstitucija amino kiselina obuhvata kombinaciju grupe (aw): D48E, A61T, A89T, S138T, A139F, G179S, V196A, A198G, E238D. Ne- ograničavajući primer plazmida koji kodira ove supstitucije amino kiselina je pSE517.
U sledećem pristupu, kombinacije supstitucija amino kiselina obuhvata kombinaciju grupe (ax): D48E, A61T, A89T, G11IV, S138T, A139F, G179S, V196A, E238D. Ne- ograničavajući primer plazmida koji kodira ove supstitucije amino kiselina je pSE518.
U narednom pristupu, kombinacije supstitucija amino kiselina obuhvata kombinaciju grupe (ay): D48E, A61T, A89T, S138T, A139T, G179S, V196S, E238D, P289L. Ne- ograničavajući primeri plazmida koji kodiraju ove supstitucije amino kiselina su pSE529 i pSE554.
U još jednom pristupu, kombinacije supstitucija amino kiselina obuhvata kombinaciju grupe (az): D48E, A61T, A89T, L136P, S138T, A139F, G179S, A198G, E238D. Ne- ograničavajući primer plazmida koji kodira ove supstitucije amino kiselina je pSE532.
U narednom pristupu, kombinacije supstitucija amino kiselina obuhvata kombinaciju grupe (ba): D48E, A89T, S138T, A139F, G179S, A198G, V220A. Ne-ograničavajući primer plazmida koji kodira ove supstitucije amino kiselina je pSE536.
U sledećem pristupu, kombinacije supstitucija amino kiselina obuhvata kombinaciju grupe (bb): D48E, A61T, A89T, S138T, A139T, G179S, V196A, E23D, R239H, P289L. Ne- ograničavajući primer plazmida koji kodira ove supstitucije amino kiselina je pSE537.
U još jednom pristupu, kombinacije supstitucija amino kiselina obuhvata kombinaciju grupe (bc): D48E, A61T, A89T, L136P, G179S, P289L. Ne-ograničavajući primer plazmida koji kodira ove supstitucije amino kiselina je pSE541.
U narednom pristupu, kombinacije supstitucija amino kiselina obuhvata kombinaciju grupe (bd): D48E, A89T, S138T, A139T, G179S, V196A, E238D, P289L. Ne-ograničavajući primeri plazmida koji kodiraju ove supstitucije amino kiselina su pSE549 i pSE553.
U narednom pristupu, kombinacije supstitucija amino kiselina obuhvata kombinaciju grupe (be): D48E, A61T, A89T, S138T, A139F, G179S, V196A, E238D. Ne-ograničavajući primer plazmida koji kodira ove supstitucije amino kiselina je pSE551.
Ovaj pronalazak se dalje odnosi na polinukelotidne molekule koji imaju nukelotidnu sekvencu koja je ista kao kod aveC alela Streptomyces avermitilis, sekvenca koja kodira proizvod AveC gena S.avermitilis plazmida pSE186(ATCC209604) nukelotidne sekvence ORE aveC S.avermitilis datog na slici 1 (SEQ ID NO: 1) ili njegova irođena varijanta, ali čija nukleotidna sekvenca dalje obuhvata mutaciju koja kodira kominacija supstitucija amino kiselina na aminokiselinskim ostacima koji odgovaraju amino kiselinama na položajima SEQ ID NO:2, kao što imaju soj S.avermitilis ćelija ATCC53692 kod kojih je divlji soj aveC alela inaktiviran i koji eksprimuje polinukelotidne molekule koji sadrže nukelotidne sekvence koje mogu da daju odnos klasa 2:1 averemektina koji je smanjen u odnosu na odnos dobijen sojem S.avermitilis ćelija ATCC53692 koji eksprimuje samo divlji soj aveC alele, gde je pdnos kalsa 2:1 avermktina smanjen na oko 0.40:1 ili manje i gde je kombinacija supstitucija amino kiselina odabrana iz grupe koja se sastoji od:
(bf) D48E, S138T, A139T, G179D, E238F; i
(bg) Y28C, Q38R, D48E, L136P, G179S, E238D.
Ne-ograničavajući primeri plazmida koji kodiraju supstitucije amino kiselina grupe (bf) su pSE556 i pSE569. Ne-ograničavajući primer plazmida koji kodira supstitucije amino kiselina grupe (bg) je pSE561.
Ovaj pronalazak razmatra i to da se bilo koja od prethodno pomenutih supstitucija amino kiselina može postići modifikacijom nukelotidne sekvence aveC alela ili njegove izrođene varijante koja kao rezlutat ima supstituciju. Na primer, moguće je izvesti najveći broj ovde opisanoh supstitucija amino kiselinamenjanjem prirodne (nativne) sekvence kodona ili njegove izrođene varijante ujedan od nekoliko alternativnih kodana koji kodiraju iste supstitucije amino kiselina. Različite sekvence koje mogu da kodiraju prethodno pomenute supstitucije amino kiselina će biti očigledne prosečnom stručnjaku u okviru ovog pronalaska i poznate izrođenosti genetskog koda. U ne-ograničavajućem pristupu za svaku posebnu prethodno datu kombinaciju, supstitucija amino kiselina se može postićiPrimetnim promenama (non-silent) nukelotida datim na SLICI 6.
Kao što je ovde korišćena fraza “ kombinacija supstitucija amino kiselina obuhvata kombinacije grupe...” i slično, označava da supstitucije amino kiselina u proizvodu AveC gena , prema ovom pronalasku, obuhvataju barem one supstitucije koje su posebno navedene i mogu da obuhvate druge supstitucije amino kiselina, uklanjanje amino kiselina ili dodavanje amino kiselina ili kombinacije, pri čemu ekspresija dobijenog proizvoda aveC gena u S.avermitilis ćelijama može dovesti do željenog smanjenja odnosa B2:B1 avermektina.
Mutacije aveC alela ili njegove izrođene varijante može se izvesti prema poznatim postupcima, uključujući i PCR podložna grešenju ili kasetnom mutagenezom . Na primer, mutageneza vođena oligonukleotidom se može primeniti za izmenu sekvenci aveC alela ili ORF-a na određen način kao stoje npr., uvođenjem jednog ili više restriksionih mesta ili stop kodona u specifične regione unutar aveC alela ili ORF. Ovakvi postupci su opisani u U.S. Patentnu 5,605,739, U.S. Patent 5,830,721 i U.S. Patentu 5,837,458, koji obuhvataju nasumičnu fragmentaciju, ponavljanje ciklusa mutageneze i mešanje nukleotida, a koji se mogu koristiti za stvaranje velikih biblioteka polinukelotida sa nukelotidnim sekvencama koje kodiraju aveC mutacije.
Ciljne mutacije mogu biti korisne, posebno ako se koriste za promenu jednog ili više konzerviranih aminokiselinskih ostataka u proizvodu AveC gena.Na primer, poređenje izvedenih aminokiselinskih sekvenci u proizvodu AveC gena S.avermitilis (SEQ ID NO:2) sa proizvodom hologog AveC gena S.griseochromogenes (SEQ ID NO:5) i S.hygroscopicus (SEQ ID NO:4) kao što je opisano u U.S. Patentu Br. 6,248,579 ukazuje na mesta primetne konzervacije aminokiselinskih ostataka između ove dve vrste. Ciljana mutageneza koja vodi do izmena u jednoj ili više konzerviranih aminokiselinskih ostataka može biti efikasna za dobijanje novih mutantih sojeva koji pokazuju željene izmene u proizvodnji avermektina.
Nasumična mutageneza može biti korisna i može se izvesti izlaganjem ćelija S.avermitilis ultravioletnom zračenju ili x-zracima, ili hemijskim mutagenim kao stoje N- metil-N'-nitrozogvanidin, etil metan sulfonat, azotna kiselina ili organska azotna jedinjenja dihlorodietilsulfida. Videti npr., Ausubel, 1989 za pregled tehnika mutageneze.
Kada se dobiju mutirani polunukleotidni molekuli, onda se ispituju kako bi se odredilo da li mogu da moduliraju biosintezu avermektina u S.avermitilis. U preferentnom prisupu, polinukelotidni molekul sa mutiranom nukleotidnom sekvencom je testiran komplementiranjem lanca S.avermitilis u kojem je aveC gen inaktiviran, kako bi se dobila negativna aveC (aveC') podloga. U ne-ograničavajućem postupku, mutirani polinukelotidni molekul je vezan u ekspresioni plazmid u operativnoj asocijaciji sa jednim ili više regulatomih elemenata, pri čemu je poželjno da plazmid sadrži jedan ili više gena otpronih na lek kako bi se omogućila selekcija tranformisanih ćelija. Ovaj vektor je zatim transformisan u aveC' ćeliju domaćina prema poznatim tehnikama i transformirane ćelije su odabrane i gajene na pogodnoj fermentacionoj podlozi pod uslovima koji omogućavaju ili indukuju proizvodnju avermektina, na primer, ubacivanjem odgovarajućih starter podjedinica u medijum i gajenjem pod optimalnim uslovima za proizvodnju avermektina poznatim u tehnici. Fermentacioni proizvodi su zatim analizirani HPLC-om kako bi se odredila sposobnost imitiranog polinukleotidnog molekula da komplementira (dopuni) ćelije domaćina. Nekoliko plazmidnih vektora sa mutiranim polinukleotidnim molekulima koji mogu da smanje odnos B2:B1 avermektina, ukljčujući i pSE188, pSE199, pSE231, pSE239 i pSE290 do pSE297 su dati u delu 8.3 u daljem tekstu. Ostali primeri ovih plazmidnih vektora su dati na SLICI 6.
Bilo koji od prethodno pomenutih postupaka ovog pronalaska se može izvesti na podlozi za fermentaciju kojem je dodata ciklohksan karboksilna kiselina, mada se mogu koristit i drugi prekursori masnih kiselina, kao što su preursori masnih kiselina datih u TABLICI 1 ili se može upoterbiti metiltiomlečna kiselina.
Kada se identifikuje polinukelotidni molekul koji moodulira proizvodnju averemktina u željenom pravcu, može se odrediti mesto mutacije u nukleotidnoj sekvenci. Na primer, polinukleotidni molekul sa nukelotidnom sekvencom koja kodira proizvod imitiranog AveC gensa, može se izolovati PCR-om ili podvrgnuti određivanju sekvence DNK prema poznatim tehnikama. Poređenjem DNK sekvence imitiranog aveC alela sa DNK sekvencom aveC alela divljeg soja, mogu se odrediti mutacija (mutacije) koje su odgovorne za izmene u proizvodnji avermektina. Na primer, proizvod AveC gena S.avermitilis-a sadrži ili jednu supstituciju amino kiseline najednom od ostataka 55 (S55F), 138(S138T), 139(A139T) ili 230(G230D) ili dvostruku supstituciju na položajima 138(S138T) i 139(A139T ili A139F), što dovodi do promena u funkciji proizvoda AveC gena, tako da se odnos klasa 2:1 dobijenog avermiktina izmenio (videti Deo 8, u dalje tekstu), pri čemu navedeni položaji amino kiselina odgovaraju onim datim na SLICI 1 (SEQ ID NO.2). Dalje, sledećih sedam kombinacija mutacija je pokazalo da efikasno redukuju odnos klasa 2:1 avermektina: (1) D48E/A89T; (2) S138T/A139T/G179S; (3)Q38P/L136P/E238D; (4)F99S/S138T/A139TG179S; (5) A139T/M228T; (6)G11V/P289L; (7)A139T/K154E/Q298H. Ovaj pronalazak opisuje još pedeset devet (59) kombinacija mutacija za koje se pokazalo da smanjuju odnos cikloheksil B2: cikloheksil B1 avermektina i date su na SLICI 6 i navedene u dodatim zahtevima.
Kao što je ovde korišćeno, prethodno navedene oznake kao na primer A139T slovo označava originalne aminokiselinske ostatke, koja je u ovom slučaju alanin (A) na označenom položaju, koje je u ovom slučaju 139 (videti SEQ ID NO:2) polipeptida, nakon čega sledi aminokiselinski ostatak koji zamenjuje originalnu aminokiselinski ostatak, koji je u ovom slučaju treonin (T).
Kao što je ovde korišćeno, kada je aminokiselinski ostatak kodiran aveC alelom u hromozomu S.avermitilis-a, ili u vektoru ili izolovanom polinukeotidnom molekulu ovog pronalaska koji je označen kao “koji odgovara” određenom aminokiselinskom ostatku SEQ ID NO.2 ili kada je aminokiselinska supstitucija označena tako da do nje dolazi na određenom položaju “koji odgovara” posebno obleženog amino kiselinskog ostataka u SEQ ID NO:2, odnosi na aminkiselinske ostatke na istim relativnim položajima proizvoda AveC gena, koje prosečan stručnjak može brzo odrediti poređenjem sa aminokiselinskom sekvencom koja je ovde data kao SEQ ID NO.2.
Kao što je ovde korišeno, specifične mutacije u aveC alelima koji kodiraju određenu mutaciju su navedene kao osnovne pormene na položajima specifičnih nukleotida u aveC alelu “koji odgovara” određenim položajima nukleotida kao što je dato na slici SEQ ID NO:l, ili gde je položaj nukleotida u aveC alelima označena kao “koji odgovara” određenom položaju nukleotida u SEQ ID NO: 1, upućuje na nukelotide na istim relativnim položajima u nukelotidnoj sekvenci aveC ili njegovog izrađenoj varijanti, koju prosečan stručnjak može brzo odrediti poređenjem sa nukleotidnom sekvencom koja je ovde data kao SEQ ID NO:l.
Izraz “oko (približno)”, koji je ovde korišćen da uputi na odnos cikloheksil B2: cikloheksil B1 avermetina, odnosi se na određene brojne vrednosti plus ili minus 10% od naznačene vrednosti.
Polinukelotidni molekul ovog pronalaska može biti “izolovan”, što znači daje ili: (i) prečišćen u toj meri daje najvećim delom nema polinukleotidne molekule različitih nukeotidnih sekvenci, ili (ii) se nalazi u okolini u kojoj se prirodno ne bi mogso naći, npr. gde je aveCalel S.avermitilis ili njegova mutirana varijanta prisutan u ćeliji koja nije S.avermtilis ćelija, ili je (iii) prisutan u obliku u kojem se e prirodno ne bi mogao naći, npr., kraćem delu DNK kao što je restrikicioni fragment iz bakterijskog hromozoma, pretežno obuhvatajući deo koji kodira aveC ili njegovu izrođenu varijantu, sa ili bez njegove dodatne rgulatome sekvence ili kao integrisan u heterologni deo DNK, kao što je hromozom bakterijske ćelije (svi drugi osim S.avermitilis) ili vektor DNK kao stoje plazmid ili faga ili integrisan u hromozome S.avermitilis-a na drugom delu u odnosu na prirodni aveC alel.
Ovaj pronalazak se dalje odnosi na rekombinantni vektor koji sadrži polinukelotidni molekul ovog pronalaska. Ovi rekombinantni vektori se mogu koristiti kao cilj svakog polinukelotidnog molekula koji sadrži mutirane nukleotidne sekvence ovog pronalaska na mestima aveC alela S.avermitilis hormozoma da ili ubaci ili zameni ORF aveC ili njegov deo, npr., homolognim rekombinaijama. Prema ovom pronalasku, međutim, polinukleotidni molekul koji sadrži mutiranu nukleotidnu sekvencu , može takođe da funkcioniše tako da modulira biosintezu avermektina kada se ubaci u hromozom S.avermitilis-a na nekom drugom mestu, a ne na aveCalelu ili kada je epizomalno održavan u ćelijama S.avermitilis. Tako, ovaj pronalazak se dalje odnosi na vektore koji sadrže polinukleotidne molekule sa imitiranom nukelotidnom sekvencom ovog pronalaska, gde se vektori mogu koristiti za ubacivanje polinukeotidnog molekula na mesto u hromozmu S.avermitilis-a koje nije aveC egna ili za epizomalno održavanje.
U ne-ograničavajućem pristupu, vektor je vektor za zamenu gena koji se može koristiti za ubacivanje imitiranih aveC alela ili njegove izrođene varijante prema ovom pronalasku, u ćeliju soja S.avermitilis, pri čemu se stvara novi soj S.avermitilis, čije ćelije mogu da proizvedu avermektine u smanjenom odnosu klasa 2:1 u poređenju sa ćelijama iste vrste koje eksprimuje smo divlji soj aveC alela. Ovakva zamena gena se može sprovesti pomoću
mutiranih polinukleotidnih molekula prisutnih u ekspresionim vektorima koji su ovde dati, kao što su primeri ekspresije vektora date u Delu 8 u daljem tekstu.
Ovaj pronalazak se odnosi i na vektore koji mogu da se koriste za ubacivanje mutiranog aveC alela ili njegove izrođene varijante u ćelije soja S.avermitilis za dobijanje novih ćelijskuh sojeva koji mogu da proizvedu izmenjene količine avermektina u predenju sa ćelijama istog soja koje eksprimuju samo divlji soj aveC alela. U preferentnom pristupu, poevćana je količina avermektina koja se dobija od ćelija. U specifičnom i ne- ograničavajućem pristupu, vektor sadrži jak promoter poznat u tehnici, kao na pr., jak konstitutivni ermEpromoter od Saccharopolyspora erythaea koja se nalazi uzvodno i u operativnoj asocijaciji sa ORF aveC. Ovi vektori se mogu dobiti pomoću mutiranih aveC alela plazmida pSE189 i u skladu sa postupcima opisanim u U.S. Patentu Br. 6,248,579.
Ovaj pronalazak se dalje odnosi na zamenu vektora koji su mogu da inaktiviraju aveC gen u divljem soju S.avermitilis. U ne-ograničvajućem pristupu, ovi vektori za zamenu gena se mogu dobiti pomoću mutiranih polinukelotidnih molekula prisutnih u plazmidu pSE180(ATCC), koji je dat primerima u Delu 8.1 u daljem tekstu (SLIKA 3). Ovaj pronalazak se dalje odnosi na vektore za zamenu gena koji sadrže polinukleotidne molekule koji su prirodno bočni aveC gen in situ u S.avermitilis hromozomu, uključujući npr., ove bočne nukleotidne sekvence date na SLICI 1 (SEQ ID NO. 1), pri emu se vektori mogu koristiti za uklanjanje (brisanje) S.avermitilis aveC ORF.
Pronalazak se dalje odnosi na ćelije domaćina sa polinukleotidnim molekulom ili rekombinantnim vektorom ovog pronalaska. Ćelije domaćini mogu biti prokariotske ili eukariotske ćelije koje kao domaćina mogu da uzmu polinukleotidni molekul ili rekombinantni vektor. U preferentnom pristupu, ćelija domaćin je ćelija bakterije. U preferentnijem pristupu, ćelija domaćin je Streptomyces ćelija. U još preferentnijem pristupu, ćelija domaćin je ćelija Streptomyces avermitilis.
Ovaj pronalazak se dalje odnosi na postupak za dobijanje novih sojeva Streptomyces avermitilis, a koji obuhvata (i) mutaciju aveC alela u ćelijama soja S.avermitilis, čijom mutacijom dolazi do kobinacije supstitucija aminokiselina u proizvodu aveC gena, ili (ii) uvođenjem u ćelijsku soj S.avermitilis, ili (ii) uvođenjem u ćeliju soj S.avermitilis, mutirani aveCalel ili njegovu izrođenu varijantu koaj kodira proizvod aveCgena koji sadrži
kombinaciju supstitucija amino kiselina, pri čemu je kombinacija supstitucija amino kiselina od (a) do (be), date ranije.
Pronalazak se dalje odnosi na postupak za dobijanje novih sojeva S.avermitilis, koji obuhvata (i)mutaciju aveC alela u ćeliji soja S.avermitilis, pri čemu se mutacijom dobija kombinacija supstitucija amino kiselina u proizvodu aveC gena, ili (ii) uvođenjem u ćelijski soj S.avermitilis, mutirani aveC alel ili njegovu izrođenu varijantu koja kodira proizvod aveC gena koji sadrži kombinaciju susptitucija amino kiselina, pri čemu ćelije sa imitiranim aveC alelom ili njegovom izrođenom varijantom može da proizvede cikloheksil B2:cikloheksil B1 avermektine u odnosu 0.35:1 ili manje. U ne-ograničavajućem pristupu, mutirani aveC aleli ili njihove izrađene varijante kodiraju proizod aveC gena koji sadrži kombinaciju supstitucija amino kiselina odabranih iz grupe koja se sastoji od (a) do (be) date ranije.
U preferentno pristupu, odnos cikloheksil B2: cikloheksil B1 avennektina iznosi oko 0.30:1 ili manje. U neograničavajućem pristupu, mutirani aveC alel ili njegova izrađena varijanta kodira proizvod aveC gena koji sadrži kombinaciju supstitucija amino kiselina odabranih iz grupe koja se sastoji od (f) do (be), date ranije.
U preferentnijem pristupu, odnos cikloheksil B2: ciklohekcil B1 avermektina iznosi oko 0.25:1 ili manje, U neograničavajućem pristupu, mutirani aveC alel ili njegova izrađena varijanta kodira proizvod aveC gena koji sadrži kombinaciju supstitucija amino kiselina odabranih iz grupe koja se sastoji od (w) do (be), date ranije.
U još preferentnijem pristupu, odnos cikloheksil B2: cikloheksil B1 avermektina iznosi oko 0.20:1 ili manje. U neograničavajućem primeru, mutirani aveC alel ili njegova izrađena varijanta kodira proizvod aveC gena koji sadrži kombinaciju supstitucija amino kiselina odabranih iz grupe koja se sastoji od (ao) do (be), date ranije.
Pronalazak se dalje odnosi na postupak za dobij anje novih sojeva S.avermitilis, koji obuhvata (i)mutaciju aveC alela u ćeliji soja S.avermitilis, pri čemu se mutacijom dobija kombinacija supstitucija amino kiselina u proizvodu aveC gena, ili (ii) uvođenjem u ćelijski soj S.avermitilis, mutirani aveC alel ili njegovu izrođenu varijantu koja kodira proizvod aveC gena koji sadrži kombinaciju susptitucija amino kiselina, pri čemu je kombinacija supstitucija amino kiselina odabranih iz grupe koja se sastoji od (bf) do (bg) date ranije. U prefemtnom pristupu, ćelije S.avermitilis, koje sadrže ove mutirane aveC alele ili njegove izrađene
varijante, mogu da daju avermektine u odnosu cikloheksil B2: cikloheksil B1 od oko 0.40:1 ili manje.
Ovim mutiranjem aveC alela, ili uvođenjem mutiranog aveC alela ili njegove izrođene varijante, u skaldu sa prethodno datim fazama, dobijen je novi soj S.avermitilis.
Ovaj pronalazak se odnosi i na Streptomyces soj koji sadrži mutirani aveC alel ili njegovu izrođena varijanta kodira proizvod aveC gena koji sadrži kombinaciju supstitucija amino kiselina odabranih iz grupe koja se sastoji od (a) do (be), date ranije. U preferentnom pristupu, soj Stertomyces-a je S.avermitilis.
U prefemtnom pristupu, pronalazak se odnosi na soj S.avermitilis, koji može da proizvde avermektine u odnosu cikloheksil B2: cikloheksil B1 od 0.35:1 ili manje. U neograničavajućem pristupu, mutirani aveC alel ili njegova izrođena varijanta kodira proizvod aveC gena koji sadrži kombinaciju supstitucija amino kiselina odabranih iz grupe koja se sastoji od (a) do (be), date ranije.
U još preferentnijem pristupu, odnos cikloheksil B2: cikloheksil B1 avermektina iznosi oko 0.30:1 ili manje. U neograničavajućem primeru, mutirani aveC alel ili njegova izrođena varijanta kodira proizvod aveC gena koji sadrži kombinaciju supstitucija amino kiselina odabranih iz grupe koja se sastoji od (f) do (be), date ranije.
U preferentnijem pristupu, odnos cikloheksil B2: cikloheksil B1 avermektina iznosi oko 0.20:1 ili manje. U neograničavajućem primeru, mutirani aveC alel ili njegova izrođena varijanta kodira proizvod aveC gena koji sadrži kombinaciju supstitucija amino kiselina odabranih iz grupe koja se sastoji od (ao) do (be), date ranije.
Ovaj pronalazak se odnosi i na ćelije Streptomyces soja koji sadrži mutirani aveC alel ili njegovu izrođena varijanta kodira proizvod aveC gena koji sadrži kombinaciju supstitucija amino kiselina odabranih iz grupe koja se sastoji od (a) do (be), date ranije. U preferentnom pristupu, soj Stertomyces-a je S.avermitilis. u još preferentnijem pristupu, ćelija je ćelija S.avermitilis, koja može proizvoseti avermektine u odnosu cikloheksil B2: cikloheksil B1 od oko 0.40:1 ili manje.
I pored toga što navedene mutacije mogu biti prisutne u ćelijama ovog pronalaska na ekstrahromozomalnom elelmentu, kao što je plazmid, ipak je preferentno da ove mutacije budu prisutne u aveC kodirajućoj sekvenci koja je deo hromozoma S.avermitilis-a i poželjno, ali ne i neophodno, na mestu nativnog aveC alela.
Novi sojevi ćelija su korisni u proizvodnji na veliko komercijalno poželjnih avermektina kao stoje dormacetin.
Pronalazak se dalje odnosi na postupak za dobijanje avermektina koji obuhvata kultivisanje S.avermetilis ćelija ovog pronalaska u podlozi za gajenje pod uslovima koja dozvoljavaju indukovanje proizvodnje avermektina, i regeneraciju dobijenog avermektina iz kulture. U prefemtnom pristupu, ćelije koje se koriste u postupku za dobijanje cikloheksil B2: ciklohkesil B1 avermektina u odnosu od 0.35:1 ili manje, bolje u odnosu od oko 0.30:1 ili manje, još bolje u odnosu od oko 0.20:1 ili manje.
U preferentnom pristupu, ćelije koje proizvode avermektine cikloheksil B2: cikloheksil BI u odnosu od oko 0.35:1 ili manje, sadrže mutirani aveCalel ili njegovu izrođenu varijantu koja kodira proizvod aveC gena koji sadrži kombinaciju supstitucija amino kiselina odabrane iz grupe koja se sastoji od (a) do (be) date ranije.
U narednom prefemtnom pristupu, ćelije koje proizvode avermektine cikloheksil B2: cikloheksil B1 u odnosu od oko 0.30:1 ili manje, sadrže mutirani aveCalel ili njegovu izrođenu varijantu koja kodira proizvod aveC gena koji sadrži kombinaciju supstitucija amino kiselina odabrane iz grupe koja se sastoji od (f) do (be) date ranije.
U sledećem preferentnom pristupu, ćelije koje proizvode avermektine cikloheksil B2: cikloheksil B1 u odnosu od oko 0.25:1 ili manje, sadrže mutirani aveCalel ili njegovu izrođenu varijantu koja kodira proizvod aveC gena koji sadrži kombinaciju supstitucija amino kiselina odabrane iz grupe koja se sastoji od (w) do (be) date ranije.
U još jednom preferentnom pristupu, ćelije koje proizvode avennektine cikloheksil B2: cikloheksil B1 u odnosu od oko 0.20:1 ili manje, sadrže mutirani aveCalel ili njegovu izrođenu varijantu koja kodira proizvod aveC gena koji sadrži kombinaciju supstitucija amino kiselina odabrane iz grupe koja se sastoji od (ao) do (be) date ranije.
U anrednom preferentnom pristupu, ćelije koje proizvode avermektine cikloheksil B2: cikloheksil B1 u odnosu od oko 0.40:1 ili manje, sadrže mutirani aveCalel ili njegovu izrođenu varijantu koja kodira proizvod aveC gena koji sadrži kombinaciju supstitucija amino kiselina odabrane iz grupe koja se sastoji od (bf) do (bg) date ranije.
Postupci ovog pronalaska povećavaju efikasnost prilikom dobijanja avermektina u komercijalne svrhe, kao na primer, dormacetina.
Ovaj pronalazak se odnosi i na preparate avermektina cikloheksil B2: cikloheksil B1 dobijenih od ćelija Streptomyces avermitilis, koji sadrže vermektine cikloheksil B2: cikloheksil B1 prisutne u hranljivoj podlozi u kojem su ćelije kultivisane, pri čemu odnos avermektina cikloheksil B2: cikloheksil B1 prisutan u medijum iznosi 0.35:1 ili manje, bolje 0.30:1 ili manje, još bolje 0.25:1 ili naje, a najbolje oko 0.20:1 ili manje. U posebnom pristupu, preparat cikloheksil B2: cikloheksil bi avermektina je dobijen od ćelija soja S.avermitilis, koja eksprimuje mutirani aveC alel ili njegovu izrođenu varijantu koja kodira proizvod gena kod kojeg je smanjen odnos cikloheksil B2: ciklohekcil B1 avermektina dobijenih ćelijama u odnosu na isti soj S.avermitilis, koji ne eksprimuje mutiran aveC alel, već eksprimuje smo divlji soj aveC alela.
U preferentno pristupu, gde je preparat odnos cikloheksil B2: ciklohekcil B1 avermektina iznosi 0.35:1 ili manje, perparat su dale ćelije koje sadrže mutiran aveC alel ili njegovu irođenu varijantu koja kodira proizvod aveCgena, koji obuhvata kombinaciju aminokiselinskih supstitucija odabran iz grupe koja se sastoji od (a) do (b(be), date ranije.
U sledeće pristupu, kada je preparat cikloheksil B2 ; BI avermektina u odnosu od oko 0.30: 1 ili manje, preparat je dobijen od ćelija koje sadrže mutirani aveCalel ili njegovu izrođenu varijantu koja kodira proizvod aveC gena koji sadrži kombinaciju supstitucija amino kiselina odabrane iz grupe koja se sastoji od (f) do (be) date ranije.
U preferentno pristupu, gde je preparat odnos cikloheksil B2: ciklohekcil B1 avermektina iznosi 0.25:1 ili manje, perparat su dale ćelije koje sadrže mutiran aveC alel ili njegovu irođenu varijantu koja kodira proizvod aveCgena, koji obuhvata kombinaciju aminokiselinskih supstitucija odabran iz grupe koja se sastoji od (w) do (be), date ranije.
U preferentno pristupu, gde je preparat odnos cikloheksil B2: ciklohekcil B1 avermektina iznosi 0.20:1 ili manje, perparat su dale ćelije koje sadrže mutiran aveC alel ili njegovu irođenu varijantu koja kodira proizvod aveCgena, koji obuhvata kombinaciju aminokiselinskih supstitucija odabran iz grupe koja se sastoji od (ao) do (be), date ranije.
Ovaj pronalazak se odnosi i na preparate avermektina cikloheksil B2: cikloheksil B1 dobijenih od ćelija Streptomyces avermitilis, koji sadrže vermektine cikloheksil B2: cikloheksil BI prisutne u hranljivoj podlozi u kojem su ćelije kultivisane, pri čemu odnos avermektina cikloheksil B2: cikloheksil B1 prisutan u medijum iznosi 0.40:1, i koji je dobijen od ćelija soja koje sadrže mutirani aveC alel ili njegovu izrođenu varijantu koja kodira
proizvod gena sa kombinacijom supstitucija amino kiselina odabranih iz grupe koja se sastoji od (bf) do (bg), date ranije.
Mada je prefemtno daje nov preparat avermektina prisutan u poglozi u u kojoj su gajene ćelije, npr. delimično ili potpuno iskorišćen fluid kulture za fermentaciju, preparati avermektina se mogu alternativno ili parcijalno ili potpuno prečistiti iz fluida kulture u kojem je gajen, preparat avermektina se može aletemativno ili parcijalno prečititi iz fluida, prema poznatim biohemijskim tehnikama prečišćavanja, kao stoje precipitacija (taloženje) amonijum sulfatom, dijazila, ffakcionisanje prema veličini, iono izmenjivačka hromatografija, HPLC itd.
Kao dodatak u pravljenju novih sojeva ćelija koje sadrže S.avermitilis, koje mogu proizvesti manji odnosb cikloheksil B2: ciklohekcil B1 kao stoje ranije opisano, pronalazak dalje razmatra i to da se dodatne mutacije mogu inkorporirati u ćelije S.avermitilis, za dalje poboljšanje karakteristika proizvodnje avermektina. U neograničavajućim pristupima, ćelije pronalaska mogu dalje da obuhvate modifikacije za povećanje proizvodnje avermektina. U jednom pristupu, ove ćelije su dobijene (i)mutacijom aveC alela u ćeliji soja S.avermitilis, ili (ii) uvođenjem u ćelijski soj S.avermitilis, mutirani aveC alel ili njegovu izrođenu varijantu, pri čemu ekspresija imitiranog alela kao rezultat ima povećanje količine proizvedenog avermektina, od strane ćelija soja S.avermitilis, koje eksprimuju mutirani aveC alel u poređenju sa ćelijama istog soja koje eksprimuju samo jedan aveC alel divljeg soja i odabiranje transformisanih ćelija koje proizvode avermektin u većoj količini u odnosu na količinu avermektina dobijenog od soja ćelija koji eksprimuju samo jedan aveC alel divljeg soja. Na primer, aveC alel se može modifikovati tako da sadrži snažan promoter, kao što je jak konsekutivni ermE promoter od Saccharoplzspora erytharea umetnutog pre i u operativnoj asocijaciji sa ORF aveC. U sledećem pristupu, može se uvesti jedna ili više mutacija u aveR 1 i/ili aveR2 gene S.avermitilis na taj način povećavajući nivo proizvedenog avermektina kao što je opisano u U.S. Patentnu Br. 6,197,591, Stuzman-Engwall et al., objavljenog 6 marta 2001.
5.4 Primena avermektina
Avermektini su veoma aktivni agensi koji se posebno primenjuju kao antihelminitici, ektoparaziticidi, insekticidi i akaricidi. Jedinjenja avermektina dobijena prema postupcima ovog pronalaska su veoma korisna za bilo koju od navedenih primena. Na primer, jedinjenja avermektina dobijena prema ovom pronalasku su korisna za lečenje različitih oboljenja ili
stanja kod ljudi, posebno kada su ova stanja ili oboljenja izazvana infekcijama parazitima, kao stoje poznato u tehnici. Videti npt., Ikeda i Omura, 1997, Chem. Rev. 97(7): 2591-2609. Detaljnije, jedinjenja avermiktina dobijena prema ovom pronalasku su efikansa u lečenju različitih oboljenja ili stanja izazvanih andoparazitima, kao što su paarzitne nematode, kojima se mogu zaraziti ljudi, domaće životinje, svinje, ovce, živina, konji i goveda.
Dalje, jedinjenja avermektina dobijena prema ovom pronalasku, efikasna su protiv nematoda , koje napadaju ljude kao i one koje napadaju druge vrste životinja. U ove nematode spadaju gastrointestinalni paraziti kao što je Ancylostoma, Necator, Ascaric, Strongyloides, Trichinella, Cpillaria, Trichuris, Enterobius, Dirofilaria i paraziti koji su nađeni u krvi i tkivima ili organima, kao što su filarialni crvi i ekstrakti intestinalnih stadijuma Stronglyoides and Trichinella.
Jedinjenja avermektina dobijena prema ovom pronalasku su takođe korisna u lečenju ectoparazitnih infekcija uključujući npr. artropodne infekcije sisara i ptica izazvanih krpeljima, grinjama, vašima, buvama, muvama, insektima koji ujedaju i larve difterije koje između ostalih napadaju telad i konje.
Jedinjenja avermektina dobijena prema ovom pronalasku su takođe korisna kao insekticidi protiv kućnih gamadi kao što su između ostalih npr., buba-švabe, moljci, bube koje se nalaze u tepisima i muve kao i insekti koji se javljaju u stovarištima žita i poljoprivrednih proizvoda, i to na primer grinje, afidi, gusenice i ortopterani kao što su između ostalih skakavci.
Životinje koje se mogu lečiti jedinjenima avetmektina dobijenim prema ovom pronalasku su ovce, telad, konji, srne i jeleni, jarci, svinje, ptice uključujući živinu i psi i mačke.
Jedinjenja avermektina dobijena prema ovom pronalasku mogu se administrirati kao formulacija koja je prilagođena specifičnoj primeni, posebno vrstama životinja domaćina koje se leče i vrstama parazita ili insekata. Za primenu kao insekticid, jedinjenje avermektina dobij eno prema ovom pronalasku može se administrirati oralno u obliku kapsule, bolusa, tablete i tečnog leka ili alternativno se može administrirati sipanjem ili injekcijama ili kao implant. Ove formulacije su priremljene na uobičajeni način u skladu sa uobičajenom veterinarskom praksom. Tako se kapsule, bolusi ili tablete mogu pripremiti mešanjem aktivne komponente sa odgovarajućim fino podeljenim razblaživačem ili nosačem koji dodatno sadrži
agens za razlaganje i/ili vezivanje kao stoje škrob, laktoza, talk, magnezijum stearat itd. Tečna formulacija leka se može pripremiti dispergovanjem aktivne komponente u vodenom rastvoru zajedno sa okvašivačem i sredstvom za dispergovanje itd. Formulacije koje se injektiraju mogu se pripremiti u obliku sterilnog rastvora, koji sadrži druge supstance kao što je npr., dovoljna količina soli i/ili glukoze za dobij anje izotoničnog rastvora.
Ove formulacije će sadržavati različite težine aktivnog jedinjenja u zavisnosti od pacijenta, vrste životinje domaćina koja se leči, ozbiljnosti i vrste infekcije i telesne težine domaćina. Generalno, za oralnu administraciju daje se doza aktivnog jedinjenj a od oko 0.001 do 10mg po kg telesne težine pacijenta ili životinje, kao jedna doza ili u više podeljenih u periodu od 1 do 5 dana. Međutim, mogući su slučajevi kada se daju manje ili veće doze koje određuje lekar ili veterinar na osnovu klinčkih simptoma.
Kao alternativa, jedinjenj a avermektiva dobijena prema ovom pronalasku mogu administrirati u kombinaciji sa hranom za životinje i u ovi svrhu može se pripremiti koncentrovani aditiv za hranu ili premiks za mešanje sa normalnom hranom za životinje.
Za upotrebu kao insekticid i za lečenje poljoprivrednih štetočina jedinjenje avermektina dobij eno prema ovom pronalasku može se primeniti kao sprej, prah, amulzija i slično u skladu sa standardnom poljoprivrednom praksom.
6. primer; Fermentacija Streptomvces Avermitilis i analiza B2:B1 avermektina
Sojevi koji ne pokazuju aktivnost dehidrogenaze razgranatog lanca 2-okso kiseline i 5- O-metiltransferaze ne proizvode avermektine ako podlozi za fermentaciju nisu dodate masne kiseline. Ovaj primer pokazuje da kod avakvih mutanata mogu se dobiti avermektini u širokom opsegu odnosa B2:B1, kada je biosinteza inicirana u prisustvu različitih masnih kiselina.
6.1 Materijali i postupci
Streptomyces avermitilis ATCC 53692 je čuvan -70°C kao rastvor pripremljen u podlozi koja se sastoji od: Starch (Nadex, Laing National) -20g; Pharmamedia (Trader’s Protein, Memphis, TN) —15g; Ardamine pH (Yeast Products Ine.) -5g; kalcijum karbonat -lg. Krajnja zapremina je podešena do 11 vodom, pH je podešen do 7.2 i medijum je stavljen u autoklav na 121°C u trajanju od 25 min.
Dva ml odrmznute suspenzije prethodno pripremljenog preparata je korišćeno za inokulaciju u sud koji sadrži 50ml istog medijuma. Posle 24 sata inkubiranja na 28°C na rotirajućoj muškalici na 180rpm, 2ml rastvora je korišćeno za inokulaciju u sud koji sadrži 50ml medijuma za proizvodnju koji sadrži: škrob -80g; kalcijum karbonat -7g; Pharmamedia- 5g; sekundarni kiseli kalijumfosfat-lg; magnezijum sulfat-lg, glutaminsku kiselinu-0.6g; ferosulfat heptahidrat-O.Og, cink sulfat-0.00lg; magnezijum sulfat-O.OOlg. Krajnja zapremina je podešena do llitra vodom, pH podešeno na 7.2 i medijum je autoklaviran 25minuta na 121°C.
Različiti supstrati karboksilne kiseline (videti Tablicu 1) su rastvoreni u metanolu i dodati u fermentacioni rastvor 24 sata posle inokulacije pri čemu krajnja koncentracija iznosi 0.2g/litru. Fermentacioni rastvor je inkubiran 14 dana na 28°C, pa je zatim centrifugiran (2,500 rpm , 2 min) i supematant je odbačen. Granule micela su ekstrahovane acetonom (15ml), zatim dihlormetanom (30ml) i odvojena je organska faza, profitrirana i onda uparena do suva. Ostatak je rastoren u metanolu (lml) i analiziran HPLC-om na Hewlett-Packard 1090A tečnom hromatografu opremljenom sa skenirajućim detektorom sa nizom dioda podešenom na 240nm. Korišćena je Beckman Ultrasphere C-18, 5pm, 4.6mmx25cm kolona i temperatura održavana na 40°C dvadeset pet pl perthodno opisanog metanolong rastvora je injektirano na kolonu. Eluiranje je sprovedeno lineranim gradijentom metanol-voda 80:20 do 95:5 u toku 40 minuta na 0.85 ml/min.Dve standardne koncentracije cikloheksil B1 su korišćene za kalibraciju detektora i izmerene su površine ispod krivih za B2 i B1 avermektina.
6.2 Rezultati
Praćena su HPLC retenciona vremena za B2 i B1 avermektine i odnosi 2:1 su dati u Tablici 1.
Podaci dati u Tablici 1 pokazuju ekstremno širok opseg odnosa B2:B1 proizvoda avermektina što ukazuje na značajne razlike u rezultatima dehidrativne konverzije jedinjenja klase 2 ujedinjenja klase, u zavisnosti od prirode starter jedinica bočnih lanaca masnih kiselina koje su na raspolaganju. Ovo ukazuje na to da promene u B2:B 1 odnosima koje nastaju kao rezultat promena na AveC proteina, mogu biti specifične za određene supstrate. Shodno tome, proveravanje na mutante koji pokazuju promene u B2:B1 odnosu dobijenom sa određenim susptratom, mora biti urađeno u prisustvu supstrata. U Primerima datim u daljem tekstu kao susptrat za proevravanje koristi su cikloheksankarbonska kiselina. Ipak, ovaj susptrat se jedino koristi kao primer za potencijal i ne ograničava primenljivost ovog pronalaska.
7. primer: Izolovanie aveC gena
Ovaj primer opisuje izolovanje i karakterizaciju regiona Streptomyces avermitilis hromozoma koji kodira prozvod AvCgena. Kao što je dato u daljem tekstu, ustanovljeno je da aveC gen može modifikovati odnos cikloheksil-B2 i cikloheksil-B 1 (B2:B1) proizvoda avermektina.
7.1 Materijali i postupci 7.1.1 Rast Streptomvces za izlovanie DNK
Sledeći postupak je praćen rastom Streptomyces. Same kolonije S.avermitilis ATCC 31272 (izolat #2) je izolovan na YPD-6 jačine 1/2 koji sadrži: Difco Yeast Extract-5g; Difco Bacto-peptone-5-g; dextrose-2.5g; MOPS-5g; Difco Bacto agar-15g. Krajnja zapreminaje podešena do 1 litra dodatkom dH2O, pH je podešeno na 7.0 i medijum je autoklaviran 25min na 121°C.
Rast micelija u ovoj podlozi je korišćen za inokulaciju lOml TSB medijuma (Difco Tryptic Soy Broth-30g u 1 litru dH20, autoklaviran 25min na 121°C) u 25mmxl50mm epruveti koja je čuvana na 28°C , 48-72sata uz mućkanje.
7.1.2. Izolovanje hromozomalne DNK iz Streptomvces
Alikvoti (0.25ml ili 0.5ml) micelija gajnih kao stoje prethodno opisano, stavljeni su u epruvete za mikrocentrifugiranje od 1.5ml i ćelije su koncentrovane centrifugiranjem na 12,000xg u trajanju od 60 sek. Supematant je bačen i ćelije su resuspendovane u 0.25ml TSE pufera (20ml 1.5M sukroza, 2.5ml IM Tris-HCl, pH 8.0, 2.5ml IM EDTA, pH 8.0 i 75ml dH20) koji sadrži 2mg/ml lizozima. Uzorci su inkubirani 20 mi na 37°C, uz mućkanje, naneti na AutoGen 540™ instrument za automatsko izolovanje nukleinskih kiselina (Integrated Separation Systems, Natick, MA) i genomske DNK izolovane pomoću Cycle 159 (softver instrumenta) prema uputstvima proizvođača.
Altemtivno, 5ml micelija je stavljeno u epruvetu dimenzija 17mm x l00mm, ćelije su koncentrovane centrifugiranjem 5 min na 3,000rpm i supematant je uklonjen. Ćelije su resuspendovane u lml TSE pufera, koncentrovane centrifugiranjem 5 min na 3,000 rpm i supematant je uklonjen. Ćelije su ponovo resuspendovane u lml TSE puferu koji sadrži 2mg/ml lizozima i inkubirani 30-60 min na 37°C uz mućkanje. Posle inkubiranja, dodato je 0.5ml 10% natrijum dodecil sulfata (SDS) i ćelije su inkubirane na 37°C dok liza nije potpuna. Lizat je inkubiran 10 min na 65°C, ohlađen do sobne temperature, podeljen u dve Ependorf epruvete od 1.5ml i ekstrahovane lx sa 0.5ml fenol/hloroform (50% fenol je prethodno ekvilibrisan sa 0.5M Tris pH 8.0; 50% hloroform). Vodena faza je uklonjena i ekstrahovana 2 do 5x sa hloroform:izoamil alkoholom (24:1). DNK je staložena dodatkom 1/10 zapremine 3M natrijum acetata, pH 4.8, smeša inkubirana na ledu 10 minuta, zatim je centrifugirana na
15,000rpm na 5°C u trajanju od 10 minuta i uklanjanje supematant u čistu epruvetu u koju je dodata 1 zapremina izopropanola.Smeša supematanta i izopropanola je onda inkubirana na ledu 20 minuta, centrifugirana 20 minuta na 15,000 rpm na 5°C, supematant uklonjen i granule DNK su isprane lx sa 70% etanolom. Posle sušenja granula, DNK je resuspendovana u TE puferu (lOmM Tris, lmM EDTA, pH 8.0).
7.1.3 Izolovanie plazmidne DNK iz Strevtomvces
Alikvoti (l.0ml) micelija su stavljeni u epruvete za mikrocentrifugiranje od 1.5ml i ćelije su koncentrovane centrifugiranjem 60 sek na 12,000xg. Supematant je odbačen, ćelije su resuspenodvane u l.0ml 10.3% sukroze i koncentovane centrifugiranjem na 12,000 x g u trajanju od 60 sek, pa je supematant odbačen. Ćelije su resuspendovane u 0.25ml TSE puferu koji sadrži 2 mg/ml lipozoma i inkubirani 20 min na 37°C uz mućkanje i naneti na AutoGen 540™ instrument za atomatsko izolovanje aminokiselina. Plazmidna DNK je izolovana pomoću Cycle 106 prema uputstvima poizvođača.
Altemtivno, 1.55ml micelija je stavljeno u epmvete za mikrocentrifugiranje i ćelije su koncentrovane centrifugiranjem 60 sek na 12,000rx g. Supematant je odbačen, ćelije su resuspendovane u lml 10.3% sukroze i koncentrovane centrifugiranjem na 12,000 x g u trajanju od 60 sek i supematant je odbačen. Ćelije su resuspendovane u 0.5ml TSE puferu koji sadrži 2mg/ml lizozima i inkubirane 15-30 min na 37°C. Posle inkubiranja, dodato je 0.25ml alkalnog SDS-a (0.3N NaOH, 2% SDS) i ćelije su inkubirane na 55°C u trajanju od 15-30 minuta ili dok rastvor ne postane bistar. U rastvor DNK dodat je natrijum acetat (0.1 ml, 3M, pH 4.8), koji je zatim inkubiran na ledu 10 minuta.Uzorci DNK su centrifugirani 10 min na
14.0 rpm na 5°C. Supematan je prebačen u čistu epruvetu i dodato je 0.2ml fenokhloroform (50% efnol: 50% hloroform) i pažljivo promešano. Rastvor DNK je centrifugiran 10 min na
14.0 rpm na 5°C i gornji sloj je uklonjen u čistu Ependorf epruvetu. Dodat je izoproanol (0.75ml) i rastvor je pažljivo promešan, pa je inkubiran na rpm u trajanju od 20 min. Rastvor DNK je centrifugiran 15 min na 14,000rpm na 5°C, supematan uklonjen i granule DNK isprane sa 70% etanolom, osušene i resuspendovane u TE puferu.
7.1.4 Izolovanie plazmidne DNK iz E.Coli
Izmenjena kolonij E.coli je inokulirana u 5ml Luria-Beratni (LB) madijuma (Bacto- Tryptone-10g, Bacto-yeast extract-5g i NaCl-lOg u 1 litru dH20, pH 7.0, autoklavirano 25min na 121°C kojem je dodato 100pg/ml ampicilina). Kultura je inkubirana preko noći i alikvot od lml je prebačen u epruvetu za mikrocentrifugiranje od 1.5ml. Uzorci kulutra su naneti na AutoGen 540™ instrument za atomatsko izolovanje aminokiselina i plazmidna DNK je izolovana pomoću Cycle 3 prema uputstvima poizvođača.
7.1.5 Pripremanje i transformacija protoplasta S.avermitilis-a
Kolonije S.avermitilis su izolovane na YPD-6 jačine 1/2. Micelijaje korišćena za inokuliranje 10ml TBS podloge u 25mmxl5mm epruveti, koja je zatim inkubirana na 28°C u trajanju od 48 sati uz muškanje (300rpm).jedan ml micelijaje upoterbljen za inokulaciju 50mnl YEME podloge. YEME podloga sadrži u litru: Difco Yeast Extract-3g; Difco Bacto- peptone-5g; Difco Malt Extract-3g; Sucrose-300g. Posle autoklaviranja na 121°C u trajanju od 25 minuta, dodato je: 2.5M MgCl2-6H20 (autoklavirano posebno 25minuta na 121°C)-2ml i glicin (20%) (sterilisan-filtriranjem)-25ml.
Micelije su gajene 48-72sata na 30°C i prikupljene centrifugiranjem u epruvetama od 50ml (Flacon) na 3,000rpm u trajanju od 20 min. Supematant je odbačen i micelijaje resuspendovana u P puferu, koji asdrži: sukrozu-205g; K2SO4-0.25g; MgCl2-6H2O-2.02g; H20-600ml; K2PO4 (0.5%)-10ml; rastvot elemenata u tragovima-20ml; CaCl2-2H20 (3.68%)- 100ml i mES pufer (1.0M, pH 6.5)-1 Omi. (*rastvor elemenata u tragovima sadrži po litru:ZnCl2-40mg; FeCl3-6H20-200mg; CuCl2-2H2O-10mg, MnCl2-4H2O-10mg; Na2B4O7-10H20-10mg; (NH4)6Mo7O24-4H2O-10mg).pH je podešeno na 6.5, kranja zapremina podešena na l litar i podloga je profiltrirana na toplo kroz filter od 0.45mikrona.
Micelijaje granulisana na 3,000rpm, 20 minuta, supematant odbačen i micelija resuspendovana u 20ml P pufera koji asdrži 2mg/ml lizozima. Micelijaje inkubirana 15minuta na 35°C uz mućkanje i formiranje protoplasta provereno mikroskopski. Kada je završeno formiranje protoplasta, potoplasti su centrifugirani l0 minuta na 8,000rpm. Supematant je uklonjen i protoplasti su resuspendovani u l0ml P pufera. Protoplasti su centrifugirani na 8,000rpm, 10 minuta, supematant uklonjen i protoplasti resuspendovani u 2ml P pufera i oko 1x109 protoplasta je raspoređeno u criogenske ampule (Nalgene) od 2ml.
Ampula koja sadrži lxl09 protoplasta je centrifugirana na 8,000rpm, 10 minuta, supematant uklonjen i protoplasti resuspendovani u O.lml P pufera. Dva do 5pg transformirajuće DNK je dodato u protoplaste, zatim je dodato 0.5ml pufera T. Osnova T pufera je: PEG-1000 (Sigma)-25g; sukroza-2.5g; H2O-83ml. pH je odešeno na 8.8 dodatkom 1N NaOH (sterilsan filtriranjem) i osnova T pufera je sterilisana fitltrianjem i čuvana na 4°C. Radni T pufer, pripremjen istog dana kada je i korišćen, je osnova T pufera-8.3ml; K2PO4 (4mM)-1.0ml; CaCl2-2H20 (5M)-0.2ml; i TES (IM, pH8)-0.5ml. Svaka komponenta radnog puferaT je individualno sterilisana filtriranjem.
U toku 20 sekundi od dodatka T pufera u protplaste, takođe je dodat l.Oml P pufera i protoplasti su centrifugirani na 8,000 rpm u trajanju od 10 min. Supematant je bačen i protoplasti su resuspendovani u O.lml P pufera. Protoplasti su zatim zasejani na RM14 podlozi koja sadrži: sukrozu-205g; K2SO4-0.25g; MgCl2-6H2O-10.12g; glukozu-10g; Difco Casamino Acid-O.lg; Difco Yeast Extract-5g; Difco Oatmeal Agar-3g; Difco Bacto Agar-22g; dH2O- 800ml. Rastvor je autoklaviran na 121°C, 25min. Possle toga, dodati su sterilni rastvori:
K2PO4 (0.5%)-10 ml; CaCl2-2H20 (5M)-5ml; L-prolin (20%)-15ml; MES pufer (1.0M, pH 6.5)-1 Omi, rastvor elemenata u tragovima (isto kao stoje prethono dato)-2ml; osnovni rastvor cikloheksimida (25mg/ml)-40ml; i 1N NaOH-2ml. Dvadeset pet ml RM14 podloge je alikvotirano po ploči i ploče su sušene 24h pre upotrebe.
Protoplasti su inkubirani 20-24 sata na 30°C i 95% vlažnosti. Za označavanje tiostrepton rezistentnih transformanti, ravnomemo je naneto lml pufera za oblaganje koji sadrži 125pg po ml tiostreptona na RM14 ploče za regeneraciju. Pufer za oblaganje sadrži u lOOml: sukrozu-10.3g; rastvor elemenata u tragovima (isto kao stoje prethono dato)-0.2ml i MES (IM, pH 6.5)-lml. Protoplasti su inkubirani 7-14dana na 30°C i 95% vlažnosti dok tiostrepton rezistentne (Thio1) kolonije nisu postale vidljive.
7.1.6 transformacija protoplasta Strevtomvces lividans S.lividans TK64 (nabavljene kod John Innes Institute, Nonvich, U.K) je korišćen za transformacije u nekim slučajevima. Postupci i preparati za rast, protoplastiranje i transformisanje S.lividans su opisani u Hopwood et al., 1985, Genetic Manipulation of Streptomvces. A Laboratorv Manual. John Innes Foundation, Nonvich, U.K., i izvedeni kao
što je tamo opisano. PLazmidna DNK je izolovana iz transformanata S.lividans kao što je opsano u prethodnom Poglavlju 7.1.3.
7.1.7.Fermentaciona analiza sojeva S.averntitilis
Micelije S.avermitilis gajene 4-7 dana na YPD-6, jačine 1/2 inokulirane u epruvete dimenzija 1x6 inča koje sadrže 8ml prethodno pripremljene podloge i dve staklene kuglice od 5mm. Prethodno pripremljena podloga sadrži: rastvomi škrob ( ili prokuvani škrob ili KOSO, Japan Com Starch Co., Nagoya)-20g/L; Pharmamedia-15g/L; Ardamine pH-5g/L (Champlain Ind., Clifton, NJ); CaC03-2g/L; 2xbcfa (“bcfa” se odnosi na masne kiseline sa razgranatim lancem) koji sadrži krajnju koncentraciju u podlozi od 50ppm 2-(+/-)-metil buteme kiseline, 60ppm izobuteme kiseline i 20ppm izovalerijanske kiseine. PH je podešeno na 7.2 i podloga je autoklavirana 25 minuta na 121°C.
Epruveta je mućkana 3 dana pod uglom od 17° na 215rpm na 29°C. Alikvot od 2ml zasejane kulture je korišćeno za inokuliranje u erlenmajer od 300ml koji sadrži 25ml medijuma koji sadrži: skrob( ili prokuvani škrob ili KOSO)-160g/L; Nutrisoy (Archer Daniels Midland, Decatur, IL)-10g/L; Ardamine pH-10g/L; K2HP04-2g/L, MgS04-4H20-2g/L, FeS04-7H20-0.02g/L; MnCl2-0.002g/L; ZnS04-7H20-0.002g/L; CaC03-14g/L; 2xbcfa (kao gore); i cikloheksan karbonsku kiseilnu (CHC) (pripremljenu kao 20% rastvor na pH 7.0)- 800ppm. pH je podešeno na 6.9 i podloga je autoklavirana 25minuta na 121°C (kao što je gore opisano, mogu se koristiti i druge polazne jedinice osim CHC (videti Tablicu 1)).
Posle inokuliranja, sud je inkubiran 12 dana na 29°C uz mešanje pri 200rpm. Posle inkubiranja, uzeto je iz suda 2ml uzorka, razblaženo sa 8ml metanola, promešano i smeša centrifugirana na l,250xg u trajanju od 10 minuta . Supematant je analizitan HPLC-om korišćenjem Beckman Ultrasphere ODS kolone (25cmx4.6mm ID), sa protokom od 0.75ml/min i detekcijom pri apsorbnci od 240nm. Mobilna faza je 86/8.9/5.1 metanol/voda/ acetonitril.
7.1.8 Izolovanie PKS gena S.avermitilis
biblioteka kozmida hromozomalne DNK S.avermitlis (ATCC 31272, SC-2) je pripremljena i hibridizovana sa probom ketosintazom (KS) dobijenom od fragmenata Saccharopolyspora erytaea gena poliketid sintaze (PKS). Detaljan opis dobijanja kozmidne
biblioteke može se naći u Sambrook et al., 1989. Detaljan opis dobijanja biblioteka hromozomalne DNK Streptomyces je dat u Hopwood et al., 1985. Kozmidni klonovi koji sadrže regione koji hibrizuju ketosintaze, su identifikovani hibridizacijom u 2.7 kb Ndel/eco47III fragment od pEX26 (dobijenom od Dr.P.Leadlay, Cambridge, UK). Oko 5ng pX26 je tretirano Ndel i Eco47III. Reakciona smeša je naneta na 0.8% SeaPlaque GTG agarozni gel (FMC BioProducts, Rockland, ME). Fragmen 2.7Kb Ndel/Eco47III je izvađen iz gela posle elektroforeze i regenerisana je DNK iz gela pomoću Gelase™, Epicentre Technologies prema Fast Protocol-u. Fragmen 2.7Kb Ndel/Eco47III je obeležen sa [alfa- 32P]dCTP (dezoksicitidin 5’-trifosfat, tetra(trietilamonijum)so, [alfa-32P]-) (NEN-Dupont, Boston, MA) korišćenjem BRL Nick Translation System (BRL Life technologies, Ine., Gaithersburg, MD) prema instrukcijama proizvođača. Tipična reakcija se odvija u zapremini od 0.05ml. Posle dodavanja 5-4H2Ohromozomalne DNK S.avermitlis Fragmen 2.7Kb Ndel/Eco47III Stop puera, obeležena DNK je odvojena od neinkorporiranih nukelotida na G- 25 Sephadex Quick Spin™ koloni (Boehringer Mannheim) prema instrukcijama proizvođača.
Oko 1,800 kozmidnih klonova je praćeno hibridizacijom kolonija. Identifikovano je deset klonova koji su hibridizovani u Sacc.erythraea KS probe. Kolonije E.coli koje sadrže kozmidnu DNK, gajene u LB tečnoj podlozi i kozmidna DNK je izolovana iz svake kulture instrumentom AutoGen540™ za automatsko izolovanje nukleinskih kiselina, korišćenjem Cycle 3 prema instrukcijama proizvođača. Restrikciono mapiranje endonukelaza i Southem- ova analiza otkriva da se pet klonova nalazi u hromozomalnim reginima koji se preklapaju. Rstrikciona mapa pet kozmida S.avermitilis genomske BamHI (tj. pSE65, pSE66, pSE67, pSE68, pSE69) je konstruisana analizom kozmida koji se preklapaju i hibridizaciom (Slika 4).
7.1.9. Identifikacija DNK koja modulira odnos B2:B1 avermekita i identifikacija aveC ORF
Sledeći postupci su korišćeni za testiranje subkloniranih fragmenata dobijenih od kozmidnog klona pSE66 na njihovu sposobnost da moduliraju odnos B2:B1 avermektina u AveC mutantima. pSE66 (5pg) su podvrgnuti digestiji sa Sad i Bamitil. Reakciona smeša je naneta na 0.8% SeaPlaque™ GTG agarozni gel (FMC BioProducts), 2.9Kb Sacl/BamHI fragment je izvađen iz gela posle elektroforeze i DNK je regenerisana iz gela pomoću
GELase™ (Epicentre Technologies) prema Fast Protocol-u. Oko 5pg dvodomog vektora (“shuttle vector”) pWHM3 (Vara et al., 1989, J. Bacteriol. 171: 5872-5881) je podvrgnuto digestiji sa Sacl i BamHI. Oko 0.5pg 2.9Kb ubačene i 0.5pg digestiranog pWHM3 je zajedno pomešano i inkubirano preko noći sa 1 jedinicom Ugaze (New England Biolabs, Ine., Beverly, MA) na 15°C u ukupnoj zapremini od 20pl, prema uputstvima proizvođača. Posle inkubacije, 5pl ligacione smeše je inkubirano 10 minuta na 70°C, ohlađeno do sobne temperature i upotrebljeno za transformisanje kompetentnih E.coli DH5a ćelija (BRL) prema instrukcijama proizvođača. Plazmidna DNK je izolovana iz amplicilin rezistantih transformanti i prisustvo 2.9Kb Sacl/BamRl dela je potvrđeno restrikcionom analizom. Plazmid je označen kao pSEl 19.
Pripremljeni su protoplasti soja S.avermitilis 1100-SC38 (Pfizer in-house soj) i transformisani sa pSEl 19 kao što je opisano u poglavlju 7.1.5. Soj 110-SC38 je mutant koji proizvodni značajno više oblik aventmektina cikloheksil-B2 u odnosu na oblik avermektin cikoheksil-B 1 kada je dodata cikloheksil karbonska kiselina (B2:B 1 oko 30:1). PSEl 19 korišćen za pretvaranje protoplasta S.avermtilis je izolovan ili iz soja E.coli GM2163 (dobijen od Dr.B.J. Bachmann, Curator, E.coli Genetic Stock Center, Yale University), soj E.coli DM1(BRL) ili S.lividans soj TK64. Tiostrepton rezitentni transformanti soja 1100-SC38 su izolovani i analizirani HPLC analizom proizvoda fermentacije. Transformanti S.avermitilis soja 1100-SC38 koji sadrži pSEl 19, proizvode izmenjeni odnos avermektina cikloheksil-B2: cikoheksil-B 1 od oko 3.7:1 (Tablica 2).
Opsle utvrđivanja da pSEl 19 može da modulira odnos avermektina B2:B1 u AveC mutantu, sekvencirana je ubačena DNK. Oko 10pg pSEl 19 je izolovano pomoću kompleta za izolovanje plazmidne DNK (Qiagen, valencia, CA) prema uputstvu proizvođača i sekvenciran pomoću ABI 373A Automated DNA Sequencer (Perkin Elmer, Forest City, CA). podaci o sekvencama su prikupljeni i uređeni pomoću Genetic Computer Group programa (GCG, Madison, WI). DNK sekvenca i aveC ORF su dati na Slici 1 (SEQ ID NO:l).
Novi plazmid, označen kao pSEl 18 je konstruisan na sledeći način. Oko 5ng pSE66 je podvrgnut digestiji sa Sphl i Bamlll. Rakciona smeša je naneta na 0.8% SeaPlaque™ GTG agarozni gel (FMC BioProducts), 2.8Kb Sph1/BamHI fragment je izvađen iz gela posle elektroforeze i DNK je regenerisana iz gela pomoću GELase™ (Epicentre Technologies) prema Fast Protocol-u. Oko 5pg dvodomog vektora (“shuttle vector”) pWHM3 je podvrgnuto
digestiji sa Sphl i BamHI. Oko 0.5pg 2.8Kb ubačene i 0.5µg digestiranog pWHM3 je zajedno pomešano i inkubirano preko noći sa 1 jedinicom ligaze (New England Biolabs) na 15°C u ukupnoj zapremini od 20µl, prema uputstvima proizvođača. Posle inkubacije, 5pl ligacione smeše je inkubirano 10 minuta na 70°C, ohlađeno do sobne temperature i upotrebljeno za transformisanje kompetentnih E.coli DH5a ćelija prema instrukcijama proizvođača.
Plazmidna DNK je izolovana iz amplicilin rezistantih transformanti i prisustvo 2.8Kb Sphl/BamHI dela je potvrđeno restrikcionom analizom. Plazmid je označen kao pSE118. Ubačena DNK u pSEl 18 i pSEl 19 se preklapaju u oko 838 nukleotida (Slika 4).
Protoplasti S.avermetilis soja 1100-SC38 su tranformisani sapSEl 18 kao stoje ranije opisano. Tiosepton rezistentni transformanti soja 1100-SC38 su izolovani i analizirani HPLC analizom proizvoda fennentacije. Transformanti S.avermetilis soja 1100-SC38 koji sadrže pSEl 18 nisu izmenjeni u odnosima avennektiva cikloheksil-B2: avermektin cikloheksil-B1 u poređenju sa sojem 1100-SC38 (Tablica 2).
7.1.10 PCR ampliflkaciia aveC gena iz hromozomalne DNK S.avermitlis
Fragment od ~ 1.2Kb koji sadrži aveC ORF je izolovan iz hromozomalne DNK S.avermitlis, PCR amplifikacijom korišćenjem prajmera oblikovanih na osnovu ranije dobijene aveC nukelotidne sekvence.PCR prajmeri su nabavljeni od Genosys Biotechnologies, Ine. (Texas). Prajmer koji je usmeren nadesno je: 5’-TCACGAAACCGGACACAC-3’ (SEQ ID NO:6), a prajmer koji je usmeren nalevo je 5’CATGARCGCTGAACCGAG-3’ (SEQ ID NO:7). PCR rakcijaje izvedena pomoću Deep Vent™ polimeraze (New England Biolabs) u puferu dobijenom od proizvođača i u prisustvu 300pM dNTP, 10% glicerola, 200pmol svakog od prajmera, 0.1 pg templata i 2.5 jedinica enzima u krajnoj zapremini od l00µl, koristeći Perkin-Elmer Cetus Thermal Cycler. Termalni profil za prvi ciklus je 95°C, 5 minuta (faza denaturacije), 60°C, 2 minuta (faza kaljenja) i 72°C, 2 min (faza produžavanja). Dvadeset i četiri uzastopna ciklusa su imala sličan termalni profil osim stoje faza denaturacije skraćena na 45 sekundi i faza kaljenja skraćena na 1 min.
PCR proizvod je elekroforeziran u 1% agaroznom gelu i detektovana je jedna DNK traka od ~1.2kb. Ova DNK je prečišćena iz gela i spojena sa 25ng linearizovanog, tupog (“blunt”) pCR-blunt vektora (inbitrogen) u 1:10 odnosu vektora: ubačenom delu perma
instrukcijama proizvođača. Ligaciona smeša je korišćena za tranformisanje One Shot™ Competent E.coli ćelije (Invitrogen) prema intrukcijama proizvođača. Plazmidna DNKje izolovana iz ampicilin rezistentnih tranformanti i prisustvo ubačenog dela~1.2kb je potvrđeno restrikcionom analizom. Plazmid je onzačen kao pSE179.
Ubačena DNK iz pSEl79 je izolovana procesiranjem sa BamHI/Xbal, odvojena elektroforezom, prečišćen iz gela i povezan sa dvodomim vektorom (“shuttle vector”), pWHM3, koji je takoje procsiran sa BamHI/Xbal, pri ukupnoj koncentraciji DNK od lpg u 1:5 molranom odnosu vektora i ubačenog dela. Ova smeša je korišćena za tranformaciju kompetentnih E.coli DH5a ćelija prema instrukcijama proizvođača. Plazmidna DNKje izlovana iz ampicilin rezistentnih tranformanti i prisustvo ubačenog dela od ~ 1.2Kb je potvrđeno restrikicionom analizom. Plazmid, koji je obeležen kao pSE186 (Slika 2, ATCC 209604) je transformisana u E.coli DM1, plzmidna DNKje izolovana iz ampicilin rezistentnih transffomanti.
7.2 Rezultati
Fragment Sacl/BamHI od 2.9Kb iz pSEl 19 je identifikovan tako, da kad je transformisan u S.avermitilis soj 1100-SC38, značajno menja odnos B2:B1 proizvedenog avermektina. S.avermetilis soj 1100-SC38 normalno ima odnos B2:B1 od oko 30:1, ali kad je transformisan vektorom koji sadrži fragment Sacl/BamHI od 2.9Kb, odnos B2:B1 avermektina je smanjen na oko 3.7:1. Pos-fermentaciona analiza kultura transformanti potvrilaje prisustvo transformiraj uće DNK.
Fragment pSEl 19 od 2.9Kb je sekvenciran i identifikovan je ORE od ~0.9Kb (Slika 1) (SEQ ID NO: 1), koji sadrži fragmen PstI/Sphl koji je prethodno mutiran na drugom mestu kako bi davao samo B2 proizvode (Ikeda et al., 1995). Poređenjem ovog ORF ili odgovarajućeg izvedenog polipeptida, u odnosu na poznatu bazu podataka (GenEMBL, SWISS-PROT) nije pokazao značajnu holologiju sa poznatom DNK ili sekvencom proteina.
Tablica 2 predstavlja fermentacionu analizu S.avermitilis soja 1100-SC38 transformisane različitim plazmidima.
8.0 Primer: Pobijanje izrođenih varijanti S.avermitilis AveC Ovaj primer opisuje dobijanje nekoliko različitih izrođenih varijanti S.avermitlis AveC korišćenjem preparata i potupaka koji su prethodno opisani. Opšti opis tehnika za uvođnje mutacija u gen Streptomyces-a su opisali Keiser i Hopwood, 1991, Meth. Enzym. 204: 430458. Detaljan opis je dao Anzai et al., 1988, J. Antibiot. XLI (2): 226-233 i Stutzman-Engwall et al., 1992, J. Bacteriol. 174(1): 144-154. Ove reference su date u potpunosti.
8.1 Inaktivaciia S.avermitilis aveC trena AveC mutanti koji sadrže inaktivirane aveC gene su dobijeni prema sldećim postupcima.
U prvom postupku, fragment PstVSphl od 640bp koji je unutrašnji u odnosu na aveC gen u pSEl 19 (plazmid opisan u Poglavlju 7.1.9) je zamenjen sa ErmE genom (otporan na eritromivin) iz Sacc.erythraea. ErmE gen je izolovan iz pIJ14026 (dobijenom od John Innes Institute, Nonvich, U.K.; vidi takođe Bibb et al., 1985, Gene 41: 357-368) digestijom restrikcionim enzimima sa BgAl i EcoRI, zatim elektroforezom i prečišćavanjem iz gela. Ovaj fragment od ~1.7Kb je povezan u pGEM7Zf (promega) koji je digestiran sa BamEil i EcoRI i dobijena smeša je tranformisana u kompetentnu E.coli DH5a ćelije prema instrukcijama proizvođača. Plazmidna DNK je izolovana iz ampilicin rezistentnih transformanti i prisustvo ubačenog dela od ~1.7Kb je potvrđeno restrikcionom analizom. Plazmid je označen kao pSE27.
pSE 118 (opisan u Poglavlju 7.1.99) je podrvgnut digestiji sa Sphl i BamHI, zatim podrvgnut elektorforezi i ubačni deo od ~2.8Kb Sphl/BamRl je prečišćen iz gela. pSEl 19 je podvrgnut digestiji sa Pstl i EcoRI, zatim elektroforeziran i ubačni deo od ~1.5Kb PstVEcoRI
je prečišćen iz gela. Dvodomi vektor (“shuttle vector”) pWHM3 je podvrgnut digstiji sa BamHl i EcdRl. PSE27 je podvrgnut digestiji sa Pstl i Sphl, zatim elelktroforeziran i ubačni deo od ~1.7Kb Pstl/Sphl je prečišćen iz gela. Sva četiri fragmenta (tj. ~2.8Kb, ~1.5Kb, ~7.2Kb, ~1.7Kb) su spojeni 4-stranom ligacijom. Ova smeša je transformisana u kompetentne E.coli DH5a ćelije prema instrukcijama proizvođača. Plazmidna DNK je izolovana iz tranformanti rezistentnih na ampicilin i prisustvo odgovarajućeg ubačenog dela je potvrđeno restrikcionom analizom. Ovaj plazmid je označen kao pSE180 (Slika 3; ATCC 209605).
PSE180 je transformisan u TK64 S.lividans i transformisane kolonije su identifikovane rezistencijom na tiostrepton i eritromicin. PSE180 je izolovan iz S.lividans i korišćen za transfromisanje protoplasta S.avermitlis. Četiri tiostrepton rezistentnih S.avermitilis transfromanti je identifikovano i protoplasti su pripremljeni i nanete na RM14 podlogu pod ne-selektivnim uslovima. Posle regeneracije protoplasta, kolonije su praćene na pristust Sacl/BamHIezistentnosti na ritromicin i odsustvo rezistentnosti na tirostrepton, ukazujući na hromozomalnu integraciju inaktiviranih aveC gena i gubitak slobodnog replikona. Jedan Ermr Thios transformant je identifikovan i označen kao soj SE 180-11. Ukupna hromozomska DNK je izolovana iz soja SE180-11, podvrgnuta digestiji sa restrikcionim enzimima BamPll, Hindlll, Pstl ili Sphl, razdvojena elektroforezom na 0.8% agaroznom gelu, prebačena na membrane od najlona i hibridizovana u ermE probe. Ove analize pokazuju da se hromozomalna integracija gena rezistentnih na ermE i brisanje fragmenata Pstl/Sphl od 640bp ovija dvostrukim unakrsnim postupkom. HPLC analiza proizvoda fermentacije lanca SE180-11 pokazuju da se normalni avermektini više ne proizvode (Slika 5).
U drugom postupku za inaktivaciju aveC gena, ermE gen od 1.7Kb je uklonjen iz hromozoma S.avermitilis soja SE180-11, ostavljajući brisanje 640bp Pstl/Sphl u aveC genu. Plazmid za zamenu gena je dobijena na sledeći način: pSE180 je podvrgnut delimičnoj digestiji sa Xbal i fragment od ~11.4Kb je prečišćen iz gela. Traci ~11.4Kb nedostaje gen od 1,7Kb rezistentnan na ermE. DNK je zatim povezana i transformisana u E.coli DH5a ćelije. Plazmidna DNK je izolovana iz transfromanti rezsitentnih na ampilicin i prisustvo odgovarajućeg ubačenog dela je potvrđeno restrikcionom analizom. Ovaj plazmid koji je označen kao pSE184 je transformisan u E.coliDM1 i plazmid DNK izolovan iz transfromanti rezistentnih na amplicilin. Ovaj plazmid je korišen za transformaciju protoplasta S.avermitilis soja SE180-11. Protoplasti su pripremljeni od triostrepton rezistentnih transformanti soja
SE180-11 i naneti su na kolonije RM14. Posle regeneracije protoplasta, kolonije su analizirane na odsustvo i rezistentnosti na eritromicin i rezistentnosti na tiostrepton, ukazujući na hromozomalnu integraciju inaktiviranog aveC gena i gubitak slobodnog replikona sa ermE genom. Jedan ErmsTios transformant je identifikovan i označen kao SE184-1-13. Fermentaciona analiza SE184-1-13 pokazuje da normalni avermektini nisu dobijeni i da SE 184-1-13 ima isti fermentacioni profil kao SE 180-11.
Treći postupak za inaktivaciju aveC gena, okvir pomeranja je ubačen u hromozomalni aveC gen dodtkom dva G posle C na nt položaju 471 pomoću PCR, dajući tako BspEl mesto. Prisustvo dobijenogBsoEl mesta je bilo korisno za detektovanje zamene gena. PCR prajmeri su dizjanirani tako da uvedu mutaciju okvira pomeranja u aveC gen i nabavljeni su od Gemosys Biotechologies,Inc. Prajmerkojijeusmeren nadesno je 5’—
GGTTCCGGATGCCGTTCTG-3’ (SEQ ID NO:8) i prajmer koji je usmeren nalevo je 5’- AACTCCGGTCGACTCCCCTTC-3’ (SEQ ID NO:9). PCR uslovi su kao što je opsiano u Poglavlju 7.1.10. Proizvod PCR od 666bp je podvgmut digestiji sa SphI, pri čemu su dobijena dva fragmenta od 278bp i 388bp. Fragment od 388bp je prečišćen iz gela.
Plazmid za zamenu gena je dobijen na sledeći način: dvodomi vektor (“shuttle vector”) pWHM3 je podvrgnut digestiji sa EcoRI i BamHI. pSE je podvrgnut digestiji sa BamHI i Sphl, zatim elektroforeziran i iz gela je prečišćen fragment od ~84bp. pSE je podvrgnut digestiji sa EcoRI i Xmnl, zatim elektroforeziran i iz gela je prečišćen fragment od ~1.7Kb. Sva četiri fragmenta (tj., ~7.2Kb, ~840bp, ~1.7Kb i 388bp) su spojeni 4-stranom ligacijom. Ova smeša je transformisana u kompetentne E.coli DH5a ćelije. Plazmidna DNK je izolovana iz tranformanti rezistentnih na ampicilin i prisustvo odgovarajućeg ubačenog dela je potvrđeno restrikcionom analizom i analizom sekvence DNK. Ovaj plazmid je označen kao pSE185 je transformisan u E.coli DM1 i plazmidna DNK izolovana iz transformanti rezistentnih na ampicilin. Plazmid je korišćen za transformaciju protoplasta S.avermitilis soja 1100-SC38. Izolovane su transformante rezistentne na tiostrepton soja 1100-SC38 i analizirane HPLC analizom proizvoda fermentacije. PSE185 nije značajno izmenio odnos B2:B1 avermektina kada je transformisan u S.avermitilis soj 1100-SC38 (Tablica 2).
PSE185 je korišćen za transformisanje protoplasta S.avermitlis za stvaranje mutacije okvira pomeranja u hromozomskom aveC genu.Protoplasti su pripremljeni od tiostrepton rezistentnih transfromanti i naneti na RM14. Posle regeneracije protoplasta, kolonije su
praćene na odstustvo rezistentnosti na tiostrepton. Hromozomska DNK je izolovana iz kolonija osetljivih na tiostrepton i analizirane PCR-om na prisustvo mutacija okvira pomeranja integrisanih u hromozomu. PCR prajmeri su dizajnirani na osnovu aveC nukleotidne sekvence i nabavljene su od Genosys Biotechnologies,. Ine. (Texas). Prajmer koji je usmeren nadesno je: 5’-GCAAGGATACGGGGACTAC-3 ’ (SEQ ID NO: 10) i PCR prajmer je: 5’-GAACCGACCGCCTGATAC-3’ (SEQ ID NO:l 1) i PCR uslovi su kao stoje dato u Poglavlju 7.1.10. Dobijeni PCR proizvod ima 453bp i kada se podvrgne digestiji sa BspE 1, uočavaju se tri fragmenta i to od 368bp, 96bp i 79bp ukazujući na integraciju hromozoma inaktiviranih aveC gena i gubitak slobodnog replikona.
Analiza fermentacije S.avermitilis nutanata koji sadrže mutaciju okvira pomeranja u aveC genu, ukazuju na to da se noramlni avermektin više ne proizvodi i da ovi mutanti imaju istu HPLC profil fermentacije kao sojevi SE180-11 i SE184-1-13. Identifikovana je jedna Thios tamsformanta i označena kao soj SE185-5a.
Dalje, dobijena je mutacija aveC gena koja menja nt položaj 520 iz G u a, što za rezultat ima promenu kodona koji kodira triptofan (W) na položaju 116 u terminacioni kodon. S.avermitilis soj sa ovom mutacijom ne proizvodi normalan avermektin ima isti fermentacioni profil kao sojevi SE180-11, SE 184-1-13, i SE185-5a.
Dodatno, dobijene su mutacije aveC gena koje menjaju i: (i) nt položaj 970 iz G u A, koji menja amino kiselinu na položaju 266 iz (G) u aspartat (D) i (ii) nt na položaju 996 iz T u C, što menja amino kiselinu na položaju 275 iz tirozina (Y) u histidin (H). S.avermitilis soj sa ovim mutacijama (G266D/Y275H) ne proizvodi normalne averemktine i ima isti profil fermentacije kao sojevi SE180-11, SE184-1-13 i SE-185-5a.
S.avermitilis aveC inaktivacioni mutantni sojeva SE180-11, SE184-1-13, SE185-5a i drugi koji su dati u ovom tekstu, obezbeđuuju sredstvo za praćenje procene uticaja ostalih mutacija u aveC genu. PSE186 koji sadrži kopiju divljeg soja aveC gena je transformisan u E.coliDMl i plazmidna DNKL je izolovana iz transformanti rezistentih na ampilicin. Ova DNK pSEl86 je korišćena za tranformisanje protoplasta S.avermitilis soja SE180-11. Izolovane su transformante rezistentne na tiostrepton soja SE180-11, određeno je prisustvo otpornosti na eritromicin i Thior Ennr transformante su analizirane HPLC analizom proizvoda fermentacije. Prisustvo funkcionalnih aveC gena u trans, moglo je da povrati proizvodnju normalnog avermektina u soj SE180-11 (Slika 5b).
8.2. Analiza mutacija u AveC genu koii menia odnos klasa B2:B1
Kao što je prethodno opisano, S.avermitilis soj SE180-11 koji sadrži inaktiviran aveC gen je upotpunjen transformacijom sa plazmidom koji sadrži funkcionalne aveC gene (pSE186). Soj pSE 180-11 je takođe korišćen kao soj domaćina za karakterizaciju drugih mutacija u aveC genu, kao stoje dato u daljem tekstu.
Hromozomska DNK je izolovana iz soja 1100-SC38 i koristi se kao templat za PCR mamplifikacije aveC gena. ORF od 1.2Kb je izolovan PCr amplifikacijom primenom prajmera koji se zasnivaju na aveC nukleotidnoj sekvenci. Prajmer koji je usmeren nadesnoje SEQ ID NO:6 i usmeren nalevo je SEQ ID NO:7 (vidie Poglavlje 7.1.10). Uslovi za PCR i subkloniranje su kao stoje opisnao u Poglavlju 7.1.10. Analiza DNK sekvence ORF od 1.2Kb pokazuje mutacije u aveC genu koja menja nt položaj 337 iz C u T, što menja amino kiselini na položaju 55 iz serina (S) u fenilalanin (F). AveC gen koji sadrži S55F mutacije je sublkoniran u pWHM3 za dobijanje plazmida koji je označen kao pSE187 i koji se koristi za tretvaranje protplasta S.avermitilis soja SE180-11. izolovane su transformante rezistentne na tiostrepton soja SE180-11, određeno je prisustvo rezistentosti na eritromicin i ThiorErmr transformante su analizirane HPLC analizom proizvoda fermentacije. Prisustvo aveC gena koji kodira promene u aminokiselinskom ostatku 55 (S55F) može da obnovi proizvodnju normalnog avermektina u soj SE 180-11 (Slika 5C); međutim, odnos cikloheksil B2:cikloheksil BI iznosi oko 26:1 u poređenju sa sojem SE180-11 transformisanog sapSE186 koji ima odnos B2:B1 od oko 1.6:1 (Tablica 3), ukazujući na to dajedna mutacija (S55F) modulira količinu proizvedenog cikloheksil-B2 u odnosu na cikloheksil-B 1.
Identifikovana je druga mutacija u aveC genu koja menja nt položaj 862 iz G u A, što menja amino kiselinu na položaju 230 iz glicina (G) u aspartat (D). S.avermitilis soj sa ovom mutacijom (G230D) proizvodi avermektine u odnosu B2:B1 od oko 30:1.
8.3. Mutacije koje smanjuju odnos B2:B1
Dobijeno je nekoliko mutacija koje smanjuju količinu proizvedenog cikloheksil-B2 u odnosu na cikloheksil-B1 i to na sledeći način.
Identifikovana je mutcija u aveC genu koja menja nt položaj 588 iz G u A, koji menja amino kiselinu u položaju 139 iz alanina (A) u treonin (T). AveC gen koji sadrži A139T mutaciju je subkloniran u pWHM3 za dobijanje plazmida koji je označen kao pSE188 i koji je
korišćen za tranformaciju protoplasta S.avermitilis soja SE180-11. Izolovane su transfromante rezistentne na tiostrepton doja SE180-11, određeno je postojanje rezistentnosti na eritromicin i Thior Ermr transformante su analizirane HPLC analizom proizvoda fermentacije. Prisustvo imitiranih aveC gena koji kodiraju promenu aminokiselinskog ostatka 139 (A139T) može da obnovi proizvodnju avermektina u soj SE180-11 (Slika 5D); međutim, B2:B1 odnos od oko 0.94:1 ukazuje da ova mutacija smanjuje kolilčinu proizvedenog cikloheksil-B2 u odnosu na cikloheksil-B 1. Ovaj rezultat je neočekivan jer objavljeni rezultati kao i rezultati mutacija koje su prethodno opisane su pokazivali ili inaktivaciju aveC gena ili povećanu proizvodnju B2 oblika avermektina u odnosu na BI oblik (Tablica 3).
Budući da A139T mutacija menja odnos B2:B1 u smeru dobijanja BI, izvedena je mutacija koja kodira treonin umesto serina na aminokiselinskom položaju 138. Tako, pSE186 koja je digestirana sa EcoKl i klonirana u pGEM3Zf (Promega) koji je digestiran sa EcoR\. Ovaj plazmid, koji je označen kao pSE186a, podvrgnut je digestiji saApal i Knpl, fragmenti DNK odvojeni na agaroznom gelu i iz gela su prečišćena dva fragmenta od ~3.8Kb i ~0.4Kb. Deo DNK od ~1.2Kb iz pSE186 je korišćen kao PCR templat za uvođenje promena jedne baze na nt položaju 585. PCR prajmeri su dizajnirani tako da uvedu mutaciju na nt položaju 585 i i nabavljeni su od Genosys Biotechnologies,. Ine. (Texas). Prajmer koji je usmeren nadesno je:
5 ’-GGGGGCGGGCCCGGGTGCGGAGGCGGAAATGCCCCTGGCGACG-3 ’ (SEQ ID NO:12) i PCR prajmer koji je usmeren nalevo je: 5 ’ -GG AACCG ACCGCCT GAT AC A-3 ’ (SEQ ID NO: 13). PCR reakcija je izvedena korišćenjem Advantage GC Genomic kompleta (Clonetech Laboratories, Palo Alto, CA) u puferu dobij enom od proizvođača u prisustvu 200(iM dNTPa, 200pmol svakog od prajmera, 50ng teplata DNK, 1.0M GC-Melt i 1 jedinicom KlenTaq Polimese Mix u krajnjoj zapremini od 50pl. Termalni profil prvog ciklusa je 94°C u trajanju od 1 min, zatim sledi 25 ciklusa od 94°C u trajanju od 30 sec i 68°C u trajanju od 2 min; i 1 ciklus na 68°C u trajanju od 2 min; i 1 ciklus na 68°C u trajanju od 3 min. PCR proizvod od 295bp je digestiran saApal i KnpI za oslobađanje fragmenta od 254bp, koji je podvrgnut eletroforezi i prečišćen iz gela. Sva tri fragmenta (~3.8Kb, ~0.4Kb i 254bp) su povezani 3-stranom ligacijom. Ova smeša je tamsformisana u kometentne DH5a ćelije E.coli. Plazmidna DNK je izolovana iz tranformanti rezistentnih na ampicilin i prisustvo odgovarajućeg ubačenog dela je potvrđeno restrikcionom analizom. Ovaj plazmid je označen kao pSE198.
pSEl 98 je podvrgnut digestiji sa EcoRI, kloniran u pWHM3, koji je digestiran sa EcoRI i transformisan u DH5a ćelije E.coli. Plazmidna DNK je izolovana iz transformanti rezistentnih na ampicilin i i prisustvo odgovarajućeg ubačenog dela je potvrđeno restrikcionom analizom i analizom sekvence DNK. Plazmidna DNK je transformisana u DMlplazmidnu DNK E.coli, plazmidna DNK je izolovana iz transformanti rezistentnih na ampicilin i prisustvo odgovarajućeg ubačenog dela je potvrđeno restrikcionom analizom. Plazmid koji je označen kao pSE199, korišćen je za pretvaranje protoplasta S.avermitilis soja SE180-11. Izolovane su transformante rezistentnih na tiostrepton soja SE180-11, utvrđenaje rezistentost na eritromicin i i ThiorErmr transformante su analizirane HPLC analizom proizvoda fermentacije. Prisustvo imitiranog aveC gena koji kodira promene u aminokiselinskom ostatku 138 (S138T) može da obnovi proizvodnju normalnog avermektina u soj SE180-11, međutim, odnos B2:B1 iznosi 0.88:1, ukazuje na to da ova mutacija modulira količinu proizvedenog cikloheksil-B2 u odnosu na cikloheksil-B 1 (Tablica 3) Ovaj odnos B2:B1 je čak manji nego odnos od 0.94:1 uočen kod mutacija A139T dobijenih pretvaranjem soja SE180-11 sa pSE188, kao stoje prethodno opisano.
Sledeća mutacija je kostruisana tako da uvede treonin na oba položaje amino kiselina i 138 i 139. Ubačen deo DNK od ~1.2Kb iz pSE186 je korišćen kao PCR templat. PCR prajmeri su tako napravljeni da uvode mutacije na nt položaje 585 i 588 i nabavljene su od Genosys Biotechnologies,. Ine. (Texas). Prajmer koji je usmeren nadesnoje: 5’- GGGGGCGGGCCCGGGTGCGGAGGCGGAAATGCCGCTGGCGACGACC-3 ’ (SEQ ID NO: 14) i PCR prajmer usmeren na levo je: 5’-GGAACATCACGGCATTCACC-3’ (SEQ ID NO: 15). PCR proizvod od449bp je podvrgnut digestiji sa Apal i Kpnl pri čemu se oslobađa fragment od 254bp koji je zatim elektroforeziran i prečišćen iz gela. pSE186a je podvrgnut digestiji saApal i Knpl, DNK fragmenti odvojeni na agaroznom gelu i iz gela su prečišćena dva fragmenta od ~3.8Kb i ~0.4Kb. Sva tri fragmenta (~3.8Kb, ~0.4Kb i 254bp) su povezani 3-smemom ligacijom i ova semša je transformisana u kompetente DH5a ćelije E.coli. Plazmidna DNK je izolovana iz transformanti rezistentnih na ampicilin i prisustvo odgovarajućeg ubačenog dela je potvrđeno restrikcionom analizom. Ovaj plazmid je iznačen kao pSE230.
PSE230 je podvrgnut digestiji sa EcoRI, kloniran u pWHM3, koji je digestiran sa EcoRI i transformisan u DH5a ćelije E.coli. Plazmidna DNK je izolovana iz transformanti
rezistentnih na ampicilin i i prisustvo odgovarajućeg ubačenog dela je potvrđeno restrikcionom analizom i analizom sekvence DNK. Plazmidna DNK je transformisana u DMlplazmidnu DNK E.coli, plazmidna DNK je izolovana iz transformanti rezistentnih na ampicilin i prisustvo odgovarajućeg ubačenog dela je potvrđeno restrikcionom analizom. Plazmid koji je označen kao pSE231, korišćen je za pretvaranje protoplasta S.avermitilis soja SE180-11. Izolovane su transformante rezistentnih na tiostrepton soja SE180-11, utvrđena je rezistentnost na eritromicin i i ThiorErmr transformante su analizirane fermentacijom. Prisustvo dvostruko imitiranog aveC gena koji kodira S138T/A139T može da obnovi proizvodnju normalnog avermektina u soj SE180-11, međutim, odnos B2:B1 iznosi 0.84:1, ukazuje na to da ova mutacija modulira količinu proizvedenog cikloheksil-B2 u odnosu na cikloheksil-B 1 (Tablica 3) u odnosu na smanjenje postignuto transformacijom soja SE180-11 sa pSE188 ili pSE199, kao stoje prethodno opisano.
Naredna mutacija je kreirana tako da dalje smanji količinu porizvedenog cikloheksil- B2 u odnosu na cikloheksil-B 1. Budući da S138T/A139T mutacije menjaju odnose B2:B1 u smeru povoljnijem za BI, mutacija je tako izvedena da uvede treonin na položaj 138 amino kiselina i fenilalanin na položaj amino kiseline 139.Kao PCR templat korišćen je deo DNK od ~1.2Kb iz pSE186. PCR prajmeri su dizajnirani tako da uvedu mutacije na položajima 585 (menjanjem T u A), 588 (menjanjem G u T) i 589 (menjanjem C u T) i i nabavljene su od Genosys Biotechnologies,. Ine. (Texas). Prajmer koji je usmeren nadesno je: 5’- GGGGGCGGGCCCGGGTGCGGAGGCGGAAATGCCGCTGGCGACGTTC-3’ (SEQ ID NO: 16) i PCR prajmer nalevo je: 5’-GGAACATCACGGCATTCACC-3’ (SEQ ID NO:15). PCR reakcija je izvedena korišćenjem Advantage GC Genomic kompleta (Clonetech Laboratories, Palo Alto, CA) u puferu dobij enom od proizvođača u prisustvu 200pM dNTPa, 200pmol svakog od prajmera, 50ng teplata DNK, 1.1 Mm Mg acetata, 1.0M GC-Melt i 1 jedinicom Tth DNA Polimese u krajnjoj zapremini od 50pl. Termalni profil prvog ciklusa je 94°C u trajanju od 1 min, zatim sledi 25 ciklusa od 94°C u trajanju od 30 sec i 68°C u trajanju od 2 min; i 1 ciklus na 68°C u trajanju od 3 min. PCR proizvod od 449bp je digestiran sa ApaI i KnpI za oslobađanje fragmenta od 254bp, koji je podvrgnut eletroforezi i prečišćen iz gela. Sva tri fragmenta (~3.8Kb, ~0.4Kb i 254bp) su povezani 3-stranom ligacijom. Ova smeša je tamsformisana u kometentne DH5a ćelije E.coli. Plazmidna DNK je izolovana iz tranformanti
rezistentnih na ampicilin i prisustvo odgovarajućeg ubačenog dela je potvrđeno restrikcionom analizom. Ovaj plazmid je označen kao pSE238.
PSE238 je podvrgnut digestiji sa EcoRl, kloniran u pWHM3, koji je digestiran sa EcoRI i transformisan u DH5a ćelije E.coli. Plazmidna DNK je izolovana iz transformanti rezistentnih na ampicilin i i prisustvo odgovarajućeg ubačenog dela je potvrđeno restrikcionom analizom i analizom sekvence DNK. Plazmidna DNK je transformisana u DMlplazmidnu DNK E.coli, plazmidna DNK je izolovana iz transformanti rezistentnih na ampicilin i prisustvo odgovarajućeg ubačenog dela je potvrđeno restrikcionom analizom. Plazmid koji je označen kao pSE239, korišćen je za pretvaranje protoplasta S.avermitilis soja SE180-11. Izolovane su transformante rezistentnih na tiostrepton soja SE180-11, utvrđena je rezistentost na eritromicin i i ThiorErmr transformante su analizirane HPLC analizom proizvoda fermentacije. Prisustvo dvostruko imitiranog aveC gena koji kodira S138T/A139F može da obnovi proizvodnju normalnog avermektina u soj SE180-11; međutim, odnos B2:B1 iznosi 0.75:1 i ukazuje na to da ova mutacija dalje smanjuje količinu proizvedenog cikloheksil-B2 u odnosu na cikloheksil-B1 (Tablica 3) u odnosu na smanjenja dobijena pretvaranjem soja SE180-11 sapSE188, pSE199 ili pSE231 kao stoje prethodno opisano.
Dodatne mutacije su osmišljene tako da dalje smanje količinu proizvedenog cikloheksil-B2 u odnosu na cikloheksil-Bl, primenom tehnike mešanja DNK(“DNK
shuffling”) kao stoje opisao Stemmer. 1994, Nature 370:389-391; i Stemmer, 1994, roc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 10747-10751; i dalje opisano u Patentima Sjedinjenih američkih Država Br. 5,605,793; 5,811,238; 5,830,721 i 5,837,458.
Plazmidi pomešanih DNK koji sadrže mutirane aveC gene su transformisani u kompetentne ćelije dam dcm E.coli. DNK plazmida je izlovana iz transfromanti rezistentnih na ampicilin i korišćena za pretvmje protoplasta S.avermitilis soja SE180-11. Izolovane su tmsformante rezistentne na tiostrepton soja Sel80-11 i proverene na proizvodnju averemektina sa odnosom cikloheksil-B2:cikloheksil-Bl od 1:1 ili manje. Određena je DNK sekvenca plazmidne DNK iz SE180-11 transformanti koje proizvode avermektin u odnosu B2:B1 od 1;1 ili manjim.
pSE290 sadrži mutacije na 4 nukelotida na nt položaju 317 iz T u A, na nt položaju 353 iz C u A, na nt položaju 438 iz G u A i nt položaju 1155 iz T u A. Promena nukelotida na položaju 317 menja amino kiselinu na AA položaju 48 iz D u E i promena nukelotida na nt položaju 438 menja amino kiselinine na AA položaju 89 iz A u T. Odnos B2:B1 proizveden ćelijama koje nose ovaj plazmid iznosio je 0.42:1 (Tablica 4).
pSE291 sadrži mutacije na 4 nukelotida na nt položaju 272 iz G u A, na nt položaju 585 iz T u A, na nt položaju 588 iz G u A i nt položaju 708 iz G u A. Promena nukelotida na položaju 585 menja amino kiselinu na AA položaju 138 iz S u T i promena nukelotida na nt položaju 588 menja amino kiselinine na AA položaju 139 i A u T i promena nukleotida na nt položaju 708 menja amino kiseline na AA nt položaju 179 iz G u S. Odnos B2:B1 proizveden ćelijama koje nose ovaj plazmid iznosio ee 0.57:1 (Tablica 4).
pSE292 sadrži iste mutacije četiri nuklleotida kapSE290. Odnos B2:B1 proizveden ćelijama koje nose ovaj plazmid iznosio je 0.40:1 (Tablica 4).
pSE293 sadrži mutacije na 6 nukelotida na nt položaju 24 iz A u G, na nt položaju 286 iz A u C, na nt položaju 497 iz T u C i nt položaju 554 iz C u T, na nt položaju 580 iz T u C i na nt položaju 886 iz A u T. Promena nukelotida na položaju 286 menja amino kiselinu na AA položaju 38 iz Q u P i promena nukelotida na nt položaju 580 menja amino kiselinine na AA položaju 136 iz L u P i nukelotidna pormena na nt položaju 886 menja amino kiselinu na AA položaju 238 iz E u D. Odnos B2:B1 proizveden ćelijama koje nose ovaj plazmid iznosio je 0.68:1 (Tablica 4).
pSE294 sadrži mutacije na 6 nukelotida na nt položaju 469 iz A u G, na nt položaju 585 iz T u A, na nt položaju 588 iz G u A i nt položaju 708 iz G u A, na nt položaju 883 iz C u T i na nt položaju 1184 iz G u A. Promena nukelotida na položajima 173, 174 i 175 su izbrisane. Promena nukleotida na nt položaju 469 menjaju amino kiselinu na AA položaju 99 iz F u S, promena nukelotida na nt položaju 585 menja amino kiselinine na AA položaju 138 iz S u T, nukelotidna promena na nt položaju 588 menja amino kiselinu na AA položaju 139 iz A u T i promena nukleotida na nt položaju 708 menja amino kiseline iz AA položaja 179 iz G u S-. Odnos B2:B1 proizveden ćelijama koje nose ovaj plazmid iznosio je 0.538:1 (Tablica 4).
pSE295 sadrži mutacije na 2 nukelotida na nt položaju 588 iz G u A, na nt položaju 856 iz T u C. Promena nukelotida na položaju 588 menja amino kiselinu na AA položaju 139 iz A u T i promena nukelotida na nt položaju 856 menja amino kiselinine na AA položaju 228 iz M u T. Odnos B2:B1 proizveden ćelijama koje nose ovaj plazmid iznosio je 0. 80:1 (Tablica 4).
pSE296 sadrži mutacije na 5 nukelotida na nt položaju 155 iz T u C, na nt položaju 505 iz G u T, na nt položaju 1039 iz C u T i nt položaju 1202 iz C u T i na nt položaju 1210 iz T u C. Promena nukelotida na položaju 505 menja amino kiselinu na AA položaju 11 iz G u V i promena nukelotida na nt položaju 1039 menja amino kiselinine na AA položaju 289 iz P u L. Odnos B2:B1 proizveden ćelijama koje nose ovaj plazmid iznosio je 0.73:1 (Tablica 4).
pSE297 sadrži mutacije na 4 nukelotida na nt položaju 377 iz G u T, na nt položaju 588 iz G u A, na nt položaju 633 iz A u G i nt položaju 1067 iz A u T. Promena nukelotida na položaju 588 menja amino kiselinu na AA položaju 139 iz A u T, promena nukelotida na nt položaju 633 menja amino kiselinine na AA položaju 154 iz K u E i nukelotidna pormena na nt položaju 1067 menja amino kiselinu na AA položaju 298 iz Q u H. Odnos B2:B1 proizveden ćelijama koje nose ovaj plazmid iznosio je 0.67:1 (Tablica 4).
Dodatni ciklus mešanja DNK(“DNK shuffling”) je izveden kako bi se dalje smanjila količina dobij enog cikloheksil-B2 avermektina u odnosu na cikloheksil-Bl avermektin i to na sledeći način.
Semi sintetičko mešanje (“shuffling”)
Najbolji klon je promešan (“shuffled”) prema postupku opisanom u PCT Međunarodnoj Objaci WO 97/20078, Maxygen Ine. Individualni oligonukleotidi koji kodiraju povoljne supstitucije koje najbolje reaguju na smanjen odnos B2:B1, dodate su reakciju mešanja (“shuffling reaction”) u višku od 5 mola u odnosu na lanac aveC templata. Svako nesparivanje nukleotid u polinukleotidu je flankirano sa 20 nukleotida savršenog identiteta kako bi se osigurala propisna inkorporacija u toku rekacije mešanja (“shuffling reaction”). Oligonukleotidi su kupljeni od Operon Technologies (Alameda,CA).
Rast HIP S.avemrmitilis-a
Nezavisni klonovi su odabrani iz ploča za transformaciju i inokulirani u 200pl R% medijum (Keiser, T., et al., “Practical Streptomyces Genetics”, 2000, Nonvich, U.K., John Innes foundation) u 96-to ćelijskoj ploči za zasejavanje i gajeni na 30°C uz mešanje. U svaku ćeliju (udubljenje), dodata je staklena kuglica za dispeziju micelije i mešanje kultura. U toku ovog perioda, kulture su se izjednačile i postale gušće. Posle 4-5 dana, 20pl podloge za
zasejavanje kulture je prebačeno u ploče za proizvodnju i preostala zapremina je zamrznuta kao osnovna na -80°C posle dodavanja glicerola tako daje krajnja koncentracija 20%. Ploče za proizvodnju su inkubirane 12-14 dana na 30°C. Sprulacija lanaca se oigrala 5-8 dana inkubacije. Pozvodne ploče su pripremljene kao stoje opisano u PCT međunatorodnoj Publikaciji WO 99/41389, Pfizer Ine., sa izuzetkom dodavanja 1% agaroze kako bi se dobila čvrsta površina.
Eksrakciia i ESI-MS/MS skrinins
Dodato je ukupno lml etil acetata u svaku ćeliju (udubljenje) i inkubirano na sobnoj temperaturi 20 minuta uz mućkanje. Oko 75Opi etil acetatne faze je regenerisano prebačeno u 96-to ćelijsku ploču i ostavljeno da uparava preko noći. Talog je resuspendovan u 100pl metanolnog rastvora lmM NaCl, pa je 5pl rastvora injektirano u maseni spektrometar, autosamplerom u 96-to ćelijskom formatu i direktno analiziran bez razdvajanja tečnom hromatografijom ili na drugi način. Jedinjenja su ionizirana elektrosprej ionizacijom i praćena su dva odvojena kanala na dve MS/MS tranzicije. MS/MS tranzicije za B1, natrijumov ion iznosi od m/z 921 do m/z 777 i za B2, natrijumov ion iznosi od m/z 939 do m/z 795 u pozitivnom modusu. Korišćeni su Finnigan TSQ-7000, Micromass Quattro-LC maseni spektrometar i Leap Technology Twin-Pal autosampler.
Identifikovano je pedeset sedam (57) novih kombinacija aminokiselinskih supstitucija koje mogu da proizvedu cikloheksil B2: cikloheksil Blavermektine u odnosima od 0.35:1 ili manje (Slika 6). Nekoliko od ovih mutacija može da proizvede cikloheksil B2: cikloheksil B1 avermektine u odnosima od 0.30:1 i manje; nekoliko može da proizvede cikloheksilB2:cikloheksil B1 avermektine u odnosima od oko 0.25:1 ili manje; i nekoliko može da proizvede cikloheksil B2:cikloheksil B1 avermektine u odnosima od oko 0.20:1 ili manje. Identifikovane su dve (2) nove mutacije koje mogu da proizvedu odnose cikloheksil B2: cikloheksil B1 avermektine 0.37 ili 0.38.
Deponovanie bioloških materijala
Sledeći plazmidi su deponovani kod American Type Culture Collection (ATCC), 12301 Parklawn Drive, Rockville, MD, 20852, USA, 29 januara 1998 i ddeljeni su im sledeći rpistupni brojevi:
Plazmid Pristupni Br.
Plazmid pSE 180 209605
Plazmid pSE 186 209604
Trenutna adresa American Type Culture Collection je 10801 Univerity Blvd, Manassas, VA, 20110, USA.
Svi patenti, patentne prijave i publikacije navedene ranije su ovde refemcom date u potpunosti.
Ovaj pronalazak nije ograničen opsegom specifičnih pristupa koji su ovde opisani i koji su dati da bi se opisali individulani aspekti pronalaska i funkcionalno ekvivalentni postupci i komponente su obuhvaćeni pronalaskom. Naravno da će različite modifikacije pronalaska, kao dodatak ovim prikazanim i opisanim u tekstu opisa, biti očigledne prosečnom stručnjaku iz prethodno datih opisa i pratećih slika. Ove modifikacije su obuhvaćene dodatim zahtevima.

Claims (14)

1.Polinukleotidni molekul, naznačen time, što sadrži nukeotidnu sekvencu koja je inače ista kao alel Streptomyces avermitilis aveC, sekvenca S.avermitilis, aveC gena koja kodira proizvod plazmida pSE186 (ATCC 209604) ili nukleotidna sekvenca aveC, ORF S.avermitilis kao stoje dato na SLICI 1 (SEQ ID NO:l), ili njegova izrođena varijanta, ali čija nukleotidna sekvenca dalje obuhvata mutacije koje kodiraju supstituciju amino kiselina na amino kiselinskim ostacima koji odgovaraju položajima amino kiselina u SEQ ID NO:2, kao recimo ćelije S.avermitilis lanca ATCC 53692 u kojem je divlji soj aveC alela inaktiviran i koji eksprimuje polinukleotidni molekul, koji sadrži mutirane nukleotidne sekvence, koji može proizvesti odnos klasa 2:1 avermektina koji je redukovan u odnosu na odnos dobijen ćelijama S.avermitilis lanca ATCC53692 koje eksprimuju samo divlji soj aveC alela, pri čemu kada su klase 2:1 avermetkina, cikloheksil B2:cikloheksil B1 avermektini, tada je odnos klasa 2:1 avermektina 0.35:1 ili manje.
2.Polinukleotidni molekul iz zahteva 1, naznačen time, što odnos cikloheksil B2:cikloheksil BI avermektina iznosi oko 0.20:1 ili manje.
3.Polinukleotidni molekul iz zahteva 1, naznačen time, što kombinacija supstitucija amino kiselina obuhvata kombinaciju odabranu iz grupe koja se sastoji od: (a)D48E,A61T,A89T,S138T,A139T,G179S,A198G,P289L; (b)G40S,D48E, L136P, G179S, E238D; (c)D48E,L136P,R163Q,G179S; (d)D48E, L136P, R163Q, G179S,E238D; (e)D48E,L136P,R163Q,G179S,A200G,E238D; (f)D48E,L136P,G179S,E238D; (g)D48E,A61T,L136P,G179S,E238D; (h)D48E,A61T, L136P, G179S; (i)D48E, A89T,S 138T, A139T,G 179S; (j)D48E,A61T,L136P,G179S,A198G,P202S,E238D,P289L; (k)D48E,A61T, L136P,S138T,A139F,G179S, E238D, P289L; (l)D48E,L136P,G 179S, A198G,E23 8D,P289L; (m)D48E,A61T,S138T,A139F,G179S,A198G,P289L; (n)D48E,L84P,G111V,S138T,A139T,G179S,A198G,P289L; (o)Y28C,D48E,A61T,A89T,S 138T,A139T,G179S, E238D; (p)D48E,A61T,A107T,S 108G, L136P,G179S, S192A, E238D,P289L; (q)D48E,L136P,G179S,R250W; (r)D48E,A89T,S138T,A139T,R163Q,G179S; (s)D48E,L136P,G179S,A198G,P289L; (t)D48E,F78L,A89T,L136P,G179S; (u)D48E,A89T,S138T,A139T,G179S,E238D,F278L; (v)D48E,A89T, L136P, R163Q,G179S; (w)D48E,A61T,A89T,G 111 V,S138T,A139F,G179S, E238D,P289L; (x)D25G,D48E,A89T,L136P,S138T,A139T,V141A,I159T,R163Q,G179S; (y)D48E,A89T,S90G,L136P, R163Q,G179S, E238D; (z)D48E,A61T,A89T,G11IV, S138T,A139T, G179S, E238D,P289L; (aa) D48E,A89T,S138T,A139T,G179S; (ab) D48E,L136P,R163Q,G179S,S231L; (ac) D48E,L136P,S 138T,A139F,G179S, V196A,E238D; (ad) D48E,A61 T,A89T,F99S,S138T,A139T,G179S,E23 8D; (ae) G35S,D48E,A89T,S138T,A139T,G179S,P289L; (af) D48E,A61 T,A89T,S 138T,A139T,G179S,V196A, E238D; (ag) D48E,A89T,G111V,S138T,A139T,G179S,A198G,E238D; (ah) S41 G,D48E,A89T,L136P,G179S; (ai) D48E,A89T,L136P, R163Q,G179S,P252S; (aj) D48E,A89T,L136P,G179S,F234S; (ak) D48E,A89T;L136P,R163Q,G179S,E238D; (al) Q36R,D48E,A89T,L136P,G179S,E238D; (am) D48E,A89T,L136P,R163Q,G179S; (an) D48E,A89T, S138T, G179S; (ao) D48E,A89T,L136P,G179S,E238D; (ap) D48E,A89T, L136P, K154E,G179S, E238D; (aq) D48E,A89T,S 138T, A139T,K154R,G179S,V196A,P289L; (ar) D48E,A89T,S138T,A139F,G179S,V196A,E238D; (as) D48E, A61T, A89T, L136P, G179S, V196A, A198G, P289L; (at) D48E, A61T, S138T, A139F, G179S, G196A, E238D, P289L; (au) D48E,A89T,L136P,G179S; (av) D48E, A89T, V120A, L 136P, G179S; (aw) D48E,A61T,A89T,S138T,A139F,G179S,V196A,A198G,E238D; (ax) D48E,A61T,A89T, G111V,S138T,A139F, G179S, V196A,E238D; (ay) D48E,A61T, A89T,S 13 8T, A139T,G179S,V 196A,E23 8D,P289L; (az) D48E,A61T,A89T, L136P, S138T,A139F, G179S,A198G, E238D; (ba) D48E,A89T,S 13 8T, A13 9F,G179S,A 198G, V220A; (bb) D48E,A61T,A89T,S138T,A139T,G179S,V196A,E238D,R239H,P289L; (bc) D48E, A61T, A89T, L136P, G179S, P289L; (bd) D48E,A89T,S 138T,A139T,G179S,V 196A,E238D,P289L; i (be) D48E,A61T,A89T,S138T,A139F,G179S,V196A,E238D.
4.Polinukleotidni molekul, naznačen time, što sadrži nukleotidnu sekvencu koja je inače ista kao alel Streptomyces avermitilis aveC, sekvence S.avermitilis, aveC gena koja kodira proizvod plazmida pSEl 86(ATCC 209604) ili nukleotidna sekvenca aveC, ORF S.avermitilis kao stoje dato na SLICI 1 (SEQ ID NO:l), ili njegova izrađena varijanta, ali čija nukleotidna sekvenca dalje sadrži mutacije koje kodiraju supstituciju amino kiselina na amino kiselinskim ostacima koji odgovaraju položajima amino kiselina u SEQ ID NO:2, kao što su ćelije avermitilis lanca ATCC 53692 u kojimam je divlji soj aveC alela inaktiviran i koji eksprimuje polinukleotidni molekul, koji sadrži muliranu nukleotidnu sekvencu, koji može proizvesti odnos klasa 2:1 avermektina koji je redukovan u odnosu na odnos dobijen ćelijama S.avermitilis lanca ATCC53692 koje eksprimuju samo divlji doj aveC alela , a kada su klase 2:1 avermetkina, cikloheksil B2:cikloheksi1131 avemiektini, tada je odnos klasa 2:1 avermektina smanjen na oko 0.40:1 ili manje, i gde kombinacija supstitucija amino kiselina obuhvata kombinacije odabrane iz grupe koja se sastoji od: (bf) D48E, S138T,A139T,G179S,E238D, i (bg) Y28C,Q38R,D48E,L136P,G179S,E238D.
5.Ćelije domaćin, naznačene time, što sadrže polinukleotid iz zahteva 1 ili zahteva 4.
6.Postupak za dobijanje novih sojeva Streptomyces avermitilis, naznačen time, što obuhvata (i) mutaciju aveC alela ćelijskog soja S.avermitilis, čijom mutacijom se dobija kombinacija supstitucija amino kiselina u proizvodu aveC gena, ili (ii) uvođenjem u ćelijski soj S.avermitilis mutiran aveC alel ili njegovu degenerativnu varijantu koja kodira proizvod aveC gena koji sadrži kombinaciju supstitucija amino kiselina, gde je kombinacija supstitucija amino kiselina u proizvodu AveC gena obuhvata kombinaciju odabranu iz grupe koju čine: (a)D48E,A61T,A89T,S138T,A139T,G179S,A198G,P289L; (b)G40S,D48E, L136P, G179S, E238D; (c)D48E,L136P,R163Q,G179S; (d)D48E, L136P, R163Q, G179S,E238D; (e)D48E,L136P,R163Q,G179S,A200G,E238D; (1)D48E,L136P,G179S,E238D; (g)D48E,A61T,L136P,G179S,E238D; (h)D48E,A61T, L136P, G179S; (i)D48E,A89T,S138T,A139T,G179S; (j)D48E, A61 T,L136P,G179S,A198G,P202S,E23 8D,P289L; (k)D48E,A61T, L136P,S138T,A139F,G179S, E238D, P289L; (l)D48E,L136P,G179S,A198G,E238D,P289L; (m)D48E,A61T,S138T,A139F,G179S,A198G,P289L; (n)D48E,L84P,G111V,S138T,A139T,G179S,A198G,P289L; (o)Y28C,D48E,A61T,A89T,S 138T,A139T,G179S, E238D; (p)D48E,A61T,A107T,S108G, L136P,G179S, S192A, E238D,P289L; (a)D48E,L136P,G179S,R250W; (b)D48E,A89T,S 13 8T,A139T,R163Q,G179S; (c)D48E,L136P,G179S,A198G,P289L; (d)D48E,F78L,A89T,L136P,G179S; (e)D48E,A89T,S 13 8T, A139T,G179S,E23 8D,F278L; (f)D48E,A89T, L136P, R163Q,G179S; (g)D48E,A61T,A89T,G111 V,S138T,A139F,G179S, E238D,P289L; (h)D25G,D48E,A89T,L136P,S138T,A139T,V141A,I159T,R163Q,G179S; (i)D48E,A89T,S90G,L136P, R163Q,G179S, E238D; (j)D48E,A61T,A89T,G11IV, S138T,A139T, G179S, E238D,P289L; (aa) D48E,A89T,S138T,A139T,G179S; (ab) D48E,L136P,R163Q,G 179S,S231L; (ac) D48E,L136P,S 138T,A139F,G179S,V 196A,E238D; (ad) D48E,A61T,A89T,F99S,S138T,A139T,G179S,E238D; (ae) G35S,D48E,A89T,S138T,A139T,G179S,P289L; (af) D48E,A61T,A89T,S 138T,A139T,G179S,V196A, E238D; (ag) D48E,A89T,G111V,S138T,A139T,G179S,A198G,E238D; (ah) S41G,D48E,A89T,L136P,G179S; (ai) D48E,A89T,L 136P, R163Q,G179S,P252S; (aj) D48E,A89T,L136P,G179S,F234S; (ak) D48E,A89T;L136P,R163Q,G179S,E238D; (al) Q36R,D48E,A89T,L136P,G179S,E238D; (am) D48E,A89T,L136P,R163Q,G179S; (an) D48E,A89T, S138T, G179S; (ao) D48E, A89T,L136P,G 179S,E23 8D; (ap) D48E,A89T, L136P, Kl54E,G179S, E238D; (aq) D48E,A89T,S138T,A139T,K154R,G179S,V196A,P289L; (ar) D48E,A89T,S138T,A139F,G179S,V196A,E238D; (as) D48E, A61T, A89T, L136P, G179S, V196A, A198G, P289L; (at) D48E, A61T, S138T, A139F, G179S, G196A, E238D, P289L; (au) D48E,A89T,L136P,G179S; (av) D48E, A89T, V120A, L 136P, G179S; (aw) D48E,A61T,A89T,S138T,A139F,G179S,V196A,A198G,E238D; (ax) D48E,A61 T,A89T, G111V,S138T,A139F, G179S, V196A,E238D; (ay) D48E,A61T,A89T,S138T,A139T,G179S,V196A,E238D,P289L; (az) D48E,A61T,A89T, L136P, S138T,A139F, G179S,A198G, E238D; (ba) D48E,A89T,S138T,A139F,G179S,A198G,V220A; (bb) D48E,A61T,A89T,S 138T,A139T,G179S,V 196A,E238D,R239H,P289L (bc) D48E, A61T, A89T, L136P, G179S, P289L; (bd) D48E,A89T,S138T,A139T,G179S,V196A,E238D,P289L; i (be) D48E,A61T,A89T,S138T,A139F,G179S,V196A,E238D.
7.Postupak za dobijanje novih sojeva Streptomyces avermitilis, naznačen time, što obuhvata (i) mutiranje aveC alela ćelijskog soja S.avermitilis, čijom mutacijom nastaje kombinacija aminokiselinskih supstitucija u proizvodu AveC gena ili (ii) uvođenje u ćelijski soj S.avermitilis, mutirani aveC alel ili njegovu degenerativnu varijantu koja kodira proizvod aveC gena koji obuhvata kombinaciju aminokiselinskih supstitucija, pri čemu ćelije sadrže mutirani aveC alel ili njegovu degenerativnu varijantu koja može proizvesti cikloheksil B2:cikloheksil BI avermektine u odnosu 0.35:1 ili manje.
8. Postupak prema zahtevu 7, naznačen time, što kombinacija supstitucija aminokiselina u proizvodu AveC gena obuhvata kombinaciju odabranu iz grupe koja se sastoji od: (a) D48E,A61T,A89T,S 138T,A139T,G179S,A198G,P289L; (b) G40S.D48E, L136P, G179S, E238D; (c) D48E,L136P,R163Q,G179S; (d) D48E, L136P, R163Q, G179S,E238D; (e) D48E,L136P,R163Q,G179S,A200G,E238D; (f) D48E,L136P,G179S,E238D; (g) D48E,A61T,L136P,G179SJE238D; (h) D48E,A61T, L136P, G179S; (i) D48E,A89T,S138T,A139T,G179S; G') D48E,A61 T,L136P,G179S,A198G,P202S,E23 8D,P289L; (k) D48E,A61T, L136P,S138T,A139F,G179S, E238D, P289L; (l) D48E,L136P,G179S,A198G,E238D,P289L; (m) D48E,A61 T,S 13 8T, A13 9F,G 179S, A198G,P289L; (n) D48E,L84P,G111V,S138T,A139T,G179S,A198G,P289L; (o) Y28C,D48E,A61T,A89T,S138T,A139T,G179S, E238D; (p) D48E,A61T,A107T,S108G, L136P,G179S, S192A, E238D,P289L; (q) D48E,L136P,G179S,R250W; (r) D48E,A89T,S138T,A139T,R163Q,G179S; (s) D48E,L136P,G179S,A198G,P289L; (t) D48E,F78L,A89T,L136P,G179S; (u) D48E,A89T,S 13 8T,A139T,G179S,E23 8D,F278L; (v) D48E,A89T, L136P, R163Q,G179S; (w) D48E,A61T,A89T,G111V,S138T,A139F,G179S, E238D,P289L; (x) D25G,D48E,A89T,L136P,S138T,A139T,V141A,I159T,R163Q,G179S; (y) D48E,A89T,S90G,L136P, R163Q,G179S, E238D; (z) D48E,A61T,A89T,G11 IV, S138T,A139T, G179S, E238D,P289L; (aa) D48E,A89T,S138T,A139T,G179S; (ab) D48E,L136P,R163Q,G179S,S231L; (ac) D48E,L136P,S138T,A139F,G179S,V196A,E238D; (ad) D48E,A61T,A89T,F99S,S138T,A139T,G179S,E238D; (ae) G35S,D48E,A89T,S138T,A139T,G179S,P289L; (af) D48E,A61T,A89T,S138T,A139T,G179S,V196A, E238D; (ag) D48E,A89T,G111 V,S138T,A139T,G179S,A198G,E238D; (ah) S41G,D48E,A89T,L136P,G179S; (ai) D48E,A89T,L136P, R163Q,G179S,P252S; (aj) D48E,A89T,L136P,G179S,F234S; (ak) D48E,A89T;L136P,R163Q,G179S,E238D; (al) Q36R,D48E,A89T,L136P,G179S,E238D; (am) D48E,A89T,L136P,R163Q,G179S; (an) D48E,A89T, S138T, G179S; (ao) D48E,A89T,L136P,G179S,E238D; (ap) D48E,A89T, L136P, K154E,G179S, E238D; (aq) D48E,A89T,S138T,A139T,K154R,G179S,V196A,P289L; (ar) D48E,A89T,S 138T,A139F,G179S,V196A,E238D; (as) D48E, A61T, A89T, L136P, G179S, V196A, A198G, P289L; (at) D48E, A61T, S138T, A139F, G179S, G196A, E238D, P289L; (au) D48E,A89T,L136P,G179S; (av) D48E, A89T, V120A, L 136P, G179S; (aw) D48E,A61T,A89T,S138T,A139F,G179S,V196A,A198G,E238D; (ax) D48E,A61T,A89T, G111V,S138T,A139F, G179S, V196A,E238D; (ay) D48E,A61T,A89T,S138T,A139T,G179S,V196A,E238D,P289L; (az) D48E,A61T,A89T, L136P, S138T,A139F, G179S,A198G, E238D; (ba) D48E,A89T,S 138T,A139F,G179S,A198G,V220A; (bb) D48E,A61T,A89T,S138T,A139T,G179S,V196A,E238D,R239H,P289L (bc) D48E, A61T, A89T, L136P, G179S, P289L; (bd) D48E,A89T,S 138T,A139T,G179S,V 196A,E238D,P289L; i (be) D48E,A61T,A89T,S 138T,A139F,G179S,V196A,E238D.
9.Postupak prema zahtevu 7, naznačen time, što odnos cikloheksil B2: cikloheksil BI averemktinima iznosi oko 0.20:1 ili manje.
10.Postupak za dobijanj e novih soj eva Streptomyces avermitilis, naznačen time, što obuhvata (i) mutaciju aveC alela ćelijskog soja S.aventiitili.s, čijom mutacijom sc dobija kombinacija supstitucija amino kiselina u proizvodu aveC gena, ili (ii) uvođenje u ćelijski i S.avermitilis mutiran aveC alel ili njegovu degenerativnu varijantu koja kodira proizvod av gena koji sadrži kombinaciju supstitucija amino kiselina, gde je kombinacija supstitucija amino kiselina u proizvodu AveC gena obuhvata kombinaciju supstitucija amino kiselina odabranu iz grupe koja se sastoji od: (bf) D48E, S138T,A139T,G179S,E238D, i (bg) Y28C,Q38R,D48E,L136P,G179S,E238D.
11. Ćelije Streptomyces vrsta koje obuhvataju mutirane S.avermitilis aveC alele ili njihove izrođene varijante koje kodiraju proizvod AveC gena koji obuhvata kombinaciju supstitucija amino kiselina odabarane iz grupe koja se sastoji od: (a) D48E,A61T,A89T,S138T,A139T,G179S,A198G,P289L; (b) G40S,D48E, L136P, G179S, E238D; (c) D48E,L136P,R163Q,G179S; (d) D48E, L136P, R163Q, G179S,E238D; (e) D48E,L136P,R163Q,G179S,A200G,E238D; (f) D48E,L136P,G179S,E238D; (g) D48E,A61T,L136P,G179S,E238D; (h) D48E,A61T, L136P, G179S; (i) D48E, A89T,S 138T, A139T,G179S; G) D48E,A61T,L136P,G179S,A198G,P202S,E238D,P289L; (k) D48E,A61T, L136P,S138T,A139F,G179S, E238D, P289L; (l) D48E,L136P,G179S,A198G,E238D,P289L; (m) D48E,A61T,S138T,A139F,G179S,A198G,P289L; (n) D48E,L84P,G111V,S138T,A139T,G179S,A198G,P289L; (o) Y28C,D48E,A61T,A89T,S 138T,A139T,G179S, E238D; (p) D48E,A61T,A107T,S108G, L136P,G179S, S192A, E238D,P289L; (q) D48E,L136P,G179S,R250W; (r) D48E,A89T,S 138T, A139T,R163Q,G 179S; (s) D48E,L136P,G179S,A198G,P289L; (t) D48E,F78L,A89T,L136P,G179S; (u) D48E,A89T,S 138T, A139T,G 179S,E23 8D,F278L; (v) D48E,A89T, L136P, R163Q,G179S; (w) D48E,A61T,A89T,G111V,S138T,A139F,G179S, E238D,P289L; (x) D25G,D48E,A89T,L136P,S138T,A139T,V141A,I159T,R163Q,G179S; (y) D48E,A89T,S90G,L136P, R163Q,G179S, E238D; (z) D48E,A61T,A89T,G11IV, S138T,A139T, G179S, E238D,P289L; (aa) D48E,A89T,S138T,A139T,G179S; (ab) D48E,L136P,R163Q,G179S,S231L; (ac) D48E,L136P,S 138T,A13 9F,G 179S, VI 96A,E238D; (ad) D48E,A61T,A89T,F99S,S138T,A139T,G179S,E238D; (ae) G35S,D48E,A89T,S138T,A139T,G179S,P289L; (af) D48E,A61T,A89T,S 138T,A139T,G179S,V 196A, E238D; (ag) D48E,A89T,G111V,S138T,A139T,G179S,A198G,E238D; (ah) S41G,D48E,A89T,L136P,G179S; (ai) D48E,A89T,L136P, R163Q,G179S,P252S; (aj) D48E,A89T,L136P,G179S,F234S; (ak) D48E,A89T;L136P,R163Q,G179S,E238D; (al) Q36R,D48E,A89T,L136P,G179S,E238D; (am) D48E,A89T,L136P,R163Q,G179S; (an) D48E,A89T, S138T, G179S; (ao) D48E,A89T,L136P,G179S,E238D; (ap) D48E,A89T, L136P, K154E,G179S, E238D; (aq) D48E,A89T,S138T,A139T,K154R,G179S,V196A,P289L; (ar) D48E, A89T,S 13 8T,A139F,G179S, V196A,E238D; (as) D48E, A61T, A89T, L136P, G179S, V196A, A198G, P289L; (at) D48E, A61T, S138T, A139F, G179S, G196A, E238D, P289L; (au) D48E,A89T,L136P,G179S; (av) D48E, A89T, V120A, L 136P, G179S; (aw) D48E,A61T,A89T,S 138T,A139F,G179S,V196A, Al 98G,E238D; (ax) D48E,A61T,A89T, G111V,S138T,A139F, G179S, V196A,E238D; (ay) D48E,A61T,A89T,S 138T,A139T,G179S,V 196A,E238D,P289L; (az) D48E,A61T,A89T, L136P, S138T,A139F, G179S,A198G, E238D; (ba) D48E,A89T,S 13 8T, Al 39F,G 179S, Al 98G, V220A; (bb) D48E,A61T,A89T,S138T,A139T,G179S,V196A,E238D,R239H,P289L (bc) D48E, A61T, A89T, L136P, G179S, P289L; (bd) D48E,A89T,S 138T,A139T,G179S,V 196A,E238D,P289L; i (be) D48E,A61 T,A89T,S 13 8T, Al 39F,G179S,V 196A,E238D.
12.Ćelije iz zahteva 22, naznačene tim,e što su to ćelije Streptomyces avermitilis.
13.Ćelije Streptomyces vrsta koje obuhvataju mutirane S.avermitilis aveC alele ili njihov izrođene varijante koje kodiraju proizvod AveC gena koji obuhvata kombinaciju supstitucije amino kiselina odabarane iz grupe koja se sastoji od: (bf) D48E, S138T,A139T,G179S,E238D, i (bg) Y28C,Q38R,D48E,L136P,G179S,E238D.
14.Preparat cikloheksil B2:cikloheksil BI avermektina dobijenog od ćelija Streptomyces avermitilis, naznačen time, što sadrži cikloheksil B2: cikloheksil BI avermektine prisutne u podlozi gde su ćelije gajene, pri čemu odnos cikloheksil B2:cikloheksil BI avermektina prisutne u hranljivoj podlozi iznosi 0.35:1 ili manje.
MEP-2008-730A 2002-02-12 2003-01-31 Streptomyces avermitilis gen koji određuje odnos b2:b1 avermektina ME00472B (me)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US35622202P 2002-02-12 2002-02-12
PCT/IB2003/000348 WO2003068955A2 (en) 2002-02-12 2003-01-31 Streptomyces avermitilis gene directing the ratio of b2:b1 avermectins

Publications (1)

Publication Number Publication Date
ME00472B true ME00472B (me) 2011-10-10

Family

ID=27734621

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
MEP-2008-730A ME00472B (me) 2002-02-12 2003-01-31 Streptomyces avermitilis gen koji određuje odnos b2:b1 avermektina

Country Status (25)

Country Link
US (2) US7388085B2 (me)
EP (2) EP2050815B1 (me)
JP (1) JP2005517406A (me)
KR (1) KR100718378B1 (me)
CN (2) CN1630712B (me)
AR (1) AR038405A1 (me)
AT (2) ATE530645T1 (me)
AU (1) AU2003245052B2 (me)
BR (1) BRPI0307620B8 (me)
CA (1) CA2475214C (me)
CY (2) CY1110454T1 (me)
DE (1) DE60326824D1 (me)
DK (2) DK1476539T3 (me)
ES (2) ES2373629T3 (me)
IL (3) IL162866A0 (me)
ME (1) ME00472B (me)
MX (1) MXPA04007777A (me)
PL (1) PL211693B1 (me)
PT (2) PT1476539E (me)
RS (1) RS50813B (me)
RU (1) RU2293117C2 (me)
SI (2) SI1476539T1 (me)
TW (1) TWI341330B (me)
WO (1) WO2003068955A2 (me)
ZA (1) ZA200405345B (me)

Families Citing this family (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR100718378B1 (ko) * 2002-02-12 2007-05-14 화이자 프로덕츠 인코포레이티드 Ｂ2:ｂ1 아베르멕틴의 비를 제어하는 스트렙토마이세스아베르미틸리스 유전자
CN102241750B (zh) * 2010-05-14 2014-05-28 中国科学院微生物研究所 一种生产阿维菌素的基因工程方法及其专用菌株
CN102093997B (zh) * 2010-12-01 2013-03-13 中国科学院上海有机化学研究所 一种改造除虫链霉菌产生多拉菌素的方法
CN109576196B (zh) * 2019-01-25 2022-01-04 北大方正集团有限公司 一种生产多拉菌素的发酵培养基及多拉菌素的生产方法

Family Cites Families (15)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
SE434277B (sv) 1976-04-19 1984-07-16 Merck & Co Inc Sett att framstella nya antihelmintiskt verkande foreningar genom odling av streptomyces avermitilis
US4429042A (en) 1978-09-08 1984-01-31 Merck & Co., Inc. Strain of Streptomyces for producing antiparasitic compounds
IN167980B (me) 1987-01-23 1991-01-19 Pfizer
US5252474A (en) 1989-03-31 1993-10-12 Merck & Co., Inc. Cloning genes from Streptomyces avermitilis for avermectin biosynthesis and the methods for their use
KR100186946B1 (ko) * 1993-10-05 1999-04-01 알렌 제이.스피겔 도라멕틴의 구충활성 중간체 및 도라멕틴의 제조방법
US5837458A (en) 1994-02-17 1998-11-17 Maxygen, Inc. Methods and compositions for cellular and metabolic engineering
US5605793A (en) 1994-02-17 1997-02-25 Affymax Technologies N.V. Methods for in vitro recombination
US6117679A (en) 1994-02-17 2000-09-12 Maxygen, Inc. Methods for generating polynucleotides having desired characteristics by iterative selection and recombination
HUP0100784A3 (en) * 1998-02-13 2004-10-28 Pfizer Prod Inc Streptomyces avermitilis gene directing the ratio of b2:b1 avermectins
US6248579B1 (en) * 1998-02-13 2001-06-19 Pfizer Inc Streptomyces avermitilis gene directing the ratio of B2:B1 avermectins
RU2156301C2 (ru) * 1998-06-09 2000-09-20 Мосин Владимир Александрович Штамм актиномицета streptomyces avermitilis ссм 4697 - продуцент авермектинов
US6197591B1 (en) 1998-09-14 2001-03-06 Pfizer Inc. Streptomyces avermitilis regulatory genes for increased avermectin production
EP1200606B1 (en) * 1999-08-12 2006-10-04 Pfizer Products Inc. Streptomyces avermitilis gene directing the ratio of b2:b1 avermectins
CA2381882C (en) 1999-08-13 2011-01-25 Vertex Pharmaceuticals Incorporated Inhibitors of c-jun n-terminal kinases (jnk) and other protein kinases
KR100718378B1 (ko) 2002-02-12 2007-05-14 화이자 프로덕츠 인코포레이티드 Ｂ2:ｂ1 아베르멕틴의 비를 제어하는 스트렙토마이세스아베르미틸리스 유전자

Also Published As

Publication number Publication date
ES2321827T3 (es) 2009-06-12
KR100718378B1 (ko) 2007-05-14
EP1476539A2 (en) 2004-11-17
TWI341330B (en) 2011-05-01
US20030166165A1 (en) 2003-09-04
IL162866A (en) 2009-11-18
ATE426659T1 (de) 2009-04-15
AR038405A1 (es) 2005-01-12
AU2003245052A1 (en) 2003-09-04
CA2475214C (en) 2012-07-31
US7388085B2 (en) 2008-06-17
HK1074644A1 (en) 2005-11-18
RU2293117C2 (ru) 2007-02-10
EP2050815A1 (en) 2009-04-22
TW200303918A (en) 2003-09-16
IL192371A0 (en) 2008-12-29
WO2003068955A2 (en) 2003-08-21
DE60326824D1 (de) 2009-05-07
EP2050815B1 (en) 2011-10-26
PL371320A1 (en) 2005-06-13
US20090017508A1 (en) 2009-01-15
RS70004A (sr) 2006-10-27
RU2004124521A (ru) 2005-04-10
CN102392028B (zh) 2013-08-14
IL162866A0 (en) 2005-11-20
HK1168383A1 (en) 2012-12-28
EP1476539B1 (en) 2009-03-25
ATE530645T1 (de) 2011-11-15
MXPA04007777A (es) 2004-10-15
ZA200405345B (en) 2005-06-14
ES2373629T3 (es) 2012-02-07
CN1630712A (zh) 2005-06-22
DK2050815T3 (da) 2011-12-12
DK1476539T3 (da) 2009-05-11
WO2003068955A3 (en) 2003-11-13
CN102392028A (zh) 2012-03-28
CN1630712B (zh) 2011-09-28
BRPI0307620B8 (pt) 2016-09-13
CY1110454T1 (el) 2015-04-29
SI1476539T1 (sl) 2009-06-30
IL192371A (en) 2010-11-30
BRPI0307620B1 (pt) 2015-08-11
CA2475214A1 (en) 2003-08-21
AU2003245052B2 (en) 2008-07-31
BR0307620A (pt) 2004-12-07
RS50813B (sr) 2010-08-31
US8008078B2 (en) 2011-08-30
JP2005517406A (ja) 2005-06-16
KR20040081199A (ko) 2004-09-20
SI2050815T1 (sl) 2012-01-31
PL211693B1 (pl) 2012-06-29
PT2050815E (pt) 2012-01-02
PT1476539E (pt) 2009-04-09
CY1112491T1 (el) 2015-12-09

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP3688640B2 (ja) Ｂ２：Ｂ１アベルメクチン比率を支配するＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓａｖｅｒｍｉｔｉｌｉｓ遺伝子
US6632673B1 (en) Directing the ratio of B2:B1 avermectins in Streptomyces avermitilis host cells
NZ518657A (en) Streptomyces hygroscopicus directing the ratio of B2:B1 avermectins
ME00472B (me) Streptomyces avermitilis gen koji određuje odnos b2:b1 avermektina
HK1168383B (en) Streptomyces avermitilis gene directing the ratio of b2:b1 avermectins