PL211693B1

PL211693B1 - Gen Streptomyces Avermitilis kierujący stosunkiem awermektyn B2:B1

Info

Publication number: PL211693B1
Application number: PL371320A
Authority: PL
Inventors: Kim Jonelle Stutzman-Engwall; Claes Eric Daniel Gustafsson; Anke Krebber; Sun Ai Raillard; Jeremy Stephen Minshull; Seran Kim; Yan Chen
Original assignee: Pfizer Prod Inc
Priority date: 2002-02-12
Filing date: 2003-01-31
Publication date: 2012-06-29
Also published as: ES2321827T3; KR100718378B1; EP1476539A2; TWI341330B; US20030166165A1; IL162866A; ATE426659T1; AR038405A1; AU2003245052A1; CA2475214C; US7388085B2; HK1074644A1; RU2293117C2; EP2050815A1; TW200303918A; IL192371A0; WO2003068955A2; DE60326824D1; EP2050815B1; PL371320A1

Description

1. Dziedzina wynalazku

Niniejszy wynalazek dotyczy kompozycji i sposobów wydajnej produkcji awermektyn takich jak „doramektyna” stosowanych początkowo w medycynie zwierząt. Bardziej szczegółowo, niniejszy wynalazek odnosi się do cząsteczek polinukleotydu zawierających sekwencję kodującą produkt genu AveC, który może być używany do modulowania stosunku awermektyn klasy 2:1 produkowanych przez przeprowadzające fermentację hodowle Streptomyces avermitilis. Niniejszy wynalazek dotyczy także wektorów, transformowanych komórek gospodarza i nowych szczepów mutanta S. avermitilis, w których gen aveC był zmutowany tak, żeby modulował stosunek produkowanych awermektyn klasy 2:1.

2. Podstawy wynalazku

2.1 Awermektyny

Gatunki Streptomyces wytwarzają dużą rozmaitość wtórnych metabolitów, włączając w to awermektyny, które obejmują serię ośmiu spośród szesnasto-członowej rodziny makrocyklicznych laktonów posiadających działanie przeciwrobacze i owadobójcze. Osiem różnych, ale ściśle powiązanych związków oznaczono jako A1a, A1b, A2a, A2b, B1a, B1b, B2a i B2b. Seria związków „a” odnosi się do naturalnej awermektyny, gdzie podstawnikiem w pozycji C25 jest (S)-sec-butyl. Seria „b” odnosi się do tych związków, gdzie podstawnikiem w pozycji C25 jest izopropyl. Oznaczenie „A” i „B” odnosi się do tych awermektyn, gdzie podstawnikiem w pozycji C5 jest odpowiednio grupa metoksy i hydroksy. Cyfra „1” odnosi się do awermektyn, w których podwójne wiązanie występuje w pozycji C22,23, cyfra „2” odnosi się do awermektyn mających wodór w pozycji C22 i grupę hydroksy w pozycji C23. Wśród pokrewnych awermektyn, typ B1 awermektyny, taki jak doramektyna wyróżnia się największą przeciwpasożytniczą i pestycydową aktywnością i dlatego z komercyjnego punktu widzenia jest najbardziej pożądaną awermektyną.

Awermektyny i ich produkcję przy zastosowaniu fermentacji tlenowej szczepów S avermitilis opisano w Patencie Stanów Zjednoczonych Nr 4 310 519 i 4 429 042. Uważa się, że synteza naturalnych awermektyn jest rozpoczynana endogennie od tioestrowych analogów CoA kwasu izomasłowego i kwasu S-(+)-2-metylomasłowego.

Połączenie zarówno ulepszania szczepu poprzez losową mutagenezę jak i zastosowanie egzogennego uzupełniania kwasów tłuszczowych prowadzi do wydajnej produkcji analogów awermektyn. Mutanty S. avermetilis z brakiem aktywności dehydrogenazy rozgałęzionych 2-oksokwasów (ang. bkd deficient mutants) mogą produkować awermektyny tylko wtedy, gdy fermentacje są uzupełniane kwasami tłuszczowymi. Skrining i izolowanie mutantów charakteryzujących się brakiem aktywności dehydrogenazy rozgałęzionych kwasów (np.: S. avermitilis, ATCC 53567) opisano w Patencie Europejskim (EP) 276103. Fermentacja takich mutantów w obecności egzogennie uzupełnianych kwasów tłuszczowych daje w wyniku produkcję tylko 4 awermektyn odpowiadających zastosowanym kwasom tłuszczowym. Tak więc uzupełnianie fermentacji S. avermitilis (ATCC 53567) kwasem S-(+)-2-metylomasłowym powoduje produkcję naturalnych awermektyn A1a, A2a, B1a i B2a; uzupełnianie fermentacji kwasem izomasłowym powoduje produkcję naturalnych awermektyn A1b, A2b, B1b i B2b; uzupełnianie fermentacji kwasem cyklopentanokarboksylowym powoduje produkcję 4 nowych cyklopentyloawermektyn A1, A2, B1 i B2.

Jeżeli dodaje się inne kwasy tłuszczowe, otrzymuje się nowe awermektyny. Poprzez skrining ponad 800 potencjalnych prekursorów zidentyfikowano ponad 60 innych nowych awermektyn (patrz Dutton i wsp., 1991, J Antibiot. 44:357-365; i Banks i wsp., 1994, Roy. Soc. Chem. 147:16-26). Dodatkowo, mutanty S. avermitilis wykazujące brak aktywności 5-O-metylotransferazy zasadniczo produkują tylko analogi B awermektyn. Zgodnie z tym, mutanty S. avermitilis wykazujące brak aktywności dehydrogenazy 2-oksokwasów, jak i 5-O-metylotransferazy produkują zasadniczo tylko awermektyny B odpowiadające kwasom tłuszczowym dodanym do fermentacji. Tak więc dodanie do takiego podwójnego mutanta kwasu S-(+)-2-metylomasłowego powoduje produkcję tylko naturalnych awermektyn B1a i B2a, podczas gdy dodanie kwasu izomasłowego lub cyklopentanokarboksylowego powoduje produkcję odpowiednio naturalnych awermektyn B1b i B2b lub nowych cykopentylowych awermektyn odpowiednio B1 i B2. Dodawanie do szczepu podwójnego mutanta kwasu cykloheksanokarboksylowego jest korzystnym sposobem produkcji ważnej z handlowego punktu widzenia nowej awermektyny, cycloheksyloawermektyny B1 (doramektyny). Izolowanie i charakterystyka takich podwójnych mutantów, np.: S. avermitilis (ATCC 53692) jest opisana w EP 276103.

PL 211 693 B1

2.2. Geny biorące udział w biosyntezie awermektyn

W wielu przypadkach stwierdzono, ż e geny biorą ce udział w produkcji wtórnych metabolitów i geny kodują ce okreś lony antybiotyk są zgrupowane razem na chromosomie. Tak jest w przypadku zgrupowania genów syntazy poliketydowej (PKS) Streptomyces (patrz Hopwood i Sherman, 1990, Ann. Rev. Genet. 24:37-66). Tak więc jedną z metod klonowania genów zaangażowanych w biosyntezę jest izolowanie genu oporności lekowej i testowanie sąsiadujących regionów chromosomu na obecność innych genów związanych z biosyntezą tego właśnie antybiotyku. Inną metodą klonowania genów biorących udział w biosyntezie ważnych metabolitów jest komplementacja mutantów. Na przykład, fragmenty biblioteki DNA z organizmu zdolnego do wytwarzania danego metabolitu są wprowadzane do niezdolnego do produkcji tego metabolitu mutanta i przeprowadza się skrining na obecność transformantów zdolnych do produkcji metabolitu. Poza tym, do identyfikacji i klonowania genów zaangaowanych w biosyntezę używana jest hybrydyzacja z zastosowaniem sond pochodzących z biblioteki innych gatunków Streptomyces.

Stwierdzono, że geny biorące udział w biosyntezie awermektyn (geny ave), podobnie jak geny potrzebne do biosyntezy innych wtórnych metabolitów (np.: PKS), są na chromosomie zgrupowane. Wiele genów ave z powodzeniem sklonowano używając wektorów aby uzupełnić mutanty S. avermitilis z zablokowaną biosyntezą awermektyny. Klonowanie takich genów opisano w Patencie U.S. Nr 5 252 474. Poza tym, Ikeda i wsp., 1995, J. Antibiot. 48:532-534, przypisuje lokalizację etapu dehydratacji C22,23 (aveC) do regionu chromosomalnego S. avermitilis zawierającego fragment BamHl wielkości 4,82 Kb oraz mutacje w genie aveC, co powoduje wytwarzanie przez producenta pojedynczego składnika B2a. Ponieważ iwermektyna, związek o silnym działaniu przeciwrobaczym może być otrzymywany chemicznie z awermektyny B2a, producent takiego pojedynczego składnika awermektyny B2a, jest uważany za szczególnie użyteczny ze względu na komercyjną produkcję iwermektyny.

Patent U.S. Nr 6 248 579 dla Stulzman-Engwall i wsp., wydany 19 czerwca 2001 opisuje pewne mutacje genu aveC Streptomyces avermitilis prowadzące do redukcji stosunku cykloheksylo B2:cykloheksylo B1 do około 0,75:1.

Publikacja PCT WO 01/12821 opublikowana przez Pfizer Products Inc., 22 lutego 2001 opisuje pewne dodatkowe mutacje genu aveC Streptomyces avermitilis prowadzące do dalszej redukcji stosunku cykloheksylo B2:cykloheksylo B1 do około 0,40:1.

Identyfikacja dodatkowych mutacji lub kombinacji mutacji w genie aveC, które zmniejszają złożoność produkcji awermektyny takie jak np. mutacje, które jeszcze bardziej obniżają stosunek awermektyn B2:B1, mogłyby uprościć produkcję i oczyszczanie ważnych z komercyjnego punktu widzenia awermektyn.

3. Streszczenie opisu wynalazku

Niniejszy wynalazek dostarcza cząsteczki polinukleotydu zawierającej sekwencję nukleotydów, która skądinąd jest taka sama jak ta w allelu aveC Streptomyces avermitilis, jak sekwencja plazmidu pSE186 (ATCC 209604) kodująca produkt genu AveC S avermitilis lub sekwencja nukleotydów aveC ORF (otwartej ramki odczytu) S avermitilis jak to przedstawiono na FIGURZE 1 (SEQ ID NO:1) lub jej zdegenerowanej odmiany ale zawierającą ponadto mutacje kodujące kombinację podstawień aminokwasów w resztach aminokwasów odpowiadających pozycjom aminokwasów SEQ ID NO:2., tak, że komórki S avermitilis szczepu ATCC 53692, w których allel aveC typu dzikiego został zinaktywowany i w których zachodzi ekspresja czą steczki polinukleotydu zawierają cej zmutowaną sekwencję nukleotydów, są zdolne do produkcji awermektyn, w których stosunek klasy 2:1 jest zredukowany w porównaniu do stosunku awermektyn produkowanych przez komórki S avermitilis szczepu ATCC 53692, takie gdzie w zamian zachodzi ekspresja tylko allelu aveC typu dzikiego, przy czym kiedy awermektynami klasy 2:1 są awermektyny cykloheksylo B2:cykloheksylo B1, stosunek awermektyn klasy 2:1 wynosi 0,35:1 lub mniej. W bardziej korzystnej postaci realizacji wynalazku stosunek awermektyn cykloheksylo B2:cykloheksylo B1 wynosi około 0,30:1 lub mniej. W bardziej korzystnej postaci realizacji wynalazku stosunek awermektyn cykloheksylo B2:cykloheksylo B1 wynosi około 0,25:1 lub mniej. W bardziej korzystnej postaci realizacji wynalazku stosunek awermektyn cykloheksylo B2:cykloheksylo B1 wynosi około 0,20:1 lub mniej.

W pewnej postaci realizacji wynalazku kombinacja podstawień aminokwasów zawiera kombinację wybraną z grupy składającej się z:

(a) D48E, A61T, A89T, S138T, A139T, G179S, A198G, P289L;

(b) G40S, D48E, L136P, G179S, E238D;

PL 211 693 B1 (c) D48E, L136P, R163Q, G179S;

(d) D48E, L136P, R163Q, G179S, E238D;

(e) D48E, L135P, R163Q, G179S, A200G, E238D;

(f) D48E, L136P, G179S, E238D;

(g) D48E, A61T, L136P, G179S, E238D;

(h) D48E, A61T, L136P, G179S;

(i) D48E, A89T, S138T, A139T, G179S;

(j) D48E, A61T, L136P, G179S, A198G, P202S, E238D, P289L;

(k) D48E, A61T, L136P, S138T, A139F, G179S, E238D, P289L;

(l) D48E, L136P, G179S, A198G, E238D, P289L;

(m) D48E, A61T, S138T, A139F, G179S, A198G, P289L;

(n) D48E, L84P, G111V, S138T, A139T, G179S, A198G, P289L;

(o) Y28C, D48E, A61T, A89T, S138T, A139T, G179S, E238D;

(p) D48E, A61T, A107T, S108G, L136P, G179S, S192A, E238D, P289L;

(q) D48E, L136P, G179S, R250W;

(r) D48E, A89T, S138T, A139T, R163Q, G179S;

(s) D48E, L136P, G179S, A198G, P289L;

(t) D48E, F78L, A89T, L136P, G179S;

(u) D48E, A89T, S138T, A139T, G179S, E238D, F278L;

(v) D48E, A89T, L136P, R163Q, G179S;

(w) D48E, A61T, A89T, G111V, S138T, A139F, G179S, E238D, P289L;

(x) D25G, D48E, A89T, L136P, S138T, A139T, V141A, I159T, R163Q, G179S;

(y) D48E, A89T, S90G, L136P, R163Q, G179S, E238D;

(z) D48E, A61T, A89T, G111V, S138T, A139T, G179S, E238D, P289L;

(aa) D48E, A89T, S138T, A139T, G179S;

(ab) D48E, L136P, R163Q, G179S, S231L;

(ac) D48E, L136P, S138T, A139F, G179S, V196A, E238D;

(ad) D48E, A61T, A89T, F99S, S138T, A139T, G179S, E238D;

(ae) G35S, D48E, A89T, S138T, A139T, G179S, P289L;

(af) D48E, A61T, A89T, S138T, A139T, G179S, V196A, E2 38D;

(ag) D48E, A89T, G111V, S138T, A139T, G179S, A198G, E238D;

(ah) S41G, D48E, A89T, L136P, G179S;

(ai) D48E, A89T, L136P, R163Q, G179S, P252S;

(aj) D48E, A89T, L136P, G179S, F234S;

(ak) D48E, A89T, L136P, R163Q, G179S, E238D;

(al) Q36R, D48E, A89T, L136P, G179S, E238D;

(am) D48E, A89T, L136P, R163Q, G179S;

(an) D48E, A89T, S138T, G179S;

(ao) D48E, A89T, L136P, G179S, E238D;

(ap) D48E, A89T, L136P, K154E, G179S, E238D;

(aq) D48E, A89T, S138T, A139T, K154R, G179S, V196A, P289L;

(ar) D48E, A89T, S138T, A139F, G179S, V196A, E238D;

(as) D48E, A61T, A89T, L136P, G179S, V196A, A198G, P289L;

(at) D48E, A61T, S138T, A139F, G179S, G196A, E238D, P289L;

(au) D48E, A89T, L135P, G179S;

(av) D48E, A89T, V120A, L136P, G179S;

(aw) D48E, A61T, A89T, S138T, A139F, G179S, V196A, A198G, E238D;

(ax) D48E, A61T, A89T, G111V, S138T, A139F, G179S, V196A, E238D;

(ay) D48E, A61T, A89T, S138T, A139T, G179S, V196A, E238D, P289L;

(az) D48E, A61T, A89T, L136P, S138T, A139F, G179S, A198G, E238D;

(ba) D48E, A89T, S138T, A139F, G179S, A198G, V220A;

(bb) D48E, A61T, A89T, S138T, A139T, G179S, V196A, E238D, R239H, P289L;

(bc) D48E, A61T, A89T, L136P, G179S, P289L;

(bd) D48E,A89T, S138T, A139T, G179S, V196A, E238D, P289L; i (be) D48E, A61T, A89T, S138T, A139F, G179S, V196A, E238D.

PL 211 693 B1

W dalszej kolejności niniejszy wynalazek dostarcza cząsteczkę polinukleotydu zawierającą sekwencję nukleotydów, która skądinąd jest taka sama jak allel aveC Streptomyces avermitilis, sekwencja plazmidu pSE186 (ATCC 209604) kodująca produkt genu AveC S. avermitilis lub sekwencja nukleotydów aveC ORF S. avermitilis jak to przedstawiono na FIGURZE 1 (SEQ ID NO:1) lub jej zdegenerowanej odmiany, ale ponadto zawierającą mutacje kodujące kombinację podstawień aminokwasów w resztach aminokwasów odpowiadających pozycjom aminokwasów SEQ ID NO:2., taką, że komórki S. avermitilis szczepu ATCC 53692, w których allel aveC typu dzikiego inaktywowano i w których ekspresji ulega cząsteczka polinukleotydu zawierająca zmutowaną sekwencję nukleotydów, są zdolne produkować awermektyny, w których stosunek klasy 2:1 jest zredukowany w porównaniu do stosunku awermektyn produkowanych przez komórki S. avermitilis szczepu ATCC 53692, w których zamiast tego ekspresji ulega tylko allel aveC typu dzikiego, przy czym kiedy awermektynami klasy 2:1 są awermektyny cykloheksylo B2:cykloheksylo B1, stosunek awermektyn klasy 2:1 jest zredukowany do około 0,40:1 lub mniej i gdzie kombinacja podstawień aminokwasów zawiera kombinację wybraną z grupy składającej się z:

(bf) D48E, S138T, A139T, G179S, E238D; i (bg) Y28C, Q38R, D48E, L136P, G179S, E238D.

W dalszej kolejności niniejszy wynalazek dostarcza zrekombinowanego wektora zawierającego cząsteczkę polinukleotydu będącą przedmiotem niniejszego wynalazku.

W dalszej kolejności niniejszy wynalazek dostarcza komórkę gospodarza zawierającą cząsteczkę polinukleotydu lub zerekombinowany wektor, będące przedmiotem niniejszego wynalazku. W korzystnej postaci realizacji wynalazku komórka gospodarza jest komórką Streptomyces. W bardziej korzystnej postaci realizacji wynalazku komórka gospodarza jest komórką Streptomyces avermitilis.

W dalszej kolejnoś ci niniejszy wynalazek dostarcza sposób otrzymywania nowych szczepów Streptomyces avermitilis, obejmujący (i) tworzenie mutacji allelu aveC w komórce szczepu S. avermitilis, która to mutacja daje w wyniku kombinację podstawień aminokwasów w produkcie genu AveC, lub (ii) wprowadzenie do komórki szczepu S. avermitilis zmutowanego allelu aveC lub jego zdegenerowanej odmiany kodującej produkt genu AveC zawierający kombinację podstawień aminokwasów, przy czym kombinacja podstawień aminokwasów jest wybierana z wymienionych powyżej (a) do (be).

W dalszej kolejności niniejszy wynalazek dostarcza sposób otrzymywania nowego szczepu Streptomyces avermitilis, obejmujący (i) tworzenie mutacji allelu aveC w komórce szczepu S. avermitilis, która to mutacja daje w wyniku kombinację podstawień aminokwasów w produkcie genu AveC, lub (ii) wprowadzenie do komórki szczepu S. avermitilis zmutowanego allelu aveC lub jego zdegenerowanej odmiany kodującej produkt genu AveC zawierający kombinację podstawień aminokwasów, przy czym komórki zawierające zmutowany allel aveC lub jego zdegenerowaną odmianę są zdolne do produkcji awermektyn cykloheksylo B2:cykloheksylo B1 w stosunku 0,35:1 lub mniejszym. W tym nieograniczającym ujęciu zmutowany allel aveC lub jego zdegenerowaną odmiana koduje produkt genu AveC zawierający kombinację podstawień aminokwasów wybranych z wymienionych powyżej (a) do (be).

W pref korzystnej postaci realizacji wynalazku stosunek awermektyn cykloheksylo B2:cykloheksylo B1 wynosi około 0,30:1 lub mniej. W tej nieograniczającej postaci realizacji, zmutowany allel aveC lub jego zdegenerowaną odmiana koduje produkt genu AveC zawierający kombinację podstawień aminokwasów wybranych z wymienionych powyżej (f) do (be).

W bardziej korzystnej postaci realizacji wynalazku stosunek awermektyn cykloheksylo B2:cykloheksyl B1 jest 0,25:1 lub mniej. W tej nieograniczającej postaci realizacji, zmutowany allel aveC lub jego zdegenerowaną odmiana koduje produkt genu AveC zawierający kombinację podstawień aminokwasów wybranych z grupy zawierającej wymienione powyżej (w) do (be).

W bardziej korzystnej postaci realizacji wynalazku stosunek awermektyn cykloheksylo B2:cykloheksyl B1 wynosi 0,20:1 lub mniej. W tym tej nieograniczającej postaci realizacji, zmutowany allel aveC lub jego zdegenerowaną odmiana koduje produkt genu AveC zawierający kombinację podstawień aminokwasów wybranych z wymienionych powyżej (ao) do (be).

W dalszej kolejnoś ci niniejszy wynalazek dostarcza sposób otrzymywania nowych szczepów

Streptomyces avermitilis, obejmujący (i) tworzenie mutacji allelu aveC w komórce szczepu S. avermitilis, która to mutacja powoduje kombinację podstawień aminokwasów w produkcie genu AveC lub (ii) wprowadzenie do komórki szczepu S. avermitilis zmutowanego allelu aveC lub jego zdegenerowanej odmiany kodującej produkt genu AveC zawierający kombinację podstawień aminokwasów, przy

PL 211 693 B1 czym kombinacja podstawień aminokwasów jest wybierana z powyżej wymienionej grupy składającej się z (bf) i (bg). W korzystnej postaci realizacji wynalazku, komórki S. avermitilis zawierające taki zmutowany allel aveC lub jego zdegenerowaną odmianę są zdolne do produkowania awermektyn cyklohehsylo B2:cyklohehsylo B1 w stosunku wynoszącym około 0,40:1 lub mniejszym.

W dalszej kolejności niniejszy wynalazek dostarcza komórki gatunku Streptomyces, która zawiera zmutowany allel aveC lub jego zdegenerowaną odmianę kodującą produkt genu AveC zawierający kombinację podstawień aminokwasów wybraną z grupy zawierającej wymienione powyżej (a) do (be). W korzystnej postaci realizacji wynalazku wynalazku gatunkiem Streptomyces jest Streptomyces avermilitis.

W dalszej kolejnoś ci niniejszy wynalazek dostarcza komórkę Streptomyces avermilitis zdolną do produkowania awermektyn cyklohehsylo B2:cyklohehsylo B1 w stosunku wynoszącym około 0,35:1 lub mniej. W tej nieograniczającej postaci realizacji, komórka zawiera zmutowany allel aveC lub jego zdegenerowaną odmianę kodującą produkt genu AveC zawierający kombinację podstawień aminokwasów wybraną z grupy zawierającej wymienione powyżej (a) do (be).

W korzystnej postaci realizacji wynalazku, stosunek awermektyn cyklohehsylo B2:cyklohehsylo B1 wynosi około 0,30:1 lub mniej. W tej nieograniczającej postaci realizacji, komórki zawierają zmutowany allel aveC lub jego zdegenerowaną odmianę kodującą produkt genu AveC zawierający kombinację podstawień aminokwasów wybraną z grupy zawierającej wymienione powyżej (f) do (be).

W bardziej korzystnej postaci realizacji wynalazku, stosunek awermektyn cyklohehsylo B2:cyklohehsylo B1 wynosi około 0,25:1 lub mniej. W tej nieograniczającej postaci realizacji, komórki zawierają zmutowany allel aveC lub jego zdegenerowaną odmianę kodującą produkt genu AveC zawierający kombinację podstawień aminokwasów wybraną z grupy zawierającej wymienione powyżej (w) do (be).

W bardziej korzystnej postaci realizacji wynalazku, stosunek awermektyn cyklohehsylo B2:cyklohehsylo B1 wynosi około 0,20:1 lub mniej. W tej nieograniczającej postaci realizacji, komórki zawierają zmutowany allel aveC lub jego zdegenerowaną odmianę kodującą produkt genu AveC zawierający kombinację podstawień aminokwasów wybraną z grupy zawierającej wymienione powyżej (ao) do (be).

W dalszej kolejnoś ci niniejszy wynalazek dostarcza komórki gatunku Streptomyces zawierają cej zmutowany allel S. avermitilis lub jego zdegenerowaną odmianę kodującą produkt genu AveC zawierający kombinację podstawień aminokwasów wybraną z grupy zawierającej wymienione powyżej (bf) i (bg). W tej nieograniczają cej postaci realizacji wynalazku gatunkiem Streptomyces jest S. avermitilis. W bardziej korzystnej postaci realizacji wynalazku komórką jest komórka S. avermitilis zdolna do produkcji awermektyn cykloheksylo B2:cykloheksylo B1 w stosunku wynoszącym około 0,40:1 lub mniej.

W dalszej kolejnoś ci niniejszy wynalazek dostarcza sposób produkcji awermektyn obejmujący hodowanie komórek szczepu Streptomyces avermitilis będących przedmiotem niniejszego wynalazku w poż ywce hodowlanej w warunkach które umoż liwiają lub indukują produkcję awermektyn i odzyskiwanie tych awermektyn z hodowli.

W dalszej kolejności niniejszy wynalazek dostarcza kompozycję awermektyn cykloheksylo B2:cykloheksylo B1 produkowanych przez komórki Streptomyces avermitilis, zawierającą awermektyny cykloheksylo B2:cykloheksylo B1 znajdujące się w pożywce, w której hodowano komórki, przy czym stosunek awermektyn cykloheksylo B2:cykloheksylo B1 obecnych w pożywce hodowlanej wynosi 0,35:1 lub raniej, korzystny stosunek wynosi 0,30:1 lub mniej, bardziej korzystny 0,25:1 lub mniej, jeszcze bardziej korzystny 0,20:1 lub mniej. W postaci realizacji kompozycja awermektyn cykloheksylo B2:cykloheksylo B1 jest produkowana przez komórki szczepu S. avermitilis, w których zachodzi ekspresja zmutowanego allelu aveC lub jego zdegenerowanej odmiany kodujących produkt genu, który powoduje redukcję stosunku awermektyn klasy 2:1 cykloheksylo B2:cykloheksylo B1 produkowanych przez te komórki w porównaniu do komórek tego samego szczepu S. avermitilis, w których nie zachodzi ekspresja zmutowanego allelu aveC ale zamiast tego zachodzi tylko ekspresja allelu aveC typu dzikiego.

W korzystnej postaci realizacji wynalazku, gdzie kompozycję stanowią awermektyny cykloheksylo B2:cykloheksylo B1 w stosunku 0,35:1 lub mniejszym, kompozycja jest produkowana przez komórki zawierające zmutowany allel aveC lub jego zdegenerowaną odmianę kodujące produkt genu AveC zawierający kombinację podstawień aminokwasów wybraną z grupy składającej się z (a) do (be) wymienionych powyżej.

W bardziej korzystnej postaci realizacji wynalazku, gdzie kompozycję stanowią awermektyny cykloheksylo B2:cykloheksylo B1 w stosunku 0,30:1 lub mniejszym, kompozycja jest produkowana przez komórki zawierające zmutowany allel aveC lub jego zdegenerowaną odmianę kodującą produkt

PL 211 693 B1 genu AveC zawierający kombinację podstawień aminokwasów wybraną z grupy składającej się z (f) do (be) wymienionych powyżej.

W bardziej preferowanym uję ciu wynalazku, gdzie kompozycję stanowią awermektyny cykloheksylo B2:cykloheksylo B1 w stosunku 0,25:1 lub mniejszym, kompozycja jest produkowana przez komórki zawierające zmutowany allel aveC lub jego zdegenerowaną odmianę kodującą produkt genu AveC zawierający kombinację podstawień aminokwasów wybraną z grupy składającej się z (w) do (be) wymienionych powyżej.

W bardziej preferowanym ujęciu wynalazku, gdzie kompozycję stanowią awermektyny cykloheksylo B2:cykloheksylo B1 w stosunku 0,20:1 lub mniejszym, kompozycja jest produkowana przez komórki zawierające zmutowany allel aveC lub jego zdegenerowaną odmianę kodującą produkt genu AveC zawierający kombinację podstawień aminokwasów wybraną z grupy składającej się (ao) do (be) wymienione powyżej.

W dalszej kolejnoś ci niniejszy wynalazek dostarcza kompozycji awermektyn cykloheksylo B2:cykloheksylo B1 produkowanych przez komórki Streptomyces avermitilis, zawierającej awermektyny cykloheksylo B2:cykloheksylo B1 w pożywce hodowlanej, w której komórki hodowano, gdzie stosunek awermektyn cykloheksylo B2:cykloheksylo B1 obecnych w pożywce hodowlanej wynosi 0,40:1 lub mniej i produkowanych przez komórki zawierające zmutowany allel aveC lub jego zdegenerowaną odmianę kodującą produkt genu AveC zawierający kombinację podstawień aminokwasów wybraną z grupy skł adają cej się z (bf) i (bg) wynienione powyż ej.

4. Krótki opis figur

FIGURA 1. Sekwencja DNA (SEQ ID NO:1) zawierająca aveC ORF S. avermitilis i wydedukowaną sekwencję aminokwasów (SEQ ID NO:2).

FIGURA 2. Wektor plazmidowy pSE186 (ATCC 209604) zawierający całą OFR genu aveC

S. avermitilis.

FIGURA 3. Wektor zastąpienia genu pSE180 (ATCC 209605) zawierający gen ermE Sacc. erythraea wstawiony do aveC ORF S. avermitilis.

FIGURA 4. Mapa restrykcyjna BamHl zgrupowania genów syntazy poliketydowej z S. avermitilis z pię cioma zidentyfikowanymi, zachodzą cymi na siebie kosmidowymi klonami (tzn. pSE65, pSE66, pSE67, pSE68, pSE69). Wskazano również zależności pomiędzy pSE118 i pSE119.

FIGURA 5. Wyniki analizy HPLC produktów fermentacji wytwarzanych przez szczepy S. avermitilis. Ilościową wartość dla pików otrzymano przez porównanie do ilości standardu cykloheksylo B1. Czas retencji dla cykloheksylo B2 wynosił 7,4 - 7,7 min; czas retencji dla cykloheksylo B1 wynosił 11,9 - 12,3 min. FIG. 5A. Szczep S. avermitilis SE180-11 z inaktywowaną aveC ORF. RYC. 5B. Szczep S. avermitilis SE180-11 transformowany pSE186 (ATCC 209604). FIG. 5C Szczep S. avermitilis SE180-11 transformowany pSE187. FIG. 5D. Szczep S. avermitilis SE180-11 transformowany pSE188.

FIGURY 6A-M. Zestawienie podstawień aminokwasów kodowanych przez mutacje w allelu aveC co zostało zidentyfikowane w drugim cyklu tasowania genów („gene shuffling”) i ich wpływ na produkcję stosunku cykloheksylo B2:cykloheksylo B1. Dla każdego plazmidu, w kolumnie zatytułowanej „Mutacje”, górna część wyszczególnia podstawienia aminokwasów, a dolna część wyszczególnia zmiany zasad nukleotydowych powodujące te podstawienia aminokwasów. Zmiany zasad nukleotydowych w nawiasach są zmianami milczącymi, tzn. nie powodują one zmian w sekwencji aminokwasów.

5. Szczegółowy opis wynalazku

Niniejszy wynalazek dotyczy identyfikacji i charakterystyki cząsteczek polinukleotydu, mających sekwencje nukleotydów, które kodują produkt genu AveC z Streptomyces avermitilis, konstrukcji nowych szczepów S. avermitilis, które mogą być użyte do testowania produktów zmutowanego genu AveC ze względu na ich wpływ na produkcję awermektyn i stwierdzenie, że pewne produkty zmutowanego genu AveC mogą redukować stosunek awermektyn B2:B1 produkowanych przez S. awermtilis. Wynalazek opisano na podstawie przykładów w sekcjach poniżej, dla cząsteczki polinukleotydu mającej albo sekwencję nukleotydów taką samą jak sekwencja plazmidu pSE186 (ATCC 209604) kodującego produkt genu AveC, albo sekwencję nukleotydów taką jak ORF na FIGURZE 1 (SEQ ID NO:1) i dla cząsteczek polinukleotydów pochodzących z niej lub z jej zdegenerowanych odmian, mających zmutowaną sekwencję nukleotydów. Jednakże zestaw zasad oprócz niniejszego wynalazku może być analogicznie zastosowany do innych cząsteczek polinukleotydów, między innymi włączając

PL 211 693 B1 w to homologiczne geny aveC z innych gatunków Streptomyces, np.: S. hygroscopicus i S. griseochromogenes.

5.1. Cząsteczki polinukleotydów kodujące produkt genu AveC S. avermitilis

Niniejszy wynalazek dostarcza izolowaną cząsteczkę polinukleotydu zawierającą kompletną aveC ORF S. avermitilis lub jej istotną część, która to izolowana cząsteczka polinukleotydu nie posiada następnej kompletnej ORF, która jest umieszczona poniżej aveC ORF w chromosomie S. avermitilis in situ.

Wskazane jest, żeby izolowana cząsteczka polinukleotydu zawierała sekwencję nukleotydów taką samą jak sekwencja plazmidu pSE186 (ATCC 209604) kodująca produkt genu AveC S. avematilis, albo taką samą jak sekwencja nukleotydów ORF z FIGURY 1 (SEQ ID NO:1) albo istotną jej część. W stosowanym tu znaczeniu, „istotna część” izolowanej cząsteczki polinukleotydu zawierającej sekwencję nukleotydów kodującą produkt genu AveC S. avemitilis oznacza izolowaną cząsteczkę polinukleotydu, zawierającą przynajmniej 70% kompletnej sekwencji aveC ORF pokazanej na FIGURZE 1 (SEQ ID NO:1) i taką, która koduje funkcjonalny równoważnik produktu genu AveC. Pod tym względem, „funkcjonalny równoważnik” produktu genu AveC, jest zdefiniowany jako produkt genu, który kiedy ulega ekspresji w szczepie S. avemitilis ATCC 53692, w którym natywny allel aveC inaktywowano, powoduje rzeczywiście produkcję w takim samym stosunku i ilości awermektyn jak produkowane przez szczep S. avermitilis ATCC 53692, w którym zachodzi ekspresja zamiast tylko allelu typu dzikiego, funkcjonalnego natywnego allelu aveC szczepu S. avermitilis ATCC 53692.

Oprócz sekwencji nukleotydów aveC ORF, cząsteczka izolowanego polinukleotydu będąca przedmiotem niniejszego wynalazku może zawierać sekwencję nukleotydów, która naturalnie flankuje gen aveC w S. avermitilis in situ, taki jak ten flankujący sekwencję nukleotydów pokazaną na FIGURZE 1 (SEQ ID NO:1).

W dalszej kolejnoś ci niniejszy wynalazek dostarcza izolowaną czą steczkę polinukleotydu zawierającą sekwencję nukleotydów SEQ ID NO:1 lub jej zdegenerowaną odmianę w oparciu o znaną degenerację kodu genetycznego.

W uż ywanym tutaj znaczeniu, okre ś lenia: „czą steczka polinukleotydu”, „sekwencja polinukleotydu”, „sekwencja kodująca”, „otwarta ramka odczytu” i „ORF” odnoszą się do obu cząsteczek: DNA i RNA, które mogą być albo jedno-niciowe albo dwu-niciowe i które mogą ulegać transkrypcji i translacji (DNA) albo translacji (RNA) dając produkt genu AveC albo polipeptyd, który jest homologiczny do produktu genu AveC, w układzie ekspresyjnym odpowiedniej komórki gospodarza kiedy znajdują się pod kontrolą odpowiednich elementów regulatorowych. Sekwencja kodująca może zawierać ale nie jest ograniczona do sekwencji prokariotycznych, sekwencji cDNA, sekwencji genomowych DNA i sekwencji chemicznie syntetyzowanych DNA i RNA.

Sekwencja nukleotydów pokazana na FIGURZE 1 (SEQ ID NO:1) zawiera cztery różne kodony GTG w pozycjach pz 42, 174, 177 i 180. Jak to poprzednio opisano w Patencie U.S. Nr 6 248 579, wielokrotne delecje regionu 5' aveC ORF (FIGURA 1; SEQ ID NO:1) skonstruowano, żeby pomóc określić, które z tych kodonów mogą działać w aveC ORF jako miejsca startu dla ekspresji białka. Delecja w pierwszym miejscu GTG w pz 42 nie pozbawia aktywności AveC. Dodatkowa delecja wszystkich kodonów razem w pozycjach 174, 177 i 180 pozbawia aktywności AveC, wskazując, że ten region jest konieczny do ekspresji białka. Niniejszy wynalazek obejmuje zmienną długość aveC ORFów.

W dalszej kolejności niniejszy wynalazek dostarcza cząsteczki polinukleotydu mającej sekwencję nukleotydów, która jest homologiczna do sekwencji plazmidu pSE186 (ATCC 209604) kodującego produkt genu AveC lub do sekwencji nukleotydów aveC ORF przedstawionej na FIGURZE 1 (SEQ ID NO:1) lub jej istotnej części. Termin „homologiczna”, jeśli jest stosowany w odniesieniu do cząsteczki polinukleotydu, która jest homologiczna do sekwencji kodującej produkt genu AveC S. avermitilis oznacza cząsteczkę polinukleotydu mającą sekwencję nukleotydów: (a) która koduje taki sam produkt genu AveC jak ten, który jest kodowany przez sekwencję plazmidu pSE186 (ATCC 209604) kodującego produkt genu AveC S. avermitilis lub która koduje taki sam produkt genu AveC, jak sekwencja nukleotydów aveC ORF przedstawiona na FIGURZE 1 (SEQ ID NO:1), ale która zawiera jedną lub więcej milczących zmian w sekwencji nukleotydów zgodnie z degeneracją kodu genetycznego (tzn. zdegenerowaną odmiana) lub (b) która hybrydyzuje do odpowiadającej cząsteczki polinukleotydu mającej sekwencję nukleotydów, która koduje sekwencję aminokwasów kodowaną przez sekwencję plazmidu pSE186 (ATCC 209604) kodującego produkt genu AveC lub która koduje sekwencję aminokwasów pokazaną na FIGURZE 1 (SEQ ID NO:2) pod umiarkowanie surowymi warunkami, tzn.

PL 211 693 B1 hybrydyzacia do filtru wiążącego DNA w 0,5 M NaHPO4, 7% soli sodowej siarczanu laurylu (SDS), 1mM EDTA w 65°C i płukanie w 0,2xSSC/0,1% SDS w 42°C (patrz Ausubel i wsp., (eds.), 1989, Current Protocols in Molecular Biology, Vol.1, Green Publishing Associates, Inc., and John Wiley & Sons, Inc., New York, at p. 2,10.3) i koduje funkcjonalny równoważnik produktu genu AveC jak zdefiniowano powyżej. W korzystnej postaci realizacji wynalazku homologiczna cząsteczka polinukleotydu hybrydyzuje do odpowiadającej sekwencji nukleotydów plazmidu pSE186 (ATCC 209604) kodującego produktu genu AveC lub do odpowiadającej sekwencji nukleotydów aveC ORF przedstawionej na FIGURZE 1 (SEQ ID NO:1) albo do istotnej jej części pod umiarkowanie surowymi warunkami, tzn, hybrydyzacji do filtra wiążącego DNA w 0,5 M NaHPO4, 7% (SDS), 1mM EDTA w 65°C płukanie w 0,1xSSC/0,1% SDS w 68°C (patrz Ausubel i wsp., 1989, powyżej) i koduje funkcjonalny równoważnik produktu genu AveC jak to zdefiniowano powyżej.

Aktywność produktu genu AveC i jego potencjalnych funkcjonalnych równoważników może być oznaczona przez analizę HPLC produktów fermentacji, jak to opisano w przykładach poniżej. Cząsteczki polinukleotydu mające sekwencje nukleotydów, które kodują funkcjonalne równoważniki produktu genu AveC S. avermitilis mogą zawierać naturalnie występujące geny aveC obecne w innych szczepach S. avemitilis, homologiczne geny aveC obecne w innych gatunkach Streptomyces i zmutowane allele aveC czy to występujące naturalnie czy konstruowane.

W dalszej kolejności niniejszy wynalazek dostarcza cząsteczki polinukleotydu zawierającej sekwencję nukleotydów, która koduje polipeptyd mający sekwencję aminokwasów, która jest homologiczna do sekwencji aminokwasów kodowanej przez sekwencję plazmidu pSE186 (ATCC 209604) kodującego produkt genu AveC albo sekwencję aminokwasów na FIGURZE 1 (SEQ ID NO:2) lub istotną jej część. Tak jak użyto tutaj, „istotna część” sekwencji aminokwasów z FIGURY 1 (SEQ ID NO:2) oznacza polipeptyd zawierający przynajmniej 70% sekwencji aminokwasów przedstawionej na FIGURZE 1 (SEQ ID NO:2) i który stanowi funkcjonalny równoważnik produktu genu AveC, tak jak to zdefiniowano powyżej.

Tak jak użyto tutaj w odniesieniu do sekwencji aminokwasów, które są homologiczne do sekwencji aminokwasów w produkcie genu AveC S. avemitilis, termin „homologiczny” odnosi się do polipeptydu, który inaczej ma sekwencję aminokwasów przedstawioną na FIGURZE 1 (SEQ ID NO:2), ale w której jedną lub więcej reszt aminokwasów podstawiono konserwatywnie innymi resztami aminokwasowymi, gdzie ta sekwencja aminokwasów ma przynajmniej około 70%, korzystniej, żeby miała przynajmniej około 80%, a najkorzystniej, żeby miała przynajmniej około 90% sekwencji aminokwasów identycznej do polipeptydu kodowanego przez sekwencję plazmidu pSE186 (ATCC 209604) kodującego produkt genu AveC lub sekwencję aminokwasów przedstawioną na FIGURZE 1 (SEQ ID NO:2) jak oznaczono przy użyciu standardowego algorytmu identyczności sekwencji aminokwasów, takiego jak algorytm BLASTP (GENBANK, NCBI) i gdzie takie konserwatywne podstawienia dają w wyniku funkcjonalny równoważnik produktu genu, jak to zdefiniowano powyżej. Podstawienia aminokwasów konserwatywnych są dobrze znane w tej dziedzinie. Reguły wykonywania takich podstawień zawierają między innymi te opisane przez Dayhof, M.D., 1978, Nat. Biomed. Res. Found., Washington, D.C., Vol. 5, Sup.3. Dokładniej podstawienia konserwatywnych aminokwasów, są to te, które głównie mają miejsce wewnątrz rodziny aminokwasów, które są spokrewnione ze względu na kwasowość lub polarność. Genetycznie kodujące aminokwasy są zasadniczo podzielone na cztery grupy: (1) kwasowe = kwas asparaginianowy, glutaminianowy; (2) zasadowe = lizyna, arginina, histydyna; (3) niepolarne = alanina, walina, leucyna, izoleucyna, prolina, fenyloalanina, metionina, tryptofan; (4) polarne bez ładunku = glicyna, asparagina, glutamina, cysteina, seryna, treonina, tyrozyna. Fenyloalanina, tryptofan i tyrozyna są także łącznie klasyfikowane jako aminokwasy aromatyczne. Jedno lub więcej podstawień wewnątrz poszczególnych grup np.: podstawienie leucyny izoleucyna lub waliną, lub kwasu asparaginianowego glutaminianowym, lub treoniny seryną, lub jakiś innych reszt aminokwasów przez strukturalnie pokrewne reszty aminokwasów, np.: reszty aminokwasów o podobnej polarności lub kwasowości, albo z podobieństwem w ich kombinacji, zasadniczo nie będą miały istotnego wpływu na funkcję polipeptydu.

Przedstawione tutaj produkcja i manipulacja cząsteczkami polinukleotydu są znane w tej dziedzinie i mogą być przeprowadzane zgodnie z technikami rekombinacji opisanymi np.: w Maniatis i wsp., 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY; Ausubel i wsp., 1989, Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates & Wiley Interscience, NY; Sambrook i wsp., 1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2d ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY; Innis i wsp., (eds.), 1995,

PL 211 693 B1

PCR strategies, Academic Press, Inc., San Diego; and Erlich (ed), 1992, PCR Technology, Oxford University Press, New York, wszystkie one są włączone tutaj poprzez odnośniki. Klony polinukleotydów kodujących produkty genu AveC lub produkty homologicznego genu AveC mogą być identyfikowane przy zastosowaniu jakiejkolwiek metody stosowanej w tej dziedzinie, włączając w to, lecz nie ograniczając się tylko do zestawu metod zamieszczonych w sekcji 7, poniżej. Biblioteka genomowa DNA dla aveC i sekwencji kodujących homolog aveC może być testowana za pomocą technik takich jak zestaw metod przedstawionych w: Benton i Davies, 1977, Science 196:180, dla bibliotek bakteriofagów i w Grunstein i Hogness, 1975, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 72:3961-3965, dla bibliotek plazmidów. Cząsteczki polinukleotydów, mające sekwencje nukleotydów, o których wiadomo, że zawierają sekwencję nukleotydów aveC ORF, jak obecne np.: w plazmidzie SE186 (ATCC 209604) lub w plazmidzie pSE119 (opisane poniż ej w Sekcji 7) mogą być użyte jako sondy w tych skriningowych badaniach. Alternatywnie, mogą być zsyntetyzowane sondy oligonukleotydowe, które odpowiadają sekwencji nukleotydów wydedukowanej na podstawie części lub całości sekwencji aminokwasów oczyszczonego produktu homologicznego genu AveC.

5.2. Metody rekombinacji

5.2.1. Klonowanie i wektory ekspresyjne

W dalszej kolejnoś ci niniejszy wynalazek dostarcza zrekombinowanych wektorów do klonowania i wektorów ekspresyjnych, które są użyteczne w klonowaniu i powodowaniu ekspresji cząsteczek polinukleotydu będących przedmiotem niniejszego wynalazku, np.: aveC ORF z S. avermitilis lub jakichkolwiek homologów aveC ORFów. W tej nieograniczającej postaci realizacji, niniejszy wynalazek dostarcza plazmidu pSE18 6 (ATCC 209604) który zawiera kompletną ORF genu aveC S. avermitllis.

Wszystkie następujące opisy dotyczące aveC ORF z S. avermitilis lub cząsteczki polinukleotydu zawierającej aveC ORF z S. avermitilis lub jej część albo produkt genu AveC S. avermitills odnoszą się także do zmutowanych alleli aveC jak to opisano poniżej, jeżeli nie wskazano wyraźnie inaczej lub nie wynika to z kontekstu.

Odkryto duży wybór różnych wektorów do specyficznego stosowania w Streptomyces, włączając w to między innymi fagi, plazmidy o dużej liczbie kopii, plazmidy o małej liczbie kopii, wektory wahadłowe E. Coli-Streptomyces i którekolwiek z nich mogą być stosowane w niniejszym wynalazku. Także dużo genów leko-oporności sklonowane z Streptomyces i kilka z tych genów włączano do wektorów jako markery selekcji. Przykłady aktualnie stosowanych w Streptomyces wektorów są podane między innymi w Hutchinson, 1980, Applied Biochem. Biotech. 16: 169-190.

Zgodnie z preferencjami, zrekombinowane wektory będące przedmiotem niniejszego wynalazku, a w szczególności wektory ekspresyjne są konstruowane tak, że sekwencja kodująca cząsteczki polinukleotydu będącego przedmiotem niniejszego wynalazku jest w operacyjnym połączeniu z jednym lub więcej elementami regulatorowymi niezbędnymi do transkrypcji i translacji sekwencji kodującej w procesie produkowania polipeptydu. Tak jak zastosowano tutaj, termin „element regulatorowy” zawiera ale nie ogranicza się do, sekwencję nukleotydów, które kodują indukowalne i nieindukowalne promotory, wzmacniacze, operatory i inne elementy znane w tej dziedzinie jako służące do uruchomienia i/lub regulowania ekspresji sekwencji kodujących polinukleotydów. Także, tak jak zastosowano tutaj, kodująca sekwencja jest w „operacyjnym połączeniu” z jednym lub więcej regulatorowymi elementami, gdzie regulatorowe elementy efektywnie regulują i pozwalają na transkrypcję sekwencji kodującej lub na translację jej mRNA lub na jedno i drugie.

Wśród wielu innych, typowe wektory plazmidowe, które mogą być skonstruowane tak, żeby zawierały między innymi cząsteczkę polinukleotydu będącą przedmiotem niniejszego wynalazku, stanowią pCR-Blunt, pCR2.1 (Invitrogen), pGEM3Zf (Promega) i wektor wahadłowy pWHMS (Vara i wsp., 1989, J. Bact, 171:5872-5881).

Metody konstruowania zrekombinowanych wektorów zawierających konkretne kodujące sekwencje w operacyjnym połączeniu z elementami regulatorowymi są dobrze znane w tej dziedzinie i mogą być uż ywane do stosowania w niniejszym wynalazku. W skład tych metod wchodzą techniki rekombinacji in vitro, techniki syntezy i genetyczna rekombinacja in vivo. Patrz techniki opisane w Maniatis i wsp., 1989, powyż ej; Ausubel i wsp., 1989, powyż ej; Sambrook i wsp., 1989, powyż ej; Innis i wsp., 1995, powyżej; i Erlich i wsp., 1992, powyżej.

Elementy regulatorowe tych wektorów mogą się różnić długością i specyficznością.

W zależ noś ci od uż ywanego ukł adu gospodarz/wektor, moż e być uż yty któryś spoś ród wielu elementów transkrypcji i translacji. Przykłady, które nie wyczerpują wszystkich możliwości, regionów regulacji transkrypcji lub promotorów bakteryjnych, zawierają promotor β-gal, promotor T7, promotor TAC, prawy

PL 211 693 B1 i lewy promotor λ , promotory trp i lac, promotory fuzyjne trp-lac i bardziej specyficzne dla Streptomyces, promotory ermE, melC i tipA itd. W specyficznym ujęciu wektor może być wytworzony tak, że zawiera aveC ORF lub jej zmutowaną ORF klonowane obok silnego konstytutywnego promotora takiego jak promotor ermE z Saccharopolyspora erythraea. Jak opisano w patencie U.S. Nr 6 248 579, wektor zawierający promotor ermE transformowano do S. avermitilis i późniejsza analiza HPLC produktów fermentacji wskazywała wzrost miana produkowanych awermektyn w porównaniu do produkowanych przez ten sam szczep, w którym zamiast tego zachodzi ekspresja tylko allelu typu dzikiego.

Wektory ekspresyjne białek fuzyjnych mogą być zastosowane do spowodowania ekspresji białka fuzyjnego produktu genu AveC. Oczyszczone białko fuzyjne może być użyte do wytwarzania surowicy odpornościowej przeciwko produktowi genu AveC, do badania biochemicznych właściwości produktu genu AveC, do konstruowania białek fuzyjnych AveC o różnej aktywności biochemicznej albo w celu identyfikacji lub oczyszczania produktu ekspresji genu AveC. Możliwe wektory białek fuzyjnych zawierają, ale nie są ograniczone do wektorów włączających sekwencje kodujące fuzje β-galaktozydazy i trpE, fuzje białka wiążącego maltozę, fuzje S-transferazy glutationu i fuzje polihistydyny (nośnikowe regiony). W alternatywnym ujęciu niniejszego wynalazku, produkt genu AveC lub jego część, może być poddany fuzji z homologiem produktu genu AveC albo jego częścią, pochodzącą z innych gatunków lub szczepów Streptomyces takich jak S. hygroscopicus lub S. griseochromogenes. Takie hybrydowe wektory mogą być transformowane do komórek S. avermitilis i badane w celu oznaczenia ich wpływu na stosunek produkowanych awermektyn klasy 2:1,

Białka fuzyjne AveC mogą być konstruowane tak, żeby zawierały obszar użyteczny ze względu na oczyszczanie. Na przykład białko fuzyjne AveC-białko wiążące maltozę może być oczyszczone na żywicy amylozowej. Białka fuzyjne AveC-S-transferaza glutationu mogą być oczyszczone przy użyciu ziaren glutation-agaroza; i białka fuzyjne AveC-polihistydyna mogą być oczyszczone przy użyciu żywicy dwuwartościowego niklu. Alternatywnie, przeciwciała przeciw nośnikowemu białku lub peptydowi mogą być użyte dla oczyszczania białek fuzyjnych metodą chromatografii powinowactwa. Na przykład sekwencja nukleotydów kodująca docelowy epitop monoklonalnego przeciwciała może być wbudowana w wektor ekspresyjny w operacyjnym połączeniu z elementami regulatorowymi i usytuowana tak, że epitop ulega fuzji z polipeptydem AveC. Na przykład, sekwencja nukleotydów kodująca epitop tag FLAG™ (International Biotechnologies Inc.), hydrofilowy marker peptydu, może być wstawiona przy użyciu standardowych technik w wektor ekspresyjny w odpowiadającym punkcie, np.: do karboksylowego końca polipeptydu AveC. Fuzyjny produkt ekspresji polipeptyd AveC-FLAG™ epitop może być wykryty i oczyszczony przy użyciu komercyjnie dostępnych przeciwciał anty-FLAG™.

Wektor ekspresyjny kodujący białko fuzyjne AveC może być konstruowany tak, żeby zawierał sekwencję polilinkera, która koduje specyficzne miejsce cięcia dla proteazy, takie, że podlegający ekspresji polipeptyd AveC będzie uwalniany z obszaru nośnika lub fuzyjnego partnera poprzez potraktowanie specyficzną proteazą. Na przykład wektor kodujący białko fuzyjne może zawierać między innymi sekwencję DNA kodującą trombinę lub miejsca cięcia czynnika Xa.

Sygnałowa sekwencja w górę od i w ramce odczytu aveC ORF może być wbudowana w wektor ekspresyjny znanymi metodami, żeby kierować ruchem i sekrecją produktu genu podlegającego ekspresji. Niewyczerpujące wszystkiego przykłady sygnałowych sekwencji zawierają między innymi czynnik, immunoglobuliny, białka błon zewnętrznych, penicylinazę, receptory komórek T.

Żeby ułatwić selekcję komórek gospodarza transformowanych lub transfekowanych wektorami do klonowania lub ekspresyjnymi będącymi przedmiotem niniejszego wynalazku, wektor może być konstruowany tak, żeby zawierał sekwencję kodującą dla produktu genu reporterowego albo innego dającego się selekcjonować markera. Najlepiej, jeżeli taka kodująca sekwencja jest w operacyjnym połączeniu z sekwencjami kodującymi elementy regulatorowe, tak jak to opisano powyżej. Geny reporterowe, które są użyteczne w wynalazku, są dobrze znane w tej dziedzinie i zawierają między innymi te kodujące zielone białko fluorescencyjne, lucyferazę, xylE, tyrozynazę. Sekwencje nukleotydów kodujące dające się selekcjonować markery są znane w tej dziedzinie i zawierają te, które kodują produkty genu nadające oporność na antybiotyki lub antymetabolity lub uzupełniają wymagania auksotroficzne. Przykłady takich sekwencji zawierają między innymi te, które kodują oporność na erytromycynę, tiostrepton lub kanamycynę.

5.2.2. Transformacja komórek gospodarza

W dalszej kolejności niniejszy wynalazek dostarcza transformowanych komórek gospodarza zawierających cząsteczkę polipeptydu lub zrekombinowany wektor, będące przedmiotem wynalazku i nowych szczepów lub linii komórek pochodzących od nich. Przy stosowaniu tego wynalazku,

PL 211 693 B1 korzystnymi komórkami gospodarza są komórki Streptomyces chociaż inne prokariotyczne i eukariotyczne komórki także mogą być stosowane. Do takich typowych transformowanych komórek gospodarza, chociaż nie ogranicza się do nich, zalicza się między innymi mikroorganizmy takie jak bakteria transformowana DNA zrekombinowanego bakteriofaga, wektory plazmidowego DNA lub kosmidowego DNA, lub drożdże transformowane wektorami rekombinantów.

Cząsteczki polinukleotydu, będące przedmiotem wynalazku, są przeznaczone do działania w komórkach Streptomyces, ale mogą także być transformowane do innych bakteryjnych lub eukariotycznych komórek, np.: w celu klonowania lub ekspresji. Typowo może być użyty szczep E. Coli, taki jak np.: szczep DH5a. dostępny z American Type Culture Collection (ATCC), Rockville, MD, USA (Accession Nr 31343) i ze źródeł komercyjnych (Stratagene). Do preferowanych eukariotycznych komórek gospodarza zalicza się komórki drożdży, chociaż komórki ssaków lub komórki owadów także mogą być efektywnie stosowane.

Zrekombinowany wektor ekspresyjny będący przedmiotem niniejszego wynalazku najchętniej jest wprowadzany np.: transformowany lub transfekowany, do jednej lub więcej komórek gospodarza w rzeczywiście homogennej hodowli komórek. Powszechnie wektor ekspresyjny jest wprowadzany do komórek gospodarza zgodnie ze znanymi technikami takimi jak np.: przez transformację protoplastów, strącanie fosforanem wapnia, traktowanie chlorkiem wapnia, mikroiniekcję, elektroporację, transfekcję przez kontakt ze zrekombinowanym wirusem, transfekcję zależną od liposomów, transfekcję DEAEdekstranem, transdukcję, koniugację lub bombardowanie mikropociskami. Selekcja transformantów może być przeprowadzona przy użyciu standardowych metod takich jak selekcja komórek, w których zachodzi ekspresja dającego się selekcjonować markera, np.: antybiotykowej oporności związanej ze zrekombinowanym wektorem, jak to opisano powyżej.

Kiedy wektor ekspresyjny jest wprowadzony do komórki gospodarza integracja i utrzymywanie sekwencji kodującej aveC albo w chromosomie komórki gospodarza albo w episomie może być potwierdzone standardowymi metodami np.: przez zastosowanie hybrydyzacji Southerna, analizy przy użyciu enzymów restrykcjnych, PCR, włączając w to PCR odwrotnej transkryptazy (rt-PCR), lub poprzez badanie immunologiczne nastawione na wykrycie spodziewanego produktu genu. Komórki gospodarza zawierające i/albo takie, w których zachodzi ekspresja sekwencji kodującej zrekombinowany aveC mogą być identyfikowane przy pomocy którejś z przynajmniej czterech powszechnie znanych w tej dziedzinie możliwości włączając w to: (i) hybrydyzację DNA-DNA, DNA-RNA, lub RNA-antysensowny RNA; (ii) detekcję obecności „markera” funkcji genu; (iii) badanie poziomu transkrypcji mierzone przez ekspresję specyficznych transkryptów mRNA aveC w komórce gospodarza; i (iv) detekcję obecności macierzystego polipeptydowego produktu mierzoną np.: przy użyciu testu immunologicznego albo przez stwierdzenie biologicznej aktywności AveC (tzn. produkcja specyficznego stosunku i ilości awermektyn wskazująca na aktywność AveC w komórkach gospodarza S. avermitilis).

5.2.3. Ekspresja i charakterystyka produktu zrekombinowanego genu AveC

Kiedy natywną lub zmutowaną sekwencję kodującą aveC trwale wprowadzono do odpowiedniej komórki gospodarza, transformowana komórka gospodarza jest powielana przez klonowanie i powstające komórki mogą rosnąć w warunkach sprzyjających maksymalnej produkcji natywnego lub zmutowanego produktu genu AveC. Typowo takie warunki powodują wzrost komórek do dużej gęstości. Tam gdzie wektor ekspresyjny zawiera indukowalny promotor, odpowiednie warunki indukcji takie jak np.: zmiana temperatury, wyczerpanie pożywki, dodatek dowolnych induktorów (np.: analogów węglowodanów takich jak izopropylo-a-D-tiogalaktopiranozyd (IPTG)), akumulacja nadmiaru ubocznych produktów metabolicznych lub podobne są używane jeśli są potrzebne do indukcji ekspresji.

Tam gdzie produkt ekspresji genu AveC jest utrzymywany wewnątrz komórki gospodarza, komórki są zbierane i poddawane lizie. Produkt jest izolowany i oczyszczany z lizatu w warunkach ekstrakcji znanych w tej dziedzinie, takich które minimalizują degradację białek tzn. w 4°C, lub w obecności inhibitorów proteazy, lub przy uwzględnieniu obu tych warunków. Tam gdzie produkt ekspresji genu AveC jest wydzielany z komórki gospodarza, zużyta pożywka może być zbierana i można z niej izolować produkt.

Produkt ekspresji genu AveC może być izolowany lub istotnie oczyszczony z lizatu komórkowego lub pożywki hodowlanej przy zastosowaniu odpowiednich standardowych metod, włączając w to, ale nie ograniczając się do nich, następujące metody: strącanie siarczanem amonu, frakcjonowanie ze względu na wielkość, chromatografię jonowymienną, HPLC, wirowanie w gradiencie ciężkości i chromatografię powinowactwa. Tam gdzie produkt ekspresji genu AveC wykazuje aktywność biologiczną, zwiększanie czystości może być monitorowane na każdym kroku procedury oczyszczania

PL 211 693 B1 poprzez odpowiednie badania. W zależności od tego, czy produkt ekspresji genu AveC wykazuje, czy nie biologiczną aktywność, może być wykrywany na podstawie wielkości lub reaktywności z przeciwciał ami ską diną d specyficznymi dla AveC lub przez obecność fuzyjnego tag. Tak jak to jest używane tutaj produkt genu AveC jest „istotnie oczyszczony” wtedy gdy produkt zawiera więcej niż około 20 wagowo% białka w danym preparacie. Także, tak jak to jest użyte tutaj, produkt AveC jest „izolowany” jeżeli produkt zawiera przynajmniej 80 wagowo% białka w danym preparacie.

Niniejszy wynalazek dostarcza izolowanego lub istotnie oczyszczonego produktu genu AveC S. avermitilis, którego ekspresja zachodzi po rekombinacji, zawierającego sekwencję aminokwasów kodowaną przez plazmid pSE186 (ATCC 209604) kodującą produkt genu AveC lub sekwencję aminokwasów przedstawioną na FIGURZE 1 (SEQ ID NO:2) lub jej istotną część i jej zmutowane wersje i zdegenerowane odmiany.

W dalszej kolejności niniejszy wynalazek dostarcza metody produkcji produktu genu AveC zawierającej hodowanie komórek gospodarza transformowanych zrekombinowanym wektorem ekspresyjnym, tym wektorem, który zawiera cząsteczkę polinukleotydu mającą sekwencję nukleotydów kodującą produkt genu AveC, która to cząsteczka polinukleotydu jest w operacyjnym połączeniu z jednym lub większą liczbą elementów regulatorowych, które kontrolują ekspresję cząsteczki polinukleotydu w komórce gospodarza w warunkach sprzyjają cych wytwarzaniu produktu zrekombinowanego genu AveC i odzyskiwaniu produktu genu AveC z hodowli komórkowej.

Produkt genu AveC S. avermitilis, którego ekspresja zachodzi po rekombinacji, jest przydatny do różnych celów włączając w to skrining związków, które zmieniają działanie produktu genu AveC i przez to modulują biosyntezę awermektyny i do wywoływania powstawania przeciwciał skierowanych przeciwko produktowi genu AveC.

Kiedy otrzymuje się produkt genu AveC o dostatecznej czystości, może być on charakteryzowany przy pomocy standardowych metod włączając w to SDS-PAGE, chromatografię wykluczenia, analizę sekwencji aminokwasów, ocenę biologicznej aktywności w produkowaniu odpowiednich produktów w biosyntetycznym szlaku awermektyn itd. Na przykład sekwencja aminokwasów produktu genu AveC może być oznaczana przy użyciu standardowych technik sekwencjonowania peptydów. Produkt genu AveC może być następnie charakteryzowany przy zastosowaniu analizy hydrofilowości (patrz Hopp i Woods, 1981, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:3824) lub analogicznych algorytmów programowych do identyfikowania hydrofobowych i hydrofilowych regionów produktu genu AveC. Może być przeprowadzona analiza struktury w celu zidentyfikowania regionów produktu genu AveC, które przybierają specyficzną drugorzędową strukturę. Biofizyczne metody, takie jak krystalografia promieni rentgenowskich (Engstrom, 1974, Biochem. Exp. Biol. 11: 7-13), modelowanie komputerowe (Fletterick i Zoller (eds.), 1986, w: Current Communications in Molecular Biology, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY) i jądrowy rezonans magnetyczny (NMR) mogą być użyte do mapowania i badania miejsc interakcji między produktem genu AveC i jego substratem. Informacje uzyskane z tych badań mog ą być zastosowane do wyboru nowych miejsc mutacji w aveC ORF, co moż e pomóc w odkryciu nowych szczepów S. avermitilis posiadających bardziej pożądaną charakterystykę produkcji awermektyn.

5.3. Konstrukcja i zastosowanie mutantów aveC

Podstawowym celem niniejszego wynalazku jest zidentyfikowanie nowych mutacji w allelu aveC S. avermitilis, które powodują zmiany, a co najbardziej wskazane redukcję w stosunku B2:B1 awermektyn. Niniejszy wynalazek dostarcza cząsteczek polinukleotydu użytecznych w produkcji nowych komórek szczepów S. avermitilis, które wykazują wykrywalne zmiany w produkcji awermektyn w porównaniu do komórek tego samego szczepu, w których w zamian zachodzi tylko ekspresja allelu typu dzikiego. W preferowanym ujęciu takie cząsteczki polinukleotydu są przydatne do produkcji nowych komórek szczepów S. avermitilis, które produkują awermektyny w zredukowanym stosunku klasy 2:1 w porównaniu do komórek tego samego szczepu w którym w zamian zachodzi tylko ekspresja allelu typu dzikiego. Komórki takiego szczepu mogą także zawierać dodatkowe mutacje, żeby produkować zwiększone ilości awermektyn w porównaniu do komórek tego samego szczepu, w którym w zamian zachodzi ekspresja tylko pojedynczego allelu typu dzikiego.

Mutacje allelu aveC lub kodującej sekwencji obejmują wszelkie mutacje, które wprowadzają jedno lub więcej podstawień aminokwasów, delecji i/lub addycji do produktu genu AveC lub powodują skrócenie produktu genu AveC, albo jakąkolwiek jego kombinację i które dają pożądany wynik. Celem takich zmutowanych sekwencji allelu aveC jest, żeby zawierać jego zdegenerowane odmiany. Na przykład, niniejszy wynalazek dostarcza cząsteczki polinukleotydu, zawierającej sekwencję nukleotydów

PL 211 693 B1 allelu aveC lub jego zdegenerowanej odmiany, albo sekwencji plazmidu pSE186 (ATCC 209604) kodującego produkt genu AveC lub jego zdegenerowanej odmiany, lub sekwencji aveC ORF S. avermitilis jak przedstawiono na FIGURZE 1 (SEQ ID NO:1) albo jej zdegenerowanej odmiany, ale tak, że nadal zawiera mutacje, które kodują kombinację podstawień aminokwasów w wybranych pozycjach w produkcie genu AveC. W tym nieograniczającym uję ciu, takie podstawienia zdarzają się w jednej lub większej liczbie pozycji aminokwasów produktu genu AveC odpowiadających pozycjom aminokwasów 25, 28, 35, 36, 38, 40, 41, 48, 55, 61, 78, 84, 89, 90, 99, 107, 108, 111, 120, 123, 136, 138, 139, 141, 154, 159, 163, 179, 192, 196, 198, 200, 202, 220, 228, 229, 230, 231, 234, 238, 239, 250, 252, 266, 275, 278, 289, lub 298 SEQ ID NO:2. Korzystne kombinacje pozycji aminokwasów do podstawienia zawierają jedną lub więcej reszt aminokwasów: D48, A61, A89, L136, S138, A139, R163, G179, V196, A198, E238, i P289. Szczególnie korzystne kombinacje podstawień aminokwasów zawierają podstawienia w obu D48 i G179, i jeszcze bardziej w D48E i G179S. Specyficzne przykłady kombinacji podstawień aminokwasów, które powodują redukcję stosunku cykloheksylo B2:cykloheksylo B1 wymieniono na FIGURZE 6A-J.

Tak więc niniejszy wynalazek dostarcza cząsteczkę polinukleotydu zawierającą sekwencję nukleotydów, która skądinąd jest taka sama jak w allelu aveC Streptomyces avermitilis, plazmidzie pSE186 (ATCC 209604) kodującym produkt genu AveC S. avermilitis lub sekwencję nukleotydów aveC ORF S. avermilitis jak to przedstawiono na FIGURZE 1 (SEQ ID NO:1) lub jej zdegenerowanej odmiany ale z sekwencją nukleotydów nadal zawierającą mutacje kodujące kombinację podstawień aminokwasów w miejscach dla reszt aminokwasów odpowiadających pozycjom aminokwasów SEQ ID NO:2., taką, że komórki S. avermilitis szczepu ATCC 53692, w których allel aveC typu dzikiego został zinaktywowany i w których zachodzi ekspresja cząsteczki polinukleotydu zawierającej zmutowaną sekwencję nukleotydów, są zdolne do produkcji awermektyn, w których stosunek klasy 2:1 jest zredukowany w porównaniu do stosunku awermektyn produkowanych przez komórki S. avermilitis szczepu ATCC 53692, w których w zamian zachodzi ekspresja tylko allelu aveC typu dzikiego, w którym kiedy awermektynami klasy 2:1 są awermektyny cykloheksylo B2:cykloheksylo B1, stosunek awermektyn klasy 2:1 wynosi 0,35:1 lub mniej. W bardziej korzystnej postaci realizacji wynalazku stosunek awermektyn cykloheksylo B2:cykloheksylo B1 wynosi około 0,30:1 lub mniej. W bardziej korzystnej postaci realizacji wynalazku stosunek awermektyn cykloheksylo B2:cykloheksylo B1 wynosi około 0,25:1 lub mniej. W bardziej korzystnej postaci realizacji wynalazku stosunek awermektyn cykloheksylo B2:cykloheksylo B1 wynosi około 0,20:1 lub mniej.

W szczególnej postaci realizacji wynalazku, kombinacja podstawień aminokwasów zawiera kombinację grupy (a): D48E, A61T, A89T, S138T, A139T, G179S, A198G, P289L. Nieograniczającym przykładem plazmidu kodującego te podstawienia aminokwasów jest pSE538 (patrz FIGURA 6).

W innej szczególnej postaci realizacji wynalazku, kombinacja podstawie ń aminokwasów zawiera kombinację grupy (b): G40S, D48E, L136P, G179S, E238D. Nieograniczającym przykładem plazmidu kodującego te podstawienia aminokwasów jest pSE559.

W innej szczególnej postaci realizacji wynalazku, kombinacja podstawie ń aminokwasów zawiera kombinację grupy (c): D48E, L136P, R163Q, G179S. Nieograniczającym przykładem plazmidu kodującego te podstawienia aminokwasów jest pSE567.

W innej szczególnej postaci realizacji, kombinacja podstawień aminokwasów zawiera kombinację grupy (d): D48E, L136P, R163Q, G179S, E238D. Nieograniczającym przykładami plazmidów kodujących te podstawienia aminokwasów są pSE570 i pSE572.

W innej szczególnej postaci realizacji wynalazku, kombinacja podstawie ń aminokwasów zawiera kombinację grupy (e): D48E, L136P, R163Q, G179S, A200G, E238D. Nieograniczającym przykładem plazmidu kodującego te podstawienia aminokwasów jest pSE571.

W innej szczególnej postaci realizacji wynalazku, kombinacja podstawie ń aminokwasów zawiera kombinację grupy (f): D48E, L136P, G179S, E238D. Nieograniczającymi przykładami plazmidów kodujących te podstawienia aminokwasów są pSE501 i pSE546.

W innej szczególnej postaci realizacji wynalazku, kombinacja podstawie ń aminokwasów zawiera kombinację grupy (g): D48E, A61T, L136P, G179S, E238D. Nieograniczającym przykładem plazmidu kodującego te podstawienia aminokwasów jest pSE510.

PL 211 693 B1

W innej szczególnej postaci realizacji wynalazku, kombinacja podstawie ń aminokwasów zawiera kombinację grupy (h): D48E, A61T, L136P, G179S. Nieograniczającym przykładem plazmidu kodującego te podstawienia aminokwasów jest pSE512.

W innej szczególnej postaci realizacji wynalazku, kombinacja podstawie ń aminokwasów zawiera kombinację grupy (i): D48E, A89T, S138T, A139T, G179S. Nieograniczającym przykładem plazmidu kodującego te podstawienia aminokwasów jest pSE519.

W innej szczególnej postaci realizacji wynalazku, kombinacja podstawie ń aminokwasów zawiera kombinację grupy (j): D48E, A61T, L136P, G179S, A198G, P202S, E238D, P289L. Nieograniczającym przykładem plazmidu kodującego te podstawienia aminokwasów jest pSE526.

W innej szczególnej postaci realizacji wynalazku, kombinacja podstawie ń aminokwasów zawiera kombinację grupy (k): D48E, A61T, L136P, S138T, A139F, G179S, E238D, P289L. Nieograniczającym przykładem plazmidu kodującego te podstawienia aminokwasów jest pSE528.

W innej szczególnej postaci realizacji wynalazku, kombinacja podstawie ń aminokwasów zawiera kombinację grupy (l): D48E, L136P, G179S, A198G, E238D, P289L. Nieograniczającym przykładem plazmidu kodującego te podstawienia aminokwasów jest pSE530.

W innej szczególnej postaci realizacji wynalazku, kombinacja podstawie ń aminokwasów zawiera kombinację grupy (m): D48E, A61T, S138T, A139F, G179S, A198G, P289L. Nieograniczającym przykładem plazmidu kodującego te podstawienia aminokwasów jest pSE531.

W innej szczególnej postaci realizacji wynalazku, kombinacja podstawie ń aminokwasów zawiera kombinację grupy (n): D48E, L84P, G111V, S138T, A139T, G179S, A198G, P289L. Nieograniczającym przykładem plazmidu kodującego te podstawienia aminokwasów jest pSE534.

W innej szczególnej postaci realizacji wynalazku, kombinacja podstawie ń aminokwasów zawiera kombinację grupy (o): Y28C, D48E, A61T, A89T, S138T, A139T, G179S, E238D. Nieograniczającym przykładem plazmidu kodującego te podstawienia aminokwasów jest pSE535.

W innej szczególnej postaci realizacji wynalazku, kombinacja podstawie ń aminokwasów zawiera kombinację grupy (p): D48E, A61T, A107T, S108G, L136P, G179S, S192A, E238D, P289L. Nieograniczającym przykładem plazmidu kodującego te podstawienia aminokwasów jest pSE542.

W innej szczególnej postaci realizacji wynalazku, kombinacja podstawie ń aminokwasów zawiera kombinację grupy (q): D48E, L136P, G179S, R250W. Nieograniczającym przykładem plazmidu kodującego te podstawienia aminokwasów jest pSE545.

W innej szczególnej postaci realizacji wynalazku, kombinacja podstawie ń aminokwasów zawiera kombinację grupy (r): D48E, A89T, S138T, A139T, R163Q, G179S. Nieograniczającym przykładem plazmidu kodującego te podstawienia aminokwasów jest pSE548.

W innej szczególnej postaci realizacji wynalazku, kombinacja podstawie ń aminokwasów zawiera kombinację grupy (s): D48E, L136P, G179S, A198G, P289L, Nieograniczającym przykładem plazmidu kodującego te podstawienia aminokwasów jest pSE552.

W innej szczególnej postaci realizacji wynalazku, kombinacja podstawie ń aminokwasów zawiera kombinację grupy (t): D48E, F78L, A89T, L136P, G179S. Nieograniczającym przykładem plazmidu kodującego te podstawienia aminokwasów jest pSE557.

W innej szczególnej postaci realizacji wynalazku, kombinacja podstawie ń aminokwasów zawiera kombinację w innym szczególnym ujęciu wynalazku, G179S, E238D, F278L. Nieograniczającym przykładem plazmidu kodującego te podstawienia aminokwasów są pSE564 i pSE565.

W innej szczególnej postaci realizacji wynalazku, kombinacja podstawie ń aminokwasów zawiera kombinację grupy (v):D48E, A89T, L136P, R163Q, G179S. Nieograniczającym przykładem plazmidu kodującego te podstawienia aminokwasów jest pSE568.

W innej szczególnej postaci realizacji wynalazku, kombinacja podstawie ń aminokwasów zawiera kombinację grupy (w): D48E, A61T, A89T, G111V, S138T, A139F, G179S, E238D, P289L. Nieograniczającym przykładem plazmidu kodującego te podstawienia aminokwasów jest pSE543.

W innej szczególnej postaci realizacji wynalazku, kombinacja podstawie ń aminokwasów zawiera kombinację grupy (x): D25G, D48E, A89T, L136P, S138T, A139T, V141A, I159T, R163Q, G179S. Nieograniczającym przykładem plazmidu kodującego te podstawienia aminokwasów jest pSE504.

W innej szczególnej postaci realizacji wynalazku, kombinacja podstawie ń aminokwasów zawiera kombinację grupy (y): D48E, A89T, S90G, L136P, R163Q, G179S, E238D. Nieograniczającym przykładem plazmidu kodującego te podstawienia aminokwasów jest pSE508.

PL 211 693 B1

W innej szczególnej postaci realizacji wynalazku, kombinacja podstawie ń aminokwasów zawiera kombinację grupy (z): D48E, A61T, A89T, G111V, S138T, A139T, G179S, E238D, P289L. Nieograniczającym przykładem plazmidu kodującego te podstawienia aminokwasów jest pSE511.

W innej szczególnej postaci realizacji wynalazku, kombinacja podstawie ń aminokwasów zawiera kombinację grupy (aa): D48E, A89T, S138T, A139T, G179S. Nieograniczającym przykładem plazmidu kodującego te podstawienia aminokwasów jest pSE520.

W innej szczególnej postaci realizacji wynalazku, kombinacja podstawie ń aminokwasów zawiera kombinację grupy (ab): D48E, L136P, R163Q, G179S, S231L. Nieograniczającym przykładem plazmidu kodującego te podstawienia aminokwasów jest pSE523.

W innej szczególnej postaci realizacji wynalazku, kombinacja podstawie ń aminokwasów zawiera kombinację grupy (ac): D48E, L136P, S138T, A139F, G179S, V196A, E238D. Nieograniczającym przykładem plazmidu kodującego te podstawienia aminokwasów jest pSE527.

W innej szczególnej postaci realizacji wynalazku, kombinacja podstawie ń aminokwasów zawiera kombinację grupy (ad): D48E, A61T, A89T, F99S, S138T, A139T, G179S, E238D. Nieograniczającym przykładem plazmidu kodującego te podstawienia aminokwasów jest pSE539.

W innej szczególnej postaci realizacji, kombinacja podstawień aminokwasów zawiera kombinację grupy (ae): G35S, D48E, A89T, S138T, A139T, G179S, P289L. Nieograniczającym przykładem plazmidu kodującego te podstawienia aminokwasów jest pSE540.

W innej szczególnej postaci realizacji, kombinacja podstawień aminokwasów zawiera kombinację grupy (af): D48E, A61T, A89T, S138T, A139T, G179S, V196A, E238D. Nieograniczającym przykładem plazmidu kodującego te podstawienia aminokwasów jest pSE547.

W innej szczególnej postaci realizacji, kombinacja podstawień aminokwasów zawiera kombinację grupy (ag): D48E, A89T, G111V, S138T, A139T, G179S, A198G, E238D. Nieograniczającym przykładem plazmidu kodującego te podstawienia aminokwasów jest pSE550.

W innej szczególnej postaci realizacji wynalazku, kombinacja podstawie ń aminokwasów zawiera kombinację grupy (ah): S41G, D48E, A89T, L136P, G179S. Nieograniczającym przykładem plazmidu kodującego te podstawienia aminokwasów jest pSE558.

W innej szczególnej postaci realizacji wynalazku, kombinacja podstawie ń aminokwasów zawiera kombinację grupy (ai): D48E, A89T, L136P, R163Q, G179S, P252S. Nieograniczającym przykładem plazmidu kodującego te podstawienia aminokwasów jest pSE563.

W innej szczególnej postaci realizacji wynalazku, kombinacja podstawie ń aminokwasów zawiera kombinację grupy (aj): D48E, A89T, L136P, G179S, F234S. Nieograniczającym przykładem plazmidu kodującego te podstawienia aminokwasów jest pSE566.

W innej szczególnej postaci realizacji wynalazku, kombinacja podstawie ń aminokwasów zawiera kombinację grupy (ak): D48E, A89T, L136P, R163Q, G179S, E238D. Nieograniczającym przykładem plazmidu kodującego te podstawienia aminokwasów są pSE573 i pSE578.

W innej szczególnej postaci realizacji wynalazku, kombinacja podstawie ń aminokwasów zawiera kombinację grupy (al): Q36R, D48E, A89T, L136P, G179S, E238D. Nieograniczającym przykładem plazmidu kodującego te podstawienia aminokwasów jest pSE574.

W innej szczególnej postaci realizacji wynalazku, kombinacja podstawie ń aminokwasów zawiera kombinację grupy (am): D48E, A89T, L136P, R163Q, G179S. Nieograniczającym przykładem plazmidu kodującego te podstawienia aminokwasów są pSE575 i pSE576.

W innej szczególnej postaci realizacji wynalazku, kombinacja podstawie ń aminokwasów zawiera kombinację grupy (an): D48E, A89T, S138T, G179S. Nieograniczającym przykładem plazmidu kodującego te podstawienia aminokwasów jest pSE577.

W innej szczególnej postaci realizacji wynalazku, kombinacja podstawie ń aminokwasów zawiera kombinację grupy (ao): D48E, A89T, L136P, G179S, E238D. Nieograniczającym przykładem plazmidu kodującego te podstawienia aminokwasów są pSE502 i pSE524.

W innej szczególnej postaci realizacji wynalazku, kombinacja podstawie ń aminokwasów zawiera kombinację grupy (ap): D48E, A89T, L136P, K154E, G179S, E238D. Nieograniczającym przykładem plazmidu kodującego te podstawienia aminokwasów jest pSE503.

W innej szczególnej postaci realizacji wynalazku, kombinacja podstawie ń aminokwasów zawiera kombinację grupy (aq): D48E, A89T, S138T, A139T, K154R, G179S, V196A, P289L. Nieograniczającym przykładem plazmidu kodującego te podstawienia aminokwasów jest pSE505.

PL 211 693 B1

W innej szczególnej postaci realizacji wynalazku, kombinacja podstawie ń aminokwasów zawiera kombinację grupy (ar): D48E, A89T, S138T, A139F, G179S, V196A, E238D. Nieograniczającym przykładem plazmidu kodującego te podstawienia aminokwasów jest pSE506.

W innej szczególnej postaci realizacji wynalazku, kombinacja podstawie ń aminokwasów zawiera kombinację grupy (as): D48E, A61T, A89T, L136P, G179S, V196A, A198G, P289L. Nieograniczającym przykładem plazmidu kodującego te podstawienia aminokwasów jest pSE507.

W innej szczególnej postaci realizacji wynalazku, kombinacja podstawie ń aminokwasów zawiera kombinację grupy (at): D48E, A61T, S138T, A139F, G179S, G196A, E238D, P289L. Nieograniczającym przykładem plazmidu kodującego te podstawienia aminokwasów jest pSE509.

W innej szczególnej postaci realizacji wynalazku, kombinacja podstawie ń aminokwasów zawiera kombinację grupy (au): D48E, A89T, L136P, G179S. Nieograniczającym przykładem plazmidu kodującego te podstawienia aminokwasów są pSE514 i pSE525.

W innej szczególnej postaci realizacji wynalazku, kombinacja podstawie ń aminokwasów zawiera kombinację grupy (av): D48E, A89T, V120A, L136P, G179S. Nieograniczającym przykładem plazmidu kodującego te podstawienia aminokwasów jest pSE515.

W innej szczególnej postaci realizacji wynalazku, kombinacja podstawie ń aminokwasów zawiera kombinację grupy (aw): D48E, A61T, A89T, S138T, A139F, G179S, V196A, A198G, E238D. Nieograniczającym przykładem plazmidu kodującego te podstawienia aminokwasów jest pSE517.

W innej szczególnej postaci realizacji wynalazku, kombinacja podstawie ń aminokwasów zawiera kombinację grupy (ax): D48E, A61T, A89T, G111V, S138T, A139F, G179S, V196A, E238D. Nieograniczającym przykładem plazmidu kodującego te podstawienia aminokwasów jest pSE518.

W innej szczególnej postaci realizacji wynalazku, kombinacja podstawie ń aminokwasów zawiera kombinację grupy (ay): D48E, A61T, A89T, S138T, A139T, G179S, V196A, E238D, P289L. Nieograniczającym przykładem plazmidu kodującego te podstawienia aminokwasów są pSE529 i pSE554,

W innej szczególnej postaci realizacji wynalazku, kombinacja podstawie ń aminokwasów zawiera kombinację grupy (az): D48E, A61T, A89T, L136P, S138T, A139F, G179S, A198G, E238D. Nieograniczającym przykładem plazmidu kodującego te podstawienia aminokwasów jest pSE532.

W innej szczególnej postaci realizacji wynalazku, kombinacja podstawie ń aminokwasów zawiera kombinację grupy (ba): D48E, A89T, S138T, A139F, G179S, A198G, V220A. Nieograniczającym przykładem plazmidu kodującego te podstawienia aminokwasów jest pSE536.

W innej szczególnej postaci realizacji wynalazku, kombinacja podstawie ń aminokwasów zawiera kombinację grupy (bb): D48E, A61T, A89T, S138T, A139T, G179S, V196A, E238D,R239H, P290L. Nieograniczającym przykładem plazmidu kodującego te podstawienia aminokwasów jest pSE537.

W innej szczególnej postaci realizacji wynalazku, kombinacja podstawie ń aminokwasów zawiera kombinację grupy (bc): D48E, A61T, A89T, L136P, G179S, P289L. Nieograniczającym przykładem plazmidu kodującego te podstawienia aminokwasów jest pSE541.

W innej szczególnej postaci realizacji wynalazku, kombinacja podstawie ń aminokwasów zawiera kombinację grupy (bd): D48E, A89T, S138T, A139T, G179S, V196A, E238D, P289L. Nieograniczającym przykładem plazmidu kodującego te podstawienia aminokwasów są pSE549 pSE553.

W innej szczególnej postaci realizacji wynalazku, kombinacja podstawie ń aminokwasów zawiera kombinację grupy (be): D48E, A61T, A89T, S138T, A139T, G179S, V196A, E238D. Nieograniczającym przykładem plazmidu kodującego te podstawienia aminokwasów jest pSE551.

W dalszej kolejnoś ci niniejszy wynalazek dostarcza czą steczkę polinukleotydu zawierają c ą sekwencję nukleotydów, która skądinąd jest taka sama jak ta w allelu aveC Streptomyces avermitilis, jak sekwencja plazmidu pSE186 (ATCC 209604) kodującego produkt genu AveC S. avermilitis lub sekwencja nukleotydów aveC ORF S. avermilitis jak to przedstawiono na FIGURZE 1 (SEQ ID NO:1) lub jej zdegenerowanej odmiany ale z sekwencją nukleotydów nadal zawierającą mutacje kodujące kombinację podstawień aminokwasów w miejscach dla reszt aminokwasów odpowiadających pozycjom aminokwasów SEQ ID NO:2, taką, że komórki S. avermilitis szczepu ATCC 53692, w których allel aveC typu dzikiego został zinaktywowany i w których zachodzi ekspresja cząsteczki polinukleotydu, zawierającej zmutowaną sekwencję nukleotydów, są zdolne do produkcji awermektyn, w których stosunek klasy 2:1 jest zredukowany w porównaniu do stosunku awermektyn produkowanych przez komórki S. avermitilis szczepu ATCC 53692, gdzie w zamian zachodzi ekspresja tylko allelu aveC typu dzikiego, w którym kiedy awermektynami klasy 2:1 są awermektyny cykloheksylo B2:cykloheksylo B1,

PL 211 693 B1 stosunek awermektyn klasy 2:1 jest zredukowany do około 0,40:1 lub mniej i gdzie kombinacja podstawień aminokwasów zawierają kombinację wybraną z grupy składającej się z:

Nieograniczającymi przykładami plazmidu kodującego podstawienia aminokwasów grupy (bf) są pSE556 i pSE569. Nieograniczającym przykładem plazmidu kodującego podstawienia aminokwasów grupy (bg) jest pSE561.

Niniejszy wynalazek rozważa, że wszystkie wcześniej wspomniane podstawienia aminokwasów mogą być dokonane przez jakąś modyfikację sekwencji nukleotydów allelu aveC albo jego zdegenerowanej odmiany, która spowoduje takie podstawienie. Na przykład, możliwe jest otrzymanie większości opisanych tutaj podstawień aminokwasów przez zmienianie sekwencji natywnego kodonu lub jego zdegenerowanej odmiany do któregokolwiek z alternatywnych kodonów, które kodują takie podstawienie aminokwasów. Różne możliwe sekwencje, które mogą kodować wcześniej wspomniane podstawienia aminokwasów będą łatwo widoczne dla osób biegłych w tej dziedzinie, przy uwzględnieniu niniejszego odkrycia i znajomości degeneracji kodu genetycznego. W tej nieograniczającej postaci realizacji, dla każdej konkretnej kombinacji wyliczonej powyżej podstawienia aminokwasów są osiągane przez inne niż milczące zmiany nukleotydów przedstawione na FIGURZE 6.

Tak jak użyto tutaj, sformułowanie „kombinacja podstawień aminokwasów zawiera kombinację grupy...” i podobne oznacza, że podstawienia aminokwasów w produkcie genu AveC zgodnie z niniejszym wynalazkiem zawierają przynajmniej te podstawienia, które są konkretnie wyliczone i mogą zawierać inne podstawienia aminokwasów, albo delecje aminokwasów, albo addycje aminokwasów albo pewne kombinacje tego, gdzie ekspresja prowadząca do powstania produktu genu AveC w komórce S. avermitilis prowadzi do pożądanej redukcji stosunku awermektyn B2:B1.

Mutacje allelu aveC lub jego zdegenerowanej odmiany mogą być przeprowadzone przy zastosowaniu którejś z rozmaitych znanych metod włączając w to zastosowanie PCR skłonnego do błędów (ang. „error-prone” lub mutagenezy kasetowej. Na przykład, mutageneza ukierunkowana na oligonukleotyd może być użyta do zmiany sekwencji allelu aveC lub ORF na określonej drodze takiej jak np,: wprowadzenie jednego lub więcej miejsc restrykcyjnych, wprowadzenie kodonu terminacji do specyficznych regionów wewnątrz allelu aveC lub ORF. Metody takie jak te opisane w Patencie U.S, 5 605 793, Patencie U,S. 5 830 721 i Patencie U.S. 5 837 458, które zawierają losową fragmentację, powtarzające się cykle mutagenez i tasowania nukleotydów, także mogą być stosowane do wytworzenia dużych bibliotek polinukleotydów mających sekwencje nukleotydów kodujące mutacje aveC.

Celowane mutacje mogą być użyteczne, szczególnie tam, gdzie służą zmianie jednej lub więcej reszt konserwatywnych aminokwasów w produkcie genu AveC. Na przykład porównanie wydedukowanej sekwencji aminokwasów produktu genu AveC S. avermitilis (SEQ ID NO:2) z produktami homologu genu Avec z S. griseochromogenes (SEQ ID NO: 5) i S. hygroscopicus (SEQ ID NO:4), jak to opisano w Patencie U.S. Nr 6 248 579 wskazuje miejsca reszt aminokwasów konserwatywnych w tych gatunkach. Celowana mutageneza, która prowadzi do zmian w jednej lub więcej z tych reszt konserwatywnych aminokwasów może być efektywna w produkowaniu nowych szczepów mutantów, które wykazują pożądane zmiany w produkcji awermektyny.

Losowa mutageneza także może być użyteczna i może być przeprowadzana przez ekspozycję komórek na promieniowanie ultrafioletowe, promieniowanie X, lub chemiczne mutageny takie jak N-metylo-N'-nitrozoguanidyna, metylosulfonian etylu, kwas azotawy, iperyt. Patrz powyżej np.: Ausubel, 1989, przegląd technik mutagenezy.

Kiedy wytwarzane są zmutowane cząsteczki polinukleotydu, są one badane w celu oznaczenia, czy mogą one modulować biosyntezę awermektyny w S. avermectilis. W korzystnej postaci realizacji wynalazku, cząsteczka polinukleotydu mająca zmutowaną sekwencję nukleotydów jest testowana przez komplementację szczepu S. avermitilis w którym gen aveC inaktywowano w celu otrzymania negatywnego tła aveC (aveC). W nieograniczającym sposobie, zmutowana cząsteczka polinukleotydu jest włączana w ekspresyjny plazmid w operacyjnym połączeniu z jednym lub więcej elementami regulatorowymi, wskazane jest także, żeby plazmid ten zawierał jeden lub więcej genów lekooporności co pozwala na selekcję transformowanych komórek. Ten wektor jest później transformowany do aveC komórek gospodarza przy użyciu znanych technik i transformowane komórki są selekcjonowane i hodowane w odpowiednim środowisku fermentacyjnym w warunkach, które pozwalają na lub indukują produkcję awermektyny, na przykład przez włączenie odpowiednich podjednostek zaczynowych w pożywce i hodowanie w warunkach optymalnych dla produkcji awermektyn zgodnie ze znajomością

PL 211 693 B1 tej dziedziny. Produkty fermentacji są następnie analizowane przy użyciu HPLC w celu oznaczenia zdolności zmutowanej cząsteczki polinukleotydu do uzupełnienia komórki gospodarza. Poszczególne wektory plazmidowe noszące cząsteczki polinukleotydu zdolne do redukowania stosunku awermektyn B2:B1, zawierające pSE188, pSE199, pSE231, pSE239 pSE290 do pSE297 są zilustrowane na przykładzie w Sekcji 8.3 poniżej. Inne przykłady takich plazmidowych wektorów są wyliczone na FIGURZE 6.

Jakikolwiek z poprzednio wymienionych sposobów według niniejszego wynalazku może być przeprowadzony przy użyciu fermentacyjnej pożywki hodowlanej, wskazane żeby była ona uzupełniona kwasem cykloheksanokarboksylowym, chociaż mogą być użyte prekursory innych odpowiednich kwasów tłuszczowych takich jak którykolwiek z prekursorów kwasów tłuszczowych wymienionych w TABELI 1 lub kwas metylotiomlekowy.

Kiedy zmutowana cząsteczka polinukleotydu, która moduluje produkcję awermektyn w pożądany sposób została zidentyfikowana, może być okreś lona lokalizacja mutacji w sekwencji nukleotydów. Na przykład cząsteczka polinukleotydu, mająca sekwencję nukleotydów kodującą produkt zmutowanego genu AveC może być izolowana przy użyciu PCR i poddana analizie sekwencji DNA przy zastosowaniu znanych metod. Przez porównanie sekwencji DNA zmutowanego allelu aveC z sekwencją allelu aveC typu dzikiego, mutacja (mutacje) odpowiedzialne za zmiany w produkcji awermektyn mogą być oznaczone. Na przykład produkty genu AveC S. avermitilis zawierające albo pojedyncze podstawienia aminokwasów w którejś z reszt 55 (S55F), 138 (S138T), 139 (A139T) lub 230 (G230D) lub podwójne podstawienia w pozycjach 138 (S138T) i 139 (A139T lub A139F) wytwarzały zmiany w działaniu produktu genu AveC takie, że stosunek klasy produkowanych awermektyn był zmieniony (patrz Sekcja 8, poniżej), gdzie wymienione pozycje aminokwasów odpowiadają tym na FIGURZE 1 (SEQ ID NO:2). Dodatkowo wykazano, że każda z następujących siedmiu kombinacji mutacji efektywnie redukuje stosunek awermektyn klasy 2:1: (1) D48E/A89T; (2) S138T/A139T/G179S; (3) Q38P/ /L136P/E238D; (4) F99S/S138T/A139T/G179S; (5) A139T/M228T; (6) G111V/P289L; (7) A139T/ /K154E/Q298H. Niniejszy wynalazek dostarcza pięćdziesięciu dziewięciu (59) dodatkowych kombinacji mutacji, dla których wykazano, że redukują stosunek awermektyn cykloheksylo B2:cykloheksylo B1 i które są przedstawione na FIGURZE 6 i wyliczone w zastrzeż eniach patentowych.

Tak jak użyto tutaj, wcześniej wspomniane oznaczenia, takie jak A139T wskazują oryginalną resztę aminokwasu przez oznaczenie pojedynczą literą, którą w tym przykładzie jest alanina (A) we wskazanej pozycji, którą w tym przykładzie jest pozycja 139 polipeptydu (odniesienie do SEQ ID NO:2) następnie występuje reszta aminokwasu, którą tym przypadku jest treonina (T), która zastępuje oryginalną resztę aminokwasu.

Tak jak użyto tutaj, gdzie reszta aminokwasu kodowana przez allel genu aveC w chromosomie S. avermitilis albo w wektorze lub w izolowanej cząsteczce polinukleotydu niniejszego wynalazku jest odnoszona do konkretnej reszty aminokwasowej SEQ ID NO:2 jako „odpowiadająca”, albo gdzie podstawienie aminokwasów jest określane jako pojawiające się w konkretnej pozycji „odpowiadającej” konkretnemu numerowaniu reszt aminokwasów w SEQ ID NO:2, ma to na celu określanie reszt aminokwasów we względnie tej samej lokalizacji w produkcie genu AveC, którą biegli pracownicy mogą szybko określić przez odniesienie do sekwencji aminokwasów przedstawionej tutaj jako SEQ ID NO:2.

Jak użyto tutaj, gdzie specyficzne mutacje w allelu aveC kodujące konkretne mutacje są wyliczane jako zmiany zasad w specyficznych pozycjach nukleotydów w allelu aveC „odpowiadających” konkretnej pozycji nukleotydu jak pokazano w SEQ ID NO:1, albo gdzie pozycja nukleotydu w allelu aveC jest inaczej określana jako „odpowiadająca” konkretnej pozycji nukleotydu w SEQ ID NO:1, ma to na celu określenie nuleotydu we względnie tej samej lokalizacji w sekwencji nukleotydów aveC albo jego zdegenerowanej odmiany, którą biegli pracownicy mogą szybko określić przez odniesienie do sekwencji nukleotydów przedstawionej tutaj jako SEQ ID NO:1.

Jak użyto tutaj w odniesieniu do stosunku awermektyn cykloheksylo B2: cykloheksylo B1, termin „około” odnosi się do konkretnie ustalonej wartości liczbowej plus lub minus 10% ustalonej wartości.

Polinukleotydowa cząsteczka będąca przedmiotem niniejszego wynalazku, może być „izolowana”, co oznacza, że jest albo: (i) oczyszczona w stopniu takim, że jest rzeczywiście wolna od innych cząsteczek polinukleotydów mających różne sekwencje nukleotydów, lub (ii) jest obecna w środowisku, w którym naturalnie się nie pojawia, np.: gdzie allel aveC S. avermitilis lub jego zmutowana odmiana są obecne w komórce innej niż komórka S. avermitilis, lub (iii) jest obecna w formie, w której naturalnie nie występuje, np.: jako krótszy odcinek DNA, taki jak fragment restrykcyjny trawiony na zewnątrz chromosomu bakterii, zawierający w przeważającej części obszar kodujący aveC lub jego

PL 211 693 B1 zmutowaną wersję, z albo bez połączeń z jakimiś regulatorowymi sekwencjami albo jako następnie zintegrowana do heterologicznego odcinka DNA, takiego jak chromosom komórki bakteryjnej (innej niż komórka S. avermitilis) albo DNA wektora takiego jak plazmid lub fag, albo zintegrowana do chromosomu S. avermitilis w miejscu innym niż to w natywnym allelu aveC.

W dalszej kolejności niniejszy wynalazek dostarcza zrekombinowanego wektora zawierającego cząsteczkę polinukleotydu będącą przedmiotem niniejszego wynalazku. Taki zrekombinowany wektor może być użyty do skierowania, będącej przedmiotem niniejszego wynalazku, jakiejkolwiek polinukleotydowej cząsteczki zawierającej zmutowaną sekwencję nukleotydów, do miejsca allelu aveC w chromosomie S. avermitilis albo do wstawienia, albo do zastąpienia aveC ORF lub jej części np.: przez homologiczną rekombinację. Jednak zgodnie z niniejszym wynalazkiem, dostarczana tutaj cząsteczka polinukleotydu będąca przedmiotem niniejszego wynalazku, zawierająca zmutowaną sekwencję nukleotydów, może także modulować biosyntezę awermektyny, kiedy została wstawiona do chromosomu S. avermitilis w miejscu innym niż allel aveC albo, kiedy jest utrzymywana w episomie w komórkach S. avermitilis. Tak więc niniejszy wynalazek dostarcza wektorów zawierających będącą przedmiotem wynalazku cząsteczkę polinukleotydu, zawierającą zmutowaną sekwencję nukleotydów, które to wektory mogą być użyte do wstawienia cząsteczki polinukleotydu w miejscu chromosomu S. avermitilis innym niż gen aveC lub być zachowane w episomie.

W tej nieograniczającej postaci realizacji, wektor jest wektorem zastąpienia genu, który może być użyty do wstawienia zmutowanego allelu aveC lub jego zdegenerowanej odmiany zgodnie z niniejszym wynalazkiem do komórek szczepu S. avermitilis wytwarzając poprzez to nowe szczepy S. avermitilis, których komórki mogą produkować awermektyny w zredukowanym stosunku klasy 2:1 w porównaniu do komórek tego samego szczepu, w których w zamian zachodzi ekspresja tylko allelu typu dzikiego. Takie wektory zastąpienia genów mogą być konstruowane przy zastosowaniu zmutownych cząsteczek polinukleotydu obecnych w wektorach ekspresyjnych dostarczanych tutaj, takich jak te wektory ekspresyjne przedstawione przykładowo w Sekcji 8, poniżej.

W dalszej kolejności niniejszy wynalazek dostarcza wektorów, które mogą być używane do wstawiania zmutowanego allelu aveC lub jego zdegenerowanej odmiany do komórek szczepu S. avermitilis w celu wytworzenia nowych szczepów komórek, które produkują zmienione ilości awermektyn w porównaniu do komórek tego samego szczepu, w których w zamian zachodzi tylko ekspresja allelu typu dzikiego. W preferowanym ujęciu niniejszego wynalazku, ilość awermektyn produkowana przez komórki jest zwiększana. Jednak w konkretnej, nieograniczającej postaci realizacji, taki wektor zawiera silny promotor, taki jak znany w tej dziedzinie np.: silny konstytutywny promotor ermE z Saccharopolyspora erythraea, który jest usytuowany w górę od i w operacyjnym połączeniu z aveC ORF. Takie wektory mogą być konstruowane przy użyciu zmutowanego allelu aveC plazmidu pSE189 według metod opisanych w Patencie U.S. Nr 6 248 579.

Niniejszy wynalazek dostarcza wektorów zastąpienia genów, które są przydatne do inaktywacji genu aveC w szczepie S. avermitilis typu dzikiego. W tej nieograniczającej postaci realizacji, takie wektory zastąpienia genów mogą być konstruowane przy użyciu zmutowanej cząsteczki polinukleotydu obecnej w plazmidzie pSE180 (ATCC 209605), który jest przykładowo przedstawiony w Sekcji 8.1 poniżej (FIGURA 3). W dalszej kolejności niniejszy wynalazek dostarcza wektorów zastąpienia genów, które zawierają cząsteczkę polinukleotydu zawierającą lub składającą się z sekwencji nukleotydów, które naturalnie flankują gen aveC w chromosomie S. avermitilis in situ włączając np.: taką flankującą sekwencję nukleotydów jak pokazana na FIGURZE 1 (SEQ ID NO:1), które to wektory mogą być użyte do usunięcia aveC ORF S. avermitilis.

W dalszej kolejności niniejszy wynalazek dostarcza komórkę gospodarza zawierającą cząsteczkę polinukleotydu lub zrekombinowany wektor, będące przedmiotem niniejszego wynalazku. Komórka gospodarza może być jakąś prokariotyczną lub eukariotyczną komórką nadającą się do użycia jako komórka gospodarza dla cząsteczki polinukleotydu lub zrekombinowanego wektora. W korzystnej postaci realizacji wynalazku, komórka gospodarza jest komórką bakterii, W bardziej korzystnej postaci realizacji wynalazku komórka gospodarza jest komórką Streptomyces. W bardziej korzystnej postaci realizacji wynalazku komórka gospodarza jest komórką Streptomyces avermitilis.

W dalszej kolejności niniejszy wynalazek dostarcza sposób otrzymywania nowych szczepów

Streptomyces avermitilis, obejmujący(i) tworzenie mutacji allelu aveC w komórce szczepu S. avermitilis, która to mutacja powoduje kombinację podstawień aminokwasów w produkcie genu AveC, lub (ii) wprowadzenie do komórki szczepu S. avermitilis zmutowanego allelu aveC lub jego zdegenerowaPL 211 693 B1 nej odmiany kodującej produkt genu AveC zawierający kombinację podstawień aminokwasów, gdzie kombinacja podstawień aminokwasów jest wybierana z wymienionych powyżej (a) do (be).

W dalszej kolejności niniejszy wynalazek dostarcza sposób otrzymywania nowego szczepu S. avermitilis, obejmujący (i) tworzenie mutacji allelu aveC w komórce szczepu S. avermitilis, która to mutacja powoduje kombinację podstawień aminokwasów w produkcie genu AveC, lub (ii) wprowadzenie do komórki szczepu S. avermitilis zmutowanego allelu aveC lub jego zdegenerowanej odmiany kodującej produkt genu AveC zawierający kombinację podstawień aminokwasów, gdzie komórki zawierające zmutowany allel aveC lub jego zdegenerowaną odmianę są zdolne do produkcji awermektyn cyklohexylo B2:cyklohexyl B1 w stosunku 0.35:1 lub mniej. W tej nieograniczającej postaci realizacji zmutowany allel aveC lub jego zdegenerowaną odmiana, koduje produkt genu AveC zawierający kombinację podstawień aminokwasów wybranych z wymienionej powyżej grupy (a) do (be).

W preferowanym ujęciu wynalazku stosunek awermektyn cykloheksylo B2:cykloheksylo B1 wynosi około 0,30:1 lub mniej. W tej nieograniczającej postaci realizacji, zmutowany allel aveC lub jego zdegenerowaną odmiana koduje produkt genu AveC zawierający kombinację podstawień aminokwasów wybranych z wymienionej powyżej grupy (f) do (be).

W bardziej korzystnej postaci realizacji wynalazku stosunek awermektyn cykloheksylo B2:cykloheksyl B1 jest 0,25:1 lub mniej. W tym nieograniczającym ujęciu, zmutowany allel aveC lub jego zdegenerowaną odmiana koduje produkt genu AveC zawierający kombinację podstawień aminokwasów wybranych z wymienionej powyżej grupy (w) do (be).

W bardziej korzystnej postaci realizacji wynalazku stosunek awermektyn cykloheksylo B2:cykloheksyl B1 jest 0,25:1 lub mniej. W tym nieograniczającym ujęciu, zmutowany allel aveC lub jego zdegenerowaną odmiana koduje produkt genu AveC zawierający kombinację podstawień aminokwasów wybranych z wymienionej powyżej grupy (ao) do (be).

W dalszej kolejności niniejszy wynalazek dostarcza sposób otrzymywania nowego szczepu Streptomyces avermitilis, obejmujący (i) tworzenie mutacji allelu aveC w komórce szczepu S. avermitilis, która to mutacja powoduje kombinację podstawień aminokwasów w produkcie genu AveC, lub (ii) wprowadzenie do komórki szczepu S. avermitilis zmutowanego allelu aveC lub jego zdegenerowanej odmiany kodującej produkt genu AveC zawierający kombinację podstawień aminokwasów gdzie kombinacja podstawień aminokwasów jest wybierana z grupy składającej się z (bf) i (bg). W korzystnej postaci realizacji wynalazku, komórki S. avermitilis zawierające taki zmutowany allel aveC lub jego zdegenerowaną odmianę, są zdolne do produkcji awermektyn cykloheksylo B2:cykloheksylo B1 w stosunku 0,40:1 lub mniejszym.

Przez takie tworzenie mutacji allelu aveC lub przez wprowadzenie zmutowanego allelu aveC lub jego zdegenerowanej odmiany, według powyżej wymienionych etapów, otrzymywany jest nowy szczep S. avermitilis.

W dalszej kolejności niniejszy wynalazek dostarcza komórki gatunku Streptomyces, która zawiera zmutowany allel aveC lub jego zdegenerowaną odmianę kodującą produkt genu AveC zawierający kombinację podstawień aminokwasów wybranych z wymienionych powyżej (a) do (be). W korzystnej postaci realizacji wynalazku, gatunkiem Streptomyces jest S. avermitilis.

W dalszej kolejnoś ci niniejszy wynalazek dostarcza komórki S. avermitilis zdolnej do produkowania awermektyn cykloheksylo B2:cykloheksylo B1 w stosunku 0,35:1 lub mniejszym. W tym nieograniczającym ujęciu, komórka zawiera zmutowany allel aveC lub jego zdegenerowaną odmianę kodującą produkt genu AveC zawierający kombinację podstawień aminokwasów wybranych z grupy składającej się z (a) do (be) wymienionych powyżej.

W korzystnej postaci realizacji wynalazku, stosunek awermektyn cykloheksylo B2: cykloheksylo B1 wynosi około 0,30:1 lub mniej. W tej nieograniczającej postaci realizacji, komórka zawiera zmutowany allel aveC lub jego zdegenerowaną odmianę kodującą produkt genu AveC zawierający kombinację podstawień aminokwasów wybranych z grupy składającej się z (f) do (be) umieszczonych na liście powyżej.

W bardziej korzystnej postaci realizacji wynalazku, stosunek awermektyn cykloheksylo B2:cykloheksylo B1 wynosi około 0,25:1 lub mniej, W tej nieograniczającej postaci realizacji, komórka zawiera zmutowany allel aveC lub jego zdegenerowaną odmianę kodującą produkt genu AveC zawierający kombinację podstawień aminokwasów wybranych z grupy składającej się z (w) do (be) umieszczonych na liście powyżej.

W bardziej obejmujący, stosunek awermektyn cykloheksylo B2:cykloheksylo B1 wynosi około 0,20:1 lub mniej. W tej nieograniczającej postaci realizacji, komórka zawiera zmutowany allel aveC lub

PL 211 693 B1 jego zdegenerowaną odmianę kodującą produkt genu AveC zawierający kombinację podstawień aminokwasów wybranych z grupy składającej się z (ao) do (be) umieszczonych na liście powyżej.

W dalszej kolejności niniejszy wynalazek dostarcza gatunku Streptomyces zawierającego zmutowany allel aveC lub jego zdegenerowaną odmianę, kodującą produkt genu AveC, zawierający kombinację podstawień aminokwasów wybraną z grupy składającej się z (bf) i (bg) umieszczonych na liście powyżej. W korzystnej postaci realizacji wynalazku, gatunkiem Streptomyces jest S. avermitilis. W bardziej korzystnej postaci realizacji wynalazku, komórką jest komórka S. avermitilis zdolna do produkowania awermektyn cykloheksylo B2:cykloheksylo B1 w stosunku około 0,40:1 lub mniej.

Mimo, że którakolwiek z wymienionych mutacji może występować w komórkach niniejszego wynalazku na poza chromosomalnych elementach, takich jak plazmid, wskazane jest, żeby takie mutacje występowały w sekwencji kodującej aveC zintegrowanej z chromosomem S. avermitilis i wskazane, chociaż niekoniecznie, żeby występowały w miejscu natywnego allelu aveC.

Takie nowe szczepy komórek są użyteczne w produkcji na dużą skalę komercyjnie pożądanych awermektyn takich jak doramektyna.

W dalszej kolejności niniejszy wynalazek dostarcza sposobu produkcji awermektyn, zawierającego hodowanie komórek S. avermitilis będących przedmiotem niniejszego wynalazku w pożywce hodowlanej w warunkach, które pozwalają na lub indukują produkcję awermektyn i odzyskiwanie tych awermektyn z hodowli. W korzystnej postaci realizacji wynalazku, komórki używane w procesie produkcji produkują awermektyny cykloheksylo B2:cykloheksylo B1 w stosunku 0,35:1 lub mniejszym, korzystniej w stosunku 0,30:1 lub mniejszym, korzystniej w stosunku 0,25:1 lub mniejszym i korzystniej w stosunku 0,20:1 lub mniejszym.

W korzystnej postaci realizacji wynalazku, komórki produkujące awermektyny cykloheksylo B2:cykloheksylo B1 w stosunku 0,35:1 lub mniejszym zawierają zmutowany allel aveC lub jego zdegenerowaną odmianę kodującą produkt genu AveC zawierający kombinację podstawień aminokwasów wybraną z grupy składającej się z (a) do (be) umieszczonych na liście powyżej.

W dalszej kolejności w korzystnej postaci realizacji wynalazku, komórki produkujące awermektyny cykloheksylo B2:cykloheksylo B1 w stosunku około 0,30:1 lub mniejszym zawierają zmutowany allel aveC lub jego zdegenerowaną odmianę kodującą produkt genu AveC zawierający kombinację podstawień aminokwasów wybranych z grupy składającej się z (f) do (be) umieszczonych na liście powyżej.

W dalszej kolejności w korzystnej postaci realizacji wynalazku, komórki produkujące awermektyny cykloheksylo B2:cykloheksylo B1 w stosunku około 0,25:1 lub mniejszym zawierają zmutowany allel aveC lub jego zdegenerowaną odmianę kodującą produkt genu AveC zawierający kombinację podstawień aminokwasów wybranych z grupy składającej się z (w) do (be) umieszczonych na liście powyżej.

W dalszej kolejności w korzystnej postaci realizacji wynalazku, komórki produkujące awermektyny cykloheksylo B2:cykloheksylo B1 w stosunku około 0,20:1 lub mniejszym zawierają zmutowany allel aveC lub jego zdegenerowaną odmianę kodującą produkt genu AveC zawierający kombinację podstawień aminokwasów wybranych z grupy składającej się z (ao) do (be) umieszczonych na liście powyżej.

W innej postaci realizacji wynalazku, komórki produkujące awermektyny cykloheksylo B2:cykloheksylo B1 w stosunku około 0,40:1 lub mniejszym zawierają zmutowany allel aveC lub jego zdegenerowaną odmianę kodującą produkt genu AveC zawierający kombinację podstawień aminokwasów wybranych z grupy składającej się z (bf) i (bg) umieszczonych na liście powyżej.

Sposób będący przedmiotem wynalazku powoduje wzrost wydajności w produkcji komercyjnie wartościowych awermektyn takich jak doramektyna.

Niniejszy wynalazek dostarcza kompozycję awermektyn cykloheksylo B2:cykloheksylo B1 produkowanych przez komórki Streptomyces avermitilis, zawierającą awermektyny cykloheksylo B2:cykloheksylo B1 w pożywce, w której hodowano komórki, gdzie stosunek awermektyn cykloheksylo B2:cykloheksylo B1 obecnych w pożywce wynosi 0,35:1 lub mniej, korzystniej około 0,30:1 lub mniej, korzystniej około 0,25:1 lub mniej, korzystnie około 0,20:1 lub mniej. W konkretnej postaci realizacji wynalazku, kompozycja awermektyn cykloheksylo B2:cykloheksylo B1 jest produkowana przez komórki szczepu S. avermitilis, w których zachodzi ekspresja zmutowanego allelu aveC lub jego zdegenerowanej odmiany, która koduje produkt genu, co powoduje redukcję stosunku awermektyn cykloheksylo B2:cykloheksylo B1 produkowanych przez te komórki w porównaniu do komórek tego samego

PL 211 693 B1 szczepu S. avermitilis, w których nie zachodzi ekspresja zmutowanego allelu aveC, ale zamiast tego tylko ekspresja allelu typu dzikiego.

W korzystnej postaci realizacji wynalazku, gdzie jest kompozycja awermektyn cykloheksylo B2:cykloheksylo B1 w stosunku 0,35:1 lub mniej, kompozycja jest wytwarzana przez komórki zawierające zmutowany allel aveC lub jego zdegenerowaną odmianę kodującą produkt genu AveC zawierający kombinację podstawień aminokwasów wybranych z grupy składającej się z (a) do (be) umieszczonych na liście powyżej.

W dalszej kolejności korzystnej postaci realizacji wynalazku, w której kompozycją są awermektyny cykloheksylo B2:cykloheksylo B1 w stosunku 0,30:1 lub mniejszym, kompozycja jest wytwarzana przez komórki zawierające zmutowany allel aveC lub jego zdegenerowaną odmianę kodującą produkt genu AveC zawierający kombinację podstawień aminokwasów wybranych z grupy składającej się z (f) do (be) umieszczonych na liście powyżej.

W dalszej kolejności w korzystnej postaci realizacji wynalazku, w której kompozycją są awermektyny cykloheksylo B2:cykloheksylo B1 w stosunku 0,25:1 lub mniejszym, kompozycja jest produkowana przez komórki zawierające zmutowany allel aveC lub jego zdegenerowaną odmianę kodującą produkt genu AveC zawierający kombinację podstawień aminokwasów wybranych z grupy składającej się z (w) do (be) umieszczonych na liście powyżej.

W dalszej kolejnoś ci w preferowanym uję ciu wynalazku, gdzie jest kompozycja awermektyn cykloheksylo B2:cykloheksylo B1 w stosunku 0,20:1 lub mniej, kompozycja jest produkowana przez komórki zawierające zmutowany allel aveC lub jego zdegenerowaną odmianę kodującą produkt genu AveC zawierający kombinację podstawień aminokwasów wybranych z grupy składającej się z (ao) do (be) umieszczonych na liście powyżej.

W dalszej kolejnoś ci niniejszy wynalazek dostarcza kompozycję awermektyn cykloheksylo B2:cykloheksylo B1, produkowaną przez komórki Streptomyces avermitilis, zawierającą awermektyny cykloheksylo B2:cykloheksylo B1 obecne w pożywce, w której hodowano komórki, gdzie stosunek awermektyn cykloheksylo B2:cykloheksylo B1 obecnych w pożywce hodowlanej wynosi 0,40:1, lub mniej i który jest wytwarzany przez komórki zawierające zmutowany allel aveC lub jego zdegenerowaną odmianę kodującą produkt genu AveC zawierający kombinację podstawień aminokwasów wybranych z grupy składającej się z (bf) i (bg) umieszczonych na liście powyżej.

Chociaż jest korzystne, by kompozycja nowych awermektyn była obecna w pożywce, w której hodowano komórki, np.: w częściowo lub całkowicie wyczerpanym płynie hodowli fermentacyjnej, alternatywnie kompozycja awermektyn może być częściowo lub istotnie oczyszczona z płynu hodowlanego, przy zastosowaniu znanych biochemicznych technik oczyszczania takich jak strącanie siarczanem amonu, dializy, frakcjonowania według wielkości, chromatografii jonowymiennej, HPLC itd.

W dodatku do otrzymywania nowych szczepów S. avermitilis zawierają cych komórki zdolne do produkowania zredukowanego stosunku cykloheksylo B2:cykloheksylo B1 jak to opisano powyżej, niniejszy wynalazek rozpatruje, że dodatkowe mutacje mogą być włączone do komórek S. avermitilis w celu dalszej poprawy charakterystyki produkcji awermektyn. W tej nieograniczającej postaci realizacji, komórki będące przedmiotem niniejszego wynalazku mogą dalej zawierać modyfikacje, które zwiększają poziom produkcji awermektyn. W pewnej postaci realizacji wynalazku, takie komórki mogą być otrzymane przez (i) tworzenie mutacji allelu aveC w komórce S. avermitilis lub (ii) wprowadzenie zmutowanego allelu aveC lub jego zdegenerowanej odmiany do komórek S. avermitilis, gdzie ekspresja zmutowanego allelu powoduje wzrost ilości awermektyn produkowanych przez komórki szczepu S. avermitilis, w których zachodzi ekspresja zmutowanego allelu aveC, w porównaniu do komórek tego samego szczepu, gdzie zamiast tego zachodzi tylko ekspresja pojedynczego allelu aveC typu dzikiego i selekcjonowanie transformowanych komórek, które produkują awermektyny w zwiększonej ilości w porównaniu do ilości awermektyn produkowanych przez komórki, w których zamiast tego zachodzi tylko ekspresja allelu typu dzikiego. Na przykład, allel aveC może być zmodyfikowany tak, że zawiera silny promotor, taki jak silny konstytutywny promotor ermE z Saccharopolyspora erythraea, wstawiony powyżej od i w operacyjnym połączeniu z aveC ORF. W innej postaci realizacji, jedna lub więcej mutacji mogą być wprowadzone do genów aveR1 i/lub aveR2 S. avermitilis, zwiększając przez to poziom produkcji awermektyny, jak to opisano w Patencie U.S. Nr 6 197 591 Stultzman-Engwall i wsp., wydano 6 marzec 2001.

5.4. Zastosowania awermektyn

Awermektyny są bardzo aktywnymi przeciwpasożytniczymi środkami, szczególnie użytecznymi jako leki przeciw robakom, przeciw pasożytom zewnętrznym, jako środki owadobójcze i roztoczobój24

PL 211 693 B1 cze. Związki awermektynowe, produkowane według sposobów według niniejszego wynalazku są użyteczne w którymkolwiek z wymienionych przypadków. Na przykład, jak jest znane w tej dziedzinie, związki awermektynowe produkowane według niniejszego wynalazku, są użyteczne w leczeniu różnych chorób albo stanów u ludzi, szczególnie jeżeli te choroby lub stany są spowodowane przez infekcje pasożytów. Patrz np.: Ikeda i Omura, 1997, Chem. Rev. 97(7):2591-2609. Bardziej szczegółowo, związki awermektynowe produkowane według niniejszego wynalazku są efektywne w leczeniu różnych chorób lub stanów powodowanych przez pasożyty wewnętrzne, takie jak pasożytnicze nicienie, które mogą zakażać ludzi, zwierzęta gospodarskie, świnie, owce, drób, konie i bydło.

Dokładniej, związki awermektynowe produkowane według niniejszego wynalazku są skuteczne przeciw nicieniom, które zakażają ludzi, jak również przeciw tym, które zakażają różne gatunki zwierząt. Do takich nicieni zalicza się pasożyty żołądkowe jelitowe takie jak Ancylostoma, Necator, Ascaris, Strongyloides, Trichinella, Capillaria, Trichuris, Enterobiusr Dirofilaria i pasożyty, które znajdowano we krwi i innych tkankach lub organach, takie jak robaki nitkowcowe i Strongyloides i Trichinella znajdowane w ekstraktach jelitowych.

Związki awermektynowe produkowane według niniejszego wynalazku są także użyteczne w leczeniu zakażeń pasożytami zewnę trznymi włączając w to np.: zakażanie przez stawonogi pasożytami ssaków i ptaków powodowane przez kleszcze, roztocza, wszy, pchły, muchy mięsne, gryzące owady lub migrujące larwy muchówek, które mogą atakować między innymi bydło i konie.

Związki awermektynowe produkowane według niniejszego wynalazku, są także użyteczne między innymi jako środki owadobójcze przeciw domowym szkodnikom latającym, takim jak karaluchy, mole ubraniowe, chrząszcze dywanowe jak również przeciw szkodnikom magazynowanego zboża i roślin uprawnych do których to szkodników zaliczamy między innymi roztocza należące do pajęczaków, mszyce, gąsienice i prostoskrzydłe takie jak szarańcza.

Związkami awermektynowymi, produkowanymi według niniejszego wynalazku, mogą być leczone zwierzęta, włączając w to: owce, bydło, konie, zwierzynę płową, kozy, świnie, ptaki, włączając w to drób, oraz psy i koty.

Związek awermektynowy produkowany według niniejszego wynalazku jest podawany w postaci odpowiedniej do specyficznych zastosowań. Poszczególne gatunki zwierząt domowych poddawane są leczeniu obejmującemu pasożyty lub insekty. Do zastosowania jako lek przeciwpasożytniczy, związek awermektynowy produkowany według niniejszego wynalazku, może być podawany doustnie w formie kapsuł, jako jedna duża dawka, tabletka lub w formie płynnej, albo moż e być podawany jako wlewka albo przez iniekcję albo jako implant. Takie postacie są sporządzane konwencjonalnymi metodami zgodnie ze standardową weterynaryjną praktyką. Tak więc kapsuły, pojedyncze duże dawki lub tabletki mogą być sporządzane przez mieszanie aktywnych składników z precyzyjnie dzielonym rozcieńczalnikiem lub nośnikiem dodatkowo zawierającym czynnik dezintegrujący i/lub czynnik wiążący taki jak skrobia, laktoza, talk, stearynian magnezu itd. Postać płynna może być przygotowana przez rozproszenie czynnych składników w wodnym roztworze razem z czynnikiem rozpraszającym lub zwilżającym itd. Postać nadająca się do iniekcji może być sporządzona w formie sterylnego roztworu, który może zawierać inne substancje takie jak sól lub glukoza w ilościach dostatecznych aby roztwór był izotoniczny w stosunku do krwi.

Takie postacie leku mogą się różnić pod względem wagi aktywnego związku zależnie od pacjenta lub gatunku zwierząt domowych, które mają być leczone, surowości przebiegu i typu infekcji oraz masy ciała. Zwykle do podania doustnego dawka aktywnego związku wynosi około 0,001 do 10 mg/kg masy ciała pacjenta lub zwierzęcia. Podawana jako pojedyncza dawka lub dawki podzielone, przez okres od 1 do 5 dni powinna być satysfakcjonująca. Niemniej jednak mogą zdarzać się przypadki, kiedy wskazane jest stosowanie mniejszych lub większych dawek np.: wyznaczonych przez lekarza lub weterynarza na podstawie objawów klinicznych.

Jako alternatywa, awermektynowy związek produkowany zgodnie z niniejszym wynalazkiem, może być podawany w połączeniu z karmą i w tym celu mogą być sporządzane skoncentrowane dodatki żywnościowe lub przedmieszki w celu mieszania z normalną zwierzęcą karmą.

Do zastosowania jako środek owadobójczy i do zwalczania szkodników upraw rolnych, awermektynowy związek produkowany według niniejszego wynalazku, może być zastosowany jako spray, proszek, emulsja i podobne zgodnie ze standardami stosownymi w uprawach rolnych.

6. Przykład: Fermentacja Streptomyces Avermitilis i analiza awermektyn B2:B1

Szczepy, w których brakuje zarówno aktywności dehydrogenazy rozgałęzionych 2-okso kwasów jak i aktywności 5-O-metylotransferazy nie produkują awermektyn, jeżeli środowisko fermentacyjPL 211 693 B1 ne nie jest uzupełniane kwasami tłuszczowymi. Ten przykład ilustruje, że w takich mutantach szeroki zakres stosunków awermektyn B2:B1 może być otrzymany jeżeli biosynteza jest inicjowana w obecnoś ci róż nych kwasów tł uszczowych.

6.1. Materiały i metody

Streptomyces avermitilis ATCC 53692 przechowywano jako całkowity bulion przygotowany w poż ywce do posiewu składają cej się z: Skrobia (Nadex, Laing National) - 20 g; Pharmamedia (Trader's Protein, Memphis, TN) - 15 g; Ardamine pH (Yeats Products Inc.) - 5 g; węglan wapnia - 1 g. Całkowitą objętość doprowadzano do 1 litra wodą kranową, pH doprowadzano do 7,2 i pożywkę autoklawowano w 121°C przez 25 min.

ml rozpuszczonej zawiesiny powyższego preparatu używano do zaszczepienia butelki zawierającej 50 ml tej samej pożywki. Po 48 godzinach inkubacji w 28°C na obrotowej wytrząsarce, przy 180 rpm, 2 ml bulionu używano do zaszczepienia butelki zawierającej 50 ml pożywki produkcyjnej składającej się z: skrobi - 80 g; węglanu wapnia - 7 g; Pharmamedia - 5 g; dwupotasowego wodorofosforanu - 1 g; siarczanu magnezu - 1 g; kwasu glutaminowego - 0,6 g; siedmiowodnego siarczanu żelaza- 0,01 g; siarczanu cynku 0,001 g; siarczanu manganu - 0,001 g. Całkowitą objętość doprowadzano do 1 litra wodą kranową, pH doprowadzano do 7,2 i pożywkę autoklawowano w 121°C przez 25 min.

Różne kwasy karboksylowe będące substratami (patrz TABELA 1) rozpuszczano w metanolu i dodawano do bulionu fermentacyjnego 24 godziny po zaszczepieniu, do otrzymania koń cowego stężenia wynoszącego 0,2 g/litr. Bulion fermentacyjny inkubowano 14 dni w temperaturze 28°C, następnie wirowano (2 500 rpm przez 2 min.) i supernantant odrzucano. Osad grzybni ekstrahowano acetonem (15 ml), następnie dwuchlorometanem (30 ml) i fazę organiczną oddzielano, sączono i odparowywano do sucha. Suchą pozostałość rozpuszczano w metanolu i wykonywano analizę HPLC przy zastosowaniu chromatografu cieczowego Hewlett-Packard 109A wyposażonego w zespół detektora skanującego z matrycą diodową dla długości fali 240 nm. Używano kolumny Beckman Ultrasphere

C-18, 5 μm, 4,6 mm x 25 cm, temperatura pracy kolumny wynosiła 40°C. Dwadzieścia pięć μΐ opisanego powyżej metanolowego roztworu wstrzykiwano na kolumnę. Eluowano stosując liniowy gradient metanol-woda od 80:20 do 95:5 w ciągu 40 min. przy przepływie 0.85 ml/min. Używano dwóch standardowych stężeń cykloheksylo B1 do kalibracji odpowiedzi detektora i mierzono powierzchnię pod krzywymi dla awermektyn B2 i B1.

6.2. Wyniki

Czasy retencji i stosunki 2:1 dla awermektyn B2 i B1 i obserwowane w analizie HPLC przedstawiono w TABELI 1.

T A B E L A 1

Substrat	Czasy retencji HPLC (min.)	Stosunek B2:B1
B2	B1
Kwas 4-tetrahydropyranokarboksylowy	8,1	14,5	0,25
Kwas izomasłowy	10,8	18,9	0,5
Kwas furano-3-karboksylowy	7,6	14,6	0,62
Kwas S-(+)-2-metylomasłowy	12,8	21,6	1,0
Kwas cykloheksanokarboksylowy	16,9	26,0	1,6
Kwas tiofenokarboksylowy	8,8	16,0	1,8
Kwas cyklopentanokarboksyIowy	14,2	23,0	2,0
Kwas 3-trifluorometylomasłowy	10,9	18,8	3,9
Kwas 2-metylopentanowy	14,5	24,9	4,2
Kwas cykloheptanokarboksyIowy	18,6	29,0	15,0

Dane zamieszczone w TABELI 1 przedstawiają ekstremalnie szeroki zakres stosunków awermektyn B2:B1, wskazując znaczne różnice w konwersji dehydratacyjnej związków klasy 2 do związków klasy 1, co zależy od rodzaju dostarczonej jednostki początkowej łańcucha bocznego kwasów

PL 211 693 B1 tłuszczowych. To wskazuje, że zmiany stosunku B2:B1 powodowane zmianami białka AveC mogą być specyficzne dla konkretnych substratów. Zgodnie z tym, badanie na obecność mutantów wykazujących zmiany w stosunku B2:B1 otrzymywane dla konkretnego substratu powinno być wykonane w obecności tego substratu. W następnych przykładach podanych poniżej, do skriningu jako substratu używano kwasu cykloheksanokarboksylowego. Nie mniej jednak, ten substrat jest użyty jedynie do przykładowego przedstawienia możliwości i nie ma na celu ograniczania stosowalności niniejszego wynalazku.

7. Przykład: Izolowanie genu aveC

Ten przykład opisuje i charakteryzuje region chromosomu Streptomyces avermitilis, który koduje produkt genu AveC. Jak wykazano poniżej, gen aveC zidentyfikowano jako zdolny do modyfikowania stosunku produkowanych awermektyn cykloheksylo-B2:cykloheksylo-B1 (B2:B1).

7.1. Materiały i metody

7.1.1. Hodowanie Streptomyces w celu izolowania DNA

Stosowano następujące metody hodowli Streptomyces.

Pojedyncze kolonie S. avermitilis ATCC 31272 (izolowana pojedyncza kolonia #2) izolowano na 1/2 długości YPD-6 zawierającym: Difco Yeast Extract - 5 g; difco Bacto-peptone - 5 g; dekstrozę - 2,5 g; MOPS - 5 g; Difco Bacto agar - 15 g. Końcową objętość doprowadzano do 1 litra dH2O, pH doprowadzano do 7,0 i pożywkę autoklawowano w 121°C przez 25 min.

Grzybnię, którą wyhodowano w powyżej opisanej pożywce stosowano do zaszczepiania 10 ml pożywki TBS (Difco Trypic Soy Broth - 30 g; w 1 litrze dH2O, autoklawowano w 121°C przez 25 min) w probówce 25 mm x 150 mm, którą wytrząsano (300 rpm) w 28°C przez 48 - 72 godzin.

7.1.2. Izolacja chromosomalnego DNA ze Streptomyces

Podwielokrotne części (0,25 ml lub 0,5 ml) grzybni, wyhodowanej tak jak opisano powyżej umieszczano w probówce wirówkowej na 1,5 ml i komórki zatężano przez wirowanie 12 000 x g przez 60 sek. Supernatant odrzucano i komórki ponownie zawieszano w 0,25 ml buforu TSE (20 ml 1,5 M sacharozy, 2,5 ml 1 M Tris-HCl, pH 8,0, 2,5 ml 1M EDTA, pH 8,0 i 75 ml dH2O) zawierającego 2 mg/ml lizozymu. Próbki inkubowano wytrzą sają c przez 20 min. w 37°C, ł adowano do AutoGen 540™, aparatu do automatycznej izolacji kwasów nukleinowych (Integrated Separation Systems, Natick, MA) i izolowano genomowy DNA używając Cycle 159 (oprogramowanie) zgodnie z instrukcją producenta.

Alternatywnie, 5 ml grzybni umieszczano w probówce 17 mm x 100 mm, komórki zatężano przez wirowanie przy 3 000 rpm przez 5 min. i supernatant usuwano. Komórki ponownie zawieszano w 1 ml buforu TSE zatężano przez wirowanie przy 3 000 rpm przez 5 min. i supernatant usuwano. Komórki ponownie zawieszano w 1 ml buforu TSE zawierającym 2 mg/ml lizozymu i inkubowano wytrząsając przez 30 - 60 min. w temperaturze 37°C. Po inkubacji dodawano 0,5 ml 10% soli sodowej siarczanu laurylu (SDS) i komórki inkubowano w 37°C do czasu zakończenia lizy. Lizat inkubowano w 65°C przez 10 min., ozię biano do temperatury pokojowej, rozdzielano do dwóch probówek Eppendorfa na 1,5 ml i ekstrahowano 1x 0,5 ml mieszaniny fenol/chloroform (50% fenolu uprzednio zrównoważonego 0,5 M Trisem, pH 8,0; 50% chloroformu). Wodną fazę przenoszono i ekstrahowano 2 do 5x mieszaniną chloroform:alkohol izoamylowy (24:1). DNA strącano przez dodanie 1/10 objętości 3M octanu sodu, pH 4,8, inkubując mieszaninę w lodzie przez 10 min, następnie mieszaninę wirowano przy 15 000 rpm w 5°C przez 10 min. i supernatant przenoszono do czystej probówki, do której dodano 1 objętość izopropanolu. Mieszaninę supernatantu z izopropanolem inkubowano w lodzie przez 20 min., wirowano przy 15 000 rpm w 5°C przez 20 min., supernatant odrzucano, osad DNA przemywano 1 raz 70% etanolem. Kiedy osad był suchy DNA ponownie zawieszano w buforze TE (10 mM Tris, 1mM EDTA, pH 8,0).

7.1.3. Izolacja plazmidowego DNA ze Streptomyces

Podwielokrotne części (1 ml) grzybni umieszczano w probówkach wirówkowych na 1,5 ml i komórki zatężano przez wirowanie przy 12 000 x g przez 60 sek. Supernatant odrzucano, komórki ponownie zawieszano w 1 ml 10,3% sacharozy i zatężano przez wirowanie przy 12 000 x g przez 60 sek. Odrzucano supernatant. Komórki ponownie zawieszano w 0,25 ml buforu TSE zawierającego 2 mg/ml lizozymu i inkubowano wytrzą sają c w 37°C przez 20 min. i ł adowano do AutoGen 540™, aparatu do automatycznej izolacji kwasów nukleinowych i izolowano DNA plazmidu używając Cycle 106 (oprogramowanie aparatu) zgodnie z instrukcją producenta.

Alternatywnie, 1,5 ml grzybni umieszczano w probówkach wirówkowych na 1,5 ml i komórki zatężano przez wirowanie przy 12 000 x g przez 60 sek. Supernatant odrzucano, komórki ponownie

PL 211 693 B1 zawieszano w 1 ml 10,3% sacharozy i zatężano przez wirowanie przy 12 000 x g przez 60 sek. Supernatant odrzucano, komórki ponownie zawieszano w 0,5 ml buforu TSE zawierającego 2 mg/ml lizozymu i inkubowano w 37°C przez 15 - 30 min. Po inkubacji, dodawano 0,25 ml zasadowego SDS (0,3 N NaOH, 2% SDS) i komórki inkubowano w 55°C przez 15 - 30 min. aż roztwór stawał się klarowny. Do roztworu DNA dodawano octanu sodu (0,1 ml, 3M, pH 4,8) i następnie inkubowano w lodzie przez 10 min. Próbki DNA wirowano przy 14 000 rpm przez 10 min. w temperaturze 5°C, Supernatant przenoszono do czystej probówki, dodawano 0,2 ml mieszaniny fenol:chloroform (50% fenol:50% chloroform) i łagodnie mieszano. Roztwór DNA wirowano przy 14 000 rpm przez 10 min. w temperaturze 5°C i górną warstwę przenoszono do czystych probówek Eppendorfa. Dodawano (0,75 ml) izopropanolu i roztwór łagodnie mieszano, następnie inkubowano w temperaturze pokojowej przez 20 min. Roztwór DNA wirowano przy 14 000 rpm przez 15 min. w temperaturze 5°C, supernatant usuwano, osad DNA przemywano 70% etanolem, suszono i ponownie zawieszano w buforze TE.

7.1.4. Izolacja plazmidowego DNA z E. Coli

Pojedynczą transformowaną kolonię E. coli zaszczepiano do 5 ml pożywki Luria-Bertani (LB) (Bacto-Tryptone - 10 g, Bact-yeast extract - 5 g i NaCl 10 g w 1 litrze dH2O, pH 7,0, autoklawowano w 121°C przez 25 min. i uzupeł niano ampicyliną 100 μ g/ml). Hodowlę inkubowano przez noc i podwielokrotność 1 ml umieszczano w probówce wirówkowej. Próbki hodowli ł adowano do AutoGen 540™, aparatu do automatycznej izolacji, kwasów nukleinowych i izolowano plazmidowe DNA używając Cycle 3 (oprogramowanie aparatu) zgodnie z instrukcjami producenta.

7.1.5. Otrzymywanie i transformacja protoplastów S. avermitilis

Pojedyncze kolonie S. avermitilis izolowano na 1/2 długości YPD-6. 10 ml pożywki TSB w probówkach 25 mm x 150 mm szczepiono grzybni ą , nastę pnie probówki inkubowano wytrzą sają c (300 rpm) w 28°C przez 48 godzin. Jeden ml grzybni używano do szczepienia 50 ml pożywki YEME. Pożywka YEME zawiera w litrze: Difco Yeats Extract - 3 g; Difco Bacto-peptone - 5 g; Difco Malt Extract 3 g; Sacharoza - 300 g. Po autoklawowaniu w 121°C przez 25 min. dodawano: 2,5 M MgCl2 . 6H2O (oddzielnie autoklawowany - 121°C, 25 min) - 2 ml i glicyna (20%) (sterylizowana przez sączenie) - 25 ml.

Grzybnię hodowano w 30°C przez 48 - 72 godzin i zbierano ją przez wirowanie w 50 ml probówce wirówkowej (Falcon) przy 3 000 rpm przez 20 min. Supernatant odrzucano i grzybnię ponownie zawieszano w buforze P, który zawiera: sacharozę 205 g; K₂SO₄ - 0,25 g; MgCl₂ · 6 H₂O - 2,02 g; H₂O

- 600 ml; K₂PO₄ (0,5%) - 10 ml; roztwór pierwiastków śladowych* - 20 ml; CaCl₂ · 2 H₂O ((3,68%)

- 100 ml i bufor MES (0,1 M, pH 6,5) - 10 ml. (* Roztwór pierwiastków śladowych zawiera w litrze: ZnCl2 - 40 mg; FeCl3 · 6 H2O - 200 mg; CUCI2 · 2 H2O -10 mg; MnCl2 · 4 H2O - 10 mg; Na2B4O7 · 10 H₂O - 10 mg; (NH₄)₆Mo₇O₂₄4 H₂O -10 mg). pH doprowadzano do 6,5, końcową objętość doprowadzano do 1 litra, gorącą pożywkę sączono przez sączek 0,45 mikronów.

Grzybnię wirowano przy 3 000 rpm przez 20 min, supernatant odrzucano i grzybnię ponownie zawieszano w 20 ml buforu P zawierającego 2 ml lizozymu. Grzybnię inkubowano wytrząsając przez 15 min. w 35°C i sprawdzano pod mikroskopem zakres tworzenia się protoplastów. Po zakończeniu tworzenia się protoplastów, protoplasty wirowano przy 8 000 rpm przez 10 min. Supernatant usuwano i protoplasty ponownie zawieszano w 10 ml buforu. Protoplasty wirowano przy 8 000 rpm przez 10 min, supernatant odrzucano protoplasty ponownie zawieszano w 2 ml buforu P i około 1 x 10⁹ protoplastów rozdzielano do 2 ml fiolek (Nalgene) do mrożenia.

Fiolkę zawierająca 1 x 10⁹ protoplastów wirowano przy 8 000 przez 10 min., supernatant usuwano, protoplasty ponownie zawieszano w 0,1 ml buforu P. Dwa do 5 μg transformującego DNA dodawano do protoplastów, bezpośrednio po tym dodawano 0,5 ml roboczego buforu T. Podstawowy bufor T zawiera: PEG -1000 (Sigma) - 25 g; sacharoza - 2,5 g; H2O - 83 ml. pH doprowadzano do 8,8 stosując 1N NaOH (sterylizowany przez sączenie). Bufor podstawowy T sterylizowano przez sączenie i przechowywano w temperaturze 4°C. Bufor roboczy, robiony w dniu używania składał się z buforu podstawowego T - 8,3 ml; K2PO4 (4 mM) - 1,0 ml; CaCl2 · H2O (5M) - 0,2 ml i TES (1M, pH 8) - 0,5 ml. Każdy składnik roboczego buforu T indywidualnie sterylizowano przez sączenie.

W ciągu 20 sekund od dodania do protoplastów buforu T, dodawano także 1 ml buforu P i protoplasty wirowano przy 8 000 rpm. przez 10 min. Supernatant odrzucano i protoplasty ponownie zawieszano w 0,1 ml buforu P. Protoplasty umieszczano następnie na płytce na pożywce RM14, która zawiera: sacharozę - 205 g; K2SO4 - 0,25 g; MgCl2 · 6 H2O -10,12 g; glukozę -10 g; Difco Casamino Acids - 0,1 g;

PL 211 693 B1

Difco Yeats Extract - 5 g; Difco Oatmeal Agar - 3 g; Difco Bacto Agar - 22 g; dH2O - 800 ml. Roztwór autoklawowano w 121°C przez 25 min. Po autoklawowaniu dodawano sterylne roztwory podstawowe: K₂PO₄ (0,5%) - 10 ml; CaCl₂ · 2 H₂O (5M) - 5 ml; L-prolinę (20%) - 15 ml; bufor MES (1,0 M, pH 6,5) - 10 ml; roztwór pierwiastków śladowych (taki sam jak poprzednio) - 2 ml; podstawowy roztwór cykloheksimidu (25 mg/ml) - 40 ml i 1N NaOH - 2 ml. Jednakowe ilości pożywki RM14 nakładano na płytki, po 25 ml na płytkę i płytki suszono przez 24 godziny przed użyciem.

Protoplasty inkubowano przy 95% wilgotności temperaturze 30°C przez 20 - 24 godziny. W celu wyselekcjonowania transformantów opornych na tiostrepton, 1 ml warstwy pokrywającego buforu zawierającego 125 μg/ml tiostreptonu rozpylano równomiernie nad płytką regeneracyjną R14. Pokrywający bufor zawiera w 100 ml: sacharozę - 10,3 g; roztwór pierwiastków śladowych (ten sam co stosowany powyżej) - 0,2 ml i MES (1 M, pH 6,5) 1 ml. Protoplasty inkubowano przy 95% wilgotności przy 30°C przez 7 do 14 dni, aż oporne na tiostrepton kolonie (Thio^r) były widoczne.

7.1.6. Transformowanie protoplastów Streptomyces lividans

W pewnych przypadkach do transformacji stosowano S. lividans TK64 (dostarczane przez John Innes Institute, Norwich, U.K.). Metody i kompozycje hodowli, tworzenie protoplastów i transformowanie S. lividans opisano w Hopwood i wsp., 1985, Genetic Manipulation of Streptomyces, A Laboratory Mannual, John Innes Foundation, Norwich, U.K. i wykonywano tak jak tu opisano. Plazmidowe DNA z S. lividans izolowano tak jak opisano w Sekcji 7.1.3, powyżej.

7.1.7 Analiza fermentacji szczepów S. avermitilis

Grzybnię hodowaną na 1/2 długości YPD 6 przez 4 do 7 dni zaszczepiano do probówek 1 x 6 cali zawierających 8 ml wstępnie przygotowanej pożywki i dwa 5 mm szklane ziarna. Przygotowana pożywka zawiera: rozpuszczalną skrobię (lub rzadką gotowaną skrobię lub KOSO, Japan Corn Starch Co, Nagoya) - 20 g/L; Pharmamedia - 15 g/L; Ardamine pH - 5 g/L (Champlain Ind. Clifton, NJ); CaCO3 - 2 g/L; 2x bcfa („bcfa” odnosi się do rozgałęzionych kwasów tłuszczowych), których końcowe stężenia wynoszą: 50 ppm kwasu 2-(+/-)metylomasłowego, 60 ppm kwasu izomasłowego i 20 ppm kwasu izowalerianowego. pH doprowadzano do 7,2 i pożywkę autoklawowano w temperaturze 121°C przez 25 min.

Probówkę wytrząsano pod kątem 17° przy 215 rpm w 29°C przez 3 dni. 2-ml podwielokrotności hodowli posiewu używano do zaszczepienia 300 ml butelki Erlenmayera zawierającej 25 ml przygotowanej pożywki, która zawierała: rozpuszczalną skrobię (lub rzadką gotowaną skrobię lub KOSO 160 g/L; K2PO4 2 g/L; MgSO4 · 4 H2O - 2 g/L, FeSO4 · 7 H2O - 0,02 g/L, MnCl2 - 0,002 g/L; ZnSO4 · 7 H2O 0,002 g/L; CaCO3 - 14 g/L; 2x bcfa (jak powyżej) i kwas cykloheksanokarboksylowy (CHC) (przygotowany jako 29% roztwór o pH 7,0) - 800 ppm. pH doprowadzano do 6,9 i pożywkę autoklawowano w 121°C przez 25 min. (jak wytłumaczono wyżej, inne niż CHC jednostki początkowe mogą być używane (patrz np.: Tabela 1)).

Po zaszczepieniu, butelkę inkubowano w 29°C przez 12 dni z wytrząsaniem 200 rpm. Po inkubacji 2 ml próbki pobierano z butelki, rozcieńczano 8 ml metanolu, mieszano i w celu odwirowania szczątków mieszaninę wirowano przy 1 250 x g przez 10 min.. Supernatant badano przy użyciu HPLC, stosując kolumnę Beckman Ultrasphere ODS (25 cm x 4,6 mm ID), szybkość przepływu 0,75 ml/min. i detekcję przez pomiar absorbancji przy 240 nm. Faza ruchoma składała się z metanol/woda/acetonitryl 86/8,9/5,1.

7.1.8. Izolacja genów PKS S. avermitilis

Kosmidową bibliotekę chromosomalnego DNA S. avermitilis (ATCC 31272, SC-2) przygotowano i hybryzydowano z sondą ketosyntaza (KS) zrobioną z fragmentu genu syntazy poliketydowej (PKS) Saccharopolyspora erythraea. Szczegółowy opis przygotowania kosmidowych bibliotek można znaleźć w Sambrook i wsp., 1989, powyżej. Szczegółowy opis przygotowania bibliotek chromosomalnego DNA Streptomyces jest przedstawiony w Hopwood i wsp., 1985, powyżej. Klony kosmidowe zawierające obszary hybrydyzujące do ketosyntazy identyfikowano przez hybrydyzację do fragmentu 2,7 kb Ndel/Eco47III z pEX26 (otrzymanego dzięki uprzejmości Dr P. Leadlay, Cambridge, UK). Około 5 ng pEX26 trawiono używając Ndel Eco47III. Mieszaninę reakcyjną nakładano na 0,8% żel agarozowy Sea-Plaque GTG (FMC BioProducts, Rockland, ME). Po elektroforezie, 2,7 Kb fragment Ndel/Eco47III wycinano z żelu i DNA odzyskiwano z żelu stosując GELase™ z Epicentre Technologies przy użyciu Fast Protocol. 2,7 Kb fragment Nde\/Eco47\W znakowano [a-³²P]dCTF (5-trójfosforan dezoksycytydyny, tetra (trójetyloamonowa) sól, [alfa-³²P]-) (NEN-Dupont, Boston, MA) używając BRL Nick Translation System (BRL Life Technologies, Inc., Gaithersburg, MD) zgodnie z instrukcją dostawcy. Typową reakcję przeprowadzano w objętości 0,05 ml. Po dodaniu 5 μl buforu hamującego,

PL 211 693 B1 znakowany DNA oddzielano od niewłączonych nukleotydów, stosując kolumny G-25 Sephadex Quick Spin™ (Boehringer Mannheim) zgodnie z instrukcją dostawcy.

Przebadano około 1 800 kosmidowych klonów poprzez hybrydyzację kolonii. 10 klonów zidentyfikowano jako silnie hybrydyzujące do sondy KS Sacc. erythraea. Kolonie E. coli zawierające kosmidowe DNA hodowano w płynnej pożywce LB i z każdej hodowli izolowano kosmidowe DNA w aparacie do automatycznej izolacji kwasów nukleinowych AutoGen 549™ stosując Cycle 3 (oprogramowanie aparatu) zgodnie z instrukcją producenta. Mapowanie endonukleazą restrykcyjną i hybrydyzacja Southerna ujawniły, że pięć spośród klonów zawierało nakładające się obszary chromosomalne. Genomową mapę restrykcyjną BamHl pięciu kosmidów S. avermitilis (tzn. pSE65, pSE66, pSE67, pSE68, pSE69) skonstruowano przez analizę nakładających się kosmidów i hybrydyzacji (FIGURA 4).

7.1.9. Identyfikacja DNA, który moduluje stosunki awermektyn B2:B1 i identyfikacja aveC ORF.

Następujące metody stosowano do testowania zdolności subklonowanych fragmentów pochodzących z klonu kosmidu pSE66 do modulowania stosunków awermektyny B2:B1 w mutantach AveC. pSE66 (5 pg) trawiono Sacl i SamHl. Mieszaninę reakcyjną nakładano na 0,8% żel agarozowy SeaPlaque™ GTG (FMC BioProducts), po elektroforezie fragment Sacl/BamHI wycinano z żelu i DNA odzyskiwano z żelu stosując GELase™ (Epicentr Technologies) przy użyciu Fast Protocol. Około 5 μg wektora wahadłowego pWHM3 (Vara i wsp., 1989, J. Bacteriol. 171:5872-5881) trawiono Sacl i SamHl. Zgodnie z instrukcją dostawcy, około 5 μg wstawki 2,9 Kb i 0,5 μg trawionego pWHMS mieszano razem i inkubowano przez noc z 1 jednostką ligazy (New England Biolabs, Inc., Beverly, MA) w 15°C, całkowita objętość wynosiła 20 pl. Po inkubacji, 5 μl mieszaniny ligacyjnej inkubowano w 70°C przez 10 min., oziębiano do temperatury pokojowej i używano do transformowania kompetentnych komórek E. coli DH5a (BRL) zgodnie z instrukcją producenta. Plazmidowe DNA izolowano z opornych na ampicylinę transformantów i obecność 2,9 Kb wstawki Sacl/BamHl potwierdzano analizą restrykcyjną. Ten plazmid oznaczono jako pSE119.

Protoplasty szczepu 1100-SC38 S. avermitilis (Pfizer szczep własny) otrzymywano i transformowano z pSE119 tak jak to opisano w sekcji 7.1.5 powyżej. Szczep 1100-SC38 jest mutantem, który produkuje znamiennie więcej awermektyny w formie cykloheksylo-B2 niż awermektyny w formie cykloheksylo-B1 kiedy dodawany jest kwas cykloheksanokarboksylowy (B2:B1 około 30:1). pSE119 używane do transformowania protoplastów S. avermitilis izolowano albo ze szczepu GM2163 E. coli (otrzymanego od Dr B. J. Bachmann, Curator, E. coli Genetic Stock Center, Yale University), szczepu E. coli (DM1 BRL) lub szczepu TK64 S. lividans. Oporne na tiostrepton transformanty szczepu 1100-SC38 izolowano i przy użyciu HPLC analizowano produkty fermentacji. Transformanty szczepu 1100-SC38 S. avermitilis zawierające pSE119 produkują zmieniony stosunek awermektyn cykloheksyloB2:cykloheksylo-B1 wynoszący około 3,7:1 (TABELA 2).

Mając ustalone, że pSE119 jest zdolny do modulowania stosunku awermektyn B2:B1 w mutancie AveC, ustalono sekwencję wstawki DNA. Izolowano około, 10 pg pSE119 stosując kit do izolacji plazmidowego DNA zgodnie z instrukcją producenta (Qiagen, Valencia, CA) i ustalano sekwencję przy użyciu ABI 373A Automated DNA Sequencer (Perkin Elmer, Poster City, CA). Dane dotyczące sekwencji gromadzono i edytowano używając programów Genetic Computer Group (GCG, Madison, WI). Sekwencję DNA i aveC ORF przedstawiono na FIGURZE 1 (SEQ ID NO:1).

Nowy plazmid oznaczony jako pSE118, skonstruowano jak następuje. Około 5 pg pSE66 trawiono Sacl/BamHl. Mieszaninę reakcyjną nakładano na 0,8% agarozowy żel SeaPlaque GTG (FMC BioProducts), po elektroforezie fragment 2,8 Kb Sphl/BamHl wycinano z żelu i DNA odzyskiwano z żelu stosując GELase™ (Epicentr Technologies) przy użyciu Fast Protocol. Około 5 pg wektora wahadłowego pWHM3 trawiono Sphl i BamHl. Około 0,5 pg wstawki 2,8 Kb i 0,5 pg trawionego pWHM3 mieszano razem i inkubowano przez noc z 1 jednostką ligazy (New England Biolabs, Inc., Beverly, MA) w 15°C, całkowita objętość wynosiła 20 pl, postępowano zgodnie z instrukcją dostawcy. Po inkubacji, 5 pl mieszaniny ligacyjnej inkubowano w 70°C przez 10 min, oziębiano do temperatury pokojowej i używano do transformowania kompetentnych komórek E. coli DH5a, postępowano zgodnie z instrukcją producenta. Plazmidowe DNA izolowano z opornych na ampicylinę transformantów i obecność wstawki 2,8 Kb Sphl/BamHl potwierdzano analizą restrykcyjną. Ten plazmid oznaczono jako pSE118. Wstawki DNA w pSE118 i w pSE119 pokrywają się dla około 838 nukleotydów (FIGURA 4).

Protoplastę szczepu 1100-SC38 S. avermitilis transformowano do pSE118 tak jak to opisano powyżej. Oporne na tiostrepton transformanty izolowano i produkty fermentacji analizowano przy użyciu HPLC. Transformanty szczepu 1100-SC38 S. avermitilis zawierające pSE118 nie zmieniały sto30

PL 211 693 B1 sunku awermektyny cykloheksylo-B2:awermektyny cykloheksylo-B1 w porównaniu do szczepu 1100-SC38 (TABELA 2).

7.1.10. Amplifikacja przy pomocy PCR genu aveC z chromosomalnego DNA S. avermitilis

Fragment ~ 1,2 Kb zawierający aveC ORF izolowano z chromosomalnego DNA S. avermitilis przez amplifikację PCR-em używając starterów zaprojektowanych na podstawie sekwencji nukleotydów aveC otrzymanej powyżej. Startery do PCR były dostarczone przez Genosys Biotechnologies Inc., (Texas). Starterem prawej strony był:

5'-TCACGAAACCGGACACAC-3' (SEQ ID NO:6);

starterem lewej strony był:

5'-CATGATCGCTGAACCGAG-3' (SEQ ID NO:7).

Reakcję PCR przeprowadzano z polimerazą Deep Vent™ (New England Biolabs) w buforze dostarczonym przez producenta i w obecności 300 μM dNTP, 10% glicerolu, 200 pmol każdego startera, 0,1 μg matrycy 2,5 jednostek enzymu w końcowej objętości 100 μl używając cyklera termicznego Perkin-Elmer Cetus. Termiczny profil pierwszego cyklu był następujący: 95°C przez 5 min. (etap denaturacji), 60°C przez 2 min. (etap przyłączania starterów) i 72°C przez 2 min. (etap wydłużania). Następne 24 cykle miały podobny profil termiczny za wyjątkiem tego, że etap denaturacji skrócono do 45 sekund i etap przyłączenia starterów skrócono do 1 min.

Produkt PCR poddawano elektroforezie na 1% żelu agarozowym i wykrywano pojedynczy prążek DNA ~ 1,2 Kb. Ten DNA oczyszczano z żelu i wiązano z 25 ng zlinearyzowanego wektora z tępymi końcami pCR-Blunt (Invitrogen) w stosunku molarnym 1:10 wektor do wstawki zgodnie z instrukcją producenta. Do transformowania komórek E. coli One Shot™ Competent (Invitrogen) używano mieszaniny ligacyjnej postępując zgodnie z instrukcją producenta. Plazmidowe DNA izolowano z opornych na ampicylinę transformantów i potwierdzano obecność wstawki ~1,2 Kb analizą restrykcyjną. Plazmid oznaczono jako pSE179.

Wstawkę DNA z pSE179 izolowano przez trawienie BamHl/Kbal, rozdzielano przy pomocy elektroforezy, oczyszczano z żelu i ligowano z wektorem wahadłowym pWHM3, który także był trawiony SamHI/Xbal, przy całkowitym stężeniu DNA 1 μg w stosunku molarnym wektor - do - wstawki 1:5. Do transformowania kompetentnych komórek E. coli DH5a używano mieszaniny ligacyjnej, postępowano zgodnie z instrukcją producenta. Plazmidowe DNA izolowano z opornych na ampicylinę transformantów i potwierdzano obecność wstawki ~ 1,2 Kb analizą restrykcyjną. Plazmid, który oznaczono jako pSE186 (FIGURA 2, ATCC 209604) transformowano do E. coli DM1 i plazmidowe DNA izolowano z opornych na ampicylinę transformantów.

7.2. Wyniki

Stwierdzono, że kiedy fragment 2,9 Kb z pSE119 jest transformowany do szczepu S. avermitilis, znamiennie zmienia stosunek B2:B1 produkowanych awermektyn. W szczepie 1100-SC38 S. avermitilis stosunek B2:B1 normalnie wynosi około 30:1 ale kiedy szczep został ztransformowany wektorem zawierającym fragment 2,9 Kb Sacl/BamHl stosunek awermektyny B2:B1 zmniejszył się do około 3,7:1. Pofermentacyjna analiza hodowli transformanta potwierdziła obecność transformującego DNA.

Ustalono sekwencję fragmentu 2,9 Kb z pSE119 i zidentyfikowano ORF wielkości ~ 0,9 Kb (FIGURA 1) (SEQ ID NO:1), która obejmuje fragment Pstl/Sphl, który poprzednio mutowano gdzie indziej w celu wytworzenia tylko produktów B2 (Ikeda i wsp., 1995, powyżej). Porównanie tej ORF lub odpowiadającego jej wydedukowanego polipeptydu ze znaną bazą danych (GenEMBL, SWISS-PROT) nie wykazuje jakiejś silnej homologii z sekwencją jakiegoś znanego DNA lub białka.

TABELA 2 przedstawia analizę fermentacji szczepu 1100-SC38 S. avermitilis transformowanego różnymi plazmidami

T A B E L A 2

Szczep S. avermitilis (plazmid transformujący)	Liczba testowanych transformantów	Średni stosunek B2:B1
1100-SC38 (żaden)	9	30,66
1100-SC38 (pWHM3)	21	31,3
1100-SC38 (pSE119)	12	3,7
1100-SC38 (pSE118)	12	30,4
1100-SC38 pSE185)	14	27,9

PL 211 693 B1

8. Przykład: konstrukcja mutantów S. avermitilis AveC

Ten przykład opisuje konstrukcję kilku różnych mutantów S. avermitilis AveC przy zastosowaniu kompozycji i sposobów opisanych powyżej. Ogólny opis technik wprowadzania mutacji do genu w Streptomyces jest opisany przez Kieser i Hopwood, 1991, Meth. Enzym. 204: 430-458. Bardziej szczegółowego opisu dostarcza praca Anzai i wsp., 1998, J. Antibiot. XLI(2):226-233 i praca Stutzman-Engwall i wsp., 1992, J. Bacteriol 174 (1):144-154. Te referencje są tu włączone przez odnośniki w całej rozciągłości.

8.1. Inaktywacja genu aveC S. avermitilis

Mutanty zawierające inaktywowany gen aveC konstruowano przy użyciu kilku metod, które szczegółowo podano poniżej.

W pierwszym sposobie fragment 640 pz Sphl/Pstl znajdujący się wewnątrz genu aveC w pSE119 (plazmid opisany w Sekcji 7.1.9, powyżej) został zastąpiony genem ermE (oporności na erytromycynę) z Sacc. erythraea. Gen ermE był wyizolowany z pIJ4026 (dostarczony przez John Innes Institute, Norwich, U.K.; patrz także Bibb i wsp., 1985, Gene 41:357-368) przez trawienie enzymami restrykcyjnymi Bg/II i EcoRI, a następnie przez elektroforezę i oczyszczenie z żelu. Ten fragment ~ 1,7 Kb był ligowany z pGEM7Zf (Promega) trawionym BamHl i EcoRl i mieszaninę ligacyjną transformowano do kompetentnych komórek DH5a E. coli postępując zgodnie z instrukcją producenta. Plazmidowe DNA izolowano z opornych na ampicylinę transformantów i obecność wstawki ~ 1,7 Kb potwierdzano analizą restrykcyjną. Plazmid oznaczono jako pSE27.

pSE118 (opisany w Sekcji 7.1.9, powyżej) trawiono Sphl i BamHl, produkt trawienia poddawano elektroforezie i wstawkę ~ 2,8 Kb Sphl/BamHl oczyszczano z żelu. pSE119 trawiono Pstl i EcoRI, produkt trawienia poddawano elektroforezie i ~ 1,5 Kb wstawkę Pstl/EcoRl oczyszczano z żelu. Wektor wahadłowy pWHM3 trawiono BamHl i EcoRI. PSE27 trawiono Pstl i Sphl, produkt trawienia poddawano elektroforezie i wstawkę Pstl/Sphl -1,7 Kb oczyszczano z żelu. Wszystkie cztery fragmenty (tzn. ~ 2,8 Kb, ~ 1,5 Kb, ~ 7,2 Kb, ~ 1,7 Kb) ligowano razem w 4-stopniowej ligacji. Mieszaninę ligacyjną transformowano do kompetentnych DH5a komórek E. coli zgodnie z instrukcją producenta. Plazmidowe DNA izolowano z transformantów opornych na ampicylinę i obecność właściwej wstawki potwierdzano analizą restrykcyjną. Plazmid oznaczono jako pSE180 (FIGURA 3; ATCC 209605).

pSE180 transformowano do TK64 S. lividans transformowane kolonie identyfikowano na podstawie oporność na tiostrepton i erytromycynę. pSE180 izolowano z S lividans i używano do transformowania protoplastów S avemitilis. Zidentyfikowano cztery transformanty S avermitilis oporne na tiostrepton, wytworzono protoplasty i hodowano na płytkach na nieselektywnej pożywce RM14. Po regeneracji protoplastów, pojedyncze kolonie badano na oporność na erytromycynę i brak oporności na tiostrepton, co wskazuje na chromosomalną integrację inaktywowanego genu aveC i utratę wolnych replikonów. Jeden transformant Erm^r Thio^r został zidentyfikowany i oznaczony jako szczep SE180-11. Całkowity chromosomalny DNA izolowano ze szczepu SE180-11, trawiono enzymami restrykcyjnymi BamHl, Hindlll, Pst lub Sphl, rozdzielano przy pomocy elektroforezy na 0,8% żelu agarozowym, przenoszono na nylonowe membrany i hybrydyzowano sondą ermE. Te analizy wykazały, że chromosomalna integracja genu oporności i towarzysząca temu delecja fragmentu 640 pz Pstl/Sphl jest powodowana przez podwójny crossing over. Analiza HPLC produktów fermentacji szczepu SE180-11 wykazała, że normalne awermektyny nie są dłużej produkowane (FIGURA 5A).

W drugim sposobie, w celu inaktywacji genu aveC, gen 1,7 Kb ermE usunięto z chromosomu szczepu SE180-11 S. avermitilis, pozostawiając delecje 640 pz Pstl/Sphl w genie aveC. Plazmid zastąpienia genu konstruowano następująco: pSE180 częściowo trawiono Xbal i fragment ~ 11,4 Kb oczyszczono z żelu. Prążkowi ~ 11,4 Kb brakuje genu oporności 1,7 Kb ermE. DNA było następnie ligowane i transformowane do komórek DH5a E. coli. Plazmidowy DNA izolowano z transformantów opornych na ampicylinę i obecność prawidłowego podstawienia potwierdzano analizą restrykcyjną. Ten plazmid, który oznaczono jako pSE184, transformowano do DM1 E. coli i plazmidowe DNA izolowano z transformantów opornych na ampicylinę. Tego plazmidu używano, żeby transformować protoplasty szczepu SE180-11 S. avermitilis. Protoplasty były otrzymywane z opornych na tiostrepton transformantów szczepu SE180-11 i były hodowane jako pojedyncze kolonie na płytkach na RM14. Po regeneracji protoplastów, pojedyncze kolonie testowano na brak lekooporności zarówno na erytromycynę jak i na tiostrepton, co wskazywało na chromosomalną integrację inaktywowanego genu aveC i utratę wolnych replikonów zawierających gen ermE. Jeden transformant Erm^s Thio^s został zidentyfikowany i oznaczony jako SE184-1-13. Analiza produktów fermentacji SE184-1-13 wykazała, że

PL 211 693 B1 normalne awermektyny nie były produkowane i, że SE184-1-13 ma taki sam profil fermentacyjny jak SE180-11.

W trzecim sposobie inaktywacji genu aveC, zmienioną ramkę odczytu wprowadzano do chromosomalnego genu aveC przez dodanie dwóch G po C w pozycji nt 471 używając PCR, dzięki temu tworząc miejsce BspE1. Obecność wbudowanego miejsca była przydatna do wykrywania przypadków zastąpienia genów. Startery PCR zaprojektowane do wprowadzenia mutacji zmienionej ramki odczytu do genu aveC były dostarczane przez Genosys Biotechnologies Inc.

Starterem prawej strony był:

5'-GGTTCCGGATGCCGTTCTCG-3' (SEQ ID NO:8) i starterem lewej strony był:

5'-AACTCCGGTCGACTCCCCTTC-3' (SEQ ID NO:9).

Warunki PCR były takie jak opisano w Sekcji 7.1.10 powyżej. Produkt PCR 666 pz trawiono Sphl, żeby otrzymać dwa fragmenty odpowiednio 278 pz i 388 pz. Fragment 388 pz oczyszczano z żelu.

Plazmid zastąpienia genu konstruowano jak następuje: wektor wahadłowy pWHM3 trawiono EcoRl i BamHl. pSE119 trawiono BamHl i Sphl, produkty trawienia poddawano elektroforezie i fragment ~ 840 pz oczyszczano z żelu. pSE119 trawiono EcoRI i Xmnl, produkty trawienia rozdzielano przy pomocy elektroforezy i fragment ~ 1,7 Kb oczyszczano z żelu. Wszystkie cztery fragmenty (tzn. ~ 7,2 Kb, ~ 840 pz, ~1,7 Kb i 388 pz) ligowano razem w 4-stopniowej ligacji. Mieszaninę ligacyjną transformowano do kompetentnych komórek DH5a E. coli. Plazmidowe DNA izolowano z opornych na ampicylinę transformantów i obecność prawidłowej wstawki potwierdzano analizą restrykcyjną i analizą sekwencji DNA. Ten plazmid który oznaczono jako pSE185, transformowano do E. coli DM1 i plazmidowe DNA izolowano z opornych na ampicylinę transformantów. Tego plazmidu używano, żeby transformować protoplasty szczepu 1100-SC38 S. avermitilis. Transformanty szczepu 1100-SC38 S. avermitilis oporne na tiostrepton izolowano i przeprowadzano analizę HPLC produktów fermentacji. pSE185 nie zmienia znamiennie stosunku awer-mektyn B2:B1 kiedy jest transformowany do szczepu 1100-SC38 S. avermitilis (TABELA 2).

pSE185 używano, żeby transformować protoplasty S. avermitilis do wytwarzania mutacji zmienionej ramki odczytu w chromosomalnym genie aveC. Protoplasty były otrzymywane z opornych na tiostrepton transformantów szczepu SE180-11 i były hodowane jako pojedyncze kolonie na RM14. Po regeneracji protoplastów, w pojedynczych koloniach badano brak lekooporności na tiostrepton. Chromosomalny DNA z wrażliwych na tiostrepton kolonii izolowano i testowano przy pomocy PCR na obecność mutacji zmienionej ramki odczytu integrowanej do chromosomu. Startery PCR były zaprojektowane na podstawie sekwencji nukleotydów aveC i były dostarczane przez Genosys Biotechnologies, Inc. (Texas).

Starterem PCR prawej strony był:

5'-GCAAGGATACGGGGACTAC-3' (SEQ ID NO:10) i starterem PCR lewej strony był:

5'-GAACCGACCGCCTGATAC-3' (SEQ ID NO:11), warunki PCR były takie jak opisano w Sekcji 7,1.10 powyżej. Otrzymany produkt PCR miał 543 pz i kiedy był trawiony BspE1, obserwowano trzy fragmenty mające 368 pz, 96 pz i 79 pz wskazujące na chromosomalną integrację inaktywowanego genu aveC i utratę wolnego replikonu.

Analiza produktów fermentacji mutantów S. avermitilis zawierających mutacje zmienionej ramki odczytu w genie aveC wykazała, że normalne awermektyny nie były dłużej produkowane i że te mutanty miały w HPLC taki sam profil produktów fermentacji jak szczepy SE180-11 i SE184-1-13. Zidentyfikowano jeden Thio^s transformant i oznaczono jako szczep SE185-5a.

Dodatkowo wytwarzano mutację w genie aveC, która zmienia nt w pozycji 520 z G na A, co powoduje zmianę kodonu kodującego tryptofan (W) w pozycji 116 w kodon terminacji. Szczep S. avermitilis z tą mutacją nie produkował normalnych awermektyn i miał ten sam fermentacyjny profil jak szczepy SE180-11, SE184-1-13 i SE185-5a.

Dodatkowo wytwarzano mutacje w genie aveC, które zmieniają zarówno: (i) nt w pozycji 970 z G na A co zmienia aminokwas w pozycji 266 z glicyny (G) na kwas asparaginianowy (D) i (ii) nt w pozycji 996 z T na C co powoduje zmianę aminokwasu w pozycji 275 z tyrozyny (Y) na histydynę (H). Szczep S. avermitilis z tą mutacją (G266D/Y275H) nie produkował normalnych awermektyn i miał ten sam fermentacyjny profil jak szczepy SE180-11, SE184-1-13 i SE185-5a.

PL 211 693 B1

Zinaktywowany mutant aveC szczepu S. avermitilis SE180-11, SE184-1-13 i SE185-5a i inne dostarczone tutaj dostarczają narzędzi skriningowych do badania wpływu innych mutacji w genie aveC. pSE186, który zawiera kopię genu aveC typu dzikiego, transformowano do DM1 E. coli i plazmidowe DNA izolowano z opornych na ampicylinę transformantów. DNA pSE186 uż ywano do transformowania protoplastów S. avermitilis szczepu SE180-11. Oporne na tiostrepton transformanty szczepu SE180-11 izolowano, oznaczano obecność oporności na erytromycynę i wykonywano analizę HPLC produktów fermentacji transformantów Thio^r Erm^r. Obecność działającego genu aveC w pozycji trans była zdolna do przywrócenia normalnej produkcji awermektyn szczepowi SE180-11 (FIGURA 5B).

8.2. Analiza mutacji w genie aveC, które zmieniają stosunki klasy B2:B1

Jak opisano powyżej, szczep SE180-11 S. avermitilis zawierający nieaktywny gen aveC był uzupełniany przez transformację plazmidem zawierającym działający gen aveC (pSE186). Szczepu SE180-11 używano także jako szczepu gospodarza w celu scharakteryzowania innych mutacji w genie aveC, tak jak to opisano poniż ej.

Chromosomalny DNA izolowano ze szczepu 1100-SC38 i używano jako matrycy do amplifikacji PCR genu aveC. 1,2 Kb ORF izolowano przez amplifikację używając starterów, które zaprojektowano na podstawie sekwencji nukleotydów aveC. Starterem prawej strony był SEQ ID NO:6, starterem lewej strony był SEQ ID NO:7 (patrz Sekcja 7.1.10 powyżej). Warunki PCR i tworzenia subklonów były takie jak opisano w Sekcji 7.1.10. Analiza sekwencji DNA 1,2 Kb ORF wykazuje mutację genu aveC, która zmienia nt w pozycji 337 z C do T, co zmienia aminokwas w pozycji 55 z seryny (S) na fenyloalaninę (F). Gen aveC zawierający mutację S55F był subklonowany do pWHM3, żeby otrzymać plazmid, który był oznaczony jako pSE187 i którego używano do transformowania protoplastów szczepu SE180-11 S. avermitilis. Oporne na tiostrepton transformanty szczepu SE180-11 izolowano, oznaczano obecność oporności na erytromycynę i wykonywano analizę HPLC produktów fermentacji transformantów Thio^r Erm^r. Obecność genu aveC kodującego zmiany reszt aminokwasów w pozycji 55 (S55F) umożliwiała przywrócenie normalnej produkcji awermektyn przez szczep SE180-11 (FIGURA 5C); jednak stosunek cykloheksylo B2:cykloheksylo B1 wynosił 26:1, w porównaniu do tego, szczep SE180-11 transformowany pSE186 miał stosunek B2:B1 około 1,6:1 (TABELA 3), co wskazuje, że pojedyncza mutacja (S55F) moduluje ilość produkowanej cykloheksylo-B2 w stosunku do ilości cykloheksylo-B1. Zidentyfikowano, że inna mutacja w genie aveC zmienia nt w pozycji 862 z G na A, co zmienia aminokwas w pozycji 230 z glicyny (G) na kwas asparaginianowy (D). Szczep mający tę mutację (G230D) produkuje awermektyny w stosunku wynoszącym około 30:1.

8.3. Mutacje, które redukują stosunek B2:B1

Skonstruowano kilka mutacji, które redukują ilość produkowanej cykloheksylo-B2 w stosunku do ilości cykloheksylo-B1, jak następuje.

Zidentyfikowano, że mutacja w aveC, która zmienia nt w pozycji 588 z G na A, zmienia aminokwas w pozycji 139 z alaniny (A) na treoninę (T). Gen aveC zawierający mutację A139T subklonowano do pWHM3, żeby wyprodukować plazmid, który oznaczono pSE188 i który stosowano do transformowania protoplastów szczepu SE180-11 S. avermitilis. Oporne na tiostrepton transformanty szczepu SE180-11 izolowano, oznaczano obecność oporności na erytromycynę i transformanty Thio^r Erm^ranalizowano przy pomocy analizy HPLC produktów fermentacji. Obecność zmutowanego genu aveC kodującego zmianę reszty aminokwasu 139 (A139T) powodowała przywrócenie produkcji awermektyn przez szczep SE180-11 (FIGURA 5D); chociaż stosunek B2:B1 wynosił około 0,94:1, wskazuje to, że mutacja redukuje ilość awer-mektyny cykloheksylo-B2 produkowanej w stosunku do ilości awermektyny cykloheksylo-B1. Ten wynik był nieoczekiwany, ponieważ publikowane wyniki, równie dobrze jak wyniki opisane powyżej, wykazywały tylko albo inaktywację genu aveC albo wzrost produkcji formy B2 awermektyny względem formy B1 (TABELA 3).

Ponieważ mutacja A139T zmienia stosunek B2:B1 w kierunku bardziej faworyzującym B1, skonstruowano mutację, która koduje treoninę zamiast seryny w 138 pozycji aminokwasów. pSE186 trawiono EcoRI i klonowano do pGEM3Zf (Promega), który trawiono EcoRI. Ten plazmid, który oznaczono jako pSE186a trawiono Apal i Kpnl, fragmenty DNA rozdzielano na żelu agarozowym i dwa fragmenty ~ 3,8 Kb i ~ 0,4 Kb oczyszczano z żelu. Wstawkę DNA ~ 1,2 Kb z pSE186 stosowano jako matrycę PCR dla wprowadzenia zmiany pojedynczej zasady w pozycji nt 585. Startery PCR zaprojektowane do wprowadzenia mutacji w pozycji nt 585 były dostarczane przez Genosys Biotechnologies, Inc. (Texas).

PL 211 693 B1

Starterem PCR prawej strony był:

5'-GGGGGCGGGCCCGGGTGCGGAGGCGGAAATGCCCCTGGCGACG-3' (SEQ ID NO:12); starterem PCR lewej strony był:

5'-GGAACCGACCGCCTGATACA-3' (SEQ ID NO:13).

Reakcję PCR przeprowadzano używając genomowego kitu PCR Advantage GC (Clonetech Laboratories, Palo Alto, CA) w buforze dostarczanym przez producenta, w obecności 200 μΜ dNTP 200 pmol każdego startera, 50 ng matrycowego DNA, 1,0 M GC-Melt i 1 jednostki Klen Tag Polymerase Mix w końcowej objętości 50 pi. Profil termiczny pierwszego cyklu był 94°C przez 1 min.; po czym następowało 25 cykli 94°C przez 30 sekund i 68°C przez 2 min. i jeden cykl 68°C przez 3 min. Produkt PCR mający 295 pz trawiono Apal i Kpnl w celu uwolnienia fragmentu 254 pz, który rozdzielano przy użyciu elektroforezy i oczyszczano z żelu. Wszystkie trzy fragmenty (~ 3,8 Kb, ~ 0,4 Kb, ~ 254 pz) ligowano w 3-stopniowej ligacji. Mieszaninę ligacyjną transformowano do kompetentnych komórek DH5a E. coli. Plazmidowe DNA izolowano z opornych na ampicylinę transformantów i obecność właściwej wstawki potwierdzano analizą restrykcyjną. Plazmid oznaczono jako pSE198.

pSE198 trawiono EcoRl, klonowano do pWHM3, który trawiono EcoRI i transformowano do komórek DH5a E. coli. Plazmidowe DNA izolowano z opornych na ampicylinę transformantów i obecność właściwej wstawki potwierdzano analizą restrykcyjną. To plazmidowe DNA transformowano do DM1 E. coli, plazmidowe DNA izolowano z opornych na ampicylinę transformantów i obecność właściwej wstawki potwierdzano analizą restrykcyjną. Ten plazmid, który oznaczono jako pSE199 używano do transformowania protoplastów szczepu SE180-11 S. avermitilis. Oporne na tiostrepton transformanty szczepu SE180-11 izolowano, oznaczano obecność oporności na erytromycynę i transformanty Thio^r Erm^r analizowano poprzez analizę HPLC produktów fermentacji. Obecność zmutowanego genu aveC kodującego zmianę reszty aminokwasu w pozycji 138 (S138T) była w stanie przywrócić szczepowi SE180-11 zdolność normalnej produkcji awermektyn, chociaż stosunek B2:B1 wynosił 0,88:1, co wskazuje, że ta mutacja redukuje ilość produkowanej awermektyny cykloheksyloB2 w stosunku do awermektyny cykloheksylo-B1 (TABELA 3). Ten stosunek B2:B1 jest nawet niższy niż stosunek 0,94:1 obserwowany dla mutacji A139T produkowanej przez szczep SE18011 z pSE188 jak to opisano powyżej.

Inną mutację skonstruowano w celu wprowadzenia treoniny w obu aminokwasowych pozycjach 138 i 139. Wstawka ~ 1,2 Kb DNA z pSE186 była użyta jako matryca PCR. Startery PCR zaprojektowane do wprowadzenia mutacji w pozycjach nt 585 i 588 były dostarczone przez Genosys Biotechnologies, Inc. (Texas).

Starterem prawej strony PCR był:

5'-GGGGGCGGGCCCGGGTGCGGAGGCGGAAATGCCGCTGGCGACGACC-3' (SEQ ID

NO:14);

starterem lewej strony PCR był:

5'-GGAACATCACGGCATTCACC -3' (SEQ ID NO:15).

Warunki reakcji PCR stosowano takie jak opisano bezpośrednio powyżej w tej Sekcji. Produkt PCR mający 449 pz trawiono Apal i Kpnl w celu uwolnienia fragmentu 254 pz, który rozdzielano przy użyciu elektroforezy i oczyszczano z żelu. pSE185a trawiono Apal i Kpnl, fragmenty DNA rozdzielano na agarozowym żelu i dwa fragmenty ~ 3,8 Kb, ~0,4 Kb oczyszczano z żelu. Wszystkie trzy fragmenty (~ 3,8 Kb, ~ 0,4 Kb, ~ 254 pz) ligowano w 3-stopniowej ligacji i mieszaninę ligacyjną transformowano do kompetentnych komórek DH5a E. coli. Plazmidowe DNA izolowano z opornych na ampicylinę transformantów i obecność właściwej wstawki potwierdzano analizą restrykcyjną. Plazmid oznaczono jako pSE230.

pSE230 trawiono EcoRl, klonowano do pWHM3, który trawiono EcoRl i transformowano do komórek DH5a E. coli. Plazmidowe DNA izolowano z opornych na ampicylinę transformantów i obecność właściwej wstawki potwierdzano analizą restrykcyjną i analizą sekwencji DNA. To plazmidowe DNA transformowano do DM1 E. coli, plazmidowe DNA izolowano z opornych na ampicylinę transformantów i obecność właściwej wstawki potwierdzano analizą restrykcyjną. Ten plazmid, który oznaczono jako pSE231 był używany do transformowania protoplastów szczepu SE180-11 S. avermitilis. Oporne na tiostrepton transformanty szczepu SE180-11 izolowano, oznaczano obecność oporności na erytromycynę i transformanty Thio^r Erm^r analizowano poprzez fermentację. Obecność podwójnie zmutowanego genu aveC, kodującego S138T/A139T powoduje przywrócenie normalnego produkowania awermektyn przez szczep SE180-11; jednak stosunek B2:B1 był 0,84:1 pokazując, że mutacja dalej redukuje ilość produkowanej awermektyny cykloheksylo-B2 w stosunku do awermektyny

PL 211 693 B1 cykloheksylo-B1 (TABELA 3), powyżej redukcji powodowanej przez transformację szczepu SE180-11 z pSE188 lub pSE199 jak to opisano powyżej.

Inną mutację skonstruowano w celu dalszej redukcji ilości produkowanej awermektyny cykloheksylo-B2 w stosunku do awermektyny cykloheksylo-B1. Ponieważ mutacja S138T/A139T zmienia stosunki B2:B1 w kierunku bardziej faworyzującym B1, skonstruowano mutację w celu wprowadzenia treoniny w aminokwasowej pozycji 138 i fenyloalaniny w aminokwasowej pozycji 139. Wstawka DNA ~ 1,2 Kb z pSE186 była używana jako matryca PCR. Startery PCR zaprojektowane do wprowadzenia mutacji w pozycjach nt 585 (zmieniającej T na A), 588 (zmieniającej G na T) i 589 (zmieniającej C na T) były dostarczane przez Genosys Biotechnologies, Inc. (Texas).

Starterem prawej strony PCR był:

5'GGGGGCGGGCCCGGGTGCGGAGGCGGAAATGCCGCTGGCGACGTTC-3' (SEQ ID NO:16) starterem lewej strony PCR był:

5'-GGAACATCACGGCATTCACC-3' (SEQ ID NO:15).

Reakcję PCR przeprowadzano używając genomowego PCR kitu Advantage GC (Clonetech Laboratories, Palo Alto, CA) w buforze dostarczanym przez producenta, w obecności 200 pM dNTP, 200 pmol każdego startera, 50 ng matrycowego DNA, 1,1 mM octanu Mg, 1,0 M GC-Melt i 1 jednostki Tth polimerazy DNA w końcowej objętości 50 pl. Profil termiczny pierwszego cyklu był 94°C przez 1 min.; po czym następowało 25 cykli 94°C przez 30 sekund i 68°C przez 2 min; i jeden cykl 68°C przez 3 min. Produkt PCR mający 449 pz trawiono z Apal i Kpnl w celu uwolnienia fragmentu 254 pz, który rozdzielano przy użyciu elektroforezy i oczyszczano z żelu. Wszystkie trzy fragmenty (~ 3,8 Kb, ~ 0,4 Kb, ~ 254 pz) ligowano w 3-stopniowej ligacji. Mieszaninę ligacyjną transformowano do kompetentnych komórek DH5D E, coli. Plazmidowe DNA izolowano z opornych na ampicylinę transformantów i obecność właściwej wstawki potwierdzano analizą restrykcyjną. Plazmid oznaczono jako pSE238.

pSE238 trawiono EcoRl, klonowano do pWHM3, który trawiono EcoRl i transformowano do komórek DH5a E. coli. Plazmidowe DNA izolowano z opornych na ampicylinę transformantów i obecność właściwej wstawki potwierdzano analizą restrykcyjną. To plazmidowe DNA transformowano do DM1 E. coli, plazmidowe DNA izolowano z opornych na ampicylinę transformantów i obecność właściwej wstawki potwierdzano analizą restrykcyjną. Ten plazmid, który oznaczono jako pSE239 używano do transformowania protoplastów szczepu SE180-11 S. avermitilis. Oporne na tiostrepton transformanty szczepu SE180-11 izolowano, oznaczano obecność oporności na erytromycynę i transformanty Thio^r Erm^r analizowano poprzez analizę HPLC produktów fermentacji. Obecność podwójnie zmutowanego genu aveC kodującego S138T/A139F była w stanie przywrócić szczepowi SE180-11 zdolność normalnej produkcji awermektyn, chociaż stosunek B2:B1 wynosił 0,75:1, co wskazuje, że ta mutacja dalej redukuje ilość produkowanej awermektyny cykloheksylo-B2 w stosunku do awermektyny cykloheksylo-B1 (TABELA 3), powyżej redukcji powodowanej przez transformację szczepu SE180-11, pSE188, pSE199 lub pSE231 tak jak to opisano powyżej.

T A B E L A 3

Szczep S. avermitilis (plazmid transformujący)	Liczba badanych transformantów	Wzgl. stężenie B2	Wzgl. stężenie B1	Średni stosunek B2:B1
SE180-11 (żaden)	30	0	0	0
SE180-11 (pWHM3)	30	0	0	0
SE180-11 (pSE186)	26		140	1,59
SE180-11 (pSE187)	12	283	11	26,3
SE180-11 (pSE188)	24	193	206	0,94
SE180-11 (pSE199)	18	155	171	0,88
SE180-11 (pSE231)	6	259	309	0,84
SE180-11 (pSE239)	20	184	242	0,75

Skonstruowano dodatkowe mutacje w celu dalszej redukcji ilości produkowanej awermektyny cykloheksylo-B2 w stosunku do awermektyny cykloheksylo-B1 przy zastosowaniu techniki tasowania

DNA, tak jak to opisano w Stemmer, 1994, Nature 370:389-391; i Stemmer, 1994, Proc. Natl. Acad.

PL 211 693 B1

Sci USA 91:10747-10751 i dalej opisano w Patencie U.S.A. Nr 5 605 793; 5 811 238; 5 830 721 i 5 837 458.

Plazmidy z tasowanym DNA zawierające zmutowane geny transformowano do kompetentnych komórek dam dcm E. coli. Plazmidowe DNA izolowano i używano do transformowania protoplastów szczepu Se180-11 S. avermitilis. Transformanty oporne na tiostrepton izolowano i badano czy mogą produkować awermektyny cykloheksylo-B2:cykloheksylo-B1 w stosunku 1:1 lub mniejszym. W plazmidowym DNA z transformantów SE180-11 produkujących awermektyny B2:B1 w stosunku 1:1 lub mniejszym oznaczana była sekwencja DNA.

Zidentyfikowano osiem transformantów, które produkowały zredukowaną ilość awermektyny cykloheksylo-B2 w stosunku do cykloheksylo-B1. Najniższy stosunek B2:B1 osiągnięty wśród tych transformantów wynosił 0,40:1 (TABELA 4). Plazmidowe DNA izolowano z każdego z ośmiu transformantów i w celu zidentyfikowania mutacji w genie aveC oznaczano sekwencję DNA. Mutacje są jak następuje.

pSE290 zawiera mutacje 4 nukleotydów w pozycji nt 317 z T na A, w pozycji nt 353 z C na A, w pozycji nt 438 z G na A i w pozycji nt 1155 z T na A. Zmiana nukleotydów w pozycji 317 zmienia aminokwasy w aminokwasowej pozycji 48 z D na E i zmiana nukleotydów w nt pozycji 438 zmienia aminokwasy w aminokwasowej pozycji 89 z A na T. Stosunek B2:B1 produkowanych przez komórki zawierające ten plazmid wynosił 0,42:1 (TABELA 4).

pSE291 zawiera mutacje 4 nukleotydów w pozycji nt 272 z G na A, w pozycji nt 585 z T na A, w nt pozycji 588 z G na A i w pozycji nt 708 z G na A. Zmiana nukleotydów w pozycji 585 zmienia aminokwasy w aminokwasowej pozycji 138 z S na T, zmiana nukleotydów w nt pozycji 588 zmienia aminokwasy w aminokwasowej pozycji 139 z A na T i zmiana nukleotydów w nt pozycji 708 zmienia aminokwasy w aminokwasowej pozycji 179 z G na S. Stosunek B2:B1 produkowanych przez komórki zawierające ten plazmid wynosił 0,57:1 (TABELA 4).

pSE292 zawiera te same cztery mutacje nukleotydów co pSE290. Stosunek B2:B1 produkowanych przez komórki zawierające ten plazmid wynosił 0,40:1 (TABELA 4).

pSE293 zawiera mutacje 6 nukleotydów w pozycji nt 24 z A na G, w pozycji nt 286 z A na C, w pozycji nt 497 z T na C, w pozycji 554 nt z C na T, w pozycji nt 580 z T na C i w pozycji nt 886 z A na T. Zmiana nukleotydów w pozycji 286 zmienia aminokwasy w aminokwasowej pozycji 38 z Q na P, zmiana nukleotydów w nt pozycji 580 zmienia aminokwasy w aminokwasowej pozycji 136 z L na P i zmiana nukleotydów w nt pozycji 886 zmienia aminokwasy w aminokwasowej pozycji 238 z E na D. Stosunek B2:B1 produkowanych przez komórki zawierające ten plazmid wynosił 0,68:1 (TABELA 4).

pSE294 zawiera mutacje 6 nukleotydów w pozycji nt 469 z T na C, w pozycji nt 585 z T na A, w pozycji nt 588 z G na A, w pozycji nt 708 z G na A, w pozycji nt 833 z C na T i w pozycji nt 1184 z G na A. Dodatkowo nt w pozycjach 173, 174 i 175 są usunięte. Zmiana nukleotydów w pozycji 469 zmienia aminokwasy w aminokwasowej pozycji 99 z F na S, zmiana nukleotydów w nt pozycji 585 zmienia aminokwasy w aminokwasowej pozycji 138 z S na T, zmiana nukleotydów w nt pozycji 588 zmienia aminokwasy w aminokwasowej pozycji 139 z A na T i zmiana nukleotydów w nt pozycji 708 zmienia aminokwasy w aminokwasowej pozycji 179 z G na S. Stosunek B2:B1 produkowanych przez komórki zawierające ten plazmid wynosił 0,53:1 (TABELA 4).

pSE295 zawiera mutacje 2 nukleotydów w pozycji nt 588 z G na A i w pozycji nt 856 z T na C. Zmiana nukleotydów w pozycji nt 588 zmienia aminokwasy w aminokwasowej pozycji 139 z A na T i zmiana nukleotydów w pozycji nt 856 zmienia aminokwasy w aminokwasowej pozycji 228 z M na T. Stosunek B2:B1 produkowanych przez komórki zawierające ten plazmid wynosił 0,80:1 (TABELA 4).

pSE296 zawiera mutacje 5 nukleotydów w pozycji nt 155 z T na C, w pozycji nt 505 z G na T, w pozycji nt 1039 z C na T, w pozycji nt 1202 z C na T i w pozycji nt 1210 z T na C. Zmiana nukleotydów w pozycji nt 505 zmienia aminokwasy w aminokwasowej pozycji 111 z G na V i zmiana nukleotydów w pozycji nt 1039 zmienia aminokwasy w aminokwasowej pozycji 289 z P na L. Stosunek B2:B1 produkowanych przez komórki zawierające ten plazmid wynosił 0,73:1 (TABELA 4).

pSE297 zawiera mutacje 4 nukleotydów w pozycji nt 377 z G na T, w pozycji nt 588 z G na A, w pozycji nt 633 z A na G i w pozycji nt 1067 z A na T. Zmiana nukleotydów w pozycji nt 588 zmienia aminokwasy w aminokwasowej pozycji 139 z A na T, zmiana nukleotydów w pozycji nt 633 zmienia aminokwasy w aminokwasowej pozycji 154 z K na E i zmiana nukleotydów w pozycji nt 1067 zmienia aminokwasy w aminokwasowej pozycji 298 z Q na H. Stosunek B2:B1 produkowanych przez komórki zawierające ten plazmid wynosił 0,67:1 (TABELA 4).

PL 211 693 B1

T A B E L A 4

Szczep S. avermitilis (plazmid transformujący)	liczba badanych transformantów	Wzgl. stężenie B2	Wzgl. stężenie B1	Średni stosunek B2:B1
SE180-11 (żaden)	4	0	0	0
SE180-11 (pWHM3)	4	0	0	0
SE180-11 (pSE290)	4	87	208	0,42
SE180-11 (pSE291)	4	106	185	0,57
SE180-11 (pSE292)	4	91	231	0,40
SE180-11 (pSE293)	4	123	180	0,68
SE180-11 (pSE294)	4	68	129	0,53
SE180-11 (pSE295)	4	217	271	0,80
SE180-11 (pSE296)	1	135	186	0,73
SE180-11 (pSE297)	1	148	221	0,67

Dla dalszej redukcji ilości awermektyny cykloheksylo-B2 produkowanej w stosunku do ilości awer-mektyny cykloheksylo-B1 przeprowadzono dodatkowy cykl tasowania DNA jak następuje.

Półsyntetyczne tasowanie

Najlepszy klon był tasowany przy zastosowaniu metody opisanej w międzynarodowym zgłoszeniu PCT WO 97/20078 przez Maxygen Inc. Indywidualne nukleotydy kodujące korzystne podstawienia najlepiej odpowiadające obniżonemu stosunkowi B2:B1 dodawano do reakcji tasowania w 5 molarnym nadmiarze w stosunku do matrycowych łańcuchów aveC. Każdy mylne zestawienie nukleotydów (mismatch) w oligonukleotydzie było flankowane przez 20 nukleotydów o doskonałej zgodności, żeby zapewnić prawidłowe włączanie podczas reakcji tasowania. Oligonukleotydy kupowano w Operon Technologies (Alameda, CA).

Hodowanie HTP S. avermitilis

Niezależne klony wybierano z transformacyjnych płytek i zaszczepiano do 250 μl pożywki R5 (Kieser, T. i wsp., „Practical Streptomyces Genetics”, 2000, Norwich, U.K., John Innes Foundation) w głębokich 96-studzienkowych płytkach posiewowych i hodowano w 30°C z wytrząsaniem. W każdej studzience umieszczono szklane ziarno w celu rozpraszania grzybni i wstrząsania hodowli. W tym czasie hodowle osiągały wyrównanie i gęsty wzrost. Po 4-5 dniach, 20 μl posiewu odmierzano do płytek produkcyjnych, pozostałą objętość po dodaniu glicerolu, którego końcowe stężenie wynosiło 20%, zamrażano jako płytki wzorcowe w -80°C. Płytki produkcyjne inkubowano w 30°C w wilgotnym środowisku przez 12-14 dni. Zarodnikowanie szczepów pojawia się po 5-8 dniach inkubacji. Płytki produkcyjne zasadniczo robiono tak jak opisano w międzynarodowym zgłoszeniu PCT WO 99/41389 przez Pfizer Inc., za wyjątkiem dodawania 1% agarozy dla zapewnienia stałej powierzchni.

Ekstrakcja i skrining ESI-MS/MS

Całość 1 ml octanu etylu dodawano do każdej studzienki i inkubowano wytrząsając w temperaturze pokojowej przez 20 min. Pobierano około 750 μl fazy octanu etylu, przenoszono do 96-studzienkowej płytki i zostawiano na noc do odparowania. Osad ponownie rozpuszczano w 100 μl metanolu 1 mM NaCl, z czego 5 μl roztworu wstrzykiwano do spektrometru masowego przy użyciu autosamplera w 96-studzienkowym formacie i analizowano bezpośrednio w przepływającej wstrzykniętej fazie bez chromatografii cieczowej lub innego rozdziału. Związki jonizowano przez naświetlanie strumieniem elektronów a przejścia MS/MS były monitorowane w dwu oddzielnych kanałach. Przejście MS/MS dla sodowanego jonu B1 jest z m/z 921 do m/z 777 a dla sodowanego jonu B2 jest z m/z 939 do m/z 795 w trybie pozytywnym. Do tego skriningu o dużej przepustowości używano spektrometru masowego Finnigan TSQ-7000, Micromass Quattro-LC i autosamplera Leap Technology Twin-Pal. Integracja dwu oddzielnych chromatogramów B1 i B2 dla każdej pozycji studzienki identyfikowała trafienia.

Pięćdziesiąt siedem (57) nowych kombinacji podstawień aminokwasów zidentyfikowano jako takie, które mogą powodować stosunki awermektyn B2:B1 wynoszące 0,35:1 lub mniej (FIGURA 6).

Kilka z tych nowych mutacji może powodować, że stosunki awermektyn B2:B1 wynoszą około 0,30:1 lub mniej; kilka może powodować, że stosunki awermektyn B2:B1 wynoszą 0,25:1 lub mniej i kilka

PL 211 693 B1 może powodować, że stosunki awermektyn B2:B1 wynoszą 0,20:1 lub mniej. Zidentyfikowano dwie (2) nowe mutacje, które mogą dawać stosunki awermektyn B2:B1 wynoszące 0,37 lub 0,38.

Bankowanie materiału biologicznego

Następujące plazmidy zostały zdeponowane w Amerykańskim Zbiorze Hodowli Typowych (ang. American Type Culture Collection) (ATCC) w 12301 Parklawn Drive, Rockville, MD, 20852, USA 29 stycznia 1998 i oznaczone następującymi numerami dostępu:

Plazmid Nr dostępu

Plazmid pSE180 209605

Plazmid pSE186 209604

Aktualny adres Amerykańskiego Zbioru Hodowli Typowych jest następujący: 10801 University Blvd, Manassas, YA, 20110, USA.

Wszystkie patenty, zastosowania patentów i publikacje cytowane powyżej są włączone tu przez odnośniki w całej rozciągłości.

Niniejszy wynalazek nie jest ograniczany w zakresie przez specyficzne ujęcie wynalazku opisane tutaj, jego intencją było zilustrowanie pojedynczych indywidualnych aspektów wynalazku i działania równoważnych metod i składników zawartych wewnątrz zakresu wynalazku. W rzeczywistości, różne modyfikacje wynalazku, w dodatku do tych pokazanych i opisanych staną się oczywiste dla specjalistów w tej dziedzinie na podstawie powyższych opisów i towarzyszących rysunków. Intencją jest, żeby takie modyfikacje mieściły się w zakresie dołączonych zastrzeżeń patentowych.

PL 211 693 B1

LISTA SEKWENCJI

<110>	PFIZER PRODUCTS	INC .
<12 0>	GEN STREPTOMYCES	AYERMIl	II.IS KIERUJĄCY STOSUNKIEM
	AWERMEKTYN 132:131
<130>	PC23034A
<14 Oj	PC23034A
<14 1>	2002-02-12
<160>	16
<170>	Patentln Ver. 2.	. 1

<210> 1 <211> 1229 <212> DNA < 2 1 3 > Streptomyces avermitilis <22O>

<221> CDS <222> (174)..(1085) < 4 0 0 > 1

t cacgaaacc	ggacacacca	cacacacgaa	ggtgagacag	cgtgaaccca	tccgagccgc	60
tcggcctgcc	caacgaacgt	gtagtagaca	cccgaccgtc	cgatgccacg	ctctcacccg	120
aggccggcct	gaacaggtca	ggagcgctgc	cccgtgaact	gctgtcgttg	ccg gtg	176

Val

gtg Val

tgg Trp

gcc Ala 5

ggg Gly

gtc Val

ggc Gly

ctg Leu

ctg Leu 10

ttt Phe

ctg Leu

gcc Ala

ctg Leu

cag Gin 15

gcg Ala

tac Tyr

224

gtg

ttc

agc

cgc

tgg

gcg

gcc

gac

ggt

ggc

tac

cgg

ctg

atc

gag

acg

272

Val

Phe

Ser

Arg

Trp

Ala

Asp

Gly

Tyr

Arg

Leu

Ile

Glu

Thr

20

25

30

gcg

ggc

cag

ggt

cag

ggc

agc

aag

gat

acg

ggg

act

acc

gat

gtg

320

Ala

Gly

Gin

Gly

Gin

Gly

Ser

Lys

Asp

Thr

Gly

Thr

Asp

Val

35

40

45

gtc

tat

ccc

gtg

att

tcc

gtc

tgc

atc

acc

gcc

gcg

tgg

368

Val

Tyr

Pro

Val

Ile

Ser

Val

Cys

Ile

Thr

Ala

Trp

PL 211 693 B1

50

55

60

65

ctc

ttc

cgg

agg

tgc

cgt

gtc

gaa

ega

cgg

ctg

ttc

gac

gcc

ctt

416

Leu

Phe

Arg

Cys

Arg

Val

Glu

Arg

Leu

Phe

Asp

Ala

Leu

70

75

80

ctc

ttc

ctc

ggg

ctg

ttc

gcg

agc

tgg

cag

agc

ccg

ctc

atg

aac

464

Leu

Phe

Leu

Gly

Leu

Phe

Ala

Ser

Trp

Gin

Ser

Pro

Leu

Met

Asn

85

90

95

tgg

ttc

cat

tcc

gtt

ctc

gtc

tcc

aac

gcg

agt

gtg

tgg

ggc

gcg

gtg

512

Trp

Phe

His

Ser

Val

Leu

Val

Ser

Asn

Ala

Ser

Val

Trp

Gly

Ala

Val

100

105

110

ggt

tcc

tgg

ggt

ccg

tat

gtg

ccc

ggc

tgg

cag

ggg

gcg

ggc

ccg

ggt

560

Gly

Ser

Trp

Gly

Pro

Tyr

Val

Pro

Gly

Trp

Gin

Gly

Ala

Gly

Pro

Gly

115

120

125

gcg

gag

gcg

gaa

atg

ccg

ctg

gcg

tcg

gcc

tcc

gtc

tgc

atg

tcg

get

60Θ

Ala

Glu

Ala

Glu

Met

Pro

Leu

Ala

Ser

Ala

Ser

Val

Cys

Met

Ser

Ala

130

135

140

145

ctg

atc

gtc

acc

gtg

ctg

tgc

agc

aag

gca

ctg

ggg

tgg

atc

aag

gcc

656

Leu

Ile

Val

Thr

Val

Leu

Cys

Ser

Lys

Ala

Leu

Gly

Trp

Ile

Lys

Ala

150

155

160

cgc

cgg

ccg

gca

tgg

cgg

acc

tgg

cgg

ctg

gtc

ctg

gcc

gtg

ttc

704

Arg

Pro

Ala

Trp

Arg

Thr

Trp

Arg

Leu

Val

Leu

Ala

Val

Phe

165

170

175

atc

ggc

atc

gtg

ctc

ggt

ctg

tcc

gag

ccg

ctg

ccg

tcc

gcc

tcc

ggg

752

Ile

Gly

Ile

Val

Leu

Gly

Leu

Ser

Glu

Pro

Leu

Pro

Ser

Ala

Ser

Gly

180

185

190

atc

agc

gta

tgg

gcc

aga

gcg

ctg

ccc

gag

gtg

acc

ttg

tgg

agt

ggc

800

Ile

Ser

Val

Trp

Ala

Arg

Ala

Leu

Pro

Glu

Val

Thr

Leu

Trp

Ser

Gly

195

200

205

gag

tgg

tac

cag

ttc

ccc

gtg

tat

cag

gcg

gtc

ggt

tcc

ggc

ctg

gtc

848

Glu

Trp

Tyr

Gin

Phe

Pro

Val

Tyr

Gin

Ala

Val

Gly

Ser

Gly

Leu

Val

210

215

220

225

tgc

atg

ctg

ggc

tcg

ctg

cgc

ttc

cgc

gac

gaa

cgc

gat

gag

B96

Cys

Met

Leu

Gly

Ser

Leu

Arg

Phe

Arg

Asp

Glu

Arg

Asp

Glu

230

235

240

tcg

tgg

gtg

gaa

cgg

gga

gcc

tgg

cgg

ttg

ccg

caa

cgg

gca

gcg

aac

944

Ser

Trp

val

Glu

Arg

Gly

Ala

Trp

Arg

Leu

Pro

Gin

Arg

Ala

Asn

PL 211 693 B1

245

250

255

tgg

gcg

cgt

ttc

ctc

gcc

gtg

gtc

ggt

ggg

gtg

aat

gcc

gtg

atg

ttc

992

Trp

Ala

Arg

Phe

Leu

Ala

Val

Gly

Val

Asn

Ala

Val

Met

Phe

260

265

270

ctc

tac

acc

tgt

ttc

cat

atc

ctc

ctg

tcc

ctc

gtc

ggt

gga

cag

ccg

1040

Leu

Tyr

Thr

Cys

Phe

His

Ile

Leu

Ser

Leu

Val

Gly

Gin

Pro

275

280

285

ccc

gac

caa

ctg

ccg

gac

tcc

ttc

caa

gcg

ccg

gcc

gct

tac

tga

1085

Pro

Asp

Gin

Leu

Pro

Asp

Ser

Phe

Gin

Ala

Pro

Ala

Tyr

290

295

300

gttcagggca	ggtcggagga	gacggagaag	gggaggcgac	cggagttccg	gtcacctccc	1145
ctttgtgcat	gggtggacgg	ggatcacgct	cccatggcgg	cgggctcctc	cagacgcacc	1205
acactcctcg	gttcagcgat	catg				1229

<210> 2 <211> 303 <212> PRT <213> Streptomyces avei'mitilis <400> 2

Val 1	Val	Val	Trp	Ala 5	Gly	Val	Gly
Tyr	Val	Phe	Ser 20	Arg	Trp	Ala	Ala
Thr	Ala	Gly 35	Gin	Gly	Gin	Gly	Gly 40
Val	Val 50	Tyr	Pro	Val	Ile	Ser 55	Val
Trp 65	Leu	Phe	Arg	Arg	Cys 70	Arg	Val
Leu	Leu	Phe	Leu	Gly 85	Leu	Leu	Phe
Asn	Trp	Phe	His 100	Ser	Val	Leu	Val
Val	Gly	Ser 115	Trp	Gly	Pro	Tyr	Val 120
Gly	Ala 130	Glu	Ala	Glu	Met	Pro 135	Leu
Ala 145	Leu	Ile	Val	Thr	Val 150	Leu	Cys
Ala	A_rg	Arg	Pro	Ala	Trp	Arg	Thr

Leu	Leu 10	Phe	Leu	Ala	Leu	Gin 15	Ala
Asp 25	Gly	Gly	Tyr	Arg	Leu 30	Ile	Glu
Ser	Lys	Asp	Thr	Gly 45	Thr	Thr	Asp
Val	Cys	Ile	Thr 60	Ala	Ala	Ala	Ala
Glu	Arg	Arg 75	Leu	Leu	Phe	Asp	Ala 80
Ala	Ser 90	Trp	Gin	Ser	Pro	Leu 95	Met
Ser 105	Asn	Ala	Ser	Val	Trp 110	Gly	Ala
Pro	Gly	Trp	Gin	Gly 125	Ala	Gly	Pro
Ala	Ser	Ala	Ser 140	Val	Cys	Met	Ser
Ser	Lys	Ala 155	Leu	Gly	Trp	Ile	Lys 160
Trp	Arg	Leu	Val	Leu	Ala	Val	Phe

PL 211 693 B1

165

170

175

Phe

Ile

Gly

Ile

Val

Leu

Gly

Leu

Ser

Glu

Pro

Leu

Pro

Ser

Ala

Ser

180

185

190

Gly

Ile

Ser

Val

Trp

Ala

Arg

Ala

Leu

Pro

Glu

Val

Thr

Leu

Trp

Ser

195

200

205

Gly

Glu

Trp

Tyr

Gin

Phe

Pro

Val

Tyr

Gin

Ala

Val

Gly

Ser

Gly

Leu

210

215

220

Val

Cys

Met

Leu

Gly

Ser

Leu

Arg

Phe

Arg

Asp

Glu

Arg

Asp

225

230

235

240

Glu

Ser

Trp

Val

Glu

Arg

Gly

Ala

Trp

Arg

Leu

Pro

Gin

Arg

Al a

Ala

245

250

255

Asn

Trp

Ala

Arg

Phe

Leu

Ala

Val

Gly

Val

Asn

Ala

Val

Met

260

265

270

Phe

Leu

Tyr

Thr

Cys

Phe

His

Ile

Leu

Ser

Leu

Val

Gly

Gin

275

280

285

Pro

Asp

Gin

Leu

Pro

Asp

Ser

Phe

Gin

Ala

Pro

Ala

Tyr

290

295

300

<210> 3 <211> 1150 <212> DNA <213> Streptomyces hygroscopicus <220>

<221> CDS <222> (58) . . (990) <400> 3 gtcgacgaag accggccgga ggccgtcggc cgggccgata ccgtacgcgg cctgcgg

gtg	ttc	acc	ctt	ccc	gta	aca	ctg	tgg
Val 1	Phe	Thr	Leu	Pro 5	Val	Thr	Leu	Trp
ctg	gga	ctt	cag	gtg	tac	gtg	ttc	gcc
Leu	Gly	Leu	Gin 20	Val	Tyr	Val	Phe	Ala 25
tac	cgc	atc	gag	aag	gcg	tcc	ccg	gcc
Tyr	Arg	Ile 35	Glu	Lys	Ala	Ser	Pro 40	Ala
cgg	atc	gcc	gat	gtg	ctg	atc	ccg	ctg
Arg	Ile 50	Ala	Asp	Val	Leu	Ile 55	Pro	Leu

gcg Ala 10	tgt Cys	gtc Val	ggc Gly	gcg Ala	ctg Leu 15	gtg Val	105
gcc	tgg	ctc	gcc	gac	agc	ggc	153
Ala	Trp	Leu	Ala	Asp 30	Ser	Gly
agg	ggc	ggt	ggg	gac	tcg	gag	201
Arg	Gly	Gly	Gly 45	Asp	Ser	Glu
ctg	tcc	gtg	gtg	gga	gcg	gtg	249
Leu	Ser	Val 60	Val	Gly	Ala	Val

PL 211 693 B1

gtc Val 65

ctc Leu

gca Ala

gtg Val

tgt Cys

ctg Leu 70

tac Tyr

cgg Arg

agg Arg

tgt Cys

cgg Arg 75

gcc Ala

agg Arg

cgg Arg

ctg Leu 80

297

acg

ttc

gac

gcg

tcg

ctc

ttc

atc

ggg

ctg

tcg

gcc

agt

tgg

cag

345

Thr

Phe

Asp

Ala

Ser

Leu

Phe

Ile

Gly

Leu

Ser

Ala

Ser

Trp

Gin

85

90

95

agt

ccc

ttg

atg

aac

tgg

atc

aat

ccg

gtg

ctc

gcg

tca

aac

gtc

aat

393

Ser

Pro

Leu

Met

Asn

Trp

Ile

Asn

Pro

Val

Leu

Ala

Ser

Asn

Val

Asn

100

105

110

gtg

ttc

gga

gcg

gtg

gcc

tcg

tgg

ggg

ccg

tat

gtg

ccc

ggt

tgg

cag

441

Val

Phe

Gly

Ala

Val

Ala

Ser

Trp

Gly

Pro

Tyr

Val

Pro

Gly

Trp

Gin

115

120

125

ggg

gcg

ggg

gcg

cac

cag

gag

gcc

gag

ctg

ccg

ctg

gcg

acc

ctg

age

489

Gly

Ala

Gly

Ala

His

Gin

Glu

Ala

Glu

Leu

Pro

Leu

Ala

Thr

Leu

Ser

130

135

140

atc

tgt

atg

acg

gcc

atg

gcc

gtg

gcc

tgc

ggc

aag

ggc

atg

537

Ile

Cys

Met

Thr

Ala

Met

Ala

Val

Ala

Cys

Gly

Lys

Gly

Met

145

150

155

160

ggt

ctt

gcc

cgg

tgg

ccg

cgg

ctg

ggg

ccg

ctc

cgg

ctg

atc

585

Gly

Leu

Ala

Arg

Trp

Pro

Arg

Leu

Gly

Pro

Leu

Arg

Leu

Ile

165

170

175

gcg

ctc

ggc

ttt

ctg

ctc

gtc

gtg

ctc

gac

atc

gcc

gag

ccg

ctg

633

Ala

Leu

Gly

Phe

Leu

Val

Leu

Asp

Ile

Ala

Glu

Pro

Leu

180

185

190

gtg

tcc

ttc

gcg

ggc

gtc

tcc

gtg

tgg

acg

cgg

gca

gtg

ccc

gag

ctg

681

Val

Ser

Phe

Ala

Gly

Val

Ser

Val

Trp

Thr

Arg

Ala

Val

Pro

Glu

Leu

195

200

205

acc

atc

tgg

agt

ggg

cac

tgg

tat

cag

ttc

ccg

ctg

tat

cag

atg

gtg

729

Thr

Ile

Trp

Ser

Gly

His

Trp

Tyr

Gin

Phe

Pro

Leu

Tyr

Gin

Met

Val

210

215

220

gct

tcg

gcg

ctc

ttc

ggc

gcc

tct

ttg

ggg

gcc

gcg

cgc

cac

ttt

cgc

777

Ala

Ser

Ala

Leu

Phe

Gly

Ala

Ser

Leu

Gly

Ala

Arg

His

Phe

Arg

225

230

235

240

aac

cgg

cgc

ggc

gaa

acg

tgt

ctg

gag

tcc

ggg

gcg

gcc

ctc

eta

ccg

825

Asn

Arg

Gly

Glu

Thr

Cys

Leu

Glu

Ser

Gly

Ala

Leu

Pro

245 250 255

PL 211 693 B1

gag Glu

ggc Gly

ccg Pro

agg Arg 260

cca Pro

tgg gtc

cgg Arg

ctg Leu 265

ctg Leu

gcg Ala

gtg Val

ggc Gly 270

ggg Gly

gcc Ala

873

Trp

Val

aac

atc

agc

atc

gcc

ctc

tac

acc

ggc

gca

cac

ggc

gca

cac

atc

ctg

921

Asn

Ile

Ser

Ile

Ala

Leu

Tyr

Thr

Gly

Ala

His

Gly

Ala

His

Ile

Leu

275

280

285

ttc

tcg

ctg

atg

gac

ggc

gct

ccc

ccg

gac

cgg

ctc

ccc

gaa

ttc

969

Phe

Ser

Leu

Met

Asp

Gly

Ala

Pro

Asp

Arg

Leu

Pro

Glu

Phe

290

295

300

cgt

ccg

gcg

gcc

ggc

tac

tga

gaccgccggc «

accacccacg tacccgatgt

1020

Arg

Pro

Ala

Gly

Tyr

305

310

gcgcgatgtg cctgatgcgc ctgatgtacc

cggggtgtca

tcggctcacc tgtggcgcct

1080

catgcggtga gcgctccgcc tcgtccttgt

' tccggctcct

gggctccacg a

ccatacgga

1140

gcggccgggg

1150

<210> 4 <211? 310 <212> PRT <213> Streptomy<	:es	hygroscopicus
<400> 4
Val Phe Thr Leu	Pro	Val Thr Leu Trp Ala Cys Val Gly Ala Leu Val
1	5	10 15
Leu Gly Leu Gin	Val	Tyr Val Phe Ala Ala Trp Leu Ala Asp Ser Gly
20		25 30
Tyr Arg Ile Glu	Lys	Ala Ser Pro Ala Arg Gly Gly Gly Asp Ser Glu
35		40 45
Arg Ile Ala Asp	Val	Leu Ile Pro Leu Leu Ser Val Val Gly Ala Val
50		55 60
Val Leu Ala Val	Cys	Leu Tyr Arg Arg Cys Arg Ala Arg Arg Arg Leu
65		70 75 80
Thr Phe Asp Ala	Ser	Leu Phe Ile Gly Leu Leu Ser Ala Ser Trp Gin
	85	90 95
Ser Pro Leu Met	Asn	Trp Ile Asn Pro Val Leu Ala Ser Asn Val Asn
100		105 no
Val Phe Gly Ala	Val	Ala Ser Trp Gly Pro Tyr Val Pro Gly Trp Gin
115		120 125
Gly Ala Gly Ala	His	Gin Glu Ala Glu Leu Pro Leu Ala Thr Leu Ser
130		135 140
Ile Cys Met Thr	Ala	Met Met Ala Ala Val Ala Cys Gly Lys Gly Met

PL 211 693 B1

145 150 155 160

Gly Leu Ala Ala Ala Arg

Trp

Pro

Arg

Leu 170

Gly

Pro

Leu

Arg

Leu 175

Ile

165

Ala

Leu

Gly

Phe

Leu

Val

Leu

Asp

Ile

Ala

Glu

Pro

Leu

180

185

190

Val

Ser

Phe

Ala

Gly

val

Ser

Val

Trp

Thr

Arg

Ala

Val

Pro

Glu

Leu

195

200

205

Thr

Ile

Trp

Ser

Gly

His

Trp

Tyr

Gin

Phe

Pro

Leu

Tyr

Gin

Met

Val

210

215

220

Ala

Ser

Ala

Leu

Phe

Gly

Ala

Ser

Leu

Gly

Ala

Arg

His

Phe

Arg

225

230

235

240

Asn

Arg

Gly

Glu

Thr

Cys

Leu

Glu

Ser

Gly

Ala

Leu

Pro

245

250

255

Glu

Gly

Pro

Arg

Pro

Trp

Val

Arg

Leu

Ala

Val

Gly

Ala

260

265

270

Asn

Ile

Ser

Ile

Ala

Leu

Tyr

Thr

Gly

Ala

His

Gly

Ala

His

Ile

Leu

275

280

285

Phe

Ser

Leu

Met

Asp

Gly

Ala

Pro

Asp

Arg

Leu

Pro

Glu

Phe

290

295

300

Arg

Pro

Ala

Gly

Tyr

305

310

<210> 5 <211> 215 <212> PRT <213> Streptomyces griseochromogenes <400> 5

Val Ile Gly Trp Ala Ala Leu Gly Ala Val Phe Leu Val Leu Gin Val 15 10 15

Tyr Val Phe Ala Arg Trp Thr Ala Asp Gly Gly Tyr His Leu Ala Asp 20 25 30

Val Ser Gly Pro Asp Gly Arg Glu Pro Gly His Arg Arg Ile Ile Asp 35 40 45

Val Leu Leu Pro Ala Leu Ser Met Ala Gly Val Val Gly Leu Ala Phe 50 55 60

Trp Leu Val Arg Arg Trp Arg Ala Glu Arg Arg Leu Ser Phe Asp Ala 65 70 75 80

Leu Leu Phe Thr Gly Val Leu Phe A.la Gly Trp Leu Ser Pro Leu Met 85 90 95

PL 211 693 B1

Asn Trp Phe His Pro Val Leu Met Ala Asn Thr His Val Trp Gly Ala 100 105 110

Val Gly Ser Trp Gly Pro Tyr Val Pro Gly Trp Arg Gly Leu Pro Pro 115 120 125

Gly Lys Glu Ala Glu Leu Pro Leu Val Thr Phe Ser Leu Gly Ser Thr 130 135 140

Val Leu Leu Gly Val Leu Gly Cys Cys Gin Val Met Ser Arg Val Arg 145 150 . 155 160

Glu Arg Trp Pro Gly Val Arg Pro Trp Gin Leu Val Gly Leu Ala Phe 165 170 175

Leu Thr Ala Val Ala Phe Asp Leu Ser Glu Pro Phe Ile Ser Phe Ala 180 185 190

Gly Val Ser Val Trp Ala Arg Ala Leu Pro Thr Val Thr Leu Trp Arg 195 200 205

Gly Ala Trp Tyr Arg Ala Arg 210 215 <210> 6 <211> 18 <212> DNA <213> Streptomyces avermitilis <400> 6 tcacgaaacc ggacacac <210> 7 <211> 18 <212> DNA <213 > Streptomyces avermitilis <400> 7 catgatcgct gaaccgag <210> 8 <211> 20 <212> DNA <213> Streptomyces avermitilis

PL 211 693 B1 <400> 8 ggttccggat gccgttctcg <210> 9 <211> 21 <212 > DNA <213 > Streptomyces avermitilis <400> 9 aactccggtc gactcccctt c <210> 10 <211> 19 <212> DNA <213> Streptomyces avermitilis <400> 10 gcaaggatac ggggactac <210> 11 <211> 18 <212> DNA <213> Streptomyces avermitilis <400> 11 gaaccgaccg cctgatac <210> 12 <211> 43 <212> DNA <213> Streptomyces avermitilis <400> 12

99999^c999^c ccgggtgcgg aggcggaaat gcccctggcg acg <210> 13 <211> 20 <212> DNA <213> Streptomyces avermitilis <400> 13 ggaaccgacc gcctgataca

PL 211 693 B1 <210> 14 <211> 46 <212> DNA <213> Streptomyces avermitilis <400> 14 gggggcgggc ccgggtgcgg aggcggaaat gccgctggcg acgacc <210> 15 <211> 20 <212> DNA <213> Streptomyces avermitilis <400> 15 ggaacatcac ggcattcacc <210> 16 <211> 46 <212> DNA <213> Streptomyces avermitilis <400> 16 gggggcgggc ccgggtgcgg aggcggaaat gccgctggcg acgttc

Claims

1. Cząsteczka polinukleotydu, znamienna tym, że zawiera sekwencję nukleotydów, która skądinąd jest taka sama jak allel aveC Streptomyces avermitilis, sekwencja plazmidu pSE186 (ATCC 209604) kodująca produkt genu AveC S. avermitilis lub sekwencja nukleotydów ORF aveC S. avermitilis tak jak to przedstawiono w SEQ ID NO:1, albo jej odmiana, która zawiera jedną lub więcej niemych zmian w sekwencji nukleotydów zgodnej z degeneracją kodu genetycznego, ale która to sekwencja nukleotydów ponadto zawiera mutacje kodujące kombinację podstawień aminokwasów reszt aminokwasowych w pozycjach aminokwasów w SEQ ID NO:2, takie, że komórki szczepu S. avermitilis ATCC 53692, w których allel aveC typu dzikiego został inaktywowany i w których zachodzi ekspresja cząsteczki polinukleotydu zawierającej zmutowaną sekwencję nukleotydów, są zdolne do produkowania stosunku awermektyn klasy 2:1, który jest zredukowany w porównaniu do stosunku produkowanego przez komórki S. avermitilis szczepu ATCC 53692, w których zamiast tego zachodzi ekspresja tylko allelu aveC typu dzikiego, przy czym kiedy awermektynami klasy 2:1 są awermektyny cykloheksylo B2:cykloheksylo B1 stosunek awer-mektyn klasy 2:1 wynosi 0,35:1 lub mniej.

2. Cząsteczka polinukleotydu według zastrz. 1, znamienna tym, że stosunek awermektyn cykloheksylo B2:cykloheksylo B1 wynosi około 0,20:1 lub mniej.

3. Cząsteczka polinukleotydu według zastrz. 1, znamienna tym, że kombinacja podstawień aminokwasów zawiera kombinację wybraną z grupy składającej się z:

(a) D48E, A61T, A89T, S138T, A139T, G179S, A198G, P289L;

(b) G40S, D48E, L136P, G179S, E238D;

(c) D48E, L136P, R163Q, G179S;

(d) D48E, L136P, R163Q, G179S, E238D;

(e) D48E, L136P, R163Q, G179S, A200G, E238D;

(f) D48E, L136P, G179S, E238D;

(g) D48E, A61T, L136P, G179S, E238D;

(h) D48E, A61T, L136P, G179S;

(i) D48E, A89T, S138T, A139T, G179S;

(j) D48E, A61T, L136P, G179S, A198G, P202S, E238D, P289L;

(k) D48E, A61T, L136P , S138T, A139F, G179S, E238D, P289L;

(l) D48E, L136P, G179S, A198G, E238D, P289L;

(m) D48E, A61T, S138T, A139F, G179S, A198G, P289L;

(n) D48E, L84P, G111V, S138T, A139T, G179S, A198G, P289L;

(o) Y28C, D48E, A61T, A89T, S138T, A139T, G179S, E28D;

(p) D48E, A61T, A107T , S108G, L136P, G179S, S192A, E238D, P289L;

(q) D48E, L136P, G179S, R250W;

(r) D48E, A89T, S138T, A139T, R163Q, G179S;

(s) D48E, L136P, G179S, A198G, P289L;

(t) D48E, F78L, A89T, L136P, G179S;

(u) D48E, A89T, S138T, A139T, G179S, E238D, F278L;

(v) D48E, A89T, L136P, R163Q, G179S;

(w) D48E, A61T, A89T, G111V, S138T, A139F, G179S, E238D, P289L;

(x) D25G, D48E, A89T, L136P, S138T, A139T, V141A, I159T, R163Q, G179S;

(y) D48E, A89T, S90G, L136P, R163Q, G179S, E238D;

(z) D48E, A61T, A89T, G111V, S138T, A139T, G179S, E238D, P289L;

(aa) D48E, A89T, S138T, A139T, G179S;

(ab) D48E, L136P, R163Q, G179S, S231L;

(ac) D48E, L136P, S138T, A139F, G179S, V196A, E238D;

(ad) D48E, A61T, A89T, F99S, S138T, A139T, G179S, E238D;

(ae) G35S, D48E, A89T, S138T, A139T, G179S, P289L;

(af) D48E, A61T, A89T, S138T, A139T, G179S, V196A, E238D;

(ag) D48E, A89T, G111V, S138T, A139T, G179S, A198G, E238D;

(ah) S41G, D48E, A89T, L136P, G179S;

(ai) D48E, A89T, L136P, R163Q, G179S, P252S;

(aj) D48E, A89T, L136P, G179S, F234S;

(ak) D48E, A89T, L136P, R163Q, G179S, E238D;

PL 211 693 B1 (al) Q36R, D48E, A89T, L136P, G179S, E238D;

(am) D48E, A89T, L136P, R163Q, G179S;

(an) D48E, A89T, S138T, G179S;

(ao) D48E, A89T, L136P, G179S, E238D;

(ap) D48E, A89T, L136P, K154E, G179S, E238D;

(aq) D48E, A89T, S138T, A139T, K154R, G179S, V196A, P289L;

(ar) D48E, A89T, S138T, A139F, G179S, V196A, E238D;

(as) D48E, A61T, A89T, L136P, G179S, V196A, A198G, P289L;

(at) D48E, A61T, S138T, A139F, G179S, G196A, E238D, P289L;

(au) D48E, A89T, L136P, G179S;

(av) D48E, A89T, V120A, L136P, G179S;

(aw) D48E, A61T, A89T, S138T, A139F, G179S, V196A, A198G, E238D;

(ax) D48E, A51T, A89T, G111V, S138T, A139F, G179S, V196A, E238D;

(ay) D48E, A61T, A89T, S138T, A139T, G179S, V196A, E238D, P289L;

(az) D48E, A61T, A89T, L136P, S138T, A139F, G179S, A198G, E238D;

(ba) D48E, A89T, S138T, A139F, G179S, A198G, V220A;

(bb) D48E, A61T, A89T, S138T, A139T, G179S, V196A, E238D, R239H, P289L;

(bc) D48E, A61T, A89T, L136P, G179S, P289L;

(bd) D48E, A89T, S138T, A139T, G179S, V196A, E238D, P289L; i (be) D48E, A61T, A89T, S138T, A139F, G179S, V196A, E238D.

4. Cząsteczka polinukleotydu, znamienna tym, że zawiera sekwencję nukleotydów, która skądinąd jest taka sama jak allel aveC Streptomyces avermitilis, sekwencja plazmidu pSE186 (ATCC 209604) kodująca produkt genu AveC S. avermitilis lub sekwencja nukleotydów ORF aveC S. avermitilis tak jak to przedstawiono SEQ ID NO:1, albo jej odmiana, która zawiera jedną lub więcej niemych zmian w sekwencji nukleotydów zgodnej z degeneracją kodu genetycznego, ale która to sekwencja nukleotydów ponadto zawiera mutacje kodujące kombinację podstawień aminokwasów reszt aminokwasowych odpowiadających pozycjom aminokwasów w SEQ ID NO:2, takie, że komórki szczepu

S. avermitilis ATCC 53692, w których allel aveC typu dzikiego został inaktywowany i w których zachodzi ekspresja cząsteczki polinukleotydu zawierającej zmutowaną sekwencję nukleotydów, są zdolne do produkowania stosunku awer-mektyn klasy 2:1, który jest zredukowany w porównaniu do stosunku produkowanego przez komórki S. avermitilis szczepu ATCC 53692, w których w zamiast tego zachodzi ekspresja tylko allelu avecC typu dzikiego, przy czym kiedy awermektynami klasy 2:1 są awermektyny cykloheksylo B2:cykloheksylo B1 stosunek awermektyn klasy 2:1 jest zredukowany do około 0,40:1 lub mniej i przy czym kombinacja podstawień aminokwasów zawiera kombinację wybraną z grupy składającej się z:

5. Komórka gospodarza, znamienna tym, że zawiera polinukleotyd jak określono w zastrzeżeniu 1 albo 4.

6. Sposób otrzymywania szczepu Streptomyces avermitilis, znamienny tym, że (i) tworzy się mutację w allelu aveC w komórce szczepu S. avermitilis, która to mutacja daje w wyniku kombinację podstawień aminokwasów w produkcie genu AveC, lub (ii) wprowadza się do komórki szczepu S. avermitilis zmutowany allel aveC lub jego odmianę, która zawiera jedną lub więcej niemych zmian w sekwencji nukleotydowej zgodnej z degeneracją kodu genetycznego, kodującą produkt genu AveC zawierający kombinację podstawień aminokwasów, przy czym kombinacja podstawień aminokwasów w produkcie genu AveC zawiera kombinację wybraną z grupy składającej się z:

(a) D48E, A61T, A89T, S138T, A139T, G179S, A198G, P289L;

(b) G40S, D48E, L136P, G179S, E238D;

(c) D48E, L136P, R163Q, G179S;

(d) D48E, L136P, R163Q, G179S, E238D;

(e) D48E, L136P, R163Q, G179S, A200G, E238D;

(f) D48E, L136P, G179S, E238D;

(g) D48E, A61T, L136P, G179S, E238D;

(h) D48E, A61T, L136P, G179S;

(i) D48E, A89T, S138T, A139T, G179S;

(j) D48E, A61T, L136P, G179S, A198G, P202S, E238D, P289L;

PL 211 693 B1 (k) D48E, A61T, L136P, S138T, A139F, G179S, E238D, P28 9L;

(l) D48E, L136P, G179S, A198G, E238D, P289L;

(m) D48E, A61T, S138T, A139F, G179S, A198G, P289L;

(n) D48E, L84P, G111V, S138T, A139T, G179S, A198G, P289L;

(o) Y28C, D48E, A61T, A89T, S138T, A139T, G179S, E238D;

(p) D48E, A61T, A107T, S108G, L136P, G179S, S192A, E238D, P289L;

(q) D48E, L136P, G179S, R250W;

(r) D48E, A89T, S138T, A139T, R163Q, G179S;

(s) D48E, L136P, G179S, A198G, P289L;

(t) D48E, F78L, A89T, L136P, G179S;

(u) D48E, A89T, S138T, A139T, G179S, E238D, F278L;

(v) D48E, A89T, L136P, R163Q, G179S;

(w) D48E, A61T, A89T, G111V, S138T, A139F, G179S, E238D, P289L;

(x) D25G, D48E, A89T, L136P, S138T, A139T, V141A, I159T, R163Q, G179S;

(y) D48E, A89T, S90G, L136P, R163Q, G179S, E238D;

(z) D48E, A61T, A89T, G111V, S138T, A139T, G179S, E238D, P289L;

(aa) D48E, A89T, S138T, A139T, G179S;

(ab) D48E, L136P, R163Q, G179S, S231L;

(ac) D48E, L136P, S138T, A139F, G179S, V196A, E238D;

(ad) D48E, A61T, A89T, F99S, S138T, A139T, G179S, E238D;

(ae) G35S, D48E, A89T, S138T, A139T, G179S, P289L;

(af) D48E, A61T, A89T, S138T, A139T, G179S, V196A, E238D;

(ag) D48E, A89T, G111V, S138T, A139T, G179S, A198G, E238D;

(ah) S41G, D48E, A89T, L136P, G179S;

(ai) D48E, A89T, L136P, R163Q, G179S, P252S;

(aj) D48E, A89T, L136P, G179S, F234S;

(ak) D48E, A89T, L136P, R163Q, G179S, E238D;

(al) Q36R, D48E, A89T, L136P, G179S, E238D;

(am) D48E, A89T, L136P, R163Q, G179S;

(an) D48E, A89T, S138T, G179S;

(ao) D48E, A89T, L136P, G179S, E238D;

(ap) D48E, A89T, L136P, K154E, G179S, E238D;

(aq) D48E, A89T, S138T, A139T, K154R, G179S, V196A, P289L;

(ar) D48E, A89T, S138T, A139F, G179S, V196A, E238D;

(as) D48E, A61T, A89T, L136P, G179S, V196A, A198G, P289L;

(at) D48E, A61T, S138T, A139F, G179S, G196A, E238D, P289L;

(au) D48E, A89T, L136P, G179S;

(av) D48E, A89T, V120A, L136P, G179S;

(aw) D48E, A61T, A89T, S138T, A139F, G179S, V196A, A198G, E238D;

(ax) D48E, A61T, A89T, G111V, S138T, A139F, G179S, V196A, E238D;

(ay) D48E, A61T, A89T, S138T, A139T, G179S, V196A, E238D, P289L;

(az) D48E, A61T, A89T, L136P, S138T, A139F, G179S, A198G, E238D;

(ba) D48E, A89T, S138T, A139F, G179S, A198G, V220A;

(bb) D48E, A61T, A89T, S138T, A139T, G179S, V196A, E238D, R239H, P289L;

(bc) D48E, A61T, A89T, L136P, G179S, P289L;

(bd) D48E, A89T, S138T, A139F, G179S, V196A, E238D, P289L;

(be) D48E, A61T, A89T, S138T, A139F, G179S, V196A, 238D.

7. Sposób otrzymywania szczepu Streptomyces avermitilis, znamienny tym, że (i) tworzy się mutację allelu avaC w komórce szczepu S. avermitilis, która to mutacja daje w wyniku kombinację podstawień aminokwasów w produkcie genu AveC, lub (ii) wprowadza się do komórki szczepu S. avermitilis zmutowany allel aveC lub jego odmianę, która zawiera jedną lub więcej niemych zmian w sekwencji nukleotydowej zgodnej z degeneracją kodu genetycznego, kodującą produkt genu AveC zawierający kombinację podstawień aminokwasów, przy czym komórki zawierające zmutowany allel aveC lub jego zdegenerowaną odmianę są zdolne do produkcji awermektyn cykloheksylo B2:cykloheksylo B1 w stosunku 0,35:1 lub mniejszym.

PL 211 693 B1

8. Sposób weług zastrz. 7, znamienny tym, że kombinacja podstawień aminokwasów w produkcie genu AveC zawiera kombinację wybraną z grupy składającej się z:

(a) D48E, A61T, A89T, S138T, A139T, G179S, A198G, P289L;

(b) G40S, D48E, L136P, G179S, E238D;

(c) D48E, L136P, R163Q, G179S;

(d) D48E, L136P, R163Q, G179S, E238D;

(e) D48E, L136P, R163Q, G179S, A200G, E238D;

(f) D48E, L136P, G179S, E238D;

(g) D48E, A61T, L136P, G179S, E238D;

(h) D48E, A61T, L136P, G179S;

(i) D48E, A89T, S138T, A139T, G179S;

(j) D48E, A61T, L136P, G179S, A198G, P202S, E238D, P289L;

(k) D48E, A61T, L136P, S138T, A139F, G179S, E238D, P289L;

(l) D48E, L136P, G179S, A198G, E238D, P289L;

(m) D48E, A61T, S138T, A139F, G179S, A198G, P289L;

(n) D48E, L84P, G111V, S138T, A139T, G179S, A198G, P289L;

(o) Y28C, D48E, A61T, A89T, S138T, A139T, G179S, E238D;

(p) D48E, A61T, A107T, S108G, L136P, G179S, S192A, E238D, P289L;

(q) D48E, L136P, G179S, R250W;

(r) D48E, A89T, S138T, A139T, R163Q, G179S;

(s) D48E, L136P, G179S, A198G, P289L;

(t) D48E, F78L, A89T, L136P, G179S;

(u) D48E, A89T, S138T, A139T, G179S, E238D, F278L;

(v) D48E, A89T, L136P, R163Q, G179S;

(w) D48E, A61T, A89T, G111V, S138T, A139F, G179S, E238D, P289L;

(x) D25G, D48E, A89T, L136P, S138T, A139T, V141A, I159T, R163Q, G179S;

(y) D48E, A89T, S90G, L136P, R163Q, G179S, E238D;

(z) D48E, A61T, A89T, G111V, S138T, A139T, G179S, E238D, P289L;

(aa) D48E, A89T, S138T, A139T, G179S;

(ab) D48E, L136P, R163Q, G179S, S231L;

(ac) D48E, L136P, S138T, A139F, G179S, V196A, E238D;

(ad) D48E, A61T, A89T, F99S, S138T, A139T, G179S, E238D;

(ae) G35S, D48E, A89T, S138T, A139T, G179S, P289L;

(af) D48E, A61T, A89T, S138T, A139T, G179S, V196A, E238D;

(ag) D48E, A89T, G111V, S138T, A139T, G179S, A198G, E238D;

(ah) S41G, D48E, A89T, L136P, G179S;

(ai) D48E, A89T, L136P, R163Q, G179S, P252S;

(aj) D48E, A89T, L136P, G179S, F234S;

(ak) D48E, A8 9T, L136P, R163Q, G179S, E238D;

(al) Q36R, D48E, A89T, L136P, G179S, E238D;

(am) D48E, A89T, L136P, R163Q, G179S;

(an) D48E, A89T, S138T, G179S;

(ao) D48E, A89T, L136P, G179S, E238D;

(ap) D48E, A89T, L136P, K154E, G179S, E238D;

(aq) D48E, A89T, S138T, A139T, K154R, G179S, V196A, P289L;

(ar) D48E, A89T, S138T, A139F, G179S, V196A, E238D;

(as) D48E, A61T, A89T, L136P, G179S, V196A, A198G, P289L;

(at) D48E, A61T, S138T, A139F, G179S, G196A, E238D, P289L;

(au) D48E, A89T, L136P, G179S;

(av) D48E, A89T, V120A, L136P, G179S;

(aw) D48E, A61T, A89T, S138T, A139F, G179S, V196A, A198G, E238D;

(ax) D48E, A61T, A89T, G111V, S138T, A139F, G179S, V196A, E238D;

(ay) D48E, A61T, A89T, S138T, A139T, G179S, V196A, E238D, P289L;

(az) D48E, A61T, A89T, L136P, S138T, A139F, G179S, A198G, E238D;

(ba) D48E, A89T, S138T, A139F, G179S, A198G, V220A;

(bb) D48E, A61T, A89T, S138T, A139T, G179S, V196A, E238D, R239H, P289L;

PL 211 693 B1 (bc) D48E, A61T, A89T, L136P, G179S, P289L;

9. Sposób według zastrz. 7, znamienny tym, że stosunek awermektyn cykloheksylo B2:cykloheksylo B1 wynosi około 0,20:1 lub mniej.

10. Sposób otrzymywania nowego szczepu Streptomyces avermitilis, znamienny tym, że (i) tworzy się mutację allelu aveC w komórce szczepu S. avermitilis, która to mutacja daje w wyniku kombinację podstawień aminokwasów w produkcie genu AveC, lub (ii) wprowadza się do komórki szczepu S. avermitilis zmutowany allel aveC lub jego zdegenerowaną odmianę kodującą produkt genu AveC zawierający kombinację podstawień aminokwasów, przy czym kombinacja podstawień aminokwasów jest wybrana z grupy składającej się z:

11. Komórka gatunku Streptomyces, znamienna tym, że zawiera zmutowany allel aveC S. avermitilis lub jego zdegenerowaną odmianę, kodującą produkt genu AveC zawierający kombinację podstawień aminokwasów wybraną z grupy składającej się z:

(a) D48E, A61T, A89T, S138T, A139T, G179S, A198G, P289L;

(b) G40S, D48E, L136P, G179S, E238D;

(c) D48E, L136P, R163Q, G179S;

(d) D48E, L136P, R163Q, G179S, E238D;

(e) D48E, L136P, R163Q, G179S, A200G, E238D;

(f) D48E, L136P, G179S, E238D;

(g) D48E, A61T, L136P, G179S, E238D;

(h) D48E, A61T, L136P, G179S;

(i) D48E, A89T, S138T, A139T, G179S;

(j) D48E, A61T, L136P, G179S, A198G, P202S, E238D, P289L;

(k) D48E, A61T, L136P, S138T, A139F, G179S, E238D, P289L;

(l) D48E, L136P, G179S, A198G, E238D, P289L;

(m) D48E, A61T, S138T, A139F, G179S, A198G, P289L;

(n) D48E, L84P, G111V, S138T, A139T, G179S, A198G P289L;

(o) Y28C, D48E, A61T, A89T, S138T, A139T, G179S, E238D;

(p) D48E, A61T, A107T, S108G, L136P, G179S, S192A, E238D, P289L;

(q) D48E, L136P, G179S, R250W;

(r) D48E, A89T, S138T, A139T, R163Q, G179S;

(s) D48E, L136P, G179S, A198G, P289L;

(t) D48E, F78L, A89T, L136P, G179S;

(u) D48E, A89T, S138T, A139T, G179S, E238D, F278L;

(v) D48E, A89T, L136P, R163Q, G179S;

(w) D48E, A61T, A89T, G111V, S138T, A139F, G179S E238D, P289L;

(x) D25G, D48E, A89T, L136P, S138T, A139T, V141A, I159T, R163Q, G179S;

(y) D48E, A89T, S90G, L136P, R163Q, G179S, E238D;

(z) D48E, A61T, A89T, G111V, S138T, A139T, G179S, E238D, P289L;

(aa) D48E, A89T, S138T, A139T, G179S;

(ab) D48E, L136P, R163Q, G179S, S231L;

(ac) D48E, L136P, S138T, A139F, G179S, V196A, E238D;

(ad) D48E, A61T, A89T, F99S, S138T, A139T, G179S, E238D;

(ae) G35S, D48E, A89T, S138T, A139T, G179S, P289L;

(af) D48E, A61T, A89T, S138T, A139T, G179S, V196A, E238D;

(ag) D48E, A89T, G111V, S138T, A139T, G179S, A198G, E238D;

(ah) S41G, D48E, A89T, L136P, G179S;

(ai) D48E, A89T, L136P, R163Q, G179S, P252S;

(aj) D48E, A89T, L136P, G179S, F234S;

(ak) D48E, A89T, L136P, R163Q, G179S, E238D;

(al) Q36R, D48E, A89T, L136P, G179S, E238D;

(am) D48E, A89T, L136P, R163Q, G179S;

(an) D48E, A89T, S138T, G179S;

PL 211 693 B1 (ao) D48E, A89T, L136P, G179S, E238D;

(ap) D48E, A89T, L136P, K154E, G179S, E238D;

(aq) D48E, A89T, S138T, A139T, K154R, G179S, V196A, P289L;

(ar) D48E, A89T, S138T, A139F, G179S, V196A, E238D;

(as) D48E, A61T, A89T, L136P, G179S, V196A, A198G, P289L;

(at) D48E, A61T, S138T, A139F, G179S, G196A, E238D, P289L;

(au) D48E, A89T, L136P, G179S;

(av) D48E, A89T, V120A, L136P, G179S;

(aw) D48E, A61T, A89T, S138T, A139F, G179S, V196A, A198G, E238D;

(ax) D48E, A61T, A89T, G111V, S138T, A139F, G179S, V196A, E238D;

(ay) D48E, A61T, A89T, S138T, A139T, G179S, V196A, E238D, P289L;

(az) D48E, A61T, A89T, L136P, S138T, A139F, G179S, A198G, E238D;

(ba) D48E, A89T, S138T, A139F, G179S, A198G, V220A;

(bb) D48E, A61T, A89T, S138T, A139T, G179S, V196A, E238D, R239H, P289L;

(bc) D48E, A61T, A89T, L136P, G179S, P289L;

12. Komórka według zastrz. 11, znamienna tym, że jest komórką Streptomyces avermitilis.

13. Komórka gatunku Streptomyces, znamienna tym, że zawiera zmutowany allel aveC

S. avermitilis lub jego zdegenerowaną odmianę kodującą produkt genu AveC zawierający kombinację podstawień aminokwasów wybraną z grupy składającej się z: