PT1476539E - Gene streptomyces avermitilis que dirige a proporção de avermectinas b2:b1 - Google Patents

Gene streptomyces avermitilis que dirige a proporção de avermectinas b2:b1 Download PDF

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Yan Chen
Kim J Stutzman-Engwall
Claes Eric Daniel Gustafsson
Anke Krebber
Sun Ai Raillard
Jeremy Stephen Minshull
Seran Kim
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Pfizer Prod Inc
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Description

1 ΡΕ1476539
DESCRIÇÃO "GENE STREPTOMYCES AVERMITILIS QUE DIRIGE A PROPORÇÃO DE AVERMECTINAS B2:B1"
1. CAMPO DO INVENTO 0 presente invento é dirigido a composições e métodos para a produção eficiente de avermectinas tais como "doramectina", que são principalmente úteis no campo da saúde animal. Mais particularmente, o presente invento relaciona-se com moléculas de polinucleótido compreendendo sequências de nucleótido codificando um produto de gene AveC, o qual pode ser usado para modular a proporção de avermectinas de classe 2:1 produzidas por culturas de fermentação de Streptomyces avermitilis. 0 presente invento relaciona-se ainda com vectores, células do hospedeiro transformadas, e novas estirpes mutantes de S. avermitilis em que o gene aveC tenha sido submetido a mutação de modo a modular a proporção de avermectinas de classe 2:1 produzidas.
FUNDAMENTOS DO INVENTO 2.1 Avermectinas
As espécies Streptomyces produzem uma ampla 2 ΡΕ1476539 variedade de metabolitos secundários, incluindo as aver-mectinas, que compreendem uma série de oito lactonas macrociclicas com dezasseis membros afins apresentando potente actividade anti-helmintica e insecticida. Os oito compostos distintos mas intimamente relacionados são referidos como Ala, Alb, A2a, A2b, Bla, B2a e B2b. A série "a" de compostos refere-se à avermectina natural onde o substituinte na posição C25 é (S)-sec-butilo, e a série "b" refere-se aos compostos onde o substituinte na posição C25 é isopropilo. As designações "A" e "B" referem-se a avermectinas onde o substituinte na posição C5 é metoxi e hidroxi, respectivamente. 0 número "1" refere-se a avermectinas onde esteja presente uma dupla ligação na posição C22,23, e o número "2" refere-se a avermectinas tendo um hidrogénio na posição C22 e um hidroxi na posição C23. De entre as avermectinas afins, o tipo BI de avermectina, tal como doramectina, é reconhecido com possuindo a actividade antiparasitária e pesticida mais eficaz, sendo assim a avermectina comercialmente mais desejável.
As avermectinas e a sua produção por fermentação aeróbica de estirpes de S. avermitilís são descritas nas Patentes dos E.U.A. Nos. 4.310.519 e 4.429.042. Pensa-se que a biossintese de avermectinas naturais seja iniciada endogenamente a partir dos análogos de tioéster CoA de ácido isobutírico e ácido S-(+)-2-metil butírico.
Uma combinação tanto da melhoria da estirpe 3 ΡΕ1476539 através de mutagenese aleatória como a utilização de ácidos gordos fornecidos exogenamente levou à produção eficiente de análogos da avermectina. Mutantes de S. avermitilis que sejam deficientes em deshidrogenase de ácido 2-oxo de cadeia ramificada (mutantes deficientes em bkd) podem apenas produzir avermectinas quando as fermentações sejam suplementadas com ácidos gordos. Passagem por crivo e isolamento de mutantes deficientes em actividade de deshidrogenase de cadeia ramificada (por exemplo, S. avermitilis, ATCC 53567) são descritos na Patente Europeia (EP) 276103. A fermentação desses mutantes na presença de ácidos gordos fornecidos de um modo exógeno dá origem à produção de apenas as quatro avermectinas correspondendo ao ácido gordo utilizado. Assim, a suplementação de fermentações de S. avermitilis (ATCC 53567) com ácido S-(+)-2-metilbutírico dá origem à produção das avermectinas naturais Ala, A2a, Bla e B2a; fermentações de suplementação com ácido isobutirico dão origem à produção das avermectinas naturais Alb, A2b, Blb, e B2b; e fermentações de suplementação com ácido ciclopentanocarboxilico dão origem à produção das quatro novas ciclopentilavermectinas Al, A2, BI e B2.
Se forem suplementadas com outros ácidos gordos, produzir-se-ão novas avermectinas. Ao rastrear 800 precursores potenciais, foram identificadas mais de 60 outras novas avermectinas. (Ver, por exemplo, Dutton et al., 1991, J. Antibiot. 44:357-365; e Banks et al., 1994, Roy. Soc. Chem. 147:16-26). Além disso, mutantes de S. 4 ΡΕ1476539 avermitilis deficientes em actividade de 5-0-metil-transferase produzem essencialmente apenas as avermectinas análogas B. Consequentemente, mutantes de S. avermitilis a que faltem tanto a deshidrogenase do ácido 2-oxo de cadeia ramificada como a actividade da 5-0-metiltransferase produzem apenas as avermectinas B correspondendo ao ácido gordo utilizado para suplementar a fermentação. Assim, a suplementação desses duplos mutantes com ácido S-( + )-2-metilbutírico dá origem à produção de apenas as avermectinas naturais Bla e B2a, enquanto que a suplementação com ácido isobutirico ou com ácido ciclopentanocarboxílico dá origem à produção das avermectinas naturais Blb e B2b ou das novas avermectinas ciclopentil BI e B2, respecti-vamente. A suplementação da estirpe de mutação dupla com ácido ciclo-hexano carboxilico constitui um método preferido para a produção da nova avermectina comercialmente importante, ciclo-hexilavermectina BI (doramectina). 0
Isolamento e caracteristicas desses duplos mutantes, por exemplo S. avermitilis (ATCC 53692), é descrito em EP 276103. 2.2. Genes Envolvidos Na Biossintese De Avermectina
Em muitos casos, genes envolvidos na produção de metabolitos secundários e genes codificando um antibiótico particular são encontrados formando clusters entre sí no cromossoma. Isso acontece com o cluster de gene sintase de genes sintase poliquetido Streptomyces (PKS) (ver Hopwood and Sherman, 1990, Ann. Rev. Genet. 24:37-66). Assim, uma 5 ΡΕ1476539 estratégia para clonar genes numa via biossintética consistiu em isolar um gene de resistência a droga e em seguida testar regiões adjacentes do cromossoma quanto a outros genes relacionados com a biossintese desse antibiótico particular. Uma outra estratégia para clonar genes envolvidos na biossintese de metabolitos importantes consistiu na complementação de mutantes. Por exemplo, porções de uma biblioteca de DNA a partir de um organismo capaz de produzir um metabolito particular são introduzidas num mutante não-produtor e transformantes rastreados para produção de metabolitos. Adicionalmente, a hibridização de uma biblioteca usando sondas derivadas de outras espécies de Streptomyces foi usada para identificar e clonar genes em vias biossintéticas.
Genes envolvidos na biossintese de avermectina (genes ave), tal como os genes requeridos para biossintese de outros metabolitos secundários de Steptomyces (por exemplo, PKS), são encontrados formando clusters no cromossoma. Um certo número de genes ave foram clonados com sucesso usando vectores para complementar mutantes de S. avermitilis bloqueados na biossintese de avermectina. A clonagem desses genes é descrita na Patente dos E.U.A. No. 5.252.474. Além disso, Ikeda et al., 1995, J. Antibiot. 48:532-534, descreve a localização de uma região cromos-sómica envolvendo o passo de desidratação (aveC) até um fragmento BamRI 4,82 Kb de S. avermitilis, assim como mutações no gene aveC que dão origem à produção de um único produtor de componente B2a. Como a ivermectina, um potente 6 ΡΕ1476539 composto anti-helmintico, pode ser produzida quimicamente a partir de avermectina B2a, um tal único produtor de avermectina B2a é considerado como sendo particularmente útil para produção comercial de ivermectina. A Patente dos E.U.A. No. 6.248.579 por Stutzman-Engwall et al., publicada em 19 de Junho de 2001, descreve certas mutações para o gene aveC de Streptomyces avermitilis levando a uma redução na proporção ciclo-hexil B2:ciclo-hexil BI até uma proporção de cerca de 0,75:1. A Publicação PCT WO 01/12821 por Pfizer Products Inc., publicada em 22 de Fevereiro de 2001, descreve certas mutações adicionais para o gene aveC de Streptomyces avermitilis levando a posteriores reduções na proporção entre ciclo-hexil B2:ciclo-hexil BI até 0,40:1. A identificação de mutações adicionais ou de combinações de mutações no gene aveC que ainda minimizam mais a complexidade da produção de avermectina, tal como, por exemplo, mutações que diminuam mais a proporção B2:B1 de avermectinas, iria simplificar a produção e purificação de avermectinas comercialmente importantes.
SUMÁRIO DO INVENTO 0 presente invento proporciona uma molécula de polinucleótido compreendendo uma sequência de nucleótidos que é por outro lado igual ao alelo de aveC de Streptomyces 7 ΡΕ1476539 avermitilis, a sequência que codifica o produto gene AveC de S. avermitilis de plasmideo pSE186 (ATCC 209604) ou a sequência de nucleótidos do ORF aveC de S. avermitilis tal como é apresentada na FIGURA 1 (SEQ ID NO:l), ou uma sua variante degenerada, mas cuja sequência de nucleótidos compreende ainda mutações que codificam uma combinação de substituições de aminoácido em resíduos de aminoácidos correspondendo às posições de aminoácidos de SEQ ID NO: 2, de modo a que as células de S.avermitilis da estirpe ATCC 53692 em que o alelo aveC do tipo selvagem tenha sido inactivado e que expresse a molécula de polinucleótido compreendendo a sequência de nucleótidos com mutação sejam capazes de produzir uma proporção da classe 2:1 de avermectinas que seja reduzida em comparação com a proporção produzida por células da estirpe S. avermitilis ATCC 53692 que pelo contrário expressam apenas o alelo aveC do tipo selvagem, em que que quando as avermectinas da classe 2:1 são avermectinas ciclo-hexil B2:ciclo-hexil Bl, a proporção das avermectinas da classe 2:1 seja de 0,35:1 ou menor. Numa forma de realização mais preferida, a proporção entre avermectinas ciclo-hexil B2:ciclo-hexil Bl é de cerca de 0,30:1 ou inferior. Numa forma de realização mais preferida, a proporção entre avermectinas ciclo-hexil B2:ciclo-hexil Bl é de cerca de 0,25:1 ou inferior. Numa forma de realização mais preferida, a proporção entre avermectinas ciclo-hexil B2:ciclo-hexil Bl é de cerca de 0,20:1 ou inferior.
Numa sua forma de realização particular, a ΡΕ1476539 combinação de substituições de aminoácido compreende uma combinação seleccionada de entre o grupo consistindo em: (a) D48E, A61T, A89T, S138T, A139T, G179S, A198G, P289L } (b) G40S, D48E, L136P, G179S, E238D; (c) D48E, L136P, R163Q, G179S; (d) D48E, L136P, R163Q, G179S, E238D; (e) D48E, L136P, R163Q, A200G, E238D; (f) D48E, L136P, G179S, E238D; (g) D48E, A61T, L136P, G179S, E238D; (h) D48E, A61T, L136P, G179S; (i) D48E, A89T, S138T, A139T, G179S; (j) D48E, A61T, L136P, G179S, A198G, P202S, E238D, P289L f (k) D48E, A61T, L136P, S138T, A139F, G179S, E238D, P289L } (1) D48E, L136P, G179S, A198G, E238D, P289L; (m) D48E, A61T, S138T, A139F, G179S, A198G, P289L f (n) D48E, L84P, G111V, S138T, A139T, G179S, A198G, P289L } (o) Y28C, D48E, A61T, A89T, S138T, A139T, G179S, E238D; (p) D48E, A61T, A107T, S108G, L136P, G179S, S192A, E238D , (q) P289L; (r) D48E, L136P, G179S, R250W; (s) D48E, A89T, S138T, A139T, R163Q, G179S; (t) D48E, L136P, G179S, A198G, P289L; (u) D48E, F78L, A89T, L136P, G179S; (V) D48E, A89T, S138T, A139T, G179S, E238D, F278L } 9 ΡΕ1476539 (w) D48E, A89T, L136P, R163Q, G179S; (χ) D48E, A61T, A89T, G111V, S138T, A139F, G179S, E238D, P289L } (y) D25G, D48E, A89T, L136P, S138T, A139T, V141A, I159T, R163Q !, G179S; (z ) D48E, A89T, S90G, L136P, R163Q, G179S , E238D; D48E , A61T , A89T, G111V, S138T, A139T, G179S, E238D, P289L; (aa) D48E, A89T, S138T, A139T, G179S; (ab) D84E, L136P, R163Q, G179S, S231L; (ac) D48E, L136P, S138T, A139F, G179S, V196A, E238D; (ad) D48E, A61T, A89T, F99S, S138T, A139T, G179S, E238D; (ae) G35S, D48E, A89T, S138T, A139T, G179S , P289L; (af) D48E, A61T, A89T, S138T, A139T, G179S, V196A, E238D; (ag) D48E, A89T, G111T, S138T, A139T, G179S, A198G, E238D; (ah) S41G, D48E, A89T, L136P, G179S; (ai) D48E, A89T, L136P, R163Q, G179S, P252S; (aj ) D48E, A89T, L136P, G179S, F234S; (ak) D48E, A89T, L136P, R163Q, G179S, E238D; (al) Q63R, D48E, A89T, L136P, G179S, E238D } (am) D48E, A89T, L136P, R163Q, G179S; (an) D48E, A89T, S138T, G179S; (ao) D48E, A89T, L136P, G179S, E238D; (ap) D48E, A89T, L136P, K154E, G179S, E238D; (aq) D48E, A89T, S138T, A139T, K154R, G179S, V196A, P289L; (ar) D48E, A89T, S138T, A139F, G179S, V196A, E238D } 10 ΡΕ1476539 (as) D48E, A61T, A89T, L136P, G179S, V196A, A198G, P289L; (at) D48E, A61T, S138T, A139F, G179S, G196A, E238D, P289L; (au) D48E, A89T, L136P, G179S; (av) D48E, A89T, V120A, L136P, G179S; (aw) D48E, A61T, A89T, S138T, A139F, G179S, V196A, A198G, E238D; (ax) D48E, A61T, A89T, G111V, S138T, A139F, G179S, V196A, E238D; (ay) D48E, A61T, A89T, S138T, A139T, G179S, V196A, E238D, P289L; (az) D48E, A61T, A89T, L136P, S138T, A139F, G179S, A198G, E238D; (ba) D48E, A89T, S138T, A139F, G179S, A198G, V220A } D48E , A61T , A89T, S138T, A139T, G179S, V196A, E238D, R239H, P289L; (bc) D48E, A61T, A89T, L136P, G179S, P289L r (bd) D48E, A89T, S138T, A139T, G179S, V196A, E238D, P289L; e (be) D48E, A61T, A89T, S138T, A139F, G179S, V196A, E238D. O presente invento proporciona ainda uma molécula de polinucleótido compreendendo uma sequência de nucleótidos que é por outro lado a mesma que o alelo aveC de Streptomyces avermitilis, a sequência codificando produto AveC de S. avermitilis de plasmideo pSE 186 (ATCC 209604) ou a sequência de nucleótidos do ORF aveC de S. 11 ΡΕ1476539 avermitilis tal como está presente na FIGURA 1 (SEQ IDNO:l), ou uma sua variante degenerada, mas cuja sequência de nucleótidos compreende ainda mutações codificando uma combinação de substituições de resíduos de aminoácidos correspondendo às posições de aminoácido de SEQ ID NO:2, de modo a que as células de S. avermitilis da estirpe ATCC 53692 em que o alelo aveC do tipo selvagem tenha sido inactivado e que expresse uma molécula de polinucleótido compreendendo a sequência de nucleótidos submetida a mutação seja capaz de produzir uma proporção 2:1 de avermectinas que seja reduzida em comparação com a proporção produzido por células da estirpe S. avermitilis ATCC 53692 que como alternativa expresse apenas o alelo aveC do tipo selvagem em que quando a classe de avermectinas 2:1 seja constituída por avermectinas ciclo-hexil B2:ciclo-hexil Bl, a proporção das avermectinas da classe 2:1 seja reduzido até cerca de 0,40:1 ou inferior, e em que a combinação de substituições de aminoácido compreenda uma combinação seleccionada de entre o grupo consistindo em: (bf) D48E, S138T, A139T, G179S, E238D; e (bg) Y28C, Q38R, D48E, L136P, G179S, E238D. O presente invento proporciona ainda um vector recombinante compreendendo uma molécula de polinucleótido do presente invento. O presente invento proporciona ainda uma célula 12 ΡΕ1476539 hospedeiro compreendendo uma molécula de polinucleótidos ou um vector recombinante do presente invento. Numa forma de realização preferida, a célula hospedeiro é uma célula de Streptomyces. Numa forma de realização mais preferida, a célula hospedeira é uma célula de Streptomyces avermitilis. 0 presente invento proporciona ainda um método para produzir uma nova estirpe de Streptomyces avermitilis, compreendendo (i) mutação do alelo aveC numa célula de um estirpe de S. avermitilis, cuja mutação dá origem a uma combinação de substituições de aminoácido no produto gene AveC, ou (ii) introduzindo para uma célula de uma estirpe de S. avermitilis um alelo aveC submetido a mutação ou uma sua variante degenerada codificando um produto gene AveC compreendendo uma combinação de substituições de aminoácido, em que a combinação de substituições de aminoácido é seleccionada de entre (a) até (b) acima indicados. 0 presente invento proporciona ainda um método para produzir uma nova estirpe de Streptomyces avermitilis, compreendendo (i) mutação do alelo aveC numa célula de uma estirpe de S. avermitilis, cuja mutação dá origem a uma combinação de substituições de aminoácido no produto gene AveC, ou (ii) introduzindo numa célula de uma estirpe de S. avermitilis um alelo aveC submetido a mutação ou uma sua variante degenerada codificando um produto gene AveC compreendendo uma combinação de substituições de aminoácido, em que células compreendendo o alelo aveC submetido a mutação ou uma sua variante degenerada sejam capazes de 13 ΡΕ1476539 produzir avermectinas ciclo-hexil B2:ciclo-hexil BI numa proporção de 0,35:1 ou inferior. Numa sua forma de realização não limitativa, o alelo aveC submetido a mutação ou uma sua variante degenerada codifica um produto gene AveC compreendendo uma combinação de substituições de aminoácido seleccionada de entre o grupo consistindo em (a) a (b) acima indicados.
Numa sua forma de realização preferida, a proporção de avermectinas ciclo-hexil B2:ciclo-hexil BI é de cerca de 0,30:1 ou inferior. Numa forma de realização não limitativa, o alelo aveC ou uma sua variante degenerada codifica um produto gene AveC compreendendo uma combinação de substituições de aminoácido seleccionada de entre o grupo consistindo em de (f) a (be) acima indicados.
Numa sua forma de realização preferida. A proporção de avermectinas ciclo-hexil B2:ciclo-hexil BI é de cerca de 0,25:1 ou inferior. Numa forma de realização não limitativa, o alelo aveC submetido a mutação ou uma sua variante degenerada codifica um produto gene AveC compreendendo uma combinação de substituições de aminoácido seleccionada de entre o grupo consistindo em de (w) a (be) acima indicados.
Numa sua forma de realização mais preferida, a proporção de avermectinas ciclo-hexilB2:ciclo-hexil BI é de cerca de 0,20:1 ou inferior. Numa forma de realização não limitativa, o alelo aveC submetido a mutação ou uma sua 14 ΡΕ1476539 variante degenerada codifica um produto gene AveC compreendendo uma combinação de substituições de aminoácido seleccionada de entre o grupo consistindo em de (ao) a (be) acima indicados. 0 presente invento proporciona ainda um método para produzir uma nova estirpe de Streptomyces avermitilis, compreendendo (I) mutação do alelo aveC numa célula de uma estirpe de S. avermitilis, cuja mutação dá origem a uma combinação de substituições de aminoácido no produto gene AveC, ou (ii) introduzindo numa célula de uma estirpe de S. avermitilis um alelo aveC submetido a mutação ou uma sua variante degenerada codificando um produto gene AveC compreendendo uma combinação de substituições de aminoácido, em que a combinação de substituições de aminoácido é seleccionada de entre o grupo consistindo em (bf) e (bg) acima indicados. Numa sua forma de realização preferida, células de S. avermitilis compreendendo esse alelo aveC submetido a mutação ou uma sua variante degenerada são capazes de produzir avermectinas ciclo-hexil B2:ciclo-hexil BI numa proporção de cerca de 0,40:1 ou inferior. O presente invento proporciona ainda uma célula de uma espécie de Streptomyces que compreende um alelo aveC de S. avermitilis submetido a mutação ou uma sua variante degenerada codificando um produto gene AveC compreendendo uma combinação de substituição de aminoácido seleccionada de entre (a) a (be) acima indicados. Numa sua forma de realização preferida, a espécie de Streptomyces é S. avermitilis. 15 ΡΕ1476539 0 presente invento proporciona ainda uma célula de Streptomyces avermitilis capaz de produzir avermectinas ciclo-hexil B2:ciclo-hexil BI numa proporção de 0,35:1 ou inferior. Numa sua forma de realização não limitativa, a célula compreende um alelo aveC submetido a mutação ou uma sua variante degenerada codificando um produto gene AveC compreendendo uma combinação de substituições de aminoácido seleccionada de entre o grupo consistindo em de (a) a (be) acima indicados.
Numa sua forma de realização preferida, a proporção de avermectinas ciclo-hexil B2:ciclo-hexil BI é de cerca de 30:1 ou inferior. Numa sua forma de realização não limitativa, as células compreendem um alelo aveC submetido a mutação ou uma sua variante degenerada codificando um produto gene AveC compreendendo uma combinação de substituições de aminoácido seleccionada de entre o grupo consistindo em de (f) a (be) acima indicados.
Numa sua forma de realização mais preferida, a proporção de avermectinas ciclo-hexil B2:ciclo-hexil BI é de cerca de 0,25:1 ou inferior. Numa sua forma de realização não limitativa, as células compreendem um alelo aveC submetido a mutação ou uma sua variante degenerada codificando um produto gene AveC compreendendo uma combinação de substituições de aminoácido seleccionada de entre o grupo consistindo em de (w) a (be) acima indicados. 16 ΡΕ1476539
Numa sua forma de realização mais preferida, a proporção de avermectinas ciclo-hexil B2:ciclo-hexil BI é de cerca de 0,20:1 ou inferior. Numa sua forma de realização não limitativa, as células compreendem um alelo aveC submetido a mutação ou uma sua variante degenerada codificando um produto gene AveC compreendendo unma combinação de substituições de aminoácido seleccionada de entre o grupo consistindo em de (ao) a (be) acima indicados. 0 presente invento proporciona ainda uma espécia de Streptomyces, compreendendo um alelo aveC de S. avermitilis ou uma sua variante degenerada codificando um produto gene AveC compreendendo uma combinação de substituições de aminoácido seleccionada de entre o grupo consistindo em (bf) e (bg) acima indicados. Numa sua forma de realização preferida, a espécie de Streptomyces é S. avermitilis. Numa forma de realização mais preferida, a célula é uma célula de S. avermitilis capaz de produzir avermectinas ciclo-hexil B2:ciclo-hexil BI numa proporção de cerca de 0,40:1 ou inferior. 0 presente invento proporciona ainda um processo para a produção de avermectinas, compreendendo a cultura de uma estirpe de células de Streptomyces avermitilis do presente invento em meio de cultura em condições que permitam ou induzam a produção de avermectinas a partir dela, e recuperando as referias avermectinas a partir da cultura. 17 ΡΕ1476539 0 presente invento proporciona ainda uma composição de avermectinas ciclo-hexil B2:ciclo-hexil BI produzidas por células de Streptomyces avermitilís, compreendendo as avermectinas ciclo-hexil B2:ciclo-hexil BI presentes num meio de cultura em que as células tenham sido cultivadas, em que a proporção de avermectinas ciclo-hexil B2: ciclo-hexil BI presente no meio de cultura seja de 0,35:1 ou inferior, de preferência de cerca de 0,30:1 ou inferior, com maior preferência cerca de 0,25:1 ou inferior, e com maior preferência cerca de 0,20:1 ou inferior. Numa forma de realização particular, a composição de avermectinas ciclo-hexil B2:ciclo-hexil Bl é produzida por células de uma estirpe de S. avermitilís que expressa um alelo aveC submetido a mutação ou uma sua variante degenerada que codifica um produto gene que dá origem à redução da proporção da classe 2:1 de avermectinas ciclo-hexil B2:ciclo-hexil Bl produzido pelas células em comparação com células da mesma estirpe de S. avermitilís que não expressam o alelo aveC submetido a mutação mas em vez disso expressam apenas o alelo aveC do tipo selvagem.
Numa sua forma de realização preferida, onde a composição é constituída por avermectinas ciclo-hexil B2:ciclo-hexil Bl numa proporção de 0,35:1 ou inferior, a composição é produzida por células compreendendo um alelo aveC submetido a mutação ou uma sua variante degenerada codificando um produto gene AveC compreendendo uma combinação de substituições de aminoácido seleccionada de entre o grupo consistindo em de (a) a (be) acima indicados. 18 ΡΕ1476539
Numa outra sua forma de realização preferida, onde a composição é constituída por avermectinas ciclo-hexil B2:ciclo-hexil BI numa proporção de cerca de 0,30:1 ou inferior, a composição é produzida por células compreendendo um alelo aveC submetido a mutação ou uma sua variante degenerada codificando um produto gene AveC compreendendo uma combinação de substituições de aminoácido seleccionada de entre o grupo consistindo em de (f) a (be) acima indicados.
Numa outra sua forma de realização preferida, onde a composição é constituída por avermectinas ciclo-hexil B2:ciclo-hexil BI numa proporção de cerca de 0,25:1 ou inferior, a composição é produzida por células compreendendo um alelo aveC submetido a mutação ou uma sua variante degenerada codificando um produto gene AveC compreendendo uma combinação de substituições de aminoácido seleccionada de entre os grupos consistindo em de (w) a (be) acima indicados.
Numa outra sua forma de realização preferida, onde a composição é constituída por avermectinas ciclo-hexil B2:ciclo-hexil BI numa proporção de 0,20:1 ou inferior, a composição é produzida por células compreendendo um alelo aveC submetido a mutação ou uma sua variante degenerada codificando um produto gene AveC compreendendo uma combinação de substituições de aminoácido seleccionada de entre o grupo consistindo em de (ao) a (be) acima indicados. 19 ΡΕ1476539 0 presente invento proporciona ainda uma composição constituída por avermectinas ciclo-hexil B2:ciclo-hexil BI produzidas por células de Streptomyces avermitilis, compreendendo as avermectinas ciclo-hexil B2: ciclo-hexil BI presentes num meio de cultura em que as
células tenham sido cultivadas, em que a proporção de avermectinas ciclo-hexil B2:ciclo-hexil BI presentes no meio de cultura seja de cerca de 0,40:1 ou inferior, e produzidas por células compreendendo um alelo aveC submetido a mutação ou uma sua variante degenerada codificando um produto gene AveC compreendendo uma combinação de substituições de aminoácido seleccionada de entre o grupo consistindo em (bf) e (bg) acima indicados.
DESCRIÇÃO RESUMIDA DAS FIGURAS FIGURA 1. Sequência de DNA (SEQ ID NO:1) compreendendo ORF aveC S. avermitilis, e sequência de aminoácido deduzida (SEQ ID NO:2) FIGURA 2. Vector de plasmídeo pSE186 (ATCC 209604) compreendendo a totralidade de ORF do gene aveC de S. avermitilis. FIGURA 3. Vector de substituição de gene pSE180 (ATCC 209605) compreendendo o gene ermE de Sacc. erythraea inserido no ORF aveC de S. avermitilis. 20 ΡΕ1476539 FIGURA 4. Mapa de restrição BamRl do cluster de gene de sintase poliquetido de avermectina a partir de S. avermitilis com cinco clones cosmidios sobrepostos identificados (isto é, pSE65, pSE66, pSE67, pSE68, pSE69). A relação de pSE118 e pSE119 é também indicada. FIGURA 5. Análise por HPLC de produtos de fermentação produzidos por estirpes de S. avermitilis. A quantificação de pico foi realizada por comparação com quantidades padrão de ciclo-hexil Bl. O tempo de retenção de ciclo-hexil B2 foi de 7,4-7,7 minutos; o tempo de retenção de ciclo-hexil Bl foi de 11,9-12,3 minutos. FIG. 5A Estirpe de S. avermitilis SE180-11 com um ORF aveC inactivado. FIG. 5B. estirpe de S. avermitilis SE180-11 transformado com pSE187. FIG. 5D. Estirpe de S. avermitilis SE180-11 transformado com pSE188. FIGURA 6A-M. Lista combinada de combinações de substituições de aminoácido codificada por mutações com o alelo aveC tal como foi identificado por uma segunda volta de "rearranjo de gene", e seus efeitos sobre a proporção de produção de ciclo-hexil B2:ciclo-hexil Bl. Para cada plasmideo, na coluna com o titulo "Mutações", a caixa superior indica as substituições de aminoácido, e a caixa inferior indica as modificações da base de nucleótido que dão origem a essas substituições de aminoácido. As modificações da base de nucleótido em parênteses são modificações silenciosas, isto é, não dão origem a modificações para a sequência de aminoácidos. 21 ΡΕ1476539
DESCRIÇÃO DETALHADA DO INVENTO 0 presente invento relaciona-se com a identificação e caracterização de moléculas de polinucleótido apresentando sequências de nucleótidos que codificam o produto gene AveC a partir de Streptomyces avermitilis, a construção de novas estirpes de S. avermitilis que podem ser usadas para rastrear produtos de gene AveC submetido a mutação quanto ao seu efeito sobre a produção de avermectina, e a descoberta de que certos produtos de gene AveC submetido a mutação pode reduzir a proporção de avermectinas B2:B1 produzidas por S. avermitilis. A título de exemplo, o invento é descrito nas secções mais abaixo para uma molécula de polinucleótido tendo quer uma sequência de nucleótido que é igual à sequência de codificação do produto gene AveC de S. avermitilis de plasmídeo pSE186 (ATCC 209604), quer a sequência de nucleótidos do ORF da FIGURA 1 (SEQ ID NO:l), e para moléculas de polinucleótidos apresentando sequências de nucleótidos deles derivados e suas variantes degeneradas. Contudo, os princípios indicados no presente invento podem ser aplicados de um modo análogo a outras moléculas de polinucleótidos, incluindo genes de homólogo aveC a partir de outra espécie de Streptomyces, por exemplo, S. hygroscopicus e S. griseochromogenes, entre outros.
Moléculas de Polinucleótido Codificando o Produto Gene AveC De S. avermitilis O presente invento proporciona uma molécula 22 ΡΕ1476539 isolada de polinucleótido compreendendo o ORF aveC completo de S. avermitilis ou uma sua porção substancial, a cuja molécula isolada de polinucleótido falta o ORF completo seguinte que está localizado para baixo a partir do ORF aveC in situ no cromossoma de S. avermitilis. A molécula isolada de polinucleótido do presente invento compreende de preferência uma sequência de nucleótidos que é igual à sequência que codifica o produto gene AveC de S. avermitilis de plasmideo pSE186 (ATCC 209604), ou que é igual à sequência de nucleótido do ORF da FIGURA 1 (SEQ ID NO: 1) ou uma sua porção substancial. Tal como é aqui usada, uma "porção substancial" de uma molécula isolada de polinucleótido compreendendo uma sequência de nucleótido codificando o produto gene AveC de S. avermitilis significa uma molécula isolada de polinucleótido compreendendo pelo menos cerca de 70% da sequência ORF aveC completa apresentada na FIGURA 1 (SEQ ID NO:l), e que codifica um produto gene AveC funcionalmente equivalente. A este respeito, um produto gene AveC "funcionalmente equivalente" é definido como um produto gene que, quando expresso na estirpe ATCC 53692 de S. avermitilis em que o alelo aveC nativo tenha sido inactivado, dá origem à produção de uma proporção e quantidade de avermectinas substancialmente iguais às avermectinas produzidas por estirpe de S. avermitilis ATCC 53692 que em alternativa expressa apenas o alelo nativo aveC funcional, do tipo selvagem para a estirpe S. avermitilis ATCC 53692. 23 ΡΕ1476539
Para além da sequência de nucleótidos do ORF aveC, a molécula isolada de polinucleótido do presente invento pode ainda compreender sequências de nucleótidos que naturalmente flanqueam o gene aveC in situ no S. avermitilis, tais como as que flanqueiam sequências de nucleótidos apresentadas na FIGURA 1 (SEQ ID N0:1). 0 presente invento proporciona ainda uma molécula isolada de polinucleótido compreendendo a sequência de nucleótido de SEQ ID N0:1 ou uma sua variante degenerada, tendo como base a degenerescência conhecida do código genético.
Tal como são aqui usados, os termos "molécula de polinucleótido," "sequência de polinucleótidos," "esquema de abertura aberta," e "ORF" pretendem referir-se às moléculas tanto de DNA como de RNA, que podem ter hélice simples ou hélice dupla, e que podem ser (DNA) transcritos e traduzidos, ou (RNA) traduzido, para um produto gene AveC, ou para um polipeptideo que seja homólogo para um produto gene AveC num sistema de expressão de célula hospedeira apropriada quando colocado sob o controlo de elementos reguladores apropriados. Uma sequência de codificação pode incluir mas não se limita a sequências procariontes, sequências cDNA, sequências de DNA genómicas, e sequências de DNA e de RNA sintetizadas quimicamente.
A sequência de nucleótidos apresentada na FIGURA 24 ΡΕ1476539 1 (SEQ ID NO:1)compreende quatro codões GTG diferentes em posições bp 42, 174, 177 e 180. Tal como foi previamente descrito na Patente dos E.U.A. No. 6.248.579, múltiplas deleções da região 5' do ORF aveC (FIGURA 1; SEQ ID NO.:l)foram construídas para ajudar a definir qual dos codões poderia funcionar no aveC ORF como sítios de partida para expressão proteica. A delecção do primeiro sítio GTG a bp 42 não elimina a actividade AveC. Delecção adicional de todos os codões GTG nas posições bp 174, 177 e 180 em conjunto eliminaram a actividade de AveC, indicando que esta região é necessária para expressão proteica. O presente invento abrange assim ORFs aveC de amplitude variável. O presente invento proporciona ainda uma molécula de polinucleótido tendo uma sequência de nucleótidos que é homologa em relação à sequência que codifica o produto gene AveC de S. avermitilis de plasmídeo pSE186 (ATCC 209604), ou em relação à sequência de nucleótidos do ORF aveC apresentado na FIGURA 1 (SEQ ID NO:l) ou uma sua porção substancial. O termo "homólogo" quando usado para se referir a uma molécula de polinucleótido que seja homóloga em relação a uma sequência que codifica produto gene AveC de S. avermitilis significa uma molécula de polinucleótido tendo uma sequência de polinucleótidos: (a) que codifique o mesmo produto gene AveC tal como a sequência de codificação de produto gene AveC de S. avermitilis de plasmídeo pSE186 (ATCC 209504), ou que codifique o mesmo produto gene AveC que a sequência de nucleótidos do ORF aveC apresentado na 25 ΡΕ1476539 FIGURA 1 (SEQ ID NO:1), mas que inclua uma ou mais modificações silenciosas de acordo com a degenerescência do código genético (isto é, uma variante degenerada); ou (b) que hibridize para o complemento de uma molécula de polinucleótido tendo uma sequência de nucleótidos que codifique a sequência de aminoácido codificada pela sequência de codificação de produto gene AveC do plasmídeo pSE186 (ATCC 209604) ou que codifique a sequência de aminoácidos apresentada na FIGURA 1 (SEQ ID NO:2) em condições moderadamente rigorosas, isto é, hibridização para DNA ligado por filtração em NaHP04 0,5 M, sulfato de dodecilo de sódio (SDS) a 7%, EDTA 1 mM a 65° C, e lavagem em 0,2xSSC/0,l% SDS a 42° C (ver Ausubel et al. (eds.), 1989, Current Protocols in Molecular Biology, Vol. 1, Green Publishing Associates, Inc., e John Wiley & Sons, Inc., New York, na p. 2.10.3), e codifica um produto gene AveC funcionalmente equivalente tal como foi acima definido. Numa forma de realização preferida, a molécula de polinucleótido homólogo hibridiza para o complemento da sequência de nucleótidos que codifica o produto gene AveC de plasmídeo pSE186 (ATCC 209604) ou para o complemento da sequência de nucleótidos do aveC ORF apresentado na FIGURA 1 (SEQ ID N0:1) ou uma sua porção substancial em condições altamente rigorosas, isto é, hibridização para DNA ligado por filtração em NaHP04 0,5 M, SDS a 7%, EDTA 1 mM a 65° C, e lavagem em 0,lxSSC/0,l% SDS a 68° C (Ausubel et al., 1989, acima referido), e codifica um produto gene AveC funcionalmente equivalente, tal como foi acima definido. 26 ΡΕ1476539 A actividade de um produto gene AveC e de seus equivalentes funcionais potenciais pode ser determinada através de análise HPLC de produtos de fermentação, tal como será descrito nos exemplos apresentados mais abaixo. Moléculas de polinucleótido tendo sequências de nucleótido que codificam equivalentes funcionais do gene AveC de S. avermitilis podem incluir genes AveC que ocorram naturalmente presentes noutras estirpes de S. avermitilis, com genes aveC homólogos presentes noutras espécies de Streptomyces, e sofrendo mutação com alelos aveC, quer ocorrendo naturalmente quer ocorrendo por engenharia. 0 presente invento proporciona ainda uma molécula de polipeptídeo compreendendo uma sequência de nucleótidos que codifica um polipeptídeo tendo uma sequência de aminoácidos que seja homóloga em relação à sequência de aminoácidos codificada pela sequência que codifica produto gene AveC de plasmídeo pSE186 (ATCC 209604), ou a sequência de aminoácido da FIGURA 1 (SEQ ID NO: 2) ou sua porção substancial. Tal como é aqui usada "porção substancial" da sequência de aminoácidos da FIGURA 1 (SEQ ID NO:2) significa um polipeptídeo compreendendo pelo menos cerca de 70% da sequência de aminoácidos apresentada na FIGURA 1 (SEQ ID NO:2), e que constitui um produto gene AveC funcionalmente equivalente, tal como foi acima definido.
Tal como é aqui usado para se referir a sequências de aminoácido que sejam homólogas em relação à sequência de aminoácidos de um produto gene AveC de S. 27 ΡΕ1476539 avermitilis, o termo "homólogo" refere-se a um polipeptídeo o qual de outro modo tem a sequência de aminoácidos da FIGURA 1 (SEQ ID NO: 2) , mas em que um ou mais resíduos de aminoácido tenha(m) sido substituído(s) de um modo moderado com um resíduo de aminoácido diferente, em que a sequência de aminoácidos tem pelo menos cerca de 70%, com maior preferência pelo menos cerca de 80%, e com a maior preferência pelo menos cerca de 90% de identidade de sequência de aminoácidos para o polipeptídeo codificado pela sequência que codifica o produto gene AveC de plasmídeo pSEl86 (ATCC 209604) ou a sequência de aminoácidos da FIGURA 1 (SEQ ID NO: 2) tal como é determinado por qualquer algoritmo de identidade de sequência de aminoácidos padrão, tal como o algoritmo BLASTP (GENBANK, NCBI), e onde essa substituição moderada dá origem a um produto gene funcionalmente equivalente, tal como foi acima definido. Substituições moderadas de aminoácido são bem conhecidas nesta técnica. Regras para fazer essas substituições incluem as descritas por Dayhof, M.D., 1978, Nat. Biomed. Res. Found., Washington, D.C., Vol. 5, Sup. 3, entre outros. Mais especificamente, substituições moderadas de aminoácido são aquelas que geralmente têm lugar numa família de aminoácidos que estão relacionados com a acidez ou com a polaridade. Amino ácidos codificados geneticamente são geralmente divididos em quatro grupos: (1) acídico = aspartato, glutamato; (2) básico = lisina, arginina, histidina; (3) não polar = alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenil-alanina, metionina, triptofan; e (4) polar não carregado = 28 ΡΕ1476539 glicina, asparagina, glutamina, cisteina, serina, treonina, tirosina. Fenilalanina, triptofan e tirosina são também classificados em conjunto como aminoácidos aromáticos. Uma ou mais substituições em qualquer grupo particular, por exemplo, de uma leucina com uma isoleucina ou valina, ou de um aspartato com um glutamato, ou de uma treonina com uma serina, ou de qualquer outro resíduo de aminoácido com um resíduo de aminoácido estruturalmente afim, por exemplo, um resíduo de aminoácido com acidez ou polaridade semelhante, ou com semelhança nalguma sua combinação, terão geralmente um efeito insignificante sobre a função do polipeptideo. A produção e manipulação das moléculas de polinu-cleótido aqui apresentadas são evidentes para qualquer especialista nesta técnica e podem ser realizadas de acordo com técnicas recombinantes descritas, por exemplo, em Maniatis, et al., 1989, Molecular Cloninq, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY; Ausubel, et al., 1989, Current Protocols In Molecular Bioloqy, Greene Publishing Associates & Wiley Interscience, NY; Sambrook, et al., 1989, Molecular Cloninq: A Laboratory Manual, 2d ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY; Innis et al., (eds), 1995, PCR Strateqies, Academic Press, Inc., San Diego; e Erlich (ed), 1992, PCR Technology, Oxford University Press, New York, sendo todos eles aqui incorporados como referência. Clones de polinucleótido codificando produtos de gene homólogo AveC podem ser identificados usando qualquer método conhecido nesta 29 ΡΕ1476539 técnica, incluindo mas não se limitado aos métodos indicados na Secção 7, mais abaixo. Bibliotecas de DNA genómico podem ser rastreadas para aveC e sequências de codificação homóloga de aveC usando técnicas tais como os métodos indicados em Benton and Davis, 1977, Science 196:180, para bibliotecas bacteriofagas, e em Grunstein and Hogness, 1975, Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 72:3961-3965, para bibliotecas de plasmideos. Moléculas de polinucleó-tidos tendo sequências de nucleótidos conhecidas por incluírem ORF aveC, como é evidente, por exemplo, em plasmídeo pSE186 (ATCC 209604), ou em plasmídeo pSE119 (descrito na Secção 7, mais abaixo), podem ser usadas como sondas nessas experimentações de rastreio. De um modo alternativo, podem ser sintetizadas sondas de oligonucleó-tidos que correspondem a sequências de nucleótidos deduzidas a partir de sequências de aminoácidos parciais ou completas do produto gene homólogo AveC purificado.
Sistemas Recombinantes Clonagem E Vectores de Expressão O presente invento proporciona ainda vectores de clonagem recombinante e vectores de expressão que são úteis na clonagem ou expressão de moléculas de polinucleótidos do presente invento, compreendendo, por exemplo, o ORF aveC de S. avermitilis ou qualquer ORFs homólogo aveC. Numa forma de realização não limitativa, o presente invento proporciona plasmídeo pSE186 (ATCC 209604), que compreende o ORF completo do gene aveC de S. avermitilis. 30 ΡΕ1476539
Toda a descrição que se segue no que se refere a ORF aveC de S. avermitilis, ou uma molécula de polinu-cleótido compreendendo o ORF aveC de S. avermitilis ou sua porção, ou um produto gene AveC de S. avermitilis, também se refere a alelos aveC com mutação tal como é descrito mais abaixo, a não ser que seja indicado de um modo explicito ou por contexto.
Foi desenvolvida uma série de diferentes vectores para utilização especifica em Streptomyces, incluindo fago, plasmideos com elevado número de cópias, plasmideos com baixo número de cópias, e vectores de vai-vem de E.coli-Streptomyces, entre outros, e qualquer um destes poderá ser usado para realizar o presente invento. Um certo número de genes de resistência a droga foi também clonado a partir de Streptomyces, e vários destes genes foram incorporados para vectores como marcadores que se possam seleccionar. São apresentados exemplos de vectores correntes para utilização em Streptomyces, entre outros locais, em Hutchinson, 1980, Applied Biochem. Biotech. 16:169-190.
Vectores recombinantes do presente invento, particularmente vectores de expressão, são de preferência construídos de modo a que a sequência de codificação para a molécula de polinucleótido do invento se encontre em associação operativa com um ou mais elementos reguladores necessários para transcrição e translação da sequência de codificação para produzir um polipeptideo. Tal como é aqui 31 ΡΕ1476539 usado, o termo "elemento regulador" inclui mas não se limita a sequências de nucleótidos que codificam promotores induziveis e não induziveis, agentes que melhorem, operadores e outros elementos conhecidos nesta técnica que servem para conduzir e/ou regular a expressão das sequências de codificação do polinucleótido. Também, tal como é aqui usada, a sequência de codificação encontra-se em "associação operativa" com um ou mais elementos reguladores onde os elementos reguladores regulam efectivamente e permitem a transcrição da sequência de codificação ou a translação do seu mRNA, ou ambos.
Vectores de plasmideo típicos que podem ser submetidos a engenharia para conterem uma molécula de polinucleótido do presente invento incluem pCR-Blunt, pCR2.1 (Invitrogen) , pGEM3Zf (promega), e o vector de translação pWHN3 (Vara et al., 1989, J. Bact. 171:5872-5881), entre muitos outros. São bem conhecidos métodos nesta técnica para a construção de vectores recombinantes contendo sequências de codificação particulares em associação operativa com elementos reguladores apropriados, e estes podem ser usados para praticar o presente invento. Estes métodos incluem técnicas recombinantes in vitro, técnicas sintéticas, e recombinação genética in vivo. Ver, por exemplo, as técnicas descritas em Maniatis et al., acima referidos; Ausubel et al., 1989, acima referidos Sambrook et al., 1989, acima referidos; Innis et al., 1995, acima referidos; e Erlich, 1992, acima referido. 32 ΡΕ1476539
Os elementos reguladores destes vectores podem variar na sua intensidade e especificidades. Dependendo do sistema hospedeiro/vector utilizado, poderão ser usados quaisquer uns de um certo número de elementos de transcrição e de translação. Exemplos não limitativos de regiões ou promotores reguladores transcripcionais para bactérias incluem o promotor β-gal, o promotor T7, o promotor TAC, promotores λ esquerdos e direitos, promotores trp e lac, promotores de fusão trp-lac e, mais especificamente para Streptomyces, os promotores ermE, melC, e tipA, etc. Numa forma de realização específica, poderá ser gerado um vector de expressão que contenha o ORF aveC ou o seu ORF submetido a mutaçãoclonado adjacente a um promotor constitutivo forte, tal como o promotor ermE a partir de Saccharopolyspora erythraea. Tal como foi descrito na Patente dos E.U.A. No. 6.248.579, um vector compreendendo o promotor ermE foi transformado em S. avermitilis, e subsequentemente análise HPLC de produtos de fermentação indicou um título aumentado de avermectinas produzidas em comparação com a produção pela mesma estirpe a qual pelo contrário expressa apenas o alelo aveC do tipo selvagem.
Vectores de expressão de proteína de fusão podem ser usados para expressar uma proteína de fusão de produto gene AveC. A proteína de fusão purificada pode ser usada para aumentar antisoros contra o produto gene AveC, para estudar as propriedades bioquímicas do produto gene AveC, 33 ΡΕ1476539 para obter por engenharia proteínas de fusão AveC com diferentes actividades bioquímicas, ou para ajudar na identificação ou purificação do produto gene AveC expressado. Vectores de expressão de proteína de fusão possíveis incluem mas não se limitam a vectores incorporando sequências que codificam β-galactosidase e fusões trpE, fusões de maltose-proteína de ligação, fusões de glutationa-S transferase e fusões de poli-histidina (regiões de transporte). Numa forma de realização alternativa, um produto gene AveC ou uma sua porção poderão ser fundidos com um produto gene homólogo AveC, ou uma sua porção, derivada de outras espécies ou estirpe de Streptomyces, tais como, por exemplo, S. hygroscopicus ou S. griseochromogenes. Esses vectores híbridos podem ser transformados em células de S. avermítílís e testados para determinar o seu efeito, por exemplo, na avermectina produzida com proporção da classe 2:1.
Proteínas de fusão AveC podem ser submetidas a engenharia para compreender uma região útil para purificação. Por exemplo, fusões de AveC-maltose-proteína de ligação podem ser purificados usando resina de amilose; proteínas de fusão AveC-glutationa-S-transferase podem ser purificadas usando pérolas de glutationa-agarose; e fusões AveC-poli-histidina podem ser purificadas usando resina de níquel divalente. De um modo alternativo, anticorpos contra uma proteína ou peptídeo veículo podem ser usados para purificação por cromatografia de afinidade da proteína de fusão. Por exemplo, uma codificação de sequência de 34 ΡΕ1476539 nucleótido para o epítopo alvo de um anticorpo monoclonal pode ser submetido a engenharia para o vector de expressão em associação operativa com os elementos reguladores e situados para que o epitopo expresso seja fundido com o polipeptideo AveC. Por exemplo, uma codificação de sequência de nucleótido para a etiqueta de epitopo FLAG™ (International Biotechnologies Inc.), que é um peptideo marcador hidrofílico, pode ser inserida por meio de técnicas padrão no vector de expressão num ponto correspondendo, por exemplo, ao término carboxilo do polipeptideo AveC. 0 produto de fusão epitopo polipeptideo-FLAG™ pode então ser detectado e purificado por afinidade usando anticorpos anti-FLAG™ disponíveis. 0 vector de expressão codificando a proteína de fusão AveC pode também ser submetida a engenharia para conter sequências de poliligação que codificam sítios de clivagem de protease específica de modo a que o polipetideo AveC expressado possa ser libertado a partir da região veículo ou parceiro de fusão por tratamento com uma protease específica. Por exemplo, o vector da proteína da fusão pode incluir sequências de DNA codificando trombina ou sítios de clivagem de factor Xa, entre outros.
Uma sequência sinal a montante de, e numa grelha de leitura com, o ORF aveC pode ser submetido a engenharia para o vector de expressão por métodos conhecidos para dirigir o transito e secreção do produto gene expresso. Exemplos não limitativos de sequências de sinal incluem as 35 ΡΕ1476539 de factor α, imunoglobulinas, proteínas membranares exteriores, penicilinase, e receptores de células T, entre outras.
Para ajudar a selecção de células hospedeiras transformadas ou transfectadas com vectores de clonagem ou de expressão do presente invento, o vector pode ser submetido a engenharia para compreender ainda uma sequência de codificação para um produto gene repórter ou outro marcador que se possa seleccionar. Uma tal sequência de codificação encontra-se de preferência em associação operativa com as sequências de codificação do elemento regulador, tal como foi acima descrito. Genes repórter que são úteis no invento são bem conhecidos nesta técnica e incluem os que codificam proteína fluorescente verde, luciferase, xylE, e tirosinase, entre outros. Marcadores que podem ser seleccionados que codificam sequências de nucleótidos são bem conhecidos nesta técnica, e incluem os que codificam produtos gene conferindo resistência a antibióticos ou anti-metabolitos, ou que fornecem um requerimento auxotrófico. Exemplos dessas sequências incluem as que codificam resistência a eritromicina, tiostrepton ou kanamicina, entre muitos outros.
Transformação De Células Hospedeiras 0 presente invento proporciona ainda células hospedeiras transformadas compreendendo uma molécula de polinucleótido ou vector recombinante do invento, e novas 36 ΡΕ1476539 estirpes ou linhagens celulares deles derivados. Células hospedeiras úteis na prática do invento são de preferência células de Streptomyces, embora possam também ser usadas outras células procariontes ou eucariontes. Essas células hospedeiras transformadas incluem tipicamente mas não se limitam a microorganismos, tais como bactérias transformadas com DNA de bacteriofago recombinante, vectores de DNA de plasmideo ou de DNA de cosmideo, ou levedura transformada com vectores recombinantes, entre outros.
Pretende-se que as moléculas de polinucleótido do presente invento funcionem em células de Streptomyces, mas podem também ser transformadas noutras células de bactérias ou eucariontes, por exemplo, tendo como finalidade clonagem ou expressão. Pode ser tipicamente usada uma estirpe de E. coli, tal como, por exemplo, a estirpe DH5a, disponível a partir da American Type Culture Collection (ATCC), Rockville, MD, USA (Accession No. 31343), e a partir de fontes comerciais (Stratagene). Células hospedeiras eucariontes preferidas incluem células de levedura, embora possam também ser utilizadas de maneira eficaz células de mamíferos ou células de insectos. 0 vector de expressão recombinante do invento é de preferência introduzido, por exemplo, transformado ou transfectado, para uma ou mais células hospdeiras de uma cultura de células sibstancialmente homogénea. 0 vector de expressão é geralmente introduzido em células hospedeiras de acordo com técnicas conhecidas, tais como, por exemplo, 37 ΡΕ1476539 por transformação do protoplasto, precipitação do fosfato de cálcio, tratamento com cloreto de cálcio, microinjecção, electroporação, transfecção por contacto com um vírus recombinado, transfecção mediada por liposoma, transfecção DEAE-dextran, transdução, conjugação, ou bombardeamento com microprojecteis. A selecção da transformação pode ser conduzida por meio de processos padrão, tais como por selecção para células expressando um marcador selec-cionável, por exemplo, resistência aos antibióticos, associada com o vector recombinante, tal como foi acima descrito.
Uma vez o vector de expressão introduzido na célula hospedeira, a integração e manutenção da sequência de codificação aveC quer no cromossoma da célula hospedeira que episomicamente podem ser confirmadas por meio de técnicas padrão, por exemplo, por análise de hibridização Southern, análise de enzima de restrição, análise PCR, incluindo transcriptase reversa PCR (rt-PCR), ou por ensaio imunológico para detectar o produto gene esperado. Células hospedeiras contendo e/ou expressando a sequência de codificação de aveC recombinante podem ser identificadas por qualquer uma de pelo menos quatro abordagens gerais que são bem conhecidas nesta técnica, incluindo: (I) DNA-DNA, DNA-RNA, ou RNA-hibridização RNA antisenso; (ii) detecção da presença de funções de gene "marcador"; (iii) rastreio do nível de transcrição tal como é medido pela expressão de aveC- transcritos mARN específicos na célula hospedeira; e (iv) detecção da presença de produto polipeptideo maduro 38 ΡΕ1476539 tal como seja medido, por exemplo, por imunoensaio ou pela presença de actividade biológica de AveC (por exemplo, a produção de proporções específicos e de quantidades de avermectinas indicativas de actividade de AveC em, por exemplo, células hospedeiras de S. avermitilis).
Expressão E Caracterização De Um Produto Gene AveC Recombinante
Uma vez que a sequência de codificação aveC nativa ou submetida a mutação tenha sido introduzida de um modo estável numa célula hospedeira apropriada, a célula hospedeira transformada é propagada mediante clonagem, e as células resultantes podem ser feitas crescer em condições que conduzam à produção máxima do produto gene AveC nativo ou submetido a mutação. Essas condições incluem de um modo típico células em crescimento para dar origem a uma densidade elevada. Quando a expressão do vector compreende um promotor induzível, condições de indução apropriadas tais como, por exemplo, deslocação da temperatura, esgotamento de nutrientes, adição de indutores gratuitos (por exemplo, análogos de hidratos de carbono, tais como isopropil-p-D-tiogalactopiranosido (IPTG)), acumulação de subprodutos metabólicos em excesso, etc., são utilizados tal como seja necessário para induzir expressão.
Quando o produto gene AveC expresso é retido no interior das células hospedeiras, as células são colhidas e submetidas a lise, e o produto é isolado e purificado a partir do lisado em condições de extracção conhecidas nesta 39 ΡΕ1476539 técnica para minimizar degradação de proteína tal como, por exemplo, a 4° C, ou na presença de inibidores da protease, ou ambos. Quando o produto gene AveC expressado é segregado a partir das células hospedeiras, o meio nutriente esgotado pode ser simplesmente recolhido sendo o produto isolado a partir delas. 0 produto gene AveC expresso pode ser isolado ou substancialmente purificado a partir de lisados de células ou de meio de cultura, como seja apropriado, usando métodos padrão, incluindo mas não se limitando a qualquer combinação dos métodos que se seguem: precipitação de sulfato de amónio, fraccionamento de tamanho, cromatografia de permuta iónica, HPLC, centrifugação de densidade, e cromatografia de afinidade. Quando o produto gene AveC expresso apresenta actividade biológica, o aumento da pureza da preparação pode ser monitorizado em cada passo do processo de purificação por utilização de um ensaio apropriado. Se o produto gene AveC expresso ou não apresentar actividade biológica, ele poderá ser detectado tendo como base, por exemplo, o tamanho, ou reactividade com um anticorpo de outro modo específicos para AveC, ou pela presença de uma etiqueta de fusão. Tal como é aqui usado, um produto gene AveC é "substancialmente purificado" quando o produto constitui mais do que cerca de 20% em peso da proteína numa preparação particular. Também, tal como é aqui usado, um produto gene AveC é "isolado" quando o produto constitui pelo menos cerca de 80% em peso da proteína numa preparação particular. 40 ΡΕ1476539 O presente invento proporciona assim um produto gene AveC de S. avermitilis expresso de um modo recombinante ou substancialmente purificado compreendendo a sequência de aminoácidos codificados por sequência codificando produto gene AveC de plasmideo pSE186 (ATCC 209604), ou a sequência de aminoácido da FIGURA 1 (SEQ ID NO:2) ou uma sua porção substancial, e versões submetidas a mutação e suas variantes degeneradas. O presente invento proporciona ainda um método para a produção de um produto gene AveC, compreendendo a cultura de uma célula hospedeira transformada com um vector de expressão recombinante, compreendendo o referido vector uma molécula de polinucleótido tendo um sequência de nucleótdos codificando o produto gene AveC, cuja molécula de polinucleótido se encontra em associação operativa com um ou mais elementos reguladores que controlam a expressão da molécula de polinucleótido na célula hospedeira, em condições que conduzem à produção do produto gene AveC recombinante, e recuperando o produto gene AveC a partir da cultura de células. O produto gene AveC de S. avermitilis expresso de um modo recombinante é útil para uma série de finalidades, incluindo para rastrear compostos que alteram a função do produto gene AveC e desse modo modulam a biosintese da avermectina, e para criar antibióticos dirigidos contra o produto gene AveC. 41 ΡΕ1476539
Uma vez obtido um produto gene AveC com suficiente pureza, ele poderá ser caracterizado por métodos padrão, incluindo por SDS-PAGE, cromatografia de exclusão de tamanhos, análise de sequência de aminoácidos, actividade biológica na produção de produtos apropriados, na via biossintética da avermectina, etc. Por exemplo, a sequência de aminoácidos do produto gene AveC pode ser determinada usando técnicas de sequência pepetidicas padrão. 0 produto gene AveC pode ainda ser caracterizado usando análise sobre hidrofilicidade (ver, por exemplo, Hopp and Woods, 1981, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 78:3824), ou algoritmos de software análogos, para identificar regiões hidrofóbicos e hidrofilicas do produto gene AveC. A análise estrutural pode ser realizada para identificar regiões do produto gene AveC que assumem estruturas secundárias especificas. Métodos biofísicos tais como cristalografia por raios X (Engstrom, 1974, Biochem. Exp. Biol. 11: 7-13), modelação por computador (Fletterick e Zoller (eds), 1986, em: Current Communications in Molecular Biology, Cold Spring Laboratory, Cold Spring Harbor, NY), e ressonância magnética molecular (RMN) poderá ser usada para fazer um mapa e estudar sítios de interaeção entre o produto gene AveC e seu substrato. Informação obtida a partir destes estudos poderá ser usada para seleccionar novos sítios para mutação no aveC ORF para ajudar a desenvolver novas estirpes de S. avermitilis tendo características de produção de avermectina mais desejáveis. 42 ΡΕ1476539
Construção E Utilização De Mutantes De AveC
Um objectivo principal do presente invento consiste em identificar novas mutações no alelo aveC de S. avermetilis que dão origem a uma alteração, e com maior preferência uma redução, na proporção de avermectinas B2:B1. 0 presente invento proporciona assim moléculas de polinucleótido úteis para produzir novas estirpes de células de S. avermitilis que apresentam uma modificação detectável na produção de avermectina em comparação com células da mesma estirpe mas que em vez disso expressam apenas o alelo de aveC do tipo selvagem. Numa forma de realização preferida, essas moléculas de polinucleótido são úteis para produzir novas estirpes de células de S. avermitilis que produzem avermectinas numa proporção reduzido de classe 2:1 em comparação com as células da mesma estirpe as quais pelo contrário expressam apenas o alelo aveC do tipo selvagem. As células dessas estirpes podem também compreender mutações adicionais para produzir uma quantidade aumentada de avermectinas em comparação com células da mesma estirpe que pelo contrário expressam apenas um único alelo aveC do tipo selvagem.
Mutações para o alelo aveC ou sequência de codificação incluem quaisquer mutações que introduzem uma ou mais substituições, delecções e/ou adições de aminoácido para o produto gene AveC, ou que dão origem a truncamento do produto gene AveC, ou qualquer sua combinação, e que produz o resultado desejado. Essas sequências de alelo aveC 43 ΡΕ1476539 submetidas a mutação pretendem incluir quaisquer suas variantes degeneradas. Por exemplo, o presente invento proporciona uma molécula de polinucleótido compreendendo a sequência de nucleótidos do alelo aveC ou uma sua variante degenerada, ou a sequência que codifica produto gene AveC de plasmideo pSE186 (ATCC 209604) ou uma sua variante degenerada, ou a sequência de nucleótidos do ORF aveC de S. avermitilis tal como é apresentado na FIGURA 1 (SEQ ID NO:l) ou uma sua variante degenerada, mas que ainda compreende mutações que codificam uma combinação de substituições de aminoácido em posições seleccionadas no produto gene AveC. Numa forma de realização não limitativa, essas substituições ocorrem numa ou mais posições de aminoácido do produto gene AveC correspondendo a posições de aminoácido 25, 28, 35, 36, 38, 40, 41, 48, 55, 61, 78, 84, 89, 90, 99, 107, 108, , 111, 120, 123, 136, 138, 141, 154, 159, 163, 179, 192, 196, 198, 200, 202, 220, 228, 229, 230, 231, 234, 238, 239, 250, 252, 266, 275, 278, 289 ou 298 de SEQ ID NO:2. Combinações preferidas de posições de aminoácido a ser substituídas compreendem um ou mais resíduos de aminoácido D48, A61, A89, L136, S138, A139, R163, G179, V196, A198, E238 e P289. De um modo específico combinações preferidas de substituições de aminoácido compreendem substituições tanto em D48 como em G179, e mais especificamente D48E e G179S. Exemplos específicos de combinações de substituições de aminoácido que dão origem a uma redução em proporções ciclo-hexil B2:ciclo-hexil BI sãoindicados na FIGURA 6A-J. 44 ΡΕ1476539 0 presente invento proporciona assim uma molécula de polinucleótido compreendendo uma sequência de nucleótidos a qual de outro modo é igual ao alelo aveC de Streptomyces avermitilis, à sequência que codifica produto gene AveC de S. avermitilis de plasmideo pSE186 (ATCC 209604) da sequência de nucleótidos do ORF aveC de S. avermetilis tal como é apresentado na FIGURA 1 (SEQ ID NO:l), ou uma sua variante degenerada, mas cuja sequência de nucleótidos compreende mutações que codificam uma combinação de substituições de aminoácido em resíduos de aminoácido correspondendo às posições de aminoácido de SEQ ID NO:2, de modo a que células de S. avermetilis da estirpe ATCC 53692 em que o alelo aveC do tipo selvagem tenha sido inactivado e que expressam a molécula de polinucleótido compreendendo a sequência de nucleótidos submetida a mutação são capazes de produzir uma proporção da classe 2:1 de avermectinas que é reduzido em comparação com a proporção produzido por células de S. avermitilis da estirpe ATCC 53692 que pelo contrário expressa apenas o alelo aveC do tipo selvagem, em que quando as avermectinas da classe 2:1 são avermectinas ciclo-hexil B2:ciclo-hexil Bl, a proporção de avermectinas da classe 2:1 é de 0,35:1. Numa forma de realização mais preferida, a proporção de avermectinas ciclo-hexil B2:ciclo-hexil Bl é de cerca de 0,30:1 ou inferior. Numa forma de realização mais preferida, a proporção de avermectinas ciclo-hexil B2:ciclo-hexil Bl é de cerca de 0,25: ou inferior. Numa forma de realização mais preferida, a proporção de avermectinas ciclo-hexil B2:ciclo-hexil Bl é de cerca de 0,20:1 ou inferior. 45 ΡΕ1476539
Numa sua forma de realização particular, a combinação de substituições de aminoácido compreende a combinação de grupo (a) : D48E, A61T, A89T, S138T, A139T, G179S, A198G, P289L. Um exemplo não limitativo de um plasmideo codificando estas substituições de aminoácido é pSE538 (ver FIGURA 6) .
Numa outra sua forma de realização particular, a combinação de substituições de aminoácido compreende a combinação de grupo (b) : G40S, D48E, L136P, G179S, E238D. Um exemplo não limitativo de um plasmideo codificando estas substituições de aminoácido é pSE559.
Numa outra sua forma de realização particular, a combinação de substituições de aminoácido compreende a combinação de grupo ©: D48E, L136P, R163Q, G179S. Um exemplo não limitativo de um plasmideo codificando estas substituições de aminoácido é pSE567.
Numa outra sua forma de realização particular, a combinação de substituições de aminoácido compreende a combinação de grupo (d): D48E, L136Q, G179Q, E238D. Exemplos não limitativos de plasmideos codificando estas substituições de aminoácido são pSE570 e pSE572.
Numa outra sua forma de realização particular, a combinação de substituições de aminoácido compreende a combinação de grupo (e) : D48E, L136P, R163Q, G179S, A200G, 46 ΡΕ1476539 E238D. Um exemplo não limitativo de um plasmideo codificando estas substituições de aminoácido é pSE571.
Numa sua forma de realização particular, a combinação de substituições de aminoácido compreende a combinação de grupo (f): D48E, L136P, G179S, E238D.
Exemplos não limitativos de plasmideos codificando essas substituições de aminoácido são pSE501 e pSE546.
Numa outra sua forma de realização particular, a combinação de substituições de aminoácido compreende a combinação de grupo (g) : D48E, A61T, L136P, G179S, E238D. Um exemplo não limitativo de um plasmideo codificando estas substituições de aminoácido é pSE510.
Numa outra sua forma de realização particular, a combinação de substituições de aminoácido compreende a combinação de grupo (h) : D48E, A61T, L136P, G179S. Um exemplo não limitativo de um plasmideo codificando estas substituições de aminoácido é pSE512.
Numa outra sua forma de realização particular, a combinação de substituições de aminoácido compreende a combinação de grupo (I): D48E, A89T, S138T, A139T, G179S. Um exemplo não limitativo de um plasmideo codificando estas substituições de aminoácido é pSE519.
Numa outra sua forma de realização particular, a combinação de substituições de aminoácido compreende a 47 ΡΕ1476539 combinação de grupo (j): D48E, A61T, L136P, G179S, A198G, P202S, E238D, P289L. Um exemplo não limitativo de um plasmideo codificando estas substituições de aminoácido é pSE526.
Numa outra sua forma de realização particular, a combinação de substituições de aminoácido compreende a combinação de grupo (k) : D48E, A61T, L136P, S138T, A139F, G179S, E238D, P289L. Um exemplo não limitativo de um plasmideo codificando estas substituições de aminoácido é pSE52 8.
Numa outra sua forma de realização particular, a combinação de substituições de aminoácido compreende a combinação de grupo (I): D48E, L136P, G179S, A198G, E238D, P289L. Um exemplo não limitativo de um plasmideo codificando estas substituições de aminoácido é pSE530.
Numa outra sua forma de realização particular, a combinação de substituições de aminoácido compreende a combinação de grupo (m) : D48E, A61T, S138T, A139F, G179S, A198G, P289L. Um exemplo não limitativo de um plasmideo codificando estas substituições de aminoácido é pSE531.
Numa outra sua forma de realização particular, a combinação de substituições de aminoácido compreende a combinação de grupo (n) : D48E, L84P, G111V, S138T, A139T, G179S, A198G, P289L. Um exemplo não limitativo de um plasmideo codificando estas substituições de aminoácido é pSE53 4. 48 ΡΕ1476539
Numa outra sua forma de realização particular, a combinação de substituições de aminoácido compreende a combinação de grupo (o) : Y28C, D48E, A61T, A89T, S138T, A139T, G179S, E238D. Um exemplo não limitativo de um plasmideo codificando estas substituições de aminoácido é pSE535.
Numa outra sua forma de realização particular, a combinação de substituições de aminoácido compreende a combinação de grupo (p) : D48E, A61T, A107T, S108G, L136P, G179S, S192A, E238D, P289L. Um exemplo não limitativo de um plasmideo codificando estas substituições de aminoácido é pSE542.
Numa outra sua forma de realização particular, a combinação de substituições de aminoácido compreende a combinação de grupo (q): D48E, L136P, R250W. Um exemplo não limitativo de um plasmideo codificando estas substituições de aminoácido é pSE545.
Numa outra sua forma de realização particular, a combinação de substituições de aminoácido compreende a combinação de grupo (r) : D48E, A89T, S138T, A139T, R163Q, G179S. Um exemplo não limitativo de um plasmideo codificando estas substituições de aminoácido é pSE548.
Numa outra sua forma de realização particular, a combinação de substituições de aminoácido compreende a 49 ΡΕ1476539 combinação de grupo (s) : D48E, L136P, G179S, A198G, P289L. Um exemplo não limitativo de um plasmideo codificando estas substituições de aminoácido é pSE552.
Numa outra sua forma de realização particular, a combinação de substituições de aminoácido compreende a combinação de grupo (t): D48E, F78L, A89T, L136P, G179S. Um exemplo não limitativo de um plasmideo codificando estas substituições de aminoácido é pSE557.
Numa outra sua forma de realização particular, a combinação de substituições de aminoácido compreende a combinação de grupo (u) : D48E, A89T, S138T, A139T, G179S, E238D, F278L. Exemplos não limitativos de plasmideos codificando estas substituições de aminoácido são pSE564 e pSE565.
Numa outra sua forma de realização particular, a combinação de substituições de aminoácido compreende a combinação de grupo (v) : D48E, A89T, L136P, R163Q, G179S. Um exemplo não limitativo de um plasmideo codificando estas substituições de aminoácido é pSE568.
Numa outra sua forma de realização particular, a combinação de substituições de aminoácido compreende a combinação de grupo (w) : D48E, A61T, A89T, G111V, S138T, A139F, G179F, E238D, P289L. Um exemplo não limitativo de um plasmideo codificando estas substituições de aminoácido é pSE543 . 50 ΡΕ1476539
Numa outra sua forma de realização particular, a combinação de substituições de aminoácido compreende a combinação de grupo (x) : D25G, D48E, A89T, L136P, S138T, A139T, VI41A, I159T, R163Q, G179S Um exemplo não limitativo de um plasmideo codificando estas substituições de aminoácido é pSE504.
Numa outra sua forma de realização particular, a combinação de substituições de aminoácido compreende a combinação de grupo (y) : D48E, A89T, S90G, L136P, R1163Q, G179S, E238D. Um exemplo não limitativo de um plasmideo codificando estas substituições de aminoácido é pSE508.
Numa outra sua forma de realização particular, a combinação de substituições de aminoácido compreende a combinação de grupo (z): D48E, A61T, A89T, G111V, S138T, A139T, G179S, E238D, P289L. Um exemplo não limitativo de um plasmideo codificando estas substituições de aminoácido é pSE511.
Numa outra sua forma de realização particular, a combinação de substituições de aminoácido compreende a combinação de grupo (aa) : D48E, A89T, S138T, A139T, G179S.
Um exemplo não limitativo de um plasmideo codificando estas substituições de aminoácido é pSE520.
Numa outra sua forma de realização particular, a combinação de substituições de aminoácido compreende a 51 ΡΕ1476539 combinação de grupo (ab): D48E, L136P, R163Q, G179S, S231L. Um exemplo não limitativo de um plasmideo codificando estas substituições de aminoácido é pSE523.
Numa outra sua forma de realização particular, a combinação de substituições de aminoácido compreende a combinação de grupo (ac): D48E, L136P, S138T, A139F, G179S, V196A, E238D. Um exemplo não limitativo de um plasmideo codificando estas substituições de aminoácido é pSE527.
Numa outra sua forma de realização particular, a combinação de substituições de aminoácido compreende a combinação de grupo (ad) : D48E, A61T, A89T, F99S, S138T, A139T, G179S, E238D. Um exemplo não limitativo de um plasmideo codificando estas substituições de aminoácido é pSE53 9. particular, a compreende a S138T, A139T, um plasmideo é pSE540.
Numa outra sua forma de realização combinação de substituições de aminoácido combinação de grupo (ae) : G35S, D48E, A89T, G179S, P289L. Um exemplo não limitativo de codificando estas substituições de aminoácido
Numa outra sua forma de realização particular, a combinação de substituições de aminoácido compreende a combinação de grupo (af): D48E, A61T, A89T, S138T, A139T, G179S, V196A, E238D. Um exemplo não limitativo de um plasmideo codificando estas substituições de aminoácido é pSE54 7. 52 ΡΕ1476539
Numa outra sua forma de realização particular, a combinação de substituições de aminoácido compreende a combinação de grupo (ag) : D48E, A89T, G111V, S138T, A139T, G179S, A198G, E238D. Um exemplo não limitativo de um plasmideo codificando estas substituições de aminoácido é pSE550.
Numa outra sua forma de realização particular, a combinação de substituições de aminoácido compreende a combinação de grupo (ah): S41G, D48E, A89T, L136P, G179S. Um exemplo não limitativo de um plasmideo codificando estas substituições de aminoácido é pSE558.
Numa outra sua forma de realização particular, a combinação de substituições de aminoácido compreende a combinação de grupo (ai): D48E, A89T, L136P, R163Q, G179S, P252S. Um exemplo não limitativo de um plasmideo codificando estas substituições de aminoácido é pSE563.
Numa outra sua forma de realização particular, a combinação de substituições de aminoácido compreende a combinação de grupo (aj): D48E, A89T, L136P, G179S, F234S. Um exemplo não limitativo de um plasmideo codificando estas substituições de aminoácido é pSE566.
Numa outra sua forma de realização particular, a combinação de substituições de aminoácido compreende a combinação de grupo (ak) : D48E, A89T, L136P, R163Q, G179S, 53 ΡΕ1476539 E238D. Exemplos não limitativos de plasmideos codificando estas substituições de aminoácido são pSE573 e pSE578.
Numa outra sua forma de realização particular, a combinação de substituições de aminoácido compreende a combinação de grupo (al): Q36R, D48E, A89T, L136P, G179S, E238D. Um exemplo não limitativo de um plasmídeo codificando estas substituições de aminoácido é pSE574.
Numa outra sua forma de realização particular, a combinação de substituições de aminoácido compreende a combinação de grupo (am) : D48E, A89T, L136P, R163P, R163Q, G179S. Exemplos não limitativos de plasmideos codificando estas substituições de aminoácido são pSE575 e pSE576.
Numa outra sua forma de realização particular, a combinação de substituições de aminoácido compreende a combinação de grupo (an) : D48E, A89T, S138T, G179S. Um exemplo não limitativo de um plasmídeo codificando estas substituições de aminoácido é pSE577.
Numa outra sua forma de realização particular, a combinação de substituições de aminoácido compreende a combinação de grupo (ao): D48E, A89T, L136P, G179S, E238D. Exemplos não limitativos de plasmideos codificando estas substituições de aminoácido são pSE502 e pSE524.
Numa outra sua forma de realização particular, a combinação de substituições de aminoácido compreende a 54 ΡΕ1476539 combinação de grupo (ap) : D48E, A89T, L136P, K154E, G179S, E238D. Um exemplo não limitativo de um plasmideo codificando estas substituições de aminoácido é pSE503.
Numa outra sua forma de realização particular, a combinação de substituições de aminoácido compreende a combinação de grupo (aq) : D48E, A89T, S138T, A139T, K154R, G179S, V196A, P289L. Um exemplo não limitativo de um plasmideo codificando estas substituições de aminoácido é pSE505. particular, a compreende a A139T, G179S, um plasmideo é pSE506.
Numa outra sua forma de realização combinação de substituições de aminoácido combinação de grupo (ar) : D48E, A89T, S138T, V196A, E238D. Um exemplo não limitativo de codificando estas substituições de aminoácido
Numa outra sua forma de realização particular, a combinação de substituições de aminoácido compreende a combinação de grupo (as): D48E, A61T, A89T, L136P, G179S, V196A, A198G, P289L. Um exemplo não limitativo de um plasmideo codificando estas substituições de aminoácido é pSE50 7.
Numa outra sua forma de realização particular, a combinação de substituições de aminoácido compreende a combinação de grupo (at) : D48E, A61T, S138T, A139F, G179S, G196A, E238D, P289L. Um exemplo não limitativo de um plasmideo codificando estas substituições de aminoácido é pSE50 9. 55 ΡΕ1476539
Numa outra sua forma de realização particular, a combinação de substituições de aminoácido compreende a combinação de grupo (au)): D48E, A89T, L136P, G179S. Exemplos não limitativos de plasmideos codificando estas substituições de aminoácido são pSE514 e pSE525.
Numa outra sua forma de realização particular, a combinação de substituições de aminoácido compreende a combinação de grupo (av) : D48E, A89T, V120A, L136P, G179S. Um exemplo não limitativo de um plasmideo codificando estas substituições de aminoácido é pSE515.
Numa outra sua forma de realização particular, a combinação de substituições de aminoácido compreende a combinação de grupo (aw): D48E, A61T, A89T, S138T, A139F, G179S, V196A, A198G, E238D. Um exemplo não limitativo de um plasmideo codificando estas substituições de aminoácido é pSE517.
Numa outra sua forma de realização particular, a combinação de substituições de aminoácido compreende a combinação de grupo (ax): D48E, A61T, A89T, G111V, S138T, A139F, G179S, V196A, E238D. Um exemplo não limitativo de um plasmideo codificando estas substituições de aminoácido é pSE518.
Numa outra sua forma de realização particular, a combinação de substituições de aminoácido compreende a 56 ΡΕ1476539 combinação de grupo (ay) : D48E, A61T, A89T, S138T, A139T, G179S, V196A, E238D, P289L. Exemplos não limitativos de plasmideos codificando estas substituições de aminoácido são pSE529 e pSE554.
Numa outra sua forma de realização particular, a combinação de substituições de aminoácido compreende a combinação de grupo (az): D48E, A61T, A89T, L136P, S138T, A139F, G179S, A198G, E238D. Um exemplo não limitativo de um plasmídeo codificando estas substituições de aminoácido é pSE532
Numa outra sua forma de realização particular, a combinação de substituições de aminoácido compreende a combinação de grupo (ba): A89T, S138T, Q139F, G178S, A198G, V220A. Um exemplo não limitativo de um plasmídeo codificando estas substituições de aminoácido é pSE536.
Numa outra sua forma de realização particular, a combinação de substituições de aminoácido compreende a combinação de grupo (bb): D48E, A61T, A89T, S138T, A139T, G179S, V196A, E238D, R239H, P289L.. Um exemplo não limitativo de um plasmídeo codificando estas substituições de aminoácido é pSE537.
Numa outra sua forma de realização particular, a combinação de substituições de aminoácido compreende a combinação de grupo (bc): D48E, A61T, A89T, L136P, G179S, P289L. Um exemplo não limitativo de um plasmídeo codificando estas substituições de aminoácido é pSE541. 57 ΡΕ1476539
Numa outra sua forma de realização particular, a combinação de substituições de aminoácido compreende a combinação de grupo (bd) : D48E, A89T, S138T, A139T, G179S, V196A, E238D, P289L. Exemplos não limitativos de plasmideos codificando estas substituições de aminoácido são pSE549 e pSE533.
Numa outra sua forma de realização particular, a combinação de substituições de aminoácido compreende a combinação de grupo (be): D48E, A61T, A89T, S138T, A139F, G179S, V196A, E238D. Um exemplo não limitativo de um plasmideo codificando estas substituições de aminoácido é pSE551. 0 presente invento proporciona ainda uma molécula de polinucleótido compreendendo uma sequência de nucleótidos que é de outro modo a mesma que o alelo aveC de Streptomyces avermitilis, a sequência que codifica produto gene AveC de S-avermitilis de plasmideo pSE 186 (ATCC 209604) ou a sequência de nucleótidos do ORF aveC de S. avermitilis tal como é apresentado na FIGURA 1 (SEQ ID N0:1), ou uma sua variante degenerada, mas cuja sequência de nucleótidos compreende ainda mutações codificando uma combinação de substituições de aminoácido em resíduos de aminoácido correspondendo às posições de aminoácido de SEQ ID NO:2, de modo a que células da estirpe de S. avermitilis da estirpe ATCC 53692 em que o alelo aveC do tipo selvagem foi inactivado e que expressa uma molécula de polinu- 58 ΡΕ1476539 cleótido compreendendo a sequência de nucleótidos submetidos a mutação são capazes de produzir uma avermectinas da classe 2:1 que é reduzido em comparação com a proporção produzido por células de S. avermitílís da estirpe ATCC 53692 que pelo contrário expressam apenas o alelo aveC do tipo selvagem, em que quando as avermectinas 2:1 são avermectinas ciclo-hexil B2:ciclo-hexil Bl, a proporção das avermectinas da classe 2:1 é reduzido até cerca de 0,40 ou inferior, e em que a combinação de substituições de aminoácido compreende uma combinação seleccionada de entre o grupo consistindo em: (bf) D48E, S138T, A139T, G179S, E238S; e (bg) Y28C, Q38R, D48E, L136P, G179S, E238D.
Exemplos não limitativos de um plasmideo codificando as substituições de aminoácido de grupo (bf) são pSE556 e pSE569. Um exemplo não limitativo de um plasmideo codificando as substituições de aminoácido de grupo (bg) é pSE561. 0 presente invento contempla que qualquer uma das substituições de aminoácidos acima mencionadas poderá ser realizada por meio de qualquer modificação à sequência de nucleótidos do alelo aveC ou uma sua variante degenerada que dá origem a essas substituições. Por exemplo, é possível efectuar a maior parte das substituições de aminoácido aqui descritas modificando uma sequência nativa de codões ou uma sua variante degenerada para qualquer um 59 ΡΕ1476539 dos vários codãos alternativos que codificam a mesma substituição de aminoácido. As várias sequências possíveis que podem codificar as subatituições de aminoácido acima mencionadas poderão tornar-se rapidamente aparentes para qualquer especialista nesta técnica tendo em vista a forma de realização do presente invento e a degenerescência conhecida do código genético. Numa forma de realização não limitativa para cada combinação particular acima referida, as substituições de aminoácido são conseguidas por modificações de nucleótido não silenciosas indicadas na FIGURA 6.
Tal como é aqui usada, a frase "a combinação de substituições de aminoácido compreende a combinação de grupo etc., significa que as substituições de aminoácido no produto gene AveC de acordo com o presente invento incluem pelo menos as substituições que são especificamente referidas, e pode incluir outras substituições de aminoácido, ou delecções de aminoácido, ou adições de aminoácido, ou algumas suas combinações, em que a expressão do resultante produto gene AveC resultante na célula de S. avermitílís proporciona uma redução desejável na proporção de avermectinas B2:B1.
Mutações para o alelo aveC ou sua variante degenerada poderão ser realizadas por qualquer uma de uma série de métodos conhecidos, incluindo por utilização de PCR sujeito a erro, ou por mutagenese de cassete. Por exemplo, mutagenese dirigida a oligonucleótido poderá ser 60 ΡΕ1476539 utilizada para alterar a sequência do alelo aveC ou ORF num modo definido tal como, por exemplo, para introduzir um ou mais sítios de restrição, ou um codão de terminação, para regiões específicas no alelo aveC ou ORF. Métodos tais como os descritos na Patente dos E.U.A. No. 5.605.793, Patente dos E.U.A. No. 5.830.721 e Patente dos E.U.A. No. 5.837.458, que envolvem fragmentação aleatória, ciclos repetidos de mutagenese, e rearranjo de nucleótido, podem também ser usados para dar origem a grandes bibliotecas de polinucleótidos tendo sequências de nucleótidos codificando mutações de aveC.
Mutações alvo podem ser úteis, particularmente quando servem para alterar um ou mais resíduos de amino-ácido conservados no produto gene AveC. Por exemplo, uma comparação da sequência de aminoácido deduzida do produto gene AveC de S. avermitilis (SEQ ID NO:2) com produtos gene homólogo AveC a partir de S. griseochromogenes (SEQ ID NO:5) e S. hygroscopícus (SEQ ID NO:4), tal como é descrito na Patente dos E.U.A. No. 6.248.579, indica sítios de conservação sugnificativa de resíduos de aminoácido entre estas espécies. Mutagenese submetida a alvo que leva a uma modificação num ou mais destes resíduos de aminoácido conservados pode ser eficaz na produção de novas estirpes mutantes que apresentam alterações desejáveis em produção de avermectina.
Mutagenese aleatória pode também ser útil, e pode ser realizada expondo células de S. avermitilis a radiação 61 ΡΕ1476539 ultravioleta ou a raios X, ou a agentes químicos muta-génicos tais como N-metil-N'-nitrosoguanidina, metanossulfonato de etilo, ácido nitroso ou mostardas de azoto. Ver, por exemplo, Ausubel, 1989, acima referido, para revisão de técnicas de mutagenese.
Uma vez geradas moléculas de polinucleótido submetidas a mutação , elas são rastreadas para determinar se podem modular biossíntese de avermectina em S. avermitilis. Numa forma de realização preferida, uma molécula de polinucleótido tendo uma sequência de nucleótido submetida a mutação é testada por complementação de uma estirpe de S. avermitilis em que o gene aveC tenha sido inactivado para dar origem a um fundo aveC negativo (aveC'). Num método não limitativo, a molécula de polinucleótido submetida a mutação é ligada a um plasmídeo de expressão em associação operativa com um ou mais elementos regulatórios, cujo plasmídeo também compreende de preferência um ou mais genes de resistência à droga para permitir uma selecção de células transformadas. Este vector é então transformado em células hospedeiras aveC' usando técnicas conhecidas, e células transformadas são seleccionadas e cultivadas em meios de fermentação apropriados em condições que permitam ou induzam produção de avermectina, por exemplo, incluindo subunidades de partida no meio, e cultivando em condições óptimas para produção de avermectina tal como é conhecido nesta técnica. Produtos de fermentação são então analisados por HPLC (cromatografia líquida de elevada performance) a fim de 62 ΡΕ1476539 determinar a capacidade da molécula de polinucleótido submetida a mutação para complementar a célula hospedeira. Vários vectores de plasmideo tendo moléculas de polinucleótido submetidas a mutação capazes de reduzir a proporção B2:B1 de avermectinas, incluindo pSE188, pSE199, pSE231, pSE239, e pSE290 a pSE297 são exemplificados na Secção 8.3, mais abaixo. Outros exemplos desses vectores de plasmideo são apresentados na FIGURA 6.
Qualquer um dos métodos acima mencionados do presente invento poderá ser realizado usando meios de cultura de fermentação de preferência suplementados com ácido ciclo-hexano carboxilico, embora outros precursores de ácido gordo apropriados, tais como qualquer um dos precursores de ácido gordo indicados no Quadro 1, ou ácido metiltioláctico, possam também ser usados.
Uma vez que tenha sido identificada uma molécula de polinucleótido submetida a mutação que module a produção de avermectina numa direcção desejável, a localização da mutação na sequência de nucleótidos poderá ser determinada. Por exemplo, uma molécula de polinucleótido tendo uma sequência de nucleótidos codificando um produto gene AveC submetido a mutação poderá ser isolada por PCR e submetida a análise de sequência de DNA usando métodos conhecidos. Comparando a sequência de DNA do alelo aveC submetido a mutação com a do alelo aveC do tipo selvagem, a(s) mutação (mutações) respnsável(responsáveis) pela alteração na produção de avermectina poderá (poderão) ser determi- 63 ΡΕ1476539 nada(s). Por exemplo, produtos gene AveC de S. avermitílis compreendendo quer substituições de aminoácido simples em qualquer um dos resíduos 55 (S55F), 138 (S138T), 139 (A139T), ou 230 (G230D), quer substituições duplas nas posições 138 (S138T) e 139 (A139T ou A139F), proporcionaram modificações na função do produto gene AveC tais que a proporção da classe 2:1 de avermectinas produzidas foi alterada (ver Secção 8, mais abaixo), em que as posições de aminoácido correspondem às apresentadas na FIGURA 1 (SEQ ID NO:2) . Além disso, as seguintes sete combinações de mutações cada uma delas revelou que reduzia de um modo eficaz a proporção 2:1 de avermectinas. (1) D48E/A89T; (2) S138T/A139T/G179S; (3) Q38P/L136P/E238D; (4) F99S/S138T/ A139T/G179S; (5) A139T/M228T; (6) G111V/P289L; (7) A139T/ K154E/Q298H. 0 presente invento proporciona cinquenta e nove (59) combinações adicionais de mutações que demonstram reduzir a proporção ciclo-hexil B2:ciclo-hexil BI de avermectinas e estas são apresentadas na FIGURA 6 e indicadas nas reivindicações apensas.
Tal como são aqui usadas, as designações acima mencionadas, tais como A139T, indicam o resíduo original de aminoácido por simples designação de letra, a qual neste exemplo é alanina (A) na posção indicada, que neste exemplo se situa na posição 139 (referindo-se a SEQ ID NO: 2) do polipeptideo, seguindo-se o resíduo de aminoácido que substitui o resíduo de aminoácido original, o qual neste exemplo é treonina (T). 64 ΡΕ1476539
Tal como é aqui usado, quando um resíduo de aminoácido codificado por um alelo aveC no cromossoma de S. avermitilis, ou num vector ou molécula isolada de polinucleótido do presente invento é referido como "correspondendo a" um resíduo particular de aminoácido de SEQ ID NO:2, ou quando uma substituição de aminoácido é referida como ocorrendo numa posição particular "correspondendoa" à de um resíduo de aminoácido numerado específico de SEQ ID NO:2, isto pretende referir-se ao resíduo de aminoácido na mesma localização relativa no produto gene AveC, o qual o técnico especialista poderá rapidamente determinar tendo como referência a sequência de aminoácidos aqui apresentada como SEQ ID NO:2.
Tal como é aqui usado, quando mutações específicas no alelo aveC codificando mutações particulares são indicadas como modificações de base em posições específicas de nucleótido no alelo aveC "correspondendo a" posições particulares de nucleótido tal como é indicado em SEQ ID N0.1, ou quando uma posição de nucleótido no alelo aveC é de outro modo referido como "correspondendo a" uma posição particular de nucleótido na SEQ ID N0:1, isto pretende referir-se ao nucleótido na mesma localização relativa na sequência de nucleótidos aveC ou uma sua variante degenerada, que o técnico especializado poderá determinar rapidamente tendo como referência a sequência de nucleótidos aqui apresentada como SEQ ID N0:1.
Tal como é aqui usado para se referir a 65 ΡΕ1476539 proporções de avermectinas ciclo-hexil B2:ciclo-hexil Bl, o termo "cerca de" refere-se ao valor numérico especi-ficamente referido mais ou menos 10% desse valor indicado.
Uma molécula de polinucleótido do presente invento pode ser "isolado", o que significa que é ou (i) purificado até ao grau que se encontre substancialmente livre de outras moléculas de polinucleótido tendo diferentes sequências de nucleótidos, ou (ii) presente no meio ambiente em que ele não ocorreria naturalmente, por exemplo, onde um alelo aveC de S. avermitilis, ou uma sua versão submetida a mutação, está presente numa célula diferente de uma célula de S. avermitilis, ou (iii) presente sob a forma em que não correria naturalmente, por exemplo, como uma peça mais curta de DNA, tal como um fragmento de restrição digerido a partir de um cromossoma bacteriano, compreendendo de um modo predominante a região de codificação aveC ou uma sua versão submetida a mutação, com ou sem quaisquer suas sequências reguladoras associadas, ou como integradas subsequentemente numa peça heteróloga de DNA, tal como o cromossoma de uma célula bacteriana (diferente de uma célula de S. avermitilis) ou o DNA de um vector tal como um plasmideo ou agente fágico, ou integrado num cromossoma de S. avermitilis num local diferente do local do alelo aveC nativo. O presente invento proporciona ainda um vector recombinante compreendendo uma molécula de polinucleótido do presente invento. Um tal vector recombinante poderá ser 66 ΡΕ1476539 usado para atingir qualquer uma das moléculas de polinucleótido compreendendo sequências de nucleótidos submetidas a mutação do presente invento para o sitio do alelo aveC do cromossoma de S. avermitilis para inserir ou substituir o ORF aveC de uma sua porção, por exemplo, por recombinação homóloga. De acordo com o presente invento, contudo, uma molécula de polinucleótido compreendendo uma sequência de nucleótidos submetida a mutação do presente invento aqui proporcionada poderá também funcionar de modo a modular a biossintese de avermectina quando inserida no cromossoma de S.avermitilis num sitio diferente do sítio do alelo aveC, ou quando mantido episomicamente nas células de S. avermitilis. Assim o presente invento proporciona ainda vectores compreendendo uma molécula de polinucleótido compreendendo uma sequência de nucleótidos submetida a mutação do presente invento, cujos vectores podem ser usados para inserir a molécula de polinucleótido num sítio no cromossoma de S. avermitilis diferente de um sítio no gene aveC, ou para ser mantido episomicamente.
Numa forma de realização não limitativa, o vector é um vector de substituição de gene que pode ser usado para inserir um alelo aveC submetido a mutação ou uma sua variante degenerada de acordo com o presente invento para células de uma estirpe de S. avermitilis, dando desse modo origem a novas estirpes de S. avermitilis, cujas células podem produzir avermectinas numa proporção reduzido de classe 2:1 em comparação com células da mesma estirpe que pelo contrário expressam apenas o alelo aveC de tipo 67 ΡΕ1476539 selvagem. Esses vectores de substituição de gene podem ser construídos usando moléculas de polinucleótido submetidas a mutação presentes em vectoes de expressão aqui proporcionados, tais como os vectores de expressão exemplificados na Secção 8 mais abaixo. 0 presente invento proporciona ainda vectores que podem ser usados para inserir um alelo aveC submetido a mutação ou uma sua variante degenerada para células de uma estirpe de S. avermítilis para dar origem a novas estirpes de células que produzem quantidades alteradas de avermectinas em comparação com células da mesma estirpe que pelo contrário expressam apenas o alelo aveC de tipo selvagem. Numa forma de realização preferida, a quantidade de avermectinas produzidas pelas células é aumentada. Numa forma de realização específica embora não limitativa, um tal vector compreende um promotor forte tal como é conhecido nesta técnica,tal como, por exemplo, o promotor ermE constitutivo forte a partir de Saccharopolyspora erythraea, que está situada a motante de, e em associação operativa com o ORF aveC. Esses vectores podem ser construídos usando o alelo aveC submetido a mutação de plasmídeo pSE189, e de acordo com métodos descritos na Patente dos E.U.A. No. 6.248.579. 0 presente invento proporciona vectores de substituição de gene que são úteis para inactivar o gene aveC numa estirpe de tipo selvagem de S. avermítilis. Numa forma de realização não limitativa, esses vectores de 68 ΡΕ1476539 substituição de gene podem ser construídos usando a molécula de polinucleótido submetido a mutação presente no plasmídeo pSE180 (ATCC 209605), que é exemplificado na Secção 8.1, mais abaixo (FIGURA 3). O presente invento proporciona ainda vectores de substituição de gene que compreendem uma molécula de polinucleótido ou consistindo em sequências de nucleótido que naturalmente flanqueiam o gene aveC in situ no cromossoma de S. avermitilis, incluindo, por exemplo, as sequências de nucleótidos que flanqueiam apresentadas na FIGURA 1 (SEQ ID NO:l), cujos vectores podem ser usados para deletar o S. avermitilis com ORF . O presente invento proporciona ainda uma célula hospedeira compreendendo uma molécula de polinucleótido ou vector recombinante do presente invento. A célula hospedeira pode ser qualquer célula procarionte ou eucarionte capaz de ser usada como um hospedeiro para a molécula de polinucleótido ou vector recombinante. Numa forma de realização preferida, a célula hospedeira é uma célula bacteriana. Numa forma de realização mais preferida, a célula hospedeira é uma célula de Streptomyces. Numa forma de realização mais preferida, a célula hospedeira é uma célula de Streptomyces avermetilis. O presente invento proporciona ainda um método para produzir uma nova estirpe de Streptomyces avermitilis, compreendendo (i) mutação do alelo aveC numa célula de uma estirpe de S. avermitilis, cuja mutação dá origem a uma 69 ΡΕ1476539 combinação de substituições de aminoácido no produto gene Avec, ou (ii) introduzindo para uma célula de uma estirpe de S. avermítílis um alelo aveC submetido a mutação com alelo aveC ou uma sua variante degenerada codificando um produto gene AveC compreendendo uma combinação de substituições de aminoácido, em que a combinação de substituições de aminoácido é seleccionada de entre (a) a (be) acima indicados. 0 presente invento proporciona ainda um método para produzir uma nova estirpe de S. avermítílis, compreendendo (i) mutação do alelo aveC numa célula de uma estirpe de S. avermítílis, mutação essa que dá origem a uma combinação de substituições de aminoácido no produto gene AveC, ou (ii) introdução para uma célula de uma estirpe de S. avermítílis de um alelo aveC submetido a mutação ou uma sua variante degenerada codificando um produto gene AveC compreendendo uma combinação de substituições de aminoácido, em que células compreendendo o alelo aveC submetido a mutação ou uma sua variante degenerada são capazes de produzir avermectinas ciclo-hexil B2:ciclo-hexil BI numa proporção de 0,35:1 ou inferior. Numa sua forma de realização não limitativa, o alelo aveC submetido a mutação ou uma sua variante degenerada codifica um produto gene AveC compreendendo uma combinação de substituições de aminoácido seleccionada de entre o grupo consistindo em de (a) a (be) acima indicados.
Numa sua forma de realização preferida, a 70 ΡΕ1476539 proporção de avermectinas ciclo-hexil B2:ciclo-hexil BI é de cerca de 0,30:1 ou inferior. Numa sua forma de realização não limitativa, o alelo aveC submetido a mutação ou uma sua variante degenerada codifica um produto gene compreendendo uma combinação de substituições de aminoácido seleccionada de entre o grupo consistindo em de (f) a (be) acima indicados.
Numa sua forma de realização preferida, a proporção de avermectinas ciclo-hexil B2:ciclo-hexil BI é de cerca de 0,25:1 ou inferior. Numa sua forma de realização não limitativa, o alelo aveC submetido a mutação ou uma sua variante degenerada codifica um produto gene AveC compreendendo uma combinação de substituições de aminoácido seleccionada de entre o grupo consistindo em de (w) a (be) acima indicados.
Numa sua forma de realização mais preferida, a proporção de avermectinas ciclo-hexil B2:ciclo-hexil BI é de cerca de 0,20:1 ou inferior. Numa sua forma de realização não limitativa, o alelo aveC submetido a mutação ou uma sua variante degenerada codifica um produto gene AveC compreendendo uma combinação de substituições de aminoácido seleccionada de entre o grupo consistindo em de (ao) a (be) acima indicados. 0 presente invento proporciona ainda um método para produzir uma nova estirpe de Streptomyces avermitilis, compreendendo (i) mutação do alelo aveC numa célula de uma 71 ΡΕ1476539 estirpe de S. avermitilis, mutação essa que dá origem a uma combinação de substituições de aminoácido no produto gene AveC, ou (ii) introdução para uma célula de uma estirpe de S. avermitilis de um alelo aveC submetido a mutação ou uma sua variante degenerada codificando um produto gene AveC compreendendo uma combinação de substituições de aminoácido, em que a combinação de substituições de aminoácido é seleccionada de entre o grupo consistindo em (bf) e (bg). Numa sua forma de realização preferida, células de S. avermitilis compreendendo um tal alelo aveC submetido a mutação ou uma sua variante degenerada são capazes de produzir avermectinas ciclo-hexil B2:ciclo-hexil BI numa proporção de cerca de 0,40:1 ou inferior.
Ao submeter assim a mutação o alelo aveC, ou ao introduzir assim um alelo aveC submetido a mutação ou uma sua variante degenerada, de acordo com os passos acima indicados, é produzida uma nova estirpe de S. avermitilis. O presente invento proporciona ainda uma célula de uma espécie de Streptomyces que compreende um alelo aveC submetido a mutação ou uma sua variante codificando um produto gene AveC compreendendo uma combinação de substituições de aminoácido seleccionada de entre (a) a (be) acima indicados. Numa sua forma de realização preferida, a espécie de Streptomyces é S.avermitilis. O presente invento proporciona ainda uma célula de S. avermitilis capaz de produzir avermectinas ciclo- 72 ΡΕ1476539 hexil B2:ciclo-hexil BI numa proporção de 0,35:1 ou inferior. Numa sua forma de realização não limitativa, a célula compreende um alelo aveC submetido a mutação ou uma sua variante degenerada codificando um produto gene Avec compreendendo uma combinação de substituições de aminoácido seleccionada de entre o grupo consistindo em de (a) a (be) acima indicada.
Numa sua forma de realização preferida, a proporção de avermectinas ciclo-hexil B2:ciclo-hexil BI é de cerca de 0,30:1 ou inferior. Numa sua forma de realização não limitativa, a célula compreende um alelo aveC submetido a mutação ou uma sua variante degenerada codificando um produto gene AveC compreendendo uma combinação de substituições de aminoácido seleccionada de entre o grupo consistindo em de (f) a (be) acima indicado.
Numa sua forma de realização mais preferida, a proporção de avermectinas ciclo-hexil B2:ciclo-hexil BI é de cerca de 0,25:1 ou inferior. Numa sua forma de realização não limitativa, a célula compreende um alelo aveC submetido a mutação ou uma sua variante degenerada codificando um produto gene AveC compreendendo uma combinação de substituições de aminoácido seleccionada de entre o grupo consistindo em de (w) a (be) acima indicados.
Numa sua forma de realização mais preferida, a proporção de avermectinas ciclo-hexil B2:ciclo-hexil BI é de cerca de 0,20:1 ou inferior. Numa sua forma de 73 ΡΕ1476539 realização não limitativa, a célula compreende um alelo aveC submetido a mutação ou uma sua variante degenerada codificando um produto gene AveC compreendendo uma combinação de substituições de aminoácido seleccionada de entre o grupo consistindo em de (ao) a (be) acima indicados. 0 presente invento proporciona ainda uma célula de uma espécie de Streptomyces, compreendendo um alelo aveC submetido a mutação ou uma sua variante degenerada codificando um produto gene AveC compreendendo uma combinação de substituições de aminoácido seleccionada de entre o grupo consistindo em (bf) e (bg) acima indicados. Numa sua forma de realização preferida, a célula é uma célula de S. avermitilis capaz de produzir avermectinas ciclo-hexil B2:ciclo-hexilç BI numa proporção de cerca de 0,40:1 ou inferior.
Embora qualquer uma das mutações indicadas possa estar presente em células do presente invento num elemento extracromossomico tal como um plasmideo, é preferido que essas mutações estejam presentes numa sequência de codificação aveC integrada para o cromossoma de S. avermitilis, e de preferência, embora não necessariamente, no sitio do alelo aveC nativo.
Essas novas estirpes de células são úteis na produção em larga escala de avermectinas comercialmente desejáveis tais como doramectina. 74 ΡΕ1476539 0 presente invento proporciona ainda um processo para a produção de avermectinas, compreendendo a cultura de células de S. avermítílís do presente invento em meios de cultura em condições que permitam ou induzam a produção de avermectinas a partir delas, e recuperando as referidas avermectinas a partir da cultura. Numa forma de realização preferida, as células usadas no processo produzem avermectinas ciclo-hexil B2:ciclo-hexil BI numa proporção de 0,35:1 ou inferior, com maior preferência numa proporção de cerca de 0,30:1 ou inferior, com maior preferência numa proporção de cerca de 0,25:1 ou inferior, e com maior preferência numa proporção de cerca de 0,20:1 ou inferior.
Numa sua forma de realização preferida, células produzindo avermectinas ciclo-hexil B2:ciclo-hexil BI numa proporção de 0,35:1 ou inferior compreende um alelo aveC submetido a mutação ou uma sua variante degenerada codificando um produto gene AveC compreendendo uma combinação de substituições de aminoácido seleccionada de entre o grupo consistindo em de (a) a (be) acima indicados.
Numa outra sua forma de realização preferida, células produzindo avermectinas ciclo-hexil B2:ciclo-hexil BI numa proporção de 0,30:1 ou inferior compreende um alelo aveC submetido a mutação ou uma sua variante degenerada codificando um produto gene AveC compreendendo uma combinação de substituições de aminoácido seleccionada de entre o grupo consistindo em de (f) a (be) acima indicados. 75 ΡΕ1476539
Numa outra sua forma de realização preferida, células produzindo avermectinas ciclo-hexil B2:ciclo-hexil BI numa proporção de 0,25:1 ou inferior compreende um alelo aveC submetido a mutação ou uma sua variante degenerada codificando um produto gene AveC compreendendo uma combinação de substituições de aminoácido seleccionada de entre o grupo consistindo em de (w) a (be) acima indicados.
Numa outra sua forma de realização preferida, células produzindo avermectinas ciclo-hexil B2:ciclo-hexil BI numa proporção de 0,20:1 ou inferior compreende um alelo aveC submetido a mutação ou uma sua variante degenerada codificando um produto gene AveC compreendendo uma combinação de substituições de aminoácido seleccionada de entre o grupo consistindo em de (ao) a (be) acima indicados.
Numa outra sua forma de realização preferida, células produzindo avermectinas ciclo-hexil B2:ciclo-hexil BI numa proporção de 0,40:1 ou inferior compreende um alelo aveC submetido a mutação ou uma sua variante degenerada codificando um produto gene AveC compreendendo uma combinação de substituições de aminoácido seleccionada de entre o grupo consistindo em (bf) e (be) acima indicados. O processo do invento proporciona eficácia aumentada na produção de avermectinas comercialmente importantes tais como doramectina. 76 ΡΕ1476539 0 presente invento proporciona ainda uma composição de avermectinas ciclo-hexil B2:ciclo-hexil BI produzidas por células de Streptomyces avermitilis, compreendendo as avermectinas ciclo-hexil B2:ciclo-hexil BI presentes num meio de cultura em que as células tenham sido cultivadas, em que a proporção das avermectinas ciclo-hexil B2:ciclo-hexil BI presentes no meio de cultura é de 0,35:1 ou inferior, de preferência cerca de 0,30:1 ou inferior, com maior preferência cerca de 0,25:1 ou inferior, e com maior preferência cerca de 0,20:1 ou inferior. Numa forma de realização preferida, a composição de avernectinas ciclo-hexil B2:ciclo-hexil Bl é produzida por células de uma estirpe de S. avermitilis que expressa um alelo aveC submetido a mutação ou uma sua variante degenerada que codifica um produto gene que dá origem a uma redução na proporção de avermectinas ciclo-hexcil B2:ciclo-hexil Bl produzidas pelas células em comparação com células da mesma estirpe de S. avermitilis que não expressa o alelo aveC submetido a mutação mas pelo contrário expressa apenas o alelo aveC do tipo selvagem.
Numa sua forma de realização preferida, onde a composição é constituída por avermectinas ciclo-hexil B2:ciclo-hexil Bl numa proporção de 0,35:1 ou inferior, a composição é produzida por células compreendendo um alelo aveC submetido a mutação ou uma sua variante degenerada codificando um produto gene AveC compreendendo uma combinação de substituições de aminoácido seleccionada de entre o grupo consistindo em de (a) a (be) acima indicados. 77 ΡΕ1476539
Numa sua outra forma de realização preferida, onde a composição é constituída por avermectinas ciclo-hexil B2:ciclo-hexil Bl numa proporção de 0,30:1 ou inferior, a composição é produzida por células compreendendo um alelo aveC submetido a mutação ou uma sua variante degenerada codificando um produto gene AveC compreendendo uma combinação de substituições de aminoácido seleccionada de entre o grupo consistindo em de (f) a (be) acima indicados.
Numa sua outra forma de realização preferida, onde a composição é constituída por avermectinas ciclo-hexil B2:ciclo-hexil Bl numa proporção de 0,25:1 ou inferior, a composição é produzida por células compreendendo um alelo aveC submetido a mutação ou uma sua variante degenerada codificando um produto gene AveC compreendendo uma combinação de substituições de aminoácido seleccionada de entre o grupo consistindo em de (w) a (be) acima indicados.
Numa sua outra forma de realização preferida, onde a composição é avermectinas ciclo-hexil B2:ciclo-hexil Bl numa proporção de 0,20:1 ou inferior, a composição é produzida por células compreendendo um alelo aveC submetido a mutação ou uma sua variante degenerada codificando um produto gene AveC compreendendo uma combinação de substituições de aminoácido seleccionada de entre o grupo consistindo em de (ao) a (be) acima indicados. 78 ΡΕ1476539 0 presente invento proporciona ainda uma composição de avermectinas ciclo-hexil B2:ciclo-hexil BI produzida por células de Streptomyces avermitilis, compreendendo as avermectinas ciclo-hexil B2:ciclo-hexil BI presentes num meio de cultura em que as células foram cultivadas, em que a proporção de avermectinas ciclo-hexil B2: ciclo-hexil BI presentes no meio de cultura é de cerca de 0,40:1 ou inferior, e que é produzido por células compreendendo um alelo aveC submetido a mutação ou uma sua variante degenerada codificando um produto gene AveC compreendendo uma combinação de substituições de aminoácido seleccionada de entre o grupo consistindo em (bf) e (bg) acima indicados.
Embora seja preferido que a nova composição de avermectina esteja presente num meio de cultura em que as células tenham sido cultivadas, por exemplo, em liquido de cultura de fermentação totalmente esgotado, a composição de avermectina pode de um modo alternativo ser parcialmente ou substancialmente purificada a partir do liquido de cultura por meio de técnicas bioquímicas conhecidas de purificação, tais como precipitação de sulfato de amónio, diálise, fraccionamento por tamanhos, cromatografia de permuta de iões, HPLC, etc.
Embora seja preferido que a nova composição de avermectina esteja presente num meio de cultura em que as células tenham sido cultivadas, por exemplo, em líquido de 79 ΡΕ1476539 cultura de fermentação parcialmente ou totalmente esgotado, a composição de avermectina pode de um modo alternativo ser parcialmente ou substancialemnet purificada a partir do liquido de cultura por meio de técnicas bioquímicas conhecidas de purificação, tais como precipitação de sulfato de sódio, diálise, fraccionamento por tamanhos, cromatografia de permuta de iões, etc.
Para além da produção de novas estirpes de S. avermítílís compreendendo células que sejam capazes de produzir proporções reduzidos de ciclo-hexil B2:ciclo-hexil BI tal como foi acima descrito, o presente invento contempla que mutações adicionais podem ser incorporadas em células de S. avermitilis para melhorar ainda mais caracteristicas da produção de avermectina. Numa forma de realização não limitativa, células do presente invento podem ainda compreender modificações para aumentar a produção deo nível de avermectinas. Numa forma de realização, essas células podem ser preparadas por (i) mutação do alelo aveC numa célula de S. avermitilis, ou (ii) introdução de um alelo aveC submetido a mutação ou uma sua variante degenerada em células de uma estirpe de S. avermitilis, em que a expresssão do alelo submetido a mutação dá origem a um aumento na quantidade de avermectinas produzidas por células de uma estirpe de S. avermitilis expressando o alelo aveC submetido a mutação em comparação com células da mesma estirpe que pelo contrário expressam apenas um alelo aveC do tipo selvagem simples, e selecção de células transformadas que produzem avermectinas 80 ΡΕ1476539 numa quantidade aumentada em comparação com a quantidade de avermectinas produzidas por células da estirpe que pelo contrário expressa apenas o alelo aveC do tipo selvagem simples. Por exemplo, o alelo aveC pode ser modificado de modo a compreender um promotor forte, tal como o promotor ermE constitutivo forte a partir de Saccharopolyspora erythraea, inserido a montente de e em associação operativa com o ORF aveC. Numa outra forma de realização, uma ou mais mutações podem ser introduzidas nos genes aveRl e/ou aveR2 de S. avermilitis, desse modo aumentando o nível de produção de avermectina tal como é descrito na Patente dos E.U.A. No. 6.197.591 de Stutzman-Engwall et al., publicada em 6 de Março de 2001.
Utilizações De avermectinas
As avermectinas são agentes antiparasitários altamente activos apresentando uma utilidade particular como anti-helmínticos, ectoparasiticidas, insecticidas e acaricidas. Compostos de avermectina produzidos de acordo com os métodos do presente invento são úteis para qualquer uma das finalidades. Por exemplo, compostos de avermectina produzidos de acordo com o presente invento são úteis para o tratamento de várias doenças ou condições em seres humanos, particularmente onde essas doenças ou condições sejam causadas por infecções por parasitas, tal como é conhecido nesta técnica. Ver, por exemplo, Ikeda and Omura, 1997, Chem. Rev. 97(7):2591-2609. Mais particularmente, compostos de avermectina produzidos de acordo com o 81 ΡΕ1476539 presente invento são eficazes no tratamento de uma série de doenças ou de condições causadas por endoparasitas, tais como nemátodos parasitários, os quais podem infectar o ser humano, animais domésticos, porcos, carneiros, aves domésticas, cavalos ou gado vacum.
Mais especificamente, compostos de avermectina produzidos de acordo com o presente invento são eficazes contra nemátodos que infectam o ser humano, assim como os que infectam várias espécies de animais. Esses nemátodos incluem parasitas gastrointestinais tais como Ancylostoma, necator, Ascaris, Strongyloides, Trichinella, Capillaria, Trichuris, Enterobius, Dirofilaria, e parasitas que se encontram no sangue ou noutros tecidos ou orgãos, tais como vermes da filária e extracto de estados intestinais de Strongyloides e de Trichinella.
Os compostos de avermectina produzidos de acordo com o presente invento são também úteis no tratamento de infecções ectoparasitárias incluindo, por exemplo, infestações por artrópodos de mamíferos e pássaros, causados por carraças, ácaros, piolhos, pulgas, moscas da carne, insectos que picam, ou larvas de dípteros que podem afectar gado vacum e cavalos, entre outros.
Os compostos de avermectina produzidos de acordo com o presente invento são também úteis como insecticidas contra pragas domésticas tais como, por exemplo, baratas, traças da roupa, escaravelhos e mosca doméstica entre 82 ΡΕ1476539 outras, assim como pragas de insectos de cereais armazenados e de plantas agrícolas, cujas pragas incluem aracnídios, afídeos, lagartas, e ortopterans tais como gafanhotos, entre outros.
Animais que podem ser tratados com os compostos de avermectina produzidos de acordo com o presente invento incluem carneiros, gado vacum, cavalos, veados, cabras, porcos, pássaros incluindo aves domésticas, e cães e gatos.
Um composto de avermectina produzido de acordo com o presente invento é administrado numa formulação apropriada à utilização específica pretendida, à espécie particular de animal hospedeiro a ser tratado, e ao parasita ou insecto envolvido. Para utilização como um parasiticida, um composto avermectina produzido de acordo com o presente invento pode ser administrado por via oral sob a forma de cápsulas, bolus, comprimidos ou poção com líquidos ou, de um modo alternativo, poderá ser administrado por derrame, ou por injecção, ou como um implante. Essas formulações são preparadas de um modo conveniente de acordo com a prática veterinária padrão. Assim, cápsulas, bolus ou comprimidos podem ser preparados misturando o ingrediente activo com um diluente ou veículo finamente dividido apropriado contendo adicionalmente um agente de desintegração e/ou um agente de ligação tal como amido, lactose, talco, estearato de magnésio, etc. Uma formulação para derramar poderá ser preparada dispersando o ingrediente activo numa solução aquosa juntamente com um 83 ΡΕ1476539 agente de dispersão ou de humidificação, etc. Formulações injectáveis podem ser preparadas sob a forma de uma solução estéril, a qual poderá conter outras substancias tais como, por exemplo, sais e/ou glucose suficientes para tornar a solução isotónica com o sangue.
Essas formulações irão variar no que se refere ao peso do composto activo dependendo do paciente, da espécie do animal hospedeiro a ser tratado, da gravidade e do tipo de infecção, e do peso corporal do hospedeiro. Geralmente, para administração por via oral uma dose do composto activo variando entre 0,001 e 10 mg em kg do peso corporal do paciente ou do animal administrada como uma dose única ou em doses divididas durante um período variando entre 1 e 5 dias será satisfatória. Contudo, poderá haver casos em que gamas de dosagem mais elevadas ou mais baixas serão indicadas, tal como é determinado, por exemplo, por um médico ou veterinário, tendo como base sintomas clínicos.
Como uma alternativa, um composto de avermectina produzido de acordo com o presente invento poderá ser administrado em combinação com a ração do animal, e para este fim um aditivo alimentar concentrado ou uma prémistura poderá ser preparado para mistura com a ração animal normal.
Para utilização como um insecticida, e para o tratamento de pragas agrícolas, um composto de avermectina produzido de acordo com o presente invento poderá ser 84 ΡΕ1476539 aplicado sob a forma de um spray, poeira, emulsão, etc., de acordo com a prática agrícola padrão. EXEMPLO: FERMENTAÇÃO DE STREPTOMYCES AVERMITILIS E ANÁLI-
SES DE AVERMECTINA B2:BI
Estirpes a que faltam tanto a desidrogenase do ácido 2-oxo de cadeia ramificada como as actividades de 5-0-metiltransferase não produzem avermectinas se o meio de fermentação não for suplementado com ácidos gordos. Este exemplo demonstra que nesses mutantes uma ampla gama de proporções B2:B1 de avermectinas poderá ser obtida quando a biosintese seja iniciada na presença de diferentes ácidos gordos.
Materiais e Métodos
Streptomyces avermitilis ATCC 53692 foi armazenado a -70° C como um caldo total preparado em meio de sementeira consistindo em: Amido (Nadex, Laing National) - 20 g;
Pharmamedia (Trader's Protein, Memphis, TN) - 15 g;
Ardamine pH (Yeast Products Inc.) - 5 g; carbonato de cálcio - 1 g. 0 volume final foi ajustado até 1 litro com água corrente, o pH foi ajustado até 7,2, e o meio foi submetido a autoclave a 121° C durante 25 minutos.
Dois ml de uma suspensão descongelada da preparação acima mencionada foram usados para inocular um frasco contendo 50 ml do mesmo meio. Após 48 horas de 85 ΡΕ1476539 incubação a 28° C num agitador rotativo a 180 rpm, 2 ml do caldo foram usados para inocular um frasco contendo 50 ml de um meio de produção consistindo em: Amido - 80 g; carbonato de cálcio - 7 g; Pharmamedia - 5 g; hidrogen fosfato de dipotássio - 1 g; sulfato de magnésio - 1 g; ácido glutâmico - 0,6 g; sulfato hepta-hidrato ferroso -0,01 g; sulfato de zinco - 0,001 g; sulfato de manganésio -0,001 g. O volume final foi ajustadao até 1 litro com água corrente, o pH foi ajustado até 7,2, e o meio foi submetido a autoclave a 121° C durante 25 minutos. Vários substratos de ácido carboxilico (ver QUADRO 1) foram dissolvidos em metanol e foram adicionados ao caldo de fermentação durante 24 horas após inoculação para dar origem a uma concentração final de 0,2 g/litro. O caldo de fermentação foi incubado durante 14 dias a 28° C, e em seguida o caldo foi centrifugado (2.500 rpm durante 2 minutos) e o produto flutuante foi eliminado. A pílula micelial foi extraída com acetona (15 ml), e em seguida com diclorometano (30 ml), e a fase orgânica foi separada, filtrada, sendo em seguida evaporada até à secura. O resíduo foi misturado com metanol (1 ml) e foi analisado por HPLC com um cromatógrafo líquido Hewlett-Packard 1090A equipado com um dispositivo detector de díodos de varrimento ligado para 240 nm. A coluna usada foi uma Beckman Ultrasphere C-18, 5 pm, coluna de 4,6 mm x 25 cm mantida a 40° C. Vinte e cinco μΐ da solução de metanol acima referida foram injectados para a coluna. A eluição foi realizada com um gradiente linear de metanol-água a 86 ΡΕ1476539 partir de 80:20 a 95:5 durante 40 minutos a 0,85/ml minutos. Duas concentrações padrão de ciclo-hexil BI foram usadas para calibrar a resposta do detector, e foi medida a área sob as curvas para avermectinas B2 e BI.
Resultados
Os tempos de retenção HPLC observados para as avermectinas B2 e Bl, e as proporções 2:1, são apresentados no QUADRO 1. QUADRO 1
Tempo Retenção HLPC (min) Proporção Substrato B2 Bl B2 :B1 Ácido 4-tetra-hidropiranocarboxílico 8, 1 14,5 0, 25 Ácido isobutirico 10, 8 18,9 0,5 Ácido 3-furóico 7, 6 14,6 0, 62 S- ( + )- 2-metilbutírico 12, 8 21,6 1,0 Ácido ciclo-hexanocarboxilico 16, 9 26,0 1,6 Ácido 3-tiofenocarboxilico 8, 8 16,0 1,8 Ácido ciclopentanocarboxilico 14,2 23,0 2,0 Ácido 3-trifluorometilbutírico 10,9 18,8 3,9 Ácido 2-metilpentanóico 14,5 24,9 4,2 Ácido ciclo-heptanocarboxilico 18, 6 29,0 15, 0
Os dados apresentados no QUADRO 1 demonstram uma gama extremamente ampla de proporções de produto avermectinas B2:B1, indicando uma considerável diferença nos resultados de conversão desidrativa de compostos da 87 ΡΕ1476539 classe 2 para compostos da classe 1, dependendo da natureza da unidade iniciadora de cadeia lateral de ácido gordo fornecida. Isto indica que modificações nas proporções B2:B1 resultantes de alterações feitas à proteína Avec podem ser específicas para substratos particulares. Consequentemente, rastreio para mutantes apresenta modificações na proporção B2:B1 obtido com um substrato particular necessita de ser feita na presença desse substrato. Os exemplos subsequentes abaixo descritos utilizam ácido ciclo-hexanocarboxílico como o substrato de rastreio. Contudo, este substrato é usado meramente para exemplificar o potencial, e não pretende limitar a capacidade de aplicação, do presente invento.
EXEMPLO: ISOLAMENTO DO GENE aveC
Este exemplo descreve o isolamento e caracterização de uma região do cromossoma de Streptomyces avermitilis que codifica o produto gene AveC. Tal como é demonstrado mais abaixo, o gene aveC foi identificado como sendo capaz de modificar a proporção de avermectinas ciclo-hexil-B2 a ciclo-hexil-Bl (B2:B1) produzidas. 7.1. Materiais e Métodos
7.1.1. Crescimento De Streptomyces Para Isolamento de DNA 0 método que se segue foi seguido para crescimento de Streptomyces. Colónias simples de S. avermitilis 88 ΡΕ1476539 ATCC 31272 (isolado de colónia simples #2)foram isoladas em YPD-6 de intensidade Vs contendo: Difco Extracto de Levedura - 5 g; Difco Bacto-peptona - 5 g; dextrose - 2,5 g; MOPS -5 g; Difco Bacto agar - 15 g. 0 volume final foi ajustado para 1 litro com dH20, o pH foi ajustado para 7,0, e o meio foi submetido a autoclave a 121° C durante 25 minutos.
Micélios feitos crescer no meio acima indicado foram usados para inocular 10 ml de meio TSB (Difco Tryptic Soy Broth - 30 g, em 1 litro dH20, foram submetidos a autoclave a 121° C durante 25 minutos) num tubo de 25 mm x 150 mm que foi mantido com agitação (300 rpm) a 28° C durante 48-72 horas. 7.1.2. Isolamento De DNA Cromossómico A Partir De Streptomyces
Porções aliquotas (0,25 ml ou 0,5 ml) de micélios feitos crescer tal como foi acima descrito foram colocados em tubos de microcentrifuga de 1,5 ml e as células foram concentradas por centrifugação a 12.000 x g durante 60 segundos. O produto flutuante foi eliminado e as células foram suspensas de novo em 0,25 ml de tapão TSE (20 ml de sucrose 1,5 M, 2,5 ml de Tris-HCl 1 M, pH 8,0, 2,5 ml de EDTA 1 M, pH 8,0, e 75 ml dH20) contendo 2 mg/ml de lisozima. As amostras foram incubadas a 37° C durante 20 minutos com agitação, foram carregadas para um instrumento de isolamento de ácido nucleico automático AutoGen 540 TM (Integrated Separation Systems, Natick, MA), e DNA genómico 89 ΡΕ1476539 isolado usando Cycle 159 (equipamento software) de acordo com as instruções do fabricante.
De um modo alternativo, 5 ml de micélios foram colocados num tubo de 17 mm x 100 mm, as células foram concentradas por centrifugação a 3.000 rpm, e o produto flutuante foi removido. As células foram suspensas de novo em 1 ml de tampão TSE, concentradas por centrifugação a 3.000 rpm durante 5 minutos, e o produto flutuante foi removido. As células foram suspensas de novo em 1 ml de tampão TSE contendo 2 mg/ml de lisozima, e foram incubadas a 37° C com agitação durante 30-60 minutos. Após incubação, 0,5 ml de dodecil sulfato de sódio (SDS) foi adicionado e as células foram incubadas a 37° C até a lise ficar completa. 0 produto da lise foi incubado a 65° C durante 10 minutos, foi arrefecido até à temperatura ambiente, foi dividido entre dois tubos Eppendorf de 1,5 ml, e extraído 1 x com 0,5 ml de fenol/clorofórmio (50% de fenol previamente equilibrada com Tris 0,5 M, pH 8,0; 50% de clorofórmio). A fase aquosa foi removida e extraída 2 a 5x com clorofórmio:álcool isoamílico (24:1). O DNA foi precipitado por adição 1/10 volume de acetato de sódio 3 M, pH 4,8, incubando a mistura sobre gelo durante 10 minutos, centrifugando a mistura a 15.000 rpm a 5° C durante 10 minutos, e removendo o produto flutuante para um tubo ao qual se adicionou 1 volume de isopropanol. A mistura do produto flutuante mais isopropanol foi então incubada sobre gelo durante 20 minutos, foi centrifugada a 15.000 rpm durante 20 minutos a 5° C, o produto flutuante foi 90 ΡΕ1476539 removido, e a pílula de DNA foi lavada lx com etanol a 70%. Depois da pílula ficar seca, o DNA foi suspenso de novo em tampão TE (Tris 10 mM, EDTA 1 mM, pH 8,0). 7.1.3. Isolamento De DNA De Plasmídeo A Partir De Streptomyces
Uma porção alíquota (1,0 ml) de micélios foi colocada em tubos de microcentrífuga de 1,5 ml e as células foram conventradas por centrifugação a 12.000 x g durante 60 segundos. 0 produto flutuante foi eliminado, as células foram suspensas de novo em 1,0 ml de sucrose a 10,3% e concentradas por centrifugação a 12.000 x g durante 60 segundos, e o produto flutuante foi eliminado. As células foram então suspensas de novo em 0,25 ml de tampão TSE contendo 2 mg/ml de lisozima, e foram incubadas a 37° C durante 20 minutos com agitação e foram carregadas para o instrumento de isolamento de ácido nucleico automatizado AutoGen 540™ . DNA de plasmídeo foi isolado usando Cycle 106 (equipamento software) de acordo com as instruções do fabricante.
De um modo alternativo, 1,5 ml de micélios foram colocados em tubos de microcentrifuga de 1,5 ml e as células foram concentradas por centrifugação a 12.000 x g durante 60 segundos. O produto flutuante foi eliminado, as células foram suspensas de novo em 1,0 ml de sucrose a 10,3% e concentradas por centrifugação a 12.000 x g durante 60 segundos, e o produto flutuante foi eliminado. As 91 ΡΕ1476539 células foram suspensas de novo em 0,5 ml de tampão TSE contendo 2 mg/ml de lisozima, e foram incubadas a 37° C durante 15-30 minutos. Após incubação, foi adicionado 0,25 ml de SDS alcalino (NaOH 0,3N, 2% de SDS) e as células foram incubadas a 55° C durante 15-30 minutos ou até a solução ficar transparente. Acetato de sódio (0,1 ml, 3M, pH 4,8) foi adicionado à solução de DNA, que foi então incubada em gelo durante 10 minutos. As amostras de DNA foram centrifugadas a 14.000 rpm durante 10 minutos a 5o C. 0 produto flutuante foi removido para um tubo limpo, e 0,2 ml de fenol:clorofórmio (50% de fenol:50% de clorofórmio) foi adicionado e foi misturado suavemente. A solução de DNA foi centrifugada a 14.000 rpm durante 10 minutos a 5o C e a camada superior foi removida para um tubo Eppemdorf limpo. Foi adicionado isopropanol (0,75 ml), e a solução foi misturada suavemente sendo em seguida incubada à temperatura ambiente durante 20 minutos. A solução de DNA foi centrifugada a 14.000 rpm durante 15 minutos a 5o C, o produto flutuante foi removido, e a pílula de DNA foi lavada com etanol a 70%, foi seca, e suspensa de novo em tampão TE.
Isolamento De AND De Plasmídeo A Partir De E.coli
Uma única colónia de E. coli. Transformada foi inoculada em 5 ml de meio Luria-Bertani (LB) (Bacto-Tryptone - 10 g, extracto de levedura Bacto - 5 g, e NaCl -10 g em 1 litro de dH20, pH 7,0, submetidos a autoclave a 121° C durante 25 minutos, e suplementados com 100 pg/,1 92 ΡΕ1476539 de ampicilina). A cultura foi incubada durante a noite, e uma porção aliquota de 1 ml foi colocada num tubo de microcentrif uga de 1,5 ml. As amostras da cultura foram carregadas para o instrumento de isolamento de ácido nucleico automático AutoGen 540™ usando Cycle 3 (equipamento de software) de acordo com instruções do fabricante.
Preparação e Transformação De Protoplastos de S. avermitilis
Colónias simples de S. avermitilis foram isoladas em YPD de força V2. Os micélios foram usados para inocular 10 ml de meio TSB num tubo de 25 mm x 150 mm, o qual foi então incubado com agitação (300 rpm) a 28° C durante 48 horas. Um ml de micélios foi usado para inocular 50 ml de meio YEME. 0 meio YEME contem por litro: Extracto de Levedura Difco - 3 g; Bacto-peptona Difco - 5 g; Extracto de Malte Difco - 3 g; Sucrose - 300 g. Após autoclave a 121° C durante 25 minutos, foram adicionados os que se seguem: MgCl2 2,5 Μ . 6H2O (submetidos a autoclave separadamente a 121° C durante 25 minutos) - 2 ml; e glicina (20%) (esterilizados por filtração)-25 ml.
Os micélios foram feitos crescer a 30° C durante 48-72 horas e foram colhidos por centrifugação num tubo de centrífuga de 50 ml (Falcon) a 3.000 rpm durante 20 minutos. O produto flutuante foi eliminado e os micélios foram suspensos de novo em tampão P, que contem: sucrose - 93 ΡΕ1476539 205 g: K2S04 - 0,25 g; MgCl2 . 6H20 - 2,02 g; H20 - 600 ml; K2P04 (0,5%) - 10 ml; solução de elemento vestigial - 20 ml; CaCl2 . 2H20 (3,68%) - 100 ml; e tampão MES (1,= M, pH 6,5) - 10 ml. (A solução de elementos vestigiais contem por litro: ZnCl2 - 40 mg; FeCl3 . 6H20 - 200 mg; CuCl2 . 2H20 -10 mg; MnCl2 . 4H20 - 10 mg; Na2B407 . 10H2O - 10 mg; (NH4)6 Mo7024 . 4H20 - 10 mg). O pH foi ajustado para 6,5, o volume final foi ajustado para 1 litro, e o meio foi filtrado a quente através de um filtro de 0,45 micron.
Os micélios foram reduzidos a pílula a 3.000 rpm durante 20 minutos, o produto flutuante foi eliminado, e os micélios foram suspensos de novo em 20 ml de tampão P contendo 2 mg/ml de lisozima. Os micélios foram incubados a 35° C durante 15 minutos com agitação, e foram rastreados microscopicamente para determinar a grau de formação de protoplasto. Quando a formação de protoplasto ficou completa, os protoplastos foram centrifugados a 8.000 rpm durante 10 minutos. O produto flutuante foi removido e os protoplastos foram suspensos de novo em 10 ml de tampão P. Os protoplastos foram centrifugados a 8.000 rpm durante 10 minutos, o produto flutuante foi removido, os protoplastos foram suspensos de novo em 2 ml de tampão P, e aproximadamente 1 x 109 de protoplastos foram distribuídos para 2,0 ml de frascos criogénicos (Nalgene).
Um frasco contendo 1 x 109 de protoplastos foi centrifugado a 8.000 rpm durante 10 minutos, o produto flutuante foi removido, e os protoplastos foram suspensos 94 ΡΕ1476539 de novo em 0,1 ml de tampão P. Dois a 5 pg de DNA de transformação foram adicionados aos protoplastos, imediatamente seguidos pela adição de 0,5 ml de tampãp P em acção. A base de tampão P contém: PEG-1000 (Sigma) - 25 g; sucrose - 2,5 g; H20 - 83 ml. O pH foi ajustado para 8,8 com NaOH 1 N (esterilizado por filtração), e a base de tampão P foi esterilizada por filtração e foi armazenada a 4o C. Tampão T em acção, feito no mesmo dia que foi usado, foi base de tampão T - 8,3 ml; K2P04 (4 mM) - 1,0 ml; CaCl2 . 2H20 (5 M) - 0,2 ml; e TES (1 M, pH 8) - 0,5 ml. Cada componente do tampão T em acção foi individualmente esterilizado por filtração. 20 segundos após a adição de tampão T aos protoplastos, 1,0 ml de tampão P foi também adicionado e os protoplastos foram centrifugados a 8.000 rpm durante 10 minutos. O produto flutuante foi eliminado e os protoplastos foram suspensos de novo em 0,1 ml de tampão P. Os protoplastos foram então colocados em placas com meio RM14, que contem: sucrose - 205 g; K2S04 - 0,25 g; MgCl2 . 6H20 - 10,12 g; glucose - 10 g; Difco Casamino Acids - 0,1 g; Extracto de levedura Difco - 5 g; Difco Oatmeal Agar - 3 g; Difco Bacto Agar - 22 g; dH20 - 800 ml. A solução foi submetida a autoclave a 121° C durante 25 minutos. Após autoclave, foram adicionados lotes estéreis do que se segue: K2P04 (0,5%) - 10 ,1; CaCl2 . 2H20 (5 M) - 5 ml; L-prolina (20%) - 15 ml; tampão MES (1,0 M, pH 6,5) - 10 ml; solução de elementos vestigiais (tal como acima) - 2 ml; lote de ciclo-heximida (25 mg/ml) - 40 ml; e NaOh IN - 2 95 ΡΕ1476539 ml. Vinte e cinco ml de meio RM14 foram divididos em porções aliquotas por placa, e as placas foram secas durante 24 horas antes da sua utilização.
Os protoplastos foram incubados em humidade a 95% a 30° C durante 20-24 horas. Para seleccionar transformantes resistentes a tiostrepton, 1 ml de tampão recoberto contendo 125 pg por ml de tiostrepton foi espalhado de um modo uniforme sobre as placas de regeneração RM14. O tampão recoberto contem por 100 ml: sucrose - 10,3 g; solução de elementos vestigiais (tal como acima) - 0,2 ml; e MES (1 M, pH 6,5) - 1 ml. Os protoplastos foram incubados em 95% de humidade a 30° C durante 7-14 dias até se tornarem visíveis colónias resistentes a tiostrepton (Thio's).
Transformação De Protoplastos De Streptomyces lividans S. lividans TK64 (proporcionado pelo John Ihnes Institute, Norwich, U.K.) foi usado para transformações nalguns casos. Métodos e composições para fazer crescer, formar protoplastos, e transformar S. lividans são descritos em Hopwood et al., 1985, Genetic Manipulation of Streptomyces, A Laboratory Manual, John Innes Foundation, Norwich, U.K., e foram realizados tal como foi ali descrito. O DNA do plasmídeo foi isolado a partir de transformantes de S. lividans tal como foi acima descrito na Secção 7.1.3. 96 ΡΕ1476539
Análise De Fermentação De Estirpes De S. avermitilis
Micélios de S. avermitilis feitos crescer em YPD-6 com uma força de V2 durante 4-7 dias foram inoculados para tubos de 1 x 6 polegadas contendo 8 ml de meio preformado e duas pérolas de vidro de 5 mm. 0 meio preformado contem: amido solúvel (amido submetido a ebulição delgado ou KOSO, Japan Corn Starch Co., Nagoya) - 20 g/1; Pharmacia - 15 g/1; Ardamine Ph - 5 g/1 (Champlain Ind., Clifton, NJ) ; CaC03 - 2 g/1; 2 x bcfa ("bcfa" refere-se a ácidos gordos de cadeia ramificada) contendo uma concentração final no meio de 50 ppm de ácido 2-(+/-)-metil butirico, e 20 ppm de ácido isovalérico. 0 pH foi ajustado para 7,2, e o meio foi submetido a autoclave a 121° C durante 25 minutos. 0 tubo foi agitado num angulo de 17° a 215 rpm a 29° C durante 3 dias. Uma porção aliquota de 2 ml da cultura da sementeira foi usada para inocular um frasco de Erlenmeyer de 300 ml contendo 25 ml de meio de produção que contém: amido (amido submetido a ebulição delgado ou KOSO) - 160 g/1; Nutrisoy (Archer Daniels Midland, Decatur, IL) -10 g/1; Ardamine pH - 10 g/1; K2HPO4 - 2 g/1; MgS04.4H20 -2g/l; FeS04.7H20 - 0,02 g/1; MnCl2 - 0,002 g/1; ZnS04.7H20 -0,002 g/1; CaC03 - 14 g/1; 2x bcfa (tal como acima); e ácido ciclo-hexano carboxilico (CHC) (produzido como uma solução a 20% com um pH 7, 0) - 800 ppm. O pH foi ajustado para 6,9, e o meio foi submetido a autoclave a 121° C durante 25 minutos. (Tal como foi acima explicado, unidades iniciadoras diferentes de CHC poderão ser utilizadas em sua substituição (ver, por exemplo, Quadro 1)). 97 ΡΕ1476539
Após inoculação, o frasco foi incubado a 29° C durante 12 dias com agitação a 200 rpm. Após incubação, uma amostra de 2 ml foi retirada do frasco, foi diluída com 8 ml de metanol, misturada, e a mistura foi centrifugada a 1.250 x g durante 10 minutos até se obterem detritos de pílulas. O produto flutuante foi então ensaiado por HPLC usando uma coluna Beckman Ultrasphere ODS (25 cm x 4,6 mm ID) com uma taxa de fluxo de 0, 75 ml/min e detecção por absorvência a 240 nm. A fase móvel foi constituída por 86/8,9/5,1 metanol/água/acetonitrilo .
Isolamento De Genes PKS De S. avermitilis
Uma biblioteca de cosmídeos do DNA cromossómico de S. avermitilis (ATCC 31272, SC-2) foi preparado e hibridizado com uma sonda cetosintase (KS) formada a partir de um fragmento do gene sintase poliketido de Saccharopolyspora erythraea (PKS). Uma descrição detalhada da preparação de bibliotecas de cosmidios pode ser encontrada em Sambrook et al., 1989, acima referido. Uma descrição detalhada da preparação de bibliotecas de DNA cromossómico de Steptomyces é apresentado em Hopwood et al., 1985, acima referido. Clones de cosmídeos contendo cetosintase-regiões de hibridização foram identificados por hibridização até 2, 7 Kb de um fragmento de IVdeI/£co47III a partir de pEX26 (gentilmente fornecido por Dr. P. Leadlay, Cambridge, UK) . Aproximadamente 5 ng de pEX26 foram digeridos usando Miei e Eco47III. A mistura da 98 ΡΕ1476539 reacção foi carregada para um gel de agarose SeaPlaque GTG a 0,8% (FMC BioProducts, Rockland, ME). O fragmento 2,7 Kb Náel / EcoAUll foi excisado a partir do gel após electro-forese e o DNA recuperado a partir do gel usando GELase™ a partir de Epicentre Technologies usando o Fast Protocol. O fragmento 2,7 kb iVdeI/£co47III foi marcado com [ot-32P]dCTP (5'-trifosfato de desoxicitidina, sal tetra(trietilamónio), [alfa-32P]-) (NEN-Dupont, Boston, MA) usando o BRL Nick Translation System (BRL Life Technologies, Inc., Gaithersburg, MD) seguindo as instruções do fornecedor. Uma reacção típica foi realizada em 0,05 ml de volume. Após adição de 5 μΐ de tampão Stop, o DNA marcado foi separado a partir de nucleótidos não incorporados usando um G-25 Sephadex Quick Spin™ Column (Boehringer Mannheim) seguindo as instruções do fornecedor.
Aproximadamente 1.800 clones de cosmídeos foram rastreados por hibridização de colónia. Foram identificados dez clones que hibridizaram fortemente para a sonda Sacc. Erythraea KS. Colónias de DNA contendo DNA de cosmídeo foram feitas crescer em meio líquido LB e DNA de cosmídeo foi isolado a partir de cada cultura no instrumento de isolamento de ácido nucleico automatizado AutoGen 540™ usando Cycle 3 (equipamento de software) de acordo com as instruções do fabricante. As análises fazendo mapas da endonuclease de restrição e de hibridização de mancha Southern revelaram que cinco dos clones continham regiões cromossómicas sobrepostas. Um mapa de restrição BamRI genómico de S. avermitilis dos cinco cosmídeos (isto é, 99 ΡΕ1476539 pSE65, pSE66, pSE67, pSE68, pSE69) foi construído por análise de cosmidios sobrepostos e hibridizações (FIGURA 4) .
7.1.9. Identificação De DNA Que Modula Proporções De Avermectinas B2:B1 E Identificação De Um ORF aveC
Os métodos que se seguem foram usados para testar fragmentos subclonados derivados do clone de cosmídeo pSE66 quanto à sua capacidade para modular proporções de avermectinas B2:B1 em mutantes AveC. PSE66 (5 pg) foi digerido com Saci e BamHI. A mistura da reacção foi carregada para um gel de agarose SeaPlaque™ GTG a 0,8% (FMC BioProducts), um fragmento 2,9 Kb Saci/BamHI foi excisado a partir do gel após electroforese, e o DNA foi recuperado a partir do gel usando GELase™ (Epicentre Technologies) usando o Fast Protocol. Aproximadamente 5 pg do vector de rearranjo pWHM3 (Vara et al., 1989, J.
Bacteriol. 171:5872-5881) foram digeridos com Saci e BamRI. Cerca de 0,5 pg do produto inserido 2,9 Kb e 0,5 pg do pWHM3 digerido foram misturados um com o outro e foram incubados durante a noite com 1 unidade de ligase (New England Biolabs, Inc., Beverly, MA) a 15° C, num volume total de 20 pl, de acordo com as instruções do fornecedor. Após incubação, 5 pl da mistura de ligação foram incubados a 70° C durante 10 minutos, foram arrefecidos atè à temperatura ambiente, e usados para transformar células DH5ot de E. coli (BRL) de acordo com as instruções do fabricante. 0 DNA do plasmídeo foi isolado a partir de 100 ΡΕ1476539 transformantes resistentes à ampicilina e a presença do elemento inserido 2, 9 Kb Saci/BamRI foi confirmada por análise de restrição. Este plasmideo foi designado como pSE119.
Protoplastos da estirpe de S. avermitilís 1100-SC38 (estirpe in-house Pfizer) foram preparados e transformados com pSE119 tal como foi acima descrito na Secção 7.1.5. A estirpe 1100-SC38 é um mutante que produz uma quantidade mais significativa de avermectina da forma ciclo-hexil-B2 em comparação com a forma de avermectina ciclo-hexil-Bl quando suplementada com ácido ciclo-hexano carboxilico (B2:B1 de cerca de 30:1). PSE119 usado para transformar protoplastos de S. avermitilís foi isolado a partir da estirpe GM2163 de E. coli GM2163 (obtida a partir de Dr. J. Bachmann, Curator, E. coli Genetic Stock Center, Yale University), estirpe E. coli DM1 (BRL), ou estirpe S. lividans TK64. Agentes de transformação resistentes a tiostrepton da estirpe 1100-Sc38 foram isolados e analisados por análise HPLC de produtos de fermentação.Os transformantes da estirpe 1100-SC38 de S. avermitilís contendo pSE119 produziram uma proporção alterado de avermectinas ciclo-hexil-B2:ciclo-hexil-Bl de cerca de 3,7:1 (QUADRO 2).
Tendo estabelecido que pSE119 era capaz de modular proporções de avermectinas B2:B1 num mutante AveC, o DNA do elemento inserido foi sequenciado. Aproximadamente pg de pSE119 foram isolados usando um 101 ΡΕ1476539 estojo de isolamento de DNA de plasmídeo (Qiagen, Valência, CA) seguindo as instruções do fabricante, e fazendo a sequência usando ABI 373A Automated DNA Sequencer (Perkin Elmer, Foster City, CA). Os dados da sequência foram reunidos e editados usando programas do Genetic Computer Group (GCG, Madison, WI) . A sequência de AND e o aveC ORF são apresentados na FIGURA 1 (SEQ ID NO:l).
Um novo plasmídeo, designado como pSE118, foi construído como se segue. Aproximadamente 5 pg de pSE66 foram digeridos com Sphl e BarriRI. A mistura da reacção foi carregada num gel de agarose SeaPlaque GTG a 0,8% (FMC BioProducts) , um fragmento 2,8 Kb SphI/BamE.1 foi excisado a partir do gel após electroforese, e o DNA foi recuperado a partir do gel usando GELase™ (Epicentre Technologies) usando o Fast protocol. Aproximadamente 5 pg do vector de lançamento pWHM3 foram digeridos com Sphl e BamHI. Cerca de 0,5 pg do elemento de inserção 2,8 Kb e 0,5 pg de pWHM3 digerido foram misturados um com o outro e incubados durante a noite com 1 unidade de ligase (New England Biolabs) a 15° C num volume total de 20 pl de acordo com as instruções do fornecedor. Após incubação, 5 pl da mistura de ligação foram incubados a 70° C durante 10 minutos, foram arrefecidos até à temperatura ambiente, e foram usados para transformar células competentes de E. coli DH5ot de acordo com as instruções do fabricante. O DNA do plasmídeo foi isolado a partir de transformantes resistentes a ampicilina, e a presença do elemento de inserção 2,8 Kb Sphl/BamHI foi confirmada por análise de 102 ΡΕ1476539 restrição. O plasmídeo foi designado como pSE118. O DNA do elemento inserido em pSE118 e pSE119 sobrepõem-se em aproximadamente 833 nucleótidos (FIGURA 4).
Protoplastos da estirpe de S. avermítilis 1100-SC38 foram transformados com pSE118 como foi acima referido. Agentes de transformação resistentes a tiostrepton da estirpe 1100-SC38 foram isolados e analisados por análise HPLC de produtos de fermentação. Agentes de transformação da estirpe de S. avermítilis da estirpe 1100-SC38 contendo pSE118 não foram alterados nas proporções de avermectina ciclo-hexil-B2: avermectina ciclo-hexil-Bl em comparação com a estirpe 1100-SC38 (QUADRO 2).
Amplificação De PCR Do Gene aveC A Partir De AND De Cromossoma de S. avermítilis
Um fragmento ~1,2 Kb contendo o ORF aveC foi isolado a partir do DNA cromossómico por amplificação PCR usando iniciadores designados tendo como base a sequência de nucleótidos do aveC acima obtida. Os iniciadores PCR foram fornecidos por Genosys Biotechnologies, Inc. (Texas). 0 iniciador para a direita foi: 5'-TCACGAAACCGGACACAC-3' (SEQ ID NO: 6) ; e o iniciador para a esquerda foi: 5 ' - CATGATCGCTGAACCGAG-3' (SEQ ID NO: 7) . A reacção PCR foi realizada com polimerase Deep Vent™ (New England Biolabs) em tampão proporcionado pelo fabricante, e na presença de 300 μΜ dNTP, 10% de glicerol, 200 pmol de cada iniciador, 0,1 pg de template (padrão), e 2,5 unidades de enzima num 103 ΡΕ1476539 volume final de 100 μΐ, usando um agente de ciclo térmico Perkin-Elmer Cetus. O perfil térmico do primeiro ciclo foi de 95° C durante 5 minutos (passo de desnaturação), 60° C durante 2 minutos (passo de recozimento), e 72° C durante 2 minutos (passo de extensão). Os subsequentes 24 ciclos tinham um perfil térmico semelhante exceptuando o facto do passo de desnaturação ser encurtado para 45 segundos e o passo de recozimento ser encurtado para 1 minuto. 0 produto PCR foi submetido a electroforese num gel de agarose a 1% e foi detectada uma banda de AND de ~1,2 Kb. Este DNA foi purificado a partir do gel, e foi ligado com 25 ng de vector pCR-Blunt (Invitrogen) atenuado, linearizado numa proporção de vector para elemento inserido de 1:10 seguindo as instruções do fabricante. A mistura de ligação foi usada para transformar células de E. coli One Shot™ Competent (Invitrogen), seguindo as instruções do fabricante. 0 DNA do plasmideo foi isolado a partir de transformantes resistentes a ampicilina, e a presença do elemento inserido ~1,2 Kb foi confirmada por análise de restrição. O plasmideo foi designado como pSE179. O DNA do elemento inserido a partir de pSE179 foi isolado por digestão com BamEI/Xbal, separado por electroforese, purificado a partir do gel, e ligado com vector de rearranjo pWHM3, o qual tinha sido digerido com BamEI/Xbal, numa concentração total de DNA de 1 pg numa proporção vector para elemento inserido molar. A mistura de 104 ΡΕ1476539 ligação foi usada para transformar células DH5a de E. coli competente de acordo com as instruções do fabricante. O DNA do plasmideo foi isolado a partir de transformantes resistentes a ampicilina e a presença de elemento de inserção ~1,2 Kb foi confirmado por análise de restrição. Este plasmideo, que foi designado como pSE186 (FIGURA 2, ATCC 209604) , foi transformado em E. coli DM1, e o DNA do plasmideo foi isolado a partir de transformantes resistentes a ampicilina.
Resultados
Um fragmento SacI/BamRI 2,9 Kb a partir de pSEll9 foi identificado o qual, quando transformado em estirpe S. avermítílís 1100-SC38, alterou de um modo significativo a proporção de produção de avermectinas B2:B1. A estirpe de S. avermítílís 1100-SC38 tem normalmente uma proporção B2:B1 de cerca de 30:1, mas quando transformado com um vector compreendendo o fragmento SacI/BamHI 2,9 Kb, a proporção de avermectinas B2:B1 diminuiu até cerca de 3,7:1. Análise pós-fermentação de células transformantes verificou a presença do DNA de transformação. 0 fragmento pSE119 2,9 Kb foi sequenciado e um ORF ~0,9 Kb foi identificado (FIGURA 1) (SEQ ID N0:1), que abrange um fragmento Pstl/Sphl que tinha sido previamente submetido a mutação noutro local para produzir apenas produtos B2 (Ikeda et al., 1995, acima referidos) . Uma comparação deste ORF, ou seu polipeptideo deduzido 105 ΡΕ1476539 correspondente, contra dados de base conhecidos (GenEMBL, SWISS-PROT) não revelou qualquer homologia conhecida com DNA conhecido ou sequências de proteína. O QUADRO 2 apresenta a análise de fermentação da estirpe S. avermitilis 1100-SC38 transformada com vários plasmídeos. QUADRO 2
Estirpe S. avermitilis (transformando plasmídeo) No. Agentes transformação testados Proporção Médio B1:B2 1100-SC38 (nenhum) 9 30,66 1100-SC38 (pWHM3) 21 31,3 110 0-SC3 8 (pSE119) 12 3, 7 110 0-SC3 8 (pSE118) 12 30, 4 110 0-SC3 8 (pSE185) 14 27,9
EXEMPLO: CONSTRUÇÃO DE MUTANTES AveC De S. AVERMITILIS
Este exemplo descreve a construção de vários diferentes mutantes de AveC de S. avermitilis diferentes usando as composições e métodos acima descritos. Uma descrição geral de técnicas para introdução de mutações num gene em Streotomyces é descrito por Kieser and Hopwood, 1991, Meth. Enzym. 204:430-458. Uma descrição mais detalhada é proporcionada por Anzai et al., 1988, J. Antibiot. XLI(2):226-233, e por Stutzman-Engwall et al. , , 1992, J. Bacteriol. 174(1):144-154. Estas referências são aqui incorpoaradas como referência na sua totalidade. 106 ΡΕ1476539
Inactivação Do Gene aveC De S. avermitilis
Mutantes Avec contendo genes aveC inactivados foram construídos usando vários métodos, tal como é descrito detalhadamente mais abaixo.
No primeiro método, um fragmento interno Sphl/PstI 640 bp para o gene aveC em pSE119 (plasmídeo descrito na Secção 7.1.9, acima referida) foi substituido com o gene ermE (para resistência a eritromicina) a partir de Sacc. Erythraea. O gene ermE foi isolado a partir de pIJ4026 (proporcionado pelo John Innes Institute, Norwich, U.K.; ver também Bibb et al., 1985, Gene 41:357-368) por digestão de enzima de restrição com Bg/II e EcoRI, seguida por electroforese, e foi purificado a partir do gel. Este fragmento ~1,7 Kb foi ligado para pGEM7Zf (Promega) que tinha sido digerido com BamEI e EcoRI, e a mistura da ligação foi transformada em células competentes de E. coli DH5ot seguindo as instruções do fabricante. O DNA de plasmídeo foi isolado a partir de transformantes resistentes a ampicilina, e a presença do elemento de inserção ~1,7 Kb foi confirmado por análise de restrição. Este plasmídeo foi designado como pSE27. PSE118 (descrito na Secção 7.1.9, acima referido) foi digerido com Sphl e BamRI, o produto digerido foi submetido a electroforese, e o elemento inserido Sphl/BamEI ~2,8 Kb foi purificado a partir do gel. PSE119 foi digerido 107 ΡΕ1476539 com Pst I e EcoRI, o produto digerido foi submetido a electroforese, e o elemento de inserção PstI/EcoRI ~1,5 Kb foi purificado a partir do gel. O vector de rearranjo pWHM3 foi digerido com BairiRI e EcoRI. PSE27 foi digerido com PstI e Sphl, o produto digerido foi submetido a electroforese, e o elemento inserido PstI/Sphl ~1, 7 Kb foi purificado a partir do gel. Os quatro fragmentos (isto é, ~2,8 Kb, ~l,5Kb, ~7,2Kb, ~l,7Kb) foram ligados uns aos outros numa ligação de 4 vias. A mistura de ligação foi transformada nas células competentes de E. coli DH5a seguindo as instruções do fabricante. O DNA do plasmideo foi isolado a partir de transformantes resistentes a ampicilina, e a presença do elemento de inserção correcto foi confirmado por análise de restrição. Este plasmideo foi designado como pSE180 (FIGURA 3; ATCC 209605). PSE180 foi transformado em S. lividans TK64 e colónias transformadas identificadas por resistência a tiostrepton e eritromicina. PSE180 foi isolado a partir de S. lividans e foi usado para transformar protoplastos de S. avermitilis. Quatro transformantes de S. avermitilis resistentes a tiostrepton foram identificados, e protoplastos foram preparados e colocados em placa em condições não selectivas nos meios RM14. Depois de os protoplastos se regenerarem, colónias simples foram rastreadas quanto à presença de resistência a eritromicina e a ausência de resistência a tiostrepton, indicando integração cromossomica do gene aveC inactivado e perda do replicon livre. Um transformante Ermr Tios foi identificado 108 ΡΕ1476539 e designado como estirpe SE180-11. DNA cromossómico total foi isolado a partir da estirpe SE180-11, foi digerido com enzimas de restrição BamiRI, HindIII, PstI, ou Sphl, separados por electrof orese num gel de agarose a 0,8%, transferido para membranas de nylon, e hibridizado para a sonda ermE. Estas análises revelaram que a integração cromossómica do gene de resistência ermE, e concomitante deleção do fragmento PstI/Sphl 640 bp tinham ocorrido por um evento cruzado duplo. Análise HPLC de produtos de fermentação da estirpe SE180-11 revelou que avermectinas normais tinham deixado de ser produzidas (FIGURA 5A).
Num segundo método para inactivar o gene aveC, o gene ermE 1,7 Kb foi removido a partir do cromossoma da estirpe S. avermitilis SE180-11, deixando uma delecção PstI/Sphl 640 bp no gene aveC. Um plasmideo de substituição de gene foi construido como se segue: pSE180 foi parcialmente digerido com Xbal e um fragmento -11,4 Kb purificado a partir de gel. À banda -11,4 Kb falta o gene de resistência ermE 1,7 Kb. O DNA foi então ligado e transformado em células de E. coli DH5a. O DNA de plasmideo foi isolado a partir de transformantes resistentes a ampicilina e a presença do elemento inserido correcto foi confirmado por análise de restrição. Este plasmideo, que foi designado como pSE184, foi transformado em E. coli DM1, e DNA de plasmideo foi isolado a partir de transformantes resistentes a ampicilina. Este plasmideo foi usado para transformar protoplastos da estirpe S. avermitilis SE180-11. Protoplastos foram preparados a 109 ΡΕ1476539 partir de transformantes resistentes a tiostrepton de estirpe SE180-11 e foram colocados em placas como colónias simples em RM14. Depois dos protoplastos se regenerarem, colónias simples foram rastreadas quanto a ausência de ambas a resistência a eritromicina e resistência a tiostrepton, indicando integração cromossómica do gene aveC inactivado e perda do replicon livre contendo gene ermE. Um transformante Erms Tios foi identificado e designado como SE184.1.13. A análide de fermentação de SE184-1-13 revelou que as avermectinas normais não foram produzidas e que SE184-1-13 tinha o mesmo perfil de fermentação que SE180-11.
Num terceiro método para inactivação do gene aveC, foi introduzido um frameshift (desvio) no gene aveC do cromossoma adicionando dois G's depois do C na posição nt 471 usando PCR, criando desse modo um sitio BspEl. A presença do sítio BspE submetido a engenharia foi útil para detectar o evento de substituição de gene. Os iniciadores PCR foram esboçados para introduzir uma mutação de frameshift (desvio) no gene aveC, e foram fornecidos por Genosys Biotechnologies, Inc. O iniciador para a direita foi: 5'-GGTTCCGGATGCCGTTCTCG-3' (SEQ ID NO:8) e o iniciador para a esquerda foi: 5'-AACTCCGGTCGACTCCCCTTC-3' (SEQ ID NO: 9). As condições PCR foram tal como foi descrito na Secção 7.1.10 acima referido. O produto PCR 666 bp foi digerido com Sphl para dar origem a dois fragmentos de 278 bp e 388 bp, respectivamente. O fragmento 388 bp foi purificado a partir do gel. 110 ΡΕ1476539 O plasmídeo de substituição de gene foi construído como se segue: vector de rearranjo pWHM3 foi digerido com EcoRI e BamYÍI. PSE119 foi digerido com BamRI e Sphl, o produto digerido foi submetido a electroforese, e um fragmento -840 bp foi purificado a partir do gel. PSE119 foi digerido com EcoRI e Xmnl, o produto digerido foi separado por electrof orese, e um fragmento -1,7 Kb foi purificado a partir do gel. Os quatro fragmentos (isto é, -7,2 Kb, -840 bp, -1,7 Kb, e 388 bp) foram ligados uns aos outros numa ligação de 4 vias. A mistura de ligação foi transformada em células competentes de E. coli DH5a. O DNA do plasmídeo foi isolado a partir de transformantes resistentes a ampicilina e a presença do elemento inserido correcto foi confirmado por análise de restrição e análise de sequência de DNA . Este plasmídeo, que foi designado como pSE185, foi transformado em E. coli DM1 e DNA de plasmídeo isolado a partir de transformantes resistentes a ampicilina. Este plasmídeo foi usado para transformar protoplastos da estirpe S. avermitilis 1100-SC38. Agentes de transformação resistentes a tiostrepton da estirpe 1100-SC38 foram isolados e analisados por análise HPLC de produtos de fermentação. PSE185 não alterou de um modo significativo as proporções de avermectinas B2:B1 quando transformados em S avermitilis da estirpe 1100-SC38 (QUADRO 2) . PSE185 foi usado para transformar protoplastos de S. avermitilis para dar origem a uma mutação de frameshift 111 ΡΕ1476539 (desvio) no gene aveC do cromossoma. Os protoplastos foram preparados a partir de transformantes resistentes a tiostrepton e foram colocados em placas sob a forma de colónias simples em RM14. Depois dos protoplastos se terem regenerado, colónias simples foram rastreadas quanto a ausência de resistência a tiostrepton. 0 DNA do cromossoma a partir de colónias sensíveis a tiostrepton foi isolado e avliado por PCR quanto à presença da mutação de frameshift integrada no cromossoma. Os iniciadores PCR foram esboçados tendo como base a sequencia de nucleótidos aveC, e foram fornecidos por Genosys Biotechnologies, Inc. (Texas). 0 iniciador PCR para a direita foi: 5'-GCAAGGATACGGGGACTAC-3' (SEQ ID NO:10) e o iniciador PCR para a esquerda foi: 5'-GAACCGACCGCCTGATAC-3' (SEQ ID NO: 11), e as condições PCR foram tal como foi descrito na Secção 7.1.10 acima referida. O produto PCR obtido foi 543 bp e, quando digerido com BspEI, três fragmentos de 368 bp, 96 bp, e 79 bp foram observados, indicando integração cromossomica do gene aveC inactivado e perda da replicação livre.
Análise de fermentação de mutantes de S. avermitilis contendo a mutação de frameshift (desvio) no gene aveC revelou que avermectinas normais deixaram de ser produzidas, e que que estes mutantes tinham o mesmo perfil HPLC de fermentação que estirpes SE180-11 e SE184-1-13. Um transformante Tios foi identificado e designado como estirpe SE185-5a. 112 ΡΕ1476539
Adicionalmente, foi produzida uma mutação no gene aveC que modifique a posição nt 520 a partir de G a A, que dá origem a alteração do codão codificando um triptofano (W) na posição (W) 116 até um codão de terminação. Uma estirpe de S.avermitilis com esta mutação não produziu avermectinas normais e apresentava o mesmo perfil de fermentação que estirpes SE180-11, SE184-1-13, e SE185-5a.
Adicionalmente, foram produzidas mutações no gene aveC que alteram ambos: (i) posição nt 970 a partir de G a A, que modifica o aminoácido na posição 266 a partir de uma glicina (G) num aspartato (D), e (ii) posição nt 996 de T a C, que modifica o aminoácido na posição 275 da tirosina (Y) a histidina (H) . Uma estirpe de S. avermitilis com estas mutações (G266D/Y275H) não produziu avermectinas normais e apresentava o mesmo perfil de fermentação que estirpes Sel80-ll, Sel84-1-13, e SE185-5a.
As estirpes de mutante de inactivação de aveC de S. avermetilis SE180-11, SE184-1-13, SE185-5a, e outras aqui proporcionadas, proporcionam instrumentos de rastreio do impacto de outras mutações no gene aveC. PSE186, que contem uma cópia do tipo selvagem do gene aveC, foi transformado em E. coli DM1, e DNA do plasmideo foi isolado a partir de transformantes resistentes a ampicilina. Este DNA de pSE186 foi usado para transformar protoplastos de S. avermitilis da estirpe SE180-11. Os transformantes resistentes a tiostrepton da estirpe Sel80-ll foram isolados, a presença de resistência a eritromicina foi 113 ΡΕ1476539 determinada, e transformantes Arm' foram analisados por análise HPLC de produtos de fermentação. A presença do gene aveC funcional in trans foi capaz de restaurar a normal produção de avermectina para a estirpe SE180-11 (FIGURA 5B) .
Análise de Mutação No Gene aveC Que Altera Proporções Da Classe B2:B1
Tal como foi acima descrito, S. avermitilis da estirpe SE180-11 contendo um gene aveC inactivo foi complementado por transformação com um plasmideo contendo um gene aveC funcional (pSE186). A estirpe SE180-11 foi também utilizada como uma estirpe hospedeira para caracterizar outras mutações no gene aveC, tal como é descrito mais abaixo. DNA cromossómico foi isolado a partir da estirpe 1100-SC38, e foi usado como um template (padrão) para amplificação PCR do gene aveC. 0 ORF 1,2 Kb foi isolado por amplificação PCR usando iniciadores designados tendo como base a sequência de nucleótidos aveC. 0 iniciador para a direita foi SEQ ID NO: 6 e o iniciador para a esquerda foi SEQ ID NO: 7 (ver Secção 7.1.0, acima referido). O PCR e condições de subclonagem foram tal como foi descrito na Secção 7.1.10. A asnálise da sequência de DNA do ORF 1,2 Kb revela uma mutação no gene aveC que modifica nt posição 337 de C a T, o que modifica o aminoácido na posição 55 de serina (S) para fenilalanina (F) . O gene aveC contendo a 114 ΡΕ1476539 mutação S55F foi subclonada para pWHM3 para produzir um plasmideo que foi designado como pSE187, e que foi usado para transformar protoplastos da estirpe S. avermitilis SE180-11. Agentes de transformação resistentes a tiostrepton da estirpe SE180-11 foram isolados, a presença de resistência de eritromicina foi determinada, e transformantes Tior Ermr foram analisados por análise HPLC de produtos de fermentação. A presença do gene aveC codificando uma modificação no resíduo de aminoácido 55 (S55F) foi capaz de restaurar a produção normal de avermectina da estirpe SE180-11 (FIGURA 5C) ; contudo, a proporção ciclo-hexil B2:ciclo-hexil BI foi de cerca de 26:1, em comparação com a estirpe SE180-11 transformada com pSE186, que apresentava uma proporção de B2:B1 de cerca de 1,6:1 (QUADRO 3), indicando que a simples mutação (S55F) modula a quantidade de ciclo-hexil-B2 produzido em relação a ciclo-hexil-Bl.
Foi identificada uma outra mutação no gene aveC que modifica nt posição 862 de G a A, que modifica o aminoácido na posição 230 de glicina (G) a aspartato (D) . Uma estirpe de S. avermitilis tendo esta mutação (G230D) produz avermectinas numa proporção B2:B1 de cerca de 30:1.
Mutações que Reduzem A proporção B2:B1
Foram realizadas várias mutações que reduzem a quantidade de ciclo-hexil-B2 produzido em relação a ciclo-hexil-Bl, como se segue. 115 ΡΕ1476539
Foi identificada uma mutação no gene aveC que modifica nt posição 588 a partir de G a A, que modifica o aminoácido na posição 139 de alanina (A) para treonina (T). 0 gene aveC contendo a mutação A139T foi subclonado para pWHM3 para produzir um plasmideo que foi designado pSE188, e que foi usado para transformar protoplastos de S. avermítílís da estirpe SE180-11. Agentes de transformação resistentes a tiostrepton da estirpe SE180-11 foram isolados, a presença de resistência a eritromicina foi determinada, e transformantes Tior Ermr foram analisados por análise HPLC de produtos de transformação. A presença do gene aveC submetido a mutação que codificou uma modificação no resíduo de aminoácido 139 (A139T) foi capaz de restaurar a produção de avermectina para estirpe SE180-11 (FIGURA 5D); contudo, a proporção B2:B1 foi de cerca de 0,94:1, indicando que esta mutação reduz a quantidade de ciclo-hexil-B2 produzido em relação a ciclo-hexil-Bl. Este resultado foi inesperado porque resultados publicados, assim como os resultados de mutações acima descritas, apenas demonstraram ou inactivação do gene aveC ou produção aumentada da forma B2 de avermectina em relação à forma BI (QUDRO 3).
Porque a mutação de A139T alterou as proporções B2:B1 na direcção BI mais favorável, foi construída uma mutação que codificou uma treonina em vez de uma serina na posição de aminoácido na posição 138. Assim, pSE186 foi 116 ΡΕ1476539 digerido com EcoRI e foi clonado para pGEM3Zf (Promega) que tinha sido digerido com EcoRI. Este plasmideo, que foi designado como pSE186a, foi digerido com ApaI e ΚρηI, os fragmentos de DNA foram separados num gel de agarose, e dois fragmentos de ~3,8 Kb e ~0,4 Kb foram purificados a partir do gal. 0 DNA inserido ~1,2 Kb de pSE186 foi usado como um template (padrão) PCR para introduzir uma modificação de base simples em nt posição 585. Os iniciadores PCR foram esboçados para introduzir uma mutação em nt posição 585, e foram fornecidos por Genosys Biotechnologies, Inc. (Texas). 0 iniciador PCR para a direita foi: 5'-GGGGGCGGGCCCGGGTGCGGAGGCGGAAATGCCCCTGGCGACG-3' (seq id no:12); e o iniciador PCR para a esquerda foi: 5'-GGAACCGACCGCCTGATACA-3' (SEQ ID N0:13). A reacção PCR foi realizada usando um estojo genómico GC Advantage (Clonetech Laboratories, Paio Alto, CA) em tampão proporcionado pelo fabricante na presença de 200 μΜ dNTPs, 200 pmol de cada iniciador, 50 ng DNA template (padrão), 1,0 M GC-Melt e 1 unidade Klen Taq Polymerase Mix num volume final de 50 μΐ. O perfil térmico do primeiro ciclo foi de 94° C durante 1 minuto; seguindo-se 25 ciclos de 94° C durante 30 segundos e 68° C durante 2 minutos; e 1 ciclo a 68° C durante 3 minutos. Um produto PCR de 295 bp foi digerido com ApaI e ΚρηI para libertar um fragmento 254 bp, o qual foi separado por electrofores e foi purificado a partir do gel. Os três fragmentos (~3,8 Kb, ~0,4 Kb e 254 bp) foram ligados uns aos outros numa ligação de 3 vias. A mistura de ligação foi 117 ΡΕ1476539 transformada em células competentes de E. coli DH5a. 0 DNA do plasmídeo foi isolado a partir de transformantes resistentes a ampicilina, e a presença do elemento inserido correcto foi confirmada por análise de restrição. 0 plasmídeo foi designado como pSE198. PSE198 foi digerido com EcoRI, foi clonado para pWHM3, que tinha sido digerido com EcoRI, e transformado em células de E. coli DH5ot. 0 DNA de plasmidio foi isolado a partir de transformantes resistentes a ampicilina e a presença do elemento de inserção correcto foi confirmada por análise de restrição e análise de sequência de DNA. Este DNA de plasmídeo foi transformado em E. coli DM1, DNA de plasmídeo foi isolado a partir de transformantes resistentes a ampicilina, e a presença do elemento de inserção correcto foi confirmada por análise de restrição. 0 plasmídeo, que foi designado como pSE199, foi usado para transformar protoplastos de S. avermitilis da estirpe SE180-11. Agentes de transformação resistentes a tiostrepton da estirpe Sel80-ll foram isolados, a presença de resistência a eritromicina foi determinada, e transformantes Tior Ermr foram analisados por análise HPLC de produtos de fermentação. A presença do gene aveC submetido a mutação codificando uma modificação no resíduo de aminoácido 138 (S138T) foi capaz de restaurar uma produção normal de avermectina para estirpe SE180:11; contudo, a proporção B2:B1 foi de 0,88:1 indicando que esta mutação reduz a quantidade de ciclo-hexil-B2 produzido em 118 ΡΕ1476539 relação a ciclo-hexil-Bl (QUADRO 3). Este proporção B2:B1 é ainda mais baixo do que a proporção 0,94:1 observado com a mutação A139T produzida por transformação da estirpe SE180-11 com pSE188, tal como foi acima descrito.
Foi construída outra mutação para introduzir uma treonina em ambas as posições de aminoácido 138 e 139. O DNA inserido ~1,2 Kb a partir de pSE186 foi usado como um template (padrão) PCR. Os iniciadores PCR foram esboçados para introduzir mutações em nt posições 585 e 588, e foram fornecidos por Genosys Biotechnologies, Inc. (Texas). O iniciador PCR para a direita foi: 5'-GGGGGCGGGCCCGGGTGCGGAGGCGGAAATGCCGCTGGCGACGACC-3' (SEQ ID NO:14) ; e o iniciador PCR para a esquerda foi: 5'-GGAACATCACGGCATTCACC-3' (SEQ ID NO:15). A reacção PCR foi realizada usando as condições imediatamente acima descritas nesta Secção. Um produto PCR de 449 bp foi digerido com Apa I e Κρη I para libertar um fragmento 254 bp, que foi separado por electroforese e foi purificado a partir do gel. PSE186a foi digerido com Apal e Kpnl, os fragmentos de DNA foram separados em gel de agarose, e dois fragmentos de ~3,8 Kb e ~0,4 Kb foram purificados a partir do gel. Os três fragmentos (~3,8 Kb, ~0,4 Kb e 254 bp) foram ligados uns aos outros numa ligação de 3 vias, e a mistura de ligação foi transformada em células competentes de E. coli DH5ot. DNA de plasmídeo foi isolado a partir de transformantes resistentes a ampicilina, e a presença do elemento de inserção correcto foi confirmado por análise de restrição. Este plasmídeo foi designado como pSE230. 119 ΡΕ1476539 pSE230 foi digerido com EcoRI, foi clonado para pWHM3, que tinha sido digerido com EcoRI, e transformado em células E. coli DH5a. DNA de plasmideo foi isolado a partir de transformantes resistentes a ampicilina e a presença de elemento de inserção correcto foi confirmada por análise de restrição e análise da sequência de DNA. Este DNA de plasmideo foi transformado em E. coli DM1, DNA de plasmideo isolado a partir de transformantes resistentes a ampicilina, e a presença do elemento de inserção correcto foi confirmada por análise de restrição. Este plasmideo, que foi designado como pSE231, foi usado para transformar protoplastos da estirpe de S.avermitilis SE180-11. Agentes de transformação resistentes a tiostrepton de SE180-11 foram isolados, a presença de resistência a eritromicina foi determinada, e os transf ormantes Tior Ermr foram analisados por fermentação. A presença do gene aveC com dupla mutação codificando S138T/A139T, foi capaz de restaurar uma normal produção de avermectina para a estirpe Sel80:ll; contudo, a proporção B2:B1 foi de 0,84:1 revelando que esta mutação reduz ainda mais a quantidade de ciclo-hexil-B2 produzida em relação a ciclo-hexil-Bl (QUADRO 3), superior às reduções proporcionadas por transformação da estirpe SE180-11 com pSE188 ou pSE199, tal como foi acima descrito.
Outra mutação foi construída para reduzir ainda mais a quantidade de ciclo-hexil-B2 produzida em relação a ciclo-hexil-Bl. Porque as mutações S138T/A139T alteraram as 120 ΡΕ1476539 proporções B2:B1 na direcção mais favorável de Bl, foi construída uma mutação para introduzir uma treonina na posição do aminoácido 138 e uma fenilalanina na posição de aminoácido 139. 0 DNA de elemento de inserção ~1,2 Kb a partir de pSE186 foi usado como um template (padrão) PCR. Os iniciadores PCR foram esboçados para introduzir mutações em nt posições 585 (mudando um T em A), 588 (mudando um G em T) , e 589 (mudando um C em T), e foram fornecidos por Genosys Biotechnologies, Inc. (Texas). O iniciador PCR para a direita foi: 5'-GGGGGCGGGCCCGGGTGCGGAGGCGGAAATGCCGCT-GGCGACGTTC-3 ' (SEQ ID NO:16); e o iniciador PCR para a esquerda foi: 5'-GGAACATCACGGCATTCACC-3' (SEQ ID NO:15). A reacção PCR foi realizada usando um PCR genómico Advantage GC (Clonetech Laboratories, Paio Alto, CA) em tampão proporcionado pelo fabricante na presença de 200 μΜ de dNTPs, 200 pmol de cada iniciador, 50 ng de DNA template (padrão), 1,1 mM de acetato de Mg, 1,0 M GC-Melt e 1 unidade de Tth DNA Polymerase num volume final de 50 μΐ. O operfil térmico do primeiro ciclo foi de 94° C durante 1 minuto; seguiram-se 25 ciclos de 94° C durante 30 segundos e 68° C durante 2 minutos; e 1 ciclo a 68° C durante 3 minutos. Um produto PCR de 449 bp foi digerido com ApaI e Kpnl para libertar um fragmento 254 bp, o qual foi separado por electrofores e purificado a partir do gel. Os três fragmentos (~3,8 Kb, ~0,4 Kb e 254 bp) foram ligados uns aos outros numa ligação de 3 vias. A mistura de ligação foi transformada em células competentes de E. coli DH5a. DNA do plasmídeo foi isolado a partir de transformantes resistentes a ampicilina, e a presença do elemento de 121 ΡΕ1476539 inserção correcto foi confirmada por análise de restrição. Este plasmideo foi designado como pSE238. pSE238 foi digerido com EcoRI, foi clonado para pWHM3, que tinha sido digerido com EcoRI, e transformado em células de E. coli DH5ot. DNA de plasmideo foi isolado a partir de transformantes resistentes a ampicilina e a presença do elemento de inserção correcto foi confirmada por análise de restrição e análise de sequência de DNA. Este DNA de plasmideo foi transformado em E. coli DM1, DNA de plasmideo isolado a partir de transformantes resistentes a ampicilina, e a presença do elemento de inserção correcto foi confirmada por análise de restrição. Este plasmideo, que foi designado como pSE231, foi usado para transformar protoplastos da estirpe de S.avermitilis SE180-11. Agentes de transformação resistentes a tiostrepton de SE180-11 foram isolados, a presença de resistência a eritromicina foi determinada, e os transf ormantes Tior Ermr foram analisados por análise HPLC de produtos de fermentação. A presença do gene aveC com dupla mutação codificando S138T/A139F, foi capaz de restaurar uma normal produção de avermectina para a estirpe Sel80:ll; contudo, a proporção B2:B1 foi de 0,75:1 revelando que esta mutação reduz ainda mais a quantidade de ciclo-hexil-B2 produzida em relação a ciclo-hexil-Bl (QUADRO 3), superior às reduções proporcionadas por transformação da estirpe SE180-11 com pSE188, pSEl99, ou pSE231, tal como foi acima descrito. 122 ΡΕ1476539 QUADRO 3
Estirpe S. avermitilis (transformando plasmídeo) No. de Trans f ormantes Testados Cone. B2 Relativa Cone. BI Relativa Proporção Média B2;B1 SE180-11 (nenhum) 30 0 0 0 SE180-11 (pWHM3) 30 0 0 0 SE180-11 (pSE18 6 ) 26 222 140 1, 59 SE180-11 (pSE18 7) 12 283 11 26,3 SE180-11 (pSE18 8) 24 193 206 0, 94 SE180-11 (pSE19 9 ) 18 155 171 0, 88 Sel80-ll (pSE231) 6 259 309 0, 84 SE180-11 (pSE23 9) 20 184 242 0, 75
Mutações adicionais foram construídas para reduzir ainda mais a quantidade de ciclo-hexil-B2 produzida em relação a ciclo-hexil-Bl usando a técnica de rearranjo de DNA tal como foi descrito por Stemmer, 1994, Nature 370:389-391; e Stemmer, 1994, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 91:10747-10751; e descrita ainda nas Patentes dos E.U.A. Nos. 5.605.793; 5.811.238; 5.830.721; e 5.837.458.
Plasmídeos com arrrastamento de DNA contendo genes aveC submetidos a mutação foram transformados em células competentes dam dem E. coli. DNA de plasmídeo foi isolado a partir de transformantes resistentes à ampicilina, e foi usado para transformar protoplastos de S. avermitilis da estirpe SE180-11. Agentes de transformação resistentes a tiostrepton da estirpe SE-180-11 foram isolados e rastreados quanto à produção de avermectinas com uma proporção de ciclo-hexil-B2:ciclo-hexil BI de 1:1 ou inferior. Foi determinada a sequência de DNA de plasmídeo a 123 ΡΕ1476539 partir de transformantes SE180-11 produzindo avermectinas com uma proporção B2:B1 de 1:1 ou inferior.
Foram identificados oito transformantes que produziram quantidades reduzidas de ciclo-hexil-B2 em relação a ciclo-hexil-Bl. A proporção B2:B1 mais baixo conseguido entre estes transformantes foi de 0,40:1 (QUADRO 4) . O DNA de plasmideo foi isolado para cada um dos oito transformantes e a sequência de DNA foi determinada para identificar as mutações no gene avec. As mutações são como se segue. PSE290 contem 4 mutações de nucleótido em nt posição 317 de T a A, em nt posição 353 de C a A, em nt
posição 438 de G a A, e em nt posição 1155 de T a A. A modificação do nucleótido em nt posição 317 modifica o aminoácido em AA posição 48 de D a E e a modificação do nucleótido em nt posição 438 modifica o aminoácido na posição 89 de AA de A a T. A proporção B2:B1 produzido por células que transportam este plasmideo foi de 0,42:1 (QUADRO 4). PSE291 contem 4 mutações de nucleótidos em nt posição 272 de G a A, em nt posição 585 de T a A, em nt
posição 588 de G a A, e em nt posição 708 de G a A. A modificação do nucleótido em nt posição 585 modifica o aminoácido na posição 138 de AA de S a T, a modificação do nucleótido em nt posição 588 modifica o aminoácido na posição 139 de AA de A a T, e a modificação do nucleótido em nt posição 708 modifica o aminoácido na posição 170 de 124 ΡΕ1476539 AA de G a S. A proporção B2:B1 produzido por células transportando este plasmídeo foi de 0,57:1 (QUADRO 4). PSE292 contem as mesmas quatro mutações de nucleótido que pSE290. A proporção B2:B1 produzido por células transportando este plasmídeo foi de 0,40:1 (QUADRO 4) . PSE293 contem 6 mutações de nucleótido em nt de A a G, em nt posição 286 de A a C, em nt posição 497 de T a C, em nt posição 554 de C a T, em nt posição 580 de T a C, e em nt posição 886 de A a T. A modificação de nucleótido em nt posição 286 modifica o aminoácido na posição 38 de AA de Q a P, a modificação do nucleótido em nt posição 580 modifica o aminoácido na posição 136 de AA de L a P, e a modificação de nucleótido em nt posição 886 modifica o aminoácido na posição 238 de AA de E a D. A proporção B2:B1 produzido por células transportando o plasmidio foi de 0,68:1 (QUADRO 4).
PSE294 contem 6 mutações de nucleótido em nt 469 de T a C, em nt posição 585 de T a A, em nt posição 588 de G a A, em nt posição 708 de G a A, em nt posição 708 de G a A, em nt posição 833 de C a T, em nt posição 1184 de G a A. Além disso, nts em posições 173, 174, e 175 são deletadas. A modificação de nucleótido em nt posição 469 modifica o aminoácido na posição 99 de AA de F a S, a modificação de nucleótido em nt posição 585 modifica o aminoácido na posição 138 de AA de S a T, a modificação de nucleótido em nt posição 588 modifica o aminoácido na posição 139 de AA 125 ΡΕ1476539 de A a T, e a modificação de nucleótido em nt posição 708 modifica o aminoácido na posição 179 de AA de G a S. A proporção B2:B1 produzido por células transportando este plasmideo foi de 0,53:1 (QUADRO 4). PSE2295 contem 2 mutações de nucleótidos em nt 588 de G a A e em nt 856 de T a C. A modificação do nucleótido em nt posição 588 modifica o aminoácido na posição 139 de AA de A a T e a modificação do nucleótido em nt posição 856 modifica o aminoácido na posição 228 de AA de M a T. A proporção B2:B1 produzido por células transportando este plasmideo foi de 0,80:1 (QUADRO 4). PSE296 contem 5 mutações de nucleótidos em nt posição 155 de T a C, em nt posição 505 de G a T, em nt posição 1039 de C a T, em nt posição 1202 de C a T, e em nt posição 1210 de T a C. A modificação de nucleótido em nt posição 505 modifica o aminoácido na posição 111 de AA de G a V e a modificação do nucleótido em nt posição 1039 modifica o aminoácido na posição 289 de AA de P a L. A proporção B2:B1 produzido por células transportando este plasmideo foi de 0,73:1 (QUADRO 4). PSE297 contem 4 mutações de nucleótido em nt posição 377 de G a T, em nt posição 588 de G a A, em nt
posição 633 de A a G, e em nt posição 1067 de A a T. A modificação do nucleótido em nt posição 588 modifica o aminoácido na posição 139 de AA de A a T, a modificação do nucleótido em nt posição 633 modifica o aminoácido na posição 154 de AA de K a E, e a modificação do nucleótido 126 ΡΕ1476539 em nt posição 1067 modifica o aminoácido na posição 298 de AA de Q a Η. A proporção B2:B1 produzido por células transportando este plasmideo foi de 0,67:1 (QUADRO 4). QUADRO 4
Estirpe S. avermitílis (transformando plasmideo) No. de Transformantes Testados Cone. Relativa B2 Cone. Relativa BI Proporção Média B2 :B1 SE180-11 (nenhum) 4 0 0 0 SE180-11 (pWHM3) 4 0 0 0 SE180-11 (pSE2 9 0) 4 87 208 0, 42 SE180-11 (pSE2 91) 4 106 185 0, 57 SE180-11 (pSE2 92) 4 91 231 0, 40 SE180-11 (pSE2 93) 4 123 180 0, 68 SE180-11 (pSE2 94) 4 68 129 0, 53 SE180—11 (pSE2 95) 4 217 271 0, 80 SE180—11 (pSE296) 1 134 186 0, 73 SE180—11 (pSE2 9 7) 1 148 221 0,67
Uma sucessão adicional de rearranjo de DNA foi conduzida para reduzir ainda mais a quantidade de avermectina ciclo-hexil-B2 produzida em relação a avermectina ciclo-hexil-Bl como se segue.
Rearranjo semi-sintético O melhor clone foi rearranjado usando o método descrito em PCT International Publication WO 97/20078 por Maxygen Inc. Oligonucleótidos individuais codificando substituições benéficas correspondendo melhor a uma proporção B2:B1 diminuído foram adicionados à reacção de rearranjo com um excesso molar de 5 sobre aos cordões 127 ΡΕ1476539 template (padrão) aveC. Cada nucleótido mal combinado do oligonucleótido foi flanqueado por 20 nucleótidos de identidade perfeita para assegurar uma incorporação apropriada ao longo da reacção de rearranjo. Os oligonicleótidos foram adquiridos a partir de Operon Technologies (Alameda, CA).
Crescimento HTP de S. avermitilis
Clones independentes foram colhidos a partir das placas de transformação e foram inoculados em 200 μΐ de meio R5 (Kieser, T., et al., "Practical Streptomyces Genetics", 2000, Norwich, U.K., John Innes Foundation) em placas para semear com 96 cavidades e foram feitos crescer a 30° C com agitação. A cada cavidade, foi fornecida uma pérola de vidro para dispersão de micélios e agitação da cultura.
Durante este período de tempo, as culturas atingiram um crescimento uniforme e denso. Após 4-5 dias, foram fornecidos às placas de produção 20 μΐ de meio de cultura para sementeira e o volume que permaneceu foi congelado como placas dominantes a -80° C depois da adição de glicerol à concentração final de 20%. As placas de produção foram incubadas a 30° sob humidade durante 12-14 dias. A esporulação das estirpes ocorreu após 5-8 dias de incubação. As placas de produção foram produzidas essencialmente tal como é descrito em PCT International Publication WO 99/41389 por Pfizer Inc., com a excepção de adição de 1% de agarose para assegurar uma superfície sólida. ΡΕ1476539 128
Extracção e rastreío de ESI-MS/MS
Um total de 1 ml de acetato de etilo foi adicionado a cada cavidade e foi incubado com agitação à temperatura ambiente durante 20 minutos. Aproximadamente 750 μΐ do acetato de etilo-fase foram recuperados, transferidos para uma placa com 96 cavidades e regulados para evaporação durante a noite.O precipitado foi suspenso de novo em 100 μΐ de metanol 1 mM NaCl dos quais 5 μΐ de solução foram injectados em espectrometro de massa por um aparelho automático de amostras num formato de 96 cavidades e analisado directamente na fase de injecção de fluxo sem cromatografia liquida ou outra separação. Os compostos foram ionizados por ionização por electropulverização e dois canais separados foram monitorizados em duas transições MS/MS. A transição MS/MS para ião sodiado BI varia entre m/z 921 e m/z 777 e para ião sodiado B2 varia entre m/z 939 e m/z 795 em modo positivo. Um espectrómetro de massa Finnigan TSQ-7000, Micromass Quattro-LC e um aparelho automático para amostras Leap TechnologY Twin-Pal foram usados para este rastreio de elevada produtividade. Integração dos cromatogramas separados BI e B2 para cada localização de cavidade identificou os pontos mais elevados.
Foram identificadas cinquenta e sete (57) novas combinações de substituições de aminoácido que podem produzir proporções de avermectinas ciclo-hexil B2:ciclo-hexil BI de 0,35:1 ou inferiores (FIGURA 6). Várias destas novas mutações podem produzir proporções de avermectinas ciclo-hexil B2:ciclo-hexil BI de cerca de 0,30:1 ou 129 ΡΕ1476539 inferiores; vários podem produzir proporções de avermectinas ciclo-hexil B2:ciclo-hexil BI de cerca de 0,25:1 ou inferiores, e várias podem produzir proporções de avermectinas ciclo-hexil B2:ciclo-hexil BI de cerca de 0,20:1 ou inferiores. Foram identificadas duas (2) novas mutações que produzem proporções de avermectinas ciclo-hexil B2:ciclo-hexil BI de 0,37 ou 0,38.
DEPÓSITO DE MATERIAIS BIOLÓGICOS
Os plasmideos que se seguem foram depositados com a American Type Culture Collection (ATCC) aeml2301 Parklawn Drive, Rockville, MD, 20852, USA, em 29 de Janeiro de 1998, e foram-lhes atribuídos os seguintes números de acesso:
Plasmídeo No. de Acesso Plasmídeo pSE 180 209605 Plasmídeo pSE 186 209604 O endereço corrente da American Type Culture Collection é 10801 University Blvd, Manassas, VA, 20110, USA. O presente invento não deverá ser limitado no seu âmbito pela forma de realização específica aqui descrita, que pretende constituir uma simples ilustração de aspectos individuais do invento. Na verdade, várias modificações do invento, para além das aqui apresentadas e descritas tornar-se-ão aparentes para os especialistas nesta técnica a partir da descrição anterior e desenhos acompanhantes. Essas modificações pretendem situar-se no âmbito das reivindicações apensas. 130 ΡΕ1476539
Lisboa, 2 de Abril de 2009 131 ΡΕ1476539 LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS <110* PFIZER PRODUCTS ÍNC.
< Í20> STRERTOMYCES AVERMÍTiUS GENE DÍRECTING THE RATJO Of B2:B1 AVERíSECTlfiS
<13Q> PC23QS4A <140> PC23Q34A <141> 2002-02-12 <163> 16 <! 70> Fateníín Ver. 2.1 <210» 1
<211> 1225 «212» DNA <213> SírepíosTiyces avermftiiís <220> <221 > CDS <222» (174)..(1085) teaegaaacc ggacacseca cacacaçgaa ggtgagacag cgtgaaccca teegagecgc 60 tcggcctgcc caacgaacgt gtagtagaca cccgsccgtc cgatgcoacg ctcteacccg 120 aggccggeefc gaacaggtca ggagcgetge ccegtgs&ct gctgtcgctg ecg gt,g 176
Val 1 cjtg gtg tS9 gee 999 gtc gge ctg ctg Val Val Trp Ala Gly Val Gly Leu Leu 5 10 gtg tte agç egç fcgg gcg gee gac ggc Val Phe ser Arg Trp Ala Ala Asp Gly 20 25 gcg gge cag ggt cag ggc ggg age aag Ala Gly Gin C-ly Gin Gly Gly Ser Lys 35 40 RtC fcat ecc gtg afct tcc gfcc gte fcgc Val Tyx Pr© val Ile Ser Val Val Cys ttt cfcg gee ctg cag gcg tac 234 Phe Leu Ala Leu Gin Ala Tyr 15 ggc tae cgg ctg afcc gag acg 272 siy Tyr Arg Leu lie Glu Thr 30 gat acg ggg act acc gat g*g 320 Asp Thr Gly Thr Thr Asp Val 45 ate acc gee gcg gcg gcg fcgg Ile Thr Ais Ala Ala Ala Trp 363 132 ΡΕ1476539 ss 55 60 65 etc ttc egg agg tgc cgt gtc gaa cg a «sg ctg ctg ttc gac gee efct 416 Leu Phe Arg Arg Cys Arg Val Glu Arg Arg Lsu Leu Phe Asp A3.«t Leu 70 75 80 ctc ttc etc 333 Ctg ctg ttc gcg age tgg cag age Ccg ctc atg aac 464 Leu Phe Leu Qly léu Leu Phe Ala SSr Trp Sln Ser Pro Leu. Met Asn ss so 95 tgg ttc cat tcc gtt ctc gtc tcc aac gcg agt gtg tgg gge gcg gtg 512 Trp Phe Kis Ser Val Leu Val Ser Asn Ala Ser Val Trp Gly Ala Val 100 105 110 S3t tcc tgg 991 ccg tat gtg CCC ggc tgg cag ggg gcg ggc ççg ggt 560 Gly Ser Trp Gly Pro Tyr Val Pro Gly Trp Gin Gly Ala Gly Pro Gly 113 220 125 gea gag geg gaa atg ccg ctg gcg teg gee tcc gtc tgc atg teg gcfc 603 Àl6 Glu Ala Glu Met Pro Leu Ala Ser Ala Ser Val Cys Met Ser Ala 130 135 140 145 ctg ate gfcc acc gfcg ctg tgc age aag gea ctg 399 tgg ate aag gee 656 Leu Ile Vai Thr Val Leu Cys Ser Lys Ala Leu Gly Trp He Lys Ala ISO 255 160 cgc egg ccg gea tgg egg acc tgg cgg ctg gtc ctg gee stg ttc ttc 704 Arg Arg Pro Ala Trp Arg Thr Trp Arg Leu. Val Leu Ala Val Phe Phe 165 170 175 ate ggc ate gtg etc 331 ctg tcc gag ceg ctg ccg tce gee tcc 993 752 Ile Gly Ile Val Leu Gly Leu Ser Glu Pro Leu Pro Ser Ala Ser Gly 180 185 ISO ate age gfca tgg gee aga gcg ctg ccc gag gtg acc ttg tgg sgt gge 800 Ile Ser Val Trp Ala Arg Ala Leu Pro Glu Val Thr Leu Trp Ser Gly 195 200 205 gag tgg tac cag ttc ccc gtg tat cag gcg gtc 3St tcc ggc ctg gtc 843 Glu Trp Tyr Gin Phe Pro Val Tyr Gin Ala Val Gly Ser Qly Leu vai 210 215 220 225 tgc tgc atg· ctg çgo teg ctg ego ttc ttc ege gac gaa CÇJÇ gat gag 396 Cys Cys Leu Gly Ser Leu Arg P.he Phe Arg· Asp Glu Arg Asp Glu 23g 33S 240 teg tgg gtg gaa. cgg SS® gee t99 cgg ttg ccg caa cgg gea gcg aac 944 Ser Trp Val Glu Arg Gly Ala Trp Arg Leu Pro Gin Arg Ala Ala Asn 133 ΡΕ1476539 245 250 255 tgg geg cgt ttc etc gee s«g Sftc 39t SS9 gtg aat gee gtg atg ttc 922 Trp Ala Arg Phe Leu Ala Val Val Gly Gly Val Asn Ala Val Ret Phe 260 285 270 etc tac aec tgt ttc cafc ate etc ctg tcc ctc gtc ggt gga eag ecg 1040 Leu Tyr Thr €ys Phe Eis Ile Leu Leu Ser Leu val Gly Gly Gin Pro 215 280 285 cqc: gac caa ctg ccg gac tcc ttc caa Scg ceg gee gct tac tga 1085 Pro· Asp Gin Leu Pro Asp Ser Phe Gin Ala Pro Ala Ala Tyr 2$Q 295 300 gfctcagggca ggtcggagga gacggagaag gggaggcgae cgyagttccg gtcacctccc X145 ctttgfcgcat gggtggacgg ggatcacgct cecatggcgg cgggctoctc eagac-gcaec 120¾ acactecteg gttcagcgat cafcg 1339
«210> 2 <2!1> 303 «212> PRT «213* Sírepíomyees avermiCSs «400>2
Val. Val Val Trp Ala Gly val Gly Leu Leu Phe Leu Ala Leu Gin Ala 1 5 10 15 Tyr Val Phe Ser Arg Trp Ala Ala Asp Gly Gly Tyr Arg Leu Ile Glu 20 25 30 Thr Ala Gly Gin Gly Gin Gly Gly Ser Lye Asp Thr Gly Thr Thr Asp 35 40 45 Val Val Tyr Pro Val He Ser Val Val Cys He Thr Ala Ala Ala Ala 50 55 60 Trp Leu Phe Arg Arg Cys Arg Val Glu Arg Arg Leu Leu Phe Asp Ala 55 70 75 80 Leu Leu Phe Leu Gly Leu Leu Phe Ala Ser Trp Gin Ser Pro Leu Met 85 90 95 Asn Trp Phe Ki. s Ser Val Leu Val Ser Asn Ala Ser Val Trp Gly Ala 100 105 110 Val Gly Ser Trp Gly Pro Tyr Val Pro Gly Trp Gin Gly Ala Gly Pro 115 120 125 Gly Ala Glu Ala Glu Refc Pro Leu Ala Ser Ala Ser Val Cys Met Ser 130 135 140 Ala Leu He Val Thr Val Lau Cys Ser Lys Ala Leu Gly Trp Ile Lys 14S 150 155 160 Ala Arg Arg Pro Ala Trp Arg Thr Trp Arg Leu Val Leu Ala val Phe 134 ΡΕ1476539 1S5 170 175 &he Ile Gly Ile val Leu Gly T.eu Ser Glu Pro Leu Pro Ser Ala Ser 180 185 190 Gly Ile Ser Vai Trp Ala Arg Ala Leu Pro Glu Val Thr Leu Trp Ser 3.9S 200 205 Gly Glu Trp Tyr Gin. Phe Pro val Tyr Gin Ala Val Gly Ser Gly Leu 210 215 220 Vai Cys Cys Wet Leu Sly Ser Leu Arg Phe Phe Arg Asp Glu Arg Asp 225 23Ô 235 240 Glu Ser Trp vai Glu Arg Gly Ala Trp Arg Leu Pro Gin Arg Ala Ala 245 250 255 Asn Trp Ala Arg ?he Leu Ala Val Val Gly Gly Val Asn Ala Val ttet 200 265 270 Phs Leu Tyr Thr Cys Phe Bis Ile Leu Leu Ser Leu val Gly Gly Gin 275 280 285 Pro Pr» Asp Gin Leu Pro Asp Ser Phe Gin Ala Pro Ala Ala Tyr 290 295 300 <211>1150 <212» ΟΝΑ <213» Síreptomyces tsy^oscopicus <22 Q» <221 > GDS <222» (58), .(930} <400»3 gtcgacgaag accggccgga ggccgtcggc cgggccgafca ccgtacgcgg cctgcgg 57 gtg fctc acc ctt ecc 3 ta aca ctg tgg 9«s tgt gtc ggc g«g ctg gtg 105 Val PhS: Thr Leu Pro Val Thr Leu Trp Ala Cys Val Gly Ala Leu Val 1 5 10 13 ctg gga ctt cag gtg tac stg fcte gee gee tgg cfc-c gee gac age 90« 153 Leu Gly Leu Glu, 20 val Tyr Val Phe Ala 25 Ala Trp Leu Ala. Asp 30 Ser Gly tac egc ate gag aag gtg tcc ceg gee agg ggc gyt sgg gac fecg gag 201 Tyr Arg ile Glu Lys Ala Ser Pro Ala Arg Gly Gly Gly Asp Ser Glu 35 40 45 egg ate gee ga-fc gtg ctg ate ccg ctg ctg tcc gtg gtg gga g«s gtg 24 9 Arg Ile Ala Asp Val Leu Ile Pro Leu Leu Sar Val Val Gly Ala Val SG S5 E0 135 ΡΕ1476539 gtc ctc gea gtg fcgt ctg tac cgg agg tgt cgg gee «gg agg cgg ctg 297 Vai Leu Ala Vai Cys Leu. Tyr Arg Arg Cys Arg Ala Arg Arg Arg Leu $5 70 7S 80 a cg ttc gac gcg teg ctc ttc ate ggg ctg ctg teg' gee agt tgg cag 245 Thr Phe Asp Ala ser Leu Phe lie Gly Leu Leu Ser Ala Ser Trp Glu, es 90 95 agt cee ttg atg aac tss ate ccg gtg ctc gcg tea aac gtc aat 393 Ser Pro Leu Met Asa Trp iie &sn Pro Val Leu Ala Ser Asn Val Asn 100 105 110 gtg ttc gga gcg gtg gee teg tgg ggg ccg tat gtg ccc ggt tgg cag 442 Vai Phe aiy Ala Val Ala Ser Trp Gly Pro Tyr Val Pro Gly Trp Gin 215 120 125 999 gcg 999 gcg cac eag gag gee Sag ctg ccg ctg gcg acc ctg age 489 Gly Ala Gly Ala His Gin Glu Ala Glu Leu Pro Leu Ala Thr Leu Ser 130 135 140 ate tgt atg aeg gee atg atg gee gee Stg gee tege ggc aag ggc atg 537 Ile Cys Ket Thr Ala Met Met Ala Ais Val Ala Cys Gly L-ys Gly Met 1.45 150 155 ISO ggt ctfc gee gee gee cgg tgg ccg cg« ctg ggg ccg ctc cgg ctg ate 585 <3iy Leu Ala Ala Ala Arg Trp Pro Arg Leu Gly Pro Leu Arg Leu Ile 165 270 17S gcg ctc 93C ttt ctg ctc gtc gtg etc ctc gac ate gee gag ccg efcg 533 Ala Leu Gly Pae Leu Leu Val Val Leu Leu Asp He Ala Glu Pro Leu 180 185 ISO 9C9 tcc ttc gcg ggc gtc tcc gtg tgg acg cgg gea gtg ccc gag ctg 681 Vai Ser Phe Ala Gly Val Ser Val Trp Thr Arg Ala Val Pro GlU Leu 295 200 205 ace ate tgg agt ggg cac tgg tat eag ttc cçg ctg tat eag atg gtg 729 Thr ne Trp Sar «iy Hís Trp Tyr Gin Phe Pro Leu Tyr Gin Mefc Val 210 215 220 gct teg 9cg ctc tfcc ggc gee tet ttg 999 gee gcg ege cac ttt ege 777 AXa Ser Ala Leu Phe Gly Ala Ser Leu Gly Ala Ala Arg HÍS Phè Arg 225 210 235 240 tlclC cgg ege 99c gaâ acg tgt ctg gag tcc ggg gcg gee ctc cta ccg S25 Asn Arg Arg Gly Glu Thr cys Leu Glu Ser Gly Ala Ala Leu Leu Pro 245 250 252 136 ΡΕ1476539 9*9 ggs ccg agg cea tgg gtc egg ctg ctg g<=9 gtg gt3 sgc 399 gee 873 Glu Gly pro Arg Pro Trp Vai Arg Leu L@U Ala Vai Vai Gly Gly Ala 260 2SS, 270 a&c ate age ate gee etc tae acc ggt gea cac 99c gea cac ate ctg 021 ASn Xis Ser lie Ala XjSU Tyr Thr Gly Ala His Gly Ala His Xle LEU 27S 280 285 tte fccg ctg atg gac 99« gct cee ccg gac cgg etc cee gaa tte tte 969 Phe Ser Leu itfefc Asp Gly Ala Pro Pro A:Sp Arg Leu Pro Glu Phe Phe 250 295 300 cgt ceg geg gee ggo fcac tga gaccgccggc aceaeecacg fcacecgar.gt 1020 Arg Pro Ala Ala Gly Ty.r 305 310 gcgcgatgtg cctgatgcgc cfcgatgtacc cggggfcgtca tcggctcacc tgtggcgcct 10 BQ catgcggtga gcgctccgce tcgtccttgt tccggctcct gggctccacg accatacgga 1140 1150 gcggccgggg
<2tQ>4 •;2': · > ;'.10 «212> PFET <213» Síreptonivees hygfoscopiais *400> 4
Vai Phe Thr Leu Pro Vai Thr Leu Trp Ara Cys Vai Gly Mâ Leu Vai 1 5 ío 15 leu Gly Leu Gin Vai Tyr Vai Phe Ma Ala Trp Leu Ala Asp Ser Gly 20 25 30 Tyr Arg Xle Glu Lys Ala Ser Pro Ala Arg Gly Gly Gly Asp Ser Glu 35 40 45 Arg Xle Ala Aap Vai Leu Xle Pro Leu Leu Ser Vai Vai Gly Ala Vai 50 55 60 Vai Leu Ala Vai Cys Leu Tyr Arg Arg Cya Arg Ala Arg Arg Arg Leu 65 70 75 80 Thr Phe Asp Ala Ser Leu Phe Xle Gly Leu Leu Ser Ala Ser Trp Gin 65 90 95 Ser Pro Leu Ket Asa Trp 11« Aso Pro Vai Leu Ala Ser Asn Vai As» 100 105 110 Vai Phe Gly Ala Vai Ala Ser Trp Gly Pro Tyr Vai Pro Gly Trp Gin 115 120 12S Gly Ala Gly Ala KÍS Gin Glu Ala Glu Leu Pro Leu Ale Thr Leu Ser 13 0 135 140 lie Cys Mefc Thr Ais ?<íet fíet Ala Ala Vai Ala Cys Gly Lys Gly Mefc 137 ΡΕ1476539 145 ISO 155 ISO Gly Leu Ais Ala Ala Arg Trp pro Arg teu Gly Pro Leu Arg teu Ile 165 270 175 Ala Leu Oly Phe teu Leu Vai Val teu Leu Asp lie Ala Glu Pro Leu 180 léS 190 Vai Ser Pise Ala Gly Vai Ser Val Trp Thr Arg Ala Val Pro Glu teu 195 200 205 Thr tle Trp Ser Oly Kis Trp Tyr Gin Phe Pro teu Tyr Gin Met Vai 210 225 220 Ala Ser Ala Leu phe Gly Ala Ser Leu Gly Ara Ala Arg Kis Phe Arg 225 220 235 240 Asn Arg Arg Gly Olu Thr Cys Leu Glu Ser Gly Ala Leu teu Pro 245 250 25S 01 u Gly Pro Arg Pro Trp Vai Arg teu Leu .Ai-â, val Val Gly Gly Ala 260 26$ 270 Asn 11a Ser lie Ala Leu Tyr Thr Gly Ala His Gly Ala Kis XXe Leu 275 280 285 Phe Ser Leu Met ASp Gly Ala Pro Pro Asp Arg Leu Pro Glu Phe Phe 290 29$ 300 Arg Pro Ala Ala Oly Tyr 305 310 «211»215
<212> PRT <213» Strepiomyces griseocftrQmGgeries •;40G > 5
Val tle Gly Trp Ala Ala teu Gly Ala Val Phe teu Val teu Glu Val 1 5 10 15 Tyr Val Phe Ala Arg Trp Thr Ala Asp Gly Gly Tyr His Leu Ala Asp 20 25 30 Val Ser Gly Pro Asp Gly Arg Glu Pro Gly Kis Arg Arg Ile Xle Asp 35 40 45 Val teu teu Pro Ala Leu Ser Met Ala Gly Val Val Gly Leu Ala Pite 50 ss 60 Trp Leu Val Arg Arg Trp Arg Ala Glu Arg Arg Leu Ser Phe Asp Ala S5 70 75 80 teu Leu Phe Thr Gly Val teu Phe Ala Gly Trp teu Ser Pro teu Met 85 90 95 138 ΡΕ1476539
Asn Trp Phe Hís Pro Vai Leu Met 100
Vai Gly Ser Trp Gly Pro Tyr Vai 1X5 120
Gly I>y* Glu Ala Glu Leu Pro Leu 130 13 S
Vai Leu Leu Gly Vai Leu Gly Cys 14 5 150
Ala Âsn Thr His Vai Trp Gly Ala 105 110
Pr O Gly Trp Arg Gly Leu Pro Pro 125
Vai Thr Phe Ser Leu Gly Ser Tbr 14 C
Cys Gin Vai Net Ser Arg Vai Arg 155 150
Glu Arg Trp Pro Gly Vai Arg Pro Trp Gin Leu Vai Gly Leu Ala Phe 155 170 17S
Leu Thr Ala Vai Ala Phe Asp Lsu Ser Glu Pr© Phe xle Ser Phe Ala 180 185 190
Gly Vai ser Vai Trp Ala Arg Ala Leu Pro Thr Vai Thr Leu Trp Arg X95 200 205
Gly Ala Trp Tyr Arg Ala Arg 2X0 215
<210» 5 <211» 18 <212> DNA <213» Sfrepíomyees avermstiiis <4S0> δ tcacgaaacc ggacacsc 1«
<21Q> 7 <211 > 18 <212> DMA <213> Srtreptomyces avermstsits <4B0>7 caígatcgd gaaccgag 18
<210>8 <211 >.20 <212> DNA <213» Strepíorrsyces averroiísíis <4S0>8 ggttccgga! gccgtícteg 20
<210>9 <211 >21 «212» DNA <213» Strep1omyc.es avermiíilis 139 ΡΕ1476539 <4GQ> 3 aadccggte gaclceeetf c 21
<210» 10 <211> 59 <212» DMA <-213» SírepSomyces averaiítds. <4GS> 10 geaaggatae ggggsdac 19
<210» I S <211> 10 <212» DMA <213> Síreplosriyces averoilfiSis <400> 11 gaaccgaccg cdgaac 18
<210» 12 <211 >43 <212> DMA <213» SírepíDfT-iVces aveísnSSUs <400» 12 gggggeggge ccgggígcgg aggcggaaat gcccdggcg acg <21Q> 13 <2 : : .·· 20 <212» DMA. <213» Streptoroyces awersnS» <4G0> 13 ggaaccgacc gcc.tgaiaca 20
<210> 14 <211 >46 <212> DMA <213» Strepíofrsyees avenni@Ís <400» 14 gggggcgggc ccgggígcgg aggcggaaat gccgcíggcg acgscc
<21Q> 55 <211» 20 <212> DMA <213» StrepíDíTsyces aveondUs <400» 15 ggaacaicac ggcatteacc 20
<21Q> 56 <211 >40 <212» DMA <213» Sireptocrsyees avermsísSís <400» 16 gggggegggc ccgggígcgg aggcggaaat gccgcíggcg acgttc ΡΕ1476539 140

Claims (10)

  1. ΡΕ1476539 1 REIVINDICAÇÕES 1. Uma molécula de polinucleótido compreendendo uma sequência de nucleótidos que é por outro lado a mesma que a do alelo aveC de Streptomyces avermitilis, a sequência que codifica o produto gene Avec de S. avermitilis de plasmideo pSE186 (ATCC 209604) da sequência de nucleótidos do aveC ORF de S. avermitilis tal como apresentados na FIGURA 1 (SEQ ID NO:l), ou uma sua variante degenerada, mas cuja sequência de nucleótidos compreende ainda mutações codificando uma combinação de substituições de aminoácido nos resíduos de aminoácido correspondendo às posições de aminoácido de SEQ ID NO: 2, de modo a que células de S. avermitilis estirpe ATCC 53692 em que o alelo aveC do tipo selvagem foi inactivado e que expressam a molécula de polinucleótido compreendendo a sequência de nucleótidos submetidos a mutação são capazes de produzir uma proporção da classe 2:1 de avermectinas que é reduzido em comparação com a proporção produzido por células de S. avermitilis da estirpe ATCC 53692 que pelo contrário expressa apenas alelo aveC do tipo selvagem, em que quando as avermectinas da classe 2:1 são avermectinas ciclo-hexil B2:ciclo-hexil BI a proporção das avermectinas da classe 2:1 é 0,2:1 ou inferior, e em que as combinações de substituições de aminoácido compreendem substituições tanto em D48 como em G179, e em que a combinação de substituições de aminoácido compreende uma combinação seleccionada de entre o grupo consistindo em: 2 ΡΕ1476539 (da) S41G, D48E, A61T, R71L, A89T, L136M, T149S, G179S, V196A, E238D, F278L, P2 S138T, 89L; A139T, (db) S41G, D48E, A61T, R71L, A89T, L136M, T149S, F176C, G179S, V196A, E238D, P2 S138T, 89L; A139T, (dc) D48E, R71L, A89T, L136P, T149S, E238D, I280V; F176C, G179S, (dd) D48E, A61T, R71L, W110L, T149S, L206M, E238D, V271A, I280V; G179S, V196A, (de) D48E, A61T, R71L, A89T, L136M, S138T, G179S, V196A, E238D, H279Q, P289L; A139T, T149S, (df) D48E, A61T, R71L, A89T, L136M, S138T, G179S, V196A, E238D, G287E, P289Q; A139T, T149S, (dg) D48E, A61T, R71L, A89T, L136M, S138T, G179S, V196A, E238D, P289L; A139T, T149S, (dh) D48E, A61T, R71L, A89T, A139T, T149S, V196A, E238D, V285G, P289L; F176C, G179S, (di) Q38R, D48E, A61T, R71L, L87V, A89T, A139T, T149S, G179S, V196A, E238D, P2 L136M, 89L; S138T, (dj ) D48E, A61T, L87V, A89T, WllOL, S138T, G179S, V196A, E238D, P289L; A139T, T149S, (dk) D48E, A61T, R71L, A89T, L136M, S138T, G179S, V196A, E238S, P289L; A139T, T149S, (dl) D48E, A89T, L136P, K154E, G179S, S231L, E238D } (ea) D48E, A61T, R71L, A89T, L136P, T149S, V196A, E238D, I280V; F176C, G179S, (eb) D48E, R71L, A89T, L136P, T149S, E238D, I280V; F176C, G179S, 3 ΡΕ1476539 (ec) Q36P, D48E, A61T, R71L, A89T, L136P, T149S, F176C, G179S, V196A, E238D, I280V; (ed) D48E, A61T, R71L, A89T, A139T, T149S, F176C, G179S, V196A, E238D, I280V; (ee) V2M, D48E, A61T, R71L, A89T, L136P, T149S, F176C, G179S, V196A, E238D, I280V; (ef) D48E, A61T, R71L, A89T, L136P, T149S, F176C, G179S, V196A, E238D, I280V, A302T; (eg) D48E, R71L, A89T, L136P, T149S, F176C, G179S E238D, P289L; (eh) D48E, R71L, A89T, L136P, T149S, F176C, G179S, E238D, A302T; (ei) D48E, R71L, A89T, L136P, T149S, F176C, G179S, V196A, E238D, I280V; (ej) D48E, A61T, R71L, A89T, L136P, T149S, F176C, G179S, V196A, E238D; (ek) V2M, D48E, R71L,A89T, L136P, T149S, F176C, G179S, V196A, E238D, I280V; (el) D48E, A61T, R71L, A89T, L136P, T149S, R162H, F176C, G179S, V196A , E238D, I280V; (em) D48E, R71L, A89T, V120A, L136P, T149S, K154E, G179S, S231L , E238D; (en) D48E, R71L, A89T, V120A, L136P, T149S, F176C, G179S, S231L , E238D, I280V; (eo) D48E, A61T, R71L, L87V, A89T, S90N, A139T, T149S, F176C, G179S , V196A, E238D, V285G, P289L; (ep) D48E, A61T, R71L, L87V, A89T, A139T, T149S, F176C, G179S V196A, E238D, V285G, P289L; 4 ΡΕ1476539 (eq) D48E, R71L, A89T, L136P, K154E, G179S, S231L, E238D; (er) D48E, R71L, A89T, V120A, L136P, K154E, F176C, G179S, S231L, E238D; e (es) D48E, R71L, A89T, V120A, L136P, T149S, K154E, F176C, G179S, S231L, E238D.
  2. 2. A molécula de polinucleótido da reivindicação 1, em que a combinação de substituições de aminoácidos é: (ea) D48E, A61T, R71L, A89T, L136P, T149S, F176C, G179S, V196A, E238D, I280V.
  3. 3. Um vector recombinante compreendendo a molécula de polinucleótido da reivindicação 1 ou 2.
  4. 4. Uma célula hospedeira compreendendo o vector recombinante da reivindicação 3, com a condição da referida célula hospedeira não ser um organismo humano.
  5. 5. A célula hospedeira da reivindicação 4, que é uma célula de Streptomyces.
  6. 6. A célula hospedeira da reivindicação 5, que é uma célula de Streptomyces avermitilis.
  7. 7. Um método para produzir uma estirpe de Streptomyces avermitilis, compreendendo (i) mutação do 5 ΡΕ1476539 alelo aveC numa célula da estirpe de S. avermitilis, cuja mutação dá origem a uma combinação de substituições de aminoácido no produto gene AveC ou (ii)introdução numa célula de uma estirpe de S. avermitilis de um alelo aveC submetido a mutação ou uma sua variante degenerada codificando um produto gene AveC compreendendo uma combinação de substituições de aminoácido, em que as células submetidas a mutação compreendendo o alelo aveC submetido a mutação ou uma sua variante degenerada são capazes de produzir avermectinas ciclo-hexil B2:ciclo-hexil BI numa proporção de 0,2:1 ou inferior, e em que as combinações de substituições de aminoácido compreendem substituições tanto em D48 como em G179, em que a combinação de substituições de aminoácido no produto gene AveC compreende uma combinação seleccionada de entre o grupo consistindo em: (da) S41G, D48E, A61T, R71L, A89T, L136M, S138T, A139T, T149S, G179S, V196A, E238D, F278L, P289L; (db) S41G, D48E, A61T, R71L, A89T, L136M, S138T, A139T, T149S, F176C, G179S, V196A, E238D, P289L; (dc) D48E, R71L, A89T, L136P, T149S, F176C, G179S, E238D, I280V; (dd) D48E, A61T, R71L, W110L, T149S, G179S, V196A, L206M, E238D, V271A, I280V; (de) D48E, A61T, R71L, A89T, L136M, S138T, A139T, T149S, G179S, V196A, E238D, H279Q, P289L; T149S (df) D48E, A61T, R71L, A89T, L136M, S138T, A139T, G179S, V196A, E238D, G287E, P289Q; 6 ΡΕ1476539 (dg) D48E, A61T, R71L, A89T, L136M, S138T, G179S, V196A, E238D, P289L; A139T, T149S, (dh) D48E, A61T, R71L, A89T, A139T, T149S, V196A, E238D, V285G, P289L; F176C, G179S, (di) Q38R, D48E, A61T, R71L, L87V, A89T, A139T, T149S, G179S, V196A, E238D, P2 L136M, 89L; S138T, (dj ) D48E, A61T, L87V, A89T, W110L, S138T, G179S, V196A, E238D, P289L; A139T, T149S, (dk) D48E, A61T, R71L, A89T, L136M, S138T, G179S, V196A, E238S, P289L; A139T, T149S, (dl) D48E, A89T, L136P, K154E, G179S, S231L, E238D f (ea) D48E, A61T, R71L, A89T, L136P, T149S, V196A, E238D, I280V; F176C, G179S, (eb) D48E, R71L, A89T, L136P, T149S, E238D, I280V; F176C, G179S, (ec) Q36P, D48E, A61T, R71L, A89T, L136P, G179S, V196A, E238D, I280V; T149S, F176C, (ed) D48E, A61T, R71L, A89T, A139T, T149S, V196A, E238D, I280V; F176C, G179S, (ee) V2M, D48E, A61T, R71L, A89T, L136P, G179S, V196A, E238D, I280V; T149S, F176C, (ef) D48E, A61T, R71L, A89T, L136P, T149S, V196A, E238D, I280V, A302T; F176C, G179S, (eg) D48E, R71L, A89T, L136P, T149S, F176C P289L; , G179S E238D, (eh) D48E, R71L, A89T, L136P, T149S, E238D, A302T; F176C, G179S, (ei) D48E, R71L, A89T, L136P, T149S, V196A, E238D, I280V; F176C, G179S, 7 ΡΕ1476539 (e j) D48E, A61T, R71L, A89T, L136F T149S, F176C, G179S, V196A, E238D } (ek) V2M, D48E, R71L,A89T, L136P, T149S, F176C, G179S, V196A, E238D , I280V; (el) D48E, A61T, R71L, A89T, L136F T149S, R162H, F176C, G179S, V196A , E238D, I280V; (em) D48E, R71L, A89T, VI20A, L136P, T149S, K154E, G179S, S231L , E238D; (en) D48E, R71L, A89T, V120A, L136P, T149S, F176C, G179S, S231L , E238D, I280V; (eo) D48E, A61T, R71L, L87V, A89T, S90N, A139T, T149S, F176C, G179S , V196A, E238D, V285G, P289L; (ep) D48E, A61T, R71L, L87V, A89T , A139T, T149S, F176C, G179S, V196A, E238D, V285G, P289L; (eq) D48E, R71L, A89T, L136P, K154E, G179S, S231L, E238D; (er) D48E, R71L, A89T, V120A, L136P, K154E, F176C, G179S, S231L , E238D; e (es) D48E, R71L, A89T, V120A, L136P, T149S, K154E, F176C, G179S , S231L, E238D.
  8. 8. Uma célula de uma espécie de Streptomyces que compreende um alelo aveC de S. avermitilis submetido a mutação ou uma sua variante degenerada codificando um produto gene AveC compreendendo uma combinação de substituições de aminoácido seleccionada de entre o grupo consistindo em: ΡΕ1476539 (da) S41G, D48E, A61T, R71L, A89T, L136M, S138T, A139T, T149S, G179S, V196A, E238D, F278L, P2 89L; (db) S41G, D48E, A61T, R71L, A89T, L136M, T149S, F176C, G179S, V196A, E238D, P2 S138T, 89L; A139T, (dc) D48E, R71L, A89T, L136P, T149S, E238D, I280V; F176C, G179S, (dd) D48E, A61T, R71L, W110L, T149S, L206M, E238D, V271A, I280V; G179S, V196A, (de) D48E, A61T, R71L, A89T, L136M, S138T, G179S, V196A, E238D, H279Q, P289L; A139T, T149S, (df) D48E, A61T, R71L, A89T, L136M, S138T, G179S, V196A, E238D, G287E, P289Q; A139T, T149S, (dg) D48E, A61T, R71L, A89T, L136M, S138T, G179S, V196A, E238D, P289L; A139T, T149S, (dh) D48E, A61T, R71L, A89T, A139T, T149S, V196A, E238D, V285G, P289L; F176C, G179S, (di) Q38R, D48E, A61T, R71L, L87V, A89T, A139T, T149S, G179S, V196A, E238D, P2 L136M, 89L; S138T, (dj ) D48E, A61T, L87V, A89T, WllOL, S138T, G179S, V196A, E238D, P289L; A139T, T149S, (dk) D48E, A61T, R71L, A89T, L136M, S138T, G179S, V196A, E238S, P289L; A139T, T149S, (dl) D48E, A89T, L136P, K154E, G179S, S231L, E238D } (ea) D48E, A61T, R71L, A89T, L136P, T149S, V196A, E238D, I280V; F176C, G179S, (eb) D48E, R71L, A89T, L136P, T149S, E238D, I280V; F176C, G179S, (ec) Q36P, D48E, A61T, R71L, A89T, L136P, G179S, V196A, E238D, I280V; T149S, F176C, 9 ΡΕ1476539 (ed) D48E, A61T, R71L, A89T, A139T, T149S, F176C, G179S, (ee) V196A, E238D, I280V; V2M, D48E, A61T, R71L, A89T, L136P, T149S, F176C, (ef) G179S, V196A, E238D, I280V; D48E, A61T, R71L, A89T, L136P, T149S, F176C, G179S, (eg) V196A, E238D, I280V, A302T; D48E, R71L, A89T, L136P, T149S, F176C, G179S E238D, (eh) P289L; D48E, R71L, A89T, L136P, T149S, F176C, G179S, (ei) E238D, A302T; D48E, R71L, A89T, L136P, T149S, F176C, G179S, (e j ) V196A, E238D, I280V; D48E, A61T, R71L, A89T, L136P, T149S, F176C, G179S, (ek) V196A, E238D; V2M, D48E, R71L,A89T, L136P, T149S, F176C, G179S, (el) V196A, E238D, I280V; D48E, A61T, R71L, A89T, L136P, T149S, R162H, F176C, (em) G179S, V196A, E238D, I280V; D48E, R71L, A89T, V120A, L136P, T149S, K154E, (en) G179S, S231L, E238D; D48E, R71L, A89T, V120A, L136P, T149S, F176C, (eo) G179S, S231L, E238D, I280V; D48E, A61T, R71L, L87V, A89T, S90N, A139T, T149S, (ep) F176C, G179S, V196A, E238D, V285G, P289L; D48E, A61T, R71L, L87V, A89T, A139T, T149S, F176C, (eq) G179S, V196A, E238D, V285G, P289L; D48E, R71L, A89T, L136P, K154E, G179S, S231L, E238D 10 ΡΕ1476539 (er) D48E, R71L, A89T, V120A, L136P, K154E, F176C, G179S, S231L, E238D; e (es) D48E, R71L, A89T, V120A, L136P, T149S, K154E, F176C, G179S, S231L, E238D.
  9. 9 . A célula da reivindicação 8, que é uma célula de Streptomyces avermitilis.
  10. 10. Um processo para a produção de avermectinas, compreendendo a cultura de uma estirpe das células de Streptomyces avermitilis da reivindicação 8, num meio de cultura sob condições que permitem ou induzem a produção de avermectinas a partir dai, e recuperação das referidas avermectinas a partir da cultura. Lisboa, 2 de Abril de 2009
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