JPH07507995A - トロンビンレセプターアンタゴニスト - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 トロンビンレセプターアンタゴニスト λ豆然艮■旦！ 本発明は、トロンビンレセプターに結合して阻害する新規な生物学的に活性な分 子に関する。本発明の分子は、トロンビンレセプターの「ヒルジン様」ドメイン に結合する部分（アミノ酸５２−８９位）によって特徴づけられる。これらのト ロンビンレセプターアンタゴニストはさらに、トロンビンの触媒活性に影響を及 ぼさずにトロンビン誘発血小板凝集を阻害する能力によって特徴づけられる。よ り詳細には、本発明のトロンビンレセプターアンタゴニストは、以下の式ヲ含有 する：　Ｙ’ＡＩ−Ｗ−ＸＩ−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４−１ｈ−Ｚ　；ここで、Ｙは、 水素、１−〜ｌＯ個のアミノ酸を有するペプチド、これは同一かまたは興なるか のいずれかであり、あるいは、Ｉｍ！〜３０４ｇの骨格原子を含有するアシル鎖 またはアルキル鎖であり；Ａ、およびＡ２のそれぞれは、同一かまたは翼なるか のいずれかであり、正の電荷を有するアミノ酸、および、ｌｌ−１ｏ個の骨格原 子および正の電荷を有する側基を含有するアシル鎖またはアルキル鎖からなる群 より選択され；Ｗおよび各Ｘは任意のアミノ酸であり、これは同一かまたは翼な るかのいずれかであり；そして、２は、ＯＲ，１個〜１１個のアミノ酸を有する ペプチド、これは同一かまたは翼なるかのいずれかであり、あるいは、１個〜３ ３個の骨格原子を含有するアシル鎖またはアルキル鎖であり、そして、ここで該 アンタゴニストは、必要に応じて、Ｙと２との間の共有結合によって環状化され ；ただし、ｗ、ｘいおよびｘ２の少なくとも１つは、塩基性アミノ酸ではない。

本発明はまた、治療および予防の目的のためにこれらの分子を用いる組成物およ び方法に関する。

１五旦！糞 トロンビンは、天然に生成するタンパク質であり、いくつかの生体調節の役割を 有する［Ｊ、　Ｗ、　Ｆｅｎｔｏｎ、目、「トロンピン生体調節機能Ｊ　、Ａｄ ｖ、　ＣｌＩｎ、　Ｅｎｚ　ｍｏｌ、、６、ｐｐ、　１１１６〜９３（１９８ｇ ）］。血血液面に深く関係することに加えて、トロンビンがまた、血小板および 内皮細胞の活性化、平滑筋細胞ならびに神経芽細胞腫殖および骨吸収で役割を果 たすことも公知である。トロンビンは、種々の生物学的効果を２つのメカニズム のうちの１つを介して及ぼす。第１のメカニズムは、純粋に酵素的であり、トロ ンビンの触媒活性のみを含む。これは、トロンビンが、フィブリノーゲンをフィ ブリンに変換するメカニズムであり、凝固カスケードの最終工程である。

トロンビン作用の第２のメカニズムは、細胞表面レセプターを介する。このレセ プターは、近年クローニングされた［Ｔ、−に　Ｈ，Ｖｕら、「機能的トロンビ ンレセプターの分子クローニングは、レセプター活性化の新規のタンパク質分解 メカニズムを表す」、皿、６４、ｐｐ、　１０５７−６８（１９９１）］。トト ロピンは、レセプターのヒルジン様の細胞外のドメイン（レセプターアミノ酸５ ２−６９位）と最初に結合することにより、レセプターを介して、細胞を活性化 すると考えられている［　Ｌ、　−Ｗ。

Ｌｉｕら、「ヒルジンに類似するトロンビンレセプターの領域は、トロンビンに 結合し、そして酵素特異性を変えるＪ　、Ｊ、　Ｂｌ。

１、　Ｃｈｅｔ、２６６、ｐｐ、１６９７７−１１０（１９９１）］　、次いで 、トロンビンは、そのレセプターの細胞外に位置したＮ末端から４１個のアミノ 酸ペプチドに開裂し、レセプター上に新しいのＮ末端を露出する。次いで、新し く露出したＮ末端は、他の、レセプターの遠方部分と相互作用して、活性化する 。活性化は、最終的に第２メツセンジヤー（例えば、キナーゼまたはｃＡＭＰ） と関係し得、それはレセプターの開裂がきっかけとなると考えられている。

トロンビンレセプターの新たに露出したＮ末端の初めの１４個のアミノ酸に対応 するペプチド（［連結リガンドペプチド（ｔｅｔｈｅｒｅｄ　ｌｉｇａｎｄ　ｐ ｅｐｔｉｄｅ）Ｊと呼ばれる）が、トロンビンがないときは、トロンビンレセプ ターを活性化し得ることが以前に示されている。この活性化には、レセプター中 の細胞外アニオン性ドメインの存在の必要がない［Ｔ、　−に、　Ｈ，Ｖｕら、 前述］。

レセプター−駆動（ｄｒｉｖａｎ）メカニズムは、トロンビンＭ発血小板凝集お よび放出反応の原因である。このような反応は、動脈の血餅形成を開始する。さ らに、そのレセプターメカニズムは、トロンビン誘発内皮細胞活性化の原因であ ると考えられる。この活性化は、これらの細胞中で血小板活性化因子（ＰＡＦ） の合成を刺激する［Ｓ、　ＰｒｅｓｅｏｔＬら、「トロンビンで刺激した場合、 培養中のヒト内皮細胞は血小板活性化因子（１−アルキル−２−アセチル−■− グリセロー３−ホスホクロリン）を産生するＪ　、Ｐｒｏｃ、　Ｎａ１ｌ　Ａｃ ａｄ、　Ｓｅｔ、　ＵＳＡ、８１、ｐｐ、　３５３４−３８（１９８４）］。Ｐ ＡＰは、内皮細胞の表面上に露出し、モして好中球の接着およびそれに続く脱顆 粒のためのリガンドとして働き、炎症を生じる［Ｇ、　Ｍ、　Ｖｅｒｃｏｌｌｅ ｔｔｉら、「血小板活性化因子が、アゴニストに対する好中球の応答を与える： 好中球が介在した内皮損傷を促進する役割」、Ｕμ世、７１、ｐｐ、　１１０Ｇ −０７（１９Ｂｇ＞］。あるいは、トトロピンは、血管透過性を増加するために 内皮細胞を変化させることにより炎症を促進し得、水腫を生成し［Ｐ、　Ｊ、　 Ｄｅｌ　Ｖｅｅｃｈｉｏら、「高分子に対する内皮の単層透過性Ｊ　、Ｆｅｄ、 　Ｐｒｏｅ、、４６、ｐｐ、２ｓ１１−１５（１９ｇ？）］　、）ロンビンレセ プターをまた含み得るプロセスを導き得る。

平滑筋細胞が、その表面上にトロンビンレセプターを発現することも公知である ［Ｄ、　Ｔ、　Ｈｕｎｇら、「非血小板細胞中のトロンビン誘発の事象は、クロ ーニングされた血小板トロンビンレセプターについて確立した唯一のタンパク質 分解メカニズムによって、媒介されるＪ　、Ｊ、　Ｃｅ１ｌ　Ｒｉｏｔ、、ｔｉ ｇ、ｐｐ、　ｓ２７−ｏｍｕ）］。トトロピンが、これらの細胞と相互作用する 場合、増殖応答が生じる。平滑筋細胞のこの増殖は、バルーン血管形成術後の再 狭窄、およびその後の冠不全に寄与し得る［Ａ、　Ｊ、　Ｂ、　Ｂｒａｄｙら、 「血管形成および再狭窄Ｊ　、Ｂｒｔｔ。

Ｍｅｄ、　Ｊ、、３０３、ｐｐ、７２９−３０（１９９１）］。トロンビンレセ プターを有する他の細胞は、線維芽細胞、神経芽細胞、および破骨細胞である。

これらの細胞の各々において、トロンビンは、いくつかの生体調節機能の原因に なることが示されている。

例えば、トロンとンは、その軸索退縮を引き起こす能力のために、神経変性疾患 に関与している［Ｄ、　Ｇｕｒｗｌｔｚら、「トロンビンは神経芽細胞腫の軸索 の生長をｇ製し、逆行させる」、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ 、　ＵＳＡ、　８５、ｐｐ、３４４０−４４（１９１１ｇ）］　ｏ　そしてトロ ンビンは、破骨細胞により骨吸収を刺激する能力のために骨粗しよう症に役割を 果たすと仮定されている［Ｄ、　Ｎ。

Ｔａｔａｋｉｓら、「骨芽細胞へのトロンビンの影響−１１，構造−機能の関係 Ｊ　、Ｂｉｏｃｈｅｔ　Ｂｉｏ　ｈ　ｓ、　Ｒｅｓ、　Ｃｏａ＊、ｂ　１１４％ ｐｐ、１８１−８＋１（１９９１）］。

従って、トロンビンのインビボでの活性を調節する能力は、多くの重要な臨床上 の意味を有している。より重要なことに、フィブリン形成に影響を及ぼさずに、 トロンビンのレセプター−駆動機能を選択的に阻害する能力が大いに望まれてお り、その結果、出血は、治療の潜在的副作用として減少し、または取り除かれる 。

トロンビンを直接的に阻害する化合物は、いくつかまたは全てのトロンビンの機 能をある程度にまたはそれ以上に阻害し得る。トロンビンの全活性部位インヒビ ターは、分子の酵素的とレセプター介在との両方の機能を阻害する。意外にも、 活性部位に結合しない他のトロンビンインヒビターもまた、両方のメカニズムを 阻害し得る。例えば、ヒルから単離された天然に生じる抗凝固剤であるヒルジン のＣ末端アミノ酸配列をモデル化したペプチドが、フィブリ／−ゲン開裂、なら びにトロンビン誘発血小板活性化および内皮細胞活性化の両方を阻害する［米国 特許出願東６７７、６０９号に同時係属中］。

他の化合物は、トロンビンの活性を選択的に阻害し得るが、これらの化合物は、 トロンビンまたはそのレセプターをＩＩＩ的に阻害せず、従って特異的ではない 。例えば、ヘパリン（これは、複合体を形成し、そして抗トロンビンＩＩ＋を活 性化する）は、血小板に依存する血栓症に影響を及ぼすことな（、フィブリン血 餅形成に影響を及ぼす。しかし、ある患者には、この化合物に対する抗体の循環 のためにヘパリンで治療され得ない。また、ヘパリンは、出血合併症を引き起こ すことが公知である。＾ｒｇ−Ｇｌｙ−＾ｓｐ含有ペプチドは、血小板の活性化 を阻害し、フィブリン形成を阻害しない。しかし、これらのペプチドは、一般の 抗血小板剤であり、トロンビン誘発血小板活性化に特異的ではない。これらのペ プチドは、血小板表面のタンパク質であるグリコプロティンＩ　１ｂ／ｌ　Ｉ　 Ｉａに競合的に結合することによって作用する。

従って、トロンビンの機能を有する直接的および選択的なアンタゴニストが、大 いに必要である。詳細には、トロンビンのレセプター介在機能を、フィブリン介 在の凝固に影響を及ぼさずに阻害し得る化合物は、高い有用性を有する。そのよ うな化合物は、血管形成術後の再狭窄−トロンビン誘発の平滑筋細胞増殖に連結 した現象の予防に特に有効である［Ｊ。

Ｎ、　Ｗｉｌｃｏｘ、［再狭窄に関するトロンビンおよび他の潜在的メカニズム Ｊ　、Ｃ４ｒｃｕｌａｔｉｏｎ、８４、ｐｐ、４３２−３５（１９９１）］。ト トロンビンレセプターアンタボニスはまた、フィブリン形成ヲ妨げることなく動 脈の血栓症を治療または予防するのに有用である。

余ｙヱと【政 本発明は、凝固に関係するフィブリノーゲンおよび他のタンパク質に対するトロ ンビンの活性に影響を及ぼすことなく、トロンビンレセプターに競合的に結合し そして阻害する新規な分子を提供することによって、上記の問題を解決する。こ れらの新規なアンタゴニストは、トロンビンレセプターの「ヒルジン様」アニオ ン性ドメインに結合する部分（アミノ酸５２−６９位）によって特徴づけられる 。本発明のアンタゴニストは、好ましくは、トロンビンのアニオン結合するエキ ソサイト（ｅｘｏｓｉｔｅ）部分（アミノ酸８５−８３位）またはその部分でモ デル化される。それは、そのレセプターのヒルジン様ドメインと会合することが 公知である。

本発明のトロンビンレセプターアンタゴニストは、出血の危険なしに特定のトロ ンビン介在機能を制御するための組成物および方法に有用であり得る。これは、 本発明の分子がトロンビンレセプター介在機能を阻害することに特異的であるの で、フィブリン血餅を形成するためのトロンビンの能力に影響を及ぼさない。本 発明のアンタゴニストを含有する薬学的組成物は、血小板の阻害；炎症の治療ま たは予防；骨吸収、の治療または予防（骨粗しよう症で普及しているプロセス） ；神経変性疾患の治療または予防；および平滑筋細胞増殖の阻害に有用である。

この最後の有用性は、冠血管形成の後特に重要であり、そこで再狭窄（初期の血 管閉鎖部位で平滑筋細胞の増殖によっ“Ｃ引き起こされると考えられている）が 、比較的高い頻度で生じる。

本発明のアンタゴニスト分子が、化学的合成の技術によって調製され得るという 事実のために、市販的に実施可能な量が、安価で製造され得る。さらに、本発明 のアンタゴニスト分子は、医学的治療に現在用いられるトロンビンインヒビター よりも顕著に小さいので、それらは治療される叡者に望ましくない免疫応答を刺 激しそうにない。

１１立１星鼠五皿 図１は、様々な濃度のトロンビンの存在下で、様々な濃度のＴＲＩＰ−１による 血小板凝集の阻害を示す。

図２は、トロンビンレセプターの連結リガンドペプチドで処理したＴＲＩＰ−１ に対する抗血小板効果の欠乏を示す。

図３は、様々なアゴニストによって誘発される血小板凝集の阻害におけるＴＲＩ Ｐ−１の効果を示す。

図４は、トロンビン誘発血小板凝集の阻害におけるＴＲＩＰ−１、ＴＲＩＰ−４ （直鎖と環状化との両方）、およびＴＲＩＰ−５（直鎖と環状化との両方）の比 較した効果を示す。

図５は、無置換のアンタゴニストと比較したＴＲＩＰ−６における単一の位置の アラニンおよびグリシン置換の相対的なトロンビンレセプター阻害の活性を示す 。

図６は、３Ｈ−チミジン取り込みによって測定した、ＴＲＩＦ−６およびＴＲＩ Ｐ−２０によるトロンビン誘発平滑筋細胞増殖の阻害を示す。

図７は、エラブトキシンＡ−ＴＲＩＰ融合タンパク質をコードするプラスミドの ヌクレオチド配列を示す。

図８は、固定化トロンビンレセプターペプチドに結合するファージ中に発現した 様々なエラブトキシンＡ−ＴＲＩＰ融合タンパク質の能力を示す。

良１叫１鼠１に皿 本明細書および特許請求の範囲を通じて、以下の標準的な略語を用いる： ０ｒｎ−オル−チン　ｃｒｙ−グリシンＡｌミーアラニン　Ｖ、ａ　ｌ−バリン Ｌｅｕ−ロイシン　１ｉｅ−イソロイシンＰｒｏ　−フロリン　Ｐｈｅ−フェニ ルアラニンＴｒｐ−）リブトファン　Ｎｅｔ−メチオニンＳ’ｅ　ｒ−セリン　 Ｔｈｒ−トレオニンＣｙｓ−７ステイン　Ｔｙｒ−チロシンＡｓｎ−アスパラギ ン　Ｇｌｎ−グルタミン＾ｓｐ−アスパラギン酸　Ｇｌｕ−グルタミン酸Ｌｙｓ −リシン　＾ｒｇ−アルギニン Ｈ１３−ヒスチジン　Ｎ１ｅ−ノルロイシン＾Ｃ−アセチル　５ｕｅ−スフ／ニ ル スルホニル ０Ｂｚｌ　−０−ベンジル　ＭｅＢｚｌ−メチルベンジル本明細書中で用いられ る「任意のアミノ酸」という用語には、天然に存在するアミノ酸のし一異性体、 および、ペプチド化学の技術分野の当業者が天然に存在するペプチドの合成類似 体を調製するときに通常利用される他の「非タンパク質」のα−アミノ酸が包含 される。天然に存在するアミノ酸は、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、 インロイシン、セリン、メチオニン、トレオニン、フェニルアラニン、チロシン 、トリプトファン、システィン、プロリン、ヒスチジン、アスパラギン酸、アス パラギン、グルタミン酸、グルタミン、γ−カルボキシグルタミン酸、アルギニ ン、オルニチン、およびリシンである。「非タンパク質」のα−アミノ酸の例に は、ノルロイシン、ノルバリン、アロインロイシン、ホモアルギニン、チオプロ リン、デヒドロプロリン、ヒドロキシプロリン（ＨＦＰ）、イソニベコチン酸＜ Ｉｎｐ）　、ホモセリン、シクロへ亭シルグリシン（Ｃｈｇ）、α−アミノ−ｎ −酪＃（＾ｂｉ）、シクロへキシルアラニン（Ｃｈａ）、アミノフェニル酪酸（ Ｐｂａ）、フェニル部分のオルト位、メタ位、またはパラ位が、次の基：（ｃｌ −Ｃ４）アルキル、（ＣＩ−Ｃ４）アルコキシ、ハロゲン、またはニトロ基の１ つもしくは２つで置換されたフェニルアラニン類。

あるいは１個のメチレンジオキシ基で置換されたフェニルアラニン類；β−２− および３−チェニラルアラニン、β−２−およびトフラニルアラニン、β−２− 、３−、および４−ピリジルアラニン、β−（ベンゾチェニル−２−オよヒ３− イル）アラニン、β−（１−および２−ナフチル）アラニン、セリン、トレオニ ン、またはチロノンのＯ−アルキル化誘導体、Ｓ−アルキル化システィン、Ｓ− アルキル化ホモンスティン、チロシンのｏ−ｉｔ酸エステル、０−リン酸エステ ル、および０−カルボン酸エステル、３−スルホチロシン、３−カルボキシチロ シン、３−ホスホチロシン、チロシンの４−メタンスルホン酸エステル、チロシ ンの４−メタンホスホン酸エステル、３．５−ショートチロシン、３−ニトロチ ロシン、ε−アルキルリシン、δ−アルキルオルニチン、および上記アミノ酸の いずれかの且−異性体が含まれる。特にことわりがなければ、本願で言及するア ミノ酸はすべてに梨である。

本願で用いられる用語「正の電荷を有するアミノ酸」とは、正の電荷を有する側 鎖を有する天然に存在する、または天然に存在しない任意のアミノ酸を包含する 。正の電荷を有するアミノ酸の例は、アルギニン、リシン、ヒスチジン、ホモア ルギニン、オルニチン、およびδ−アルキルオルニチンである。

本明細書中で用いられる用語「アリール側鎖含有アミノ酸」とは、芳香族基を有 する任意のアミノ酸を示す。チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、チ ロシンの〇−硫酸エステル、および５−ニトロチロシンが、そのようなアミノ酸 の例として挙げられる。

用語「極性アミノ酸」は、電荷を有さない側鎖を有する任意のアミノ酸を示し、 それは比較的、水に可溶である。例えば、グルタミン、アスパラギン、グリシン 、セリン、ヒドロキシプロリン、およびホモセリンが挙げられる。

用語「疎水性アミノ酸」は、電荷を有さない側鎖を有するアミノ酸を示し、それ は比較的、水に不溶である。この群は、ロイン７　、ハＩＪン、トリプトファン 、ノルロイシン、ノルバリン、アロインロイシン、チオプロリン、デヒドロプロ リン、／クロへキシルアラニン、およびシクロへキシルグリシンを包含する。

用語「酸性アミノ酸」は、負の電荷を有する側鎖を有するアミノ酸を示す。例え ば、アスパラギン酸およびグルタミン酸を包含する。

本願で用いられる「患者」という用語は、あらゆる哺乳類、特にヒトを意味する 。

本明細書中で用いられる「骨格績」という用語は、化学構造の一方の末端から他 方の末端までたどり得る、最小数の連続した結合を定義する化学構造の部分を示 す。骨格績を形成する原子成分は、少なくとも２つの他の原子と結合を形成し得 るいかなる原子をも含有し得る。

例えば、以下の化学構造は各々、７つの原子の骨格績を特徴とする（骨格績を構 成する原子は肉太活字で示しである）。

く以下余白〉 本発明は、トロンビンと競合して、その細胞表面のレセプターに結合する分子に 関する。この特性により、本発明の分子は、トロンビンレセプターを介して、ト ロンビンの機能を阻害する。

出願人は、これまでに、ヒルジンのＣ−末端アミノ酸配列に相当するペプチドが トロンビン誘発血小板活性化を阻害することを示した（ＰＣＴ公開Ｎｏ、　ＷＯ ９０１０３３９１）　ｏ　これらのＣ−末端ヒルジンペプチドは、トロンビンの アニオン結合するエキソサイトと会合することが公知であった。この研究は、ト ロンビンのアニオン結合性エキソサイトドメインが、血小板活性化と関係するこ とを示していた。

最近の血小板トロンビンレセプターのクローニングおよび配列決定は、この指摘 を確証した［Ｔ、　−に、　Ｈ，Ｖｕら、［トロンヒンレセプター相互作用を明 確にするドメイン」、■ｔｕｒｅ、３５３、ｐｐ、　６７４−７７　（１９９１ ）］。トロンビンレセプターの推定アミノ酸配列は、アミノ酸５２−６９位の細 胞外ドメイン中のヒルジン様アニオン性領域の存在を明らかにした。トロンビン がそのレセプターと会合するための、この領域の重要性は、野生型のレセプター をそのアニオン性領域がない欠失変異体と比較することにより証明された。トロ ンビンは、野生型と比較すると変異体のレセプターを活性化するのに１００倍有 効でない［Ｔ、　−［、Ｒ，Ｖｕら、前述］。

トロンビン−〇−末端ヒルジンペプチド複合体の三次元Ｘ線結晶解析構造［Ｅ、 　５ｋｒｚｙｐｅｚａｋ−Ｊａｎｋｕｎら、「α−トロンビンのヒルジエン（Ｈ ｉｒｕｇｅｎ）およびヒルログ１７ｇ合体の構造」、ＬＭｏｌ、　Ｂｉｏ＋、２ ２１　ｐｐ、　１３７９−９３（１９９１））を用いることによって、出願人は トロンビンがアニオン性ドメインに結合するのに必要ないくつかの構造的な特徴 を同定した。特に、トロンビンのβ−鎖のアミノ酸６５−８５位は、２つの逆平 行β−ストランドの末端でループを形成する。トロンビンとヒルジンのＣ末端と の間の相互作用の多くは、ループの側鎖成分により仲介される。

同様に、出願人は、これらの側鎖は多数の正の荷電を冑するアミノ酸を含有し、 トロンビンレセプターのヒルジン様アニオノ性ドメインらと静電気的に無になっ たもの（ＣＯ鵬ｐｌｉｍｅｎｔａｒｉｔｙ）を形成すると考えている。このよう な特徴を包含するペプチドおよびその他の分子は、トロンビンレセプターに結合 し、インビボおよびインビトロで、トロンビンによってその活性化を阻害する。

これらのペプチドおよびその他の分子、ならびに、それらを用いた組成物および 方法は、本発明を構成する。

１つの実施態様によれば、本発明のトロンビンレセプターアンタゴニストは、ト ロンビンレセプターの「ヒルジン様」ドメインに結合する領域によって特徴付け られる。好ましくは、その領域は、トロンビンのアニオン結合性エキソサイト（ トロンビンのアミノ酸６５−８３位；配列番号１：Ｌ４ｕ−Ａｊｎ−１１１１− Ｇｌｕ−Ｌｙ１！−１１＠−５＠ｒ）　。

あるいはその一部についてモデル化される。本発明のアンタゴニストはさらに＝ 　（１）単純なインビトロアツセイ中におけるトロンビン誘発血小板凝集を阻害 する能力、および（２）トロンビンの触媒的活性を阻害できないことによって、 特徴付けられる。

本発明に従って、アンタゴニスト分子を設計する際に、２つの重要な問題を考慮 しなければならない。第一に、分子は物理的にトロンビンレセプターと会合し得 なければならない。

最近のトロンビンレセプター活性化理論は、活性化の最初の工［＋ｔ、レセプタ ーとトロンビンとの間のイオン的相互作用を最小限必要とすることを示唆してい る。詳細には、トロンビンはアニオン結合性エキソサイト領域、すなわち正電荷 のクラスターを利用して、レセプターのアニオン性ドメインに結合する。その他 の分子相互作用、例えば水素結合および疎水性相互作用は、この会合においては 重要であることも予想される。従って、これらの相互作用の同定および維持Ｉヨ 、有効なトロンビンレセプターアンタゴニストを設計する際に、重要である。

本発明のアンタゴニストを設計する際に第二に考慮すべきことは、二次および三 次構造である。アンタゴニストの特定の部分は、レセプターと分子の相互作用に 直接に関与することはないが、それらはアンタゴニストの全体的なフンホメーン ッンに役割を演じ得る。代わりに、これは効果に劇的な影響ヲ有し得る。アンタ ゴニストが適当なコンホメーシ曹ンを仮定し得ない場合、たとえそのような相互 作用を形成し得る成分が分子中に存在するとしても、レセプターとの会合に必要 とされる分子相互作用は達成され得ない。従って、本発明のアンタゴニストはレ セプターと会合させるフンホメーシ請ンを仮定するように、設計されなければな らない。コンホメーシ璽ン上の必要なことは、アンタゴニストの全体の三次元的 構造および配向の性質、あるいはレセプターと直接的に相互作用するアンタゴニ スト上の２つの部位の間の単なる間隙中にあり得る。

本発明のトロンビンレセプターアンタゴニストに必要な、重要な構造上およびコ ンホメーシ嘗ン上の特質を同定し定義付けるために、当業者はトロンビンのアミ ノ酸６ト８３位からなるペプチドを用いて始める。このペプチド自身が、本発明 のトロンビンレセプターアンタゴニストである。

このペプチドの１９個のアミノ酸のうちのも）ずれのアミノ酸が、トロンビンレ セプターとの重要な分子相互作用の原因であるのかを試験するために、アラニン およびグリシンの両方の走査手順を行った。これらの手順で、それぞれが具なる 残基での単一のアラニンあるいはグリシン置換を有する一連のペプチドを合成す る。ペプチドはその後、トロンビン触媒によるフィブリン形成に影響を及ぼすこ となく、それらがトロンビン誘発血小板会合を阻害するかを決定するためにアブ セイされる。

これらのアラニンあるいはグリシン置換のペプチド１１、）ロンピノのアミノ酸 ６５−８３位と同様に、血小板阻害活性を維持し、レセプターと直接に作用せず 、分子の折りたたみ（ｆｏｌｄｉｎｇ）に重要な役割を演する側鎖を有さない、 アンタゴニストの部分を示している。このようなペプチドは、本発明の好ましい アンタゴニストである。逆に、抗血小板活性がないあるいは著しく減少している ペプチドは、活性に重要なアンタゴニストの領域を強調する。これらの後者のペ プチドは、置換されたアミノ酸に基づく重要な分子間あるいは分子内相互作用の 性質を示唆する。例えば、減少した活性をもたらすアルギニンからアラニン、ま たはアルギニンからグリシンへの置　・換は、それがレセプターとのイオン性相 互作用であるか、あるいはアンタゴニスト内での分子内イオン性相互作用である かのいずれかの、重要な正電荷の所在を示唆し、最適なフンホメーン瑳ンを保持 することが必要とされる。活性に負の影響を及ぼす、セリンからアラニン、また はセリンからグリシンへの置換は、重要な水素結合の所在を示唆する。さらに、 水素結合は、アンタゴニストとトロンビンレセプターとの間にあり得、あるいは 、アンタゴニストのコンホメーシヨンに重要な役割を演する分子内水素結合であ り得る。

上記の単一置換ペプチドのいくつかは、任意の所定の位置の置換がアラニンであ るか、またはグリシンであるかに依存して、活性が異なる。グリシンとアラニン との間の重要な差は：アラニンは光学的に活性であり、よりバルキー（ｂｕｌｋ ｙ）であり、より疎水性であることである。従って、アラニン置換ペプチドがそ の阻害活性を保持しているとき、これに相当するグリシン置換ペプチドは活性を 保持しないが、当業者は、置換位置が活性であるべき置換位置で３つの上記の特 性のうちの１つを必要とすることを知っている。

構造の特徴が分子間または分子内相互作用において重要なのかどうかの識別をす ることが、アンタゴニスト−レセプター複合体のＸ線結晶構造を試験することに よってのみ、達成し得ることを当業者は理解している。しかし、この識別は、本 発明のアンタゴニストの設計においてそれほど重要ではない。

すなわち、静電気性、疎水性、イオン性、相互作用の性質が決定されると、その 位置での電位置換の選択が明らかになる。

本発明のトロンビンレセプターアンタゴニストの適当な折りたたみおよび配向に 重要な部位をさらに確かめるために、単一位置欠失分析が行われる。この手順で は、阻害活性に影響を及ぼさない（上記において決定した）位置で、単一の欠失 を含有する一連のペプチドを合成し、抗血小板活性についてアッセイする。顕著 な抗血小板活性を保持するこれら一連のペプチドは、適当なフンホメーンコンに 不可欠でないアンタゴニストの領域を示す。このようなペプチドもまた、本発明 の範囲内にある。

著しく低い血小板阻害活性を有するこの一連からの欠失ペプチドは、アンタゴニ スト中に重要な間隙を提供する成分の存在を示す。これは、欠失したアミノ酸を 異なるが類似の構造のものと置き換えることにより実証され得る。例えば、著し い活性の損失なしに、コンホメーシ璽ン上重要な任意のアミノ酸を、３つの炭素 のアルキル鎖と置換すること１こより、分子のその部分における間隙が重要であ ることを確認する。

本発明の有効なトロンビンレセプターアンタゴニストを設計するために必要な構 造およびコンホメーシヨンの重要な特徴についての他の情報は、コンビニ−タモ プリングと連結した３次元Ｘ線結晶解析手順を介して得られ得る。詳細に（嘘、 当業者は、このような方法を使用してトロンビンレセプター／トロンビンアミノ 酸６５−８３位ペプチド複合体を分析し得る。

あるいは、類似のＣ−末端ヒルジンペプチド−トロンビン複合体のＸ線結晶解析 データを使用し得た［Ｅ、　５ｋｒｚｙｐｃｚａｋ−Ｊａｎｋｕｎら、［α−ト ロンビンのヒルジエンおよびヒルログｔ　Ｗｉ　合体の構造Ｊ　、Ｊ、Ｍｏ１． ８ｉｏ１．．２２１、ＰＰ、　１３７９−９３（１９９１）］。最後ζこ、当業 者はまた、複数のアラニン置換ある（Ｘは複数の欠失を用いて、アンタゴニスト それ自身の重要な分子内相互作用を同定し得る。設計および試験される各新い１ トロンビンレセプターアンタゴニストが、それ自身、トロンビンレセプターの阻 害に重要な構造上の特徴について池の情報を提供することも明らかである。

トロンビン６５−８３位ペプチド中の重要な残基力（一旦、位置をターアンタゴ ニストは設計され、合成され得る。これ（ヨ、同様の特徴を有する、その他の成 分と、トロンビンペプチドの同定された鍵となる残基と置換することにより達成 されるＯこれらの置換は、初めは保存的である。すなわち、置換成分は、鍵とな る残基として、おおよそ同じサイズ、形状、疎水性、および電荷を有する。当業 者は、所定のアミノ酸の適当な置換について周知であり［Ｄａｙｈｏｆｆら、　 ＾ｔｌａｓ　ｏｆ　Ｐｒｏｔｅｉｌとｕｅｎｅｅ　ａｎｄ　５ｔｒｕｃｔｕｒｅ 上、］、１９７８およびＡｒｇｏｓら１ＥＭＢＯＪ、、８、ｐｉｌ、　７７９− １ｔｓ（１９８９）１゜アミノ酸の典型的な保存的置換は、同様の電荷を有する 他のアミノ酸である。例えば、グルタミン酸に代えてアスパラギン酸、リシンに 代えてアルギニン、グルタミンに代えてアスパラギン、ヒロド牛シブロリンに代 えてプロリン、および逆もまた同様である。アンタゴニストのペプチド性の性質 （ｐｅｐｔｉｄｉｃ　ｎａｔｕｒｅ）を減少するために、非天然アミノ酸による 置換もなされ得る。いくつかの例としては、チロシンに代えてシクロヘキシルア ラニン、グリシンに代えてサルコシン、トレオニンに代えてスタチン、およびア ルギニンに代えてホモアルギニンがある。これらの改変物は、その有効性を増加 することの他に、アンタゴニストの生物学的安定性を増加し得る。

置換成分を含有する分子が、有効なトロンビンレセプターアンタゴニストである ことが示された後、同じ位置により弱い保存的置換が行われ得る。これらの置換 は、典型的には、その位置におけるアミノ酸によってもたらされた重要な特徴を 包含する、非アミノ酸成分の導入を包含する。このような置換は当業者には周知 である。例えば、配列Ｌｅｕ−Ｖａｌ−＾ｒｇ　（）ロンビンのアミノ酸６５− ６７位に相当）は、ｐ−グアニジノ安息香酸により置換され得る。この置換は、 Ｌｅｕ−Ｖａｌの疎水性および＾ｒｇのグアニジニウム機能性を保持する。

トロンビン６５−８３位アミノ酸配列中の非必須アミノ酸についての置換物の選 択には、より大きな自由度があることは明らかである。さらに、非必須アミノ酸 は、簡単に除去し得る。

フンホメーン璽ンに変化をもたらさない、任意の置換の大部分は、非必須アミノ 酸に使用し得る。これらは、直鎖アルキルおよびアンル基を包含するが、決して これに限定されるものではない。また、アンタゴニストの正味の正電荷の重要性 のため、アニオン性置換は避けるべきである。コンホメーシヨンを変えることが 当業者に知られている成分もまた、避けるべきである。このような成分の１つは プロリンであり、分子のターン（ｔｕｒｎ）構造を引き起こすアミノ酸である。

他は、当業者に周知である［Ｇ、　Ｄ、　Ｒｏｓｅら、「ペプチドおよびタンパ ク質におけるターンＪ　、Ａｄｖ、　Ｐｒｏｔ、　Ｃｈｅｔ、３７．　ｐＰ、　 １−１１０（１９１１５）］。

上述の置換および欠失から得られたアンタゴニストに加えて、本発明の新規トロ ンビンレセプターアンタゴニストは、トロンビン６５−８３位ペプチドに沿った 種々の部位への挿入により設計され得る。成分が電位的に挿入され得る、トロン ビン６５−１１３位ペプチドの領域を決定するために、種々の部位に単一のアラ ニンの挿入を有する一連のペプチドが合成される。抗血小板活性を保持するこの 一連のペプチドは電位的な挿入を示す。

挿入すべき成分を選択するに際して、置換成分を選択する際に上述と同じ考慮に より、方向付けられるべきである。特ニ、挿入がアンタゴニストとトロンビンレ セプターとの間の分子の相互作用にどのように電位上の影響を及ぼし得るか、お よびそれらがアンタゴニストのコンホメーシ嘗ンにどのように影響を及ぼすか、 について留意すべきである。例えば、トロンビン６５−８３位の重要なカチオン 性アミノ酸に隣接したアニオン性成分の挿入は、重要なイオン性相互作用を妨害 し得、従って、避けるべきである。同様に、構造的摂動を引き起こすことが知ら れる成分の挿入、例えばプロリンも避けるべきである。

上述の欠失のいずれかあるいはすべてを用いて、置換および挿入の技術により、 当業者が有する技術で、本発明のトロンビンレセプターアンタゴニストを設計し 得る。さらに、これらの任意の変化の電位的な効果は、当該技術分野で既知のコ ンピュータモデリング技術の使用により、アンタゴニストを合成する前に、理論 的に観察し得る。このようなモデリングにより、電位を有するアンタゴニストと 複合体化するトロンビンレセプターの予想された構造を観察し得る。理論上の構 造が、レセプターと電位を有するアンタゴニストとの間の相互作用が不十分であ ることを示唆する場合、分子の合成や試験のために時間や資源を浪費する必要は ない。一方、コンピューターモデリングが強い相互作用を示す場合、次に分子を 合成し抗血小板活性についてアッセイし得る。このように、それらを合成する前 に、有効でない分子を除去し得る。

最後に、上述の技法で設計されたアンタゴニストの環状誘導体もまた、本発明の 一部分である。環状化により、アンタゴニストがトロンビンレセプターとの会合 のためにより好ましいコンホメーシ冒ンであることを仮定し得る。環状化は、当 業者に周知の方法で達成し得る。１つの方法は、２つの非隣接システィン残基（ Ｄ−１またはし一コンホメーシ謬ン）間の、あるいは遊離スルフヒドリル基を有 する任意の２つの適当な間隙の成分間のジスルフィド結合の形成である。ジスル フィド結合が、他の分子間共有結合と同様に、アンタゴニスト内に種々の成分の 間に形成し得ることは知られている。このような結合を形成する成分は、アミノ 酸、非アミノ酸成分、あるいはそれら２つの組合せの側鎖であり得る。

アラニン／グリシン置換および一連の欠失分析の両方で得たデータに基づいて、 次いで切断（ｔｒｕｎｃａｔｅｄ）ペプチド（すなわち、多数のＮ−および／ま たはＣ−末端欠失物）を合成して、トロンビンレセプターアンタゴニスト活性を 決定し得る。

上述の分析を用いて、出願人は、レセプター阻害に必要なト０ンピンの最小部分 −＾ｒｇ−ｌ　１ｅ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−旧５−５ｅｒ−＾ｒｇ　（）ロンビンア ミノ酸６７−７３位；配列番号ｌのア！　／　酸３−９）　ヲ同定した。出願人 はさらに、この最小配列内て置換を行い、トロンビンペプチドの増強した阻害活 性を有するペプチドを開発した。これらの置換体は、以下に議論し、そして特定 の実施例により詳細に述べる。

上述のような保存的な置換は、以下の式を含有する本発明の好ましいトロンビン レセプターアンタゴニストを特徴付ける：　Ｙ−ＡＨ−ＩＦ−ＸＩ−Ｘ２−Ｘ３ −Ｘ４−Ａ２−Ｚ：　ＣコテＹは水素、１個〜１０個のアミノ酸を有するペプチ ド、これは同一かまたは翼なるかのいずれかであり、あるいは、１個〜３０個の 骨格原子を含有するアシル鎖またはアルキル鎖であり；Ａ、およびＡ２のそれぞ れは、同一かまたは興なるかのいずれかであり、正の電荷を有するアミノ酸、お よび、１個〜ｌＯ個の骨格原子および正の電荷を有する側基を含有するアシル鎖 またはアルキル鎖からなる群より選択され；Ｗおよび各Ｘは任意のアミノ酸であ り、これは同一かまたは興なるかのいずれかであり；そして２はＯ）Ｉ、１個〜 １１個のアミノ酸を有するペプチド、これは同一かまたは興なるかのいずれかで あり、あるいは、１個〜３３個の骨格原子を含有するアシル鎖あるいはアルキル 鎖であり、そしてここで該アンタゴニストは必要に応じてＹとＺとの間の共有結 合により環状化され；ただし、Ｗ％Ｘ１、およびＸ２の少な（とも１つは、塩基 性アミノ酸ではない。

本発明のさらに好ましいアンタゴニストは、上述の一般式を包含し、ここで、Ｙ は、式ｙｔ−ａＦｌ−ｃ、を有し、Ｙ、は水素、１個〜６個のアミノ酸を有する ペプチド、これは同一かまたは興なるかのいずれかであり、あるいは１個〜１８ 個の骨格原子を含有するアシル鎖またはアルキル鎖であり；Ｂは疎水性アミノ酸 であり；Ｃは酸性アミノ酸であり、これは同一かまたは翼なるかのいずれかであ り、ｎは０またはｌであり；モしてｍは１〜３の整数である。他の好ましい実施 態様は、Ａ１がＡｒｇであるアンタゴニスト；Ａ２がＡｒｇであるアンタゴニス ト；ＷがＩｌｅ、　ｒ４−Ｃｙｓ、あるいは４１ｍであるアンタゴニスト；Ｘ２ がアニオン性アミノ酸であるアンタゴニスト；ＸＳが旧６であるアンタゴニスト ；およびｘ４がＳｅｔであるアンタゴニストである。

本発明の最も好ましいアンタゴニストは、トロンビンレセプター阻害ペプチドあ るいはＴＲＩＰとして示される。これらのアンタゴニストは以下の式を有する： ｎ工Ｐ　２０：　Ｌａｕ−Ｖａｌ−Ａｒｇ−ｆｌ−Ｃｙｓ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ｈ ｉｓ−５ａｒ−Ａｒｇ；Ａｌｋ−ＴＲＩＰ　２０：　Ｌａｕ−Ｖａｌ−Ａｒｇ− ａｌｋｃｙｓ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ｈｉｓ−５＠ｒ−Ａｒｇ；π工Ｐ　２４：　Ｌ ａｕ−Ｖａｌ−Ａｒ９７Ｑ−ＣｙＳ−Ｇｌｙ−Ｌｙ！！−Ｔｙｒ−Ａｌａ−Ａｒ ｑ；ＴＲＩＰ　２５：　Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ａｒｇ−Ｑ−Ｃｙｓ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ −Ｈｌｓ−Ｐｈｅ−Ａｒｇ；ＴＲＩＰ　２６：　シａｌ−Ｖａｌ−Ａｒｇ−Ｑ− Ｃｙｓ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ｈｌｓｓ−Ｐｈｅ−Ａｒｇ　；ＴＲＩＰ　２７：　ｔ ４ｕ−Ｖａｌ−Ａｒｇ−］；］ｊ−Ｃｙｓ−５ｅｒ−Ｌｙｓ−Ｈ１ｓ５ｅｒ−Ａ ｒｇ；ＴＲＩＰ　２８：　Ｌａｕ−Ｖａｌ　−Ａｒｇ−Ｑ−Ｃｙｓ−’ｒｈｒ− Ｌｙｓ−Ｈｉｓ−８ｕｒ−Ａｒｇ；ＴＲＩＰ　２９：　Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ａｒｇ −ｐ−Ｃｙｓ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ−Ｈｉｓ−５ａｒ−Ａｒｇ；ＴＲＩＰ　３０：　 Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ａｒｇ−Ｑ−ｅｙｓ−Ａｓｓｎ−Ｔｙｒ−Ｈｉｓ−５ｅｒ−Ａ ｒｇ；ＴＲＩＰ　３１：　Ｌａｕ−Ｖａｌ−Ａｒｇ−Ｑ−Ｃｙｓ−Ｇｉｎ−Ｌｙ ｓ−Ｈｉｓ−５ｅｒ−Ａｒｇ；ＴＲＩＰ　３２：　Ｌａｕ−Ｖａｌ−Ａｒｇ−Ｑ −Ｃｙｓ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ−Ｈｌｓ−５ｅｒ−Ａｒｇ；ＴＲＩＰ　コ４：　Ｌｅ ｕ−Ｖａｌ−人ｒｑ−Ω−Ｃｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｈｉｓｓ−５ｅｒ−Ａｒｇ ；ＴＲＩＰ　コ５：　Ｌｅｕ−ｖａｌ−Ａｒｑ−ｐ−ＣｙＳ−Ａｒｑ−Ｌｙｓ− Ｈ１！！−５＠ｒ−Ａｒｑ；ＴＲＩＰ　コロ：　Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ａｒｇ−Ｑ− Ｃｙｓ−Ｈｉｓ−Ｌｙｓ−Ｈｉｓ−５ａｒ−Ａｒｇ；ＴＲＩＰ　３フ：　Ｌａｕ −Ｖａｌ−人ｒｇ−Ｑ−Ｃｙｓ−Ｑ−Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ｈｉｓ−５ａｒ−Ａｒｇ ；ＴＲＩＰ　コｌ　Ｌａｕ−Ｖａｌ−Ａｒ９−Ｑ−Ｃｙｓ−Ω−８＠ｒ−Ｌｙｓ −Ｈｉｓ−５ａｒ−Ａｒｇ；ＴＲＩＰ　３９：　Ｌａｕ−Ｖａｌ−Ａｒｇ−Ｑ− Ｃｙｓ−Ｑ−Ｔｈｒ−Ｌｙｓ−Ｈｉｓ−５ａｒ−Ａｒｇ；ｍ工Ｐ　４０：　Ｌａ ｕ−Ｖａｌ−Ａｒｇ−Ｑ−Ｃｙｓｓ−Ｑ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ−Ｈｌｓ−５ｅｒ−Ａ ｒｇ；ｍ工Ｐ　４１：　Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ａｒｑ−ｐ−ＣｙＳ−Ｑ−ＡＩ！ｎ− ＬｙＳ−Ｈｌｓ−５ａｒ−Ａｒ（ｉ；ＴＲＩＰ　４２：　Ｌａｕ−Ｖａｌ−人ｒ ｑ−Ｑ−（：’ｆｍ−Ｑ−Ｇｌｎ−Ｌ　ｙＳ−ＨＩＳ−ＢＳ！ｒ−Ａｒ９；π工 Ｐ　４３：　Ｌａｕ−Ｖａｌ−Ａｒｇ−Ｑ−Ｃｙｓ−Ｑ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ−Ｈｌ ｓ−５ａｒ−Ａｒｇ；ＴＲＩＰ　４４：　Ｌａｕ−Ｖａｌ−Ａｒｇ−Ｑ−Ｃｙｓ −ｐｊ−Ｇｌｕ−Ｌｙｓ−Ｈｉｓ−５ｅｒ−Ａｒｇ；’ｒＲＸＰ　４５　：　Ｌ ｌ＠ｕ−Ｖａ　ｌｌ−Ａｒ９−Ｑ−ＣｙｌＩ−Ｑ−Ｌｙ　−Ｌｙｊ！　−ＨＬ　 ＠−８＠ｒ−紅９　；ＴＲＩＰ　４６：　Ｌａｕ−Ｖａｌ−Ａｒｇ−Ｑ−Ｃｙｓ −Ｑ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ｈｌｓ−５＠ｒ−人ｒｑｉτＲＸＰ　４７：　Ｌｅｕ− Ｖａｌ−人ｒｇ−Ｑ−Ｃｙｓ−Ｑ−Ｈ１ｓ−Ｌｙｓ−Ｈｌｓ−５ａｒ−人ｒｑ； ＴＲＩＰ　４８：　Ｑ−Ｃｙｔｘ−Ａｒｑ−Ｌｅｕ−５ａｒ−Ｖａｌ−Ｈｌｓ− Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ；ＴＲＩＰ−２、ＴＲＩＰ−４、ＴＲＩＰ−５、ＴＲＩ Ｐ−１１、およびＴＲＩＰ−１２１よ、それぞれが分子内ジスルフィド結合を含 有し、環状トロンビンレセプターアンタゴニストの例である。ＴＲＩＰ−２、Ｔ ＲＩＰ−４およびＴＲＩＰ−５では、ジスルフィド結合はシスティン残基間であ る。

ＴＲＩ？−１１およびＴＲＩＰ−１２では、ジスルフィド結合Ｃよ、非アミノ酸 成分であるＮ−末端のメルカプトプロピオン酸とＣ−末端のシスティン残基との 間で形成される。

（以下余白） トロンビンのアミノ酸６５−８３位が、天然に存在する分子中で、２つの逆平行 βストランド間でβループを形成することは公知である［Ｌ　Ｂｏｄｅら、「ヒ トα−トロンビンの精製された１゜９Ａの結晶構造：　Ｄ−Ｐｈｅ−Ｐｒｏ−＾ ｒｇクロロメチルケトンとの相互作用およびＴｙｒ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｔｒｐ挿 大挿片切片要性」、ＥＭＢＯＪ、、８、ｐｐ、３４Ｇ？−７５（１９８９）］。

理論に縛られることな（、類似のフンホメーシッンであると考えられ得る本発明 のアンタゴニストは、より構造的に安定であり、従ってより有効であると、出願 人は考える。従って、本発明のその他の実施態様は、式：　ＰＰＬ−Ｔ−ＰＰＲ を有する融合タンパク質である；ここで、Ｔは本発明のトロンビンレセプターア ンタゴニストであり；そして、ＰＰＬおよびＰＰＲは、式：　ＰＰＬ−ＢＬ−Ｐ ＰＲのポリペプチドの両方の部分であり；ここで、ＢＬは該ポリペプチド中でβ ループ構造を形成し；各ＰＰＬおよびＰＰａは、該ポリペプチド中の逆平行βス トランド構造により特徴づけられる。

このような融合タンパク質の設計は、最初は、２つの逆平行βストランド構造間 のβループを育する、天然に存在するタンパク質の同定に関連する。数種の天然 に存在するタン／（り質は、このような構造を有することが知られている。これ らには、エラブトキシン＾、重鎮および軽鎖の両方の免疫グロブリン、および、 トリプシンのようなセリンプロテアーゼが包含される。結晶化された任意のタン パク質は、Ｘ線結晶解析により、このようなループ／逆平行ストランド構造につ いて走査され得る。

一旦適切なタンパク質が同定されると、βループ部分を構成するアミノ酸は、ト ロンビンレセプターアンタゴニストとして作用するために、上記の方法に示され ているペプチドと置換される。この置換は通常、組換えＤＮＡ法によりヌクレオ チドレベルでなされる。このことにより、天然に存在するタンパク質をフードす る遺伝子あるいはｅＤＮ＾は、入手可能でなければならない。さらに、βループ 置換、すなわち、トロンビンレセプターアンタゴニストペプチドは、天然に存在 するアミノ酸で完全に構成されなければならないし、そして、そのアンタゴニス トをコードする合成遺伝子が合成されなければならない。

このような融合タンパク質を構築するために要求される操作は、当該分野で通常 使用されている。典型的には、これは、制限エンドヌクレアーゼ消化、エキソヌ クレアーゼ消化、あるいは両方の組み合わせによる、天然に存在するβループコ ーディング領域の除去を包含する。次に、そのタンパク質をフードする残りのＤ ＮＡを単離し、アンタゴニストをコードする合成遺伝子に連結する。所望の融合 タンパク質をコードする多量のＤＮＡは、ＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）また は従来のクローニング法により得られ得る。あるいは、所望の融合タンパク質を コードする遺伝子は、種々のオリゴヌクレオチドをともに連結して、合成的に構 築され得る。

融合タンパク質は次に、上記のＤＮＡを有する適切な宿主の形質転換あるいはト ラスフェクシ璽ンにより産生される。当業者は、融合タンパク質の十分な発現を 達成するために必要な因子は周知である。これらには、適切な宿主、適切な増殖 条件などを選択した、融合タンパク質をコードするＤＮＡの適切なプロモーター への、作動可能な連結が包含される。

本発明のアンタゴニストの抗血小板活性が、多くの従来の、任意のインビトロ血 小板アッセイにより測定され得る。好ましくは、アッセイは、血小板の凝集程度 の変化、あるいは、トロンビン存在下での血小板分泌成分の放出の変化を測定す る。前者は、血小板凝集計で測定され得る。後者は、分泌された成分に特異的な ＲＩＡまたはＥＬＩＳＡ法を用いて測定され得る。

本発明のアンタゴニストのトロンビンの触媒活性を阻害する能力のないことは、 比色マーカーにより、合成ペプチジル基質を使用して、インビトロでアッセイし 得る。このような基質の例は、ＳｐｅｃＬｒｏｚｙｍｅ　ＴＯ（トシル−Ｇｌｙ −Ｐｒｏ−Ａｒｇ−ｐ−ニトロアニリド；　Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｄｌａｇｎｏｓ ｔｉｃａ、　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ、　ＮＹ）である。

この基質の切断は、分光光度計を使用して定量され得る。トロンビン触媒活性の 阻害もまた、フィブリノーゲン切断のインビトロアッセイを用いてアッセイされ 得る。

本発明のアンタゴニストが、トロンビンレセプターのアニオン性ドメインに結合 する能力は、競合アッセイで容易に測定され得る。例えば、トロンビンレセプタ ーを有する細胞（血小板、平滑筋細胞、内皮細胞など）の、トロンビンレセプタ ーアニオン性ドメイン（「トロンビンレセプターペプチド」）に対応する非標識 ペプチドの存在下または非存在下での、放射ｉｍアンタゴニストとのインキニベ ーシーンは、このような結合の定量を提供する。あるいは、不溶性マトリックス に架橋結合されたトロンビンレセプターペプチドヲ有スるカラムでの、標識アン タゴニストのアフィニティークロマトグラフィーは、結合をアッセイするために 使用され得た。

この後者の方法では、トロンビンレセプターのアニオン性ドメインに結合するア ンタゴニストは、可溶性の非４１１識トロンビンレセプターペプチドで溶出され るまで、特異的にカラムに結合する。上記のアッセイおよび方法は、当該分野で は周知である。

本発明のトロンビンレセプターアンタゴニストは、当該分野では周知の種々の技 法により、合成され得る。これらには、トロンビンの酵素による切断、組換えＤ ＮＡ法、固相ペプチド合成、溶液相ペプチド合成、有機化学合成法、ある（１は これらの技法の組み合わせが、包含される。合成法の選択は、無論のこと、特定 のアンタゴニストの組成に依存する。本発明の好ましい実施態様では、トロンビ ンアンタゴニストは、完全にペプチド性であり、これらのアンタゴニストの商業 的な量を生産するために、最も経費的に有効な生産方法を構成する、固相ペプチ ド合成法、溶液相ペプチド合成法、あるいは、それらの組み合わせにより、合成 される。

「非タンパク質］アミノ酸が、トロンビンレセプターアンタゴニストに含まれる ときには、所望の「非タンパク質」アミノ酸の性質によって、それらは、ペプチ ド合成中に伸長する鎖に直接加えられるか、または完全に合成されたペプチドの 化学的改変によりｇ製され得る。化学合成分野の当業者は、「非タンパク質」ア ミノ酸が直接加えられ得るか、そしてペプチド合成後に完全ペプチド鎖を化学改 変することにより合成されるべきかは、周知である。

非アミノ酸およびペプチド性部分の両方を含有する、本発明のトロンビンアンタ ゴニストの合成は、好ましくは、混合した異種／固相法により達成される。この 技法は、全分子あるいは分子のほとんどのペプチド部分の固相合成に関連する。

これは、溶液相法により合成される非アミノ酸成分の付加が続き、次に、固相あ るいは溶液相法によりペプチド性部分に結合される。残りのペプチド性部分は、 次に、固相あるいは溶液相法により付加され得る。

本発明のトロンビンレセプターアンタゴニストは、トロンビン介在およびトロン ビン関連の機能およびプロセスに起因する種々の疾患の治療および予防のための 、組成物および方法に有用である。これらには、心筋梗塞、卒中、肝性梗塞症、 末梢動脈閉塞、動脈損傷または侵入的心臓病学的処置後の再狭窄、急性または慢 性のアテローム性動脈硬化症、浮腫および炎症、種々の細胞調節プロセス（例え ば、分泌、形状変化、増殖）、および神経変性疾患が、包含される。

本発明のトロンビンレセプターアンタゴニストは、薬学的に受容し得るキャリア の添加のような、薬学的に有用な組成物を調製するための従来法により、処方さ れ得る。これらの組成物およびそれらを使用する方法は、患者における血小板活 性化の治療および予防のために使用され得る。トロンビン誘発血小板活性化の阻 害は、特に、血小板依存（動脈）血栓症の治療および予防に有用である。

本発明の組成物を投与するための、種々の投与形態が使用され得る。これらには 、非経口投与、経口投与、および局所適用が含まれるが、これらには限定されな い。本発明の組成物は、単回あるいは連続注入により患者の静脈内に、を椎傍お よび関節周囲を含む筋肉内、皮下、皮内、関節内、滑液嚢内、鞘内、病巣内、骨 膜内、または、経口、鼻内、あるいは局所経路により、薬学的に受容し得る任意 の投与形態で患者に投与され得る。このような組成物は、好ましくは、局所、鼻 内、経口および非経口投与に適応されるが、最も好ましくは、非経口投与用に処 方される。

非経口組成物は、最も好ましくは、定常注入として投与される。非経口投与用に は、液体ユニット投与形態が調製され、それには、本発明のトロンビンレセプタ ーアンタゴニストおよび滅菌賦形剤が含まれる。アンタゴニストは、賦形剤の性 質および特定のアンタゴニストの性質に依存して、懸濁あるいは溶解され得る。

非経口組成物は通常、賦形剤中にトロンビンレセプターアンタゴニストを溶解し 、必要に応じてその他の成分とともに溶解し、適切なバイアルあるいはアンプル に充填する前に濾過滅菌して密閉することにより調製される。

好ましくは、局所麻酔剤などのアジュバント、保存剤、およびＩ！衝液もまた賦 形剤に溶解される。次に、組成物は凍結されて、安定性を増すために凍結乾燥さ れる。

非経口懸濁液は、活性成分が賦形剤に溶解されずに懸濁されること以外は、実質 的に同様の様式で調製される。組成物の滅菌は、好ましくは、滅菌賦形剤に＠濁 する前にエチレンオキサイドに曝して行われる。好都合に、表面活性剤あるいは 湿潤剤が、成分の均質分散を促進するために、組成物中に含まれる。

経口投与用の錠剤およびカプセルは、結合剤、充填剤、希釈剤、錠剤化剤、潤滑 剤、崩壊剤、および湿潤剤のような従来の補助剤を含有し得る。錠剤は、当該分 野で周知の方法に従って被覆され得る。使用され得る適切な充填剤には、セルロ ース、マンニトール、ラクトース、詰よびその他の同様の薬剤が含まれる。適切 な崩壊剤には、デンプン、ポリビニルピロリドン、およびデンプングリコール酸 ナトリウムのようなデンプン誘導体が含まれるが、これらには限定されない。

適切な潤滑剤には、例えば、ステアリン酸マグネシウムが含まれる。適切な湿潤 剤には、ラウリル硫酸ナトリウムが含まれる。

経口液体製剤は、水性または油性懸濁液、溶液、乳化剤、ノロノブ剤あるいはエ ルキシル剤の形態であり得るか、あるいは、使用前に、水またはその他の適切な Ｖ形削で再構成するための乾燥生成物として存在し得る。このような液体製剤は 、従来の添加剤を含有し得る。これらには、ソルビトール、シロップ、メチルセ ルロース、ゼラチン、ヒドロキシエチルセルロース、カルボキシメチルセ！レロ ース、ステアリン酸アルミニウムゲル、または水素添加食用脂のような、懸濁剤 ；レシチン、モノオレイン酸ソルビタン、ポリエチレングリフール類、またはア ラビアゴムを含む、乳化剤；扁桃油、分画ココナツツ油、および油状エステル類 のような、非水性賦形剤；および、メチルまたはプロピルｐ−ヒドロキシベンゾ エートあるいはソルビン酸のような、保存剤が含まれる。

局所投与用に処方された組成物は、例えば、水性ゼリー、油性懸濁液、あるいは 乳化軟膏形態であり得る。

トロンビンレセプターアンタゴニストの投与量および投与速度は、患者の大きさ 、使用される特定の薬学的組成物、処置の目的、例えば、治療あるいは予防、治 療される症状の性質、および治療医の判断のような、種々の因子に依存する。

薬学的に宵効な投与量は、本明細書では、治療されるべき患者の１ｋｇ体重あた り、約０．００１■ｇとｉｏＯｍｇとの間として定義される。しかし、上記に列 挙された因子に基づいて、他の投与量が有用であり得ることは、理解されるべき である。

患者の症状に改善が生じると、必要に応じて、本発明の組成物の維持投与量が投 与される。次に、投与量あるいは投与頻度、または両方が、症候の機能として、 改善症状が保持されるレベルにまで減少され得る。症候が所望のレベルにまで軽 減されると、処置は終了されるべきである。しかし、患者は、疾患症候の再発に 対して断続的な処置を要求し得る。

本発明の他の実施態様では、トロンビンレセプターアンタゴニストは、患者にお けるトロンビン誘発の平滑筋細胞増殖を阻害するための組成物および方法に使用 され得る。血管外側表面に並ぶ動脈内膜平滑筋細胞のトロンビン誘発増殖は、進 行したアテローム性動脈硬化症および血管形成術後の再狭窄に関連している［Ｄ 、　Ｔ、　Ｈｕｎｇら、Ｊ、　Ｃｅ１ｌ　Ｂｉｏｌ、、１１６、ｐｐ８２１−３ ２　（１９９２）　；　＾、Ｊ、Ｂ、Ｂｒａｄｙら、Ｂｒ１ｔ、Ｊ、Ｍｅｄ、、 ３０３、Ｉｌ＋）、　７２９−３０　（１９９１）］。現在では、アテローム性 動脈硬化プラーク（自然発生あるいは血管形成術により沈積された）の破裂が、 プラーク部位にトロンビンを引き付ける一連の事象を作動させると、考えられて いる。そこで、トロンビンは、血栓形成および平滑筋増殖を引き起こす。これら の２つの現象は、血管封鎖および潜在的冠状動脈不全の原因になる。従って、平 滑筋細胞複製を阻害する能力は、血管形成術の最大の成功において、臨床上重要 なものである。

本発明の好ましい実施態様では、患者における平滑筋細胞増殖の阻害は、本発明 のトロンビンレセプターアンタゴニストを含有する組成物を送達する装置を、該 患者中に挿入することにより達成される。動脈内膜平滑筋細胞への、トロンビン レセプターの部位特異的送達を可能にするために、装置の一部分（好ましくは末 端）が、該アンタゴニストが装置から出られるような開口手段を包含すべきであ る。このような装置は、当該分野では周知であり、バルーンカテーテルにより例 示される。この方法の好ましい実施態様では、トロンビンレセプターアンタゴニ スト組成物を含有する装置として、滲出性バルーンカテーテルを使用する［例え ば、米国特許第５゜０４９、１３２号、および、Ｗｏｌｉｎｓｋｙら、「正常イ ヌ動脈壁中へ濃縮したヘパリンを送達するための穿孔バルーンカテーテルの使用 」、Ｊ、＾ｓｅｒ、　Ｃｏ１１．　Ｃａｒｄｉｏｌ、、１５、ｐｐ、　４７５− ８１　（１９９０）、本明細書中に参考として援用されている開示を参照のこと ］。

本発明の他の実施態様では、トロンビンレセプターアンタゴニストは、骨吸収を 治療あるいは予防するための方法に使用され得る。破骨細胞は、骨の交替および 変形のプロセスでの、再吸収に応答する細胞である。これらの細胞は、破骨細胞 表面上のレセプターを介するトロンビンにより刺激されることが知られている［ Ｄ、　Ｎ、　Ｔａｔａｋｌｓら、Ｂｉｏｃｈｅｔ　Ｂｉｏ　ｈ　ｓ。

Ｒｅｓ、　Ｃｏａｔ、１７４、ｐｐ、　１８１−８１１　（１９９１）］。トロ ンビン誘誘発破骨細胞性を阻害することにより、骨吸収が減少する。これは特に 、骨粗しよう症、および、非常に高レベルの骨吸収および無機分減少により特徴 づけられる他の症状の治療に有用であり得る。

本発明はまた、トロンビン誘発炎症を阻害するために、上記のトロンビンレセプ ターアンタゴニストを使用する方法に関する。トロンビンが、内皮細胞により血 小板活性化因子（ＰＡＰ）の合成を誘発することは、公知である［Ｓ、　Ｐｒｅ ｓｃｏｔｔら、Ｐｒｏｅ、　Ｎａｔｌ、＾ｅａｄ、　Ｓｅｔ、υＳ＾、８１、ｐ ｐ、３ｓ３４−３１１　（１９５１４）］。

トトロピンは、内皮細胞表面のレセプターに結合することにより、この影響を及 ぼすと考えられている。これらの方法は、トロンビン誘発の炎症および浮腫によ り特徴づけられる疾患（ＰＡＦにより媒介されると考えられている）の治療に、 重要な適用を有する。このような疾患には、成人呼吸促進症候群、敗血症性シ碧 ツク、敗血症、および再潅流損傷が含まれるが、これらに限定されない。

本発明のトロンビンレセプターアンタゴニストはまた、神経変性疾患を治療する 方法に使用され得る。トロンビンが、アルツハイマー病およびパーキンソン病の ような、脳細胞の形状変化で丸みを示唆し、神経変性疾患に関連するプロセスで ある、軸索退縮を引き起こすことが知られている。トロンビンは、それらの細胞 表面上の特異的レセプターを介して、神経芽細胞に作用すると考えられている［ Ｄ、　Ｇｕｒｖｉｔｚら、江ｏｃ、　Ｎａｔｌ、＾ｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳ＾ 、８５、ｐｐ、　３４４０−４４　（１０ｇ））。

本明細書に記載されている発明をさらに十分に理解し得るために、以下の実施例 を挙げる。これらの実施例は、例示のみを目的とし、いかなる方法においても本 発明を限定するようには構成されていないことを理解すべきである。

（以下余白） 友嵐丘上 ■」ソし１底 他に記載が無い限り、本発明者らはＡｐｐｌｉｅｄ　Ｂｌｏｓｙｓｌ＠ｓｓ　４ ３０　Ａ　Ｐｅｐｔｉｄｅ　５ｙｎｔｈｅｓｌｚｅｒ　（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉ ｏｓｙｓＬｅｍｓ、　Ｆｏｓｔｅｒ　Ｃ１ｔｙ、　ＣＡ）を用いて従来の固相ペ プチド合成により、すべてのＴＲＩＰを合成した。種々のＴＲＩＰを合成するた めに用いた樹脂は、アンタゴニストのＣ末端アミノ酸に依存する。詳細にハ、用 イた樹脂は、　ｔ−ＢＯＣ− シーＧｌｕ　（ＯＢｚｌ）　（ＯＣＲ，）−ＰＡＭ、　ｔ−ＢＯＣ−Ｅ２−Ｃｙ ｓ　（４−ＭｅＢｚｌ）　（−ＯＣＲ，）　−ＰＡＮ。

ｔ−ＢＯＣ−１，−１１＊（ＯＣＨ，）−ＰＡＭ、　ｔ−ＢＯＣ−Ｇｌｙ（ＯＣ Ｈ２）−ＰＡＮ、　ｔ−ＢＯＣ−ｐ−Ｃｙｓ　（４−Ｍ＠Ｂｚｌ）　（−ｏｃＨ ，）−ＰＡＭ、　ｔ−ＢＯＣ−Ｌ−Ａｒ９（Ｍｔｇ）　ｋ　！びｔ−ＢＯＣ−１ −λｓｎ　。

であった。樹脂は、Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｇｙｓｔ＠ｍｓまたはＰｅｎ１ｎｓ ｕｌａ　Ｌｍｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ　（ＢｅｌｍｏｎＬ、　ＣＡ）のいずれかか ら購入した。

本発明者らは、特定のＴＲＩＰ中のアミノ酸配列によって、ペプチド合成のため の種々の保護アミノ酸を用いた。合成に用いた保護アミノ酸は・ｔ−ＢＯＣ−Ｑ −−ｕ、　ｔ−ＢＯＣ−ンＶａｌ、　ｔ−ＢＯＣ−Ａｒｇ□！ｔｓ）、　ｔ−Ｂ ＯＣ−１，−１１＊（１／２　Ｈ２Ｏ）、　ｔ−ＢＯＣ−Ｇｌｙ。

ｔ−ＢＯＣ−シーＩ、ｙｓ（２−Ｃ１−ｚ）、　ｔ−ＢＯＣ−１−５＠ｒ（Ｂｚ ｌ）、　ｔ−ＢＯＣ−ｐ−Ｔｈｒ（Ｂｚｌ）、　ｔ−１ｓｏｃ−１，−Ｔｙｒ（ ２−ｓｒ−ｚ）、　ｔ−ＢＯＣ−シーＧｌｕ（ＯＢｚｌ）、　ｔ−ＢＯＣ−に→ ｕｐ（ＣＢＺｌ）、ｔ−ＢＯＣ−シーＡｓｎおよびｔ−ＢＯＣ−ｐ−Ｏｒｎ（２ −Ｃ１−ｚ）Ｐｅｎｉｎｓｕｌａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉ＠ｓから購入；および ｔ−ＢＯＣ−１，−Ｈｌｓ　（Ｎ−１ｎ−ＣＢＺ）　。

ｔ−ＢＯＣ−０−（２，６−シクａ　Ｏヘア　シル）−コｅｓ−シｗ−ト・レチ ａｚ、７　ｍヨヒｔ−ＢＯＣ−シフａ　ヘ＊　シル−１，−７５ニア　Ｂａｃｈ ＠ｍ　（ＴＯＩＴａｎＣＬ　ＣＡ）　ｂｓ　ラＩＩ　人であった。

大ｍ ■上５ぜと１或 ＴＲＩＰ−１（配列番号２　：　Ｌａｕ−Ｖａｌ−Ａｒｇ−工１ｅ−Ｇｌｙ−Ｌ ｙｓ−Ｈ１ｓ−５ｅｒ−Ａｒｇ−Ｔｈｒ−Ａｒｇ−Ｔｙｒ−Ｇｌｕ−Ａｒｇ−人 ｓｎ−工１ｅ−Ｇｌｕ）を、ｔ−ＢＯＣ−Ｌ−Ｇ　１ｕ（ＯＢｚｌ　１　（ＯＣ Ｈ２）−ＰＡＭ樹脂、および実施例１に挙げたアミノ酸から選択した適切な保護 アミノ酸を用いて合成した。合成完了後、ペプチドを、完全に脱保護し、無水１ １Ｐ：１−クレゾール：硫酸エチルメチル（１０：１：１．　ｖ／ｖ／ｖ）で処 理することにより樹脂から切り離した。次いで、ペプチドを５％酢酸で樹脂から 抽出し、凍結乾燥した。

粗ＴＲＩＰ−１を、Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ　１５１＾液体りＯ ？トゲラフイー／ステムおよびＶｙｄａｃ　Ｃ１ｌカラム（２，２ｘ２５ｃｍ） を用いて逆相ＨＰＬＣにより精製した。カラムは０．１％トリフルオロ酢酸（Ｔ Ｆ＾）水溶液で平衡化し、４．０ｍｌ／分の流速で、４ｓ分にわたり０．１％Ｔ ＦＡ中のアセトニトリル濃度を上昇させる（０から８０％）直線ａ度勾配で展開 した。溶出液流は、２２９ｎｗで吸光度をモニターした。両分を手動で集めた。

ＴＲＩＰ−１を含む画分をプールし、凍結乾燥した。典型的には、粗ＴＲＩＰ− １の２０〜Ｓｏｎｇをカラムに載せ、５〜３５Ｂの精製ペプチドを得た。

本発明者らは、いくつかの技法によりＴＲＩＰ−１の構造を確認した。アミノ酸 加水分解物を、ペプチドを６ＮＯＣＩで真空中で１００℃２４時間、処理して調 製した。次いで、加水分解物をＢｅｅｋｍａｎ　６３０Ｇアミノ酸分析機（Ｂｅ ｃｌｖａｎ　ＩｎｓＬｒｕｍｅｎ、Ｌｇ、　Ｐａｌ。

Ａｌｔｏ、　Ｃ＾）で分析した。これにはポストカラムにニンヒドリン誘導体化 と組み合わせたイオン交換分離法を用いる。

本発明者らは、Ｍｏｄｅｌ　９００＾データ７ステムを装着したＡｐｐｌｉｅｄ 　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｓｓ　４７０＾気相シークエンサーで自動化エドマン分解を 用いて、アミノ酸配列分析を行った。フェニルチオヒダントイン（ＰＴＨ）アミ ノ酸をＡｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ　１２０＾ＰＴＨ−Ａｎａｌｙｚ ｅｒおよびＰＴＨ−ＣＩ８カラム（２，１ｘ２２０ｍｍ）を用いてオンライン分 析した。

本発明者らはまた、外部契約の研究所のＭ−Ｓｃａｎ　（Ｗｅｓｔ　Ｃｈｅｓｔ ｅｒ、　ＰＡ）により精製ＴＲＩＰ−１についてＦＡＢ−質量分析を行った。

特に記載の無い限り、以下に記載の全てのＴＲＩＰを適切な樹脂および保護アミ ノ酸とを用いて、ＴＲＩＰ−１につ０ての記載と同様に合成した。同様に、以下 に記載の全ＴＲＩＰをＴＲＩＰ−１１こりいての記載と同様に切り離し、脱保護 し、精製し、そして分析した。

Ｋ嵐叢ｌ ■＋ｐ−ｚｏ”戊 ＴＲＩ　Ｐ　−２（Ｌａｕ−Ｖａｌ−Ａｒｇ−１１ｅ−Ｃｙｓ−Ｌｙｓ−Ｈｉｓ −５ｉｒ−Ａｒｇ−Ｔｈｒ−Ａｒ（Ｊ−Ｔ’７ｒ−Ｇｌｕ−Ａｒｑ−ｋｍｎ−Ｘ １＠−（Ｑ−Ｃｆ露）　）を、適切な樹脂および保護アミノ酸を用いてＴＲＩＰ −１と同様（こ合成した。切り離し、脱保護、精製、および分析もまたＴＲＩＰ −１についての記載のように行った。

精製に続いて、０．２Ｍはう酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ９，０）　５゜０１中に １＋１＋＋Ｈのペプチドを溶解することにより、アンタゴニストを環状化した。

この溶液を室温で１〜５日間放置した。これにより、環状化を７ステイン残基の 単純空気酸化により生じさせた。

本発明者らは、種々の時点で溶液の５０μｍアリコートをとることにより、環状 化のキネティックスをモニターした。そのアリコートをＯ１％ＴＦ＾水溶液ＳＯ μｌで酸性にし、次いでＡｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ　ｌ５ＯＡ液体 クロマトグラフィーシステムを用いてＡｑｕａｐｏｒｅ　Ｃ８カラム（１０１４ ，６ｍｍ）でクロマトグラフィーを行った。カラムは、４５分にわたり０．１％ ＴＦ＾中のアセトニトリルの濃度を上昇させる直線勾配（０〜８０％）で展開し た。溶出液流を２１４ｎ−で吸光度をモニターした。環状化アンタゴニストの存 在が、紫外吸収の新たなピークの存在（直鎖状ＴＲＩＰ−２を示すピークの前に 溶出した）により示された。本発明者らはまた、直鎖状ＴＲＩＰ−２の後に溶出 される他のピークを観察し、それは分子間架橋結合したＴＲＩＰ−２分子の存在 によるものであった。

環状化ＴＲＩＰ−２をＴＲＩＰ−１の精製についての記載あような同様の逆相Ｈ ＰＬＣクロマトグラフィーにより精製した。環状化ＴＲＩＰ−２の構造は、ＦＡ Ｂ−質量分析により確認した。環状化ＴＲＩＰ−２の親イオン分子量は、直鎖状 ＴＲＩＰ−２の質量より２ユニット小さかった。これにより、ジスルフィドが得 られたチオールの酸化が起こったことが示された。

他に記載が無い限り、下記の他の全ての環状化ＴＲＩＰ　（ＴＲＩＰ−４、−５ 、−１１および−１２）が、同様に環状化され、精製され、そして分析される。

Ｌ敷匠土 ■Ｍ！狂ｂ１昧 ＴＲＩＰ−３は以下の式を有し、上記のように合成された：配列番号３　：　Ｉ ｊ！ｕ−Ｃｙｓ−Ａｒｇ−１１ｅ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ｈｉｓ−５ｉｒ−人ｒｇ− Ｔｈｒ−Ａｒｑ−Ｔｙｒ−Ｇｌｕ−ＡｒＣｊ−ｋｓｎ−１１＠。

支嵐五ｌ ■止ユ曵皇底 ＴＲＩＦ−４は以下の式を有する：　Ｌａｕ−Ｖａｌ−ｋｒｑ−（、Ｑ−Ｃｙｓ ）　−Ｇ１’ｆ−ＬｙＳ−Ｈｉｓ−５＠ｒ−Ａｒｇ−Ｔｈｒ−Ａｒｑ−ＴＹｒ− Ｇｌｕ−Ａｒｑ−Ａｓｎ−Ｃｙｓ−Ｇｌｕ−ＬＹＳ−工１ｅ。

ＴＲＩＰ−４を、上記のように合成し、環状化しｔこ。

友敷鳳立 Ｕ圧」旦食底 ＴＲＩＰ−５は以下の式を有する二Ｌａｕ−Ｖａｌ−Ａｒｇ−（Ｑ−Ｃｙｓ）　 −Ｇ　１ｙ−ＬｙＳ−Ｈｉｓ　−５ｅｒ−Ａｒｑ−Ｔｈｒ−Ａｒｑ−Ｔ’ｆｒ　 −Ｇ　ｌｕ　−Ａｒｑ−Ａｓｎ−１（Ｑ−ＣＹＳ）　−Ｇｌｕ−Ｌｙｓ−工１ａ 。

ＴＲＩＰ−５を、上記のように合成し、環状化した。

ＩＬ廻工 …比」血止底 ＴＲＩＰ−６は以下の式を有し、上記のように合成された：配列番号４　’　Ｌ ｌ！！ｕ−Ｖａｌ−Ａｒｇ−１１ｅ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ｈｌｓ−８＠ｒ−Ａｒｇ −Ｔｈｒ−Ａｒｑ−’ｒｙｒ−Ｇｌｕ−ｋｌ−ｑ−Ａｓｎ−工１ｅ−Ｇｌｕ−Ｌ ｙｓ−工１ａ。

Ｌ１匠ｌ 匡止旦旦金感 ＴＲＩＰ−７は以下の式を有し、上記のように合成された：配列番号５　：　Ｌ ａｕ−Ｖａｌ−Ａｒｇ−工１＠！−ＧＩＹ−ｏｒｎ−Ｈｉｓ−ｓｅｒ−Ａｒｑ− Ｔｈｒ−Ａｒｇ−Ｔｙｒ−Ｇｌｕ−Ａｒｇ−Ａｓｎ−工１ｅ−Ｇｌｕ−Ｌｙ＋ｓ −工１ｓ！。

宜１１凹」− １止」旦會底 ＴＲＩＰ−８は以下の式を有し、上記のように合成される：配列番号ａ　：　Ｉ 、ａｕ−Ｖａｌ−Ａｒｇ−１１ｅ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ｈｉｓ−５ａｒ−Ａｒｇ− Ｔｈｒ−入ｒｃｒ−’ｒｙｒ−人ｓｐ−人ｒｑ−人５ｎ−ｘ１ｅ−Ｇｌｕ−Ｌｙ ｓ−工１ｅ。

寒ＩＬｉ！ｌ！！Ｌ ■月！■し１底 ＴＲＩＰ−９は以下の式を有し、上記のように合成された：配列番号７　：　Ｌ ａｕ−Ｖａｌ−ＨＡｒｇ−１１ｅ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ｈｌｓ−５ｅｒ−Ａｒｇ− Ｔｈｒ−Ａｒｇ−Ｔｙｒ−Ｇｌｕ−Ａｒｇ−Ａｓｎ−工１ｅ−Ｇｌｕ−Ｌｙｓ− ＩＩｓ。

Ｂｏｃ−ＨＡｒｇを、タンパク質合成の技術分野で周知の従来法ζこより合成し た。

Ｋ夜匠上土 ＴＲＩＰ−１１北番底 ＴＲＩＰ−１ｏは以下の式を有し、上記のように合成された：配ｙ＋１番号Ｂ　 ：　Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ａｒｇ−工１ｅ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ｈｉｓ−５ａｒ−Ａｒ ｇ−Ｔｈｒ−Ａｒｇ−Ｔｙｒ−Ｇｌｕ−Ａｒｇ−Ａｓｎ−Ｘ１＊−Ｇｌｕ−Ｌｙ ｓ−Ｃｈａ−Ｇｌｙ。

支五匠上主 ＴＲＩＰ−１上北亀底 ＴＲＩＰ−１１は以下の式を有する：配列番号９　：　ＭＰＲ−ｖａ　１−ｋｒ ｑ−Ｘ　ｌｅ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ｈｌｓ−５ｅｒ−Ａｒｇ−Ｔｈｒ−Ａｒｇ−Ｔ ｙｒ−Ｇｌｕ−Ａｒｇ−ｋｓｎ−Ｘｌｅ−Ｇｌｕ−Ｌｙｓ−Ｃｙｓ　＠このアン タゴニストの２〜１９残基を、実施例２に記載のように従来のペプチド合成法に より合成する。次いでペプチド樹脂を、Ａｐｐｌｉｅｄ　ＢｉｏｓｙｓＬｅｍｓ ペプチド合成機の従来の結合法を用いて、１００倍モル過剰のメルカプトプロピ オン酸（ＭＰＲ）と反応させた。ＭＰＲをアンタゴニストにうまく結合させたこ とを、反応１４１１１のアリコートのニンヒドリン分析により試験した。

二／ヒドリン反応の青色の消失は、ＭＰＲの取り込みが成功したことを示す。陽 性反応（青色）が起これば、さらにＭＰＲ付加物のサイクルを行なった。

ＴＲＩＰ−１１の環状化を完全な分子の合成に続いて実施例３に記載のように行 った。

大ＪｉＪＬＬｊ工 ■ぜｊ１墾番底 ＴＲＩＰ−１２は以下の式を有する：配列番号１０７　ＭＰＨ−Ｃｈａ　−Ｖａ 　１−Ａｒｇ−Ｘ　１ｅ−Ｇ　１　ｙ−Ｌｙｓ　−Ｈｉ　ｓ−５ｅｒ−Ａｒｇ− Ｔｈｒ−Ａｒ−５ｅｒ−Ａｒ　ｌｕ−Ａｒｑ−ＡＩｉｎ−Ｘ　１ｅ−Ｇ　１ｕ− ＬｙＳ−ＣｙＢ　ｅＴＲＩＰ−１２を、２〜２０残基をＭＰＲ付加の前に従来の 固相合成により合成した以外は、ＴＲＩＰ−１１に関する上記と同じ方法で合成 した。ＴＲＩＰ−１２を上記のように環状化した。

寒ＪＬＬＬ土 ■ＩＰ−１３１７１”或 ＴＲＩＰ−１３は以下の式を有し、上記のように合成された：配列番号１１　： 　Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ａｒｇ−１１ｅ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ｈｉｓ−５ｅｒ−Ａｒｇ −Ｃｈａ−人ｒｇ−Ｔｙｒ−Ｇｌｕ−Ａｒｇ−人ａｎ−工１ｅ−Ｇｌｕ−Ｌｙｓ −１１＠。

Ｋ庭五上旦 ■且」工Ａ１底 ＴＲＩＰ−１４は以下の式を有し、上記のように合成された：配列に凰五工亙 ■■」工Ａ血底 ＴＲＩＰ−Ｉｓは以下の式を有する：配列番号１３：ＧＢＡ−工ｌｅ−Ｇｌｙ− Ｌｙｓ−Ｈｌｓ−５ｅｒ−Ａｒｇ−Ｔｈｒ−Ａｒｇ−Ｔｙｒ−Ｇｌｕ−Ａｒｇ− Ａｓｎ（ｌｅ−Ｇｌｕ−Ｌｙｓ−１１ａ　。

ＴＲＩＰ−Ｉｓの２〜１６残基を、実施例２に記載の従来の固相法により合成す る。次いでペプチド樹脂を、Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｒｉｏｓｙｓｔｅｓｓペプチド合 成機の従来の結合法を用いて、１００倍モル過剰のパラ−グアニジノ安息香酸（ ＧＢＡ）と反応させた。ＧＢＡの付加が成功したことを、ＴＲＩＰ−１１につい て記載のニンヒドリン試験により確認した（実施例１２）。

Ｌ敷匠上エ バ　アツセイ 血小板富化血漿（ＰＲＰ）を、サンプル摂取前少なくとも１週間アスピリンの服 用を控えていた健常人ボランティアから得た。血液を、２１ゲージのバタフライ カニユーレ（ｂｕｔＬｅｒｆｌｙｅａｎｎｕｌａ）を用いて、１／１０容量の３ ．８％のクエン酸三ナトリウム中に集めた。次いで血液を室温で１１０Ｏｘで１ ５分間遠心分離して、上清を集めた。上清は、２５０．０００〜４００．　Ｇｏ ｏ個／μｍの血小板を含んでいた。次いで、２０〜４０ｍ１のＰＲＰを５ｅｐｈ ａｒｏｓｅ　２Ｂ−３００カラム（２，ＳｘｌＯｃｍ）に付し、血小板をゲル濾 過した。カラムは０．５６■−デキストロースおよび０．３５％ウシ血清アルブ ミンを追加したｐＨ７，４のＴｙｒｏｄｅ−ＨＥＰＥＳ緩衝液（１２９ｍＭ　Ｎ ａＣ１，１０，９ｍＭクエン酸三ナトリウム、８．９ｍＭ炭酸ナトリウム、５鳳 Ｍ　ＨＥＰＥＳ。

２．８ＢＭ　ＫＣＩ、０．８ｍＭ　リン酸水素二カリウム、０．８４−Ｍ　Ｍｇ Ｃｌ２．０゜２４ｍＭ　ＣａＣ１２）で平衡化して溶出した。溶出液流を、血小 板の出現を視覚的にモニターした（濁った液として観察される）。

この手法で得られた血小板を室温で維持し、調製２時間以内に使用した。

血小板凝集研究を、４−チャンネル血小板凝集プロフィラー（ＰＡＰ４、Ｂｉｏ ｄａＬａ、　ＨａＬｂｏｒｏ、ＰＡ）を用いて、ゲル濾過した血小板で行った。

詳細には、アッセイは以下のように行った：種々の濃度のＴＲＩＰ−１（最終濃 度で０〜ｌ　ｍＭ）をゲル濾過した血小板懸濁液０．４５ｍ１に加えた。次いで この混合物を血小板凝集針に置き、３７℃にまで温め、攪拌し始めた。平衡化（ 約５分間）後、混合物にヒトトロンビン（最終濃度で０．１６〜０．４８０／ｍ ｌ）を加えた。凝集応答を５分間モニターした。阻害は、次の式で算出した： 図１は、ＴＲＩＰ−１が種々のトロンビン濃度で用量依存的にトロンビン誘発血 小板凝集を阻害したことを示す。８００μＭの濃度で、ＴＲＩＰ−１はトロンビ ン誘発血小板凝集を、試験した全トロンビン濃度について８０％より大きく阻害 した。

本発明者らはまた、本発明のトロンビンレセプターアンタゴニストが、連結リガ ンド（５μＭ）、コラーゲン（７６μｇ／■１）、またはＡＤＰ　（４μＭ）に より誘発された血小板凝集を阻害する能力を分析した。ＡＤＰ誘発血小板凝集の 阻害をアッセイするために、ゲル濾過した血小板懸濁液に精製したヒトフィブリ ／−ゲン（１諷ｇ／鵬■）を添加した。これらのアッセイの各々について、トロ ンビン誘発凝集を十分に阻害したアンタゴニスト濃度（ＴＲＩＰ−１に関しては ８００μＭ）を用いた。この実験結果を図２および図３に示す。

図２に、ＴＲＩＰ−１が、トロンビン誘発血小板凝集を完全に阻害する濃度で、 連結リガンドペプチドにより誘発された血小板凝集に阻害効果を有さなかうたこ とを示す。図３に、ＴＲＩＰ−１がトロンビン誘発血小板凝集の阻害に特異的で あり、ＡＤＰまたはコラーゲンにより誘発された血小板には効果がなかったこと を示す。

寒ＩＬＬＬ アンタゴニスト−トロンビンレセプター°ムアツセイ本発明のアンタゴニストが トロンビンレセプターのヒルジン様アニオン性ドメインに結合する能力は、まず アンタゴニストを１２５■で標識することにより、アッセイされる。次いで標識 されたアンタゴニストを、トロンビンレセプターを含む細胞（例えば、血小板ま たは平滑筋細胞）とインキュベートした。トロンビンレセプター含有細胞は、浮 遊培養あるいはプラスチ、りまたは池の適切な基質上への接着による増殖で維持 され得る。トロンビンレセプターのアニオン性ドメインへのアンタゴニストの結 合は、以下の方法で証明された＝（１）細胞への標識アンタゴニストの特異的結 合；および（２）トロンビンレセプターのアニオン性ドメイン（アミノ酸４９〜 ６２位；「トロンビンレセプターペプチド」）に相当するシト標識ペプチドの存 在下でインキュベートしたときに、標識アンタゴニストの同一細胞への結合が著 しく減少すること。

あるいは、トロンビンレセプターペプチドは、不溶性支持体（例えば、ＣＮＢｒ −活性化５ｅｐｈａｒｏｓｅ）に架橋結合し得る。次いでこの複合体は、１２５ ■−標識アンタゴニストの結合のためにカラム中でアフィニティーマトリックス として作用し得る。

本発明のアンタゴニストのこのようなマトリックス（従ってトロンビンレセプタ ーのアニオン性ドメイン）への特異的結合が、カラムへの吸着により確認された 。次いでアンタゴニストは、可溶性非標識トロンビンレセプターペプチドを用い て、カラムから特異的に溶出される。

大Ｊｕ１１」− 血ハ　凝集の阻　におけるＴＲＩＰ−４および−５の環　ヒの環状化がＴＲＩＰ −４および−５の血小板凝集阻害特性について有する効果を、実施例１７に記載 のアッセイと類似のアッセイで測定した。このアッセイでは、一定量のトロンビ ン（０，０６Ｕ／１）および種々の濃度の直鎖状または酸化（環状化）したＴＲ ＩＰ−４および−５（０〜１−Ｍ）を用いた。次いでその結果を、同じ条件下で ＴＲＩＰ−１に関して得られた結果と比較した。図４に、この実験結果を図示す る。下記の表に、これらのアンタゴニストそれぞれに関する推定ＩＣ５ｏ　（血 小板凝集の５０％阻害が達成されるＴＲＩＰ濃度）値を示す。

この表は、ＴＲＩＰ−４および−５の環状化の結果、それぞれ２５倍および７． ５倍阻害効力が減少したことを示す。

支度丘ｌ立 ＴＲＩＰ−６のグリシンおよびアラニンウオーク　Ｗａｌｋ本発明者らは、上記 のペプチド合成法により、ＴＲＩＰ−６の各位置で中独のアラニンまたは単独の グリシンの置換を含む一連のペプチドを合成した。ペプチドの精製に続いて、各 ペプチドの血小板凝集の阻害の能力を測定し、ＴＲＩＰ−６と阻害を比較した。

これらのアラニンおよびグリシンウオークの結果を図５に示す。

この実験は、ＴＲＩＰ−６のＣ末端の１０アミノ酸が、グリシンまたはアラニン のいずれか（または、ある位置では両方とも）と、阻害がＴＲＩＰ−６で観察さ れた阻害の５０％未満に減少することなく置換し得ることを示した。このことは 、これらのアミノ酸が阻害特性を破壊することなく分子から削除し得ることを示 唆した。さらに、より小さいペプチドが、抗原性を減少しているため、治療用に はより望ましい。

Ｋ嵐丘ｌ土 ■ぜ」１東１虱 ＴＲＩＰ−１６は以下の式を有し、上記のように合成された；Ｌａｕ−Ｖａｌ− 人ｒｇ−Ｑ−Ｃｙｓ−Ｇｌｙ−Ｌｙ１１−Ｈｉｓ−ｓｅｒ−人ｒｇ−Ｔｈｒ−人 ｒｇ−Ｔｙｒ−Ｇｌｕ−Ａｒｇ−Ａｓｎ。

叉１」ＬＬｌ ■■ヨユへ１戊 ＴＲＩＰ−ＩＴは以下の式を有し、上記のように合成された：配列Ｌ１ｍ主 ■ＩＰ−１９１λ１底 ＴＲＩＰ−１９は以下の式を有し、上記のように合成された：配列番号Ｉｓ　： 　Ｌｅｕ−Ｖａｌ−ｋｒｑ−Ｘ１ｅ−ＧＩＹ−ＬＹ！ｌ−Ｈｌｓ−５ａｒ−Ａｒ ９　。

大Ｊｕｉ主」ユ ■■≦工東工区 １底ＩＰ−２０は以下の式を有し、上記のように合成された：Ｌ＠ｕ−Ｖａｌ− Ａｒｑ−Ｑ−ＣＹＩ；ａ−ＧＬｙ−Ｌｙｓ−Ｈｉｓ−５＠ｒ−Ａｒｇ　。

寡１１ＬＬＬ ＾１に−ＴＲＩＦ−２０のム Ａｌｋ−ＴＲＩＰ−２０は以下の５式を有し、実施例２４に記載のように合成さ れた： Ｌｅｕ−Ｖａｌ−人ｒ９−　ａｌｋｃｙｓ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ｈｉｓ−５ａｒ− Ａｒｇ　。

次いで、１ｍＭのペプチドを室温で３０分間、１．１ｍＭ：ｌ−）’アセトアミ ドとインキコベートした。アルキル化した生成物を逆相Ｃ−１１１クロマトグラ フイーで単離した。生成物の同定は、上記の質量分析によりおよびエルマン試薬 での色素生成物が生成しないことにより確認した（Ｇ、Ｅ、　Ｍｅａｎｓおよび Ｒ，Ｅ、　Ｆｅｅｎｅｙ、「タンパク質の化学改変Ｊ　、１ｏｌｄｅｎ−Ｄａｙ 、　Ｉｎｃ、、　Ｓｉｎ　Ｆｒａｎｅｉｓｅｏ、Ｃ＾−ｐｐ、ｌｏ）、１５５） 　。

Ｌ凰五ｌ亙 ■■≦１へ創成 ＴＲＩＰ−２１は以下の式を有し、上記のように合成された：Ｌｅｕ−Ｖａ　１ −ｋｒｑ−、Ｑ−５ｅｒ−ｃｌｙ−Ｌｙｓ−Ｈｉｓ−８ｓｒ−Ａｒｇ　。

Ｌ庭且ｌ工 ■■５１生良底 ＴＲＩＰ−２２は以下の式を有し、上記のように合成された：配列番号１６：Ｌ ・ｕ−Ｖａｌ−Ａｒｇ−５ａｒ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ｈｉｓ−５ｅｒ−Ａｒｇ。

（以下余白） 寒ｔｉＬＬＬ ■■」ユへ創成 ＴＲＩＰ−２３は以下の式を有し、上記のように合成された：配列番号１フ：　 Ｌ４ｕ−Ｖａｌ−Ａｒｇ−Ｍ＠ｔ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ｈｌｓ−５ａｒ−Ａｒｇ　 。

１直五２９ ■せ５１Δ１底 ＴＲＩＰ−２４は以下の式を有し、上記のように合成される：Ｌａｕ−Ｖａｌ− Ａｒ９−Ｑ−ＣＹ’−’　ｌＹ−”ｙ！−ＴＹｒ−Ａｌ”−Ｊ１１ｒ９　。

１敷匠ｌ立 ＴＲＩＰｊｌへ１底 ＴＲＩＰ−２５は以下の式を有し、上記のように合成される：１１丘１１ ■ｕｊｌ東１底 ＴＲＩＰ−２１ｉは以下の式を有し、上記のように合成される：Ｖａｌ−Ｖａｌ −Ａｒｇ−ｐ−Ｃｙｓ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ｈｉｓ−Ｐｈｅ−Ａｒｇ　。

寒ｍ ■土ヒＩｐし１店 ＴＲＩＰ−２７は以下の式を有し、上記のように合成される：Ｌ＊ｕ−Ｖａｌ− Ａ−ｒｑ−Ｄ−ＣＹＳ−５ｉｒ−１，ｙＢ−１（ｌＩＢ−５＠　ｒ−人ｒ９．。

友１匠１ユ ■甘５１生１店 ＴＲＩＰ−２８は以下の式を有し、上記のように合成される：Ｌｅｕ−Ｖａｌ− Ａｒｇ−ｐ−Ｃｙｓ−Ｔｈｒ−Ｌｙｓ−Ｈｉｓ−５ａｒ−ＡｒｇＬ嵐Δ主± ■Ｕ≦１些１成 ＴＲＩＰ−２９は以下の式を有し、上記のように合成される：Ｌｅｕ−Ｖａｌ− Ａｒｑ−Ｑ−ＣＹＩＡ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ−Ｈｉｓ−５ａｒ−Ａｒｇ１目丘工１ ■且」！東良底 ＴＲτＰ−３０は以下の式を有し、上記のように合成される：にｍ ■土ヒ１ばＵ「戊 ＴＲＩＰ−３１は以下の式を有し、上記のように合成される：Ｌ＠ｕ−Ｖａｌ− Ａｒｇ−Ｑ−ＣＹｆｉ−Ｇｉｎ−Ｌｙｓ−Ｈｉｓ−５ａｒ−Ａｒｇ支Ｉ丘ｌ工 ■ＩＰ−３２東良底 ＴＲＩＰ−３２は以下の式を有し、上記のように合成される：Ｌａｕ−Ｖａ　ｌ −Ａｒｑ−Ｑ−ＣＭＳ−ＡｓＰ−ＬＹＳ−Ｈｌｓ−５ａｒ−Ａｒｑｏに監匠ｌ工 ■Ｕ≦ユ東１底 ＴＲＩＰ−３３は以下の式ををし、上記のように合成される：Ｌａｕ−Ｖａ　１ −Ａｒｑ−Ｑ−ｃｙＩａ−Ｇｌｕ−Ｉ、ｙｓ−Ｈｉ　ｓ−５＠ｒ−Ａｒｑ友立匠 ｌ工 ■ぜ」１色１底 ＴＲＩＰ−３４は以下の式を有し、上記のように合成される：Ｌｅｕ−Ｖａｌ− Ａｒｇ−Ｑ−Ｃｙｒ、−Ｌｙｅ−Ｌｙｓ−Ｈｉｓ−５ａｒ−Ａｒｇ寒ｍ ｕ上ヒΣビ８１成 ＴＲＩＰ−３５は以下の式を有し、上記のように合成される：Ｌａｕ−Ｖａｌ− 人ｒｑ−ｕ−ｃｙｓ−人ｒｇ−Ｌｙｓ−Ｈ１ｓ−５ｔｒ−人ｒ９゜Ｌ１匠土上 １パ」１墾１底 ＴＲＩＰ−３６は以下の式を有し、上記のように合成される：Ｌａｕ−Ｖａｌ− ｈｒｑ−Ｑ−ＣＹｓ−Ｈｉｇ−ＬＹＳ−）！１ｓ−ｓｅｒ−Ａｒ９瓦敷−土主 ■■」に創成 ＴＲＩＰ−３７は以下の式を有し、上記のように合成される：Ｌａｕ−Ｖａｌ→ ｗｑ−Ｑ−ｃｙｇ−Ｑ−ＡｌＩ３−ＬＹ！！−Ｈｌｓ−５ａｒ→「９支１丘土ユ ＴＲＩＰ≦１へ１底 ＴＲＩＰ−３８は以下の式を有し、上記のように合成される：Ｌ＠ｕ−Ｖａｌ− Ａｒｑ−Ｑ−Ｃｙｓ−Ω−５ｅｒ−Ｌｙｇ−Ｈｌｓ−Ｂａｒ−ｋｒｑＫ１五土工 ■土ヒ１ｐし１店 ＴＲＩＰ−３９は以下の式を有し、上記のように合成される：Ｌ＠ｕ−Ｖ＆１− Ａｒ９−Ｑ−Ｃｙｓ−Ｑ−Ｔｈｒ−ＬＹＳ１−ＨＬＩＡ−８ａｒ−ＡｒｑａＫ血 丘土工 ■Ｕヨ互二番底 ＴＲＩＰ−４０は以下の式を有し、上記のように合成される二に１鳳土ｌ ■迂ヨ１墾創底 ＴＲＩＰ−４１は以下の式を有し、上記のように合成される＝Ｌｅｕ−Ｖａｌ− Ａｒｇ−Ｑ−Ｃｙｓ−Ｑ−Ａｓｎ−Ｌｙｓ−Ｈｉｓ−５ｅｒ−ＡｒｇＫ監五土工 ■げヨに４番底 ＴＲＩＰ−４２は以下の式を有し、上記のように合成される：Ｌｅｕ−Ｖａｌ− Ａｒｇ−、Ｑ−Ｃｙｓ−Ｑ−Ｇｉｎ−Ｌｙｓ−Ｈｉｓ−５ａｒ−Ａｒｇ寡覇」１ （ｌ 毬土ヒ土ド目１戊 ＴＲＩＰ−４３は以下の式を有し、上記のように合成される：Ｌｅｕ−Ｖａｌ− ｋｒｑ−Ｑ−Ｃｙｓ−Ｑ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ−Ｈｉｓ−５ｅｒ−ＡｒｇＬ１里土工 ■パヨエ墾１底 ＴＲＩＰ−４４は以下の式を有し、上記のように合成される：Ｌ＠ｕ−Ｖａｌ− Ａｒｇ＝Ｑ−ＣＹＳ−１２−Ｇｌｕ−Ｌｙｓ−Ｈｌｓ−５ａｒ−ＡｒｇＫ凰興ｌ 立 ■ＩＰ−４５弘１底 ｒＲｍｐ−４ｓは以下の式を有し、上記のように合成される：Ｌａｕ−Ｖａｌ− Ａｒｇ−Ω−Ｃｙｓ−Ω−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｈｉｓ−５ｅｒ−Ａｒｇ　０支敷五 １１ ■茸ヨ１生１底 ＴＲＩＰ−４６は以下の式を有し、上記のように合成される：Ｌａｕ−Ｖａｌ− Ａｒｇ−Ｑ−Ｃｙｓ−Ｑ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ｈｉｓ−５ｅｒ−Ａｒｇ０大ｆｌ ■土ヒ支匡８１戎 ＴＲＩＰ−４７は以下の式を有し、上記のように合成される：Ｉ、＠ｕ−Ｖａｌ −Ａｒｇ−１１−Ｃｙｓ　−Ｑ−Ｈｌｓ−Ｌｙｓ−Ｈｉｓ−５ｅｒ−Ａｒｇ　。

案１１乱旦」− ■■ヨＩＡ番成 ＴＲＩＰ−４！ｌは以下の式を有し、上記のように合成される：Ω−Ｃｙｓ−Ａ ｒｑ−′Ｌ＠ｕ−５ｅｒ−ｖａｌ−Ｈｌｓ−Ａｒｑ−Ｌｙｔ、−Ｇｌｙｏに嵐五 ｌ土 ■旦ヨ１４番成 ＴＲＩＰ−４９は以下の式を有し、上記のように合成される：配列番号１８　： 　Ｉ、ａｕ−ｖａｌ−Ａｒｇ−１１ｅ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ｈｉｓ−５＠ｒ−Ｌｙ ｓ−Ｔｈｒ−ｊＬｒｑ−Ｔｙｒ−Ｇｌｕ−Ｌｙｓ−Ａｓｎ　ｔｌＫ監五ｌ旦 ■廿」工へ１底 ＴＲＩＰ−５ｏは以下の式を有し、上記のように合成される：配列番号１９　： 　Ｌａｕ−Ｖａｌ−Ａｒｇ−１１ｅ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ｈｉｓ−５ｅｒ−Ｈｌｓ −Ｔｈｒ−に叛丘ｌ工 ■上ヒ１匡」１或 ＴＲＩＰ−５１は以下の式を有し、上記のように合成される：配列番号２０：し 川−Ｖａｌ−Ａｒｇ４１ｅ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ｈｌｓ−８ａｒ−Ａｌａ−Ｔｈｒ −Ａｒｇ−Ｔｙｒ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ａｓｎ０友１五旦工 ■且ｊに創成 ＴＲＩＰ−５２は以下の式を有し、上記のように合成される：配列番号２１　： 　Ｌ＠ｕ−Ｖａｌ−Ａｒｇ−１１ｅ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ｈｌｓ−５ａｒ−Ａｒｇ −Ｔｈｒ−Ｃｙｓ−Ｔｙｒ−Ｇｌｕ−Ａｒｇ−Ａｓｎ。

Ｋ１丘１１ のＴＲＩＰの　ハ　アッセイ 本発明者らは、ＴＲＩＰ−２からＴＲＩＦ−２１（ＴＲＩＰ−９を除く）がトロ ンビン誘発血小板凝集を阻害する能力を、実施例！７に記載のアＩセイでア・７ セイした。これらのアッセイ結果を、下記の表に示す。

（以下余白） この表で、ＴＲＩＰ−２、−４、−５、−１１、および−１２の環状化が実際に 阻害効力を減少したことが確認される。本発明者ら１よ、この減少が、これらの 分子の環状化はあまり好ましくな一１配置ニなす、従ッてトロンビンレセプター への結合能力を減少させたという事実によるものであったと考える。しかし、環 状化ＴＲＩＰは、著しい阻害活性を維持し、トロンビンレセプターアンタボ−ス トとして有用であることを注目すべきである。

ＴＲＩＰ−１９は、ＴＲＩＰ−４の１０１１のＣ末端アミノ酸の除去で、３から ４倍のみの効力の低いインヒビターになることを示す。ＴＲＩＦ−１９のＩＩｓ 残基のＤ−Ｃｙｓとの置換（ＴＲＩＰ−２０）で、２０倍より大きい阻害活性の 増加を生じ、より長いＴＲＩＰ−６の６倍の効力もある分子になる。これにより 、トロンビンのアミノ酸７４〜８３位はトロンビンレセプターへの結合において 比較的重要でないことが確認される。

さらにＴＲＩＰ−１９を越えるＴＲＩＰ−２０の増加した効力につぃてのンステ ィンのジ−セリンでの置換（ＴＲＩＰ−２１；　実施例２６）により行われた。

これらの後者の分子は両方とも、ＴＲＩＰ−２０よりも高いｌオーダーより大き いＩＣ５ｏ−およびＴＲＩＰ−１９の効力に等しいＩＣ５ｏを示す。

夾１」ＩＬＩ ＴＲＩＰはトロンビンの　活　を　しない本発明者らは、ＴＲＩＰ−６がＳｐｅ ｃｔｒｏｚｙｍｅ　ＴＨ（）　ンルーＧｌｙ−Ｐｒ。

−Ａｒｇ−ｐ−＝トロアニリド：＾ｍｅｒｉｅａｎ　Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃａ、 　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ。

ＮＹ）のトロンビン−触媒化開裂を阻害する能力を測定した。

詳細には、２．５〜２５μＭ（Ｄ基質１度で、ＴＲＩＰ−６（０、２００ｕ　Ｍ 、４００μＭ）の存在または非存在下での初速度を測定した。トロンビン−触媒 化速度はＣａｒＹ　１９分光光度計で４０Ｓｎ−でモニターし、時間関数として 継続的に記録した。キネティックスは室ｆｆ１（２５＋１℃）で、Ｏ，０５Ｍ） 　’）　ス（ｐＨ７，５，０，１Ｍ　ＮａＣ１）緩衝液中で行った。

典型的な酵素反応として、１．０１の緩衝液をサンプルキュベツトと対照キュベ ツトとの両方に加えた。トロンビン（最終濃［テ３．２ｘｌＯ−’Ｍ）　、およ びＴＲＩＰ−６（０〜４　ｘｌｏ−’Ｍ）まり１ｔＨＩＲＵＬＯＧ”　（）ロン ビン触媒活性の既知のインヒビター）を５ｐｅｃｔｒｏｚｙ■ｅＴ［ｌを添加す る前にサンプルキュベツトに加えた。

基質添加後すぐにサンプルキュベツトの内容物をプラスチックピペットを用いて 攪拌した。反応は５〜１５分間、分光光度計でモニターした。キネティックスパ ラメーターを初速度データの二重逆数プロｙトから算出した。

このアッセイ結果は、ＴＲＩＰ−６はいずれの濃度でもＳｐｅｃｔｒｏｚｙｗｒ ｅ　ＴＨのトロンビン開裂を阻害しないことを示した。本発明のｆ也のトロンビ ンレセプターアンタゴニストもまたトロンビンの触媒活性を阻害しない。

Ｋ１鳳見立 ＴＲＩＰはトロンビンのフィブリン　ム　を　しない本発明のトロンビンレセプ ターが、フィブリンを形成するためのフィブリノーゲンのトロンビン開裂を阻害 する能力を、間接的にフィブリン重合化の混濁度アッセイで測定した。トロンビ ン（０，１１０／ｍｌ）を、２５℃で緩衝液（コントロール）、ＴＲＩＰ−６（ １００μＭ）　、または旧ＲＵＬＯＧＴＭ（９ｎＭ）を含む５０ｍＭ　）リス（ １００ｍＭ　ＮａＣ１，ｐＨ８）中のヒトフィブリノーゲン溶液（１ｍｇ／ｓｌ ）に加えた。混濁度における変化の開始（「開始時間」）を、３４０１園で９６ ウエルプレートリーダー（Ｔｈｅｒｍｏｍａｘ、　Ｍｏ１ｅｃｕｆａｒ　Ｄｅｖ ｉｃｅｓ、　Ｍｅｎｌｏ　ＰａｒｋＳＣＡ）に記録した。結果を下記に示す。

これらの結果は、ＴＲＩＰ−６がトロンビン触媒のフィブリン形成を阻害しない ことを実証する。本発明の池のトロンビンレセプターアンタゴニストは同様の結 果を示Ｔ０ＪＪＬＪＬＬ上 也のトロンビン　発ｍ　の 一般に、トロンビン誘発細胞機能の阻害を、標的細胞を本発明のｆｌ！ｂの濃度 のトロンビンレセプターアンタゴニスト（０〜Ｉ　ｍＭ）とともに５〜３０分間 ブレインキュベートすることによりアッセイする。次いでトロンビンをこれらの 細胞に５〜３０分間加え、所定の細胞応答を刺激する。次いで、細胞および／ま たは培地を採集し、既知のトロンビン誘発成分をアッセイする。ＴＲＩＰ−１と インキネベートしたサンプルをコントロールサンプル（インヒビターなし）と比 較して、阻害を定量する。

トロンビンは、内皮細胞で好中球接着性の増加を誘発することが知られている。

このトロン、ビン誘発機能に対するアンタゴニストの阻害効果を測定するために 、血小板活性化因子（ＰＡＦ）の生成、およびＧＮＰ−１４０の細胞表面発現を 分析する［　Ｓ、　ＰｒｅｓｃｏＬｔら、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｅａｄ、Ｓｅ ｔ、ＵＳＡ、８１．　ｐｐ、３ｓ３４−３８（１９８４）］。

多型核白血球（ＰＭＮ）を、クエン酸添加の全血を市販のフィコールグラジェン ト（Ｐｈａｒｓａｃｉａ、　ＰｉｓｃａＬａｗａｙ、　ＮＪ）に通して遠心分離 することにより調製する（実施例１７参照）。詳細には、全血３０−１をゆっく りとグラジェントを含むチューブの側壁に、界面を乱さないように気を付けなが らピペットで入れる。グラジェントを１６００ｒｐ−で２２℃、４０分間遠心分 離する。ＰＭＮを含ムペレノトを、ＨＢＳＳ　（カルシウムおよびマグネシウム を除く）中に０．５％ラウン清アルブミンを有するｐＨ７，３の２５■關ＨＥＰ ＥＳを含む白血球培地（毎逼新たに調製する）　３０ｍ１に再懸濁する。次いで ＰＭＮを、３．０１のＢＣＥＣＦ−ＡＭ　（２’　、ブービス−（２−カルボキ ンエチル）−５（および−６）−カルボキシフルオレセインアセトキンメチルエ ステル）　（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｐｒｏｂｅｓ、Ｉｎｃ、、　Ｅｕｇｅｎｅ、 　ＯＲ）を加えて３７℃で３０分間標識する。次いで、細胞を白血球培地の５容 量を加えて希釈する。

ヒトＩｌｌ帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）を４８ウエルプレート中で、３日間フ ンフルエンドになるまで増殖させる。次いでＨＵＶＥＣをＨＢＳＳで洗浄し、０ 〜Ｉ諷Ｍトロンビンレセプターアンタゴニストを加える。次いで細胞を３７℃で １０〜３０分間インキコベートする。ＰＭＮ懸濁液（０，５＋＋１）を３７℃に 平衡化し、ＩＩＵＶＥｃ培養物に加え、２分間置く。次いで、トロンビン（０− Ｉ　Ｕ／■ｌ）を細胞混合物に加えてさらに３７°Ｃで１ｏ分間インキ１ベート し得ル。

ウェルを数回ＨＢＳＳで洗浄し、接着しないＰＭＮを除く。次に、ウェルを１％ ＭＰ−４００ｊｍｌで処理して、各ウェルの内容物を別個の９６ウエルプレート に移す。ＮＰ−４０処理物質について、励起波長４８５ｎ■および測定波長５ｕ ｎｓを用いて蛍光測定を行う。蛍光は、ＨＵＶＥＣ単層に接着するＰＭＨの数に 比例する。トロンビンレセプターアンタゴニストとのプレインキュベージ震ンに より、トロンビンを含むがインヒビターを含まないコントロールウェルに比較し て、平均の蛍光が減少する。

ＰＡＦの生成およびＧＮＰ−１４０の細胞表面発現を、以前に記載のようにアッ セイするＣＳ、　ＰｒｅｓｃｏｔＬら、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　 Ｓｅｉ、　ｌｌ５Ａ、　８１．　ｐｐＪ５３４−３８（１９１１４）］。

Ｌ甑五ｌ主 ＴＲＩＰは立　において　胞の　裂　殖を　する平滑筋細胞に対する本発明のア ンタゴニストの阻害効果を測定するために、ラット血管平滑筋細胞（ＡＩＯ、ラ ット平滑筋胚胸郭大動脈；　ＡＴＣＣ１４７６−ＣＲＬ、　Ｂａｔｃｈ　＃Ｆ９ ４３２）を、９６ウエルマイクロタイタープレート（２０，０００細胞／ウエル ）中で一晩、５％ウシ血清、４ｍＭグルタミン、および１００ユニツトのペニシ リン／ストレプトマイシンを追加したＤＭＰ１Ｍ中で培養した。２４培地に交換 した。イン手ユベーンヨンを３７℃で１時間継続した。次いで細胞にトロンビン （１ｎＭ）を加えた。約４０時間後、細胞を′Ｈ−チミジン（２１議ＣＩ／−ｇ ｓ　ｌμＣｉ／ウェル）で瞬間標識し、さらに８時間増殖させた後採集した。図 ６に、本発明のトロンビンレセプターアンタゴニストが平滑筋細胞への３トチミ ジンの取り込みの用量依存的な阻害を示すことを示す。これにより、これらのト ロンビンレセプターアンタゴニストが平滑筋細胞表面のトロンビンレセプターを 阻害することを確認した。

尖ＪＬＬＬＬ ニラブトキシンＡＴＲＩＰ融合ＤＮＡのエラブトキンンＡ−ＴＲＩＰ融合タンパ ク質を、以下の構造の特徴（ト末端からＣ−末端の順で挙げた）を含むように設 計した：ファージＭｔ３ｐｍタンパク質由来のシグナルペプチド；エラブトキシ ン−Ａのアミノ酸１〜２４位；　ＴＲＩＰ−６のアミノ酸３〜１８位に相当する 配列（配列番号４のアミノ酸３〜１８位）；エラブトキシン−Ａアミ／９３０〜 ５７位、２つのアラニン残基のリンカー：抗Ｃ謁ｉｃｅ抗体９Ｅ１０により認識 される配列；ｘａ因子開裂部位をコードする配列；およびファージＭ１３　ｐＨ ＋タンパク質の全長配列（成熟分子の最初の残基で開始する）。

エラフトキ／ン＾／ＴＲＩＰ融合遺伝子は、下記に示すオリゴヌクレオチドフラ グメント由来の合成遺伝子として構築された。

全てのオリゴヌクレオチドは、Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｊｏｓｙｓｔｅｍｓ　Ｍｏｄ ｅｌ　３９４オリゴヌクレオチド合成機（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ ｓ、　Ｆｏｓｔｅｒ　Ｃ１ｔｙ、　ＣＡ）を用いて合成した。

２７：　（、、、、号２２．　ＣＧＴ　ＡＴＣＴＧＣＴＴＣＡＡＣＣＡＣＣＡＧ 　ＴＣＣＴＣＣＣＡＧ　ＣＣＧ　ＣＡＧ　ＡＣＣＡＣＣＡＡＡ　ＡｃＣＴＧＣＴ ＣＣＣＣＧ　ＧＧＴ；２８：　（配列１　ｑ　２３　）　ＧＡＡ　ＴＣＣＴＣＣ ＴＧＣＴＡＣＡＡＣＡＡＡ　ＣＡＧＴＧＧ　ＣＧＴ　ＡＴＣＧＧＴ　ＡＡＡ　Ｃ ＡＣＴＣＣＣＧＴ　ＡＣＣＣＧＴ　ＴＡＣＧＡＡ；２９：（配列番号２４　）　 ＣＧＴ　ＡＡＣＡＴＣＧＡＡ　ＡＡＡ　ＡＣＣＡＴＣＡＴＣＧＡＡ　ＣＧＴ　に ＧＴ　ＴＧＣＧＧＴ　ＴＧＣＣＣＧ　Ａｃｅ　ＧＴｒ　ＡＡＡ　ＣＣＧ　ＧＧＴ ；３０：　（配ＦＩＪ番号２５）　ＡＴＣＡＡＡ　ＣＴＧ　ＴＣＣ’ｒＧＣＴＧ ＣＧＡＡ　ＴＣＣＧＡＡ　ＧＴｒ　ＴＧＣＡＡＣＡＡＣＧＣ；コｌ：　（配列番 号２％）　ＣＡＧ　ＧＴＴ　ＴＴＧ　ＧＴＧ　ＧＴＣＴＧＣＧＧＣＴＧＧＧＡＧ 　ＧＡＣＴＧＧ　ＴＧＧ　ＴｒＧ　ＡＡＧ　ＣＡＧ　ＡＴＡ　ＣＧ；’３２：　 （ｌｌｉＪ＋Ｊｌ）ｑ２７・）　ＧＴＡ　ＣＧＧ　ＧＡＧ　ＴＧＴ　ＴＴＡ　Ｃ ＣＧ　ＡＴＧ　ＧＡＣＣＡＣＴＧＴ　Ｔ！’Ｇ　ＴＴＧ　ＴＡＧ　ＣＡＧ　ＧＡ Ｇ　ＧＡＴ　ＴＣＡ　ＣＣＣＧＧＧ　ＧＡＧ；３３：　（配列番号２８）　ＡＣ ＣＧＴＣＧＧＧ　ＣＡＡ　ＣＣＧ　ＣＭ　ＣＣＡ　ＣＧＴＴＣＧ　ＡＴＧ　ＡＴ Ｇ　ＧＴｒ　ＴＴＴ　ＴＣＧ　ＡＴＧ　ＴＴＡ　ＣＧＴ　ＴＣＧ　ＴＡＡ　ＣＧ Ｇ；および、 コ４：（配列番号２９）　ＧＧＣＣＧＣＧＴＴ　ＧＴＴ　ＧＣＡ　ＡＡＣＴＴＣ ＧＧＡＴＴＣＧＣＡ　ＧＣＡ　ＧＧＡ　ＣＡＧ　ＴＩＴ　ＧＡＴ　ＡＣＣＣＧＧ 　ＴＴＴ　Ａ　ｅ上記オリゴヌクレオチドを、標準的な分子生物学的手法を用い て、キナーゼ処理し、アニールし、そしてライゲートした。オリゴヌクレオチド ３０および３４もまた、遺伝子中にＮｏｔｌ制限部位を導入した。オリゴヌクレ オチド２７および３１は、平滑末端を作り出す。一度合酸されると、この合成遺 伝子はｋｏ４７１１１およびＮｏｔｌ’ｔ’ｐＨ１−ｐＴＺ１９Ｒヘクターを切 断し、エラブトキ７ン＾−ＴＲＩＰシン遺伝子（ｓｙｎｇｅｎｅ）にライゲート することにより、市販の７ｙ−ジミドベクターｐＴＺ１９Ｒ（Ｐｈａｒｍａｃｉ ａ）中の改変Ｐ１１１遺伝子構築物中に導入された。構築物はＤＮＡ配列決定で 確認した。このベクターの完全なりＮＡ配列［配列番号３０］を図７に示す。

最終的な構築物の鍵となる特徴は（５“から３゛の順に）、Ｐｉ１１シグナル配 列（ヌクレオチド２６６５−２７３３位）、エラブトキシン＾の最初の２４個の アミノ酸（ヌクレオチド２７３４−２８２０位）、ＴＲＩＰ配列（ヌクレオチド ２１１２１−２８６ａ位）、エラブトキシンＡのアミノ酸３０〜５７位（ヌクレ オチド２８ｆ＋９−２９５２位）　、Ａｌａ−Ａｌａリンカ−（ヌクレオチド２ ９５３−２９５８位）、抗Ｃ１ｙｅ抗体９Ｅ１０により認識されるエピトープを コードする領域（ヌクレオチド２９５９−２９８７位）　、Ｘａ因子開裂部位を フードする領域（ヌクレオチド２９８ｇ−３０１５位）、およびＰｉｌ＋タンパ ク質コーデコーディング配列レオチド３０Ｌ６−４２３３位）である。このベク ターはまた、旧ｎａ１１１部位（ヌクレオチド２６５７位）、およびＮｏｔ１部 位（ヌクレオチド２９５５位）を含んでいた。

この構築物によりコードされる予測されたタンパク質の配列は、Ｐｉｌ＋シグナ ル配列Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−＋１ｅ−Ｐｈｅ−Ａｓｎで始まり、＾ｒｇ−Ａｓｎ−Ｌ ｙｓ−Ｇｌｕ−Ｓｅｒで終わる。細菌で発現しおよびプロセシングされるときに シグナルペプチド配列は除かれ、エラブトキシンＡの残基１である新しいＮ−末 端が作り出されると推定された・用いたオリゴヌクレオチドの結果として、エラ ブトキシン−Ａのアミノ酸２５〜２９位（５ｅｒ−Ａｓｐ−Ｐｈｅ−＾ｒｇ−Ｇ ｌｙ）がＴＲけ配列に置換する。

叉ｍ土 ファージでのエラブトキシン＾　ＴＲＩＰＡ　ンパクノ能力のあるＤＨ５ｃｘＦ ’ｌｑｇ、　ｃｏ旦細胞を、ライゲートしたｐＴＺ１９Ｒ／エラブトキンン−八 −ＴＲＩＰ／ｐＨ１構築物で形質転換し、アンヒシ’Ｊ７（Ｓｏμｇ／ｍｌ）　 ＬＢプレートに塗布した。コロニー出現後、畢−のコロニーを選びとり、１００ μｇ　ＡＭＰおよび２％グルコースを含む２ＸＹＴ培地１ｊｍｌを植え付けるた めに用いた。形質転換体を００６００が約０．９になるまで３７℃で４〜６時間 激しく攪拌して増殖させた。次いで細胞を遠心分離し、細胞ペレットヲ１　ｘｌ ｏ”コｏニー形成ユ＝・ｙ　ト（ＣＦＵ）　（０７ｙ−シＭ１３ＫＯ７とともに ２ＸＹＴ　６１１１に再懸濁し、水上で５〜１ｏ分間インキュベートした。感染 細胞を２５０ｍ１のフラスコに移し、３０”Ｃで１時間激しく撹拌して増殖させ た。）１−ジの生成を、ＩＰＴＯ（１０μＭ）、アンビンリン（８０μｇ／■ｌ ）、およびカナマイシン（８３μｇ／−１）を添加することにより刺激した。培 養物は３７℃で１４〜１８時間増殖させた。次いで細胞を遠心分離して、ファー ジについて上清の力価を測定した。この方法でｗ４ｖしたファージは４℃で保存 し得る。

塞Ｗ虹ｌ エラブトキシン＾　ＴＲＩＰ　ムタンパク　ノＴＲＩＰＩノ重復伸長によ６スプ ライソングのＰＣＲ法［Ｒ，Ｍ、Ｈｏｒｔｏｎら、旺旦、７７、ｐｐ、　６ｌ− ６８（１９１１９）、本明細書中で参考として援用されている開示］を用いて、 エラブトキシン＾／ＴＲＩＦ融合タンパク質中のＴＲＩＰ配列の改変を生じさせ た。

この改変した構築物の５”セグメントは、ｐＴＺ１９Ｒ／エラブトキシン＾−Ｔ ’ＲＩＰをオリゴヌクレオチドＳＴＩ　ｌおよび５ＲＰ２４で増幅することによ り作製された。３つの異なった３°セグメントを、オリゴヌクレオチド５ＲＰＩ Ｏ＾、および、ＴＲＩＰ配列に３つの変異型の各々を作製するためにオリゴヌク レオチド５丁Ｂ、Ｓｉ２、または５ＴＩＯのうちの１つを用いて作製した。ＰＣ Ｒに続いて、５゜および３°セグメントをアガロースゲルで単離し、Ｇｅｎｅ　 Ｃ１ａｓｎ　Ｗｉｔ　（Ｂｉｏ　１０１．　Ｓａｎ　Ｄｉｅｇｏ、　Ｃ＾）を用 いて回収した。次いでこれらの６慢セグメントを、オリゴヌクレオチド５ＲＰ２ ４および５ＲＰＩＯ＾を用いるスプライス重複伸長法により接合した。得られた フラグメントを上記のように単離し、次いでＨ１ｎｄｌｌ！およびＮｏｔｌで切 断し、親ベクター中にもどしてクローン化した。

上記のオリゴヌクレオチドの配列は以下の通りである：Ｓ’！’１１：（配列番 号３１）　ＧＧＡ　ＧＴＧ　ＴＴＴＡＣＣＧＡＴ　ＡＣＧ　ＣＣＡ　ＣＴＧ　ｍ ５Ｔ９　：　（配列番号３３）　ＡＡＡ　ＣＡＣＴＣＣＣＡＴ　ＡＣＣＣＧＴ　 ＴＡＣＧＡＡ　ＣＡＴＡＣＣ； ５７ＩＯ＝（配列番号３４）　ＡＡＡ　ＣＡＣＴＣＣＡＡＡ　ＡＣＣＣＧＴ　Ｔ ＡＣＧＭ　ＡＡＡＡＡＣ； ５ＲＰ２４：（配列番号３５）　ＣＴＣＴＡＡ　ＡＧＣＴＴＩ’　ＴＴｒ　ＴＧ Ｇ　ＡＧＡ　ＴＴＴＴＣ入入ＣＧ　ＴＧＡ　ＡＡＡ　ＡＡＴ　’ｒ；および、５ ＲＰ１０Ａ：　（配列番ｑ　３６）　、ＣＴＴ　ＴＣＡ　ＡＣＡ　ＧＴｒ　ＴＣ Ｔ　ＧＣＧ　ＧＣＣＣＣＡＣＧＴ　ＣＣＴ　ＴＣＧ　ＡＴＣＣＣＡ　ＴＴＣＡＧ Ａ　ＴＣＣＴＣＴ　ＴＣＴ　ＧＡＧ　ＡＴ　０本発明者らは、ＤＮＡ配列決定に より所望の生成物がうまく構築されたことを確認した。得られた融合タンパク質 は、ＴＲＩＰ−６（配列番号４）のアミノ酸９位および１４位でのＡｒｇからし ｙｓ、および、Ａｒｇから旧♂またはＡｒｇから＾ｌａの２重置換により特徴付 けられる改変ＴＩＩＩＰ配列を含んでいた。上記の改変ＴＲＩＰ配列に加えて、 突然変異事象はまた、ＡｒｇからＬｙｓへ二重置換されたＴＲＩＰ配列のアミノ 酸１１で、さらにＡｒｇからＣｙｓへの置換を生じた。

Ｌ直立ｌ立 エラブトキシン＾　ＴＲＩＰ融ムタシムタンパクるトロンビンレセプ　−４ 実ｍ　例６Ｓに記載の各々のエラブトキシンＡ／　ＴＲＩＰ融合９７パク貿を表 面上に発現するフ１−ノを、実施例６４に記載のように調製し、次いで２０％Ｐ ＥＧ　１１０００の１１５容量を加え、４℃で１晩インキコベートし、次いで１ ５．ＯＯＯｘｇで１５分間遠心分離して濃縮した。ファージペレットをトリス緩 衝化生理食塩１　（ＴＢＳ、＋００■績トリス、１５０霞Ｍ　ＮａＣ１）　１０ ０μｌに再懸濁した。濃縮ファージの力価は、２　ｘｔｏ”　〜９　ｘｌｏ”　 ＣＦＩＩ／ｓ＋Ｉの間の範囲であフた。

トロンビンレセプターのヒルジン様領域に相当するペプチドＡｓｎ−人５ｐ−Ｌ ｙｓ−Ｔｙｒ−Ｇｌｕ−Ｐｒｏ−Ｐｈ＠−Ｔｒｐ−Ｇｌｕ−Ａｓｐ−Ｇｌｕ−Ｃ １ｕ−Ｌｙｓ−人５ｎ−Ｇｌｕ−５ａｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−ｃｌｙ−Ｃｙｓ　（ 配列番号３７）（以下余白） を、２６ｇヘブｆ　Ｆ　：　５＠ｇＢＳＡノ比率で、まずＢＳＡ５ＩＩｇを５Ｐ ＤＰ（Ｐｉｅｒｃｅ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏ５ｐａｎｙｑ　Ｒｏｃｋｆａｒｄ 　Ｉｆ）　０．２５Ｂと室温で１時間反応させ、次いでペプチドを加え、さらに １時間インキュベートして、ウシ血清アルブミン（ｒＢｓＡＪ　）に結合した。

プラスチックマイクロタイクープレートを０．ＩＭ　ＮａＨ２Ｃ０３（ｐＨ９， ６）中の２μｇ／■ｌのトロンビンレセプターペプチド−ＢＳＡフンシュゲート で１時間コートし、次いでＴＢＳ中の５％ＢＳ＾でブロックした。プレートをＴ ＢＳ中ノ０．　ｆ％ＴｆＥＥＮ−２０（Ｔａｓ−Ｔｗｅｅｎ）で３回洗浄した後 、ＴＢＳ−Ｔｗｅｅｎで希釈した種々の濃度のファージを加えた。１時間後にプ レートを洗浄し、ポリクローナルウサギ抗Ｍｕ抗体（１：　１０．０００）を加 えた。洗浄後、結合したウサギ抗体を可視化し、ヤギ抗ウサギ抗体をコンジユゲ ートした西洋ワサビペルオキシダーゼ（に１０００）と反応させ、次いで呈色基 質の０−フェニレンジアミンで発色させて定置した。

上記の実験結果を、コントロールファージおよび種々の量の各組換えファージに ついて図８に示す。これらの結果は、置換のない配列を有するエラブトキ７ン＾ −ＴＲＩＰ構築物を発現するファージに対する、ならびに、９位および１４位の アルギニンがリジンまたはヒスチジンに変わった構築物に対するファージの結合 が用量依存的に増加（ＯＤ４．ｏの増加で示される）することを示す。１１位の アルギニンをシスティンで置換することにより、結合し得ない融合タンパク質が 生じる。同様に、エラブトキシン＾／ＴＲＩＦ融合のない野生型ファージは、ト ロンビンレセプターに由来するペプチドに結合しない。

本明細書以前に本発明の多くの実施態様を示したが、本発明者らの基本的な構築 を、本発明のプロセスおよび生成物を利用する他の実施態様を提供するために変 更し得ることは明らかである。従って、本発明の範囲は実施例としてこれ以前に 提示した特定の実施態様よりむしろ、本明細書に添付する請求の範囲により定義 されるべきであると認識される。

（↓・ｔ）４り 配列表 （＋１一般的情報： （１）出願人；バイオツエン、インコーポレイテッドマラガノア、ジ謬ン　エム （ｌｉ１発明の名称ニトロンビンレセプターアンタゴニスト（ＩＩＩ）配列数： ３８ （Ａｌ住Ｆ＋人：フィブノ島　アンド　シーブ（８１番地：１２５１　アベニ１ −　オブ　ジ　アメリカズ（Ｃ）市：二１−！１−り　シティ （ＤＪ州二二二−！Ｉ−り （Ｅ１国：Ｔメリ禽合衆国 （Ｆ）郵便番号：　１００２Ｇ （ｖ）コンビ１−ター読み出し形！Ｉ：（Ｂ）コンビニーター：　ＩＢＮ　ＰＣ 互換用（Ｄ）ノットウェア：パテントインリリース＃１．Ｏ、バージ嘗ン＃１． ２Ｓ（ｖｉ）現在の出願データー （＾）出願番号： （Ｂ）出願日： （Ｃ）分類： （ｖｉｉ）優先権出願データ： （Ａ）出願番号：υＳ　Ｏ１／８４フ、５６Ｉ（Ｂｌ出願日；　１９９２年３月 ２日 （ｖｉｉｉ）代理人／事務所情報： （Ｂ）登録番号：　３３．２５９ （Ｃ）照会／記録番号：　８１！８ＣＩＦ（ｉｘ）電話回線情報： （２）配列番号１の情報： （１）配列の特色： （Ａ）長さ：２０アミノ酸 （８）梨；アミノ酸 （Ｄ）トポロジー二直鎖状 （ｉｌｌ配列の種ＩＩ：ペプチド （ｖ）フラグメント盟：中間部 （ｘｌ）配列：配列番号！＝ Ｌｓｕ　Ｖａｌ　Ａａ−ｇ　！ｌ＠　Ｃ１ｙ　ＬＹ＠　Ｈｌｓ　ｊｓｒ　ＪＬｒ ｇ　Ｔｈｅ　ＪＬｒｇ　Ｔｙｒ　Ｇｌｕ　Ａｒｇ＾ｓｎ　！Pｓ １０　ｌ。

Ｇｌｕ　Ｌｙｅ　Ｋｌ＠　！＠ｒ （２）配列番号２の情報： （１）配列の特色： （＾）長さ目７アミノ酸 （Ｂ）型：アミ／ａｌ （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （１１）配列の橿１：ペプチド （ｉｌｌ）ハイポセティカル二Ｎ。

（ｘｉ）配列：配列番号２： ｔａｕ　Ｖａｌ　Ａｒｇ　１１ｍ　Ｏｌｙ　Ｌｙｓ　ＨＬｍ　ｆｉａｒ　Ａｒｇ 　Ｔｈｒ　Ｍ９　Ｔｙｒ　ＯＬｕ　ｋｇ＾ａｎ　！ｌ＠Ｉ　Ｓ　ｌｏ　１ｓ （２）配列番号３の情報： （１）配列の特色・ （＾）長さ＝１６アミノ酸 （Ｂｌ型二アミノ酸 （Ｄ）トポロジー・直鎖状 （１１）配列の種類・ペプチド （ｌｉｔ）ハイポセティカル：Ｎ。

（χ直）配列：配列番号３゜ Ｌｅｕ　Ｃｙｍ　Ａｒｇ　ＨＬｍ　Ｃ１ｙ　Ｌｙｓ　ＨＬｍ　５−ｏｒ　Ａｒｇ 　Ｔｈｅ　ＪＬｒｇ　Ｔｙｒ　ｃｌｕ　Ａｒｇ　ｋｉｎ　Ｈkｍ ｉ　Ｓ　ＸＯ１ｓ （２）配列番号４の情報二 （ｉｔ配列の特色： （Ａｌ長さ°１９アミノ酸 （Ｂ）型：アミ／＃ （Ｄ）トポロジー二直鎖状 （１１）配列の種類、ペプチド （ＩＮ）ハイポセティカル：Ｎ。

（買１）配列：配列番号４： Ｌｅｕ　Ｖａｌ　Ａｒｇ　！ｌ＠Ｃ１ｙ　Ｌｙｓ　ＨＬｍ　ｉ＠ｒ　紅ｇ　Ｔｈ ｅ　Ａｒｇ　Ｔｙｒ　Ｇｌｕ　Ａｒｇ＾−ｎ　ＨＬｍｉ　Ｓ　１０　１ｓ ａｌｕ　Ｌｙ口！ｌ・ （２）配列番号５の情報： （１）配列の特色： （Ａ）長さｌアミノ酸 （Ｂｌ型二アミノ酸 （Ｄ）トポクノー：直鎖状 （ｉ　ｉ）配列の種類：ペプチド （ｉｉｉ）ハイポセティカル：Ｎ。

（１ｘ）配列の特徴： （＾）特徴を表す記号：　Ｍｏｄｉｆｉｅｄ−ｓｌｔａ（Ｂ）存在位置：６ （Ｄ）他の情報：／注−°残基６はオルニチンである。

（ｘｌ）配列：配列番号５： Ｌｓｕ　Ｖａｌ　ｊｌｒ９　Ｘｉｓ　Ｃ１ｙ　！ａａ　Ｈｌｓ　＠＠ｒ　鳩Ｔ８ ｒ　Ａｒｇ　Ｔｙｒ　Ｏｌｕ　Ａｒｇ　Ａ＊ｌ’ｌ　Ｘ１ｅＧｌｕＬＦ自Ｘ１ｍ （２）配列番号６の情報： （Ｉ）配列の特色： （＾）長さ゛１９アミノ酸 （Ｂ）型、アミノ酸 （Ｄ）トポロノー：ｆｉｌｌ状 Ｇｌｕ　Ｌｙｓ　ＨＬｍ （２）配列番号７の情報： （ｉ）配列の特色： （Ａ）長さ＝１９アミノ酸 （Ｂｌ型二アミノ酸 （Ｄ）トポロジー、直鎖状 （１１）配列の種類：ペプチド （ｉｘ）配列の特徴： （＾）特徴を表す記号：　ＭｏｄＨｉｅｄ−ｓｉｔｅ＋Ｂｌ存在位置＝３ しｍｕ　ＶａｌＸａａ　ＩＬｓ　Ｇｌｙ　Ｌｙｅ　ＨＬｍ　ｌｌ＠ｒ　Ａｒｇ　 Ｔｈｒ　Ａｒｇ　Ｔｙｒ　Ｇｌｕ　Ａｒｇ　Ａｓｎ　！１ｍｌ　Ｓ　工ｏ　１ｓ （ｘｉ）配列、配列番号９： Ｘａａ　Ｘａａ　Ｖａｌ　Ａｒｇ　１１ｍ　Ｏｌｙ　ＬＹ＠　ＩＩＬｓ　Ｓａｔ 　Ａｒ９　テｈｒ　Ａｒ９　ＴＹｔ　ＧＬｕ　Ａｒ９　＾１■ ｌ　５　１０　１！１ （ｘｉ）配列；配列番号１１： ！ａｕ　Ｖａｌ　入１９　Ｘｉｓ　Ｏｌｙ　Ｌｙｅ　ｌｌｉ＠　ＳＡＹ　Ａｒｇ 　Ｘａａ　Ａｒ９　Ｔｙｒ　Ｇｌｕ　ｋｒｑ　Ａｓｎ　Ｘ１■ １　Ｓ　五〇　ｉｓ Ｌ・ｕＶａｌＡｒｇＸＬ＊ＧｌｙＬｙＩＩＨＬｍｍａｔ＾ｒｇ！ｈｒ＾ｔ９↑ｙ ｒ＠ＬｕＡｒｇ＾−ｎ！ｌ＠１　１　ＸＯ１％ （２）配列番号１４の情報： ＋＋１配列の特色； ｋｒｑ　ＨＬｍ　Ｇｌｙ　Ｌｙｅ　５１１ｍ　Ｓａｔ　Ａｒ９　Ｔｈｒ　ｋｔｑ 　’ｅｆｔ　Ｏｌｕ　社ｇ　ＡｌＩｎエ　５１０ Ｌｅｕ　Ｖａｔ　Ｍｇ　！ｌｅ　Ｏｌｙ　Ｌｙｓ　ｍｉｓ　ｍａｔ　ｈｘｑ−Ｖ ａｌ　ＪＬｆ’９　Ｓａｔ　Ｇｌｙ　Ｌ７＠　ＩＬｓ　Ｓａｔ　ｈｘｑ（翼Ｉ） 配列：配列番号＋７： ＬａｕＶａｌ＾ｒｇＸｌ＠０１ｙＬ、ｙｍｌｌｉｓ＄５ｒＩＩＬ−Ｔｈｒ＆ｒｇ テｙｒＧｌｕＭＬ−＾ａｒｔｚ　ｓ　１ａ　ｉｓ Ｌ＃ｕ　Ｖａｌ　ｋｅｇ　Ｈａ　Ｃ１ｙ　Ｌｙｓ　Ｈｌｓ　ｊ＠ｒ　Ａｌａ　？ ｈｒ　ｋｇ　’５ｒ　Ｇｌｕ＾１ａ＾―ｎＩ　Ｓ　１０　１Ｓ （Ｄ）トポロノー：直輪状 （ｘｌ）配列：配列番号２４ ＋８１！！！：核酸 ＡＧＧＧｋＡ（：ＡＡＡ　ＧＣＩ；ｋｋＡＧＧＡＧ　ＣＧＧＧＣＧＣＴｋＱ　Ｇ ＯＣＩ５ＣＴＧＧＣＡ　ＡＣＴＣ丁＾ＧＣｔＡ　Ｔ（Ｊ６ＧbＴＯＣＤ　４２０ ２ＴｋＭ：ＣＡＣＣＡＣＡＣｅｅ＋：Ｃ（Ｗ　国ｅ’！’？ｊＷＣＣＧα功ゴＡ ロｃ　ｃｃｅｃｃａｔｅｍ　ｅｒａα：Ａｅ　４＠ＯＣττＴＣＣＴＧＣＤ　Ｔ τｋＴｃｃｃｃＴＧ　ｋＴＴＣＴＧＴＧＧ＾　テ＾＾ｅｃａ丁＾τ丁　ＡＣＣＧ ＣＩ：τ丁Ｔｏ　＾Ｇテ０ｊ４ｅI’ＯＡ　２３４゜ ↑ｋＣＣＣｃＴ３ｃ　Ｃ１；ｃＡＯＣＣＸ２に＾　ｃｃ入ｅｅｌ：Ｎ：Ｗ　ｅ＾ ＧＣｔＬＭｉテＣ＾　σＴＯ＾ａｃり＾ａｓｈ＾ＧＯＳＧｊk＾Ｇ＾　２４ｏσ ＡＣ＾＾口Ｍ？　Ｇ＾ｅｒｅｅａ＾＾＾　＾ｅｃｃテＷテ　丁＾ＣＣＣ＾＾ｅｒ 丁　＾＾テＣりｅｃテテａＣ＾ａＣ＾Ｃ＾？ｅｌ：　４３２p （２）配列番号３Ｉの情報： （ｉ１配列の特色： （＾）長さ＝３０塩基対 （８）型：核酸 （Ｃ）鎖の数；一本鑓 （Ｄ）トポロジー二直饋状 （Ｉｌｌ配列の櫂１１ｅＤＮＡ （ｌｌｉ）”イポセチイカル：１ＩＯ （ｘｉ）配列：配列番号３１＝ ｇａｆｆ丁＾　ＣｅＯ＾丁ＡＯ；Ｃｅ　ｈｃテＣ丁丁テＧＴ丁　１０（２）配列 番号３２の情報： （１）配列の特色： （＾）長さ：３０塙基対 （Ｂｌ型：核酸 （Ｃ）鎖の数ニ一本鎖 （Ｄ）トポＣジー：直鎖状 （ＩＩ）配列の種類：　ｃＤＩＩＡ （Ｉｌｌ）ハイポセチイカル：恥 （ｘｉ）配列：配列番号コ２： （２）配列番号３３の情報： （１）配列の特色： （＾）＆さ：３０塩基対 （８）盟：核酸 （Ｃ）饋の数ニ一本鎖 （Ｄ）トポロジー二直鎖状 Ｏｌ）配列の種類：　ｅＤＮＡ （１■）ハイポセテイカル：ｋ （ｘｉ）配列：配列番号コ３： ＾＾＾Ｃ＾ＣτＣＣＣ＾テＪＩＣＣＣＣ？テ＾　ｅｅ入＾ζ＾テ＾ｅｅ　３６（ ２）配列番号３４の情報： （＋）配列の特色： （Ａ）長さ：３０塩基対 （１１型：核酸 （ＩＩ）配列の種ＩＡｃＤＮ＾ （ｉｉｉ）ハイポセティカル、恥 （買１）配列；配列番号コ４： ｕｕｕａｅｒｃｃＡＡＭαｘ１１為α１ＡＡＡＡＩＩＡＡｃ　３０（２）配列番 号３Ｓの情報： （１）配列の特色； （Ａ）長さ＝４０塩基対 （Ｂ）型：鎖酸 （Ｃａｌｌの数ニ一本鎖 （Ｄ）　）　ｚロジー二１１１Ｉ状 （１１）配列の種＠　：　ｃＤ！ＩＡ （ｉｌｌ）ハイポセティカルニ恥 （ｘｉ）配列：配列番号３ｓ： ＩＣＴＮ１３ゴ！＆ＧＡ茸１１１国ｎＡＡＭＭｆｆｉ　４０（２）配列番号３６ の情報： （ｉ）配列の特色： （＾）長さ；５９塩基対 （ｅｌｇｌ：核酸 （Ｃ１鎖の数ニ一本鎖 （Ｄ）トポロジー二直鎖状 （ｉｉ）配列の種類：　、ｃＤ、、Ａ （■１）ハイボセティカル：１１０ （２）配列番号３１の情報： （ｉ）配列の特色： （＾）長さ：２０アミノ酸 （Ｂｌ型二アミノ酸 （Ｄ）トポクジー：直鎖状 ｌ配列の橿ｍ：ペプチド （ｉｉｌ）ハイポセテイカル：Ｉｌ。

（ｘｉ）配列：配列番号コｌ： ＾−ｎ　Ｊｎｐ　Ｌ）ｎ　テｙｒ　Ｃ１ｕ　Ｐｒｏ　Ｐｈ・　テｒｐ　ａｌｕ　 ＾−ｐ　（ｌｕ　Ｏｌｕ　Ｌｙ−＾ａｎ　（：ｌｕ　ｍ＠ｒＩ　Ｓ　１０　ｉ％ ＦＩＧＵＲＥ　２ ￥１τ　％ ＦＩＧＵＲＥ　４ ＦＩＧＵＲＥ５ ＬＶＲＩＧＫＨ５ＲＴＲＹＥＲＮＩＥＫＩ置１そアミノｔ〔 ＦＩＧＵＲＥ６ ［アシタゴ°ニスＨ（μ〜Ｄ ＦＩＧＵＲＥ７ ＡＣＴにＡＴＴＡＡＧＣＡＴＴＧＧＴＡＡＣＴＧＴＣＡＧＡＣＣＡＡＧＴ！ＴＡ ＣＴＣＡＴＡＴＡＴＡＣＴｒＴＡＧＡＴＴＧＡＴＴＴ　１５O０ ＦＩＧＵＲＥ　７　（耗シ） ＧＡＡＧＧＡＣＧＴＧＧＧＧＣＣＧＣＡＧＡＡＡＣＴＧＴｒＧＡＡＡＧＴｒＧＴ ＣＴにＧＣＡＡＡＡＣＣＴＣＡＴＡＣＡＧＡＡＡＡＴ　１０U０ ＦＩＧＵＲＥ　７（資）り ＧＣＣＣＡにＣＣＴＧＡＡＴＧＧＣＣ入ＡＴＧＧＧ　４４０３ＦＩＧＵＲＥ８ フナーシ゛’＜４ｔＸＯＪＡ＞ 補正書の写しく翻訳文）提出書く特許法第１８４条の８）

Claims (27)

【特許請求の範囲】
1. １．以下の式を含むトロンビンレセプターアンタゴニストＹ−Ａ１−Ｗ−Ｘ１− Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４−Ａ２−Ｚ；ここで、Ｙは水素、同一かまたは異なるかのいず れかの１個〜１０個のアミノ酸を有するペプチド、あるいは１個〜３０個の骨格 原子を含有するアシル鎖またはアルキル鎖であり；同一かまたは異なるかのいず れかのＡ１およびＡ２のそれぞれが、正の電荷を有するアミノ酸、および、１個 〜１０個の骨格原子および正の電荷を有する側基を含有するアシル鎖またはアル キル鎖からなる群より選択され； Ｗおよび各Ｘは、同一かまたは異なるかのいずれかの任意のアミノ酸であり；そ して Ｚは、ＯＨ、同一かまたは異なるかのいずれかの１個〜１１個のアミノ酸を有す るペプチド、あるいは１個〜３３個の骨格原子を含有するアシル鎖またはアルキ ル鎖であり；ただし、Ｗ、Ｘ１、およびＸ２の少なくとも１つは、塩基性アミノ 酸ではなく；そしてここで、 該アンタゴニストは、必要に応じてＹとＺとの間の共有結合により環状化される 。
2. ２．Ｙが、式Ｙ１−Ｂｎ−Ｃｍを有する、請求項２に記載のトロンビンレセプタ ーアンタゴニストであって、ここで、Ｙ１は水素、同一かまたは異なるかのいず れかの１個〜６個のアミノ酸を有するペプチド、あるいは１個〜１８個の骨格原 子を含有するアシル鎖またはアルキル鎖であり；Ｂは、疎水性アミノ酸であり； Ｃは、同一かまたは異なるかのいずれかの酸性アミノ酸であり； ｎは、０または１であり；そして ｍは、１〜３の整数である、 トロンビンレセプターアンタゴニスト。
3. ３．Ｂが、存在するならば、Ａｓｐであり；そしてＣｍが、Ｖａｌ、Ｌｅｕ−Ｖ ａｌ、Ｖａｌ−Ｖａｌ、Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ、Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｖａｌ、Ｉ ｌｅ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ、およびＩｌｅ−Ｖａｌ−Ｖａｌから選択される、請求項 ２に記載のトロンビンインヒビター。
4. ４．Ａ１がＡｒｇである、請求項１に記載のトロンビンレセプターアンタゴニス ト。
5. ５．Ａ２がＡｒｇである、請求項１に記載のトロンピンレセプターアンタゴニス ト。
6. ６．Ｗが、Ｉｌｅ、Ｄ−Ｃｙｓ、またはＡｌａである、請求項１に記載のトロン ビンレセプターアンタゴニスト。
7. ７．ＷがＤ−Ｃｙｓである、請求項６に記載のトロンビンレセプターアンタゴニ スト。
8. ８．Ｘ２がアニオン性アミノ酸である、請求項１に記載のトロンビンレセプター アンタゴニスト。
9. ９．Ｘ３がＨｉｓである、請求項１に記載のトロンビンレセプターアンタゴニス ト。
10. １０．Ｘ４がＳｅｒである、請求項２に記載のトロンビンレセプターアンタゴニ スト。
11. １１．Ｃｍが、Ｌｅｕ−Ｖａｌであり；Ａｌが、Ａｒｇであり； Ｗが、Ｄ−Ｃｙｓであり； Ｘ２が、ＬｙｓまたはＯｒｎであり； Ｘ３が、Ｈｉｓであり； Ｘ４が、Ｓｅｒであり；そして Ａ２が、Ａｒｇである、 請求項３に記載のトロンビンレセプターアンタゴニスト。
12. １２．以下の式を有するトロンビンレセプターアンタゴニスト 【配列があります】
13. １３．以下の式を有するトロンビンレセプターアンタゴニスト： 【配列があります】
14. １４．以下の式（配列番号４）からなる、請求項２に記載のトロンビンレセプタ ーアンタゴニスト：【配列があります】
15. １５．以下の式を有するトロンビンレセプターアンタゴニスト： 【配列があります】
16. １６．以下の式を有するトロンビンレセプターアンタゴニスト： 【配列があります】
17. １７．以下の式を有するトロンビンレセプターアンタゴニスト： 【配列があります】
18. １８．請求項１に記載のトロンビンレセプターアンタゴニストの薬学的に有効な 量と薬学的に受容し得るキャリアとを含有する、トロンビンレセプター介在プロ セスを阻害するための組成物。
19. １９．患者を請求項１８に記載の組成物で治療する工程を包含する、該患者のト ロンビン誘発血小板活性化を阻害するための方法。
20. ２０．前記患者に請求項１８に記載の組成物を投与する工程を包含する、該患者 のトロンビン誘発平滑筋細飽増殖を阻害するための方法。
21. ２１．請求項２０に記載の方法であって、ここで、前記組成物が、前記患者に挿 入さ札るデバイスを介して該患者に投与され、ここで、該デバイスの一部分が該 組成物を通過し得る間隙手段により特徴づけられる、方法。
22. ２２．前記デバイスが、滲出性バルーンカテーテルである、請求項２１に記載の 方法。
23. ２３．前記患者に請求項１８に記載の組成物を投与する工程を包含する、該患者 の神経変性疾患を治療または予防するための方法。
24. ２４．前記患者に請求項１８に記載の組成物を投与する工程を包含する、該患者 の骨吸収を治療または予防するための方法。
25. ２５．前記患者が、骨粗しょう症に罹患している、請求項２４に記載の方法。
26. ２６．前記患者のトロンビン誘発炎症を治療または予防するための方法であって 、該患者に請求項１８に記載の粗成物を投与する工程を包含する、方法。
27. ２７．前記炎症が、成人呼吸促進症候群、敗血症性ショック、敗血症、および再 灌流損傷からなる群より選択される疾患によって引き起こされる、請求項２６に 記載の方法。