JPH07224100A - 新規トロンボモジュリン類 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【構成】 シアル酸を実質的に含まないトロンボモジュ
リン類、トロンボモジュリンにシアリダーゼ又は希酸を
作用させる該トロンボモジュリン類の製造法、及び該ト
ロンボモジュリン類を含有する抗血液凝固剤。 【効果】 従来のトロンボモジュリンに比べ血中の半減
期が著しく短くなるため、人工透析の際に用いる抗凝固
剤の有効成分として有用である。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、天然のトロンボモジュ
リンとは異った糖鎖構造を有するトロンボモジュリン
類、この製造法及びこれを含有する医薬に関する。

【０００２】

【従来の技術】血液凝固系の中で、蛋白分解酵素として
のトロンビンの果たす役割については種々の研究が行わ
れ、凝固系のメカニズムに関してはほぼ解明されてい
る。

【０００３】生体内において、抗凝固系及び線溶系に作
用するといわれているプロテインＣをトロンビンが活性
化すること、並びにその機構に補酵素的に働く因子がウ
サギ肺組織抽出物中に存在することが報告されており、
この因子はトロンボモジュリンと命名されている〔Ｎ．
Ｌ．Ｅｓｍｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅ
ｍ．，２５７，（２），８５９−８６４（１９８
２）〕。青木らは、ヒト胎盤より分離した同様な性質を
有する分子量約７１，０００（非還元状態）のヒト・ト
ロンボモジュリンを報告している〔Ｔｈｒｏｍｂ．Ｒｅ
ｓ．，３７，３５３−３６４（１９８５）〕。また、
Ｈ．Ｉｓｈｉｉらはヒト血漿中及び尿中にトロンボモジ
ュリンと同じ活性を有する物質が存在すること、そして
血漿中の当該物質の分子量が約６３，０００と約５４，
０００であることを報告している〔Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎ
ｖｅｓｔ．，７６，２１７８−２１８１（１９８
５）〕。尿由来のトロンボモジュリンについてはその
後、分子量約３９，０００及び約３１，０００のもの
（特開昭６３−１４６８９８号公報）、分子量約５６，
０００及び約６３，０００のもの（特開平３−８６９０
０号公報）、分子量約７２，０００及び約７９，０００
のもの：ＵＴＭ（特開平３−２１８３９９号公報）、な
どが報告されている。

【０００４】一方、Ｋ．Ｓｕｚｕｋｉらは遺伝子工学の
手法を用いてヒト肺ｃＤＮＡライブラリーから、シグナ
ルペプチドを含むヒトトロンボモジュリン前駆体の遺伝
子をクローニングし、トロンボモジュリンの全遺伝子構
造を解明し、５５７残基のアミノ酸配列を明らかにした
〔ＥＭＢＯ Ｊ．６，１８９１−１８９７（１９８
７）、配列番号１参照〕。その後、アミノ酸の数が異な
る各種のヒト・トロンボモジュリンが遺伝子操作によっ
て製造され、報告されている〔ＷＯ ８８／５０５３
（全長のヒト・トロンボモジュリン、Ｎ末端のＡｌａか
ら４９８番目のＧｌｙまでなど）、特開昭６３−３０１
７９１号（シグナルペプチドを含む全長のヒト・トロン
ボモジュリン）、ＷＯ ８８／０９８１１（３０７番目
のＡｓｐから４９７番目のＳｅｒまで、３０７番目のＡ
ｓｐから４６９番目のＧｌｙまで）、ＷＯ ９０／１０
０８１（２１６番目のＨｉｓから４６８番目のＡｓｐま
で、２１６番目のＨｉｓから４６４番目のＳｅｒまでな
ど）、特開平２−２５５６９９号（３６５番目のＧｌｎ
から４６２番目のＣｙｓまで）、特開平３−２５９０８
４号（Ｎ末端のＡｌａから４６８番目のＡｓｐまで：ｒ
−ＵＴＭ）、ＷＯ ９２／３２５（Ｎ末端付近から４４
７番目のＩｌｅ付近まで）等参照〕。

【０００５】また、遺伝子操作によってトロンボモジュ
リンを製造すると、グリコサミノグリカンで修飾された
トロンボモジュリンが同時に生成され、このものはアン
チトロンビンIII 活性増強作用を示すことが報告されて
いる〔ＥＰ４１２８４１（Ｎ末端のＡｌａから４９７番
目のＳｅｒまで）、ＷＯ ９１／４２７６（Ｎ末端のＡ
ｌａから４９８番目のＧｌｙまでなど）、ＷＯ ９１／
５８０３（Ｎ末端のＡｌａから４９１番目のＡｌａま
で）等参照〕。

【０００６】更に、本出願人は上記のｒ−ＵＴＭをコー
ドするＤＮＡ断片の３′−末端に特定のＤＮＡ断片を組
み込んだ組換えベクターを用いて宿主細胞を形質転換
し、当該ＤＮＡを発現することによりアンチトロンビン
III 活性増強作用及び血小板凝集抑制作用を有するトロ
ンボモジュリン（ｒ−ＧＡＧ−ＵＴＭ）が得られること
を見いだし特許出願した（ＥＰ公開４８８３１７）。

【０００７】更にまた、糖蛋白質であるトロンボモジュ
リンの蛋白構造は既に解明されている。すなわち、トロ
ンボモジュリンの分子は５つの領域、つまり１〜２４４
番目のＮ末端領域、２４５〜４８０番目のＥＧＦ様ドメ
インに富む領域、４８１〜５１４番目のＯ型糖鎖を有す
る領域、５１５〜５３７番目の膜通過領域及び残りの３
８残基よりなる細胞質領域から構成されている。トロン
ボモジュリンの糖構造のうちには、グリコサミノグリカ
ンが存在する場合、この糖鎖によって活性が増強される
ことが知られている。しかしながら、その他の糖鎖につ
いてはその詳細及び機能等について報告がない。

【０００８】

【発明が解決しようとする課題】一方、医薬品を疾病の
治療に使用する際、投与された医薬品の血中濃度が有効
濃度に達し、完治後は速やかに代謝されることは極めて
重要である。特に人工透析における抗血液凝固剤として
トロンボモジュリンを使用する場合には、透析中は有効
濃度を保ち、透析後は速やかに血中から消失することが
望ましい。しかしながら、従来のトロンボモジュリン類
は比較的血中半減期が長く、ＤＩＣ等の治療に使用する
場合には適しているが、人工透析の際に抗血液凝固剤と
して使用するためには、更に血中半減期の短いトロンボ
モジュリンが望まれていた。従って、本発明の目的は、
血中半減期が短く抗血液凝固活性を保持したトロンボモ
ジュリン誘導体を提供することにある。

【０００９】

【課題を解決するための手段】斯かる実情に鑑み、トロ
ンボモジュリンのグリコサミノグリカン以外の糖鎖の機
能等について鋭意研究を行ったところ、トロンボモジュ
リンにシアリダーゼを作用させ、その糖鎖からシアル酸
を除去したトロンボモジュリン類が、血中半減期が短
く、抗血液凝固活性を保持していることを見出し本発明
を完成した。

【００１０】すなわち本発明は、シアル酸を実質的に含
まないトロンボモジュリン類の第一の発明；トロンボモ
ジュリンにシアリダーゼを作用させることを特徴とする
該トロンボモジュリン類の製造法の第二の発明；及びこ
れを有効成分とする抗血液凝固剤又は血小板凝集抑制剤
の第三の発明を提供するものである。

【００１１】本発明のトロンボモジュリン類は、シアル
酸を実質的に含まないものであるが、その含量は０．５
μｇ／mg以下であるのが好ましい。

【００１２】本発明のトロンボモジュリン類は、シアル
酸を含む糖鎖を有するトロンボモジュリン、例えばヒト
組織から抽出したトロンボモジュリン、ヒト尿から抽出
したトロンボモジュリン又は遺伝子組換えによって得ら
れたトロンボモジュリンにシアリダーゼを作用させるこ
とにより製造される。

【００１３】ここで原料トロンボモジュリンのうち、ヒ
ト組織から抽出したトロンボモジュリンとしてはヒト胎
盤、ヒト肺等から抽出したものが挙げられる。また、遺
伝子組換えによって得られたトロンボモジュリンとして
は、Ｎ末端のＡｌａより４６８番目のＡｓｐまで、Ｎ末
端のＡｌａより４９１番目のＡｌａまで、Ｎ末端のＡｌ
ａより４９７番目のＳｅｒまで又はＮ末端のＡｌａより
４９８番目のＧｌｙまでのアミノ酸配列を含むもの、及
び図１に示すアミノ酸配列を有するものが挙げられる。
このうち、図１に示すアミノ酸配列を有するトロンボモ
ジュリンはヨーロッパ公開第４８８３１７号公報記載の
ものであり、その具体例としては配列番号２及び配列番
号３のアミノ酸配列を有するものが挙げられるが、更に
配列番号２、すなわちＮ末端のＡｌａより４６８番目の
Ａｓｐまでを含むトロンボモジュリンのＣ末端にＧｌｕ
−Ａｓｐ−Ｔｙｒ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−
Ｇｌｕが結合したアミノ酸配列を有するものが特に好ま
しい。

【００１４】ここで用いるシアリダーゼはシアル酸と他
の糖鎖を分解する酵素であり、これには、ウイルスや細
菌、例えばビブリオコレラ（Ｖｉｂｒｉｏ ｃｈｏｌｅ
ｒａｅ）、クロストリディウム・パフリンジェンス（Ｃ
ｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｐｅｆｒｉｎｇｅｎｓ）、連鎖
球菌等を由来とするシアリダーゼ、動物臓器例えば、ラ
ット肝臓、ブタ肝臓、ヒト胎盤、ブタ顎下線等を由来と
するシアリダーゼなどが挙げられるが、ノイラミニダー
ゼとして市販されているものが好ましい。

【００１５】上記、トロンボモジュリンとシアリダーゼ
を溶媒中で、６０℃以下、好ましくは２０〜５０℃で１
〜５０時間反応させれば、本発明のトロンボモジュリン
類が得られる。ここで用いる溶媒としては、pH３〜１０
特に、pH６〜８の緩衝液が好ましく、具体的にはこの範
囲のトリス緩衝液が例示される。

【００１６】得られた反応液から本発明のトロンボモジ
ュリン類を単離、精製する方法としては、特に限定され
ないが、例えば反応液を種々のカラムクロマトグラフィ
ーに付すことによって行うことが好ましい。カラムクロ
マトグラフィーとしてはイオン交換クロマトグラフィ
ー、アフィニティークロマトグラフィー（例えば特開平
１−４５３９８号公報記載のモノクローナル抗体を使
用）、ゲルフィルトレイションクロマトグラフィーなど
を単独又は組み合わせて用いることができる。

【００１７】このようにして得られた本発明のトロンボ
モジュリン類にはシアル酸が実質的に含まれていない。
通常糖蛋白質中の糖鎖構造におけるシアル酸は非還元末
端に結合しているものであることから、本発明トロンボ
モジュリン類においても糖鎖の非還元末端のシアル酸が
除去されているものと推定される。

【００１８】また、本発明のトロンボモジュリン類は、
原料として用いたトロンボモジュリンと同様の抗血液凝
固作用、血小板凝集抑制作用及びアンチトロンビンIII
増強作用を有し、血中半減期が短縮されている。従っ
て、抗血液凝固活性をコントロールすることが望まれる
疾患の予防及び治療において、抗血液凝固剤、血小板凝
固抑制剤として有用である。

【００１９】本発明のトロンボモジュリン類を上記薬剤
の有効成分として使用する場合の剤型としては、例えば
注射剤が挙げられる。注射剤としては、凍結乾燥粉末を
用時、注射用蒸留水、生理食塩水などに溶解して投与す
る形態が好ましい。投与部位としては、静脈内が好まし
い。投与量は患者の体重、透析時間などにより異なる
が、通常１０μｇ〜１０mg／回であることが好ましい。
なお、本発明のトロンボモジュリン類は、上記投与量の
範囲においては全く異常が認められず安全である。

【００２０】

【実施例】次に実施例を挙げて本発明を説明するが、本
発明はこれに何ら制限されるものではない。

【００２１】実施例１ ＧＡＧ−ＵＴＭ（配列番号２記載のアミノ酸配列を有す
るＥＰ公開４８８３１７号公報記載のｒ−ＧＡＧ−ＵＴ
Ｍ１）を０．１Ｍ ＮａＣｌを含む２０mM トリス緩衝
液（pH７．４）で５００μｇ／mlに調整した。この溶液
２mlに連鎖球菌由来のシアリダーゼ〔ノイラミニダー
ゼ，生化学工業社製〕０．２単位を加え、３７℃で１６
時間反応した。反応液の全量をモノクローナル抗体Ａ−
７３（特開平１−４５３９８号公報）を結合させたセフ
ァロース４Ｂ（２mg ＩｇＣ／ml樹脂）１mlに吸着させ
た。カラムを１Ｍ ＮａＣｌを含む２０mM トリス緩衝
液（pH７．４）２０mlで洗浄したのち、２Ｍチオシアン
酸ナトリウム、５mM ＥＤＴＡ及び０．１Ｍ ＮａＣｌ
を含む２０mM トリス緩衝液（pH７．４）５mlで溶出し
た。溶出液を０．１ＭＮａＣｌを含む２０mM トリス緩
衝液（pH７．４）で透析し、７５０μｇの目的物を得
た。

【００２２】実施例２ ｒ−ＵＴＭ（Ｎ末端のＡｌａより４６８番目のＡｓｐま
でのアミノ酸配列を有する遺伝子組換えによって得られ
るトロンボモジュリン，特開平３−２５９０８４号公報
記載）及びＧＡＧ−ＵＴＭ５（Ｎ末端のＡｌａより４９
７番目のＳｅｒまでのアミノ酸配列を有する、遺伝子組
換えによって得られるトロンボモジュリン）を用いて実
施例１と同様に反応及び処理し、それぞれ７７０μｇ及
び７２０μｇの目的物を得た。

【００２３】試験例１ トロンボモジュリンに含まれるシアル酸量の測定：原料
のトロンボモジュリン及び実施例１、２又は３で得られ
た本発明のトロンボモジュリン類を５０mM ＨＣｌ中８
０℃で１時間加熱してシアル酸を遊離させた。次いでシ
アル酸測定キット（宝酒造社製）を用い、ＤＭＢ（１，
２−ジアミノ−４，５−メチレンジオキシベンゼン）法
〔Ｈａｒａ，Ｓ．ｅｔ ａｌ．Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅ
ｍ．１７９，１６２−１６６（１９８９）〕でシアル酸
の分析を行い、結果を表１に示した。

【００２４】

【表１】

【００２５】試験例２ 血中半減期の測定 ラット（Ｗｉｓｔａｒ系、雄）に麻酔下、右大腿静脈内
にカテーテルを挿入し、被験薬物（原料のトロンボモジ
ュリン及び本発明トロンボモジュリン類を０．１５Ｍの
食塩を含むリン酸緩衝液に溶解し、１mg／mlとした）１
mg／ml／kgをこのカテーテルより急速投与した。薬物投
与前及び投与後２，５，１０，２０，３０，６０，９
０，１２０分に各０．１ml採血し、ヘパリンと混和後血
漿を分取して血中濃度測定用に供した。

【００２６】血中濃度はモノクローナル抗体を用いたサ
ンドイッチＥＬＩＳＡ法にて行った。その結果、いずれ
のトロンボモジュリンもシアリダーゼ処理前はＴｗｏ−
ｃｏｍｐｅｒｔｍｅｎｔ ｍｏｄｅｌで、シアリダーゼ
処理後はＯｎｅ−ｃｏｍｐｅｒｔｍｅｎｔ ｍｏｄｅｌ
で解析可能であった。結果を図２〜４及び表２に示す。

【００２７】

【表２】

【００２８】以上の結果よりシアリダーゼ処理によって
得られた本発明トロンボモジュリン類は血中半減期が有
為に短縮されたことが認められた。

【００２９】試験例３ ヒト・フィブリノーゲン（２mg／ml）１００μｌをあら
かじめ３７℃で２分間保温した後、各トロンボモジュリ
ン（原料及び本発明トロンボモジュリン類）５０μｌを
加えて３７℃で１分間保温した。反応液にヒト・トロン
ビン（４Ｕ／ml）５０μｌを加え、凝固時間を測定し
た。抗血液凝固活性の結果を図５〜７に示す。以上の結
果より、シアリダーゼ処理によって得られた本発明トロ
ンボモジュリン類は、処理前のトロンボモジュリンと同
様な抗血液凝固活性を示すことが認められた。

【００３０】

【発明の効果】以上のように、本発明のトロンボモジュ
リン類は従来のトロンボモジュリンに比較して血中半減
期が著しく短くなるが、抗血液凝固活性を保持している
ので、例えば人工透析の際に用いる抗血液凝固剤の有効
成分として有用である。

【００３１】

【配列表】配列番号：１ 配列の長さ：557 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：タンパク質 配列 Ala Pro Ala Glu Pro Gln Pro Gly Gly Ser Gln Cys Val Glu His Asp 5 10 15 Cys Phe Ala Leu Tyr Pro Gly Pro Ala Thr Phe Leu Asn Ala Ser Gln 20 25 30 Ile Cys Asp Gly Leu Arg Gly His Leu Met Thr Val Arg Ser Ser Val 35 40 45 Ala Ala Asp Val Ile Ser Leu Leu Leu Asn Gly Asp Gly Gly Val Gly 50 55 60 Arg Arg Arg Leu Trp Ile Gly Leu Gln Leu Pro Pro Gly Cys Gly Asp 65 70 75 80 Pro Lys Arg Leu Gly Pro Leu Arg Gly Phe Gln Trp Val Thr Gly Asp 85 90 95 Asn Asn Thr Ser Tyr Ser Arg Trp Ala Arg Leu Asp Leu Asn Gly Ala 100 105 110 Pro Leu Cys Gly Pro Leu Cys Val Ala Val Ser Ala Ala Glu Ala Thr 115 120 125 Val Pro Ser Glu Pro Ile Trp Glu Glu Gln Gln Cys Glu Val Lys Ala 130 135 140 Asp Gly Phe Leu Cys Glu Phe His Phe Pro Ala Thr Cys Arg Pro Leu 145 150 155 160 Ala Val Glu Pro Gly Ala Ala Ala Ala Ala Val Ser Ile Thr Tyr Gly 165 170 175 Thr Pro Phe Ala Ala Arg Gly Ala Asp Phe Gln Ala Leu Pro Val Gly 180 185 190 Ser Ser Ala Ala Val Ala Pro Leu Gly Leu Gln Leu Met Cys Thr Ala 195 200 205 Pro Pro Gly Ala Val Gln Gly His Trp Ala Arg Glu Ala Pro Gly Ala 210 215 220 Trp Asp Cys Ser Val Glu Asn Gly Gly Cys Glu His Ala Cys Asn Ala 225 230 235 240 Ile Pro Gly Ala Pro Arg Cys Gln Cys Pro Ala Gly Ala Ala Leu Gln 245 250 255 Ala Asp Gly Arg Ser Cys Thr Ala Ser Ala Thr Gln Ser Cys Asn Asp 260 265 270 Leu Cys Glu His Phe Cys Val Pro Asn Pro Asp Gln Pro Gly Ser Tyr 275 280 285 Ser Cys Met Cys Glu Thr Gly Tyr Arg Leu Ala Ala Asp Gln His Arg 290 295 300 Cys Glu Asp Val Asp Asp Cys Ile Leu Glu Pro Ser Pro Cys Pro Gln 305 310 315 320 Arg Cys Val Asn Thr Gln Gly Gly Phe Glu Cys His Cys Tyr Pro Asn 325 330 335 Tyr Asp Leu Val Asp Gly Glu Cys Val Glu Pro Val Asp Pro Cys Phe 340 345 350 Arg Ala Asn Cys Glu Tyr Gln Cys Gln Pro Leu Asn Gln Thr Ser Tyr 355 360 365 Leu Cys Val Cys Ala Glu Gly Phe Ala Pro Ile Pro His Glu Pro His 370 375 380 Arg Cys Gln Met Phe Cys Asn Gln Thr Ala Cys Pro Ala Asp Cys Asp 385 390 395 400 Pro Asn Thr Gln Ala Ser Cys Glu Cys Pro Glu Gly Tyr Ile Leu Asp 405 410 415 Asp Gly Phe Ile Cys Thr Asp Ile Asp Glu Cys Glu Asn Gly Gly Phe 420 425 430 Cys Ser Gly Val Cys His Asn Leu Pro Gly Thr Phe Glu Cys Ile Cys 435 440 445 Gly Pro Asp Ser Ala Leu Val Arg His Ile Gly Thr Asp Cys Asp Ser 450 455 460 Gly Lys Val Asp Gly Gly Asp Ser Gly Ser Gly Glu Pro Pro Pro Ser 465 470 475 480 Pro Thr Pro Gly Ser Thr Leu Thr Pro Pro Ala Val Gly Leu Val His 485 490 495 Ser Gly Leu Leu Ile Gly Ile Ser Ile Ala Ser Leu Cys Leu Val Val 500 505 510 Ala Leu Leu Ala Leu Leu Cys His Leu Arg Lys Lys Gln Gly Ala Ala 515 520 525 Arg Ala Lys Met Glu Try Lys Cys Ala Ala Pro Ser Lys Glu Val Val 530 535 540 Leu Gln His Val Arg Thr Glu Arg Thr Pro Gln Arg Leu 545 550 555

【００３２】配列番号：２ 配列の長さ：476 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：タンパク質 配列 Ala Pro Ala Glu Pro Gln Pro Gly Gly Ser Gln Cys Val Glu His Asp 5 10 15 Cys Phe Ala Leu Tyr Pro Gly Pro Ala Thr Phe Leu Asn Ala Ser Gln 20 25 30 Ile Cys Asp Gly Leu Arg Gly His Leu Met Thr Val Arg Ser Ser Val 35 40 45 Ala Ala Asp Val Ile Ser Leu Leu Leu Asn Gly Asp Gly Gly Val Gly 50 55 60 Arg Arg Arg Leu Trp Ile Gly Leu Gln Leu Pro Pro Gly Cys Gly Asp 65 70 75 80 Pro Lys Arg Leu Gly Pro Leu Arg Gly Phe Gln Trp Val Thr Gly Asp 85 90 95 Asn Asn Thr Ser Tyr Ser Arg Trp Ala Arg Leu Asp Leu Asn Gly Ala 100 105 110 Pro Leu Cys Gly Pro Leu Cys Val Ala Val Ser Ala Ala Glu Ala Thr 115 120 125 Val Pro Ser Glu Pro Ile Trp Glu Glu Gln Gln Cys Glu Val Lys Ala 130 135 140 Asp Gly Phe Leu Cys Glu Phe His Phe Pro Ala Thr Cys Arg Pro Leu 145 150 155 160 Ala Val Glu Pro Gly Ala Ala Ala Ala Ala Val Ser Ile Thr Tyr Gly 165 170 175 Thr Pro Phe Ala Ala Arg Gly Ala Asp Phe Gln Ala Leu Pro Val Gly 180 185 190 Ser Ser Ala Ala Val Ala Pro Leu Gly Leu Gln Leu Met Cys Thr Ala 195 200 205 Pro Pro Gly Ala Val Gln Gly His Trp Ala Arg Glu Ala Pro Gly Ala 210 215 220 Trp Asp Cys Ser Val Glu Asn Gly Gly Cys Glu His Ala Cys Asn Ala 225 230 235 240 Ile Pro Gly Ala Pro Arg Cys Gln Cys Pro Ala Gly Ala Ala Leu Gln 245 250 255 Ala Asp Gly Arg Ser Cys Thr Ala Ser Ala Thr Gln Ser Cys Asn Asp 260 265 270 Leu Cys Glu His Phe Cys Val Pro Asn Pro Asp Gln Pro Gly Ser Tyr 275 280 285 Ser Cys Met Cys Glu Thr Gly Tyr Arg Leu Ala Ala Asp Gln His Arg 290 295 300 Cys Glu Asp Val Asp Asp Cys Ile Leu Glu Pro Ser Pro Cys Pro Gln 305 310 315 320 Arg Cys Val Asn Thr Gln Gly Gly Phe Glu Cys His Cys Tyr Pro Asn 325 330 335 Tyr Asp Leu Val Asp Gly Glu Cys Val Glu Pro Val Asp Pro Cys Phe 340 345 350 Arg Ala Asn Cys Glu Tyr Gln Cys Gln Pro Leu Asn Gln Thr Ser Tyr 355 360 365 Leu Cys Val Cys Ala Glu Gly Phe Ala Pro Ile Pro His Glu Pro His 370 375 380 Arg Cys Gln Met Phe Cys Asn Gln Thr Ala Cys Pro Ala Asp Cys Asp 385 390 395 400 Pro Asn Thr Gln Ala Ser Cys Glu Cys Pro Glu Gly Tyr Ile Leu Asp 405 410 415 Asp Gly Phe Ile Cys Thr Asp Ile Asp Glu Cys Glu Asn Gly Gly Phe 420 425 430 Cys Ser Gly Val Cys His Asn Leu Pro Gly Thr Phe Glu Cys Ile Cys 435 440 445 Gly Pro Asp Ser Ala Leu Val Arg His Ile Gly Thr Asp Cys Asp Ser 450 455 460 Gly Lys Val Asp Glu Asp Tyr Ser Gly Ser Gly Glu 465 470 475

【００３３】配列番号：３ 配列の長さ：476 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：タンパク質 配列 Ala Pro Ala Glu Pro Gln Pro Gly Gly Ser Gln Cys Val Glu His Asp 5 10 15 Cys Phe Ala Leu Tyr Pro Gly Pro Ala Thr Phe Leu Asn Ala Ser Gln 20 25 30 Ile Cys Asp Gly Leu Arg Gly His Leu Met Thr Val Arg Ser Ser Val 35 40 45 Ala Ala Asp Val Ile Ser Leu Leu Leu Asn Gly Asp Gly Gly Val Gly 50 55 60 Arg Arg Arg Leu Trp Ile Gly Leu Gln Leu Pro Pro Gly Cys Gly Asp 65 70 75 80 Pro Lys Arg Leu Gly Pro Leu Arg Gly Phe Gln Trp Val Thr Gly Asp 85 90 95 Asn Asn Thr Ser Tyr Ser Arg Trp Ala Arg Leu Asp Leu Asn Gly Ala 100 105 110 Pro Leu Cys Gly Pro Leu Cys Val Ala Val Ser Ala Ala Glu Ala Thr 115 120 125 Val Pro Ser Glu Pro Ile Trp Glu Glu Gln Gln Cys Glu Val Lys Ala 130 135 140 Asp Gly Phe Leu Cys Glu Phe His Phe Pro Ala Thr Cys Arg Pro Leu 145 150 155 160 Ala Val Glu Pro Gly Ala Ala Ala Ala Ala Val Ser Ile Thr Tyr Gly 165 170 175 Thr Pro Phe Ala Ala Arg Gly Ala Asp Phe Gln Ala Leu Pro Val Gly Ser Ser Ala Ala Val Ala Pro Leu Gly Leu Gln Leu Met Cys Thr Ala 195 200 205 Pro Pro Gly Ala Val Gln Gly His Trp Ala Arg Glu Ala Pro Gly Ala 210 215 220 Trp Asp Cys Ser Val Glu Asn Gly Gly Cys Glu His Ala Cys Asn Ala 225 230 235 240 Ile Pro Gly Ala Pro Arg Cys Gln Cys Pro Ala Gly Ala Ala Leu Gln 245 250 255 Ala Asp Gly Arg Ser Cys Thr Ala Ser Ala Thr Gln Ser Cys Asn Asp 260 265 270 Leu Cys Glu His Phe Cys Val Pro Asn Pro Asp Gln Pro Gly Ser Tyr 275 280 285 Ser Cys Met Cys Glu Thr Gly Tyr Arg Leu Ala Ala Asp Gln His Arg 290 295 300 Cys Glu Asp Val Asp Asp Cys Ile Leu Glu Pro Ser Pro Cys Pro Gln 305 310 315 320 Arg Cys Val Asn Thr Gln Gly Gly Phe Glu Cys His Cys Tyr Pro Asn 325 330 335 Tyr Asp Leu Val Asp Gly Glu Cys Val Glu Pro Val Asp Pro Cys Phe 340 345 350 Arg Ala Asn Cys Glu Tyr Gln Cys Gln Pro Leu Asn Gln Thr Ser Tyr 355 360 365 Leu Cys Val Cys Ala Glu Gly Phe Ala Pro Ile Pro His Glu Pro His 370 375 380 Arg Cys Gln Met Phe Cys Asn Gln Thr Ala Cys Pro Ala Asp Cys Asp 385 390 395 400 Pro Asn Thr Gln Ala Ser Cys Glu Cys Pro Glu Gly Tyr Ile Leu Asp 405 410 415 Asp Gly Phe Ile Cys Thr Asp Ile Asp Glu Cys Glu Asn Gly Gly Phe 420 425 430 Cys Ser Gly Val Cys His Asn Leu Pro Gly Thr Phe Glu Cys Ile Cys 435 440 445 Gly Pro Asp Ser Ala Leu Val Arg His Ile Gly Thr Asp Cys Asp Ser 450 455 460 Gly Lys Val Asp Asp Glu Ala Ser Gly Ser Gly Asp 465 470 475

【図面の簡単な説明】

【図１】原料トロンボモジュリンの１例のアミノ酸配列
を示す図面である。

【図２】ＧＡＧ−ＵＴＭの血中濃度推移を示す図面であ
る。

【図３】ｒ−ＵＴＭの血中濃度推移を示す図面である。

【図４】ＧＡＧ−ＵＴＭ５の血中濃度推移を示す図面で
ある。

【図５】ＧＡＧ−ＵＴＭの抗血液凝固活性を示す図面で
ある。

【図６】ｒ−ＵＴＭの抗血液凝固活性を示す図面であ
る。

【図７】ＧＡＧ−ＵＴＭ５の抗血液凝固活性を示す図面
である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ 9282−4Ｂ (72)発明者 山本 進 東京都立川市一番町６−３−１ 一番町57 −306 (72)発明者 枝野 敏行 埼玉県川越市富士見町31−21−301

Claims (8)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 シアル酸を実質的に含有しないトロンボ
   モジュリン類。
2. 【請求項２】 シアル酸含量が０．５μｇ／mg以下であ
   る請求項１記載のトロンボモジュリン類。
3. 【請求項３】 ヒト組織から抽出したトロンボモジュリ
   ン、ヒト尿から抽出したトロンボモジュリン又は遺伝子
   組換えによって得られたトロンボモジュリンにシアリダ
   ーゼを作用させることにより得られるものである請求項
   １記載のトロンボモジュリン類。
4. 【請求項４】 遺伝子組換えにより得られたトロンボモ
   ジュリンが、Ｎ末端のＡｌａより４６８番目のＡｓｐま
   で、Ｎ末端のＡｌａより４９１番目のＡｌａまで、Ｎ末
   端のＡｌａより４９７番目のＳｅｒまで又はＮ末端のＡ
   ｌａより４９８番目のＧｌｙまで含むものである請求項
   ３記載のトロンボモジュリン類。
5. 【請求項５】 遺伝子組換えにより得られたトロンボモ
   ジュリンが、Ｎ末端のＡｌａより４６８番目のＡｓｐま
   でを含むトロンボモジュリンのＣ末端にＧｌｕ−Ａｓｐ
   −Ｔｙｒ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕが
   結合したアミノ酸配列を有するものである請求項３記載
   のトロンボモジュリン類。
6. 【請求項６】 トロンボモジュリンにシアリダーゼを作
   用させることを特徴とする請求項１記載のトロンボモジ
   ュリン類の製造法。
7. 【請求項７】 請求項１記載のトロンボモジュリン類を
   有効成分とする抗血液凝固剤。
8. 【請求項８】 請求項１記載のトロンボモジュリン類を
   有効成分とする血小板凝集抑制剤。