JPH02145526A - 抗血液凝固剤に対する解毒剤 - Google Patents

抗血液凝固剤に対する解毒剤

Info

Publication number
JPH02145526A
JPH02145526A JP1257982A JP25798289A JPH02145526A JP H02145526 A JPH02145526 A JP H02145526A JP 1257982 A JP1257982 A JP 1257982A JP 25798289 A JP25798289 A JP 25798289A JP H02145526 A JPH02145526 A JP H02145526A
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
anticoagulant
hirudin
factor viii
desulfatohirudin
dna
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
JP1257982A
Other languages
English (en)
Inventor
Valerie S Findlay
バレリー　スティーブンソン　フィンドレイ
Roger Kerry
ケリー ロジャー
Graham F Pay
グラハム　フレデリック　ペイ
Robert B Wallis
ロバート　ブライアン　ウォリス
Keith D Butler
キース　デイビッド　バトラー
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Novartis AG
Original Assignee
Ciba Geigy AG
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=10644806&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=JPH02145526(A) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Ciba Geigy AG filed Critical Ciba Geigy AG
Publication of JPH02145526A publication Critical patent/JPH02145526A/ja
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/02—Peptides of undefined number of amino acids; Derivatives thereof
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/81—Protease inhibitors
    • C07K14/815—Protease inhibitors from leeches, e.g. hirudin, eglin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/715—Polysaccharides, i.e. having more than five saccharide radicals attached to each other by glycosidic linkages; Derivatives thereof, e.g. ethers, esters
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/56—Materials from animals other than mammals
    • A61K35/62—Leeches; Worms, e.g. cestodes, tapeworms, nematodes, roundworms, earth worms, ascarids, filarias, hookworms, trichinella or taenia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/04—Peptides having up to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • A61K38/08—Peptides having 5 to 11 amino acids
    • A61K38/09—Luteinising hormone-releasing hormone [LHRH], i.e. Gonadotropin-releasing hormone [GnRH]; Related peptides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/04—Peptides having up to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • A61K38/08—Peptides having 5 to 11 amino acids
    • A61K38/095—Oxytocins; Vasopressins; Related peptides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/36—Blood coagulation or fibrinolysis factors
    • A61K38/37—Factors VIII
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P39/00—General protective or antinoxious agents
    • A61P39/02—Antidotes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A61P7/04—Antihaemorrhagics; Procoagulants; Haemostatic agents; Antifibrinolytic agents

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Reproductive Health (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
  • Materials For Medical Uses (AREA)
  • Dental Preparations (AREA)
  • Materials Applied To Surfaces To Minimize Adherence Of Mist Or Water (AREA)
  • Saccharide Compounds (AREA)
  • External Artificial Organs (AREA)

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は抗血液凝固剤１と対する解毒剤（ａｎｔｉｄｏ
ｔｅ）に関する。
〔発明の背景〕
効果的に機能する止血機構は哺乳類生物体にとって非常
に必要性が高い。健康な生物体の血漿中で、線溶系と凝
固系との間に動的平衡が存在し、その結果、効果的に機
能する血管ネットワークが維持される。血管の障害が生
じた場合、凝固系がフィブリンマトリクスを沈澱せしめ
、止血条件を完了した後線溶系によって再び破壊される
。生物体の線溶系の能力が、形成された血管内血栓を破
壊するために十分でない場合、例えば血栓塞栓症又は術
後合併症に罹っている患者においては、線溶剤又は抗凝
固剤の投与によりその生物体を援助することが必須であ
る。
例えばヒルジン、ヘパリン、低分子ヘパリン類、又は低
分子合成スロンビン阻害剤のごとき抗凝固剤は、フィブ
リン血餅の形成を阻害することにより凝固系に対抗する
。古くから知られており、そして蛭〔ヒルド・メディシ
ナリス（Ｈｉｒｕｄｏ　ｍｅｄｉｃｉｎａｌｉｓ）中に
天然に存在する［Ｗａｌｓｍａｎ、　Ｐ、及びＭａｒｋ
ｗａｒｄｔ、　Ｐ、　（１９８１）、　Ｐｈａｒｍａｚ
ｉｅ　３６．６５３　）ヒルジンは既知のすべての天然
に存在する抗凝固剤及び合成抗凝固剤の中で“２　Ｘｌ
０−”Ｍの複合体解離定数を有する最も強力なスロンビ
ン阻害剤であり、前駆体フィブリノーゲンからのフィブ
リンの生成を防止する。血液凝固カスケードの他の酵素
はヒルジンにより阻害されない。従来の抗凝固療法にお
いて好ましい抗凝固剤であるヘパリンとは異り、ヒルジ
ンはその阻害作用をスロンビンに対して直接発揮し、そ
して前者とは異りアンチスロンビン■を介して作用しな
い。ヒルジンをイヌに静脈内投与した場合、高投与量に
おいてさえ、心拍数、呼吸、血圧、血小板数、フィブリ
ノーゲン及びヘモグロビンに対する効果は観察されない
。ラット、ブタ及びイヌに対する試験において、ヒルジ
ンは実験血栓症（止血、血管の損傷又はスロンビンの注
射により誘導される）において、エンドトキシンショッ
クにおいて、そしてさらにＤＩＣ（播種住血管内凝固；
ｄｉｓｓｅｍｉｎａｔｅｄ　ｉｎｔｒａｖａｓｃｕｌａ
ｒｃｏａｇｕ　ｆａｔ　１ｏｎ）において効果的である
ことが証明されている。
ヒルジンは単一ポリペプチド種ではなく、ヒルジン変形
体（ｖａｒｉａｎｔ）　　１　　（ＨＶＩ）　、ヒルジ
ン変形体２（ＨＶ２：ＥＰ出願Ｎｏ、　０．１５８．５
６４）　、ヒルジン変形体ＰＡ　（ＰＣＴ出願Ｗ０８８
１０３４９３）、及びｒｄｅｓ−（Ｖａｌ）２−ヒルジ
ンＪ　　（ＥＰ出願Ｎ（Ｌ肌１５８．９８６）　　と称
する少なくとも四種類から成る同様に作用するポリペプ
チドの群である。これらの変形体（ｖａｒｉａｎｔ）は
幾つかのアミノ酸により相互に異り、例えハＮ−末端配
列において、ＨＶＩではＶａｌ−Ｖａｌ−Ｔｙｒであり
、Ｉ（Ｖ２及びｆ’Ａではｌ　Ｉｅ−Ｔｈｒ−Ｔｙｒで
あり、そしてｒ　ｄｅｓ−（Ｖａｌ）、−ヒルジン」で
はＴｈｒ−Ｔｙｒである。
ＮＭＲ研究に基いて、ＨＶＩは突出した「フィンガー」
（残基３ｌ−３６）を有するＮ−末端コアートメイン及
び酸性末端ループから構成されている（Ｃ１ｏｒｅ等、
ＥＭＢＯＪｏｕｒｎａｌ　６．５２９．１９８７）。上
記のすべてのヒルジン変形体は、Ｎ−末端での疎水性ア
ミノ酸の蓄積、Ｃ−末端での極性アミノ酸の蓄積、硫酸
モノエステルとして存在するチロシン残基（Ｔｙｒ６３
）、３個のジスルフィド橋及び抗凝固活性を共通に有す
る。
最近、ヒルジン変形体をコードするｃＤＮＡ及び合成遺
伝子がクローン化され、そして微生物宿主中で発現され
ている。発現生成物はＴｙｒ　６３に硫酸モノエステル
を欠き、そしてそれ故に「デスルファトヒルジン」と称
されるが、これらは天然の硫酸化されたヒルジンとおよ
そ同じ生物学的活性を示す。デスルファトヒルジン変形
体ＨＶＩは大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｔ　
ｉ）　（ヨーロッパ特許出願Ｎｏ、１５８．５６４及び
Ｎα１６８．３４２）並びにサツカロミセス・セレビシ
ェ−（Ｓａｃｃｈａｒｏｍ　ｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉ
ａｅ）（ヨー０ツバ特許出願Ｎｏ、　１６８．３４２、
Ｎｏ、　２００．６５５、Ｎａ　２２５．６３３及びＮ
ｏ、　２５２．８５４）において発現されている。同様
に、デスルファトヒルジンＨＶ２は大腸ｍ　＜ヨーロッ
パ特許出願Ｎｏ、　２００．６５５、ＰＣＴ−出ＭＮｏ
、８６１０１２２４）において発現されており、そして
ｄｅｓ−（Ｖａ　１）　２−デスルファトヒルジンは大
腸菌（ヨーロッパ特許出願Ｎα１５Ｂ、　９８６）にお
いて発現されている。
ヒルジン及び他の抗凝固剤の主たる用途は、動脈、静脈
又は体外循環にふける血栓の予防又は治療である。抗凝
固剤の療法的使用のための１つの前提条件は、抗凝固活
性の中和のために高度に効果的な、該抗凝固剤の効果を
調査又は制御するために使用され得る解毒剤の入手可能
性である。従来、この様な解毒剤（硫酸プロタミン）は
ヘパリンに対して利用可能であり、従ってこれは（負の
副作用及び多くの非特異的反応にも拘らず）今まで、病
院で使用される主たる抗血栓（ａｎｔｉｔｈｒｏｍ−ｂ
ｏｔｉｃ）剤である。しかしながら、硫酸プロタミンは
、さらに強力な抗血栓剤であるヒルジンのごとき他の抗
凝固剤に対しては解毒剤として無効である。抗凝固効果
を迅速に逆転しそして望ましいレベルよりも高レベルの
抗凝固を伴うすべての患者への出血の危険を減少せしめ
る解毒剤が存在すれば、効果的な解毒剤の非存在下でヘ
パリンではなくヒルジン又は他の抗凝固剤を使用するこ
とへのためらいは解消されるであろう。
〔発明の概要〕
本発明の目的はヒルジンのごとき抗血液凝固剤に対する
解毒剤を提供することである。この目的は、ファクター
■（Ｆ■）として知られているプロ凝固（ｐｒｏｃｏａ
ｇｕｌａｎｔ）活性を有する血漿蛋白質もしくはその活
性を維持している断片又はＦＶＩＩＩの血中濃度を上昇
せしめる物質が抗凝固剤として機能するという驚くべき
知見により達成される。
〔具体的な記載〕
本発明は、ファクターＶＩＩＩもしくはその活性を維持
しているファクターＶＩＩＩの断片又はその血中濃度を
上昇せしめる物質を、抗血液凝固剤に対する解毒剤とし
て使用する医薬の製造のために使用することに関する。
ファクター■は血友病Ａと称される先天性出血性疾患に
おいて減少し又は欠けている血液凝固因子である。ヒト
の血漿中でファクター■はフォノ・ビルブランド−７７
クター（ｖｏｎ　Ｗｉｌｌｅｂｒａｎｄ　Ｆａｃｔｏｒ
：ｖ　Ｗ　Ｆ　）と非共有結合複合体を形成する。ファ
クター■は２６０．０００〜２８０．０００６の分子量
及び０．０５〜０．１ｎ／ｒｄの予想血漿中濃度を有す
る糖蛋白質であり［Ｐｅａｋｅ、　１．Ｒ，（１９８４
）、　Ｃ１１ｎｉｃａｌ　５ｃｉｅｎｃｅ、　５７゜５
６１−５６７　　；Ｈａｍｅｒ、　ＲｏＪ、ら（１９８
５）、　Ｃｒ１ｔｉｃａｌ　Ｒｅｖ。
０ｎｃｏｌ、　／Ｈｅｍａｔｏｌ、　６４．１９−５４
１　、このものはスロンビンにより活性化され、そして
ファクターＸの活性酵素ファクターＸａへの転換を非酵
素的に促進し、そしてフィブリンの生成を導く一連の酵
素反応において重要な役割を演する。ファクターＶＩＩ
Ｉのアミノ酸配列はすでに数年前に解明されており［Ｖ
ｅｈａｒ、　Ｇ、Ａ、　　ら（１９８４）、　Ｎａｔｕ
ｒｅ、　３１２．３３７３そして組換ファクター■は哺
乳類細胞培養において発現されている（Ｗｏｏｄ、　Ｗ
、Ｊ、ら（１９８４）、　Ｎａｔｕｒｅ３１２、３３０
　）。ファクター■は血液から抽出することができ、又
は組換技法により製造することができる。本明細書を通
じて理解されるようにファクター■は種々の哺乳類例え
ばウシ、又は特にヒトに由来することができる。
血漿濃縮物としてヒトに投与するために公認されるファ
クター■は、ファクター■欠損により惹起される疾患す
なわち血友病Ａ及びフォノ・ビルプラント病の患者に、
そのヘモスタシス（ｈａｅｍｏｓ−ｔａｓｉｓ）を正常
化しそして外科手術及び抜歯に伴う出血を防止するため
に静脈内投与されている（Ｍｅｌ’５ｓｏｒｉ、　Ａ、
　　ら（１９８７）、　Ｃ１１ｎｉｃａｌ　Ｐｈａｒｍ
ａｃｏ−ｋｉｎｅｔｉｃｓ、　１３．３６５−３８０〕
。
ファクターＶＩＩＩの血中濃度を上昇せしめる物質は例
えばデスモプレッシン（１−デアミノ−８−Ｄ−アルギ
ニンバソプレッシン、ＤＤＡｖＰ）、アドレナリン、バ
ソプレッシン又はインシユリンである〔総説、Ｍａｎｎ
ｕｃｃｉ、　Ｐ、Ｍ、　（１９８６）、　Ｐｒｏｇｒｅ
ｓｓ　ｉｎ）１ｅｍｏｓｔａｓｉｓ　ａｎｄ　Ｔｈｒｏ
ｍｂｏｓｉｓ　８．１９−４５）　ｏ　ＤＤＡＶＰは多
くの出血性疾患状態において失血を少なくしそして出血
時間を短縮することが知られており、そしてこれは循環
しているファクター■濃度の増加と相関する（Ｋｏｂｒ
　１ｎｓｋｙ　ら、（１９８４）、　Ｌａｎｃｅｔ。
１、１１４５−１１４８３゜ ＤＤＡＶＰはヒトにおいて使用するために許可されてお
り、そしてファクター■不足及び尿毒症を有する患者に
おける出血エピソードを臨床的に治療するために使用さ
れる。投与は静脈内、皮下又は鼻内経路であることがで
きる。
従来技術は、種々の疾患状態により誘導される出血時間
の延長を修正におけるＤＤＡＶＰの使用（Ｖｉｇａｎｏ
ら（１９８９）Ａｒｎｅｒ、　Ｊ、　ｔ（ｅ＋ｙ＋ａｔ
ｏ１．、３１．３２　；Ｗｉｊｅｒｍａｎｓ　ら（１９
８９）Ａｍｅｒ、Ｊ、Ｈｅｍａｔｏｌ、、３０．　１５
４　　ＨＫｉｍ　ら（１９８８）Ｔｈｒｏｍｂ、Ｈａｅ
ｍ、、　５９．２２１　）及びファクターＶＩＩＩの使
用ＣＦｕｋｕｉ　　ら（１９８８）Ｂｌｕｔ、　５６．
１７１；Ｇｒａｚｅｎｇｅｌ　　ら（１９８８）Ｎｏｕ
ｖ、Ｒｅｖ、Ｆｒ、Ｉ（ｅｍａｔｏｌ、、　３０゜２２
５〕を報告している。しかしながら、ＤＤＡＶＰ又はフ
ァクター■が、抗凝固剤の効果を克服するための解毒剤
（ａｎｔｉｄｏｔｅ）としてインビボ又はインビトロで
投与されたという報告は存在しない。
活性化された部分的スロンボプラスチン時間（ａｃｔｉ
ｖａｔｅｃｌ　ｐａｒｔｉａｌ　ｔｈｒｏｍｂｏｐｌａ
ｓｔｉｎ　ｔｉｍｅ（ＡＰＴＴ）。
Ｂａ５ｕら（１９７２）Ｎ、Ｅｎｇｌ、Ｊ、Ｍｅｄ、、
　２８７．３２４　）により測定した場合、ＤＤＡＶＰ
及びファクターＶＩＩＩの両者はインビトロ血液凝固時
間を多少短縮せしめる。本発明者らが今見出したところ
によれば、ヒルジンのごとき抗凝固剤の添加又は投与に
より凝血時間が延長される場合、ＤＤＡＶＰ及びファク
ターＶＩＩＩの両者は非常に大きな効果を有し、そして
この効果は、それらの薬剤による抗凝固の逆転のための
解毒剤として使用できる程十分に高い。
従って、本発明は、ファクターＶＩＩＩもしくはその活
性を維持しているファクターＶＩＩＩの断片又はその血
中濃度を増加せしめる物質の、抗血液凝固に対する解毒
剤としての使用に関するものである。
断片なる用語は、ファクター■と配列相同性を共有しそ
してファクターＶＩＩＩのトリプシン消化か又は組換Ｄ
ＮＡ技法のいずれかにより得られ、そして抗出血活性を
維持しているすべてのペプチドを包含する（例えば、ヨ
ーロッパ特許出願Ｎα１９７．９０１）。
例えば、Ｇｅｒｖａｓｉ　　ら、Ａｒｚｎｅｉｍ、Ｆｏ
ｒｓｃｈ、／ＤｒｕｇＲｅｓ、３Ｂ　（ＩＩ　）　Ｎｏ
、　９　（１９８８）は、プロ凝固（ｐｒｏｃｏａｇｕ
−１ａｎｔ）性及び血小板凝集性を欠いているがしかし
微小血管の内皮層に対する顕著な親和性及び抗凝固活性
を有する分子量ｉ、ｏｏｏ〜２５．０００ダルトンの小
ペプチド画分（ＰＦ）をウシ・ファクター■からトリプ
シン消化によって得ることができたと述べている。ＰＦ
は、実験動物、例えばヘパリン又はアセチルサリチル酸
により出血時間が延長された実験動物における出血時間
の短縮を示した。このことは、血小板及び血液凝固を妨
害することなく起った。対応する性質を示す類似の断片
をヒト・ファクターＶＩＩＩのトリプシン消化の後に得
ることができる。
ファクターＶＩＩＩもしくはその活性を維持しているフ
ァクターＶＩＩＩの断片又はその血中濃度を上昇せしめ
る物質がそれに対して解毒剤として作用する抗凝固剤に
はヒルジン、ヘパリン、低分子ヘパリン、例えばフラグ
ミン（ｆｒａｇｍｉｎ）　、及び低分子合成スロンビン
阻害剤、例えば（２Ｒ・４Ｒ）−４−メチル−１−〔Ｎ
”　−（３−（ＲＳ）−メチル−１・２．３．４−テト
ラヒドロ−８−キノリニル−スルホニル）−＜Ｓ）−ア
ルギニル）−２−ピペリジンカルボン酸ＣＭＣＩ　９０
３８　；　Ｋｉｋｕｍｏｔｏら（１９８４）Ｂｉｏｃｈ
ｅｍ、３３．８５）　、Ｄ−フェ−”ルアラニルーし一
プロリルーし一アルギニンアルデヒドサルフェー）　（
ＧＹにＩ　１４１６６　；ヨーロッパ特許出願Ｎα１８
５．３９０）及びＮ“−（２−ナフタレンスルホニル−
グリシル）−４−アミジノ−フェニルアラニン−ピペリ
ジド（１（ａｉｓｅｒら（１９８５）、　Ｂｉｏｍｅｄ
、Ｂｉｏｃｈｅｍ、Ａｃｔａ７１８、１２０１−１２１
０）が含まれる。
この明細書において、特にことわらない限り、ヒルジン
なる語は、 （１）すべての天然の又は合成のヒルジン変形体（ｖａ
ｒｉａｎｔ）及びヒルジン誘導体、例えば抗凝固活性を
維持しているヒルジン断片；及び（２）すべてのデスル
ファトヒルジン変形体及びデスルファトヒルジン誘導体
、例えばＣ−末端短縮デスルファトヒルジン； であって文献に記載されているもの、又は組換ＤＮＡ技
法により得られるもの、を包含する。
この様なヒルジン類の例として、 （１）次の式（Ｉ） Ｈ−Ｚｏ−Ｚ＋−Ｔｙｒ−Ｔｈｒ−Ａｓｐ−Ｃｙｓ−Ｔ
ｈｒ−Ｇｌｕ−３ｅｒ−Ｇｌｙ−−Ｇｌｎ−Ａｓｎ−Ｌ
ｅｕ−Ｃｙｓ−Ｌｅｕ−Ｃｙｓ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−３ｅ
ｒ−Ａｓｎ−−Ｖａｌ−Ｃｙｓ−Ｇｌｙ−Ｇｌｎ−Ｇｌ
ｙ−Ａｓｎ−Ｚ、−Ｃｙｓ−１１ｅ−１ｅｕ−−Ｇ　１
ｙ−３ｅｒ−Ａｓｐ−Ｇ　１ｙ−Ｇ　１ｕ−Ｚ３−Ａｓ
ｎ−Ｇ　Ｉｎ−Ｃｙｓ−Ｖａ　ｌ−−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−
Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−２４−２，−２６−
３ｅｔ−−Ｚ、−Ｚ、−Ａｓｐ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｐｈ
ｅ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−１１ｅ−Ｐｒｏ−−Ｇ　１ｕ−Ｇ
　１ｕ−Ｔｙｒ　（Ｒ）　−Ｌｅｕ−Ｇ　Ｉｎ−ＯＨ。
（Ｉ） 〔式中、（Ｒ）はＴｙｒのフェノール性ヒドロキシ基（
デスルファトヒルジン）又は−〇　−５Ｏ３Ｈ基であり
；全体分子がＣ−末端アミノ酸Ｇｌｎ　ＳＣ−末端ジペ
プチドＬｅｕ−Ｇｉｎ　、　Ｃ−末端トリペプチドＴｙ
ｒ−Ｌｅｕ−Ｇｉｎ又はＣ−末端テトラペプチドＧｌｕ
−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ｇｌｎにより短縮されていてもよく
；そしてＺ。は直接結合、又はＶａｌ、　ｌｉｅもしく
はＧｔｙ　。
又はジペプチジル基Ｇｌｙ−Ｖａｌ　もしくはＭｅｔ−
Ｖａｌ　であり；Ｚ、はＶａｔ、　ｌｉｅ又はＴｈｒで
あり；Ｚ２はＬｙｓ、　Ｇｉｎ、　Ａｓｎ、　Ｌｅｕ、
　Ａｒｇ又はＶａｔ　であり；ｚ３はｔ、ｙｓ、　Ａｒ
ｇ、　Ａｓｎ、　Ｖａｌ、　Ｌｅｕ又はＧｉｎであり、
Ｚ。
はＬｙｓ、　Ａｒｇ、　Ａｓｎ、　Ｖａｌ又はＬｅｕで
あり、ＺｓはＰｒｏ又はＧｌｙであり、Ｚｓ及びＺ８は
相互に独立にＧｌｎ、　Ａｓｎ又はＭｅｔであり、そし
てｚｌは旧Ｓ。
Ｇｉｎ又はＡｓｎである〕 で表わされるタイプＨＶｉのヒルジン又はヒルジン変形
体； （２）次の式（ｎ） に独立にＧｌｕ、　Ｇｉｎ又は遺伝的にコードされた中
性アミノ酸の基であり、Ｙ６はＴｙｒ又は遺伝的にコー
ドされた酸性アミノ酸の基であり、そしてＹ。
はＧｉｎ又はジペプチド基Ｇｉｎ−Ｐｒｏである）で表
わされるタイプＨＶＩのデスルファトヒルジン変形体； （３）次の式（■）： ｎ −Ｙ、−Ｙ、−Ｙ６−Ｌｅｕ−Ｙ、−ＯＨ。
（ｎ） （式中、Ｙ、はＡｓｐ又は遺伝的にコードされた中性ア
ミノ酸の基でありＩＶ２及びＹ、は相互に独立にＧｌｕ
、　Ｇｉｎ、　Ａｓｎ又は遺伝的にコードされた親脂性
アミノ酸の基であり；Ｙ４及びＹ、は相互Ｇ　１ｕ−Ｇ
　１ｕ−Ｔ　ｙｒ　（Ｒ）　−Ｌｅｕ−Ｇ　Ｉｎ−ＯＨ
。
（ＩＩＩ） 〔式中、（Ｒ）はＴｙｒのフェノール性ヒドロキシル基
（デスルファトヒルジン）又は−〇−３Ｏ３１を基であ
り−；そしてＩｌｅ　１はＶａｌで置き換えられそして
Ｔｈｒ　’ｌはＶａｌで置き換えられていてもよく（変
形された）ＩＶ２）：あるいはＡｓｎ　４７はＬｙｓ、
　Ａｒｇ又は旧Ｓにより置き換えられていてもよく；あ
るいはＴｙｒ　６３はＧｌｕ又はＡｓｐにより置き換え
られていてもよい〕 で表わされるタイプＨＶ２のヒルジン変形体；（４）次
の式（■）： −Ｇｌｕ−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ｔｙｒ　（Ｒ）−Ａｓｐ−
Ｇｌｕ−ＤＨ。
（ＩＶ） 〔式中、（Ｒ）はＴｙｒのフェノール性ヒドロキシル基
（デスルファトヒルジン）又は−〇−３Ｏ３Ｈ基であり
；そしてポリペプチド鎖はＣ−末端において１８・１０
，９．６．４又は２個のアミノ酸により短縮されていて
もよく；あるいはポリペプチドはＮ−末端において１又
は２個のアミノ酸により短縮されていてもよい〕 により表わされるタイプＰＶ（ｌｌＶ３）のヒルジン変
形体が挙げられる。
式（Ｉ）のヒルジン類の例として、（Ｒ）がＴｙｒのフ
ェノール性ヒドロキシル基であり、ＺＤがＶａｌであり
、ＺｌがＶａｌ　であり、２．．２３及びＺ、がそれぞ
れＬｙｓであり、ＺｓがＰｒｏであり、ＺｓがＧｉｎで
あり、Ｚ７がＨｉｓでありそしてＺ８がＡｓｎであるデ
スルファトヒルジンＨＶＩ；及びＺｏが直接結合であり
、ＺｌがＴｈｒであり、そしてＺ２　　Ｚｓ及び（Ｒ）
がＨＶＩについて定義した通りであるｄｅｓ−（Ｖａ　
１）　２−デスルファトヒルジンが挙げられる。他の例
として、ＨＶＩの変形体、例えば〔ＡＳｎ２１〕−デス
ルファトヒルジン、（Ａｓｎ３６）−デスルファトヒル
ジン、（Ｖａｌ”　］−デスルファトヒルジン、［：Ｇ
１ｙ’ａ　）−デスルファトヒルジン、［Ｍｅｔ４９］
−デスルファトヒルジン、（Ｍｅｔ”　）−デスルファ
トヒルジン、〔Ａｓ０５′〕−デスルファトヒルジン、
ＣＧＩｎ”、　Ａｒｇ”］−デスルファトヒルジン、Ｃ
Ｇ　Ｉ　ｎ　”　＊　Ｇ　ｌ　ｎ　”　＋　Ａ　ｒ　ｇ
　”　）−デスルファトヒルジン、［Ａｒｇ３６．　Ａ
ｒｇ４７）−デスルファトヒルジン、（Ａｒｇ”＋　Ａ
ｒｇ”：ｌ−デスルファトヒルジン、グリシル−ＣＧＩ
ｎ”、　Ｇ１ｎ３６．　Ａｒｇ”　）−デスルファトヒ
ルジン、メチオニル−（Ｇｉｎ”Ａｒｇ４’？　）−デ
スルファトヒルジン、Ｃ１１ｅ’、　　ｌｉｅ”）−デ
スルファトヒルジン、及びＣＧｌｙ’ｌ−デスルファト
ヒルジンが挙げられる。
遺伝的にコードされた中性アミノ酸は、Ａｌａ。
Ｓｅｒ、　　Ｔｈｒ、　　Ｖａｌ、　　Ｌｅｕ、　　Ｉ
ｌｅ、　　Ａｓｎ、　　Ｇｌｎ、　　Ｍｅｔ、　　Ｐｈ
ｅ。
Ｔｒｐ及びＰｒｏ　、そしてさらにアミノ酸Ｇ１ｙであ
る。
遺伝的にコードされた親脂性アミノ酸は、Ａｌａ。
Ｖａｌ、　Ｌｅｕ、　　Ｉｌｅ、　Ｐｈｅ及びＧｌｙで
ある。
遺伝的にコードされた酸性アミノ酸はＡｓｐ及びＧｌｕ
である。
式（Ｉｔ）のデスルファトヒルジン変形体の例として、
［Ｇ１ｎ６１１２］−デスルファトヒルジン、［：Ｌｅ
ｕｌｌｌｌ　１ｔ２）−デスルファトヒルジン、（Ａ　
Ｓ　ｎ　ｇ　ｌ−６２〕−デスルファトヒルジン、［Ｌ
ｅｕＳｆｆ１５８．６１．６２’］−デスルファトヒル
ジン、［Ａｓｎ”・５８・α・６２〕−デスルファトヒ
ルジン、（Ａｌａ”　）−デスルファトヒルジン、〔Ａ
Ｓｐ６３〕−デスルファトヒルジン、［：Ｇｌｕ６３：
］−デスルファトヒルジン、［Ｐｒｏ６６］−デスルフ
ァトヒルジン、及び（Ｇｉｎ”・５８・６１・６２〕−
デスルファトヒルジンが挙げられる。
式（ＩＩＩ）のタイプＨＶ２のヒルジン変形体の例とし
てデスルファトヒルジン）ＩＶ２及びデスルファトヒル
ジン）ＩＶ　２　（Ｌｙｓ　４７）が挙げられる。
式（ｒＶ）のタイプＰＡのヒルジン変形体の例としてデ
スルファトヒルジンＰＡが挙ケラレる。
式（１）、　（ｎ）、　（Ｉ［Ｉ）及び（ＩＶ）のデス
ルファトヒルジン変形体は当業界においてよく知られて
いる常用の組換ＤＮＡ技法により製造することができる
。ヒルジン遺伝子の単離及びクローニングに続き、クロ
ーニングされたＤＮＡ中の特定のコドンの変異（例えば
、塩基の交換、塩基の欠失又は塩基の延長）が、適切な
変異原プライマーを用いる部位特定変異誘発法により行
われる（例１）。
生ずる変異体遺伝子は適当な発現ベクター中に組み込ま
れ、そして微生物宿主、例えば大腸菌、バシルス・ズブ
チリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　５ｕｂｔｉｌｉｓ）又はサ
ツカロミセス・セレビシェ−の形質転換が行われる。変
異体遺伝子をコードするＤＮＡ配列に適切なリーディン
グフレーム内に連結されたシグナル配列を含んで成るバ
イブリドベクターを担持する形質転換体が、常法を用い
て培養される。培養液からデスルファトヒルジン変形体
が単離され、そして今日当業者によりよく知られている
方法により単離される。
ファクター■、ファクターＶＩＩＩの断片、ファクター
■の誘導剤、及び抗血液凝固剤は既知物質であり、又は
当業界において知られている常法により製造することが
できる。
本発明はまた、（ａ）抗血液凝固剤を含有する組成物と
、（ｂ）ファクターＶＩＩＩもしくはその活性を維持し
ているファクターＶＩＩＩの断片又はその血中濃度を上
昇せしめる物質を含有する組成物とを含んで成る、個別
に、同時に、又は逐次的に使用するための組合せ製剤を
提供する。
本発明はまた、抗血液凝固剤を含む第一容器、及びファ
クターＶＩＩＩもしくはその活性を維持しているファク
ターＶＩＩＩの断片又はその血中濃度を上昇せしめる物
質を含む第二容器を含んで成るキットを提供する。
このキットは、抗血液凝固剤を含む組成物、及びファク
ターＶＩＩＩもしくはその活性を維持しているファクタ
ーＶＩＩＩの断片又はその血中濃度を上昇せしめる物質
を含む組成物の両者を含み、これらは使用前にさらに稀
釈される濃厚物であるか、又は使用濃度を有し、バイア
ルは１回又は複数回の量を含有することができる。便利
には、単位投与量が注射器に入れられ、そして無菌容器
に収容され、こうすることにより医師は注射器を直接使
用することができ、ここで注射器は望ましい量及び濃度
の薬剤を含む。すなわち、キットは、抗血液凝固剤を含
有するある数の注射器、及びファクターＶＩＩＩもしく
はその活性を維持しているファクターＶＩＩＩの断片又
はその血中濃度を上昇せしめる物質を含有するある数の
注射器を有することができる。
抗凝固効果を逆転するために必要なＦ■又はＦＶＩＩＩ
の断片の量は通常、体重ｋｇ当り１〜２００ユニツト、
好ましくは体重ｋｇ当り３０〜１２０ユニツトである。
１ユニツトは正常ヒト血液１ｍｆｉ中に見出されるＦＶ
ＩＩＩの量である。ファクターＶＩＩＩの血中濃度を上
昇せしめる物質は、上記の量のファクターＶＩＩＩの誘
導を導く濃度において投与される。
ヒルジンの療法的有効量は通常、体重ｋｇ当り約０、０
０１〜１０ｍｇの投与量範囲にあり、体重ｋｇ当り約０
．０１〜３ｍｇの範囲が好ましい。
他の抗凝固剤は、前記のヒルジン濃度により得られるの
と同様の対応する抗血栓活性を導く濃度において投与さ
れる。投与は静脈内注射、筋肉内注射又は皮下注射によ
り行われる。
前記のキットは療法的に有効な量のファクター■もしく
はファクターＶＩＩＩの断片又はファクターＶＩＩＩの
誘導剤、及び抗凝固剤を含む。
ファクター■、又はＤＤＡＶＰのごときファクターＶＩ
ＩＩの誘導剤は製造者の明細に従って非経口経路を介し
て、例えば静脈内に、皮下に又は鼻内に、そして抗凝固
剤に対する解毒剤として必要な場合に投与される。この
ものは、抗凝固剤と同時に投与してもよいが、しかし通
常は抗凝固剤の後に投与する。ファクターＶＩＩＩの投
与は抗凝固の逆転を即座に導くが、０ＤＡＶＰは抗凝固
の逆転の開始が望まれる時点より１０〜２０分間前に投
与する。
次に、例により本発明をさらに具体的に説明するが、こ
れにより本発明の範囲を限定するものではない。例２〜
６において、使用したヒルジンはデスルファトヒルジン
ＨＶＩであり、そして使用したファクター■はＫＲＹＯ
ＢＵＬＩＮ　ＴＩＭ３の商標のもとに販売されているも
のである。
１０ｆｆのプラスミドｐｌＮ−１１１−ｏｍｐＡ−２（
Ｊ、Ｇｈｒａｙｅｂら、ＥＭＢ［ｌ−Ｊ、３．２４３７
（１９８４））を２５４の１００ｍＭ　Ｔｒｉｓ−）Ｉ
Ｃｊ！　（ｐＨ７，５）、　５０ｍＭ　ＮａＣ１及び１
００ｆｆ　／−ゼラチンに溶解し、そして制限エンドヌ
クレアーゼεｃｏＲＩ及びＢａｍＨＩにより消化する。
この溶液をＴＮＥに調整し、そしてフェノール／クロロ
ホルムで抽出する。ＤＮＡをエタノールにより沈澱せし
める。アガロースでの電気泳動の後、ゲル溶出によりベ
クターＤＮＡ　ｐｌＮ−ｍ−ｏｍｐＡ−２／εｃｏＲＩ
／１３ａｍＨＩを単離する。
ｂ）プラスミドｐＭＬ３１０のＤＮＡの消化２０汀のプ
ラスミドｐＭＬ３１０　（ヨーロッパ特許出願Ｎｏ、　
１６８．３４２を参照のこと）を５０４の１００ｍＭ　
Ｔｒｉｓ−ＨＣＩｌ　（ｐＨ７，５）、　５０ｍＭ　Ｎ
ａＣｊ！及び１００ｇ　／−ゼラチン中で制限エンドヌ
クレアーゼＥｃｏＲＩ　及び３ａｍＨＩにより消化する
。この溶液をＴＮＥに調整し、そしてフェノール／クロ
ロホルムにより抽出する。
アガロースでのゲル電気泳動の後ゲル溶出によりＦ、−
Ｆ２−ＤＮＡ　（ヒルジン遺伝子）を単離する。
１ＪＩｔのＦ、−Ｆ２−ＤＮＡ　（ヒルジン遺伝子）　
／ＢｃｏＲＩ／Ｒａｍ）ＩＩ及び３００汀のベクターＤ
ＮＡ　ｐｌＮ−１１１−ｏｍｐＡ−２／ＥｃｏＲＩ　／
ＢａｍＨＩを５０Ｉの１００ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩｌ
（ｐｆ１７、５）、　５０ｍＭ　ＮａＣ１及び１００ｆ
ｆ　／ｍｌゼラチン中ニ溶解し、ＴＮＥに調整する。こ
の溶液をフェノール／クロロホルムで抽出し、そしてＤ
ＮＡをエタノールで沈澱せしめる。ＤＮＡ沈澱物を５０
ｍλＩＴｒｉｓ−Ｈｉ　（ｐＨ７，８）、　１０＋ｍＭ
　ＭｇＣｊ！ｚ、　１０ｍＭ　ＤＴＴ。
０．５ｍＭ　ＡＴＰ及びｌＯｋ／ｄゼラチンの溶液２０
ｉｌＩに溶解し、そして２５ユニツト／ＩのＴ４ＤＮＡ
！Ｊガーゼ（バイオラプス）により１５℃にて３時間反
応せしめる。こうして、挿入されたＦｌ−Ｆ２−ＤＮＡ
　（ヒルジン遺伝子）を含有する組換えプラスミドル：
札３５０を生成せしめる。
ｄ）プラスミドｐＭＬ３５０による大腸菌ＨＢ、　１０
１の形質転換 カルシウムで前処理された大腸菌）１８１０１細胞を１
４　ａ　ｎ　ｄ　ｅ　ｌら〔ＪｌＭｏｌ、Ｂｉｏｌ、　
５３．１５９（１９７０）　〕により記載されているよ
うにして調製する。
組換えプラスミドｐＭＬ３５０を含有するＣ）で得た溶
液を６５℃にて１０分間加熱してＴ、ＤＮＡ’Ｊガーゼ
を不活性化し、そして次に３７℃に冷却する。１０ｄの
生ずる反応混合物を、１０ｍＭ　ＭｇＣＩ！　２及び１
０ｄＴｒｉｓ−ＨＣｌ　（１１８７，５）中力ルシウム
処理された大腸閉ＨＢ　１０１細胞１５０ｐＩに加えて
全容を２００Ｉとする。
次に、この混合物を水中で３０分間冷却し、４２℃にて
２分間加熱し、そして次に１艷のし一培地（バタトトリ
プトン１０　ｇ　／　１、バクト酵母エキス５　ｇ／ｌ
、ＮａＣｆ　５ｇ／ｉ’、グルコース５ｇ／Ｒ。
アンピシリン０．１ｇ／ｊり中に３７℃にて５０分間放
置する。次に、この混合物を０．２ｍｌずつ、６０ｎ／
−のアンピシリン（セルバ）を含有する５枚の寒天培地
（マツコンキー寒天、デイフコ）に拡げる。
次に、これらの寒天プレートを３７℃にて１６〜１８時
間維持する。形質転換された大腸菌ＨＢ　１０１細胞の
アンピシリン耐性コロニー１８５個を得る。
ｅ　）　Ｆｌ−Ｆ２−ＤＮＡを含有するコロニースクリ
ーニング ６個の形質転換されたコロニーをニトロセルロースＢ８
５（Ｓｃｕｌｅｉｃｈｅｒ　＆　５ｃｈｕｌｌ）上に押
し付ける。
Ｇｒｕｎｓｔｅｉｎ　及びＨｏｇｎｅｓｓ　　［Ｐｒｏ
ｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、５ｃ３ｔｌｓＡ　７２．３９
６Ｈ１９７９）］に従ってコロニーを溶解し、そしてそ
れらの変性したＤＮＡをフィルターに固定する。次に、
フィルターのプレハイブリダイゼーションを２０ｍ１ｌ
！／フイルターの４Ｘ　ＳＥＴ　（３０ｍＭＴｒｉｓ−
１（Ｃｊ！　（ｐｔ１８）、　１５０ｍＭ　ＮａＣｆ！
、　１ｍＭ　ＥＤＴＡの溶液：ｌ、０．ＩＷ／Ｖ％フィ
コール４００（ファルマシア）０．５％ＳＯ３，５０Ｒ
／−変性ウシ胸腺ＤＮＡ中で６４℃にて４時間行う。次
に、このニトロセルロースフィルターを２０ｄ／フイル
ター５Ｘ　ＳＥＴ　（ｗ／　ｖ　）、０．１Ｗ／Ｖ％フ
ィコール４００．０．２％ＳＯＳ及び５０ｐｌ／ｄ！変
性ウシ胸腺ＤＮＡ中で６４℃にて１６時間、３２ｐ−放
射能慄識されたプローブ（フィルター当り約１０’　〜
ｌＯ’　Ｃｅｒｅｎｃｏｖ　ｃｐｍ）　　ニより処理す
る。
オリゴヌクレオチド４６／６４相補性、１１５８　、９
６／６７、及び１５４／６４相補性から成る混合物（ヨ
ーロッパ特許出願Ｎｏ、　１６８．３４２）をプローブ
として使用する。
次ニ、フィルターを２Ｘ　ＳＥＴ、　０．２％ＳＤＳ中
で室温にて２回、次１：２Ｘ　ＳＥＴ、　０．５　％Ｓ
ＤＳ中テロ０℃にて２回（最初３０分間、次に６０分間
）洗浄する。次にフィルター１Ｍ１．！ペーパー（ワッ
トマン）の間で乾燥し、そして−８０℃にてＸ−線フィ
ルム（フジ）上に強化スクリーン（Ｉｌｆｏｒｄ）を用
いて１〜２日間置く。
得られるオートラジオダラムは５個の陽性コロニー（ク
ローン）を示し、これらはさらに処理するために使用す
ることができ、その内の１つをｐＭＬ３５０と命名する
。
Ｂ、プラスミドＢ１１１０９の作製 プラスミドｐＭＬ３５０はマルチ−クローニングリンカ
−（ＢｃｏＲＩ　、１（ｉｎｄＩ［Ｉ　、　ＢａｍＨ１
部位）を含有するプラスミドｐＩＮ−ＩＩＩ−ｏｍｐＡ
−２に由来するので、成熟ヒルジン遺伝子の前にＡｌａ
、　Ｇｌｎ、　Ｐｈｅ及びＭｅｔをコードする追加の１
２塩基対を含有する。成熟デスルファトヒルジンを発現
せしめるため、２７マー・オリゴヌクレオチドを用いる
インビトロ変異誘発により前言己の１２塩基対をプール
アウトする。
ａ　）　ｐＭＬ３５０／　Ｘｂａ　Ｉ　／ＢａｍＨＩ　
　（Ｓ　Ｉ　）の調製５ＪＪ′ＩｌのプラスミドｐＭＬ
３５０をエンドヌクレアーゼＸｂａ　Ｉ及びＢａｍＨＩ
により消化する。２個のＸｂａ　Ｉ−ＢａｍＨＩ断片の
内大きい方（ｓｒ）をアガロース上での電気泳動後の溶
出により単離し、そして１ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｊ！　
（ｐ）１７．５）、　０１１ｍＭ　８ＤＴＡに溶解する
。
ｂ）ｐｌ札３５０／　Ｐｖｕ　Ｉ　　（Ｓ　ＩＩ）の調
製５ｎのプラスミドｐＭＬ３５０をエンドヌクレアーゼ
ｐｖｕ　■により消化する。次に、線状化されたＤＮＡ
ｐＭＬ３５０／　ｐｖｕ　Ｉを３ユニツトの腸アルカリ
性ホス７７ターゼ（Ｂｏｅｈｒ　ｉｎｇｅｒ）により３
７℃にて３０分間消化する。この溶液を６５℃にて６０
分間加熱することにより酵素を不活性化する。線状ｐＭ
Ｌ３５０／　Ｐｖｕ　１（ＳＩＩ）ＤＮＡをアガロース
上での電気泳動後のゲル溶出により単離し、そして１ｍ
Ｍ　Ｔｒｉｓ−Ｈｌ　（ｐＨ７、５）、　０．１ｍＭ　
ＥＤＴＡに溶解する。
Ｃ）オリゴヌクレオチド（２７ｍｅｒ）　　Ｉ　２７の
調製ヨーロッパ特許出願ｋ　１６８，３４２に記載され
ている方法と同様にして、次のＤＮＡ断片（Ｉ２７と称
する）　： ５’　　−ＧＴ八　ＧＣＧ　　ＣＡＧ　　ＧＣ［”　　
ＧＴＴ　　ＧＴＴ　　ＴへＣＡＣＣＧＡＣを合成する。
５′−末端のリン酸化をＣｒ−３２Ｐ　）−ＡＴＰ及び
Ｔ、ポリヌクレオチドキナーゼ（１３ｏｅｈ３′ ｒｉｎｇｅｒ）を用いて、Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏ
ｎｉｎｇ、　Ａ　Ｌａｂｏ−ｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａ
ｌ（Ｔ、Ｍａｎｉａｔｉｓら編）　、Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒ
ｉｎｇＨａｒｂｏｒ　Ｌａｂ、　　（１９８２）　、１
２５頁、に記載されているようにして行った。
ｄ）プラスミドｐＢＨ１０９の作製 ０．３４ずつのＳ　Ｉ　ＤＮＡ及び５ＩＩＤＮＡを４Ｑ
ｐｍｏｌのリン酸化されたＤＮＡ断片Ｉ２７と、２７４
’の１ｍＭＴｒｉｓ−）１ｃｆ　（ｐＨ７，５）、　０
．１ｍＭ　ＢＤＴＡ中で混合する。
この混合物に３ｐｌのＩＯＸポリメラーゼ−リガーゼ緩
衝液（ＬＭ　Ｎａｌ、　６５ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ！
（ｐＨ７，５）。
８０ｍＭ　ＭｇＣｌ　２及びｌ　Ｑ　ｍ　Ｍ　　β−メ
ルカプトエタノール〕を加える。この混合物を沸騰水浴
中で３分間加熱してＤＮＡ断片を変性せしめる。次に、
この混合物を徐々に（約り℃／分）３０℃まで冷却し、
そしてこの温度で３０分間インキュベートする。さらに
、この混合物を４℃にて３０分間インキュベートし、そ
して次に水中で１０分間インキニベートする。
１２ｄの４種類のデオキシリボヌクレオチドホス７エー
）　（７，５ｍＭずつ）、６ｐ１のｌＱｍＭ　ＡＴＰ、
　６ｉ１１のＴ、ＤＮＡリガーゼ（２，５Ｕ／ｐり及び
１．２１ｄのＫｌｅｎｏｗ　ＤＮＡポリメラーゼ（Ｂｏ
ｅｈｒｉｎｇｅｒ、　５　Ｕ／ｌｄ　）を添加し、そし
てＤＮＡ混合物（合計容量５５ｐ１）を１２．５℃にて
１６時間インキニベートする。
ＤＮＡ混合物を２ユニツトのエンドヌクレアーゼＥＣＯ
ＲＩにより３７℃にて１時間消化して未変化の出発プラ
スミドｐＭＬ３５０を破壊する。この方法によりプラス
ミドｐＢＨ１０９が形成される。プラスミドｐＢＨ１０
９は、成熟デスルファトヒルジンをコードする遺伝子に
読枠を合わせて連結されたｏｍｐＡ−２シグナル配列に
作用可能に（ｏｐｅｒａｂｌｙ）連結されたｌａｃプロ
モーター／オペレーター及び１ｐｐプロモーターを含有
する。
ｅ）プラスミドｐａｌ（１０９により大腸菌ＨＢ　１０
１の形質転換 カルシウム処理された大腸菌Ｈｅ　１吋による形質転換
を前記のようにして行う。使用した全反応混合物は５５
／’である。
ｆ）プラスミドｐＢ８１０９を含有するクローンのスク
リーニング １００個の形質転換されたコロニーを培養し、各コロニ
ーからプラスミドＤＮＡを調製し、そしてＥｃｏＲＩで
消化する。ＥｃｏＲＩにより消化されないすべてのプラ
スミドＤＮＡはＥｃｏＲＩ部位を欠く有効なプラスミド
ｐＢＨ１０９である。
２個の同一のコロニーが同定された。その内の１つを選
択し、そしてｐＢＨ１０９と命名する。
ｏｍｐＡ−２リ一ダー配列に続＜Ｆ、−Ｆ、−ＤＮＡの
正しい配列を配列分析により確認する。
ヒルジンの　　　　Ｇｉｎ　Ｇｌｙ　Ａｓｎ　Ｌｙｓ　
Ｃｙｓ　ｌｉｅ　Ｌｅｕコード配列　　５　’　ＣＡＧ
　ＧＧＴ　ＡＡＣＡＡＡ　ＴＧＣＡＴＣＣＴＧ　３　’
変異原 プライマー１ ３　’　ＧＴ［：　ＣＣＡ　ＴＴＧ　ＴＴＡ　ＡＣＧ　
ＴＡＧ　ＧＡＣ５’変異した　５　’　ＣＡＧ　ＧＧＴ
　ＡＡＣＡＡＴ　ＴＧ［：　ＡＴＣＣＴＧ　３　’コー
ド配列　　　　Ｇｉｎ　Ｇｌｙ　Ａｓｎ　Ａｓｎ　［：
ｙｓ　Ｉｌｅ　Ｌｅｕアプライド・バイオシステムス（
モデル３８０Ｂ）合成機により、ホスホラミデート法Ｃ
Ｍ、　Ｈ，Ｃａｒｕ−ｔｈｅｒｓ、　Ｃｈｅｍｉｃａｌ
　ａｎｄ　Ｆｉｎｚｙｍａｔｉｃ　５ｙｎｔｈｅｓｉｓ
　ｏｆＧｅｎｅ　Ｆｒａｇｍｅｎｔｓ（Ｈ，Ｇ、　Ｇａ
５５ｅｎ及びＡ、　Ｌａｎｇ編）ＶｅｒｌａｇＣｈｅｍ
ｉｅ、　Ｗｅｉｎｈｅｉｍ、西独〕を用いて変異原プラ
イマーを合成する。
５ＩのＭ１３ｍｐ１９二本鎮Ｄ　Ｎ　Ａ　（ｄｓ−ＤＮ
Ａ　；　０．１　ｇ／−；　ＢＲＬ）に、２ｐＩの反応
媒体２　［５００ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ！　　（ｐＨ
８，０）、　　１００ｍＭ　ＭｇＣｊ！２．　５００ｍ
Ｍ　ＮａＣ１］（ＢＲＬ）　、１ｄのＸｂａ　Ｉ　（Ｉ
ＯＵ／ａ’　）　、０．５　ｔｄのＢａｍＨＩ　　（Ｉ
ＯＵ／ｄ）及び１２ｍの水を加える。３７℃にて１．５
時間のインキュベーションの後、０．５７’のＢａｍＨ
Ｉ、２．５１１１の反応媒体３　（５００ｍＭ　Ｔｒｉ
ｓ−ＨＣ１（ｐＨ８，０）、　１００ｍＭ　ｕｇ１２．
１０００ｍＭ　Ｎａ［［：］（ＢＲＬ）　、及び２Ｉの
水を加え、そして３７℃にて１時間インキュベーション
を続ける。容量を水により１００ｐ１にする。このｄｓ
−ＤＮＡをフェノール抽出及びエタノール沈澱により単
離し、そして３０ｄのＴＥ緩衡液＜１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ
−ＨＣＩ、　１＋Ｔｌ１Ｍ　ｌ１ｉＤＴＡ、　ｐＨ８，
０）に溶解する。
ＤＮＡの挿入 ５河のプラスミドｐＢＨ１０９をＸｂａ　Ｉ及び３ａｍ
ＨＩ　ｌ：より上記の様にして切断し、そして消化物を
、３．５％ポリアクリルアミドゲルをＩＸＴＨＥ緩衝液
（ＩＯＸ　ＴＢＩＥ緩衝液：　１０８ｇ　Ｔｒｉｓ、　
５５ｇ硼酸、９．３ｇ　ＢＤＴＡ　　・２Ｈ２０＃）と
共に用いて１５０Ｖにて３時間電気泳動する。１０／＋
７の臭化エチジウム溶液（水中１に／ｍｊりを含有する
ＩＸＴＢＥ緩衝液４０〇−にゲルを浸漬した後、ヒルジ
ン遺伝子（２５０ｂｐ）を含有するＸｂａ　Ｉ　−Ｂａ
ｍＨＩ断片をＵＶ光のもとて可視化する。制限断片を含
有するゲル部分をゲルから切り取り、そして５００１ｄ
の０．５ＸＴＢＥと共に透析バッグに入れ、そして泳動
緩衝液として０．５Ｘ　ＴＢＥを用いて８１０−ＲＡＤ
　ミニゲル電気泳動装置中で１７０Ｖにて３０分間、Ｄ
ＮＡを電気溶出する。
ＤＮＡを、０．５ＸＴＢＢにより平衡化したエルチップ
（Ｂｌｕｔｉｐ）　−ｄカラム（Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ
　＆　５ｃｈｕｌｌ）　に負荷する。カラムを２−の０
．５ＸＴＢＢで洗浄し、そしてＤＮＡを０．５　Ｘ　Ｔ
ＢＨ（ｌ　ｄ）中ＩＭＮａＣｊ７により溶出する。ＤＮ
Ａをエタノールにより沈殿せしめ、そして１０ＩのＴＥ
緩衝液中に再溶解する。
５１ｄのＸｂａ　Ｉ　＝ＢａｒｒｒＨＩヒルジン挿入部
、２ＩのＸｂａ　Ｉ　−ＢａｍＨＩ切断Ｍ１３ｍｐ１９
．１７’のＩＯＸリガーゼ緩衝液（５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ
−ＨＣｊ！　（ｐＨ７，５）、　１０ｍ！、４ＭｇＣ１
２，１０ｍＭ　ジチオスレイトール〕、ＩＩｄのＡＴＰ
、及び１．５４のＴ、　ＤＮＡリガーゼ（ＢＲＬ、ＩＵ
／Ｉ）を混合し、そして１４℃にて一夜インキユベート
する。Ｊ、Ｍｅｓｓｉｎｇ　　（Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ
　ｔＥｎｚｙｍｏｌｏｇｙｌｏｌ、　２ｌ−７８（１９
８３）　）の方法に従って大腸菌ＪＭＩＯＩコンピテン
ト細胞を形質転換する。１２個の透明なプラークを拾い
、そして各プラークからＪ、　Ｍｅｓｓｉｎｇ（前掲）
により記載されるようにして各プラークから単鎖ＤＮＡ
　（ｓｓ−ＤＮＡ）を調製する。このＭ１３ｍｐ１９／
ヒルジンと称するＤＮＡを５０ＩのＴＥ緩衝液（０，１
〜０．５ｔ／ＩＩ”）と再溶解する。
■１部位特定変異誘発 ２ＱＯｐｍｏｌ　（２３１１１）の変異原ブライ７−１
＜前記を参照のこと）を、３ｐ１のＩＯＸキナーゼ緩衝
液（ＬＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＬ　Ｏ，ＬＭ　ＭｇＣｊ！　
２．０．１Ｍジチオスレイトール、ｐＨ８，３）　、３
ｄのｌＱｍＭ　ＡＴＰ、及びＩＩのＴ、ポリヌクレオチ
ドキナーゼ（ＢＲＬ　、１０　Ｕ　／ｄ　）を加えるこ
とによりリン酸化する。３７℃にて１時間のインキュベ
ーションの後、６５℃にて１０分間加熱することにより
反応を停止せしめる。
６１１Ｉ（０，５ｆｆ）の単鎖Ｍ１３ｍｐ１９／ヒルジ
ンを３ｄ　（２０ｐｍｏｌ）のリン酸化された変異原オ
リゴデオキシリボヌクレオチド（６，６ｐｍｏｌ　／ｌ
ｓ　）及びｌ１１１の緩衝液Ａ　Ｃ０，２Ｍ　Ｔｒｉｓ
−ＨＣｊ！　（ｐｆ１７．５）、　０．ＩＭＭｇＣＬ、
　　０．５Ｍ　Ｎａ［Ｃ０，ＯＩＭ　ＤＴＴ　］　と共
に７０℃にて５分間インキコベートし、そして３０分間
にわたって徐々に室温まで冷却する。
延長一連結反応 前記のアニール処理された混合物に１ｔｄの１１（Ｍｒ
液Ｂ　［０，２Ｍ　Ｔｒｉｓ−Ｈｆｌ’Ａ　＜ｐＨ７，
５）、　０．１ＭＭｇＣｌ！２゜０．０１Ｍ　ＤＴＴ　
）　、Ｉ　ｍの１０ｍ！、Ｉ　ＡＴＰ、　４ｍの２ｍＭ
　ｄＮＴＰ混合物、５ｐ１のＴ４　ＤＮＡポリメラーゼ
（Ｂｏｅｈｒ　ｉ　ｎｇｅｒ。
ＩＵ／１１り、及び５ＩのＴ、　ＤＮＡリガーゼ（ＢＲ
Ｌ。
ＩＵ／ｄ）を加える。この混合物を１６℃にて３時間イ
ンキュベートする。６５℃にて１０分間インキュベート
することにより反応を停止する。
形質転換及び単鎖変異体ＤＮＡの調製 前記連結混合物を水により１：２０で稀釈し、そしてそ
の１ｐＩ及び５ｍ、並びに未稀釈の連結混合物ＩＩを用
いてコンピテント大腸菌ＢＭＨ７１−８７１−８ｌ細胞
（Ｂ、にｒａｍｅｒ、　Ｗ、Ｋｒａｍｅｒ及びＨ８−Ｊ
、Ｆｒ１ｔｚ、　Ｃｅ１１３８、８７９−８８７（１９
８４）　）を形質転換する。［Ｍ１３ｃｌｏｎｔｎｇ　
ａｎｄ　ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ　Ｈａｎｄｂｏｏｋ　Ｊ
　（Ａｍｅｒｓｈａｍにより発行）に記載されているよ
うにしてプレートする。１２個の無色のプラークを拾い
、そして５Ｓ−ＤＮＡを前記のようにして調製する。
変異についての単６Ｍ　Ｄ　Ｎ　Ａのスクリーニング変
異した単鎖Ｄ　Ｎ　Ａについてスクリーニングするため
、１２個の５ｓ−ＤＮＡサンプルのそれぞれをジデオキ
シヌクレオチド・チエイン・ターミネーション法ＣＦ、
Ｓａｎｇｅｒ、　Ｓ、Ｎ１ｃｋｌｅｒ及びＡ、　Ｒ，Ｃ
ｏｕｌｓｏｎ。
Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　７
４．５４６３−５４６７（１９７７）　）により配列決
定する。まず、予想される変異した塩基に対応するジデ
オキシヌクレオチドのみを反応において使用する。次に
、幾つかの陽性変異体からの５ｓ−ＤＮＡを、Ｔａｂｏ
ｒ及びＲｉｃｈａｒｄｓｏｎ　（Ｐｒｏｃ。
Ｎａｔｌ、＾ｃａｄ、Ｓｃｉ　ＵＳＡ　８４．４７６７
−４７７０１９８７）　）の方法に従ってＴ、　ＤＮＡ
ポリメラーゼ（Ｓｅｑｕｅｎａｓｅ、　ｔｌｓＢ）を用
いて配列決定して変異体の全ＤＮＡ配列を確立する。組
換えヒルジンの２７位のＬｙｓ−＋Ａｓｎ変異をコード
する予想通りの塩基変化がＤＮＡ配列中に観察される。
予想通りの配列を有するファージＤＮＡをＭ１３ｍｐ１
９／ヒルジンに２７Ｎと称する。
ｒＭ１３　ｃｌｏｎｉｎｇ　ａｎｄ　ｓｅｑｕｅｎｃｉ
ｎｇ　）ｌａｎｄｂｏｏｋ　Ｊ（Ａｍｅｒｓｈａｍ発行
）に記載されているようにして、コンピテント大腸菌Ｊ
Ｍ　１０１細胞を１０〜２０ｎｇの単鎖ヒルジンに２７
Ｎ変異体ＤＮＡにより形質転換しそしてｄｓ−ＤＮＡを
調製する。４０〜５０ｇの収量のｄｓ−［］ＮＡが１０
０−の培養物から得られる。
変異体ヒルジンＸｂａ　Ｉ　−ＢａｍＨＩ挿入部の単離
変異したヒルジンＸｂａ　Ｉ　−ＢａｍＨＩ挿入部を２
５籍のｄｓ−ＤＮＡから切り出し、そしてセクションＩ
Ｂに記載したようにして精製する。ＤＮＡを２０ｄの無
菌水に溶解する。
Ｘｂａ　　Ｉ　−ＢａｍＨＩ切断ｐｌＮ−ＩＩＩ−ｏｍ
ｐＡ−２ヘクターＤＮＡの調製 ６Ｉの反応媒体２（ＢＲＬ）　、２ｄ　（２０ユニツト
）のＸｂａ　Ｔ、ｌｉ　　（ｌＱユ＝７ト）の１３ａｍ
ｌ（Ｉ、１ｙ（１０ユニツト）の［１ｃｏＲＩ及び３２
１１！の水（合計５０Ｍ’）を加え、そして３７℃にて
３時間インキュベートすることにより約１．５ｎのｐｌ
Ｎ−Ｉ［−ｏｍｐＡ−２プラスミドの消化物を調製する
。ｌｌ１１（１０ユニツト）のＢａｍＨＩ、　　Ｌｄ　
　（１０ユニツト）　（ＤＥｃｏＲＩ、５ｐ１の反応媒
体３　（ＢＲＬ）及び１２ｊ’の水を加え、そしてイン
キュベーションを３７℃にて１時間続ける。
ＤＮＡの連結 ９Ｉｄのヒルジンに２７Ｎ　Ｘｂａ　Ｉ　−ＢａｍＨＩ
挿入部ＤＮＡ、２１１１のＸｂａ　Ｉ　−ＢａｍＨＩ切
断ｐＩＮ−ｍ−ｏｍｐｆｉ、−２ヘクターＤＮＡ、３ｄ
の１０Ｘ連結緩衝液（ＢＲＬ）及びＩＩｄ（ＩＵ／１１
りのＴ４　ＤＮＡリガーゼ（ＢＲＬ）を混合し、そして
１４℃にて１６〜２０時間インキニベートする。
Ｊ、　Ｍｅｓｓｉｎｇ（前掲）の方法に従って、５Ｉの
連結反応混合物を用いて０．３ｒｒｔｌ！の大腸菌ＪＭ
　１０１コンピテント細胞を形質転換する。３ｒｎｌの
２ＸＹＴ／アンピシリン（５０ｎアンピシリン／−２Ｘ
　ＹＴ）をサンプルに加え、そして細胞を室温にて１時
間増殖せし袷る。培養物の１ｍＮのサンプルを取り、そ
してＬＢ／アンピシリン（５０〜アンピシリン／ｍｊ！
　ＬＢ−寒天）プレート上に注ぎ、そして３７℃にて一
夜増殖せしめる。この形質転換プラスミドＤＮＡをｐｌ
Ｎ−ＩＩＩ−ｏｍｐＡ−２／ＨＩＲ−に２７Ｎと称する
。
〔ＡＳｎ２１〕−テスルファトヒルジン発現コロニーの
選択 ＬＢ／アンピシリンプレートから１０個の細菌コロニー
を拾い、そして５ｍ７！のＬＢ／アンピシリン（５０ｎ
アンピシリン／ｍｉ’　ＬＢ）中で３７℃にて５時間、
別々に増殖せしめる。１ｍＩ！のサンプルを各培養チュ
ーブから取り、そして細胞を遠心分離により回収する（
３００ｈｇ、　５分間）。各サンプルの細胞を１００、
’の１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｊ！　（ｐＨ８，１）　
により０℃にて３０分間処理することにより浸透圧ショ
ックにかけて細菌のペリプラズム空間中の物質を放出せ
しめる。細胞を前記のようにして遠心分離により除去し
、そして上清をヒルジン活性について試験する。最も高
い阻害活性を示すサンプルをバッチ培養から選択する。
バッチ培養及び（Ａｓｎ”　］−デデスルファトヒルジ
の単離 最も活性なサンプルからの残りの細胞（４ｒｄ分）を用
いて１１のＬＢ／アンピシリン（５にアンピシリン／ｍ
ＩＬＢ）に接種する。培養物を３７℃にて一夜増殖せし
め、そして細胞を遠心分離（３０００ｘｇにて１５分間
）により回収する。細胞ペレットを５０ｍ１の１０ｍＭ
　Ｔｒｉｓ−）ＩＣｊ！　（ｐ）１８．１）　に０℃に
て１時間再懸濁することにより浸透圧ショックをかける
。
６０００ｘｇにて１０分間の遠心により細胞をペリプラ
ズム画分から除去する。
（Ａｓｎ”　）−デスルファトヒルジンの精製ペリプラ
ズムの画分のｐＨを０．１ＭＨＣｌにより６．５ニ調整
し、そして０．４５ｖｍ　７　、（ルター（Ｎａｌｇｅ
ｎｅ）を通して濾過する。蛋白質を、５ＱｍＭ　ｂｉｓ
−Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ！緩衝液（ｐＨ６，５）により平衡
化したＭｏｎｏ−ＱカラムＦＰＬＣ系（Ｆａｓｔ　Ｐｒ
ｏｔｅｉｎ　Ｌｉｑｕｉｄ　Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐ
ｈｙ。
Ｐｈａｒｍａｃｉａ−ＬＫＢ）に負荷する。ｂｉｓ−Ｔ
ｒｉｓ−ＨＣＲ（ｐＨ６，５）中０−３００ｍＭ　Ｎａ
Ｃｊ！の４５分間にわたる直線グラジェントを用いてデ
スルファトヒルジン変異体をカラムから溶出する。カラ
ム溶出液の０．８ｒｒｌずつの画分を集め、そして前記
のようにしてヒルジン活性について試験する。デスルフ
ァトヒルジン変異体含有画分をプールし、上記のように
して濾過し、そして水中０．０９Ｖ／Ｖ％トリフルオロ
酢酸により平衡化されたＢｒｏｗｎｌｅｅ　Ｌａｂｓ　
Ｃ８逆相ＨＰＬＣカラムを用いてＭｉｌｌｉｐｏｒｅ−
Ｗａｔｅｒｓ　ＨＰＬＣ系上でクロマトグラフ処理する
。水中０．０９　Ｖ　／　Ｖ％トリフルオロ酢酸中７〜
２８　Ｖ　／　Ｖ％アセトニ）　ＩＪルの直線グラジェ
ントによりカラムからヒルジン変異体を溶出する。約９
８％以上の純度を有する［Ａｓｎ”　］−デスルファト
ヒルジンを２８分における単一ピークとして得る。
Ｄ、ヒルジンの残基Ｌｙｓ　２７からＧ１ｎ２７への、
及ヒルジンの　　　Ｇｌｎ　Ｇｌｙ　Ａｓｎ　Ｌｙｓ　
Ｃｙｓ　ｆｌｅ　Ｌｅｕコード鎮　５　’　ＣＡＧ　Ｇ
ＧＴ　ＡＡＣＡＡＡ　ＴＧＣＡＴＣＣＴＧ　３　’変異
した　　５　’　ＣＡＧ　ＧＧＴ　ＡＡＣＣＡＡ　ＴＧ
ＣＡＴＣＣＴＧ　３　’コード鎖　　　　　Ｇｉｎ　Ｇ
ｌｙ　Ａｓｎ　Ｇｉｎ　Ｃｙｓ　Ｉｌｅ　Ｌｅｕｂ　：
　Ｌｙｓ　４７からＡｒｇ４７への変異ヒルジンの　　
　Ｇｌｙ　Ｔｈｒ　Ｐｒｏ　Ｌｙｓ　Ｐｒｏ　Ｇｌｎ　
Ｓｅｒコード鎮　５　’　ＧＧＴ　ＡＣＣＣＣＧ　ＡＡ
Ａ　ＣＣＧ　ＣＡＧ　ＴＣＴ　３　’変異原プライマー
２Ａ及び２Ｂを用いて前記の方法を繰り返し、Ｌｙｓ　
２７がＧｉｎ　２７により置き換えられておりそしてＬ
ｙｓ　４７がＡｒｇ　４７に置き換えられている目的の
変異体蛋白質を得、そして特徴付ける。形質転換プラス
ミドＤＮＡをｐＩＮ−Ｉ［−ｏｍｐＡ−２／ＨＩＲ−に
２７Ｑ、　Ｋ４７Ｒと称する。この変異体蛋白質を〔Ｇ
１ｎ２１．Ａｒｇ４７〕−デスルファトヒルジンと称す
る。
ヒルジンの コード鎖 変異原 プライマー３ Ａｓｐ　Ｇｌｙ　Ｇｌｕ　Ｌｙｓ　Ａｓｎ　Ｇｌｎ　Ｃ
ｙｓ５’Ｇ八ＣＧＧＴ　　ＧＡＡ　　ＡＡＡ　　ＡＡＣ
ＣＡＧ　　ＴＧＣ３’３’ＣＴＧ ＣＡ ＧＴＴ ＧＴＴ　ＴＴＧ ＧＴＣＡＣＧ ５′ 変異した　　５　’　ＧＧＴ　ＡＣＣＣ［：Ｇ　ＡＧＡ
　ＣＣＧ　［：ＡＧ　ＴＣＴ　３　’　　　変異したコ
ードｍｊ４　　　　　　Ｇｌｙ　Ｔｈｒ　Ｐｒｏ　Ａｒ
ｇ　Ｐｒｏ　Ｇｉｎ　Ｓｅｒ　　　　　　コード鎖５　
’　ＧＡＣＧＧＴ　ＧＡＡ　ＣＡＡ　ＡＡＣ［：ＡＧ　
ＴＧＣ３’Ａｓｐ　Ｇｌｙ　Ｇｌｕ　Ｇｉｎ　Ａｓｎ　
Ｇｉｎ　Ｃｙｓｂ）　Ｌｙｓ　２７からＧ１ｎ２７への
変異Ｌｙｓ　２７からＧ１ｎ２７への変異はＤ（前記）
に従って行う。
ｃ　）　Ｌｙｓ　４７からＡｒｇ４７への変異Ｌｙｓ　
４７からＡｒｇ４７への変異はＤ（前記）に従って行う
。
前記の方法を変異原ブライマー２Ａ、３及び２Ｂを用い
て行い、Ｌｙｓ　２７がＧｉｎ　２７に置き換えられて
おり、Ｌｙｓ　３６がＧｉｎ　３６により置き換えられ
ており、そしてＬＹＳ　４７がＡｒｇ　４７により置き
換えられている目的の変異体蛋白質を得、そして特徴付
ける。形質転換プラスミドＤＮＡをｐｌＮ−ＩＩＩ−ｏ
ｍｐＡ−２／ＩＩＩＲ−に２７０．　Ｋ３６Ｑ、　Ｋ４
７Ｒと称する。変異体蛋白質を（Ｇｌｎ”、　Ｇ１ｎ３
６．　Ａｒｇ”　）−デスルファトヒルジンと称する。
Ｆ。
メチオニン残基による ＣＧｉｎ”、　Ａｒｇ４ｆｆ　）− ヒルジンの コード鎖 変異原 ブライマー　　４ 変異した コード鎖 シグナル配列　　　Ｖａｌ　Ｖａｌ　Ｔｙｒ　Ｔｈｒ　
Ａｓｐ　Ｃｙｓ５　’　ＧＣＧ　ＣＡＧ　ＧＣＣ・・・
ＧＴＴ　ＧＴＴ　ＴＡＣＡＣＣＧＡＣＴＧＣ３′ ＣＧＣＧＴＣＣＧＧ　ＴＡＣＣＡＡ　ＣＡＡ　ＡＴＧ　
ＴＧＧ　［：ＴＧ　ＡＣＣ５’　ＧＣＧ　ＣＡＧ　ＧＣ
ＣＡＴＧ　ＧＴＴ　ＧＴＴ　ＴＡＣＡＣＣＧＡＣＴＧＣ
シグナル配列　Ｍｅｔ　Ｖａｌ　Ｖａｌ　Ｔｙｒ　Ｔｈ
ｒ　Ａｓｐ　Ｃｙｓ変異原ブライマー２Ａ・２Ｂ及び４
を用いて前記の方法を反復することにより、［Ｇｌｎ”
、　Ａｒｇ”］−デデスルファトヒルジのＮ−末端がＭ
ｅｔにより延長されている目的の変異体蛋白質を得、そ
して特徴付ける。この蛋白質をメチオニル−（Ｇｉｎ”
Ａ、ｇ４７）−デスルファトヒルジンと称する。
ヒルジンの残基Ｇｌｕ　５７．５８．６１．６２の残基
ンと称する。
Ｌｅｕ　Ｇｉｎ ［’ＴＧ　ＣＡＧ　　３’ ［ ＣＴＧ　ＣＡＧ　　３’ Ｌｅｕ　　Ｇｌｎ 変異原ブライマー５を用いて前記の方法を反復すること
により、Ｇｌｕ　５７．５８，６１．６２がＧ１ｎ５７
゜５８．６１．６２により置き換えられている目的の変
異体蛋白質を得、そして特徴付ける。この変異体蛋白質
ヲＣＧＩｎ”・５６・８１・６２〕−デスルファトヒル
ジブスルファトヒルジンをコードするＤＮＡ配列を、プ
ロリンをコードするオリゴヌクレオチドＣＣＡにより延
長する。生ずる新しいデスルファトヒルジンを酵母にお
いて発現せしめる。このものは、そのＣ−末端のプロリ
ンを伴って６６個のアミノ酸を含有する。このペプチド
を［Ｐｒｏ６６］　−デスルファトヒルジンと称する。
酵母発現プラスミドｐＪＤＢ２０７／ＧＡＰＦＬ−ＨＩ
Ｒ（第２図を参照のこと：ヨーロッパ特許出１１Ｎｏ、
２２５．６３３）を制限エンドヌクレアーゼＳａｌ　Ｉ
及びＥｃｏＲＩにより消化する。４７８ｂｐ　Ｓａｌ　
Ｉ　−ＢｃｏＲＩ断片を、ＴＢＥ緩衝液（９０ｍＭ　Ｔ
ｒｉｓ−塩基、９０ｍＭ硼酸、２．５ｍＭＢＤＴＡ、　
ｐＨ８，３）中０．８％分取用アガロースゲル上で分離
する。臭化エチジウムで染色された断片をゲルから単離
する。ＤＮＡを０．２ＸＴＢＥ緩衝液中で４５分間１０
０ｍＡにて電気溶出しそして０８５２　（ワットマン）
イオン交換クロマトグラフィーにより精製する。ＤＮＡ
をＤＨ５２カラムから高塩濃度緩衝液［１，５Ｍ　Ｎａ
Ｃ１，１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ｔｌｃｉ’　（ｐＨ８，０
）、　１ｍ！、ＩＢＤＴＡ　）により溶出し、エタノー
ルで沈澱せしめ、そして水にＯ，ｌｐｍｏｌ／ａｚの濃
度で再溶解する。この４７８ｂｐ　Ｓａｌ　Ｉ　−８ｃ
ｏＲＩ断片はＢｇｌ　Ｉ［−ＢｃｏＲＩＧＡＰＦＬプロ
モーター断片に融合したｐＢＲ３２２のＳａｌＩ−Ｂａ
ｍＨＩ配列を含有する。
プラスミドルＪ口８２０７／ＧＡＰＦＬ−ＨＩＲをＢａ
ｍ）ｌ　Ｉ及びＳａｌ　Ｉにより消化する。大５．７ｋ
ｂベクター断片を前記のようにして単離する。小７４０
ｂｐ断片も単離する。このものは、デスルファトヒルジ
ンのコード配列に読枠を合わせて融合したｐＨ０５Ｈｌ
ナル配列に加えて４７８ｂｐ　Ｓａｌ　Ｉ　−ＢｃｏＲ
Ｉ断片（上記参照のこと）を含有する。この７４０ｂｐ
断片を＾５ｕｌＪにより消化する。ＤＮＡをフェノール
／クロロホルムにより抽出し、エタノールにより沈澱せ
しめ、そして水に再溶解する。
次の式： ％式％ で表わされる合成オリゴヌクレオチドを、４０ｔＩＩの
６０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−Ｈｌ　（ｐＨ７，５）、　１０ｍ
Ｍ　ＭｇＣ１ｚ、　　５ｍＭ　ＤＴＴ。
Ｑ、５ｍＭ　ＡＴＰ及び２７ＵのＴ、ポリヌクレオチド
キナーゼ（Ｂｏｅｈｒ　ｉｎｇｅｒ）中で３７℃にて４
５分間キナーゼ処理する。オリゴヌクレオチド（１）　
り反応混合物とオリゴヌクレオチド（２）のそれを−緒
にする。
この混合物を７５℃にて１０分間加熱し、そして室温に
放冷する。アニールされたオリゴヌクレオチドリンカー
（１＋２）を−２０℃にて貯蔵する。
０、８５ｇ　（３，８ｐｍｏｌ）のＡｓｕ　Ｕ消化ＤＮ
Ａを１５℃にて１６時間、１００倍過剰量のキナーゼ処
理されそしてアニールされたオリゴヌクレオチドリンカ
ーと１５０−’の６０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−）ＩＣｆ　　（
ｐ）１７．５）、　　１０ｍ！Ｊ　ＭｇＣｊ！２゜５ｍ
Ｍ　ＤＴＴ、　　３．５ｍＭ　ＡＴＰ及び１２００　Ｕ
のＴ、　ＤＮＡリガーゼ（バイオラプス）と共にインキ
ユベートする。
８５℃にて１０分間にわたりＴ、ＤＮＡＩＪガーゼを不
活性化した後、１０ｒｎＭ　ＢＤＴ＾、３００ｍＭ酢酸
ナトリウム（ｐＨ６，０）及び０，５４容量のイソプロ
パ〕−ルの存在下でＤＮＡを沈殿せしめることにより過
剰のリンカ−を除去する。生ずる断片をＴＢＥ緩衝緩衝
液９仔 断片を電気溶出によりゲルから回収しそしてエタノール
沈澱せしめる。ＤＮＡを０．　１　ｐｍｏｌ　／Ｉｄの
濃度に再懸濁する。ＢｃｏＲ　Ｉ　−Ｂａｍｔｌ　Ｉ断
片は、Ｐｒｏ　６６をコードする追加のＣＣＡトリブレ
ットと共にデスルファトヒルジンのコード配列を含有す
る。
上記のようにして単離した３つのＤＮＡ断片を次の反応
により連結する。すなわち、０．　２　ｐｍｏｌの４７
８ｂｐ　Ｓａｌ　Ｉ　−ＥｃｏＲ　Ｉ断片、Ｑ．２ｐｍ
ｏｌの２６２ｂｐＢｃｏＲ　Ｉ　−ＢａｍＨ　Ｉ断片及
びＱ，　ｌ　ｐｍｏｌの６．７ｋｂヘクタ一断片を１０
ｉｄの６０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｆ　　（ｐＨ７．　５
）、　１０ｍＭＭｇＣ　１　２．　　５　ｍＭ　ＤＴＴ
，　　１　ｆｎＭ　ＡＴＰ及び２００　ＵのＴ，　ＤＮ
Ａリガーゼ中で１５℃にて６時間連結する。この連結混
合物のｌ１１１のアリコートを１００Ｉｄのカルシウム
処理された形質転換コンピテント大腸菌ＨＢ　１０１細
胞に加える。
１２個の形質転換されたアンピーシリン耐性コロニーを
１００ｍｇ／Ｉ！のアンピシリンを含有するＬＢ培地中
で増殖せしめる。プラスミドＤＮＡを調製し［：Ｈｏｌ
ｍｅｓら、Ａｎａｌ，Ｂｉｏｃｈｅｍ，　　１１４（１
９８１）、　　１９３）、そしてＢａｍＨ　Ｉ及びＢｃ
ｏＲ　Ｔによる二重消化によって分析する。ＤＮＡ中の
変異の存在をＤＮＡ配列決定［Ｓａｎｇｅｒら、Ｐｒｏ
，Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ，　　ＵＳＡ　７４（１
９７７）５４６３］により確認する。ヒルジン構造遺伝
子中にＣＣＡコドンを有する１つのクローンをｐＪＤＢ
２０７／ＧＡＰＦＬ−ＨＩＲ（Ｐｒｏ　６６）と称する
。
■．ヒルジンの残基Ｖａ１１　、　２からｌ１ｅｌ，２
への変異 ヒルジンの　　シグナル配列　Ｖａｌ　Ｖａｌ　Ｔｙｒ
　Ｔｈｒ　八ｓｐ　Ｃｙｓコード鎮　５　’　ＧＣＧ　
ＣＡＧ　ＧＣＣ　ＧＴＴ　ＧＴＴ　ＴＡＣ　ＡＣＣ　Ｇ
ＡＣ　ＴＧ［：　３　’変異しｔこ　　５　’　　ＧＣ
Ｇ　　ＣＡＧ　　ＧＣＣ　　ＡＴＴ　　ＡＴＴ　　ＴＡ
Ｃ　　Ａ（１：Ｃ　　ＧへＣＴＧＣ３’コード鎮　　シ
グナル配列　１１ｅ　Ｉｌｅ　Ｔｙｒ　Ｔｈｒ　Ａｓｐ
　Ｃｙｓ変異原ブライマー６を用いて前記の方法を反復
シテ、Ｎ−末端アミノ酸Ｖａｌ　　１　、　２がｌ１ｅ
ｌ，２により置き換えられている目的の変異体蛋白質を
得、そして特徴付ける。この変異体蛋白質を（Ｉ　Ｉｅ
’°２〕−デスルファトヒルジンと称する。
Ｊ、ヒルジンの残基Ｖａｌ　　１からＧｌｙ　　ｌへの
変異ヒルジンの　　シグナル配列　Ｖａｌ　Ｖａｌ　Ｔ
ｙｒ　Ｔｈｒ　Ａｓｐ　Ｃｙｓコード鎮　５　’　ＧＣ
Ｇ　ＣＡＧ　ＧＣＣＧＴＴ　ＧＴＴ　ＴＡＣＡＣＣＧＡ
ＣＴＧＣ変異原 ブライマー　７ ３　’　ＣＧＣＧＴＣＣＧＧ　ＣＣＡ　ＣＡＡ　ＡＴＧ
　ＴＧＧ　ＣＴＧ　ＡＣＧ変異した コード鎖 ５　’　ＧＣＧ　ＣＡＧ　ＧＣＣＧＧＴ　ＧＴＴ　ＴＡ
ＣＡＣＣＧＡＣＴＧＣシグナル配列　Ｇｌｙ　Ｖａｔ　
Ｔｙｒ　Ｔｈｒ　Ａｓｐ　Ｃｙｓ変異変異原プライマー
用いて前記の方法を反復することにより、Ｎ−末端アミ
ノ酸Ｖａｌ　　１がＧｌｙｌにより置き換えられている
目的の変異体蛋白質を得、そして特徴付ける。この変異
体をＣＧ１ｙ’１−デスルファトヒルジンと称する。
同様にして例３に詳述した方法を適用することにより、
デスルファトヒルジンＨＶ　１　、ヒルジンＨＶ２及び
ヒルジンＰＡの他の所望の変異体を製造することができ
る。
３′ ５′ ３′ 例　２．　ヒルジンを含有するヒト血漿における口効果 ＡＰＴＴ測定〔＾ｃｔｉｖａｔｅｄ　ｐａｒｔｉａｌ　
ｔｈｒｏｍｂｏｐｌａｓｔｉｎｔｉｍｅ　　；　Ｂａ５
ｕら（１９７２）、　　Ｎ、Ｅｎｇｌ、Ｊ、Ｍｅｄ、　
２８？、　３２４に従って血液凝固を測定するための手
段〕の１分間前に種々の濃度のヒルジン（食塩水中）が
添加されたヒト血漿に対してヒルジンの抗凝固効果を測
定する。種々の濃度のＦ■（製造者の明細に行って水に
溶解）を添加し、そして結果を第３図に示す。ヒルジン
の抗凝固効果をＡＰＴＴにより測定する。その結果は、
ヒルジンを添加してない未処理のヒト血漿を用いる廖ｔ
がマツチした食塩対象に比較して抗凝固の程度とは無関
係のヒルジンの抗凝固効果の低下を示す。
ラットに、ビヒクルとして食塩水を用いてヒルジンの種
々のポルス（ｂｏｌｕｓ）量を尾静脈を介して静脈内投
与する（ｌｒｄ、／ｋｇ）。適当な場合には種々の量の
Ｆ■（製造者の明細に従って水に溶解したもの）を同時
投与によりラットに投与する。結果を第４図に示す。こ
の図は抗凝固の低下を示している。この結果には容量が
マツチした食塩対照も加えである。
ラットにヒルジンのポルス量（３ｍｇ／ｋｇ）を尾静脈
を介して静脈内投与（１ｍｌ／ｋｇ）して早い時点にお
ける高レベルの抗凝固を生じさせる。ヒルジン処理の後
２分間及び１０分間の時点において、ラットに１２０Ｕ
／ｋｇのＦ■を静脈内に投与する（２〜４ｄ／ｋｇ）。
Ｆ■は製造者の明細に従って水に溶解する。この結果を
第５図に示す。この結果は、容量がマツチした食塩対照
に比較してヒルジンの作用の持続時間をＦ■が短縮する
ことを示している。
例　５．　ヒルジンの注入により誘導される増加しの効
果 ヒルジン（食塩中）を頚静脈を介してラットに０．０１
２５　ｔａｇ／　ｋｇ／分の速度で注入して、対照ＡＰ
ＴＴの約２，５倍の抗凝固レベルを得る。注入の２０分
間目においてＦ■（製造者の明細に従って水に溶解した
もの）を尾静脈を介してポルスとして３０．６０及び１
２０Ｕ／ｋｇで静脈内投与した。結果を第６図に示す。
この結果は、注射の５分間以内にＡＰＴＴが有意に低下
することを示している。結果を容量がマツチした食塩対
照と比較する。
１−デアミノ−８−Ｄ−アルギニンバソプレッシン（Ｄ
［１ＡＶＰ）　（無菌食塩水中０．３ｍｇ／ｋｇ）を１
５分間にわたり０〜１５分の間、ヒトの志願者に注入す
る。
次に、血液サンプルを取り、そしてＦ■レベルを測定し
ＣＬａｎｇｄｅｌｌら（１９５３）、　Ｊ、Ｌａｂ、Ｃ
ｈｉｍ、Ｍｅｄ、　４１゜６３７〕そしてＡＰＴＴのヒ
ルジンにより誘導される増加に対する対応する効果をイ
ン−ビトロで評価する。結果を第７図に示す。この図は
１０人の志願者における研究の典型的な例を示している
。この結果が示すところによれば、ＤＤＡＶＰがＦ■レ
ベルを上昇せしめ、そしてヒルジンにより誘導される抗
凝固の程度を減少せしめる。この結果を容量がマツチし
た食塩水対照と比較する。
例２の方法を反復するが、ヒルジンの代りに次の抗凝固
剤を使用する。
結果を第８図〜第１２図に示す。この結果は、ファクタ
ーＶＩＩＩの添加により試験された種々の抗凝固剤の抗
凝固効果の低下を明らかに示している。
例　１２．　　　医薬製剤 デスルファトヒルジンを０．９％ＮａＣＩ溶液に溶解し
て最＃濃度０．２　ｒｎｇ／　ｍｊ！又は２ｍｇ／ｒｄ
とする。
この溶液を細菌学的フィルター（０，２２７−孔サイズ
）に通し、そして濾液を分割し、そして無菌条件下で２
ｍｌの無菌アンプルに導入する。
５０、０００ユニツトのファクター■を２０ｍ１ｌ！の
生理食塩水に溶解し、この溶液を限外濾過により無菌化
し、そして２−の無菌アンプルに分配する。
無菌化した溶液は、例えば静脈内注射のために直接使用
することもできる。
【図面の簡単な説明】
第１図は、プラスミドｐＭＬ３５０の作製過程を模式第
２図は、プラスミドｐＪＤＢ　２０７／ＧＡＰＦＬ−Ｈ
ＩＲのプラスミドマツプを模式的に示す。 第３図は、ヒルジンを含むヒト血漿におけるＡＰＴＴに
対するファクターＶＩＩＩのイン−ビトロ効果を示す。 第４図は、ラットにおけるヒルジンにより誘導されたＡ
ＰＴＴの増加に対する増加する量のファクターＶＩＩＩ
のインービボ効果を示す。 第５図は、ラットにおけるヒルジンの作用の持続に対す
るファクターＶＩＩＩのインービボ効果を示す。 第６図は、ヒルジンの注入により誘導された増加したラ
ット血漿ＡＰＴＴに対するファクターＶＩＩＩの効果を
示す。 第７図は、ヒト血漿中のファクター■レベルに対する０
ＤＡＶＰの注入の結果、及びイン−ビトロでのヒルジン
に誘導されたＡＰＴＴの増加に対する対応する効果を示
す。 第８図〜第１２図は、種々の抗凝固剤〔第８図：ヘハリ
ン；第９図：フラグミン；第１０図：　　（２Ｒ。 ４Ｒ）−４−メチル−１−（Ｎ２−　（３−（ＲＳ）−
メチル−１，２，３，４−テトラヒドロ−８−キノリニ
ル−スルホニル）−（Ｓ）−アルギニル〕−２−ピペリ
ジンカルボン酸；第１１図：　Ｄ−フェニルアラニル−
Ｌ−７’ロリルーし一アルギニンアルデヒドサルフェー
ト；第１２図二Ｎ“−（２−ナフタレンスルホニル−グ
リシル）−４−アミジノ（ＲＳ） 一フ二重ルアラニンピペリジド〕 を含有 するヒト血漿中のＡＰＴＴに対するファクターＶＩＩＩ
のイン−ビトロ効果を示す。

Claims (1)

  1. 【特許請求の範囲】 １、抗血液凝固剤に対する解毒剤として使用するための
    医薬の製造のための、ファクターVIIIもしくはその活性
    を維持しているファクターVIIIの断片又はその血中濃度
    を上昇せしめる物質の使用。 ２、抗血液凝固剤に対する解毒剤としての、ファクター
    VIIIもしくはその活性を維持しているファクターVIIIの
    断片又はその濃度を上昇せしめる物質の使用。 ３、前記抗血液凝固剤がヒルジン、ヘパリン、低分子ヘ
    パリン及び低分子スロンビン阻害剤である、請求項１又
    は２に記載の使用。 ４、前記血液凝固剤が、天然のもしくは合成のヒルジン
    変形態を包含するヒルジン、誘導体及び断片、並びにデ
    スルファトヒルジン変形体又は誘導体である、請求項３
    に記載の使用。 ５、前記抗血液凝固剤がデスルファトヒルジンＨＶ１で
    ある、請求項４に記載の使用。 ６、前記抗血液凝固剤がヘパリンである、請求項３に記
    載の使用。 ７、前記抗血液凝固剤がフラグミンである、請求項３に
    記載の使用。 ８、前記抗血液凝固剤が、（２Ｒ，４Ｒ）−４−メチル
    −１−〔Ｎ＾２−（３−（ＲＳ）−メチル−１，２，３
    ，４−テトラヒドロ−８−キノリニル−スルホニル）−
    （Ｓ）−アルギニル〕−２−ピペリジンカルボン酸、Ｄ
    −フェニルアラニル−Ｌ−プロリル−Ｌ−アルギニンア
    ルデヒドサルフェート、及びＮ＾α−（２−ナフタレン
    スルホニル−グリシル）−４−アミジノ−フェニルアラ
    ニン−ピペリジドから成る群から選択された低分子スロ
    ンビン阻害剤である、請求項３に記載の使用。 ９、ファクターVIIIの血中濃度を増加せしめる物質が１
    −デアミノ−８−Ｄ−アルギニンバソプレッシンである
    、請求項１又は２に記載の使用。 １０、（ａ）抗血液凝固剤を含有する組成物と（ｂ）フ
    ァクターVIIIもしくはその活性を維持しているファクタ
    ーVIIIの断片又はその血中濃度を上昇せしめる物質を含
    有する組成物とを含んで成る、個別に、同時に又は逐次
    的に使用するための組合せ製剤。 １１、前記抗血液凝固剤がヒルジン、ヘパリン、低分子
    ヘパリン及び低分子スロンビン阻害剤である、請求項１
    １に記載の組合せ製剤。 １２、前記血液凝固剤が、天然のもしくは合成のヒルジ
    ン変形態を包含するヒルジン、誘導体及び断片、並びに
    デスルファトヒルジン変形体又は誘導体である、請求項
    １１に記載の組合せ製剤。 １３、前記抗血液凝固剤がデスルファトヒルジンＨＶ１
    である、請求項１０に記載の組合せ製剤。 １４、前記抗血液凝固剤がヘパリンである、請求項１０
    に記載の組合せ製剤。 １５、前記抗血液凝固剤がフラグミンである、請求項１
    ０に記載の組合せ製剤。 １６、前記抗血液凝固剤が、（２Ｒ，４Ｒ）−４−メチ
    ル−１−〔Ｎ＾２−（３−（ＲＳ）−メチル−１，２，
    ３，４−テトラヒドロ−８−キノリニル−スルホニル）
    −（Ｓ）−アルギニル〕−２−ピペリジンカルボン酸、
    Ｄ−フェニルアラニル−Ｌ−プロリル−Ｌ−アルギニン
    アルデヒドサルフェート、及びＮ＾α−（２−ナフタレ
    ンスルホニル−グリシル）−４−アミジノ−フェニルア
    ラニン−ピペリジドから成る群から選択された低分子ス
    ロンビン阻害剤である、請求項１０に記載の組合せ製剤
    。 １７、ファクターVIIIの血中濃度を増加せしめる物質が
    １−デアミノ−８−Ｄ−アルギニンバソプレッシンであ
    る、請求項１０に記載の組合せ製剤。 １８、抗血液凝固剤を含む第一容器、及びファクターV
    IIIもしくはその活性を維持しているファクターVIIIの
    断片又はその血中濃度を増加せしめる物質を含む第二容
    器を含んで成るキット。 １９、前記抗血液凝固剤がヒルジン、ヘパリン、低分子
    ヘパリン及び低分子スロンビン阻害剤である、請求項１
    ８に記載のキット。 ２０、前記血液凝固剤が、天然のもしくは合成のヒルジ
    ン変形体を包含するヒルジン、誘導体及び断片、並びに
    デスルファトヒルジン変形体又は誘導体である、請求項
    １９に記載のキット。 ２１、前記抗血液凝固剤がデスルファトヒルジンＨＶ１
    である、請求項１８に記載のキット。 ２２、前記抗血液凝固剤がヘパリンである、請求項１８
    に記載のキット。 ２３、前記抗血液凝固剤がフラグミンである、請求項１
    ８に記載のキット。 ２４、前記抗血液凝固剤が、（２Ｒ，４Ｒ）−４−メチ
    ル−１−〔Ｎ＾２−（３−（ＲＳ）−メチル−１，２，
    ３，４−テトラヒドロ−８−キノリニル−スルホニル）
    −（Ｓ）−アルギニル〕−２−ピペリジンカルボン酸、
    Ｄ−フェニルアラニル−Ｌ−プロリル−Ｌ−アルギニン
    アルデヒドサルフェート、及びＮ＾α−（２−ナフタレ
    ンスルホニル−グリシル）−４−アミジノ−フェニルア
    ラニン−ピペリジドから成る群から選択された低分子ス
    ロンビン阻害剤である、請求項１８に記載のキット。 ２５、ファクターVIIIの血中濃度を増加せしめる物質が
    １−デアミノ−８−Ｄ−アルギニンバソプレッシンであ
    る、請求項１８に記載のキット。
JP1257982A 1988-10-06 1989-10-04 抗血液凝固剤に対する解毒剤 Pending JPH02145526A (ja)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
GB8823480.2 1988-10-06
GB888823480A GB8823480D0 (en) 1988-10-06 1988-10-06 Antidote

Publications (1)

Publication Number Publication Date
JPH02145526A true JPH02145526A (ja) 1990-06-05

Family

ID=10644806

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP1257982A Pending JPH02145526A (ja) 1988-10-06 1989-10-04 抗血液凝固剤に対する解毒剤

Country Status (13)

Country Link
EP (1) EP0367713B2 (ja)
JP (1) JPH02145526A (ja)
KR (1) KR0147294B1 (ja)
AT (1) ATE77752T1 (ja)
AU (1) AU624635B2 (ja)
CA (1) CA2000153C (ja)
DE (1) DE68901964T2 (ja)
DK (1) DK491289A (ja)
GB (1) GB8823480D0 (ja)
IE (1) IE61361B1 (ja)
IL (1) IL91886A (ja)
NZ (1) NZ230899A (ja)
ZA (1) ZA897586B (ja)

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1994008034A1 (en) * 1992-09-28 1994-04-14 Japan Energy Corporation Novel hirudine variant, process for producing the same, and anticoagulant containing the same as active ingredient
US5972648A (en) * 1993-09-28 1999-10-26 Japan Energy Corporation Hirudin analogs, methods of manufacture thereof and anticoagulant compositions having these as active ingredients

Families Citing this family (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
IL99527A (en) * 1990-09-28 1997-08-14 Lilly Co Eli Tripeptide antithrombotic agents
DE4430205A1 (de) * 1994-08-26 1996-02-29 Behringwerke Ag Zusammensetzungen, die als Gegenmittel für Blut-Antikoagulanzien geeignet sind und deren Verwendung
DE4437544A1 (de) 1994-10-20 1996-04-25 Behringwerke Ag Einsatz von vWF-enthaltenden Konzentraten als Kombinationstherapie bei Therapie mit Antithrombotika und Fibrinolytika

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1994008034A1 (en) * 1992-09-28 1994-04-14 Japan Energy Corporation Novel hirudine variant, process for producing the same, and anticoagulant containing the same as active ingredient
US5972648A (en) * 1993-09-28 1999-10-26 Japan Energy Corporation Hirudin analogs, methods of manufacture thereof and anticoagulant compositions having these as active ingredients

Also Published As

Publication number Publication date
DE68901964D1 (de) 1992-08-06
KR0147294B1 (ko) 1998-08-17
AU4266289A (en) 1990-04-12
CA2000153C (en) 1999-07-13
EP0367713B1 (en) 1992-07-01
GB8823480D0 (en) 1988-11-16
EP0367713A1 (en) 1990-05-09
NZ230899A (en) 1991-10-25
IL91886A0 (en) 1990-06-10
IE61361B1 (en) 1994-11-02
DE68901964T2 (de) 1995-06-14
IL91886A (en) 1995-07-31
DK491289A (da) 1990-04-07
KR900005992A (ko) 1990-05-07
ZA897586B (en) 1990-05-30
DK491289D0 (da) 1989-10-05
IE893212L (en) 1990-04-06
CA2000153A1 (en) 1990-04-06
AU624635B2 (en) 1992-06-18
ATE77752T1 (de) 1992-07-15
EP0367713B2 (en) 1995-01-04

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US5204323A (en) Heparin and hirudin antidotal compositions and methods
AU628854B2 (en) Pharmaceutically active combination
FI90787B (fi) Menetelmä desulfatohirudiinin valmistamiseksi
DK174837B1 (da) Fremgangsmåde til fremstilling af hirudin samt transformeret gær som kan anvendes ved fremgangsmåden
EP0687731B1 (en) Secretion vector, transformed microorganisms containing said vector and manufacture of products from said microorganism
AU735427B2 (en) Bi- or multifunctional molecules based on a dendroaspin scaffold
FI99211C (fi) Menetelmä hirudiinivariantin valmistamiseksi
EP1541589A1 (en) Fused protein with the function of both hemolysis and anticoagulation and the use of it
RU2186110C2 (ru) Рекомбинантный белок asp-паллидипин, способ его производства и очистки, вектор, штамм, фармацевтическая композиция
US5583111A (en) Thrombin inhibitors
JPH05506646A (ja) ヒト・フォンビルブラント因子のクローニング及び製造、並びにその使用方法
JPH02145526A (ja) 抗血液凝固剤に対する解毒剤
JP3490444B2 (ja) 昆虫類の唾液からのトロンビン阻害剤
NZ575632A (en) Therapeutic and/or ameliorating agent for disseminated intravascular coagulation
CA2343716C (en) Contortrostatin (cn) and methods for its use in preventing metastasis and other conditions
JPH04173798A (ja) ヒルジン変異体，その製造法及び抗凝血剤
JPH07224100A (ja) 新規トロンボモジュリン類
JP2002241400A (ja) 血液体外循環回路用の血液凝固防止のための医薬組成物
PT100299B (pt) Analogo de hirudina, metodo para a sua producao e anti-coagulante contendo-o, e vector de secrecao , microorganismos transformados com o referido vector e metodo para a producao de produtos a partir dos referidos microorganismos