JPH0219399A - トロンビン結合ポリピペプチド - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （技術分野） 本発明は一般に合成ポリペプチドに関する。詳細には２
本発明はトロンビンの凝固活性を阻害し。

かつプロティンＣの活性化を促進する能力を有するペプ
チド、およびプロティンＣの活性化を促進せずにトロン
ビンの凝固活性を阻害する能力を有するペプチドに関す
る。

（発明の要旨） 本発明の合成ポリペプチドは１次の配列を有する： Ｈｉｓ　　Ｔｒｐ　　Ａｌａ　　Ａｒｇ　　Ｇｌｕ　　
Ａｌａ　　Ｐｒｏ　　Ｇｌｙ　　ＡｌａＴｒｐ　　　Ａ
ｓｐ　　　Ｃｙｓ　　　Ｓｅｒ　　　Ｖａｌ　　　Ｇｌ
ｕ　　　Ａｓｎ　　　Ｇｌｙ　　　ＧｌｙＣｙｓ　　　
Ｇｌｕ　　　Ｈｉｓ　　　Ａｌａ　　　Ｃｙｓ　　　Ａ
ｓｎ　　　Ａｌａ　　　ｒｌｅ　　　Ｐｒ。

Ｇｌｙ　　Ａｌａ　　Ｐｒｏ　　Ａｒｇ　　Ｃｙｓ　　
Ｇｉｎ　　Ｃｙｓ　　Ｐｒｏ　　ＡｌａＧｌｙ　　　Ａ
ｌａ　　　Ａｌａ　　　Ｌｅｕ　　　Ｇｌｎ　　　Ａｌ
ａ　　　Ａｓｐ　　　Ｇｌｙ　　　ＡｒｇＳｅｒ　　Ｃ
ｙｓ　　　Ｔｈｒ　　Ａｌａ　　　Ｓｅｒ　　Ａｌａ　
　　Ｔｈｒ　　Ｇｌｎ　　　５ｅｒＣｙｓ　　　Ａｓｎ
　　　Ａｓｐ　　　Ｌｅｕ　　　Ｃｙｓ　　　Ｇｌｕ　
　　ｆｌｉｓ　　　Ｐｈｅ”　　ＣｙｓＶａｔ　　　Ｐ
ｒｏ　　　Ａｓｎ　　　Ｐｒｏ　　　Ａｓｐ　　　Ｇｉ
ｎ　　　Ｐｒｏ　　　Ｇｌｙ　　　５ｅｒＴｙｒ　　Ｓ
ｅｒ　　Ｃｙｓ　　Ｍｅｔ　　Ｃｙｓ　　Ｇｌｕ　　Ｔ
ｈｒ　　Ｇｌｙ　　ＴｙｒＡｒｇ　　　Ｌｅｕ　　　Ａ
ｌａ　　　Ａｌａ　　　Ａｓｐ　　　Ｇｉｎ　　　Ｈｉ
ｓ　　　Ａｒｇ　　　ＣｙｓＧｌｕ　　Ａｓｎ　　Ｖａ
ｌ　　Ａｓｎ　　Ａｓｎ　　Ｃｙｓ　　ｌｉｅ　　Ｌｅ
ｕ　　ＧｌｕＰｒｏ　　Ｓｅｒ　　Ｐｒｏ　　Ｃｙｓ　
　Ｐｒｏ　　Ｇｉｎ　　Ａｒｇ　　Ｃｙｓ　　ＶａｌＡ
ｓｎ　　Ｔｈｒ　　Ｇｉｎ　　Ｇｌｙ　　Ｇｌｙ　　Ｐ
ｈｅ　　Ｇｌｕ　　Ｃｙｓ　　Ｈ４５Ｃｙｓ　　Ｔｙｒ
　　Ｐｒｏ　　Ａｓｎ　　Ｔｙｒ　　Ａｓｐ　　Ｌｅｕ
　　Ｖａｌ　　ＧｌｕＡｓｐ　　Ｇｌｙ　　Ｃｙｓ　　
Ｖａｌ　　Ｇｌｕ　　Ｐｒｏ　　Ｖａｌ　　Ａｓｐ　　
Ｐｒ。

Ｃｙｓ　　Ｐｈｅ　　Ａｒｇ　　Ａｌａ　　Ａｓｎ　　
Ｃｙｓ　　Ｇｌｙ　　Ｔｙｒ　　ＧｌｎＣｙｓ　　　Ｇ
ｌｎ　　　Ｐｒｏ　　　Ｌｅｕ　　　Ａｓｎ　　　Ｇｌ
ｎ　　　Ｔｈｒ　　　Ｓｅｒ　　　ＴｙｒＬｅｕ　　Ｃ
ｙｓ　　Ｖａｌ　　Ｃｙｓ　　Ａｌａ　　Ｇｌｕ　　Ｇ
ｌｙ　　Ｐｈｅ　　ＡｌａＰｒｏ　　Ｉｌｅ　　Ｐｒｏ
　　旧ｓ　　Ｇｌｕ　　Ｐｒｏ　　Ｈｉｓ　　Ａｒｇ　
　ＣｙｓＧｉｎ　　Ｍｅｔ　　Ｐｈｅ　　Ｃｙｓ　　Ａ
ｓｎ　　Ｇｉｎ　　Ｔｈｒ　　Ａｌａ　　ＣｙｓＰｒｏ
　　Ａｌａ　　Ａｓｐ　　Ｃｙｓ　　Ａｓｐ　　Ｐｒｏ
　　Ａｓｎ　　Ｔｈｒ　　ＧｉｎＡｌａ　　Ｓｅｒ　　
Ｃｙｓ　　Ｇｌｕ　　Ｃｙｓ　　Ｐｒｏ　　Ｇｌｕ　　
Ｇｌｙ　　Ｔｙｒｌｌｅ　　Ｌｅｕ　　Ａｓｐ　　Ａｓ
ｐ　　Ｇｌｙ　　Ｐｈｅ　　Ｔｙｒ　　Ｃｙｓ　　Ｔｈ
ｒＡｓｐ　　ｒｌｅ　　Ａｓｐ　　Ｇｌｕ　　Ｃｙｓ　
　Ｇｌｕ　　Ａｓｎ　　Ｇｌｙ　　ＧｌｙＰｈｅ　　Ｃ
ｙｓ　　Ｓｅｒ　　Ｇｌｙ　　Ｖａｌ　　Ｃｙｓ　　Ｈ
ｉｓ　　Ａｓｎ　　ＬｅｕＰｒｏ　　Ｇｌｙ　　Ｔｈｒ
　　Ｐｈｅ　　Ｇｌｕ　　Ｃｙｓ　　ｌｉｅ　　Ｃｙｓ
　　ＧｌｙＰｒｏ　　　Ａｓｐ　　　Ｓｅｒ　　　Ａｌ
ａ　　　Ｌｅｕ　　　Ａｌａ　　　Ａｒｇ　　　Ｈｉｓ
　　　ｌ１ｅＧｌｙ　　Ｔｈｒ　　Ａｓｐ　　Ｃｙｓ　
　Ａｓｐ　　Ｓｅｒ　　Ｇｌｙ　　Ｌｙｓ　　ＶａｔＡ
ｓｐ。

本発明の他の合成ポリペプチドは２次の配列を有する： Ｃｙｓ　　Ｇｌｕ Ａｓｐ　　Ｇｉｎ Ａｓｎ　　Ｃｙｓ Ｐｒｏ　　Ｇｉｎ Ｇｌｙ　　Ｐｈｅ Ｔｙｒ　　Ａｓｐ Ｇｌｕ　　Ｐｒ。

Ａｓｎ　　Ｃｙｓ 八ｓｎ　　　Ｇｌｎ Ａｌａ　　Ｇｌｕ Ｇｌｕ　　　Ｐｒ。

Ａｓｎ　　　Ｇｉｎ 八ｓｐ　　　Ｐｒ。

Ｃｙｓ　　Ｐｒ。

Ｇｌｙ　　Ｐｈｅ Ｃｙｓ　　Ｇｌｕ Ｖａｌ　　Ｃｙｓ Ｇｌｕ　　Ｃｙｓ Ｌｅｕ　　　Ａｌａ Ｔｈｒ Ｈｉｓ １ｅ Ａｒｇ Ｇｌｕ Ｌｅｕ Ｖａｌ Ｇ［ｕ Ｔｈｒ Ｇｌｙ Ｈｉｓ Ｔｈｒ 八ｓｎ Ｇｌｕ Ｔｙｒ Ａｓｎ Ｈｉｓ Ｉｓ Ａｒｇ Ｇｌｙ Ａｒｇ Ｌｅｕ Ｃｙｓ Ｃｙｓ Ｖａｌ Ａｓｐ Ｔｙｒ Ｓｅｒ Ｐｈｅ Ａｒｇ Ａｌａ Ｔｈｒ ｔｙ Ｃｙｓ Ｇｌｙ ＾ｓｎ Ｃｙｓ Ｈｉｓ Ｔｙｒ Ｃｙｓ Ｇｌｕ Ｖａｌ Ｈｉｓ １ｕ Ｐｒ。

Ｇｉｎ Ｔｙｒ 八１ａ Ｃｙｓ Ｃｙｓ Ｇｉｎ Ｔｙｒ Ｔｈｒ ｔｙ Ｌｅｕ Ｇｌｙ Ｉｌｅ 八ｒｇ １ｕ Ｐｒ。

八ｓｎ Ｃｙｓ Ａｓｐ Ｃｙｓ Ｃｙｓ Ｌｅｕ Ｐｒ。

１ｎ Ｐｒ。

Ａｌａ Ｉｌｅ Ａｓｐ Ｐｈｅ Ｐｒ。

Ｐｒ。

ｔｙ Ａｓｐ　　Ｓｅｒ　　Ｇｌｙ　　Ｌｙｓ　　Ｖａｌ　　
Ａｓｐ。

本発明のさらに他の合成ポリペプチドは１次の配列を有
する： Ｐｈｅ　　　Ｃｙｓ　　　Ａｓｎ　　　Ｇｉｎ　　　Ｔ
ｈｒ　　　Ａｌａ　　　Ｃｙｓ　　　Ｐｒｏ　　　Ａｌ
ａＡｓｐ　　Ｃｙｓ　　Ａｓｐ　　Ｐｒｏ　　Ａｓｎ　
　Ｔｈｒ　　Ｇｉｎ　　Ａｌａ　　５ｅｒＣｙｓ　　Ｇ
ｌｕ　　Ｃｙｓ　　Ｐｒｏ　　Ｇｌｕ　　Ｇｌｙ　　Ｔ
ｙｒ　　Ｉｌｅ　　ＬｅｕＡｓｐ　　Ａｓｐ　　Ｇｌｙ
　　Ｐｈｅ　　Ｔｙｒ　　Ｃｙｓ　　Ｔｈｒ　　Ａｓｐ
　　［］ｅＡｓｐ　　Ｇｌｕ　　Ｃｙｓ　　Ｇｌｕ　　
Ａｓｎ　　Ｇｌｙ　　Ｇｌｙ　　Ｐｈｅ　　ＣｙｓＳｅ
ｒ　　Ｇｌｙ　　Ｖａｌ　　Ｃｙｓ　　Ｈ４ｓ　　Ａｓ
ｎ　　Ｌｅｕ　　Ｐｒｏ　　ＧｌｙＴｈｒ　　　Ｐｈｅ
　　　Ｇｌｕ　　　Ｃｙｓ　　　ｌｉｅ　　　Ｃｙｓ　
　　Ｇｌｙ　　　Ｐｒｏ　　　八５ｐＳｅｒ　　　Ａｌ
ａ　　　Ｌｅｕ　　　Ａｌａ　　　Ａｒｇ　　　１ｌｉ
ｓ　　　Ｉｌｅ　　　Ｇｌｙ　　　ＴｈｒＡｓｐ−Ｃｙ
ｓ　　Ａｓｐ　　Ｓｅｒ　　Ｇｌｙ　　Ｌｙｓ　　Ｖａ
ｌ　Ａｓｐ。

本発明のさらに他の合成ポリペプチドは、トロンボモジ
ュリンの２３４番目から４８６番目のアミノ酸残基に相
当するアミノ酸配列および該配列の類似物を有する。

本発明のさらに他の合成ポリペプチドは、トロンボモジ
ュリンの３１０番目から４８６番目のアミノ酸残基に相
当するアミノ酸配列および該配列の類似物を有する。

本発明のさらに他の合成ポリペプチドは、トロンボモジ
ュリンの４０７番目から４８６番目のアミノ酸残基に相
当するアミノ酸配列および該配列の類似物を有する。

本発明のトロンボモジュリンのフラグメントは２３４番
目から４８６番目のアミノ酸残基を有する。

本発明の他のトロンボモジュリンのフラグメントは、３
１０番目から４８６番目のアミノ酸残基を有する。

本発明の他のトロンボモジュリンのフラグメントは　４
０７番目から４８６番目のアミノ酸残基を有する。

本発明の物品は、上記配列を有する合成ポリペプチドで
その表面が被覆されている。

本発明の他の物品は、トロンボモジュリンの２３４番目
から４８６番目のアミノ酸残基に相当するアミノ酸配列
および該アミノ酸配列の類似物を有する合成ポリペプチ
ドで表面を被覆した。哺乳動物の血液を接触させるのに
適した表面を有する。

本発明の他の物品は、トロンボモジュリンの３１０番目
から４８６番目のアミノ酸残基に相当するアミノ酸配列
および該アミノ酸配列の類似物を有する合成ポリペプチ
ドで表面を被覆した２哺乳動物の血液を接触させるのに
適した表面を有する。

本発明の他の物品は、トロンボモジュリンの４０７番目
から４８６番目のアミノ酸残基に相当するアミノ酸配列
および該アミノ酸配列の類似物を有する合成ポリペプチ
ドで表面を被覆した。哺乳動物の血液を接触させるのに
適した表面を有する。

本発明の他の物品は、トロンボモジュリンの２３４番目
から４８６番目のアミノ酸残基のフラグメントを有する
ポリペプチドで表面を被覆した、哺乳動物の血液を接触
させるのに適した表面を有する。

本発明の他の物品は、トロンボモジュリンの３１０番目
から４８６番目のアミノ酸残基のフラグメントを有する
ポリペプチドで表面を被覆した。哺乳動物の血液を接触
させるのに適した表面を有する。

本発明の他の物品は、トロンボモジュリンの４０７番目
から４８６番目のアミノ酸残基のフラグメントを有する
ポリペプチドで表面を被覆した、哺乳動物の血液を接触
させるのに適した表面を有する。

本発明の薬剤組成物は、上記配列を有する合成ポリペプ
チドまたは該ポリペプチドの類似物、および受容可能な
担体を含有する。

本発明の薬剤組成物の投与方法は、哺乳動物被検体のト
ロンビンの凝固活性を阻害し、かつプロティンＣ活性化
を増大するための方法であって。

上記配列のポリペプチドまたは該ポリペプチドの類似物
、および受容可能な担体を含有する薬剤組成物の有効量
を該被検体に投与する方法である二辺上をまとめると１
本発明は、それぞれ２３４〜４８６番目、３１０〜４８
６番目および４０７〜４８６番目の残基を含有するトロ
ンボモジュリン分子の選択されたポリペプチドフラグメ
ント、これらのアミノ酸残基に相当するアミノ酸配列を
含有するポリペプチド、およびこれらの類似物に関する
。

本発明はさらに２本発明のポリペプチドで被覆した表面
を有する物品に関する。

本発明は、このようなポリペプチドを含有する薬剤組成
物を包含する。

さらに１本発明はトロンビンの血液凝固活性を阻害する
ためのこのような組成物を用いた方法。

ならびにトロンビンの血液凝固活性を阻害し、かつプロ
ティンＣの活性化を増大するための方法を包含する。

（発明の構成） トロンボモジュリンは、トロンビンと高度に親和性の複
合体を形成する内皮細胞表面のグリコプロティンである
。トロンビンがトロンボモジュリンに結合するとプロテ
ィンＣの活性化速度を少なくとも１　、０００倍増大し
、これによってプロティンＣで活性化される抗凝血性の
酵素が形成される。

さらに、トロンビンがトロンボモジュリンに結合すると
、トロンビンはもはやプロ抗凝血性酵素として働かなく
なる。特に、トロンビンが触媒するフィブリン形成、第
Ｖ因子活性化および血小板活性化、これらは全てトロン
ボモジュリンの存在下で阻害される。このように、トロ
ンボモジュリンはトロンビンを生理的な抗凝血剤に変え
る。

トロンボモジュリンは、最初にＣ，Ｔ、Ｅｓｍｏｎら。

心臓潅流システム（Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ
、　Ｓｃｉ、　Ｕ、Ｓ、Ａ、。

邦：２２４９−２２５２　（１９８１）　）により１９
８０年に同定された。トロンボモジュリンはウサギの肺
（Ｅｓｍｏｎら、　Ｊ、　Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、　２６
１　：　８５９−８６４（１９８２）　）　、ウシの肺
（Ｊａｋｕｂｏｗｓｋｉら、　Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈ
ｅｍ、２６１　：３８７６　３８８２（１９８６）　Ｈ
５ｕｚｕｋｉら、　Ｂｉｏｃｈｉｍ、　Ｂｉｏｐｈｙｓ
、　Ａｃｔａ、、８８２　：３４３−３５２（１９８６
））　、およびヒト胎盤（Ｓａｌｅｍら。

Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、、２５９：１２２４６−
１２２５１（１９８４）　；　Ｋｕｒｏｓａｗａら、　
Ｔｈｒｏｍｂ、　Ｒｅｓ、３７　：　３５３・−３６４
（１９８５）　）から単離および精製されている。最近
、ヒトのトロンボモジュリンのｃＤＮＡが報告されてお
り、トロンボモジュリンの構造図が提供されている。（
Ｓｕｚｕｋｉら。

ＥＭＢＯＪ、　６　：　１８９１−１８９７（１９８７
）　；　Ｗｅｎら、　Ｂｉｏｃｈｅｍ。

２６　：　４３５０−４３５７（１９８７）　ＨＪａｃ
ｋｍａｎらＰｒｏｃ、　Ｎａｔｌ。

Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、Ｕ、Ｓ、Ａ、　８４　：　６４２
５−６４２９　（１９８７）　）。

ウシのトロンボモジュリンの部分的ｃＤＮＡ配列も報告
されており（Ｊａｃｋｍａｎら、　Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ
、　Ａｃａｄ。

Ｓｃｉ、　Ｕ、Ｓ、Ａ、　８２：８８３４　８８３８　
（１９８６））　、ヒトのトロンボモジュリンに構造が
非常によく似ている。

このように、ヒトおよびウシのトロンボモジュリンは構
造および機能に関して研究され、特徴付けられている。

しかし、トロンボモジュリン分子の特異的機能部位はこ
れまで知られていなかった。

以前の報告が示すように、トロンボモジュリン分子は５
つの領域から構成される。つまり、アミノ末端の１〜２
４４番目の残基の疎水性領域；２４５〜４８０番目の残
基のシスティンに冨む領域；４８１〜５１４番目の残基
の潜在的０−グリコジル化部位を有するセリン／スレオ
ニン／プロリンに富む領域；５１５〜５３７番目の残基
の疎水性膜通過領域；および残りの３８残基を含存する
細胞質ゾルの連部（ｃｙ　ｔｏｓｏ　ｌ　１ｃｔａｉｌ
）から構成される。

２３４〜４８０番目の２４６アミノ酸残基からなるシス
ティンに富んだ領域は３表皮成長因子の前駆体と類似の
６つの繰り返し構造を有することが示されている。従っ
て、これらはＥＧＦ様またはＥＧＦ類似ドメインと呼ば
れる。我々の研究は、第６図に示されるようにトロンボ
モジュリンの機能的部分はこの領域内に含まれることを
示す。

より詳細には、我々はトロンビンに結合する能力を　有
し、プロティンＣ活性化を有意に増大する２３４〜４８
６番目の残基および３１０〜４８６番目の残基を有する
ポリペプチド、ならびに４０７〜４８６番目の残基を有
する小さな８０残基のポリペプチドを（このポリペプチ
ドはプロティンＣ活性化に効果がなく、トロンビンに結
合してその凝血活性阻害することがないけれども）示す
。

我々は、これらのトロンビンの機能的フラグメントは種
特異的ではないということを示している。

我々が単離したフラグメントは、ウシのトロンビンとよ
く反応した。さらに、アミノ酸組成分析およびこれらの
フラグメントの配列決定は、ウシ。

ヒトおよびウサギのトロンボモジュリンのシスティンに
冨んだ領域の構造的類似性の程度が高いことを示した。

それゆえ２本発明の種々の面を実施する場合に。

いくつかの例ではそうするのが好ましいことであり得る
が、トロンビンの種に対応する機能的フラグメントと構
造的に等しいポリペプチドを使用する必要はない。しか
しながら、あるひとつの以前の研究は、ウサギのトロン
ボモジュリンはヒトのトロンボモジュリンよりもヒトの
トロンビンに対してより高い親和性を有することを示す
ような報告をしていることは、特筆すべきである（Ｋｕ
ｍａｄａら、　Ｂｌｏｏｄ　７１　：　７２８−７３３
　（１９８７））　、このように。

含まれているトロンビンがヒトであるいくつかの適用に
おいて、ウサギのフラグメントとは少し異なる構造を有
するポリペプチドを使用するのが好ましいことであり得
る。

従って９本発明はトロンボモジュリンの選択されたフラ
グメント、すなわち２３４〜４８６’ｍ目、３１０〜４
８６番目、および４０７〜４８６番目の残基に相当する
構造を有する合成ポリペプチドに関する。これらのフラ
グメントを、ここではそれぞれＣＣＢ１−２−３（ｅｌ
−Ｔ　）　、　ＣＢ２−３　、およびＣＢ３と呼ぶ。な
ぜならば、これらは臭化シアンで分解したからである。

本発明のポリペプチドは、臨床的応用に対して多くの実
際的に有利な点を提供する。なぜならば。

これらは比較的小さなサイズ（それぞれ２５３．１７６
および８０残基）であり、これらのペプチドを生産する
のは非常に容易であるからである。トロンボモジュリン
とは異なり、これらのフラグメントは緩衝液に可溶であ
り、従って該フラグメントを生産する細胞により分泌さ
れる。さらに、これらのフラグメントの活性は該フラグ
メントの糖鎖に依存しないので、遺伝的に改変された細
菌により効果的に生産することができる。

これらは生体自身のタンパクに由来するので。

これらのペプチドは免疫応答を引き起こさない。

このように、薬剤組成物中のこれらのポリペプチドは、
ヘパリン、ワルファリンまたはヒルジンのようなタンパ
クの抗凝血剤に普通に起こる困ったまたは不利な副作用
なしに天然の抗凝血剤物質を提供する。

本発明のポリペプチドの好適な適用は１人工弁。

人工心臓などのような血液に接触する物品の表面の被覆
である。以下に述べるように、これらのペプチドの構造
は該ペプチドを合成物の表面に容易に結合するのを可能
にする。このように、血液がポリペプチドで被覆された
表面と接触する場合トロンビンは表面に結合し、該表面
上の凝血を阻害する。換言すれば３本発明のポリペプチ
ドで被覆した表面は、血管の内皮細胞の非血栓形成性の
表面に似ている。

さらに、これらのポリペプチドの最も小さいものである
８０残基のＣＢ３は、トロンビンの結合は必要とするが
プロティンＣの活性化は必要としないという特別な臨床
的適用を有する。このような場合には、プロティンＣの
レヘルが減少している血管的凝血異常が広められる。

ポリペプチドのれ１ 本発明に従って、まず、ここで定義したトロンボモジュ
リンの機能的フラグメントの一つの配列に相当するアミ
ノ酸残基の配列を含有する合成ポリペプチドが調製され
る。以下に記述するように。

本発明のポリペプチドは天然には存在しないが。

天然の材料源、すなわちトロンボモジュリンから得られ
得るか、または人工的に生産され得る。

トロンボモジュリンからのポリペプチドの調製方法をこ
こに記述する。これらのポリペプチドはまた。遺伝子工
学の結果としても得られ得るということが理解される。

これらの技術により、細菌または哺乳動物の細胞系のよ
うな生体を該生体が自然には産生じない物質を継続的に
産生ずるように遺伝的に改変される。これらの方法は公
にされており、ここでは詳細には記述しない。さらに。

公知のアミノ酸構造を有する本発明のポリペプチドは、
ペプチド合成により製造し得る。このように、ここで用
いる”合成ポリペプチド゛°とは、これらまたはその他
の手法のいずれかにより生産されるポリペプチドを示す
ということが理解される。

天然源からこれらのポリペプチドを調製するためには、
まず、好ましくはヒト、ウシまたはウサギの組織由来で
ある哺乳動物の組織からトロンボモジュリンを単離・精
製する。あるひとつの適当な方法は、界面活性剤による
抽出を用いたウサギ肺組織からのトロンボモジュリンの
単離、および固定化した抗ウサギトロンボモジュリン抗
体を用いた該トロンボモジュリンの精製を包含する。こ
れはＧａ１ｖｉｎら（Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、、
２６２　：　２１９９　２２０５（１９８７）　）に記
載されている。

得られた実質的に純粋なトロンボモジュリンを用いて、
活性なエラスターゼによるタンパク分解産物、または“
’ｅｌ−ＴＭ　”を次に生産し得る。これは、以下の実
施例２で論じるようなＫｕｒｏｓａｗａら〔Ｊ、　Ｂｉ
ｏｌ、　Ｃｈｅｍ、、　２６２　：　２２０６−２２１
２　（１９８７）　）により教示されている方法により
達成し得る。

ｅｌ−ＴＭをより小さなフラグメントにするためには、
以下の実施例４に記述するようにｅｌ−ＴＭを臭化シア
ンで分解し得る。ＣＮＢｒ分解により産生された活性な
フラグメントは１次いで以下の実施例５で記述するよう
に２分解物をＤＩＰ−１−ロンビンカラムにかけること
により好適に同定し得る。

ＤＩＰ−トロンビンカラムに結合したフラグメントを分
離するために、以下の実施例７に記述するように該カラ
ムから溶出したフラグメントをゲル濾過に供し得る。こ
れは、　ｅｌ−ＴＭおよびＣＢ２−３　　（両方ともプ
ロティンＣを活性化できる）の、ＣＢ３（プロティンＣ
を活性化できない）からの分離を可能にする。

ゲル濾過により得られたＣＢＳ、　ＣＢ２−３．および
ＣＢ１−２−３　　（ｅｌ−ＴＭ　）を含む単離された
機能的フラグメントは、別々に、または選択された組合
せでプールされる。次いで、セファデックスＧ−１０カ
ラム（０，９ｃｍ　Ｘ３０ｃｍ、　０．２％Ｎ−エチル
モノホリンアセテートｐＨ７，５）で脱塩される。次い
でフラグメントは凍結乾燥され、４°Ｃにて保存される
。

された　０のれ１ 本発明は、前述したように、その表面のひとつまたはそ
れ以上を本発明の合成ポリペプチドで被覆した物品を包
含する。物品の被覆された表面は。

血液と接触させた場合比較的非血栓形成性である。

なぜならば、ポリペプチドはトロンビンと結合し。

そのことによって凝固機構を不活性化するからである（
そうでなければ、この凝固機構は“異種の°”表面上で
誘引される）。

本発明のポリペプチドで被覆した物品は、哺乳動物の身
体に移植するのに特に適している。ここで用いたように
、移植は一時的または恒久的であり得、物品の全てまた
は一部のみを含み得る。このように１本発明の目的のた
めの移植可能な物品は、針、カテーテルおよびチューブ
、ならびに人工の弁、管および器官を包含する。

生体外で血液を導くかまたは入れるのに用いる管の内空
または他の導管は、これらのポリペプチドで被覆され得
る。この性質の好適な適応は、血液透析および人工心肺
装置で使用される導管を包含する。

いくつかの理由のため２本発明の比較的小さなポリペプ
チドはより大きなトロンボモジュリン分子そのものより
も、物品の表面に結合するのにより適している。第一に
、前述したようにトロンボモジュリンの大きな膜結合ド
メインは緩衝液に可溶性ではないが、これらのポリペプ
チドは緩衝溶液に可溶性である。さらに、トロンボモジ
ュリンは単一の化学的結合部位を持っていないが、これ
らの小さなポリペプチドでは、リジン残基の数が限られ
ているので結合は簡単にされているやリジン残基数が限
られているので１本発明のポリペプチドでの物品の表面
の被覆は、いくつかの公知技術のいずれによっても実施
し得る。適切な技術は、カルボジイミド架橋結合または
ヒドロキシコハク酸イミド反応のような一部アミノ基と
カルボキシル基との間の共有結合の架橋結合を利用する
技術を包含する。これらの方法は、結合されるポリペプ
チドの領域が、最も小さなＣＢ３フラグメントまたはよ
り大きなｅｌ−ＴＭエラスターゼ産物（ＣＢ１−２−３
　＞の、アミノ末端またはカルボキシ末端に対応するか
どうかに利用することができる。

架橋結合するための他の適切な方法は、配列の適当な位
置でのシスティン残基の置換を包含する。

この位置は、典型的にはＥＧＦ　　ドメインのアミノ末
端またはカルボキシ末端もしくはその近辺である。

これは、ポリペプチドの化学合成におけるｃＤＮＡまた
は介在物の部位特異的突然変位処理により実施し得る。

選択された残基の挿入についていくつかの技術が記述さ
れている。このような技術のひとつは。

Ｚｏｌｌｅｒら（Ｍｅｔｈ、　Ｅｎｚｙｗｏｌ、、　１
００　：　４６８−５００（１９８３）　）により記載
されており１Ｍ１３でクローニングし。

次いで所望の変異が起こったものをアニーリングするこ
とを包含する。

物品を被覆するのに用いられるポリペプチドの特異的構
造に関して２本発明のポリペプチドは種特異的ではない
ということに注意すべきである。

このように２例えば、ウサギのトロンボモジュリンの機
能的フラグメントと同じ構造を有するポリペプチドは、
ヒトのトロンビンと効果的に結合する。実際、前述した
ように、含まれるトロンビンがヒト由来である場合、物
品はウサギのトロンボモジュリンのフラグメントに対応
するポリペプチドで被覆されるのが好ましいということ
がいくつか示されている。

二″　、　　および几　　法 本発明のポリペプチドは、薬剤組成物に使用し得る。本
発明に従った薬剤組成物は、静脈内投与に用いるのに適
している。このように、上述のポリペプチドは、好まし
くは５％デキストロース水溶液、乳酸加すンガー液３通
常生理食塩溶液、滅菌水、または静脈内輸注のために考
案されたその他のいずれの市販の調製された生理的緩衝
溶液のような、受容可能な滅菌した担体と結合される。

担体溶液の選択ならびに組成物の用量および投与は、被
検体および各々の臨床的環境で変化し、標準の医療方法
により決定されると理解される。

本発明の方法に従って、　ＣＢ３の場合には、これらの
薬剤組成物は被検体におけるトロンビンの凝固活性を阻
害するのに効果的な量で投与され得る。

そして、　ＣＢ２−３またはＣＢ１−２−３の場合には
、プロティンＣの活性化も増大するのに効果的な量で投
与され得る。このような療法は、全凝固時間、　ＡＰＴ
Ｔｓ　、フィブリノーゲンレベルおよび血小板数のよう
な凝固パラメーターを参照することによって調節される
。

（以下余白） （実施例） 以下の実施例は１本発明のポリペプチドの製造方法およ
び該ポリペプチドの活性を確かめる方法を説明する。

叉詣炭土 精製トロンボモジュリンの調製 まず、トロンボモジュリン（ＴＭ″°）を実質的に精製
された形で調製した。このタンパクは凍結したウサギ肺
組織から界面活性剤により単離し。

ウサギのトロンボモジュリンに対するモノクローナル抗
体および固定化ＤＩＰ〜トロンビンカラム（実施例５を
参照のこと）でのアフィニティクロマトグラフィーを用
いて精製した。これらは全て、　Ｇａ１ｖｉｎら（Ｊ、
　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、２６２：２１９９−２２０５
　（１９８７）　）により以前に記述されている。

１施±１ エラスターゼによるトロンボモジュリンの活性なタンパ
ク分解産物の調製 ＴＭのエラスターゼによるタンパク分解産物である”ｅ
ｌ−ＴＭ’を、　Ｋｕｒｏｓａｗａら（Ｊ、　Ｂｉｏｌ
、　Ｃｈｅｍ、２６２　：２２０６−２２１２　（１９
８７）　）により記載されているようにして、精製され
たウサギのＴＭから調製した。この方法により得られる
ｅｌ−７Ｍフラグメントは界面活性剤がなくても緩衝液
に可溶性であり、リン脂質と相互作用しない。このこと
およびアミノ酸組成および配列分析は、以下に述べるよ
うに、膜結合領域はエラスターゼ反応の結果として失わ
れることを示す。報告したように、　ｅｌ−７Ｍフラグ
メントはトロンビンに結合し、　ｅｌ−ＴＭ　／　）ロ
ンビン複合体は有意にプロティンＣ活性化を増大させる
。

裏旌炭主 ｅｌ−ＴＭのアミノ末端配列決定 ｅｌ−ＴＭのアミノ酸配列決定を、　Ｍｏｄｅｌ　１２
０八ＰＴＩ＋分析装置（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓ
ｔｅｍｓ、　Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ　Ｄｉｖｉｓｉｏｎ
。

５ａｎｔａ　Ｃ１ａｒａ、　Ｃａ１ｉｆｏｒｎｔａ　）
によるオンラインのＰＴＨアミノ酸同定装置を装備した
Ａｐｐｌｉｅｄ　ＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓＭｏｄｅ　４７
０Ａ気相配列決定装置を用いて行った。

これらの決定は、　Ｔｕｌｓａ　Ｍｅｄｔｃａｌ　Ｒｅ
５ｅａｒｃｈ　ＩｎｓｔｉＬｕｔｅ（Ｏｋｌａｈｏｍａ
　Ｃ１ｔｙ、Ｏｋｌａｈｏｍａ）の５ａｉｎｔ　Ｆｒａ
ｎｃｉｓＨｏｓｐｉｔａｌのＭｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｂｉ
ｏｌｏｇｙ　Ｒｅ５ｏｕｒｃｅ　Ｆａｃｉｌｉｔｙで行
った。

この分析の結果を第１図の“ウサギｅｌ−ＴＭ／ＣＢＩ
’”に示す。一つの文字は以下のようなアミノ酸を示す
：アラニン、゛Ａ゛°　：アルギニン、“ｌＲ１＋、ア
スパラギン、　“Ｎ゛；アスパラギン酸、　゛Ｄ゛；シ
スティン、　′Ｃ″　：グルタミン酸、゛Ｅ”；グルタ
ミン、“Ｑ°゛　；グリシン、“Ｇパ；ヒスチジン　ｌ
ｌｕ　Ｉ＋　、イソロイシン　１１１１１．ロイシン。

゛Ｌ゛；リシン、゛に゛；メチオニン　ＩＩＭ　Ｉ＋　
　。

フェニルアラニン、“Ｆ”°　；プロリン、゛Ｐ゛；セ
リン、　Ｓ°゛　：スレオニン、　“Ｔ　”　　ｉ　ｌ
−リプトファン、　−°”　；チロシン、　°“Ｙ゛°
　；およびバリン、　”Ｊ　ｌ”。

前に示したように、ウシのトロンボモジュリンのｃＤＮ
Ａの部分的配列が報告されており、ウシのタンパクのア
ミノ酸構造の推測を可能にしている。

さらに、ヒトのトロンボモジュリンのｃＤＮＡからヒト
のトロンボモジュリンのアミノ酸配列が推測されている
。この情報を用いて２次に我々は、我々のウサギｅｌ−
ＴＭフラグメントのアミノ末端の配列をウシおよびヒト
のタンパク配列とともに並べた。

このことは、　ｅｌ−ＴＭが２３４番目の残基から始ま
ることを示した。

第１図に示したように、トロンボモジュリンの対応する
部分は実質的に似ている。図中、同じ残基は枠で囲んで
ある。ウシおよびヒトのトロンボモジュリンにおけるシ
スティン残基に相当する部位を示す空白部分（“？゛°
）も、同様に枠で囲んである。番号（２３４，２４５な
ど）は、ヒトのトロンボモジュリン残基の番号に相当す
る。

夫施貫土 ｅｌ−ＴＭのＣＮＢｒ分解 ｅｌ−ＴＭを臭化シアン（ＣＮＢｒ）で分解し、　ｅｌ
−ＴＭをメチオニン結合部位で開裂した。タンパクを分
解するのに一般的な方法は、すでに記述されている（Ｓ
ｔｅｅｒｓら、　Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、２４０
：２４７８−２４８４（１９６５））。

ｅｌ−ＴＭを分解するために、７０％ギ酸に溶解した１
〜１．３Ｂ　／ｍｌのｅｌ−ＴＭを室温で２４時間、　
５０ｍｇ／ｍｌのＣＮＢｒで分解した。以下の実施例９
で示すように。

より大きなＣＢ２−３フラグメントを単離するためには
、この分解操作をＣＮＢｒの濃度を１０ｍｇ／ｍｌに減
らして繰り返した。次いで１分解液を凍結乾燥した。

実施■ニ トロンビンに結合するＣＮＢｒフラグメントの選択トロ
ンビンに結合する能力を有するこれらのＣＮＢｒフラグ
メントを選択するために１分解物をＤＩＰ−トロンビン
カラムにかけた。このカラムを調製するために、まずウ
シのトロンビンをＯｗｅｎら［：Ｊ、　Ｂｉ。

１、　Ｃｈｅｍ、２４９　：　５９４　６０５　（１９
７４）　）により記載されているように精製した。精製
したウシのトロンビンは、　Ｋｕｒｏｓａｗａら（Ｊ、
Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、　２６２　：　２２０６−２２
１２（１９８７）　）により記載されているように、　
Ａｆｆｉ−Ｇｅ１１０　（Ｂｉｏ−Ｒａｄ　）　　（０
，９Ｘ１１．５ｃｍ、　５ｍｇ　／ｍｌ）カラムに固定
化し、ジイソプロピルフルオロホスフェ−）　（Ｂｅｈ
ｒｉｎｇ　Ｄｔａｇｎｏｓｔｉｃｓ　）で不活性化した
。

このように、このカラムをＤＩＰ−）ロンビンカラムと
呼ぶ。

凍結乾燥したＣＮＢｒ分解物を１ｍｌの０．ＩＭ　Ｎａ
Ｃ１。

０．０５Ｍトリス塩酸（ｐＨ７，５）に溶解した。カラ
ムは０．ＩＭ　ＮａＣ１、０，０２Ｍ　　）リス塩酸（
ｐＨ７，５）で平衡化した。次いで、この分解物の溶液
をＤＩＰ−）ロンビンカラムにかけた。

添加した試料中またはカラムの両分中には、沈澱物質は
観察されなかった。添加したＡ２８０の３７％〜７０％
がカラムに結合しなかった。非結合画分をプールし、０
．２％Ｎ−エチルモルホリノアセテート（ｐＨ７，５）
に対して透析し２凍結乾燥させた。

添加したＡ２８０の３１％〜４１％にあたる結合したタ
ンパクは、　２．ＯＭ　ＮａＣ１，１，５Ｍグアニジン
塩酸、　１ｍＭＥＤＴ八、　０．へ２Ｍ　　トリス塩酸
（ｐＨ７，５）で溶出した。

次いで、溶出画分をセファデックスＧ−１０カラム（０
，９Ｘ３０ｃｍ、　０．２％Ｎ−エチルモルホリノアセ
テート（ｐＨ７，５）　）で脱塩し、凍結乾燥した。

実施■旦 非結合画分の補因子活性についての試験カラムに全ての
活性物質が保持されたことを証明するために、ＤＩＰ−
）ロンビンカラムからの非結合または通過フラグメント
を、トロンビンが触媒するプロティンＣの活性化を５ｍ
Ｍ　Ｃａ”＋中で促進する能力について試験した。これ
は、　Ｇａ１ｖｉｎら（Ｊ。

Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、　％泗：　２１９９−２２０５
　（１９８７）　）により記載されているようにして行
った。これらの画分は補因子活性を全く示さなかった。

３０ｎＭ　）ロンビンまで力価測定した試料の０．２の
Ａｔ１ｌ。は、　＜０．０７ｎＭ活性化プロティンＣ／
ｍｉｎを与えた。通過画分もまた。ウェスタンプロット
で１２ＳＩ−トロンビンに結合しなかった。

これらのフラグメントの同一性を、逆相クロマトグラフ
ィーおよびアミノ末端配列分析により調べた。非結合フ
ラグメントの配列は、　ＣＢＩおよびＣＢ２に相当した
。これらの配列を第１図に示す。

使用した方法は、すでに公開されているものである。　
（ｋｕｒｏｓａｗａら、　Ｊ、　Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、
２６３　：　５９９３−５９９６（１９８８）　）。

災廉拠工 結合フラグメントのゲル濾過 ＤＩＰ−トロンビンカラムに結合したフラグメントを分
離するため、およびフラグメントのサイズを前もって見
積るために、溶出したフラグメントを３Ｍグアニジン塩
酸、　０．０２Ｍ　　）リス塩酸（ｐＨ７，５）でもど
し、ゲル濾過を行った。ゲル濾過は、　ＦＰＬＣポンプ
（Ｐｈａｒｍａｃｉａ　ＬＫＢ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ
ｏｇｙ　Ｃｏｒｐ、　）に連結したＴＳＫ−１２５ＨＰ
ＬＣカラム（３００Ｘ　７．５ｍｍ　。

Ｂｉｏ−Ｒａｄ）で行った。カラムは３Ｍグアニジン塩
酸。

０．０２Ｍ　　トリス塩酸（ｐＨ７，５）で平衡化した
。使用したゲル濾適用の標準物質は、オバルブミン（４
４ｋＤａ）、　　ミオグロビン（１７，５ｋＤａ　）　
、チトクロームＣ（１２，６ｋＤａ）、およびインスリ
ン（５，７ｋＤａ）であった。

それぞれ２５μｍの試料を注入し、　０．５ｍｌの両分
を１分間あたり０．７ｎ＋１の流速で集めた。吸光度は
。

Ｇ１１ｓｏｎｌ１６　ＵＶ検出器で２８０ｎｍにてモニ
ターした。

ゲル濾過の結果を第２図に示す。点線は４９ｋＤａのタ
ンパクとして溶出されたｅｌ−ＴＭのクロマトグラムを
示す。矢印は４つの標準物質の溶出容量を示し、これら
の標準物質の公知の分子量を矢印の隣に示す。

１つの主要ピークおよび４つの小さなピークが観察され
た。ｋＤａでの分子量は、標準物質の分子量の対数に対
するＶｅ／Ｖｏの標準曲線に従って、？８出容量からグ
ラフ的に計算した。ここで、　Ｖｅ−溶出容量、そして
Ｖｏ＝排除容Ｍ（ここでは５．３２ｍ１）である。主要
ピークは１０ｋＤａに相当した。他の４つの小さなピー
クが観察され、それぞれｖｏ、　４５ｋＤａ。

２９ｋＤａ　、およびＶ、に相当した。

実施１ 最も小さいトロンビン結合フラグメント（ＣＢ３　）の
逆相クロマトグラフィー １０ｋＤａタンパクまたはＣＢ３に相当するゲル濾過カ
ラムからの主要ピークを、逆相クロマトグラフィーによ
りさらに分析した。このことにより調製物の純度を確か
めた。

この分析のためには、　Ｐｒｏ　ＲＰＣ５／１０　Ｃ＋
−Ｃｍカラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ　ＬＫＢ　Ｂｉｏｔ
ｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、　Ｉｎｃ、　）を用いた。カラム
は０．１％トリフルオロ酢酸水溶液で平衡化した。ＴＳ
Ｋ−１２５カラム（濾過を参照のこと）からの１０ｋＤ
ａタンパクの試料は、全容量が５０μｌとなるように０
．１％トリフルオロ酢酸水溶液でもどした。これらの試
料をカラムに注入し、０．１％トリフルオロ酢酸中のア
セトニトリルの直線勾配を用いて、　０．２ｍｌ　／ｍ
ｉｎの流速にて溶出した。１０ｋＤａフラグメントの逆
相クロマトグラフィーの結果を、第３図に示す。

裏上五１ ２９ｋＤａのＣＮＢｒフラグメントの単離２９ｋＤａの
ＣＮＢｒフラグメントまたはＣＢ２−３を、　ＣＮＢｒ
の濃度をＬｏｎｇ／ｍｌに減らしたことを除いては、実
施例４で詳述したように、　ＣＢ３フラグメントを単離
した方法と本質的に同様の方法で単離した。この方法は
、全て上述したようなＣＮＢｒ分解、　ＤＩＰ−トロン
ビンカラムでの分解物のアフィニティクロマトグラフィ
ー、およびＴＳＫ−１２５カラムでのトロンビン結合種
のゲル濾過を包含する。

ＴＳＫ−１２５カラムは計グアニジン塩酸、　０．０２
Ｍ　　トリス塩酸（ｐＨ７，５）で平衡化した。凍結乾
燥したＤＩＰ−トロンビン？容出物は、同じグアニジン
緩衝液２００μｌに溶解し、カラムに注入した。第４図
に示したように、流速は０．７ｍｌ　／ｍｉｎであり、
　０．２５ｍ１の両分を集めた。

補因子の活性について分析するために、　０．ＩＭ　Ｎ
ａＣ１゜０．１％ゼラチン、　０．０２Ｍ　　ｌ−リス
塩酸（ｐＨ７，５）でこれらの両分の２０μｌをそれぞ
れｉ　　：１，０００に希釈した。これらを１μ台プロ
ティンＣ，１０ｎＭｌ−リス塩酸および５ｍＭ　ＣａＣ
ｌ２とともに２０分間インキュベートした。反応は、抗
トロンビン■を終濃度が７．１　μ台になるまで添加す
ることにより停止させた。次いで、活性化したプロティ
ンＣをＧａ１ｖｔｎら（Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、
２６２　：　２１９９−２２０５（１９Ｂ？）　）によ
り記載されているように分析した。

第４図に示すように、２つのはっきりした補因子の活性
のピークがある。最初のピークはＣＮＢｒ分解で残った
ｅｌ−ＴＭである４５ｋＤａの物質と関係がある。２番
目の活性ピークは２９ｋＤａの物質と関係がある。補因
子活性を全く持たない３番目の大きなＡｚｅ。吸光度ピ
ークは、　ＣＢ３フラグメントである。

実施斑刊 ＣＢ３フラグメントのアミノ末端配列の決定逆相カラム
からのＣＢ３の試料（上記第８節）を実施例１２に示す
ように還元し、カルボキシアミドメチル化した。そして
、これを実施例３に上述したようにアミノ末端配列分析
にかけた。次いで。

決定された配列をヒトおよびウシの推測された公知の配
列と比較した。これを第１図に示す。ＣＢ３は４０７０
７番目基から始まる。

１隻斑旦 ＣＢ２−３のアミノ末端配列の決定 ＣＢ２−３フラグメントのアミノ末端配列の決定は。

本質的にｅｌ−ＴＭ　　（実施例３）およびＣＢ３　　
（実施例１０）について記述したようにして行った。配
列決定のために、上述のゲル濾過クロマトグラフィーか
らのＣＢ２−３の試料を、　４Ｍグアニジン塩酸、　１
ｍＭＢＤＴＡおよび０．ＩＭＦリス塩酸（ｐＨ８，５）
で懸濁することにより調製した。これらの試料をシステ
ィンの５０倍過剰のモル数のジチオスレイトール（Ｃａ
ｌｂｉ。

ｃｈｅｗ　）で、３７°Ｃにて３時間、Ｎ２存在下で還
元した。

ヨードアセタミド（Ｓｉｇｍａ　）をジチオスレイトー
ルのモル数の２．６倍過剰量で添加し、この溶液をＮ２
存在下で３７°Ｃにて２時間インキュベートした。

この溶液中の過剰量の試薬は、　ＨＰＬＣＥｃｏｎｏｓ
ｐｈｅｒｅ３００Ｃ４カラム（４，６Ｘ　２５０ｍｍ、
八１ｌｔｅｃｈ　Ａｓ５ｏｃｉａｔｅｓ。

Ｉｎｃ、　）での逆相クロマトグラフィーにより除去し
た。このカラムは０，１％トリフルオロ酢酸水溶液で平
衡化した。物質は０．１％トリフルオロ酢酸中のアセト
ニトリルの０％〜７０％の直線勾配で、　１ｍｌ／ｌｌ
ｌ１ｎの流速にて溶出し、　２２０ｎｒａで検出した。

次いで、ペプチドのアミノ末端配列を実施例３で上述し
たように決定した。アミノ末端配列の分析の結果は、　
ＣＢ２−３が３１０番目の残基から始まり。

以前にＣＢ２　　（実施例６）で観察されたのと同じ結
果であることを示した。

このフラグメントの分子量（２９ｋＤａ　）　、アミノ
末端配列およびＤＩＰ−トロンビンカラムに結合する能
力は、該フラグメントがＣＢ２およびＣＢ３の両方を含
有することを示した。ここで、　ｅｌ−ＴＭは３０９０
９番目基の後でのみＣＮＢｒで分解されていた。従って
、この活性なフラグメントをＣＢ２−３と呼ぶ。

１隻炭旦 アミノ酸組成の分析 ４Ｍグアニジン塩酸、　１ｍＭ　ＥＤＴＡおよび０．Ｉ
ＭＦリス塩酸（ｐＨ８，５）の溶液に懸濁したＣＢ３フ
ラグメントを、システィンよりも５０倍多いモル数のジ
チオスレイトール（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）で、　Ｎ２
下、３７°Ｃにて１時間還元した。ヨードアセタミド（
Ｓｉｇｍａ　）をジチオスレイトールよりも２．６倍多
いモル数で添加した。この溶液を＋　Ｌ下、３７°Ｃに
て１時間インキュベートした。

ＣＢ３については、過剰の試薬を４．６ｍｍ　Ｘ　７５
ｍｍの寸法を有する肝ＬＣＣ，カラム（Ｂｅｃｋｍａｎ
　Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓｏｆ　Ｂｅｒｋｅｌｅｙ、　
Ｃａ１ｉｆｏｒｎｉａ　）での逆相クロマトグラフィー
により除去した。二〇カラムは０．１％トリフルオロ酢
酸（Ｐｆｅｒｃｅ）水溶液で平衡化した。

次いで試料を、０．１％トリフルオロ酢酸（Ｂｕｒｄｉ
ｃｋａｎｄ　Ｊｏｈｎｓｏｎ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅ
ｓ）中のアセトニトリルの０％〜５０％直線勾配を用い
て溶出した。次いでこの溶出液を、真空中、１１０°Ｃ
にて２４時間、　６Ｎ塩酸中で加水分解した。

アミノ酸組成は、　Ｄｉｏｎｅｘ　Ｄ−５００アミノ酸
分析器を製造業者の指示に従って用いて決定した。アミ
ノ酸分析もＭｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ　Ｒｅ
５ｏｕｒｃｅ　Ｆａｃｉｌｉｔｙに従って行った。ＣＢ
３についての結果を表Ｉに示す。

ＣＢ２−３については、アミノ酸組成の分析のための試
料を、上述の実施例１１の配列決定のためと同様の方法
で調製した。ＣＢ２−３のための残りの分析方法は、上
述のＣＢ３と同じ方法で行った。ＣＢ２−３の分析の結
果を表■に示す。

ＣＢ２−３のアミノ酸組成は、２６個の予想されるシス
ティン残基および全部で１７７残基を仮定することの両
方に基づいて計算した。

この組成は１７７残基に基づいた場合予想された組成に
よく一致し、やや不完全な還元およびカルボキシアミド
エチル化を示唆している。

（以下余白） 表■ ウサギの付のトロンビン結合ドメインのアミノ酸組成の
、　ＴＭの５番目および６番目のＥＧＦ様領域の比較。

ｄ）グルタミンおよびグルタミン酸残基を含む。

ｅ）検出せず。

表■ ３１０〜４８６番目のトロンビンの残基を有する活性な
ＣＮＢｒフラグメントのアミノ酸組成の比較。

実１１帽Ｊ ＣＢ３　　（ならびにＣＢ２−３およびｅｌ、−ＴＭ　
）のカルボキシ末端の同定 次に、我々はＣＢ３のカルボキシ末端を同定し。

該カルボキシ末端はＣＢ２〜３およびｅｌ−ＴＭのカル
ボキシ末端を推論により与えた。ＣＢ３は１個のアルギ
ニン残基を含有し、かつリシン残基を含有しないので、
還元し、カルボキシアミドメチル化したＣＢ３を、　Ｔ
ＰＣＫ−トリプシンと共にインキュベートした。分解物
から単離したペプチドを配列決定し。

６番目のＥＧＦ　ｉ領域における４５７番目の残基（ア
スパラギン）で始まることを見い出した（第６図）。

ペプチド全体を配列決定した： ５ム“Ｓ’＋４龜−た−隙−５ｅｔ−分一ムーク窮は一
五−Ω勾ば一年冑ｈ−葎−３−Ｐｒｏ−ムｄ」〜０妙θ
細Ｖａｔ−Ｓｅｒ−Ｔｈｒ−Ｇ　１　ｕ−＄−Ｔｙｒ−
Ｐｒｏ　−Ｔｏｗ　−Ｇｉｎ　−ＭｉＳｅｒ４１１６゜
斜体字の残基はウシのＴＭと同じであり。

下線を施した残基はヒトの耐と同じである。このウサギ
のペプチドの最後の残基であるセリン（４８６）は、予
測されるエラスターゼ切断部位であり、この残基はＣａ
３　、　ＣＢ２−３およびｅｌ−ＴＭＯカルボキシ末端
残基であることを示唆している。配列決定から予測され
る８０残基のペプチドは、総残基数が７７と計算された
。報告したＣａ３のアミノ酸組成（表Ｉ）を含む。

実施拠■ 補因子活性についてのＣａ３フラグメントの試験ＣＢ３
　　（１０ｋＤａ　）フラグメントを、ヒトのプロティ
ンＣを活性化する能力について試験した。この試験は、
　Ｖｉｇａｎｏ−Ｄ’Ａｎｇｅｌｏら（Ｊ、　Ｃｌ１ｎ
、　１ｎｖｅｓｔ、。

ｕ：　４１６−４２５　（１９８６）　〕により記載さ
れているように１μ門のヒトプロティンＣを用いて、　
Ｇａ１ｖｉｎら（Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｒ６．２６
２：　２１９９−２２０５（１９Ｂ？）　：ｌに記載の
方法に従って行った。Ｃａ３の補因子活性（１モルあた
り）は、　ｅｌ−ＴＨの活性の０．０６％であることが
見い出された。このように、　Ｃａ３フラグメントはト
ロンビンに結合するにもかかわらず、　Ｃａ３フラグメ
ントのみではプロティンＣの有意な活性化に不十分であ
ることが結論された。

尖施斑艮 プロティンＣ活性化を阻害する能力についてのＣＢＳフ
ラグメントの試験 プロティンＣの活性化速度を阻害するＣａ３の能力は、
プロティンＣの活性化を触媒するｅｌ−ＴＭ　／トロン
ビンを阻害するＣａ３の能力を調べることにより測定し
た。プロティンＣ（１μＭ）は、　０．ＩＭＮａＣｌ、
　０．１％ゼラチン、　５ｍＭ　Ｃａ”、　０．０２Ｍ
　　トリス塩酸（ｐＨ７，５）および０．１６ｎＭウシ
トロンビンを含有する溶液中で３７℃にて活性化した。

活性化は。

４種類のＣＢ３濃度：　ＯｎＭ、　２６ｎＭ、　５２ｎ
Ｍおよび１１０４ｎ。

および第５図に示したような種々のｅｌ−ＴＭ濃度で試
験した。２０分後１反応を抗トロンビンＩＩＩ　（７，
１μ旧を添加することにより停止し、　Ｇａ１ｖｉｎら
（Ｊ、　Ｂｉｏｌ。

Ｃｈｅｍ、　２６２　：　２１９９−２２０５（１９８
７）　）により記載されているようにして分析した。結
果を第５図に示す。

第５図において、棒線は二連測定の標準偏差を表す。デ
ータの非線形回帰分析は、　Ｃ１ｅｌａｎｄ　（Ａｄｖ
。

Ｅｎｚｙｍｏｌ、　　Ｒｅ１ａｔ、　　八ｒｅａｓ　　
Ｍｏ１．　　Ｂｉｏｌ、２９　：　　１−３２（１９６
７））により記載されているような競争阻害および非競
争阻害の分析のためのプログラムを用いて、　Ｈｅｗ１
６ｔｔＰａｃｋａｒｄ　９Ｂ２６Ａコンピユータで行っ
た。分析は。

ｅｌ−ＴＭに関しては阻害が事実上競争的であることを
示した。

尖立甜匹 Ｃａ３およびｅｌ−ＴＭのトロンビンの凝固活性を阻害
する能力の測定 示されるように、　Ｃａ３はプロティンＣの活性化を促
進しない。フィブリノーゲンを凝固するトロンビンをこ
のフラグメントが阻害するかどうかを決定するために、
　Ｃａ３の存在下および不在下で遊離されるフィブリノ
ペプチドによりフィブリンの形成をモニターした。

使用したフィブリノーゲンはヒト血漿から精製し、フィ
ブロネクチンおよび第Ｘ■因子を含有しないヒトフィブ
リノーゲンを用いた。このフィブリノーゲンは、　Ｏｋ
ｌａｈｏｍａ　Ｍｅｄｉｃａｌ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　Ｆ
ｏｕｎ−ｄａｔｉｏｎ　（Ｏｋｌａｈｏｍａ　Ｃ１ｔｙ
、Ｏｋｌａｈｏｍａ）のＢｕｎｅｉ　Ａｎｄ。

博士から入手した。還元条件下でのドデシル硫酸ナトリ
ウムポリアクリルアミドゲル電気泳動は。

フィブリノーゲンのα、βおよびＴ鎖に相当するひとつ
のタンパクバンドを示した。フィブリノーゲンを０．Ｉ
Ｍ　ＮａＣ１、０，１％ポリエチレングリコール６００
０．０．０２％ＮａＮ＋、　０．０２Ｍ　　）リス塩酸
（ｐＨ７，５）に対して透析し、　−８０″Ｃで保存し
た。

ヒトフィブリノーゲン（０，１ｍｇ　／ｍｌ）を、　０
．ＩＭＮａＣｌ、　０．１％ポリエチレングリコール６
０００．０．０２％ＮａＮ５．０．０２Ｍ　　）リス塩
酸（ｐＨ７，５’）に溶かした５０ｎＭ　ｅｌ−ＴＭお
よび５０ｎＭ　Ｃａ３のそれぞれと、３７°Ｃにて混合
した。３番目の混合液にはｅｌ−ＴＭとＣａ３のいずれ
も加えなかった。反応を開始するために゛ウシのトロン
ビン（終濃度０．２Ｍ）を添加し、各試料の総容量が０
．５ｍｌとなるようにした。第７図に示した時間で５０
μｌの試料を採取し、ジイソプロピルフルオロホスフェ
ート（終濃度４０ｍＭ　）を添加した。

これらの試料を、フィブリノペプチドＡ（“ＦＰＡ”　
）およびフィブリノペプチドＢ　（“ＦＰＢ”）の含有
量について、後述のｔｌＰＬｃ　Ｃ，、ｔカラムでのク
ロマトグラフィーにより分析した。

各実験について、フィブリノーゲン（０，１ｍｇ／ｍｌ
）を１０ｎＭのトロンビンと共に３７°Ｃにて６０分間
インキユベートすることにより、フィブリノペプチドの
総数出量を測定した。凝固物はガラス棒にからみつき、
その上清をフィブリノペプチド含有量について分析した
。これらの条件下で得たＦＰＡおよびＦＰＢのピーク面
積を、１００％とみなした。標準曲線（ピーク面積対ナ
ノモルＦＰ＾またはＦＰＢ　）は。

４．４　ｐＨフィブリノーゲンおよび７ＢＭ　トロンビ
ンのインキュベーション（９０分、３７°Ｃ）の結果か
ら作成した。放出された試料の総量についての実験値は
１通常、標準曲線を参照すると予想した値の１０％〜１
４％以内であった。

フィブリノペプチドの分離のために、２５μｌの試料を
Ｖｙｄａｃ　ＨＰＬＣＣ１８カラム（１０ミクロン、　
４，６Ｘ２５９ｍｍ　）に注入した。緩衝液は１０ｍＭ
　ＫＨｚＰＯ４（ｐＨ５，８）を含有していた。緩衝液
Ａは２％アセトニトリルを含有し、緩衝液Ｂは２５％ア
セトニトリルを含有していた。

濃度勾配の概要は公開されている（Ｈｏｆｓｔｅｅｎｇ
ｅら、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　Ｊ、　２３７　：　２４３
−２５０１９８６）　　）　　：０分ニア５％緩衝液Ａ
、２５％緩衝液Ｂ１０分：５６％緩衝液Ａ、４４％緩衝
液Ｂ２０分：３０％緩衝液Ａ、７０％緩衝液Ｂ流速は１
ｍｌ　／ｍｉｎであり、ペプチドは２１５ｎｍで検出し
た。クロマトグラムは、以前に報告されたクロマトグラ
ムと本質的に同じであった。フィブリノペプチドＡは、
典型的には１１．９分で溶出され。

フィブリノペプチドＢは１８．７分で溶出された。

これらの実験から得られたデータは第７Ａ図および第７
Ｂ図のグラフに示す。これらのデータは、全反応混合液
から測定されるピーク面積に対する。

時間ＴにおけるＦＰＡまたはＦＰＢのピーク面積の比と
して示されている。このデータは、　ｅｌ−ＴＭとＣＢ
３の両方が、トロンビンによりフィブリノーゲンからフ
ィブリノペプチドが放出される速度を阻害することを示
している。このように、トロンビンの凝固活性はこれら
のフラグメントの存在下で減少させられる。

ス１１汁Ｕ Ｋｄ値の決定のためのＣＢ２−３のドロンビン力価測定
ヒトのプロティンＣ（１μＭ）を、　２ＢＭ　ｅｌ−Ｔ
ＭおよびＣＢ２−３とそれぞれ別にインキュベートした
。

各反応は、　０．１Ｍ　ＮａＣｌ　、　０．１％ゼラチ
ン、　５ｍＭ　ＣａＣ１，。

０．０２Ｍトリス塩酸（ｐＨ７，５）中で３７°Ｃにて
行った。

反応はトロンビン（終濃度θ〜１１００ｎ　）を添加す
ることにより開始した。この溶液を７分間インキュベー
トし、抗トロンビン■を７．１　μ門まで添加すること
により反応を停止させた。次いで、活性化されたプロテ
ィンＣをＧａ１ｖｉｎら（Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｗ
。

％招：　２１９９−２２０５（１９８７）　）により記
載されているようにして分析した。

ＣＢ２−３の２つに分けた試料を二連で測定したＫｄ値
は、　１３．２±２．４ＢＭおよび８．９±０．９ＢＭ
であった。

ｅｌ−ＴＭについて測定したＫｄ値は、７．４±２．７
ＢＭ　　（１つの調製物について二連で測定）であった
。Ｋｄ値は、データの非線形回帰分析により定量した。

これは、複合体中に化学量論的に１　：１であると仮定
し、結合したトロンビンについてＥｎｚｆｉｔｔｅｒソ
フトウェア（Ｅｌｓｅｖｉｅｒ　５ｃｉｅｎｃｅＰｕｂ
ｌｉｓｈｅｒｓ　ＢＶ＋Ａｍｓｔｅｒｄａｍ＋　ｔｈｅ
　Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）を用いて補正した後に行っ
た。

結果を第８図に示す。この図に示すように、　ＣＢ２−
３はプロティンＣの活性化を支持できる。トロンビンに
ついてのＫｄ値は、　ｅｌ−ＴＭについて観察されるＫ
ｄ値と同様である。しかし、　ＣＢ２−３　／　ｌ−ロ
ンビン複合体による活性化の最大速度はかなり低い。

実施拠」 ＫＩＩＩ値決定のためのプロティンＣの力価測定それぞ
れ終濃度８０ｎＭのＣＢ２−３およびｅｌ−ＴＭを。

０、ＩＭＮａＣｌ、　０．１％ゼラチン、　０．３ｍＭ
　ＣａＣ１ｚ、　０．０２Ｍトリス塩酸（ｐＨ７，５）
中で０〜１０μ門のヒトプロティンＣとともに３７°Ｃ
にてインキュベートした。

トロンビン（終濃度０．１ＢＭ　）を添加し、この溶液
を８分間インキュベートした。反応を抗トロンビン■を
７．１　ｐＨまで添加することにより停止した。

活性化されたプロティンＣは、以前にＧａ１ｖｉｎら〔
Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｉ、２６２　：　２１９９−
２２０５（１９Ｂ？）　）により記載されているように
して分析した。

ＣＢ２−３の２つの別々の調製物で測定したＫｍ値は。

１．９±０．３μＨおよび１．６±０．２μ拘であった
。

ｅｌ−ＴＨの１つの調製物で測定したＫｍ値は、０．８
±０．００９μ台であった。Ｋｍ値は、上述のソフトウ
ェア゛を用いてデータを非線形回帰分析することにより
測定した。ＣＢ２−３調製物について計算したｋｃａ　
を値は、それぞれ１０３および１５９ｍｏｌ　／　ｍｔ
ｎ　／　ｍｏｌであった。ｅｌ−ＴＭについては、　ｋ
ｃａｔ値は２１２ｍｏｌ　／　１１ｉｎ　／ｍｏｌであ
った。結果を第９図に示す。

尖指斑旦 Ｃａ３のＮ−結合オリゴ糖はトロンビン結合に必要では
ないということの証明 Ｃａ３の４０９番目の位置は、配列決定において一貫し
てブランクサイクルを与えること、およびＡｓｎ−Ｘ−
Ｔｈｒ配列（Ｎ−グリコジル化のコンセンサス配列）は
種間で保存されているということの観察に基づいて、我
々はＣａ３がグリコジル化されていることを信じる理由
を持った。この成分がトロンビンの結合に必要かどうか
を決定するために、　Ｃａ３を脱グリコジル化した。

Ｃａ３を、製造者の指示に従ってＥｎｚｙｍｏｂｅａｄ
ｓ　　（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を用いてヨウ素化した。”Ｊ
−Ｃａ３　（４，５Ｘ１０９ｃｐｍ　）を、　０．１Ｍ
　ＮａＣ１、１ｍＭ　ＣａＣ１ｇ　、　０．０２Ｍトリ
ス塩酸（ｐＨ７，５）で平衡化した２ｍｌのコンカナバ
リンＡレクチンカラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ　ＬＫＢ　
Ｂｉ。

ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　Ｃｏｒｐ、　）　　（５，１８
Ｂタンパク／ｎ＋１）にかけｋ　（０，５ｍｌ／ｍｔｎ
、　０．２５ｍ１画分）。結合した１２５１−Ｃａ３は
、　０．５Ｍエチル−α−Ｄ−マンノピラノシド（Ｓｉ
ｇｍａ　）で溶出し、第１０八図の矢印で示した。溶出
ビーク画分（斜線で囲んだ部分）は、　０．ＩＭＮａＣ
ｌ。

０、ＩＭＦリス塩酸（ｐＨ８，６）　ニ対シテ透析した
。５ＩＣＢ３は、ガンマカウンターで両分をカウントす
ることによって検出した。

透析物質の５０μｍを、終濃度が１２００／ｍｌのＮ−
グリカナーゼ（Ｇｅｎｚｙｍｅ　Ｃｏｍｐａｎｙ　ｏｆ
　Ｂｏｓｔｏｎ＋Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ）。

１０ｍＭ　１．１０−フェナントロリン、　０．０３Ｍ
　ＮａＣ１，０，１Ｍ　トリス塩酸（ｐＨ８，６）の総
容量１５０μｌ中で、３７°Ｃにて一晩インキユベート
した。＋２Ｓｌ−Ｃａ３を含有するがＮ−グリカナーゼ
を含有しない対照のチューブを、平行してインキュベー
トした。

（以下余白） 第１０図Ｂに示されたデータは、第１０図Ａで示される
ように溶出したサンプルを、上記のようにＮ−グリカナ
ーゼで処理したときのデータである。第１０図Ｃは、Ｎ
−グリカナーゼで処理しないコントロールサンプルを示
す。第１０図りに示すのは、Ｎ−グリカナーゼで処理し
たＣａ３を［これはもはやＣｏｎ　Ａカラム（第１０図
Ｂの斜線を施したピーク）には結合しない］をＤＴＰ−
１−ロンビンカラム（０，９Ｘ１１ｃｍ、　０．５ｍ１
１分、　０．２５ｍｆ画分）にかけて得られたデータで
ある。カラムは、　０．Ｉ　Ｍ　ＮａＣ１、０，０２Ｍ
　Ｔｒｉｓ　ＩＩｃＩ、　ｐＨ７，５で平衡化した。結
合した脱グリコジル化＋ｚＳｌ−（：Ｂ３は、　　２Ｍ
　ＮａＣ１、１，５ＭグアニジンＨＣＩ　、　　５ｍＭ
　ＥＤＴＡ　、　ｐＨ７，５で溶出した。これは、第１
０図りにおいて矢印で示す。

これらのデータにより、　Ｃａ３に存在するＮ−結合オ
リゴ糖は、ペプチドがトロンビンに結合するためには必
要ではないことが示される。このように、遺伝子的に変
化した細菌（これは糖を生産し得ない）が本発明のポリ
ペプチドを生産するために使用され得る。

本発明の特許請求の範囲に記載された内容および範囲か
ら逸脱することなく、ここに示された種々の構成要素の
性質９組成、操作および改変；工程および手順の変更が
行なわれ得る。

（以下余白） （発明の要約） 本０発明によれば、トロンボモジュリンの２３４番目か
ら４８６番目の残基、３１０番目から４８６番目のの残
基、および４０７番目から４８６番目の残基に対応する
アミノ酸構造を有する小さな、緩衝液に可溶なポリペプ
チドおよびその類似物が提供される。

これらのポリペプチドは哺乳動物の血液を接触させるの
に適した物品の表面に結合し得る。これらのポリペプチ
ドで被覆することにより、該物品の表面における凝血が
阻害される。本発明の薬剤組成物においては、これらの
ポリペプチドは天然の抗凝血剤物質として作用する。

４、°　　の　　なｉ゛口 第１図は、ウサギ、ウシ、およびヒトのトロンボモジュ
リン由来の、　ｅｌ−ＴＭのアミノ末端領域およびＣＢ
Ｉ　、　ＣＢ２　、およびＣＢ３のＣＮＢｒのフラグメ
ントのアミノ酸配列を示す図である。番号は、ヒトトロ
ンボモジュリンの残基に対応する。

第２図は、　ＣＮＢｒフラグメントのゲル濾過の結果を
示すグラフである。トロンビンに結合し得るフラグメン
トは実線で、そしてｅｌ−ＴＭに結合し得るフラグメン
トは破線で示す。

第３図は、　ＣＢＳについて行なわれた逆相クロマトグ
ラフィーの結果を示すグラフである。

第４図は、　ＣＢ２−３を単離するために行なわれたゲ
ル濾過の結果を示すグラフである。

第５図は、　ＣＢ３がｅｌ−ＴＭと競合してトロンビン
の結合部位に結合する能力を４つの異なる濃度について
示した図である。

第６図は、トロンボモジュリンの２３４番目から４８６
番目の残基に相当する。ヒトｅｌ−ＴＭのアミノ酸構造
の概略図である。

第７図は、　ＣＢ３およびｅｌ−ＴＭの存在下において
トロンビンによりフィブリノペプチドが遊離される速度
を示す図である。

第８図は、　Ｋｄ値の決定結果を示す図である。

第９図は、　Ｋｍ値の決定結果を示す図である。

第１０図Ａ〜Ｄは、コンカナバリンＡおよヒＤＩＰトロ
ンビンカラムにおける脱グリコジル化ＣＢ３の挙動を示
す図である。

ＦＩＧ、３ 工面の；う書（）・１部ニー７万なし）容 量 （ｍｌ） ＦＩＧ、４ ＦＩＧ、７Ａ 叶ｒ４（分） ・１→・　Ｆｏンし／のｂ Ｏ−Ｏｃａ３ Δ−へ　Ｅｌ−ＴＭ 〔←Ｑン己ンＪｎＭ ・ −Ｅｌ−ＴＭ −ＣＢ２−３ ＦＩＧ、８ ＦＩＧ、７Ｂ ０　　　２０　　　ＬＯ６０ Ｕ＋間　（９） 膳−■　ト０／Ｌ／のみ Ｄ−Ｏｃ口３ Ａ（Ｅｌ−ＴＭ 図面の浄書（内容に変更ない ［プロティンＣ１ １Ｍ ・　−Ｅｌ−ＴＭ Ｘ　　−ＣＢ２−３ ＦＩＧ、９ ＦＩ　Ｇ、ｌ０Ａ ＦＩＧ、ｌ０Ｂ ＦＩＧ、ｌ０Ｃ ＦＩＧ、ｌ○Ｄ 界ｉ １ｍ１）

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、次の配列を有する合成ポリペプチド： 【遺伝子配列があります】 【遺伝子配列があります】 ２、次の配列を有する合成ポリペプチド： 【遺伝子配列があります】 【遺伝子配列があります】 ３、次の配列を有する合成ポリペプチド： 【遺伝子配列があります】 【遺伝子配列があります】 ４、トロンボモジュリンの２３４番目から４８６番目の
   アミノ酸残基に相当するアミノ酸配列および該配列の類
   似物を有する合成ポリペプチド。 ５、トロンボモジュリンがヒト由来である、特許請求の
   範囲第４項に記載のポリペプチド。 ６、トロンボモジュリンがウサギ由来である、特許請求
   の範囲第４項に記載のポリペプチド。 ７、トロンボモジュリンの３１０番目から４８６番目の
   アミノ酸残基に相当するアミノ酸配列および該配列の類
   似物を有する合成ポリペプチド。 ８、トロンボモジュリンがヒト由来である、特許請求の
   範囲第７項に記載のポリペプチド。 ９、トロンボモジュリンがウサギ由来である、特許請求
   の範囲第７項に記載のポリペプチド。 １０、トロンボモジュリンの４０７番目から４８６番目
   のアミノ酸残基に相当するアミノ酸配列および該配列の
   類似物を有する合成ポリペプチド。 １１、トロンボモジュリンがヒト由来である、特許請求
   の範囲第１０項に記載のポリペプチド。 １２、トロンボモジュリンがウサギ由来である、特許請
   求の範囲第１０項に記載のポリペプチド。 １３、２３４番目から４８６番目のアミノ酸残基を有す
   るトロンボモジュリンのフラグメント。 １４、トロンボモジュリンがヒト由来である、特許請求
   の範囲第１３項に記載のフラグメント。 １５、トロンボモジュリンがウサギ由来である、特許請
   求の範囲第１３項に記載のフラグメント。 １６、３１０番目から４８６番目のアミノ酸残基を有す
   るトロンボモジュリンのフラグメント。 １７、トロンボモジュリンがヒト由来である、特許請求
   の範囲第１６項に記載のフラグメント。 １８、トロンボモジュリンがウサギ由来である、特許請
   求の範囲第１６項に記載のフラグメント。 １９、４０７番目から４８６番目のアミノ酸残基を有す
   るトロンボモジュリンのフラグメント。 ２０、トロンボモジュリンがヒト由来である、特許請求
   の範囲第１９項に記載のフラグメント。 ２１、トロンボモジュリンがウサギ由来である、特許請
   求の範囲第１９項に記載のフラグメント。 ２２、次の配列を有する合成ポリペプチドで表面を被覆
   した物品： 【遺伝子配列があります】 【遺伝子配列があります】 ２３、次の配列を有する合成ポリペプチドで表面を被覆
   した物品： 【遺伝子配列があります】 【遺伝子配列があります】 ２４、次の配列を有する合成ポリペプチドで表面を被覆
   した物品： 【遺伝子配列があります】 【遺伝子配列があります】 ２５、トロンボモジュリンの２３４番目から４８６番目
   のアミノ酸残基に相当するアミノ酸配列および該アミノ
   酸配列の類似物を有する合成ポリペプチドで表面を被覆
   した、哺乳動物の血液を接触させるのに適した表面を有
   する物品。 ２６、血液がヒト由来であり、かつトロンボモジュリン
   がウサギ由来である、特許請求の範囲第２５項に記載の
   物品。 ２７、トロンボモジュリンおよび血液が同じ種に由来す
   る、特許請求の範囲第２５項に記載の物品。 ２８、前記種がヒトである、特許請求の範囲第２７項に
   記載の物品。 ２９、トロンボモジュリンの３１０番目から４８６番目
   のアミノ酸残基に相当するアミノ酸配列および該アミノ
   酸配列の類似物を有する合成ポリペプチドで表面を被覆
   した、哺乳動物の血液を接触させるのに適した表面を有
   する物品。 ３０、トロンボモジュリンおよび血液が同じ種に由来す
   る、特許請求の範囲第２９項に記載の物品。 ３１、前記種がヒトである、特許請求の範囲第３１項に
   記載の物品。 ３２、血液がヒト由来であり、かつトロンボモジュリン
   がウサギ由来である、特許請求の範囲第２９項に記載の
   物品。 ３３、トロンボモジュリンの４０７番目から４８６番目
   のアミノ酸残基に相当するアミノ酸配列および該アミノ
   酸配列の類似物を有する合成ポリペプチドで表面を被覆
   した、哺乳動物の血液を接触させるのに適した表面を有
   する物品。 ３４、トロンボモジュリンおよび血液が同じ種に由来す
   る、特許請求の範囲第３３項に記載の物品。 ３５、前記種がヒトである、特許請求の範囲第３４項に
   記載の物品。 ３６、血液がヒト由来であり、かつトロンボモジュリン
   がウサギ由来である、特許請求の範囲第３３項に記載の
   物品。 ３７、トロンボモジュリンの２３４番目から４８６番目
   のアミノ酸残基のフラグメントを有するポリペプチドで
   表面を被覆した、哺乳動物の血液を接触させるのに適し
   た表面を有する物品。 ３８、トロンボモジュリンおよび血液が同じ種に由来す
   る、特許請求の範囲第３７項に記載の物品。 ３９、前記種がヒトである、特許請求の範囲第３８項に
   記載の物品。 ４０、血液がヒト由来であり、かつトロンボモジュリン
   がウサギ由来である、特許請求の範囲第３７項に記載の
   物品。 ４１、トロンボモジュリンの３１０番目から４８６番目
   のアミノ酸残基のフラグメントを有するポリペプチドで
   表面を被覆した、哺乳動物の血液を接触させるのに適し
   た表面を有する物品。 ４２、トロンボモジュリンおよび血液が同じ種に由来す
   る、特許請求の範囲第４１項に記載の物品。 ４３、前記種がヒトである、特許請求の範囲第４２項に
   記載の物品。 ４４、血液がヒト由来であり、かつトロンボモジュリン
   がウサギ由来である、特許請求の範囲第４１項に記載の
   物品。 ４５、トロンボモジュリンの４０７番目から４８６番目
   のアミノ酸残基のフラグメントを有するポリペプチドで
   表面を被覆した、哺乳動物の血液を接触させるのに適し
   た表面を有する物品。 ４６、トロンボモジュリンおよび血液が同じ種に由来す
   る、特許請求の範囲第４５項に記載の物品。 ４７、前記種がヒトである、特許請求の範囲第４６項に
   記載の物品。 ４８、血液がヒト由来であり、かつトロンボモジュリン
   がウサギ由来である、特許請求の範囲第４５項に記載の
   物品。 ４９、次の配列を有する合成ポリペプチドまたは該ポリ
   ペプチドの類似物、および受容可能な担体を含有する薬
   剤組成物： 【遺伝子配列があります】 【遺伝子配列があります】 ５０、次の配列を有する合成ポリペプチドまたは該ポリ
   ペプチドの類似物、および受容可能な担体を含有する薬
   剤組成物： 【遺伝子配列があります】 【遺伝子配列があります】 ５１、次の配列を有する合成ポリペプチドまたは該ポリ
   ペプチドの類似物、および受容可能な担体を含有する薬
   剤組成物： 【遺伝子配列があります】 【遺伝子配列があります】 ５２、哺乳動物被検体のトロンビンの凝固活性を阻害し
   、かつプロテインＣ活性化を増大するための方法であっ
   て、次の配列のポリペプチドまたは該ポリペプチドの類
   似物、および受容可能な担体を含有する薬剤組成物の有
   効量を該被検体に投与する方法： 【遺伝子配列があります】 【遺伝子配列があります】 ５３、哺乳動物被検体のトロンビンの凝固活性を阻害し
   、かつプロテインＣ活性化を増大するための方法であっ
   て、次の配列のポリペプチドまたは該ポリペプチドの類
   似物、および受容可能な担体を含有する薬剤組成物の有
   効量を該被検体に投与する方法： 【遺伝子配列があります】 【遺伝子配列があります】 ５４、哺乳動物被検体のトロンビンの凝固活性を阻害す
   るための方法であって、次の配列のポリペプチドまたは
   該ポリペプチドの類似物、および受容可能な担体を含有
   する薬剤組成物の有効量を該被検体に投与する方法： 【遺伝子配列があります】