KR20000070258A - 반복적 서열 재조합에 의한 전세포 및 유기체의 개량 방법 - Google Patents

반복적 서열 재조합에 의한 전세포 및 유기체의 개량 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 목적 성질의 획득을 위해 전세포 및 유기체를 개량하기 위한 반복적 재조합 및 선택/선별 사이클을 이용하는 방법에 관한 것이다. 이와 같은 성질의 예로는 개선된 재조합원성, 게놈 카피수 및 단백질과 2차 대사물질의 발현 및/또는 분비 성질을 포함한다.

Description

반복적 서열 재조합에 의한 전세포 및 유기체의 개량 방법{EVOLUTION OF WHOLE CELLS AND ORGANISMS BY RECURSIVE SEQUENCE RECOMBINATION}
세포는 분자 생물학 분야에서 볼때 많은 소정의 용도가 있다. 예컨대, 세포는 일반적으로 형질전환 및 재조합과 같은 과정에서 DNA를 조작할 수 있는 숙주로서 이용된다. 또한, 세포는 이 세포를 형질전환시키는 DNA에 의해 암호된 재조합 단백질을 발현시키는데 사용된다. 세포의 일부 형태는 돌연변이 동물 및 식물을 생성하는 후대로 사용되기도 한다. 현재 이와 같은 과정들은 모두 통상적이지만, 이와 같은 과정에 사용되는 세포의 게놈은 천연 세포의 게놈으로부터 거의 개량되는 바가 없었고, 특히 상기 과정에 사용하기 위해 신규하거나 개선된 성질을 갖도록 개량하는 방향에 대해서 제시된 바도 없다.
인위적 또는 강제적으로 분자를 개량하는 통상적인 방법은 독특하고 선택가능한 표현형이 있는 각 유전자를 최적화하는데 촛점을 두고 있다. 이 전략은 유전자를 클로닝하는 단계, 이 유전자의 독특한 기능과 선택 분석법을 동정하는 단계, 유전자의 선택된 위치를 돌연변이시키는 단계(예컨대, 잘못이 있는 PCR이나 카세트 돌연변이유발법 사용) 및 상기 유전자의 공지 기능이 개선된 상기 유전자의 변형체를 선택하는 단계를 포함한다. 그 다음, 개선된 기능이 있는 변형체는 바람직한 세포 종류에서 발현시킬 수 있다. 이와 같은 방법은 많은 단점이 있다. 첫째, 분리되고 기능적으로 특성 규명된 유전자에만 적용가능하다는 점이다. 둘째, 이 방법은 보통 독특한 기능이 있는 유전자에만 적용가능하다는 점이다. 즉, 하나의 표현형을 공조적으로 제공하는 다수의 유전자는 이 방법으로 최적화될 수 없는데, 대부분의 유전자는 공조적 기능을 보유한다. 마지막으로, 이 방법은 심지어 단일 유전자에 대한 총 과돌연변이 중 극히 제한된 수만 이용할 수 있다는 점이다. 예컨대, 단백질 중 10개 위치를 가능한 모든 아미노산으로 변화시키면 2010변형체가 생성되며, 이 수는 기존의 형질감염 및 선별 방법시 얻어지는 수보다 많은 것이다.
이와 같은 단점으로 인해, 종래 방법은 많은 유용한 성질에 대해 세포 게놈을 개선시키는데에는 부적당하다. 예컨대, 세포의 재조합 단백질 발현력을 개선시키기 위해서는 전사, 해독, 해독후 변형, 분비 또는 단백분해성 분해 작용 등에 역할을 하는 공지 및 미지의 모든 실질적인 수의 유전자를 변형시킬 필요가 있다. 이와 같은 기능을 가진 공지의 모든 유전자를 각각 최적화하기 위한 개별적인 시도는, 아직 해명되지 않은 발현 방식에 관여할 수 있는 미지 유전자의 최적화는 차치하고라도 사실상 불가능한 일이다.
따라서, 본 발명은 구체적으로 종래 방법의 단점과 문제점을 해결하기 위한 전세포 및 유기체의 게놈을 개량시키는 방법을 제공하는 것이다.
용어 정의
"동족"이라는 용어는 종간에 진화적, 기능적으로 관련성이 있는 유전자 서열을 의미한다. 예컨대, 인간 게놈에서 인간 CD4 유전자는 마우스 CD4 유전자와 동족 유전자인데, 그 이유는 이 두 유전자의 서열과 구조가 고도로 상동성이고 두 유전자 모두 MHC 제II군 제한성 항원 인식을 통해 T 세포 활성화 시그널링 작용을 하는 단백질을 암호하는 것으로 나타나기 때문이다.
일반적으로, 선별은 먼저 세포가 선별 마커를 발현하는지, 발현하지 않는지를 측정하고, 그 다음 목적 성질을 가진 세포를 물리적으로 분리하는 2단계 과정이다. 선택은 동정 및 물리적 분리가, 마커를 발현하는 세포는 생존시키고 다른 세포는 죽이는(또는 그 반대) 일부 유전자 환경에서 선택 마커의 발현에 의해 동시적으로 실시되는 선별의 한 형태이다. 선별 마커로는 루시퍼라제, β-갈락토시다제 및 녹색 형광성 단백질을 포함한다. 선택 마커로는 약물 및 독소 내성 유전자를 포함한다.
외인성 DNA 분절은 세포에 외래(또는 이종성)인 것이거나 또는 세포와 동종성이지만 숙주 세포의 핵산 내 위치에서 그 분절이 통상적으로 발견되지 않는 위치에 있는 것이다. 외인성 DNA 분절은 발현되면 외인성 폴리펩티드를 생성할 수 있다.
유전자란 용어는 광의적으로 생물학적 기능과 관련이 있는 DNA의 모든 분절을 의미하는 것이다. 따라서, 유전자는 발현에 필요한 조절 서열 및/또는 암호 서열을 포함한다. 또한, 유전자는 예컨대 다른 단백질에 대한 인식 서열을 형성하는 발현되지 않는 DNA 분절도 포함한다.
서열 동일성 %는 비교 창에서 적절히 정렬된 2개 서열을 비교하고, 두 서열에 존재하는 동일 핵산 염기의 위치 수를 측정하여 정합 위치의 수를 얻은 뒤, 정합 위치의 수를 비교창 중의 총 위치수로 나누어서 계산한다. 비교창을 정렬하기 위한 서열의 최적 정렬은 미국 위스콘신주 사이언스 드라이브 575에 소재하는 제네틱스 컴퓨터 그룹에서 개발된 위스콘신 제네틱스 소프트웨어 팩키지 릴리스 7.0 중의 알고리듬 GAP, BESTFIT, FASTA 및 TFASTA의 자동화 방법으로 실시할 수 있다.
"천연 발생"이란 용어는 천연에서 발견될 수 있는 대상물을 나타내는 것이다. 예컨대, 천연에서 분리될 수 있는 유기체(바이러스 포함)에 존재하고 실험실에서 인위적으로 변형되지 않은 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드 서열은 천연 발생의 것이다. 일반적으로, 천연 발생이란 용어는 비병리 상태(무질환) 개체에 존재하는 대상물, 예컨대 그 종에 전형적인 것을 의미한다.
무성 재조합은 생식체가 융합하여 접합체를 형성함이 없이 나타나는 재조합이다.
본 출원은 1997년 1월 17일자로 제출된 USSN 60/035,054호(본 출원에 참고 인용됨)를 우선권으로 한다.
본 발명은 세포와 유기체의 게놈을 개량하여 새롭고 개선된 성질을 획득하기 위한 분자 유전학의 기술 분야에 관한 것이다.
도 1은 유전자의 시험관내 셔플링을 도시한 개략도.
도 2는 MutS를 사용하여 부정합 서열을 증량시키기 위한 개략도.
도 3은 MutS를 사용하여 부정합 서열을 증량시키기 위한 또 다른 개략도.
도 4는 성장 호르몬 유전자를 개량하여 어류를 대형화하기 위한 개략도.
도 5는 원형질 융합으로 셔플링하기 위한 개략도.
도 6은 종전에는 유성 생식할 수 없었던 진균류에 유성 생식 사이클을 도입시키기 위한 개략도.
도 7은 원형질 융합으로 진균류를 셔플링하기 위한 일반적 개략도.
도 8은 세포벽 형성에 주요 역할을 하는 효소의 억제제를 사용하여 만든 원형질을 이용한 원형질 융합에 의한 진균류의 셔플링.
도 9는 원형질을 자발적으로 형성하는 세포벽 합성 결손형의 진균류 균주를 이용한 원형질 융합에 의한 진균류의 셔플링.
도 10은 사카로마이세스 세레비지에와 관련 유기체에 대한 YAC 매개의 전게놈 셔플링.
도 11은 대형 DNA 단편의 YAC 매개의 셔플링.
도 12A, 도 12B, 도 12C 및 도 12D는 야생형 recA 단백질의 DNA 서열(신규 Minshall로 표시)과 5가지 과재조합성 변형체.
도 13은 야생형 recA 단백질과 5가지 과재조합성 변형체의 아미노산 서열.
상세한 설명
I. 개론
A. 기본 요지
본 발명은 반복적 서열 재조합 방법에 의해 세포를 인위적으로 개량하여 신규하거나 개선된 성질을 제공하는 방법을 제공한다. 간략히 설명하면, 반복적 서열 재조합 방법은 재조합과 선별/선택 과정을 연속 순환시켜 분자 다양성을 생성하는 단계를 포함한다. 즉, 서로 실질적인 서열 및/또는 구조 동일성을 보이지만 돌연변이의 존재로 상이한 핵산 분자 군을 만든다. 각각의 재조합 사이클은 목적 성질을 가진 분자에 대한 선별 또는 선택 과정을 1회 이상 순환시킨 후 실시한다. 제1 단계에서 선택된 분자는 다양성을 얻기 위한 다음 단계의 출발 물질로서 사용한다.
개량되는 세포는 박테리아, 아케박테리아 또는 진핵 세포일 수 있고, 동종 세포주 또는 혼합 배양물을 구성할 수 있다. 개량에 적합한 세포로는 유전자 조작과 단백질 발현에 널리 사용되는 박테리아 및 진핵 세포주를 포함한다. 적합한 포유동물 세포로는 예컨대, 마우스, 래트, 햄스터, 영장류 및 인간 유래의 세포주 및 1차 배양물을 모두 포함한다. 이와 같은 세포로는 태아 간세포와 조혈 간(幹)세포를 비롯한 간세포, 접합체, 섬유아세포, 림프구세포, 중국 햄스터 난소(CHO), 마우스 섬유아세포(NIH3T3), 신장, 간, 근육 및 피부 세포를 포함한다. 기타 바람직한 진핵 세포로는 식물 세포, 예컨대 옥수수, 쌀, 밀, 면, 대두, 사탕수수, 담배 및 아라비돕시스; 어류, 조류, 진균류(페니실륨, 아스퍼질러스, 포돕스포라, 뉴로스포라, 사카로마이세스), 곤충(예, 바률로 레피돕테라), 효모(피키아 및 사카로마이세스, 시조사카로마이세스 폼베)를 포함한다. 또한, 그람 음성 및 그람 양성의 많은 박테리아 세포 종류, 예컨대 바실러스 서브틸리스, 바실러스 리케니포미스, 바실러스 세레우스, 에세리키아 콜리, 슈도모나스, 살모넬라, 악티노마이세테스 및 에르위니아를 포함한다. 이.콜리와 바실러스 서브틸리스의 완전한 게놈 서열은 문헌[Blattner et al., Science 277, 1454-1462(1997); Kunst et al., Nature 390, 249-256(1997)]에 개시되어 있다.
개량은 변형 세포 집단을 만들어 개시한다. 일반적으로, 이 집단 중의 세포는 동일 형태이지만 양친 세포의 변형체를 나타낸다. 일부 경우에, 변형은 1종 내의 여러 개체에서 여러 세포를 얻거나 여러 종에서 여러 세포를 얻는 경우와 같이 자연적인 것이다. 일부 다른 경우에는 변형은 양친 세포의 돌연변이유발에 의해 유도된다. 돌연변이유발은 세포를 돌연변이원제로 처리하여 실시하거나, 또는 세포가 돌연변이 세포(예, 돌연변이 도입에 바람직한 DNA 복제, 재조합 및/또는 수복과 관련있는 유전자의 돌연변이를 보유함)인 경우 단순히 돌연변이 세포를 전파시켜 실시할 수 있다. 돌연변이 세포는 단순히 표현형이 변화한 것을 후속적으로 선택하여 얻을 수 있다[예, 리팜피신 내성 획득, 그 다음 날리딕스 산 내성, 그 다음 lac- 내지 lac+의 획득(Mao et al., J.Bacteriol. 179, 417-422(1997)].
다른 경우에, 변형은 DNA 단편의 라이브러리를 세포로 전이시킨 결과이다(예, 접합, 형질전환, 형질도입 또는 자연 적응). 라이브러리 중 1개 이상의 단편, 통상 다수의 단편은 세포내 동족 또는 대립 유전자와 완전하지는 않지만 동종 재조합을 일으키기에 충분한 일부 서열 또는 구조의 동일성이 있다. 단편의 라이브러리는 1가지 이상의 기원에서 얻을 수 있다. 단편의 1가지 기원은 여러 종, 세포 유형, 유기체 또는 형질감염된 세포 유래의 개체로부터 만든 단편의 게놈 라이브러리이다. 이 라이브러리 중의 단편의 대부분은 형질전환된 세포 중에 존재하는 동족 또는 대립 유전자이지만, 천연 발생의 종 변화, 다형성 및 돌연변이의 존재 때문에 유전자가 동일하지 않다. 또는, 라이브러리는 방사선, 잘못이 있는 PCR, 돌연변이 유기체 중에서의 성장 또는 카세트 돌연변이유발법과 같은 통상의 방법으로 DNA를 돌연변이 유도 처리한 후 형질전환시킨 동일 세포 종류 유래의 DNA로부터 얻을 수도 있다. 이와 같은 어떤 경우든지간에, 게놈 라이브러리는 완전한 게놈 라이브러리이거나, 예컨대 소정의 염색체 또는 염색체의 일부 또는 세포 내 에피솜 인자 유래의 준게놈 라이브러리일 수 있다. 이와 같은 기원의 DNA 단편 뿐만 아니라 또는 이와 같은 DNA 단편 대신에, 라이브러리는 공지 기능을 가진 소정 유전자의 천연 변형체 또는 소정 변형체를 나타내는 단편을 포함할 수 있다(즉, 집중(focused) 라이브러리).
라이브러리 중에 포함된 단편의 수는 1개의 단편에서 부터 약 1010까지 다양할 수 있고, 보통 103내지 108단편을 가진 라이브러리가 일반적이다. 단편은 동종 재조합을 수행할 수 있을 정도로 충분히 길고 세포 중으로 도입될 수 있을 정도로 충분히 짧아야 하며, 필요하다면 도입 전에 조작될 수 있다. 단편의 크기는 10b 내지 1000 kb 범위일 수 있으며, 보통 500 내지 10,000 염기가 일반적이다. 단편은 2본쇄 또는 1본쇄일 수 있다.
단편은 전체 게놈으로서 또는 바이러스, 플라스미드, YAC, HAC 또는 BAC의 성분으로서, 또는 단편 자체로서 세포 중으로 도입될 수 있는데, 이 때 모든 단편이나 단편 대부분에는 복제 오리진이 결실되어 있다. 1본쇄 게놈을 가진 바이러스 단편의 이용은 재조합을 촉진하는 1본쇄 형태로 단편을 전달할 수 있다는 잇점을 제공한다. 또한, 단편은 도입시키기 전에 선택성 마커에 결합시킬 수도 있다. 단편이 세포에 의해 분해 또는 선택되고 세포로부터 배출되기 전에 동족 유전자와 재조합할 수 있는 세포중으로 도입된 후, 복제 오리진을 가진 벡터에 단편이 병입되는데에는 장시간이 걸리며, 그 결과 재조합 게놈을 가진 세포의 비율이 증가된다. 경우에 따라, 벡터는 분리된 DNA 단편 보다 장시간 존재할 수 있으나 세포주내에 영구 유지될 수 없는 자기불활화 벡터이다. 이 벡터는 충분한 시간 동안 마커를 일시 발현하여 벡터를 보유한 세포를 선택하거나 선별가능케 하나, 그 다음 분해되거나 마커를 발현할 수 없게 된다. 이와 같은 벡터의 사용은 하기 기재되는 후속 재조합 과정을 수행하는데 유리할 수 있다. 예컨대, 일부 자기불활화 벡터는 동일 벡터에서 발현되는 단기 지속성 분자에 의해 중화되는 장기 지속성 독소를 발현한다. 독소의 단독 발현은 벡터 형성을 어렵게 할 것이다[Jense & Gerdes, Mol.Microbiol., 17, 205-210(1995); Bernard et al., Gene 162, 159-160]. 대안적으로, 벡터는 결손형 복제 오리진(즉, 감온성)의 병입 또는 복제 오리진의 결실로 자기불활화 벡터로 만들 수 있다. 또한, 벡터는 효모 중의 oraB 또는 많은 박테리아 중의 sacB와 같은 음성 선택 마커를 병입시켜 자기불활화 벡터로 만들 수도 있다. 이 유전자는 특정 화합물의 존재하에서만 독성이 된다. 이와 같은 벡터는 광범위한 안정성을 갖도록 선택될 수 있다.
단편은 세포 중으로 도입된 후, 세포의 에피좀이나 게놈에 존재하는 DNA와 동종, 비동종 또는 부위 특이적 재조합을 통해 재조합할 수 있다. 이와 같은 목적에는 동종 재조합법이 세포 개량시 가장 바람직한 역할을 하는데, 그 이유는 이 동종 재조합법이 형질감염된 세포의 DNA와 DNA 단편간에 존재하는 다양성을 증폭시키기 때문이다. 예컨대, 형질감염된 DNA 단편이 동족 또는 대립 유전자와 2개 위치에서 상이하다면, 가능한 재조합 생성물은 4개이고 이 재조합 생성물 각각은 형질전환된 집단 중의 상이한 세포에서 형성될 수 있다. 따라서, 단편의 동종 재조합은 이 유전자내 초기 다양성을 2배화한다. 많은 단편이 대응하는 동족 또는 대립 유전자와 재조합하는 경우, 출발 생성물에 대한 재조합 생성물의 다양성은 단편의 수를 지수적으로 증가시킨다. 재조합은 변형된 게놈 및/또는 에피좀을 가진 변형 세포를 형성시킨다.
변형 세포는 자연 변형이거나 돌연변이유발 또는 재조합에 의한 변형이거나 간에 신규 성질 또는 개선된 성질의 획득에 대해 개량된 세포의 아집단을 동정하기 위하여 선별하거나 선택한다. 물론, 선별의 기준은 성질에 따라 다르며, 몇가지 예를 하기 설명하겠다. 경우에 따라, 선별은 재조합의 후속 사이클을 실시하기 전에 반복한다. 선별의 반복 사이클 마다 엄중도는 증가할 수 있다.
선별시 생존한 세포의 아집단을 추가 재조합 사이클에 사용한다. 일부 경우, 추가 재조합 사이클은 세포간 DNA의 교환을 허용하는 조건하에서 세포를 전파시켜 실시한다. 예컨대, 원형질은 세포로부터 제조하고, 융합시킨 후, 융합된 원형질로부터 재조합 게놈을 가진 세포를 전파시킨다. 대안적으로, DNA 교환은 전기장에서 세포를 전파시켜 촉진할 수 있다. 접합 전이 장치를 보유한 세포의 경우 DNA 교환은 단순히 세포를 전파시키면 촉진될 수 있다.
다른 방법으로, 추가 재조합 단계는 분할 수집 방법을 사용하여 실시한다. 즉, 생존 세포를 2개의 수집물로 나눈다. 수집물 1개에서 DNA를 분리하고, 필요하다면 증폭시킨 뒤, 다른 수집물을 형질전환시킨다. 따라서, 제1 수집물 유래의 DNA 단편은 단편의 추가 라이브러리를 구성하고 제2 수집물 중의 동족 단편과 재조합하여 추가 다양성을 제공한다.
다른 방법으로, 선별시 생존한 세포 일부 또는 전부를 새로운 DNA 단편 라이브러리로 형질감염시키며, 이 때 상기 라이브러리는 1차 재조합 과정에 사용된 것과 동일하거나 상이할 수 있다. 이와 같은 경우에, 새로운 라이브러리 중의 유전자는 생존 세포 중에 존재하는 동족 유전자와 재조합한다. 유전자가 벡터의 성분으로 도입되는 경우, 이 벡터와 전 단계의 형질감염 시 사용된 임의의 벡터와의 화합성을 고려해야 한다. 전 단계에 사용된 벡터가 자기불활화 벡터였다면 불화합성의 문제는 없겠지만 전단계에 사용된 벡터가 자기불활화 벡터가 아니라면 다음 단계에 사용되는 벡터는 상이한 불화합성 오리진을 가진 벡터를 보유한 것을 사용해야 한다. 이와 같은 방식에서, 추가 재조합은 세포의 DNA 성분에 추가 다양성을 제공하고, 따라서 추가 변형 세포를 얻을 수 있다.
추가 변형 세포는 제1 단계에서와 같은 원리에 따라 추가 선별/선택 단계로 처리한다. 선별/선택을 통해 목적 성질의 획득에 대해 추가 개량된 추가 변형 세포의 아집단을 동정한다. 동정된 세포의 아집단을 동일 원리에 따라 추가 재조합 및 선별 단계로 처리하고, 경우에 따라 선별 엄중도는 각 단계 마다 증가시킨다. 결과적으로, 목적 성질을 획득한 세포가 동정된다.
B. 변형
1. recA 단백질을 이용한 단편 코팅
라이브러리 단편과 동족 내인성 유전자간 동종 재조합의 빈도수는 전술한 단편을 세포중으로 도입시키기 전에 재조합원성 단백질로 코팅하면 증가시킬 수 있다. 문헌[Pati et al., Molecular Biology of Cancer 1, 1(1996); Sena & Zarling, Nature Genetics 3, 365(1996); Revet et al., J.Mol.Biol. 232, 779-791(1993); Kowalczkowski & Zarling in Gene Targeting(CRC 1995), Ch.7.] 참조. 재조합원성 단백질은 동종 짝지음 및/또는 가닥 교환을 촉진한다. 특성이 가장 잘 규명된 recA 단백질은 이.콜리 유래의 것으로, 파마시아(미국 뉴저지주 피스카타웨이 소재)에서 시판한다. 야생형 단백질 외에도 다수의 돌연변이 recA 유사 단백질이 동정되었다(예, recA803). 또한, 많은 유기체들이 가닥 전이 활성을 보유한 recA 유사 재조합효소를 보유한다[예컨대, 문헌 Ogawa et al., Cold Spring Harbor Symposium on Quantitative Biology 18, 567-576(1993); Johnson & Symington, Mol. Cell. Biol. 15, 4843-4850(1995); Fugisawa et al., Nucl.Acids Res. 13, 7473(1985); Hsieh et al., Cell 44, 885(1986); Hsieh et al., J.Biol.Chem. 264, 5089(1989); Fishel et al., Proc.Natl.Acad.Sci. USA 85, 3683(1988); Cassuto et al., Mol.Gen.Genet. 208, 10(1987); Ganea et al., Mol. Cell Biol. 7, 3124(1987); Moore et al., J.Biol.Chem. 19, 11108(1990); Keene et al., Nucl.Acids Res. 12, 3057(1984); Kimiec, Cold Spring Harbor Symp. 48, 675(1984); Kimeic, Cell 44, 545(1986); Kolodner et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84, 5560(1987); Sugino et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85, 3683(1985); Halbrook et al., J. Biol.Chem. 264, 21403(1989); Eisen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85, 7481(1988); McCarthy et al., Proc.Natl.Acad.Sci. USA 85, 5854(1988); Lowenhaupt et al., J.Biol.Chem. 264, 20568(1989)]. 이 재조합효소 단백질의 예로는 recA, recA803, uvsX[Roca, A.I., Crit.Rev.Biochem.Molec.Biol. 25, 415(1990)], sep1[Kolodner et al., Proc.Natl.Acad.Sci.(U.S.A.) 84, 5560(1987); Tishkoff et al., Molec.Cell.Biol.11,2593], RuvC(Dunderdale et al., Nature 354, 506(1991)], DST2, KEM1, XRN1(Dykstra et al., Molec.Cell.Biol.11,2583 (1991)], STPα/DST1(Clark et al., Molec.Cell.Biol.11, 2576(1991)], HPP-1[Moore et al., Proc.Natl.Acad.Sci.(U.S.A.) 88, 9067(1991)], 기타 다른 진핵 재조합효소[Bishop et al., Cell 69, 439(1992); Shinohara et al., Cell 69, 457]를 포함한다.
recA 단백질은 1본쇄 DNA를 코팅하는 경우 핵단백질사를 형성한다. 이 핵단백질사에서, recA 단백질 1 단량체는 약 3개의 뉴클레오티드에 결합되어 있다. 이와 같은 1본쇄 DNA를 코팅하는 recA의 성질은 비록 특정 서열이 폴리뉴클레오티드 상에 recA가 초기 장입되는 것을 유리하게 하더라도(예컨대, 핵형성 서열) 본질적으로 서열 의존적이다. 핵단백질사는 셔플링되는 거의 모든 것에 형성될 수 있고, 원핵 세포 및 진핵 세포에 존재하는 1본쇄 및 2본쇄 DNA와 복합체를 형성할 수 있다.
단편은 recA 또는 기타 재조합효소와 접촉시키기 전에 종종 열처리 등으로 변성시킨다. 그 다음, recA 단백질을 약 1 내지 10 μM의 농도로 첨가한다. 항온처리후 recA 코팅된 1본쇄 DNA를 통상의 방법, 예컨대 화학적 형질전환 또는 전기침투 등으로 수용체 세포 중으로 병입시킨다. 단편은 동족 내인성 유전자와 동종 재조합한다. 재조합 효소의 코팅으로 재조합 빈도가 증가하기 때문에 단편을 벡터의 성분으로서 도입시킬 필요는 없다.
단편은 때로 재조합을 촉진하거나, 핵산을 분해로부터 보호하거나 핵산을 핵으로 유도하는 기타 다른 핵산 결합 단백질로 코팅되기도 한다. 이와 같은 단백질의 예로는 아그로박테리움 virE2를 포함한다[Durrenberger et al., Proc.Natl. Acad.Sci. USA 86, 9154-9158(1989)].
2. MutS 선택
이.콜리 부정합 수복 단백질 MutS는 친화성 크로마토그래피에 사용하면 부정합 염기가 1개 이상인 2본쇄 DNA의 단편을 증량시킬 수 있다. MutS 단백질은 부정합 점에서 각 가닥에 의해 형성된 버블을 인식한다[예컨대, Hsu & Chang, WO 9320233]. 부분 부정합 2본쇄를 증량시키는 친화성 방법은 본 발명의 방법에 병입시키면 유입되는 단편의 라이브러리와 이에 대응하는 수용체 세포중에 존재하는 동족 또는 대립 유전자 간 다양성을 증가시킬 수 있다.
도 2는 다양성을 증가시키기 위하여 MutS를 사용한 1가지 개략도이다. 증량하기 위한 DNA 기질은 몇몇 부위가 다른 것을 제외하고는 서로 실질적으로 유사하다. 예컨대, DNA 기질은 다형성에 의해 차이가 있는 여러 개체 유래의 전체 게놈 또는 부분 게놈(예, 염색체 라이브러리)일 수 있다. 또한, 이 기질은 야생형 서열의 유도된 돌연변이체일 수 있다. 이 DNA 기질을 모아, 제한 분해하고, 변성시켜 1본쇄 DNA 가닥을 형성시킨다. 이 1본쇄 DNA를 그 다음 재어닐링한다. 일부 1본쇄 단편은 완전하게 정합되는 상보성 가닥과 재어닐링하여 완전 정합된 2본쇄를 형성하기도 한다. 다른 1본쇄 단편은 어닐링하여 부정합성 2본쇄를 형성한다. 이 부정합성 2본쇄는 완전 정합성 2본쇄로부터 MutS 크로마토그래피(예컨대, 비드에 MutS를 고정시킨 것)로 증량시킨다. 크로마토그래피로 회수한 부정합 2본쇄를 수용체 세포 중으로 유입시켜 전술한 바와 같이 동족 내인성 유전자와 재조합시킨다. MutS 친화성 크로마토그래피는 서로 상이한 단편과 동족 내인성 유전자의 비율을 증가시킨다. 따라서, 유입 단편과 내인성 유전자 간의 재조합은 다양성을 증가시킬 것이다.
도 3은 MutS 증량의 제2 방법을 도시한 것이다. 이 방법에서, MutS 증량을 위한 기질은 비교적 짧은 분절의 변형체, 예컨대 여러 변형체의 대부분이 뉴클레오티드 1개 이하 정도 상이한 유전자 또는 유전자 클러스터를 나타낸다. MutS 증량의 목표는 천연 발생의 서열보다 많은 변형을 각각 포함하는 재조합용 기질을 생성하는 것이다. 이와 같은 목표는 기질을 무작위로 단편화하여 중첩 단편을 형성시켜 달성한다. 이 단편을 1차 방법에서와 같이 변성시키고 재어닐링한다. 재어닐링은 MutS 친화성 크로마토그래피에 의해 완전하게 정합된 2본쇄로부터 분리될 수 있는 일부 부정합성 2본쇄를 형성한다. 전술한 바와 같이 MutS 크로마토그래피는 1개 이상의 부정합을 보유하는 2본쇄를 증량시킨다. 이 부정합 2본쇄를 그 다음 보다 긴 단편으로 재어셈블리한다. 이는, 부분 어닐링 2본쇄를 변성, 재어닐링 및 사슬 연장 단계로 순환 처리하여 수행한다(섹션 V 참조). 수회 순환처리하면, 본래 기질과 동일한 길이의 단편이 얻어지는데, 이 단편은 다수 부위에서 서로 상이하다. 이 단편을 그 다음 동족 내인성 유전자와 재조합을 일으키는 세포 중으로 유입시킨다.
3. 대립 유전자 교환에 대한 양성 선택
본 발명은 출발 세포에 상대적으로 변형 유전자를 보유하는 세포를 증량시키는 방법을 제공한다. 이것은 양성 및 음성 선택 마커를 모두 포함하는 자기불활화 벡터(즉, 수용체 세포 종류에 기능성 복제 오리진이 결실됨) 중에 DNA 단편 라이브러리를 유입시켜 실시할 수 있다. 경우에 따라, 상이한 기원(예, 바실러스 서브틸리스, 바실러스 리케니포미스 및 바실러스 세레우스) 유래의 다중 단편 라이브러리를 다른 선택 마커를 보유하는 다른 벡터 중으로 클로닝시킬 수 있다. 적합한 양성 선택 마커로는 neoR, 카나마이신R, hyg, hisD, gpt, ble, tetR, hprt, ura3 및 sacB를 포함한다. 적합한 음성 선택 마커로는 hsv-tk, hprt, gpt 및 시토신 디아미나제를 포함한다. 음성 선택시 사용가능한 다른 방법은 스트렙토마이신 내성을 부여하는 돌연변이 rpsL 유전자를 가진 세포에 사용할 수 있는 벡터 중에 야생형 rpsL 유전자(리보솜 단백질 S12 암호)를 포함하는 것이다. rpsL의 돌연변이 형태는 야생형 rpsL을 가진 세포에서 열성형이다. 따라서, Sm 내성 선택은 rpsL의 야생형 카피를 보유한 세포에 대하여 실시한다[Skorupski & Taylor, Gene 169, 47-52(1996)]. 대안적으로, 양성 선택 마커만을 보유한 벡터를, 마커를 발현하는 세포를 선택하는 1차 단계와 마커를 상실한 세포를 선별하는 후속 단계(예컨대, 약물 감수성에 대한 선별)에 사용할 수 있다. 양성 선택 마커를 상실한 세포에 대한 선별은 음성 선별 마커에 대하여 선별하는 것과 동등한 것이다. 예컨대, CAT 유전자를 보유하는 벡터와 통합될 서열로 바실러스를 형질전환시킬 수 있다[Harwood & Cutting, Molecular Biological Methods for Bacillus, at pp. 31-33]. 클로람페니콜 내성에 대한 선택 단계로 벡터를 보유한 세포를 분리한다. 재조합되기에 적합한 기간이 경과한 후, CAT 감수성에 대한 선택 단계로 CAT 유전자를 상실한 세포를 분리한다. 이와 같은 세포 약 50%는 통합될 서열과 재조합될 것이다.
양성 선택 마커와 경우에 따라 음성 선택 마커 및 DNA 단편을 보유하는 자기불활화 벡터는 상기 단편에 상동성인 염색체 DNA 중의 일정 부위에 1회 유전자 교환을 통해 숙주 염색체 DNA 중으로 통합될 수 있다. 재조합은 상동성 서열의 직접 반복체가 인접하고 있는 통합 벡터를 형성한다. 일부 세포에서, 후속되는 반복체간 재조합은 벡터를 절단시키고 벡터 유래의 원하는 돌연변이를 획득시키거나 야생형으로 게놈이 수복된다.
이 방법에서, 적합한 벡터 중에 클로닝된 유전자 라이브러리를 전이시킨 후 양성 선택 마커를 발현하는지 양성 선택을 실시한다. 통합되지 않은 자기불활화 벡터 카피는 세포로부터 빠르게 제거되기 때문에, 이 선택 과정을 통해 숙주 염색체 중으로 벡터가 통합된 세포가 증량된다. 그 다음, 양성 선택 과정에서 생존한 세포를전파시킨 후, 음성 선택 과정으로 처리하거나 또는 양성 선택 마커의 상실 여부로 선별한다. 음성 선택 과정은 음성 선택 마커를 발현하는 세포를 선택한다. 따라서, 통합된 벡터를 보유한 세포는 음성 마커를 발현하고 선택적으로 제거된다. 이 두 선택 과정에서 생존한 세포는 처음에는 벡터에 통합된 후 벡터에서 제거된 것이다. 이 세포 중에서, 상기 벡터와의 동종 재조합에 의해 변형된 유전자를 보유한 세포에 대해 증량시킨다.
4. 개별적인 유전자 최적화
일반적으로, 전술한 방법은 최적화될 유전자의 수, 유전자 지도 상의 위치 또는 기능에 대해 알 필요가 없다. 하지만, 일부 경우에는 이와 같은 정보가 1개 이상의 유전자에 대해 알려져 있어 이용가능한 경우도 있다. 예컨대, 개량에 의해 획득될 성질이 세포 재조합율의 향상인 경우, 공지이거나 공지되지 않은 많은 다른 유전자들이 다른 주요 역할을 제공하더라도 중요한 것으로 간주되는 1개의 유전자는 recA이다. 이 경우, recA 유전자는 다른 시험 유전자와는 별도로 최소한 부분적으로 개량할 수 있다. recA 유전자는 섹션 V에 기재된 모든 반복적 재조합 방법으로도 개량할 수 있다. 간략히 설명하면, 이 방법은 recA 유전자의 다양한 형태를 얻고, 이 형태를 재조합한 뒤, 개선된 성질을 보유한 재조합체를 선택하고, 그 다음 재조합체를 추가 재조합과 선택 단계로 처리하는 과정을 수반한다. 개별적인 recA 개선 과정 중 어떤 단계에서든지 recA의 다양성 형태는 전술한 일반 방법에 사용되는 라이브러리 중에서 다른 유전자를 암호하는 단편과 함께 수집될 수 있다. 그 후, 상기 라이브러리는 다른 어떤 것보다 획득하고자 하는 성질에 중요한 것으로 알려진 유전자에 다수의 변형체를 포함하도록 시드(seed)한다.
5. 셔플링을 위한 DNA 기질의 수확
일부 셔플링 방법에서, DNA 기질은 천연원에서 분리되지만, 효소 반응에 유해 역할을 하는 제거 용이하지 않은 불순물 때문에 DNA 변형 효소 또는 DNA 중합화 효소에 의해 쉽게 조작되지 않는다. 이와 같은 문제점은 회수 균주를 통해 DNA 기질을 처리하므로써 해소할 수 있다. 회수 균주는 일반적으로 천연 컴피턴스능 및 실질적 다양성이 있는 서열(예, 서열 동일성이 75% 정도인 서열)간 동종 재조합 성능이 있는 세포 종류이다. 회수 균주는 표적 유기체 유래의 DNA에 목적하는 유전자 또는 기타 다른 영역에 인접한 두 분절에 각각 상보적인 두 분절이 인접해 있는 음성 선택 마커를 암호하는 벡터를 보유한다. 이 회수 균주를 표적 유기체 유래의 DNA 단편과 접촉시킨다. 단편은 천연 컴피턴스능에 의해 흡수되고, 표적 유기체 유래의 목적 단편은 회수 균주의 벡터와 재조합하여 음성 선택 마커를 상실하게 된다. 음성 마커에 대한 선택 과정을 통해 목적 단편을 흡수한 세포를 분리할 수 있다. 셔플링은 회수 균주내에서 실시하거나, 또는 시험관내 셔플링의 경우 또는 생체내 셔플링되는 다른 세포 종류로의 전이시 회수 균주로부터 벡터를 분리하여 실시할 수 있다. 대안적으로, 벡터를 접합, 원형질 융합 또는 전기융합에 의해 다른 세포 종류로 전이시킬 수 있다. 적합한 회수 균주의 일예는 아시네토박터 칼코아세티쿠스 mutS이다[Young et al., 97th ASM Meeting Abstracts]. 이 균주는 천연적으로 컴피턴스이고, 비서열 특이적 방식으로 DNA를 흡수한다. 또한, mutS 돌연변이로 인해 이 균주는 서열 동일성이 단지 75%인 서열을 동종 재조합할 수 있다.
III. 용도
A. 재조합원성
전세포 개량의 1가지 목적은 개선된 재조합 활성을 가진 세포를 생성하는 것이다. 이와 같은 세포는 섹션 V에 기재된 생체내 반복적 서열 재조합 방법을 비롯하여 분자 유전학의 다양한 용도에 유용하다. 유전자 재조합에 관련이 있는 유전자로서 대략 30개의 유전자(예, recA, recB, recC, recD, recE, recF, recG, recO, recQ, recR, recT, ruvA, ruvB, ruvC, sbcB, ssb, topA, gyrA 및 gyrB, lig, polA, uvrD, E, recL, mutD, mutH, mutL, mutU, helD) 및 DNA 부위(예, chi, recN, sbcC)가 이.콜리에서 동정되었고, 이 유전자 중 몇몇은 그 동족 유전자가 다른 유기체에서 발견되었다[예, 효모 중의 rad51, rad55, rad57, Dmc1(Kowalczkowski et al., Microbiol.Rev. 58, 401-465(1994); 전술한 Kowalczkowski & Zarling 문헌 참조) 및 Rad51과 Dmc1의 인간 동족체가 동정됨(Sandler et al., Nucl.Acids Res. 24, 2125-2132(1996)]. 이.콜리 유전자 중 recA를 비롯한 적어도 일부는 포유 동물 세포 중에서 기능적이고, SV40 대형 T 항원 핵 표적화 서열과의 융합체로서 핵을 표적으로 할 수 있다[Reiss et al., Proc.Natl.Acad.Sci. USA, 93, 3094-3098(1996)]. 또한, 부정합 수복 유전자의 돌연변이, 예컨대 mutL, mutS, mutH는 상동성 조건을 완화시켜 보다 다양한 서열 간의 재조합을 허용한다[Rayssiguier et al., Nature 342, 396-401(1989)]. 다양성 균주 간의 재조합 정도는 부정합 수복 유전자를 손상시키고 SOS 유전자를 자극하여 향상시킬 수 있다. 이것은 부정합 수복 유전자를 억제하고 SOS를 자극하는 것으로 밝혀진 대사 스트레스 조건하에서의 성장 및/또는 적당한 돌연변이 균주의 이용을 통해 수행될 수 있다[Vulic et al., Proc.Natl.Acad.Sci. USA 94(1997)].
재조합의 출발 기질은 전술한 일반 원리에 따라 선택한다. 즉, 기질은 재조합 유전자 또는 부위를 포함하는 전게놈 또는 그 분획일 수 있다. 대부분 무작위 단편인 대규모 라이브러리는 recA와 같은 1종 이상의 공지 재조합 유전자의 변형체를 구성하는 단편의 수집물을 시드로 하여 만들 수 있다. 또는, 라이브러리는 다양한 공지 재조합 유전자 및 부위의 변형 형태를 혼합하여 형성할 수 있다.
단편의 라이브러리는 개선될 수용체 세포로 도입시키면 재조합이 일어나고, 그 결과 변형된 세포가 얻어진다. 수용체 세포는 재조합시 보완이 가능한 발현 불능성 마커 유전자를 포함하는 것이 좋다. 예컨대, 이 세포는 상이한 부위에 돌연변이를 보유하고, 재조합시 야생형 유전자를 생성하는 2개의 마커 유전자 카피를 포함할 수 있다. 적합한 마커 유전자는 녹색 형광성 단백질이다. 벡터는 N-말단 부근에 종결 코돈을 보유한 GFP의 제1 카피와, 이 단백질의 C 말단에 종결 코돈을 보유한 GFP의 제2 카피를 암호하도록 작제할 수 있다. 이 분자의 각 말단에 있는 종결 코돈 사이의 거리는 500 bp이고, 활성 GFP에서 나타나는 재조합율은 약 25%이다. 세포 중에서의 GFP의 발현은 세포가 종결 코돈 간에 재조합하는 동종 재조합을 실시하여 근접 암호 서열을 생성할 수 있다는 것을 나타낸다. GFP를 발현하는 세포를 선별하여 최고 재조합 활성을 가진 세포를 증량시킨다. 이어서 후속 재조합 단계로 처리한 후 동일한 선별 방식을 이용하여 실시가능하다. 하지만, 이전 단계에서 사용된 선택 마커가 자기불활화 벡터 상에 존재하지 않는다면 후속 단계에는 상이한 복제 기원을 보유한 제2 벡터 내에 존재하는 제2 불능 선별 마커 또는 전단계에서 사용된 벡터와 상이한 양성 선택 마커를 이용해야 한다.
B. 다중게놈성 카피수
영양 배지에서 증식된 정지상 배양물에 존재하는 박테리아 세포 대부분은 2개, 4개 또는 8개의 염색체를 포함한다. 최소 배지에서 세포는 1개 또는 2개의 염색체를 포함한다. 따라서, 박테리아 세포 당 염색체의 수는 정지상에 도달하는 세포의 증식 속도에 따라 달라진다. 그 이유는 증식 속도가 빠른 세포는 다중 복제 포크를 포함하여 종결 반응 후 세포내 여러 염색체가 존재하기 때문이다. 시험된 모든 균주는 정지상에서 1개 이상의 염색체를 보유하더라도, 염색체의 수는 균주마다 다르다. 그 이유는 포유 동물 세포 중의 고사 현상과 유사한 전체 염색체의 단편화 및 분해 때문인 것으로 보인다. 다중 게놈 카피를 포함하는 세포내 게놈의 단편화는 대규모 재조합과 돌연변이유발을 일으킨다. 유용한 돌연변이체를 통해 증식을 유지시키는 에너지원을 이용하는 방식을 규명할 수 있다.
데이노코커스 라디안스(Deinococcus radians)와 같은 일부 세포 종류[Daly and Minton J.Bacteriol. 177, 5495-5505(1995)]는 세포 주기를 통해 다배수성을 나타낸다. 이 세포 종류는 게놈이 다수 카피로 존재하기 때문에 고도로 방사선 내성적이다. 게놈간 높은 재조합 빈도는 다양한 DNA 손상제에 의해 유도되는 돌연변이를 신속하게 제거한다.
이 방법의 목표는 데이노코커스 라디안스와 유사하게 게놈 카피수가 증가되도록 다른 세포 종류를 개량하는 것이다. 카피수의 증가는 대부분 또는 모든 증식 조건에서 전 세포 주기 또는 세포 주기 대부분 동안 유지되는 것이 바람직하다. 이와 같은 세포내 다중 게놈 카피의 존재는 세포내 여러 게놈 중의 일정 유전자의 카피간, 그리고 세포내 게놈과 형질감염된 단편 간에 동종 재조합이 높은 빈도로 세포내에서 일어나게 한다. 이와 같이 증가된 재조합 빈도로 인해 세포는 다른 유용한 특성을 획득하기 위해 보다 신속하게 개량될 수 있다.
재조합의 출발 기질은 게놈 카피수와 관련이 있는 몇몇 유전자를 보유한 다양한 유전자 라이브러리, 게놈 카피수에 큰 역할을 하는 것으로 공지되거나 추정되는 유전자의 변형체로부터 제조된 집중 라이브러리 또는 이 두 라이브러리의 조합체일 수 있다. 대체로, 복제에 손상을 입히지 않으면서 세포 격막화가 억제되도록 복제 및 세포 격막화에 관여하는 유전자를 개량하면 카피수를 증가시킬 수 있을 것으로 추정된다. 복제에 관여하는 유전자로는 tus, xerC, xerD, dif, gyrA, gyrB, parE, parC, dif, TerA, TerB, TerC, TerD, TerE, TerF를 포함하고, 염색체 분할과 유전자 카피수에 영향을 미치는 유전자로는 minD, mukA(tolC), mukB, mukC, mukD, spoOJ, spoIIIE를 포함한다[Wake & Errington, Annu.Rev.Genet. 29, 41-67(1995)]. 유용한 기질은 다중게놈 카피수의 바람직한 표현형을 나타내는 것으로 알려진 데이노코커스 라디안스와 같은 세포 종류의 게놈이다. 이와 같은 기질 뿐만 아니라, 또는 이 기질 대신 세포 격막화에 관여하는 것으로 알려진 유전자에 대한 단백질 또는 안티센스 RNA 억제제를 암호하는 단편도 사용될 수 있다.
천연적으로, 한 세포 종류에 다중 게놈 카피가 존재하는 것은 이 카피수를 유지하는데 필요한 영양 조건이 더 많이 필요하기 때문에 유리하지 않은 것이 일반적이다. 하지만, 높은 카피수를 나타내는 세포를 선택하기 위한 합성 조건을 고안할 수 있다. 즉, 재조합 게놈을 가진 변형 세포를 영양 배지(이 조건에서 다중카피수는 문제점이 아니어야 함)에서 증식시키고, 자외선이나 감마선 또는 화학 돌연변이원(예, 미토마이신, 질산, 광활성화 소랄렌)과 같은 돌연변이원 단독물이나 조합물에 노출시켜 재조합에 의해 수복이 용이한 DNA 붕괴를 유도한다. 이와 같은 조건하에서는 돌연변이가 절단될 수 있는 효율 증가 때문에 다중카피수의 세포를 선택한다. 돌연변이원에 노출시에도 생존하는 변형 세포 중에서 다중 게놈 카피수를 가진 세포를 증량시킨다. 필요하면, 선택한 세포 각각을 게놈 카피수에 대해 분석할 수도 있다(예컨대, 적당한 대조군과의 정량적 하이브리드화를 통해). 선택 과정을 통해 생존한 세포의 수집물 일부 또는 전부는 다음 재조합 과정의 기질로서 사용된다. 결과적으로, 세포는 세포 주기를 통해 최소 2개, 4개, 6개, 8개 또는 10개의 게놈 카피를 보유하도록 개량한다.
C. 분비
박테리아와 진핵 세포의 단백질(또는 대사산물) 분비 경로는 목적 분자를 보다 효율적으로 배출시키기 위하여, 예컨대 단백질 약제, 소분자 약물 또는 특수 화합물 제조를 위해 개량될 수 있다. 분비 전 해독후 변형이나 다중서브유니트 어셈블리를 요구하는 단백질(예, 항체)에 특히 바람직한 것은 효율 향상이다.
분비 효율은 시그널 펩티드 암호 서열, 암호 서열을 절단하거나 인식하는 단백질을 암호하는 서열 및 분비되는 단백질의 암호 서열을 비롯한 다수의 유전자 서열에 따라 달라질 수 있다. 후자는 단백질의 폴딩 및 막으로 병입하여 통과하는 용이성에 영향을 미칠 수 있다. 이.콜리에 존재하는 박테리아 분비 경로로는 SecA, SecB, SecE, SecD 및 SecF 유전자를 포함한다. 바실러스 서브틸리스 중에 존재하는 주요 유전자는 5개의 시그널 펩티다제 유전자(sipS, sipT, sipU, sipV 및 sipW)와 함께 secA, secD, secE, secF, secY, ffh, ftsY이다[전술한 Kunst et al. 문헌 참조]. 해독후 변형을 요하는 단백질의 경우, 이와 같은 변형에 영향을 미치는 유전자의 개량은 분비 개선에 큰 역할을 할 수 있다. 또한, 다중서브유니트 단백질(예, 챠페로닌)의 어셈블리에 큰 역할을 하는 발현 생성물에 대한 유전자도 분비 개선에 기여할 수 있다.
재조합에 사용되는 기질의 선택은 전술한 일반 원리에 따른다. 이 경우, 전술한 집중 라이브러리는 공지 분비 유전자의 변형체를 포함한다. 진핵 단백질을 발현하는 원핵 세포를 개량하기 위하여 재조합의 초기 기질은 적어도 일부분이 진핵원 유래인 것이 보통이다. 유입되는 단편은 수용체 세포 중의 염색체 DNA 및 이 세포 중에 존재하는 선별용 마커 작제물과 모두 재조합할 수 있다[하기 참조]. 재조합의 후자 형태는 선별용 마커 작제물에 병입된 시그널 암호 서열의 개량에 중요하다. 분비 개선의 선별은 개량되는 세포 중에 마커 작제물을 병입시켜 실시할 수 있다. 이 마커 작제물은 발현 서열에 작동가능하게 결합된, 통상은 시그널 펩티드 암호 서열에 작동가능하게 결합된 마커 유전자를 암호한다. 마커 유전자는 때로 목적하는 재조합 단백질과 융합 단백질로서 발현되기도 한다. 이 방법은 분비 유전자와 함께 재조합 단백질 암호 서열을 개량하고자 하는 경우 유용하다.
1가지 변형예로서, 마커 유전자는 생성물이 분비되지 않으면 그 작제물을 함유하는 세포에 독성을 나타내는 생성물을 암호한다. 적합한 독소 단백질로는 디프테리아 독소 및 리신 독소를 포함한다. 이와 같은 작제물을 보유하는 변형 세포를 전파하여 독소 분비를 개선시키기 위하여 개량된 세포를 선택한다. 또는, 마커 유전자는 공지 수용체에 대한 리간드를 암호할 수 있고, 리간드를 보유한 세포를 표지된 수용체를 이용하는 FACS로 검출할 수 있다. 경우에 따라, 이와 같은 리간드는 분비후 세포막 표면에 리간드를 결합시키는 인지질 고착 서열에 작동가능하게 결합될 수 있다(본 출원인 명의로 동시계류중인 08/309,345). 또 다른 변형예로서, 분비된 마커 단백질은 각 세포를 아가 점적액에 접종하면 이 단백질을 분비하는 세포와 친밀하게 유지될 수 있다. 분비된 단백질은 아가 매트릭스내에 존재하게 되어 FACStm과 같은 방법으로 검출할 수 있다. 또 다른 변형예로서, 목적 단백질은 b-락타마제 또는 알칼리성 포스파타제와 함께 융합 단백질로서 발현된다. 이 효소는 시판용 발색원성 기질(예, X-gal)을 대사하지만, 이것은 원형질로 분비된 후에 일어나는 것이다. 따라서, 세포 콜로니에 착색된 기질의 출현은 융합 단백질을 분비하는 성질을 나타내고, 색의 강도는 분비 효율과 관련이 있다.
이와 같은 선별 및 분비 방법에 의해 동정된 세포는 단백질의 증가량을 분비하는 성질이 있다. 이 성질은 분비 및 발현 증가에 의한 것이거나 단지 분비에 의한 것일 수 있다.
D. 발현
세포는 재조합 단백질의 발현율을 증가시키기 위하여 개량될 수도 있다. 발현율은 물론 재조합 단백질이 발현되고, 조절 서열, 예컨대 프로모터, 인헨서 및 전사 종결 부위가 포함되어 있는 작제물에 따라 크게 달라진다. 또한, 발현은 전사, 해독후 변형 및 해독에 큰 역할을 하는 다수의 숙주 유전자에 의해 영향을 받을 수 있다. 또한, 리보뉴클레오티드 합성에 관여하는 숙주 유전자와 전사 및 해독을 위한 아미노산 단량체는 발현 효율에 간접적인 영향을 미칠 수 있다. 재조합을 위한 기질의 선택은 전술한 일반 원리에 따른다. 이 경우, 집중 라이브러리는 발현에 주요 역할을 하는 것으로 알려진 유전자의 변형체를 포함한다. 진핵 단백질을 발현시키기 위하여 원핵 세포를 개량하고자 하는 경우 재조합의 초기 기질은 일부 이상이 진핵원, 즉 단백질의 분비 및/또는 어셈블리와 연관이 있는 챠페로닌과 같은 단백질을 암호하는 진핵 유전자로부터 유래되는 경우가 흔하다. 유입 단편은 수용체 세포 중에 존재하는 염색체 DNA 및 이 세포 중에 존재하는 선별 마커 작제물과 재조합될 수 있다(하기 참조).
발현 개선에 대한 선별은 개량되는 세포 중에 리포터 작제물을 병입시켜 실시할 수 있다. 리포터 작제물은 GFP와 같이 쉽게 검출되고 비독성인 리포터 단백질을 발현(및 보통 분비)한다. 이 리포터 단백질은 단독으로 발현되거나 목적 단백질과 함께 융합 단백질로서 발현될 수 있다. 리포터 유전자가 분비되는 경우, 선별을 통해 분비 개선 또는 발현 개선, 또는 이 양자가 개선된 세포가 효과적으로 선택된다.
E. 식물 세포
반복적 서열 재조합의 또 다른 용도는 병원성 질환, 화학 약품, 항바이러스제, 항진균제, 살충제(예, BT 독소), 제초제(예, 아트라진 또는 글리포세이트) 및 살균제에 대한 내성을 얻기 위한 식물 세포 및 이 세포 유래의 돌연변이 식물의 개량이다. 재조합의 기질은 전체 게놈 라이브러리, 이의 분획 또는 전술한 제제 중 1가지 제제에 대한 내성을 제공하는 것으로 공지되거나 추정되는 유전자의 변형체를 포함하는 집중 라이브러리일 수 있다. 라이브러리 단편은 개량되는 식물과 다른 종류의 식물에서 얻는 것이 흔하다.
DNA 단편은 배양된 식물 세포 또는 식물 원형질로 표준 방법을 통해 병입시키며, 그 방법의 예로는 전기침투[From et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82, 5824(1985)], 꽃양배추 모자이크 바이러스(CaMV)와 같은 바이러스 벡터에 의한 감염[Hohn et al., Molecular Biology of Plant Tumors(Academic Press, New York, 1982) pp. 549-560; Howell, US 4,407,956], 작은 비드 또는 입자의 매트릭스내 또는 표면 상에 핵산을 보유한 소립자에 의한 고속 충돌 침투법[Klein et al., Nature 327, 70-73(1987)], 벡터로서 화분 이용법(WO 85/01856) 또는 DNA 단편이 클로닝된 Ti 플라스미드로 형질전환된 아그로박테리움 튜머페이션스의 이용법이 있다. Ti 플라스미드는 아그로박테리움 튜머페이션스에 의한 감염시 식물 세포로 전달된 뒤 식물 게놈 중으로 안정하게 통합된다[Horsch et al., Science 233, 496-498(1984); Fraley et al, Proc.Natl.Acad.Sci. USA 80, 4803(1983)].
또한, 다양성은 진균 원형질에 대해 하기 기재된 바와 동일한 원리에 따라 식물 원형질간 유전자 교환으로 형성시킬 수 있다. 식물 원형질의 형성 절차 및 융합은 문헌[Takahashi et al. US 4,677,066; Akagi et al., US 5,360,725; Shimamoto et al., US 5,250,433; Cheney et al., US 5,426,040]에 기재되어 있다.
재조합이 일어나고 재조합 유전자가 발현되기에 적합한 항온처리 기간 후 식물 세포를 내성을 획득하고자 하는 제제와 접촉시키고 생존하는 식물 세포를 수거한다. 이 식물 세포 중 일부 또는 전부를 추가 재조합 및 선별 단계로 처리할 수 있다. 그 결과, 필요한 내성도를 가진 식물 세포가 얻어진다.
이 세포는 그 다음 돌연변이 식물로 배양될 수 있다. 배양된 원형질로부터 식물의 재생에 대해서는 다음과 같은 문헌에 기재되어 있다[Evans et al., "Protoplasts Isolation and Culture", Handbook of Plant Cell Cultures 1, 124-176(MacMillan Publishing Co., New York, 1983); Davey, "Recent Developments in the Culture and Regeneration of Plant Protoplasts", Protoplasts(1983) pp.12-29, (Birkhauser, Basal 1983); Dale, "Protoplast Culture and Plant Regeneration of Cereals and Other Recalcitrant Crops", Protoplasts(1983) pp. 31-41(Birkhauser, Basel 1983); Binding, "Regeneration of Plants" Plant Protoplasts, pp.21-73, (CRC Press, Boca Raton, 1985)].
이 방법의 변형으로, 1회 이상의 예비 재조합 및 선별 단계는 상기 식물 세포에 대해 전술한 바와 동일한 일반 원리에 따라 박테리아 세포에서 실시될 수 있다. 이 박테리아 세포에서는 빠른 성장 속도와 이 세포 중으로 도입될 수 있는 DNA의 효율 증가로 보다 신속한 개량이 실시될 수 있다. 재조합/선별을 1회 이상 실시한 후, 박테리아로부터 DNA 단편 라이브러리를 회수하여 식물을 형질전환시킬 수 있다. 이 라이브러리는 완전한 라이브러리이거나 집중 라이브러리일 수 있다. 집중 라이브러리는 식물 서열, 특히 내성 제공에 역할을 하는 것으로 공지되거나 추정되는 식물 서열에 특이적인 프라이머로부터 증폭시켜 형성시킬 수 있다.
실시예 : 아트라진 이화대사성 플라스미드의 콘카터머 어셈블리
슈도모나스의 아트라진 이화대사성 유전자 AtzA 및 AtzB를 pMD1[deSouza et al., Appl. Environ. Microbiol. 61, 3373-3378(1995); de Souza et al., J.Bacteriol. 178, 4894-4900(1996)]로부터 pUC18 중으로 서브클로닝하였다. AtzA를 포함하는 1.9 kb AvaI 단편을 평활말단화한 뒤, pUC18의 AvaI 부위에 삽입시켰다. AtzB를 포함하는 3.9 kb ClaI 단편을 평활말단화하고 pUC18의 HincII 부위로 클로닝하였다. 그 다음 pUC18로부터 EcoRI 및 BamHI으로 AtzA를 절단하고, BamHI 및 HindIII로 AzB를 절단한 뒤, 이 2개의 삽입체를 EcoRI 및 HindIII 절단된 pUC18 중에 동시 결찰시켰다. 그 결과물은 pUC18 중에 AtzA 및 AtzB를 포함하는 5.8 kb 삽입체(총 플라스미드 크기 8.4 kb)이다.
반복적 서열 재조합은 다음과 같이 실시하였다. 전체 8.4 kb 플라스미드를 50 mM Tris-Cl(pH 7.5), 10mM MnCl2중에 용해한 DNaseI으로 처리한 뒤, 500 bp 내지 2000 bp 사이의 단편을 겔 정제하였다. 이 단편을 Tth-XL 효소, 퍼킨 엘머의 완충액, 2.5 mM MgOAc, 400 μM dNTP 및 DNA 단편의 일련의 희석물을 사용하여 PCR 반응으로 어셈블리하였다. 이 어셈블리 반응은 다음과 같은 사이클로 프로그래밍된 MJ 리서치 "DNA Engine"에서 실시하였다.
1 94 ℃, 20초
2 94 ℃, 15초
3 40 ℃, 30초
4 72 ℃, 30초 + 사이클당 2 초
5 단계 2로 사이클, 39회 실시
6 4 ℃.
그 결과, 어셈블리 반응액 유래의 AtzA 및 AtzB 유전자는 폴리머라제 연쇄 반응을 이용하여 증폭시킬 수 없었고, 따라서 그 대신 페놀 추출법과 에탄올 침전법을 사용하여 반응액으로부터 DNA를 정제한 후, 어셈블리된 DNA를 플라스미드를 선형화하는 제한 효소(KpnI : 서브클로닝 동안 pUC18 중의 KpnI 부위는 상실되어 AtzA 중의 KpnI 부위만 남음)로 분해하였다. 선형화된 플라스미드를 겔 정제하고, 하룻밤 동안 자가 결찰시킨 뒤, 이.콜리 균주 NM522의 형질전환에 이용하였다(숙주 균주의 선택은 중요하며, TG1, DH10B, DH12S를 비롯한 다수의 시판용 균주에서는 질이 양호하지 않은 극소량의 플라스미드가 얻어졌다).
형질전환 반응의 일련의 희석물을 암피실린 50 ㎍/㎖을 함유하는 LB 평판상에 평판 배양하고, 나머지 형질전환물은 글리세롤 중에 25%로 만들고 -80 ℃에서 동결시켰다. 형질전환된 세포의 역가를 측정한 후, 동결 세포를 아트라진 500 ㎍/㎖을 함유하는 150 ㎜ 직경의 평판상에 200 내지 500의 밀도로 평판도말하고 37 ℃에서 증식시켰다.
500 ㎍/㎖의 아트라진은 불용성 침전물을 형성시킨다. AtzA 및 AtzB 유전자의 생성물은 아트라진을 가용성 생성물로 변형시킨다. pUC18 중에 야생형 AtzA 및 AtzB 유전자를 포함하는 세포는 아트라진이 분해된 투명 광륜으로 둘러싸일 것이다. AtzA 및 AtzB 효소가 보다 활성적이면 투명 광륜이 아트라진 함유 평판 상에 보다 신속하게 형성되면서 증식할 것이다. 양성군으로서 가장 큰 투명 구역을 가장 신속하게 형성한 콜로니 중에서 채취하였다. 약 40개의 최상의 콜로니를 취하여 수집하고 50㎍/㎖의 암피실린 존재하에 증식시킨 다음, 이로부터 플라스미드를 제조하였다. 이 전 과정(DNase 처리에서 부터 아트라진 평판 상에 도말하는 단계)을 사이클 당 2000개 내지 4000개 콜로니를 사용하여 4회 반복하였다.
4번째 사이클에는 변형을 주었다. 즉, 세포를 아트라진 500 ㎍/㎖ 및 야생형 AtzA와 AtzB 유전자에 의해 분해될 수 없는 아트라진 유사체 테르부틸라진 500 ㎍/㎖ 상에 평판 도말하였다. 이 2가지 화합물을 모두 분해하는 양성군이 얻어졌다. 아트라진 클로르하이드롤라제(AtzA 유전자의 생성물)의 생성량은 야생형 유전자에 의해 생성되는 것보다 10 내지 100배 더 높았다.
F. 돌연변이 동물
1. 돌연변이유전자의 최적화
돌연변이유발의 1가지 목적은 우유 중에 재조합 단백질을 분비하는 돌연변이 동물, 예컨대 마우스, 래빗, 양, 돼지, 염소 및 소를 얻는 것이다. 이와 같은 목적의 돌연변이유전자는 유단백질 유전자(예, α, β또는 γ카세인, β-락토글로불린, 산 훼이 단백질 또는 α-락트알부민) 유래의 프로모터와 인헨서, 시그널 서열, 재조합 단백질 암호 서열 및 전사 종결 부위를 보통 작동가능한 결합으로 포함하는 것이 일반적이다. 경우에 따라, 돌연변이유전자는 면역글로불린과 같은 다중쇄 단백질의 복수의 사슬을 암호할 수 있는데, 이 경우 2개의 사슬은 각각 작동가능하게 조절 서열 군에 결합되는 것이 일반적이다. 돌연변이유전자는 반복적 서열 재조합에 의한 발현 및 분비에 최적화 상태로 만들어질 수 있다. 재조합에 적합한 기질로는 여러 종이나 각 동물에서 얻어지는 유단백질 유전자 유래의 프로모터 및 인헨서와 같은 조절 서열을 포함한다. 재조합 사이클은 섹션 V에 기재된 어떤 방식으로든지 시험관내 또는 생체내에서 실시될 수 있다. 선별은 전술한 바와 같은 돌연변이유전자 및 리포터 작제물로 형질감염된 유선 유래의 세포, 예컨대 HC11 또는 MacT의 배양물에 대해 생체내에서 실시한다. 재조합 및 선별을 수회 반복한 후, 최고의 발현 및 분비율을 나타내는 돌연변이유전자를 유선 조직 배양물 세포로부터 추출하고, 접합체 및 배아 간 세포와 같은 배아 세포를 형질감염시키는데 사용하여, 돌연변이 동물로 성숙시킨다.
2. 완전 동물의 최적화
이 방법에서는 유입 단편의 라이브러리를 사용하여 ES 세포 또는 접합체와 같은 배아 세포를 형질전환시킨다. 이 단편은 성장 호르몬과 같은 목적 서열을 부여하는 것으로 알려진 유전자의 변형체일 수 있다. 또는, 이 단편은 다수의 유전자를 포함하는 부분 또는 게놈 라이브러리일 수 있다.
단편은 보통 다음과 같은 문헌에 기재된 바와 같이 미량주입으로 접합체 중으로 도입시키는 것이 일반적이다. Gordon et al., Methods Enzymol. 101, 414(1984); Hogan et al., Manipulation of the Mouse Embryo: A Laboratory Manual(C.S.H.L. N.Y., 1986)(마우스 배아); Hammer et al., Nature 315, 680(1985)(래빗 및 돼지 배아); Gandolfi et al., J.Repro.Fert. 81, 23-28(1987); Rexroad et al., J.Anim.Sci. 66, 947-953(1988)(양 배아) and Eyestone et al., J.Reprod.Fert. 85, 715-720(1989); Camous et al., J. Reprod. Fert. 72, 779-785(1984); and Heyman et al., Theriogenology 27, 5968(1987)(소 배아)[이 문헌들은 모두 본원에 참고 인용된 것이다]. 그 다음 접합체를 성숙시키고, 수용체 암컷 동물에 도입시켜 배아를 임신시키고 돌연변이 후대를 출산시킨다.
또는, 돌연변이유전자를 배아 간 세포(ES) 중으로 도입시킬 수 있다. 이 세포는 시험관내 배양된 이식전 배아에서 얻는다[Bradley et al., Nature 309, 255-258(1984)]. 이 세포 중으로 전기침투 또는 미량주입을 통해 돌연변이유전자를 도입시킬 수 있다. 형질전환된 ES 세포를 인간을 제외한 동물의 아세포와 조합시킨다. 이 ES 세포를 배아에서 집단 형성시키면, 일부 배아에서는 최종적으로 키메라 동물을 만드는 배선을 형성시킨다[Jaenisch, Science, 240, 1468-1474(1988)].
접합체 또는 ES의 사용에 관계없이, 선별은 전체 동물에 대하여 목적 성질, 예컨대 크기 증가 및/또는 성장 속도 증가와 같은 성질이 있는지를 실시한다. 목적 성질의 획득에 대하여 개량된 동물로부터 DNA를 추출한다. 그 다음, 이 DNA를 사용하여 배아 세포를 더 형질감염시킨다. 또한, 이 세포는 분할 및 수집 방법으로 목적 성질을 획득한 동물로부터 얻을 수 있다. 즉, 이와 같은 동물 중 1개의 아집단에서 얻은 DNA를 사용하여 다른 아집단의 동물로부터 제조한 배아 세포를 형질전환시킨다. 또는, 목적 성질의 획득을 통해 개량된 동물 유래의 DNA를 사용하여 새로운 배아 세포를 형질감염시킬 수 있다. 또 다른 대안으로서, 형질감염된 세포를 돌연변이 동물로 성숙시키고, 이 동물을 목적 성질에 대한 추가 선별 단계로 처리한다.
도 4는 크기 증가를 위한 어류 개량시 상기 방법을 적용한 예를 도시한 것이다. 먼저, 라이브러리를 성장 호르몬 유전자의 변형체로 제조한다. 이 변형체는 천연적이거나 또는 유도된 것일 수 있다. 이 라이브러리를 recA 단백질로 코팅하고, 수정된 어류 난을 형질감염시킨다. 이 어류 난을 여러 크기의 어류로 성숙시킨다. 그 다음, 크기가 큰 어류로부터 게놈 DNA의 성장 호르몬 유전자 단편을 PCR로 증폭시킨 뒤, 다음 재조합 사이클에 사용한다.
G. 예측용 기구로서 신속한 개량
반복적 서열 재조합은 시험 중인 약물에 대해 노출시 응답 반응으로 병원성 미생물을 천연적으로 개량하기 위한 모의 시험에 사용할 수 있다. 반복적 서열 재조합을 사용하면, 개량은 천연 개량에서 보다 더 빠른 속도로 진행한다. 개량 속도를 측정하는 1가지 척도는 미생물이 약물에 대해 소정의 내성도를 획득하는데 필요한 재조합 및 선별의 사이클 횟수이다. 이 분석에서 얻어지는 정보는 여러 약물의 상대적 장점을 비교하고, 특히 장기간 반복 투여시 나타나는 효능을 예측하는 데에도 매우 중요하다.
이 분석에 사용되는 병원성 미생물은 인간을 감염시키는 통상적인 박테리아, 예컨대 클라미디아, 리케치아 박테리아, 마이코박테리아, 스타필로코시, 트립토코시, 뉴모노코시, 메닝고코시 및 코노코시, 크렙시엘라, 프로테우스, 세라티아, 슈도모나스, 레져넬라, 디프테리아, 살모넬라, 바실러스, 콜레라, 테타누스, 보툴리즘, 안트락스, 플래그, 렙토스피로시스 및 라임병 박테리아를 포함한다. 개량은 DNA 단편의 라이브러리를 사용하여 시험 중인 약물에 민감한 박테리아 분리물을 형질전환시켜 실시한다. 이 단편은 개량되는 박테리아 게놈의 변형 형태일 수 있다. 약물의 표적이 공지 단백질이면, 이 단백질을 암호하는 유전자의 변형체를 포함하는 집중 라이브러리를 사용할 수 있다. 또는, 다른 종류의 박테리아, 구체적으로 인간 조직에서 생육하는 것으로 통상 발견되는 박테리아에서 유래되는 라이브러리를 사용하여, 생체내 재조합에 유용한 공급원을 모의 실험할 수 있다. 또한, 라이브러리는 약물에 대해 내성적인 것으로 알려진 박테리아에서 유래될 수 있다. 재조합이 일어나고 재조합된 유전자가 발현되기에 적당한 기간 동안 박테리아를 형질전환 및 전파시킨 후, 박테리아를 시험 약물에 노출시킨 다음 생존 세포를 수거하여 선별한다. 생존 박테리아를 다음 재조합 사이클로 처리한다. 후속 사이클은 생존 박테리아의 제1 아집단 유래의 DNA를 제2 박테리아 아집단에 도입시키는 분할 및 수집 방식으로 실시할 수 있다. 또는, DNA 단편의 새로운 라이브러리를 생존 박테리아로 도입시킬 수 있다. 후속 선택 사이클은 약물 농도를 증가시키면서 실시하여 선택 엄중도를 증가시킬 수 있다.
이와 유사한 전략을 사용하여 바이러스의 약물 내성 획득에 대해 모의 실험할 수 있다. 그 목적은 내성이 단지 서서히 획득될 수 있는 약물 등을 동정하는 것이다. 개량되는 바이러스는 효과가 최소한 중간 정도인 약물이 이용가능한 것으로, 인간을 감염시키는 것이다. 재조합 기질은 유도된 돌연변이체, 동일 바이러스 균주의 천연 변형체 또는 다른 바이러스로부터 얻을 수 있다. 약물의 표적이 공지되었다면(예, HIV의 역전사효소 유전자를 억제하는 뉴클레오티드 유사체), 표적 유전자의 변형체를 함유하는 집중 라이브러리를 만들 수 있다. 단편의 라이브러리와 바이러스 게놈의 재조합은 보통 시험관내에서 실시한다. 하지만, 단편의 라이브러리가 바이러스 게놈의 변형체 또는 이 게놈 중에 포함될 수 있는 단편을 구성하는 경우에는, 재조합은 생체내에서, 예컨대 다중 기질 카피로 세포를 형질감염시켜 실시할 수 있다(섹션 V 참조). 선별을 위해, 재조합 바이러스 게놈을 바이러스 감염에 민감한 숙주 세포 중으로 도입시키고, 이 세포를 바이러스에 대해 효과적인 약물(초기에는 저농도)에 노출시킨다. 이 세포를 회전 침전시켜 비감염 바이러스를 모두 제거한다. 감염 후, 배양액으로부터 후대 바이러스를 수집할 수 있고, 이 후대 바이러스 중 약물에 대해 적어도 부분 내성을 획득한 바이러스를 증량시킨다. 또는, 바이러스 감염 세포를 소프트 아가 상에 평판 도말하고 플라크로부터 내성 바이러스를 분리한다. 플라크 크기는 부분적으로 바이러스 내성의 정도를 나타낸다.
선별시 생존하는 후대 바이러스는 소정의 약물 내성이 얻어질 때까지 엄중도를 증가시키면서 재조합과 선별 사이클로 더 반복처리한다. 소정의 약물 내성도는 허용되지 않는 부작용없이 환자에게 투여할 수 있는 실질적인 약물의 최대 투여량을 반영할 수 있다. 이 분석은 점차 증가하는 승인된 항HIV 약물(예, AZT, ddI, ddC, d4T, TIBO 82150, 네바리핀, 3TC, 크리시반 및 리토나비르)과 같이 약물의 다양한 조합물에 대한 내성 획득을 연구하는데 매우 중요하다.
IV. 유전자 교환 촉진
(1) 개론
본 발명의 일부 방법은 세포간 DNA의 교환을 유도하는 조건하에서 세포를 전파시켜 세포 DNA의 재조합을 실시한다. DNA 교환은 전기침투, 바이오리스틱스, 세포 융합, 또는 일부 경우 접합이나 아그로박테리움 매개 전이법과 같은 일반 방법으로 촉진시킬 수 있다. 예컨대, 아그로박테리움은 동종 재조합 및 갭 수복 기작을 통해 효모 게놈 중으로 병입되는 T-DNA를 사용하여 에스. 세레비지에를 형질전환시킬 수 있다[Piers et al., Proc.Natl.Acad.Sci. USA 93(4), 1613-8(1996)].
일부 방법에서, 최초의 세포간 다양성(즉, 게놈 교환전)은 양친 세포 종류의 화합물 또는 방사선 유도성 돌연변이유발법과, 그 후 경우에 따라 목적 표현형에 대해 선별하여 유도된다. 다른 방법에서, 다양성은 세포가 여러 개체, 균주 또는 종에서 얻어지는 경우와 같이 천연적인 것이다.
일부 셔플링 방법에서, DNA의 유도 교환은 각 재조합 사이클에서 재조합을 실시하는 유일한 수단으로 사용되기도 한다. 일부 다른 방법에서는, 유도 교환과 함께 유기체의 천연 유성 재조합을 실시하기도 한다. 또 다른 방법에서는, 유도 교환 및/또는 천연 유성 재조합과 함께 단편 라이브러리의 도입 방법을 사용하기도 한다. 이와 같은 단편 라이브러리는 전체 게놈, 전체 염색체, 기능적 또는 유전자적으로 결합된 유전자군, 플라스미드, 코스미드, 미토콘드리아 게놈, 또는 바이러스 게놈(복제형 및 비복제형) 또는 이들의 모든 단편일 수 있다. DNA는 벡터에 병입되거나 유리 형태일 수 있다. 일부 벡터는 숙주 게놈과의 동종 재조합 또는 이종 재조합을 촉진하는 서열을 포함한다. 일부 단편은 재조합을 자극하기 위하여 유리 비드, 초음파처리 또는 화학적 또는 효소적 단편화로 전단시 생성되는 것과 같은 2본쇄 분해물을 포함한다.
각 경우에, DNA는 재조합으로 하이브리드 게놈을 형성한 후 세포간에 교환될 수 있다. 하이브리드 게놈을 보유하는 세포를 목적 표현형에 대해 선별하고, 이 표현형을 가진 세포를 분리한다. 이 세포는 반복적 재조합/선택 공정 중 후속 사이클의 출발 물질로 사용된다.
세포간 DNA 교환을 촉진하는 1가지 방법은 세포 융합, 예컨대 원형질 융합이다. 원형질은 세포로부터 세포벽을 제거하여 얻고, 막결합 세포를 완전하게 유지시키기 위하여 등장액 또는 저장액에 보관한다. 세포벽이 부분적으로 제거되는 경우에 생성되는 세포는 엄밀히 말하면 스페로플라스트라고 하고, 완전하게 제거된 경우에 원형질이라 한다. 하지만, 본 명세서에 사용된 원형질이란 용어는 다른 표시가 없는한 스페로플라스트를 포함한다.
원형질 융합은 문헌[Shaffner et al., Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77, 2163(1980)]에 기재되어 있고, 다른 절차의 예도 문헌[Yoakum et al., US 4,608,339, Takahashi et al., US4,677,066 및 Sambrook et al., at Ch 16]에 개시되어 있다. 원형질 융합은 균주간, 종간 및 속간(예, 효모와 병아리 적혈구)에도 알려져 있다.
원형질은 박테리아 세포 및 진핵 세포, 예컨대 포유류 세포 및 식물 세포에 대해 세포벽을 제거하는 화학적 처리를 비롯한 여러 수단을 사용하여 제조할 수 있다. 예컨대, 세포벽은 10 내지 20% 슈크로스, 50 mM EDTA 완충액 중의 리소자임을 이용하여 분해 제거할 수 있다. 세포가 구형 원형질로 변환되는지는 위상차 현미경으로 조사할 수 있다. 또한, 원형질은 세포벽 합성의 억제제가 보충된 배지에서 세포를 전파시키거나 세포벽 형성능이 부족한 돌연변이 균주를 사용하여 제조할 수 있다. 진핵 세포는 α인자, K.락티스 킬러 독소, 레플론아미드 및 아데닐레이트 사이클라제 억제제 등의 억제제를 사용하여 억제시켜 G1 단계에서 동시제조할 수 있다. 경우에 따라 융합될 원형질은 사멸화하고(또는) 그 DNA를 자외선 조사, 히드록실아민 또는 쿠페론 처리로 단편화할 수 있다[Reeves et al., FEMS Microbiol.Lett. 99, 193-198(1992)]. 이 경우에 사멸된 원형질은 공여체라고 하고, 생존 원형질은 수용체라고 한다. 사멸된 공여체 세포를 사용하면 하기 기재되는 바와 같은 하이브리드 게놈으로 융합된 세포를 후속적으로 인식하는데 유리할 수 있다. 또한, 공여체 세포 중의 DNA를 절단하면 수용체 DNA와의 재조합을 자극하는데 유리하다. 경우에 따라, 수용체 및/또는 융합 세포는 간단히, 하지만 비치사량으로 자외선에 더 노출시켜 재조합을 자극할 수 있다.
원형질은 일단 형성되면, 다양한 삼투물 및 염화나트륨, 염화칼륨, 인산나트륨, 인산칼륨, 슈크로스, 소르비톨과 같은 화합물 중에서 DTT 존재하에 안정화될 수 있다. 완충액, pH, 환원제 및 삼투 안정화제의 조합물은 세포 종류에 따라 최적화한다. 원형질의 융합은 PEG, 염화칼슘 또는 프로피온산칼슘과 같은 화합물이나 전기융합 처리에 의해 유도될 수 있다[Tsoneva, Acta Microbiologica Bulgaria 24, 53-59(1989)]. 또한, 전기장을 이용한 세포 융합 방법도 개시되어 있다[Chang US 4,970,154 참조]. 상이한 균주 마다 조건은 최적화될 수 있다.
융합된 세포는 2가지 성분의 원형질에서 유래되는 게놈을 포함하는 이핵접합체이다. 융합 세포는 슈크로스 구배 침강 또는 세포 분류법에 의해 비융합형 양친 세포로부터 농축 분리될 수 있다. 이핵접합체 중의 2개의 핵은 융합(핵융합)할 수 있고 게놈간에 동종 재조합이 일어날 수 있다. 또한, 염색체는 비대칭적으로 분리하여 전체 염색체를 얻거나 상실한 재생 원형질을 형성할 수 있다. 재조합 빈도는 자외선 처리 또는 recA나 재조합 유전자(예, MutS 또는 MutL) 또는 효모 rad 유전자를 과잉발현하는 균주 및 다른 종에 속하는 동족 변형체를 사용하여 증가시킬 수 있다. 과잉발현은 외인성 재조합 유전자를 도입시킨 결과이거나 또는 천연 변형 또는 유도된 돌연변이의 결과로 내인성 재조합 유전자를 과잉발현하는 균주를 선택한 결과일 수 있다. 융합된 원형질은 세포벽 재생, 이핵접합체로부터 후대 세포로 재조합 게놈의 재조합과 분리 및 재조합 유전자의 발현을 허용하는 조건하에서 전파시킨다. 융합 세포를 회수한 후, 또는 경우에 따라 회수하기 전이나 회수하는 동안 목적 성질의 획득을 통해 개량된 세포를 선별하거나 선택한다.
그 후, 후속 재조합 사이클은 이전 사이클 중의 선별/선택시 생존한 세포로부터 원형질을 제조하여 실시할 수 있다. 이 원형질을 융합시키고, 이 융합된 원형질 중에서 재조합을 일으키고, 융합된 원형질로부터 세포를 재생시킨다. 원형질, 재생된 세포 또는 재생하는 세포를 추가 선택이나 선별 단계로 처리한다.
또는, 후속 재조합 사이클을 전술한 분할 수집 기법으로 실시할 수 있다. 즉, 이전 사이클의 선택/선별을 통해 생존한 세포의 제1 아집단을 사용하여 원형질을 형성시킨다. 이전 사이클의 선택/선별을 통해 생존한 세포의 제2 아집단을 DNA 라이브러리 제조물의 공급원으로 사용한다. 그 다음, 세포의 제2 아집단 유래의 DNA 라이브러리를 사용하여 제1 아집단의 원형질을 형질전환시킨다. 이 라이브러리를 원형질의 게놈과 재조합하여 재조합 게놈을 형성한다. 원형질로부터 세포를 재생시키고, 재생된 세포 또는 재생하는 세포에 대해 선택/선별을 실시한다. 또 다른 변형예로서, 새로운 핵산 단편의 라이브러리를 이전 사이클의 선택/선별 단계에서 생존한 원형질 중으로 도입시킨다.
원형질 융합을 이용한 셔플링의 예시적 형태는 도 5에 도시하였다. 이 도면은 다음과 같은 단계, 즉 공여체와 수용체 균주의 원형질 형질, 이핵접합체 형성, 핵융합, 재조합 및 다른 세포 중으로 재조합 게놈의 분리 단계를 도시하고 있다. 경우에 따라, 유성 생식 주기가 있다면, 재조합 게놈은 감수분열 및 교배의 결과로서 서로 추가 재조합될 수 있다. 그 다음 목적 성질에 대해 세포를 선별하거나 선택한다. 선택/선별에서 생존한 세포를 다음 원형질화 사이클의 출발 물질로서 사용한다.
2. 하이브리드 균주의 선택
본 발명은 2종 이상의 다른 아집단 유래의 양친 세포로부터 얻은 성분을 융합하여 만들어진 세포를 동정하는 선택 방법을 제공한다. 하이브리드 세포의 선택은 보통 목적 성질을 획득하도록 개량된(유전자 교환의 결과) 세포를 선택 또는 선별하기 전에 실시된다. 이와 같은 선택 방식의 기본 전제 조건은 2종의 초기 아집단이 2가지 상이한 마커를 보유한다는 것이다. 따라서, 2가지 마커에 대한 선택을 통해 하이브리드 게놈을 가진 세포를 동정할 수 있다.
이와 같은 1가지 방식에서 1종 이상의 세포의 아집단은 세포막에 결합된 선택 마커를 보유한다. 적합한 막 마커의 예로는 비오틴, 플루오레세인 및 로다민을 포함한다. 마커는 아미드기 또는 티올기에 결합되거나, 또는 보다 특이적인 유도체화 화학, 예컨대 조도아세테이트, 조도아세트아미드, 말레이미드를 통해 결합될 수 있다. 예컨대, 마커는 다음과 같이 부착시킬 수 있다. 막 단백질의 N-말단 아미노기 또는 리신의 아미노기와 반응하는 화학적 활성 리간드의 화학적 커플링을 방해하지 않는 완충액(예, PBS)으로 세포 또는 원형질을 세척한다. 이 리간드는 자가 아민 반응성(예, 이소티오시아네이트, 숙신이미딜 에스테르, 설포닐 클로라이드)이거나, 또는 헤테로이작용성 링커(예, EMCS, SIAB, SPDP, SMB)에 의해 활성화되어 아민 반응성이 된다. 이 리간드는 단백질 유도체를 가진 자기 비드 또는 다른 포착 고체 지지체에 용이하게 결합되는 분자이다. 예컨대, 리간드는 숙신이미딜 활성화된 비오틴(분자 프로브: B-1606, B-2603, S-1515, S-1582)일 수 있다. 이 링커는 세포내와 세포 표면상에 존재하는 단백질의 아미노기와 반응한다. 그 다음, 세포를 세척하여 제2의 선택 마커를 보유한 제2의 아집단 유래의 세포와 접촉하기 전 과량의 표지화제를 제거한다.
또한, 제2의 세포 아집단도 제1 아집단과 다른 막 마커이지만 역시 막 마커를 보유할 수 있다. 또는, 제2 아집단은 유전자 마커를 보유할 수 있다. 이 유전자 마커는 약물 내성과 같은 선택 성질이나 또는 녹색 형광성 단백질의 발현과 같은 선별 성질을 제공할 수 있다.
제1 아집단과 제2 아집단에 속하는 세포를 융합하여 회수한 후, 양친 아집단 상에 존재하는 마커에 대해 세포를 선별 또는 선택한다. 예컨대, 융합체를 특정 비드에 흡착시켜 하나의 집단으로 증식시키고 그 후 FACStm으로 마커 발현체를 분류한다. 양 마커에 대한 선별시 생존한 세포는 원형질 융합된 것으로, 재조합 게놈을 보유할 가능성이 보다 크다. 보통, 마커는 각각 선별 또는 선택하는 것이 일반적이다. 비오틴과 같은 막 결합된 마커는 세포막 마커에 대한 친화성 농축(예, 친화성 매트릭스 상에 융합 세포를 패닝시킴)하여 선별할 수 있다. 예컨대, 비오틴 막 표지의 경우, 세포는 스트렙트아비딘 코팅된 자기 비드(Dynal)를 사용하여 친화성 정제할 수 있다. 이 비드를 수회 세척하여 비융합 숙주 세포를 제거한다. 대안적으로, 막 마커의 항체에 대하여 세포를 패닝시킬 수 있다. 또 다른 변형예로서, 막 마커가 형광성인 경우 마커를 보유한 세포는 FACStm으로 확인할 수 있다. 유전자 마커의 선별은 마커의 성질에 따라 좌우되는데, 약물 처리된 배지 상에서의 증식력이나 녹색 형광성 단백질에 대한 FACStm을 포함한다. 제1 세포 집단 및 제2 세포 집단이 다른 파장의 형광성 마커를 보유하는 경우에는 2가지 마커를 FACStm분류법으로 동시에 선별할 수 있다.
다른 하이브리드 세포 선택 방식에서, 융합될 제1 세포 집단 및 제2 세포 집단은 이종다량체 효소의 여러 서브유닛을 발현한다. 보통, 이종다량체 효소는 2개의 상이한 서브유닛을 보유하는 것이 일반적이지만, 3개, 4개 또는 그 이상의 상이한 서브유닛을 가진 이종다량체 효소도 사용할 수 있다. 효소가 2종 이상의 서브유닛을 보유하는 경우, 각 서브유닛은 여러 세포 아집단(예컨대, 3개의 서브유닛이면 3개의 아집단)에서 발현되거나, 또는 1개 이상의 서브유닛이 동일 세포 아집단에서 발현될 수 있다(예컨대, 제1 아집단에서 1개의 서브유닛, 제2 아집단에서 2개의 서브유닛).
제1 아집단 성분 세포와 제2 아집단 성분 세포가 보유한 게놈의 조합을 나타내는 하이브리드 세포는 본래 효소의 분석법으로 인식할 수 있다. 이와 같은 분석법은 결합 분석법일 수 있으나, 기능적 분석법(예컨대, 효소의 기질을 대사하는 활성)이 보다 일반적이다. 효소 활성은 예컨대 기질을 형광성이나 다른 검출 용이한 방출 스펙트럼을 나타내는 생성물로 가공하여 검출할 수 있다. 이와 같은 분석법에 사용되는 이종다량체 효소의 각 서브유닛은 해리된 형태인 경우 어떤 효소적 활성도 나타내지 않거나, 또는 적어도 결합된 형태 보다 해리된 형태일 때 활성이 유의적으로 감소되는 것이 바람직하다. 융합에 사용되는 세포는 이종다량체 효소의 내인성 형태를 보유하지 않거나, 적어도 세포 융합으로 형성된 이종다량체 효소 유래의 활성보다 내인성 활성이 유의적으로 적은 것이 바람직하다.
적합한 이종다량체 효소의 예로는 페니실린 아실라제 효소, 세팔로스포린 아실라제 및 페니실린 아실트란스퍼라제를 포함한다. 이 효소들은 단일 유전자에 의해 암호되는 것으로, 프로효소로서 해독되고 해독후 자가촉매성 단백분해작용에 의해 절단되어 스페이서 엔도펩티드를 제거하고, 결합을 통해 활성 이종이량체 효소를 형성하는 2개의 서브유닛을 생성한다. 각 서브유닛은 다른 서브유닛이 존재하지 않으면 활성을 나타내지 못한다. 하지만, 분리된 유전자부가 동시형질전환에 의해 동일 세포내에서 발현된다면 활성은 복원될 수 있다. 사용될 수 있는 다른 효소는 독특한 유전자에 의해 암호되는 서브유닛을 보유한다[예컨대, faoA 및 faoB 유전자는 슈도모나스 프라지의 3-옥소아실-CoA 티올라제를 암호한다(Biochem. J 328, 815-820(1997))].
효소의 일예는, 단일 유전자에 의해 2개의 서브유닛이 암호되는 에세리치아 콜리 유래의 페니실린 G 아실라제이다. 적당한 발현 조절 서열에 작동가능하게 결합된 2개의 서브유닛을 암호하는 유전자의 단편을 사용하여 내인성 페니실린 아실라제 활성이 결실된 세포의 제1 및 제2 아집단을 형질감염시킨다. 제1 및 제2 아집단 유래의 성분 세포를 융합하여 형성시킨 세포는 2개의 서브유닛을 발현하고, 이것은 어셈블리하여 기능적 효소, 예컨대 페니실린 아실라제를 형성한다. 그 다음, 융합 세포는 페니실린 아실라제에 의해 분해되는 페니실린 G를 포함하는 아가 평판 상에서 선택할 수 있다.
또 다른 변형예로서, 융합 세포는 영양요구 돌연변이체의 보충을 통해 동정할 수 있다. 공지의 영양요구 돌연변이를 통해 세포의 양친 아집단을 선택할 수 있다. 대안적으로, 출발 세포 집단의 영양요구 돌연변이는 돌연변이제에 노출시켜 동시에 형성시킬 수 있다. 영양요구 돌연변이된 세포는 최소 배지 및 완전 배지 상에서 레플리카 평판법으로 선택한다. 영양요구성을 제공하는 병변부는 게놈을 통해 아미노산, 뉴클레오티드 및 비타민 생합성 경로의 유전자들에 분산되어 있을 것으로 예상된다. 양친 세포를 융합한 후, 얻어지는 융합 세포는 최소 배지상에서의 증식성을 통해 동정할 수 있다. 그 다음, 이 세포를 목적 성질의 개량에 대해 선별하거나 선택할 수 있다. 후속 재조합 및 선별/선택 사이클에는 새로운 영양요구 돌연변이를 형성하는 추가 돌연변이유발 단계를 부가할 수 있다.
이 방법의 변형으로서, 각 셔플링 단계에서 영양요구 돌연변이의 새로운 형성은 동일 영양요구균을 재기시켜 피할 수 있다. 예컨대, 영양요구균은 선택 마커를 보유하는 트란스포손을 사용하여 트란스포손 돌연변이유발시켜 생성시킬 수 있다. 영양요구균은 레플리카 평판과 같은 스크린으로 동정한다. 영양요구균을 수집하고, 영양요구 세포 집단 상에서 파지를 성장시켜 일반화된 형질도입 파지 용균물을 제조한다. 이와 별도로 영양요구 세포 집단을 유전자 교환 처리하고, 유전자 교환 및 재조합이 일어난 세포를 선택하는데에는 보족 방법을 사용한다. 이 세포를 목적하는 성질의 획득에 대해 선별하거나 선택한다. 선별 또는 선택시 생존하는 세포는 형질도입 트란스포손 라이브러리의 도입으로 재생된 영양요구 마커를 보유한다. 그 다음, 새로 생성된 영양요구 세포를 다른 유전자 교환 및 선별/선택 단계로 더 처리할 수 있다.
또 다른 변형예로서, 영양요구 돌연변이는 선택 마커와 이에 인접한 개량될 세포 게놈의 생합성 영역과 상동성 영역을 포함하는 표적 벡터와 동종 재조합하여 형성한다. 벡터와 게놈 간의 재조합은 영양요구 돌연변이를 유발하는 게놈 중으로 양성 선택 마커를 삽입한다. 이 벡터는 세포를 도입시키기 전에는 선형이다. 경우에 따라 벡터가 도입되는 빈도는 헤어핀 형성으로 어닐링된 자가 상보성 올리고뉴클레오티드로 말단을 캡핑하여 증가시킬 수 있다. 유전자 교환 및 선별/선택은 전술한 바와 같이 진행한다. 각 단계에서, 표적 벡터는 재도입하여 영양요구 마커의 동일 집단을 생성시킨다.
다른 변형예로서, 융합 세포는 양친 세포의 제1 아집단에 존재하는 게놈 마커와 세포의 제2 아집단 상에 존재하는 에피솜 마커를 선별하여 동정한다. 예컨대, 미토콘드리아를 포함하는 효모의 제1 아집단을 사용하여 페타이트 표현형(즉, 미토콘드리아 결실)을 가진 효모의 제2 아집단을 보족할 수 있다.
또 다른 변형예로서, 유전자 교환은, 한 세포는 사멸된 것인 두 세포 아집단간에 실시한다. 그 다음, 생존 세포를 사멸된 양친 아집단 상에 존재하였던 마커에 대하여 선별한다.
3. 리포좀 매개 전이법
전술한 방법에서, 핵산 단편 라이브러리가 원형질 중으로 도입되는 경우 때로 핵산을 리포좀에 캡슐화하면 원형질 중으로 용이하게 흡수된다. 원형질에 DNA를 리포좀 매개로 흡수시키는 방법은 문헌[Redford et al., Mol.Gen.Genet. 184, 567-569(1981)]에 기재되어 있다. 리포좀은 원형질로 다량의 DNA를 효과적으로 전달할 수 있다[Deshayes et al., EMBO J. 4, 2731-2737(1985)]. 또한, DNA는 전체 게놈 보다 더 재조합성인 선형 단편으로 전달될 수 있다. 일부 방법에서, 단편은 리포좀에 캡슐화되기 전에 돌연변이시키기도 한다. 다른 일부 방법에서, 단편은 재조합을 촉진하기 위해 리포좀에 캡슐화하기 전에 RecA 및 동족체, 또는 뉴클레아제(예, 제한 효소)와 결합시키기도 한다.
4. 사상 진균류의 셔플링
사상 진균류는 특히 전술한 셔플링 방법을 수행하는데 적합하다. 사상 진균류는 유성 생식의 구조에 근거하여 4가지 주부류로 나누어진다. 즉, 조상균류(Phycomycetes), 자낭균류(Ascomycetes), 담자균류(Basidiomycetes) 및 불완전 균류(Fungi Imperfecti). 조상균류(예, 라이조푸스, 뮤코)는 포자낭에서 유성 포자를 형성한다. 이 포자는 단핵 또는 다핵성일 수 있고 종종 균사에 격막도 없다(다핵체성). 자낭균류(예, 아스퍼질러스, 뉴로스포라, 페니실륨)는 감수분열의 결과로서 자낭 중에 유성 포자를 생성한다. 자낭은 보통 4개의 감수분열 생성물을 포함하는 것이 일반적이지만, 일부 자낭은 추가 유사분열의 결과로서 8개를 포함한다. 담자균류는 버섯, 수균 및 흑수균을 포함하고, 담자기의 표면 상에 유성 포자를 형성한다. 진정담자균류(예, 버섯)에서 담자기는 분열하지 않는다. 반담자균류[예, 수균(녹균) 및 흑수균(깜부기균목)]에서 담자기는 분열된다. 불완전균류는 대부분의 인간 병원균을 포함하는 것으로, 유성 단계-무성 생식 단계가 없다.
진균류는 무성, 유성 또는 준유성적 방식으로 생식할 수 있다. 무성 생식은 배우자가 관여하지 않고 핵융합이 없는 균사의 무성 증식, 핵분열 및 세포 분열을 포함한다. 세포 분열은 균사의 포자 형성, 발아 또는 단편화로 일어날 수 있다.
유성 생식은 세포간 유전자 물질을 셔플링하는 기작을 제공한다. 유성 생식 사이클은 반수체상 및 이배체상의 변화를 특징으로 한다. 이배체화는 2개의 반수체 배우자 핵이 융합(핵 융합)할 때 일어난다. 배우자 핵은 자웅동체 진균과 같이 동일한 양친 균주(자가 수정)에서 유래될 수 있다. 자웅이체 진균에서, 양친 균주는 다른 교배 형태의 균주에서 유래될 수 있다. 이배체 세포는 실질적으로 핵분열 2회와 염색체 분열 1회로 구성되는 감수분열을 통해 반수체로 변환된다. 1회의 감수분열 생성물은 4분자(4개의 반수체 핵)이다. 일부 경우에는 감수분열 후 유사분열이 일어나서 8개의 세포가 얻어진다. 최종 세포(보통 포자 중에 봉입되어 있음)의 배열은 양친 균주의 배열과 유사하다. 반수체 및 이배체 단계의 길이는 각 진균류마다 상이하다. 예컨대 담자균류와 대다수의 자낭균류는 대부분 반수체 생활환(즉, 핵융합 후 즉시 감수분열이 일어남)을 나타내고, 기타 다른 균(예, 사카로마이세스 세레비지에)들은 대부분의 생활환(감수분열 후 즉시 핵융합이 일어남) 동안 이배체이다. 유성 생식은 동일 균주 중의 세포간(자가 생식)이나 또는 상이한 균주 유래의 세포간(이형교잡)에 일어날 수 있다.
유성 이형성(자웅이주)은 다른 균사 상에 암수 기관을 별도로 생성하는 것이다. 이 예는 몇가지가 알려져 있지만, 진균류 중에서 드문 현상이다. 자웅이체(1개의 유전자좌-2개의 대립형질)는 자가 불화합성인 교잡화합성 균주간에 이종교잡을 형성한다. 가장 간단한 형태는 다음 미생물 중에서 예시되는 바와 같은 교배 형태/인자의 2개의 대립형질-1개의 유전자좌 시스템이다.
뉴로스포라의 A 및 a
사카로마이세스의 a 및 α
시조사카로마이세스 및 자이고마이세테스의 + 및 -
흑수균속의 a1및 a2.
고등 담자균류(예, 복균류 및 균심류) 중 일부는 복대립 형질을 나타내는데, 이것은 자웅이체이고 복대립형질에 의해 측정되는 여러 교배 형태를 갖고 있다. 이 유기체에서 나타나는 자웅이체는 1개의 교배형 인자를 가진 2극성이거나, 2개의 비관련 인자, A 및 B를 가진 4극성이다. 안정한 생식성 이핵접합체 형성은 상이한 A 인자의 존재에 달려있고, 4극성 유기체의 경우에는 역시 상이한 B 인자의 존재에 달려있다. 이 시스템은 이형교잡의 촉진과 자가 교배 방지에 효과적이다. 상이한 교배 인자의 수는 매우 많을 수 있으며(즉, 수천개)[Kothe, FEMS Microbiol.Rev. 18, 65-87(1996)], 비양친 교배 인자가 재조합에 의해 생길 수도 있다.
준유성 생식은 세포간 유전자 물질을 셔플링할 수 있는 추가 수단을 제공한다. 이 과정은 교배형이나 배우자에 관계없이 양친 DNA를 재조합시킨다. 준유성 융합은 균사 융합에 의해 일어나고, 따라서 상이한 핵을 포함하는 공통 세포질이 생길 수 있다. 2개의 핵은 최종 이핵접합체에서 각각 분열하지만 경우에 따라 융합할 수도 있다. 융합 후에는 염색체 상실과 상동성 염색체간의 유사분열 교배를 포함할 수 있는 반수체화가 일어난다. 원형질 융합은 준유성 생식의 한 형태이다.
전술한 4가지 부류 중에서, 진균류는 무성 화합성 군으로 분류된다. 무성 화합성 군에 속하는 진균류는 서로 이핵접합체를 형성할 수 있다. 따라서, 여러 진균류 균주간 유전자 물질을 교환하고자 하는 경우, 보통 동일한 무성 화합성 군으로부터 진균류를 제조하는 것이 일반적이다. 하지만, 일부 유전자 교환은 준유성 생식의 결과로서 상이한 불화합성 군 유래의 진균류 간에 일어날 수도 있다[Timberlake et al., US 5,605,820]. 또한, 다른 여러 문헌들에 기재된 바와 같이 진균의 천연 무성 화합성 군을 셔플링의 결과로서 증식시킬 수 있다.
아스퍼질러스 니듈란스(Aspergillus nidulans), 아스퍼질러스 플라버스(A. flavus), 아스퍼질러스 휴미가투스(A. fumigatus), 페니실륨 크리소게넘(Penicillium chrysogenum), 페니실륨 노타텀(P. notatum), 세팔로스포륨 크리소게넘(Cephalosporium chrysogenum), 뉴로스포라 크라사(Neurospora crassa), 아우레오바시듐 플루란스(Aureobasidium pullulans)를 핵형별화하였다. 게놈 크기는 아스퍼질러스의 경우 보통 20 내지 50 Mb 범위가 일반적이다. 핵형의 차이는 유사 균주 간에 존재하며 외인성 DNA에 의한 형질전환시 일어나기도 한다. 사상 진균류 유전자는 유사한 콘센서스 5' 및 3' 접목 서열을 가진 보통 ~ 50 내지 100 bp의 인트론을 포함한다. 촉진 시그널 및 종결 시그널은 한 진균(예, 아스퍼질러스 니듈란스) 유래의 유전자/경로를 다른 진균(예, 페니실륨 크리소게넘)에서 발현시킬 수 있는 교차 인식성이기도 하다.
진균 세포벽의 주 성분은 키틴(또는 키토산), β-글루칸 및 만노단백질이다. 키틴과 β-글루칸은 골격을 형성하고, 만노단백질은 벽의 다공성, 항원성 및 점착성을 나타내는 간극 성분이다. 키틴 합성효소는 β-(1,4)-결합된 N-아세틸글루코사민(GIcNAc) 잔기의 중합을 촉매하여 역평행으로 진행하는 선형 가닥을 형성한다. β-(1,3)-글루칸 합성효소는 글루코스의 단독중합을 촉매한다.
셔플링의 일반적인 1가지 목표는 유전자 조작, 구체적으로 무관련 유전자의 셔플링에 유용한 숙주가 되도록 진균을 개량하는 것이다. 아스퍼질러스 니듈란스는 일반적으로 고전적 분자 유전학에서 그 사용 방식이 공지되어 있고 유성 생활 주기를 보유하기 때문에 상기 조작에 숙주로서 작용하는 선택된 진균류이다. 다른 일반 목표는 진균의 활성을 개선시켜 특정 화합물[예, 항균제(페니실린, 세팔로스포린)], 항진균제(예, 에키노칸딘, 아우레오바시딘) 및 목분해 효소를 제조하는 것이다. 이와 같은 일반 목표 사이에는 일부 중복되는 점이 있고, 따라서 양 목표를 달성하는데에는 일부 바람직한 성질이 유용하게 이용될 수 있다.
1가지 바람직한 성질은 현재에는 유성 생식 주기가 없는 진균류 중으로 감수분열 기구를 도입시키는 것이다[Sharon et al., Mol. Gen. Genet. 251, 60-68(1996)]. 진균류 페니실륨 크리소게넘(불완전균류) 중으로 유성 생식 주기를 도입시키는 개략도는 도 6에 도시하였다. 아스퍼질러스 니듈란스(유성 생식 주기를 보유함)와 페니실륨 크리소게넘(유성 생식 주기를 보유하지 않음)로부터 원형질 아집단을 만든다. 이 두 균주는 상이한 마커를 보유하는 것이 바람직하다. 아스퍼질러스 니듈란스 원형질은 자외선 또는 히드록실아민 처리시 사멸한다. 2가지 아집단을 융합하여 이핵접합체를 만든다. 일부 이핵접합체에서 핵이 융합하면 재조합이 약간 일어난다. 융합된 세포는 새로운 세포벽을 형성한 후 유성 재조합을 일으키는 조건하에서 배양한다. 그 다음 재조합 게놈을 가진 세포를 선택한다(예, 각각의 양친 균주 상에 존재하는 영양요구 마커의 보족에 대해 선택함). 하이브리드 게놈을 가진 세포가 유성 생식 주기에 필요한 유전자를 획득할 가능성이 보다 크다. 그 다음 세포의 원형질을 유성 생식 주기(전 단계와 동일하거나 상이함)를 보유하는 것으로 공지된 세포의 다른 집단의 사멸된 원형질과 동일 방식으로 교배한 다음, 하이브리드 게놈을 가진 세포를 선택할 수 있다.
또 다른 바람직한 성질은 진균의 돌연변이 균주를 생성하는 것이다. 이 진균은 작용성 생성물의 발현에 손상을 입히거나 발현을 억제하는 돌연변이를 1개 이상 가진 마커 유전자를 포함하는 진균류 균주를 셔플링하여 만들 수 있다. 셔플링체는 양성 마커의 발현을 선택하는 조건하에서 전파시킨다(소량은 발현없이 잔류 증식됨). 가장 증식 속도가 빠른 셔플링체는 다음 셔플링 단계의 출발 물질로서 사용한다.
또 다른 바람직한 성질은 다른 무성 생식 화합성 군 유래의 진균과 이핵접합체를 형성할 수 있도록 진균의 숙주 범위를 확대하는 것이다. 종간 불화합성은 여러 불화합성 좌(예컨대, "het" 좌)에서 특정 대립형질이 상호작용하면 생긴다. 두 균주가 균사물합을 일으키는 경우, 유전자좌가 서로 다르면 치명적인 세포질 불화합성 반응이 일어난다. 따라서, 균주는 완전하게 화합성이 되도록 동일한 유전자좌를 보유해야만 한다. 이들 유전자좌 중 몇가지가 여러 종에서 동정되었고, 불화합성 효과는 다소 부가적 효과일 뿐이다(즉, "부분 불화합성"이 일어날 수 있음). 이들 미생물에 대한 일부 내성균주와 het 음성 돌연변이체도 개시되었다(예, Dales & Croft, J.Gen.Microbiol. 136, 1717-1724(1990)]. 또한, 교배형 이핵접합체 불화합성을 억제하는 내성 유전자(tol)도 보고되었다. 셔플링은 여러 불화합성 군에 속하는 균주의 원형질 간에 실시된다. 바람직한 방식은 수용체 생균주와 UV 조사로 사멸된 수용체 균주를 사용하는 것이다. UV 조사는 DNA 중으로 돌연변이를 도입시켜 het 유전자를 불활성화시키는 작용을 한다. 두 균주는 상이한 유전자 마커를 보유해야 한다. 이 균주의 원형질을 융합시키고, 세포를 재생시킨 후, 마커의 보족에 대해 선별한다. 후속 셔플링과 선택 단계는 생존 세포를 융합시키고, 새로운 공여체 세포 집단의 원형질로 선별하므로써 동일 방식으로 실시할 수 있다.
또 다른 목적 성질은 자낭균류 및 불완전균류에 통상적으로는 나타나지 않는 복대립 자웅이체를 도입시키는 것이다. 이 교배 시스템은 자가 교배가 아닌 이형교배를 일으킨다. 이와 같은 교배 시스템은 이 시스템을 보유한 복균강 또는 균심강 유래의 DNA로 자낭균류 및 불완전균류를 셔플링하여 도입시킬 수 있다.
또 다른 목적 성질은 셔플링 숙주로서 진균 균주의 이용을 용이하게 하는 자발적인 원형질 형성이다. 여기서, 개량될 진균류는 보통 돌연변이유발되는 것이 일반적이다. 먼저, 개량될 진균의 포자를 완전한 원형질 형성에 불충분한 시간 동안 세포벽 분해제로 간단히 처리하고, 다른 진균 균주 유래의 원형질과 혼합한다. 2가지 다른 아집단을 융합시켜 형성된 원형질은 전술한 바와 같은 유전자 조작 또는 다른 선택/또는 선별 기법으로 동정한다. 이 원형질을 사용하여 균사 및 그 다음 포자로 재생시키고, 이것을 다음 셔플링 단계의 출발 물질로서 사용한다. 후속 단계로서, 생존 포자의 일부 이상을 이전 단계에서 보다 짧은 시간 동안 세포벽 제거 효소로 처리한다. 처리 후, 부분 박리된 세포를 제1 표지로 표지한다. 이 세포를 그 다음 전단계에서 선택시 생존한 다른 세포로부터 유래되거나 새로운 진균 균주로부터 유래되는 원형질과 혼합한다. 이 원형질을 제2 표지로 물리적으로 표지한다. 원형질 융합 조건하에서 세포를 항온배양한 후, 두 표지를 보유한 융합체를 선택한다. 이 융합체를 사용하여 균사와 포자를 생성시키고 이것을 다음 셔플링 단계에 사용한다. 이 과정을 반복하면, 결국 원형질을 자발적으로 형성하는 후대(즉, 세포벽 분해제 첨가 없이)가 얻어진다.
또 다른 목적 성질은 생합성 경로에 관여하는 효소를 암호하는 유전자, 전달 단백질을 암호하는 유전자, 및 대사 유입 조절에 관여하는 단백질을 암호하는 유전자를 획득 및/또는 개선시키는 것이다. 여기에서, 경로에 관여하는 유전자는 그 경로를 보유하는 다른 진균 균주와 유전자 교환하거나 그 경로를 보유하는 미생물 유래의 단편 라이브러리를 도입시켜 개량될 진균 중으로 도입시킨다. 그 다음, 이 진균의 유전자 물질을 본 명세서에 기재된 각종 절차를 통해 추가 셔플링 및 선별/선택 처리할 수 있다. 진균의 셔플링 균주는 대사 경로에서 생성되는 화합물이나 그 전구체를 생성하는 것을 선택/선별한다.
다른 목적 성질은 열과 같은 극한 조건에 대한 진균의 안정성을 증가시키는 것이다. 여기에서, 안정성을 부여하는 유전자는 이와 같은 성질을 보유하고 있는 균주 유래의 DNA와 교환하거나 형질전환시켜 획득할 수 있다. 또는, 개량될 균주는 무작위 돌연변이유발시킬 수 있다. 개량될 진균의 유전자 물질은 본 명세서에 기재된 임의의 절차를 통해 셔플링할 수 있고, 셔플링체는 극한 조건에 노출시 생존하는 것으로 선택할 수 있다.
또 다른 목적 성질은 개량된 영양 조건(예, 특정 탄소원 또는 질소원에서 증식) 하에서의 진균의 성장 능력이다. 영양 조건을 변화시키는 방법은, 예컨대 상업적으로 주요한 생성물을 생성하지만, 심원하고 값비싼 영양 성분을 필요로 하는 진균류의 천연 분리물의 경우에는 특히 중요하다. 개량될 균주를 먼저 목적 영양 조건을 보유하는 균주 유래의 DNA로 유전자 교환 및/또는 형질전환시킨다. 그 다음, 경우에 따라 본 명세서에 기재된 바와 같은 셔플링 방법으로 추가 처리하고 목적하는 영양 환경에서 성장하는 성질을 가진 재조합 균주를 선택한다. 경우에 따라, 영양 환경은 개량될 진균의 천연 요구 조건과 가까워질 때 개시되는 후속 셔플링 단계 및 목적 영양 조건에 근사해지는 후속 단계에서는 변화시킬 수 있다.
또 다른 목적 성질은 진균에 의한 천연 컴피턴스의 획득이다. 셔플링에 의한 천연 컴피턴스의 획득 절차는 일반적으로 PCT/US97/04494에 기재되어 있다. 개량될 진균류를 일반적으로 상기 성질을 보유하고 있는 박테리아 균주 또는 진균 균주 유래의 DNA로 유전자 교환 또는 형질전환시킨다. 그 다음, 선택 마커를 보유하는 플라스미드를 흡수하는 성질을 통해 재조합 게놈을 보유한 세포를 선택한다. 전술한 임의 절차를 사용하여 재조합 및 선택 과정을 추가 실시할 수 있다.
다른 목적 성질은 프로테아제 및 DNase 분비의 감소 또는 증가이다. 여기에서, 개량될 진균은 목적 성질을 보유한 것으로 알려진 다른 균주 유래의 DNA를 교환이나 형질전환을 통해 획득하거나 또는 무작위 돌연변이유발시킬 수 있다. 개량될 진균은 전술한 바와 같이 셔플링한다. 선택/선별 분리하기 전에, 진균의 수집 분리물을 용균시켜 프로테아제 또는 DNase를 주위 배지로 방출시키는 것이 일반적이다. 이와 같은 효소의 존재 또는 결실은 펩티드 또는 DNA 결합을 통해 지지체에 결합된 형광성 분자와 배지를 접촉시켜 분석할 수 있다. 결합이 절단되면 검출가능한 형광성이 배지로 방출된다.
또 다른 목적 성질은 개량된 수송인자(예, MDR)를 가진 진균을 생성하는 것이다. 이와 같이 변화된 수송인자는, 예컨대 새로운 2차 대사산물을 생성하거나, 새로운 2차 대사산물의 합성에 필요한 전구체를 세포 중으로 도입시키거나, 또는 세포로부터 2차 대사산물을 유출시키기 위해 개량되는 진균에서 유용하다. 수송인자는 진균 세포 중으로 수송인자 변형체의 라이브러리를 진균 세포 중으로 도입시키고 이 세포를 유성 또는 준유성 재조합으로 재조합하여 개량할 수 있다. 전구체를 세포 중으로 수송하는 성질을 가진 수송인자를 개량하기 위하여, 전구체 존재하에 세포를 전파시키고, 그 다음 대사물질의 생성에 대해 세포를 선별한다. 대사물질을 유출시키는 성질을 가진 수송인자를 개량하기 위하여, 세포를 대사물질의 생성을 지지하는 조건 하에서 전파시키고 배지로 대사물질의 배출을 조사하여 선별한다.
일반적인 진균류 셔플링 방법은 도 7에 도시하였다. 아가 평편에서 얻은 동결 수집물이나 새로운 배양물 유래의 포자를 사용하여 적합한 액체 배지에 접종하였다(1). 포자를 발아시켜 균사를 성장시켰다(2). 균사를 수확하고, 여과 및/또는 원심분리하여 세척하였다. 경우에 따라, 시료를 DTT로 예비처리하여 원형질이 잘 형성되도록 하였다(3). 원형질화는 삼투압적으로 안정한 배지(예, 1M NaCl/20mM MgSO4, pH 5.8)에서 세포벽 분해 효소(예, Novozyme 234)를 첨가하여 실시하였다(4). 세포벽 분해 효소는 삼투압적으로 안정한 용액으로 반복 세척하여 제거하였다(5). 미라클로드(miracloth)를 통해 여과하고 밀도 원심분리하여 균사, 찌꺼기 및 포자로부터 원형질을 분리할 수 있다(6). 원형질은 원심분리로 수거하고 적당한 농도로 재현탁하였다. 이 단계는 일부 원형질 융합으로 유도할 수 있다(7). 융합은 PEG(예, PEG3350)를 첨가하여 자극할 수 있고(또는), 반복하여 원심분리한 뒤 PEG 존재 또는 부재하에 재현탁시킨다. 또한, 전기융합을 실시할 수도 있다(8). 경우에 따라 슈크로스 구배 침강(또는 전술한 다른 선별 방법)을 통해 융합되지 않은 원형질로부터 융합된 원형질을 농축시킬 수 있다. 융합된 원형질은 경우에 따라 자외선으로 자극하여 재조합을 자극할 수 있다(9). 원형질은 삼투압적으로 안정화된 아가 평판에서 배양하여 세포벽을 재생시키고 균사를 형성시킨다(10). 이 균사를 사용하여 포자(11)을 형성시키고, 이것을 다음 셔플링 단계의 출발 물질로서 사용한다(12). 목적 성질에 대한 선택은 재생된 균사 또는 이로부터 유래된 포자에 대하여 실시할 수 있다.
다른 방법으로, 원형질은 세포벽 합성에 필요한 1종 이상의 효소를 억제하여 형성시키기도 한다(도 8). 억제제는 사용 조건하에서 제균성이기 보다는 정균성이어야 한다. 억제제의 예로는 문헌[Georgopapadakou & Walsh, Antimicrob. Ag. Chemother. 40, 279-291(1996); Lyman & Walsh, Drugs 44, 9-35(1992)]에 기재된 항진균 화합물을 포함한다. 다른 예로는 키틴 신타제 억제제(폴리옥신 또는 닉코나이신 화합물) 및/또는 글루칸 신타제 억제제(예, 에치노칸딘스, 파퓰로칸딘스, 뉴로칸딘스)를 포함한다. 억제제는 삼투압적으로 안정화된 배지에 적용되어야 한다. 세포벽이 제거된 세포는 유전자 형질전환/균주 개발 프로그램에서 융합되거나 숙주 또는 공여체로서 이용될 수 있다. 이와 같은 방법을 반복적으로 이용하는 것이 가능한 개략도는 도 8에 요약하였다.
또 다른 변형으로서, 원형질은 본래 세포벽을 합성하는 성질이 유전자적으로 결손형이거나 타협성인 진균 균주를 사용하여 제조한다(예, 도 9). 이와 같은 돌연변이는 일반적으로 파괴성, 삼투압 교정성 또는 세포벽 결실성이라고 하며, 균주 기탁소에서 입수할 수 있다. 이와 같은 균주의 예로는 뉴로스포라 크라사 os 돌연변이체를 포함한다[Selitrennikoff, Antimicrob. Agents. Chemother. 23, 757-765(1983)]. 이러한 돌연변이중 일부는 온도 민감성이다. 온도 민감성 균주는 선택과 증폭에 허용되는 온도 및 원형질 형성과 융합에 허용되지 않는 온도에서 전파시킬 수 있다. 온도 민감성 균주 뉴로스포라 크라사 os 균주는 미국 특허 4,873,196호에 비허용 온도에서 솔보스 및 폴리옥신을 포함하는 삼투압 안정성 배지에서 증식시킬 때 원형질로서 전파하지만 허용 온도에서 소르비톨을 함유하는 배지로 전이시키면 완전 세포를 형성한다고 개시되어 있다.
다른 적합한 균주는 키틴 합성, 글루칸 합성 및 다른 세포벽 관련 과정에 관여하는 유전자를 표적화 돌연변이유발시켜 생성할 수 있다. 이와 같은 유전자의 예로는 사카로마이세스 세레비지에 및 칸디다 종의 CHT1, CHT2 및 CALI(또는 CSD2)(Georgopapadakou & Walsh, 1996); 사카로마이세스 세레비지에, 칸디다 알비칸스, 크립토코커스 네오포르만스, 아스퍼질러스 푸미가투스, ChvAINdvA 아그로박테리움 및 라이조븀 중의 ETGI/FKSI/CNDI/CWH53/PB RI 및 동족체를 포함한다. 다른 예로는 아스퍼질러스 니듈란스의 MA, orlB, orlC, MD, tsE 및 bimG를 포함한다[Borgia, J. Bacteriol., 174, 377-389(1992)]. OrlA 1, tse6 및 bimG11 돌연변이 균주는 제한 온도에서 용균을 일으키는 돌연변이를 보유한다. 용균은 삼투압 안정화로 방지한다. 돌연변이는 N-아세틸글루코사민(GlcNAc)을 첨가하여 보충한다. bimG11 돌연변이 균주는 분생자기 중의 타입 1 단백질 포스파타제에 대한 ts이다. 다른 적합한 유전자는 아스퍼질러스 푸미가투스의 chsA, chsB, chsC, chsD 및 chsE; 뉴로스포라 크라사의 chs1 및 chs2; 피코마이세스의 블레익스리아누스 MM 및 사카로마이세스 세레비지에의 chs1, 2 및 3을 포함한다. chs1은 비필수 수복 효소이고, chs2는 격막 형성에 관여하며 chs3은 세포벽 성숙 및 출아환 형성에 관여한다. 다른 유용한 균주는 PKC1 유전자의 결실(CYL 15 균주)과 같은 사카로마이세스 세레비지에 CLY 돌연변이 균주(세포 용균) ts 균주[Paravicini et al., Mol. Cell Biol. 12, 4896-4905(1992)], srb(액틴 유전자)내 균주 VY 1160-ts 돌연변이[Schade et al. Acta Histochem. Suppl. 41, 193-200(1991)] 및 달팽이 장에서 분리된 세포벽 분해 효소에 대한 감수성이 증가된 반수체 돌연변이체 ses[Metha & Gregory, Appl.Environ.Microbiol. 41, 992-999(1981)]. 다른 유용한 균주는 C.알비칸스 chs1, 2, 3 키틴 합성효소, 삼투압 교정용 조정 치사 돌연변이체[Payton & de Tiani, Curr. Genet. 17, 293-296(1990)]; 달팽이 장에서 분리된 세포벽 분해 효소에 대한 감수성이 증가된 C. 유틸리스 돌연변이체[상기 Metha & Grogory, 1981 문헌 참조]; 및 N. 크라사 돌연변이체 os-1,2,3,4,5,6[Selitrennikoff, Antimicrob. Agents Chemother. 23, 757-765(1983)]. 이와 같은 돌연변이체는 37 ℃에서는 세포벽을 형성함이 없이 증식하고 분열하지만 22 ℃에서는 세포벽을 형성한다.
표적화 돌연변이유발은 표적화 분절에 인접한 상동성 영역, 상동성 영역 사이에 존재하는 양성 선택 마커 및 상동성 영역 외측에 존재하는 음성 선택 마커를 포함하는 양성-음성 선택 벡터로 세포를 형질전환시켜 수행할 수 있다[Capecchi, 미국 5,627,059]. 변형예로서, 음성 선택 마커는 양성 선택 마커의 안티센스 전사체일 수 있다(미국 5,527,674 참조).
다른 적합한 세포는 선택 방법과 함께 셔플링 또는 무작위 돌연변이 절차를 실시하여 선택할 수 있다. 예컨대, 세포의 제1 아집단을 돌연변이유발시키고, 돌연변이유발 후 회수하고, 세포벽을 불완전 분해시킨 뒤, 세포의 제2 아집단의 원형질과 접촉시킨다. 상기 두 아집단 유래의 마커를 보유하는 하이브리드 세포를 동정하고(전술한 바대로) 후속 셔플링 단계의 출발 물질로서 사용한다. 이 선택 방법은 자발적인 원형질 형성 능력을 가진 세포 및 향상된 재조합원성을 가진 세포를 모두 선택한다.
또 다른 변형으로, 자발적 원형질 형성력을 가진 세포를 본 발명의 기타 다른 방법을 사용하여 개량된 향상된 재조합원성을 가진 세포와 교잡시킬 수 있다. 이 하이브리드 세포는 특히 전체 게놈 셔플링의 숙주로서 적합하다.
세포벽 합성 또는 유지와 관련이 있는 효소에 돌연변이가 있는 세포는 자발적인 원형질 형성에 의해 삼투압 차단된 배양물에서 세포를 전파시킨 결과로서 간단히 융합을 진행할 수 있다. 돌연변이가 조건적이면, 세포는 비허용 조건으로 변화된다. 원형질 형성과 융합은 PEG 또는 전기장과 같은 촉진제를 첨가하여 가속화시킬 수 있다[Philipova & Venkov, Yeast 6, 205-212(1990); Tsoneva et al., FEMS Microbiol. Lett. 51, 61-65(1989)].
5. 효모의 셔플링 방법
효모는 단독 세포로서 성장하는 진균의 아종이다. 효모는 발효 음료 및 발효소 생성, 연료, 저분자량 화합물로서의 에탄올 생성 및 단백질과 효소의 이종 생성에 사용된다(첨부되는 효모 균주의 목록과 그 용도를 참조하라). 통상적으로 사용되는 효모 균주로는 사카로마이세스 세레비지에, 피치아 종, 카니디아 종 및 시조사카로마이세스 폼베를 포함한다.
통합 플라스미드(YIp), 효모 복제 플라스미드(2 μ서클계 벡터와 같은 YRp), 효모 에피솜 플라스미드(YEp), 효모 중심체 플라스미드(YCp) 또는 효모 합성 염색체(YAC)를 비롯한 여러 종류의 벡터가 효모 클로닝에 유용하다. 각 벡터는 LUE2, URA3 및 H1S3과 같은 플라스미드의 존재 또는 URA3(5-플루오로 오로트산의 존재하에 증식하는 세포에 독성인 유전자)과 같은 플라스미드의 부재를 선별하는데 유용한 마커를 운반할 수 있다.
대부분의 효모는 유성 주기와 무성 주기를 보유한다. 유성 주기는 세포가 감수분열을 통해 계대할 때마다 유기체의 전체 게놈을 재조합하는 단계를 포함한다. 예컨대, 사카로마이세스 세레비지에의 이배체 세포를 질소 및 탄소 제한 조건에 노출시키면 이배체 세포는 감수분열하여 자낭을 형성한다. 각 자낭은 4개의 반수체 포자, "a" 교배형 2개와 "α" 교배형 2개를 보유한다. 다시 영양 배지로 전환시키면, 교배형이 반대인 반수체 포자들은 교배하여 다시 이배체 세포를 형성한다. 반대 교배형의 자낭은 자낭내에서 교배할 수 있고, 자낭이 예컨대 자이몰라제에 의해 분해되는 경우 반수체 세포는 다른 자낭 유래의 포자와 교배할 수 있다. 이 유성 주기는 효모 중에 삽입된 효모의 내인성 게놈 및/또는 외인성 단편 라이브러리를 셔플링하는 형식을 제공한다. 이 과정은 하이브리드 유전자를 축적 또는 교환시키고, 교배 세포가 공유하는 동종 서열을 셔플링시킨다.
여러 공지 유전자에 돌연변이가 있는 효모 균주는 셔플링에 유용한 성질을 갖고 있다. 이 성질로는 세포내 자발적 돌연변이 빈도를 증가시키고 재조합 빈도를 증가시키는 것을 포함한다. 이 성질은 야생형 암호 서열이 돌연변이된 결과이거나 야생형 암호 서열이 변화 발현(보통 과잉발현)된 것이다. HO 뉴클레아제는 교배형을 전환시키는 MAT 좌로의 HMLa/α및 HMRa/α의 전위에 영향을 미친다. 이 효소를 암호하는 유전자의 돌연변이는 교배형을 전환시키지 않으며 소정 유전자형의 균주, 예컨대 라이브러리를 보유하고 있거나 소정 표현형이 있는 균주를 서로 교잡시키고 출발 균주의 교배를 방지하는데 사용될 수 있다. PMS1, MLH1, MSH2, MSH6가 부정합 수복에 관여한다. 이 유전자 중의 돌연변이는 모두 돌연변이 표현형을 보유한다[Chambers et al., Mol.Cell.Biol.16, 6110-6120(1996)]. TOP3 DNA 토포이소머라제의 돌연변이는 염색체간 동종 재조합을 6배 향상시킨다[Bailis et al., Molecular and Cellular Biology 12, 4988-4993(1992)]. RAD50-57 유전자는 방사선에 대한 내성을 부여한다. rad3은 피리미딘 이량체를 절단하는 작용을 한다. RAD52는 유전자 전환 기능을 한다. RAD50, MRE11, XRS52는 동종 재조합과 위법 재조합에 있어 작용을 한다. HOP1, RED1은 초기 감수분열 재조합에 작용한다[Mao-Draayer, Genetics 144, 71-86]. HOP1 또는 RED1에 대한 돌연변이는 HIS2 재조합 과열지점에서 2본쇄 붕괴를 감소시킨다. 이 유전자가 결손성인 균주는 YAC 상에 운반되는 직렬 발현 라이브러리와 같은 과재조합원성 작제물의 안정성을 유지시키는데 유용하다. HPR1의 돌연변이는 과재조합원성이다. HDF1은 DNA 말단 결합 활성이 있고 2본쇄 붕괴 수복 및 V(D)J 재조합에 관여한다. 이 돌연변이를 보유하는 균주는 원형질 융합이나 전기침투에 의한 무작위 게놈 단편으로의 형질전환에 유용하다. Kar-1은 핵융합을 방해하는 주요 돌연변이이다. Kar-1 돌연변이체는 공여체 균주에서 수용체 균주로 단독 염색체를 직접 전이시키는데 유용하다. 이 기법은 균주간에 YAC를 전이시키는데 널리 사용되었으며, 또한 개량된 유전자/염색체를 다른 미생물로 전이시키는데에도 유용하다[Markie, YAC Protocols, Humana Press, Totowa, NJ, 1996)]. HOT1는 rDNA 반복 서열의 프로모터와 인헨서 영역내에 존재하는 사카로마이세스 세레비지에 재조합 과열지역이다. 이 유전자좌는 아마도 높은 전사율로 인하여 인접 서열에 유사분열 재조합을 유도한다. 이 영역의 전사 조절하에 삽입된 유전자 및/또는 경로는 유사분열 재조합의 증가를 나타낸다. CDC2는 폴리머라제 δ를 암호하여 유사분열 유전자 전환에 필수적이다. 이 유전자의 과잉발현은 셔플링 또는 돌연변이 균주에 사용될 수 있다. CDC4중의 감온성 돌연변이는 제한 온도에서 세포 주기를 G1에서 중지시키고, 최적의 융합과 후속 재조합을 위해 원형질을 동조배양하는데 사용될 수 있다.
사상 진균과 관련하여 효모를 셔플링하는 일반적인 목표는 유전자 조작시의 숙주 미생물로서, 그리고 각종 화합물의 생성 기구로서 효모를 개량하는 것을 포함한다. 어떤 경우이든지 1가지 목적 성질은 이종 단백질을 발현 및 분비하는 효모의 성질을 개선시키는 것이다. 다음은 증가된 RNaseA 양을 발현 및 분비하도록 효모를 개량하기 위해 셔플링을 이용한 예를 설명한 것이다.
RNase A는 특히 피리미딘 뉴클레오티드 이후에 존재하는 RNA의 결합인 P-05의 절단을 촉매한다. 이 효소는 기본적으로 124개의 아미노산 폴리펩티드로 구성되며, 촉매 작용에 각각 필요한 8개의 절반 시스틴 잔기를 보유한다. YEpWL-RNase A는 효모 사카로마이세스 세레비지에로부터 RNaseA의 발현과 분비에 영향을 미치는 벡터이고, 이 벡터를 보유하는 효모는 배양액 1 리터당 재조합 RNaseA 1 내지 2 ㎎을 분비한다[delCardayre et al., Protein Engineering 8(3):26, 1-273(1995)]. 이방법의 총 수율은 효모 중에서 이종 발현되는 단백질의 경우 매우 적지만, 셔플링에 의해 최소 10 내지 100배 증가될 수 있다. RNaseA의 발현은 여러 평판과 미량역가 평판 분석법에 의해 쉽게 검출된다[delCardayre & Raines, Biochemistry 33, 6031-6037, 1994]. 전체 게놈 셔플링에 대하여 전술한 방법은 각각 YEpWL.RNase A를 수용하는 사카로마이세스 세레비지에 균주를 셔플링하는데 사용할 수 있고, 배지 중으로 RNaseA의 분비가 증가된 최종 세포를 선별할 수 있다. 이 신규 균주를 RNaseA 분비율이 충분히 높아질 때까지 셔플링 방식으로 반복적으로 순환시킨다. RNaseA의 이용은 적당한 폴딩과 이황화결합 형성을 필요로 할 뿐만 아니라 적당한 글리코실화를 필요로 하기 때문에 특히 유용하다. 따라서, 발현, 폴딩 및 분비 시스템의 많은 성분들이 최적화될 수 있다. 또한, 최종 균주는 다른 이종 단백질의 분비 증가를 위해 더 개량될 수도 있다.
효모를 셔플링하는 또 다른 목적은 에탄올에 대한 효모의 내성을 증가시키기 위한 것이다. 이것은 에탄올을 상업적으로 생성하고, 알코올도가 높은 맥주와 와인을 생성하기 위한 용도에 유용하다. 셔플링될 효모 균주는 에탄올에 대한 내성이 우수한 것으로 알려지거나 알려지지 않은 다른 효모 균주와의 교환이나 형질전환에 의해 유전자 물질을 획득한다. 개량될 균주는 셔플링하고, 셔플링체를 에탄올 노출시 생존하는 능력을 통해 선택한다. 연속 셔플링 단계에 증가 농도의 에탄올을 사용할 수 있다. 동일 원리를 사용하여 삼투내성이 향상된 빵효모를 셔플링할 수 있도 있다.
효모를 셔플링하는 다른 목적 성질은 바람직한 영양 조건하에서의 성장 능력이다. 예컨대, 입수용이성에 따라 메탄올, 전분, 당밀, 셀룰로스, 셀로바이오스 또는 크실로스와 같은 값싼 탄소원에서 효모를 성장시키는데 유용하다. 셔플링 및 선택 원리는 사상 진균에서 논의한 바와 유사하다.
또 다른 목적 성질은 사상 진균 또는 박테리아에 의해 천연적으로 생성되는 2차 대사산물을 생성하는 성질이다. 이와 같은 2차 대사산물의 예는 시클로스포린 A, 탁솔 및 세팔로스포린이다. 개량될 효모는 유전자 교환으로 처리하거나 2차 대사산물을 생산하는 미생물 유래의 DNA로 형질전환시킨다. 예컨대, 탁솔을 생성하는 진균으로는 탁소마이세스 안드라아네(Taxomyces andreanae) 및 페스탈로토피스 마이크로스포라[Stierle et al., Science 260, 214-216(1993); Strobel et al., Microbiol. 142, 435-440(1996)]를 포함한다. 또한, DNA는 탁수스 브레비폴리아(Taxus brevifolia)와 같은 탁솔을 천연적으로 생성하는 나무에서 얻을 수 있다. 탁솔 생합성에서 감작 단계를 촉매하는 것으로 추정되고 보베럴(voveral) 탁솔 생성에 있어서 속도 제한성일 수 있는 탁솔 경로 중의 1가지 효소인 탁사디엔 합성효소를 암호하는 DNA는 클로닝되어 있다[Wildung & Croteau, J.Biol.Chem. 271, 9201-4(1996)]. 그 다음 DNA를 셔플링하고, 2차 대사산물의 생성에 대해 셔플링체를 선별/선택한다. 예컨대, 탁솔 생성은 탁솔에 대한 항체를 질량 분광분석법 또는 uv 분광분석법을 통해 모니터할 수 있다. 또는, 탁솔 합성중의 중간체 또는 탁솔 합성 경로 중의 효소 생성을 모니터할 수 있다[Concetti & Ripani, Biol.Chem.Hoppe Seyler 375, 419-23(1994)]. 2차 대사산물의 다른 예로는 폴리올, 아미노산 및 에르고스테롤을 포함한다.
다른 목적 성질은 에탄올 제조시 분리를 용이하게 하기 위하여 효모 응집성을 증가시키는 것이다. 효모는 전술한 절차 중 임의 절차를 사용하여 셔플링할 수 있고, 이어 가장 큰 덩어리를 형성하는 셔플링된 효모를 선택한다.
효모 원형질화 절차의 예
효모의 원형질 제조에 대해서는 문헌[Morgan, in Protoplasts(Birkhauser Verlag, Basel, 1983)]에 논의되어 있다. 새로운 세포(~108)를 0.1 M 인산 칼륨과 같은 완충액으로 세척하고, 50 mM DTT와 같은 환원제를 함유하는 동일 완충액 중에 재현탁한 뒤, 천천히 교반하면서 30 ℃에서 1 시간 동안 항온처리한 다음 다시 완충액으로 세척하여 환원제를 제거한다. 이 세포를 그 다음 Novozyme 234(1 ㎎/㎖)와 같은 세포벽 분해 효소 및 다양한 농도의 슈크로스, 소르비톨, NaCl, KCl, MgSO4, MgCl2또는 NH4Cl과 같은 기타 다양한 삼투압 안정화제를 함유하는 완충액에 재현탁시킨다. 이 현탁액을 원형질이 방출될 때까지 천천히 교반하면서(~ 60 rpm) 30 ℃에서 항온처리하였다. 생산적인 융합체를 형성할 가능성이 보다 큰 원형질을 만드는 방법에는 여러가지가 가능하다.
원형질 형성은 원형질의 세포 주기가 G1에서 중지되도록 동조배양되면 증가될 수 있다. 이것은, 사카로마이세스 세레비지에의 경우 a 또는 α형의 교배 인자를 첨가하면 실시될 수 있다[Curran & Carter, J.Gen.Microbiol. 129, 1589-1591(1983)]. 이 펩티드는 cAMP의 세포 농도를 감소시켜 세포 주기를 G1에서 정지시키는 아데닐레이트 사이클라제 억제제로서 작용한다. 또한, a 및 α세포의 유성 융합시 세포벽의 약화를 유도하는 것으로 밝혀졌다[Crandall & Brock, Bacteriol. Rev. 32, 139-163(1968); Osumi et al., Arch. Microbiol. 97, 27-38(1974)]. 따라서, 원형질 제조시, 세포를 교배 인자 또는 다른 공지의 아데닐레이트 사이클라제 억제제, 예컨대 레플루노마이드 또는 K.락티스 유래의 킬러 독소로 세포를 처리하면 세포를 G1에서 정지시킬 수 있다[Sugisaki et al., Nature 304, 464-466(1983)]. 그 다음 원형질을 융합시킨 후(단계 2), cAMP를 재생 배지에 첨가하면 S 단계와 DNA 합성을 유도할 수 있다. 대안적으로, CDC4 유전자 중에 감온성 돌연변이가 있는 효모 균주를 사용하여 세포를 동조화하고 G1에서 정지시킬 수 있다. 융합 후, 세포는 허용성 온도로 복귀시키면 DNA 합성과 성장이 재개된다.
적합한 원형질이 제조되면 물리적 수단이나 화학적 수단으로 융합을 유도할 필요가 있다. 각 세포 종류 마다 동일한 수의 원형질을, 삼투압 안정화제, 예컨대 0.8 M NaCl 및 PEG 6000(33% w/v)을 포함하는 인산염 완충액(0.2 M, pH 5.8, 2 x 108세포/㎖)에 혼합하고, 그 다음 30 ℃에서 5 분간 항온배양하여 융합시킨다. 물에 결합하는 폴리올이나 기타 다른 화합물을 이용할 수도 있다. 그 다음, 융합체를 세척하고 PEG를 뺀 삼투압 안정화 완충액에 재현탁한 뒤, 삼투압 안정화된 재생 배지로 전이시켜 목적 성질을 가진 세포를 선택 또는 선별할 수 있다.
6. 합성 염색체를 이용한 셔플링 방법
효모 합성 염색체(Yac)는 매우 큰 DNA 단편(예, 50 내지 2000 kb)이 클로닝될 수 있는 효모 벡터이다[예컨대, Monaco & Larin, Trends. Biotech. 12(7), 280-286(1994); Ramsey, Mol.Biotechnol. 1(2), 181-201, 1994; Huxley, Genet.Eng. 16, 65-91(1994); Jakobovits, Curr. Biol. 4(8), 761-3(1994); Lamb & Gearhart, Curr.Opin.Genet.Dev. 5(3), 342-8(1995); Montoliu et al., Reprod.Fertil.Dev. 6, 577-84(1994)]. 이 벡터는 말단소립(Tel), 중심절(Cen), 자율 복제 서열(ARS)을 보유하고 있고, 양성 선택(예, TRP1) 및 음성 선택(예, URA3)용 유전자를 보유할 수 있다. 2YAC를 유지, 복제하고, 감수분열과 유사분열을 통해 다른 효모 염색체로서 분리되면 클로닝된 DNA가 진정한 감수분열 재조합할 수 있는 수단을 제공한다.
YAC는 생체내에서 대형 DNA 단편의 라이브러리를 셔플링할 수 있는 매개체를 제공한다. 셔플링 기질은 보통 20 kb 내지 2 Mb 범위의 대형 단편인 것이 일반적이다. 이 단편은 무작위 단편이거나 목적 성질을 암호하는 것으로 공지된 단편일 수 있다. 예컨대, 단편은 항생제 생성에 관여하는 유전자의 오페론을 포함할 수 있다. 또한, 라이브러리는 전체 게놈이나 염색체를 포함할 수도 있다. 바이러스 게놈 및 일부 박테리아 게놈은 단독 YAC에 본래 상태로 클로닝될 수 있다. 일부 라이브러리에서, 단편은 단일 유기체로부터 얻고, 다른 라이브러리는 일부 라이브러리가 다른 개체 또는 종에서 얻어지는 경우와 같이 단편 변형체를 포함한다. 또한, 단편 변형체는 유도성 돌연변이로 얻을 수 있다. 일반적으로, 단편내 유전자는 효모 중의 천연 결합된 조절 서열로부터 발현된다. 또는, 개개의 유전자를 효모 조절 인자에 결합시켜 발현 카세트를 형성할 수 있고, 다른 유전자를 각각 포함하는 전술한 카세트의 콘카터머(concatemer)를 YAC 중으로 삽입시킬 수 있다.
일부 경우에는 단편을 효모 게놈 중으로 병입시키고 셔플링을 사용하여 효모 균주를 개량시킬 수 있다. 다른 일부 경우에는, 단편을 셔플링 과정을 통해 YAC의 성분으로서 유지시키고, YAC 중에 목적 성질이 획득된 후에 목적 수용 세포로 전이시킨다.
a. 효모 균주를 개량하는 방법
YAC 벡터 중으로 단편을 클로닝하고, 얻은 YAC 라이브러리를 이용하여 컴피턴트 효모 세포를 형질전환시킨다. YAC를 포함하는 형질전환체를 YAC 상에 존재하는 양성 선택 마커에 대해 선택하여 동정한다. 이 세포를 회수한 다음 수집한다. 그 다음, 세포를 영양 배지에서 질소 및 탄소 제한 배지로 전이시켜 포자형성을 유도한다. 포자형성 과정 중에 세포는 감수분열한다. 그 다음 포자를 영양 배지로 복귀시켜 교배 유도한다. 경우에 따라, 포자를 용해시켜 교배를 자극할 수도 있다. 교배 결과, 상이한 삽입체를 보유하는 YAC 사이, 및 YAC와 천연 효모 염색체 사이에 재조합이 일어난다. YAC와 천연 효모 염색체 간의 재조합은 포자에 자외선 조사시 촉진될 수 있다. 재조합은 YAC 상의 단편에 의해 발현되는 유전자의 결과 또는 숙주 유전자와의 재조합 결과로서, 또는 이 두가지 모두의 결과로서 새로운 표현형을 형성할 수 있다.
YAC와 천연 효모 염색체간에 재조합을 유도한 후, YAC 상의 음성 선택 마커에 대하여 선택하여 YAC를 제거하기도 한다. 예컨대, 마커 URA3을 포함하는 YAC는 5-플루오로-오로트산을 포함하는 배지 상에서 전파하는 것에 대하여 선택할 수 있다. 유지되는 임의의 외인성 또는 변화된 유전자 물질은 천연 효모 염색체 중에 포함되어 있다. 경우에 따라, 천연 효모 염색체간의 재조합을 YAC 제거후 추가 실시할 수도 있다. 경우에 따라, 동일 또는 상이한 YAC 라이브러리를 이용하여 세포를 형질전환시킬 수 있고, 상기 단계를 반복한다.
YAC를 제거한 후 목적 성질이 얻어졌는지 효모를 선별 또는 선택한다. 이 성질은 전이된 단편에 의해 부여되는 새로운 성질, 예컨대 항생제 생성 등의 성질일 수 있다. 또한, 이 성질은 외인성 유전자를 발현 또는 분비하는 개선된 성질, 개선된 재조합원성, 개선된 온도 또는 용매 안정성 또는 상업적이나 연구용 효모 균주에 필요한 다른 성질일 수 있다.
선택/선별시 생존하는 효모 균주를 그 다음 재조합 단계로 더 처리한다. 재조합은 선택/선별시 생존하는 효모의 염색체간에만 일어날 수 있다. 또는, 단편의 라이브러리를 효모 세포로 도입시키고 전술한 바와 같이 내인성 효모 염색체와 재조합시킬 수 있다. 이 단편의 라이브러리는 전 재조합 단계에서 사용된 라이브러리와 동일하거나 상이할 수 있다. YAC는 전술한 바와 같이 제거한 다음, 다른 YAC 라이브러리로의 재조합 및/또는 형질전환 단계로 처리한다. 재조합 이후 전술한 바와 같이 추가 선택/선별 단계로 처리한다. 추가 재조합/선별 단계는 효모 균주가 개량되어 목적 성질을 얻을 때까지 필요한 만큼 실시할 수 있다.
YAC 라이브러리를 도입시켜 효모를 개량하기 위한 예시적인 개략도는 도 10에 도시하였다. 이 도면의 처음 부분은 내인성 이배체 게놈을 포함하는 효모와 서열의 변형체를 나타내는 단편의 YAC 라이브러리를 도시한 것이다. 이 라이브러리로 세포를 형질전환시켜 DNA 1 ㎍당 100개 내지 1000개의 콜로니를 얻는다. 따라서, 대부분의 형질전환된 효모 세포는 1개의 YAC 뿐만 아니라 내인성 염색체도 포함하게 된다. 질소 및 탄소 제한 배지에서 증식시켜 감수분열을 유도한다. 감수분열중에 YAC는 동일 세포 중의 다른 염색체와 재조합한다. 감수분열시 얻어지는 반수체 포자를 교배하면 복원된 이배체가 형성된다. 얻어진 이배체는 이중 일부가 내인성 염색체 유래이고 다른 일부가 YAC 유래인 재조합 염색체를 보유한다. 경우에 따라, YAC 상에 존재하는 음성 선택 마커에 대하여 선택하여 세포로부터 YAC를 제거할 수 있다. YAC가 선택 제거되는 것에 관계없이, 그 다음 목적 성질을 가진 세포를 선별 또는 선택한다. 선택/선별시 생존하는 세포를 다른 YAC 라이브러리로 형질전환시켜 다른 셔플링 주기를 개시할 수 있다.
b. 수용체 균주로 전이시키기 위한 YAC 개량 방법
이 방법은 부분적으로 복수의 YAC가 동일 효모 세포 중에 존재할 수 있다는 사실과 YAC-YAC 재조합이 일어난다는 공지 사실에 근거한 것이다[Green & Olson, Science 250, 94-98 1990]. YAC간 재조합은 >20 kb 단편에 상동성 유전자를 보유하고 있는 군을 생체내에서 셔플링할 수 있는 방식을 제공한다.
DNA 단편의 출발 집단은 서로 서열의 유사성을 나타내지만, 예컨대 유도성인 대립 형질 또는 종의 다양성으로 인해 서열이 상이하다. 종종 DNA 단편은 공통 경로에서 작용하는 복수 유전자를 암호하는 것으로 알려져 있거나 추정된다.
단편을 Yac에 클로닝하여, 효모를 형질전환시킨 다음, 보통 양성 선택하여 형질전환체를 얻는다. 이 형질전환체의 염색체를 감수 분열시켜 포자형성을 유도한다. 그 다음 세포를 교배한다. 얻어지는 이배체 세포 대부분은 각각 상이한 삽입체를 보유한 2개의 YAC를 운반한다. 이것을 다시 포자 형성시키고 교배한다. 얻어지는 세포는 재조합 서열의 YAC를 보유하게 된다. 그 다음, 이 세포 중 목적 성질을 갖는 것을 선별하거나 선택할 수 있다. 보통, 이와 같은 선택은 셔플링에 사용된 효모 균주 중에서 일어난다. 하지만, 셔플링되는 단편이 효모 중에서 발현되지 않는다면 YAC를 분리하여 YAC가 발현되는 적당한 세포 종류로 전이시킨 뒤 선별한다. 이러한 성질의 예로는 목적 화합물의 합성 또는 분해, 목적 유전자 생성물의 분비 증가 또는 다른 검출가능한 표현형을 포함한다.
선택/선별시 생존하는 세포는 목적 표현형이 얻어질 때까지 후속 수집, 포자형성, 교배 및 선택/선별 단계로 처리한다. 재조합은 영양 배지에서 탄소 및 질소 제한 배지로 세포를 전이시켜 포자 형성을 유도하고, 그 다음 포자를 영양 배지로 복귀시켜 교배를 유도하면 간단하게 실시될 수 있다. 포자를 용해하여 교배를 자극할 수도 있다.
목적 성질을 암호하도록 YAC를 개량한 후 YAC를 다른 세포 종류로 전이시킬 수 있다. 전이는 DNA 분리 및 재형질전환, 원형질 융합 또는 전기침투에 의해 일어날 수 있다. 예컨대 효모에서 포유류 세포로의 YAC 전이에 대해서는 문헌[Monaco & Larin, Trends in Biotechnology 12, 280-286(1994); Montoliu et al., Repro. Fertil. Dev. 6, 577-84(1994); Lamb et al., Curr. Opin. Genet. Dev. 5, 342-8(1995)].
효모 중의 YAC 단편 라이브러리를 셔플링하기 위한 예시적인 개략도는 도 11에 도시하였다. 유전자 변형체를 나타내는 YAC 단편의 라이브러리를 사용하여 이배체 내인성 염색체를 가진 효모를 형질전환시킨다. 이와 같이 형질전환된 효모를 단일 YAC 외에도 이배체 내인성 염색체를 보유하도록 지속시킨다. 이 효모를 감수분열과 포자형성을 진행하도록 유도한다. 이 포자는 반수체 게놈을 포함하는데, 일부는 내인성 효모 염색체만을 포함하고, 다른 일부는 효모 염색체와 YAC를 포함한다. 이 포자를 교배 유도하여 이배체 세포를 형성시킨다. 이배체 세포중 일부는 2개의 YAC를 보유하는 상이한 삽입체 뿐만 아니라 이배체 내인성 염색체를 포함하게 된다. 이 세포를 다시 감수분열과 포자형성하도록 유도한다. 2개의 YAC를 보유하는 세포에서 삽입체간에 재조합이 일어나고, 재조합된 YAC는 자낭세포로 분리된다. 따라서, 일부 자낭세포는 반수체 내인성 염색체 + 재조합 삽입체를 가진 YAC 염색체를 포함한다. 이 자낭 세포는 포자로 성숙하고, 이것을 다시 교배하면 이배체 세포가 형성된다. 일부 이배체 세포는 내인성 염색체의 이배체 보체 + 2개의 재조합 YAC를 포함한다. 이 세포를 그 다음 추가 감수 분열, 포자 형성 및 교배 단계로 처리할 수 있다. 각 단계에서, YAC 삽입체 간에 추가 재조합이 일어나 삽입체의 추가 재조합 형태가 얻어진다. 재조합 단계를 1회 이상 반복한 후, 세포가 목적 성질을 획득하였는지 시험할 수 있다. 그 다음 재조합과 선별의 후속 과정을 유사한 방식으로 실시할 수 있다.
c. 비관련 유전자를 클로닝하는데 사용되는 YAC의 용도
YAC의 셔플링은 특히 종마다 관련되어 있지 않으나 기능적으로 관련이 있는 유전자, 특히 동정되지 않은 유전자를 전이시키는데 이용하기 쉽다. 이러한 경우의 예는 여러 상업적으로 중요한 천연 생성물, 예컨대 탁솔을 들 수 있다. 대사 경로 중에 존재하는 유전자를 다른 미생물로 전이시키는 방법은 이와 같은 화합물을 천연적으로 생성하는 미생물이 대량 배양에 적합하지 않기 때문에 바람직하다.
이와 같은 유전자의 클러스터는 유용한 화합물을 생성하는 미생물 유래의 DNA의 총 게놈 라이브러리를 YAC 라이브러리에 클로닝하여 분리할 수 있다. 그 다음 YAC 라이브러리를 사용하여 효모를 형질전환시킨다. 효모를 포자형성시키고 교배하여 YAC 간에 및/또는 YAC와 천연 효모 염색체간에 재조합을 일으킨다. 그 다음 선택/선별을 실시한 후 목적하는 유전자 수집물을 발현시킨다. 이 유전자가 생합성 경로를 암호한다면, 그 경로에서 나타나는 생성물의 검출을 통해 발현을 확인할 수 있다. 이 경로에 존재하는 각 효소의 생성이나, 최종 발현 셍성물의 중간체 또는 이 중간체를 대사하는 세포의 능력은 합성 경로의 부분적 획득을 시사한다. 선택이나 선별에서 생존하는 세포 중으로 본래의 라이브러리 또는 상이한 라이브러리를 도입시킬 수 있고, 목적 대사 경로의 최종 생성물이 생성될 때까지 재조합 및 선택/선별 과정을 더 실시할 수 있다.
7. 접합 매개의 유전자 교환
접합은 여러 가지 방식으로 세포 게놈을 개량하는데 이용될 수 있다. 접합에 의한 DNA 전이는 세포가 접촉하는 동안 일어난다[Guiney(1993) in: Bacterial Conjugation(Clewell, ed., Plenum Press, New York), pp. 75-104; Reimann & Haas in Bacterial Conjugation(Clewell, ed., Plenum Press, New York 1993), at pp. 137-188(본 명세서에 참고 인용됨)]. 접합은 다양한 그람 음성 박테리아 및 일부 그람 양성 박테리아 간에 일어난다. 또한, 접합 전이는 박테리아와 식물 세포(아그로박테리움 튜머페이션스) 또는 효모간의 전이가 알려져 있다. 동시계류중인 출원(대리인 관리 번호 16528J-014612)에 논의되고 있는 바와 같이, 접합 전이에 주요 역할을 하는 유전자는 그 전이가 일어날 수 있는 세포 종류의 범위를 확대(예컨대, 박테리아에서 포유류로)시키는 개량이 실시될 수 있다.
접합 전이는 전이 기원(oriT)과 인접 유전자(MOB A, B 및 C) 및 접합을 일으키기에 필수적인 효소와 구조체를 암호하는 tra라고 하는 15개 내지 25개의 유전자에 의해 실시된다. 전이 오리진은 DNA 전이가 시스형으로 요구되는 부위를 의미한다. tra 유전자로는 traA, B, C, D, E, F, G, H, I, J, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, U, V, W, X, Y, Z, vir AB(대립형질 1 내지 11), C, D, E, G, IHF 및 FinOP를 포함한다. 이 유전자는 oriT에 대해 시스형이나 트란스형으로 발현될 수 있다. 기타 다른 세포 효소, 예컨대 RecBCD 경로 중의 효소, RecA, SSB 단백질, DNA 자이라제, DNA polI 및 DNA 리가제 등은 접합 전이에 관여하는 효소이다. RecBCD 대신에 recE 또는 recF 경로를 사용할 수도 있다.
tra 유전자에 의해 암호되는 1가지 구조 단백질은 세포 표면에서 돌출하는 단일 폴리펩티드의 응집물로 제조된 필라멘트인 성선체이다. 성선체는 수용체 세포 상의 다당류에 결합하고 DNA가 이동할 수 있는 접합 가교를 형성한다. 이 과정은 MOB 유전자에 의해 암호화되고 전이될 DNA를 oriT에서 특이적으로 절단하는 부위 특이적 뉴클레아제를 활성화시킨다. 이 절단된 DNA는 그 다음 다른 tra 효소의 작용에 의하여 접합 가교를 통해 이동된다.
이동성 벡터는 에피솜 형태로 존재하거나 염색체에 통합될 수 있다. 에피솜 이동성 벡터는 벡터에 삽입된 단편을 세포간에 교환하는데 사용할 수 있다. 통합된 이동성 벡터는 염색체로부터 인접 유전자를 이동시키는데 사용할 수 있다.
a. 게놈 DNA의 교환을 촉진시키는데 사용되는 통합된 이동성 벡터의 용도
이.콜리의 F 플라스미드는 높은 빈도로 염색체 중으로 통합되고 통합 부위로부터 단일 방향으로 유전자를 이동시킨다[전술한 Clewell, 1993 문헌; Firth et al., in Escherichia coli and Salmonella Cellular and Molecular Biology 2, 2377-2401(1996); Frost et al., Microbiol.Rev. 58, 162-210(1994)]. 다른 이동성 벡터는 고효율로 숙주 염색체 중으로 자발적으로 통합되지 않으나, 특정 조건하에 증식시키면 통합 유도될 수 있다(예컨대, 돌연변이제로 처리하고, 플라스미드 복제가 허용되지 않는 온도에서 증식)[Reimann & Hass in Bacterial Conjugation(ed. Clewell, Plenum Press, NY 1993), Ch 6]. 특히 바람직한 것은, 숙주 범위가 광범위한 것을 특징으로 하는 접합 플라스미드의 IncP 군이다(전술한 Clewell, 1993 문헌 참조).
이.콜리의 F 인자와 같은 접합 플라스미드가 염색체에 삽입된 공여체 "웅성" 박테리아는 F가 없는(F-) 수용체 "자성" 장내 박테리아로 염색체 DNA를 효과적으로 제공할 수 있다. 공여체로부터 수용체로의 접합 전이는 oriT에서 개시된다. 수용체로 틈(nick)이 있는 1본쇄의 전이는 직렬 염색체 카피를 이동시키는 회전 순환 기작에 의해 5'에서 3' 방향으로 일어난다. 수용체로 유입시 공여체 가닥은 불연속적으로 복제된다. 선상의 1본쇄 공여체 DNA 가닥은 수용체내에서 recA를 매개로 한 동종 재조합을 개시시킬 수 있는 강력한 기질이다. 공여체 가닥과 수용체 염색체 간의 재조합은 공여체 형질을 유전시킨다. 따라서, F의 염색체 카피를 보유하는 균주는 Hfr(고빈도 재조합)이라 표시한다[Low, 1996 in Escherichia coli and Salmonella Cellular and Molecular Biology Vol.2, pp. 2402-2405; Sanderson, in Escherichia coli and Salmonella Cellular and Molecular Biology 2, 2406-2412(1996)].
통합된 이동성 벡터를 보유한 균주가 염색체 DNA를 전이시키는 성질은 박테리아 집단 간에 유전자 물질을 교환시키는 신속하고 효과적인 수단을 제공하여 양성 돌연변이를 조합하고 음성 돌연변이를 희석시킬 수 있다. 이와 같은 셔플링 방법은 일반적으로 최소한 약간의 유전자 다양성을 포함하는 통합된 이동성 벡터를 가진 일군의 균주를 사용하여 개시한다. 유전자 다양성은 자연적 변화의 결과이거나, 돌연변이제 노출이나 단편 라이브러리 도입의 결과일 수 있다. 세포 집단은 유전자 교환, 재조합 및 재조합 유전자의 발현이 일어나도록 선택없이 배양한다. 그 다음 이 세포를 목적 성질이 개량되었는지에 대해 선별 또는 선택한다. 선택/선별시 생존하는 집단을 HFR 매개의 유전자 교환이나 다른 방법으로 추가 셔플링시킬 수 있다.
Hfr 및 접합 전이의 수용체로서 통합된 mob 벡터를 가진 다른 균주의 천연 효율은 여러가지 방법으로 개선될 수 있다. 천연 HFR 균주의 수용체 효율이 비교적 낮은 것은 F의 traS 및 traT 유전자 생성물 때문이다[전술한 Clewell, 1993 참조; 전술한 Firth et al., 1996 문헌; 전술한 Frost et al., 1994; Achtman et al., J. Mol. Biol. 138, 779-795(1980)]. 이 생성물은 각각 F+균주의 내막 및 외막에 위치하여, DNA를 제공할 수 있는 두 균주 간에 풍부한 교배를 억제하는 작용을 한다. traS 및 traT의 효과 및 다른 균주들에 존재하는 동족 유전자의 효과는 이 효소들을 발현할 수 없는 녹아웃 세포를 사용하여 제거하거나 탄소 제한 배지에서 세포를 전파시켜 감소시킬 수 있다[Peters et al., J.Bacteriol., 178, 3037-3043(1996)].
일부 방법에서, 출발 세포 집단은 여러 게놈 부위에 이동성 벡터가 통합되어 있는 경우도 있다. oriT의 방향성 전이는 oriT에 근접한 형질 유전의 빈도를 증가시키는 것이 일반적이다. 그 이유는 교배 쌍이 파괴되기 쉬워 해리하기 쉽고(특히 액체 배지 중에서), 결국 전이가 중단되기 때문이다. 여러 부위에 이동성 벡터가 통합되어 있는 세포의 집단인 경우, 염색체 교환은 보다 무작위 방식으로 일어난다. Hfr 균주의 키트는 이.콜리 유전자 스톡 센터 및 살모넬라 유전자 스톡 센터로부터 입수 용이하다[전술한 Frost et al., 1994 참조]. 또는, oriT를 보유하는 트란스포손을 사용한 삽입 돌연변이유발에 의해 oriT를 무작위 부위와 배향으로 보유한 균주의 라이브러리를 얻을 수 있다. 트란스포손계 oriT 부위로부터 이동시키기 위한 전이 기능은 헬퍼 벡터에 의해 제공될 수 있다.
경우에 따라, 통합된 이동성 벡터를 보유한 균주는 부정합 수복 유전자가 결손되어 있는 경우도 있다. 서열 이종성으로 일어나는 공여체 형질의 유전성은 메틸 유래의 부정합 수복계가 없는 균주인 경우 증가한다.
DNA가 20% 정도 상이한 이.콜리 및 살모넬라 티피뮤리엄과 같은 종 사이의 유전자간 접합 전이는 수용체 균주가 mutH, mutL 또는 mutS인 경우 가능하다[Rayssigueir et al., Nature 342, 396-401(1989)]. 이와 같은 전이를 사용하면 다음 예를 통해 관찰되는 바와 같이 여러 부위에서의 재조합을 얻을 수 있다.
본 예에서는 지도 위치 0에 마커 thr557, 33 min에 pyrF2690, 62 min에 serA13 및 43 min에 hfrK5를 보유한 살모넬라 티피뮤리엄 Hfr 공여체 균주를 이용한다. MutS +/-, F-이.콜리 수용체 균주는 21 min에 마커 pyrD68, 51 min에 aroC355, 85 min에 ilv3164 및 59 min에 mutS215를 보유하고 있다. 3중 영양요구성 살모넬라 티피뮤리엄 Hfr 공여체 및 동유전자형의 mutS +/- 3중 영양요구성 이.콜리 수용체를 3 ㎖의 LB 배지에 접종하고 완전 증식할 때까지 37 ℃에서 진탕한다. 공여체와 각 수용체 100 ㎕를 새로운 LB 배지 10 ㎖에 혼합하고, Nalgene 250 ㎖ 재활용가능한 여과 장치를 사용하여 멸균 밀리포어 0.45 μM HA 여과기에 침적시켰다. 공여체와 수용체를 각각 유사하게 희석하고 변환을 조사하기 위하여 침적시켰다. 세포를 보유한 여과기를 LB 아가 평판의 표면 상에 세포면이 위를 향하게 놓고 37 ℃에서 하룻밤 동안 항온배양하였다. 여과기는 멸균 핀셋을 사용하여 분리하여, 최소 염 배지 5 ㎖를 함유하는 멸균 50 ㎖ 튜브에 넣었다. 강력하게 교반하여 여과기로부터 세포를 세척하였다. 공여체 및 수용체 대조물 뿐만 아니라 교배 혼합물 100 ㎕를 생세포 계수를 위하여 LB에 도말하고, 단독 재조합체 계수를 위해 3가지 수용체 필요 성분 중 2가지가 보충된 최소 글루코스 배지, 2중 재조합체 계수를 위해서는 3가지 필요 성분 중 1가지가 보충된 최소 글루코스 배지, 또는 3중 재조합체 계수를 위해 3가지 필요 성분이 전혀 첨가되지 않은 최소 글루코스 배지에 도말하였다. 이 평판을 37 ℃에서 48 시간 동안 항온배양하고, 그 후 콜로니를 계수하였다.
배지 재조합체 재조합체 CFU/총 CFU mutS-/mutS+
보충물 유전자형 mutS+ mutS-
Aro + Ilv pyr+aro-ilv- - - -
Aro + Ura pyr-aro-ilv+ 1.2 x 10-8 2.5 x 10-6 208
Ile + Ura pyr-aro+ilv- 2.7 x 10-8 3.0 x 10-6 111
Aro pyr+aro-ilv+ - - -
Ilv pyr-aro+ilv+ - - -
Ura pyr+aro+ilv+ <10-9 <10-9
무첨가
Aro = 방향족 아미노산 및 비타민Ilv = 분지쇄 아미노산Ura = 우라실
이 데이터는 Hfr 교배를 사용하여 재조합체를 적당한 빈도로 형성시킬 수 있음을 시사하고 있다. 유전자간 재조합은 메틸 유래의 부정합 수복이 결손형인 수용체에서 100 내지 200 배 향상된다.
b. 접합에 의한 단편의 도입
이동성 벡터는 개량될 세포 중으로 단편 라이브러리를 전이시키는데에도 사용될 수 있다. 이 시도는 개량될 세포가 단편 라이브러리로 직접 효과적으로 형질전환될 수 없으나 단편 라이브러리로 형질전환될 수 있는 원시 세포와 접합할 수 있는 경우에 특히 유용하다.
숙주 세포 중으로 도입될 DNA 단편은 숙주 세포 게놈에 비해 다양성을 포함한다. 다양성은 천연 다양성의 결과이거나 돌연변이유발의 결과일 수 있다. 이 DNA 단편 라이브러리를 전이의 오리진을 가진 이동성 벡터 중으로 클로닝한다. 또한, 이와 같은 벡터 일부는 mob 유전자를 포함하는데, 이 작용기들은 트란스로 제공될 수도 있다. 이 벡터는 원시 세포와 목적 숙주 세포간에 효과적으로 접합 전이할 수 있어야 한다. 또한, 이 벡터는 선택성 표현형을 부여해야 한다. 이 표현형은 개량되는 표현형과 동일하거나 또는 약물 내성 마커와 같은 마커에 의해 부여될 수 있다. 이 벡터는 목적 숙주 세포 중에서 자가 제거되어 클로닝된 단편이 중복되기 보다는 숙주의 상동성 단편과 유전자 교환된 세포를 선택할 수 있는 것이 바람직하다. 이것은 목적하는 숙주 유형에서 기능적인 복제 오리진이 결실된 벡터를 사용하거나 벡터에 음성 선택 마커를 병입시켜 실시할 수 있다.
1가지 적합한 벡터는 문헌[Simon et al., Bio/Technology 1, 784-791(1983); TrieuCuot et al., Gene 102, 99-104(1991); Bierman et al., Gene 116, 43-49(1992)]에 개시되어 있는 숙주 범위가 넓은 접합 플라스미드이다. 이 플라스미드를 사용하여 이.콜리를 형질전환시킬 수 있고, 그 다음 화학적 또는 전기적 컴피턴스 유도에 의해 형질전환시키기가 어렵거나 불가능한 박테리아를 강제 교배시킬 수 있다. 이 플라스미드는 IncP 플라스미드의 오리진, oriT를 포함한다. 이동 기능은 필수 유전자의 염색체 통합된 카피에 의해 트란스형으로 공급된다. DNA의 접합 전이는 일부 경우 수용체(그람 양성인 경우)를 준억제 농도의 페니실린으로 처리하여 보조할 수 있다[Trieu-Cuot et al., 1993 FEMS Microbiol. Lett. 109, 19-23].
라이브러리 단편과 대립형질의 교환이 일어난 세포는 목적 표현형이 개량되었는지 선별 또는 선택할 수 있다. 접합 전이 단계를 반복하여 후속 재조합 과정을 반복할 수 있다. 단편의 라이브러리는 이전 선택/선별 과정에서 생존한 세포 중 일부(전부는 아님)에서 얻거나 새로운 것일 수 있다. 접합 매개의 셔플링은 다른 셔플링 방법과 조합할 수 있다.
8. 형질도입 파지에 의해 촉진되는 유전자 교환
형질도입은 바이러스 외피 내에 존재하는 비바이러스 유전자 물질이 제1 세포에서 제2 세포로 전이되는 것이다[Masters, in Escherichia coli and Salmonella Cellular and Molecular Biology 2, 2421-2442(1996)]. 가장 바람직한 일반 형질도입 파지의 예는 각각 이.콜리 및 살로넬라 티피뮤리엄의 박테리오파지 P1 및 P22이다. 일반적인 형질도입 박테리오파지 입자는 숙주(공여체로서 작용)의 바이러스 게놈 크기의 2본쇄 단편이 파지 두부(head)로 포장되는 경우 용균 감염 동안 저빈도로 형성된다. 서열 특이성이 적은 DNA를 효과적으로 포장하는 박테리오파지 P22의 고형질도입(HT) 돌연변이체를 우연히 분리하였다. 감수성 숙주를 감염시킨 결과 파지의 최대 50%가 형질도입 입자인 용균물이 얻어졌다. 일반 형질도입 입자가 감수성 수용체 세포로 흡착되면 공여체의 염색체 단편이 주입된다. 공여체 단편의 주입 후 RecA 매개의 상동성 재조합을 통해 공여체 형질이 유전된다.
일반 형질도입 파지는 유전자 다양성을 보유하고 파지 감염성이 민감한 세포 집단 간에 유전자 물질을 교환시키는데 사용할 수 있다. 유전자 다양성은 세포간 자연적인 변화, 세포의 유도성 돌연변이 또는 세포에 단편 라이브러리의 도입 결과로 얻어질 수 있다. DNA는 그 다음 일반 형질도입에 의해 세포간에 교환된다. 파지가 세포 용균을 일으키지 않는 경우에는 파지가 존재하여도 전 세포 집단은 전파될 수 있다. 파지가 용균 감염을 일으키는 경우, 전체 세포 집단은 파지 존재하에 전파될 수 있다. 파지가 용균 감염을 일으키는 경우, 분할 수집 방법에 근거하여 형질도입을 실시한다. 즉, 출발 세포 집단을 2개로 나눈다. 1개의 아집단을 사용하여 형질도입 파지를 제조한다. 이 형질도입 파지를 가지고 다른 아집단을 감염시킨다. 감염은 세포당 높은 다중도의 파지로 실시하여 감염되지 않은 것이 거의 없도록 하는 것이 바람직하다. 감염에서 생존한 세포를 전파시키고 목적 성질이 개량되었는지 선별하거나 선택한다. 선별/선택시 생존한 세포의 수집물을 그 다음 추가의 일반 형질도입 방법이나 다른 셔플링 방법으로 셔플링할 수 있다.
이 방법의 효율은 감염성(비형질도입) 파지에 의한 세포 감염을 감소시키고 용해소원 형성을 감소시켜 세포의 감염성을 줄여 증가시킬 수 있다. 감염성 파지에 의한 세포 감염은 2가 양이온의 킬레이터, 예컨대 구연산염 및 EGTA를 배양액에 첨가하여 실시할 수 있다. 2가 양이온은 파지 흡수에 필요한 바, 킬레이트제를 첨가하면 원하지 않는 감염을 예방할 수 있게 된다. 일반 형질도입 파지의 통합 결손형(int-) 유도체는 용해소원 형성을 억제하는데 사용할 수 있다. 또 다른 변형예로서, 부정합 수복 유전자가 결손된 숙주 세포를 사용하면 형질도입된 DNA와 게놈 DNA간의 재조합을 증가시킬 수 있다.
V. 반복적 서열 재조합 방법
때로 DNA 셔플링(shuffling) 또는 분자 교배(breeding)라고도 부르는 반복적 서열 재조합의 일부 방식과 예에 대해서는 동시 계류중인 1996.3.25 출원된 대리인 관리번호 16528A-014612, 1995.2.17에 출원된 PCT/US95/02126(WO95/22625); 문헌[Stemmer, Science 270:1510(1995); Stemmer et al., Gene 164:49-53(1995); Stemmer, Bio/Technology 13:549-553(1995); Stemmer, Proc.Natl.Acad.Sci. U.S.A. 91:10747-10751(1994); Stemmer, Nature 370:389-391(1994); Crameri et al., Nature Medicine 2(1):1-3(1996); Crameri et al., Nature Biotechnology 14:315-319(1996)]에 본 발명자들과 동료들에 의해 설명된 바 있으며, 상기 공보 및 문헌은 모두 본 명세서에 참고 문헌으로 인용하였다.
(1) 시험관내 방식
시험관내에서 셔플링을 실시하는 1가지 방식을 도 1에 도시하였다. 재조합의 초기 기질은 관련 서열의 수집물이다. 도 1의 패널 A에 도시된 X는 서열이 상이한 경우를 나타내는 것이다. 이 서열은 DNA 또는 RNA일 수 있고, 재조합 또는 재어셈블리될 유전자 또는 DNA 단편의 크기에 따라 길이가 다양할 수 있다. 이 서열의 길이는 50 bp 내지 50 kb인 것이 바람직하다.
관련 기질의 푸울을 도 1의 패널 B에 도시된 바와 같이, 예컨대 약 5 bp 내지 5 kb 또는 그 이상인 중복 단편으로 변환시킨다. 이 단편의 크기는 약 10 bp 내지 1000 bp인 것이 일반적하고, 때로 DNA 단편의 크기가 약 100 bp 내지 500 bp인 경우도 있다. 변환은 DNAseI이나 RNAse 분해, 무작위 전단이나 부분 제한 효소 분해와 같은 다양한 방법으로 실시할 수 있다. 또는, 기질의 불완전 PCR 증폭 또는 단일 프라이머 개시하는 PCR를 사용하여 기질을 단편으로 변환시킬 수 있다. 특정 길이와 서열의 핵산 단편의 농도는 종종 총 핵산의 0.1 중량% 또는 1 중량% 미만이다. 혼합물내 존재하는 여러 특정 핵산 단편의 수는 최소 약 100개, 500개 또는 1000개 이상인 것이 보통이다.
핵산 단편의 혼합물은 최소한 부분적으로 1본쇄 형태로 변환시킨다. 변환은 약 80 ℃ 내지 100 ℃, 보다 바람직하게는 90 ℃ 내지 96 ℃로 가열하여 1본쇄 핵산 단편화한 뒤 재어닐링할 수 있다. 또한, 변환은 1본쇄 DNA 결합 단백질이나 recA 단백질로 처리하려 실시할 수 있다. 다른 1본쇄 핵산 단편과 서열 동일성이 있는 영역을 가진 1본쇄 핵산 단편은 20 ℃ 내지 75 ℃, 바람직하게는 40 ℃ 내지 65 ℃로 냉각시켜 재어닐링시킬 수 있다. 복원은 폴리에틸렌 글리콜("PEG") 또는 다른 부피가 크지 않은 시약이나 염을 첨가하여 가속화할 수 있다. 염의 농도는 0 mM 내지 200 mM인 것이 바람직하고, 특히 10 mM 내지 100 mM인 것이 보다 바람직하다. 염은 KCl 또는 NaCl과 같은 염일 수 있다. PEG의 농도는 0% 내지 20% 범위, 보다 바람직하게는 5% 내지 10%가 좋다. 재어닐링하는 단편은 도 1의 패널 C에 도시된 바와 같이 상이한 기질로부터 유래될 수 있다. 어닐링된 핵산 단편은 Taq 또는 클리나우와 같은 핵산 폴리머라제, 또는 pfu나 pwo와 같은 프루프리딩 폴리머라제 및 dNTP(즉, dATP, dCTP, dGTP 및 dTTP)의 존재하에 항온배양한다. 서열 동일성의 영역이 큰 경우에는 45 내지 65 ℃의 어닐링 온도에서 Taq 폴리머라제를 사용할 수 있다. 동일성의 영역이 작다면 클리나우 폴리머라제를 20 내지 30 ℃의 어닐링 온도에서 사용할 수 있다(Stemmer, Proc.Natl.Acad.Sci. USA 1994). 폴리머라제는 어닐링 이전에, 어닐링과 동시에 또는 어닐링 후에 무작위 핵산 단편에 첨가할 수 있다.
변성, 복원 및 폴리머라제 존재하에 중복 단편의 항온처리의 사이클은 시험관내 핵산의 "셔플링(shuffling)"이라고 부른다. 이 사이클은 바람직한 횟수만큼 반복한다. 그 횟수는 2 내지 100회 반복하는 것이 바람직하고, 특히 10 내지 40회 반복하는 것이 바람직하다. 최종 핵산은 도 1의 패널 D에 도시된 바와 같이 약 50 bp 내지 약 100 kb, 바람직하게는 500 bp 내지 50 kb인 2본쇄 폴리뉴클레오티드 군이다. 이 핵산 군은 실질적으로 서열이 동일하지만 여러 위치에서 상이한 출발 기질의 변형체로서, 출발 기질보다 더 많은 구성원을 포함한다. 셔플링에 의해 얻어지는 단편의 군을 사용하여, 경우에 따라 벡터에 클로닝한 후 숙주 세포를 형질전환시킨다.
시험관내 셔플링의 변형예로서, 재조합 기질의 준서열은 불완전하게 신장된 증폭 생성물의 실질적인 분획을 보통 최소 20% 또는 그 이상 생성하는 조건하에서 총 길이 서열을 증폭시켜 생성할 수 있다. 그 결과 불완전하게 신장된 증폭 생성물을 비롯한 증폭 생성물을 변성시키고 재어닐링 및 증폭 사이클을 1회 이상 반복 처리한다. 이와 같이 1회 이상의 재어닐링 및 증폭 사이클을 통해 불완전하게 신장된 생성물의 실질적인 분획을 제공하는 변형예는 "스터터링(stuttering)"이라고 부른다. 불완전하게 신장된 생성물은 후속 증폭 단계를 통해 재어닐링하고 다른 서열 관련 주형 종류 상에서 신장 반응을 개시한다.
다른 변형예로서, 단편의 혼합물에 1종 이상의 올리고뉴클레오티드를 스파이크 처리한다. 이 올리고뉴클레오디트는 야생형 서열에 소정의 돌연변이를 포함하거나 개체나 종간의 자연 변형의 부위를 포함하도록 디자인할 수 있다. 또한, 이 올리고뉴클레오티드는 이 돌연변이나 변형 부위에 인접하게 충분한 서열이나 구조의 상동성을 보유하여 야생형 단편과 어닐링할 수도 있다. 일부 올리고뉴클레오티드는 무작위 서열일 수 있다. 어닐링 온도는 상동성의 길이에 따라 조정할 수 있다.
또 다른 변형예로서, 예컨대 1가지 주형 유래의 DNA 단편을 관련성은 있지만 상이한 주형의 상동성 위치에 프라이밍하는 경우와 같이 주형 전환을 통해 1회 이상의 사이클을 통해 재조합시킨다. 주형 전환은 증폭 혼합물에 recA, rad51, rad55, rad57 또는 다른 폴리머라제(예컨대, 바이러스 폴리머라제, 역전사효소)를 첨가하여 유도할 수 있다. 또한, 주형 전환은 DNA 주형 농도를 증가시켜 향상시킬 수 있다.
또 다른 변형예로서, 길이가 다양한 관련 서열의 중첩성 1본쇄 DNA 단편 수집물을 사용하여 1회 이상의 증폭 사이클을 실시할 수 있다. 단편은 M13과 같은 1본쇄 DNA 파지를 사용하여 제조할 수 있다. 각 단편은 수집물의 제2 단편에 하이브리드하여 제2 단편의 폴리뉴클레오티드 사슬 신장 반응을 개시시킴으로써 서열 재조합된 폴리뉴클레오티드를 형성할 수 있다. 또 다른 변형으로서, 가변 길이의 1본쇄 DNA 단편은 제1 DNA 주형상에서 Vent 또는 다른 DNA 폴리머라제에 의해 단일 프라이머로부터 생성시킬 수 있다. 이 1본쇄 DNA 단편은 우라실을 함유하는 환상의 1본쇄 DNA로 구성되는 제2의 쿤켈(Kunkel)형 주형에 대한 프라이머로서 사용한다. 결과적으로 제1 주형이 제2 주형으로 복수 치환된다[Levichkin et al., Mol. Biology 29:572-577(1995)].
(2) 생체내 방식
(a) 플라스미드-플라스미드 재조합
재조합의 1차 기질로서 유전자의 변형 형태를 포함하는 폴리뉴클레오티드의 수집물을 사용한다. 이 변형 형태는 보통 기질 간에 동종 재조합을 일으키기에 충분한 실질적인 서열 동일성을 서로 나타낸다. 폴리뉴클레오티드 간 다양성은 천연적(예, 대립형질 변형체 또는 종 변형체), 유도적(예, 잘못이 있는 PCR) 또는 시험관내 재조합의 결과일 수 있다. 또한, 다양성은 천연 단백질을 암호하는 유전자를 대체 코돈 및/또는 혼합 코돈을 이용하여 재합성하므로써 얻을 수 있다. 이 때, 기질 간에는 최소한 충분한 다양성이 존재하여 재조합을 통해 출발 물질에서 보다 많은 다양한 생성물을 생성할 수 있어야 한다. 또한, 2개 이상의 기질은 최소 2개의 위치가 상이해야만 한다. 하지만, 보통 구성원이 103내지 108인 기질의 라이브러리를 이용한다. 다양도는 재조합되는 기질의 길이와 개량되는 기능적 변화의 정도에 따라 달라진다. 다양성은 0.1 내지 50% 사이의 위치에 존재하는 것이 일반적이다. 상이한 기질을 플라스미드 중으로 도입시킨다. 이 때 플라스미드로는 박테리아 다중카피 플라스미드와 같은 표준 클로닝 벡터가 보통 사용된다. 하지만, 하기 기재되는 일부 방법에서 플라스미드는 이동성 기능을 포함한다. 기질은 동일 플라스미드 또는 다른 플라스미드에 첨가할 수 있다. 2 종류 이상의 벡터를 함유하는 세포를 선택할 수 있도록 상이한 선택성 마커를 가진 2종 이상의 상이한 플라스미드를 사용하기도 한다. 또한, 상이한 유형의 플라스미드가 사용되는 경우 이 상이한 플라스미드는 2개의 다른 불화합성 군에서 선택하면 세포 중에 2개의 상이한 플라스미드를 안정하게 공존시킬 수 있다. 그럼에도 불구하고 동일한 불화합성 군 유래의 플라스미드는 동종 재조합이 일어나기에 충분한 시간동안 동일 세포내에서 공존시킬 수 있다.
먼저, 상이한 기질을 함유하는 플라스미드는 임의의 형질감염 방법(예컨대, 화학적 형질전환, 천연 적응, 전기침투, 바이러스 형질도입, 바이오리스틱스)으로 세포 중에 도입시킨다. 이 플라스미드는 종종 포화 농도(최대 형질감염능과 관련됨)로 제공되거나 거의 포화 농도로 제공하여 1개 이상의 플라스미드가 동일 세포로 유입될 가능성을 증가시킨다. 다양한 기질을 포함하는 플라스미드는 동시에 또는 다단계로 형질감염시킬 수 있다. 예컨대, 다단계 방법의 경우 세포는 1차 플라스미드 일정량으로 형질감염시키고, 형질감염체를 선택하여 전파시킨 다음, 2차 플라스미드 일정량으로 형질감염시킨다.
세포에 플라스미드가 도입되면, 세포를 단지 전파시키므로써 상이한 복수의 플라스미드를 함유하는 세포 중에서 재조합 유전자를 생성하기 위한 기질간 재조합이 일어난다. 하지만, 단지 1개의 플라스미드를 수용한 세포는 재조합에 관여할 수 없고, 그러한 플라스미드 상에 존재하는 기질에 의한 가능한 개량성은 완전하게 이용되지 않는다(하지만, 이 플라스미드들은 돌연변이 세포 중에서 전파되는 경우 또는 점 돌연변이(즉, 자외선 처리를 통해)가 축적되는 경우 어느 정도로 관여할 수 있다). 개량율은 모든 기질이 재조합에 관여하도록 함으로써 증가시킬 수 있다. 이것은 형질감염된 세포를 전기침투시켜 실시할 수 있다. 전기침투의 조건은 외인성 DNA를 세포 중으로 도입시키는데 종래 사용된 조건과 동일하다(예, 1000 내지 2500 볼트, 400 μF 및 1 내지 2 mM 갭). 이와 같은 조건 하에서, 플라스미드는 모든 기질이 재조합에 관여하도록 세포 간에 교환된다. 또한, 재조합 생성물은 추가로 서로 재조합되거나 본래의 기질과 재조합될 수 있다. 또한, 개량율은 접합 전이법을 이용하여 증가시킬 수 있다. 접합 전이계는 많은 박테리아에서 알려져 있고(이.콜리, P.아에루기노사, S.뉴모니아 및 H.인플루엔자), 박테리아와 효모간이나 박테리아와 포유류 세포간에 DNA를 전이시키는데 사용할 수 있다.
접합 전이법을 이용하고자 하는 경우 기질은 MOB 유전자를 가진 플라스미드 중으로 클로닝할 수 있으며, tra 유전자는 MOB 유전자에 대해 시스 또는 트란스로 제공한다. 접합 전이법의 효과는 세포간에 플라스미드를 이동시키고, 상기 재조합 생성물과 임의의 기질간에 재조합이 단지 배양물을 전파시킴으로써 실시될 수 있다는 점에서 전기침투와 매우 유사하다. 이와 같은 벡터 중에서 접합 전이법이 사용되는 방식에 대한 설명은 이하에 상세히 기재하겠다. 또한, 개량율은 세포를 융합시켜 플라스미드 또는 염색체 교환을 유도하므로써 증가시킬 수 있다. 융합은 PEG와 같은 화학제 또는 인플루엔자 바이러스 헤마글루티닌, HSV-1 gB 및 gD와 같은 바이러스 단백질을 사용하여 유도할 수 있다. 또한, 개량율은 돌연변이 숙주 세포(예컨대, Mut L, S, D, T, H 박테리아 및 모세혈관확장성운동실조증 인간 세포주)를 사용하여 증가시킬 수 있다.
세포가 전파되고 재조합이 일어나는 시간은 세포 종류에 따라 물론 다르지만, 일반적으로 작은 재조합도를 통해서도 출발 물질에 대한 다양성을 실질적으로 증가시킬 수 있기 때문에 중요한 것은 아니다. 재조합 유전자를 포함하는 플라스미드를 보유한 세포는 목적 기능에 대해 선별하거나 선택한다. 예컨대, 개량되는 기질이 약물 내성 유전자를 포함한다면 선택은 내약성에 대하여 실시한다. 선별이나 선택에서 생존하는 세포는 선별/선택과 후속 재조합을 1회 이상 반복하거나 추가 재조합 과정으로 직접 처리할 수 있다.
후속 재조합 과정은 이전 과정과 달리 여러가지 상이한 방식으로 실시할 수 있다. 예컨대, 단순히 전술한 바와 같은 플라스미드의 전기침투 또는 접합 매개의 세포내 전이를 재개하여 추가 재조합을 실시할 수 있거나, 또는 이전 기질과 동일하거나 상이한 새 기질을 사용하여 상기 선택/선별에서 생존한 세포를 형질감염시킬 수도 있다. 선택적으로, 새 기질은 본래의 플라스미드와 다른 불화합성 군 유래이고(또는) 상이한 선택성 마커를 보유하는 플라스미드 벡터에 병입시킨다. 다른 양태로서, 선택/선별에서 생존한 세포는 2가지 아집단으로 분류할 수 있고, 1가지 아집단에서 얻은 플라스미드 DNA로 다른 아집단에서 얻은 플라스미드 DNA를 형질감염시키면 두 아집단의 플라스미드 유래의 기질은 추가 재조합이 일어난다. 이 2가지 방법 중 어느 방법에서든지 개량율은 전술한 바와 같이 DNA 추출, 전기침투, 접합 또는 돌연변이 세포를 이용하면 증가될 수 있다. 또 다른 변형예로서, 선별/선택에서 생존한 세포 유래의 DNA를 추출한 뒤 시험관내 반복적 서열 재조합을 실시할 수도 있다.
2차 재조합 후 2차 선별/선택을, 바람직하게는 엄중도가 증가된 조건하에서 실시한다. 필요하다면, 추가 재조합과 선별/선택을 2차 시기의 경우와 동일한 전략으로 실시할 수 있다. 재조합 및 선택/선별을 연속 실시함으로써 생존한 재조합 기질은 개량되어 목적하는 표현형을 얻게 된다. 일반적으로, 이와 같은 반복적 재조합 방법과 기타 다른 방법에서 목적하는 표현형을 획득한 최종 재조합 생성물은 출발 기질과 위치 0.1% 내지 25%에서 상이하고 개량율도 선천성 획득 돌연변이율인 세대당 10-9위치당 약 1개의 돌연변이[Anderson et al., Proc.Natl.Acad.Sci. U.S.A. 93:906-907(1996)]로 나타나는 개량율보다 훨씬 큰 등급(예컨대, 최소 10배, 100배, 1000배 또는 10000배)으로 개량되었다.
(b) 바이러스-플라스미드 재조합
또한, 플라스미드-플라스미드 재조합에 사용된 전략은 바이러스-플라스미드 재조합, 보통 파지-플라스미드 재조합에도 사용할 수 있다. 하지만, 바이러스의 이용에 특별한 몇몇 부가 설명도 적당하다. 재조합의 초기 기질은 플라스미드 및 바이러스 벡터 모두에 클로닝된다. 일반적으로, 어떤 기질이 바이러스 벡터에 삽입되어야 하고 플라스미드에 삽입되어야 하는지는 중요하지 않지만 바이러스 벡터는 플라스미드는 다른 기질을 병입시키는 것이 좋다. 전술한 바와 같이 플라스미드(및 바이러스)는 선택성 마커를 포함하는 것이 일반적이다. 플라스미드 및 바이러스 벡터는 전술한 바와 같이 형질감염을 통해 세포 중으로 도입시킬 수 있다. 하지만, 보다 효과적인 절차는 세포를 플라스미드로 형질감염시키고, 형질감염체를 선택하고, 형질감염체를 바이러스로 감염시키는 것이다. 많은 바이러스의 감염 효율은 100% 세포에 가깝기 때문에 이 경로를 통해 형질감염되고 감염된 세포 대부분은 플라스미드 및 다른 기질을 보유한 바이러스를 포함한다.
플라스미드와 바이러스 간에는 동종 재조합이 일어나 재조합된 플라스미드와 재조합된 바이러스를 생성한다. 세포내 DNA가 2본쇄 형태 및 1본쇄 형태로 존재하는 사상 파지와 같은 일부 바이러스의 경우에는, 두 형태 모두 재조합에 참여할 수 있다. 이 바이러스가 세포를 급사시키지 않는다면 전기침투나 접합을 사용하여 세포간 플라스미드를 전이시킴으로써 재조합을 보강할 수 있다. 또한, 재조합은 일부 바이러스 종류에서 한 세포의 후대 바이러스를 사용하여 다른 세포를 재감염시키므로써 보강될 수 있다. 일부 바이러스 종류에 있어서 바이러스 감염된 세포는 중감염에 대해 내성을 나타낸다. 하지만, 이와 같은 내성은 중감염에 대한 내성이 감소된 바이러스의 돌연변이 균주를 사용하고(또는) 높은 다중도로 감염시키면 극복될 수 있다.
플라스미드 함유 세포를 바이러스로 감염시킨 결과는 바이러스의 성질에 따라 다르다. 사상 파지와 같은 일부 바이러스는 세포 중의 플라스미드와 안정적으로 공존하고, 또 후대 파지를 세포로부터 배출하기도 한다. 코스미드 게놈을 가진 람다와 같은 기타 다른 바이러스는 후대 비리온을 생성함이 없이 플라스미드 처럼 세포 중에 안정하게 존재할 수 있다. T 파지 및 용균성 람다와 같은 기타 다른 바이러스는 플라스미드와 재조합하나, 궁극적으로 숙주 세포를 죽이고 플라스미드 DNA를 파괴시킨다. 숙주를 죽이지 않고 세포를 감염시키는 바이러스의 경우 재조합 플라스미드와 바이러스를 함유하는 세포는 플라스미드-플라스미드 재조합에서와 동일한 방법을 사용하여 선별/선택할 수 있다. 또한, 선택/선별을 통해 생존한 세포에서 배출된 후대 바이러스를 수집하여 후속 재조합 과정의 기질로서 사용할 수 있다. 숙주 세포를 죽이는 바이러스의 경우 재조합으로 생긴 재조합 유전자는 후대 바이러스에만 존재한다. 선별이나 선택 분석법이 세포 중에서의 재조합 유전자 발현을 필요로 하는 경우 재조합 유전자는 후대 바이러스로부터 다른 벡터, 예컨대 플라스미드 벡터로 전이되어야 하고, 선택/선별을 수행하기 전에 세포의 재감염에 이용되어야 한다.
사상 파지의 경우 재조합 생성물은 재조합에서 생존한 세포 및 이 세포로부터 배출된 파지중에 존재한다. 이와 같은 재조합 생성물의 이중 공급처는 플라스미드-플라스미드 재조합에 비해 선택 사항을 제공한다. 예컨대, 시험관내 재조합 단계에 사용하기 위하여 DNA를 파지 입자로부터 분리할 수 있다. 또는, 후대 파지를 사용하여 이전 선별/선택시 생존한 세포를 형질감염 또는 감염시키거나 또는 새 재조합 기질로 형질감염된 새 세포를 형질감염 또는 감염시킬 수 있다.
(c) 바이러스-바이러스 재조합
상기 플라스미드-플라스미드 및 플라스미드-바이러스 재조합에 대하여 기재한 원리는 몇몇 변형을 제외하고는 바이러스-바이러스 재조합에도 적용할 수 있다. 이 재조합의 1차 기질은 바이러스 벡터에 클로닝시킨다. 일반적으로, 모든 기질에 대해 동일한 벡터를 사용한다. 바이러스는 천연적으로 또는 돌연변이의 결과로서 세포를 죽이지 않는 것이 바람직하다. 삽입후, 일부 바이러스 게놈은 시험관내에서 포장할 수 있다. 포장된 바이러스는 세포 감염에 높은 다중도로 사용하면 세포가 여러 기질을 보유한 복수의 바이러스를 수용할 수 있는 가능성이 증가된다.
1차 감염 후, 후속 단계는 이전 문항에서 논한 바와 같은 감염의 성질에 따라 달라진다. 예컨대, 바이러스가 람다 코스미드 또는 M13, F1 또는 Fd 파지미드와 같은 파지미드 게놈을 보유하는 경우, 파지미드는 세포 내의 플라스미드처럼 작용하여 세포 내에서 단순히 전파하므로써 재조합될 수 있다. 재조합은 세포의 전기침투를 통해 보강될 수 있다. 선택/선별 이후, 재조합 유전자를 함유하는 코스미드는 예컨대 cos-용원성 숙주 세포의 가열 유도에 의해 생존 세포로부터 회수할 수 있고, 그 다음 시험관내에서 코스미드 DNA를 재포장하 후, 추가 재조합 과정에 높은 다중도로 새로운 세포를 감염시키는데 사용할 수 있다.
바이러스가 사상 파지인 경우, 복제형 DNA의 재조합은 감염 세포의 배양물을 전파시키면 일어난다. 재조합 유전자를 가진 바이러스 벡터를 포함하는 세포의 콜로니와, 이 세포로부터 배출된 감염성 입자(즉, 파지 또는 포장된 파지미드)를 선택/선별하여 동정한다. 후속 단계들은 플라스미드-바이러스 재조합의 경우와 대부분 동일하다.
(d) 염색체-플라스미드 재조합
이 방식은 특히 염색체 및 플라스미드계 기질을 개량하는데 사용할 수 있다. 특히, 하나의 표현형에 대하여 많은 염색체 유전자가 관여하거나 개량될 염색체 유전자의 정확한 위치를 알지 못하는 경우에 바람직하다. 1차 재조합 기질은 플라스미드 벡터에 클로닝한다. 개량될 염색체 유전자를 알고 있다면 기질은 고도의 서열 동일성을 나타내지만 염색체 유전자와 약간의 다양성을 보유한 서열 군으로 구성한다. 개량될 염색체 유전자의 위치가 밝혀지지 않은 경우 1차 기질은 소수 분절만이 개량될 유전자와 서열 동일성을 나타내는 DNA 분절의 라이브러리로 구성하는 것이 일반적이다. 플라스미드계 기질과 염색체 유전자 간의 다양성은 돌연변이유발법으로 유도하거나 염색체를 보유하는 세포와는 다른 종류의 플라스미드계 기질을 얻어서 유도할 수 있다.
재조합에 이용되는 기질을 보유한 플라스미드를 사용하여 개량될 염색체 유전자를 보유한 세포를 형질감염시킬 수 있다. 개량은 이 배양물을 단순히 전파시키므로써 실시할 수 있으며, 접합이나 전기침투에 의해 세포간 플라스미드 전이를 실시하면 가속화될 수 있다. 또한, 돌연변이 숙주 세포를 사용하거나 또는 개량될 비돌연변이 숙주 세포의 배양물을 돌연변이 숙주 세포와 함께 접종한 뒤 전기침투 또는 접합에 의해 플라스미드의 세포내 전이를 유도하여 개량을 더욱 가속화할 수 있다. 접종에 사용된 돌연변이 숙주 세포는 개량되는 비돌연변이 세포의 순수 배양물을 용이하게 분리하기 위한 음성 선택성 마커를 포함하는 것이 바람직하다. 선택/선별을 통해 목적 기능을 획득하여 개량된 플라스미드 및/또는 염색체 보유 세포를 동정한다.
후속되는 재조합과 선택/선별 과정은 플라스미드-플라스미드 재조합에서 기재한 바와 유사한 방식으로 진행한다. 예컨대, 추가 재조합은 플라스미드의 전기침투 또는 접합 전이와 함께 재조합에서 생존한 세포를 전파시켜 실시할 수 있다. 또는, 재조합에 이용가능한 다른 기질을 보유한 플라스미드를 생존 세포 중으로 도입시킨다. 이와 같은 플라스미드는 상이한 불화합성 군 유래이고 원 플라스미드와 다른 선택성 마커를 보유하여 2 이상의 상이한 플라스미드를 포함한 세포의 선택이 가능하도록 한다. 다른 양태로서, 생존 세포의 아집단으로부터 플라스미드 및/또는 염색체 DNA를 분리하여 제2 아집단을 형질감염시킬 수 있다. 염색체 DNA는 형질감염 이전에 플라스미드 벡터에 클로닝할 수 있다.
(e) 바이러스-염색체 재조합
전술한 다른 방법에서와 같이, 바이러스는 일반적으로 세포를 죽이지 않는 것이고, 파지 또는 파지미드인 경우도 있다. 이 절차는 실질적으로 플라스미드-염색체 재조합의 경우와 동일하다. 재조합 기질은 벡터에 클로닝한다. 그 다음 기질을 포함하는 벡터를 사용하여 세포를 형질감염시키거나 또는 시험관내 포장한 뒤 감염으로 세포 중으로 도입시킨다. 바이러스 게놈은 배양물을 단순히 전파시키면 숙주 염색체와 재조합한다. 개량은 전기침투를 통해 바이러스 게놈을 세포내 전이하거나 후대 비리온으로 세포를 재감염시키면 가속화될 수 있다. 그 다음 선별/선택을 통해 목적 기능의 획득으로 개량된 염색체 및/또는 바이러스 게놈을 가진 세포를 동정한다.
후속 재조합에는 여러가지 방식을 사용할 수 있다. 예컨대, 선택/재조합에서 생존한 세포간에 전기 침투를 통해 바이러스 게놈을 전이시킬 수 있다. 또는, 선택/선별에서 생존한 세포로부터 배출된 바이러스를 모으고 높은 다중도 세포를 중감염시키는데 사용한다. 또는, 재조합의 새 기질을 플라스미드 또는 바이러스 벡터 상에서 세포 중으로 도입시킬 수 있다.
본 발명의 제1 목적은 목적 기능을 갖도록 세포를 개량하는 방법을 제공하는 것이다. 이 방법은 DNA 단편의 라이브러리를 복수의 세포 중으로 도입시켜 1개 이상의 단편이 게놈 중의 분절 또는 세포의 에피좀과 재조합하므로써 변형된 세포를 얻는 것을 수반한다. 그 다음 변형된 세포 중에서 목적 기능을 획득하여 개량된 변형 세포를 선별한다. 이어서, 목적 기능에 대해 개량된 변형 세포 유래의 DNA를, 상기 변형된 세포의 에피좀이나 게놈 중의 분절과 1종 이상이 재조합되는 다른 DNA 분절의 라이브러리와 재조합시켜 추가 변형 세포를 얻는다. 그 다음, 이 추가 변형 세포 중에서 목적 기능에 대해 더욱 개량된 추가 변형 세포를 선별한다. 추가 변형 세포가 목적 기능을 얻을 때까지 필요한 만큼 재조합 및 선별/선택 단계를 반복한다.
일부 방법에서, DNA 단편의 라이브러리 또는 추가 라이브러리는 recA 단백질로 코팅되어 게놈 분절과의 재조합이 자극되기도 한다. 일부 방법에서는 단편의 라이브러리를 변성시켜 1본쇄 DNA를 생성하고, 이 1본쇄 DNA를 어닐링하여, 일부가 단편 중의 변형 위치에 부정합을 포함하는 2본쇄를 만든 뒤, 부정합을 포함하는 2본쇄를 고정화된 MutS를 이용한 친화성 크로마토그래피로 선택하기도 한다.
일부 방법에서, 목적 기능은 단백질 분비이고, 복수의 세포가 그 단백질을 암호하는 작제물을 포함한다. 경우에 따라, 단백질은 분비되지 않는 한 복수의 세포에 대해 독성인 바, 목적 기능에 대하여 개량된 변형 세포 또는 추가 변형 세포를 선별하기 위하여 세포를 전파시키고 생존 세포를 회수한다.
일부 방법에서, 목적 기능은 향상된 재조합 성질이다. 이 방법에서 단편의 라이브러리는 때로 총체적으로 재조합 성질을 부여하는 유전자 클러스터를 포함한다. 선별은 재조합으로 제거되는 돌연변이에 의해 발현이 차단되는 마커를 암호하는 유전자를 더 포함하는 세포를 사용하여 실시할 수 있다. 세포는 재조합에 의해 돌연변이가 제거되어 마커를 발현하는 것으로 선별한다.
일부 방법에서, 복수의 세포는 식물 세포이고, 목적 성질은 화합물이나 미생물에 대한 개선된 내성으로, 선별 단계는 변형 세포 또는 추가 변형 세포를 화합물이나 미생물에 노출시키고, 이 노출에도 생존하는 성질을 통해 목적 기능을 획득하여 개량된 변형 세포 또는 추가 변형 세포를 선택하는 것으로 구성된다.
일부 방법에서, 복수의 세포는 동물의 배아 세포로서, 이 방법은 형질전환된 세포를 돌연변이 동물로 증식시키는 것을 포함한다.
또한, 본 발명은 생체내 재조합을 실시하는 방법을 제공한다. 이 방법은 세포 격막화 유전자를 발현할 수 없는 세포를 제공하는 것을 수반한다. 1종 이상의 유전자에서 유래되는 최소한 제1 분절과 제2 분절(이 분절은 2개 이상의 뉴클레오티드가 서로 상이함)을 세포 중으로 도입시키면, 이 분절들은 재조합하여 키메라 유전자의 라이브러리를 형성한다. 목적 기능을 얻은 라이브러리 중에서 키메라 유전자를 선택한다.
본 발명은 바이러스 감염 치료에 있어서 약물의 효능을 예측하는 방법을 제공하기도 한다. 이 방법은 감염이 약물에 의해 억제되는 바이러스 유래의 핵산 분절을 상기 바이러스 유래의 최소한 제2 핵산 분절(이 제2 핵산 분절은 상기 핵산 분절과 2개 이상의 뉴클레오티드에 차이가 있음)과 재조합하여 재조합 핵산 분절의 라이브러리를 형성시키는 단계를 수반한다. 그 다음, 숙주 세포를 약물 함유 배지 중에서 재조합 핵산 분절을 포함하는 게놈을 보유한 바이러스 수집물과 접촉시키고, 숙주 세포가 감염된 후 생성되는 후대 바이러스를 수집한다. 제1 후대 바이러스 유래의 재조합 DNA 분절을 최소한 제2 후대 바이러스 유래의 재조합 DNA 분절과 재조합하여 또 다른 재조합 핵산 분절의 라이브러리를 만든다. 추가 라이브러리 또는 재조합 핵산 분절을 포함하는 게놈을 보유한 바이러스 수집물과 숙주 세포를 약물 함유 배지 중에서 접촉시키고, 이 숙주 세포를 통해 다음 후대 바이러스를 만든다. 추가 후대 바이러스가 목적하는 정도의 약물 내성을 얻을 때까지 필요한 만큼 재조합 및 선택 단계를 반복하고, 이와 같이 얻은 약물 내성 정도와 이를 달성하는데 필요한 반복 횟수를 통해 바이러스를 치료하는 약물의 효능을 알 수 있다.
또한, 본 발명은 병원성 미생물에 의한 감염을 치료하는 약물의 효능을 예측하는 방법을 제공한다. 이 방법은 DNA 분절의 라이브러리로 상기 미생물의 복수 세포를 형질전환시켜, DNA 단편 중 최소한 일부가 상기 세포의 게놈 내 분절과 재조합하므로써 변형된 미생물 세포를 생성하는 단계를 포함한다. 변형된 미생물은 약물 함유 배지 중에서 전파하고, 생존 미생물을 회수한다. 생존 미생물 유래의 DNA를 또 다른 DNA 단편의 라이브러리와 재조합하여, 그 일부 단편을 생존 미생물 유래의 DNA중에 존재하는 동족 분절과 재조합시키므로써 추가 변형된 미생물 세포를 생성시킨다. 추가 변형된 미생물을 약물 함유 배지 중에서 전파시키고, 추가 생존 미생물을 수집한다. 이와 같은 추가 생존 미생물이 약물에 대한 목적하는 정도의 내성을 획득할 때까지 필요한 만큼 재조합 단계 및 선택 단계를 반복하며, 결과적으로 획득된 내성 정도와 이 내성을 획득하는데 필요로 된 반복 횟수를 통해 병원성 미생물을 사멸시킬 수 있는 약물의 효능을 판단한다.
또한, 본 발명은 목적 기능을 획득하도록 세포를 개량하는 방법을 제공한다. 이 방법은 상이한 세포의 집단을 제공하는 단계를 수반한다. 먼저, 세포간 DNA가 교환되는 조건하에 세포를 배양하여 하이브리드 게놈을 가진 세포를 형성시킨다. 그 다음 이 세포를 목적 성질을 획득하여 개량된 세포에 대해 선별하거나 선택한다. DNA 교환 및 선별/선택 단계는, 제1 사이클에서 얻은 선별/선택된 세포를 가지고 제2 사이클에서 상이한 세포의 집단을 형성시켜 이 세포가 목적 성질을 획득할 때까지 필요한 만큼 반복한다.
DNA 교환 기작으로는 접합, 파지 매개의 형질도입, 원형질 융합 및 세포의 유성 재조합을 포함한다. 경우에 따라, DNA 단편의 라이브러리를 사용하여 세포를 형질전환시킬 수 있다.
전술한 바와 같이, 목적 성질을 획득하도록 세포를 개량하는 몇몇 방법은 세포간 DNA의 원형질 매개의 교환 반응으로 실시한다. 이와 같은 방법은 상이한 세포 집단의 원형질을 형성시키는 단계를 수반한다. 이 원형질을 그 다음 융합시켜 하이브리드 원형질을 형성시키며, 이때 원형질 유래의 게놈의 재조합을 통해 하이브리드 게놈을 얻는다. 하이브리드 원형질을 세포 재생 촉진 조건하에서 항온배양한다. 그 다음, 목적 성질에 대해 개량 재생된 세포를 분리하여 선택하거나 선별한다. 제1 사이클에서 얻은 재생된 세포를 목적 성질의 재생된 세포가 얻어질 때까지 다음 사이클에서 원형질을 형성하는데 사용하여 필요한 만큼 DNA 교환 및 선택/선별 단계를 반복한다. 이와 같은 방법을 수행하는데 바람직한 유기체는 진균류이다. 일부 방법은 모세포의 비융합 원형질로부터 융합 원형질을 선택 또는 선별하는 단계를 더 포함한다. 또 다른 일부 방법은 양친 게놈을 가진 세포가 없게 하이브리드 게놈을 가진 융합된 원형질을 선택 또는 선별하는 단계를 더 포함한다. 일부 방법에서, 원형질은 세포벽을 분해하는 효소를 가지고 균사 또는 포자를 처리하여 제공한다. 또 다른 방법에서, 진균류는 파괴되기 쉬운 균주로서, 본래의 세포벽 합성력이 부족하여 자발적으로 원형질을 형성하기도 한다. 또 다른 방법에서, 원형질은 균사를 세포벽 형성 억제제로 처리하여 원형질을 형성시키기도 한다.
일부 방법에서, 목적 성질은 탁솔과 같은 2차 대사산물이나 단백질의 발현 및/또는 분비 성질이다. 또 다른 방법에서, 목적 성질은 감수분열 성질이다. 다른 일부 방법에서, 목적 성질은 다른 균주와 이핵접합체를 형성할 수 있는 화합성이다.
본 발명은 목적 성질의 획득을 통해 세포를 개량하는 방법을 제공하는 것이다. 이 방법은 상이한 세포의 집단을 제공하는 단계를 포함한다. 상이한 세포의 제1 아집단으로부터 DNA를 분리하고 리포좀에 캡슐화한다. 상이한 세포의 제2 아집단으로부터 원형질을 형성한다. 리포좀을 원형질과 융합하여, 리포좀 유래의 DNA를 원형질에 흡수시켜 원형질의 게놈과 재조합시킨다. 이 원형질을 재생 조건하에서 항온배양한다. 그 다음 재생 세포 또는 재생된 세포 중에서 목적 성질에 대해 개량된 세포를 선택하거나 선별한다. 제1 사이클에서 목적 성질이 개량된 세포를 가지고 제2 사이클에서 상이한 세포의 집단을 형성시켜 상기 방법을 반복한다.
또한, 본 발명은 합성 염색체를 사용하여 목적 성질을 획득하도록 세포를 개량하는 방법을 제공한다. 이 방법은 합성 염색체에 클로닝된 DNA 단편 라이브러리를 세포 집단으로 도입시키는 단계를 포함한다. 그 다음, 이 세포를 세포간 유성 재조합이 일어나는 조건하에서 배양하여, 합성 염색체 중에 클로닝된 DNA 단편을 세포 집단의 내인성 염색체 중에 대응하는 단편과 동종 재조합시키고, 내인성 염색체는 서로 재조합시킨다. 그 다음 목적 성질의 획득에 대해 개량된 세포를 선택하거나 선별한다.
본 발명은 목적 성질을 획득하기 위하여 합성 염색체 중으로 클로닝된 DNA 분절을 개량하는 방법을 제공한다. 이 방법은 각 변형체가 합성 염색체의 별도 카피에 클로닝된 분절 변형체의 라이브러리를 제공하는 단계를 수반한다. 합성 염색체의 카피를 세포 집단 중으로 도입시킨다. 이 세포를 일정 조건하에서 배양하여 세포간에 유성 재조합을 일으키고 변형체를 보유한 합성 염색체의 카피 간에 동종 재조합을 일으킨다. 그 다음, 목적 성질을 획득하여 개량된 변형체를 선별하거나 선택한다.
또한, 본 발명은 과재조합성 recA 단백질을 제공한다. 이와 같은 단백질의 예로는 도 13에 도시된 바와 같은 클론 2, 4, 5, 6 및 13을 포함한다.
1. 과재조합원성 RecA의 개량
recA 단백질은 대부분의 이.콜리 상동성 재조합 경로에 관여한다. recA 중의 대부분의 돌연변이는 재조합을 억제하나, 일부는 재조합을 증가시키는 것으로 보고되었다[Kowalczykowski et al., Microbiol.Rev., 58, 401-465(1994)]. 다음 실시예는 생체내 셔플링 방법에 유용한 과재조합원성 활성을 획득하기 위하여 RecA를 개량하는 방법에 관한 것이다.
과재조합원성 RecA는 문헌[Shen et al., Genetics 112, 441-457(1986); Shen et al., Mol. Gen. Genet. 218, 358-360(1989)]에서 개발된 시스템의 변형으로 선택하여 재조합 빈도에 대한 기질 길이와 상동성의 효과를 측정하였다. 센과 후앙의 시스템은 2개가 재조합할 수 있는 작은 상동성 영역(31 내지 430 bp)을 보유한 플라스미드와 박테리오파지를 사용하였다. 제한 숙주에서, 플라스미드 서열을 병입시킨 파지만이 플라크를 형성할 수 있었다.
recA를 셔플링하기 위하여 숙주 균주 MC1061로부터 내인성 recA 및 mutS를 결실시켰다. 이 균주에서는 플라스미드와 파지간에 어떤 재조합도 관찰되지 않았다. 그 다음 이.콜리 recA를 2개의 재조합 벡터(Bp221 및 πMT631c18) 중에 클로닝하였다. 클로닝된 RecA를 포함하는플라스미드는 동종 파지:λV3(Bp221과 430 bp 동일), λV13(Bp221과 89% 동일한 430 bp 신장부) 및 λlinkH(위치 18에 존재하는 1개의 부정을 제외하고는 πMt631c18과 31 bp 동일)와 재조합할 수 있었다.
클로닝된 RecA를 표준 DNase 처리와 이어 PCR계 재어셈블리를 사용하여 시험관내에서 셔플링하였다. 셔플링된 플라스미드를 사용하여 비재조합성 숙주 균주를 형질전환시켰다. 이 세포를 하룻밤 동안 증식시키고, 파지 λVc, λV13 또는 λlink H로 감염시킨 뒤, 10배 과량의 MC1061 결손 플라스미드 존재하에 NZCYM 평판상에 평판배양하였다. recA 대립형질이 플라스미드와 파지간의 재조합을 보다 효율적으로 자극할수록 박테리오파지 DNA에서 대립형질이 보다 많이 나타났다. 그 후, 평판에서 모든 파지를 수확하고 recA 유전자를 회수하여 가장 우수한 재조합원성 recA 대립형질을 선별한다.
야생형과 셔플링 3회 후 과재조합원성 RecA 수집물의 재조합 빈도는 다음과 같았다.
교배 야생형 과재조합원성
BP221 x V3 6.5 x 10-4 3.3 x 10-2
BP221 x V13 2.2 x 10-5 1.0 x 10-3
πMT631c18 x 링크 H 8.7 x 10-6 4.7 x 10-6
이 결과는 430 bp 기질에 대한 재조합 비율이 50배 증가하고 31 bp 기질에 대해서는 5배 증가함을 시사하고 있다.
5가지 각 클론 분리물에 있어서 BP221과 V3 간의 재조합 빈도는 이하에 예시하였고, DNA 서열과 단백질 서열 및 이의 정렬은 도 12 및 도 13에 도시하였다.
야생형 : 1.6 x 10-4
클론 2 : 9.8 x 10-3(61배 증가)
클론 4 : 9.9 x 10-3(62배 증가)
클론 5 : 6.2 x 10-3(39배 증가)
클론 6 : 8.5 x 10-3(53배 증가)
클론 13 : 0.019(116배 증가)
클론 2, 4, 5, 6 및 13은 recA에 추가 개선이 필요하다면 후속 셔플링 단계의 기질로서 사용될 수 있다. 야생형 recA 서열 유래의 변화가 모두 과재조합원성 표현형에 반드시 영향을 미치지는 않는다. 침묵 돌연변이는 역교배에 의해 제거될 수 있다. 또는, 코돈 5, 18, 156, 190, 236, 268, 271, 283, 304, 312, 317, 345 및 353에 야생형과 다른 변화점이 각각 병입된 recA의 변형체를 가지고 활성 시험할 수도 있다.
2. 과재조합을 위한 전체 유기체 개량
재조합율이 증가된 이.콜리 균주를 선택할 수 있는 가능성은 미토마이신 C - DNA의 쇄간 가교제에 노출 후 야생형, △recA, mutS 및 △recA mutS 균주의 표현형을 통해 추정하였다.
미토마이신 C에 이.콜리를 노출시키면 DNA의 쇄간 가교가 일어나 DNA 복제가 차단되게 된다. 이.콜리에서 쇄간 DNA 가교의 수복은 RecA 의존적 재조합 수복 경로를 통해 일어난다[Friedberg et al., in DNA Repair and Mutagenesis(1995), pp. 191-232]. 수복 동안 가교의 프로세싱은 RecA 의존적 재조합 경로에 의해 역시 수복되는 2본쇄 DNA 붕괴를 때로 일으킨다. 따라서, recA-균주는 미토마이신 C 노출시 야생형 균주 보다 유의적으로 더 민감하다. 사실상, 미토마이신 C는 간단한 디스크 감수성 분석에 사용되어 RecA+와 RecA-균주를 구별할 수 있다.
재조합원성 외에도 미토마이신 C는 돌연변이원이다. 미토마이신 C와 같은 DNA 손상제에 노출되면, DNA 손상의 잘못이 있는 수복에 관련이 있는 생성물을 포함하는 이.콜리 SOS 레귤론이 유도되는 것이 일반적이다[전술한 Friedberg et al., 1995, pp. 465-522 참조].
파지 P1 매개의 일반 형질도입으로 △(recA-sr1)::Tn10 대립형질(비작용성 대립형질)을 야생형 및 mutS 이.콜리 중으로 도입시킨 후, 미토마이신 C 감수성 분석법을 사용하여 recA-표현형에 대해 형질도입체를 선별하였다. 37 ℃에서 48 시간 후 미토마이신 10 ㎍으로 포화된 1/4 인치 필터 디스크를 중층시킨 LB에서, 야생형 균주와 mutS 균주의 성장이 디스크 중심에서 부터 반경이 약 10 ㎜인 영역 이내로 억제되었다. 고농도의 미토마이신 C에 의한 DNA 가교는 완전한 재조합 수복을 일으켜 DNA 복제를 치명적으로 차단한다. 콜로니 빈도수가 mutS 균주의 경우 ~10 내지 20배 더 높더라도 억제 구역 내에서는 두 균주 모두 드문 콜로니 형성 단위를 나타냈다. 이것은 아마도 mutS 기준물의 자발적인 돌연변이율의 증가 때문인 것으로 추정된다. 이와 비교 연구를 통해 △recA 및 △recA mutS 균주가 디스크의 중심에서 부터 약 15 ㎜ 이내의 영역에서 증식 억제되어 미토마이신 C에 유의적으로 더욱 민감하다는 것을 알 수 있었다. 하지만, recA+균주와 달리, mutS 기준물은 제외하고 성장 억제 영역에서 관찰되는 Mitr개체는 없었다. △recA 기준물은 제외하고 recA+기준물에서 관찰되는 Mitr개체의 출현은 Mitr이 기능적 RecA 단백질에 의존적임을 시사하고 Mirr이 미토마이신 C 유도 손상의 재조합적 수복 능력을 증가시킬 수 있음을 암시한다.
RecA 매개의 재조합 수복 능력을 증가시키는 돌연변이는 다양하고, 예상치 못하며 관련이 없고 강력하게 상승 작용적일 수 있다. Mitr에 대한 선택과 염색체 셔플링을 교대로 이용하는 반복적 방법은 재조합력이 크게 증가되게 각 세포를 개량시킨다.
반복적 방법은 다음과 같다. 미토마이신 S에 mutS 균주를 노출시킨 다음, Mitr개체를 수집하고 교배한다[예컨대, Hfr 매개의 염색체 셔플링 또는 분리 수집 일반 형질도입법 이용]. Mitr을 초래하고 재조합 수복력을 증가시킬 것으로 추정되는 대립형질을 부정합 수복이 없는 집단 중에서 셔플링시킨다. 또한, 미토마이신 C에 노출시킨 후의 잘못이 있는 수복은 다음 셔플링 과정에 새로운 돌연변이를 도입시킬 수 있다. 이 과정을 미토마이신 C에 점차 보다 엄격하게 노출시키면서 반복한다. 다양한 대립형질을 생성하기 위한 수단으로 1 단계에서는 다수의 대등한 선택을 실시한다. 경우에 따라, 분리물의 재조합원성을 플라스미드 x 플라스미드 분석법이나 염색체 x 염색체 분석법을 사용하여 과재조합에 대해 조사할 수 있다[예컨대, Konrad, J.Bacteriol. 130, 167-172(1977) 참조].
3. 스트렙토마이세스 콜리콜러(Streptomyces coelicolor)의 전체 게놈 셔플링
전체 게놈의 반복적 돌연변이와 재조합을 사용하여 특정 표현형을 개선시킬 수 있는지 증명하기 위하여, S. 콜리콜러를 단독으로, 그리고 근연성이 있는 S.리비단스(lividans)와 함께 반복적으로 셔플링하여 청색 γ-악티노로딘의 총 생산을 향상시킨다. 이 균주 개선 방법을, 재조합을 포함하지 않는 유사 균주 개선 프로그램과 비교한다.
S. 콜리콜러와 S. 리비단스의 포자 현탁액을 멸균수에 재현탁하고 스트라타링커(스트라타진)를 사용하여 UV 돌연변이유발(600 "에너지" 단위)시킨 뒤, 얻어지는 돌연변이체를 포자형성 아가에서 "완전 증식"시킨다. 포자를 수집하여 고체 RG-2 배지에서 평판 배양한다[Bystrykn et al., J.Bact. 178, 2238-2244(1996)]. 보다 크거나 어두운 청색 환을 생성하는 콜로니를 선택하여 RG-2 액체 배지에서 증식시킨 뒤, 생성되는 γ-악티노로딘의 양을 미량역가 방식으로 알칼리 배양물 상청액의 650 nm 흡광도 측정에 의한 분광분석법으로 결정한다. 안료의 농도와 구조는 LC/MS, MS/MS 및/또는 NMR로 더 확인한다. γ-악티노로딘을 야생형보다 많이 생산하는 세포를 균주 개량 프로그램으로 더 처리한다. 각 돌연변이체로부터 분리된 포자를 1) 다시 전술한 바와 같이 돌연변이유발 및 선별하거나(대조용으로 재조합 없이) 또는 2) 증식하여 원형질을 제조한 뒤 융합시킨다. 스트렙토마이세스 원형질을 제조하고 융합시키는 방법은 문헌[Genetic Manipulation of Streptomyces -- A Laboratory Manual, Hopwood, D.A. et al.]에 기재되어 있다. 그 다음, 융합된 세포 보다 다량의 γ-악티노로딘을 생성하는 재조합된 클론에 대해 전술한 바와 같이 재생 융합된 원형질을 선별한다. 선택된 클론을 UV 돌연변이유발법으로 다시 처리하고 선별과 재조합을 목적하는 수준의 γ-악티노로딘이 생성될 때까지 반복하였다.
이상, 본 발명의 바람직한 양태에 대한 설명은 예시적 목적으로 기재한 것으로, 본 발명을 개시된 형태 만으로 제한하기 위한 것이 아니며 상기 교시된 내용으로 부터 다양한 변형과 수정이 가능하다. 이와 같은 변형과 수정은 당업자에게 명백한 것으로 본 발명의 범위에 속한다. 상기 인용된 모든 특허와 공개 문헌은 각각 표시되어 있지만 동일한 정도로 전문이 참고 인용된 것이다.

Claims (90)

  1. (1) 복수의 세포 중으로 DNA 단편의 라이브러리를 도입시켜 적어도 1개의 단편이 게놈 중의 분절이나 세포의 에피솜과 재조합하여 변형 세포를 형성시키는 단계,
    (2) 변형 세포 중에서 개량되어 목적 기능을 획득한 변형 세포를 선별하는 단계,
    (3) 목적 기능이 개량된 변형 세포 유래의 DNA와, 1개 이상의 단편이 변형 세포의 에피솜이나 게놈 중의 분절과 재조합하는 DNA 단편의 추가 라이브러리와 재조합하여 추가 변형 세포를 형성시키는 단계,
    (4) 이 추가 변형 세포 중에서 목적 기능의 획득과 관련하여 더 개량된 추가 변형 세포를 선별하는 단계, 및
    (5) 단계 (3)과 (4)를 추가 변형 세포가 목적 기능을 획득할 때까지 필요한 만큼 반복하는 단계를 포함하는, 목적 기능을 획득하기 위한 세포의 개량 방법.
  2. 제1항에 있어서, DNA 단편의 라이브러리가 1종 이상의 이종 세포 종류 유래의 실질적으로 완전한 게놈 라이브러리인 것이 특징인 개량 방법.
  3. 제1항에 있어서, 단편의 라이브러리가 상이한 개체 유래의 유전자의 자연 변형체를 포함하는 것이 특징인 개량 방법.
  4. 제1항에 있어서, 변형 세포를 제1 및 제2 수집물로 분할하는 단계, 제2 수집물로부터 DNA 단편의 추가 라이브러리를 분리하는 단계 및 DNA 단편의 추가 라이브러리를 제1 수집물로 도입시키는 단계를 더 포함하는 것이 특징인 개량 방법.
  5. 제1항에 있어서, DNA 단편의 라이브러리가 바이러스 성분이고, 도입이 바이러스에 의한 세포 감염시 일어나는 것이 특징인 개량 방법.
  6. 제1항에 있어서, DNA 단편의 라이브러리가 영구적 에피좀으로 세포 중에 존재할 수 없는 자기불활화 벡터 중으로 클로닝되는 것이 특징인 개량 방법.
  7. 제6항에 있어서, 자기불활화 벡터가 선택 마커를 더 포함하는 것이 특징인 개량 방법.
  8. 제1항에 있어서, DNA 단편의 라이브러리 또는 DNA 단편의 추가 라이브러리를 recA 단백질로 코팅하여 게놈 분절과의 재조합을 자극하는 단계를 더 포함하는 것이 특징인 개량 방법.
  9. 제1항에 있어서, 단편의 라이브러리를 변성시켜 1본쇄 DNA를 생성하는 단계, 1본쇄 DNA를 재어닐링하여 일부가 단편 중의 변형점에서 부정합을 포함하는 2본쇄를 형성시키는 단계 및 부정합을 포함하는 2본쇄를 MutS 고정된 친화성 크로마토그래피로 선택하는 단계를 더 포함하는 것이 특징인 개량 방법.
  10. 제10항에 있어서, 단편의 라이브러리를 변성시키기 전에 단편화하여 준단편을 생성하는 단계 및 부정합을 포함하는 준단편의 2본쇄를 재어셈블리된 단편으로 재어셈블리하는 단계를 더 포함하는 것이 특징인 개량 방법.
  11. 제10항에 있어서, 재어셈블리된 단편 간의 평균 다양성이 단편간 평균 다양성 보다 5배 이상인 것이 특징인 개량 방법.
  12. 제1항에 있어서, 목적 기능이 단백질의 분비이고, 복수의 세포가 이 단백질을 암호하는 작제물을 더 포함하는 것이 특징인 개량 방법.
  13. 제12항에 있어서, 단백질이 분비되지 않는 한 복수의 세포에 대해 독성이고 목적 기능의 획득에 대하여 개량된 변형 세포 또는 추가 변형된 세포는 세포를 전파시키고 생존한 세포를 회수하므로써 선별되는 것이 특징인 개량 방법.
  14. 제13항에 있어서, 단백질이 β-락타마제 또는 알칼리성 포스파타제이고, 목적 기능의 획득에 대하여 개량된 변형 세포 또는 추가 변형된 세포는 b-락타마제 또는 알칼리성 포스파타제의 발색성 기질의 대사를 모니터하여 선별하는 것이 특징인 개량 방법.
  15. 제14항에 있어서, 단백질이 항체이고 복수의 세포가 이.콜리인 것이 특징인 개량 방법.
  16. 제15항에 있어서, 작제물이 융합 단백질로서 단백질과 함께 발현되는 마커를 더 암호하고, 선별 단계는 변형 세포 또는 추가 변형 세포를 전파하는 단계 및 융합 단백질을 분비하는 세포를 FACSTM분류법으로 동정하는 단계를 포함하는 것이 특징인 개량 방법.
  17. 제16항에 있어서, 마커 단백질이 세포로부터 분비후 세포 표면에 마커 단백질을 부착시키는 인지질 부착 도메인에 결합되어 있는 것이 특징인 개량 방법.
  18. 제16항에 있어서, 세포가 단백질을 분비하는 세포 부근에 분비된 단백질을 한정시키는 아가 점적액에 포함되어 있는 것이 특징인 개량 방법.
  19. 제12항에 있어서, 라이브러리 중의 1개 이상의 단편이 시그널 서열을 암호하고, 1개 이상의 단편이 세포로부터 분비될 단백질을 암호하는 서열에 작동가능하게 결합된 작제물에 통합되어 있는 것이 특징인 개량 방법.
  20. 제12항에 있어서, 라이브러리 중의 1개 이상의 단편이 시그널 프로세싱 효소를 암호하고 세포가 시그널 서열에 작동가능하게 결합된 분리될 단백질을 암호하는 작제물을 포함하는 것이 특징인 개량 방법.
  21. 제12항에 있어서, 라이브러리 중의 1개 이상의 단편이 SecA, SecB, SecE, SecD 및 SecF 유전자로 구성된 군 중에서 선택되는 유전자를 암호하는 것이 특징인 개량 방법.
  22. 제1항에 있어서, 목적 기능이 향상된 재조합성인 것이 특징인 개량 방법.
  23. 제1항에 있어서, 단편의 라이브러리가 집합적으로 재조합능을 제공하는 유전자 클러스터를 포함하는 것이 특징인 개량 방법.
  24. 제1항에 있어서, 1종 이상의 유전자가 recA, recBCD, recBC, recE, recF, recG, recO, recQ, recR, recT, ruvA, ruvB, ruvC, sbcB, ssb, topA, gyrA 및 gyrB, lig, polA, uvrD, uvrE, recL, mutU 및 helD로 구성된 군 중에서 선택되는 것이 특징인 개량 방법.
  25. 제24항에 있어서, 복수의 세포가 재조합시 제거가능한 돌연변이에 의해 발현이 차단되는 마커 암호 유전자를 더 포함하고, 변형 세포 또는 추가 변형 세포가 재조합에 의해 돌연변이를 제거시키는 마커의 발현에 의해 선별되는 것이 특징인 개량 방법.
  26. 제24항에 있어서, 선별 단계에서 변형 세포 또는 추가 변형 세포가 돌연변이원에 노출되고, 목적 기능의 획득에 대하여 개량된 변형 세포 또는 추가 변형 세포를 노출시의 생존성을 통해 선별하고, 이 때 생존이 돌연변이원에 의해 유도된 손상을 제거하는 세포의 향상된 재조합능에 의해 부여되는 것이 특징인 개량 방법.
  27. 제26항에 있어서, 돌연변이원이 방사선인 것이 특징인 개량 방법.
  28. 제27항에 있어서, 향상된 재조합이 변형 세포 또는 추가 변형 세포의 게놈 카피수의 증가에 의해 제공되는 것이 특징인 개량 방법.
  29. 제22항에 있어서, 1종 이상의 유전자가 복제 유전자 또는 세포 격막화 유전자 중에서 선택되는 것이 특징인 개량 방법.
  30. 제29항에 있어서, 목적 기능의 획득에 대하여 개량된 변형 세포 또는 추가 변형 세포가 합포체 형성능이나 세포 융합능 중에서 선택되는 것이 특징인 개량 방법.
  31. 제1항에 있어서, 복수의 세포가 식물 세포이고 목적 성질이 화합물이나 미생물에 대한 향상된 내성이며, 선별 단계에서 변형 세포 또는 추가 변형 세포를 화합물이나 미생물에 노출시킨 뒤, 이 노출시에도 생존하는 성질을 통해 목적 기능의 획득에 대하여 개량된 변형 세포 또는 추가 변형 세포를 선택하는 것이 특징인 개량 방법.
  32. 제31항에 있어서, 미생물이 바이러스, 박테리아, 진균류 또는 곤충인 것이 특징인 개량 방법.
  33. 제32항에 있어서, 화합물이 항바이러스제, 항진균제, 살충제, 살균제 또는 제초제 중에서 선택되는 것이 특징인 개량 방법.
  34. 제33항에 있어서, 화합물이 BT-독소인 것이 특징인 개량 방법.
  35. 제33항에 있어서, 화합물이 글리포세이트 또는 아트라진인 것이 특징인 개량 방법.
  36. 제33항에 있어서, 목적 기능을 획득한 식물 세포를 증식시켜 돌연변이 식물을 형성시키는 단계를 더 포함하는 것이 특징인 개량 방법.
  37. 제1항에 있어서, 복수의 세포가 동물의 배아 세포이고, 형질전환된 세포를 증식시켜 돌연변이 동물을 형성시키는 단계를 더 포함하는 것이 특징인 개량 방법.
  38. 제37항에 있어서, 변형 세포가 돌연변이 동물의 성분으로서 선별되는 것이 특징인 개량 방법.
  39. 제38항에 있어서, 목적 성질 획득에 대하여 개량된 변형 세포를 가진 돌연변이 동물로부터 배아 세포를 얻는 단계 및 이 세포를 추가 라이브러리로 형질전환시키는 단계를 더 포함하는 것이 특징인 개량 방법.
  40. 제37항에 있어서, 목적 성질의 획득에 대하여 개량된 돌연변이 동물로부터 DNA를 분리하는 단계 및 이 DNA를 새로운 배아 세포로 도입시키는 단계를 더 포함하는 것이 특징인 개량 방법.
  41. 제37항에 있어서, 동물이 어류인 것이 특징인 개량 방법.
  42. 제37항에 있어서, 1종 이상의 단편이 성장 호르몬을 암호하고 목적 성질이 동물 크기의 증가인 것이 특징인 개량 방법.
  43. (1) 단백질을 암호하는 유전자에 있어 2개 이상의 뉴클레오티드가 서로 상이한 최소한 제1 형태 및 제2 형태를 재조합하여 키메라 유전자의 라이브러리를 형성시키는 단계,
    (2) 이 라이브러리를 선별하여, 조직 유래의 세포내에 존재하는 단백질의 발현을 그 유전자의 야생형 형태를 함유하는 돌연변이유전자에 비하여 향상시키는 돌연변이유전자의 성분으로서 1종 이상의 키메라 유전자를 동정하는 단계,
    (3) 상기 제1 형태 및 제2 형태와 동일하거나 상이한 상기 유전자의 또 다른 형태와 1종 이상의 키메라 유전자를 재조합하여 키메라 유전자의 추가 라이브러리를 형성시키는 단계,
    (4) 이 추가 라이브러리를 선별하여, 조직 유래의 세포 중에 존재하는 단백질의 발현을 이전 선별 단계 중의 키메라 유전자를 포함하는 돌연변이유전자에 비해 향상시키는 돌연변이유전자의 성분으로서 1종 이상의 추가 키메라 유전자를 동정하는 단계,
    (5) 추가 키메라 유전자가 조직 유래의 세포 중에서 목적하는 발현율을 제공할 때까지 필요한 만큼 단계 (3) 및 (4)를 반복하는 단계를 포함하여, 돌연변이 동물 중에 존재하는 단백질의 조직 특이적 발현을 향상시키는 방법.
  44. 제43항에 있어서, 유전자의 최소한 2가지 형태가 암호 서열에서 서로 상이한 것이 특징인 방법.
  45. 제43항에 있어서, 유전자의 최소한 2가지 형태가 조절 서열내에서 서로 상이한 것이 특징인 방법.
  46. 제43항에 있어서, 세포가 유선 세포인 것이 특징인 방법.
  47. 제43항에 있어서, 돌연변이유전자가 유단백 인헨서, 유단백 프로모터, 시그널 서열 및 단백질 암호 서열을 작동가능한 결합으로 포함하는 것이 특징인 방법.
  48. 제43항에 있어서, 단백질 및 마커가 융합 단백질로서 발현되는 것이 특징인 방법.
  49. 제48항에 있어서, 발현 향상이 융합 단백질을 발현하는 세포 외부에 있는 융합 단백질의 성분으로서 마커의 존재를 검출하여 측정되는 것이 특징인 방법.
  50. 세포 격막화 유전자를 발현할 수 없는 세포를 제공하는 단계,
    2개 이상의 뉴클레오티드가 서로 상이하되 1종 이상의 유전자에서 유래되는 최소한 제1 분절과 제2 분절을 세포 중으로 도입시켜 분절을 재조합하므로써 키메라 유전자의 라이브러리를 형성시키는 단계,
    획득된 기능을 가진 라이브러리로부터 키메라 유전자를 선택하는 단계를 포함하여 생체내 재조합을 수행하는 방법.
  51. 제50항에 있어서, 세포가 격막화 유전자의 발현을 차단하는 세포 격막화 유전자의 안티센스 mRNA를 발현하는 작제물을 포함하는 것이 특징인 방법.
  52. 제50항에 있어서, 세포가 세포 격막화 유전자를 발현할 수 없게 하는 약물에 노출되는 것이 특징인 방법.
  53. 제50항에 있어서, 세포 격막화 유전자가 발현을 차단하는 돌연변이를 포함하는 것이 특징인 방법.
  54. (1) 약물에 의해 감염 억제되는 바이러스 유래의 핵산 분절을, 이 바이러스로부터 유래하되 2개 이상의 뉴클레오티드가 상기 핵산 분절과 상이한 최소한 제2 핵산 분절과 재조합하여 재조합 핵산 분절의 라이브러리를 형성시키는 단계,
    (2) 약물을 함유하는 배지에서 재조합 핵산 분절을 포함하는 게놈을 가진 바이러스 수집물과 숙주 세포를 접촉시키고, 숙주 세포의 감염으로 얻어지는 후대 바이러스를 수집하는 단계,
    (3) 제1 후대 바이러스 유래의 재조합 DNA 분절과 최소한 제2 후대 바이러스 유래의 재조합 DNA 분절을 재조합하여 재조합 핵산 분절의 추가 라이브러리를 형성시키는 단계,
    (4) 추가 라이브러리 또는 재조합 핵산 분절을 포함하는 게놈을 가진 바이러스 수집물과 숙주 세포를 약물 함유 배지에서 접촉시키고, 이 숙주 세포에 의해 생성되는 추가 후대 바이러스를 수집하는 단계,
    (5) 추가 후대 바이러스가 목적하는 약물에 대한 내성도를 얻을때까지 필요한 만큼 단계 (3)과 (4)를 반복하고, 이와 같이 획득된 내성도와 획득에 필요한 단계 (3) 및 (4)의 반복 횟수가 바이러스 처리시의 약물 효능의 척도를 나타내는 것인 단계를 포함하여, 바이러스 감염을 치료하는 약물의 효능을 예측하는 방법.
  55. 제54항에 있어서, 배지가 약물의 혼합물을 포함하는 것이 특징인 방법.
  56. 제55항에 있어서, 바이러스가 HIV인 것이 특징인 방법.
  57. (1) 병원성 미생물의 복수의 세포를, 이 세포의 게놈내 분절과 일부 이상이 재조합되는 DNA 단편의 라이브러리로 형질전환시켜 변형된 미생물 세포를 형성시키는 단계,
    (2) 약물을 함유하는 배지 중에서 변형된 미생물을 전파시키고 생존 미생물을 회수하는 단계,
    (3) 생존 미생물 유래의 DNA를, 생존 미생물 유래의 DNA내 동족 분절과 일부 이상이 재조합되는 또 다른 DNA 단편의 라이브러리와 재조합하여 추가 변형된 미생물 세포를 생성시키는 단계,
    (4) 추가 변형된 미생물을 약물 함유 배지에서 전파시키고 추가 생존 미생물을 수집하는 단계,
    (5) 추가 생존 미생물이 약물에 대한 목적 내성도가 얻어질 때까지 필요한 만큼 단계 (3)과 (4)를 반복하고, 이와 같이 획득된 내성도와 획득에 필요한 단계 (3) 및 (4)의 반복 횟수가 병원성 미생물을 사멸시키는 약물 효능의 척도를 나타내는 것인 단계를 포함하여, 병원성 미생물 감염을 치료하는 약물의 효능을 예측하는 방법.
  58. 제57항에 있어서, 생존 미생물을 제1 수집물 및 제2 수집물로 분할하고, 제1 수집물 유래의 추가 DNA 라이브러리를 분리한 뒤, 제2 수집물을 추가 라이브러리로 형질전환시키는 단계를 더 포함하는 것이 특징인 방법.
  59. 제57항에 있어서, 추가 DNA 라이브러리가 다른 미생물에서 얻어지는 것인 방법.
  60. (a) 상이한 세포 집단을 제공하는 단계,
    (b) 세포간에 DNA가 교환되는 조건하에서 세포를 배양하여, 하이브리드 게놈을 가진 세포를 형성시키는 단계,
    (c) 이 세포 중에서 목적 성질의 획득에 대하여 개량된 세포를 선별 또는 선택하는 단계,
    (d) 세포가 목적 성질을 획득할 때까지 상이한 세포 집단을 형성하는 선택 또는 선별된 세포를 가지고 단계 (b) 및 (c)를 반복하는 단계를 포함하는, 목적 기능을 획득하기 위한 세포의 개량 방법.
  61. 제60항에 있어서, DNA가 접합에 의해 세포간에 교환되는 것이 특징인 개량 방법.
  62. 제60항에 있어서, DNA가 파지 매개의 형질도입에 의해 세포간에 교환되는 것이 특징인 개량 방법.
  63. 제60항에 있어서, DNA가 세포의 원형질 융합에 의해 세포간에 교환되는 것이 특징인 개량 방법.
  64. 제60항에 있어서, DNA가 세포의 유성 재조합에 의해 세포간에 교환되는 것이 특징인 개량 방법.
  65. 제60항에 있어서, DNA 라이브러리로 세포를 형질전환시키는 단계를 더 포함하는 것이 특징인 개량 방법.
  66. (1) 상이한 세포 집단의 원형질을 형성시키는 단계,
    (2) 원형질을 융합시켜 하이브리드 원형질을 형성시키고, 여기에서 원형질 유래의 게놈이 재조합하여 하이브리드 게놈을 형성시키는 단계,
    (3) 세포 재생을 촉진시키는 조건하에서 하이브리드 원형질을 항온배양하는 단계,
    (4) 목적 성질의 획득에 대하여 개량하여 재생된 세포를 분리하기 위하여 선택 또는 선별하는 단계,
    (5) 재생된 세포가 목적 성질을 획득할 때까지 단계 (4)에서 얻은 재생된 세포를 단계 (1)에서 원형질을 형성하는데 사용하여 단계 (1) 내지 (4)를 반복하는 단계를 포함하는, 목적 성질의 획득에 대한 세포의 개량 방법.
  67. 제66항에 있어서, 상이한 세포가 진균 세포이고, 재생된 세포가 진균 균사인 것이 특징인 개량 방법.
  68. 제66항에 있어서, 양친 게놈을 가진 세포 없이 하이브리드 게놈을 가진 재생 세포를 분리하기 위하여 선택 또는 선별하는 단계를 더 포함하는 것이 특징인 개량 방법.
  69. 제66항에 있어서, 세포의 제1 아집단이 제1 마커를 포함하고, 세포의 제2 아집단이 제2 마커를 포함하며, 이 제1 마커와 제2 마커를 모두 발현하는 재생된 세포를 동정하기 위하여 선별 또는 선택하는 단계를 더 포함하는 것이 특징인 개량 방법.
  70. 제66항에 있어서, 제1 마커가 막 마커이고 제2 마커가 유전자 마커인 것이 특징인 개량 방법.
  71. 제69항에 있어서,제1 마커가 이합체 효소의 제1 서브유닛이고 제2 마커가 이합체 효소의 제2 서브유닛인 것이 특징인 개량 방법.
  72. 제66항에 있어서, 원형질을 DNA 단편의 라이브러리로 1회 이상 형질전환시키는 단계를 더 포함하는 것이 특징인 개량 방법.
  73. 제72항에 있어서, DNA 단편이 제한 효소 부위를 수반하는 것이 특징인 개량 방법.
  74. 제66항에 있어서, 원형질을 자외선에 1회 이상 노출시키는 단계를 더 포함하는 것이 특징인 개량 방법.
  75. 제67항에 있어서, 원형질은 균사 또는 포자를 효소로 처리하여 얻는 것임이 특징인 개량 방법.
  76. 제67항에 있어서, 진균이 본래 세포벽 합성능이 없는 파괴되기 쉬운 균주로서, 원형질이 자발적으로 형성되는 것이 특징인 개량 방법.
  77. 제67항에 있어서, 세포벽 형성의 억제제로 균사를 처리하여 원형질을 형성시키는 단계를 더 포함하는 것이 특징인 개량 방법.
  78. 제66항에 있어서, 목적 성질이 단백질이나 2차 대사산물의 발현성인 것이 특징인 개량 방법.
  79. 제66항에 있어서, 목적 성질이 단백질이나 2차 대사산물의 발현성인 것이 특징인 개량 방법.
  80. 제79항에 있어서, 2차 대사산물이 탁솔인 것이 특징인 개량 방법.
  81. 제66항에 있어서, 목적 성질이 감수분열능인 것이 특징인 개량 방법.
  82. 제66항에 있어서, 목적 성질이 다른 균주와의 이핵접합체를 형성하는 화합성인 것이 특징인 개량 방법.
  83. 제67항에 있어서, 원형질이나 균사를 돌연변이제에 1회 이상 노출시키는 단계를 더 포함하는 것이 특징인 개량 방법.
  84. (a) 상이한 세포의 집단을 제공하는 단계,
    (b) 상이한 세포의 제1 아집단으로부터 DNA를 분리하여 이 DNA를 리포좀에 캡슐화하는 단계,
    (c) 상이한 세포의 제2 아집단으로부터 원형질을 형성시키는 단계,
    (d) 상기 리포좀과 원형질을 융합시켜 리포좀 중의 DNA가 원형질에 흡수되어 원형질의 게놈과 재조합되는 단계,
    (e) 재생 조건하에서 원형질을 항온배양하는 단계,
    (f) 목적 성질의 획득에 대하여 개량된 재생 또는 재생된 세포를 선택 또는 선별하는 단계,
    (g) 목적 성질의 획득에 대하여 개량된 세포를 가지고 단계 (a) 내지 (f)를 반복하여 단계 (a) 중의 상이한 세포의 집단을 형성시키는 단계를 포함하는, 목적 성질을 획득하기 위한 세포의 개량 방법.
  85. (a) 합성 염색체 중으로 클로닝된 DNA 단편 라이브러리를 세포 집단으로 도입시키는 단계,
    (b) 세포간에 유성 재조합이 일어나는 조건하에서 세포를 배양하여, 합성 염색체 중으로 클로닝된 DNA 단편을 세포 집단의 내인성 염색체의 상응하는 분절과 동종 재조합하고, 내인성 염색체는 서로 재조합시키는 단계,
    (c) 목적 성질을 획득하기 위하여 개량된 세포를 선별 또는 선택하는 단계를 포함하는 목적 성질을 획득하기 위한 세포의 개량 방법.
  86. 제89항에 있어서, 세포가 효모 세포이고 합성 염색체가 YAC인 것이 특징인 개량 방법.
  87. 제89항에 있어서, (d) 선별 또는 선택 단계에서 생존한 세포를, 세포간에 유성 재조합이 일어나고 내인성 염색체간에 추가 재조합이 일어나는 조건하에서 배양하는 단계,
    (e) 목적 성질의 획득에 대하여 개량된 추가 세포를 선별 또는 선택하는 단계,
    (f) 목적 성질이 획득될 때까지 필요한 만큼 단계 (d) 및 (e)를 반복하는 단계를 더 포함하는 것이 특징인 개량 방법.
  88. (a) 합성 염색체의 분리된 카피 중으로 각각 클로닝된, 분절 변형체의 라이브러리를 제공하는 단계,
    (b) 세포 집단 중으로 합성 염색체의 카피를 도입시키는 단계,
    (c) 세포간에 유성 재조합이 일어나고 변형체를 보유하는 합성 염색체의 카피간에 동종 재조합이 일어나는 조건하에서 세포를 배양하는 단계,
    (d) 목적 성질을 획득하기 위해 개량된 변형체를 선별 또는 선택하는 단계를 포함하는, 목적 성질을 획득하기 위한 DNA 분절의 개량 방법.
  89. 도 13에 도시된 클론 2, 클론 4, 클론 5, 클론 6 및 클론 13으로 구성된 군 중에서 선택되는 recA 단백질.
  90. 도 12에 도시된 클론 2, 클론 4, 클론 5, 클론 6 및 클론 13으로 구성된 군 중에서 선택되는 핵산 분절을 비롯하여 recA의 변형체를 암호하는 핵산 분절의 집단을 셔플링하여 재조합 분절을 생성시키는 단계,
    상기 클론 군 중에서 선택되는 핵산 분절에 비하여 재조합원성 활성이 증가된 재조합 분절을 선별 또는 선택하는 단계를 포함하여 재조합원성 활성을 증가시키기 위해 recA 단백질을 개량하는 방법.
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