MXPA00012522A - Evolución de células y organismos enteros mediante la recombinación de secuencias recursivas - Google Patents

Abstract

La invención ofrece métodos que emplean ciclos reiterativos de recombinación y selección/clasificación para la evolución de células y organismos enteros para la adquisición de las propiedades deseadas. Los ejemplos de estas propiedades incluyen una recombinogenicidad mejorada, numero de copia del genoma, y capacidad para la expresión y/o secreción de proteínas y metabolitos secundarios.

Description

EVOLUCIÓN DE CÉLULAS Y ORGANISMOS ENTEROS MEDIANTE LA RECOMBINACIÓN DE SECUENCIA RECURSIVA REFERENCIA CRUZADA CON SOLICITUD RELACIONADA Esta solicitud es una continuación parcial de la 09/116,188. La solicitud tema reclama la prioridad de esta solicitud anterior, que también se incorpora por referencia en su totalidad para todos los propósitos. CAMPO DE LA INVENCIÓN Esta invención se aplica al campo técnico de la genética molecular para desarrollar los genomas de células y organismos con el fin de adquirir propiedades nuevas y mejoradas . ANTECEDENTES La WO 98/31837 (PCT/US98/00852) ofrece una tecnología precursora para desarrollar el genoma de células y organismos enteros. Las personas capacitadas se darán cuenta de que la tecnología estipulada en la WO 98/31837 es fundamental para la destreza de las personas capacitadas para desarrollar rápidamente células y organismos enteros. Por ejemplo, el documento enseña una variedad de métodos recursivos para recombinar artificialmente ácidos nucleicos in vivo, incluyendo genomas enteros, y formas de seleccionar a los organismos recombinantes resultantes.

Esta habilidad para desarrollar genes artificialmente es de importancia fundamental. Por ejemplo, las células tienen cierto número de usos perfectamente establecidos en la biología molecular, en la medicina y en los procesos industriales. Por ejemplo, las células se utilizan comúnmente como huéspedes para manipular el ADN en procesos como la transformación y la recombinación. Las células se utilizan para la expresión de proteínas recombinantes codificadas mediante el ADN transformado/transfectado o introducido de otra forma en las células. Algunos tipos de células se utilizan como progenitoras para la generación de animales y plantas transgénitas . A pesar de que todos estos procesos son de rutina actualmente, antes de la tecnología proporcionada por la WO 98/31837, los genomas de las células utilizadas en estos procesos habían evolucionado poco a partir de los genomas de células naturales, y no se desarrollaban particularmente para la adquisición de propiedades nuevas o mejoradas para utilizarse en los procesos anteriores. Podrían utilizarse métodos adicionales para recombinar de manera recursiva ácido nucleicos in vivo y para seleccionar los recombinantes resultantes. La presente invención ofrece cierto número de métodos y composiciones nuevas y valiosas para la evolución del genoma entero y parcial .

COMPENDIO DE LA INVENCIÓN En un aspecto, la invención ofrece métodos para desarrollar una célula con el fin de adquirir una función deseada. Estos métodos incluyen, por ejemplo, introducir una biblioteca de fragmentos del ADN dentro de una pluralidad de células, mediante lo cual por lo menos uno de los fragmentos experimenta la recombinación con un segmento en el genoma o un episoma de las células para producir células modificadas. Opcionalmente, estas células modificadas se cultivan para incrementar la diversidad de la población celular recombinada resultante. Las células modificadas, o la población celular recombinada se clasifica posteriormente para seleccionar las células modificadas o recombinadas que se han desarrollado para la adquisición de la función deseada. El ADN de las células modificadas que se han desarrollado para la función deseada se recombina opcionalmente después con una biblioteca adicional de fragmentos del ADN, donde por lo menos uno de los cuales experimenta la recombinación con un segmento en el genoma o el episoma de las células modificadas para producir más células modificadas. Las células modificadas adicionales se clasifican posteriormente para más células modificadas que se han desarrollado posteriormente para la adquisición de la función deseada. Los pasos de la recombinación y la clasificación/selección se repiten según se requiera hasta que las células modificadas adicionales hayan adquirido la función deseada. En una forma de realización preferente, las células modificadas se recombinan de manera recursiva para incrementar la diversidad de las células antes de llevar a cabo cualquier paso de selección sobre cualquier célula resultante . En algunos métodos, la biblioteca o la biblioteca adicional de fragmentos de ADN se recubre con proteína recA para estimular la recombinación con el segmento del genoma. La biblioteca de fragmentos se desnaturaliza opcionalmente para producir ADN de una sola estirpe, que son templados para producir duplexos, algunos de los cuales contienen desemparejamientos en puntos de variación en los fragmentos. Los duplexos que contienen desemparejamientos se seleccionan opcionalmente mediante una cromatografía de afinidad para los MutS inmovilizados. Opcionalmente, la función deseada es la secreción de una proteína, y la pluralidad de células incluye además una construcción que codifica la proteína. La proteína es inactiva opcionalmente a menos que sea secretada, y las células modificadas adicionales se seleccionan opcionalmente para la función de la proteína. Opcionalmente, la proteína es tóxica para la pluralidad de células, a menos que sea secretada. En este caso, las células modificadas o modificadas posteriormente que se desarrollan para la adquisición de la función deseada se clasifican mediante la propagación de las células y la recuperación de las células supervivientes . En algunos métodos, las función deseada es una recombinación mejorada. En estos métodos, la biblioteca de fragmentos incluye algunas veces un racimo de genes que confieren de manera colectiva una capacidad de recombinación. La clasificación puede lograrse utilizando células que portan un gen que codifica un marcador cuya expresión es prevenida mediante la mutación removible mediante recombinación. Las células se clasifican por medio de su expresión del marcador resultante de la eliminación de la mutación mediante la recombinación . En algunos métodos, la pluralidad de las células son células vegetales y la propiedad deseada es una resistencia mejorada a un químico o un microbio. Las células modificadas o modificadas posteriormente (o plantas enteras) se exponen al químico o al microbio y las células modificadas o modificadas posteriormente que se han desarrollado para la adquisición de la función deseada se seleccionan por su capacidad para sobrevivir a la exposición. En algunos métodos, la pluralidad de células son células embriónicas de un animal, y el método incluye además la propagación de las células transformadas a los animales transgénicos.

La pluralidad de células pueden ser una pluralidad de microorganismos industriales que son enriquecidos para los microorganismos que son tolerantes a condiciones deseadas del proceso (calor, luz, radiación, pH seleccionado, presencia de detergentes u otros desnaturalizantes, presencia de alcoholes u otras moléculas orgánicas, etc.) . La invención incluye además métodos para llevar a cabo una recombinación in vivo . Por lo menos el primero y el segundo segmento de por lo menos un gen se introducen dentro de una célula, los segmentos difieren entre sí en por lo menos dos nucleótidos, mediante lo cual los segmentos se recombinan para producir una biblioteca de genes quiméricos. Un gen quimérico se selecciona de la biblioteca habiendo adquirido una función deseada. La invención proporciona además métodos para predecir la eficacia de un medicamento para tratar una infección viral . Estos métodos incluyen la recombinación de un segmento del ácido nucleico a partir de un virus, cuya infección es inhibida por medio de un medicamento, con por lo menos un segundo segmento del ácido nucleico proveniente del virus, donde el segundo segmento del ácido nucleico difiere del primer segmento del ácido nucleico en por lo menos dos nucleótidos, para producir una biblioteca de segmentos del ácido nucleico recombinante. Posteriormente, las células huésped se ponen en contacto con un grupo de virus que poseen genomas que incluyen los segmentos del ácido nucleico recombinante en un medio que contiene el medicamento, y los virus de progenie resultantes de la infección de las células huésped se recolectan. Un segmento del ADN recombinante a partir de un primer virus de progenie se recombina con por lo menos un segmento del ADN recombinante proveniente de un segundo virus de progenie para producir una biblioteca adicional de segmentos del ácido nucleico recombinante . Las células huésped se ponen en contacto con un grupo de virus que poseen genomas que incluyen la biblioteca adicional o los segmentos del ácido nucleico recombinante, en un medio que contiene el medicamento, y los virus de progenie adicionales son producidos por las células huésped. Los pasos de recombinación y selección se repiten, según se desee, hasta que un virus de progenie adicional ha adquirido un grado deseado de resistencia al medicamento, mediante lo cual el grado de resistencia adquirido y el número de repeticiones necesarias para adquirirlo proporcionan una medida de eficacia del medicamento para tratar el virus. Los virus se adaptan opcionalmente para desarrollarse en líneas celulares particulares . La invención proporciona métodos para predecir la eficacia de un medicamento para tratar una infección por medio de un microorganismo patógeno. Estos métodos incluyen la entrega de una biblioteca de fragmentos del ADN a una pluralidad de células de microorganismos, donde por lo menos algunas de las cuales experimentan la recombinación con segmentos en el genoma de las células para producir células de microorganismos modificados. Los microorganismos modificados se propagan en un medio que contiene el medicamento, y se recuperan los microorganismos sobrevivientes. El ADN de los microorganismos sobrevivientes se recombinan con una biblioteca adicional de fragmentos del ADN donde por lo menos algunos de los cuales experimentan la recombinación con segmentos cognados en el ADN de los microorganismos sobrevivientes para producir células de microorganismos modificados posteriormente. Los microorganismos modificados posteriormente se propagan en un medio que contiene el medicamento, y se recolectan los microorganismos sobrevivientes adicionales. Los pasos de recombinación y selección se repiten según sea necesario, hasta que el microorganismo sobreviviente adicional ha adquirido un grado deseado de resistencia al medicamento. El grado de resistencia adquirido y el número de repeticiones necesarios para adquirirlo proporcionan una medida de la eficacia del medicamento para matar al microorganismo patógeno . La invención proporciona además métodos para desarrollar una célula con el fin de adquirir una función deseada. Estos métodos incluyen proporcionar una población de células diferentes. Las células se cultivan bajo condiciones mediante las cuales el ADN se intercambia entre las células, formando células con genomas híbridos. Las células se clasifican o se seleccionan posteriormente para las células que se han desarrollado para la adquisición de una propiedad deseada. Los pasos del intercambio y la clasificación/selección del ADN se repiten, según sea necesario, con las células clasificadas/seleccionadas de un ciclo formando la población de diferentes células en el siguiente ciclo, hasta que una célula ha adquirido la propiedad deseada. Los mecanismos de intercambio del ADN incluyen la conjugación, transducción mediada por fagos, entrega de liposomas, fusión del protoplasto y la recombinación sexual de las células. Opcionalmente, una biblioteca de fragmentos del ADN puede transformarse o electroporan dentro de las células . Como puede observarse, algunos métodos para desarrollar una célula con el fin de adquirir una propiedad deseada se llevan a cabo mediante el intercambio mediado por protoplastos de ADN entre las células. Estos métodos incluyen la formación de protoplastos de una población de células diferentes. Los protoplastos se fusionan posteriormente para formar protoplastos híbridos, en los cuales los genomas de los protoplastos se recombinan para formar genomas híbridos . Los protoplastos híbridos se incuban bajo condiciones que promueven la regeneración de células. Las células regeneradas pueden recombinarse una o más veces (es decir, por medio de los protoplastos o cualquier otro método que combine los genomas de las células) para incrementar la diversidad de cualquier célula resultante. De preferencia, las células regeneradas se recombinan varias veces, por ejemplo, mediante la fusión de protoplastos para generar una población diversa de células. El siguiente paso es seleccionar o clasificar para aislar las células regeneradas que se han desarrollado para la adquisición de la propiedad deseada. Se repiten los pasos de intercambio y selección/clasificación del ADN, según sea necesario, con las células regeneradas en un ciclo que se utilizaron para formar los protoplastos en el siguiente ciclo hasta que las células regeneradas han adquirido la propiedad deseada. Los microorganismos industriales son una clase preferida de organismos para conducir los métodos anteriores. Algunos métodos incluyen además el paso de seleccionar o clasificar los protoplastos fusionados libres de protoplastos no fusionados de células parentales. Algunos métodos incluyen además un paso de seleccionar o clasificar los protoplastos fusionados con genomas híbridos libres de las células con genomas parentales. En algunos métodos, los protoplastos se suministran tratando células individuales, micelias o esporas con una enzima que degrada las paredes celulares. En algunos métodos, la cepa es un mutante que carece de capacidad para la síntesis de la pared celular intacta, y los protoplastos se forman de manera espontánea. En algunos métodos, los protoplastos se forman tratando las células en desarrollo con un inhibidor de la formación de la pared celular para generar los protoplastos. En algunos métodos, la propiedad deseada es la expresión y/o secreción de una proteína o metabolito secundario, como por ejemplo una enzima industrial, una proteína terapéutica, un metabolito primario como por ejemplo un ácido láctico o etanol, o un metabolito secundario como por ejemplo la eritromicina, ciclosporina A o taxol. En otros métodos, es la capacidad de la célula para convertir compuestos proporcionados a la célula para diferentes compuestos. En otros métodos más, la propiedad deseada es la capacidad para la meiosis. En otros métodos, la propiedad deseada es la compatibilidad para formar un heterocarión con otra cepa. La invención ofrece además métodos para desarrollar una célula para la adquisición de una propiedad deseada. Estos métodos incluyen proporcionar una población de diferentes células. El ADN se aisla de una primera subpoblación de las células diferentes y encapsuladas en liposomas. Los protoplastos se forman a partir de una segunda subpoblación de las diferentes células. Los liposomas se fusionan con los protoplastos, mediante lo cual el ADN de los liposomas es tomado por los protoplastos y se recombina con los genomas de los protoplastos. Los protoplastos se incuban bajo condiciones de regeneración. Las células en regeneración o regeneradas se seleccionan o se clasifican posteriormente para la evolución con el fin de lograr la propiedad deseada. La invención ofrece además métodos para desarrollar una célula para la adquisición de una propiedad deseada utilizando cromosomas artificiales. Estos métodos incluyen la introducción de una biblioteca de fragmentos del ADN clonada en un cromosoma artificial dentro de una población de células. Las células se cultivan posteriormente bajo condiciones mediante las cuales ocurre una recombinación sexual entre las células, y los fragmentos del ADN clonados dentro del cromosoma artificial se recombinan mediante la recombinación homologa con los segmentos correspondientes de cromosomas endógenos de las poblaciones de células, y los cromosomas endógenos se recombinan entre sí . Las células también pueden recombinarse por medio de conjugación. Cualquier pérdida resultante puede recombinarse por medio de cualquier método indicado en la presente, tantas veces como sea necesario, para generar un nivel deseado de diversidad en las células recombinantes resultantes. En cualquier caso, después de la generación de una biblioteca diversa de células, las células que se han desarrollado para la adquisición de la propiedad deseada se clasifican y/o seleccionan para una propiedad deseada. El método se repite posteriormente con células que se han desarrollado para la propiedad deseada en un ciclo formando la población de células diferentes en el siguiente ciclo. Aquí, una vez más, se llevan a cabo opcionalmente ciclos múltiples de recombinación in vivo antes de cualquier paso adicional de selección o clasificación. La invención ofrece además métodos para desarrollar un segmento del ADN clonado dentro de un cromosoma artificial para la adquisición de una propiedad deseada. Estos métodos incluyen proporcionar una biblioteca de variantes del segmento, cada variante clonada en copias separadas de un cromosoma artificial. Las copias del cromosoma artificial se introducen dentro de una población de células. Las células se cultivan bajo condiciones mediante las cuales ocurre la recombinación sexual entre células y se presenta una recombinación homologa entre copias del cromosoma artificial que porta las variantes. Las variantes se clasifican o seleccionan posteriormente para la evolución con el fin de lograr la adquisición de la propiedad deseada. La invención proporciona además proteínas recA hiperrecombinogénicas. Los ejemplos de estas proteínas son a partir de los clones 2, 4, 5, 6 y 13 mostrados en la Figura 13. El método también ofrece métodos para la agrupación y reproducción reiterativa de organismos superiores. En los métodos, se produce una biblioteca de organismos multicelulares diversos (por ejemplo, plantas, animales o similares) . Se proporciona un grupo de gametos machos junto con un grupo de gametos hembras . Por lo menos uno del grupo de machos o el grupo de hembras incluye una pluralidad de diferentes gametos derivados de diferentes cepas de una especie o diferentes especies. Los gametos machos se utilizan para fertilizar los gametos hembras. Por lo menos una porción de los gametos fertilizados resultantes se desarrollan en organismos viables de manera reproductiva. Estos organismos viables de manera reproductiva se cruzan (por ejemplo, mediante una agrupación en pares y la unión de los gametos macho y hembra como se indico anteriormente) para producir una biblioteca de organismos diversos. La biblioteca se selecciona posteriormente para un rasgo o propiedad deseada. La biblioteca de organismos diversos puede incluir una pluralidad de plantas como la Gramineae, Fetucoideae, Poacoideae, Agrostis, Phleum, Dactylis, Sorgum, Setaria, Zea, Oryza, Triticum, Sécale, Avena, Hordeum, Saccharum, Poa, Festuca, Stenotaphrum, Cynodon, Coix, Olyreae, Phareae, Compositae o Leguminosae. Por ejemplo, las plantas pueden ser, maíz, arroz, trigo, centeno, avenas, cebada, guisantes, habas, lentejas, cacahuates, semillas de hilaza, semillas de cautí, semillas aterciopeladas, semillas aterciopeladas, semillas de soya, trébol, alfalfa, lupino, arbejas, loto, trébol cloroso, gliana, haba de las Indias, sorgo, mijo, semilla de girasol, cañóla o similares. De igual forma, la biblioteca de organismos diversos puede incluir una pluralidad de animales como por ejemplo mamíferos no humanos, peces, insectos o similares. De manera opcional, una pluralidad de los miembros de la biblioteca seleccionados pueden cruzarse mediante la agrupación de gametos de los miembros seleccionados y cruzando de manera repetida cualquier organismo viable de manera reproductiva adicional resultante para producir una segunda biblioteca de organismos diversos (por ejemplo, mediante la división en pares de la agrupación y la reunión de gametos machos y hembras) . Aquí, una vez más, la segunda biblioteca puede seleccionarse para un rasgo o propiedad deseada, con los miembros seleccionados resultantes formando la base de una reproducción y selección de agrupaciones adicional . Una característica de la invención son las bibliotecas formadas por medio de estos métodos (o cualquier método anterior) . BREVE DESCRIPCIÓN DE LA ILUSTRACIÓN Figura 1: paneles A-D: Esquema para la mezcla in vi tro de genes. Figura 2 : Esquema para el enriquecimiento de secuencias desemparejadas utilizando MutS. Figura 3 : Esquema alternativo para enriquecer las secuencias desemparejadas utilizando MutS. Figura 4: Esquema para desarrollar genes de la hormona de crecimiento para producir peces más grandes. Figura 5 : Esquema para mezclar procariotas mediante la fusión de protoplastos. Figura 6 : Esquema para introducir un ciclo sexual en los hongos previamente incapaces de reproducción sexual . Figura 7 : Esquema general para mezclar los hongos mediante fusión de protoplastos. Figura 8 : Mezcla de hongos mediante la fusión de protoplastos con protoplastos generados mediante el uso de inhibidores de enzimas responsables de la formación de la pared celular. Figura 9 : Mezcla de hongos mediante la fusión de protoplastos utilizando cepas de hongos deficientes en la síntesis de la pared celular que forma espontáneamente protoplastos . Figura 10: Mezcla del genoma entero mediado por YAC de Saccharomyces cerevisiae y organismos relacionados.

Figura 11: Mezcla mediada por YAC de fragmentos grandes del ADN. Figura 12: Secuencias del ADN (A, B, C y D) de una proteína recA tipo silvestre y cinco variantes hiperrecombinogénicas de la misma. Figura 13 : Secuencias del aminoácido de una proteína recA tipo silvestre y cinco variantes hiperrecombinogénicas de la misma. Figura 14: Ilustración de combinatorialidad. Figura 15: Recombinación en pares repetida para accesar la progenie multimutante . Figura 16: Gráfica de adaptación contra espacio de la secuencia para tres diferentes estrategias de mutación. Figura 17: Gráficas de mutagénesis secuencial a sexual y recombinación recursiva sexual. Figura 18: Esquema para la recombinación no homologa. Figura 19: Esquema para la estrategia de división y agrupación. Figura 20, panel A: Esquema para la estrategia del marcador seleccionable/contraseleccionable . Figura 20, panel B: Esquema para la estrategia del marcador seleccionable/contraseleccionable para recA. Figura 21: Estrategia de regeneración de la planta para regenerar plantas tolerantes a las sales.

Figura 22 : Mezcla de genoma entero de genomas analizados (subclonados) . Figura 23: Esquema para la clonación ciega de genes homólogos . Figura 24: Mezcla de familia de alto rendimiento. Figura 25: Esquema y gráfica de recombinación en forma de agrupación. Figura 26: Esquema de fusión de protoplastos. Figura 27: Ensayo esquemático para la recombinación en forma de agrupación. Figura 28: Esquema del ensayo del halo y el sistema integrado. Figura 29: Plano esquemático que ilustra la reproducción agrupada recursiva de peces. Figura 30: Plano esquemático que ilustra la reproducción agrupada recursiva de plantas. Figura 31: Esquema para la mezcla de S. Colicolor. Figura 32 : Plano esquemático que ilustra el ensayo de actinorodina http. Figura 33 : Plano esquemático y tabla que ilustran la mezcla del genoma entero de cuatro cepas parentales. Figura 34: Plano esquemático de WGS a través de una mezcla del heteroduplexo organizado. DESCRIPCIÓN DETALLADA I . GENERALIDADES A. EL ENFOQUE BÁSICO La invención ofrece métodos para desarrollar artificialmente células con el fin de adquirir una propiedad nueva o mejorada mediante la recombinación de la secuencia recursiva. Brevemente, la recombinación de la secuencia recursiva implica ciclos sucesivos de recombinación para generar una diversidad molecular y de clasificación/selección para aprovechar la diversidad molecular. Es decir, una familia de moléculas del ácido nucleico se crea mostrando una secuencia sustancial y/o una identidad estructural, difiriendo sin embargo, con respecto a la presencia de mutaciones. Estas secuencias se recombinan posteriormente en cualesquiera de los formatos descritos con el fin de perfeccionar la diversidad de combinaciones mutantes representadas en la biblioteca recombinada resultante. Por lo general, cualquier ácido nucleico o genoma recombinante resultante se recombinan de manera recursiva para uno o más ciclos de recombinación con el fin de incrementar la diversidad de los productos resultantes. Después de este procedimiento de recombinación recursiva, los productos finales resultantes se clasifican y/o se seleccionan para un rasgo o propiedad deseada. De manera alternativa, cada ciclo de recombinación puede ser seguido por lo menos por un ciclo de clasificación o selección de las moléculas que poseen una característica deseada. En esta forma de realización, las moléculas seleccionadas en una ronda forman los materiales de inicio para generar la diversidad en la siguiente ronda. Las células que se desarrollarán pueden ser bacterias, arquebacterias, o células eucarióticas y pueden constituir una línea de células homogéneas o un cultivo mezclado. Las células adecuadas para la evolución incluyen las líneas celulares eucarióticas y bacterianas que se utilizan comúnmente en la ingeniería genética, la expresión de proteínas, o la producción o conversión industrial de proteínas, enzimas, metabolitos primarios, metabolitos secundarios, químicos finos, especializados o a granel. Las células de mamíferos adecuadas incluyen las de por ejemplo, ratones, ratas, hámsteres, primates y humanos, tanto líneas celulares como cultivos primarios. Estas células incluyen células impulsoras, incluyendo células impulsoras embrionarias y células impulsoras hemopoiéticas, cigotos, fibroblastos, linfocitos, ovario de hámster chino (CHO) , fibroblastos de ratón (NIH3T3) , células del riñon, hígado, músculo y piel . Otras células eucarióticas de interés incluyen células vegetales, como las del maíz, arroz, trigo, algodón, semilla de soya, caña de azúcar, tabaco y arabidopsis; peces, algas, hongos (penicillium, aspergillus, podospora, neurospora, saccharomyces) , insectos (por ejemplo, báculo lepidóptera) , levadura (picchia y saccharomyces , Schizosaccharomyces pombe) . También son de interés varios tipos de células bacterianas, tanto gram-negativas y grampositivas, como por ejemplo Bacillus subtilis, B. Licehniformis, B . Cereus, Escherichia coli , Streptomyces, Pseudomonas, Salmonella, Actinomycetes , Lactobacillus, Actoni tcbacter, Deinococcus, y Erwinia . Las secuencias del genoma completo de E. Coli y Bacillus subtilis son descritas por Blattner y colaboradores, Science (Ciencia) 277, 1454-1462 (1997); Kunst y colaboradores; Nature (Naturaleza) 390, 249-256 (1997) ) . La evolución se inicia mediante la generación de una población de células variables. Por lo general, las células en la población son del mismo tipo pero representan variantes de una célula progenitora. En algunos casos, la variación es natural como cuando se obtienen células diferentes de diferentes individuos dentro de una especie, de diferentes especies o de diferentes géneros. En otros casos, la variación es inducida mediante mutagénesis de una célula progenitora. La mutagénesis puede efectuarse sometiendo la célula a agentes mutagénicos, o si la célula es una célula mutadora (por ejemplo, tiene mutaciones en genes implicados en la duplicación, recombinación y/o reparación del ADN que favorece la introducción de mutaciones) propagando sencillamente las células imitadoras . Las células mutadoras pueden generarse a partir de selecciones sucesivas para cambios fenotípicos sencillos (por ejemplo, la adquisición de resistencia a rifampicina, posteriormente la resistencia al ácido nalidíxico, posteriormente lac- a lac+ (consultar Mao y colaboradores, J. Bacteriol (Boletín de Bacteriología) , 179,417-422 (1997)), o las células mutadoras pueden generarse mediante la exposición a inhibidores específicos de factores celulares que resultan en el fenotipo mutador. Éstos podrían ser inhibidores de mutS, MutL., mutD , recD, mutY, mutM, dam, uvrD y similares. De manera más general, las mutaciones son inducidas en poblaciones celulares utilizando cualquier técnica de mutación disponible. Los mecanismos comunes para inducir mutaciones incluyen, pero no se limitan a, el uso de cepas que incluyen mutaciones como las implicadas en la reparación de desmparejamientos, por ejemplo, las mutaciones en mutS, MutT., ?iutL y mutH; exposición a la luz ultravioleta; mutagénesis química, por ejemplo, el uso de inhibidores de MMR, genes inducibles por daño del ADN, o inductores SOS; sobreproducción/subproducción/mutación de cualquier componente del complejo/vía de recombinación homologa, por ejemplo, recA, ssb, etc.; sobreproducción/subproducción/ mutación de genes implicados en la síntesis/homeostasis del ADN; sobreproducción/subproducción/mutación de los genes de recombinación-estimulación a partir de bacterias, fagos (por ejemplo, función Lambda Roj ) , u otros organismos; adición de sitios chi dentro de/flanqueo de fragmentos del ADN donante; recubrimiento de fragmentos del ADN con recA/ssb y similares. En otros casos, la variación es el resultado de la transferencia de una biblioteca de fragmentos del ADN dentro de las células (por ejemplo, mediante conjugación, fusión de protoplastos, fusión de liposomas, transformación, transducción o competencia natural) . Por lo menos uno, y por lo general varios de los fragmentos en la biblioteca, muestran una cierta secuencia o identidad estructural, pero no completa, con un gen cognado o alélico dentro de las células suficiente para permitir que se lleve a cabo la recombinación homologa. Por ejemplo, en una forma de realización, la integración homologa de un plásmido que lleva un gen mezclado o una vía metabólica conduce a la inserción de las secuencias conducidas por los plasmidios adyacentes a la copia genómica. Opcionalmente, se utiliza una estrategia del marcador contraseleccionable para seleccionar los recombinantes en la cual la recombinación que ocurre entre las secuencias homologas conduce a la eliminación del marcador contraseleccionable. Esta estrategia se ilustra en la Figura 20A. Una variedad de marcadores seleccionables y contraseleccionables se ilustra ampliamente en la técnica. Para una lista de marcadores útiles, consul tar, Berg y Berg (1996) . Transposable element tools for microbial genetics (Herramientas del Elemento Transportable para la Genética Microbiana . Escherichia coli y Salmonella (Neidhardt, Washington, D.C., Prensa ASM, 2: 2588-2612; La Rossa, ibid, 2527-2587. Esta estrategia puede repetirse de manera recursiva para perfeccionar la diversidad de la secuencia de los genes enfocados antes de la clasificación/selección de un rasgo o propiedad deseada. La biblioteca de fragmentos puede derivarse de una o más fuentes. Una fuente de fragmentos es la biblioteca genómica de fragmentos de una especie diferente, tipo de célula, organismo o individuo a partir de las células transfectadas. En esta situación, muchos de los fragmentos en la biblioteca poseen un gen cognado o alélico en las células que se transforma pero que difiere del gen debido a la presencia de la variación de las especies que ocurren naturalmente, polimorfismos, mutaciones y la presencia de múltiples copias de ciertos genes homólogos en el genoma. De manera alternativa, la biblioteca puede derivarse a partir del ADN del mismo tipo de célula que se está transformando después de que este ADN ha estado sometido a una mutación inducida, mediante métodos convencionales, como por ejemplo la radiación, PCR propenso a error, crecimiento en un organismo mutador, mutagénesis del transposón, o mutagénesis de cásete. De manera alternativa, la biblioteca puede derivarse de una biblioteca genómica de fragmentos generados a partir del ADN genómico agrupado de una población de células que poseen las características deseadas. De manera alternativa, la biblioteca puede derivarse de una biblioteca genómica de fragmentos generados a partir del ADN genómico agrupado de una población de células que poseen las características deseadas. En cualesquiera de estas situaciones, la biblioteca genómica puede ser una biblioteca genómica completa o una biblioteca subgenómica que se deriva, por ejemplo, de un cromosoma seleccionado, o parte de un cromosoma o un elemento episomal dentro de una célula. De la misma forma que, o en lugar de estas fuentes de fragmentos del ADN, la biblioteca puede incluir fragmentos que representan variantes naturales o seleccionadas de genes seleccionados de función conocida (es decir, bibliotecas enfocadas) . El número de fragmentos en una biblioteca puede variar de un solo fragmento a aproximadamente 1010, siendo comunes las bibliotecas que poseen fragmentos de 103 a 108. Los fragmentos deben ser lo suficientemente grandes de tal forma que puedan someterse a una recombinación homologa y suficientemente cortos para que puedan introducirse dentro de una célula, y si es necesario, ser manipulados antes de la introducción. Los tamaños de fragmentos pueden variar desde aproximadamente 10 b a aproximadamente 2Omb. Los fragmentos pueden ser de una sola estirpe o de estirpe doble.

Los fragmentos pueden ser introducidos dentro de las células como genomas enteros o como componentes de virus, plasmidios, YACS, HACs ó BACs o pueden ser introducidos tal como están, en cuyo caso todos o la mayoría de los fragmentos carecen de un origen de duplicación. El uso de fragmentos virales con genomas de una sola estirpe ofrecen la ventaja de entregar fragmentos en forma de una sola estirpe, lo que promueve la recombinación. Los fragmentos también pueden unirse a un marcador selectivo antes de la introducción. La inclusión de fragmentos en un vector que posee un origen de duplicación enfrenta un período más largo de tiempo después de la introducción dentro de la célula en cuyos fragmentos puede llevarse a cabo la recombinación por un gen cognado antes de degradarse o seleccionarse contra y perderse de la célula, incrementando de esta manera la proporción de células con genomas recombinantes. De manera opcional, el vector es un vector suicida capaz de una existencia mayor que un fragmento de ADN aislado, pero que no es capaz de una retención permanente en la línea celular. Este vector puede expresar de manera transitoria un marcador durante un tiempo suficiente para clasificar o seleccionar una célula que lleve el vector (por ejemplo, porque las células trasducidas por el vector son el tipo de célula objetivo que debe clasificarse en ensayos de selección subsecuentes) , pero posteriormente se degradan o de otra forma es incapaz de expresar el marcador.

El uso de estos vectores puede ser ventajoso al llevar a cabo rondas subsecuentes opcionales de recombinación que se explicarán posteriormente. Por ejemplo, algunos vectores suicidas expresan una toxina de larga vida que es neutralizada por una molécula de vida corta expresada a partir del mismo vector. La expresión de la toxina por sí sola no permitirá que se establezca el vector. Jense & Gerdes, Mol . Microbiol . (Microbiología Molecular) , 17, 205-210 (1995); Bernard y colaboradores, Gene (Gen) 162, 159-160. De manera alternativa, un vector puede convertirse en suicida mediante la incorporación de un origen defectuoso de duplicación (por ejemplo, un origen de duplicación sensible a la temperatura) o mediante la omisión de un origen de duplicación. Los vectores también pueden convertirse en suicidas mediante la inclusión de marcadores de selección negativa, como por ejemplo ura3 en la levadura o sacB en varias bacterias. Estos genes se vuelven tóxicos únicamente en presencia de compuestos específicos. Estos vectores pueden seleccionarse para tener una amplia gama de estabilidades. Una lista de los defectos de duplicación condicionales para los vectores que pueden ser utilizados, por ejemplo, para convertir la duplicación del vector en defectuosa se encuentran, por ejemplo, en Berg y Berg (1996) , "Transposable element tools for microbial genetics" ("Herramientas del elemento transportable para la genética microbiana") Escherichia coli y Salmonella Neidhardt, Washington, D.C., Prensa ASM, 2: 2588-2612. De manera similar, una lista de marcadores contraseleccionables, aplicables por lo general para la selección del vector se encuentra también en Berg y Berg, id . Consul tar también, LaRossa (1996) "Mutant selections linking physiology, inhibitors, and genotypes" ("Selecciones de mutantes que enlazan la fisiología, los inhibidores y los genotipos") Escherichia coli y Salmonella F.C. Neidhardt, Washington, D.C., Prensa ASM, 2: 2527-2587. Después de la introducción dentro de las células, los fragmentos pueden reco binarse con el ADN presente en el genoma, o los episomas de las células mediante una recombinación homologa, no homologa o específica en el sitio. Para los propósitos actuales, la recombinación homologa presenta la contribución más significativa para la evolución de las células porque esta forma de recombinación amplifica la diversidad existente entre el ADN de las células que son transfectadas y los fragmentos del ADN. Por ejemplo, si un fragmento del ADN que es transfectado difiere de un gen cognado o alélico en dos posiciones, existen cuatro productos de recombinación posibles, y cada uno de estos productos de recombinación puede formarse en diferentes células en la población transformada. Por lo tanto, la recombinación homologa del fragmento duplica la diversidad inicial en este gen. Cuando varios fragmentos se recombinan con los genes cognados o alélicos correspondientes, la diversidad de los productos de recombinación con respecto a los productos de inicio incrementa se exponencialmente con el número de mutaciones . La recombinación da como resultado células modificadas que poseen genomas y/o episomas modificados. La recombinación recursiva antes de la selección incrementa además la diversidad de las células modificadas resultantes. Las células variadas, ya sea el resultado de la variación natural, mutagénesis o recombinación, se clasifican o se seleccionan para identificar un subgrupo de células que han evolucionado para la adquisición de una propiedad nueva o mejorada. La naturaleza de la clasificación, por supuesto, depende de la propiedad y los diversos ejemplos que se discutían posteriormente. Por lo general, la recombinación se repite antes de la clasificación inicial. Sin embargo, opcionalmente, la clasificación también puede repetirse antes de llevar a cabo los ciclos subsecuentes de recombinación. La severidad puede incrementarse en ciclos de clasificación repetidos . La subpoblación de células que sobreviven a la clasificación está sometido opcionalmente a una ronda posterior de recombinación. En algunos casos, la ronda posterior de recombinación se lleva a cabo mediante la propagación de las células bajo condiciones que permiten el intercambio de ADN entre las células. Por ejemplo, los protoplastos pueden formarse a partir de las células, puede permitirse su fusión, y pueden regenerarse. Las células con genomas recombinantes se propagan a partir de los protoplastos fusionados. De manera alternativa, el intercambio del ADN puede promoverse mediante la propagación de células o protoplastos en un campo eléctrico. Para las células que poseen un aparato de transferencia de conjugación, el intercambio del ADN puede promoverse propagando sencillamente las células. En otros métodos, la ronda posterior de recombinación se lleva a cabo mediante un enfoque de división y agrupación. Es decir, las células sobrevivientes se dividen en dos grupos. El ADN se aisla de un grupo, y si es necesario se amplifica, y después se transforma dentro del otro grupo. De acuerdo con esto, los fragmentos del ADN del primer grupo constituyen una biblioteca adicional de fragmentos y se recombinan con los fragmentos cognados en el segundo grupo resultante en la diversidad adicional. Un ejemplo de esta estrategia se ilustra en la Figura 19. Tal como se muestra, un grupo de bacterias mutantes, mejoramientos en un fenotipo deseado se obtiene y se divide. Los genes se obtienen de una mitad, por ejemplo, mediante PCR, clonando fragmentos genómicos aleatorios, mediante la infección con un fago de transducción y cultivando partículas de la transducción, o mediante la introducción de un origen de transferencia (OriT) de manera aleatoria dentro del cromosoma relevante para crear una población donante de células capaz de transferir fragmentos aleatorios mediante la conjugación a una población aceptante. Estos genes son mezclados posteriormente (in vitro mediante métodos conocidos o in vivo tal como se indica en la presente) , o sencillamente se clonan dentro de un vector de sustitución alélica (por ejemplo, uno que porte marcadores seleccionables y contraseleccionables) . La agrupación de genes se transforma posteriormente dentro de la otra mitad de la agrupación mutante original y los recombinantes se seleccionan y se clasifican para mejoramientos adicionales en el fenotipo. Estas mejores variantes se utilizan como punto de inicio para el siguiente ciclo. De manera alternativa, la recombinación recursiva mediante cualesquiera de los métodos indicados puede llevarse a cabo antes de la clasificación, incrementando de esta manera la diversidad de la población de células que deben clasificarse. En otros métodos, algunas o todas de las células que sobreviven a la clasificación son transfectadas con una biblioteca fresca de fragmentos de ADN, que puede ser la misma o diferente de la biblioteca utilizada en la primera ronda de recombinación. En esta situación, los genes en la biblioteca fresca se someten a recombinación con los genes cognados en las células sobrevivientes. Si los genes se introducen como componentes de un vector, la compatibilidad de este vector con cualquier vector utilizado en una ronda previa de transducción deberá tomarse en consideración. Si el vector utilizado en una ronda previa era un vector suicida, no existen problemas de incompatibilidad. Sin embargo, si el vector utilizado en una ronda previa no era un vector suicida, deberá utilizarse un vector que posea un origen de incompatibilidad diferente en la ronda subsecuente. En todos estos formatos, una recombinación adicional genera una diversidad adicional en el componente del ADN de las células, resultantes en células modificadas adicionales. Las células modificadas adicionales son sometidas a otra ronda de clasificación/selección de acuerdo con los mismos principios que la primera ronda. La clasificación/ selección identifica una subpoblación de células modificadas adicionales que han evolucionado posteriormente para la adquisición de la propiedad. Esta subpoblación de células puede estar sometida a rondas adicionales de recombinación y clasificación de acuerdo con los mismos principios, opcionalmente con la severidad de la clasificación implementada en cada ronda. A la larga, se identifican las células que han adquirido la propiedad deseada. II. DEFINICIONES El término cognado se refiere a una secuencia de genes que se relaciona de manera evolutiva y funcional entre las especies. Por ejemplo, en el genoma humano, el gen CD4 humano es el gen cognado del gen CD4 del ratón, ya que las secuencias y las estructuras de estos dos genes indican que son homólogos y que ambos genes codifican una proteína que funciona para señalar la activación de la célula T a través del reconocimiento del antígeno restringido por la clase II MHC. La clasificación, por lo general, es un proceso de dos pasos en donde el primero determina qué células expresan y cuáles no expresan un marcador o fenotipo de clasificación (o un nivel seleccionado del marcador o el fenotipo) , y después separa físicamente las células que poseen la propiedad deseada. La selección es una forma de clasificación en donde la identificación y la separación física se llevan a cabo de manera simultánea mediante la expresión de un marcador de selección, que, en algunas circunstancias genéticas, permite a las células que expresan el marcador sobrevivir mientras que las otras células mueren (o viceversa) . Los marcadores de clasificación incluyen la luciferaza, ß-galactosidasa, y proteína fluorescente verde. Los marcadores de selección incluyen genes de resistencia a medicamentos y toxinas . Un segmento de ADN exógeno es uno extraño (o heterólogo) a la célula u homólogo a la célula pero en una posición dentro del ácido nucleico de la célula huésped en donde el elemento no se encuentra ordinariamente . Los segmentos del ADN exógenos pueden expresarse para producir polipéptidos exógenos. El término "gen" se utiliza ampliamente para referirse a cualquier segmento del ADN asociado con una función biológica. Por lo tanto, los genes incluyen secuencias de codificación y/o las frecuencias regulatorias requeridas para su expresión. Los genes también incluyen segmentos del ADN no expresados que, por ejemplo, forman las secuencias de reconocimiento para otras proteínas. Los términos "idénticos" o "identidad porcentual", en el contexto de dos o más secuencias de ácidos nucleicos o polipéptidos, se refieren a dos o más secuencias o subsecuencias que son las mismas o que tienen un porcentaje especificado de residuos de aminoácido o nucleótidos que son los mismos, al compararse y alinearse para una correspondencia máxima, de acuerdo con lo medido utilizando uno de los siguientes algoritmos de comparación de secuencia o mediante inspección visual. La frase "substancialmente idénticas", en el contexto de dos ácidos nucleicos o polipéptidos, se refiere a dos o más secuencias o subsecuencias que tienen por lo menos el 60%, de preferencia el 80%, y de manera más preferente el 90-95% de identidad de residuos del aminoácido o nucleótido, al compararse y alinearse para una correspondencia máxima, de acuerdo con lo medido utilizando uno de los siguientes algoritmos de comparación de secuencia o mediante inspección visual. De preferencia, la identidad substancial existe sobre una región de las secuencias que es de por lo menos aproximadamente 50 residuos de longitud, de manera más preferente sobre una región de por lo menos aproximadamente 100 residuos, y de manera más preferente, las secuencias son substancialmente idénticas sobre por lo menos aproximadamente 150 residuos. En una forma de realización preferida, las secuencias son substancialmente idénticas sobre la longitud total de las regiones de codificación. Para la comparación de secuencias, por lo general una secuencia actúa como una secuencia de referencia, con la cual se comparan las secuencias de la prueba. Al utilizar un algoritmo de comparación de secuencias, las secuencias de prueba y de referencia se introducen a una computadora, se designan coordenadas de la subsecuencia, si es necesaria, y se designan los parámetros del programa del algoritmo de la secuencia. El algoritmo de comparación de la secuencia calcula entonces la identidad de la secuencia porcentual de las secuencias de prueba en relación con las secuencias de referencia, en base a los parámetros del programa designado. La alineación óptima de las secuencias para su comparación puede llevarse a cabo por ejemplo, mediante el algoritmo de homología local de Smith & Waterman, Adv. Appl . Math . (Matemáticas Aplicadas Avanzadas) 2:482 (1981), mediante el algoritmo de alineación de homología de Needleman & Wunsch, J. Mol . Biol . (Boletín de Biología Molecular) , 48:443 (1970), mediante la búsqueda de un método de similaridad de Pearson & Lipman, Proc . Nat 'l . Acad. Sci . USA (Procedimientos de la Academia Nacional de Ciencias EUA 85:2444 (1988), mediante la puesta en práctica computarizada de algoritmos GAP, BESTFIT, FASTA y TFASTA en el Paquete de Software de Genética de Wisconsin, Versión 7.0, Grupo de Cómputo de Genética, 575 Science Dr., Madison, Wl . Otro ejemplo de un algoritmo de alineación útil es PILEUP. PILEUP crea una alineación de secuencias múltiples a partir de un grupo de secuencias relacionadas utilizando alineaciones progresivas, en pares, para mostrar la relación y la identidad de la secuencia porcentual. También gráfica un árbol o dendograma que muestra las relaciones de los racimos utilizadas para crear la alineación. PILEUP utiliza una simplificación del método de alineación progresivo de Feng & Doolittle, J". Mol . Evol . (Boletín de Evolución Molecular) 35:351-360 (1987). El método utilizado es similar al método descrito por Higgins & Sharp, CABIOS 5:151-153 (1989). El programa puede alinear hasta 300 secuencias, cada una de una longitud máxima de 5,000 nucleótidos o aminoácidos. El procedimiento de alineación múltiple inicia con la alineación en pares de las dos secuencias más similares, produciendo un racimo de dos secuencias alineadas. Este racimo se alinea posteriormente a la siguiente secuencia más relacionada o racimo de secuencias alineadas. Dos racimos de secuencias se alinean mediante una extensión sencilla de la alineación en pares de dos secuencias individuales. La alineación final se logra mediante una serie de alineaciones progresivas, en pares. El programa se lleva a cabo designando secuencias específicas y las coordenadas de su aminoácido o nucleótido para regiones de comparación de secuencias y designando los parámetros del programa. Por ejemplo, una secuencia de referencia puede compararse con otras secuencias de prueba para determinar la relación de la identidad de la secuencia porcentual utilizando los siguientes parámetros: peso del intervalo por omisión (3.00), peso de la longitud del intervalo por omisión (0.10) e intervalos finales pesados. Otro ejemplo de algoritmo que es adecuado para determinar la identidad de la secuencia porcentual y la similaridad de la secuencia es el algoritmo BLAST, que se describe en Altschul y colaboradores, J. Mol . Biol . (Boletín de Biología Molecular) 215:403-410 (1990). El software para llevar a cabo los análisis del BLAST está disponible públicamente a través del National Center for Biotechnology Information (Centro Nacional para Información de Biotecnología) (http; //www.ncbi.nlm.nih.gov/) . Este algoritmo implica identificar primero los pares de secuencia de calificación más alta (HSPs) identificando palabras cortas de la longitud W en la secuencia de consulta, que ya sea concuerda con o satisface cierta clasificación T del umbral de valuación positiva al alinearse con una palabra de la misma longitud en una secuencia de la base de datos. T se refiere como el umbral de calificación de la palabra cercana (Altschul y colaboradores , consul tar arriba) . Estos golpes de palabras cercanas iniciales actúan como semillas para iniciar las búsquedas con el fin de encontrar HSPs más grandes que las contengan. Los golpes de palabras se extienden posteriormente en ambas direcciones a lo largo de cada secuencia hasta donde puede incrementarse la calificación de la alineación acumulada. Las calificaciones acumuladas se calculan utilizando, para las secuencias de nucleótidos, los parámetros M (calificación de recompensa para un par de residuos concordantes; siempre > 0) y N (calificación de penalidad para residuos desemparejados; siempre < 0) . Para las secuencias de aminoácidos, se utiliza una matriz de calificación para calcular la calificación acumulada. La extensión de los golpes de palabras en cada dirección se interrumpe cuando: la calificación de alineación acumulada cae por debajo de la cantidad X desde su valor máximo logrado; la calificación acumulada baja a cero o menos, debido a la acumulación de una o más alineaciones de residuos de calificación negativa; o se alcanza el extremo de cualquier secuencia. Los parámetros W, T y X del algoritmo BLAST determinan la sensibilidad y velocidad de la alineación. El programa BLASTN (para secuencias de nucleótidos) utiliza como valores por omisión una longitud de palabra (W) de 11, una expectativa (E) de 10, M=5, N=-4, y una comparación de ambas estirpes. Para las secuencias del aminoácido, el programa BLAST utiliza como valores por omisión una longitud de palabra (W) de 3, una expectativa (E) de 10, y la matriz de calificación BLOSUM62 ( consul tar Henikoff & Henikoff, Proc . Nati . Acad. Sci . USA (Procedimientos de la Academia Nacional de Ciencias EUA 89:10915 (1989) ) . Además de calcular la identidad de la secuencia porcentual, el algoritmo BLAST también lleva a cabo un análisis estadístico de la similaridad entre dos secuencias ( consul tar, por ejemplo, Karlin & Altschul, Proc . Nati . Acad. Sci . USA (Procedimiento de la Academia Nacional de Ciencias EUA 90:5873-5787 (1993)). Una medida de similaridad proporcionada por el algoritmo BLAST es la probabilidad de la suma más pequeña (P(N)), que proporciona un indicio de la probabilidad mediante la cual podría ocurrir una concordancia por casualidad entre dos secuencias de nucleótidos o aminoácidos. Por ejemplo, un ácido nucleico se considera similar a una secuencia de referencia si la probabilidad de la suma más pequeña en una comparación del ácido nucleico de la prueba con el ácido nucleico de referencia es menor a aproximadamente 0.1, de preferencia menor a 0.01, y de manera más preferente menor a aproximadamente 0.001. Un indicio adicional de que dos secuencias del ácido nucleico o polipéptidos son substancialmente idénticas es que el polipéptido codificado por el primer ácido nucleico tiene una reacción cruzada inmunológicamente con el polipéptido codificado por el segundo ácido nucleico, tal como se describe posteriormente. De esta manera, un polipéptido es por lo general substancialmente idéntico a un segundo polipéptido, por ejemplo, cuando los dos péptidos difieren únicamente en las sustituciones conservadoras. Otro indicio de que dos secuencias del ácido nucleico son substancialmente idénticas es que las dos moléculas se hibridan entre sí bajo condiciones severas. El término "de ocurrencia natural" se utiliza para describir un objeto que puede encontrarse en la naturaleza. Por ejemplo, una secuencia de un polipéptido o polinucleótido que está presente en un organismo (incluyendo virus) que puede aislarse de una fuente en la naturaleza y que no ha sido modificado intencionalmente por el hombre en el laboratorio de ocurrencia natural. Por lo general, el término de ocurrencia natural se refiere a un objeto tal como está presente en un individuo no patológico (sin enfermedad) , lo cual sería típico para las especies.

La recombiniación asexual es la recombinación que ocurre sin la fusión de gametos para formar un cigoto. Una "cepa deficiente de reparación de desemparejamiento" puede incluir cualquier mutante en cualquier organismo trastornado en las funciones de reparación de desemparejamiento. Éstos incluyen productos del gen mutante de mutS, mutT, mutH, Mult . OvrD, dem, vsr, umuC, umuD, sbcB, recJ, etc. El deterioro se logra por mutación genética, sustitución alélica, inhibición selectiva por medio de un reactivo agregado como por ejemplo un pequeño compuesto o un ARN antisentido expresado, u otras técnicas. El deterioro puede ser en los genes observados, o en los genes homólogos en cualquier organismo. III. VARIACIONES A. FRAGMENTOS DE RECUBRIMIENTO CON PROTEÍNA RECA La frecuencia de la recombinación homologa entre los fragmentos de la biblioteca y los genes endógenos cognados puede incrementarse mediante el recubrimiento de los fragmentos con una proteína recombinogénica antes de la introducción a las células. Consultar Pati y colaboradores, Molecular Biology of Cáncer (Biología Molecular del Cáncer) 1, 1 (1996) ; Sena & Zarling, Nature Genetics (Genética de la Naturaleza) 3, 365 (1996); Revet y colaboradores, J". Mol . Biol . (Boletín de Biología Molecular) 232, 779-791 (1993); Kowalczkowski Se Zarling en Gene Targeting (Enfoque de Genes) (CRC 1995), Capítulo 7. La proteína recombinogénica promueve el apareamiento homólogo y/o el intercambio de estirpe. La mejor proteína recA caracterizada proviene de E. coli y está disponible en Pharmacia (Piscataway, NJ) . Además de la proteína tipo silvestre, se han identificado cierto número de proteínas mutantes similares a recA (por ejemplo, recA803). Además, muchos organismos poseen recombinasas similares a recA con actividades de transferencia de estirpe (por ejemplo, Ogawa y colaboradores, Cold Spring Harbor Symposium on Quanti tative Biology (Simposio de Cold Spring Harbor sobre Biología Cuanti tativa) 18, 567-576 (1993); Jonson & Symington, Mol . Cell . Biol . (Biología Celular Molecular) 15, 4843-4850 (1995); Fugisawa y colaboradores, Nucí . Acids Res . (Investigación de Ácidos Nucleicos) 13, 7473 (1985); Hsieh y colaboradores, Cell (Célula) 44,885 (1986); Hsieh y colaboradores, J". Biol . Chem. (Boletín de Biología Química) 264,5089 (1989); Fishel y colaboradores, Proc . Nati . Acad. Sci . USA (Procedimientos de la Academia Nacional de Ciencias USA) 85,3683 (1988); Cassuto y colaboradores, Mol . Gen . Genet . (Genética General y Molecular) 208,10 (1987); Ganea y colaboradores, Mol . Cell Biol . (Biología Celular Molecular) 7,3124 (1987); Moore y colaboradores, J". Biol . Chem. (Boletín de Biología Química) 19,11108 (1990); Keenee y colaboradores, Nucí . Acids Res . (Investigación de Ácidos Nucleicos) 12,3057 (1984) ; Kimiec, Cold Spring Harbor Sy p . (Simposio de Cold Spring Harbor) 48,675 (1984); Kimeic, Cell (Célula) 44,545 (1986); Kolodner y colaboradores, Proc. Nati. Acad. Sci. USA (Procedimientos de la Academia Nacional de Ciencias EUA 84,5560 (1987); Sugino y colaboradores, Proc. Nati. Acad. Sci. USA (Procedimientos de la Academia Nacional de Ciencias EUA) 85,3683 (1985); Halbrook y colaboradores, J. Biol. Chem. (Boletín de Biología Química) 264,21403 (1989); Eisen y colaboradores, Proc. Nati. Acad. Sci. USA (Procedimientos de la Academia Nacional de Ciencias EUA) ; McCarthy y colaboradores, Proc. Nati. Acad. Sci. USA (Procedimientos de la Academia Nacional de Ciencias EUA) ; Lowenhaupt y colaboradores, J. Biol. Chem. (Boletín de Biología Química) 264,20568 (1989) . Los ejemplos de estas proteínas de recombinasa incluyen recA, recA803, uvsX, (Roca, A.I., Crit. Rev. Biochem. Molec . Biol. (Criterios de Revisión de Bioquímica y Biología Molecular) , sepl (Kolodner y colaboradores, Proc. Nati. Acad. Sci. (U.S. A.) (Procedimientos de la Academia Nacional de Ciencias (E.U.A.) 84,5560 (1987); Tishkoff y colaboradores, Molec. Cell. Biol. (Biología Celular y Molecular) 11,2593); RuvC (Dunderdale y colaboradores, Nature (Naturaleza) 354,506 (1991)), DST2 , KEM1, XRN1 (Dykstra y colaboradores, Molec. Cell. Biol. (Biología Celular y Molecular) 11,2576 (1991)), HPP-1 (Moore y colaboradores, Proc. Nati. Acad. Sci. (U.S. A.) (Procedimiento de la Academia Nacional de Ciencias) (E.U.A.) 88,9067 (1991)), otras recombinasas eucarióticas (Bishop y colaboradores, Cell (Célula) 69,439 (1992); Shinohara y colaboradores, Cell (Célula) 69,457. La proteína recA forma un filamento de nucleoproteína cuando recubre un ADN de estirpe única. En este filamento de nucleoproteína, un monómero de proteína recA se enlaza a aproximadamente 3 nucleótidos. Esta propiedad de recA para recubrir el ADN de una sola estirpe es esencialmente independiente de la secuencia, a pesar de que las secuencias particulares favorecen la carga inicial de recA dentro de un polinucleótido (por ejemplo, secuencias de nucleación) . Los filamentos de nucleoproteína pueden formarse en casi cualquier ADN que tenga que mezclarse y puede formar complejos tanto con ADN de una sola estirpe como ADN de doble estirpe en células procarióticas y eucarióticas. Antes de ponerse en contacto con recA u otra recombinasa, los fragmentos con frecuencia se desnaturalizan, por ejemplo, mediante un tratamiento térmico. La proteína recA se agrega posteriormente a una concentración de aproximadamente 1-10 µM. Después de la incubación, el ADN de una sola estirpe recubierto con recA se introduce dentro de células receptoras mediante métodos convencionales, como la transformación química o la electroforesis. En general, puede desearse recubrir el ADN con una recA homologa aislada del organismo dentro de la cual se entrega el ADN recubierto. La recombinación implica varios factores celulares y la recA huésped equivalente por lo general interactúa mejor con otros factores huéspedes que con moléculas recA que están menos relacionadas estrechamente. Los fragmentos experimentan una recombinación homologa con los genes endógenos cognados. Debido a la frecuencia creciente de la recombinación provocada por el recubrimiento de la recombinasa, los fragmentos no necesitan introducirse como componentes de los vectores. Los fragmentos algunas veces se recubren con otras proteínas enlazadoras del ácido nucleico que promueven la recombinación, protegen a los ácidos nucleicos de la degradación, o enfocan los ácidos nucleicos al núcleo. Los ejemplos de estas proteínas incluyen Agrobacterium virE2 (Durrenberger y colaboradores, Proc . Nati . Acad. Sci . USA (Procedimientos de la Academia Nacional de Ciencias EUA) . De manera alternativa, las cepas del receptor son deficientes en la actividad de la RecD. Los extremos de una sola estirpe también pueden generarse mediante la actividad de la exonucleasa 3' -5' o las enzimas de restricción que producen proyecciones de 5 A 1. Selección de MutS La proteína de reparación de desemparejamiento del E. coli MutS puede utilizarse en la cromatografía por afinidad para enriquecer fragmentos de ADN de doble estirpe que contengan por lo menos una base de desemparejamiento. La proteína MutS reconoce la burbuja formada por las estirpes individuales aproximadamente en el punto del desemparejamiento. Consultar, por ejemplo, Hsu S Chang, WO 9320233. La estrategia de la afinidad que enriquece los duplexos desemparejados parcialmente puede incorporarse en los métodos actuales para incrementar la diversidad entre una biblioteca entrante de fragmentos y los genes cognados o alélicos correspondientes en las células receptoras. La Figura 2 muestra un esquema en el cual se utiliza la MutS para incrementar la diversidad. Los substratos del ADN para el enriquecimiento son substancialmente similares entre sí pero difieren en unos cuantos sitios. Por ejemplo, los' sustratos del ADN pueden representar genomas completos o parciales (por ejemplo, una biblioteca de cromosomas) a partir de individuos diferentes donde las diferencias se deben a los polimorfismos. Los substratos también pueden representar mutantes inducidos de una secuencia de tipo silvestre. Los substratos del ADN se agrupan, se digieren mediante restricción y se desnaturalizan para producir fragmentos de ADN de una sola estirpe. Posteriormente, se permite que el ADN de una sola estirpe vuelva a recocerse por segunda vez. Algunos fragmentos de una sola estirpe se vuelven a recocer con una estirpe complementaria perfectamente emparejada para generar duplexos perfectamente concordantes. Otros fragmentos de una sola estirpe se recuecen para generar duplexos desemparejados. Los duplexos desemparejados son enriquecidos a partir de duplexos perfectamente emparejados mediante la cromatografía de MutS (por ejemplo, con MutS inmovilizadas en cuentas) . Los duplexos desemparejados recuperados mediante cromatografía se introducen en células receptoras para la recombinación con genes endógenos cognados tal como se describió anteriormente . La cromatografía por afinidad de MutS incrementa la proporción de fragmentos que difieren entre sí y el gen endógeno cognado. De esta manera, la recombinación entre los fragmentos entrantes y los genes endógenos da como resultado una mayor diversidad. La Figura 3 muestra una segunda estrategia para el enriquecimiento de MutS. En esta estrategia, los substratos para el enriquecimiento de MutS representan variantes de un segmento relativamente corto, por ejemplo, un gen o racimo de genes, en donde la mayoría de las variantes diferentes difieren en no más de un solo nucleótido. El objetivo del enriquecimiento de MutS es producir substratos para la recombinación que contenga más variaciones que las secuencias que ocurren en la naturaleza. Esto se logra fragmentando los substratos de manera aleatoria para producir fragmentos superpuestos. Los fragmentos son desnaturalizados y recocidos por segunda vez como la primera estrategia. El segundo recocido genera ciertos duplexos desemparejados que pueden separarse de los duplexos perfectamente emparejados mediante la cromatografía por afinidad de MutS. Tal como se indicó antes, la cromatografía de MutS enriquece los duplexos que portan por lo menos un solo desemparejamiento. Los duplexos desemparejados se vuelven a ensamblar posteriormente en fragmentos más grandes. Esto se logra mediante ciclos de desnaturalización, recocido, y extensión de la cadena y los duplexos parcialmente recocidos (consultar Sección V) . Después de varios de estos ciclos, se logran fragmentos de la misma longitud que los substratos originales, con excepción de que estos fragmentos difieren entre sí entre sitios múltiples. Estos fragmentos se introducen posteriormente a las células donde experimentan una recombinación con genes endógenos cognados . 2. Selección Positiva paira el Intercambio Alélico La invención proporciona además métodos para enriquecer las células que portan genes modificados en relación con las células de inicio. Esto puede lograrse introduciendo una biblioteca de fragmentos de ADN (por ejemplo, un solo segmento específico o una biblioteca genómica entera o parcial) en un vector suicida (es decir, que carece de un origen de duplicación funcional en tipo de célula receptora) que contenga marcadores de selección tanto positivos como negativos. Opcionalmente, pueden clonarse bibliotecas de fragmentos múltiples de diferentes fuentes (por ejemplo, B. Subtilis, B. Licheniformis y B. Cereus) dentro de diferentes vectores que portan diferentes marcadores de selección. Los marcadores de selección positiva adecuados incluyen neoR, kanamicinaR, hyg, isD, gpt, ble, tetR. Los marcadores de selección negativa adecuados incluyen sv-tk, pret, gpt, SacB ura3 y deaminasa de citosina. Una variedad de ejemplos de vectores de duplicación condicionales, mutaciones que afectan la duplicación del vector, vectores de rango de huésped limitado, y marcadores contraseleccionables se encuentran en Berg y Berg, consul tar arriba, y LaRossa, ibid, y las referencias a los mismos. En un ejemplo, un plasmidio con orígenes R6K y fl de duplicación, Se utilizó un marcador seleccionable postiviamente (beta-lactamasa) , y un marcador contraseleccionable (B. subtilis sacB) . La transducción M13 de plasmidios que contenían genes clonados se recombinó de manera eficiente en la copia cromosómica de este gen en una cepa de E. coli mutante rep . Otra estrategia para aplicar la selección negativa es incluir . un gen rpsL de tipo silvestre (que codifica la proteína ribosómica S12) en un vector para utilizar en células con un gen rpsL mutante que confiere resistencia a la estreptomicina. La forma mutante del rpsL es recesiva en células posee rpsL de tipo silvestre. Por lo tanto, la selección para la resistencia Sm selecciona contra células que poseen una copia de tipo silvestre de rpsL. Consultar Skorupski & Taylor, Gene (Gen) 169, 47-52 (1996) . Alternativamente, los vectores que portan únicamente un marcador de selección positiva pueden utilizarse con una ronda de selección para las células que expresan el marcador, y una ronda subsecuente de clasificación para las células que han perdido el marcador (por ejemplo, clasificación para la sensibilidad del medicamento) . La clasificación para las células que han perdido el marcador de selección positiva equivale a la clasificación contra la expresión de un marcador de selección negativa. Por ejemplo, el Bacilo puede transformarse con un vector que porta un gen CAT y una secuencia que debe integrarse. Consultar Harwood & Cutting, Molecular Biological Methods for Facillus (Métodos Biológicos Moleculares para Bacilos) , en las páginas 31-33. La selección para la resistencia al cloranfenicol aisla las células que han absorbido el vector. Después de un período adecuado para permitir la recombinación, la selección para la sensibilidad CAT aisla las células que han perdido el gen CAT. Aproximadamente el 50% de estas células habrán experimentado la recombinación con la secuencia que debe ser integrada. Los vectores suicidas portan un marcador de selección positiva y opcionalmente, un marcador de selección negativa y un fragmento de ADN pueden integrarse dentro del ADN cromosómico huésped mediante un cruce sencillo en un sitio en el ADN cromosómico homólogo al fragmento. La recombinación genera un vector integrado flanqueado por repeticiones directas de la secuencia homologa. En algunas células, la reco binación subsecuente entre las repeticiones da como resultado la excisión del vector y ya sea la adquisición de una mutación deseada a partir del vector por medio del genoma o la restauración del genoma al tipo silvestre. En los métodos actuales, después de la transferencia de la biblioteca de genes clonada en un vector adecuado, la selección positiva se aplica para la expresión del marcador de selección positiva. Debido a que las copias no integradas del vector suicida se eliminan rápidamente de las células, esta selección enriquece las células que han integrado el vector dentro del cromosoma huésped. Las células que sobreviven a la selección positiva pueden propagarse posteriormente y ser sometidas a una selección negativa, o clasificarse para la pérdida del marcador de selección positiva. La selección negativa realiza una selección contra las células que expresan el marcador de selección negativa. De estas manera, las células que han retenido el vector integrado expresan el marcador negativo y se eliminan de manera selectiva. Las células que sobreviven ambas rondas de selección son aquellas que se integraron inicialmente y posteriormente eliminaron el vector. Estas células son enriquecidas para las células que poseen genes modificados mediante la recombinación homologa con el vector. Este proceso se diversifica mediante un intercambio sencillo de información genética. Sin embargo, si el proceso se repite ya sea con los mismos vectores o con una biblioteca de fragmentos generados mediante el PCR del ADN agrupado a partir de la población recombinante enriquecida, da como resultado la diversidad de los genes enfocados que mejoran exponencialmente cada ronda de la recombinación. Este proceso puede repetirse de manera recursiva, realizando la selección según se desee. 3. Perfeccionamiento Individualizado de los Genes En general, los métodos anteriores no requieren el conocimiento del número de genes que deben perfeccionarse, su ubicación en el mapa o su función. Sin embargo, en algunos casos, puede explotarse si está disponible esta información para uno o más genes. Por ejemplo, si la propiedad que va a adquirirse mediante evolución es una recombinación mejorada de células, un gen que probablemente es importante es el recA, aún cuando muchos otros genes, conocidos y desconocidos, pudieran realizar contribuciones adicionales. En esta situación, el gen recA puede desarrollarse, por lo menos parcialmente, de manera separada a los demás genes candidatos. El gen recA puede desarrollarse mediante cualesquiera de los métodos de la recombinación recursiva descritos en la Sección V. De manera breve, este enfoque incluye la obtención de formas diversas del gen recA, permitiendo que las formas se recombinen, seleccionar recombinantes que poseen propiedades mejoradas, y someter los recombinantes o ciclos adicionales de recombinación y selección. En cualquier punto del mejoramiento individualizado de recA, las formas diversas de recA pueden agruparse con fragmentos que codifican otros genes en una biblioteca que se utilizará en los métodos generales descritos en la presente. De esta manera, la biblioteca se siembra para incluir una proporción mayor de variantes en un gen conocido como importante para la propiedad que se busca adquirir, que sería el caso de otra forma. En un ejemplo (ilustrado en la Figura 20B) , se construye un plasmidio transportando una versión no funcional (mutada) de un gen cromosómico como el URA3 , donde el gen de tipo silvestre confiere sensibilidad a un medicamento (en este caso ácido 5-fluoroorótico) . El plasmidio también transporta un marcador seleccionable (resistencia a otro medicamento como la canamicina) , y una biblioteca de variantes recA. La transformación del plasmidio dentro de la célula da como resultado la expresión de los variantes recA, algunos de los cuales catalizarán la recombinación homologa a una velocidad creciente. Aquellas células en donde se presentó la recombinación homologa son resistentes al medicamento seleccionable en el plasmidio, y al ácido 5- fluoroorótico debido a la disrupción de la copia cromosómica de este gen. Las variantes recA que proporcionan los porcentajes más altos de recombinación homologa son los representados en la parte más alta de una agrupación de recombinantes homólogos . Los genes recA mutantes pueden aislarse de este grupo mediante PCR, volver a mezclarse, clonarse otra vez dentro del plásmido y puede repetirse el proceso. Pueden insertarse otras secuencias en lugar de recA para desarrollar otros componentes del sistema de recombinación homologa. 4. Recolección de Substratos del ADN para la Mezcla En algunos métodos de mezclado, los substratos de ADN se aislan de fuentes naturales y no son manipulados fácilmente por el ADN que modifica o polimeriza las enzimas debido a las impurezas recalcitrantes, que envenenan las reacciones enzimáticas. Estas dificultades pueden evitarse procesando los substratos del ADN a través de una cepa de recolección. La cepa de recolección es por lo general un tipo de célula con competencia natural y una capacidad para la recombinación homologa entre secuencias con diversidad substancial (por ejemplo, secuencias que muestran únicamente el 75% de identidad de la secuencia) . La cepa de recolección transporta un vector que codifica un marcador de selección efectiva flanqueado por dos segmentos que son respectivamente complementarios a dos segmentos que flanquean un gen u otra región de interés en el ADN de un organismo meta. La cepa de recolección se pone en contacto con fragmentos del ADN del organismo meta. Los fragmentos son absorbidos por competencia natural, u otros métodos descritos en la presente, y una fragmento de interés del organismo meta se recombina con el vector de la cepa de recolección provocando la pérdida del marcador de selección negativa. La selección contra el marcador negativo permite el asilamiento de las células que han absorbido el fragmento de interés. La mezcla puede llevarse a cabo en la cepa del recolector (por ejemplo, una cepa RecE/T) o el vector puede ser aislado de la cepa del recolector para la mezcla in vitro o la transferencia a un tipo de célula diferente para la mezcla in vivo. De manera alternativa, el puede ser transferido a un tipo de célula diferente mediante conjugación, fusión de protoplastos o electrofusión. Un ejemplo de una cepa del recolector adecuada es Acinetobacter calcoaceticus mutS . Melnikov y Youngman, (1999) Nucí Acid Res (Investigación del Ácido Nucleico) 27 (4) : 1056-1062. Esta cepa es competente de manera natural y absorbe el ADN de una manera no específica de la secuencia. También, debido a la mutación de mutS, esta cepa es capaz de la recombinación homologa de secuencias que muestran únicamente el 75% de identidad de la secuencia. IV. APLICACIONES A. RECOMBINOGENICIDAD Un objetivo de la evolución de la célula entera es generar células que posean una capacidad mejorada para la recombinación. Estas células son útiles para una variedad de propósitos en la genética molecular que incluyen los formatos in vivo de la recombinación de la secuencia recursiva descrita en la Sección V. Casi treinta genes (por ejemplo, recA, recB, recC, recD, recE, recF, recG, recO, recQ, recR, recT, ruvA, ruvB, ruvC, sbcB, ssb, topA, gyrA y B, lig, polA, uvfD, E, recL, mutD, mutH, mutL, mut? , mutü , helO) y sitios del ADN (por ejemplo, chi , recN, sbcC) implicados en la recombinación genética han sido identificados en E. coli , y se han descubierto formas cognadas de varios de estos genes en otros organismos (por ejemplo, rad51, rad55-rad57, Dmcl en la levadura (consultar Kowalczykowski y colaboradores, Microbiol . Rev. (Revisión de Microbiología) 58, 401-465 (1994) ; Kowalczkowski & Zarling, consultar arriba) y se han identificado homólogos humanos de Rad51 y Dmcl (consultar Sandler y colaboradores, Nucí . Acids Res . (Investigación de Ácidos Nucleicos) 24, 2125-2132 (1996)). Por lo menos algunos de los genes de E. coli , incluyendo recA son funcionales en las células de mamíferos, y pueden enfocarse para el núcleo para una fusión con la secuencia de enfoque nuclear del antígeno T grande SV40 (Reiss y colaboradores, Proc . Nati . Acad . Sci . USA (Procedimientos de la Academia Nacional de Ciencias E. U.A . ) 93, 3094-3098 (1996)). Además, las mutaciones en genes de reparación de desemparejamiento, como por ejemplo muth, mu tS , utH, mutT suavizan los requerimientos de homología y permiten una recombinación entre secuencias más divergentes (Rayssiguier y colaboradores, Nature (Naturaleza) 342, 396-401 (1989)). El grado de recombinación entre las cepas divergentes puede mejorarse deteriorando los genes de reparación de desemparejamiento y estimulando los genes SOS. Esto puede lograrse mediante el uso de cepas mutantes apropiadas y/o el desarrollo bajo condiciones de tensión metabólicas, que se ha descubierto que estimulan el SOS e inhiben a los genes de reparación de desemparejamiento. Vulic y colaboradores, Proc . Nati . Acad. Sci . USA (Procedimientos de la Academia Nacional de Ciencias EUA 94 (1997) . Además, esto puede lograrse deteriorando los productos de los genes de reparación de desemparejamiento mediante la exposición a inhibidores selectivos . Los substratos de inicio para la recombinación se seleccionan de acuerdo con los principios generales descritos anteriormente. Es decir, los substratos pueden ser genomas enteros o fracciones de los mismos que contengan genes o sitios de recombinación. Las grandes bibliotecas de fragmentos esencialmente aleatorios pueden sembrarse con recolecciones de fragmentos que constituyen variantes de uno o más genes de recombinación conocidos, como por ejemplo recA. De manera alternativa, las bibliotecas pueden formarse mezclando formas de variantes de los diferentes genes y sitios de recombinación conocidos. La biblioteca de fragmentos se introduce dentro de las células receptoras para mejorarse y para que ocurra la recombinación, generando células modificadas. Las células receptoras de preferencia contienen un gen marcador cuya expresión ha sido desactivada de tal forma que puede corregirse mediante recombinación. Por ejemplo, las células pueden contener dos copias de un gen marcador que transporta mutaciones a diferentes sitios, cuyas copias pueden recombinarse para generar el gen tipo silvestre. Un gen marcador adecuado es la proteína fluorescente verde. Puede construirse un vector codificando una copia de GFP que posea codones de terminación cerca del término N, y otra copia de GFP que posea codones de terminación cerca del término C de la proteína. La distancia entre los codones de terminación en los extremos respectivos de la molécula es de 500 bp y aproximadamente el 25% de los eventos de recombinación dan como resultado un GFP activo. La expresión de GFP en una célula señala que una célula es capaz de una recombinación homologa para recombinarse entre los codones de terminación para generar una secuencia de codificación contigua. Al clasificar las células que expresan el GFP, se enriquecen las células que poseen la capacidad más alta de recombinación.

Puede utilizarse el mismo tipo de clasificación después de las rondas subsecuentes de la recombinación. Sin embargo, a menos que el marcador de selección utilizando en rondas anteriores haya estado presente en un vector suicida, las rondas subsecuentes deben emplear un segundo marcador de clasificación desactivado dentro de un segundo vector que transporte un origen diferente de duplicación o un marcador de selección positiva diferente para los vectores utilizados en las rondas previas . B. NÚMERO DE COPIA MULTIGENÓMICA - REDUNDANCIA DE GENES La mayoría de las células bacterianas en los cultivos de fase estacionaria desarrollados en medios ricos contienen dos, cuatro u ocho genomas. En medios mínimos, las células contienen uno o dos genomas. El número de genomas por célula bacteriana depende por ende de la velocidad de crecimiento de la célula a medida que entra a la fase estacionaria. Esto se debe a que las células de rápido crecimiento contienen múltiples bifurcaciones de duplicación, lo que da como resultado varios genomas en las células después de la terminación. El número de genomas depende de la cepa, a pesar de que todas las cepas probadas poseen más de un cromosoma en la fase estacionaria. El número de genomas en las células de fase estacionaria disminuye con el tiempo. Esto parece ser el resultado de la fragmentación y la degradación de los cromosomas enteros, similar a la apoptosis en las células de mamíferos. Esta fragmentación de genomas en las células que contienen múltiples copias del genoma da como resultado una combinación y mutagénesis masiva. Los mutantes útiles pueden encontrar formas y utilizar fuentes de energía que les permitirán continuar desarrollándose. Las células de multigenomas o redundantes de genes son mucho más resistentes a la mutagénesis y puede mejorarse para un rasgo seleccionado más rápido. Algunos tipos de células, como por ejemplo la Deinococcus radians (Daly y Minton J". Bacteriol (Boletín de Bacteriología) 177, 5495-5505 (1995)) muestran poliploidía a través de todo el ciclo de la célula. Este tipo de célula es altamente resistente a la radiación debido a la presencia de varias copias del genoma. La recombinación de alta frecuencia entre los genomas permite una rápida eliminación de las mutaciones inducidas por una variedad de agentes que dañan el ADN. Un objetivo de los métodos actuales es desarrollar otros tipos de células para hacer aumentar el número de la copia de genomas similar al de la Deinoccocus radians . De preferencia, el número de copias incrementado se mantiene a través de todo o la mayor parte de su ciclo celular en todas las o la mayoría de las condiciones de crecimiento. La presencia de copias de genoma múltiples en estas células da como resultado una frecuencia mayor de la recombinación homologa en estas células, tanto entre las copias de un gen en diferentes genomas dentro de la célula, como entre un genoma dentro de la célula y un fragmento transfectado. La frecuencia creciente de la recombinación permite que las células se desarrollen de manera más rápida para adquirir otras características útiles. Los substratos de inicio para la recombinación pueden ser una biblioteca diversa de genes, de los cuales únicamente algunos son relevantes para el número de copia genómica, una biblioteca enfocada formada a partir de variantes de genes conocidos o que se sospecha que poseen una fusión en el número de copia fenómica o una combinación de los dos. Como regla general, podríamos esperar lograr un número de copia creciente mediante la evolución de los genes implicados en la duplicación y la septación celular de tal forma que ésta septación celular se inhibe sin deteriorar la duplicación. Los genes implicados en la duplicación incluyen tus, xerC, xerD, dif, gyrA, gyrB, parE, parC, dif, Ter A, TefB, TerC, TefD , TerE, TerF, y los genes que tienen influencia en la división de los cromosomas y el número de copia del gen incluyen miríD , mukA ( tole) , ukB , mukC, mukD , spoOJ, spoIIIE (Wake & Errington, Annu . Rev. Genet . (Revisión Anual de Genética 29, 41-67 (1995) ) . Una fuente útil de substratos es el genoma de un tipo celular como el de la Deinoccocus radians que conoce que posee el fenotipo deseado del número de copia multigenómica . De la misma forma que, o en lugar de, los anteriores sustratos, también pueden utilizarse los fragmentos que codifican la proteína o los inhibidores del ARN antisentido para los genes conocidos como implicados en la separación de la célula. En la naturaleza, la existencia de copias genómicas múltiples en un tipo celular por lo general no sería ventajoso debido a los mayores requerimientos nutricionales que se necesitan para mantener este número de copia. Sin embargo, pueden programarse condiciones artificiales para seleccionar un número de copia alto. Las células modificadas que poseen genomas recombinantes se desarrollan en medios ricos (en cuyas condiciones, el número de copia múltiple no debería ser desventaja) y se exponen a un mutágeno, como por ejemplo la irradiación ultravioleta o gama, o mutágeno químico, por ejemplo, nitomicina, ácido nitroso, psoralens, fotoactivado, juntos o en combinación, que induce el rompimiento del ADN sujeto a reparación mediante recombinación. Estas condiciones son seleccionadas para las células que poseen un número de copia múltiple debido a la mayor eficiencia con la cual pueden extirparse las mutaciones. Las células modificadas que sobreviven a la exposición a los mutágenos están enriquecidas para las células con copias de genoma múltiple. Si se desea, las células seleccionadas pueden analizarse individualmente en cuanto al número de copia del genoma (por ejemplo, mediante una hibridización cuantitativa con controles apropiados) . Una parte o toda recolección de las células que sobreviven a la selección proporcionan los substratos para la siguiente ronda de recombinación. Además, las células individuales pueden clasificarse utilizando un clasificador de células para aquellas células que contienen más ADN, por ejemplo, utilizando compuestos fluorescentes específicos para el ADN o clasificando por tamaño incrementado utilizando dispersión de luz. A la larga, las células desarrolladas poseen por lo menos 2, 4, 6, 8 ó 10 copias del genoma a lo largo del ciclo celular. De manera similar, también pueden recombinarse los protoplastos . C. SECRECIÓN Las vías de secreción de la proteína (o metabolito) de las células bacterianas y eucarióticas pueden desarrollarse para exportar las moléculas deseadas de manera más eficiente, como por ejemplo para la manufactura de productos farmacéuticos de proteína, medicamentos de moléculas pequeñas o químicos especializados. Las mejoras en la eficiencia son particularmente deseables para proteínas que requieren un ensamble de subunidades múltiples (como por ejemplo los anticuerpos) o una modificación extensa posterior a la translación antes de la secreción.

La eficiencia de la secreción puede depender de cierto número de secuencias genéticas que incluyen una secuencia de codificación del péptido de señal, secuencias que codifican las proteínas que segmentan o de otra forma reconocen la secuencia de codificación, y la secuencia de codificación de la proteína que se secreta. Ésta última puede afectar el doblamiento de la proteína y la facilidad con la cual puede integrarse y atravesar membranas . La vía de secreción bacteriana en E. coli incluye a los genes SecA, SecB, SecE, SecD y SecF. En el Bacillus subtilis, los genes principales son secA, secD, secE, secF, secY, ffh, ftsY junto con cinco genes de peptidasa de señal (sipS, sipT, sipU, sipV y sipW) (Kunst y colaboradores, consul tar arriba) . Para las proteínas que requieren una modificación posterior a la traslación, la evolución de los genes que efectúan esta modificación puede contribuir a una secreción mejorada. De igual forma, los genes con productos de expresión que tienen una función en el ensamble de las proteínas de subunidades múltiples (por ejemplo, chaperoninas) también pueden contribuir a una secreción mejorada. La selección de los substratos para la recombinación sigue los principios generales que se mencionaron anteriormente. En este caso, las bibliotecas enfocadas referidas anteriormente incluyen variantes de los genes de secreción conocidos. Para la evolución de células procarióticas para expresar las proteínas eucarióticas, substratos iniciales para la recombinación se obtienen con frecuencia por lo menos de manera parcial a partir de fuentes eucarióticas. Los fragmentos entrantes pueden experimentar una recombinación tanto con el ADN cromosómico en las células receptoras como con la construcción del marcador de clasificación presente en las células mencionadas (consultar abajo) . Esta última forma de recombinación es importante para la evolución de la secuencia de codificación de la señal incorporada en la construcción del marcador de clasificación. Una secreción mejorada puede clasificarse mediante la inclusión de la construcción del marcador en las células que se están desarrollando. La construcción del marcador codifica un gen marcador, que se enlace de manera operativa a las secuencias de expresión, y por lo general está enlazado de manera operativa a una secuencia de codificación del péptido de señal . El gen marcador algunas veces se expresa como una proteína de fusión con una proteína recombinante de interés. Este enfoque es útil cuando se desea desarrollar la secuencia de codificación de la proteína recombinante junto con los genes de secreción. En una variación, el gen marcador codifica un producto que es tóxico para la célula que contiene la construcción a menos que el producto sea secretado. Las proteínas de la toxina adecuadas incluyen la toxina de la difteria y la toxina de la ricina. La propagación de las células modificadas que portan esta construcción selecciona células que se han desarrollado para mejorar la secreción de la toxina. De manera alternativa, el gen marcador puede codificar un ligando a un receptor conocido, y las células que portan el ligando pueden ser detectadas mediante FACS utilizando un receptor etiquetado. Opcionalmente, este ligando puede estar enlazado de manera operativa a una secuencia de anclaje de fosfolípidos que enlaza el ligando a la superficie de la membrana celular después de la secreción.

(Consultar 08/309,345 de propiedad común, copendiente). En una variación adicional, la proteína del marcador secretada puede mantenerse en proximidad con la célula que la secreta distribuyendo células individuales dentro de las gotas de ágar. Esto se realiza, por ejemplo, mediante la formación de gotitas de una suspensión celular. La proteína secretada se confina dentro de la matriz del ágar y puede ser detectada mediante, por ejemplo, FACS. En otra variación, una proteína de interés se expresa como una proteína de fusión junto con b-lactamasa o fosfatasa alcalina. Estas enzimas metabolizan los substratos cromogénicos disponibles comercialmente (por ejemplo, X-gal) , pero lo hacen únicamente después de la secreción dentro del periplasma. La apariencia del substrato con color en una colonia de células por lo tanto indica la capacidad de secretar la proteína de fusión y la intensidad del color se relaciona con la eficiencia de la secreción. Las células identificadas por medio de estos métodos de clasificación y selección tienen la capacidad de secretar cantidades crecientes de proteína. Esta capacidad puede ser atribuida a una secreción creciente y una expresión creciente, o por una secreción creciente únicamente. 1. Expresión Las células también pueden desarrollarse para adquirir una expresión creciente de una proteína recombinante. El nivel de la expresión es, por supuesto, dependiente en gran medida de la construcción a partir de la cual se expresa la proteína recombinante y las secuencias reglamentarias, como por ejemplo el promotor, los estimuladores y el sitio de terminación de la trascripción contenido en la misma. La expresión también puede estar afectada por un gran número de genes huéspedes que tienen funciones en la trascripción, modificación posterior a la traslación y la traslación. Además, los genes huéspedes implicados en la síntesis de los monómeros del aminoácido y el ribonucleótido para la trascripción y la traslación pueden tener efectos indirectos sobre la eficiencia de la expresión. La selección de substratos para la recombinación sigue los principios generales discutidos anteriormente. En este caso, las bibliotecas enfocadas incluyen variantes de genes conocidos como poseedores de funciones en la expresión. Para la evolución de células procarióticas con el fin de expresar proteínas eucarióticas, los substratos iniciales para la recombinación se obtienen con frecuencia, por lo menos de manera parcial, a partir de fuentes eucarióticas; es decir, los genes eucarióticos que codifican proteínas como las chaperoninas implicadas en la secreción y el ensamble de proteínas. Los fragmentos entrantes pueden experimentar una recombinación tanto con el ADN cromosómico en las células receptoras como con la construcción del marcador de clasificación presente en estas células (consultar abajo) . La clasificación para una expresión mejorada puede efectuarse incluyendo una construcción relatora en las células que se están desarrollando. La construcción relatora expresa (y por lo general secreta) una proteína relatora, como por ejemplo GFP, que es detectada fácilmente y no es tóxica. La proteína relatora puede ser expresada por sí sola o junto con una proteína de interés como proteína de fusión. Si se secreta el gen relator, la clasificación selecciona de manera efectiva las células que poseen ya sea una secreción mejorada o una expresión mejorada, o ambas. 2. Células Vegetales Una aplicación adicional de la recombinación de secuencia recursiva es la evolución de células vegetales, y plantas transgénicas derivadas de las mismas, para adquirir resistencia a las enfermedades patógenas (hongos, virus y bacterias), insectos, químicos (como por ejemplo, la sal, selenio, contaminantes, pesticidas, herbicidas, o similares), incluyendo, por ejemplo, atrazina o glifosato, o para modificar la composición química, el producto o similares. Los substratos para la recombinación pueden ser una vez más bibliotecas genómicas enteras, fracciones de las mismas o bibliotecas enfocadas que contengan variantes de genes conocidos o que se sospeche que confieren resistencia a uno de los agentes anteriores. Con frecuencia, los fragmentos de bibliotecas se obtienen de diferentes especies para la planta que se está desarrollando. Los fragmentos de ADN se introducen dentro de los tejidos de la planta, las. células de la planta cultivada, las microesporas de la planta o los protoplastos de la planta mediante métodos estándares incluyendo la electroforésis (From y colaboradores, Proc . Nati . Acad. Sci . USA (Procedimientos de la Cadena Nacional de Ciencias EUA) 82, 5824 (1985) , la infección mediante vectores virales como por ejemplo el virus de mosaico de la coliflor (CaMV) (Hohn y colaboradores, Molecular Biology of Plant Tumors (Biología Molecular de Tumores Vegetales) , (Academic Press, Nueva York, 1982) página 549-560; Howell, US 4,407,956), penetración de balística de alta velocidad mediante partículas pequeñas con el ácido nucleico ya sea dentro de la matriz de pequeñas cuentas o partículas, o en la superficie (Klen y colaboradores, Nature (Naturaleza) 327, 70-73 (1987)), el uso de polen como vector (WO 85/01856) , o el uso de Agrobacterium tumefaciens o A . Rhizogenes que portan un plasmidio del ADN-T en donde se clonan los fragmentos del ADN. El plasmidio del ADN-T se transmite a las células vegetales después de la infección con Agrobacterium tumefaciens, y una porción se integra de manera estable dentro del genoma de la planta (Horsch y colaboradores, Science (Ciencia) 233, 496-498 (1984); Fraley y colaboradores, Proc . Nati . Acad. Sci . USA (Procedimientos de la Academia Nacional de Ciencias EUA) 80, 4803 (1983) ) . La diversidad también puede ser generada mediante el intercambio genético entre protoplastos vegetales de acuerdo con los mismos principios descritos posteriormente para los protoplastos de hongos. Los procedimientos para la formación y fusión de protoplastos vegetales son descritos por Takahashi y colaboradores, EUA 4,677,066; Akagi y colaboradores, EUA 5,360,725; Shimamoto y colaboradores, EUA 5,250,433; Cheney y colaboradores, EUA 5,426,040. Después de un período de incubación adecuado para permitir que se lleve a cabo la recombinación y la expresión de los genes recombinantes, las células vegetales se ponen en contacto con el agente para el cual se va a adquirir la resistencia, y se recolectan las células de la planta sobrevivientes. Algunas o todas de estas células de la planta pueden ser sometidas a una ronda adicional de recombinación y clasificación. A la larga, se obtienen las células de la planta que poseen el grado de resistencia requerido. Estas células pueden después cultivarse dentro de plantas transgénicas. La regeneración vegetal a partir de protoplastos cultivados se describe en Evans y colaboradores, "Protoplast Isolation and Culture" ("Aislamiento y Cultivo de Protoplastos"), Handbook of Plant Cell Cul tures (Manual de Cul tivos de Células Vegetales) 1, 124-176 (MacMillan Publishing Co . , Nueva York, 1983); Davey, "Recent Developments in the Culture and Regeneration of Plant Protoplasts" ("Desarrollos Recientes en el Cultivo y Regeneración de Protoplastos Vegetales"), Protoplasts (Protoplastos) (1983) página 12-29, (Birkhauser, Basal 1983) ; Dale, "Protoplast Culture and Plant Regeneration of Cereals and Other Recalcitrant Crops" ("Cultivo de Protoplastos y Regeneración Vegetal de Cereales y Otras Cosechas Recalcitrantes"), Protoplasts (Protoplastos) (1983) página 31-41, (Birkhauser, Basel 1983) ; Binding, "Regeneration of Plants" ("Regeneración de Plantas"), Plant Protoplasts (Protoplastos Vegetales) , página 21-73, (CRC Press, Boca Ratón, 1985) . En una variación del método anterior, puede llevarse a cabo una o más rondas preliminares de recombinación y clasificación en las células bacterianas de acuerdo con la misma estrategia general que se describió para las células vegetales. Puede lograrse una evolución más rápida en células bacterianas debido a su mayor velocidad de crecimiento y la mayor eficiencia con la cual puede introducirse el ADN en estas células. Después de una o más rondas de recombinación/ clasificación, se recupera una biblioteca de fragmentos del ADN a partir de la bacteria y se transforma dentro de las células vegetales. La biblioteca puede ser ya sea una biblioteca completa o una biblioteca enfocada. Una biblioteca enfocada puede producirse mediante amplificación a partir de primarios específicos para las secuencias vegetales, particularmente secuencias vegetales que se sabe o se sospecha que poseen una función para conferir resistencia. 3 . Ejemplo: Ensamble Concatemérico del Plasmidio Catabolizador de Atrazina Los genes AtzA y AtzB catabolizadores de atrazina de la Pseudomonas fueron subclonados a partir de pMDl (de Souza y colaboradores, Appl . Environ . Microbiol . (Microbiología Ambiental Aplicada) 61, 3373-3378 (1995) ; de Souza y colaboradores, J. Bacteriol . (Boletín de Bacteriología) , 178, 4894-4900 (1996)) dentro de pUC18. Un fragmento Aval de 1.9 kb que contenía AtzA fue llenado al extremo e insertado dentro de una sede Aval de pUC18. Un fragmento de CLAI de 3.9 kb que contenía AtzB fue llenado al extremo y clonado dentro de la sede HincII de pUC18. Posteriormente AtzA fue extirpado de pUC18 con EcoRl y BamHl, AzB con Ba HI y Hindi, y los dos insertos fueron coligados dentro de pUC18 digerido con EcoRI y Hindi . El resultado fue un inserto de 5.8 kb que contenía AtzA y AtzB en pUC18 (tamaño total del plasmidio 8.4 kb) . La recombinación de la secuencia recursiva se llevó a cabo de la siguiente forma. El plasmidio completo de 8.4 kb fue tratado con Dnasel en 50 mM de Tris-Cl pH 7.5, 10 mM MnCl2 y fragmentos entre 500 y 2000 bp fueron purificados con gel . Los fragmentos fueron ensamblados dentro de una reacción PCR utilizando la enzima Tth-XL y solución amortiguadora Perkin Elmer, 2.5 M MgOAc, 400 µM dNTPs y diluciones seriales de fragmentos del ADN. La reacción del ensamble se llevó a cabo en un "Motor de ADN" de MJ Research programado con los siguientes ciclos: 1) 94 °C, 20 segundos; 2) 94 °C, 15 segundos; 3) 40 °C, 30 segundos, 4) 72 °C, 30 segundos + 2 segundos por ciclo; 5) pasar al paso 2, 39 veces más; 6) 4°C. Los genes AtzA y AtzB no fueron amplificados a partir de la reacción del ensamble utilizando la reacción en cadena de la polimerasa, por lo tanto, en lugar de esto, el ADN fue purificado a partir de la reacción mediante la extracción de fenol y la precipitación de etanol, después se digirió el ADN ensamblado con una enzima de restricción que linealizó el plasmidio (Kpnl: el sitio Kpnl en pUC18 se perdió durante la subclonación, dejando únicamente el sitio Kpnl en AtzA) . El plasmidio linealizado se purificó con gel, se autoligó toda la noche y se transformó en la cepa NM522 de E. coli . (La elección de la cepa huésped fue relevante: se obtuvo muy poco plasmidio de mala calidad de un número de otras cepas disponibles comercialmente incluyendo TG1 , DH10B, DH12S) . Las diluciones en serie de la reacción y transformación fueron colocadas sobre placas LB que contenían 50 µg/ml de ampicilina, el resto de la transformación se elaboró en 25% de glicerol y se congeló a -80°C. Una vez que las células transformadas se valoraron, las células congeladas se colocaron en placas a una densidad de entre 200 y 500 sobre placas de 150 mm de diámetro que contenían 500 µg/ml de atrazina y se desarrollaron a 37 °C. La atrazina a 500 µg/ml se forma un precipitado insoluble. Los productos de los genes AtzA y AtzB transforman la atrazina en un producto soluble. Las células que contienen el tipo silvestre de los genes AtzA y AtzB en pUC18 estarán rodeadas por lo tanto por un halo transparente en el lugar donde se ha degradado la atrazina. Mientras más activas sean las enzimas AtzA y AtzB, más rápidamente se formará un halo transparente y se desarrollará en las placas que contienen atrazina. Las positivas fueron recolectadas como las colonias que formaron de manera más rápida las zonas transparentes más grandes. Las cuarenta (aproximadamente) 40 mejores colonias se recolectaron, agruparon, cultivaron en la presencia de 50 µg/ml de ampicilina y plasmidio preparadas para éstas. El proceso completo (desde el tratamiento de DNase hasta la colocación en placas en placas de atrazina) se repitió 4 veces con 2000-4000 colonias/ciclo. Se llevó a cabo una modificación en la cuarta ronda.

Las células se colocaron en placas tanto en 500 µg/ml de atrazina como en 500 µg/ml de la terbutilazina análoga a la atrazina, que no pudo degradarse por los genes AtzA y AtzB de tipo silvestre. Se obtuvieron positivas que degradaron ambos compuestos. La clorohidrolaza de atrazina (producto del gen AtzA) fue 10-100 veces mayor a la producida por el gen de tipo silvestre. D. MEZCLA DEL GENOMA VEGETAL La mezcla del genoma vegetal permite utilizar ciclos recursivos para la introducción y la combinación de genes o vías que confieren propiedades mejoradas a la especie de la planta deseada. Cualquier especie de planta, incluyendo malezas y cultivos silvestres, que muestren un rasgo deseado, como por ejemplo resistencia a los herbicidas, tolerancia a la sal, resistencia a las placas, o tolerancia a la temperatura, pueden ser utilizadas como la fuente del ADN que se introduce dentro de las especies de plantas huéspedes hortícolas o cosecha. El ADN genómico preparado a partir de la planta fuente se fragmenta (por ejemplo, mediante de DNasel, enzimas de restricción, o mecánicamente) y se clona dentro de un vector adecuado para elaborar bibliotecas genómicas vegetales, como por ejemplo pGA482 (An. G., 1995, Methods Mol. Biol. (Métodos de Biología Molecular 44:47-58). Este vector contiene los límites izquierdo y derecho de A . Tumefaciens necesarios para la transferencia de genes a las células vegetales y los marcadores antibióticos para la selección en E. coli , Agrobacterium, y células vegetales. Se proporciona un sitio de clonación múltiple para la inserción de los fragmentos genómicos. Está presente una secuencia eos para el empaque eficiente del ADN dentro de las cabezas lambda del bacteriófago para la transducción de la biblioteca primaria dentro de E. coli . El vector acepta fragmentos de ADN de 25-40 kb. La biblioteca primaria también puede electroforarse directamente dentro de una cepa de A . Tumefaciens o A . Rhizogenes que se utiliza para infectar y transformar las células vegetales huéspedes (Main, GD y colaboradores, 1995, Methods Mol. Biol. (Métodos de Biología Molecular) 44:405-412) . De manera alternativa, el ADN puede ser introducido mediante la electroporación o la absorción mediada por PEG dentro de los protoplastos de las especies vegetales receptoras (Bilang y colaboradores (1994) Plant Mol . Biol .. Manual (Manual de Biología Molecular de Plantas, Kluwer Academic Publishers, Al: 1-16) o mediante el bombardeo de partículas de células o tejidos (Christou, ibid, A2:l-15). Si es necesario, pueden eliminarse los marcadores de antibiótico en la región del ADN-T siempre y cuando sea posible la selección del rasgo, de tal forma que los productos vegetales finales no contengan genes de antibióticos. Las células enteras transformadas de manera estable que adquieren el rasgo se seleccionan en medios sólidos o líquidos que contengan el agente al cual el ADN introducido confiere resistencia o tolerancia. Si el rasgo en cuestión no puede seleccionarse directamente, las células transformadas pueden ser seleccionadas con antibióticos y se puede permitir que formen tallos o que se regeneren para plantas enteras y después se clasifiquen para la propiedad deseada. El segundo ciclo y los posteriores consisten en aislar el ADN genómico de cada línea transgénica y en introducirlo a una o más de las otras líneas transgénicas. En cada ronda, las células transformadas se seleccionan o se clasifican para una mejora creciente. Para acelerar el proceso de utilizar ciclos múltiples de transformación, la regeneración vegetal puede diferirse hasta la última ronda. El tejido del tallo generado a partir de los protoplastos o tejidos transformados puede servir como fuente de ADN genómico y nuevas células huéspedes. Después de la ronda final, las plantas fértiles se regeneran y se selecciona la progenie para la capacidad de homocigosis de los ADNs insertados. Finalmente, se crea una nueva planta que transporta varios insertos que se combinan por añadidura o sinérgicamente para conferir altos niveles del rasgo deseado. De manera alternativa, las microesporas pueden ser aisladas como homocigotos generados a partir de diploides espontáneos. Además, el ADN introducido que confiere el rasgo deseado puede ser rastreado ya que está flanqueado por secuencias conocidas en el vector. Se utiliza ya sea PCR o el rescate de plasmidios para aislar las secuencias y caracterizarlas con más detalle. El PCR grande (Foord, OS y Rose, EA, 1995, PCR Primer: A Laboratory Manual (PCR Primario: Un Manual de Laboratorio, CSCHL Press, página 63-77) del inserto completo de 25-40 kb se logra con los reactivos y técnicas apropiadas utilizando como primarias las secuencias límites del ADN-T. Si el vector se modifica para contener el origen de duplicación de E. coli y un marcador del antibiótico entre los límites del ADN-T, una enzima de restricción de corte rara, como la Notl ó Sfil,m que corta únicamente en los extremos del ADN insertado, se utiliza para crear fragmentos que contienen el ADN de la planta fuente que posteriormente son autoligados y transformados en E. coli en el lugar en que se duplican como plasmidios. El ADN total o subfragmento de éste que es responsable del rasgo transferido puede estar sometido a una evolución in vitro mediante la mezcla del ADN. La biblioteca mezclada puede recombinarse de manera reiterativa por medio de un método explicado aquí y después puede introducirse dentro de las células vegetales huéspedes y clasificarse para el mejoramiento del rasgo. De esta manera, los rasgos de un solo gen y de genes múltiples pueden transferirse de una especie a otra y perfeccionarse para una expresión mayor o una actividad que conduzca a un mejoramiento del organismo entero. Este proceso completo también puede repetirse de manera reiterada. Alternativamente, las células pueden transformarse en microesporas con las plantas haploides regeneradas que se clasifican directamente para los rasgos mejorados como se indica posteriormente . E. MANIPULACIÓN DE MICROESPORAS Las microesporas son esporas macho haploides (ln) que se desarrollan en granos de polen. Otras contienen un gran número de microesporas en las etapas prematuras-uninucleadas a la primera-mitosis . Las microesporas se han inducido con éxito para desarrollar plantas de la mayor parte de las especies, como por ejemplo, arroz (Chen, CC 1977 In Vitro 13: 484-489), tabaco (Atanassov, I. y colaboradores 1998 Plant Mol Biol. (Biología Moilecular de Plantas) 38:1169-1178), Tradescantia (Savage JRK y Papworth DG. 1998 Mutat Res.

(Investigación de Mutantes) 422:313-322), Arabidopsis (Park SK y colaboradores 1998 Development (Desarrollo) 125:3789-3799) , betabel (Majewska-Sawka A y Rodríguez-García MI 1996 J Cell Sci. (Boletín de Ciencia Celular) 109:859-866), Cebada (Olsen FL 1991 Hereditas 115:255-266) y nabo de semilla oleaginosa (Boutillier KA y colaboradores 1994 Plant Mol. Biol. (Biología Molecular de Plantas) 26:1711-1723). Las plantas derivadas de microesporas son predominantemente haploides o diploides (es poco frecuente que sean poliploides y aneuploides) . Las plantas diploides son homocigotos y fértiles y pueden generarse en un tiempo relativamente corto. Las microesporas obtenidas a partir de plantas híbridas Fl representan gran diversidad, por lo tanto son un modelo excelente para estudiar la recombinación. Además, las microesporas pueden transformarse con ADN-T introducido mediante agrobacterias u otros medios disponibles y después regenerarse en plantas individuales. Además, los protoplastos pueden elaborarse a partir de microesporas y pueden fusionarse de manera similar a la que ocurre en los hongos y bacterias. Las microesporas, debido a su ploidía compleja y capacidad de regeneración, proporcionan una herramienta para la mezcla de genomas enteros de plantas. Por ejemplo, si el polen de 4 padres se recolecta y se agrupa, y después se utiliza para polimizar de manera aleatoria los padres, las progenies deben tener 24 = 16 posibles combinaciones. Asumiendo que esta planta posee 7 cromosomas, las microesporas recolectadas a partir de las 16 progenies representarán 27xl6 = 2048 posibles combinaciones cromosómicas. Este número es incluso mayor si ocurren procesos meióticos. Cuando los embriones diploides, homocigotos, se generan a partir de estas microesporas, en muchos casos, son clasificados en cuanto a fenotipos deseados, como por ejemplo, resistentes a los herbicidas o a las enfermedades. Además, para la composición de aceites vegetales, estos embriones pueden disecarse en dos mitades: una para análisis y la otra para la regeneración en una planta viable. Los protoplastos generados a partir de las microesporas (especialmente los haploides) se agrupan y se fusionan. Las microesporas obtenidas a partir de las plantas generadas por la fusión de protoplastos se agrupan y se fusionan una vez más, incrementando la diversidad genética de las microesporas resultantes. Las microesporas pueden estar sometidas a mutagénesis de diferentes formas, como por ejemplo la mutagénesis química, la mutagénesis inducida por radiación y, por ejemplo, la transformación ADN-t, antes de la fusión o la regeneración. Las nuevas mutaciones que se generan pueden recombinarse a través de los procesos recursivos descritos anteriormente y en la presente. F. EJEMPLO: ADQUISICIÓN DE TOLERANCIA A LA SAL Tal como se muestra en la Figura 21, el ADN de una planta tolerante a la sal se aisla y se utiliza para crear una biblioteca genómica. Los protoplastos elaborados a partir de las especies del receptor se transforman/transfectan con la biblioteca genómica (por ejemplo, mediante electroforésis, agrobacteria, etc) . Las células se seleccionan en los medios con un nivel normalmente inhibitorio de NaCl . Únicamente las células con tolerancia a la sal recién adquirida se desarrollarán dentro del tejido del callo. Las mejores líneas se eligen y las bibliotecas genómicas se elaboran a partir de su ADN agrupado. Estas bibliotecas se transforman en protoplastos elaborados a partir del tallo transformado de la primera ronda. Una vez más, las células se seleccionan en concentraciones de sal crecientes. Después de lograr el nivel deseado de tolerancia a la sal, el tejido del tallo puede inducirse para regenerar plantas enteras. La progenie de estas plantas canaliza por lo general para verificar la homocigocidad de los insertos para garantizar la estabilidad del rasgo adquirido. En los pasos indicados, la regeneración de la planta o el aislamiento y mezcla de los genes introducidos puede agregarse al protocolo global . G. ANIMALES TRANSGÉNICOS 1. Perfeccionamiento de Transgenes Un objetivo de la transgénesis es producir animales transgénicos, como por ejemplo ratones, conejos, ovejas, cerdos, cabras y ganado, secretando una proteína recombinante en la leche. Un transgen para este propósito incluye por lo general en el enlace operable un promotor y un estimulador a partir de un gen de la proteína de la leche (por ejemplo, a, ß, ó y de caseína, ß-lactoglobulina, proteína del suero ácido o a-lactalbúmina) , una secuencia de señal, una secuencia decodificación de la proteína recombinante y un sitio de terminación de la trascripción. Opcionalmente, un transgen puede codificar cadenas múltiples de una proteína con cadenas múltiples, como por ejemplo una inmunoglobulina, en cuyo caso, las dos cadenas por lo general se enlazan de manera operativa e individual con grupos de secuencias regulatorias. Los Transgenes pueden perfeccionarse en cuanto a su expresión y secreción mediante una recombinación de la secuencia recursiva. Los substratos adecuados para la recombinación incluyen secuencias regulatorias como por ejemplo los promotores y estimuladores a partir de genes de la proteína de la leche de diferentes especies o animales individuales. Los ciclos de recombinación pueden llevarse a cabo in vi tro o in vivo mediante cualesquiera de los formatos discutidos en la Sección V. La clasificación de lleva a cabo in vivo en cultivos de células derivadas de la glándula mamaria, como por ejemplo HC11 ó MacT, trasnfectadas con Transgenes y construcciones del relator como lo que se explicó anteriormente. Después de varios ciclos de recombinación y clasificación, los transgenes que resulten con niveles más altos de expresión y secreción son extraídos de las células del cultivo del tejido de la glándula mamaria y se utilizan para transfectar células embriónicas, como por ejemplo cigotos y células impulsoras embrionarias, que maduran en animales transgénicos . 2. Perfeccionamiento del Animal Entero En este enfoque, las bibliotecas de fragmentos entrantes se transforman en células embrionarias, como por ejemplo células ES o cigotos. Los fragmentos pueden ser variantes de un gen conocido que confiera una propiedad deseada, como por ejemplo la hormona de crecimiento. De manera alternativa, los fragmentos pueden ser bibliotecas genómicas parciales o completas, incluyendo varios genes. Los fragmentos se introducen por lo general dentro de los cigotos mediante una microinyección que se describe en Gordon y colaboradores, Methods Enzymol . (Métodos de Enzimología) 101,414 (1984); Hogan y colaboradores, Manipulation of the Mouse Embryo : A Laboratory Manual (Manipulación del Embrión del Ratón : Un Manual de Laboratorio) (C.S.H.L. N.Y., 1986) (embrión de ratón); y Hammer y colaboradores, Nature (Naturaleza) 315,680 (1985) (embriones de conejo y porcinos) ; Gandolfi y colaboradores, J. Reprod. Fert . (Boletín de Fertilidad y Reproducción) 81, 23-28 (1987); Rexroad y colaboradores, J". Ani . Sci . (Boletín de Ciencia Animal ) 66,947-954 (1988) (embriones de ovino) y Eyestone y colaboradores, J". Reprod. Fert . (Boletín de Fertilidad y Reproducción) 66,947-953 (1988); Camous y colaboradores, J". Reprod . Fert . (Boletín de Fertilidad y Reproducción) 72, 779-785 (1984); y Heyman y colaboradores, Theriogenology (Teriogenología) 27, 5968 (1987) (embriones bovinos) . Posteriormente, los cigotos se maduran y se introducen dentro de animales hembras receptoras quienes gestan el embrión y dan a luz a descendencia transgénica. De manera alternativa, los transgenes pueden introducirse dentro de células impulsoras embrionarias (ES) . Estas células se obtienen a partir de embriones de preimplantación cultivados in vi tro . Bradley y colaboradores, Nature (Naturaleza) 309, 255-258 (1984) . Los transgenes pueden introducirse dentro de estas células mediante electroforésis o microinyección. Las células ES transformadas se combinan con los blastocistos de un animal no humano. Las células ES colonizan el embrión y en algunos embriones forman la línea de germen del animal quimérico resultante. Consul tar Jaenisch, Science (Ciencias) , 240, 1468-1474 (1988). Sin tomar en cuenta si se utilizan cigotos o ES, la clasificación se lleva a cabo en animales enteros para una propiedad deseada, como por ejemplo, el tamaño incrementado y/o la velocidad de crecimiento. El ADN se extrae de animales que se han desarrollado para la adquisición de la propiedad deseada. Posteriormente, este ADN se utiliza para transfectar células embrionarias adicionales. Estas células también pueden obtenerse de animales que se han adquiridos para la propiedad deseada en un enfoque de división y agrupación. Es decir, el ADN de un subconjunto de estos animales se transforman en células embrionarias preparadas de otro subconjunto de los animales. De manera alternativa, el ADN de los animales que se han desarrollado para la adquisición de la propiedad deseada, puede transfectarse en células embrionarias frescas. En cualquier alternativa, las células trasnfectadas se maduran en animales transgénicos, y los animales son sometidos a una ronda adicional de clasificación para la propiedad deseada. La Figura 4 muestra la aplicación de este enfoque para desarrollar peces con el propósito de lograr un tamaño más grande. Inicialmente, se prepara una biblioteca de variantes de un gen de la hormona de crecimiento. Los variantes pueden ser naturales o inducidos. La biblioteca se recubre con proteína recA y se transfecta dentro de los huevos del pez fertilizado. Los huevos del pez se maduran entonces en peces de diferentes tamaños. El fragmento del gen de la hormona de crecimiento del ADN genómico del pez más grande se amplifica posteriormente mediante PCR y se utiliza en la siguiente ronda de recombinación. De manera alternativa, el pez -IFN se desarrolla para mejorar la resistencia ante las infecciones virales tal como se describe posteriormente . 3. Evolución de hormonas mejoradas para la expresión en animales transgénicos (por ejemplo, peces) para crear animales con rasgos mejorados. Las hormonas y las citocinas son reguladoras clave del tamaño, peso corporal, resistencia viral y muchos otros rasgos importantes comercialmente. La mezcla del ADN se utiliza para desarrollar rápidamente los genes para estas proteínas utilizando ensayos in vitro. Esto se demostró con la evolución de los genes alfa interferón humanos para tener una actividad antiviral potente en células de murino. Se lograron grandes mejoras en la actividad en dos ciclos de la mezcla de familias de los genes IFN humanos. En general, un método para incrementar la resistencia a la infección de virus en las células puede llevarse a cabo introduciendo primero una biblioteca mezclada que incluya por lo menos un gen de interferón mezclado en células animales para crear una biblioteca inicial de células animales o animales. La biblioteca inicial se desafía entonces con el virus. Las células animales o los animales se seleccionan de la biblioteca inicial que sean resistentes al virus y una pluralidad de transgenes de una pluralidad de células animales o animales que sean resistentes al virus se recuperan. La pluralidad de transgenes se recupera para producir una biblioteca desarrollada de células animales o animales que se desafía una vez más con el virus. Las células o animales se seleccionan a partir de la biblioteca desarrollada, los cuales son resistentes a los virus. Por ejemplo, los genes desarrollados con los ensayos in vitro se introducen dentro del plasma germinal de animales o plantas para crear cepas mejoradas. Una limitación de este procedimiento es que los ensayos in vitro con frecuencia son únicamente predictores crudos de la actividad in vivo. Sin embargo, al mejorar los métodos para la producción de plantas y animales transgénicos, se puede actualmente juntar la reproducción del organismo entero con la reproducción molecular. El enfoque es introducir las bibliotecas mezcladas de genes de la hormona dentro de las especies de interés. Éste puede realizarse con un solo gen por transgénico o con grupos de genes por transgénico. La progenie se selecciona posteriormente para el fenotipo de interés. En este caso, las bibliotecas mezcladas de genes de interferón (alfa IFN por ejemplo) se introducen dentro del pez transgénico. La biblioteca del pez transgénico se desafía con un virus. El pez más resistente se identifica (es decir, ya sea los sobrevivientes de un desafío mortal; o aquellos que se consideran los más 'sanos' después del desafío) . Los transgenes IFN se recuperan mediante PCR y se mezclan ya sea en grupos o en pares. Esto genera una biblioteca desarrollada de genes IFN. Se crea una segunda biblioteca de peces transgénicos y el proceso se repite. De esta manera, el IFN se desarrolla para la actividad antiviral mejorada en un ensayo de un organismo entero. Este procedimiento es general y puede aplicarse a cualquier rasgo que sea afectado por un gen o familia de genes de interés y que pueda ser medido cuantitativamente. Los datos de la secuencia del interferón de los peces están disponibles para el lenguado japonése ( Paralichthys olivaceus) como secuencia mARN (Tamai y colaboradores (1993) "Cloning and expresión of flatfish" ("Clonación y expresión del cADN de interferón del lenguado (Paralichthys olivaceus) " . Biochem. Biophys. Acta (Acta de Biofísica y Bioquímica 1174, 182-186; consul tar también, Tami y colaboradores (1993) "Purificación y caracterización de la proteína antiviral similar al interferón derivada de los linfocitos del lenguado (Paralichthys olivaceus) inmortalizados por oncogenes" . Cytotechnology (Citotecnología) 1993; 1 1 (2) : 121-131) . Esta secuencia puede utilizarse para clonar los genes IFN de estas especies. Esta secuencia también puede utilizarse como una sonda para los interferones homólogos del clon a partir de especies adicionales de peces. De la misma forma, la información de la secuencia adicional puede utilizarse para clonar más especies de interferones de peces. Una vez que se ha clonado una biblioteca de interferones, éstos pueden mezclarse entre familias para generar una biblioteca de variantes. Una secuencia de proteína del interferón del lenguado es : MIRSTNSNKS DILMNCHHLIIR YDDNSAPSGGSL FRKMIMLLKL LKLITFGQLRW ELFVKSNTSKTS TVLSIDGSNLISL LDAPKDILDKPSCNSF QLDLLLASSAWTLLT ARLLNYPYPA VLLSAGVASWLVQVP . En una forma de realización, BHK-21 (una línea celular de fibroblastos de un hámster) puede transfectarse con los plasmidios de expresión de IFN mezclados. El IFN recombinante activo se produce y después se purifica mediante una cromatografía por afinidad de agarosa WGA (Tamai, y colaboradores 1993 Biochim Ciophys Acta (Acta de Ciofísica y Bioquímica, consul tar arriba) . La actividad antiviral del IFN puede medirse en las células de peces desafiadas mediante rabdovirus. Tami y colaboradores (1993) "Purification and characterization of interferon-like antiviral protein derived from flatish (Paralichthys olivaceus) lymphocytes immortalized by oncogenes" ("Purificación y caracterización de la proteína antiviral similar al interferón derivada de los linfocitos de lenguado (Paralichthys olivaceus) inmortaliziados por oncogenes" . Cytotechnology (Citotecnología) 1993; 1 1 (2) .121-131) . H. MEZCLA DE GENOMA ENTERO EN ORGANISMOS SUPERIORES-REPRODUCCIÓN RECURSIVA EN FORMA DE GRUPOS La presente invención ofrece un procedimiento para generar grandes bibliotecas combinadas de eucariotas superiores, plantas, peces, animales domesticados, etc. Además de los procedimientos delineados anteriormente, la combinación en forma de grupos de gametos macho y hembra también puede utilizarse para generar grandes bibliotecas moleculares diversas. En un aspecto, el proceso incluye el emparejamiento en forma de grupos recursivo para varias generaciones sin ninguna clasificación deliberada. Esto es similar a la reproducción clásica, con excepción de que los grupos de organismos, en lugar de ser pares de organismos, se aparean, acelerando de esta manera la generación de la diversidad genética. Este método es similar a la fusión recursiva de una población diversa de protoplastos bacterianos que da como resultado la generación de progenie multiparental que contiene información genética de toda la población de inicio de la bacteria. El proceso que se describe aquí es llevar a cabo apareamientos artificiales o naturales análogos de grandes poblaciones de aislados naturales, impartiendo una estrategia de apareamiento en grupos divididos . Antes del apareamiento, todos los gametos macho, es decir, polen, esperma, etc., se aislan de la población de inicio y se agrupan. Posteriormente, éstos se utilizan para "auto" fertilizar un grupo mezclado de los gametos hembra de la misma población. El proceso se repite con la progenie subsiguiente para varias generaciones, siendo la progenie final una biblioteca de organismos combinados donde cada miembro posee información genética que se origina desde varios, si no es que todos, los "padres" de inicio. Este proceso genera grandes bibliotecas de organismos diversos en las cuales pueden impartirse varias elecciones y/o clasificaciones, y no requieren una manipulación in vi tro sofisticada de los genes. Sin embargo, da como resultado la creación de nuevas cepas útiles (quizás perfectamente diluidas en la población) en un marco de tiempo mucho más corto que si estos organismos fueran generados utilizando un enfoque de reproducción meta clásico. Estas bibliotecas son generadas relativamente rápido (por ejemplo, por lo general en menos de tres años para la mayoría de plantas de interés comercial, con seis ciclos o menos de reproducción recursiva suficientes para generar la diversidad deseada) . Un beneficio adicional de estos métodos es que las bibliotecas resultantes proporcionan diversidad de organismos en áreas como la agricultura, acuacultura y cría de animales, que son homogéneas genéticamente en la actualidad.

Los ejemplos de estos métodos para varios organismos se describen posteriormente. 1. Plantas Una población de plantas, por ejemplo todas de diferentes cepas del maíz en una recolección de semilla comercial/plasma germinal, se cultivan y el polen de toda la población se siembra y se agrupa. Esta población de polen mezclado se utiliza posteriormente para "auto" fertiliziar la misma población. Se evita la autopolimización, de tal forma que la fertilización es combinada. Los resultados cruzados en todas las cruzas en pares posibles dentro de la población, y las semillas resultantes dan como resultado varios de los posibles productos de cada una de estas cruzas en pares. Las semillas de las plantas fertilizadas se siembran posteriormente, se agrupan, se plantan y el polen se siembra, se agrupa otra vez, y se utiliza para "auto" fertilizar la población. Después de varias generaciones únicamente, la población resultante es una biblioteca combinada muy diversa del maíz. Las semillas de esta biblioteca se siembran y se clasifican en cuanto a sus rasgos deseables, por ejemplo, tolerancia a la sal, porcentaje de crecimiento, productividad, producto, resistencia a la enfermedad, etc. Esencialmente cualquier recolección de plantas puede modificarse mediante este enfoque. Las cosechas comerciales importantes incluyen tanto monocotiledóneas como dicotiledóneas. Las monocotiledóneas incluyen plantas en la familia de las hierbas (Gramineae) , como por ejemplo las plantas en las subfamilias Fetuacoideae y Poacodeae, que juntas incluyen varios cientos de géneros incluyendo plantas en los géneros de Agrostis, Phleum, Dactylis, Sorgum, Setaria, Zea (por ejemplo, maíz) , Oryza (por ejemplo, arroz) , Tri ticum (por ejemplo, trigo) , Sécale (por ejemplo, centeno) , Avena (por ejemplo, avenas), Hordeum (por ejemplo, centeno), Saccharum, Poa, Festuca, Stenotaphrum, Cynodon, Coix, la Olyreae, Phareae y muchas otras. Las plantas en la familia Gramineae son plantas meta particularmente preferidas para los métodos de la invención. Las metas preferidas adicionales incluyen otras cosechas importantes comercialmente, por ejemplo, en las familias Composi tae (la familia más grande de plantas vasculares, incluyendo por lo menos 1,000 géneros, incluyendo cosechas comerciales importantes como la semilla de girasol), y Leguminosae o "familia de guisantes", que incluye cientos varios de géneros, entre los cuales están varias cosechas comercialmente valiosas como por ejemplo los guisantes, habas, lentejas, cacahuate, semilla de hilaza, semilla de cautí, semillas aterciopeladas, semilla de soya, trébol, alfalfa, lupino, arveja, loto, trébol cloroso, gliana y haba de las indias. Las cosechas comunes aplicables a los métodos de la invención incluyen Zea mays, arroz, semilla de soya, sorgo, trigo, avena, centeno, mijo, semilla de girasol y cánola. Este proceso también puede llevarse a cabo utilizando polen de diferentes especies o cepas más divergentes (por ejemplo, cruzando las hierbas antiguas con maíz) . Puede forzarse la cruza de diferentes especies de plantas. Únicamente unas cuantas plantas de una cruza inicial tendrían que llevarse a cabo con el fin de lograr que el proceso sea viable. Estas cuantas progenies, por ejemplo, de una cruza entre la semilla de soya y el maíz, generarían polen y huevos, cada uno de los cuales representaría un diferente resultado meiótico a partir de la recombinación de los dos genomas. El polen sería cosechado y utilizado para "auto" polinizar la progenie original. Este proceso posteriormente se llevaría a cabo de manera recursiva. Esto generaría una biblioteca mezclada de familia grande de dos o más especies, que sería clasificada subsecuentemente. La estrategia anterior se ilustra esquemáticamente en la Figura 30. 2. Peces La tendencia natural del pez de poner sus huevos fuera del cuerpo y hacer que el macho cubra estos huevos con esperma ofrece otra oportunidad para una estrategia de reproducción agrupada dividida. Los huevos de varios peces diferentes, por ejemplo, el salmón de diferentes pescaderías del mundo, pueden cosecharse, agruparse y después fertilizarse con espermas de salmón recolectado y agrupado de manera similar. La fertilización dará como resultado todos los apareamientos por pares posibles de la población inicial. La progenia resultante se desarrolla posteriormente y una vez más se cosecha el esperma y los huevos, y se agrupan, donde cada huevo y el esperma representa un diferente resultado meiótico de las diferentes cruces. El esperma agrupado se utiliza posteriormente para fertilizar los huevos agrupados y el proceso se lleva a cabo de manera recursiva. Después de varias generaciones, la progenia resultante puede someterse a selecciones y clasificaciones para las propiedades deseadas, como por ejemplo el tamaño, resistencia a las enfermedades, etc . La estrategia anterior se ilustra esquemáticamente en la Figura 29. 3. Animales La llegada de la fertilización in vi tro y la maternidad substituta proporciona un medio de mezcla de genoma entero en animales como por ejemplo los mamíferos. Al igual que con los peces, los huevos y el esperma de una población, por ejemplo, de todas las vacas de matanza, se recolecta y se agrupa. Los huevos agrupados se fertilizan posteriormente in vi tro con el esperma agrupado. Los embriones resultantes se devuelven posteriormente a las madres substitutas para su desarrollo. Al igual que antes, este proceso se repite de manera recursiva hasta que se genera una gran población diversa que puede ser clasificada en cuanto a sus rasgos deseados . Un enfoque técnicamente factible sería similar al utilizado para las plantas. En este caso, el esperma de los machos de la población de inicio se recolecta y se agrupa, y después esta muestra agrupada se utiliza para inseminar artificialmente varias hembras de cada una de las poblaciones de inicio. Únicamente uno (o unos cuantos) espermas tendría éxito en cada animal, pero éstos deben ser diferentes para cada fertilización. El proceso se repite cosechando el esperma de toda la progenie macho, agrupándolo, y utilizándolo para fertilizar toda la progenie hembra. El proceso se lleva a cabo de manera recursiva durante varias generaciones para generar la biblioteca del organismo, que puede clasificarse posteriormente. I. EVOLUCIÓN RÁPIDA COMO HERRAMIENTA PREDICTIVA La recombinación de secuencia recursiva puede utilizarse para simular la evolución natural de microorganismos patógenos en respuesta a la exposición a un medicamento bajo prueba. Utilizando la recombinación de secuencia recursiva, la evolución se lleva a cabo a una velocidad mayor que la evolución natural . Una medida de la velocidad de la evolución es el número de ciclos de recombinación y clasificación requeridos hasta que el microorganismo adquiere un nivel definido de resistencia al medicamento. La información de este análisis es valiosa al comparar los méritos relativos de diferentes medicamentos y en particular, para predecir su eficacia a largo plazo en una administración repetida. Los microorganismos patógenos utilizados en este análisis incluyen la bacteria que es una fuente común de infecciones humanas, como por ejemplo la chlamydia, rickettsial bacteria, mycobacteria, staphylococci , streptocci , pneumonococci , meningococci y conococci , klebsiella, proteus, serratia, pseudomonas, legionella, diphteria, salmonella, bacilli , cholera, tetanus, botulism, ántrax, plague, leptospirosis , y la bacteria de la enfermedad Lymes. La evolución se lleva a cabo transformando un aislado de la bacteria que es sensible a un medicamento bajo prueba con una biblioteca de fragmentos del ADN. Los fragmentos pueden ser una versión mutada del genoma de la bacteria que se está desarrollando. Si la meta del medicamento es una proteína o ácido nucleico conocido, una biblioteca enfocada que contenga variantes del gen correspondiente puede ser utilizada. De manera alternativa, la biblioteca puede provenir de otras clases de bacteria, especialmente la bacteria que se encuentra por lo general habitando los tejidos humanos, simulando de esta manera el material fuente disponible para la recombinación in vivo . La biblioteca también puede provenir de bacterias conocidas como resistentes a los medicamentos. Después de la transformación y la propagación de la bacteria durante un período apropiado para permitir que ocurra la recombinación y que se expresen los genes recombinantes, las bacterias se clasifican exponiéndolas al medicamento bajo prueba y después recolectando las sobrevivientes. Las bacterias sobrevivientes se someten a rondas de recombinación adicionales. La ronda subsecuente puede realizarse por medio de un enfoque de división y agrupación en donde el ADN de un subconjunto de bacterias sobrevivientes se introduce a un segundo subconjunto de bacterias. De manera alternativa, puede introducirse una biblioteca fresca de fragmentos de ADN dentro de las bacterias sobrevivientes. Pueden llevarse a cabo rondas subsecuentes de selección a concentraciones crecientes del medicamento, incrementando de esta manera la severidad de la selección. Puede utilizarse una estrategia similar para simular la adquisición viral de la resistencia al medicamento. El objetivo es identificar medicamentos para los cuales puede adquirirse resistencia únicamente poco a poco, si es que esto sucede. Los virus que deben desarrollarse son aquellos que causan infecciones en seres humanos para los cuales están disponibles medicamentos que por lo menos son modestamente efectivos. Los substratos para la recombinación pueden provenir de mutantes inducidos, variantes naturales de la misma cepa viral o diferentes virus. Si se conoce la meta del medicamento (por ejemplo, análogos del nucleótido que inhiben el gen de transcriptasa inversa de VIH) , pueden producirse bibliotecas enfocadas que contengan variantes del gen meta. La recombinación de un genoma viral con una biblioteca de fragmentos se lleva a cabo por lo general in vi tro . Sin embargo, en situaciones en donde la biblioteca de fragmentos constituye variantes de genomas virales o fragmentos que pueden ser incluidos en estos genomas, la recombinación también puede llevarse a cabo in vivo, por ejemplo, trascriptando células con copias de sustrato múltiples (consultar Sección V) . Para la clasificación, los genomas virales recombinantes se introducen dentro de células huéspedes susceptibles a la infección por el virus y las células se exponen a un medicamento efectivo contra el virus (inicialmente a concentración baja). Las células pueden revolverse para eliminar cualquier virus no infectado. Después de un período de infección, los virus de la progenie pueden recolectarse del medio del cultivo, donde los virus de la progenie están enriquecidos con virus que han adquirido por lo menos una resistencia parcial al medicamento. Alternativamente, las células infectadas viralmente pueden colocarse en placas en una capa de ágar suave y los virus resistentes pueden aislarse de las placas. El tamaño de la placa proporciona cierto indicio del grado de resistencia viral . Los virus de la progenie que sobreviven a la clasificación son sometidos a rondas adicionales de recombinación y clasificación con una severidad creciente hasta que se ha adquirido un nivel predeterminado de resistencia al medicamento. El nivel predeterminado de resistencia al medicamento puede reflejar la dosificación máxima de un medicamento práctico para administrar a un paciente sin efectos secundarios intolerables. El análisis es particularmente valioso para investigar la adquisición de la resistencia ante diversas combinaciones de medicamentos, como por ejemplo la lista creciente de medicamentos anti-VIH aprobados (por ejemplo, AZT, ddl, ddC, d4T, TIBO 82150, nevaripine, 3TC, crixivan y ritonavir) . J. LA IMPORTANCIA EVOLUTIVA DE LA RECOMBINACIÓN El mejoramiento de la cepa es la evolución dirigida de un organismo para estar más "adecuado" para una tarea deseada. En la naturaleza, la adaptación se facilita por la recombinación sexual . La recombinación sexual permite a una población explotar la diversidad genética dentro de ella, por ejemplo, consolidando mutaciones útiles y desechando las nocivas. De esta forma, la adaptación y la evolución pueden proceder rápidamente. En ausencia de un ciclo sexual, los miembros de una población deben desarrollarse de manera independiente acumulando mutaciones aleatorias de manera secuencial. Varias mutaciones útiles se pierden mientras que las mutaciones nocivas pueden acumularse. La adaptación y la evolución de esta forma procede lentamente en comparación con la evolución sexual . Tal como se muestra en la Figura 17, la evolución asexual es un proceso lento e ineficiente. Las poblaciones se mueven como individuos mas que como grupos . Una población diversa se genera mediante la mutagénesis de un solo padre que da como resultado una distribución de individuos adecuados y no adecuados. En ausencia de un ciclo sexual, cada pieza de información genética de la población sobreviviente recae en los mutantes individuales. La selección del "más adecuado" da como resultado varios individuos "adecuados" que se desechan en el camino junto con la información genética útil que cargan. La evolución asexual lleva a cabo un evento genético a la vez y por lo tanto está limitada por el valor intrínseco de un solo evento genético. La evolución sexual se mueve de manera más rápida y eficiente. El apareamiento dentro de una población consolida la información genética dentro de la población y da como resultado que las mutaciones útiles se combinen entre sí. La combinación de información genética útil da como resultado progenie que es mucho más adecuada que sus padres . De esta manera, la evolución sexual procede de manera mucho más rápida por medio de eventos genéticos múltiples. Años de reproducción vegetal y animal han demostrado el poder de emplear la recombinación sexual para efectuar la evolución rápida de genomas complejos para lograr una tarea particular. Este principio general se demuestra adicionalmente utilizando la mezcla del ADN para recombinar moléculas del ADN in vi tro para acelerar la velocidad de la evolución molecular dirigida. Los esfuerzos de mejoramiento de la cepa de la industria de la fermentación recaen en la evolución dirigida de microorganismos mediante mutagénesis aleatoria secuencial . La incorporación de la recombinación dentro de este proceso reiterativo acelera en gran medida el proceso de mejoramiento de la cepa, que a su vez incrementa la lucratividad de los procesos de fermentación actuales y facilita el desarrollo de nuevos productos. K. MEZCLA DEL ADN CONTRA RECOMBINACIÓN NATURAL - LA UTILIDAD DE LA RECOMBINACIÓN EN FORMA DE GRUPOS La mezcla del ADN incluye la recombinación recursiva de secuencias del ADN. Una diferencia significativa entre la mezcla del ADN y la recombinación sexual natural es que la mezcla del ADN puede producir secuencias de ADN que se originan de secuencias parentales múltiples, mientras que la recombinación sexual produce secuencias del ADN que se originan de únicamente dos secuencias parentales (Figura 25) .

Tal como se muestra en la Figura 25, la velocidad de la evolución está limitada en parte por el número de mutaciones útiles que un miembro de una población puede acumular entre eventos de selección. En la mutagénesis aleatoria secuencial, las mutaciones útiles se acumulan una por evento de selección. Varias mutaciones útiles se desechan cada ciclo en favor del mejor realizador, y las mutaciones neutras o nocivas que sobreviven son tan difíciles de perder como lo son de ganar, por lo tanto se acumulan. En la evolución sexual, la recombinación en pares permite mutaciones de dos diferentes padres para segregar y recombinarse en diferentes combinaciones. Las mutaciones útiles pueden acumularse y las mutaciones nocivas pueden perderse. La recombinación en forma de grupos, como por ejemplo la efectuada por la mezcla del ADN, tiene las mismas ventajas que la recombinación en pares pero permite que las mutaciones de varios padres se consoliden en una progenie única. Por lo tanto, la recombinación en forma de grupo ofrece un medio para incrementar el número de mutaciones útiles que pueden acumular cada evento de selección. La gráfica en la Figura 25 muestra un diagrama del número potencial de mutaciones que puede acumular un individuo en cada uno de estos procesos. La recombinación es exponencialmente superior a la mutagénesis aleatoria secuencial, y esta ventaja se incrementa de manera exponencial con el número de padres que pueden recombinarse. Por lo tanto, la recombinación sexual es más conservadora. En la naturaleza, la naturaleza en pares de la recombinación sexual puede ofrecer una estabilidad importante dentro de una población impidiendo los grandes cambios en la secuencia del ADN que pueden ser resultado de la recombinación en forma de grupos. Sin embargo, para los propósitos de una evolución dirigida, la recombinación en forma de grupos es más eficiente . La diversidad potencial que puede generarse a partir de una población es mayor como resultado de la recombinación en forma de grupos, en comparación con la resultante de la recombinación en forma de pares. Además, la recombinación en forma de grupos permite la combinación de mutaciones benéficas múltiples que se originan de secuencias parentales múltiples . Para demostrar la importancia de la recombinación en forma de grupos contra la recombinación en forma de pares en la generación de una diversidad molecular se debe considerar la reproducción de diez secuencias de ADN independientes, donde cada una contiene únicamente una sola mutación. Existen 210 = 1024 diferentes combinaciones de estas diez mutaciones que van de una sola secuencia sin mutaciones (el consenso) hasta la que posee todas las diez mutaciones. Si este grupo fuera recombinado entre sí mediante una recombinación en forma de pares, una población que contenga el consenso, los padres, y las 45 diferentes combinaciones de cualesquiera de las dos mutaciones daría como resultado 56 o ca. 5% de las posibles 1024 combinaciones mutantes. De manera alternativa, si el grupo fuera recombinado entre sí en una forma de grupos, todas las 1024 se generarían teóricamente, dando como resultado aproximadamente un incremento de 20 veces en la diversidad de la biblioteca. Al buscar una solución única a un problema en la evolución molecular, mientras más compleja sea la biblioteca, más compleja es la posible solución. De hecho, el miembro más adecuado de una biblioteca mezclada con frecuencia contiene varias mutaciones que se originan de varias secuencias de inicio independientes. 1. La Mezcla de ADN Ofrece Una Recombinación en Forma de Pares Recursiva La mezcla del ADN in vi tro da como resultado la producción eficiente de bibliotecas genéticas combinadas catalizando la recombinación de varias secuencias del ADN. Mientras que el resultado de la mezcla del ADN es una población que representa la recombinación en forma de grupos de varias secuencias, el proceso no depende de la recombinación de varias secuencias del ADN de manera simultánea, sino más bien de su recombinación en forma de pares recursiva. En ensamble de genes completos de un grupo mezclado de pequeños fragmentos de genes requiere sitios de recocido y alargamiento múltiples, los ciclos térmicos de la reacción PCR sin iniciador. Durante cada ciclo térmico varios pares de fragmentos se recuecen y se extienden para formar una población combinada de fragmentos del ADN quiméricos más grandes. Después del primer ciclo de reensamble, los fragmentos quiméricos contienen una secuencia que se origina de sobre todo dos diferentes genes padres, con todos los pares posibles de una secuencia "parental" teóricamente representada. Esto es similar al resultado de un solo ciclo sexual dentro de una población. Durante el segundo ciclo, estos fragmentos quiméricos se recuecen entre sí o con otros fragmentos pequeños, dando como resultado quimeras que originan desde hasta cuatro de las diferentes secuencias de inicio, una vez más con todas las combinaciones posibles de las cuatro secuencias parentales representadas teóricamente. Este segundo ciclo es análogo a la población completa resultante de una sola cruza sexual, tanto de padres como de descendencia, en la reproducción. Los ciclos adicionales dan como resultado quimeras que se originan desde 8, 16, 32, etc., secuencias parentales y son análogos a sus reproducciones posteriores de la población precedente. Esto podría considerarse como similar a la diversidad generada a partir de una pequeña población de pájaros que están aislados en una isla, reproduciéndose entre sí durante varias generaciones. El resultado simula el producto de la recombinación "en forma de grupos", pero la vía es a través de una recombinación en forma de pares recursiva. Por esta razón, las moléculas de ADN generadas a partir de la mezcla del ADN in vi tro no son la "progenie" de las secuencias "parentales" de inicio, sino más bien la gran, gran, gran, grann, .. (n = número de ciclos térmicos) gran progenie de las moléculas "ancestrales" de inicio. L. FERMENTACIÓN La fermentación de microorganismos para la producción de productos naturales es la aplicación más antigua y más sofisticada de la biocatálisis . Los microorganismos industriales llevan a cabo una conversión de pasos múltiples de existencias alimenticias renovables a productos químicos de alto valor en un solo reactor y al hacer esto, catalizan una industria de miles de millones de dólares. Los productos de fermentación varían de químicos finos y a granel como el etanol, ácido láctico, aminoácidos y vitaminas, hasta productos farmacéuticos de moléculas pequeñas de alto valor, productos farmacéuticos de proteínas y enzimas industriales. Consul tar, por ejemplo, McCoy (1998) C&EN 13-19) para una introducción a la biocatálisis. El éxito al llevar estos productos al mercado y el éxito al competir en el mercado depende de un mejoramiento continuo de los biocatalizadores de la célula entera. Los mejoramientos incluyen una producción creciente de productos deseados, la eliminación co-metabolitos no deseados, la utilización mejorada de fuentes de carbono y nitrógeno no costosas, y la adaptación a condiciones del fermentador, la producción creciente de un metabolito primario, la producción creciente de un metabolito secundario, la tolerancia creciente a las condiciones acidas, la tolerancia creciente a condiciones básicas, la tolerancia creciente a solventes orgánicos, la tolerancia creciente a condiciones de sal alta y la tolerancia creciente a temperaturas altas o bajas. Las carencias en cualesquiera de estas áreas puede dar como resultado altos costos de manufactura, la incapacidad de capturar o mantener la participación en el mercado, y la falla al no introducir productos prometedores al mercado. Por esta razón, la industria de la fermentación invierte recursos financieros y de personal significativos para el mejoramiento de las cepas de producción. Las estrategias actuales para el mejoramiento de la cepa dependen de la modificación empírica y reiterativa de las condiciones del fermentador y la manipulación genética del organismo productor. A pesar de que se han realizado avances en la biología molecular de los organismos industriales establecidos, la ingeniería metabólica racional es intensa en cuanto a información y no puede aplicarse ampliamente a cepas industriales menos caracterizados. La estrategia aplicada de manera más amplia para el mejoramiento de la cepa emplea una mutagénesis aleatoria de la cepa productora y la clasificación de mutantes que poseen propiedades mejoradas. Para las cepas maduras, aquellas sometidas a varias rondas de mejoramiento, estos esfuerzos ofrecen de manera rutinaria un incremento del 10% en la valoración del producto al año. A pesar de que es efectiva, esta estrategia clásica es lenta, laboriosa y costosa. Los avances tecnológicos en esta área se enfocan en la automatización y en incrementar el resultado de la clasificación de muestras con la esperanza de reducir el costo del mejoramiento de la cepa. Sin embargo, la barrera técnica real reside en la limitación intrínseca de las mutaciones sencillas para efectuar un mejoramiento significativo de la cepa. Los métodos de la presente superan esta limitación y ofrecen acceso a varias mutaciones útiles por ciclo, que pueden utilizarse para complementar las tecnologías de automatización y catalizar los procesos de mejoramiento de la cepa. Los métodos de la presente permiten que los biocatalizadores sean mejorados a un paso más rápido que los métodos convencionales. La mezcla del genoma entero puede por lo menos duplicar la velocidad del mejoramiento de la cepa para los microorganismos utilizados en la fermentación en comparación con los métodos tradicionales. Esto ofrece una disminución relativa en el costo de los procesos de fermentación. Pueden entrar productos nuevos en el mercado de manera más rápida, los productores pueden incrementar sus utilidades así como la participación en el mercado, y los consumidores obtienen acceso a más productos de mayor calidad y menores precios. Además, la eficiencia creciente de los procesos de producción se traduce en menos producción de desechos y el uso más frugal de recursos . La mezcla del genoma entero ofrece un medio para acumular una mutación útil múltiple por ciclo y elimina de esta manera la alimentación inherente de programas de mejoramiento de la cepa actuales (SIPs) . La mezcla del ADN ofrece una mutagénesis recursiva, una recombinación y una selección de las secuencias del ADN. Una diferencia clave entre la recombinación mediada por la mezcla del ADN y la recombinación sexual natural es que la mezcla del ADN lleva a cabo la recombinación tanto en forma de pares (dos padres) como en forma de grupos (varios padres) de las moléculas padres, tal como se describe anteriormente. La recombinación natural es más conservadora y se limita a una recombinación en forma de pares. En la naturaleza, la recombinación en forma de pares ofrece estabilidad dentro de una población previniendo saltos grandes en secuencias o una estructura genómica que puede resultar de la recombinación en forma de grupos. Sin embargo, para los propósitos de la evolución dirigida, la recombinación en forma de grupos es atractiva ya que las mutaciones benéficas de varios padres pueden combinarse durante una sola cruza para producir una descendencia superior. La recombinación en forma de grupos es análoga a la reproducción cruzada de las cepas reproducidas en la misma familia en un mejoramiento clásico de la cepa, con excepción de que las cruzas se llevan a cabo entre varias cepas a la vez. En esencia, la recombinación en forma de grupos es una secuencia de eventos que efectúa la recombinación de una población de secuencias del ácido nucleico que da como resultado la generación de nuevos ácidos nucleicos que contienen información genética de más de dos de los ácidos nucleicos originales. El poder de la mezcla del ADN in vi tro es que pueden generarse bibliotecas combinadas grandes a partir de una pequeña agrupación de fragmentos del ADN reensamblados mediante reacciones de recocido y extensión en forma de pares recursivas, "apareamientos". Varios de los formatos de recombinación in vivo descritos (como por ejemplo plasmidio-plasmidio, plasmidio-cromosoma, fago-fago, fago-cromosoma, fago-plasmidio, ADN de conjugación-cromosoma, ADN exógeno-cromosoma, cromosoma-cromosoma, donde el ADN se introduce dentro de la célula mediante competencia natural y no natural, transducción, transfección, conjugación, fusión de protoplastos, etc.) dan como resultado principalmente la recombinación en forma de pares de dos moléculas del ADN. De esta forma, estos formatos cuando se llevan a cabo durante únicamente un sólo ciclo de recombihación, están limitados de manera inherente en su potencial para generar una diversidad molecular. Para generar el nivel de diversidad obtenido por los métodos de mezcla del ADN in vi tro, deben llevarse a cabo de manera recursiva formatos de apareamiento en forma de pares; es decir, durante varias generaciones, antes de clasificar las secuencias mejoradas. Por lo tanto, una agrupación de secuencias del ADN, como por ejemplo cuatro cromosomas independientes, debe recombinarse, por ejemplo, mediante la fusión de protoplastos, y la progenie de esta recombinación (cada una representando un resultado único del apareamiento en forma de pares) debe ser entonces agrupada, sin selección, y después recombinada otra vez, y otra vez, y otra vez. Este proceso debe repetirse durante un número suficiente de ciclos para que dé como resultado la progenie que posee la complejidad deseada. Únicamente se ha generado una diversidad suficiente, si la población resultante es clasificada para secuencias nuevas y mejoradas. Existen algunos métodos generales para efectuar la recombinación eficiente en las procariotas. Las bacterias no poseen un ciclo sexual conocido per se, pero existen mecanismos naturales mediante los cuales los genomas de estos organismos experimentan la recombinación. Estos mecanismos incluyen competencia natural, transducción mediada por fagos y conjugación de célula-célula. Las bacterias que son competentes naturalmente son capaces de absorber de manera eficiente el ADN puro del ambiente. Si es homólogo, este ADN experimenta una recombinación con el genoma de la célula, dando como resultado un intercambio genético. Bacillus subtilis, el organismo de producción primario de la industria de las enzimas, se conoce por la eficiencia con la cual lleva a cabo este proceso. En una transducción generalizada, un bacteriófago media el intercambio genético. Un fago de transducción con frecuencia empacará cabezas llenas del genoma huésped. Este fago puede infectar un nuevo huésped y entregar un fragmento del genoma huésped anterior que con frecuencia está integrado por medio de una recombinación homologa. Las células también pueden transferir ADN entre sí mediante conjugación. Las células que contienen los factores de apareamiento apropiados transfieren los episomas, así como los cromosomas enteros, a una célula aceptadora apropiada donde puede recombinarse con el genoma aceptador. La conjugación se asemeja a la recombinación sexual para microbios y puede ser intraespecífica, interespecífica, e intergenérica. Por ejemplo, un medio eficiente de transformar la especia Streptomyces , un género responsable de producir varios antibióticos comerciales, es por medio de la transferencia por conjugación de plasmidios de Echerichia coli .

Para varios microorganismos industriales, hace falta el conocimiento de la competencia, el fago de transducción o los factores de fertilidad. La fusión de protoplastos ha sido desarrollada como una alternativa versátil y general para estos métodos naturales de recombinación. Los protoplastos se preparan retirando la pared celular tratando las células con enzimas líticas en presencia de estabilizadores osmóticos. En la presencia de un agente fusogénico, como por ejemplo el polietilenglicol (PEG) , los protoplastos son inducidos a fusionarse y formar híbridos transitorios o "fusionadores" . Durante este estado híbrido, la recombinación genética ocurre a alta frecuencia permitiendo que los genomas se reclasifiquen. El paso crucial final es la segregación y regeneración exitosa de células viables a partir de los protoplastos fusionados. La fusión de los protoplastos puede ser intraespecífica, interespecífica, e intergenérica y ha sido aplicada tanto a procariotas como a eucariotas. Además, es posible fusionar más de dos células, ofreciendo de esta manera un mecanismo para efectuar una recombinación en forma de grupos. A pesar de que no se necesitan factores de fertilidad, fagos de transducción o un desarrollo de competencia para la fusión de protoplastos, un método para la formación, fusión y regeneración de protoplastos se perfecciona por lo general para cada organismo. La fusión de protoplastos de acuerdo con lo aplicado a la recombinación en forma de grupos se describe con mayor detalle, consul tar anteriormente . Una clave para el SIP es tener un ensayo que pueda utilizarse de manera dependiente para identificar unos cuantos mutantes de miles que poseen incrementos sutiles en el rendimiento del producto. El factor limitante en varios formatos de ensayo es la uniformidad del crecimiento celular. Esta variación es la fuente de variabilidad de la línea base en ensayos subsecuentes . El tamaño del inoculo y el entorno del cultivo (temperatura/humedad) son fuentes de variación del desarrollo celular. La automatización de todos los aspectos del establecimiento de cultivos iniciales y los incubadores controlados en temperatura y humedad de la más alta tecnología son útiles para reducir la variabilidad. Las células o esporas mutantes se separan en medio sólido para producir colonias de esporulación individuales. Utilizando un colector de colonia automatizado (Q-bot, Genetix, Reino Unido) , las colonias se identifican, se recolectan y 10,000 mutantes diferentes se inoculan en 96 portaobjetos de microvaloración de pozo que contienen dos bolas de vidrio de 3 mm/pozo. El Q-bot no recoleta una colonia entera sino más bien inserta una clavija a través del centro de la colonia y sal con un pequeño muestreo de células (o micelia) y esporas. El tiempo que la clavija se encuentra en la colonia, el número de inmersiones para inocular el medio del cultivo, y el tiempo que la clavija se encuentra en este medio afectan cada uno el tamaño del inoculo, y cada uno puede controlarse y perfeccionarse. El proceso uniforme del Q-bot disminuye el error de manejo humano e incrementa la velocidad de establecimiento de cultivos (aproximadamente 10,000/4 horas). Posteriormente estos cultivos se agitan en un incubador controlado en temperatura y humedad. Las bolas de vidrio actúan para promover una aereación uniforme de las células y la dispersión de fragmentos miceliales similares a las cuchillas de un fermentador. Una forma de realización de este procedimiento se ilustra adicionalmente en la Figura 28, incluyendo un sistema integrado para el ensayo. 1. Clasificación Previa La capacidad de detectar un incremento sutil en el rendimiento de un mutante sobre el de una cepa padre recae en la sensibilidad del ensayo. La posibilidad de encontrar los organismos que poseen un mejoramiento se incrementa con el número de mutantes individuales que puedan ser clasificados por el ensayo. Para incrementar las probabilidades de identificar un grupo de tamaño suficiente, puede utilizarse una clasificación previa que incrementa el número de mutantes procesados 10 veces más. El objetivo de la clasificación primaria será identificada rápidamente a los mutantes que poseen valoraciones del producto iguales o mejores que las cepas padre y mover únicamente estos mutantes hacia el cultivo de la célula líquida. La clasificación primaria es una clasificación en placa de ágar analizada por el colector de colonia Q-bot. A pesar de que los ensayos pueden ser fundamentalmente diferentes, muchos dan como resultado, por ejemplo, la producción de halos de la colonia. Por ejemplo, la producción de antibiótico se somete a ensayo en placas utilizando una capa de una cepa indicadora sensible, como por ejemplo B . subtilis . La producción de antibiótico se somete a ensayo por lo general como una zona de aclaración (desarrollo inhibido del organismo indicador) alrededor del organismo productor. De manera similar, la producción de enzima puede someterse a ensayo en placas que contengan el substrato de la enzima, donde la actividad se detecta como una zona de modificación del substrato alrededor de la colonia productora. La valoración del producto se correlaciona con la relación del área del halo con el área de la colonia. El Q-bot u otro sistema automatizado se recomienda para recolectar únicamente colonias que poseen una relación de halo en el 10% superior de la población, es decir, 10,000 mutantes de los 100,000 que entran a la preclasificación de la placa. Esto incrementa el número de clones mejorados en el ensayo secundario y elimina el esfuerzo inútil de clasificar productores bajos y fuera de combate. Esto mejora el "porcentaje de éxito" del ensayo secundario. M. PROMOCIÓN DEL INTERCAMBIO GENÉTICO 1. Generalidades Algunos métodos de la invención llevan a cabo la recombinación del ADN celular propagando las células bajo condiciones que inducen el intercambio del ADN entre las células. El intercambio del ADN puede promoverse mediante métodos generalmente aplicables como la electroforésis, biolística, fusión celular, o en algunos casos, mediante conjugación, transducción, o transferencia mediada por agrobacterias y meiosis. Por ejemplo, la Agrobacterium puede transformar la S. cerevisiae con ADN-T, que se incorpora dentro del genoma de la levadura tanto por recombinación homologa como un mecanismo de reparación de intervalo. (Piers y colaboradores, Proc . Nati . Acad. Sci . USA (Procedimientos de la Academia Nacional de Ciencias EUA) 93(4), 1613-8 (1996) ) . En algunos métodos, la diversidad inicial entre células (es decir, antes del intercambio del genoma) es inducida mediante mutagénesis inducida por radiación o química de un tipo de célula progenitora, opcionalmente seguida por la clasificación de un genotipo deseado. En otros métodos, la diversidad es natural como cuando las células se obtienen de diferentes individuos, cepas o especies.

En algunos métodos de mezcla, el intercambio inducido del ADN se utiliza como el único medio para llevar a cabo la recombinación en cada ciclo de recombinación. En otros métodos, el intercambio inducido se utiliza en combinación con la recombinación sexual de un organismo. En otros métodos, el intercambio inducido y/o la recombinación sexual natural se utilizan en combinación con la introducción de una biblioteca de fragmentos. Esta biblioteca de fragmentos puede ser un genoma entero, un cromosoma entero, un grupo de genes enlazados funcional o genéticamente, un plasmidio, un cosmidio, un genoma mitocondrial, un genoma viral (repetitivo y no repetitivo) o fragmentos específicos o aleatorios de cualesquiera de éstos. El ADN puede enlazarse a un vector o puede ser de forma libre. Algunos vectores contienen secuencias que promueven la recombinación homologa o no homologa con el genoma huésped. Algunos fragmentos contienen rompimientos de doble estirpe como los provocados por el corte con cuentas de vidrio, sonicación, o fragmentación química o enzimática, para estimular la recombinación. En cada caso, el ADN puede intercambiarse entre células después de lo cual puede experimentar una recombinación para formar genomas híbridos. Por lo general, las células están sujetas de manera recursiva a la recombinación para incrementar la diversidad de la población antes de la clasificación. Las células que transportan genomas híbridos, por ejemplo, que se generan después de por lo menos uno, y por lo general varios ciclos de recombinación, se clasifican para un fenotipo deseado, y las células que poseen este fenotipo se aislan. Estas células pueden formar adicionalmente materiales de inicio para ciclos adicionales de recombinación en un esquema recursivo de recombinación/seleccion . Un medio de promover el intercambio de ADN entre células es mediante la fusión de células, como por ejemplo mediante la fusión de protoplastos. Un protoplasto es el resultado de la eliminación de una célula de su pared celular, dejando una célula unida a la membrana que depende de un medio isotónico o hipertónico para mantener su integridad. Si la pared celular se retira parcialmente, la célula resultante se refiere estrictamente como un esferoplasto y si se retira completamente, como un protoplasto. Sin embargo, aquí el término protoplasto incluye esferoplastos a menos que se indique otra cosa. La fusión de protoplastos se describe por Shaffner y colaboradores, Proc. Nati . Acad. Sci . USA (Procedimiento de la Academia Nacional de Ciencias EUA) 11 , 2163 (1980) y otros procedimientos ejemplares se describen por Yoakum y colaboradores, EUA 4,608,339, Takahashi y colaboradores, EUA 4,677,066 y Sambrooke y colaboradores, en el Capítulo 16. La fusión de protoplastos ha sido reportada entre cepas, especies y géneros (por ejemplo, levadura y eritrocitos de pollo) . Los protoplastos pueden prepararse para células tanto bacterianas como eucarióticas, incluyendo las células de mamíferos y células vegetales, mediante varios medios que incluyen el tratamiento químico para pelar las paredes celulares. Por ejemplo, las paredes celulares pueden pelarse mediante digestión con una enzima degradante de la pared celular como la lisozima en una solución amortiguadora EDTA de 50 mM, con 10-20% de sacarosa. La conversión de las células a protoplastos esféricos puede monitorearse mediante una microscopía de contraste de fases. Los protoplastos también pueden prepararse mediante la propagación de células en medios complementados con un inhibidor de la síntesis de la pared celular, o mediante el uso de cepas mutantes que carecen de capacidad para la formación de la pared celular. De preferencia, las células eucarióticas se sincronizan en la fase Gl mediante arresto con inhibidores como el a-factor, la toxina asesina K. lactis, la leflonamida y los inhibidores de adenilato ciclasa. Opcionalmente, algunos pero no todos los protoplastos que deben fusionarse pueden matarse y/o hacer que se fragmente su ADN mediante un tratamiento con irradiación ultravioleta, hidroxilamina o cupferón (Reeves y colaboradores, FEMS Microbiol . Lett . (Carta de Microbiología de FEMS) 99, 193-198 (1992)). En esta situación, los protoplastos matados se refieren como donantes, y los protoplastos viables como aceptadores. Utilizar células de donantes muertos puede ser ventajoso para reconocer posteriormente las células fusionadas con genomas híbridos, tal como se describe posteriormente. Además, la desintegración del ADN en las células del donante es ventajosa para estimular la recombinación con el ADN del aceptador. Opcionalmente, las células del aceptador y/o fusionadas también pueden ser expuestas brevemente, pero no mortalmente a la irradiación ultravioleta posteriormente para estimular la recombinación. Una vez formados, los protoplastos pueden estabilizarse en una variedad de osmolitos y compuestos como el cloruro de sodio, cloruro de potasio, fosfato de sodio, fosfato de potasio, sacarosa, sorbitol en la presencia de DTT. La combinación de la producción amortiguadora, pH, agente reductor, y el estabilizador osmótico puede perfeccionarse para diferentes tipos de células. Los protoplastos pueden inducirse a la fusión mediante el tratamiento con un químico como por ejemplo PEG, cloruro de calcio o propionato de calcio o electrofusión (Tsoneva, Acta Microbiológica Bulgaria 24, 53-59 (1989)) . También se ha descrito un método de fusión celular empleando campos eléctricos. Consultar Chang EUA, 4,970,154. Las condiciones pueden perfeccionarse para diferentes cepas.

Las células fusionadas son heterocariones que contienen genomas de dos o más protoplastos del componente. Las células fusionadas pueden enriquecerse a partir de células parentales no fusionadas mediante la sedimentación del gradiente de sacarosa o la clasificación celular. Los dos núcleos en los heterocariones puede fusionarse (cariogamía) y puede ocurrir la recombinación homologa entre los genomas . Los cromosomas también pueden segregarse asimétricamente dando como resultado protoplastos regenerados que han perdido o ganado cromosomas enteros. La frecuencia de la recombinación puede incrementarse mediante el tratamiento con irradiación ultravioleta o mediante el uso de cepas que expresan de manera excesiva la recA u otros genes de recombinación, o los genes rad de la levadura, y variantes cognadas de las mismas en otras especies, o mediante la inhibición de productos del gen de MutS, MutL., ó AfutD. La sobreexpresión puede ser ya sea el resultado de la introducción de genes de recombinación exógenos o el resultado de seleccionar las cepas, que como resultado de una variación natural o una mutación inducida, expresan excesivamente los genes de recombinación endógenos. Los protoplastos fusionados se propagan bajo condiciones que permiten la regeneración de las paredes celulares, la recombinación y la segregación de genomas recombinantes en las células de progenie a partir del heterocarión y la expresión de genes recombinantes. Este proceso puede repetirse varias veces para incrementar la diversidad de cualquier grupo de protoplastos o células. Después, u ocasionalmente antes o durante, la recuperación de las células fusionadas, las células se clasifican o se seleccionan para su evolución con el fin de lograr una propiedad deseada. Posteriormente, puede realizarse una ronda subsecuente de recombinación preparando los protoplastos de las células que sobreviven a la selección/clasificación en una ronda previa. Los protoplastos se fusionan, la recombinación se lleva a cabo en los protoplastos fusionados, y las células se regeneran a partir de los protoplastos fusionados. Este proceso puede repetirse otra vez más varias veces para incrementar la diversidad de la población inicial . Los protoplastos, regenerados o las células en regeneración están sujetos a una selección o clasificación adicional. Las rondas subsecuentes de recombinación pueden llevarse a cabo en una base de agrupación dividida como se describe anteriormente. Es decir, se utiliza una primera subpoblación de células que sobreviven a la selección/ clasificación de una ronda previa para la formación del protoplasto. Una segunda subpoblación de células que sobreviven a la selección/clasificación de una ronda previa se utiliza como fuente para la preparación de la biblioteca del ADN. La biblioteca del ADN de la segunda subpoblación de células se transforma posteriormente en los protoplastos provenientes de la primera subpoblación. La biblioteca experimenta una recombinación o los genomas de los protoplastos para formar genomas recombinantes. Este proceso puede repetirse varias veces en ausencia de un evento de selección para incrementar la diversidad de la población celular. Las células se regeneran a partir de protoplastos, y la selección/clasificación se aplican a las células en proceso de regeneración o regeneradas. En una variación adicional, se introduce una biblioteca fresca de fragmentos del ácido nucleico dentro de los protoplastos que sobreviven a la selección/clasificación de una ronda previa. Un formato de ejemplo para la mezcla utilizando una fusión de protoplastos se muestra en la Figura 5. La figura muestra los siguientes pasos: formación del protoplasto del donante y cepas del receptor, formación de heterocariones, cariogamía, recombinación y segregación de genomas recombinantes en células separadas. Opcionalmente, los genomas recombinantes, si poseen un ciclo sexual, pueden experimentar una recombinación adicional entre sí como resultado de la meiosis y el apareamiento. Con frecuencia se utilizan ciclos recursivos de fusión de protoplastos o un apareamiento/meiosis recursiva para incrementar la diversidad de una población celular. Después de lograr una población suficientemente diversa a través de una de estas formas de recombinación, las células se clasifican o se seleccionan para una propiedad deseada. Las células que sobreviven a la selección/clasificación pueden utilizarse posteriormente como los materiales de inicio en un ciclo adicional de formación de protoplastos u otros métodos de recombinación tal como se indica en la presente. 2. Selección para Cepas Híbridas La invención ofrece estrategias de selección para identificar las células formadas mediante fusión de los componentes a partir de células parentales de dos o más subpoblaciones distintas. La selección de células híbridas se lleva a cabo por lo general antes de seleccionar o clasificar las células que han evolucionado (como resultado de un intercambio genético) hasta la adquisición de una propiedad deseada. Una premisa básica de la mayoría de estos esquemas de selección es que dos subpoblaciones iniciales poseen dos distintos marcadores. Por lo tanto, las células con genomas híbridos pueden identificarse mediante la selección para ambos marcadores . En uno de estos esquemas, por lo menos una subpoblación de células transporta un marcador selectivo unido a su membrana celular. Los ejemplos de marcadores de membrana adecuados incluyen biotina, fluoresceína y rodamina. Los marcadores pueden enlazarse a grupos de amida o tilo o a través de químicas de derivación más específicas, como por ejemplo yodo, acetatos, yodo-acetamidas, maleimidas. Por ejemplo, un marcador puede anexarse de la siguiente forma. Las células o protoplastos se lavan con una solución amortiguadora (por ejemplo, PBS) , que no interfiere con el acoplamiento químico de un ligando químicamente activo que reacciona con grupos de amino de lisinas o aminogrupos terminal N de proteínas de la membrana. El ligando es ya sea reactivo a la amina en sí (por ejemplo, isotiocianatos, esteres de succinimidilo, cloruros de sulfonilo) o se activa mediante un enlazador heterobifuncional (por ejemplo, EMCS, SIAB, SPDP, SMB) para convertirse en un reactivo de amina. El ligando es una molécula que se enlaza fácilmente mediante cuentas magnéticas derivadas de la proteína u otros soportes sólidos de capturación. Por ejemplo, el ligando puede ser una biotina activada con succinimidilo (Molecular Probes Inc.: B-1606, B-2603, S-1515, S-1582) . Este enlazador reacciona con aminogrupos de proteínas que residen dentro y sobre la superficie de una célula. Posteriormente, las células se lavan para eliminar el agente de etiquetación excedente antes de ponerse en contacto con las células de la segunda subpoblación que transporta un segundo marcador selectivo. La segunda subpoblación de células también puede transportar un marcador de membrana, si bien un diferente marcador de membrana de la primera subpoblación. De manera alternativa, la segunda subpoblación puede transportar un marcador genético. El marcador genético puede conferir una propiedad selectiva como por ejemplo resistencia al medicamento o una propiedad clasificable, como la expresión de la proteína fluorescente verde. Después de la fusión de la primera y segunda subpoblaciones de células y su recuperación, las células se clasifican o se seleccionan para la presencia de marcadores en ambas subpoblaciones parentales. Por ejemplo, los fusionadores se enriquecen para una población mediante la adsorción a cuentas específicas y éstas se clasifican posteriormente mediante FACS para aquellas que expresan un marcador. Las células que sobreviven ambas clasificaciones para ambos marcadores son aquellas que han experimentado la fusión de protoplastos, y por lo tanto son más propensas a poseer genomas recombinados. Por lo general, los marcadores se clasifican o se seleccionan por separado. Los marcadores enlazados por membrana, como la biotina, pueden clasificarse mediante enriquecimiento de afinidad para el marcador de la membrana celular (por ejemplo, produciendo células fusionadas en una matriz de afinidad) . Por ejemplo, para una etiqueta de la membrana de biotina, las células pueden purificarse por afinidad utilizando cuentas magnéticas recubiertas con estreptavidina (Dynal) . Estas cuentas se lavan varias veces para eliminar las células huéspedes no fusionadas. De manera alternativa, las células pueden producirse contra un anticuerpo para el marcador de la membrana. En una variación posterior, si el marcador de la membrana es fluorescente, las células que portan el marcador pueden identificarse mediante FACS. Las clasificaciones para los marcadores genéticos dependen de la naturaleza de los marcadores, e incluyen la capacidad de desarrollarse en medios tratados con medicamentos o selección de FACS para la proteína fluorescente verde. Si la primera y la segunda población celular tienen marcadores fluorescentes o diferentes longitudes de onda, ambos marcadores pueden clasificarse simultáneamente mediante una selección por FACS. En un esquema de selección adicional para células híbridas, la primera y segunda población de células que deben fusionarse expresan diferentes subunidades de una enzima heteromultimérica . Por lo general, la enzima heteromultimérica tiene dos subunidades diferentes, pero las enzimas heteromultiméricas que poseen tres, cuatro o más subunidades diferentes también pueden utilizarse. Si una enzima tiene más de dos subunidades diferentes, cada subunidad puede expresarse en una diferente subpoblación de células (por ejemplo, tres subunidades en tres subpoblaciones) , o más de una subunidad puede expresarse en la misma subpoblación de células (por ejemplo, una subunidad en una subpoblación, dos subunidades en una segunda subpoblación) . En el caso en el que más de dos subunidades se utilicen, puede lograrse la selección para la recombinación en forma de grupos de más de dos protoplastos. Las células híbridas que representan una combinación de genomas de células componentes de la primera, segunda o más subpoblaciones pueden reconocerse mediante un ensayo de la enzima intacta. Este ensayo puede ser un ensayo de enlace, pero generalmente se trata de un ensayo funcional (por ejemplo, capacidad de metabolizar un substrato de la enzima) . La actividad enzimática puede detectarse por ejemplo procesando un substrato en un producto con una absorbancia fluorescente o de otro tipo fácilmente detectable o un espectro de emisión. Las subunidades individuales de una enzima heteromultimérica utilizada en este tipo de ensayo, de preferencia no tienen actividad enzimática en forma disociada, o por lo menos tienen una actividad significativamente menor en forma disociada que en forma asociada. De preferencia, las células utilizadas para la función carecen de una forma endógena de la enzima heteromultimérica, o por lo menos tienen una actividad endógena significativamente menor que la que resulta de la enzima heteromultimérica formada por la fusión de células. Las enzimas de acilasa de penicilina, acilasa de cefalosforina y aciltransferasa de penicilina son ejemplos de enzimas heteromultiméricas adecuadas. Estas enzimas se codifican por medio de un gen sencillo, que se traduce como una proenzima y se segmenta mediante una proteólisis autocatalítica posttransnacional para eliminar un endopéptido de espaciador y generar dos subunidades, que se asocian para formar la enzima heteromultimérica activa. Ninguna subunidad es activa en ausencia de la otra subunidad. Sin embargo, la actividad puede reconstituirse si estas porciones del gen separado se expresan en la misma célula mediante cotransformación. Otras enzimas que pueden utilizarse tienen subunidades que están codificadas por genes distintos (por ejemplo, los genes faoA y faoB codifican 3-oxoacil-CoA tiolasa de Pseudonmonas fragi (Biochem. J {Boletín de Bioquímica} ) 328, 815-820 (1997)). Una enzima que sirve como ejemplo es la acilasa de penicilina G de la Escherichia coli , que posee dos subunidades codificadas por un solo gen. Los fragmentos del gen que codifica las dos subunidades enlazadas de manera operativa a secuencias de regulación de expresión adecuada son transfectados dentro de la primera y la segunda subpoblación de células, que carecen de una actividad de la acilasa de penicilina endógena. Una célula formada mediante fusión de las células componentes de la primera y segunda subpoblación expresa las dos subunidades, que se ensamblan para formar una enzima funcional, por ejemplo, la acilasa de penicilina. Posteriormente, las células fusionadas pueden seleccionarse en placas de ágar que contienen penicilina G, que es degradada por la acilasa de penicilina. En otra variación, las células fusionadas son identificadas mediante la complementación de mutantes auxotróficos . Las subpoblaciones parentales de células pueden seleccionarse con respecto a las mutaciones auxotróficas conocidas. De manera alternativa, las mutaciones auxotróficas en una población inicial de células pueden generarse espontáneamente mediante la exposición a un agente mutagénico. Las células con mutaciones auxotróficas se seleccionan mediante colocación en placas duplicadas en medios mínimos y completos. Se espera que las lesiones resultantes en la auxotrofía sean esparcidas a través del genoma, en genes para el aminoácido, nucleótido, y las vías biosintéticas de las vitaminas. Después de la fusión de las células parentales, las células resultantes de la fusión pueden identificarse por su capacidad de desarrollarse en medios mínimos. Posteriormente, estas células pueden clasificarse o seleccionarse para su evolución con el fin de lograr una propiedad deseada . Pueden incorporase pasos adicionales de mutagénesis que generan mutaciones auxotróficas frescas en ciclos subsecuentes de recombinación y clasificación/selección. En variaciones del método anterior, la nueva generación de mutaciones auxotróficas en cada ronda de la mezcla puede evitarse reutilizando los mismos auxotrofos. Por ejemplo, los auxotrofos pueden generarse mediante mutagénesis del transposón utilizando un transposón que porte el marcador selectivo. Los auxotrofos se identifican mediante una clasificación como por ejemplo la colocación en placas duplicadas. Los auxotrofos se agrupan, y un lisado de fagos de transducción generalizada se prepara mediante el desarrollo de un fago en una población de células auxotróficas. Una población separada de enzima células auxotróficas es sometida a un intercambio genético, y se utiliza la complementación para las células seleccionadas que han experimentado intercambio genético y recombinación. Estas células se clasifican posteriormente o se seleccionan para la adquisición de una propiedad deseada. Las células que sobreviven a la clasificación o selección experimentan posteriormente la regeneración de los marcadores auxotróficos mediante la introducción de la biblioteca del transposón de transducción. Las células auxotróficas recién generadas pueden someterse entonces a intercambios genéticos adicionales y clasificación/selección. En una variación adicional, las mutaciones auxotróficas son generadas mediante una recombinación homologa con un vector enfocado que incluye un marcador de selección flanqueado por regiones de homología con una región biosintética del genoma de las células que se van a desarrollar. La recombinación entre el vector y el genoma inserta el marcador de selección positiva dentro del genoma provocando una mutación auxotrófica. El vector se encuentra en forma lineal- antes de la introducción de las células. Opcionalmente, la frecuencia de la introducción del vector pueden incrementarse cubriendo sus extremos con oligonucleótidos autocomplementarios recocidos en una formación de pasador de cabello. El intercambio genético y la clasificación/selección proceden tal como se describió anteriormente. En cada ronda, los vectores enfocados se reintroducen regenerando la misma población de marcadores auxotróficos . En otra variación, las células fusionadas son identificadas mediante la clasificación de un marcador genómico presente en una subpoblación de células parentales y un marcador episomal presente en una segunda subpoblación de células. Por ejemplo, una primera subpoblación de levadura que contiene mitocondrios puede utilizarse para complementar una segunda subpoblación de levadura que posee un fenotipo pequeño (es decir, que carece de mitocondrios) . En una variación adicional, el intercambio genético se lleva a cabo entre dos subpoblaciones de células, una de las cuales está muerta. Las células son matadas de preferencia por medio de una breve exposición a los agentes de fragmentación del ADN como por ejemplo la hidroxilamina, cupferón o la irradiación. Posteriormente, las células viables se clasifican para un marcador presente en la subpoblación parental muerta. 3. Transferencias mediadas por liposomas En los métodos indicados anteriormente, en los cuales se introducen bibliotecas con fragmentos del ácido nucleico dentro de los protoplastos, los ácidos nucleicos algunas veces se encapsulan dentro de los liposomas para facilitar la absorción por parte de los protoplastos. La absorción mediada por liposomas del ADN por parte de los protoplastos se describe en Redford y colaboradores, Mol . Gen . Genet .

(Genética General Molecular) 184, 567-569 (1981) . Los liposomas pueden entregar de manera eficiente grandes volúmenes de ADN a los protoplastos (consultar Deshayes y colaboradores, EMBO J. (Boletín EMBO) 4, 2731-2737 (1985)). Consultar también, Philippot y Schuber (eds) (1995) Liposomes as Tools in Basic Research and Industry (Liposomas como Herramientas en la Investigación Básica e Industria CRC press, Boca Ratón, por ejemplo, Capítulo 9, Remy y colaboradores . "Gene Transfer with Cationic Amphiphiles" ("Transferencia de Genes con Anfifilas Catiónicas"). Además, el ADN puede entregarse como fragmentos lineales, que con frecuencia son más recombinogénicos que los genomas enteros .

En algunos métodos, los fragmentos son mutados antes de la encapsulación en liposomas. En algunos métodos, los fragmentos se combinan con RecA y homólogos, o nucleasas (por ejemplo, endonucleasas de restricción) antes de la encapsulación en liposomas para promover la recombinación. Alternativamente, los protoplastos pueden tratarse con dosis letales de reactivos cortantes y después fusionarse. Las células que sobreviven son aquellas que son reparadas mediante recombinación con otros fragmentos genómicos, proporcionando de esta manera un mecanismo de selección para seleccionar los protoplastos recombinantes (y por lo tanto deseablemente diversos) . 4. Mezcla de hongos filamentosos Los hongos filamentosos son particularmente adecuados para llevar a cabo los métodos de mezclado descritos anteriormente. Los hongos filamentosos se dividen en cuatro clasificaciones principales en base a sus estructuras para la reproducción sexual: Phycomycetes, Ascomycetes , Basidiomycetes y los Fungí Imperfecti . Los Phycomycetes (por ejemplo, Rhizopus, Mucor) forman esporas sexuales en esporangios. Las esporas pueden ser uní o multinucleadas y con frecuencia carecen de hifas septadas (cenocítica) . Los Ascomycetes (por ejemplo, Aspergillus, Neurospora, Penicillum) producen esporas sexuales en una asea como resultado de la división meiótica. Las aseas contienen por lo general cuatro productos meióticos, pero algunas contienen ocho como resultado de una división mitótica adicional . Los Basidiomycetes incluyen cepas, y manchan y forman esporas sexuales en la superficie de un basidio. En los holobasidiomycetes, como por ejemplo las cepas, el basidio no está dividido. En los hemibasidiomycetes, como los hongos con surcos ( Uredinales) y con manchas ( Ustilanginales) , el basidio está dividido. Los Fungí imperfecti , que incluyen la mayoría de los patógenos humanos, no tienen una etapa sexual conocida . Los hongos pueden reproducirse por medios asexuales, sexuales o parasexuales. La reproducción asexual implica el crecimiento vegetativo de micelia, la división nuclear y la división celular sin la implicación de gametos y sin fusión nuclear. La división celular puede ocurrir mediante esporulación, injerto o fragmentación de las hifas. La reproducción sexual ofrece un mecanismo para mezclar material genético entre las células. Un ciclo reproductivo sexual se caracteriza por una alteración de una fase haploide y una fase diploide. La diploidía ocurre cuando dos núcleos de un gameto haploide se fusionan (cariogamía) . Los núcleos del gameto pueden provenir de las mismas cepas parentales (autofertilizado) , como en los hongos homotálicos. En los hongos heterotálicos, las cepas parentales provienen de cepas de diferentes tipos de apareamiento. Una célula diploide se convierte en haploide a través de la meiósis, que consiste esencialmente en dos divisiones del núcleo acompañadas por una división de los cromosomas. Los productos de una meiósis son una tetrada (4 núcleos haploides) . En algunos casos, ocurre una división mitótica después de la meiósis, lo que da origen a ocho células del producto. La disposición de las células resultantes (por lo general incluidas en las esporas) se asemeja a la de las cepas parentales. La duración de las etapas haploide y diploide difiere en varios hongos: por ejemplo, los Basidiomicetes y muchos de los Ascomycetes poseen un ciclo de vida principalmente haploide (es decir, la meiósis ocurre inmediatamente después de la cariogamía) , mientras que otros (por ejemplo, Saccharomyces cerevisiae) son diploides en la mayor parte de su ciclo de vida (la cariogamía ocurre inmediatamente después de la meiósis) . La reproducción sexual puede ocurrir entre células de la misma cepa (autofecundación) o entre células de diferentes cepas (cruzamiento abierto) . El dimorfismo sexual (dioicismo) es la producción separada de órganos macho y hembra en diferentes micelios. Éste es un fenómeno raro entre los hongos, a pesar de que se conocen algunos ejemplos. El heterotalismo (un locus-dos alelos) permite el cruzamiento abierto entre cepas compatibles cruzadas que son autoincompatibles . La forma más sencilla es el sistema de dos alelos-un locus de tipos/factores de apareamiento, ilustrada por los siguientes organismos : A y a en Neurospora; a y en Saccharomyces, - más y menos en un Schizzosaccharomyces y Zygomycetes; a y a2 en Ustilago . El heterotalismo alelomorfo múltiple se muestra en algunos de los Basidiomycetes superiores (por ejemplo, Gasteromycetes y Hymenomycetes) , que son heterotálicos y poseen varios tipos de apareamiento determinados por alelos múltiples. El heterotalismo en estos organismos es ya sea bipolar con un factor del tipo de apareamiento, o tetrapolar con dos factores no enlazados, A y B. La formación de heterocariones fértiles, estables, depende de la presencia de diferentes factores A y, en el caso de organismos tetrapolares, de diferentes factores B también. Este sistema es efectivo en la promoción de la reproducción abierta y la prevención de autoreproducción. El número de diferentes factores de apareamiento puede ser muy grande (es decir, miles) (Kothe, FEMS Microbiol . Rev. (Revisión de Microbiología FEMS) , 18, 65-87 (1996)), y los factores de apareamiento no parentales pueden derivarse por recombinación . La reproducción parasexual ofrece un medio adicional para mezclar material genético entre las células. Este proceso permite la recombinación del ADN parental sin la implicación de tipos de apareamiento o gametos. La fusión parasexual ocurre mediante la fusión hifal dando origen a un citoplasma común que contiene diferentes núcleos. Los dos núcleos pueden dividirse independientemente en el heterocarión resultante pero ocasionalmente se fusionan. La fusión va seguida por la haploidización, que puede implicar pérdida de cromosomas y cruzamiento mitótico entre cromosomas homólogos. La fusión de protoplastos es una forma de reproducción parasexual . Dentro de las cuatro clases anteriores, los hongos también se clasifican por grupo de compatibilidad vegetativa. Los hongos dentro de un grupo de compatibilidad vegetativa pueden formar heterocariones entre sí. De esta manera, para el intercambio de material genético entre diferentes cepas de hongos, los hongos por lo general son preparados a partir del mismo grupo de compatibilidad vegetativa. Sin embargo, puede ocurrir cierto intercambio genético entre los hongos de diferentes grupos de incompatibilidad como resultado de la reproducción parasexual (consultar Timberlake y colaboradores, EUA 5,605,820). Adicionalmente, tal como se discutió en otra parte, el grupo de compatibilidad vegetativa natural de los hongos puede expandirse como resultado de la mezcla. Varios aislados de Aspergillus nidulans, A. flavus, Penicillium chrysogenum, P. Notatum, Cephalosporium chrysogenum, Neurospora crassa, Aureobasidium pullulans han sido cariotipificados . Los tamaños del genoma por lo general varían entre 20 y 50 Mb entre los Aspergilli. Las diferencias en cariotipos existen con frecuencia entre cepas similares y también son provocadas por la transformación con el ADN exógeno. Los genes fúngales filamentosos contienen intrones, por lo general de -50-100 bp de tamaño, con un consenso similar de secuencias divididas de 5' y 3 A Las señales de promoción y terminación con frecuencia pueden reconocerse de manera cruzada, permitiendo la expresión de un gen/vía desde un hongo (por ejemplo A. nidulans) a otro (por ejemplo, P. chrysogenum) . Los componentes principales de la pared celular fungal son la quitina (o quitosana) , ß-glucan, y manoproteínas . La quitina y ß-glucan forman la estructura, las manoproteínas son componentes intersticiales que dictan la porosidad de la pared, la antigenicidad y la adhesión. La sintetasa de la quitina cataliza la polimerización de los residuos ß- (1, 4) -N-acetilglucosamina enlazado (GicNAc) , formando estirpes lineales que corren de manera antiparalela; la sintetasa de ß- (1, 3) -glucan cataliza la homopolimerización de la glucosa. Un objetivo general de la mezcla es desarrollar hongos que se conviertan en huéspedes útiles para la ingeniería genética, en particular para la mezcla de genes no relacionados. A . nidulans y neurospora son por lo general los organismos fúngales de elección que sirven como huéspedes para esta manipulación debido a sus ciclos sexuales y su uso perfectamente establecido en la genética clásica y molecular. Otro objetivo general es mejorar la capacidad de los hongos para elaborar compuestos específicos (por ejemplo, antibacterianos (penicilinas, cefalosporinas) , antifungales (por ejemplo, echinocandins, aureobasidins) , y enzimas de degradación de la madera) . Existe cierta superposición entre estas metas generales, y por lo tanto, algunas propiedades deseadas son útiles para lograr ambas metas. Una propiedad deseada es la introducción del aparato meiótico dentro del hongo que carece en ese momento de un ciclo sexual (consultar Sharon y colaboradores, Mol . Gen . Genet . (Genética General Molecular) 251, 60-68 (1996)). Un esquema para introducir un ciclo sexual dentro del hongo P. chrysogenum (un hongo imperfecto) aparece en la Figura 6. Las subpoblaciones de protoplastos se forman a partir de A . nidulans (que posee un ciclo sexual) y P. chrysogemum, que no lo tiene. Las dos cepas de preferencia portan diferentes marcadores. Los protoplastos de A . nidulans son matados mediante el tratamiento con ultravioleta o hidroxilamida. Las dos subpoblaciones se fusionan para formar heterocariones. En algunos heterocariones, ocurre la fusión de núcleos y cierta recombinación. Las células fusionadas se cultivan bajo condiciones para generar nuevas paredes celulares y después para permitir que se lleve a cabo la recombinación sexual. Las células con genomas recombinantes se seleccionan posteriormente (por ejemplo, seleccionando la complementación de marcadores auxotróficos presentes en las cepas padres respectivas) . Las células con genomas híbridos son más propensas a adquirir los genes necesarios para un ciclo sexual . Los protoplastos de las células pueden cruzarse posteriormente con los protoplastos matados de una población adicional de células conocidas por tener un ciclo sexual (el mismo o diferente que en la ronda previa) de la misma manera, seguido por la selección de células con genomas híbridos. Otra propiedad deseada es la producción de una cepa imitadora del hongo. Este hongo puede ser producido mezclando una cepa fungal que contiene un gen marcador con una o más mutaciones que evitan o previenen la expresión de un producto funcional. Los mezcladores se propagan bajo condiciones que seleccionan la expresión del marcador positivo (permitiendo al mismo tiempo una pequeña cantidad de desarrollo residual sin expresión) . Los mezcladores con crecimiento más rápido se seleccionan para formar los materiales de inicio para la siguiente ronda de la mezcla. Otra propiedad deseada es expandir el rango del huésped de un hongo de tal forma que pueda formar heterocariones con hongos de otros grupos de compatibilidad vegetativa. La incompatibilidad entre especies es el resultado de las interacciones de alelos específicos en diferentes sitios de incompatibilidad (como por ejemplo el sitio "het") . Si dos cepas experimentan una anastomosis hifal, puede ocurrir una reacción de incompatibilidad citoplásmica letal si las cepas difieren en estos lugares. Las cepas deben transportar lugares idénticos para ser completamente compatibles. Varios de estos lugares han sido identificados en diferentes especies, y el efecto de incompatibilidad es de cierta forma agregado (por ende, puede ocurrir una "incompatibilidad parcial"). Algunos mutantes tolerantes y .he -negativos han sido descritos para estos organismos (por ejemplo, Dales & Croft, J". Gen . Microbiol .

(Boletín de Microbiología General) . Además, ha sido reportado un gen de tolerancia (toi) , que suprime la incompatibilidad del heterocarión tipo apareamiento. La mezcla se lleva a cabo entre protoplastos de cepas provenientes de diferentes grupos de incompatibilidad. Un formato preferido utiliza una cepa aceptadora viva y una cepa aceptadora muerta irradiada con ultravioleta. La irradiación ultravioleta sirve para introducir mutaciones dentro de los genes het que inactivan el ADN. Las dos cepas deben transportar diferentes marcadores genéticos. Los protoplastos de las cepas se fusionan, las células se regeneran y se clasifican para la complementación de los marcadores. Pueden llevarse a cabo rondas subsiguientes de mezcla y selección en la misma forma fusionando las células sobrevivientes clasificadas con los protoplastos de una población fresca de células donantes. De manera similar a otros procedimientos indicados en la presente, las células resultantes de la regeneración de los protoplastos se vuelven a fusionar opcionalmente mediante la formación de protoplastos y se regeneran en células una o más veces antes de cualquier paso de selección para aumentar la diversidad de la población resultante de células que deben clasificarse. Otra propiedad deseada es la introducción de un heterotalismo alelomorfo múltiple dentro de Ascomycetes y Fungi imperfecti , que no muestran normalmente esta propiedad. Este sistema de apareamiento permite la reproducción abierta sin autoreproducción. Este sistema de apareamiento puede ser introducido mezclando el Ascomycetes y Fungi imperfecti con ADN a partir del Gasteromycetes o Hymenomycetes, que poseen este sistema. Otra propiedad deseada es la formación espontánea de protoplastos para facilitar el uso de una cepa fungal como huésped de mezcla. Aquí, el hongo que debe desarrollarse por lo general está mutagenizado. Las esporas del hongo que debe desarrollarse se tratan brevemente con un agente de degradación de la pared celular durante un tiempo insuficiente para una formación completa de protoplastos, y se mezcla con protoplastos de otra cepa de hongos. Los protoplastos formados mediante la fusión de las dos diferentes subpoblaciones se identifican mediante genética u otra selección/o clasificación tal como se describió anteriormente. Estos protoplastos se utilizan para regenerar los micelios y después las esporas, que forman el material de inicio para la siguiente ronda de mezcla. En la siguiente ronda, por lo menos algunas de las esporas sobrevivientes son tratadas con una enzima eliminadora de la pared celular, pero por un tiempo más corto que la ronda anterior. Después del tratamiento, las células parcialmente peladas se etiquetan con una primera etiqueta. Estas células se mezclan posteriormente con protoplastos, que pueden derivarse de otras células sobrevivientes a la selección en una ronda previa, o provenientes de una cepa fresca de hongos. Estos protoplastos están etiquetados físicamente con una segunda etiqueta. Después de incubar las células bajo condiciones para la fusión de protoplastos, los fusionadores con ambas etiquetas se seleccionan. Estos fusionadores se utilizan para generar micelios y esporas para la siguiente ronda de mezclado, y así sucesivamente. A la larga, la progenie que espontáneamente forma protoplastos (es decir, si la añadidura del agente degradante de la pared celular) se identifican. Al igual que con otros procedimientos indicados en la presente, las células o protoplastos pueden fusionarse de manera reiterada y regenerarse antes de llevar a cabo cualquier parte de selección para incrementar la diversidad de las células o protoplastos resultantes que se van a clasificar. De manera similar, las células o protoplastos seleccionados pueden fusionarse de manera reiterada y pueden regenerarse durante uno o varios ciclos sin imponer la selección en las poblaciones resultantes de células o protoplastos, incrementando de esta manera la diversidad de células o protoplastos que a la larga son clasificados. Este proceso de llevar a cabo varios ciclos de recombinación intercalados con pasos de selección puede repetirse de manera reiterada según se desee. Otra propiedad deseada es la adquisición y/o mejoramiento de genes que codifican las enzimas en vías biosintéticas, genes que codifican proteínas del transportador, y genes que codifican proteínas implicadas en el control de flujo metabólico. En esta situación, los genes de la vía pueden introducirse dentro del hongo que se va a desarrollar ya sea mediante intercambio genético con otra cepa de hongos que posee la vía o mediante la introducción de una biblioteca del fragmento a partir de un organismo que posee la vía. El material genético de estos hongos puede someterse posteriormente a una mezcla adicional y clasificación/selección mediante los diferentes procedimientos discutidos en esta aplicación. Las cepas de mezcladores de hongos se seleccionan/clasifican para la producción del compuesto producido a través de la vía metabólica o precursores de la misma. Otra propiedad deseada es incrementar la estabilidad del hongo para situaciones extremas como el calor. En esta situación, los genes que confieren estabilidad pueden ser adquiridos intercambiando el ADN con o transformando el ADN a partir de una cepa que ya posee estas propiedades. De manera alternativa, la cepa que se va a desarrollar puede estar sometida a una mutagénesis aleatoria. El material genético del hongo que se va a desarrollar puede mezclarse por medio de cualesquiera de los procedimientos descritos en esta solicitud, seleccionando los mezcladores que sobrevivan a la exposición de condiciones extremas. Otra propiedad deseada es la capacidad de un hongo para crecer bajo requerimientos nutricionales alterados (por ejemplo, crecimiento en fuentes particulares de carbono o nitrógeno) . La alteración de los requerimientos nutricionales es particularmente valiosa, por ejemplo, para aislados naturales de hongos que producen productos comerciales valiosos pero poseen un requerimiento nutricional esotérico y por lo tanto costoso. La cepa que se va a desarrollar experimenta un intercambio genético y/o transformación con el ADN a partir de una cepa que posee los requerimientos nutricionales deseados. El hongo que se va a desarrollar puede estar sometido opcionalmente a una mezcla adicional tal como se describe en esta solicitud y seleccionando las cepas recombinantes en cuanto a su capacidad de crecimiento en las circunstancias nutricionales deseadas. Opcionalmente, las circunstancias nutricionales pueden variar en rondas sucesivas del mezclado iniciando en proximidad a los requerimientos naturales del hongo que se va a desarrollar y en rondas subsecuentes enfocando los requerimientos nutricionales deseados. Otra propiedad deseada es la adquisición de una competencia natural en un hongo. El procedimiento de la adquisición de la competencia natural mediante la mezcla se describe por lo general en PCT/US97/04494. El hongo que se va a desarrollar experimenta por lo general un intercambio o transformación genética con el ADN proveniente de una cepa bacteriana o una cepa fungal que ya posee esta propiedad. Las células con genomas recombinantes se seleccionan posteriormente por su capacidad para absorber un plasmidio que porta un marcador selectivo. Pueden llevarse a cabo rondas adicionales de recombinación y selección utilizando cualesquiera de los procedimientos descritos anteriormente. Otra propiedad deseada es la secreción reducida o creciente de proteasas y DNasa. En esta situación, el hongo que se va a desarrollar puede adquirir el ADN mediante intercambio o transformación a partir de otra cepa conocida como poseedora de la propiedad deseada . De manera alternativa, el hongo que se va a desarrollar puede estar sometido a una mutagénesis aleatoria. El hongo que se va a desarrollar se mezcla como se indicó anteriormente. La presencia de estas enzimas, o la falta de las mismas, puede someterse a ensayo poniendo en contacto el medio de cultivo a partir de aislados individuales con una molécula fluorescente pegada a un soporte a través de un péptido o enlace del ADN. La segmentación del enlace libera la fluorescencia detectable al medio. Otra propiedad deseada es producir hongos con transportadores alterados (por ejemplo, MDR) . Estos transportadores alterados son útiles, por ejemplo, en hongos que han sido desarrollados para producir nuevos metabolitos secundarios, para permitir la entrada de precursores requeridos para la síntesis de los nuevos metabolitos secundarios dentro de una célula, o para permitir el flujo del metabolito secundario desde la célula. Los transportadores pueden desarrollarse mediante la introducción de una biblioteca de variantes del transportador dentro de las células fúngales y permitiendo que las células se recombinen mediante una recombinación sexual o parasexual . Para desarrollar un transportador con la capacidad de transportar un precursor dentro de las células, las células se propagan en la presencia de un precursor, y las células se clasifican posteriormente para la producción del metabolito. Para desarrollar un transportador con la capacidad de exportar un metabolito, las células se propagan bajo condiciones que dan soporte a la producción del metabolito, y se clasifican para la exportación del metabolito al medio de cultivo. Un método general de mezcla de hongos se muestra en la Figura 7. Las esporas de un suministro congelado, un suministro liofilizado, o fresco de una placa de ágar se utilizan para inocular un medio líquido adecuado (1) . Las esporas se germinan dando como resultado un crecimiento hifal (2) . Los micelios se cultivan, y se lavan mediante filtración y/o centrifugación. Opcionalmente, la muestra se trata previamente con DTT para mejorar la formación del protoplasto (3) . La formación del protoplasto se lleva a cabo en un medio estable osmóticamente (por ejemplo, 1 m NaCl/20mM MgS04 , pH 5.8) mediante la adición de una enzima degradante de la pared celular (por ejemplo, Novozyme 234) (4) . La enzima degradante de la pared celular se elimina mediante un lavado repetido con una solución osmóticamente estabilizadora (5) . Los protoplastos pueden separarse de los micelios, los residuos y las esporas mediante la filtración a través de miracloth, y centrifugación por densidad (6) . Los protoplastos se cultivan mediante centrifugación y se vuelven a suspender en la concentración apropiada. Este paso puede conducir a cierta fusión del protoplasto (7) . La fusión puede ser estimulada mediante la añadidura de PEG (por ejemplo, PEG 3350) , y/o una centrifugación repetida y una nueva suspensión con o sin PEG. También puede llevarse a cabo una electrofusión (8) . Los protoplastos fusionados pueden enriquecerse opcionalmente a partir de protoplastos no fusionados mediante la sedimentación del gradiente de sacarosa (u otros métodos de clasificación descritos arriba) . Los protoplastos fusionados pueden tratarse opcionalmente con irradiación ultravioleta para estimular la recombinación (9) . Los protoplastos se cultivan en placas de ágar estabilizadas osmóticamente para regenerar las paredes celulares y formar micelios (10) . Los micelios se utilizan para generar esporas (11) , que se utilizan como el material de inicio en la siguiente ronda de mezclado (12) . La selección de una propiedad deseada puede llevarse a cabo ya sea en los micelios regenerados o las esporas derivadas de los mismos. En un método alternativo, los protoplastos se forman mediante la inhibición de una o más enzimas requeridas para la síntesis de la pared celular (consultar Figura 8) . El inhibidor debe ser fungiestático mas que fungicida bajo las condiciones de uso. Los ejemplos de inhibidores incluyen compuestos antifungales descritos por (por ejemplo, Georgopapadakou & Walsh, Antimocrob . Ag. Chemother.

(Quimioterapia Ag. Antimicrobiana) 40, 279-291 (1996); Lyman S Walsh, Drugs (Medicamentos) A , 9-35 (1992)). Otros ejemplos incluyen inhibidores de sintasa de quitina (compuestos de polioxina o nicomicina) y/o inhibidores de sintasa de glucan (por ejemplo, equinocandinas, papulocandinas, pneumocandinas) . Los inhibidores deben ser aplicados en un medio osmóticamente estabilizado. Las células desprendidas de sus paredes celulares pueden fusionarse o de otra forma emplearse como donantes o huéspedes en los programas de transformación genética/desarrollo de cepas. En la Figura 8 se presenta un posible esquema que utiliza este método de manera reiterada. En una variación adicional, los protoplastos se preparan utilizando cepas de hongos, que son genéticamente deficientes o están comprometidos en su capacidad de sintetizar las paredes células intactas (consultar Figura 9) . Estos mutantes son por lo general referidos como frágiles, correctores osmóticos, o sin pared celular, y pueden obtenerse a partir de depósitos de cepas. Los ejemplos de estas cepas incluyen mutantes de Neurospora crassa os (Selitrennikoff , Antimicrob . Agents . Chemother.

(Quimioterapia de Agentes Antimicrobianos) 23, 757-765 (1983) ) . Algunas de estas mutaciones son sensibles a la temperatura. Las cepas sensibles a la temperatura pueden propagarse a la temperatura permitida para propósitos de selección y amplificación y a una temperatura no permitida para propósitos de la formación y fusión de protoplastos. Una cepa sensible a la temperatura de la cepa Neurospora crassa ha sido descrita y se propaga como protoplastos al desarrollarse en un medio osmóticamente estabilizador que contiene sorbosa y polioxina a una temperatura no permitida, pero genera células enteras en la transferencia a un medio que contiene sorbitol a una temperatura permitida. Consultar EUA 4,873,196. Otras cepas adecuadas pueden producirse mediante una mutagénesis enfocada de genes implicados en la síntesis de quitina, síntesis de glucan y otros procesos relacionados con la pared celular. Los ejemplos de estos genes incluyen CHT1, CHT2 y CALI (o CSD2) de Saccharomyces cerevisiae y Candida supp. (Georgopapadakou & Walsh 1996) ; ETGI/FKSI/CNDI/CWH53/PB Rl y homólogos en S. Cerevisiae, Candida albicans, Cryptococcus neof ormans, Aspergillus fumigatus, ChvAINdvA Agrobacterium y Rhizobium. Otros ejemplos son MA, orlB , orle , MD, tsE , y bi G de Aspergillus nidulans (Borgia, J. Bacteriol . (Boletín de Bacteriología) 174, 377-389 (1992)). Las cepas de A . nidulans que contienen mutaciones de OrlAl o tse 1 son disueltas por usinas a temperaturas restrictivas. La lisis de estas cepas puede ser evitada mediante una estabilización osmótica, y las mutaciones pueden complementarse mediante la añadidura de N-acetilglucosimina (Glc-Nac) . Las mutaciones de Bi Gll son ts para una fosfatasa de proteína tipo 1 (las líneas germinales de cepas que portan esta mutación carecen de quitina, y expansión y disolución de condriomas) . Otros genes adecuados son chsA, chsB, chsC , chsD y chsE de Aspergillus fumigatus; chsl y chs2 de Neurospora crassa; Phycomyces blakesleeanus MM y chs 1, 2 y 3 de S . cerevisiae . La chsl es una enzima de reparación no esencial; la chs2 está implicada en la formación del septo y la chs3 está implicada en la maduración de la pared celular y la formación de anillos del injerto. Otras cepas útiles incluyen mutantes de S. cerevisiae CLY (lisis celular) como las cepas ts (Paravicini y colaboradores, Mol . Cell . Biol . (Biología Celular Molecular) 12, 4896-4905 (1992)), y las cepa CLY 15 que alberga la eliminación del gen PKC 1. Otras cepas útiles incluyen la cepa VY 1160 que contiene una mutación ts en srb (que codifica la actina) (Schade y colaboradores, Acta Histochem. Suppl . (Complemento del Acta de Histoquímica) A l , 193-200 (1991)), y una cepa con una mutación ses que da como resultado una sensibilidad creciente a las enzimas de digestión de la pared celular aisladas de los intestinos del caracol (Metha & Gregory, Appl . Environ . Microbiol .

(Microbiología Ambiental Aplicada) Al , 992-999 (1981)). Las cepas útiles de C. albicans incluyen aquellas con mutaciones en chsl, chs2 , ó chs3 (que codifican sintetasas de quitina), como los mutantes letales condiciones correctivos osmóticos descritos por Payton S de Tiani, Curr. Genet . (Genética Actual) 17, 293-296 (1990); los mutantes de C. Utilis con sensibilidad creciente a las enzimas de digestión de la pared celular aisladas de los intestinos del caracol (Metha Sc Gregory, 1981, consul tar arriba) ; y los mutantes de N. Crassa os-1 , os-2, os-3 , os-4 , os-5, y os- 6. Consul tar, Selitrennikoff , Antimicrob. Agents Chemother. (Quimioterapia de Agentes Antimicrobianos) 23, 757-765 (1983) . Estos mutantes se desarrollan y se dividen sin una pared celular a 37°C, pero 22 °C producen una pared celular. La mutagénesis enfocada puede ser lograda mediante la transformación de células con un vector de selección positiva-negativa que contenga regiones homologas flanqueando un segmento que deba enfocarse, un marcador de selección positiva entre las regiones homologas y un marcador de selección negativa fuera de las regiones homologas (consultar Capecchi, EUA 5,627,059). En una variación, el marcador de selección negativa puede ser una trascripción antisentido del marcador de selección positiva (consultar EUA 5,527,674). Otras células adecuadas pueden ser seleccionadas mediante mutagénesis aleatoria o procedimientos de mezcla en combinación con la selección. Por ejemplo, una primera subpoblación de células se mutageniza, se permite su recuperación de la mutagénesis, se somete a una degradación incompleta de las paredes celulares y después se pone en contacto con los protoplastos de una segunda subpoblación de células. Se identifican las células de los híbridos que portan marcadores de ambas subpoblaciones (tal como se describió anteriormente) y se utilizan como los materiales de inicio en la ronda siguiente de mezclado. Este esquema de selección selecciona tanto las células con capacidad de formación espontánea de protoplastos como las células con una recombinogenicidad mejorada. En una variación adicional, las células que poseen capacidad para la formación espontánea de protoplastos pueden cruzarse con las células que poseen una recombinogenicidad mejorada desarrolladas utilizando otros métodos de la invención. Las células híbridas son particularmente adecuadas como huéspedes para una mezcla del genoma entero. Las células con mutaciones en las enzimas implicadas en la síntesis de la pared celular o su mantenimiento pueden experimentar la fusión sencillamente como resultado de la propagación de las células en el cultivo protegido osmóticamente debido a la formación espontánea de protoplastos. Si la mutación es condicional, las células cambian a una condición no permitida. La formación y fusión de protoplastos puede acelerarse mediante la añadidura de agentes de promoción, como por ejemplo el PEG o un campo eléctrico (Consultar Philipova & Venkov, Yeast (Levadura) 6, 205,212 (1990); Tsoneva y colaboradores, FEMS Microbiol . Lett . (Carta de Microbiología de FEMS) 51, 61-65 (1989)). 5. Mezcla Enfocada - Puntos Calientes En un aspecto, los genes homólogos enfocados se clonan en regiones específicas del genoma (por ejemplo, mediante la recombinación homologa u otros procedimientos de enfoque) que se conocen como "puntos calientes" de recombinación (es decir, regiones que muestran niveles elevados de recombinación en comparación con el nivel promedio de recombinación observada a través de un genoma entero), o conocidos como próximos a estos puntos calientes. Las cepas recombinantes resultantes se aparean de manera recursiva. Durante la recombinación meiótica, los genes recombinantes homólogos se recombinan, incrementando de esta manera la diversidad de los genes. Después de varios ciclos de recombinación mediante apareamiento recursivo, las células resultantes se clasifican. 6. Métodos de Mezcla en la Levadura Las levaduras son subespecies de hongos que se desarrollan como células sencillas. Las levaduras se utilizan para la producción de bebidas fermentadas y la adición de levadura, para la producción del etanol como combustible, compuestos de peso molecular bajo, y para la producción heteróloga de proteínas y enzimas (consultar lista acompañante de cepas de la levadura y sus usos) . Las cepas comúnmente utilizadas de la levadura incluyen Saccharomyces cerevisiae, Pichia sp. , Canidia sp. y Schizosaccharomyces pombe . Varios tipos de vectores están disponibles para la clonación en la levadura incluyendo el plasmidio integrador (YIp) , plasmidio duplicador de levadura (YRp, como los vectores basados en el círculo 2µ) , plasmidio episomal de levadura (YEp) , plasmidio centromérico de levadura (YCp) , o cromosoma artificial de levadura (YAC) . Cada vector puede transportar marcadores útiles para seleccionar la presencia del plasmidio como por ejemplo LUE2 , URA3 , y H1S3, o la ausencia del plasmidio como por ejemplo URA3 (un gen que es tóxico para el crecimiento de las células en presencia de ácido 5-fluoroorótico) . Varias levaduras poseen un ciclo sexual y ciclos asexuales (vegetativo) . El ciclo sexual implica la recombinación del genoma entero del organismo cada vez que la célula pasa a través de la meiósis. Por ejemplo, cuando las células diploides de S. cerevisiae se exponen a condiciones limitantes de nitrógeno y carbono, las células diploides experimentan la meiósis para formar aseas. Cada asea posee cuatro esporas haploides, dos de tipo "a" de apareamiento y dos de tipo "OÍ" de apareamiento. Después de regresar al medio rico, las esporas haploides del tipo de apareamiento opuesto se aparean para formar células diploides otra vez. Las asioesporas del tipo de apareamiento opuesto pueden aparearse dentro de la asea, o si la asea se degrada, por ejemplo con zimolasa, las células haploides se liberan y pueden aparearse con las esporas de otras aseas. Este ciclo sexual ofrece un formato para mezclar los genomas endógenos de la levadura y/o las bibliotecas del fragmento exógeno insertadas dentro de los vectores de la levadura. Este proceso da como resultado el intercambio o acumulación de genes híbridos, y la mezcla de secuencias homologas compartidas por las células del apareamiento. Las cepas de la levadura poseen mutaciones en varios genes conocidos que tienen propiedades útiles para la mezcla. Estas propiedades incluyen incrementar la frecuencia de la recombinación e incrementar la frecuencia de las mutaciones espontáneas dentro de una célula. Estas propiedades pueden ser el resultado de la mutación de una secuencia de codificación o la expresión alterada (por lo general la expresión excesiva) de una secuencia de codificación tipo silvestre. La nucleasa HO efectúa la transposición de HMLa/ y HMRa/a hacia el locus MAT dando como resultado un intercambio tipo apareamiento. Los mutantes en el gen que codifica esta enzima no intercambian su tipo de apareamiento y pueden ser empleados para forzar el cruzamiento entre las cepas del genotipo definido, como por ejemplo las que albergan una biblioteca o tienen un fenotipo deseado y para evitar la reproducción de cepas del iniciador. PMS1, MLH1, MSH2 , MSH6 están implicadas en la reparación de desemparejamientos. Las mutaciones en estos genes poseen todas un fenotipo del mutador (Chambers y colaboradores, Mol . Cell . Biol . (Biología Celular Molecular) 16, 6110-6120 (1996) ) . Las mutaciones en la topoisomerasa del ADN TOP3 poseen un mejoramiento 6 veces mayor de la recombinación homologa intercromosómica (Bailis y colaboradores, Molecular and Cellular Biology (Biología Celular y Molecular) 12, 4988-4993 (1992) ) . Los genes RAD50-57 confieren resistencia para la radiación. Rad3 funciona en la excisión de dímeros de pirimidina. RAD52 funciona en la conversión de genes. RAD50, MRE11, XRS2 funcionan tanto en la recombinación homologa como en la recombinación ilegítima. H0P1, REDI funcionan en la recombinación meiótica prematura (Mao-Draayer, Genetics (Genética) 144, 71-86). Las mutaciones en HOP1 ó REDI reducen la desintegración de doble estirpe en el punto caliente de recombinación del HIS2. Las cepas deficientes en estos genes son útiles para mantener la estabilidad en construcciones hiperrecombinogénicas como por ejemplo las bibliotecas de expresión en tándem transportadas en las YACs. Las mutaciones en HPR 1 son hiperrecombinogénicas. HDF1 posee una actividad enlazadora terminal del ADN y participa en la reparación de la desintegración de doble estirpe y la recombinación V(D)J. Las cepas que portan esta mutación son útiles para la transformación con fragmentos genómicos aleatorios ya sea mediante fusión de protoplastos o electroporación. Kar-1 es una mutación dominante que evita la cariogamía. Los mutantes Kar-1 son útiles para la transferencia dirigida de cromosomas únicos a partir de un donante a una cepa receptora. Esta técnica ha sido utilizada ampliamente en la transferencia de YACs entre cepas, y también es útil en la transferencia de genes/cromosomas desarrollados a otros organismos (Markie, YAC Protocols, (Protocolos YAC) (Humana Press, Totowa, NJ, 1996) . HOT1 es un punto caliente de recombinación de S. cerevisiae dentro de la región del promotor y estimulador de las secuencias de repetición ADNr. Este sitio induce la recombinación mitótica en secuencias adyacentes, supuestamente debido a su alto nivel de trascripción. Los genes y/o vías insertadas bajo el control de trascripción de esta región experimentan una recombinación mitótica creciente. Las regiones que rodean a arg 4 y sus 4 genes también son puntos calientes de recombinación, y los genes clonados en estas regiones tienen una probabilidad creciente de experimentar una recombinación durante la meiósis. Los genes homólogos pueden ser clonados en estas regiones y mezclarse in vivo mediante el apareamiento recursivo de las cepas recombinantes. CDC2 codifica la polimerasa d y es necesario para la conversión del gen mitótico. La expresión excesiva de este gen puede ser utilizada en una cepa del mezclador o mutador. Una mutación sensible a la temperatura en CDC4 detiene el ciclo de la célula en Gl en la temperatura restrictiva y puede ser utilizada para sincronizar los protoplastos para una función perfeccionada y una recombinación siguiente. Al igual que con los hongos filamentosos, los objetivos generales de la mezcla de levadura incluyen el mejoramiento en la levadura como organismo huésped para la manipulación genética, y como un aparato de producción para diferentes compuestos. Una propiedad deseada en cualquier caso es mejorar la capacidad de la levadura para expresar y secretar una proteína heteróloga. El siguiente ejemplo describe el uso de la mezcla para desarrollar la levadura con el fin de expresar y secretar cantidades crecientes de RNasa A. RNasa cataliza la segmentación del enlace P-05- del ARN específicamente después de los nucleótidos de pirimidina. La enzima es un polipéptido de aminoácido 124 básico que posee 8 residuos de cistina medios, cada uno requerido para la catálisis. YEpWL-RNasa A es un vector que efectúa la expresión y secreción de RNasa A de S. cerevisiae de la levadura y la levadura que alberga este vector secreta 1-2 mg de RNasa A recombinante por litro del medio de cultivo (del Cardayré y colaboradores, Protein Engineering (Ingeniería de Proteínas) 8(3) :26, 1-273 (1995)). Esta producción global es deficiente para una proteína expresada de manera heteróloga en la levadura y puede mejorarse por lo menos 10-100 veces mediante el mezclado. La expresión de RNasa A es detectada fácilmente por varios ensayos de placa y de placa de microvaloración (del Cardayré & Raines, Biochemistry (Bioquímica) 33, 6031-6037 1994)). Cada uno de los formatos descritos para la mezcla del genoma entero puede utilizarse para mezclar una cepa de S . cerevisiae que alberga YEpWL RNasa A, y las células resultantes pueden clasificarse para la secreción creciente de RNasa A dentro del medio. Las nuevas cepas son sometidas a un ciclo recursivo a través del formato del mezclado, hasta que se observan niveles suficientemente altos de secreción de RNasa A. El uso de RNasa A es particularmente útil ya que no solo requiere un doblamiento y una formación del enlace de disulfuro adecuadas, sino también una glicosilación adecuada. Por lo tanto, pueden perfeccionarse varios componentes de los sistemas de expresión, doblamiento y secreción. La cepa resultante también se desarrolla para una secreción mejorada de otras proteínas heterólogas. Otro objetivo de mezclar la levadura es incrementar la tolerancia de la levadura ante el etanol. Esto es útil tanto para la producción comercial del etanol como para la producción de más cervezas y vinos alcohólicos. La cepa de la levadura que debe mezclarse requiere material genético mediante el intercambio o transformación con otras cepas de levadura, que pueden o no pueden ser conocidas como poseedoras de una resistencia superior al etanol. La cepa que se va a desarrollar se mezcla y los mezcladores son seleccionados por su capacidad de sobrevivir a la exposición al etanol. Pueden utilizarse concentraciones crecientes de etanol en rondas sucesivas del mezclado. Estos mismos principios pueden utilizarse para mezclar levaduras horneadas para una osmotolerancia mejorada. Otra propiedad deseada de la mezcla de levadura es la capacidad de desarrollarse bajo condiciones nutricionales deseadas. Por ejemplo, es útil para la levadura desarrollarse en fuentes de carbono baratas como por ejemplo metanol, almidón, molasas, celulosa, celobiosa o xilosa dependiendo de la disponibilidad. Los principios de mezclado y selección son similares a los explicados para los hongos filamentosos. Otra propiedad deseada es la capacidad de producir metabolitos secundarios producidos naturalmente por hongos filamentosos o bacterias. Los ejemplos de estos metabolitos secundarios son la ciclosporina A, taxol, y cefalosporina. La levadura que debe desarrollarse experimenta un intercambio genético o es transformada con el ADN de organismos que producen el metabolito secundario. Por ejemplo, los hongos que producen taxol incluyen Taxomyces andreanae y Pestalotopis microspora (Stierle y colaboradores, Science (Ciencia) 260, 214-216 (1993); Strobel y colaboradores, Microbiol . (Microbiología) 142, 435-440 (1996)). El ADN también puede obtenerse a partir de árboles que producen de manera natural el taxol, como por ejemplo el Taxus brevi folia . El ADN codifica una enzima en la vía del taxol, la sintasa de taxadieno, que se cree que cataliza el paso comprometido en la biosíntesis del taxol y puede ser limitante de la velocidad en la producción global de taxol, ya ha sido clonado (Wildung & Croteau, J. Biol . Chem . (Boletín de Química y Biología) 271, 9201-4 (1996) . El ADN se mezcla posteriormente, y los mezcladores se clasifican/ seleccionan para la producción del metabolito secundario. Por ejemplo, la producción de taxol puede monitorearse utilizando anticuerpos para el taxol, mediante una espectroscopia de masa o una espectrofotometría ultravioleta. De manera alternativa, la producción de intermediarios en la síntesis del taxol o las enzimas en la vía sintética del taxol pueden monitorearse. Concetti & Ripani , Biol . Chem. Hoppe Seyler (Química Biológica Hoppe Seyler) 375, 419-23 (1994) . Otros ejemplos de metabolitos secundarios son los polioles, aminoácidos, policétidos polipéptidos no ribosómicos, ergosterol, carotenoides, terpinoides, esteróles, vitamina E, y similares. Otra propiedad deseada es incrementar la floculencia de la levadura para facilitar la separación en la preparación del etanol . La levadura puede ser mezclada mediante cualesquiera de los procedimientos indicados anteriormente con la selección de la levadura mezclada que forma las masas más grandes . 7. Procedimiento de ejemplo para la formación de protoplastos en la levadura La preparación de protoplastos en la levadura es revisada por Morgan, en Protoplasts (Protoplastos) (Birkhauser Verlag, Basel, 1983). Las células frescas (~108) se lavan con solución amortiguadora, por ejemplo 0.1 M de fosfato de potasio, después se vuelven a suspender en esta misma solución amortiguadora que contiene un agente reductor, como por ejemplo 50 M de DTT, se incuban durante 1 a 30°C con agitación suave, y después se vuelven a lavar con solución amortiguadora para eliminar el agente reductor. Estas células se vuelven a suspender posteriormente en una solución amortiguadora que contiene una enzima degradante de la pared celular, como por ejemplo la Novozyme 234 (1 mg/mL) , y cualquiera de una variedad de estabilizadores osmóticos, como la sacarosa, sorbitol, NaCl, KCl, MgS04, MgCl2, ó NH4C1 en cualquiera de una variedad de concentraciones. Estas suspensiones se incuban posteriormente a 30°C con una agitación suave (-60 rpm) hasta que se liberan los protoplastos. Para generar los protoplastos que son más propensos a producir fusionadores productivos son posibles varias estrategias. La formación de protoplastos puede incrementarse si el ciclo celular de los protoplastos ha sido sincronizado para detenerse en Gl . En el caso de S. cerevisiae esto puede lograrse mediante la añadidura de factores de apareamiento, ya sea a ó a (Curran & Cárter, J". Gen . Microbiol . (Boletín de Microbiología General) 129, 1589-1591 (1983)). Estos péptidos actúan como inhibidores de la ciclasa de adenilato, que disminuyendo el nivel celular de cAMP detienen el ciclo celular en Gl . Además, se ha demostrado que los factores sexuales inducen el debilitamiento de la pared celular en preparación de la fusión sexual de las células a a (Crandall S Brock, Bacteriol . Rev. (Revisión de Bacteriología) 32, 139-163 (1968); Osumi y colaboradores, Arch . Microbiol . (Microbiología Arq. ) 97, 27-38 (1974)). Por lo tanto, en la preparación de los protoplastos, las células pueden ser tratadas con factores de apareamiento u otros inhibidores conocidos de ciclasa de adenilato, como por ejemplo la leflunomida o la toxina matadora de K. Lactis, para interrumpirlos en Gl (Sugisaki y colaboradores, Nature (Naturaleza) 304, 464-466 (1983)). Posteriormente, después de la fusión de los protoplastos (paso 2) , puede agregarse cAMP al medio de regeneración para inducir la fase S y la síntesis del AD?. De manera alternativa, pueden utilizarse las cepas de la levadura que poseen una mutación sensible a la temperatura en el gen CDC4 , de tal forma que las células pueden ser sincronizadas y detenidas en Gl . Después de la fusión, las células son devueltas a la temperatura permitida de tal forma que se reanuda la síntesis del ADN y el crecimiento . Una vez que los protoplastos adecuados han sido preparados, es necesario inducir la fusión mediante medios físicos o químicos. Un número equivalente de protoplastos de cada tipo de célula se mezcla en una solución amortiguadora de fosfato (0.2 M, pH 5.8, 2 x 108 células/mL) que contiene un estabilizador osmótico, por ejemplo 0.8 M de NcCl, y PEG 6000 (33% peso/volumen) y después se incuba a 30°C durante 5 minutos mientras ocurre la fusión. Pueden emplearse polioles, u otros compuestos que enlacen el agua. Los fusionadores se lavan posteriormente y se vuelven a suspender en la solución amortiguadora estabilizada osmóticamente sin PEG, y se transfieren a un medio de regeneración estabilizado osmóticamente en/dentro del cual las células pueden seleccionarse o clasificarse para una propiedad deseada. 8. Métodos de Mezclado Utilizando Cromosomas Artificiales Los cromosomas artificiales de la levadura (Yacs) son vectores de la levadura dentro de los cuales pueden clonarse fragmentos muy grandes del ADN (por ejemplo, 50-2000 kb) (consultar, por ejemplo, Monaco & Larin, Trends . Biotech .

Tendencias de Biotecnología) 12(7), 280-286 (1994); Ramsay, Mol . Biotechnol . (Biotecnología Molecular) 1(2), 181-201 1994; Huxley, Genet . Eng. (Ingeniería Genética) 16, 65-91 (1994); Jakobovits, Curr. Biol . (Biología Actual) 4(8), 761-3 (1994) ; Lamb S Gearhart , Curr. Opin . Genet . Dev.

(Disposi tivos Genéticos de Opinión Actual ) 5(3), 342-8 (1995); Montoliu y colaboradores, Reprod. Fértil . Dev.

(Disposi tivos de Fertilización y Reproducción) 6, 577-84 (1994) ) . Estos vectores poseen telómeros (Tel) , un centrómero (Cen) , una secuencia de duplicación autónoma (ARS) , y puede tener genes para selección positiva (por ejemplo, TRP1) y negativo (por ejemplo, URA3) . Los YACs son mantenidos, duplicados y segregados como otros cromosomas de la levadura a través de tanto meiosis como mitosis proporcionando de esta manera un medio para exponer el ADN clonado a una verdadera recombinación meiótica. Los YACs proporcionan un vehículo para el mezclado de bibliotecas de fragmentos grandes de ADN in vivo . Los substratos para el mezclado son por lo general fragmentos grandes de 20 kb a 2 Mb. Los fragmentos pueden ser fragmentos aleatorios o pueden ser fragmentos conocidos por codificar una propiedad deseable. Por ejemplo, un fragmento podría incluir un operón de genes implicado en la producción de antibióticos. Las bibliotecas también pueden incluir genomas o cromosomas enteros. Los genomas virales y algunos genomas bacterianos pueden clonarse intactos dentro de un solo YAC. En algunas bibliotecas, los fragmentos se obtienen a partir de un solo organismo. Otras bibliotecas incluyen variantes del fragmento, como en el caso en que algunas bibliotecas se obtienen a partir de diferentes individuos o especies. Las variantes de fragmentos también pueden generarse mediante una mutación inducida. Por lo general, los genes con fragmentos se expresan a partir de secuencias regulatorias asociadas naturalmente dentro de la levadura. Sin embargo, de manera alternativa, los genes individuales pueden enlazarse a elementos regulatorios de la levadura para formar un cásete de expresión, y un concatémero de estos casetes, cada uno conteniendo un gen diferente, puede insertarse dentro de un YAC. En algunos casos, los fragmentos se incorporan dentro del genoma de la levadura, y el mezclado se utiliza para desarrollar cepas mejoradas de la levadura. En otros casos, los fragmentos permanecen como componentes de YACs a lo largo de todo el proceso de mezclado, y después de la adquisición de una propiedad deseada, los YACs son transferidos a la célula del receptor deseada. 9. Métodos para Desarrollar Cepas de Levadura Los fragmentos se clonan dentro de un vector YAC, y la biblioteca YAC resultante se transforma dentro de células de levadura competentes. Los transformadores que contienen un YAC se identifican seleccionando un marcador de selección positiva presente en el YAC. A las células se les permite recuperarse y posteriormente se agrupan. Posteriormente, las células son inducidas para la esporulación transfiriendo las células del medio rico, al medio limitante de nitrógeno y carbono. Durante el transcurso de la esporulación, las células experimentan la meiosis. Posteriormente, se inducen las esporas para aparearse por medio del retorno al medio rico. Opcionalmente, las aseas se diluyen mediante lisis o liberan esporas, de tal forma que las esporas pueden aparearse con otras esporas que se originan de otras aseas. El apareamiento da como resultado la recombinación entre YACs que portan diferentes insertos, y entre YACs y cromosomas de levadura naturales. Éstos últimos pueden promoverse irradiando esporas con luz ultravioleta. La recombinación puede dar origen a nuevos fenotipos ya sea como resultado de genes expresados por fragmentos en los YACs o como resultado de la recombinación con genes huéspedes, o ambas cosas. Después de la inducción de la recombinación entre YACs y las cromosomas de levadura natural, los YACs son eliminados con frecuencia realizando una selección contra un marcador de selección negativa en los YACs. Por ejemplo, los YACs que contienen el marcador URA3 pueden seleccionarse en contra mediante la propagación en el medio que contiene ácido 5-fluoro-orótico. Cualquier material genético exógeno o alterado que permanezca está contenido dentro de las cromosomas de levadura natural. Opcionalmente, pueden llevarse a cabo rondas adicionales de recombinación entre los cromosomas de levadura natural después de la eliminación de los YACs. Opcionalmente, la misma o una biblioteca diferente de YACs puede transformarse dentro de las células, y pueden repetirse los pasos anteriores. Al repetir de manera recursiva este proceso, la diversidad de la población se incrementa antes de la clasificación. Después de la eliminación de los YACs, la levadura se clasifica o se selecciona con respecto a una propiedad deseada. La propiedad puede ser una nueva propiedad conferida por medio de los fragmentos transferidos, como por ejemplo, la producción de un antibiótico. La propiedad también puede ser una propiedad mejorada de la levadura como por ejemplo una capacidad mejorada para expresar o secretar una proteína exógena, una recombinogenicidad mejorada, estabilidad mejorada a la temperatura o los solventes, u otra propiedad requerida de las cepas comerciales o de investigación de la levadura. Las cepas de la levadura que sobreviven a la selección/clasificación se someten posteriormente a una ronda adicional de recombinación. La reco binación puede ser exclusivamente entre los cromosomas de la levadura que sobrevive a la selección/clasificación. De manera alternativa, puede introducirse una biblioteca de fragmentos dentro de las células de la levadura y recombinarse con cromosomas de la levadura endógenos como se revisó antes. Esta biblioteca de fragmentos puede ser la misma o diferente a la biblioteca utilizada en la ronda previa de transformación. Por ejemplo, los YACs podrían contener una biblioteca de ADN genómico aislado de un grupo de las cepas mejoradas obtenidas en los pasos anteriores. Los YACs se eliminan en la forma que se explicó antes, seguidos por rondas adicionales de recombinación y/o transformación con bibliotecas YAC adicionales. La recombinación va seguida de otra ronda de selección/clasificación, como se indicó antes. Pueden realizarse rondas adicionales de recombinación/clasificación según sea necesario hasta que una cepa de la levadura haya evolucionado para adquirir la propiedad deseada. Un esquema de ejemplo para la evolución de la levadura mediante la introducción de una biblioteca de YACs se muestra en la Figura 10. La primera parte de la Figura muestra la levadura que contiene un genoma diploide endógeno y una biblioteca YAC de fragmentos que representan variantes de una secuencia. La biblioteca se transforma dentro de las células para producir 100-1000 colonias por µg del ADN. La mayoría de las células de la levadura transformadas albergan ahora un solo YAC, así como cromosomas endógenos. La meiosis es inducida por el crecimiento en el medio limitante de nitrógeno y carbono. En el curso de la meiosis, los YACs se recombinan con otros cromosomas en la misma célula. Las esporas haploides resultantes de la meiosis se aparean y regeneran en formas diploides. Las formas diploides albergan ahora cromosomas recombinantes, cuyas partes provienen de cromosomas endógenos y partes de los YACs. Opcionalmente, los YACs pueden curarse en este momento fuera de las células realizando una selección contra el marcador de selección negativa presente en los YACs. Sin tomar en cuenta que los YACs se seleccionen en contra, las células se clasifican o se seleccionan entonces para una propiedad deseada. Las células sobrevivientes a la selección/clasificación se transforman con otra biblioteca YAC para iniciar otro ciclo de mezclado. 10. Método para Desarrollar YACs para la Transferencia a la Cepa del Receptor Estos métodos se basan en parte en el hecho de que pueden albergarse varios YACs en la misma célula de la levadura, y se sabe que se lleva a cabo una recombinación YAC-YAC (Green & Olson, Science (Ciencia) 250, 94-98 1990)). La recombinación inter-YAC ofrece un formato para el cual las familias de los genes homólogos albergados en los fragmentos de >20 kb pueden mezclarse in vivo . La población inicial de los fragmentos del ADN muestran una similaridad en la secuencia entre sí pero difiere como resultado de, por ejemplo, la diversidad inducida, alélica, o de las especies. Con frecuencia se sabe o se sospecha que los fragmentos del ADN codifican genes múltiples que funcionan en una vía común. Los fragmentos son clonados dentro de un Yac y son transformados en levadura, por lo general con la selección positiva para los transformadores. Los transformadores son inducidos a la esporulación, como resultado de lo cual los cromosomas experimentan meiosis. Posteriormente, las células se aparean. La mayoría de las células diploides resultantes transportan en este momento dos YACs, cada uno con un inserto diferente. Éstos inducen una vez más la esporulación y el apareamiento. Las células resultantes albergan YACs de secuencia recombinada. Las células pueden entonces clasificarse o seleccionarse con respecto a una propiedad deseada. Por lo general, esta selección ocurre en la cepa de la levadura que se utiliza para el mezclado. Sin embargo, si los fragmentos que se están mezclando no se expresan en la levadura, los YACs pueden aislarse y transferirse a un tipo de célula apropiada en donde se expresan para la clasificación. Los ejemplos de estas propiedades incluyen la síntesis o degradación de un compuesto deseado, la secreción creciente de un producto del gen deseado, u otro fenotipo detectable. De preferencia, la biblioteca del YAC se transforma en células haploides a y haploides a. Estas células se inducen posteriormente para aparearse entre sí, es decir, se agrupan y se inducen para aparearse por crecimiento en el medio rico. Las células diploides, cada una transportando dos YACs, se transfieren posteriormente al medio de esporulación. Durante la esporulación, las células experimentan la meiosis, y los cromosomas homólogos se recombinan. En este caso, los genes albergados en los YACs se recombinarán, diversificando sus secuencias. Las ascosporas haploides resultantes se liberan posteriormente de las aseas mediante una degradación enzimática de la pared de las aseas u otro medio disponible, y las ascosporas haploides liberadas agrupadas se inducen para aparearse mediante transferencia en el medio rico. Este proceso se repite durante varios ciclos para incrementar la diversidad del ADN clonado dentro de los YACs. La población resultante de las células de la levadura, de preferencia en el estado haploide, se clasifica ya sea para las propiedades mejoradas, o el ADN diversificado se entrega a otra célula huésped u organismo para su clasificación. Las células que sobreviven a la selección/ clasificación son sometidas a ciclos sucesivos de agrupamiento, esporulación, apareamiento y selección/ clasificación hasta que se ha observado el fenotipo deseado. La recombinación puede lograrse sencillamente transfiriendo células desde el medio rico hasta el medio limitado de carbono y nitrógeno para inducir la esporulación, y después regresando las esporas al medio rico para inducir el apareamiento. Las aseas pueden diluirse mediante lisis para estimular el apareamiento de las esporas que se originan a partir de las aseas diferentes. Después de que los YACs han sido desarrollados para codificar una propiedad deseada, pueden ser transferidos a otros tipos de célula. La transferencia puede ser mediante fusión de protoplastos, o una retransformación con el ADN aislado. Por ejemplo, la transferencia de los YACs de la levadura a las células de mamíferos se explica en Monaco Sc Larin, Trends in Biotechnology (Tendencias en Biotecnología) 12, 280-286 (1994); Montoliu y colaboradores, Reprod . Fértil .

Dev. (Disposi tivos de Fertilización y Reproducción) 6, 577-84 (1994) ; Lamb y colaboradores, Curr. Opin . Genet . Dev. (Disposi tivos de Genética Opin . Actual ) 5, 342-8 (1995) . Un esquema ejemplar para el mezclado de una biblioteca de fragmentos del YAC en la levadura se muestra en la Figura 11. Una biblioteca de fragmentos del YAC que representa variantes genéticas se transforma en levadura que posee cromosomas endógenos diploides. La levadura transformada continúa teniendo cromosomas endógenos diploides, además de un solo YAC. La levadura es inducida para experimentar la meiosis y la esporulación. Las esporas contienen genomas haploides y son seleccionadas con respecto a aquellas que contienen un YAC, utilizando el marcador selectivo de YAC. Las esporas son inducidas para aparearse generando células diploides. Las células diploides contienen ahora dos YACs que portan diferentes insertos, así como cromosomas endógenos diploides. Las células se inducen una vez más para experimentar meiosis y esporulación. Durante la meiosis, ocurre una recombinación entre los insertos del YAC, y los YACs recombinantes se segregan en ascoitos. Por lo tanto, algunos escoitos contienen cromosomas endógenos haploides más un cromosoma YAC con un inserto recombinante. Los ascoitos maduran en esporas, que pueden aparearse una vez generando células diploides. Alguas células diploides poseen ahora un complemento diploide de cromosomas endógenos más dos YACs recombinantes. Estas células pueden entonces tomarse a través de ciclos adicionales de meiosis, esporulación y apareamiento. En cada ciclo, ocurre una recombinación adicional entre los insertos del YAC y formas recombinantes adicionales de insertos se generan. Después de que ha ocurrido uno o varios ciclos de recombinación, las células pueden someterse a prueba para la adquisición de una propiedad deseada. Posteriormente, pueden llevarse a cabo ciclos posteriores de recombinación, seguidos por la selección, de manera similar. 11. Mezclado Jn vivo de Genes mediante el Apareamiento Recursivo de Células de Levadura que Albergan Genes Homólogos en Sitios Idénticos.

Un objetivo del mezclado del ADN es simular y expandir las capacidades de combinación de la recombinación sexual. El mezclado del ADN in vi tro es satisfactorio en este proceso. Sin embargo, al cambiar el mecanismo de recombinación y alterar las condiciones bajo las cuales ocurre la recombinación, los métodos de recombinación in vi tro naturales pueden obstaculizar la información intrínseca en una secuencia de ADN que la vuelve "desarrollable" . El mezclado in vivo empleando encruzamiento natural sobre los mecanismos que ocurren durante la meiosis puede accesar la información de la secuencia natural inherente y ofrece un medio para crear bibliotecas mezcladas de calidad mayor. Aquí se describe un método para el mezclado in vivo del ADN que utiliza los mecanismos naturales de la recombinación meiótica y ofrece un método alternativo para el mezclado del ADN. La estrategia básica es clonar genes que deben ser mezclados dentro en sitios idénticos dentro del genoma haploide de la levadura. Las células haploides se inducen posteriormente de manera recursiva para aparearse y esporularse. El proceso somete los genes clonados a una recombinación recursiva durante los ciclos recursivos de la meiosis. Posteriormente, los genes mezclados resultantes se clasifican in si tu o se aislan o se clasifican bajo condiciones diferentes.

Por ejemplo, si se desea mezclar una familia de cinco genes de lipasa, a continuación se presenta un medio para hacer esto in vivo . El marco de lectura abierta de cada lipasa se amplifica mediante el PCR de tal forma que cada ORF está flanqueado por secuencias idénticas de 3' y 5 A La secuencia de flanqueo de 5' es idéntica a una región dentro de la secuencia de codificación de 5' del gen S. cerevisiae ura 3 y la secuencia de flanqueo de 3' es idéntica a una región dentro del gen de 3' del ura 3. Las secuencias de flanqueo se eligen de tal forma que la recombinación homologa del producto del PCR con el gen ura 3 dé como resultado la incorporación del gen de la lipasa y la disrupción del ORF ura 3. Tanto las celdas haploides a y a del S. cerevisiae se transforman posteriormente con cada uno de los ORFs de la lipasa amplificada del PCR, y las células que han incorporado un gen de lipasa dentro del sitio ura 3 se seleccionan por crecimiento en ácido 5 fluoroorótico (5FOA es mortal para las células que expresan URA3 funcional) . El resultado es 10 tipos de células, dos tipos diferentes de apareamiento, de los cuales cada uno alberga uno de los cinco genes de lipasa en el sitio ura 3 trastornado. Estas células se agrupan posteriormente y se desarrollan bajo condiciones donde se favorece el apareamiento entre las células a y , por ejemplo en un medio rico.

El apareamiento da como resultado una mezcla combinada de células diploides que poseen todas 32 posibles combinaciones de genes de lipasa en los dos sitios ura 3. Las células se inducen posteriormente a la esporulación mediante crecimiento bajo condiciones limitadas de carbono y nitrógeno. Durante la esporulación, las células diploides experimentan meiosis para formar cuatro (dos a y dos a) ascosporas haploides albergadas en una asea. Durante la meiosis II del proceso de esporulación los cromatidios hermanos se alinean y se cruzan. Los genes de lipasa clonados dentro del sitio ura 3 también se alinearán y reco binarán . De esta manera, las ascosporas haploides resultantes representarán una biblioteca de células que alberga cada una un diferente gen de lipasa quimérica posible, cada uno un resultado único de la combinación meiótica de los dos genes de lipasa en la célula diploide original. Las paredes de la asea se degradan mediante tratamiento con zimolase para liberar y permitir el mezclado de ascosporas individuales. Esta mezcla se desarrolla posteriormente bajo condiciones que promueven el apareamiento de las células haploides a y a. Es importante liberar las ascosporas individuales, ya que el apareamiento ocurrirá de otra forma entre las ascosporas dentro de una asea. La mezcla de las células haploides permite la recombinación entre más de dos genes de lipasa, permitiendo una "recombinación en forma de grupos" . El apareamiento produce nuevas combinaciones de genes quiméricos que pueden entonces experimentar la recombinación después de la esporulación. Las células tienen un ciclo recursivo a través de la esporulación, la mezcla de ascosporas y el apareamiento hasta que se ha generado la suficiente diversidad mediante la recombinación en forma de pares recursiva de los cinco genes de lipasa. Los genes de lipasa quimérica individuales pueden ser clasificados directamente en las células de levadura haploides o transferirse a un huésped de expresión apropiada. El proceso se describe anteriormente para las lipasas y la levadura; sin embargo, puede emplearse cualquier organismo sexual dentro del cual puedan dirigirse genes, y cualquier gen, por supuesto, podría sustituirse por lipasas. Este proceso es análogo al método del mezclado de genomas enteros mediante apareamiento en forma de pares recursivo. Sin embargo, la diversidad en el caso del genoma entero ese distribuye a través de todo el genoma huésped mas que localizarse en lugares específicos. 12. Uso de YACs para Clonar Genes No Enlazados El mezclado de YACs es particularmente viable para transferir genes no enlazados pero funcionalmente relacionados de una especie a otra, particularmente cuando estos genes no han sido identificados. Este es el caso de varios productos naturales comercialmente importantes, como por ejemplo el taxol. La transferencia de los genes en la vía metabólica a un organismo diferente con frecuencia es deseable ya que los organismos que producen naturalmente estos compuestos no están bien adaptados para el cultivo en masa. Los racimos de estos genes pueden aislarse clonando una biblioteca genómica total de ADN a partir de un organismo que produzca un compuesto útil dentro de una biblioteca YAC. Posteriormente, la biblioteca YAC se transforma en levadura. La levadura se somete a esporulación y se aparea de tal forma que ocurre una recombinación entre los YACs y/o entre los YACs y los cromosomas de levadura natural . La selección/ clasificación se lleva a cabo posteriormente para la expresión de la recolección deseada de genes. Si los genes codifican una vía biosintética, puede detectarse la expresión a partir de la apariencia del producto de la vía. La producción de enzimas individuales en la vía, o intermedias del producto de expresión final o la capacidad de las células para metabolizar estos intermedios indica la adquisición parcial de la vía sintética. La biblioteca original o una biblioteca diferente puede introducirse dentro de las células que sobreviven a la selección/clasificación, y pueden llevarse a cabo rondas adicionales de recombinación y selección/clasificación hasta que se produzca el producto final de la vía metabólica deseada. 13. Mezcla de YAC-YAC Si un fenotipo de interés puede aislarse a un solo alargamiento del ADN genómico menos a 2 megabases de longitud, éste puede ser clonado dentro de un YAC y duplicarse en S. cerevisiae . La clonación de alargamientos similares del ADN a partir de huéspedes relacionados dentro de un YAC idéntico da como resultado una población de células de levadura que albergan cada una un YAC que posee un inserto homólogo que efectúa un fenotipo deseado. La reproducción recursiva de éstas células de levadura permite que las regiones homologas de estos YACs se recombinen durante la meiosis, permitiendo que los genes, las vías y los racimos se recombinen durante cada ciclo de meiosis. Después de varios ciclos de apareamiento y segregación, los insertos del YAC se mezclan perfectamente. La actualmente muy diversa biblioteca de levadura podría clasificarse entonces en cuanto a mejoramientos fenotípicos resultantes del mezclado de los insertos del YAC. 14. Mezclado de YAC-Cromosoma La recombinación "mitótica" ocurre durante la división celular y es el resultado de la recombinación de genes durante la duplicación. Este tipo de recombinación no se limita a la existente entre cromatidios hermanos y puede mejorarse por medio de agentes que inducen la maquinaria de recombinación, como por ejemplo los químicos cortantes y la irradiación ultravioleta. Como con frecuencia es difícil aparear directamente a través de una barrera de la especie, es posible inducir la recombinación de los genes homólogos que se originan de especies diferentes proporcionando los genes meta a un organismo del huésped deseado como por ejemplo una biblioteca del YAC. Los genes agregados en esta biblioteca se inducen posteriormente para recombinarse con genes homólogos en el cromosoma huésped mediante una recombinación mitótica mejorada. Este proceso se lleva a cabo de manera recursiva para generar una biblioteca de organismos diversos y después se clasifica para aquellos que poseen los mejoramientos fenotípicos deseados. La subpoblación mejorada se aparea posteriormente de manera recursiva tal como se indicó antes para identificar nuevas cepas que hayan acumulado múltiples alteraciones genéticas útiles. 15. Acumulación de YACs Múltiples Que Alberga Genes Útiles La acumulación de genes no enlazados múltiples que se requieren para la adquisición o mejoramiento de un fenotipo dado puede lograrse mediante el mezclado de bibliotecas YAC. El ADN genómico de los organismos que poseen fenotipos deseados, como por ejemplo la tolerancia al etanol, termotolerancia y la capacidad de fermentar azúcares de pentosa se agrupan, fragmentan y se clonan dentro de varios vectores YAC diferentes, cada uno en posesión de un diferente marcador selectivo (his, ura, ade, etc.). S. cerevisiae se transforma con estas bibliotecas, y se selecciona su presencia (utilizando medios selectivos, es decir, medios de goteo de uracil para el YAC que contiene el marcador selectivo Ura3) y después se clasifica por haber adquirido o mejorado un fenotipo deseado. Las células sobrevivientes se agrupan, se aparean de manera recursiva, y se seleccionan para la acumulación de YACs múltiples (mediante la propagación en el medio con goteos nutricionales múltiples) . Las células que adquieren YACs múltiples que albergan insertos genómicos útiles son identificados mediante una clasificación posterior. Las cepas perfeccionadas pueden utilizarse directamente, sin embargo, debido a la carga que puede significar un YAC para una célula, los insertos del YAC relevante pueden reducirse, subclonarse, y recombinarse dentro del cromosoma huésped, para generar una cepa de producción más estable. 16. Elección del Organismo SSF Huésped El uso de un ejemplo para la presente invención es crear una levadura mejorada para la producción de etanol a partir de una biomasa lignocelulósica. Específicamente, una cepa de levadura con tolerancia mejorada para el etanol y termoestabilidad/termotolerancia es deseable. Las cepas de la levadura padre conocidas por su buen comportamiento se identifican en un proceso de Sacarificación y Fermentación Simultánea (SSF) . Estas cepas se combinan con otras conocidas por poseer tolerancia al etanol y/o termoestabilidad. S. cerevisiae es altamente aceptable para el desarrollo en procesos SSF perfeccionados. Posee de manera inherente varios rasgos para este uso, incluyendo la capacidad de importar y fermentar una variedad de azúcares como por ejemplo sacarosa, glucosa, galactosa, maltosa y maltriosa. También, la levadura tiene la capacidad de flocular, permitiendo la recuperación de la biomasa de la levadura al final de un ciclo de fermentación, y permitiendo su nuevo uso en bioprocesos subsiguientes. Ésta es una propiedad importante ya que perfecciona el uso de nutrientes en el medio de crecimiento. S. cerevisiae también es altamente aceptable para la manipulación en laboratorio, tiene una genética altamente caracterizada y posee un ciclo reproductor sexual. S. cerevisiae puede desarrollarse bajo condiciones ya sea aeróbicas o anaeróbicas, en contraste con algunos otros organismos de SSF potenciales que son anaerobios estrictamente (por ejemplo, Clostridium spp.), dificultando mucho su manejo en el laboratorio. S. cerevisiae también son "considerados generalmente como seguros" ("GRAS"), y debido a su uso expandido para la producción de comestibles importantes para el público en general (por ejemplo, cerveza, vino, pan, etc.), es generalmente familiar y bastante conocido. S. cerevisiae se utiliza comúnmente en procesos de fermentación, y la familiaridad en este manejo por los expertos de fermentación facilita la introducción de nuevas cepas de levadura mejoradas dentro del entorno industrial . Las cepas de S. cerevisiae que han sido identificadas previamente como organismos SSF particularmente buenos, por ejemplo, S. cerevisiae D5A (ATCC200062) (South CR y Lynd LR (1994) Appl. Biochem. Biotechnol. (Biotecnología y Bioquímica Aplicadas) 45/46: 467-481; Ranatunga TD y colaboradores (1997) Biotechnol. Lett. (Carta Sobre Biotecnología) 19:1125-1127) pueden utilizarse como materiales de inicio. Además, otras cepas de S. cerevisiae utilizadas industrialmente se utilizan de manera opcional como cepas huéspedes, particularmente aquellas que muestran características de fermentación deseables, como por ejemplo la Y567 de S. cerevisiae (ATCC24858) (Sitton OC y colaboradores (1979) Process Biochem. (Bioquímica del Proceso) 14(9): 7-10; Sitton OC y colaboradores (1981) Adv. Biotechnol. (Biotecnología Avanzada) 2: 231-237; McMurrough I y colaboradores (1971) Folia Microbiol. (Microbiología Folia) 16: 346-349) y la ACA 174 de S. cerevisiae (ATCC 60868) (Benitez T y colaboradores (1983) Appl. Environ. Microbiol. (Microbiología Ambiental Aplicada) 45: 1429-1436; Chem. Eng. J. (Boletín de Ingeniería Química) 50: B17-B22, 1992), que han demostrado tener rasgos deseables para una fermentación a gran escala. 17. Elección de Cepas Tolerantes al Etanol Muchas cepas de S. cerevisiae han sido aisladas de ambientes altos en etanol, y han sobrevivido en el entorno rico en etanol mediante una evolución adaptada. Por ejemplo, las cepas del envejecimiento del vino Sherry (cepas "Flor") han desarrollado mitocondrios altamente funcionales para permitir su supervivencia en un ambiente alto en etanol. Se ha demostrado que la transferencia de estos mitocondrios de la levadura del vino a otras cepas incrementa la resistencia del receptor ante una concentración de etanol alta, así como la termotolerancia (Jiménez, J. y Benitez, T (1988) Curr. Genet. (Genética Actual) 13: 461-469). Existen varias cepas flor depositadas en la ATCC, por ejemplo, S. cerevisiae MY91 (ATCC 201301) , MY138 (ATCC 201302) , C5 (ATCC 201298) , ET7 (ATCC 201299) , LA6 (ATCC 201300) , OSB21 (ATCC 201303) , F23 (S. globosus ATCC 90920) . También, se han depositado varias cepas flor de S. uvaru y Torulaspora pretoriensis . Otras cepas de vino tolerantes al etanol incluyen S. cerevisiae ACA 174 (ATCC 60868), 15% de etanol, y S. cerevisiae A54 (ATCC 90921) , aislado del vino que contiene 18% (volumen/volumen) de etanol y NRCC 202036 (ATCC 46534) , también una levadura del vino. Otros etanológenos de S. cerevisiae que muestran adicionalmente una tolerancia al etanol mejorada incluyen ATCC 24858, ATCC 24858, G 3706 (ATCC 42594), NRRL Y-265 (ATCC 60539); y ATCC 24845 - ATCC 24860. Una cepa de S. pastorianus ( S. carlsbergensis ATCC 2345) posee una tolerancia al etanol alto (13% volumen/volumen). S. cerevisiae Sa28 (ATCC 26603), de una muestra de jugo de caña de Jamaica, produce altos niveles de alcohol de la malaza, y es tolerante al azúcar, y produce etanol a partir del hidrolizado del ácido de madera. Varias de las cepas enlistadas, así como otras cepas pueden utilizarse como materiales de inicio para reproducir la tolerancia al etanol . 18. Elección de Cepas Tolerantes a la Temperatura Se han reportado algunas cepas tolerantes a la temperatura, incluyendo la cepa altamente fluoculenta S. pastoriamus SA 23 (S. carlsbergensis ATCC 26602) , que produce etanol a temperaturas elevadas, y S. cerevisiae Kyokai 7 (S. sake, ATCC 26422) , un tolerante a la levadura del sake al calor ligero y tensión de oxidación. Ballesteros y colaboradores ( (1991) Appl . Biochem. Biotechnol .

(Biotecnología y Bioquímica Aplicada) . 28/29: 307-315) se examinaron 27 cepas de levadura en cuanto a su capacidad de desarrollar y fermentar glucosa en el rango de temperatura de 32 a 35°C, incluyendo Saccharomyces, Kluyveromyces y Candida spp. De éstos, los clones mejor termotolerantes fueron Kluyveromyces marxianus LG y Kluyveromyces fragilis 2671 (Ballesteros y colaboradores (1993) Appl. Biochem. Biotechnol. (Biotecnología y Bioquímica Aplicada). 39/40: 201-211) . El FDI de S. cerevisiae-pretoriensis fue de cierta forma termotolerante, sin embargo, fue deficiente en la tolerancia al etanol . La recombinación recursiva de esta cepa con otras que muestran tolerancia al etanol puede utilizarse para adquirir las características termotolerantes de la cepa en la progenie que también muestra tolerancia al etanol . Candida acidothermophilum (Issatchenkia orientalis, ATCC 20381) es una buena cepa SSF que también muestra un rendimiento mejorado en la producción de etanol a partir de biomasa lignocelulósica a temperaturas SSF mayores que S. cerevisiae D5A (Kadam, KL, Schmidt, SL (1997) Appl . Microbiol . Biotechnol . (Biotecnología y Microbiología Aplicada) . 48: 709-713). Esta cepa también puede ser contribuyente genético de una cepa SSF mejorada. 19. Mezclado de Cepas En aquellos casos en que las cepas están altamente relacionadas, puede buscarse una estrategia de apareamiento recursivo. Por ejemplo, una población de S. cerevisiae haploide (a y alfa) se mutageniza y se clasifica para la EtOH mejorada o tolerancia térmica. La subpoblación haploide mejorada se mezcla entre sí y se aparea como grupo y se induce a la esporulación. Las esporas haploides resultantes se liberan degradando la pared de las aseas y se mezcla. Las esporas liberadas se inducen posteriormente para el apareamiento y las esporulación recursivas. Este proceso se repite un número de veces suficiente para generar todas las combinaciones mutantes posibles. La población mezclada del genoma entero (haploide) se clasifica posteriormente para una EtOH adicional o tolerancia térmica. Cuando las cepas no están lo suficientemente relacionados para un apareamiento recursivo, pueden emplearse formatos basados en la fusión de protoplastos . La fusión de protoplastos en forma de grupos y recursiva puede llevarse a cabo para generar poblaciones quiméricas de varias cepas parentales. El grupo resultante de la progenie se selecciona y se clasifica para identificar cepas tolerantes térmicas y al etanol mejoradas. De manera alternativa, puede utilizarse un formato de Mezclado de Genoma Entero basado en YACs. En este formato, se utilizan los YACs para mezclar grandes fragmentos cromosómicos entre cepas. Tal como se detalló anteriormente, la recombinación ocurre entre YACs o entre YACs y los cromosomas huéspedes. El ADN genómico de los organismos que poseen genotipos deseados se agrupa, se fragmenta y se clona dentro de varios vectores YAC diferentes, cada uno con un diferente marcador selectivo (his, ura, ade, etc.). S. cerevisiae se transforma con estas bibliotecas, y se selecciona su presencia (utilizando medios selectivos, es decir, medios de goteo de uracil para el YAC que contiene el marcador selectivo Ura3) y después se selecciona por poseer el fenotipo deseado a adquirido o mejorado. Las células sobrevivientes se agrupan, se aparean de manera recursiva (como se explicó anteriormente) , y se selecciona para la acumulación de YACs múltiples mediante la propagación en el medio con goteos nutricionales múltiples) . Las células que adquieren YACs múltiples que albergan insertos genómicos útiles son identificadas mediante una clasificación posterior (consultar abajo) . 20. Selección de Cepas Mejoradas Después de producir grandes bibliotecas de cepas nuevas mediante mutagénesis y recombinación, una primera tarea sería aislar estas cepas que poseen mejoras en los fenotipos deseados. La identificación de las bibliotecas del organismo se facilita cuando los rasgos clave deseados son fenotipos que pueden seleccionarse. Por ejemplo, el etanol tiene efectos diferentes en la velocidad de crecimiento de una población de levadura, viabilidad y velocidad de fermentación. La inhibición del crecimiento celular y la viabilidad se incrementan con la concentración de etanol, pero la capacidad fermentativa alta se inhibe únicamente a concentraciones mayores de etanol. Por ende, la selección de células en crecimiento dentro del etanol es un enfoque viable para aislar cepas tolerantes al etanol. Posteriormente, las cepas seleccionadas pueden analizarse en cuanto a su capacidad de fermentación para producir etanol . Tomando en cuenta que las condiciones de crecimiento y el medio sean las mismas para todas las cepas (padres y progenie) , puede construirse una jerarquía de la tolerancia del etanol. Están disponibles esquemas de selección sencillos para la identificación de cepas tolerantes térmicas y tolerantes al etanol y, en este caso, se basan en aquellas previamente diseñadas para identificar cepas SSF potencialmente útiles. La selección de la tolerancia al etanol se lleva a cabo exponiendo la población al etanol, y después colocando en placas la población e investigando el crecimiento. Las colonias capaces de desarrollarse después de la exposición al etanol puede volver a exponerse a una concentración más alta de etanol y el ciclo puede repetirse hasta que se hayan seleccionado las cepas más tolerantes. Con el objeto de discernir las cepas que poseen una tolerancia al etanol heredable de las que son adaptaciones temporalmente adquiridas, estos ciclos pueden acentuarse con ciclos de crecimiento en ausencia de selección (por ejemplo, sin etanol) . De manera alternativa, la población mezclada puede desarrollarse directamente a concentraciones crecientes de etanol, y las cepas más tolerantes pueden enriquecerse (Aguilera y Benitez, 1986, Arch Microbiol. (Microbiología Arq.) 4:337-44). Por ejemplo, este enriquecimiento podría llevarse a cabo en un quimiostato o un turbidostato . Pueden desarrollarse selecciones similares para la tolerancia térmica, en donde las cepas son identificadas por su capacidad de desarrollarse después de un tratamiento térmico, o directamente para su desarrollo a temperaturas elevadas (Ballesteros y colaboradores, 1991, Applied. Biochem. and Biotech. (Bioquímica y Biotecnología Aplicadas), 28:307-315). Las mejores cepas identificadas por estas selecciones se someterán a ensayo de manera más minuciosa en clasificaciones subsecuentes para la tolerancia al etanol, térmica, u otras propiedades de interés. En un aspecto, se seleccionan organismos que poseen una tolerancia al etanol creciente. Se butageniza una población de aislados naturales de S . cerevisiae . Esta población después se desarrolla bajo las condiciones del fermentador bajo concentraciones de etanol bajas iniciales. Una vez que el cultivo ha llegado a la saturación, el cultivo se diluye dentro del medio fresco que posee un contenido de etanol ligeramente alto. Este proceso de dilución sucesiva dentro del medio de una concentración de etanol creciente gradualmente continúa hasta que se alcanza un umbral de la tolerancia del etanol . La población mutante sobreviviente que posee la tolerancia al etanol más alta se agrupa posteriormente y sus genomas son recombinados mediante cualesquiera de los métodos indicados en la presente. También puede lograrse el enriquecimiento mediante un cultivo continuo en un quimiestato o un turbidostato en donde la temperatura a las concentraciones de etanol se eleven progresivamente. La población mezclada resultante se expone posteriormente otra vez a la estrategia de enriquecimiento pero con una concentración de etanol del medio de inicio más alta. Esta estrategia se aplica opcionalmente para el enriquecimiento de células termotolerantes y para el enriquecimiento de células que poseen una tolerancia combinada térmica y al etanol . 21. Clasificación de Cepas Mejoradas Las cepas que muestran una viabilidad en las selecciones iniciales se someten a ensayo de manera más cuantitativa en cuanto a las mejoras en las propiedades deseadas antes de volver a mezclarse con otras cepas. La progenie resultante de la mutagénesis de una cepa, o aquellas preseleccionadas por su tolerancia al etanol y/o termoestabilidad, puede colocarse en placas en un ágar no selectivo. Las colonias pueden recolectarse robóticamente dentro de platinas de microvaloración y desarrollarse. Los cultivos se duplican en las placas de microvaloración frescas, y los duplicados se incuban bajo las condiciones de tensión apropiadas. El desarrollo o actividad metabólica de los clones individuales puede monitorearse y clasificarse. Los indicadores de viabilidad pueden variar desde el tamaño de las colonias en desarrollo de medios sólidos, la densidad de los cultivos en desarrollo, o el cambio de color de un indicador de la actividad metabólica agregado al medio líquido. Las cepas que muestran la mayor viabilidad se mezclan y se combinan posteriormente, y la progenie resultante se vuelve a clasificar bajo condiciones más severas . 22. Desarrollo de un Etanológeno Capaz de Convertir Celulosa en Etanol Una vez que se desarrolla una cepa de levadura que muestra termotolerancia y tolerancia al etanol, la degradación de celulosa en azúcares monoméricas se proporciona mediante la inclusión a la cepa huésped de una vía de degradación de celulaza. Pueden ser útiles características deseables adicionales para mejorar la producción del etanol por medio del huésped. Por ejemplo, la inclusión de enzimas heterólogas y vías que amplían el rango del azúcar del sustrato puede llevarse a cabo. La "sintonización" de la cepa puede lograrse mediante la añadidura de varios otros rasgos, o la restauración de ciertos rasgos endógenos que son deseables, pero que se pierden durante los procedimientos de recombinación. 23. Suministro de Actividad de la Celulasa Se ha caracterizado un amplio número de celulasas y sistemas de degradación de la celulasa a partir de hongos, bacterias y levaduras (consultar revisiones por parte de Beguin, P y Aubert, J-P (1994) FEMS Microbiol Rev. (Revisión de Microbiología de FEMS. 13: 25-58; Ohima, K. y colaboradores (1997) Biotechnol. Genet. Eng. Rev. (Revisión de Ingeniería Genética y Biotecnología) . 14: 365-414). Una vía enzimática requerida para una sacarificación eficiente de la celulosa implica la acción sinergística de las endoglucanasas (endo-1 , 4-ß-D-glucanasas, EC 3.2.1.4), exocelobiohidrolasas (exo-1 , 4-ß-D-glucanasas, EC 3.2.1.91), y ß-glucosidasas (celobiasas, 1, 4-ß-D-glucanasas EC 3.2.1.21) (Figura 9) . La producción heteróloga de enzimas de celulasa en el etanológeno podrían permitir la sacarificación de la celulosa, produciendo azúcares monoméricas que pueden ser utilizadas por el organismo para la producción del etanol. Existen varias ventajas para la expresión heteróloga de una vía de celulasa funcional en el etanológeno. Por ejemplo, el proceso SSF eliminaría la necesidad de un paso de bioproceso separado para la sacarificación y mejoraría la inhibición del producto final de las enzimas de celulasa por medio de azúcares del producto e intermedias acumuladas. Las vías de celulasa de ocurrencia natural se insertan dentro del etanológeno, o podríamos elegir utilizar vías de celulasa "híbridas" mejoradas y adaptadas, empleando la acción coordinada de las celulasas derivadas de fuentes naturales diferentes, incluyendo termófilos.

Varias celulasas derivadas que no son de Saccharomyces han sido producidas y secretadas de este organismo con éxito, incluyendo enzimas bacterianas, fúngales y de la levadura, por ejemplo T. Reesei CBH I (Shoemaker (1994), en "The Cellulase System of Trichoderma reesei : Trichoderma strain improvement and Expresión of Trichoderma cellulases in Yeast, " ("El Sistema de Celulasa de Trichoderma reesei : mejoramiento de la cepa Trichoderma y Expresión de celulasas de Trichoderma en la Levadura" ) , Online, Pinner, Reino Unido, 593-600) . Es posible emplear técnicas de ingeniería metabólica directas para engendrar la actividad de la celulasa en el Saccharomyces . También, la levadura ha sido forzada para adquirir elementos de las vías de degradación de la celulosa mediante la fusión de protoplastos (por ejemplo, se han creado híbridos intergenéticos de Saccharomyces y Zygosaccharomyces fermentati , una levadura productora de celobiasa, (Pina A, y colaboradores (1986) Appl. Environ. Microbiol. (Microbiología Ambiental Aplicada). 51: 995-1003) . En general, cualquier enzima del componente de celulasa que se derive de un organismo de levadura relacionado estrechamente podría transferirse mediante fusión de protoplastos. Las celobiasas producidas por un rango de cierta forma más amplio de levadura pueden accesarse mediante el mezclado del genoma entero en uno de sus varios formatos (por ejemplo, entero, fragmentado, basado en YAC) .

De manera óptima, las enzimas de celulasa que deben utilizarse deben mostrar una buena sinergia, un nivel adecuado de expresión y secreción desde el huésped, buena actividad específica (es decir, resistencia a los factores de degradación del huésped y modificación de la enzima) y estabilidad en el entorno de SSF deseado. Un ejemplo de una vía de degradación de celulosa híbrida con una sinergia excelente incluye las siguientes enzimas: exocelobiohidrasa de CBH I de Trichoderma reesei , la endoglucanada El de Acidothermus cellulyticus, y la exocelulasa E3 de Thermomonospera fusca (Baker, y colaboradores (1998) Appl . Biochem. Biotechnol. (Biotecnología y Bioquímica Aplicadas). 70-72: 395-403) . Se sugiere aquí que estas enzimas (o los mutantes mejorados de las mismas) sean consideradas para utilizarse en el organismo de SSF, junto con una celobiasa (ß-glucosidasa) , como la de la Candida peí tata . Otros sistemas de celulasa posible que deben tomarse en consideración deben poseer particularmente una buena actividad contra la celulosa cristalina, como por ejemplo el sistema de celulasa de T. Reesei (Terri, TT, y colaboradores (1988) Biochem. Soc. Trans. (Trans. Soc. Bioquímica). 26: 173-178), o poseer características de termoestabilidad particularmente buenas (por ejemplo, sistemas de celulasa a partir de organismos termofílicos, como por ejemplo Thermomonospora fusca (Zhang, S., y colaboradores (1995) Biochem. (Bioquímica) . 34: 3386-335) . Puede utilizarse un enfoque racional para la clonación de celulasas en el huésped de la levadura etanologénica . Por ejemplo, los genes de la celulasa conocidos se clonan dentro de casetes de expresión utilizando las secuencias del promotor S. cerevisiae y los fragmentos lineales resultantes del ADN pueden transformarse dentro del huésped receptor colocando las secuencias cortas de la levadura en los términos para fomentar la integración específica en el sitio dentro del genoma. Esto se prefiere a la transformación plasmídica por razones de estabilidad genética y mantenimiento del ADN de transformación. Si se introduce una vía de degradación de celulosa entera, puede implementarse una selección en un formato basado en placa de ágar, y podría someterse a ensayo un gran número de clones para la actividad de la celulasa en un período corto de tiempo. Por ejemplo, la selección de una exocelulasa puede ser accesible proporcionando un substrato de oligocelulosa soluble o carboximetilcelulosa (CMC) como la única fuente de carbono para el huésped, de otra forma incapaz de desarrollarse en el ágar que contiene esta única fuente de carbono. Los clones que producen vías de celulasa activa se desarrollarían en virtud de su capacidad para producir glucosa.

De manera alternativa, si se introdujeron de manera secuencial diferentes celulasas, sería útil introducir primero una celobiasa, permitiendo una selección utilizando la celobiosa disponible comercialmente como única fuente de carbono. Varias cepas de S . cerevisiae que son capaces de desarrollarse en la celobiosa han sido creadas mediante la introducción de un gen de celobiasa (por ejemplo, Rajoka MI, y colaboradorese (1998) Floia Microbiol . (Praha) (Microbiología Floia) 43, 129-135; Skory, CD, y colaboradores (1996) Curr. Genet. (Genética Actual). 30, 417-422; D'Auria, S, y colaboradores (1996) Appl. Biochem. Biotechnol.

(Biotecnología y Bioquímica Aplicadas) . 61, 157-166; Adam, AC, y colaboradores (1995) Yeast (Levadura) 11, 395-406; Adam, AC (1991) Curr. Genet. (Genética Actual) 20, 5-8) . La transformación subsecuente de este organismo con exocelulasa de CBHI puede seleccionarse mediante el desarrollo en un substrato de celulosa como por ejemplo la carboximetilcelulosa (CMC) . Por último, la añadidura de una endoglucanasa crea una cepa de levadura con una capacidad de degradación cristalina mejorada. 24. Suministro de Utilización de Azúcar de Pentosa La inclusión de vías de utilización de azúcar de pentosa es una faceta importante para un organismo SSF potencialmente útil. La expresión exitosa de las vías de utilización de azúcar de xilosa para la producción de etanol ha sido reportada en Saccharomyces (por ejemplo, Chen, ZD y Ho, NWY (1993) Appl. Biochem. Biotechnol. (Biotecnología y Bioquímica Aplicada. 39/40 135-147) . También sería útil lograr la utilización del substrato de L-arabinosa para la producción de etanol en el huésped de Saccharomyces . Las cepas de levadura que utilizan L-arabinosa incluyen ciertas especies de Candida y Pichia spp. (McMillan JD y Boynton BL (1994) Appl. Biochem. Biotechnol. (Biotecnología Bioquímica Aplicada. 45-46: 569-584; Dien BS, y colaboradores (1996) Appl. Biochem. Biotechnol. (Biotecnología Bioquímica Aplicada. 57-58: 233-242) . Los genes necesarios para la fermentación de la arabinosa en E. coli también podrían introducirse por medios racionales (por ejemplo, tal como se llevó a cabo previamente en Z . Mobilis (Deanda K, y colaboradores (1996) Appl . Environ. Microbiol. (Microbiología Ambiental Aplicada). 62 : 4465-4470) ) . 25. Suministro de Otras Actividades Útiles Varios otros rasgos que son importantes para el perfeccionamiento de una cepas SSF han sido demostrados como transferibles al S. cerevisiae . Al igual que la tolerancia térmica, la actividad de la celulasa y la utilización del azúcar de pentosa, estos rasgos podrían no mostrarse normalmente por el Saccharomyces (o la cepa particular de Saccharomyces utilizándose como un huésped) , y podrían agregarse por medios genéticos. Por ejemplo, la expresión de la acilfosfatasa del músculo humano en S. cerevisiae ha sido sugerida para incrementar la producción del etanol (Rougei, G., y colaboradores (1996) Biotechnol. Appl. Biochem. (Bioquímica Aplicada y Biotecnología) . 23: 273-278). Puede suceder que la cepa de SSF tolerante a la tensión desarrollada adquiera ciertas mutaciones no deseables en el curso de la estrategia de evolución. De hecho, éste es un problema penetrante en las estrategias de mejoramiento de la cepa que se basan en las técnicas de mutagénesis, y puede dar como resultado cepas de producción frágiles o altamente inestables. Es posible restaurar algunos de estos rasgos deseables mediante métodos racionales, como por ejemplo la clonación de genes específicos que han sido eliminados o influenciados negativamente en las rondas previas del mejoramiento de la cepa. La ventaja de este enfoque es la especificidad, el gen ofensor puede enfocarse directamente. La desventaja es que puede consumir tiempo y ser repetitivo si se han comprometido varios genes, y sólo dirige problemas que han sido ya caracterizados. Un enfoque preferido (y más tradicional) para la eliminación de mutaciones no deseables/ nocivas es cruzar otra vez la cepa desarrollada con una cepa padre deseable (por ejemplo, la cepa SSF "huésped" original) . Esta estrategia ha sido empleada con éxito para el mejoramiento de la cepa cuando está accesible (es decir, para organismos que poseen ciclos sexuales de reproducción) .

Cuando no existe la ventaja de un proceso sexual, se ha logrado utilizando otros métodos, como por ejemplo la recombinación parasexual o fusión de protoplastos. Por ejemplo, la habilidad para flocular fue conferida a una cepa no floculante de S. cerevisiae mediante la fusión de protoplastos con la S. cerevisiae competente en floculación (Watarii, J. , y colaboradores (1990) Agrie. Biol. Chem.

(Química y Biología Agrícola) . 54: 1677-1681). N. MEZCLADO DE GENOMA ENTERO IN VITRO El mezclado de secuencias de ADN grandes, como por ejemplo los cromosomas eucarióticos, es difícil mediante métodos de mezclado in vi tro de la técnica anterior. En la presente se describe un método para superar esta limitante. Las células de especies eucarióticas relacionadas se someten a lisis ligeramente y se liberan los cromosomas intactos. Los cromosomas liberados se clasifican posteriormente mediante FACS o un método similar (como por ejemplo, la electroforésis de campo de pulsos) con cromosomas de tamaño similar secuestrados entre sí . Cada fracción del tamaño de los cromosomas clasificados por lo general representará un grupo de cromosomas análogos, por ejemplo, el cromosoma Y de mamíferos relacionados. El objetivo es aislar los cromosomas intactos que no han sido dañados de manera irreversible.

La fragmentación y el reensamble de estas grandes piezas complejas de ADN que emplean polimerasas de ADN es difícil y sería probable introducir un nivel inaceptablemente alto de mutaciones aleatorias. Un enfoque alternativo que emplea enzimas de restricción y ligasa de ADN ofrece una solución destructiva menos factible. Una fracción cromosómica se digiere con una o más enzimas de restricción que reconocen secuencias largas de ADN (~15-20bp) , como por ejemplo las endonucleasas codificadas con intrones y inteína (I-Ppo I, I-Ceu I , PI - Psp I, PI - Tli I, Pl- Sce I (VDE) . Estas enzimas cada una se corta, en la mayoría de los casos, unas cuantas veces dentro de cada cromosoma, lo que da como resultado una mezcla combinada de fragmentos grandes, cada uno con términos de una sola estirpe en proyección que son complementarios con los demás sitios segmentados por la misma enzima. La digestión se modifica adicionalmente por una incubación muy breve con una exonucleasa de una sola estirpe. La polaridad de la nucleasa elegida depende de la proyección de una sola estirpe que resulta de la enzima de restricción elegida. La exonucleasa de 5' -3' para proyecciones de 3' y la exonucleasa de 3' -5' para proyecciones de 5A Esta digestión da como resultado regiones significativamente grandes de proyecciones del ADNss en cada término del ADNds . El propósito de esta incubación es generar regiones de ADN que definan regiones específicas del ADN donde pueda ocurrir la recombinación. Los fragmentos se incuban posteriormente bajo condiciones en que los extremos de los fragmentos se recosan con otros fragmentos que poseen términos del ADNss homólogos. Con frecuencia, los dos fragmentos que se recosen habrán sido originados de diferentes cromosomas y en la presencia de ligasa del ADN están enlazados de' manera covalente para formar un cromosoma quimérico. Esto genera diversidad genética que simula el cruzamiento de cromosomas homólogos. La reacción de ligación completa incluirá una mezcla combinada de todas posibles ligaciones de fragmentos que poseen términos de proyección homologa. Un subconjunto de esta población completará los cromosomas quiméricos. Para clasificar la biblioteca mezclada, los cromosomas son entregados a un huésped adecuado en una manera que permite la absorción y expresión de los cromosomas enteros. Por ejemplo, los YACs (cromosomas artificiales de la levadura) pueden ser entregados a las células eucarióticas mediante la fusión de protoplastos. De esta manera, la biblioteca de mezcla podría encapsularse en los liposomas y fusionarse con protoplastos de la célula huésped apropiada. Los transformadores resultantes podrían propagarse y clasificarse para los mejoramientos celulares deseados. Una vez que se ha identificado la población mejorada, los cromosomas se aislarían, mezclarían y clasificarían de manera recursiva.

O. MEZCLADO DEL GENOMA ENTERO DE MICROORGANISMOS COMPETENTES NATURALMENTE La competencia natural es un fenómeno observado para algunas especies microbianas mediante la cual las células individuales adsorben el ADN del ambiente y lo incorporan dentro de su genoma mediante una recombinación homologa. Se sabe que el Bacillus subtilis y Acetinetobacter spp. son particularmente eficientes en este proceso. Un método del mezclado del genoma entero (WGS) de éstos y organismos análogos se describe empleando este proceso. Un objetivo del mezclado del genoma entero es la acumulación rápida de mutaciones útiles a partir de una población de cepas individuales dentro de una cepa superior. Si los organismos que deben desarrollarse son componentes naturalmente, entonces una estrategia de agrupación dividida para la transformación recursiva de células naturalmente competentes con el ADN que se origina del grupo, llevará a cabo este proceso. Un procedimiento de ejemplo se explica a continuación. Una población de organismos naturalmente competentes que demuestra una variedad de rasgos útiles (como por ejemplo una secreción creciente de la proteína) se identifica. Las cepas se agrupan, y el grupo se divide. La mitad del grupo se utiliza como fuente de ADNg, mientras que la otra se utiliza para generar un grupo de células naturalmente competentes.

Las células competentes se desarrollan en presencia del ADNg agrupado para permitir la adsorción y recombinación del ADN. Las células de un genotipo absorben e incorporan el ADNg de las células de un tipo diferente que genera células con genomas quiméricos. El resultado es una población de células que representa una mezcla combinada de las variaciones genéticas que se originan en el grupo original . Estas células se agrupan una vez más y se transforman con la misma fuente del ADN otra vez. Este proceso se lleva a cabo de manera recursiva para incrementar la diversidad de los genomas de las células resultantes de la transformación. Una vez que se ha generado una diversidad suficiente, la población celular se clasifica en cuanto a organismos quiméricos nuevos que demuestren mejoramientos deseados. Este proceso es mejorado incrementando la competencia natural del organismo huésped. La COMS es una proteína que, al expresarse en B . subtilis, mejora la eficiencia de la transformación mediada por competencia natural en más de un orden de magnitud. Se demostró que aproximadamente el 100% de las células que albergan el pCOMS del plasmidio absorben y recombinan los fragmentos del ADN genómico dentro de sus genomas. En general, aproximadamente el 10% del genoma se recombina dentro de cualquier célula transformada dada. Esta observación fue demostrada con lo siguiente.

Una cepa de pCOMS de B . subtilis auxotrófica para dos marcadores nutricionales fue transformada con el ADN genómico (ADNg) aislado de una cepa prototrófica del mismo organismo. 10% de las células expuestas al ADN eran prototróficas para uno de los dos marcadores del nutriente. El tamaño promedio de la cepa del ADN absorbida por B . subtilis es de aproximadamente 50kb ó -2% del genoma. De esta forma, una de cada diez células poseían un marcador recombinado que era representado por uno en cada cincuenta moléculas de absorción de ADNg. De esta forma, la mayoría de las células absorben y recombinan aproximadamente cinco moléculas de 50kb ó 10% del genoma. Este método representa una herramienta poderosa para recombinar de manera rápida y eficiente los genomas microbianos enteros. En ausencia de pCOMS, únicamente el 0.3% de las células preparadas para la competencia natural absorben e integran un marcador específico. Esto sugirió que aproximadamente el 15% de las células experimentó en realidad la recombinación con un fragmento genómico único. Por lo tanto, una estrategia de transformación recursiva tal como se describió anteriormente, produce una biblioteca mezclada de genoma entero, incluso en ausencia de pCOMS . Sin embargo, en ausencia del pCOMS, los genomas complejos representarán un porcentaje menor, pero aún así clasificable, de la población transformada o mezclada.

P. CONGRESION La congresión es la integración de dos marcadores no enlazados independientes dentro de una célula. 0.3% de las células de B. subtilis naturalmente competentes integran un solo marcador (descrito anteriormente). De éstas, aproximadamente el 10% han absorbido un marcador adicional. Por lo tanto, si uno selecciona o clasifica la integración de un marcador específico, el 10% de la población resultante habrá integrado otro marcador específico. Esto ofrece una forma de enriquecer eventos de integración específicos. Por ejemplo, si buscamos la integración de un gen para el cual no existe una clasificación o selección fácil, éste existirá como 0.3% de la población de la célula. Si la población se selecciona primero para un evento de integración específico, entonces la integración deseada se encontrará en el 10% de la población. Esto representan un enriquecimiento significativo (~30-veces) para el evento deseado. Este enriquecimiento se define como el "efecto de congresión" . El efecto de congresión no está influenciado por la presencia de pCOMS, por lo tanto el "efecto pCOMS" es sencillamente incrementar el porcentaje de células naturalmente competentes que son verdaderamente naturalmente competentes desde aproximadamente el 15% en su ausencia al 100% en su presencia. Todas las células competentes siguen consumiendo aproximadamente la misma cantidad de ADN o -10% del genoma del Bacillus. El efecto de congresión puede utilizarse en los siguientes ejemplos para mejorar el mezclado del genoma entero, así como la integración enfocada de los genes mezclados para el cromosoma. Q. MEZCLADO DE B . SUBTILIS La población de células B . subtilis que poseen las propiedades deseadas se identifica, se agrupa y se mezcla tal como se describió anteriormente con una excepción: una vez que la población agrupada se divide, la mitad de la población se transforma con un marcador de selección antibiótica, que es flanqueado por una secuencia que enfoca su integración y disrupción de un gen nutricional específico, por ejemplo, uno implicado en la aminobiosíntesis . Los transformadores resistentes al medicamento son auxotróficos para este nutriente. La población resistente se agrupa y se desarrolla bajo condiciones que los convierten en naturalmente competentes (u opcionalmente se transforman primero con pCOMS) . Las células competentes se transforman posteriormente con el ADNg aislado del agrupamiento original, y se seleccionan los prototrofos . La población prototrófica habrá experimentado una recombinación con fragmentos genómicos que codifican una copia funcional del marcador nutricional, y por lo tanto estará enriquecida para las células que han experimentado una recombinación en otros lugares genéticos mediante el efecto de congregación. R. ENFOQUE DE GENES Y BIBLIOTECAS DE GENES PARA EL CROMOSOMA Es útil poder entregar de manera eficiente genes o bibliotecas de genes directamente a un sitio específico en el cromosoma de una célula. Tal como se indicó antes, las células meta se transforman con un marcador de selección positiva flanqueado por secuencias que enfocan la recombinación homologa dentro del cromosoma. Las células seleccionadas que albergan el marcador se convierten en naturalmente competentes (con o sin pCOMS, pero de preferencia lo primero) y se transforma con una mezcla de dos grupos de fragmentos del ADN. El primer grupo contiene un gen o una biblioteca de genes mezclados, cada uno flanqueado con una secuencia para enfocar su integración a un lugar cromosómico específico. El segundo grupo contiene un marcador de selección positiva (diferente al primer integrado dentro de las células) flanqueado por una secuencia que enfocará su integración y el reemplazo del primer marcador de selección positiva. Bajo condiciones óptimas, la mezcla es tal que el gen o la biblioteca de genes tiene un exceso molar sobre el marcador de selección positiva. Posteriormente, se seleccionan transformadores para las células que contienen el nuevo marcador positivo. Estas células son enriquecidas para las células que han integrado una copia del gen deseado o la biblioteca de genes mediante el efecto de congresión y pueden clasificarse directamente para las células que albergan el gen o las variantes del gen de interés. Este proceso se llevó a cabo utilizando fragmentos de PCR <10kb, y se descubrió que, al emplear el efecto de congresión, una población puede enriquecerse de tal forma que el 50% de las células son congregantes. De esta manera, una de dos células contenía un gen o un variante del gen. De manera alternativa, el huésped de expresión puede estar ausente del primer marcador de selección positiva, y las células competentes se transforman con una mezcla de los genes enfocados y una cantidad limitante del primer fragmento del marcador de selección positiva. Las células seleccionadas para el marcador positivo se clasifican en cuanto a las propiedades deseadas en los genes enfocados . Los genes mejorados se amplifican mediante el PCR, se vuelven a mezclar y después se regresan al huésped original otra vez con el primer marcador de selección positiva. Este proceso se lleva a cabo de manera recursiva hasta que se obtiene la función deseada de los genes. Este proceso elimina la necesidad de construir una cepa del huésped primario y la necesidad de dos marcadores postiviso. S. INTERCAMBIO GENÉTICO MEDIADO POR CONJUGACIÓN La conjugación puede emplearse en la evolución de los genomas celulares de varias formas. La transferencia mediante conjugación del ADN ocurre durante el contacto entre las células. Consultar Guiney (1993) en: Bacterial Conjugation (Conjugación Bacteriana) (Clewell, ed. , Plenum Press, Nueva York), páginas 75-104; Reimmann & Haas in Bacterial Conjugation (Conjugación Bacteriana) (Clewell, ed. , Plenum Press, Nueva York 1993) , en las páginas 137-188 (incorporda por referencia en su totalidad para todos los propósitos) . La conjugación ocurre entre varios tipos de bacterias gram negativas, y algunos tipos de bacterias gram positivas. La trasferencia mediante conjugación también se conoce entre las bacterias y las células vegetales (Agrobacterium tumefaciens) o la levadura. Tal como se explicó en la Patente 5,837,458, los genes responsables de la transferencia por conjugación pueden ellos mismos desarrollarse para expander el rango de los tipos celulares (por ejemplo, de bacterias a mamíferos) entre los cuales puede ocurrir esta transferencia. La transferencia por conjugación se efectúa mediante un origen de la transferencia (oriT) y genes flanqueados (MOB A, B y C) , y 15-25 genes, denominados tra, que codifican las estructuras y las enzimas necesarias para que se lleve a cabo la conjugación. El origen de la transferencia se define como el sitio requerido en cis para la transferencia del ADN. Los genes incluyen A, B, C, D, E, F, G, H, I, J, K, L, M, N, P.

Q, R, S, T, U, V, W, X, Z, tra, AB vir (alelos 1-11) , C, D, E, G, IHF, y FinOP . Los genes tra pueden expresarse en cis o trans hasta oriT. Otras enzimas celulares, incluyendo aquellas de la vía RecBCD, RecA, proteína SSB, girasa del ADN, poli del ADN, y ligasa del ADN, también participan en la transferencia por conjugación. Las vías RecE o recF pueden sustituir la RecBCD. Una proteína estructural codificada por un gen tra es el pilus sexual, con filamento construido a partir de un agregado de un polipéptido sencillo que sobresale de la superficie celular. El pilus sexual se enlaza a un polisacárido en las células receptoras y forma un puente de conjugación a través del cual puede transferirse el ADN. Este proceso activa una nucleasa específica del sitio codificada por un gen MOB, que segmenta específicamente el ADN que se va a transferir a oriT. El ADN segmentado se enrosca posteriormente a través del puente de conjugación mediante la acción de otras enzimas tra. Los vectores que pueden tener movimiento pueden existir en forma episomal o integrados dentro del cromosoma. Los vectores que pueden movilizarse episomales pueden utilizarse para intercambiar fragmentos insertados dentro de los vectores entre las células. Los vectores que pueden movilizarse integrados pueden utilizarse para movilizar genes adyacentes desde el cromosoma .

T. USO DE VECTORES MOVILIZABLES INTEGRADOS PARA PROMOVER EL INTERCAMBIO DEL ADN GENÓMICO El plasmidio F de E. coli se integra dentro del cromosoma a una alta frecuencia y moviliza los genes de manera unidireccional del sitio de integración (Clewell, 1993, consul tar arriba ; Firth y colaboradores, en Escherichia coli and Salmonella Cellular and Molecular Biology (Escherichia coli y Salmonela, Biología Molecular y Celular) , -2, 2377-2401 (1996); Froest y colaboradores, Microbiol Rev. (Revisión de Microbiología) 58, 162-210 (1994)). Otros vectores movilizables no se integran de manera espontánea dentro de un cromosoma huésped a alta eficiencia, pero pueden inducirse para hacerlo mediante el desarrollo bajo condiciones particulares (por ejemplo, tratamiento con un agente mutagénico, desarrollo a una temperatura no permitida para la duplicación de plasmidios) . Consul tar Reimann & Haas en Bacterial Conjugation (Conjugación Bacteriana) (ed. Clewell, Plenum Press, NY 1993), Ch. 6. De interés particular es el grupo IncP de plasmidios de conjugación que están tipificados por su rango amplio de huésped. (Clewell, 1993, consul tar arriba) . La bacteria "macho" del donante que porta una inserción cromosómica de un plasmidio de conjugación, como por ejemplo el factor F de E. coli puede donar de manera eficiente el ADN cromosómico a la bacteria entérica "hembra" del receptor que carece de F (F~) . La transferencia de conjugación de un donante a un receptor se inicia en oriT. La transferencia de la estirpe única cortada al receptor ocurre en una dirección de 5' a 3' mediante mecanismos de círculo en rotación que permiten la movilización de las copias cromosómicas en tándem. Después de entrar al receptor, la estirpe del donante se duplica de manera discontinua. La estirpe del ADN del donante de una sola estirpe, lineal, es un substrato potente para la iniciación de una recombinación homologa mediada por recA dentro del receptor. La recombinación entre la estirpe del donante y los cromosomas del receptor pueden dar como resultado la herencia de los rasgos del donante. De acuerdo con esto, las cepas que portan una copia cromosómica de F se designan como Hfr (por alta frecuencia de recombinación) (Low, 1996 en Escherichia coli and Salmonella Cellular and Molecular Biology (Escherichia coli y Biología Celular y Molecular) Volumen 2, páginas 2402-2405; Sanderson, en Escherichia coli and Salmonella Cellular and Molecular Biology 2 (Escherichia coli y Biología Celular y Molecular) 2, 2406-2412 (1996)). La habilidad de las cepas con un vector movilizable integrado para transferir el ADN cromosómico ofrece un medio rápido y eficiente para intercambiar material genético entre una población de bacterias permitiendo de esta manera la combinación de mutaciones positivas y la dilución de mutaciones negativas. Estos métodos de mezclado por lo general se inician con una población de cepas con un vector movilizable integrado que incluye por lo menos cierta diversidad genética. La diversidad genética puede ser el resultado de una variación natural, de la exposición a un agente mutagénico o la introducción de una biblioteca de fragmentos. La población de células se cultiva sin la selección para permitir el intercambio genético, la recombinación y la expresión de los genes recombinantes. Las células se clasifican o se seleccionan posteriormente en cuanto a su evolución hacia una propiedad deseada. La población que sobrevive a la selección/clasificación puede estar sujeta a una ronda adicional de mezclado mediante un intercambio genético mediado por HFR, o de otra forma. La eficiencia natural de Hfr y otras cepas con vectores mob integrados como receptores de transferencia mediante conjugación puede mejorarse por varios medios. La eficiencia del receptor relativamente baja de las cepas HFR naturales se atribuye a los productos de los genes traS y traT de F (Clewell, 1993, consul tar arriba Firth y colaboradores, 1996, consul tar arriba; Frost y colaboradores, 1994, consul tar arriba; Achtman y colaboradores; J". Mol . Biol . (Boletín de Biología Molecular) 138, 779-795 (1980). Estos productos se localizan para las membranas interna y externa de las cepas F+, respectivamente, donde tienen la función de inhibir los apareamientos redundantes entre dos cepas que son capaces ambas de donar ADN. Los efectos de traS y traT, y los genes cognados en otros plasmidios de conjugación, pueden eliminarse mediante el uso de células de eliminación incapaces de expresar estas enzimas, o reducirse propagando las células en una fuente limitada de carbono. (Peters y colaboradores, J". Bacteriol . (Boletín de Bacteriología) , 178, 3037-3043 (1996)). En algunos métodos, la población de inicio de las células posee un vector movilizable integrado en diferentes sitios genómicos. La transferencia direccional desde oriT da como resultado por lo general una herencia más frecuente de rasgos próximos a oriT. Esto se debe a que los pares de apareamiento son frágiles y tienden a disociarse (particularmente cuando se encuentran en un medio líquido) dando como resultado la interrupción de la transferencia. En una población de células que poseen un vector movilizable integrado en sitios diferentes, el intercambio cromosómico ocurre de una manera más aleatoria. Están disponibles paquetes de cepas Hfr en el Centro de Abastecimiento Genético de E. coli y el Centro de Abastecimiento Genético de Salmonella (Frost y colaboradores, 1994, consul tar arriba) . De manera alternativa, puede producirse una biblioteca de cepas con oriT en sitios y orientaciones aleatorias mediante la mutagénesis por inserción utilizando un transposón que porta oriT. El uso de un transposón que porta un oriT [por ejemplo, el Tn5-oriT descrito por Yakobson EA, y colaboradores J. Bacteriol. (Boletín de Bacteriología). Octubre de 1984; 160(1): 451-453] ofrece un método rápido para generar esta biblioteca. Las funciones de transferencia para la movilización desde los sitios de oriT transportados por el transposón se proporcionan mediante un vector de ayuda en trans . Es posible generar construcciones genéticas similares utilizando otras secuencias conocidas para las personas capacitadas también. En un aspecto, se proporciona un esquema recursivo para el mezclado genómico utilizando elementos Tn-oriT. Una cepa bacteriana prototrófica o un conjunto de cepas relacionadas que portan un plasmidio de conjugación, como por ejemplo el factor de fertilidad F o un miembro del grupo IncP de los plasmidios del rango de huésped amplio se mutageniza y se clasifica para las propiedades deseadas. Los individuos con propiedades deseadas se mutagenizan con un elemento Tn-oriT y se clasifican para la adquisición de una auxotrofía (por ejemplo, mediante la colocación en placas duplicadas para un medio mínimo y completo) resultante de la inserción dele elemento Tn-oriT en cualesquiera de varios genes biosintéticos esparcidos a través del genoma. Los auxotrofos resultantes se agrupan y se permite su apareamiento bajo condiciones que promueven los apareamientos macho con macho, por ejemplo, durante el desarrollo en proximidad cercana en una membrana de filtro. Observar que las funciones de transferencia se proporcionan por el plasmidio de conjugación de ayuda que está presente en el grupo de la cepa original . Los transconjugadores recombinantes se seleccionan en un medio mínimo y se clasifican en cuanto a mejoras adicionales. De manera opcional, las cepas que portan vectores movilizables integrados son defectuosas en cuanto a los genes de reparación de desemparejamientos. La herencia de rasgos del donante que se derivan de las eterologías de la secuencia se incrementa en las cepas que carecen del sistema de reparación de desemparejamiento dirigido al metilo. Opcionalmente, los productos del gen que disminuyen la eficiencia de la recombinación pueden inhibirse por las pequeñas moléculas. La transferencia de conjugación intergénica entre las especies como por ejemplo la E. coli y la Salmonella typhimurium, que son el 20% divergentes a nivel del ADN, también es posible si la cepa del receptor es mutH, Mult. Ó mutS (consultar Raysiguier y colaboradores, Nature (Naturaleza) 342, 396-401 (1989)). Esta transferencia puede utilizarse para obtener la recombinación en varios puntos tal como se muestra en el siguiente ejemplo. Un ejemplo utiliza una cepa del donante Hfr de S. typhimurium que posee marcadores thr557 en la posición map 0, pyrF2690 a 33 min, serA13 a 62 min y hfrK5 a 43 min. La MutS +/-, las cepas receptoras de E. coli F- tenían marcadores pyrD68 a 21 min, aroC355 a 51 min, ilv3164 a 85 min y mutS215 a 59 min. El donante Hfr triauxotrófico de S. typhimurium y el receptor de E. coli triauxotrófico mutS +/- isogénico fueron inoculados dentro de 3 ml de caldo de Lb y agitado a 37 °C hasta que se desarrollaron por completo. 100 µl del donante y cada receptor se mezclaron en 10 ml de caldo fresco LB, y después se depositaron en un filtro HA de 0.45 µM Millipore esterilizado, utilizando un dispositivo de filtración reutilizable de 250 ml Nalgene. El donante y los recipientes por separado se diluyeron de manera similar y se depositaron para revisar la reversión. Los filtros con células fueron colocados con las células hacia arriba en la superficie de una placa de ágar LB que fue incubada toda la noche a 37 °C. Los filtros fueron retirados con la ayuda de pinzas esterilizadas y se colocaron en un tubo de 50 ml esterilizado que contenía 5 ml de caldo con un mínimo de sales. Se utilizó el vórtex de manera vigorosa para las células de los filtros. 100 µl de las mezclas de apareamiento, así como los controles del donante y el receptor se esparcieron en LB para el conteo de células viables y la glucosa mínima complementado con ya sea dos de los tres requerimientos del receptor para los conteos recombinantes sencillos, uno de los tres requerimientos para los conteos recombinantes dobles, o ninguno de los tres requerimientos para los conteos recombinantes triples. Las placas se incubaron durante 48 a 37° después de lo cual se contaron las colonias.

Medio Recombinante CFUs/Recombinantes/Total CFU ptutS / mutS Suplementos Genotipo mutS mutS Aro + Iiv pyr* aro " ilv - - - Aro + Ura pyr" aro ~ ilv * 1.2 x 10'8 2.5 x 10"5 208 Aro + Ura pyr" aro * ilv 2.7 x 10"8 3.0 X 10"d 111 Aro pyr* aro " ilv * - - - Ilv pyr* aro * ilv - - - Ura pyr" aro * ilv * <?cA <10" Nada pyr* aro * ilv * Aro = vitaminas y aminoácidos aromáticos Ilv = aminoácidos de cadena ramificada Ura = uracil Los datos indican que los recombinantes pueden generarse en frecuencias razonables utilizando apareamientos Hfr. La recombinación intergenérica se mejora de 100 a 200 veces en un receptor que es defectuoso en cuanto a la reparación de desemparejamientos dirigidos por metilo. Las frecuencias se mejoran adicionalmente incrementando la relación de la célula del donante con las del receptor, o mediante el apareamiento repetido de cepas del donante original con la progenie del recombinante generada previamente . U. INTRODUCCIÓN DE FRAGMENTOS MEDIANTE CONJUGACIÓN Los vectores sobilizados también pueden utilizarse para transferir bibliotecas de fragmentos dentro de las células que se van a desarrollar. Este enfoque es particularmente útil en situaciones en las cuales las células que se deben desarrollar no pueden transformarse de manera eficiente directamente con la biblioteca del fragmento pero pueden experimentar una conjugación con las células primarias que pueden transformarse con la biblioteca de fragmentos. Los fragmentos del ADN que deben introducirse dentro de las células huésped incluyen una diversidad relativa con el genoma de la célula huésped. La diversidad puede ser el resultado de una diversidad natural o mutagénesis. La biblioteca de fragmentos del ADN se clona dentro de un vector movilizable que posee un origen de transferencia. Algunos de estos vectores también contienen genes mob a pesar de que de manera alternativa, estas funciones también pueden proporcionarse en trans. El vector debe ser capaz de una transferencia por conjugación eficiente entre las células primarias y las células huésped previstas. El vector también debe conferir un fenotipo seleccionable. Este fenotipo puede ser el mismo que el fenotipo que se desarrolla o puede estar conferido por un marcador, como por ejemplo un marcador de resistencia al medicamento. El vector de preferencia debe permitir la autoeliminación en las células huésped previstas permitiendo de esta manera la selección de células en donde un fragmento clonado ha experimentado un intercambio genético con un segmento del huésped homólogo mas que la duplicación.

Esto puede lograrse mediante el uso de un vector que carece de un origen de duplicación funcional en el tipo de huésped previsto o la inclusión de un marcador de selección negativa en el vector. Un vector adecuado es el plasmidio de conjugación de rango amplio del huésped, descrito por Simón y colaboradores, Bio/Technology (Bio /Tecnología) 1, 784-791 (1983) ; TrieuCuot y colaboradores, Gene (Gen) 102, 99-104 (1991); Bierman y colaboradores, Gene (Gen) 116, 43-49 (1992) . Estos plasmidios pueden transformarse en E. coli y después aparearse de manera forzada dentro de las bacterias que son difíciles o imposibles de transformar mediante la inducción química o eléctrica de la competencia. Estos plasmidios contienen el origen del plasmidio IncP, oriT' . Las funciones de movilización son suministradas en trans mediante copias integradas cromosómicamenté de los genes necesarios. La transferencia por conjugación del ADN puede ser asistida en algunos casos por el tratamiento del receptor (si es gram-positivo) con concentraciones subinhibidoras de penicilinas (Trieu-Cuot, y colaboradores, 1993 FEMS Microbiol . Lett .

(Carta de Microbiología de FEMS) 109, 19-23) . Para aumentar la diversidad en las poblaciones, se lleva a cabo un apareamiento de conjugación recursivo antes de la clasificación.

Las células que han experimentado un intercambio alélico con fragmentos de la biblioteca pueden clasificarse o seleccionarse en cuanto a su evolución hacia un fenotipo deseado. Pueden llevarse a cabo rondas subsecuentes de recombinación repitiendo el paso de la transferencia por conjugación. La biblioteca de fragmentos puede estar fresca o puede obtenerse de algunas (pero no todas) de las células que sobreviven a una ronda previa de selección/clasificación. El mezclado mediado por conjugación puede combinarse con otros medios del mezclado. V. INTERCAMBIO GENÉTICO PROMOVIDO POR EL FAGO DE TRANSDUCCIÓN La transducción del fago puede incluir la transferencia, de una célula a otra, del material genético no viral dentro de un recubrimiento viral (Masters, en Escherichia coli and Salmonella Cellular and Molecular Biology 2 (Escherichia coli y Salmonela, Biología Celular y Molecular 2) 2421-2442 (1996) . Quizás los dos mejores ejemplos de un fago de transducción generalizada son los bacteriófagos Pl y P22 de E. coli y S. typhimurium, respectivamente. Las partículas del bacteriófago de transducción generalizada se forman en una frecuencia baja durante la infección lítica cuando los fragmentos de doble estirpe, del tamaño de un genoma viral del ADN cromosómico del huésped (que sirve como donante) se empaca dentro de las cabezas del fago. Los mutantes promiscuos de alta transducción (HT) del bacteriófago P22 que empaca de manera eficiente el ADN con poca especificidad en la secuencia ya han sido aislados. La infección de un huésped susceptible da como resultado un lisado en el cual hasta el 50% de los fagos son partículas de transducción. La adsorción de la partícula de transducción generalizada a una célula receptora susceptible da como resultado la inyección del fragmento cromosómico del donante. La recombinación homologa mediada por RecA después de la inyección del fragmento del donante puede dar como resultado la herencia de los rasgos del donante. Otro tipo de fago que logra una inserción casi aleatoria del ADN dentro del cromosoma huésped es Mu. Para una revisión de la biología del Mu, consul tar Groisman (1991) en Methods in Enzymology (Métodos de Enzimología) v. 204. Mu puede generar una variedad de redisposiciones cromosómicas, incluyendo eliminaciones, inversiones, duplicaciones y transposiciones. Además, los elementos que combinan las características de P22 y Mu están disponibles, incluyendo el Mud-P22, que contiene los extremos del genoma Mu en lugar del sitio att del P22 y el gen int. Consul tar Berg, ver arriba . El fago de transducción generalizada puede utilizarse para intercambiar material genético entre una población de células que incluyen una diversidad genética susceptibles a la infección por parte del fago. La diversidad genética puede ser el resultado de la variación natural entre células, la mutación inducida de células o la introducción de bibliotecas de fragmentos dentro de las células. El ADN se intercambia posteriormente entre las células mediante una transducción generalizada. Si el fago no provoca la lisis de las células, la población completa de células puede propagarse en la presencia del fago. Si el fago da como resultado una infección lítica, la transducción se lleva a cabo en una base de agrupamiento dividido. Es decir, la población inicial de las células se divide en dos. Una subpoblación se utiliza para preparar el fago de transducción. El fago de transducción se infecta posteriormente dentro de la otra subpoblación. De preferencia, la infección se lleva a cabo a una alta multiplicidad del fago por célula de tal forma que sólo unas cuantas células quedan sin infectarse. Las células que sobreviven a la infección se propagan y se clasifican o se seleccionan para su evolución hacia una propiedad deseada. El agrupamiento de células que sobreviven a la clasificación/ selección puede mezclarse posteriormente en una ronda adicional de transducción generalizada o por medio de otros métodos de mezclado. La transducción mediante agrupación dividida recursiva se lleva a cabo opcionalmente antes de la selección para incrementar la diversidad de cualquier población que deba ser clasificada.

La eficiencia de los métodos anteriores puede incrementarse reduciendo la infección de las células mediante el fago infeccioso (fago sin transducción) y reduciendo la formación de lisógenos. Lo primero puede lograrse mediante la inclusión de queladores de cationes divalentes, como por ejemplo el citrato y el EGTA en medios de cultivo. Los fagos de transducción defectuosa terminales pueden utilizarse para permitir únicamente una ronda única de infección. Los cationes divalentes se requieren para la adsorción del fago y la inclusión de agentes de quelación, proporciona por lo tanto un medio para evitar una infección no deseada. Los derivados defectuosos de la integración ( inf) del fago de transducción generalizada pueden utilizarse para evitar la formación del lisógeno. En una variación adicional, las células huéspedes con defectos en los genes de reparación de desemparejamientos pueden utilizarse para incrementar la recombinación entre el ADN de transducción y el ADN genómico. 1. Uso de Profagos Bloqueados para Facilitar el Mezclado del ADN El uso de un elemento genético móvil, híbrido (profagos bloqueados) como medio para facilitar el mezclado del genoma entero de organismos utilizando la transducción de fagos como medio para transferir el ADN de un donante a un receptor es una forma de realización preferida. Uno de estos elementos (Mud-P22) basado en el fago de Salmonella templado P22 ha sido descrito para su uso en el mapeo genético y físico de mutaciones. Consul tar, Youderian y colaboradores (1998) Genetics (Genética) 118:581-592, y Benson y Goldman (1992) J. Bacteriol . (Boletín de Bacteriología) 174(5) :1673-1681. Las inserciones del Mud-P22 individuales empacan regiones específicas del cromosoma de la Salmonella dentro de las partículas P22 del fago. Las bibliotecas de las inserciones del Mud-P22 aleatorias pueden aislarse fácilmente e inducirse para crear agrupaciones de partículas de fagos que empacan fragmentos del ADN cromosómico aleatorios. Estas partículas del fago pueden utilizarse para infectar células nuevas y transferir el ADN del huésped hacia el receptor en el proceso de la transducción. De manera alternativa, el ADN cromosómico empacado puede aislarse y manipularse posteriormente mediante técnicas como por ejemplo el mezclado del ADN o cualquier otra técnica de mutagénesis antes de volver a introducirse dentro de las células (especialmente células recD para el ADN lineal) mediante la transformación o electroporación, donde se integran en el cromosoma. Ya sea las partículas del fago de transducción intactas o el ADN aislado pueden someterse a una variedad de mutágenos antes de volver a introducirse en las células para mejorar la velocidad de la mutación. Las líneas de células del mutador, como por ejemplo, mutD también pueden utilizarse para el desarrollo de fagos. Cualquier método puede utilizarse de manera recursiva en un proceso para crear genes o cepas con propiedades deseadas. Las células de E. coli que portan un clon de cosmidio de los genes LPS de Salmonella pueden ser infectados por el fago P22. Es posible desarrollar elementos genéticos similares utilizando otras combinaciones de elementos que pueden transponerse y bacteriófagos o virus también. El P22 es un fago lambdoide que empaca su ADN dentro de partículas preensambladas del fago (cabezas) por medio de un mecanismo de "llenado de cabeza" . El empaque del ADN del fago se inicia en un sitio específico (pac) y procede de manera unidireccional a lo largo de una molécula concatamérica normalmente de doble estirpe y lineal. Cuando la cabeza del fago está llena (-43 kb) , la estirpe del ADN se segmenta, y se inicia el empaque de la siguiente cabeza del fago. Sin embargo, los profagos P22 bloqueados o defectuosos en la escisión, inician el empaque en su sitio pac, y después proceden de manera unidireccional a lo largo del cromosoma, empacando cabezas llenas sucesivas del ADN cromosómico (en lugar del ADN del fago) . Cuando estos fagos de transducción infectan nuevas células de Salmonella, inyectan el ADN cromosómico del huésped original hacia la célula del receptor, donde puede recombinarse dentro del cromosoma mediante una recombinación homologa que crea un cromosoma quimérico. Después de la infección de células receptoras a una alta multiplicidad de infección, también puede ocurrir la recombinación entre los fragmentos de transducción entrantes antes de la recombinación en el cromosoma. La integración de estos profagos P22 bloqueados en diferentes sitios en el cromosoma permite que las regiones flanqueadas se amplifiquen y se empaquen en partículas del fago. El elemento genético móvil del Mud-P22 contiene un profago P22 defectuoso en la excisión flanqueado por los extremos del fago/transposón Mu. Todo el elemento Mud-P22 puede transponerse a virtualmente cualquier ubicación en el cromosoma u otro episoma (por ejemplo, el clon BAC, F' ) cuando las proteínas A y B del Mu se proporcionan en trans . Está disponible cierto número de formas de realización para este tipo de elemento genético. En un ejemplo, el profago bloqueado se utiliza como fago de transducción generalizado para transferir fragmentos aleatorios de un cromosoma del donante dentro del receptor. El elemento Mud-P22 actúa como transposón cuando se proporcionan proteínas de transposasa A y B del Mu en trans y se integran copias de sí mismo en sitios aleatorios en el cromosoma. De esta manera, puede generarse una biblioteca de inserciones del Mud-P22 cromosómico aleatorias en un huésped adecuado. Cuando los profagos Mud-P22 en esta biblioteca se inducen, los fragmentos aleatorios del ADN cromosómico serán empacados dentro de las partículas del fago. Cuando estos fagos infectan las células receptoras, el ADN cromosómico es inyectado y puede recombinarse dentro del cromosoma del receptor. Estas células del receptor se clasifican para una propiedad deseada y las células que muestran mejoramientos se propagan posteriormente. El proceso puede repetirse, ya que el elemento genético del Mud-P22 no se transfiere al receptor en este proceso. La infección a una alta multiplicidad permite que múltiples fragmentos cromosómicos sean inyectados y recombinados dentro del cromosoma del receptor. Los profagos bloqueados también pueden utilizarse como un fago de transducción especializado. Las inserciones individuales cerca de un gen de interés pueden aislarse a partir de una biblioteca de inserción aleatoria por medio de una variedad de métodos . La inducción de estos profagos específicos da como resultado el empaque del ADN cromosómico de flanqueo que incluye los genes de interés dentro de las partículas del fago. La infección de las células receptoras con estos fagos y la recombinación del ADN empacado dentro del cromosoma crea genes quiméricos que pueden clasificarse en cuanto a sus propiedades deseadas. La infección a una alta multiplicidad de infección puede permitir la recombinación entre fragmentos de transducción entrantes antes de la recombinación en el cromosoma. Estos fagos de transducción especializada también pueden utilizarse para aislar grandes cantidades de ADN de alta calidad que contenga genes específicos de interés sin ningún conocimiento previo de la secuencia del ADN. No se requiere la clonación de genes específicos. La inserción de este elemento cerca de un operón biosintético por ejemplo, permite que grandes cantidades del ADN de este operón sean aisladas para utilizarse en el mezclado del ADN (in vi tro y/o in vivo) , la clonación, la secuenciación, u otros usos que se estipulan en la presente. El ADN aislado de inserciones similares en otros organismos que contienen operones homólogos se mezcla opcionalmente para utilizarse en formatos de mezclado de familias tal como se describe en la presente, en donde se encuentran genes homólogos de diferentes organismos (o diferentes ubicaciones cromosómicas dentro de una sola especie, o ambas cosas) . De manera alternativa, la población que se transduce, experimenta una transducción recursiva con un fago de transducción agrupado o un fago de transducción nuevo generado de las células de la transducción previa. Esto puede llevarse a cabo de manera recursiva para perfeccionar la diversidad de los genes antes del mezclado. Los fagos aislados de las inserciones en una variedad de cepas u organismos que contienen operones homólogos se mezclan opcionalmente y se utilizan para coinfectar células a un MOI alto permitiendo la recombinación entre los fragmentos de transducción entrantes antes de la recombinación dentro del cromosoma .

Los profagos bloqueados son útiles para el mapeo de genes, operones, y/o mutaciones específicas con fenotipos, ya sea deseables o no deseables. Los profagos bloqueados también pueden ofrecer un medio para separar y mapear mutaciones múltiples en un huésped dado. Si buscamos mutaciones benéficas fuera de un gen u operón de interés, entonces un gen u operón no modificados pueden someterse a transducción dentro de un huésped mutagenizado o mezclado, y después puede clasificarse para la presencia de las mutaciones secundarias deseadas. De manera alternativa, el gen/operón de interés puede moverse fácilmente de un huésped mutagenizado/mezclado dentro de un entorno diferente para clasificar/seleccionar las modificaciones en el mismo gen/operón. También es posible desarrollar elementos genéticos similares utilizando otras combinaciones de elementos que pueden transponerse y bacteriófagos o virus también. Los sistemas similares se fijan en otros organismos, por ejemplo, que no permiten la duplicación de P22 ó Pl . Los fagos de rango amplio del huésped y los elementos que pueden transponerse son útiles en especial. Los elementos genéticos similares se derivan de otros fagos templados que también se empacan mediante un mecanismo de llenado de cabezas. En general, éstos son los fagos capaces de una transducción generalizada. Los virus que infectan las células eucarióticas pueden adaptarse para propósitos similares. Los ejemplos de fagos de transducción generalizada que son útiles se describen en Green y colaboradores, "Isolation and preliminary characterization of lytic and lysogenic phages with wide host range within the streptomycetes" ("Aislamiento y caracterización preliminar de fagos Uticos y lisogénicos con un rango amplio del huésped dentro de los estreptomicetos" ) , J. Gen . Microbiol . 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(Boletín de Bacteriología) 179 (2) : 323-329 (1997); Willi y colaboradores , "Transduction of antibiotic resístanse markers among Actinobacillus actinomycetemcomi tans strains by températe bacteriophages Aa phi 23" (Transducción de marcadores de resistencia al antibiótico entre las cepas de Actinobacillus actinomycetemcomi tans mediante los bacteriófagos templados Aa phi 23", Cell Mol Life Sci (Ciencias de la Vida Molecular y Celular) 53 (11-12) : 904-910 (1997) ; Jensen y colaboradores, "Prevalence of board-host-range lytic bacteriophages of Sphaerotilus natans, Escherichia coli , and Pseudomonas aeruginosa" (Prevalencia de bacteriófagos líticos de rango amplio del huésped de Sphaerotilus natans, Escherichia coli , and Pseudomonas aeruginosa" ) , Appl . Environ . Microbiol . (Microbiología Ambiental Aplicada) 64 (2) : 575-580 (1998), y Nedelman y colaboradores, "Generalized transduction for genetic linkage análisis and transfer of transposon insertions in different Staphylococcus epidermidis strains" (Transducción generalizada para el análisis de enlace genético de transferencia de inserciones del transposón en diferentes cepas de Staphylococcus epidermidis" ) , Zentiviralalbl Bakteriol 287 (1-2) : 85-92 (1998). Se desarrolla un sistema Mud-Pl/Tn-Pl comparable con el Mud-P22 utilizando el fago Pl . El fago Pl tiene la ventaja de empacar fragmentos mucho más grandes (-110 kb) por llenado de cabeza. El fago Pl se utiliza actualmente para crear cromosomas artificiales bacterianas o BAC's. Los vectores BAC basados en Pl están designados junto con estos principios de tal forma que el ADN clonado se empaque dentro de las partículas del fago, en lugar del sistema actual, que requiere la preparación del ADN a partir de episomas de copia sencilla. Esto combina las ventajas de ambos sistemas al tener los genes clonados en un formato de copia única estable, permitiendo al mismo tiempo la amplificación y el empaque específico del ADN clonado después de la inducción del profago. W. COLOCACIÓN ALEATORIA DE GENES O GENES MEJORADOS A TRAVÉS DEL GENOMA PARA EL PERFECCIONAMIENTO DEL CONTEXTO DEL GEN La colocación y orientación de genes en un cromosoma huésped (el "contexto" del gen en un cromosoma) o el episoma tiene efectos grandes en expresión y actividad del gen. La integración aleatoria del plasmidio u otras secuencias episomales dentro de un cromosoma huésped mediante la recombinación no homologa, seguida por la selección o clasificación para el fenotipo deseado, es una forma preferida de identificar posiciones cromosómicas óptimas para la expresión de una meta. Esta estrategia se ilustra en la Figura 18. Una variedad de sistemas de entrega mediados por transposones puede emplearse para entregar genes de interés, ya sea genes individuales, bibliotecas genómicas, o una biblioteca de genes mezclados aleatoriamente a través del genoma de un huésped. De esta manera, en una forma de realización preferida, el mejoramiento de una función celular se logra mediante la clonación de un gen de interés, por ejemplo un gen que codifica una vía metabólica deseada, dentro de un vehículo de entrega del transposón. Estos vehículos del transposón están disponibles para bacterias tanto gram-negativas como gram-positivas . De Lorenzo y Timis (1994) Methods in Enzymology (Métodos de Enzimología 235:385-404 describen el análisis y la construcción de fenotipos estables en Bacterias gramnegativas con minitransposones derivados de Tn5 y TnlO. Kleckner y colaboradores (1991) Methods in Enzymology (Métodos de Enzimología 204, capítulo 7 describen los usos de los transposones como por ejemplo el TnlO, incluyendo el uso en bacterias gram positivas. Petit y colaboradores (1990) Journal of Bacteriology (Boletín de Bacteriología) 172 (12) : 6736-6740 describe los transposones derivados de TnlO activos en el Bacillus Subtilis . El vehículo de entrega del transposón se introduce dentro de una población celular, que posteriormente se selecciona en cuanto a las células recombinantes que han incorporado el transposón dentro del genoma . La selección se lleva a cabo por lo general mediante cualquiera de una variedad de marcadores resistentes al medicamento que también son transportados dentro del transposón. La subpoblación seleccionada se clasifica en cuanto a las células que poseen una expresión mejorada del gen de interés. Una vez que las células que albergan los genes de interés en la ubicación óptima se aislan, los genes se amplifican desde dentro del genoma utilizando PCR, se mezclan, y se vuelven a clonar dentro de un vehículo de entrega del transposón similar, que contiene un marcador de selección diferente dentro del transposón y carece del gen de integrasa del transposón. Esta biblioteca mezclada se transforma posteriormente otra vez dentro de la cepa que alberga el transposón original, y las células se seleccionan para la presencia del nuevo marcador de resistencia y la pérdida del marcador de selección previo. Las células seleccionadas se enriquecen para aquellas que han intercambiado mediante recombinación homologa el transposón original por el nuevo transposón que porta los miembros de la biblioteca mezclada. Posteriormente, las células sobrevivientes se clasifican en cuanto a sus mejoras adicionales en la expresión del fenotipo deseado. Los genes de las células mejoradas se amplifican posteriormente por medio del PCR y se vuelven a mezclar. Este proceso se lleva a cabo de manera recursiva, oscilando cada ciclo entre los diferentes marcadores de selección. Una vez que los genes de interés se perfeccionan a un nivel deseado, el fragmento puede amplificarse y distribuirse otra vez de manera aleatoria a través del genoma tal como se describió antes para identificar la ubicación óptima de los genes mejorados. De manera alternativa, los genes que confieren una propiedad deseada podrían no ser conocidos. En este caso, los fragmentos del ADN clonados dentro del vehículo de entrega del transposón podrían ser una biblioteca de fragmentos genómicos originados de una población de células derivadas de una o más cepas que poseen las propiedades deseadas. La biblioteca se entrega a una población de células derivadas de una o más cepas que poseen o carecen de las propiedades deseadas y se seleccionan las células que incorporan el transposón. Las células sobrevivientes se clasifican después para la adquisición o el mejoramiento de la propiedad deseada. Los fragmentos contenidos dentro de las células sobrevivientes se amplifican mediante PCR y después se clonan en grupo dentro de un vector de entrega del transposón similar que alberga un marcador de selección diferente al del primer vector de entrega. Esta biblioteca se entrega posteriormente al grupo de células sobrevivientes, y se selecciona la población que ha adquirido el nuevo marcador de selección. Las células seleccionadas se clasifican posteriormente en cuanto a la adquisición o mejoramiento adicional de la propiedad deseada. De esta manera, las diferentes combinaciones posibles de genes que confieren o mejoran un fenotipo deseado se exploran de manera combinada. Este proceso se lleva a cabo de manera repetida con cada ciclo nuevo empleando un marcador de selección adicional . De manera alternativa, los fragmentos del PCR se clonan dentro de un grupo de vectores del transposón que poseen marcadores selectivos diferentes. Éstos se entregan a las células y se seleccionan en cuanto a l, 2, 3, ó más marcadores. De manera alternativa, los fragmentos amplificados de cada célula mejorada se mezclan independientemente. Las bibliotecas mezcladas se clonan otra vez posteriormente dentro de un vehículo de entrega del transposón similar al vector original, pero que contiene un marcador de selección diferente y carece del gen de transpopsasa. La selección posterior se realiza para la adquisición del nuevo marcador y la pérdida del marcador previo. Las células seleccionadas se enriquecen para aquellas que incorporan las variantes mezcladas de los genes amplificados mediante una recombinación homologa. Este proceso se lleva a cabo de manera recursiva, oscilando cada ciclo entre los dos marcadores selectivos. X. MEJORAMIENTO DE LOS GENES DE EXPRESIÓN EXCESIVA PARA UN FENOTIPO DESEADO El mejoramiento de una propiedad celular o fenotipo se mejora con frecuencia incrementando el número de copia o la expresión de los genes que participan en la expresión de esta propiedad. Los genes que poseen este efecto sobre una propiedad deseada también pueden ser mejorados mediante la mezcla del ADN para tener un efecto similar. Una biblioteca del ADN genómico se clona dentro de un vector de expresión excesiva y se transforma en una población celular meta de tal forma que los fragmentos genómicos están expresados altamente en las células seleccionadas para la presencia del vector de expresión excesiva. Las células seleccionadas se clasifican posteriormente en cuanto al mejoramiento de una propiedad deseada. El vector de expresión excesiva de las células mejoradas se aislan y los fragmentos genómicos clonados se mezclan. El fragmento genómico transportado en el vector a partir de cada aislado mejorado se mezcla independientemente o con genes homólogos identificados (mezcla de familia) . Las bibliotecas mezcladas se vuelven a entregar a una población de células y los transformadores seleccionados se vuelven a clasificar en cuanto a sus mejoras adicionales en la propiedad deseada. Este proceso de mezclado/clasificación tiene un ciclo recursivo hasta que se ha perfeccionado la propiedad deseada al nivel deseado. Tal como se indicó antes, la dosificación de genes puede mejorar en gran medida una propiedad celular deseada. Un método para incrementar el número de copia de genes desconocidos es utilizar un método de amplificación aleatoria ( consul tar también, Mavingui y colaboradores (1997) Nature Biotech . (Biotecnología de la Naturaleza) 15, 564) . En este método, una biblioteca genómica se clona dentro de un vector suicida que contiene un marcador selectivo que también a una dosificación superior proporciona un fenotipo mejorado. Un ejemplo de este marcador es el gen de resistencia a la canamicina. Con un número de copia sucesivamente mayor, se logra una resistencia a niveles de canamicina sucesivamente mayores. La biblioteca genómica se entrega a una célula meta mediante cualquiera de una variedad de métodos que incluyen la transformación, transducción, conjugación, etc. Las células que han incorporado el vector dentro del cromosoma mediante una recombinación homologa entre el vector y las copias cromosómicas de los genes clonados pueden seleccionarse solicitando la expresión del marcador de selección bajo condiciones en las que el vector no se duplica. Este evento de recombinación da como resultado la duplicación del fragmento del ADN clonado en el cromosoma huésped con una copia del vector y el marcador de selección separando las dos copias. La población de células sobrevivientes se clasifica en cuanto a su mejoramiento de una propiedad celular deseada resultante del evento de duplicación de genes. Pueden generarse eventos de duplicación de genes adicionales que den como resultado copias adicionales de los fragmentos del ADN clonado original, propagando posteriormente las células bajo condiciones selectivas sucesivamente más severas, es decir, concentraciones crecientes de canamicina. En este caso, la selección requiere copias crecientes del marcador de selección, pero las copias crecientes del fragmento del gen deseado también son concomitantes. Las células sobrevivientes se clasifican otra vez para el mejoramiento del fenotipo deseado. La población resultante de células quizás da como resultado la amplificación de genes diferentes ya que con frecuencia muchos genes tienen efecto sobre un fenotipo dado. Para generar una biblioteca de las posibles combinaciones de estos genes, se recombinan la biblioteca seleccionada original que muestra las mejoras fenotípicas, utilizando los métodos descritos en la presente, por ejemplo, fusión de protoplastos, transducción de la agrupación dividida, transformación, conjugación, etc.

Las células reco binadas se seleccionan en cuanto a la expresión creciente del marcador selectivo. Los sobrevivientes se enriquecen con células que poseen copias adicionales incorporadas de la secuencia del vector mediante una recombinación homologa, y estas células serán enriquecidas para aquellas que poseen duplicaciones combinadas de diferentes genes. En otras palabras, la duplicación de una célula de fenotipo mejorado llega a combinarse con la duplicación de otra célula de fenotipo mejorado. Estos sobreviventes se clasifican en cuanto a sus mejoras adicionales en el fenotipo deseado. Este procedimiento se repite de manera recursiva hasta que se logra el nivel deseado de expresión fenotípica. De manera alternativa, los genes que han sido identificados o se sospecha que son benéficos en el número de copia creciente, se clonan en tándem dentro de vectores del plasmidio apropiados. Estos vectores se transforman y se propagan posteriormente en un organismo huésped apropiado. La recombinación de plasmidio-plasmidio entre los fragmentos del gen clonado dan como resultado una duplicación posterior de los genes . La resolución del doblete del plasmidio puede dar como resultado la distribución desigual de las copias del gen, donde algunos plasmidios poseen copias del gen adicionales y otros poseen menos copias del gen. Las células que transportan esta distribución de plasmidios se clasifican después con respecto al mejoramiento en el fenotipo efectuado por las duplicaciones del gen. En resumen, se proporciona un método para la selección de un número de copia creciente de una secuencia del ácido nucleico por medio del procedimiento anterior. En el método, una biblioteca genómica en un vector suicida que incluye un marcador seleccionable y sensible a la dosis se suministra tal como se indicó anteriormente. La biblioteca genómica se somete a transducción dentro de una población de células meta. Las células meta se seleccionan en una población de células meta para incrementar la dosis del marcador seleccionable bajo condiciones en las cuales el vector suicida no se duplica de manera episomal. Se selecciona una pluralidad de células meta para el fenotipo deseado, se recombinan y se vuelven a seleccionar. El proceso se repite de manera recursiva, si se desea, hasta obtener el fenotipo deseado. Y. ESTRATEGIAS PARA MEJORAR EL MEZCLADO GENÓMICO A TRAVÉS DE LA TRANSFORMACIÓN DE FRAGMENTOS DEL ADN LINEALES Los miembros tipo silvestre de la Enterobacteriaceae (por ejemplo, Escherichia coli) son por lo general resistentes al intercambio genético que sigue a la transformación de las moléculas del ADN lineales. Esto se debe, por lo menos en parte, a la actividad de la Exonucleasa V (Exo V) de la holoenzima RecBCD que degrada rápidamente las moléculas del ADN lineal después de la transformación. La producción de ExoV ha sido rastreada para el gen recD, que codifica la subunidad D de la holoenzima. Tal como se demostró por Russel y colaboradores (1989) Journal of Bacteriology (Boletín de Bacteriología) 2609-2613, la recombinación homologa entre una molécula del ADN del donante lineal transformada y el cromosoma del receptor es fácilmente detectada en cepas que portan una pérdida de la función de mutación en un mutante recD. El uso de las cepas recD ofrece un medio sencillo para el mezclado genómico de la recD. Por ejemplo, una cepa bacteriana o un conjunto de cepas relacionadas que transportan una mutación nula del recD (por ejemplo, el recD1903 de E. coli : . - alelo mini-Tet) se mutageniza y se clasifica para las propiedades deseadas. En una forma de agrupamiento dividido, el ADN cromosómico en una alícuota podría utilizarse para transformar (por ejemplo, mediante electroporación o competencia inducida químicamente) la segunda alícuota. Los transformadores resultantes se clasifican posteriormente para su mejoramiento, o se transforman de manera recursiva antes de la clasificación. El uso de RecE/recT tal como se describe arriba, puede mejorar la recombinación homologa de fragmentos del ADN lineal . La holoenzima RecBCD juega un papel importante en la iniciación de la recombinación homologa dependiente de RecA.

Después de reconocer como un extremo del ADNds, la enzima RecBCD se desenrolla y degrada el ADN de manera asimétrica en una dirección de 5' a 3' hasta que encuentra un sitio chi (ó "X") (concenso 5' -GCTGGTGG-3 ' ) que atenúa la actividad de la nucleasa. Esto da como resultado la generación de un ADNss que termina cerca del sitio c con un extremo del ADNss de 3 que se prefiere para la carga del RecA y la invasión subsecuente del ADNds para la recombinación homologa. De acuerdo con esto, el procesamiento previo de los fragmentos de transformación con una exonucleasa del ADNss específica de 5' a 3' como por ejemplo la Exonucleasa de Lamda (?) (disponible, por ejemplo, de Boeringer Mannheim) antes de la transformación que puede servir para estimular la recombinación homologa en la cepa recD' , proporcionando un extremo invasor del ADNss para la carga del RecA y la invasión de estirpes subsecuente. La añadidura de la secuencia del ADN que codifica los sitios chi (concenso 5' -GCTGGTGG-3 ' ) a los fragmentos del ADN puede servir tanto para atenuar la actividad de la Exonucleasa V y estimular la recombinación homologa, eliminando de esta manera la necesidad de una mutación de recD (consultar también, Kowalczykowski, y colaboradores (1994) "Biochemistry of homologous recombination in Escherichia coli , " ("Bioquímica de recombinación homologa en Escherichia coli" ) Microbiol . Rev. (Revisión de Microbiología ") 58:401-465 y Jessen, y colaboradores (1998) "Modification of bacterial artificial chromosomes through Chi-stimulated homologous recombination and its application in zebrafish transgénesis" ("Modificación de los cromosomas artificiales bacterianos a través de una recombinación homologa estimulada por Chi y su aplicación en la transgénesis del pez cebra". Proc . Nati . Acad. Sci . (Procedimientos de la Academia Nacional de Ciencias) 95:5121-5126) . Los sitios Chi se incluyen opcionalmente en enlazadores ligados a los extremos de los fragmentos de transformación o se incorporan dentro de los primarios externos utilizados para generar fragmentos del ADN que deben ser transformados. El uso de secuencias estimulatorias de recombinación como por ejemplo la chi, es un enfoque generalmente útil para la evolución de una amplia gama de tipos de célula mediante la transformación del fragmento. Los métodos para inhibir o mutar los análogos de Exo V u otras nucleasas (como por ejemplo, Exonucleases I ( endAl) , II (nth) , IV (nfo) , VII, y VIII de E. coli) es útil también. La inhibición o eliminación de las nucleasas o la modificación de los extremos de los fragmentos del ADN de transformación para volverlos resistentes a la actividad de la exonucleasa tiene aplicaciones en la evolución de una amplia gama de tipos de células.

Z. MEZCLADO PARA PERFECCIONAR INTERACCIONES DESCONOCIDAS Muchos rasgos observados son el resultado de interacciones complejas de genes múltiples o productos de genes. La mayoría de estas interacciones sigue sin caracterizarse todavía. De acuerdo con esto, con frecuencia no queda claro qué genes necesitan perfeccionarse para lograr un rasgo deseado, aún cuando se sabe que algunos de los genes contribuyen para este rasgo. Esta falta de caracterización no es un problema durante el mezclado del ADN, que produce soluciones que perfeccionan lo que tenga que seleccionarse. Un enfoque alternativo, que tiene el potencial de resolver no solo este problema, sino también factores limitantes de porcentaje en eun futuro anticipado, es la complementación mediante la expresión excesiva de secuencias genómicas desconocidas. Una biblioteca del ADN genómico se elabora primero tal como se describió, consul tar arriba . Ésta se transforma dentro de la célula que se va a perfeccionar y los transformadores se clasifican en cuanto a los incrementos de una propiedad deseada. Los fragmentos genómicos que dan como resultado una propiedad mejorada se desarrollan mediante la mezcla del ADN para incrementar posteriormente su efecto benéfico. Este enfoque no requiere la información de la secuencia, ni tampoco conocimiento o suposiciones sobre la naturaleza de la proteína o las interacciones de la vía, o incluso qué pasos son limitantes de la velocidad; se basa únicamente en la detección del fenotipo deseado. Este tipo de clonación aleatoria y evolución subsecuente mediante la mezcla del ADN de secuencias genómicas postivamente interactivas, es extremadamente poderoso y genérico. Se utiliza una variedad de fuentes del ADN genómico, desde cepas isogénicas hasta especies relacionadas de manera más distante con las propiedades potencialmente deseables. Además, la técnica es aplicable a cualquier célula para la cual esté disponible la biología molecular básica de la transformación y los vectores de clonación, y para cualquier propiedad que pueda someterse a ensayo (de preferencia en un formato de alto rendimiento) . De manera alternativa, una vez que se perfecciona, el ADN desarrollado puede devolvese al cromosoma mediante la recombinación homologa o de manera aleatoria mediante una recombinación específica en el sitio mediada por los fagos. AA. RECOMBINACIÓN HOMOLOGA DENTRO DEL CROMOSOMA La recombinación homologa dentro del cromosoma se utiliza para evitar las limitaciones de la evolución basada en el plasmidio y las restricciones del tamaño. La estrategia es similar a la descrita anteriormente para los genes de mezclado dentro de su contexto cromosómico, con la excepción de que no ocurre una mezcla in vi tro . En lugar de esto, una cepa padre se trata con mutágenos como por ejemplo la luz ultravioleta o nitrosoguanidina, y se seleccionan los mutantes mejorados. Los mutantes mejorados se agrupan y se dividen. La mitad de la agrupación se utiliza para generar fragmentos genómicos aleatorios para la clonación dentro de un vector de recombinación homologa. Los fragmentos genómicos adicionales se derivan opcionalmente de especies relacionadas con propiedades deseables. Los fragmentos genómicos clonados se recombinan de manera homologa dentro de los genomas de la mitad restante del grupo de mutantes, y se seleccionan las variantes con propiedades mejoradas. Éstos son sometidos a una ronda adicional de mutagénesis, selección y recombinación. Una vez más, este proceso es totalmente genérico para el mejoramiento de cualquier biocatalizador de la célula entera para el cual pueda desarrollarse un vector de recombinación y un ensayo. Una vez más, debe observarse que la recombinación puede llevarse a cabo de manera recursiva antes de la clasificación. BB. MÉTODOS PARA LA RECOMBINACIÓN DE SECUENCIA RECURSIVA Algunos formatos y ejemplos para la recombinación de secuencia recursiva, referida algunas veces como mezcla del ADN o reproducción molecular, han sido descritos por estos inventores y colegas en una solicitud copendiente, expediente del abogado número 16528A-014612 , presentada el 25 de marzo de 1996, PCT/US95/02126 presentada el 17 de febrero de 1995 (publicada como WO 95/22625) ; Stemmer, Science 270, 1510 (1995); Stemmer y colaboradores, Gene (Gen) , 164, 49-53 (1995); Stemmer, Bio/Technology (Bio /Tecnología) 13, 549-553 (1995); Stemmer, Proc . Nati . Acad. Sci . USA (Procedimientos de la Academia Nacional de Ciencias EUA) 91, 10747-10751 (1994); Stemmer, Nature (Naturaleza) 370, 389-391 (1994); Crameri y colaboradores, Nature Medicine (Medicina Natural) 2(l):l-3, (1996), y Crameri y colaboradores, Nature Biotechnology (Biotecnología Natural) 14, 315-319 (1996) (cada una de las cuales se incorpora por referencia en su totalidad para todos los propósitos) . Tal como se muestra en las Figuras 16 y 17, la mezcla del ADN ofrece una tecnología más rápida para la evolución de nuevas funciones complejas. Tal como se muestra en la Figura 16, panel (A), la recombinación en la mezcla del ADN logra la acumulación de múltiples mutaciones benéficas en unos cuantos ciclos. En contraste, debido a la alta frecuencia de mutaciones nocivas en relación con las benéficas, la mutación del punto reiterativo debe crear mutaciones benéficas una a la vez, y en consecuencia, requiere varios ciclos para alcanzar el mismo punto. Tal como se muestra en la Figura 16, panel B, más que una sencilla secuencia lineal de acumulación de mutación, la mezcla del ADN es un proceso paralelo donde pueden resolverse múltiples problemas de manera independiente, y después combinarse. 1. Formatos In Vi tro Un formato para la mezcla in vi tro se ilustra en la Figura 1. Los substratos iniciales para la recombinación son un grupo de secuencias relacionadas. Las X's en la Figura 1, panel A, muestran el lugar en donde las secuencias divergen. Las secuencias pueden ser de ADN ó ARN y pueden ser de diferentes longitudes dependiendo del tamaño del gen y el fragmento del ADN que deba ser recombinado o reensamblado. De preferencia, las secuencias son de 50 bp a 50 kb. El grupo de sustratos relacionados se convierte en fragmentos superpuestos, por ejemplo, desde aproximadamente 5 bp a 5 kb o más, tal como se muestra en la Figura 1, panel B. Con frecuencia, el tamaño de los fragmentos es desde aproximadamente 10 bp a 1000 bp, y algunas veces el tamaño de los fragmentos del ADN es de aproximadamente 100 bp a 500 bp. La conversión puede efectuarse por medio de cierto número de métodos diferentes, como por ejemplo la digestión de DNasel ó RNase, el corte aleatorio o la digestión de enzima de restricción parcial. De manera alternativa, la conversión de substratos en fragmentos puede llevarse a cabo mediante la amplificación de PCR incompleto de los substratos o el PCR cargado desde un cargador único. Alternativamente, pueden generarse fragmentos de una sola estirpe adecuados en un sintetizador del ácido nucleico. La concentración de fragmentos del ácido nucleico de una longitud y secuencia particulares con frecuencia es menor a 0.1% ó 1% por peso del ácido nucleico total . El número de fragmentos del ácido nucleico específico diferentes en la mezcla por lo general es de por lo menos aproximadamente 100, 500 ó 1000. La población mezclada de fragmentos del ácido nucleico se convierte en una forma por lo menos parcial de estirpe única. La conversión puede llevarse a cabo calentando a aproximadamente 80 °C a 100 °C, de manera más preferente de 90 °C a 96 °C, para formar fragmentos de ácido nucleico de una sola estirpe y después mediante recocido. La conversión también puede efectuarse por medio del tratamiento con una proteína enlazadora del ADN de una sola estirpe o proteína recA. Los fragmentos del ácido nucleico de una sola estirpe que poseen regiones de la identidad de la secuencia con otros fragmentos del ácido nucleico de una sola estirpe, pueden recocerse posteriormente enfriando de 4°C a 75°C, y de preferencia de 40 °C a 65 °C. La renaturalización puede acelerarse mediante la añadidura de polietilenglicol (PEG) , otros reactivos que excluyen el volumen o sal. La concentración de sal es de preferencia de 0 mM a 200 mM, de manera más preferente, la concentración de sal es de 10 mM a 100 mM. La sal puede ser KCl ó NaCl. La concentración de PEG es de preferencia de 0% a 20%, y de manera más preferente 5% a 10%. Los fragmentos que se recocen pueden ser de diferentes substratos tal como se muestra en la Figura 1, panel C. Los fragmentos del ácido nucleico recocidos se incuban en presencia de una polimerasa del ácido nucleico, como por ejemplo Taq ó Klenow, o polimerasas a base de prueba de lecturas, como por ejemplo pfu ó pwo, y dNTP's (es decir, dATP, dCTP, dGTP y dTTP) . Si las regiones de identidad de la secuencia son largas, puede utilizarse la polimerasa Taq con una temperatura de recocido de entre 45-65°C. Si las áreas de identidad son pequeñas, puede utilizarse la polimerasa Klenow con una temperatura de recocido de entre 20-30°C (Stemmer, Proc. Nati . Acad . Sci . USA (Procedimientos de la Academia Nacional de Ciencias EUA) (1994) , consul tar arriba) . La polimerasa puede agregarse a los fragmentos del ácido nucleico aleatorios antes del recocido, de manera simultánea con el recocido o después del recocido. El proceso de desnaturalización, renaturalización e incubación en presencia de la polimerasa de fragmentos superpuestos para generar una recolección de polinucleótidos que contienen diferentes permutaciones de fragmentos, algunas veces se refiere como la mezcla del ácido nucleico in vi tro . Este ciclo se repite un número deseado de veces. De preferencia, el ciclo se repite de 2 a 100 veces, y de manera más preferente, la secuencia se repite de 10 a 40 veces. Los ácidos nucleicos resultantes son una familia de polinucleótidos de doble estirpe que van desde aproximadamente 50 bp a aproximadamente 100 kb, de preferencia de 500 bp a 50 kb, tal como se muestra en la Figura 1, panel D. La población representa variantes de los substratos de inicio que muestran una identidad de secuencia sustancial con éstos, pero que también tienen diferencias en varias posiciones. La población tiene mucho más miembros que los substratos iniciales. La población de fragmentos resultantes de la mezcla se utiliza para transformar las células huésped, opcionalmente después de la clonación dentro de un vector. En una variación de la mezcla in vi tro, pueden generarse subsecuencias de los substratos de recombinación amplificando las frecuencias de longitud completa bajo condiciones que producen una fracción substancial, por lo general, por lo menos del 20 por ciento o más, de productos de amplificación extendida que no están completos. Los productos de amplificación, incluyendo los productos de amplificación extendida que no están completos se desnaturalizan y se someten a por lo menos un ciclo adicional de recocido y amplificación. Esta variación, en la cual por lo menos un ciclo del recocido y la amplificación ofrece una fracción substancial de productos extendidos de manera incompleta, se denomina "tartamudeo". En la ronda de amplificación subsecuente, los productos extendidos de manera incompleta son recocidos y cargan la extensión en diferentes especies templadas relacionadas con la secuencia.

En una variación posterior, se clava una mezcla de fragmentos con uno o más oligonucleótidos. Los oligonucleótidos pueden estar diseñados para incluir mutaciones precaracterizadas de una secuencia tipo silvestre, o sitios de variaciones naturales entre individuos o especies. Los oligonucleótidos también incluyen una secuencia suficiente u homología estructural que flanquea estas mutaciones o variaciones para permitir el recocido con los fragmentos tipo silvestre. Algunos oligonucleótidos pueden ser secuencias aleatorias. Las temperaturas de recocido pueden ajustarse dependiendo de la longitud de la homología. En una variación adicional, la recombinación ocurre en por lo menos un ciclo mediante un intercambio de templados, como por ejemplo cuando un fragmento del ADN derivado de un templado se carga en la posición homologa de un templado relacionado pero diferente. La conexión de templados puede ser inducida mediante la adición de recA, rad55, rad57 u otras polimerasas (por ejemplo, polimerasas virales, transcriptasa inversa) a la mezcla de amplificación. La conexión de templados también puede incrementarse aumentando la concentración del templado del ADN. En una variación adicional, puede llevarse a cabo por lo menos un ciclo de amplificación utilizando una recolección de fragmentos del ADN de estirpe única superpuestos de secuencia relacionada, y diferentes longitudes. Los fragmentos pueden prepararse utilizando un fago del ADN de estirpe única, como por ejemplo el M13. Cada fragmento puede hibridar y cargar la extensión de la cadena de polinucleótidos de un segundo fragmento proveniente de la recolección, formando de esta manera polinucleótidos recombinados de la secuencia. En una variación adicional, pueden generarse fragmentos del ADNss de longitud variable a partir de un cargador único mediante Vent u otra polimerasa del ADN en un primer templado del ADN. Los fragmentos del ADN de estirpe única se utilizan como cargadores para un segundo templado tipo Kunkel, formado por un ADNss circular que contiene uracilo. Esto da como resultado sustituciones múltiples del primer templado dentro del segundo. Consul tar Levichkin y colaboradores, Mol . Biology (Biología Molecular) 29, 572-577 (1995) . 2. Formatos Jn Vivo (a) Recombinación de Plasmidio-Plasmidio Los substratos iniciales para la recombinación son una recolección de polinucleótidos que incluyen formas variantes de un gen. Las formas variantes muestran por lo general una identidad de secuencia substancial entre sí, suficiente para permitir una recombinación homologa entre los substratos. La diversidad entre los polinucleótidos puede ser natural (por ejemplo, alélica o variantes de especies) , inducida (por ejemplo, PCR propenso a error) , o el resultado de una recombinación in vi tro . La diversidad también puede ser resultado de volver a sintetizar los genes que codifican proteínas naturales con un uso del codón alternativo y/o mixto. Debe existir por lo menos una diversidad suficiente entre los substratos para que la recombinación pueda generar más productos diversos que los que existen en los materiales de inicio. Deben existir por lo menos dos substratos que difieran en por lo menos dos posiciones. Sin embargo, se emplea por lo general una biblioteca de substratos de miembros de 103-108. El grado de diversidad depende de la longitud del substrato que se está recombinando y el grado del cambio funcional que debe desarrollarse. La diversidad entre 0.1-50% de las posiciones es típica. Los diversos substratos se incorporan en plasmidios. Los plasmidios por lo general son vectores de clonación estándares, por ejemplo, plasmidios de copias múltiples bacterianas. Sin embargo, en algunos métodos que se describirán posteriormente, los plasmidios incluyen funciones de movilización. Los substratos pueden incorporarse dentro de los mismos o diferentes plasmidios. Con recuencia, por lo menos dos tipos diferentes de plasmidios que poseen tipos diferentes de marcador de selecciónse utilizan para permitir la selección de células que contienen por lo menos dos tipos de vector. También, cuando se emplean diferentes tipos de plasmidio, los plasmidios diferentes pueden provenir de dos grupos distintos de incompatibilidad para permitir la coexistencia estable de dos plasmidios diferentes dentro de la célula. A pesar de esto, los plasmidios del mismo grupo de incompatibilidad pueden ser coexistiendo dentro de la misma célula durante un tiempo suficiente para permitir que se lleve a cabo la recombinación homologa. Los plasmidios que contienen diversos substratos se introducen inicialmente dentro de células procarióticas o eucarióticas mediante cualquier método de transfección (por ejemplo, transformación química, competencia natural, electroporación, transducción viral o biolística) . Con frecuencia, los plasmidios están presentes en o cerca de una concentración de saturación (con respecto a la capacidad de transfección máxima) para incrementar la probabilidad de que más de un plasmidio entre a la misma célula. Los plasmidios que contienen los diferentes substratos pueden transfectarse de manera simultánea o en rondas múltiples. Por ejemplo, en el último enfoque, las células pueden transfectarse con una primera alícuota de plasmidio, los transfectados pueden seleccionarse y propagarse, y después infectarse con una segunda alícuota del plasmidio. Después de haber introducido los plasmidios dentro de las células, ocurre una recombinación entre los substratos para generar genes reco binantes dentro de las células que contienen plasmidios diferentes y múltiples propagándose sencillamente en las células. Sin embargo, las células que reciben únicamente un plasmidio son incapaces de participar en la recombinación y la contribución potencial de los substratos en estos plasmidios para la devolución no se explota por completo (a pesar de que estos plasmidios pueden contribuir en cierto grado si se propagan en las células mutadoras o de otra forma acumulan mutaciones en el punto (es decir, mediante tratamiento de radiación ultravioleta) . El porcentaje de la evolución puede incrementarse permitiendo que todos los substratos participen en la recombinación. Esto puede lograrse sometiendo las células transfectadas a electroporación. Las condiciones para la electroporación son las mismas que las que se utilizan de manera convencional para introducir el ADN exógeno dentro de las células (por ejemplo, 1,000-2,500 voltios, 400 µF y un gap de 1-2 mM) . Bajo estas condiciones, los plasmidios se intercambian entre las células permitiendo que todos los substratos participen en la recombinación. Además, los productos de la recombinación pueden experimentar rondas adicionales de recombinación entre sí o con el substrato original . La velocidad de la evolución también puede ser incrementada por el uso de la tansferencia por conjugación. Los sistemas de transferencia por conjugación se conocen en varias bacterias (E. coli , P. aeruginosa, S . pneumoniae, y H. Influenzae) y también pueden utilizarse para transferir el ADN entre las bacterias y la levadura o entre las bacterias y las células de mamíferos. Para explotar la transferencia por conjugación, los substratos son clonados dentro de los plasmidios que poseen genes MOB, y también se suministran genes tra en cis o en trans a los genes MOB. El efecto de la transferencia por conjugación es muy similar a la electroporación, ya que permite que los plasmidios se mueven entre las células y permite que la recombinación entre cualquier substrato y los productos de de una recombinación previa se lleve a cabo sencillamente propagando el cultivo. Los detalles de cómo se explota la transferencia por conjugación en estos vectores se discuten con más detalle posteriormente. La velocidad de la evolución también puede incrementarse fusionando los protoplastos de las células para inducir el intercambio de plasmidios o cromosomas. La fusión puede inducirse mediante agentes químicos, como por ejemplo el PEG, o virus o proteínas virales, como por ejemplo la hemaglutinina del virus de influenza, HSV-l gB Y gD. La velocidad de la evolución puede también incrementarse mediante el uso de células huéspedes mutadoras (por ejemplo, Mut L, S, D, T, H y líneas celulares humanas de Ataxia talangiectasia) . De manera alternativa, los plasmidios pueden propagarse de manera conjunta para fomentar la recombinación y después aislarse, agruparse y reintroducirse en las células. La combinación de plasmidios es diferente en cada célula y la recombinación incrementa además la diversidad de la secuencia dentro de la población. Esto se lleva a cabo opcionalmente de manera recursiva hasta que se logra el nivel deseado de diversidad. La población se clasifica y se selecciona posteriormente, y este proceso se repite opcionalmente con cualquier célula/plas idio seleccionado. El tiempo durante el cual las células se propagan y se permite que ocurra la recombinación, por supuesto, varía con el tipo de célula, pero por lo general no es crítico, ya que incluso un pequeño grado de recombinación puede incrementar de manera substancial la diversidad en relación con los materiales de inicio. Las células que transportan plasmidios que contienen genes recombinados están sujetas a clasificación o selección para una función deseada. Por ejemplo, si el substrato que se está desarrollando contiene un gen resistente al medicamento, se selecciona para resistencia al medicamento. Las células que sobreviven a la clasificación o selección pueden someterse a una o más rondas de clasificación/selección seguidas por la recombinación, o pueden someterse directamente a una ronda adicional de recombinación . La siguiente ronda de recombinación puede lograrse mediante varios formatos diferentes, independientemente de la ronda previa. Por ejemplo, puede llevarse a cabo una ronda adicional de recombinación reanudando sencillamente la electroporación o la transferencia intracelular mediada por fl) conjugación de los plasmidios descrita anteriormente. De manera alternativa, un substrato o substratos frescos, el 5 mismo o diferente a los substratos previos, pueden transfectarse dentro de las células que sobreviven a la selección/clasificación. Opcionalmente, los nuevos substratos se incluyen en los vectores de plasmidios que portan un marcador selectivo diferente y/o de un grupo de incompatibilidad diferente a los plasmidios originales. Como una alternativa adicional, las células que sobreviven a la selección/clasificación pueden subdividirse en dos subpoblaciones, y el ADN del plasmidio de una subpoblación pueden transfectarse dentro del otro, donde los substratos de los plasmidios provenientes de las dos subpoblaciones experimentan una ronda adicional de recombinación. En cualesquiera de las últimas dos opciones, la velocidad de la evolución puede incrementarse empleando la extracción del ADN, electroporación, conjugación o células del mutador, tal como se describió anteriormente. En otra variación adicional, el ADN de las células que sobreviven a la clasificación/ selección puede extraerse y someterse a un mezclado del ADN in vi tro . Después de la segunda ronda de recombinación, se lleva a cabo una segunda ronda de clasificación/selección, de preferencia bajo condiciones de severidad creciente. Si se desea, peuden llevarse a cabo rondas posteriores de recombinación y selección/clasificación utilizando la misma estrategia que para la segunda ronda. Con rondas sucesivas de recombinación y selección/clasificación, los substratos recombinados sobrevivientes se desarrollan para la adquisición de un fenotipo deseado. Por lo general, en éste y otros métodos de recombinación recursiva, el producto final de la recombinación que ha adquirido el fenotipo deseado difiere de los substratos de inicio en 0.1%-25% de las posiciones y se ha desarrollado en un orden de porcentaje de la magnitud excedente (por ejemplo, por lo menos 10 veces, 100 veces, 1000 veces, o 10,000 veces) del porcentaje de mutación adquirida naturalmente de aproximadamente una mutación por 10"9 posiciones por generación ( consul tar Anderson & Hughes, Proc . Nati . Acad. Sci . USA (Procedimientos de la Academia Nacional de Ciencias EUA) 93, 906-907 (1996)). Al igual que con otras técnicas de la presente, los pasos de la recombinación pueden realizarse de manera recursiva para mejorar la diversidad antes de la clasificación. Además, el proceso completo puede llevarse a cabo de una manera recursiva para generar los organismos deseados, clones o ácidos nucleicos. 3. Recombinación de Virus-Plasmidio La estrategia utilizada para la recombinación de plasmidio-plasmidio también puede utilizarse para la recombinación de virus-plasmidio; por lo general, una recombinación de fago-plasmidio. Sin embargo, son adecuados algunos comentarios adicionales particulares para el uso de virus. Los substratos iniciales para la recombinación se clonan dentro de vectores tanto de plasmidio como virales. Por lo general, no es importante qué tipo de substrato se inserta dentro del vector viral y cuál dentro del plasmidio, a pesar de que por lo general el vector viral debe contener diferentes substratos del plasmidio. Al igual que se explicó antes, el plasmidio (y el virus) por lo general contiene un marcador selectivo. El plasmidio y los vectores virales pueden introducirse ambos dentro de las células mediante transfección tal como se describió antes. Sin embargo, un procedimiento más eficiente es transformar las células con el plasmidio, seleccionar los transformadores e infectar los transformadores con un virus. Debido a que la eficiencia de la inyección de varios virus se acerca al 100% de las células, la mayoría de las células transformadas e infectadas por esta ruta contienen tanto un plasmidio como un virus que portan diferentes substratos. La recombinación homologa ocurre entre el plasmidio y el virus generando tanto plasmidios recombinados como virus recombinados. Para algunos virus, como por ejemplo el fago filamentoso, en donde existe el ADN intracelular en la formas tanto de estirpe doble como de estirpe única, ambos pueden participar en la recombinación. Con la condición de que el virus no sea de un tipo que mate rápidamente las células, la recombinación puede aumentarse mediante el uso de electoporación o conjugación para transferir los plasmidios entre las células. La recombinación también puede ser aumentada para algunos tipos de virus permitiendo que el virus de la progenie de una célula reinfecte a otras células. Para algunos tipos de virus, las células infectadas con virus muestran resistencia a una superifección. Sin embargo, esta resistencia puede ser superada infectando a una alta multiplicidad y/o utilizando cepas mutantes del virus en donde se reduzca la resistencia a la superinfección. La infección recursiva y la transformación antes de la clasificación pueden llevarse a cabo para mejorar la diversidad. El resultado de infectar células que contengan plasmidios con un virus depende de la naturaleza del virus. Algunos virus, como el fago filamentoso, existe de manera estable con un plasmidio en la célula y también extruye al fago de la progenie de la célula. Otros virus, como por ejemplo el lambda que posee un genoma de cosmidio, existe de manera estable en plasmidios similares a la célula sin producir viriones de la progenie. Otros virus, como por ejemplo el fago T y el lambda lítico, experimentan una recombinación con el plasmidio pero finalmente matan la célula huésped y destruyen el ADN del plasmidio. Para los virus que infectan las células sin matar el huésped, las células que contienen plasmidios recombinantes y virus pueden clasificarse/seleccionarse utilizando el mismo enfoque que para la recombinación de plasmidio-plasmidio. Los virus de la progenie extruidos por las células que sobreviven a la selección/clasificación también pueden recolectarse y utilizarse como substratos en rondas subsecuentes de recombinación. Para los virus que matan sus células huésped, los genes recombinantes que resultan de la recombinación reciben únicamente en el virus de la progenie. Si el ensayo de clasificación o selectivo requiere la expresión de genes recombinantes en una célula, los genes recombinantes deben ser transferidos del virus de la progenie a otro vector, por ejemplo, un vector del plasmidio, y volver a transfectarse dentro de las células antes de llevar a cabo la selección/ clasificación. Para el fago filamentoso, los productos de la recombinación están presentes en ambas células que sobreviven a la recombinación y en el fago extruido de estas células. La fuente doble de productos recombinantes ofrece ciertas opciones adicionales en relación con la recombinación del plasmidio-plasmidio. Por ejemplo, el ADN puede aislarse de las partículas del fago para utilizarse en una ronda de recombinación in vi tro . De manera alternativa, el fago de la progenie puede utilizarse para transfectar o infectar células que sobreviven a una ronda previa de selección/clasificación, o las células frescas pueden transfectarse con substratos frescos para la recombinación. 4. Recombinación de Virus-Virus Los principios descritos para la recombinación de plasmidio-plasmidio y plasmidio-viral pueden aplicarse a la recombinación de virus-virus con unas cuantas modificaciones. Los substratos iniciales para la recombinación se clonan dentro de un vector viral. Por lo general, se utiliza el mismo vector para todos los substratos. De preferencia, el virus es tal que, naturalmente o como resultado de una mutación, no mata las células. Después de la inserción, algunos genomas virales pueden empacarse in vi tro . Los virus empacados se utilizan para infectar las células a una alta multiplicidad de tal forma que exista una alta probabilidad de que una célula reciba virus múltiples que transporten diferentes substratos. Después de la ronda inicial de infección, los pasos subsiguientes dependen de la naturaleza de la infección, tal como se explicó en la sección previa. Por ejemplo, si los virus poseen genomas fagomidios como por ejemplo cosmidios lambda o fagomidios M13, Fl ó Fd, los fagomidios se comportan como plasmidios dentro de la célula y experimentan la recombinación propagándose sencillamente en las células. La recombinación y la diversidad de la secuencia pueden mejorarse mediante la electroporación de las células. Después de la selección/clasificación, los cosmidios que contienen genes recombinantes pueden recuperarse de las células sobrevivientes (por ejemplo, mediante la inducción térmica de una célula huésped lisogénica eos") , pueden volver a empacarse in vi tro y utilizarse para infectar células frescas a una alta multiplicidad durante una ronda adicional de recombinación . Si los virus son un fago filamentoso, la recombinación del ADN en forma de duplicación ocurre propagando el cultivo de las células infectadas. La selección/clasificación identifica colonias de células que contienen vectores virales que poseen genes recombinantes con propiedades mejoradas, junto con el fago extruido de estas células. Las opciones siguientes son esencialmente las mismas que para una recombinación de plasmidio-viral. 5. Recombinación de Cromosoma-Plasmidio Este formato puede utilizarse para desarrollar los substratos tanto cromosómicos como transportados por plasmidios. El formato es particularmente útil en situaciones en las cuales varios genes cromosómicos contribuyen para un fentipo o no se conoce la ubicación exacta del gen cromosómico que se va a desarrollar. Los substratos inciales para la recombinación se clonan dentro de un vector de plasmidio. Si se conocen los genes cromosómicos que se van a desarrollar, los substratos constituyen una familia de secuencias que muestran un alto grado de identidad de la secuencia, pero cierta divergencia del gel cromosómico. Si no se han localizado los genes cromosómicos que se van a desarrollar, los substratos iniciales por lo general constituyen una biblioteca de segmentos del ADN de los cuales sólo un pequeño número muestran identidad de la secuencia con el gen o genes que se van a desarrollar. La divergencia entre un substrato transportado por un plasmidio y el gen cromosómico puede inducirse mediante mutagénesis u obteniendo los substratos transportados por plasmidios de una especie diferente a las de las células que portan el cromosoma. Los plasmidios que portan substratos para la recombinación son transfectados dentro de las células que poseen el gen cromosómico que se va a desarrollar. La evolución puede ocurrir sencillamente propagando el cultivo, y puede acelearse transfiriendo los plasmidios entre las células mediante conjugación, electroporación o fusión de protoplastos. La evolución puede acelerarse adicionalmente mediante el uso de células huéspedes mutadoras o sembrando un cultivo de células huéspedes no mutadoras que se desarrollan con células huéspedes mutadoras e induciendo la transferencia intercelular de plasmidios mediante electroporación, conjugación o fusión de protoplastos. De manera alternativa, puede utilizarse el aislamiento recursivo y la transformación. De preferencia, las células huéspedes mutadoras utilizadas para la siembra contienen un marcador de selección negativa para facilitar el aislamiento de un cultivo puro de las células no mutadoras que se están desarrollando. La selección/clasificación identifica las células que portan los cromosomas y/o los plasmidios que han evolucionado en búsqueda de la adquisición de una función deseada . Las rondas subsecuentes de recombinación y selección/ clasificación proceden de manera similar a las descritas para la recombinación de plasmidio-plasmidio. Por ejemplo, puede efctuarse una recombinación adicional propagando las células que sobreviven a la recombinación en combinación con la electroporación, transferencia por conjugación de plasmidios, o fusión de protoplastos. De manera alternativa, los plasmidios que portan substratos adicionales para la recombinación pueden introducirse dentro de las células sobrevivientes. De preferencia, estos plasmidios provienen de un grupo de incompatibilidad diferente y portan un marcador selectivo diferente que los plasmidios originales para permitir la selección de células que contienen por lo menos dos plasmidios diferentes. Como alternativa adicional, el plasmidio y/o el ADN cromosómico pueden aislase de una subpoblación de células sobrevivientes y transfectarse dentro de una segunda subpoblación. El ADN cromosómico puede clonarse dentro de un vector de plasmidio antes de la transfección. 6. Recombinación de Virus-Cromosoma Al igual que en los otros métodos descritos anteriormente, el virus es por lo general uno que no mata las células, y con frecuencia es un fago o fagomidio . El procedimiento es substancialmente el mismo que para la recombinación de plasmidio-cromosoma . Los substratos para la recombinación se clonan dentro del vector. Los vectores que incluyen los substratos pueden transfectarse posteriormente dentro de las células o empacarse in vi tro e introducirse dentro de las células mediante infección. Los genomas virales se recombinan con los cromosomas huéspedes propagando simplemente un cultivo. La evolución puede acelerarse permitiendo la transferencia intercelular de genomas virales mediante electroporación, o reinfección de células mediante viriones de la progenie. La selección/clasificación identifica las células que poseen cromosomas y/o genomas virales que se han desarrollado para la adquisición de una función deseada. Existen varias opciones para las rondas subsecuentes de recombinación. Por ejemplo, los genomas virales pueden transferirse entre las células que sobreviven a la selección/recombinación mediante aislamiento y transfección recursivas y electroporación. De manera alternativa, los virus extruidos de las células que sobreviven a la selección/clasificación pueden agruparse y utilizarse para superinfectar las células a una alta multiplicidad. Alternativamente, pueden introducirse substratos frescos para la recombinación dentro de las células, ya sea en el plasmidio o los vectores virales. CC. RECOMBINACIÓN DEL GENOMA ENTERO EN FORMA DE GRUPO La evolución asexual es un proceso lento e ineficiente. Las poblaciones se mueven como individuos mas que como grupos. Una población diversa se genera mediante mutagénesis de un solo padre, lo que da como resultado una distribución de individuos adecuados y no adecuados. En ausencia de un ciclo sexual, cada pieza de información genética para la población sobreviviente permanece en los mutantes individuales. La selección del más adecuado da como resultado la eliminación de varios individuos adecuados, junto con la información genéticamente útil que transportan. La evolución asexual lleva a cabo un evento genético a la vez, y por lo tanto está limitada por el valor intrínseco de un solo evento genético. La evolución sexual se mueve de manera más rápida y eficiente. El apareamiento dentro de una población consolida la información genética dentro de la población y da como resultado que la información útil se combine entre sí. La combinación de información genética útil da como resultado la progenie que es mucho más adecuada que sus padres. Por lo tanto, la evolución sexual se lleva a cabo de una manera mucho más rápida mediante eventos genéticos mútliples. Estas diferencias se ilustran posteriormente en la Figura 17. En contraste con la evolución sexual, el mezclado del ADN es la mutagénesis recursiva, la recombinación y la selección de secuencias del ADN ( consul tar también, la Figura 25) . La recombinación sexual en la naturaleza lleva a cabo la recombinación en pares y da como resultado una progenie que son híbridos genéticos de dos padres. En contraste, el mezclado del ADN in vi tro lleva a cabo una recombinación en forma de grupo, en donde la progenie son híbridos de varias moléculas parentales. Esto se debe a que el mezclado del ADN lleva a cabo varios eventos de recombinación en pares individuales con cada ciclo térmico. Después de varios ciclos, el resultado es una población reproducida de manera repetitiva, siendo la "progenie" el Fx (para X ciclos de reensamble) de las moléculas parentales originales. Esta progenie son descendientes potencialmente de muchos o todos los padres originales. La gráfica mostrada en la Figura 25 exhibe un esquema del número potencial de mutaciones que puede acumular un individuo mediante una recombinación secuencial, en pares y en grupos. La recombinación en grupos es una característica importante para el mezclado del ADN ya que ofrece un medio para generar una proporción mayor de las combinaciones posibles de mutaciones a partir de un experimento único de "reproducción" . De esta manera, el "potencial genético" de una población puede evaluarse fácilmente clasificando la progenie de un solo experimento de mezclado del ADN. Por ejemplo, si una población consta de 10 padres mutantes únicos, existen 210 = 1024 posibles combinaciones de estas mutaciones que varían de una progenie que posee 0-10 mutaciones. De estas 1024, sólo 56 serán el resultado de un solo cruzamiento en pares (Figura 14) (es decir, aquéllas que tienen 0, 1 y 2 mutaciones) . En la naturaleza, las combinaciones entre padres múltiples surgirán lugar a la larga después de varios apareamientos sexuales aleatorios, asumiendo que no se imparte una selección para eliminar ciertas mutaciones de la población. De esta manera, el sexo lleva a cabo la consolidación y muestreo de todas las combinaciones mutantes útiles posibles dentro de una población. Para los propósitos de la evolución dirigida, es conveniente tener el mayor número de combinaciones de mutantes dentro de una clasificación o selección, de tal forma que se identifique a la mejor progenie (es decir, de acuerdo con los criterios de selección utilizados en la clasificación de selección) en el menor tiempo posible. Un reto para el mezclado de genoma entero y in vivo es establecer métodos para llevar a cabo una recombinación en grupos o eventos de recombinación en pares repetitivos múltiples. Encruzamientos con un solo cruzamiento en pares sencillo por ciclo antes de la clasificación, la capacidad para clasificar el "potencial genético" de la población de inicio está limitada. Por esta razón, la velocidad de la evolución celular mediada por mezclado del genoma entero y in vivo se facilitaría llevando a cabo una recombinación en forma de grupos. A continuación se describen dos estrategias para la recombinación en grupos (fusión de protoplastos y transducción) . 1. Fusión de Protoplastos: El mezclado de genoma entero (WGS) mediado por fusión de protoplastos (explicada arriba) es un formato que puede tener un efecto directo en la recombinación en grupos. El mezclado del gen entero es la recombinación recursiva de los genomas enteros, en forma de una o más moléculas del ácido nucleico (fragmentos, cromosomas, episomas, etc.), de una población de organismos, que da como resultado la producción de nuevos organismos que han distribuido información genética a partir de por lo menos dos de la población inicial de organismos. El proceso de la fusión de protoplastos se ilustra posteriormente en la Figura 26. La progenie resultante de la fusión de protoplastos de padres múltiples ha sido observada (Hopwood Se Wright, 1978), sin embargo, esta progenie es rara (10"-10~6) . La baja frecuencia se atribuye a la distribución de fusionadores que se derivan de dos, tres, cuatro padres y la probabilidad de los eventos de recombinación múltiples (6 cruzamientos para una cruza de cuatro padres) que tendrían que ocurrir para que surgiera una progenie de padres múltiples. Por lo tanto, es útil para enriquecer la progenie de padres múltiples. Esto puede lograrse, por ejemplo, mediante una fusión repetitiva o el enriquecimiento para multiplicar protoplastos fusionados. El proceso de la fusión en grupos y la recombinación se ilustra posteriormente en la Figura 27. 2. Fusión Repetitiva Los protoplastos de células padres identificadas se preparan, se fusionan y se regeneran. Posteriormente, los protoplastos de la progenie regenerada, sin clasificación o enriquecimiento, se forman, fusionan y regeneran. Esto puede llevarse a cabo para dos, tres o más ciclos antes de la clasificación para incrementar la representación de la progenie de padres múltiples. El número de mutaciones posibles/progenie se duplica para cada ciclo. Por ejemplo, si un cruzamiento produce una progenie de manera predominante con 0, 1 y 2 mutaciones, una reproducción de esta población en sí producirá una progenie con 0, 1, 2, 3 y 4 mutaciones (Figura 15), el tercer cruzamiento hasta ocho, etc. La representación de la progenie de padres múltiples a partir de estos cruzamientos subsecuentes no será tan alta como la progenie de padres únicos y dobles, pero será detectable y mucho mayor que la de un cruzamiento sencillo. La fusión repetitiva antes de la clasificación es análoga a varios cruzamientos sexuales dentro de una población, y los ciclos térmicos individuales de la mezcla del ADN in vi tro descrita arriba . Un factor que tiene efecto en el valor de este enfoque es el tamaño inicial de la población parental . A medida que la población crece, es más probable que surja una fusión de padres múltiples a partir de fusiones repetitivas. Por ejemplo, si 4 padres se fusionan dos veces, la progenie de 4 padres constituirá aproximadamente el 0.2% de la progenie total . Esto es suficiente para encontrar en una población de 3000 (95% de confianza) , pero es preferible una mejor representación. Si diez padres se fusionan dos veces >20% de la progenie será la descendencia de cuatro padres. 3. Enriquecimiento para protoplastos fusionados múltiples : Después de la fusión de una población de protoplastos, los fusionadores se diluyen por lo general dentro de un medio hipotónico, para diluir el agente de fusión (por ejemplo, 50% PEG) . Las células fusionadas pueden desarrollarse durante un período prevé para regenerar las paredes celulares o pueden separarse directamente, y posteriormente se separan en base al tamaño. Esto se lleva a cabo, por ejemplo, mediante la clasificación de células, utilizando la dispersión de la luz como un cálculo del tamaño para aislar los fusionadores más grandes. De manera alternativa, los fusionadores pueden clasificarse mediante FACS en base al contenido de ADN. Los fusionadores grandes o aquellos que contengan más ADN resultan de la fusión de padres múltiples y es más probable que se segreguen en la progenie de padres múltiples. Los fusionadores enriquecidos son regenerados y clasificados directamente o la progenie sea fusionada de manera recursiva como se indicó antes para enriquecer adicionalmente la población para diversas combinaciones de mutantes. 4. Transducción: La transducción teóricamente puede tener efecto en la recombinación en forma de grupos, si las partículas del fago de transducción contienen de manera predominante un ADN genómico huésped en lugar de un ADN del fago. Si el ADN del fago está representado en exceso, enconces la mayoría de las células recibirán por lo menos un genoma del fago no deseado. Las partículas del fago generadas a partir del profago bloqueado ( consul tar arriba) son útiles para este propósito. Una población de células es infectada con un fago de transducción apropiado, y el lisado se recolecta y se utiliza para infectar la misma población de inicio. Se emplea una alta multiplicidad de la infección para entregar fragmentos genómicos múltiples a cada célula infectada, incrementando de esta manera la probabilidad de producir recombinantes que contenen mutaciones de más de dos genomas padres. Los transductores resultantes se recuperan bajo condiciones en las que el fago no pueda propagarse por ejemplo, en la presencia del citrato. Esta población se clasifica posteriormente de manera directa o se infecta otra vez con el fago, utilizando las partículas de la transducción resultantes para transducir la primera progenie. Esto simularía la fusión de protoplastos recursiva, la recombinación sexual múltiple y el mezclado del ADN in vi tro . DD. MÉTODOS PARA EL MEZCLADO DEL GENOMA ENTERO MEDIANTE MEZCLADO DE FAMILIAS CIEGO DE GENOMAS ANALIZADOS Y CICLOS RECURSIVOS DE INTEGRACIÓN FORZADA Y EXCISIÓN MEDIANTE RECOMBINACIÓN HOMOLOGA, Y CLASIFICACIÓN PARA FENOTIPOS MEJORADOS Se han desarrollado métodos in vitro para mezclar genes sencillos y operones, tal como se estipula, por ejemplo, en la presente. El mezclado de "familia" de genes homólogos dentro de especies y a partir de diferentes especies también es un método efectivo para acelerar la evolución molecular. Esta sección describe métodos adicionales para extender estos métodos de tal forma que puedan aplicarse a genomas enteros. fl) En algunos casos, los genes que codifican los pasos limitantes de la velocidad en un proceso bioquímico, o que 5 contribuyen a un genotipo de interés, ya se conocen. Este método puede utilizarse para enfocar bibliotecas mezcladas de familias para estos lugares, generando bibliotecas de organismos con bibliotecas mezcladas de familias de alta calidad de alelos en el sitio de interés. Un ejemplo de este gen sería la evolución de una chaperonina huésped para chaperonar de manera más eficiente el doblamiento de una proteína expresada excesivamente en E. coli. Los objetivos de este proceso son mezclar genes homólogos de dos o más especies y después integrar los genes mezclados dentro del cromosoma de un organismo meta. La integración de genes mezclados múltiples en sitios múltiples puede lograrse utilizando ciclos recursivos de integración (generando duplicaciones), excisión (dejando el alelo mejorado en el cromosoma) y la transferencia de genes desarrollados adicionales aplicando en serie el mismo procedimiento . En el primer paso, los genes que deben mezclarse dentro de los vectores bacterianos adecuados se subclonan. Estos vectores pueden ser plasmidios, cosmidios, BACS o similares. De esta manera, pueden manejarse fragmentos desde 100 bp hasta 100 kb. Los fragmentos homólogos se "mezclan en familia" entre sí posteriormente (es decir, los fragmentos homólogos de diferentes especies o sitios cromosómicos se recombinan de manera homologa) . Como caso sencillo, los homólogos de dos especies (digamos, E. coli y Salmonella) se clonan, se mezclan en familia in vitro y se clonan dentro de un vector de reemplazo de alelo (por ejemplo, un vector con un marcador seleccionable positivamente, un marcador seleccionable negativamente y un origen de duplicación condicionalmente activo) . La estrategia básica para el mezclado de la familia del genoma entero de genomas analizados (subclonados) se estipula adicionalmente en la Figura 22. Los vectores se transfectan dentro de E. coli y se seleccionan, por ejemplo, para la resistencia al medicamento. La mayoría de las células resistentes al medicamento deben surgir mediante recombinación homologa entre un inserto mezclado en familia y una copia cromosómica del inserto clonado. Las colonias con un fenotipo mejorado se clasifican (por ejemplo, mediante espectroscopia de masa para la actividad de la enzima o la producción de moléculas pequeñas, o una clasificación cromogénica, o algo similar, dependiendo del fenotipo que se debe someter a ensayo) . La selección negativa (es decir, selección suc) se impone para forzar la excisión de la duplicación en tándem. Aproximadamente, la mitad de las colonias deben retener el fenotipo mejorado. De manera importante, este proceso regenera un cromosoma 'limpio' en donde se reemplaza el sitio tipo silvestre con un fragmento mezclado de la familia que codifica un alelo benéfico. Como el cromosoma está "limpio" (es decir, no posee secuencias del vector) , también pueden moverse otros alelos mejorados dentro de este punto en el cromosoma mediante una recombinación homologa. La selección o clasificación del fenotipo mejorado puede ocurrir ya sea después del paso 3 o el paso 4 en la Figura 22. Si la selección o la clasificación se lleva a cabo después del paso 3, entonces el alelo mejorado puede moverse de manera conveniente a otras cepas mediante, por ejemplo, la transducción de Pl . Entonces, se puede regenerar una cepa que contenga el alelo mejorado pero que carezca de secuencias en el vector mediante una "selección negativa" contra el marcador suc. En rondas subsecuentes, las variantes mejoradas identificadas de manera independiente del gen pueden moverse secuencialmente dentro de la cepa mejorada (por ejemplo, mediante la transducción de Pl de la duplicación en tándem marcada por el medicamento antes mencionado) . Los transductores se clasifican con respecto a un mejoramiento adicional en el fenotipo por virtud de recibir la duplicación en tándem de la transducción, que en sí contiene el material genético mezclado de la familia. Una vez más, se impone la selección negativa y el proceso del mezclado de la cepa mejorada se repite de manera recursiva según se desee. A pesar de que' este proceso fue descrito con referencia a enfocar un gen o genes de interés puede ser utilizado "ciegamente", sin realizar suposiciones en cuanto a qué sitio debe enfocarse. Este procedimiento se estipula en la Figura 23. Por ejemplo, el genoma entero de un organismo de interés se clona dentro de fragmentos manejables (por ejemplo, 10 kb para métodos en basados en el plasmidio); posteriormente, los fragmentos homólogos se aislan a partir de especies relacionadas a través del método mostrado en la Figura 23. La recombinación forzada con homólogos cromosómicos crea quimeras (Figura 22) . EE. MÉTODOS PARA EL MEZCLADO DE FAMILIA DE ALTO RENDIMIENTO DE LOS GENES Para E. coli . , la clonación del genoma en fragmentos de 10 kb requiere aproximadamente 300 clones. Los fragmentos homólogos se aislan, por ejemplo, de la Salmonella . Esto proporciona aproximadamente 300 pares de fragmentos homólogos. Cada par se mezcla en familia y los fragmentos mezclados se clonan dentro de un vector de reemplazo del alelo. Los insertos se integran dentro del genoma de E. coli . como se describió anteriormente. Se lleva a cabo una clasificación global para identificar los variantes con un fenotipo mejorado. Esto sirve como una recolección base de los mejoramientos que deben ser mezclados para producir la cepa deseada. La mezcla de estos variantes identificados independientemente dentro de una súpercepa se realiza tal como se describió antes . Se ha demostrado que la mezcla de familias es un método eficiente para crear bibliotecas de alta calidad de variantes genéticos. Dado un gen clonado de una especie, es interesante aislar de manera rápida y fácil homólogos aislados de otras especies, y este proceso puede ser limitante de la velocidad. Por ejemplo, si se desea llevar a cabo la mezcla de familias en un genoma entero, podríamos necesitar construir de cientos a miles de bibliotecas mezcladas de familias individuales. En esta forma de realización, se clona opcionalmente un gen de interés dentro de un vector en donde puede elaborarse un ADNss. Un ejemplo de este vector es un vector de fagomidio con un origen de duplicación M13. El ADN genómico o ADNc de una especie de interés se aisla, desnaturaliza, recoce para el fagemidio, y después se manipula de manera enzimática para clonarlo. El ADN clonado se utiliza posteriormente para la mezcla de familia con el gen original de interés. Los formatos basados en PCR también están disponibles tal como se estipula en la Figura 24. Estos formatos no requieren pasos de clonación intermedios, y por lo tanto, son de interés particular para aplicaciones de alto rendimiento. De manera alternativa, el gen de interés puede obtenerse utilizando la proteína RecA purificada. El gen de interés se amplifica mediante PCR utilizando cargadores que están etiquetados con una etiqueta de afinidad como por ejemplo la biotina, se desnaturaliza, y después se recubre con proteína RecA (o una variante mejorada de la misma) . El ADNss recubierto se mezcla después con una biblioteca del plasmidio ADNg. Bajo las condiciones apropiadas, como por ejemplo en la presencia de análogos rATP no hidrolizables, RecA catalizará la hibridación del gen recubierto con RecA (ADNss) de la biblioteca del plasmidio. El heteroduplexo se purifica por afinidad posteriormente a partir de los plasmidios no hibridados de la biblioteca del gen mediante la adsorción de los productos de PCR etiquetados y su ADN homólogo asociado para una matriz de afinidad apropiada. El ADN homólogo se utiliza en la reacción de mezcla de familias para el mejoramiento de la función deseada. La mezcla del gen DnaJ de chaperonina de E. coli. con otros homólogos se describe abajo como ejemplo. El ejemplo puede generalizarse para cualquier otro gen, incluyendo genes eucarióticos como por ejemplo genes vegetales o animales (incluyendo genes de mamíferos) , siguiendo el formato descrito. La Figura 24 ofrece un lineamiento esquemático de los pasos para el mezclado de familia de alto rendimiento. Como primer paso, el gen DnaJ de E. coli. se clona dentro de un vector de fagomidio M13. Posteriormente, se produce ADNss, de preferencia en una cepa dut(-) ung(-) de tal forma que puedan aplicarse los protocolos de mutagénesis dirigidos en el sitio Kunkel. Después el ADN genómico se aisla de una fuente que no sea de E. coli . , como por ejemplo la Salmonella y Yersinia Pestis . . Los ADNs genómicos bacterianos se desnaturalizan y se recocen para el ADNss del fagomidio (por ejemplo, aproximadamente 1 microgramo de ADNss) . El producto recocido se trata con una enzima como por ejemplo la nucleasa Mung Bean que degrada el ADNss como una exonucleasa pero no como una endonucleasa (la nucleasa no degrada el ADN desemparejado que está incorporado en un fragmento recocido más grande) . El protocolo de mutagénesis dirigida en el sitio de Kunkel estándar se utiliza para extender el fragmento y las células meta se transforman con el ADN mutagenizado resultante. En una primera variación en lo anterior, el procedimiento se adapta a la situación cuando el gen o genes meta de interés son desconocidos. En esta variación, el genoma entero del organismo de interés se clona en fragmentos (por ejemplo, de aproximadamente 10 kb cada uno) dentro de un fagomidio. Posteriormente, se produce el ADN del fagomidio de una sola estirpe. El ADN genómico de las especies relacionadas se desnaturaliza y se recoce para los fagomidios. La nucleasa de la semilla Mung se utiliza para recortar los extremos del ADN no hibridados. La polimerasa más ligasa se utiliza para llenar los círculos intermedios resultantes. Estos clones se transforman en una cepa deficiente de reparación de desemparejamientos. Cuando las moléculas desemparejadas se duplican en la bacteria, la mayoría de las colonias contienen tanto el fragmento del E. coli. como el fragmento homólogo. Los dos genes homólogos se aislan posteriormente de las colonias (por ejemplo, ya sea mediante una purificación del plasmidio estándar o el PCR de la colonia) y se mezclan. Otro enfoque para la generación de quimeras que no requiere un mezclado in vitro es sencillamente clonar el genoma de Salmonella dentro de un vector de reemplazo del alelo, transformar el E. coli . y seleccionar los integrantes cromosómicos. La recombinación homologa entre los genes de Salmonella y los homólogos de E. coli. genera quimeras mezcladas. Se realiza una clasificación global para clasificar los fenotipos mejorados. De manera alternativa, se lleva a cabo una transformación recursiva y una recombinación para incrementar la diversidad antes de la clasificación. Si se obtienen colonias con fenotipos mejorados, se verifica que el mejoramiento se deba al reemplazo del alelo mediante la transducción de Pl dentro de una cepa fresca y se contraclasifica para un fenotipo mejorado. Posteriormente, puede combinarse una recolección de estos alelos mejorados dentro de una cepa utilizando los métodos para el mezclado de genoma entero mediante mezclado de familia ciego de genomas analizados tal como se estipula en la presente. Además, una vez que se identifican estos lugares, es probable que las rondas adicionales de mezclado y clasificación produzcan nuevas mejoras. Esto podría realizarse mediante la clonación del gen quimérico y después utilizando los métodos descritos en esta presentación para reproduir el gen con homólogos de varias cepas diferentes de bacterias. En general, los transformadores contienen clones del homólogo del gen meta (por ejemplo, DnaJ de E. coli. en el ejemplo anterior) . La reparación del desemparejamiento in vivo da como resultado una disminución en la diversidad del gen. Existen por lo menos dos soluciones para éste. Primero, la transducción puede llevarse a cabo dentro de una cepa deficiente de reparación del desemparejamiento. De manera alternativa o por añadidura, el ADN templado M13 puede degradarse de manera selectiva, dejando el homólogo clonado. Esto puede realizarse utilizando métodos similares a la técnica de mutagénesis dirigida en el sitio Eckstein estándar (los textos generales que describen las técnicas biológicas moleculares generales que son útiles en la presente, incluyendo la mutagénesis, incluyen Sambrook y colaboradores, Molecular Cloning - A Laboratory Manual (Clonación Molecular Un Manual de Laboratorio) (2a Edición), Volumen 1-3, Laboratorio de Cold Spring Harbor, Cold Spring Harbor, Nueva York 1989 ("Sambrook") y Current Protocols in Molecular Biology (Protocolos Actuales en la Biología Molecular) , F.M. Ausubel y colaboradores, eds., Current Protocols (Protocolos Actuales) , una empresa de coinversión entre Greene Publishing Associates, Inc., y John Wiley Sc Sons, Inc., (complementado a durante 1998) ("Ausubel")). Este método se basa en la incorporación de los dNTPs modificados de alfa tilo durante la síntesis de la nueva estirpe seguida por la degradación selectiva del templado y la nueva síntesis de la estirpe del templado. En una forma de realización, la estirpe del templado se desarrolla en una cepa dut(-) ung(-) de tal forma que el uracilo se incorpora dentro del ADN del fagomidio. Después de la extensión, tal como se indicó anteriormente (y antes de la transformación) el ADN se trata con glicosilato de uracilo y una endonucleasa del sitio apurínico como por ejemplo Endo III ó Endo IV. El ADN tratado se trata posteriormente con una exonucleasa del proceso que se reseca de las aberturas resultantes dejando la otra estirpe intacta (como en la mutagénesis Eckstein) . El ADN se polimeriza y se liga. Posteriormente, las células meta se transforman. Este proceso enriquece los clones que codifican el homólogo que no se deriva de la meta (es decir, en el ejemplo anterior, el homólogo que no es de E. coli . ) . Un procedimiento análogo se lleva a cabo opcionalmente en un formato PCR. Tal como se aplicó a la ilustración de DnaJ anterior, el ADN de DnaJ se amplifica mediante PCR con cargadores que construyen 30 sitios de carga mer en cada extremo. El PCR se desnaturaliza y se recoce con un excedente del ADN genómico de Salmonella . El gen DnaJ de Salmonella se híbrida con el homólogo de E. coli . Después del tratamiento con la nucleasa de la Semilla Mung, el híbrido desemparejado resultante se amplifica mediante PCR con los 30 cargadores mer flanqueados. Este producto de PCR puede utilizarse directamente para el mezclado de familias. Consultar, por ejemplo, Figura 24. Como los estudios genómicos ofrecen una cantidad creciente de información sobre secuencias, es posible gradualmente amplificar mediante PCR directamente los homólogos con los cargadores designados. Por ejemplo, dada la secuencia del genoma de E. coli . y de un genoma relacionado (es decir, Salmonella) , cada genoma puede amplificarse mediante PCR con cargadores designados en, por ejemplo, fragmentos de 5 kb. Los fragmentos homólogos pueden colocarse juntos en forma de pares para el mezclado. Para la mecía del genoma, los productos mezclados se clonan dentro del vector de reemplazo del alelo y se reproducen dentro del genoma como se describe arriba . FF. CLONES RECA HIPERRICQMBINOGÉNICOS La invención ofrece además proteínas RecA hiperrecombinogénicas ( consul tar, los ejemplos posteriores) . Los ejemplos de estas proteínas provienen de los clones 2, 4, 5, 6 y 13 mostrados en la Figura 13. Se espera totalmente que una persona capacitada pueda elaborar una variedad de proteínas recombinogénicas relacionadas dadas las secuencias presentadas . Los clones que incluyen las secuencias en las Figuras 12 y 13 se utilizan opcionalmente como el punto de inicio para cualesquiera de los métodos de mezclado de la presente, estipulando un punto de inicio para la mutación y la recombinación con el fin de mejorar los clones que se muestran. Pueden utilizarse técnicas biológicas moleculares estándares para elaborar ácidos nucleicos que incluyen los ácidos nucleicos dados, por ejemplo, mediante la clonación de los ácidos nucleicos dentro de cualquier vector conocido. Los ejemplos de técnicas de clonación y secuenciación adecuadas, y las instrucciones suficientes para dirigir personas capacitadas a través de varios ejercicios de clonación se encuentran en Berger y Kimmel, Guide to Molecular Cloning Techniques, Methods in Enzymology (Guía para las Técnicas de Clonación Molecular, Métodos de Enzimología) Volumen 152, Academic Press, Inc., San Diego, CA (Berger); Sambrook y colaboradores (1989) Molecular Cloning - A Laboratory Manual (Clonación Molecular - Un Manual de Laboratorio) (2a. Edición) , Volumen 1-3, Laboratorio de Cold Spring Harbor, Cold Spring Harbor Press, NY, (Sambrook) ; y Current Protocols in Molecular Biology. (Protocolos Actuales de Biología Molecular) , F.M. Ausubel y colaboradores, eds., Current Protocols (Protocolos Actuales) , una empresa de coinversión entre Green Publishing Associates, Inc., y John Wiley & Sons, Inc., (Suplemento de 1994) (Ausubel). La información del producto de los fabricantes de reactivos biológicos y equipo experimental también ofrece información útil sobre métodos biológicos conocidos. Estos fabricantes incluyen la compañía química SIGMA (Saint Louis, MO) , sistemas R&D (Minneapolis, MN) , Pharmacia LKB Biotechnology (Piscataway, NJ) , CLONTECH Laboratories, Inc. (Palo Alto, CA) , Chem Genes Corp., Aldrich Chemical Company (Milwaukee, Wl) , Glen Research, Inc., GIBCO BRL Life Technologies, Inc. (Gaithersberg, MD) , Fluka Chemica-Biochemika Analítica (Fluka Chemie AG, Busch, Suiza) , Invitrogen, San Diego, CA, y Applied Biosystems (Biosistemas Aplicados) (Foster City, CA) , así como muchas otras fuentes comerciales conocidas para las personas capacitadas. Podrá apreciarse que las substituciones conservadoras de las secuencias dadas pueden utilizarse para producir ácidos nucleicos que codifican clones hiperrecombinogénicos . Las "variaciones modificadas de manera conservadora" de una secuencia de un ácido nucleico particular se refieren a aquellos ácidos nucleicos que codifican secuencias de aminoácidos idénticas o esencialmente idénticas, o cuando el ácido nucleico no codifica una secuencia del aminoácido, en secuencias esencialmente idénticas. Debido a la degeneración del código genético, un gran número de ácidos nucleicos funcionalmente idénticos codifican cualquier polipéptido dado. Por ejemplo, los codones CGU, CGC, CGA, CGG, AGA, y AGG codifican todos la arginina del aminoácido. De esta manera, en cualquier posición en que se especifique una arginina por un codón, el codón puede alterarse para cualesquiera de los codones correspondientes descritos sin alterar el polipéptido codificado. Estas variaciones del ácido nucleico son "variaciones silenciosas" que son una especie de "variaciones conservadoramente modificadas" . Cada secuencia del ácido nucleico en la presente que codifica un polipéptido también describe cualquier variación silenciosa posible. Una persona capacitada reconocerá que cada codón en un ácido nucleico (con excepció de AUG, que por lo general es el único codón , para la metionina) puede ser modificado para producir una molécula funcionalmente idéntica mediante técnicas estándares. De acuerdo con esto, cada "variación silenciosa" de un ácido nucleico que codifica un polipéptido es implícita en cualquier secuencia descrita. Además, una persona capacitada reconocerá que las sustituciones, eliminaciones o adiciones individuales que alteran, agregan o borran un aminoácido sencillo o un pequeño porcentaje de aminoácidos (por lo general menos del 5%, de manera más general menos del 1%) en una secuencia codificada son "variaciones conservadoramente modificadas" donde las alteraciones dan como resultado la sustitución de un aminoácido por un aminoácido químicamente similar. Las tablas de sustitución conservadora que proporcionan aminoácidos funcionalmente similares son bastante conocidas en la técnica. Los siguientes seis grupos contienen cada uno aminoácidos que son sustituciones conservadoras de otros: 1) Alanina (A), Serina (S) , Treonina (T) ; 2) Ácido aspártico (D) , Ácido glutámico (E) ; 3) Asparagina (M) , Glutamina (Q) ; 4) Arginina (R) , Lisina (K) ; 5) Isoleucina (I) , Leucina (L) , Metionina (M) , Valina (V) ; y 6) Fenilanalina (F) , Tirosina (Y) , Triptófano (W) . Consul tar también, Creighton (1984) Proteins (Proteínas) W.H. Freeman and Company. Finalmente, la añadidura de secuencias que no alteran la actividad codificada de una molécula del ácido nucleico, como por ejemplo una secuencia no funcional es una modificación conservadora del ácido nucleico básico. Una persona capacitada se dará cuenta que muchas variaciones conservadoras de las construcciones del ácido nucleico presentadas producen una construcción funcionalmente idéntica. Por ejemplo, debido a la degeneración del código genético, las "sustituciones silenciosas" (es decir, sustituciones de una secuencia del ácido nucleico que no dan como resultado una alteración en un polipéptido codificado) son una característica implícita de cada secuencia del ácido nucleico que codifica un aminoácido. De manera similar, las "sustituciones del aminoácido conservador" en uno o algunos aminoácidos en una secuencia de aminoácidos de una construcción empacada o empaquetable son sustituidos por diferentes aminoácidos con propiedades altamente similares, y también pueden identificarse fácilmente como altamente similares para una construcción presentada. Estas variaciones sustituidas de manera conservadora de cada secuencia presentada explícitamente son una característica de la presente invención. Los ácidos nucleicos que se hibridan bajo condiciones severas en los ácidos nucleicos en las figuras son una característica de la invención. Las "condiciones de lavado de hibridación severas" en el contexto de los experimento de hibridación del ácido nucleico como las hibridaciones del sur y del norte dependen de la secuencia, y son diferentes bajo diferentes parámetros ambientales. Una guía extensa para la hibridación de los ácidos nucleicos se encuentra en Tijssen (1993) Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology - Hybridization wi th Nucleic Acid Probes (Técnicas de Laboratorio en Bioquímica y Biología Molecular) - Hibridación con Sondas de Ácidos Nucleicos) , Parte I, Capítulo 2 "overview of principies of hybridization and the strategy of nucleic acid probé assays" ("panorama de principios de hibridación y la estrategia de los ensayos de sondeo del ácido nucleico"), Elsevier, Nueva York. Por lo general, las condiciones del lavado y la hibridación altamente severas se seleccionan como aproximadamente 5°C menos que el punto de fusión térmica (Tm) para la secuencia específica en una resistencia iónica y pH definidos. El Tm es la temperatura (bajo una resistencia iónica y pH definidos) en la cual el 50% de la secuencia meta se hibrida para un sondeo perfectamente emparejado. Las condiciones muy severas se seleccionan como equivalentes al Tm para un sondeo particular. En general, una relación de señal a ruido de 2x (o mayor) que la observada para un sondeo no relacionado en el ensayo de hibridación particular indica la detección de una hibridación específica. Los ácidos nucleicos que no se hibridan entre sí bajo condiciones severas siguen siendo substancialmente idénticos si los polipéptidos que codifican son substancialmente idénticos. Esto ocurre, por ejemplo, cuando se crea una copia de un ácido nucleico utilizando la degeneración del codón máximo permitida por el código genético.

Por último, los ácidos nucleicos preferidos codifican proteínas RecA hiperrecombinogénicas que son por lo menos un orden de magnitud (10 veces) igual de activas que las proteína ReaA tipo silvestre en un ensayo estándar para la actividad de Rec A. GG. MEZCLA MEDIADA POR recE / recT JN VIVO Al igual que recA, recE y recT (o sus homólogos, por ejemplo, las proteínas de recombinación lambda reda y redß) pueden estimular la recombinación homologa in vivo . Consul tar, Muyrers y colaboradores (1999) Nucleic Acids Res (Investigación de Ácidos Nucleicos) 27(6): 1555-7 y Zhang y colaboradores (1998) Nat Genet (Genética Natural) 20(2) :123-8. La recE y recT hiperrecombinogénicas se desarrollan mediante el mismo método que se describió para recA. De manera alternativa, se seleccionan variantes con recombinogenicidad creciente por su habilidad para provocar la recombinación entre un vector suicida (carente de un origen de duplicación) que transporta un marcador seleccionable, y una región homologa en el cromosoma o en un episoma mantenido en forma estable. Se mezcla un plasmidio que contiene los genes de recA y recE (ya sea utilizando estos genes como puntos de inicio únicos, o mediante la mezcla de familias (con, por ejemplo, reda y redß, u otros genes homólogos identificados a partir de bases de datos de secuencias disponibles) . Esta biblioteca mezclada se clona posteriormente dentro de un vector con un marcador seleccionable y se transforma en una cepa deficiente de recombinación apropiada. La biblioteca de células se transformaría posteriormente con un segundo marcador seleccionado, ya sea transportado en un vector suicida o como un fragmento del ADN lineal con regiones en sus extremos que son homologas a una secuencia meta (ya sea en el plasmidio o en el cromosoma huésped) . La integración de este marcador mediante recombinación homologa es un evento seleccionable, dependiente de la actividad de los productos de los genes recE y recT. Los genes recE/recT se aislan de las células en donde ha ocurrido la recombinación homologa. El proceso se repite varias veces para enriquecer las variantes más eficientes antes de llevar a cabo la siguiente ronda del mezclado. Además, pueden llevarse a cabo ciclos de recombinación sin selección para incrementar la diversidad de una población celular antes de la selección. Una vez que se aislan los genes recE/recT hiperricombinogénicos, se utilizan tal como se describió para la recA hiperricombinogénica. Por ejemplo, se expresan (constitutiva o condicionalmente) en una célula huésped para facilitar la recombinación homologa entre los fragmentos del gen variante y los homólogos dentro de la célula huésped. De manera alternativa, se introducen mediante microinyección. biolística, lipofección u otros medios dentro de una célula huésped al mismo tiempo que los genes variantes. Los recE/recT hiperricombinogénicos (ya sea de origen bacterial/fago, o de homólogos vegetales) son útiles para facilitar la recombinación homologa en las plantas. Por ejemplo, se clonan dentro del vector de clonación de agrobacterias, donde se expresan después de la entrada en la planta, estimulando de esta manera la recombinación homologa en la célula receptora. En una forma de realización preferida, los recE/recT se utilizan y/o se generan en cepas mutS. HH. RECOMBINACIÓN MULTICÍCLICA Tal como se indicó, la fusión de protoplastos es un medio eficiente para recombinar dos genomas microbianos. El proceso da como resultado de manera reproducible aproximadamente el 10% de una población no seleccionada que son organismos quiméricos recombinantes. Los protoplastos son células que han sido desprendidas de sus paredes celulares mediante el tratamiento en un medio hipotónico con enzimas de degradación de la pared celular. La fusión de protoplastos es la fusión inducida de las membranas de dos o más de estos protoplastos mediante agentes fusogénicos como el polietilenglicol. La fusión da como resultado la mezcla citoplásmica y coloca los genomas de las células fusionadas dentro de la misma membrana. Bajo estas condiciones, es frecuente la recombinación entre los genomas . Los protoplastos fusionados se regeneran y, durante la división celular, los genomas sencillos se segregan dentro de cada célula hija. Por lo general, el 105 de estas células hijas poseen genomas que se originan parcialmente de más de uno de los genomas del protoplasto parental original . Este resultado es similar al del cruzamiento de cromatidios hermanos en las células eucarióticas durante la profase de la meiósis II. El porcentaje de células hijas que son recombinantes es únicamente inferior después de la fusión de protoplastos. A pesar de que la fusión de protoplastos da como resultado una recombinación eficiente, la recombinación ocurre de manera predominante entre dos células como en la recombinación sexual . Con el fin de generar de manera eficiente bibliotecas a partir de bibliotecas mezcladas del genoma entero, se elaboran células hijas que poseen información genética que se origina de padres múltiples. El mezclado del ADN in vitro da como resultado la recombinación en grupos eficiente de secuencias del ADN homólogo múltiples. El reensamble de genes de longitud completa a partir de un grupo mezclado de fragmentos pequeños de gen requiere ciclos múltiples de recocido y alargamiento, los ciclos térmicos de la reacción PCR sin cargadores.

Durante cada ciclo térmico, varios pares de fragmentos se recocen y se extienden para formar una población combinada de fragmentos del ADN quimérico más grande. Después del primer ciclo de reensamble, los fragmentos quiméricos contienen secuencias que se originan a partir de dos diferentes genes padres. Esto es similar al resultado de un solo ciclo sexual dentro de una población, un cruzamiento en pares, o fusión de protoplastos. Durante el segundo ciclo, estos fragmentos quiméricos pueden recocerse entre sí, o con otros fragmentos pequeños, lo que da como resultado quimeras que se originan de hasta cuatro diferentes secuencias parentales. Este segundo ciclo es análogo a toda la progenie de un solo cruzamiento sexual que se reproduce con sí mismo. Los ciclos posteriores darán como resultado quimeras que se originan de 8, 16, 32, etc. secuencias parentales y son análogos para reproducciones abiertas posteriores de la población de la progenie. El poder de la mezcla del ADN in vi tro es que puede generarse una gran biblioteca combinada a patir de un solo grupo de fragmentos del ADN reensamblados mediante estos "apareamientos" en pares recursivos. Tal como se describió anteriormente, las estrategias de mezclado in vivo, como por ejemplo la fusión de protoplastos, da como resultado una reacción de apareamiento en pares única. De esta manera, para generar el nivel de diversidad obtenida por los métodos in vi tro, los métodos in vivo se llevan a cabo de manera recursiva. Es decir, se recombina un grupo de organismos y la progenie se agrupa, sin selección, y después se vuelve a recombinar. Este proceso se repite durante ciclos suficientes para dar como resultado la progenie que posee secuencias parentales múltiples. A continución se describe un método utilizado para mezclar cuatro cepas de Streptomyces coelicolor. A partir de las cuatro cepas iniciales, cada una incluyendo un marcador nutricional único, fueron suficientes de tres a cuatro rondas de fusión de protoplastos agrupados de manera recursiva para generar una población de organismos mezclados que contiene todas las 16 combinaciones posibles de los cuatro marcadores. Esto representa un mejoramiento de 106 veces en la generación de progenie de cuatro padres en comparación con una fusión agrupada única de las cuatro cepas. Tal como se estipula en la Figura 31, los protoplastos fueron generados a partir de varias cepas de S. coelicolor, fueron agrupados y fusionados. Los micelios se regeneraron y se permitió su esporulación. Se recolectaron las esporas, se permitió su desarrollo en micelios, se formaron en protoplastos, se agruparon y se fusionaron y el proceso se repitió durante tres a cuatro rondas, y las esporas resultantes se sometieron posteriormente a clasificación.

El protocolo básico para la generación de una biblioteca mezclada de genoma entero a partir de cuatro cepas de S. coelicolor, cada una con uno a cuatro marcadores distintos, fue el siguiente. Se desarrollaron cuatro cultivos miceliales, cada uno con una cepa que poseía de uno a cuatro diferentes marcadores, a una fase estacionaria prematura. Los micelios fueron cultivados cada uno mediante centrifugación y se lavaron. Los protoplastos de cada cultivo se prepararon de la siguiente manera. Aproximadamente 109 esporas de S. coelicolor se inocularon dentro de YEME de 50ml con .0.5% de Glicina en un matraz deflector de 250 ml . Las esporas se incubaron a 30°C durante 36-40 en un agitador orbital. Los micelios se verificaron utilizando un microscopio. Algunas cepas necesitaban un día adicional de desarrollo. El cultivo fue transferido dentro de un tupo de 50 ml y se centrífugo a 4,000 rpm durante 10 minutos. Los micelios se lavaron dos veces con 10.3% de sacarosa y se centrifugaron a 4,000 rpm durante 10 minutos (los micelios pueden almacenarse a -80°C después del lavado) . Se agregaron 5ml de lisozima a los -0.5 g de comprimidos de micelios. Los compromidos se suspendieron y se incubaron a 30°C durante 20-60 minutos, con una agitación suave cada 10 minutos. El microscopio se revisó para verificar la formación de protoplastos cada 20 minutos. Una vez que la mayoría eran protoplastos, la formación de protoplastos se detuvo agregando lOml de solución amortiguadora P. Los protoplastos se filtraron a través de algodón y el protoplasto fue girado a 3,000 rpm durante 7 minutos a temperatura ambiental . Se desecho el sobrenadante y el protoplasto se volvió a suspender ligeramente, agregando una cantidad adecuada de solución amortiguadora P de acuerdo con el tamaño del comprimidos (por lo general aproximadamente 500 µl) . Se realizaron diluciones en serie diez veces en la solución amortiguadora P, y los protoplastos se contaron en una dilución de 10"2. Los protoplastos se ajustaron a 1010 protoplastos por ml . Los protoplastos de cada cultivo se cuantificaron mediante microscopía. 108 protoplastos de cada cultivo se mezclaron en el mismo tubo, se lavaron y después se fusionaron mediante la añadidura de 50% de PEG. Los protoplastos fusionados se diluyeron y se colocaron en placas del medio de regeneración y se incubaron hasta que las colonias experimentaron esporulación (cuatro días) . Las esporas se cultivaron y se lavaron. Estas esporas representan una agrupación de todos los recombinantes y padres que forman la fusión. Posteriormente, se utilizó una muestra de las esporas agrupadas para inocular un cultivo líquido único. El cultivo se desarrolló a una fase estacionaria prematura, los micelios se cultivaron, y se prepararon los protoplastos. 108 protoplastos de esta "biblioteca micelial" se fusionaron posteriormente entre sí mediante la añadidura de 50% de PEG. Los pasos de la fusión de protoplastos/regeneración/cultivo/ preparación de protoplastos se repitieron dos veces. Las esporas resultantes de la cuarta ronda de fusión se consideraron como la "biblioteca mezclada del genoma entero" y se clasificaron en cuanto a la frecuencia de las 16 combinaciones posibles de los cuatro marcadores. Los resultados de cada ronda de la fusión se muestran en la Figura 33 y en la siguiente tabla. Los resultados del procedimiento de mezclado se estipulan en la Figura 33. En particular, la añadidura de rondas de recombinación antes de la selección produjo incrementos significativos en el número de clones que incorporaban todos los cuatro marcadores seleccionables relevantes, lo que indica que la población llegó a ser cada vez más diversa mediante una agrupación y esporulación recursivas. Los resultados adicionales se estipulan en la siguiente tabla.

C? Las cuatro cepas del mezclado de cuatro padres eran cada una auxotróficas para tres y prototrófica para uno de los cuatro posibles marcadores nutricionales : arginina (A) , cistina (C) , proling (P) , y/o uracilo (U) . Las esporas de cada fusión se colocaron en placas en cada una de las 16 combinaciones posibles de estos cuatro nutrientes, y el porcentaje de la población en desarrollo en un medio particulado, se calculó como la relación de estas colonias que forman una placa selectiva con las que se desarrollan en una placa que posee los cuatro nutrientes (todas las variantes se desarrollan en el medio que posee los cuatro nutrientes, por lo tanto, las colonias de esta placa representan de esta manera el total de la población viable) . Los porcentajes corregidos para cada uno de los fenotipos nulo, uno, dos y tres del marcador se determinaron restando el porcentaje de estas células que poseían marcadores adicionales y que podían desarrollarse en el medio con nutrientes "innecesarios". Por ejemplo, el número de colonias que se desarrollaron sin nutrientes adicionales (el prototrofo) se restó del número de colonias que se desarrollaron en cualquier placa que requería nutrientes. II. MEZCLA DE GENOMA ENTERO A TRAVÉS DE LA MEZCLA DEL ETERODUPLEXO ORGANIZADA Se proporciona un nuevo procedimiento para perfeccionar los fenotipos de intereses mediante la mezcla de heteroduplexo de bibliotecas de cosmidios del organismo de elección. Ese procedimiento no requiere la fusión de protoplastos y es aplicable a las bacterias para las cuales están disponibles sistemas genéticos perfectamente establecidos, incluyendo la clonación de cosmidios, transformación, empaque in vitro/transformación y transferencia de plasmidio/movilización. Los microorganismos que pueden ser mejorados a través de estos métodos incluyen Escherichia coli , Pseudomonas aeruginosa, Pseudomonas putida, Pseudomonas spp . , Rhizobium spp . , Xanthomonas spp . , y otros organismos gram-negativos . Este método también es aplicable para microorganismos gram positivos. En la Figura 34 se establece un procedimiento básico para la mezcla del genoma entero a través de la mezcla del heteroduplexo organizada. En el paso A, el ADN cromosómico del organismo que va a mejorarse se digiere con enzimas de restricción adecuadas y se liga dentro de un cosmidio. El cosmidio utilizado para el WGS guiado con heteroduplexo basado en un cosmidio posee por lo menos dos sitios de reconocimiento de la enzima de restricción rara (por ejemplo, Sfr y Notl) que serán utilizados para la linealización en pasos posteriores. Se purifican suficientes cosmidios para representar el cromosoma completo y se almacenan en portaobjetos de microvaloración de 96 cavidades. En el paso B, las muestras pequeñas de la biblioteca se mutagenizan in vitro, utilizando hidroxilamina u otros químicos mutagénicos. En el paso C, se utiliza una muestra de cada cavidad de la recolección mutagenizada para transfectar las células meta. En el paso D, los transfectadores se someten a ensayo (en forma de grupo a partir de cada cavidad de la muestra mutagenizada) para las mejoras fenotípicas. Los resultados positivos de este ensayo indican que un cosmidio proveniente de una cavidad en particular puede conferir mejoras fenotípicas y por lo tanto contener fragmentos genómicos grandes que son metas adecuadas para la mezcla medida por heteroduplexos . En el paso E, las células transfectadas que albergan una biblioteca de mutantes de los cosmidios identificados son separadas mediante la colocación en placas en medios sólidos y se clasifican en cuanto a los mutantes independientes confiriendo un fenotipo mejorado. En el paso F, el ADN de las células positivas se aisla y se agrupa por origen. En el paso G, los grupos del cosmidio seleccionado se dividen de tal forma que una muestra puede ser digerida con Sfr y la otra con Notl. Estas muestras que ocurra la "recombinación" .entre las estirpes de los heteroduplexos in vivo. Los tra-nsfectadores pueden A ( clasificarse (la población representará los recombinantes en forma de pares) o, comúnmente, de acuerdo con lo representado por el paso I, los cosmidios recombinados se mezclan otra vez por medio de una formación del heteroduplexo in vitro recursiva y una recombinación in vivo (para generar una 5 biblioteca de combinación completa de las mutaciones posibles) antes de la clasificación. También podría añadirse un paso de mutagénesis adicional para la diversidad creciente durante el proceso de mezclado. En el paso J, una vez que varios cosmidios que albergan diferentes sitios distribuidos han sido mejorados, se combinan dentro del mismo huésped mediante la integración de cromosomas. Este organismo puede utilizarse directamente o someterse a una nueva ronda del mezclado del genoma entero guiado por heteroduplexos. 15 EJEMPLOS Los siguientes ejemplos se ofrecen para ilustrar, pero no limitar la presente invención. Las variaciones / esencialmente equivalentes para los procedimientos exactos estipulados serán aparentes para las personas capacitadas después de la revisión de esta presentación. A. EJEMPLO 1: DESARROLLO DE LA RECA HIPERRECOMBINOGÉNICA La proteína RecA participa en la mayoría de la vías de recombinación homologa de E. coli . La mayoría de las mutaciones en RecA inhiben la recombinación, pero se ha reportado que algunas incrementan la recombinación (Kowalczykowski y colaboradores, Microbiol . Rev. (Revisión de Microbiología) , 58, 401-465 (1994)). El siguiente ejemplo describe la evolución de RecA para adquirir una actividad hiperrecombinogénica útil en los formatos de mezcla in vivo . La RecA hiperrecombinogénica fue seleccionada utilizando una modificación de un sistema desarrollado por Shen y colaboradores, Genetics (Genética) 112, 441-457 (1986); Shen y colaboradores, Mol . Gen . Genet . (Genética General y Molecular) 218, 358-360 (1989)) para medir el efecto de la longitud del substrato y la homología en la frecuencia de la recombinación. El sistema de Shen & Huang' s utilizaba plasmidios y bacteriófagos con pequeñas regiones (31-430 bp) de homología en las cuales los dos podían recombinarse. En un huésped restrictivo, únicamente los fagos que habían incorporado la secuencia del plasmidio podían formar placas . Para el mezclado de RecA, se eliminaron las RecA y mutS endógenas de la cepa huésped MC1061. En esta cepa, no se observó recombinación entre el plasmidio y el fago. Posteriormente, la RecA de E. coli . se clonó dentro de dos de los vectores de recombinación (Bp221 y pMT631cl8) . Los plasmidios que contenían la RecA clonada pudieron recombinarse con el fago homólogo: ?V3 (identidad de 430 bp con Bp221), ?V13 (estrechamiento de 430 bp del 89% de la identidad con Bp221) y ?enlace H (identidad de 31 bp con pMt631cl8, con excepción de un desemparejamiento en la posición 18) . La RecA clonada se mezcló posteriormente in vi tro utilizando el tratamiento DNase estándar seguido por un reensamble basado en PCR. Los plasmidios mezclados se transformaron dentro de la cepa huésped no recombinante. Estas células se desarrollaron toda la noche, se infectaron con el fago ?Vc, ?V13 ó ?enlace H, y se colocaron en placas dentro de las placas NZCYM en presencia de un excedente 10 veces mayor del plasmidio que carece de MC1061. Mientras más eficientemente un alelo de recA promueva la recombinación entre el plasmidio y el fago, más alto estará representado el alelo en el ADN del bacteriófago. En consecuencia, el cultivo de todos los fagos a partir de las placas y la recuperación de los genes de recA selecciona los alelos de recA más recombinogénicos . Las frecuencias de recombinación para el tipo silvestre y una agrupación de RecA hiperrecombinogénica después de 3 rondas de mezcla fueron las siguientes : Cruzamiento Tipo Silvestre Hiperrecombinación BP221 x V3 6.5 x 10"4 3.3 x 10~2 BP221 x V13 2.2 x 10"5 1.0 x 10"3 pMT631cl8 x enlace H 8.7 x 10"6 4.7 x 10"5 Estos resultados indican un incremento de 50 veces en la recombinación para el substrato de 430 pb, y un incremento de 5 veces para el substrato de bp . La frecuencia de la recombinación entre BP221 y V3 para cinco aislados clónales individuales se muestra abajo, y las secuencias del ADN y la proteína y las alineaciones de las mismas se incluyen en las Figuras 12 y 13. Tipo silvestre: 1.6 x 10"4 Clon 2: 9.8 x 10"3 (61 x incremento) Clon 4: 9.9 x 10"3 (62 x incremento) Clon 5: 6.2 x 10"3 (39 x incremento) Clon 6: 8.5 x 10"3 (53 x incremento) Clon 13: 0.019 (116 x incremento) Los clones 2, 4, 5, 6 y 13 pueden utilizarse como los substratos en las rondas de mezclado subsecuente, si se desea un mejoramiento adicional en recA. No todas las variaciones de la secuencia de la recA tipo silvestre contribuye necesariamente para el fenotipo hiperrecombinogénico. Pueden eliminarse variaciones silenciosas mediante un nuevo cruzamiento. De manera alternativa, los variantes de recA que incorporan puntos individuales de variación a partir del tipo silvestre en los codones 5, 18, 156, 190, 236, 268, 271, 283, 304, 312, 317, 345 y 353 pueden someterse a prueba para su actividad.

B. EJEMPLO 2: EVOLUCIÓN DEL ORGANISMO ENTERO PARA HIPERRECOMBINACIÓN La posibilidad de selección de una cepa de E. coli . con un nivel creciente de recombinación fue indicada a partir de los fenotipos de tipo silvestre, las cepas recA, mutS y recA mutS después de la exposición a la mitomicina C, un agente de enlace cruzado entre estirpes del ADN. La exposición del E. coli . a la mitomicina se provoca un enlace cruzado entre estirpes del ADN bloqueando de esta manera la duplicación del ADN. La reparación de los enlaces cruzado del ADN entre estirpes en E. coli . ocurre a través de una vía de reparación de recombinación dependiente de RecA (Friedberg y colaboradores, en DNA Repair and Mutagénesis (Reparación del ADN y Mutagénesis) (1995) páginas 191-232) . El procesamiento de los enlaces cruzados durante la reparación da como resultado rompimientos ocasionales de ADN de estirpe doble, que también son reparados por medio de una ruta de recombinación dependiente de RecA. De acuerdo con esto, las cepas recA" son significativamente más sensibles que las cepas tipo silvestre ante la exposición a la mitomicina C. De hecho, la mitomicina C se utiliza en ensayos de sensibilidad de disco sencillos para diferenciar entre las cepas RecA+ y RecA" . Además de sus propiedades recombinogénicas, la mitomiciona C es un mutágeno. La exposición a los agentes que dañan el ADN, como por ejemplo la mitomicina C, da como resultado por lo general la inducción del reguión SOS de E. coli . que incluye productos implicados en la reparación propensa a error del daño del ADN (Friedber y colaboradores, 1995, consul tar arriba, en páginas 465-522) . Después de la transducción generalizada mediada por Pl de los fagos del alelo ( recA-srl ) : :TnlO (un alelo no funcional) dentro del tipo silvestre y mutS de E. coli . , los transductores resistentes a la tetraciclina se clasificaron en cuanto al fenotipo recA" utilizando el ensayo de sensibilidad de la mitomicina C. Se observó en capas LB con un disco del filtro de 1/4 pulgadas saturado con 10 µg de mitomicina C después de 48 horas a 37°C, el crecimiento del tipo silvestre y las cepas mutS se inhibieron dentro de una región con un rango de aproximadamente 10 mm a partir del centro del disco. El enlace cruzado del ADN a niveles altos de mitomicina C satura la reparación de recombinación resultante en el bloqueo letal de la duplicación del ADN. Ambas cepas dieron origen a unidades formadoras de colonias ocasionales dentro de la zona de inhibición, a pesar de que la frecuencia de las colonias era -10-20 veces mayor en la cepa de mutS. Esto se debe presumiblemente a la velocidad creciente de la mutación espontánea de los antecedentes de mutS. Una comparación lado a lado demostró que las cepas recA y recA mutS fueron significativamente más sensibles a la mitomicina C con un crecimiento inhibido en una región que se extendía aproximadamente a 15 mm del centro del disco. Sin embargo, en contraste con las cepas recA+, no se observaron individuos Mitr dentro de la región de inhibición del crecimiento, ni siquiera en el fondo de mutS . La aparición de individuos de Mitr en los fondos de recA+, pero no en los fondos de recA indica que el Mitr depende de una proteína RecA funcional y sugiere que el Mitr puede ser el resultado de una capacidad creciente de reparación de recombinación del daño inducido por la mitomicina C. Las mutaciones que conducen a una capacidad creciente para la reparación por recombinación mediada con RecA pueden ser diversas, inesperadas, no enlazadas y potencialmente sinergísticas. Un protocolo recursivo que alterna la selección de Mitr y la mezcla cromosómica desarrolla células individuales con una capacidad dramáticamente creciente de recombinación . El protocolo recursivo es el siguiente. Después de la exposición de una cepa mutS a la mitomicina C, los individuos Mitr se agrupan y se reproducen de manera cruzada (por ejemplo, a través de una mezcla cromosómica mediada por Hfr o una transducción generalizada de agrupación/división, o la fusión de protoplastos) . Los alelos que resultan en Mitr y que resultan presumiblemente en una capacidad creciente de reparación por recombinación se mezclan entre la población en ausencia de una reparación de desemparejamiento. Además, la reparación propensa a error después de la exposición a la mitomicina C puede introducir nuevas mutaciones para la siguiente ronda de mezcla. El proceso se repite utilizando exposiciones cada vez severas a la mitomicina C. Un número de selecciones paralelas en la primera ronda funciona como medio para generar una variedad de alelos. Opcionalmente, la recombinogenicidad de aislados puede monitorearse para la hiperrecombinación utilizando un ensayo de plasmidio x plasmidio o un ensayo de cromosoma x cromosoma (por ejemplo, el de Konrad, J". Bacteriol . (Boletín de Bacteriología) 130, 167-172 (1977) ) . C . EJEMPLO 3 : MEZCLA DEL GENOMA ENTERO DE STREPTOMYCES COELICOLOR PARA MEJORAR LA PRODUCCIÓN DE ?-ACTINORODINA Para mejorar la producción del metabolito secundario ?-actinorodina de S. coelicolor, el genoma entero de este organismo se mezcla ya sea sólo o con su familiar cercano S. lividans . En el primer procedimiento descrito posteriormente, la diversidad genética se deriva de las mutaciones aleatorias generadas por medios químicos o físicos. En el segundo procedimiento, la diversidad genética se deriva de la diversidad natural existente entre los genomas de S. coelicolor y S. lividans. Las suspensiones de esporas de S. coelicolor se vuelven a suspender en agua esterilizada y se someten a una mutagénesis ultravioleta de tal forma que el 1% de las esporas sobrevivan (-600 unidades de "energía" utilizando un Stratalinker, Stratagene) , y los mutantes resultantes se "desarrollan" en un ágar de esporulación. Las esporas individuales representan células uninucleadas que albergan diferentes mutaciones dentro de su genoma. Las esporas se recolectan, se lavan y se colocan en placas en medios sólidos, de preferencia ágar de soya, R5 , u otro medio rico que dé como resultado colonias de esporulación. Las colonias se representan mediante imágenes posteriormente y se seleccionan de manera aleatoria utilizando un recolector de colonias automatizado, por ejemplo, el Q-bot (Genetix) . Alternativamente, las colonias que producen halos más grandes o más oscuros de pigmento azul se seleccionan en añadidura o de manera preferente. Las colonias son inoculadas dentro de placas de microvaloración de 96 cavidades que contienen 1/3 x medio YEME (170 µl/cavidad) . Se agregan dos cuentas de vidrio de 3 mm esterilizadas a cada cavidad, y las placas se agitan a 150-250 rpm a 30°C en un incubador humedecido. Las placas se incuban hasta por 7 días y los sobrenadantes de la célula se someten a ensayo para la producción de ?-actinorodina . Para el ensayo, se agregan 50 µL del sobrenadante a 100 µL de agua destilada en una placa de microvaloración de polipropileno de 96 cavidades, y la placa se centrífuga a 4000 rpm para comprimir los micelios. Posteriormente, se retiran 50 µL del sobrenadante aclarado y se agregan a una placa de microvaloración de 96 cavidades de poliestireno con el fondo plano, que contengan 150 µL ÍM KOH en cada cavidad. Las placas resultantes se leen posteriormente en el lector de placas de microvaloración midiendo la absorbancia a 654 nm de las muestras individuales como medida del contenido de ?~ actinorodina . Los micelios de cultivos que producen ?-actinorodina a niveles significativamente más altos que la S. coelicolor de tipo silvestre se aislan posteriormente. Éstos se propagan en un medio de esporulación sólida, y se realizan preparaciones de esporas de cada mutante mejorado. A partir de estas preparaciones, los protoplastos de cada uno de los mutantes mejorados se generan, se agrupan entre sí, y se fusionan (tal como se describe en Genetic Manipulation of Streptomyces - A laboratory Manual, (Manipulación Genética del Streptomyces - Un Manual de Laboratorio, Hopwood, D.A. y colaboradores) . Los protoplastos fusionados se regeneran y se permite su esporulación. Las esporas se recolectan y ya sea se colocan en placas en un medio sólido para una selección y clasificación posterior, o para incrementar la representación de la progenie multiparental, y se utilizan para generar protoplastos y se fusionan otra vez (o varias veces de acuerdo con lo descrito previamente para los métodos para efectuar la recombinación en forma de grupos) antes de una recolección y clasificación posterior. Los mutantes mejorados adicionales son el resultado de la combinación de dos o más mutaciones que poseen efectos aditivos o sinergísticos sobre la producción de g-actinorodina. Pueden aparearse otra vez los mutantes mejorados adicionales mediante la fusión en forma de grupos del protoplasto, o pueden exponerse a una mutagénesis aleatoria para crear una nueva población de células que deberá clasificarse y aparearse para mejoras posteriores. Como una alternativa para la mutagénesis aleatoria, puede emplearse una fuente de diversidad genética, y diversidad natural. En este caso, los protoplastos generados a partir de S. coelicolor y S . lividans de tipo silvestre se fusionan entre sí. Las esporas de la progenie regenerada de este apareamiento posteriormente se fusionan de manera repetitiva y se regeneran para crear una diversidad adicional, o se separan en un medio sólido, se recolectan y se clasifican en cuanto a la producción mejorada de g-actinorodina. Como se indicó anteriormente, la subpoblación mejorada se aparea entre sí para identificar los organismos mezclados de la familia mejorados. D. EJEMPLO 4: UN ENSAYO DE ACTINORODINA DE ALTO RENDIMIENTO En la Figura 32 se estipulan los detalles adicionales sobre un ensayo de actinorodina de mezcla de alto rendimiento utilizado para seleccionar micelios. En breve, los mezcladores se recolectaron mediante procedimientos automatizados estándares utilizando un sistema robótico Q-bot y se transfirieron a placas estándares de 96 cavidades. Después de la incubación a 30°C durante 7 días, los micelios resultantes se centrifugaron, y una muestra del sobrenadante de la célula se retiró y se mezcló con 0.1 M de KOH en una placa de 96 cavidades y la absorbancia se leyó en 654 nm. Los mejores clones positivos se seleccionaron y desarrollaron en matraces de agitación. Aproximadamente 109 protoplastos se centrifugaron a 3,000 rpm durante 7 minutos. Cuando se utilizó más de una cepa, se obtuvo un número equivalente de protoplastos de cada cepa. La mayoría de la solución amortiguadora se retiró y el comprimido se suspendió en la solución amortiguadora restante (-25 µl total del volumen) mediante un golpeteo suave. 0.5 ml de 50% de PEG 1000 se agregaron y se mezclaron con los protoplastos pipetando ligeramente hacia adentro y hacia afuera dos veces. La mezcla se incubó posteriormente durante 2 minutos. 0.5 ml de solución amortiguadora P se agregaron y se mezclaron suavemente. (Ésta es la fusión a una dilución de 10"1) . Se llevó a cabo una dilución en serie diez veces en solución amortiguadora P. Después de 2 minutos, las diluciones se colocaron en placas a 10"1, 10"2 y 10"3 sobre placas R5 con 50 µl de cada una, 2"3 placas cada dilución (para la colocación en placas, se utilizaron 20 cuentas de vidrio de 3 mm, y se agitó suavemente) . Como primer control, para la regeneración de protoplastos, se utilizaron los mismos números de protoplastos que arriba, añadiendo solución amortiguadora P a un total de 1 ml (ésta es la regeneración a una dilución de 10"1) . La mezcla se diluyó posteriormente (10X) en solución amortiguadora P. Las diluciones se colocaron en placas a 10"3, 10"4 y 10"5 sobre placas R5 con 50 µl de cada una. Como segundo control (como una revisión de fondo de micelios que no formaban protoplastos) se utilizó el mismo número de protoplastos que arriba añadiendo 0.1% de SDS a un total de 1 ml (éste es el fondo en una dilución de 10"1) .

Después de una dilución 10X adicional en 0.1% de SDS, la dilución se colocó en placas a 10"1, 10"2 y 10"3 sobre placas R5 con 50 µl de cada una. Las placas se secaron al aire y se incubaron a 30°C durante 3 días. El número de colonias se contó de cada placa (aquellas que podían contarse) , utilizando el número de protoplastos regenerados como un 100% y calculando el porcentaje del fondo (por lo general menos de uno) y la supervivencia a la fusión (por lo general mayor a 10) . Las placas de fusión se incubaron a 30°C durante 2 días más hasta que todas las colonias estuvieron perfectamente esporuladas .

Las esporas se cultivaron a partir de aquellas placas que tenían menos de 5,000 colonias. Las esporas se filtraron a través de algodón y se lavaron una vez con agua, se suspendieron en 20% de glicerol y se contaron. Estas esporas se utilizan para estudios adicionales, para la inoculación de cultivos o simplemente se almacenan a -20°C. E . EJEMPLO 4 : MEZCLA DE GENOMA ENTERO DE RHODOCOCCUS PARA CATÁLISIS DE REACCIÓN DE DOS FASES Este ejemplo proporciona un ejemplo de cómo aplicar las técnicas descritas en la presente a las tecnologías que permiten el mejoramiento genérico de las biotransformaciones catalizadas por las células enteras. Se seleccionó el Rhodococcus como una meta inicial porque es tanto representativo de los sistemas en donde la biología molecular es rudimentaria (lo cual es común en los catalizadores de células enteras que por lo general se seleccionan mediante la clasificación de aislados ambientales) , como porque se trata de un organismo que puede catalizar reacciones de dos fases. El objetivo de la mezcla del genoma entero del Rhodococcus es obtener un incremento en el flujo a través de cualquier vía elegida. La especificidad del substrato de la vía puede alterarse para aceptar moléculas que actualmente no son substratos. Cada una de estas características puede ser seleccionada durante la mezcla del genoma entero. Durante la mezcla del genoma entero, las bibliotecas de vías y enzimas mezcladas se elaboran y transforman dentro del Rhodococcus y se clasifican, de preferncia mediante ensayos de alto rendimiento para los mejoramientos en el fenotipo meta, por ejemplo, mediante espectroscopia de masa para medir el producto. Como se indicó antes, el contexto cromosómico de los genes puede tener efectos dramáticos en otras actividades. La clonación de los genes meta dentro de un plasmidio pequeño en Rhodococcus puede reducir dramáticamente la actividad global de la vía (por un factor de 5 a 10 veces o más) . De esta manera, el punto de inicio para la mezcla del ADN de una vía (en un plasmidio) puede ser 10 veces menor que la actividad de la cepa tipo silvestre. En contraste, la integración de los genes en sitios aleatorios en la cromosoma del Rhodococcus puede dar como resultado un incremento significativo (de 5 a 10 veces) en la actividad. Un fenómeno similar se observó en la evolución dirigida reciente en E. coli . de un operón de resistencia al arsenato (originalmente de Staphylococcus aureus) mediante el mezclado del ADN. La mezcla de este plasmidio produjo cambios en las secuencias que condujeron a una integración eficiente del operón dentro del cromosoma de E. coli . Del total del incremento de 50 veces en la resistencia al arsenato obtenida por la evolución dirigida de la vía de tres genes, aproximadamente 10 veces resultaron de esta integración dentro del cromosoma. La posición dentro del cromosoma es probable que también sea importante: por ejemplo, las secuencias cercanas al origen de la duplicación poseen una dosificación del gen efectivamente mayor y por lo tanto un mayor nivel de expresión. Con el fin de explotar completamente los efectos de la posición cromosómica no predecibles, y para incorporarlos dentro de una estrategia de evolución dirigida que utiliza ciclos múltiples de mutación, recombinación y selección, los genes se manipulan in vi tro y después se transfieren a una posición cromosómica óptima. La recombinación entre el plasmidio y el cromosoma ocurre en dos formas diferentes. La integración se lleva a cabo en una posición donde existe una homología de la secuencia significativa entre el plasmidio y el cromosoma, es decir, mediante recombinación homologa. La integración también se lleva a cabo donde no existe una identidad de secuencia aparente, es decir, mediante recombinación no homologa. Estos dos mecanismos de recombinación son afectados por diferentes maquinarias celulares y poseen diferentes aplicaciones potenciales en la evolución dirigida. Para combinar el incremento en la actividad que fue resultado de la duplicación de genes y la integración cromosómica de la vía meta con la poderosa técnica del mezclado del ADN, las bibliotecas de genes mezclados se elaboran in vi tro, y se integran dentro del cromosoma en lugar de los genes tipo silvestre mediante recombinación homologa. Los recombinantes se clasifican posteriormente en cuanto a su acetividad creciente. Este proceso se elabora opcionalmente de manera recursiva tal como se explicó en la presente. Las mejores variantes Rhodococcus se agrupan, y el grupo se divide en dos. Los genes se clonan fuera del grupo mediante PCR, se mezclan entre sí y se vuelven a integrar dentro de los cromosomas de la otra mitad del grupo mediante recombinación homologa. Los recombinantes se clasifican una vez más, los mejores se toman y se agrupan y el proceso se repite opcionalmente. Algunas veces existen interacciones complejas entre las enzimas que catalizan reacciones sucesivas en una vía. Algunas veces la presencia de una enzima puede afectar adversamente las actividades de otras en la vía. Esto puede ser el resultado de interacciones de proteína-proteína, o la inhibición de una enzima por el producto de otra, o un desequilibrio del metabolismo primario o secundario. Este problema es superado mediante la mezcla del ADN, que produce soluciones en el racimo de genes meta que llevan a cabo mejoras en cualquier rasgo que se clasifique. Un enfoque alternativo, que puede resolver no solo este problema, sino también pasos limitantes para la velocidad en un futuro anticipado como por ejemplo el suministro de potencia de reducción y transportación del substrato, es la complementación mediante la expresión excesiva de otras que todavía son secuencias genómicas desconocidas.

Una biblioteca de ADN genómico de Rhodococcus en un vector de Rhodococcus de copias múltiples como por ejemplo pRCl se elabora primero. Ésta se transforma dentro del Rhodococcus y los transformadores se clasifican en cuanto a los incrementos en el fenotipo deseado. Los fragmentos genómicos que dan como resultado una actividad de la vía creciente se desarrollan mediante mezcla del ADN para incrementar posteriormente su efecto benéfico en una propiedad seleccionada. Este enfoque no requiere información de la secuencia, ni ningún conocimiento o suposición sobre la naturaleza de la proteína o las interacciones de la vía, o incluso del paso limitador de la velocidad, se basa únicamente en la detección del fenotipo deseado. Esta clase de clonación aleatoria y evolución subsecuente por medio de la mezcla del ADN de secuencias genómicas que interactúan de manera positiva es extremadamente potente y genérica. Se utiliza una variedad de fuentes del ADN genómico, desde cepas isogénicas hasta especies relacionadas de manera más distante con propiedades potencialmente deseables. Además, la técnica es, en principio, aplicable a cualquier microorganismo para el cual esté disponible la información básica de biología molecular de los vectores de transformación y clonación, y para cualquier propiedad que pueda ser sometida a ensayo, de preferencia en un formato de alto rendimiento.

La recombinación homologa dentro del cromosoma se utiliza para evitar las limitaciones de las restricciones de tamaño y la evolución de plasmidio y se utiliza opcionalmente para alterar el metabolismo central. La estrategia es similar a la descrita anteriormente para los genes de mezcla de su contexto cromosómico, con la excepción de que no ocurre ninguna mezcla in vi tro . En lugar de esto, la cepa padre se trata con mutágenos como por ejemplo, la luz ultravioleta o nitrosoguanidina, y se seleccionan los mutantes mejorados. Los mutantes mejorados se agrupan y se dividen. La mitad de la agrupación se utiliza para generar fragmentos genómicos aleatorios para su clonación dentro de un vector de recombinación homologa. Los fragmentos genómicos adicionales se derivan de especies relacionadas con propiedades deseables (en este caso, velocidades metabólicas mayores y la capacidad de desarrollarse en fuentes de carbono más baratas) . Los fragmentos genómicos clonados se recombinan de manera homologa dentro de los genomas de la mitad restante del grupo de mutantes, y se seleccionan los variantes con fenotipos mejorados. Éstos son sometidos a una ronda adicional de mutagénesis, selección y recombinación. Una vez más, este proceso es totalmente genérico para el mejoramiento de cualquier biocatalizador de célula entera para el cual puede desarrollarse un vector de recombinación y un ensayo. Puede llevarse a cabo la recombinación recursiva para incrementar la diversidad del agrupamiento en cualquier paso del proceso. La recombinación homologa eficiente es importante para la recursividad de las estrategias de evolución cromosómica delineadas anteriormente. La recombinación no homologa da como resultado una integración inútil (después de la selección) seguida por la excisión (después de la contraselección) del plasmidio entero. De manera alternativa, si no se utilizó una contraselección, existe la integración de más y más copias de secuencias de plasmidios/genómicas que son ambas inestables y también requieren un marcador seleccionable adicional para cada ciclo. Además, la recombinación no homologa adicional ocurrirá en posiciones aleatorias y podría o no conducir a una buena expresión de la secuencia integrada. F. EJEMPLO 5: AUMENTO DE LA VELOCIDAD DE LA RECOMBINACIÓN HOMOLOGA EN EL RHODOCOCCUS Se utiliza un enfoque genético para incrementar la velocidad de la recombinación homologa en el Rhodococcus . Se utilizan las estrategias tanto enfocadas como no enfocadas para desarrollar incrementos en la recombinación homologa. El recA del Rhodococcus se desarrolla mediante la mezcla del ADN para incrementar su capacidad de promover la recombinación homologa dentro del cromosoma. El gen recA fue elegido porque existen variantes de recA conocidas que dan como resultado velocidades crecientes de la recombinación homologa en E. coli . tal como se discutió anteriormente. El gen recA del Rhodococcus es mezclado en el ADN y clonado dentro de un plasmidio que porta un marcador seleccionable y una copia modificada del homólogo de Rhodococcus del gen URA3 de S . cerevisiae (un gen que también confiere sensibilidad al ácido 5-fluoroorótico análogo del precursor de uracilo) . La integración homologa del plasmidio dentro del cromosoma trastorna la vía de síntesis del uracilo huésped que conduce a una cepa que porta el marcador seleccionable y también es resistente al ácido 5-fluoroorótico . Los genes de recA mezclados se integran, y pueden amplificarse a partir del cromosoma, volverse a mezclar y clonarse otra vez dentro del vector de integración-selección. En cada ciclo, los genes recA que promueven el grado más alto de recombinación homologa, son aquellos que son los mejor representados como integrantes en el genoma. Por lo tanto, se desarrolla un recA de Rhodococcus con una actividad mejorada de recombinación-promoción homologa. Muchos otros genes participan en diversas vías de recombinación homologa diferentes, y las mutaciones en algunas de estas proteínas también pueden conducir a células con un nivel creciente de recombinación homologa. Por ejemplo, las mutaciones en la polimerasa III del ADN de E. coli . han demostrado recientemente que incrementan la recombinación homologa independiente de RecA. La resistencia a los agentes de enlace cruzado del ADN como el ácido nitroso, la mitomicina y ultravioleta, dependen de la recombinación homologa. De esta manera, los incrementos en la actividad de esta vía dan como resultado una resistencia creciente a estos agentes. Las células de Rhodococcus se mutagenizan y se seleccionan para una tolerancia creciente ante los agentes de enlace cruzado del ADN. Estos mutantes se someten a prueba con respecto a la velocidad en la cual un plasmidio se integrará de manera homologa dentro del cromosoma. Las bibliotecas genómicas se preparan a partir de estos mutantes, combinadas tal como se describió anteriormente, y se utilizan para desarrollar una cepa con niveles incluso más altos de recombinación homologa. La descripción anterior de las formas de realización preferida de la presente invención ha sido presentada para propósitos de ilustración y descripción. No tienen el propósito de ser minuciosas o delimitar la invención a la forma precisa presentada, y son posibles varias modificaciones y variaciones en vista de la enseñanza anterior. Estas modificaciones y variaciones que pueden ser aparentes para una persona capacitada en la técnica tiene el propósito de entrar en el alcance de esta invención. Todos los documentos de patentes y publicaciones citadas anteriormente se incorporan por referencia en su totalidad para todos los propósitos al mismo grado como si cada partida hubiera sido denotada individualmente.

Claims (42)

1. REIVINDICACIONES 1. Un método para producir una biblioteca de organismos multicelulares diversos, donde el método incluye: propocionar un grupo de gametos macho y un grupo de gametos hembra, donde por lo menos uno del grupo macho o del grupo hembra incluye una pluralidad de gametos diferentes derivados de diferentes cepas de una especie o diferentes especies, donde los gametos macho fertilizan a los gametos hembra; permitir que por lo menos una porción de los gametos fertilizados resultantes se desarrollen dentro de organismos reproductivamente viables; cruzar de manera repetida los organismos reproductivamente viables para producir una biblioteca de organismos diversos; y seleccionar la biblioteca para un rasgo o propiedad deseada.
2. 2. El método de la reivindicación 1, donde la biblioteca de organismos diversos incluye una pluralidad de plantas.
3. 3. El método de la reivindicación 1, donde las plantas se seleccionan a partir de: Gramineae, Fetucoideade , Poacoideae, Agrostis, Phleum, Dactylis, Sorgum, Steria, Zea, Oryza, Tri ticum, Sécale, Avena, Hordeum, Saccharum, Poa, Festuca, Stenotaphrum, Cynodon, Coix, Olyreae, Phareae, Composi tae, y Leguminosae .
4. 4. El método de la Reivindicación 2, donde las plantas se seleccionan a partir de maíz, arroz, trigo, centeno, avenas, cebada, guisantes, habas, lentejas, cacahuates, semillas de hilaza, semillas de caupí, semillas aterciopeladas, semilla de soya, trébol, alfalfa, lupino, arbeza, loto, trébol cloroso, gliana, haba de las indias, sorgo, mijo, semilla de girasol y cánola.
5. 5. El método de la reivindicación 1, donde la biblioteca de organismos diversos incluye una pluralidad de animales .
6. 6. El método de la reivindicación 5, donde los animales se seleccionan a partir de mamíferos no humanos y peces.
7. 7. La biblioteca producida por el método de la reivindicación 1.
8. 8. El método de la reivindicación 1, que incluye además : cruzar una pluralidad de miembros de la biblioteca seleccionada agrupando gametos de los miembros seleccionados y cruzando de manera repetida cualquier organismo reproductivamente viable adicional resultante para producir una segunda biblioteca de organismos diversos; y seleccionar la segunda biblioteca para un rasgo o propiedad deseada.
9. 9. La segunda biblioteca elaborada mediante el método de la reivindicación 8.
10. 10. Un método para desarrollar una célula para adquirir una propiedad deseada, que incluye: i) formar protoplastos de una población de células diferentes; ii) fusionar los protoplastos para formar protoplastos híbridos, en donde los genomas de los protoplastos se recombinan para formar genomas híbridos ,- iii) incubar los protoplastos híbridos bajo condiciones que promueven la regeneración de células, produciendo de esta manera células regeneradas; iv) formar repetidamente protoplastos a partir de las células regeneradas, fusionando los protoplastos para formar protoplastos híbridos, en donde los genomas de los protoplastos se recombinan para formar genomas híbridos adicionales; incubar los protoplastos híbridos adicionales bajo condiciones que promueven la regeneración de células, produciendo de esta manera células regeneradas adicionales; y v) seleccionar o clasificar células regeneradas aisladas o células regeneradas adicionalmente que se han desarrollado para la adquisición de la propiedad deseada.
11. 11. El método de la reivindicación 10, donde la propiedad deseada se selecciona de: tolerancia térmica, producción de etanol, tolerancia al etanol, ácido, producción mejorada y mantenimiento de cofactores de la enzima, producción mejorada y mantenimiento de NAD(P)H, y transporte mejorado de la glucosa.
12. 12. El método de la reivindicación 10, que incluye además los pasos repetidos (i) - (v) con las células regeneradas en el paso (iii) o las células regeneradas adicionales en el paso (iv) utilizados para formar los protoplastos en el paso (i) hasta que las células regeneradas hayan adquirido la propiedad deseada.
13. 13. El método de la reivindicación 10, que incluye el paso (iv) , donde el paso (iv) se lleva a cabo antes del paso (v) .
14. 14. El método de la reivindicación 10, donde los protoplastos híbridos incluyen células que poseen más de dos genomas parentales.
15. 15. El método de la reivindicación 10, donde las células diferentes son células fúngales, y las células regeneradas son micelios de hongos.
16. 16. El método de la reivindicación 15, donde los protoplastos se suministran tratando los micelios o esporas con una enzima.
17. 17. El método de la reivindicación 15, donde las células fúngales provienen de una cepa frágil, que carece de capacidad para una síntesis de la pared celular intacta, mediante la cual los protoplastos se forman espontáneamente.
18. 18. El método de la reivindicación 15, que incluye además tratar los micelios con un inhibidor de la formación de la pared celular para generar protoplastos.
19. 19. El método de la reivindicación 10, que incluye además la selección o clasificación para aislar las células regeneradas con genomas híbridos libres de las células con genomas parentales.
20. 20. El método de la reivindicación 10, donde una primera subpoblación de células contiene un primer marcador y la segunda subpoblación de células contiene un segundo marcador, y el método incluye además la selección o clasificación para identificar las células regeneradas que expresan tanto el primero como el segundo marcador.
21. 21. El método de la reivindicación 10, donde el primer marcador es un marcador de la membrana y el segundo marcador es un marcador genético.
22. 22. El método de la reivindicación 10, donde el primer marcador es una primera subunidad de una enzima eteromérica y el segundo marcador es una segunda subunidad de la enzima eteromérica.
23. 23. El método de la reivindicación 10, que incluye además la transformación de protoplastos con una biblioteca de fragmentos del ADN en por lo menos un ciclo.
24. 24. El método de la reivindicación 23, donde los fragmentos del ADN están acompañados por una enzima de restricción.
25. 25. El método de la reivindicación 10, que incluye además exponer los protoplastos a una irradiación ultravioleta en por lo menos un ciclo.
26. 26. El método de la reivindicación 10, donde la propiedad deseada es la expresión de una proteína, metabolito primario o metabolito secundario.
27. 27. El método de la reivindicación 10, donde la propiedad deseada es la secreción de una proteína o un metabolito secundario.
28. 28. El método de la reivindicación 27, donde el metabolito secundario es seleccionado a partir del taxol, ciclosporina A, y eritromicina.
29. 29. El método de la reivindicación 10, donde la propiedad deseada es la capacidad para la meiósis.
30. 30. El método de la reivindicación 10, donde la propiedad deseada es la compatibilidad para formar un heterocarión con otra cepa.
31. 31. El método de la reivindicación 10, que incluye además la exposición de los protoplastos o los micelios a un agente mutagénico en por lo menos un ciclo.
32. 32. Un método para la mezcla del genoma entero a través de una mezcla del heteroduplexo organizado, donde el método incluye: (a) proporcionar al ADN cromosómico un organismo que está enfocado para la mezcla, digerir el ADN cromosómico con una o más enzimas de restricción, ligar el ADN cromosómico dentro de un cosmidio, donde el cosmidio incluye por lo menos dos sitios raros de reconocimiento de la enzima de restricción, elaborar la alícuota, purificar y almacenar suficientes cosmidios para representar un cromosoma completo; (b) mutagenizar alícuotas de la biblioteca in vitro utilizando un mutágeno; (c) transfectar una muestra a partir de una pluralidad de las alícuotas mutagenizadas dentro de una población de células meta; (d) someter a ensayo los transfectadores resultantes para mejoramientos fenotípicos; (e) desarrollar células transfectadas que albergan una biblioteca de mutantes de los cosmidios identificados en los medios y clasificar las colonias de células resultantes para los mutantes independientes que confieren un fenotipo deseado; (f) aislar y agrupar el ADN de las células identificadas en la clasificiación; (g) dividir los grupos seleccionados y digerir por lo menos una muestra con una enzima de restricción de corte raro, agrupar las muestras segmentadas, desnaturalizar las muestras, recocer las muestras y volver a ligar las muestras; y (h) transfectar las células meta con los heteroduplexos resultantes y propagar las células para permitir que ocurra la recombinación entre las estirpes de los heteroduplexos in vivo.
33. 33. El método de la reivindicación 32, que incluye además la clasificación adicional de los transfectadores .
34. 34. El método de la reivindicación 32, que incluye además la mezcla posterior de los heteroduplexos mediante una formación de heteroduplexos in vitro recursiva y una recombinación in vivo antes de clasificar adicionalmente los transfectadores .
35. 35. El método de la reivindicación 33, que incluye además, llevar a cabo un paso de mutagénesis adicional para incrementar la diversidad durante el proceso de mezclado.
36. 36. El método de la reivindicación 32, que incluye además combinar uno o más heteroduplexos dentro de un cromosoma huésped mediante la integración de cromosomas.
37. 37. El método de la reivindicación 36, que incluye además repetir los pasos (a) - (h) , utilizando el organismo resultante de la integración cromosómica como la fuente para el ADN cromosómico en el paso (a) .
38. 38. El método de la reivindicación 32, donde el cosmidio incluye sitios de restricción para Sfr ó Notl.
39. 39. El método de la reivindicación 32, donde los transfectadores se someten a ensayo como un grupo proveniente de cada alícuota mutagenizada.
40. 40. El método de la reivindicación 32, donde el resultado del ensayo positivo indica que un cosmidio proveniente de una alícuota particular puede conferir mejoramientos fenotípicos y contiene fragmentos genómicos grandes que son metas adecuadas para la mezcla mediada por heteroduplexos .
41. 41. El método de la reivindicación 32, donde el mutágeno es un mutágeno químico.
42. 42. El método de la reivindicación 32, donde las células transfectadas en desarrollo que albergan una biblioteca de mutantes de los cosmidios identificados en los medios incluye la colocación de las células transfectadas en placas en medios sólidos.