JP2023507575A - 操作された酸性アルファ-グルコシダーゼバリアント - Google Patents
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Abstract
本発明は、操作された酸性アルファ-グルコシダーゼ(GAA)ポリペプチドおよびそれらの組成物を提供する。一部の実施形態では、操作されたGAAポリペプチドは、発現の増加、中性pHでの安定性の増大、および細胞溶解物における活性の増加を提供するために最適化されたものである。本発明は、操作されたGAAポリペプチドを含む組成物を治療上のおよび他の目的に利用するための方法も提供する。【選択図】図1
Description
本願は、2019年12月20日に出願した米国特許仮出願第62/951,625号の優先権を主張するものであり、前記仮出願は、これによりその全体があらゆる目的で参照により本明細書に組み込まれる。
発明の分野
本発明は、操作された酸性アルファ-グルコシダーゼ(GAA)ポリペプチドおよびそれらの組成物を提供する。一部の実施形態では、操作されたGAAポリペプチドは、発現の増加、中性および酸性pHでの安定性の増加、細胞への取込みの増加、および細胞溶解物における活性の増加を提供するために最適化されたものである。本発明は、操作されたGAAポリペプチドを含む組成物を治療上のおよび他の目的に利用するための方法も提供する。
本発明は、操作された酸性アルファ-グルコシダーゼ(GAA)ポリペプチドおよびそれらの組成物を提供する。一部の実施形態では、操作されたGAAポリペプチドは、発現の増加、中性および酸性pHでの安定性の増加、細胞への取込みの増加、および細胞溶解物における活性の増加を提供するために最適化されたものである。本発明は、操作されたGAAポリペプチドを含む組成物を治療上のおよび他の目的に利用するための方法も提供する。
配列表、表またはコンピュータプログラムへの言及
配列表の公式コピーは、ファイル名が「CX7-199WO2_ST25.txt」であり、作成日が2020年12月17日であり、サイズが18.2メガバイトである、ASCII形式のテキストファイルとして、本明細書と同時にEFS-Web経由で提出されている。EFS-Web経由で出願したこの配列表は、本明細書の一部であり、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
配列表の公式コピーは、ファイル名が「CX7-199WO2_ST25.txt」であり、作成日が2020年12月17日であり、サイズが18.2メガバイトである、ASCII形式のテキストファイルとして、本明細書と同時にEFS-Web経由で提出されている。EFS-Web経由で出願したこの配列表は、本明細書の一部であり、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
発明の背景
ポンペ病は、酸性アルファ-グルコシダーゼをコードする遺伝子の突然変異により引き起こされる常染色体劣性リソソーム蓄積障害である。この遺伝的欠陥は、体組織におけるGAAの低減または非存在につながる。結果として生じる、リソソーム内へのグリコーゲンの蓄積は、リソソームの腫脹および破裂をもたらし、その結果、細胞傷害、細胞小器官機能不全、および他の細胞欠陥に至ることがある。古典的乳児型および遅発(小児期または成人期)型を含む、2つの型のポンペ病がある。疾患重症度は、罹患した個体の細胞に存在する酵素活性の量に関連している。乳児型は、最も重症度の高い急速進行性の型であり、通常はGAA活性が1%未満であり、骨格筋はもちろん心臓および他の組織へもグリコーゲンの顕著な蓄積を生じさせる結果となる(例えば、Hahn and Schanzer, Ann. Transl. Med., 7:283 [2019]を参照されたい)。これらの患者には、心臓、骨格筋、および脳組織に蓄積されたリソソームおよび非リソソーム結合グリコーゲンの多系統貯蔵がある(Schoser, Ann. Transl. Med., 7:292 [2019]を参照されたい)。患者は、クレアチニンキナーゼレベルの上昇、肥大型心筋症、成長障害、筋緊張低下、および体軸筋力低下を呈する。未処置の場合、患者は、通常は、心肺機能不全に起因して生後1年以内に死亡する。月齢18カ月を超える生存は例外的である。この型は、患者がはるかに重症度の低い心肥大を呈する、非古典的または遅発乳児型ポンペ病とは区別される。遅発ポンペ病を有する患者は、概して、進行性肢帯型ミオパチーおよび呼吸機能障害を経験する。これらの患者は、排他的ではないが優勢な筋病変を呈する。患者は、最終的には、車椅子および/または人工呼吸器に頼ることになる。呼吸不全は、これらの患者の主たる死亡原因である。非機能的形態のGAAを合成し得る患者もいるが、いずれのタイプの天然酵素も産生することができない患者もいる。GAAをコードするヒトGAA遺伝子は、第17染色体q25.2~q25.3に位置が同定されており、クローニングおよびシークエンシングされている(Peruzzo et all, Ann. Transl. Med., 7:278-287 [2019];およびMartiniuk et al., DNA Cell. Biol., 10:283-292 [1991]を参照されたい)。この遺伝子の非常に多くの突然変異が報告されているが、罹患患者において観察される広範な表現型をもたらす病理学的機序は、依然として不明である。組換えGAAを用いる酵素補充療法(ERT)が利用可能であるにもかかわらず、罹患患者にとってのよりよい処置および管理選択肢が依然として必要とされている。
ポンペ病は、酸性アルファ-グルコシダーゼをコードする遺伝子の突然変異により引き起こされる常染色体劣性リソソーム蓄積障害である。この遺伝的欠陥は、体組織におけるGAAの低減または非存在につながる。結果として生じる、リソソーム内へのグリコーゲンの蓄積は、リソソームの腫脹および破裂をもたらし、その結果、細胞傷害、細胞小器官機能不全、および他の細胞欠陥に至ることがある。古典的乳児型および遅発(小児期または成人期)型を含む、2つの型のポンペ病がある。疾患重症度は、罹患した個体の細胞に存在する酵素活性の量に関連している。乳児型は、最も重症度の高い急速進行性の型であり、通常はGAA活性が1%未満であり、骨格筋はもちろん心臓および他の組織へもグリコーゲンの顕著な蓄積を生じさせる結果となる(例えば、Hahn and Schanzer, Ann. Transl. Med., 7:283 [2019]を参照されたい)。これらの患者には、心臓、骨格筋、および脳組織に蓄積されたリソソームおよび非リソソーム結合グリコーゲンの多系統貯蔵がある(Schoser, Ann. Transl. Med., 7:292 [2019]を参照されたい)。患者は、クレアチニンキナーゼレベルの上昇、肥大型心筋症、成長障害、筋緊張低下、および体軸筋力低下を呈する。未処置の場合、患者は、通常は、心肺機能不全に起因して生後1年以内に死亡する。月齢18カ月を超える生存は例外的である。この型は、患者がはるかに重症度の低い心肥大を呈する、非古典的または遅発乳児型ポンペ病とは区別される。遅発ポンペ病を有する患者は、概して、進行性肢帯型ミオパチーおよび呼吸機能障害を経験する。これらの患者は、排他的ではないが優勢な筋病変を呈する。患者は、最終的には、車椅子および/または人工呼吸器に頼ることになる。呼吸不全は、これらの患者の主たる死亡原因である。非機能的形態のGAAを合成し得る患者もいるが、いずれのタイプの天然酵素も産生することができない患者もいる。GAAをコードするヒトGAA遺伝子は、第17染色体q25.2~q25.3に位置が同定されており、クローニングおよびシークエンシングされている(Peruzzo et all, Ann. Transl. Med., 7:278-287 [2019];およびMartiniuk et al., DNA Cell. Biol., 10:283-292 [1991]を参照されたい)。この遺伝子の非常に多くの突然変異が報告されているが、罹患患者において観察される広範な表現型をもたらす病理学的機序は、依然として不明である。組換えGAAを用いる酵素補充療法(ERT)が利用可能であるにもかかわらず、罹患患者にとってのよりよい処置および管理選択肢が依然として必要とされている。
Hahn and Schanzer, Ann. Transl. Med., 7:283 [2019]
Schoser, Ann. Transl. Med., 7:292 [2019]
Peruzzo et all, Ann. Transl. Med., 7:278-287 [2019]
Martiniuk et al., DNA Cell. Biol., 10:283-292 [1991]
発明の概要
本発明は、操作された酸性アルファ-グルコシダーゼ(GAA)ポリペプチドおよびそれらの組成物を提供する。一部の実施形態では、操作されたGAAポリペプチドは、発現の増加、中性および酸性pHでの安定性の増加、細胞への取込みの増加、および細胞溶解物における活性の増加を提供するために最適化されたものである。本発明は、操作されたGAAポリペプチドを含む組成物を治療上のおよび他の目的に利用するための方法も提供する。
一部の実施形態では、本発明は、本質的に同じ条件下で野生型GAA酵素および/または参照GAAポリペプチドと比較したときに改善された特性を有する、操作されたGAAポリペプチド(本明細書では「組換えGAAポリペプチド」とも呼ばれる)ならびにそれらの生物活性断片およびアナログを提供する。本発明は、さらに、治療用および/または他の組成物における操作されたGAAポリペプチドならびにそれらの生物活性断片およびアナログの使用方法に関する。
本発明は、操作された酸性アルファ-グルコシダーゼ(GAA)ポリペプチドおよびそれらの組成物を提供する。一部の実施形態では、操作されたGAAポリペプチドは、発現の増加、中性および酸性pHでの安定性の増加、細胞への取込みの増加、および細胞溶解物における活性の増加を提供するために最適化されたものである。本発明は、操作されたGAAポリペプチドを含む組成物を治療上のおよび他の目的に利用するための方法も提供する。
一部の実施形態では、本発明は、本質的に同じ条件下で野生型GAA酵素および/または参照GAAポリペプチドと比較したときに改善された特性を有する、操作されたGAAポリペプチド(本明細書では「組換えGAAポリペプチド」とも呼ばれる)ならびにそれらの生物活性断片およびアナログを提供する。本発明は、さらに、治療用および/または他の組成物における操作されたGAAポリペプチドならびにそれらの生物活性断片およびアナログの使用方法に関する。
本発明は、配列番号2、6、8、12、14、16、18、20、946、1956、2496、2880、および/または3104に対して少なくとも約70%、少なくとも約75%、少なくとも約80%、少なくとも約85%、少なくとも約90%、少なくとも約91%、少なくとも約92%、少なくとも約93%、少なくとも約94%、少なくとも約95%、少なくとも約96%、少なくとも約97%、少なくとも約98%、または少なくとも約99%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む組換え酸性アルファ-グルコシダーゼおよび/または生物活性組換え酸性アルファ-グルコシダーゼ断片を提供する。一部の実施形態では、本発明は、配列番号2、6、8、12、14、16、18、20、946、1956、2496、2880、および/または3104に対して少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、または少なくとも99%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む組換え酸性アルファ-グルコシダーゼおよび/または生物活性組換え酸性アルファ-グルコシダーゼ断片を提供する。一部の実施形態では、本発明は、配列番号2、6、8、12、14、16、18、20、946、1956、2496、2880、および/または3104を含むアミノ酸配列を含む組換え酸性アルファ-グルコシダーゼおよび/または生物活性組換え酸性アルファ-グルコシダーゼ断片も提供する。一部の実施形態では、本発明は、配列番号2、6、8、12、14、16、18、20、946、1956、2496、2880、および/または3104からなるアミノ酸配列を含む組換え酸性アルファ-グルコシダーゼおよび/または生物活性組換え酸性アルファ-グルコシダーゼ断片をさらに提供する。一部の実施形態では、組換え酸性アルファ-グルコシダーゼ配列は、配列番号3381および3383で示されるポリヌクレオチドによりそれぞれコードされるシグナルペプチド配列(例えば、配列番号3382または3384)を含む。一部の実施形態では、本発明の組換え酸性アルファ-グルコシダーゼをコードする組換えポリヌクレオチドは、シグナルペプチドをコードする57塩基対配列を含む。一部の実施形態では、本発明の組換え酸性アルファ-グルコシダーゼのポリペプチドは、19アミノ酸シグナルペプチドを含む。一部の代替実施形態では、組換え酸性アルファ-グルコシダーゼをコードする組換えポリヌクレオチドは、シグナルペプチドをコードする配列を含まない。一部の追加の実施形態では、組換え酸性アルファ-グルコシダーゼを含む組換えポリペプチドは、シグナルペプチドを含まない。本発明が、シグナルペプチドヌクレオチドまたはポリペプチド配列を含む組換え酸性アルファ-グルコシダーゼポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列に限定されることは、意図されていない。本発明が、シグナルペプチドヌクレオチドまたはポリペプチド配列を含まない組換え酸性アルファ-グルコシダーゼポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列に限定されることも、意図されていない。
本発明は、配列番号2に対して少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、または少なくとも99%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む組換え酸性アルファ-グルコシダーゼおよび/または生物活性組換え酸性アルファ-グルコシダーゼ断片を提供する。一部の実施形態では、酸性アルファ-グルコシダーゼは、27、27/944、28、29/478、30、88、107、109、109/842、110、113、135、137、138、148、150、247、274、276、278、375、403、414、418、418/499、421、426、437、444、455、463、471、471/478、476、489、527、547、581、610、642、668、670、692、725/732、750、753、786、820、862、871、895、897、930、934、および944から選択される位置または位置のセットに少なくとも1つの置換を含み、これらの位置は、配列番号2を参照して番号付けされている。一部の実施形態では、酸性アルファ-グルコシダーゼは、27P、27P/944W、27R、28P、28R、28S、29T/478T、30G、30K、30T、88G、88S、107G、107P、109G/842E、109P、110G、110L、113S、135A、135Q、137P、138A、148G、148Y、150G、247R、274G、276F、276Y、278A、278G、375E、403W、414P、418E/499R、418R、421S、426R、437S、444T、455V、463A、471Q/478S、471S、476A、476H、489R、527R、547G、581G、581T、610A、610G、610S、642M、642Q、642S、668H、670N、692Q、725N/732I、750P、753T、786P、786Y、820E、862G、871E、895R、897V、930R、934R、944G、および944Rから選択される1つまたは複数の位置に少なくとも1つの置換または置換セットを含み、これらの位置は、配列番号2を参照して番号付けされている。一部の実施形態では、酸性アルファ-グルコシダーゼは、F27P、F27P/C944W、F27R、L28P、L28R、L28S、L29T/A478T、V30G、V30K、V30T、K88G、K88S、Q107G、Q107P、L109G/G842E、L109P、Q110G、Q110L、Q113S、S135A、S135Q、E137P、M138A、T148G、T148Y、T150G、Q247R、D274G、A276F、A276Y、T278A、T278G、I375E、R403W、R414P、A418E/H499R、A418R、Q421S、G426R、A437S、A444T、R455V、E463A、K471Q/A478S、K471S、S476A、S476H、A489R、N527R、A547G、K581G、K581T、W610A、W610G、W610S、L642M、L642Q、L642S、S668H、L670N、T692Q、K725N/V732I、A750P、A753T、R786P、R786Y、G820E、R862G、L871E、K895R、T897V、C930R、L934R、C944G、およびC944Rから選択される1つまたは複数の位置に少なくとも1つの置換または置換セットを含み、これらの位置は、配列番号2を参照して番号付けされている。一部の実施形態では、酸性アルファ-グルコシダーゼは、29/218/240/668/700/744/869、29/218/240/700/869、29/240/596/668/700/744/869、29/240/596/668/869、36/106/150/218/527/750/883/894、106/112/150/218/414/527/793/883、106/150/169/218/414/486/527/750/894、106/150/169/218/414/486/527/894、106/150/169/218/414/486/749/793/883/894、106/150/169/218/414/486/750/793/883/894、106/150/169/218/414/486/793/883、106/150/169/218/414/486/894、106/150/169/218/414/749/750/793/883、106/150/169/218/414/749/793、106/150/169/218/414/749/793/883、106/150/169/218/486/527/749/793/894、106/150/169/218/486/749/883、106/150/169/218/486/883、106/150/169/218/749/800、106/150/169/414/486/749/750/883、106/150/169/527/749/793/883、106/150/169/749/793/883/894、106/150/218/331/414/486/527/733/749/793、106/150/218/414/486/642/750/793/883、106/150/218/414/486/750/793/894、106/150/218/414/527/749/750/883、106/150/218/414/527/749/793/883/894、106/150/218/414/749/750/793/883/894、106/150/218/414/749/793/883、106/150/218/486/527/749/894、106/150/218/486/793/883、106/150/218/527/749/750/793、106/150/218/527/793/894、106/150/218/749/750/793、106/150/218/793、106/150/218/793/894、106/150/245/793/883/894、106/150/414/749/750/793/894、106/150/414/749/793/894、106/150/486/527/750/793、106/150/486/749/793/883/894、106/150/749/793/883、106/169/185/218/414/749/750/793、106/191/280/402/414/444/727、106/191/414/444/522/928/944、106/191/414/489/928/944、106/280/402/414/444/489/727/944、150/169/218/414/527/793、150/218/414/486/749/750、150/218/414/486/750/793、150/218/414/486/750/793/883、150/218/414/749/750/793/894、150/218/414/749/793、150/218/527/749/793、150/218/749/750/793、150/218/749/793、150/414/486/527/750/894、150/414/486/749/750/793、150/486/750/883/894、169/486/750/793/883、180/275/402/518/547/610/638/669/671、180/402/431/507/547/610/669/671/793、180/402/507/547/610/671、191/280/402/414/444/465/842/928、191/280/402/414/444/489/500/944、191/280/414/444/489/500/522/842/928/944、191/280/414/444/489/522/727/944、191/280/414/489/842/928/944、191/280/414/944、191/414/522/842/944、196/402/431/547/610/638、218/668/700/869、224/402/507/518/547/638/668、269/275/431/518/547/638/668/669、275/281/402/431/507/518/610/668、275/281/402/431/518/547/610/669/671、275/281/402/507/518/547/638/669/671、275/281/402/518/547/610/638/671、275/281/402/518/547/610/668/669/887、275/281/402/547/610/638/669/671、275/281/431/518/547/638/669/671、275/281/507/547/669/671、275/281/610/638/668/669、275/281/671、275/377/402/507/518/669/671/715、275/402/431/507/547/671、275/402/431/518/610/638/669/671/922、275/402/507/547/610/638/668/669、275/402/507/547/610/638/669/671、275/402/507/547/610/671、275/402/547/610/638/669/671、275/402/547/638/669/671、275/402/638/669/671、275/431/507/518/547/668/669/671、275/431/507/518/610/669/671、275/431/507/547/610/638/671、275/431/518/547/638/668、275/431/518/610/638/669/671、275/431/638、275/507/518/547/610/638/668/669、275/507/518/547/638/669/671、275/507/547/610/638/669/671、275/507/547/668/669/671、275/518/671、280/402/536/928、281/402/507/518/547/610/638/669/671、281/402/507/547/638/669/671、281/402/518/547/610/638/668/669、281/402/518/547/668、281/431/507/518/547/610/638/668、402/431/518/547/610/668、402/431/518/547/671、402/431/518/610、402/431/547/638/671、431/507/518/541/547/638/669/671、431/507/518/669/671、507/547/610、507/547/638/669/671、547/610/638/671、および547/638/668から選択される位置または位置のセットに少なくとも1つの置換を含み、これらの位置は、配列番号2を参照して番号付けされている。一部の実施形態では、酸性アルファ-グルコシダーゼは、29Q/218S/240I/668D/700F/744V/869L、29Q/240I/596P/668D/869L、29Q/240I/596S/668D/700F/744V/869T、29V/218S/240I/700F/869T、36R/106P/150S/218S/527D/750P/883H/894R、106P/112S/150S/218S/414G/52
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8/414/486/750/793、150/218/414/486/750/793/883、150/218/414/749/750/793/894、150/218/414/749/793、150/414/486/527/750/894、150
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47G/668D、281V/431V/507L/518V/547G/610R/638I/668D、375E、402A/431V/518V/547G/610R/668D、402A/431V/518V/547G/671N、402A/431V/51
8V/610R、402A/431V/547G/638I/671N、403W、414P、418E/499R、431V/507L/518V/541E/547G/638I/669H/671N、431V/507L/518V/669H/671N、437S、471Q/478S、507L/547G/610R、507L/547G/638I/669H/671N、547G、547G/610R/638I/671N、547G/638I/668D、581G、581T、642Q、642S、670N、692Q、750P、753T、820E、871E、および944Gから選択される1つまたは複数の位置に少なくとも1つの置換または置換セットを含み、これらの位置は、配列番号2を参照して番号付けされている。一部の実施形態では、酸性アルファ-グルコシダーゼは、F27P、F27P/C944W、F27R、L28P、L28S、L29Q/L218S/L240I/S668D/H700F/I744V/I869L、L29Q/L240I/A596P/S668D/I869L、L29Q/L240I/A596S/S668D/H700F/I744V/I869T、L29T/A478T、L29V/L218S/L240I/H700F/I869T、V30G、V30K、V30T、G36R/K106P/T150S/L218S/N527D/A750P/R883H/Q894R、K106P/A112S/T150S/L218S/R414G/N527D/E793K/R883H、K106P/T150S/N169S/L218S/R414G/T486E/N527D/A750P/Q894R、K106P/T150S/N169S/L218S/R414G/T486E/N527D/Q894R、K106P/T150S/N169S/L218S/R414G/T486E/Q749E/E793K/R883H/Q894R、K106P/T150S/N169S/L218S/R414G/T486E/A750P/E793K/R883H/Q894R、K106P/T150S/N169S/L218S/R414G/T486E/E793K/R883H、K106P/T150S/N169S/L218S/R414G/T486E/Q894R、K106P/T150S/N169S/L218S/R414G/Q749E/A750P/E793K/R883H、K106P/T150S/N169S/L218S/R414G/Q749E/E793K、K106P/T150S/N169S/L218S/R414G/Q749E/E793K/R883H、K106P/T150S/N169S/L218S/T486E/Q749E/R883H、K106P/T150S/N169S/L218S/T486E/R883H、K106P/T150S/N169S/R414G/T486E/Q749E/A750P/R883H、K106P/T150S/N169S/N527D/Q749E/E793K/R883H、K106P/T150S/N169S/Q749E/E793K/R883H/Q894R、K106P/T150S/L218S/V331A/R414G/T486E/N527D/D733E/Q749E/E793K、K106P/T150S/L218S/R414G/T486E/L642F/A750P/E793K/R883H、K106P/T150S/L218S/R414G/T486E/A750P/E793K/Q894R、K106P/T150S/L218S/R414G/N527D/Q749E/A750P/R883H、K106P/T150S/L218S/R414G/N527D/Q749E/E793K/R883H/Q894G、K106P/T150S/L218S/R414G/Q749E/A750P/E793K/R883H/Q894R、K106P/T150S/L218S/R414G/Q749E/E793K/R883H、K106P/T150S/L218S/T486E/N527D/Q749E/Q894R、K106P/T150S/L218S/T486E/E793K/R883H、K106P/T150S/L218S/N527D/E793K/Q894G、K106P/T150S/P245S/E793K/R883H/Q894R、K106P/T150S/R414G/Q749E/A750P/E793K/Q894R、K106P/T150S/R414G/Q749E/E793K/Q894R、K106P/T150S/T486E/N527D/A750P/E793K、K106P/T150S/T486E/Q749E/E793K/R883H/Q894G、K106P/T150S/Q749E/E793K/R883H、K106P/N169S/V185G/L218S/R414G/Q749E/A750P/E793K、K106P/H191R/G280D/S402A/R414G/A444P/S727P、K106P/G280D/S402A/R414G/A444P/A489D/S727P/C944S、Q107G、L109G/G842E、L109P、Q110G、Q110L、S135Q、M138A、T148G、T148Y、T150G、T150S/L218S/R414G/T486A/A750P/E793K、T150S/L218S/R414G/T486E/Q749E/A750P、T150S/L218S/R414G/T486E/A750P/E793K/R883H、T150S/L218S/R414G/Q749E/A750P/E793K/Q894R、T150S/L218S/R414G/Q749E/E793K、T150S/R414G/T486E/N527D/A750P/Q894R、T150S/R414G/T486E/Q749E/A750P/E793K、T150S/T486E/A750P/R883H/Q894G、N169S/T486E/A750P/E793K/R883H、N180H/L275M/S402A/I518V/A547G/W610R/V638I/L669H/S671N、N180H/S402A/M431V/M507L/A547G/W610R/L669H/S671N/E793G、N180H/S402A/M507L/A547G/W610R/S671N、H191R/G280D/S402A/R414G/A444P/A489D/D500A/C944S、H191R/G280D/R414G/A444P/A489D/E522V/S727P/C944S、H191R/G280D/R414G/C944S、H191R/R414G/E522V/G842S/C944S、A196V/S402A/M431V/A547G/W610R/V638I、L218S/S668D/H700F/I869T、L224F/S402A/M507L/I518V/A547G/V638I/S668D、T269N/L275M/M431V/I518V/A547G/V638I/S668D/L669H、D274G、L275M/A281V/S402A/M431V/M507L/I518V/W610R/S668D、L275M/A281V/S402A/M507L/I518V/A547G/V638I/L669H/S671N、L275M/A281V/S402A/I518V/A547G/W610R/V638I/S671N、L275M/A281V/S402A/I518V/A547G/W610R/S668D/L669H/E887D、L275M/A281V/S402A/A547G/W610R/V638I/L669H/S671N、L275M/A281V/M507L/A547G/L669H/S671N、L275M/A281V/W610R/V638I/S668D/L669H、L275M/S402A/M431V/M507L/A547G/S671N、L275M/S402A/M507L/A547G/W610R/S671N、L275M/S402A/A547G/V638I/L669H/S671N、L275M/M431V/I518V/A547G/V638I/S668D、L275M/M431V/I518V/W610R/V638I/L669H/S671N、L275M/M431V/V638I、L275M/M507L/A547G/S668D/L669H/S671N、L275V/A281V/S402A/M431V/I518V/A547G/W610R/L669H/S671N、L275V/A281V/M431V/I518V/A547G/V638I/L669H/S671N、L275V/R377K/S402A/M507L/I518V/L669H/S671N/V715G、L275V/S402A/M431V/I518V/W610R/V638I/L669H/S671N/P922L、L275V/S402A/M507L/A547G/W610R/V638I/S668D/L669H、L275V/S402A/M507L/A547G/W610R/V638I/L669H/S671N、L275V/S402A/A547G/W610R/V638I/L669H/S671N、L275V/S402A/V638I/L669H/S671N、L275V/M431V/M507L/I518V/A547G/S668D/L669H/S671N、L275V/M431V/M507L/I518V/W610R/L669H/S671N、L275V/M431V/M507L/A547G/W610R/V638I/S671N、L275V/M507L/I518V/A547G/W610R/V638I/S668D/L669H、L275V/M507L/I518V/A547G/V638I/L669H/S671N、L275V/M507L/A547G/W610R/V638I/L669H/S671N、A276Y、A281V/S402A/M507L/I518V/A547G/W610R/V638I/L669H/S671N、A281V/S402A/M507L/A547G/V638I/L669H/S671N、A281V/S402A/I518V/A547G/W610R/V638I/S668D/L669H、A281V/S402A/I518V/A547G/S668D、A281V/M431V/M507L/I518V/A547G/W610R/V638I/S668D、I375E、S402A/M431V/I518V/A547G/W610R/S668D、S402A/M431V/I518V/A547G/S671N、S402A/M431V/I518V/W610R、S402A/M431V/A547G/V638I/S671N、R403W、R414P、A418E/H499R、M431V/M507L/I518V/G541E/A547G/V638I/L669H/S671N、M431V/M507L/I518V/L669H/S671N、A437S、K471Q/A478S、M507L/A547G/W610R、M507L/A547G/V638I/L669H/S671N、A547G、A547G/W610R/V638I/S671N、A547G/V638I/S668D、K581G、K581T、L642Q、L642S、L670N、T692Q、A750P、A753T、G820E、L871E、およびC944Gから選択される1つまたは複数の位置に少なくとも1つの置換または置換セットを含み、これらの位置は、配列番号2を参照して番号付けされている。
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8/414/486/750/793、150/218/414/486/750/793/883、150/218/414/749/750/793/894、150/218/414/749/793、150/414/486/527/750/894、150
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47G/668D、281V/431V/507L/518V/547G/610R/638I/668D、375E、402A/431V/518V/547G/610R/668D、402A/431V/518V/547G/671N、402A/431V/51
8V/610R、402A/431V/547G/638I/671N、403W、414P、418E/499R、431V/507L/518V/541E/547G/638I/669H/671N、431V/507L/518V/669H/671N、437S、471Q/478S、507L/547G/610R、507L/547G/638I/669H/671N、547G、547G/610R/638I/671N、547G/638I/668D、581G、581T、642Q、642S、670N、692Q、750P、753T、820E、871E、および944Gから選択される1つまたは複数の位置に少なくとも1つの置換または置換セットを含み、これらの位置は、配列番号2を参照して番号付けされている。一部の実施形態では、酸性アルファ-グルコシダーゼは、F27P、F27P/C944W、F27R、L28P、L28S、L29Q/L218S/L240I/S668D/H700F/I744V/I869L、L29Q/L240I/A596P/S668D/I869L、L29Q/L240I/A596S/S668D/H700F/I744V/I869T、L29T/A478T、L29V/L218S/L240I/H700F/I869T、V30G、V30K、V30T、G36R/K106P/T150S/L218S/N527D/A750P/R883H/Q894R、K106P/A112S/T150S/L218S/R414G/N527D/E793K/R883H、K106P/T150S/N169S/L218S/R414G/T486E/N527D/A750P/Q894R、K106P/T150S/N169S/L218S/R414G/T486E/N527D/Q894R、K106P/T150S/N169S/L218S/R414G/T486E/Q749E/E793K/R883H/Q894R、K106P/T150S/N169S/L218S/R414G/T486E/A750P/E793K/R883H/Q894R、K106P/T150S/N169S/L218S/R414G/T486E/E793K/R883H、K106P/T150S/N169S/L218S/R414G/T486E/Q894R、K106P/T150S/N169S/L218S/R414G/Q749E/A750P/E793K/R883H、K106P/T150S/N169S/L218S/R414G/Q749E/E793K、K106P/T150S/N169S/L218S/R414G/Q749E/E793K/R883H、K106P/T150S/N169S/L218S/T486E/Q749E/R883H、K106P/T150S/N169S/L218S/T486E/R883H、K106P/T150S/N169S/R414G/T486E/Q749E/A750P/R883H、K106P/T150S/N169S/N527D/Q749E/E793K/R883H、K106P/T150S/N169S/Q749E/E793K/R883H/Q894R、K106P/T150S/L218S/V331A/R414G/T486E/N527D/D733E/Q749E/E793K、K106P/T150S/L218S/R414G/T486E/L642F/A750P/E793K/R883H、K106P/T150S/L218S/R414G/T486E/A750P/E793K/Q894R、K106P/T150S/L218S/R414G/N527D/Q749E/A750P/R883H、K106P/T150S/L218S/R414G/N527D/Q749E/E793K/R883H/Q894G、K106P/T150S/L218S/R414G/Q749E/A750P/E793K/R883H/Q894R、K106P/T150S/L218S/R414G/Q749E/E793K/R883H、K106P/T150S/L218S/T486E/N527D/Q749E/Q894R、K106P/T150S/L218S/T486E/E793K/R883H、K106P/T150S/L218S/N527D/E793K/Q894G、K106P/T150S/P245S/E793K/R883H/Q894R、K106P/T150S/R414G/Q749E/A750P/E793K/Q894R、K106P/T150S/R414G/Q749E/E793K/Q894R、K106P/T150S/T486E/N527D/A750P/E793K、K106P/T150S/T486E/Q749E/E793K/R883H/Q894G、K106P/T150S/Q749E/E793K/R883H、K106P/N169S/V185G/L218S/R414G/Q749E/A750P/E793K、K106P/H191R/G280D/S402A/R414G/A444P/S727P、K106P/G280D/S402A/R414G/A444P/A489D/S727P/C944S、Q107G、L109G/G842E、L109P、Q110G、Q110L、S135Q、M138A、T148G、T148Y、T150G、T150S/L218S/R414G/T486A/A750P/E793K、T150S/L218S/R414G/T486E/Q749E/A750P、T150S/L218S/R414G/T486E/A750P/E793K/R883H、T150S/L218S/R414G/Q749E/A750P/E793K/Q894R、T150S/L218S/R414G/Q749E/E793K、T150S/R414G/T486E/N527D/A750P/Q894R、T150S/R414G/T486E/Q749E/A750P/E793K、T150S/T486E/A750P/R883H/Q894G、N169S/T486E/A750P/E793K/R883H、N180H/L275M/S402A/I518V/A547G/W610R/V638I/L669H/S671N、N180H/S402A/M431V/M507L/A547G/W610R/L669H/S671N/E793G、N180H/S402A/M507L/A547G/W610R/S671N、H191R/G280D/S402A/R414G/A444P/A489D/D500A/C944S、H191R/G280D/R414G/A444P/A489D/E522V/S727P/C944S、H191R/G280D/R414G/C944S、H191R/R414G/E522V/G842S/C944S、A196V/S402A/M431V/A547G/W610R/V638I、L218S/S668D/H700F/I869T、L224F/S402A/M507L/I518V/A547G/V638I/S668D、T269N/L275M/M431V/I518V/A547G/V638I/S668D/L669H、D274G、L275M/A281V/S402A/M431V/M507L/I518V/W610R/S668D、L275M/A281V/S402A/M507L/I518V/A547G/V638I/L669H/S671N、L275M/A281V/S402A/I518V/A547G/W610R/V638I/S671N、L275M/A281V/S402A/I518V/A547G/W610R/S668D/L669H/E887D、L275M/A281V/S402A/A547G/W610R/V638I/L669H/S671N、L275M/A281V/M507L/A547G/L669H/S671N、L275M/A281V/W610R/V638I/S668D/L669H、L275M/S402A/M431V/M507L/A547G/S671N、L275M/S402A/M507L/A547G/W610R/S671N、L275M/S402A/A547G/V638I/L669H/S671N、L275M/M431V/I518V/A547G/V638I/S668D、L275M/M431V/I518V/W610R/V638I/L669H/S671N、L275M/M431V/V638I、L275M/M507L/A547G/S668D/L669H/S671N、L275V/A281V/S402A/M431V/I518V/A547G/W610R/L669H/S671N、L275V/A281V/M431V/I518V/A547G/V638I/L669H/S671N、L275V/R377K/S402A/M507L/I518V/L669H/S671N/V715G、L275V/S402A/M431V/I518V/W610R/V638I/L669H/S671N/P922L、L275V/S402A/M507L/A547G/W610R/V638I/S668D/L669H、L275V/S402A/M507L/A547G/W610R/V638I/L669H/S671N、L275V/S402A/A547G/W610R/V638I/L669H/S671N、L275V/S402A/V638I/L669H/S671N、L275V/M431V/M507L/I518V/A547G/S668D/L669H/S671N、L275V/M431V/M507L/I518V/W610R/L669H/S671N、L275V/M431V/M507L/A547G/W610R/V638I/S671N、L275V/M507L/I518V/A547G/W610R/V638I/S668D/L669H、L275V/M507L/I518V/A547G/V638I/L669H/S671N、L275V/M507L/A547G/W610R/V638I/L669H/S671N、A276Y、A281V/S402A/M507L/I518V/A547G/W610R/V638I/L669H/S671N、A281V/S402A/M507L/A547G/V638I/L669H/S671N、A281V/S402A/I518V/A547G/W610R/V638I/S668D/L669H、A281V/S402A/I518V/A547G/S668D、A281V/M431V/M507L/I518V/A547G/W610R/V638I/S668D、I375E、S402A/M431V/I518V/A547G/W610R/S668D、S402A/M431V/I518V/A547G/S671N、S402A/M431V/I518V/W610R、S402A/M431V/A547G/V638I/S671N、R403W、R414P、A418E/H499R、M431V/M507L/I518V/G541E/A547G/V638I/L669H/S671N、M431V/M507L/I518V/L669H/S671N、A437S、K471Q/A478S、M507L/A547G/W610R、M507L/A547G/V638I/L669H/S671N、A547G、A547G/W610R/V638I/S671N、A547G/V638I/S668D、K581G、K581T、L642Q、L642S、L670N、T692Q、A750P、A753T、G820E、L871E、およびC944Gから選択される1つまたは複数の位置に少なくとも1つの置換または置換セットを含み、これらの位置は、配列番号2を参照して番号付けされている。
本発明は、配列番号6に対して少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、または少なくとも99%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む組換え酸性アルファ-グルコシダーゼおよび/または生物活性組換え酸性アルファ-グルコシダーゼ断片を提供する。一部の実施形態では、酸性アルファ-グルコシダーゼは、27、27/944、28、29/218/240/668/700/744/869、29/218/240/700/869、29/240/596/668/700/744/869、29/240/596/668/869、29/478、30、36/106/150/218/527/750/883/894、88、106/112/150/218/414/527/793/883、106/150/169/218/414/486/527/750/894、106/150/169/218/414/486/527/894、106/150/169/218/414/486/749/793/883/894、106/150/169/218/414/486/750/793/883/894、106/150/169/218/414/486/793/883、106/150/169/218/414/486/894、106/150/169/218/414/749/750/793/883、106/150/169/218/414/749/793、106/150/169/218/414/749/793/883、106/150/169/218/486/527/749/793/894、106/150/169/218/486/749/883、106/150/169/218/486/883、106/150/169/218/749/800、106/150/169/414/486/749/750/883、106/150/169/527/749/793/883、106/150/169/749/793/883/894、106/150/218/331/414/486/527/733/749/793、106/150/218/414/486/642/750/793/883、106/150/218/414/486/750/793/894、106/150/218/414/527/749/750/883、106/150/218/414/527/749/793/883/894、106/150/218/414/749/750/793/883/894、106/150/218/414/749/793/883、106/150/218/486/527/749/894、106/150/218/486/793/883、106/150/218/527/749/750/793、106/150/218/527/793/894、106/150/218/749/750/793、106/150/218/793、106/150/218/793/894、106/150/245/793/883/894、106/150/414/749/750/793/894、106/150/414/749/793/894、106/150/486/527/750/793、106/150/486/749/793/883/894、106/150/749/793/883、106/169/185/218/414/749/750/793、106/191/280/402/414/444/727、106/191/414/444/522/928/944、106/191/414/489/928/944、106/280/402/414/444/489/727/944、107、109、109/842、110、113、135、137、138、148、150、150/169/218/414/527/793、150/218/414/486/749/750、150/218/414/486/750/793、150/218/414/486/750/793/883、150/218/414/749/750/793/894、150/218/414/749/793、150/218/527/749/793、150/218/749/750/793、150/218/749/793、150/414/486/527/750/894、150/414/486/749/750/793、150/486/750/883/894、169/486/750/793/883、180/275/402/518/547/610/638/669/671、180/402/431/507/547/610/669/671/793、180/402/507/547/610/671、191/280/402/414/444/465/842/928、191/280/402/414/444/489/500/944、191/280/414/444/489/500/522/842/928/944、191/280/414/444/489/522/727/944、191/280/414/489/842/928/944、191/280/414/944、191/414/522/842/944、196/402/431/547/610/638、218/668/700/869、224/402/507/518/547/638/668、247、269/275/431/518/547/638/668/669、274、275/281/402/431/507/518/610/668、275/281/402/431/518/547/610/669/671、275/281/402/507/518/547/638/669/671、275/281/402/518/547/610/638/671、275/281/402/518/547/610/668/669/887、275/281/402/547/610/638/669/671、275/281/431/518/547/638/669/671、275/281/507/547/669/671、275/281/610/638/668/669、275/281/671、275/377/402/507/518/669/671/715、275/402/431/507/547/671、275/402/431/518/610/638/669/671/922、275/402/507/547/610/638/668/669、275/402/507/547/610/638/669/671、275/402/507/547/610/671、275/402/547/610/638/669/671、275/402/547/638/669/671、275/402/638/669/671、275/431/507/518/547/668/669/671、275/431/507/518/610/669/671、275/431/507/547/610/638/671、275/431/518/547/638/668、275/431/518/610/638/669/671、275/431/638、275/507/518/547/610/638/668/669、275/507/518/547/638/669/671、275/507/547/610/638/669/671、275/507/547/668/669/671、275/518/671、276、278、280/402/536/928、281/402/507/518/547/610/638/669/671、281/402/507/547/638/669/671、281/402/518/547/610/638/668/669、281/402/518/547/668、281/431/507/518/547/610/638/668、375、402/431/518/547/610/668、402/431/518/547/671、402/431/518/610、402/431/547/638/671、403、414、418、418/499、421、426、431/507/518/541/547/638/669/671、431/507/518/669/671、437、444、455、463、471、471/478、476、489、507/547/610、507/547/638/669/671、527、547、547/610/638/671、547/638/668、581、610、642、668、670、692、725/732、750、753、786、820、862、871、895、897、934、および944から選択される位置または位置のセットに少なくとも1つの置換を含み、これらの位置は、配列番号6を参照して番号付けされている。一部の実施形態では、酸性アルファ-グルコシダーゼは、27P、27P/944W、27R、28P、28R、28S、29Q/218S/240I/668D/700F/744V/869L、29Q/240I/596P/668D/869L、29Q/240I/596S/668D/700F/744V/869T、29T/478T、29V/218S/240I/700F/869T、30G、30K、30T、36R/106P/150S/218S/527D/750P/883H/894R、88G、88S、106P/112S/150S/218S/414G/527D/793K/883H、106P/150S/169S/218S/414G/486E/527D/750P/894R、106P/150S/169S/218S/414G/486E/527D/894R、106P/150S/169S/218S/414G/486E/749E/793K/883H/894R、106P/150S/169S/218S/414G/486E/750P/793K/883H/894R、106P/150S/169S/218S/414G/486E/793K/883H、106P/150S/169S/218S/414G/486E/894R、106P/150S/169S/218S/414G/749E/750P/793K/883H、106P/150S/169S/218S/414G/749E/793K、106P/150S/169S/218S/414G/749E/793K/883H、106P/150S/169S/218S/486E/527D/749E/793K/894R、106P/150S/169S/218S/486E/749E/883H、106P/150S/169S/218S/486E/883H、106P/150S/169S/218S/749E/800A、106P/150S/169S/414G/486E/749E/750P/883H、106P/150S/169S/527D/749E/793K/883H、106P/150S/169S/749E/793K/883H/894R、106P/150S/218S/331A/414G/486E/527D/733E/749E/793K、106P/150S/218S/414G/486E/642F/750P/793K/883H、106P/150S/218S/414G/486E/750P/793K/894R、106P/150S/218S/414G/527D/749E/750P/883H、106P/150S/218S/414G/527D/749E/793K/883H/894G、106P/150S/218S/414G/749E/750P/793K/883H/894R、106P/150S/218S/414G/749E/793K/883H、106P/150S/218S/486E/527D/749E/894R、106P/150S/218S/486E/793K/883H、106P/150S/218S/527D/749E/750P/793K、106P/150S/218S/527D/793K/894G、106P/150S/218S/749E/7
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50S/T486E/Q749E/E793K/R883H/Q894G、K106P/T150S/Q749E/E793K/R883H、K106P/N169S/V185G/L218S/R414G/Q749E/A750P/E793K、K106P/H19
1R/G280D/S402A/R414G/A444P/S727P、K106P/H191R/R414G/A444P/E522V/D928T/C944S、K106P/H191R/R414G/A489D/D928T/C944S、K106P/G280D/S402A/R414G/A444P/A489D/S727P/C944S、Q107G、Q107P、L109G/G842E、L109P、Q110G、Q110L、Q113S、S135A、S135Q、E137P、M138A、T148G、T148Y、T150G、T150S/N169S/L218S/R414G/N527D/E793K、T150S/L218S/R414G/T486A/A750P/E793K、T150S/L218S/R414G/T486E/Q749E/A750P、T150S/L218S/R414G/T486E/A750P/E793K/R883H、T150S/L218S/R414G/Q749E/A750P/E793K/Q894R、T150S/L218S/R414G/Q749E/E793K、T150S/L218S/N527D/Q749E/E793K、T150S/L218S/Q749E/A750P/E793K、T150S/L218S/Q749E/E793K、T150S/R414G/T486E/N527D/A750P/Q894R、T150S/R414G/T486E/Q749E/A750P/E793K、T150S/T486E/A750P/R883H/Q894G、N169S/T486E/A750P/E793K/R883H、N180H/L275M/S402A/I518V/A547G/W610R/V638I/L669H/S671N、N180H/S402A/M431V/M507L/A547G/W610R/L669H/S671N/E793G、N180H/S402A/M507L/A547G/W610R/S671N、H191R/G280D/S402A/R414G/A444P/G465E/G842S/D928T、H191R/G280D/S402A/R414G/A444P/A489D/D500A/C944S、H191R/G280D/R414G/A444P/A489D/D500A/E522V/G842S/D928T/C944S、H191R/G280D/R414G/A444P/A489D/E522V/S727P/C944S、H191R/G280D/R414G/A489D/G842S/D928T/C944S、H191R/G280D/R414G/C944S、H191R/R414G/E522V/G842S/C944S、A196V/S402A/M431V/A547G/W610R/V638I、L218S/S668D/H700F/I869T、L224F/S402A/M507L/I518V/A547G/V638I/S668D、Q247R、T269N/L275M/M431V/I518V/A547G/V638I/S668D/L669H、D274G、L275M/A281V/S402A/M431V/M507L/I518V/W610R/S668D、L275M/A281V/S402A/M507L/I518V/A547G/V638I/L669H/S671N、L275M/A281V/S402A/I518V/A547G/W610R/V638I/S671N、L275M/A281V/S402A/I518V/A547G/W610R/S668D/L669H/E887D、L275M/A281V/S402A/A547G/W610R/V638I/L669H/S671N、L275M/A281V/M507L/A547G/L669H/S671N、L275M/A281V/W610R/V638I/S668D/L669H、L275M/S402A/M431V/M507L/A547G/S671N、L275M/S402A/M507L/A547G/W610R/S671N、L275M/S402A/A547G/V638I/L669H/S671N、L275M/M431V/I518V/A547G/V638I/S668D、L275M/M431V/I518V/W610R/V638I/L669H/S671N、L275M/M431V/V638I、L275M/M507L/A547G/S668D/L669H/S671N、L275V/A281V/S402A/M431V/I518V/A547G/W610R/L669H/S671N、L275V/A281V/M431V/I518V/A547G/V638I/L669H/S671N、L275V/A281V/S671N、L275V/R377K/S402A/M507L/I518V/L669H/S671N/V715G、L275V/S402A/M431V/I518V/W610R/V638I/L669H/S671N/P922L、L275V/S402A/M507L/A547G/W610R/V638I/S668D/L669H、L275V/S402A/M507L/A547G/W610R/V638I/L669H/S671N、L275V/S402A/A547G/W610R/V638I/L669H/S671N、L275V/S402A/V638I/L669H/S671N、L275V/M431V/M507L/I518V/A547G/S668D/L669H/S671N、L275V/M431V/M507L/I518V/W610R/L669H/S671N、L275V/M431V/M507L/A547G/W610R/V638I/S671N、L275V/M507L/I518V/A547G/W610R/V638I/S668D/L669H、L275V/M507L/I518V/A547G/V638I/L669H/S671N、L275V/M507L/A547G/W610R/V638I/L669H/S671N、L275V/I518V/S671N、A276F、A276Y、T278A、T278G、G280D/S402A/V536I/D928T、A281V/S402A/M507L/I518V/A547G/W610R/V638I/L669H/S671N、A281V/S402A/M507L/A547G/V638I/L669H/S671N、A281V/S402A/I518V/A547G/W610R/V638I/S668D/L669H、A281V/S402A/I518V/A547G/S668D、A281V/M431V/M507L/I518V/A547G/W610R/V638I/S668D、I375E、S402A/M431V/I518V/A547G/W610R/S668D、S402A/M431V/I518V/A547G/S671N、S402A/M431V/I518V/W610R、S402A/M431V/A547G/V638I/S671N、R403W、R414P、A418E/H499R、A418R、Q421S、G426R、M431V/M507L/I518V/G541E/A547G/V638I/L669H/S671N、M431V/M507L/I518V/L669H/S671N、A437S、A444T、R455V、E463A、K471Q/A478S、K471S、S476A、S476H、A489R、M507L/A547G/W610R、M507L/A547G/V638I/L669H/S671N、N527R、A547G、A547G/W610R/V638I/S671N、A547G/V638I/S668D、K581G、K581T、W610A、W610G、W610S、L642M、L642Q、L642S、S668H、L670N、T692Q、K725N/V732I、A750P、A753T、R786P、R786Y、G820E、R862G、L871E、K895R、T897V、L934R、C944G、およびC944Rから選択される位置または位置のセットに少なくとも1つの置換を含み、これらの位置は、配列番号6を参照して番号付けされている。
本発明は、配列番号8に対して少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、または少なくとも99%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む組換え酸性アルファ-グルコシダーゼおよび/または生物活性組換え酸性アルファ-グルコシダーゼ断片を提供する。一部の実施形態では、酸性アルファ-グルコシダーゼは、4、27、27/28/489、27/418/478、28、28/29、28/29/113/135/138、28/29/113/135/418、28/29/135、28/29/418、29/113/126/135/193、29/113/135、29/113/135/455、29/113/138、29/148、29/478、106、106/138/218/431/671/749、106/218/281、106/218/455、106/218/455/507/749、106/489/671、106/638、106/671/934、113、113/135/418、113/418/455/478/581、113/418/478/489/581、135、135/148/150/418、135/478/489/581、135/489、135/944、138/218/668/671、138/218/749/934、138/671/749/934、157、218、218/281、218/281/431、218/281/671、218/431、218/431/489/507/749/934、218/455、218/507/749、218/507/934、218/638/671、218/749、281/431/489/668、345/934、418、418/489、431/668/671、489/638/934、489/671/934、489/749、489/934、507/668、507/671/934、671/749、671/934、および749/784から選択される位置または位置のセットに少なくとも1つの置換を含み、これらの位置は、配列番号8を参照して番号付けされている。一部の実施形態では、酸性アルファ-グルコシダーゼは、4H、27P/28S/489R、27P/418E/478T、27R、28S、28S/29T、28S/29T/113S/135Q/138A、28S/29T/113S/135Q/418E、28S/29T/135Q、28S/29T/418E、29T/113S/126Q/135Q/193Q、29T/113S/135Q、29T/113S/135Q/455V、29T/113S/138A、29T/148G、29T/478T、106P、106P/138A/218S/431V/671N/749E、106P/218S/281V、106P/218S/455V、106P/218S/455V/507L/749E、106P/489R/671N、106P/638I、106P/671N/934R、113S、113S/135Q/418E、113S/418E/455V/478T/581T、113S/418E/478T/489R/581T、135P/944Y、135Q、135Q/148G/150G/418E、135Q/478T/489R/581T、135Q/489R、138A/218S/668D/671N、138A/218S/749E/934R、138A/671N/749E/934R、157M、218S、218S/281V、218S/281V/431V、218S/281V/671N、218S/431V、218S/431V/489R/507L/749E/934R、218S/455V、218S/507L/749E、218S/507L/934R、218S/638I/671N、218S/749E、281V/431V/489R/668D、345K/934R、418E、418E/489R、431V/668D/671N、489R/638I/934R、489R/671N/934R、489R/749E、489R/934R、507L/668D、507L/671N/934R、671N/749E、671N/934R、および749E/784Tから選択される1つまたは複数の位置に少なくとも1つの置換または置換セットを含み、これらの位置は、配列番号8を参照して番号付けされている。一部の実施形態では、酸性アルファ-グルコシダーゼは、P4H、F27P/L28S/A489R、F27P/A418E/A478T、F27R、L28S、L28S/L29T、L28S/L29T/Q113S/S135Q/M138A、L28S/L29T/Q113S/S135Q/A418E、L28S/L29T/S135Q、L28S/L29T/A418E、L29T/Q113S/P126Q/S135Q/H193Q、L29T/Q113S/S135Q、L29T/Q113S/S135Q/R455V、L29T/Q113S/M138A、L29T/T148G、L29T/A478T、K106P、K106P/M138A/L218S/M431V/S671N/Q749E、K106P/L218S/A281V、K106P/L218S/R455V、K106P/L218S/R455V/M507L/Q749E、K106P/A489R/S671N、K106P/V638I、K106P/S671N/L934R、Q113S、Q113S/S135Q/A418E、Q113S/A418E/R455V/A478T/K581T、Q113S/A418E/A478T/A489R/K581T、S135P/C944Y、S135Q、S135Q/T148G/S150G/A418E、S135Q/A478T/A489R/K581T、S135Q/A489R、M138A/L218S/S668D/S671N、M138A/L218S/Q749E/L934R、M138A/S671N/Q749E/L934R、L157M、L218S、L218S/A281V、L218S/A281V/M431V、L218S/A281V/S671N、L218S/M431V、L218S/M431V/A489R/M507L/Q749E/L934R、L218S/R455V、L218S/M507L/Q749E、L218S/M507L/L934R、L218S/V638I/S671N、L218S/Q749E、A281V/M431V/A489R/S668D、Q345K/L934R、A418E、A418E/A489R、M431V/S668D/S671N、A489R/V638I/L934R、A489R/S671N/L934R、A489R/Q749E、A489R/L934R、M507L/S668D、M507L/S671N/L934R、S671N/Q749E、S671N/L934R、およびQ749E/A784から選択される1つまたは複数の位置に少なくとも1つの置換または置換セットを含み、これらの位置は、配列番号8を参照して番号付けされている。一部の実施形態では、酸性アルファ-グルコシダーゼは、27、27/418/478、28、28/29、28/29/113/135/138、28/29/113/135/418、28/29/135、28/29/418、29/113/126/135/193、29/113/135、29/113/135/455、29/113/138、29/148、29/478、106、106/138/218/431/671/749、106/489/671、106/638、113/135/418、113/418/455/478/581、113/418/478/489/581、135、135/148/150/418、135/478/489/581、135/944、138/218/668/671、157、218/638/671、418、418/489、431/668/671、507/668、および671/749から選択される1つまたは複数の位置に少なくとも1つの置換または置換セットを含み、これらの位置は、配列番号8を参照して番号付けされている。一部の実施形態では、酸性アルファ-グルコシダーゼは、27P/418E/478T、27R、28S、28S/29T、28S/29T/113S/135Q/138A、28S/29T/113S/135Q/418E、28S/29T/135Q、28S/29T/418E、29T/113S/126Q/135Q/193Q、29T/113S/135Q、29T/113S/135Q/455V、29T/113S/138A、29T/148G、29T/478T、106P、106P/138A/218S/431V/671N/749E、106P/489R/671N、106P/638I、113S/135Q/418E、113S/418E/455V/478T/581T、113S/418E/478T/489R/581T、135P/944Y、135Q、135Q/148G/150G/418E、135Q/478T/489R/581T、138A/218S/668D/671N、157M、218S/638I/671N、418E、418E/489R、431V/668D/671N、507L/668D、および671N/749Eから選択される1つまたは複数の位置に少なくとも1つの置換または置換セットを含み、これらの位置は、配列番号8を参照して番号付けされている。一部の実施形態では、酸性アルファ-グルコシダーゼは、F27P/A418E/A478T、F27R、L28S、L28S/L29T、L28S/L29T/Q113S/S135Q/M138A、L28S/L29T/Q113S/S135Q/A418E、L28S/L29T/S135Q、L28S/L29T/A418E、L29T/Q113S/P126Q/S135Q/H193Q、L29T/Q113S/S135Q、L29T/Q113S/S135Q/R455V、L29T/Q113S/M138A、L29T/T148G、L29T/A478T、K106P、K106P/M138A/L218S/M431V/S671N/Q749E、K106P/A489R/S671N、K106P/V638I、Q113S/S135Q/A418E、Q113S/A418E/R455V/A478T/K581T、Q113S/A418E/A478T/A489R/K581T、S135P/C944Y、S135Q、S135Q/T148G/S150G/A418E、S135Q/A478T/A489R/K581T、M138A/L218S/S668D/S671N、L157M、L218S/V638I/S671N、A418E、A418E/A489R、M431V/S668D/S671N、M507L/S668D、およびS671N/Q749Eから選択される1つまたは複数の位置に少なくとも1つの置換または置換セットを含み、これらの位置は、配列番号8を参照して番号付けされている。
本発明は、配列番号12に対して少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、または少なくとも99%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む組換え酸性アルファ-グルコシダーゼおよび/または生物活性組換え酸性アルファ-グルコシダーゼ断片も提供する。一部の実施形態では、酸性アルファ-グルコシダーゼは、4、27、27/28/489、27/418/478、28、28/29、28/29/113/135/138、28/29/113/135/418、28/29/135、28/29/418、29/113/126/135/193、29/113/135、29/113/135/455、29/113/138、29/148、29/478、106、106/138/218/431/671/749、106/218/281、106/218/455、106/218/455/507/749、106/489/671、106/638、106/671/934、113、113/135/418、113/418/455/478/581、113/418/478/489/581、135、135/148/150/418、135/478/489/581、135/489、135/944、138/218/668/671、138/218/749/934、138/671/749/934、157、218、218/281/431、218/281/671、218/431、218/455、218/507/749、218/638/671、218/749、281/431/489/668、345/934、418、418/489、431/668/671、489/638/934、489/671/934、489/749、489/934、507/668、507/671/934、671/749、671/934、および749/784から選択される位置または位置のセットに少なくとも1つの置換を含み、これらの位置は、配列番号12を参照して番号付けされている。一部の実施形態では、酸性アルファ-グルコシダーゼは、4H、27P/28S/489R、27P/418E/478T、27R、28S、28S/29T、28S/29T/113S/135Q/138A、28S/29T/113S/135Q/418E、28S/29T/135Q、28S/29T/418E、29T/113S/126Q/135Q/193Q、29T/113S/135Q、29T/113S/135Q/455V、29T/113S/138A、29T/148G、29T/478T、106P、106P/138A/218S/431V/671N/749E、106P/218S/281V、106P/218S/455V、106P/218S/455V/507L/749E、106P/489R/671N、106P/638I、106P/671N/934R、113S、113S/135Q/418E、113S/418E/455V/478T/581T、113S/418E/478T/489R/581T、135P/944Y、135Q、135Q/148G/150G/418E、135Q/478T/489R/581T、135Q/489R、138A/218S/668D/671N、138A/218S/749E/934R、138A/671N/749E/934R、157M、218S、218S/281V/431V、218S/281V/671N、218S/431V、218S/455V、218S/507L/749E、218S/638I/671N、218S/749E、281V/431V/489R/668D、345K/934R、418E、418E/489R、431V/668D/671N、489R/638I/934R、489R/671N/934R、489R/749E、489R/934R、507L/668D、507L/671N/934R、671N/749E、671N/934R、および749E/784Tから選択される位置または位置のセットに少なくとも1つの置換を含み、これらの位置は、配列番号12を参照して番号付けされている。一部の実施形態では、酸性アルファ-グルコシダーゼは、P4H、F27P/L28S/A489R、F27P/A418E/A478T、F27R、L28S、L28S/L29T、L28S/L29T/Q113S/S135Q/M138A、L28S/L29T/Q113S/S135Q/A418E、L28S/L29T/S135Q、L28S/L29T/A418E、L29T/Q113S/P126Q/S135Q/H193Q、L29T/Q113S/S135Q、L29T/Q113S/S135Q/R455V、L29T/Q113S/M138A、L29T/T148G、L29T/A478T、K106P、K106P/M138A/L218S/M431V/S671N/Q749E、K106P/L218S/A281V、K106P/L218S/R455V、K106P/L218S/R455V/M507L/Q749E、K106P/A489R/S671N、K106P/V638I、K106P/S671N/L934R、Q113S、Q113S/S135Q/A418E、Q113S/A418E/R455V/A478T/K581T、Q113S/A418E/A478T/A489R/K581T、S135P/C944Y、S135Q、S135Q/T148G/S150G/A418E、S135Q/A478T/A489R/K581T、S135Q/A489R、M138A/L218S/S668D/S671N、M138A/L218S/Q749E/L934R、M138A/S671N/Q749E/L934R、L157M、L218S、L218S/A281V/M431V、L218S/A281V/S671N、L218S/M431V、L218S/R455V、L218S/M507L/Q749E、L218S/V638I/S671N、L218S/Q749E、A281V/M431V/A489R/S668D、Q345K/L934R、A418E、A418E/A489R、M431V/S668D/S671N、A489R/V638I/L934R、A489R/S671N/L934R、A489R/Q749E、A489R/L934R、M507L/S668D、M507L/S671N/L934R、S671N/Q749E、S671N/L934R、およびQ749E/A784Tから選択される位置または位置のセットに少なくとも1つの置換を含み、これらの位置は、配列番号12を参照して番号付けされている。
本発明は、配列番号14に対して少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、または少なくとも99%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む組換え酸性アルファ-グルコシダーゼおよび/または生物活性組換え酸性アルファ-グルコシダーゼ断片を提供する。本発明は、配列番号16に対して少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、または少なくとも99%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む組換え酸性アルファ-グルコシダーゼおよび/または生物活性組換え酸性アルファ-グルコシダーゼ断片を提供する。一部の実施形態では、酸性アルファ-グルコシダーゼは、22、24、27、27/165、30、33、34、37/62、37/62/79/196/696/862、37/62/523、37/62/523/793、37/64/66/79/154/523/681/793/862、37/79/154/793、37/196、37/528/696/793、37/528/790、37/528/790/793/862、37/790/793、39、39/58/489/725/830/842/930/944、39/70/109/830/842、39/70/489/612、39/70/725、39/267、39/267/489/522/612/830/842、39/267/489/830/944、39/489/500/612、39/500/612、40、44/157、47、49、50、55、60/500/612、62/79/154/862、62/79/196/681/862、62/79/523/528/790、62/79/790/793、62/79/862、62/92、62/92/790/793、62/106/523/528/696/793/862、62/154/696/793/862、62/793/862、68、70、70/267/725/944、70/267/930/944、70/489/930、70/725/830/860/930/944、77、79/154/681、79/154/793/862、79/862、89、97、106/154、107、109、109/522/612/725、109/522/830/944、109/612、118、149、157、158、178、179、196/528/681/790/793、207、208、217、267/489/500/725/830/930、267/522/725、352、385、424、448、463、489/830/944、500、500/612/830/860、500/860/930、500/930/944、522/725、523、523/790/793、528/681、528/793、528/862、672、673、725、734、740、753、774、778、793、830、844、862、875、880、892、902、922、925、930、932、934、938、および944から選択される位置または位置のセットに少なくとも1つの置換を含み、これらの位置は、配列番号14および/または16を参照して番号付けされている。一部の実施形態では、酸性アルファ-グルコシダーゼは、22R、24E、24R、24W、27A、27G、27G/165I、27K、27R、27S、27V、27W、30D、30L、33G、33P、34D、34M、34T、37F/62E、37F/62E/79S/196T/696S/862Q、37F/62E/523N、37F/62E/523N/793K、37F/64Q/66G/79S/154R/523N/681Q/793K/862Q、37F/79S/154R/793K、37F/196T、37F/528S/696S/793K、37F/528S/790V、37F/528S/790V/793K/862Q、37F/790V/793K、39D、39H、39Q、39Q/58L/489D/725E/830K/842S/930P/944S、39Q/70A/109P/830K/842S、39Q/70A/489D/612D、39Q/70A/725E、39Q/267K、39Q/267K/489D/522V/612D/830K/842S、39Q/267K/489D/830K/944S、39Q/489D/500A/612D、39Q/500A/612D、40W、44I/157V、47G、47R、49A、49G、50G、50L、50V、55C、55L、60V/500A/612D、62E/79S/154R/862Q、62E/79S/196T/681Q/862Q、62E/79S/523N/528S/790V、62E/79S/790V/793K、62E/79S/862Q、62E/92R、62E/92R/790V/793K、62E/106R/523N/528S/696S/793K/862Q、62E/154R/696S/793K/862Q、62E/793K/862Q、68N、68S、68W、70A/267K/725E/944S、70A/267K/930P/944S、70A/489D/930P、70A/725E/830K/860F/930P/944S、70Q、77W、79S/154R/681Q、79S/154R/793K/862Q、79S/862Q、89R、97D、97G、106R/154R、107G、109D、109P/522V/612D/725E、109P/522V/830K/944S、109P/612D、118F、149R、157Q、158E、158F、178G、178V、179L、196T/528S/681Q/790V/793K、207R、207Y、208G、208I、217A、217D、267K/489D/500A/725E/830K/930P、267K/522V/725E、352K、352V、385G、424K、448L、463A、489D/830K/944S、500A、500A/612D/830K/860F、500A/860F/930P、500A/930P/944S、522V/725E、523N、523N/790V/793K、528S/681Q、528S/793K、528S/862Q、672E、672K、673N、673R、725F、725V、734K、740G、740Q、753S、774G、774S、778Q、793K、830V、844R、862Q、875D、880R、892L、902L、922E、925A、925W、930P、932A、934F、938A、938P、944R、および944Sから選択される1つまたは複数の位置に少なくとも1つの置換または置換セットを含み、これらの位置は、配列番号14および/または16を参照して番号付けされている。一部の実施形態では、酸性アルファ-グルコシダーゼは、I22R、L24E、L24R、L24W、F27A、F27G、F27G/M165I、F27K、F27R、F27S、F27V、F27W、V30D、V30L、E33G、E33P、L34D、L34M、L34T、S37F/A62E、S37F/A62E/N79S/A196T/A696S/R862Q、S37F/A62E/D523N、S37F/A62E/D523N/E793K、S37F/P64Q/R66G/N79S/K154R/D523N/E681Q/E793K/R862Q、S37F/N79S/K154R/E793K、S37F/A196T、S37F/N528S/A696S/E793K、S37F/N528S/I790V、S37F/N528S/I790V/E793K/R862Q、S37F/I790V/E793K、P39D、P39H、P39Q、P39Q/R58L/A489D/K725E/Q830K/G842S/C930P/C944S、P39Q/V70A/L109P/Q830K/G842S、P39Q/V70A/A489D/S612D、P39Q/V70A/K725E、P39Q/R267K、P39Q/R267K/A489D/E522V/S612D/Q830K/G842S、P39Q/R267K/A489D/Q830K/C944S、P39Q/A489D/D500A/S612D、P39Q/D500A/S612D、V40W、T44I/L157V、A47G、A47R、Q49A、Q49G、Q50G、Q50L、Q50V、P55C、P55L、A60V/D500A/S612D、A62E/N79S/K154R/R862Q、A62E/N79S/A196T/E681Q/R862Q、A62E/N79S/D523N/N528S/I790V、A62E/N79S/I790V/E793K、A62E/N79S/R862Q、A62E/Q92R、A62E/Q92R/I790V/E793K、A62E/K106R/D523N/N528S/A696S/E793K/R862Q、A62E/K154R/A696S/E793K/R862Q、A62E/E793K/R862Q、R68N、R68S、R68W、V70A/R267K/K725E/C944S、V70A/R267K/C930P/C944S、V70A/A489D/C930P、V70A/K725E/Q830K/L860F/C930P/C944S、V70Q、P77W、N79S/K154R/E681Q、N79S/K154R/E793K/R862Q、N79S/R862Q、A89R、A97D、A97G、K106R/K154R、Q107G、L109D、L109P/E522V/S612D/K725E、L109P/E522V/Q830K/C944S、L109P/S612D、W118F、P149R、L157Q、T158E、T158F、P178G、P178V、A179L、A196T/N528S/E681Q/I790V/E793K、E207R、E207Y、E208G、E208I、Q217A、Q217D、R267K/A489D/D500A/K725E/Q830K/C930P、R267K/E522V/K725E、Y352K、Y352V、R385G、H424K、R448L、E463A、A489D/Q830K/C944S、D500A、D500A/S612D/Q830K/L860F、D500A/L860F/C930P、D500A/C930P/C944S、E522V/K725E、D523N、D523N/I790V/E793K、N528S/E681Q、N528S/E793K、N528S/R862Q、L672E、L672K、P673N、P673R、K725F、K725V、H734K、E740G、E740Q、A753S、A774G、A774S、L778Q、E793K、Q830V、E844R、R862Q、N875D、E880R、Q892L、A902L、P922E、K925A、K925W、C930P、S932A、L934F、Q938A、Q938P、C944R、およびC944Sから選択される1つまたは複数の位置に少なくとも1つの置換または置換セットを含み、これらの位置は、配列番号14および/または16を参照して番号付けされている。
本発明は、位置が配列番号18を参照して番号付けされている、配列番号18に対して少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、または少なくとも99%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む組換え酸性アルファ-グルコシダーゼおよび/または生物活性組換え酸性アルファ-グルコシダーゼ断片も提供する。一部の実施形態では、酸性アルファ-グルコシダーゼは、22、24、27、27/165、30、33、34、37/62、37/62/79/196/696/862、37/62/523、37/196、37/528/790、39、39/70/109/830/842、39/70/725、39/267、39/267/489/522/612/830/842、39/267/489/830/944、40、70/267/725/944、70/267/930/944、70/489/930、107、109、109/522/830/944、217、267/489/500/725/830/930、267/522/725、352、385、500/930/944、673、734、774、778、875、930、932、および934から選択される位置または位置のセットに少なくとも1つの置換を含み、これらの位置は、配列番号18を参照して番号付けされている。一部の実施形態では、酸性アルファ-グルコシダーゼは、22R、24E、24R、24W、27G、27G/165I、27K、27R、27W、30D、33G、34D、34M、34T、37F/62E、37F/62E/79S/196T/696S/862Q、37F/62E/523N、37F/196T、37F/528S/790V、39D、39Q、39Q/70A/109P/830K/842S、39Q/70A/725E、39Q/267K、39Q/267K/489D/522V/612D/830K/842S、39Q/267K/489D/830K/944S、40W、70A/267K/725E/944S、70A/267K/930P/944S、70A/489D/930P、107G、109D、109P/522V/830K/944S、217D、267K/489D/500A/725E/830K/930P、267K/522V/725E、352K、352V、385G、500A/930P/944S、673N、734K、774G、778Q、875D、930P、932A、および934Fから選択される位置または位置のセットに少なくとも1つの置換を含み、これらの位置は、配列番号18を参照して番号付けされている。一部の実施形態では、酸性アルファ-グルコシダーゼは、I22R、L24E、L24R、L24W、F27G、F27G/M165I、F27K、F27R、F27W、V30D、E33G、L34D、L34M、L34T、S37F/A62E、S37F/A62E/N79S/A196T/A696S/R862Q、S37F/A62E/D523N、S37F/A196T、S37F/N528S/I790V、P39D、P39Q、P39Q/V70A/L109P/Q830K/G842S、P39Q/V70A/K725E、P39Q/R267K、P39Q/R267K/A489D/E522V/S612D/Q830K/G842S、P39Q/R267K/A489D/Q830K/C944S、V40W、V70A/R267K/K725E/C944S、V70A/R267K/C930P/C944S、V70A/A489D/C930P、Q107G、L109D、L109P/E522V/Q830K/C944S、Q217D、R267K/A489D/D500A/K725E/Q830K/C930P、R267K/E522V/K725E、Y352K、Y352V、R385G、D500A/C930P/C944S、P673N、H734K、A774G、L778Q、N875D、C930P、S932A、およびL934Fから選択される位置または位置のセットに少なくとも1つの置換を含み、これらの位置は、配列番号18を参照して番号付けされている。
本発明は、位置が配列番号20を参照して番号付けされている、配列番号20に対して少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、または少なくとも99%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む組換え酸性アルファ-グルコシダーゼおよび/または生物活性組換え酸性アルファ-グルコシダーゼ断片も提供する。一部の実施形態では、酸性アルファ-グルコシダーゼは、22/24、22/24/27/50/107/109/489/612/725、22/24/27/489、22/24/27/489/612/774、22/24/27/612/944、22/24/50/109/267/489/774/944、22/24/50/267/612/922/944、22/24/107/267/489/922、22/24/489、22/24/612/725/944、22/50/107/267/489/612/944、22/50/109/267/489、22/267/489/612、24、24/27/50/107/267/774/944、24/27/89/500/842、24/27/107/267/612/944、24/27/267/944、24/27/500/842、24/27/500/842/932、24/27/944、24/39/49/89/97/842/932、24/39/68/89/107/500/842、24/39/89/97/842/932、24/39/842/932、24/50/489/944、24/50/612、24/70/107/109/489/612/725、24/70/267/774、24/89/500、24/107/109/267/489/612/725/774、24/109/612、24/109/944、24/267/725/944、24/489/944、24/725、24/842/932、24/944、27/39/49/97/500/842、27/49/68/500/842、34/39/500/932、39/89/97/500、42、48、50/109/489/612、50/489/774、50/612/944、57、62、68、68/89/97/932、71、88、89/97/107、89/97/500、89/842、107/109、107/500/842、108、109/612/774/944、112、123、124、148、188、193、197、204、253、264、305、312、333、381、402、402/781、489、489/944、500/842、500/932、523、527、612、612/725/944、612/922、614、727、742、748、820、823、832、842/932、858、862、911、913、914、916、923、937、および940から選択される位置または位置のセットに少なくとも1つの置換を含み、これらの位置は、配列番号20を参照して番号付けされている。一部の実施形態では、酸性アルファ-グルコシダーゼは、22R/24W、22R/24W/27A/50V/107G/109D/489A/612S/725E、22R/24W/27A/489A、22R/24W/27A/489A/612S/774S、22R/24W/27A/612S/944R、22R/24W/50V/109D/267R/489A/774S/944R、22R/24W/50V/267R/612S/922E/944R、22R/24W/107G/267R/489A/922E、22R/24W/489A、22R/24W/612S/725E/944R、22R/50V/107G/267R/489A/612S/944S、22R/50V/109D/267R/489A、22R/267R/489A/612S、24R、24R/27G/89R/500A/842G、24R/27G/500A/842G、24R/27G/500A/842G/932A、24R/39D/68S/89R/107G/500A/842G、24R/39H/49G/89R/97G/842G/932A、24R/39H/89R/97D/842G/932A、24R/39H/842G/932A、24R/89R/500A、24R/842G/932A、24W、24W/27A/50V/107G/267R/774S/944S、24W/27A/107G/267R/612S/944S、24W/27A/267R/944R、24W/27A/944R、24W/50V/489A/944S、24W/50V/612S、24W/70A/107G/109D/489A/612S/725E、24W/70A/267R/774S、24W/107G/109D/267R/489A/612S/725E/774S、24W/109D/612S、24W/109D/944S、24W/267R/725E/944S、24W/489A/944R、24W/725E、24W/944S、27G/39H/49G/97G/500A/842G、27G/49G/68S/500A/842G、34T/39D/500A/932A、39D/89R/97G/500A、42G、48Q、48V、48W、50V/109D/489A/612S、50V/489A/774S、50V/612S/944S、57F、57L、57M、62F、62L、62W、68N/89R/97G/932A、68S、71G、71L、71V、71W、71Y、88L、88R、89R/97G/107G、89R/97G/500A、89R/842G、107G/109D、107G/500A/842G、108R、109D/612S/774S/944S、112H、123L、123V、124G、124M、124V、148K、148R、188R、188W、193E、193P、197G、204A、253M、264M、305F、312A、333L、381R、381V、381W、402N、402V/781Q、489A、489A/944R、500A/842G、500A/932A、523E、527R、527V、612S、612S/725E/944S、612S/922E、614Q、614R、614W、727W、742V、748V、820A、820V、823F、823V、832A、832R、842G/932A、858C、858W、862I、862M、862Q、862Y、911G、911R、913G、913R、913W、914G、914I、914K、914Q、914R、914S、914T、916G、916H、916R、923L、923V、923W、937K、および940Qから選択される位置または位置のセットに少なくとも1つの置換を含み、これらの位置は、配列番号20を参照して番号付けされている。一部の実施形態では、酸性アルファ-グルコシダーゼは、I22R/L24W、I22R/L24W/F27A/Q50V/Q107G/L109D/D489A/D612S/K725E、I22R/L24W/F27A/D489A、I22R/L24W/F27A/D489A/D612S/A774S、I22R/L24W/F27A/D612S/C944R、I22R/L24W/Q50V/L109D/K267R/D489A/A774S/C944R、I22R/L24W/Q50V/K267R/D612S/P922E/C944R、I22R/L24W/Q107G/K267R/D489A/P922E、I22R/L24W/D489A、I22R/L24W/D612S/K725E/C944R、I22R/Q50V/Q107G/K267R/D489A/D612S/C944S、I22R/Q50V/L109D/K267R/D489A、I22R/K267R/D489A/D612S、L24R、L24R/F27G/A89R/D500A/S842G、L24R/F27G/D500A/S842G、L24R/F27G/D500A/S842G/S932A、L24R/Q39D/R68S/A89R/Q107G/D500A/S842G、L24R/Q39H/Q49G/A89R/A97G/S842G/S932A、L24R/Q39H/A89R/A97D/S842G/S932A、L24R/Q39H/S842G/S932A、L24R/A89R/D500A、L24R/S842G/S932A、L24W、L24W/F27A/Q50V/Q107G/K267R/A774S/C944S、L24W/F27A/Q107G/K267R/D612S/C944S、L24W/F27A/K267R/C944R、L24W/F27A/C944R、L24W/Q50V/D489A/C944S、L24W/Q50V/D612S、L24W/V70A/Q107G/L109D/D489A/D612S/K725E、L24W/V70A/K267R/A774S、L24W/Q107G/L109D/K267R/D489A/D612S/K725E/A774S、L24W/L109D/D612S、L24W/L109D/C944S、L24W/K267R/K725E/C944S、L24W/D489A/C944R、L24W/K725E、L24W/C944S、F27G/Q39H/Q49G/A97G/D500A/S842G、F27G/Q49G/R68S/D500A/S842G、L34T/Q39D/D500A/S932A、Q39D/A89R/A97G/D500A、E42G、H48Q、H48V、H48W、Q50V/L109D/D489A/D612S、Q50V/D489A/A774S、Q50V/D612S/C944S、P57F、P57L、P57M、A62F、A62L、A62W、R68N/A89R/A97G/S932A、R68S、P71G、P71L、P71V、P71W、P71Y、K88L、K88R、A89R/A97G/Q107G、A89R/A97G/D500A、A89R/S842G、Q107G/L109D、Q107G/D500A/S842G、G108R、L109D/D612S/A774S/C944S、A112H、P123L、P123V、S124G、S124M、S124V、T148K、T148R、E188R、E188W、H193E、H193P、P197G、E204A、A253M、S264M、L305F、V312A、I333L、E381R、E381V、E381W、S402N、S402V/P781Q、D489A、D489A/C944R、D500A/S842G、D500A/S932A、D523E、N527R、N527V、D612S、D612S/K725E/C944S、D612S/P922E、E614Q、E614R、E614W、S727W、L742V、L748V、G820A、G820V、L823F、L823V、P832A、P832R、S842G/S932A、E858C、E858W、R862I、R862M、R862Q、R862Y、N911G、N911R、V913G、V913R、V913W、P914G、P914I、P914K、P914Q、P914R、P914S、P914T、S916G、S916H、S916R、D923L、D923V、D923W、E937K、およびL940Qから選択される位置または位置のセットに少なくとも1つの置換を含み、これらの位置は、配列番号20を参照して番号付けされている。一部の追加の実施形態では、酸性アルファ-グルコシダーゼは、22/24、22/24/27/50/107/109/489/612/725、22/24/27/489、22/24/27/489/612/774、22/24/27/612/944、22/24/50/109/267/489/774/944、22/24/50/267/612/922/944、22/24/107/267/489/922
、22/24/489、22/24/612/725/944、22/50/107/267/489/612/944、22/50/109/267/489、22/267/489/612、24、24/27/50/107/267/774/944、24/27/89/500/842、24/27/107/267/612/944、24/27/267/944、24/27/500/842、24/27/500/842/932、24/27/944、24/39/49/89/97/842/932、24/39/68/89/107/500/842、24/39/89/97/842/932、24/39/842/932、24/50/489/944、24/50/612、24/70/107/109/489/612/725、24/70/267/774、24/89/500、24/107/109/267/489/612/725/774、24/109/612、24/109/944、24/267/725/944、24/489/944、24/725、24/842/932、24/944、27/39/49/97/500/842、27/49/68/500/842、34/39/500/932、50/109/489/612、50/612/944、68/89/97/932、89/97/107、89/842、106、107/109、107/500/842、108、109/612/774/944、112、148、148/772、188/377、238、240、240/374、243、244、246、248、249/777、252、253、259、260、261、262、264、279、305、309、312、319、320、329、333、387、402、421、432、500/842、500/932、556、612、612/725/944、612/922、727、736、737、741、742、748、815、816、818、823、832、842/932、911、913、914、916、923、937、および940から選択される位置または位置のセットに少なくとも1つの置換を含み、これらの位置は、配列番号20を参照して番号付けされている。一部の実施形態では、酸性アルファ-グルコシダーゼは、22R/24W、22R/24W/27A/50V/107G/109D/489A/612S/725E、22R/24W/27A/489A、22R/24W/27A/489A/612S/774S、22R/24W/27A/612S/944R、22R/24W/50V/109D/267R/489A/774S/944R、22R/24W/50V/267R/612S/922E/944R、22R/24W/107G/267R/489A/922E、22R/24W/489A、22R/24W/612S/725E/944R、22R/50V/107G/267R/489A/612S/944S、22R/50V/109D/267R/489A、22R/267R/489A/612S、24R、24R/27G/89R/500A/842G、24R/27G/500A/842G、24R/27G/500A/842G/932A、24R/39D/68S/89R/107G/500A/842G、24R/39H/49G/89R/97G/842G/932A、24R/39H/89R/97D/842G/932A、24R/39H/842G/932A、24R/89R/500A、24R/842G/932A、24W、24W/27A/50V/107G/267R/774S/944S、24W/27A/107G/267R/612S/944S、24W/27A/267R/944R、24W/27A/944R、24W/50V/489A/944S、24W/50V/612S、24W/70A/107G/109D/489A/612S/725E、24W/70A/267R/774S、24W/107G/109D/267R/489A/612S/725E/774S、24W/109D/612S、24W/109D/944S、24W/267R/725E/944S、24W/489A/944R、24W/725E、24W/944S、27G/39H/49G/97G/500A/842G、27G/49G/68S/500A/842G、34T/39D/500A/932A、50V/109D/489A/612S、50V/612S/944S、68N/89R/97G/932A、89R/97G/107G、89R/842G、106A、106G、106N、106T、107G/109D、107G/500A/842G、108H、108N、108R、108S、108V、109D/612S/774S/944S、112H、112P、148E、148G、148H、148K、148R/772I、188Q/377Q、238Q、240I、240W/374T、240Y、243E、243G、243R、243V、244I、244V、246A、246G、248A、248R、248V、249V/777N、252V、253G、253P、259G、259N、259S、260W、261E、262P、264C、279E、305F、305G、305R、305V、305Y、309C、309G、312A、319F、320M、329F、333L、333V、387L、402G、402N、421P、432C、500A/842G、500A/932A、556H、556R、556S、556Y、612S、612S/725E/944S、612S/922E、727G、727Q、727T、727W、736M、736V、736W、737M、741C、741D、741E、741G、741T、742V、748I、748T、748V、815A、815M、816V、818T、818V、823A、823F、823G、823R、832E、832G、842G/932A、911G、913A、913E、913G、913H、913L、913Q、913R、913W、914E、914G、914H、914K、914Q、914R、914S、914T、916A、916G、916H、916I、916R、916V、923W、937Q、940G、940Q、940T、および940Wから選択される位置または位置のセットに少なくとも1つの置換を含み、これらの位置は、配列番号20を参照して番号付けされている。一部の実施形態では、酸性アルファ-グルコシダーゼは、I22R/L24W、I22R/L24W/F27A/Q50V/Q107G/L109D/D489A/D612S/K725E、I22R/L24W/F27A/D489A、I22R/L24W/F27A/D489A/D612S/A774S、I22R/L24W/F27A/D612S/C944R、I22R/L24W/Q50V/L109D/K267R/D489A/A774S/C944R、I22R/L24W/Q50V/K267R/D612S/P922E/C944R、I22R/L24W/Q107G/K267R/D489A/P922E、I22R/L24W/D489A、I22R/L24W/D612S/K725E/C944R、I22R/Q50V/Q107G/K267R/D489A/D612S/C944S、I22R/Q50V/L109D/K267R/D489A、I22R/K267R/D489A/D612S、L24R、L24R/F27G/A89R/D500A/S842G、L24R/F27G/D500A/S842G、L24R/F27G/D500A/S842G/S932A、L24R/Q39D/R68S/A89R/Q107G/D500A/S842G、L24R/Q39H/Q49G/A89R/A97G/S842G/S932A、L24R/Q39H/A89R/A97D/S842G/S932A、L24R/Q39H/S842G/S932A、L24R/A89R/D500A、L24R/S842G/S932A、L24W、L24W/F27A/Q50V/Q107G/K267R/A774S/C944S、L24W/F27A/Q107G/K267R/D612S/C944S、L24W/F27A/K267R/C944R、L24W/F27A/C944R、L24W/Q50V/D489A/C944S、L24W/Q50V/D612S、L24W/V70A/Q107G/L109D/D489A/D612S/K725E、L24W/V70A/K267R/A774S、L24W/Q107G/L109D/K267R/D489A/D612S/K725E/A774S、L24W/L109D/D612S、L24W/L109D/C944S、L24W/K267R/K725E/C944S、L24W/D489A/C944R、L24W/K725E、L24W/C944S、F27G/Q39H/Q49G/A97G/D500A/S842G、F27G/Q49G/R68S/D500A/S842G、L34T/Q39D/D500A/S932A、Q50V/L109D/D489A/D612S、Q50V/D612S/C944S、R68N/A89R/A97G/S932A、A89R/A97G/Q107G、A89R/S842G、K106A、K106G、K106N、K106T、Q107G/L109D、Q107G/D500A/S842G、G108H、G108N、G108R、G108S、G108V、L109D/D612S/A774S/C944S、A112H、A112P、T148E、T148G、T148H、T148K、T148R/V772I、E188Q/R377Q、L238Q、L240I、L240W/A374T、L240Y、S243E、S243G、S243R、S243V、L244I、L244V、S246A、S246G、Y248A、Y248R、Y248V、I249V/S777N、L252V、A253G、A253P、L259G、L259N、L259S、M260W、L261E、S262P、S264C、P279E、L305F、L305G、L305R、L305V、L305Y、A309C、A309G、V312A、A319F、L320M、L329F、I333L、I333V、H387L、S402G、S402N、Q421P、M432C、D500A/S842G、D500A/S932A、F556H、F556R、F556S、F556Y、D612S、D612S/K725E/C944S、D612S/P922E、S727G、S727Q、S727T、S727W、L736M、L736V、L736W、L737M、A741C、A741D、A741E、A741G、A741T、L742V、L748I、L748T、L748V、I815A、I815M、I816V、L818T、L818V、L823A、L823F、L823G、L823R、P832E、P832G、S842G/S932A、N911G、V913A、V913E、V913G、V913H、V913L、V913Q、V913R、V913W、P914E、P914G、P914H、P914K、P914Q、P914R、P914S、P914T、S916A、S916G、S916H、S916I、S916R、S916V、D923W、E937Q、L940G、L940Q、L940T、およびL940Wから選択される位置または位置のセットに少なくとも1つの置換を含み、これらの位置は、配列番号20を参照して番号付けされている。
、22/24/489、22/24/612/725/944、22/50/107/267/489/612/944、22/50/109/267/489、22/267/489/612、24、24/27/50/107/267/774/944、24/27/89/500/842、24/27/107/267/612/944、24/27/267/944、24/27/500/842、24/27/500/842/932、24/27/944、24/39/49/89/97/842/932、24/39/68/89/107/500/842、24/39/89/97/842/932、24/39/842/932、24/50/489/944、24/50/612、24/70/107/109/489/612/725、24/70/267/774、24/89/500、24/107/109/267/489/612/725/774、24/109/612、24/109/944、24/267/725/944、24/489/944、24/725、24/842/932、24/944、27/39/49/97/500/842、27/49/68/500/842、34/39/500/932、50/109/489/612、50/612/944、68/89/97/932、89/97/107、89/842、106、107/109、107/500/842、108、109/612/774/944、112、148、148/772、188/377、238、240、240/374、243、244、246、248、249/777、252、253、259、260、261、262、264、279、305、309、312、319、320、329、333、387、402、421、432、500/842、500/932、556、612、612/725/944、612/922、727、736、737、741、742、748、815、816、818、823、832、842/932、911、913、914、916、923、937、および940から選択される位置または位置のセットに少なくとも1つの置換を含み、これらの位置は、配列番号20を参照して番号付けされている。一部の実施形態では、酸性アルファ-グルコシダーゼは、22R/24W、22R/24W/27A/50V/107G/109D/489A/612S/725E、22R/24W/27A/489A、22R/24W/27A/489A/612S/774S、22R/24W/27A/612S/944R、22R/24W/50V/109D/267R/489A/774S/944R、22R/24W/50V/267R/612S/922E/944R、22R/24W/107G/267R/489A/922E、22R/24W/489A、22R/24W/612S/725E/944R、22R/50V/107G/267R/489A/612S/944S、22R/50V/109D/267R/489A、22R/267R/489A/612S、24R、24R/27G/89R/500A/842G、24R/27G/500A/842G、24R/27G/500A/842G/932A、24R/39D/68S/89R/107G/500A/842G、24R/39H/49G/89R/97G/842G/932A、24R/39H/89R/97D/842G/932A、24R/39H/842G/932A、24R/89R/500A、24R/842G/932A、24W、24W/27A/50V/107G/267R/774S/944S、24W/27A/107G/267R/612S/944S、24W/27A/267R/944R、24W/27A/944R、24W/50V/489A/944S、24W/50V/612S、24W/70A/107G/109D/489A/612S/725E、24W/70A/267R/774S、24W/107G/109D/267R/489A/612S/725E/774S、24W/109D/612S、24W/109D/944S、24W/267R/725E/944S、24W/489A/944R、24W/725E、24W/944S、27G/39H/49G/97G/500A/842G、27G/49G/68S/500A/842G、34T/39D/500A/932A、50V/109D/489A/612S、50V/612S/944S、68N/89R/97G/932A、89R/97G/107G、89R/842G、106A、106G、106N、106T、107G/109D、107G/500A/842G、108H、108N、108R、108S、108V、109D/612S/774S/944S、112H、112P、148E、148G、148H、148K、148R/772I、188Q/377Q、238Q、240I、240W/374T、240Y、243E、243G、243R、243V、244I、244V、246A、246G、248A、248R、248V、249V/777N、252V、253G、253P、259G、259N、259S、260W、261E、262P、264C、279E、305F、305G、305R、305V、305Y、309C、309G、312A、319F、320M、329F、333L、333V、387L、402G、402N、421P、432C、500A/842G、500A/932A、556H、556R、556S、556Y、612S、612S/725E/944S、612S/922E、727G、727Q、727T、727W、736M、736V、736W、737M、741C、741D、741E、741G、741T、742V、748I、748T、748V、815A、815M、816V、818T、818V、823A、823F、823G、823R、832E、832G、842G/932A、911G、913A、913E、913G、913H、913L、913Q、913R、913W、914E、914G、914H、914K、914Q、914R、914S、914T、916A、916G、916H、916I、916R、916V、923W、937Q、940G、940Q、940T、および940Wから選択される位置または位置のセットに少なくとも1つの置換を含み、これらの位置は、配列番号20を参照して番号付けされている。一部の実施形態では、酸性アルファ-グルコシダーゼは、I22R/L24W、I22R/L24W/F27A/Q50V/Q107G/L109D/D489A/D612S/K725E、I22R/L24W/F27A/D489A、I22R/L24W/F27A/D489A/D612S/A774S、I22R/L24W/F27A/D612S/C944R、I22R/L24W/Q50V/L109D/K267R/D489A/A774S/C944R、I22R/L24W/Q50V/K267R/D612S/P922E/C944R、I22R/L24W/Q107G/K267R/D489A/P922E、I22R/L24W/D489A、I22R/L24W/D612S/K725E/C944R、I22R/Q50V/Q107G/K267R/D489A/D612S/C944S、I22R/Q50V/L109D/K267R/D489A、I22R/K267R/D489A/D612S、L24R、L24R/F27G/A89R/D500A/S842G、L24R/F27G/D500A/S842G、L24R/F27G/D500A/S842G/S932A、L24R/Q39D/R68S/A89R/Q107G/D500A/S842G、L24R/Q39H/Q49G/A89R/A97G/S842G/S932A、L24R/Q39H/A89R/A97D/S842G/S932A、L24R/Q39H/S842G/S932A、L24R/A89R/D500A、L24R/S842G/S932A、L24W、L24W/F27A/Q50V/Q107G/K267R/A774S/C944S、L24W/F27A/Q107G/K267R/D612S/C944S、L24W/F27A/K267R/C944R、L24W/F27A/C944R、L24W/Q50V/D489A/C944S、L24W/Q50V/D612S、L24W/V70A/Q107G/L109D/D489A/D612S/K725E、L24W/V70A/K267R/A774S、L24W/Q107G/L109D/K267R/D489A/D612S/K725E/A774S、L24W/L109D/D612S、L24W/L109D/C944S、L24W/K267R/K725E/C944S、L24W/D489A/C944R、L24W/K725E、L24W/C944S、F27G/Q39H/Q49G/A97G/D500A/S842G、F27G/Q49G/R68S/D500A/S842G、L34T/Q39D/D500A/S932A、Q50V/L109D/D489A/D612S、Q50V/D612S/C944S、R68N/A89R/A97G/S932A、A89R/A97G/Q107G、A89R/S842G、K106A、K106G、K106N、K106T、Q107G/L109D、Q107G/D500A/S842G、G108H、G108N、G108R、G108S、G108V、L109D/D612S/A774S/C944S、A112H、A112P、T148E、T148G、T148H、T148K、T148R/V772I、E188Q/R377Q、L238Q、L240I、L240W/A374T、L240Y、S243E、S243G、S243R、S243V、L244I、L244V、S246A、S246G、Y248A、Y248R、Y248V、I249V/S777N、L252V、A253G、A253P、L259G、L259N、L259S、M260W、L261E、S262P、S264C、P279E、L305F、L305G、L305R、L305V、L305Y、A309C、A309G、V312A、A319F、L320M、L329F、I333L、I333V、H387L、S402G、S402N、Q421P、M432C、D500A/S842G、D500A/S932A、F556H、F556R、F556S、F556Y、D612S、D612S/K725E/C944S、D612S/P922E、S727G、S727Q、S727T、S727W、L736M、L736V、L736W、L737M、A741C、A741D、A741E、A741G、A741T、L742V、L748I、L748T、L748V、I815A、I815M、I816V、L818T、L818V、L823A、L823F、L823G、L823R、P832E、P832G、S842G/S932A、N911G、V913A、V913E、V913G、V913H、V913L、V913Q、V913R、V913W、P914E、P914G、P914H、P914K、P914Q、P914R、P914S、P914T、S916A、S916G、S916H、S916I、S916R、S916V、D923W、E937Q、L940G、L940Q、L940T、およびL940Wから選択される位置または位置のセットに少なくとも1つの置換を含み、これらの位置は、配列番号20を参照して番号付けされている。
本発明は、位置が配列番号946を参照して番号付けされている、配列番号946に対して少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、または少なくとも99%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む組換え酸性アルファ-グルコシダーゼおよび/または生物活性組換え酸性アルファ-グルコシダーゼ断片をさらに提供する。一部の実施形態では、酸性アルファ-グルコシダーゼは、19/124/149/381/727、24/39/489/862、24/57/62/89/489/823/862、24/57/823/862、24/62/89/188/823/842/862、24/89/489、24/89/489/727/862、24/489/500/842、39/57/62/188/500/842、39/57/500/862、57、57/62/120/527/913/916、57/62/305/437/500/614/727/916、57/62/305/437/500/727/913/916、57/62/305/437/614/683/913/916/932、57/62/305/489/907/913/916、57/62/305/489/913/916、57/62/305/500/913/916、57/62/305/913、57/62/305/916、57/62/437/500/761/914/916、57/62/437/527/727、57/62/437/913/916、57/62/913/916/932、57/62/916、57/188/489/823/862、57/305、57/305/437/916、57/437/500/527/727/916、57/437/500/614/727/914、57/437/913/914、57/489/527/914/916、57/614/916/932、62/89、62/89/124/148/381/858、62/89/124/381/858、62/89/148/381/614/858、62/89/148/923、62/89/149/381、62/89/149/381/832、62/89/188/489/500/727/823、62/89/381、62/89/381/858、62/89/381/923、62/89/858、62/96/614、62/124/148/149/381/614、62/124/149/381/832/858/937、62/124/188/823/842/862、62/124/381/832、62/148/149/381/858/937、62/148/381/614/937、62/148/381/727、62/148/381/858、62/149/381/614/937、62/149/381/858/937、62/149/727、62/305/437/500/727/913、62/305/727、62/381、62/437/489/527/727/913/932、62/437/489/614/727/913、62/437/527/727、62/437/527/916/932、62/437/913/916、62/489/500/932、62/489/527/916/932、62/489/614/916、62/500、62/527、62/527/727/916、62/614、62/727、62/916、89/148/149、89/148/149/381、89/381、124/148/381/727/858/937、124/381/614、124/500/842/862、124/832/937、148/832/858/937、381、381/614/832、381/858/937、437、437/489/914/916、437/727/914、437/914/916、489/500、489/614/916、500/727/913/916、500/914/916、および923から選択される位置または位置のセットに少なくとも1つの置換を含み、これらの位置は、配列番号946を参照して番号付けされている。一部の実施形態では、酸性アルファ-グルコシダーゼは、19T/124V/149R/381V/727W、24R/39H/489A/862Q、24R/57L/62W/89R/489A/823F/862Q、24R/57L/823F/862Q、24R/62W/89R/188W/823V/842G/862Q、24R/89R/489A、24R/89R/489A/727W/862Q、24R/489A/500A/842G、39H/57L/62W/188W/500A/842G、39H/57L/500A/862Q、57F/62L/305F/437G/500A/614Q/727W/916R、57F/62L/305F/437G/614Q/683S/913R/916R/932A、57F/62L/305F/500A/913R/916G、57F/62L/305F/913R、57F/62L/437G/500A/761F/914K/916R、57F/62L/437G/527R/727W、57F/62L/913R/916R/932A、57F/62L/916G、57F/62W/120I/527R/913R/916R、57F/62W/305F/437G/500A/727W/913R/916R、57F/62W/305F/489A/907K/913R/916G、57F/62W/305F/489A/913R/916G、57F/62W/305F/916R、57F/62W/437G/913R/916G、57F/305F、57F/305F/437G/916G、57F/437G/500A/527R/727W/916R、57F/437G/500A/614Q/727W/914R、57F/437G/913R/914R、57F/489A/527R/914R/916G、57F/614Q/916G/932A、57L、57L/188W/489A/823F/862Q、62F/89R、62F/89R/124V/148R/381W/858W、62F/89R/148R/381V/614R/858W、62F/89R/148R/923W、62F/89R/149R/381W/832R、62F/89R/381V/923W、62F/89R/858C、62F/96K/614R、62F/124V/381W/832R、62F/149R/381V/858W/937K、62F/149R/727W、62F/381V、62F/614R、62L/305F/437G/500A/727W/913R、62L/305F/727W、62L/437G/489A/527R/727W/913R/932A、62L/437G/527R/727W、62L/437G/527R/916G/932A、62L/437G/913R/916R、62L/489A/500A/932A、62L/489A/614Q/916R、62L/527R、62L/527R/727W/916G、62W/89R/124V/381W/858C、62W/89R/149R/381W、62W/89R/188W/489A/500A/727W/823F、62W/89R/381V、62W/89R/381W/858C、62W/124V/148R/149R/381W/614R、62W/124V/149R/381V/832R/858C/937K、62W/124V/188W/823F/842G/862Q、62W/148R/149R/381V/858C/937K、62W/148R/381W/614R/937K、62W/148R/381W/727W、62W/148R/381W/858C、62W/149R/381W/614R/937K、62W/381V、62W/437G/489A/614Q/727W/913R、62W/489A/527R/916R/932A、62W/500A、62W/727W、62W/916G、89R/148R/149R、89R/148R/149R/381W、89R/381W、124V/148R/381W/727W/858W/937K、124V/381W/614R、124V/500A/842G/862Q、124V/832R/937K、148R/832R/858W/937K、381V、381V/614R/832R、381W/858C/937K、437G、437G/489A/914R/916R、437G/727W/914K、437G/914R/916G、489A/500A、489A/614Q/916G、500A/727W/913R/916R、500A/914R/916G、および923Wから選択される位置または位置のセットに少なくとも1つの置換を含み、これらの位置は、配列番号946を参照して番号付けされている。一部の実施形態では、酸性アルファ-グルコシダーゼは、S19T/S124V/P149R/E381V/S727W、W24R/Q39H/D489A/R862Q、W24R/P57L/A62W/A89R/D489A/L823F/R862Q、W24R/P57L/L823F/R862Q、W24R/A62W/A89R/E188W/L823V/S842G/R862Q、W24R/A89R/D489A、W24R/A89R/D489A/S727W/R862Q、W24R/D489A/D500A/S842G、Q39H/P57L/A62W/E188W/D500A/S842G、Q39H/P57L/D500A/R862Q、P57F/A62L/L305F/A437G/D500A/E614Q/S727W/S916R、P57F/A62L/L305F/A437G/E614Q/A683S/V913R/S916R/S932A、P57F/A62L/L305F/D500A/V913R/S916G、P57F/A62L/L305F/V913R、P57F/A62L/A437G/D500A/L761F/P914K/S916R、P57F/A62L/A437G/N527R/S727W、P57F/A62L/V913R/S916R/S932A、P57F/A62L/S916G、P57F/A62W/F120I/N527R/V913R/S916R、P57F/A62W/L305F/A437G/D500A/S727W/V913R/S916R、P57F/A62W/L305F/D489A/Q907K/V913R/S916G、P57F/A62W/L305F/D489A/V913R/S916G、P57F/A62W/L305F/S916R、P57F/A62W/A437G/V913R/S916G、P57F/L305F、P57F/L305F/A437G/S916G、P57F/A437G/D500A/N527R/S727W/S916R、P57F/A437G/D500A/E614Q/S727W/P914R、P57F/A437G/V913R/P914R、P57F/D489A/N527R/P914R/S916G、P57F/E614Q/S916G/S932A、P57L、P57L/E188W/D489A/L823F/R862Q、A62F/A89R、A62F/A89R/S124V/T148R/E381W/E858W、A62F/A89R/T148R/E381V/E614R/E858W、A62F/A89R/T148R/D923W、A62F/A89R/P149R/E381W/P832R、A62F/A89R/E381V/D923W、A62F/A89R/E858C、A62F/E96K/E614R、A62F/S124V/E381W/P832R、A62F/P149R/E381V/E858W/E937K、A62F/P149R/S727W、A62F/E381V、A62F/E614R、A62L/L305F/A437G/D500A/S727
W/V913R、A62L/L305F/S727W、A62L/A437G/D489A/N527R/S727W/V913R/S932A、A62L/A437G/N527R/S727W、A62L/A437G/N527R/S916G/S932A、A62L/A437G/V913R/S916R、A62L/D489A/D500A/S932A、A62L/D489A/E614Q/S916R、A62L/N527R、A62L/N527R/S727W/S916G、A62W/A89R/S124V/E381W/E858C、A62W/A89R/P149R/E381W、A62W/A89R/E188W/D489A/D500A/S727W/L823F、A62W/A89R/E381V、A62W/A89R/E381W/E858C、A62W/S124V/T148R/P149R/E381W/E614R、A62W/S124V/P149R/E381V/P832R/E858C/E937K、A62W/S124V/E188W/L823F/S842G/R862Q、A62W/T148R/P149R/E381V/E858C/E937K、A62W/T148R/E381W/E614R/E937K、A62W/T148R/E381W/S727W、A62W/T148R/E381W/E858C、A62W/P149R/E381W/E614R/E937K、A62W/E381V、A62W/A437G/D489A/E614Q/S727W/V913R、A62W/D489A/N527R/S916R/S932A、A62W/D500A、A62W/S727W、A62W/S916G、A89R/T148R/P149R、A89R/T148R/P149R/E381W、A89R/E381W、S124V/T148R/E381W/S727W/E858W/E937K、S124V/E381W/E614R、S124V/D500A/S842G/R862Q、S124V/P832R/E937K、T148R/P832R/E858W/E937K、E381V、E381V/E614R/P832R、E381W/E858C/E937K、A437G、A437G/D489A/P914R/S916R、A437G/S727W/P914K、A437G/P914R/S916G、D489A/D500A、D489A/E614Q/S916G、D500A/S727W/V913R/S916R、D500A/P914R/S916G、およびD923Wから選択される位置または位置のセットに少なくとも1つの置換を含み、これらの位置は、配列番号946を参照して番号付けされている。一部の実施形態では、酸性アルファ-グルコシダーゼは、57/62/120/527/913/916、57/62/305/437/500/614/727/916、57/62/305/437/500/727/913/916、57/62/305/437/614/683/913/916/932、57/62/305/489/907/913/916、57/62/305/489/913/916、57/62/305/500/913/916、57/62/305/913、57/62/305/916、57/62/437/500/761/914/916、57/62/437/527/727、57/62/437/913/916、57/62/913/916/932、57/62/916、57/188/489/823/862、57/305、57/305/437/916、57/437/500/527/727/916、57/437/500/614/727/914、57/437/913/914、57/489/527/914/916、57/614/916/932、62/89/188/489/500/727/823、62/124/188/823/842/862、62/305/437/500/727/913、62/305/727、62/437/489/527/727/913/932、62/437/489/614/727/913、62/437/527/727、62/437/527/916/932、62/437/913/916、62/489/500/932、62/489/527/916/932、62/527/727/916、62/727、62/916、124/500/842/862、437、437/489/914/916、437/727/914、437/914/916、489/614/916、500/727/913/916、500/914/916、および923から選択される位置または位置のセットに少なくとも1つの置換を含み、これらの位置は、配列番号946を参照して番号付けされている。一部の実施形態では、酸性アルファ-グルコシダーゼは、57F/62L/305F/437G/500A/614Q/727W/916R、57F/62L/305F/437G/614Q/683S/913R/916R/932A、57F/62L/305F/500A/913R/916G、57F/62L/305F/913R、57F/62L/437G/500A/761F/914K/916R、57F/62L/437G/527R/727W、57F/62L/913R/916R/932A、57F/62L/916G、57F/62W/120I/527R/913R/916R、57F/62W/305F/437G/500A/727W/913R/916R、57F/62W/305F/489A/907K/913R/916G、57F/62W/305F/489A/913R/916G、57F/62W/305F/916R、57F/62W/437G/913R/916G、57F/305F、57F/305F/437G/916G、57F/437G/500A/527R/727W/916R、57F/437G/500A/614Q/727W/914R、57F/437G/913R/914R、57F/489A/527R/914R/916G、57F/614Q/916G/932A、57L/188W/489A/823F/862Q、62L/305F/437G/500A/727W/913R、62L/305F/727W、62L/437G/489A/527R/727W/913R/932A、62L/437G/527R/727W、62L/437G/527R/916G/932A、62L/437G/913R/916R、62L/489A/500A/932A、62L/527R/727W/916G、62W/89R/188W/489A/500A/727W/823F、62W/124V/188W/823F/842G/862Q、62W/437G/489A/614Q/727W/913R、62W/489A/527R/916R/932A、62W/727W、62W/916G、124V/500A/842G/862Q、437G、437G/489A/914R/916R、437G/727W/914K、437G/914R/916G、489A/614Q/916G、500A/727W/913R/916R、500A/914R/916G、および923Wから選択される位置または位置のセットに少なくとも1つの置換を含み、これらの位置は、配列番号946を参照して番号付けされている。一部の実施形態では、酸性アルファ-グルコシダーゼは、P57F/A62L/L305F/A437G/D500A/E614Q/S727W/S916R、P57F/A62L/L305F/A437G/E614Q/A683S/V913R/S916R/S932A、P57F/A62L/L305F/D500A/V913R/S916G、P57F/A62L/L305F/V913R、P57F/A62L/A437G/D500A/L761F/P914K/S916R、P57F/A62L/A437G/N527R/S727W、P57F/A62L/V913R/S916R/S932A、P57F/A62L/S916G、P57F/A62W/F120I/N527R/V913R/S916R、P57F/A62W/L305F/A437G/D500A/S727W/V913R/S916R、P57F/A62W/L305F/D489A/Q907K/V913R/S916G、P57F/A62W/L305F/D489A/V913R/S916G、P57F/A62W/L305F/S916R、P57F/A62W/A437G/V913R/S916G、P57F/L305F、P57F/L305F/A437G/S916G、P57F/A437G/D500A/N527R/S727W/S916R、P57F/A437G/D500A/E614Q/S727W/P914R、P57F/A437G/V913R/P914R、P57F/D489A/N527R/P914R/S916G、P57F/E614Q/S916G/S932A、P57L/E188W/D489A/L823F/R862Q、A62L/L305F/A437G/D500A/S727W/V913R、A62L/L305F/S727W、A62L/A437G/D489A/N527R/S727W/V913R/S932A、A62L/A437G/N527R/S727W、A62L/A437G/N527R/S916G/S932A、A62L/A437G/V913R/S916R、A62L/D489A/D500A/S932A、A62L/N527R/S727W/S916G、A62W/A89R/E188W/D489A/D500A/S727W/L823F、A62W/S124V/E188W/L823F/S842G/R862Q、A62W/A437G/D489A/E614Q/S727W/V913R、A62W/D489A/N527R/S916R/S932A、A62W/S727W、A62W/S916G、S124V/D500A/S842G/R862Q、A437G、A437G/D489A/P914R/S916R、A437G/S727W/P914K、A437G/P914R/S916G、D489A/E614Q/S916G、D500A/S727W/V913R/S916R、D500A/P914R/S916G、およびD923Wから選択される位置または位置のセットに少なくとも1つの置換を含み、これらの位置は、配列番号946を参照して番号付けされている。
W/V913R、A62L/L305F/S727W、A62L/A437G/D489A/N527R/S727W/V913R/S932A、A62L/A437G/N527R/S727W、A62L/A437G/N527R/S916G/S932A、A62L/A437G/V913R/S916R、A62L/D489A/D500A/S932A、A62L/D489A/E614Q/S916R、A62L/N527R、A62L/N527R/S727W/S916G、A62W/A89R/S124V/E381W/E858C、A62W/A89R/P149R/E381W、A62W/A89R/E188W/D489A/D500A/S727W/L823F、A62W/A89R/E381V、A62W/A89R/E381W/E858C、A62W/S124V/T148R/P149R/E381W/E614R、A62W/S124V/P149R/E381V/P832R/E858C/E937K、A62W/S124V/E188W/L823F/S842G/R862Q、A62W/T148R/P149R/E381V/E858C/E937K、A62W/T148R/E381W/E614R/E937K、A62W/T148R/E381W/S727W、A62W/T148R/E381W/E858C、A62W/P149R/E381W/E614R/E937K、A62W/E381V、A62W/A437G/D489A/E614Q/S727W/V913R、A62W/D489A/N527R/S916R/S932A、A62W/D500A、A62W/S727W、A62W/S916G、A89R/T148R/P149R、A89R/T148R/P149R/E381W、A89R/E381W、S124V/T148R/E381W/S727W/E858W/E937K、S124V/E381W/E614R、S124V/D500A/S842G/R862Q、S124V/P832R/E937K、T148R/P832R/E858W/E937K、E381V、E381V/E614R/P832R、E381W/E858C/E937K、A437G、A437G/D489A/P914R/S916R、A437G/S727W/P914K、A437G/P914R/S916G、D489A/D500A、D489A/E614Q/S916G、D500A/S727W/V913R/S916R、D500A/P914R/S916G、およびD923Wから選択される位置または位置のセットに少なくとも1つの置換を含み、これらの位置は、配列番号946を参照して番号付けされている。一部の実施形態では、酸性アルファ-グルコシダーゼは、57/62/120/527/913/916、57/62/305/437/500/614/727/916、57/62/305/437/500/727/913/916、57/62/305/437/614/683/913/916/932、57/62/305/489/907/913/916、57/62/305/489/913/916、57/62/305/500/913/916、57/62/305/913、57/62/305/916、57/62/437/500/761/914/916、57/62/437/527/727、57/62/437/913/916、57/62/913/916/932、57/62/916、57/188/489/823/862、57/305、57/305/437/916、57/437/500/527/727/916、57/437/500/614/727/914、57/437/913/914、57/489/527/914/916、57/614/916/932、62/89/188/489/500/727/823、62/124/188/823/842/862、62/305/437/500/727/913、62/305/727、62/437/489/527/727/913/932、62/437/489/614/727/913、62/437/527/727、62/437/527/916/932、62/437/913/916、62/489/500/932、62/489/527/916/932、62/527/727/916、62/727、62/916、124/500/842/862、437、437/489/914/916、437/727/914、437/914/916、489/614/916、500/727/913/916、500/914/916、および923から選択される位置または位置のセットに少なくとも1つの置換を含み、これらの位置は、配列番号946を参照して番号付けされている。一部の実施形態では、酸性アルファ-グルコシダーゼは、57F/62L/305F/437G/500A/614Q/727W/916R、57F/62L/305F/437G/614Q/683S/913R/916R/932A、57F/62L/305F/500A/913R/916G、57F/62L/305F/913R、57F/62L/437G/500A/761F/914K/916R、57F/62L/437G/527R/727W、57F/62L/913R/916R/932A、57F/62L/916G、57F/62W/120I/527R/913R/916R、57F/62W/305F/437G/500A/727W/913R/916R、57F/62W/305F/489A/907K/913R/916G、57F/62W/305F/489A/913R/916G、57F/62W/305F/916R、57F/62W/437G/913R/916G、57F/305F、57F/305F/437G/916G、57F/437G/500A/527R/727W/916R、57F/437G/500A/614Q/727W/914R、57F/437G/913R/914R、57F/489A/527R/914R/916G、57F/614Q/916G/932A、57L/188W/489A/823F/862Q、62L/305F/437G/500A/727W/913R、62L/305F/727W、62L/437G/489A/527R/727W/913R/932A、62L/437G/527R/727W、62L/437G/527R/916G/932A、62L/437G/913R/916R、62L/489A/500A/932A、62L/527R/727W/916G、62W/89R/188W/489A/500A/727W/823F、62W/124V/188W/823F/842G/862Q、62W/437G/489A/614Q/727W/913R、62W/489A/527R/916R/932A、62W/727W、62W/916G、124V/500A/842G/862Q、437G、437G/489A/914R/916R、437G/727W/914K、437G/914R/916G、489A/614Q/916G、500A/727W/913R/916R、500A/914R/916G、および923Wから選択される位置または位置のセットに少なくとも1つの置換を含み、これらの位置は、配列番号946を参照して番号付けされている。一部の実施形態では、酸性アルファ-グルコシダーゼは、P57F/A62L/L305F/A437G/D500A/E614Q/S727W/S916R、P57F/A62L/L305F/A437G/E614Q/A683S/V913R/S916R/S932A、P57F/A62L/L305F/D500A/V913R/S916G、P57F/A62L/L305F/V913R、P57F/A62L/A437G/D500A/L761F/P914K/S916R、P57F/A62L/A437G/N527R/S727W、P57F/A62L/V913R/S916R/S932A、P57F/A62L/S916G、P57F/A62W/F120I/N527R/V913R/S916R、P57F/A62W/L305F/A437G/D500A/S727W/V913R/S916R、P57F/A62W/L305F/D489A/Q907K/V913R/S916G、P57F/A62W/L305F/D489A/V913R/S916G、P57F/A62W/L305F/S916R、P57F/A62W/A437G/V913R/S916G、P57F/L305F、P57F/L305F/A437G/S916G、P57F/A437G/D500A/N527R/S727W/S916R、P57F/A437G/D500A/E614Q/S727W/P914R、P57F/A437G/V913R/P914R、P57F/D489A/N527R/P914R/S916G、P57F/E614Q/S916G/S932A、P57L/E188W/D489A/L823F/R862Q、A62L/L305F/A437G/D500A/S727W/V913R、A62L/L305F/S727W、A62L/A437G/D489A/N527R/S727W/V913R/S932A、A62L/A437G/N527R/S727W、A62L/A437G/N527R/S916G/S932A、A62L/A437G/V913R/S916R、A62L/D489A/D500A/S932A、A62L/N527R/S727W/S916G、A62W/A89R/E188W/D489A/D500A/S727W/L823F、A62W/S124V/E188W/L823F/S842G/R862Q、A62W/A437G/D489A/E614Q/S727W/V913R、A62W/D489A/N527R/S916R/S932A、A62W/S727W、A62W/S916G、S124V/D500A/S842G/R862Q、A437G、A437G/D489A/P914R/S916R、A437G/S727W/P914K、A437G/P914R/S916G、D489A/E614Q/S916G、D500A/S727W/V913R/S916R、D500A/P914R/S916G、およびD923Wから選択される位置または位置のセットに少なくとも1つの置換を含み、これらの位置は、配列番号946を参照して番号付けされている。
本発明は、位置が配列番号1956を参照して番号付けされている、配列番号1956に対して少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、または少なくとも99%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む組換え酸性アルファ-グルコシダーゼおよび/または生物活性組換え酸性アルファ-グルコシダーゼ断片を提供する。一部の実施形態では、酸性アルファ-グルコシダーゼは、3/569、41/53、44、44/347、56、65、78、78/87/176/266/536/615、78/87/266、78/87/266/372/386/777、78/87/266/372/536、78/87/266/483/924、78/87/483/777、78/87/536、78/266/483/536/615、78/266/483/795、78/266/763、78/372/390、78/390、78/536/615、87、87/266、87/266/372/483、87/266/483、87/266/924、87/372/777、87/536/777、87/615、87/795、105、136、141、145、154/588、156、157、199、202、222、225、227、229、266、266/372/536/615/763/777、266/372/924、266/536/615/795、344、348、390/615、412、423、425/678/894、430、446、484、488、496、499/711、503、530、543、569、572、573、574、577、578、579、580、581、583、585、588、589/663、615、628、629、631、633、656、663、669、670、671、678、679、687、690、691、692、693、705、706、708、709、710、711、726、768、773、777、779、795、797、816、826、834、857、859、868、869、871、873、877、878、および909から選択される位置または位置のセットに少なくとも1つの置換を含み、これらの位置は、配列番号1956を参照して番号付けされている。一部の実施形態では、酸性アルファ-グルコシダーゼは、3L/569F、41I/53M、44E、44G、44L、44P/347I、44R、56A、56L、56R、65L、65V、78E、78E/87E/176T/266N/536T/615D、78E/87E/266N、78E/87E/266N/372T/386Y/777G、78E/87E/266N/372T/536T、78E/87E/266N/483S/924N、78E/87E/483S/777G、78E/87E/536T、78E/266N/483S/536T/615D、78E/266N/483S/795E、78E/266N/763L、78E/372T/390Q、78E/390Q、78E/536T/615D、87E、87E/266N、87E/266N/372T/483S、87E/266N/483S、87E/266N/924N、87E/372T/777G、87E/536T/777G、87E/615D、87E/795E、105T、136G、141S、141W、145I、145R、154R/588L、156L、157S、199V、202K、202L、202N、202R、202T、222C、222P、225D、227A、229C、266N、266N/372T/536T/615D/763L/777G、266N/372T/924N、266N/536T/615D/795E、344G、344M、348G、390Q/615D、412Y、423V、425R/678I/894C、430F、446T、484L、488G、488K、488M、496G、499Y/711F、503S、503T、530V、543C、543Q、543S、543V、569H、569I、569Q、569S、569T、569V、569Y、572G、572S、573C、573D、573H、573M、573Q、574S、577A、577D、577E、577M、577T、577V、578S、579V、580E、580G、580I、580L、580W、580Y、581F、581G、581H、581L、581S、581T、581V、581Y、583C、583G、583K、583L、585F、585L、585M、585Q、585V、588L、588V、589I/663F、615G、628I、628M、628V、629A、629C、629G、629I、631I、631L、631M、633V、656M、656V、663A、663F、669R、670E、670F、670I、670Q、670R、670S、670T、670V、670W、671A、671G、671M、671T、678H、678L、678T、678Y、679W、687L、690V、691F、691V、692C、692F、692G、692I、692L、692R、692S、692V、692Y、693F、693I、693Y、705M、706F、706M、706V、708C、709S、710K、710L、710M、710N、710S、711C、711F、711G、711H、711L、711R、711W、726E、768S、773V、777G、777I、777R、779E、779H、779R、795E、797L、797M、816L、826G、834H、857T、859T、859Y、868I、868L、869L、869S、871E、871K、871R、873A、873F、873Y、877L、877V、878A、878F、878G、878K、878L、878Q、878R、878S、878W、および909Fから選択される位置または位置のセットに少なくとも1つの置換を含み、これらの位置は、配列番号1956を参照して番号付けされている。一部の実施形態では、酸性アルファ-グルコシダーゼは、W3L/L569F、L41I/S53M、T44E、T44G、T44L、T44P/L347I、T44R、G56A、G56L、G56R、G65L、G65V、P78E、P78E/D87E/K176T/T266N/V536T/Q615D、P78E/D87E/T266N、P78E/D87E/T266N/S372T/A386Y/S777G、P78E/D87E/T266N/S372T/V536T、P78E/D87E/T266N/T483S/T924N、P78E/D87E/T483S/S777G、P78E/D87E/V536T、P78E/T266N/T483S/V536T/Q615D、P78E/T266N/T483S/Q795E、P78E/T266N/T763L、P78E/S372T/L390Q、P78E/L390Q、P78E/V536T/Q615D、D87E、D87E/T266N、D87E/T266N/S372T/T483S、D87E/T266N/T483S、D87E/T266N/T924N、D87E/S372T/S777G、D87E/V536T/S777G、D87E/Q615D、D87E/Q795E、A105T、S136G、T141S、T141W、T145I、T145R、K154R/F588L、I156L、L157S、P199V、S202K、S202L、S202N、S202R、S202T、V222C、V222P、N225D、T227A、A229C、T266N、T266N/S372T/V536T/Q615D/T763L/S777G、T266N/S372T/T924N、T266N/V536T/Q615D/Q795E、Q344G、Q344M、D348G、L390Q/Q615D、G412Y、L423V、Q425R/S678I/G894C、Y430F、S446T、N484L、L488G、L488K、L488M、A496G、H499Y/A711F、P503S、P503T、L530V、T543C、T543Q、T543S、T543V、L569H、L569I、L569Q、L569S、L569T、L569V、L569Y、A572G、A572S、I573C、I573D、I573H、I573M、I573Q、A574S、R577A、R577D、R577E、R577M、R577T、R577V、A578S、L579V、V580E、V580G、V580I、V580L、V580W、V580Y、K581F、K581G、K581H、K581L、K581S、K581T、K581V、K581Y、R583C、R583G、R583K、R583L、T585F、T585L、T585M、T585Q、T585V、F588L、F588V、V589I/M663F、Q615G、L628I、L628M、L628V、L629A、L629C、L629G、L629I、V631I、V631L、V631M、L633V、L656M、L656V、M663A、M663F、L669R、L670E、L670F、L670I、L670Q、L670R、L670S、L670T、L670V、L670W、S671A、S671G、S671M、S671T、S678H、S678L、S678T、S678Y、F679W、M687L、A690V、L691F、L691V、T692C、T692F、T692G、T692I、T692L、T692R、T692S、T692V、T692Y、L693F、L693I、L693Y、F705M、H706F、H706M、H706V、A708C、H709S、V710K、V710L、V710M、V710N、V710S、A711C、A711F、A711G、A711H、A711L、A711R、A711W、D726E、Q768S、E773V、S777G、S777I、S777R、P779E、P779H、P779R、Q795E、V797L、V797M、I816L、T826G、A834H、L857T、V859T、V859Y、V868I、V868L、I869L、I869S、L871E、L871K、L871R、R873A、R873F、R873Y、I877L、I877V、V878A、V878F、V878G、V878K、V878L、V878Q、V878R、V878S、V878WおよびL909Fから選択される位置または位置のセットに少なくとも1つの置換を含み、これらの位置は、配列番号1956を参照して番号付けされている。一部の実施形態では、酸性アルファ-グルコシダーゼは、44、53、56、63、65、105、125、129、136、139、141、142、145、152、156、162、176、177、185、186、187、199、199/775、202、265、267、337、344、348、350、354、372、373、401、412、446、469、484、488、493、496、499、503、526、543、612、615、649、677、678、679、730、752、765、768、773、777、779、788、797、822、826、834、855、856、857、859、860、924、926、931、および936から選択される位置に少なくとも1つの置換を含み、これらの位置は、配列番号1956を参照して番号付けされている。一部の実施形態では、酸性アルファ-グルコシダーゼは、44A、44F、44V、44W、44Y、53I、56S、56W、63N、65A、65F、65R、65Y、105V、105W、125H、125W、129E、129I、129S、129T、129V、129W、136K、136R、136V、139E、141K、141R、142G、145A、145L、152L、152S、15
2W、156C、156K、156R、156S、162T、176R、177Q、185L、186H、187I、199A、199G、199I、199R、199T、199V/775I、199W、202A、202D、202G、202H、202Q、202Y、265D、265F、265H、267E、267G、267R、337H、344C、348E、348W、350F、350I、354L、354S、372D、373A、373S、401G、401S、412R、412S、412W、446C、446D、446G、446I、446K、469M、469T、469V、484A、484K、484R、488C、488E、488S、493L、496M、496W、499A、499E、499I、499M、499Q、499V、503C、503H、503N、526L、526V、543G、543H、543K、543L、543R、612G、612L、612R、612T、615M、615S、649M、677T、678Q、678R、678V、678W、679Y、730K、730L、730R、752F、752G、752L、752N、752S、752W、765W、768I、768K、768V、773P、777M、777W、779I、779M、779S、788A、788H、788I、788L、788N、788Q、788S、788T、788Y、797E、797F、797I、797R、797W、822R、826I、826M、834G、834S、834V、834W、855G、855L、856A、856G、857A、857E、857R、857S、857V、859A、859G、860S、924A、926M、926T、931L、936N、936R、および936Sから選択される位置に少なくとも1つの置換を含み、これらの位置は、配列番号1956を参照して番号付けされている。一部の実施形態では、酸性アルファ-グルコシダーゼは、T44A、T44F、T44V、T44W、T44Y、S53I、G56S、G56W、H63N、G65A、G65F、G65R、G65Y、A105V、A105W、Y125H、Y125W、K129E、K129I、K129S、K129T、K129V、K129W、S136K、S136R、S136V、G139E、T141K、T141R、A142G、T145A、T145L、F152L、F152S、F152W、I156C、I156K、I156R、I156S、D162T、K176R、D177Q、V185L、P186H、L187I、P199A、P199G、P199I、P199R、P199T、P199V/L775I、P199W、S202A、S202D、S202G、S202H、S202Q、S202Y、W265D、W265F、W265H、K267E、K267G、K267R、P337H、Q344C、D348E、D348W、V350F、V350I、F354L、F354S、S372D、T373A、T373S、D401G、D401S、G412R、G412S、G412W、S446C、S446D、S446G、S446I、S446K、I469M、I469T、I469V、N484A、N484K、N484R、L488C、L488E、L488S、D493L、A496M、A496W、H499A、H499E、H499I、H499M、H499Q、H499V、P503C、P503H、P503N、P526L、P526V、T543G、T543H、T543K、T543L、T543R、S612G、S612L、S612R、S612T、Q615M、Q615S、L649M、Y677T、S678Q、S678R、S678V、S678W、F679Y、W730K、W730L、W730R、K752F、K752G、K752L、K752N、K752S、K752W、Y765W、Q768I、Q768K、Q768V、E773P、S777M、S777W、P779I、P779M、P779S、P788A、P788H、P788I、P788L、P788N、P788Q、P788S、P788T、P788Y、V797E、V797F、V797I、V797R、V797W、G822R、T826I、T826M、A834G、A834S、A834V、A834W、E855G、E855L、S856A、S856G、L857A、L857E、L857R、L857S、L857V、V859A、V859G、L860S、T924A、V926M、V926T、V931L、G936N、G936R、およびG936Sから選択される位置に少なくとも1つの置換を含み、これらの位置は、配列番号1956を参照して番号付けされている。一部の実施形態では、酸性アルファ-グルコシダーゼは、78/87/176/266/536/615、78/87/266/372/386/777、78/87/266/372/536、78/266/763、78/372/390、87/266/372/483、87/372/777、105、125、129、136、139、141、142、152、154/588、156、222、225、227、229、266/372/536/615/763/777、266/372/924、267、372、401、493、496、499、569、572、573、574、577、579、580、581、583、585、588、589/663、628、629、631、663、669、670、671、691、692、693、706、708、710、711、765、768、779、797、826、834、855、856、857、869、871、873、878、909、924、および926から選択される位置または位置のセットに少なくとも1つの置換を含み、これらの位置は、配列番号1956を参照して番号付けされている。一部の実施形態では、酸性アルファ-グルコシダーゼは、78E/87E/176T/266N/536T/615D、78E/87E/266N/372T/386Y/777G、78E/87E/266N/372T/536T、78E/266N/763L、78E/372T/390Q、87E/266N/372T/483S、87E/372T/777G、105T、105W、125W、129E、129S、136G、136K、136V、139E、141S、142G、152S、152W、154R/588L、156C、156L、222C、222P、225D、227A、229C、266N/372T/536T/615D/763L/777G、266N/372T/924N、267E、372D、401G、493L、496G、499E、499I、499M、499Q、569H、569Q、569S、569T、569V、569Y、572G、572S、573C、573D、573H、573M、573Q、574S、577A、577D、577E、577T、579V、580E、580G、580W、581G、581H、581T、583C、583G、585Q、588L、588V、589I/663F、628V、629A、629C、629G、629I、631I、631L、631M、663A、663F、669R、670E、670F、670I、670Q、670R、670S、670T、670V、670W、671A、671G、671T、691V、692C、692F、692G、692I、692L、692Y、693F、693I、693Y、706F、708C、710K、710L、710M、710N、710S、711C、711G、711H、711W、765W、768I、779E、797E、797F、797I、797L、797M、797W、826G、834G、834H、834S、834W、855G、856G、857A、857E、857S、857T、857V、869L、869S、871E、871K、873A、873F、873Y、878A、878G、878K、878Q、878S、878W、909F、924A、926M、および926Tから選択される位置または位置のセットに少なくとも1つの置換を含み、これらの位置は、配列番号1956を参照して番号付けされている。一部の実施形態では、酸性アルファ-グルコシダーゼは、P78E/D87E/K176T/T266N/V536T/Q615D、P78E/D87E/T266N/S372T/A386Y/S777G、P78E/D87E/T266N/S372T/V536T、P78E/T266N/T763L、P78E/S372T/L390Q、D87E/T266N/S372T/T483S、D87E/S372T/S777G、A105T、A105W、Y125W、K129E、K129S、S136G、S136K、S136V、G139E、T141S、A142G、F152S、F152W、K154R/F588L、I156C、I156L、V222C、V222P、N225D、T227A、A229C、T266N/S372T/V536T/Q615D/T763L/S777G、T266N/S372T/T924N、K267E、S372D、D401G、D493L、A496G、H499E、H499I、H499M、H499Q、L569H、L569Q、L569S、L569T、L569V、L569Y、A572G、A572S、I573C、I573D、I573H、I573M、I573Q、A574S、R577A、R577D、R577E、R577T、L579V、V580E、V580G、V580W、K581G、K581H、K581T、R583C、R583G、T585Q、F588L、F588V、V589I/M663F、L628V、L629A、L629C、L629G、L629I、V631I、V631L、V631M、M663A、M663F、L669R、L670E、L670F、L670I、L670Q、L670R、L670S、L670T、L670V、L670W、S671A、S671G、S671T、L691V、T692C、T692F、T692G、T692I、T692L、T692Y、L693F、L693I、L693Y、H706F、A708C、V710K、V710L、V710M、V710N、V710S、A711C、A711G、A711H、A711W、Y765W、Q768I、P779E、V797E、V797F、V797I、V797L、V797M、V797W、T826G、A834G、A834H、A834S、A834W、E855G、S856G、L857A、L857E、L857S、L857T、L857V、I869L、I869S、L871E、L871K、R873A、R873F、R873Y、V878A、V878G、V878K、V878Q、V878S、V878W、L909F、T924A、V926M、およびV926Tから選択される位置または位置のセットに少なくとも1つの置換を含み、これらの位置は、配列番号1956を参照して番号付けされている。
2W、156C、156K、156R、156S、162T、176R、177Q、185L、186H、187I、199A、199G、199I、199R、199T、199V/775I、199W、202A、202D、202G、202H、202Q、202Y、265D、265F、265H、267E、267G、267R、337H、344C、348E、348W、350F、350I、354L、354S、372D、373A、373S、401G、401S、412R、412S、412W、446C、446D、446G、446I、446K、469M、469T、469V、484A、484K、484R、488C、488E、488S、493L、496M、496W、499A、499E、499I、499M、499Q、499V、503C、503H、503N、526L、526V、543G、543H、543K、543L、543R、612G、612L、612R、612T、615M、615S、649M、677T、678Q、678R、678V、678W、679Y、730K、730L、730R、752F、752G、752L、752N、752S、752W、765W、768I、768K、768V、773P、777M、777W、779I、779M、779S、788A、788H、788I、788L、788N、788Q、788S、788T、788Y、797E、797F、797I、797R、797W、822R、826I、826M、834G、834S、834V、834W、855G、855L、856A、856G、857A、857E、857R、857S、857V、859A、859G、860S、924A、926M、926T、931L、936N、936R、および936Sから選択される位置に少なくとも1つの置換を含み、これらの位置は、配列番号1956を参照して番号付けされている。一部の実施形態では、酸性アルファ-グルコシダーゼは、T44A、T44F、T44V、T44W、T44Y、S53I、G56S、G56W、H63N、G65A、G65F、G65R、G65Y、A105V、A105W、Y125H、Y125W、K129E、K129I、K129S、K129T、K129V、K129W、S136K、S136R、S136V、G139E、T141K、T141R、A142G、T145A、T145L、F152L、F152S、F152W、I156C、I156K、I156R、I156S、D162T、K176R、D177Q、V185L、P186H、L187I、P199A、P199G、P199I、P199R、P199T、P199V/L775I、P199W、S202A、S202D、S202G、S202H、S202Q、S202Y、W265D、W265F、W265H、K267E、K267G、K267R、P337H、Q344C、D348E、D348W、V350F、V350I、F354L、F354S、S372D、T373A、T373S、D401G、D401S、G412R、G412S、G412W、S446C、S446D、S446G、S446I、S446K、I469M、I469T、I469V、N484A、N484K、N484R、L488C、L488E、L488S、D493L、A496M、A496W、H499A、H499E、H499I、H499M、H499Q、H499V、P503C、P503H、P503N、P526L、P526V、T543G、T543H、T543K、T543L、T543R、S612G、S612L、S612R、S612T、Q615M、Q615S、L649M、Y677T、S678Q、S678R、S678V、S678W、F679Y、W730K、W730L、W730R、K752F、K752G、K752L、K752N、K752S、K752W、Y765W、Q768I、Q768K、Q768V、E773P、S777M、S777W、P779I、P779M、P779S、P788A、P788H、P788I、P788L、P788N、P788Q、P788S、P788T、P788Y、V797E、V797F、V797I、V797R、V797W、G822R、T826I、T826M、A834G、A834S、A834V、A834W、E855G、E855L、S856A、S856G、L857A、L857E、L857R、L857S、L857V、V859A、V859G、L860S、T924A、V926M、V926T、V931L、G936N、G936R、およびG936Sから選択される位置に少なくとも1つの置換を含み、これらの位置は、配列番号1956を参照して番号付けされている。一部の実施形態では、酸性アルファ-グルコシダーゼは、78/87/176/266/536/615、78/87/266/372/386/777、78/87/266/372/536、78/266/763、78/372/390、87/266/372/483、87/372/777、105、125、129、136、139、141、142、152、154/588、156、222、225、227、229、266/372/536/615/763/777、266/372/924、267、372、401、493、496、499、569、572、573、574、577、579、580、581、583、585、588、589/663、628、629、631、663、669、670、671、691、692、693、706、708、710、711、765、768、779、797、826、834、855、856、857、869、871、873、878、909、924、および926から選択される位置または位置のセットに少なくとも1つの置換を含み、これらの位置は、配列番号1956を参照して番号付けされている。一部の実施形態では、酸性アルファ-グルコシダーゼは、78E/87E/176T/266N/536T/615D、78E/87E/266N/372T/386Y/777G、78E/87E/266N/372T/536T、78E/266N/763L、78E/372T/390Q、87E/266N/372T/483S、87E/372T/777G、105T、105W、125W、129E、129S、136G、136K、136V、139E、141S、142G、152S、152W、154R/588L、156C、156L、222C、222P、225D、227A、229C、266N/372T/536T/615D/763L/777G、266N/372T/924N、267E、372D、401G、493L、496G、499E、499I、499M、499Q、569H、569Q、569S、569T、569V、569Y、572G、572S、573C、573D、573H、573M、573Q、574S、577A、577D、577E、577T、579V、580E、580G、580W、581G、581H、581T、583C、583G、585Q、588L、588V、589I/663F、628V、629A、629C、629G、629I、631I、631L、631M、663A、663F、669R、670E、670F、670I、670Q、670R、670S、670T、670V、670W、671A、671G、671T、691V、692C、692F、692G、692I、692L、692Y、693F、693I、693Y、706F、708C、710K、710L、710M、710N、710S、711C、711G、711H、711W、765W、768I、779E、797E、797F、797I、797L、797M、797W、826G、834G、834H、834S、834W、855G、856G、857A、857E、857S、857T、857V、869L、869S、871E、871K、873A、873F、873Y、878A、878G、878K、878Q、878S、878W、909F、924A、926M、および926Tから選択される位置または位置のセットに少なくとも1つの置換を含み、これらの位置は、配列番号1956を参照して番号付けされている。一部の実施形態では、酸性アルファ-グルコシダーゼは、P78E/D87E/K176T/T266N/V536T/Q615D、P78E/D87E/T266N/S372T/A386Y/S777G、P78E/D87E/T266N/S372T/V536T、P78E/T266N/T763L、P78E/S372T/L390Q、D87E/T266N/S372T/T483S、D87E/S372T/S777G、A105T、A105W、Y125W、K129E、K129S、S136G、S136K、S136V、G139E、T141S、A142G、F152S、F152W、K154R/F588L、I156C、I156L、V222C、V222P、N225D、T227A、A229C、T266N/S372T/V536T/Q615D/T763L/S777G、T266N/S372T/T924N、K267E、S372D、D401G、D493L、A496G、H499E、H499I、H499M、H499Q、L569H、L569Q、L569S、L569T、L569V、L569Y、A572G、A572S、I573C、I573D、I573H、I573M、I573Q、A574S、R577A、R577D、R577E、R577T、L579V、V580E、V580G、V580W、K581G、K581H、K581T、R583C、R583G、T585Q、F588L、F588V、V589I/M663F、L628V、L629A、L629C、L629G、L629I、V631I、V631L、V631M、M663A、M663F、L669R、L670E、L670F、L670I、L670Q、L670R、L670S、L670T、L670V、L670W、S671A、S671G、S671T、L691V、T692C、T692F、T692G、T692I、T692L、T692Y、L693F、L693I、L693Y、H706F、A708C、V710K、V710L、V710M、V710N、V710S、A711C、A711G、A711H、A711W、Y765W、Q768I、P779E、V797E、V797F、V797I、V797L、V797M、V797W、T826G、A834G、A834H、A834S、A834W、E855G、S856G、L857A、L857E、L857S、L857T、L857V、I869L、I869S、L871E、L871K、R873A、R873F、R873Y、V878A、V878G、V878K、V878Q、V878S、V878W、L909F、T924A、V926M、およびV926Tから選択される位置または位置のセットに少なくとも1つの置換を含み、これらの位置は、配列番号1956を参照して番号付けされている。
本発明は、位置が配列番号2496を参照して番号付けされている、配列番号2496に対して少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、または少なくとも99%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む組換え酸性アルファ-グルコシダーゼおよび/または生物活性組換え酸性アルファ-グルコシダーゼ断片を提供する。一部の実施形態では、酸性アルファ-グルコシダーゼは、246、304、313、569、569/588、569/588/589/628/629/692/711、569/588/678/692、569/588/711/869/871/878、569/588/878、569/589/628/670/678/692/711/795/871、569/589/628/670/692/711、569/589/628/692/711/795、569/589/670、569/589/670/678/692/711/795、569/589/670/871、569/589/678/871/878、569/589/692/795/871/878、569/589/711/871、569/589/871、569/628、569/628/670、569/628/670/678、569/628/670/692/711/871、569/628/670/711、569/628/678/711、569/628/692、569/670、569/670/678、569/670/678/692/871、569/670/692、569/670/711、569/670/711/871、569/678/692/795、569/678/869/878、569/678/878、569/692、569/692/711、569/692/711/869/871/878、569/711、569/711/795/871/878、569/711/869/878、569/711/871、569/795、569/871、572/588/678/692/869/878、572/588/795、572/692/869/878、572/692/878、582、584、585、588/589/628/678、589、589/670/692/795/871、589/670/795/871、589/871、628/629/692/871/878、628/670、628/670/692/711/795、628/711/795、628/871、628/878、629/869/878、670/678、670/678/692/871、670/692/871、678/692/711/869、678/692/795/869、678/692/869、678/795/871/878、692、692/711、692/711/795/869、692/711/795/869/871/878、692/711/869/878、692/711/871/878、692/869、692/869/871/878/916、692/871、711、711/795/869/878、711/869/878、711/871、795/878、812、871、および878から選択される位置または位置のセットに少なくとも1つの置換を含み、これらの位置は、配列番号2496を参照して番号付けされている。一部の実施形態では、酸性アルファ-グルコシダーゼは、246T、304M、313I、313L、569H/589I/628M/670T/678T/692G/711H/795E/871S、569H/628M、569H/628M/670F/678T、569H/628M/670T、569H/628M/670T/692Y/711H/871K、569H/670F/678T/692G/871S、569H/670T/692G、569H/678T/692G/795E、569H/692G、569H/692Y、569H/711H/795E/871S/878S、569H/711H/869S/878S、569H/711H/871K、569T、569T/588L、569T/588L/589I/628M/629I/692Y/711H、569T/588L/678T/692Y、569T/588L/711H/869L/871K/878S、569T/588L/878S、569T/589I/628M/670F/692G/711H、569T/589I/678T/871K/878S、569T/589I/692G/795E/871K/878S、569T/589I/871S、569T/628M/678T/711H、569T/628M/692Y、569T/670T/678T/692G/871K、569T/670T/711H/871E、569T/678T/869S/878S、569T/678T/878S、569T/692Y、569T/692Y/711H/869L/871K/878A、569T/711H、569T/795E、569T/871K、569T/871S、569Y/589I/628M/670T/692Y/711H、569Y/589I/628M/692G/711H/795E、569Y/589I/670F、569Y/589I/670T/678T/692G/711H/795E、569Y/589I/670T/871K、569Y/589I/711H/871K、569Y/628M/670T/692Y/711H/871S、569Y/628M/670T/711H、569Y/670F/678T、569Y/670T、569Y/670T/711H、569Y/692Y/711H、569Y/711H、569Y/871E、572S/588L/678T/692G/869L/878A、572S/588L/795E、572S/692G/869S/878S、572S/692G/878S、572S/692L/869S/878S、582T、584E、585K、588L/589I/628M/678T、589I、589I/670T/692G/795E/871K、589I/670T/795E/871S、589I/871E、628M/629I/692Y/871S/878S、628M/670F、628M/670T/692G/711H/795E、628M/711H/795E、628M/871S、628M/878S、629I/869L/878S、670T/678T、670T/678T/692Y/871S、670T/692G/871K、678T/692G/711H/869S、678T/692G/795E/869S、678T/692G/869S、678T/795E/871K/878A、692G/711H、692G/711H/795E/869L/871K/878A、692G/711H/795E/869S、692G/711H/869L/878S、692G/711H/869S/878A、692G/711H/871S/878A、692G/869L/871K/878S/916R、692G/869S、692G/871K、692Y、711H、711H/795E/869S/878S、711H/869S/878S、711H/871K、795E/878S、812E、871K、871S、および878Sから選択される位置または位置のセットに少なくとも1つの置換を含み、これらの位置は、配列番号2496を参照して番号付けされている。一部の実施形態では、酸性アルファ-グルコシダーゼは、S246T、L304M、V313I、V313L、L569H/V589I/L628M/L670T/S678T/T692G/A711H/Q795E/L871S、L569H/L628M、L569H/L628M/L670F/S678T、L569H/L628M/L670T、L569H/L628M/L670T/T692Y/A711H/L871K、L569H/L670F/S678T/T692G/L871S、L569H/L670T/T692G、L569H/S678T/T692G/Q795E、L569H/T692G、L569H/T692Y、L569H/A711H/Q795E/L871S/V878S、L569H/A711H/I869S/V878S、L569H/A711H/L871K、L569T、L569T/F588L、L569T/F588L/V589I/L628M/L629I/T692Y/A711H、L569T/F588L/S678T/T692Y、L569T/F588L/A711H/I869L/L871K/V878S、L569T/F588L/V878S、L569T/V589I/L628M/L670F/T692G/A711H、L569T/V589I/S678T/L871K/V878S、L569T/V589I/T692G/Q795E/L871K/V878S、L569T/V589I/L871S、L569T/L628M/S678T/A711H、L569T/L628M/T692Y、L569T/L670T/S678T/T692G/L871K、L569T/L670T/A711H/L871E、L569T/S678T/I869S/V878S、L569T/S678T/V878S、L569T/T692Y、L569T/T692Y/A711H/I869L/L871K/V878A、L569T/A711H、L569T/Q795E、L569T/L871K、L569T/L871S、L569Y/V589I/L628M/L670T/T692Y/A711H、L569Y/V589I/L628M/T692G/A711H/Q795E、L569Y/V589I/L670F、L569Y/V589I/L670T/S678T/T692G/A711H/Q795E、L569Y/V589I/L670T/L871K、L569Y/V589I/A711H/L871K、L569Y/L628M/L670T/T692Y/A711H/L871S、L569Y/L628M/L670T/A711H、L569Y/L670F/S678T、L569Y/L670T、L569Y/L670T/A711H、L569Y/T692Y/A711H、L569Y/A711H、L569Y/L871E、A572S/F588L/S678T/T692G/I869L/V878A、A572S/F588L/Q795E、A572S/T692G/I869S/V878S、A572S/T692G/V878S、A572S/T692L/I869S/V878S、A582T、G584E、T585K、F588L/V589I/L628M/S678T、V589I、V589I/L670T/T692G/Q795E/L871K、V589I/L670T/Q795E/L871S、V589I/L871E、L628M/L629I/T692Y/L871S/V878S、L628M/L670F、L628M/L670T/T692G/A711H/Q795E、L628M/A711H/Q795E、L628M/L871S、L628M/V878S、L629I/I869L/V878S、L670T/S678T、L670T/S678T/T692Y/L871S、L670T/T692G/L871K、S678T/T692G/A711H/I869S、S678T/T692G/Q795E/I869S、S678T/T692G/I869S、S678T/Q795E/L871K/V878A、T692G/A711H、T692G/A711H/Q795E/I869L/L871K/V878A、T692G/A711H/Q795E/I869S、T692G/A711H/I869L/V878S、T692G/A711H/I869S/V878A、T692G/A711H/L871S/V878A、T692G/I869L/L871K/V878S/S916R、T692G/I869S、T692G/L87
1K、T692Y、A711H、A711H/Q795E/I869S/V878S、A711H/I869S/V878S、A711H/L871K、Q795E/V878S、A812E、L871K、L871S、およびV878Sから選択される位置または位置のセットに少なくとも1つの置換を含み、これらの位置は、配列番号2496を参照して番号付けされている。一部の実施形態では、酸性アルファ-グルコシダーゼは、60/589、307、313、584、および810から選択される位置または位置のセットに少なくとも1つの置換を含み、これらの位置は、配列番号2496を参照して番号付けされている。一部の実施形態では、酸性アルファ-グルコシダーゼは、60V/589A、307T、313T、584C、および810Vから選択される位置または位置のセットに少なくとも1つの置換を含み、これらの位置は、配列番号2496を参照して番号付けされている。一部の実施形態では、酸性アルファ-グルコシダーゼは、A60V/V589A、S307T、V313T、G584C、およびL810Vから選択される位置または位置のセットに少なくとも1つの置換を含み、これらの位置は、配列番号2496を参照して番号付けされている。一部の実施形態では、酸性アルファ-グルコシダーゼは、60/589、246、304、307、313、569、569/588、569/588/589/628/629/692/711、569/588/678/692、569/588/711/869/871/878、569/588/878、569/589/628/670/678/692/711/795/871、569/589/628/670/692/711、569/589/628/692/711/795、569/589/670、569/589/670/678/692/711/795、569/589/670/871、569/589/678/871/878、569/589/692/795/871/878、569/589/711/871、569/589/871、569/628、569/628/670、569/628/670/678、569/628/670/692/711/871、569/628/670/711、569/628/678/711、569/628/692、569/670、569/670/678、569/670/678/692/871、569/670/692、569/670/711、569/670/711/871、569/678/692/795、569/678/869/878、569/678/878、569/692、569/692/711、569/692/711/869/871/878、569/711、569/711/795/871/878、569/711/869/878、569/711/871、569/795、569/871、572/588/678/692/869/878、572/588/795、572/692/869/878、572/692/878、582、584、585、588/589/628/678、589、589/670/692/795/871、589/670/795/871、589/871、628/629/692/871/878、628/670、628/670/692/711/795、628/711/795、628/871、628/878、629/869/878、670/678、670/678/692/871、670/692/871、678/692/711/869、678/692/795/869、678/692/869、678/795/871/878、692、692/711、692/711/795/869、692/711/795/869/871/878、692/711/869/878、692/711/871/878、692/869、692/869/871/878/916、692/871、711、711/795/869/878、711/869/878、711/871、795/878、810、812、871、および878から選択される位置または位置のセットに少なくとも1つの置換を含み、これらの位置は、配列番号2496を参照して番号付けされている。一部の実施形態では、酸性アルファ-グルコシダーゼは、60V/589A、246T、304M、307T、313I、313L、313T、569H/589I/628M/670T/678T/692G/711H/795E/871S、569H/628M、569H/628M/670F/678T、569H/628M/670T、569H/628M/670T/692Y/711H/871K、569H/670F/678T/692G/871S、569H/670T/692G、569H/678T/692G/795E、569H/692G、569H/692Y、569H/711H/795E/871S/878S、569H/711H/869S/878S、569H/711H/871K、569T、569T/588L、569T/588L/589I/628M/629I/692Y/711H、569T/588L/678T/692Y、569T/588L/711H/869L/871K/878S、569T/588L/878S、569T/589I/628M/670F/692G/711H、569T/589I/678T/871K/878S、569T/589I/692G/795E/871K/878S、569T/589I/871S、569T/628M/678T/711H、569T/628M/692Y、569T/670T/678T/692G/871K、569T/670T/711H/871E、569T/678T/869S/878S、569T/678T/878S、569T/692Y、569T/692Y/711H/869L/871K/878A、569T/711H、569T/795E、569T/871K、569T/871S、569Y/589I/628M/670T/692Y/711H、569Y/589I/628M/692G/711H/795E、569Y/589I/670F、569Y/589I/670T/678T/692G/711H/795E、569Y/589I/670T/871K、569Y/589I/711H/871K、569Y/628M/670T/692Y/711H/871S、569Y/628M/670T/711H、569Y/670F/678T、569Y/670T、569Y/670T/711H、569Y/692Y/711H、569Y/711H、569Y/871E、572S/588L/678T/692G/869L/878A、572S/588L/795E、572S/692G/869S/878S、572S/692G/878S、572S/692L/869S/878S、582T、584C、584E、585K、588L/589I/628M/678T、589I、589I/670T/692G/795E/871K、589I/670T/795E/871S、589I/871E、628M/629I/692Y/871S/878S、628M/670F、628M/670T/692G/711H/795E、628M/711H/795E、628M/871S、628M/878S、629I/869L/878S、670T/678T、670T/678T/692Y/871S、670T/692G/871K、678T/692G/711H/869S、678T/692G/795E/869S、678T/692G/869S、678T/795E/871K/878A、692G/711H、692G/711H/795E/869L/871K/878A、692G/711H/795E/869S、692G/711H/869L/878S、692G/711H/869S/878A、692G/711H/871S/878A、692G/869L/871K/878S/916R、692G/869S、692G/871K、692Y、711H、711H/795E/869S/878S、711H/869S/878S、711H/871K、795E/878S、810V、812E、871K、871S、および878Sから選択される位置または位置のセットに少なくとも1つの置換を含み、これらの位置は、配列番号2496を参照して番号付けされている。一部の実施形態では、酸性アルファ-グルコシダーゼは、A60V/V589A、S246T、L304M、S307T、V313I、V313L、V313T、L569H/V589I/L628M/L670T/S678T/T692G/A711H/Q795E/L871S、L569H/L628M、L569H/L628M/L670F/S678T、L569H/L628M/L670T、L569H/L628M/L670T/T692Y/A711H/L871K、L569H/L670F/S678T/T692G/L871S、L569H/L670T/T692G、L569H/S678T/T692G/Q795E、L569H/T692G、L569H/T692Y、L569H/A711H/Q795E/L871S/V878S、L569H/A711H/I869S/V878S、L569H/A711H/L871K、L569T、L569T/F588L、L569T/F588L/V589I/L628M/L629I/T692Y/A711H、L569T/F588L/S678T/T692Y、L569T/F588L/A711H/I869L/L871K/V878S、L569T/F588L/V878S、L569T/V589I/L628M/L670F/T692G/A711H、L569T/V589I/S678T/L871K/V878S、L569T/V589I/T692G/Q795E/L871K/V878S、L569T/V589I/L871S、L569T/L628M/S678T/A711H、L569T/L628M/T692Y、L569T/L670T/S678T/T692G/L871K、L569T/L670T/A711H/L871E、L569T/S678T/I869S/V878S、L569T/S678T/V878S、L569T/T692Y、L569T/T692Y/A711H/I869L/L871K/V878A、L569T/A711H、L569T/Q795E、L569T/L871K、L569T/L871S、L569Y/V589I/L628M/L670T/T692Y/A711H、L569Y/V589I/L628M/T692G/A711H/Q795E、L569Y/V589I/L670F、L569Y/V589I/L670T/S678T/T692G/A711H/Q795E、L569Y/V589I/L670T/L871K、L569Y/V589I/A711H/L871K、L569Y/L628M/L670T/T692Y/A711H/L871S、L569Y/L628M/L670T/A711H、L569Y/L670F/S678T、L569Y/L670T、L569Y/L670T/A711H、L569Y/T692Y/A711H、L569Y/A711H、L569Y/L871E、A572S/F588L/S678T/T692G/I869L/V878A、A572S/F588L/Q795E、A572S/T692G/I869S/V878S、A572S/T692G/V878S、A572S/T692L/I869S/V878S、A582T、G584C、G584E、T585K、F588L/V589I/L628M/S678T、V589I、V589I/L670T/T692G/Q795E/L871K、V589I/L670T/Q795E/L871S、V589I/L871E、L628M/L629I/T692Y/L871S/V878S、L628M/L670F、L628M/L670T/T692G/A711H/Q795E、L628M/A711H/Q795E、L628M/L871S、L628M/
V878S、L629I/I869L/V878S、L670T/S678T、L670T/S678T/T692Y/L871S、L670T/T692G/L871K、S678T/T692G/A711H/I869S、S678T/T692G/Q795E/I869S、S678T/T692G/I869S、S678T/Q795E/L871K/V878A、T692G/A711H、T692G/A711H/Q795E/I869L/L871K/V878A、T692G/A711H/Q795E/I869S、T692G/A711H/I869L/V878S、T692G/A711H/I869S/V878A、T692G/A711H/L871S/V878A、T692G/I869L/L871K/V878S/S916R、T692G/I869S、T692G/L871K、T692Y、A711H、A711H/Q795E/I869S/V878S、A711H/I869S/V878S、A711H/L871K、Q795E/V878S、L810V、A812E、L871K、L871S、およびV878Sから選択される位置または位置のセットに少なくとも1つの置換を含み、これらの位置は、配列番号2496を参照して番号付けされている。
1K、T692Y、A711H、A711H/Q795E/I869S/V878S、A711H/I869S/V878S、A711H/L871K、Q795E/V878S、A812E、L871K、L871S、およびV878Sから選択される位置または位置のセットに少なくとも1つの置換を含み、これらの位置は、配列番号2496を参照して番号付けされている。一部の実施形態では、酸性アルファ-グルコシダーゼは、60/589、307、313、584、および810から選択される位置または位置のセットに少なくとも1つの置換を含み、これらの位置は、配列番号2496を参照して番号付けされている。一部の実施形態では、酸性アルファ-グルコシダーゼは、60V/589A、307T、313T、584C、および810Vから選択される位置または位置のセットに少なくとも1つの置換を含み、これらの位置は、配列番号2496を参照して番号付けされている。一部の実施形態では、酸性アルファ-グルコシダーゼは、A60V/V589A、S307T、V313T、G584C、およびL810Vから選択される位置または位置のセットに少なくとも1つの置換を含み、これらの位置は、配列番号2496を参照して番号付けされている。一部の実施形態では、酸性アルファ-グルコシダーゼは、60/589、246、304、307、313、569、569/588、569/588/589/628/629/692/711、569/588/678/692、569/588/711/869/871/878、569/588/878、569/589/628/670/678/692/711/795/871、569/589/628/670/692/711、569/589/628/692/711/795、569/589/670、569/589/670/678/692/711/795、569/589/670/871、569/589/678/871/878、569/589/692/795/871/878、569/589/711/871、569/589/871、569/628、569/628/670、569/628/670/678、569/628/670/692/711/871、569/628/670/711、569/628/678/711、569/628/692、569/670、569/670/678、569/670/678/692/871、569/670/692、569/670/711、569/670/711/871、569/678/692/795、569/678/869/878、569/678/878、569/692、569/692/711、569/692/711/869/871/878、569/711、569/711/795/871/878、569/711/869/878、569/711/871、569/795、569/871、572/588/678/692/869/878、572/588/795、572/692/869/878、572/692/878、582、584、585、588/589/628/678、589、589/670/692/795/871、589/670/795/871、589/871、628/629/692/871/878、628/670、628/670/692/711/795、628/711/795、628/871、628/878、629/869/878、670/678、670/678/692/871、670/692/871、678/692/711/869、678/692/795/869、678/692/869、678/795/871/878、692、692/711、692/711/795/869、692/711/795/869/871/878、692/711/869/878、692/711/871/878、692/869、692/869/871/878/916、692/871、711、711/795/869/878、711/869/878、711/871、795/878、810、812、871、および878から選択される位置または位置のセットに少なくとも1つの置換を含み、これらの位置は、配列番号2496を参照して番号付けされている。一部の実施形態では、酸性アルファ-グルコシダーゼは、60V/589A、246T、304M、307T、313I、313L、313T、569H/589I/628M/670T/678T/692G/711H/795E/871S、569H/628M、569H/628M/670F/678T、569H/628M/670T、569H/628M/670T/692Y/711H/871K、569H/670F/678T/692G/871S、569H/670T/692G、569H/678T/692G/795E、569H/692G、569H/692Y、569H/711H/795E/871S/878S、569H/711H/869S/878S、569H/711H/871K、569T、569T/588L、569T/588L/589I/628M/629I/692Y/711H、569T/588L/678T/692Y、569T/588L/711H/869L/871K/878S、569T/588L/878S、569T/589I/628M/670F/692G/711H、569T/589I/678T/871K/878S、569T/589I/692G/795E/871K/878S、569T/589I/871S、569T/628M/678T/711H、569T/628M/692Y、569T/670T/678T/692G/871K、569T/670T/711H/871E、569T/678T/869S/878S、569T/678T/878S、569T/692Y、569T/692Y/711H/869L/871K/878A、569T/711H、569T/795E、569T/871K、569T/871S、569Y/589I/628M/670T/692Y/711H、569Y/589I/628M/692G/711H/795E、569Y/589I/670F、569Y/589I/670T/678T/692G/711H/795E、569Y/589I/670T/871K、569Y/589I/711H/871K、569Y/628M/670T/692Y/711H/871S、569Y/628M/670T/711H、569Y/670F/678T、569Y/670T、569Y/670T/711H、569Y/692Y/711H、569Y/711H、569Y/871E、572S/588L/678T/692G/869L/878A、572S/588L/795E、572S/692G/869S/878S、572S/692G/878S、572S/692L/869S/878S、582T、584C、584E、585K、588L/589I/628M/678T、589I、589I/670T/692G/795E/871K、589I/670T/795E/871S、589I/871E、628M/629I/692Y/871S/878S、628M/670F、628M/670T/692G/711H/795E、628M/711H/795E、628M/871S、628M/878S、629I/869L/878S、670T/678T、670T/678T/692Y/871S、670T/692G/871K、678T/692G/711H/869S、678T/692G/795E/869S、678T/692G/869S、678T/795E/871K/878A、692G/711H、692G/711H/795E/869L/871K/878A、692G/711H/795E/869S、692G/711H/869L/878S、692G/711H/869S/878A、692G/711H/871S/878A、692G/869L/871K/878S/916R、692G/869S、692G/871K、692Y、711H、711H/795E/869S/878S、711H/869S/878S、711H/871K、795E/878S、810V、812E、871K、871S、および878Sから選択される位置または位置のセットに少なくとも1つの置換を含み、これらの位置は、配列番号2496を参照して番号付けされている。一部の実施形態では、酸性アルファ-グルコシダーゼは、A60V/V589A、S246T、L304M、S307T、V313I、V313L、V313T、L569H/V589I/L628M/L670T/S678T/T692G/A711H/Q795E/L871S、L569H/L628M、L569H/L628M/L670F/S678T、L569H/L628M/L670T、L569H/L628M/L670T/T692Y/A711H/L871K、L569H/L670F/S678T/T692G/L871S、L569H/L670T/T692G、L569H/S678T/T692G/Q795E、L569H/T692G、L569H/T692Y、L569H/A711H/Q795E/L871S/V878S、L569H/A711H/I869S/V878S、L569H/A711H/L871K、L569T、L569T/F588L、L569T/F588L/V589I/L628M/L629I/T692Y/A711H、L569T/F588L/S678T/T692Y、L569T/F588L/A711H/I869L/L871K/V878S、L569T/F588L/V878S、L569T/V589I/L628M/L670F/T692G/A711H、L569T/V589I/S678T/L871K/V878S、L569T/V589I/T692G/Q795E/L871K/V878S、L569T/V589I/L871S、L569T/L628M/S678T/A711H、L569T/L628M/T692Y、L569T/L670T/S678T/T692G/L871K、L569T/L670T/A711H/L871E、L569T/S678T/I869S/V878S、L569T/S678T/V878S、L569T/T692Y、L569T/T692Y/A711H/I869L/L871K/V878A、L569T/A711H、L569T/Q795E、L569T/L871K、L569T/L871S、L569Y/V589I/L628M/L670T/T692Y/A711H、L569Y/V589I/L628M/T692G/A711H/Q795E、L569Y/V589I/L670F、L569Y/V589I/L670T/S678T/T692G/A711H/Q795E、L569Y/V589I/L670T/L871K、L569Y/V589I/A711H/L871K、L569Y/L628M/L670T/T692Y/A711H/L871S、L569Y/L628M/L670T/A711H、L569Y/L670F/S678T、L569Y/L670T、L569Y/L670T/A711H、L569Y/T692Y/A711H、L569Y/A711H、L569Y/L871E、A572S/F588L/S678T/T692G/I869L/V878A、A572S/F588L/Q795E、A572S/T692G/I869S/V878S、A572S/T692G/V878S、A572S/T692L/I869S/V878S、A582T、G584C、G584E、T585K、F588L/V589I/L628M/S678T、V589I、V589I/L670T/T692G/Q795E/L871K、V589I/L670T/Q795E/L871S、V589I/L871E、L628M/L629I/T692Y/L871S/V878S、L628M/L670F、L628M/L670T/T692G/A711H/Q795E、L628M/A711H/Q795E、L628M/L871S、L628M/
V878S、L629I/I869L/V878S、L670T/S678T、L670T/S678T/T692Y/L871S、L670T/T692G/L871K、S678T/T692G/A711H/I869S、S678T/T692G/Q795E/I869S、S678T/T692G/I869S、S678T/Q795E/L871K/V878A、T692G/A711H、T692G/A711H/Q795E/I869L/L871K/V878A、T692G/A711H/Q795E/I869S、T692G/A711H/I869L/V878S、T692G/A711H/I869S/V878A、T692G/A711H/L871S/V878A、T692G/I869L/L871K/V878S/S916R、T692G/I869S、T692G/L871K、T692Y、A711H、A711H/Q795E/I869S/V878S、A711H/I869S/V878S、A711H/L871K、Q795E/V878S、L810V、A812E、L871K、L871S、およびV878Sから選択される位置または位置のセットに少なくとも1つの置換を含み、これらの位置は、配列番号2496を参照して番号付けされている。
本発明は、位置が配列番号2880を参照して番号付けされている、配列番号2880に対して少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、または少なくとも99%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む組換え酸性アルファ-グルコシダーゼおよび/または生物活性組換え酸性アルファ-グルコシダーゼ断片を提供する。一部の実施形態では、酸性アルファ-グルコシダーゼは、24/28/29/39/50/62/78/87/135/150/266/267/522/527/551/670/727/750/830/842/871/883/894/932、24/28/39/50/62/78/87/135/150/266/267/522/527/551/569/727/830/842/871/883/894/913、24/28/50/135/150/437/522/527/871/883/894/932、24/28/62/522/569/932、24/28/437/486/527、24/29/39/50/62/78/87/135/150/267/437/486/522/527/551/711/727/750/830/842/871/883/894/913/932、24/50/78/87/135/150/267/486/522/527/551/670/727/750/830/842/871/883/894/913/932、24/50/486/527/711/727、24/62/87/486/727、24/62/727/830/932、24/87/135/522/670/711/830/842/913、24/150/522/527/727/883/894、24/527/727/842/871/883/913/932、24/670/727/750/842/871、28、28/50/78/87/135/266/267/437/486/527/551/670/727/750/830/842/871/883/894/913/932、28/50/522/527/711/727/871、28/62、28/62/267/932、28/437/527/871、28/522/527/569/711/830/894、28/727、28/727/871、29/39/50/62/65/78/87/135/150/437/551/569/670/727/750/830/842/883/894/932、29/62/437/527、29/78/87/150/527/727、29/78/135/727/830、29/87、29/135/150/527/670/727/883、29/150/267/727/750/871/883/932、29/150/437/727、29/522/670/711/871、29/670/932、39/50、39/727/750/932、50/135/150/932、50/437/522/527、50/711、50/727/750/883/894、62、62/87/150、62/87/150/727、62/135/522/711/727/750/842/871/894、62/437、62/437/727、78/87/486/527/670/727/750/830/842/871/913/932、87/750、89/109/527/678/727/842、89/109/678/727/736/812/878、89/109/727/932、89/109/932、89/527、89/527/678/692/736/842/878/932、89/527/678/932、89/527/727/812/860、89/678/692/736/932、89/678/812/878、89/842/878、109/527/678/812、109/678/692/842/860/878/932、109/678/727/860、109/678/736/812/878、109/678/812、109/678/842/878、109/692/727/736/812、109/692/727/812/842/860、109/727/860/878、109/736/932、109/812、109/842、109/932、135/670/727、135/711/750/932、150/527/842/871/913、150/871/932、150/883/932、267/527/727、403/527/678/692/736/812/842/860、437/522/527/670/871、437/750/830/932、522、522/527/569/727、522/830、527、527/678/692/727/736/878、527/678/692/812/932、527/692/727/736/812、527/692/727/736/842/860/878、527/727/736、527/736/932、527/812、670/711/871、670/830/871、678/692/727/812/842、678/692/812、678/812、678/860/878、678/913、678/932、692/727/736/842/913、692/812、727、727/932、871、および878/932から選択される位置または位置のセットに少なくとも1つの置換を含み、これらの位置は、配列番号2880を参照して番号付けされている。一部の実施形態では、酸性アルファ-グルコシダーゼは、__から選択される位置または位置のセットに少なくとも1つの置換を含み、これらの位置は、配列番号2880を参照して番号付けされている。一部の実施形態では、酸性アルファ-グルコシダーゼは、24L/28L/29L/39P/50Q/62A/78P/87D/135S/150T/266T/267R/522E/527N/551V/670L/727S/750A/830Q/842G/871L/883R/894Q/932S、24L/28L/39P/50Q/62A/78P/87D/135S/150T/266T/267R/522E/527N/551V/569L/727S/830Q/842G/871L/883R/894Q/913V、24L/28L/50Q/135S/150T/437A/522E/527N/871L/883R/894Q/932S、24L/28L/62A/522E/569L/932S、24L/28L/437A/486T/527N、24L/29L/39P/50Q/62A/78P/87D/135S/150T/267R/437A/486T/522E/527N/551V/711A/727S/750A/830Q/842G/871L/883R/894Q/913V/932S、24L/50Q/78P/87D/135S/150T/267R/486T/522E/527N/551V/670L/727S/750A/830Q/842G/871L/883R/894Q/913V/932S、24L/50Q/486T/527N/711A/727S、24L/62A/87D/486T/727S、24L/62A/727S/830Q/932S、24L/87D/135S/522E/670L/711A/830Q/842G/913V、24L/150T/522E/527N/727S/883R/894Q、24L/527N/727S/842G/871L/883R/913V/932S、24L/670L/727S/750A/842G/871L、28L、28L/50Q/78P/87D/135S/266T/267R/437A/486T/527N/551V/670L/727S/750A/830Q/842G/871L/883R/894Q/913V/932S、28L/50Q/522E/527N/711A/727S/871L、28L/62A、28L/62A/267R/932S、28L/437A/527N/871L、28L/522E/527N/569L/711A/830Q/894Q、28L/727S、28L/727S/871L、29L/39P/50Q/62A/65R/78P/87D/135S/150T/437A/551V/569L/670L/727S/750A/830Q/842G/883R/894Q/932S、29L/62A/437A/527N、29L/78P/87D/150T/527N/727S、29L/78P/135S/727S/830Q、29L/87D、29L/135S/150T/527N/670L/727S/883R、29L/150T/267R/727S/750A/871L/883R/932S、29L/150T/437A/727S、29L/522E/670L/711A/871L、29L/670L/932S、39P/50Q、39P/727S/750A/932S、50Q/135S/150T/932S、50Q/437A/522E/527N、50Q/711A、50Q/727S/750A/883R/894Q、62A、62A/87D/150T、62A/87D/150T/727S、62A/135S/522E/711A/727S/750A/842G/871L/894Q、62A/437A、62A/437A/727S、78P/87D/486T/527N/670L/727S/750A/830Q/842G/871L/913V/932S、87D/750A、89R/109D/527N/678T/727S/842G、89R/109D/678T/727S/736M/812E/878S、89R/109D/727S/932S、89R/109D/932S、89R/527N、89R/527N/678T/692G/736M/842G/878S/932S、89R/527N/678T/932S、89R/527N/727S/812E/860F、89R/678T/692G/736M/932S、89R/678T/812E/878S、89R/842G/878S、109D/527N/678T/812E、109D/678T/692G/842G/860F/878S/932S、109D/678T/727S/860F、109D/678T/736M/812E/878S、109D/678T/812E、109D/678T/842G/878S、109D/692G/727S/736M/812E、109D/692G/727S/812E/842G/860F、109D/727S/860F/878S、109D/736M/932S、109D/812E、109D/842G、109D/932S、135S/670L/727S、135S/711A/750A/932S、150T/527N/842G/871L/913V、150T/871L/932S、150T/883R/932S、267R/527N/727S、403H/527N/678T/692G/736M/812E/842G/860F、437A/522E/527N/670L/871L、437A/750A/830Q/932S、522E、522E/527N/569L/727S、522E/830Q、527N、527N/678T/692G/727S/736M/878S、527N/678T/692G/812E/932S、527N/692G/727S/736M/812E、527N/692G/727S/736M/842G/860F/878S、527N/727S/736M、527N/736M/932S、527N/812E、670L/711A/871L、670L/830Q/871L、678T/692G/727S/812E/842G、678T/692G/812E、678T/812E、678T/860F/878S、678T/913V、678T/932S、692G/727S/736M/842G/91
3V、692G/812E、727S、727S/932S、871L、および878S/932Sから選択される位置または位置のセットに少なくとも1つの置換を含み、これらの位置は、配列番号2880を参照して番号付けされている。一部の実施形態では、酸性アルファ-グルコシダーゼは、W24L/S28L/T29L/Q39P/V50Q/L62A/E78P/E87D/Q135S/S150T/N266T/K267R/V522E/R527N/A551V/T670L/W727S/P750A/K830Q/S842G/E871L/H883R/G894Q/A932S、W24L/S28L/Q39P/V50Q/L62A/E78P/E87D/Q135S/S150T/N266T/K267R/V522E/R527N/A551V/T569L/W727S/K830Q/S842G/E871L/H883R/G894Q/R913V、W24L/S28L/V50Q/Q135S/S150T/G437A/V522E/R527N/E871L/H883R/G894Q/A932S、W24L/S28L/L62A/V522E/T569L/A932S、W24L/S28L/G437A/E486T/R527N、W24L/T29L/Q39P/V50Q/L62A/E78P/E87D/Q135S/S150T/K267R/G437A/E486T/V522E/R527N/A551V/H711A/W727S/P750A/K830Q/S842G/E871L/H883R/G894Q/R913V/A932S、W24L/V50Q/E78P/E87D/Q135S/S150T/K267R/E486T/V522E/R527N/A551V/T670L/W727S/P750A/K830Q/S842G/E871L/H883R/G894Q/R913V/A932S、W24L/V50Q/E486T/R527N/H711A/W727S、W24L/L62A/E87D/E486T/W727S、W24L/L62A/W727S/K830Q/A932S、W24L/E87D/Q135S/V522E/T670L/H711A/K830Q/S842G/R913V、W24L/S150T/V522E/R527N/W727S/H883R/G894Q、W24L/R527N/W727S/S842G/E871L/H883R/R913V/A932S、W24L/T670L/W727S/P750A/S842G/E871L、S28L、S28L/V50Q/E78P/E87D/Q135S/N266T/K267R/G437A/E486T/R527N/A551V/T670L/W727S/P750A/K830Q/S842G/E871L/H883R/G894Q/R913V/A932S、S28L/V50Q/V522E/R527N/H711A/W727S/E871L、S28L/L62A、S28L/L62A/K267R/A932S、S28L/G437A/R527N/E871L、S28L/V522E/R527N/T569L/H711A/K830Q/G894Q、S28L/W727S、S28L/W727S/E871L、T29L/Q39P/V50Q/L62A/G65R/E78P/E87D/Q135S/S150T/G437A/A551V/T569L/T670L/W727S/P750A/K830Q/S842G/H883R/G894Q/A932S、T29L/L62A/G437A/R527N、T29L/E78P/E87D/S150T/R527N/W727S、T29L/E78P/Q135S/W727S/K830Q、T29L/E87D、T29L/Q135S/S150T/R527N/T670L/W727S/H883R、T29L/S150T/K267R/W727S/P750A/E871L/H883R/A932S、T29L/S150T/G437A/W727S、T29L/V522E/T670L/H711A/E871L、T29L/T670L/A932S、Q39P/V50Q、Q39P/W727S/P750A/A932S、V50Q/Q135S/S150T/A932S、V50Q/G437A/V522E/R527N、V50Q/H711A、V50Q/W727S/P750A/H883R/G894Q、L62A、L62A/E87D/S150T、L62A/E87D/S150T/W727S、L62A/Q135S/V522E/H711A/W727S/P750A/S842G/E871L/G894Q、L62A/G437A、L62A/G437A/W727S、E78P/E87D/E486T/R527N/T670L/W727S/P750A/K830Q/S842G/E871L/R913V/A932S、E87D/P750A、A89R/L109D/R527N/S678T/W727S/S842G、A89R/L109D/S678T/W727S/L736M/A812E/V878S、A89R/L109D/W727S/A932S、A89R/L109D/A932S、A89R/R527N、A89R/R527N/S678T/T692G/L736M/S842G/V878S/A932S、A89R/R527N/S678T/A932S、A89R/R527N/W727S/A812E/L860F、A89R/S678T/T692G/L736M/A932S、A89R/S678T/A812E/V878S、A89R/S842G/V878S、L109D/R527N/S678T/A812E、L109D/S678T/T692G/S842G/L860F/V878S/A932S、L109D/S678T/W727S/L860F、L109D/S678T/L736M/A812E/V878S、L109D/S678T/A812E、L109D/S678T/S842G/V878S、L109D/T692G/W727S/L736M/A812E、L109D/T692G/W727S/A812E/S842G/L860F、L109D/W727S/L860F/V878S、L109D/L736M/A932S、L109D/A812E、L109D/S842G、L109D/A932S、Q135S/T670L/W727S、Q135S/H711A/P750A/A932S、S150T/R527N/S842G/E871L/R913V、S150T/E871L/A932S、S150T/H883R/A932S、K267R/R527N/W727S、R403H/R527N/S678T/T692G/L736M/A812E/S842G/L860F、G437A/V522E/R527N/T670L/E871L、G437A/P750A/K830Q/A932S、V522E、V522E/R527N/T569L/W727S、V522E/K830Q、R527N、R527N/S678T/T692G/W727S/L736M/V878S、R527N/S678T/T692G/A812E/A932S、R527N/T692G/W727S/L736M/A812E、R527N/T692G/W727S/L736M/S842G/L860F/V878S、R527N/W727S/L736M、R527N/L736M/A932S、R527N/A812E、T670L/H711A/E871L、T670L/K830Q/E871L、S678T/T692G/W727S/A812E/S842G、S678T/T692G/A812E、S678T/A812E、S678T/L860F/V878S、S678T/R913V、S678T/A932S、T692G/W727S/L736M/S842G/R913V、T692G/A812E、W727S、W727S/A932S、E871L、およびV878S/A932Sから選択される位置または位置のセットに少なくとも1つの置換を含み、これらの位置は、配列番号2880を参照して番号付けされている。一部の実施形態では、酸性アルファ-グルコシダーゼは、62/87/150、89/109/527/678/727/842、89/109/678/727/736/812/878、89/109/932、89/527/678/692/736/842/878/932、89/527/727/812/860、89/678/692/736/932、89/678/812/878、109/527/678/812、109/678/692/842/860/878/932、109/678/736/812/878、109/678/812、109/692/727/736/812、109/692/727/812/842/860、109/736/932、109/812、109/842、109/932、403/527/678/692/736/812/842/860、522/830、527/678/692/727/736/878、527/678/692/812/932、527/692/727/736/812、527/692/727/736/842/860/878、527/727/736、527/736/932、527/812、678/692/727/812/842、678/692/812、678/812、692/727/736/842/913、および692/812から選択される位置または位置のセットに少なくとも1つの置換を含み、これらの位置は、配列番号2880を参照して番号付けされている。一部の実施形態では、酸性アルファ-グルコシダーゼは、62A/87D/150T、89R/109D/527N/678T/727S/842G、89R/109D/678T/727S/736M/812E/878S、89R/109D/932S、89R/527N/678T/692G/736M/842G/878S/932S、89R/527N/727S/812E/860F、89R/678T/692G/736M/932S、89R/678T/812E/878S、109D/527N/678T/812E、109D/678T/692G/842G/860F/878S/932S、109D/678T/736M/812E/878S、109D/678T/812E、109D/692G/727S/736M/812E、109D/692G/727S/812E/842G/860F、109D/736M/932S、109D/812E、109D/842G、109D/932S、403H/527N/678T/692G/736M/812E/842G/860F、522E/830Q、527N/678T/692G/727S/736M/878S、527N/678T/692G/812E/932S、527N/692G/727S/736M/812E、527N/692G/727S/736M/842G/860F/878S、527N/727S/736M、527N/736M/932S、527N/812E、678T/692G/727S/812E/842G、678T/692G/812E、678T/812E、692G/727S/736M/842G/913V、および692G/812Eから選択される位置または位置のセットに少なくとも1つの置換を含み、これらの位置は、配列番号2880を参照して番号付けされている。一部の実施形態では、酸性アルファ-グルコシダーゼは、L62A/E87D/S150T、A89R/L109D/R527N/S678T/W727S/S842G、A89R/L109D/S678T/W727S/L736M/A812E/V878S、A89R/L109D/A932S、A89R/R527N/S678T/T692G/L736M/S842G/V878S/A932S、A89R/R527N/W727S/A812E/L860F、A89R/S678T/T692G/L736M/A932S、A89R/S678T/A812E/V878S、L109D/R527N/S678T/A812E、L109D/S678T/T692G/S842G/L860F/V878S/A932S、L109D/
S678T/L736M/A812E/V878S、L109D/S678T/A812E、L109D/T692G/W727S/L736M/A812E、L109D/T692G/W727S/A812E/S842G/L860F、L109D/L736M/A932S、L109D/A812E、L109D/S842G、L109D/A932S、R403H/R527N/S678T/T692G/L736M/A812E/S842G/L860F、V522E/K830Q、R527N/S678T/T692G/W727S/L736M/V878S、R527N/S678T/T692G/A812E/A932S、R527N/T692G/W727S/L736M/A812E、R527N/T692G/W727S/L736M/S842G/L860F/V878S、R527N/W727S/L736M、R527N/L736M/A932S、R527N/A812E、S678T/T692G/W727S/A812E/S842G、S678T/T692G/A812E、S678T/A812E、T692G/W727S/L736M/S842G/R913V、およびT692G/A812Eから選択される位置または位置のセットに少なくとも1つの置換を含み、これらの位置は、配列番号2880を参照して番号付けされている。
3V、692G/812E、727S、727S/932S、871L、および878S/932Sから選択される位置または位置のセットに少なくとも1つの置換を含み、これらの位置は、配列番号2880を参照して番号付けされている。一部の実施形態では、酸性アルファ-グルコシダーゼは、W24L/S28L/T29L/Q39P/V50Q/L62A/E78P/E87D/Q135S/S150T/N266T/K267R/V522E/R527N/A551V/T670L/W727S/P750A/K830Q/S842G/E871L/H883R/G894Q/A932S、W24L/S28L/Q39P/V50Q/L62A/E78P/E87D/Q135S/S150T/N266T/K267R/V522E/R527N/A551V/T569L/W727S/K830Q/S842G/E871L/H883R/G894Q/R913V、W24L/S28L/V50Q/Q135S/S150T/G437A/V522E/R527N/E871L/H883R/G894Q/A932S、W24L/S28L/L62A/V522E/T569L/A932S、W24L/S28L/G437A/E486T/R527N、W24L/T29L/Q39P/V50Q/L62A/E78P/E87D/Q135S/S150T/K267R/G437A/E486T/V522E/R527N/A551V/H711A/W727S/P750A/K830Q/S842G/E871L/H883R/G894Q/R913V/A932S、W24L/V50Q/E78P/E87D/Q135S/S150T/K267R/E486T/V522E/R527N/A551V/T670L/W727S/P750A/K830Q/S842G/E871L/H883R/G894Q/R913V/A932S、W24L/V50Q/E486T/R527N/H711A/W727S、W24L/L62A/E87D/E486T/W727S、W24L/L62A/W727S/K830Q/A932S、W24L/E87D/Q135S/V522E/T670L/H711A/K830Q/S842G/R913V、W24L/S150T/V522E/R527N/W727S/H883R/G894Q、W24L/R527N/W727S/S842G/E871L/H883R/R913V/A932S、W24L/T670L/W727S/P750A/S842G/E871L、S28L、S28L/V50Q/E78P/E87D/Q135S/N266T/K267R/G437A/E486T/R527N/A551V/T670L/W727S/P750A/K830Q/S842G/E871L/H883R/G894Q/R913V/A932S、S28L/V50Q/V522E/R527N/H711A/W727S/E871L、S28L/L62A、S28L/L62A/K267R/A932S、S28L/G437A/R527N/E871L、S28L/V522E/R527N/T569L/H711A/K830Q/G894Q、S28L/W727S、S28L/W727S/E871L、T29L/Q39P/V50Q/L62A/G65R/E78P/E87D/Q135S/S150T/G437A/A551V/T569L/T670L/W727S/P750A/K830Q/S842G/H883R/G894Q/A932S、T29L/L62A/G437A/R527N、T29L/E78P/E87D/S150T/R527N/W727S、T29L/E78P/Q135S/W727S/K830Q、T29L/E87D、T29L/Q135S/S150T/R527N/T670L/W727S/H883R、T29L/S150T/K267R/W727S/P750A/E871L/H883R/A932S、T29L/S150T/G437A/W727S、T29L/V522E/T670L/H711A/E871L、T29L/T670L/A932S、Q39P/V50Q、Q39P/W727S/P750A/A932S、V50Q/Q135S/S150T/A932S、V50Q/G437A/V522E/R527N、V50Q/H711A、V50Q/W727S/P750A/H883R/G894Q、L62A、L62A/E87D/S150T、L62A/E87D/S150T/W727S、L62A/Q135S/V522E/H711A/W727S/P750A/S842G/E871L/G894Q、L62A/G437A、L62A/G437A/W727S、E78P/E87D/E486T/R527N/T670L/W727S/P750A/K830Q/S842G/E871L/R913V/A932S、E87D/P750A、A89R/L109D/R527N/S678T/W727S/S842G、A89R/L109D/S678T/W727S/L736M/A812E/V878S、A89R/L109D/W727S/A932S、A89R/L109D/A932S、A89R/R527N、A89R/R527N/S678T/T692G/L736M/S842G/V878S/A932S、A89R/R527N/S678T/A932S、A89R/R527N/W727S/A812E/L860F、A89R/S678T/T692G/L736M/A932S、A89R/S678T/A812E/V878S、A89R/S842G/V878S、L109D/R527N/S678T/A812E、L109D/S678T/T692G/S842G/L860F/V878S/A932S、L109D/S678T/W727S/L860F、L109D/S678T/L736M/A812E/V878S、L109D/S678T/A812E、L109D/S678T/S842G/V878S、L109D/T692G/W727S/L736M/A812E、L109D/T692G/W727S/A812E/S842G/L860F、L109D/W727S/L860F/V878S、L109D/L736M/A932S、L109D/A812E、L109D/S842G、L109D/A932S、Q135S/T670L/W727S、Q135S/H711A/P750A/A932S、S150T/R527N/S842G/E871L/R913V、S150T/E871L/A932S、S150T/H883R/A932S、K267R/R527N/W727S、R403H/R527N/S678T/T692G/L736M/A812E/S842G/L860F、G437A/V522E/R527N/T670L/E871L、G437A/P750A/K830Q/A932S、V522E、V522E/R527N/T569L/W727S、V522E/K830Q、R527N、R527N/S678T/T692G/W727S/L736M/V878S、R527N/S678T/T692G/A812E/A932S、R527N/T692G/W727S/L736M/A812E、R527N/T692G/W727S/L736M/S842G/L860F/V878S、R527N/W727S/L736M、R527N/L736M/A932S、R527N/A812E、T670L/H711A/E871L、T670L/K830Q/E871L、S678T/T692G/W727S/A812E/S842G、S678T/T692G/A812E、S678T/A812E、S678T/L860F/V878S、S678T/R913V、S678T/A932S、T692G/W727S/L736M/S842G/R913V、T692G/A812E、W727S、W727S/A932S、E871L、およびV878S/A932Sから選択される位置または位置のセットに少なくとも1つの置換を含み、これらの位置は、配列番号2880を参照して番号付けされている。一部の実施形態では、酸性アルファ-グルコシダーゼは、62/87/150、89/109/527/678/727/842、89/109/678/727/736/812/878、89/109/932、89/527/678/692/736/842/878/932、89/527/727/812/860、89/678/692/736/932、89/678/812/878、109/527/678/812、109/678/692/842/860/878/932、109/678/736/812/878、109/678/812、109/692/727/736/812、109/692/727/812/842/860、109/736/932、109/812、109/842、109/932、403/527/678/692/736/812/842/860、522/830、527/678/692/727/736/878、527/678/692/812/932、527/692/727/736/812、527/692/727/736/842/860/878、527/727/736、527/736/932、527/812、678/692/727/812/842、678/692/812、678/812、692/727/736/842/913、および692/812から選択される位置または位置のセットに少なくとも1つの置換を含み、これらの位置は、配列番号2880を参照して番号付けされている。一部の実施形態では、酸性アルファ-グルコシダーゼは、62A/87D/150T、89R/109D/527N/678T/727S/842G、89R/109D/678T/727S/736M/812E/878S、89R/109D/932S、89R/527N/678T/692G/736M/842G/878S/932S、89R/527N/727S/812E/860F、89R/678T/692G/736M/932S、89R/678T/812E/878S、109D/527N/678T/812E、109D/678T/692G/842G/860F/878S/932S、109D/678T/736M/812E/878S、109D/678T/812E、109D/692G/727S/736M/812E、109D/692G/727S/812E/842G/860F、109D/736M/932S、109D/812E、109D/842G、109D/932S、403H/527N/678T/692G/736M/812E/842G/860F、522E/830Q、527N/678T/692G/727S/736M/878S、527N/678T/692G/812E/932S、527N/692G/727S/736M/812E、527N/692G/727S/736M/842G/860F/878S、527N/727S/736M、527N/736M/932S、527N/812E、678T/692G/727S/812E/842G、678T/692G/812E、678T/812E、692G/727S/736M/842G/913V、および692G/812Eから選択される位置または位置のセットに少なくとも1つの置換を含み、これらの位置は、配列番号2880を参照して番号付けされている。一部の実施形態では、酸性アルファ-グルコシダーゼは、L62A/E87D/S150T、A89R/L109D/R527N/S678T/W727S/S842G、A89R/L109D/S678T/W727S/L736M/A812E/V878S、A89R/L109D/A932S、A89R/R527N/S678T/T692G/L736M/S842G/V878S/A932S、A89R/R527N/W727S/A812E/L860F、A89R/S678T/T692G/L736M/A932S、A89R/S678T/A812E/V878S、L109D/R527N/S678T/A812E、L109D/S678T/T692G/S842G/L860F/V878S/A932S、L109D/
S678T/L736M/A812E/V878S、L109D/S678T/A812E、L109D/T692G/W727S/L736M/A812E、L109D/T692G/W727S/A812E/S842G/L860F、L109D/L736M/A932S、L109D/A812E、L109D/S842G、L109D/A932S、R403H/R527N/S678T/T692G/L736M/A812E/S842G/L860F、V522E/K830Q、R527N/S678T/T692G/W727S/L736M/V878S、R527N/S678T/T692G/A812E/A932S、R527N/T692G/W727S/L736M/A812E、R527N/T692G/W727S/L736M/S842G/L860F/V878S、R527N/W727S/L736M、R527N/L736M/A932S、R527N/A812E、S678T/T692G/W727S/A812E/S842G、S678T/T692G/A812E、S678T/A812E、T692G/W727S/L736M/S842G/R913V、およびT692G/A812Eから選択される位置または位置のセットに少なくとも1つの置換を含み、これらの位置は、配列番号2880を参照して番号付けされている。
本発明は、位置が配列番号3104を参照して番号付けされている、配列番号3104に対して少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、または少なくとも99%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む組換え酸性アルファ-グルコシダーゼおよび/または生物活性組換え酸性アルファ-グルコシダーゼ断片を提供する。一部の実施形態では、酸性アルファ-グルコシダーゼは、62、62/89/830、62/248/678/830/878/932、62/678、62/678/785、62/678/830、62/678/830/860、62/678/830/860/871/878/932、62/678/830/860/878、62/678/830/860/878/932、62/678/830/860/932、62/678/830/871、62/678/830/871/932、62/678/830/878/932、62/678/830/932、62/678/860、62/678/860/878、62/678/860/932、62/678/871、62/678/871/932、62/678/878/932、62/678/932、62/830、62/830/860、62/830/860/871/873、62/830/860/878/932、62/830/860/932、62/830/871/932、62/830/878、62/830/932、62/833/860/932、62/860、62/860/871、62/860/871/878、62/860/871/932、62/860/878/932、62/860/932、62/871/878/932、62/871/932、62/878、62/878/932、62/932、678、678/830/932、678/932、および860/932から選択される位置または位置のセットに少なくとも1つの置換を含み、これらの位置は、配列番号3104を参照して番号付けされている。一部の実施形態では、酸性アルファ-グルコシダーゼは、62A、62A/89D/830Q、62A/248H/678T/830Q/878S/932S、62A/678T、62A/678T/785Q、62A/678T/830Q、62A/678T/830Q/860F、62A/678T/830Q/860F/871L/878S/932S、62A/678T/830Q/860F/878S、62A/678T/830Q/860F/878S/932S、62A/678T/830Q/860F/932S、62A/678T/830Q/871L、62A/678T/830Q/871L/932S、62A/678T/830Q/878S/932S、62A/678T/830Q/932S、62A/678T/860F、62A/678T/860F/878S、62A/678T/860F/932S、62A/678T/871L、62A/678T/871L/932S、62A/678T/878S/932S、62A/678T/878S/932T、62A/678T/932S、62A/830Q、62A/830Q/860F、62A/830Q/860F/871L/873H、62A/830Q/860F/878S/932S、62A/830Q/860F/932S、62A/830Q/871L/932S、62A/830Q/878S、62A/830Q/932S、62A/833I/860F/932S、62A/860F、62A/860F/871L、62A/860F/871L/878S、62A/860F/871L/932S、62A/860F/878S/932S、62A/860F/932S、62A/871L/878S/932S、62A/871L/932S、62A/878S、62A/878S/932S、62A/932S、678T、678T/830Q/932S、678T/932S、および860F/932Sから選択される位置または位置のセットに少なくとも1つの置換を含み、これらの位置は、配列番号3104を参照して番号付けされている。一部の実施形態では、酸性アルファ-グルコシダーゼは、L62A、L62A/A89D/K830Q、L62A/Y248H/S678T/K830Q/V878S/A932S、L62A/S678T、L62A/S678T/P785Q、L62A/S678T/K830Q、L62A/S678T/K830Q/L860F、L62A/S678T/K830Q/L860F/E871L/V878S/A932S、L62A/S678T/K830Q/L860F/V878S、L62A/S678T/K830Q/L860F/V878S/A932S、L62A/S678T/K830Q/L860F/A932S、L62A/S678T/K830Q/E871L、L62A/S678T/K830Q/E871L/A932S、L62A/S678T/K830Q/V878S/A932S、L62A/S678T/K830Q/A932S、L62A/S678T/L860F、L62A/S678T/L860F/V878S、L62A/S678T/L860F/A932S、L62A/S678T/E871L、L62A/S678T/E871L/A932S、L62A/S678T/V878S/A932S、L62A/S678T/V878S/A932T、L62A/S678T/A932S、L62A/K830Q、L62A/K830Q/L860F、L62A/K830Q/L860F/E871L/R873H、L62A/K830Q/L860F/V878S/A932S、L62A/K830Q/L860F/A932S、L62A/K830Q/E871L/A932S、L62A/K830Q/V878S、L62A/K830Q/A932S、L62A/M833I/L860F/A932S、L62A/L860F、L62A/L860F/E871L、L62A/L860F/E871L/V878S、L62A/L860F/E871L/A932S、L62A/L860F/V878S/A932S、L62A/L860F/A932S、L62A/E871L/V878S/A932S、L62A/E871L/A932S、L62A/V878S、L62A/V878S/A932S、L62A/A932S、S678T、S678T/K830Q/A932S、S678T/A932S、およびL860F/A932Sから選択される位置または位置のセットに少なくとも1つの置換を含み、これらの位置は、配列番号3104を参照して番号付けされている。
一部の実施形態では、酸性アルファ-グルコシダーゼは、62/89/830、62/830、62/830/860、62/830/860/932、および62/830/932から選択される位置または位置のセットに少なくとも1つの置換を含み、これらの位置は、配列番号3104を参照して番号付けされている。一部の実施形態では、酸性アルファ-グルコシダーゼは、62A/89D/830Q、62A/830Q、62A/830Q/860F、62A/830Q/860F/932S、および62A/830Q/932Sから選択される位置または位置のセットに少なくとも1つの置換を含み、これらの位置は、配列番号3104を参照して番号付けされている。一部の実施形態では、酸性アルファ-グルコシダーゼは、L62A/A89D/K830Q、L62A/K830Q、L62A/K830Q/L860F、L62A/K830Q/L860F/A932S、およびL62A/K830Q/A932Sから選択される位置または位置のセットに少なくとも1つの置換を含み、これらの位置は、配列番号3104を参照して番号付けされている。
一部の実施形態では、組換え酸性アルファグルコシダーゼは、表3-1、3-2、4-1、6-1、10-1、10-2、12-1、13-1、13-2、14-1、14-2、15-1、16-1、17-1、17-2、17-3、17-4、17-5、17-6、17-7、17-8、および/または17-9で提供されるように少なくとも1つの位置に少なくとも1つの突然変異を含む。一部の追加の実施形態では、組換え酸性アルファグルコシダーゼは、ヒト酸性アルファグルコシダーゼに由来する。さらに一部の追加の実施形態では、配列番号2、6、8、12、14、16、18、20、946、1956、2496、2880、および/または3104のポリペプチド配列を含む組換え酸性アルファグルコシダーゼ。
一部の追加の実施形態では、本明細書で提供される組換え酸性アルファ-グルコシダーゼは、熱安定性である。一部のさらなる実施形態では、組換え酸性アルファ-グルコシダーゼは、タンパク質分解に対する抵抗性を示す。さらに一部の追加の実施形態では、組換え酸性アルファ-グルコシダーゼは、少なくとも1つの消化管プロテアーゼに対する抵抗性を示す。一部の実施形態では、消化管プロテアーゼは、キモトリプシン、トリプシン、カルボキシペプチダーゼ、およびエラスターゼから選択される。一部のさらなる実施形態では、組換え酸性アルファ-グルコシダーゼは、酸安定性である。一部の追加の実施形態では、組換え酸性アルファ-グルコシダーゼは、酸性pHおよび中性pHに対して安定している。さらに一部の追加の実施形態では、組換え酸性アルファ-グルコシダーゼは、精製されている。一部のさらなる実施形態では、組換え酸性アルファ-グルコシダーゼは、参照配列と比較して、i)触媒活性の増強、ii)発現の増加、iii)中性pHレベルでの安定性の増大、iv)酸性pHレベルでの安定性の増大、iv)細胞溶解物における活性の増強、およびvi)免疫原性の減少、またはi)、ii)、iii)、iv)、v)、および/もしくはvi)のいずれかの組合せから選択される、少なくとも1つの改善された特性を示す。一部のさらなる実施形態では、組換え酸性アルファグルコシダーゼは、参照配列と比較して、i)触媒活性の増強、ii)pH7に対する耐性の増大、iii)pH4に対する耐性の増大、iv)発現の増加、v)細胞への取込みの増加、vi)細胞溶解物における酵素活性の増加、vii)免疫原性の減少、またはi)、ii)、iii)、iv)、v)、vi)、および/もしくはvii)のいずれかの組合せから選択される、少なくとも1つの改善された特性を示す。一部の実施形態では、参照配列は、配列番号2、6、8、12、14、16、18、20、946、1956、2496、2880、および/または3104から選択される。一部のさらなる実施形態では、組換え酸性アルファグルコシダーゼは、pH7で配列番号2、6、8、12、14、16、18、20、946、1956、2496、2880、および/または3104の酸性アルファグルコシダーゼより安定性が高い。さらに一部の他の実施形態では、組換え酸性アルファグルコシダーゼは、pH4で配列番号2、6、8、12、14、16、18、20、946、1956、2496、2880、および/または3104の酸性アルファグルコシダーゼより安定性が高い。一部のさらなる実施形態では、組換え酸性アルファグルコシダーゼは、配列番号2、6、8、12、14、16、18、20、946、1956、2496、2880、および/または3104の酸性アルファグルコシダーゼと比べて発現の増加を示す。さらに一部の追加の実施形態では、組換え酸性アルファグルコシダーゼは、配列番号2、6、8、12、14、16、18、20、946、1956、2496、2880、および/または3104の酸性アルファグルコシダーゼよりリソソーム安定性が高い。一部のさらなる実施形態では、組換え酸性アルファグルコシダーゼは、配列番号2、6、8、12、14、16、18、20、946、1956、2496、2880、および/または3104の酸性アルファグルコシダーゼより容易に細胞に取り込まれる。一部の追加の実施形態では、組換え酸性アルファグルコシダーゼは、細胞溶解物において配列番号2、6、8、12、14、16、18、20、946、1956、2496、2880、および/または3104の酸性アルファグルコシダーゼより大きい酵素活性を示す。一部の追加の実施形態では、組換え酸性アルファグルコシダーゼは、配列番号2、6、8、12、14、16、18、20、946、1956、2496、2880、および/または3104の酸性アルファグルコシダーゼと比べて免疫原性の低下または減少を示す。一部の実施形態では、組換え酸性アルファグルコシダーゼは、精製されている。
一部のさらなる実施形態では、組換え酸性アルファ-グルコシダーゼは、配列番号8~3378のうちの偶数番号の配列の少なくとも1つに対して、少なくとも約85%、約86%、約87%、約88%、約89%、約90%、約91%、約92%、約93%、約94%、約95%、約96%、約97%、約98%、または約99%の配列同一性を有するポリペプチド配列を含む。一部のさらなる実施形態では、組換え酸性アルファ-グルコシダーゼは、配列番号8~3378のうちの偶数番号の配列の少なくとも1つに対して少なくとも85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、または99%の配列同一性を有するポリペプチド配列を含む。一部の実施形態では、組換え酸性アルファグルコシダーゼは、配列番号8~3378のうちの偶数番号の配列の少なくとも1つと少なくとも90%同一のポリペプチド配列を含む。一部のさらなる実施形態では、組換え酸性アルファ-グルコシダーゼは、配列番号2~3378のうちの偶数番号の配列の少なくとも1つを含むポリペプチド配列を含む。一部のさらなる実施形態では、組換え酸性アルファ-グルコシダーゼは、配列番号8~3378のうちの偶数番号の配列の少なくとも1つを含むポリペプチド配列からなる。
本発明は、本明細書で提供される少なくとも1つの組換え酸性アルファ-グルコシダーゼを含む組成物も提供する。一部の実施形態では、組成物は、本明細書で提供される1つの組換え酸性アルファ-グルコシダーゼを含む。
本発明は、本明細書で提供される少なくとも1つの組換え酸性アルファ-グルコシダーゼをコードする組換えポリヌクレオチド配列も提供する。一部の実施形態では、組換えポリヌクレオチド配列は、1つの組換え酸性アルファ-グルコシダーゼをコードする。一部の実施形態では、組換えポリヌクレオチド配列は、DNA、RNAおよびmRNAから選択される。一部の実施形態では、ポリヌクレオチド配列は、コドン最適化されている。一部のさらなる実施形態では、組換えポリヌクレオチド配列は、配列番号8~3378のうちの偶数番号の配列の少なくとも1つに対して、少なくとも約85%、約86%、約87%、約88%、約89%、約90%、約91%、約92%、約93%、約94%、約95%、約96%、約97%、約98%、または約99%の配列同一性を有するポリペプチド配列を含む組換え酸性アルファ-グルコシダーゼをコードする。一部のさらなる実施形態では、ポリヌクレオチド配列によりコードされる組換え酸性アルファ-グルコシダーゼは、配列番号8~3378のうちの偶数番号の配列の少なくとも1つに対して少なくとも85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、または99%の配列同一性を有するポリペプチド配列を含む。
一部のさらなる実施形態では、組換えポリヌクレオチド配列は、配列番号7~3377のうちの奇数番号の配列の少なくとも1つに対して、少なくとも約85%、約86%、約87%、約88%、約89%、約90%、約91%、約92%、約93%、約94%、約95%、約96%、約97%、約98%、または約99%配列同一性である。一部のさらなる実施形態では、組換えポリヌクレオチド配列は、配列番号7~3377のうちの奇数番号の配列の少なくとも1つと少なくとも85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、または99%同一である。一部の追加の実施形態では、組換えポリヌクレオチド配列は、配列番号7~3377のうちの奇数番号の配列の少なくとも1つに対して少なくとも90%の配列同一性を有する配列を含む。さらに一部のさらなる実施形態では、組換えポリヌクレオチド配列は、配列番号7~3377のうちの奇数番号の配列を含む。
本発明は、組換え酸性アルファ-グルコシダーゼをコードする組換えポリヌクレオチド配列を含む発現ベクターも提供する。一部の実施形態では、組換えポリヌクレオチド配列は、制御配列に作動可能に連結されている。一部のさらなる実施形態では、制御配列は、プロモーターである。一部の追加の実施形態では、プロモーターは、異種プロモーターである。本発明は、本明細書でpDHと呼ばれる発現ベクターも提供する。一部の実施形態では、pDHベクターは、酸性アルファグルコシダーゼをコードする少なくとも1つのポリヌクレオチド配列を含む。一部の追加の実施形態では、pDHベクターは、本明細書で提供される酸性アルファグルコシダーゼをコードする少なくとも1つのポリヌクレオチド配列を含む。一部のさらなる実施形態では、pDHベクターは、配列番号1~3377のうちの奇数番号の配列から選択される少なくとも1つのポリヌクレオチド配列を含む。一部の追加の実施形態では、pDHベクターは、配列番号2~3378のうちの偶数番号の配列から選択される酸性アルファグルコシダーゼをコードする少なくとも1つのポリヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態では、pDHベクターは、配列番号3379を含むが、一部の他の実施形態では、pDHベクターは、配列番号3380を含む。一部の追加の実施形態では、配列番号3379に含まれる配列番号1は、別のポリヌクレオチド配列で置き換えられる。一部の実施形態では、配列番号3379中の配列番号1は、配列番号1~3377のうちの奇数番号の配列から選択される少なくとも1つのポリヌクレオチド配列に置き換えられる。一部の追加の実施形態では、pDHベクターは、図9にマップで提供されるプラスミドを含むが、一部の他の実施形態では、pDHベクターは、図10にマップで提供されるプラスミドを含む。一部の実施形態では、図10に示されているプラスミドにおける「スタッファー配列」(すなわち、bla配列)は、目的の遺伝子に置き換えられる。一部の実施形態では、「スタッファー遺伝子」ATG開始コドンから遺伝子の最後のコドンまでには、塩基対724~1581の番号が付けられている(合計858塩基対について)。本明細書で使用される場合、用語「スタッファー遺伝子」および「スタッファー配列」は、目的の遺伝子に置き換えられるプラスミドベクター内の配列を指す。本明細書で使用される場合、用語「目的の遺伝子」は、所望のポリペプチド(例えば、「目的のポリペプチド」)をコードする遺伝子を指す。一部の追加の実施形態では、スタッファー配列は、目的の遺伝子(すなわち、バリアント酸性アルファグルコシダーゼなどの目的のポリペプチドが産生されるために発現が望まれる遺伝子)に置き換えられる。
本発明は、本明細書で提供される少なくとも1つの発現ベクターを含む宿主細胞も提供する。一部の実施形態では、宿主細胞内に備えられている発現ベクターは、pDHである。一部の実施形態では、宿主細胞は、真核生物および原核生物から選択される。一部のさらなる実施形態では、宿主細胞は、哺乳動物細胞である。
本発明は、組換え酸性アルファグルコシダーゼバリアントを産生する方法であって、本明細書で提供される少なくとも1つの宿主細胞を、組換えポリヌクレオチドによりコードされる酸性アルファグルコシダーゼが産生される条件下で培養するステップを含む方法も提供する。一部の実施形態では、方法は、酸性アルファグルコシダーゼを回収するステップをさらに含む。さらに一部のさらなる実施形態では、方法は、酸性アルファグルコシダーゼを精製するステップをさらに含む。本発明は、本明細書で提供される方法に従って産生される組換え酸性アルファグルコシダーゼバリアントも提供する。
本発明は、本明細書で提供される少なくとも1つの組換え酸性アルファグルコシダーゼを含む組成物も提供する。本発明は、本明細書で提供される組成物の使用にも備えている。一部の実施形態では、本発明は、本明細書で提供される少なくとも1つの組成物を含む、ポンペ病の処置のための医薬組成物を提供する。一部の追加の実施形態では、医薬組成物は、少なくとも1つの薬学的に許容される担体および/または賦形剤をさらに含む。一部のさらなる実施形態では、医薬組成物は、ヒトへの非経口注射または注入に好適である。さらに一部の追加の実施形態では、本発明は、本明細書で提供される少なくとも1つの組換えポリヌクレオチドを含む医薬組成物を提供する。さらに一部のさらなる実施形態では、本発明は、本明細書で提供される少なくとも1つの組換えポリペプチドを含む医薬組成物を提供する。さらに一部の追加の実施形態では、本発明は、本明細書で提供される少なくとも1つの組換えポリヌクレオチドおよび少なくとも1つの組換えポリペプチドを含む組成物を提供する。
本発明は、対象におけるポンペ病の症状を処置および/または予防するための方法であって、ポンペ病を有する対象と本明細書で提供される少なくとも1つの医薬組成物とを用意するステップ、および医薬組成物を対象に投与するステップを含む方法も提供する。一部の実施形態では、ポンペ病の症状が改善される。一部の追加の実施形態では、対象は、乳児または小児である。さらに一部のさらなる実施形態では、対象は、成人または若年成人である。
発明の説明
本発明は、操作された酸性アルファ-グルコシダーゼ(GAA)ポリペプチドおよびそれらの組成物を提供する。一部の実施形態では、操作されたGAAポリペプチドは、タンパク質分解に対する感受性を低下させながら増強された触媒活性および増強された酸安定性を提供するために最適化されたものである。本発明は、操作されたGAAポリペプチドを含む組成物を治療上のおよび他の目的に利用するための方法も提供する。
略号および定義:
本発明は、操作された酸性アルファ-グルコシダーゼ(GAA)ポリペプチドおよびそれらの組成物を提供する。一部の実施形態では、操作されたGAAポリペプチドは、タンパク質分解に対する感受性を低下させながら増強された触媒活性および増強された酸安定性を提供するために最適化されたものである。本発明は、操作されたGAAポリペプチドを含む組成物を治療上のおよび他の目的に利用するための方法も提供する。
略号および定義:
別段の定義がない限り、本明細書で使用される全ての専門および科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般に理解されているのと同じ意味を一般に有する。一般に、本明細書で使用される命名法、ならびに下記の細胞培養、分子遺伝学、微生物学、有機化学、分析化学および核酸化学の実験手順は、当技術分野において周知かつ一般に利用されているものである。そのような技法は、周知であり、当業者に周知の非常に多くの教科書および参考文献に記載されている。標準的な技術またはそれらの改良形態が、化学合成および化学分析に使用される。本明細書において上記および下記両方で言及される全ての特許、特許出願、論文および公表文献は、これにより参照により本明細書に明確に組み込まれる。
本明細書に記載のものと同様または同等の任意の好適な方法および材料が本発明の実施の際に使用されるが、一部の方法および材料が本明細書に記載される。本発明が、記載される特定の方法論、プロトコールおよび試薬に限定されないことを理解されたい。これらの方法論、プロトコールおよび試薬は、それらが当業者によって使用される状況に依存して変わり得るからである。したがって、直ぐ下で定義される用語は、本願を全体として参照することによって、より十分に説明される。本明細書において上記および下記の両方で言及される全ての特許、特許出願、論文および公表文献は、これにより参照により本明細書に明確に組み込まれる。
また、本明細書で使用される場合、単数形「1つの(a)」、「1つの(an)」および「その(the)」は、文脈による別段の明確な指示がない限り、複数形の言及対象を含む。
数値範囲は、範囲を定義する数を含む。したがって、本明細書で開示されるあらゆる数値範囲は、そのようなより広い数値範囲内に入るあらゆるより狭い数値範囲を、そのようなより狭い数値範囲が全て本明細書に明確に記載されているかのごとく包含するように意図されている。本明細書で開示されるあらゆる最大(または最小)数値限定は、あらゆる数値下(または上)限を、そのような数値下(または上)限が本明細書に明確に記載されているかのごとく含むことも、意図されている。
用語「約」は、特定の値についての許容される誤差を意味する。一部の例では、「約」は、所与の値範囲の0.05%、0.5%、1.0%または2.0%以内を意味する。一部の例では、「約」は、所与の値の標準偏差1、2、3または4以内を意味する。一部の例では、「約」は、所与の値の2.5%、3%、3.5%、4%、4.5%、5%、5.5%、6%、6.5%、7%、7.5%、8%、8.5%、9%、9.5%または10%以内である値を包含する。
さらに、本明細書で与えられる見出しは、本願を全体として参照することにより分かり得る本発明の様々な態様または実施形態を限定するものではない。したがって、直ぐ下で定義される用語は、本願を全体として参照することによって、より十分に定義される。とはいえ、本発明の理解を容易にするために、いくつかの用語が下記で定義される。
別段の指示がない限り、それぞれ、核酸は、左から右へ5’から3’への方向で記載され、アミノ酸配列は、左から右へアミノからカルボキシへの方向で記載される。
本明細書で使用される場合、用語「含むこと(comprising)」およびその同語源語は、それらの包括的意味で使用される(すなわち、「含むこと(including)」およびその対応する同語源語と同等である)。
「EC」番号は、国際生化学・分子生物学連合の命名法委員会(the Nomenclature Committee of the International Union of Biochemistry and Molecular Biology)(NC-IUBMB)の酵素命名法に関する。IUBMB生化学分類は、酵素についての、それらが触媒する化学反応に基づく、数値分類体系である。
「ATCC」は、米国培養細胞系統保存機関(American Type Culture Collection)を指し、そのバイオレポジトリーコレクションは、遺伝子および株を含む。
「NCBI」は、米国国立生物学情報センター(National Center for Biological Information)およびそこで提供されている配列データベースを指す。
本明細書で使用される場合、用語「酸性アルファ-グルコシダーゼ」、「酸性α-グルコシダーゼ」、「酸性アルファ-グルコシダーゼポリペプチド」、「リソソームアルファ-グルコシダーゼ」、および「GAA」は、リソソームに存在するグリコーゲンを破壊する酵素のファミリー(EC 3.2.1.20)内の酵素を指す。この酵素は、「アルファ-1,4-グルコシダーゼ」、「α-1,4-グルコシダーゼ」、「酸性マルターゼ」、「グルコインベルターゼ」、「グルコシドスクラーゼ」、「リソソームアルファ-グルコシダーゼ」、「リソソームα-グルコシダーゼ」、「マルターゼ」、または「マルターゼ-グルコアミラーゼ」と呼ばれることもある。酵素により触媒される1つの反応は、アルファ-D-グルコースが放出されることになる、末端の、非還元性の(1→4)連結アルファ-D-グルコース残基の加水分解である。
本明細書で使用される場合、「ポンペ病」は、骨格筋および他の組織におけるグリコーゲンのリソソーム蓄積を特徴とする代謝障害をもたらす、常染色体劣性遺伝性障害である、II型グリコーゲン貯蔵症を指す。ポンペ病は、発症年齢、臓器病変、重症度、および進行速度に基づいて特徴付けられる。より重症度の高い型は、乳児期に起こる乳児期発症ポンペ病(IOPD)である。「遅発ポンペ病」(LOPD)と呼ばれる他の型は、月齢12カ月より前に疾患が発症したがIOPDに関連する心筋症のない個体、および月齢12カ月より後に疾患が発症した全ての個体において起こる。ポンペ病の同義語としては、「酸性アルファ-グルコシダーゼ欠損症」、「酸性マルターゼ欠損症」、「GAA欠損症」、「II型グリコーゲン貯蔵症」、「GSD II」、「GSD2」、および「II型糖原病」が挙げられる。
「タンパク質」、「ポリペプチド」、および「ペプチド」は、長さや翻訳後修飾(例えば、グリコシル化やリン酸化)を問わず、アミド結合により共有結合で連結されている少なくとも2アミノ酸のポリマーを示すために、本明細書では同義で使用される。
「アミノ酸」は、本明細書では、それらの一般に公知の3文字記号、またはIUPAC-IUB生化学命名法委員会により推奨されている1文字記号、どちらかによって言及される。ヌクレオチドは、同様に、それらの一般に受け入れられている1文字コードによって言及され得る。
用語「操作された」、「組換え(の)」、「天然に存在しない」、および「バリアント」は、細胞、ポリヌクレオチドまたはポリペプチドに関して使用される場合、普通なら天然に存在しない方法で修飾された、またはそれと同一であるが合成材料からおよび/もしくは組換え技法を使用する操作によって生産もしくは導出された、材料またはその材料の天然もしくはネイティブ形態に対応する材料を指す。
本明細書で使用される場合、「野生型」および「天然に存在する」は、自然界に見られる形態を指す。例えば、野生型ポリペプチドまたはポリヌクレオチド配列は、生物に存在する配列であって、自然界の供給源から単離することができ、ヒトによる操作によって意図的に修飾されていない、配列である。
「コード配列」は、タンパク質のアミノ酸配列をコードする核酸(例えば、遺伝子)の部分を指す。
用語「配列同一性パーセント(%)」は、ポリヌクレオチドおよびポリペプチド間の比較を指すために本明細書で使用され、比較ウィンドウにわたって2つの最適にアラインメントされた配列を比較することにより決定され、比較ウィンドウ内のポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列の一部分は、これら2つの配列の最適なアラインメントのために参照配列と比較して付加または欠失(すなわち、ギャップ)を含み得る。パーセンテージは、同一の核酸塩基またはアミノ酸残基が両方の配列に出現する位置の数を決定してマッチした位置の数を得、マッチした位置の数を比較ウィンドウ内の位置の総数で割り、その結果に100を掛けて配列同一性パーセンテージを得ることによって計算することができる。あるいは、パーセンテージは、同一の核酸塩基もしくはアミノ酸残基が両方の配列に出現する位置の数または核酸塩基もしくはアミノ酸残基がギャップを用いてアラインメントされる位置の数を決定してマッチした位置の数を得、マッチした位置の数を比較ウィンドウ内の位置の総数で割り、その結果に100を掛けて配列同一性パーセンテージを得ることによって計算することができる。2配列のアラインメントに利用可能な多数の確立されたアルゴリズムがあることは、当業者には理解される。比較のための配列の最適なアライメントは、例えば、当技術分野において公知の、SmithおよびWatermanの局所相同性アルゴリズム(Smith and Waterman、Adv. Appl. Math. 2:482 [1981])によって、NeedlemanおよびWunschの相同性アライメントアルゴリズム(Needleman and Wunsch、J. Mol. Biol.、48:443 [1970])によって、PearsonおよびLipmanの類似性検索法(Pearson and Lipman、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 2444 [1988])によって、これらのアルゴリズムのコンピューターによるインプリメンテーション(例えば、GCG Wisconsin Software Package中のGAP、BESTFIT、FASTA、およびTFASTA)、または目視検査によって、行うことができる。配列同一性パーセントおよび配列類似性パーセントの決定に好適であるアルゴリズムの例としては、Altschulらによって記載されているBLASTおよびBLAST 2.0アルゴリズムが挙げられるが、これらに限定されない(それぞれ、Altschul et al.、J. Mol. Biol.、215: 403-410 [1990];およびAltschul et al.、1977、Nucleic Acids Res.、3389-3402 [1977]を参照されたい)。BLAST解析を行うためのソフトウェアは、米国国立生物工学情報センター(National Center for Biotechnology Information)のウェブサイトを通して公的に入手できる。このアルゴリズムは、データベース配列中の同じ長さのワードとアラインメントしたときにマッチするか何らか正の値の閾スコアTを満たす、問い合わせ配列中の長さWの短いワードを特定することによって、高スコアの配列対(HSP)を先ず特定することを含む。Tは、隣接ワードスコア閾値と呼ばれる(Altschul et al.、上掲を参照されたい)。これらの最初の隣接ワードヒットは、それらを含有するより長いHSPを見つけるための検索を開始するためのシードとしての役割を果す。したがって、ワードヒットは、累積アラインメントスコアが増加され得る限り、各配列に沿って両方向に拡大される。累積スコアは、ヌクレオチド配列については、パラメーターM(1対のマッチ残基に対する報酬スコア;常に、>0)およびN(ミスマッチ残基に対するペナルティスコア;常に、<0)を使用して計算される。アミノ酸配列については、累積スコアを計算するためにスコア行列が使用される。各方向のワードヒットの拡大は、累積アラインメントスコアがその最大達成値からX量低下すると、停止され;累積スコアが、1つもしくは複数の負のスコアの残基アラインメントの累積に起因してゼロもしくはそれ未満になると、停止され;またはどちらかの配列の末端に達すると停止される。BLASTアルゴリズムパラメーターW、TおよびXによって、アラインメントの感度および速度が決定される。BLASTNプログラム(ヌクレオチド配列について)は、デフォルトとして、11のワード長(W)、10の期待値(E)、M=5、N=-4、および両鎖の比較を使用する。アミノ酸配列について、BLASTPプログラムは、デフォルトとして、3のワード長(W)、10の期待値(E)、およびBLOSUM62スコア行列を使用する(Henikoff and Henikoff、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10915 [1989]を参照されたい)。配列アラインメントおよび配列同一性%の例示的決定は、提供されているデフォルトパラメーターを使用する、GCG Wisconsin Software package(Accelrys、Madison WI)のBESTFITまたはGAPプログラムを利用することができる。
本明細書で使用される場合、用語「参照配列」は、配列比較の基準として使用される定義された配列を指す。参照配列は、より大きい配列のサブセット、例えば、完全長遺伝子またはポリペプチド配列のセグメントであることもある。一般に、参照配列は、核酸またはポリペプチドの、長さ少なくとも20ヌクレオチドもしくはアミノ酸残基、長さ少なくとも25残基、長さ少なくとも50残基、長さ少なくとも100残基または完全長である。2つのポリヌクレオチドまたはポリペプチドは、各々、(1)2配列間で類似している配列(すなわち、完全配列の一部分)を含むことがあり、かつ(2)2配列間で相違する配列をさらに含むことがあるので、2つの(またはそれより多くの)ポリヌクレオチドまたはポリペプチド間の配列比較は、配列類似性の局所領域を同定し、比較するために、「比較ウィンドウ」にわたって2つのポリヌクレオチドまたはポリペプチドの配列を比較することによって通常は行われる。一部の実施形態では、「参照配列」は、一次アミノ酸配列に基づくことがあり、この場合、参照配列は、一次配列の1つまたは複数の変化を有し得る配列である。「比較ウィンドウ」は、連続する少なくとも約20のヌクレオチド位置またはアミノ酸残基の概念上のセグメントであって、ある配列を、連続する少なくとも20ヌクレオチドまたはアミノ酸の参照配列と比較することができ、その配列の比較ウィンドウ内の部分が、2配列の最適なアラインメントのために参照配列(付加も欠失も含まない)と比較して20パーセントまたはそれ未満の付加または欠失(すなわち、ギャップ)を含み得る、概念上のセグメントを指す。比較ウィンドウは、連続する20残基より長いことがあり、必要に応じて30、40、50、100またはそれより長いウィンドウを含む。
「に対応すること」、「への参照」または「と比べて」は、所与のアミノ酸またはポリヌクレオチド配列の番号付けの文脈で使用される場合、所与のアミノ酸またはポリヌクレオチド配列が参照配列と比較されるときに指定参照配列の残基の番号付けを照会する。言い換えると、所与のポリマーの残基番号または残基位置は、所与のアミノ酸またはポリヌクレオチド配列中の残基の実際の番号の位置によるのではなく、参照配列を基準として示される。例えば、所与のアミノ酸配列、例えば、操作されたGAAのアミノ酸配列は、2配列間の残基マッチを最適化するためにギャップを導入することによって参照配列とアラインメントすることができる。これらの場合、ギャップは存在するが、所与のアミノ酸またはポリヌクレオチド配列中の残基の番号付けは、それがアラインメントされた参照配列を基準として行われる。
「アミノ酸相違」または「残基相違」は、ポリペプチド配列のある位置におけるアミノ酸残基の、参照配列中の対応する位置におけるアミノ酸残基と比べての相違を指す。アミノ酸相違の位置は、本明細書では一般に「Xn」と呼ばれ、この場合のnは、残基相違の基準となる参照配列中の対応する位置を指す。例えば、「配列番号2と比較してX27位における残基相違」は、配列番号2の27位に対応するポリペプチド位置におけるアミノ酸残基の相違を指す。したがって、配列番号2の参照ポリペプチドが2位にフェニルアラニンを有する場合には、「配列番号2と比較してX27位における残基相違」は、配列番号2の27位に対応するポリペプチドの位置におけるフェニルアラニン以外の任意の残基のアミノ酸置換__。本明細書におけるほとんどの例では、ある位置における特定のアミノ酸残基相違は、「XnY」として示され、この場合、「Xn」は、上で説明したように対応する位置を指定し、「Y」は、操作されたポリペプチド中に見られるアミノ酸(すなわち、参照ポリペプチド中のものとは異なる残基)の1文字識別子である。一部の例では(例えば、表3-1、3-2、4-1、6-1、10-1、10-2、12-1、13-1、13-2、14-1、14-2、15-1、16-1、17-1、17-2、17-3、17-4、17-5、17-6、17-7、17-8、および/または17-9に示されているように)、本開示は、従来表記「AnB」により示される特定のアミノ酸相違も提供し、この場合、Aは、参照配列中の残基の1文字識別子であり、「n」は、参照配列中の残基位置の番号であり、Bは、操作されたポリペプチドの配列中の残基置換の1文字識別子である。一部の例では、本開示のポリペプチドは、参照配列と比べて1つまたは複数のアミノ酸残基相違を含むことがあり、これらの相違は、参照配列と比べて残基相違が存在する指定位置のリストにより示される。1個より多くのアミノ酸がポリペプチドの指定残基位置に使用され得る一部の実施形態では、使用され得る様々なアミノ酸残基は、「/」によって隔てられている(例えば、X27P/X27RまたはX27P/R)。一部の実施形態では、酵素バリアントは、1つより多くの置換を含む。これらの置換は、読取りを容易にするためにスラッシュによって隔てられている(例えば、F27P/C944W)。一部の場合には、「X」が本願における位置番号の前に付かない。本願は、保存的アミノ酸置換および非保存的アミノ酸置換のどちらか/または両方を含む1つまたは複数のアミノ酸相違を含む、操作されたポリペプチド配列を含む。
「保存的アミノ酸置換」は、類似の側鎖を有する異なる残基での残基の置換を指し、したがって、アミノ酸の同じまたは類似の定義されたクラス内のアミノ酸でのポリペプチド中のアミノ酸の置換を通常は含む。例として、限定ではなく、脂肪族側鎖を有するアミノ酸は、別の脂肪族アミノ酸(例えば、アラニン、バリン、ロイシンおよびイソロイシン)で置換され得、ヒドロキシル側鎖を有するアミノ酸は、ヒドロキシル側鎖を有する別のアミノ酸(例えば、セリンおよびトレオニン)で置換され、芳香族側鎖を有するアミノ酸は、芳香族側鎖を有する別のアミノ酸(例えば、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファンおよびヒスチジン)で置換され、塩基性側鎖を有するアミノ酸は、塩基性側鎖を有する別のアミノ酸(例えば、リシンおよびアルギニン)で置換され、酸性側鎖を有するアミノ酸は、酸性側鎖を有する別のアミノ酸(例えば、アスパラギン酸もしくはグルタミン酸)で置換され、および/または疎水性もしくは親水性アミノ酸は、それぞれ、別の疎水性もしくは親水性アミノ酸で置き換えられる。
「非保存的置換」は、有意に異なる側鎖特性を有するアミノ酸でのポリペプチド中のアミノ酸の置換を指す。非保存的置換は、定義された群内ではなく定義された群間のアミノ酸を使用することがあり、(a)置換(例えば、プロリンでのグリシンの置換)の領域内のペプチド骨格の構造、(b)電荷もしくは疎水性、または(c)側鎖の嵩に影響を与える。例として、限定ではなく、例示的な非保存的置換は、塩基性または脂肪族アミノ酸で置換された酸性アミノ酸、小さいアミノ酸で置換された芳香族アミノ酸、および疎水性アミノ酸で置換された親水性アミノ酸であり得る。
「欠失」は、参照ポリペプチドからの1個または複数のアミノ酸の除去によるポリペプチドの修飾を指す。欠失は、操作された酵素の酵素活性を保持しながら、および/または改善された特性を保持しながら、参照酵素を構成する1個もしくはそれより多くのアミノ酸、2個もしくはそれより多くのアミノ酸、5個もしくはそれより多くのアミノ酸、10個もしくはそれより多くのアミノ酸、15個もしくはそれより多くのアミノ酸、または20個もしくはそれより多くのアミノ酸、アミノ酸の総数の最大10%、またはアミノ酸の総数の最大20%の除去を含むことがある。欠失は、ポリペプチドの内部部分および/または末端部分に関することがある。様々な実施形態では、欠失は、連続するセグメントを含むこともあり、または不連続であることもある。
「挿入」は、参照ポリペプチドからの1個または複数のアミノ酸の付加によるポリペプチドの修飾を指す。挿入は、ポリペプチドの内部部分におけるものであることもあり、またはカルボキシもしくはアミノ末端へのものであることもある。本明細書で使用される場合の挿入は、当技術分野において公知であるような融合タンパク質を含む。挿入は、天然に存在するポリペプチド中の、アミノ酸の連続したセグメントであることもあり、またはアミノ酸の1個もしくは複数によって隔てられていることもある。
本明細書では同義で使用される「機能的断片」または「生物活性断片」は、アミノ末端および/もしくはカルボキシ末端欠失ならびに/または内部欠失を有するが、残りのアミノ酸配列の場所が、それが比較されることになる配列(例えば、本発明の完全長の操作されたGAA)中の対応する位置と同一である、ポリペプチドであって、完全長ポリペプチドの活性の実質的に全てを保持するポリペプチドを指す。
「単離されたポリペプチド」は、それに天然に付随する他の夾雑物(例えば、タンパク質、脂質およびポリヌクレオチド)から実質的に分離されているポリペプチドを指す。この用語は、それらの天然に存在する環境または発現系(例えば、宿主細胞またはin vitro合成)から除去または精製されたポリペプチドを包含する。組換えGAAポリペプチドは、細胞内に存在することもあり、細胞培地に存在することもあり、または溶解物もしくは単離された調製物などの様々な形態で調製されることもある。しかるが故に、一部の実施形態では、組換えGAAポリペプチドは、単離されたポリペプチドであり得る。
「実質的に純粋なポリペプチド」は、そのポリペプチド種が、存在する優勢種である(すなわち、モルまたは重量ベースで、組成物中のその存在量がいずれの他の個々の高分子種よりも多い)組成物を指し、一般的に、目的種が、存在する高分子種のモルまたは重量%で少なくとも約50パーセントを占める場合、実質的に精製された組成物である。一般に、実質的に純粋なGAA組成物は、組成物中に存在する全高分子種のモルまたは重量%で約60%またはそれより高い%、約70%またはそれより高い%、約80%またはそれより高い%、約90%またはそれより高い%、約95%またはそれより高い%、および約98%またはそれより高い%を構成する。一部の実施形態では、目的種は、組成物が単一の高分子種から本質的になる本質的均質まで精製される(すなわち、従来の検出法により夾雑種を組成物中で検出することができない)。溶媒種、小分子(<500ダルトン)、および元素イオン種は、高分子種と見なされない。一部の実施形態では、単離された組換えGAAポリペプチドは、実質的に純粋なポリペプチド組成物である。
「改善された酵素特性」は、参照GAAポリペプチドと比較して、および/または野生型GAAポリペプチドもしくは別の操作されたGAAポリペプチドと同様の、任意の酵素特性の改善を示す、操作されたGAAポリペプチドを指す。改善された特性は、タンパク質発現の増加、熱活性の増加、熱安定性の増大、pH活性の増加、安定性の増大、酵素活性の増加、基質特異性または親和性の増大、比活性の増加、基質または最終産物阻害に対する抵抗性の増大、化学的安定性の増大、化学選択性の向上、溶媒安定性の向上、酸性、中性または塩基性pHに対する耐性の増大、タンパク質分解活性に対する耐性の増大(すなわち、タンパク質分解に対する感受性の低下)、凝集の低減、溶解度の増加、免疫原性の低下、翻訳後修飾(例えば、グリコシル化)の改善、温度プロファイルの変更、リソソーム安定性の増大などのような特性を含むが、これらに限定されない。
「酵素活性の増加」または「酵素活性の増強」は、参照GAA酵素と比較して、比活性(例えば、産生された産物/時間/タンパク質重量)の増加、または基質の産物への変換パーセント(例えば、指定量のGAAを使用する指定期間内の出発量の基質の産物への変換パーセント)の上昇によって表され得る、操作されたGAAポリペプチドの改善された特性を指す。酵素活性を決定するための例示的な方法は、実施例で提供される。酵素活性に関係するあらゆる特性が影響を受ける可能性があり、そのような特性には、その変化が酵素活性の増加につながり得るKm、Vmaxまたはkcatの古典的酵素特性が含まれる。酵素活性の向上は、対応する野生型酵素の酵素活性の約1.1倍から、GAAポリペプチドが誘導された天然に存在するGAAまたは別の操作されたGAAの2倍、5倍、10倍、20倍、25倍、50倍、75倍、100倍、150倍、200倍ほどものまたはそれよりも高い酵素活性までの向上であり得る。
一部の実施形態では、操作されたGAAポリペプチドは、少なくとも0.1/秒、少なくとも0.5/秒、少なくとも1.0/秒、少なくとも5.0/秒、少なくとも10.0/秒の、および一部の好ましい実施形態では10.0/秒を超える、kcatを有する。一部の実施形態では、Kmは、約1μM~約5mMの範囲内、約5μM~約10mMの範囲内、約30μM~約30mMの範囲内、または約50μM~約50mMの範囲内である。一部の特定の実施形態では、操作されたGAA酵素は、ある特定の条件への曝露後に参照GAA酵素(例えば、野生型GAAまたは任意の他の参照GAA、例えば、配列番号2、6、8、12、14、16、18、20、946、1956、2496、2880、および/または3104)のものの1.5~10倍、1.5~25倍、1.5~50倍、1.5~100倍の範囲内のまたはそれより大きい酵素活性の向上を示す。
GAA活性は、当技術分野において公知の任意の好適な方法(例えば、反応物または産物の分光測光特性の変化のモニタリングなどの、標準的なアッセイ)によって測定することができる。一部の実施形態では、産生された産物の量を、UV吸光度または蛍光検出と組み合わせた高速液体クロマトグラフィー(HPLC)分離によって測定することができる。一部の実施形態では、産生された産物の量を、4-メチルウンベリフェリル-アルファ-D-グルコピラノシド(4-MUGlu)分子の加水分解後に蛍光(Ex.355nm、Em.460nm)をモニターすることによって測定することができる。酵素活性の比較は、本明細書中で詳細にさらに説明するような、酵素の定義された調製、設定条件下での定義されたアッセイ、および1つまたは複数の定義された基質を使用して行われる。一般的に、溶解物が比較される場合、アッセイされる細胞の数およびタンパク質の量が決定され、宿主細胞によって産生され溶解物中に存在する酵素の量の変動を最小にするために同一の発現系および同一の宿主細胞の使用も決定される。
用語「酸性pHに対する耐性の向上」は、本発明による組換えGAAが、参照GAAまたは別の酵素と比較して安定性の向上(指定の期間(例えば、1時間、最大24時間)の酸性pHへの曝露後に約pH4.8でより高度に保持された活性)を有することになることを意味する。
用語「中性pHに対する耐性の向上」は、本発明による組換えGAAが、参照GAAまたは別の酵素と比較して安定性の向上(指定の期間(例えば、1時間、最大24時間)の中性pHへの曝露後に約pH7でより高度に保持された活性)を有することになることを意味する。
用語「細胞取込みの改善」は、本明細書で提供される組換えGAAが、参照GAA(野生型GAAを含む)または別の酵素と比較して細胞内へのエンドサイトーシスの増加を示すことを意味する。一部の実施形態では、細胞は、培養されたポンペ患者細胞である(参照GAAまたは別の酵素と比較して、指定の期間にわたっての培養細胞のインキュベーション後に細胞内活性をより高度に保持した)。一部の追加の実施形態では、本明細書で提供される組換えGAAは、参照GAA(野生型GAAを含む)または別の酵素と比較して、指定の期間にわたって培養細胞でより大きく保持される細胞内活性を示す。一部の追加の実施形態では、期間は約4時間であるが、一部の他の実施形態では、期間は、4時間未満(例えば、1、2または3時間)であり、一部の代替実施形態では、期間は、4時間より長い(例えば、5、6、7、8、またはそれより長い時間)。
用語「免疫原性の低下」および「免疫原性の減少」は、本明細書で提供される組換えGAAが、野生型または別の参照GAAと比較して免疫応答の低下を誘導することを意味する。
「生理的pH」は、本明細書で使用される場合、対象の(例えば、ヒトの)血液中で一般に見られるpH範囲を意味する。
用語「塩基性pH」(例えば、塩基性pH条件に対する安定性の向上または塩基性pHに対する耐性の増大に関して使用される)は、約7~11のpH範囲を意味する。
用語「酸性pH」(例えば、酸性pH条件に対する安定性の向上または酸性pHに対する耐性の増大に関して使用される)は、約1.5~4.5のpH範囲を意味する。
「変換」は、基質の対応する産物への酵素的変換(または生体内変換)を指す。「変換パーセント」は、指定条件下で期間内に産物に変換される基質のパーセントを指す。したがって、GAAポリペプチドの「酵素活性」または「活性」を特定の期間内の産物への基質の「変換パーセント」として表すことができる。
「ハイブリダイゼーションストリンジェンシー」は、核酸のハイブリダイゼーションにおけるハイブリダイゼーション条件、例えば、洗浄条件に関する。一般に、ハイブリダイゼーション反応は、より低度のストリンジェンシーの条件下で行われ、これに様々な、しかしより高度な、ストリンジェンシーの洗浄が続く。用語「中等度にストリンジェントなハイブリダイゼーション」は、標的DNAが、標的DNAに対する約60%の同一性、好ましくは、約75%の同一性、約85%の同一性と標的ポリヌクレオチドに対する約90%より高い同一性を有する相補的核酸に結合することを可能にする条件を指す。例示的な中等度にストリンジェントな条件は、50%ホルムアミド、5×デンハート液、5×SSPE、0.2%SDS中、42℃でのハイブリダイゼーション、続いて0.2×SSPE、0.2%SDS中、42℃での洗浄に相当する条件である。「高ストリンジェンシーハイブリダイゼーション」は、定義されたポリヌクレオチド配列について溶液条件下で決定された熱融解温度Tmから約10℃またはそれ未満である条件を一般に指す。一部の実施形態では、高ストリンジェンシー条件は、0.018M NaCl中、65℃で安定したハイブリッドを形成する核酸配列のみのハイブリダイゼーションを可能にする条件を指す(すなわち、ハイブリッドが、0.018M NaCl中、65℃で、安定していない場合、それは、本明細書で企図されるような高ストリンジェンシー条件下で安定していないことになる)。高ストリンジェンシー条件は、例えば、0.1×SSPE、および0.1%SDS中、65℃での洗浄が後に続く、42℃で50%ホルムアミド、5×デンハート液、5×SSPE、0.2%SDSに相当する条件でのハイブリダイゼーションによって、提供され得る。別の高ストリンジェンシー条件は、0.1%(w:v)SDSを含有する5×SSC中、65℃でのハイブリダイゼーションおよび0.1%SDSを含有する0.1×SSC中、65℃での洗浄に相当する条件でのハイブリダイゼーションである。他の高ストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件、および中等度にストリンジェントな条件は、上記の参考文献に記載されている。
「コドン最適化された」は、コードされたタンパク質が目的の生物においてより効率的に発現されるような、タンパク質をコードするポリヌクレオチドのコドンの、その特定の生物において優先的に使用されるコドンへの変化を指す。遺伝コードは、大部分のアミノ酸が、「シノニム」または「同義」コドンと呼ばれるいくつかのコドンによって表されることから縮重しているが、特定の生物によるコドン使用頻度がランダムでなく、特定のコドントリプレットに偏っていることは、周知である。このコドン使用頻度の偏りは、所与の遺伝子、共通の機能または祖先の遺伝子、低コピー数タンパク質に対して高度に発現されるタンパク質、および生物のゲノムの凝集タンパク質コード領域に関して、より高度であり得る。一部の実施形態では、GAA酵素をコードするポリヌクレオチドは、発現のために選択された宿主生物からの最適な産生のためにコドン最適化され得る。
「制御配列」は、本明細書では、本願のポリヌクレオチドおよび/またはポリペプチドの発現に必要または有利な全ての構成成分を含むように言及する。各制御配列は、ポリペプチドをコードする核酸配列にとってネイティブであることもあり、または異質であることもある。そのような制御配列は、リーダー、ポリアデニル化配列、プロペプチド配列、プロモーター配列、シグナルペプチド配列、開始配列および転写ターミネーターを含むが、これらに限定されない。少なくとも、制御配列は、プロモーター、ならびに転写および翻訳停止シグナルを含む。制御配列は、制御配列とポリペプチドをコードする核酸配列のコード領域とのライゲーションを助長する特異的制限部位を導入するためにリンカーを備えていることもある。
「作動可能に連結した」は、制御配列が目的のポリヌクレオチドおよび/またはポリペプチドの発現を指令または調節するために制御配列が目的のポリヌクレオチドに対する相対位置に適切に(すなわち、機能的関係で)配置されている構成と、本明細書では定義される。
「プロモーター配列」は、目的のポリヌクレオチドの発現のための宿主細胞により認識される核酸配列、例えば、コード配列を指す。プロモーター配列は、目的のポリヌクレオチドの発現を媒介する転写制御配列を含有する。プロモーターは、突然変異型、切断型およびハイブリッドプロモーターを含む、選択される宿主細胞において転写活性を示す任意の核酸配列であり得、プロモーターを、宿主細胞にとって同種または異種のどちらかの細胞外または細胞内ポリペプチドをコードする遺伝子から得ることができる。
「好適な反応条件」は、本願のGAAポリペプチドが基質を所望の産物化合物に変換することができる、酵素的変換反応溶液における条件(例えば、酵素負荷量、基質負荷量、温度、pH、緩衝剤、共溶媒などの範囲)を指す。例示的な「好適な反応条件」は、本願の中で提供され、実施例により例証される。「化合物負荷量」または「酵素負荷量」におけるような「負荷量」は、反応開始時の反応混合物中の構成成分の濃度または量を指す。酵素的変換反応プロセスの文脈での「基質」は、GAAポリペプチドによる作用を受ける化合物または分子を指す。酵素的変換プロセスの文脈での「産物」は、基質に対するGAAポリペプチドの作用の結果として生じる化合物または分子を指す。
本明細書で使用される場合、用語「培養すること」は、任意の好適な条件下で(例えば、液体、ゲルまたは固体培地を使用して)微生物細胞の集団を増殖させることを指す。
組換えポリペプチドは、当技術分野において公知の任意の好適な方法を使用して産生することができる。目的の野生型ポリペプチドをコードする遺伝子をプラスミドなどのベクター内にクローニングし、E.coli、S.cerevisiaeなどのような所望の宿主に発現させることができる。組換えポリペプチドのバリアントを当技術分野において公知の様々な方法により生成することができる。実際に、当業者に周知の多種多様な異なる突然変異誘発技法がある。加えて、突然変異誘発キットも、多くの商業的分子生物学供給業者から入手することができる。定義されたアミノ酸における特異的置換(部位指向性)、遺伝子の局所領域における特異的もしくはランダム突然変異(位置特異的)、または遺伝子全体にわたってのランダム突然変異誘発(例えば、飽和突然変異誘発)を行う方法を利用することができる。酵素バリアントを生成するための非常に多数の好適な方法が、当業者に公知であり、そのような方法としては、PCRを使用する一本鎖DNAもしくは二本鎖DNAの部位特異的突然変異誘発、カセット突然変異誘発、遺伝子合成、エラープローンPCR、シャフリング、および化学的飽和突然変位誘発、または当技術分野において公知の任意の他の好適な方法が挙げられるが、これらに限定されない。DNAおよびタンパク質工学に使用される方法の非限定的な例は、次の特許で提供されている:米国特許第6,117,679号、米国特許第6,420,175号、米国特許第6,376,246号、米国特許第6,586,182号、米国特許第7,747,391号、米国特許第7,747,393号、米国特許第7,783,428号、および米国特許第8,383,346号。バリアントを産生した後、それらを任意の所望の特性(例えば、高い活性もしくは活性の増加、または低い活性もしくは活性の低下、熱活性の増加、熱安定性の増大、および/または酸性pH安定性など)についてスクリーニングすることができる。一部の実施形態では、「組換えGAAポリペプチド」(本明細書では「操作されたGAAポリペプチド」、「バリアントGAA酵素」、および「GAAバリアント」とも呼ばれる)が使用される。
本明細書で使用される場合、「ベクター」は、DNA配列を細胞に導入するためのDNA構築物である。一部の実施形態では、ベクターは、DNA配列にコードされたポリペプチドの好適な宿主における発現を果たすことができる好適な制御配列に作動可能に連結されている発現ベクターである。一部の実施形態では、「発現ベクター」は、宿主細胞における発現を駆動するためのDNA配列(例えば、導入遺伝子)に作動可能に連結されたプロモーター配列を有し、一部の実施形態では、転写ターミネーター配列も含む。一部の好ましい実施形態では、本明細書で提供されるpDHベクターが使用される。
本明細書で使用される場合、用語「遺伝子治療ベクター」は、細胞へのポリヌクレオチド配列の送達に好適なビヒクルまたは担体を指す。一部の実施形態では、ベクターは、細胞または組織への送達のための遺伝子(例えば、治療遺伝子)またはポリヌクレオチド配列をカプセル化するものであり、そのようなベクターとしては、アデノウイルス(AV)ベクター、アデノ随伴ウイルス(AAV)ベクター、レンチウイルス(LV)ベクター、および非ウイルスベクター、例えばリポソームが挙げられるが、これらに限定されない。所与の設定に好適な任意のビヒクルが使用されるので、本発明がいずれかの特定の遺伝子治療ベクターに限定されることは、意図されていない。遺伝子治療ベクターは、遺伝子を特定の種もしくは宿主に送達するように設計することができ、またはより一般的な利用可能性を見出すことができる。
本明細書で使用される場合、用語「発現」は、転写、転写後修飾、翻訳、および翻訳後修飾を含むがこれらに限定されない、ポリペプチドの産生に関与する任意のステップを含む。一部の実施形態では、この用語は、細胞からのポリペプチドの分泌も包含する。
本明細書で使用される場合、用語「産生する」は、細胞によるタンパク質および/または他の化合物の産生を指す。この用語は、転写、転写後修飾、翻訳、および翻訳後修飾を含むがこれらに限定されない、ポリペプチドの産生に関与する任意のステップを包含することが意図されている。一部の実施形態では、この用語は、細胞からのポリペプチドの分泌も包含する。
本明細書で使用される場合、アミノ酸またはヌクレオチド配列(例えば、プロモーター配列、シグナルペプチド、ターミネーター配列など)は、この配列が作動可能に連結されている別の配列にとって、それら2つの配列が天然に会合していない場合、「異種」である。
本明細書で使用される場合、用語「宿主細胞」および「宿主株」は、本明細書で提供されるDNA(例えば、GAAバリアントをコードするポリヌクレオチド)を含む発現ベクターのための好適な宿主を指す。一部の実施形態では、宿主細胞は、当技術分野において公知の組換えDNA技法を使用して構築されたベクターが形質転換で導入されたまたはトランスフェクトされた真核または原核細胞である。
用語「類似体」は、参照ポリペプチドと70%より高い配列同一性、しかし100%未満の配列同一性(例えば、75%、78%、80%、83%、85%、88%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%より高い配列同一性)を有する、ポリペプチドを意味する。一部の実施形態では、類似体という用語は、天然に存在するアミノ酸ばかりでなく、ホモアルギニン、オルニチンおよびノルバリンを含むがこれらに限定されない、1つまたは複数の天然に存在しないアミノ酸残基も含有する、ポリペプチドを指す。一部の実施形態では、類似体は、1つまたは複数のD-アミノ酸残基、および2つまたはそれより多くのアミノ酸残基間の非ペプチド連結も含む。
用語「治療薬」は、病的状態の徴候または症状を示す対象に投与される化合物であって、有益なまたは望ましい医療効果がある化合物を指す。
用語「医薬組成物」は、哺乳動物対象(例えば、ヒト)における薬学的使用に好適な組成物であって、本発明により包含される操作されたGAAポリペプチドの薬学的有効量と許容される担体とを含む組成物を指す。
用語「遺伝子治療」は、疾患の処置または予防のための、細胞または組織への、それらの細胞または組織の改変のための、遺伝子治療ベクターによる遺伝子、ポリデオキシリボヌクレオチドまたはポリヌクレオチド配列の送達を指す。遺伝子治療は、疾患を引き起こす突然変異遺伝子をその遺伝子の健康なコピーで置き換えること、または不適切に機能している突然変異遺伝子を不活性化することもしくは「ノックアウトすること」を含み得る。一部の実施形態では、遺伝子治療は、患者における疾患の処置に使用される。
用語「mRNA療法」は、疾患の処置または予防のための、細胞または組織への、それらの細胞または組織の改変のための、mRNAポリリボヌクレオチド配列の送達を指す。一部の実施形態では、細胞または組織への送達のためのmRNAポリヌクレオチド配列は、例えば、これに限定されないが、リポソームに入れて、製剤化される。一部の実施形態では、mRNA療法は、患者における疾患の処置に使用される。
用語「細胞療法」は、疾患の処置または予防のための、欠けている遺伝子を供給するための、患者への外因的に改変された生細胞の送達を指す。その後、改変された細胞は体内に再導入される。
用語「有効量」は、所望の結果を生じさせるのに十分な量を意味する。当業者は、日常的な実験を使用することにより有効量が何なのかを決定することができる。
用語「単離された」および「精製された」は、それが天然に会合している少なくとも1つの他の構成成分から除去されている、分子(例えば、単離された核酸、ポリペプチドなど)または他の構成成分を指すために使用される。用語「精製された」は、絶対純度を必要とせず、むしろ、相対的定義として意図されている。
用語「対象」は、哺乳動物、例えば、ヒト、非ヒト霊長類、家畜、伴侶動物、および実験動物(例えば、げっ歯類およびウサギ目の動物)を包含する。この用語は、雌も雄も包含することが意図されている。
本明細書で使用される場合、用語「患者」は、疾患について評定されることになる、疾患について処置されることになる、または疾患を経験している、任意の対象を意味する。
用語「乳児」は、生後1カ月からおおよそ一(1)歳までの時期の子供を指す。本明細書で使用される場合、用語「新生児」は、出生から生後28日までの時期の子供を指す。用語「早産児」は、妊娠満20週以降だが満期より前の、一般に出生時の体重が約500~約2499グラムである、乳児を指す。「超低出生体重児」は、出生時の体重が1500g未満の乳児である。
本明細書で使用される場合、用語「子供」は、処置または研究手順に同意するための法定年齢に達していない人物を指す。一部の実施形態では、この用語は、出生時と青年期の間の人物を指す。
本明細書で使用される場合、用語「成人」は、関連司法管轄区の到達法定年齢(例えば、米国では18歳)を有する人物を指す。一部の実施形態では、この用語は、任意の十分に成長した成熟生物を指す。一部の実施形態では、用語「若年成人」は、18歳未満だが性的成熟に達している人物を指す。
本明細書で使用される場合、「組成物」および「製剤」は、任意の好適な使用のためのものである、本発明の少なくとも1つの操作されたGAAを含む産物(例えば、医薬組成物、健康/栄養補助食品、飼料など)を包含する。
「投与」および組成物を「投与すること」という用語は、本発明の組成物を対象に(例えば、ポンペ病の影響を受けている人物に)提供することを意味する。
用語「担体」は、医薬組成物に関連して使用される場合、標準的な医薬担体、緩衝剤および賦形剤、例えば、安定剤、保存剤およびアジュバントのいずれかを意味する。
用語「薬学的に許容される」は、いかなる望ましくない生物学的効果も引き起こすことも、それが含有され、望ましい生物活性を有するいずれの構成成分とも有害に相互作用することもなく、対象に投与することができる材料を意味する。
本明細書で使用される場合、用語「賦形剤」は、医薬品有効成分(API;例えば、本発明の操作されたGAAポリペプチド)以外の、任意の薬学的に許容される添加剤、担体、希釈剤、アジュバントまたは他の成分を指す。賦形剤は、典型的には、製剤および/または投与のために含有される。
用語「治療有効量」は、疾患/状態の症状に関連して使用される場合、疾患/状態の1つもしくは複数の症状を改善、減弱もしくは消失させる、または症状の発現を防ぐまたは遅延させる、化合物(例えば、操作されたGAAポリペプチド)の量および/または濃度を指す。
用語「治療有効量」は、疾患/状態に関連して使用される場合、疾患/状態を改善、減弱または消失させる、組成物(例えば、操作されたGAAポリペプチド)の量および/または濃度を指す。一部の実施形態では、この用語は、研究者、医師、獣医または他の臨床医により探求される、組織、系または動物対象による生物学的(例えば、医学的)応答を惹起する組成物の量に関連して使用される。
用語「処置すること」、「処置する」および「処置」は、緩和的処置ばかりでなく予防的(例えば、予防のための)処置も包含することが意図される。
操作されたGAAポリペプチド:
操作されたGAAポリペプチド:
一部の実施形態では、操作されたGAAポリペプチドは、少なくとも1つの操作されたGAAポリペプチドをコードする少なくとも1つのポリヌクレオチド配列を含む微生物を、操作されたGAAポリペプチドの産生を助長する条件下で培養することによって産生される。一部の実施形態では、操作されたGAAポリペプチドは、結果として得られる培養培地および/または細胞から回収される。
本発明は、GAA活性を有する例示的な操作されたGAAポリペプチドを提供する。実施例は、特定のアミノ酸配列特徴と操作されたGAAポリペプチドの機能的活性との相関関係を証明する配列構造情報を示す表を提供する。この構造-機能相関関係情報は、実施例で示されるように、参照の操作されたポリペプチドと比べた特定のアミノ酸残基相違の形で提供される。実施例は、例示的な操作されたGAAポリペプチドについての実験によって決定された活性データをさらに提供する。
操作されたポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、発現ベクターおよび宿主細胞:
操作されたポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、発現ベクターおよび宿主細胞:
本発明は、本明細書に記載される操作されたGAAポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを提供する。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、ポリペプチドを発現させることができる組換えポリヌクレオチドを作出するために遺伝子発現を制御する1つまたは複数の異種調節配列に作動可能に連結されている。操作されたGAAポリペプチドをコードする異種ポリヌクレオチドを含有する発現構築物を適切な宿主細胞に導入して、対応するGAAポリペプチドを発現させることができる。
当業者には明らかであるように、タンパク質配列と様々なアミノ酸に対応するコドンについての知識とが得られることによって、対象ポリペプチドをコードすることができる全てのポリヌクレオチドについての説明が得られる。同じアミノ酸が代替または同義コドンによりコードされる遺伝コードの縮重は、全てが、操作されたGAAポリペプチドをコードするものである、極めて多数の核酸を作製することを可能にする。したがって、特定のアミノ酸配列の知識があると、当業者は、タンパク質のアミノ酸配列を変えない方法で1つまたは複数のコドンの配列を単に修飾することにより、任意の数の異なる核酸を作製することができる。このことに関連して、本発明は、本明細書に記載されるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの各々のおよびあらゆる可能な変形形態であって、可能性のあるコドン選択肢に基づいて組合せを選択することにより作製され得るそのような変形形態を具体的に企図しており、すべてのそのような変形形態は、表3-1、3-2、4-1、6-1、10-1、10-2、12-1、13-1、13-2、14-1、14-2、15-1、16-1、17-1、17-2、17-3、17-4、17-5、17-6、17-7、17-8および/または17-9、ならびに配列番号2、8および/または14で提供されるバリアントを含めて、本明細書に記載されるあらゆるポリペプチドについて具体的に開示されていると考えるものとする。
様々な実施形態では、コドンは、好ましくは、タンパク質が産生されることになる宿主細胞に合うように選択される。例えば、細菌において使用される好ましいコドンは、細菌における発現のために使用される。それ故、操作されたGAAポリペプチドをコードするコドン最適化ポリヌクレオチドは、完全長コード領域のコドン位置の約40%、50%、60%、70%、80%に、または90%より多くに、好ましいコドンを含有する。
一部の実施形態では、上で説明したように、ポリヌクレオチドは、本明細書で開示される特性を有するGAA活性を有する操作されたポリペプチドであって、配列番号2、6、8、12、14、16、18、20、946、1956、2496、2880および/もしくは3104から選択される参照配列に対して少なくとも80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%のもしくはそれより高い同一性を有するアミノ酸配列、または表3-1、3-2、4-1、6-1、10-1、10-2、12-1、13-1、13-2、14-1、14-2、15-1、16-1、17-1、17-2、17-3、17-4、17-5、17-6、17-7、17-8および/もしくは17-9で開示されるような任意のバリアントのアミノ酸配列を含み、かつ配列番号2、6、8、12、14、16、18、20、946、1956、2496、2880および/もしくは3104の参照ポリペプチド、または表3-1、3-2、4-1、6-1、10-1、10-2、12-1、13-1、13-2、14-1、14-2、15-1、16-1、17-1、17-2、17-3、17-4、17-5、17-6、17-7、17-8および/もしくは17-9で開示されるような任意のバリアントのアミノ酸配列(例えば、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10もしくはそれより多くのアミノ酸残基位置)と比較して1つまたは複数の残基相違を含む、ポリペプチドをコードする。一部の実施形態では、参照配列は、配列番号2、6、8、12、14、16、18、20、946、1956、2496、2880、および/または3104から選択される。
本発明は、配列番号2に対して少なくとも約70%、少なくとも約75%、少なくとも約80%、少なくとも約85%、少なくとも約90%、少なくとも約91%、少なくとも約92%、少なくとも約93%、少なくとも約94%、少なくとも約95%、少なくとも約96%、少なくとも約97%、少なくとも約98%、または少なくとも約99%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む組換え酸性アルファ-グルコシダーゼおよび/または生物活性組換え酸性アルファ-グルコシダーゼ断片を提供する。本発明は、配列番号2に対して少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、または少なくとも99%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む組換え酸性アルファ-グルコシダーゼおよび/または生物活性組換え酸性アルファ-グルコシダーゼ断片を提供する。一部の実施形態では、酸性アルファ-グルコシダーゼは、27、27/944、28、29/478、30、88、107、109、109/842、110、113、135、137、138、148、150、247、274、276、278、375、403、414、418、418/499、421、426、437、444、455、463、471、471/478、476、489、527、547、581、610、642、668、670、692、725/732、750、753、786、820、862、871、895、897、930、934、および944から選択される位置または位置のセットに少なくとも1つの置換を含み、これらの位置は、配列番号2を参照して番号が付けられている。一部の実施形態では、酸性アルファ-グルコシダーゼは、27P、27P/944W、27R、28P、28R、28S、29T/478T、30G、30K、30T、88G、88S、107G、107P、109G/842E、109P、110G、110L、113S、135A、135Q、137P、138A、148G、148Y、150G、247R、274G、276F、276Y、278A、278G、375E、403W、414P、418E/499R、418R、421S、426R、437S、444T、455V、463A、471Q/478S、471S、476A、476H、489R、527R、547G、581G、581T、610A、610G、610S、642M、642Q、642S、668H、670N、692Q、725N/732I、750P、753T、786P、786Y、820E、862G、871E、895R、897V、930R、934R、944G、および944Rから選択される1つまたは複数の位置に少なくとも1つの置換または置換のセットを含み、これらの位置は、配列番号2を参照して番号が付けられている。一部の実施形態では、酸性アルファ-グルコシダーゼは、F27P、F27P/C944W、F27R、L28P、L28R、L28S、L29T/A478T、V30G、V30K、V30T、K88G、K88S、Q107G、Q107P、L109G/G842E、L109P、Q110G、Q110L、Q113S、S135A、S135Q、E137P、M138A、T148G、T148Y、T150G、Q247R、D274G、A276F、A276Y、T278A、T278G、I375E、R403W、R414P、A418E/H499R、A418R、Q421S、G426R、A437S、A444T、R455V、E463A、K471Q/A478S、K471S、S476A、S476H、A489R、N527R、A547G、K581G、K581T、W610A、W610G、W610S、L642M、L642Q、L642S、S668H、L670N、T692Q、K725N/V732I、A750P、A753T、R786P、R786Y、G820E、R862G、L871E、K895R、T897V、C930R、L934R、C944G、およびC944Rから選択される1つまたは複数の位置に少なくとも1つの置換または置換のセットを含み、これらの位置は、配列番号2を参照して番号が付けられている。一部の実施形態では、酸性アルファ-グルコシダーゼは、29/218/240/668/700/744/869、29/218/240/700/869、29/240/596/668/700/744/869、29/240/596/668/869、36/106/150/218/527/750/883/894、106/112/150/218/414/527/793/883、106/150/169/218/414/486/527/750/894、106/150/169/218/414/486/527/894、106/150/169/218/414/486/749/793/883/894、106/150/169/218/414/486/750/793/883/894、106/150/169/218/414/486/793/883、106/150/169/218/414/486/894、106/150/169/218/414/749/750/793/883、106/150/169/218/414/749/793、106/150/169/218/414/749/793/883、106/150/169/218/486/527/749/793/894、106/150/169/218/486/749/883、106/150/169/218/486/883、106/150/169/218/749/800、106/150/169/414/486/749/750/883、106/150/169/527/749/793/883、106/150/169/749/793/883/894、106/150/218/331/414/486/527/733/749/793、106/150/218/414/486/642/750/793/883、106/150/218/414/486/750/793/894、106/150/218/414/527/749/750/883、106/150/218/414/527/749/793/883/894、106/150/218/414/749/750/793/883/894、106/150/218/414/749/793/883、106/150/218/486/527/749/894、106/150/218/486/793/883、106/150/218/527/749/750/793、106/150/218/527/793/894、106/150/218/749/750/793、106/150/218/793、106/150/218/793/894、106/150/245/793/883/894、106/150/414/749/750/793/894、106/150/414/749/793/894、106/150/486/527/750/793、106/150/486/749/793/883/894、106/150/749/793/883、106/169/185/218/414/749/750/793、106/191/280/402/414/444/727、106/191/414/444/522/928/944、106/191/414/489/928/944、106/280/402/414/444/489/727/944、150/169/218/414/527/793、150/218/414/486/749/750、150/218/414/486/750/793、150/218/414/486/750/793/883、150/218/414/749/750/793/894、150/218/414/749/793、150/218/527/749/793、150/218/749/750/793、150/218/749/793、150/414/486/527/750/894、150/414/486/749/750/793、150/486/750/883/894、169/486/750/793/883、180/275/402/518/547/610/638/669/671、180/402/431/507/547/610/669/671/793、180/402/507/547/610/671、191/280/402/414/444/465/842/928、191/280/402/414/444/489/500/944、191/280/414/444/489/500/522/842/928/944、191/280/414/444/489/522/727/944、191/280/414/489/842/928/944、191/280/414/944、191/414/522/842/944、196/402/431/547/610/638、218/668/700/869、224/402/507/518/547/638/668、269/275/431/518/547/638/668/669、275/281/402/431/507/518/610/668、275/281/402/431/518/547/610/669/671、275/281/402/507/518/547/638/669/671、275/281/402/518/547/610/638/671、275/281/402/518/547/610/668/669/887、275/281/402/547/610/638/669/671、275/281/431/518/547/638/669/671、275/281/507/547/669/671、275/281/610/638/668/669、275/281/671、275/377/402/507/518/669/671/715、275/402/431/507/547/671、275/402/431/518/610/638/669/671/922、275/402/507/547/610/638/668/669、275/402/507/547/610/638/669/671、275/402/507/547/610/671、275/402/547/610/638/669/671、275/402/547/638/669/671、275/402/638/669/671、275/431/507/518/547/668/669/671、275/431/507/518/610/669/671、275/431/507/547/610/638/671、275/431/518/547/638/668、275/431/518/610/638/669/671、275/431/638、275/507/518/547/610/638/668/669、275/507/518/547/638/669/671、275/507/547/610/638/669/671、275/507/547/668/669/671、275/518/671、280/402/536/928、281/402/507/518/547/610/638/669/671、281/402/507/547/638/669/671、281/402/518/547/610/638/668/669、281/402/518/547/668、281/431/507/518/547/610/638/668、402/431/518/547/610/668、402/431/518/547/671、402/431/518/610、402/431/547/638/671、431/507/518/541/547/638/669/671、431/507/518/669/671、507/547/610、507/547/638/669/671、547/610/638/671、および547/638/668から選択される位置または位置のセットに少なくとも1つの置換を含み、これら
の位置は、配列番号2を参照して番号が付けられている。一部の実施形態では、酸性アルファ-グルコシダーゼは、29Q/218S/240I/668D/700F/744V/869L、29Q/240I/596P/668D/869L、29Q/240I/596S/668D/700F/744V/869T、29V/218S/240I/700F/869T、36R/106P/150S/218S/527D/750P/883H/894R、106P/112S/150S/218S/414G/527D/793K/883H、106P/150S/169S/218S/414G/486E/527D/750P/894R、106P/150S/169S/218S/414G/486E/527D/894R、106P/150S/169S/218S/414G/486E/749E/793K/883H/894R、106P/150S/169S/218S/414G/486E/750P/793K/883H/894R、106P/150S/169S/218S/414G/486E/793K/883H、106P/150S/169S/218S/414G/486E/894R、106P/150S/169S/218S/414G/749E/750P/793K/883H、106P/150S/169S/218S/414G/749E/793K、106P/150S/169S/218S/414G/749E/793K/883H、106P/150S/169S/218S/486E/527D/749E/793K/894R、106P/150S/169S/218S/486E/749E/883H、106P/150S/169S/218S/486E/883H、106P/150S/169S/218S/749E/800A、106P/150S/169S/414G/486E/749E/750P/883H、106P/150S/169S/527D/749E/793K/883H、106P/150S/169S/749E/793K/883H/894R、106P/150S/218S/331A/414G/486E/527D/733E/749E/793K、106P/150S/218S/414G/486E/642F/750P/793K/883H、106P/150S/218S/414G/486E/750P/793K/894R、106P/150S/218S/414G/527D/749E/750P/883H、106P/150S/218S/414G/527D/749E/793K/883H/894G、106P/150S/218S/414G/749E/750P/793K/883H/894R、106P/150S/218S/414G/749E/793K/883H、106P/150S/218S/486E/527D/749E/894R、106P/150S/218S/486E/793K/883H、106P/150S/218S/527D/749E/750P/793K、106P/150S/218S/527D/793K/894G、106P/150S/218S/749E/750P/793K、106P/150S/218S/793K、106P/150S/218S/793K/894R、106P/150S/245S/793K/883H/894R、106P/150S/414G/749E/750P/793K/894R、106P/150S/414G/749E/793K/894R、106P/150S/486E/527D/750P/793K、106P/150S/486E/749E/793K/883H/894G、106P/150S/749E/793K/883H、106P/169S/185G/218S/414G/749E/750P/793K、106P/191R/280D/402A/414G/444P/727P、106P/191R/414G/444P/522V/928T/944S、106P/191R/414G/489D/928T/944S、106P/280D/402A/414G/444P/489D/727P/944S、150S/169S/218S/414G/527D/793K、150S/218S/414G/486A/750P/793K、150S/218S/414G/486E/749E/750P、150S/218S/414G/486E/750P/793K/883H、150S/218S/414G/749E/750P/793K/894R、150S/218S/414G/749E/793K、150S/218S/527D/749E/793K、150S/218S/749E/750P/793K、150S/218S/749E/793K、150S/414G/486E/527D/750P/894R、150S/414G/486E/749E/750P/793K、150S/486E/750P/883H/894G、169S/486E/750P/793K/883H、180H/275M/402A/518V/547G/610R/638I/669H/671N、180H/402A/431V/507L/547G/610R/669H/671N/793G、180H/402A/507L/547G/610R/671N、191R/280D/402A/414G/444P/465E/842S/928T、191R/280D/402A/414G/444P/489D/500A/944S、191R/280D/414G/444P/489D/500A/522V/842S/928T/944S、191R/280D/414G/444P/489D/522V/727P/944S、191R/280D/414G/489D/842S/928T/944S、191R/280D/414G/944S、191R/414G/522V/842S/944S、196V/402A/431V/547G/610R/638I、218S/668D/700F/869T、224F/402A/507L/518V/547G/638I/668D、269N/275M/431V/518V/547G/638I/668D/669H、275M/281V/402A/431V/507L/518V/610R/668D、275M/281V/402A/507L/518V/547G/638I/669H/671N、275M/281V/402A/518V/547G/610R/638I/671N、275M/281V/402A/518V/547G/610R/668D/669H/887D、275M/281V/402A/547G/610R/638I/669H/671N、275M/281V/507L/547G/669H/671N、275M/281V/610R/638I/668D/669H、275M/402A/431V/507L/547G/671N、275M/402A/507L/547G/610R/671N、275M/402A/547G/638I/669H/671N、275M/431V/518V/547G/638I/668D、275M/431V/518V/610R/638I/669H/671N、275M/431V/638I、275M/507L/547G/668D/669H/671N、275V/281V/402A/431V/518V/547G/610R/669H/671N、275V/281V/431V/518V/547G/638I/669H/671N、275V/281V/671N、275V/377K/402A/507L/518V/669H/671N/715G、275V/402A/431V/518V/610R/638I/669H/671N/922L、275V/402A/507L/547G/610R/638I/668D/669H、275V/402A/507L/547G/610R/638I/669H/671N、275V/402A/547G/610R/638I/669H/671N、275V/402A/638I/669H/671N、275V/431V/507L/518V/547G/668D/669H/671N、275V/431V/507L/518V/610R/669H/671N、275V/431V/507L/547G/610R/638I/671N、275V/507L/518V/547G/610R/638I/668D/669H、275V/507L/518V/547G/638I/669H/671N、275V/507L/547G/610R/638I/669H/671N、275V/518V/671N、280D/402A/536I/928T、281V/402A/507L/518V/547G/610R/638I/669H/671N、281V/402A/507L/547G/638I/669H/671N、281V/402A/518V/547G/610R/638I/668D/669H、281V/402A/518V/547G/668D、281V/431V/507L/518V/547G/610R/638I/668D、402A/431V/518V/547G/610R/668D、402A/431V/518V/547G/671N、402A/431V/518V/610R、402A/431V/547G/638I/671N、431V/507L/518V/541E/547G/638I/669H/671N、431V/507L/518V/669H/671N、507L/547G/610R、507L/547G/638I/669H/671N、547G/610R/638I/671N、および547G/638I/668Dから選択される1つまたは複数の位置に少なくとも1つの置換または置換のセットを含み、これらの位置は、配列番号2を参照して番号が付けられている。一部の実施形態では、酸性アルファ-グルコシダーゼは、L29Q/L218S/L240I/S668D/H700F/I744V/I869L、L29Q/L240I/A596P/S668D/I869L、L29Q/L240I/A596S/S668D/H700F/I744V/I869T、L29V/L218S/L240I/H700F/I869T、G36R/K106P/T150S/L218S/N527D/A750P/R883H/Q894R、K106P/A112S/T150S/L218S/R414G/N527D/E793K/R883H、K106P/T150S/N169S/L218S/R414G/T486E/N527D/A750P/Q894R、K106P/T150S/N169S/L218S/R414G/T486E/N527D/Q894R、K106P/T150S/N169S/L218S/R414G/T486E/Q749E/E793K/R883H/Q894R、K106P/T150S/N169S/L218S/R414G/T486E/A750P/E793K/R883H/Q894R、K106P/T150S/N169S/L218S/R414G/T486E/E793K/R883H、K106P/T150S/N169S/L218S/R414G/T486E/Q894R、K106P/T150S/N169S/L218S/R414G/Q749E/A750P/E793K/R883H、K106P/T150S/N169S/L218S/R414G/Q749E/E793K、K106P/T150S/N169S/L218S/R414G/Q749E/E793K/R883H、K106P/T150S/N169S/L218S/T486E/N527D/Q749E/E793K/Q894R、K106P/T150S/N169S/L218S/T486E/Q749E/R883H、K106P/T150S/N169S/L218S/T486E/R883H、K106P/T150S/N169S/L218S/Q749E/P800A、K106P/T150S/N169S/R414G/T486E/Q749E/A750P/R883H、K106P/T150S/N169S/N527D/Q749E/E793
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の位置は、配列番号2を参照して番号が付けられている。一部の実施形態では、酸性アルファ-グルコシダーゼは、29Q/218S/240I/668D/700F/744V/869L、29Q/240I/596P/668D/869L、29Q/240I/596S/668D/700F/744V/869T、29V/218S/240I/700F/869T、36R/106P/150S/218S/527D/750P/883H/894R、106P/112S/150S/218S/414G/527D/793K/883H、106P/150S/169S/218S/414G/486E/527D/750P/894R、106P/150S/169S/218S/414G/486E/527D/894R、106P/150S/169S/218S/414G/486E/749E/793K/883H/894R、106P/150S/169S/218S/414G/486E/750P/793K/883H/894R、106P/150S/169S/218S/414G/486E/793K/883H、106P/150S/169S/218S/414G/486E/894R、106P/150S/169S/218S/414G/749E/750P/793K/883H、106P/150S/169S/218S/414G/749E/793K、106P/150S/169S/218S/414G/749E/793K/883H、106P/150S/169S/218S/486E/527D/749E/793K/894R、106P/150S/169S/218S/486E/749E/883H、106P/150S/169S/218S/486E/883H、106P/150S/169S/218S/749E/800A、106P/150S/169S/414G/486E/749E/750P/883H、106P/150S/169S/527D/749E/793K/883H、106P/150S/169S/749E/793K/883H/894R、106P/150S/218S/331A/414G/486E/527D/733E/749E/793K、106P/150S/218S/414G/486E/642F/750P/793K/883H、106P/150S/218S/414G/486E/750P/793K/894R、106P/150S/218S/414G/527D/749E/750P/883H、106P/150S/218S/414G/527D/749E/793K/883H/894G、106P/150S/218S/414G/749E/750P/793K/883H/894R、106P/150S/218S/414G/749E/793K/883H、106P/150S/218S/486E/527D/749E/894R、106P/150S/218S/486E/793K/883H、106P/150S/218S/527D/749E/750P/793K、106P/150S/218S/527D/793K/894G、106P/150S/218S/749E/750P/793K、106P/150S/218S/793K、106P/150S/218S/793K/894R、106P/150S/245S/793K/883H/894R、106P/150S/414G/749E/750P/793K/894R、106P/150S/414G/749E/793K/894R、106P/150S/486E/527D/750P/793K、106P/150S/486E/749E/793K/883H/894G、106P/150S/749E/793K/883H、106P/169S/185G/218S/414G/749E/750P/793K、106P/191R/280D/402A/414G/444P/727P、106P/191R/414G/444P/522V/928T/944S、106P/191R/414G/489D/928T/944S、106P/280D/402A/414G/444P/489D/727P/944S、150S/169S/218S/414G/527D/793K、150S/218S/414G/486A/750P/793K、150S/218S/414G/486E/749E/750P、150S/218S/414G/486E/750P/793K/883H、150S/218S/414G/749E/750P/793K/894R、150S/218S/414G/749E/793K、150S/218S/527D/749E/793K、150S/218S/749E/750P/793K、150S/218S/749E/793K、150S/414G/486E/527D/750P/894R、150S/414G/486E/749E/750P/793K、150S/486E/750P/883H/894G、169S/486E/750P/793K/883H、180H/275M/402A/518V/547G/610R/638I/669H/671N、180H/402A/431V/507L/547G/610R/669H/671N/793G、180H/402A/507L/547G/610R/671N、191R/280D/402A/414G/444P/465E/842S/928T、191R/280D/402A/414G/444P/489D/500A/944S、191R/280D/414G/444P/489D/500A/522V/842S/928T/944S、191R/280D/414G/444P/489D/522V/727P/944S、191R/280D/414G/489D/842S/928T/944S、191R/280D/414G/944S、191R/414G/522V/842S/944S、196V/402A/431V/547G/610R/638I、218S/668D/700F/869T、224F/402A/507L/518V/547G/638I/668D、269N/275M/431V/518V/547G/638I/668D/669H、275M/281V/402A/431V/507L/518V/610R/668D、275M/281V/402A/507L/518V/547G/638I/669H/671N、275M/281V/402A/518V/547G/610R/638I/671N、275M/281V/402A/518V/547G/610R/668D/669H/887D、275M/281V/402A/547G/610R/638I/669H/671N、275M/281V/507L/547G/669H/671N、275M/281V/610R/638I/668D/669H、275M/402A/431V/507L/547G/671N、275M/402A/507L/547G/610R/671N、275M/402A/547G/638I/669H/671N、275M/431V/518V/547G/638I/668D、275M/431V/518V/610R/638I/669H/671N、275M/431V/638I、275M/507L/547G/668D/669H/671N、275V/281V/402A/431V/518V/547G/610R/669H/671N、275V/281V/431V/518V/547G/638I/669H/671N、275V/281V/671N、275V/377K/402A/507L/518V/669H/671N/715G、275V/402A/431V/518V/610R/638I/669H/671N/922L、275V/402A/507L/547G/610R/638I/668D/669H、275V/402A/507L/547G/610R/638I/669H/671N、275V/402A/547G/610R/638I/669H/671N、275V/402A/638I/669H/671N、275V/431V/507L/518V/547G/668D/669H/671N、275V/431V/507L/518V/610R/669H/671N、275V/431V/507L/547G/610R/638I/671N、275V/507L/518V/547G/610R/638I/668D/669H、275V/507L/518V/547G/638I/669H/671N、275V/507L/547G/610R/638I/669H/671N、275V/518V/671N、280D/402A/536I/928T、281V/402A/507L/518V/547G/610R/638I/669H/671N、281V/402A/507L/547G/638I/669H/671N、281V/402A/518V/547G/610R/638I/668D/669H、281V/402A/518V/547G/668D、281V/431V/507L/518V/547G/610R/638I/668D、402A/431V/518V/547G/610R/668D、402A/431V/518V/547G/671N、402A/431V/518V/610R、402A/431V/547G/638I/671N、431V/507L/518V/541E/547G/638I/669H/671N、431V/507L/518V/669H/671N、507L/547G/610R、507L/547G/638I/669H/671N、547G/610R/638I/671N、および547G/638I/668Dから選択される1つまたは複数の位置に少なくとも1つの置換または置換のセットを含み、これらの位置は、配列番号2を参照して番号が付けられている。一部の実施形態では、酸性アルファ-グルコシダーゼは、L29Q/L218S/L240I/S668D/H700F/I744V/I869L、L29Q/L240I/A596P/S668D/I869L、L29Q/L240I/A596S/S668D/H700F/I744V/I869T、L29V/L218S/L240I/H700F/I869T、G36R/K106P/T150S/L218S/N527D/A750P/R883H/Q894R、K106P/A112S/T150S/L218S/R414G/N527D/E793K/R883H、K106P/T150S/N169S/L218S/R414G/T486E/N527D/A750P/Q894R、K106P/T150S/N169S/L218S/R414G/T486E/N527D/Q894R、K106P/T150S/N169S/L218S/R414G/T486E/Q749E/E793K/R883H/Q894R、K106P/T150S/N169S/L218S/R414G/T486E/A750P/E793K/R883H/Q894R、K106P/T150S/N169S/L218S/R414G/T486E/E793K/R883H、K106P/T150S/N169S/L218S/R414G/T486E/Q894R、K106P/T150S/N169S/L218S/R414G/Q749E/A750P/E793K/R883H、K106P/T150S/N169S/L218S/R414G/Q749E/E793K、K106P/T150S/N169S/L218S/R414G/Q749E/E793K/R883H、K106P/T150S/N169S/L218S/T486E/N527D/Q749E/E793K/Q894R、K106P/T150S/N169S/L218S/T486E/Q749E/R883H、K106P/T150S/N169S/L218S/T486E/R883H、K106P/T150S/N169S/L218S/Q749E/P800A、K106P/T150S/N169S/R414G/T486E/Q749E/A750P/R883H、K106P/T150S/N169S/N527D/Q749E/E793
K/R883H、K106P/T150S/N169S/Q749E/E793K/R883H/Q894R、K106P/T150S/L218S/V331A/R414G/T486E/N527D/D733E/Q749E/E793K、K106P/T150S/L218S/R414G/T486E/L642F/A750P/E793K/R883H、K106P/T150S/L218S/R414G/T486E/A750P/E793K/Q894R、K106P/T150S/L218S/R414G/N527D/Q749E/A750P/R883H、K106P/T150S/L218S/R414G/N527D/Q749E/E793K/R883H/Q894G、K106P/T150S/L218S/R414G/Q749E/A750P/E793K/R883H/Q894R、K106P/T150S/L218S/R414G/Q749E/E793K/R883H、K106P/T150S/L218S/T486E/N527D/Q749E/Q894R、K106P/T150S/L218S/T486E/E793K/R883H、K106P/T150S/L218S/N527D/Q749E/A750P/E793K、K106P/T150S/L218S/N527D/E793K/Q894G、K106P/T150S/L218S/Q749E/A750P/E793K、K106P/T150S/L218S/E793K、K106P/T150S/L218S/E793K/Q894R、K106P/T150S/P245S/E793K/R883H/Q894R、K106P/T150S/R414G/Q749E/A750P/E793K/Q894R、K106P/T150S/R414G/Q749E/E793K/Q894R、K106P/T150S/T486E/N527D/A750P/E793K、K106P/T150S/T486E/Q749E/E793K/R883H/Q894G、K106P/T150S/Q749E/E793K/R883H、K106P/N169S/V185G/L218S/R414G/Q749E/A750P/E793K、K106P/H191R/G280D/S402A/R414G/A444P/S727P、K106P/H191R/R414G/A444P/E522V/D928T/C944S、K106P/H191R/R414G/A489D/D928T/C944S、K106P/G280D/S402A/R414G/A444P/A489D/S727P/C944S、T150S/N169S/L218S/R414G/N527D/E793K、T150S/L218S/R414G/T486A/A750P/E793K、T150S/L218S/R414G/T486E/Q749E/A750P、T150S/L218S/R414G/T486E/A750P/E793K/R883H、T150S/L218S/R414G/Q749E/A750P/E793K/Q894R、T150S/L218S/R414G/Q749E/E793K、T150S/L218S/N527D/Q749E/E793K、T150S/L218S/Q749E/A750P/E793K、T150S/L218S/Q749E/E793K、T150S/R414G/T486E/N527D/A750P/Q894R、T150S/R414G/T486E/Q749E/A750P/E793K、T150S/T486E/A750P/R883H/Q894G、N169S/T486E/A750P/E793K/R883H、N180H/L275M/S402A/I518V/A547G/W610R/V638I/L669H/S671N、N180H/S402A/M431V/M507L/A547G/W610R/L669H/S671N/E793G、N180H/S402A/M507L/A547G/W610R/S671N、H191R/G280D/S402A/R414G/A444P/G465E/G842S/D928T、H191R/G280D/S402A/R414G/A444P/A489D/D500A/C944S、H191R/G280D/R414G/A444P/A489D/D500A/E522V/G842S/D928T/C944S、H191R/G280D/R414G/A444P/A489D/E522V/S727P/C944S、H191R/G280D/R414G/A489D/G842S/D928T/C944S、H191R/G280D/R414G/C944S、H191R/R414G/E522V/G842S/C944S、A196V/S402A/M431V/A547G/W610R/V638I、L218S/S668D/H700F/I869T、L224F/S402A/M507L/I518V/A547G/V638I/S668D、T269N/L275M/M431V/I518V/A547G/V638I/S668D/L669H、L275M/A281V/S402A/M431V/M507L/I518V/W610R/S668D、L275M/A281V/S402A/M507L/I518V/A547G/V638I/L669H/S671N、L275M/A281V/S402A/I518V/A547G/W610R/V638I/S671N、L275M/A281V/S402A/I518V/A547G/W610R/S668D/L669H/E887D、L275M/A281V/S402A/A547G/W610R/V638I/L669H/S671N、L275M/A281V/M507L/A547G/L669H/S671N、L275M/A281V/W610R/V638I/S668D/L669H、L275M/S402A/M431V/M507L/A547G/S671N、L275M/S402A/M507L/A547G/W610R/S671N、L275M/S402A/A547G/V638I/L669H/S671N、L275M/M431V/I518V/A547G/V638I/S668D、L275M/M431V/I518V/W610R/V638I/L669H/S671N、L275M/M431V/V638I、L275M/M507L/A547G/S668D/L669H/S671N、L275V/A281V/S402A/M431V/I518V/A547G/W610R/L669H/S671N、L275V/A281V/M431V/I518V/A547G/V638I/L669H/S671N、L275V/A281V/S671N、L275V/R377K/S402A/M507L/I518V/L669H/S671N/V715G、L275V/S402A/M431V/I518V/W610R/V638I/L669H/S671N/P922L、L275V/S402A/M507L/A547G/W610R/V638I/S668D/L669H、L275V/S402A/M507L/A547G/W610R/V638I/L669H/S671N、L275V/S402A/A547G/W610R/V638I/L669H/S671N、L275V/S402A/V638I/L669H/S671N、L275V/M431V/M507L/I518V/A547G/S668D/L669H/S671N、L275V/M431V/M507L/I518V/W610R/L669H/S671N、L275V/M431V/M507L/A547G/W610R/V638I/S671N、L275V/M507L/I518V/A547G/W610R/V638I/S668D/L669H、L275V/M507L/I518V/A547G/V638I/L669H/S671N、L275V/M507L/A547G/W610R/V638I/L669H/S671N、L275V/I518V/S671N、G280D/S402A/V536I/D928T、A281V/S402A/M507L/I518V/A547G/W610R/V638I/L669H/S671N、A281V/S402A/M507L/A547G/V638I/L669H/S671N、A281V/S402A/I518V/A547G/W610R/V638I/S668D/L669H、A281V/S402A/I518V/A547G/S668D、A281V/M431V/M507L/I518V/A547G/W610R/V638I/S668D、S402A/M431V/I518V/A547G/W610R/S668D、S402A/M431V/I518V/A547G/S671N、S402A/M431V/I518V/W610R、S402A/M431V/A547G/V638I/S671N、M431V/M507L/I518V/G541E/A547G/V638I/L669H/S671N、M431V/M507L/I518V/L669H/S671N、M507L/A547G/W610R、M507L/A547G/V638I/L669H/S671N、A547G/W610R/V638I/S671N、およびA547G/V638I/S668Dから選択される1つまたは複数の位置に少なくとも1つの置換または置換のセットを含み、これらの位置は、配列番号2を参照して番号が付けられている。
本発明は、配列番号8に対して少なくとも約70%、少なくとも約75%、少なくとも約80%、少なくとも約85%、少なくとも約90%、少なくとも約91%、少なくとも約92%、少なくとも約93%、少なくとも約94%、少なくとも約95%、少なくとも約96%、少なくとも約97%、少なくとも約98%、または少なくとも約99%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む組換え酸性アルファ-グルコシダーゼおよび/または生物活性組換え酸性アルファ-グルコシダーゼ断片を提供する。本発明は、配列番号8に対して少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、または少なくとも99%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む組換え酸性アルファ-グルコシダーゼおよび/または生物活性組換え酸性アルファ-グルコシダーゼ断片を提供する。一部の実施形態では、酸性アルファ-グルコシダーゼは、4、27、27/28/489、27/418/478、28、28/29、28/29/113/135/138、28/29/113/135/418、28/29/135、28/29/418、29/113/126/135/193、29/113/135、29/113/135/455、29/113/138、29/148、29/478、106、106/138/218/431/671/749、106/218/281、106/218/455、106/218/455/507/749、106/489/671、106/638、106/671/934、113、113/135/418、113/418/455/478/581、113/418/478/489/581、135、135/148/150/418、135/478/489/581、135/489、135/944、138/218/668/671、138/218/749/934、138/671/749/934、157、218、218/281、218/281/431、218/281/671、218/431、218/431/489/507/749/934、218/455、218/507/749、218/507/934、218/638/671、218/749、281/431/489/668、345/934、418、418/489、431/668/671、489/638/934、489/671/934、489/749、489/934、507/668、507/671/934、671/749、671/934、および749/784から選択される位置または位置のセットに少なくとも1つの置換を含み、これらの位置は、配列番号8を参照して番号が付けられている。一部の実施形態では、酸性アルファ-グルコシダーゼは、4H、27P/28S/489R、27P/418E/478T、27R、28S、28S/29T、28S/29T/113S/135Q/138A、28S/29T/113S/135Q/418E、28S/29T/135Q、28S/29T/418E、29T/113S/126Q/135Q/193Q、29T/113S/135Q、29T/113S/135Q/455V、29T/113S/138A、29T/148G、29T/478T、106P、106P/138A/218S/431V/671N/749E、106P/218S/281V、106P/218S/455V、106P/218S/455V/507L/749E、106P/489R/671N、106P/638I、106P/671N/934R、113S、113S/135Q/418E、113S/418E/455V/478T/581T、113S/418E/478T/489R/581T、135P/944Y、135Q、135Q/148G/150G/418E、135Q/478T/489R/581T、135Q/489R、138A/218S/668D/671N、138A/218S/749E/934R、138A/671N/749E/934R、157M、218S、218S/281V、218S/281V/431V、218S/281V/671N、218S/431V、218S/431V/489R/507L/749E/934R、218S/455V、218S/507L/749E、218S/507L/934R、218S/638I/671N、218S/749E、281V/431V/489R/668D、345K/934R、418E、418E/489R、431V/668D/671N、489R/638I/934R、489R/671N/934R、489R/749E、489R/934R、507L/668D、507L/671N/934R、671N/749E、671N/934R、および749E/784Tから選択される1つまたは複数の位置に少なくとも1つの置換または置換のセットを含み、これらの位置は、配列番号8を参照して番号が付けられている。一部の実施形態では、酸性アルファ-グルコシダーゼは、P4H、F27P/L28S/A489R、F27P/A418E/A478T、F27R、L28S、L28S/L29T、L28S/L29T/Q113S/S135Q/M138A、L28S/L29T/Q113S/S135Q/A418E、L28S/L29T/S135Q、L28S/L29T/A418E、L29T/Q113S/P126Q/S135Q/H193Q、L29T/Q113S/S135Q、L29T/Q113S/S135Q/R455V、L29T/Q113S/M138A、L29T/T148G、L29T/A478T、K106P、K106P/M138A/L218S/M431V/S671N/Q749E、K106P/L218S/A281V、K106P/L218S/R455V、K106P/L218S/R455V/M507L/Q749E、K106P/A489R/S671N、K106P/V638I、K106P/S671N/L934R、Q113S、Q113S/S135Q/A418E、Q113S/A418E/R455V/A478T/K581T、Q113S/A418E/A478T/A489R/K581T、S135P/C944Y、S135Q、S135Q/T148G/S150G/A418E、S135Q/A478T/A489R/K581T、S135Q/A489R、M138A/L218S/S668D/S671N、M138A/L218S/Q749E/L934R、M138A/S671N/Q749E/L934R、L157M、L218S、L218S/A281V、L218S/A281V/M431V、L218S/A281V/S671N、L218S/M431V、L218S/M431V/A489R/M507L/Q749E/L934R、L218S/R455V、L218S/M507L/Q749E、L218S/M507L/L934R、L218S/V638I/S671N、L218S/Q749E、A281V/M431V/A489R/S668D、Q345K/L934R、A418E、A418E/A489R、M431V/S668D/S671N、A489R/V638I/L934R、A489R/S671N/L934R、A489R/Q749E、A489R/L934R、M507L/S668D、M507L/S671N/L934R、S671N/Q749E、S671N/L934R、およびQ749E/A784から選択される1つまたは複数の位置に少なくとも1つの置換または置換のセットを含み、これらの位置は、配列番号8を参照して番号が付けられている。
本発明は、配列番号14に対して少なくとも約70%、少なくとも約75%、少なくとも約80%、少なくとも約85%、少なくとも約90%、少なくとも約91%、少なくとも約92%、少なくとも約93%、少なくとも約94%、少なくとも約95%、少なくとも約96%、少なくとも約97%、少なくとも約98%、または少なくとも約99%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む組換え酸性アルファ-グルコシダーゼおよび/または生物活性組換え酸性アルファ-グルコシダーゼ断片を提供する。本発明は、配列番号14に対して少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、または少なくとも99%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む組換え酸性アルファ-グルコシダーゼおよび/または生物活性組換え酸性アルファ-グルコシダーゼ断片を提供する。一部の実施形態では、酸性アルファ-グルコシダーゼは、22、24、27、27/165、30、33、34、37/62、37/62/79/196/696/862、37/62/523、37/62/523/793、37/64/66/79/154/523/681/793/862、37/79/154/793、37/196、37/528/696/793、37/528/790、37/528/790/793/862、37/790/793、39、39/58/489/725/830/842/930/944、39/70/109/830/842、39/70/489/612、39/70/725、39/267、39/267/489/522/612/830/842、39/267/489/830/944、39/489/500/612、39/500/612、40、44/157、47、49、50、55、60/500/612、62/79/154/862、62/79/196/681/862、62/79/523/528/790、62/79/790/793、62/79/862、62/92、62/92/790/793、62/106/523/528/696/793/862、62/154/696/793/862、62/793/862、68、70、70/267/725/944、70/267/930/944、70/489/930、70/725/830/860/930/944、77、79/154/681、79/154/793/862、79/862、89、97、106/154、107、109、109/522/612/725、109/522/830/944、109/612、118、149、157、158、178、179、196/528/681/790/793、207、208、217、267/489/500/725/830/930、267/522/725、352、385、424、448、463、489/830/944、500、500/612/830/860、500/860/930、500/930/944、522/725、523、523/790/793、528/681、528/793、528/862、672、673、725、734、740、753、774、778、793、830、844、862、875、880、892、902、922、925、930、932、934、938、および944から選択される位置または位置のセットに少なくとも1つの置換を含み、これらの位置は、配列番号14を参照して番号が付けられている。一部の実施形態では、酸性アルファ-グルコシダーゼは、22R、24E、24R、24W、27A、27G、27G/165I、27K、27R、27S、27V、27W、30D、30L、33G、33P、34D、34M、34T、37F/62E、37F/62E/79S/196T/696S/862Q、37F/62E/523N、37F/62E/523N/793K、37F/64Q/66G/79S/154R/523N/681Q/793K/862Q、37F/79S/154R/793K、37F/196T、37F/528S/696S/793K、37F/528S/790V、37F/528S/790V/793K/862Q、37F/790V/793K、39D、39H、39Q、39Q/58L/489D/725E/830K/842S/930P/944S、39Q/70A/109P/830K/842S、39Q/70A/489D/612D、39Q/70A/725E、39Q/267K、39Q/267K/489D/522V/612D/830K/842S、39Q/267K/489D/830K/944S、39Q/489D/500A/612D、39Q/500A/612D、40W、44I/157V、47G、47R、49A、49G、50G、50L、50V、55C、55L、60V/500A/612D、62E/79S/154R/862Q、62E/79S/196T/681Q/862Q、62E/79S/523N/528S/790V、62E/79S/790V/793K、62E/79S/862Q、62E/92R、62E/92R/790V/793K、62E/106R/523N/528S/696S/793K/862Q、62E/154R/696S/793K/862Q、62E/793K/862Q、68N、68S、68W、70A/267K/725E/944S、70A/267K/930P/944S、70A/489D/930P、70A/725E/830K/860F/930P/944S、70Q、77W、79S/154R/681Q、79S/154R/793K/862Q、79S/862Q、89R、97D、97G、106R/154R、107G、109D、109P/522V/612D/725E、109P/522V/830K/944S、109P/612D、118F、149R、157Q、158E、158F、178G、178V、179L、196T/528S/681Q/790V/793K、207R、207Y、208G、208I、217A、217D、267K/489D/500A/725E/830K/930P、267K/522V/725E、352K、352V、385G、424K、448L、463A、489D/830K/944S、500A、500A/612D/830K/860F、500A/860F/930P、500A/930P/944S、522V/725E、523N、523N/790V/793K、528S/681Q、528S/793K、528S/862Q、672E、672K、673N、673R、725F、725V、734K、740G、740Q、753S、774G、774S、778Q、793K、830V、844R、862Q、875D、880R、892L、902L、922E、925A、925W、930P、932A、934F、938A、938P、944R、および944Sから選択される1つまたは複数の位置に少なくとも1つの置換または置換のセットを含み、これらの位置は、配列番号14を参照して番号が付けられている。一部の実施形態では、酸性アルファ-グルコシダーゼは、I22R、L24E、L24R、L24W、F27A、F27G、F27G/M165I、F27K、F27R、F27S、F27V、F27W、V30D、V30L、E33G、E33P、L34D、L34M、L34T、S37F/A62E、S37F/A62E/N79S/A196T/A696S/R862Q、S37F/A62E/D523N、S37F/A62E/D523N/E793K、S37F/P64Q/R66G/N79S/K154R/D523N/E681Q/E793K/R862Q、S37F/N79S/K154R/E793K、S37F/A196T、S37F/N528S/A696S/E793K、S37F/N528S/I790V、S37F/N528S/I790V/E793K/R862Q、S37F/I790V/E793K、P39D、P39H、P39Q、P39Q/R58L/A489D/K725E/Q830K/G842S/C930P/C944S、P39Q/V70A/L109P/Q830K/G842S、P39Q/V70A/A489D/S612D、P39Q/V70A/K725E、P39Q/R267K、P39Q/R267K/A489D/E522V/S612D/Q830K/G842S、P39Q/R267K/A489D/Q830K/C944S、P39Q/A489D/D500A/S612D、P39Q/D500A/S612D、V40W、T44I/L157V、A47G、A47R、Q49A、Q49G、Q50G、Q50L、Q50V、P55C、P55L、A60V/D500A/S612D、A62E/N79S/K154R/R862Q、A62E/N79S/A196T/E681Q/R862Q、A62E/N79S/D523N/N528S/I790V、A62E/N79S/I790V/E793K、A62E/N79S/R862Q、A62E/Q92R、A62E/Q92R/I790V/E793K、A62E/K106R/D523N/N528S/A696S/E793K/R862Q、A62E/K154R/A696S/E793K/R862Q、A62E/E793K/R862Q、R68N、R68S、R68W、V70A/R267K/K725E/C944S、V70A/R267K/C930P/C944S、V70A/A489D/C930P、V70A/K725E/Q830K/L860F/C930P/C944S、V70Q、P77W、N79S/K154R/E681Q、N79S/K154R/E793K/R862Q、N79S/R862Q、A89R、A97D、A97G、K106R/K154R、Q107G、L109D、L109P/E522V/S612D/K725E、L109P/E522V/Q830K/C944S、L109P/S612D、W118F、P149R、L157Q、T158E、T158F、P178G、P178V、A179L、A196T/N528S/E681Q/I790V/E793K、E207R、E207Y、E208G、E208I、Q217A、Q217D、R267K/A489D/D500A/K725E/Q830K/C930P、R267K/E522V/K725E、Y352K、Y352V、R385G、H424K、R448L、E463A、A489D/Q830K/C944S、D500A、D500A/S612D/Q830K/L860F、D500A/L860F/C930P、D500A/C930P/C944S、E522V/K725E、D523N、D523N/I790V/E793K、N528S/E681Q、N528S/E793K、N528S/R862Q、L672E、L672K、P673N、P673R、K725F、K725V、H734K、E740G、E740Q、A753S、A774G、A774S、L778Q、E793K、Q830V、E844R、R862Q、N875D、E880R、Q892L、A902L、P922E、K925A、K925W、C930P、S932A、L934F、Q938A、Q938P、C944R、およびC944Sから選択される1つまたは複数の位置に少なくとも1つの置換または置換のセットを含み、これらの位置は、配列番号14を参照して番号が付けられている。
一部の実施形態では、組換え酸性アルファグルコシダーゼは、表3-1、3-2、4-1、6-1、10-1、10-2、12-1、13-1、13-2、14-1、14-2、15-1、16-1、17-1、17-2、17-3、17-4、17-5、17-6、17-7、17-8、および/または17-9で提供されるように少なくとも1つの位置に少なくとも1つの突然変異を含む。一部の追加の実施形態では、組換え酸性アルファグルコシダーゼは、ヒト酸性アルファグルコシダーゼに由来する。さらに一部の追加の実施形態では、配列番号2、6、8、12、14、16、18、20、946、1956、2496、2880、および/または3104のポリペプチド配列を含む組換え酸性アルファグルコシダーゼ。
一部の実施形態では、操作されたGAAポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、配列番号1、5、7、11、13、15、17、19、945、1955、2495、2879および/または3103をコードするポリヌクレオチド配列から選択されるポリヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態では、操作されたGAAポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、配列番号1、5、7、11、13、15、17、19、945、1955、2495、2879および/または3103に対して少なくとも約80%、約85%、約90%、約91%、約92%、約93%、約94%、約95%、約96%、約97%、約98%、または約99%のヌクレオチド残基同一性を有する。一部の実施形態では、操作されたGAAポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、配列番号1、5、7、11、13、15、17、19、945、1955、2495、2879および/または3103に対して少なくとも80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、または99%のヌクレオチド残基同一性を有する。一部の実施形態では、操作されたGAAポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、配列番号1、5、7、11、13、15、17、19、945、1955、2495、2879および/または3103を含む。一部の実施形態では、操作されたGAAポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、配列番号1、5、7、11、13、15、17、19、945、1955、2495、2879および/または3103からなる。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、配列番号1、5、7、11、13、15、17、19、945、1955、2495、2879および/もしくは3103から選択される参照ポリヌクレオチド配列、またはその相補配列、または本明細書で提供されるバリアントGAAポリペプチドのいずれかをコードするポリヌクレオチド配列と、高度にストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができる。
一部の実施形態では、本明細書で提供される操作されたGAAポリペプチドのいずれかをコードする単離されたポリヌクレオチドは、ポリペプチドの発現をもたらすように様々な方法で操作される。一部の実施形態では、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、1つまたは複数の制御配列が、ポリヌクレオチドおよび/またはポリペプチドの発現を調節するために存在する、発現ベクターとして提供される。ベクターへのその挿入の前の単離されたポリヌクレオチドの操作は、発現ベクターに依存して、望ましいこともあり、または必要であることもある。組換えDNA法を利用してポリヌクレオチドおよび核酸配列を修飾するための技法は、当技術分野において周知である。
一部の実施形態では、制御配列は、数ある配列の中でも特に、プロモーター、コザック配列、リーダー配列、ポリアデニル化配列、プロペプチド配列、シグナルペプチド配列、遺伝子治療保持のためのDNAに基づく調節エレメント、および転写ターミネーターを含む。当技術分野において公知であるように、好適なプロモーターは、使用される宿主細胞に基づいて選択され得る。細菌宿主細胞について、本願の核酸構築物の転写を指令するために好適なプロモーターとしては、E.coli lacオペロン、Streptomyces coelicolorアガラーゼ遺伝子(dagA)、Bacillus subtilisレバンスクラーゼ遺伝子(sacB)、Bacillus licheniformisアルファ-アミラーゼ遺伝子(amyL)、Bacillus stearothermophilusマルトース生成アミラーゼ遺伝子(amyM)、Bacillus amyloliquefaciensアルファ-アミラーゼ遺伝子(amyQ)、Bacillus licheniformisペニシリナーゼ遺伝子(penP)、Bacillus subtilis xylAおよびxylB遺伝子、ならびに原核生物ベータ-ラクタマーゼ遺伝子(例えば、Villa-Kamaroff et al.、Proc. Natl Acad. Sci. USA 75: 3727-3731 [1978]を参照されたい)、ならびにtacプロモーター(例えば、DeBoer et al.、Proc. Natl Acad. Sci. USA 80: 21-25 [1983]を参照されたい)が挙げられるが、これらに限定されない。糸状真菌宿主細胞についての例示的プロモーターとしては、Aspergillus oryzae TAKAアミラーゼ、Rhizomucor mieheiアスパラギン酸プロテイナーゼ、Aspergillus niger中性アルファ-アミラーゼ、Aspergillus niger酸安定性アルファ-アミラーゼ、Aspergillus nigerまたはAspergillus awamoriグルコアミラーゼ(glaA)、Rhizomucor mieheiリパーゼ、Aspergillus oryzaeアルカリプロテアーゼ、Aspergillus oryzaeトリオースリン酸イソメラーゼ、Aspergillus nidulansアセトアミダーゼ、およびFusarium oxysporumトリプシン様プロテアーゼの遺伝子から得られるプロモーター(例えば、WO96/00787を参照されたい)、ならびにNA2-tpiプロモーター(Aspergillus niger中性アルファ-アミラーゼの遺伝子からのプロモーターとAspergillus oryzaeトリオースリン酸イソメラーゼの遺伝子からのプロモーターのハイブリッド)、ならびにこれらの突然変異型、切断型およびハイブリッドプロモーターが挙げられる。例示的な酵母細胞プロモーターは、Saccharomyces cerevisiaeエノラーゼ(ENO-1)、Saccharomyces cerevisiaeガラクトキナーゼ(GAL1)、Saccharomyces cerevisiaeアルコールデヒドロゲナーゼ/グリセルアルデヒド-3-リン酸デヒドロゲナーゼ(ADH2/GAP)、およびSaccharomyces cerevisiae 3-ホスホグリセリン酸キナーゼの遺伝子に由来し得る。酵母宿主細胞についての他の有用なプロモーターは、当技術分野において公知である(例えば、Romanos et al.、Yeast 8:423-488 [1992]を参照されたい)。哺乳動物細胞における使用のための例示的なプロモーターとしては、サイトメガロウイルス(CMV)からのもの、CMVエンハンサーと融合したニワトリβ-アクチンプロモーター、サル空胞化ウイルス40(SV40)、Homo sapiensホスホグリセリン酸キナーゼ、ベータアクチン、伸長因子-1aもしくはグリセロアルデヒド-3-リン酸デヒドロゲナーゼからのもの、またはGallus gallus β-アクチンからのものが挙げられるが、これらに限定されない。
一部の実施形態では、制御配列は、転写を終結させるための宿主細胞により認識される配列である、好適な転写ターミネーター配列である。ターミネーター配列は、ポリペプチドをコードする核酸配列の3’末端に作動可能に連結されている。選択される宿主細胞において機能する任意のターミネーターが、本発明において使用される。例えば、糸状真菌宿主細胞についての例示的な転写ターミネーターは、Aspergillus oryzae TAKAアミラーゼ、Aspergillus nigerグルコアミラーゼ、Aspergillus nidulansアントラニル酸シンターゼ、Aspergillus nigerアルファ-グルコシダーゼ、およびFusarium oxysporumトリプシン様プロテアーゼの遺伝子から得ることができる。酵母宿主細胞についての例示的なターミネーターは、Saccharomyces cerevisiaeエノラーゼ、Saccharomyces cerevisiaeシトクロムC(CYC1)、およびSaccharomyces cerevisiaeグリセルアルデヒド-3-リン酸デヒドロゲナーゼの遺伝子から得ることができる。酵母宿主細胞についての他の有用なターミネーターは、当技術分野において公知である(例えば、Romanos et al.、上掲を参照されたい)。哺乳動物細胞についての例示的なターミネーターとしては、サイトメガロウイルス(CMV)からのもの、サル空胞化ウイルス40(SV40)、Homo sapiens成長ホルモンhGHからのもの、ウシ成長ホルモンBGHからのもの、およびヒトまたはウサギベータグロブリンからのものが挙げられるが、これらに限定されない。
一部の実施形態では、制御配列は、好適なリーダー配列、5’キャップ修飾、5’UTRなどである。一部の実施形態では、これらの調節配列エレメントは、mRNA輸送および翻訳に関与する分子への結合を媒介し、5’-エキソヌクレアーゼ分解を阻害し、デキャッピングに対する抵抗性を付与する。リーダー配列は、ポリペプチドをコードする核酸配列の5’末端に作動可能に連結されている。選択される宿主細胞において機能する任意のリーダー配列を使用することができる。糸状真菌宿主細胞についての例示的リーダーは、Aspergillus oryzae TAKAアミラーゼ、およびAspergillus nidulansトリオースリン酸イソメラーゼの遺伝子から得られる。酵母宿主細胞についての好適なリーダーとしては、Saccharomyces cerevisiaeエノラーゼ(ENO-1)、Saccharomyces cerevisiae 3-ホスホグリセリン酸キナーゼ、Saccharomyces cerevisiaeアルファ因子、およびSaccharomyces cerevisiaeアルコールデヒドロゲナーゼ/グリセロアルデヒド-3-リン酸デヒドロゲナーゼ(ADH2/GAP)の遺伝子から得られるものが挙げられるが、これらに限定されない。哺乳動物宿主細胞についての好適なリーダーとしては、オルソポックスウイルスmRNAに存在する5’-UTRエレメントが挙げられるが、これに限定されない。
一部の実施形態では、制御配列は、タンパク質コード核酸配列の3’末端に作動可能に連結されている配列であって、mRNA輸送および翻訳ならびにmRNA半減期に関与するタンパク質への結合を媒介する配列である、3’非翻訳核酸領域およびポリアデニル化テール核酸配列を含む。選択される宿主細胞において機能する任意のポリアデニル化配列および3’UTRを本発明において使用することができる。糸状真菌宿主細胞についての例示的なポリアデニル化配列としては、Aspergillus oryzae TAKAアミラーゼ、Aspergillus nigerグルコアミラーゼ、Aspergillus nidulansアントラニル酸シンターゼ、Fusarium oxysporumトリプシン様プロテアーゼ、およびAspergillus nigerアルファ-グルコシダーゼの遺伝子からのものが挙げられるが、これらに限定されない。酵母宿主細胞についての有用なポリアデニル化配列も当技術分野において公知である(例えば、Guo and Sherman、Mol. Cell. Biol.、15:5983-5990 [1995]を参照されたい)。哺乳動物宿主細胞についての有用なポリアデニル化および3’UTR配列としては、mRNAの安定性を向上させ翻訳を増加させるいくつかの配列エレメントを保有する、α-およびβ-グロビンmRNAの3’-UTRが挙げられるが、これらに限定されない。
一部の実施形態では、制御配列は、ポリペプチドのアミノ末端に連結されたアミノ酸配列をコードし、コードされたポリペプチドを細胞の分泌経路に方向付ける、シグナルペプチドコード領域である。核酸配列のコード配列の5’末端は、分泌されるポリペプチドをコードするコード領域のセグメントと翻訳リーディングフレーム内で自然に連結されているシグナルペプチドコード領域をもともと含有することがある。あるいは、コード配列の5’末端は、コード配列にとって異質であるシグナルペプチドコード領域を含有することもある。発現されたポリペプチドを選択される宿主細胞の分泌経路に方向付ける任意のシグナルペプチドコード領域が、本明細書において提供される操作されたGAAポリペプチドの発現に使用される。細菌宿主細胞についての有効なシグナルペプチドコード領域としては、Bacillus NClB 11837マルトース生成アミラーゼ、Bacillus stearothermophilusアルファ-アミラーゼ、Bacillus licheniformisサブチリシン、Bacillus licheniformisベータ-ラクタマーゼ、Bacillus stearothermophilus中性プロテアーゼ(nprT、nprS、nprM)、およびBacillus subtilis prsAの遺伝子から得られるシグナルペプチドコード領域が挙げられるが、これらに限定されない。さらなるシグナルペプチドは、当技術分野において公知である(例えば、Simonen and Palva、Microbiol. Rev.、57:109-137 [1993]を参照されたい)。糸状真菌宿主細胞についての有効なシグナルペプチドコード領域としては、Aspergillus oryzae TAKAアミラーゼ、Aspergillus niger中性アミラーゼ、Aspergillus nigerグルコアミラーゼ、Rhizomucor mieheiアスパラギン酸プロテイナーゼ、Humicola insolensセルラーゼ、およびHumicola lanuginosaリパーゼの遺伝子から得られるシグナルペプチドコード領域が挙げられるが、これらに限定されない。酵母宿主細胞についての有用なシグナルペプチドとしては、Saccharomyces cerevisiaeアルファ因子およびSaccharomyces cerevisiaeインベルターゼの遺伝子からのものが挙げられるが、これらに限定されない。一部の実施形態では、S.cerevisiae a-接合因子プレプロペプチド(Mfalpha)が使用される(例えば、配列番号3383および3384)。哺乳動物宿主細胞についての有用なシグナルペプチドとしては、免疫グロブリンガンマ(IgG)の遺伝子からのものが挙げられるが、これらに限定されない。哺乳動物宿主に有用な追加のシグナルペプチドとしては、マウスシグナルペプチドが挙げられる。一部の実施形態では、合成マウスIGシグナルペプチドが使用される(例えば、配列番号3381および3382)。
一部の実施形態では、制御配列は、ポリペプチドのアミノ末端に位置するアミノ酸配列をコードするプロペプチドコード領域である。結果として得られるポリペプチドは、一部の場合には、「プロ酵素」、「プロポリペプチド」または「チモーゲン」と呼ばれる。プロポリペプチドからのプロペプチドの触媒的または自己触媒的切断によって、プロポリペプチドは成熟活性ポリペプチドに変換され得る。プロペプチドコード領域は、Bacillus subtilisアルカリプロテアーゼ(aprE)、Bacillus subtilis中性プロテアーゼ(nprT)、Saccharomyces cerevisiaeアルファ因子、Rhizomucor mieheiアスパラギン酸プロテイナーゼ、およびMyceliophthora thermophilaラクターゼの遺伝子を含むが、これらに限定されない(例えば、WO95/33836を参照されたい)。シグナルペプチド領域とプロペプチド領域の両方がポリペプチドのアミノ末端に存在する場合、プロペプチド領域は、ポリペプチドのアミノ末端の隣に位置し、シグナルペプチド領域は、プロペプチド領域のアミノ末端の隣に位置する。
一部の実施形態では、調節配列も利用される。これらの配列は、宿主細胞の増殖に関連してポリペプチドの発現の調節を助長する。調節系の例は、調節化合物の存在を含む、化学的または物理的刺激に応答して遺伝子発現をオンまたはオフにさせるものである。原核生物宿主細胞において、好適な調節配列としては、lac、tacおよびtrpオペレータ系が挙げられるが、これらに限定されない。酵母宿主細胞において、好適な調節系としては、ADH2系またはGAL1系が挙げられるが、これらに限定されない。糸状真菌において、好適な調節配列としては、TAKAアルファ-アミラーゼプロモーター、Aspergillus nigerグルコアミラーゼプロモーター、およびAspergillus oryzaeグルコアミラーゼプロモーターが挙げられるが、これらに限定されない。
別の態様では、本発明は、操作されたGAAポリペプチドをコードするポリヌクレオチドと、導入されることになる宿主のタイプに依存してプロモーターおよびターミネーター、複製起点などのような1つまたは複数の発現調節領域とを含む組換え発現ベクターも提供する。一部の実施形態では、上記の様々な核酸および制御配列は、1つまたは複数の適便な制限部位を、そのような部位でのバリアントGAAポリペプチドをコードする核酸配列の挿入または置換を可能にするために含む組換え発現ベクターを生じさせるために互いに結合される。あるいは、本発明のポリヌクレオチド配列は、ポリヌクレオチド配列、またはポリヌクレオチド配列を含む核酸構築物を、発現のための適切なベクターに挿入することによって発現される。発現ベクターを作出する場合、コード配列は、ベクター内に、コード配列が発現のための適切な制御配列と作動可能に連結されるように位置する。
組換え発現ベクターは、適便に組換えDNA手順に付すことができ、その結果、バリアントGAAポリヌクレオチド配列の発現を生じさせることができる、任意の好適なベクター(例えば、アデノウイルス(AV)、アデノ随伴ウイルス(AAV)、レンチウイルス(LV)、および非ウイルスベクター、例えばリポソームを含むがこれらに限定されない、プラスミドまたはウイルス)であり得る。ベクターの選択は、ベクターとベクターが導入されることになる宿主細胞との適合性に概して依存することになる。ベクターは、線状プラスミドであってもよく、または閉環状プラスミドであってもよい。実際には、本発明がいずれかの特定のベクターに限定されることは、意図されていない。
一部の実施形態では、発現ベクターは、自己複製ベクター(すなわち、染色体外実体として存在し、その複製が染色体複製に依存しないベクター、例えば、プラスミド、染色体外エレメント、ミニ染色体、または人工染色体)である。ベクターは、自己複製を確実にするための何らかの手段を含有し得る。一部の代替実施形態では、ベクターは、宿主細胞に導入されたとき、ゲノムに組み込まれ、自体が組み込まれた染色体とともに複製されるものであり得る。さらに、単一のベクターもしくはプラスミドを使用してもよく、または合わせると宿主細胞のゲノムにもしくはトランスポゾンに導入されることになる全DNAを含有する2つもしくはそれより多くのベクターもしくはプラスミドを使用してもよい。
一部の実施形態では、発現ベクターは、pDHである。配列番号1を含有するこのベクターのプラスミドマップは、図9で提供される。このプラスミドの配列は、配列番号3379として提供される。ベータ-ラクタマーゼスタッファー配列を含有するこのベクターのプラスミドマップは、図10で提供される。このプラスミドの配列は、配列番号3380として提供される。pDHベクターは、本明細書で提供される酸性アルファ-グルコシダーゼをコードするポリヌクレオチド配列を含むがこれらに限定されない、様々な遺伝子の発現に使用されることになることが企図される。実際には、スタッファー配列(または配列番号3379に存在する配列番号1)は、目的の任意の好適な遺伝子で置換されることになることが企図される。
一部の実施形態では、発現ベクターは、好ましくは、形質転換細胞の容易な選択を可能にする1つまたは複数の選択可能なマーカーを含有する。「選択可能なマーカー」は、その産物が、殺生物剤またはウイルス抵抗性を、重金属に対する抵抗性を、栄養要求株に原栄養性を、およびこれらに類するものをもたらす、遺伝子である。細菌の選択可能なマーカーの例としては、Bacillus subtilisもしくはBacillus licheniformisからのdal遺伝子、またはアンピシリン、カナマイシン、クロラムフェニコールもしくはテトラサイクリン抵抗性などの抗生物質抵抗性を付与するマーカーが挙げられるが、これらに限定されない。酵母宿主細胞についての好適なマーカーとしては、ADE2、HIS3、LEU2、LYS2、MET3、TRP1およびURA3が挙げられるが、これらに限定されない。糸状真菌宿主細胞における使用のための選択可能なマーカーとしては、amdS(アセトアミダーゼ)、argB(オルニチンカルバモイルトランスフェラーゼ)、bar(ホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼ)、hph(ハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ)、niaD(硝酸レダクターゼ)、pyrG(オロチジン-5’-リン酸デカルボキシラーゼ)、sC(硫酸アデニルトランスフェラーゼ)、およびtrpC(アントラニル酸シンターゼ)、ならびにこれらの等価物が挙げられるが、それらに限定されない。別の態様では、本発明は、本願の少なくとも1つの操作されたGAAポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む宿主細胞であって、ポリヌクレオチドが、宿主細胞における操作されたGAA酵素の発現のために1つまたは複数の制御配列に作動可能に連結されている、宿主細胞を提供する。本発明の発現ベクターによりコードされるポリペプチドを発現させる際に使用するための宿主細胞は、当技術分野において周知であり、細菌細胞、例えば、E.coli、Vibrio fluvialis、StreptomycesおよびSalmonella typhimurium細胞、真菌細胞、例えば、酵母細胞(例えば、Saccharomyces cerevisiaeおよびPichia pastoris[ATCC受託番号201178])、昆虫細胞、例えば、Drosophila S2およびSpodoptera Sf9細胞、動物細胞(例えば、CHO、CHO-K1、COS、およびBHK)、ならびにヒト細胞(例えば、HEK293T、ヒト線維芽細胞、THP-1、ジャーカットおよびBowes黒色腫細胞株)、ならびに植物細胞を含むが、これらに限定されない。
したがって、別の態様では、本発明は、操作されたGAAポリペプチドを産生するための方法であって、操作されたGAAポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを発現することができる宿主細胞をポリペプチドの発現に好適な条件下で培養するステップを含む方法を提供する。一部の実施形態では、方法は、本明細書に記載されるようにGAAポリペプチドを単離および/または精製するステップをさらに含む。
上記宿主細胞についての適切な培養培地および増殖条件は、当技術分野において周知である。GAAポリペプチド発現のためのポリヌクレオチドを、当技術分野において公知の様々な方法により細胞に導入することができる。技法としては、数ある中でも特に、電気穿孔、バイオリスティック・パーティクル・ボンバードメント、リポソーム媒介トランスフェクション、塩化カルシウムトランスフェクション、およびプロトプラスト融合が挙げられる。
本明細書で開示される特性を有する操作されたGAAは、天然に存在するまたは操作されたGAAポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを、当技術分野において公知のおよび本明細書に記載の突然変異誘発および/または指向性進化法に付すことによって得ることができる。例示的な指向性進化技法は、突然変異誘発および/またはDNAシャフリングである(例えば、Stemmer、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:10747-10751 [1994];WO95/22625、WO97/0078、WO97/35966、WO98/27230、WO00/42651、WO01/75767および米国特許第6,537,746号を参照されたい)。使用することができる他の指向性進化手順としては、数ある中でも特に、スタガード伸長プロセス(StEP)、in vitro組換え(例えば、Zhao et al.、Nat. Biotechnol.、16:258-261 [1998]を参照されたい)、突然変異誘発PCR(例えば、Caldwell et al.、PCR Methods Appl.、3:S136-S140 [1994]を参照されたい)、およびカセット突然変異誘発(例えば、Black et al.、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:3525-3529 [1996]を参照されたい)が挙げられる。
例えば、突然変異誘発および指向性進化方法をポリヌクレオチドに容易に適用してバリアントライブラリーを生成することができ、それらを発現、スクリーニングおよびアッセイすることができる。突然変異誘発および指向性進化方法は、当技術分野において周知である(例えば、米国特許第5,605,793号、同第5,811,238号、同第5,830,721号、同第5,834,252号、同第5,837,458号、同第5,928,905号、同第6,096,548号、同第6,117,679号、同第6,132,970号、同第6,165,793号、同第6,180,406号、同第6,251,674号、同第6,265,201号、同第6,277,638号、同第6,287,861号、同第6,287,862号、同第6,291,242号、同第6,297,053号、同第6,303,344号、同第6,309,883号、同第6,319,713号、同第6,319,714号、同第6,323,030号、同第6,326,204号、同第6,335,160号、同第6,335,198号、同第6,344,356号、同第6,352,859号、同第6,355,484号、同第6,358,740号、同第6,358,742号、同第6,365,377号、同第6,365,408号、同第6,368,861号、同第6,372,497号、同第6,337,186号、同第6,376,246号、同第6,379,964号、同第6,387,702号、同第6,391,552号、同第6,391,640号、同第6,395,547号、同第6,406,855号、同第6,406,910号、同第6,413,745号、同第6,413,774号、同第6,420,175号、同第6,423,542号、同第6,426,224号、同第6,436,675号、同第6,444,468号、同第6,455,253号、同第6,479,652号、同第6,482,647号、同第6,483,011号、同第6,484,105号、同第6,489,146号、同第6,500,617号、同第6,500,639号、同第6,506,602号、同第6,506,603号、同第6,518,065号、同第6,519,065号、同第6,521,453号、同第6,528,311号、同第6,537,746号、同第6,573,098号、同第6,576,467号、同第6,579,678号、同第6,586,182号、同第6,602,986号、同第6,605,430号、同第6,613,514号、同第6,653,072号、同第6,686,515号、同第6,703,240号、同第6,716,631号、同第6,825,001号、同第6,902,922号、同第6,917,882号、同第6,946,296号、同第6,961,664号、同第6,995,017号、同第7,024,312号、同第7,058,515号、同第7,105,297号、同第7,148,054号、同第7,220,566号、同第7,288,375号、同第7,384,387号、同第7,421,347号、同第7,430,477号、同第7,462,469号、同第7,534,564号、同第7,620,500号、同第7,620,502号、同第7,629,170号、同第7,702,464号、同第7,747,391号、同第7,747,393号、同第7,751,986号、同第7,776,598号、同第7,783,428号、同第7,795,030号、同第7,853,410号、同第7,868,138号、同第7,783,428号、同第7,873,477号、同第7,873,499号、同第7,904,249号、同第7,957,912号、同第7,981,614号、同第8,014,961号、同第8,029,988号、同第8,048,674号、同第8,058,001号、同第8,076,138号、同第8,108,150号、同第8,170,806号、同第8,224,580号、同第8,377,681号、同第8,383,346号、同第8,457,903号、同第8,504,498号、同第8,589,085号、同第8,762,066号、同第8,768,871号、同第9,593,326号、同第9,684,771号、同第9,665,694号、ならびにWO95/22625、WO97/0078、WO97/35966、WO98/27230、WO00/42651、WO01/75767、WO2009/152336、WO2013/138339、WO2015/048572、およびWO2015/048573、ならびにこれらの列挙した特許および出願の全ての関連米国および非米国対応特許;Ling et al.、Anal. Biochem.、254:157-78 [1997]; Dale et al.、Meth. Mol. Biol.、57:369-74 [1996];Smith、Ann.Rev. Genet.、19:423-462 [1985];Botstein et al.、Science、229:1193-1201 [1985];Carter、Biochem. J.、237:1-7 [1986];Kramer et al.、Cell、38:879-887 [1984];Wells et al.、Gene、34:315-323 [1985];Minshull et al.、Curr. Op. Chem. Biol.、3:284-290 [1999];Christians et al.、Nat. Biotechnol.、17:259-264 [1999];Crameri et al.、Nature、391:288-291 [1998];Crameri、et al.、Nat. Biotechnol.、15:436-438 [1997];Zhang et al.、Proc. Nat. Acad. Sci. U.S.A.、94:4504-4509 [1997];Crameri et al.、Nat. Biotechnol.、14:315-319 [1996];Stemmer、Nature、370:389-391 [1994];およびStemmer、Proc. Nat. Acad. Sci. USA、91:10747-10751 [1994]を参照されたく、これらの全ては、参照により本明細書に組み込まれる)。
一部の実施形態では、突然変異誘発処理後に得られる酵素クローンは、酵素を定義された温度(または他のアッセイ条件)に付すこと、および熱処理または他のアッセイ条件後に残存する酵素活性の量を測定することによって、スクリーニングされる。次いで、GAAポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有するクローンは、遺伝子から単離され、ヌクレオチド配列変化(もしあれば)を同定するためにシークエンシングされ、宿主細胞において酵素を発現させるために使用される。発現ライブラリーからの酵素活性の測定は、当技術分野において公知の任意の好適な方法(例えば、HPLC分析などの標準的な生化学技法)を使用して行うことができる。
配列の分かっている操作されたポリペプチドについては、酵素をコードするポリヌクレオチドを公知の合成方法に従って標準的な固相法により調製することができる。一部の実施形態では、最大約100塩基の断片を個々に合成し、次いで(例えば、酵素的もしくは化学的ライゲーション方法、またはポリメラーゼにより媒介される方法によって)結合させて、任意の所望の連続配列を形成することができる。例えば、本明細書で開示されるポリヌクレオチドおよびオリゴヌクレオチドは、通常は自動合成法で実施されるが、古典的なホスホロアミダイト法を使用する化学合成(例えば、Beaucage et al.、Tetra. Lett.、22:1859-69 [1981];およびMatthes et al.、EMBO J.、3:801-05 [1984]を参照されたい)によって調製することができる。ホスホロアミダイト法に従って、オリゴヌクレオチドは、合成され(例えば、自動DNA合成装置で)、精製され、アニーリングされ、ライゲ-ションされ、適切なベクターにクローニングされる。
したがって、一部の実施形態では、操作されたGAAポリペプチドを調製するための方法は、(a)表3-1、3-2、4-1、6-1、10-1、10-2、12-1、13-1、13-2、14-1、14-2、15-1、16-1、17-1、17-2、17-3、17-4、17-5、17-6、17-7、17-8、および/または17-9、ならびに配列番号2、6、8、12、14、16、18、20、946、1956、2496、2880、および/または3104で提供される任意のバリアントのアミノ酸配列から選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを合成するステップ、および(b)ポリヌクレオチドによりコードされるGAAポリペプチドを発現させるステップを含むことができる。方法の一部の実施形態では、ポリヌクレオチドによりコードされるアミノ酸配列は、必要に応じて、1つまたはいくつか(例えば、最大3、4、5、または最大10)のアミノ酸残基欠失、挿入および/または置換を有することができる。一部の実施形態では、アミノ酸配列は、必要に応じて、1~2、1~3、1~4、1~5、1~6、1~7、1~8、1~9、1~10、1~15、1~20、1~21、1~22、1~23、1~24、1~25、1~30、1~35、1~40、1~45、または1~50アミノ酸残基欠失、挿入および/または置換を有する。一部の実施形態では、アミノ酸配列は、必要に応じて、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、30、35、40、45または50アミノ酸残基欠失、挿入および/または置換を有する。一部の実施形態では、アミノ酸配列は、必要に応じて、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、18、20、21、22、23、24または25アミノ酸残基欠失、挿入および/または置換を有する。一部の実施形態では、置換は、保存的置換であることもあり、または非保存的置換であることもある。
発現された操作されたGAAポリペプチドを、本明細書に記載されるアッセイおよび条件を含むがこれらに限定されない、当技術分野において公知の任意の好適なアッセイを使用して、任意の所望の改善された特性(例えば、活性、選択性、安定性、耐酸性、プロテアーゼ感受性など)について測定することができる。
一部の実施形態では、宿主細胞に発現された操作されたGAAポリペプチドのいずれか、一部または全ては、数ある中でも特に、リゾチーム処理、超音波処理、濾過、塩析、超遠心分離およびクロマトグラフィーを含む、タンパク質精製のための周知技術のいずれか1つまたは複数を使用して、細胞および/または培養培地から回収される。
GAAポリペプチドの単離のためのクロマトグラフィー技法としては、数ある中でも特に、逆相クロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、ゲル電気泳動、および親和性クロマトグラフィーが挙げられる。特定の酵素を精製するための条件は、一部は、正味電荷、疎水性、親水性、分子量、分子形状などのような因子に依存し、当業者には明らかであろう。一部の実施形態では、親和性技法を使用して、改善されたバリアントGAA酵素を単離することができる。親和性クロマトグラフィー精製を利用する一部の実施形態では、バリアントGAAポリペプチドに特異的に結合する任意の抗体が使用される。抗体の産生のために、ウサギ、マウス、ラットなどを含むがこれらに限定されない様々な宿主動物が、GAAポリペプチド(例えば、GAAバリアント)またはその断片を注射することにより免疫される。一部の実施形態では、GAAポリペプチドまたは断片は、側鎖官能基によって、または側鎖官能基に結合しているリンカーによって、BSAなどの好適な担体に結合される。
一部の実施形態では、操作されたGAAポリペプチドは、本明細書に記載の操作されたGAAポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含む宿主細胞(例えば、S.cerevisiae、Daucus carota、Nicotiana tabacum、H.sapiens[例えば、HEK293T]、またはCricetulus属[例えば、CHO])を、操作されたGAAポリペプチドの産生を助長する条件下で培養するステップ、および操作されたGAAポリペプチドを細胞および/または培養培地から回収するステップを含む方法により、宿主細胞において産生される。
一部の実施形態では、操作されたGAAポリペプチドは、本明細書に記載の操作されたGAAポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含む宿主細胞を、操作されたGAAポリペプチドの産生を助長する条件下で培養するステップ、および操作されたGAAポリペプチドを細胞および/または培養培地から回収するステップを含む方法により、宿主細胞において産生される。
一部の好ましい実施形態では、本発明は、操作されたGAAポリペプチドを産生する方法であって、アラインメントされたときに、参照配列である配列番号2、6、8、12、14、16、18、20、946、1956、2496、2880および/または3104に対して少なくとも85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%、または100%の配列同一性を有し、かつ配列番号2、6、8、12、14、16、18、20、946、1956、2496、2880および/もしくは3104、ならびに/またはこれらの組合せと比較して1つまたは複数のアミノ酸残基相違を有する、操作されたGAAポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含む組換え細菌細胞を、操作されたGAAポリペプチドの産生を可能にするために好適な培養条件下で培養するステップ、および必要に応じて、操作されたGAAポリペプチドを培養物および/または培養細菌細胞から回収するステップを含む方法を包含する。
一部の実施形態では、操作されたGAAポリペプチドは、組換え宿主細胞または細胞培養物から回収されると、当技術分野において公知の任意の好適な方法によってさらに精製される。一部の追加の実施形態では、精製されたGAAポリペプチドは、操作されたGAAポリペプチドを異なる応用および使用(例えば、医薬組成物)のために適宜含む組成物および製剤を提供するために、他の成分および化合物と併せられる。
組成物:
組成物:
本発明は、医薬組成物および他の組成物、例えば健康/栄養補助食品における使用はもちろん、他の目的にも好適な、操作されたGAAポリペプチドを提供する。
医薬組成物:
医薬組成物:
投与方法に依存して、本発明による操作されたGAAの治療有効量を含む組成物は、固体、半固体、ゲルまたは液体の形態である。一部の実施形態では、組成物は、他の薬学的に許容される構成成分、例えば、希釈剤、緩衝剤、賦形剤、塩、乳化剤、保存剤、安定剤、充填剤、および他の成分を含む。製剤および投与についての技法に関する詳細は、当技術分野において周知であり、文献に記載されている。
一部の実施形態では、操作されたGAAポリペプチドは、経口医薬組成物での使用のために製剤化される。操作されたGAAポリペプチドを送達する際の使用に好適な任意の形式が本発明で使用され、そのような形式としては、丸剤、錠剤、ゲルタブ、カプセル、トローチ剤、糖衣丸、粉末、軟質ゲル、ゾル-ゲル、ゲル、エマルジョン、移植片、パッチ、スプレー剤、軟膏、リニメント剤、クリーム、ペースト、ゼリー、塗布薬、エアロゾル、チューインガム、粘滑薬、スティック、懸濁液(油性懸濁液、水中油型エマルジョンなどを含むがこれらに限定されない)、スラリー、シロップ、制御放出製剤、坐薬などが挙げられるが、これらに限定されない。一部の実施形態では、操作されたGAAポリペプチドは、注射に好適な形式で(すなわち、注射製剤で)提供される。一部の実施形態では、操作されたGAAポリペプチドは、シリカベースの(例えば、オキシシラン)ゾル-ゲルをはじめとするゾル-ゲルなどの、生体適合性マトリックスに入れて提供される。一部の実施形態では、操作されたGAAポリペプチドは、カプセル化される。一部の代替実施形態では、操作されたGAAポリペプチドは、ナノ構造(例えば、ナノチューブ、ナノ細管、ナノカプセル、またはマイクロカプセル、マイクロスフェア、リポソームなど)にカプセル化される。実際には、本発明がいずれかの特定の送達製剤および/または送達手段に限定されることは、意図されていない。操作されたGAAポリペプチドは、非経口、経口、局所的、経皮、鼻腔内、眼内、髄腔内、移植片経由などを含むがこれらに限定されない、当技術分野において公知の任意の好適な手段により投与されることが、意図されている。
一部の実施形態では、操作されたGAAポリペプチドは、グリコシル化、PEG化(すなわち、ポリエチレングリコール[PEG]または活性化PEGなどで修飾される)、または他の化合物によって化学的に修飾される(例えば、Ikeda、Amino Acids 29:283-287 [2005];米国特許第7,531,341号、同第7,534,595号、同第7,560,263号および同第7,53,653号、米国特許出願公開第2013/0039898号、同第2012/0177722号などを参照されたい)。実際には、本発明がいずれかの特定の送達方法および/または機構に限定されることは、意図されていない。
一部の追加の実施形態では、操作されたGAAポリペプチドは、アデノウイルス(AV)、アデノ随伴ウイルス(AAV)、レンチウイルス(LV)を含むがこれらに限定されないウイルス送達ベクター、または非ウイルスベクター(例えば、リポソーム)を含む、遺伝子治療による細胞または組織への送達のために提供される。一部の実施形態では、操作されたGAAポリペプチドは、リポソームなどのカプセル化送達での、ポリリボヌクレオチド配列の製剤化後のmRNA療法による細胞または組織への送達のために提供される。一部の追加の実施形態では、操作されたGAAポリペプチドは、操作されたGAAポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列が外来性細胞に導入され、その細胞(または複数の細胞)が、レシピエント(例えば、ポンペ病を提示しているまたは発症するリスクがある患者)に導入される、細胞療法による細胞または組織への送達のために提供される。
一部の追加の実施形態では、操作されたGAAポリペプチドは、マトリックス安定化酵素結晶を含む製剤で提供される。一部の実施形態では、製剤は、架橋した結晶性の操作されたGAA酵素と、その酵素結晶に付着する反応性部分を有するポリマーとを含む。本発明は、ポリマー中の操作されたGAAポリペプチドも提供する。
一部の実施形態では、本発明の操作されたGAAポリペプチドを含む組成物は、糖(例えば、ラクトース、スクロース、マンニトールおよび/もしくはソルビトール)、デンプン(例えば、トウモロコシ、小麦、米、馬鈴薯もしくは他の植物デンプン)、セルロース(例えば、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム)、ゴム(例えば、アラビアゴム、トラガカントゴム、グアーガムなど)、および/またはタンパク質(例えば、ゼラチン、コラーゲンなど)を含むがこれらに限定されない、1つまたは複数の一般に使用される担体化合物を含む。経口製剤における追加の成分としては、着色およびまたは甘味剤(例えば、グルコース、スクロースおよびマンニトール)ならびに滑沢剤(例えば、ステアリン酸マグネシウム)、ならびに腸溶コーティング剤(例えば、メタクリレートポリマー、ヒドロキシプロピルメチルセルロースフタル酸エステル、および/または当技術分野において公知の任意の他の好適な腸溶コーティング剤)を挙げることができる。一部の実施形態では、崩壊または可溶化剤が含まれる(例えば、架橋ポリビニルピロリドン、寒天、アルギン酸またはその塩、例えばアルギン酸ナトリウム)。一部の実施形態では、操作されたGAAポリペプチドは、特に液体製剤の場合、保存剤、懸濁化剤、増粘剤、湿潤剤、アルコール、脂肪酸および/または乳化剤を含むがこれらに限定されない、様々な追加の成分と併せられる。一部の実施形態では、操作されたGAAポリペプチドは、薬理学的シャペロンを含むがこれらに限定されないポンペ病の処置に使用される他の化合物、分子および/または材料、ならびに任意の他の好適な化合物と組み合わせて、対象に投与される。一部の追加の実施形態では、医薬組成物は、ヒトへの非経口注射に好適である。一部の実施形態では、医薬組成物は、腸溶コーティングをさらに有する、丸剤、錠剤、カプセルまたはジェルキャップを含む。
一部の実施形態では、本発明は、組織内のグリコーゲンの濃度を低下させる際の使用に好適な操作されたGAAポリペプチドを提供する。動物に投与される操作されたGAAポリペプチドの投薬量は、疾患の状態、動物の全身状態、および当業者に公知の他の因子に依存する。一部の実施形態では、組成物は、動物への単回または複数回投与用である。一部の実施形態では、動物(例えば、ポンペ病を有するヒト)に投与される組成物中の操作されたGAAポリペプチドの濃度は、疾患の症状(例えば、ポンペ病ならびに/またはポンペ病に関連した状態、疾患および/もしくは症状)を有効に処置、改善および/または予防するのに十分であることが企図される。一部の実施形態では、操作されたGAAポリペプチドは、他の医薬および/または食事組成物と組み合わせて投与される。
本発明の上述のおよび他の態様は、以下の非限定的実施例に関連してよりよく理解され得る。これらの実施例は、単に例証を目的として提供されるものであり、いかなる点においても本発明の範囲を限定するためのものではない。
実験
達成した実験および結果を含む以下の実施例は、単に説明に役立つことを目的として提供するものであり、本発明を限定するものと解釈すべきでない。
達成した実験および結果を含む以下の実施例は、単に説明に役立つことを目的として提供するものであり、本発明を限定するものと解釈すべきでない。
下で開示する実験では、以下の略語が適用される:ppm(100万分の1);M(モル濃度);mM(ミリモル濃度);uMおよびμM(マイクロモル濃度);nM(ナノモル濃度);mol(モル);gmおよびg(グラム);mg(ミリグラム);ugおよびμg(マイクログラム);Lおよびl(リットル);mlおよびmL(ミリリットル);cm(センチメートル);mm(ミリメートル);umおよびμm(マイクロメートル);sec.(秒);min(分);hおよびhr(時(時間));U(単位);MW(分子量);rpm(回転毎分);℃(摂氏度);CDS(コード配列);DNA(デオキシリボ核酸);RNA(リボ核酸);E.coli W3110(Coli Genetic Stock Center[CGSC]、New Haven、CTから入手可能な、一般に使用される実験室用E.coli株);DPBS(ダルベッコリン酸緩衝食塩水);LB(Luria-Burtani);TB(テリフィックブロス);4-MUGlu(4-メチルウンベリフェリルα-D-グルコピラノシド);SD-Ura(ウラシルを含有しないシングルドロップアウト培地);HPLC(高圧液体クロマトグラフィー);SDS-PAGE(ドデシル硫酸ナトリウム・ポリアクリルアミドゲル電気泳動);MU-Glu(4-メチルウンベリフェリルα-D-グルコピラノシド);IPTG(イソプロピルβ-D-1-チオガラクトピラノシド);PMBS(ポリミキシンB硫酸塩);FIOPC(陽性対照に対する改善倍数);PBMC(末梢血単核細胞);LB(Luriaブロス);MeOH(メタノール);Axygen(Axygen,Inc.、Union City、CA);Athens Research(Athens Research Technology、Athens、GA);ProSpec(ProSpec Tany Technogene、East Brunswick、NJ);Sigma-Aldrich(Sigma-Aldrich、St.Louis、MO);Ram Scientific(Ram Scientific,Inc.、Yonkers、NY);Pall Corp.(Pall,Corp.、Pt.Washington、NY);Millipore(Millipore,Corp.、Billerica MA);Difco(Difco Laboratories、BD Diagnostic Systems、Detroit、MI);Molecular Devices(Molecular Devices,LLC、Sunnyvale、CA);Kuhner(Adolf Kuhner,AG、Basel、Switzerland);Microfluidics(Microfluidics Corp.、Westwood、MA);Thermotron(Thermotron,Inc.、Holland、MI);Cambridge Isotope Laboratories(Cambridge Isotope Laboratories,Inc.、Tewksbury、MA);Applied Biosystems(Life Technologies,Corp.の一部であるApplied Biosystems、Grand Island、NY);Greiner Bio-One(Greiner Bio-One North America、Monroe、NC);Agilent(Agilent Technologies,Inc.、Santa Clara、CA);Thermo Scientific(Thermo Fisher Scientificの一部、Waltham、MA);Corning(Corning,Inc.、Palo Alto、CA);Megazyme(Megazyme International、Wicklow、Ireland);Enzo(Enzo Life Sciences,Inc.、Farmingdale、NY);GE Healthcare(GE Healthcare Bio-Sciences、Piscataway、NJ);Pierce(Pierce Biotechnology(現在はThermo Fisher Scientificの一部)、Rockford、IL);Phenomenex(Phenomenex,Inc.、Torrance、CA);Optimal(Optimal Biotech Group、Belmont、CA);およびBio-Rad(Bio-Rad Laboratories、Hercules、CA)。
(実施例1)
GAA遺伝子獲得および発現ベクターの構築
(実施例1)
GAA遺伝子獲得および発現ベクターの構築
本実施例では、GAA遺伝子獲得および発現ベクター構築を説明する。ネイティブシグナルペプチドが除去されたWTヒトGAA(Uniprot ID P10253)をコードする合成遺伝子をSaccharomyces cerevisiaeにおける最適化遺伝子発現のために設計し、酵母MFαシグナルペプチド配列(配列番号3383)に融合させて、配列番号2により表される遺伝子配列を生成し、それを、以前に記載されたように酵母発現ベクターpYT-72にクローニングした(例えば、米国特許出願公開第2017/0360900A1号を参照されたい)。組換えクローニングおよび遺伝子発現は、S.cerevisiae株INVSc1で行った。指向性進化技法を使用して、このプラスミド構築物から遺伝子バリアントのライブラリーを生成した(例えば米国特許第8,383,346号およびWO2010/144103を参照されたい)。
哺乳動物細胞における分泌発現および一過性トランスフェクションのために、異なるGAAバリアントをコードする合成遺伝子に融合させた合成マウスIGシグナルペプチド(Uniprot受託番号A0N1R5の残基1~19、配列番号3381)をコードするキメラGAA発現構築物を以下のように生成した。一部の実施形態では、合成GAA遺伝子バリアントは、酵母のためにコドン最適化されているGAA配列(配列番号3)に基づくが、一部の代替実施形態では、合成GAAバリアントは、哺乳動物発現のためにコドン最適化されているGAA配列(配列番号5)に基づく。BamHI/XhoI部位またはHindIII/XhoI部位のどちらかへのクローニングを可能にするために隣接する制限酵素を含有するオリゴヌクレオチドを使用して、合成マウスIGシグナルペプチド(配列番号3381および3382)をコードする断片、および成熟形態のGAAのコード配列を増幅した。哺乳動物発現のために、線状化ベクターpcDNA3.1(+)のBamHI/XhoI部位またはHindIII/XhoI部位(Invitrogen)のどちらかにPCR産物をライゲーションした。指向性進化を使用して、配列番号18~828に由来する特定の遺伝子バリアントをpcDNA3.1(+)プラスミド構築物内に生成した(例えば、米国特許第8,383,346号およびWO2010/144103を参照されたく、これらの各々は、その全体が参照により組み込まれる)。
ライブラリーバリアント生成との適合性を可能にするためにベクターコピー数、所望の選択薬、および塩基対長が最適になるようにpDHベクターを生成した。哺乳動物発現のために、PCR産物を線状化pDHベクターのBamHI/XhoI部位またはHindIII/XhoI部位のどちらかにライゲーションした。指向性進化を使用して、配列番号20に由来する特定の遺伝子バリアント(配列番号829~3378)をpDHプラスミド構築物内に生成した。WT GAAを含有するpDHについてのプラスミドマップを図9に示し、プラスミド配列を配列番号3379として提供する。加えて、ベータ-ラクタマーゼ(bla)スタッファー配列を含有するpDHについてのプラスミドマップを図10に提供し、配列を配列番号3380として提供する。
一部の実験では、GAAバリアントの発現は、pcDNA3.1(+)またはpDH内の上記の発現カセットの線状PCR増幅産物(すなわち、異なるGAAバリアントをコードする合成遺伝子に融合させた合成マウスIGシグナルペプチド(Uniprot受託番号A0N1R5の残基1~19;配列番号3381)で構成されているキメラ発現構築物)を使用して行った。PCR増幅は、当業者に一般に公知の最適化と、pcDNA3.1(+)についてはプライマー対(配列番号3387および3388)を、pDHについてはプライマー対(配列番号3385および3386;または配列番号3387および3388)を用いて行った。一部の場合には、ホスホロチオエートプライマーを使用した。
(実施例2)
Saccharomyces cerevisiaeのハイスループット増殖およびGAAアッセイ
(実施例2)
Saccharomyces cerevisiaeのハイスループット増殖およびGAAアッセイ
本実施例では、GAAバリアントを産生する細胞のハイスループット増殖を含む実験、およびGAA活性を決定するためのアッセイを説明する。
S.cerevisiaeのハイスループット(HTP)増殖
S.cerevisiaeのハイスループット(HTP)増殖
当技術分野において公知の酢酸リチウム法を使用してGAAおよびGAAバリアントを発現するベクターを形質転換で導入した酵母(INVSc1)細胞を、SD-Ura寒天プレートで選択した。30℃で72時間のインキュベーション後、6%グルコース補充した200μl/ウェルのSD-Uraブロス(2g/LのSD-Ura、6.8g/Lの酵母ニトロゲンベース・アミノ酸不含[Sigma Aldrich])、3.06g/Lのリン酸二水素ナトリウム、0.804g/Lのリン酸水素二ナトリウム、pH6.0を充填したAXYGEN(登録商標)1.1ml 96ウェルディープウェルプレート(Axygen)のウェルにコロニーを入れた。細胞を20~24時間、Kuhnerシェーカー(250rpm、30℃、および相対湿度85%)の中で増殖させた。終夜培養試料(20μL)を、2%グルコースを補充した380μLのSD-uraブロスを充填したCOSTAR(登録商標)96ウェルディーププレート(Corning)に移した。プレートを66~84時間、Kuhnerシェーカー(250rpm、30℃、および相対湿度85%)の中でインキュベートした。次いで、細胞をペレット化し(4000rpm×20分)、上清(条件培地)を分析するまで4℃で保存した。
上清のHTP分析
上清のHTP分析
GAAバリアントの活性を、4-メチルウンベリフェリルα-D-グルコピラノシド(4-MUGlu)の加水分解を測定することにより決定した。非曝露アッセイのために、上で説明したように生成した50μLのSD-URA条件培地を、96ウェル、黒色、不透明底プレートにおいて、マッキルバイン緩衝液(McIlvaine、J. Biol. Chem.、49:183-186 [1921])、pH4.5中の50μLの1mM 4-MUGluと混合した。反応物を短時間混合し、37℃で4~24時間インキュベートした後、100μLの0.5M炭酸ナトリウム、pH10.5で反応を停止させた。SPECTRAMAX(登録商標)M2マイクロプレートリーダー(Molecular Devices)を使用し、蛍光(Ex.355nm、Em.460nm)をモニターすることにより、加水分解を分析した。
中性緩衝液に曝露した上清のHTP分析
中性緩衝液に曝露した上清のHTP分析
GAAバリアントを、バリアントが患者への投与後に血液中で遭遇するpHをシミュレートするために、中性からほぼ中性(pH6.5~7.5)の緩衝液に曝露した。先ず、SD-URA条件培地中の50μLのGAAバリアント、および50μLのマッキルバイン緩衝液(pH6.5~7.4)を、96ウェル丸底プレートのウェルに添加した。プレートを密封し、37℃で1時間インキュベートした。次いで、50μLの各々の曝露された試料を、マッキルバイン緩衝液、pH4.4中の50μLの1mM 4-MUGluと混合した。反応物を短時間混合し、37℃で4~24時間インキュベートした後、100μLの0.5M炭酸ナトリウム、pH10.5で反応を停止させた。SPECTRAMAX(登録商標)M2マイクロプレートリーダー(Molecular Devices)を使用し、蛍光(Ex.355nm、Em.460nm)をモニターすることにより、加水分解を分析した。
酸で前処理した上清のHTP分析
酸で前処理した上清のHTP分析
GAAバリアントを、バリアントが患者への投与後にリソソーム中で遭遇するpHをシミュレートするために、酸性(pH3)の緩衝液に曝露した。先ず、SD-URA条件培地中の50μLのGAAバリアント、および50μLのマッキルバイン緩衝液(pH3)を、96ウェル丸底プレートのウェルに添加した。プレートを密封し、37℃で1時間インキュベートした。次いで、50μLの各々の曝露された試料を、マッキルバイン緩衝液、pH4.4中の50μLの1mM 4-MUGluと混合した。反応物を短時間混合し、37℃で4~24時間インキュベートした後、100μLの0.5M炭酸ナトリウム、pH10.5で反応を停止させた。SPECTRAMAX(登録商標)M2マイクロプレートリーダー(Molecular Devices)を使用し、蛍光(Ex.355nm、Em.460nm)をモニターして、加水分解を分析した。
グリコーゲン基質での上清のHTP分析
グリコーゲン基質での上清のHTP分析
GAAバリアントの加水分解活性を、グリコーゲンのグルコースへの加水分解を測定することにより決定した。非曝露アッセイのために、上で説明したように生成した50μLのSD-URA条件培地を、96ウェル、黒色、不透明底プレートにおいて、pH4.5マッキルバイン緩衝液(7.71mLの0.2M Na2HPO4および12.29の0.1Mクエン酸)中の50μLの5mMグリコーゲンと混合した。反応物を短時間混合し、37℃で24時間インキュベートした。インキュベーション後、20uLのグリコーゲン加水分解反応混合物を80uLのAMPLEX(登録商標)Red Glucose Assay Kit(Sigma)と混合して、各反応物のグルコース含有量を決定した。SPECTRAMAX(登録商標)M2マイクロプレートリーダー(Molecular Devices)を使用し、蛍光(Ex.544nm、Em.585nm)をモニターすることにより、加水分解を分析した。
(実施例3)
GAAおよびGAAバリアント
(実施例3)
GAAおよびGAAバリアント
GAAおよびGAAバリアント活性を、一連の独立した曝露後に酵素活性をアッセイすることにより決定した。バリアントの全てについての結果およびそれらのポリペプチド配列の各々における置換を配列番号2に関連して報告する。これらのバリアントを、実施例2で説明したように、GAA 4-MUGlu活性(非曝露活性のFIOPC)について、pH6.5インキュベーション後(pH6.5安定性活性のFIOPC)に、およびグリコーゲン加水分解(グリコーゲン活性のFIOPC)について、試験した。表3-1および3-2は、これらのアッセイの結果を提供する。
(実施例4)
配列番号8のGAAバリアント
配列番号8のGAAバリアント
本実施例では、一連の曝露後のGAA活性の改善についての配列番号8に由来するGAAバリアントの分析を説明する。配列番号8によりコードされるGAAの指向性進化を、バリアント遺伝子のライブラリーを構築することにより行った。次いで、これらのライブラリーを、実施例2で説明したように、播種し、増殖させ、GAA 4-MUGlu活性について非曝露、プレインキュベーションなし活性アッセイにおいて(非曝露活性のFIOPC)、pH7インキュベーション後(pH7安定性活性のFIOPC)、またはpH3インキュベーション後に(pH3安定性活性のFIOPC)、スクリーニングした。結果を表4-1に提示する。
(実施例5)
接着性哺乳動物細胞のハイスループット増殖、および接着性哺乳動物発現によって達成されるGAAアッセイ
接着性哺乳動物細胞(HEK293T)におけるGAAおよびGAAバリアントのハイスループット(HTP)増殖
接着性哺乳動物細胞のハイスループット増殖、および接着性哺乳動物発現によって達成されるGAAアッセイ
接着性哺乳動物細胞(HEK293T)におけるGAAおよびGAAバリアントのハイスループット(HTP)増殖
野生型GAAまたはGAAバリアントに融合させた、合成マウスIGシグナルペプチド(配列番号3381および3382)をコードする、pcDNA 3.1(+)ベクター(ThermoFisher Scientific)、pDHベクター、またはPCR増幅線状DNA(実施例1で説明した通り)を、LIPOFECTAMINE(登録商標)3000試薬(ThermoFisher Scientific)を用いるリポフェクション法を使用して、HEK 293T細胞にトランスフェクトした。HEK 293T細胞を標準的な完全増殖培地(10%ウシ胎児血清を含有するDMEM[両方ともCorningからのもの])で培養し、NUNC(登録商標)Edge 2.0 96ウェルプレート(ThermoFisher Scientific)に0.5×105細胞/ウェル/250μLの密度で播種して、24時間、37℃で、5%CO2の存在下で接着および増殖させた後、リポフェクション媒介トランスフェクションに付した。トランスフェクション後、GAAバリアントの発現および条件培地への分泌を可能にするために、細胞を24~96時間インキュベートした。次いで、HEK293Tトランスフェクションからの条件培地(20~100μL)を、活性、安定性または細胞への取込みの分析のために新しい96ウェルプレートに移した。
上清のHTP分析
上清のHTP分析
GAAバリアントの活性を、4-メチルウンベリフェリルα-D-グルコピラノシド(4-MUGlu)の加水分解を測定することにより決定した。非曝露アッセイのために、上で説明したように生成した20μLのHEK 293T条件培地を、96ウェル、黒色、不透明底プレートにおいて、マッキルバイン緩衝液(McIlvaine、J. Biol. Chem.、49:183-186 [1921])、pH4.4中の50μLの1.5mM 4-MUGluと混合した。反応物を400rpmで攪拌しながら25~37℃で30~60分間インキュベートした後、100μLの0.5M炭酸ナトリウム、pH10.5で反応を停止させた。SPECTRAMAX(登録商標)M2マイクロプレートリーダー(Molecular Devices)またはENVISION(登録商標)マイクロプレートリーダー(Perkin Elmer)を使用し、蛍光(Ex.355nm、Em.460nm)をモニターして、加水分解を分析した。
中性緩衝液に曝露した上清のHTP分析
中性緩衝液に曝露した上清のHTP分析
GAAバリアントを、バリアントが患者への投与後に血液中で遭遇するpHをシミュレートするために、中性緩衝液に曝露した。先ず、HEK 293T発現からのGAAバリアントを含有する20μLの条件培地を96ウェルプレートにおいて100μLのDPBS緩衝液(pH7.4)と併せた。プレートを密封し、37℃で24~96時間インキュベートした。次に、20μLの中性pH曝露試料を、マッキルバイン緩衝液、pH4.4中の50μLの1.5mM 4-MUGluと混合した。反応物を400rpmで攪拌しながら37℃で180分間インキュベートした後、100μLの0.5M炭酸ナトリウム、pH10.5で反応を停止させた。SPECTRAMAX(登録商標)M2マイクロプレートリーダーまたはENVISION(登録商標)マイクロプレートリーダー(Perkin Elmer)を使用し、蛍光(Ex.355nm、Em.460nm)をモニターして、加水分解を分析した。
血漿に曝露した上清のHTP分析
血漿に曝露した上清のHTP分析
GAAバリアントを、バリアントが患者への投与後に血液中で遭遇する条件をシミュレートするために、血漿に曝露した。先ず、HEK 293T発現からのGAAバリアントを含有する30μLの条件培地を96ウェルプレートにおいて30μLの血漿(Innovative Research、Innovative Grade US Origin Monkey Cynomolgus Plasma K2 EDTA)と併せた。プレートを密封し、37℃で2~4時間インキュベートした。次に、10μLの血漿曝露試料を、マッキルバイン緩衝液、pH4.4中の50μLの1.5mM 4-MUGluと混合した。反応物を400rpmで攪拌しながら25~37℃で15~60分間インキュベートした後、100μLの0.5M炭酸ナトリウム、pH10.5で反応を停止させた。SPECTRAMAX(登録商標)M2マイクロプレートリーダーまたはENVISION(登録商標)マイクロプレートリーダー(Perkin Elmer)を使用し、蛍光(Ex.355nm、Em.460nm)をモニターして、加水分解を分析した。
ポンペ線維芽細胞およびC2C12 GAAノックアウト筋芽細胞の溶解物におけるGAA活性のHTP分析
ポンペ線維芽細胞およびC2C12 GAAノックアウト筋芽細胞の溶解物におけるGAA活性のHTP分析
HTPで産生したGAAバリアントを標的細胞とともにインキュベートし、24時間後に残留細胞内活性についてアッセイした。これらの実験には、機能的GAA活性を欠いている哺乳動物細胞、すなわち、ポンペ患者由来の線維芽細胞(Coriell Institute for Medical Research #GM00248)、およびCrispr-Cas9編集を使用してネイティブGAA遺伝子をノックアウトしたC2C12筋芽細胞を使用した。これらの実験では、ポンペ線維芽細胞またはC2C12 GAAノックアウト筋芽細胞を、黒色、透明底、組織培養処理COSTAR(登録商標)96ウェルプレート(Corning、3904)に播種し、標準的な完全増殖培地中でコンフルエントになるまで放置して増殖させた。コンフルエントになったら、自動BIOMEK(登録商標)i5液体処理ロボットを使用して完全増殖培養培地をプレートから除去した。上で説明したように一過性にトランスフェクトしたHEK293T細胞により産生された条件培地を、ポンペ患者由来の線維芽細胞およびC2C12筋芽細胞にトランスフェクトし、4~24時間、37℃、5%CO2で放置してインキュベートした。自動BIOMEK(登録商標)i5液体処理ロボットを使用して培地を培養物から除去した。細胞を150μLの1×DPBS/ウェルで短時間洗浄し、自動BIOMEK(登録商標)i5液体処理ロボットを使用してDPBSを除去した。次いで、200μLの標準的な完全増殖培養培地を各ウェルに添加し、プレートを0~72時間、インキュベーターに戻した。インキュベーションの完了時に、自動BIOMEK(登録商標)i5液体処理ロボットを使用して標準的な完全増殖培地を除去した。細胞を150μLの1×DPBS/ウェルで洗浄し、自動BIOMEK(登録商標)i5液体処理を使用してDPBSを除去した。0.2~0.5%TRITON X-100(商標)非イオン性界面活性剤(Sigma #93443)を補充した50μLのマッキルバイン緩衝液、pH4.4の添加、および室温で30分間の攪拌によって、細胞を溶解した。マッキルバイン緩衝液、pH4.4中の50μLの1.5mM 4-MUGluの添加により、活性を評定した。プレートを密封し、400rpmで攪拌しながら37℃で300~360分間インキュベートした後、100μLの0.5M炭酸ナトリウム、pH10.5で反応を停止させた。SPECTRAMAX(登録商標)M2マイクロプレートリーダーまたはENVISION(登録商標)マイクロプレートリーダー(Perkin Elmer)を使用し、蛍光(Ex.355nm、Em.460nm)をモニターして、加水分解を分析した。示した配列番号を有する参照ポリペプチドの活性で正規化GAAバリアント細胞内活性を割ることにより、細胞取込みのFIOPCを計算した。
(実施例6)
配列番号16のGAAバリアント
(実施例6)
配列番号16のGAAバリアント
本実施例では、配列番号16から導出したGAAバリアントの、進化についての実験、および一連の曝露後のGAA活性の改善についてのスクリーニングを説明する。配列番号13をコードするGAA合成遺伝子を合成マウスIGシグナルペプチドポリヌクレオチド(配列番号3381)に(実施例1で説明したように)融合させて、配列番号15をコードする合成遺伝子を生成した。配列番号16によりコードされるGAAの指向性進化を、バリアント遺伝子のライブラリーを構築することにより行った。次いで、これらのライブラリーを、実施例5で説明したように、播種し、増殖させ、GAA MU-Glu活性(「非曝露活性のFIOPC」)についてスクリーニングし、pH7.4プレインキュベーション後(「pH7.4安定性および活性のFIOPC」)にもスクリーニングした。バリアントも、実施例5で説明したように、4-MUGlu活性について、ポンペ線維芽細胞の溶解後(「ポンペ線維芽細胞溶解物からの活性のFIOPC」)またはGAA-/-C2C12細胞の溶解後(「C2C12 GAA-/-溶解物からの活性のFIOPC」)に試験した。これらのアッセイの結果を表6-1に提示する。
(実施例7)
GAAバリアントの産生
GAAバリアントの産生
本実施例では、GAAバリアントの産生を説明する。
EXPI293F(商標)細胞におけるGAAの産生
EXPI293F(商標)細胞におけるGAAの産生
GAAバリアントのミリグラム規模の産生を、EXPI293(商標)Expression Medium(ThermoFisher Scientific)中のEXPIFECTAMINE(商標)293 Reagent(ThermoFisher Scientific)を用いるリポフェクション法を使用するEXPI293(商標)細胞(ThermoFisher Scientific)の一過性トランスフェクションにより果たした。N末端合成哺乳動物シグナルペプチド(配列番号3381)に融合させたGAAバリアントを、実施例1に記載の哺乳動物発現ベクターpLEV113、pcDNA 3.1(+)、またはpDHにサブクローニングした。EXPI293(商標)細胞にプラスミドDNAをトランスフェクトし、それを浮遊状態で4~7日間、増殖させた。次いで、条件培地を収集し、遠心分離および濾過により清澄化し、分析まで4℃で保存した。
(実施例8)
GAAバリアントの精製
(実施例8)
GAAバリアントの精製
本実施例では、GAAバリアントを精製する方法を説明する。
哺乳動物細胞上清からのGAAバリアントの精製
哺乳動物細胞上清からのGAAバリアントの精製
実施例7で説明したようにEXPI293F(商標)細胞で産生したGAAバリアント(配列番号4、6、10、12、16、18、20、946、1894、1924、1950、1956、1984、2034、2054、2066、2074、2178、2202、および2496)を、文献(Yasuda et al.、Prot. Exp. Pur,. 37:499-506 [2004])に記載されているように哺乳動物培養上清から精製した。コンカナバリンA樹脂(Sigma Aldrich)を0.1M酢酸ナトリウム、0.1M NaCl、1mM MgCl2、CaCl2、およびMnCl2、pH6.0(コンカナバリンA結合緩衝液)と平衡させた。上清を0.2μmボトルトップフィルターで滅菌濾過した後、それをカラムにロードした。ロード後、カラムを10カラム体積のコンカナバリンA結合緩衝液で洗浄し、結合したタンパク質を、0.9Mメチル-α-D-マンノピラノシドおよび0.9Mメチル-α-D-グルコピラノシドを補充したコンカナバリンA結合緩衝液で溶出した。溶出したタンパク質を濃縮し、分画分子量50kDaの膜(Millipore)を備えたAMICON(登録商標)Ultra 15mL濾過ユニットを使用して保存用緩衝液(20mMリン酸ナトリウム、150mM塩化ナトリウム、185μM TWEEN(登録商標)-20非イオン性デタージェント、pH6.0)に緩衝液交換した。保存用緩衝液中のGAAをANOTOP(登録商標)0.2μmシリンジフィルター(Whatman)に通して滅菌濾過し、-80℃で保存した。BCA定量(下で説明する)に基づいて、この精製プロセスによって培養上清1ml当たり2.4~50ngの精製タンパク質を得た。
BCAアッセイによるタンパク質定量
BCAアッセイによるタンパク質定量
ビシンコニン酸(BCA)タンパク質アッセイ(Sigma Aldrich)を使用して、上で説明したように産生した精製GAAバリアントを定量した。マイクロタイタープレートにおいて、25μLのタンパク質標準物質および適切に希釈した精製GAAを、50部のBCA試薬Aおよび1部のBCA試薬Bを含有する200μLの作業用試薬と混合した。プレートを30秒間、プレートシェーカーで入念に混合し、37℃で30分間インキュベートした。プレートリーダーを用いて562nmで吸光度を測定した。
(実施例9)
GAAバリアントのin vitroでの特徴付け
(実施例9)
GAAバリアントのin vitroでの特徴付け
本実施例では、本明細書で示すように産生したGAAバリアントを特徴付けるために行った実験を説明する。
rhGAAおよびGAAバリアントの動態特徴付け
rhGAAおよびGAAバリアントの動態特徴付け
GAAバリアントの活性を、4-メチルウンベリフェリルα-D-グルコピラノシド(4-MUGlu)の加水分解を測定することにより決定した。上で説明したように産生した精製酵素を、96ウェル、黒色、不透明底プレートにおいて、マッキルバイン緩衝液(McIlvaine、J. Biol. Chem.、49:183-186 [1921])、pH4.5中の50μLの0~2.5mM 4-MUGluと混合した。反応物を短時間混合し、37℃で15~30分インキュベートした後、100μLの0.5M炭酸ナトリウム、pH10.5で反応を停止させた。SPECTRAMAX(登録商標)M2マイクロプレートリーダーを使用し、蛍光(Ex.355nm、Em.460nm)をモニターして加水分解を分析し、ミカエリス・メンテン式を使用してプロットし、分析した。このアッセイからの結果を図1に提示する。
rhGAAおよびGAAバリアントの中性pHでの安定性
rhGAAおよびGAAバリアントの中性pHでの安定性
中性pHに対するGAAバリアントの安定性を、96ウェルプレートにおいて100μLのMEM完全増殖培地(pH7.4)中でバリアントをインキュベートすることにより決定した。プレートを密封し、37℃で最大48時間インキュベートした。次に、10μLの中性pH曝露試料を、96ウェル、黒色、不透明底プレートにおいてマッキルバイン緩衝液、pH4.4中の50μLの1.5mM 4-MUGluと混合した。反応物を攪拌しながら室温で30分間インキュベートした後、100μLの0.5M炭酸ナトリウム、pH10.5で反応を停止させた。SPECTRAMAX(登録商標)M2マイクロプレートリーダーまたはENVISION(登録商標)マイクロプレートリーダー(Perkin Elmer)を使用し、蛍光(Ex.355nm、Em.460nm)をモニターし、4-メチルウンベリフェリルα-D-グルコピラノシド(4-MUGlu)の加水分解を測定して、加水分解を分析した。このアッセイからの結果を図11に提示する。
Expi293F細胞に発現された精製GAAバリアントのポンペ線維芽細胞またはC2C12 GAAノックアウト筋芽細胞内への細胞取込み
Expi293F細胞に発現された精製GAAバリアントのポンペ線維芽細胞またはC2C12 GAAノックアウト筋芽細胞内への細胞取込み
GAAバリアントの細胞取込みを参照酵素と比較(配列番号4および6)して決定して、培養細胞にエンドサイトーシスされるそれらの全般的能力を評定した。ポンペ線維芽細胞(GM00248、Coriell Institute for Medical Research)またはC2C12 GAAノックアウト細胞を、黒壁、透明底96ウェルプレート(Costar、#3603)内の標準的な完全増殖培地に播種し、コンフルエントになるように放置した(37℃、5%CO2で2~3日)。コンフルエントになった後、自動BIOMEK(登録商標)i5液体処理ロボットを使用して標準的な完全増殖培培地を除去した。実施例8で説明したように精製した酵素を、標準的な完全増殖培地中、0~10ug GAA/mLで細胞に添加し、急性(1~6時間)または長期(16~96時間)処置のために37℃、5%CO2で放置してインキュベートした。自動BIOMEK(登録商標)i5液体処理ロボットを使用して、GAAバリアントを含有する培地を吸引した。細胞を150μLの1×DPBS/ウェルで短時間洗浄し、自動BIOMEK(登録商標)i5液体処理ロボットによりDPBSを除去した。次いで、200μLの標準的な完全増殖培地を各ウェルに添加し、プレートを0~72時間、インキュベーターに戻した。インキュベーションの完了時に、自動BIOMEK(登録商標)i5液体処理ロボットを使用してMEM完全増殖培地を除去した。細胞を150μLの1×DPBS/ウェルで洗浄し、自動BIOMEK(登録商標)i5液体処理ロボットを使用してDPBSを除去した。0.2~0.5%TRITON X-100(商標)非イオン性界面活性剤(Sigma #93443)を補充した50μLのマッキルバイン緩衝液、pH4.4の添加、および室温で30分間の攪拌によって、細胞を溶解した。マッキルバイン緩衝液、pH4.4中の50μLの1.5mM 4-MUGluの添加により、GAA活性を評定した。プレートを密封し、400rpmで攪拌しながら37℃で300~360分間インキュベートした後、100μLの0.5M炭酸ナトリウムpH10.5で反応を停止させた。SPECTRAMAX(登録商標)M2マイクロプレートリーダーを使用し、蛍光(Ex.355nm、Em.460nm)をモニターして、加水分解を分析した。対照(WT)活性で正規化GAAバリアント細胞内活性を割ることにより、細胞取込みのFIOPCを計算した。図4、5、8、12、13、16~18、22、24および26は、1~96時間の処置後の精製GAAバリアントのポンペ線維芽細胞内への細胞取込みを示すグラフを提供する。図6、7、14、15、19~21、23、25および27は、1~96時間の処置後の精製GAAバリアントのC2C12 GAA KO筋芽細胞内への細胞取込みを示すグラフを提供する。図8は、1~7日後のGAAバリアントの細胞取込みおよび安定性を示すグラフを提供する。
EXPI293F(商標)細胞に発現されたGAAバリアントのグリコーゲン分解活性
EXPI293F(商標)細胞に発現されたGAAバリアントのグリコーゲン分解活性
GAAバリアントの相対グリコーゲン加水分解活性を、本明細書に記載する変更を加えて製造業者の使用説明書に従ってAMPLEX(登録商標)Red Glucose/Glucose Oxidase Kit(Invitrogen、#A22189)を使用して評定した。手短に述べると、GAAバリアントを、COSTAR(登録商標)黒壁、透明底96ウェルプレート(#3603、Corning)内での50μL反応に適切な濃度範囲(0~2μg/mL)に、マッキルバイン緩衝液、pH4.4中の10mMグリコーゲンで希釈した。プレートを密封し、室温で30分間、穏やかに振盪した。25μLの0.5M炭酸ナトリウム、pH10.5の添加により、反応物を中和した。製造業者の使用説明書に従って調製した50μLのAMPLEX(登録商標)Red/ホースラディッシュペルオキシダーゼ/グルコースオキシダーゼ溶液を各ウェルに添加した。プレートを密封し、室温で30分間、穏やかに振盪した。SPECTRAMAX(登録商標)M2マイクロプレートリーダーを使用し、蛍光(Ex.530nm、Em.590nm)をモニターして、グルコース不含の標準曲線に対して反応物を定量した。結果を図2に示す。
(実施例10)
配列番号20のGAAバリアント
(実施例10)
配列番号20のGAAバリアント
本実施例では、配列番号20から導出したGAAバリアントの、進化についての実験、および一連の曝露後のGAA活性の改善についてのスクリーニングを説明する。配列番号20によりコードされる/配列番号20に基づくバリアント遺伝子GAAのライブラリーを、実施例5で説明したように、構築し、播種し、増殖させ、GAA MU-Glu活性(「非曝露活性のFIOPC」)についてスクリーニングし、血漿曝露後(「血漿安定性および活性のFIOPC」)にもスクリーニングした。バリアントも、実施例5で説明したように、4-MuGlu活性について、ポンペ線維芽細胞の溶解後(「ポンペ線維芽細胞溶解物からの活性のFIOPC」)またはGAA-/-C2C12細胞の溶解後(「C2C12 GAA-/-溶解物からの活性のFIOPC」)に試験した。これらのアッセイの結果を表10-1および10-2に提示する。
(実施例11)
浮遊哺乳動物細胞のハイスループット増殖、および浮遊哺乳動物発現によって達成されるGAAアッセイ
浮遊哺乳動物細胞(Expi293F)におけるGAAおよびGAAバリアントのハイスループット(HTP)増殖
浮遊哺乳動物細胞のハイスループット増殖、および浮遊哺乳動物発現によって達成されるGAAアッセイ
浮遊哺乳動物細胞(Expi293F)におけるGAAおよびGAAバリアントのハイスループット(HTP)増殖
野生型GAAまたはGAAバリアントに融合させた、合成マウスIGシグナルペプチド(配列番号3381および3382)をコードする、pDHまたはPCR増幅線状DNA(実施例1で説明した通り)を、EXPI293(商標)Expression Medium(ThermoFisher Scientific)中のEXPIFECTAMINE(商標)293試薬(ThermoFisher Scientific)を用いるリポフェクション法を使用して、EXPI293F(商標)細胞(ThermoFisher Scientific)にトランスフェクトした。EXPI293F(商標)細胞(ThermoFisher Scientific)をEXPI293(商標)Expression Medium(ThermoFisher Scientific)で培養し、Axygen 1.1mLディープウェルプレート(Corning、P-DW-11-C-S)に1×106細胞/ウェル/400μLの密度で播種した。細胞をリポフェクション媒介トランスフェクションに付し、GAAバリアントの発現および条件培地への分泌を可能にするために3~4日間、8%CO2および湿度70%を有する振盪インキュベーターに戻した。条件培地を、発現プレートの遠心分離、およびBioRad Hardshell PCR Plate(BioRad、HSP9601)への条件培地の移入により収集した。プレートを再び遠心分離し、清澄化された条件培地を、活性、安定性または細胞への取込みの分析のために新しい96ウェルプレートに移した。
上清のHTP分析
上清のHTP分析
GAAバリアント活性を、4-メチルウンベリフェリルα-D-グルコピラノシド(4-MUGlu)の加水分解を測定することにより決定した。非曝露アッセイのために、上で説明したように生成した5~10μLのEXPI293F(商標)清澄化条件培地を、96ウェル、黒色、不透明底プレートにおいて、マッキルバイン緩衝液(McIlvaine、J. Biol. Chem.、49:183-186 [1921])、pH4.4中の50μLの1.5mM 4-MUGluと混合した。反応物を400rpmで攪拌しながら25~37℃で10~60分間インキュベートした後、100μLの0.5M炭酸ナトリウム、pH10.5で反応を停止させた。SPECTRAMAX(登録商標)M2マイクロプレートリーダー(Molecular Devices)またはENVISION(登録商標)マイクロプレートリーダー(Perkin Elmer)を使用し、蛍光(Ex.355nm、Em.460nm)をモニターして、加水分解を分析した。示した配列番号を有する参照ポリペプチドの活性で正規化GAAバリアントを割ることにより、非曝露活性のFIOPCを計算した。
血漿に曝露した上清のHTP分析
血漿に曝露した上清のHTP分析
GAAバリアントを、バリアントが患者への投与後に血液中で遭遇する条件をシミュレートするために、血漿に曝露した。先ず、EXPI293F(商標)清澄化条件培地中の30μLのGAAバリアントを、96ウェルプレートにおいて30μLの血漿(Innovative Research、Innovative Grade US Origin Monkey Cynomolgus Plasma K2 EDTA)と併せた。プレートを密封し、37℃で2~4時間インキュベートした。次に、10μLの血漿曝露試料を、マッキルバイン緩衝液、pH4.4中の50μLの1.5mM 4-MUGluと混合した。反応物を400rpmで攪拌しながら25~37℃で15~60分間インキュベートした後、100μLの0.5M炭酸ナトリウム、pH10.5で反応を停止させた。SPECTRAMAX(登録商標)M2マイクロプレートリーダーまたはENVISION(登録商標)マイクロプレートリーダー(Perkin Elmer)を使用し、蛍光(Ex.355nm、Em.460nm)をモニターして、加水分解を分析した。示した配列番号を有する参照ポリペプチドの活性で曝露後の正規化GAAバリアント活性を割ることにより、血漿安定化のFIOPCを計算した。
ポンペ線維芽細胞およびC2C12 GAAノックアウト筋芽細胞の溶解物におけるGAA活性のHTP分析
ポンペ線維芽細胞およびC2C12 GAAノックアウト筋芽細胞の溶解物におけるGAA活性のHTP分析
清澄化条件培地におけるHTP EXPI293F(商標)発現からのGAAバリアントを標的細胞とともにインキュベートし、24~72時間後に残留細胞内活性についてアッセイした。これらの実験には、機能的GAA活性を欠いている哺乳動物細胞、すなわち、ポンペ患者由来の線維芽細胞(Coriell Institute for Medical Research #GM00248)、およびCrispr-Cas9編集を使用してネイティブGAA遺伝子をノックアウトしたC2C12筋芽細胞を使用した。これらの実験では、ポンペ線維芽細胞またはC2C12 GAAノックアウト筋芽細胞を、96ウェルプレートCOSTAR(登録商標)(3904、Corning)に播種し、標準的な完全増殖培地中でコンフルエントになるまで放置して増殖させた。コンフルエントになったら、自動BIOMEK(登録商標)i5液体処理ロボットを使用して完全増殖培養培地をプレートから除去した。EXPI293F(商標)への一過性HPTトランスフェクトからの清澄化条件培地を、ポンペ患者由来の線維芽細胞およびC2C12筋芽細胞に移し、4~24時間、37℃、5%CO2で放置してインキュベートした。自動BIOMEK(登録商標)i5液体処理ロボットを使用して培地を培養物から除去した。細胞を150μLの1×DPBS/ウェルで短時間洗浄し、自動BIOMEK(登録商標)i5液体処理ロボットを使用してDPBSを除去した。次いで、200μLの標準的な完全増殖培養培地を各ウェルに添加し、プレートを0~72時間、インキュベーターに戻した。インキュベーションの完了時に、自動BIOMEK(登録商標)i5液体処理ロボットを使用して標準的な完全増殖培地を除去した。細胞を150μLの1×DPBS/ウェルで洗浄し、自動BIOMEK(登録商標)i5液体処理を使用してDPBSを除去した。0.2~0.5%TRITON X-100(商標)非イオン性界面活性剤(Sigma #93443)を補充した50μLのマッキルバイン緩衝液、pH4.4の添加、および室温で30分間の攪拌によって、細胞を溶解した。マッキルバイン緩衝液、pH4.4中の50μLの1.5mM 4-MUGluの添加により、活性を評定した。プレートを密封し、400rpmで攪拌しながら37℃で300~360分間インキュベートした後、100μLの0.5M炭酸ナトリウム、pH10.5で反応を停止させた。SPECTRAMAX(登録商標)M2マイクロプレートリーダーまたはENVISION(登録商標)マイクロプレートリーダー(Perkin Elmer)を使用し、蛍光(Ex.355nm、Em.460nm)をモニターして、加水分解を分析した。示した配列番号を有する参照ポリペプチドの活性で正規化GAAバリアント細胞内活性を割ることにより、細胞取込みのFIOPCを計算した。
(実施例12)
配列番号946のGAAバリアント
(実施例12)
配列番号946のGAAバリアント
本実施例では、配列番号946から導出したGAAバリアントの、進化についての実験、および一連の曝露後のGAA活性の改善についてのスクリーニングを説明する。配列番号946によりコードされる/配列番号946に基づくバリアント遺伝子GAAのライブラリーを、実施例11で説明したように、構築し、播種し、増殖させ、GAA MU-Glu活性(「非曝露活性のFIOPC」)についてスクリーニングし、血漿曝露後(「血漿安定性および活性のFIOPC」)にもスクリーニングした。バリアントを、4-MUGlu活性について、実施例11で説明したように、24時間処置したポンペ線維芽細胞の溶解後(「ポンペ線維芽細胞の長期処置からの溶解物活性のFIOPC」)もしくはGAA-/-C2C12細胞の溶解後(「長期処置C2C12 GAA-/-からの溶解物活性のFIOPC」)、または6時間処置したポンペ線維芽細胞の溶解後(「ポンペ線維芽細胞の急性処置からの溶解物活性のFIOPC」)もしくはGAA-/-C2C12細胞の溶解後(「急性処置C2C12 GAA-/-からの溶解物活性のFIOPC」)にも試験した。これらのアッセイの結果を表12-1に提示する。
(実施例13)
配列番号1956のGAAバリアント
配列番号1956のGAAバリアント
本実施例では、配列番号1956から導出したGAAバリアントの、進化についての実験、および一連の曝露後のGAA活性の改善についてのスクリーニングを説明する。配列番号1956によりコードされる/配列番号1956に基づくバリアント遺伝子GAAのライブラリーを、実施例11で説明したように、構築し、播種し、増殖させ、GAA MU-Glu活性(「非曝露活性のFIOPC」)についてスクリーニングし、血漿曝露後(「血漿安定性および活性のFIOPC」)にもスクリーニングした。バリアントを、4-MUGlu活性について、実施例11で説明したように、24時間処置したポンペ線維芽細胞の溶解後(「ポンペ線維芽細胞の長期処置からの溶解物活性のFIOPC」)もしくはGAA-/-C2C12細胞の溶解後(「長期処置C2C12 GAA-/-からの溶解物活性のFIOPC」)、または6時間処置したポンペ線維芽細胞の溶解後(「ポンペ線維芽細胞の急性処置からの溶解物活性のFIOPC」)もしくはGAA-/-C2C12細胞の溶解後(「急性処置C2C12 GAA-/-からの溶解物活性のFIOPC」)にも試験した。これらのアッセイの結果を表13-1および13-2に提示する。
(実施例14)
配列番号2496のGAAバリアント
配列番号2496のGAAバリアント
本実施例では、配列番号2496から導出したGAAバリアントの、進化についての実験、および一連の曝露後のGAA活性の改善についてのスクリーニングを説明する。配列番号2496によりコードされる/配列番号2496に基づくバリアント遺伝子GAAのライブラリーを、実施例11で説明したように、構築し、播種し、増殖させ、GAA MU-Glu活性(「非曝露活性のFIOPC」)についてスクリーニングし、血漿曝露後(「血漿安定性および活性のFIOPC」)にもスクリーニングした。バリアントを、4-MUGlu活性について、実施例11で説明したように、24時間処置したポンペ線維芽細胞の溶解後(「ポンペ線維芽細胞の長期処置からの溶解物活性のFIOPC」)もしくはGAA-/-C2C12細胞の溶解後(「長期処置C2C12 GAA-/-からの溶解物活性のFIOPC」)、または6時間処置したポンペ線維芽細胞の溶解後(「ポンペ線維芽細胞の急性処置からの溶解物活性のFIOPC」)もしくはGAA-/-C2C12細胞の溶解後(「急性処置C2C12 GAA-/-からの溶解物活性のFIOPC」)にも試験した。これらのアッセイの結果を表14-1および表14-2に提示する。
(実施例15)
配列番号2880のGAAバリアント
配列番号2880のGAAバリアント
本実施例では、配列番号2880から導出したGAAバリアントの、進化についての実験、および一連の曝露後のGAA活性の改善についてのスクリーニングを説明する。配列番号2880によりコードされる/配列番号2880に基づくバリアント遺伝子GAAのライブラリーを、実施例11で説明したように、構築し、播種し、増殖させ、GAA MU-Glu活性(「非曝露活性のFIOPC」)についてスクリーニングし、血漿曝露後(「血漿安定性および活性のFIOPC」)にもスクリーニングした。バリアントを、4-MUGlu活性について、実施例11で説明したように、GAA-/-C2C12細胞の溶解後(「長期処置C2C12 GAA-/-からの溶解物活性のFIOPC」)、または6時間の処置時間のポンペ線維芽細胞の溶解後(「ポンペ線維芽細胞の急性処置からの溶解物活性のFIOPC」)もしくはGAA-/-C2C12細胞の溶解後(「急性処置C2C12 GAA-/-からの溶解物活性のFIOPC」)にも試験した。これらのアッセイの結果を表15-1に提示する。
(実施例16)
配列番号3104のGAAバリアント
配列番号3104のGAAバリアント
本実施例では、配列番号3104から導出したGAAバリアントの、進化についての実験、および一連の曝露後のGAA活性の改善についてのスクリーニングを説明する。配列番号3104によりコードされる/配列番号3104に基づくバリアント遺伝子GAAのライブラリーを、実施例11で説明したように、構築し、播種し、増殖させ、GAA MU-Glu活性(「非曝露活性のFIOPC」)についてスクリーニングし、血漿曝露後(「血漿安定性および活性のFIOPC」)にもスクリーニングした。バリアントを、4-MUGlu活性について、実施例11で説明したように、20時間処置したポンペ線維芽細胞の溶解後(「ポンペ線維芽細胞の長期処置からの溶解物活性のFIOPC」)もしくはGAA-/-C2C12細胞の溶解後(「長期処置C2C12 GAA-/-からの溶解物活性のFIOPC」)、または4時間の処置時間のポンペ線維芽細胞の溶解後(「ポンペ線維芽細胞の急性処置からの溶解物活性のFIOPC」)もしくはGAA-/-C2C12細胞の溶解後(「急性処置C2C12 GAA-/-からの溶解物活性のFIOPC」)にも試験した。これらのアッセイの結果を表16-1に提示する。
(実施例17)
免疫原性が低減された活性GAAバリアントの同定
免疫原性が低減された活性GAAバリアントの同定
WT GAA(配列番号6)における推定的T細胞エピトープを、当技術分野で公知のImmune Epitope Database(IEDB;Immune Epitope Database and Analysis Resourceウェブサイト)ツール、および有標統計解析ツール(例えば、iedb.org and Vita et al.、Nucl. Acids Res.、38(Database issue): D854-62 [2010]. Epub 2009 Nov 11]を参照されたい)を使用して、同定した。WT GAAを、各フレームが最後のフレームと14アミノ酸オーバーラップしている可能な全ての15mer解析フレームにパースした。15mer解析フレームを、ヒト集団のほぼ95%を集合的にカバーする8つの共通するクラスII HLA-DR対立遺伝子(DRB1*0101、DRB1*0301、DRB1*0401、DRB1*0701、DRB1*0801、DRB1*1101、DRB1*1301、およびDRB1*1501)に結合すると予測されるそれらの9merコア領域(例えば、Southwood et al.、J. Immunol.、160:3363-3373 [1998]を参照されたい)を、IEDBウェブサイトで推奨されている方法を使用してスコア化することにより、免疫原性の可能性について評価した。酵素内に含有されている可能性のあるT細胞エピトープクラスター(すなわち、免疫原性の可能性が異常に高い、GAA内に含有されている小領域)を、当技術分野において公知の統計解析ツールを使用して同定した。
実施例5および11で説明したアッセイで活性であると実施例3、4、6、10および12~16で同定したGAAバリアントを、それらの予測される免疫原性レベルについて、8つの共通のクラスII HLA-DR対立遺伝子へのそれらの結合を評価することによって解析した。総免疫原性スコアおよび免疫原性ヒットカウントをバリアントごとに計算した。総免疫原性スコア(TIS)は、バリアントの全体的な予測免疫原性を表す(すなわち、スコアが高いほど、高い予測免疫原性レベルを示す)。免疫原性「ヒットカウント」(IHC)は、免疫原性の可能性が異常に高い15mer解析フレームの数を示す(すなわち、スコアが高いほど、高い免疫原性の可能性を示す)。参照配列と比較して総免疫原性スコアおよび/または免疫原性ヒットカウントの低減をもたらす突然変異を「脱免疫化突然変異」の可能性があると見なした。それらを表17-1、17-2、17-3、17-4、17-5、17-6、17-7、17-8、および17-9に示す。一連の大部分の脱免疫化突然変異を組み換えて、活性であり、WT GAAより免疫原性が有意に低いと予測された、いくつかのバリアントを生成した。
本発明を特定の実施形態に関して説明したが、特定の状況、材料、物質組成、プロセス、プロセスステップ(単数または複数)に適応するように様々な変更を加えることおよび均等物で代用することができ、それによって、特許請求の範囲に記載の範囲を逸脱することなく本発明の利益を得ることができる。
アメリカ合衆国では、本開示に引用した各々のおよびあらゆる公表文献および特許文献は、各々のそのような公表文献または文献が、参照により本明細書に組み込まれると具体的にかつ個々に示されているかのごとく、参照により本明細書に組み込まれる。公表文献および特許文献の引用は、いずれかのそのような文献が関連先行技術であることを示すことを目的としたものでも、その内容または日付について承認するものでもない。
Claims (69)
- 配列番号2、6、8、12、14、16、18、20、946、1956、2496、2880および/または3104に対して少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、または少なくとも99%の配列同一性を含むアミノ酸配列を含む組換え酸性アルファグルコシダーゼおよび/または生物活性組換え酸性アルファグルコシダーゼ断片。
- 前記組換え酸性アルファグルコシダーゼが、配列番号2に対して少なくとも85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%もしくはそれを超える配列同一性を有するポリペプチド配列またはその機能的断片を含み、前記組換え酸性アルファグルコシダーゼが、27、27/944、28、29/478、30、88、107、109、109/842、110、113、135、137、138、148、150、247、274、276、278、375、403、414、418、418/499、421、426、437、444、455、463、471、471/478、476、489、527、547、581、610、642、668、670、692、725/732、750、753、786、820、862、871、895、897、930、934、および944から選択される1つまたは複数の位置に少なくとも1つの置換または置換セットを含み、前記ポリペプチド配列のアミノ酸位置が、配列番号2を参照して番号付けされている、請求項1に記載の組換え酸性アルファグルコシダーゼ。
- 前記組換え酸性アルファグルコシダーゼが、配列番号2に対して少なくとも85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%もしくはそれを超える配列同一性を有するポリペプチド配列またはその機能的断片を含み、前記組換え酸性アルファグルコシダーゼが、29/218/240/668/700/744/869、29/218/240/700/869、29/240/596/668/700/744/869、29/240/596/668/869、36/106/150/218/527/750/883/894、106/112/150/218/414/527/793/883、106/150/169/218/414/486/527/750/894、106/150/169/218/414/486/527/894、106/150/169/218/414/486/749/793/883/894、106/150/169/218/414/486/750/793/883/894、106/150/169/218/414/486/793/883、106/150/169/218/414/486/894、106/150/169/218/414/749/750/793/883、106/150/169/218/414/749/793、106/150/169/218/414/749/793/883、106/150/169/218/486/527/749/793/894、106/150/169/218/486/749/883、106/150/169/218/486/883、106/150/169/218/749/800、106/150/169/414/486/749/750/883、106/150/169/527/749/793/883、106/150/169/749/793/883/894、106/150/218/331/414/486/527/733/749/793、106/150/218/414/486/642/750/793/883、106/150/218/414/486/750/793/894、106/150/218/414/527/749/750/883、106/150/218/414/527/749/793/883/894、106/150/218/414/749/750/793/883/894、106/150/218/414/749/793/883、106/150/218/486/527/749/894、106/150/218/486/793/883、106/150/218/527/749/750/793、106/150/218/527/793/894、106/150/218/749/750/793、106/150/218/793、106/150/218/793/894、106/150/245/793/883/894、106/150/414/749/750/793/894、106/150/414/749/793/894、106/150/486/527/750/793、106/150/486/749/793/883/894、106/150/749/793/883、106/169/185/218/414/749/750/793、106/191/280/402/414/444/727、106/191/414/444/522/928/944、106/191/414/489/928/944、106/280/402/414/444/489/727/944、150/169/218/414/527/793、150/218/414/486/749/750、150/218/414/486/750/793、150/218/414/486/750/793/883、150/218/414/749/750/793/894、150/218/414/749/793、150/218/527/749/793、150/218/749/750/793、150/218/749/793、150/414/486/527/750/894、150/414/486/749/750/793、150/486/750/883/894、169/486/750/793/883、180/275/402/518/547/610/638/669/671、180/402/431/507/547/610/669/671/793、180/402/507/547/610/671、191/280/402/414/444/465/842/928、191/280/402/414/444/489/500/944、191/280/414/444/489/500/522/842/928/944、191/280/414/444/489/522/727/944、191/280/414/489/842/928/944、191/280/414/944、191/414/522/842/944、196/402/431/547/610/638、218/668/700/869、224/402/507/518/547/638/668、269/275/431/518/547/638/668/669、275/281/402/431/507/518/610/668、275/281/402/431/518/547/610/669/671、275/281/402/507/518/547/638/669/671、275/281/402/518/547/610/638/671、275/281/402/518/547/610/668/669/887、275/281/402/547/610/638/669/671、275/281/431/518/547/638/669/671、275/281/507/547/669/671、275/281/610/638/668/669、275/281/671、275/377/402/507/518/669/671/715、275/402/431/507/547/671、275/402/431/518/610/638/669/671/922、275/402/507/547/610/638/668/669、275/402/507/547/610/638/669/671、275/402/507/547/610/671、275/402/547/610/638/669/671、275/402/547/638/669/671、275/402/638/669/671、275/431/507/518/547/668/669/671、275/431/507/518/610/669/671、275/431/507/547/610/638/671、275/431/518/547/638/668、275/431/518/610/638/669/671、275/431/638、275/507/518/547/610/638/668/669、275/507/518/547/638/669/671、275/507/547/610/638/669/671、275/507/547/668/669/671、275/518/671、280/402/536/928、281/402/507/518/547/610/638/669/671、281/402/507/547/638/669/671、281/402/518/547/610/638/668/669、281/402/518/547/668、281/431/507/518/547/610/638/668、402/431/518/547/610/668、402/431/518/547/671、402/431/518/610、402/431/547/638/671、431/507/518/541/547/638/669/671、431/507/518/669/671、507/547/610、507/547/638/669/671、547/610/638/671、および547/638/668から選択される1つまたは複数の位置に少なくとも1つの置換または置換セットを含み、前記ポリペプチド配列のアミノ酸位置が、配列番号2を参照して番号付けされている、請求項1に記載の組換え酸性アルファグルコシダーゼ。
- 前記組換え酸性アルファグルコシダーゼが、配列番号2に対して少なくとも85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%もしくはそれを超える配列同一性を有するポリペプチド配列またはその機能的断片を含み、前記組換え酸性アルファグルコシダーゼが、27、27/944、28、29/218/240/668/700/744/869、29/218/240/700/869、29/240/596/668/700/744/869、29/240/596/668/869、29/478、30、36/106/150/218/527/750/883/894、106/112/150/218/414/527/793/883、106/150/169/218/414/486/527/750/894、106/150/169/218/414/486/527/894、106/150/169/218/414/486/749/793/883/894、106/150/169/218/414/486/750/793/883/894、106/150/169/218/414/486/793/883、106/150/169/218/414/486/894、106/150/169/218/414/749/750/793/883、106/150/169/218/414/749/793、106/150/169/218/414/749/793/883、106/150/169/218/486/749/883、106/150/169/218/486/883、106/150/169/414/486/749/750/883、106/150/169/527/749/793/883、106/150/169/749/793/883/894、106/150/218/331/414/486/527/733/749/793、106/150/218/414/486/642/750/793/883、106/150/218/414/486/750/793/894、106/150/218/414/527/749/750/883、106/150/218/414/527/749/793/883/894、106/150/218/414/749/750/793/883/894、106/150/218/414/749/793/883、106/150/218/486/527/749/894、106/150/218/486/793/883、106/150/218/527/793/894、106/150/245/793/883/894、106/150/414/749/750/793/894、106/150/414/749/793/894、106/150/486/527/750/793、106/150/486/749/793/883/894、106/150/749/793/883、106/169/185/218/414/749/750/793、106/191/280/402/414/444/727、106/280/402/414/444/489/727/944、107、109、109/842、110、135、138、148、150、150/218/414/486/749/750、150/218/414/486/750/793、150/218/414/486/750/793/883、150/218/414/749/750/793/894、150/218/414/749/793、150/414/486/527/750/894、150/414/486/749/750/793、150/486/750/883/894、169/486/750/793/883、180/275/402/518/547/610/638/669/671、180/402/431/507/547/610/669/671/793、180/402/507/547/610/671、191/280/402/414/444/489/500/944、191/280/414/444/489/522/727/944、191/280/414/944、191/414/522/842/944、196/402/431/547/610/638、218/668/700/869、224/402/507/518/547/638/668、269/275/431/518/547/638/668/669、274、275/281/402/431/507/518/610/668、275/281/402/431/518/547/610/669/671、275/281/402/507/518/547/638/669/671、275/281/402/518/547/610/638/671、275/281/402/518/547/610/668/669/887、275/281/402/547/610/638/669/671、275/281/431/518/547/638/669/671、275/281/507/547/669/671、275/281/610/638/668/669、275/377/402/507/518/669/671/715、275/402/431/507/547/671、275/402/431/518/610/638/669/671/922、275/402/507/547/610/638/668/669、275/402/507/547/610/638/669/671、275/402/507/547/610/671、275/402/547/610/638/669/671、275/402/547/638/669/671、275/402/638/669/671、275/431/507/518/547/668/669/671、275/431/507/518/610/669/671、275/431/507/547/610/638/671、275/431/518/547/638/668、275/431/518/610/638/669/671、275/431/638、275/507/518/547/610/638/668/669、275/507/518/547/638/669/671、275/507/547/610/638/669/671、275/507/547/668/669/671、276、281/402/507/518/547/610/638/669/671、281/402/507/547/638/669/671、281/402/518/547/610/638/668/669、281/402/518/547/668、281/431/507/518/547/610/638/668、375、402/431/518/547/610/668、402/431/518/547/671、402/431/518/610、402/431/547/638/671、403、414、418/499、431/507/518/541/547/638/669/671、431/507/518/669/671、437、471/478、507/547/610、507/547/638/669/671、547、547/610/638/671、547/638/668、581、642、670、692、750、753、820、871、および944から選択される1つまたは複数の位置に少なくとも1つの置換または置換セットを含み、前記ポリペプチド配列のアミノ酸位置が、配列番号2を参照して番号付けされている、請求項1に記載の組換え酸性アルファグルコシダーゼ。
- 前記組換え酸性アルファグルコシダーゼが、配列番号6に対して少なくとも85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%もしくはそれを超える配列同一性を有するポリペプチド配列またはその機能的断片を含み、前記組換え酸性アルファグルコシダーゼが、27、27/944、28、29/218/240/668/700/744/869、29/218/240/700/869、29/240/596/668/700/744/869、29/240/596/668/869、29/478、30、36/106/150/218/527/750/883/894、88、106/112/150/218/414/527/793/883、106/150/169/218/414/486/527/750/894、106/150/169/218/414/486/527/894、106/150/169/218/414/486/749/793/883/894、106/150/169/218/414/486/750/793/883/894、106/150/169/218/414/486/793/883、106/150/169/218/414/486/894、106/150/169/218/414/749/750/793/883、106/150/169/218/414/749/793、106/150/169/218/414/749/793/883、106/150/169/218/486/527/749/793/894、106/150/169/218/486/749/883、106/150/169/218/486/883、106/150/169/218/749/800、106/150/169/414/486/749/750/883、106/150/169/527/749/793/883、106/150/169/749/793/883/894、106/150/218/331/414/486/527/733/749/793、106/150/218/414/486/642/750/793/883、106/150/218/414/486/750/793/894、106/150/218/414/527/749/750/883、106/150/218/414/527/749/793/883/894、106/150/218/414/749/750/793/883/894、106/150/218/414/749/793/883、106/150/218/486/527/749/894、106/150/218/486/793/883、106/150/218/527/749/750/793、106/150/218/527/793/894、106/150/218/749/750/793、106/150/218/793、106/150/218/793/894、106/150/245/793/883/894、106/150/414/749/750/793/894、106/150/414/749/793/894、106/150/486/527/750/793、106/150/486/749/793/883/894、106/150/749/793/883、106/169/185/218/414/749/750/793、106/191/280/402/414/444/727、106/191/414/444/522/928/944、106/191/414/489/928/944、106/280/402/414/444/489/727/944、107、109、109/842、110、113、135、137、138、148、150、150/169/218/414/527/793、150/218/414/486/749/750、150/218/414/486/750/793、150/218/414/486/750/793/883、150/218/414/749/750/793/894、150/218/414/749/793、150/218/527/749/793、150/218/749/750/793、150/218/749/793、150/414/486/527/750/894、150/414/486/749/750/793、150/486/750/883/894、169/486/750/793/883、180/275/402/518/547/610/638/669/671、180/402/431/507/547/610/669/671/793、180/402/507/547/610/671、191/280/402/414/444/465/842/928、191/280/402/414/444/489/500/944、191/280/414/444/489/500/522/842/928/944、191/280/414/444/489/522/727/944、191/280/414/489/842/928/944、191/280/414/944、191/414/522/842/944、196/402/431/547/610/638、218/668/700/869、224/402/507/518/547/638/668、247、269/275/431/518/547/638/668/669、274、275/281/402/431/507/518/610/668、275/281/402/431/518/547/610/669/671、275/281/402/507/518/547/638/669/671、275/281/402/518/547/610/638/671、275/281/402/518/547/610/668/669/887、275/281/402/547/610/638/669/671、275/281/431/518/547/638/669/671、275/281/507/547/669/671、275/281/610/638/668/669、275/281/671、275/377/402/507/518/669/671/715、275/402/431/507/547/671、275/402/431/518/610/638/669/671/922、275/402/507/547/610/638/668/669、275/402/507/547/610/638/669/671、275/402/507/547/610/671、275/402/547/610/638/669/671、275/402/547/638/669/671、275/402/638/669/671、275/431/507/518/547/668/669/671、275/431/507/518/610/669/671、275/431/507/547/610/638/671、275/431/518/547/638/668、275/431/518/610/638/669/671、275/431/638、275/507/518/547/610/638/668/669、275/507/518/547/638/669/671、275/507/547/610/638/669/671、275/507/547/668/669/671、275/518/671、276、278、280/402/536/928、281/402/507/518/547/610/638/669/671、281/402/507/547/638/669/671、281/402/518/547/610/638/668/669、281/402/518/547/668、281/431/507/518/547/610/638/668、375、402/431/518/547/610/668、402/431/518/547/671、402/431/518/610、402/431/547/638/671、403、414、418、418/499、421、426、431/507/518/541/547/638/669/671、431/507/518/669/671、437、444、455、463、471、471/478、476、489、507/547/610、507/547/638/669/671、527、547、547/610/638/671、547/638/668、581、610、642、668、670、692、725/732、750、753、786、820、862、871、895、897、934、および944から選択される1つまたは複数の位置に少なくとも1つの置換または置換セットを含み、前記ポリペプチド配列のアミノ酸位置が、配列番号6を参照して番号付けされている、請求項1に記載の組換え酸性アルファグルコシダーゼ。
- 前記組換え酸性アルファグルコシダーゼが、配列番号8に対して少なくとも85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%もしくはそれを超える配列同一性を有するポリペプチド配列またはその機能的断片を含み、前記組換え酸性アルファグルコシダーゼが、4、27、27/28/489、27/418/478、28、28/29、28/29/113/135/138、28/29/113/135/418、28/29/135、28/29/418、29/113/126/135/193、29/113/135、29/113/135/455、29/113/138、29/148、29/478、106、106/138/218/431/671/749、106/218/281、106/218/455、106/218/455/507/749、106/489/671、106/638、106/671/934、113、113/135/418、113/418/455/478/581、113/418/478/489/581、135、135/148/150/418、135/478/489/581、135/489、135/944、138/218/668/671、138/218/749/934、138/671/749/934、157、218、218/281、218/281/431、218/281/671、218/431、218/431/489/507/749/934、218/455、218/507/749、218/507/934、218/638/671、218/749、281/431/489/668、345/934、418、418/489、431/668/671、489/638/934、489/671/934、489/749、489/934、507/668、507/671/934、671/749、671/934、および749/784から選択される1つまたは複数の位置に少なくとも1つの置換または置換セットを含み、前記ポリペプチド配列のアミノ酸位置が、配列番号8を参照して番号付けされている、請求項1に記載の組換え酸性アルファグルコシダーゼ。
- 前記組換え酸性アルファグルコシダーゼが、配列番号8に対して少なくとも85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%もしくはそれを超える配列同一性を有するポリペプチド配列またはその機能的断片を含み、前記組換え酸性アルファグルコシダーゼが、27、27/418/478、28、28/29、28/29/113/135/138、28/29/113/135/418、28/29/135、28/29/418、29/113/126/135/193、29/113/135、29/113/135/455、29/113/138、29/148、29/478、106、106/138/218/431/671/749、106/489/671、106/638、113/135/418、113/418/455/478/581、113/418/478/489/581、135、135/148/150/418、135/478/489/581、135/944、138/218/668/671、157、218/638/671、418、418/489、431/668/671、507/668、および671/749から選択される1つまたは複数の位置に少なくとも1つの置換または置換セットを含み、前記ポリペプチド配列のアミノ酸位置が、配列番号8を参照して番号付けされている、請求項1に記載の組換え酸性アルファグルコシダーゼ。
- 前記組換え酸性アルファグルコシダーゼが、配列番号12に対して少なくとも85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%もしくはそれを超える配列同一性を有するポリペプチド配列またはその機能的断片を含み、前記組換え酸性アルファグルコシダーゼが、4、27、27/28/489、27/418/478、28、28/29、28/29/113/135/138、28/29/113/135/418、28/29/135、28/29/418、29/113/126/135/193、29/113/135、29/113/135/455、29/113/138、29/148、29/478、106、106/138/218/431/671/749、106/218/281、106/218/455、106/218/455/507/749、106/489/671、106/638、106/671/934、113、113/135/418、113/418/455/478/581、113/418/478/489/581、135、135/148/150/418、135/478/489/581、135/489、135/944、138/218/668/671、138/218/749/934、138/671/749/934、157、218、218/281/431、218/281/671、218/431、218/455、218/507/749、218/638/671、218/749、281/431/489/668、345/934、418、418/489、431/668/671、489/638/934、489/671/934、489/749、489/934、507/668、507/671/934、671/749、671/934、および749/784から選択される1つまたは複数の位置に少なくとも1つの置換または置換セットを含み、前記ポリペプチド配列のアミノ酸位置が、配列番号12を参照して番号付けされている、請求項1に記載の組換え酸性アルファグルコシダーゼ。
- 前記組換え酸性アルファグルコシダーゼが、配列番号14に対して少なくとも85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%もしくはそれを超える配列同一性を有するポリペプチド配列またはその機能的断片を含み、前記組換え酸性アルファグルコシダーゼが、22、24、27、27/165、30、33、34、37/62、37/62/79/196/696/862、37/62/523、37/62/523/793、37/64/66/79/154/523/681/793/862、37/79/154/793、37/196、37/528/696/793、37/528/790、37/528/790/793/862、37/790/793、39、39/58/489/725/830/842/930/944、39/70/109/830/842、39/70/489/612、39/70/725、39/267、39/267/489/522/612/830/842、39/267/489/830/944、39/489/500/612、39/500/612、40、44/157、47、49、50、55、60/500/612、62/79/154/862、62/79/196/681/862、62/79/523/528/790、62/79/790/793、62/79/862、62/92、62/92/790/793、62/106/523/528/696/793/862、62/154/696/793/862、62/793/862、68、70、70/267/725/944、70/267/930/944、70/489/930、70/725/830/860/930/944、77、79/154/681、79/154/793/862、79/862、89、97、106/154、107、109、109/522/612/725、109/522/830/944、109/612、118、149、157、158、178、179、196/528/681/790/793、207、208、217、267/489/500/725/830/930、267/522/725、352、385、424、448、463、489/830/944、500、500/612/830/860、500/860/930、500/930/944、522/725、523、523/790/793、528/681、528/793、528/862、672、673、725、734、740、753、774、778、793、830、844、862、875、880、892、902、922、925、930、932、934、938、および944から選択される1つまたは複数の位置に少なくとも1つの置換または置換セットを含み、前記ポリペプチド配列のアミノ酸位置が、配列番号14を参照して番号付けされている、請求項1に記載の組換え酸性アルファグルコシダーゼ。
- 前記組換え酸性アルファグルコシダーゼが、配列番号18に対して少なくとも85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%もしくはそれを超える配列同一性を有するポリペプチド配列またはその機能的断片を含み、前記組換え酸性アルファグルコシダーゼが、22、24、27、27/165、30、33、34、37/62、37/62/79/196/696/862、37/62/523、37/196、37/528/790、39、39/70/109/830/842、39/70/725、39/267、39/267/489/522/612/830/842、39/267/489/830/944、40、70/267/725/944、70/267/930/944、70/489/930、107、109、109/522/830/944、217、267/489/500/725/830/930、267/522/725、352、385、500/930/944、673、734、774、778、875、930、932、および934から選択される1つまたは複数の位置に少なくとも1つの置換または置換セットを含み、前記ポリペプチド配列のアミノ酸位置が、配列番号18を参照して番号付けされている、請求項1に記載の組換え酸性アルファグルコシダーゼ。
- 前記組換え酸性アルファグルコシダーゼが、配列番号20に対して少なくとも85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%もしくはそれを超える配列同一性を有するポリペプチド配列またはその機能的断片を含み、前記組換え酸性アルファグルコシダーゼが、22/24、22/24/27/50/107/109/489/612/725、22/24/27/489、22/24/27/489/612/774、22/24/27/612/944、22/24/50/109/267/489/774/944、22/24/50/267/612/922/944、22/24/107/267/489/922、22/24/489、22/24/612/725/944、22/50/107/267/489/612/944、22/50/109/267/489、22/267/489/612、24、24/27/50/107/267/774/944、24/27/89/500/842、24/27/107/267/612/944、24/27/267/944、24/27/500/842、24/27/500/842/932、24/27/944、24/39/49/89/97/842/932、24/39/68/89/107/500/842、24/39/89/97/842/932、24/39/842/932、24/50/489/944、24/50/612、24/70/107/109/489/612/725、24/70/267/774、24/89/500、24/107/109/267/489/612/725/774、24/109/612、24/109/944、24/267/725/944、24/489/944、24/725、24/842/932、24/944、27/39/49/97/500/842、27/49/68/500/842、34/39/500/932、39/89/97/500、42、48、50/109/489/612、50/489/774、50/612/944、57、62、68、68/89/97/932、71、88、89/97/107、89/97/500、89/842、107/109、107/500/842、108、109/612/774/944、112、123、124、148、188、193、197、204、253、264、305、312、333、381、402、402/781、489、489/944、500/842、500/932、523、527、612、612/725/944、612/922、614、727、742、748、820、823、832、842/932、858、862、911、913、914、916、923、937、および940から選択される1つまたは複数の位置に少なくとも1つの置換または置換セットを含み、前記ポリペプチド配列のアミノ酸位置が、配列番号20を参照して番号付けされている、請求項1に記載の組換え酸性アルファグルコシダーゼ。
- 前記組換え酸性アルファグルコシダーゼが、配列番号20に対して少なくとも85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%もしくはそれを超える配列同一性を有するポリペプチド配列またはその機能的断片を含み、前記組換え酸性アルファグルコシダーゼが、22/24、22/24/27/50/107/109/489/612/725、22/24/27/489、22/24/27/489/612/774、22/24/27/612/944、22/24/50/109/267/489/774/944、22/24/50/267/612/922/944、22/24/107/267/489/922、22/24/489、22/24/612/725/944、22/50/107/267/489/612/944、22/50/109/267/489、22/267/489/612、24、24/27/50/107/267/774/944、24/27/89/500/842、24/27/107/267/612/944、24/27/267/944、24/27/500/842、24/27/500/842/932、24/27/944、24/39/49/89/97/842/932、24/39/68/89/107/500/842、24/39/89/97/842/932、24/39/842/932、24/50/489/944、24/50/612、24/70/107/109/489/612/725、24/70/267/774、24/89/500、24/107/109/267/489/612/725/774、24/109/612、24/109/944、24/267/725/944、24/489/944、24/725、24/842/932、24/944、27/39/49/97/500/842、27/49/68/500/842、34/39/500/932、50/109/489/612、50/612/944、68/89/97/932、89/97/107、89/842、106、107/109、107/500/842、108、109/612/774/944、112、148、148/772、188/377、238、240、240/374、243、244、246、248、249/777、252、253、259、260、261、262、264、279、305、309、312、319、320、329、333、387、402、421、432、500/842、500/932、556、612、612/725/944、612/922、727、736、737、741、742、748、815、816、818、823、832、842/932、911、913、914、916、923、937、および940から選択される1つまたは複数の位置に少なくとも1つの置換または置換セットを含み、前記ポリペプチド配列のアミノ酸位置が、配列番号20を参照して番号付けされている、請求項1に記載の組換え酸性アルファグルコシダーゼ。
- 前記組換え酸性アルファグルコシダーゼが、配列番号20に対して少なくとも85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%もしくはそれを超える配列同一性を有するポリペプチド配列またはその機能的断片を含み、前記組換え酸性アルファグルコシダーゼが、29、42、45、48、57、61、62、63、71、88、91、106、108、112、123、124、127/914、148、148/772、154、186、188、188/377、193、195、197、204、205、237、238、240、240/374、243、244、246、248、249、249/777、251、252、253、255、259、260、261、262、264、279、298/421、305、309、312、319、320、323、325、329、333、381、387、402、421、432、445、455、523、527、556、614、682、727、736、737、741、748、815、816、818、820、823、832、858、862、911、913、914、916、937、および940から選択される1つまたは複数の位置に少なくとも1つの置換または置換セットを含み、前記ポリペプチド配列のアミノ酸位置が、配列番号20を参照して番号付けされている、請求項1に記載の組換え酸性アルファグルコシダーゼ。
- 前記組換え酸性アルファグルコシダーゼが、配列番号946に対して少なくとも85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%もしくはそれを超える配列同一性を有するポリペプチド配列またはその機能的断片を含み、前記組換え酸性アルファグルコシダーゼが、19/124/149/381/727、24/39/489/862、24/57/62/89/489/823/862、24/57/823/862、24/62/89/188/823/842/862、24/89/489、24/89/489/727/862、24/489/500/842、39/57/62/188/500/842、39/57/500/862、57、57/62/120/527/913/916、57/62/305/437/500/614/727/916、57/62/305/437/500/727/913/916、57/62/305/437/614/683/913/916/932、57/62/305/489/907/913/916、57/62/305/489/913/916、57/62/305/500/913/916、57/62/305/913、57/62/305/916、57/62/437/500/761/914/916、57/62/437/527/727、57/62/437/913/916、57/62/913/916/932、57/62/916、57/188/489/823/862、57/305、57/305/437/916、57/437/500/527/727/916、57/437/500/614/727/914、57/437/913/914、57/489/527/914/916、57/614/916/932、62/89、62/89/124/148/381/858、62/89/124/381/858、62/89/148/381/614/858、62/89/148/923、62/89/149/381、62/89/149/381/832、62/89/188/489/500/727/823、62/89/381、62/89/381/858、62/89/381/923、62/89/858、62/96/614、62/124/148/149/381/614、62/124/149/381/832/858/937、62/124/188/823/842/862、62/124/381/832、62/148/149/381/858/937、62/148/381/614/937、62/148/381/727、62/148/381/858、62/149/381/614/937、62/149/381/858/937、62/149/727、62/305/437/500/727/913、62/305/727、62/381、62/437/489/527/727/913/932、62/437/489/614/727/913、62/437/527/727、62/437/527/916/932、62/437/913/916、62/489/500/932、62/489/527/916/932、62/489/614/916、62/500、62/527、62/527/727/916、62/614、62/727、62/916、89/148/149、89/148/149/381、89/381、124/148/381/727/858/937、124/381/614、124/500/842/862、124/832/937、148/832/858/937、381、381/614/832、381/858/937、437、437/489/914/916、437/727/914、437/914/916、489/500、489/614/916、500/727/913/916、500/914/916、および923から選択される1つまたは複数の位置に少なくとも1つの置換または置換セットを含み、前記ポリペプチド配列のアミノ酸位置が、配列番号946を参照して番号付けされている、請求項1に記載の組換え酸性アルファグルコシダーゼ。
- 前記組換え酸性アルファグルコシダーゼが、配列番号946に対して少なくとも85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%もしくはそれを超える配列同一性を有するポリペプチド配列またはその機能的断片を含み、前記組換え酸性アルファグルコシダーゼが、57/62/120/527/913/916、57/62/305/437/500/614/727/916、57/62/305/437/500/727/913/916、57/62/305/437/614/683/913/916/932、57/62/305/489/907/913/916、57/62/305/489/913/916、57/62/305/500/913/916、57/62/305/913、57/62/305/916、57/62/437/500/761/914/916、57/62/437/527/727、57/62/437/913/916、57/62/913/916/932、57/62/916、57/188/489/823/862、57/305、57/305/437/916、57/437/500/527/727/916、57/437/500/614/727/914、57/437/913/914、57/489/527/914/916、57/614/916/932、62/89/188/489/500/727/823、62/124/188/823/842/862、62/305/437/500/727/913、62/305/727、62/437/489/527/727/913/932、62/437/489/614/727/913、62/437/527/727、62/437/527/916/932、62/437/913/916、62/489/500/932、62/489/527/916/932、62/527/727/916、62/727、62/916、124/500/842/862、437、437/489/914/916、437/727/914、437/914/916、489/614/916、500/727/913/916、500/914/916、および923から選択される1つまたは複数の位置に少なくとも1つの置換または置換セットを含み、前記ポリペプチド配列のアミノ酸位置が、配列番号946を参照して番号付けされている、請求項1に記載の組換え酸性アルファグルコシダーゼ。
- 前記組換え酸性アルファグルコシダーゼが、配列番号1956に対して少なくとも85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%もしくはそれを超える配列同一性を有するポリペプチド配列またはその機能的断片を含み、前記組換え酸性アルファグルコシダーゼが、3/569、41/53、44、44/347、56、65、78、78/87/176/266/536/615、78/87/266、78/87/266/372/386/777、78/87/266/372/536、78/87/266/483/924、78/87/483/777、78/87/536、78/266/483/536/615、78/266/483/795、78/266/763、78/372/390、78/390、78/536/615、87、87/266、87/266/372/483、87/266/483、87/266/924、87/372/777、87/536/777、87/615、87/795、105、136、141、145、154/588、156、157、199、202、222、225、227、229、266、266/372/536/615/763/777、266/372/924、266/536/615/795、344、348、390/615、412、423、425/678/894、430、446、484、488、496、499/711、503、530、543、569、572、573、574、577、578、579、580、581、583、585、588、589/663、615、628、629、631、633、656、663、669、670、671、678、679、687、690、691、692、693、705、706、708、709、710、711、726、768、773、777、779、795、797、816、826、834、857、859、868、869、871、873、877、878、および909から選択される1つまたは複数の位置に少なくとも1つの置換または置換セットを含み、前記ポリペプチド配列のアミノ酸位置が、配列番号1956を参照して番号付けされている、請求項1に記載の組換え酸性アルファグルコシダーゼ。
- 前記組換え酸性アルファグルコシダーゼが、配列番号1956に対して少なくとも85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%もしくはそれを超える配列同一性を有するポリペプチド配列またはその機能的断片を含み、前記組換え酸性アルファグルコシダーゼが、44、53、56、63、65、105、125、129、136、139、141、142、145、152、156、162、176、177、185、186、187、199、199/775、202、265、267、337、344、348、350、354、372、373、401、412、446、469、484、488、493、496、499、503、526、543、612、615、649、677、678、679、730、752、765、768、773、777、779、788、797、822、826、834、855、856、857、859、860、924、926、931、および936から選択される1つまたは複数の位置に少なくとも1つの置換または置換セットを含み、前記ポリペプチド配列のアミノ酸位置が、配列番号1956を参照して番号付けされている、請求項1に記載の組換え酸性アルファグルコシダーゼ。
- 前記組換え酸性アルファグルコシダーゼが、配列番号1956に対して少なくとも85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%もしくはそれを超える配列同一性を有するポリペプチド配列またはその機能的断片を含み、前記組換え酸性アルファグルコシダーゼが、78/87/176/266/536/615、78/87/266/372/386/777、78/87/266/372/536、78/266/763、78/372/390、87/266/372/483、87/372/777、105、125、129、136、139、141、142、152、154/588、156、222、225、227、229、266/372/536/615/763/777、266/372/924、267、372、401、493、496、499、569、572、573、574、577、579、580、581、583、585、588、589/663、628、629、631、663、669、670、671、691、692、693、706、708、710、711、765、768、779、797、826、834、855、856、857、869、871、873、878、909、924、および926から選択される1つまたは複数の位置に少なくとも1つの置換または置換セットを含み、前記ポリペプチド配列のアミノ酸位置が、配列番号1956を参照して番号付けされている、請求項1に記載の組換え酸性アルファグルコシダーゼ。
- 前記組換え酸性アルファグルコシダーゼが、配列番号2496に対して少なくとも85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%もしくはそれを超える配列同一性を有するポリペプチド配列またはその機能的断片を含み、前記組換え酸性アルファグルコシダーゼが、246、304、313、569、569/588、569/588/589/628/629/692/711、569/588/678/692、569/588/711/869/871/878、569/588/878、569/589/628/670/678/692/711/795/871、569/589/628/670/692/711、569/589/628/692/711/795、569/589/670、569/589/670/678/692/711/795、569/589/670/871、569/589/678/871/878、569/589/692/795/871/878、569/589/711/871、569/589/871、569/628、569/628/670、569/628/670/678、569/628/670/692/711/871、569/628/670/711、569/628/678/711、569/628/692、569/670、569/670/678、569/670/678/692/871、569/670/692、569/670/711、569/670/711/871、569/678/692/795、569/678/869/878、569/678/878、569/692、569/692/711、569/692/711/869/871/878、569/711、569/711/795/871/878、569/711/869/878、569/711/871、569/795、569/871、572/588/678/692/869/878、572/588/795、572/692/869/878、572/692/878、582、584、585、588/589/628/678、589、589/670/692/795/871、589/670/795/871、589/871、628/629/692/871/878、628/670、628/670/692/711/795、628/711/795、628/871、628/878、629/869/878、670/678、670/678/692/871、670/692/871、678/692/711/869、678/692/795/869、678/692/869、678/795/871/878、692、692/711、692/711/795/869、692/711/795/869/871/878、692/711/869/878、692/711/871/878、692/869、692/869/871/878/916、692/871、711、711/795/869/878、711/869/878、711/871、795/878、812、871、および878から選択される1つまたは複数の位置に少なくとも1つの置換または置換セットを含み、前記ポリペプチド配列のアミノ酸位置が、配列番号2496を参照して番号付けされている、請求項1に記載の組換え酸性アルファグルコシダーゼ。
- 前記組換え酸性アルファグルコシダーゼが、配列番号2496に対して少なくとも85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%もしくはそれを超える配列同一性を有するポリペプチド配列またはその機能的断片を含み、前記組換え酸性アルファグルコシダーゼが、60/589、307、313、584、および810から選択される1つまたは複数の位置に少なくとも1つの置換または置換セットを含み、前記ポリペプチド配列のアミノ酸位置が、配列番号2496を参照して番号付けされている、請求項1に記載の組換え酸性アルファグルコシダーゼ。
- 前記組換え酸性アルファグルコシダーゼが、配列番号2496に対して少なくとも85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%もしくはそれを超える配列同一性を有するポリペプチド配列またはその機能的断片を含み、前記組換え酸性アルファグルコシダーゼが、60/589、246、304、307、313、569、569/588、569/588/589/628/629/692/711、569/588/678/692、569/588/711/869/871/878、569/588/878、569/589/628/670/678/692/711/795/871、569/589/628/670/692/711、569/589/628/692/711/795、569/589/670、569/589/670/678/692/711/795、569/589/670/871、569/589/678/871/878、569/589/692/795/871/878、569/589/711/871、569/589/871、569/628、569/628/670、569/628/670/678、569/628/670/692/711/871、569/628/670/711、569/628/678/711、569/628/692、569/670、569/670/678、569/670/678/692/871、569/670/692、569/670/711、569/670/711/871、569/678/692/795、569/678/869/878、569/678/878、569/692、569/692/711、569/692/711/869/871/878、569/711、569/711/795/871/878、569/711/869/878、569/711/871、569/795、569/871、572/588/678/692/869/878、572/588/795、572/692/869/878、572/692/878、582、584、585、588/589/628/678、589、589/670/692/795/871、589/670/795/871、589/871、628/629/692/871/878、628/670、628/670/692/711/795、628/711/795、628/871、628/878、629/869/878、670/678、670/678/692/871、670/692/871、678/692/711/869、678/692/795/869、678/692/869、678/795/871/878、692、692/711、692/711/795/869、692/711/795/869/871/878、692/711/869/878、692/711/871/878、692/869、692/869/871/878/916、692/871、711、711/795/869/878、711/869/878、711/871、795/878、810、812、871、および878から選択される1つまたは複数の位置に少なくとも1つの置換または置換セットを含み、前記ポリペプチド配列のアミノ酸位置が、配列番号2496を参照して番号付けされている、請求項1に記載の組換え酸性アルファグルコシダーゼ。
- 前記組換え酸性アルファグルコシダーゼが、配列番号2880に対して少なくとも85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%もしくはそれを超える配列同一性を有するポリペプチド配列またはその機能的断片を含み、前記組換え酸性アルファグルコシダーゼが、24/28/29/39/50/62/78/87/135/150/266/267/522/527/551/670/727/750/830/842/871/883/894/932、24/28/39/50/62/78/87/135/150/266/267/522/527/551/569/727/830/842/871/883/894/913、24/28/50/135/150/437/522/527/871/883/894/932、24/28/62/522/569/932、24/28/437/486/527、24/29/39/50/62/78/87/135/150/267/437/486/522/527/551/711/727/750/830/842/871/883/894/913/932、24/50/78/87/135/150/267/486/522/527/551/670/727/750/830/842/871/883/894/913/932、24/50/486/527/711/727、24/62/87/486/727、24/62/727/830/932、24/87/135/522/670/711/830/842/913、24/150/522/527/727/883/894、24/527/727/842/871/883/913/932、24/670/727/750/842/871、28、28/50/78/87/135/266/267/437/486/527/551/670/727/750/830/842/871/883/894/913/932、28/50/522/527/711/727/871、28/62、28/62/267/932、28/437/527/871、28/522/527/569/711/830/894、28/727、28/727/871、29/39/50/62/65/78/87/135/150/437/551/569/670/727/750/830/842/883/894/932、29/62/437/527、29/78/87/150/527/727、29/78/135/727/830、29/87、29/135/150/527/670/727/883、29/150/267/727/750/871/883/932、29/150/437/727、29/522/670/711/871、29/670/932、39/50、39/727/750/932、50/135/150/932、50/437/522/527、50/711、50/727/750/883/894、62、62/87/150、62/87/150/727、62/135/522/711/727/750/842/871/894、62/437、62/437/727、78/87/486/527/670/727/750/830/842/871/913/932、87/750、89/109/527/678/727/842、89/109/678/727/736/812/878、89/109/727/932、89/109/932、89/527、89/527/678/692/736/842/878/932、89/527/678/932、89/527/727/812/860、89/678/692/736/932、89/678/812/878、89/842/878、109/527/678/812、109/678/692/842/860/878/932、109/678/727/860、109/678/736/812/878、109/678/812、109/678/842/878、109/692/727/736/812、109/692/727/812/842/860、109/727/860/878、109/736/932、109/812、109/842、109/932、135/670/727、135/711/750/932、150/527/842/871/913、150/871/932、150/883/932、267/527/727、403/527/678/692/736/812/842/860、437/522/527/670/871、437/750/830/932、522、522/527/569/727、522/830、527、527/678/692/727/736/878、527/678/692/812/932、527/692/727/736/812、527/692/727/736/842/860/878、527/727/736、527/736/932、527/812、670/711/871、670/830/871、678/692/727/812/842、678/692/812、678/812、678/860/878、678/913、678/932、692/727/736/842/913、692/812、727、727/932、871、および878/932から選択される1つまたは複数の位置に少なくとも1つの置換または置換セットを含み、前記ポリペプチド配列のアミノ酸位置が、配列番号2880を参照して番号付けされている、請求項1に記載の組換え酸性アルファグルコシダーゼ。
- 前記組換え酸性アルファグルコシダーゼが、配列番号2880に対して少なくとも85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%もしくはそれを超える配列同一性を有するポリペプチド配列またはその機能的断片を含み、前記組換え酸性アルファグルコシダーゼが、62/87/150、89/109/527/678/727/842、89/109/678/727/736/812/878、89/109/932、89/527/678/692/736/842/878/932、89/527/727/812/860、89/678/692/736/932、89/678/812/878、109/527/678/812、109/678/692/842/860/878/932、109/678/736/812/878、109/678/812、109/692/727/736/812、109/692/727/812/842/860、109/736/932、109/812、109/842、109/932、403/527/678/692/736/812/842/860、522/830、527/678/692/727/736/878、527/678/692/812/932、527/692/727/736/812、527/692/727/736/842/860/878、527/727/736、527/736/932、527/812、678/692/727/812/842、678/692/812、678/812、692/727/736/842/913、および692/812から選択される1つまたは複数の位置に少なくとも1つの置換または置換セットを含み、前記ポリペプチド配列のアミノ酸位置が、配列番号2880を参照して番号付けされている、請求項1に記載の組換え酸性アルファグルコシダーゼ。
- 前記組換え酸性アルファグルコシダーゼが、配列番号3104に対して少なくとも85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%もしくはそれを超える配列同一性を有するポリペプチド配列またはその機能的断片を含み、前記組換え酸性アルファグルコシダーゼが、62、62/89/830、62/248/678/830/878/932、62/678、62/678/785、62/678/830、62/678/830/860、62/678/830/860/871/878/932、62/678/830/860/878、62/678/830/860/878/932、62/678/830/860/932、62/678/830/871、62/678/830/871/932、62/678/830/878/932、62/678/830/932、62/678/860、62/678/860/878、62/678/860/932、62/678/871、62/678/871/932、62/678/878/932、62/678/932、62/830、62/830/860、62/830/860/871/873、62/830/860/878/932、62/830/860/932、62/830/871/932、62/830/878、62/830/932、62/833/860/932、62/860、62/860/871、62/860/871/878、62/860/871/932、62/860/878/932、62/860/932、62/871/878/932、62/871/932、62/878、62/878/932、62/932、678、678/830/932、678/932、および860/932から選択される1つまたは複数の位置に少なくとも1つの置換または置換セットを含み、前記ポリペプチド配列のアミノ酸位置が、配列番号3104を参照して番号付けされている、請求項1に記載の組換え酸性アルファグルコシダーゼ。
- 前記組換え酸性アルファグルコシダーゼが、配列番号3104に対して少なくとも85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%もしくはそれを超える配列同一性を有するポリペプチド配列またはその機能的断片を含み、前記組換え酸性アルファグルコシダーゼが、62/89/830、62/830、62/830/860、62/830/860/932、および62/830/932から選択される1つまたは複数の位置に少なくとも1つの置換または置換セットを含み、前記ポリペプチド配列のアミノ酸位置が、配列番号3104を参照して番号付けされている、請求項1に記載の組換え酸性アルファグルコシダーゼ。
- 表3-1、3-2、4-1、6-1、10-1、10-2、12-1、13-1、13-2、14-1、14-2、15-1、16-1、17-1、17-2、17-3、17-4、17-5、17-6、17-7、17-8、および/または17-9で提供されるように少なくとも1つの位置に少なくとも1つの突然変異を含む、請求項1に記載の組換え酸性アルファグルコシダーゼ。
- ヒト酸性アルファグルコシダーゼに由来する、請求項1から26のいずれかに記載の組換え酸性アルファグルコシダーゼ。
- 配列番号2、6、8、12、14、16、18、20、946、1956、2496、2880、および/または3104のポリペプチド配列を含む組換え酸性アルファグルコシダーゼ。
- 配列番号2、6、8、12、14、16、18、20、946、1956、2496、2880、および/または3104の酸性アルファグルコシダーゼより熱安定性が高い、請求項1から28のいずれかに記載の組換え酸性アルファグルコシダーゼ。
- pH7で配列番号2、6、8、12、14、16、18、20、946、1956、2496、2880、および/または3104の酸性アルファグルコシダーゼより安定性が高い、請求項1から29のいずれかに記載の組換え酸性アルファグルコシダーゼ。
- pH4で配列番号2、6、8、12、14、16、18、20、946、1956、2496、2880、および/または3104の酸性アルファグルコシダーゼより安定性が高い、請求項1から30のいずれかに記載の組換え酸性アルファグルコシダーゼ。
- 配列番号2、6、8、12、14、16、18、20、946、1956、2496、2880、および/または3104の酸性アルファグルコシダーゼと比べて発現の増加を示す、請求項1から31のいずれかに記載の組換え酸性アルファグルコシダーゼ。
- 配列番号2、6、8、12、14、16、18、20、946、1956、2496、2880、および/または3104の酸性アルファグルコシダーゼよりリソソーム安定性が高い、請求項1から32のいずれかに記載の組換え酸性アルファグルコシダーゼ。
- 配列番号2、6、8、12、14、16、18、20、946、1956、2496、2880、および/または3104の酸性アルファグルコシダーゼより容易に細胞に取り込まれる、請求項1から33のいずれかに記載の組換え酸性アルファグルコシダーゼ。
- 細胞溶解物において配列番号2、6、8、12、14、16、18、20、946、1956、2496、2880、および/または3104の酸性アルファグルコシダーゼより大きい酵素活性を示す、請求項1から34のいずれかに記載の組換え酸性アルファグルコシダーゼ。
- 配列番号2、6、8、12、14、16、18、20、946、1956、2496、2880、および/または3104の酸性アルファグルコシダーゼと比較して免疫原性の低下を示す、請求項1から35のいずれかに記載の組換え酸性アルファグルコシダーゼ。
- 精製されている、請求項1から36のいずれかに記載の組換え酸性アルファグルコシダーゼ。
- 参照配列と比較して、i)触媒活性の増強、ii)pH7に対する耐性の増大、iii)pH4に対する耐性の増大、iv)発現の増加、v)細胞への取込みの増加、vi)細胞溶解物における酵素活性の増加、vii)免疫原性の低下、またはi)、ii)、iii)、iv)、v)、v)、および/もしくはvii)のいずれかの組合せから選択される、少なくとも1つの改善された特性を示す、請求項1から37のいずれかに記載の組換え酸性アルファグルコシダーゼ。
- 前記参照配列が、配列番号2、6、8、12、14、16、18、20、946、1956、2496、2880、および/または3104から選択される、請求項38に記載の組換え酸性アルファグルコシダーゼ。
- 請求項1から39のいずれかに記載の少なくとも1つの組換え酸性アルファグルコシダーゼを含む組成物。
- 請求項1から40のいずれかに記載の少なくとも1つの組換え酸性アルファグルコシダーゼをコードする組換えポリヌクレオチド配列。
- DNA、RNAおよびmRNAから選択される、請求項41に記載の組換えポリヌクレオチド配列。
- コドン最適化されている、請求項41および/または42に記載の組換えポリヌクレオチド配列。
- 請求項41、42および/または43に記載の組換えポリヌクレオチド配列を含む発現ベクター。
- 前記組換えポリヌクレオチド配列が、制御配列に作動可能に連結されている、請求項44に記載の発現ベクター。
- 前記制御配列がプロモーターである、請求項45に記載の発現ベクター。
- 前記プロモーターが、異種プロモーターである、請求項46に記載の発現ベクター。
- 発現ベクターpDH。
- 配列番号3379または配列番号3380のヌクレオチド配列を含む、請求項48に記載の発現ベクターpDH。
- 配列番号7~3377のうちの奇数番号の配列のいずれかのポリヌクレオチド配列を含む、請求項48に記載の発現ベクター。
- 請求項44から50のいずれかに記載の発現ベクターを含む宿主細胞。
- 真核生物および原核生物から選択される、請求項51に記載の宿主細胞。
- 哺乳動物細胞である、請求項51および/または52に記載の宿主細胞。
- 組換え酸性アルファグルコシダーゼバリアントを産生する方法であって、請求項52から53のいずれかに記載の前記宿主細胞を、前記組換えポリヌクレオチドによりコードされる前記酸性アルファグルコシダーゼが産生される条件下で培養するステップを含む方法。
- 前記酸性アルファグルコシダーゼを回収するステップをさらに含む、請求項54に記載の方法。
- 前記酸性アルファグルコシダーゼを精製するステップをさらに含む、請求項55に記載の方法。
- 請求項54から56のいずれかに記載の方法に従って産生される組換え酸性アルファグルコシダーゼバリアント。
- 請求項57に記載の組換え酸性アルファグルコシダーゼを含む組成物。
- 請求項41から43のいずれかに記載の少なくとも1つのポリヌクレオチドを含む組成物。
- 請求項40、58および/または59に記載の組成物を含む、ポンペ病の処置のための医薬組成物。
- 請求項40および/または58に記載の組成物を含む、ポンペ病の処置のための医薬組成物。
- 請求項41から43のいずれかに記載の組換えポリヌクレオチドを含む医薬組成物。
- 薬学的に許容される担体および/または賦形剤をさらに含む、請求項60から62のいずれかに記載の医薬組成物。
- ヒトへの非経口注射または注入に好適である、請求項60から63のいずれかに記載の医薬組成物。
- 対象におけるポンペ病の症状を処置および/または予防するための方法であって、ポンペ病を有する対象を用意するステップ、および請求項40、58、59、60、61、62、63および/または64のいずれかに記載の医薬組成物および/または組成物を前記対象に提供するステップを含む方法。
- ポンペ病の前記症状が改善される、請求項65に記載の方法。
- 前記対象が、乳児または小児である、請求項65から66のいずれかに記載の方法。
- 前記対象が、成人または若年成人である、請求項65から67のいずれかに記載の方法。
- 請求項40、および58から64のいずれかで提供される組成物の使用。
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