CN116897205A - 工程化淀粉酶变体 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了工程化淀粉酶多肽及其组合物。该工程化淀粉酶多肽已经过优化以提供改进的热稳定性、蛋白酶稳定性和在一定范围的pH条件包括酸性(pH<7)条件下的稳定性。本发明还涉及包含该工程化淀粉酶多肽的组合物用于治疗目的和/或营养目的的用途。本发明还提供了编码该工程化淀粉酶多肽的多核苷酸，以及用于制备工程化多核苷酸和淀粉酶多肽的方法。
Description
相关申请的交叉引用
本申请根据35 U.S.C.§119(e)要求2020年8月28日提交的美国临时申请第63/071,641号的权益，该美国临时申请的全部内容通过引用并入本文。
发明领域
本发明提供了工程化淀粉酶多肽及其组合物。该工程化淀粉酶多肽已经过优化以提供改进的热稳定性、蛋白酶稳定性和在一定范围的pH条件包括酸性(pH<7)条件下的稳定性。本发明还涉及包含该工程化淀粉酶多肽的组合物用于治疗目的和/或营养目的的用途。本发明还提供了编码该工程化淀粉酶多肽的多核苷酸，以及用于制备工程化多核苷酸和淀粉酶多肽的方法。
对序列表、表格或计算机程序的引用
序列表的正式副本作为ASCII格式的文本文件经由EFS-Web与说明书同时提交，文件名为“CX7-211WO2_ST25.txt”，创建日期为2021年8月27日，且大小为5.61兆字节。经由EFS-Web提交的序列表为说明书的一部分并且通过引用以其整体并入本文。
发明背景
胰腺酶替代疗法(pancreatic enzyme replacement therapy,PERT)可用于治疗胰腺酶不足(pancreatic enzyme insufficiency,PEI)。各种疾病，包括胰腺炎、囊性纤维化、乳糜泻(celiac disease)、炎性肠病和胰腺癌，都可以导致PEI，作为进入十二指肠的胰腺酶分泌减少的结果。这导致食物消化不良、肠对脂肪、蛋白质、碳水化合物和维生素的吸收不足，其可以导致营养不良。尽管口服施用的PERT治疗目前是可用的，但在一些人中状况可能不会减轻，这是由于PERT在胃肠道中活性不足，和/或由于与当前治疗方案相关的显著药负担(significant pill burden)，患者对治疗的依从性不足。在一些情况下，脂肪吸收系数(CFA)和/或氮吸收系数(CNA)不如健康患者，导致体重减轻和其他健康问题。因此，本领域仍然需要改进的PERT治疗。
发明概述
本发明提供了工程化淀粉酶多肽及其组合物。该工程化淀粉酶多肽已经过优化以提供改进的热稳定性、蛋白酶稳定性和在一定范围的pH条件包括酸性(pH<7)条件下的稳定性。本发明还涉及包含该工程化淀粉酶多肽的组合物用于治疗目的和/或营养目的的用途。本发明还提供了编码该工程化淀粉酶多肽的多核苷酸，以及用于制备工程化多核苷酸和淀粉酶多肽的方法。
本发明提供了重组淀粉酶和/或生物活性重组淀粉酶片段，其包含含有与SEQ IDNO:2的至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，重组淀粉酶和/或生物活性重组淀粉酶片段包含与SEQ ID NO:2、18、40、156、174、276、308、422、456、546、632、664、780、988、1104、1122、1224、1256、1370、1404、1494、1580、1612和/或1728具有至少约70％、约75％、约76％、约77％、约78％、约79％、约80％、约81％、约82％、约83％、约84％、约85％、约86％、约87％、约88％、约89％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％或更多序列同一性的多肽序列。
本发明提供了重组淀粉酶和/或生物活性重组淀粉酶片段，其包含含有与SEQ IDNO:2的至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，重组淀粉酶和/或生物活性重组淀粉酶片段包含与SEQ ID NO:18、40、156、174、276、308、422、456、546、632、664、780、988、1104、1122、1224、1256、1370、1404、1494、1580、1612和/或1728具有至少70％、75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多序列同一性的多肽序列。
在一些实施方案中，重组淀粉酶包含与SEQ ID NO:2或18具有至少70％、75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多序列同一性的多肽序列或其功能片段，并且其中重组淀粉酶在选自以下的位置处包含一个或更多个取代：2、6、16、18、19、24、26、27、29、31、33、37、38、39、41、45、48、49、51、52、58、61、66、72、73、74、81、82、91、92、94、95、98、103、111、112、114、122、123、124、126、127、128、129、130、131、132、134、137、140、141、145、149、157、158、165、166、167、170、171、172、178、180、183、184、189、194、203、204、205、206、210、214、216、220、221、223、224、225、226、227、228、246、250、252、253、254、255、256、257、258、259、268、269、270、272、275、276、279、280、282、284、285、286、294、295、298、301、302、304、305、306、308、309、310、313、315、317、319、322、324、331、338、345、346、349、359、360、366、371、374、380、383、384、385、387、388、392、393、394、396、397、409、411、412、413、415、417、420、423、428、429、431、437、441、442、444、446、448、451、455、458、459、463、464、466、467、468、469、470、473、474、480、481、482、483、491、492、493、494和495，其中多肽序列的氨基酸位置参考SEQ ID NO:2或18来编号。
在一些另外的实施方案中，重组淀粉酶包含与SEQ ID NO:2或18具有至少70％、75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多序列同一性的多肽序列或其功能片段，并且其中重组淀粉酶在选自以下的位置处包含一个或更多个取代：16、26、29、33、91、114、157、158、180、184、214、223、256、272、298、302、371、380、383、394、412、428和437，其中多肽序列的氨基酸位置参考SEQ IDNO:2或18来编号。
在一些另外的实施方案中，重组淀粉酶包含与SEQ ID NO:2或18具有至少70％、75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多序列同一性的多肽序列或其功能片段，并且其中重组淀粉酶包含选自以下的一个或更多个取代：16D、26A、29G、29R、29S、29A、29E、33E、91H、114H、157Y、158R、180E、180Q、184D、184K、214G、223L、256T、272G、272K、272P、272R、272S、298H、302Q、302G、302H、302R、302V、302W、371F、380R、383E、383I、394N、394S、394G、412A、412L、412D、412S、428T和437L，其中多肽序列的氨基酸位置参考SEQ ID NO:2或18来编号。
在一些另外的实施方案中，重组淀粉酶包含与SEQ ID NO:2或18具有至少70％、75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多序列同一性的多肽序列或其功能片段，并且其中重组淀粉酶在选自以下的一个或更多个位置处包含至少一个取代或取代集：2/73/256/493、16/33/73/130/256/282/371/374/493、16/33/130/256/302/371/383/470、16/33/157/256/302/371/383、16/73/74/256/282/366/371/383/493、16/73/256/282/302/331/371/383、16/130/256/276/374/470、16/256/302/374、19/72/345/473、26/27/396/412/428/473、26/27/412、26/27/466/473、29、73/130/256/282/302/493、74/371/374/383/493、130/256/493、149、158、254、256、256/383、257、259、272、279、284、317/383、322、345/388/396/428、388/396/412/428、396/412、396/412/428/466、409、412和495，其中多肽序列的氨基酸位置参考SEQ ID NO:2或18来编号。在一些此外的实施方案中，重组淀粉酶包含与SEQ ID NO:2或18具有至少70％、75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多序列同一性的多肽序列或其功能片段，并且其中重组淀粉酶包含选自以下的至少一个取代或取代集：2K/73V/256S/493D、16D/33E/73V/130D/256S/282D/371F/374S/493D、16D/33E/130D/256S/302Q/371F/383E/470T、16D/33E/157Y/256S/302Q/371F/383E、16D/73V/74A/256S/282D/366L/371F/383E/493D、16D/73V/256S/282D/302Q/331P/371F/383E、16D/130D/256S/276Q/374S/470T、16D/256S/302Q/374S、19E/72T/345A/473D、26A/27L/396H/412D/428E/473D、26A/27L/412D、26A/27L/466E/473D、29G、29R、29S、73V/130D/256S/282D/302Q/493D、74A/371F/374S/383E/493D、130D/256S/493D、149R、149T、158R、254G、254S、256S、256S/383E、257E、257G、257R、257S、257V、259Q、272G、272K、272P、272R、272S、279R、284C、284R、284S、284Y、317G/383L、322A、345A/388E/396H/428E、388E/396H/412D/428E、396H/412D、396H/412D/428E/466E、409S、412S、495E、495L和495Y，其中多肽序列的氨基酸位置参考SEQ ID NO:2或18来编号。在一些此外的实施方案中，重组淀粉酶包含与SEQ ID NO:2或18具有至少70％、75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多序列同一性的多肽序列或其功能片段，并且其中重组淀粉酶包含选自以下的至少一个取代或取代集：R2K/I73V/A256S/E493D、E16D/D33E/I73V/E130D/A256S/E282D/Y371F/H374S/E493D、E16D/D33E/E130D/A256S/M302Q/Y371F/Q383E/V470T、E16D/D33E/F157Y/A256S/M302Q/Y371F/Q383E、E16D/I73V/P74A/A256S/E282D/F366L/Y371F/Q383E/E493D、E16D/I73V/A256S/E282D/M302Q/H331P/Y371F/Q383E、E16D/E130D/A256S/T276Q/H374S/V470T、E16D/A256S/M302Q/H374S、K19E/S72T/P345A/E473D、E26A/R27L/D396H/L412D/D428E/E473D、E26A/R27L/L412D、E26A/R27L/Q466E/E473D、D29G、D29R、D29S、I73V/E130D/A256S/E282D/M302Q/E493D、P74A/Y371F/H374S/Q383E/E493D、E130D/A256S/E493D、Q149R、Q149T、K158R、E254G、E254S、A256S、A256S/Q383E、P257E、P257G、P257R、P257S、P257V、P259Q、D272G、D272K、D272P、D272R、D272S、D279R、K284C、K284R、K284S、K284Y、V317G/Q383L、F322A、P345A/D388E/D396H/D428E、D388E/D396H/L412D/D428E、D396H/L412D、D396H/L412D/D428E/Q466E、V409S、L412S、I495E、I495L和I495Y，其中多肽序列的氨基酸位置参考SEQ ID NO:2或18来编号。
在一些其他实施方案中，重组淀粉酶包含与SEQ ID NO:40或988具有至少80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多序列同一性的多肽序列或其功能片段，并且其中重组淀粉酶在选自以下的一个或更多个位置处包含至少一个取代或取代集：26/29/158/272/412、26/29/272/279/412/493、26/29/272/396/412、26/29/279/412/428、26/158/272/279/388/412/428、26/158/272/412、26/272/279/412/428/493、29/272/279/396/412、130/149/254/284/322/409/495、130/149/257/284/322/409/466/473、130/254/284/322/374/409/466、130/257/284/374/409/466、130/284/322/374/409/473、149/257/284/322/409/466、158/272/279/394/396/412/428/493、158/272/388/412/428/493、158/272/412/428、158/279/388/396/412/428、254/257/284/322/409/473、254/284/409/466/495、272/279/412/428/493、272/412/428、272/412/493和284/322/409/473，其中多肽序列的氨基酸位置参考SEQ ID NO:40或988来编号。在一些此外的实施方案中，重组淀粉酶包含与SEQ ID NO:40或988具有至少80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多序列同一性的多肽序列或其功能片段，并且其中重组淀粉酶包含选自以下的至少一个取代或取代集：26A/29R/158R/272G/412D、26A/29R/272G/279R/412D/493D、26A/29R/272G/396H/412D、26A/29R/279R/412D/428E、26A/158R/272G/279R/388E/412D/428E、26A/158R/272G/412D、26A/272G/279R/412D/428E/493D、29R/272G/279R/396H/412D、130D/149R/254S/284S/322A/409S/495E、130D/149R/257G/284S/322A/409S/466E/473D、130D/254S/284S/322A/374S/409S/466E、130D/257G/284S/374S/409S/466E、130D/284S/322A/374S/409S/473D、149R/257G/284S/322A/409S/466E、158R/272G/279R/394R/396H/412D/428E/493D、158R/272G/388E/412D/428E/493D、158R/272G/412D/428E、158R/279R/388E/396H/412D/428E、254S/257G/284S/322A/409S/473D、254S/284S/409S/466E/495E、272G/279R/412D/428E/493D、272G/412D/428E、272G/412D/493D和284S/322A/409S/473D，其中多肽序列的氨基酸位置参考SEQ ID NO:40或988来编号。在一些此外的实施方案中，重组淀粉酶包含与SEQ ID NO:40或988具有至少80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多序列同一性的多肽序列或其功能片段，并且其中重组淀粉酶包含选自以下的至少一个取代或取代集：E26A/D29R/K158R/D272G/L412D、E26A/D29R/D272G/D279R/L412D/E493D、E26A/D29R/D272G/D396H/L412D、E26A/D29R/D279R/L412D/D428E、E26A/K158R/D272G/D279R/D388E/L412D/D428E、E26A/K158R/D272G/L412D、E26A/D272G/D279R/L412D/D428E/E493D、D29R/D272G/D279R/D396H/L412D、E130D/Q149R/E254S/K284S/F322A/V409S/I495E、E130D/Q149R/P257G/K284S/F322A/V409S/Q466E/E473D、E130D/E254S/K284S/F322A/H374S/V409S/Q466E、E130D/P257G/K284S/H374S/V409S/Q466E、E130D/K284S/F322A/H374S/V409S/E473D、Q149R/P257G/K284S/F322A/V409S/Q466E、K158R/D272G/D279R/Q394R/D396H/L412D/D428E/E493D、K158R/D272G/D388E/L412D/D428E/E493D、K158R/D272G/L412D/D428E、K158R/D279R/D388E/D396H/L412D/D428E、E254S/P257G/K284S/F322A/V409S/E473D、E254S/K284S/V409S/Q466E/I495E、D272G/D279R/L412D/D428E/E493D、D272G/L412D/D428E、D272G/L412D/E493D和K284S/F322A/V409S/E473D，其中多肽序列的氨基酸位置参考SEQ ID NO:40或988来编号。
在一些另外的实施方案中，重组淀粉酶包含与SEQ ID NO:156或1104具有至少80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多序列同一性的多肽序列或其功能片段，并且其中重组淀粉酶在选自以下的一个或更多个位置处包含至少一个取代或取代集：37、51、91、111、112、114、122、124、128、140、167、171、183、194、276、280、298、397和464，其中多肽序列的氨基酸位置参考SEQ ID NO:156或1104来编号。在一些此外的实施方案中，重组淀粉酶包含与SEQ ID NO:156或1104具有至少80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多序列同一性的多肽序列或其功能片段，并且其中重组淀粉酶包含选自以下的至少一个取代或取代集：37R、51R、91H、111A、112Q、114H、122P、122R、124R、128W、140K、167W、171I、183E、183N、183V、194E、194R、276A、276K、280L、298K、298M、397T和464L，其中多肽序列的氨基酸位置参考SEQ ID NO:156或1104来编号。在一些此外的实施方案中，重组淀粉酶包含与SEQ ID NO:156或1104具有至少80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多序列同一性的多肽序列或其功能片段，并且其中重组淀粉酶包含选自以下的至少一个取代或取代集：N37R、G51R、K91H、E111A、K112Q、A114H、A122P、A122R、D124R、I128W、R140K、E167W、E171I、G183E、G183N、G183V、L194E、L194R、T276A、T276K、Q280L、E298K、E298M、E397T和N464L，其中多肽序列的氨基酸位置参考SEQ ID NO:156或1104来编号。
在一些另外的实施方案中，重组淀粉酶包含与SEQ ID NO:174或1122具有至少80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多序列同一性的多肽序列或其功能片段，并且其中重组淀粉酶在选自以下的一个或更多个位置处包含至少一个取代或取代集：24、91、91/122、91/122/128/130/167/171/409、91/122/128/130/183/322、91/122/128/130/194、91/122/128/130/322、91/122/128/171/183/194/322、91/122/128/183/409、91/122/130/167/183/194/409、91/122/130/171/183、91/122/130/183/194、91/122/130/194、91/122/130/194/322、91/122/167/171/194、91/122/167/171/194/322、91/122/171/183/194/409、91/130/171/183/322/409、91/167/171、91/167/183/194、91/167/322、91/183、91/183/322/409、91/194、91/322、91/409、122/128、122/128/194/409、122/130/171/322/409、122/409、137/145/227/394/480/481、137/145/295、145/227/295/481、145/309/481、183、227、295/394、322、322/409、394和480/481，其中多肽序列的氨基酸位置参考SEQ ID NO:174或1122来编号。在一些此外的实施方案中，重组淀粉酶包含与SEQ ID NO:174或1122具有至少80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多序列同一性的多肽序列或其功能片段，并且其中重组淀粉酶包含选自以下的至少一个取代或取代集：24V、91H、91H/122P、91H/122P/130D/183N/194R、91H/122P/130D/194R/322A、91H/122R、91H/122R/128W/130D/167W/171I/409S、91H/122R/128W/130D/183N/322A、91H/122R/128W/130D/194R、91H/122R/128W/130D/322A、91H/122R/128W/171I/183N/194R/322A、91H/122R/128W/183N/409S、91H/122R/130D/167W/183N/194R/409S、91H/122R/130D/171I/183N、91H/122R/130D/194R、91H/122R/167W/171I/194R、91H/122R/167W/171I/194R/322A、91H/122R/171I/183N/194R/409S、91H/130D/171I/183N/322A/409S、91H/167W/171I、91H/167W/183N/194R、91H/167W/322A、91H/183N、91H/183N/322A/409S、91H/194R、91H/322A、91H/409S、122P/409S、122R/128W、122R/128W/194R/409S、122R/130D/171I/322A/409S、137A/145G/227L/394E/480P/481V、137A/145G/295N、145G/227L/295N/481V、145G/309S/481V、183N、227L、295N/394E、322A、322A/409S、394E和480T/481V，其中多肽序列的氨基酸位置参考SEQ ID NO:174或1122来编号。在一些此外的实施方案中，重组淀粉酶包含与SEQ ID NO:174或1122具有至少80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多序列同一性的多肽序列或其功能片段，并且其中重组淀粉酶包含选自以下的至少一个取代或取代集：L24V、K91H、K91H/A122P、K91H/A122P/E130D/G183N/L194R、K91H/A122P/E130D/L194R/F322A、K91H/A122R、K91H/A122R/I128W/E130D/E167W/E171I/V409S、K91H/A122R/I128W/E130D/G183N/F322A、K91H/A122R/I128W/E130D/L194R、K91H/A122R/I128W/E130D/F322A、K91H/A122R/I128W/E171I/G183N/L194R/F322A、K91H/A122R/I128W/G183N/V409S、K91H/A122R/E130D/E167W/G183N/L194R/V409S、K91H/A122R/E130D/E171I/G183N、K91H/A122R/E130D/L194R、K91H/A122R/E167W/E171I/L194R、K91H/A122R/E167W/E171I/L194R/F322A、K91H/A122R/E171I/G183N/L194R/V409S、K91H/E130D/E171I/G183N/F322A/V409S、K91H/E167W/E171I、K91H/E167W/G183N/L194R、K91H/E167W/F322A、K91H/G183N、K91H/G183N/F322A/V409S、K91H/L194R、K91H/F322A、K91H/V409S、A122P/V409S、A122R/I128W、A122R/I128W/L194R/V409S、A122R/E130D/E171I/F322A/V409S、G137A/A145G/T227L/Q394E/F480P/C481V、G137A/A145G/K295N、A145G/T227L/K295N/C481V、A145G/T309S/C481V、G183N、T227L、K295N/Q394E、F322A、F322A/V409S、Q394E和F480T/C481V，其中多肽序列的氨基酸位置参考SEQ ID NO:174或1122来编号。
在一些其他实施方案中，重组淀粉酶包含与SEQ ID NO:276或1224具有至少80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多序列同一性的多肽序列或其功能片段，并且其中重组淀粉酶在选自以下的一个或更多个位置处包含至少一个取代或取代集：16/26/29/128/145/256/309/383、16/26/33/114/145/309/383/394、16/26/33/128/130/145/302/309/322/371、16/26/33/145/158/383/394、16/26/145/302、16/29/33/145/256/302、18、26/29/33/130/145/157/158/183/394、26/29/33/145/157/183/256/309/383、26/29/122/130/145/183/256/272/309/394、26/29/145/157/256/302/322/481、26/29/145/256/272/302/309/322/481、26/33/91/145/272/302/481、26/33/145/309/322/383、26/114/145/322、26/145/183/256/309/383、29/122/145/158/383、29/130/145/256/272/371/394、29/145/183/302/309/412、29/309/394、33/122/145/272/309/412、91/130/145/158/183/383、91/309/383、130/145/256/272/371、130/145/302/309、130/272/481、145/302/309、268、309、349、360、380、394、463和483，其中多肽序列的氨基酸位置参考SEQ ID NO:276或1224来编号。在一些此外的实施方案中，重组淀粉酶包含与SEQ ID NO:276或1224具有至少80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多序列同一性的多肽序列或其功能片段，并且其中重组淀粉酶包含选自以下的至少一个取代或取代集：16E/26E/29D/128I/145G/256A/309S/383Q、16E/26E/33D/114A/145G/309S/383Q/394E、16E/26E/33D/128I/130E/145G/302M/309S/322F/371Y、16E/26E/33D/145G/158K/383Q/394E、16E/26E/145G/302M、16E/29D/33D/145G/256A/302M、18S、26E/29D/33D/130E/145G/157F/158K/183G/394E、26E/29D/33D/145G/157F/183G/256A/309S/383Q、26E/29D/122A/130E/145G/183G/256A/272D/309S/394E、26E/29D/145G/157F/256A/302M/322F/481V、26E/29D/145G/256A/272D/302M/309S/322F/481V、26E/33D/91K/145G/272D/302M/481V、26E/33D/145G/309S/322F/383Q、26E/114A/145G/322F、26E/145G/183G/256A/309S/383Q、29D/122A/145G/158K/383Q、29D/130E/145G/256A/272D/371Y/394E、29D/145G/183G/302M/309S/412L、29D/309S/394E、33D/122A/145G/272D/309S/412L、91K/130E/145G/158K/183G/383Q、91K/309S/383Q、130E/145G/256A/272D/371Y、130E/145G/302M/309S、130E/272D/481V、145G/302M/309S、268T、309A、349R、360G、380R、394G、394N、394S、463M和483T，其中多肽序列的氨基酸位置参考SEQ ID NO:276或1224来编号。在一些此外的实施方案中，重组淀粉酶包含与SEQ ID NO:276或1224具有至少80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多序列同一性的多肽序列或其功能片段，并且其中重组淀粉酶包含选自以下的至少一个取代或取代集：D16E/A26E/R29D/W128I/A145G/S256A/T309S/E383Q、D16E/A26E/E33D/H114A/A145G/T309S/E383Q/Q394E、D16E/A26E/E33D/W128I/D130E/A145G/Q302M/T309S/A322F/F371Y、D16E/A26E/E33D/A145G/R158K/E383Q/Q394E、D16E/A26E/A145G/Q302M、D16E/R29D/E33D/A145G/S256A/Q302M、G18S、A26E/R29D/E33D/D130E/A145G/Y157F/R158K/N183G/Q394E、A26E/R29D/E33D/A145G/Y157F/N183G/S256A/T309S/E383Q、A26E/R29D/R122A/D130E/A145G/N183G/S256A/G272D/T309S/Q394E、A26E/R29D/A145G/Y157F/S256A/Q302M/A322F/C481V、A26E/R29D/A145G/S256A/G272D/Q302M/T309S/A322F/C481V、A26E/E33D/H91K/A145G/G272D/Q302M/C481V、A26E/E33D/A145G/T309S/A322F/E383Q、A26E/H114A/A145G/A322F、A26E/A145G/N183G/S256A/T309S/E383Q、R29D/R122A/A145G/R158K/E383Q、R29D/D130E/A145G/S256A/G272D/F371Y/Q394E、R29D/A145G/N183G/Q302M/T309S/D412L、R29D/T309S/Q394E、E33D/R122A/A145G/G272D/T309S/D412L、H91K/D130E/A145G/R158K/N183G/E383Q、H91K/T309S/E383Q、D130E/A145G/S256A/G272D/F371Y、D130E/A145G/Q302M/T309S、D130E/G272D/C481V、A145G/Q302M/T309S、S268T、T309A、P349R、N360G、G380R、Q394G、Q394N、Q394S、G463M和G483T，其中多肽序列的氨基酸位置参考SEQ ID NO:276或1224来编号。
在一些另外的实施方案中，重组淀粉酶包含与SEQ ID NO:308或1256具有至少80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多序列同一性的多肽序列或其功能片段，并且其中重组淀粉酶在选自以下的一个或更多个位置处包含至少一个取代或取代集：29、37/124/250/270/349/380/394/442/491、37/145、37/145/250/301/349/394、37/145/258/442/491、38/349/491、81/259、81/313/495、92/257/258/338/468、92/258、94/127/132/145/250/349、94/270/301/349/394/442、94/349/491、145/270、178、225、226、246、250/349/442、259/313/338、270/349、286/338、294、313、349、349/380/442、413、413/468、448和473，其中多肽序列的氨基酸位置参考SEQID NO:308或1256来编号。在一些此外的实施方案中，重组淀粉酶包含与SEQ ID NO:308或1256具有至少80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多序列同一性的多肽序列或其功能片段，并且其中重组淀粉酶包含选自以下的至少一个取代或取代集：29A、37T/124N/250D/270D/349R/380R/394E/442E/491L、37T/145G、37T/145G/250D/301K/349R/394E、37T/145G/258S/442E/491L、38I/349R/491L、81E/259D、81E/313D/495L、92E/257E/258Q/338S/468T、92E/258Q、94G/127E/132V/145G/250D/349R、94G/270D/301K/349R/394E/442E、94G/349R/491L、145G/270D、178I、225D、226T、246R、250D/349R/442E、259D/313D/338S、270D/349R、286T/338S、294L、313D、349R、349R/380R/442E、413Y、413Y/468I、448T和473D，其中多肽序列的氨基酸位置参考SEQ IDNO:308或1256来编号。在一些此外的实施方案中，重组淀粉酶包含与SEQ ID NO:308或1256具有至少80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多序列同一性的多肽序列或其功能片段，并且其中重组淀粉酶包含选自以下的至少一个取代或取代集：R29A、N37T/D124N/E250D/E270D/P349R/G380R/G394E/D442E/I491L、N37T/A145G、N37T/A145G/E250D/R301K/P349R/G394E、N37T/A145G/K258S/D442E/I491L、M38I/P349R/I491L、A81E/P259D、A81E/T313D/I495L、R92E/P257E/K258Q/A338S/R468T、R92E/K258Q、D94G/Q127E/I132V/A145G/E250D/P349R、D94G/E270D/R301K/P349R/G394E/D442E、D94G/P349R/I491L、A145G/E270D、V178I、E225D、Q226T、K246R、E250D/P349R/D442E、P259D/T313D/A338S、E270D/P349R、M286T/A338S、M294L、T313D、P349R、P349R/G380R/D442E、F413Y、F413Y/R468I、H448T和E473D，其中多肽序列的氨基酸位置参考SEQ ID NO:308或1256来编号。
在一些另外的实施方案中，重组淀粉酶包含与SEQ ID NO:422或1370具有至少80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多序列同一性的多肽序列或其功能片段，并且其中重组淀粉酶在选自以下的一个或更多个位置处包含至少一个取代或取代集：38、38/178/226/286/338、38/178/286/448、38/178/349/448、38/226/246/258/286、38/226/258/286/338/380/448、38/226/258/349/413、38/226/286、38/226/286/338/380、38/226/338/349/380、38/226/413/448、38/246/286、38/246/286/380、38/258、38/286、38/286/413/448、38/286/448、38/448、178、178/226/258/286/310/338、178/226/286/338、178/246/338、178/258/286/413、178/286、178/286/338/349、178/286/338/448、178/380、178/413、178/448、184/246/258/380、226、226/246/286/349/448、226/246/413、226/258/286/349/380、226/258/286/413/448、226/286、226/286/380/448、226/349/380、246、246/286、246/286/380/413、246/338、246/413、258/286/413、286、286/413/448、338/448、349和413，其中多肽序列的氨基酸位置参考SEQ IDNO:422或1370来编号。在一些此外的实施方案中，重组淀粉酶包含与SEQ ID NO:422或1370具有至少80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多序列同一性的多肽序列或其功能片段，并且其中重组淀粉酶包含选自以下的至少一个取代或取代集：38I、38I/178I/226T/286T/338S、38I/178I/286T/448T、38I/178I/349R/448T、38I/226T/246R/258S/286T、38I/226T/258S/286T/338S/380R/448T、38I/226T/258S/349R/413Y、38I/226T/286T、38I/226T/286T/338S/380R、38I/226T/338S/349R/380R、38I/226T/413Y/448T、38I/246R/286T、38I/246R/286T/380R、38I/258S、38I/286T、38I/286T/413Y/448T、38I/286T/448T、38I/448T、178I、178I/226T/258S/286T/310R/338S、178I/226T/286T/338S、178I/246R/338S、178I/258S/286T/413Y、178I/286T、178I/286T/338S/349R、178I/286T/338S/448T、178I/380R、178I/413Y、178I/448T、184K/246R/258S/380R、226T、226T/246R/286T/349R/448T、226T/246R/413Y、226T/258S/286T/349R/380R、226T/258S/286T/413Y/448T、226T/286T、226T/286T/380R/448T、226T/349R/380R、246R、246R/286T、246R/286T/380R/413Y、246R/338S、246R/413Y、246T、258S/286T/413Y、286T、286T/413Y/448T、338S/448T、349R和413Y，其中多肽序列的氨基酸位置参考SEQ IDNO:422或1370来编号。在一些此外的实施方案中，重组淀粉酶包含与SEQ ID NO:422或1370具有至少80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多序列同一性的多肽序列或其功能片段，并且其中重组淀粉酶包含选自以下的至少一个取代或取代集：M38I、M38I/V178I/Q226T/M286T/A338S、M38I/V178I/M286T/H448T、M38I/V178I/P349R/H448T、M38I/Q226T/K246R/K258S/M286T、M38I/Q226T/K258S/M286T/A338S/G380R/H448T、M38I/Q226T/K258S/P349R/F413Y、M38I/Q226T/M286T、M38I/Q226T/M286T/A338S/G380R、M38I/Q226T/A338S/P349R/G380R、M38I/Q226T/F413Y/H448T、M38I/K246R/M286T、M38I/K246R/M286T/G380R、M38I/K258S、M38I/M286T、M38I/M286T/F413Y/H448T、M38I/M286T/H448T、M38I/H448T、V178I、V178I/Q226T/K258S/M286T/Q310R/A338S、V178I/Q226T/M286T/A338S、V178I/K246R/A338S、V178I/K258S/M286T/F413Y、V178I/M286T、V178I/M286T/A338S/P349R、V178I/M286T/A338S/H448T、V178I/G380R、V178I/F413Y、V178I/H448T、E184K/K246R/K258S/G380R、Q226T、Q226T/K246R/M286T/P349R/H448T、Q226T/K246R/F413Y、Q226T/K258S/M286T/P349R/G380R、Q226T/K258S/M286T/F413Y/H448T、Q226T/M286T、Q226T/M286T/G380R/H448T、Q226T/P349R/G380R、K246R、K246R/M286T、K246R/M286T/G380R/F413Y、K246R/A338S、K246R/F413Y、K246T、K258S/M286T/F413Y、M286T、M286T/F413Y/H448T、A338S/H448T、P349R和F413Y，其中多肽序列的氨基酸位置参考SEQ ID NO:422或1370来编号。
在一些另外的实施方案中，重组淀粉酶包含与SEQ ID NO:456或1404具有至少80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多序列同一性的多肽序列或其功能片段，并且其中重组淀粉酶在选自以下的一个或更多个位置处包含至少一个取代或取代集：29/31/92/220、29/469、49/58/103/141/197/269/294/298、49/58/103/194/204/298、49/58/141/298、49/103、103、123、126、127、131、134、180、210、214、220/469、228、259、279、282、302、319、393、415、417、428、429、466和469，其中多肽序列的氨基酸位置参考SEQ ID NO:456或1404来编号。在一些此外的实施方案中，重组淀粉酶包含与SEQ ID NO:456或1404具有至少80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多序列同一性的多肽序列或其功能片段，并且其中重组淀粉酶包含选自以下的至少一个取代或取代集：29E/31L/92A/220G、29E/469I、49A/58T/103L/141F/197Y/269F/294H/298Q、49A/58T/103L/194F/204D/298H、49A/58T/141F/298H、49A/103L、103L、123R、126R、127W、131H、131R、131Y、134R、180E、210P、214G、220G/469I、228V、259C、279L、282T、302H、302R、302W、319S、393R、393S、415C、417W、428T、429S、466C和469I，其中多肽序列的氨基酸位置参考SEQ ID NO:456或1404来编号。在一些此外的实施方案中，重组淀粉酶包含与SEQ ID NO:456或1404具有至少80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多序列同一性的多肽序列或其功能片段，并且其中重组淀粉酶包含选自以下的至少一个取代或取代集：R29E/F31L/R92A/A220G、R29E/V469I、S49A/S58T/V103L/Y141F/F197Y/H269F/M294H/E298Q、S49A/S58T/V103L/L194F/N204D/E298H、S49A/S58T/Y141F/E298H、S49A/V103L、V103L、D123R、T126R、Q127W、E131H、E131R、E131Y、E134R、D180E、H210P、E214G、A220G/V469I、Q228V、P259C、D279L、E282T、Q302H、Q302R、Q302W、A319S、E393R、E393S、D415C、P417W、D428T、E429S、Q466C和V469I，其中多肽序列的氨基酸位置参考SEQ ID NO:456或1404来编号。
在一些另外的实施方案中，重组淀粉酶包含与SEQ ID NO:456或1404具有至少80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多序列同一性的多肽序列或其功能片段，并且其中重组淀粉酶在选自以下的一个或更多个位置处包含至少一个取代或取代集：92、123、126、127、129、131、134、140、172、180、210、214、221、228、253、254、259、279、282、302、304、305、319、322、346、359、384、385、387、393、409、412、415、417、428、429、441、442、444、446、451、455、459、466、467、470、473、474、492和494，其中多肽序列的氨基酸位置参考SEQ ID NO:456或1404来编号。在一些此外的实施方案中，重组淀粉酶包含与SEQ ID NO:456或1404具有至少80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多序列同一性的多肽序列或其功能片段，并且其中重组淀粉酶包含选自以下的至少一个取代或取代集：92G、92Q、123C、123G、123R、126Q、126R、127I、127R、127S、127V、127W、129C、129W、131H、131R、131Y、134A、134F、134R、140V、172K、172R、180E、180P、180Q、210G、210P、214G、214L、214R、221T、221V、228V、253R、254G、259C、259R、259W、279L、279V、282R、282T、302G、302H、302R、302V、302W、304T、305Q、305R、305W、319L、319S、322R、346G、359G、384M、385L、387G、387V、393R、393S、393W、409A、409R、409W、412A、415C、415G、417W、428T、429S、441R、441W、442R、442W、444G、444R、444V、446G、451F、455L、455R、455T、455W、459W、466C、467P、467W、470G、470L、470S、473M、474G、492G、492R和494C，其中多肽序列的氨基酸位置参考SEQ IDNO:456或1404来编号。在一些此外的实施方案中，重组淀粉酶包含与SEQ ID NO:456或1404具有至少80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多序列同一性的多肽序列或其功能片段，并且其中重组淀粉酶包含选自以下的至少一个取代或取代集：R92G、R92Q、D123C、D123G、D123R、T126Q、T126R、Q127I、Q127R、Q127S、Q127V、Q127W、D129C、D129W、E131H、E131R、E131Y、E134A、E134F、E134R、R140V、D172K、D172R、D180E、D180P、D180Q、H210G、H210P、E214G、E214L、E214R、R221T、R221V、Q228V、Q253R、E254G、P259C、P259R、P259W、D279L、D279V、E282R、E282T、Q302G、Q302H、Q302R、Q302V、Q302W、R304T、D305Q、D305R、D305W、A319L、A319S、A322R、W346G、E359G、T384M、Y385L、I387G、I387V、E393R、E393S、E393W、V409A、V409R、V409W、D412A、D415C、D415G、P417W、D428T、E429S、D441R、D441W、D442R、D442W、E444G、E444R、E444V、T446G、E451F、N455L、N455R、N455T、N455W、R459W、Q466C、E467P、E467W、V470G、V470L、V470S、E473M、N474G、E492G、E492R和V494C，其中多肽序列的氨基酸位置参考SEQ ID NO:456或1404来编号。
在一些另外的实施方案中，重组淀粉酶包含与SEQ ID NO:546或1494具有至少80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多序列同一性的多肽序列或其功能片段，并且其中重组淀粉酶在选自以下的一个或更多个位置处包含一个或更多个取代或取代集：123、123/126/180/214/298/302/393、123/126/180/214/393/428、123/126/210/298/302/393、123/126/210/428、123/126/428、123/210/302、126/180/210/214/298/302、126/180/210/214/428、126/180/298/302/393、126/210/302/428、126/214/393、126/298/302/393、126/298/302/393/428、129、129/228/253、131/228/279、131/282、180/214、210/214/302/393/428、228/282/444、253/279/470、253/279/492、279、279/470和441，其中多肽序列的氨基酸位置参考SEQ ID NO:546或1494来编号。在一些此外的实施方案中，重组淀粉酶包含与SEQ ID NO:546或1494具有至少80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多序列同一性的多肽序列或其功能片段，并且其中重组淀粉酶包含选自以下的至少一个取代或取代集：123R、123R/126R/180E/214L/298Q/302W/393R、123R/126R/180Q/214G/393R/428T、123R/126R/210P/298Q/302W/393R、123R/126R/210P/428T、123R/126R/428T、123R/210P/302R、126R/180E/210P/214G/428T、126R/180E/298Q/302R/393R、126R/180Q/210P/214L/298Q/302R、126R/210P/302R/428T、126R/214G/393R、126R/298Q/302H/393R、126R/298Q/302R/393R/428T、129W、129W/228V/253R、131H/228V/279V、131Y/282T、180Q/214L、210P/214L/302R/393R/428T、228V/282T/444R、253R/279L/492G、253R/279V/470S、279L、279L/470S和441R，其中多肽序列的氨基酸位置参考SEQ ID NO:546或1494来编号。在一些此外的实施方案中，重组淀粉酶包含与SEQ ID NO:546或1494具有至少80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多序列同一性的多肽序列或其功能片段，并且其中重组淀粉酶包含选自以下的至少一个取代或取代集：D123R、D123R/T126R/D180E/E214L/H298Q/Q302W/E393R、D123R/T126R/D180Q/E214G/E393R/D428T、D123R/T126R/H210P/H298Q/Q302W/E393R、D123R/T126R/H210P/D428T、D123R/T126R/D428T、D123R/H210P/Q302R、T126R/D180E/H210P/E214G/D428T、T126R/D180E/H298Q/Q302R/E393R、T126R/D180Q/H210P/E214L/H298Q/Q302R、T126R/H210P/Q302R/D428T、T126R/E214G/E393R、T126R/H298Q/Q302H/E393R、T126R/H298Q/Q302R/E393R/D428T、D129W、D129W/Q228V/Q253R、E131H/Q228V/D279V、E131Y/E282T、D180Q/E214L、H210P/E214L/Q302R/E393R/D428T、Q228V/E282T/E444R、Q253R/D279L/E492G、Q253R/D279V/V470S、D279L、D279L/V470S和D441R，其中多肽序列的氨基酸位置参考SEQ ID NO:546或1494来编号。
在一些另外的实施方案中，重组淀粉酶包含与SEQ ID NO:632或1580具有至少80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多序列同一性的多肽序列或其功能片段，并且其中重组淀粉酶在选自以下的一个或更多个位置处包含至少一个取代或取代集：2、45/166/298、48、48/166/170/203、52、58/166、58/203、72、82、114、114/223/306/308、149、165、166/203、167、170、184/216/306/308、184/223/306/437、189、203、225、255、258、275、280、284、294、298、396、397、411、431、448、468、482、483和495，其中多肽序列的氨基酸位置参考SEQ ID NO:632或1580来编号。在一些此外的实施方案中，重组淀粉酶包含与SEQ ID NO:632或1580具有至少80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多序列同一性的多肽序列或其功能片段，并且其中重组淀粉酶包含选自以下的至少一个取代或取代集：2L、45S/166L/298D、48D、48D/166L/170S/203S、52R、58A/166L、58A/203S、72T、82A、114R、114R/223L/306F/308L、149K、165V、166L/203S、167Y、170S、184D/216L/306F/308L、184D/223L/306F/437L、189D、203S、225T、255M、255R、258S、275I、275R、280C、284L、284M、294A、298D、298N、396E、396Q、397M、411E、431T、448P、468V、482L、483A、495G和495L，其中多肽序列的氨基酸位置参考SEQ ID NO:632或1580来编号。在一些此外的实施方案中，重组淀粉酶包含与SEQ ID NO:632或1580具有至少80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多序列同一性的多肽序列或其功能片段，并且其中重组淀粉酶包含选自以下的至少一个取代或取代集：R2L、Y45S/I166L/H298D、A48D、A48D/I166L/D170S/E203S、Y52R、T58A/I166L、T58A/E203S、S72T、Q82A、H114R、H114R/V223L/Y306F/M308L、Q149K、H165V、I166L/E203S、E167Y、D170S、E184D/I216L/Y306F/M308L、E184D/V223L/Y306F/M437L、Q189D、E203S、E225T、V255M、V255R、K258S、Q275I、Q275R、Q280C、K284L、K284M、M294A、H298D、H298N、D396E、D396Q、E397M、T411E、P431T、H448P、R468V、N482L、G483A、I495G和I495L，其中多肽序列的氨基酸位置参考SEQ ID NO:632或1580来编号。
在一些另外的实施方案中，重组淀粉酶包含与SEQ ID NO:664或1612具有至少80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多序列同一性的多肽序列或其功能片段，并且其中重组淀粉酶在选自以下的一个或更多个位置处包含至少一个取代或取代集：6/39/103/324/420、41、58/500/501、61、95/98/205/227/423/458、95/98/227/423、95/205、95/252/285/324、123/170/197/275/298/396/448/483、123/197、123/197/225/294/396/448/469、123/284/294/324/396/448、134/225/275/302、165/225/284/298/469/483、170/275/294/298/448、205/206、205/206/224/315/458/480、206/227、206/227/315/423、225/294/298/396、227、392/503、458、499和500，其中多肽序列的氨基酸位置参考SEQ ID NO:664或1612来编号。在一些此外的实施方案中，重组淀粉酶包含与SEQ ID NO:664或1612具有至少80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多序列同一性的多肽序列或其功能片段，并且其中重组淀粉酶包含选自以下的至少一个取代或取代集：6I/39I/103D/324T/420V、41F、58S/500P/501P、61Y、95L/252I/285V/324T、95V/98I/205V/227V/423V/458F、95V/98I/227V/423V、95V/205V、123E/170S/197Y/275I/298N/396Q/448Q/483Q、123E/197Y、123E/197Y/225G/294A/396Q/448Q/469I、123E/284L/294A/324T/396Q/448Q、134R/225G/275I/302W、165V/225G/284L/298N/469I/483Q、170S/275I/294A/298N/448Q、205V/206E、205V/206E/224L/315S/458F/480L、206E/227V、206E/227V/315S/423V、225G/294A/298N/396Q、227C、392C/503L、458F、458Y、499R和500P，其中多肽序列的氨基酸位置参考SEQID NO:664或1612来编号。在一些此外的实施方案中，重组淀粉酶包含与SEQ ID NO:664或1612具有至少80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多序列同一性的多肽序列或其功能片段，并且其中重组淀粉酶包含选自以下的至少一个取代或取代集：L6I/V39I/V103D/A324T/I420V、L41F、T58S/H500P/H501P、L61Y、I95L/V252I/T285V/A324T、I95V/L98I/I205V/T227V/S423V/W458F、I95V/L98I/T227V/S423V、I95V/I205V、D123E/D170S/F197Y/Q275I/H298N/D396Q/H448Q/G483Q、D123E/F197Y、D123E/F197Y/E225G/M294A/D396Q/H448Q/V469I、D123E/K284L/M294A/A324T/D396Q/H448Q、E134R/E225G/Q275I/Q302W、H165V/E225G/K284L/H298N/V469I/G483Q、D170S/Q275I/M294A/H298N/H448Q、I205V/D206E、I205V/D206E/M224L/T315S/W458F/F480L、D206E/T227V、D206E/T227V/T315S/S423V、E225G/M294A/H298N/D396Q、T227C、I392C/H503L、W458F、W458Y、G499R和H500P，其中多肽序列的氨基酸位置参考SEQ IDNO:664或1612来编号。
在一些另外的实施方案中，重组淀粉酶包含与SEQ ID NO:664或1612具有至少80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多序列同一性的多肽序列或其功能片段，并且其中重组淀粉酶在选自以下的一个或更多个位置处包含至少一个取代或取代集：95/252/285/324、123/197、123/197/225/294/396/448/469、134/225/275/302、205/206和205/206/224/315/458/480，其中多肽序列的氨基酸位置参考SEQ ID NO:664或1612来编号。在一些此外的实施方案中，重组淀粉酶包含与SEQ ID NO:664或1612具有至少80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多序列同一性的多肽序列或其功能片段，并且其中重组淀粉酶包含选自以下的至少一个取代或取代集：95L/252I/285V/324T、123E/197Y、123E/197Y/225G/294A/396Q/448Q/469I、134R/225G/275I/302W、205V/206E和205V/206E/224L/315S/458F/480L，其中多肽序列的氨基酸位置参考SEQ ID NO:664或1612来编号。在一些此外的实施方案中，重组淀粉酶包含与SEQ ID NO:664或1612具有至少80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多序列同一性的多肽序列或其功能片段，并且其中重组淀粉酶包含选自以下的至少一个取代或取代集：I95L/V252I/T285V/A324T、D123E/F197Y、D123E/F197Y/E225G/M294A/D396Q/H448Q/V469I、E134R/E225G/Q275I/Q302W、I205V/D206E和I205V/D206E/M224L/T315S/W458F/F480L，其中多肽序列的氨基酸位置参考SEQ ID NO:664或1612来编号。
在一些另外的实施方案中，重组淀粉酶包含与SEQ ID NO:780或1728具有至少80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多序列同一性的多肽序列或其功能片段，并且其中重组淀粉酶在位置126处包含取代，其中多肽序列的氨基酸位置参考SEQ ID NO:780或1728来编号。在一些此外的实施方案中，重组淀粉酶包含与SEQ ID NO:780或1728具有至少80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多序列同一性的多肽序列或其功能片段，并且其中重组淀粉酶包含选自以下的至少一个取代或取代集：126C、126D、126E、126K、126L、126M、126N、126Q、126S、126T和126W，其中多肽序列的氨基酸位置参考SEQ ID NO:780或1728来编号。在一些此外的实施方案中，重组淀粉酶包含与SEQ ID NO:780或1728具有至少80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多序列同一性的多肽序列或其功能片段，并且其中重组淀粉酶包含选自以下的至少一个取代或取代集：R126C、R126D、R126E、R126K、R126L、R126M、R126N、R126Q、R126S、R126T和R126W，其中多肽序列的氨基酸位置参考SEQ ID NO:780或1728来编号。
在一些另外的实施方案中，重组淀粉酶包含如表4-1、表4-2、表4-3、表4-4、表4-5、表4-6、表4-7、表4-8、表4-9、表4-10、表4-11、表4-12、表4-13和/或表4-14中提供的至少一个位置中的至少一个突变，其中位置参考SEQ ID NO:2、18、40、156、174、276、308、422、456、546、632、780、988、1104、1122、1224、1256、1370、1404、1494、1580、1612和/或1728来编号。在一些此外的实施方案中，重组淀粉酶包含与SEQ ID NO:4-18、22-966和970-1914中的偶数编号序列中列出的至少一个序列具有至少约80％、约85％、约86％、约87％、约88％、约89％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％或更多序列同一性的多肽序列。在一些此外的实施方案中，重组淀粉酶包含与SEQ ID NO:4-18、22-966和970-1914中的偶数编号序列中列出的至少一个序列具有至少80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多序列同一性的多肽序列。在一些实施方案中，重组淀粉酶包含与SEQ ID NO:40、156、174、276、308、422、456、546、632、664、780、810、988、1104、1122、1224、1256、1370、1404、1494、1580、1612、1728和1758的多肽序列具有至少80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多序列同一性的多肽序列。
在一些另外的实施方案中，重组淀粉酶包含SEQ ID NO:4-18、22-966和970-1914中的偶数编号序列中列出的至少一个序列。在一些实施方案中，重组淀粉酶包含SEQ IDNO:40、156、174、276、308、422、456、546、632、664、780、810、988、1104、1122、1224、1256、1370、1404、1494、1580、1612、1728或1758的多肽序列。
在一些另外的实施方案中，与参考序列相比，重组淀粉酶在暴露于高温和/或低温后保留更大的酶活性。在一些实施方案中，参考序列是野生型淀粉酶，而在一些其他实施方案中，参考序列是另一种重组淀粉酶。在一些另外的实施方案中，重组淀粉酶比SEQ ID NO:2的淀粉酶更热稳定。在一些此外的实施方案中，重组淀粉酶比SEQ ID NO:18、40、156、174、276、308、422、456、546、632、664、780、988、1104、1122、1224、1256、1370、1404、1494、1580、1612和/或1728的淀粉酶更热稳定。在一些实施方案中，重组淀粉酶在30℃、37℃、40℃、50℃、60℃和/或95℃和/或40℃至60℃是稳定的。在一些实施方案中，重组淀粉酶在25℃、37℃、42℃和/或48℃是稳定的。在一些另外的实施方案中，重组淀粉酶比参考序列在30℃、37℃、40℃、50℃、60℃和/或95℃和/或40℃至60℃更稳定。在一些实施方案中，重组淀粉酶比参考序列在30℃、37℃、40℃、50℃、60℃和/或95℃和/或40℃至60℃更稳定。在一些另外的实施方案中，重组淀粉酶比SEQ ID NO:2的淀粉酶更热稳定。在一些此外的实施方案中，重组淀粉酶比SEQ ID NO:18、40、156、174、276、308、422、456、546、632、664、780、988、1104、1122、1224、1256、1370、1404、1494、1580、1612和/或1728的淀粉酶更热稳定。
在一些实施方案中，重组淀粉酶在低pH环境中是稳定的，而在其他实施方案中，重组淀粉酶在高pH环境中是稳定的，并且在仍此外的实施方案中，重组淀粉酶在中性pH环境中是稳定的。在一些实施方案中，重组淀粉酶在低、高和/或中性pH环境中是稳定的。在一些实施方案中，重组淀粉酶在暴露于低、高和/或中性pH环境后保留酶活性。在一些另外的实施方案中，与参考序列相比，重组淀粉酶在高、低和/或中性pH环境中更稳定。在一些实施方案中，参考序列是野生型淀粉酶，而在其他实施方案中，参考序列是另一种工程化淀粉酶。在一些另外的实施方案中，重组淀粉酶比SEQ ID NO:2的淀粉酶更稳定。在一些此外的实施方案中，重组淀粉酶比SEQ ID NO:18、40、156、174、276、308、422、456、546、632、664、780、988、1104、1122、1224、1256、1370、1404、1494、1580、1612和/或1728的淀粉酶更稳定。在一些另外的实施方案中，重组淀粉酶在大于7的pH比SEQ ID NO:2的淀粉酶更稳定。在一些另外的实施方案中，重组淀粉酶在大于7的pH比SEQ ID NO:18、40、156、174、276、308、422、456、546、632、664、780、988、1104、1122、1224、1256、1370、1404、1494、1580、1612和/或1728的淀粉酶更稳定。在一些另外的实施方案中，重组淀粉酶在pH 7.8比SEQ ID NO:2的淀粉酶更稳定。在一些另外的实施方案中，重组淀粉酶在pH 7.8比SEQ ID NO:18、40、156、174、276、308、422、456、546、632、664、780、988、1104、1122、1224、1256、1370、1404、1494、1580、1612和/或1728的淀粉酶更稳定。在一些另外的实施方案中，重组淀粉酶在pH 7.5比SEQ IDNO:2的淀粉酶更稳定。在一些另外的实施方案中，重组淀粉酶在pH 7.5比SEQ ID NO:18、40、156、174、276、308、422、456、546、632、664、780、988、1104、1122、1224、1256、1370、1404、1494、1580、1612和/或1728的淀粉酶更稳定。在一些另外的实施方案中，重组淀粉酶在pH 7比SEQ ID NO:2的淀粉酶更稳定。在一些另外的实施方案中，重组淀粉酶在pH 7比SEQ IDNO:18、40、156、174、276、308、422、456、546、632、664、780、988、1104、1122、1224、1256、1370、1404、1494、1580、1612和/或1728的淀粉酶更稳定。在一些此外的实施方案中，重组淀粉酶在小于7的pH(即，在酸性pH条件或水平下)比SEQ ID NO:2的淀粉酶更稳定。在一些另外的实施方案中，重组淀粉酶在小于pH 7的pH(即，在酸性pH条件或水平下)比SEQ ID NO:18、40、156、174、276、308、422、456、546、632、664、780、988、1104、1122、1224、1256、1370、1404、1494、1580、1612和/或1728的淀粉酶更稳定。在一些另外的实施方案中，重组淀粉酶在pH 6.8比SEQ ID NO:2的淀粉酶更稳定。在一些另外的实施方案中，重组淀粉酶在pH 6.8比SEQ ID NO:18、40、156、174、276、308、422、456、546、632、664、780、988、1104、1122、1224、1256、1370、1404、1494、1580、1612和/或1728的淀粉酶更稳定。在一些另外的实施方案中，重组淀粉酶在pH 6.7比SEQ ID NO:2的淀粉酶更稳定。在一些另外的实施方案中，重组淀粉酶在pH 6.7比SEQ ID NO:18、40、156、174、276、308、422、456、546、632、664、780、988、1104、1122、1224、1256、1370、1404、1494、1580、1612和/或1728的淀粉酶更稳定。在一些另外的实施方案中，重组淀粉酶在pH 6.5比SEQ ID NO:2的淀粉酶更稳定。在一些另外的实施方案中，重组淀粉酶在pH 6.5比SEQ ID NO:18、40、156、174、276、308、422、456、546、632、664、780、988、1104、1122、1224、1256、1370、1404、1494、1580、1612和/或1728的淀粉酶更稳定。在一些另外的实施方案中，重组淀粉酶在pH 6比SEQ ID NO:2的淀粉酶更稳定。在一些另外的实施方案中，重组淀粉酶在pH 6比SEQ ID NO:18、40、156、174、276、308、422、456、546、632、664、780、988、1104、1122、1224、1256、1370、1404、1494、1580、1612和/或1728的淀粉酶更稳定。在一些此外的实施方案中，重组淀粉酶在小于5的pH比SEQ ID NO:2的淀粉酶更稳定。在一些另外的实施方案中，重组淀粉酶在pH 5比SEQ ID NO:2的淀粉酶更稳定。在一些另外的实施方案中，重组淀粉酶在pH 5比SEQ ID NO:18、40、156、174、276、308、422、456、546、632、664、780、988、1104、1122、1224、1256、1370、1404、1494、1580、1612和/或1728的淀粉酶更稳定。在一些此外的实施方案中，重组淀粉酶在pH 4比SEQ ID NO:2的淀粉酶更稳定。在一些此外的实施方案中，重组淀粉酶在pH 5比SEQ ID NO:18、40、156、174、276、308、422、456、546、632、664、780、988、1104、1122、1224、1256、1370、1404、1494、1580、1612和/或1728的淀粉酶更稳定。在一些另外的实施方案中，重组淀粉酶在pH 3.8比SEQ ID NO:2的淀粉酶更稳定。在一些另外的实施方案中，重组淀粉酶在pH 3.8比SEQ ID NO:18、40、156、174、276、308、422、456、546、632、664、780、988、1104、1122、1224、1256、1370、1404、1494、1580、1612和/或1728的淀粉酶更稳定。
在一些另外的实施方案中，重组淀粉酶在pH 3.5比SEQ ID NO:2的淀粉酶更稳定。在一些另外的实施方案中，重组淀粉酶在pH 3.5比SEQ ID NO:18、40、156、174、276、308、422、456、546、632、664、780、988、1104、1122、1224、1256、1370、1404、1494、1580、1612和/或1728的淀粉酶更稳定。在一些另外的实施方案中，重组淀粉酶在pH 3.25比SEQ ID NO:2的淀粉酶更稳定。在一些另外的实施方案中，重组淀粉酶在pH 3.25比SEQ ID NO:18、40、156、174、276、308、422、456、546、632、664、780、988、1104、1122、1224、1256、1370、1404、1494、1580、1612和/或1728的淀粉酶更稳定。在一些此外的实施方案中，重组淀粉酶在pH 3比SEQID NO:2的淀粉酶更稳定。在一些此外的实施方案中，重组淀粉酶在pH 3比SEQ ID NO:18、40、156、174、276、308、422、456、546、632、664、780、988、1104、1122、1224、1256、1370、1404、1494、1580、1612和/或1728的淀粉酶更稳定。在一些另外的实施方案中，重组淀粉酶在pH2.75比SEQ ID NO:2的淀粉酶更稳定。在一些另外的实施方案中，重组淀粉酶在pH 2.75比SEQ ID NO:18、40、156、174、276、308、422、456、546、632、664、780、988、1104、1122、1224、1256、1370、1404、1494、1580、1612和/或1728的淀粉酶更稳定。在一些此外的实施方案中，重组淀粉酶在pH 2.5比SEQ ID NO:2的淀粉酶更稳定。在一些此外的实施方案中，重组淀粉酶在pH 2.5比SEQ ID NO:18、40、156、174、276、308、422、456、546、632、664、780、988、1104、1122、1224、1256、1370、1404、1494、1580、1612和/或1728的淀粉酶更稳定。在一些此外的实施方案中，重组淀粉酶在pH 2.3比SEQ ID NO:2的淀粉酶更稳定。在一些此外的实施方案中，重组淀粉酶在pH 2.3比SEQ ID NO:18、40、156、174、276、308、422、456、546、632、664、780、988、1104、1122、1224、1256、1370、1404、1494、1580、1612和/或1728的淀粉酶更稳定。在一些此外的实施方案中，重组淀粉酶在pH 2比SEQ ID NO:2的淀粉酶更稳定。在一些此外的实施方案中，重组淀粉酶在pH 2比SEQ ID NO:18、40、156、174、276、308、422、456、546、632、664、780、988、1104、1122、1224、1256、1370、1404、1494、1580、1612和/或1728的淀粉酶更稳定。
在一些实施方案中，重组淀粉酶比SEQ ID NO:2的淀粉酶更抗蛋白水解。在一些实施方案中，重组淀粉酶比SEQ ID NO:18、40、156、174、276、308、422、456、546、632、664、780、988、1104、1122、1224、1256、1370、1404、1494、1580、1612和/或1728的淀粉酶更抗蛋白水解。在一些实施方案中，重组淀粉酶抗胃蛋白酶的蛋白水解。在一些另外的实施方案中，重组淀粉酶比SEQ ID NO:2的淀粉酶更抗胃蛋白酶的蛋白水解。在一些实施方案中，重组淀粉酶比SEQ ID NO:18、40、156、174、276、308、422、456、546、632、664、780、988、1104、1122、1224、1256、1370、1404、1494、1580、1612和/或1728的淀粉酶更抗胃蛋白酶的蛋白水解。
在一些另外的实施方案中，重组淀粉酶在存在至少一种胆盐的情况下是有活性的。在一些另外的实施方案中，重组淀粉酶在存在至少一种胆盐的情况下比SEQ ID NO:2的淀粉酶更有活性。在一些另外的实施方案中，重组淀粉酶在存在至少一种胆盐的情况下比SEQ ID NO:18、40、156、174、276、308、422、456、546、632、664和/或780、988、1104、1122、1224、1256、1370、1404、1494、1580、1612和/或1728的淀粉酶更有活性。在一些实施方案中，重组淀粉酶在暴露于胆盐后保留酶活性。在一些另外的实施方案中，与参考序列相比，重组淀粉酶在暴露于胆盐后保留更大的酶活性。在一些实施方案中，参考序列是SEQ ID NO:2、18、40、156、174、276、308、422、456、546、632、664、780、988、1104、1122、1224、1256、1370、1404、1494、1580、1612和/或1728的淀粉酶。在一些另外的实施方案中，胆盐是牛磺胆酸盐。
在又一些另外的实施方案中，与野生型淀粉酶或另一种重组淀粉酶相比，重组淀粉酶表现出多于一种改进的特性。在一些实施方案中，与SEQ ID NO:2相比，重组淀粉酶表现出多于一种改进的特性，而在一些另外的实施方案中，重组淀粉酶与SEQ ID NO:18、40、156、174、276、308、422、456、546、632、664、780、988、1104、1122、1224、1256、1370、1404、1494、1580、1612和/或1728相比，表现出多于一种改进的特性。在一些实施方案中，改进的特性选自酸稳定性、碱稳定性、在酸性pH的稳定性和/或活性、在碱性pH的稳定性、在中性pH的稳定性、热稳定性、蛋白水解抗性、自溶抗性和增加的在存在至少一种胆盐的情况下的活性。在又另外一些实施方案中，重组淀粉酶在酸性pH比SEQ ID NO:2、18、40、156、174、276、308、422、456、546、632、664、780、988、1104、1122、1224、1256、1370、1404、1494、1580、1612和/或1728的淀粉酶更稳定和/或更有活性、更热稳定、更抗蛋白水解和/或在存在至少一种胆盐的情况下更有活性。设想了可将改进的特性的任何组合用于本发明。不意图本发明受限于改进的特性的任何特定组合。此外，在一些实施方案中，有两种改进的特性，而在一些其他实施方案中，有三种改进的特性，在一些另外的实施方案中，有四种改进的特性，并且在一些另外的实施方案中，有五种或更多种改进的特性。还设想了本发明的重组淀粉酶还包括另外的改进。在一些实施方案中，这些另外的改进提供了优于野生型淀粉酶的优势，而在一些其他实施方案中，另外的改进将提供优于其他重组淀粉酶的优势。
在一些实施方案中，与SEQ ID NO:2的淀粉酶相比，重组淀粉酶表现出至少一种选自以下的改进的特性：改进的在酸性pH的稳定性和/或活性、改进的热稳定性、改进的对蛋白水解的抗性和/或改进的在存在至少一种胆盐的情况下的活性。在一些实施方案中，与SEQ ID NO:18、40、156、174、276、308、422、456、546、632、664、780、988、1104、1122、1224、1256、1370、1404、1494、1580、1612和/或1728的淀粉酶相比，重组淀粉酶表现出至少一种选自以下的改进的特性：改进的在酸性pH的稳定性和/或活性、改进的热稳定性、改进的对蛋白水解的抗性和/或改进的在存在至少一种胆盐的情况下的活性。在一些实施方案中，与SEQ ID NO:2的淀粉酶相比，重组淀粉酶表现出至少两种选自以下的改进的特性：改进的在酸性pH的稳定性和/或活性、改进的热稳定性、改进的对蛋白水解的抗性和/或改进的在存在至少一种胆盐的情况下的活性。在一些实施方案中，与SEQ ID NO:18、40、156、174、276、308、422、456、546、632、664、780、988、1104、1122、1224、1256、1370、1404、1494、1580、1612和/或1728的淀粉酶相比，重组淀粉酶表现出至少两种选自以下的改进的特性：改进的在酸性pH的稳定性和/或活性、改进的热稳定性、改进的对蛋白水解的抗性和/或改进的在存在至少一种胆盐的情况下的活性。在一些实施方案中，与SEQ ID NO:2的淀粉酶相比，重组淀粉酶表现出至少三种选自以下的改进的特性：改进的在酸性pH的稳定性和/或活性、改进的热稳定性、改进的对蛋白水解的抗性和/或改进的在存在至少一种胆盐的情况下的活性。在一些实施方案中，与SEQ ID NO:18、40、156、174、276、308、422、456、546、632、664、780、988、1104、1122、1224、1256、1370、1404、1494、1580、1612和/或1728的淀粉酶相比，重组淀粉酶表现出至少三种选自以下的改进的特性：改进的在酸性pH的稳定性和/或活性、改进的热稳定性、改进的对蛋白水解的抗性和/或改进的在存在至少一种胆盐的情况下的活性。在一些实施方案中，与SEQ ID NO:2的淀粉酶相比，重组淀粉酶表现出以下改进的特性：改进的在酸性pH的稳定性和/或活性、改进的热稳定性、改进的对蛋白水解的抗性和改进的在存在至少一种胆盐的情况下的活性。在一些实施方案中，与SEQ ID NO:18、40、156、174、276、308、422、456、546、632、664、780、988、1104、1122、1224、1256、1370、1404、1494、1580、1612和/或1728的淀粉酶相比，重组淀粉酶表现出以下改进的特性：改进的在酸性pH的稳定性和/或活性、改进的热稳定性、改进的对蛋白水解的抗性和/或改进的在存在至少一种胆盐的情况下的活性。在一些实施方案中，与SEQ ID NO:2的淀粉酶相比，重组淀粉酶表现出至少一种选自以下的改进的特性：改进的在酸性pH的稳定性和/或活性、改进的热稳定性、改进的对蛋白水解的抗性和/或改进的在存在至少一种胆盐的情况下的活性，以及至少一种另外的改进的特性。在一些实施方案中，与SEQ ID NO:18、40、156、174、276、308、422、456、546、632、664、780、988、1104、1122、1224、1256、1370、1404、1494、1580、1612和/或1728的淀粉酶相比，重组淀粉酶表现出至少一种选自以下的改进的特性：改进的在酸性pH的稳定性和/或活性、改进的热稳定性、改进的对蛋白水解的抗性和/或改进的在存在至少一种胆盐的情况下的活性，以及至少一种另外的改进的特性。在一些实施方案中，与参考序列相比，重组淀粉酶表现出至少一种选自以下的改进的特性：i)增加的催化活性；ii)增加的对酸性pH的耐受性；iii)增加的对pH 2.3、2.5、2.75、3、3.25和/或3.5的耐受性；iv)增加的对pH 6.7和/或6.8的耐受性；v)增加的对至少一种蛋白酶的耐受性；vi)增加的对至少一种胆盐的耐受性；vii)增加的耐热性；或i)、ii)、iii)、iv)、v)、vi)和vii)中的任何组合。在一些实施方案中，参考序列是SEQ ID NO:2，而在一些可选的实施方案中，参考序列选自SEQ ID NO:18、40、156、174、276、308、422、456、546、632、664、780、988、1104、1122、1224、1256、1370、1404、1494、1580、1612和/或1728。在一些实施方案中，与至少一个参考序列相比，重组淀粉酶表现出至少一种选自以下的改进的特性：i)增强的催化活性；ii)增加的对酸性pH的耐受性；iii)增加的对pH 2.3、2.5、2.75、3、3.25和/或3.5的耐受性；iv)增加的对pH 6.7和/或6.8的耐受性；v)增加的对至少一种蛋白酶的耐受性；vi)增加的对至少一种胆盐的耐受性；vii)增加的耐热性；或i)、ii)、iii)、iv)、v)、vi)和vii)中的任何组合。在一些实施方案中，参考序列是SEQ ID NO:2，而在一些可选的实施方案中，参考序列选自SEQ ID NO:18、40、156、174、276、308、422、456、546、632、664、780、988、1104、1122、1224、1256、1370、1404、1494、1580、1612和/或1728。在一些实施方案中，与至少两个或更多个参考序列相比，重组淀粉酶表现出至少一种选自以下的改进的特性：i)增强的催化活性；ii)增加的对酸性pH的耐受性；iii)增加的对pH 2.3、2.5、2.75、3、3.25和/或3.5的耐受性；iv)增加的对pH 6.7和/或6.8的耐受性；v)增加的对至少一种蛋白酶的耐受性；vi)增加的对至少一种胆盐的耐受性；vii)增加的耐热性；或i)、ii)、iii)、iv)、v)、vi)和vii)中的任何组合。在一些实施方案中，参考序列选自SEQ ID NO:18、40、156、174、276、308、422、456、546、632、664、780、988、1104、1122、1224、1256、1370、1404、1494、1580、1612和/或1728。在一些实施方案中，蛋白酶选自胃蛋白酶、胰蛋白酶和/或胰凝乳蛋白酶。在一些实施方案中，在30℃、37℃、40℃、50℃、60℃和/或95℃和/或40℃至60℃测量增加的耐热性。在一些此外的实施方案中，重组淀粉酶是纯化的。
在仍一些此外的实施方案中，淀粉酶在食物和/或饮料中是稳定的。在一些另外的实施方案中，淀粉酶在营养补充剂和其他补充剂中是稳定的。在一些实施方案中，补充剂是液体，而在其他实施方案中，它们是乳液、悬浮液或固体。不意图本发明受限于任何特定的食品、饮料和/或补充剂形制(format)或形式。
本发明还提供了编码至少一种本文提供的重组淀粉酶的重组多核苷酸序列。在一些实施方案中，重组多核苷酸序列是密码子优化的。在一些此外的实施方案中，重组多核苷酸包含与SEQ ID NO:3-17、21-965和969-1913中的奇数编号序列中列出的至少一个序列具有至少约85％、约86％、约87％、约88％、约89％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％或更多序列同一性的序列。在一些此外的实施方案中，多核苷酸包含与SEQ ID NO:3-17、21-965和969-1913中的奇数编号序列中列出的至少一个序列具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多序列同一性的序列。在一些另外的实施方案中，本发明提供了SEQID NO:3-17、21-965和969-1913中的奇数编号序列中列出的至少一个序列。在一些另外的实施方案中，重组多核苷酸序列包含选自SEQ ID NO:3-17、21-965和969-1913中的奇数编号序列的序列。在一些实施方案中，重组多核苷酸序列包含选自SEQ ID NO:3-17、21-965和969-1913中的奇数编号序列的序列，其中所述序列编码本文提供的重组多肽。在一些实施方案中，重组多核苷酸序列包含选自SEQ ID NO:3-17、21-965和969-1913中的奇数编号序列的序列，其中所述序列编码SEQ ID NO:4-18、22-966和970-1914中的偶数编号序列中提供的重组多肽。在一些此外的实施方案中，编码本文提供的重组淀粉酶的重组多核苷酸包含与SEQ ID NO:3-17、21-965和969-1913中的奇数编号序列中列出的至少一个序列具有至少约85％、约86％、约87％、约88％、约89％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％或更多序列同一性的序列。在一些此外的实施方案中，编码本文提供的重组淀粉酶的重组多核苷酸包含与SEQ ID NO:3-17、21-965和969-1913中的奇数编号序列中列出的至少一个序列具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多序列同一性的序列。在一些此外的实施方案中，编码本文提供的重组淀粉酶的重组多核苷酸包含与SEQ ID NO:3-17、21-965和969-1913中的奇数编号序列中列出的至少一个序列具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多序列同一性的序列，其中重组淀粉酶包含含有SEQ ID NO:4-18、22-966和970-1914中提供的偶数编号序列的多肽序列。
本发明还提供了表达载体，所述表达载体包含至少一种本文提供的重组多核苷酸序列。本发明还提供了表达载体，所述表达载体包含编码至少一种本文提供的重组淀粉酶的至少一种重组多核苷酸序列。在一些另外的实施方案中，重组多核苷酸序列可操作地连接至控制序列。在一些实施方案中，控制序列是启动子。在一些此外的实施方案中，启动子是异源启动子。
本发明还提供了包含至少一种本文提供的表达载体的宿主细胞。本发明还提供了包含至少一种表达载体的宿主细胞，所述至少一种表达载体包含至少一种编码至少一种本文提供的重组淀粉酶的重组多核苷酸序列。本发明还提供了包含表达载体的宿主细胞，所述表达载体包含至少一种编码至少一种本文提供的重组淀粉酶的重组多核苷酸序列。本发明还提供了包含表达载体的宿主细胞，所述表达载体包含至少一种编码本文提供的重组淀粉酶的重组多核苷酸序列。在一些实施方案中，宿主细胞是真核的，而在一些可选的实施方案中，宿主细胞是原核的。在一些实施方案中，宿主细胞是大肠杆菌(Escherichia coli)。在一些可选的实施方案中，宿主细胞是酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)。
本发明还提供了产生至少一种重组淀粉酶的方法，该方法包括在产生由重组多核苷酸编码的重组淀粉酶的条件下培养至少一种本文提供的宿主细胞。在一些实施方案中，方法还包括回收淀粉酶的步骤。在又一些另外的实施方案中，方法还包括纯化淀粉酶的步骤。
本发明还提供了包含至少一种本文提供的重组淀粉酶的组合物。在一些实施方案中，包含至少一种重组淀粉酶的组合物包括药物组合物。在一些另外的实施方案中，药物组合物适用于胰功能不全(pancreatic insufficiency)的治疗。在一些另外的实施方案中，药物组合物还包括药学上可接受的载体和/或赋形剂。在一些实施方案中，药物组合物适用于肠胃外注射或输注、皮下注射、吸入和/或皮肤应用至人类。在一些实施方案中，药物组合物适用于口服施用至人类。在一些实施方案中，药物组合物还包含肠溶包衣。
在一些另外的实施方案中，药物组合物还包含至少一种脂肪酶。在一些此外的实施方案中，药物组合物还包含至少一种蛋白酶。在又一些另外的实施方案中，药物组合物还包含至少一种蛋白酶和至少一种脂肪酶。在一些实施方案中，药物组合物还包含含有脂肪酶、蛋白酶和淀粉酶活性的胰提取物。本发明还提供了包含至少一种本文提供的重组淀粉酶的组合物，其中该组合物适用于其他用途。
本发明还提供了用于治疗和/或预防受试者中胰功能不全的症状的方法，该方法包括提供具有胰功能不全的受试者，并向受试者提供本文提供的药物组合物。在一些实施方案中，在向受试者施用包含至少一种重组淀粉酶的组合物后，受试者的胰功能不全的症状得到改善。在一些此外的实施方案中，受试者能够食用比表现出胰功能不全的症状的受试者所需的饮食在碳水化合物成分(例如，淀粉)方面的限制更少的饮食。在一些另外的实施方案中，受试者是人类患者。在一些实施方案中，人类患者是婴儿，而在一些其他实施方案中，人类患者是儿童。在又一些此外的实施方案中，人类患者是成年人，而在一些可选的实施方案中，人类患者是年轻人。在一些实施方案中，受试者是非人类哺乳动物，诸如非人类灵长类动物、猪、牛、狗和猫。本发明还提供了包含至少一种本文提供的重组淀粉酶的药物。本发明还提供了包含至少一种本文提供的重组淀粉酶的组合物的用途。
本发明还提供了用于淀粉水解的方法，该方法包括提供淀粉和至少一种本文提供的工程化淀粉酶；以及在使得淀粉被所述工程化淀粉酶水解的条件下将淀粉暴露于所述工程化淀粉酶。在一些实施方案中，本发明提供了用于淀粉水解的方法，该方法包括提供淀粉和包含至少一种工程化淀粉酶的组合物，以及在使得所述淀粉被所述组合物中的所述工程化淀粉酶水解的条件下将所述淀粉暴露于所述组合物。
发明描述
本发明提供了工程化淀粉酶多肽及其组合物。该工程化淀粉酶多肽已经过优化以提供改进的热稳定性、蛋白酶稳定性和在一定范围的pH条件包括酸性(pH<7)条件下的稳定性。本发明还涉及包含工程化淀粉酶多肽的组合物用于治疗目的和/或营养目的的用途。在一些实施方案中，本发明的淀粉酶变体可用于PEI状况的PERT治疗。在一些另外的实施方案中，淀粉酶以不需要肠溶包衣和/或质子泵抑制剂(PPI)的形制施用。本发明还提供了编码工程化淀粉酶多肽的多核苷酸，以及用于制备工程化多核苷酸和淀粉酶多肽的方法。
缩写和定义：
除非另外定义，否则本文使用的所有技术术语和科学术语通常具有与本发明所属领域普通技术人员通常理解的相同的含义。通常，本文使用的命名法和下文描述的细胞培养、分子遗传学、微生物学、有机化学、分析化学和核酸化学中的实验程序是本领域熟知的并且普遍地采用的那些。这样的技术是熟知的，并且在本领域技术人员熟知的许多教科书和参考著作中进行了描述。对于化学合成和化学分析使用了标准技术或其修改形式。本文(上文和下文两者)提及的所有专利、专利申请、文章和出版物，在此通过引用明确并入本文。
尽管本发明的实践中可使用类似或等同于本文描述那些的任何合适的方法和材料，本文描述了一些方法和材料。应理解本发明不限于所描述的特定方法、方案和试剂，因为这些可以根据本领域技术人员使用它们的情况而改变。因此，下文即将定义的术语通过参考本申请作为整体而被更充分地描述。本文(上文和下文两者)提及的所有专利、专利申请、文章和出版物，在此通过引用明确并入本文。
如本文使用的，除非上下文另外清楚地指示，否则单数“一(a)”、“一(an)”和“所述/该(the)”包括复数指示物。
数值范围包括限定该范围的数字。因此，本文公开的每个数值范围意图包括落在这样的较宽数值范围内的每一较窄数值范围，如同这样的较窄数值范围在本文中被全部清楚地写出。还意图本文公开的每个最大的(或最小的)数值限制包含每个较低(或较高)的数值限制，如同这样的较低(或较高)数值限制在本文中被清楚地写出。
如本文使用的，术语“约”意指特定值的可接受的误差。在一些情况下，“约”意指在给定值范围的0.05％、0.5％、1.0％或2.0％内。在一些情况下，“约”意指在给定值的1、2、3或4个标准差内。
此外，本文所提供的标题不是可以通过参考本申请作为整体而被具有的本发明的各个方面或实施方案的限制。因此，下文即将定义的术语通过参考本申请作为整体而被更充分地描述。尽管如此，为了便于理解本发明，许多术语定义如下。
除非另外指示，否则，分别地，核酸以5’至3’方向从左到右书写；氨基酸序列以氨基至羧基方向从左至右书写。
如本文使用的，术语“包含(comprising)”及其同源词以其包括性含义被使用(即，等同于术语“包括(including)”及其相应的同源词)。
如本文使用的，“EC”编号是指生物化学和分子生物学国际联合命名委员会(Nomenclature Committee of the International Union of Biochemistry andMolecular Biology)(NC-IUBMB)的酶命名法。该IUBMB生化分类是基于酶催化的化学反应的酶数字分类系统。
如本文使用的，“ATCC”是指美国典型培养物保藏中心(American Type CultureCollection)，其生物保藏收集物包括基因和菌株。
如本文使用的，“NCBI”是指美国国家生物技术信息中心(National Center forBiological Information)和其中提供的序列数据库。
如本文使用的，“淀粉酶”是指能够水解淀粉来产生葡萄糖和麦芽糖的酶。
如本文使用的，“蛋白酶(protease)”(以及“蛋白酶(proteinase)”和“肽酶”)是指许多水解蛋白质的酶。有许多蛋白酶参与蛋白质分解成较小的多肽单元或单个氨基酸。蛋白酶对许多生物功能，包括摄入的蛋白质的消化、蛋白质分解代谢和细胞信号传导都很重要。
如本文使用的，“脂肪酶”是指任何通常称为“脂肪酶”的酶，其通过水解甘油三酯的酯键来催化脂肪的水解。胰脂肪酶在分解脂肪为脂肪酸、甘油和其他醇方面是重要的。脂肪酶是大多数生物体中膳食脂质的消化、运输和加工中必不可少的。
如本文使用的，术语“脂质”是指一类不溶于水的大分子，其包括脂肪酸及其酯、固醇、萜醇、某些难溶维生素和其他相关化合物。“脂肪”是由脂肪酸酯(例如，甘油三酯，其由甘油和三个脂肪酸组成)组成的脂质的子集。不意图本发明受限于任何特定的脂质和/或脂肪。考虑上下文，术语“脂肪”和“脂质”在本文中可互换使用。
如本文使用的，术语“蛋白”、“多肽”和“肽”可互换使用，以表示无论长度或翻译后修饰(例如，糖基化或磷酸化)，通过酰胺键共价连接的至少两个氨基酸的聚合物。
如本文使用的，术语“氨基酸”通过其通常已知的三字母符号或通过IUPAC-IUB生物化学命名委员会推荐的单字母符号在本文中被提及。同样地，核苷酸可以通过其通常可接受的单字母代码被提及。
如本文使用的，当提及细胞、多核苷酸或多肽使用时，术语“工程化”、“重组”、“非天然存在的”和“变体”是指如下材料或与该材料的天然或自然形式对应的材料：已经以自然界中本来不存在的方式被修饰或与其相同但从合成材料产生或衍生和/或通过使用重组技术操作产生或衍生。
重组多肽可以使用本领域已知的任何合适的方法产生。编码感兴趣的野生型多肽的基因可以在载体例如质粒中克隆，并在期望的宿主中表达，例如大肠杆菌(E.coli)、酿酒酵母(S.cerevisiae)等。重组多肽的变体可以通过本领域已知的各种方法产生。实际上，存在本领域技术人员熟知的各种各样不同的诱变技术。另外，诱变试剂盒还可从许多商业分子生物学供应商获得。产生确定的氨基酸(定点)处的特定取代、基因的局部区域中的特异性(区域特异性)或随机突变，或整个基因内的随机诱变(例如，饱和诱变)的方法是可得的。本领域的技术人员已知产生酶变体的许多合适的方法，包括但不限于，使用PCR对单链DNA或双链DNA定点诱变、盒式诱变、基因合成、易错PCR、改组和化学饱和诱变，或本领域已知的任何其他合适的方法。用于DNA和蛋白工程化的方法的非限制性实例在以下专利中提供：美国专利第6,117,679号；美国专利第6,420,175号；美国专利第6,376,246号；美国专利第6,586,182号；美国专利第7,747,391号；美国专利第7,747,393号；美国专利第7,783,428号和美国专利第8,383,346号。在变体产生之后，可以对它们筛选任何期望的特性(例如，高的或增加的活性、或低的或降低的活性、增加的热活性、增加的热稳定性和/或酸性pH稳定性等)。在一些实施方案中，可使用“重组淀粉酶多肽”(在本文中也称为“工程化淀粉酶多肽”、“变体淀粉酶”和“淀粉酶变体”)。
如本文使用的，“野生型”和“天然存在的”是指在自然界中发现的形式。例如，野生型多肽或多核苷酸序列为生物体中存在的序列，其可从天然来源分离且未通过人为操纵被有意地修饰。
如本文使用的，“编码序列”是指核酸(例如基因)编码蛋白质的氨基酸序列的部分。
术语“序列同一性百分比(％)”在本文中用于指多核苷酸和多肽之间的比较，并通过比较比较窗中两条最佳对齐的序列确定，其中多核苷酸或多肽序列在比较窗中的部分与参考序列相比可以包括添加或缺失(即，空位)，以用于两个序列的最佳对齐。百分比可以通过如下计算：确定两个序列中出现相同核酸碱基或氨基酸残基的位置的数目以产生匹配位置的数目，将匹配位置的数目除以比较窗中位置的总数目，并将结果乘以100以得到序列同一性百分比。可选地，百分比可以通过如下计算：确定两个序列中出现相同的核酸碱基或氨基酸残基或者核酸碱基或氨基酸残基与空位对齐的位置的数目以产生匹配位置的数目，将匹配位置的数目除以比较窗中位置的总数目，并将结果乘以100以得到序列同一性的百分比。本领域技术人员理解，存在许多可用于比对两个序列的已建立的算法。用于比较的序列的最佳比对可以例如通过以下进行：通过Smith和Waterman的局部同源性算法(Smith和Waterman,Adv.Appl.Math.,2:482[1981])，通过Needleman和Wunsch的同源性比对算法(Needleman和Wunsch,J.Mol.Biol.,48:443[1970])，通过Pearson和Lipman的相似性搜索方法(Pearson和Lipman,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:2444[1988])，通过这些算法的计算机化实现(例如，GCG Wisconsin软件包中的GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA)，或者通过目视检查，如本领域已知的。适用于确定序列同一性和序列相似性百分比的算法的实例包括但不限于BLAST和BLAST 2.0算法，由Altschul等人描述(分别参见Altschul等人,J.Mol.Biol.,215:403-410[1990]；和Altschul等人,Nucleic Acids Res.,3389-3402[1977])。公众可通过美国国家生物技术信息中心网站获得用于进行BLAST分析的软件。该算法包括首先通过鉴定查询序列中长度W的短字来鉴定高评分序列对(HSP)，所述短字在与数据库序列中相同长度的字比对时匹配或满足某一正值的阀值评分T。T被称为邻近字评分阈值(参见，Altschul等人，上文)。这些最初的邻近字击中(word hit)充当启动搜索的种子以找到包含它们的更长HSP。然后字击中沿着每个序列的两个方向延伸直到累积比对评分不能增加的程度。对于核苷酸序列，累积评分使用参数M(用于匹配残基对的奖励评分；总是＞0)和N(用于错配残基的惩罚评分；总是＜0)计算。对于氨基酸序列，评分矩阵用于计算累积评分。在以下情况时，停止字击中在每一个方向的延伸：累积比对评分从其最大达到值下降了量X；由于累积了一个或更多个负评分残基比对，累积得分达到0或小于0；或到达任一序列末端。BLAST算法参数W、T和X决定比对的灵敏度和速度。BLASTN程序(对于核苷酸序列)使用以下作为默认值：字长(W)为11、期望值(E)为10、M＝5、N＝-4、以及两条链的比较。对于氨基酸序列，BLASTP程序使用以下作为默认值：字长(W)为3，期望(E)为10和BLOSUM62评分矩阵(参见，Henikoff和Henikoff,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89:10915[1989])。序列比对与％序列同一性的示例性确定可以使用GCG Wisconsin软件包(Accelrys,Madison WI)中的BESTFIT或GAP程序，使用提供的默认参数。
如本文使用的，“参考序列”是指用作序列比较的基础的确定序列。参考序列可以是更大序列的子集，例如，全长基因或多肽序列的区段(segment)。通常，参考序列为至少20个核苷酸或氨基酸残基的长度、至少25个残基的长度、至少50个残基的长度、至少100个残基的长度或核酸或多肽的全长。因为两个多核苷酸或多肽可以各自(1)包含两个序列之间相似的序列(即，完整序列的一部分)，和(2)还可以包含两个序列之间不同的(divergent)序列，所以两个(或更多个)多核苷酸或多肽之间的序列比较通常通过比较两个多核苷酸或多肽在“比较窗”中的序列以鉴定和比较局部区域的序列相似性来进行。在一些实施方案中，“参考序列”可以基于一级氨基酸序列(primary amino acid sequence)，其中参考序列是可以在一级序列中具有一个或更多个变化的序列。“比较窗”是指至少约20个连续核苷酸位置或氨基酸残基的概念性区段，其中序列可以与至少20个连续核苷酸或氨基酸的参考序列进行比较，并且其中在比较窗口中序列的一部分与用于两个序列的最佳比对的参考序列(其不包含添加或缺失)相比，可包括20％或更少的添加或缺失(即，空位)。比较窗可以比20个连续残基更长，并任选地包括30、40、50、100或更长的窗。
在用于指定的氨基酸或多核苷酸序列的编号的情况下，“对应于”、“参考”或“相对于”指当指定的氨基酸或多核苷酸序列与参考序列相比较时指定的参考序列残基的编号。换言之，给定聚合物的残基编号或残基位置关于参考序列被指定，而不是通过给定氨基酸或多核苷酸序列内残基的实际数字位置被指定。例如，给定氨基酸序列，诸如工程化淀粉酶的氨基酸序列可以通过引入空位以与参考序列对齐，来优化两个序列之间的残基匹配。在这些情况中，尽管存在空位，但对给定氨基酸或多核苷酸序列中残基的编号是关于与其比对的参考序列进行的。
如本文使用的，“突变”是指多肽或多核苷酸序列中的任何变化。意图包括序列中存在的任何数量(即，一个或更多个)的取代、插入、缺失和/或重排(即，与起始或参考序列相比)。因此，序列中的突变导致变体多肽(例如，变体或重组淀粉酶)的产生，如本文所提供的。
如本文使用的，“氨基酸差异”或“残基差异”是指多肽序列的一个位置处的氨基酸残基相对于参考序列中对应位置处的氨基酸残基的差异。本文中氨基酸差异的位置通常被称为“Xn”，其中n是指残基差异所基于的参考序列中的对应位置。例如，“与SEQ ID NO:2相比位置X92处的残基差异”是指对应于SEQ ID NO:2的位置92的多肽位置处的氨基酸残基的差异。因此，如果参考多肽SEQ ID NO:2在位置92处具有苏氨酸，那么“与SEQ ID NO:2相比在位置X92处的残基差异”意指在对应于SEQ ID NO:2的位置92的多肽位置处的除了苏氨酸之外的氨基酸残基(例如，T92A)。在本文的大多数情况下，在一个位置处的特定氨基酸残基差异指示为“XnY”，其中“Xn”指定如上文描述的对应位置，并且“Y”是在工程化多肽中发现的氨基酸(即，与参考多肽中的不同的残基)的单字母标识符。在一些情况下(例如，在表4-1、表4-2、表4-3、表4-4、表4-5、表4-6、表4-7、表4-8、表4-9、表4-10、表4-11、表4-12、表4-13和/或表4-14中)，本公开内容还提供由常规符号“AnB”表示的特定氨基酸差异，其中A是参考序列中的残基的单字母标识符，“n”是在参考序列中的残基位置的编号，并且B是工程化多肽的序列中残基取代的单字母标识符。在一些情况下，本公开内容的多肽可以包含相对于参考序列的一个或更多个氨基酸残基差异，所述氨基酸残基差异由相对于参考序列存在残基差异的指定位置的列表指示。在一些实施方案中，在多于一个氨基酸可以用于多肽的具体残基位置中时，可以使用的各种氨基酸残基由“/”分开(例如，X446A/X446G/X446M或X446A/G/M或P446A/G/M)。在一些实施方案中，酶变体包含多于一个取代。为了便于阅读，这些取代由斜线分开(例如，V408A/M439S)。本申请包括包含一个或更多个氨基酸差异的工程化多肽序列，所述一个或更多个氨基酸差异包括保守氨基酸取代和非保守氨基酸取代的任一种/或两者。
如本文使用的，“保守氨基酸取代”是指用具有相似侧链的不同残基取代残基，并且因此通常包括用相同或相似的氨基酸定义类别中的氨基酸取代多肽中的氨基酸。例如但不限于，具有脂肪族侧链的氨基酸可以被另一种脂肪族氨基酸(例如，丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸)取代；具有羟基侧链的氨基酸被另一种具有羟基侧链的氨基酸(例如，丝氨酸和苏氨酸)取代；具有芳香族侧链的氨基酸被另一种具有芳香族侧链的氨基酸(例如，苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸和组氨酸)取代；具有碱性侧链的氨基酸被另一种具有碱性侧链的氨基酸(例如，赖氨酸和精氨酸)取代；具有酸性侧链的氨基酸被另一种具有酸性侧链的氨基酸(例如，天冬氨酸或谷氨酸)取代；和/或疏水性氨基酸或亲水性氨基酸分别被另一种疏水性氨基酸或亲水性氨基酸取代。
如本文使用的，“非保守取代”是指用具有显著不同的侧链特性的氨基酸取代多肽中的氨基酸。非保守取代可以使用定义的组之间而不是之内的氨基酸，并且影响：(a)取代区域中的肽主链的结构(例如，脯氨酸取代甘氨酸)，(b)电荷或疏水性，或(c)侧链体积。例如但不限于，示例性非保守取代可以是用碱性或脂肪族氨基酸取代酸性氨基酸；用小氨基酸取代芳香族氨基酸；和用疏水性氨基酸取代亲水性氨基酸。
如本文使用的，“缺失”是指通过从参考多肽去除一个或更多个氨基酸对多肽进行的修饰。缺失可以包括去除1个或更多个氨基酸、2个或更多个氨基酸、5个或更多个氨基酸、10个或更多个氨基酸、15个或更多个氨基酸或者20个或更多个氨基酸、多达组成参考酶的氨基酸总数的10％或多达氨基酸总数的20％，同时保留酶活性和/或保留工程化酶的改进的特性。缺失可以涉及多肽的内部部分和/或末端部分。在各种实施方案中，缺失可以包括连续的区段或可以是不连续的。
如本文使用的，“插入”是指通过向参考多肽添加一个或更多个氨基酸对多肽进行的修饰。插入可以处于多肽的内部部分或者到羧基或氨基末端。如本文使用的插入包括如本领域已知的融合蛋白。插入可以是氨基酸的连续区段或由天然存在的多肽中的一个或更多个氨基酸分开。
如本文使用的，在多核苷酸序列上下文中使用的星号(*)指示多核苷酸序列中终止密码子的存在。在一些实施方案中，由于终止密码子的存在，与起始或参考序列相比，变体淀粉酶是截短的。
在本文中可互换使用的“功能片段”和“生物活性片段”是指这样的多肽：所述多肽具有氨基末端缺失和/或羧基末端缺失和/或内部缺失(例如，序列是截短的)，但其中剩余的氨基酸序列与和它进行比较的序列(例如，本发明的全长工程化淀粉酶)中的对应位置相同，并且保留全长多肽的基本上全部活性。
如本文使用的，“分离的多肽”是指与天然伴随其的其他污染物(例如蛋白质、脂质和多核苷酸)基本上分开的多肽。该术语包括已经从其天然存在的环境或表达系统(例如，宿主细胞或体外合成)中取出或纯化的多肽。重组淀粉酶多肽可以存在于细胞内、存在于细胞培养基中，或以各种形式(诸如裂解物或分离的制品)制备。因此，在一些实施方案中，重组淀粉酶多肽可以是分离的多肽。
术语“分离的”和“纯化的”用于指分子(例如，分离的核酸、多肽等)或其他组分从与其天然缔合的至少一种其他组分中取出。术语“纯化的”不要求绝对纯度，而是意图作为相对定义。
如本文使用的，“基本上纯的多肽”是指如下组合物，在所述组合物中多肽物质是存在的主要物质(即，在摩尔或重量基础上，它比该组合物中的任何其他单独的大分子物质更丰富)，并且当目标物质构成存在的大分子物质的按摩尔或％重量计至少约50％时，通常是基本上纯化的组合物。通常，基本上纯的淀粉酶组合物构成该组合物中存在的所有大分子物质的按摩尔或％重量计约60％或更多、约70％或更多、约80％或更多、约90％或更多、约95％或更多以及约98％或更多。在一些实施方案中，将目标物质从起始制品纯化至基本同质(即，通过常规检测方法不能在组合物中检测出污染物物质)，其中该组合物基本上由单一大分子物质组成。溶剂物质、小分子(<500道尔顿)和元素离子物质不被认为是大分子物质。在一些实施方案中，分离的重组淀粉酶多肽是基本上纯的多肽组合物。在一些实施方案中，基本上纯的重组淀粉酶多肽制品被添加到适用于本发明的制剂中(例如，多糖、表面活性剂等)。
如本文使用的，“改进的酶特性”和“改进的特性”是指与参考淀粉酶多肽和/或野生型淀粉酶多肽或另一种工程化淀粉酶多肽相比，工程化淀粉酶多肽的特性包括任何酶特性的改进。改进的特性包括但不限于诸如以下的特性：增加的蛋白表达、增加的热活性(thermoactivity)、增加的热稳定性、增加的pH活性、增加的稳定性、增加的酶活性、增加的底物特异性或亲和力、增加的比活性、增加的对底物或终产物抑制的抗性、增加的化学稳定性、改进的化学选择性、改进的溶剂稳定性、增加的对酸性或碱性pH的耐受性、增加的对蛋白水解活性的耐受性(即，降低的对蛋白水解的敏感性)、降低的聚集、增加的溶解度、降低的免疫原性、改进的翻译后修饰(例如，糖基化)和改变的温度谱(temperature profile)。
如本文使用的，“增加的酶活性”或“增强的催化活性”是指工程化淀粉酶多肽的改进的特性，其可以被表示为与参考淀粉酶相比，比活性(例如，产生的产物/时间/重量蛋白)的增加或底物向产物的转化百分比(例如，使用指定量的淀粉酶，在指定的时间段内，起始量的底物向产物的转化百分比)的增加。在实施例中提供了确定酶活性的示例性方法。与酶活性相关的任何特性都可以被影响，包括经典的酶特性Km、Vmax或kcat，其变化可以导致酶活性的增加。酶活性的改进可以是从对应野生型酶的酶活性的约1.1倍至多达天然存在的淀粉酶或从其衍生淀粉酶多肽的另一种工程化淀粉酶的2倍、5倍、10倍、20倍、25倍、50倍、75倍、100倍、150倍、200倍或更多的酶活性。
淀粉酶活性可以通过本领域已知的任何合适的方法来测量(例如，标准测定，诸如监测反应物或产物的分光光度特性的变化)。在一些实施方案中，产生的产物的量可以通过使用亚乙基pNP-G7作为底物并通过监测405nm处的吸光度(A405)来监测释放的对硝基苯酚来测量。在一些实施方案中，淀粉可以用作底物，并且产生的麦芽糖的量可以用二硝基水杨酸测定并监测540nm处的吸光度来测量，而在一些其他实施方案中，产物可以使用本领域已知的可选的方法来测量。酶活性的比较使用定义的酶制品、在设定条件下的定义的测定和一种或更多种定义的底物进行，如本文进一步详细描述的。
如本文使用的，术语“蛋白酶稳定的”和“对蛋白水解的稳定性”是指蛋白质(例如，本发明的重组淀粉酶)发挥功能并耐受由任何蛋白水解酶或其他蛋白水解化合物或因子介导的蛋白水解，并在用蛋白酶处理后保留其功能的能力。不意图该术语受限于使用任何特定的蛋白酶来评估蛋白质的稳定性。实际上，本发明的工程化淀粉酶是稳定的，并且在存在各种蛋白酶的情况下保留酶活性。在一些实施方案中，本发明的重组淀粉酶发挥功能并耐受由任何蛋白水解酶或其他蛋白水解化合物或因子介导的蛋白水解，并在暴露于蛋白酶后保留其功能。在一些实施方案中，工程化淀粉酶在存在胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶和/或胃蛋白酶的情况下是稳定的。然而，不意图本发明受限于任何特定的蛋白酶或任何特定的评估蛋白水解稳定性的方法。
如本文使用的，术语“pH稳定性”是指蛋白质(例如，本发明的重组淀粉酶)在特定pH孵育后发挥作用的能力。在一些实施方案中，本发明提供了在一定范围的pH(包括但不限于pH 2至pH 7的范围)稳定的重组淀粉酶。在一些实施方案中，重组淀粉酶在不同的pH范围是稳定的，如本文提供的实施例中所示。不意图本发明受限于任何pH稳定性水平或pH范围。
如本文使用的，术语“改进的对酸性pH的耐受性”意指与参考淀粉酶或另一种酶相比，根据本发明的重组淀粉酶将具有增加的稳定性(在暴露于酸性pH指定的时间段[例如，1小时，最多24小时，等]后，在约pH 7、6、5、4、3、2或甚至更低pH保留更高的活性)。
如本文使用的“生理pH”意指通常在受试者(例如，人类)的血液内发现的pH范围(例如，pH 7.2-7.4)。
术语“碱性pH”(例如，提及改进的对碱性pH条件的稳定性或增加的对碱性pH的耐受性使用的)意指约7至11的pH范围，或者在一些实施方案中，大于pH 11。
术语“酸性pH”(例如，提及改进的对酸性pH条件的稳定性或增加的对酸性pH的耐受性使用的)意指包括任何pH值小于7的pH范围。在一些实施方案中，酸性pH小于7，而在一些其他实施方案中，pH小于约6、5、4、3、2或更低。在一些可选的实施方案中，本发明的重组淀粉酶在2至4的pH水平是稳定的。然而，不意图本发明受限于任何特定的pH值或值范围。
如本文使用的，措辞“胃挑战(gastric challenge)”是指将本发明的重组淀粉酶暴露于低pH环境和至少一种酶(例如胃蛋白酶)的存在，使得重组淀粉酶暴露于胃(例如，人类的胃)中可能遇到的条件。
如本文使用的，措辞“肠挑战”是指将本发明的重组淀粉酶暴露于中性pH环境和至少一种蛋白酶(例如，肠蛋白酶，诸如胰蛋白酶和/或胰凝乳蛋白酶)和/或至少一种胆盐(例如，牛磺胆酸钠)的存在，使得重组淀粉酶暴露于肠道(例如，人类的肠)中可能遇到的条件。
如本文使用的，措辞“多个顺序挑战”是指将本发明的重组淀粉酶暴露于一系列挑战条件。例如，在一些实施方案中，一小时的热挑战之后是一小时的胃挑战，并且然后是一小时的肠挑战。不意图本发明受限于任何特定的挑战和/或挑战条件或者特定的挑战顺序。
术语“热稳定性(thermal stability)”和“热稳定性(thermostability)”是指蛋白质(例如，本发明的重组淀粉酶)在特定温度发挥作用的能力。在一些实施方案中，该术语指蛋白质在特定温度孵育后发挥作用的能力。在一些实施方案中，本发明的重组淀粉酶是“耐热的”(即，酶在升高的温度保持其催化活性)。在一些实施方案中，重组淀粉酶在升高的温度耐受失活，并且在一些实施方案中，在升高的温度持续延长的暴露时间保持催化活性。这些术语在本文中可互换使用。不意图本发明受限于任何特定温度和/或暴露时间。这样的稳定性可以通过本领域中已知的任何方法(例如，本文描述的方法)来测量。不意图本发明受限于任何特定的温度稳定性水平或温度范围。在一些实施方案中，在特定温度孵育蛋白质(例如，本发明的重组淀粉酶)后测量热稳定性。
如本文使用的，术语“化学稳定性”是指蛋白质(例如，本发明的重组淀粉酶)在存在对另一蛋白质的功能产生不利影响的化学物质的情况下发挥作用的能力。不意图本发明受限于任何特定的化学稳定性水平或化学稳定性范围。
如本文使用的，术语“转化”是指底物向对应产物的酶促转化(或生物转化)。“转化百分比”是指在指定条件下在一定时间段内被转化为产物的底物的百分比。因此，淀粉酶多肽的“酶活性”或“活性”可以表示为在特定时间段内底物向产物的“转化百分比”。
如本文使用的，“杂交严格性”是指核酸杂交中的杂交条件，诸如洗涤条件。通常，杂交反应在较低严格性的条件下进行，随后是不同的但较高严格性的洗涤。术语“中度严格杂交”是指允许靶DNA结合以下互补的核酸的条件，所述互补的核酸与靶DNA具有约60％同一性，优选地约75％同一性，约85％同一性，与靶多核苷酸具有大于约90％同一性。示例性中度严格条件是等同于在50％甲酰胺、5×Denhart溶液、5×SSPE、0.2％ SDS中在42℃杂交，随后在0.2×SSPE、0.2％ SDS中在42℃洗涤的条件。“高严格性杂交”通常是指与如对限定的多核苷酸序列在溶液条件下确定的热解链温度Tm相差约10℃或更小的条件。在一些实施方案中，高严格性条件是指仅允许在0.018M NaCl中在65℃形成稳定杂交体的那些核酸序列的杂交(即，如果杂交体在0.018M NaCl中在65℃是不稳定的，它在如本文设想的高严格性条件下是不稳定的)的条件。可以提供高严格性条件，例如，通过在等同于在50％甲酰胺、5×Denhart溶液、5×SSPE、0.2％ SDS在42℃的条件杂交，然后在0.1×SSPE和0.1％SDS中在65℃洗涤提供。另一种高严格性条件是在等同于在含有0.1％(w:v)SDS的5X SSC中在65℃杂交的条件进行杂交和在含有0.1％ SDS的0.1×SSC中在65℃洗涤。其他高严格性杂交条件以及中度严格条件在上文引用的参考文献中描述。
如本文使用的，“载体”是用于将DNA序列引入细胞中的DNA构建体。在一些实施方案中，载体是可操作地连接至能够实现DNA序列中编码的多肽在合适宿主中的表达的合适的控制序列的表达载体。在一些实施方案中，质粒可用作载体。在一些实施方案中，“表达载体”具有可操作地连接至DNA序列(例如，转基因)以驱动在宿主细胞中表达的启动子序列，并且在一些实施方案中，还包含转录终止子序列。
如本文使用的，“密码子优化的”是指编码蛋白的多核苷酸的密码子改变为在特定生物体中优先使用的那些密码子，使得编码的蛋白在感兴趣的生物体中更有效地表达。尽管遗传密码是简并的，即大多数氨基酸由被称为“同义”(“synonyms”)或“同义”(“synonymous”)密码子的若干密码子表示，但熟知的是，特定生物体的密码子使用是非随机的和对于特定的密码子三联体是有偏倚的。就给定基因、具有共同功能或祖先起源的基因、高表达的蛋白对比低拷贝数蛋白和生物体的基因组的聚集蛋白编码区而言，这种密码子使用偏倚可能更高。在一些实施方案中，编码淀粉酶的多核苷酸可以被密码子优化以用于从所选择的用于表达的宿主生物体的最佳产生。
如本文使用的，“控制序列”包括对本申请的多核苷酸和/或多肽的表达是必需或有利的所有组分。每一个控制序列对于编码多肽的核酸序列可以是天然的或外来的。这样的控制序列包括但不限于，前导序列、多腺苷酸化序列、前肽序列、启动子序列、信号肽序列、起始序列和转录终止子。在最小程度上，控制序列包括启动子和转录及翻译终止信号。出于引入特定限制性位点的目的，控制序列可以与接头一起提供，所述特定限制性位点促进控制序列与编码多肽的核酸序列的编码区的连接。
如本文使用的，术语“可操作地连接的”在本文中被定义为如下配置：在所述配置中控制序列被适当地放置(即，以功能关系)在相对于感兴趣的多核苷酸的位置处，使得控制序列指导或调节感兴趣的多核苷酸和/或多肽的表达。
如本文使用的，“启动子序列”是指被宿主细胞识别用于表达感兴趣的多核苷酸诸如编码序列的核酸序列。启动子序列包含介导感兴趣的多核苷酸的表达的转录控制序列。启动子可以是在选择的宿主细胞中显示出转录活性的任何核酸序列，包括突变体、截短的和杂合的启动子，并且可以从编码与宿主细胞同源或异源的细胞外或细胞内多肽的基因获得。
如本文使用的，措辞“合适的反应条件”是指在酶促转化反应溶液中的那些条件(例如，酶载量、底物载量、温度、pH、缓冲液、助溶剂等的范围)，在该条件下本申请的淀粉酶多肽能够将底物转化为期望的产物化合物。示例性的“合适的反应条件”被提供于本申请中并且通过实施例来说明。
如本文使用的，诸如在“化合物载量”或“酶载量”中，“载量”是指在反应起始时组分在反应混合物中的浓度或量。
如本文使用的，在酶促转化反应过程的上下文中，术语“底物”是指淀粉酶多肽所作用于的化合物或分子。
如本文使用的，在酶促转化过程的上下文中使用的术语“产物”是指从淀粉酶多肽对底物发挥的作用而产生的化合物或分子。
如本文使用的，术语“表达”包括参与多肽产生的任何步骤，包括但不限于，转录、转录后修饰、翻译和翻译后修饰。在一些实施方案中，该术语还包括多肽从细胞的分泌。
如本文使用，术语“产生”指由细胞产生蛋白和/或其他化合物。意图该术语包括参与多肽产生的任何步骤，包括但不限于转录、转录后修饰、翻译和翻译后修饰。在一些实施方案中，该术语还包括多肽从细胞的分泌。
如本文使用的，如果氨基酸或核苷酸序列(例如，启动子序列、信号肽、终止子序列等)与它可操作地连接至的另一个序列在自然界中未缔合，则这两个序列是“异源的”。
如本文使用的，术语“宿主细胞”和“宿主菌株”是指用于包含本文提供的DNA(例如，编码淀粉酶变体的多核苷酸)的表达载体的合适的宿主。在一些实施方案中，宿主细胞是已经用使用如本领域已知的重组DNA技术构建的载体转化或转染的原核细胞或真核细胞。
术语“类似物”意指与参考多肽具有多于70％序列同一性，但少于100％序列同一性(例如，多于75％、78％、80％、83％、85％、88％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％序列同一性)的多肽。在一些实施方案中，“类似物”包括含有一个或更多个非天然存在的氨基酸残基(包括但不限于高精氨酸、鸟氨酸和正缬氨酸)以及天然存在的氨基酸的多肽。在一些实施方案中，类似物还包括一个或更多个D-氨基酸残基和两个或更多个氨基酸残基之间的非肽键。
如本文使用的，术语“培养”是指细胞群体在任何合适的条件(例如，使用液体、凝胶或固体培养基)下的生长。在一些实施方案中，细胞是微生物细胞(例如，细菌)，而在一些其他实施方案中，细胞是哺乳动物细胞、昆虫细胞或从另一种动物获得的细胞。不意图本发明受限于任何特定的细胞或细胞类型的培养或者任何特定的培养方法。实际上，意图本发明包括在任何合适的条件下培养的任何合适的细胞类型。
如本文使用的，术语“治疗剂”是指当向显示出病理学迹象或症状的受试者施用时提供有益或期望的效果(包括医学效果)的化合物。
如本文使用的，术语“药物组合物”是指包含药学有效量的由本发明所包括的工程化淀粉酶多肽和可接受的载体的适用于受试者(例如，人类)的药物用途的组合物。
如本文使用的，术语“有效量”意指足以产生期望的结果的量。本领域普通技术人员可以通过使用常规实验确定有效量是多少。
如本文使用的，术语“受试者”包括动物，包括但不限于哺乳动物诸如人类、非人类灵长目动物、家畜、宠物和实验动物(例如，啮齿动物和兔形目动物)。意图该术语包括雌性以及雄性。
如本文使用的，术语“患者”意指正在被评估、治疗或正在经历疾病的任何受试者。
如本文使用的，术语“婴儿”是指在出生之后第一个月至约一(1)岁的时期内的儿童。如本文使用的，术语“新生儿”是指在从出生至生命的第28天的时期内的儿童。术语“早产婴儿”是指妊娠第二十个完整周之后但在妊娠期满之前出生的婴儿，通常在出生时体重～500至～2499克。“极低出生体重婴儿”是在出生时体重少于1500g的婴儿。
如本文使用的，术语“儿童”是指对于同意治疗或研究程序未达到法定年龄的人。在一些实施方案中，该术语是指在出生和青春期的时期之间的人。
如本文使用的，术语“成人”是指对于相关司法权已经达到法定年龄的人(例如，在美国为18岁)。在一些实施方案中，该术语是指任何完全发育成熟的生物体。在一些实施方案中，术语“年轻人”是指小于18岁但已经达到性成熟的人。
如本文使用的，“组合物”和“制剂”包括意图用于任何合适的用途(例如，药物组合物、膳食和/或营养补充剂、饲料等)的包含至少一种本发明的工程化淀粉酶的产物。
如本文使用的，术语“施用(administration)”和“施用(administering)”组合物意指向受试者(例如，遭受胰功能不全的效应的人)提供本发明的组合物。
如本文使用的，当提及药物组合物使用时，术语“载体”意指标准药物载体、缓冲剂和赋形剂诸如稳定剂、防腐剂和佐剂中的任一种。
如本文使用的，术语“药学上可接受的”意指可以向受试者施用而不引起任何不良生物效应或以有害的方式与在其中它被包含的组分的任何一种相互作用并且拥有期望的生物活性的材料。
如本文使用的，术语“赋形剂”是指任何药学上可接受的添加剂、载体、稀释剂、佐剂或其他成分，而不是活性药物成分(API；例如，本发明的工程化淀粉酶多肽)。赋形剂通常被包括以用于配制和/或施用目的。
如本文使用的，当提及疾病/状况的症状使用时，术语“治疗有效量”是指改善、减弱或消除疾病/状况的一种或更多种症状或者预防或延缓症状的发作的化合物(例如，工程化淀粉酶多肽)的量和/或浓度。
如本文使用的，当提及疾病/状况使用时，术语“治疗有效量”是指改善、减弱或消除该疾病/状况的组合物(例如，工程化淀粉酶多肽)的量和/或浓度。在一些实施方案中，该术语被用于指组合物的量，所述组合物的量引发研究者、医师、兽医师或其他临床医师寻求的组织、系统或动物受试者的生物学(例如，医学)响应。
如本文使用的，术语“治疗(treating)”、“治疗(treat)”和“治疗(treatment)”是指给予受试者(例如，人类患者)的医疗护理，包括药物组合物(诸如本文提供的那些)的施用。意图术语“治疗(treating)”、“治疗(treat)”和“治疗(treatment)”包括预防性治疗(例如，预防剂)以及姑息治疗或护理。在一些实施方案中，提供治疗以预防或改善疾病的症状。在一些实施方案中，本发明的药物组合物可用于治疗或预防胰腺酶不足疾病或症状。
工程化淀粉酶多肽
本发明提供了适用于各种用途(包括治疗胰腺酶不足)的工程化淀粉酶。在一些实施方案中，与野生型淀粉酶(例如，SEQ ID NO:2的多肽)相比，工程化淀粉酶表现出至少一种改进的特性。在一些实施方案中，工程化淀粉酶具有与SEQ ID NO:2、18、40、156、174、276、308、422、456、546、632、664、780、988、1104、1122、1224、1256、1370、1404、1494、1580、1612和/或1728的至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约88％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或至少约100％氨基酸序列同一性，以及如与SEQ ID NO:2、18、40、156、174、276、308、422、456、546、632、664、780、988、1104、1122、1224、1256、1370、1404、1494、1580、1612和/或1728相比在一个或更多个氨基酸位置处(诸如与SEQ ID NO:2、18、40、156、174、276、308、422、456、546、632、664、780、988、1104、1122、1224、1256、1370、1404、1494、1580、1612和/或1728相比在1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个、26个、27个、28个、29个、30个或更多个氨基酸位置处)的氨基酸残基差异，或者与SEQ ID NO:2、18、40、156、174、276、308、422、456、546、632、664、780、988、1104、1122、1224、1256、1370、1404、1494、1580、1612和/或1728具有至少70％、75％、80％、85％、至少88％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或更大氨基酸序列同一性的序列。在一些实施方案中，与SEQ ID NO:2、18、40、156、174、276、308、422、456、546、632、664、780、988、1104、1122、1224、1256、1370、1404、1494、1580、1612和/或1728相比在一个或更多个位置的残基差异包括至少1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个、26个、27个、28个、29个、30个或更多个保守氨基酸取代。在一些实施方案中，工程化淀粉酶多肽包含表4-1、表4-2、表4-3、表4-4、表4-5、表4-6、表4-7、表4-8、表4-9、表4-10、表4-11、表4-12、表4-13和/或表4-14中列出的多肽；或表4-1、表4-2、表4-3、表4-4、表4-5、表4-6、表4-7、表4-8、表4-9、表4-10、表4-11、表4-12、表4-13中列出的多肽，其中多肽不存在组氨酸标签和前面的氨基酸接头。在一些实施方案中，工程化淀粉酶多肽包含SEQ ID NO:18、40、156、174、276、308、422、456、546、632、664、780、988、1104、1122、1224、1256、1370、1404、1494、1580、1612或1728。
本发明提供了重组淀粉酶和/或生物活性重组淀粉酶片段，其包含含有与SEQ IDNO:2的至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，重组淀粉酶和/或生物活性重组淀粉酶片段包含与SEQ ID NO:2、18、40、156、174、276、308、422、456、546、632、664、780、988、1104、1122、1224、1256、1370、1404、1494、1580、1612或1728具有至少约70％、约75％、约76％、约77％、约78％、约79％、约80％、约81％、约82％、约83％、约84％、约85％、约86％、约87％、约88％、约89％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％或更多序列同一性的多肽序列。
本发明提供了重组淀粉酶和/或生物活性重组淀粉酶片段，其包含含有与SEQ IDNO:2的至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，重组淀粉酶包含与SEQ ID NO:2具有至少70％、75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多序列同一性的多肽序列或其功能片段，并且包含相对于SEQ ID NO:2的序列的一个或更多个取代。
在一些实施方案中，重组淀粉酶包含与SEQ ID NO:2具有至少70％、75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多序列同一性的多肽序列或其功能片段，并且其中重组淀粉酶在选自以下的位置处包含一个或更多个取代：2、6、16、18、19、24、26、27、29、31、33、37、38、39、41、45、48、49、51、52、58、61、66、72、73、74、81、82、91、92、94、95、98、103、111、112、114、122、123、124、126、127、128、129、130、131、132、134、137、140、141、145、149、157、158、165、166、167、170、171、172、178、180、183、184、189、194、203、204、205、206、210、214、216、220、221、223、224、225、226、227、228、246、250、252、253、254、255、256、257、258、259、268、269、270、272、275、276、279、280、282、284、285、286、294、295、298、301、302、304、305、306、308、309、310、313、315、317、319、322、324、331、338、345、346、349、359、360、366、371、374、380、383、384、385、387、388、392、393、394、396、397、409、411、412、413、415、417、420、423、428、429、431、437、441、442、444、446、448、451、455、458、459、463、464、466、467、468、469、470、473、474、480、481、482、483、491、492、493、494和495，其中多肽序列的氨基酸位置参考SEQ ID NO:2或18来编号。
在一些实施方案中，一个或更多个取代在选自以下的位置处：16、26、29、33、49、58、91、114、122、126、128、130、141、145、157、158、180、183、184、205、206、210、214、223、246、256、270、272、286、298、302、306、322、371、380、383、394、412、413、428和437。在一些实施方案中，一个或更多个取代在选自以下的位置处：16、26、29、33、49、91、58、114、122、128、130、141、145、157、158、183、246、256、270、272、286、298、302、322、371、380、383、394、412和413。在一些实施方案中，一个或更多个取代在选自以下的位置处：16、26、29、33、91、114、122、128、130、145、157、158、183、256、270、272、302、322、371、383和394、412。在一些实施方案中，一个或更多个取代在选自以下的位置处：16、33、157、256、302、371和383。
在一些实施方案中，一个或更多个取代选自2K或L；6I；16D；18S；19E；24V；26A；27L；29G、R、S、A或E；31L；33E；37T或R；38I；39I；41F；45S；48D；49A；51R；52R；58T或A；61Y；66L；72T；73V；74A；81E；82A；91H；92A、E、G或Q；94G；95L或V；98I；103D或L；111A；112Q；114H或R；122P或R；123E、C、G或R；124N或R；126C、D、E、K、L、M、N、Q、W、R或S；127E、I、R、S、V或W；128W；129C或W；130D；131H；R或Y；132V；134A、F或R；137A；140K或V；141F；145G；149K、R或T；157Y；158R；165V；166L；167W或Y；170S；171I；172K或R；178I；180E、P或Q；183E、N或V；184D或K；189D；194F、E或R；203S；204D；205V；206E；210G或P；214G、L或R；216L；220G；221T或V；223L；224L；225G、D或T；226T；227C或V；228V；246R或T；250D；252I；253R；254G或S；255M或R；256S；257E、G、R、S或V；258Q或S；259C、D、Q、R或W；268T；269F；270D；272G、K、P、R或S；275I或R；276Q、A或K；279L、R或V；280C或L；282R或T；284C、L、M、R、S或Y；285V；286T；294H、A或L；295N；298H、K、M、Q、D或N；301K；302Q、G、H、R、V或W；304T；305Q、R或W；306F；308L；309A或S；310R；313D；315S；317G；319L或S；322R或A；324T；331P；338S；345A；346G；349R；359G；360G；366L；371F；374S；380R；383E或L；384M；385L；387G或V；388E；392C；393R、S或W；394E、G、N、R或S；396H、E或Q；397M或T；409A、R、S或W；411E；412A、L、D或S；413Y；415C或G；417W；420V；423V；428E或T；429S；431T；437L；441R或W；442E、R或W；444G、R或V；446G；448P、Q或T；451F；455L、R、T或W；458F；459W；463M；464L；466C或E；467P或W；468I、T或V；469I；470S、G、L、S或T；473D或M；474G；480P、T或L；481V；482L；483A、Q或T；491L；492G或R；493D；494C；以及495E、G、L或Y。在一些实施方案中，多肽序列的氨基酸位置参考SEQ ID NO:2或18来编号。在一些此外的实施方案中，多肽序列的氨基酸位置参考SEQ ID NO:40、156、174、276、308、422、456、546、632、664、780、988、1104、1122、1224、1256、1370、1404、1494、1580、1612或1728来编号，如本文进一步描述。
在一些实施方案中，重组淀粉酶和/或生物活性重组淀粉酶片段包含与SEQ IDNO:18、40、156、174、276、308、422、456、546、632、664、780、988、1104、1122、1224、1256、1370、1404、1494、1580、1612或1728具有至少70％、75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多序列同一性的多肽序列。在一些实施方案中，重组淀粉酶和/或生物活性重组淀粉酶片段包含与SEQ ID NO:18、40、156、174、276、308、422、456、546、632、664、780、988、1104、1122、1224、1256、1370、1404、1494、1580、1612或1728具有至少70％、75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多序列同一性的多肽序列，条件是重组淀粉酶不具有SEQ ID NO:2的多肽序列。
在一些实施方案中，重组淀粉酶和/或生物活性重组淀粉酶片段包含与SEQ IDNO:18、40、156、174、276、308、422、456、546、632、664、780、988、1104、1122、1224、1256、1370、1404、1494、1580、1612或1728具有至少70％、75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多序列同一性的多肽序列，并且还包含一个或更多个取代。在一些实施方案中，重组淀粉酶和/或生物活性重组淀粉酶片段包含与SEQ ID NO:18、40、156、174、276、308、422、456、546、632、664、780、988、1104、1122、1224、1256、1370、1404、1494、1580、1612或1728具有至少70％、75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多序列同一性的多肽序列，并且还包含在选自以下的位置处的一个或更多个取代：2、6、16、18、19、24、26、27、29、31、33、37、38、39、41、45、48、49、51、52、58、61、66、72、73、74、81、82、91、92、94、95、98、103、111、112、114、122、123、124、126、127、128、129、130、131、132、134、137、140、141、145、149、157、158、165、166、167、170、171、172、178、180、183、184、189、194、203、204、205、206、210、214、216、220、221、223、224、225、226、227、228、246、250、252、253、254、255、256、257、258、259、268、269、270、272、275、276、279、280、282、284、285、286、294、295、298、301、302、304、305、306、308、309、310、313、315、317、319、322、324、331、338、345、346、349、359、360、366、371、374、380、383、384、385、387、388、392、393、394、396、397、409、411、412、413、415、417、420、423、428、429、431、437、441、442、444、446、448、451、455、458、459、463、464、466、467、468、469、470、473、474、480、481、482、483、491、492、493、494和495，其中多肽序列的氨基酸位置参考SEQ ID NO:18、40、156、174、276、308、422、456、546、632、664、780、988、1104、1122、1224、1256、1370、1404、1494、1580、1612或1728来编号。在一些实施方案中，可以使用上述位置的氨基酸取代。
在一些另外的实施方案中，重组淀粉酶包含与SEQ ID NO:2或18具有至少70％、75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多序列同一性的多肽序列或其功能片段，并且其中重组淀粉酶在选自以下的位置处包含一个或更多个取代：16、26、29、33、91、114、157、158、180、184、214、223、256、272、298、302、371、380、383、394、412、428和437，其中多肽序列的氨基酸位置参考SEQ IDNO:2或18来编号。
在一些另外的实施方案中，重组淀粉酶包含与SEQ ID NO:2或18具有至少70％、75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多序列同一性的多肽序列或其功能片段，并且其中重组淀粉酶包含选自以下的一个或更多个取代：16D、26A、29G、29R、29S、29A、29E、33E、91H、114H、157Y、158R、180E、180Q、184D、184K、214G、223L、256T、272G、272K、272P、272R、272S、298H、302Q、302G、302H、302R、302V、302W、371F、380R、383E、383I、394N、394S、394G、412A、412L、412D、412S、428T和437L，其中多肽序列的氨基酸位置参考SEQ ID NO:2或18来编号。
在一些另外的实施方案中，重组淀粉酶包含与SEQ ID NO:2或18具有至少70％、75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多序列同一性的多肽序列或其功能片段，并且其中重组淀粉酶在选自以下的一个或更多个位置处包含至少一个取代或取代集：2/73/256/493、16/33/73/130/256/282/371/374/493、16/33/130/256/302/371/383/470、16/33/157/256/302/371/383、16/73/74/256/282/366/371/383/493、16/73/256/282/302/331/371/383、16/130/256/276/374/470、16/256/302/374、19/72/345/473、26/27/396/412/428/473、26/27/412、26/27/466/473、29、73/130/256/282/302/493、74/371/374/383/493、130/256/493、149、158、254、256、256/383、257、259、272、279、284、317/383、322、345/388/396/428、388/396/412/428、396/412、396/412/428/466、409、412和495，其中多肽序列的氨基酸位置参考SEQ ID NO:2或18来编号。在一些此外的实施方案中，重组淀粉酶包含与SEQ ID NO:2或18具有至少70％、75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多序列同一性的多肽序列或其功能片段，并且其中重组淀粉酶包含选自以下的至少一个取代或取代集：2K/73V/256S/493D、16D/33E/73V/130D/256S/282D/371F/374S/493D、16D/33E/130D/256S/302Q/371F/383E/470T、16D/33E/157Y/256S/302Q/371F/383E、16D/73V/74A/256S/282D/366L/371F/383E/493D、16D/73V/256S/282D/302Q/331P/371F/383E、16D/130D/256S/276Q/374S/470T、16D/256S/302Q/374S、19E/72T/345A/473D、26A/27L/396H/412D/428E/473D、26A/27L/412D、26A/27L/466E/473D、29G、29R、29S、73V/130D/256S/282D/302Q/493D、74A/371F/374S/383E/493D、130D/256S/493D、149R、149T、158R、254G、254S、256S、256S/383E、257E、257G、257R、257S、257V、259Q、272G、272K、272P、272R、272S、279R、284C、284R、284S、284Y、317G/383L、322A、345A/388E/396H/428E、388E/396H/412D/428E、396H/412D、396H/412D/428E/466E、409S、412S、495E、495L和495Y，其中多肽序列的氨基酸位置参考SEQ ID NO:2或18来编号。在一些此外的实施方案中，重组淀粉酶包含与SEQ ID NO:2或18具有至少70％、75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多序列同一性的多肽序列或其功能片段，并且其中重组淀粉酶包含选自以下的至少一个取代或取代集：R2K/I73V/A256S/E493D、E16D/D33E/I73V/E130D/A256S/E282D/Y371F/H374S/E493D、E16D/D33E/E130D/A256S/M302Q/Y371F/Q383E/V470T、E16D/D33E/F157Y/A256S/M302Q/Y371F/Q383E、E16D/I73V/P74A/A256S/E282D/F366L/Y371F/Q383E/E493D、E16D/I73V/A256S/E282D/M302Q/H331P/Y371F/Q383E、E16D/E130D/A256S/T276Q/H374S/V470T、E16D/A256S/M302Q/H374S、K19E/S72T/P345A/E473D、E26A/R27L/D396H/L412D/D428E/E473D、E26A/R27L/L412D、E26A/R27L/Q466E/E473D、D29G、D29R、D29S、I73V/E130D/A256S/E282D/M302Q/E493D、P74A/Y371F/H374S/Q383E/E493D、E130D/A256S/E493D、Q149R、Q149T、K158R、E254G、E254S、A256S、A256S/Q383E、P257E、P257G、P257R、P257S、P257V、P259Q、D272G、D272K、D272P、D272R、D272S、D279R、K284C、K284R、K284S、K284Y、V317G/Q383L、F322A、P345A/D388E/D396H/D428E、D388E/D396H/L412D/D428E、D396H/L412D、D396H/L412D/D428E/Q466E、V409S、L412S、I495E、I495L和I495Y，其中多肽序列的氨基酸位置参考SEQ ID NO:2或18来编号。
在一些其他实施方案中，重组淀粉酶包含与SEQ ID NO:40或988具有至少80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多序列同一性的多肽序列或其功能片段，并且其中重组淀粉酶在选自以下的一个或更多个位置处包含至少一个取代或取代集：26/29/158/272/412、26/29/272/279/412/493、26/29/272/396/412、26/29/279/412/428、26/158/272/279/388/412/428、26/158/272/412、26/272/279/412/428/493、29/272/279/396/412、130/149/254/284/322/409/495、130/149/257/284/322/409/466/473、130/254/284/322/374/409/466、130/257/284/374/409/466、130/284/322/374/409/473、149/257/284/322/409/466、158/272/279/394/396/412/428/493、158/272/388/412/428/493、158/272/412/428、158/279/388/396/412/428、254/257/284/322/409/473、254/284/409/466/495、272/279/412/428/493、272/412/428、272/412/493和284/322/409/473，其中多肽序列的氨基酸位置参考SEQ ID NO:40或988来编号。在一些此外的实施方案中，重组淀粉酶包含与SEQ ID NO:40或988具有至少80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多序列同一性的多肽序列或其功能片段，并且其中重组淀粉酶包含选自以下的至少一个取代或取代集：26A/29R/158R/272G/412D、26A/29R/272G/279R/412D/493D、26A/29R/272G/396H/412D、26A/29R/279R/412D/428E、26A/158R/272G/279R/388E/412D/428E、26A/158R/272G/412D、26A/272G/279R/412D/428E/493D、29R/272G/279R/396H/412D、130D/149R/254S/284S/322A/409S/495E、130D/149R/257G/284S/322A/409S/466E/473D、130D/254S/284S/322A/374S/409S/466E、130D/257G/284S/374S/409S/466E、130D/284S/322A/374S/409S/473D、149R/257G/284S/322A/409S/466E、158R/272G/279R/394R/396H/412D/428E/493D、158R/272G/388E/412D/428E/493D、158R/272G/412D/428E、158R/279R/388E/396H/412D/428E、254S/257G/284S/322A/409S/473D、254S/284S/409S/466E/495E、272G/279R/412D/428E/493D、272G/412D/428E、272G/412D/493D和284S/322A/409S/473D，其中多肽序列的氨基酸位置参考SEQ ID NO:40或988来编号。在一些此外的实施方案中，重组淀粉酶包含与SEQ ID NO:40或988具有至少80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多序列同一性的多肽序列或其功能片段，并且其中重组淀粉酶包含选自以下的至少一个取代或取代集：E26A/D29R/K158R/D272G/L412D、E26A/D29R/D272G/D279R/L412D/E493D、E26A/D29R/D272G/D396H/L412D、E26A/D29R/D279R/L412D/D428E、E26A/K158R/D272G/D279R/D388E/L412D/D428E、E26A/K158R/D272G/L412D、E26A/D272G/D279R/L412D/D428E/E493D、D29R/D272G/D279R/D396H/L412D、E130D/Q149R/E254S/K284S/F322A/V409S/I495E、E130D/Q149R/P257G/K284S/F322A/V409S/Q466E/E473D、E130D/E254S/K284S/F322A/H374S/V409S/Q466E、E130D/P257G/K284S/H374S/V409S/Q466E、E130D/K284S/F322A/H374S/V409S/E473D、Q149R/P257G/K284S/F322A/V409S/Q466E、K158R/D272G/D279R/Q394R/D396H/L412D/D428E/E493D、K158R/D272G/D388E/L412D/D428E/E493D、K158R/D272G/L412D/D428E、K158R/D279R/D388E/D396H/L412D/D428E、E254S/P257G/K284S/F322A/V409S/E473D、E254S/K284S/V409S/Q466E/I495E、D272G/D279R/L412D/D428E/E493D、D272G/L412D/D428E、D272G/L412D/E493D和K284S/F322A/V409S/E473D，其中多肽序列的氨基酸位置参考SEQ ID NO:40或988来编号。
在一些另外的实施方案中，重组淀粉酶包含与SEQ ID NO:156或1104具有至少80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多序列同一性的多肽序列或其功能片段，并且其中重组淀粉酶在选自以下的一个或更多个位置处包含至少一个取代或取代集：37、51、91、111、112、114、122、124、128、140、167、171、183、194、276、280、298、397和464，其中多肽序列的氨基酸位置参考SEQ ID NO:156或1104来编号。在一些此外的实施方案中，重组淀粉酶包含与SEQ ID NO:156或1104具有至少80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多序列同一性的多肽序列或其功能片段，并且其中重组淀粉酶包含选自以下的至少一个取代或取代集：37R、51R、91H、111A、112Q、114H、122P、122R、124R、128W、140K、167W、171I、183E、183N、183V、194E、194R、276A、276K、280L、298K、298M、397T和464L，其中多肽序列的氨基酸位置参考SEQ ID NO:156或1104来编号。在一些此外的实施方案中，重组淀粉酶包含与SEQ ID NO:156或1104具有至少80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多序列同一性的多肽序列或其功能片段，并且其中重组淀粉酶包含选自以下的至少一个取代或取代集：N37R、G51R、K91H、E111A、K112Q、A114H、A122P、A122R、D124R、I128W、R140K、E167W、E171I、G183E、G183N、G183V、L194E、L194R、T276A、T276K、Q280L、E298K、E298M、E397T和N464L，其中多肽序列的氨基酸位置参考SEQ ID NO:156或1104来编号。
在一些另外的实施方案中，重组淀粉酶包含与SEQ ID NO:174或1122具有至少80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多序列同一性的多肽序列或其功能片段，并且其中重组淀粉酶在选自以下的一个或更多个位置处包含至少一个取代或取代集：24、91、91/122、91/122/128/130/167/171/409、91/122/128/130/183/322、91/122/128/130/194、91/122/128/130/322、91/122/128/171/183/194/322、91/122/128/183/409、91/122/130/167/183/194/409、91/122/130/171/183、91/122/130/183/194、91/122/130/194、91/122/130/194/322、91/122/167/171/194、91/122/167/171/194/322、91/122/171/183/194/409、91/130/171/183/322/409、91/167/171、91/167/183/194、91/167/322、91/183、91/183/322/409、91/194、91/322、91/409、122/128、122/128/194/409、122/130/171/322/409、122/409、137/145/227/394/480/481、137/145/295、145/227/295/481、145/309/481、183、227、295/394、322、322/409、394和480/481，其中多肽序列的氨基酸位置参考SEQ ID NO:174或1122来编号。在一些此外的实施方案中，重组淀粉酶包含与SEQ ID NO:174或1122具有至少80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多序列同一性的多肽序列或其功能片段，并且其中重组淀粉酶包含选自以下的至少一个取代或取代集：24V、91H、91H/122P、91H/122P/130D/183N/194R、91H/122P/130D/194R/322A、91H/122R、91H/122R/128W/130D/167W/171I/409S、91H/122R/128W/130D/183N/322A、91H/122R/128W/130D/194R、91H/122R/128W/130D/322A、91H/122R/128W/171I/183N/194R/322A、91H/122R/128W/183N/409S、91H/122R/130D/167W/183N/194R/409S、91H/122R/130D/171I/183N、91H/122R/130D/194R、91H/122R/167W/171I/194R、91H/122R/167W/171I/194R/322A、91H/122R/171I/183N/194R/409S、91H/130D/171I/183N/322A/409S、91H/167W/171I、91H/167W/183N/194R、91H/167W/322A、91H/183N、91H/183N/322A/409S、91H/194R、91H/322A、91H/409S、122P/409S、122R/128W、122R/128W/194R/409S、122R/130D/171I/322A/409S、137A/145G/227L/394E/480P/481V、137A/145G/295N、145G/227L/295N/481V、145G/309S/481V、183N、227L、295N/394E、322A、322A/409S、394E和480T/481V，其中多肽序列的氨基酸位置参考SEQ ID NO:174或1122来编号。在一些此外的实施方案中，重组淀粉酶包含与SEQ ID NO:174或1122具有至少80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多序列同一性的多肽序列或其功能片段，并且其中重组淀粉酶包含选自以下的至少一个取代或取代集：L24V、K91H、K91H/A122P、K91H/A122P/E130D/G183N/L194R、K91H/A122P/E130D/L194R/F322A、K91H/A122R、K91H/A122R/I128W/E130D/E167W/E171I/V409S、K91H/A122R/I128W/E130D/G183N/F322A、K91H/A122R/I128W/E130D/L194R、K91H/A122R/I128W/E130D/F322A、K91H/A122R/I128W/E171I/G183N/L194R/F322A、K91H/A122R/I128W/G183N/V409S、K91H/A122R/E130D/E167W/G183N/L194R/V409S、K91H/A122R/E130D/E171I/G183N、K91H/A122R/E130D/L194R、K91H/A122R/E167W/E171I/L194R、K91H/A122R/E167W/E171I/L194R/F322A、K91H/A122R/E171I/G183N/L194R/V409S、K91H/E130D/E171I/G183N/F322A/V409S、K91H/E167W/E171I、K91H/E167W/G183N/L194R、K91H/E167W/F322A、K91H/G183N、K91H/G183N/F322A/V409S、K91H/L194R、K91H/F322A、K91H/V409S、A122P/V409S、A122R/I128W、A122R/I128W/L194R/V409S、A122R/E130D/E171I/F322A/V409S、G137A/A145G/T227L/Q394E/F480P/C481V、G137A/A145G/K295N、A145G/T227L/K295N/C481V、A145G/T309S/C481V、G183N、T227L、K295N/Q394E、F322A、F322A/V409S、Q394E和F480T/C481V，其中多肽序列的氨基酸位置参考SEQ ID NO:174或1122来编号。
在一些其他实施方案中，重组淀粉酶包含与SEQ ID NO:276或1224具有至少80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多序列同一性的多肽序列或其功能片段，并且其中重组淀粉酶在选自以下的一个或更多个位置处包含至少一个取代或取代集：16/26/29/128/145/256/309/383、16/26/33/114/145/309/383/394、16/26/33/128/130/145/302/309/322/371、16/26/33/145/158/383/394、16/26/145/302、16/29/33/145/256/302、18、26/29/33/130/145/157/158/183/394、26/29/33/145/157/183/256/309/383、26/29/122/130/145/183/256/272/309/394、26/29/145/157/256/302/322/481、26/29/145/256/272/302/309/322/481、26/33/91/145/272/302/481、26/33/145/309/322/383、26/114/145/322、26/145/183/256/309/383、29/122/145/158/383、29/130/145/256/272/371/394、29/145/183/302/309/412、29/309/394、33/122/145/272/309/412、91/130/145/158/183/383、91/309/383、130/145/256/272/371、130/145/302/309、130/272/481、145/302/309、268、309、349、360、380、394、463和483，其中多肽序列的氨基酸位置参考SEQ ID NO:276或1224来编号。在一些此外的实施方案中，重组淀粉酶包含与SEQ ID NO:276或1224具有至少80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多序列同一性的多肽序列或其功能片段，并且其中重组淀粉酶包含选自以下的至少一个取代或取代集：16E/26E/29D/128I/145G/256A/309S/383Q、16E/26E/33D/114A/145G/309S/383Q/394E、16E/26E/33D/128I/130E/145G/302M/309S/322F/371Y、16E/26E/33D/145G/158K/383Q/394E、16E/26E/145G/302M、16E/29D/33D/145G/256A/302M、18S、26E/29D/33D/130E/145G/157F/158K/183G/394E、26E/29D/33D/145G/157F/183G/256A/309S/383Q、26E/29D/122A/130E/145G/183G/256A/272D/309S/394E、26E/29D/145G/157F/256A/302M/322F/481V、26E/29D/145G/256A/272D/302M/309S/322F/481V、26E/33D/91K/145G/272D/302M/481V、26E/33D/145G/309S/322F/383Q、26E/114A/145G/322F、26E/145G/183G/256A/309S/383Q、29D/122A/145G/158K/383Q、29D/130E/145G/256A/272D/371Y/394E、29D/145G/183G/302M/309S/412L、29D/309S/394E、33D/122A/145G/272D/309S/412L、91K/130E/145G/158K/183G/383Q、91K/309S/383Q、130E/145G/256A/272D/371Y、130E/145G/302M/309S、130E/272D/481V、145G/302M/309S、268T、309A、349R、360G、380R、394G、394N、394S、463M和483T，其中多肽序列的氨基酸位置参考SEQ ID NO:276或1224来编号。在一些此外的实施方案中，重组淀粉酶包含与SEQ ID NO:276或1224具有至少80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多序列同一性的多肽序列或其功能片段，并且其中重组淀粉酶包含选自以下的至少一个取代或取代集：D16E/A26E/R29D/W128I/A145G/S256A/T309S/E383Q、D16E/A26E/E33D/H114A/A145G/T309S/E383Q/Q394E、D16E/A26E/E33D/W128I/D130E/A145G/Q302M/T309S/A322F/F371Y、D16E/A26E/E33D/A145G/R158K/E383Q/Q394E、D16E/A26E/A145G/Q302M、D16E/R29D/E33D/A145G/S256A/Q302M、G18S、A26E/R29D/E33D/D130E/A145G/Y157F/R158K/N183G/Q394E、A26E/R29D/E33D/A145G/Y157F/N183G/S256A/T309S/E383Q、A26E/R29D/R122A/D130E/A145G/N183G/S256A/G272D/T309S/Q394E、A26E/R29D/A145G/Y157F/S256A/Q302M/A322F/C481V、A26E/R29D/A145G/S256A/G272D/Q302M/T309S/A322F/C481V、A26E/E33D/H91K/A145G/G272D/Q302M/C481V、A26E/E33D/A145G/T309S/A322F/E383Q、A26E/H114A/A145G/A322F、A26E/A145G/N183G/S256A/T309S/E383Q、R29D/R122A/A145G/R158K/E383Q、R29D/D130E/A145G/S256A/G272D/F371Y/Q394E、R29D/A145G/N183G/Q302M/T309S/D412L、R29D/T309S/Q394E、E33D/R122A/A145G/G272D/T309S/D412L、H91K/D130E/A145G/R158K/N183G/E383Q、H91K/T309S/E383Q、D130E/A145G/S256A/G272D/F371Y、D130E/A145G/Q302M/T309S、D130E/G272D/C481V、A145G/Q302M/T309S、S268T、T309A、P349R、N360G、G380R、Q394G、Q394N、Q394S、G463M和G483T，其中多肽序列的氨基酸位置参考SEQ ID NO:276或1224来编号。
在一些另外的实施方案中，重组淀粉酶包含与SEQ ID NO:308或1256具有至少80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多序列同一性的多肽序列或其功能片段，并且其中重组淀粉酶在选自以下的一个或更多个位置处包含至少一个取代或取代集：29、37/124/250/270/349/380/394/442/491、37/145、37/145/250/301/349/394、37/145/258/442/491、38/349/491、81/259、81/313/495、92/257/258/338/468、92/258、94/127/132/145/250/349、94/270/301/349/394/442、94/349/491、145/270、178、225、226、246、250/349/442、259/313/338、270/349、286/338、294、313、349、349/380/442、413、413/468、448和473，其中多肽序列的氨基酸位置参考SEQID NO:308或1256来编号。在一些此外的实施方案中，重组淀粉酶包含与SEQ ID NO:308或1256具有至少80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多序列同一性的多肽序列或其功能片段，并且其中重组淀粉酶包含选自以下的至少一个取代或取代集：29A、37T/124N/250D/270D/349R/380R/394E/442E/491L、37T/145G、37T/145G/250D/301K/349R/394E、37T/145G/258S/442E/491L、38I/349R/491L、81E/259D、81E/313D/495L、92E/257E/258Q/338S/468T、92E/258Q、94G/127E/132V/145G/250D/349R、94G/270D/301K/349R/394E/442E、94G/349R/491L、145G/270D、178I、225D、226T、246R、250D/349R/442E、259D/313D/338S、270D/349R、286T/338S、294L、313D、349R、349R/380R/442E、413Y、413Y/468I、448T和473D，其中多肽序列的氨基酸位置参考SEQ IDNO:308或1256来编号。在一些此外的实施方案中，重组淀粉酶包含与SEQ ID NO:308或1256具有至少80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多序列同一性的多肽序列或其功能片段，并且其中重组淀粉酶包含选自以下的至少一个取代或取代集：R29A、N37T/D124N/E250D/E270D/P349R/G380R/G394E/D442E/I491L、N37T/A145G、N37T/A145G/E250D/R301K/P349R/G394E、N37T/A145G/K258S/D442E/I491L、M38I/P349R/I491L、A81E/P259D、A81E/T313D/I495L、R92E/P257E/K258Q/A338S/R468T、R92E/K258Q、D94G/Q127E/I132V/A145G/E250D/P349R、D94G/E270D/R301K/P349R/G394E/D442E、D94G/P349R/I491L、A145G/E270D、V178I、E225D、Q226T、K246R、E250D/P349R/D442E、P259D/T313D/A338S、E270D/P349R、M286T/A338S、M294L、T313D、P349R、P349R/G380R/D442E、F413Y、F413Y/R468I、H448T和E473D，其中多肽序列的氨基酸位置参考SEQ ID NO:308或1256来编号。
在一些另外的实施方案中，重组淀粉酶包含与SEQ ID NO:422或1370具有至少80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多序列同一性的多肽序列或其功能片段，并且其中重组淀粉酶在选自以下的一个或更多个位置处包含至少一个取代或取代集：38、38/178/226/286/338、38/178/286/448、38/178/349/448、38/226/246/258/286、38/226/258/286/338/380/448、38/226/258/349/413、38/226/286、38/226/286/338/380、38/226/338/349/380、38/226/413/448、38/246/286、38/246/286/380、38/258、38/286、38/286/413/448、38/286/448、38/448、178、178/226/258/286/310/338、178/226/286/338、178/246/338、178/258/286/413、178/286、178/286/338/349、178/286/338/448、178/380、178/413、178/448、184/246/258/380、226、226/246/286/349/448、226/246/413、226/258/286/349/380、226/258/286/413/448、226/286、226/286/380/448、226/349/380、246、246/286、246/286/380/413、246/338、246/413、258/286/413、286、286/413/448、338/448、349和413，其中多肽序列的氨基酸位置参考SEQ IDNO:422或1370来编号。在一些此外的实施方案中，重组淀粉酶包含与SEQ ID NO:422或1370具有至少80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多序列同一性的多肽序列或其功能片段，并且其中重组淀粉酶包含选自以下的至少一个取代或取代集：38I、38I/178I/226T/286T/338S、38I/178I/286T/448T、38I/178I/349R/448T、38I/226T/246R/258S/286T、38I/226T/258S/286T/338S/380R/448T、38I/226T/258S/349R/413Y、38I/226T/286T、38I/226T/286T/338S/380R、38I/226T/338S/349R/380R、38I/226T/413Y/448T、38I/246R/286T、38I/246R/286T/380R、38I/258S、38I/286T、38I/286T/413Y/448T、38I/286T/448T、38I/448T、178I、178I/226T/258S/286T/310R/338S、178I/226T/286T/338S、178I/246R/338S、178I/258S/286T/413Y、178I/286T、178I/286T/338S/349R、178I/286T/338S/448T、178I/380R、178I/413Y、178I/448T、184K/246R/258S/380R、226T、226T/246R/286T/349R/448T、226T/246R/413Y、226T/258S/286T/349R/380R、226T/258S/286T/413Y/448T、226T/286T、226T/286T/380R/448T、226T/349R/380R、246R、246R/286T、246R/286T/380R/413Y、246R/338S、246R/413Y、246T、258S/286T/413Y、286T、286T/413Y/448T、338S/448T、349R和413Y，其中多肽序列的氨基酸位置参考SEQ IDNO:422或1370来编号。在一些此外的实施方案中，重组淀粉酶包含与SEQ ID NO:422或1370具有至少80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多序列同一性的多肽序列或其功能片段，并且其中重组淀粉酶包含选自以下的至少一个取代或取代集：M38I、M38I/V178I/Q226T/M286T/A338S、M38I/V178I/M286T/H448T、M38I/V178I/P349R/H448T、M38I/Q226T/K246R/K258S/M286T、M38I/Q226T/K258S/M286T/A338S/G380R/H448T、M38I/Q226T/K258S/P349R/F413Y、M38I/Q226T/M286T、M38I/Q226T/M286T/A338S/G380R、M38I/Q226T/A338S/P349R/G380R、M38I/Q226T/F413Y/H448T、M38I/K246R/M286T、M38I/K246R/M286T/G380R、M38I/K258S、M38I/M286T、M38I/M286T/F413Y/H448T、M38I/M286T/H448T、M38I/H448T、V178I、V178I/Q226T/K258S/M286T/Q310R/A338S、V178I/Q226T/M286T/A338S、V178I/K246R/A338S、V178I/K258S/M286T/F413Y、V178I/M286T、V178I/M286T/A338S/P349R、V178I/M286T/A338S/H448T、V178I/G380R、V178I/F413Y、V178I/H448T、E184K/K246R/K258S/G380R、Q226T、Q226T/K246R/M286T/P349R/H448T、Q226T/K246R/F413Y、Q226T/K258S/M286T/P349R/G380R、Q226T/K258S/M286T/F413Y/H448T、Q226T/M286T、Q226T/M286T/G380R/H448T、Q226T/P349R/G380R、K246R、K246R/M286T、K246R/M286T/G380R/F413Y、K246R/A338S、K246R/F413Y、K246T、K258S/M286T/F413Y、M286T、M286T/F413Y/H448T、A338S/H448T、P349R和F413Y，其中多肽序列的氨基酸位置参考SEQ ID NO:422或1370来编号。
在一些另外的实施方案中，重组淀粉酶包含与SEQ ID NO:456或1404具有至少80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多序列同一性的多肽序列或其功能片段，并且其中重组淀粉酶在选自以下的一个或更多个位置处包含至少一个取代或取代集：29/31/92/220、29/469、49/58/103/141/197/269/294/298、49/58/103/194/204/298、49/58/141/298、49/103、103、123、126、127、131、134、180、210、214、220/469、228、259、279、282、302、319、393、415、417、428、429、466和469，其中多肽序列的氨基酸位置参考SEQ ID NO:456或1404来编号。在一些此外的实施方案中，重组淀粉酶包含与SEQ ID NO:456或1404具有至少80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多的序列同一性的多肽序列或其功能片段，并且其中重组淀粉酶包含选自以下的至少一个取代或取代集：29E/31L/92A/220G、29E/469I、49A/58T/103L/141F/197Y/269F/294H/298Q、49A/58T/103L/194F/204D/298H、49A/58T/141F/298H、49A/103L、103L、123R、126R、127W、131H、131R、131Y、134R、180E、210P、214G、220G/469I、228V、259C、279L、282T、302H、302R、302W、319S、393R、393S、415C、417W、428T、429S、466C和469I，其中多肽序列的氨基酸位置参考SEQ ID NO:456或1404来编号。在一些此外的实施方案中，重组淀粉酶包含与SEQ ID NO:456或1404具有至少80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多的序列同一性的多肽序列或其功能片段，并且其中重组淀粉酶包含选自以下的至少一个取代或取代集：R29E/F31L/R92A/A220G、R29E/V469I、S49A/S58T/V103L/Y141F/F197Y/H269F/M294H/E298Q、S49A/S58T/V103L/L194F/N204D/E298H、S49A/S58T/Y141F/E298H、S49A/V103L、V103L、D123R、T126R、Q127W、E131H、E131R、E131Y、E134R、D180E、H210P、E214G、A220G/V469I、Q228V、P259C、D279L、E282T、Q302H、Q302R、Q302W、A319S、E393R、E393S、D415C、P417W、D428T、E429S、Q466C和V469I，其中多肽序列的氨基酸位置参考SEQ IDNO:456或1404来编号。
在一些另外的实施方案中，重组淀粉酶包含与SEQ ID NO:456或1404具有至少80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多序列同一性的多肽序列或其功能片段，并且其中重组淀粉酶在选自以下的一个或更多个位置处包含至少一个取代或取代集：92、123、126、127、129、131、134、140、172、180、210、214、221、228、253、254、259、279、282、302、304、305、319、322、346、359、384、385、387、393、409、412、415、417、428、429、441、442、444、446、451、455、459、466、467、470、473、474、492和494，其中多肽序列的氨基酸位置参考SEQ ID NO:456或1404来编号。在一些此外的实施方案中，重组淀粉酶包含与SEQ ID NO:456或1404具有至少80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多序列同一性的多肽序列或其功能片段，并且其中重组淀粉酶包含选自以下的至少一个取代或取代集：92G、92Q、123C、123G、123R、126Q、126R、127I、127R、127S、127V、127W、129C、129W、131H、131R、131Y、134A、134F、134R、140V、172K、172R、180E、180P、180Q、210G、210P、214G、214L、214R、221T、221V、228V、253R、254G、259C、259R、259W、279L、279V、282R、282T、302G、302H、302R、302V、302W、304T、305Q、305R、305W、319L、319S、322R、346G、359G、384M、385L、387G、387V、393R、393S、393W、409A、409R、409W、412A、415C、415G、417W、428T、429S、441R、441W、442R、442W、444G、444R、444V、446G、451F、455L、455R、455T、455W、459W、466C、467P、467W、470G、470L、470S、473M、474G、492G、492R和494C，其中多肽序列的氨基酸位置参考SEQ IDNO:456或1404来编号。在一些此外的实施方案中，重组淀粉酶包含与SEQ ID NO:456或1404具有至少80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多序列同一性的多肽序列或其功能片段，并且其中重组淀粉酶包含选自以下的至少一个取代或取代集：R92G、R92Q、D123C、D123G、D123R、T126Q、T126R、Q127I、Q127R、Q127S、Q127V、Q127W、D129C、D129W、E131H、E131R、E131Y、E134A、E134F、E134R、R140V、D172K、D172R、D180E、D180P、D180Q、H210G、H210P、E214G、E214L、E214R、R221T、R221V、Q228V、Q253R、E254G、P259C、P259R、P259W、D279L、D279V、E282R、E282T、Q302G、Q302H、Q302R、Q302V、Q302W、R304T、D305Q、D305R、D305W、A319L、A319S、A322R、W346G、E359G、T384M、Y385L、I387G、I387V、E393R、E393S、E393W、V409A、V409R、V409W、D412A、D415C、D415G、P417W、D428T、E429S、D441R、D441W、D442R、D442W、E444G、E444R、E444V、T446G、E451F、N455L、N455R、N455T、N455W、R459W、Q466C、E467P、E467W、V470G、V470L、V470S、E473M、N474G、E492G、E492R和V494C，其中多肽序列的氨基酸位置参考SEQ ID NO:456或1404来编号。
在一些另外的实施方案中，重组淀粉酶包含与SEQ ID NO:546或1494具有至少80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多序列同一性的多肽序列或其功能片段，并且其中重组淀粉酶在选自以下的一个或更多个位置处包含一个或更多个取代或取代集：123、123/126/180/214/298/302/393、123/126/180/214/393/428、123/126/210/298/302/393、123/126/210/428、123/126/428、123/210/302、126/180/210/214/298/302、126/180/210/214/428、126/180/298/302/393、126/210/302/428、126/214/393、126/298/302/393、126/298/302/393/428、129、129/228/253、131/228/279、131/282、180/214、210/214/302/393/428、228/282/444、253/279/470、253/279/492、279、279/470和441，其中多肽序列的氨基酸位置参考SEQ ID NO:546或1494来编号。在一些此外的实施方案中，重组淀粉酶包含与SEQ ID NO:546或1494具有至少80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多序列同一性的多肽序列或其功能片段，并且其中重组淀粉酶包含选自以下的至少一个取代或取代集：123R、123R/126R/180E/214L/298Q/302W/393R、123R/126R/180Q/214G/393R/428T、123R/126R/210P/298Q/302W/393R、123R/126R/210P/428T、123R/126R/428T、123R/210P/302R、126R/180E/210P/214G/428T、126R/180E/298Q/302R/393R、126R/180Q/210P/214L/298Q/302R、126R/210P/302R/428T、126R/214G/393R、126R/298Q/302H/393R、126R/298Q/302R/393R/428T、129W、129W/228V/253R、131H/228V/279V、131Y/282T、180Q/214L、210P/214L/302R/393R/428T、228V/282T/444R、253R/279L/492G、253R/279V/470S、279L、279L/470S和441R，其中多肽序列的氨基酸位置参考SEQ ID NO:546或1494来编号。在一些此外的实施方案中，重组淀粉酶包含与SEQ ID NO:546或1494具有至少80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多序列同一性的多肽序列或其功能片段，并且其中重组淀粉酶包含选自以下的至少一个取代或取代集：D123R、D123R/T126R/D180E/E214L/H298Q/Q302W/E393R、D123R/T126R/D180Q/E214G/E393R/D428T、D123R/T126R/H210P/H298Q/Q302W/E393R、D123R/T126R/H210P/D428T、D123R/T126R/D428T、D123R/H210P/Q302R、T126R/D180E/H210P/E214G/D428T、T126R/D180E/H298Q/Q302R/E393R、T126R/D180Q/H210P/E214L/H298Q/Q302R、T126R/H210P/Q302R/D428T、T126R/E214G/E393R、T126R/H298Q/Q302H/E393R、T126R/H298Q/Q302R/E393R/D428T、D129W、D129W/Q228V/Q253R、E131H/Q228V/D279V、E131Y/E282T、D180Q/E214L、H210P/E214L/Q302R/E393R/D428T、Q228V/E282T/E444R、Q253R/D279L/E492G、Q253R/D279V/V470S、D279L、D279L/V470S和D441R，其中多肽序列的氨基酸位置参考SEQ ID NO:546或1494来编号。
在一些另外的实施方案中，重组淀粉酶包含与SEQ ID NO:632或1580具有至少80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多序列同一性的多肽序列或其功能片段，并且其中重组淀粉酶在选自以下的一个或更多个位置处包含至少一个取代或取代集：2、45/166/298、48、48/166/170/203、52、58/166、58/203、72、82、114、114/223/306/308、149、165、166/203、167、170、184/216/306/308、184/223/306/437、189、203、225、255、258、275、280、284、294、298、396、397、411、431、448、468、482、483和495，其中多肽序列的氨基酸位置参考SEQ ID NO:632或1580来编号。在一些此外的实施方案中，重组淀粉酶包含与SEQ ID NO:632或1580具有至少80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多序列同一性的多肽序列或其功能片段，并且其中重组淀粉酶包含选自以下的至少一个取代或取代集：2L、45S/166L/298D、48D、48D/166L/170S/203S、52R、58A/166L、58A/203S、72T、82A、114R、114R/223L/306F/308L、149K、165V、166L/203S、167Y、170S、184D/216L/306F/308L、184D/223L/306F/437L、189D、203S、225T、255M、255R、258S、275I、275R、280C、284L、284M、294A、298D、298N、396E、396Q、397M、411E、431T、448P、468V、482L、483A、495G和495L，其中多肽序列的氨基酸位置参考SEQ ID NO:632或1580来编号。在一些此外的实施方案中，重组淀粉酶包含与SEQ ID NO:632或1580具有至少80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多序列同一性的多肽序列或其功能片段，并且其中重组淀粉酶包含选自以下的至少一个取代或取代集：R2L、Y45S/I166L/H298D、A48D、A48D/I166L/D170S/E203S、Y52R、T58A/I166L、T58A/E203S、S72T、Q82A、H114R、H114R/V223L/Y306F/M308L、Q149K、H165V、I166L/E203S、E167Y、D170S、E184D/I216L/Y306F/M308L、E184D/V223L/Y306F/M437L、Q189D、E203S、E225T、V255M、V255R、K258S、Q275I、Q275R、Q280C、K284L、K284M、M294A、H298D、H298N、D396E、D396Q、E397M、T411E、P431T、H448P、R468V、N482L、G483A、I495G和I495L，其中多肽序列的氨基酸位置参考SEQ ID NO:632或1580来编号。
在一些另外的实施方案中，重组淀粉酶包含与SEQ ID NO:664或1612具有至少80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多序列同一性的多肽序列或其功能片段，并且其中重组淀粉酶在选自以下的一个或更多个位置处包含至少一个取代或取代集：6/39/103/324/420、41、58/500/501、61、95/98/205/227/423/458、95/98/227/423、95/205、95/252/285/324、123/170/197/275/298/396/448/483、123/197、123/197/225/294/396/448/469、123/284/294/324/396/448、134/225/275/302、165/225/284/298/469/483、170/275/294/298/448、205/206、205/206/224/315/458/480、206/227、206/227/315/423、225/294/298/396、227、392/503、458、499和500，其中多肽序列的氨基酸位置参考SEQ ID NO:664或1612来编号。在一些此外的实施方案中，重组淀粉酶包含与SEQ ID NO:664或1612具有至少80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多序列同一性的多肽序列或其功能片段，并且其中重组淀粉酶包含选自以下的至少一个取代或取代集：6I/39I/103D/324T/420V、41F、58S/500P/501P、61Y、95L/252I/285V/324T、95V/98I/205V/227V/423V/458F、95V/98I/227V/423V、95V/205V、123E/170S/197Y/275I/298N/396Q/448Q/483Q、123E/197Y、123E/197Y/225G/294A/396Q/448Q/469I、123E/284L/294A/324T/396Q/448Q、134R/225G/275I/302W、165V/225G/284L/298N/469I/483Q、170S/275I/294A/298N/448Q、205V/206E、205V/206E/224L/315S/458F/480L、206E/227V、206E/227V/315S/423V、225G/294A/298N/396Q、227C、392C/503L、458F、458Y、499R和500P，其中多肽序列的氨基酸位置参考SEQID NO:664或1612来编号。在一些此外的实施方案中，重组淀粉酶包含与SEQ ID NO:664或1612具有至少80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多序列同一性的多肽序列或其功能片段，并且其中重组淀粉酶包含选自以下的至少一个取代或取代集：L6I/V39I/V103D/A324T/I420V、L41F、T58S/H500P/H501P、L61Y、I95L/V252I/T285V/A324T、I95V/L98I/I205V/T227V/S423V/W458F、I95V/L98I/T227V/S423V、I95V/I205V、D123E/D170S/F197Y/Q275I/H298N/D396Q/H448Q/G483Q、D123E/F197Y、D123E/F197Y/E225G/M294A/D396Q/H448Q/V469I、D123E/K284L/M294A/A324T/D396Q/H448Q、E134R/E225G/Q275I/Q302W、H165V/E225G/K284L/H298N/V469I/G483Q、D170S/Q275I/M294A/H298N/H448Q、I205V/D206E、I205V/D206E/M224L/T315S/W458F/F480L、D206E/T227V、D206E/T227V/T315S/S423V、E225G/M294A/H298N/D396Q、T227C、I392C/H503L、W458F、W458Y、G499R和H500P，其中多肽序列的氨基酸位置参考SEQ IDNO:664或1612来编号。
在一些另外的实施方案中，重组淀粉酶包含与SEQ ID NO:664或1612具有至少80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多序列同一性的多肽序列或其功能片段，并且其中重组淀粉酶在选自以下的一个或更多个位置处包含至少一个取代或取代集：95/252/285/324、123/197、123/197/225/294/396/448/469、134/225/275/302、205/206和205/206/224/315/458/480，其中多肽序列的氨基酸位置参考SEQ ID NO:664或1612来编号。在一些此外的实施方案中，重组淀粉酶包含与SEQ ID NO:664或1612具有至少80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多序列同一性的多肽序列或其功能片段，并且其中重组淀粉酶包含选自以下的至少一个取代或取代集：95L/252I/285V/324T、123E/197Y、123E/197Y/225G/294A/396Q/448Q/469I、134R/225G/275I/302W、205V/206E和205V/206E/224L/315S/458F/480L，其中多肽序列的氨基酸位置参考SEQ ID NO:664或1612来编号。在一些此外的实施方案中，重组淀粉酶包含与SEQ ID NO:664或1612具有至少80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多序列同一性的多肽序列或其功能片段，并且其中重组淀粉酶包含选自以下的至少一个取代或取代集：I95L/V252I/T285V/A324T、D123E/F197Y、D123E/F197Y/E225G/M294A/D396Q/H448Q/V469I、E134R/E225G/Q275I/Q302W、I205V/D206E和I205V/D206E/M224L/T315S/W458F/F480L，其中多肽序列的氨基酸位置参考SEQ ID NO:664或1612来编号。
在一些另外的实施方案中，重组淀粉酶包含与SEQ ID NO:780或1728具有至少80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多序列同一性的多肽序列或其功能片段，并且其中重组淀粉酶在位置126处包含取代，其中多肽序列的氨基酸位置参考SEQ ID NO:780或1728来编号。在一些此外的实施方案中，重组淀粉酶包含与SEQ ID NO:780或1728具有至少80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多序列同一性的多肽序列或其功能片段，并且其中重组淀粉酶包含选自以下的至少一个取代或取代集：126C、126D、126E、126K、126L、126M、126N、126Q、126S、126T和126W，其中多肽序列的氨基酸位置参考SEQ ID NO:780或1728来编号。在一些此外的实施方案中，重组淀粉酶包含与SEQ ID NO:780或1728具有至少80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多序列同一性的多肽序列或其功能片段，并且其中重组淀粉酶包含选自以下的至少一个取代或取代集：R126C、R126D、R126E、R126K、R126L、R126M、R126N、R126Q、R126S、R126T和R126W，其中多肽序列的氨基酸位置参考SEQ ID NO:780或1728来编号。
在一些另外的实施方案中，重组淀粉酶包含如表4-1、表4-2、表4-3、表4-4、表4-5、表4-6、表4-7、表4-8、表4-9、表4-10、表4-11、表4-12、表4-13和/或表4-14中提供的至少一个位置中的至少一个突变，其中位置参考SEQ ID NO:2、18、40、156、174、276、308、422、456、546、632、664、780、988、1104、1122、1224、1256、1370、1404、1494、1580、1612和/或1728来编号。在一些此外的实施方案中，重组淀粉酶包含与SEQ ID NO:4-18、22-966和970-1914中的偶数编号序列中列出的至少一个序列具有至少约80％、约85％、约86％、约87％、约88％、约89％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％或更多序列同一性的多肽序列。在一些此外的实施方案中，重组淀粉酶包含与SEQ ID NO:4-18、22-966和970-1914中的偶数编号序列中列出的至少一个序列具有至少80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多序列同一性的多肽序列。在一些另外的实施方案中，重组淀粉酶包含SEQ ID NO:4-18、22-966和970-1914中的偶数编号序列中列出的至少一个序列。
在一些实施方案中，重组淀粉酶包含SEQ ID NO:22-124和970-1072中的偶数编号序列中列出的至少一个序列。在一些实施方案中，重组淀粉酶包含SEQ ID NO:126-172和1074-1120中的偶数编号序列中列出的至少一个序列。在一些实施方案中，重组淀粉酶包含SEQ ID NO:174-222和1122-1170中的偶数编号序列中列出的至少一个序列。在一些实施方案中，重组淀粉酶包含SEQ ID NO:224-306和1172-1254中的偶数编号序列中列出的至少一个序列。在一些实施方案中，重组淀粉酶包含SEQ ID NO:308-380和1256-1328中的偶数编号序列中列出的至少一个序列。在一些实施方案中，重组淀粉酶包含SEQ ID NO:382-440和1330-1388中的偶数编号序列中列出的至少一个序列。在一些实施方案中，重组淀粉酶包含SEQ ID NO:442-540和1390-1488中的偶数编号序列中列出的至少一个序列。在一些实施方案中，重组淀粉酶包含SEQ ID NO:542-608和1490-1556中的偶数编号序列中列出的至少一个序列。在一些实施方案中，重组淀粉酶包含SEQ ID NO:610-660和1558-1608中的偶数编号序列中列出的至少一个序列。在一些实施方案中，重组淀粉酶包含SEQ ID NO:662-746和1610-1694中的偶数编号序列中列出的至少一个序列。在一些实施方案中，重组淀粉酶包含SEQ ID NO:748-798和1696-1746中的偶数编号序列中列出的至少一个序列。在一些实施方案中，重组淀粉酶包含SEQ ID NO:800-820和1748-1768中的偶数编号序列中列出的至少一个序列。在一些实施方案中，重组淀粉酶包含SEQ ID NO:822-966和1770-1914中的偶数编号序列中列出的至少一个序列。
在一些实施方案中，工程化淀粉酶多肽包含由本发明包括的工程化淀粉酶多肽的功能片段。功能片段具有其所源自的工程化淀粉酶多肽(即，亲本工程化淀粉酶)的活性的至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％。在一些实施方案中，功能片段包含工程化淀粉酶的亲本序列的至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％以及甚至99％。在一些实施方案中，功能片段被截短了少于5个、少于10个、少于15个、少于10个、少于25个、少于30个、少于35个、少于40个、少于45个和少于50个氨基酸。
在一些另外的实施方案中，与参考序列相比，重组淀粉酶在暴露于高温和/或低温后保留更大的酶活性。在一些实施方案中，参考序列是野生型淀粉酶，而在一些其他实施方案中，参考序列是另一种重组淀粉酶。在一些另外的实施方案中，重组淀粉酶比SEQ ID NO:2的淀粉酶更热稳定。在一些此外的实施方案中，重组淀粉酶比SEQ ID NO:18、40、156、174、276、308、422、456、546、632、664、780、988、1104、1122、1224、1256、1370、1404、1494、1580、1612和/或1728的淀粉酶更热稳定。在一些实施方案中，重组淀粉酶在30℃、37℃、40℃、50℃、60℃和/或95℃和/或40℃至60℃是稳定的。在一些实施方案中，重组淀粉酶在30℃、37℃、42℃和/或48℃是稳定的。在一些另外的实施方案中，重组淀粉酶比参考序列在30℃、37℃、40℃、50℃、60℃和/或95℃和/或40℃至60℃更稳定。在一些实施方案中，重组淀粉酶比参考序列在30℃、37℃、40℃、50℃、60℃和/或95℃和/或40℃至60℃更稳定。在一些另外的实施方案中，重组淀粉酶比SEQ ID NO:2的淀粉酶更热稳定。在一些此外的实施方案中，重组淀粉酶比SEQ ID NO:18、40、156、174、276、308、422、456、546、632、664、780、988、1104、1122、1224、1256、1370、1404、1494、1580、1612和/或1728的淀粉酶更热稳定。
在一些实施方案中，重组淀粉酶在低pH环境中是稳定的，而在其他实施方案中，重组淀粉酶在高pH环境中是稳定的，并且在仍此外的实施方案中，重组淀粉酶在中性pH环境中是稳定的。在一些实施方案中，重组淀粉酶在低、高和/或中性pH环境中是稳定的。在一些实施方案中，重组淀粉酶在暴露于低、高和/或中性pH环境后保留酶活性。在一些另外的实施方案中，与参考序列相比，重组淀粉酶在高、低和/或中性pH环境中更稳定。在一些实施方案中，参考序列是野生型淀粉酶，而在其他实施方案中，参考序列是另一种工程化淀粉酶。在一些另外的实施方案中，重组淀粉酶比SEQ ID NO:2的淀粉酶更稳定。在一些此外的实施方案中，重组淀粉酶比SEQ ID NO:18、40、156、174、276、308、422、456、546、632、664、780、988、1104、1122、1224、1256、1370、1404、1494、1580、1612和/或1728的淀粉酶更稳定。在一些另外的实施方案中，重组淀粉酶在大于7的pH比SEQ ID NO:2的淀粉酶更稳定。在一些另外的实施方案中，重组淀粉酶在大于7的pH比SEQ ID NO:18、40、156、174、276、308、422、456、546、632、664、780、988、1104、1122、1224、1256、1370、1404、1494、1580、1612和/或1728的淀粉酶更稳定。在一些另外的实施方案中，重组淀粉酶在pH 7.8比SEQ ID NO:2的淀粉酶更稳定。在一些另外的实施方案中，重组淀粉酶在pH 7.8比SEQ ID NO:18、40、156、174、276、308、422、456、546、632、664、780、988、1104、1122、1224、1256、1370、1404、1494、1580、1612和/或1728的淀粉酶更稳定。在一些另外的实施方案中，重组淀粉酶在pH 7.5比SEQ IDNO:2的淀粉酶更稳定。在一些另外的实施方案中，重组淀粉酶在pH 7.5比SEQ ID NO:18、40、156、174、276、308、422、456、546、632、664、780、988、1104、1122、1224、1256、1370、1404、1494、1580、1612和/或1728的淀粉酶更稳定。在一些另外的实施方案中，重组淀粉酶在pH 7比SEQ ID NO:2的淀粉酶更稳定。在一些另外的实施方案中，重组淀粉酶在pH 7比SEQ IDNO:18、40、156、174、276、308、422、456、546、632、664、780、988、1104、1122、1224、1256、1370、1404、1494、1580、1612和/或1728的淀粉酶更稳定。在一些此外的实施方案中，重组淀粉酶在小于7的pH比SEQ ID NO:2的淀粉酶更稳定。在一些另外的实施方案中，重组淀粉酶在小于7的pH比SEQ ID NO:18、40、156、174、276、308、422、456、546、632、664、780、988、1104、1122、1224、1256、1370、1404、1494、1580、1612和/或1728的淀粉酶更稳定。在一些另外的实施方案中，重组淀粉酶在pH 6.8比SEQ ID NO:2的淀粉酶更稳定。在一些另外的实施方案中，重组淀粉酶在pH 6.8比SEQ ID NO:18、40、156、174、276、308、422、456、546、632、664、780、988、1104、1122、1224、1256、1370、1404、1494、1580、1612和/或1728的淀粉酶更稳定。在一些另外的实施方案中，重组淀粉酶在pH 6.7比SEQ ID NO:2的淀粉酶更稳定。在一些另外的实施方案中，重组淀粉酶在pH 6.7比SEQ ID NO:18、40、156、174、276、308、422、456、546、632、664、780、988、1104、1122、1224、1256、1370、1404、1494、1580、1612和/或1728的淀粉酶更稳定。在一些另外的实施方案中，重组淀粉酶在pH 6.5比SEQ ID NO:2的淀粉酶更稳定。在一些另外的实施方案中，重组淀粉酶在pH 6.5比SEQ ID NO:18、40、156、174、276、308、422、456、546、632、664、780、988、1104、1122、1224、1256、1370、1404、1494、1580、1612和/或1728的淀粉酶更稳定。在一些另外的实施方案中，重组淀粉酶在pH 6比SEQ IDNO:2的淀粉酶更稳定。在一些另外的实施方案中，重组淀粉酶在pH 6比SEQ ID NO:18、40、156、174、276、308、422、456、546、632、664、780、988、1104、1122、1224、1256、1370、1404、1494、1580、1612和/或1728的淀粉酶更稳定。在一些此外的实施方案中，重组淀粉酶在小于5的pH比SEQ ID NO:2的淀粉酶更稳定。在一些另外的实施方案中，重组淀粉酶在pH 5比SEQID NO:2的淀粉酶更稳定。在一些另外的实施方案中，重组淀粉酶在pH 5比SEQ ID NO:18、40、156、174、276、308、422、456、546、632、664、780、988、1104、1122、1224、1256、1370、1404、1494、1580、1612和/或1728的淀粉酶更稳定。在一些此外的实施方案中，重组淀粉酶在pH 4比SEQ ID NO:2的淀粉酶更稳定。在一些此外的实施方案中，重组淀粉酶在pH 5比SEQ IDNO:18、40、156、174、276、308、422、456、546、632、664、780、988、1104、1122、1224、1256、1370、1404、1494、1580、1612和/或1728的淀粉酶更稳定。在一些另外的实施方案中，重组淀粉酶在pH 3.8比SEQ ID NO:2的淀粉酶更稳定。在一些另外的实施方案中，重组淀粉酶在pH3.8比SEQ ID NO:18、40、156、174、276、308、422、456、546、632、664、780、988、1104、1122、1224、1256、1370、1404、1494、1580、1612和/或1728的淀粉酶更稳定。
在一些另外的实施方案中，重组淀粉酶在pH 3.5比SEQ ID NO:2的淀粉酶更稳定。在一些另外的实施方案中，重组淀粉酶在pH 3.5比SEQ ID NO:18、40、156、174、276、308、422、456、546、632、664、780、988、1104、1122、1224、1256、1370、1404、1494、1580、1612和/或1728的淀粉酶更稳定。在一些另外的实施方案中，重组淀粉酶在pH 3.25比SEQ ID NO:2的淀粉酶更稳定。在一些另外的实施方案中，重组淀粉酶在pH 3.25比SEQ ID NO:18、40、156、174、276、308、422、456、546、632、664、780、988、1104、1122、1224、1256、1370、1404、1494、1580、1612和/或1728的淀粉酶更稳定。在一些此外的实施方案中，重组淀粉酶在pH 3比SEQID NO:2的淀粉酶更稳定。在一些此外的实施方案中，重组淀粉酶在pH 3比SEQ ID NO:18、40、156、174、276、308、422、456、546、632、664、780、988、1104、1122、1224、1256、1370、1404、1494、1580、1612和/或1728的淀粉酶更稳定。在一些另外的实施方案中，重组淀粉酶在pH2.75比SEQ ID NO:2的淀粉酶更稳定。在一些另外的实施方案中，重组淀粉酶在pH 2.75比SEQ ID NO:18、40、156、174、276、308、422、456、546、632、664、780、988、1104、1122、1224、1256、1370、1404、1494、1580、1612和/或1728的淀粉酶更稳定。在一些此外的实施方案中，重组淀粉酶在pH 2.5比SEQ ID NO:2的淀粉酶更稳定。在一些此外的实施方案中，重组淀粉酶在pH 2.5比SEQ ID NO:18、40、156、174、276、308、422、456、546、632、664、780、988、1104、1122、1224、1256、1370、1404、1494、1580、1612和/或1728的淀粉酶更稳定。在一些此外的实施方案中，重组淀粉酶在pH 2.3比SEQ ID NO:2的淀粉酶更稳定。在一些此外的实施方案中，重组淀粉酶在pH 2.3比SEQ ID NO:18、40、156、174、276、308、422、456、546、632、664、780、988、1104、1122、1224、1256、1370、1404、1494、1580、1612和/或1728的淀粉酶更稳定。在一些此外的实施方案中，重组淀粉酶在pH 2比SEQ ID NO:2的淀粉酶更稳定。在一些此外的实施方案中，重组淀粉酶在pH 2比SEQ ID NO:18、40、156、174、276、308、422、456、546、632、664、780、988、1104、1122、1224、1256、1370、1404、1494、1580、1612和/或1728的淀粉酶更稳定。
在一些实施方案中，重组淀粉酶比SEQ ID NO:2的淀粉酶更抗蛋白水解。在一些实施方案中，重组淀粉酶比SEQ ID NO:18、40、156、174、276、308、422、456、546、632、664、780、988、1104、1122、1224、1256、1370、1404、1494、1580、1612和/或1728的淀粉酶更抗蛋白水解。在一些实施方案中，重组淀粉酶抗胃蛋白酶的蛋白水解。在一些另外的实施方案中，重组淀粉酶比SEQ ID NO:2的淀粉酶更抗胃蛋白酶的蛋白水解。在一些实施方案中，重组淀粉酶比SEQ ID NO:18、40、156、174、276、308、422、456、546、632、664、780、988、1104、1122、1224、1256、1370、1404、1494、1580、1612和/或1728的淀粉酶更抗胃蛋白酶的蛋白水解。在一些另外的实施方案中，重组淀粉酶抗胰蛋白酶的蛋白水解。在一些另外的实施方案中，重组淀粉酶比SEQ ID NO:2的淀粉酶更抗胰蛋白酶的蛋白水解。在一些实施方案中，重组淀粉酶比SEQ ID NO:18、40、156、174、276、308、422、456、546、632、664、780、988、1104、1122、1224、1256、1370、1404、1494、1580、1612和/或1728的淀粉酶更抗胰蛋白酶的蛋白水解。在一些实施方案中，重组淀粉酶抗胰凝乳蛋白酶的蛋白水解。在一些另外的实施方案中，重组淀粉酶比SEQ ID NO:2的淀粉酶更抗胰凝乳蛋白酶的蛋白水解。在一些实施方案中，重组淀粉酶比SEQ ID NO:18、40、156、174、276、308、422、456、546、632、664、780、988、1104、1122、1224、1256、1370、1404、1494、1580、1612和/或1728的淀粉酶更抗胰凝乳蛋白酶的蛋白水解。在一些此外的实施方案中，重组淀粉酶抗胃蛋白酶、胰蛋白酶和/或胰凝乳蛋白酶的蛋白水解。在一些另外的实施方案中，重组淀粉酶比SEQ ID NO:2的淀粉酶更抗胃蛋白酶、胰蛋白酶和/或胰凝乳蛋白酶的蛋白水解。在一些实施方案中，重组淀粉酶比SEQ ID NO:18、40、156、174、276、308、422、456、546、632、664、780、988、1104、1122、1224、1256、1370、1404、1494、1580、1612和/或1728的淀粉酶更抗胃蛋白酶、胰蛋白酶和/或胰凝乳蛋白酶的蛋白水解。
在一些另外的实施方案中，重组淀粉酶在存在至少一种胆盐的情况下是有活性的。在一些另外的实施方案中，重组淀粉酶在存在至少一种胆盐的情况下比SEQ ID NO:2的淀粉酶更有活性。在一些另外的实施方案中，重组淀粉酶在存在至少一种胆盐的情况下比SEQ ID NO:18、40、156、174、276、308、422、456、546、632、664、780、988、1104、1122、1224、1256、1370、1404、1494、1580、1612和/或1728的淀粉酶更有活性。在一些实施方案中，重组淀粉酶在暴露于胆盐后保留酶活性。在一些另外的实施方案中，与参考序列相比，重组淀粉酶在暴露于胆盐后保留更大的酶活性。在一些实施方案中，参考序列是SEQ ID NO:2、18、40、156、174、276、308、422、456、546、632、664、780、988、1104、1122、1224、1256、1370、1404、1494、1580、1612和/或1728的淀粉酶。在一些另外的实施方案中，胆盐是牛磺胆酸盐。
在又一些另外的实施方案中，与野生型淀粉酶或另一种重组淀粉酶相比，重组淀粉酶表现出多于一种改进的特性。在一些实施方案中，与SEQ ID NO:2相比，重组淀粉酶表现出多于一种改进的特性，而在一些另外的实施方案中，重组淀粉酶与SEQ ID NO:18、40、156、174、276、308、422、456、546、632、664、780、988、1104、1122、1224、1256、1370、1404、1494、1580、1612和/或1728相比，表现出多于一种改进的特性。在一些实施方案中，改进的特性选自酸稳定性、碱稳定性、在酸性pH的稳定性和/或活性、在碱性pH的稳定性、在中性pH的稳定性、热稳定性、蛋白水解抗性和增加的在存在至少一种胆盐的情况下的活性。在又一些另外的实施方案中，重组淀粉酶在酸性pH比SEQ ID NO:2、18、40、156、174、276、308、422、456、546、632、664、780、988、1104、1122、1224、1256、1370、1404、1494、1580、1612和/或1728的淀粉酶更稳定和/或更有活性、更热稳定、更抗蛋白水解和/或在存在至少一种胆盐的情况下更有活性。设想了可将改进的特性的任何组合用于本发明。不意图本发明受限于改进的特性的任何特定组合。此外，在一些实施方案中，有两种改进的特性，而在一些其他实施方案中，有三种改进的特性，在一些另外的实施方案中，有四种改进的特性，并且在一些另外的实施方案中，有五种或更多种改进的特性。还设想了本发明的重组淀粉酶还包括另外的改进。在一些实施方案中，这些另外的改进提供了优于野生型淀粉酶的优势，而在一些其他实施方案中，另外的改进将提供优于其他重组淀粉酶的优势。
在一些实施方案中，与SEQ ID NO:2的淀粉酶相比，重组淀粉酶表现出至少一种选自以下的改进的特性：改进的在酸性pH的稳定性和/或活性、改进的热稳定性、改进的对蛋白水解的抗性和/或改进的在存在至少一种胆盐的情况下的活性。在一些实施方案中，与SEQ ID NO:18、40、156、174、276、308、422、456、546、632、664、780、988、1104、1122、1224、1256、1370、1404、1494、1580、1612和/或1728的淀粉酶相比，重组淀粉酶表现出至少一种选自以下的改进的特性：改进的在酸性pH的稳定性和/或活性、改进的热稳定性、改进的对蛋白水解的抗性和/或改进的在存在至少一种胆盐的情况下的活性。在一些实施方案中，与SEQ ID NO:2的淀粉酶相比，重组淀粉酶表现出至少两种选自以下的改进的特性：改进的在酸性pH的稳定性和/或活性、改进的热稳定性、改进的对蛋白水解的抗性和/或改进的在存在至少一种胆盐的情况下的活性。在一些实施方案中，与SEQ ID NO:18、40、156、174、276、308、422、456、546、632、664、780、988、1104、1122、1224、1256、1370、1404、1494、1580、1612和/或1728的淀粉酶相比，重组淀粉酶表现出至少两种选自以下的改进的特性：改进的在酸性pH的稳定性和/或活性、改进的热稳定性、改进的对蛋白水解的抗性和/或改进的在存在至少一种胆盐的情况下的活性。在一些实施方案中，与SEQ ID NO:2的淀粉酶相比，重组淀粉酶表现出至少三种选自以下的改进的特性：改进的在酸性pH的稳定性和/或活性、改进的热稳定性、改进的对蛋白水解的抗性和/或改进的在存在至少一种胆盐的情况下的活性。在一些实施方案中，与SEQ ID NO:18、40、156、174、276、308、422、456、546、632、664、780、988、1104、1122、1224、1256、1370、1404、1494、1580、1612和/或1728的淀粉酶相比，重组淀粉酶表现出至少三种选自以下的改进的特性：改进的在酸性pH的稳定性和/或活性、改进的热稳定性、改进的对蛋白水解的抗性和/或改进的在存在至少一种胆盐的情况下的活性。在一些实施方案中，与SEQ ID NO:2的淀粉酶相比，重组淀粉酶表现出以下改进的特性：改进的在酸性pH的稳定性和/或活性、改进的热稳定性、改进的对蛋白水解的抗性和改进的在存在至少一种胆盐的情况下的活性。在一些实施方案中，与SEQ ID NO:18、40、156、174、276、308、422、456、546、632、664、780、988、1104、1122、1224、1256、1370、1404、1494、1580、1612和/或1728的淀粉酶相比，重组淀粉酶表现出以下改进的特性：改进的在酸性pH的稳定性和/或活性、改进的热稳定性、改进的对蛋白水解的抗性和/或改进的在存在至少一种胆盐的情况下的活性。在一些实施方案中，与SEQ ID NO:2的淀粉酶相比，重组淀粉酶表现出至少一种选自以下的改进的特性：改进的在酸性pH的稳定性和/或活性、改进的热稳定性、改进的对蛋白水解的抗性和/或改进的在存在至少一种胆盐的情况下的活性，以及至少一种另外的改进的特性。在一些实施方案中，与SEQ ID NO:18、40、156、174、276、308、422、456、546、632、664、780、988、1104、1122、1224、1256、1370、1404、1494、1580、1612和/或1728的淀粉酶相比，重组淀粉酶表现出至少一种选自以下的改进的特性：改进的在酸性pH的稳定性和/或活性、改进的热稳定性、改进的对蛋白水解的抗性和/或改进的在存在至少一种胆盐的情况下的活性，以及至少一种另外的改进的特性。在一些实施方案中，与参考序列相比，重组淀粉酶表现出至少一种选自以下的改进的特性：i)增强的催化活性；ii)增加的对酸性pH的耐受性；iii)增加的对pH 2.3、2.5、2.75、3、3.25和/或3.5的耐受性；iv)增加的对pH 6.7和/或6.8的耐受性；v)增加的对至少一种蛋白酶的耐受性；vi)增加的对至少一种胆盐的耐受性；vii)增加的耐热性；或i)、ii)、iii)、iv)、v)、vi)和vii)中的任何组合。在一些实施方案中，参考序列是SEQ ID NO:2，而在一些可选的实施方案中，参考序列选自SEQ ID NO:18、40、156、174、276、308、422、456、546、632、664、780、988、1104、1122、1224、1256、1370、1404、1494、1580、1612和/或1728。在一些实施方案中，与至少一个参考序列相比，重组淀粉酶表现出至少一种选自以下的改进的特性：i)增强的催化活性；ii)增加的对酸性pH的耐受性；iii)增加的对pH 2.3、2.5、2.75、3、3.25和/或3.5的耐受性；iv)增加的对pH 6.7和/或6.8的耐受性；v)增加的对至少一种蛋白酶的耐受性；vi)增加的对至少一种胆盐的耐受性；vii)增加的耐热性；或i)、ii)、iii)、iv)、v)、vi)和vii)中的任何组合。在一些实施方案中，参考序列是SEQ ID NO:2，而在一些可选的实施方案中，参考序列选自SEQ ID NO:18、40、156、174、276、308、422、456、546、632、664、780、988、1104、1122、1224、1256、1370、1404、1494、1580、1612和/或1728。在一些实施方案中，与至少两个或更多个参考序列相比，重组淀粉酶表现出至少一种选自以下的改进的特性：i)增强的催化活性；ii)增加的对酸性pH的耐受性；iii)增加的对pH 2.3、2.5、2.75、3、3.25和/或3.5的耐受性；iv)增加的对pH 6.7和/或6.8的耐受性；v)增加的对至少一种蛋白酶的耐受性；vi)增加的对至少一种胆盐的耐受性；vii)增加的耐热性；或i)、ii)、iii)、iv)、v)、vi)和vii)中的任何组合。在一些实施方案中，参考序列选自SEQ ID NO:18、40、156、174、276、308、422、456、546、632、664、780、988、1104、1122、1224、1256、1370、1404、1494、1580、1612和/或1728。在一些此外的实施方案中，重组淀粉酶是纯化的。
本发明还提供了用于淀粉水解的方法，该方法包括提供淀粉和本文提供的至少一种工程化淀粉酶；以及在使得淀粉被所述工程化淀粉酶水解的条件下将淀粉暴露于所述工程化淀粉酶。
在仍一些此外的实施方案中，淀粉酶在食物和/或饮料中是稳定的。在一些另外的实施方案中，淀粉酶在营养补充剂和其他补充剂中是稳定的。在一些实施方案中，补充剂是液体，而在其他实施方案中，它们是乳液、悬浮液或固体。不意图本发明受限于任何特定的食品、饮料和/或补充剂形制或形式。
编码工程化多肽的多核苷酸、表达载体和宿主细胞
本发明提供了编码本文描述的工程化淀粉酶多肽的多核苷酸。在一些实施方案中，多核苷酸被可操作地连接至控制基因表达的一个或更多个异源调控序列，以创建能够表达多肽的重组多核苷酸。包含编码工程化淀粉酶多肽的异源多核苷酸的表达构建体可以被引入到适当的宿主细胞中以表达对应的淀粉酶多肽。
如对技术人员将是明显的，蛋白序列的可得性以及对对应于各种氨基酸的密码子的了解提供能够编码主题多肽的所有多核苷酸的说明。遗传密码子的简并性，其中相同氨基酸由可替代的密码子或同义的密码子编码，允许制备极大数目的核酸，所有这些核酸编码工程化淀粉酶多肽。因此，知道了特定的氨基酸序列后，本领域技术人员可以通过以不改变蛋白的氨基酸序列的方式简单改变一个或更多个密码子的序列来制备任何数目的不同核酸。在这方面，本发明具体地设想了可以通过基于可能的密码子选择来选择组合以制备编码本文描述的多肽的多核苷酸的每种和每一种可能的改变，并且对于本文描述的任何多肽，包括表4-1、表4-2、表4-3、表4-4、表4-5、表4-6、表4-7、表4-8、表4-9、表4-10、表4-11、表4-12、表4-13和/或表4-14中提供的变体；和表4-1、表4-2、表4-3、表4-4、表4-5、表4-6、表4-7、表4-8、表4-9、表4-10、表4-11、表4-12、表4-13和/或表4-14中提供的变体，其中变体缺少组氨酸标签和前面的氨基酸接头(preceding amino acid linker)，所有这样的改变被视为是具体公开的。
在各种实施方案中，密码子被优选地选择为适应在其中产生蛋白的宿主细胞。例如，细菌中使用的优选的密码子被用于在细菌中的表达，而真菌中使用的优选的密码子被用于在真菌中的表达。因此，编码工程化淀粉酶多肽的密码子优化的多核苷酸在全长编码区的约40％、50％、60％、70％、80％或大于90％的密码子位置处包含优选的密码子。
在一些实施方案中，本发明提供了与SEQ ID NO:1、17、39、155、173、275、307、421、455、545、631、663、779、987、1103、1121、1223、1255、1369、1403、1493、1579、1611和/或1727具有至少约80％、至少约85％、约86％、约87％、约88％、约89％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％或更多序列同一性的重组多核苷酸序列。在一些实施方案中，本发明提供了与SEQ ID NO:1、17、39、155、173、275、307、421、455、545、631、663、779、987、1103、1121、1223、1255、1369、1403、1493、1579、1611和/或1727具有至少80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多序列同一性的重组多核苷酸序列。在一些实施方案中，重组多核苷酸序列与SEQ ID NO:3-17、21-965和969-1913中的奇数编号序列具有至少80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多序列同一性。在一些实施方案中，编码工程化淀粉酶多肽的多核苷酸包含SEQ ID NO:1、17、39、155、173、275、307、421、455、545、631、663、779、987、1103、1121、1223、1255、1369、1403、1493、1579、1611或1727的多核苷酸序列。在一些实施方案中，编码工程化淀粉酶多肽的多核苷酸包含SEQ ID NO:3-17、21-965和969-1913中的奇数编号序列的多核苷酸序列。
在一些实施方案中，如本文描述的，多核苷酸编码具有本文公开的特性的具有淀粉酶活性的工程化多肽，其中所述多肽包含与参考序列(例如，SEQ ID NO:2、18、40、156、174、276、308、422、456、546、632、664、780、988、1104、1122、1224、1256、1370、1404、1494、1580、1612和/或1728)具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多同一性的氨基酸序列，或者如表4-1、表4-2、表4-3、表4-4、表4-5、表4-6、表4-7、表4-8、表4-9、表4-10、表4-11、表4-12、表4-13和/或表4-14中公开的任何变体的氨基酸序列；或者如表4-1、表4-2、表4-3、表4-4、表4-5、表4-6、表4-7、表4-8、表4-9、表4-10、表4-11、表4-12、表4-13和/或表4-14中公开的任何变体的氨基酸序列，其中变体缺乏组氨酸标签和前面的氨基酸接头，以及如与以下相比的一个或更多个残基差异(例如1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个、26个、27个、28个、29个、30个或更多个氨基酸残基位置)：SEQ ID NO:2、18、40、156、174、276、308、422、456、546、632、664、780、988、1104、1122、1224、1256、1370、1404、1494、1580、1612和/或1728的参考多肽；或者如表4-1、表4-2、表4-3、表4-4、表4-5、表4-6、表4-7、表4-8、表4-9、表4-10、表4-11、表4-12、表4-13和/或表4-14中公开的任何变体的氨基酸序列，或表格中公开的任何变体的氨基酸序列，所述变体具有或不具有组氨酸标签和前面的氨基酸接头。在一些实施方案中，多核苷酸编码具有本文公开的特性的具有淀粉酶活性的工程化多肽，其中当与SEQ ID NO:2、18、40、156、174、276、308、422、456、546、632、664、780、988、1104、1122、1224、1256、1370、1404、1494、1580、1612和/或1728的多肽进行最佳比对时，所述多肽包含与参考序列SEQ ID NO:2、18、40、156、174、276、308、422、456、546、632、664、780、988、1104、1122、1224、1256、1370、1404、1494、1580、1612和/或1728具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多序列同一性的氨基酸序列，以及与SEQ ID NO:2、18、40、156、174、276、308、422、456、546、632、664、780、988、1104、1122、1224、1256、1370、1404、1494、1580、1612和/或1728相比，在选自表4-1、表4-2、表4-3、表4-4、表4-5、表4-6、表4-7、表4-8、表4-9、表4-10、表4-11、表4-12、表4-13和/或表4-14中提供的残基位置的残基位置处的一个或更多个残基差异。
在一些实施方案中，多核苷酸编码重组淀粉酶，所述重组淀粉酶包含与SEQ IDNO:2或18具有至少70％、75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多序列同一性的多肽序列或其功能片段。
在一些实施方案中，多核苷酸编码重组淀粉酶，所述重组淀粉酶包含与SEQ IDNO:2或18具有至少80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多序列同一性的多肽序列或其功能片段，并且其中编码的重组淀粉酶在选自以下的一个或更多个位置处包含至少一个取代或取代集：2/73/256/493、16/33/73/130/256/282/371/374/493、16/33/130/256/302/371/383/470、16/33/157/256/302/371/383、16/73/74/256/282/366/371/383/493、16/73/256/282/302/331/371/383、16/130/256/276/374/470、16/256/302/374、19/72/345/473、26/27/396/412/428/473、26/27/412、26/27/466/473、29、73/130/256/282/302/493、74/371/374/383/493、130/256/493、149、158、254、256、256/383、257、259、272、279、284、317/383、322、345/388/396/428、388/396/412/428、396/412、396/412/428/466、409、412和495，其中多肽序列的氨基酸位置参考SEQ ID NO:2或18来编号。在一些实施方案中，编码的重组淀粉酶包含选自以下的至少一个取代或取代集：2K/73V/256S/493D、16D/33E/73V/130D/256S/282D/371F/374S/493D、16D/33E/130D/256S/302Q/371F/383E/470T、16D/33E/157Y/256S/302Q/371F/383E、16D/73V/74A/256S/282D/366L/371F/383E/493D、16D/73V/256S/282D/302Q/331P/371F/383E、16D/130D/256S/276Q/374S/470T、16D/256S/302Q/374S、19E/72T/345A/473D、26A/27L/396H/412D/428E/473D、26A/27L/412D、26A/27L/466E/473D、29G、29R、29S、73V/130D/256S/282D/302Q/493D、74A/371F/374S/383E/493D、130D/256S/493D、149R、149T、158R、254G、254S、256S、256S/383E、257E、257G、257R、257S、257V、259Q、272G、272K、272P、272R、272S、279R、284C、284R、284S、284Y、317G/383L、322A、345A/388E/396H/428E、388E/396H/412D/428E、396H/412D、396H/412D/428E/466E、409S、412S、495E、495L和495Y，其中多肽序列的氨基酸位置参考SEQ ID NO:2或18来编号。在一些实施方案中，编码的重组淀粉酶包含选自以下的至少一个取代或取代集：R2K/I73V/A256S/E493D、E16D/D33E/I73V/E130D/A256S/E282D/Y371F/H374S/E493D、E16D/D33E/E130D/A256S/M302Q/Y371F/Q383E/V470T、E16D/D33E/F157Y/A256S/M302Q/Y371F/Q383E、E16D/I73V/P74A/A256S/E282D/F366L/Y371F/Q383E/E493D、E16D/I73V/A256S/E282D/M302Q/H331P/Y371F/Q383E、E16D/E130D/A256S/T276Q/H374S/V470T、E16D/A256S/M302Q/H374S、K19E/S72T/P345A/E473D、E26A/R27L/D396H/L412D/D428E/E473D、E26A/R27L/L412D、E26A/R27L/Q466E/E473D、D29G、D29R、D29S、I73V/E130D/A256S/E282D/M302Q/E493D、P74A/Y371F/H374S/Q383E/E493D、E130D/A256S/E493D、Q149R、Q149T、K158R、E254G、E254S、A256S、A256S/Q383E、P257E、P257G、P257R、P257S、P257V、P259Q、D272G、D272K、D272P、D272R、D272S、D279R、K284C、K284R、K284S、K284Y、V317G/Q383L、F322A、P345A/D388E/D396H/D428E、D388E/D396H/L412D/D428E、D396H/L412D、D396H/L412D/D428E/Q466E、V409S、L412S、I495E、I495L和I495Y，其中多肽序列的氨基酸位置参考SEQ ID NO:2或18来编号。
在一些实施方案中，多核苷酸编码重组淀粉酶，所述重组淀粉酶包含与SEQ IDNO:40或988具有至少80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多序列同一性的多肽序列或其功能片段，并且其中编码的重组淀粉酶在选自以下的一个或更多个位置处包含至少一个取代或取代集：26/29/158/272/412、26/29/272/279/412/493、26/29/272/396/412、26/29/279/412/428、26/158/272/279/388/412/428、26/158/272/412、26/272/279/412/428/493、29/272/279/396/412、130/149/254/284/322/409/495、130/149/257/284/322/409/466/473、130/254/284/322/374/409/466、130/257/284/374/409/466、130/284/322/374/409/473、149/257/284/322/409/466、158/272/279/394/396/412/428/493、158/272/388/412/428/493、158/272/412/428、158/279/388/396/412/428、254/257/284/322/409/473、254/284/409/466/495、272/279/412/428/493、272/412/428、272/412/493和284/322/409/473，其中多肽序列的氨基酸位置参考SEQ ID NO:40或988来编号。在一些实施方案中，编码的重组淀粉酶包含选自以下的至少一个取代或取代集：26A/29R/158R/272G/412D、26A/29R/272G/279R/412D/493D、26A/29R/272G/396H/412D、26A/29R/279R/412D/428E、26A/158R/272G/279R/388E/412D/428E、26A/158R/272G/412D、26A/272G/279R/412D/428E/493D、29R/272G/279R/396H/412D、130D/149R/254S/284S/322A/409S/495E、130D/149R/257G/284S/322A/409S/466E/473D、130D/254S/284S/322A/374S/409S/466E、130D/257G/284S/374S/409S/466E、130D/284S/322A/374S/409S/473D、149R/257G/284S/322A/409S/466E、158R/272G/279R/394R/396H/412D/428E/493D、158R/272G/388E/412D/428E/493D、158R/272G/412D/428E、158R/279R/388E/396H/412D/428E、254S/257G/284S/322A/409S/473D、254S/284S/409S/466E/495E、272G/279R/412D/428E/493D、272G/412D/428E、272G/412D/493D和284S/322A/409S/473D，其中多肽序列的氨基酸位置参考SEQ ID NO:40或988来编号。在一些实施方案中，编码的重组淀粉酶包含选自以下的至少一个取代或取代集：E26A/D29R/K158R/D272G/L412D、E26A/D29R/D272G/D279R/L412D/E493D、E26A/D29R/D272G/D396H/L412D、E26A/D29R/D279R/L412D/D428E、E26A/K158R/D272G/D279R/D388E/L412D/D428E、E26A/K158R/D272G/L412D、E26A/D272G/D279R/L412D/D428E/E493D、D29R/D272G/D279R/D396H/L412D、E130D/Q149R/E254S/K284S/F322A/V409S/I495E、E130D/Q149R/P257G/K284S/F322A/V409S/Q466E/E473D、E130D/E254S/K284S/F322A/H374S/V409S/Q466E、E130D/P257G/K284S/H374S/V409S/Q466E、E130D/K284S/F322A/H374S/V409S/E473D、Q149R/P257G/K284S/F322A/V409S/Q466E、K158R/D272G/D279R/Q394R/D396H/L412D/D428E/E493D、K158R/D272G/D388E/L412D/D428E/E493D、K158R/D272G/L412D/D428E、K158R/D279R/D388E/D396H/L412D/D428E、E254S/P257G/K284S/F322A/V409S/E473D、E254S/K284S/V409S/Q466E/I495E、D272G/D279R/L412D/D428E/E493D、D272G/L412D/D428E、D272G/L412D/E493D和K284S/F322A/V409S/E473D，其中多肽序列的氨基酸位置参考SEQ ID NO:40或988来编号。
在一些实施方案中，多核苷酸编码重组淀粉酶，所述重组淀粉酶包含与SEQ IDNO:156或1104具有至少80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多序列同一性的多肽序列或其功能片段，其中编码的重组淀粉酶在选自以下的一个或更多个位置处包含至少一个取代或取代集：37、51、91、111、112、114、122、124、128、140、167、171、183、194、276、280、298、397和464，其中多肽序列的氨基酸位置参考SEQ ID NO:156或1104来编号。在一些实施方案中，编码的重组淀粉酶包含选自以下的至少一个取代或取代集：37R、51R、91H、111A、112Q、114H、122P、122R、124R、128W、140K、167W、171I、183E、183N、183V、194E、194R、276A、276K、280L、298K、298M、397T和464L，其中多肽序列的氨基酸位置参考SEQ ID NO:156或1104来编号。在一些实施方案中，编码的重组淀粉酶包含选自以下的至少一个取代或取代集：N37R、G51R、K91H、E111A、K112Q、A114H、A122P、A122R、D124R、I128W、R140K、E167W、E171I、G183E、G183N、G183V、L194E、L194R、T276A、T276K、Q280L、E298K、E298M、E397T和N464L，其中多肽序列的氨基酸位置参考SEQ ID NO:156或1104来编号。
在一些实施方案中，多核苷酸编码重组淀粉酶，所述重组淀粉酶包含与SEQ IDNO:174或1122具有至少80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多序列同一性的多肽序列或其功能片段，并且其中编码的重组淀粉酶在选自以下的一个或更多个位置处包含至少一个取代或取代集：24、91、91/122、91/122/128/130/167/171/409、91/122/128/130/183/322、91/122/128/130/194、91/122/128/130/322、91/122/128/171/183/194/322、91/122/128/183/409、91/122/130/167/183/194/409、91/122/130/171/183、91/122/130/183/194、91/122/130/194、91/122/130/194/322、91/122/167/171/194、91/122/167/171/194/322、91/122/171/183/194/409、91/130/171/183/322/409、91/167/171、91/167/183/194、91/167/322、91/183、91/183/322/409、91/194、91/322、91/409、122/128、122/128/194/409、122/130/171/322/409、122/409、137/145/227/394/480/481、137/145/295、145/227/295/481、145/309/481、183、227、295/394、322、322/409、394和480/481，其中多肽序列的氨基酸位置参考SEQ ID NO:174或1122来编号。在一些实施方案中，编码的重组淀粉酶包含选自以下的至少一个取代或取代集：24V、91H、91H/122P、91H/122P/130D/183N/194R、91H/122P/130D/194R/322A、91H/122R、91H/122R/128W/130D/167W/171I/409S、91H/122R/128W/130D/183N/322A、91H/122R/128W/130D/194R、91H/122R/128W/130D/322A、91H/122R/128W/171I/183N/194R/322A、91H/122R/128W/183N/409S、91H/122R/130D/167W/183N/194R/409S、91H/122R/130D/171I/183N、91H/122R/130D/194R、91H/122R/167W/171I/194R、91H/122R/167W/171I/194R/322A、91H/122R/171I/183N/194R/409S、91H/130D/171I/183N/322A/409S、91H/167W/171I、91H/167W/183N/194R、91H/167W/322A、91H/183N、91H/183N/322A/409S、91H/194R、91H/322A、91H/409S、122P/409S、122R/128W、122R/128W/194R/409S、122R/130D/171I/322A/409S、137A/145G/227L/394E/480P/481V、137A/145G/295N、145G/227L/295N/481V、145G/309S/481V、183N、227L、295N/394E、322A、322A/409S、394E和480T/481V，其中多肽序列的氨基酸位置参考SEQID NO:174或1122来编号。在一些实施方案中，编码的重组淀粉酶包含选自以下的至少一个取代或取代集：L24V、K91H、K91H/A122P、K91H/A122P/E130D/G183N/L194R、K91H/A122P/E130D/L194R/F322A、K91H/A122R、K91H/A122R/I128W/E130D/E167W/E171I/V409S、K91H/A122R/I128W/E130D/G183N/F322A、K91H/A122R/I128W/E130D/L194R、K91H/A122R/I128W/E130D/F322A、K91H/A122R/I128W/E171I/G183N/L194R/F322A、K91H/A122R/I128W/G183N/V409S、K91H/A122R/E130D/E167W/G183N/L194R/V409S、K91H/A122R/E130D/E171I/G183N、K91H/A122R/E130D/L194R、K91H/A122R/E167W/E171I/L194R、K91H/A122R/E167W/E171I/L194R/F322A、K91H/A122R/E171I/G183N/L194R/V409S、K91H/E130D/E171I/G183N/F322A/V409S、K91H/E167W/E171I、K91H/E167W/G183N/L194R、K91H/E167W/F322A、K91H/G183N、K91H/G183N/F322A/V409S、K91H/L194R、K91H/F322A、K91H/V409S、A122P/V409S、A122R/I128W、A122R/I128W/L194R/V409S、A122R/E130D/E171I/F322A/V409S、G137A/A145G/T227L/Q394E/F480P/C481V、G137A/A145G/K295N、A145G/T227L/K295N/C481V、A145G/T309S/C481V、G183N、T227L、K295N/Q394E、F322A、F322A/V409S、Q394E和F480T/C481V，其中多肽序列的氨基酸位置参考SEQ ID NO:174或1122来编号。
在一些实施方案中，多核苷酸编码重组淀粉酶，所述重组淀粉酶包含与SEQ IDNO:276或1224具有至少80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多序列同一性的多肽序列或其功能片段，并且其中编码的重组淀粉酶在选自以下的一个或更多个位置处包含至少一个取代或取代集：16/26/29/128/145/256/309/383、16/26/33/114/145/309/383/394、16/26/33/128/130/145/302/309/322/371、16/26/33/145/158/383/394、16/26/145/302、16/29/33/145/256/302、18、26/29/33/130/145/157/158/183/394、26/29/33/145/157/183/256/309/383、26/29/122/130/145/183/256/272/309/394、26/29/145/157/256/302/322/481、26/29/145/256/272/302/309/322/481、26/33/91/145/272/302/481、26/33/145/309/322/383、26/114/145/322、26/145/183/256/309/383、29/122/145/158/383、29/130/145/256/272/371/394、29/145/183/302/309/412、29/309/394、33/122/145/272/309/412、91/130/145/158/183/383、91/309/383、130/145/256/272/371、130/145/302/309、130/272/481、145/302/309、268、309、349、360、380、394、463和483，其中多肽序列的氨基酸位置参考SEQ ID NO:276或1224来编号。在一些实施方案中，编码的重组淀粉酶包含选自以下的至少一个取代或取代集：16E/26E/29D/128I/145G/256A/309S/383Q、16E/26E/33D/114A/145G/309S/383Q/394E、16E/26E/33D/128I/130E/145G/302M/309S/322F/371Y、16E/26E/33D/145G/158K/383Q/394E、16E/26E/145G/302M、16E/29D/33D/145G/256A/302M、18S、26E/29D/33D/130E/145G/157F/158K/183G/394E、26E/29D/33D/145G/157F/183G/256A/309S/383Q、26E/29D/122A/130E/145G/183G/256A/272D/309S/394E、26E/29D/145G/157F/256A/302M/322F/481V、26E/29D/145G/256A/272D/302M/309S/322F/481V、26E/33D/91K/145G/272D/302M/481V、26E/33D/145G/309S/322F/383Q、26E/114A/145G/322F、26E/145G/183G/256A/309S/383Q、29D/122A/145G/158K/383Q、29D/130E/145G/256A/272D/371Y/394E、29D/145G/183G/302M/309S/412L、29D/309S/394E、33D/122A/145G/272D/309S/412L、91K/130E/145G/158K/183G/383Q、91K/309S/383Q、130E/145G/256A/272D/371Y、130E/145G/302M/309S、130E/272D/481V、145G/302M/309S、268T、309A、349R、360G、380R、394G、394N、394S、463M和483T，其中多肽序列的氨基酸位置参考SEQ ID NO:276或1224来编号。在一些实施方案中，编码的重组淀粉酶包含选自以下的至少一个取代或取代集：D16E/A26E/R29D/W128I/A145G/S256A/T309S/E383Q、D16E/A26E/E33D/H114A/A145G/T309S/E383Q/Q394E、D16E/A26E/E33D/W128I/D130E/A145G/Q302M/T309S/A322F/F371Y、D16E/A26E/E33D/A145G/R158K/E383Q/Q394E、D16E/A26E/A145G/Q302M、D16E/R29D/E33D/A145G/S256A/Q302M、G18S、A26E/R29D/E33D/D130E/A145G/Y157F/R158K/N183G/Q394E、A26E/R29D/E33D/A145G/Y157F/N183G/S256A/T309S/E383Q、A26E/R29D/R122A/D130E/A145G/N183G/S256A/G272D/T309S/Q394E、A26E/R29D/A145G/Y157F/S256A/Q302M/A322F/C481V、A26E/R29D/A145G/S256A/G272D/Q302M/T309S/A322F/C481V、A26E/E33D/H91K/A145G/G272D/Q302M/C481V、A26E/E33D/A145G/T309S/A322F/E383Q、A26E/H114A/A145G/A322F、A26E/A145G/N183G/S256A/T309S/E383Q、R29D/R122A/A145G/R158K/E383Q、R29D/D130E/A145G/S256A/G272D/F371Y/Q394E、R29D/A145G/N183G/Q302M/T309S/D412L、R29D/T309S/Q394E、E33D/R122A/A145G/G272D/T309S/D412L、H91K/D130E/A145G/R158K/N183G/E383Q、H91K/T309S/E383Q、D130E/A145G/S256A/G272D/F371Y、D130E/A145G/Q302M/T309S、D130E/G272D/C481V、A145G/Q302M/T309S、S268T、T309A、P349R、N360G、G380R、Q394G、Q394N、Q394S、G463M和G483T，其中多肽序列的氨基酸位置参考SEQ ID NO:276或1224来编号。
在一些实施方案中，多核苷酸编码重组淀粉酶，所述重组淀粉酶包含与SEQ IDNO:308或1256具有至少80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多序列同一性的多肽序列或其功能片段，并且其中编码的重组淀粉酶在选自以下的一个或更多个位置处包含至少一个取代或取代集：29、37/124/250/270/349/380/394/442/491、37/145、37/145/250/301/349/394、37/145/258/442/491、38/349/491、81/259、81/313/495、92/257/258/338/468、92/258、94/127/132/145/250/349、94/270/301/349/394/442、94/349/491、145/270、178、225、226、246、250/349/442、259/313/338、270/349、286/338、294、313、349、349/380/442、413、413/468、448和473，其中多肽序列的氨基酸位置参考SEQ ID NO:308或1256来编号。在一些实施方案中，编码的重组淀粉酶包含选自以下的至少一个取代或取代集：29A、37T/124N/250D/270D/349R/380R/394E/442E/491L、37T/145G、37T/145G/250D/301K/349R/394E、37T/145G/258S/442E/491L、38I/349R/491L、81E/259D、81E/313D/495L、92E/257E/258Q/338S/468T、92E/258Q、94G/127E/132V/145G/250D/349R、94G/270D/301K/349R/394E/442E、94G/349R/491L、145G/270D、178I、225D、226T、246R、250D/349R/442E、259D/313D/338S、270D/349R、286T/338S、294L、313D、349R、349R/380R/442E、413Y、413Y/468I、448T和473D，其中多肽序列的氨基酸位置参考SEQ ID NO:308或1256来编号。在一些实施方案中，编码的重组淀粉酶包含选自以下的至少一个取代或取代集：R29A、N37T/D124N/E250D/E270D/P349R/G380R/G394E/D442E/I491L、N37T/A145G、N37T/A145G/E250D/R301K/P349R/G394E、N37T/A145G/K258S/D442E/I491L、M38I/P349R/I491L、A81E/P259D、A81E/T313D/I495L、R92E/P257E/K258Q/A338S/R468T、R92E/K258Q、D94G/Q127E/I132V/A145G/E250D/P349R、D94G/E270D/R301K/P349R/G394E/D442E、D94G/P349R/I491L、A145G/E270D、V178I、E225D、Q226T、K246R、E250D/P349R/D442E、P259D/T313D/A338S、E270D/P349R、M286T/A338S、M294L、T313D、P349R、P349R/G380R/D442E、F413Y、F413Y/R468I、H448T和E473D，其中多肽序列的氨基酸位置参考SEQ IDNO:308或1256来编号。
在一些实施方案中，多核苷酸编码重组淀粉酶，所述重组淀粉酶包含与SEQ IDNO:422或1370具有至少80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多序列同一性的多肽序列或其功能片段，并且其中编码的重组淀粉酶在选自以下的一个或更多个位置处包含至少一个取代或取代集：38、38/178/226/286/338、38/178/286/448、38/178/349/448、38/226/246/258/286、38/226/258/286/338/380/448、38/226/258/349/413、38/226/286、38/226/286/338/380、38/226/338/349/380、38/226/413/448、38/246/286、38/246/286/380、38/258、38/286、38/286/413/448、38/286/448、38/448、178、178/226/258/286/310/338、178/226/286/338、178/246/338、178/258/286/413、178/286、178/286/338/349、178/286/338/448、178/380、178/413、178/448、184/246/258/380、226、226/246/286/349/448、226/246/413、226/258/286/349/380、226/258/286/413/448、226/286、226/286/380/448、226/349/380、246、246/286、246/286/380/413、246/338、246/413、258/286/413、286、286/413/448、338/448、349和413，其中多肽序列的氨基酸位置参考SEQ ID NO:422或1370来编号。在一些实施方案中，编码的重组淀粉酶包含选自以下的至少一个取代或取代集：38I、38I/178I/226T/286T/338S、38I/178I/286T/448T、38I/178I/349R/448T、38I/226T/246R/258S/286T、38I/226T/258S/286T/338S/380R/448T、38I/226T/258S/349R/413Y、38I/226T/286T、38I/226T/286T/338S/380R、38I/226T/338S/349R/380R、38I/226T/413Y/448T、38I/246R/286T、38I/246R/286T/380R、38I/258S、38I/286T、38I/286T/413Y/448T、38I/286T/448T、38I/448T、178I、178I/226T/258S/286T/310R/338S、178I/226T/286T/338S、178I/246R/338S、178I/258S/286T/413Y、178I/286T、178I/286T/338S/349R、178I/286T/338S/448T、178I/380R、178I/413Y、178I/448T、184K/246R/258S/380R、226T、226T/246R/286T/349R/448T、226T/246R/413Y、226T/258S/286T/349R/380R、226T/258S/286T/413Y/448T、226T/286T、226T/286T/380R/448T、226T/349R/380R、246R、246R/286T、246R/286T/380R/413Y、246R/338S、246R/413Y、246T、258S/286T/413Y、286T、286T/413Y/448T、338S/448T、349R和413Y，其中多肽序列的氨基酸位置参考SEQID NO:422或1370来编号。在一些实施方案中，编码的重组淀粉酶包含选自以下的至少一个取代或取代集：M38I、M38I/V178I/Q226T/M286T/A338S、M38I/V178I/M286T/H448T、M38I/V178I/P349R/H448T、M38I/Q226T/K246R/K258S/M286T、M38I/Q226T/K258S/M286T/A338S/G380R/H448T、M38I/Q226T/K258S/P349R/F413Y、M38I/Q226T/M286T、M38I/Q226T/M286T/A338S/G380R、M38I/Q226T/A338S/P349R/G380R、M38I/Q226T/F413Y/H448T、M38I/K246R/M286T、M38I/K246R/M286T/G380R、M38I/K258S、M38I/M286T、M38I/M286T/F413Y/H448T、M38I/M286T/H448T、M38I/H448T、V178I、V178I/Q226T/K258S/M286T/Q310R/A338S、V178I/Q226T/M286T/A338S、V178I/K246R/A338S、V178I/K258S/M286T/F413Y、V178I/M286T、V178I/M286T/A338S/P349R、V178I/M286T/A338S/H448T、V178I/G380R、V178I/F413Y、V178I/H448T、E184K/K246R/K258S/G380R、Q226T、Q226T/K246R/M286T/P349R/H448T、Q226T/K246R/F413Y、Q226T/K258S/M286T/P349R/G380R、Q226T/K258S/M286T/F413Y/H448T、Q226T/M286T、Q226T/M286T/G380R/H448T、Q226T/P349R/G380R、K246R、K246R/M286T、K246R/M286T/G380R/F413Y、K246R/A338S、K246R/F413Y、K246T、K258S/M286T/F413Y、M286T、M286T/F413Y/H448T、A338S/H448T、P349R和F413Y，其中多肽序列的氨基酸位置参考SEQ ID NO:422或1370来编号。
在一些实施方案中，多核苷酸编码重组淀粉酶，所述重组淀粉酶包含与SEQ IDNO:456或1404具有至少80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多序列同一性的多肽序列或其功能片段，并且其中编码的重组淀粉酶在选自以下的一个或更多个位置处包含至少一个取代或取代集：29/31/92/220、29/469、49/58/103/141/197/269/294/298、49/58/103/194/204/298、49/58/141/298、49/103、103、123、126、127、131、134、180、210、214、220/469、228、259、279、282、302、319、393、415、417、428、429、466和469，其中多肽序列的氨基酸位置参考SEQ ID NO:456或1404来编号。在一些实施方案中，编码的重组淀粉酶包含选自以下的至少一个取代或取代集：29E/31L/92A/220G、29E/469I、49A/58T/103L/141F/197Y/269F/294H/298Q、49A/58T/103L/194F/204D/298H、49A/58T/141F/298H、49A/103L、103L、123R、126R、127W、131H、131R、131Y、134R、180E、210P、214G、220G/469I、228V、259C、279L、282T、302H、302R、302W、319S、393R、393S、415C、417W、428T、429S、466C和469I，其中多肽序列的氨基酸位置参考SEQ ID NO:456或1404来编号。在一些实施方案中，编码的重组淀粉酶包含选自以下的至少一个取代或取代集：R29E/F31L/R92A/A220G、R29E/V469I、S49A/S58T/V103L/Y141F/F197Y/H269F/M294H/E298Q、S49A/S58T/V103L/L194F/N204D/E298H、S49A/S58T/Y141F/E298H、S49A/V103L、V103L、D123R、T126R、Q127W、E131H、E131R、E131Y、E134R、D180E、H210P、E214G、A220G/V469I、Q228V、P259C、D279L、E282T、Q302H、Q302R、Q302W、A319S、E393R、E393S、D415C、P417W、D428T、E429S、Q466C和V469I，其中多肽序列的氨基酸位置参考SEQ ID NO:456或1404来编号。
在一些实施方案中，多核苷酸编码重组淀粉酶，所述重组淀粉酶包含与SEQ IDNO:456或1404具有至少80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多序列同一性的多肽序列或其功能片段，并且其中编码的重组淀粉酶在选自以下的一个或更多个位置处包含至少一个取代或取代集：92、123、126、127、129、131、134、140、172、180、210、214、221、228、253、254、259、279、282、302、304、305、319、322、346、359、384、385、387、393、409、412、415、417、428、429、441、442、444、446、451、455、459、466、467、470、473、474、492和494，其中多肽序列的氨基酸位置参考SEQ ID NO:456或1404来编号。在一些实施方案中，编码的重组淀粉酶包含选自以下的至少一个取代或取代集：92G、92Q、123C、123G、123R、126Q、126R、127I、127R、127S、127V、127W、129C、129W、131H、131R、131Y、134A、134F、134R、140V、172K、172R、180E、180P、180Q、210G、210P、214G、214L、214R、221T、221V、228V、253R、254G、259C、259R、259W、279L、279V、282R、282T、302G、302H、302R、302V、302W、304T、305Q、305R、305W、319L、319S、322R、346G、359G、384M、385L、387G、387V、393R、393S、393W、409A、409R、409W、412A、415C、415G、417W、428T、429S、441R、441W、442R、442W、444G、444R、444V、446G、451F、455L、455R、455T、455W、459W、466C、467P、467W、470G、470L、470S、473M、474G、492G、492R和494C，其中多肽序列的氨基酸位置参考SEQID NO:456或1404来编号。在一些实施方案中，编码的重组淀粉酶包含选自以下的至少一个取代或取代集：R92G、R92Q、D123C、D123G、D123R、T126Q、T126R、Q127I、Q127R、Q127S、Q127V、Q127W、D129C、D129W、E131H、E131R、E131Y、E134A、E134F、E134R、R140V、D172K、D172R、D180E、D180P、D180Q、H210G、H210P、E214G、E214L、E214R、R221T、R221V、Q228V、Q253R、E254G、P259C、P259R、P259W、D279L、D279V、E282R、E282T、Q302G、Q302H、Q302R、Q302V、Q302W、R304T、D305Q、D305R、D305W、A319L、A319S、A322R、W346G、E359G、T384M、Y385L、I387G、I387V、E393R、E393S、E393W、V409A、V409R、V409W、D412A、D415C、D415G、P417W、D428T、E429S、D441R、D441W、D442R、D442W、E444G、E444R、E444V、T446G、E451F、N455L、N455R、N455T、N455W、R459W、Q466C、E467P、E467W、V470G、V470L、V470S、E473M、N474G、E492G、E492R和V494C，其中多肽序列的氨基酸位置参考SEQ ID NO:456或1404来编号。
在一些实施方案中，多核苷酸编码重组淀粉酶，所述重组淀粉酶包含与SEQ IDNO:546或1494具有至少80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多序列同一性的多肽序列或其功能片段，并且其中编码的重组淀粉酶在选自以下的一个或更多个位置处包含至少一个取代或取代集：123、123/126/180/214/298/302/393、123/126/180/214/393/428、123/126/210/298/302/393、123/126/210/428、123/126/428、123/210/302、126/180/210/214/298/302、126/180/210/214/428、126/180/298/302/393、126/210/302/428、126/214/393、126/298/302/393、126/298/302/393/428、129、129/228/253、131/228/279、131/282、180/214、210/214/302/393/428、228/282/444、253/279/470、253/279/492、279、279/470和441，其中多肽序列的氨基酸位置参考SEQ ID NO:546或1494来编号。在一些实施方案中，编码的重组淀粉酶包含选自以下的至少一个取代或取代集：123R、123R/126R/180E/214L/298Q/302W/393R、123R/126R/180Q/214G/393R/428T、123R/126R/210P/298Q/302W/393R、123R/126R/210P/428T、123R/126R/428T、123R/210P/302R、126R/180E/210P/214G/428T、126R/180E/298Q/302R/393R、126R/180Q/210P/214L/298Q/302R、126R/210P/302R/428T、126R/214G/393R、126R/298Q/302H/393R、126R/298Q/302R/393R/428T、129W、129W/228V/253R、131H/228V/279V、131Y/282T、180Q/214L、210P/214L/302R/393R/428T、228V/282T/444R、253R/279L/492G、253R/279V/470S、279L、279L/470S和441R，其中多肽序列的氨基酸位置参考SEQ ID NO:546或1494来编号。在一些实施方案中，编码的重组淀粉酶包含选自以下的至少一个取代或取代集：D123R、D123R/T126R/D180E/E214L/H298Q/Q302W/E393R、D123R/T126R/D180Q/E214G/E393R/D428T、D123R/T126R/H210P/H298Q/Q302W/E393R、D123R/T126R/H210P/D428T、D123R/T126R/D428T、D123R/H210P/Q302R、T126R/D180E/H210P/E214G/D428T、T126R/D180E/H298Q/Q302R/E393R、T126R/D180Q/H210P/E214L/H298Q/Q302R、T126R/H210P/Q302R/D428T、T126R/E214G/E393R、T126R/H298Q/Q302H/E393R、T126R/H298Q/Q302R/E393R/D428T、D129W、D129W/Q228V/Q253R、E131H/Q228V/D279V、E131Y/E282T、D180Q/E214L、H210P/E214L/Q302R/E393R/D428T、Q228V/E282T/E444R、Q253R/D279L/E492G、Q253R/D279V/V470S、D279L、D279L/V470S和D441R，其中多肽序列的氨基酸位置参考SEQ ID NO:546或1494来编号。
在一些实施方案中，多核苷酸编码重组淀粉酶，所述重组淀粉酶包含与SEQ IDNO:632或1580具有至少80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多序列同一性的多肽序列或其功能片段，并且其中编码的重组淀粉酶在选自以下的一个或更多个位置处包含至少一个取代或取代集：2、45/166/298、48、48/166/170/203、52、58/166、58/203、72、82、114、114/223/306/308、149、165、166/203、167、170、184/216/306/308、184/223/306/437、189、203、225、255、258、275、280、284、294、298、396、397、411、431、448、468、482、483和495，其中多肽序列的氨基酸位置参考SEQID NO:632或1580来编号。在一些实施方案中，编码的重组淀粉酶包含选自以下的至少一个取代或取代集：2L、45S/166L/298D、48D、48D/166L/170S/203S、52R、58A/166L、58A/203S、72T、82A、114R、114R/223L/306F/308L、149K、165V、166L/203S、167Y、170S、184D/216L/306F/308L、184D/223L/306F/437L、189D、203S、225T、255M、255R、258S、275I、275R、280C、284L、284M、294A、298D、298N、396E、396Q、397M、411E、431T、448P、468V、482L、483A、495G和495L，其中多肽序列的氨基酸位置参考SEQ ID NO:632或1580来编号。在一些实施方案中，编码的重组淀粉酶包含选自以下的至少一个取代或取代集：R2L、Y45S/I166L/H298D、A48D、A48D/I166L/D170S/E203S、Y52R、T58A/I166L、T58A/E203S、S72T、Q82A、H114R、H114R/V223L/Y306F/M308L、Q149K、H165V、I166L/E203S、E167Y、D170S、E184D/I216L/Y306F/M308L、E184D/V223L/Y306F/M437L、Q189D、E203S、E225T、V255M、V255R、K258S、Q275I、Q275R、Q280C、K284L、K284M、M294A、H298D、H298N、D396E、D396Q、E397M、T411E、P431T、H448P、R468V、N482L、G483A、I495G和I495L，其中多肽序列的氨基酸位置参考SEQ ID NO:632或1580来编号。
在一些实施方案中，多核苷酸编码重组淀粉酶，所述重组淀粉酶包含与SEQ IDNO:664或1612具有至少80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多序列同一性的多肽序列或其功能片段，并且其中编码的重组淀粉酶在选自以下的一个或更多个位置处包含至少一个取代或取代集：6/39/103/324/420、41、58/500/501、61、95/98/205/227/423/458、95/98/227/423、95/205、95/252/285/324、123/170/197/275/298/396/448/483、123/197、123/197/225/294/396/448/469、123/284/294/324/396/448、134/225/275/302、165/225/284/298/469/483、170/275/294/298/448、205/206、205/206/224/315/458/480、206/227、206/227/315/423、225/294/298/396、227、392/503、458、499和500，其中多肽序列的氨基酸位置参考SEQ ID NO:664或1612来编号。在一些实施方案中，编码的重组淀粉酶包含选自以下的至少一个取代或取代集：6I/39I/103D/324T/420V、41F、58S/500P/501P、61Y、95L/252I/285V/324T、95V/98I/205V/227V/423V/458F、95V/98I/227V/423V、95V/205V、123E/170S/197Y/275I/298N/396Q/448Q/483Q、123E/197Y、123E/197Y/225G/294A/396Q/448Q/469I、123E/284L/294A/324T/396Q/448Q、134R/225G/275I/302W、165V/225G/284L/298N/469I/483Q、170S/275I/294A/298N/448Q、205V/206E、205V/206E/224L/315S/458F/480L、206E/227V、206E/227V/315S/423V、225G/294A/298N/396Q、227C、392C/503L、458F、458Y、499R和500P，其中多肽序列的氨基酸位置参考SEQ ID NO:664或1612来编号。在一些实施方案中，编码的重组淀粉酶包含选自以下的至少一个取代或取代集：L6I/V39I/V103D/A324T/I420V、L41F、T58S/H500P/H501P、L61Y、I95L/V252I/T285V/A324T、I95V/L98I/I205V/T227V/S423V/W458F、I95V/L98I/T227V/S423V、I95V/I205V、D123E/D170S/F197Y/Q275I/H298N/D396Q/H448Q/G483Q、D123E/F197Y、D123E/F197Y/E225G/M294A/D396Q/H448Q/V469I、D123E/K284L/M294A/A324T/D396Q/H448Q、E134R/E225G/Q275I/Q302W、H165V/E225G/K284L/H298N/V469I/G483Q、D170S/Q275I/M294A/H298N/H448Q、I205V/D206E、I205V/D206E/M224L/T315S/W458F/F480L、D206E/T227V、D206E/T227V/T315S/S423V、E225G/M294A/H298N/D396Q、T227C、I392C/H503L、W458F、W458Y、G499R和H500P，其中多肽序列的氨基酸位置参考SEQ ID NO:664或1612来编号。
在一些实施方案中，多核苷酸编码重组淀粉酶，所述重组淀粉酶包含与SEQ IDNO:664或1612具有至少80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多序列同一性的多肽序列或其功能片段，并且其中编码的重组淀粉酶在选自以下的一个或更多个位置处包含至少一个取代或取代集：95/252/285/324、123/197、123/197/225/294/396/448/469、134/225/275/302、205/206和205/206/224/315/458/480，其中多肽序列的氨基酸位置参考SEQ ID NO:664或1612来编号。在一些实施方案中，编码的重组淀粉酶包含选自以下的至少一个取代或取代集：95L/252I/285V/324T、123E/197Y、123E/197Y/225G/294A/396Q/448Q/469I、134R/225G/275I/302W、205V/206E和205V/206E/224L/315S/458F/480L，其中多肽序列的氨基酸位置参考SEQ ID NO:664或1612来编号。在一些实施方案中，编码的重组淀粉酶包含选自以下的至少一个取代或取代集：I95L/V252I/T285V/A324T、D123E/F197Y、D123E/F197Y/E225G/M294A/D396Q/H448Q/V469I、E134R/E225G/Q275I/Q302W、I205V/D206E和I205V/D206E/M224L/T315S/W458F/F480L，其中多肽序列的氨基酸位置参考SEQ ID NO:664或1612来编号。
在一些实施方案中，多核苷酸编码重组淀粉酶，所述重组淀粉酶包含与SEQ IDNO:780或1728具有至少80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多序列同一性的多肽序列或其功能片段，并且其中编码的重组淀粉酶在位置126处包含取代，其中多肽序列的氨基酸位置参考SEQ ID NO:780或1728来编号。在一些实施方案中，编码的重组淀粉酶包含选自以下的至少一个取代：126C、126D、126E、126K、126L、126M、126N、126Q、126S、126T和126W，其中多肽序列的氨基酸位置参考SEQID NO:780或1728来编号。在一些实施方案中，编码的重组淀粉酶包含选自以下的至少一个取代：R126C、R126D、R126E、R126K、R126L、R126M、R126N、R126Q、R126S、R126T和R126W，其中多肽序列的氨基酸位置参考SEQ ID NO:780或1728来编号。
在一些实施方案中，多核苷酸能够在高度严格的条件下与参考多核苷酸序列杂交。在一些实施方案中，参考序列选自SEQ ID NO:1、17、39、155、173、275、307、421、455、545、631、663、779、987、1103、1121、1223、1255、1369、1403、1493、1579、1611和1727或其互补物，或编码本文提供的任何变体淀粉酶多肽的多核苷酸序列。在一些实施方案中，能够在高度严格的条件下杂交的多核苷酸编码淀粉酶多肽，所述淀粉酶多肽包含与SEQ ID NO:2、18、40、156、174、276、30、422、456、546、632、664、780、988、1104、1122、1224、1256、1370、1404、1494、1580、1612和1728相比，在选自如表4-1、表4-2、表4-3、表4-4、表4-5、表4-6、表4-7、表4-8、表4-9、表4-10、表4-11、表4-12、表4-13和/或表4-14中列出的任何位置的残基位置处具有一个或更多个残基差异的氨基酸序列。在一些此外的实施方案中，工程化多核苷酸选自表4-1、表4-2、表4-3、表4-4、表4-5、表4-6、表4-7、表4-8、表4-9、表4-10、表4-11、表4-12、表4-13和/或表4-14中提供的那些，或者包含与选自SEQ ID NO:1、17、39、155、173、275、307、421、455、545、631、663、779、987、1103、1121、1223、1255、1369、1403、1493、1579、1611和1727的参考序列具有至少70％、75％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多序列同一性的多核苷酸。在一些另外的实施方案中，工程化多核苷酸包含与表4-1、表4-2、表4-3、表4-4、表4-5、表4-6、表4-7、表4-8、表4-9、表4-10、表4-11、表4-12、表4-13和/或表4-14中提供的至少一种多核苷酸序列具有至少70％、75％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多序列同一性的序列，或表4-1、表4-2、表4-3、表4-4、表4-5、表4-6、表4-7、表4-8、表4-9、表4-10、表4-11、表4-12、表4-13和/或表4-14中提供的至少一种多核苷酸序列，其中多核苷酸序列缺少编码组氨酸标签和前面的氨基酸接头的序列，和/或SEQ ID NO:1、17、39、155、173、275、307、421、455、545、631、663、779、987、1103、1121、1223、1255、1369、1403、1493、1579、1611和1727。在一些此外的实施方案中，与参考多核苷酸序列相比，工程化多核苷酸序列包含1-2个、1-3个、1-4个、1-5个、1-6个、1-7个、1-8个、1-9个、1-10个、1-15个、1-20个、1-21个、1-22个、1-23个、1-24个、1-25个、1-30个、1-35个、1-40个、1-45个或1-50个碱基变化。在仍一些其他实施方案中，与参考多核苷酸序列相比，工程化多核苷酸序列包含1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个、30个、31个、32个、33个、34个、35个、40个、41个、42个、43个、44个、45个、46个、47个、48个、49个或50个碱基变化。在一些实施方案中，与参考多核苷酸序列相比，工程化多核苷酸序列包含1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、18个、20个、21个、22个、23个、24个或25个碱基变化。
在一些实施方案中，编码本文提供的任何工程化淀粉酶多肽的分离的多核苷酸以各种方式被操作，以提供多肽基因的表达和多肽的产生。在一些实施方案中，编码多肽的多核苷酸以表达载体提供，其中存在一个或更多个控制序列以调控多核苷酸和/或多肽的表达。取决于表达载体，在将分离的多核苷酸插入到载体中之前对其进行操作可以是期望的或必要的。用于利用重组DNA方法修饰多核苷酸和核酸序列的技术是本领域熟知的。
在一些实施方案中，控制序列包括，除了其他序列以外，启动子、前导序列、多腺苷酸化序列、前肽序列、信号肽序列和转录终止子。如本领域已知的，合适的控制序列可以基于使用的宿主细胞来选择。不意图本发明受限于任何特定的控制序列。
用于细菌宿主细胞的示例性启动子包括但不限于从以下的基因获得的启动子：大肠杆菌乳糖操纵子、色氨酸操纵子、阿拉伯糖操纵子、来自T7噬菌体的T7启动子和红色糖多孢菌(Saccharopolyspora erythraea)红霉素抗性基因。
用于丝状真菌宿主细胞的示例性启动子包括从以下的基因获得的启动子：米曲霉(Aspergillus oryzae)TAKA淀粉酶、米黑根毛霉(Rhizomucor miehei)天冬氨酸蛋白酶(proteinase)、黑曲霉(Aspergillus niger)中性α-淀粉酶、黑曲霉酸稳定型α-淀粉酶、黑曲霉或泡盛曲霉(Aspergillus awamori)葡糖淀粉酶、米黑根毛霉蛋白酶(protease)、米曲霉碱性蛋白酶、米曲霉磷酸丙糖异构酶、构巢曲霉(Aspergillus nidulans)乙酰胺酶和尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)胰蛋白酶样蛋白酶(参见，例如WO 96/00787)，以及NA2-tpi启动子(来自黑曲霉中性α-淀粉酶基因和米曲霉磷酸丙糖异构酶基因的启动子的杂合体)，和其突变体、截短的和杂合的启动子。示例性酵母细胞启动子可以来自以下的基因：酿酒酵母烯醇化酶(ENO-1)、酿酒酵母半乳糖激酶(GAL1)、酿酒酵母醇脱氢酶/甘油醛-3-磷酸脱氢酶(ADH2/GAP)和酿酒酵母3-磷酸甘油酸激酶。用于酵母宿主细胞的其他有用的启动子是本领域已知的(参见例如，Romanos等人，Yeast 8:423-488[1992])。用于在哺乳动物细胞中使用的示例性启动子包括但不限于，来自巨细胞病毒(CMV)的启动子、猿猴空泡病毒40(SV40)的启动子、来自智人(Homo sapiens)的磷酸甘油酸激酶、β-肌动蛋白、延伸因子-1a或甘油醛-3-磷酸脱氢酶的启动子或来自原鸡(Gallus gallus)的β-肌动蛋白的启动子。
在一些实施方案中，控制序列是合适的转录终止子序列，转录终止子序列是由宿主细胞识别以终止转录的序列。终止子序列被可操作地连接至编码多肽的核酸序列的3’末端。在选择的宿主细胞中有功能的任何终止子可用于本发明。例如，可以从T7细菌噬菌体(例如T7终止子)或大肠杆菌核糖体RNA(例如rrnB终止子)获得用于细菌宿主细胞的示例性转录终止子。例如，用于丝状真菌宿主细胞的示例性转录终止子可以从以下的基因获得：米曲霉TAKA淀粉酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、构巢曲霉邻氨基苯甲酸合酶、黑曲霉α-葡萄糖苷酶和尖孢镰刀菌胰蛋白酶样蛋白酶。用于酵母宿主细胞的示例性终止子可以从以下的基因获得：酿酒酵母烯醇化酶、酿酒酵母细胞色素C(CYC1)和酿酒酵母甘油醛-3-磷酸脱氢酶。用于酵母宿主细胞的其他有用的终止子是本领域已知的(参见例如，Romanos等人，上文)。用于哺乳动物细胞的示例性终止子包括但不限于来自巨细胞病毒(CMV)、猿猴空泡病毒40(SV40)或来自智人生长激素的终止子。
在一些实施方案中，控制序列是合适的前导序列，前导序列是对由宿主细胞的翻译重要的mRNA的非翻译区。前导序列被可操作地连接至编码多肽的核酸序列的5’末端。可以使用在所选择的宿主细胞中有功能的任何前导序列。用于丝状真菌宿主细胞的示例性前导序列从以下的基因获得：米曲霉TAKA淀粉酶和构巢曲霉磷酸丙糖异构酶。用于酵母宿主细胞的合适的前导序列包括但不限于从以下的基因获得的那些：酿酒酵母烯醇化酶(ENO-1)、酿酒酵母3-磷酸甘油酸激酶、酿酒酵母α-因子和酿酒酵母醇脱氢酶/甘油醛-3-磷酸脱氢酶(ADH2/GAP)。
在一些实施方案中，控制序列还可以是多腺苷酸化序列，多腺苷酸化序列是可操作地连接于核酸序列的3’末端并且当转录时被宿主细胞识别为向转录的mRNA添加多腺苷残基的信号的序列。在本发明中可以使用在所选择的宿主细胞中有功能的任何多腺苷酸化序列。用于丝状真菌宿主细胞的示例性多腺苷酸化序列包括但不限于从以下的基因获得的那些：米曲霉TAKA淀粉酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、构巢曲霉邻氨基苯甲酸合酶、尖孢镰刀菌胰蛋白酶样蛋白酶和黑曲霉α-葡萄糖苷酶。用于酵母宿主细胞的有用的多腺苷酸化序列也是本领域已知的(参见例如，Guo和Sherman,Mol.Cell.Biol.,15:5983-5990[1995])。
在一些实施方案中，控制序列是信号肽编码区，信号肽编码区编码连接至多肽的氨基末端的氨基酸序列并将编码的多肽引导到细胞的分泌途径中。核酸序列的编码序列的5’末端可以固有地包含信号肽编码区，信号肽编码区符合翻译阅读框地(in translationreading frame)与编码分泌的多肽的编码区的区段天然地连接。可选地，编码序列的5’末端可以包含对编码序列是外来的信号肽编码区。
将表达的多肽引导到选择的宿主细胞的分泌途径中的任何信号肽编码区可用于本文提供的工程化淀粉酶多肽的表达。用于丝状真菌宿主细胞的有效信号肽编码区包括但不限于从以下的基因获得的信号肽编码区：米曲霉TAKA淀粉酶、黑曲霉中性淀粉酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、米黑根毛霉天冬氨酸蛋白酶、特异腐质霉(Humicola insolens)纤维素酶和绵毛状腐质霉(Humicola lanuginosa)蛋白酶。用于酵母宿主细胞的有用的信号肽包括但不限于来自以下的基因的那些：酿酒酵母α因子和酿酒酵母转化酶。用于哺乳动物宿主细胞的有用的信号肽包括但不限于来自免疫球蛋白γ(IgG)基因的信号肽。
在一些实施方案中，控制序列是前肽编码区，前肽编码区编码定位在多肽的氨基末端处的氨基酸序列。产生的多肽被称为“前酶(proenzyme)”、“前多肽(propolypeptide)”或在某些情况下称为“酶原(zymogen)”。前多肽可以通过催化或自体催化前肽从前多肽的裂解被转化为成熟活性多肽。
在另一方面，本发明还提供了重组表达载体，所述重组表达载体包含编码工程化淀粉酶多肽的多核苷酸和取决于多核苷酸被引入到的宿主的类型的一个或更多个表达调控区域，诸如启动子和终止子、复制起点等。在一些实施方案中，将以上描述的各种核酸和控制序列连接在一起以产生重组表达载体，所述重组表达载体包含一个或更多个方便的限制位点以允许编码变体淀粉酶多肽的核酸序列在这样的位点处插入或取代。可选地，本发明的多核苷酸序列通过将多核苷酸序列或包含该多核苷酸序列的核酸构建体插入到用于表达的适当的载体中来表达。在创建表达载体时，编码序列位于载体中，使得编码序列与用于表达的适当的控制序列可操作地连接。
重组表达载体可以是任何载体(例如，质粒或病毒)，其可以方便地经历重组DNA程序并且可以导致变体淀粉酶多核苷酸序列的表达。载体的选择通常将取决于载体与待引入载体的宿主细胞的相容性。载体可以是线性质粒或闭合的环状质粒。
在一些实施方案中，表达载体是自主复制载体(即，作为染色体外实体存在的载体，其复制独立于染色体复制，诸如质粒、染色体外元件、微型染色体或人工染色体)。载体可以包含用于确保自我复制的任何工具(means)。在一些可选的实施方案中，载体可以是当被引入到宿主细胞中时，被整合到基因组中并与其被整合进的染色体一起复制的载体。此外，可以使用单一载体或质粒或者一起包含待引入到宿主细胞基因组中的总DNA的两种或更多种载体或质粒，或转座子。
在一些实施方案中，表达载体优选地包含一个或更多个选择标记(selectablemarker)，其允许容易选择经转化的细胞。
“选择标记”为其产物提供杀生物剂或病毒抗性、对重金属的抗性、对营养缺陷型的原养型等的基因。用于细菌宿主细胞的合适的标志物包括但不限于提供针对以下的抗性的那些：羧苄青霉素、氨苄青霉素、氯霉素、四环素、卡那霉素、吉欧霉素。
用于酵母宿主细胞的合适的标记包括但不限于ADE2、HIS3、LEU2、LYS2、MET3、TRP1和URA3。用于在丝状真菌宿主细胞中使用的选择标记包括但不限于amdS(乙酰胺酶)、argB(鸟氨酸氨甲酰基转移酶)、bar(膦丝菌素乙酰基转移酶)、hph(潮霉素磷酸转移酶)、niaD(硝酸盐还原酶)、pyrG(乳清酸核苷-5’-磷酸脱羧酶)、sC(硫酸腺苷酰转移酶(sulfateadenyltransferase))和trpC(邻氨基苯甲酸合酶)，以及其等效物。在另一方面，本发明提供了宿主细胞，所述宿主细胞包含编码本申请的至少一种工程化淀粉酶多肽的多核苷酸，所述多核苷酸被可操作地连接至一个或更多个控制序列用于在宿主细胞中表达工程化淀粉酶。
用于表达由本发明的表达载体编码的多肽的宿主细胞是本领域熟知的，并且包括但不限于细菌细胞(例如，大肠杆菌)；真菌细胞，诸如酵母细胞(例如，酿酒酵母和巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)[例如，ATCC登录号201178])；昆虫细胞(例如，果蝇属(Drosophila)S2和夜蛾属(Spodoptera)Sf9细胞)、植物细胞、动物细胞(例如，CHO、CHO-K1、COS和BHK)和人类细胞(例如，HEK293T、人类成纤维细胞、THP-1、Jurkat和Bowes黑素瘤细胞系)。
因此，在另一方面，本发明提供了用于产生工程化淀粉酶多肽的方法，其中该方法包括将能够表达编码工程化淀粉酶多肽的多核苷酸的宿主细胞在适用于表达该多肽的条件下培养。在一些实施方案中，该方法还包括分离和/或纯化如本文描述的淀粉酶多肽的步骤。
用于上文描述的宿主细胞的适当的培养基和生长条件是本领域熟知的。用于表达淀粉酶的多核苷酸可以通过本领域已知的各种方法被引入到细胞中。技术包括，除了其他以外，电穿孔、生物弹射粒子轰击(biolistic particle bombardment)、脂质体介导的转染、氯化钙转染和原生质体融合。
具有本文公开的特性的工程化淀粉酶可以通过使编码天然存在或工程化的淀粉酶多肽的多核苷酸经历本领域已知的和如本文所描述的诱变和/或定向演化方法来获得。示例性定向演化技术为诱变和/或DNA改组(参见例如，Stemmer,Proc.Natl.Acad.Sci.USA91:10747-10751[1994]；WO 95/22625；WO 97/0078；WO 97/35966；WO 98/27230；WO 00/42651；WO 01/75767和美国专利6,537,746)。可以使用的其他定向演化程序包括交错延伸过程(StEP)、体外重组(参见例如，Zhao等人，Nat.Biotechnol.，16:258-261[1998])、诱变PCR(参见例如，Caldwell等人，PCR Methods Appl.,3:S136-S140[1994])和盒式诱变(参见例如，Black等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93:3525-3529[1996])以及其他。
重组多肽可以使用本领域已知的任何合适的方法产生。编码感兴趣的野生型多肽的基因可以在载体例如质粒中克隆，并在期望的宿主例如大肠杆菌等中表达。重组多肽的变体可以通过本领域已知的各种方法产生。实际上，存在本领域技术人员熟知的各种各样不同的诱变技术。另外，诱变试剂盒还可从许多商业分子生物学供应商获得。产生确定的氨基酸(定点)处的特定取代、基因的局部区域中的特异性(区域特异性)或随机突变，或整个基因内的随机诱变(例如，饱和诱变)的方法是可得的。本领域的技术人员已知产生酶变体的许多合适的方法，包括但不限于，使用PCR对单链DNA或双链DNA定点诱变、盒式诱变、基因合成、易错PCR、改组和化学饱和诱变，或本领域已知的任何其他合适的方法。诱变和定向演化方法可以容易地应用于编码酶的多核苷酸，以产生可以被表达、筛选和测定的变体文库。任何合适的诱变和定向演化方法都可用于本发明，并且是本领域熟知的(参见例如，美国专利第5,605,793号、第5,811,238号、第5,830,721号、第5,834,252号、第5,837,458号、第5,928,905号、第6,096,548号、第6,117,679号、第6,132,970号、第6,165,793号、第6,180,406号、第6,251,674号、第6,265,201号、第6,277,638号、第6,287,861号、第6,287,862号、第6,291,242号、第6,297,053号、第6,303,344号、第6,309,883号、第6,319,713号、第6,319,714号、第6,323,030号、第6,326,204号、第6,335,160号、第6,335,198号、第6,344,356号、第6,352,859号、第6,355,484号、第6,358,740号、第6,358,742号、第6,365,377号、第6,365,408号、第6,368,861号、第6,372,497号、第6,337,186号、第6,376,246号、第6,379,964号、第6,387,702号、第6,391,552号、第6,391,640号、第6,395,547号、第6,406,855号、第6,406,910号、第6,413,745号、第6,413,774号、第6,420,175号、第6,423,542号、第6,426,224号、第6,436,675号、第6,444,468号、第6,455,253号、第6,479,652号、第6,482,647号、第6,483,011号、第6,484,105号、第6,489,146号、第6,500,617号、第6,500,639号、第6,506,602号、第6,506,603号、第6,518,065号、第6,519,065号、第6,521,453号、第6,528,311号、第6,537,746号、第6,573,098号、第6,576,467号、第6,579,678号、第6,586,182号、第6,602,986号、第6,605,430号、第6,613,514号、第6,653,072号、第6,686,515号、第6,703,240号、第6,716,631号、第6,825,001号、第6,902,922号、第6,917,882号、第6,946,296号、第6,961,664号、第6,995,017号、第7,024,312号、第7,058,515号、第7,105,297号、第7,148,054号、第7,220,566号、第7,288,375号、第7,384,387号、第7,421,347号、第7,430,477号、第7,462,469号、第7,534,564号、第7,620,500号、第7,620,502号、第7,629,170号、第7,702,464号、第7,747,391号、第7,747,393号、第7,751,986号、第7,776,598号、第7,783,428号、第7,795,030号、第7,853,410号、第7,868,138号、第7,783,428号、第7,873,477号、第7,873,499号、第7,904,249号、第7,957,912号、第7,981,614号、第8,014,961号、第8,029,988号、第8,048,674号、第8,058,001号、第8,076,138号、第8,108,150号、第8,170,806号、第8,224,580号、第8,377,681号、第8,383,346号、第8,457,903号、第8,504,498号、第8,589,085号、第8,762,066号、第8,768,871号、第8,849,575号、第9,593,326号、第9,665,694号、第9,684,771号、第9,864,833号、第9,996,661号和所有相关美国以及PCT和非美国对应专利；Ling等人,Anal.Biochem.,254(2):157-78[1997]；Dale等人,Meth.Mol.Biol.,57:369-74[1996]；Smith,Ann.Rev.Genet.,19:423-462[1985]；Botstein等人,Science,229:1193-1201[1985]；Carter,Biochem.J.,237:1-7[1986]；Kramer等人,Cell,38:879-887[1984]；Wells等人,Gene,34:315-323[1985]；Minshull等人,Curr.Op.Chem.Biol.,3:284-290[1999]；Christians等人,Nat.Biotechnol.,17:259-264[1999]；Crameri等人,Nature,391:288-291[1998]；Crameri,等人,Nat.Biotechnol.,15:436-438[1997]；Zhang等人,Proc.Nat.Acad.Sci.U.S.A.,94:4504-4509[1997]；Crameri等人,Nat.Biotechnol.,14:315-319[1996]；Stemmer,Nature,370:389-391[1994]；Stemmer,Proc.Nat.Acad.Sci.USA,91:10747-10751[1994]；WO 95/22625、WO 97/0078、WO 97/35966、WO 98/27230、WO 00/42651、WO 01/75767和WO 2009/152336，所有这些通过引用并入本文)。
在一些实施方案中，诱变处理后获得的酶变体通过使酶变体经受确定的温度(或其他测定条件)并测量热处理或其他测定条件之后剩余的酶活性的量来筛选。然后从宿主细胞分离包含编码淀粉酶多肽的多核苷酸的DNA，测序以鉴定核苷酸序列改变(如果有的话)，并用于在不同或相同的宿主细胞中表达酶。测量来自表达文库的酶活性可以使用本领域已知的任何合适的方法(例如，标准生物化学技术，诸如HPLC分析)来进行。
对于已知序列的工程化多肽，编码酶的多核苷酸可以根据已知的合成方法通过标准的固相方法制备。在一些实施方案中，多达约100个碱基的片段可以被单独地合成，然后连接(例如，通过酶促或化学连接方法(chemical ligation method)或聚合酶介导的方法)以形成任何期望的连续序列。例如，本文公开的多核苷酸和寡核苷酸可以使用经典的亚磷酰胺方法(参见例如，Beaucage等人,Tetra.Lett.,1981,22:1859-69；和Matthes等人,EMBOJ.,1984,3:801-05)，如通常在自动化合成方法中所实践的，通过化学合成制备。根据亚磷酰胺方法，寡核苷酸被合成(例如，在自动DNA合成仪中)、纯化、退火、连接并克隆到适当的载体中。然而，不意图本发明受限于任何特定的用于产生多核苷酸和寡核苷酸的方法，因为任何合适的方法可用于本发明。
因此，在一些实施方案中，用于制备工程化淀粉酶多肽的方法可以包括：(a)合成编码多肽的多核苷酸，所述多肽包含选自以下的氨基酸序列：表4-1、表4-2、表4-3、表4-4、表4-5、表4-6、表4-7、表4-8、表4-9、表4-10、表4-11、表4-12、表4-13和/或表4-14中提供的任何变体的氨基酸序列；表4-1、表4-2、表4-3、表4-4、表4-5、表4-6、表4-7、表4-8、表4-9、表4-10、表4-11、表4-12、表4-13和/或表4-14中提供的任何变体、其中变体缺少组氨酸标签和前面的氨基酸接头的氨基酸序列；以及SEQ ID NO:2、18、40、156、174、276、308、422、456、546、632、664、780、988、1104、1122、1224、1256、1370、1404、1494、1580、1612和/或1728；SEQID NO:4-18、22-966、970-1914中偶数编号的多肽序列中的任一个；和(b)表达由所述多核苷酸编码的淀粉酶多肽。在该方法的一些实施方案中，由多核苷酸编码的氨基酸序列包含一个或若干个(例如，多达3个、4个、5个或多达10个)氨基酸残基缺失、插入和/或取代。在一些此外的实施方案中，氨基酸序列包含1-2个、1-3个、1-4个、1-5个、1-6个、1-7个、1-8个、1-9个、1-10个、1-15个、1-20个、1-21个、1-22个、1-23个、1-24个、1-25个、1-30个、1-35个、1-40个、1-45个或1-50个氨基酸残基缺失、插入和/或取代。在仍一些其他实施方案中，氨基酸序列包含1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个、30个、31个、32个、33个、34个、35个、40个、45个或50个氨基酸残基缺失、插入和/或取代。在一些实施方案中，氨基酸序列包含1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、18个、20个、21个、22个、23个、24个或25个氨基酸残基缺失、插入和/或取代。在一些实施方案中，取代是保守的或非保守的取代。
可以使用本领域已知的任何合适的测定，包括但不限于本文描述的测定和条件，测定所表达的工程化淀粉酶多肽的任何期望的改进的特性(例如，活性、选择性、稳定性、酸耐受性、蛋白酶敏感性等)。
在一些实施方案中，使用用于蛋白纯化的熟知技术中的任何一种或更多种，将在宿主细胞中表达的工程化淀粉酶多肽的任一种从细胞和/或培养基回收，用于蛋白纯化的熟知技术除了其他以外包括，溶菌酶处理、声处理(sonication)、过滤、盐析、热处理、超速离心和色谱法。
用于分离淀粉酶多肽的色谱技术，除了其他以外，包括反相色谱法、高效液相色谱法、离子交换色谱法、疏水相互作用色谱法、凝胶电泳和亲和色谱法。用于纯化特定酶的条件部分地取决于因素诸如净电荷、疏水性、亲水性、分子量、分子形状等，并且对本领域技术人员将是明显的。在一些实施方案中，亲和技术可以用于分离改进的变体淀粉酶。在利用亲和色谱法纯化的一些实施方案中，可使用特异性结合变体淀粉酶多肽的任何抗体。
在一些利用亲和色谱法纯化的实施方案中，可使用与共价附接至淀粉酶的聚糖结合的蛋白。在利用亲和色谱法纯化的其他实施方案中，可使用任何与淀粉酶活性位点结合的小分子。为了产生抗体，通过注射多肽(例如，淀粉酶变体)或其片段来免疫接种各种宿主动物，包括但不限于兔、小鼠、大鼠等。在一些实施方案中，淀粉酶多肽或片段通过侧链官能团或附接至侧链官能团的接头的手段附接至合适的载体，诸如BSA。
在一些实施方案中，工程化淀粉酶多肽通过包括以下的方法在宿主细胞中产生：将包含编码如本文描述的工程化淀粉酶多肽的多核苷酸序列的宿主细胞(例如，大肠杆菌、酿酒酵母、胡萝卜(Daucus carota)、烟草(Nicotiana tabacum)、智人(H.Sapiens)(例如，HEK293T)或灰仓鼠(Cricetulus griseus)(例如，CHO))在有利于工程化淀粉酶多肽产生的条件下培养，并从细胞和/或培养基回收工程化淀粉酶多肽。
在一些实施方案中，本发明包括产生工程化淀粉酶多肽的方法，包括在允许产生工程化淀粉酶多肽的合适的培养条件下培养包含编码工程化淀粉酶多肽的多核苷酸序列的重组真核细胞，并任选地从培养物和/或培养的真核细胞回收工程化淀粉酶多肽，所述工程化淀粉酶多肽当与SEQ ID NO:2、18、40、156、174、276、308、422、456、546、632、664、780、988、1104、1122、1224、1256、1370、1404、1494、1580、1612和/或1728的氨基酸序列进行最佳比对时，具有与参考序列(例如，SEQ ID NO:2、18、40、156、174、276、308、422、456、546、632、664、780、988、1104、1122、1224、1256、1370、1404、1494、1580、1612和/或1728)的至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性，和与SEQ ID NO:2、18、40、156、174、276、308、422、456、546、632、664、780、988、1104、1122、1224、1256、1370、1404、1494、1580、1612和/或1728相比，选自表4-1、表4-2、表4-3、表4-4、表4-5、表4-6、表4-7、表4-8、表4-9、表4-10、表4-11、表4-12、表4-13和/或表4-14中提供的一个或更多个氨基酸残基和/或其组合。
在一些实施方案中，将工程化多肽从重组宿主细胞或细胞培养基回收后，将它们通过本领域已知的任何合适的方法进一步纯化。在一些另外的实施方案中，纯化的淀粉酶多肽与其他成分和化合物组合以提供适当包含工程化淀粉酶多肽用于不同应用和用途的组合物和制剂(例如，药物组合物)。在一些另外的实施方案中，纯化的多肽或配制的淀粉酶多肽被冻干。
组合物
本发明提供了各种组合物和形制，包括但不限于下文描述的那些。在一些实施方案中，本发明提供了工程化淀粉酶多肽，所述工程化淀粉酶多肽适用于在药物组合物和其他组合物(诸如膳食和/或营养补充剂)中使用。
取决于施用方式，包含治疗有效量的根据本发明的工程化淀粉酶的这些组合物呈固体、半固体或液体的形式。在一些实施方案中，组合物包括其他药学上可接受的组分，诸如稀释剂、缓冲剂、赋形剂、盐、乳化剂、防腐剂、稳定剂、填料和其他成分。用于配制和施用的技术的细节是本领域熟知的，并在文献中被描述。
在一些实施方案中，工程化淀粉酶多肽被配制用于在药物组合物中使用。用于在递送工程化淀粉酶多肽中使用的任何合适的形制可用于本发明，所述形制包括但不限于丸剂、片剂、凝胶片(gel tab)、胶囊、锭剂、糖衣丸、粉末、软凝胶、溶胶凝胶、凝胶、乳剂、植入物、贴剂、喷雾剂、软膏剂、搽剂、霜剂、糊剂、凝胶剂、涂剂、气雾剂、口香糖、缓和剂(demulcent)、条状物、溶液、悬浮液(包括但不限于油基悬浮液、水包油乳剂等)、浆液、糖浆剂、控释制剂、栓剂等。在一些实施方案中，工程化淀粉酶多肽以适用于注射或输注的形制提供(即，以可注射制剂的形制)。在一些实施方案中，工程化淀粉酶多肽以生物相容性基质诸如溶胶凝胶，包括基于二氧化硅(例如，氧基硅烷(oxysilane))的溶胶凝胶提供。在一些实施方案中，将工程化淀粉酶多肽封装和/或肠溶包衣。在一些可选的实施方案中，将工程化淀粉酶多肽封装在纳米结构(例如，纳米管、纳米小管、纳米胶囊或微米胶囊、微球体、脂质体等)中。实际上，不意图本发明受限于任何特定递送制剂和/或递送方式。意图工程化淀粉酶多肽通过本领域已知的任何合适的方式来施用，包括但不限于：肠胃外、口服、表面(topical)、经皮、鼻内、眼内、鞘内、经由植入物等。
在一些实施方案中，工程化淀粉酶多肽通过糖基化、化学交联试剂、聚乙二醇化(即，用聚乙二醇[PEG]或活化的PEG等修饰)或其他化合物被化学修饰(参见例如，Ikeda,Amino Acids,2005,29:283-287；美国专利第7,531,341号、第7,534,595号、第7,560,263号和第7,553,653号；美国专利申请公布第2013/0039898号、第2012/0177722号等)。实际上，不意图本发明受限于任何特定递送方法和/或机制。
在一些另外的实施方案中，工程化淀粉酶多肽在包含基质稳定的酶晶体的制剂中提供。在一些实施方案中，制剂包含交联的结晶工程化淀粉酶和具有附接至酶晶体的反应部分的聚合物。本发明还以聚合物提供了工程化淀粉酶多肽。
在一些实施方案中，包含本发明的工程化淀粉酶多肽的组合物包含一种或更多种常用的载体化合物，包括但不限于糖(例如，乳糖、蔗糖、甘露糖醇和/或山梨糖醇)、淀粉(例如，玉米淀粉、小麦淀粉、大米淀粉、马铃薯淀粉或其他植物淀粉)、纤维素(例如，甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、羧甲基纤维素钠)、树胶(例如，阿拉伯胶、黄芪胶、瓜尔胶等)和/或蛋白(例如，明胶、胶原蛋白等)。
在一些实施方案中，工程化淀粉酶多肽适用于用于改善膳食淀粉消化。在一些此外的实施方案中，工程化淀粉酶多肽可用于在食用食物或饲料之前分解食物和饲料中的淀粉。施用的工程化淀粉酶多肽的剂量取决于状况或疾病、受试者的一般状况以及本领域技术人员已知的其他因素。在一些实施方案中，意图将组合物单次或多于一次施用。在一些实施方案中，设想了向患有胰功能不全病的人类施用的组合物中工程化淀粉酶多肽的浓度足以有效治疗和/或改善疾病(例如，胰功能不全病)。在一些实施方案中，将本公开内容的工程化淀粉酶多肽中的一种或更多种(例如配制为组合物)以足以有效治疗和/或改善疾病(胰功能不全病)的量施用到患有胰功能不全病的人类。在一些实施方案中，工程化淀粉酶多肽与其他药物和/或膳食组合物组合施用。在一些实施方案中，工程化淀粉酶多肽可用于与其他酶(诸如脂肪酶和/或蛋白酶)组合用于治疗疾病(诸如胰腺酶不足)。在一些实施方案中，进行治疗的受试者是非人类哺乳动物，诸如但不限于非人类灵长类动物、猪、牛、狗和猫。
在一些实施方案中，工程化淀粉酶多肽与其他药物和/或膳食组合物(包括但不限于膳食补充剂、营养保健品等)组合施用。不意图本发明受限于任何特定的施用方法或形式，因为任何合适的方法和/或形式都可以使用。
实施例
提供以下实施例，包括实验和获得的结果，仅用于说明的目的，而不应被解释为限制本发明。在以下的实验公开内容中，应用以下缩写：ppm(百万分率(parts permillion))；M(摩尔/升)；mM(毫摩尔/升)，uM和μM(微摩尔/升)；nM(纳摩尔/升)；mol(摩尔)；gm和g(克)；mg(毫克)；ug和μg(微克)；L和l(升)；ml和mL(毫升)；cm(厘米)；mm(毫米)；um和μm(微米)；sec.(秒)；min(s)(分钟)；h(s)和hr(s)(小时)；kDa(千道尔顿)；U(单位)；MW(分子量)；rpm(转/分钟)；℃(摄氏度)；CDS(编码序列)；DNA(脱氧核糖核酸)；RNA(核糖核酸)；大肠杆菌W3110(常用的实验室大肠杆菌菌株，可从大肠杆菌遗传资源中心(Coli GeneticStock Center)[CGSC],New Haven,CT获得)；EPI(外分泌胰功能不全)；亚乙基-pNP-G7(亚乙基-4-硝基苯基-α-D-麦芽七糖苷)；btLIP(热噬淀粉芽孢杆菌(B.thermoamylovorans)脂肪酶)；HPLC(高压液相色谱法)；ms(质谱法或质谱)；SDS-PAGE(十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳)；PBS(磷酸盐缓冲盐水)；PES(聚醚砜)；ACN(乙腈)；DNSA(二硝基水杨酸)；IPA(异丙醇)；IPTG(异丙基β-D-1-硫代吡喃半乳糖苷)；PMBS(硫酸多黏菌素B)；NADPH(烟酰胺腺嘌呤二核苷酸膦酸)；LB(Luria培养基)；MeOH(甲醇)；FIOPC和FIOP(相对于阳性对照的改进倍数)；HTP(高通量)；CAV(池加速电压；碰撞池加速电压)；CE(碰撞能量)；RF(射频)；NEB(NewEngland Biolabs,Inc.,Ipswich,MA)；Biorad(Bio-Rad Laboratories,Inc.,Hercules,CA)；Greiner(Greiner Bio-One North America,Inc.,Monroe,NC)；GE Healthcare(GEHealthcare,Chicago,IL)；Sigma-Aldrich(Sigma-Aldrich,St.Louis,MO)；Pall Corp.(Pall,Corp.,Pt.Washington,NY)；Millipore(Millipore,Corp.,Billerica MA)；Difco(Difco Laboratories,BD Diagnostic Systems,Detroit,MI)；Molecular Devices(Molecular Devices,LLC,Sunnyvale,CA)；Kuhner(Adolf Kuhner,AG,Basel,Switzerland)；Applied Biosystems(Applied Biosystems,Life Technologies,Corp.的一部分,Grand Island,NY),Agilent(Agilent Technologies,Inc.,Santa Clara,CA)；MS(/>质谱仪,Agilent)；Thermo Scientific(ThermoFisherScientific的一部分,Waltham,MA)；Gibco(ThermoFisher Scientific)；Pierce(PierceBiotechnology(现在是Thermo Fisher Scientific的一部分),Rockford,IL)；ThermoFisher Scientific(Thermo Fisher Scientific,Waltham,MA)；Corning(Corning,Inc.,Palo Alto,CA)；以及Bio-Rad(Bio-Rad Laboratories,Hercules,CA)。
实施例1-淀粉酶基因的获取和表达载体的构建
对编码表1-1中列出的来自各种生物体的细菌淀粉酶的DNA序列进行密码子优化以用于在大肠杆菌中表达，并将其克隆到大肠杆菌表达载体pCK110900载体系统(参见例如，美国专利第7,629,157号和第9,714,437号，以及美国专利申请公布2006/0195947，所有这些都在此通过引用并入本文)。将质粒构建体转化到源自W3110的大肠杆菌菌株中。如实施例3中描述的，使含有淀粉酶基因的大肠杆菌菌株以96孔板或摇瓶形制生长，并测定淀粉酶活性。从这些淀粉酶获得的活性在表1-1中示出。
实施例2-工程化淀粉酶变体的表达和构建
基于表1-1中示出的结果，将来自SEQ ID NO:2的淀粉酶用C-末端6xHis-标签亚克隆到pJV110900载体系统中(参见例如美国专利申请公布2017/213758，在此通过引用并入)以产生SEQ ID NO:18。然而，不意图本发明受限于任何特定的载体。将质粒构建体转化到源自W3110的大肠杆菌菌株中。使用本领域技术人员通常已知的定向演化技术从该质粒构建体产生基因变体文库(参见例如，美国专利第8,383,346号和WO2010/144103)及其衍生物。
实施例3-淀粉酶变体的高通量(HTP)生长和筛选条件
在本实施例中提供了用于培养产生本发明淀粉酶的细胞的方法，以及表征淀粉酶的筛选方法。
淀粉酶和变体淀粉酶大肠杆菌的高通量(HTP)培养
通过将转化的大肠杆菌细胞铺在含有1％葡萄糖和选择物的LB琼脂板上来进行选择。在37℃孵育过夜后，将菌落放置到96孔浅平底板(NUNCTM,Thermo-Scientific)的孔中，所述孔中填充有180μl/孔的补充有1％葡萄糖和选择标记的LB。允许培养物在振荡培养箱(200rpm，30℃和85％相对湿度；Kuhner)中过夜生长18-20小时。
将过夜生长的样品(20μL)转移到填充有380μL的补充有选择化合物(例如，氯霉素)的Terrific培养基的96孔深板中。将板在振荡培养箱(250rpm，30℃和85％相对湿度；Kuhner)中孵育135分钟。然后用40μL在无菌水中的10mM IPTG诱导淀粉酶变体的表达，并将培养物在振荡培养箱(250rpm、30℃和85％相对湿度；Kuhner)中过夜孵育20-24小时。使细胞通过离心(4000rpm x 20min)沉淀，将上清液弃去，并在分析前将细胞在-80℃冷冻。
HTP沉淀的裂解
首先，向细胞沉淀添加200-400μL的裂解缓冲液(1X PBS，1mg/ml溶菌酶，和0.5mg/ml硫酸多黏菌素B)以及0.1U/mL DNA酶I(NEB)。将细胞沉淀和缓冲液在室温温和地摇动1.5-2小时，并离心(4000rpm x 15min)，然后在本文描述的各个HTP测定中使用澄清的裂解物。通过SDS-PAGE对这些裂解物的分析揭示，过表达的蛋白条带以57kDa的表观MW存在，与感兴趣的淀粉酶的预期MW一致。在一些另外的实验中，在挑战和分析之前，用PBS缓冲液对澄清的裂解物进行另外的稀释。
澄清的裂解物或纯化的蛋白的淀粉酶活性分析
淀粉酶活性使用可溶性淀粉作为底物并使用二硝基水杨酸(DNSA)定量从淀粉水解产生的麦芽糖来评估。将10mg/mL马铃薯淀粉混合在测定缓冲液(20mM磷酸钠缓冲液pH6.9+6.7mM NaCl或100mM Na3PO4 pH6.0-7.0)中来制备淀粉溶液。为了溶解淀粉，将溶液在搅拌板上加热至接近沸腾，然后允许冷却至室温。为了产生DNSA溶液，将在水中的20ml96mM DNSA逐滴添加到12ml水和8ml在2N NaOH中的5.3M酒石酸钾钠四水合物中，并在热板(70-80℃)上混合；在使用前将DNSA溶液冷却至室温。为了建立淀粉酶活性反应，在PCR板(BioRad)中将淀粉底物溶液与稀释的酶2:1混合，并在37℃孵育30分钟。然后将反应物与DNSA溶液1:1混合，并在热循环仪中在95℃孵育15分钟。将样品在测定缓冲液中稀释2x，并转移到平底板(Greiner)中，然后在Molecular Devices/>M2板读取器上读取540nm处的吸光度。在一些实验中，为了确保样品不使测定饱和，在分析前，基于预定的稀释系数(高达512x)将样品在PBS缓冲液中稀释。
分析澄清的裂解物或纯化的蛋白的淀粉酶活性的替代方法
在一些实验中，淀粉酶活性通过使用亚乙基pNP-G7作为底物，并通过监测405nm处的吸光度(A405)来监测释放的对硝基苯酚来评估。使用淀粉酶活性测定试剂盒(Sigma)进行该测定。在该测定中，将50ul挑战的稀释的淀粉酶变体添加到50ul提供的测定缓冲液和50ul提供的亚乙基pNP-G7底物溶液中。监测405nm处的吸光度15分钟，并且将代表性时间点的吸光度用于后续分析。
用热挑战预处理的澄清的裂解物或纯化的蛋白的HTP分析
为了评估变体的热稳定性，将澄清的裂解物转移到PCR板(Biorad)中，并在热循环仪中于40℃-60℃孵育1hr。孵育后，将样品离心以沉淀热沉淀的蛋白，并如本文描述地分析上清液的淀粉酶残留活性。
用低pH和胃蛋白酶预处理的澄清的裂解物或纯化的蛋白的HTP分析
在模拟胃环境的在存在胃蛋白酶的情况下在低pH预孵育之后，确定淀粉酶变体的活性。首先，将澄清的裂解物在PBS缓冲液中稀释0x-32x，然后在PCR板(Biorad)中与McIlvaine缓冲液pH 2.3-3.5+3.0mg/ml来自猪胃粘膜的胃蛋白酶(Sigma)1:1混合，使最终挑战pH为2.3-3.5和最终胃蛋白酶浓度为1.5mg/ml。混合样品，并然后在37℃孵育1-2hr。为了停止挑战，将样品与400mM Na3PO4 pH 7.0 1:1混合来中和pH并使胃蛋白酶失活。然后如本文描述地分析中和的挑战样品的残留淀粉酶活性。
与肠蛋白酶一起孵育后的淀粉酶活性的HTP评价
在模拟肠环境的在存在牛磺胆酸钠和肠蛋白酶的情况下在中性pH预孵育之后，确定变体的活性。在PCR板(BioRad)中，将澄清的裂解物与100mM Na3PO4 pH 7.0或含有0-10mM牛磺胆酸钠、3mg/ml来自猪胰腺的胰蛋白酶和3mg/ml来自牛胰腺的胰凝乳蛋白酶的PBS 1:1混合，使最终浓度为0-5mM牛磺胆酸钠，和每种挑战性肠蛋白酶的最终浓度为1.5mg/ml。将混合物在热循环仪中于37℃孵育1-2hr。然后如本文描述地分析样品的残留淀粉酶活性。
与工程化蛋白酶一起孵育后的淀粉酶活性的HTP评价
在存在工程化胰蛋白酶样蛋白酶(SEQ ID NO:20)的情况下在中性pH预孵育之后，确定淀粉酶变体的活性。在PCR板(BioRad)中，将澄清的裂解物与含有3mg/ml SEQ ID NO:20的多肽的冻干粉的PBS 1:1混合，使挑战中蛋白酶的最终浓度为1.5mg/ml。将混合物在热循环仪中于37℃孵育1-2hr。然后如本文描述地分析样品的残留淀粉酶活性。
多个顺序挑战后淀粉酶活性的HTP评价
当同时研究两种稳定性特性时，将多个挑战筛选按顺序组合。例如，在一些实验中，一小时的热挑战之后是一小时的pH和胃蛋白酶挑战，然后是一小时的肠挑战。在胃挑战之后是肠挑战的情况下，将挑战的肠蛋白酶溶解在用于胃挑战的中和缓冲液中，使得在中和胃挑战后立即开始肠挑战。这被表示为“顺序挑战”。在顺序挑战后，如本文描述地分析样品的残留淀粉酶活性。
淀粉酶变体的摇瓶表达、纯化和表征
将含有编码工程化淀粉酶的质粒的大肠杆菌的单菌落接种到含有1％葡萄糖和选择标记的5mL Luria Bertani培养基中。使细胞在培养箱中在30℃以250rpm振荡生长过夜(至少16小时)。在1升烧瓶中，将培养物稀释到250mL含有选择物的Terrific培养基(12g/L细菌胰蛋白酶，24g/L酵母提取物，4mL/L甘油，65mM磷酸钾，pH 7，1mM MgSO4)中，并允许其在30℃生长。当培养物的OD600达到0.6至0.8时，通过将IPTG添加至1mM的最终浓度来诱导淀粉酶基因的表达。然后继续孵育过夜(至少16小时)。通过离心(5000rpm，15min，4℃)并弃去上清液来收获细胞。将细胞重悬于40-50mL含有150mM NaCl的PBS中，并使其通过具有标准大肠杆菌裂解设置的高压均质仪(Microfluidics)，并维持在4℃。
收集澄清的裂解物上清液，并向裂解物中添加咪唑，使最终浓度为25mM。使用制造商(GE Healthcare)的方案，使用含有150ml NaCl和25mM咪唑的PBS作为洗涤缓冲液，以及含有150ml NaCl和250mM咪唑的PBS作为洗脱缓冲液，在具有AC步进1ml/5ml HiTrap-亲和色谱快速启动(Affinity Chromatography Quick Start)的AKTA启动系统上对该裂解物进行HIS亲和纯化。用-10DG脱盐预填充重力流柱(Biorad)将纯化的淀粉酶变体经缓冲液交换到PBS中。
以与如本文描述的类似的方式，除了在稳定性实验中使用1mg/ml纯化的酶而不是使用细胞裂解物，测定纯化的淀粉酶变体的未挑战的活性、胃稳定性、肠稳定性。
实施例4：淀粉酶变体的筛选结果
基于SEQ ID NO:18的结构模型，由同源物多样性和表面位置的饱和诱变产生文库变体。如实施例3中描述的，在50℃孵育1小时，随后1小时胃挑战(1.5mg/mL胃蛋白酶，pH 3)和最后1小时肠挑战1小时的顺序挑战之后，一式三份筛选这些变体在pH 6.8的淀粉酶活性。结果(相对于SEQ ID NO:18的结果)在表4-1中提供。
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基于表4-1中示出的结果，选择SEQ ID NO:40作为用于下一蛋白优化迭代的亲本序列。从表4-2中列出的突变中鉴定出的有益突变被重组到该主链中。如实施例3中描述的，在用以下两种不同条件预孵育之后，一式三份测定变体在pH 6.8的淀粉酶活性：在50℃孵育1hr，随后进行1hr肠挑战，以及在50℃孵育1hr，随后在pH 3.5进行1小时胃挑战。结果(相对于SEQ ID NO:40的结果)在表4-2中示出。
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基于表4-2中示出的结果，选择SEQ ID NO:156作为用于下一蛋白优化迭代的亲本序列。从表4-2示出的结果中鉴定出的有益突变被重组到主链中。另外，为了产生新的多样性，还使用SEQ ID NO:156构建经由在不同位置处的饱和诱变产生的变体。
在两种不同条件下预孵育之后，一式三份测定变体在pH 6.8的淀粉酶活性。如实施例3中描述的，第一种条件是在pH 3.25的1小时胃挑战，并且第二种条件是在pH 3.25的2hr胃挑战。结果(相对于SEQ ID NO:156的结果)在表4-3中提供。
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基于表4-3中示出的结果，选择SEQ ID NO:174作为用于下一蛋白优化迭代的亲本序列。从表4-2和表4-3鉴定出的有益突变以及来自同源物的多样性被重组到该主链中。如实施例3中描述的，在pH 3.25用1小时胃挑战预孵育之后，一式一份测定变体在pH 6.8的淀粉酶活性。结果(相对于SEQ ID NO:174的结果)在表4-4中提供。
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基于表4-4中示出的结果，选择SEQ ID NO:276作为用于下一蛋白优化迭代的亲本序列。基于表4-4中示出的结果鉴定出的有益突变以及将变异序列恢复为野生型序列的突变被重组到该主链中。另外，为了产生新的多样性，还使用SEQ ID NO:276构建经由在不同位置处的饱和诱变产生的变体。在两种不同条件下预孵育之后，一式三份测定变体在pH6.8的淀粉酶活性。如实施例3中描述的，第一种条件是在pH 2.75的1小时胃挑战，并且第二种条件是1小时肠挑战。结果(相对于SEQ ID NO:276的结果)在
表4-5中提供。
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基于表4-5中示出的结果，选择SEQ ID NO:308作为用于下一蛋白优化迭代的亲本序列。从表4-5鉴定出的有益突变以及来自同源物的多样性被重组到该主链中。另外，为了产生新的多样性，还使用SEQ ID NO:308构建具有在不同位置处的单一突变的变体。在两种不同条件下预孵育之后，一式三份测定变体在pH 6.8的淀粉酶活性。如实施例3中描述的，第一种条件是在pH 2.5的2小时胃挑战，并且第二种条件是2小时肠挑战。结果(相对于SEQID NO:308的结果)在表4-6中提供。
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基于表4-6中示出的结果，选择SEQ ID NO:422作为用于下一蛋白优化迭代的亲本序列。基于表4-6示出的结果鉴定出的有益突变被重组到该主链中。如实施例3中描述的，在以下两种不同条件下预孵育之后，在pH6.8一式一份测定变体的淀粉酶活性：第一种是在pH2.3的2小时胃挑战，并且第二种是2小时肠挑战。结果(相对于SEQ ID NO:422的结果)在表4-7中提供。
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基于来自表4-7的结果，选择SEQ ID NO:456作为用于下一蛋白优化迭代的亲本序列。为了产生新的多样性，使用SEQ ID NO:456重组来自同源物的突变，并且还使用该主链构建具有在不同位置处的饱和诱变的变体。一式三份测定变体在pH 6和pH 7的未挑战条件下以及在两种不同条件下预孵育之后在pH 6的淀粉酶活性。如实施例3中描述的，第一种条件是在pH 2.3的2小时胃挑战，并且第二种条件是2小时肠挑战。结果(相对于SEQ ID NO:456的结果)在表4-8中提供。在一些另外的实验中，如实施例3中描述的，在pH 2.3的2小时胃挑战之后，一式一份测定一些变体在pH 6的淀粉酶活性。结果(相对于SEQ ID NO:456的结果)在表4-9中提供。
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基于表4-8中示出的结果，选择SEQ ID NO:546作为用于下一蛋白优化迭代的亲本序列。从表4-9鉴定出的有益突变被重组到该主链中。一式三份测定变体在pH 6和pH 7的未挑战的活性以及在两种不同条件下预孵育之后在pH 6的淀粉酶活性。如实施例3中描述的，第一种条件是在pH 2.3的2小时胃挑战，并且第二种条件是2小时肠挑战。结果(相对于SEQID NO:546的结果)在表4-10中提供。
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基于表4-10中示出的结果，选择SEQ ID NO:632作为用于下一蛋白优化迭代的亲本序列。为了产生新的多样性，使用主链重组来自同源物的突变。另外，还在该主链上构建在不同位置处使用饱和诱变产生的变体。一式三份测定变体在pH 6的未挑战的活性以及还在两种不同条件下预孵育之后的淀粉酶活性。如实施例3中描述的，第一种条件是在pH 2.3的2小时胃挑战，并且第二种条件是2小时肠挑战。结果(相对于SEQ ID NO:632的结果)在表4-11中提供。
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基于表4-11中示出的结果，选择SEQ ID NO:664作为用于下一蛋白优化迭代的亲本序列。来自同源物的突变，以及从所有尚未整合的筛选结果中鉴定出的任何其他有益突变被重组到该主链上。另外，还在该主链上构建在不同位置处使用饱和诱变产生的变体。一式三份测定变体在pH 6的未挑战的活性以及还在两种不同条件下预孵育之后的淀粉酶活性。如实施例3中描述的，第一种条件是在pH 2.3的2小时胃挑战，并且第二种条件是2小时肠挑战。结果(相对于SEQ ID NO:664的结果)在表4-12中提供。
在其他实验中，还对一些来自表4-12的变体进行规模扩大以用于在摇瓶中产生，并且测定纯化的酶在pH 6的未挑战的活性以及在两种不同条件下预孵育之后的淀粉酶活性。如实施例3中描述的，第一种条件是在pH 3的2小时胃挑战，并且第二种条件是3小时肠挑战。结果(相对于SEQ ID NO:664的结果)在表4-13中提供。
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基于表4-10中示出的结果，发现与SEQ ID NO:546相比，SEQ ID NO:632具有改进的胃稳定性、但较低的肠稳定性。序列分析鉴定出可能导致肠稳定性受损的T126R取代。基于来自表4-13的结果，选择SEQ ID NO:780作为用于下一蛋白优化迭代的亲本序列。使用SEQ ID NO:780构建在位置126处的NNK文库，以拯救肠稳定性的损失，同时维持胃稳定性。在三种不同条件下预孵育之后，测定变体在pH 6的淀粉酶活性。如实施例3中描述的，第一种条件是在pH 2.3的2小时胃挑战，第二种条件是2小时的仅胰蛋白酶挑战(无胰凝乳蛋白酶)，并且第三种条件是与蛋白酶(SEQ ID NO:20)一起孵育2小时。结果(相对于SEQ ID NO:780的结果)在表4-14中提供。
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实施例5：带有和不带有His标签的淀粉酶变体的比较
从SEQ ID NO:810移除C-末端接头和His标签以产生SEQ ID NO:1758。如实施例3中描述的，这两种变体都以高通量生长，并一式两份筛选在pH 6.8的淀粉酶活性、2小时胃挑战(1.5mg/mL胃蛋白酶，pH 2.3)、2小时肠挑战和2hr蛋白酶挑战之后的淀粉酶活性。发现这两种变体在所筛选的不同条件下具有相似的特性，如表5中的吸光度值示出的。
出于所有目的，本申请中引用的所有出版物、专利、专利申请和其他文件在此通过引用以其整体并入，其程度如同每个单独的出版物、专利、专利申请或其他文件被单独地指出出于所有目的通过引用并入一样。
虽然已说明并描述了多种具体实施方案，但是应当理解，可以进行各种改变，而不偏离本发明的精神和范围。
Claims (65)
1.一种重组淀粉酶，所述重组淀粉酶包含含有与SEQ ID NO:2的至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的氨基酸序列。
2.根据权利要求1所述的重组淀粉酶，其中所述重组淀粉酶包含与SEQ ID NO:18、40、156、174、276、308、422、456、546、632、664、780、988、1104、1122、1224、1256、1370、1404、1494、1580、1612和/或1728具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多序列同一性的多肽序列。
3.根据权利要求1或2所述的重组淀粉酶，其中所述多肽序列还包含相对于(a)SEQ IDNO:2或(b)SEQ ID NO:18、40、156、174、276、308、422、456、546、632、664、780、988、1104、1122、1224、1256、1370、1404、1494、1580、1612或1728的序列的一个或更多个取代。
4.根据权利要求1所述的重组淀粉酶，其中所述重组淀粉酶包含与SEQ ID NO:2或18具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多序列同一性的多肽序列或其功能片段，并且其中所述重组淀粉酶在选自以下的位置处包含一个或更多个取代：16、26、29、33、91、114、157、158、180、184、214、223、256、272、298、302、371、380、383、394、412、428和437，其中所述多肽序列的氨基酸位置参考SEQID NO:2或18来编号。
5.根据权利要求1所述的重组淀粉酶，所述重组淀粉酶包含与SEQ ID NO:2或18具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多序列同一性的多肽序列或其功能片段，并且其中所述重组淀粉酶包含选自以下的一个或更多个取代：16D、26A、29G、29R、29S、29A、29E、33E、91H、114H、157Y、158R、180E、180Q、184D、184K、214G、223L、256T、272G、272K、272P、272R、272S、298H、302Q、302G、302H、302R、302V、302W、371F、380R、383E、383I、394N、394S、394G、412A、412L、412D、412S、428T和437L，其中所述多肽序列的氨基酸位置参考SEQ ID NO:2或18来编号。
6.根据权利要求1所述的重组淀粉酶，其中所述重组淀粉酶包含与SEQ ID NO:2或18具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多序列同一性的多肽序列，其中所述重组淀粉酶在选自以下的一个或更多个位置处包含至少一个取代或取代集：2/73/256/493、16/33/73/130/256/282/371/374/493、16/33/130/256/302/371/383/470、16/33/157/256/302/371/383、16/73/74/256/282/366/371/383/493、16/73/256/282/302/331/371/383、16/130/256/276/374/470、16/256/302/374、19/72/345/473、26/27/396/412/428/473、26/27/412、26/27/466/473、29、73/130/256/282/302/493、74/371/374/383/493、130/256/493、149、158、254、256、256/383、257、259、272、279、284、317/383、322、345/388/396/428、388/396/412/428、396/412、396/412/428/466、409、412和495，其中所述多肽序列的氨基酸位置参考SEQ ID NO:2或18来编号。
7.根据权利要求1所述的重组淀粉酶，其中所述重组淀粉酶包含与SEQ ID NO:40或988具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多序列同一性的多肽序列，其中所述重组淀粉酶在选自以下的一个或更多个位置处包含至少一个取代或取代集：6/29/158/272/412、26/29/272/279/412/493、26/29/272/396/412、26/29/279/412/428、26/158/272/279/388/412/428、26/158/272/412、26/272/279/412/428/493、29/272/279/396/412、130/149/254/284/322/409/495、130/149/257/284/322/409/466/473、130/254/284/322/374/409/466、130/257/284/374/409/466、130/284/322/374/409/473、149/257/284/322/409/466、158/272/279/394/396/412/428/493、158/272/388/412/428/493、158/272/412/428、158/279/388/396/412/428、254/257/284/322/409/473、254/284/409/466/495、272/279/412/428/493、272/412/428、272/412/493和284/322/409/473，其中所述多肽序列的氨基酸位置参考SEQ ID NO:40或988来编号。
8.根据权利要求1所述的重组淀粉酶，其中所述重组淀粉酶包含与SEQ ID NO:156或1104具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多序列同一性的多肽序列，其中所述重组淀粉酶在选自以下的一个或更多个位置处包含至少一个取代或取代集：37、51、91、111、112、114、122、124、128、140、167、171、183、194、276、280、298、397和464，其中所述多肽序列的氨基酸位置参考SEQ ID NO:156或1104来编号。
9.根据权利要求1所述的重组淀粉酶，其中所述重组淀粉酶包含与SEQ ID NO:174或1122具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多序列同一性的多肽序列，其中所述重组淀粉酶在选自以下的一个或更多个位置处包含至少一个取代或取代集：24、91、91/122、91/122/128/130/167/171/409、91/122/128/130/183/322、91/122/128/130/194、91/122/128/130/322、91/122/128/171/183/194/322、91/122/128/183/409、91/122/130/167/183/194/409、91/122/130/171/183、91/122/130/183/194、91/122/130/194、91/122/130/194/322、91/122/167/171/194、91/122/167/171/194/322、91/122/171/183/194/409、91/130/171/183/322/409、91/167/171、91/167/183/194、91/167/322、91/183、91/183/322/409、91/194、91/322、91/409、122/128、122/128/194/409、122/130/171/322/409、122/409、137/145/227/394/480/481、137/145/295、145/227/295/481、145/309/481、183、227、295/394、322、322/409、394和480/481，其中所述多肽序列的氨基酸位置参考SEQ ID NO:174或1122来编号。
10.根据权利要求1所述的重组淀粉酶，其中所述重组淀粉酶包含与SEQ ID NO:276或1224具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多序列同一性的多肽序列，其中所述重组淀粉酶在选自以下的一个或更多个位置处包含至少一个取代或取代集：16/26/29/128/145/256/309/383、16/26/33/114/145/309/383/394、16/26/33/128/130/145/302/309/322/371、16/26/33/145/158/383/394、16/26/145/302、16/29/33/145/256/302、18、26/29/33/130/145/157/158/183/394、26/29/33/145/157/183/256/309/383、26/29/122/130/145/183/256/272/309/394、26/29/145/157/256/302/322/481、26/29/145/256/272/302/309/322/481、26/33/91/145/272/302/481、26/33/145/309/322/383、26/114/145/322、26/145/183/256/309/383、29/122/145/158/383、29/130/145/256/272/371/394、29/145/183/302/309/412、29/309/394、33/122/145/272/309/412、91/130/145/158/183/383、91/309/383、130/145/256/272/371、130/145/302/309、130/272/481、145/302/309、268、309、349、360、380、394、463和483，其中所述多肽序列的氨基酸位置参考SEQ ID NO:276或1224来编号。
11.根据权利要求1所述的重组淀粉酶，其中所述重组淀粉酶包含与SEQ ID NO:308或1256具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多序列同一性的多肽序列，其中所述重组淀粉酶在选自以下的一个或更多个位置处包含至少一个取代或取代集：29、37/124/250/270/349/380/394/442/491、37/145、37/145/250/301/349/394、37/145/258/442/491、38/349/491、81/259、81/313/495、92/257/258/338/468、92/258、94/127/132/145/250/349、94/270/301/349/394/442、94/349/491、145/270、178、225、226、246、250/349/442、259/313/338、270/349、286/338、294、313、349、349/380/442、413、413/468、448和473，其中所述多肽序列的氨基酸位置参考SEQID NO:308或1256来编号。
12.根据权利要求1所述的重组淀粉酶，其中所述重组淀粉酶包含与SEQ ID NO:422或1370具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多序列同一性的多肽序列，其中所述重组淀粉酶在选自以下的一个或更多个位置处包含至少一个取代或取代集：38、38/178/226/286/338、38/178/286/448、38/178/349/448、38/226/246/258/286、38/226/258/286/338/380/448、38/226/258/349/413、38/226/286、38/226/286/338/380、38/226/338/349/380、38/226/413/448、38/246/286、38/246/286/380、38/258、38/286、38/286/413/448、38/286/448、38/448、178、178/226/258/286/310/338、178/226/286/338、178/246/338、178/258/286/413、178/286、178/286/338/349、178/286/338/448、178/380、178/413、178/448、184/246/258/380、226、226/246/286/349/448、226/246/413、226/258/286/349/380、226/258/286/413/448、226/286、226/286/380/448、226/349/380、246、246/286、246/286/380/413、246/338、246/413、258/286/413、286、286/413/448、338/448、349和413，其中所述多肽序列的氨基酸位置参考SEQ ID NO:422或1370来编号。
13.根据权利要求1所述的重组淀粉酶，其中所述重组淀粉酶包含与SEQ ID NO:456或1404具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多序列同一性的多肽序列，其中所述重组淀粉酶在选自以下的一个或更多个位置处包含至少一个取代或取代集：29/31/92/220、29/469、49/58/103/141/197/269/294/298、49/58/103/194/204/298、49/58/141/298、49/103、103、123、126、127、131、134、180、210、214、220/469、228、259、279、282、302、319、393、415、417、428、429、466和469，其中所述多肽序列的氨基酸位置参考SEQ ID NO:456或1404来编号。
14.根据权利要求1所述的重组淀粉酶，其中所述重组淀粉酶包含与SEQ ID NO:456或1404具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多序列同一性的多肽序列，其中所述重组淀粉酶在选自以下的一个或更多个位置处包含至少一个取代或取代集：92、123、126、127、129、131、134、140、172、180、210、214、221、228、253、254、259、279、282、302、304、305、319、322、346、359、384、385、387、393、409、412、415、417、428、429、441、442、444、446、451、455、459、466、467、470、473、474、492和494，其中所述多肽序列的氨基酸位置参考SEQ ID NO:456或1404来编号。
15.根据权利要求1所述的重组淀粉酶，其中所述重组淀粉酶包含与SEQ ID NO:546或1494具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多序列同一性的多肽序列，其中所述重组淀粉酶在选自以下的一个或更多个位置处包含至少一个取代或取代集：123、123/126/180/214/298/302/393、123/126/180/214/393/428、123/126/210/298/302/393、123/126/210/428、123/126/428、123/210/302、126/180/210/214/298/302、126/180/210/214/428、126/180/298/302/393、126/210/302/428、126/214/393、126/298/302/393、126/298/302/393/428、129、129/228/253、131/228/279、131/282、180/214、210/214/302/393/428、228/282/444、253/279/470、253/279/492、279、279/470和441，其中所述多肽序列的氨基酸位置参考SEQ ID NO:546或1494来编号。
16.根据权利要求1所述的重组淀粉酶，其中所述重组淀粉酶包含与SEQ ID NO:632或1580具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多序列同一性的多肽序列，其中所述重组淀粉酶在选自以下的一个或更多个位置处包含至少一个取代或取代集：2、45/166/298、48、48/166/170/203、52、58/166、58/203、72、82、114、114/223/306/308、149、165、166/203、167、170、184/216/306/308、184/223/306/437、189、203、225、255、258、275、280、284、294、298、396、397、411、431、448、468、482、483和495，其中所述多肽序列的氨基酸位置参考SEQ ID NO:632或1580来编号。
17.根据权利要求1所述的重组淀粉酶，其中所述重组淀粉酶包含与SEQ ID NO:664或1612具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多序列同一性的多肽序列，其中所述重组淀粉酶在选自以下的一个或更多个位置处包含至少一个取代或取代集：6/39/103/324/420、41、58/500/501、61、95/98/205/227/423/458、95/98/227/423、95/205、95/252/285/324、123/170/197/275/298/396/448/483、123/197、123/197/225/294/396/448/469、123/284/294/324/396/448、134/225/275/302、165/225/284/298/469/483、170/275/294/298/448、205/206、205/206/224/315/458/480、206/227、206/227/315/423、225/294/298/396、227、392/503、458、499和500，其中所述多肽序列的氨基酸位置参考SEQ ID NO:664或1612来编号。
18.根据权利要求1所述的重组淀粉酶，其中所述重组淀粉酶包含与SEQ ID NO:664或1612具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多序列同一性的多肽序列，其中所述重组淀粉酶在选自以下的一个或更多个位置处包含至少一个取代或取代集：95/252/285/324、123/197、123/197/225/294/396/448/469、134/225/275/302、205/206和205/206/224/315/458/480，其中所述多肽序列的氨基酸位置参考SEQ ID NO:664或1612来编号。
19.根据权利要求1所述的重组淀粉酶，其中所述重组淀粉酶包含与SEQ ID NO:780或1728具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多序列同一性的多肽序列，其中所述重组淀粉酶在位置126处包含至少一个取代或取代集，其中所述多肽序列的氨基酸位置参考SEQ ID NO:780或1728来编号。
20.根据权利要求1所述的重组淀粉酶，其中所述重组淀粉酶包含表4-1、表4-2、表4-3、表4-4、表4-5、表4-6、表4-7、表4-8、表4-9、表4-10、表4-11、表4-12、表4-13和/或表4-14中提供的至少一个位置中的至少一个突变，其中所述位置参考SEQ ID NO:2、18、40、156、174、276、308、422、456、546、632、664、780、988、1104、1122、1224、1256、1370、1404、1494、1580、1612和/或1728来编号。
21.根据权利要求1所述的重组淀粉酶，所述重组淀粉酶包含选自SEQ ID NO:4-18、22-966和970-1914中的偶数编号序列的多肽序列。
22.根据权利要求1所述的重组淀粉酶，所述重组淀粉酶包含选自SEQ ID NO:970-1914中的偶数编号序列的多肽序列。
23.根据权利要求1所述的重组淀粉酶，所述重组淀粉酶包含选自SEQ ID NO:800-820和1748-1768中的偶数编号序列的多肽序列。
24.根据权利要求1所述的重组淀粉酶，所述重组淀粉酶包含选自SEQ ID NO:40、156、174、276、308、422、456、546、632、664、780、810、988、1104、1122、1224、1256、1370、1404、1494、1580、1612、1728和1758的多肽序列。
25.根据权利要求1-24中任一项所述的重组淀粉酶，其中所述重组淀粉酶比SEQ IDNO:2、18、40、156、174、276、308、422、456、546、632、664、780、988、1104、1122、1224、1256、1370、1404、1494、1580、1612和/或1728的淀粉酶更热稳定。
26.根据权利要求1-25中任一项所述的重组淀粉酶，其中所述重组淀粉酶在酸性pH条件下比SEQ ID NO:2、18、40、156、174、276、308、422、456、546、632、664、780、988、1104、1122、1224、1256、1370、1404、1494、1580、1612和/或1728的淀粉酶更稳定。
27.根据权利要求1-26中任一项所述的重组淀粉酶，其中所述重组淀粉酶在pH 6比SEQID NO:2、18、40、156、174、276、308、422、456、546、632、664、780、988、1104、1122、1224、1256、1370、1404、1494、1580、1612和/或1728的淀粉酶更有活性。
28.根据权利要求1-27中任一项所述的重组淀粉酶，其中所述重组淀粉酶比SEQ IDNO:2、18、40、156、174、276、308、422、456、546、632、664、780、988、1104、1122、1224、1256、1370、1404、1494、1580、1612和/或1728的淀粉酶更抗蛋白水解。
29.根据权利要求1-28中任一项所述的重组淀粉酶，其中所述重组淀粉酶在存在至少一种胆盐的情况下比SEQ ID NO:2、18、40、156、174、276、308、422、456、546、632、664、780、988、1104、1122、1224、1256、1370、1404、1494、1580、1612和/或1728的淀粉酶更有活性。
30.根据权利要求1-29中任一项所述的重组淀粉酶，其中所述重组淀粉酶是纯化的。
31.根据权利要求1-30中任一项所述的重组淀粉酶，其中与参考序列相比，所述重组淀粉酶表现出至少一种选自以下的改进的特性：i)增强的催化活性；ii)增加的对酸性pH条件的耐受性；iii)增加的对至少一种蛋白酶的耐受性；iv)增加的对至少一种胆盐的耐受性；v)增加的耐热性；或i)、ii)、iii)、iv)和v)的任何组合。
32.根据权利要求31所述的重组淀粉酶，其中所述参考序列是SEQ ID NO:2。
33.根据权利要求31所述的重组淀粉酶，其中所述参考序列选自SEQ ID NO:18、40、156、174、276、308、422、456、546、632、664、780、988、1104、1122、1224、1256、1370、1404、1494、1580、1612和1728。
34.一种组合物，所述组合物包含至少一种权利要求1-33中任一项所述的重组淀粉酶。
35.一种重组多核苷酸序列，所述重组多核苷酸序列编码至少一种权利要求1-33中任一项所列的重组淀粉酶。
36.根据权利要求35所述的重组多核苷酸序列，其中所述多核苷酸序列是密码子优化的。
37.一种表达载体，所述表达载体包含至少一种权利要求35和/或36所述的重组多核苷酸序列。
38.根据权利要求37所述的表达载体，其中所述重组多核苷酸序列可操作地连接至控制序列。
39.根据权利要求37或38所述的表达载体，其中所述控制序列是启动子。
40.根据权利要求39所述的表达载体，其中所述启动子是异源启动子。
41.一种宿主细胞，所述宿主细胞包含权利要求37-40中任一项所述的表达载体。
42.根据权利要求41所述的宿主细胞，其中所述宿主细胞是真核的或原核的。
43.一种产生重组淀粉酶的方法，所述方法包括将权利要求41或42所述的宿主细胞在产生由所述重组多核苷酸编码的所述重组淀粉酶的条件下培养。
44.根据权利要求43所述的方法，所述方法还包括回收所述淀粉酶的步骤。
45.根据权利要求44所述的方法，所述方法还包括纯化所述淀粉酶的步骤。
46.一种药物组合物，用于治疗胰功能不全，所述药物组合物包含权利要求34所述的组合物。
47.根据权利要求46所述的药物组合物，所述药物组合物还包含药学上可接受的载体和/或赋形剂。
48.根据权利要求46和/或47所述的药物组合物，其中所述组合物还包含至少一种蛋白酶。
49.根据权利要求46-48中任一项所述的药物组合物，其中所述组合物还包含至少一种脂肪酶。
50.根据权利要求46和/或47所述的药物组合物，其中所述组合物还包含至少一种脂肪酶和至少一种蛋白酶。
51.根据权利要求34和46-50中任一项所述的组合物，所述组合物还包含胰提取物，其中所述胰提取物包含脂肪酶、蛋白酶和淀粉酶活性。
52.根据权利要求46-51中任一项所述的药物组合物，其中所述组合物适用于肠胃外注射或输注、皮下注射、吸入或皮肤应用至人类。
53.根据权利要求46-51中任一项所述的药物组合物，其中所述组合物适用于口服施用至人类。
54.根据权利要求53所述的药物组合物，其中所述组合物包含肠溶包衣。
55.一种用于治疗和/或预防受试者的胰功能不全的症状的方法，所述方法包括提供患有胰功能不全的受试者，并向所述受试者提供权利要求46-54中任一项所述的药物组合物。
56.根据权利要求55所述的方法，其中所述胰功能不全的症状得到改善。
57.根据权利要求55和/或56所述的方法，其中所述受试者能够食用比表现出所述胰功能不全的症状的受试者所需的饮食在其碳水化合物成分方面限制更少的饮食。
58.根据权利要求55-57中任一项所述的方法，其中所述受试者是人类患者。
59.根据权利要求58所述的方法，其中所述人类患者是婴儿或儿童。
60.根据权利要求58所述的方法，其中所述人类患者是成年人或年轻人。
61.根据权利要求55-57中任一项所述的方法，其中所述受试者是非人类哺乳动物。
62.权利要求34和46-54中任一项提供的所述组合物的用途。
63.权利要求1-33中任一项所述的重组淀粉酶或权利要求34和46-54中任一项所述的组合物，用于用作药物。
64.权利要求1-33中任一项所述的重组淀粉酶或权利要求34和46-54中任一项所述的组合物，用于用作营养补充剂。
65.权利要求1-33中任一项所述的重组淀粉酶或权利要求34和46-54中任一项所述的组合物，用于治疗或预防胰功能不全的症状。
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