JP2023539634A

JP2023539634A - 操作されたアミラーゼバリアント

Info

Publication number: JP2023539634A
Application number: JP2023513732A
Authority: JP
Inventors: チンピンチェン，; ニッキデラス，; ダデュアン，; ラヴィデイビッドガルシア，; ハーヴィンダーチャガーマニアー，
Original assignee: コデクシス，インコーポレイテッド; ソシエテデプロデュイネスレエス．アー．
Priority date: 2020-08-28
Filing date: 2021-08-27
Publication date: 2023-09-15
Also published as: WO2022047264A1; BR112023003643A2; CN116897205A; KR20230145027A; US20220090038A1; MX2023002421A; CA3191900A1; US20240026326A1; US11767519B2; AU2021331493A1; IL300533A; EP4204552A1

Abstract

本発明は、操作されたアミラーゼポリペプチドおよびその組成物を提供する。操作されたアミラーゼポリペプチドは、改善された熱安定性、プロテアーゼ安定性、および酸性（ｐＨが７未満である）条件を含むある範囲のｐＨ条件下での安定性をもたらすように最適化された。本発明はまた、治療および／または栄養目的のための、操作されたアミラーゼポリペプチドを含む組成物の使用に関する。本発明はまた、操作されたアミラーゼポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、ならびに操作されたポリヌクレオチドおよびアミラーゼポリペプチドを作製するための方法を提供する。

Description

関連出願の相互参照
本出願は、米国特許法第１１９条（ｅ）項の下で、その内容全体が参照により本明細書に組み込まれる、２０２０年８月２８日に出願された米国仮出願第６３／０７１，６４１号の利益を主張する。

発明の分野
本発明は、操作されたアミラーゼポリペプチドおよびその組成物を提供する。操作されたアミラーゼポリペプチドは、改善された熱安定性、プロテアーゼ安定性、および酸性（ｐＨ＜７）条件を含むある範囲のｐＨ条件下での安定性をもたらすように最適化された。本発明はまた、治療および／または栄養目的のための、操作されたアミラーゼポリペプチドを含む組成物の使用に関する。本発明はまた、操作されたアミラーゼポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、ならびに操作されたポリヌクレオチドおよびアミラーゼポリペプチドを作製するための方法を提供する。

配列表、表またはコンピュータプログラムの参照
配列表の公式の写しは、ＥＦＳ－Ｗｅｂ経由でＡＳＣＩＩフォーマットのテキストファイルとして、本明細書と同時に提出され、ファイル名は「ＣＸ７－２１１ＷＯ２＿ＳＴ２５．ｔｘｔ」であり、作成日は２０２１年８月２７日であり、サイズは５．６１メガバイトである。ＥＦＳ－Ｗｅｂ経由で出願された配列表は、本明細書の一部であり、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。

発明の背景
膵酵素補充療法（ＰＥＲＴ）は、膵酵素機能不全（ＰＥＩ）の処置において用途がある。膵炎、嚢胞性線維症、セリアック病、炎症性腸疾患および膵がんを含む様々な障害が、十二指腸への膵酵素の分泌減少の結果としてＰＥＩを生じ得る。その結果、食物の消化不良、腸による脂肪、タンパク質、炭水化物およびビタミンの不適切な吸収がもたらされ、これにより、栄養障害が生じ得る。経口投与されたＰＥＲＴ処置を現在利用できるが、この状態は、胃腸管におけるＰＥＲＴの不十分な活性および／または現在の処置プロトコールに伴う著しい丸剤服用負担による治療法の不十分な患者服薬遵守が原因で、一部の人々において軽減されない場合がある。一部の場合では、脂肪吸収係数（ＣＦＡ）および／または窒素吸収係数（ＣＮＡ）は、健康な患者のものよりも劣っており、体重減少および他の健康上の懸念をもたらす。よって、当技術分野には、改善されたＰＥＲＴ処置の必要が依然としてある。

発明の概要
本発明は、操作されたアミラーゼポリペプチドおよびその組成物を提供する。操作されたアミラーゼポリペプチドは、改善された熱安定性、プロテアーゼ安定性、および酸性（ｐＨ＜７）条件を含むある範囲のｐＨ条件下での安定性をもたらすように最適化された。本発明はまた、治療および／または栄養目的のための、操作されたアミラーゼポリペプチドを含む組成物の使用に関する。本発明はまた、操作されたアミラーゼポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、ならびに操作されたポリヌクレオチドおよびアミラーゼポリペプチドを作製するための方法を提供する。

本発明は、配列番号２に対して少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％または少なくとも約９９％配列同一性を含むアミノ酸配列を含む、組換えアミラーゼおよび／または生物活性がある組換えアミラーゼ断片を提供する。一部の実施形態では、組換えアミラーゼおよび／または生物活性がある組換えアミラーゼ断片は、配列番号２、１８、４０、１５６、１７４、２７６、３０８、４２２、４５６、５４６、６３２、６６４、７８０、９８８、１１０４、１１２２、１２２４、１２５６、１３７０、１４０４、１４９４、１５８０、１６１２および／または１７２８に対して少なくとも約７０％、約７５％、約７６％、約７７％、約７８％、約７９％、約８０％、約８１％、約８２％、約８３％、約８４％、約８５％、約８６％、約８７％、約８８％、約８９％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％またはそれを超える配列同一性を有するポリペプチド配列を含む。

本発明は、配列番号２に対して少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％配列同一性を含むアミノ酸配列を含む、組換えアミラーゼおよび／または生物活性がある組換えアミラーゼ断片を提供する。一部の実施形態では、組換えアミラーゼおよび／または生物活性がある組換えアミラーゼ断片は、配列番号１８、４０、１５６、１７４、２７６、３０８、４２２、４５６、５４６、６３２、６６４、７８０、９８８、１１０４、１１２２、１２２４、１２５６、１３７０、１４０４、１４９４、１５８０、１６１２および／または１７２８に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれを超える配列同一性を有するポリペプチド配列を含む。

一部の実施形態では、組換えアミラーゼは、配列番号２もしくは１８に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくはそれを超える配列同一性を有するポリペプチド配列、またはその機能的断片を含み、組換えアミラーゼは、２、６、１６、１８、１９、２４、２６、２７、２９、３１、３３、３７、３８、３９、４１、４５、４８、４９、５１、５２、５８、６１、６６、７２、７３、７４、８１、８２、９１、９２、９４、９５、９８、１０３、１１１、１１２、１１４、１２２、１２３、１２４、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３４、１３７、１４０、１４１、１４５、１４９、１５７、１５８、１６５、１６６、１６７、１７０、１７１、１７２、１７８、１８０、１８３、１８４、１８９、１９４、２０３、２０４、２０５、２０６、２１０、２１４、２１６、２２０、２２１、２２３、２２４、２２５、２２６、２２７、２２８、２４６、２５０、２５２、２５３、２５４、２５５、２５６、２５７、２５８、２５９、２６８、２６９、２７０、２７２、２７５、２７６、２７９、２８０、２８２、２８４、２８５、２８６、２９４、２９５、２９８、３０１、３０２、３０４、３０５、３０６、３０８、３０９、３１０、３１３、３１５、３１７、３１９、３２２、３２４、３３１、３３８Ｓ、３４５、３４６、３４９、３５９、３６０、３６６、３７１、３７４、３８０、３８３、３８４、３８５、３８７、３８８、３９２、３９３、３９４、３９６、３９７、４０９、４１１、４１２、４１３、４１５、４１７、４２０、４２３、４２８、４２９、４３１、４３７Ｌ４４１、４４２、４４４、４４６、４４８、４５１、４５５、４５８、４５９、４６３、４６４、４６６、４６７、４６８、４６９、４７０、４７３、４７４、４８０、４８１、４８２、４８３、４９１、４９２、４９３、４９４および４９５から選択される位置に１個または複数の置換を含み、ポリペプチド配列のアミノ酸位置は、配列番号２または１８を参照して番号付けされる。

一部の追加の実施形態では、組換えアミラーゼは、配列番号２もしくは１８に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくはそれを超える配列同一性を有するポリペプチド配列、またはその機能的断片を含み、組換えアミラーゼは、１６、２６、２９、３３、９１、１１４、１５７、１５８、１８０、１８４、２１４、２２３、２５６、２７２、２９８、３０２、３７１、３８０、３８３、３９４、４１２、４２８および４３７から選択される位置に１個または複数の置換を含み、ポリペプチド配列のアミノ酸位置は、配列番号２または１８を参照して番号付けされる。

一部の追加の実施形態では、組換えアミラーゼは、配列番号２もしくは１８に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくはそれを超える配列同一性を有するポリペプチド配列、またはその機能的断片を含み、組換えアミラーゼは、１６Ｄ、２６Ａ、２９Ｇ、２９Ｒ、２９Ｓ、２９Ａ、２９Ｅ、３３Ｅ、９１Ｈ、１１４Ｈ、１５７Ｙ、１５８Ｒ、１８０Ｅ、１８０Ｑ、１８４Ｄ、１８４Ｋ、２１４Ｇ、２２３Ｌ、２５６Ｔ、２７２Ｇ、２７２Ｋ、２７２Ｐ、２７２Ｒ、２７２Ｓ、２９８Ｈ、３０２Ｑ、３０２Ｇ、３０２Ｈ、３０２Ｒ、３０２Ｖ、３０２Ｗ、３７１Ｆ、３８０Ｒ、３８３Ｅ、３８３Ｉ、３９４Ｎ、３９４Ｓ、３９４Ｇ、４１２Ａ、４１２Ｌ、４１２Ｄ、４１２Ｓ、４２８Ｔおよび４３７Ｌから選択される１個または複数の置換を含み、ポリペプチド配列のアミノ酸位置は、配列番号２または１８を参照して番号付けされる。

一部の追加の実施形態では、組換えアミラーゼは、配列番号２もしくは１８に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくはそれを超える配列同一性を有するポリペプチド配列、またはその機能的断片を含み、組換えアミラーゼは、２／７３／２５６／４９３、１６／３３／７３／１３０／２５６／２８２／３７１／３７４／４９３、１６／３３／１３０／２５６／３０２／３７１／３８３／４７０、１６／３３／１５７／２５６／３０２／３７１／３８３、１６／７３／７４／２５６／２８２／３６６／３７１／３８３／４９３、１６／７３／２５６／２８２／３０２／３３１／３７１／３８３、１６／１３０／２５６／２７６／３７４／４７０、１６／２５６／３０２／３７４、１９／７２／３４５／４７３、２６／２７／３９６／４１２／４２８／４７３、２６／２７／４１２、２６／２７／４６６／４７３、２９、７３／１３０／２５６／２８２／３０２／４９３、７４／３７１／３７４／３８３／４９３、１３０／２５６／４９３、１４９、１５８、２５４、２５６、２５６／３８３、２５７、２５９、２７２、２７９、２８４、３１７／３８３、３２２、３４５／３８８／３９６／４２８、３８８／３９６／４１２／４２８、３９６／４１２、３９６／４１２／４２８／４６６、４０９、４１２および４９５から選択される１個または複数の位置に少なくとも１個の置換または置換セットを含み、ポリペプチド配列のアミノ酸位置は、配列番号２または１８を参照して番号付けされる。一部のさらなる実施形態では、組換えアミラーゼは、配列番号２もしくは１８に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくはそれを超える配列同一性を有するポリペプチド配列、またはその機能的断片を含み、組換えアミラーゼは、２Ｋ／７３Ｖ／２５６Ｓ／４９３Ｄ、１６Ｄ／３３Ｅ／７３Ｖ／１３０Ｄ／２５６Ｓ／２８２Ｄ／３７１Ｆ／３７４Ｓ／４９３Ｄ、１６Ｄ／３３Ｅ／１３０Ｄ／２５６Ｓ／３０２Ｑ／３７１Ｆ／３８３Ｅ／４７０Ｔ、１６Ｄ／３３Ｅ／１５７Ｙ／２５６Ｓ／３０２Ｑ／３７１Ｆ／３８３Ｅ、１６Ｄ／７３Ｖ／７４Ａ／２５６Ｓ／２８２Ｄ／３６６Ｌ／３７１Ｆ／３８３Ｅ／４９３Ｄ、１６Ｄ／７３Ｖ／２５６Ｓ／２８２Ｄ／３０２Ｑ／３３１Ｐ／３７１Ｆ／３８３Ｅ、１６Ｄ／１３０Ｄ／２５６Ｓ／２７６Ｑ／３７４Ｓ／４７０Ｔ、１６Ｄ／２５６Ｓ／３０２Ｑ／３７４Ｓ、１９Ｅ／７２Ｔ／３４５Ａ／４７３Ｄ、２６Ａ／２７Ｌ／３９６Ｈ／４１２Ｄ／４２８Ｅ／４７３Ｄ、２６Ａ／２７Ｌ／４１２Ｄ、２６Ａ／２７Ｌ／４６６Ｅ／４７３Ｄ、２９Ｇ、２９Ｒ、２９Ｓ、７３Ｖ／１３０Ｄ／２５６Ｓ／２８２Ｄ／３０２Ｑ／４９３Ｄ、７４Ａ／３７１Ｆ／３７４Ｓ／３８３Ｅ／４９３Ｄ、１３０Ｄ／２５６Ｓ／４９３Ｄ、１４９Ｒ、１４９Ｔ、１５８Ｒ、２５４Ｇ、２５４Ｓ、２５６Ｓ、２５６Ｓ／３８３Ｅ、２５７Ｅ、２５７Ｇ、２５７Ｒ、２５７Ｓ、２５７Ｖ、２５９Ｑ、２７２Ｇ、２７２Ｋ、２７２Ｐ、２７２Ｒ、２７２Ｓ、２７９Ｒ、２８４Ｃ、２８４Ｒ、２８４Ｓ、２８４Ｙ、３１７Ｇ／３８３Ｌ、３２２Ａ、３４５Ａ／３８８Ｅ／３９６Ｈ／４２８Ｅ、３８８Ｅ／３９６Ｈ／４１２Ｄ／４２８Ｅ、３９６Ｈ／４１２Ｄ、３９６Ｈ／４１２Ｄ／４２８Ｅ／４６６Ｅ、４０９Ｓ、４１２Ｓ、４９５Ｅ、４９５Ｌおよび４９５Ｙから選択される少なくとも１個の置換または置換セットを含み、ポリペプチド配列のアミノ酸位置は、配列番号２または１８を参照して番号付けされる。一部のさらなる実施形態では、組換えアミラーゼは、配列番号２もしくは１８に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくはそれを超える配列同一性を有するポリペプチド配列、またはその機能的断片を含み、組換えアミラーゼは、Ｒ２Ｋ／Ｉ７３Ｖ／Ａ２５６Ｓ／Ｅ４９３Ｄ、Ｅ１６Ｄ／Ｄ３３Ｅ／Ｉ７３Ｖ／Ｅ１３０Ｄ／Ａ２５６Ｓ／Ｅ２８２Ｄ／Ｙ３７１Ｆ／Ｈ３７４Ｓ／Ｅ４９３Ｄ、Ｅ１６Ｄ／Ｄ３３Ｅ／Ｅ１３０Ｄ／Ａ２５６Ｓ／Ｍ３０２Ｑ／Ｙ３７１Ｆ／Ｑ３８３Ｅ／Ｖ４７０Ｔ、Ｅ１６Ｄ／Ｄ３３Ｅ／Ｆ１５７Ｙ／Ａ２５６Ｓ／Ｍ３０２Ｑ／Ｙ３７１Ｆ／Ｑ３８３Ｅ、Ｅ１６Ｄ／Ｉ７３Ｖ／Ｐ７４Ａ／Ａ２５６Ｓ／Ｅ２８２Ｄ／Ｆ３６６Ｌ／Ｙ３７１Ｆ／Ｑ３８３Ｅ／Ｅ４９３Ｄ、Ｅ１６Ｄ／Ｉ７３Ｖ／Ａ２５６Ｓ／Ｅ２８２Ｄ／Ｍ３０２Ｑ／Ｈ３３１Ｐ／Ｙ３７１Ｆ／Ｑ３８３Ｅ、Ｅ１６Ｄ／Ｅ１３０Ｄ／Ａ２５６Ｓ／Ｔ２７６Ｑ／Ｈ３７４Ｓ／Ｖ４７０Ｔ、Ｅ１６Ｄ／Ａ２５６Ｓ／Ｍ３０２Ｑ／Ｈ３７４Ｓ、Ｋ１９Ｅ／Ｓ７２Ｔ／Ｐ３４５Ａ／Ｅ４７３Ｄ、Ｅ２６Ａ／Ｒ２７Ｌ／Ｄ３９６Ｈ／Ｌ４１２Ｄ／Ｄ４２８Ｅ／Ｅ４７３Ｄ、Ｅ２６Ａ／Ｒ２７Ｌ／Ｌ４１２Ｄ、Ｅ２６Ａ／Ｒ２７Ｌ／Ｑ４６６Ｅ／Ｅ４７３Ｄ、Ｄ２９Ｇ、Ｄ２９Ｒ、Ｄ２９Ｓ、Ｉ７３Ｖ／Ｅ１３０Ｄ／Ａ２５６Ｓ／Ｅ２８２Ｄ／Ｍ３０２Ｑ／Ｅ４９３Ｄ、Ｐ７４Ａ／Ｙ３７１Ｆ／Ｈ３７４Ｓ／Ｑ３８３Ｅ／Ｅ４９３Ｄ、Ｅ１３０Ｄ／Ａ２５６Ｓ／Ｅ４９３Ｄ、Ｑ１４９Ｒ、Ｑ１４９Ｔ、Ｋ１５８Ｒ、Ｅ２５４Ｇ、Ｅ２５４Ｓ、Ａ２５６Ｓ、Ａ２５６Ｓ／Ｑ３８３Ｅ、Ｐ２５７Ｅ、Ｐ２５７Ｇ、Ｐ２５７Ｒ、Ｐ２５７Ｓ、Ｐ２５７Ｖ、Ｐ２５９Ｑ、Ｄ２７２Ｇ、Ｄ２７２Ｋ、Ｄ２７２Ｐ、ｄｄＤ２７２Ｒ、Ｄ２７２Ｓ、Ｄ２７９Ｒ、Ｋ２８４Ｃ、Ｋ２８４Ｒ、Ｋ２８４Ｓ、Ｋ２８４Ｙ、Ｖ３１７Ｇ／Ｑ３８３Ｌ、Ｆ３２２Ａ、Ｐ３４５Ａ／Ｄ３８８Ｅ／Ｄ３９６Ｈ／Ｄ４２８Ｅ、Ｄ３８８Ｅ／Ｄ３９６Ｈ／Ｌ４１２Ｄ／Ｄ４２８Ｅ、Ｄ３９６Ｈ／Ｌ４１２Ｄ、Ｄ３９６Ｈ／Ｌ４１２Ｄ／Ｄ４２８Ｅ／Ｑ４６６Ｅ、Ｖ４０９Ｓ、Ｌ４１２Ｓ、Ｉ４９５Ｅ、Ｉ４９５ＬおよびＩ４９５Ｙから選択される少なくとも１個の置換または置換セットを含み、ポリペプチド配列のアミノ酸位置は、配列番号２または１８を参照して番号付けされる。

一部の追加の実施形態では、組換えアミラーゼは、配列番号４０もしくは９８８に対して少なくとも８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくはそれを超える配列同一性を有するポリペプチド配列、またはその機能的断片を含み、組換えアミラーゼは、２６／２９／１５８／２７２／４１２、２６／２９／２７２／２７９／４１２／４９３、２６／２９／２７２／３９６／４１２、２６／２９／２７９／４１２／４２８、２６／１５８／２７２／２７９／３８８／４１２／４２８、２６／１５８／２７２／４１２、２６／２７２／２７９／４１２／４２８／４９３、２９／２７２／２７９／３９６／４１２、１３０／１４９／２５４／２８４／３２２／４０９／４９５、１３０／１４９／２５７／２８４／３２２／４０９／４６６／４７３、１３０／２５４／２８４／３２２／３７４／４０９／４６６、１３０／２５７／２８４／３７４／４０９／４６６、１３０／２８４／３２２／３７４／４０９／４７３、１４９／２５７／２８４／３２２／４０９／４６６、１５８／２７２／２７９／３９４／３９６／４１２／４２８／４９３、１５８／２７２／３８８／４１２／４２８／４９３、１５８／２７２／４１２／４２８、１５８／２７９／３８８／３９６／４１２／４２８、２５４／２５７／２８４／３２２／４０９／４７３、２５４／２８４／４０９／４６６／４９５、２７２／２７９／４１２／４２８／４９３、２７２／４１２／４２８、２７２／４１２／４９３および２８４／３２２／４０９／４７３から選択される１個または複数の位置に少なくとも１個の置換または置換セットを含み、ポリペプチド配列のアミノ酸位置は、配列番号４０または９８８を参照して番号付けされる。一部のさらなる実施形態では、組換えアミラーゼは、配列番号４０もしくは９８８に対して少なくとも８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくはそれを超える配列同一性を有するポリペプチド配列、またはその機能的断片を含み、組換えアミラーゼは、２６Ａ／２９Ｒ／１５８Ｒ／２７２Ｇ／４１２Ｄ、２６Ａ／２９Ｒ／２７２Ｇ／２７９Ｒ／４１２Ｄ／４９３Ｄ、２６Ａ／２９Ｒ／２７２Ｇ／３９６Ｈ／４１２Ｄ、２６Ａ／２９Ｒ／２７９Ｒ／４１２Ｄ／４２８Ｅ、２６Ａ／１５８Ｒ／２７２Ｇ／２７９Ｒ／３８８Ｅ／４１２Ｄ／４２８Ｅ、２６Ａ／１５８Ｒ／２７２Ｇ／４１２Ｄ、２６Ａ／２７２Ｇ／２７９Ｒ／４１２Ｄ／４２８Ｅ／４９３Ｄ、２９Ｒ／２７２Ｇ／２７９Ｒ／３９６Ｈ／４１２Ｄ、１３０Ｄ／１４９Ｒ／２５４Ｓ／２８４Ｓ／３２２Ａ／４０９Ｓ／４９５Ｅ、１３０Ｄ／１４９Ｒ／２５７Ｇ／２８４Ｓ／３２２Ａ／４０９Ｓ／４６６Ｅ／４７３Ｄ、１３０Ｄ／２５４Ｓ／２８４Ｓ／３２２Ａ／３７４Ｓ／４０９Ｓ／４６６Ｅ、１３０Ｄ／２５７Ｇ／２８４Ｓ／３７４Ｓ／４０９Ｓ／４６６Ｅ、１３０Ｄ／２８４Ｓ／３２２Ａ／３７４Ｓ／４０９Ｓ／４７３Ｄ、１４９Ｒ／２５７Ｇ／２８４Ｓ／３２２Ａ／４０９Ｓ／４６６Ｅ、１５８Ｒ／２７２Ｇ／２７９Ｒ／３９４Ｒ／３９６Ｈ／４１２Ｄ／４２８Ｅ／４９３Ｄ、１５８Ｒ／２７２Ｇ／３８８Ｅ／４１２Ｄ／４２８Ｅ／４９３Ｄ、１５８Ｒ／２７２Ｇ／４１２Ｄ／４２８Ｅ、１５８Ｒ／２７９Ｒ／３８８Ｅ／３９６Ｈ／４１２Ｄ／４２８Ｅ、２５４Ｓ／２５７Ｇ／２８４Ｓ／３２２Ａ／４０９Ｓ／４７３Ｄ、２５４Ｓ／２８４Ｓ／４０９Ｓ／４６６Ｅ／４９５Ｅ、２７２Ｇ／２７９Ｒ／４１２Ｄ／４２８Ｅ／４９３Ｄ、２７２Ｇ／４１２Ｄ／４２８Ｅ、２７２Ｇ／４１２Ｄ／４９３Ｄおよび２８４Ｓ／３２２Ａ／４０９Ｓ／４７３Ｄから選択される少なくとも１個の置換または置換セットを含み、ポリペプチド配列のアミノ酸位置は、配列番号４０または９８８を参照して番号付けされる。一部のさらなる実施形態では、組換えアミラーゼは、配列番号４０もしくは９８８に対して少なくとも８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくはそれを超える配列同一性を有するポリペプチド配列、またはその機能的断片を含み、組換えアミラーゼは、Ｅ２６Ａ／Ｄ２９Ｒ／Ｋ１５８Ｒ／Ｄ２７２Ｇ／Ｌ４１２Ｄ、Ｅ２６Ａ／Ｄ２９Ｒ／Ｄ２７２Ｇ／Ｄ２７９Ｒ／Ｌ４１２Ｄ／Ｅ４９３Ｄ、Ｅ２６Ａ／Ｄ２９Ｒ／Ｄ２７２Ｇ／Ｄ３９６Ｈ／Ｌ４１２Ｄ、Ｅ２６Ａ／Ｄ２９Ｒ／Ｄ２７９Ｒ／Ｌ４１２Ｄ／Ｄ４２８Ｅ、Ｅ２６Ａ／Ｋ１５８Ｒ／Ｄ２７２Ｇ／Ｄ２７９Ｒ／Ｄ３８８Ｅ／Ｌ４１２Ｄ／Ｄ４２８Ｅ、Ｅ２６Ａ／Ｋ１５８Ｒ／Ｄ２７２Ｇ／Ｌ４１２Ｄ、Ｅ２６Ａ／Ｄ２７２Ｇ／Ｄ２７９Ｒ／Ｌ４１２Ｄ／Ｄ４２８Ｅ／Ｅ４９３Ｄ、Ｄ２９Ｒ／Ｄ２７２Ｇ／Ｄ２７９Ｒ／Ｄ３９６Ｈ／Ｌ４１２Ｄ、Ｅ１３０Ｄ／Ｑ１４９Ｒ／Ｅ２５４Ｓ／Ｋ２８４Ｓ／Ｆ３２２Ａ／Ｖ４０９Ｓ／Ｉ４９５Ｅ、Ｅ１３０Ｄ／Ｑ１４９Ｒ／Ｐ２５７Ｇ／Ｋ２８４Ｓ／Ｆ３２２Ａ／Ｖ４０９Ｓ／Ｑ４６６Ｅ／Ｅ４７３Ｄ、Ｅ１３０Ｄ／Ｅ２５４Ｓ／Ｋ２８４Ｓ／Ｆ３２２Ａ／Ｈ３７４Ｓ／Ｖ４０９Ｓ／Ｑ４６６Ｅ、Ｅ１３０Ｄ／Ｐ２５７Ｇ／Ｋ２８４Ｓ／Ｈ３７４Ｓ／Ｖ４０９Ｓ／Ｑ４６６Ｅ、Ｅ１３０Ｄ／Ｋ２８４Ｓ／Ｆ３２２Ａ／Ｈ３７４Ｓ／Ｖ４０９Ｓ／Ｅ４７３Ｄ、Ｑ１４９Ｒ／Ｐ２５７Ｇ／Ｋ２８４Ｓ／Ｆ３２２Ａ／Ｖ４０９Ｓ／Ｑ４６６Ｅ、Ｋ１５８Ｒ／Ｄ２７２Ｇ／Ｄ２７９Ｒ／Ｑ３９４Ｒ／Ｄ３９６Ｈ／Ｌ４１２Ｄ／Ｄ４２８Ｅ／Ｅ４９３Ｄ、Ｋ１５８Ｒ／Ｄ２７２Ｇ／Ｄ３８８Ｅ／Ｌ４１２Ｄ／Ｄ４２８Ｅ／Ｅ４９３Ｄ、Ｋ１５８Ｒ／Ｄ２７２Ｇ／Ｌ４１２Ｄ／Ｄ４２８Ｅ、Ｋ１５８Ｒ／Ｄ２７９Ｒ／Ｄ３８８Ｅ／Ｄ３９６Ｈ／Ｌ４１２Ｄ／Ｄ４２８Ｅ、Ｅ２５４Ｓ／Ｐ２５７Ｇ／Ｋ２８４Ｓ／Ｆ３２２Ａ／Ｖ４０９Ｓ／Ｅ４７３Ｄ、Ｅ２５４Ｓ／Ｋ２８４Ｓ／Ｖ４０９Ｓ／Ｑ４６６Ｅ／Ｉ４９５Ｅ、Ｄ２７２Ｇ／Ｄ２７９Ｒ／Ｌ４１２Ｄ／Ｄ４２８Ｅ／Ｅ４９３Ｄ、Ｄ２７２Ｇ／Ｌ４１２Ｄ／Ｄ４２８Ｅ、Ｄ２７２Ｇ／Ｌ４１２Ｄ／Ｅ４９３ＤおよびＫ２８４Ｓ／Ｆ３２２Ａ／Ｖ４０９Ｓ／Ｅ４７３Ｄから選択される少なくとも１個の置換または置換セットを含み、ポリペプチド配列のアミノ酸位置は、配列番号４０または９８８を参照して番号付けされる。

一部の追加の実施形態では、組換えアミラーゼは、配列番号１５６もしくは１１０４に対して少なくとも８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくはそれを超える配列同一性を有するポリペプチド配列、またはその機能的断片を含み、組換えアミラーゼは、３７、５１、９１、１１１、１１２、１１４、１２２、１２４、１２８、１４０、１６７、１７１、１８３、１９４、２７６、２８０、２９８、３９７および４６４から選択される１個または複数の位置に少なくとも１個の置換または置換セットを含み、ポリペプチド配列のアミノ酸位置は、配列番号１５６または１１０４を参照して番号付けされる。一部のさらなる実施形態では、組換えアミラーゼは、配列番号１５６もしくは１１０４に対して少なくとも８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくはそれを超える配列同一性を有するポリペプチド配列、またはその機能的断片を含み、組換えアミラーゼは、３７Ｒ、５１Ｒ、９１Ｈ、１１１Ａ、１１２Ｑ、１１４Ｈ、１２２Ｐ、１２２Ｒ、１２４Ｒ、１２８Ｗ、１４０Ｋ、１６７Ｗ、１７１Ｉ、１８３Ｅ、１８３Ｎ、１８３Ｖ、１９４Ｅ、１９４Ｒ、２７６Ａ、２７６Ｋ、２８０Ｌ、２９８Ｋ、２９８Ｍ、３９７Ｔおよび４６４Ｌから選択される少なくとも１個の置換または置換セットを含み、ポリペプチド配列のアミノ酸位置は、配列番号１５６または１１０４を参照して番号付けされる。一部のさらなる実施形態では、組換えアミラーゼは、配列番号１５６もしくは１１０４に対して少なくとも８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくはそれを超える配列同一性を有するポリペプチド配列、またはその機能的断片を含み、組換えアミラーゼは、Ｎ３７Ｒ、Ｇ５１Ｒ、Ｋ９１Ｈ、Ｅ１１１Ａ、Ｋ１１２Ｑ、Ａ１１４Ｈ、Ａ１２２Ｐ、Ａ１２２Ｒ、Ｄ１２４Ｒ、Ｉ１２８Ｗ、Ｒ１４０Ｋ、Ｅ１６７Ｗ、Ｅ１７１Ｉ、Ｇ１８３Ｅ、Ｇ１８３Ｎ、Ｇ１８３Ｖ、Ｌ１９４Ｅ、Ｌ１９４Ｒ、Ｔ２７６Ａ、Ｔ２７６Ｋ、Ｑ２８０Ｌ、Ｅ２９８Ｋ、Ｅ２９８Ｍ、Ｅ３９７ＴおよびＮ４６４Ｌから選択される少なくとも１個の置換または置換セットを含み、ポリペプチド配列のアミノ酸位置は、配列番号１５６または１１０４を参照して番号付けされる。

一部の追加の実施形態では、組換えアミラーゼは、配列番号１７４もしくは１１２２に対して少なくとも８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくはそれを超える配列同一性を有するポリペプチド配列、またはその機能的断片を含み、組換えアミラーゼは、２４、９１、９１／１２２、９１／１２２／１２８／１３０／１６７／１７１／４０９、９１／１２２／１２８／１３０／１８３／３２２、９１／１２２／１２８／１３０／１９４、９１／１２２／１２８／１３０／３２２、９１／１２２／１２８／１７１／１８３／１９４／３２２、９１／１２２／１２８／１８３／４０９、９１／１２２／１３０／１６７／１８３／１９４／４０９、９１／１２２／１３０／１７１／１８３、９１／１２２／１３０／１８３／１９４、９１／１２２／１３０／１９４、９１／１２２／１３０／１９４／３２２、９１／１２２／１６７／１７１／１９４、９１／１２２／１６７／１７１／１９４／３２２、９１／１２２／１７１／１８３／１９４／４０９、９１／１３０／１７１／１８３／３２２／４０９、９１／１６７／１７１、９１／１６７／１８３／１９４、９１／１６７／３２２、９１／１８３、９１／１８３／３２２／４０９、９１／１９４、９１／３２２、９１／４０９、１２２／１２８、１２２／１２８／１９４／４０９、１２２／１３０／１７１／３２２／４０９、１２２／４０９、１３７／１４５／２２７／３９４／４８０／４８１、１３７／１４５／２９５、１４５／２２７／２９５／４８１、１４５／３０９／４８１、１８３、２２７、２９５／３９４、３２２、３２２／４０９、３９４および４８０／４８１から選択される１個または複数の位置に少なくとも１個の置換または置換セットを含み、ポリペプチド配列のアミノ酸位置は、配列番号１７４または１１２２を参照して番号付けされる。一部のさらなる実施形態では、組換えアミラーゼは、配列番号１７４もしくは１１２２に対して少なくとも８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくはそれを超える配列同一性を有するポリペプチド配列、またはその機能的断片を含み、組換えアミラーゼは、２４Ｖ、９１Ｈ、９１Ｈ／１２２Ｐ、９１Ｈ／１２２Ｐ／１３０Ｄ／１８３Ｎ／１９４Ｒ、９１Ｈ／１２２Ｐ／１３０Ｄ／１９４Ｒ／３２２Ａ、９１Ｈ／１２２Ｒ、９１Ｈ／１２２Ｒ／１２８Ｗ／１３０Ｄ／１６７Ｗ／１７１Ｉ／４０９Ｓ、９１Ｈ／１２２Ｒ／１２８Ｗ／１３０Ｄ／１８３Ｎ／３２２Ａ、９１Ｈ／１２２Ｒ／１２８Ｗ／１３０Ｄ／１９４Ｒ、９１Ｈ／１２２Ｒ／１２８Ｗ／１３０Ｄ／３２２Ａ、９１Ｈ／１２２Ｒ／１２８Ｗ／１７１Ｉ／１８３Ｎ／１９４Ｒ／３２２Ａ、９１Ｈ／１２２Ｒ／１２８Ｗ／１８３Ｎ／４０９Ｓ、９１Ｈ／１２２Ｒ／１３０Ｄ／１６７Ｗ／１８３Ｎ／１９４Ｒ／４０９Ｓ、９１Ｈ／１２２Ｒ／１３０Ｄ／１７１Ｉ／１８３Ｎ、９１Ｈ／１２２Ｒ／１３０Ｄ／１９４Ｒ、９１Ｈ／１２２Ｒ／１６７Ｗ／１７１Ｉ／１９４Ｒ、９１Ｈ／１２２Ｒ／１６７Ｗ／１７１Ｉ／１９４Ｒ／３２２Ａ、９１Ｈ／１２２Ｒ／１７１Ｉ／１８３Ｎ／１９４Ｒ／４０９Ｓ、９１Ｈ／１３０Ｄ／１７１Ｉ／１８３Ｎ／３２２Ａ／４０９Ｓ、９１Ｈ／１６７Ｗ／１７１Ｉ、９１Ｈ／１６７Ｗ／１８３Ｎ／１９４Ｒ、９１Ｈ／１６７Ｗ／３２２Ａ、９１Ｈ／１８３Ｎ、９１Ｈ／１８３Ｎ／３２２Ａ／４０９Ｓ、９１Ｈ／１９４Ｒ、９１Ｈ／３２２Ａ、９１Ｈ／４０９Ｓ、１２２Ｐ／４０９Ｓ、１２２Ｒ／１２８Ｗ、１２２Ｒ／１２８Ｗ／１９４Ｒ／４０９Ｓ、１２２Ｒ／１３０Ｄ／１７１Ｉ／３２２Ａ／４０９Ｓ、１３７Ａ／１４５Ｇ／２２７Ｌ／３９４Ｅ／４８０Ｐ／４８１Ｖ、１３７Ａ／１４５Ｇ／２９５Ｎ、１４５Ｇ／２２７Ｌ／２９５Ｎ／４８１Ｖ、１４５Ｇ／３０９Ｓ／４８１Ｖ、１８３Ｎ、２２７Ｌ、２９５Ｎ／３９４Ｅ、３２２Ａ、３２２Ａ／４０９Ｓ、３９４Ｅおよび４８０Ｔ／４８１Ｖから選択される少なくとも１個の置換または置換セットを含み、ポリペプチド配列のアミノ酸位置は、配列番号１７４または１１２２を参照して番号付けされる。一部のさらなる実施形態では、組換えアミラーゼは、配列番号１７４もしくは１１２２に対して少なくとも８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくはそれを超える配列同一性を有するポリペプチド配列、またはその機能的断片を含み、組換えアミラーゼは、Ｌ２４Ｖ、Ｋ９１Ｈ、Ｋ９１Ｈ／Ａ１２２Ｐ、Ｋ９１Ｈ／Ａ１２２Ｐ／Ｅ１３０Ｄ／Ｇ１８３Ｎ／Ｌ１９４Ｒ、Ｋ９１Ｈ／Ａ１２２Ｐ／Ｅ１３０Ｄ／Ｌ１９４Ｒ／Ｆ３２２Ａ、Ｋ９１Ｈ／Ａ１２２Ｒ、Ｋ９１Ｈ／Ａ１２２Ｒ／Ｉ１２８Ｗ／Ｅ１３０Ｄ／Ｅ１６７Ｗ／Ｅ１７１Ｉ／Ｖ４０９Ｓ、Ｋ９１Ｈ／Ａ１２２Ｒ／Ｉ１２８Ｗ／Ｅ１３０Ｄ／Ｇ１８３Ｎ／Ｆ３２２Ａ、Ｋ９１Ｈ／Ａ１２２Ｒ／Ｉ１２８Ｗ／Ｅ１３０Ｄ／Ｌ１９４Ｒ、Ｋ９１Ｈ／Ａ１２２Ｒ／Ｉ１２８Ｗ／Ｅ１３０Ｄ／Ｆ３２２Ａ、Ｋ９１Ｈ／Ａ１２２Ｒ／Ｉ１２８Ｗ／Ｅ１７１Ｉ／Ｇ１８３Ｎ／Ｌ１９４Ｒ／Ｆ３２２Ａ、Ｋ９１Ｈ／Ａ１２２Ｒ／Ｉ１２８Ｗ／Ｇ１８３Ｎ／Ｖ４０９Ｓ、Ｋ９１Ｈ／Ａ１２２Ｒ／Ｅ１３０Ｄ／Ｅ１６７Ｗ／Ｇ１８３Ｎ／Ｌ１９４Ｒ／Ｖ４０９Ｓ、Ｋ９１Ｈ／Ａ１２２Ｒ／Ｅ１３０Ｄ／Ｅ１７１Ｉ／Ｇ１８３Ｎ、Ｋ９１Ｈ／Ａ１２２Ｒ／Ｅ１３０Ｄ／Ｌ１９４Ｒ、Ｋ９１Ｈ／Ａ１２２Ｒ／Ｅ１６７Ｗ／Ｅ１７１Ｉ／Ｌ１９４Ｒ、Ｋ９１Ｈ／Ａ１２２Ｒ／Ｅ１６７Ｗ／Ｅ１７１Ｉ／Ｌ１９４Ｒ／Ｆ３２２Ａ、Ｋ９１Ｈ／Ａ１２２Ｒ／Ｅ１７１Ｉ／Ｇ１８３Ｎ／Ｌ１９４Ｒ／Ｖ４０９Ｓ、Ｋ９１Ｈ／Ｅ１３０Ｄ／Ｅ１７１Ｉ／Ｇ１８３Ｎ／Ｆ３２２Ａ／Ｖ４０９Ｓ、Ｋ９１Ｈ／Ｅ１６７Ｗ／Ｅ１７１Ｉ、Ｋ９１Ｈ／Ｅ１６７Ｗ／Ｇ１８３Ｎ／Ｌ１９４Ｒ、Ｋ９１Ｈ／Ｅ１６７Ｗ／Ｆ３２２Ａ、Ｋ９１Ｈ／Ｇ１８３Ｎ、Ｋ９１Ｈ／Ｇ１８３Ｎ／Ｆ３２２Ａ／Ｖ４０９Ｓ、Ｋ９１Ｈ／Ｌ１９４Ｒ、Ｋ９１Ｈ／Ｆ３２２Ａ、Ｋ９１Ｈ／Ｖ４０９Ｓ、Ａ１２２Ｐ／Ｖ４０９Ｓ、Ａ１２２Ｒ／Ｉ１２８Ｗ、Ａ１２２Ｒ／Ｉ１２８Ｗ／Ｌ１９４Ｒ／Ｖ４０９Ｓ、Ａ１２２Ｒ／Ｅ１３０Ｄ／Ｅ１７１Ｉ／Ｆ３２２Ａ／Ｖ４０９Ｓ、Ｇ１３７Ａ／Ａ１４５Ｇ／Ｔ２２７Ｌ／Ｑ３９４Ｅ／Ｆ４８０Ｐ／Ｃ４８１Ｖ、Ｇ１３７Ａ／Ａ１４５Ｇ／Ｋ２９５Ｎ、Ａ１４５Ｇ／Ｔ２２７Ｌ／Ｋ２９５Ｎ／Ｃ４８１Ｖ、Ａ１４５Ｇ／Ｔ３０９Ｓ／Ｃ４８１Ｖ、Ｇ１８３Ｎ、Ｔ２２７Ｌ、Ｋ２９５Ｎ／Ｑ３９４Ｅ、Ｆ３２２Ａ、Ｆ３２２Ａ／Ｖ４０９Ｓ、Ｑ３９４ＥおよびＦ４８０Ｔ／Ｃ４８１Ｖから選択される少なくとも１個の置換または置換セットを含み、ポリペプチド配列のアミノ酸位置は、配列番号１７４または１１２２を参照して番号付けされる。

一部の追加の実施形態では、組換えアミラーゼは、配列番号２７６もしくは１２２４に対して少なくとも８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくはそれを超える配列同一性を有するポリペプチド配列、またはその機能的断片を含み、組換えアミラーゼは、１６／２６／２９／１２８／１４５／２５６／３０９／３８３、１６／２６／３３／１１４／１４５／３０９／３８３／３９４、１６／２６／３３／１２８／１３０／１４５／３０２／３０９／３２２／３７１、１６／２６／３３／１４５／１５８／３８３／３９４、１６／２６／１４５／３０２、１６／２９／３３／１４５／２５６／３０２、１８、２６／２９／３３／１３０／１４５／１５７／１５８／１８３／３９４、２６／２９／３３／１４５／１５７／１８３／２５６／３０９／３８３、２６／２９／１２２／１３０／１４５／１８３／２５６／２７２／３０９／３９４、２６／２９／１４５／１５７／２５６／３０２／３２２／４８１、２６／２９／１４５／２５６／２７２／３０２／３０９／３２２／４８１、２６／３３／９１／１４５／２７２／３０２／４８１、２６／３３／１４５／３０９／３２２／３８３、２６／１１４／１４５／３２２、２６／１４５／１８３／２５６／３０９／３８３、２９／１２２／１４５／１５８／３８３、２９／１３０／１４５／２５６／２７２／３７１／３９４、２９／１４５／１８３／３０２／３０９／４１２、２９／３０９／３９４、３３／１２２／１４５／２７２／３０９／４１２、９１／１３０／１４５／１５８／１８３／３８３、９１／３０９／３８３、１３０／１４５／２５６／２７２／３７１、１３０／１４５／３０２／３０９、１３０／２７２／４８１、１４５／３０２／３０９、２６８、３０９、３４９、３６０、３８０、３９４、４６３および４８３から選択される１個または複数の位置に少なくとも１個の置換または置換セットを含み、ポリペプチド配列のアミノ酸位置は、配列番号２７６または１２２４を参照して番号付けされる。一部のさらなる実施形態では、組換えアミラーゼは、配列番号２７６もしくは１２２４に対して少なくとも８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくはそれを超える配列同一性を有するポリペプチド配列、またはその機能的断片を含み、組換えアミラーゼは、１６Ｅ／２６Ｅ／２９Ｄ／１２８Ｉ／１４５Ｇ／２５６Ａ／３０９Ｓ／３８３Ｑ、１６Ｅ／２６Ｅ／３３Ｄ／１１４Ａ／１４５Ｇ／３０９Ｓ／３８３Ｑ／３９４Ｅ、１６Ｅ／２６Ｅ／３３Ｄ／１２８Ｉ／１３０Ｅ／１４５Ｇ／３０２Ｍ／３０９Ｓ／３２２Ｆ／３７１Ｙ、１６Ｅ／２６Ｅ／３３Ｄ／１４５Ｇ／１５８Ｋ／３８３Ｑ／３９４Ｅ、１６Ｅ／２６Ｅ／１４５Ｇ／３０２Ｍ、１６Ｅ／２９Ｄ／３３Ｄ／１４５Ｇ／２５６Ａ／３０２Ｍ、１８Ｓ、２６Ｅ／２９Ｄ／３３Ｄ／１３０Ｅ／１４５Ｇ／１５７Ｆ／１５８Ｋ／１８３Ｇ／３９４Ｅ、２６Ｅ／２９Ｄ／３３Ｄ／１４５Ｇ／１５７Ｆ／１８３Ｇ／２５６Ａ／３０９Ｓ／３８３Ｑ、２６Ｅ／２９Ｄ／１２２Ａ／１３０Ｅ／１４５Ｇ／１８３Ｇ／２５６Ａ／２７２Ｄ／３０９Ｓ／３９４Ｅ、２６Ｅ／２９Ｄ／１４５Ｇ／１５７Ｆ／２５６Ａ／３０２Ｍ／３２２Ｆ／４８１Ｖ、２６Ｅ／２９Ｄ／１４５Ｇ／２５６Ａ／２７２Ｄ／３０２Ｍ／３０９Ｓ／３２２Ｆ／４８１Ｖ、２６Ｅ／３３Ｄ／９１Ｋ／１４５Ｇ／２７２Ｄ／３０２Ｍ／４８１Ｖ、２６Ｅ／３３Ｄ／１４５Ｇ／３０９Ｓ／３２２Ｆ／３８３Ｑ、２６Ｅ／１１４Ａ／１４５Ｇ／３２２Ｆ、２６Ｅ／１４５Ｇ／１８３Ｇ／２５６Ａ／３０９Ｓ／３８３Ｑ、２９Ｄ／１２２Ａ／１４５Ｇ／１５８Ｋ／３８３Ｑ、２９Ｄ／１３０Ｅ／１４５Ｇ／２５６Ａ／２７２Ｄ／３７１Ｙ／３９４Ｅ、２９Ｄ／１４５Ｇ／１８３Ｇ／３０２Ｍ／３０９Ｓ／４１２Ｌ、２９Ｄ／３０９Ｓ／３９４Ｅ、３３Ｄ／１２２Ａ／１４５Ｇ／２７２Ｄ／３０９Ｓ／４１２Ｌ、９１Ｋ／１３０Ｅ／１４５Ｇ／１５８Ｋ／１８３Ｇ／３８３Ｑ、９１Ｋ／３０９Ｓ／３８３Ｑ、１３０Ｅ／１４５Ｇ／２５６Ａ／２７２Ｄ／３７１Ｙ、１３０Ｅ／１４５Ｇ／３０２Ｍ／３０９Ｓ、１３０Ｅ／２７２Ｄ／４８１Ｖ、１４５Ｇ／３０２Ｍ／３０９Ｓ、２６８Ｔ、３０９Ａ、３４９Ｒ、３６０Ｇ、３８０Ｒ、３９４Ｇ、３９４Ｎ、３９４Ｓ、４６３Ｍおよび４８３Ｔから選択される少なくとも１個の置換または置換セットを含み、ポリペプチド配列のアミノ酸位置は、配列番号２７６または１２２４を参照して番号付けされる。一部のさらなる実施形態では、組換えアミラーゼは、配列番号２７６もしくは１２２４に対して少なくとも８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくはそれを超える配列同一性を有するポリペプチド配列、またはその機能的断片を含み、組換えアミラーゼは、Ｄ１６Ｅ／Ａ２６Ｅ／Ｒ２９Ｄ／Ｗ１２８Ｉ／Ａ１４５Ｇ／Ｓ２５６Ａ／Ｔ３０９Ｓ／Ｅ３８３Ｑ、Ｄ１６Ｅ／Ａ２６Ｅ／Ｅ３３Ｄ／Ｈ１１４Ａ／Ａ１４５Ｇ／Ｔ３０９Ｓ／Ｅ３８３Ｑ／Ｑ３９４Ｅ、Ｄ１６Ｅ／Ａ２６Ｅ／Ｅ３３Ｄ／Ｗ１２８Ｉ／Ｄ１３０Ｅ／Ａ１４５Ｇ／Ｑ３０２Ｍ／Ｔ３０９Ｓ／Ａ３２２Ｆ／Ｆ３７１Ｙ、Ｄ１６Ｅ／Ａ２６Ｅ／Ｅ３３Ｄ／Ａ１４５Ｇ／Ｒ１５８Ｋ／Ｅ３８３Ｑ／Ｑ３９４Ｅ、Ｄ１６Ｅ／Ａ２６Ｅ／Ａ１４５Ｇ／Ｑ３０２Ｍ、Ｄ１６Ｅ／Ｒ２９Ｄ／Ｅ３３Ｄ／Ａ１４５Ｇ／Ｓ２５６Ａ／Ｑ３０２Ｍ、Ｇ１８Ｓ、Ａ２６Ｅ／Ｒ２９Ｄ／Ｅ３３Ｄ／Ｄ１３０Ｅ／Ａ１４５Ｇ／Ｙ１５７Ｆ／Ｒ１５８Ｋ／Ｎ１８３Ｇ／Ｑ３９４Ｅ、Ａ２６Ｅ／Ｒ２９Ｄ／Ｅ３３Ｄ／Ａ１４５Ｇ／Ｙ１５７Ｆ／Ｎ１８３Ｇ／Ｓ２５６Ａ／Ｔ３０９Ｓ／Ｅ３８３Ｑ、Ａ２６Ｅ／Ｒ２９Ｄ／Ｒ１２２Ａ／Ｄ１３０Ｅ／Ａ１４５Ｇ／Ｎ１８３Ｇ／Ｓ２５６Ａ／Ｇ２７２Ｄ／Ｔ３０９Ｓ／Ｑ３９４Ｅ、Ａ２６Ｅ／Ｒ２９Ｄ／Ａ１４５Ｇ／Ｙ１５７Ｆ／Ｓ２５６Ａ／Ｑ３０２Ｍ／Ａ３２２Ｆ／Ｃ４８１Ｖ、Ａ２６Ｅ／Ｒ２９Ｄ／Ａ１４５Ｇ／Ｓ２５６Ａ／Ｇ２７２Ｄ／Ｑ３０２Ｍ／Ｔ３０９Ｓ／Ａ３２２Ｆ／Ｃ４８１Ｖ、Ａ２６Ｅ／Ｅ３３Ｄ／Ｈ９１Ｋ／Ａ１４５Ｇ／Ｇ２７２Ｄ／Ｑ３０２Ｍ／Ｃ４８１Ｖ、Ａ２６Ｅ／Ｅ３３Ｄ／Ａ１４５Ｇ／Ｔ３０９Ｓ／Ａ３２２Ｆ／Ｅ３８３Ｑ、Ａ２６Ｅ／Ｈ１１４Ａ／Ａ１４５Ｇ／Ａ３２２Ｆ、Ａ２６Ｅ／Ａ１４５Ｇ／Ｎ１８３Ｇ／Ｓ２５６Ａ／Ｔ３０９Ｓ／Ｅ３８３Ｑ、Ｒ２９Ｄ／Ｒ１２２Ａ／Ａ１４５Ｇ／Ｒ１５８Ｋ／Ｅ３８３Ｑ、Ｒ２９Ｄ／Ｄ１３０Ｅ／Ａ１４５Ｇ／Ｓ２５６Ａ／Ｇ２７２Ｄ／Ｆ３７１Ｙ／Ｑ３９４Ｅ、Ｒ２９Ｄ／Ａ１４５Ｇ／Ｎ１８３Ｇ／Ｑ３０２Ｍ／Ｔ３０９Ｓ／Ｄ４１２Ｌ、Ｒ２９Ｄ／Ｔ３０９Ｓ／Ｑ３９４Ｅ、Ｅ３３Ｄ／Ｒ１２２Ａ／Ａ１４５Ｇ／Ｇ２７２Ｄ／Ｔ３０９Ｓ／Ｄ４１２Ｌ、Ｈ９１Ｋ／Ｄ１３０Ｅ／Ａ１４５Ｇ／Ｒ１５８Ｋ／Ｎ１８３Ｇ／Ｅ３８３Ｑ、Ｈ９１Ｋ／Ｔ３０９Ｓ／Ｅ３８３Ｑ、Ｄ１３０Ｅ／Ａ１４５Ｇ／Ｓ２５６Ａ／Ｇ２７２Ｄ／Ｆ３７１Ｙ、Ｄ１３０Ｅ／Ａ１４５Ｇ／Ｑ３０２Ｍ／Ｔ３０９Ｓ、Ｄ１３０Ｅ／Ｇ２７２Ｄ／Ｃ４８１Ｖ、Ａ１４５Ｇ／Ｑ３０２Ｍ／Ｔ３０９Ｓ、Ｓ２６８Ｔ、Ｔ３０９Ａ、Ｐ３４９Ｒ、Ｎ３６０Ｇ、Ｇ３８０Ｒ、Ｑ３９４Ｇ、Ｑ３９４Ｎ、Ｑ３９４Ｓ、Ｇ４６３ＭおよびＧ４８３Ｔから選択される少なくとも１個の置換または置換セットを含み、ポリペプチド配列のアミノ酸位置は、配列番号２７６または１２２４を参照して番号付けされる。

一部の追加の実施形態では、組換えアミラーゼは、配列番号３０８もしくは１２５６に対して少なくとも８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくはそれを超える配列同一性を有するポリペプチド配列、またはその機能的断片を含み、組換えアミラーゼは、２９、３７／１２４／２５０／２７０／３４９／３８０／３９４／４４２／４９１、３７／１４５、３７／１４５／２５０／３０１／３４９／３９４、３７／１４５／２５８／４４２／４９１、３８／３４９／４９１、８１／２５９、８１／３１３／４９５、９２／２５７／２５８／３３８／４６８、９２／２５８、９４／１２７／１３２／１４５／２５０／３４９、９４／２７０／３０１／３４９／３９４／４４２、９４／３４９／４９１、１４５／２７０、１７８、２２５、２２６、２４６、２５０／３４９／４４２、２５９／３１３／３３８、２７０／３４９、２８６／３３８、２９４、３１３、３４９、３４９／３８０／４４２、４１３、４１３／４６８、４４８および４７３から選択される１個または複数の位置に少なくとも１個の置換または置換セットを含み、ポリペプチド配列のアミノ酸位置は、配列番号３０８または１２５６を参照して番号付けされる。一部のさらなる実施形態では、組換えアミラーゼは、配列番号３０８もしくは１２５６に対して少なくとも８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくはそれを超える配列同一性を有するポリペプチド配列、またはその機能的断片を含み、組換えアミラーゼは、２９Ａ、３７Ｔ／１２４Ｎ／２５０Ｄ／２７０Ｄ／３４９Ｒ／３８０Ｒ／３９４Ｅ／４４２Ｅ／４９１Ｌ、３７Ｔ／１４５Ｇ、３７Ｔ／１４５Ｇ／２５０Ｄ／３０１Ｋ／３４９Ｒ／３９４Ｅ、３７Ｔ／１４５Ｇ／２５８Ｓ／４４２Ｅ／４９１Ｌ、３８Ｉ／３４９Ｒ／４９１Ｌ、８１Ｅ／２５９Ｄ、８１Ｅ／３１３Ｄ／４９５Ｌ、９２Ｅ／２５７Ｅ／２５８Ｑ／３３８Ｓ／４６８Ｔ、９２Ｅ／２５８Ｑ、９４Ｇ／１２７Ｅ／１３２Ｖ／１４５Ｇ／２５０Ｄ／３４９Ｒ、９４Ｇ／２７０Ｄ／３０１Ｋ／３４９Ｒ／３９４Ｅ／４４２Ｅ、９４Ｇ／３４９Ｒ／４９１Ｌ、１４５Ｇ／２７０Ｄ、１７８Ｉ、２２５Ｄ、２２６Ｔ、２４６Ｒ、２５０Ｄ／３４９Ｒ／４４２Ｅ、２５９Ｄ／３１３Ｄ／３３８Ｓ、２７０Ｄ／３４９Ｒ、２８６Ｔ／３３８Ｓ、２９４Ｌ、３１３Ｄ、３４９Ｒ、３４９Ｒ／３８０Ｒ／４４２Ｅ、４１３Ｙ、４１３Ｙ／４６８Ｉ、４４８Ｔおよび４７３Ｄから選択される少なくとも１個の置換または置換セットを含み、ポリペプチド配列のアミノ酸位置は、配列番号３０８または１２５６を参照して番号付けされる。一部のさらなる実施形態では、組換えアミラーゼは、配列番号３０８もしくは１２５６に対して少なくとも８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくはそれを超える配列同一性を有するポリペプチド配列、またはその機能的断片を含み、組換えアミラーゼは、Ｒ２９Ａ、Ｎ３７Ｔ／Ｄ１２４Ｎ／Ｅ２５０Ｄ／Ｅ２７０Ｄ／Ｐ３４９Ｒ／Ｇ３８０Ｒ／Ｇ３９４Ｅ／Ｄ４４２Ｅ／Ｉ４９１Ｌ、Ｎ３７Ｔ／Ａ１４５Ｇ、Ｎ３７Ｔ／Ａ１４５Ｇ／Ｅ２５０Ｄ／Ｒ３０１Ｋ／Ｐ３４９Ｒ／Ｇ３９４Ｅ、Ｎ３７Ｔ／Ａ１４５Ｇ／Ｋ２５８Ｓ／Ｄ４４２Ｅ／Ｉ４９１Ｌ、Ｍ３８Ｉ／Ｐ３４９Ｒ／Ｉ４９１Ｌ、Ａ８１Ｅ／Ｐ２５９Ｄ、Ａ８１Ｅ／Ｔ３１３Ｄ／Ｉ４９５Ｌ、Ｒ９２Ｅ／Ｐ２５７Ｅ／Ｋ２５８Ｑ／Ａ３３８Ｓ／Ｒ４６８Ｔ、Ｒ９２Ｅ／Ｋ２５８Ｑ、Ｄ９４Ｇ／Ｑ１２７Ｅ／Ｉ１３２Ｖ／Ａ１４５Ｇ／Ｅ２５０Ｄ／Ｐ３４９Ｒ、Ｄ９４Ｇ／Ｅ２７０Ｄ／Ｒ３０１Ｋ／Ｐ３４９Ｒ／Ｇ３９４Ｅ／Ｄ４４２Ｅ、Ｄ９４Ｇ／Ｐ３４９Ｒ／Ｉ４９１Ｌ、Ａ１４５Ｇ／Ｅ２７０Ｄ、Ｖ１７８Ｉ、Ｅ２２５Ｄ、Ｑ２２６Ｔ、Ｋ２４６Ｒ、Ｅ２５０Ｄ／Ｐ３４９Ｒ／Ｄ４４２Ｅ、Ｐ２５９Ｄ／Ｔ３１３Ｄ／Ａ３３８Ｓ、Ｅ２７０Ｄ／Ｐ３４９Ｒ、Ｍ２８６Ｔ／Ａ３３８Ｓ、Ｍ２９４Ｌ、Ｔ３１３Ｄ、Ｐ３４９Ｒ、Ｐ３４９Ｒ／Ｇ３８０Ｒ／Ｄ４４２Ｅ、Ｆ４１３Ｙ、Ｆ４１３Ｙ／Ｒ４６８Ｉ、Ｈ４４８ＴおよびＥ４７３Ｄから選択される少なくとも１個の置換または置換セットを含み、ポリペプチド配列のアミノ酸位置は、配列番号３０８または１２５６を参照して番号付けされる。

一部の追加の実施形態では、組換えアミラーゼは、配列番号４２２もしくは１３７０に対して少なくとも８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくはそれを超える配列同一性を有するポリペプチド配列、またはその機能的断片を含み、組換えアミラーゼは、３８、３８／１７８／２２６／２８６／３３８、３８／１７８／２８６／４４８、３８／１７８／３４９／４４８、３８／２２６／２４６／２５８／２８６、３８／２２６／２５８／２８６／３３８／３８０／４４８、３８／２２６／２５８／３４９／４１３、３８／２２６／２８６、３８／２２６／２８６／３３８／３８０、３８／２２６／３３８／３４９／３８０、３８／２２６／４１３／４４８、３８／２４６／２８６、３８／２４６／２８６／３８０、３８／２５８、３８／２８６、３８／２８６／４１３／４４８、３８／２８６／４４８、３８／４４８、１７８、１７８／２２６／２５８／２８６／３１０／３３８、１７８／２２６／２８６／３３８、１７８／２４６／３３８、１７８／２５８／２８６／４１３、１７８／２８６、１７８／２８６／３３８／３４９、１７８／２８６／３３８／４４８、１７８／３８０、１７８／４１３、１７８／４４８、１８４／２４６／２５８／３８０、２２６、２２６／２４６／２８６／３４９／４４８、２２６／２４６／４１３、２２６／２５８／２８６／３４９／３８０、２２６／２５８／２８６／４１３／４４８、２２６／２８６、２２６／２８６／３８０／４４８、２２６／３４９／３８０、２４６、２４６／２８６、２４６／２８６／３８０／４１３、２４６／３３８、２４６／４１３、２５８／２８６／４１３、２８６、２８６／４１３／４４８、３３８／４４８、３４９および４１３から選択される１個または複数の位置に少なくとも１個の置換または置換セットを含み、ポリペプチド配列のアミノ酸位置は、配列番号４２２または１３７０を参照して番号付けされる。一部のさらなる実施形態では、組換えアミラーゼは、配列番号４２２もしくは１３７０に対して少なくとも８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくはそれを超える配列同一性を有するポリペプチド配列、またはその機能的断片を含み、組換えアミラーゼは、３８Ｉ、３８Ｉ／１７８Ｉ／２２６Ｔ／２８６Ｔ／３３８Ｓ、３８Ｉ／１７８Ｉ／２８６Ｔ／４４８Ｔ、３８Ｉ／１７８Ｉ／３４９Ｒ／４４８Ｔ、３８Ｉ／２２６Ｔ／２４６Ｒ／２５８Ｓ／２８６Ｔ、３８Ｉ／２２６Ｔ／２５８Ｓ／２８６Ｔ／３３８Ｓ／３８０Ｒ／４４８Ｔ、３８Ｉ／２２６Ｔ／２５８Ｓ／３４９Ｒ／４１３Ｙ、３８Ｉ／２２６Ｔ／２８６Ｔ、３８Ｉ／２２６Ｔ／２８６Ｔ／３３８Ｓ／３８０Ｒ、３８Ｉ／２２６Ｔ／３３８Ｓ／３４９Ｒ／３８０Ｒ、３８Ｉ／２２６Ｔ／４１３Ｙ／４４８Ｔ、３８Ｉ／２４６Ｒ／２８６Ｔ、３８Ｉ／２４６Ｒ／２８６Ｔ／３８０Ｒ、３８Ｉ／２５８Ｓ、３８Ｉ／２８６Ｔ、３８Ｉ／２８６Ｔ／４１３Ｙ／４４８Ｔ、３８Ｉ／２８６Ｔ／４４８Ｔ、３８Ｉ／４４８Ｔ、１７８Ｉ、１７８Ｉ／２２６Ｔ／２５８Ｓ／２８６Ｔ／３１０Ｒ／３３８Ｓ、１７８Ｉ／２２６Ｔ／２８６Ｔ／３３８Ｓ、１７８Ｉ／２４６Ｒ／３３８Ｓ、１７８Ｉ／２５８Ｓ／２８６Ｔ／４１３Ｙ、１７８Ｉ／２８６Ｔ、１７８Ｉ／２８６Ｔ／３３８Ｓ／３４９Ｒ、１７８Ｉ／２８６Ｔ／３３８Ｓ／４４８Ｔ、１７８Ｉ／３８０Ｒ、１７８Ｉ／４１３Ｙ、１７８Ｉ／４４８Ｔ、１８４Ｋ／２４６Ｒ／２５８Ｓ／３８０Ｒ、２２６Ｔ、２２６Ｔ／２４６Ｒ／２８６Ｔ／３４９Ｒ／４４８Ｔ、２２６Ｔ／２４６Ｒ／４１３Ｙ、２２６Ｔ／２５８Ｓ／２８６Ｔ／３４９Ｒ／３８０Ｒ、２２６Ｔ／２５８Ｓ／２８６Ｔ／４１３Ｙ／４４８Ｔ、２２６Ｔ／２８６Ｔ、２２６Ｔ／２８６Ｔ／３８０Ｒ／４４８Ｔ、２２６Ｔ／３４９Ｒ／３８０Ｒ、２４６Ｒ、２４６Ｒ／２８６Ｔ、２４６Ｒ／２８６Ｔ／３８０Ｒ／４１３Ｙ、２４６Ｒ／３３８Ｓ、２４６Ｒ／４１３Ｙ、２４６Ｔ、２５８Ｓ／２８６Ｔ／４１３Ｙ、２８６Ｔ、２８６Ｔ／４１３Ｙ／４４８Ｔ、３３８Ｓ／４４８Ｔ、３４９Ｒおよび４１３Ｙから選択される少なくとも１個の置換または置換セットを含み、ポリペプチド配列のアミノ酸位置は、配列番号４２２または１３７０を参照して番号付けされる。一部のさらなる実施形態では、組換えアミラーゼは、配列番号４２２もしくは１３７０に対して少なくとも８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくはそれを超える配列同一性を有するポリペプチド配列、またはその機能的断片を含み、組換えアミラーゼは、Ｍ３８Ｉ、Ｍ３８Ｉ／Ｖ１７８Ｉ／Ｑ２２６Ｔ／Ｍ２８６Ｔ／Ａ３３８Ｓ、Ｍ３８Ｉ／Ｖ１７８Ｉ／Ｍ２８６Ｔ／Ｈ４４８Ｔ、Ｍ３８Ｉ／Ｖ１７８Ｉ／Ｐ３４９Ｒ／Ｈ４４８Ｔ、Ｍ３８Ｉ／Ｑ２２６Ｔ／Ｋ２４６Ｒ／Ｋ２５８Ｓ／Ｍ２８６Ｔ、Ｍ３８Ｉ／Ｑ２２６Ｔ／Ｋ２５８Ｓ／Ｍ２８６Ｔ／Ａ３３８Ｓ／Ｇ３８０Ｒ／Ｈ４４８Ｔ、Ｍ３８Ｉ／Ｑ２２６Ｔ／Ｋ２５８Ｓ／Ｐ３４９Ｒ／Ｆ４１３Ｙ、Ｍ３８Ｉ／Ｑ２２６Ｔ／Ｍ２８６Ｔ、Ｍ３８Ｉ／Ｑ２２６Ｔ／Ｍ２８６Ｔ／Ａ３３８Ｓ／Ｇ３８０Ｒ、Ｍ３８Ｉ／Ｑ２２６Ｔ／Ａ３３８Ｓ／Ｐ３４９Ｒ／Ｇ３８０Ｒ、Ｍ３８Ｉ／Ｑ２２６Ｔ／Ｆ４１３Ｙ／Ｈ４４８Ｔ、Ｍ３８Ｉ／Ｋ２４６Ｒ／Ｍ２８６Ｔ、Ｍ３８Ｉ／Ｋ２４６Ｒ／Ｍ２８６Ｔ／Ｇ３８０Ｒ、Ｍ３８Ｉ／Ｋ２５８Ｓ、Ｍ３８Ｉ／Ｍ２８６Ｔ、Ｍ３８Ｉ／Ｍ２８６Ｔ／Ｆ４１３Ｙ／Ｈ４４８Ｔ、Ｍ３８Ｉ／Ｍ２８６Ｔ／Ｈ４４８Ｔ、Ｍ３８Ｉ／Ｈ４４８Ｔ、Ｖ１７８Ｉ、Ｖ１７８Ｉ／Ｑ２２６Ｔ／Ｋ２５８Ｓ／Ｍ２８６Ｔ／Ｑ３１０Ｒ／Ａ３３８Ｓ、Ｖ１７８Ｉ／Ｑ２２６Ｔ／Ｍ２８６Ｔ／Ａ３３８Ｓ、Ｖ１７８Ｉ／Ｋ２４６Ｒ／Ａ３３８Ｓ、Ｖ１７８Ｉ／Ｋ２５８Ｓ／Ｍ２８６Ｔ／Ｆ４１３Ｙ、Ｖ１７８Ｉ／Ｍ２８６Ｔ、Ｖ１７８Ｉ／Ｍ２８６Ｔ／Ａ３３８Ｓ／Ｐ３４９Ｒ、Ｖ１７８Ｉ／Ｍ２８６Ｔ／Ａ３３８Ｓ／Ｈ４４８Ｔ、Ｖ１７８Ｉ／Ｇ３８０Ｒ、Ｖ１７８Ｉ／Ｆ４１３Ｙ、Ｖ１７８Ｉ／Ｈ４４８Ｔ、Ｅ１８４Ｋ／Ｋ２４６Ｒ／Ｋ２５８Ｓ／Ｇ３８０Ｒ、Ｑ２２６Ｔ、Ｑ２２６Ｔ／Ｋ２４６Ｒ／Ｍ２８６Ｔ／Ｐ３４９Ｒ／Ｈ４４８Ｔ、Ｑ２２６Ｔ／Ｋ２４６Ｒ／Ｆ４１３Ｙ、Ｑ２２６Ｔ／Ｋ２５８Ｓ／Ｍ２８６Ｔ／Ｐ３４９Ｒ／Ｇ３８０Ｒ、Ｑ２２６Ｔ／Ｋ２５８Ｓ／Ｍ２８６Ｔ／Ｆ４１３Ｙ／Ｈ４４８Ｔ、Ｑ２２６Ｔ／Ｍ２８６Ｔ、Ｑ２２６Ｔ／Ｍ２８６Ｔ／Ｇ３８０Ｒ／Ｈ４４８Ｔ、Ｑ２２６Ｔ／Ｐ３４９Ｒ／Ｇ３８０Ｒ、Ｋ２４６Ｒ、Ｋ２４６Ｒ／Ｍ２８６Ｔ、Ｋ２４６Ｒ／Ｍ２８６Ｔ／Ｇ３８０Ｒ／Ｆ４１３Ｙ、Ｋ２４６Ｒ／Ａ３３８Ｓ、Ｋ２４６Ｒ／Ｆ４１３Ｙ、Ｋ２４６Ｔ、Ｋ２５８Ｓ／Ｍ２８６Ｔ／Ｆ４１３Ｙ、Ｍ２８６Ｔ、Ｍ２８６Ｔ／Ｆ４１３Ｙ／Ｈ４４８Ｔ、Ａ３３８Ｓ／Ｈ４４８Ｔ、Ｐ３４９ＲおよびＦ４１３Ｙから選択される少なくとも１個の置換または置換セットを含み、ポリペプチド配列のアミノ酸位置は、配列番号４２２または１３７０を参照して番号付けされる。

一部の追加の実施形態では、組換えアミラーゼは、配列番号４５６もしくは１４０４に対して少なくとも８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくはそれを超える配列同一性を有するポリペプチド配列、またはその機能的断片を含み、組換えアミラーゼは、２９／３１／９２／２２０、２９／４６９、４９／５８／１０３／１４１／１９７／２６９／２９４／２９８、４９／５８／１０３／１９４／２０４／２９８、４９／５８／１４１／２９８、４９／１０３、１０３、１２３、１２６、１２７、１３１、１３４、１８０、２１０、２１４、２２０／４６９、２２８、２５９、２７９、２８２、３０２、３１９、３９３、４１５、４１７、４２８、４２９、４６６および４６９から選択される１個または複数の位置に少なくとも１個の置換または置換セットを含み、ポリペプチド配列のアミノ酸位置は、配列番号４５６または１４０４を参照して番号付けされる。一部のさらなる実施形態では、組換えアミラーゼは、配列番号４５６もしくは１４０４に対して少なくとも８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくはそれを超える配列同一性を有するポリペプチド配列、またはその機能的断片を含み、組換えアミラーゼは、２９Ｅ／３１Ｌ／９２Ａ／２２０Ｇ、２９Ｅ／４６９Ｉ、４９Ａ／５８Ｔ／１０３Ｌ／１４１Ｆ／１９７Ｙ／２６９Ｆ／２９４Ｈ／２９８Ｑ、４９Ａ／５８Ｔ／１０３Ｌ／１９４Ｆ／２０４Ｄ／２９８Ｈ、４９Ａ／５８Ｔ／１４１Ｆ／２９８Ｈ、４９Ａ／１０３Ｌ、１０３Ｌ、１２３Ｒ、１２６Ｒ、１２７Ｗ、１３１Ｈ、１３１Ｒ、１３１Ｙ、１３４Ｒ、１８０Ｅ、２１０Ｐ、２１４Ｇ、２２０Ｇ／４６９Ｉ、２２８Ｖ、２５９Ｃ、２７９Ｌ、２８２Ｔ、３０２Ｈ、３０２Ｒ、３０２Ｗ、３１９Ｓ、３９３Ｒ、３９３Ｓ、４１５Ｃ、４１７Ｗ、４２８Ｔ、４２９Ｓ、４６６Ｃおよび４６９Ｉから選択される少なくとも１個の置換または置換セットを含み、ポリペプチド配列のアミノ酸位置は、配列番号４５６または１４０４を参照して番号付けされる。一部のさらなる実施形態では、組換えアミラーゼは、配列番号４５６もしくは１４０４に対して少なくとも８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくはそれを超える配列同一性を有するポリペプチド配列、またはその機能的断片を含み、組換えアミラーゼは、Ｒ２９Ｅ／Ｆ３１Ｌ／Ｒ９２Ａ／Ａ２２０Ｇ、Ｒ２９Ｅ／Ｖ４６９Ｉ、Ｓ４９Ａ／Ｓ５８Ｔ／Ｖ１０３Ｌ／Ｙ１４１Ｆ／Ｆ１９７Ｙ／Ｈ２６９Ｆ／Ｍ２９４Ｈ／Ｅ２９８Ｑ、Ｓ４９Ａ／Ｓ５８Ｔ／Ｖ１０３Ｌ／Ｌ１９４Ｆ／Ｎ２０４Ｄ／Ｅ２９８Ｈ、Ｓ４９Ａ／Ｓ５８Ｔ／Ｙ１４１Ｆ／Ｅ２９８Ｈ、Ｓ４９Ａ／Ｖ１０３Ｌ、Ｖ１０３Ｌ、Ｄ１２３Ｒ、Ｔ１２６Ｒ、Ｑ１２７Ｗ、Ｅ１３１Ｈ、Ｅ１３１Ｒ、Ｅ１３１Ｙ、Ｅ１３４Ｒ、Ｄ１８０Ｅ、Ｈ２１０Ｐ、Ｅ２１４Ｇ、Ａ２２０Ｇ／Ｖ４６９Ｉ、Ｑ２２８Ｖ、Ｐ２５９Ｃ、Ｄ２７９Ｌ、Ｅ２８２Ｔ、Ｑ３０２Ｈ、Ｑ３０２Ｒ、Ｑ３０２Ｗ、Ａ３１９Ｓ、Ｅ３９３Ｒ、Ｅ３９３Ｓ、Ｄ４１５Ｃ、Ｐ４１７Ｗ、Ｄ４２８Ｔ、Ｅ４２９Ｓ、Ｑ４６６ＣおよびＶ４６９Ｉから選択される少なくとも１個の置換または置換セットを含み、ポリペプチド配列のアミノ酸位置は、配列番号４５６または１４０４を参照して番号付けされる。

一部の追加の実施形態では、組換えアミラーゼは、配列番号４５６もしくは１４０４に対して少なくとも８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくはそれを超える配列同一性を有するポリペプチド配列、またはその機能的断片を含み、組換えアミラーゼは、９２、１２３、１２６、１２７、１２９、１３１、１３４、１４０、１７２、１８０、２１０、２１４、２２１、２２８、２５３、２５４、２５９、２７９、２８２、３０２、３０４、３０５、３１９、３２２、３４６、３５９、３８４、３８５、３８７、３９３、４０９、４１２、４１５、４１７、４２８、４２９、４４１、４４２、４４４、４４６、４５１、４５５、４５９、４６６、４６７、４７０、４７３、４７４、４９２および４９４から選択される１個または複数の位置に少なくとも１個の置換または置換セットを含み、ポリペプチド配列のアミノ酸位置は、配列番号４５６または１４０４を参照して番号付けされる。一部のさらなる実施形態では、組換えアミラーゼは、配列番号４５６もしくは１４０４に対して少なくとも８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくはそれを超える配列同一性を有するポリペプチド配列、またはその機能的断片を含み、組換えアミラーゼは、９２Ｇ、９２Ｑ、１２３Ｃ、１２３Ｇ、１２３Ｒ、１２６Ｑ、１２６Ｒ、１２７Ｉ、１２７Ｒ、１２７Ｓ、１２７Ｖ、１２７Ｗ、１２９Ｃ、１２９Ｗ、１３１Ｈ、１３１Ｒ、１３１Ｙ、１３４Ａ、１３４Ｆ、１３４Ｒ、１４０Ｖ、１７２Ｋ、１７２Ｒ、１８０Ｅ、１８０Ｐ、１８０Ｑ、２１０Ｇ、２１０Ｐ、２１４Ｇ、２１４Ｌ、２１４Ｒ、２２１Ｔ、２２１Ｖ、２２８Ｖ、２５３Ｒ、２５４Ｇ、２５９Ｃ、２５９Ｒ、２５９Ｗ、２７９Ｌ、２７９Ｖ、２８２Ｒ、２８２Ｔ、３０２Ｇ、３０２Ｈ、３０２Ｒ、３０２Ｖ、３０２Ｗ、３０４Ｔ、３０５Ｑ、３０５Ｒ、３０５Ｗ、３１９Ｌ、３１９Ｓ、３２２Ｒ、３４６Ｇ、３５９Ｇ、３８４Ｍ、３８５Ｌ、３８７Ｇ、３８７Ｖ、３９３Ｒ、３９３Ｓ、３９３Ｗ、４０９Ａ、４０９Ｒ、４０９Ｗ、４１２Ａ、４１５Ｃ、４１５Ｇ、４１７Ｗ、４２８Ｔ、４２９Ｓ、４４１Ｒ、４４１Ｗ、４４２Ｒ、４４２Ｗ、４４４Ｇ、４４４Ｒ、４４４Ｖ、４４６Ｇ、４５１Ｆ、４５５Ｌ、４５５Ｒ、４５５Ｔ、４５５Ｗ、４５９Ｗ、４６６Ｃ、４６７Ｐ、４６７Ｗ、４７０Ｇ、４７０Ｌ、４７０Ｓ、４７３Ｍ、４７４Ｇ、４９２Ｇ、４９２Ｒおよび４９４Ｃから選択される少なくとも１個の置換または置換セットを含み、ポリペプチド配列のアミノ酸位置は、配列番号４５６または１４０４を参照して番号付けされる。一部のさらなる実施形態では、組換えアミラーゼは、配列番号４５６もしくは１４０４に対して少なくとも８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくはそれを超える配列同一性を有するポリペプチド配列、またはその機能的断片を含み、組換えアミラーゼは、Ｒ９２Ｇ、Ｒ９２Ｑ、Ｄ１２３Ｃ、Ｄ１２３Ｇ、Ｄ１２３Ｒ、Ｔ１２６Ｑ、Ｔ１２６Ｒ、Ｑ１２７Ｉ、Ｑ１２７Ｒ、Ｑ１２７Ｓ、Ｑ１２７Ｖ、Ｑ１２７Ｗ、Ｄ１２９Ｃ、Ｄ１２９Ｗ、Ｅ１３１Ｈ、Ｅ１３１Ｒ、Ｅ１３１Ｙ、Ｅ１３４Ａ、Ｅ１３４Ｆ、Ｅ１３４Ｒ、Ｒ１４０Ｖ、Ｄ１７２Ｋ、Ｄ１７２Ｒ、Ｄ１８０Ｅ、Ｄ１８０Ｐ、Ｄ１８０Ｑ、Ｈ２１０Ｇ、Ｈ２１０Ｐ、Ｅ２１４Ｇ、Ｅ２１４Ｌ、Ｅ２１４Ｒ、Ｒ２２１Ｔ、Ｒ２２１Ｖ、Ｑ２２８Ｖ、Ｑ２５３Ｒ、Ｅ２５４Ｇ、Ｐ２５９Ｃ、Ｐ２５９Ｒ、Ｐ２５９Ｗ、Ｄ２７９Ｌ、Ｄ２７９Ｖ、Ｅ２８２Ｒ、Ｅ２８２Ｔ、Ｑ３０２Ｇ、Ｑ３０２Ｈ、Ｑ３０２Ｒ、Ｑ３０２Ｖ、Ｑ３０２Ｗ、Ｒ３０４Ｔ、Ｄ３０５Ｑ、Ｄ３０５Ｒ、Ｄ３０５Ｗ、Ａ３１９Ｌ、Ａ３１９Ｓ、Ａ３２２Ｒ、Ｗ３４６Ｇ、Ｅ３５９Ｇ、Ｔ３８４Ｍ、Ｙ３８５Ｌ、Ｉ３８７Ｇ、Ｉ３８７Ｖ、Ｅ３９３Ｒ、Ｅ３９３Ｓ、Ｅ３９３Ｗ、Ｖ４０９Ａ、Ｖ４０９Ｒ、Ｖ４０９Ｗ、Ｄ４１２Ａ、Ｄ４１５Ｃ、Ｄ４１５Ｇ、Ｐ４１７Ｗ、Ｄ４２８Ｔ、Ｅ４２９Ｓ、Ｄ４４１Ｒ、Ｄ４４１Ｗ、Ｄ４４２Ｒ、Ｄ４４２Ｗ、Ｅ４４４Ｇ、Ｅ４４４Ｒ、Ｅ４４４Ｖ、Ｔ４４６Ｇ、Ｅ４５１Ｆ、Ｎ４５５Ｌ、Ｎ４５５Ｒ、Ｎ４５５Ｔ、Ｎ４５５Ｗ、Ｒ４５９Ｗ、Ｑ４６６Ｃ、Ｅ４６７Ｐ、Ｅ４６７Ｗ、Ｖ４７０Ｇ、Ｖ４７０Ｌ、Ｖ４７０Ｓ、Ｅ４７３Ｍ、Ｎ４７４Ｇ、Ｅ４９２Ｇ、Ｅ４９２ＲおよびＶ４９４Ｃから選択される少なくとも１個の置換または置換セットを含み、ポリペプチド配列のアミノ酸位置は、配列番号４５６または１４０４を参照して番号付けされる。

一部の追加の実施形態では、組換えアミラーゼは、配列番号５４６もしくは１４９４に対して少なくとも８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくはそれを超える配列同一性を有するポリペプチド配列、またはその機能的断片を含み、組換えアミラーゼは、１２３、１２３／１２６／１８０／２１４／２９８／３０２／３９３、１２３／１２６／１８０／２１４／３９３／４２８、１２３／１２６／２１０／２９８／３０２／３９３、１２３／１２６／２１０／４２８、１２３／１２６／４２８、１２３／２１０／３０２、１２６／１８０／２１０／２１４／２９８／３０２、１２６／１８０／２１０／２１４／４２８、１２６／１８０／２９８／３０２／３９３、１２６／２１０／３０２／４２８、１２６／２１４／３９３、１２６／２９８／３０２／３９３、１２６／２９８／３０２／３９３／４２８、１２９、１２９／２２８／２５３、１３１／２２８／２７９、１３１／２８２、１８０／２１４、２１０／２１４／３０２／３９３／４２８、２２８／２８２／４４４、２５３／２７９／４７０、２５３／２７９／４９２、２７９、２７９／４７０および４４１から選択される１個または複数の位置に少なくとも１個の置換または置換セットを含み、ポリペプチド配列のアミノ酸位置は、配列番号５４６または１４９４を参照して番号付けされる。一部のさらなる実施形態では、組換えアミラーゼは、配列番号５４６もしくは１４９４に対して少なくとも８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくはそれを超える配列同一性を有するポリペプチド配列、またはその機能的断片を含み、組換えアミラーゼは、１２３Ｒ、１２３Ｒ／１２６Ｒ／１８０Ｅ／２１４Ｌ／２９８Ｑ／３０２Ｗ／３９３Ｒ、１２３Ｒ／１２６Ｒ／１８０Ｑ／２１４Ｇ／３９３Ｒ／４２８Ｔ、１２３Ｒ／１２６Ｒ／２１０Ｐ／２９８Ｑ／３０２Ｗ／３９３Ｒ、１２３Ｒ／１２６Ｒ／２１０Ｐ／４２８Ｔ、１２３Ｒ／１２６Ｒ／４２８Ｔ、１２３Ｒ／２１０Ｐ／３０２Ｒ、１２６Ｒ／１８０Ｅ／２１０Ｐ／２１４Ｇ／４２８Ｔ、１２６Ｒ／１８０Ｅ／２９８Ｑ／３０２Ｒ／３９３Ｒ、１２６Ｒ／１８０Ｑ／２１０Ｐ／２１４Ｌ／２９８Ｑ／３０２Ｒ、１２６Ｒ／２１０Ｐ／３０２Ｒ／４２８Ｔ、１２６Ｒ／２１４Ｇ／３９３Ｒ、１２６Ｒ／２９８Ｑ／３０２Ｈ／３９３Ｒ、１２６Ｒ／２９８Ｑ／３０２Ｒ／３９３Ｒ／４２８Ｔ、１２９Ｗ、１２９Ｗ／２２８Ｖ／２５３Ｒ、１３１Ｈ／２２８Ｖ／２７９Ｖ、１３１Ｙ／２８２Ｔ、１８０Ｑ／２１４Ｌ、２１０Ｐ／２１４Ｌ／３０２Ｒ／３９３Ｒ／４２８Ｔ、２２８Ｖ／２８２Ｔ／４４４Ｒ、２５３Ｒ／２７９Ｌ／４９２Ｇ、２５３Ｒ／２７９Ｖ／４７０Ｓ、２７９Ｌ、２７９Ｌ／４７０Ｓおよび４４１Ｒから選択される少なくとも１個の置換または置換セットを含み、ポリペプチド配列のアミノ酸位置は、配列番号５４６または１４９４を参照して番号付けされる。一部のさらなる実施形態では、組換えアミラーゼは、配列番号５４６もしくは１４９４に対して少なくとも８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくはそれを超える配列同一性を有するポリペプチド配列、またはその機能的断片を含み、組換えアミラーゼは、Ｄ１２３Ｒ、Ｄ１２３Ｒ／Ｔ１２６Ｒ／Ｄ１８０Ｅ／Ｅ２１４Ｌ／Ｈ２９８Ｑ／Ｑ３０２Ｗ／Ｅ３９３Ｒ、Ｄ１２３Ｒ／Ｔ１２６Ｒ／Ｄ１８０Ｑ／Ｅ２１４Ｇ／Ｅ３９３Ｒ／Ｄ４２８Ｔ、Ｄ１２３Ｒ／Ｔ１２６Ｒ／Ｈ２１０Ｐ／Ｈ２９８Ｑ／Ｑ３０２Ｗ／Ｅ３９３Ｒ、Ｄ１２３Ｒ／Ｔ１２６Ｒ／Ｈ２１０Ｐ／Ｄ４２８Ｔ、Ｄ１２３Ｒ／Ｔ１２６Ｒ／Ｄ４２８Ｔ、Ｄ１２３Ｒ／Ｈ２１０Ｐ／Ｑ３０２Ｒ、Ｔ１２６Ｒ／Ｄ１８０Ｅ／Ｈ２１０Ｐ／Ｅ２１４Ｇ／Ｄ４２８Ｔ、Ｔ１２６Ｒ／Ｄ１８０Ｅ／Ｈ２９８Ｑ／Ｑ３０２Ｒ／Ｅ３９３Ｒ、Ｔ１２６Ｒ／Ｄ１８０Ｑ／Ｈ２１０Ｐ／Ｅ２１４Ｌ／Ｈ２９８Ｑ／Ｑ３０２Ｒ、Ｔ１２６Ｒ／Ｈ２１０Ｐ／Ｑ３０２Ｒ／Ｄ４２８Ｔ、Ｔ１２６Ｒ／Ｅ２１４Ｇ／Ｅ３９３Ｒ、Ｔ１２６Ｒ／Ｈ２９８Ｑ／Ｑ３０２Ｈ／Ｅ３９３Ｒ、Ｔ１２６Ｒ／Ｈ２９８Ｑ／Ｑ３０２Ｒ／Ｅ３９３Ｒ／Ｄ４２８Ｔ、Ｄ１２９Ｗ、Ｄ１２９Ｗ／Ｑ２２８Ｖ／Ｑ２５３Ｒ、Ｅ１３１Ｈ／Ｑ２２８Ｖ／Ｄ２７９Ｖ、Ｅ１３１Ｙ／Ｅ２８２Ｔ、Ｄ１８０Ｑ／Ｅ２１４Ｌ、Ｈ２１０Ｐ／Ｅ２１４Ｌ／Ｑ３０２Ｒ／Ｅ３９３Ｒ／Ｄ４２８Ｔ、Ｑ２２８Ｖ／Ｅ２８２Ｔ／Ｅ４４４Ｒ、Ｑ２５３Ｒ／Ｄ２７９Ｌ／Ｅ４９２Ｇ、Ｑ２５３Ｒ／Ｄ２７９Ｖ／Ｖ４７０Ｓ、Ｄ２７９Ｌ、Ｄ２７９Ｌ／Ｖ４７０ＳおよびＤ４４１Ｒから選択される少なくとも１個の置換または置換セットを含み、ポリペプチド配列のアミノ酸位置は、配列番号５４６または１４９４を参照して番号付けされる。

一部の追加の実施形態では、組換えアミラーゼは、配列番号６３２もしくは１５８０に対して少なくとも８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくはそれを超える配列同一性を有するポリペプチド配列、またはその機能的断片を含み、組換えアミラーゼは、２、４５／１６６／２９８、４８、４８／１６６／１７０／２０３、５２、５８／１６６、５８／２０３、７２、８２、１１４、１１４／２２３／３０６／３０８、１４９、１６５、１６６／２０３、１６７、１７０、１８４／２１６／３０６／３０８、１８４／２２３／３０６／４３７、１８９、２０３、２２５、２５５、２５８、２７５、２８０、２８４、２９４、２９８、３９６、３９７、４１１、４３１、４４８、４６８、４８２、４８３および４９５から選択される１個または複数の位置に少なくとも１個の置換または置換セットを含み、ポリペプチド配列のアミノ酸位置は、配列番号６３２または１５８０を参照して番号付けされる。一部のさらなる実施形態では、組換えアミラーゼは、配列番号６３２もしくは１５８０に対して少なくとも８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくはそれを超える配列同一性を有するポリペプチド配列、またはその機能的断片を含み、組換えアミラーゼは、２Ｌ、４５Ｓ／１６６Ｌ／２９８Ｄ、４８Ｄ、４８Ｄ／１６６Ｌ／１７０Ｓ／２０３Ｓ、５２Ｒ、５８Ａ／１６６Ｌ、５８Ａ／２０３Ｓ、７２Ｔ、８２Ａ、１１４Ｒ、１１４Ｒ／２２３Ｌ／３０６Ｆ／３０８Ｌ、１４９Ｋ、１６５Ｖ、１６６Ｌ／２０３Ｓ、１６７Ｙ、１７０Ｓ、１８４Ｄ／２１６Ｌ／３０６Ｆ／３０８Ｌ、１８４Ｄ／２２３Ｌ／３０６Ｆ／４３７Ｌ、１８９Ｄ、２０３Ｓ、２２５Ｔ、２５５Ｍ、２５５Ｒ、２５８Ｓ、２７５Ｉ、２７５Ｒ、２８０Ｃ、２８４Ｌ、２８４Ｍ、２９４Ａ、２９８Ｄ、２９８Ｎ、３９６Ｅ、３９６Ｑ、３９７Ｍ、４１１Ｅ、４３１Ｔ、４４８Ｐ、４６８Ｖ、４８２Ｌ、４８３Ａ、４９５Ｇおよび４９５Ｌから選択される少なくとも１個の置換または置換セットを含み、ポリペプチド配列のアミノ酸位置は、配列番号６３２または１５８０を参照して番号付けされる。一部のさらなる実施形態では、組換えアミラーゼは、配列番号６３２もしくは１５８０に対して少なくとも８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくはそれを超える配列同一性を有するポリペプチド配列、またはその機能的断片を含み、組換えアミラーゼは、Ｒ２Ｌ、Ｙ４５Ｓ／Ｉ１６６Ｌ／Ｈ２９８Ｄ、Ａ４８Ｄ、Ａ４８Ｄ／Ｉ１６６Ｌ／Ｄ１７０Ｓ／Ｅ２０３Ｓ、Ｙ５２Ｒ、Ｔ５８Ａ／Ｉ１６６Ｌ、Ｔ５８Ａ／Ｅ２０３Ｓ、Ｓ７２Ｔ、Ｑ８２Ａ、Ｈ１１４Ｒ、Ｈ１１４Ｒ／Ｖ２２３Ｌ／Ｙ３０６Ｆ／Ｍ３０８Ｌ、Ｑ１４９Ｋ、Ｈ１６５Ｖ、Ｉ１６６Ｌ／Ｅ２０３Ｓ、Ｅ１６７Ｙ、Ｄ１７０Ｓ、Ｅ１８４Ｄ／Ｉ２１６Ｌ／Ｙ３０６Ｆ／Ｍ３０８Ｌ、Ｅ１８４Ｄ／Ｖ２２３Ｌ／Ｙ３０６Ｆ／Ｍ４３７Ｌ、Ｑ１８９Ｄ、Ｅ２０３Ｓ、Ｅ２２５Ｔ、Ｖ２５５Ｍ、Ｖ２５５Ｒ、Ｋ２５８Ｓ、Ｑ２７５Ｉ、Ｑ２７５Ｒ、Ｑ２８０Ｃ、Ｋ２８４Ｌ、Ｋ２８４Ｍ、Ｍ２９４Ａ、Ｈ２９８Ｄ、Ｈ２９８Ｎ、Ｄ３９６Ｅ、Ｄ３９６Ｑ、Ｅ３９７Ｍ、Ｔ４１１Ｅ、Ｐ４３１Ｔ、Ｈ４４８Ｐ、Ｒ４６８Ｖ、Ｎ４８２Ｌ、Ｇ４８３Ａ、Ｉ４９５ＧおよびＩ４９５Ｌから選択される少なくとも１個の置換または置換セットを含み、ポリペプチド配列のアミノ酸位置は、配列番号６３２または１５８０を参照して番号付けされる。

一部の追加の実施形態では、組換えアミラーゼは、配列番号６６４もしくは１６１２に対して少なくとも８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくはそれを超える配列同一性を有するポリペプチド配列、またはその機能的断片を含み、組換えアミラーゼは、６／３９／１０３／３２４／４２０、４１、５８／５００／５０１、６１、９５／９８／２０５／２２７／４２３／４５８、９５／９８／２２７／４２３、９５／２０５、９５／２５２／２８５／３２４、１２３／１７０／１９７／２７５／２９８／３９６／４４８／４８３、１２３／１９７、１２３／１９７／２２５／２９４／３９６／４４８／４６９、１２３／２８４／２９４／３２４／３９６／４４８、１３４／２２５／２７５／３０２、１６５／２２５／２８４／２９８／４６９／４８３、１７０／２７５／２９４／２９８／４４８、２０５／２０６、２０５／２０６／２２４／３１５／４５８／４８０、２０６／２２７、２０６／２２７／３１５／４２３、２２５／２９４／２９８／３９６、２２７、３９２／５０３、４５８、４９９および５００から選択される１個または複数の位置に少なくとも１個の置換または置換セットを含み、ポリペプチド配列のアミノ酸位置は、配列番号６６４または１６１２を参照して番号付けされる。一部のさらなる実施形態では、組換えアミラーゼは、配列番号６６４もしくは１６１２に対して少なくとも８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくはそれを超える配列同一性を有するポリペプチド配列、またはその機能的断片を含み、組換えアミラーゼは、６Ｉ／３９Ｉ／１０３Ｄ／３２４Ｔ／４２０Ｖ、４１Ｆ、５８Ｓ／５００Ｐ／５０１Ｐ、６１Ｙ、９５Ｌ／２５２Ｉ／２８５Ｖ／３２４Ｔ、９５Ｖ／９８Ｉ／２０５Ｖ／２２７Ｖ／４２３Ｖ／４５８Ｆ、９５Ｖ／９８Ｉ／２２７Ｖ／４２３Ｖ、９５Ｖ／２０５Ｖ、１２３Ｅ／１７０Ｓ／１９７Ｙ／２７５Ｉ／２９８Ｎ／３９６Ｑ／４４８Ｑ／４８３Ｑ、１２３Ｅ／１９７Ｙ、１２３Ｅ／１９７Ｙ／２２５Ｇ／２９４Ａ／３９６Ｑ／４４８Ｑ／４６９Ｉ、１２３Ｅ／２８４Ｌ／２９４Ａ／３２４Ｔ／３９６Ｑ／４４８Ｑ、１３４Ｒ／２２５Ｇ／２７５Ｉ／３０２Ｗ、１６５Ｖ／２２５Ｇ／２８４Ｌ／２９８Ｎ／４６９Ｉ／４８３Ｑ、１７０Ｓ／２７５Ｉ／２９４Ａ／２９８Ｎ／４４８Ｑ、２０５Ｖ／２０６Ｅ、２０５Ｖ／２０６Ｅ／２２４Ｌ／３１５Ｓ／４５８Ｆ／４８０Ｌ、２０６Ｅ／２２７Ｖ、２０６Ｅ／２２７Ｖ／３１５Ｓ／４２３Ｖ、２２５Ｇ／２９４Ａ／２９８Ｎ／３９６Ｑ、２２７Ｃ、３９２Ｃ／５０３Ｌ、４５８Ｆ、４５８Ｙ、４９９Ｒおよび５００Ｐから選択される少なくとも１個の置換または置換セットを含み、ポリペプチド配列のアミノ酸位置は、配列番号６６４または１６１２を参照して番号付けされる。一部のさらなる実施形態では、組換えアミラーゼは、配列番号６６４もしくは１６１２に対して少なくとも８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくはそれを超える配列同一性を有するポリペプチド配列、またはその機能的断片を含み、組換えアミラーゼは、Ｌ６Ｉ／Ｖ３９Ｉ／Ｖ１０３Ｄ／Ａ３２４Ｔ／Ｉ４２０Ｖ、Ｌ４１Ｆ、Ｔ５８Ｓ／Ｈ５００Ｐ／Ｈ５０１Ｐ、Ｌ６１Ｙ、Ｉ９５Ｌ／Ｖ２５２Ｉ／Ｔ２８５Ｖ／Ａ３２４Ｔ、Ｉ９５Ｖ／Ｌ９８Ｉ／Ｉ２０５Ｖ／Ｔ２２７Ｖ／Ｓ４２３Ｖ／Ｗ４５８Ｆ、Ｉ９５Ｖ／Ｌ９８Ｉ／Ｔ２２７Ｖ／Ｓ４２３Ｖ、Ｉ９５Ｖ／Ｉ２０５Ｖ、Ｄ１２３Ｅ／Ｄ１７０Ｓ／Ｆ１９７Ｙ／Ｑ２７５Ｉ／Ｈ２９８Ｎ／Ｄ３９６Ｑ／Ｈ４４８Ｑ／Ｇ４８３Ｑ、Ｄ１２３Ｅ／Ｆ１９７Ｙ、Ｄ１２３Ｅ／Ｆ１９７Ｙ／Ｅ２２５Ｇ／Ｍ２９４Ａ／Ｄ３９６Ｑ／Ｈ４４８Ｑ／Ｖ４６９Ｉ、Ｄ１２３Ｅ／Ｋ２８４Ｌ／Ｍ２９４Ａ／Ａ３２４Ｔ／Ｄ３９６Ｑ／Ｈ４４８Ｑ、Ｅ１３４Ｒ／Ｅ２２５Ｇ／Ｑ２７５Ｉ／Ｑ３０２Ｗ、Ｈ１６５Ｖ／Ｅ２２５Ｇ／Ｋ２８４Ｌ／Ｈ２９８Ｎ／Ｖ４６９Ｉ／Ｇ４８３Ｑ、Ｄ１７０Ｓ／Ｑ２７５Ｉ／Ｍ２９４Ａ／Ｈ２９８Ｎ／Ｈ４４８Ｑ、Ｉ２０５Ｖ／Ｄ２０６Ｅ、Ｉ２０５Ｖ／Ｄ２０６Ｅ／Ｍ２２４Ｌ／Ｔ３１５Ｓ／Ｗ４５８Ｆ／Ｆ４８０Ｌ、Ｄ２０６Ｅ／Ｔ２２７Ｖ、Ｄ２０６Ｅ／Ｔ２２７Ｖ／Ｔ３１５Ｓ／Ｓ４２３Ｖ、Ｅ２２５Ｇ／Ｍ２９４Ａ／Ｈ２９８Ｎ／Ｄ３９６Ｑ、Ｔ２２７Ｃ、Ｉ３９２Ｃ／Ｈ５０３Ｌ、Ｗ４５８Ｆ、Ｗ４５８Ｙ、Ｇ４９９ＲおよびＨ５００Ｐから選択される少なくとも１個の置換または置換セットを含み、ポリペプチド配列のアミノ酸位置は、配列番号６６４または１６１２を参照して番号付けされる。

一部の追加の実施形態では、組換えアミラーゼは、配列番号６６４もしくは１６１２に対して少なくとも８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくはそれを超える配列同一性を有するポリペプチド配列、またはその機能的断片を含み、組換えアミラーゼは、９５／２５２／２８５／３２４、１２３／１９７、１２３／１９７／２２５／２９４／３９６／４４８／４６９、１３４／２２５／２７５／３０２、２０５／２０６および２０５／２０６／２２４／３１５／４５８／４８０から選択される１個または複数の位置に少なくとも１個の置換または置換セットを含み、ポリペプチド配列のアミノ酸位置は、配列番号６６４または１６１２を参照して番号付けされる。一部のさらなる実施形態では、組換えアミラーゼは、配列番号６６４もしくは１６１２に対して少なくとも８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくはそれを超える配列同一性を有するポリペプチド配列、またはその機能的断片を含み、組換えアミラーゼは、９５Ｌ／２５２Ｉ／２８５Ｖ／３２４Ｔ、１２３Ｅ／１９７Ｙ、１２３Ｅ／１９７Ｙ／２２５Ｇ／２９４Ａ／３９６Ｑ／４４８Ｑ／４６９Ｉ、１３４Ｒ／２２５Ｇ／２７５Ｉ／３０２Ｗ、２０５Ｖ／２０６Ｅおよび２０５Ｖ／２０６Ｅ／２２４Ｌ／３１５Ｓ／４５８Ｆ／４８０Ｌから選択される少なくとも１個の置換または置換セットを含み、ポリペプチド配列のアミノ酸位置は、配列番号６６４または１６１２を参照して番号付けされる。一部のさらなる実施形態では、組換えアミラーゼは、配列番号６６４もしくは１６１２に対して少なくとも８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくはそれを超える配列同一性を有するポリペプチド配列、またはその機能的断片を含み、組換えアミラーゼは、Ｉ９５Ｌ／Ｖ２５２Ｉ／Ｔ２８５Ｖ／Ａ３２４Ｔ、Ｄ１２３Ｅ／Ｆ１９７Ｙ、Ｄ１２３Ｅ／Ｆ１９７Ｙ／Ｅ２２５Ｇ／Ｍ２９４Ａ／Ｄ３９６Ｑ／Ｈ４４８Ｑ／Ｖ４６９Ｉ、Ｅ１３４Ｒ／Ｅ２２５Ｇ／Ｑ２７５Ｉ／Ｑ３０２Ｗ、Ｉ２０５Ｖ／Ｄ２０６ＥおよびＩ２０５Ｖ／Ｄ２０６Ｅ／Ｍ２２４Ｌ／Ｔ３１５Ｓ／Ｗ４５８Ｆ／Ｆ４８０Ｌから選択される少なくとも１個の置換または置換セットを含み、ポリペプチド配列のアミノ酸位置は、配列番号６６４または１６１２を参照して番号付けされる。

一部の追加の実施形態では、組換えアミラーゼは、配列番号７８０もしくは１７２８に対して少なくとも８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくはそれを超える配列同一性を有するポリペプチド配列、またはその機能的断片を含み、組換えアミラーゼは、位置１２６に置換を含み、ポリペプチド配列のアミノ酸位置は、配列番号７８０または１７２８を参照して番号付けされる。一部のさらなる実施形態では、組換えアミラーゼは、配列番号７８０もしくは１７２８に対して少なくとも８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくはそれを超える配列同一性を有するポリペプチド配列、またはその機能的断片を含み、組換えアミラーゼは、１２６Ｃ、１２６Ｄ、１２６Ｅ、１２６Ｋ、１２６Ｌ、１２６Ｍ、１２６Ｎ、１２６Ｑ、１２６Ｓ、１２６Ｔおよび１２６Ｗから選択される少なくとも１個の置換または置換セットを含み、ポリペプチド配列のアミノ酸位置は、配列番号７８０または１７２８を参照して番号付けされる。一部のさらなる実施形態では、組換えアミラーゼは、配列番号７８０もしくは１７２８に対して少なくとも８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくはそれを超える配列同一性を有するポリペプチド配列、またはその機能的断片を含み、組換えアミラーゼは、Ｒ１２６Ｃ、Ｒ１２６Ｄ、Ｒ１２６Ｅ、Ｒ１２６Ｋ、Ｒ１２６Ｌ、Ｒ１２６Ｍ、Ｒ１２６Ｎ、Ｒ１２６Ｑ、Ｒ１２６Ｓ、Ｒ１２６ＴおよびＲ１２６Ｗから選択される少なくとも１個の置換または置換セットを含み、ポリペプチド配列のアミノ酸位置は、配列番号７８０または１７２８を参照して番号付けされる。

一部の追加の実施形態では、組換えアミラーゼは、表４－１、４－２、４－３、４－４、４－５、４－６、４－７、４－８、４－９、４－１０、４－１１、４－１２、４－１３および／または４－１４に提供される少なくとも１個の位置における少なくとも１個の突然変異を含み、位置は、配列番号２、１８、４０、１５６、１７４、２７６、３０８、４２２、４５６、５４６、６３２、７８０、９８８、１１０４、１１２２、１２２４、１２５６、１３７０、１４０４、１４９４、１５８０、１６１２および／または１７２８を参照して番号付けされる。一部のさらなる実施形態では、組換えアミラーゼは、配列番号４～１８、２２～９６６および９７０～１９１４のうち偶数番号の配列に表示される少なくとも１種の配列に対して少なくとも約８０％、８５％、約８６％、約８７％、約８８％、約８９％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％またはそれを超える配列同一性を有するポリペプチド配列を含む。一部のさらなる実施形態では、組換えアミラーゼは、配列番号４～１８、２２～９６６および９７０～１９１４のうち偶数番号の配列に表示される少なくとも１種の配列に対して少なくとも８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれを超える配列同一性を有するポリペプチド配列を含む。一部の実施形態では、組換えアミラーゼは、配列番号４０、１５６、１７４、２７６、３０８、４２２、４５６、５４６、６３２、６６４、７８０、８１０、９８８、１１０４、１１２２、１２２４、１２５６、１３７０、１４０４、１４９４、１５８０、１６１２、１７２８または１７５８のポリペプチド配列に対して少なくとも８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれを超える配列同一性を有するポリペプチド配列を含む。

一部の追加の実施形態では、組換えアミラーゼは、配列番号４～１８、２２～９６６および９７０～１９１４のうち偶数番号の配列に表示される少なくとも１種の配列を含む。一部の実施形態では、組換えアミラーゼは、配列番号４０、１５６、１７４、２７６、３０８、４２２、４５６、５４６、６３２、６６４、７８０、８１０、９８８、１１０４、１１２２、１２２４、１２５６、１３７０、１４０４、１４９４、１５８０、１６１２、１７２８または１７５８のポリペプチド配列を含む。

一部の追加の実施形態では、組換えアミラーゼは、高温および／または低温への曝露後に、参照配列と比較して、より高い酵素活性を保持する。一部の実施形態では、参照配列は、野生型アミラーゼであり、一方、一部の他の実施形態では、参照配列は、別の組換えアミラーゼである。一部の追加の実施形態では、組換えアミラーゼは、配列番号２のアミラーゼよりも熱安定性が高い。一部のさらなる実施形態では、組換えアミラーゼは、配列番号１８、４０、１５６、１７４、２７６、３０８、４２２、４５６、５４６、６３２、６６４、７８０、９８８、１１０４、１１２２、１２２４、１２５６、１３７０、１４０４、１４９４、１５８０、１６１２および／または１７２８のアミラーゼよりも熱安定性が高い。一部の実施形態では、組換えアミラーゼは、３０℃、３７℃、４０℃、５０℃、６０℃および／または９５℃および／または４０℃～６０℃で安定している。一部の実施形態では、組換えアミラーゼは、２５℃、３７℃、４２℃および／または４８℃で安定している。一部の追加の実施形態では、組換えアミラーゼは、３０℃、３７℃、４０℃、５０℃、６０℃および／または９５℃および／または４０℃～６０℃で参照配列よりも安定している。一部の実施形態では、組換えアミラーゼは、３０℃、３７℃、４０℃、５０℃、６０℃および／または９５℃および／または４０℃～６０℃で参照配列よりも安定している。一部の追加の実施形態では、組換えアミラーゼは、配列番号２のアミラーゼよりも熱安定性が高い。一部のさらなる実施形態では、組換えアミラーゼは、配列番号１８、４０、１５６、１７４、２７６、３０８、４２２、４５６、５４６、６３２、６６４、７８０、９８８、１１０４、１１２２、１２２４、１２５６、１３７０、１４０４、１４９４、１５８０、１６１２および／または１７２８のアミラーゼよりも熱安定性が高い。

一部の実施形態では、組換えアミラーゼは、低ｐＨ環境において安定しており、一方、他の実施形態では、組換えアミラーゼは、高ｐＨ環境において安定しており、またさらなる実施形態では、組換えは、中性ｐＨ環境において安定している。一部の実施形態では、組換えアミラーゼは、低、高および／または中性ｐＨ環境において安定している。一部の実施形態では、組換えアミラーゼは、低、高および／または中性ｐＨ環境への曝露後に、酵素活性を保持する。一部の追加の実施形態では、組換えアミラーゼは、参照配列と比較して、高、低および／または中性ｐＨ環境（複数可）において、より安定している。一部の実施形態では、参照配列は、野生型アミラーゼであり、一方、他の実施形態では、参照配列は、別の操作されたアミラーゼである。一部の追加の実施形態では、組換えアミラーゼは、配列番号２のアミラーゼよりも安定している。一部のさらなる実施形態では、組換えアミラーゼは、配列番号１８、４０、１５６、１７４、２７６、３０８、４２２、４５６、５４６、６３２、６６４、７８０、９８８、１１０４、１１２２、１２２４、１２５６、１３７０、１４０４、１４９４、１５８０、１６１２および／または１７２８のアミラーゼよりも安定している。一部の追加の実施形態では、組換えアミラーゼは、７よりも大きいｐＨで、配列番号２のアミラーゼよりも安定している。一部の追加の実施形態では、組換えアミラーゼは、７よりも大きいｐＨで、配列番号１８、４０、１５６、１７４、２７６、３０８、４２２、４５６、５４６、６３２、６６４、７８０、９８８、１１０４、１１２２、１２２４、１２５６、１３７０、１４０４、１４９４、１５８０、１６１２および／または１７２８のアミラーゼよりも安定している。一部の追加の実施形態では、組換えアミラーゼは、ｐＨ７．８で、配列番号２のアミラーゼよりも安定している。一部の追加の実施形態では、組換えアミラーゼは、ｐＨ７．８で、配列番号１８、４０、１５６、１７４、２７６、３０８、４２２、４５６、５４６、６３２、６６４、７８０、９８８、１１０４、１１２２、１２２４、１２５６、１３７０、１４０４、１４９４、１５８０、１６１２および／または１７２８のアミラーゼよりも安定している。一部の追加の実施形態では、組換えアミラーゼは、ｐＨ７．５で、配列番号２のアミラーゼよりも安定している。一部の追加の実施形態では、組換えアミラーゼは、ｐＨ７．５で、配列番号１８、４０、１５６、１７４、２７６、３０８、４２２、４５６、５４６、６３２、６６４、７８０、９８８、１１０４、１１２２、１２２４、１２５６、１３７０、１４０４、１４９４、１５８０、１６１２および／または１７２８のアミラーゼよりも安定している。一部の追加の実施形態では、組換えアミラーゼは、ｐＨ７で、配列番号２のアミラーゼよりも安定している。一部の追加の実施形態では、組換えアミラーゼは、ｐＨ７で、配列番号１８、４０、１５６、１７４、２７６、３０８、４２２、４５６、５４６、６３２、６６４、７８０、９８８、１１０４、１１２２、１２２４、１２５６、１３７０、１４０４、１４９４、１５８０、１６１２および／または１７２８のアミラーゼよりも安定している。一部のさらなる実施形態では、組換えアミラーゼは、７未満のｐＨで（すなわち、酸性ｐＨ条件またはレベル下で）、配列番号２のアミラーゼよりも安定している。一部の追加の実施形態では、組換えアミラーゼは、ｐＨ７未満のｐＨで（すなわち、酸性ｐＨ条件またはレベル下で）、配列番号１８、４０、１５６、１７４、２７６、３０８、４２２、４５６、５４６、６３２、６６４、７８０、９８８、１１０４、１１２２、１２２４、１２５６、１３７０、１４０４、１４９４、１５８０、１６１２および／または１７２８のアミラーゼよりも安定している。一部の追加の実施形態では、組換えアミラーゼは、ｐＨ６．８で、配列番号２のアミラーゼよりも安定している。一部の追加の実施形態では、組換えアミラーゼは、ｐＨ６．８で、配列番号１８、４０、１５６、１７４、２７６、３０８、４２２、４５６、５４６、６３２、６６４、７８０、９８８、１１０４、１１２２、１２２４、１２５６、１３７０、１４０４、１４９４、１５８０、１６１２および／または１７２８のアミラーゼよりも安定している。一部の追加の実施形態では、組換えアミラーゼは、ｐＨ６．７で、配列番号２のアミラーゼよりも安定している。一部の追加の実施形態では、組換えアミラーゼは、ｐＨ６．７で、配列番号１８、４０、１５６、１７４、２７６、３０８、４２２、４５６、５４６、６３２、６６４、７８０、９８８、１１０４、１１２２、１２２４、１２５６、１３７０、１４０４、１４９４、１５８０、１６１２および／または１７２８のアミラーゼよりも安定している。一部の追加の実施形態では、組換えアミラーゼは、ｐＨ６．５で、配列番号２のアミラーゼよりも安定している。一部の追加の実施形態では、組換えアミラーゼは、ｐＨ６．５で、配列番号１８、４０、１５６、１７４、２７６、３０８、４２２、４５６、５４６、６３２、６６４、７８０、９８８、１１０４、１１２２、１２２４、１２５６、１３７０、１４０４、１４９４、１５８０、１６１２および／または１７２８のアミラーゼよりも安定している。一部の追加の実施形態では、組換えアミラーゼは、ｐＨ６で、配列番号２のアミラーゼよりも安定している。一部の追加の実施形態では、組換えアミラーゼは、ｐＨ６で、配列番号１８、４０、１５６、１７４、２７６、３０８、４２２、４５６、５４６、６３２、６６４、７８０、９８８、１１０４、１１２２、１２２４、１２５６、１３７０、１４０４、１４９４、１５８０、１６１２および／または１７２８のアミラーゼよりも安定している。一部のさらなる実施形態では、組換えアミラーゼは、５未満のｐＨで、配列番号２のアミラーゼよりも安定している。一部の追加の実施形態では、組換えアミラーゼは、ｐＨ５で、配列番号２のアミラーゼよりも安定している。一部の追加の実施形態では、組換えアミラーゼは、ｐＨ５で、配列番号１８、４０、１５６、１７４、２７６、３０８、４２２、４５６、５４６、６３２、６６４、７８０、９８８、１１０４、１１２２、１２２４、１２５６、１３７０、１４０４、１４９４、１５８０、１６１２および／または１７２８のアミラーゼよりも安定している。一部のさらなる実施形態では、組換えアミラーゼは、ｐＨ４で、配列番号２のアミラーゼよりも安定している。一部のさらなる実施形態では、組換えアミラーゼは、ｐＨ５で、配列番号１８、４０、１５６、１７４、２７６、３０８、４２２、４５６、５４６、６３２、６６４、７８０、９８８、１１０４、１１２２、１２２４、１２５６、１３７０、１４０４、１４９４、１５８０、１６１２および／または１７２８のアミラーゼよりも安定している。一部の追加の実施形態では、組換えアミラーゼは、ｐＨ３．８で、配列番号２のアミラーゼよりも安定している。一部の追加の実施形態では、組換えアミラーゼは、ｐＨ３．８で、配列番号１８、４０、１５６、１７４、２７６、３０８、４２２、４５６、５４６、６３２、６６４、７８０、９８８、１１０４、１１２２、１２２４、１２５６、１３７０、１４０４、１４９４、１５８０、１６１２および／または１７２８のアミラーゼよりも安定している。

一部の追加の実施形態では、組換えアミラーゼは、ｐＨ３．５で、配列番号２のアミラーゼよりも安定している。一部の追加の実施形態では、組換えアミラーゼは、ｐＨ３．５で、配列番号１８、４０、１５６、１７４、２７６、３０８、４２２、４５６、５４６、６３２、６６４、７８０、９８８、１１０４、１１２２、１２２４、１２５６、１３７０、１４０４、１４９４、１５８０、１６１２および／または１７２８のアミラーゼよりも安定している。一部の追加の実施形態では、組換えアミラーゼは、ｐＨ３．２５で、配列番号２のアミラーゼよりも安定している。一部の追加の実施形態では、組換えアミラーゼは、ｐＨ３．２５で、配列番号１８、４０、１５６、１７４、２７６、３０８、４２２、４５６、５４６、６３２、６６４、７８０、９８８、１１０４、１１２２、１２２４、１２５６、１３７０、１４０４、１４９４、１５８０、１６１２および／または１７２８のアミラーゼよりも安定している。一部のさらなる実施形態では、組換えアミラーゼは、ｐＨ３で、配列番号２のアミラーゼよりも安定している。一部のさらなる実施形態では、組換えアミラーゼは、ｐＨ３で、配列番号１８、４０、１５６、１７４、２７６、３０８、４２２、４５６、５４６、６３２、６６４、７８０、９８８、１１０４、１１２２、１２２４、１２５６、１３７０、１４０４、１４９４、１５８０、１６１２および／または１７２８のアミラーゼよりも安定している。一部の追加の実施形態では、組換えアミラーゼは、ｐＨ２．７５で、配列番号２のアミラーゼよりも安定している。一部の追加の実施形態では、組換えアミラーゼは、ｐＨ２．７５で、配列番号１８、４０、１５６、１７４、２７６、３０８、４２２、４５６、５４６、６３２、６６４、７８０、９８８、１１０４、１１２２、１２２４、１２５６、１３７０、１４０４、１４９４、１５８０、１６１２および／または１７２８のアミラーゼよりも安定している。一部のさらなる実施形態では、組換えアミラーゼは、ｐＨ２．５で、配列番号２のアミラーゼよりも安定している。一部のさらなる実施形態では、組換えアミラーゼは、ｐＨ２．５で、配列番号１８、４０、１５６、１７４、２７６、３０８、４２２、４５６、５４６、６３２、６６４、７８０、９８８、１１０４、１１２２、１２２４、１２５６、１３７０、１４０４、１４９４、１５８０、１６１２および／または１７２８のアミラーゼよりも安定している。一部のさらなる実施形態では、組換えアミラーゼは、ｐＨ２．３で、配列番号２のアミラーゼよりも安定している。一部のさらなる実施形態では、組換えアミラーゼは、ｐＨ２．３で、配列番号１８、４０、１５６、１７４、２７６、３０８、４２２、４５６、５４６、６３２、６６４、７８０、９８８、１１０４、１１２２、１２２４、１２５６、１３７０、１４０４、１４９４、１５８０、１６１２および／または１７２８のアミラーゼよりも安定している。一部のさらなる実施形態では、組換えアミラーゼは、ｐＨ２で、配列番号２のアミラーゼよりも安定している。一部のさらなる実施形態では、組換えアミラーゼは、ｐＨ２で、配列番号１８、４０、１５６、１７４、２７６、３０８、４２２、４５６、５４６、６３２、６６４、７８０、９８８、１１０４、１１２２、１２２４、１２５６、１３７０、１４０４、１４９４、１５８０、１６１２および／または１７２８のアミラーゼよりも安定している。

一部の実施形態では、組換えアミラーゼは、配列番号２のアミラーゼよりもタンパク質分解に対する抵抗性が高い。一部の実施形態では、組換えアミラーゼは、配列番号１８、４０、１５６、１７４、２７６、３０８、４２２、４５６、５４６、６３２、６６４、７８０、９８８、１１０４、１１２２、１２２４、１２５６、１３７０、１４０４、１４９４、１５８０、１６１２および／または１７２８のアミラーゼよりもタンパク質分解に対する抵抗性が高い。一部の実施形態では、組換えアミラーゼは、ペプシンによるタンパク質分解に対して抵抗性である。一部の追加の実施形態では、組換えアミラーゼは、配列番号２のアミラーゼよりも、ペプシンによるタンパク質分解に対する抵抗性が高い。一部の実施形態では、組換えアミラーゼは、配列番号１８、４０、１５６、１７４、２７６、３０８、４２２、４５６、５４６、６３２、６６４、７８０、９８８、１１０４、１１２２、１２２４、１２５６、１３７０、１４０４、１４９４、１５８０、１６１２および／または１７２８のアミラーゼよりも、ペプシンによるタンパク質分解に対する抵抗性が高い。

一部の追加の実施形態では、組換えアミラーゼは、少なくとも１種の胆汁酸塩の存在下で活性がある。一部の追加の実施形態では、組換えアミラーゼは、少なくとも１種の胆汁酸塩の存在下で、配列番号２のアミラーゼよりも活性が高い。一部の追加の実施形態では、組換えアミラーゼは、少なくとも１種の胆汁酸塩の存在下で、配列番号１８、４０、１５６、１７４、２７６、３０８、４２２、４５６、５４６、６３２、６６４および／または７８０、９８８、１１０４、１１２２、１２２４、１２５６、１３７０、１４０４、１４９４、１５８０、１６１２および／または１７２８のアミラーゼよりも活性が高い。一部の実施形態では、組換えアミラーゼは、胆汁酸塩への曝露後に酵素活性を保持する。一部の追加の実施形態では、組換えアミラーゼは、参照配列と比較して、胆汁酸塩への曝露後により高い酵素活性を保持する。一部の実施形態では、参照配列は、配列番号２、１８、４０、１５６、１７４、２７６、３０８、４２２、４５６、５４６、６３２、６６４、７８０、９８８、１１０４、１１２２、１２２４、１２５６、１３７０、１４０４、１４９４、１５８０、１６１２および／または１７２８のアミラーゼである。一部の追加の実施形態では、胆汁酸塩は、タウロコール酸塩である。

また一部の追加の実施形態では、組換えアミラーゼは、野生型アミラーゼまたは別の組換えアミラーゼと比較して、２種以上の改善された特性を示す。一部の実施形態では、組換えアミラーゼは、配列番号２と比較して、２種以上の改善された特性を示し、一方、一部の追加の実施形態では、組換えアミラーゼは、配列番号１８、４０、１５６、１７４、２７６、３０８、４２２、４５６、５４６、６３２、６６４、７８０、９８８、１１０４、１１２２、１２２４、１２５６、１３７０、１４０４、１４９４、１５８０、１６１２および／または１７２８と比較して、２種以上の改善された特性を示す。一部の実施形態では、改善された特性は、酸安定性、アルカリ安定性、酸性ｐＨにおける安定性および／または活性、アルカリｐＨにおける安定性、中性ｐＨにおける安定性、熱安定性、タンパク質分解抵抗性、自己分解抵抗性、ならびに少なくとも１種の胆汁酸塩の存在下での増加した活性から選択される。また一部の追加の実施形態では、組換えアミラーゼは、配列番号２、１８、４０、１５６、１７４、２７６、３０８、４２２、４５６、５４６、６３２、６６４、７８０、９８８、１１０４、１１２２、１２２４、１２５６、１３７０、１４０４、１４９４、１５８０、１６１２および／または１７２８のアミラーゼよりも、酸性ｐＨで安定性が高いおよび／もしくは活性が高い、熱安定性が高い、タンパク質分解に対する抵抗性が高い、ならびに／または少なくとも１種の胆汁酸塩の存在下で活性が高い。改善された特性のいずれかの組合せが、本発明において用途があることが企図される。本発明が、改善された特性のいずれか具体的な組合せに限定されることは意図されない。さらに、一部の実施形態では、２種の改善された特性が存在し、一方、一部の他の実施形態では、３種の改善された特性が存在し、一部の追加の実施形態では、４種の改善された特性が存在し、一部の追加の実施形態では、５種またはそれを超える改善された特性が存在する。本発明の組換えアミラーゼが、追加の改善をさらに含むことも企図される。一部の実施形態では、このような追加の改善は、野生型アミラーゼを上回る利点を提供し、一方、一部の他の実施形態では、追加の改善は、他の組換えアミラーゼを上回る利点を提供するであろう。

一部の実施形態では、組換えアミラーゼは、配列番号２のアミラーゼと比較して、酸性ｐＨにおける改善された安定性および／もしくは活性、改善された熱安定性、タンパク質分解に対する改善された抵抗性、ならびに／または少なくとも１種の胆汁酸塩の存在下での改善された活性から選択される少なくとも１種の改善された特性を示す。一部の実施形態では、組換えアミラーゼは、配列番号１８、４０、１５６、１７４、２７６、３０８、４２２、４５６、５４６、６３２、６６４、７８０、９８８、１１０４、１１２２、１２２４、１２５６、１３７０、１４０４、１４９４、１５８０、１６１２および／または１７２８のアミラーゼと比較して、酸性ｐＨにおける改善された安定性および／もしくは活性、改善された熱安定性、タンパク質分解に対する改善された抵抗性、ならびに／または少なくとも１種の胆汁酸塩の存在下での改善された活性から選択される少なくとも１種の改善された特性を示す。一部の実施形態では、組換えアミラーゼは、配列番号２のアミラーゼと比較して、酸性ｐＨにおける改善された安定性および／もしくは活性、改善された熱安定性、タンパク質分解に対する改善された抵抗性、ならびに／または少なくとも１種の胆汁酸塩の存在下での改善された活性から選択される少なくとも２種の改善された特性を示す。一部の実施形態では、組換えアミラーゼは、配列番号１８、４０、１５６、１７４、２７６、３０８、４２２、４５６、５４６、６３２、６６４、７８０、９８８、１１０４、１１２２、１２２４、１２５６、１３７０、１４０４、１４９４、１５８０、１６１２および／または１７２８のアミラーゼと比較して、酸性ｐＨにおける改善された安定性および／もしくは活性、改善された熱安定性、タンパク質分解に対する改善された抵抗性、ならびに／または少なくとも１種の胆汁酸塩の存在下での改善された活性から選択される少なくとも２種の改善された特性を示す。一部の実施形態では、組換えアミラーゼは、配列番号２のアミラーゼと比較して、酸性ｐＨにおける改善された安定性および／もしくは活性、改善された熱安定性、タンパク質分解に対する改善された抵抗性、ならびに／または少なくとも１種の胆汁酸塩の存在下での改善された活性から選択される少なくとも３種の改善された特性を示す。一部の実施形態では、組換えアミラーゼは、配列番号１８、４０、１５６、１７４、２７６、３０８、４２２、４５６、５４６、６３２、６６４、７８０、９８８、１１０４、１１２２、１２２４、１２５６、１３７０、１４０４、１４９４、１５８０、１６１２および／または１７２８のアミラーゼと比較して、酸性ｐＨにおける改善された安定性および／もしくは活性、改善された熱安定性、タンパク質分解に対する改善された抵抗性、ならびに／または少なくとも１種の胆汁酸塩の存在下での改善された活性から選択される少なくとも３種の改善された特性を示す。一部の実施形態では、組換えアミラーゼは、配列番号２のアミラーゼと比較して、酸性ｐＨにおける改善された安定性および／もしくは活性、改善された熱安定性、タンパク質分解に対する改善された抵抗性、ならびに少なくとも１種の胆汁酸塩の存在下での改善された活性の改善された特性を示す。一部の実施形態では、組換えアミラーゼは、配列番号１８、４０、１５６、１７４、２７６、３０８、４２２、４５６、５４６、６３２、６６４、７８０、９８８、１１０４、１１２２、１２２４、１２５６、１３７０、１４０４、１４９４、１５８０、１６１２および／または１７２８のアミラーゼと比較して、酸性ｐＨにおける改善された安定性および／もしくは活性、改善された熱安定性、タンパク質分解に対する改善された抵抗性、ならびに／または少なくとも１種の胆汁酸塩の存在下での改善された活性の改善された特性を示す。一部の実施形態では、組換えアミラーゼは、配列番号２のアミラーゼと比較して、酸性ｐＨにおける改善された安定性および／もしくは活性、改善された熱安定性、タンパク質分解に対する改善された抵抗性、ならびに／または少なくとも１種の胆汁酸塩の存在下での改善された活性から選択される少なくとも１種の改善された特性、ならびに少なくとも１種の追加の改善された特性を示す。一部の実施形態では、組換えアミラーゼは、配列番号１８、４０、１５６、１７４、２７６、３０８、４２２、４５６、５４６、６３２、６６４、７８０、９８８、１１０４、１１２２、１２２４、１２５６、１３７０、１４０４、１４９４、１５８０、１６１２および／または１７２８のアミラーゼと比較して、酸性ｐＨにおける改善された安定性および／もしくは活性、改善された熱安定性、タンパク質分解に対する改善された抵抗性、ならびに／または少なくとも１種の胆汁酸塩の存在下での改善された活性から選択される少なくとも１種の改善された特性、ならびに少なくとも１種の追加の改善された特性を示す。一部の実施形態では、組換えアミラーゼは、参照配列と比較して、ｉ）増強された触媒活性；ｉｉ）酸性ｐＨに対する増加した耐性；ｉｉｉ）ｐＨ２．３、２．５、２．７５、３、３．２５および／もしくは３．５に対する増加した耐性；ｉｖ）ｐＨ６．７および／もしくは６．８に対する増加した耐性；ｖ）少なくとも１種のプロテアーゼに対する増加した耐性；ｖｉ）少なくとも１種の胆汁酸塩に対する増加した耐性；ｖｉｉ）増加した熱耐性；またはｉ）、ｉｉ）、ｉｉｉ）、ｉｖ）、ｖ）、ｖｉ）およびｖｉｉ）のいずれかの組合せから選択される少なくとも１種の改善された特性を示す。一部の実施形態では、参照配列は、配列番号２であり、一方、一部の代替実施形態では、参照配列は、配列番号１８、４０、１５６、１７４、２７６、３０８、４２２、４５６、５４６、６３２、６６４、７８０、９８８、１１０４、１１２２、１２２４、１２５６、１３７０、１４０４、１４９４、１５８０、１６１２および／または１７２８から選択される。一部の実施形態では、組換えアミラーゼは、少なくとも１種の参照配列と比較して、ｉ）増強された触媒活性；ｉｉ）酸性ｐＨに対する増加した耐性；ｉｉｉ）ｐＨ２．３、２．５、２．７５、３、３．２５および／もしくは３．５に対する増加した耐性；ｉｖ）ｐＨ６．７および／もしくは６．８に対する増加した耐性；ｖ）少なくとも１種のプロテアーゼに対する増加した耐性；ｖｉ）少なくとも１種の胆汁酸塩に対する増加した耐性；ｖｉｉ）増加した熱耐性；またはｉ）、ｉｉ）、ｉｉｉ）、ｉｖ）、ｖ）、ｖｉ）およびｖｉｉ）のいずれかの組合せから選択される少なくとも１種の改善された特性を示す。一部の実施形態では、参照配列は、配列番号２であり、一方、一部の代替実施形態では、参照配列は、配列番号１８、４０、１５６、１７４、２７６、３０８、４２２、４５６、５４６、６３２、６６４、７８０、９８８、１１０４、１１２２、１２２４、１２５６、１３７０、１４０４、１４９４、１５８０、１６１２および／または１７２８から選択される。一部の実施形態では、組換えアミラーゼは、少なくとも２種またはそれを超える参照配列と比較して、ｉ）増強された触媒活性；ｉｉ）酸性ｐＨに対する増加した耐性；ｉｉｉ）ｐＨ２．３、２．５、２．７５、３、３．２５および／もしくは３．５に対する増加した耐性；ｉｖ）ｐＨ６．７および／もしくは６．８に対する増加した耐性；ｖ）少なくとも１種のプロテアーゼに対する増加した耐性；ｖｉ）少なくとも１種の胆汁酸塩に対する増加した耐性；ｖｉｉ）増加した熱耐性；またはｉ）、ｉｉ）、ｉｉｉ）、ｉｖ）、ｖ）、ｖｉ）およびｖｉｉ）のいずれかの組合せから選択される少なくとも１種の改善された特性を示す。一部の実施形態では、参照配列は、配列番号１８、４０、１５６、１７４、２７６、３０８、４２２、４５６、５４６、６３２、６６４、７８０、９８８、１１０４、１１２２、１２２４、１２５６、１３７０、１４０４、１４９４、１５８０、１６１２および／または１７２８から選択される。一部の実施形態では、プロテアーゼは、ペプシン、トリプシンおよび／またはキモトリプシンから選択される。一部の実施形態では、増加した熱耐性は、３０℃、３７℃、４０℃、５０℃、６０℃および／または９５℃および／または４０℃～６０℃で測定される。一部のさらなる実施形態では、組換えアミラーゼは、精製されている。

さらに一部のさらなる実施形態では、アミラーゼは、食物および／または飲料において安定している。一部の追加の実施形態では、アミラーゼは、栄養および他の補助食品において安定している。一部の実施形態では、補助食品は、液体であり、一方、他の実施形態では、エマルション、懸濁液または固体である。本発明が、いずれか特定の食物、飲料および／または補助食品形式または形態に限定されることは意図されない。

本発明はまた、本明細書に提供される少なくとも１種の組換えアミラーゼをコードする組換えポリヌクレオチド配列を提供する。一部の実施形態では、組換えポリヌクレオチド配列は、コドン最適化されている。一部のさらなる実施形態では、組換えポリヌクレオチドは、配列番号３～１７、２１～９６５および９６９～１９１３のうち奇数番号の配列に表示される少なくとも１種の配列に対して少なくとも約８５％、約８６％、約８７％、約８８％、約８９％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％またはそれを超える配列同一性を有する配列を含む。一部のさらなる実施形態では、ポリヌクレオチドは、配列番号３～１７、２１～９６５および９６９～１９１３のうち奇数番号の配列に表示される少なくとも１種の配列に対して少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれを超える配列同一性を有する配列を含む。一部の追加の実施形態では、本発明は、配列番号３～１７、２１～９６５および９６９～１９１３のうち奇数番号の配列に表示される少なくとも１種の配列を提供する。一部の追加の実施形態では、組換えポリヌクレオチド配列は、配列番号３～１７、２１～９６５および９６９～１９１３のうち奇数番号の配列から選択される配列を含む。一部の実施形態では、組換えポリヌクレオチド配列は、配列番号３～１７、２１～９６５および９６９～１９１３のうち奇数番号の配列から選択される配列を含み、前記配列は、本明細書に提供される組換えポリペプチドをコードする。一部の実施形態では、組換えポリヌクレオチド配列は、配列番号３～１７、２１～９６５および９６９～１９１３のうち奇数番号の配列から選択される配列を含み、前記配列は、配列番号４～１８、２２～９６６および９７０～１９１４のうち偶数番号の配列に提供される組換えポリペプチドをコードする。一部のさらなる実施形態では、本明細書に提供される組換えアミラーゼをコードする組換えポリヌクレオチドは、配列番号３～１７、２１～９６５および９６９～１９１３のうち奇数番号の配列に表示される少なくとも１種の配列に対して少なくとも約８５％、約８６％、約８７％、約８８％、約８９％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％またはそれを超える配列同一性を有する配列を含む。一部のさらなる実施形態では、本明細書に提供される組換えアミラーゼをコードする組換えポリヌクレオチドは、配列番号３～１７、２１～９６５および９６９～１９１３のうち奇数番号の配列に表示される少なくとも１種の配列に対して少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれを超える配列同一性を有する配列を含む。一部のさらなる実施形態では、本明細書に提供される組換えアミラーゼをコードする組換えポリヌクレオチドは、配列番号３～１７、２１～９６５および９６９～１９１３のうち奇数番号の配列に表示される少なくとも１種の配列に対して少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれを超える配列同一性を有する配列を含み、組換えアミラーゼは、配列番号４～１８、２２～９６６および９７０～１９１４に提供される偶数番号の配列を含むポリペプチド配列を含む。

本発明はまた、本明細書に提供される少なくとも１種の組換えポリヌクレオチド配列を含む発現ベクターを提供する。本発明はまた、本明細書に提供される少なくとも１種の組換えアミラーゼをコードする少なくとも１種の組換えポリヌクレオチド配列を含む発現ベクターを提供する。一部の追加の実施形態では、組換えポリヌクレオチド配列は、制御配列に作動可能に連結されている。一部の実施形態では、制御配列は、プロモーターである。一部のさらなる実施形態では、プロモーターは、異種プロモーターである。

本発明はまた、本明細書に提供される少なくとも１種の発現ベクターを含む宿主細胞を提供する。本発明はまた、本明細書に提供される少なくとも１種の組換えアミラーゼをコードする少なくとも１種の組換えポリヌクレオチド配列を含む少なくとも１種の発現ベクターを含む宿主細胞を提供する。本発明はまた、本明細書に提供される少なくとも１種の組換えアミラーゼをコードする少なくとも１種の組換えポリヌクレオチド配列を含む発現ベクターを含む宿主細胞を提供する。本発明はまた、本明細書に提供される組換えアミラーゼをコードする少なくとも１種の組換えポリヌクレオチド配列を含む発現ベクターを含む宿主細胞を提供する。一部の実施形態では、宿主細胞は、真核細胞であり、一方、一部の代替実施形態では、宿主細胞は、原核細胞である。一部の実施形態では、宿主細胞は、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉである。一部の代替実施形態では、宿主細胞は、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅである。

本発明はまた、少なくとも１種の組換えアミラーゼを産生する方法であって、組換えポリヌクレオチドによってコードされた組換えアミラーゼが産生される条件下で、本明細書に提供される少なくとも１種の宿主細胞を培養するステップを含む方法を提供する。一部の実施形態では、方法は、アミラーゼを回収するステップをさらに含む。また一部の追加の実施形態では、方法は、アミラーゼを精製するステップをさらに含む。

本発明はまた、本明細書に提供される少なくとも１種の組換えアミラーゼを含む組成物を提供する。一部の実施形態では、少なくとも１種の組換えアミラーゼを含む組成物は、医薬組成物を含む。一部の追加の実施形態では、医薬組成物は、膵機能不全の処置に適する。一部の追加の実施形態では、医薬組成物は、薬学的に許容される担体および／または賦形剤をさらに含む。一部の実施形態では、医薬組成物は、ヒトへの非経口注射もしくは注入、皮下注射、吸入および／または皮膚適用に適する。一部の実施形態では、医薬組成物は、ヒトへの経口投与に適する。一部の実施形態では、医薬組成物は、腸溶コーティングをさらに含む。

一部の追加の実施形態では、医薬組成物は、少なくとも１種のリパーゼをさらに含む。一部のさらなる実施形態では、医薬組成物は、少なくとも１種のプロテアーゼをさらに含む。また一部の追加の実施形態では、医薬組成物は、少なくとも１種のプロテアーゼおよび少なくとも１種のリパーゼをさらに含む。一部の実施形態では、医薬組成物は、リパーゼ、プロテアーゼおよびアミラーゼ活性を含む膵臓抽出物をさらに含む。本発明はまた、本明細書に提供される少なくとも１種の組換えアミラーゼを含む組成物であって、他の使用に適する組成物を提供する。

本発明はまた、対象における膵機能不全の症状を処置および／または予防するための方法であって、膵機能不全を有する対象を確保するステップと、本明細書に提供される医薬組成物を対象に与えるステップとを含む方法を提供する。一部の実施形態では、膵機能不全の症状は、対象への少なくとも１種の組換えアミラーゼを含む組成物の投与後に、対象において軽快する。一部のさらなる実施形態では、対象は、膵機能不全の症状を示す対象に要求される食事よりも、その炭水化物含有量（例えば、デンプン）の制限が少ない食事を取ることができる。一部の追加の実施形態では、対象は、ヒト患者である。一部の実施形態では、ヒト患者は、乳児であり、一方、一部の他の実施形態では、ヒト患者は、小児である。また一部のさらなる実施形態では、ヒト患者は、成人であり、一方、一部の代替実施形態では、ヒト患者は、若年成人である。一部の実施形態では、対象は、非ヒト霊長類、ブタ、ウシ、イヌおよびネコ等の非ヒト哺乳動物である。本発明はさらに、本明細書に提供される少なくとも１種の組換えアミラーゼを含む医薬を提供する。本発明はまた、本明細書に提供される少なくとも１種の組換えアミラーゼを含む組成物の使用を提供する。

本発明はさらに、デンプン加水分解のための方法であって、デンプン、および本明細書に提供される少なくとも１種の操作されたアミラーゼを提供するステップと、デンプンが前記操作されたアミラーゼによって加水分解されるような条件下で、デンプンを操作されたアミラーゼに曝露するステップとを含む方法を提供する。一部の実施形態では、本発明は、デンプン加水分解のための方法であって、デンプン、および少なくとも１種の操作されたアミラーゼを含む組成物を提供するステップと、前記デンプンが前記組成物の前記操作されたアミラーゼによって加水分解されるような条件下で、前記デンプンを前記組成物に曝露するステップとを含む方法を提供する。

発明の説明
本発明は、操作されたアミラーゼポリペプチドおよびその組成物を提供する。操作されたアミラーゼポリペプチドは、改善された熱安定性、プロテアーゼ安定性、および酸性（ｐＨ＜７）条件を含む幅広いｐＨ条件下での安定性を提供するように最適化されている。本発明はまた、治療および／または栄養上の目的のための、操作されたアミラーゼポリペプチドを含む組成物の使用に関する。一部の実施形態では、本発明のアミラーゼバリアントは、ＰＥＩ状態のＰＥＲＴ処置における用途が見出されている。一部の追加の実施形態では、アミラーゼは、腸溶コーティングおよび／またはプロトンポンプ阻害薬（ＰＰＩ）を必要としないフォーマットにおいて投与される。本発明はまた、操作されたアミラーゼポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、ならびに操作されたポリヌクレオチドおよびアミラーゼポリペプチドを産生するための方法を提供する。
略語および定義：

他に規定がなければ、本明細書で使用されているあらゆる技術および科学用語は一般に、本発明が属する技術分野の当業者によって一般的に理解されているものと同じ意義を有する。一般に、本明細書で使用されている命名法、ならびに後述する細胞培養、分子遺伝学、微生物学、生化学、有機化学、分析化学および核酸化学の研究室手順は、当技術分野で周知かつ一般的に用いられているものである。そのような技法は、周知されており、当業者にとって周知の多数の教科書および参考文献に記載されている。標準技法またはその修正が、化学合成および化学分析のために使用される。上記および下記の両方で本明細書に言及されているあらゆる特許、特許出願、論文および刊行物は、これにより明確に参照により本明細書に組み込まれる。

本明細書に記載されているものと同様または等価の任意の適切な方法および材料が、本発明の実施において用途があるが、一部の方法および材料が、本明細書に記載されている。記載されている特定の方法論、プロトコールおよび試薬は、当業者によって使用される文脈に応じて変動し得るため、本発明が、そのようなものに限定されないことを理解されたい。したがって、直ぐ下に定義されている用語は、本出願を全体として参照することによって、より十分に記載される。上記および下記の両方で本明細書に言及されているあらゆる特許、特許出願、論文および刊行物は、これにより明確に参照により本明細書に組み込まれる。

本明細書で使用される場合、単数形「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」および「その（ｔｈｅ）」は、文脈がそれ以外のことを明らかに指示しない限り、複数の参照を含む。

数的な範囲は、当該範囲を定義する数を包括する。よって、本明細書に開示されている全ての数的範囲は、斯かるより広い数的範囲内に収まる全てのより狭い数的範囲を、あたかも斯かるより狭い数的範囲が全て本明細書に明確に書かれているかのように、包含することが意図される。本明細書に開示されている全ての最大（または最小）の数的限界が、全てのより低い（またはより高い）数的限界を、あたかも斯かるより低い（またはより高い）数的限界が本明細書に明確に書かれているかのように、含むことも意図される。

本明細書で使用される場合、「約」という用語は、特定の値の許容誤差を意味する。一部の例では、「約」は、所与の値から０．０５％、０．５％、１．０％、または２．０％以内の範囲を意味する。一部の例では、「約」は、所与の値から１、２、３、または４標準偏差以内を意味する。

さらに、本明細書に提供される見出しは、本出願を全体として参照することによって得られる本発明の様々な態様または実施形態を限定するものではない。したがって、直ぐ下に定義されている用語は、本出願を全体として参照することによって、より十分に定義される。そうであるにもかかわらず、本発明の理解を容易にするために、いくつかの用語を下に定義する。

他に指示がなければ、核酸は、左から右へ、５’から３’への方向性で；アミノ酸配列は、左から右へ、アミノからカルボキシへの方向性で、それぞれ書かれる。

本明細書で使用される場合、用語「を含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」およびその同語源語は、それらの包括的な意味で（すなわち、用語「を含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」およびその対応する同語源語と等価に）使用される。

本明細書で使用される場合、「ＥＣ」番号は、国際生化学分子生物学連合の命名委員会の酵素命名法（ＥｎｚｙｍｅＮｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅｏｆｔｈｅＮｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅＣｏｍｍｉｔｔｅｅｏｆｔｈｅＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌＵｎｉｏｎｏｆＢｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙａｎｄＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ）（ＮＣ－ＩＵＢＭＢ）を指す。ＩＵＢＭＢ生化学分類は、触媒する化学反応に基づく酵素の数的分類系である。

本明細書で使用される場合、「ＡＴＣＣ」は、そのバイオレポジトリ収集物が遺伝子および系統を含む、アメリカ合衆国培養細胞系統保存機関（ＡｍｅｒｉｃａｎＴｙｐｅＣｕｌｔｕｒｅＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）を指す。

本明細書で使用される場合、「ＮＣＢＩ」は、国立生物工学情報センター（ＮａｔｉｏｎａｌＣｅｎｔｅｒｆｏｒＢｉｏｌｏｇｉｃａｌＩｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）およびその中で提供される配列データベースを指す。

本明細書で使用される場合、「アミラーゼ」とは、デンプンを加水分解してグルコースおよびマルトースを生成することができる酵素を指す。

本明細書で使用される場合、「プロテアーゼ」（ならびに「プロテイナーゼ」および「ペプチダーゼ」）とは、タンパク質を加水分解する多数の酵素を指す。タンパク質のより小さなポリペプチド単位または単一アミノ酸への分解に関与する多数のプロテアーゼが存在する。プロテアーゼは、摂取されたタンパク質の消化、タンパク質異化、および細胞シグナル伝達を含む多数の生物学的機能に重要である。

本明細書で使用される場合、「リパーゼ」とは、トリグリセリドのエステル結合を加水分解することによって脂肪の加水分解を触媒する、一般的に「リパーゼ」と称されるあらゆる酵素を指す。膵リパーゼは、脂肪の、脂肪酸、グリセロール、および他のアルコールへの分解において重要である。リパーゼは、大半の生物において、食事性脂質の消化、輸送、および処理に不可欠である。

本明細書で使用される場合、用語「脂質」は、脂肪酸およびそのエステル、ステロール、プレノール（ｐｒｅｎｏｌ）、ある特定の難溶性ビタミン、ならびに他の関連化合物を含む、非水溶性巨大分子のクラスを指す。「脂肪」は、脂肪酸エステル（例えば、グリセロールおよび３個の脂肪酸でできたトリグリセリド）で構成された脂質のサブセットである。本発明が、いずれかの具体的な脂質および／または脂肪に限定されることは意図されない。文脈を考慮に入れると、用語「脂肪」および「脂質」は、本明細書で互換的に使用されている。

本明細書で使用される場合、「タンパク質」、「ポリペプチド」、および「ペプチド」という用語は、交換可能に使用され、長さまたは翻訳後修飾（例えば、グリコシル化もしくはリン酸化）にかかわらず、アミド結合によって共有結合した少なくとも２つのアミノ酸のポリマーを表す。

本明細書で使用される場合、用語「アミノ酸」は、ＩＵＰＡＣ－ＩＵＢ生化学命名法委員会（ＢｉｏｃｈｅｍｉｃａｌＮｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅＣｏｍｍｉｓｓｉｏｎ）によって推奨される、その一般的に公知の３文字記号または１文字記号のいずれかで、本明細書で参照される。ヌクレオチドは、同様に、その一般的に許容される単一文字コードで参照することができる。

本明細書で使用される場合、用語「操作された」、「組換え」、「天然に存在しない」および「バリアント」は、細胞、ポリヌクレオチドまたはポリペプチドを参照して使用される場合、修飾されなければ自然界に存在し得ない様式で修飾された、または自然界のものと同一であるが、合成材料からおよび／または組換え技法を使用したマニピュレーションによって産生もしくは派生された、材料または当該材料の天然もしくはネイティブ形態に対応する材料を指す。

組換えポリペプチドは、当技術分野で公知の任意の適切な方法を使用して産生することができる。目的の野生型ポリペプチドをコードする遺伝子は、プラスミド等のベクターにクローニングし、Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ等の所望の宿主において発現させることができる。組換えポリペプチドのバリアントは、当技術分野で公知の様々な方法によって生成することができる。実際に、当業者にとって周知の多種多様な異なる突然変異誘発技法が存在する。さらに、多くの商業的分子生物学サプライヤーから突然変異誘発キットを入手することもできる。規定されたアミノ酸における特異的置換（部位指定）、遺伝子の限局された領域における特異的もしくはランダム突然変異（位置指定）、または遺伝子全体にわたるランダム突然変異誘発（例えば、飽和突然変異誘発）を行うための方法を利用できる。ＰＣＲを使用した一本鎖ＤＮＡもしくは二本鎖ＤＮＡの部位指定突然変異誘発、カセット突然変異誘発、遺伝子合成、エラープローンＰＣＲ、シャッフリングおよび化学的飽和突然変異誘発、または当技術分野で公知の他の任意の適切な方法が含まれるがこれらに限定されない、酵素バリアントを生成するための多数の適切な方法が、当業者にとって公知である。ＤＮＡおよびタンパク質操作のために使用される方法の非限定的な例は、次の特許に提供される：米国特許第６，１１７，６７９号；米国特許第６，４２０，１７５号；米国特許第６，３７６，２４６号；米国特許第６，５８６，１８２号；米国特許第７，７４７，３９１号；米国特許第７，７４７，３９３号；米国特許第７，７８３，４２８号；および米国特許第８，３８３，３４６号。バリアントが産生された後に、バリアントをいずれか所望の特性（例えば、高いもしくは増加した活性、または低いもしくは低減した活性、増加した熱的活性、増加した熱的安定性、および／または酸性ｐＨ安定性等）についてスクリーニングすることができる。一部の実施形態では、「組換えアミラーゼポリペプチド」（「操作されたアミラーゼポリペプチド」、「バリアントアミラーゼ酵素」および「アミラーゼバリアント」とも本明細書で称される）は用途がある。

本明細書で使用される場合、「野生型」および「天然に存在する」は、自然界に見出される形態を指す。例えば、野生型ポリペプチドまたはポリヌクレオチド配列は、自然界における供給源から単離され得る、人間によるマニピュレーションによって意図的に修飾されたことがない、生物に存在する配列である。

本明細書で使用される場合、「コード配列」は、タンパク質のアミノ酸配列をコードする、核酸の一部（例えば、遺伝子）を指す。

用語「パーセント（％）配列同一性」は、ポリヌクレオチド間およびポリペプチド間の比較を指すように本明細書で使用されており、比較ウィンドウにわたり２種の最適に整列された配列を比較することにより決定され、比較ウィンドウにおけるポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列の部分は、２種の配列の最適な整列のために、参照配列と比較して付加または欠失（すなわち、ギャップ）を含むことができる。パーセンテージは、同一の核酸塩基またはアミノ酸残基が両方の配列で発生する位置の数を決定して、マッチした位置の数を得て、マッチした位置の数を比較のウィンドウにおける位置の総数で割り、その結果に１００を掛けて、配列同一性のパーセンテージを得ることにより計算することができる。あるいは、パーセンテージは、同一の核酸塩基もしくはアミノ酸残基が両方の配列で発生するかまたは核酸塩基もしくはアミノ酸残基がギャップを用いて整列される位置の数を決定して、マッチした位置の数を得て、マッチした位置の数を比較のウィンドウにおける位置の総数で割り、その結果に１００を掛けて、配列同一性のパーセンテージを得ることにより計算することができる。当業者は、２種の配列の整列に利用できる多くの確立されたアルゴリズムが存在することを認める。比較のための配列の最適な整列は、例えば、当技術分野で公知の通り、ＳｍｉｔｈおよびＷａｔｅｒｍａｎの局所的相同性アルゴリズム（ＳｍｉｔｈａｎｄＷａｔｅｒｍａｎ，Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．，２：４８２［１９８１］）、ＮｅｅｄｌｅｍａｎおよびＷｕｎｓｃｈの相同性整列アルゴリズム（ＮｅｅｄｌｅｍａｎａｎｄＷｕｎｓｃｈ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，４８：４４３［１９７０］）、ＰｅａｒｓｏｎおよびＬｉｐｍａｎの類似性検索方法（ＰｅａｒｓｏｎａｎｄＬｉｐｍａｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８５：２４４４［１９８８］）、これらのアルゴリズムのコンピュータ処理されたインプリメンテーション（例えば、ＧＣＧＷｉｓｃｏｎｓｉｎＳｏｆｔｗａｒｅＰａｃｋａｇｅにおけるＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡおよびＴＦＡＳＴＡ）、または目視検査によって実行することができる。パーセント配列同一性および配列類似性の決定に適切なアルゴリズムの例は、Ａｌｔｓｃｈｕｌら（それぞれＡｌｔｓｃｈｕｌｅｔａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２１５：４０３－４１０［１９９０］；およびＡｌｔｓｃｈｕｌｅｔａｌ．，ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ．，３３８９－３４０２［１９７７］を参照）によって記載されているＢＬＡＳＴおよびＢＬＡＳＴ２．０アルゴリズムが含まれるがこれらに限定されない。ＢＬＡＳＴ解析を行うためのソフトウェアは、国立バイオテクノロジー情報センター（ＮａｔｉｏｎａｌＣｅｎｔｅｒｆｏｒＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙＩｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）ウェブサイトにより公開されている。このアルゴリズムは、先ず、データベース配列における同じ長さのワードと整列されたときにある正の値の閾値スコアＴにマッチするかこれを満たす、クエリー配列における長さＷの短いワードを同定することにより、高スコアリング配列対（ＨＳＰ）を同定することを伴う。Ｔは、近隣ワードスコア閾値と称される（Ａｌｔｓｃｈｕｌｅｔａｌ．、上記を参照）。このような初期近隣ワードヒットは、これを含有するより長いＨＳＰを見出すための検索を開始するためのシードとして作用する。次に、ワードヒットは、累積的整列スコアを増加させ得る限り、各配列に沿って両方向に伸長される。累積的スコアは、ヌクレオチド配列のため、パラメーターＭ（マッチする残基の対のための報酬スコア；常に＞０）およびＮ（ミスマッチする残基のためのペナルティースコア；常に＜０）を使用して計算される。アミノ酸配列のために、累積的スコアを計算するためのスコアリングマトリックスが使用される。各方向におけるワードヒットの伸長は、次の場合に停止される：累積的整列スコアが、その最大達成値から含量Ｘだけ落ちる；１つもしくは複数の負のスコアリング残基整列の蓄積により、累積的スコアがゼロまたはそれを下回る値になる；またはどちらかの配列の終わりに達する。ＢＬＡＳＴアルゴリズムパラメーターＷ、ＴおよびＸは、整列の感度およびスピードを決定する。ＢＬＡＳＴＮプログラム（ヌクレオチド配列のための）は、デフォルトとして、１１のワード長さ（Ｗ）、１０の期待値（Ｅ）、Ｍ＝５、Ｎ＝－４、および両方の鎖の比較を使用する。アミノ酸配列のために、ＢＬＡＳＴＰプログラムは、デフォルトとして、３のワード長さ（Ｗ）、１０の期待値（Ｅ）、およびＢＬＯＳＵＭ６２スコアリングマトリックスを使用する（ＨｅｎｉｋｏｆｆａｎｄＨｅｎｉｋｏｆｆ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８９：１０９１５［１９８９］を参照）。配列整列および％配列同一性の例示的な決定は、提供されるデフォルトパラメーターを使用して、ＧＣＧＷｉｓｃｏｎｓｉｎＳｏｆｔｗａｒｅパッケージ（Ａｃｃｅｌｒｙｓ、ＭａｄｉｓｏｎＷＩ）におけるＢＥＳＴＦＩＴまたはＧＡＰプログラムを用いることができる。

本明細書で使用される場合、「参照配列」は、配列比較のための基盤として使用される、規定された配列を指す。参照配列は、より大型の配列のサブセット、例えば、全長遺伝子またはポリペプチド配列のセグメントであり得る。一般に、参照配列は、少なくとも２０個のヌクレオチドもしくはアミノ酸残基の長さ、少なくとも２５個の残基の長さ、少なくとも５０個の残基の長さ、少なくとも１００個の残基の長さ、または核酸もしくはポリペプチドの全長である。２種のポリヌクレオチドまたはポリペプチドはそれぞれ、（１）２種の配列の間で同様である配列（すなわち、完全配列の部分）を含むことができ、かつ（２）２種の配列の間で多岐にわたる配列をさらに含むことができるため、２種の（またはそれを超える）ポリヌクレオチドまたはポリペプチドの間の配列比較は典型的に、「比較ウィンドウ」にわたり２種のポリヌクレオチドまたはポリペプチドの配列を比較して、配列類似性の局所的領域を同定および比較することにより行われる。一部の実施形態では、「参照配列」は、一次アミノ酸配列に基づくことができ、参照配列は、一次配列に１個または複数の変化を有し得る配列である。「比較ウィンドウ」は、少なくとも約２０個の近接ヌクレオチド位置またはアミノ酸残基の概念的セグメントを指し、配列は、少なくとも２０個の近接ヌクレオチドまたはアミノ酸の参照配列と比較され得、比較ウィンドウにおける配列の部分は、２種の配列の最適な整列のために、参照配列（付加も欠失も含まない）と比較して、２０パーセントまたはそれ未満の付加または欠失（すなわち、ギャップ）を含むことができる。比較ウィンドウは、２０個の近接残基よりも長いことがあり、必要に応じて、３０、４０、５０、１００個またはそれよりも長いウィンドウを含む。

所与のアミノ酸またはポリヌクレオチド配列の番号付けの文脈で使用される場合、「に対応して」、「を参照して」または「と比べて」は、所与のアミノ酸またはポリヌクレオチド配列が参照配列と比較される場合、その指定の参照配列の残基の番号付けを指す。換言すると、所与のポリマーの残基番号または残基位置は、所与のアミノ酸またはポリヌクレオチド配列内の残基の実際の数的位置によるのではなく、参照配列に対して指名される。例えば、操作されたアミラーゼのアミノ酸配列等の所与のアミノ酸配列は、ギャップを導入して２種の配列の間の残基マッチを最適化することにより、参照配列と整列することができる。これらの場合では、ギャップが存在するが、所与のアミノ酸またはポリヌクレオチド配列における残基の番号付けは、それが整列された参照配列に対して為される。

本明細書で使用される場合、「突然変異」は、ポリペプチドまたはポリヌクレオチド配列の任意の変化を指す。これは、配列に存在するいずれかの数（すなわち、１個または複数）の置換、挿入、欠失および／または再編成（すなわち、出発または参照配列と比較して）を包含することが意図される。よって、配列における突然変異は、本明細書に提供されるバリアントポリペプチド（例えば、バリアントまたは組換えアミラーゼ）の産生をもたらす。

本明細書で使用される場合、「アミノ酸差異」または「残基差異」とは、ポリペプチド配列中のある位置におけるアミノ酸残基の、参照配列中の対応する位置におけるアミノ酸残基に対する差異を指す。アミノ酸差異の位置は、本明細書では全般に「Ｘｎ」と称され、ここで、ｎは、残基差異が基づく参照配列中の対応する位置を指す。例えば、「配列番号２と比較した位置Ｘ９２における残基差異」は、配列番号２の位置９２に対応するポリペプチド位置におけるアミノ酸残基の差異を指す。したがって、配列番号２の参照ポリペプチドが位置９２にスレオニンを有する場合、「配列番号２と比較した位置Ｘ９２における残基差異」は、ポリペプチドの、配列番号２の位置９２に対応する位置に、スレオニン以外のアミノ酸残基（例えば、Ｔ９２Ａ）が存在することを意味する。本明細書における大半の例では、ある位置における特定のアミノ酸残基差異は「ＸｎＹ」として示され、ここで、「Ｘｎ」は上に記載したように対応する位置を明記し、「Ｙ」は操作されたポリペプチドにおいて見出されたアミノ酸（すなわち、参照ポリペプチドとは異なる残基）の１文字識別子である。一部の例では（例えば、表４－１、４－２、４－３、４－４、４－５、４－６、４－７、４－８、４－９、４－１０、４－１１、４－１２、４－１３、および／または４－１４において）、本開示はまた、従来の表記である「ＡｎＢ」によって表される特定のアミノ酸差異を提供し、ここで、Ａは参照配列における残基の１文字識別子であり、「ｎ」は参照配列における残基位置の番号であり、Ｂは操作されたポリペプチドの配列における残基置換の１文字識別子である。一部の例では、本開示のポリペプチドは、参照配列に対する残基差異が存在する明記された位置のリストによって示される、参照配列に対する１個または複数のアミノ酸残基差異を含み得る。一部の実施形態では、ポリペプチドの特定の残基位置において２つ以上のアミノ酸が使用され得る場合、使用され得る様々なアミノ酸残基は「／」によって区切られる（例えば、Ｘ４４６Ａ／Ｘ４４６Ｇ／Ｘ４４６Ｍ、またはＸ４４６Ａ／Ｇ／Ｍ、またはＰ４４６Ａ／Ｇ／Ｍ）。一部の実施形態では、酵素バリアントは２個以上の置換を含む。これらの置換は、読みやすさのためにスラッシュによって区切られる（例えば、Ｖ４０８Ａ／Ｍ４３９Ｓ）。本出願は、保存的および非保存的アミノ酸置換のいずれか／または両方を含む１個または複数のアミノ酸差異を含む操作されたポリペプチド配列を含む。

本明細書で使用される場合、「保存的アミノ酸置換」は、残基の、同様の側鎖を有する異なる残基による置換を指し、よって、典型的に、ポリペプチドにおけるアミノ酸の、アミノ酸の同じまたは同様の規定されたクラス内のアミノ酸による置換が関与する。限定ではなく例として、脂肪族側鎖を有するアミノ酸は、別の脂肪族アミノ酸により置換され得る（例えば、アラニン、バリン、ロイシンおよびイソロイシン）；ヒドロキシル側鎖を有するアミノ酸は、ヒドロキシル側鎖を有する別のアミノ酸により置換される（例えば、セリンおよびスレオニン）；芳香族側鎖を有するアミノ酸は、芳香族側鎖を有する別のアミノ酸により置換される（例えば、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファンおよびヒスチジン）；塩基性側鎖を有するアミノ酸は、基準（ｂａｓｉｓ）側鎖を有する別のアミノ酸により置換される（例えば、リシンおよびアルギニン）；酸性側鎖を有するアミノ酸は、酸性側鎖を有する別のアミノ酸により置換される（例えば、アスパラギン酸またはグルタミン酸）；および／または疎水性もしくは親水性アミノ酸は、それぞれ別の疎水性もしくは親水性アミノ酸により置き換えられる。

本明細書で使用される場合、「非保存的置換」は、ポリペプチドにおけるアミノ酸の、著しく異なる側鎖特性を有するアミノ酸による置換を指す。非保存的置換は、規定された群内ではなく規定された群間のアミノ酸を使用することができ、（ａ）置換の区域におけるペプチド骨格の構造（例えば、グリシンに代えたプロリン）、（ｂ）電荷もしくは疎水性、または（ｃ）側鎖の容積に影響を与える。限定ではなく例として、例示的な非保存的置換は、塩基性または脂肪族アミノ酸により置換された酸性アミノ酸；小型のアミノ酸により置換された芳香族アミノ酸；および疎水性アミノ酸により置換された親水性アミノ酸であり得る。

本明細書で使用される場合、「欠失」は、参照ポリペプチドからの１個または複数のアミノ酸の除去による、ポリペプチドに対する修飾を指す。欠失は、操作された酵素の酵素活性を保持しながらおよび／または改善された特性を保持しながら、参照酵素を構成する１個もしくはそれを超えるアミノ酸、２個もしくはそれを超えるアミノ酸、５個もしくはそれを超えるアミノ酸、１０個もしくはそれを超えるアミノ酸、１５個もしくはそれを超えるアミノ酸または２０個もしくはそれを超えるアミノ酸、アミノ酸の総数の最大１０％、またはアミノ酸の総数の最大２０％の除去を含むことができる。欠失は、ポリペプチドの内部部分および／または末端部分を指向することができる。様々な実施形態では、欠失は、連続的セグメントを含み得る、または不連続であり得る。

本明細書で使用される場合、「挿入」とは、１つまたは複数のアミノ酸の付加による、ポリペプチドに対する参照ポリペプチドからの改変を指す。挿入はポリペプチドの内部部分、またはカルボキシもしくはアミノ末端に存在し得る。挿入には、本明細書で使用される場合、当技術分野で公知である融合タンパク質が含まれる。挿入は、アミノ酸の連続するセグメントであり得るか、または天然に存在するポリペプチドにおける１つもしくは複数のアミノ酸によって分断され得る。

本明細書で使用される場合、ポリヌクレオチド配列の文脈において使用されるアスタリスク（＊）は、ポリヌクレオチド配列内の停止コドンの存在を示す。一部の実施形態では、改変アミラーゼは、停止コドンの存在のために、出発または参照配列と比較して短縮されている。

「機能的断片」および「生物活性がある断片」は、アミノ末端および／もしくはカルボキシ末端欠失（複数可）ならびに／または内部欠失を有するが（例えば、配列はトランケートされている）、残っているアミノ酸配列が、比較されている配列（例えば、全長の本発明の操作されたアミラーゼ）における対応する位置と同一であり、全長ポリペプチドの活性の実質的に全てを保持する、ポリペプチドを指すように本明細書で互換的に使用される。

本明細書で使用される場合、「単離されたポリペプチド」は、それに天然で付随する他の夾雑物（例えば、タンパク質、脂質およびポリヌクレオチド）から実質的に分離されたポリペプチドを指す。この用語は、その天然に存在する環境または発現系（例えば、宿主細胞またはｉｎｖｉｔｒｏ合成）から除去または精製されたポリペプチドを包含する。組換えアミラーゼポリペプチドは、細胞内に存在し得る、細胞培地中に存在し得る、またはライセートもしくは単離された調製物等の様々な形態で調製され得る。したがって、一部の実施形態では、組換えアミラーゼポリペプチドは、単離されたポリペプチドであり得る。

用語「単離された」および「精製された」は、それが天然で付随する少なくとも１種の他の構成成分から除去された分子（例えば、単離された核酸、ポリペプチド等）または他の構成成分を指すように使用される。用語「精製された」は、絶対的な純度を要求するものではなく、むしろ、相対的な定義として意図される。

本明細書で使用される場合、「実質的に純粋なポリペプチド」は、ポリペプチド種が、存在する優勢種である（すなわち、モル濃度または重量基盤で、組成物における他のいずれの個々の巨大分子種よりも豊富である）組成物を指し、一般に、対象種が、モルまたは％重量で存在する巨大分子種の少なくとも約５０パーセントを構成する場合、実質的に精製された組成物である。一般に、実質的に純粋なアミラーゼ組成物は、組成物中に存在するモルまたは％重量で全巨大分子種の約６０％またはそれよりも多く、約７０％またはそれよりも多く、約８０％またはそれよりも多く、約９０％またはそれよりも多く、約９５％またはそれよりも多く、および約９８％またはそれよりも多くを構成する。一部の実施形態では、対象種は、出発調製物から、組成物が単一の巨大分子種から本質的になる本質的均一性（すなわち、従来の検出方法によって組成物において夾雑物種を検出することができない）となるまで精製される。溶媒種、小分子（＜５００ダルトン）および元素イオン種は、巨大分子種と考慮されない。一部の実施形態では、単離された組換えアミラーゼポリペプチドは、実質的に純粋なポリペプチド組成物である。一部の実施形態では、実質的に純粋な組換えアミラーゼポリペプチド調製物は、本発明における使用に適切な製剤に添加される（例えば、多糖、界面活性物質等）。

本明細書で使用される場合、「改善された酵素特性」および「改善された特性」は、参照アミラーゼポリペプチドと比較した、および／または野生型アミラーゼポリペプチドもしくは別の操作されたアミラーゼポリペプチドとしての、いずれかの酵素特性における改善を含む、操作されたアミラーゼポリペプチドの特性を指す。改善された特性は、増加したタンパク質発現、増加した熱活性（ｔｈｅｒｍｏａｃｔｉｖｉｔｙ）、増加した熱安定性、増加したｐＨ活性、増加した安定性、増加した酵素活性、増加した基質特異性または親和性、増加した比活性、基質または最終産物阻害に対する増加した抵抗性、増加した化学的安定性、改善された化学選択性、改善された溶媒安定性、酸性または塩基性ｐＨに対する増加した耐性、タンパク質分解活性に対する増加した耐性（すなわち、タンパク質分解に対する低減した感受性）、低減した凝集、増加した溶解性、低減した免疫原性、改善された翻訳後修飾（例えば、グリコシル化）および変更された温度プロファイル等の特性が含まれるがこれらに限定されない。

本明細書で使用される場合、「増加した酵素活性」または「増強された触媒活性」は、参照アミラーゼ酵素と比較した、比活性（例えば、産生された産物／時間／重量タンパク質）の増加または基質から産物へのパーセント変換の増加（例えば、指定の量のアミラーゼを使用した指定の期間における出発量の基質から産物へのパーセント変換）によって表すことができる、操作されたアミラーゼポリペプチドの改善された特性を指す。酵素活性を決定するための例示的な方法は、実施例に提供される。Ｋ_ｍ、Ｖ_ｍａｘまたはｋ_ｃａｔの古典的酵素特性を含む、酵素活性に関するいずれかの特性が影響され得、その変化は、増加した酵素活性を生じ得る。酵素活性における改善は、対応する野生型酵素の酵素活性の約１．１倍から、アミラーゼポリペプチドが派生された天然に存在するアミラーゼまたは別の操作されたアミラーゼの２倍、５倍、１０倍、２０倍、２５倍、５０倍、７５倍、１００倍、１５０倍、２００倍またはそれを超える酵素活性もの大きさであり得る。

アミラーゼ活性は、当技術分野で公知の任意の適する方法（例えば、反応物または産物の分光光度特性の変化をモニタリングすることなどの標準的なアッセイ）によって測定することができる。一部の実施形態では、産生された産物の量は、エチリデンｐＮＰ－Ｇ７を基質として使用し、Ａ４０５の吸光度をモニタリングして、放出されるｐ－ニトロフェノールをモニタリングすることによって測定することができる。一部の実施形態では、デンプンが基質として使用されてもよく、産生されたマルトースの量は、ジニトロサリチル酸アッセイを用いて、５４０ｎｍの吸光度をモニタリングして測定することができるが、一部の他の実施形態では、産物は、当技術分野で公知の代替的な方法を使用して測定してもよい。酵素活性の比較は、本明細書においてさらに詳細に記載されるように、規定の酵素調製物、設定された条件下での規定のアッセイ、および１種または複数の規定の基質を使用して行われる。

本明細書で使用される場合、「プロテアーゼ安定」および「タンパク質分解に対する安定性」という用語は、タンパク質（例えば、本発明の組換えアミラーゼ）の、機能し、任意のタンパク質分解酵素または他のタンパク質分解化合物もしくは因子によって媒介されるタンパク質分解に耐え、プロテアーゼを用いた処理後にその機能を保持する能力を指す。この用語は、タンパク質の安定性を評価するための任意の特定のプロテアーゼの使用に限定されることを意図されていない。実際、本発明の操作されたアミラーゼは、様々なプロテアーゼの存在下で安定しており、酵素活性を保持する。一部の実施形態では、機能し、任意のタンパク質分解酵素または他のタンパク質分解化合物もしくは因子によって媒介されるタンパク質分解に耐え、プロテアーゼへの曝露後にその機能を保持する本発明の組換えアミラーゼ。一部の実施形態では、操作されたアミラーゼは、トリプシン、キモトリプシン、および／またはペプシンの存在下で安定している。しかしながら、本発明は、タンパク質分解安定性を評価する任意の特定のプロテアーゼにも任意の特定の方法にも限定されることを意図されていない。

本明細書で使用される場合、「ｐＨ安定性」という用語は、タンパク質（例えば、本発明の組換えアミラーゼ）の、特定のｐＨでのインキュベーション後に機能する能力を指す。一部の実施形態では、本発明は、ｐＨ２～ｐＨ７の範囲を含むがこれらに限定されない幅広いｐＨにおいて安定している組換えアミラーゼを提供する。一部の実施形態では、組換えアミラーゼは、本明細書において提供される実施例に示されるように、異なるｐＨ範囲において安定している。本発明は、いかなるｐＨ安定性レベルにもｐＨ範囲にも限定されることを意図されていない。

本明細書で使用される場合、「酸性ｐＨに対する改善した耐性」という用語は、本発明の組換えアミラーゼが、参照アミラーゼまたは別の酵素と比較して増大した安定性（酸性ｐＨへの特定の期間［例えば、１時間、最大２４時間など］の曝露後に、約７、６、５、４、３、２、またはより一層低いｐＨにおいてより高く保持された活性）を有し得ることを意味する。

「生理的ｐＨ」とは、本明細書で使用される場合、対象の（例えば、ヒトの）血液において一般に見出されるｐＨ範囲（例えば、ｐＨ７．２～７．４）を意味する。

「塩基性ｐＨ」という用語（例えば、塩基性ｐＨ条件に対する改善した安定性または塩基性ｐＨに対する増加した耐性に関連して使用される）は、約７～１１の、または一部の実施形態では、ｐＨ１１よりも大きいｐＨ範囲を意味する。

「酸性ｐＨ」という用語（例えば、酸性ｐＨ条件に対する改善した安定性または酸性ｐＨに対する増加した耐性に関連して使用される）は、７未満の任意のｐＨ値を包含するｐＨ範囲を意味する。一部の実施形態では、酸性ｐＨは７未満であり、一部の他の実施形態では、ｐＨは約６、５、４、３、２、またはそれよりも小さい値未満である。一部の代替的な実施形態では、本発明の組換えアミラーゼは２～４のｐＨレベルにおいて安定している。しかしながら、本発明は、任意の特定のｐＨ値にも値の範囲にも限定されることを意図されていない。

本明細書で使用される場合、「胃的チャレンジ」という語句は、組換えアミラーゼが胃（例えば、ヒトの胃）において遭遇し得る条件に曝露されるような、本発明の組換えアミラーゼの、低ｐＨ環境および少なくとも１種の酵素（例えば、ペプシン）の存在への曝露を指す。

本明細書で使用される場合、「腸的チャレンジ」という語句は、組換えリパーゼが腸管（例えば、ヒトの腸）において遭遇し得る条件に曝露されるような、本発明の組換えアミラーゼの、中性ｐＨ環境ならびに少なくとも１種のプロテアーゼ（例えば、トリプシンおよび／もしくはキモトリプシンなどの腸プロテアーゼ）および／または少なくとも１種の胆汁酸塩（例えば、タウロコール酸ナトリウム）の存在への曝露を指す。

本明細書で使用される場合、「複数の連続したチャレンジ」という語句は、本発明の組換えアミラーゼの一連のチャレンジ条件への曝露を指す。例えば、一部の実施形態では、１時間の熱チャレンジに続いて１時間の胃的チャレンジが行われ、次いで１時間の腸的チャレンジが行われる。本発明は、任意の特定のチャレンジおよび／またはチャレンジ条件にもチャレンジの特定の順番にも限定されることを意図されていない。

「熱的安定性」および「熱安定性」という用語は、タンパク質（例えば、本発明の組換えアミラーゼ）の特定の温度において機能する能力を指す。一部の実施形態では、この用語は、タンパク質の特定の温度でのインキュベーション後に機能する能力を指す。一部の実施形態では、本発明の組換えアミラーゼは「耐熱性」である（すなわち、酵素は上昇した温度においてその触媒活性を維持する）。一部の実施形態では、組換えアミラーゼは、上昇した温度において不活性化に抵抗し、一部の実施形態では、上昇した温度において長期の曝露時間にわたって触媒活性を維持する。これらの用語は本明細書において交換可能に使用される。本発明は、任意の特定の温度および／または曝露時間に限定されることを意図されていない。そのような安定性は、当技術分野で公知の任意の方法（例えば、本明細書に記載される方法）によって測定することができる。本発明は、任意の特定の温度安定性レベルにも温度範囲にも限定されることを意図されていない。一部の実施形態では、熱的安定性は、タンパク質（例えば、本発明の組換えアミラーゼ）の特定の温度でのインキュベーション後に測定される。

本明細書で使用される場合、用語「化学的安定性」は、別のタンパク質の機能に有害に影響する化学物質の存在下で機能するタンパク質（例えば、本発明の組換えアミラーゼ）の能力を指す。本発明が、いずれかの具体的な化学的安定性レベルや化学的安定性の範囲に限定されることは意図されない。

本明細書で使用される場合、用語「変換」は、基質（複数可）から対応する産物（複数可）への酵素変換（または生体内分解）を指す。「パーセント変換」は、指定の条件下で、ある期間内に産物へと変換される基質のパーセントを指す。よって、アミラーゼポリペプチドの「酵素活性」または「活性」は、特異的な期間における基質から産物への「パーセント変換」として表現することができる。

本明細書で使用される場合、「ハイブリダイゼーションストリンジェンシー」は、核酸のハイブリダイゼーションにおける洗浄条件等のハイブリダイゼーション条件に関する。一般に、ハイブリダイゼーション反応は、より低いストリンジェンシーの条件下で行われ、続いて、変動するものの、より高いストリンジェンシーの洗浄が為される。用語「中等度にストリンジェントなハイブリダイゼーション」は、標的ＤＮＡが、標的ＤＮＡに対して約６０％同一性、好ましくは約７５％同一性、約８５％同一性を有する、標的ポリヌクレオチドに対して約９０％を超える同一性を有する相補的核酸に結合することを可能にする条件を指す。例示的な中等度にストリンジェントな条件は、４２℃での５０％ホルムアミド、５×デンハルト（Ｄｅｎｈａｒｔ）液、５×ＳＳＰＥ、０．２％ＳＤＳにおけるハイブリダイゼーションと、それに続く４２℃での０．２×ＳＳＰＥ、０．２％ＳＤＳにおける洗浄と等価の条件である。「高ストリンジェンシーハイブリダイゼーション」は一般に、規定されたポリヌクレオチド配列に関して溶液条件下で決定される熱的融解温度Ｔ_ｍよりも約１０℃低い条件を指す。一部の実施形態では、高ストリンジェンシー条件は、６５℃で０．０１８ＭＮａＣｌにおいて安定したハイブリッドを形成する核酸配列のみのハイブリダイゼーションを可能にする条件を指す（すなわち、ハイブリッドが、６５℃で０．０１８ＭＮａＣｌにおいて安定していない場合、本明細書で考慮される高ストリンジェンシー条件下で安定していないことになる）。高ストリンジェンシー条件は、例えば、４２℃での５０％ホルムアミド、５×デンハルト液、５×ＳＳＰＥ、０．２％ＳＤＳと等価の条件におけるハイブリダイゼーションと、それに続く６５℃での０．１×ＳＳＰＥおよび０．１％ＳＤＳにおける洗浄によって提供することができる。別の高ストリンジェンシー条件は、６５℃での０．１％（ｗ：ｖ）ＳＤＳを含有する５×ＳＳＣにおけるハイブリダイズと等価の条件におけるハイブリダイズと、６５℃での０．１％ＳＤＳを含有する０．１×ＳＳＣにおける洗浄である。他の高ストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件と共に中等度にストリンジェントな条件は、上に引用されている参考文献に記載されている。

本明細書で使用される場合、「ベクター」とは、ＤＮＡ配列を細胞に導入するためのＤＮＡ構築物である。一部の実施形態では、ベクターは、ＤＮＡ配列にコードされたポリペプチドの適する宿主での発現をもたらすことができる、適する制御配列に作動可能に連結される発現ベクターである。一部の実施形態では、プラスミドはベクターとしての用途が見出されている。一部の実施形態では、「発現ベクター」は、宿主細胞における発現を駆動するためにＤＮＡ配列（例えば、導入遺伝子）に作動可能に連結されたプロモーター配列を有し、一部の実施形態では、転写終結因子配列も含む。

本明細書で使用される場合、「コドン最適化された」は、コードされたタンパク質が、目的の生物においてより効率的に発現されるような、タンパク質をコードするポリヌクレオチドのコドンの、特定の生物において優先的に使用されるコドンへの変化を指す。大部分のアミノ酸が、「シノニム」または「同義」コドンと呼ばれるいくつかのコドンによって表されるという点において、遺伝暗号は縮重しているが、特定の生物によるコドン使用は、非ランダムであり、特定のコドントリプレットに偏ることが周知である。このコドン使用バイアスは、所与の遺伝子、共通機能または祖先起源の遺伝子、高度に発現されるタンパク質、対、低コピー数タンパク質、および生物のゲノムの凝集したタンパク質コード領域に関して、より高いことがある。一部の実施形態では、アミラーゼ酵素をコードするポリヌクレオチドは、発現のために選択された宿主生物からの最適な産生のためにコドン最適化され得る。

本明細書で使用される場合、「制御配列」は、本出願のポリヌクレオチドおよび／またはポリペプチドの発現に必要なまたは有利なあらゆる構成成分を含む。各制御配列は、ポリペプチドをコードする核酸配列にとってネイティブまたは外来性であり得る。そのような制御配列は、リーダー、ポリアデニル化配列、プロペプチド配列、プロモーター配列、シグナルペプチド配列、開始配列および転写ターミネーターが含まれるがこれらに限定されない。最小でも、制御配列は、プロモーター、ならびに転写および翻訳停止シグナルを含む。制御配列は、ポリペプチドをコードする核酸配列のコード領域と制御配列のライゲーションを容易にする特異的な制限部位を導入する目的のリンカーと共に提供することができる。

本明細書で使用される場合、用語「作動可能に連結された」は、制御配列が、目的のポリヌクレオチドおよび／またはポリペプチドの発現を方向付けるまたは調節するように、制御配列が、目的のポリヌクレオチドと相対的な位置に適切に置かれた（すなわち、機能的な関係性で）配置として本明細書で定義される。

本明細書で使用される場合、「プロモーター配列」は、コード配列等の目的のポリヌクレオチドの発現のために宿主細胞によって認識される核酸配列を指す。プロモーター配列は、目的のポリヌクレオチドの発現を媒介する転写制御配列を含有する。プロモーターは、突然変異体、トランケート型およびハイブリッドプロモーターを含む、最適な宿主細胞において転写活性を示すいずれかの核酸配列であり得、宿主細胞にとって相同または異種のいずれかである、細胞外または細胞内ポリペプチドをコードする遺伝子から得ることができる。

本明細書で使用される場合、語句「適切な反応条件」は、本出願のアミラーゼポリペプチドが、基質を所望の産物化合物に変換することができる、酵素変換反応溶液における条件（例えば、酵素ローディング、基質ローディング、温度、ｐＨ、緩衝液、共溶媒の範囲、等）を指す。例示的な「適切な反応条件」は、本出願に提供され、実施例によって説明される。

本明細書で使用される場合、「化合物ローディング」または「酵素ローディング」の中等の「ローディング」は、反応開始時の反応混合物における構成成分の濃度または量を指す。

本明細書で使用される場合、酵素変換反応プロセスの文脈で使用される用語「基質」は、アミラーゼポリペプチドによって作用される化合物または分子を指す。

本明細書で使用される場合、酵素変換プロセスの文脈において使用される「産物」という用語は、アミラーゼポリペプチドの基質に対する作用から生じる化合物または分子を指す。

本明細書で使用される場合、用語「発現」は、転写、転写後修飾、翻訳および翻訳後修飾が含まれるがこれらに限定されない、ポリペプチドの産生に関与するいずれかのステップを含む。一部の実施形態では、この用語は、細胞からのポリペプチドの分泌も包含する。

本明細書で使用される場合、用語「産生する」は、細胞によるタンパク質および／または他の化合物の産生を指す。この用語は、転写、転写後修飾、翻訳および翻訳後修飾が含まれるがこれらに限定されない、ポリペプチドの産生に関与するいずれかのステップを包含することが意図される。一部の実施形態では、この用語は、細胞からのポリペプチドの分泌も包含する。

本明細書で使用される場合、アミノ酸またはヌクレオチド配列（例えば、プロモーター配列、シグナルペプチド、ターミネーター配列等）は、それが作動可能に連結された別の配列にとって「異種」である（この２種の配列が、自然界で付随していない場合）。

本明細書で使用される場合、用語「宿主細胞」および「宿主系統」は、本明細書に提供されるＤＮＡ（例えば、アミラーゼバリアントをコードするポリヌクレオチド）を含む発現ベクターに適切な宿主を指す。一部の実施形態では、宿主細胞は、当技術分野で公知の組換えＤＮＡ技法を使用して構築されたベクターにより形質転換またはトランスフェクトされた原核または真核細胞である。

用語「アナログ」は、参照ポリペプチドと７０％超の配列同一性かつ１００％未満の配列同一性（例えば、７５％、７８％、８０％、８３％、８５％、８８％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％超の配列同一性）を有するポリペプチドを意味する。一部の実施形態では、アナログは、ホモアルギニン、オルニチンおよびノルバリンが含まれるがこれらに限定されない１個または複数の天然に存在しないアミノ酸残基、ならびに天然に存在するアミノ酸を含有するポリペプチドを含む。一部の実施形態では、アナログは、１個または複数のＤ－アミノ酸残基、および２個またはそれを超えるアミノ酸残基の間の非ペプチド連結も含む。

本明細書で使用される場合、用語「培養すること」は、任意の適切な条件（例えば、液体、ゲルまたは固体培地を使用した）下での細胞の集団の生育を指す。一部の実施形態では、細胞は、微生物細胞（例えば、細菌）であり、一方、一部の他の実施形態では、細胞は、哺乳動物細胞、昆虫細胞または別の動物から得られる細胞である。本発明が、いずれか特定の細胞もしくは細胞型の培養またはいずれかの具体的な培養方法に限定されることは意図されない。実際に、本発明が、任意の適切な条件下で培養された任意の適切な細胞型を包含することが意図される。

本明細書で使用される場合、「治療薬」という用語は、病態の徴候または症状を示す対象に投与される、医学的効果を含む有益なまたは望ましい効果を提供する化合物を指す。

本明細書で使用される場合、用語「医薬組成物」は、本発明によって包含される薬学的有効量の操作されたアミラーゼポリペプチドおよび許容される担体を含む、対象（例えば、ヒト）における医薬品使用に適切な組成物を指す。

本明細書で使用される場合、用語「有効量」は、所望の結果の産生に十分な量を意味する。当業者は、ルーチンの実験法を使用することにより有効量を決定することができる。

本明細書で使用される場合、用語「対象」は、ヒト、非ヒト霊長類、家畜、コンパニオンアニマルおよび実験動物（例えば、齧歯類およびウサギ類（ｌａｇａｍｏｒｐｈ））等の哺乳動物が含まれるがこれらに限定されない、動物を包含する。この用語は、雌と共に雄を包含することが意図される。

本明細書で使用される場合、用語「患者」は、疾患について評価されている、これについて処置されている、またはこれを経験している、いずれかの対象を意味する。

本明細書で使用される場合、用語「乳児」は、生後１ヶ月からおよそ１歳までの期間の小児を指す。本明細書で使用される場合、用語「新生児」は、出生から生後２８日目の期間の小児を指す。用語「未熟児」は、一般に、出生時にほぼ５００～ほぼ２４９９グラムの体重の、妊娠期間満２０週より後だが正常満期出産の前に生まれた乳児を指す。「極低出生体重児」は、出生時に１５００ｇ未満の体重の乳児である。

本明細書で使用される場合、用語「小児」は、処置または研究手順の同意に関する法定年齢に達していない人物を指す。一部の実施形態では、この用語は、出生時と青年期の間の人物を指す。

本明細書で使用される場合、用語「成人」は、関連する管轄権に関する法定年齢に達した人物を指す（例えば、米国では１８歳）。一部の実施形態では、この用語は、任意の十分に成長した成熟した生物を指す。一部の実施形態では、用語「若年成人」は、１８歳未満だが、性的成熟に達した人物を指す。

本明細書で使用される場合、「組成物」および「製剤」は、任意の適切な使用（例えば、医薬組成物、食事用および／または栄養補助食品、餌等）に意図される、本発明の少なくとも１種の操作されたアミラーゼを含む産物を包含する。

本明細書で使用される場合、組成物の「投与」およびこれを「投与すること」という用語は、本発明の組成物を対象（例えば、膵機能不全の影響を被る人物）に与えることを意味する。

本明細書で使用される場合、用語「担体」は、医薬組成物に関して使用される場合、安定剤、保存料およびアジュバント等、標準医薬品担体、緩衝液および賦形剤のいずれかを意味する。

本明細書で使用される場合、用語「薬学的に許容される」は、いかなる望ましくない生物学的効果を引き起こすこともなく、またはそれが含有される構成成分のいずれかと有害な様式で相互作用することなく対象に投与することができ、所望の生物活性を保持する、材料を意味する。

本明細書で使用される場合、用語「賦形剤」は、活性医薬品成分（ＡＰＩ；例えば、本発明の操作されたアミラーゼポリペプチド）以外の、任意の薬学的に許容される添加剤、担体、希釈剤、アジュバントまたは他の成分を指す。賦形剤は典型的に、製剤化および／または投与目的で含まれる。

本明細書で使用される場合、用語「治療有効量」は、疾患／状態の症状に関して使用される場合、疾患／状態の１種もしくは複数の症状を軽快、減弱もしくは排除する、または症状（複数可）の発病を予防もしくは遅延する、化合物（例えば、操作されたアミラーゼポリペプチド）の量および／または濃度を指す。

本明細書で使用される場合、用語「治療有効量」は、疾患／状態に関して使用される場合、疾患／状態を軽快、減弱または排除する、組成物（例えば、操作されたアミラーゼポリペプチド）の量および／または濃度を指す。一部の実施形態では、この用語は、研究者、医師、獣医師または他の臨床医によって探究される、組織、系または動物対象による生物学的（例えば、医学的）応答を誘発する、組成物の量に関して使用される。

本明細書で使用される場合、用語「処置すること」、「処置する」および「処置」は、本明細書に提供されるもの等の医薬組成物の投与を含む、対象（例えば、ヒト患者）に施される医療を指す。用語「処置すること」、「処置する」および「処置」は、予防性（例えば、予防的）と共に対症的な処置またはケアを包含することが意図される。一部の実施形態では、処置は、疾患の症状を予防または軽快するために提供される。一部の実施形態では、本発明の医薬組成物は、膵酵素機能不全疾患または状態の処置または予防において用途がある。
操作されたアミラーゼポリペプチド

本発明は、膵酵素機能不全の処置を含む様々な使用に適する操作されたアミラーゼを提供する。一部の実施形態では、操作されたアミラーゼは、少なくとも１つの、野生型アミラーゼ（例えば、配列番号２のポリペプチド）と比較して改善された特性を示す。一部の実施形態では、操作されたアミラーゼは、配列番号２、１８、４０、１５６、１７４、２７６、３０８、４２２、４５６、５４６、６３２、６６４、７８０、９８８、１１０４、１１２２、１２２４、１２５６、１３７０、１４０４、１４９４、１５８０、１６１２および／もしくは１７２８と少なくとも約７５％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約８８％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％もしくは約１００％アミノ酸配列同一性、ならびに配列番号２、１８、４０、１５６、１７４、２７６、３０８、４２２、４５６、５４６、６３２、６６４、７８０、９８８、１１０４、１１２２、１２２４、１２５６、１３７０、１４０４、１４９４、１５８０、１６１２および／もしくは１７２８と比較した、１個もしくは複数のアミノ酸位置（例えば、配列番号２、１８、４０、１５６、１７４、２７６、３０８、４２２、４５６、５４６、６３２、６６４、７８０、９８８、１１０４、１１２２、１２２４、１２５６、１３７０、１４０４、１４９４、１５８０、１６１２および／もしくは１７２８と比較した、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０個もしくはそれよりも多いアミノ酸位置におけるアミノ酸残基差異、または配列番号２、１８、４０、１５６、１７４、２７６、３０８、４２２、４５６、５４６、６３２、６６４、７８０、９８８、１１０４、１１２２、１２２４、１２５６、１３７０、１４０４、１４９４、１５８０、１６１２および／もしくは１７２８と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、少なくとも８８％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％もしくはそれを超えるアミノ酸配列同一性を有する配列を有する。一部の実施形態では、配列番号２、１８、４０、１５６、１７４、２７６、３０８、４２２、４５６、５４６、６３２、６６４、７８０、９８８、１１０４、１１２２、１２２４、１２５６、１３７０、１４０４、１４９４、１５８０、１６１２および／または１７２８と比較した、１個または複数の位置における残基差異は、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０個またはそれよりも多い保存的アミノ酸置換を含む。一部の実施形態では、操作されたアミラーゼポリペプチドは、表４－１、４－２、４－３、４－４、４－５、４－６、４－７、４－８、４－９、４－１０、４－１１、４－１２、４－１３および／もしくは４－１４に列挙されるポリペプチド、または表４－１、４－２、４－３、４－４、４－５、４－６、４－７、４－８、４－９、４－１０、４－１１、４－１２、４－１３に列挙されるポリペプチドであって、ヒスチジンタグおよびその前にあるアミノ酸リンカーが存在しない、ポリペプチドを含む。一部の実施形態では、操作されたアミラーゼポリペプチドは、配列番号１８、４０、１５６、１７４、２７６、３０８、４２２、４５６、５４６、６３２、６６４、７８０、９８８、１１０４、１１２２、１２２４、１２５６、１３７０、１４０４、１４９４、１５８０、１６１２または１７２８を含む。

本発明は、配列番号２に対して少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％または少なくとも約９９％配列同一性を含むアミノ酸配列を含む、組換えアミラーゼおよび／または生物学的に活性な組換えアミラーゼ断片を提供する。一部の実施形態では、組換えアミラーゼおよび／または生物学的に活性な組換えアミラーゼ断片は、配列番号２、１８、４０、１５６、１７４、２７６、３０８、４２２、４５６、５４６、６３２、６６４、７８０、９８８、１１０４、１１２２、１２２４、１２５６、１３７０、１４０４、１４９４、１５８０、１６１２または１７２８に対して少なくとも約７０％、約７５％、約７６％、約７７％、約７８％、約７９％、約８０％、約８１％、約８２％、約８３％、約８４％、約８５％、約８６％、約８７％、約８８％、約８９％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％またはそれを超える配列同一性を有するポリペプチド配列を含む。

本発明は、配列番号２に対して少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％配列同一性を含むアミノ酸配列を含む、組換えアミラーゼおよび／または生物学的に活性な組換えアミラーゼ断片を提供する。一部の実施形態では、組換えアミラーゼは、配列番号２に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくはそれを超える配列同一性を有するポリペプチド配列、またはその機能的断片を含み、配列番号２の配列と比べて１個または複数の置換を含む。

一部の実施形態では、組換えアミラーゼは、配列番号２に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくはそれを超える配列同一性を有するポリペプチド配列、またはその機能的断片を含み、組換えアミラーゼは、２、６、１６、１８、１９、２４、２６、２７、２９、３１、３３、３７、３８、３９、４１、４５、４８、４９、５１、５２、５８、６１、６６、７２、７３、７４、８１、８２、９１、９２、９４、９５、９８、１０３、１１１、１１２、１１４、１２２、１２３、１２４、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３４、１３７、１４０、１４１、１４５、１４９、１５７、１５８、１６５、１６６、１６７、１７０、１７１、１７２、１７８、１８０、１８３、１８４、１８９、１９４、２０３、２０４、２０５、２０６、２１０、２１４、２１６、２２０、２２１、２２３、２２４、２２５、２２６、２２７、２２８、２４６、２５０、２５２、２５３、２５４、２５５、２５６、２５７、２５８、２５９、２６８、２６９、２７０、２７２、２７５、２７６、２７９、２８０、２８２、２８４、２８５、２８６、２９４、２９５、２９８、３０１、３０２、３０４、３０５、３０６、３０８、３０９、３１０、３１３、３１５、３１７、３１９、３２２、３２４、３３１、３３８Ｓ、３４５、３４６、３４９、３５９、３６０、３６６、３７１、３７４、３８０、３８３、３８４、３８５、３８７、３８８、３９２、３９３、３９４、３９６、３９７、４０９、４１１、４１２、４１３、４１５、４１７、４２０、４２３、４２８、４２９、４３１、４３７Ｌ４４１、４４２、４４４、４４６、４４８、４５１、４５５、４５８、４５９、４６３、４６４、４６６、４６７、４６８、４６９、４７０、４７３、４７４、４８０、４８１、４８２、４８３、４９１、４９２、４９３、４９４および４９５から選択される位置に１個または複数の置換を含み、ポリペプチド配列のアミノ酸位置は、配列番号２または１８を参照して番号付けされる。

一部の実施形態では、１個または複数の置換は、１６；２６；２９；３３；４９；５８、９１；１１４；１２２；１２６；１２８；１３０；１４１；１４５；１５７；１５８；１８０；１８３；１８４；２０５；２０６；２１０；２１４；２２３；２４６；２５６；２７０；２７２；２８６；２９８；３０２；３０６；３２２；３７１；３８０；３８３；３９４；４１２；４１３；４２８；および４３７から選択される位置に存在する。一部の実施形態では、１個または複数の置換は、１６、２６、２９、３３、４９、９１、５８、１１４、１２２、１２８、１３０、１４１、１４５、１５７、１５８、１８３、２４６、２５６、２７０、２７２、２８６、２９８、３０２、３２２、３７１、３８０、３８３、３９４、４１２および４１３から選択される位置に存在する。一部の実施形態では、１個または複数の置換は、１６、２６、２９、３３、９１、１１４、１２２、１２８、１３０、１４５、１５７、１５８、１８３、２５６、２７０、２７２、３０２、３２２、３７１、３８３、および３９４、４１２から選択される位置に存在する。一部の実施形態では、１個または複数の置換は、１６、３３、１５７、２５６、３０２、３７１および３８３から選択される位置に存在する。

一部の実施形態では、１個または複数の置換は、２ＫまたはＬ；６Ｉ；１６Ｄ；１８Ｓ；１９Ｅ；２４Ｖ；２６Ａ；２７Ｌ；２９Ｇ、Ｒ、Ｓ、ＡまたはＥ；３１Ｌ；３３Ｅ；３７ＴまたはＲ；３８Ｉ；３９Ｉ；４１Ｆ；４５Ｓ；４８Ｄ；４９Ａ；５１Ｒ；５２Ｒ；５８ＴまたはＡ；６１Ｙ；６６Ｌ；７２Ｔ；７３Ｖ；７４Ａ；８１Ｅ；８２Ａ；９１Ｈ；９２Ａ、Ｅ、ＧまたはＱ；９４Ｇ；９５ＬまたはＶ；９８Ｉ；１０３ＤまたはＬ；１１１Ａ；１１２Ｑ；１１４ＨまたはＲ；１２２ＰまたはＲ；１２３Ｅ、Ｃ、ＧまたはＲ；１２４ＮまたはＲ；１２６Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｑ、Ｗ、ＲまたはＳ；１２７Ｅ、Ｉ、Ｒ、Ｓ、ＶまたはＷ；１２８Ｗ；１２９ＣまたはＷ；１３０Ｄ；１３１Ｈ；ＲまたはＹ；１３２Ｖ；１３４Ａ、ＦまたはＲ；１３７Ａ；１４０ＫまたはＶ；１４１Ｆ；１４５Ｇ；１４９Ｋ、ＲまたはＴ；１５７Ｙ；１５８Ｒ；１６５Ｖ；１６６Ｌ；１６７ＷまたはＹ；１７０Ｓ；１７１Ｉ；１７２ＫまたはＲ；１７８Ｉ；１８０Ｅ、ＰまたはＱ；１８３Ｅ、ＮまたはＶ；１８４ＤまたはＫ；１８９Ｄ；１９４Ｆ、ＥまたはＲ；２０３Ｓ；２０４Ｄ；２０５Ｖ；２０６Ｅ；２１０ＧまたはＰ；２１４Ｇ、ＬまたはＲ；２１６Ｌ；２２０Ｇ；２２１ＴまたはＶ；２２３Ｌ；２２４Ｌ；２２５Ｇ、ＤまたはＴ；２２６Ｔ；２２７ＣまたはＶ；２２８Ｖ；２４６ＲまたはＴ；２５０Ｄ；２５２Ｉ；２５３Ｒ；２５４ＧまたはＳ；２５５ＭまたはＲ；２５６Ｓ；２５７Ｅ、Ｇ、Ｒ、ＳまたはＶ；２５８ＱまたはＳ；２５９Ｃ、Ｄ、Ｑ、ＲまたはＷ；２６８Ｔ；２６９Ｆ；２７０Ｄ；２７２Ｇ、Ｋ、Ｐ、ＲまたはＳ；２７５ＩまたはＲ；２７６Ｑ、ＡまたはＫ；２７９Ｌ、ＲまたはＶ；２８０ＣまたはＬ；２８２ＲまたはＴ；２８４Ｃ、Ｌ、Ｍ、Ｒ、ＳまたはＹ；２８５Ｖ；２８６Ｔ；２９４Ｈ、ＡまたはＬ；２９５Ｎ；２９８Ｈ、Ｋ、Ｍ、Ｑ、ＤまたはＮ；３０１Ｋ；３０２Ｑ、Ｇ、Ｈ、Ｒ、ＶまたはＷ；３０４Ｔ；３０５Ｑ、ＲまたはＷ；３０６Ｆ；３０８Ｌ；３０９ＡまたはＳ；３１０Ｒ；３１３Ｄ；３１５Ｓ；３１７Ｇ；３１９ＬまたはＳ；３２２ＲまたはＡ；３２４Ｔ；３３１Ｐ；３３８Ｓ；３４５Ａ；３４６Ｇ；３４９Ｒ；３５９Ｇ；３６０Ｇ；３６６Ｌ；３７１Ｆ；３７４Ｓ；３８０Ｒ；３８３ＥまたはＬ；３８４Ｍ；３８５Ｌ；３８７ＧまたはＶ；３８８Ｅ；３９２Ｃ；３９３Ｒ、ＳまたはＷ；３９４Ｅ、Ｇ、Ｎ、ＲまたはＳ；３９６Ｈ、ＥまたはＱ；３９７ＭまたはＴ；４０９Ａ、Ｒ、ＳまたはＷ；４１１Ｅ；４１２Ａ、Ｌ、ＤまたはＳ；４１３Ｙ；４１５ＣまたはＧ；４１７Ｗ；４２０Ｖ；４２３Ｖ；４２８ＥまたはＴ；４２９Ｓ；４３１Ｔ；４３７Ｌ；４４１ＲまたはＷ；４４２Ｅ、ＲまたはＷ；４４４Ｇ、ＲまたはＶ；４４６Ｇ；４４８Ｐ、ＱまたはＴ；４５１Ｆ；４５５Ｌ、Ｒ、ＴまたはＷ；４５８Ｆ；４５９Ｗ；４６３Ｍ；４６４Ｌ；４６６ＣまたはＥ；４６７ＰまたはＷ；４６８Ｉ、ＴまたはＶ；４６９Ｉ；４７０Ｓ、Ｇ、Ｌ、ＳまたはＴ；４７３ＤまたはＭ；４７４Ｇ；４８０Ｐ、ＴまたはＬ；４８１Ｖ；４８２Ｌ；４８３Ａ、ＱまたはＴ；４９１Ｌ；４９２ＧまたはＲ；４９３Ｄ；４９４Ｃ；および４９５Ｅ、Ｇ、ＬまたはＹから選択される。一部の実施形態では、ポリペプチド配列のアミノ酸位置は、配列番号２または１８を参照して番号付けされる。一部のさらなる実施形態では、ポリペプチド配列のアミノ酸位置は、本明細書にさらに記載されるように、配列番号４０、１５６、１７４、２７６、３０８、４２２、４５６、５４６、６３２、６６４、７８０、９８８、１１０４、１１２２、１２２４、１２５６、１３７０、１４０４、１４９４、１５８０、１６１２または１７２８を参照して番号付けされる。

一部の実施形態では、組換えアミラーゼおよび／または生物学的に活性な組換えアミラーゼ断片は、配列番号１８、４０、１５６、１７４、２７６、３０８、４２２、４５６、５４６、６３２、６６４、７８０、９８８、１１０４、１１２２、１２２４、１２５６、１３７０、１４０４、１４９４、１５８０、１６１２または１７２８に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれを超える配列同一性を有するポリペプチド配列を含む。一部の実施形態では、組換えアミラーゼおよび／または生物学的に活性な組換えアミラーゼ断片は、配列番号１８、４０、１５６、１７４、２７６、３０８、４２２、４５６、５４６、６３２、６６４、７８０、９８８、１１０４、１１２２、１２２４、１２５６、１３７０、１４０４、１４９４、１５８０、１６１２または１７２８に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれを超える配列同一性を有するポリペプチド配列を含み、但し、組換えアミラーゼは配列番号２のポリペプチド配列を有しない。

一部の実施形態では、組換えアミラーゼおよび／または生物学的に活性な組換えアミラーゼ断片は、配列番号１８、４０、１５６、１７４、２７６、３０８、４２２、４５６、５４６、６３２、６６４、７８０、９８８、１１０４、１１２２、１２２４、１２５６、１３７０、１４０４、１４９４、１５８０、１６１２または１７２８に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれを超える配列同一性を有するポリペプチド配列を含み、１個または複数の置換をさらに含む。一部の実施形態では、組換えアミラーゼおよび／または生物学的に活性な組換えアミラーゼ断片は、配列番号１８、４０、１５６、１７４、２７６、３０８、４２２、４５６、５４６、６３２、６６４、７８０、９８８、１１０４、１１２２、１２２４、１２５６、１３７０、１４０４、１４９４、１５８０、１６１２または１７２８に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれを超える配列同一性を有するポリペプチド配列を含み、２、６、１６、１８、１９、２４、２６、２７、２９、３１、３３、３７、３８、３９、４１、４５、４８、４９、５１、５２、５８、６１、６６、７２、７３、７４、８１、８２、９１、９２、９４、９５、９８、１０３、１１１、１１２、１１４、１２２、１２３、１２４、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３４、１３７、１４０、１４１、１４５、１４９、１５７、１５８、１６５、１６６、１６７、１７０、１７１、１７２、１７８、１８０、１８３、１８４、１８９、１９４、２０３、２０４、２０５、２０６、２１０、２１４、２１６、２２０、２２１、２２３、２２４、２２５、２２６、２２７、２２８、２４６、２５０、２５２、２５３、２５４、２５５、２５６、２５７、２５８、２５９、２６８、２６９、２７０、２７２、２７５、２７６、２７９、２８０、２８２、２８４、２８５、２８６、２９４、２９５、２９８、３０１、３０２、３０４、３０５、３０６、３０８、３０９、３１０、３１３、３１５、３１７、３１９、３２２、３２４、３３１、３３８Ｓ、３４５、３４６、３４９、３５９、３６０、３６６、３７１、３７４、３８０、３８３、３８４、３８５、３８７、３８８、３９２、３９３、３９４、３９６、３９７、４０９、４１１、４１２、４１３、４１５、４１７、４２０、４２３、４２８、４２９、４３１、４３７Ｌ４４１、４４２、４４４、４４６、４４８、４５１、４５５、４５８、４５９、４６３、４６４、４６６、４６７、４６８、４６９、４７０、４７３、４７４、４８０、４８１、４８２、４８３、４９１、４９２、４９３、４９４および４９５から選択される位置に１個または複数の置換をさらに含み、ポリペプチド配列のアミノ酸位置は、配列番号１８、４０、１５６、１７４、２７６、３０８、４２２、４５６、５４６、６３２、６６４、７８０、９８８、１１０４、１１２２、１２２４、１２５６、１３７０、１４０４、１４９４、１５８０、１６１２または１７２８を参照して番号付けされる。一部の実施形態では、上記位置に対して上に記載したアミノ酸置換が使用され得る。

一部の追加の実施形態では、組換えアミラーゼは、配列番号２もしくは１８に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくはそれを超える配列同一性を有するポリペプチド配列、またはその機能的断片を含み、組換えアミラーゼは、２／７３／２５６／４９３、１６／３３／７３／１３０／２５６／２８２／３７１／３７４／４９３、１６／３３／１３０／２５６／３０２／３７１／３８３／４７０、１６／３３／１５７／２５６／３０２／３７１／３８３、１６／７３／７４／２５６／２８２／３６６／３７１／３８３／４９３、１６／７３／２５６／２８２／３０２／３３１／３７１／３８３、１６／１３０／２５６／２７６／３７４／４７０、１６／２５６／３０２／３７４、１９／７２／３４５／４７３、２６／２７／３９６／４１２／４２８／４７３、２６／２７／４１２、２６／２７／４６６／４７３、２９、７３／１３０／２５６／２８２／３０２／４９３、７４／３７１／３７４／３８３／４９３、１３０／２５６／４９３、１４９、１５８、２５４、２５６、２５６／３８３、２５７、２５９、２７２、２７９、２８４、３１７／３８３、３２２、３４５／３８８／３９６／４２８、３８８／３９６／４１２／４２８、３９６／４１２、３９６／４１２／４２８／４６６、４０９、４１２および４９５から選択される１個または複数の位置に少なくとも１個の置換または置換セットを含み、ポリペプチド配列のアミノ酸位置は、配列番号２または１８を参照して番号付けされる。一部のさらなる実施形態では、組換えアミラーゼは、配列番号２もしくは１８に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくはそれを超える配列同一性を有するポリペプチド配列、またはその機能的断片を含み、組換えアミラーゼは、２Ｋ／７３Ｖ／２５６Ｓ／４９３Ｄ、１６Ｄ／３３Ｅ／７３Ｖ／１３０Ｄ／２５６Ｓ／２８２Ｄ／３７１Ｆ／３７４Ｓ／４９３Ｄ、１６Ｄ／３３Ｅ／１３０Ｄ／２５６Ｓ／３０２Ｑ／３７１Ｆ／３８３Ｅ／４７０Ｔ、１６Ｄ／３３Ｅ／１５７Ｙ／２５６Ｓ／３０２Ｑ／３７１Ｆ／３８３Ｅ、１６Ｄ／７３Ｖ／７４Ａ／２５６Ｓ／２８２Ｄ／３６６Ｌ／３７１Ｆ／３８３Ｅ／４９３Ｄ、１６Ｄ／７３Ｖ／２５６Ｓ／２８２Ｄ／３０２Ｑ／３３１Ｐ／３７１Ｆ／３８３Ｅ、１６Ｄ／１３０Ｄ／２５６Ｓ／２７６Ｑ／３７４Ｓ／４７０Ｔ、１６Ｄ／２５６Ｓ／３０２Ｑ／３７４Ｓ、１９Ｅ／７２Ｔ／３４５Ａ／４７３Ｄ、２６Ａ／２７Ｌ／３９６Ｈ／４１２Ｄ／４２８Ｅ／４７３Ｄ、２６Ａ／２７Ｌ／４１２Ｄ、２６Ａ／２７Ｌ／４６６Ｅ／４７３Ｄ、２９Ｇ、２９Ｒ、２９Ｓ、７３Ｖ／１３０Ｄ／２５６Ｓ／２８２Ｄ／３０２Ｑ／４９３Ｄ、７４Ａ／３７１Ｆ／３７４Ｓ／３８３Ｅ／４９３Ｄ、１３０Ｄ／２５６Ｓ／４９３Ｄ、１４９Ｒ、１４９Ｔ、１５８Ｒ、２５４Ｇ、２５４Ｓ、２５６Ｓ、２５６Ｓ／３８３Ｅ、２５７Ｅ、２５７Ｇ、２５７Ｒ、２５７Ｓ、２５７Ｖ、２５９Ｑ、２７２Ｇ、２７２Ｋ、２７２Ｐ、２７２Ｒ、２７２Ｓ、２７９Ｒ、２８４Ｃ、２８４Ｒ、２８４Ｓ、２８４Ｙ、３１７Ｇ／３８３Ｌ、３２２Ａ、３４５Ａ／３８８Ｅ／３９６Ｈ／４２８Ｅ、３８８Ｅ／３９６Ｈ／４１２Ｄ／４２８Ｅ、３９６Ｈ／４１２Ｄ、３９６Ｈ／４１２Ｄ／４２８Ｅ／４６６Ｅ、４０９Ｓ、４１２Ｓ、４９５Ｅ、４９５Ｌおよび４９５Ｙから選択される少なくとも１個の置換または置換セットを含み、ポリペプチド配列のアミノ酸位置は、配列番号２または１８を参照して番号付けされる。一部のさらなる実施形態では、組換えアミラーゼは、配列番号２もしくは１８に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくはそれを超える配列同一性を有するポリペプチド配列、またはその機能的断片を含み、組換えアミラーゼは、Ｒ２Ｋ／Ｉ７３Ｖ／Ａ２５６Ｓ／Ｅ４９３Ｄ、Ｅ１６Ｄ／Ｄ３３Ｅ／Ｉ７３Ｖ／Ｅ１３０Ｄ／Ａ２５６Ｓ／Ｅ２８２Ｄ／Ｙ３７１Ｆ／Ｈ３７４Ｓ／Ｅ４９３Ｄ、Ｅ１６Ｄ／Ｄ３３Ｅ／Ｅ１３０Ｄ／Ａ２５６Ｓ／Ｍ３０２Ｑ／Ｙ３７１Ｆ／Ｑ３８３Ｅ／Ｖ４７０Ｔ、Ｅ１６Ｄ／Ｄ３３Ｅ／Ｆ１５７Ｙ／Ａ２５６Ｓ／Ｍ３０２Ｑ／Ｙ３７１Ｆ／Ｑ３８３Ｅ、Ｅ１６Ｄ／Ｉ７３Ｖ／Ｐ７４Ａ／Ａ２５６Ｓ／Ｅ２８２Ｄ／Ｆ３６６Ｌ／Ｙ３７１Ｆ／Ｑ３８３Ｅ／Ｅ４９３Ｄ、Ｅ１６Ｄ／Ｉ７３Ｖ／Ａ２５６Ｓ／Ｅ２８２Ｄ／Ｍ３０２Ｑ／Ｈ３３１Ｐ／Ｙ３７１Ｆ／Ｑ３８３Ｅ、Ｅ１６Ｄ／Ｅ１３０Ｄ／Ａ２５６Ｓ／Ｔ２７６Ｑ／Ｈ３７４Ｓ／Ｖ４７０Ｔ、Ｅ１６Ｄ／Ａ２５６Ｓ／Ｍ３０２Ｑ／Ｈ３７４Ｓ、Ｋ１９Ｅ／Ｓ７２Ｔ／Ｐ３４５Ａ／Ｅ４７３Ｄ、Ｅ２６Ａ／Ｒ２７Ｌ／Ｄ３９６Ｈ／Ｌ４１２Ｄ／Ｄ４２８Ｅ／Ｅ４７３Ｄ、Ｅ２６Ａ／Ｒ２７Ｌ／Ｌ４１２Ｄ、Ｅ２６Ａ／Ｒ２７Ｌ／Ｑ４６６Ｅ／Ｅ４７３Ｄ、Ｄ２９Ｇ、Ｄ２９Ｒ、Ｄ２９Ｓ、Ｉ７３Ｖ／Ｅ１３０Ｄ／Ａ２５６Ｓ／Ｅ２８２Ｄ／Ｍ３０２Ｑ／Ｅ４９３Ｄ、Ｐ７４Ａ／Ｙ３７１Ｆ／Ｈ３７４Ｓ／Ｑ３８３Ｅ／Ｅ４９３Ｄ、Ｅ１３０Ｄ／Ａ２５６Ｓ／Ｅ４９３Ｄ、Ｑ１４９Ｒ、Ｑ１４９Ｔ、Ｋ１５８Ｒ、Ｅ２５４Ｇ、Ｅ２５４Ｓ、Ａ２５６Ｓ、Ａ２５６Ｓ／Ｑ３８３Ｅ、Ｐ２５７Ｅ、Ｐ２５７Ｇ、Ｐ２５７Ｒ、Ｐ２５７Ｓ、Ｐ２５７Ｖ、Ｐ２５９Ｑ、Ｄ２７２Ｇ、Ｄ２７２Ｋ、Ｄ２７２Ｐ、Ｄ２７２Ｒ、Ｄ２７２Ｓ、Ｄ２７９Ｒ、Ｋ２８４Ｃ、Ｋ２８４Ｒ、Ｋ２８４Ｓ、Ｋ２８４Ｙ、Ｖ３１７Ｇ／Ｑ３８３Ｌ、Ｆ３２２Ａ、Ｐ３４５Ａ／Ｄ３８８Ｅ／Ｄ３９６Ｈ／Ｄ４２８Ｅ、Ｄ３８８Ｅ／Ｄ３９６Ｈ／Ｌ４１２Ｄ／Ｄ４２８Ｅ、Ｄ３９６Ｈ／Ｌ４１２Ｄ、Ｄ３９６Ｈ／Ｌ４１２Ｄ／Ｄ４２８Ｅ／Ｑ４６６Ｅ、Ｖ４０９Ｓ、Ｌ４１２Ｓ、Ｉ４９５Ｅ、Ｉ４９５ＬおよびＩ４９５Ｙから選択される少なくとも１個の置換または置換セットを含み、ポリペプチド配列のアミノ酸位置は、配列番号２または１８を参照して番号付けされる。

一部の追加の実施形態では、組換えアミラーゼは、表４－１、４－２、４－３、４－４、４－５、４－６、４－７、４－８、４－９、４－１０、４－１１、４－１２、４－１３および／または４－１４に提供される少なくとも１個の位置における少なくとも１個の突然変異を含み、位置は、配列番号２、１８、４０、１５６、１７４、２７６、３０８、４２２、４５６、５４６、６３２、６６４、７８０、９８８、１１０４、１１２２、１２２４、１２５６、１３７０、１４０４、１４９４、１５８０、１６１２および／または１７２８を参照して番号付けされる。一部のさらなる実施形態では、組換えアミラーゼは、配列番号４～１８、２２～９６６および９７０～１９１４のうち偶数番号の配列に表示される少なくとも１種の配列に対して少なくとも約８０％、８５％、約８６％、約８７％、約８８％、約８９％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％またはそれを超える配列同一性を有するポリペプチド配列を含む。一部のさらなる実施形態では、組換えアミラーゼは、配列番号４～１８、２２～９６６および９７０～１９１４のうち偶数番号の配列に表示される少なくとも１種の配列に対して少なくとも８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれを超える配列同一性を有するポリペプチド配列を含む。一部の追加の実施形態では、組換えアミラーゼは、配列番号４～１８、２２～９６６および９７０～１９１４のうち偶数番号の配列に表示される少なくとも１種の配列を含む。

一部の実施形態では、組換えアミラーゼは、配列番号２２～１２４および９７０～１０７２のうち偶数番号の配列に表示される少なくとも１種の配列を含む。一部の実施形態では、組換えアミラーゼは、配列番号１２６～１７２および１０７４～１１２０のうち偶数番号の配列に表示される少なくとも１種の配列を含む。一部の実施形態では、組換えアミラーゼは、配列番号１７４～２２２および１１２２～１１７０のうち偶数番号の配列に表示される少なくとも１種の配列を含む。一部の実施形態では、組換えアミラーゼは、配列番号２２４～３０６および１１７２～１２５４のうち偶数番号の配列に表示される少なくとも１種の配列を含む。一部の実施形態では、組換えアミラーゼは、配列番号３０８～３８０および１２５６～１３２８のうち偶数番号の配列に表示される少なくとも１種の配列を含む。一部の実施形態では、組換えアミラーゼは、配列番号３８２～４４０および１３３０～１３８８のうち偶数番号の配列に表示される少なくとも１種の配列を含む。一部の実施形態では、組換えアミラーゼは、配列番号４４２～５４０および１３９０～１４８８のうち偶数番号の配列に表示される少なくとも１種の配列を含む。一部の実施形態では、組換えアミラーゼは、配列番号５４２～６０８および１４９０～１５５６のうち偶数番号の配列に表示される少なくとも１種の配列を含む。一部の実施形態では、組換えアミラーゼは、配列番号６１０～６６０および１５５８～１６０８のうち偶数番号の配列に表示される少なくとも１種の配列を含む。一部の実施形態では、組換えアミラーゼは、配列番号６６２～７４６および１６１０～１６９４のうち偶数番号の配列に表示される少なくとも１種の配列を含む。一部の実施形態では、組換えアミラーゼは、配列番号７４８～７９８および１６９６～１７４６のうち偶数番号の配列に表示される少なくとも１種の配列を含む。一部の実施形態では、組換えアミラーゼは、配列番号８００～８２０および１７４８～１７６８のうち偶数番号の配列に表示される少なくとも１種の配列を含む。一部の実施形態では、組換えアミラーゼは、配列番号８２２～９６６および１７７０～１９１４のうち偶数番号の配列に表示される少なくとも１種の配列を含む。

一部の実施形態では、操作されたアミラーゼポリペプチドは、本発明によって包含される操作されたアミラーゼポリペプチドの機能的断片を含む。機能的断片は、それが由来した操作されたアミラーゼポリペプチド（すなわち、操作された親アミラーゼ）の少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の活性を有する。一部の実施形態では、機能的断片は、操作されたアミラーゼの親配列の少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％およびさらには９９％を含む。一部の実施形態では、機能的断片は、５未満、１０未満、１５未満、１０未満、２５未満、３０未満、３５未満、４０未満、４５未満および５０未満のアミノ酸だけ短縮されている。

一部の追加の実施形態では、組換えアミラーゼは、高温および／または低温への曝露後に、参照配列と比較して、より高い酵素活性を保持する。一部の実施形態では、参照配列は、野生型アミラーゼであり、一方、一部の他の実施形態では、参照配列は、別の組換えアミラーゼである。一部の追加の実施形態では、組換えアミラーゼは、配列番号２のアミラーゼよりも熱安定性が高い。一部のさらなる実施形態では、組換えアミラーゼは、配列番号１８、４０、１５６、１７４、２７６、３０８、４２２、４５６、５４６、６３２、６６４、７８０、９８８、１１０４、１１２２、１２２４、１２５６、１３７０、１４０４、１４９４、１５８０、１６１２および／または１７２８のアミラーゼよりも熱安定性が高い。一部の実施形態では、組換えアミラーゼは、３０℃、３７℃、４０℃、５０℃、６０℃および／または９５℃および／または４０℃～６０℃で安定している。一部の実施形態では、組換えアミラーゼは、３０℃、３７℃、４２℃および／または４８℃で安定している。一部の追加の実施形態では、組換えアミラーゼは、３０℃、３７℃、４０℃、５０℃、６０℃および／または９５℃および／または４０℃～６０℃で参照配列よりも安定している。一部の実施形態では、組換えアミラーゼは、３０℃、３７℃、４０℃、５０℃、６０℃および／または９５℃および／または４０℃～６０℃で参照配列よりも安定している。一部の追加の実施形態では、組換えアミラーゼは、配列番号２のアミラーゼよりも熱安定性が高い。一部のさらなる実施形態では、組換えアミラーゼは、配列番号１８、４０、１５６、１７４、２７６、３０８、４２２、４５６、５４６、６３２、６６４、７８０、９８８、１１０４、１１２２、１２２４、１２５６、１３７０、１４０４、１４９４、１５８０、１６１２および／または１７２８のアミラーゼよりも熱安定性が高い。

一部の実施形態では、組換えアミラーゼは、低ｐＨ環境において安定しており、一方、他の実施形態では、組換えアミラーゼは、高ｐＨ環境において安定しており、またさらなる実施形態では、組換えは、中性ｐＨ環境において安定している。一部の実施形態では、組換えアミラーゼは、低、高および／または中性ｐＨ環境において安定している。一部の実施形態では、組換えアミラーゼは、低、高および／または中性ｐＨ環境への曝露後に、酵素活性を保持する。一部の追加の実施形態では、組換えアミラーゼは、参照配列と比較して、高、低および／または中性ｐＨ環境（複数可）において、より安定している。一部の実施形態では、参照配列は、野生型アミラーゼであり、一方、他の実施形態では、参照配列は、別の操作されたアミラーゼである。一部の追加の実施形態では、組換えアミラーゼは、配列番号２のアミラーゼよりも安定している。一部のさらなる実施形態では、組換えアミラーゼは、配列番号１８、４０、１５６、１７４、２７６、３０８、４２２、４５６、５４６、６３２、６６４、７８０、９８８、１１０４、１１２２、１２２４、１２５６、１３７０、１４０４、１４９４、１５８０、１６１２および／または１７２８のアミラーゼよりも安定している。一部の追加の実施形態では、組換えアミラーゼは、７よりも大きいｐＨで、配列番号２のアミラーゼよりも安定している。一部の追加の実施形態では、組換えアミラーゼは、７よりも大きいｐＨで、配列番号１８、４０、１５６、１７４、２７６、３０８、４２２、４５６、５４６、６３２、６６４、７８０、９８８、１１０４、１１２２、１２２４、１２５６、１３７０、１４０４、１４９４、１５８０、１６１２および／または１７２８のアミラーゼよりも安定している。一部の追加の実施形態では、組換えアミラーゼは、ｐＨ７．８で、配列番号２のアミラーゼよりも安定している。一部の追加の実施形態では、組換えアミラーゼは、ｐＨ７．８で、配列番号１８、４０、１５６、１７４、２７６、３０８、４２２、４５６、５４６、６３２、６６４、７８０、９８８、１１０４、１１２２、１２２４、１２５６、１３７０、１４０４、１４９４、１５８０、１６１２および／または１７２８のアミラーゼよりも安定している。一部の追加の実施形態では、組換えアミラーゼは、ｐＨ７．５で、配列番号２のアミラーゼよりも安定している。一部の追加の実施形態では、組換えアミラーゼは、ｐＨ７．５で、配列番号１８、４０、１５６、１７４、２７６、３０８、４２２、４５６、５４６、６３２、６６４、７８０、９８８、１１０４、１１２２、１２２４、１２５６、１３７０、１４０４、１４９４、１５８０、１６１２および／または１７２８のアミラーゼよりも安定している。一部の追加の実施形態では、組換えアミラーゼは、ｐＨ７で、配列番号２のアミラーゼよりも安定している。一部の追加の実施形態では、組換えアミラーゼは、ｐＨ７で、配列番号１８、４０、１５６、１７４、２７６、３０８、４２２、４５６、５４６、６３２、６６４、７８０、９８８、１１０４、１１２２、１２２４、１２５６、１３７０、１４０４、１４９４、１５８０、１６１２および／または１７２８のアミラーゼよりも安定している。一部のさらなる実施形態では、組換えアミラーゼは、７未満のｐＨで、配列番号２のアミラーゼよりも安定している。一部の追加の実施形態では、組換えアミラーゼは、ｐＨ７未満のｐＨで、配列番号１８、４０、１５６、１７４、２７６、３０８、４２２、４５６、５４６、６３２、６６４、７８０、９８８、１１０４、１１２２、１２２４、１２５６、１３７０、１４０４、１４９４、１５８０、１６１２および／または１７２８のアミラーゼよりも安定している。一部の追加の実施形態では、組換えアミラーゼは、ｐＨ６．８で、配列番号２のアミラーゼよりも安定している。一部の追加の実施形態では、組換えアミラーゼは、ｐＨ６．８で、配列番号１８、４０、１５６、１７４、２７６、３０８、４２２、４５６、５４６、６３２、６６４、７８０、９８８、１１０４、１１２２、１２２４、１２５６、１３７０、１４０４、１４９４、１５８０、１６１２および／または１７２８のアミラーゼよりも安定している。一部の追加の実施形態では、組換えアミラーゼは、ｐＨ６．７で、配列番号２のアミラーゼよりも安定している。一部の追加の実施形態では、組換えアミラーゼは、ｐＨ６．７で、配列番号１８、４０、１５６、１７４、２７６、３０８、４２２、４５６、５４６、６３２、６６４、７８０、９８８、１１０４、１１２２、１２２４、１２５６、１３７０、１４０４、１４９４、１５８０、１６１２および／または１７２８のアミラーゼよりも安定している。一部の追加の実施形態では、組換えアミラーゼは、ｐＨ６．５で、配列番号２のアミラーゼよりも安定している。一部の追加の実施形態では、組換えアミラーゼは、ｐＨ６．５で、配列番号１８、４０、１５６、１７４、２７６、３０８、４２２、４５６、５４６、６３２、６６４、７８０、９８８、１１０４、１１２２、１２２４、１２５６、１３７０、１４０４、１４９４、１５８０、１６１２および／または１７２８のアミラーゼよりも安定している。一部の追加の実施形態では、組換えアミラーゼは、ｐＨ６で、配列番号２のアミラーゼよりも安定している。一部の追加の実施形態では、組換えアミラーゼは、ｐＨ６で、配列番号１８、４０、１５６、１７４、２７６、３０８、４２２、４５６、５４６、６３２、６６４、７８０、９８８、１１０４、１１２２、１２２４、１２５６、１３７０、１４０４、１４９４、１５８０、１６１２および／または１７２８のアミラーゼよりも安定している。一部のさらなる実施形態では、組換えアミラーゼは、５未満のｐＨで、配列番号２のアミラーゼよりも安定している。一部の追加の実施形態では、組換えアミラーゼは、ｐＨ５で、配列番号２のアミラーゼよりも安定している。一部の追加の実施形態では、組換えアミラーゼは、ｐＨ５で、配列番号１８、４０、１５６、１７４、２７６、３０８、４２２、４５６、５４６、６３２、６６４、７８０、９８８、１１０４、１１２２、１２２４、１２５６、１３７０、１４０４、１４９４、１５８０、１６１２および／または１７２８のアミラーゼよりも安定している。一部のさらなる実施形態では、組換えアミラーゼは、ｐＨ４で、配列番号２のアミラーゼよりも安定している。一部のさらなる実施形態では、組換えアミラーゼは、ｐＨ５で、配列番号１８、４０、１５６、１７４、２７６、３０８、４２２、４５６、５４６、６３２、６６４、７８０、９８８、１１０４、１１２２、１２２４、１２５６、１３７０、１４０４、１４９４、１５８０、１６１２および／または１７２８のアミラーゼよりも安定している。一部の追加の実施形態では、組換えアミラーゼは、ｐＨ３．８で、配列番号２のアミラーゼよりも安定している。一部の追加の実施形態では、組換えアミラーゼは、ｐＨ３．８で、配列番号１８、４０、１５６、１７４、２７６、３０８、４２２、４５６、５４６、６３２、６６４、７８０、９８８、１１０４、１１２２、１２２４、１２５６、１３７０、１４０４、１４９４、１５８０、１６１２および／または１７２８のアミラーゼよりも安定している。

一部の実施形態では、組換えアミラーゼは、配列番号２のアミラーゼよりもタンパク質分解に対する抵抗性が高い。一部の実施形態では、組換えアミラーゼは、配列番号１８、４０、１５６、１７４、２７６、３０８、４２２、４５６、５４６、６３２、６６４、７８０、９８８、１１０４、１１２２、１２２４、１２５６、１３７０、１４０４、１４９４、１５８０、１６１２および／または１７２８のアミラーゼよりもタンパク質分解に対する抵抗性が高い。一部の実施形態では、組換えアミラーゼは、ペプシンによるタンパク質分解に対する抵抗性が高い。一部の追加の実施形態では、組換えアミラーゼは、配列番号２のアミラーゼよりもペプシンによるタンパク質分解に対する抵抗性が高い。一部の実施形態では、組換えアミラーゼは、配列番号１８、４０、１５６、１７４、２７６、３０８、４２２、４５６、５４６、６３２、６６４、７８０、９８８、１１０４、１１２２、１２２４、１２５６、１３７０、１４０４、１４９４、１５８０、１６１２および／または１７２８のアミラーゼよりもペプシンによるタンパク質分解に対する抵抗性が高い。一部の追加の実施形態では、組換えアミラーゼは、トリプシンによるタンパク質分解に対する抵抗性が高い。一部の追加の実施形態では、組換えアミラーゼは、配列番号２のアミラーゼよりもトリプシンによるタンパク質分解に対する抵抗性が高い。一部の実施形態では、組換えアミラーゼは、配列番号１８、４０、１５６、１７４、２７６、３０８、４２２、４５６、５４６、６３２、６６４、７８０、９８８、１１０４、１１２２、１２２４、１２５６、１３７０、１４０４、１４９４、１５８０、１６１２および／または１７２８のアミラーゼよりもトリプシンによるタンパク質分解に対する抵抗性が高い。一部の実施形態では、組換えアミラーゼは、キモトリプシンによるタンパク質分解に対する抵抗性が高い。一部の追加の実施形態では、組換えアミラーゼは、配列番号２のアミラーゼよりもキモトリプシンによるタンパク質分解に対する抵抗性が高い。一部の実施形態では、組換えアミラーゼは、配列番号１８、４０、１５６、１７４、２７６、３０８、４２２、４５６、５４６、６３２、６６４、７８０、９８８、１１０４、１１２２、１２２４、１２５６、１３７０、１４０４、１４９４、１５８０、１６１２および／または１７２８のアミラーゼよりもキモトリプシンによるタンパク質分解に対する抵抗性が高い。一部のさらなる実施形態では、組換えアミラーゼは、ペプシン、トリプシンおよび／またはキモトリプシンによるタンパク質分解に対する抵抗性が高い。一部の追加の実施形態では、組換えアミラーゼは、配列番号２のアミラーゼよりもペプシン、トリプシンおよび／またはキモトリプシンによるタンパク質分解に対する抵抗性が高い。一部の実施形態では、組換えアミラーゼは、配列番号１８、４０、１５６、１７４、２７６、３０８、４２２、４５６、５４６、６３２、６６４、７８０、９８８、１１０４、１１２２、１２２４、１２５６、１３７０、１４０４、１４９４、１５８０、１６１２および／または１７２８のアミラーゼよりもペプシン、トリプシンおよび／またはキモトリプシンによるタンパク質分解に対する抵抗性が高い。

一部の追加の実施形態では、組換えアミラーゼは、少なくとも１種の胆汁酸塩の存在下で活性がある。一部の追加の実施形態では、組換えアミラーゼは、少なくとも１種の胆汁酸塩の存在下で、配列番号２のアミラーゼよりも活性が高い。一部の追加の実施形態では、組換えアミラーゼは、少なくとも１種の胆汁酸塩の存在下で、配列番号１８、４０、１５６、１７４、２７６、３０８、４２２、４５６、５４６、６３２、６６４、７８０、９８８、１１０４、１１２２、１２２４、１２５６、１３７０、１４０４、１４９４、１５８０、１６１２および／または１７２８のアミラーゼよりも活性が高い。一部の実施形態では、組換えアミラーゼは、胆汁酸塩への曝露後に酵素活性を保持する。一部の追加の実施形態では、組換えアミラーゼは、参照配列と比較して、胆汁酸塩への曝露後により高い酵素活性を保持する。一部の実施形態では、参照配列は、配列番号２、１８、４０、１５６、１７４、２７６、３０８、４２２、４５６、５４６、６３２、６６４、７８０、９８８、１１０４、１１２２、１２２４、１２５６、１３７０、１４０４、１４９４、１５８０、１６１２および／または１７２８のアミラーゼである。一部の追加の実施形態では、胆汁酸塩は、タウロコール酸塩である。

また一部の追加の実施形態では、組換えアミラーゼは、野生型アミラーゼまたは別の組換えアミラーゼと比較して、２種以上の改善された特性を示す。一部の実施形態では、組換えアミラーゼは、配列番号２と比較して、２種以上の改善された特性を示し、一方、一部の追加の実施形態では、組換えアミラーゼは、配列番号１８、４０、１５６、１７４、２７６、３０８、４２２、４５６、５４６、６３２、６６４、７８０、９８８、１１０４、１１２２、１２２４、１２５６、１３７０、１４０４、１４９４、１５８０、１６１２および／または１７２８と比較して、２種以上の改善された特性を示す。一部の実施形態では、改善された特性は、酸安定性、アルカリ安定性、酸性ｐＨにおける安定性および／または活性、アルカリｐＨにおける安定性、中性ｐＨにおける安定性、熱安定性、タンパク質分解抵抗性、ならびに少なくとも１種の胆汁酸塩の存在下での増加した活性から選択される。また一部の追加の実施形態では、組換えアミラーゼは、配列番号２、１８、４０、１５６、１７４、２７６、３０８、４２２、４５６、５４６、６３２、６６４、７８０、９８８、１１０４、１１２２、１２２４、１２５６、１３７０、１４０４、１４９４、１５８０、１６１２および／または１７２８のアミラーゼよりも、酸性ｐＨで安定性が高いおよび／もしくは活性が高い、熱安定性が高い、タンパク質分解に対する抵抗性が高い、ならびに／または少なくとも１種の胆汁酸塩の存在下で活性が高い。改善された特性のいずれかの組合せが、本発明において用途があることが企図される。本発明が、改善された特性のいずれか具体的な組合せに限定されることは意図されない。さらに、一部の実施形態では、２種の改善された特性が存在し、一方、一部の他の実施形態では、３種の改善された特性が存在し、一部の追加の実施形態では、４種の改善された特性が存在し、一部の追加の実施形態では、５種またはそれを超える改善された特性が存在する。本発明の組換えアミラーゼが、追加の改善をさらに含むことも企図される。一部の実施形態では、このような追加の改善は、野生型アミラーゼを上回る利点を提供し、一方、一部の他の実施形態では、追加の改善は、他の組換えアミラーゼを上回る利点を提供するであろう。

一部の実施形態では、組換えアミラーゼは、配列番号２のアミラーゼと比較して、酸性ｐＨにおける改善された安定性および／もしくは活性、改善された熱安定性、タンパク質分解に対する改善された抵抗性、ならびに／または少なくとも１種の胆汁酸塩の存在下での改善された活性から選択される少なくとも１種の改善された特性を示す。一部の実施形態では、組換えアミラーゼは、配列番号１８、４０、１５６、１７４、２７６、３０８、４２２、４５６、５４６、６３２、６６４、７８０、９８８、１１０４、１１２２、１２２４、１２５６、１３７０、１４０４、１４９４、１５８０、１６１２および／または１７２８のアミラーゼと比較して、酸性ｐＨにおける改善された安定性および／もしくは活性、改善された熱安定性、タンパク質分解に対する改善された抵抗性、ならびに／または少なくとも１種の胆汁酸塩の存在下での改善された活性から選択される少なくとも１種の改善された特性を示す。一部の実施形態では、組換えアミラーゼは、配列番号２のアミラーゼと比較して、酸性ｐＨにおける改善された安定性および／もしくは活性、改善された熱安定性、タンパク質分解に対する改善された抵抗性、ならびに／または少なくとも１種の胆汁酸塩の存在下での改善された活性から選択される少なくとも２種の改善された特性を示す。一部の実施形態では、組換えアミラーゼは、配列番号１８、４０、１５６、１７４、２７６、３０８、４２２、４５６、５４６、６３２、６６４、７８０、９８８、１１０４、１１２２、１２２４、１２５６、１３７０、１４０４、１４９４、１５８０、１６１２および／または１７２８のアミラーゼと比較して、酸性ｐＨにおける改善された安定性および／もしくは活性、改善された熱安定性、タンパク質分解に対する改善された抵抗性、ならびに／または少なくとも１種の胆汁酸塩の存在下での改善された活性から選択される少なくとも２種の改善された特性を示す。一部の実施形態では、組換えアミラーゼは、配列番号２のアミラーゼと比較して、酸性ｐＨにおける改善された安定性および／もしくは活性、改善された熱安定性、タンパク質分解に対する改善された抵抗性、ならびに／または少なくとも１種の胆汁酸塩の存在下での改善された活性から選択される少なくとも３種の改善された特性を示す。一部の実施形態では、組換えアミラーゼは、配列番号１８、４０、１５６、１７４、２７６、３０８、４２２、４５６、５４６、６３２、６６４、７８０、９８８、１１０４、１１２２、１２２４、１２５６、１３７０、１４０４、１４９４、１５８０、１６１２および／または１７２８のアミラーゼと比較して、酸性ｐＨにおける改善された安定性および／もしくは活性、改善された熱安定性、タンパク質分解に対する改善された抵抗性、ならびに／または少なくとも１種の胆汁酸塩の存在下での改善された活性から選択される少なくとも３種の改善された特性を示す。一部の実施形態では、組換えアミラーゼは、配列番号２のアミラーゼと比較して、酸性ｐＨにおける改善された安定性および／もしくは活性、改善された熱安定性、タンパク質分解に対する改善された抵抗性、ならびに少なくとも１種の胆汁酸塩の存在下での改善された活性の改善された特性を示す。一部の実施形態では、組換えアミラーゼは、配列番号１８、４０、１５６、１７４、２７６、３０８、４２２、４５６、５４６、６３２、６６４、７８０、９８８、１１０４、１１２２、１２２４、１２５６、１３７０、１４０４、１４９４、１５８０、１６１２および／または１７２８のアミラーゼと比較して、酸性ｐＨにおける改善された安定性および／もしくは活性、改善された熱安定性、タンパク質分解に対する改善された抵抗性、ならびに／または少なくとも１種の胆汁酸塩の存在下での改善された活性の改善された特性を示す。一部の実施形態では、組換えアミラーゼは、配列番号２のアミラーゼと比較して、酸性ｐＨにおける改善された安定性および／もしくは活性、改善された熱安定性、タンパク質分解に対する改善された抵抗性、ならびに／または少なくとも１種の胆汁酸塩の存在下での改善された活性から選択される少なくとも１種の改善された特性、ならびに少なくとも１種の追加の改善された特性を示す。一部の実施形態では、組換えアミラーゼは、配列番号１８、４０、１５６、１７４、２７６、３０８、４２２、４５６、５４６、６３２、６６４、７８０、９８８、１１０４、１１２２、１２２４、１２５６、１３７０、１４０４、１４９４、１５８０、１６１２および／または１７２８のアミラーゼと比較して、酸性ｐＨにおける改善された安定性および／もしくは活性、改善された熱安定性、タンパク質分解に対する改善された抵抗性、ならびに／または少なくとも１種の胆汁酸塩の存在下での改善された活性から選択される少なくとも１種の改善された特性、ならびに少なくとも１種の追加の改善された特性を示す。一部の実施形態では、組換えアミラーゼは、参照配列と比較して、ｉ）増強された触媒活性；ｉｉ）酸性ｐＨに対する増加した耐性；ｉｉｉ）ｐＨ２．３、２．５、２．７５、３、３．２５および／もしくは３．５に対する増加した耐性；ｉｖ）ｐＨ６．７および／もしくは６．８に対する増加した耐性；ｖ）少なくとも１種のプロテアーゼに対する増加した耐性；ｖｉ）少なくとも１種の胆汁酸塩に対する増加した耐性；ｖｉｉ）増加した熱耐性；またはｉ）、ｉｉ）、ｉｉｉ）、ｉｖ）、ｖ）、ｖｉ）およびｖｉｉ）のいずれかの組合せから選択される少なくとも１種の改善された特性を示す。一部の実施形態では、参照配列は、配列番号２であり、一方、一部の代替実施形態では、参照配列は、配列番号１８、４０、１５６、１７４、２７６、３０８、４２２、４５６、５４６、６３２、６６４、７８０、９８８、１１０４、１１２２、１２２４、１２５６、１３７０、１４０４、１４９４、１５８０、１６１２および／または１７２８から選択される。一部の実施形態では、組換えアミラーゼは、少なくとも１種の参照配列と比較して、ｉ）増強された触媒活性；ｉｉ）酸性ｐＨに対する増加した耐性；ｉｉｉ）ｐＨ２．３、２．５、２．７５、３、３．２５および／もしくは３．５に対する増加した耐性；ｉｖ）ｐＨ６．７および／もしくは６．８に対する増加した耐性；ｖ）少なくとも１種のプロテアーゼに対する増加した耐性；ｖｉ）少なくとも１種の胆汁酸塩に対する増加した耐性；ｖｉｉ）増加した熱耐性；またはｉ）、ｉｉ）、ｉｉｉ）、ｉｖ）、ｖ）、ｖｉ）およびｖｉｉ）のいずれかの組合せから選択される少なくとも１種の改善された特性を示す。一部の実施形態では、参照配列は、配列番号２であり、一方、一部の代替実施形態では、参照配列は、配列番号１８、４０、１５６、１７４、２７６、３０８、４２２、４５６、５４６、６３２、６６４、７８０、９８８、１１０４、１１２２、１２２４、１２５６、１３７０、１４０４、１４９４、１５８０、１６１２および／または１７２８から選択される。一部の実施形態では、組換えアミラーゼは、少なくとも２種またはそれを超える参照配列と比較して、ｉ）増強された触媒活性；ｉｉ）酸性ｐＨに対する増加した耐性；ｉｉｉ）ｐＨ２．３、２．５、２．７５、３、３．２５および／もしくは３．５に対する増加した耐性；ｉｖ）ｐＨ６．７および／もしくは６．８に対する増加した耐性；ｖ）少なくとも１種のプロテアーゼに対する増加した耐性；ｖｉ）少なくとも１種の胆汁酸塩に対する増加した耐性；ｖｉｉ）増加した熱耐性；またはｉ）、ｉｉ）、ｉｉｉ）、ｉｖ）、ｖ）、ｖｉ）およびｖｉｉ）のいずれかの組合せから選択される少なくとも１種の改善された特性を示す。一部の実施形態では、参照配列は、配列番号１８、４０、１５６、１７４、２７６、３０８、４２２、４５６、５４６、６３２、６６４、７８０、９８８、１１０４、１１２２、１２２４、１２５６、１３７０、１４０４、１４９４、１５８０、１６１２および／または１７２８から選択される。一部のさらなる実施形態では、組換えアミラーゼは、精製されている。

本発明は、デンプン加水分解のための方法であって、デンプンと本明細書において提供される少なくとも１種の操作されたアミラーゼとを提供するステップ、およびデンプンが前記操作されたアミラーゼによって加水分解されるような条件下でデンプンを操作されたアミラーゼに曝露するステップを含む、方法をさらに提供する。

さらに一部のさらなる実施形態では、アミラーゼは、食物および／または飲料において安定している。一部の追加の実施形態では、アミラーゼは、栄養および他の補助食品において安定している。一部の実施形態では、補助食品は、液体であり、一方、他の実施形態では、エマルション、懸濁液または固体である。本発明が、いずれか特定の食物、飲料および／または補助食品形式または形態に限定されることは意図されない。
操作されたポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、発現ベクター、および宿主細胞

本発明は、本明細書に記載される操作されたアミラーゼポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを提供する。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、ポリペプチドを発現することができる組換えポリヌクレオチドを生じるように遺伝子発現を制御する１種または複数の異種調節配列に作動的に連結する。操作されたアミラーゼポリペプチドをコードする異種ポリヌクレオチドを含有する発現構築物は、対応するアミラーゼポリペプチドを発現するのに適切な宿主細胞に導入することができる。

当業者には明らかであるように、タンパク質配列が利用可能であることと、様々なアミノ酸に対応するコドンに関する知識から、主題のポリペプチドをコードすることができる全てのポリヌクレオチドの記載が提供される。同じアミノ酸が代替または同義コドンによってコードされる遺伝コードの縮重は、その全てが操作されたアミラーゼポリペプチドをコードする、非常に多くの数の核酸が作製されることを可能にする。したがって、特定のアミノ酸配列に関する知識を有する場合、当業者は、１個または複数のコドンの配列を、タンパク質のアミノ酸配列を変更しないように単に改変することによって、任意の数の異なる核酸を作製することができる。この点において、本発明は、可能なコドン選択に基づく組合せを選択することによって作製され得る本明細書に記載されるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドのあらゆる可能な変種を具体的に企図し、全てのそのような変種は、表４－１、４－２、４－３、４－４、４－５、４－６、４－７、４－８、４－９、４－１０、４－１１、４－１２、４－１３および／または４－１４に提供されるバリアント、ならびに表４－１、４－２、４－３、４－４、４－５、４－６、４－７、４－８、４－９、４－１０、４－１１、４－１２、４－１３および／または４－１４に提供されるバリアントであって、ヒスチジンタグおよびその前にあるアミノ酸リンカーが存在しない、バリアントを含む本明細書に記載される任意のポリペプチドに関して具体的に開示されていると見なされるべきである。

様々な実施形態では、コドンは、好ましくは、タンパク質が産生されている宿主細胞に適合するように選択される。例えば、細菌において使用される好ましいコドンは、細菌における発現のために使用され、真菌において使用される好ましいコドンは、真菌における発現のために使用される。結果として、操作されたアミラーゼポリペプチドをコードするコドン最適化ポリヌクレオチドは、全長コード領域の約４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、または９０％超のコドン位置において好ましいコドンを含有する。

一部の実施形態では、本発明は、配列番号１、１７、３９、１５５、１７３、２７５、３０７、４２１、４５５、５４５、６３１、６６３、７７９、９８７、１１０３、１１２１、１２２３、１２５５、１３６９、１４０３、１４９３、１５７９、１６１１および／または１７２７に対して少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、約８６％、約８７％、約８８％、約８９％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％またはそれを超える配列同一性を有する組換えポリヌクレオチド配列を提供する。一部の実施形態では、本発明は、配列番号１、１７、３９、１５５、１７３、２７５、３０７、４２１、４５５、５４５、６３１、６６３、７７９、９８７、１１０３、１１２１、１２２３、１２５５、１３６９、１４０３、１４９３、１５７９、１６１１および／または１７２７に対して少なくとも８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれを超える配列同一性を有する組換えポリヌクレオチド配列を提供する。一部の実施形態では、組換えポリヌクレオチド配列は、配列番号３～１７、２１～９６５および９６９～１９１３のうち奇数番号の配列に対して少なくとも８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれを超える配列同一性を有する。一部の実施形態では、操作されたアミラーゼポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、配列番号１、１７、３９、１５５、１７３、２７５、３０７、４２１、４５５、５４５、６３１、６６３、７７９、９８７、１１０３、１１２１、１２２３、１２５５、１３６９、１４０３、１４９３、１５７９、１６１１または１７２７のポリヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態では、操作されたアミラーゼポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、配列番号３～１７、２１～９６５および９６９～１９１３のうち奇数番号の配列のポリヌクレオチド配列を含む。

一部の実施形態では、本明細書に記載されるように、ポリヌクレオチドは、本明細書に開示される特性と共にアミラーゼ活性を有する操作されたポリペプチドをコードし、ポリペプチドは、参照配列（例えば、配列番号２、１８、４０、１５６、１７４、２７６、３０８、４２２、４５６、５４６、６３２、６６４、７８０、９８８、１１０４、１１２２、１２２４、１２５６、１３７０、１４０４、１４９４、１５８０、１６１２および／もしくは１７２８）または表４－１、４－２、４－３、４－４、４－５、４－６、４－７、４－８、４－９、４－１０、４－１１、４－１２、４－１３および／もしくは４－１４に開示される任意のバリアントのアミノ酸配列に対して少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれを超える同一性を有するアミノ酸配列；あるいは表４－１、４－２、４－３、４－４、４－５、４－６、４－７、４－８、４－９、４－１０、４－１１、４－１２、４－１３および／または４－１４に開示される任意のバリアントであって、ヒスチジンタグおよびその前にあるアミノ酸リンカーを欠いている、バリアントのアミノ酸配列、ならびに配列番号２、１８、４０、１５６、１７４、２７６、３０８、４２２、４５６、５４６、６３２、６６４、７８０、９８８、１１０４、１１２２、１２２４、１２５６、１３７０、１４０４、１４９４、１５８０、１６１２および／もしくは１７２８の参照ポリペプチド；または表４－１、４－２、４－３、４－４、４－５、４－６、４－７、４－８、４－９、４－１０、４－１１、４－１２、４－１３および／もしくは４－１４に開示される任意のバリアントのアミノ酸配列、またはヒスチジンタグおよびその前にあるアミノ酸リンカーを有するかもしくは有しない上記表に開示される任意のバリアントのアミノ酸配列（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０個もしくはそれよりも多いアミノ酸残基位置）と比較した、１個または複数の残基差異を含む。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、本明細書に開示される特性と共にアミラーゼ活性を有する操作されたポリペプチドをコードし、ポリペプチドは、参照配列である配列番号２、１８、４０、１５６、１７４、２７６、３０８、４２２、４５６、５４６、６３２、６６４、７８０、９８８、１１０４、１１２２、１２２４、１２５６、１３７０、１４０４、１４９４、１５８０、１６１２および／または１７２８に対して少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれを超える配列同一性を有するアミノ酸配列、ならびに配列番号２、１８、４０、１５６、１７４、２７６、３０８、４２２、４５６、５４６、６３２、６６４、７８０、９８８、１１０４、１１２２、１２２４、１２５６、１３７０、１４０４、１４９４、１５８０、１６１２および／または１７２８のポリペプチドと最適にアラインメントした場合における、配列番号２、１８、４０、１５６、１７４、２７６、３０８、４２２、４５６、５４６、６３２、６６４、７８０、９８８、１１０４、１１２２、１２２４、１２５６、１３７０、１４０４、１４９４、１５８０、１６１２および／または１７２８と比較した、表４－１、４－２、４－３、４－４、４－５、４－６、４－７、４－８、４－９、４－１０、４－１１、４－１２、４－１３および／または４－１４に提供されるものから選択される残基位置における１個または複数の残基差異を含む。

一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、配列番号２もしくは１８に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくはそれを超える配列同一性を有するポリペプチド配列、またはその機能的断片を含む、組換えアミラーゼをコードする。

一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、配列番号２もしくは１８に対して少なくとも８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくはそれを超える配列同一性を有するポリペプチド配列、またはその機能的断片を含む、組換えアミラーゼをコードし、コードされる組換えアミラーゼは、２／７３／２５６／４９３、１６／３３／７３／１３０／２５６／２８２／３７１／３７４／４９３、１６／３３／１３０／２５６／３０２／３７１／３８３／４７０、１６／３３／１５７／２５６／３０２／３７１／３８３、１６／７３／７４／２５６／２８２／３６６／３７１／３８３／４９３、１６／７３／２５６／２８２／３０２／３３１／３７１／３８３、１６／１３０／２５６／２７６／３７４／４７０、１６／２５６／３０２／３７４、１９／７２／３４５／４７３、２６／２７／３９６／４１２／４２８／４７３、２６／２７／４１２、２６／２７／４６６／４７３、２９、７３／１３０／２５６／２８２／３０２／４９３、７４／３７１／３７４／３８３／４９３、１３０／２５６／４９３、１４９、１５８、２５４、２５６、２５６／３８３、２５７、２５９、２７２、２７９、２８４、３１７／３８３、３２２、３４５／３８８／３９６／４２８、３８８／３９６／４１２／４２８、３９６／４１２、３９６／４１２／４２８／４６６、４０９、４１２および４９５から選択される１個または複数の位置に少なくとも１個の置換または置換セットを含み、ポリペプチド配列のアミノ酸位置は、配列番号２または１８を参照して番号付けされる。一部の実施形態では、コードされる組換えアミラーゼは、２Ｋ／７３Ｖ／２５６Ｓ／４９３Ｄ、１６Ｄ／３３Ｅ／７３Ｖ／１３０Ｄ／２５６Ｓ／２８２Ｄ／３７１Ｆ／３７４Ｓ／４９３Ｄ、１６Ｄ／３３Ｅ／１３０Ｄ／２５６Ｓ／３０２Ｑ／３７１Ｆ／３８３Ｅ／４７０Ｔ、１６Ｄ／３３Ｅ／１５７Ｙ／２５６Ｓ／３０２Ｑ／３７１Ｆ／３８３Ｅ、１６Ｄ／７３Ｖ／７４Ａ／２５６Ｓ／２８２Ｄ／３６６Ｌ／３７１Ｆ／３８３Ｅ／４９３Ｄ、１６Ｄ／７３Ｖ／２５６Ｓ／２８２Ｄ／３０２Ｑ／３３１Ｐ／３７１Ｆ／３８３Ｅ、１６Ｄ／１３０Ｄ／２５６Ｓ／２７６Ｑ／３７４Ｓ／４７０Ｔ、１６Ｄ／２５６Ｓ／３０２Ｑ／３７４Ｓ、１９Ｅ／７２Ｔ／３４５Ａ／４７３Ｄ、２６Ａ／２７Ｌ／３９６Ｈ／４１２Ｄ／４２８Ｅ／４７３Ｄ、２６Ａ／２７Ｌ／４１２Ｄ、２６Ａ／２７Ｌ／４６６Ｅ／４７３Ｄ、２９Ｇ、２９Ｒ、２９Ｓ、７３Ｖ／１３０Ｄ／２５６Ｓ／２８２Ｄ／３０２Ｑ／４９３Ｄ、７４Ａ／３７１Ｆ／３７４Ｓ／３８３Ｅ／４９３Ｄ、１３０Ｄ／２５６Ｓ／４９３Ｄ、１４９Ｒ、１４９Ｔ、１５８Ｒ、２５４Ｇ、２５４Ｓ、２５６Ｓ、２５６Ｓ／３８３Ｅ、２５７Ｅ、２５７Ｇ、２５７Ｒ、２５７Ｓ、２５７Ｖ、２５９Ｑ、２７２Ｇ、２７２Ｋ、２７２Ｐ、２７２Ｒ、２７２Ｓ、２７９Ｒ、２８４Ｃ、２８４Ｒ、２８４Ｓ、２８４Ｙ、３１７Ｇ／３８３Ｌ、３２２Ａ、３４５Ａ／３８８Ｅ／３９６Ｈ／４２８Ｅ、３８８Ｅ／３９６Ｈ／４１２Ｄ／４２８Ｅ、３９６Ｈ／４１２Ｄ、３９６Ｈ／４１２Ｄ／４２８Ｅ／４６６Ｅ、４０９Ｓ、４１２Ｓ、４９５Ｅ、４９５Ｌおよび４９５Ｙから選択される少なくとも１個の置換または置換セットを含み、ポリペプチド配列のアミノ酸位置は、配列番号２または１８を参照して番号付けされる。一部の実施形態では、コードされる組換えアミラーゼは、Ｒ２Ｋ／Ｉ７３Ｖ／Ａ２５６Ｓ／Ｅ４９３Ｄ、Ｅ１６Ｄ／Ｄ３３Ｅ／Ｉ７３Ｖ／Ｅ１３０Ｄ／Ａ２５６Ｓ／Ｅ２８２Ｄ／Ｙ３７１Ｆ／Ｈ３７４Ｓ／Ｅ４９３Ｄ、Ｅ１６Ｄ／Ｄ３３Ｅ／Ｅ１３０Ｄ／Ａ２５６Ｓ／Ｍ３０２Ｑ／Ｙ３７１Ｆ／Ｑ３８３Ｅ／Ｖ４７０Ｔ、Ｅ１６Ｄ／Ｄ３３Ｅ／Ｆ１５７Ｙ／Ａ２５６Ｓ／Ｍ３０２Ｑ／Ｙ３７１Ｆ／Ｑ３８３Ｅ、Ｅ１６Ｄ／Ｉ７３Ｖ／Ｐ７４Ａ／Ａ２５６Ｓ／Ｅ２８２Ｄ／Ｆ３６６Ｌ／Ｙ３７１Ｆ／Ｑ３８３Ｅ／Ｅ４９３Ｄ、Ｅ１６Ｄ／Ｉ７３Ｖ／Ａ２５６Ｓ／Ｅ２８２Ｄ／Ｍ３０２Ｑ／Ｈ３３１Ｐ／Ｙ３７１Ｆ／Ｑ３８３Ｅ、Ｅ１６Ｄ／Ｅ１３０Ｄ／Ａ２５６Ｓ／Ｔ２７６Ｑ／Ｈ３７４Ｓ／Ｖ４７０Ｔ、Ｅ１６Ｄ／Ａ２５６Ｓ／Ｍ３０２Ｑ／Ｈ３７４Ｓ、Ｋ１９Ｅ／Ｓ７２Ｔ／Ｐ３４５Ａ／Ｅ４７３Ｄ、Ｅ２６Ａ／Ｒ２７Ｌ／Ｄ３９６Ｈ／Ｌ４１２Ｄ／Ｄ４２８Ｅ／Ｅ４７３Ｄ、Ｅ２６Ａ／Ｒ２７Ｌ／Ｌ４１２Ｄ、Ｅ２６Ａ／Ｒ２７Ｌ／Ｑ４６６Ｅ／Ｅ４７３Ｄ、Ｄ２９Ｇ、Ｄ２９Ｒ、Ｄ２９Ｓ、Ｉ７３Ｖ／Ｅ１３０Ｄ／Ａ２５６Ｓ／Ｅ２８２Ｄ／Ｍ３０２Ｑ／Ｅ４９３Ｄ、Ｐ７４Ａ／Ｙ３７１Ｆ／Ｈ３７４Ｓ／Ｑ３８３Ｅ／Ｅ４９３Ｄ、Ｅ１３０Ｄ／Ａ２５６Ｓ／Ｅ４９３Ｄ、Ｑ１４９Ｒ、Ｑ１４９Ｔ、Ｋ１５８Ｒ、Ｅ２５４Ｇ、Ｅ２５４Ｓ、Ａ２５６Ｓ、Ａ２５６Ｓ／Ｑ３８３Ｅ、Ｐ２５７Ｅ、Ｐ２５７Ｇ、Ｐ２５７Ｒ、Ｐ２５７Ｓ、Ｐ２５７Ｖ、Ｐ２５９Ｑ、Ｄ２７２Ｇ、Ｄ２７２Ｋ、Ｄ２７２Ｐ、Ｄ２７２Ｒ、Ｄ２７２Ｓ、Ｄ２７９Ｒ、Ｋ２８４Ｃ、Ｋ２８４Ｒ、Ｋ２８４Ｓ、Ｋ２８４Ｙ、Ｖ３１７Ｇ／Ｑ３８３Ｌ、Ｆ３２２Ａ、Ｐ３４５Ａ／Ｄ３８８Ｅ／Ｄ３９６Ｈ／Ｄ４２８Ｅ、Ｄ３８８Ｅ／Ｄ３９６Ｈ／Ｌ４１２Ｄ／Ｄ４２８Ｅ、Ｄ３９６Ｈ／Ｌ４１２Ｄ、Ｄ３９６Ｈ／Ｌ４１２Ｄ／Ｄ４２８Ｅ／Ｑ４６６Ｅ、Ｖ４０９Ｓ、Ｌ４１２Ｓ、Ｉ４９５Ｅ、Ｉ４９５ＬおよびＩ４９５Ｙから選択される少なくとも１個の置換または置換セットを含み、ポリペプチド配列のアミノ酸位置は、配列番号２または１８を参照して番号付けされる。

一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、配列番号４０もしくは９８８に対して少なくとも８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくはそれを超える配列同一性を有するポリペプチド配列、またはその機能的断片を含む、組換えアミラーゼをコードし、コードされる組換えアミラーゼは、２６／２９／１５８／２７２／４１２、２６／２９／２７２／２７９／４１２／４９３、２６／２９／２７２／３９６／４１２、２６／２９／２７９／４１２／４２８、２６／１５８／２７２／２７９／３８８／４１２／４２８、２６／１５８／２７２／４１２、２６／２７２／２７９／４１２／４２８／４９３、２９／２７２／２７９／３９６／４１２、１３０／１４９／２５４／２８４／３２２／４０９／４９５、１３０／１４９／２５７／２８４／３２２／４０９／４６６／４７３、１３０／２５４／２８４／３２２／３７４／４０９／４６６、１３０／２５７／２８４／３７４／４０９／４６６、１３０／２８４／３２２／３７４／４０９／４７３、１４９／２５７／２８４／３２２／４０９／４６６、１５８／２７２／２７９／３９４／３９６／４１２／４２８／４９３、１５８／２７２／３８８／４１２／４２８／４９３、１５８／２７２／４１２／４２８、１５８／２７９／３８８／３９６／４１２／４２８、２５４／２５７／２８４／３２２／４０９／４７３、２５４／２８４／４０９／４６６／４９５、２７２／２７９／４１２／４２８／４９３、２７２／４１２／４２８、２７２／４１２／４９３および２８４／３２２／４０９／４７３から選択される１個または複数の位置に少なくとも１個の置換または置換セットを含み、ポリペプチド配列のアミノ酸位置は、配列番号４０または９８８を参照して番号付けされる。一部の実施形態では、コードされる組換えアミラーゼは、２６Ａ／２９Ｒ／１５８Ｒ／２７２Ｇ／４１２Ｄ、２６Ａ／２９Ｒ／２７２Ｇ／２７９Ｒ／４１２Ｄ／４９３Ｄ、２６Ａ／２９Ｒ／２７２Ｇ／３９６Ｈ／４１２Ｄ、２６Ａ／２９Ｒ／２７９Ｒ／４１２Ｄ／４２８Ｅ、２６Ａ／１５８Ｒ／２７２Ｇ／２７９Ｒ／３８８Ｅ／４１２Ｄ／４２８Ｅ、２６Ａ／１５８Ｒ／２７２Ｇ／４１２Ｄ、２６Ａ／２７２Ｇ／２７９Ｒ／４１２Ｄ／４２８Ｅ／４９３Ｄ、２９Ｒ／２７２Ｇ／２７９Ｒ／３９６Ｈ／４１２Ｄ、１３０Ｄ／１４９Ｒ／２５４Ｓ／２８４Ｓ／３２２Ａ／４０９Ｓ／４９５Ｅ、１３０Ｄ／１４９Ｒ／２５７Ｇ／２８４Ｓ／３２２Ａ／４０９Ｓ／４６６Ｅ／４７３Ｄ、１３０Ｄ／２５４Ｓ／２８４Ｓ／３２２Ａ／３７４Ｓ／４０９Ｓ／４６６Ｅ、１３０Ｄ／２５７Ｇ／２８４Ｓ／３７４Ｓ／４０９Ｓ／４６６Ｅ、１３０Ｄ／２８４Ｓ／３２２Ａ／３７４Ｓ／４０９Ｓ／４７３Ｄ、１４９Ｒ／２５７Ｇ／２８４Ｓ／３２２Ａ／４０９Ｓ／４６６Ｅ、１５８Ｒ／２７２Ｇ／２７９Ｒ／３９４Ｒ／３９６Ｈ／４１２Ｄ／４２８Ｅ／４９３Ｄ、１５８Ｒ／２７２Ｇ／３８８Ｅ／４１２Ｄ／４２８Ｅ／４９３Ｄ、１５８Ｒ／２７２Ｇ／４１２Ｄ／４２８Ｅ、１５８Ｒ／２７９Ｒ／３８８Ｅ／３９６Ｈ／４１２Ｄ／４２８Ｅ、２５４Ｓ／２５７Ｇ／２８４Ｓ／３２２Ａ／４０９Ｓ／４７３Ｄ、２５４Ｓ／２８４Ｓ／４０９Ｓ／４６６Ｅ／４９５Ｅ、２７２Ｇ／２７９Ｒ／４１２Ｄ／４２８Ｅ／４９３Ｄ、２７２Ｇ／４１２Ｄ／４２８Ｅ、２７２Ｇ／４１２Ｄ／４９３Ｄおよび２８４Ｓ／３２２Ａ／４０９Ｓ／４７３Ｄから選択される少なくとも１個の置換または置換セットを含み、ポリペプチド配列のアミノ酸位置は、配列番号４０または９８８を参照して番号付けされる。一部の実施形態では、コードされる組換えアミラーゼは、Ｅ２６Ａ／Ｄ２９Ｒ／Ｋ１５８Ｒ／Ｄ２７２Ｇ／Ｌ４１２Ｄ、Ｅ２６Ａ／Ｄ２９Ｒ／Ｄ２７２Ｇ／Ｄ２７９Ｒ／Ｌ４１２Ｄ／Ｅ４９３Ｄ、Ｅ２６Ａ／Ｄ２９Ｒ／Ｄ２７２Ｇ／Ｄ３９６Ｈ／Ｌ４１２Ｄ、Ｅ２６Ａ／Ｄ２９Ｒ／Ｄ２７９Ｒ／Ｌ４１２Ｄ／Ｄ４２８Ｅ、Ｅ２６Ａ／Ｋ１５８Ｒ／Ｄ２７２Ｇ／Ｄ２７９Ｒ／Ｄ３８８Ｅ／Ｌ４１２Ｄ／Ｄ４２８Ｅ、Ｅ２６Ａ／Ｋ１５８Ｒ／Ｄ２７２Ｇ／Ｌ４１２Ｄ、Ｅ２６Ａ／Ｄ２７２Ｇ／Ｄ２７９Ｒ／Ｌ４１２Ｄ／Ｄ４２８Ｅ／Ｅ４９３Ｄ、Ｄ２９Ｒ／Ｄ２７２Ｇ／Ｄ２７９Ｒ／Ｄ３９６Ｈ／Ｌ４１２Ｄ、Ｅ１３０Ｄ／Ｑ１４９Ｒ／Ｅ２５４Ｓ／Ｋ２８４Ｓ／Ｆ３２２Ａ／Ｖ４０９Ｓ／Ｉ４９５Ｅ、Ｅ１３０Ｄ／Ｑ１４９Ｒ／Ｐ２５７Ｇ／Ｋ２８４Ｓ／Ｆ３２２Ａ／Ｖ４０９Ｓ／Ｑ４６６Ｅ／Ｅ４７３Ｄ、Ｅ１３０Ｄ／Ｅ２５４Ｓ／Ｋ２８４Ｓ／Ｆ３２２Ａ／Ｈ３７４Ｓ／Ｖ４０９Ｓ／Ｑ４６６Ｅ、Ｅ１３０Ｄ／Ｐ２５７Ｇ／Ｋ２８４Ｓ／Ｈ３７４Ｓ／Ｖ４０９Ｓ／Ｑ４６６Ｅ、Ｅ１３０Ｄ／Ｋ２８４Ｓ／Ｆ３２２Ａ／Ｈ３７４Ｓ／Ｖ４０９Ｓ／Ｅ４７３Ｄ、Ｑ１４９Ｒ／Ｐ２５７Ｇ／Ｋ２８４Ｓ／Ｆ３２２Ａ／Ｖ４０９Ｓ／Ｑ４６６Ｅ、Ｋ１５８Ｒ／Ｄ２７２Ｇ／Ｄ２７９Ｒ／Ｑ３９４Ｒ／Ｄ３９６Ｈ／Ｌ４１２Ｄ／Ｄ４２８Ｅ／Ｅ４９３Ｄ、Ｋ１５８Ｒ／Ｄ２７２Ｇ／Ｄ３８８Ｅ／Ｌ４１２Ｄ／Ｄ４２８Ｅ／Ｅ４９３Ｄ、Ｋ１５８Ｒ／Ｄ２７２Ｇ／Ｌ４１２Ｄ／Ｄ４２８Ｅ、Ｋ１５８Ｒ／Ｄ２７９Ｒ／Ｄ３８８Ｅ／Ｄ３９６Ｈ／Ｌ４１２Ｄ／Ｄ４２８Ｅ、Ｅ２５４Ｓ／Ｐ２５７Ｇ／Ｋ２８４Ｓ／Ｆ３２２Ａ／Ｖ４０９Ｓ／Ｅ４７３Ｄ、Ｅ２５４Ｓ／Ｋ２８４Ｓ／Ｖ４０９Ｓ／Ｑ４６６Ｅ／Ｉ４９５Ｅ、Ｄ２７２Ｇ／Ｄ２７９Ｒ／Ｌ４１２Ｄ／Ｄ４２８Ｅ／Ｅ４９３Ｄ、Ｄ２７２Ｇ／Ｌ４１２Ｄ／Ｄ４２８Ｅ、Ｄ２７２Ｇ／Ｌ４１２Ｄ／Ｅ４９３ＤおよびＫ２８４Ｓ／Ｆ３２２Ａ／Ｖ４０９Ｓ／Ｅ４７３Ｄから選択される少なくとも１個の置換または置換セットを含み、ポリペプチド配列のアミノ酸位置は、配列番号４０または９８８を参照して番号付けされる。

一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、配列番号１５６もしくは１１０４に対して少なくとも８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくはそれを超える配列同一性を有するポリペプチド配列、またはその機能的断片を含む、組換えアミラーゼをコードし、コードされる組換えアミラーゼは、３７、５１、９１、１１１、１１２、１１４、１２２、１２４、１２８、１４０、１６７、１７１、１８３、１９４、２７６、２８０、２９８、３９７および４６４から選択される１個または複数の位置に少なくとも１個の置換または置換セットを含み、ポリペプチド配列のアミノ酸位置は、配列番号１５６または１１０４を参照して番号付けされる。一部の実施形態では、コードされる組換えアミラーゼは、３７Ｒ、５１Ｒ、９１Ｈ、１１１Ａ、１１２Ｑ、１１４Ｈ、１２２Ｐ、１２２Ｒ、１２４Ｒ、１２８Ｗ、１４０Ｋ、１６７Ｗ、１７１Ｉ、１８３Ｅ、１８３Ｎ、１８３Ｖ、１９４Ｅ、１９４Ｒ、２７６Ａ、２７６Ｋ、２８０Ｌ、２９８Ｋ、２９８Ｍ、３９７Ｔおよび４６４Ｌから選択される少なくとも１個の置換または置換セットを含み、ポリペプチド配列のアミノ酸位置は、配列番号１５６または１１０４を参照して番号付けされる。一部の実施形態では、コードされる組換えアミラーゼは、Ｎ３７Ｒ、Ｇ５１Ｒ、Ｋ９１Ｈ、Ｅ１１１Ａ、Ｋ１１２Ｑ、Ａ１１４Ｈ、Ａ１２２Ｐ、Ａ１２２Ｒ、Ｄ１２４Ｒ、Ｉ１２８Ｗ、Ｒ１４０Ｋ、Ｅ１６７Ｗ、Ｅ１７１Ｉ、Ｇ１８３Ｅ、Ｇ１８３Ｎ、Ｇ１８３Ｖ、Ｌ１９４Ｅ、Ｌ１９４Ｒ、Ｔ２７６Ａ、Ｔ２７６Ｋ、Ｑ２８０Ｌ、Ｅ２９８Ｋ、Ｅ２９８Ｍ、Ｅ３９７ＴおよびＮ４６４Ｌから選択される少なくとも１個の置換または置換セットを含み、ポリペプチド配列のアミノ酸位置は、配列番号１５６または１１０４を参照して番号付けされる。

一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、配列番号１７４もしくは１１２２に対して少なくとも８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくはそれを超える配列同一性を有するポリペプチド配列、またはその機能的断片を含む、組換えアミラーゼをコードし、コードされる組換えアミラーゼは、２４、９１、９１／１２２、９１／１２２／１２８／１３０／１６７／１７１／４０９、９１／１２２／１２８／１３０／１８３／３２２、９１／１２２／１２８／１３０／１９４、９１／１２２／１２８／１３０／３２２、９１／１２２／１２８／１７１／１８３／１９４／３２２、９１／１２２／１２８／１８３／４０９、９１／１２２／１３０／１６７／１８３／１９４／４０９、９１／１２２／１３０／１７１／１８３、９１／１２２／１３０／１８３／１９４、９１／１２２／１３０／１９４、９１／１２２／１３０／１９４／３２２、９１／１２２／１６７／１７１／１９４、９１／１２２／１６７／１７１／１９４／３２２、９１／１２２／１７１／１８３／１９４／４０９、９１／１３０／１７１／１８３／３２２／４０９、９１／１６７／１７１、９１／１６７／１８３／１９４、９１／１６７／３２２、９１／１８３、９１／１８３／３２２／４０９、９１／１９４、９１／３２２、９１／４０９、１２２／１２８、１２２／１２８／１９４／４０９、１２２／１３０／１７１／３２２／４０９、１２２／４０９、１３７／１４５／２２７／３９４／４８０／４８１、１３７／１４５／２９５、１４５／２２７／２９５／４８１、１４５／３０９／４８１、１８３、２２７、２９５／３９４、３２２、３２２／４０９、３９４および４８０／４８１から選択される１個または複数の位置に少なくとも１個の置換または置換セットを含み、ポリペプチド配列のアミノ酸位置は、配列番号１７４または１１２２を参照して番号付けされる。一部の実施形態では、コードされる組換えアミラーゼは、２４Ｖ、９１Ｈ、９１Ｈ／１２２Ｐ、９１Ｈ／１２２Ｐ／１３０Ｄ／１８３Ｎ／１９４Ｒ、９１Ｈ／１２２Ｐ／１３０Ｄ／１９４Ｒ／３２２Ａ、９１Ｈ／１２２Ｒ、９１Ｈ／１２２Ｒ／１２８Ｗ／１３０Ｄ／１６７Ｗ／１７１Ｉ／４０９Ｓ、９１Ｈ／１２２Ｒ／１２８Ｗ／１３０Ｄ／１８３Ｎ／３２２Ａ、９１Ｈ／１２２Ｒ／１２８Ｗ／１３０Ｄ／１９４Ｒ、９１Ｈ／１２２Ｒ／１２８Ｗ／１３０Ｄ／３２２Ａ、９１Ｈ／１２２Ｒ／１２８Ｗ／１７１Ｉ／１８３Ｎ／１９４Ｒ／３２２Ａ、９１Ｈ／１２２Ｒ／１２８Ｗ／１８３Ｎ／４０９Ｓ、９１Ｈ／１２２Ｒ／１３０Ｄ／１６７Ｗ／１８３Ｎ／１９４Ｒ／４０９Ｓ、９１Ｈ／１２２Ｒ／１３０Ｄ／１７１Ｉ／１８３Ｎ、９１Ｈ／１２２Ｒ／１３０Ｄ／１９４Ｒ、９１Ｈ／１２２Ｒ／１６７Ｗ／１７１Ｉ／１９４Ｒ、９１Ｈ／１２２Ｒ／１６７Ｗ／１７１Ｉ／１９４Ｒ／３２２Ａ、９１Ｈ／１２２Ｒ／１７１Ｉ／１８３Ｎ／１９４Ｒ／４０９Ｓ、９１Ｈ／１３０Ｄ／１７１Ｉ／１８３Ｎ／３２２Ａ／４０９Ｓ、９１Ｈ／１６７Ｗ／１７１Ｉ、９１Ｈ／１６７Ｗ／１８３Ｎ／１９４Ｒ、９１Ｈ／１６７Ｗ／３２２Ａ、９１Ｈ／１８３Ｎ、９１Ｈ／１８３Ｎ／３２２Ａ／４０９Ｓ、９１Ｈ／１９４Ｒ、９１Ｈ／３２２Ａ、９１Ｈ／４０９Ｓ、１２２Ｐ／４０９Ｓ、１２２Ｒ／１２８Ｗ、１２２Ｒ／１２８Ｗ／１９４Ｒ／４０９Ｓ、１２２Ｒ／１３０Ｄ／１７１Ｉ／３２２Ａ／４０９Ｓ、１３７Ａ／１４５Ｇ／２２７Ｌ／３９４Ｅ／４８０Ｐ／４８１Ｖ、１３７Ａ／１４５Ｇ／２９５Ｎ、１４５Ｇ／２２７Ｌ／２９５Ｎ／４８１Ｖ、１４５Ｇ／３０９Ｓ／４８１Ｖ、１８３Ｎ、２２７Ｌ、２９５Ｎ／３９４Ｅ、３２２Ａ、３２２Ａ／４０９Ｓ、３９４Ｅおよび４８０Ｔ／４８１Ｖから選択される少なくとも１個の置換または置換セットを含み、ポリペプチド配列のアミノ酸位置は、配列番号１７４または１１２２を参照して番号付けされる。一部の実施形態では、コードされる組換えアミラーゼは、Ｌ２４Ｖ、Ｋ９１Ｈ、Ｋ９１Ｈ／Ａ１２２Ｐ、Ｋ９１Ｈ／Ａ１２２Ｐ／Ｅ１３０Ｄ／Ｇ１８３Ｎ／Ｌ１９４Ｒ、Ｋ９１Ｈ／Ａ１２２Ｐ／Ｅ１３０Ｄ／Ｌ１９４Ｒ／Ｆ３２２Ａ、Ｋ９１Ｈ／Ａ１２２Ｒ、Ｋ９１Ｈ／Ａ１２２Ｒ／Ｉ１２８Ｗ／Ｅ１３０Ｄ／Ｅ１６７Ｗ／Ｅ１７１Ｉ／Ｖ４０９Ｓ、Ｋ９１Ｈ／Ａ１２２Ｒ／Ｉ１２８Ｗ／Ｅ１３０Ｄ／Ｇ１８３Ｎ／Ｆ３２２Ａ、Ｋ９１Ｈ／Ａ１２２Ｒ／Ｉ１２８Ｗ／Ｅ１３０Ｄ／Ｌ１９４Ｒ、Ｋ９１Ｈ／Ａ１２２Ｒ／Ｉ１２８Ｗ／Ｅ１３０Ｄ／Ｆ３２２Ａ、Ｋ９１Ｈ／Ａ１２２Ｒ／Ｉ１２８Ｗ／Ｅ１７１Ｉ／Ｇ１８３Ｎ／Ｌ１９４Ｒ／Ｆ３２２Ａ、Ｋ９１Ｈ／Ａ１２２Ｒ／Ｉ１２８Ｗ／Ｇ１８３Ｎ／Ｖ４０９Ｓ、Ｋ９１Ｈ／Ａ１２２Ｒ／Ｅ１３０Ｄ／Ｅ１６７Ｗ／Ｇ１８３Ｎ／Ｌ１９４Ｒ／Ｖ４０９Ｓ、Ｋ９１Ｈ／Ａ１２２Ｒ／Ｅ１３０Ｄ／Ｅ１７１Ｉ／Ｇ１８３Ｎ、Ｋ９１Ｈ／Ａ１２２Ｒ／Ｅ１３０Ｄ／Ｌ１９４Ｒ、Ｋ９１Ｈ／Ａ１２２Ｒ／Ｅ１６７Ｗ／Ｅ１７１Ｉ／Ｌ１９４Ｒ、Ｋ９１Ｈ／Ａ１２２Ｒ／Ｅ１６７Ｗ／Ｅ１７１Ｉ／Ｌ１９４Ｒ／Ｆ３２２Ａ、Ｋ９１Ｈ／Ａ１２２Ｒ／Ｅ１７１Ｉ／Ｇ１８３Ｎ／Ｌ１９４Ｒ／Ｖ４０９Ｓ、Ｋ９１Ｈ／Ｅ１３０Ｄ／Ｅ１７１Ｉ／Ｇ１８３Ｎ／Ｆ３２２Ａ／Ｖ４０９Ｓ、Ｋ９１Ｈ／Ｅ１６７Ｗ／Ｅ１７１Ｉ、Ｋ９１Ｈ／Ｅ１６７Ｗ／Ｇ１８３Ｎ／Ｌ１９４Ｒ、Ｋ９１Ｈ／Ｅ１６７Ｗ／Ｆ３２２Ａ、Ｋ９１Ｈ／Ｇ１８３Ｎ、Ｋ９１Ｈ／Ｇ１８３Ｎ／Ｆ３２２Ａ／Ｖ４０９Ｓ、Ｋ９１Ｈ／Ｌ１９４Ｒ、Ｋ９１Ｈ／Ｆ３２２Ａ、Ｋ９１Ｈ／Ｖ４０９Ｓ、Ａ１２２Ｐ／Ｖ４０９Ｓ、Ａ１２２Ｒ／Ｉ１２８Ｗ、Ａ１２２Ｒ／Ｉ１２８Ｗ／Ｌ１９４Ｒ／Ｖ４０９Ｓ、Ａ１２２Ｒ／Ｅ１３０Ｄ／Ｅ１７１Ｉ／Ｆ３２２Ａ／Ｖ４０９Ｓ、Ｇ１３７Ａ／Ａ１４５Ｇ／Ｔ２２７Ｌ／Ｑ３９４Ｅ／Ｆ４８０Ｐ／Ｃ４８１Ｖ、Ｇ１３７Ａ／Ａ１４５Ｇ／Ｋ２９５Ｎ、Ａ１４５Ｇ／Ｔ２２７Ｌ／Ｋ２９５Ｎ／Ｃ４８１Ｖ、Ａ１４５Ｇ／Ｔ３０９Ｓ／Ｃ４８１Ｖ、Ｇ１８３Ｎ、Ｔ２２７Ｌ、Ｋ２９５Ｎ／Ｑ３９４Ｅ、Ｆ３２２Ａ、Ｆ３２２Ａ／Ｖ４０９Ｓ、Ｑ３９４ＥおよびＦ４８０Ｔ／Ｃ４８１Ｖから選択される少なくとも１個の置換または置換セットを含み、ポリペプチド配列のアミノ酸位置は、配列番号１７４または１１２２を参照して番号付けされる。

一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、配列番号２７６もしくは１２２４に対して少なくとも８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくはそれを超える配列同一性を有するポリペプチド配列、またはその機能的断片を含む、組換えアミラーゼをコードし、コードされる組換えアミラーゼは、１６／２６／２９／１２８／１４５／２５６／３０９／３８３、１６／２６／３３／１１４／１４５／３０９／３８３／３９４、１６／２６／３３／１２８／１３０／１４５／３０２／３０９／３２２／３７１、１６／２６／３３／１４５／１５８／３８３／３９４、１６／２６／１４５／３０２、１６／２９／３３／１４５／２５６／３０２、１８、２６／２９／３３／１３０／１４５／１５７／１５８／１８３／３９４、２６／２９／３３／１４５／１５７／１８３／２５６／３０９／３８３、２６／２９／１２２／１３０／１４５／１８３／２５６／２７２／３０９／３９４、２６／２９／１４５／１５７／２５６／３０２／３２２／４８１、２６／２９／１４５／２５６／２７２／３０２／３０９／３２２／４８１、２６／３３／９１／１４５／２７２／３０２／４８１、２６／３３／１４５／３０９／３２２／３８３、２６／１１４／１４５／３２２、２６／１４５／１８３／２５６／３０９／３８３、２９／１２２／１４５／１５８／３８３、２９／１３０／１４５／２５６／２７２／３７１／３９４、２９／１４５／１８３／３０２／３０９／４１２、２９／３０９／３９４、３３／１２２／１４５／２７２／３０９／４１２、９１／１３０／１４５／１５８／１８３／３８３、９１／３０９／３８３、１３０／１４５／２５６／２７２／３７１、１３０／１４５／３０２／３０９、１３０／２７２／４８１、１４５／３０２／３０９、２６８、３０９、３４９、３６０、３８０、３９４、４６３および４８３から選択される１個または複数の位置に少なくとも１個の置換または置換セットを含み、ポリペプチド配列のアミノ酸位置は、配列番号２７６または１２２４を参照して番号付けされる。一部の実施形態では、コードされる組換えアミラーゼは、１６Ｅ／２６Ｅ／２９Ｄ／１２８Ｉ／１４５Ｇ／２５６Ａ／３０９Ｓ／３８３Ｑ、１６Ｅ／２６Ｅ／３３Ｄ／１１４Ａ／１４５Ｇ／３０９Ｓ／３８３Ｑ／３９４Ｅ、１６Ｅ／２６Ｅ／３３Ｄ／１２８Ｉ／１３０Ｅ／１４５Ｇ／３０２Ｍ／３０９Ｓ／３２２Ｆ／３７１Ｙ、１６Ｅ／２６Ｅ／３３Ｄ／１４５Ｇ／１５８Ｋ／３８３Ｑ／３９４Ｅ、１６Ｅ／２６Ｅ／１４５Ｇ／３０２Ｍ、１６Ｅ／２９Ｄ／３３Ｄ／１４５Ｇ／２５６Ａ／３０２Ｍ、１８Ｓ、２６Ｅ／２９Ｄ／３３Ｄ／１３０Ｅ／１４５Ｇ／１５７Ｆ／１５８Ｋ／１８３Ｇ／３９４Ｅ、２６Ｅ／２９Ｄ／３３Ｄ／１４５Ｇ／１５７Ｆ／１８３Ｇ／２５６Ａ／３０９Ｓ／３８３Ｑ、２６Ｅ／２９Ｄ／１２２Ａ／１３０Ｅ／１４５Ｇ／１８３Ｇ／２５６Ａ／２７２Ｄ／３０９Ｓ／３９４Ｅ、２６Ｅ／２９Ｄ／１４５Ｇ／１５７Ｆ／２５６Ａ／３０２Ｍ／３２２Ｆ／４８１Ｖ、２６Ｅ／２９Ｄ／１４５Ｇ／２５６Ａ／２７２Ｄ／３０２Ｍ／３０９Ｓ／３２２Ｆ／４８１Ｖ、２６Ｅ／３３Ｄ／９１Ｋ／１４５Ｇ／２７２Ｄ／３０２Ｍ／４８１Ｖ、２６Ｅ／３３Ｄ／１４５Ｇ／３０９Ｓ／３２２Ｆ／３８３Ｑ、２６Ｅ／１１４Ａ／１４５Ｇ／３２２Ｆ、２６Ｅ／１４５Ｇ／１８３Ｇ／２５６Ａ／３０９Ｓ／３８３Ｑ、２９Ｄ／１２２Ａ／１４５Ｇ／１５８Ｋ／３８３Ｑ、２９Ｄ／１３０Ｅ／１４５Ｇ／２５６Ａ／２７２Ｄ／３７１Ｙ／３９４Ｅ、２９Ｄ／１４５Ｇ／１８３Ｇ／３０２Ｍ／３０９Ｓ／４１２Ｌ、２９Ｄ／３０９Ｓ／３９４Ｅ、３３Ｄ／１２２Ａ／１４５Ｇ／２７２Ｄ／３０９Ｓ／４１２Ｌ、９１Ｋ／１３０Ｅ／１４５Ｇ／１５８Ｋ／１８３Ｇ／３８３Ｑ、９１Ｋ／３０９Ｓ／３８３Ｑ、１３０Ｅ／１４５Ｇ／２５６Ａ／２７２Ｄ／３７１Ｙ、１３０Ｅ／１４５Ｇ／３０２Ｍ／３０９Ｓ、１３０Ｅ／２７２Ｄ／４８１Ｖ、１４５Ｇ／３０２Ｍ／３０９Ｓ、２６８Ｔ、３０９Ａ、３４９Ｒ、３６０Ｇ、３８０Ｒ、３９４Ｇ、３９４Ｎ、３９４Ｓ、４６３Ｍおよび４８３Ｔから選択される少なくとも１個の置換または置換セットを含み、ポリペプチド配列のアミノ酸位置は、配列番号２７６または１２２４を参照して番号付けされる。一部の実施形態では、コードされる組換えアミラーゼは、Ｄ１６Ｅ／Ａ２６Ｅ／Ｒ２９Ｄ／Ｗ１２８Ｉ／Ａ１４５Ｇ／Ｓ２５６Ａ／Ｔ３０９Ｓ／Ｅ３８３Ｑ、Ｄ１６Ｅ／Ａ２６Ｅ／Ｅ３３Ｄ／Ｈ１１４Ａ／Ａ１４５Ｇ／Ｔ３０９Ｓ／Ｅ３８３Ｑ／Ｑ３９４Ｅ、Ｄ１６Ｅ／Ａ２６Ｅ／Ｅ３３Ｄ／Ｗ１２８Ｉ／Ｄ１３０Ｅ／Ａ１４５Ｇ／Ｑ３０２Ｍ／Ｔ３０９Ｓ／Ａ３２２Ｆ／Ｆ３７１Ｙ、Ｄ１６Ｅ／Ａ２６Ｅ／Ｅ３３Ｄ／Ａ１４５Ｇ／Ｒ１５８Ｋ／Ｅ３８３Ｑ／Ｑ３９４Ｅ、Ｄ１６Ｅ／Ａ２６Ｅ／Ａ１４５Ｇ／Ｑ３０２Ｍ、Ｄ１６Ｅ／Ｒ２９Ｄ／Ｅ３３Ｄ／Ａ１４５Ｇ／Ｓ２５６Ａ／Ｑ３０２Ｍ、Ｇ１８Ｓ、Ａ２６Ｅ／Ｒ２９Ｄ／Ｅ３３Ｄ／Ｄ１３０Ｅ／Ａ１４５Ｇ／Ｙ１５７Ｆ／Ｒ１５８Ｋ／Ｎ１８３Ｇ／Ｑ３９４Ｅ、Ａ２６Ｅ／Ｒ２９Ｄ／Ｅ３３Ｄ／Ａ１４５Ｇ／Ｙ１５７Ｆ／Ｎ１８３Ｇ／Ｓ２５６Ａ／Ｔ３０９Ｓ／Ｅ３８３Ｑ、Ａ２６Ｅ／Ｒ２９Ｄ／Ｒ１２２Ａ／Ｄ１３０Ｅ／Ａ１４５Ｇ／Ｎ１８３Ｇ／Ｓ２５６Ａ／Ｇ２７２Ｄ／Ｔ３０９Ｓ／Ｑ３９４Ｅ、Ａ２６Ｅ／Ｒ２９Ｄ／Ａ１４５Ｇ／Ｙ１５７Ｆ／Ｓ２５６Ａ／Ｑ３０２Ｍ／Ａ３２２Ｆ／Ｃ４８１Ｖ、Ａ２６Ｅ／Ｒ２９Ｄ／Ａ１４５Ｇ／Ｓ２５６Ａ／Ｇ２７２Ｄ／Ｑ３０２Ｍ／Ｔ３０９Ｓ／Ａ３２２Ｆ／Ｃ４８１Ｖ、Ａ２６Ｅ／Ｅ３３Ｄ／Ｈ９１Ｋ／Ａ１４５Ｇ／Ｇ２７２Ｄ／Ｑ３０２Ｍ／Ｃ４８１Ｖ、Ａ２６Ｅ／Ｅ３３Ｄ／Ａ１４５Ｇ／Ｔ３０９Ｓ／Ａ３２２Ｆ／Ｅ３８３Ｑ、Ａ２６Ｅ／Ｈ１１４Ａ／Ａ１４５Ｇ／Ａ３２２Ｆ、Ａ２６Ｅ／Ａ１４５Ｇ／Ｎ１８３Ｇ／Ｓ２５６Ａ／Ｔ３０９Ｓ／Ｅ３８３Ｑ、Ｒ２９Ｄ／Ｒ１２２Ａ／Ａ１４５Ｇ／Ｒ１５８Ｋ／Ｅ３８３Ｑ、Ｒ２９Ｄ／Ｄ１３０Ｅ／Ａ１４５Ｇ／Ｓ２５６Ａ／Ｇ２７２Ｄ／Ｆ３７１Ｙ／Ｑ３９４Ｅ、Ｒ２９Ｄ／Ａ１４５Ｇ／Ｎ１８３Ｇ／Ｑ３０２Ｍ／Ｔ３０９Ｓ／Ｄ４１２Ｌ、Ｒ２９Ｄ／Ｔ３０９Ｓ／Ｑ３９４Ｅ、Ｅ３３Ｄ／Ｒ１２２Ａ／Ａ１４５Ｇ／Ｇ２７２Ｄ／Ｔ３０９Ｓ／Ｄ４１２Ｌ、Ｈ９１Ｋ／Ｄ１３０Ｅ／Ａ１４５Ｇ／Ｒ１５８Ｋ／Ｎ１８３Ｇ／Ｅ３８３Ｑ、Ｈ９１Ｋ／Ｔ３０９Ｓ／Ｅ３８３Ｑ、Ｄ１３０Ｅ／Ａ１４５Ｇ／Ｓ２５６Ａ／Ｇ２７２Ｄ／Ｆ３７１Ｙ、Ｄ１３０Ｅ／Ａ１４５Ｇ／Ｑ３０２Ｍ／Ｔ３０９Ｓ、Ｄ１３０Ｅ／Ｇ２７２Ｄ／Ｃ４８１Ｖ、Ａ１４５Ｇ／Ｑ３０２Ｍ／Ｔ３０９Ｓ、Ｓ２６８Ｔ、Ｔ３０９Ａ、Ｐ３４９Ｒ、Ｎ３６０Ｇ、Ｇ３８０Ｒ、Ｑ３９４Ｇ、Ｑ３９４Ｎ、Ｑ３９４Ｓ、Ｇ４６３ＭおよびＧ４８３Ｔから選択される少なくとも１個の置換または置換セットを含み、ポリペプチド配列のアミノ酸位置は、配列番号２７６または１２２４を参照して番号付けされる。

一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、配列番号３０８もしくは１２５６に対して少なくとも８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくはそれを超える配列同一性を有するポリペプチド配列、またはその機能的断片を含む、組換えアミラーゼをコードし、コードされる組換えアミラーゼは、２９、３７／１２４／２５０／２７０／３４９／３８０／３９４／４４２／４９１、３７／１４５、３７／１４５／２５０／３０１／３４９／３９４、３７／１４５／２５８／４４２／４９１、３８／３４９／４９１、８１／２５９、８１／３１３／４９５、９２／２５７／２５８／３３８／４６８、９２／２５８、９４／１２７／１３２／１４５／２５０／３４９、９４／２７０／３０１／３４９／３９４／４４２、９４／３４９／４９１、１４５／２７０、１７８、２２５、２２６、２４６、２５０／３４９／４４２、２５９／３１３／３３８、２７０／３４９、２８６／３３８、２９４、３１３、３４９、３４９／３８０／４４２、４１３、４１３／４６８、４４８および４７３から選択される１個または複数の位置に少なくとも１個の置換または置換セットを含み、ポリペプチド配列のアミノ酸位置は、配列番号３０８または１２５６を参照して番号付けされる。一部の実施形態では、コードされる組換えアミラーゼは、２９Ａ、３７Ｔ／１２４Ｎ／２５０Ｄ／２７０Ｄ／３４９Ｒ／３８０Ｒ／３９４Ｅ／４４２Ｅ／４９１Ｌ、３７Ｔ／１４５Ｇ、３７Ｔ／１４５Ｇ／２５０Ｄ／３０１Ｋ／３４９Ｒ／３９４Ｅ、３７Ｔ／１４５Ｇ／２５８Ｓ／４４２Ｅ／４９１Ｌ、３８Ｉ／３４９Ｒ／４９１Ｌ、８１Ｅ／２５９Ｄ、８１Ｅ／３１３Ｄ／４９５Ｌ、９２Ｅ／２５７Ｅ／２５８Ｑ／３３８Ｓ／４６８Ｔ、９２Ｅ／２５８Ｑ、９４Ｇ／１２７Ｅ／１３２Ｖ／１４５Ｇ／２５０Ｄ／３４９Ｒ、９４Ｇ／２７０Ｄ／３０１Ｋ／３４９Ｒ／３９４Ｅ／４４２Ｅ、９４Ｇ／３４９Ｒ／４９１Ｌ、１４５Ｇ／２７０Ｄ、１７８Ｉ、２２５Ｄ、２２６Ｔ、２４６Ｒ、２５０Ｄ／３４９Ｒ／４４２Ｅ、２５９Ｄ／３１３Ｄ／３３８Ｓ、２７０Ｄ／３４９Ｒ、２８６Ｔ／３３８Ｓ、２９４Ｌ、３１３Ｄ、３４９Ｒ、３４９Ｒ／３８０Ｒ／４４２Ｅ、４１３Ｙ、４１３Ｙ／４６８Ｉ、４４８Ｔおよび４７３Ｄから選択される少なくとも１個の置換または置換セットを含み、ポリペプチド配列のアミノ酸位置は、配列番号３０８または１２５６を参照して番号付けされる。一部の実施形態では、コードされる組換えアミラーゼは、Ｒ２９Ａ、Ｎ３７Ｔ／Ｄ１２４Ｎ／Ｅ２５０Ｄ／Ｅ２７０Ｄ／Ｐ３４９Ｒ／Ｇ３８０Ｒ／Ｇ３９４Ｅ／Ｄ４４２Ｅ／Ｉ４９１Ｌ、Ｎ３７Ｔ／Ａ１４５Ｇ、Ｎ３７Ｔ／Ａ１４５Ｇ／Ｅ２５０Ｄ／Ｒ３０１Ｋ／Ｐ３４９Ｒ／Ｇ３９４Ｅ、Ｎ３７Ｔ／Ａ１４５Ｇ／Ｋ２５８Ｓ／Ｄ４４２Ｅ／Ｉ４９１Ｌ、Ｍ３８Ｉ／Ｐ３４９Ｒ／Ｉ４９１Ｌ、Ａ８１Ｅ／Ｐ２５９Ｄ、Ａ８１Ｅ／Ｔ３１３Ｄ／Ｉ４９５Ｌ、Ｒ９２Ｅ／Ｐ２５７Ｅ／Ｋ２５８Ｑ／Ａ３３８Ｓ／Ｒ４６８Ｔ、Ｒ９２Ｅ／Ｋ２５８Ｑ、Ｄ９４Ｇ／Ｑ１２７Ｅ／Ｉ１３２Ｖ／Ａ１４５Ｇ／Ｅ２５０Ｄ／Ｐ３４９Ｒ、Ｄ９４Ｇ／Ｅ２７０Ｄ／Ｒ３０１Ｋ／Ｐ３４９Ｒ／Ｇ３９４Ｅ／Ｄ４４２Ｅ、Ｄ９４Ｇ／Ｐ３４９Ｒ／Ｉ４９１Ｌ、Ａ１４５Ｇ／Ｅ２７０Ｄ、Ｖ１７８Ｉ、Ｅ２２５Ｄ、Ｑ２２６Ｔ、Ｋ２４６Ｒ、Ｅ２５０Ｄ／Ｐ３４９Ｒ／Ｄ４４２Ｅ、Ｐ２５９Ｄ／Ｔ３１３Ｄ／Ａ３３８Ｓ、Ｅ２７０Ｄ／Ｐ３４９Ｒ、Ｍ２８６Ｔ／Ａ３３８Ｓ、Ｍ２９４Ｌ、Ｔ３１３Ｄ、Ｐ３４９Ｒ、Ｐ３４９Ｒ／Ｇ３８０Ｒ／Ｄ４４２Ｅ、Ｆ４１３Ｙ、Ｆ４１３Ｙ／Ｒ４６８Ｉ、Ｈ４４８ＴおよびＥ４７３Ｄから選択される少なくとも１個の置換または置換セットを含み、ポリペプチド配列のアミノ酸位置は、配列番号３０８または１２５６を参照して番号付けされる。

一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、配列番号４２２もしくは１３７０に対して少なくとも８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくはそれを超える配列同一性を有するポリペプチド配列、またはその機能的断片を含む、組換えアミラーゼをコードし、コードされる組換えアミラーゼは、３８、３８／１７８／２２６／２８６／３３８、３８／１７８／２８６／４４８、３８／１７８／３４９／４４８、３８／２２６／２４６／２５８／２８６、３８／２２６／２５８／２８６／３３８／３８０／４４８、３８／２２６／２５８／３４９／４１３、３８／２２６／２８６、３８／２２６／２８６／３３８／３８０、３８／２２６／３３８／３４９／３８０、３８／２２６／４１３／４４８、３８／２４６／２８６、３８／２４６／２８６／３８０、３８／２５８、３８／２８６、３８／２８６／４１３／４４８、３８／２８６／４４８、３８／４４８、１７８、１７８／２２６／２５８／２８６／３１０／３３８、１７８／２２６／２８６／３３８、１７８／２４６／３３８、１７８／２５８／２８６／４１３、１７８／２８６、１７８／２８６／３３８／３４９、１７８／２８６／３３８／４４８、１７８／３８０、１７８／４１３、１７８／４４８、１８４／２４６／２５８／３８０、２２６、２２６／２４６／２８６／３４９／４４８、２２６／２４６／４１３、２２６／２５８／２８６／３４９／３８０、２２６／２５８／２８６／４１３／４４８、２２６／２８６、２２６／２８６／３８０／４４８、２２６／３４９／３８０、２４６、２４６／２８６、２４６／２８６／３８０／４１３、２４６／３３８、２４６／４１３、２５８／２８６／４１３、２８６、２８６／４１３／４４８、３３８／４４８、３４９および４１３から選択される１個または複数の位置に少なくとも１個の置換または置換セットを含み、ポリペプチド配列のアミノ酸位置は、配列番号４２２または１３７０を参照して番号付けされる。一部の実施形態では、コードされる組換えアミラーゼは、３８Ｉ、３８Ｉ／１７８Ｉ／２２６Ｔ／２８６Ｔ／３３８Ｓ、３８Ｉ／１７８Ｉ／２８６Ｔ／４４８Ｔ、３８Ｉ／１７８Ｉ／３４９Ｒ／４４８Ｔ、３８Ｉ／２２６Ｔ／２４６Ｒ／２５８Ｓ／２８６Ｔ、３８Ｉ／２２６Ｔ／２５８Ｓ／２８６Ｔ／３３８Ｓ／３８０Ｒ／４４８Ｔ、３８Ｉ／２２６Ｔ／２５８Ｓ／３４９Ｒ／４１３Ｙ、３８Ｉ／２２６Ｔ／２８６Ｔ、３８Ｉ／２２６Ｔ／２８６Ｔ／３３８Ｓ／３８０Ｒ、３８Ｉ／２２６Ｔ／３３８Ｓ／３４９Ｒ／３８０Ｒ、３８Ｉ／２２６Ｔ／４１３Ｙ／４４８Ｔ、３８Ｉ／２４６Ｒ／２８６Ｔ、３８Ｉ／２４６Ｒ／２８６Ｔ／３８０Ｒ、３８Ｉ／２５８Ｓ、３８Ｉ／２８６Ｔ、３８Ｉ／２８６Ｔ／４１３Ｙ／４４８Ｔ、３８Ｉ／２８６Ｔ／４４８Ｔ、３８Ｉ／４４８Ｔ、１７８Ｉ、１７８Ｉ／２２６Ｔ／２５８Ｓ／２８６Ｔ／３１０Ｒ／３３８Ｓ、１７８Ｉ／２２６Ｔ／２８６Ｔ／３３８Ｓ、１７８Ｉ／２４６Ｒ／３３８Ｓ、１７８Ｉ／２５８Ｓ／２８６Ｔ／４１３Ｙ、１７８Ｉ／２８６Ｔ、１７８Ｉ／２８６Ｔ／３３８Ｓ／３４９Ｒ、１７８Ｉ／２８６Ｔ／３３８Ｓ／４４８Ｔ、１７８Ｉ／３８０Ｒ、１７８Ｉ／４１３Ｙ、１７８Ｉ／４４８Ｔ、１８４Ｋ／２４６Ｒ／２５８Ｓ／３８０Ｒ、２２６Ｔ、２２６Ｔ／２４６Ｒ／２８６Ｔ／３４９Ｒ／４４８Ｔ、２２６Ｔ／２４６Ｒ／４１３Ｙ、２２６Ｔ／２５８Ｓ／２８６Ｔ／３４９Ｒ／３８０Ｒ、２２６Ｔ／２５８Ｓ／２８６Ｔ／４１３Ｙ／４４８Ｔ、２２６Ｔ／２８６Ｔ、２２６Ｔ／２８６Ｔ／３８０Ｒ／４４８Ｔ、２２６Ｔ／３４９Ｒ／３８０Ｒ、２４６Ｒ、２４６Ｒ／２８６Ｔ、２４６Ｒ／２８６Ｔ／３８０Ｒ／４１３Ｙ、２４６Ｒ／３３８Ｓ、２４６Ｒ／４１３Ｙ、２４６Ｔ、２５８Ｓ／２８６Ｔ／４１３Ｙ、２８６Ｔ、２８６Ｔ／４１３Ｙ／４４８Ｔ、３３８Ｓ／４４８Ｔ、３４９Ｒおよび４１３Ｙから選択される少なくとも１個の置換または置換セットを含み、ポリペプチド配列のアミノ酸位置は、配列番号４２２または１３７０を参照して番号付けされる。一部の実施形態では、コードされる組換えアミラーゼは、Ｍ３８Ｉ、Ｍ３８Ｉ／Ｖ１７８Ｉ／Ｑ２２６Ｔ／Ｍ２８６Ｔ／Ａ３３８Ｓ、Ｍ３８Ｉ／Ｖ１７８Ｉ／Ｍ２８６Ｔ／Ｈ４４８Ｔ、Ｍ３８Ｉ／Ｖ１７８Ｉ／Ｐ３４９Ｒ／Ｈ４４８Ｔ、Ｍ３８Ｉ／Ｑ２２６Ｔ／Ｋ２４６Ｒ／Ｋ２５８Ｓ／Ｍ２８６Ｔ、Ｍ３８Ｉ／Ｑ２２６Ｔ／Ｋ２５８Ｓ／Ｍ２８６Ｔ／Ａ３３８Ｓ／Ｇ３８０Ｒ／Ｈ４４８Ｔ、Ｍ３８Ｉ／Ｑ２２６Ｔ／Ｋ２５８Ｓ／Ｐ３４９Ｒ／Ｆ４１３Ｙ、Ｍ３８Ｉ／Ｑ２２６Ｔ／Ｍ２８６Ｔ、Ｍ３８Ｉ／Ｑ２２６Ｔ／Ｍ２８６Ｔ／Ａ３３８Ｓ／Ｇ３８０Ｒ、Ｍ３８Ｉ／Ｑ２２６Ｔ／Ａ３３８Ｓ／Ｐ３４９Ｒ／Ｇ３８０Ｒ、Ｍ３８Ｉ／Ｑ２２６Ｔ／Ｆ４１３Ｙ／Ｈ４４８Ｔ、Ｍ３８Ｉ／Ｋ２４６Ｒ／Ｍ２８６Ｔ、Ｍ３８Ｉ／Ｋ２４６Ｒ／Ｍ２８６Ｔ／Ｇ３８０Ｒ、Ｍ３８Ｉ／Ｋ２５８Ｓ、Ｍ３８Ｉ／Ｍ２８６Ｔ、Ｍ３８Ｉ／Ｍ２８６Ｔ／Ｆ４１３Ｙ／Ｈ４４８Ｔ、Ｍ３８Ｉ／Ｍ２８６Ｔ／Ｈ４４８Ｔ、Ｍ３８Ｉ／Ｈ４４８Ｔ、Ｖ１７８Ｉ、Ｖ１７８Ｉ／Ｑ２２６Ｔ／Ｋ２５８Ｓ／Ｍ２８６Ｔ／Ｑ３１０Ｒ／Ａ３３８Ｓ、Ｖ１７８Ｉ／Ｑ２２６Ｔ／Ｍ２８６Ｔ／Ａ３３８Ｓ、Ｖ１７８Ｉ／Ｋ２４６Ｒ／Ａ３３８Ｓ、Ｖ１７８Ｉ／Ｋ２５８Ｓ／Ｍ２８６Ｔ／Ｆ４１３Ｙ、Ｖ１７８Ｉ／Ｍ２８６Ｔ、Ｖ１７８Ｉ／Ｍ２８６Ｔ／Ａ３３８Ｓ／Ｐ３４９Ｒ、Ｖ１７８Ｉ／Ｍ２８６Ｔ／Ａ３３８Ｓ／Ｈ４４８Ｔ、Ｖ１７８Ｉ／Ｇ３８０Ｒ、Ｖ１７８Ｉ／Ｆ４１３Ｙ、Ｖ１７８Ｉ／Ｈ４４８Ｔ、Ｅ１８４Ｋ／Ｋ２４６Ｒ／Ｋ２５８Ｓ／Ｇ３８０Ｒ、Ｑ２２６Ｔ、Ｑ２２６Ｔ／Ｋ２４６Ｒ／Ｍ２８６Ｔ／Ｐ３４９Ｒ／Ｈ４４８Ｔ、Ｑ２２６Ｔ／Ｋ２４６Ｒ／Ｆ４１３Ｙ、Ｑ２２６Ｔ／Ｋ２５８Ｓ／Ｍ２８６Ｔ／Ｐ３４９Ｒ／Ｇ３８０Ｒ、Ｑ２２６Ｔ／Ｋ２５８Ｓ／Ｍ２８６Ｔ／Ｆ４１３Ｙ／Ｈ４４８Ｔ、Ｑ２２６Ｔ／Ｍ２８６Ｔ、Ｑ２２６Ｔ／Ｍ２８６Ｔ／Ｇ３８０Ｒ／Ｈ４４８Ｔ、Ｑ２２６Ｔ／Ｐ３４９Ｒ／Ｇ３８０Ｒ、Ｋ２４６Ｒ、Ｋ２４６Ｒ／Ｍ２８６Ｔ、Ｋ２４６Ｒ／Ｍ２８６Ｔ／Ｇ３８０Ｒ／Ｆ４１３Ｙ、Ｋ２４６Ｒ／Ａ３３８Ｓ、Ｋ２４６Ｒ／Ｆ４１３Ｙ、Ｋ２４６Ｔ、Ｋ２５８Ｓ／Ｍ２８６Ｔ／Ｆ４１３Ｙ、Ｍ２８６Ｔ、Ｍ２８６Ｔ／Ｆ４１３Ｙ／Ｈ４４８Ｔ、Ａ３３８Ｓ／Ｈ４４８Ｔ、Ｐ３４９ＲおよびＦ４１３Ｙから選択される少なくとも１個の置換または置換セットを含み、ポリペプチド配列のアミノ酸位置は、配列番号４２２または１３７０を参照して番号付けされる。

一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、配列番号４５６もしくは１４０４に対して少なくとも８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくはそれを超える配列同一性を有するポリペプチド配列、またはその機能的断片を含む、組換えアミラーゼをコードし、コードされる組換えアミラーゼは、２９／３１／９２／２２０、２９／４６９、４９／５８／１０３／１４１／１９７／２６９／２９４／２９８、４９／５８／１０３／１９４／２０４／２９８、４９／５８／１４１／２９８、４９／１０３、１０３、１２３、１２６、１２７、１３１、１３４、１８０、２１０、２１４、２２０／４６９、２２８、２５９、２７９、２８２、３０２、３１９、３９３、４１５、４１７、４２８、４２９、４６６および４６９から選択される１個または複数の位置に少なくとも１個の置換または置換セットを含み、ポリペプチド配列のアミノ酸位置は、配列番号４５６または１４０４を参照して番号付けされる。一部の実施形態では、コードされる組換えアミラーゼは、２９Ｅ／３１Ｌ／９２Ａ／２２０Ｇ、２９Ｅ／４６９Ｉ、４９Ａ／５８Ｔ／１０３Ｌ／１４１Ｆ／１９７Ｙ／２６９Ｆ／２９４Ｈ／２９８Ｑ、４９Ａ／５８Ｔ／１０３Ｌ／１９４Ｆ／２０４Ｄ／２９８Ｈ、４９Ａ／５８Ｔ／１４１Ｆ／２９８Ｈ、４９Ａ／１０３Ｌ、１０３Ｌ、１２３Ｒ、１２６Ｒ、１２７Ｗ、１３１Ｈ、１３１Ｒ、１３１Ｙ、１３４Ｒ、１８０Ｅ、２１０Ｐ、２１４Ｇ、２２０Ｇ／４６９Ｉ、２２８Ｖ、２５９Ｃ、２７９Ｌ、２８２Ｔ、３０２Ｈ、３０２Ｒ、３０２Ｗ、３１９Ｓ、３９３Ｒ、３９３Ｓ、４１５Ｃ、４１７Ｗ、４２８Ｔ、４２９Ｓ、４６６Ｃおよび４６９Ｉから選択される少なくとも１個の置換または置換セットを含み、ポリペプチド配列のアミノ酸位置は、配列番号４５６または１４０４を参照して番号付けされる。一部の実施形態では、コードされる組換えアミラーゼは、Ｒ２９Ｅ／Ｆ３１Ｌ／Ｒ９２Ａ／Ａ２２０Ｇ、Ｒ２９Ｅ／Ｖ４６９Ｉ、Ｓ４９Ａ／Ｓ５８Ｔ／Ｖ１０３Ｌ／Ｙ１４１Ｆ／Ｆ１９７Ｙ／Ｈ２６９Ｆ／Ｍ２９４Ｈ／Ｅ２９８Ｑ、Ｓ４９Ａ／Ｓ５８Ｔ／Ｖ１０３Ｌ／Ｌ１９４Ｆ／Ｎ２０４Ｄ／Ｅ２９８Ｈ、Ｓ４９Ａ／Ｓ５８Ｔ／Ｙ１４１Ｆ／Ｅ２９８Ｈ、Ｓ４９Ａ／Ｖ１０３Ｌ、Ｖ１０３Ｌ、Ｄ１２３Ｒ、Ｔ１２６Ｒ、Ｑ１２７Ｗ、Ｅ１３１Ｈ、Ｅ１３１Ｒ、Ｅ１３１Ｙ、Ｅ１３４Ｒ、Ｄ１８０Ｅ、Ｈ２１０Ｐ、Ｅ２１４Ｇ、Ａ２２０Ｇ／Ｖ４６９Ｉ、Ｑ２２８Ｖ、Ｐ２５９Ｃ、Ｄ２７９Ｌ、Ｅ２８２Ｔ、Ｑ３０２Ｈ、Ｑ３０２Ｒ、Ｑ３０２Ｗ、Ａ３１９Ｓ、Ｅ３９３Ｒ、Ｅ３９３Ｓ、Ｄ４１５Ｃ、Ｐ４１７Ｗ、Ｄ４２８Ｔ、Ｅ４２９Ｓ、Ｑ４６６ＣおよびＶ４６９Ｉから選択される少なくとも１個の置換または置換セットを含み、ポリペプチド配列のアミノ酸位置は、配列番号４５６または１４０４を参照して番号付けされる。

一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、配列番号４５６もしくは１４０４に対して少なくとも８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくはそれを超える配列同一性を有するポリペプチド配列、またはその機能的断片を含む、組換えアミラーゼをコードし、コードされる組換えアミラーゼは、９２、１２３、１２６、１２７、１２９、１３１、１３４、１４０、１７２、１８０、２１０、２１４、２２１、２２８、２５３、２５４、２５９、２７９、２８２、３０２、３０４、３０５、３１９、３２２、３４６、３５９、３８４、３８５、３８７、３９３、４０９、４１２、４１５、４１７、４２８、４２９、４４１、４４２、４４４、４４６、４５１、４５５、４５９、４６６、４６７、４７０、４７３、４７４、４９２および４９４から選択される１個または複数の位置に少なくとも１個の置換または置換セットを含み、ポリペプチド配列のアミノ酸位置は、配列番号４５６または１４０４を参照して番号付けされる。一部の実施形態では、コードされる組換えアミラーゼは、９２Ｇ、９２Ｑ、１２３Ｃ、１２３Ｇ、１２３Ｒ、１２６Ｑ、１２６Ｒ、１２７Ｉ、１２７Ｒ、１２７Ｓ、１２７Ｖ、１２７Ｗ、１２９Ｃ、１２９Ｗ、１３１Ｈ、１３１Ｒ、１３１Ｙ、１３４Ａ、１３４Ｆ、１３４Ｒ、１４０Ｖ、１７２Ｋ、１７２Ｒ、１８０Ｅ、１８０Ｐ、１８０Ｑ、２１０Ｇ、２１０Ｐ、２１４Ｇ、２１４Ｌ、２１４Ｒ、２２１Ｔ、２２１Ｖ、２２８Ｖ、２５３Ｒ、２５４Ｇ、２５９Ｃ、２５９Ｒ、２５９Ｗ、２７９Ｌ、２７９Ｖ、２８２Ｒ、２８２Ｔ、３０２Ｇ、３０２Ｈ、３０２Ｒ、３０２Ｖ、３０２Ｗ、３０４Ｔ、３０５Ｑ、３０５Ｒ、３０５Ｗ、３１９Ｌ、３１９Ｓ、３２２Ｒ、３４６Ｇ、３５９Ｇ、３８４Ｍ、３８５Ｌ、３８７Ｇ、３８７Ｖ、３９３Ｒ、３９３Ｓ、３９３Ｗ、４０９Ａ、４０９Ｒ、４０９Ｗ、４１２Ａ、４１５Ｃ、４１５Ｇ、４１７Ｗ、４２８Ｔ、４２９Ｓ、４４１Ｒ、４４１Ｗ、４４２Ｒ、４４２Ｗ、４４４Ｇ、４４４Ｒ、４４４Ｖ、４４６Ｇ、４５１Ｆ、４５５Ｌ、４５５Ｒ、４５５Ｔ、４５５Ｗ、４５９Ｗ、４６６Ｃ、４６７Ｐ、４６７Ｗ、４７０Ｇ、４７０Ｌ、４７０Ｓ、４７３Ｍ、４７４Ｇ、４９２Ｇ、４９２Ｒおよび４９４Ｃから選択される少なくとも１個の置換または置換セットを含み、ポリペプチド配列のアミノ酸位置は、配列番号４５６を参照して番号付けされる。一部の実施形態では、コードされる組換えアミラーゼは、Ｒ９２Ｇ、Ｒ９２Ｑ、Ｄ１２３Ｃ、Ｄ１２３Ｇ、Ｄ１２３Ｒ、Ｔ１２６Ｑ、Ｔ１２６Ｒ、Ｑ１２７Ｉ、Ｑ１２７Ｒ、Ｑ１２７Ｓ、Ｑ１２７Ｖ、Ｑ１２７Ｗ、Ｄ１２９Ｃ、Ｄ１２９Ｗ、Ｅ１３１Ｈ、Ｅ１３１Ｒ、Ｅ１３１Ｙ、Ｅ１３４Ａ、Ｅ１３４Ｆ、Ｅ１３４Ｒ、Ｒ１４０Ｖ、Ｄ１７２Ｋ、Ｄ１７２Ｒ、Ｄ１８０Ｅ、Ｄ１８０Ｐ、Ｄ１８０Ｑ、Ｈ２１０Ｇ、Ｈ２１０Ｐ、Ｅ２１４Ｇ、Ｅ２１４Ｌ、Ｅ２１４Ｒ、Ｒ２２１Ｔ、Ｒ２２１Ｖ、Ｑ２２８Ｖ、Ｑ２５３Ｒ、Ｅ２５４Ｇ、Ｐ２５９Ｃ、Ｐ２５９Ｒ、Ｐ２５９Ｗ、Ｄ２７９Ｌ、Ｄ２７９Ｖ、Ｅ２８２Ｒ、Ｅ２８２Ｔ、Ｑ３０２Ｇ、Ｑ３０２Ｈ、Ｑ３０２Ｒ、Ｑ３０２Ｖ、Ｑ３０２Ｗ、Ｒ３０４Ｔ、Ｄ３０５Ｑ、Ｄ３０５Ｒ、Ｄ３０５Ｗ、Ａ３１９Ｌ、Ａ３１９Ｓ、Ａ３２２Ｒ、Ｗ３４６Ｇ、Ｅ３５９Ｇ、Ｔ３８４Ｍ、Ｙ３８５Ｌ、Ｉ３８７Ｇ、Ｉ３８７Ｖ、Ｅ３９３Ｒ、Ｅ３９３Ｓ、Ｅ３９３Ｗ、Ｖ４０９Ａ、Ｖ４０９Ｒ、Ｖ４０９Ｗ、Ｄ４１２Ａ、Ｄ４１５Ｃ、Ｄ４１５Ｇ、Ｐ４１７Ｗ、Ｄ４２８Ｔ、Ｅ４２９Ｓ、Ｄ４４１Ｒ、Ｄ４４１Ｗ、Ｄ４４２Ｒ、Ｄ４４２Ｗ、Ｅ４４４Ｇ、Ｅ４４４Ｒ、Ｅ４４４Ｖ、Ｔ４４６Ｇ、Ｅ４５１Ｆ、Ｎ４５５Ｌ、Ｎ４５５Ｒ、Ｎ４５５Ｔ、Ｎ４５５Ｗ、Ｒ４５９Ｗ、Ｑ４６６Ｃ、Ｅ４６７Ｐ、Ｅ４６７Ｗ、Ｖ４７０Ｇ、Ｖ４７０Ｌ、Ｖ４７０Ｓ、Ｅ４７３Ｍ、Ｎ４７４Ｇ、Ｅ４９２Ｇ、Ｅ４９２ＲおよびＶ４９４Ｃから選択される少なくとも１個の置換または置換セットを含み、ポリペプチド配列のアミノ酸位置は、配列番号４５６または１４０４を参照して番号付けされる。

一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、配列番号５４６もしくは１４９４に対して少なくとも８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくはそれを超える配列同一性を有するポリペプチド配列、またはその機能的断片を含む、組換えアミラーゼをコードし、コードされる組換えアミラーゼは、１２３、１２３／１２６／１８０／２１４／２９８／３０２／３９３、１２３／１２６／１８０／２１４／３９３／４２８、１２３／１２６／２１０／２９８／３０２／３９３、１２３／１２６／２１０／４２８、１２３／１２６／４２８、１２３／２１０／３０２、１２６／１８０／２１０／２１４／２９８／３０２、１２６／１８０／２１０／２１４／４２８、１２６／１８０／２９８／３０２／３９３、１２６／２１０／３０２／４２８、１２６／２１４／３９３、１２６／２９８／３０２／３９３、１２６／２９８／３０２／３９３／４２８、１２９、１２９／２２８／２５３、１３１／２２８／２７９、１３１／２８２、１８０／２１４、２１０／２１４／３０２／３９３／４２８、２２８／２８２／４４４、２５３／２７９／４７０、２５３／２７９／４９２、２７９、２７９／４７０および４４１から選択される１個または複数の位置に少なくとも１個の置換または置換セットを含み、ポリペプチド配列のアミノ酸位置は、配列番号５４６または１４９４を参照して番号付けされる。一部の実施形態では、コードされる組換えアミラーゼは、１２３Ｒ、１２３Ｒ／１２６Ｒ／１８０Ｅ／２１４Ｌ／２９８Ｑ／３０２Ｗ／３９３Ｒ、１２３Ｒ／１２６Ｒ／１８０Ｑ／２１４Ｇ／３９３Ｒ／４２８Ｔ、１２３Ｒ／１２６Ｒ／２１０Ｐ／２９８Ｑ／３０２Ｗ／３９３Ｒ、１２３Ｒ／１２６Ｒ／２１０Ｐ／４２８Ｔ、１２３Ｒ／１２６Ｒ／４２８Ｔ、１２３Ｒ／２１０Ｐ／３０２Ｒ、１２６Ｒ／１８０Ｅ／２１０Ｐ／２１４Ｇ／４２８Ｔ、１２６Ｒ／１８０Ｅ／２９８Ｑ／３０２Ｒ／３９３Ｒ、１２６Ｒ／１８０Ｑ／２１０Ｐ／２１４Ｌ／２９８Ｑ／３０２Ｒ、１２６Ｒ／２１０Ｐ／３０２Ｒ／４２８Ｔ、１２６Ｒ／２１４Ｇ／３９３Ｒ、１２６Ｒ／２９８Ｑ／３０２Ｈ／３９３Ｒ、１２６Ｒ／２９８Ｑ／３０２Ｒ／３９３Ｒ／４２８Ｔ、１２９Ｗ、１２９Ｗ／２２８Ｖ／２５３Ｒ、１３１Ｈ／２２８Ｖ／２７９Ｖ、１３１Ｙ／２８２Ｔ、１８０Ｑ／２１４Ｌ、２１０Ｐ／２１４Ｌ／３０２Ｒ／３９３Ｒ／４２８Ｔ、２２８Ｖ／２８２Ｔ／４４４Ｒ、２５３Ｒ／２７９Ｌ／４９２Ｇ、２５３Ｒ／２７９Ｖ／４７０Ｓ、２７９Ｌ、２７９Ｌ／４７０Ｓおよび４４１Ｒから選択される少なくとも１個の置換または置換セットを含み、ポリペプチド配列のアミノ酸位置は、配列番号５４６または１４９４を参照して番号付けされる。一部の実施形態では、コードされる組換えアミラーゼは、Ｄ１２３Ｒ、Ｄ１２３Ｒ／Ｔ１２６Ｒ／Ｄ１８０Ｅ／Ｅ２１４Ｌ／Ｈ２９８Ｑ／Ｑ３０２Ｗ／Ｅ３９３Ｒ、Ｄ１２３Ｒ／Ｔ１２６Ｒ／Ｄ１８０Ｑ／Ｅ２１４Ｇ／Ｅ３９３Ｒ／Ｄ４２８Ｔ、Ｄ１２３Ｒ／Ｔ１２６Ｒ／Ｈ２１０Ｐ／Ｈ２９８Ｑ／Ｑ３０２Ｗ／Ｅ３９３Ｒ、Ｄ１２３Ｒ／Ｔ１２６Ｒ／Ｈ２１０Ｐ／Ｄ４２８Ｔ、Ｄ１２３Ｒ／Ｔ１２６Ｒ／Ｄ４２８Ｔ、Ｄ１２３Ｒ／Ｈ２１０Ｐ／Ｑ３０２Ｒ、Ｔ１２６Ｒ／Ｄ１８０Ｅ／Ｈ２１０Ｐ／Ｅ２１４Ｇ／Ｄ４２８Ｔ、Ｔ１２６Ｒ／Ｄ１８０Ｅ／Ｈ２９８Ｑ／Ｑ３０２Ｒ／Ｅ３９３Ｒ、Ｔ１２６Ｒ／Ｄ１８０Ｑ／Ｈ２１０Ｐ／Ｅ２１４Ｌ／Ｈ２９８Ｑ／Ｑ３０２Ｒ、Ｔ１２６Ｒ／Ｈ２１０Ｐ／Ｑ３０２Ｒ／Ｄ４２８Ｔ、Ｔ１２６Ｒ／Ｅ２１４Ｇ／Ｅ３９３Ｒ、Ｔ１２６Ｒ／Ｈ２９８Ｑ／Ｑ３０２Ｈ／Ｅ３９３Ｒ、Ｔ１２６Ｒ／Ｈ２９８Ｑ／Ｑ３０２Ｒ／Ｅ３９３Ｒ／Ｄ４２８Ｔ、Ｄ１２９Ｗ、Ｄ１２９Ｗ／Ｑ２２８Ｖ／Ｑ２５３Ｒ、Ｅ１３１Ｈ／Ｑ２２８Ｖ／Ｄ２７９Ｖ、Ｅ１３１Ｙ／Ｅ２８２Ｔ、Ｄ１８０Ｑ／Ｅ２１４Ｌ、Ｈ２１０Ｐ／Ｅ２１４Ｌ／Ｑ３０２Ｒ／Ｅ３９３Ｒ／Ｄ４２８Ｔ、Ｑ２２８Ｖ／Ｅ２８２Ｔ／Ｅ４４４Ｒ、Ｑ２５３Ｒ／Ｄ２７９Ｌ／Ｅ４９２Ｇ、Ｑ２５３Ｒ／Ｄ２７９Ｖ／Ｖ４７０Ｓ、Ｄ２７９Ｌ、Ｄ２７９Ｌ／Ｖ４７０ＳおよびＤ４４１Ｒから選択される少なくとも１個の置換または置換セットを含み、ポリペプチド配列のアミノ酸位置は、配列番号５４６または１４９４を参照して番号付けされる。

一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、配列番号６３２もしくは１５８０に対して少なくとも８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくはそれを超える配列同一性を有するポリペプチド配列、またはその機能的断片を含む、組換えアミラーゼをコードし、コードされる組換えアミラーゼは、２、４５／１６６／２９８、４８、４８／１６６／１７０／２０３、５２、５８／１６６、５８／２０３、７２、８２、１１４、１１４／２２３／３０６／３０８、１４９、１６５、１６６／２０３、１６７、１７０、１８４／２１６／３０６／３０８、１８４／２２３／３０６／４３７、１８９、２０３、２２５、２５５、２５８、２７５、２８０、２８４、２９４、２９８、３９６、３９７、４１１、４３１、４４８、４６８、４８２、４８３および４９５から選択される１個または複数の位置に少なくとも１個の置換または置換セットを含み、ポリペプチド配列のアミノ酸位置は、配列番号６３２を参照して番号付けされる。一部の実施形態では、コードされる組換えアミラーゼは、２Ｌ、４５Ｓ／１６６Ｌ／２９８Ｄ、４８Ｄ、４８Ｄ／１６６Ｌ／１７０Ｓ／２０３Ｓ、５２Ｒ、５８Ａ／１６６Ｌ、５８Ａ／２０３Ｓ、７２Ｔ、８２Ａ、１１４Ｒ、１１４Ｒ／２２３Ｌ／３０６Ｆ／３０８Ｌ、１４９Ｋ、１６５Ｖ、１６６Ｌ／２０３Ｓ、１６７Ｙ、１７０Ｓ、１８４Ｄ／２１６Ｌ／３０６Ｆ／３０８Ｌ、１８４Ｄ／２２３Ｌ／３０６Ｆ／４３７Ｌ、１８９Ｄ、２０３Ｓ、２２５Ｔ、２５５Ｍ、２５５Ｒ、２５８Ｓ、２７５Ｉ、２７５Ｒ、２８０Ｃ、２８４Ｌ、２８４Ｍ、２９４Ａ、２９８Ｄ、２９８Ｎ、３９６Ｅ、３９６Ｑ、３９７Ｍ、４１１Ｅ、４３１Ｔ、４４８Ｐ、４６８Ｖ、４８２Ｌ、４８３Ａ、４９５Ｇおよび４９５Ｌから選択される少なくとも１個の置換または置換セットを含み、ポリペプチド配列のアミノ酸位置は、配列番号６３２または１５８０を参照して番号付けされる。一部の実施形態では、コードされる組換えアミラーゼは、Ｒ２Ｌ、Ｙ４５Ｓ／Ｉ１６６Ｌ／Ｈ２９８Ｄ、Ａ４８Ｄ、Ａ４８Ｄ／Ｉ１６６Ｌ／Ｄ１７０Ｓ／Ｅ２０３Ｓ、Ｙ５２Ｒ、Ｔ５８Ａ／Ｉ１６６Ｌ、Ｔ５８Ａ／Ｅ２０３Ｓ、Ｓ７２Ｔ、Ｑ８２Ａ、Ｈ１１４Ｒ、Ｈ１１４Ｒ／Ｖ２２３Ｌ／Ｙ３０６Ｆ／Ｍ３０８Ｌ、Ｑ１４９Ｋ、Ｈ１６５Ｖ、Ｉ１６６Ｌ／Ｅ２０３Ｓ、Ｅ１６７Ｙ、Ｄ１７０Ｓ、Ｅ１８４Ｄ／Ｉ２１６Ｌ／Ｙ３０６Ｆ／Ｍ３０８Ｌ、Ｅ１８４Ｄ／Ｖ２２３Ｌ／Ｙ３０６Ｆ／Ｍ４３７Ｌ、Ｑ１８９Ｄ、Ｅ２０３Ｓ、Ｅ２２５Ｔ、Ｖ２５５Ｍ、Ｖ２５５Ｒ、Ｋ２５８Ｓ、Ｑ２７５Ｉ、Ｑ２７５Ｒ、Ｑ２８０Ｃ、Ｋ２８４Ｌ、Ｋ２８４Ｍ、Ｍ２９４Ａ、Ｈ２９８Ｄ、Ｈ２９８Ｎ、Ｄ３９６Ｅ、Ｄ３９６Ｑ、Ｅ３９７Ｍ、Ｔ４１１Ｅ、Ｐ４３１Ｔ、Ｈ４４８Ｐ、Ｒ４６８Ｖ、Ｎ４８２Ｌ、Ｇ４８３Ａ、Ｉ４９５ＧおよびＩ４９５Ｌから選択される少なくとも１個の置換または置換セットを含み、ポリペプチド配列のアミノ酸位置は、配列番号６３２または１５８０を参照して番号付けされる。

一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、配列番号６６４もしくは１６１２に対して少なくとも８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくはそれを超える配列同一性を有するポリペプチド配列、またはその機能的断片を含む、組換えアミラーゼをコードし、コードされる組換えアミラーゼは、６／３９／１０３／３２４／４２０、４１、５８／５００／５０１、６１、９５／９８／２０５／２２７／４２３／４５８、９５／９８／２２７／４２３、９５／２０５、９５／２５２／２８５／３２４、１２３／１７０／１９７／２７５／２９８／３９６／４４８／４８３、１２３／１９７、１２３／１９７／２２５／２９４／３９６／４４８／４６９、１２３／２８４／２９４／３２４／３９６／４４８、１３４／２２５／２７５／３０２、１６５／２２５／２８４／２９８／４６９／４８３、１７０／２７５／２９４／２９８／４４８、２０５／２０６、２０５／２０６／２２４／３１５／４５８／４８０、２０６／２２７、２０６／２２７／３１５／４２３、２２５／２９４／２９８／３９６、２２７、３９２／５０３、４５８、４９９および５００から選択される１個または複数の位置に少なくとも１個の置換または置換セットを含み、ポリペプチド配列のアミノ酸位置は、配列番号６６４または１６１２を参照して番号付けされる。一部の実施形態では、コードされる組換えアミラーゼは、６Ｉ／３９Ｉ／１０３Ｄ／３２４Ｔ／４２０Ｖ、４１Ｆ、５８Ｓ／５００Ｐ／５０１Ｐ、６１Ｙ、９５Ｌ／２５２Ｉ／２８５Ｖ／３２４Ｔ、９５Ｖ／９８Ｉ／２０５Ｖ／２２７Ｖ／４２３Ｖ／４５８Ｆ、９５Ｖ／９８Ｉ／２２７Ｖ／４２３Ｖ、９５Ｖ／２０５Ｖ、１２３Ｅ／１７０Ｓ／１９７Ｙ／２７５Ｉ／２９８Ｎ／３９６Ｑ／４４８Ｑ／４８３Ｑ、１２３Ｅ／１９７Ｙ、１２３Ｅ／１９７Ｙ／２２５Ｇ／２９４Ａ／３９６Ｑ／４４８Ｑ／４６９Ｉ、１２３Ｅ／２８４Ｌ／２９４Ａ／３２４Ｔ／３９６Ｑ／４４８Ｑ、１３４Ｒ／２２５Ｇ／２７５Ｉ／３０２Ｗ、１６５Ｖ／２２５Ｇ／２８４Ｌ／２９８Ｎ／４６９Ｉ／４８３Ｑ、１７０Ｓ／２７５Ｉ／２９４Ａ／２９８Ｎ／４４８Ｑ、２０５Ｖ／２０６Ｅ、２０５Ｖ／２０６Ｅ／２２４Ｌ／３１５Ｓ／４５８Ｆ／４８０Ｌ、２０６Ｅ／２２７Ｖ、２０６Ｅ／２２７Ｖ／３１５Ｓ／４２３Ｖ、２２５Ｇ／２９４Ａ／２９８Ｎ／３９６Ｑ、２２７Ｃ、３９２Ｃ／５０３Ｌ、４５８Ｆ、４５８Ｙ、４９９Ｒおよび５００Ｐから選択される少なくとも１個の置換または置換セットを含み、ポリペプチド配列のアミノ酸位置は、配列番号６６４または１６１２を参照して番号付けされる。一部の実施形態では、コードされる組換えアミラーゼは、Ｌ６Ｉ／Ｖ３９Ｉ／Ｖ１０３Ｄ／Ａ３２４Ｔ／Ｉ４２０Ｖ、Ｌ４１Ｆ、Ｔ５８Ｓ／Ｈ５００Ｐ／Ｈ５０１Ｐ、Ｌ６１Ｙ、Ｉ９５Ｌ／Ｖ２５２Ｉ／Ｔ２８５Ｖ／Ａ３２４Ｔ、Ｉ９５Ｖ／Ｌ９８Ｉ／Ｉ２０５Ｖ／Ｔ２２７Ｖ／Ｓ４２３Ｖ／Ｗ４５８Ｆ、Ｉ９５Ｖ／Ｌ９８Ｉ／Ｔ２２７Ｖ／Ｓ４２３Ｖ、Ｉ９５Ｖ／Ｉ２０５Ｖ、Ｄ１２３Ｅ／Ｄ１７０Ｓ／Ｆ１９７Ｙ／Ｑ２７５Ｉ／Ｈ２９８Ｎ／Ｄ３９６Ｑ／Ｈ４４８Ｑ／Ｇ４８３Ｑ、Ｄ１２３Ｅ／Ｆ１９７Ｙ、Ｄ１２３Ｅ／Ｆ１９７Ｙ／Ｅ２２５Ｇ／Ｍ２９４Ａ／Ｄ３９６Ｑ／Ｈ４４８Ｑ／Ｖ４６９Ｉ、Ｄ１２３Ｅ／Ｋ２８４Ｌ／Ｍ２９４Ａ／Ａ３２４Ｔ／Ｄ３９６Ｑ／Ｈ４４８Ｑ、Ｅ１３４Ｒ／Ｅ２２５Ｇ／Ｑ２７５Ｉ／Ｑ３０２Ｗ、Ｈ１６５Ｖ／Ｅ２２５Ｇ／Ｋ２８４Ｌ／Ｈ２９８Ｎ／Ｖ４６９Ｉ／Ｇ４８３Ｑ、Ｄ１７０Ｓ／Ｑ２７５Ｉ／Ｍ２９４Ａ／Ｈ２９８Ｎ／Ｈ４４８Ｑ、Ｉ２０５Ｖ／Ｄ２０６Ｅ、Ｉ２０５Ｖ／Ｄ２０６Ｅ／Ｍ２２４Ｌ／Ｔ３１５Ｓ／Ｗ４５８Ｆ／Ｆ４８０Ｌ、Ｄ２０６Ｅ／Ｔ２２７Ｖ、Ｄ２０６Ｅ／Ｔ２２７Ｖ／Ｔ３１５Ｓ／Ｓ４２３Ｖ、Ｅ２２５Ｇ／Ｍ２９４Ａ／Ｈ２９８Ｎ／Ｄ３９６Ｑ、Ｔ２２７Ｃ、Ｉ３９２Ｃ／Ｈ５０３Ｌ、Ｗ４５８Ｆ、Ｗ４５８Ｙ、Ｇ４９９ＲおよびＨ５００Ｐから選択される少なくとも１個の置換または置換セットを含み、ポリペプチド配列のアミノ酸位置は、配列番号６６４または１６１２を参照して番号付けされる。

一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、配列番号６６４もしくは１６１２に対して少なくとも８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくはそれを超える配列同一性を有するポリペプチド配列、またはその機能的断片を含む、組換えアミラーゼをコードし、コードされる組換えアミラーゼは、９５／２５２／２８５／３２４、１２３／１９７、１２３／１９７／２２５／２９４／３９６／４４８／４６９、１３４／２２５／２７５／３０２、２０５／２０６および２０５／２０６／２２４／３１５／４５８／４８０から選択される１個または複数の位置に少なくとも１個の置換または置換セットを含み、ポリペプチド配列のアミノ酸位置は、配列番号６６４または１６１２を参照して番号付けされる。一部の実施形態では、コードされる組換えアミラーゼは、９５Ｌ／２５２Ｉ／２８５Ｖ／３２４Ｔ、１２３Ｅ／１９７Ｙ、１２３Ｅ／１９７Ｙ／２２５Ｇ／２９４Ａ／３９６Ｑ／４４８Ｑ／４６９Ｉ、１３４Ｒ／２２５Ｇ／２７５Ｉ／３０２Ｗ、２０５Ｖ／２０６Ｅおよび２０５Ｖ／２０６Ｅ／２２４Ｌ／３１５Ｓ／４５８Ｆ／４８０Ｌから選択される少なくとも１個の置換または置換セットを含み、ポリペプチド配列のアミノ酸位置は、配列番号６６４または１６１２を参照して番号付けされる。一部の実施形態では、コードされる組換えアミラーゼは、Ｉ９５Ｌ／Ｖ２５２Ｉ／Ｔ２８５Ｖ／Ａ３２４Ｔ、Ｄ１２３Ｅ／Ｆ１９７Ｙ、Ｄ１２３Ｅ／Ｆ１９７Ｙ／Ｅ２２５Ｇ／Ｍ２９４Ａ／Ｄ３９６Ｑ／Ｈ４４８Ｑ／Ｖ４６９Ｉ、Ｅ１３４Ｒ／Ｅ２２５Ｇ／Ｑ２７５Ｉ／Ｑ３０２Ｗ、Ｉ２０５Ｖ／Ｄ２０６ＥおよびＩ２０５Ｖ／Ｄ２０６Ｅ／Ｍ２２４Ｌ／Ｔ３１５Ｓ／Ｗ４５８Ｆ／Ｆ４８０Ｌから選択される少なくとも１個の置換または置換セットを含み、ポリペプチド配列のアミノ酸位置は、配列番号６６４または１６１２を参照して番号付けされる。

一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、配列番号７８０もしくは１７２８に対して少なくとも８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくはそれを超える配列同一性を有するポリペプチド配列、またはその機能的断片を含む、組換えアミラーゼをコードし、コードされる組換えアミラーゼは、位置１２６に置換を含み、ポリペプチド配列のアミノ酸位置は、配列番号７８０または１７２８を参照して番号付けされる。一部の実施形態では、コードされる組換えアミラーゼは、１２６Ｃ、１２６Ｄ、１２６Ｅ、１２６Ｋ、１２６Ｌ、１２６Ｍ、１２６Ｎ、１２６Ｑ、１２６Ｓ、１２６Ｔおよび１２６Ｗから選択される少なくとも１個の置換を含み、ポリペプチド配列のアミノ酸位置は、配列番号７８０または１７２８を参照して番号付けされる。一部の実施形態では、コードされる組換えアミラーゼは、Ｒ１２６Ｃ、Ｒ１２６Ｄ、Ｒ１２６Ｅ、Ｒ１２６Ｋ、Ｒ１２６Ｌ、Ｒ１２６Ｍ、Ｒ１２６Ｎ、Ｒ１２６Ｑ、Ｒ１２６Ｓ、Ｒ１２６ＴおよびＲ１２６Ｗから選択される少なくとも１個の置換を含み、ポリペプチド配列のアミノ酸位置は、配列番号７８０または１７２８を参照して番号付けされる。

一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、高ストリンジェントな条件下で参照ポリヌクレオチド配列とハイブリダイズすることができる。一部の実施形態では、参照配列は、配列番号１、１７、３９、１５５、１７３、２７５、３０７、４２１、４５５、５４５、６３１、６６３、７７９、９８７、１１０３、１１２１、１２２３、１２５５、１３６９、１４０３、１４９３、１５７９、１６１１および１７２７、またはその相補体、または本明細書において提供される改変アミラーゼポリペプチドのいずれかをコードするポリヌクレオチド配列から選択される。一部の実施形態では、高ストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができるポリヌクレオチドは、配列番号１、１７、３９、１５５、１７３、２７５、３０７、４２１、４５５、５４５、６３１、６６３、７７９、９８７、１１０３、１１２１、１２２３、１２５５、１３６９、１４０３、１４９３、１５７９、１６１１および１７２７と比較して、表４－１、４－２、４－３、４－４、４－５、４－６、４－７、４－８、４－９、４－１０、４－１１、４－１２、４－１３および／または４－１４に表示されるいずれかの位置から選択される残基位置に１個または複数の残基差異を有するアミノ酸配列を含むアミラーゼポリペプチドをコードする。一部のさらなる実施形態では、操作されたポリヌクレオチドは、表４－１、４－２、４－３、４－４、４－５、４－６、４－７、４－８、４－９、４－１０、４－１１、４－１２、４－１３および／もしくは４－１４に提供されるものから選択されるか、または配列番号１、１７、３９、１５５、１７３、２７５、３０７、４２１、４５５、５４５、６３１、６６３、７７９、９８７、１１０３、１１２１、１２２３、１２５５、１３６９、１４０３、１４９３、１５７９、１６１１および１７２７から選択される参照配列に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくはそれを超える配列同一性を有するポリヌクレオチドを含む。一部の追加の実施形態では、操作されたポリヌクレオチドは、表４－１、４－２、４－３、４－４、４－５、４－６、４－７、４－８、４－９、４－１０、４－１１、４－１２、４－１３および／もしくは４－１４に提供される少なくとも１種のポリヌクレオチド配列、または表４－１、４－２、４－３、４－４、４－５、４－６、４－７、４－８、４－９、４－１０、４－１１、４－１２、４－１３および／もしくは４－１４に提供される少なくとも１種のポリヌクレオチド配列であって、ヒスチジンタグおよびその前にあるアミノ酸リンカーをコードする配列を欠く、ポリヌクレオチド配列、ならびに／または配列番号１、１７、３９、１５５、１７３、２７５、３０７、４２１、４５５、５４５、６３１、６６３、７７９、９８７、１１０３、１１２１、１２２３、１２５５、１３６９、１４０３、１４９３、１５７９、１６１１および１７２７に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれを超える配列同一性を有する配列を含む。一部のさらなる実施形態では、操作されたポリヌクレオチド配列は、参照ポリヌクレオチド配列と比較して、１～２、１～３、１～４、１～５、１～６、１～７、１～８、１～９、１～１０、１～１５、１～２０、１～２１、１～２２、１～２３、１～２４、１～２５、１～３０、１～３５、１～４０、１～４５または１～５０個の塩基変化を含む。さらなる一部の他の実施形態では、操作されたポリヌクレオチド配列は、参照ポリヌクレオチド配列と比較して、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、３０、３１、３２、３３、３４、３５、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９または５０個の塩基変化を含む。一部の実施形態では、操作されたポリヌクレオチド配列は、参照ポリヌクレオチド配列と比較して、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１８、２０、２１、２２、２３、２４または２５個の塩基変化を含む。

一部の実施形態では、本明細書で提供される操作されたアミラーゼポリペプチドのうちいずれかをコードする単離されたポリヌクレオチドは、遺伝子の発現およびポリペプチドの産生を提供するために、種々の方法で操作される。一部の実施形態では、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、発現ベクターとして提供され、その中には、１個または複数の制御配列が、ポリヌクレオチドおよび／またはポリペプチドの発現を調節するために存在する。ベクターへのその挿入の前の単離されたポリヌクレオチドの操作が、発現ベクターに依存して、望ましいまたは必要な場合がある。組換えＤＮＡ法を利用してポリヌクレオチドおよび核酸配列を改変するための技法は、当技術分野で周知である。

一部の実施形態では、制御配列には、他の配列のうちで、プロモーター、リーダー配列、ポリアデニル化配列、プロペプチド配列、シグナルペプチド配列、および転写ターミネーターが含まれる。当技術分野で公知のように、適切な制御配列は、使用される宿主細胞に基づいて選択され得る。本発明は、任意の具体的な制御配列に限定されない意図である。

細菌宿主細胞のための例示的なプロモーターには、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉラクトースオペロン、トリプトファンオペロン、アラビノースオペロン、Ｔ７バクテリオファージ由来のＴ７プロモーター、およびＳａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａｅｒｙｔｈｒａｅａエリスロマイシン抵抗性遺伝子の遺伝子から得られたプロモーターが含まれるがこれらに限定されない。

糸状菌宿主細胞のための例示的なプロモーターとしては、ＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｏｒｙｚａｅＴＡＫＡアミラーゼ、Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒｍｉｅｈｅｉアスパラギン酸プロテイナーゼ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｎｉｇｅｒ中性アルファ－アミラーゼ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｎｉｇｅｒ酸安定性アルファ－アミラーゼ、ＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｎｉｇｅｒまたはＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓａｗａｍｏｒｉグルコアミラーゼ、Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒｍｉｅｈｅｉプロテアーゼ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｏｒｙｚａｅアルカリプロテアーゼ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｏｒｙｚａｅトリオースリン酸イソメラーゼ、ＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｎｉｄｕｌａｎｓアセトアミダーゼおよびＦｕｓａｒｉｕｍｏｘｙｓｐｏｒｕｍトリプシン様プロテアーゼの遺伝子から得られるプロモーター（例えば、国際公開第９６／００７８７号を参照のこと）、ならびにＮＡ２－ｔｐｉプロモーター（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｎｉｇｅｒ中性アルファ－アミラーゼおよびＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｏｒｙｚａｅトリオースリン酸イソメラーゼの遺伝子由来のプロモーターのハイブリッド）、ならびにそれらの突然変異、短縮型およびハイブリッドプロモーターが挙げられる。例示的な酵母細胞プロモーターは、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅエノラーゼ（ＥＮＯ－１）、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅガラクトキナーゼ（ＧＡＬ１）、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅアルコール脱水素酵素／グリセルアルデヒド－３－リン酸デヒドロゲナーゼ（ＡＤＨ２／ＧＡＰ）、およびＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ３－ホスホグリセリン酸キナーゼの遺伝子由来であり得る。酵母宿主細胞のための他の有用なプロモーターは当技術分野で公知である（例えば、Ｒｏｍａｎｏｓｅｔａｌ．Ｙｅａｓｔ８：４２３－４８８［１９９２］を参照のこと）。哺乳動物細胞における使用のための例示的なプロモーターとしては、これらに限定されないが、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）由来、サル空胞ウイルス４０（ＳＶ４０）由来、Ｈｏｍｏｓａｐｉｅｎｓホスホグリセリン酸キナーゼ、ベータアクチン、伸長因子－１ａ、もしくはグリセルアルデヒド－３－リン酸デヒドロゲナーゼ由来またはＧａｌｌｕｓｇａｌｌｕｓのβ－アクチン由来のものが挙げられる。

一部の実施形態では、制御配列は、適切な転写ターミネーター配列であり、これは、転写を終結させるために宿主細胞によって認識される配列である。ターミネーター配列は、ポリペプチドをコードする核酸配列の３’末端に作動可能に連結される。選択された宿主細胞において機能的な任意のターミネーターが、本発明において使用される。例えば、細菌宿主細胞のための例示的な転写ターミネーターは、Ｔ７ターミネーターについてはＴ７細菌ファージから得られ得る、またはＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉリボソームＲＮＡから得られ得る（例えば、ｒｒｎＢターミネーター）。例えば、糸状菌宿主細胞のための例示的な転写ターミネーターは、ＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｏｒｙｚａｅＴＡＫＡアミラーゼ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｎｉｇｅｒグルコアミラーゼ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｎｉｄｕｌａｎｓアントラニル酸シンターゼ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｎｉｇｅｒアルファ－グルコシダーゼ、およびＦｕｓａｒｉｕｍｏｘｙｓｐｏｒｕｍトリプシン様プロテアーゼの遺伝子から得られ得る。酵母宿主細胞のための例示的なターミネーターは、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅエノラーゼ、ＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅチトクロムＣ（ＣＹＣ１）、およびＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅグリセロアルデヒド－３－リン酸デヒドロゲナーゼの遺伝子から得られ得る。酵母宿主細胞のための他の有用なターミネーターは、当技術分野で公知である（例えば、Ｒｏｍａｎｏｓｅｔａｌ．、上記を参照されたい）。哺乳動物細胞のための例示的なターミネーターには、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、サル空胞ウイルス４０（ＳＶ４０）由来のもの、またはＨｏｍｏｓａｐｉｅｎｓ成長ホルモン由来のものが含まれるがこれらに限定されない。

一部の実施形態では、制御配列は、適切なリーダー配列であり、これは、宿主細胞による翻訳のために重要なｍＲＮＡの非翻訳領域である。リーダー配列は、ポリペプチドをコードする核酸配列の５’末端に作動可能に連結される。選択された宿主細胞において機能的な任意のリーダー配列が使用され得る。糸状菌宿主細胞のための例示的なリーダーは、ＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｏｒｙｚａｅＴＡＫＡアミラーゼおよびＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｎｉｄｕｌａｎｓトリオースリン酸イソメラーゼの遺伝子から得られる。酵母宿主細胞のための適切なリーダーには、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅエノラーゼ（ＥＮＯ－１）、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ３－ホスホグリセリン酸キナーゼ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅアルファ－因子、およびＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅアルコールデヒドロゲナーゼ／グリセロアルデヒド－３－リン酸デヒドロゲナーゼ（ＡＤＨ２／ＧＡＰ）の遺伝子から得られるものが含まれるがこれらに限定されない。

一部の実施形態では、制御配列は、ポリアデニル化配列であってもよく、これは、核酸配列の３’末端に作動可能に連結された配列であり、転写されると、転写されたｍＲＮＡにポリアデノシン残基を付加するためのシグナルとして、宿主細胞によって認識される。選択された宿主細胞において機能的な任意のポリアデニル化配列が、本発明において使用され得る。糸状菌宿主細胞のための例示的なポリアデニル化配列には、ＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｏｒｙｚａｅＴＡＫＡアミラーゼ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｎｉｇｅｒグルコアミラーゼ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｎｉｄｕｌａｎｓアントラニル酸シンターゼ、Ｆｕｓａｒｉｕｍｏｘｙｓｐｏｒｕｍトリプシン様プロテアーゼ、およびＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｎｉｇｅｒアルファ－グルコシダーゼの遺伝子由来のものが含まれるがこれらに限定されない。酵母宿主細胞のための有用なポリアデニル化配列もまた、当技術分野で公知である（例えば、ＧｕｏａｎｄＳｈｅｒｍａｎ，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，１５：５９８３－５９９０［１９９５］を参照されたい）。

一部の実施形態では、制御配列は、ポリペプチドのアミノ末端に連結されたアミノ酸配列をコードし、コードされたポリペプチドを細胞の分泌経路に仕向ける、シグナルペプチドコード領域である。核酸配列のコード配列の５’末端は、分泌されるポリペプチドをコードするコード領域のセグメントとイン翻訳リーディングフレームで天然に連結されたシグナルペプチドコード領域を固有に含有し得る。あるいは、コード配列の５’末端は、コード配列にとって外来のシグナルペプチドコード領域を含有し得る。

発現されたポリペプチドを選択された宿主細胞の分泌経路に仕向ける任意のシグナルペプチドコード領域は、本明細書で提供される操作されたアミラーゼポリペプチドの発現のために使用される。糸状菌宿主細胞のための有効なシグナルペプチドコード領域には、ＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｏｒｙｚａｅＴＡＫＡアミラーゼ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｎｉｇｅｒ中性アミラーゼ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｎｉｇｅｒグルコアミラーゼ、Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒｍｉｅｈｅｉアスパラギン酸プロテイナーゼ、Ｈｕｍｉｃｏｌａｉｎｓｏｌｅｎｓセルラーゼ、およびＨｕｍｉｃｏｌａｌａｎｕｇｉｎｏｓａプロテアーゼの遺伝子から得られたシグナルペプチドコード領域が含まれるがこれらに限定されない。酵母宿主細胞のための有用なシグナルペプチドには、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅアルファ－因子およびＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅインベルターゼの遺伝子由来のものが含まれるがこれらに限定されない。哺乳動物宿主細胞のための有用なシグナルペプチドには、免疫グロブリンガンマ（ＩｇＧ）の遺伝子由来のものが含まれるがこれらに限定されない。

一部の実施形態では、制御配列は、ポリペプチドのアミノ末端に位置するアミノ酸配列をコードするプロペプチドコード領域である。得られたポリペプチドは、一部の場合には、「プロ酵素」、「プロポリペプチド」、または「酵素原」と呼ばれる。プロポリペプチドは、プロポリペプチドからのプロペプチドの触媒的または自己触媒的切断によって、成熟活性ポリペプチドに変換され得る。

別の態様では、本発明は、操作されたアミラーゼポリペプチドをコードするポリヌクレオチドと、それらが導入される宿主の型に依存した、１個または複数の発現調節領域、例えば、プロモーターおよびターミネーター、複製起点等とを含む、組換え発現ベクターもまた提供する。一部の実施形態では、上記種々の核酸および制御配列は、そのような部位におけるバリアントアミラーゼポリペプチドをコードする核酸配列の挿入または置換を可能にするための１個または複数の簡便な制限部位を含む組換え発現ベクターを産生するために互いに接続される。あるいは、本発明のポリヌクレオチド配列（複数可）は、ポリヌクレオチド配列、またはポリヌクレオチド配列を含む核酸構築物を、発現のための適切なベクターに挿入することによって、発現される。発現ベクターを創出する際に、コード配列が発現のための適切な制御配列と作動可能に連結されるように、コード配列をベクター中に位置させる。

組換え発現ベクターは、組換えＤＮＡ手順に簡便に供することができ、バリアントアミラーゼポリヌクレオチド配列の発現を生じ得る、任意のベクター（例えば、プラスミドまたはウイルス）であり得る。ベクターの選択は、典型的には、ベクターと、ベクターが導入される宿主細胞との適合性に依存する。ベクターは、線状または閉鎖環状プラスミドであり得る。

一部の実施形態では、発現ベクターは、自律的に複製するベクター（すなわち、その複製が染色体複製から独立した染色体外実体として存在するベクター、例えば、プラスミド、染色体外エレメント、ミニ染色体、または人工染色体）である。ベクターは、自己複製を確実にするための任意の手段を含有し得る。一部の代替的実施形態では、ベクターは、宿主細胞中に導入されると、ゲノム中に組み込まれ、それが中に組み込まれた染色体（複数可）と一緒に複製されるベクターであり得る。さらに、合わせると、宿主細胞のゲノム中に導入される総ＤＮＡを含有する単一のベクターもしくはプラスミドまたは２個もしくはそれよりも多くのベクターもしくはプラスミド、あるいはトランスポゾンが使用され得る。

一部の実施形態では、発現ベクターは、好ましくは、形質転換された細胞の容易な選択を可能にする１種または複数の選択可能なマーカーを含有する。

「選択マーカー」とは、その産物が殺生物剤またはウイルス抵抗性、重金属に対する抵抗性、栄養要求株に対する原栄養性などをもたらす遺伝子である。細菌宿主細胞に適するマーカーとしては、これらに限定されないが、カルベニシリン、アンピシリン、クロラムフェニコール、テトラサイクリンＪＤ、カナマイシンおよびゼオシンが挙げられる。

酵母宿主細胞のための適切なマーカーには、ＡＤＥ２、ＨＩＳ３、ＬＥＵ２、ＬＹＳ２、ＭＥＴ３、ＴＲＰ１、およびＵＲＡ３が含まれるがこれらに限定されない。糸状菌宿主細胞における使用のための選択可能なマーカーには、ａｍｄＳ（アセトアミダーゼ）、ａｒｇＢ（オルニチンカルバモイルトランスフェラーゼ）、ｂａｒ（ホスフィノスリシンアセチルトランスフェラーゼ）、ｈｐｈ（ハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ）、ｎｉａＤ（硝酸レダクターゼ）、ｐｙｒＧ（オロチジン－５’－リン酸デカルボキシラーゼ）、ｓＣ（硫酸アデニリルトランスフェラーゼ）、およびｔｒｐＣ（アントラニル酸シンターゼ）、ならびにそれらの等価物が含まれるがこれらに限定されない。別の態様では、本発明は、本出願の少なくとも１種の操作されたアミラーゼポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む宿主細胞を提供し、このポリヌクレオチドは、宿主細胞における操作されたアミラーゼ酵素（複数可）の発現のための１個または複数の制御配列に動作可能に連結されている。

本発明の発現ベクターによってコードされるポリペプチドを発現する際の使用のための宿主細胞は、当技術分野で周知であり、これには、細菌細胞（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ）；真菌細胞、例えば、酵母細胞（例えば、ＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅおよびＰｉｃｈｉａｐａｓｔｏｒｉｓ［例えば、ＡＴＣＣ受託番号２０１１７８］）；昆虫細胞（例えば、ＤｒｏｓｏｐｈｉｌａＳ２およびＳｐｏｄｏｐｔｅｒａＳｆ９細胞）、植物細胞、動物細胞（例えば、ＣＨＯ、ＣＯＳ、およびＢＨＫ）、およびヒト細胞（例えば、ＨＥＫ２９３Ｔ、ヒト線維芽細胞、ＴＨＰ－１、ＪｕｒｋａｔおよびＢｏｗｅｓ黒色腫細胞系）が含まれるがこれらに限定されない。

したがって、別の態様では、本発明は、操作されたアミラーゼポリペプチドを産生するための方法であって、ポリペプチドの発現に適切な条件下で、操作されたアミラーゼポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを発現することが可能な宿主細胞を培養するステップを含む方法を提供する。一部の実施形態では、これらの方法は、本明細書に記載されるアミラーゼポリペプチドを単離および／または精製するステップをさらに含む。

上記宿主細胞のための適切な培養培地および成長条件は、当技術分野で周知である。アミラーゼの発現のためのポリヌクレオチドは、当技術分野で公知の種々の方法によって、細胞中に導入され得る。技法には、とりわけ、電気穿孔、微粒子銃、リポソーム媒介性トランスフェクション、塩化カルシウムトランスフェクション、およびプロトプラスト融合が含まれる。

本明細書に開示される特性を有する操作されたアミラーゼは、天然に存在するかまたは操作されたアミラーゼポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを、当技術分野で公知かつ本明細書に記載される突然変異誘発および／または指向性進化法に供することによって得ることができる。例示的な指向性進化技法は、突然変異誘発および／またはＤＮＡシャッフリングである（例えば、Ｓｔｅｍｍｅｒ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９１：１０７４７－１０７５１［１９９４］、国際公開第９５／２２６２５号、同第９７／００７８号、同第９７／３５９６６号、同第第９８／２７２３０号、同第００／４２６５１号、同第０１／７５７６７号および米国特許第６，５３７，７４６号を参照のこと）。使用され得る他の指向性進化手順としては、とりわけ、互い違い伸長プロセス（ＳｔＥＰ）、ｉｎｖｉｔｒｏ組換え（例えば、Ｚｈａｏｅｔａｌ．，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，１６：２５８－２６１［１９９８］を参照のこと）、突然変異誘発ＰＣＲ（例えば、Ｃａｌｄｗｅｌｌｅｔａｌ．，ＰＣＲＭｅｔｈｏｄｓＡｐｐｌ．，３：Ｓ１３６－Ｓ１４０［１９９４］を参照のこと）、およびカセット突然変異誘発（例えば、Ｂｌａｃｋｅｔａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９３：３５２５－３５２９［１９９６］を参照のこと）が挙げられる。

組換えポリペプチドは、当技術分野で公知の任意の適切な方法を使用して産生され得る。目的の野生型ポリペプチドをコードする遺伝子は、ベクター、例えば、プラスミドにクローニングし、所望の宿主、例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ等において発現させることができる。組換えポリペプチドのバリアントは、当技術分野で公知の種々の方法によって生成することができる。実際、当業者にとって周知の多種多様な異なる突然変異誘発技法が存在する。さらに、多くの分子生物学サプライヤーから突然変異誘発キットを入手することもできる。規定されたアミノ酸における特異的置換（部位指定）、遺伝子の限局された領域における特異的もしくはランダム突然変異（位置特異的）、または遺伝子全体にわたるランダム突然変異誘発（例えば、飽和突然変異誘発）を行う方法が利用できる。ＰＣＲを使用した一本鎖ＤＮＡまたは二本鎖ＤＮＡの部位指定突然変異誘発、カセット突然変異誘発、遺伝子合成、エラープローンＰＣＲ、シャッフリング、および化学的飽和突然変異誘発、または当技術分野で公知の任意の他の適切な方法が含まれるがこれらに限定されない、酵素バリアントを生成するための多数の適切な方法が、当業者にとって公知である。突然変異誘発法および指向性進化法は、発現、スクリーニングおよびアッセイされ得るバリアントライブラリーを生成するために、酵素をコードするポリヌクレオチドに容易に適用され得る。任意の適切な突然変異誘発法および指向性進化法が、本発明において使用され、当技術分野で周知である（例えば、米国特許第５，６０５，７９３号、同第５，８１１，２３８号、同第５，８３０，７２１号、同第５，８３４，２５２号、同第５，８３７，４５８号、同第５，９２８，９０５号、同第６，０９６，５４８号、同第６，１１７，６７９号、同第６，１３２，９７０号、同第６，１６５，７９３号、同第６，１８０，４０６号、同第６，２５１，６７４号、同第６，２６５，２０１号、同第６，２７７，６３８号、同第６，２８７，８６１号、同第６，２８７，８６２号、同第６，２９１，２４２号、同第６，２９７，０５３号、同第６，３０３，３４４号、同第６，３０９，８８３号、同第６，３１９，７１３号、同第６，３１９，７１４号、同第６，３２３，０３０号、同第６，３２６，２０４号、同第６，３３５，１６０号、同第６，３３５，１９８号、同第６，３４４，３５６号、同第６，３５２，８５９号、同第６，３５５，４８４号、同第６，３５８，７４０号、同第６，３５８，７４２号、同第６，３６５，３７７号、同第６，３６５，４０８号、同第６，３６８，８６１号、同第６，３７２，４９７号、同第６，３３７，１８６号、同第６，３７６，２４６号、同第６，３７９，９６４号、同第６，３８７，７０２号、同第６，３９１，５５２号、同第６，３９１，６４０号、同第６，３９５，５４７号、同第６，４０６，８５５号、同第６，４０６，９１０号、同第６，４１３，７４５号、同第６，４１３，７７４号、同第６，４２０，１７５号、同第６，４２３，５４２号、同第６，４２６，２２４号、同第６，４３６，６７５号、同第６，４４４，４６８号、同第６，４５５，２５３号、同第６，４７９，６５２号、同第６，４８２，６４７号、同第６，４８３，０１１号、同第６，４８４，１０５号、同第６，４８９，１４６号、同第６，５００，６１７号、同第６，５００，６３９号、同第６，５０６，６０２号、同第６，５０６，６０３号、同第６，５１８，０６５号、同第６，５１９，０６５号、同第６，５２１，４５３号、同第６，５２８，３１１号、同第６，５３７，７４６号、同第６，５７３，０９８号、同第６，５７６，４６７号、同第６，５７９，６７８号、同第６，５８６，１８２号、同第６，６０２，９８６号、同第６，６０５，４３０号、同第６，６１３，５１４号、同第６，６５３，０７２号、同第６，６８６，５１５号、同第６，７０３，２４０号、同第６，７１６，６３１号、同第６，８２５，００１号、同第６，９０２，９２２号、同第６，９１７，８８２号、同第６，９４６，２９６号、同第６，９６１，６６４号、同第６，９９５，０１７号、同第７，０２４，３１２号、同第７，０５８，５１５号、同第７，１０５，２９７号、同第７，１４８，０５４号、同第７，２２０，５６６号、同第７，２８８，３７５号、同第７，３８４，３８７号、同第７，４２１，３４７号、同第７，４３０，４７７号、同第７，４６２，４６９号、同第７，５３４，５６４号、同第７，６２０，５００号、同第７，６２０，５０２号、同第７，６２９，１７０号、同第７，７０２，４６４号、同第７，７４７，３９１号、同第７，７４７，３９３号、同第７，７５１，９８６号、同第７，７７６，５９８号、同第７，７８３，４２８号、同第７，７９５，０３０号、同第７，８５３，４１０号、同第７，８６８，１３８号、同第７，７８３，４２８号、同第７，８７３，４７７号、同第７，８７３，４９９号、同第７，９０４，２４９号、同第７，９５７，９１２号、同第７，９８１，６１４号、同第８，０１４，９６１号、同第８，０２９，９８８号、同第８，０４８，６７４号、同第８，０５８，００１号、同第８，０７６，１３８号、同第８，１０８，１５０号、同第８，１７０，８０６号、同第８，２２４，５８０号、同第８，３７７，６８１号、同第８，３８３，３４６号、同第８，４５７，９０３号、同第８，５０４，４９８号、同第８，５８９，０８５号、同第８，７６２，０６６号、同第８，７６８，８７１号、同第８，８４９，５７５号、同第９，５９３，３２６号、同第９，６６５，６９４号、同第９，６８４，７７１号、同第９，８６４，８３３号、同第９，９９６，６６１号、ならびに全ての関連の米国、ならびにＰＣＴおよび非米国対応物；Ｌｉｎｇｅｔａｌ．，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，２５４（２）：１５７－７８［１９９７］；Ｄａｌｅｅｔａｌ．，Ｍｅｔｈ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，５７：３６９－７４［１９９６］；Ｓｍｉｔｈ，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｇｅｎｅｔ．，１９：４２３－４６２［１９８５］；Ｂｏｔｓｔｅｉｎｅｔａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２２９：１１９３－１２０１［１９８５］；Ｃａｒｔｅｒ，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．，２３７：１－７［１９８６］；Ｋｒａｍｅｒｅｔａｌ．，Ｃｅｌｌ，３８：８７９－８８７［１９８４］；Ｗｅｌｌｓｅｔａｌ．，Ｇｅｎｅ，３４：３１５－３２３［１９８５］；Ｍｉｎｓｈｕｌｌｅｔａｌ．，Ｃｕｒｒ．Ｏｐ．Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．，３：２８４－２９０［１９９９］；Ｃｈｒｉｓｔｉａｎｓｅｔａｌ．，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，１７：２５９－２６４［１９９９］；Ｃｒａｍｅｒｉｅｔａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３９１：２８８－２９１［１９９８］；Ｃｒａｍｅｒｉ，ｅｔａｌ．，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，１５：４３６－４３８［１９９７］；Ｚｈａｎｇｅｔａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，９４：４５０４－４５０９［１９９７］；Ｃｒａｍｅｒｉｅｔａｌ．，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，１４：３１５－３１９［１９９６］；Ｓｔｅｍｍｅｒ，Ｎａｔｕｒｅ，３７０：３８９－３９１［１９９４］；Ｓｔｅｍｍｅｒ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９１：１０７４７－１０７５１［１９９４］；ＷＯ９５／２２６２５；ＷＯ９７／００７８；ＷＯ９７／３５９６６；ＷＯ９８／２７２３０；ＷＯ００／４２６５１；ＷＯ０１／７５７６７；およびＷＯ２００９／１５２３３６を参照されたい。これらは全て、これにより参照により本明細書に組み込まれる）。

一部の実施形態では、突然変異誘発処理後に得られた酵素バリアントは、酵素バリアントを規定された温度（または他のアッセイ条件）に供し、熱処理または他のアッセイ条件後に残存する酵素活性の量を測定することによってスクリーニングされる。次いで、アミラーゼポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有するＤＮＡが、宿主細胞から単離され、ヌクレオチド配列変化（存在する場合）を同定するために配列決定され、異なるまたは同じ宿主細胞において酵素を発現するために使用される。発現ライブラリーからの酵素活性を測定することは、当技術分野で公知の任意の適切な方法（例えば、標準的な生化学の技法、例えば、ＨＰＬＣ解析）を使用して実施され得る。

公知の配列の操作されたポリペプチドの場合、酵素をコードするポリヌクレオチドは、公知の合成法に従って、標準的な固相法によって調製することができる。一部の実施形態では、最大約１００塩基の断片が個々に合成され、次いで接合されて（例えば、酵素もしくは化学ライゲーション法、またはポリメラーゼ媒介法によって）、任意の所望の連続的配列を形成することができる。例えば、本明細書に開示されるポリヌクレオチドおよびオリゴヌクレオチドは、典型的には自動合成法において実施される、古典的なホスホロアミダイト法を使用する化学合成（例えば、Ｂｅａｕｃａｇｅｅｔａｌ．，Ｔｅｔｒａ．Ｌｅｔｔ．，１９８１，２２：１８５９－６９、およびＭａｔｔｈｅｓｅｔａｌ．，ＥＭＢＯＪ．，１９８４，３：８０１－０５を参照のこと）によって調製することができる。ホスホロアミダイト法において、オリゴヌクレオチドは、合成され（例えば、自動ＤＮＡ合成装置において）、精製され、アニーリングされ、ライゲートされ、適切なベクターにクローニングされる。しかしながら、いかなる適する方法も本発明における用途が見出されているため、本発明は、ポリヌクレオチドおよびオリゴヌクレオチドの作製のための任意の特定の方法に限定されることを意図されていない。

したがって、一部の実施形態では、操作されたアミラーゼポリペプチドを調製するための方法は、（ａ）表４－１、４－２、４－３、４－４、４－５、４－６、４－７、４－８、４－９、４－１０、４－１１、４－１２、４－１３および／または４－１４に提供される任意のバリアントのアミノ酸配列；表４－１、４－２、４－３、４－４、４－５、４－６、４－７、４－８、４－９、４－１０、４－１１、４－１２、４－１３および／または４－１４に提供される任意のバリアントであって、ヒスチジンタグおよびその前にあるアミノ酸リンカーを欠く、バリアント；ならびに配列番号２、１８、４０、１５６、１７４、２７６、３０８、４２２、４５６、５４６、６３２、６６４、７８０、９８８、１１０４、１１２２、１２２４、１２５６、１３７０、１４０４、１４９４、１５８０、１６１２および／または１７２８；配列番号４～１８、２２～９６６および９７０～１９１４のうち偶数番号のポリペプチド配列のいずれかから選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを合成するステップと、（ｂ）ポリヌクレオチドによってコードされるアミラーゼポリペプチドを発現するステップとを含み得る。方法の一部の実施形態では、ポリヌクレオチドによってコードされるアミノ酸配列は、１個またはいくつか（例えば、最大３、４、５もしくは最大１０個）のアミノ酸残基欠失、挿入および／または置換を含む。一部のさらなる実施形態では、アミノ酸配列は、１～２、１～３、１～４、１～５、１～６、１～７、１～８、１～９、１～１０、１～１５、１～２０、１～２１、１～２２、１～２３、１～２４、１～２５、１～３０、１～３５、１～４０、１～４５または１～５０個のアミノ酸残基欠失、挿入および／または置換を含む。さらなる一部の他の実施形態では、アミノ酸配列は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、３０、３１、３２、３３、３４、３５、４０、４５または５０個のアミノ酸残基欠失、挿入および／または置換を含む。一部の実施形態では、アミノ酸配列は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１８、２０、２１、２２、２３、２４または２５個のアミノ酸残基欠失、挿入および／または置換を含む。一部の実施形態では、置換は保存的または非保存的置換である。

発現した操作されたアミラーゼポリペプチドは、本明細書に記載されるアッセイおよび条件を含むがこれらに限定されない当技術分野で公知の任意の適するアッセイを使用して、任意の所望の改善された特性（例えば、活性、選択性、安定性、酸耐性、プロテアーゼ感受性など）について評価することができる。

一部の実施形態では、宿主細胞において発現した操作されたアミラーゼポリペプチドのいずれかは、とりわけ、リゾチーム処理、超音波処理、濾過、塩析、熱処理、超遠心分離およびクロマトグラフィーを含む、タンパク質精製のための周知の技法のうちの任意の１つまたは複数を使用して、細胞および／または培養培地から回収される。

アミラーゼポリペプチドの単離のためのクロマトグラフィー技法としては、とりわけ、逆相クロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、ゲル電気泳動および親和性クロマトグラフィーが挙げられる。特定の酵素を精製するための条件は、部分的には、例えば正味電荷、疎水性、親水性、分子量、分子形状などの因子に依存し、当業者には明らかだろう。一部の実施形態では、親和性技法が、改善された改変アミラーゼ酵素を単離するために使用され得る。親和性クロマトグラフィー精製を利用する一部の実施形態では、改変アミラーゼポリペプチドと特異的に結合するいかなる抗体も用途が見出されている。

親和性クロマトグラフィー精製を利用する一部の実施形態では、アミラーゼに共有結合したグリカンに結合するタンパク質は用途が見出されている。親和性クロマトグラフィー精製を利用するさらに他の実施形態では、アミラーゼ活性部位に結合するいかなる低分子も用途が見出されている。抗体の作製の場合、ウサギ、マウス、ラットなどを含むがこれらに限定されない様々な宿主動物は、ポリペプチド（例えば、アミラーゼバリアント）またはその断片の注射によって免疫化される。一部の実施形態では、アミラーゼポリペプチドまたは断片は、側鎖官能基または側鎖官能基に結合したリンカーによって、ＢＳＡなどの適する担体に結合する。

一部の実施形態では、操作されたアミラーゼポリペプチドは、本明細書に記載される操作されたアミラーゼポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含む宿主細胞（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｄａｕｃｕｓｃａｒｏｔａ、Ｎｉｃｏｔｉａｎａｔａｂａｃｕｍ、Ｈ．ｓａｐｉｅｎｓ（例えば、ＨＥＫ２９３Ｔ）、またはＣｒｉｃｅｔｕｌｕｓｇｒｉｓｅｕｓ（例えば、ＣＨＯ））を、操作されたアミラーゼポリペプチドの産生に資する条件下で培養するステップと、操作されたアミラーゼポリペプチドを細胞および／または培養培地から回収するステップとを含む方法によって、宿主細胞において産生される。

一部の実施形態では、本発明は、操作されたアミラーゼポリペプチドを産生する方法であって、参照配列（例えば、配列番号２、１８、４０、１５６、１７４、２７６、３０８、４２２、４５６、５４６、６３２、６６４、７８０、９８８、１１０４、１１２２、１２２４、１２５６、１３７０、１４０４、１４９４、１５８０、１６１２および／または１７２８）に対して少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％配列同一性、ならびに配列番号２、１８、４０、１５６、１７４、２７６、３０８、４２２、４５６、５４６、６３２、６６４、７８０、９８８、１１０４、１１２２、１２２４、１２５６、１３７０、１４０４、１４９４、１５８０、１６１２および／または１７２８のアミノ酸配列と最適にアラインメントした場合における、配列番号２、１８、４０、１５６、１７４、２７６、３０８、４２２、４５６、５４６、６３２、６６４、７８０、９８８、１１０４、１１２２、１２２４、１２５６、１３７０、１４０４、１４９４、１５８０、１６１２および／または１７２８と比較した、表４－１、４－２、４－３、４－４、４－５、４－６、４－７、４－８、４－９、４－１０、４－１１、４－１２、４－１３および／もしくは４－１４に提供されるものならびに／またはそれらの組合せから選択される１個または複数のアミノ酸残基差異を有する操作されたアミラーゼポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含む組換え真核細胞を、操作されたアミラーゼポリペプチドの産生を可能にするのに適する培養条件下で培養するステップと、必要に応じて、操作されたアミラーゼポリペプチドを培養および／または培養細菌細胞から回収するステップとを含む、方法を包含する。

一部の実施形態では、操作されたポリペプチドは、組換え宿主細胞または細胞培養培地から回収した後、当技術分野で公知の任意の適する方法によってさらに精製される。一部の追加の実施形態では、精製されたアミラーゼポリペプチドは、種々の適用および用途に適切な操作されたアミラーゼポリペプチドを含む組成物および製剤（例えば、医薬組成物）を提供するために、他の成分および化合物と組み合わされる。一部の追加の実施形態では、精製されたポリペプチドまたは製剤化されたアミラーゼポリペプチドは凍結乾燥される。
組成物

本発明は、以下に記載されるものを含むがこれらに限定されない様々な組成物およびフォーマットを提供する。一部の実施形態では、本発明は、医薬組成物、ならびに栄養補給食品および／または栄養補助食品などの他の組成物における使用に適する操作されたアミラーゼポリペプチドを提供する。

投与様式に応じて、治療有効量の本発明による操作されたアミラーゼを含むこれらの組成物は、固体、半固体または液体の形態である。一部の実施形態では、組成物は、希釈剤、緩衝液、賦形剤、塩、乳化剤、保存剤、安定剤、充填剤、および他の成分などの他の薬学的に許容される構成成分を含む。製剤化および投与の技法に関する詳細は、当技術分野で周知であり、文献に記載されている。

一部の実施形態では、操作されたアミラーゼポリペプチドは、医薬組成物における使用のために製剤化される。操作されたアミラーゼポリペプチドの送達における使用に適する任意のフォーマットは、本発明における用途が見出されており、これらに限定されないが、丸剤、錠剤、ゲルタブ、カプセル剤、ロゼンジ剤、糖衣錠、散剤、軟ゲル、ゾル－ゲル、ゲル、エマルション、埋込剤、貼付剤、噴霧剤、軟膏剤、リニメント剤、クリーム剤、ペースト剤、ゼリー剤、塗布剤、エアロゾル剤、チューインガム剤、粘滑剤、スティック剤、溶液、懸濁剤（油系懸濁剤、水中油型エマルションなどを含むがこれらに限定されない）、スラリー、シロップ剤、放出制御型製剤、坐剤などが挙げられる。一部の実施形態では、操作されたアミラーゼポリペプチドは、注射または注入に適するフォーマットにおいて（すなわち、注射用製剤において）提供される。一部の実施形態では、操作されたアミラーゼポリペプチドは、シリカ系（例えば、オキシシラン）ゾル－ゲルを含むゾル－ゲルなどの生体適合性マトリックスにおいて提供される。一部の実施形態では、操作されたアミラーゼポリペプチドは、封入および／または腸溶コーティングされる。一部の代替的な実施形態では、操作されたアミラーゼポリペプチドは、ナノ構造体（例えば、ナノチューブ、ナノチューブ、ナノカプセル、またはマイクロカプセル、マイクロスフェア、リポソームなど）に封入される。実際、本発明は、任意の特定の送達製剤および／または送達手段に限定されることを意図されていない。操作されたアミラーゼポリペプチドは、非経口、経口、局所、経皮、鼻腔内、眼内、髄腔内、埋込剤などを含むがこれらに限定されない、当技術分野で公知の任意の適する手段によって投与されることが意図されている。

一部の実施形態では、操作されたアミラーゼポリペプチドは、グリコシル化、化学架橋試薬、ペグ化（すなわち、ポリエチレングリコール［ＰＥＧ］もしくは活性化ＰＥＧなどを用いる修飾）、または他の化合物によって化学修飾される（例えば、Ｉｋｅｄａ，ＡｍｉｎｏＡｃｉｄｓ，２００５，２９：２８３－２８７、米国特許第７，５３１，３４１号、同第７，５３４，５９５号、同第７，５６０，２６３号および同第７，５５３，６５３号、米国特許出願公開第２０１３／００３９８９８号、同第２０１２／０１７７７２２号などを参照のこと）。実際、本発明は、任意の特定の送達法および／または機構に限定されることを意図されていない。

一部の追加の実施形態では、操作されたアミラーゼポリペプチドは、マトリックス安定化酵素結晶を含む製剤において提供される。一部の実施形態では、製剤は、操作されたアミラーゼの架橋結晶酵素と、酵素結晶に付着する反応性部分を有するポリマーとを含む。本発明はまた、ポリマーにおける操作されたアミラーゼポリペプチドを提供する。

一部の実施形態では、本発明の操作されたアミラーゼポリペプチドを含む組成物は、糖（例えば、ラクトース、スクロース、マンニトールおよび／もしくはソルビトール）、デンプン（例えば、トウモロコシ、コムギ、イネ、ジャガイモもしくは他の植物デンプン）、セルロース（例えば、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム）、ガム（例えば、アラビア、トラガカント、グアーなど）、ならびに／またはタンパク質（例えば、ゼラチン、コラーゲンなど）を含むがこれらに限定されない１種または複数の一般的に使用される担体化合物を含む。

一部の実施形態では、操作されたアミラーゼポリペプチドは、食事性デンプン消化を改善するための使用に適している。一部のさらなる実施形態では、操作されたアミラーゼポリペプチドは、食物または飼料の消費前に食物および飼料中のデンプンを分解することにおける用途が見出されている。投与される操作されたアミラーゼポリペプチドの投薬量は、状態または疾患、対象の全身状態および当業者に公知の他の因子に依存する。一部の実施形態では、組成物は、単回または多回投与が意図されている。一部の実施形態では、膵機能不全疾患を有するヒトに投与される組成物における操作されたアミラーゼポリペプチドの濃度は、疾患（例えば、膵機能不全疾患）を効果的に処置および／または軽快するのに十分であることが企図される。一部の実施形態では、例えば組成物として製剤化される本開示の１種または複数の操作されたアミラーゼポリペプチドは、膵機能不全疾患を有するヒトに、疾患、例えば膵機能不全疾患を効果的に処置および／または軽快するのに十分な量で投与される。一部の実施形態では、操作されたアミラーゼポリペプチドは、他の医薬組成物および／または食品組成物と組み合わせて投与される。一部の実施形態では、操作されたアミラーゼポリペプチドは、膵酵素機能不全などの疾患の処置のためのリパーゼおよび／またはプロテアーゼなどの他の酵素との組合せにおいて用途が見出されている。一部の実施形態では、処置のための対象は、非ヒト哺乳動物、例えば、これらに限定されないが、非ヒト霊長類、ブタ、ウシ、イヌおよびネコである。

一部の実施形態では、操作されたリパーゼポリペプチドは、他の医薬組成物および／または食品組成物、例えば、これらに限定されないが、栄養補給食品、機能性食品などと組み合わせて投与される。いかなる適する方法および／または形態も用途が見出されているため、本発明は、投与の任意の特定の方法にも形態にも限定されることを意図されていない。

実験および達成される結果を含む以下の実施例は、例示的な目的としてのみ提供され、本発明を限定するものと解釈されるべきではない。以下の実験の開示では、以下の略記が適用される：ｐｐｍ（百万分率）；Ｍ（モル濃度）；ｍＭ（ミリモル濃度）、ｕＭおよびμＭ（マイクロモル濃度）；ｎＭ（ナノモル濃度）；ｍｏｌ（モル）；ｇｍおよびｇ（グラム）；ｍｇ（ミリグラム）；ｕｇおよびμｇ（マイクログラム）；Ｌおよびｌ（リットル）；ｍｌおよびｍＬ（ミリリットル）；ｃｍ（センチメートル）；ｍｍ（ミリメートル）；ｕｍおよびμｍ（マイクロメートル）；ｓｅｃ．（秒）；ｍｉｎ（分）；ｈおよびｈｒ（時間）；ｋＤａ（キロダルトン）；Ｕ（単位）；ＭＷ（分子量）；ｒｐｍ（回転毎分）；℃（摂氏度）；ＣＤＳ（コード配列）；ＤＮＡ（デオキシリボ核酸）；ＲＮＡ（リボ核酸）；Ｅ．ｃｏｌｉＷ３１１０（ＣｏｌｉＧｅｎｅｔｉｃＳｔｏｃｋＣｅｎｔｅｒ［ＣＧＳＣ］、ＮｅｗＨａｖｅｎ、ＣＴから入手可能な一般的に使用される実験用Ｅ．ｃｏｌｉ株）；ＥＰＩ（膵外分泌機能不全）；エチリデン－ｐＮＰ－Ｇ７（エチリデン－４－ニトロフェニル－アルファ－Ｄ－マルトヘプタオシド）；ｂｔＬＩＰ（Ｂ．ｔｈｅｒｍｏａｍｙｌｏｖｏｒａｎｓリパーゼ）；ＨＰＬＣ（高圧液体クロマトグラフィー）；ｍｓ（質量分析または質量分析法）；ＳＤＳ－ＰＡＧＥ（ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動）；ＰＢＳ（リン酸緩衝食塩水）；ＰＥＳ（ポリエーテルスルホン）；ＡＣＮ（アセトニトリル）；ＤＮＳＡ（ジニトロサリチル酸）；ＩＰＡ（イソプロピルアルコール）；ＩＰＴＧ（イソプロピルβ－Ｄ－１－チオガラクトピラノシド）；ＰＭＢＳ（硫酸ポリミキシンＢ）；ＮＡＤＰＨ（ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸）；ＬＢ（ルリア培地）；ＭｅＯＨ（メタノール）；ＦＩＯＰＣおよびＦＩＯＰ（陽性対照に対する向上倍率）；ＨＴＰ（ハイスループット）；ＣＡＶ（セル加速電圧；衝突セル加速電圧）；ＣＥ（衝突エネルギー）；ＲＦ（高周波）；ＮＥＢ（ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄＢｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．、Ｉｐｓｗｉｃｈ、ＭＡ）；Ｂｉｏｒａｄ（Ｂｉｏ－ＲａｄＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ）；Ｇｒｅｉｎｅｒ（ＧｒｅｉｎｅｒＢｉｏ－ＯｎｅＮｏｒｔｈＡｍｅｒｉｃａ，Ｉｎｃ．、Ｍｏｎｒｏｅ、ＮＣ）；ＧＥＨｅａｌｔｈｃａｒｅ（ＧＥＨｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ｃｈｉｃａｇｏ、ＩＬ）；Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）；ＰａｌｌＣｏｒｐ．（Ｐａｌｌ，Ｃｏｒｐ．、Ｐｔ．Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ、ＮＹ）；Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｃｏｒｐ．、ＢｉｌｌｅｒｉｃａＭＡ）；Ｄｉｆｃｏ（ＤｉｆｃｏＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、ＢＤＤｉａｇｎｏｓｔｉｃＳｙｓｔｅｍｓ、Ｄｅｔｒｏｉｔ、ＭＩ）；ＭｏｌｅｃｕｌａｒＤｅｖｉｃｅｓ（ＭｏｌｅｃｕｌａｒＤｅｖｉｃｅｓ，ＬＬＣ、Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ、ＣＡ）；Ｋｕｈｎｅｒ（ＡｄｏｌｆＫｕｈｎｅｒ，ＡＧ、Ｂａｓｅｌ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）；ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｃｏｒｐ．、ＧｒａｎｄＩｓｌａｎｄ、ＮＹの一部であるＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）、Ａｇｉｌｅｎｔ（ＡｇｉｌｅｎｔＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．、ＳａｎｔａＣｌａｒａ、ＣＡ）；ＲＡＰＩＤＦＩＲＥ（登録商標）ＭＳ（ＲＡＰＩＤＦＩＲＥ（登録商標）質量分析計、Ａｇｉｌｅｎｔ）；ＴｈｅｒｍｏＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡの一部）；Ｇｉｂｃｏ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）；Ｐｉｅｒｃｅ（ＰｉｅｒｃｅＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（現在、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃの一部）、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ）；ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）；Ｃｏｒｎｉｎｇ（Ｃｏｒｎｉｎｇ，Ｉｎｃ．、ＰａｌｏＡｌｔｏ、ＣＡ）；ならびにＢｉｏ－Ｒａｄ（Ｂｉｏ－ＲａｄＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ）。
（実施例１）
アミラーゼ遺伝子の取得および発現ベクターの構築

表１－１に列挙される様々な生物由来の細菌アミラーゼをコードするＤＮＡ配列を、Ｅ．ｃｏｌｉにおける発現のためにコドン最適化し、Ｅ．ｃｏｌｉ発現ベクターｐＣＫ１１０９００ベクター系にクローニングした（例えば、これらの全てがこれにより参照により本明細書に組み込まれる米国特許第７，６２９，１５７号および同第９，７１４，４３７号、ならびに米国特許出願公開第２００６／０１９５９４７号を参照のこと）。プラスミド構築物を、Ｗ３１１０に由来するＥ．ｃｏｌｉ株に形質転換した。アミラーゼ遺伝子を含有するＥ．ｃｏｌｉ株を、実施例３に記載するように、９６ウェルまたは振盪フラスコフォーマットのいずれかにおいて増殖させ、アミラーゼ活性についてアッセイした。これらのアミラーゼから得られた活性を表１－１に示す。

（実施例２）
操作されたアミラーゼバリアントの発現および構築

表１－１に示した結果に基づいて、配列番号２からのアミラーゼをＣ末端６×Ｈｉｓタグと共にｐＪＶ１１０９００ベクター系にサブクローニングして（例えば、これにより参照により本明細書に組み込まれる米国特許出願公開第２０１７／２１３７５８号を参照のこと）、配列番号１８を生成した。しかしながら、本発明は、任意の特定のベクターに限定されることを意図されていない。プラスミド構築物を、Ｗ３１１０に由来するＥ．ｃｏｌｉ株に形質転換した。当業者に一般に公知の指向性進化技法を使用して、このプラスミド構築物由来の遺伝子バリアント（例えば、米国特許第８，３８３，３４６号および国際公開第２０１０／１４４１０３号を参照のこと）ならびにその誘導体のライブラリーを作成した。
（実施例３）
アミラーゼバリアントのハイスループット（ＨＴＰ）増殖およびスクリーニング条件

本発明のアミラーゼを産生する細胞を増殖させるために使用した方法、およびアミラーゼを特徴付けるスクリーニング方法をこの実施例において提供する。
Ｅ．ｃｏｌｉアミラーゼおよび改変アミラーゼのハイスループット（ＨＴＰ）増殖

形質転換したＥ．ｃｏｌｉ細胞を、選択剤を加えた１％グルコースを含有するＬＢ寒天プレートにプレーティングすることによって選択した。３７℃での一晩のインキュベーション後、コロニーを、１％グルコースおよび選択マーカーを補充した１８０μｌ／ウェルのＬＢを充填した９６ウェル浅平底プレート（ＮＵＮＣ（商標）、Ｔｈｅｒｍｏ－Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）のウェルに入れた。培養を振盪インキュベーター（２００ｒｐｍ、３０℃および８５％相対湿度；Ｋｕｈｎｅｒ）において１８～２０時間にわたって一晩増殖させた。

一晩増殖試料（２０μＬ）を、選択化合物（例えば、クロラムフェニコール）を補充した３８０μＬのＴｅｒｒｉｆｉｃＢｒｏｔｈを充填したＣＯＳＴＡＲ（登録商標）９６ウェル深底プレートに移した。プレートを振盪インキュベーター（２５０ｒｐｍ、３０℃および８５％相対湿度；Ｋｕｈｎｅｒ）において１３５分間インキュベートした。次いで、アミラーゼバリアントの発現を、４０μＬの滅菌水中１０ｍＭＩＰＴＧを用いて誘導し、培養を振盪インキュベーター（２５０ｒｐｍ、３０℃および８５％相対湿度；Ｋｕｈｎｅｒ）において２０～２４時間にわたって一晩インキュベートした。細胞を遠心分離（４０００ｒｐｍ×２０分）によってペレット化し、上清を廃棄し、細胞を－８０℃で凍結させた後に分析した。
ＨＴＰペレットの溶解

初めに、２００～４００μＬの溶解緩衝液（１×ＰＢＳ、１ｍｇ／ｍｌリゾチーム、０．５ｍｇ／ｍｌ硫酸ポリミキシンＢおよび．１Ｕ／ｍＬＤＮＡｓｅＩ（ＮＥＢ）を細胞ペレットに添加した。細胞ペレットおよび緩衝液を室温で１．５～２時間穏やかに振盪し、遠心分離（４０００ｒｐｍ×１５分）した後、清澄化溶解液を本明細書に記載される様々なＨＴＰアッセイにおいて使用した。これらの溶解液のＳＤＳ－ＰＡＧＥによる分析は、５７ｋＤａの見かけのＭＷにおける過剰発現タンパク質バンドの存在を明らかにし、これは目的のアミラーゼの予期されたＭＷと矛盾しなかった。一部の追加の実験では、ＰＢＳ緩衝液を用いて清澄化溶解液の追加の希釈を実施した後にチャレンジおよび分析を行った。
清澄化溶解液または精製タンパク質のアミラーゼ活性についての分析

可溶性デンプンを基質として使用し、ジニトロサリチル酸（ＤＮＳＡ）を使用してデンプン加水分解から生成されたマルトースを定量することによって、アミラーゼ活性を評価した。デンプン溶液を、１０ｍｇ／ｍＬジャガイモデンプンをアッセイ緩衝液（２０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液ｐＨ６．９＋６．７ｍＭＮａＣｌ、または１００ｍＭＮａＰＯ_４ｐＨ６．０～７．０）において混合することによって調製した。デンプンを溶解するために、溶液を撹拌板上で沸騰直前まで加熱し、次いで室温まで冷却した。ＤＮＳＡ溶液を作製するために、２０ｍｌの水中９６ｍＭＤＮＳＡを、２ＮＮａＯＨ中１２ｍｌの水および８ｍｌの５．３Ｍ酒石酸ナトリウムカリウム四水和物に、ホットプレート（７０～８０℃）上で混合しながら滴加し、ＤＮＳＡ溶液を室温まで冷却した後、使用した。アミラーゼ活性反応を起こすために、デンプン基質溶液を希釈酵素と２：１でＰＣＲプレート（ＢｉｏＲａｄ）において混合し、３７℃で３０分間インキュベートした。次いで、反応をＤＮＳＡ溶液と１：１で混合し、サーモサイクラーにおいて９５℃で１５分間インキュベートした。試料をアッセイ緩衝液に２倍に希釈し、ＵＶ－ＳＴＡＲ（登録商標）平底プレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ）に移し、次いでＭｏｌｅｃｕｌａｒＤｅｖｉｃｅｓＳＰＥＣＴＲＡＭＡＸ（登録商標）Ｍ２プレートリーダーにおいて５４０ｎｍの吸光度を読み取った。一部の実験では、試料がアッセイを飽和しなかったことを保証するために、試料を所定の希釈率（最大５１２倍）に基づいてＰＢＳ緩衝液に希釈した後に分析した。
清澄化溶解液または精製タンパク質のアミラーゼ活性についての分析の代替法

一部の実験では、アミラーゼ活性は、エチリデンｐＮＰ－Ｇ７を基質として使用し、Ａ４０５の吸光度をモニタリングして、放出されるｐ－ニトロフェノールをモニタリングすることによって評価した。このアッセイは、アミラーゼ活性アッセイキット（Ｓｉｇｍａ）を使用して実施した。このアッセイでは、５０ｕｌのチャレンジされる希釈アミラーゼバリアントを５０ｕｌの提供したアッセイ緩衝液および５０ｕｌの提供したエチリデンｐＮＰ－Ｇ７基質溶液に添加した。４０５ｎｍの吸光度を１５分間モニタリングし、代表的な時点の吸光度をその後の分析のために使用した。
熱チャレンジにより前処理した清澄化溶解液または精製タンパク質のＨＴＰ分析

バリアントの熱安定性を評価するために、清澄化溶解液をＰＣＲプレート（Ｂｉｏｒａｄ）に移し、サーモサイクラーにおいて４０～６０℃で１時間インキュベートした。インキュベーション後、試料を遠心分離して熱沈殿タンパク質をペレット化し、上清をアミラーゼ残存活性について、本明細書に記載されるように分析した。
低ｐＨおよびペプシンにより前処理した清澄化溶解液または精製タンパク質のＨＴＰ分析

アミラーゼバリアントの活性を、胃内環境を模倣するペプシンの存在下の低ｐＨでのプレインキュベーション後に決定した。初めに、清澄化溶解液を、ＰＢＳ緩衝液に０倍～３２倍に希釈し、次いで、２．３～３．５の最終チャレンジｐＨおよび１．５ｍｇ／ｍｌの最終ペプシン濃度のために、ＭｃＩｌｖａｉｎｅ緩衝液ｐＨ２．３～３．５＋３．０ｍｇ／ｍＬのブタ胃粘膜由来ペプシン（Ｓｉｇｍａ）と１：１でＰＣＲプレート（Ｂｉｏｒａｄ）において混合した。試料を混合し、次いで、３７℃で１～２時間インキュベートした。チャレンジを停止するために、試料を４００ｍＭＮａＰＯ_４、ｐＨ７．０と１：１で混合して、ｐＨを中性にし、ペプシンを不活性化した。次いで、中和されたチャレンジ試料を残存アミラーゼ活性について、本明細書に記載されるように分析した。
腸プロテアーゼとのインキュベーション後のアミラーゼ活性のＨＴＰ評価

バリアントの活性を、腸内環境を模倣するタウロコール酸ナトリウムおよび腸プロテアーゼの存在下の中性ｐＨでのプレインキュベーション後に決定した。清澄化溶解液を、０～５ｍＭタウロコール酸ナトリウムの最終濃度および各チャレンジ用腸プロテアーゼの１．５ｍｇ／ｍｌの最終濃度のために、０～１０ｍＭタウロコール酸ナトリウム、３ｍｇ／ｍｌのブタ膵臓由来トリプシンおよび３ｍｇ／ｍｌのウシ膵臓由来キモトリプシンを含有する１００ｍＭＮａＰＯ_４、ｐＨ７．０またはＰＢＳと１：１でＰＣＲプレート（ＢｉｏＲａｄ）において混合した。混合物をサーモサイクラーにおいて３７℃で１～２時間インキュベートした。次いで、試料を残存アミラーゼ活性について、本明細書に記載されるように分析した。
操作されたプロテアーゼとのインキュベーション後のアミラーゼ活性のＨＴＰ評価

アミラーゼバリアントの活性を、操作されたトリプシン様プロテアーゼ（配列番号２０）の存在下の中性ｐＨでのプレインキュベーション後に決定した。清澄化溶解液を、チャレンジにおける１．５ｍｇ／ｍｌのプロテアーゼの最終濃度のために、３ｍｇ／ｍｌの配列番号２０の凍結乾燥粉末を含有するＰＢＳと１：１でＰＣＲプレート（ＢｉｏＲａｄ）において混合した。混合物をサーモサイクラーにおいて３７℃で１～２時間インキュベートした。次いで、試料を残存アミラーゼ活性について、本明細書に記載されるように分析した。
複数の連続チャレンジの後のアミラーゼ活性のＨＴＰ評価

２つの安定性特徴を同時に検討していた場合は、複数のチャレンジスクリーニングを連続させて組み合わせた。例えば、一部の実験では、１時間の熱チャレンジに続いて１時間のｐＨおよびペプシンチャレンジを行い、次いで１時間の腸的チャレンジを行った。腸的チャレンジが胃的チャレンジに続く場合、腸的チャレンジが胃的チャレンジの中和後に直ちに開始されるように、チャレンジ用腸プロテアーゼを胃的チャレンジのための中和緩衝液に溶解した。これは「連続チャレンジ」として表される。連続チャレンジの後、試料を残存アミラーゼ活性について、本明細書に記載されるように分析した。
アミラーゼバリアントの振盪フラスコでの発現、精製および特徴付け

操作されたアミラーゼをコードするプラスミドを含有するＥ．ｃｏｌｉの単一コロニーを、１％グルコースおよび選択マーカーを含有する５ｍＬのルリア・ベルターニ培地に播種した。細胞を、３０℃のインキュベーターにおいて２５０ｒｐｍで振盪しながら一晩（少なくとも１６時間）増殖させた。培養を、１リットルフラスコにおいて、選択剤を加えた２５０ｍＬのＴｅｒｒｉｆｉｃＢｒｏｔｈ（１２ｇ／Ｌバクトトリプトン、２４ｇ／Ｌ酵母抽出物、４ｍＬ／Ｌグリセロール、６５ｍＭリン酸カリウム、ｐＨ７、１ｍＭＭｇＳＯ_４）に希釈し、３０℃で増殖させた。培養のＯＤ６００が０．６～０．８に達した場合、１ｍＭの最終濃度までのＩＰＴＧの添加によってアミラーゼ遺伝子の発現を誘導した。次いで、インキュベーション一晩（少なくとも１６時間）継続した。細胞を遠心分離（５０００ｒｐｍ、１５分、４℃）によって回収し、上清を廃棄した。細胞を、１５０ｍＭＮａＣｌを含有する４０～５０ｍｌのＰＢＳに再懸濁し、標準的なＥ．ｃｏｌｉ溶解設定を用いたＭＩＣＲＯＦＬＵＤＩＺＥＲ（登録商標）高圧ホモジナイザー（Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ）にかけ、４℃で維持した。

澄んだ溶解液上清を採取し、イミダゾールを２５ｍＭの最終濃度のために溶解液に添加した。この溶解液を、ＡＣＳｔｅｐ１ｍｌ／５ｍｌＨｉＴｒａｐ－ＡｆｆｉｎｉｔｙＣｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙＱｕｉｃｋＳｔａｒｔを備えるＡＫＴＡＳｔａｒｔシステムにおいて、製造業者（ＧＥＨｅａｔｈｌｃａｒｅ）のプロトコールを使用し、１５０ｍＬのＮａＣｌおよび２５ｍＭイミダゾールを含有するＰＢＳを洗浄緩衝液として、ならびに１５０ｍｌのＮａＣｌおよび２５０ｍＭイミダゾールを含有するＰＢＳを溶出緩衝液として使用して、ＨＩＳ親和性精製した。精製されたアミラーゼバリアントを、ＥＣＯＮＯＰＡＣ（登録商標）－１０ＤＧ脱塩充填済み自然落下式カラム（Ｂｉｏｒａｄ）を用いてＰＢＳに緩衝液交換した。

精製されたアミラーゼバリアントを、細胞溶解液を使用した代わりに１ｍｇ／ｍｌの精製酵素を安定性実験において使用したことを除いては本明細書に記載されるのと類似した方式で、チャレンジなしの活性、胃内安定性、腸内安定性についてアッセイした。
（実施例４）
アミラーゼバリアントのスクリーニング結果

ライブラリーバリアントを、配列番号１８の構造モデルに基づいて、表面位置に関する相同体多様性および飽和突然変異誘発から生成した。これらのバリアントを、実施例３に記載したような、５０℃での１時間のインキュベーションと、それに続く１時間の胃的チャレンジ（１．５ｍｇ／ｍＬペプシン、ｐＨ３）と、最後に１時間の腸的チャレンジ１時間との連続チャレンジの後、ｐＨ６．８におけるアミラーゼ活性について、３連でスクリーニングした。結果（配列番号１８の結果と比べた）を表４－１に示す。

表４－１に示した結果に基づいて、配列番号４０を、次のタンパク質最適化の反復のための親配列として選択した。表４－２に列挙されるものから同定された有益な突然変異をこの骨格に組み換えた。バリアントを、実施例３に記載したような２つの異なる条件：５０℃での１時間のインキュベーションとそれに続く１時間の腸性スクリーニング、および５０℃での１時間のインキュベーションとそれに続くｐＨ３．５における１時間の胃的チャレンジによるプレインキュベーション後、ｐＨ６．８におけるアミラーゼ活性について、３連でアッセイした。結果（配列番号４０の結果と比べた）を表４－２に示す。

表４－２に示した結果に基づいて、配列番号１５６を、次のタンパク質最適化の反復のための親配列として選択した。表４－２に示した結果から同定された有益な突然変異を骨格に組み換えた。加えて、新たな多様性を生成するために、異なる位置における飽和突然変異誘発を用いて作製したバリアントもまた配列番号１５６を使用して構築した。

バリアントを、２つの異なる条件下でのプレインキュベーション後、ｐＨ６．８におけるアミラーゼ活性について、３連でアッセイした。実施例３に記載したように、第１の条件はｐＨ３．２５における１時間の胃的チャレンジであり、第２の条件はｐＨ３．２５における２時間の胃的チャレンジであった。結果（配列番号１５６の結果と比べた）を表４－３に示す。

表４－３に示した結果に基づいて、配列番号１７４を、次のタンパク質最適化の反復のための親配列として選択した。表４－２および表４－３から同定された有益な突然変異、ならびに相同体からの多様性をこの骨格に組み換えた。バリアントを、実施例３に記載したようなｐＨ３．２５における１時間の胃的チャレンジによるプレインキュベーション後、ｐＨ６．８におけるアミラーゼ活性について、１連でアッセイした。結果（配列番号１７４の結果と比べた）を表４－４に示す。

表４－４に示した結果に基づいて、配列番号２７６を、次のタンパク質最適化の反復のための親配列として選択した。表４－４に示した結果に基づいて同定された有益な突然変異、および改変配列を野生型配列に復帰させる突然変異をこの骨格に組み換えた。加えて、新たな多様性を生成するために、異なる位置における飽和突然変異誘発を用いて生成したバリアントもまた配列番号２７６を使用して構築した。バリアントを、２つの異なる条件下でのプレインキュベーション後、ｐＨ６．８におけるアミラーゼ活性について、３連でアッセイした。実施例３に記載したように、第１の条件はｐＨ２．７５における１時間の胃的チャレンジであり、第２の条件は１時間の腸的チャレンジであった。結果（配列番号２７６の結果と比べた）を表４－５に示す。

表４－５に示した結果に基づいて、配列番号３０８を、次のタンパク質最適化の反復のための親配列として選択した。表４－５から同定された有益な突然変異、および相同体からの多様性をこの骨格に組み換えた。加えて、新たな多様性を生成するために、異なる位置に単一の突然変異を有するバリアントもまた配列番号３０８を使用して構築した。バリアントを、２つの異なる条件下でのプレインキュベーション後、ｐＨ６．８におけるアミラーゼ活性について、３連でアッセイした。実施例３に記載したように、第１の条件はｐＨ２．５における２時間の胃的チャレンジであり、第２の条件は２時間の腸的チャレンジであった。結果（配列番号３０８の結果と比べた）を表４－６に示す。

表４－６に示した結果に基づいて、配列番号４２２を、次のタンパク質最適化の反復のための親配列として選択した。表４－６に示した結果に基づいて同定された有益な突然変異をこの骨格に組み換えた。バリアントを、実施例３に記載したような２つの異なる条件下、すなわち第１がｐＨ２．３における２時間の胃的チャレンジであり、第２が２時間の腸的チャレンジである条件下でのプレインキュベーション後、ｐＨ６．８におけるアミラーゼ活性について、１連でアッセイした。結果（配列番号４２２の結果と比べた）を表４－７に示す。

表４－７からの結果に基づいて、配列番号４５６を、次のタンパク質最適化の反復のための親配列として選択した。新たな多様性を生成するために、相同体からの突然変異を、配列番号４５６を使用して組み換え、異なる位置に飽和突然変異誘発を有するバリアントもまたこの骨格を使用して構築した。バリアントを、チャレンジなしの条件下のｐＨ６およびｐＨ７におけるアミラーゼ活性、さらに２つの異なる条件下でのプレインキュベーション後のｐＨ６におけるアミラーゼ活性について、３連でアッセイした。実施例３に記載したように、第１の条件はｐＨ２．３における２時間の胃的チャレンジであり、第２の条件は２時間の腸的チャレンジであった。結果（配列番号４５６の結果と比べた）を表４－８に示す。一部の追加の実験では、一部のバリアントを、実施例３に記載したようなｐＨ２．３における２時間の胃的チャレンジの後、ｐＨ６におけるアミラーゼ活性について、１連でアッセイした。結果（配列番号４５６の結果と比べた）を表４－９に示す。

表４－８に示した結果に基づいて、配列番号５４６を、次のタンパク質最適化の反復のための親配列として選択した。表４－９から同定された有益な突然変異をこの骨格に組み換えた。バリアントを、ｐＨ６およびｐＨ７におけるチャレンジなしの活性に関するアミラーゼ活性、ならびに２つの異なる条件下でのプレインキュベーション後のｐＨ６におけるアミラーゼ活性について、３連でアッセイした。実施例３に記載したように、第１の条件はｐＨ２．３における２時間の胃的チャレンジであり、第２の条件は２時間の腸的チャレンジであった。結果（配列番号５４６の結果と比べた）を表４－１０に示す。

表４－１０に示した結果に基づいて、配列番号６３２を、次のタンパク質最適化の反復のための親配列として選択した。新たな多様性を生成するために、相同体からの突然変異を、骨格を使用して組み換えた。加えて、異なる位置における飽和突然変異誘発を使用して作製したバリアントもまたこの骨格に対して構築した。バリアントを、ｐＨ６におけるチャレンジなしの活性に関するアミラーゼ活性、さらに２つの異なる条件下でのプレインキュベーション後のアミラーゼ活性について、３連でアッセイした。実施例３に記載したように、第１の条件はｐＨ２．３における２時間の胃的チャレンジであり、第２の条件は２時間の腸的チャレンジであった。結果（配列番号６３２の結果と比べた）を表４－１１に示す。

表４－１１に示した結果に基づいて、配列番号６６４を、次のタンパク質最適化の反復のための親配列として選択した。相同体からの突然変異、および全てのスクリーニング結果から同定されたが未だ組み込まれていない任意の他の有益な突然変異をこの骨格において組み換えた。加えて、異なる位置における飽和突然変異誘発を使用して作製したバリアントもまたこの骨格に対して構築した。バリアントを、ｐＨ６におけるチャレンジなしの活性に関するアミラーゼ活性、さらに２つの異なる条件下でのプレインキュベーション後のアミラーゼ活性について、３連でアッセイした。実施例３に記載したように、第１の条件はｐＨ２．３における２時間の胃的チャレンジであり、第２の条件は２時間の腸的チャレンジであった。結果（配列番号６６４の結果と比べた）を表４－１２に示す。

追加の実験において、表４－１２からのバリアントの一部をまた、振盪フラスコでの作製のためにスケールアップし、精製酵素を、ｐＨ６におけるチャレンジなしの活性に関するアミラーゼ活性、さらに２つの異なる条件下でのプレインキュベーション後のアミラーゼ活性についてアッセイした。実施例３に記載したように、第１の条件はｐＨ３における２時間の胃的チャレンジであり、第２の条件は３時間の腸的チャレンジであった。結果（配列番号６６４の結果と比べた）を表４－１３に示す。

表４－１０に示した結果に基づいて、配列番号６３２は、配列番号５４６と比較して、改善した胃内安定性を有するが、より低い腸内安定性を有することが見出された。配列分析により、損なわれた腸内安定性を引き起こした可能性があるＴ１２６Ｒ置換が同定された。表４－１３からの結果に基づいて、配列番号７８０を、次のタンパク質最適化の反復のための親配列として選択した。胃内安定性を維持すると同時に腸内安定性の喪失を救済するために、配列番号７８０を使用して位置１２６におけるＮＮＫライブラリーを構築した。バリアントを、３つの異なる条件下でのプレインキュベーション後のｐＨ６におけるアミラーゼ活性についてアッセイした。実施例３に記載したように、第１の条件はｐＨ２．３における２時間の胃的チャレンジであり、第２の条件は２時間のトリプシンのみのチャレンジ（キモトリプシンなし）であり、第３の条件はプロテアーゼ（配列番号２０）との２時間のインキュベーションであった。結果（配列番号７８０の結果と比べた）を表４－１４に示す。

（実施例５）
Ｈｉｓタグを有するアミラーゼバリアントと有しないアミラーゼバリアントとの比較

配列番号８１０のＣ末端リンカーおよびＨｉｓタグを除去して、配列番号１７５８を生成した。これらのバリアントの両方をＨＴＰにおいて増殖させ、ｐＨ６．８におけるアミラーゼ活性、ならびに実施例３に記載したような、２時間の胃的チャレンジ（１．５ｍｇ／ｍＬペプシン、ｐＨ２．３）、２時間の腸的チャレンジおよび２時間のプロテアーゼチャレンジの後の活性について、２連でスクリーニングした。これらの２つのバリアントは、表５における吸光度値によって示されるように、スクリーニングした異なる条件下において類似した特性を有することが見出された。

本出願において引用される全ての刊行物、特許、特許出願および他の文献は、各個々の刊行物、特許、特許出願または他の文献が全ての目的のために参照により本明細書に組み込まれると個々に示されるのと同じ程度まで、全ての目的のためにそれらの全体がこれにより参照により本明細書に組み込まれる。

種々の具体的な実施形態が例示され記載されてきたが、本発明の精神および範囲から逸脱することなしに種々の変化がなされ得ることが理解される。

Claims

配列番号２に対して少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％配列同一性を含むアミノ酸配列を含む組換えアミラーゼ。
配列番号１８、４０、１５６、１７４、２７６、３０８、４２２、４５６、５４６、６３２、６６４、７８０、９８８、１１０４、１１２２、１２２４、１２５６、１３７０、１４０４、１４９４、１５８０、１６１２および／または１７２８に対して少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれを超える配列同一性を有するポリペプチド配列を含む、請求項１に記載の組換えアミラーゼ。
前記ポリペプチド配列が、（ａ）配列番号２、または（ｂ）配列番号１８、４０、１５６、１７４、２７６、３０８、４２２、４５６、５４６、６３２、６６４、７８０、９８８、１１０４、１１２２、１２２４、１２５６、１３７０、１４０４、１４９４、１５８０、１６１２もしくは１７２８の配列と比べて１個または複数の置換をさらに含む、請求項１または２に記載の組換えアミラーゼ。
前記組換えアミラーゼが、配列番号２もしくは１８に対して少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくはそれを超える配列同一性を有するポリペプチド配列、またはその機能的断片を含み、前記組換えアミラーゼが、１６、２６、２９、３３、９１、１１４、１５７、１５８、１８０、１８４、２１４、２２３、２５６、２７２、２９８、３０２、３７１、３８０、３８３、３９４、４１２、４２８および４３７から選択される位置に１個または複数の置換を含み、前記ポリペプチド配列の前記アミノ酸位置が、配列番号２または１８を参照して番号付けされる、請求項１に記載の組換えアミラーゼ。
前記組換えアミラーゼが、配列番号２もしくは１８に対して少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくはそれを超える配列同一性を有するポリペプチド配列、またはその機能的断片を含み、前記組換えアミラーゼが、１６Ｄ、２６Ａ、２９Ｇ、２９Ｒ、２９Ｓ、２９Ａ、２９Ｅ、３３Ｅ、９１Ｈ、１１４Ｈ、１５７Ｙ、１５８Ｒ、１８０Ｅ、１８０Ｑ、１８４Ｄ、１８４Ｋ、２１４Ｇ、２２３Ｌ、２５６Ｔ、２７２Ｇ、２７２Ｋ、２７２Ｐ、２７２Ｒ、２７２Ｓ、２９８Ｈ、３０２Ｑ、３０２Ｇ、３０２Ｈ、３０２Ｒ、３０２Ｖ、３０２Ｗ、３７１Ｆ、３８０Ｒ、３８３Ｅ、３８３Ｉ、３９４Ｎ、３９４Ｓ、３９４Ｇ、４１２Ａ、４１２Ｌ、４１２Ｄ、４１２Ｓ、４２８Ｔおよび４３７Ｌから選択される１個または複数の置換を含み、前記ポリペプチド配列の前記アミノ酸位置が、配列番号２または１８を参照して番号付けされる、請求項１に記載の組換えアミラーゼ。
前記組換えアミラーゼが、配列番号２または１８に対して少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれを超える配列同一性を有するポリペプチド配列を含み、前記組換えアミラーゼが、２／７３／２５６／４９３、１６／３３／７３／１３０／２５６／２８２／３７１／３７４／４９３、１６／３３／１３０／２５６／３０２／３７１／３８３／４７０、１６／３３／１５７／２５６／３０２／３７１／３８３、１６／７３／７４／２５６／２８２／３６６／３７１／３８３／４９３、１６／７３／２５６／２８２／３０２／３３１／３７１／３８３、１６／１３０／２５６／２７６／３７４／４７０、１６／２５６／３０２／３７４、１９／７２／３４５／４７３、２６／２７／３９６／４１２／４２８／４７３、２６／２７／４１２、２６／２７／４６６／４７３、２９、７３／１３０／２５６／２８２／３０２／４９３、７４／３７１／３７４／３８３／４９３、１３０／２５６／４９３、１４９、１５８、２５４、２５６、２５６／３８３、２５７、２５９、２７２、２７９、２８４、３１７／３８３、３２２、３４５／３８８／３９６／４２８、３８８／３９６／４１２／４２８、３９６／４１２、３９６／４１２／４２８／４６６、４０９、４１２、および４９５から選択される１個または複数の位置に少なくとも１個の置換または置換セットを含み、前記ポリペプチド配列の前記アミノ酸位置が、配列番号２または１８を参照して番号付けされる、請求項１に記載の組換えアミラーゼ。
前記組換えアミラーゼが、配列番号４０または９８８に対して少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれを超える配列同一性を有するポリペプチド配列を含み、前記組換えアミラーゼが、２６／２９／１５８／２７２／４１２、２６／２９／２７２／２７９／４１２／４９３、２６／２９／２７２／３９６／４１２、２６／２９／２７９／４１２／４２８、２６／１５８／２７２／２７９／３８８／４１２／４２８、２６／１５８／２７２／４１２、２６／２７２／２７９／４１２／４２８／４９３、２９／２７２／２７９／３９６／４１２、１３０／１４９／２５４／２８４／３２２／４０９／４９５、１３０／１４９／２５７／２８４／３２２／４０９／４６６／４７３、１３０／２５４／２８４／３２２／３７４／４０９／４６６、１３０／２５７／２８４／３７４／４０９／４６６、１３０／２８４／３２２／３７４／４０９／４７３、１４９／２５７／２８４／３２２／４０９／４６６、１５８／２７２／２７９／３９４／３９６／４１２／４２８／４９３、１５８／２７２／３８８／４１２／４２８／４９３、１５８／２７２／４１２／４２８、１５８／２７９／３８８／３９６／４１２／４２８、２５４／２５７／２８４／３２２／４０９／４７３、２５４／２８４／４０９／４６６／４９５、２７２／２７９／４１２／４２８／４９３、２７２／４１２／４２８、２７２／４１２／４９３、および２８４／３２２／４０９／４７３から選択される１個または複数の位置に少なくとも１個の置換または置換セットを含み、前記ポリペプチド配列の前記アミノ酸位置が、配列番号４０または９８８を参照して番号付けされる、請求項１に記載の組換えアミラーゼ。
前記組換えアミラーゼが、配列番号１５６または１１０４に対して少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれを超える配列同一性を有するポリペプチド配列を含み、前記組換えアミラーゼが、３７、５１、９１、１１１、１１２、１１４、１２２、１２４、１２８、１４０、１６７、１７１、１８３、１９４、２７６、２８０、２９８、３９７および４６４から選択される１個または複数の位置に少なくとも１個の置換または置換セットを含み、前記ポリペプチド配列の前記アミノ酸位置が、配列番号１５６または１１０４を参照して番号付けされる、請求項１に記載の組換えアミラーゼ。
前記組換えアミラーゼが、配列番号１７４または１１２２に対して少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれを超える配列同一性を有するポリペプチド配列を含み、前記組換えアミラーゼが、２４、９１、９１／１２２、９１／１２２／１２８／１３０／１６７／１７１／４０９、９１／１２２／１２８／１３０／１８３／３２２、９１／１２２／１２８／１３０／１９４、９１／１２２／１２８／１３０／３２２、９１／１２２／１２８／１７１／１８３／１９４／３２２、９１／１２２／１２８／１８３／４０９、９１／１２２／１３０／１６７／１８３／１９４／４０９、９１／１２２／１３０／１７１／１８３、９１／１２２／１３０／１８３／１９４、９１／１２２／１３０／１９４、９１／１２２／１３０／１９４／３２２、９１／１２２／１６７／１７１／１９４、９１／１２２／１６７／１７１／１９４／３２２、９１／１２２／１７１／１８３／１９４／４０９、９１／１３０／１７１／１８３／３２２／４０９、９１／１６７／１７１、９１／１６７／１８３／１９４、９１／１６７／３２２、９１／１８３、９１／１８３／３２２／４０９、９１／１９４、９１／３２２、９１／４０９、１２２／１２８、１２２／１２８／１９４／４０９、１２２／１３０／１７１／３２２／４０９、１２２／４０９、１３７／１４５／２２７／３９４／４８０／４８１、１３７／１４５／２９５、１４５／２２７／２９５／４８１、１４５／３０９／４８１、１８３、２２７、２９５／３９４、３２２、３２２／４０９、３９４、および４８０／４８１から選択される１個または複数の位置に少なくとも１個の置換または置換セットを含み、前記ポリペプチド配列の前記アミノ酸位置が、配列番号１７４または１１２２を参照して番号付けされる、請求項１に記載の組換えアミラーゼ。
前記組換えアミラーゼが、配列番号２７６または１２２４に対して少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれを超える配列同一性を有するポリペプチド配列を含み、前記組換えアミラーゼが、１６／２６／２９／１２８／１４５／２５６／３０９／３８３、１６／２６／３３／１１４／１４５／３０９／３８３／３９４、１６／２６／３３／１２８／１３０／１４５／３０２／３０９／３２２／３７１、１６／２６／３３／１４５／１５８／３８３／３９４、１６／２６／１４５／３０２、１６／２９／３３／１４５／２５６／３０２、１８、２６／２９／３３／１３０／１４５／１５７／１５８／１８３／３９４、２６／２９／３３／１４５／１５７／１８３／２５６／３０９／３８３、２６／２９／１２２／１３０／１４５／１８３／２５６／２７２／３０９／３９４、２６／２９／１４５／１５７／２５６／３０２／３２２／４８１、２６／２９／１４５／２５６／２７２／３０２／３０９／３２２／４８１、２６／３３／９１／１４５／２７２／３０２／４８１、２６／３３／１４５／３０９／３２２／３８３、２６／１１４／１４５／３２２、２６／１４５／１８３／２５６／３０９／３８３、２９／１２２／１４５／１５８／３８３、２９／１３０／１４５／２５６／２７２／３７１／３９４、２９／１４５／１８３／３０２／３０９／４１２、２９／３０９／３９４、３３／１２２／１４５／２７２／３０９／４１２、９１／１３０／１４５／１５８／１８３／３８３、９１／３０９／３８３、１３０／１４５／２５６／２７２／３７１、１３０／１４５／３０２／３０９、１３０／２７２／４８１、１４５／３０２／３０９、２６８、３０９、３４９、３６０、３８０、３９４、４６３、および４８３から選択される１個または複数の位置に少なくとも１個の置換または置換セットを含み、前記ポリペプチド配列の前記アミノ酸位置が、配列番号２７６または１２２４を参照して番号付けされる、請求項１に記載の組換えアミラーゼ。
前記組換えアミラーゼが、配列番号３０８または１２５６に対して少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれを超える配列同一性を有するポリペプチド配列を含み、前記組換えアミラーゼが、２９、３７／１２４／２５０／２７０／３４９／３８０／３９４／４４２／４９１、３７／１４５、３７／１４５／２５０／３０１／３４９／３９４、３７／１４５／２５８／４４２／４９１、３８／３４９／４９１、８１／２５９、８１／３１３／４９５、９２／２５７／２５８／３３８／４６８、９２／２５８、９４／１２７／１３２／１４５／２５０／３４９、９４／２７０／３０１／３４９／３９４／４４２、９４／３４９／４９１、１４５／２７０、１７８、２２５、２２６、２４６、２５０／３４９／４４２、２５９／３１３／３３８、２７０／３４９、２８６／３３８、２９４、３１３、３４９、３４９／３８０／４４２、４１３、４１３／４６８、４４８、および４７３から選択される１個または複数の位置に少なくとも１個の置換または置換セットを含み、前記ポリペプチド配列の前記アミノ酸位置が、配列番号３０８または１２５６を参照して番号付けされる、請求項１に記載の組換えアミラーゼ。
前記組換えアミラーゼが、配列番号４２２または１３７０に対して少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれを超える配列同一性を有するポリペプチド配列を含み、前記組換えアミラーゼが、３８、３８／１７８／２２６／２８６／３３８、３８／１７８／２８６／４４８、３８／１７８／３４９／４４８、３８／２２６／２４６／２５８／２８６、３８／２２６／２５８／２８６／３３８／３８０／４４８、３８／２２６／２５８／３４９／４１３、３８／２２６／２８６、３８／２２６／２８６／３３８／３８０、３８／２２６／３３８／３４９／３８０、３８／２２６／４１３／４４８、３８／２４６／２８６、３８／２４６／２８６／３８０、３８／２５８、３８／２８６、３８／２８６／４１３／４４８、３８／２８６／４４８、３８／４４８、１７８、１７８／２２６／２５８／２８６／３１０／３３８、１７８／２２６／２８６／３３８、１７８／２４６／３３８、１７８／２５８／２８６／４１３、１７８／２８６、１７８／２８６／３３８／３４９、１７８／２８６／３３８／４４８、１７８／３８０、１７８／４１３、１７８／４４８、１８４／２４６／２５８／３８０、２２６、２２６／２４６／２８６／３４９／４４８、２２６／２４６／４１３、２２６／２５８／２８６／３４９／３８０、２２６／２５８／２８６／４１３／４４８、２２６／２８６、２２６／２８６／３８０／４４８、２２６／３４９／３８０、２４６、２４６／２８６、２４６／２８６／３８０／４１３、２４６／３３８、２４６／４１３、２５８／２８６／４１３、２８６、２８６／４１３／４４８、３３８／４４８、３４９、および４１３から選択される１個または複数の位置に少なくとも１個の置換または置換セットを含み、前記ポリペプチド配列の前記アミノ酸位置が、配列番号４２２または１３７０を参照して番号付けされる、請求項１に記載の組換えアミラーゼ。
前記組換えアミラーゼが、配列番号４５６または１４０４に対して少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれを超える配列同一性を有するポリペプチド配列を含み、前記組換えアミラーゼが、２９／３１／９２／２２０、２９／４６９、４９／５８／１０３／１４１／１９７／２６９／２９４／２９８、４９／５８／１０３／１９４／２０４／２９８、４９／５８／１４１／２９８、４９／１０３、１０３、１２３、１２６、１２７、１３１、１３４、１８０、２１０、２１４、２２０／４６９、２２８、２５９、２７９、２８２、３０２、３１９、３９３、４１５、４１７、４２８、４２９、４６６および４６９から選択される１個または複数の位置に少なくとも１個の置換または置換セットを含み、前記ポリペプチド配列の前記アミノ酸位置が、配列番号４５６または１４０４を参照して番号付けされる、請求項１に記載の組換えアミラーゼ。
前記組換えアミラーゼが、配列番号４５６または１４０４に対して少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれを超える配列同一性を有するポリペプチド配列を含み、前記組換えアミラーゼが、９２、１２３、１２６、１２７、１２９、１３１、１３４、１４０、１７２、１８０、２１０、２１４、２２１、２２８、２５３、２５４、２５９、２７９、２８２、３０２、３０４、３０５、３１９、３２２、３４６、３５９、３８４、３８５、３８７、３９３、４０９、４１２、４１５、４１７、４２８、４２９、４４１、４４２、４４４、４４６、４５１、４５５、４５９、４６６、４６７、４７０、４７３、４７４、４９２および４９４から選択される１個または複数の位置に少なくとも１個の置換または置換セットを含み、前記ポリペプチド配列の前記アミノ酸位置が、配列番号４５６または１４０４を参照して番号付けされる、請求項１に記載の組換えアミラーゼ。
前記組換えアミラーゼが、配列番号５４６または１４９４に対して少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれを超える配列同一性を有するポリペプチド配列を含み、前記組換えアミラーゼが、１２３、１２３／１２６／１８０／２１４／２９８／３０２／３９３、１２３／１２６／１８０／２１４／３９３／４２８、１２３／１２６／２１０／２９８／３０２／３９３、１２３／１２６／２１０／４２８、１２３／１２６／４２８、１２３／２１０／３０２、１２６／１８０／２１０／２１４／２９８／３０２、１２６／１８０／２１０／２１４／４２８、１２６／１８０／２９８／３０２／３９３、１２６／２１０／３０２／４２８、１２６／２１４／３９３、１２６／２９８／３０２／３９３、１２６／２９８／３０２／３９３／４２８、１２９、１２９／２２８／２５３、１３１／２２８／２７９、１３１／２８２、１８０／２１４、２１０／２１４／３０２／３９３／４２８、２２８／２８２／４４４、２５３／２７９／４７０、２５３／２７９／４９２、２７９、２７９／４７０、および４４１から選択される１個または複数の位置に少なくとも１個の置換または置換セットを含み、前記ポリペプチド配列の前記アミノ酸位置が、配列番号５４６または１４９４を参照して番号付けされる、請求項１に記載の組換えアミラーゼ。
前記組換えアミラーゼが、配列番号６３２または１５８０に対して少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれを超える配列同一性を有するポリペプチド配列を含み、前記組換えアミラーゼが、２、４５／１６６／２９８、４８、４８／１６６／１７０／２０３、５２、５８／１６６、５８／２０３、７２、８２、１１４、１１４／２２３／３０６／３０８、１４９、１６５、１６６／２０３、１６７、１７０、１８４／２１６／３０６／３０８、１８４／２２３／３０６／４３７、１８９、２０３、２２５、２５５、２５８、２７５、２８０、２８４、２９４、２９８、３９６、３９７、４１１、４３１、４４８、４６８、４８２、４８３および４９５から選択される１個または複数の位置に少なくとも１個の置換または置換セットを含み、前記ポリペプチド配列の前記アミノ酸位置が、配列番号６３２または１５８０を参照して番号付けされる、請求項１に記載の組換えアミラーゼ。
前記組換えアミラーゼが、配列番号６６４または１６１２に対して少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれを超える配列同一性を有するポリペプチド配列を含み、前記組換えアミラーゼが、６／３９／１０３／３２４／４２０、４１、５８／５００／５０１、６１、９５／９８／２０５／２２７／４２３／４５８、９５／９８／２２７／４２３、９５／２０５、９５／２５２／２８５／３２４、１２３／１７０／１９７／２７５／２９８／３９６／４４８／４８３、１２３／１９７、１２３／１９７／２２５／２９４／３９６／４４８／４６９、１２３／２８４／２９４／３２４／３９６／４４８、１３４／２２５／２７５／３０２、１６５／２２５／２８４／２９８／４６９／４８３、１７０／２７５／２９４／２９８／４４８、２０５／２０６、２０５／２０６／２２４／３１５／４５８／４８０、２０６／２２７、２０６／２２７／３１５／４２３、２２５／２９４／２９８／３９６、２２７、３９２／５０３、４５８、４９９、および５００から選択される１個または複数の位置に少なくとも１個の置換または置換セットを含み、前記ポリペプチド配列の前記アミノ酸位置が、配列番号６６４または１６１２を参照して番号付けされる、請求項１に記載の組換えアミラーゼ。
前記組換えアミラーゼが、配列番号６６４または１６１２に対して少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれを超える配列同一性を有するポリペプチド配列を含み、前記組換えアミラーゼが、９５／２５２／２８５／３２４、１２３／１９７、１２３／１９７／２２５／２９４／３９６／４４８／４６９、１３４／２２５／２７５／３０２、２０５／２０６および２０５／２０６／２２４／３１５／４５８／４８０から選択される１個または複数の位置に少なくとも１個の置換または置換セットを含み、前記ポリペプチド配列の前記アミノ酸位置が、配列番号６６４または１６１２を参照して番号付けされる、請求項１に記載の組換えアミラーゼ。
前記組換えアミラーゼが、配列番号７８０または１７２８に対して少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれを超える配列同一性を有するポリペプチド配列を含み、前記組換えアミラーゼが、位置１２６に少なくとも１個の置換または置換セットを含み、前記ポリペプチド配列の前記アミノ酸位置が、配列番号７８０または１７２８を参照して番号付けされる、請求項１に記載の組換えアミラーゼ。
前記組換えアミラーゼが、表４－１、４－２、４－３、４－４、４－５、４－６、４－７、４－８、４－９、４－１０、４－１１、４－１２、４－１３および／または４－１４に提供される少なくとも１個の位置における少なくとも１個の突然変異を含み、前記位置が、配列番号２、１８、４０、１５６、１７４、２７６、３０８、４２２、４５６、５４６、６３２、６６４、７８０、９８８、１１０４、１１２２、１２２４、１２５６、１３７０、１４０４、１４９４、１５８０、１６１２および／または１７２８を参照して番号付けされる、請求項１に記載の組換えアミラーゼ。
配列番号４～１８、２２～９６６および９７０～１９１４のうち偶数番号の配列から選択されるポリペプチド配列を含む、請求項１に記載の組換えアミラーゼ。
配列番号９７０～１９１４のうち偶数番号の配列から選択されるポリペプチド配列を含む、請求項１に記載の組換えアミラーゼ。
配列番号８００～８２０および１７４８～１７６８のうち偶数番号の配列から選択されるポリペプチド配列を含む、請求項１に記載の組換えアミラーゼ。
配列番号４０、１５６、１７４、２７６、３０８、４２２、４５６、５４６、６３２、６６４、７８０、８１０、９８８、１１０４、１１２２、１２２４、１２５６、１３７０、１４０４、１４９４、１５８０、１６１２、１７２８および１７５８から選択されるポリペプチド配列を含む、請求項１に記載の組換えアミラーゼ。
配列番号２、１８、４０、１５６、１７４、２７６、３０８、４２２、４５６、５４６、６３２、６６４、７８０、９８８、１１０４、１１２２、１２２４、１２５６、１３７０、１４０４、１４９４、１５８０、１６１２および／または１７２８のアミラーゼよりも熱安定性が高い、請求項１～２４のいずれかに記載の組換えアミラーゼ。
酸性ｐＨ条件下で、配列番号２、１８、４０、１５６、１７４、２７６、３０８、４２２、４５６、５４６、６３２、６６４、７８０、９８８、１１０４、１１２２、１２２４、１２５６、１３７０、１４０４、１４９４、１５８０、１６１２および／または１７２８のアミラーゼよりも安定している、請求項１～２５のいずれかに記載の組換えアミラーゼ。
ｐＨ６で、配列番号２、１８、４０、１５６、１７４、２７６、３０８、４２２、４５６、５４６、６３２、６６４、７８０、９８８、１１０４、１１２２、１２２４、１２５６、１３７０、１４０４、１４９４、１５８０、１６１２および／または１７２８のアミラーゼよりも活性が高い、請求項１～２６のいずれかに記載の組換えアミラーゼ。
配列番号２、１８、４０、１５６、１７４、２７６、３０８、４２２、４５６、５４６、６３２、６６４、７８０、９８８、１１０４、１１２２、１２２４、１２５６、１３７０、１４０４、１４９４、１５８０、１６１２および／または１７２８のアミラーゼよりもタンパク質分解に対する抵抗性が高い、請求項１～２７のいずれかに記載の組換えアミラーゼ。
少なくとも１種の胆汁酸塩の存在下で、配列番号２、１８、４０、１５６、１７４、２７６、３０８、４２２、４５６、５４６、６３２、６６４、７８０、９８８、１１０４、１１２２、１２２４、１２５６、１３７０、１４０４、１４９４、１５８０、１６１２および／または１７２８のアミラーゼよりも活性が高い、請求項１～２８のいずれかに記載の組換えアミラーゼ。
精製されている、請求項１～２９のいずれかに記載の組換えアミラーゼ。
参照配列と比較して、ｉ）増強された触媒活性；ｉｉ）酸性ｐＨ条件に対する増加した耐性；ｉｉｉ）少なくとも１種のプロテアーゼに対する増加した耐性；ｉｖ）少なくとも１種の胆汁酸塩に対する増加した耐性；ｖ）増加した熱耐性；またはｉ）、ｉｉ）、ｉｉｉ）、ｉｖ）およびｖ）のいずれかの組合せから選択される少なくとも１種の改善された特性を示す、請求項１～３０のいずれかに記載の組換えアミラーゼ。
前記参照配列が、配列番号２である、請求項３１に記載の組換えアミラーゼ。
前記参照配列が、配列番号１８、４０、１５６、１７４、２７６、３０８、４２２、４５６、５４６、６３２、６６４、７８０、９８８、１１０４、１１２２、１２２４、１２５６、１３７０、１４０４、１４９４、１５８０、１６１２および１７２８から選択される、請求項３１に記載の組換えアミラーゼ。
請求項１～３３のいずれかに記載の少なくとも１種の組換えアミラーゼを含む組成物。
請求項１～３３のいずれかに表示される少なくとも１種の組換えアミラーゼをコードする組換えポリヌクレオチド配列。
コドン最適化されている、請求項３５に記載の組換えポリヌクレオチド配列。
請求項３５および／または３６に記載の少なくとも１種の組換えポリヌクレオチド配列を含む発現ベクター。
前記組換えポリヌクレオチド配列が、制御配列に作動可能に連結されている、請求項３７に記載の発現ベクター。
前記制御配列が、プロモーターである、請求項３７または３８に記載の発現ベクター。
前記プロモーターが、異種プロモーターである、請求項３９に記載の発現ベクター。
請求項３７～４０のいずれかに記載の発現ベクターを含む宿主細胞。
真核細胞または原核細胞である、請求項４１に記載の宿主細胞。
組換えアミラーゼを産生する方法であって、前記組換えポリヌクレオチドによってコードされる前記組換えアミラーゼが産生される条件下で、請求項４１または４２に記載の宿主細胞を培養するステップを含む方法。
前記アミラーゼを回収するステップをさらに含む、請求項４３に記載の方法。
前記アミラーゼを精製するステップをさらに含む、請求項４４に記載の方法。
請求項３４に記載の組成物を含む、膵機能不全の処置のための医薬組成物。
薬学的に許容される担体および／または賦形剤をさらに含む、請求項４６に記載の医薬組成物。
少なくとも１種のプロテアーゼをさらに含む、請求項４６および／または４７に記載の医薬組成物。
少なくとも１種のリパーゼをさらに含む、請求項４６～４８のいずれかに記載の医薬組成物。
少なくとも１種のリパーゼおよび少なくとも１種のプロテアーゼをさらに含む、請求項４６および／または４７に記載の医薬組成物。
リパーゼ、プロテアーゼおよびアミラーゼ活性を含む膵臓抽出物をさらに含む、請求項３４および４６～５０のいずれかに記載の組成物。
ヒトへの非経口注射もしくは注入、皮下注射、吸入、または皮膚適用に適する、請求項４６～５１のいずれかに記載の医薬組成物。
ヒトへの経口投与に適する、請求項４６～５１のいずれかに記載の医薬組成物。
腸溶コーティングを含む、請求項５３に記載の医薬組成物。
対象における膵機能不全の症状を処置および／または予防するための方法であって、膵機能不全を有する対象を確保するステップと、請求項４６～５４のいずれかに記載の医薬組成物を前記対象に与えるステップとを含む方法。
膵機能不全の前記症状が軽快する、請求項５５に記載の方法。
前記対象が、膵機能不全の前記症状を示す対象に要求される食事よりも、その炭水化物含有量の制限が少ない食事を消費することができる、請求項５５および／または５６に記載の方法。
前記対象が、ヒト患者である、請求項５５～５７のいずれかに記載の方法。
前記ヒト患者が、乳児または小児である、請求項５８に記載の方法。
前記ヒト患者が、成人または若年成人である、請求項５８に記載の方法。
前記対象が、非ヒト哺乳動物である、請求項５５～５７のいずれかに記載の方法。
請求項３４および４６～５４のいずれかに提供される組成物の使用。
医薬としての使用のための、請求項１～３３のいずれかに記載の組換えアミラーゼまたは請求項３４および４６～５４のいずれかに記載の組成物。
栄養補助食品としての使用のための、請求項１～３３のいずれかに記載の組換えアミラーゼまたは請求項３４および４６～５４のいずれかに記載の組成物。
膵機能不全の症状の処置または予防における使用のための、請求項１～３３のいずれかに記載の組換えアミラーゼまたは請求項３４および４６～５４のいずれかに記載の組成物。