KR20000071014A - 재조합 할로지방족 탈할로겐화 효소 - Google Patents
재조합 할로지방족 탈할로겐화 효소 Download PDFInfo
- Publication number
- KR20000071014A KR20000071014A KR1019997007280A KR19997007280A KR20000071014A KR 20000071014 A KR20000071014 A KR 20000071014A KR 1019997007280 A KR1019997007280 A KR 1019997007280A KR 19997007280 A KR19997007280 A KR 19997007280A KR 20000071014 A KR20000071014 A KR 20000071014A
- Authority
- KR
- South Korea
- Prior art keywords
- enzyme
- polypeptide
- sequence
- rdhl
- amino acid
- Prior art date
Links
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims abstract description 272
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims abstract description 260
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 70
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims abstract description 59
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims abstract description 51
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 claims abstract description 45
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 claims abstract description 40
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 claims abstract description 39
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims abstract description 38
- 238000005695 dehalogenation reaction Methods 0.000 claims abstract description 32
- 150000001338 aliphatic hydrocarbons Chemical class 0.000 claims abstract description 15
- 108010093096 Immobilized Enzymes Proteins 0.000 claims abstract description 14
- 239000007787 solid Substances 0.000 claims abstract description 13
- 150000001298 alcohols Chemical class 0.000 claims abstract description 4
- 125000001931 aliphatic group Chemical group 0.000 claims abstract 2
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims description 81
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 claims description 45
- 241000316848 Rhodococcus <scale insect> Species 0.000 claims description 39
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 claims description 33
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims description 26
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims description 25
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 25
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 24
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 22
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 claims description 21
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 20
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 claims description 19
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 claims description 17
- AVGQTJUPLKNPQP-UHFFFAOYSA-N 1,1,1-trichloropropane Chemical compound CCC(Cl)(Cl)Cl AVGQTJUPLKNPQP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 16
- 230000027455 binding Effects 0.000 claims description 14
- 108010004901 Haloalkane dehalogenase Proteins 0.000 claims description 13
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 claims description 13
- -1 halogenated aliphatic alcohols Chemical class 0.000 claims description 13
- 150000003944 halohydrins Chemical class 0.000 claims description 13
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 claims description 12
- 150000001350 alkyl halides Chemical class 0.000 claims description 11
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 claims description 11
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 claims description 11
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 claims description 11
- 244000005700 microbiome Species 0.000 claims description 10
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 claims description 9
- 230000008569 process Effects 0.000 claims description 9
- 239000001913 cellulose Substances 0.000 claims description 7
- 229920002678 cellulose Polymers 0.000 claims description 7
- 125000005843 halogen group Chemical group 0.000 claims description 6
- 125000000487 histidyl group Chemical group [H]N([H])C(C(=O)O*)C([H])([H])C1=C([H])N([H])C([H])=N1 0.000 claims description 6
- ZXCYIJGIGSDJQQ-UHFFFAOYSA-N 2,3-dichloropropan-1-ol Chemical compound OCC(Cl)CCl ZXCYIJGIGSDJQQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 claims description 5
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 claims description 4
- 125000004432 carbon atom Chemical group C* 0.000 claims description 4
- KNKRKFALVUDBJE-UHFFFAOYSA-N 1,2-dichloropropane Chemical compound CC(Cl)CCl KNKRKFALVUDBJE-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 241000193830 Bacillus <bacterium> Species 0.000 claims description 3
- 241000589516 Pseudomonas Species 0.000 claims description 3
- 241000235070 Saccharomyces Species 0.000 claims description 3
- 150000001718 carbodiimides Chemical class 0.000 claims description 3
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 claims description 3
- WBEJYOJJBDISQU-UHFFFAOYSA-N 1,2-Dibromo-3-chloropropane Chemical compound ClCC(Br)CBr WBEJYOJJBDISQU-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- WSLDOOZREJYCGB-UHFFFAOYSA-N 1,2-Dichloroethane Chemical compound ClCCCl WSLDOOZREJYCGB-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 229940100682 1,2-dibromo-3-chloropropane Drugs 0.000 claims description 2
- PQBOTZNYFQWRHU-UHFFFAOYSA-N 1,2-dichlorobutane Chemical compound CCC(Cl)CCl PQBOTZNYFQWRHU-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 241000186046 Actinomyces Species 0.000 claims description 2
- 241000228212 Aspergillus Species 0.000 claims description 2
- 241000235648 Pichia Species 0.000 claims description 2
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 claims description 2
- 125000005442 diisocyanate group Chemical group 0.000 claims description 2
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 claims description 2
- 229910052698 phosphorus Inorganic materials 0.000 claims description 2
- 241000588722 Escherichia Species 0.000 claims 2
- 150000004985 diamines Chemical class 0.000 claims 2
- 229920005862 polyol Polymers 0.000 claims 2
- 125000003396 thiol group Chemical group [H]S* 0.000 claims 2
- ZOKHGHDRKCYWTH-UHFFFAOYSA-N 1,1-dichloropropan-2-ol Chemical compound CC(O)C(Cl)Cl ZOKHGHDRKCYWTH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- TVDCSPSRGSLXOV-UHFFFAOYSA-N 1-bromo-3-chloropropan-2-ol Chemical compound ClCC(O)CBr TVDCSPSRGSLXOV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- VNBFUGOVQMFIRN-UHFFFAOYSA-N 1-chlorobutan-2-ol Chemical compound CCC(O)CCl VNBFUGOVQMFIRN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- YYTSGNJTASLUOY-UHFFFAOYSA-N 1-chloropropan-2-ol Chemical compound CC(O)CCl YYTSGNJTASLUOY-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- QWVCIORZLNBIIC-UHFFFAOYSA-N 2,3-dibromopropan-1-ol Chemical compound OCC(Br)CBr QWVCIORZLNBIIC-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- WQTCNBWIWNNMFO-UHFFFAOYSA-N 2-bromo-3-chloropropan-1-ol Chemical compound OCC(Br)CCl WQTCNBWIWNNMFO-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- VZIQXGLTRZLBEX-UHFFFAOYSA-N 2-chloro-1-propanol Chemical compound CC(Cl)CO VZIQXGLTRZLBEX-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- FTOKYBLHOYVORA-UHFFFAOYSA-N 2-chlorobutan-1-ol Chemical compound CCC(Cl)CO FTOKYBLHOYVORA-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- SZIFAVKTNFCBPC-UHFFFAOYSA-N 2-chloroethanol Chemical compound OCCCl SZIFAVKTNFCBPC-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- OAICVXFJPJFONN-UHFFFAOYSA-N Phosphorus Chemical compound [P] OAICVXFJPJFONN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- 150000001913 cyanates Chemical class 0.000 claims 1
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 claims 1
- 239000011574 phosphorus Substances 0.000 claims 1
- 150000003077 polyols Chemical class 0.000 claims 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 abstract description 34
- 230000003100 immobilizing effect Effects 0.000 abstract description 5
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 216
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 132
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 80
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 75
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 65
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 56
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 43
- 239000013615 primer Substances 0.000 description 35
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 34
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 30
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 29
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 28
- 229920002873 Polyethylenimine Polymers 0.000 description 25
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 25
- 239000000047 product Substances 0.000 description 25
- 239000000377 silicon dioxide Substances 0.000 description 24
- PNEYBMLMFCGWSK-UHFFFAOYSA-N aluminium oxide Inorganic materials [O-2].[O-2].[O-2].[Al+3].[Al+3] PNEYBMLMFCGWSK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 21
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 19
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 18
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 18
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 16
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 16
- CFXQEHVMCRXUSD-UHFFFAOYSA-N 1,2,3-Trichloropropane Chemical compound ClCC(Cl)CCl CFXQEHVMCRXUSD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 14
- SXRSQZLOMIGNAQ-UHFFFAOYSA-N Glutaraldehyde Chemical compound O=CCCCC=O SXRSQZLOMIGNAQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 14
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 14
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 14
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 14
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-M Chloride anion Chemical compound [Cl-] VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 13
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 13
- 230000008859 change Effects 0.000 description 13
- 238000003119 immunoblot Methods 0.000 description 13
- 238000011068 loading method Methods 0.000 description 13
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 13
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 12
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 12
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 12
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 11
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 11
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 11
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 11
- 238000005342 ion exchange Methods 0.000 description 11
- 125000005647 linker group Chemical group 0.000 description 11
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 11
- 239000011347 resin Substances 0.000 description 11
- 229920005989 resin Polymers 0.000 description 11
- KJDRSWPQXHESDQ-UHFFFAOYSA-N 1,4-dichlorobutane Chemical compound ClCCCCCl KJDRSWPQXHESDQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 10
- BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N isopropyl beta-D-thiogalactopyranoside Chemical compound CC(C)S[C@@H]1O[C@H](CO)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N 0.000 description 10
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 10
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- 230000004544 DNA amplification Effects 0.000 description 9
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 9
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 description 9
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 9
- 239000002585 base Substances 0.000 description 9
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 9
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 9
- 230000014616 translation Effects 0.000 description 9
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 8
- 239000013592 cell lysate Substances 0.000 description 8
- 230000008878 coupling Effects 0.000 description 8
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 description 8
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 description 8
- ATDGTVJJHBUTRL-UHFFFAOYSA-N cyanogen bromide Chemical compound BrC#N ATDGTVJJHBUTRL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 8
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 8
- 239000000463 material Substances 0.000 description 8
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 8
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 8
- 229920002704 polyhistidine Polymers 0.000 description 8
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 8
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 8
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 8
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 7
- 239000003155 DNA primer Substances 0.000 description 7
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-L Sulfate Chemical compound [O-]S([O-])(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 7
- 108020004566 Transfer RNA Proteins 0.000 description 7
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 7
- 150000002367 halogens Chemical class 0.000 description 7
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 7
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 7
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 7
- 239000007793 ph indicator Substances 0.000 description 7
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 7
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 7
- INEWUCPYEUEQTN-UHFFFAOYSA-N 3-(cyclohexylamino)-2-hydroxy-1-propanesulfonic acid Chemical compound OS(=O)(=O)CC(O)CNC1CCCCC1 INEWUCPYEUEQTN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 108010020195 FLAG peptide Proteins 0.000 description 6
- XZWYTXMRWQJBGX-VXBMVYAYSA-N FLAG peptide Chemical group NCCCC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O)CC1=CC=C(O)C=C1 XZWYTXMRWQJBGX-VXBMVYAYSA-N 0.000 description 6
- 108010038807 Oligopeptides Proteins 0.000 description 6
- 102000015636 Oligopeptides Human genes 0.000 description 6
- 102000002933 Thioredoxin Human genes 0.000 description 6
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 6
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 6
- 239000000460 chlorine Substances 0.000 description 6
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 6
- 238000013461 design Methods 0.000 description 6
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 6
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 6
- 229910052736 halogen Inorganic materials 0.000 description 6
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 6
- GBZANUMDJPCQHY-UHFFFAOYSA-L mercury(ii) thiocyanate Chemical compound [Hg+2].[S-]C#N.[S-]C#N GBZANUMDJPCQHY-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 6
- 238000002264 polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 6
- 229920006395 saturated elastomer Polymers 0.000 description 6
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 6
- 108060008226 thioredoxin Proteins 0.000 description 6
- 229940094937 thioredoxin Drugs 0.000 description 6
- 230000002103 transcriptional effect Effects 0.000 description 6
- CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N Carbon dioxide Chemical compound O=C=O CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 229920002271 DEAE-Sepharose Polymers 0.000 description 5
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 5
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical compound N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 description 5
- 235000011130 ammonium sulphate Nutrition 0.000 description 5
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 5
- 238000004132 cross linking Methods 0.000 description 5
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 5
- 150000008282 halocarbons Chemical class 0.000 description 5
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 5
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 5
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 5
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 5
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 5
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 5
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 4
- OLQIKGSZDTXODA-UHFFFAOYSA-N 4-[3-(4-hydroxy-2-methylphenyl)-1,1-dioxo-2,1$l^{6}-benzoxathiol-3-yl]-3-methylphenol Chemical compound CC1=CC(O)=CC=C1C1(C=2C(=CC(O)=CC=2)C)C2=CC=CC=C2S(=O)(=O)O1 OLQIKGSZDTXODA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- ZAMOUSCENKQFHK-UHFFFAOYSA-N Chlorine atom Chemical compound [Cl] ZAMOUSCENKQFHK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 4
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N Hydrochloric acid Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 108090000604 Hydrolases Proteins 0.000 description 4
- 102000004157 Hydrolases Human genes 0.000 description 4
- CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N L-aspartic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N 0.000 description 4
- HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N L-histidine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 4
- TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L Magnesium chloride Chemical compound [Mg+2].[Cl-].[Cl-] TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 4
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 4
- 229920005654 Sephadex Polymers 0.000 description 4
- 239000012507 Sephadex™ Substances 0.000 description 4
- 101710168624 Thioredoxin 2 Proteins 0.000 description 4
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 229910052801 chlorine Inorganic materials 0.000 description 4
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 4
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 4
- 150000004820 halides Chemical class 0.000 description 4
- 235000014304 histidine Nutrition 0.000 description 4
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 4
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 4
- 239000000543 intermediate Substances 0.000 description 4
- VCJMYUPGQJHHFU-UHFFFAOYSA-N iron(3+);trinitrate Chemical compound [Fe+3].[O-][N+]([O-])=O.[O-][N+]([O-])=O.[O-][N+]([O-])=O VCJMYUPGQJHHFU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 4
- VLTRZXGMWDSKGL-UHFFFAOYSA-N perchloric acid Chemical compound OCl(=O)(=O)=O VLTRZXGMWDSKGL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 4
- 239000011148 porous material Substances 0.000 description 4
- 230000000644 propagated effect Effects 0.000 description 4
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 4
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 4
- 241001515965 unidentified phage Species 0.000 description 4
- BFSVOASYOCHEOV-UHFFFAOYSA-N 2-diethylaminoethanol Chemical compound CCN(CC)CCO BFSVOASYOCHEOV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- ACERFIHBIWMFOR-UHFFFAOYSA-N 2-hydroxy-3-[(1-hydroxy-2-methylpropan-2-yl)azaniumyl]propane-1-sulfonate Chemical compound OCC(C)(C)NCC(O)CS(O)(=O)=O ACERFIHBIWMFOR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N Acetonitrile Chemical compound CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 3
- IGXWBGJHJZYPQS-SSDOTTSWSA-N D-Luciferin Chemical compound OC(=O)[C@H]1CSC(C=2SC3=CC=C(O)C=C3N=2)=N1 IGXWBGJHJZYPQS-SSDOTTSWSA-N 0.000 description 3
- 108020001019 DNA Primers Proteins 0.000 description 3
- CYCGRDQQIOGCKX-UHFFFAOYSA-N Dehydro-luciferin Natural products OC(=O)C1=CSC(C=2SC3=CC(O)=CC=C3N=2)=N1 CYCGRDQQIOGCKX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 102100036504 Dehydrogenase/reductase SDR family member 9 Human genes 0.000 description 3
- 241000701959 Escherichia virus Lambda Species 0.000 description 3
- BJGNCJDXODQBOB-UHFFFAOYSA-N Fivefly Luciferin Natural products OC(=O)C1CSC(C=2SC3=CC(O)=CC=C3N=2)=N1 BJGNCJDXODQBOB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N Glutamic acid Natural products OC(=O)C(N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 101000928746 Homo sapiens Dehydrogenase/reductase SDR family member 9 Proteins 0.000 description 3
- QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N L-tryptophane Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N 0.000 description 3
- DDWFXDSYGUXRAY-UHFFFAOYSA-N Luciferin Natural products CCc1c(C)c(CC2NC(=O)C(=C2C=C)C)[nH]c1Cc3[nH]c4C(=C5/NC(CC(=O)O)C(C)C5CC(=O)O)CC(=O)c4c3C DDWFXDSYGUXRAY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241001625930 Luria Species 0.000 description 3
- 102000008109 Mixed Function Oxygenases Human genes 0.000 description 3
- 108010074633 Mixed Function Oxygenases Proteins 0.000 description 3
- MKWKNSIESPFAQN-UHFFFAOYSA-N N-cyclohexyl-2-aminoethanesulfonic acid Chemical compound OS(=O)(=O)CCNC1CCCCC1 MKWKNSIESPFAQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M Sodium laurylsulphate Chemical compound [Na+].CCCCCCCCCCCCOS([O-])(=O)=O DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 101710137500 T7 RNA polymerase Proteins 0.000 description 3
- QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N Tryptophan Natural products C1=CC=C2C(CC(N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 description 3
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 3
- 125000003277 amino group Chemical group 0.000 description 3
- 230000001588 bifunctional effect Effects 0.000 description 3
- 238000006065 biodegradation reaction Methods 0.000 description 3
- 239000006227 byproduct Substances 0.000 description 3
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 3
- 230000003197 catalytic effect Effects 0.000 description 3
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 3
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 3
- SUYVUBYJARFZHO-RRKCRQDMSA-N dATP Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@H]1C[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 SUYVUBYJARFZHO-RRKCRQDMSA-N 0.000 description 3
- RGWHQCVHVJXOKC-SHYZEUOFSA-N dCTP Chemical compound O=C1N=C(N)C=CN1[C@@H]1O[C@H](CO[P@](O)(=O)O[P@](O)(=O)OP(O)(O)=O)[C@@H](O)C1 RGWHQCVHVJXOKC-SHYZEUOFSA-N 0.000 description 3
- HAAZLUGHYHWQIW-KVQBGUIXSA-N dGTP Chemical compound C1=NC=2C(=O)NC(N)=NC=2N1[C@H]1C[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 HAAZLUGHYHWQIW-KVQBGUIXSA-N 0.000 description 3
- NHVNXKFIZYSCEB-XLPZGREQSA-N dTTP Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)[C@@H](O)C1 NHVNXKFIZYSCEB-XLPZGREQSA-N 0.000 description 3
- 238000006298 dechlorination reaction Methods 0.000 description 3
- 238000001976 enzyme digestion Methods 0.000 description 3
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 3
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 3
- HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N histidine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- RAXXELZNTBOGNW-UHFFFAOYSA-N imidazole Natural products C1=CNC=N1 RAXXELZNTBOGNW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 description 3
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 3
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 3
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 3
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 3
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 3
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 3
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 3
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 3
- 239000011535 reaction buffer Substances 0.000 description 3
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 3
- 238000011160 research Methods 0.000 description 3
- MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N (2S)-2-Amino-3-hydroxypropansäure Chemical compound OC[C@H](N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N 0.000 description 2
- HZAXFHJVJLSVMW-UHFFFAOYSA-N 2-Aminoethan-1-ol Chemical compound NCCO HZAXFHJVJLSVMW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 2
- WKBOTKDWSSQWDR-UHFFFAOYSA-N Bromine atom Chemical compound [Br] WKBOTKDWSSQWDR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000008000 CHES buffer Substances 0.000 description 2
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000004971 Cross linker Substances 0.000 description 2
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 2
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 2
- 239000003109 Disodium ethylene diamine tetraacetate Substances 0.000 description 2
- 108010042407 Endonucleases Proteins 0.000 description 2
- 102000004533 Endonucleases Human genes 0.000 description 2
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 2
- DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N L-asparagine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N 0.000 description 2
- AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N L-isoleucine Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 2
- ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N L-leucine Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 2
- COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N L-phenylalanine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 2
- OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N L-tyrosine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 2
- 102000003960 Ligases Human genes 0.000 description 2
- 108090000364 Ligases Proteins 0.000 description 2
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229910021380 Manganese Chloride Inorganic materials 0.000 description 2
- GLFNIEUTAYBVOC-UHFFFAOYSA-L Manganese chloride Chemical compound Cl[Mn]Cl GLFNIEUTAYBVOC-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 108020005187 Oligonucleotide Probes Proteins 0.000 description 2
- 239000004743 Polypropylene Substances 0.000 description 2
- 238000012181 QIAquick gel extraction kit Methods 0.000 description 2
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 2
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 2
- 241000242743 Renilla reniformis Species 0.000 description 2
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 2
- 235000014680 Saccharomyces cerevisiae Nutrition 0.000 description 2
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 2
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- PMZURENOXWZQFD-UHFFFAOYSA-L Sodium Sulfate Chemical compound [Na+].[Na+].[O-]S([O-])(=O)=O PMZURENOXWZQFD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 108091081024 Start codon Proteins 0.000 description 2
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N Sulfuric acid Chemical compound OS(O)(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108091036066 Three prime untranslated region Proteins 0.000 description 2
- DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N Trifluoroacetic acid Chemical compound OC(=O)C(F)(F)F DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000589506 Xanthobacter Species 0.000 description 2
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 2
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 2
- QDFHPFSBQFLLSW-KQYNXXCUSA-N adenosine 2'-phosphate Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H]1OP(O)(O)=O QDFHPFSBQFLLSW-KQYNXXCUSA-N 0.000 description 2
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 2
- 238000005349 anion exchange Methods 0.000 description 2
- 125000000129 anionic group Chemical group 0.000 description 2
- 239000012736 aqueous medium Substances 0.000 description 2
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 2
- 235000003704 aspartic acid Nutrition 0.000 description 2
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 2
- OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N beta-carboxyaspartic acid Natural products OC(=O)C(N)C(C(O)=O)C(O)=O OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 2
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 description 2
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 description 2
- 239000011616 biotin Substances 0.000 description 2
- GDTBXPJZTBHREO-UHFFFAOYSA-N bromine Substances BrBr GDTBXPJZTBHREO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229910052794 bromium Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 2
- 239000001569 carbon dioxide Substances 0.000 description 2
- 229910002092 carbon dioxide Inorganic materials 0.000 description 2
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 2
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 2
- 239000002738 chelating agent Substances 0.000 description 2
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 2
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 2
- 239000013599 cloning vector Substances 0.000 description 2
- OPTASPLRGRRNAP-UHFFFAOYSA-N cytosine Chemical compound NC=1C=CNC(=O)N=1 OPTASPLRGRRNAP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- SUYVUBYJARFZHO-UHFFFAOYSA-N dATP Natural products C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1C1CC(O)C(COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 SUYVUBYJARFZHO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 2
- 229960003964 deoxycholic acid Drugs 0.000 description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 description 2
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 2
- 229940079919 digestives enzyme preparation Drugs 0.000 description 2
- 235000019301 disodium ethylene diamine tetraacetate Nutrition 0.000 description 2
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 2
- 235000013922 glutamic acid Nutrition 0.000 description 2
- 239000004220 glutamic acid Substances 0.000 description 2
- UYTPUPDQBNUYGX-UHFFFAOYSA-N guanine Chemical compound O=C1NC(N)=NC2=C1N=CN2 UYTPUPDQBNUYGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 description 2
- 230000003301 hydrolyzing effect Effects 0.000 description 2
- 238000003384 imaging method Methods 0.000 description 2
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 2
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 2
- 229910052740 iodine Inorganic materials 0.000 description 2
- 229920000831 ionic polymer Polymers 0.000 description 2
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 2
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 2
- 229910001629 magnesium chloride Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000011565 manganese chloride Substances 0.000 description 2
- 235000002867 manganese chloride Nutrition 0.000 description 2
- 229940099607 manganese chloride Drugs 0.000 description 2
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 2
- VUZPPFZMUPKLLV-UHFFFAOYSA-N methane;hydrate Chemical compound C.O VUZPPFZMUPKLLV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000035118 modified proteins Human genes 0.000 description 2
- 108091005573 modified proteins Proteins 0.000 description 2
- 229930027945 nicotinamide-adenine dinucleotide Natural products 0.000 description 2
- BOPGDPNILDQYTO-NNYOXOHSSA-N nicotinamide-adenine dinucleotide Chemical compound C1=CCC(C(=O)N)=CN1[C@H]1[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OC[C@@H]2[C@H]([C@@H](O)[C@@H](O2)N2C3=NC=NC(N)=C3N=C2)O)O1 BOPGDPNILDQYTO-NNYOXOHSSA-N 0.000 description 2
- 239000002751 oligonucleotide probe Substances 0.000 description 2
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 2
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 2
- 229920001155 polypropylene Polymers 0.000 description 2
- 230000009465 prokaryotic expression Effects 0.000 description 2
- 230000001902 propagating effect Effects 0.000 description 2
- 239000000376 reactant Substances 0.000 description 2
- 238000012950 reanalysis Methods 0.000 description 2
- 238000004064 recycling Methods 0.000 description 2
- 230000003578 releasing effect Effects 0.000 description 2
- 229930195734 saturated hydrocarbon Natural products 0.000 description 2
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 2
- 238000007423 screening assay Methods 0.000 description 2
- FHHPUSMSKHSNKW-SMOYURAASA-M sodium deoxycholate Chemical compound [Na+].C([C@H]1CC2)[C@H](O)CC[C@]1(C)[C@@H]1[C@@H]2[C@@H]2CC[C@H]([C@@H](CCC([O-])=O)C)[C@@]2(C)[C@@H](O)C1 FHHPUSMSKHSNKW-SMOYURAASA-M 0.000 description 2
- 229910052938 sodium sulfate Inorganic materials 0.000 description 2
- 235000011152 sodium sulphate Nutrition 0.000 description 2
- WUWHFEHKUQVYLF-UHFFFAOYSA-M sodium;2-aminoacetate Chemical compound [Na+].NCC([O-])=O WUWHFEHKUQVYLF-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 238000000527 sonication Methods 0.000 description 2
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 2
- 230000001629 suppression Effects 0.000 description 2
- 239000004094 surface-active agent Substances 0.000 description 2
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 2
- RWQNBRDOKXIBIV-UHFFFAOYSA-N thymine Chemical compound CC1=CNC(=O)NC1=O RWQNBRDOKXIBIV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000014621 translational initiation Effects 0.000 description 2
- LWIHDJKSTIGBAC-UHFFFAOYSA-K tripotassium phosphate Chemical compound [K+].[K+].[K+].[O-]P([O-])([O-])=O LWIHDJKSTIGBAC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 2
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 2
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 2
- BPHPUYQFMNQIOC-MBOVONDJSA-N (2r,3r,4s,5r)-2-(hydroxymethyl)-6-propan-2-ylsulfanyloxane-3,4,5-triol Chemical compound CC(C)SC1O[C@H](CO)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O BPHPUYQFMNQIOC-MBOVONDJSA-N 0.000 description 1
- QVLAWKAXOMEXPM-UHFFFAOYSA-N 1,1,1,2-tetrachloroethane Chemical compound ClCC(Cl)(Cl)Cl QVLAWKAXOMEXPM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- NWUYHJFMYQTDRP-UHFFFAOYSA-N 1,2-bis(ethenyl)benzene;1-ethenyl-2-ethylbenzene;styrene Chemical compound C=CC1=CC=CC=C1.CCC1=CC=CC=C1C=C.C=CC1=CC=CC=C1C=C NWUYHJFMYQTDRP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- VFWCMGCRMGJXDK-UHFFFAOYSA-N 1-chlorobutane Chemical compound CCCCCl VFWCMGCRMGJXDK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- KJCVRFUGPWSIIH-UHFFFAOYSA-N 1-naphthol Chemical compound C1=CC=C2C(O)=CC=CC2=C1 KJCVRFUGPWSIIH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- DLZKEQQWXODGGZ-KCJUWKMLSA-N 2-[[(2r)-2-[[(2s)-2-amino-3-(4-hydroxyphenyl)propanoyl]amino]propanoyl]amino]acetic acid Chemical group OC(=O)CNC(=O)[C@@H](C)NC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 DLZKEQQWXODGGZ-KCJUWKMLSA-N 0.000 description 1
- BKMMTJMQCTUHRP-UHFFFAOYSA-N 2-aminopropan-1-ol Chemical compound CC(N)CO BKMMTJMQCTUHRP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010052386 2-haloacid dehalogenase Proteins 0.000 description 1
- NKDFYOWSKOHCCO-YPVLXUMRSA-N 20-hydroxyecdysone Chemical compound C1[C@@H](O)[C@@H](O)C[C@]2(C)[C@@H](CC[C@@]3([C@@H]([C@@](C)(O)[C@H](O)CCC(C)(O)C)CC[C@]33O)C)C3=CC(=O)[C@@H]21 NKDFYOWSKOHCCO-YPVLXUMRSA-N 0.000 description 1
- LAMUXTNQCICZQX-UHFFFAOYSA-N 3-chloropropan-1-ol Chemical compound OCCCCl LAMUXTNQCICZQX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910000619 316 stainless steel Inorganic materials 0.000 description 1
- DGZSVBBLLGZHSF-UHFFFAOYSA-N 4,4-diethylpiperidine Chemical compound CCC1(CC)CCNCC1 DGZSVBBLLGZHSF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ZPLCXHWYPWVJDL-UHFFFAOYSA-N 4-[(4-hydroxyphenyl)methyl]-1,3-oxazolidin-2-one Chemical compound C1=CC(O)=CC=C1CC1NC(=O)OC1 ZPLCXHWYPWVJDL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ZCYVEMRRCGMTRW-UHFFFAOYSA-N 7553-56-2 Chemical compound [I] ZCYVEMRRCGMTRW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000589291 Acinetobacter Species 0.000 description 1
- 229930024421 Adenine Natural products 0.000 description 1
- GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N Adenine Chemical compound NC1=NC=NC2=C1N=CN2 GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000007698 Alcohol dehydrogenase Human genes 0.000 description 1
- 108010021809 Alcohol dehydrogenase Proteins 0.000 description 1
- 244000153158 Ammi visnaga Species 0.000 description 1
- 235000010585 Ammi visnaga Nutrition 0.000 description 1
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 description 1
- DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N Asparagine Natural products OC(=O)C(N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- LSNNMFCWUKXFEE-UHFFFAOYSA-M Bisulfite Chemical compound OS([O-])=O LSNNMFCWUKXFEE-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- BTBUEUYNUDRHOZ-UHFFFAOYSA-N Borate Chemical compound [O-]B([O-])[O-] BTBUEUYNUDRHOZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 1
- 241000195493 Cryptophyta Species 0.000 description 1
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 1
- 238000007399 DNA isolation Methods 0.000 description 1
- 238000001712 DNA sequencing Methods 0.000 description 1
- 101710088194 Dehydrogenase Proteins 0.000 description 1
- ZNZYKNKBJPZETN-WELNAUFTSA-N Dialdehyde 11678 Chemical compound N1C2=CC=CC=C2C2=C1[C@H](C[C@H](/C(=C/O)C(=O)OC)[C@@H](C=C)C=O)NCC2 ZNZYKNKBJPZETN-WELNAUFTSA-N 0.000 description 1
- 101000801882 Dictyostelium discoideum Putative thioredoxin-5 Proteins 0.000 description 1
- 102100029727 Enteropeptidase Human genes 0.000 description 1
- 108010013369 Enteropeptidase Proteins 0.000 description 1
- 239000004593 Epoxy Substances 0.000 description 1
- 108010074124 Escherichia coli Proteins Proteins 0.000 description 1
- 241001524679 Escherichia virus M13 Species 0.000 description 1
- JOYRKODLDBILNP-UHFFFAOYSA-N Ethyl urethane Chemical compound CCOC(N)=O JOYRKODLDBILNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000233866 Fungi Species 0.000 description 1
- 108700007698 Genetic Terminator Regions Proteins 0.000 description 1
- 101000633503 Homo sapiens Nuclear receptor subfamily 2 group E member 1 Proteins 0.000 description 1
- 101710181894 Homogentisate geranylgeranyltransferase Proteins 0.000 description 1
- DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M Ilexoside XXIX Chemical compound C[C@@H]1CC[C@@]2(CC[C@@]3(C(=CC[C@H]4[C@]3(CC[C@@H]5[C@@]4(CC[C@@H](C5(C)C)OS(=O)(=O)[O-])C)C)[C@@H]2[C@]1(C)O)C)C(=O)O[C@H]6[C@@H]([C@H]([C@@H]([C@H](O6)CO)O)O)O.[Na+] DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M 0.000 description 1
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 1
- 241000235058 Komagataella pastoris Species 0.000 description 1
- QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N L-alanine Chemical compound C[C@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N L-valine Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N Leucine Natural products CC(C)CC(N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 1
- 108010047290 Multifunctional Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 102000006833 Multifunctional Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 101710135898 Myc proto-oncogene protein Proteins 0.000 description 1
- 102100038895 Myc proto-oncogene protein Human genes 0.000 description 1
- 241000187479 Mycobacterium tuberculosis Species 0.000 description 1
- 239000000020 Nitrocellulose Substances 0.000 description 1
- 102100029534 Nuclear receptor subfamily 2 group E member 1 Human genes 0.000 description 1
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 1
- 108010033276 Peptide Fragments Proteins 0.000 description 1
- 102000007079 Peptide Fragments Human genes 0.000 description 1
- BELBBZDIHDAJOR-UHFFFAOYSA-N Phenolsulfonephthalein Chemical compound C1=CC(O)=CC=C1C1(C=2C=CC(O)=CC=2)C2=CC=CC=C2S(=O)(=O)O1 BELBBZDIHDAJOR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000004160 Phosphoric Monoester Hydrolases Human genes 0.000 description 1
- 108090000608 Phosphoric Monoester Hydrolases Proteins 0.000 description 1
- 229920000805 Polyaspartic acid Polymers 0.000 description 1
- 239000004721 Polyphenylene oxide Substances 0.000 description 1
- ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N Proline Natural products OC(=O)C1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101000702488 Rattus norvegicus High affinity cationic amino acid transporter 1 Proteins 0.000 description 1
- 108020005091 Replication Origin Proteins 0.000 description 1
- 238000012300 Sequence Analysis Methods 0.000 description 1
- AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N Threonine Natural products CC(O)C(N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004473 Threonine Substances 0.000 description 1
- RTAQQCXQSZGOHL-UHFFFAOYSA-N Titanium Chemical compound [Ti] RTAQQCXQSZGOHL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101710150448 Transcriptional regulator Myc Proteins 0.000 description 1
- XSTXAVWGXDQKEL-UHFFFAOYSA-N Trichloroethylene Chemical group ClC=C(Cl)Cl XSTXAVWGXDQKEL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N Valine Natural products CC(C)C(N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000726445 Viroids Species 0.000 description 1
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 1
- 241000589494 Xanthobacter autotrophicus Species 0.000 description 1
- 101000929861 Xanthobacter autotrophicus Haloalkane dehalogenase Proteins 0.000 description 1
- MZVQCMJNVPIDEA-UHFFFAOYSA-N [CH2]CN(CC)CC Chemical group [CH2]CN(CC)CC MZVQCMJNVPIDEA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960000643 adenine Drugs 0.000 description 1
- 239000003463 adsorbent Substances 0.000 description 1
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000001261 affinity purification Methods 0.000 description 1
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000013019 agitation Methods 0.000 description 1
- 235000004279 alanine Nutrition 0.000 description 1
- 150000001299 aldehydes Chemical class 0.000 description 1
- 150000007824 aliphatic compounds Chemical class 0.000 description 1
- 125000000746 allylic group Chemical group 0.000 description 1
- 150000001408 amides Chemical class 0.000 description 1
- 238000012870 ammonium sulfate precipitation Methods 0.000 description 1
- 238000005571 anion exchange chromatography Methods 0.000 description 1
- 239000003957 anion exchange resin Substances 0.000 description 1
- 150000001450 anions Chemical class 0.000 description 1
- 238000000137 annealing Methods 0.000 description 1
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 1
- 230000003466 anti-cipated effect Effects 0.000 description 1
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000009582 asparagine Nutrition 0.000 description 1
- 229960001230 asparagine Drugs 0.000 description 1
- 238000003287 bathing Methods 0.000 description 1
- 238000011021 bench scale process Methods 0.000 description 1
- 230000008033 biological extinction Effects 0.000 description 1
- 125000004057 biotinyl group Chemical group [H]N1C(=O)N([H])[C@]2([H])[C@@]([H])(SC([H])([H])[C@]12[H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C(*)=O 0.000 description 1
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 description 1
- VPKDCDLSJZCGKE-UHFFFAOYSA-N carbodiimide group Chemical group N=C=N VPKDCDLSJZCGKE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 150000001721 carbon Chemical group 0.000 description 1
- 235000011089 carbon dioxide Nutrition 0.000 description 1
- 150000001735 carboxylic acids Chemical class 0.000 description 1
- 125000002057 carboxymethyl group Chemical group [H]OC(=O)C([H])([H])[*] 0.000 description 1
- 239000003054 catalyst Substances 0.000 description 1
- 239000003729 cation exchange resin Substances 0.000 description 1
- 229940023913 cation exchange resins Drugs 0.000 description 1
- 150000001768 cations Chemical class 0.000 description 1
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 1
- 210000002421 cell wall Anatomy 0.000 description 1
- 238000011210 chromatographic step Methods 0.000 description 1
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 description 1
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 1
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 1
- 238000012790 confirmation Methods 0.000 description 1
- OBRMNDMBJQTZHV-UHFFFAOYSA-N cresol red Chemical compound C1=C(O)C(C)=CC(C2(C3=CC=CC=C3S(=O)(=O)O2)C=2C=C(C)C(O)=CC=2)=C1 OBRMNDMBJQTZHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- XLJMAIOERFSOGZ-UHFFFAOYSA-M cyanate Chemical compound [O-]C#N XLJMAIOERFSOGZ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 description 1
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940104302 cytosine Drugs 0.000 description 1
- 238000000354 decomposition reaction Methods 0.000 description 1
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 1
- 238000005237 degreasing agent Methods 0.000 description 1
- 230000003111 delayed effect Effects 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 239000003599 detergent Substances 0.000 description 1
- RAABOESOVLLHRU-UHFFFAOYSA-N diazene Chemical group N=N RAABOESOVLLHRU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940111685 dibasic potassium phosphate Drugs 0.000 description 1
- ZPWVASYFFYYZEW-UHFFFAOYSA-L dipotassium hydrogen phosphate Chemical compound [K+].[K+].OP([O-])([O-])=O ZPWVASYFFYYZEW-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 230000008034 disappearance Effects 0.000 description 1
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 230000009977 dual effect Effects 0.000 description 1
- 239000000975 dye Substances 0.000 description 1
- 238000002635 electroconvulsive therapy Methods 0.000 description 1
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 1
- 239000003995 emulsifying agent Substances 0.000 description 1
- 239000000839 emulsion Substances 0.000 description 1
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 1
- 230000006862 enzymatic digestion Effects 0.000 description 1
- 230000007071 enzymatic hydrolysis Effects 0.000 description 1
- 238000006047 enzymatic hydrolysis reaction Methods 0.000 description 1
- 238000009585 enzyme analysis Methods 0.000 description 1
- 238000001952 enzyme assay Methods 0.000 description 1
- 125000003700 epoxy group Chemical group 0.000 description 1
- QUSNBJAOOMFDIB-UHFFFAOYSA-O ethylaminium Chemical group CC[NH3+] QUSNBJAOOMFDIB-UHFFFAOYSA-O 0.000 description 1
- 229940071106 ethylenediaminetetraacetate Drugs 0.000 description 1
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000010195 expression analysis Methods 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 1
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 description 1
- 229910052731 fluorine Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000012458 free base Substances 0.000 description 1
- 230000008014 freezing Effects 0.000 description 1
- 238000007710 freezing Methods 0.000 description 1
- 239000012737 fresh medium Substances 0.000 description 1
- 238000004817 gas chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000001641 gel filtration chromatography Methods 0.000 description 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000013905 glycine and its sodium salt Nutrition 0.000 description 1
- 239000004247 glycine and its sodium salt Substances 0.000 description 1
- 150000002334 glycols Chemical class 0.000 description 1
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 1
- PJJJBBJSCAKJQF-UHFFFAOYSA-N guanidinium chloride Chemical compound [Cl-].NC(N)=[NH2+] PJJJBBJSCAKJQF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- YVWGMAFXEJHFRO-UHFFFAOYSA-N halopropane Chemical compound FC(F)C(F)(F)CBr YVWGMAFXEJHFRO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229950000188 halopropane Drugs 0.000 description 1
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 description 1
- 125000004435 hydrogen atom Chemical group [H]* 0.000 description 1
- 125000002887 hydroxy group Chemical group [H]O* 0.000 description 1
- QWPPOHNGKGFGJK-UHFFFAOYSA-N hypochlorous acid Chemical compound ClO QWPPOHNGKGFGJK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 1
- 229940027941 immunoglobulin g Drugs 0.000 description 1
- 230000001771 impaired effect Effects 0.000 description 1
- 238000005470 impregnation Methods 0.000 description 1
- 230000001976 improved effect Effects 0.000 description 1
- 239000003262 industrial enzyme Substances 0.000 description 1
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 230000002458 infectious effect Effects 0.000 description 1
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 1
- 239000002054 inoculum Substances 0.000 description 1
- 239000002198 insoluble material Substances 0.000 description 1
- 238000010813 internal standard method Methods 0.000 description 1
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 1
- 239000011630 iodine Substances 0.000 description 1
- 238000004255 ion exchange chromatography Methods 0.000 description 1
- 239000003456 ion exchange resin Substances 0.000 description 1
- 229920003303 ion-exchange polymer Polymers 0.000 description 1
- AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N isoleucine Natural products CCC(C)C(N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960000310 isoleucine Drugs 0.000 description 1
- 150000002542 isoureas Chemical class 0.000 description 1
- 238000002386 leaching Methods 0.000 description 1
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 1
- 239000000314 lubricant Substances 0.000 description 1
- KNJDBYZZKAZQNG-UHFFFAOYSA-N lucigenin Chemical compound [O-][N+]([O-])=O.[O-][N+]([O-])=O.C12=CC=CC=C2[N+](C)=C(C=CC=C2)C2=C1C1=C(C=CC=C2)C2=[N+](C)C2=CC=CC=C12 KNJDBYZZKAZQNG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000012139 lysis buffer Substances 0.000 description 1
- 239000011777 magnesium Substances 0.000 description 1
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 description 1
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 1
- 230000004060 metabolic process Effects 0.000 description 1
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 1
- 229910021645 metal ion Inorganic materials 0.000 description 1
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 description 1
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 description 1
- 239000003607 modifier Substances 0.000 description 1
- 239000003068 molecular probe Substances 0.000 description 1
- 229940111688 monobasic potassium phosphate Drugs 0.000 description 1
- 235000019796 monopotassium phosphate Nutrition 0.000 description 1
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 1
- 229920001220 nitrocellulos Polymers 0.000 description 1
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000012038 nucleophile Substances 0.000 description 1
- 150000002482 oligosaccharides Polymers 0.000 description 1
- 150000002894 organic compounds Chemical class 0.000 description 1
- 239000003960 organic solvent Substances 0.000 description 1
- 230000010355 oscillation Effects 0.000 description 1
- 230000003204 osmotic effect Effects 0.000 description 1
- 125000004430 oxygen atom Chemical group O* 0.000 description 1
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 1
- 230000008823 permeabilization Effects 0.000 description 1
- 239000012466 permeate Substances 0.000 description 1
- 239000000575 pesticide Substances 0.000 description 1
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 1
- 229960003531 phenolsulfonphthalein Drugs 0.000 description 1
- COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N phenylalanine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 150000008300 phosphoramidites Chemical class 0.000 description 1
- 229920003023 plastic Polymers 0.000 description 1
- 239000004033 plastic Substances 0.000 description 1
- 229920001467 poly(styrenesulfonates) Polymers 0.000 description 1
- 108010064470 polyaspartate Proteins 0.000 description 1
- 229920000570 polyether Polymers 0.000 description 1
- 229920001601 polyetherimide Polymers 0.000 description 1
- 229920000151 polyglycol Polymers 0.000 description 1
- 239000010695 polyglycol Substances 0.000 description 1
- 229910052700 potassium Inorganic materials 0.000 description 1
- GNSKLFRGEWLPPA-UHFFFAOYSA-M potassium dihydrogen phosphate Chemical compound [K+].OP(O)([O-])=O GNSKLFRGEWLPPA-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 229940093916 potassium phosphate Drugs 0.000 description 1
- 229910000160 potassium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011009 potassium phosphates Nutrition 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 210000001236 prokaryotic cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000004952 protein activity Effects 0.000 description 1
- 235000004252 protein component Nutrition 0.000 description 1
- 238000002331 protein detection Methods 0.000 description 1
- 230000002797 proteolythic effect Effects 0.000 description 1
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 1
- 125000001453 quaternary ammonium group Chemical group 0.000 description 1
- 239000012429 reaction media Substances 0.000 description 1
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 1
- 230000035484 reaction time Effects 0.000 description 1
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 1
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 1
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 1
- 230000008929 regeneration Effects 0.000 description 1
- 238000011069 regeneration method Methods 0.000 description 1
- 230000022532 regulation of transcription, DNA-dependent Effects 0.000 description 1
- 230000004044 response Effects 0.000 description 1
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 1
- SIOLHBFVZMHKPF-FMJGGDQGSA-N s tag peptide Chemical group C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC=CC=1)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CCCCN)C(C)O)C1=CN=CN1 SIOLHBFVZMHKPF-FMJGGDQGSA-N 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 238000005070 sampling Methods 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 230000035939 shock Effects 0.000 description 1
- 230000011664 signaling Effects 0.000 description 1
- 239000000741 silica gel Substances 0.000 description 1
- 229910002027 silica gel Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000002002 slurry Substances 0.000 description 1
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 1
- 229910052708 sodium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 229940029258 sodium glycinate Drugs 0.000 description 1
- 239000001488 sodium phosphate Substances 0.000 description 1
- 229910000162 sodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 description 1
- 125000006850 spacer group Chemical group 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 230000009870 specific binding Effects 0.000 description 1
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 1
- 229910001220 stainless steel Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000010935 stainless steel Substances 0.000 description 1
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 1
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 1
- 229910052717 sulfur Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000001502 supplementing effect Effects 0.000 description 1
- FBWNMEQMRUMQSO-UHFFFAOYSA-N tergitol NP-9 Chemical compound CCCCCCCCCC1=CC=C(OCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCO)C=C1 FBWNMEQMRUMQSO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000010257 thawing Methods 0.000 description 1
- 238000009210 therapy by ultrasound Methods 0.000 description 1
- WXXFXPKBLGEIRF-UHFFFAOYSA-M thiocyanatomercury Chemical class [Hg]SC#N WXXFXPKBLGEIRF-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 229940113082 thymine Drugs 0.000 description 1
- PRZSXZWFJHEZBJ-UHFFFAOYSA-N thymol blue Chemical compound C1=C(O)C(C(C)C)=CC(C2(C3=CC=CC=C3S(=O)(=O)O2)C=2C(=CC(O)=C(C(C)C)C=2)C)=C1C PRZSXZWFJHEZBJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052719 titanium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000010936 titanium Substances 0.000 description 1
- 230000005030 transcription termination Effects 0.000 description 1
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 description 1
- YNDXUCZADRHECN-JNQJZLCISA-N triamcinolone acetonide Chemical compound C1CC2=CC(=O)C=C[C@]2(C)[C@]2(F)[C@@H]1[C@@H]1C[C@H]3OC(C)(C)O[C@@]3(C(=O)CO)[C@@]1(C)C[C@@H]2O YNDXUCZADRHECN-JNQJZLCISA-N 0.000 description 1
- UBOXGVDOUJQMTN-UHFFFAOYSA-N trichloroethylene Natural products ClCC(Cl)Cl UBOXGVDOUJQMTN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K trisodium phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[O-]P([O-])([O-])=O RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 229910052721 tungsten Inorganic materials 0.000 description 1
- OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N tyrosine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 description 1
- 241000701447 unidentified baculovirus Species 0.000 description 1
- 239000004474 valine Substances 0.000 description 1
- 229910052720 vanadium Inorganic materials 0.000 description 1
- 210000002845 virion Anatomy 0.000 description 1
- 230000000007 visual effect Effects 0.000 description 1
- 239000003039 volatile agent Substances 0.000 description 1
- 239000002699 waste material Substances 0.000 description 1
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N β‐Mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N11/00—Carrier-bound or immobilised enzymes; Carrier-bound or immobilised microbial cells; Preparation thereof
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
- C12N15/52—Genes encoding for enzymes or proenzymes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
- C12P7/02—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a hydroxy group
- C12P7/04—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a hydroxy group acyclic
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
- C12P7/02—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a hydroxy group
- C12P7/04—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a hydroxy group acyclic
- C12P7/16—Butanols
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02E—REDUCTION OF GREENHOUSE GAS [GHG] EMISSIONS, RELATED TO ENERGY GENERATION, TRANSMISSION OR DISTRIBUTION
- Y02E50/00—Technologies for the production of fuel of non-fossil origin
- Y02E50/10—Biofuels, e.g. bio-diesel
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Immobilizing And Processing Of Enzymes And Microorganisms (AREA)
Abstract
본 발명은 할로겐화 지방족 기질 분자를 vic-할로히드린으로 전환할 수 있는 할로지방족 탈할로겐화 효소, 및 이 효소의 폴리펩티드를 코딩하는 DNA 서열, 이 DNA가 들어있는 발현 제작물, 이 발현 제작물을 숙주 세포에 넣어 이 형질전환체가 탈할로겐화 효소를 생산하기에 충분한 조건에서 효소를 제조하는 방법에 관한 것이다. 고체 지지체에 효소를 고정시키는 방법 및 이 고정된 효소의 할로겐화 지방족 탄화수소를 알코올로 전환시키기 위한 용도도 개시되어 있다.
Description
단쇄 할로겐화 지방족 탄화수소 (HAH)는 유기 용매, 탈지제(脫脂劑), 살충제, 다른 각종 유기 화합물 합성의 중간체, 플라스틱의 제조에서의 중간체로 사용하기 위해서 다량 생산된다. 이들 할로겐화 화합물을 공업 공정에서 대규모로 사용하면, 여기서 발생하는 저급 부산물을 개량하거나 재활용할 수 있는 새로운 기술이 필요하다.
화학적 제조 공정에서 부산물로 생산된 과량의 HAH는 연소시켜서 열을 발생시킬 수 있으며, 어떤 경우에는 저급 출발 물질로 재활용되어 폐기물이나 과량의 부산물로부터 어느 정도 회수할 수 있다. 복잡한 미생물 환경 (자연, 물 처리 공장 등)에서는 HAH 분해가 미생물에 의한 생분해를 통해 이루어진다. HAH를 생분해하면 이산화탄소, 물 및 염산 (할로겐이 염소인 경우)이 생성된다.
미국 특허 제4,853,334호 및 미국 특허 제4,877,736호에는 특정 미생물을 써서 HAH를 이산화탄소, 물, 염산으로 생분해하는 방법이 개시되어 있다. 미국 특허 제4,749,491호에는 염소화 지방족 탄화수소의 분해 방법을 개시하고 있으나 관련 미생물을 특정하지는 않았다. 또한 아시네토박터(Acinetobacter) 종에 의한 트리클로로에틸렌의 호기성 대사작용도 문헌 (Nelson et al., Appl. Environ. Microbiol., 52: 383-384 (1986))에 보고되어 있다. 문헌 (Vogel et al., Environ. Sci. Technol., 21: 722-736 (1987))에는 환경에서 일어나는 할로겐화 지방족 화합물의 분해가 개괄적으로 설명되어 있다. 미국 특허 제5,372,944호는 HAH를 할로히드린으로 전환시키는 탈할로겐화 효소를 생산하는 로도코쿠스 (Rhodoccocus) 종을 개시하고 있다. 그러나 이런 문헌들은 세포계에 크게 의존하는데 그치고, 고정된 활성 개질 효소를 연속 공급 공정에 사용했을 때 얻을 수 있는 이점을 이용하지는 않았다. 가장 적절한 것은 야생형 또는 돌연변이 세포를 포함하는 로도코쿠스 배양에 의존하는 미국 특허 제5,372,944호이다. 그러나 이 문헌에서 설명한 돌연변이 기법은 재조합 DNA 방법을 사용하는 것은 아니어서, 탈할로겐화 효소의 활성 및 발현을 개선시키는 것과 관련해서 재조합 DNA 방법이 제공하는 이점을 이용하지는 못했다.
세포 배양에 의한 HAH의 생분해에 의존하는 것보다는, 연속 공급 방법에 맞게 용이하게 조화시킬 수 있는 개선된 재조합 효소를 사용하는 것이 HAH를 다른 유용한 생성물을 제조하는데 사용하기에 유용한 중간체, 예를 들면 폴리우레탄 제조용 폴리에테르 제조에 있어서의 화학적 중간체 또는 윤활제, 계면활성제, 유화제 등의 제조용 글리콜 및 폴리글리콜 제조에 있어서의 화학적 중간체 등으로 효과적으로 전환시킬 수 있기 때문에 유리하다.
본 발명은 도 2의 아미노산 서열 1-292 잔기와 실질적으로 상동인 아미노산 서열을 포함하며, HAH를 vic-할로히드린 (비시날 할로히드린)으로 전환시킬 수 있는 재조합 효소에 관한 것이다. 본 발명의 다른 목적은 그러한 효소를 포함하는 폴리펩티드를 코딩하는 DNA 서열을 제공하는 것이며, 더 구체적으로는 도 2의 염기 37-912의 뉴클레오타이드 서열과 실질적으로 상동인 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 DNA 서열을 제공하는 것이다.
본 발명의 또다른 목적은 그런 DNA 서열(들)을 포함하는 벡터 및 이 벡터를 숙주 세포에 넣고 이 형질전환체가 탈할로겐화 효소를 제조할 수 있는 조건에서 이 숙주 세포를 증식시키는 것을 포함하는 폴리펩티드의 제조 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또다른 목적은 고체 지지체 상에 고정된 효소 형태, 및 이 고정된 효소와 HAH를 접촉시키는 것을 포함하는, HAH를 알코올 또는 할로히드린으로 전환시키는 방법을 제공하는 것이다.
도 1은 pEXPROK 벡터의 플라스미드 지도를 보여준다. pEXPROK 플라스미드는 Ptac 프로모터 및 5S, T1T2 종료 서열(terminator sequence)이 들어있는 시판되는 플라스미드인 pPROK-1 (Clontech 제품, 미국 캘리포니아주 마운틴 뷰 소재)에서 유래된 것이다. 도 1에서 T1T2 영역은 "Term"으로 표시했다. 이 플라스미드는 pPROK-1 다중 클로닝 위치를 한쌍의 올리고뉴클레오타이드로 대체하여 만들었는데, 이 한쌍의 올리고뉴클레오타이드는 링커에 Nco I, Hind III, Xho I, Nhe I, 및 Not I 제한 위치를 들여온다. Nco I 위치의 ATG 서열은 기능적인 프레임내 (in-frame) 출발 위치이다. Nhe I 위치 다음에는 EXFLAG 링커 서열이 온다. EXFLAG 링커의 서열은 도 2의 뉴클레오타이드 919-975에 해당하며, 도 2에 나타낸 RDh1 단백질 서열의 아미노산 295-315를 코딩한다.
도 2 (도 2a 및 2b)는 로도코쿠스 로도크로우스 (Rhodococus rhodochrous) TDTM003 할로알칸 탈할로겐화 효소로 추정되는 효소를 코딩하는 뉴클레오타이드 및 이 뉴클레오타이드 서열에서 유도된 아미노산 서열을 보여준다. 아미노산 잔기 1-292는 로도코쿠스 탈할로겐화 효소 (RDhl) 구조 유전자에 해당하며, 뉴클레오타이드 37-912에 의해 코딩된다. 아미노산 잔기 -12 내지 -1 (뉴클레오타이드 1-36)은 폴리히스티딘을 포함하는 아미노 말단 테일이며, 잔기 -12 및 -11는 번역 출발점 및 Nco I 클로닝 위치 모두를 형성하는데 참여한다. 아미노산 잔기 293-294 (뉴클레오타이드 913-918)는 Nhe I 클로닝 위치에 의해 코딩되며, 그에 뒤에 오는 아미노산 295-305는 본원에서 EXFLAG 펩티드라고 부른다. EXFLAG 링커 (뉴클레오타이드 919-975)는 EXFLAG 펩티드 및 이중 번역(dual translational) 중단 위치 (각각 별표(*)로 표시)를 코딩한다.
도 3은 pEXPROK-RDhl 벡터의 플라스미드 지도를 보여준다.
도 4 (도 4a 및 4b)는 추정(推定) 로도코쿠스 로도크로우스 TDTM003 할로알칸 탈할로겐화 효소, 크산토박터 오토트로피쿠스 (Xanthobacter autotrophicus) GJ10 탈할로겐화 효소, 레닐라 레니포르미스 (Renilla reniformis) 루시페린 모노옥시게나제, 슈도모나스 (Pseudomonas) 종 LinB 유전자 생성물 (테트라클로로시클로헥사디엔 히드롤라제)의 비교 배열 차트이다.
도 5는 IPTG 유도 Ptac 전사 프로모터의 조절을 받는 추정 로도코쿠스 로도크로우스 TDTM003 할로알칸 탈할로겐화 효소 유전자가 포함된 pRDhl-KO2.3-EXPROK 벡터의 플라스미드 지도이다.
도 6은 T7 전사 프로모터의 조절을 받는 추정 로도코쿠스 로도크로우스 TDTM003 할로알칸 탈할로겐화 효소 유전자가 포함된 pRSET-RDhl 벡터의 플라스미드 지도이다.
도 7은 trc 전사 프로모터의 조절을 받는 추정 로도코쿠스 로도크로우스 TDTM003 할로알칸 탈할로겐화 효소 유전자가 포함된 pTrcHis-RDhl 벡터의 플라스미드 지도이다.
도 8은 대장균 (E. coli) 티오레독신을 코딩하는 유전자에 융합된 추정 로도코쿠스 로도크로우스 TDTM003 할로알칸 탈할로겐화 효소 유전자의 변형 형태를 포함하는 고수준 발현 pTrxFus-RDhl 벡터의 플라스미드 지도이며, 여기서 결합된 융합 유전자는 PL전사 프로모터의 조절을 받는다.
도 9는 pEXPROK-RDhl 클론을 발현하는 세포로부터 얻은 세포 용해물 (lysate) 샘플을 부분적으로 정제된 rRDhl 효소와 비교한 SDS-PAGE 겔의 영상이다.
도 10은 도 9의 것과 동일한 SDS-PAGE 겔의 항-FLAG 항체 면역블롯의 영상이다.
도 11은 pRSET-RDhl을 발현하는 세포로부터 얻은 세포 유리 추출물의 SDS-PAGE 겔의 영상이다.
도 12는 도 11의 것과 동일한 SDS-PAGE 겔의 항-FLAG 항체 면역블롯의 영상이다.
도 13은 pTrcHis-RDhl을 발현하는 세포로부터 얻은 세포 유리 추출물의 SDS-PAGE 겔의 영상이다.
도 14는 도 13의 것과 동일한 SDS-PAGE 겔의 항-FLAG 항체 면역블롯의 영상이다.
도 15은 pTrxFus-RDhl을 발현하는 세포로부터 얻은 세포 유리 추출물의 SDS-PAGE 겔의 영상이다.
도 16는 기질인 1,2,3-트리클로로프로판에 작용하는 효소 고정 생물반응기의 생산성 프로파일이다.
도 17은 EPPCR-돌연변이 로도코쿠스 로도크로우스 할로알칸 탈할로겐화 효소의 활성을 나타낸 막대 그래프이다.
도 18은 EPPCR-돌연변이 로도코쿠스 로도크로우스 할로알칸 탈할로겐화 효소의 활성을 나타낸 막대 그래프이다.
도 19는 카르복시 말단 S-Tag 폴리펩티드 테일을 보유한 RDhl 효소 및 카르복시 말단 EXFLAG 폴리펩티드 테일을 보유한 RDhl 효소에 대한 효소 활성 데이타 그래프이다.
본 발명은 로도코쿠스 속(屬)에 속하는 미생물로부터 할로지방족 탈할로겐화 효소 활성이 있는 펩티드를 코딩하는 DNA 서열을 얻고, 이 DNA 서열을 그 자체로 또는 변형시켜서 벡터에 통합시켜 재조합 DNA 서열을 만들고, 이 재조합 벡터로 미생물을 형질전환시킨 철저한 연구의 결과이다. 형질전환체를 탈할로겐화 효소 활성도에 대해 스크리닝하여, 활성이 높은 것으로부터 탈할로겐화 효소를 단리했다. 그 다음은 고체 지지체 고정계 여러 개를 평가하여, 효소가 할로겐화 지방족 탄화수소를 알코올 또는 할로히드린으로 효과적으로 전환시킬 수 있는 효소-지지체 조합을 밝혀냈다.
고정된 탈할로겐화 효소를 사용하여 전환시킬 할로겐화 지방족 탄화수소 (HAH)로는 둘 이상의 할로겐 원자가 결합되어 있되, 이 할로겐 원자들 가운데 적어도 2개가 인접한 탄소 원자에 존재하는 C2-C10지방족 탄화수소 분자 및 기 등이 있다. 바람직한 HAH는 1 개 이상의 할로겐이 분자 또는 기에서 제1 위치를 차지하는 포화 탄화수소이며, 더 바람직한 것은 오직 1 개의 할로겐이 동일한 탄소 원자에 존재하는 것들이다. 특히 바람직한 HAH는 1,2-디할로기가 있는 포화 탄화수소로서, 그 예로는 1,2-디할로에탄, 1,2-디할로프로판, 1,2-디할로부탄, 1,2,3-트리할로프로판 분자 및 기가 있다. 이런 부류로는 예를 들면 1,2-디클로로에탄, 1,2-디클로로프로판, 1,2-디클로로부탄, 1,2,3-트리클로로프로판, 1,2-디브로모-3-클로로프로판 분자 및 기가 있다.
본원에서 사용된 용어 "할로겐"은 염소, 브롬 또는 요오드를 의미한다. 바람직한 할로겐은 브롬 및 염소이다. 가장 바람직한 할로겐은 염소이고, 가장 바람직한 HAH 중에는 휘발성 염소화 지방족 탄화수소 (VCAH) 분자 및 기가 있고, 특히 바람직한 VCAH는 1,2-디클로로프로판 및 1,2,3-트리클로로프로판 분자 및 기이다.
본원에서 사용된 용어 "할로히드린"은 비시날(vic-) 할로히드린, 즉 카르복실산 이외에, 분자 내에서 인접한 탄소 원자에 히드록실 치환체 및 할로겐 치환체 모두를 포함하는 모든 지방족 유기 화합물을 의미한다.
본원에서 "면역블롯" 및 "면역블롯팅"이란 용어는 1) 전기영동 겔, 예를 들면 PAGE용 폴리아크릴아미드 겔에서 단백질(들)을 단백질 결합막으로 옮긴 후, 2) 이 막에 옮겨진 것들 가운데 포함되어 있을 수 있는 단백질 성분에 특이적인 항체로 막을 탐침시키고, 3) 이 항체의 위치를 당업계에 잘 알려진 임의의 각종 발색 방법, 예를 들면 항체에 직접 또는 간접적으로 결합하는 칼라 마커에서 색을 유발하는 등의 방법으로 확인하는 과정을 의미한다. 면역블롯팅 방법의 예가 웨스턴 블롯이다.
본원에서 "투과성화하다", "투과성", 및 "투과성화"란 용어는 어떤 것을 투과성이 되도록 만드는 방법, 예를 들면 세포벽을 투과성이 되도록 하는 방법을 지시한다. 본원에서 사용된 용어 "초음파 처리"는 시험관이나 그 밖의 용기의 내용물을 완전히 혼합하기 위해 초음파를 써서 그 내용물을 급속히 진동시키는 것을 의미한다. 본원에서 "볼텍스"란 용어는 시험관의 내용물을 혼합하기 위해서 시험관의 상부는 움직이지 않도록 손으로 잡고 그 하부는 기계적으로 소용돌이 모양으로 움직이게 하는 것을 의미한다.
본원에서 사용된 말인 "선택가능한"이란 "선택될 수 있는"이란 의미이다. 예를 들면 "선택가능한 마커(또는 선택 마커)" 또는 "우성(優性) 선택가능한 마커 (또는 선택 마커)"란 구절은 예를 들면, 어떤 유전자가 항생제 내성 효소를 코딩하고 있어서, 그것이 있으면 숙주 세포가 상응하는 선택 배지 (예를 들면 그 항생제가 들어있는 증식 배지) 내에서 증식할 수 있게 만드는 유전적 특질을 나타낸다. 그러한 유전적 특질을 RDhl 효소를 코딩하는 유전자가 포함된 플라스미드에 도입하고 이 플라스미드를 받아들이도록 세포를 처리하면, 선택 배지에서 이 세포를 증식시킬 때 실제로 그 플라스미드를 수용한 세포만 선택적으로 증식하고, 플라스미드를 받아들이지 않았거나 보유하지 않은 세포들은 증식하지 못하다. 이를 통해서 RDhl 유전자가 있는 세포를 쉽게 밝혀낼 수 있다.
본원에서 쓰인 "발현 제작물"이란 용어는 플라스미드, 바이러스, 비리온, 비로이드, 전좌(轉座) 요소 (transposable element), cos-제작물, 감염성 담체 결합 DNA 가닥 (예를 들면 DNA 코팅된 "유전자 총" 펠렛 또는 DNA 코팅된 천연 또는 합성 히스톤형 입자), 또는 그 밖에 당업계에 알려진 DNA 대 세포 운반계를 의미한다.
본원에서는 아미노산 서열을 설명하는데 다음의 한 문자 명명법을 적용했다.
A, a : 알라닌 (Ala) M, m : 메티오닌 (Met)
C, c : 시스테인 (Cys) N, n : 아스파라진 (Asn)
D, d : 아스파르트산 (Asp) P, p : 프롤린 (Pro)
E, e : 글루탐산 (Glu) Q, q : 글루타민 (Gln)
F, f : 페닐알라닌 (Phe) R, r : 아르기닌 (Arg)
G, g : 글리신 (Gly) S, s : 세린 (Ser)
H, h : 히스티딘 (His) T, t : 트레오닌 (Thr)
I, i : 이소루이신 (Ile) V, v : 발린 (Val)
K, k : 라이신 (Lys) W, w : 트립토판 (Trp)
L, l : 루이신 (Leu) Y, y : 티로신 (Tyr)
본원에서는 DNA 서열을 설명하는데 다음과 같은 한 문자 명명법을 적용했다.
A : 아데닌 G : 구아닌 C : 시토신 T : 티민
N : A, C, G 또는 T
R : A 또는 G
Y : C 또는 T
다음의 약자 및 정의가 본원에 사용된다.
@ : ∼에서, 예를 들면 @37 ℃는 "37 ℃"에서, @60분은 "60 분에서"를 의미.
Å : 옹스트롬 (1 옹스트롬은 1 x 10-10미터)
A : 흡광도, 예를 들어 A280은 280 nm에서 측정된 흡광도이다.
a.a.: 아미노산
Amp : 암피실린
2-AMP : 2-아미노프로판올
AMPSO : 3-[(1,1-디메틸-2-히드록시에틸)아미노]-2-히드록시-프로판술폰산
ATCC : 아메리칸 타입 컬쳐 컬렉션 (미국 메릴랜드주 록크빌 소재)
염기(base): 폴리뉴클레오타이드의 일부인 뉴클레오타이드
bp : 염기쌍
CAPSO : 3-(시클로헥실아미노)-2-히드록시-1-프로판술폰산
CD : 콤팩트 디스크
CHES : 2-(N-시클로헥실아미노)에탄술폰산
CM : 카르복시메틸
CnBr : 브롬화 시아노겐
Δ: 변화 또는 차이, 예를 들면 ΔA는 흡광도 변화를 의미함
dATP : 데옥시아데노신 트리포스페이트
DCB : 1,4-디클로로부탄
DCH : 2,3-디클로로-1-프로판올
dCTP : 데옥시시티딘 트리포스페이트
DEAE : 디에틸아미노에틸
dGTP : 데옥시구아노신 트리포스페이트
dTTP : 데옥시티미딘 트리포스페이트
EDTA : 에틸렌디아민 테트라아세트산 또는 에틸렌디아민 테트라아세테이트
EPPCR : 오류 발생 (error-prone) 중합효소 연쇄 반응
GC : 기체 크로마토그래피
GIA : 글루타르알데히드
gm : 그램
hr : 시간
Hz : 헤르츠 (1 초당 사이클수, 주파수 측정 단위)
ID : 내부 직경
Ig : 면역글로불린, 예를 들면 IgG는 면역글로불린 G임
IPTG : 이소프로필티오갈락토피라노시드
IUB : 국제생화학회
kbp : 킬로염기쌍
kD : 킬로 달톤 (1 달톤은12O 원자의 1/12에 해당하는 무게이다)
K : 억제 상수
LB : 루리아 배양액
㎍ : 마이크로그램
㎕ : 마이크로리터
μM : 마이크로몰 농도
μmole : 마이크로몰
M : 몰 농도 (용액 1 리터에 들어있는 용질의 몰수)
mg : 밀리그램
min : 분
mL : 밀리리터
mm : 밀리미터
mM : 밀리몰 농도
MW : 분자량
N : 노르말 농도 (용액 1 리터당 화학적 활성 용질기의 몰 수, 예를 들면 H2SO4는 두 개의 활성 수소가 있으므로 1 M H2SO4는 2 N 용액이다)
nm : 나노미터
ng : 나노그램
NP-40 : 나녹시놀 : p-(n-C9H19)-C6H4-(OCH2CH2)nOH, 또는 노닐페녹시폴리에톡시에탄올 (비이온성 세정제 계면활성제)로 불림
OD : 흡광도, 예를 들면 OD600은 600 nm에서 측정한 흡광도임
올리고(oligo) : 올리고뉴클레오타이드
p__ : 플라스미드, 예를 들면 pRSET, pTrcHis, pTrxFus, 또는 pUC
PAGE : 폴리아크릴아미드 겔 전기영동
PCR : 중합효소 연쇄 반응
PEI : 폴리에틸렌이민
pfu : 플라크 형성 단위
파아지(Phage) : 박테리오파아지
QAE : 4급 에틸 암모늄 (음이온 교환기)
RDhl : 로도코쿠스 할로알칸 탈할로겐화 효소
잔기 : 폴리펩티드의 일부인 아미노산
rpm : 분당 회전수
rRDhl : 재조합 로도코쿠스 할로알칸 탈할로겐화 효소
SDS : 나트륨 도데실 술페이트
spp. : 종(種)
TCP : 1,2,3-트리클로로프로판
TM : 상표
트리스(Tris) : 트리스(히드록시메틸)아미노메탄
tRNA : 전달 RNA
U : 단위
Vmax: 최대 효소 속도
%w/v : 부피당 중량%, 즉 용액 100 ml 당 용질의 그램 수, "%(w/v)"로도 씀
%w/w : 중량당 중량%, 어떤 물질을 함유하는 혼합물 100 g당 그 물질의 그램수, "%(w/w)"로도 씀
∼ : 약(約)
효소 및 본 발명의 목적을 충족시키는 고정된 효소를 얻기 위해 다음의 단계들을 수행했다. 이 단계들은 당업자에게 알려진 기술을 써서 수행되었다.
(1) 탈할로겐화 효소 및 그 아미노산 서열의 단리 및 부분 서열 결정
(2) 부분적인 서열 결정을 기반으로 올리고뉴클레오타이드 프로브의 제작
(3) 이 올리고뉴클레오타이드 프로브를 써서 탈할로겐화 효소를 코딩하는 DNA 단편을 단리한 후, 이 DNA를 증폭시킴
(4) 상기 단편을 적당한 복제 개시점 (replication origin) 및 우성 선택 마커를 코딩하는 유전자가 있는 클로닝 벡터에 라이게이션시킴
(5) 재조합 플라스미드가 들어있는 미생물의 형실전환 및 선별
(6) DNA 서열을 적절한 발현 벡터로 이전하고, 이 재조합 벡터를 써서 숙주 세포를 형질전환시킴
(7) 형질전환체에 의한 재조합 탈할로겐화 효소의 생산
(8) 탈할로겐화 효소의 정제, 이어서
(9) 상기 탈할로겐화 효소를 각종 고체 지지체에 고정시킴
(10) 고정된 탈할로겐화 효소를 써서 HAH를 알코올 또는 할로히드린으로 전환처리함
(11) 효과적인 탈할로겐화 효소 지지체계를 선별
이와 같이 요약한 연구를 수행하는 과정에서 놀랍게도 재조합 효소를 유래시킨 야생형 효소보다도 성능이 우수한 신규한 재조합 탈할로겐화 효소가 얻어졌다. 또한 효과적인 탈할로겐화 효소 고정 지지체계를 밝혀냈다.
본 발명에 사용되는 탈할로겐화 효소는 로도코쿠스 종 ATCC 55388에서 유래된 것이 바람직하며, HAH를 할로히드린 또는 알코올, 바람직하게는 할로히드린으로 전환시킬 수 있는 것이다. 바람직한 재조합 효소는 야생형 탈할로겐화 효소의 최소 기능 부위 (즉, 적절하게 폴딩된 후 할로알칸 탈할로겐화 효소 활성을 보유하는 야생형 탈할로겐화 효소의 최소한의 조각)를 포함하는 효소 활성 폴리펩티드를 포함한다. 바람직하게는 이 폴리펩티드가 도 2의 잔기 1-292의 아미노산 서열과 실질적으로 상동이다. 더욱 바람직하게는 이 폴리펩티드가 적어도 약 90 %의 상동성이 있는 것, 더욱더 바람직하게는 적어도 약 95 %의 상동성이 있는 것, 그보다 더 바람직하게는 약 99 %의 상동성이 있는 것이다. 특히 바람직한 것은 도 2의 잔기 1-292의 아미노산 서열을 갖는 효소 활성 폴리펩티드이다.
바람직한 재조합 효소는 또한 표지, 태그(tag), 테일, 링커, 고체 지지체, 킬레이트제, 다른 효소 등과 같이, 탈할로겐화 효소의 효소 활성 폴리펩티드와 함께 제조될 수 있거나 또는 효소가 생성된 후 그것에 연결될 수 있는 하나 이상의 다른 유닛을 포함할 수도 있다. 그러한 유닛은 효소가 적절히 폴딩되고(거나) 고체 지지체에 고정된 후 효소로부터 잘라낼 수 있다. 바람직한 실시태양에서 효소는 실질적으로 친수성인 테일과 함께 제조되거나 또는 그것에 연결된다. 이 테일은 효소의 일부로서 발현된 친수성 올리고펩티드일 수 있거나 또는 효소의 발현 이후에 숙주 세포에 의해서 코어 효소에 부착되는 올리고사카라이드기일 수 있다. 테일은 충분한 길이여야 하고, 코어 효소가 수성 매질 중의 현탁액으로 남아있을 수 있을 정도로 친수성이 있어야 한다. 바람직한 테일은 효소의 일부로서 발현된 실질적으로 친수성인 올리고펩티드이다. 더욱 바람직하게는, 효소가 친수성이 큰 올리고펩티드 테일과 함께 발현된다. 가장 바람직하게는 올리고펩티드 테일이 효소의 카르복시 말단에서 발현된다. 가장 바람직한 올리고펩티드 테일은 히스티딘 및(또는) 아스파르트산이 풍부한 친수성, 카르복시 말단 테일이고, 특히 길이가 아미노산 약 5 내지 25 개이며, 적어도 약 25 % 이상 히스티딘 또는 아스파르트산 잔기를 포함하며, 더욱 바람직하게는 약 50 % 이상 그러한 잔기를 포함하는 것이다. 재조합 효소는 도 2의 염기 37-912의 뉴클레오타이드 서열을 갖는 폴리뉴클레오타이드의 구획을 포함하는 숙주 세포에 의해 생산되는 것이 바람직하다.
본 발명은 또한 본 발명의 효소를 발현할 수 있는 재조합 DNA 서열에 관한 것이다. 이들 DNA 서열으로는, 신규한 할로알칸 탈할로겐화 효소(들)을 발현하되 표준적인 DNA 코드의 코돈 대 아미노산 대응 패턴을 따르지 않거나 전적으로 따르는 것은 아닌 번역 시스템을 써서 그러한 효소를 발현할 수 있는 것들이 있다. 그러한 시스템에는 표준적인 DNA 코드에 비해서 특정 코돈이 "억제되는(suppressed)" 것이 포함된다. 어떤 종류의 "억제된" 발현계에서는, 아미노아실-tRNA ("aa-tRNA") 분자의 20여개의 아미노산 특이적 부류 중 적어도 하나가 "잘못된" 아미노산에 연결되어 있어서 번역 시스템이 표준적인 DNA 코드를 위반하기 쉽게 만드는 (즉, 자라나는 폴리펩티드 쇄의 한 곳 이상에서, 정상적으로라면 그 위치를 관할하는 mRNA 코돈과 일치하는 것으로 발견되지 않는 아미노산의 삽입(insertion)을 일으킴) (그 부류에 속하는 안티코돈을 갖는) 하나 이상의 tRNA 분자를 포함한다. 또다른 변형된 그러한 번역 시스템에서는 아미노-아실-tRNA 분자 집단에 번역의 개시 또는 종료의 신호를 정상적으로 전달하는 mRNA 코돈과 상보적인 안티코돈을 갖는 aa-tRNA가 포함되어 있어서 그 신호를 억제하게 된다. 이러한 시스템은 예를 들면 하나 이상의 tRNA 또는 aa-tRNA 신테타제(synthetase)의 돌연변이의 결과이거나 비돌연변이된 aa-tRNA 신테타제(들)에 의한 오류의 결과로, 또는 아미노산이 tRNA에 비표준적으로 결합되도록 인위적으로 조작한 결과로 생길 수 있다.
그러한 번역 시스템에서는 본 발명의 DNA 서열이 신규한 할로알칸 탈할로겐화 효소(들)를 여전히 만들어내는데, 왜냐하면 "잘못된" 아미노산의 삽입(들)이 효소의 활성을 빼앗아가지 않기 때문이거나 그 DNA 서열이 번역 시스템에서의 변화가 예측되는 코돈을 (그렇지 않았더라면 "부정확한" 아미노산이 삽입되었을 위치에) 포함하고 있어서 "올바른" 아미노산의 삽입 또는 mRNA 코돈의 "올바른" 신호전달이 가능해지기 때문이다. 바람직한 DNA 서열은 도 2의 염기 37-912의 뉴클레오타이드 서열과 실질적으로 상동인 폴리뉴클레오타이드를 포함한다. 더욱 바람직하게는 이 폴리뉴클레오타이드가 적어도 약 90 %의 상동성이 있는 것, 더욱더 바람직하게는 적어도 약 95 %의 상동성이 있는 것, 그보다 더 바람직하게는 약 99 %의 상동성이 있는 것이다. 특히 바람직한 것은 도 2의 37-912 염기의 뉴클레오타이드 서열을 갖는 폴리뉴클레오타이드이다.
본원에서 사용된 "실질적으로 상동"이란 구절은 해당 서열, 즉 (올리고 또는 폴리뉴클레오타이드 또는 DNA 가닥의) 해당 뉴클레오타이드 서열 또는 (올리고 또는 폴리펩티드 또는 단백질의) 해당 아미노산 서열이 친족 (related) 참조 뉴클레오타이드 또는 아미노산 서열에 대해 동일한 정도를 표현한다. 이 구절은 해당 서열과 참조 서열을 "배열 (alignment)"했을 때 그 사이에 적어도 약 75 %의 일치율 (즉, 동일한 요소 - 뉴클레오타이드 또는 아미노산 -이 나란히 놓여있는 상태)로 정의된다. 이러한 맥락에서 "배열"이란 "무효(null)" 요소가 최소한의 개수로 대상 및(또는) 참조 서열에 삽입되어 있어서 이 서열들 사이에 일치하는, 존재하는 요소의 수가 최대화되도록 나타내는 것을 의미한다. "무효" 요소는 대상 및 참조 서열의 일부가 아니며, 또한 대상 서열에 삽입된 최소한의 "무효" 요소의 개수가 참조 서열에 삽입된 최소한의 개수와 상이할 수 있다. 주어진 서열의 상동성 (예를 들면 "90 % 상동성"으로 표현할 수 있음)의 증가 정도는 참조 서열에 대한 그 서열의 서열 일치도와 관련하여 정의되는 것이다.
이 정의에서 참조 서열은 대상 서열과 (1) 두 뉴클레오타이드 서열이, 동일한 IUB 하위클래스로 동정될 수 있는 단백질 또는 단백질의 일부를 코딩하고 있거나 (2) 두 아미노산 서열이, 동일한 IUB 하위클래스로 동정될 수 있는 단백질 또는 단백질의 일부를 이룬다는 점에서, 그러한 동정이 관능성, 서열 상동성, 부모 기원 중 어느 것을 기초로 했느냐와 무관하게, "친족 (related)" 것으로 간주된다. "부모 기원 (parental origin)"은 주어진 효소가 그것의 인지된 주요한 또는 중요치 않은 기능(들)을 이유로 IUB 하위클래스 내에 애초에 묶일 수 있으나, 그 효소를 코딩하는 DNA 서열이 하나 이상의 돌연변이(들)을 축적한 후, 코딩된 효소가 본래의 관능성을 보유하고 있건 그렇지 않건 간에 상이한 IUB 하위클래스의 관능성을 보일 있다는 사실을 가리킨다 (상이한 IUB 하위클래스들은 동일한 또는 상이한 IUB 주요 클래스에 속할 수 있다). "단백질의 일부"를 언급한 것은, 융합 단백질을 비롯해서 이관능성 및 다관능성 효소가 그들의 관능성 도메인 중 하나의 하위클래스가 동일함을 기준으로 소정의 IUB 하위클래스 내에 속하는 것으로 간주된다는 것을 의미한다.
본 발명의 바람직한 실시태양에서 할로알칸 탈할로겐화 효소는 적어도 기원 상으로는 IUB 하위-하위클래스 3.8.1에 속한다. 본 발명의 효소는 예를 들면 미국 특허 제5,372,944호에서 이용되었던, 로도코쿠스에서 발견되는 야생형 할로알칸 탈할로겐화 효소의 성질 보다 의외로 더 우수한 성질을 갖는 것으로 밝혀졌다. 대개 주어진 효소는 반응 조건에서의 그것의 안정성을 제외하면 두 가지 특징이 공업적 공정에서 그 유용성을 결정하게 되는데, 생성물에 대한 그것의 친화도 및 기질에 대한 친화도가 그것이다. 생성물 분자에 대한 효소의 친화도가 상대적으로 큰 경우엔 효소가 생성물에 의한 피드백 억제에 상당히 민감할 것이다. 그러한 효소는 대개 상당한 농도의 생성물이 존재하는 상태에서 효소가 기능해야 하는 공업 공정에서는 유용성이 떨어질 것이다. 생성물에 대한 효소의 상대적 친화도의 편리한 지표는 90 % 억제율에서 측정된 효소의 억제 상수("Ki(90)")로서, 즉 효소가 그 Vmax(생성물의 농도가 0일 때 측정함) 중 단지 10 %만을 보유할 때의 생성물 농도이다. 본 발명과 관련하여, 야생형 할로알칸 탈할로겐화 효소는 측정된 Ki(90)이 20 mM이고, 본 발명의 재조합 효소 (도 2 참조)는 Ki(90)가 50 mM로 측정되었다. 다시 말하면 재조합 효소는 생성물에 의한 피드백 억제에 대해 훨씬 덜 민감하며, 따라서 야생형 효소의 경우에는 기능이 거의 중단되는 생성물 농도에서도 재조합 효소는 기능할 수 있다.
본 발명의 효소는 단독으로 또는 그의 아미노 및(또는) 카르복시 말단에서 하나 이상의 폴리펩티드 테일(들)에 공유결합된 상태로 발현될 수 있다. 그러한 테일은 효소 코팅 엑손에서 독립된 엑손에 의해 또는 효소 코딩 엑손의 일부인 DNA 서열에 의해 코딩될 수 있다. 테일 코딩 DNA가 효소 코딩 엑손의 일부분이 되는 경우, 테일 코딩 DNA는 효소 유전자의 3' 및(또는) 5' 말단에, 예를 들면 (1) 테일 코딩 뉴클레오타이드 서열을 올리고뉴클레오타이드 프라이머에 포함시켜서 효소 유전자를 증폭시키는 동안에 또는 (2) (효소 유전자가 테일 코딩 DNA의 삽입 전에 플라스미드로 삽입되든 그 후에 삽입되든) 효소 유전자를 포함하는 플라스미드 내로 테일 코딩 DNA를 직접 라이게이션시켜서 플라스미드를 제작하는 동안에 부착되거나 "융합"될 수 있다.
그러한 DNA(또는 mRNA) 융합 유전자는, 적절한 유전자 조절 요소 (즉 인핸서, 프로모터, 전자 및 번역 개시 및 중지 서열 등)의 영향하에서 한쪽 또는 양쪽 말단에 폴리펩티드 테일을 보유한 탈할로겐화 효소를 생산하게 된다. 바람직한 무(無)테일 효소의 예는 도 2의 잔기 1-292의 아미노산 서열을 갖는 것이다. 일부 바람직한 폴리펩티드 테일의 예로는, 폴리-히스티딘 서열, 폴리산 (예를 들면, 폴리아스파르트산 및(또는) 글루탐산), 셀룰로오즈 결합 도메인, c-myc 펩티드, S-Tag 펩티드 및 FLAG 펩티드 등이 있다. 이런 예시된 테일에 결합하는 항체 및 친화성 컬럼은 시판되고 있으며, 발현된 융합 단백질의 정제 및 고정에 쉽게 쓸 수 있다. 그러나, 다른 많은 테일이 관능성 탈할로겐화 효소를 유지하면서 사용될 수 있다. 테일 코딩 서열이 발현 유전자에 포함되든 아니든, 발현 유전자는 효소 유전자 또는 효소 테일 융합 유전자의 바깥 위치에 번역 개시점, 바람직하게는 ATG를 포함해야 하며, 또한 바람직하게는 엔도뉴클레아제 제한 위치를 포함할 것이다.
바람직한 실시태양에서, 단일 엑손의 오픈 리딩 프레임은 아미노 및(또는) 카르복시 말단에서 약 30개 이하의 아미노산 잔기로 이루어진 테일을 갖는 관능성 탈할로겐화 효소를 코딩한다. 이 실시태양에서 양 말단에 테일이 있는 경우, 그 테일은 대략 동일한 길이일 수 있다. 다른 바람직한 실시태양에서는, 효소가 아미노 및(또는) 카르복시 말단 테일과 함께 발현되지만, 카르복시 말단 테일은 아미노 말단 테일보다 훨씬 더 길다. 이 실시태양에서는 아미노 말단 테일이 약 25개 이하의 아미노산 길이이며, 카르복시 말단 테일이 약 2 내지 약 150개의 아미노산 길이가 바람직하다. 이들 실시태양 가운데 어떤 것은 바람직하게는 아미노 및(또는) 카르복시 말단 테일이 적어도 5개의 인접 히스티딘 잔기 신장부를 포함할 것이다. 다른 실시태양에서는 아미노 말단 테일이 약 10 내지 150개의 아미노산 길이이며, 바람직하게는 폴리히스티딘 서열을 포함하거나 그 자체가 폴리히스티딘 서열이다. 이 실시태양에서는 효소가 Mg2+또는 Ni2+등의 킬레이트화 2가 금속 이온으로 코팅된 표면에 접촉시키면 가역적으로 고정되거나 가역적으로 불활성화될 수 있다. 이 실시태양에서 폴리히스티딘 포함 아미노 말단 테일은 효소 활성 부위로의 접근을 부분적으로 또는 전적으로 차단하는 한에서 존재할 수 있다. 이 실시태양의 다른 형태에서는 테일이 테일의 형상 (configuration)을 변화시키는 하나 이상의 아미노산 잔기를 포함하고 있어서, 폴리히스티딘 서열에서 발견되는 형상에서 굽은 형상, 거꾸로 휜 형상 또는 유연성 접합 형상으로 변화되어 효소의 활성 부위로의 접근도가 커진다.
더욱 바람직한 실시태양에서는 오픈 리딩 프레임이, 약 1 내지 약 25 개의 아미노산으로 이루어진 아미노 말단 테일, 및 폴리히스티딘 서열, FLAG 펩티드 서열 (KODAK Imaging Systems/VWR 판매, 미국 뉴욕 로체스터 소재) 및(또는) S-Tag 펩티드 서열을 갖는 카르복시 말단 연장부가 있는 관능성 탈할로겐화 효소를 코딩한다. 특히 바람직한 실시태양에서, 오픈 리딩 프레임은 (1) 약 10개 이하의 아미노산 및 폴리히스티딘 서열으로 이루어진 아미노산 말단 테일 및 (2) FLAG (도 2 참조) 또는 S-Tag 펩티드 서열을 포함하는 카르복시 말단 테일이 있는 관능성 탈할로겐화 효소를 코딩한다.
상기 탈할로겐화 효소의 효소 및(또는) 테일은 유도 진화 (directed evolution) 기술을 써서 변형시킴으로써 생산성, 안정성 및(또는) 억제 프로파일을 개선시킬 수 있다. 유도 진화법 가운데 하나는 미국 특허 제5,605,793호 (Stemmer et al.)에 개시된 유전자 재편 (gene shuffling) 방법을 사용하는데, 여기서 유사한 DNA 서열 여러개를 단편화한 후 무작위적 방식으로 재조립해서, 매우 다양한 라이브러리를 만들어 흥미로운 특질이 있는 효소를 스크리닝할 수 있다. 이 기술의 다른 형태는 오류 발생 (error-prone) 유전자 증폭 기술을 사용한다. 유도 진화법의 제3 형태는 이 두 방법을 병용한다. 유도 진화법의 제4 형태는 문헌 (Zhao et al., Nature Biotechnology (1998), 현재 인쇄중)에 개시된 소위 "엇갈림 확장 (staggered extension)" 방법이다. 바람직한 실시태양에서, 오류 발생 유전자 증폭법을 써서 반무작위 돌연변이를 탈할로겐화 효소 (예를 들면 도 2, 잔기 1-292)에 유전자 증폭 반응마다 유전자 복제본 한 개당 약 1-6 점의 돌연변이의 비율로 도입한다. 그 다음 돌연변이 라이브러리를 박테리아에 도입하여 단백질을 발현시키고, 활성을 바람직하게는 공간적으로 처리할 수 있는 격자 형태 (96 웰 또는 384 웰 등)에서 스크리닝한다.
효소 또는 효소 패밀리를 개선하는데 유도 진화법을 효과적으로 사용하려면, 최적의 돌연변이 유발 방법 및 발현계와 효소의 바람직한 성능 특질을 효과적으로 검출할 수 있는 스크리닝 방법 및 스크리닝 조건이 필요하다. (비무작위) 프라이머 의존적 돌연변이 유발 방법 (예를 들면 오류 발생 유전자 증폭법 및 정의된 프라이머에 기초한 재조합)의 경우 특정 단백질 하위도메인은 프라이머 설계 및 위치지정을 통해 쉽게 돌연변이 유발의 표적이 될 수 있다. 바람직한 실시태양에서는, 발현 제작물 내에 존재하기 때문에 전체 전사 및 번역 도메인의 돌연변이를 가능케하는 프라이머를 사용한다. 바람직하게는 프라이머가 발현 제작물 또는 표적 DNA (테일 포함)의 단백질 코딩 영역에만 관련된 것이다. 더 바람직한 실시태양에서는 프라이머가 테일의 서열을 보존하면서 탈할로겐화 효소 유전자에 표적 돌연변이를 유발시키는 방식으로 설계된다. 예를 들면 도 2와 관련해서, 오류 발생 유전자 증폭 기술에서 뉴클레오타이드 36의 앞에 가깝게 위치하는 뉴클레오타이드들에 상보적인 프라이머 및 뉴클레오타이드 912 다음에 가깝게 위치하는 뉴클레오타이드들에 상보적인 프라이머를 사용하는 경우, 탈할로겐화 효소 유전자는 유일한 돌연변이 유발 표적이 될 수 있다. 이와 마찬가지로 전체 도 2의 코딩 영역은 프라이머가 뉴클레오타이드 1-951의 영역 밖에 어닐링될 때 돌연변이 유발 표적이 된다. 도 2의 아미노 테일 또는 카르복시 테일은 각각 뉴클레오타이드 1-36 또는 913-951의 바깥에 프라이머가 어닐링될 때 표적이 된다.
본 발명의 효소 또는 융합 단백질을 코딩하는 DNA 서열(들)은 바람직하게는 발현 벡터에 삽입되며, 그 다음 이 벡터로 숙주 세포를 감염시키고, 이 숙주 세포가 효소를 발현시킬 수 있는 조건에서 숙주 세포를 증식시킨다. 원핵 세포에 맞는 다양한 재조합 숙주 벡터 발현계가 공지되어 있으며, 본 발명에 사용될 수 있다. 예를 들면, 시판되는 pKK233-2, pKK388-1, pSE380, pTrcHis (A, B 및 C), pRSET (A, B 및 C), pProEX-1 및 박테리오파아지 람다 (gt11), T3 및 T7 등의 벡터가 모두 대장균 및 그 밖의 그램음성 원핵생물에서 이종 단백질을 발현시킬 수 있다. 이런 발현 형식에서, 균주에 적절한 다양한 유도 프로모터도 사용될 수 있다. 또한 다른 원핵생물 (바실러스 속, 슈도모나스 속, 악티노미세스 (Actinomyces) 속, 바실러스 속, 또는 로도코쿠스 속), 진핵 미생물 (효모 및 진균류 등, 예를 들면 피키아(Pichia), 사카로미세스 (Saccharomyces) 또는 아스페길러스 (Aspergillus) 속에 속하는 것들, 예를 들면 피키아 파스토리스 (Pichia pastoris) 또는 사카로미세스 세레비지에 (Saccharomyces cerevisiae)), 그 외의 진핵세포 및 세포주 (바쿨로바이러스 유래 벡터로 감염된 Sf21 세포 등), 및 조류 세포까지도 원핵생물 기원의 이종 단백질을 활성 형태로 생산할 수 있으며, 결과적으로 이들 다른 세포들을 본 발명에 이용한다면, 그것과 함께 사용할 적절한 발현 벡터가 선택될 것이다. 많은 원핵생물 발현 벡터가 공개적으로 입수가능하며, 본 발명에 사용될 수 있지만, 신규한 효소의 발현은 pTrcHis, pRSET 및 pTrxFus 시리즈 (Invitrogen 제품, 미국 캘리포니아주 샌디에고 소재)의 시판 벡터를 대장균 숙주 세포와 함께 사용하는 것이 본원에 예시되어 있다.
오류 발생 (error-prone) 유전자 증폭 (예를 들면 오류 발생 PCR 또는 EPPCR) 등의 유도 진화 기술을 쓰는 경우, 이렇게 발생된 돌연변이 유전자 집단의 DNA는 적절한 제한 효소 (제한 위치가 돌연변이 유발 표적의 외부에 위치하는 엔도뉴클레아제)로 소화시킨 후, 돌연변이 유전자를 정제하고, 원핵생물 발현 벡터에 라이게이션시켜서, 플라스미드 라이브러리를 제조한다. 감응(competent) 숙주 세포, 예를 들면 바람직하게는 대장균 세포를 상기 플라스미드 라이브러리로 형질전환시킨 후 적절한 배지에서 증식시키며, 대장균의 경우에는 세포를 선택 증식 배지가 들어있는 아가 상에 평판배양한다. 그 다음 세포를 희석시켜서 개별 클론을 만들고, 대장균과 같은 원핵생물의 경우에는 초기 성장 단계를 거친 후, 세포 콜로니들을 개별적으로 취해서 별도의 용기, 예를 들면 96 웰 플레이트로 옮기되, 각 웰에 형질전환된 세포의 개별 클론이 하나씩 담기도록 했다. 클론의 라이브러리에서 개별 클론의 수를 늘이고, 원하는 단백질의 발현을 유도하고, 원하는 활성에 대해 스크리닝한다.
신규 효소의 할로지방족 탈할로겐화 효소 활성에 대한 스크리닝은 바람직하게는 기질 분자에서 탄소-수소 공유결합을 가수분해시킬 때 빠져나오는 양성자 또는 할라이드 이온을 검출함으로써 수행한다. 바람직한 실시태양에서는 양성자 방출에 수반되는 pH 변화가 효소 활성의 척도가 되는데, 이 pH 변화의 측정은 (표적 효소의 관능적 pH 범위에 걸쳐 측정가능한 색변화를 보이는) 형광성 또는 육안으로 확인할 수 있는 pH 지시약을 사용해서 수행한다.
활성 스크리닝 분석에서, 분석할 혼합물에는 (1) 온전한 세포, 투과성화된 세포, 세포 용해물, 돌연변이 탈할로겐화 효소를 발현하는 세포로부터, 바람직하게는 박테리아 세포로부터 얻어진 정제된 효소, (2) 기질 및 (3) 저농도의 완충액 (전형적으로는 < 10 mM)이 포함될 것이다. 투과성화된 세포를 사용하는 것이 바람직한 경우에는 화학적 세정제 (예를 들면 나트륨 데옥시콜레이트) 또는 물리적 냉동/해동 과정을 써서 박테리아 세포를 투과가능하게 만들 수 있다. 기질은 바람직하게는 상기한 바와 같은 하나 이상의 할로겐화 지방족 탄화수소를 포함할 것이다. 완충액은 효소가 활성을 보유하는 pH 범위에 걸쳐 유효하다고 알려진 것 또는 유효한 것으로 밝혀진 것이면 무엇이든지 선택할 수 있다. 어떤 경우에는 세포 잔해 자체가 충분한 완충 용량을 제공하여 정확한 활성 정량이 가능하다. 첨가 완충액을 사용하는 경우, pKa가 약 6 내지 약 10의 범위인 것이 바람직하지만, 다른 완충액도 사용할 수 있다. 바람직한 완충액의 예로는, 글리신, 2-AMP, CAPSO, 에탄올아민, CHES, 붕산염, 세린 및 AMPSO 등이 있으며, CAPSO가 특히 바람직하고, 더욱 바람직한 것은 약 5 mM 농도의 CAPSO이다.
활성 스크리닝 분석은 검출 방법을 사용하는 것이 또한 필요할 것이다. 바람직한 실시태양에서는 pH 변화가 검출된다. 바람직하게는 pH 지시약이 분석될 혼합물에 포함될 것이다. 효소가 활성이 있는 pH 범위에서 색변화를 보이는 임의의 pH 지시약을 사용할 수 있을 것이다. 바람직하게는 pH 지시약이 약 pH 6 내지 약 pH 10의 범위, 더욱 바람직하게는 약 pH 7 내지 약 pH 9의 범위에서 색변화을 보이는 것이다. 육안으로 확인할 수 있는 pH 지시약의 바람직한 예로는, m-크레졸 퍼플, 크레졸 레드, 페놀 레드, 브롬티몰 블루, 티몰 블루 등이 있으며, 바람직한 형광성 pH 지시약의 바람직한 예로는 α-나프톨 술폰산, 1,4-나프톨 술폰산, 코우마르산, 3,6-디옥시프탈산 디니트릴, 오르시나우린 등이 있다. 다른 실시태양에서는 pH 프로브를 써서 pH 변화를 검출할 수 있다. 특히 바람직한 것은 육안으로 확인할 수 있는 pH 지시약인 m-크레졸 퍼플을 사용하는 것이며, 더욱더 바람직한 것은 약 50 μM 농도의 m-크레졸 퍼플이다.
다른 바람직한 실시태양에서, 검출은 기질로부터 할라이드 이온의 방출량을 측정함으로써 수행되며, 이때 (1) 분석될 혼합물에는 루시게닌 (Molecular Probes of Eugene 제품, 미국 오레곤주 소재, 루시게닌은 할라이드 이온과 접촉하면 켄칭되어 형광을 측정하면 감소된다) 등의 할라이드 민감성 형광 염료를 포함시키거나 (2) 할라이드 민감성 전극 등의 할라이드 이온 반응성 프로브 장치를 사용한다.
제3의 바람직한 실시태양에서, 효소 활성의 검출은 커플 효소 시스템을 사용하여 수행한다. 예를 들면, 커플 효소 시스템을 써서 생성물 분자의 생성물을 검출하는데, 즉, 할로알칸을 탈할로겐화시키면 알코올이 얻어지고, 많은 알코올들은 시판되는 하나 이상의 알코올 탈수소화 효소의 기질이 되므로 이 효소의 활성을 NADH의 소멸량으로 측정한다. 탈수소화 효소의 NADH 요구량에 대해 연결지어 알코올을 검출하는 방법은 당업계에 잘 알려져 있다.
본 발명의 효소는 하나 이상의 고체 지지체(들)에 고정될 수 있다. 효소 고정 기술은 가장 간단히 나누자면 공유결합 및 비공유결합 방법으로 분류된다. 공유결합 방법은 특정 아미노산 측쇄에 존재하는 반응성 기가 직접적으로 또는 이관능성 가교결합제를 써서 중합체 지지체 또는 무기 지지체에 결합하는 것을 이용한다. 이런 방법의 으뜸가는 이점은 결합이 강하다는 점이다. 비공유결합 고정 방법은 훨씬더 다양하며, 직접 및 간접 (예를 들면 킬레이트 매개 또는 킬레이트화제 매개) 이온성, 흡착성 또는 생물친화성 지지체 회합 (예를 들면, 바이오틴-아비딘)에서부터 겔 포획 (gel-entrapment) 또는 마이크로캡슐화에 이른다.
공업적인 효소 공정에 맞는 특정한 고정 기술은 여러 요인을 함께 고려하여 선택된다. 가장 중요한 사항은 지지체 매트릭스의 비용과 그것의 생물상용성 결합 또는 커플링의 화학적 특징이다. 다음으로 중요한 것은 고정된 상태에서 활성의 회복율과 반응 조건하에서 고정된 지지체의 강성이다. 효소마다 독특하기 때문에 최상의 시스템을 찾는 방법은 경험적인 것이다. 그러나 본 발명의 효소와 관련해서는 바람직한 고정 방법이 효소를 지지체에 에폭시드, 활성 친핵체, 이소우레아 등의 반응성 기를 써서 공유결합시키는 것이다. 이들 반응성 기는 지지체 물질의 본래 표면에 존재하는 것이거나 지지체 물질이 변형되어 그러한 기를 포함하는 링커를 보유하게 된 것일 수도 있다. 바람직한 링커로는, 디알데히드, 이중산, 디아미노, 디이소시아네이트, 시아네이트, 디이미드 기 중의 적어도 하나를 포함하는 것들이 있으며, 디아미노 기를 카르보디이미드와 함께 사용하지 않는다면 적어도 하나의 카르보이미드 기를 포함하는 링커도 사용할 수 있다. 바람직한 고체 지지체로는 알루미나-기재 지지체 및 실리카-기재 지지체 등이 있으며, 더욱 바람직한 것은 폴리에틸렌이민 함침 알루미나- 또는 실리카-기재 지지체이다. 바람직한 고정 방법은 글루타르알데히드로 고체 지지체를 미리 처리하고, 지지체에 효소를 접촉시키는 단계를 포함한다.
일단 고정되면, 효소는 그것의 기질/반응물을 생성물로 전환시키는데 편리하게 쓰일 수 있다. 이런 전환은 탈할로겐화 효소의 활성에 거의 영향을 주지 않는 임의의 적절한 매질에서 수행할 수 있다. 바람직하게는 효소적 전환은 완충계 또는 하나 이상의 pH 조절 장치가 포함된 수성 매질에서 수행된다.
할로겐화 탄화수소 기질은 대개 기질의 포화점까지 반응 매질에 첨가되는데, 어떤 경우에는 과포화된 기질 혼합물, 기질 에멀젼, 또는 순수한 기질 제제를 사용할 수도 있다. 대부분의 할로겐화 탄화수소 기질의 포화점이 주어진다면, 사용된 할로겐화 탄화수소의 농도는 대개 약 0.005 % 내지 약 0.5 %(w/v)이다. 바람직하게는 할로겐화 탄화수소의 농도가 약 0.005 % 내지 약 0.25 %이다. 더욱 바람직한 것은 매질 중의 할로겐화 탄화수소의 농도가 약 0.005 % 내지 약 0.2 %이다. 기질은 반응 용액에 처음부터 배치식으로 첨가되거나 또는 연속 공급 공정의 액체 스트림으로 첨가될 수 있다. 이런 연속 공급 공정에서 액체 스트림은 처음부터 기질을 포함할 수 있으며, 또는 액체 스트림이 반응기로 들어가는 도중에 기질이 액체 스트림으로 첨가될 수도 있다. 둘 중 어느 경우나 반응기 전체에 걸쳐 효소에 고농도의 기질이 확실히 공급되도록 하기 위해서는 반응기 내의 액체 스트림에 더 많은 기질을 첨가시킬 수 있다. 액체 스트림은 기질의 용해도 한계 보다 더 높은 농도에서 생성물의 축적을 가능하도록 공정내에서 간격을 달리하여 기질로 재포화시킬 수 있다. 배치식 반응은 대개 진탕 또는 교반시키면서 수행되는 것이 일반적이다. 반응 시간 또는 반응기 잔류 시간이 기질 농도 또는 효소량 등의 반응 조건에 따라서 달라질 수 있지만, 반응 조건은 반응이 최대 120 시간 내에 완결되도록 선택하는 것이 바람직하다.
본 발명을 단순히 예시하기 위한 다음의 실시예를 참작함으로써 본 발명은 더욱 선명하게 이해될 것이다. 모든 백분율은 특별한 표시가 없다면 중량%이다.
일반 실험
재료 및 배지:
모든 올리고뉴클레오타이드는 제노시스 바이오테크놀로지 인크 (Genosys Biotechnologies Inc., 미국 텍사스주 우드랜드 소재), 라이프 테크놀로지, 인크 (Life Technologies, Inc., 미국 메릴랜드주 록빌 소재), 또는 인테그레이티드 DNA 테크놀로지, 인크 (Integrated DNA Technologies, Inc., 미국 아이오와주 코랄빌 소재)의 제품으로 합성 및 정제했다. 제한 효소 및 DNA 변형 효소는 기브코-베쎄스다 리써치 래버러토리즈 (Gibco-Bethesda Research Laboratories, 미국 메릴랜드주 게이터스버그 소재), 뉴 잉글랜드 바이오랩 인크 (New England Biolab Inc., 미국 매사추세츠주 비버리 소재), 스트라타젠 클로닝 시스템스 (Stratagene Cloning Systems, 미국 캘리포니아주 라 졸라 소재)으로부터 구입해서 제조자의 프로토콜에 따라 사용했다. 감응 (competent) 대장균 AG1 세포는 스트라타젠 클로닝 시스템스에서, 감응 대장균 JM109 세포 및 TOP 10F' 세포는 인비트로젠사(Invitrogen Corp., 미국 캘리포니아주 샌디에고 소재)에서 구입했다. 소규모 플라스미드 DNA 단리는 Rapid Pure Miniprep (RPM (상표)) 시스템 (BIO 101, Inc., 미국 캘리포니아주 라졸라 소재)을 써서 수행했다. DNA 라이게이션은 스트라타젠 클로닝 시스템스(Stratagene Cloning Systems)에서 구입한 예비시험 시약 키트로 수행했다. DNA 단편의 정제는 퀴아겐 인크(Qiagen Inc., 미국 캘리포니아주 채츠워쓰 소재)에서 구입한 QIAquick 겔 추출 키트 및 QIAquick PCT 정제 키트 중 하나를 사용했다. SDS-폴리아크릴아미드 겔 및 관련 완충액 및 염료와 전기블롯 이동 완충액은 인테그레이티드 세퍼레이션 시스템(Integrated Separation System, ISS, 미국 매사추세츠주 나틱 소재)에서 구입했다. 항체, 항-FLAG (상표) 모노클로날 항체 M2 및 염소 항-생쥐 IgG1은 각각 인터내셔널 바이오테크놀로지 인크 (International Biotechnology, Inc., IBI, 미국 코넥티커트주 뉴헤이븐 소재) 및 써던 바이오테크놀로지 어쏘시에이트 (Southern Biotechnology Associates, 미국 알라바마주 버밍햄 소재)에서 구입했다. 박테리아는 루리아 배양액 ("LB")에서 기브코-베쎄스다 리써치 래버러토리즈 (Gibco-Bethesda Research Laboratories, G-BRL, 미국 메릴랜드주 게이터스버그 소재)에서 구입한 예비혼합 시약을 써서 배양했다.
시약
1,4-디클로로부탄, 60 % 과염소산, 질산제2철 및 티오시안산 수은은 알드리치 (Aldrich)사에서 구입했다. 무수 에탄올은 Quantum/USI (미국 일리노이주 투스콜라 소재)에서 구입했다. 1,2,3-트리클로로프로판은 다우 케이칼사의 Allylics Group (미국 텍사스주 프리포트 소재)에서 기증받았다. 일염기성 인산칼륨, 이염기성 인산칼륨, 이미다졸, 구아니딘 염화수소, 이나트륨 EDTA, 황산암모늄, 및 트리스 유리 염기는 피셔 바이테크 그레이드(Fisher Biotech Grade)로부터 구입했다. 황산은 피셔 (Fisher, ACS grade)에서 구입했다.
지지체 물질
트레실-토요오펄 크로마토그래피 지지체는 도소하스(TosoHaas) (Lot# 65TRM72R)로부터 구입했다. 세파덱스 G-25 팩키지 컬럼은 파마시아(Pharmacia)사에서 구입했다. 셀라이트 R-648은 맨빌(Manville)사에서 구입했다. 폴리에틸렌이민 (50,000 MW) 및 PEI-실리카는 시그마(Sigma)사에서 구입했다. 1급 글루타르알데히드는 25 % 수용액으로 시그마사에서 구입하여 사용하기 전까지 -20 ℃에서 저장했다. 고정화에 사용된 다른 샘플은 Davison Low SA Alumina, Norton SA 6176 Alumina, Calcicat Type C Alumina, Calcicat s-88-473 Type A Silica, Shell 5980-F Silica, Davison 952-08-5X Silica, Borecker subnit Carbon, 및 AmCy 5701-Sn Carbon 등이다.
방법:
PCR 반응
DNA 증폭은 퍼킨 엘머 세투스 (Perkin-Elmer-Cetus, 미국 뉴저지주 뉴틀레이 소재)에서 공급하는 표준 중합효소 연쇄 반응 완충액을 써서 수행했다. 대개 50 ㎕ 반응물에는 1x 농도의 제조자 공급 완충액, 1.5 mM MgCl2, 125 μM dATP, 125 μM dCTP, 125 μM dGTP, 125 μM dTTP, 0.1-1.0 μM 순방향 및 역방향 프라이머, 5 U AmpliTaq DNA 중합효소 및 < 1 ng 표적 DNA가 포함된다. 특별한 언급이 없다면, DNA 증폭을 위한 가열 주기는 94 ℃에서 0.5 분, 55 ℃에서 1 분, 72 ℃에서 1 분을 한 주기로 35 주기를 진행한다.
폴리아크릴아미드 겔 전기영동에 의한 단백질 검출
가용성 단백질을 용해용 완충액 (Tris/SDS/β-메르캅토에탄올 pH 6.8; ISS)과 1 : 1로 혼합하여 5 분 동안 끓인 후, 10-20 % 겔 (Daiichi, 미국 매사추세츠주 나틱 소재)에 로딩하고, 트리스-글리신 완충액 (ISS)을 써서 전기영동시켰다. 겔을 Pro-Blue(상표)(ISS)로 염색했다.
표준 염화이온 검출 분석을 통한 효소 활성 단위의 측정
1,4-디클로로부탄 (Aldrich)을 기질로 사용하는 경우에는, 100 mM 글리신산 나트륨 (pH 9)을 최종 부피가 6 ml이 되도록 마개가 달린 9 ml 유리병에 첨가했다. 1,2,3-트리클로로프로판을 기질로 사용하는 경우에는, 10 mM 트리스 황산/1 mM EDTA (pH 7.0)를 사용했다. 그 다음 기질 6 ㎕를 첨가하고, 내용물을 볼텍싱시켰다. 유리병을 30 ℃에서 1 시간 동안 교반시키면서 인큐베이션시켰다. 샘플채취는 혼합물 1 ml를 꺼내어 5.25 M HClO4중의 100 ㎕ 0.375 M Fe3+(NO3)3이 들어있는 에펜도르프 튜브에 그것을 넣음으로써 5개의 시점에서 이루어졌다. 이 튜브를 볼텍싱했다. 모든 샘플을 모았을 때, 에탄올 중에 포화된 티오시안산 수은(II) 100 ㎕를 각 튜브에 첨가했다. 다시 샘플을 볼텍싱한 후, 3 분 동안 원심분리했다. 흡광도를 460 nm에서 측정했다. 시간에 따라 흡광도 변화를 나타내는 기울기 (ΔA/분)를 결정하고, 이것을 1.52 (표준으로 NaCl을 사용할 경우 460 nm에서의 소광 계수 (단위: ΔA/μmol Cl-))로 나누어 "μmol Cl-/분"을 얻었다. 1 단위의 효소 활성은 특정 조건에서 1 분당 기질 1.0 μmol을 탈할로겐화시키는데 필요한 양으로 정의된다.
오류 발생 PCR 돌연변이 유발 방법
이 유도 진화 방법에서, RDhl 효소 유전자 또는 RDhl 융합 단백질 유전자를 예를 들면, 적절한 제한 효소를 써서 이들 표적 DNA 서열이 포함된 플라스미드를 소화시킴으로써, EPPCR 돌연변이 유발 표적으로 제공했다. 대부분의 경우에, 표적 DNA는 겔 전기영동을 통해 정제한 후, 표적 DNA를 겔 추출했다. EPPCR은 적절한 올리고뉴클레오타이드 프라이머를 써서 표적 유전자의 표준 PCR 유전자 증폭을 수행하는 것을 수반하되, 표준 PCR 완충액에 충분한 양의 염화마그네슘 및 염화망간을 보충하여 반응 혼합물이 7 mM 염화마그네슘 및 0.15 mM 염화망간을 함유하도록 한다. 이 과정을 하나 이상의 EPPCR 생성물에 대해 반복해서 그안에 추가의 돌연변이를 도입할 수 있다.
생성된 EPPCR 생성물을 발현 벡터 (예를 들면, pTrcHis, TrxFus)로 라이게이션시키고, 그 다음 효소 발현 및 효소 활동 분석에 적절한 감응 숙주 세포 (예를 들면, 대장균 AG1 또는 JM109 세포)를 이 벡터를 써서 형질전환시켰다. 플라스미드 포함 클론을 LB/Amp 아가 플레이트 상에서 선택적 증식을 통해 동정했다. 개별 콜로니들을 이쑤시개를 써서, 선택 증식 배지가 들어있는 96-웰 플레이트의 웰로 옮기고 37 ℃에서 약 8-12 시간 동안 인큐베이션시켜 증식시켰다. 초기 증식 단계 이후에, 레플리카 플레이트를 만들고, 확장시키고, 그의 개별 클론을 다음 단락에서 설명한 바와 같이 탈할로겐화 효소 활성에 대해 분석했다.
pH 변화의 검출을 이용한 RDhl 효소 활성의 측정 방법
RDhl 효소 활성은 이 효소가 기질을 탈할로겐화시킴으로써 빚어지는 pH 변화를 검출함으로써 측정했다. 이 효소를 발현하는 원핵생물 숙주 세포를 배양액에서 증식시키고, 정량하고, 투과성화한 다음 pH 지시약, 완충액, 기질을 첨가했다.
96-웰 마이크로플레이트의 각 웰에는 암피실린 약 50-100 ㎍/ml를 보충한 SOB 배양액 (Difco, 미국 미시간주 디트로이트 소재) ("SOB/Amp")을 넣었다. 효소 생산 대장균 클론의 콜로니 하나로부터 유래된 세포들을 상기 플레이트의 한 웰에 접종했다. rRDhl 효소 또는 rRDHL 융합 단백질의 라이브러리를 시험하는 경우, 각 웰마다 다른 대장균 클론으로부터 유래된 세포로 접종했다. 6개 웰은 음성 비교용으로 사용하기 위해서 세포를 접종시키지 않았고, 6개의 추가 웰은 야생형 RDhl 효소를 생산하는 대장균을 접종해서 양성 비교용으로 사용했다. 접종물을 250 rpm으로 진탕시키면서 37 ℃의 Psycrotherm 오븐에서 밤새 인큐베이션시켰다.
인큐베이션 후에, 배양물에 최종 농도가 1 mM가 되도록 IPTG를 첨가하여 (유전자 발현을) 유도하고, 150 rpm으로 진탕시키면서, Psycrotherm 오븐 (37 ℃)에서 5 시간을 더 인큐베이션시켰다. 5 시간 인큐베이션이 끝난 후, 각 배양물의 세포 밀도는 1.573 Vmax/Kinetic 마이크로플레이트 판독기 (Molecular Devices, 미국 캘리포니아주 선니베일 소재)를 써서 측정했다. 그 다음 발현유도된 배양물 각각에서 취한 20 ㎕ 분액을 새 96-웰 플레이트의 웰로 옮기고, pH 8.0, 10x 투과성화 완충액 (10 mM 나트륨 데옥시콜레이트, 1 % NP-40, 50 mM 트리스 및 50 mM EDTA) 2.2 ㎕를 각 분액에 첨가하고 3-5 분 동안 적절한 진탕 속도로 진탕시켰다. 그 다음 세포 배양물 분액 각각에, 5 mM CAPSO 및 100 μM 크레졸 퍼플이 포함된 DCB-포화 완충액 (>1 ㎕ DCB/ml 완충계, pH 9.2-9.5) 200 ㎕를 넣었다. 지시약의 현상 색변화를 SpectraMaxPlus 마이크로플레이트 판독기 (Molecular Devices, 미국 캘리포니아주 선니베일 소재)를 써서 측정했고, 색 변화의 기울기를 그래프로 나타내어 초기 효소 활성을 추정했다.
<실시예 1>
로도코쿠스로부터 탈할로겐화 효소의 단리
로도코쿠스 종 ATCC 55388을 미국 특허 제5,372,944호에 기재되어 있는 바와 같이 배양했다. 효소 추출물을 미국 특허 제5,373,944호에 개괄적으로 기재된 바와 같이, 25-75 % 황산암모늄 침전분(cut)을 취하여, 2회의 이온 교환 크로마토그래피 단계 (1. DEAE-세파덱스, 2. DEAE-세파크릴) (여기서 염 농도는 구배 형태의 0 - 400 mmol 황산나트륨 범위에 걸쳐 달리했음), 세파덱스 G-75를 이용한 겔 여과 크로마토그래피, 그 다음 한외여과(ultrafiltration)에 의한 농축을 통해, SDS-폴리아크릴아미드 분석 결과 65 % 이상의 탈할로겐화 효소가 함유되어 있는 효소 제제를 얻음으로써 제조했다.
정제된 효소 일부 (약 25 mg)을 브롬화시아노겐으로 소화시켰다. 펩티드 단편을 0.1 % 트리플루오로아세트산이 함유된 0-80 % 아세토니트릴/물 구배가 있는 RP-8 Macrosphere (Altech) 혼합식 양이온 컬럼을 써서 단리했다.
3개의 정제된 단백질 및 정제된 브롬화시아노겐 (CnBr) 단편을 자동 에드만 분해를 통해 서열 분석했다. N-말단 및 3개의 CnBr 단편의 서열을 결정했다. CnBr 단편 중 하나는 N-말단과 서열상으로 동일했다. 다른 두 개는 고유한 내부 탈할로겐화 효소 서열에 대응되었다. 모든 펩티드의 서열을 표 1에 나타낸다.
| N 말단 서열 |
| SEIGT GFPFD PHYVE VLGER |
| 브롬화시아노겐 단편 서열 |
| 1. HYVDV GPRDG2. DHYRE PFLKP VDRE |
DNA 프라이머 설계
프라이머 RDhl 5.4 및 RDhl 3.12는 pEXPROK 발현계 내의 로도코쿠스 탈할로겐화 효소 (RDhl) 유전자를 코딩하는 오픈 리딩 프레임의 증폭 및 클로닝이 가능하도록 설계되었다. RDhl 5.4의 서열은 상기 단백질의 N 말단 서열에서 유래된 것인 반면, RDhl 3.12는 실제 DNA 서열을 기초로 설계되었다. 프라이머 RDhl 5.7 및 RDhl 3.13은 pRSET 및 pTrcHis 발현계 내의 RDhl 유전자를 생성시키도록 설계되었다. 프라이머 Trx2++ 및 Trx-는 pTrxFus 발현계 내의 RDhl 유전자를 생성시키도록 설계되었다.
이들 올리고뉴클레오타이드 프라이머의 서열은 다음과 같다.
| 올리고 이름 | 배향 | 설계의 기재 | 서열* |
| RDhl 5.4 | 순방향 | N 말단/상동성 | 5'GGTTCCATGGGNTT(CT)CCNTT(CT)GA(CT)CCNCA(TC)TA |
| RDhl 3.12 | 역방향 | 3'-서열 데이타 | 5'-바이오-CAGAGCTAGC GAGTCCGGGGAGCCAGCG |
| RDhl 5.7 | 순방향 | 5'-CGTACATATGGCCATGGGG GGT TCT CAT CAT CATNde I Nco I G S H H HCAT CAT CAT GGT ATG TCT GAA ATA GGT ACCH H HGGT TTT CCC TTC GAC CCT CAT TA-3' | |
| RDhl 3.13 | 역방향 | 5'-GAT GAC AAA TAA TGA GCG GCC GCA AGC TTG TAC-3'Not I Hind III | |
| Trx2++ | 5'-CC GGG GAT CCC ATG GCT TCT GAA ATA GGT ACC GGTBamH I Nco ITTT CCC TTC GAC CCT CAT TA-3' | ||
| Trx- | 5'-TCG ACT GCA GGC CGC TCA TTA TTT GTC ATC-3'Pst I Not I | ||
| *바이오 = 바이오틴; N = A, C, G 또는 T; ( ) : 주어진 위치에서 정의된 염기 여분 (redundancy), 밑줄친 서열은 증폭된 DNA 생성물 내로, 염두해둔 클로닝 벡터 (pEXPROK)와 병용할 수 있는 제한 위치를 도입하기 위한 5' 서열에 상응한다. |
부분 로도코쿠스 탈할로겐화 효소 유전자의 클로닝
로도코쿠스 탈할로겐화 효소 유전자의 클로닝은 게놈 DNA 라이브러리로부터 다음과 같이 증폭하여 수행했다. 게놈 DNA는 로도코쿠스 ATCC 균주 5538로부터 문헌 (P. J. Asturias and K. Timmis, J. Bacteriology 175: 4631-4640 (1993))의 방법을 써서 단리했다. 정제된 게놈 DNA (100 ㎍)를 평균 크기 10 kbp 미만이 되도록 기계적으로 잘랐다. 단편들을 BamH I 링커에 라이게이션시킨 다음, BamH I로 소화시키고, BamH I에 의해 소화시킨 박테리오파아지 람다-ZAP Express (상표) DNA (Stratagene Inc., 미국 캘리포니아 라졸라 소재)와 라이게이션시켰다. 게놈 로도코쿠스 DNA 단편이 포함된 라이브러리는 상업적으로 제조되어 (Stratagene Inc., 미국 캘리포니아 라졸라 소재), 1 x 104pfu/㎕ (1 ㎕당 플라크 형성 단위)의 적가로 공급된 것이었다. N 말단 서열의 아미노산 6-13에 대한 코돈에 상응하는 여유 (redundant) DNA 프라이머 (RDhl 5.4)를 고상 포스포라미다이트 화학으로 합성하여 HPLC로 정제했다 (표 2).
RDhl 5.4 프라이머를 T3 박테리오파아지 프로모터 서열을 인식하는 (또한 람다 ZAP Express(상표) 벡터내에 포함되는) 시판되는 프라이머와 함께 사용하여, 단독으로 확장된 게놈 DNA 박테리오파아지 라이브러리로부터 탈할로겐화 효소 서열을 증폭시켰다. 증폭은 RDhl 5.4 프라이머 1 μM, 100 nM 바이오티닐 T3 프로 프라이머 (New England Biolabs), 10 x Amplitaq 반응 완충액 (Perkin-Elmer-Cetus), 1.5 mM MgCl2, 5 U의 rAmpliTaq DNA 중합효소 (Perkin-Elmer-Cetus) 및 파아지 라이브러리 (온전한 전체 파아지) 4 ㎕를 포함하는 중합효소 연쇄 반응물 (50 ㎕)을 써서 수행했다. 증폭은 94 ℃에서 1 분, 55 ℃에서 2 분, 72 ℃에서 2 분의 가열 주기를 1 주기로 하여 35 주기를 수행했다. PCT 생성물을 1.0 % 아가로오즈를 통해 전기영동시켜서 분리했으며, 1.3 kbp의 불연속 밴드가 동정되었으며, 이를 겔에서 잘라내고, QiaQuick 겔 정제 키트 (Qiagen, Inc.)를 써서 단리했다. 이 DNA가 다른 로도코쿠스 탈할로겐화 효소 특이적 프라이머에 의해서 증폭될 수 있는지를 확인한 후, 단편을 제한 효소 Nco I 및 Pst I로 소화시켜 Nco I/Pst I에 의해 소화된 pGEM5zf(+) (ProMega, 미국 위스콘신주 매디슨 소재)로 라이게이션시켰다. 클로닝된 구획의 3'-비번역 영역의 서열분석을 통해서 추정 (putative) 중지 코돈을 밝혀내었고, 이어서 RDhl 5.4 및 RDhl 3.12 프라이머를 써서 코딩 영역을 증폭시켰다.
서열 및 제한 효소 분석
탈할로겐화 효소 유전자의 이중 가닥 서열분석은, 연속적인 디데옥시 방법 되풀이를 위해 이전 판의 서열분석 결과에 기초해서 설계된 바이오티닐화 프라이머 (표 3)을 써서 연속적인 디데옥시 방법의 되풀이를 통해 수행했다. 밴드들을 5.5 - 6.0 % 폴리아크릴아미드 우레아 서열분석 겔에서 분리했고, DNA를 모세관 운반으로 니트로셀룰로오즈 필터로 옮기고, 잘 알려진 스트렙다비딘-알칼리성 포스파타제 현상 프로토콜을 화학발광 물질과 병용하여 육안으로 확인할 수 있도록 만들었다.
| 올리고 이름 | 배향 | bp에 특이적 | 서열* |
| Dh1 Seq 7 | 순방향 | 697-714 | 5'-바이오-CCTGTCCCGAAGTTGTTG |
| Dh1 Seq 8 | 역방향 | 807-791 | 5'-바이오-CGGGCCGATGTCCACTG |
| Dh1 Seq 11 | 순방향 | 186-202 | 5'-바이오-TGCTCCAGACCTGATCG |
| Dh1 Seq 12 | 역방향 | 496-480 | 5'-바이오-TCTGATCGATGATCAAC |
| Dh1 Seq 13 | 순방향 | 404-422 | 5'-바이오-TCCCGACGTGGACGAATG |
| Dh1 Seq 14 | 역방향 | 663-646 | 5'-바이오-GAGCGCGACGATGTTCGC |
| Dh1 Seq 15 | 순방향 | 725-742 | 5'-바이오-CACCCGGCGTACTGATCC |
| Dh1 Seq 18 | 역방향 | 951-934 | 5'-바이오-GAGACCGGTCAGCATTCC |
| PROK-SEQ1 | 순방향 | 프로모터 | 5'-바이오-GAGCGGATAACAATTTCA |
| PROK-SEQ2 | 역방향 | 터미네이터 | 5'-바이오-TCTCATCCGCCAAAACAG |
| *바이오=바이오틴; N=A, C, G 또는 T; ( )= 주어진 위치에서 정의된 염기 여분. 유전자의 서열을 결정하는데 사용된 표 2에 이미 기재된 바이오티닐화 프라이머는 포함되지 않는다. T3, T7 및 SP6 프로모터에 특이적인 시판되는(New England Biolabs) 바이오티닐화 프라이머를 사용했으나 여기에는 열거하지 않았다. |
pEXPROK 벡터 (도 1)는 시판되는 pPROK-1 벡터 (Clontech, Inc., 미국 캘리포니아 마운튼 뷰 소재)의 유도체이다. pEXPROK가 pPROK 벡터의 기능적 요소 (암피실린 내성 마커, Ptac 전사 프로모터, 및 폴리링커 다음에 오는 쌍을 이룬 전사 종결 신호 포함)를 보유하고 있지만 pEXPROK 벡터는 pPROK-1의 EcoR I 내지 Hind III 폴리링커를 EXFLAG로 불리는 연장된 합성 폴리링커로 대체한다. EXFLAG 링커는 Nco I 위치 및 Nhe I 위치 사이에 오픈 리딩 프레임의 삽입이 가능하도록 설계된다. 6개 뉴클레오타이드 Nhe I 위치는 11개 아미노산 펩티드과 프레임내(in-frame)에 있으며, 그것의 마지막 옥타펩티드는 잘 알려진 FLAG 펩티드 (Kodak Imaging Systems, 미국 뉴욕주 로체스터 소재)에 상응하며, 이 펩티드의 항체 및 친화성 시약은 시판되고 있다. EXFLAG의 서열 및 특징은 다음과 같다.
RDhl 5.4/T3Pro 유전자를 pGEM5 제작물로부터 RDhl 5.4 및 RDhl 3.12 프라이머를 써서 PCR 증폭시킨 후, Nco I 및 Nhe I으로 소화시키면, 로도코쿠스 탈할로겐화 효소 유전자를 적절하게 소화된 발현 벡터내로 라이게이션시킬 수 있게 된다. 이 방법을 통해 RDhl 유전자를 pEXPROK내로 삽입했다. pEXPROK 및 pEXPROK-RDhl의 플라스미드 지도를 각각 도 1 및 3에 나타냈다. pEXPROK-RDhl 제작물의 DNA 서열은 나중에 자동 DNA 서열분석을 통해 확인했다.
서열 분석: 탈할로겐화 효소 유전자에 대한 완전한 DNA 서열 및 유도된 단백질 서열을 도 2에 나타냈다. DNA 서열 데이타는 876 bp의 오픈 리딩 프레임을 보여주며, 추론된 단백질 서열은 292개의 아미노산이며, 예상 분자량은 33 kD이다. 이는 다른 많은 가수분해성 탈할로겐화 효소에 대해 보고된 분자량과 유사하다.
단리된 유전자가 탈할로겐화 효소를 코딩하는 것인지를 결정하기 위해서 MacVector v.4.5.2 (Kodak, Inc.) 서열 분석 팩키지를 써서 유도된 단백질 서열을 엔트레즈(Entrez) 서열 데이타베이스 (이 데이타베이스는 미국립생명공학정보센터 (National Center of Biotechnology Information)에서 운영함)에 들어있는 다른 모든 공지 단백질의 서열과 비교했다. RDhl 폴리펩티드는 여러 할로알칸 및 할로산 탈할로겐화 효소, 에폭시 히드롤라제, 및 많은 다양한 촉매 기능이 있는 효소를 포함하는 소위 α/β 히드롤라제 패밀리에 속하는 것과 가장 큰 유사성을 보인다. 다우(Dow) 로도코쿠스 탈할로겐화 효소를 두 가지 다른 탈할로겐화 효소 및 비탈할로겐화 효소 (루시페린 모노옥시게나제) 효소와 배열 (alignment)한 것을 도 4에 나타냈다. 효소는 그 도면에 포함되었으며, 이들의 공개 문헌은 크산토박터 오토트로피쿠스 할로알칸 탈할로게나제의 경우는 문헌 (D. B. Janssen, et al., J. Bacteriology 171: 6791-6799 (1989))에, 테트라클로로시클로헥사디엔 히드롤라제 (TCCH 또는 LinB)의 경우 문헌 (Y. Nagata, et al., J. Bacteriology 175 (20) : 6403-6410 (1993)), 레닐라 레니포르미스 루세페린 모노옥시게나제는 문헌 (W.W. Lorenz, et al., Proc. National Acad. of Sciences, U.S.A. 88 (10): 4438-4442 (1992))이다. 엔트레즈 데이타베이스의 더 최근의 발표는, 또한 다우 RDhl 단백질 및 아직 기능이 밝혀지지 않은 두개의 가상 미코박테리움 투베르쿨로시스 단백질 (엔트레즈 데이타베이스 수탁번호 1449324 및 1478233, 96년 7월 22일 및 96년 7월 23에 각각 K. Badcock 및 C. M. Churcher et al.에 의해 제출됨) 뿐만 아니라 로도코쿠스 로도크로우스에서 단리된 할로알칸 탈할로겐화 효소 (엔트레즈 데이타베이스 수탁번호 1196824, A.N. Kulakava et al.에 의해 96년 2월 15일 제출됨)사이에 상당한 유사성이 있음을 보여준다.
도 4에 배열된 서열 중에서 크산토박터 탈할로겐화 효소만 구조적 수준 및 기계적 수준에서 특징이 잘 규명되어 있다. 크산토박터 촉매 주기에서 직접 관련된 것으로 알려진 3개의 잔기 중 두 개 (가장 중요한 잔기 2개 Asp-124 및 His 289)는 로도코쿠스 서열에 보존되어(conserved) 있다. 이들 유사성 및 도면에 지시된 것은 이 단백질 패밀리에 속하는 것들 사이에서 구조적 및 기계적 보존도가 높다는 것을 나타낸다.
탈할로겐화 효소 단백질 발현
탈할로겐화 효소로 상기 클로닝된 효소의 정체를 확인하기 위해, 대장균 내의 전체 길이(full-length) 단백질을 발현시켰다. 이를 수행하기 위해, RDhl 유전자를 포함하는 1300 bp Nco I/Spe I 제한 단편을 pRDhlK02.1-pGEM5 제작물로부터 잘라내고 NcoI/NheI-소화된 pEXPROK 벡터와 라이게이션시켰다. SpeI 및 Nhe 1이 라이게이션 상용성 (compatible) 제한 단편을 발생시키기 때문에, 이로 인해서 IPTG-유도성 Ptac 프로모터의 전사 조절 및 내인성 RDhl 3' 비번역 영역의 종결 조절하에 완전한 추정 RDhl 유전자를 포함하는 발현 제작물 (도 5)이 생겼다.
생성된 플라스미드 (pRDhlKO2.3-EXPROK)로 형질전환된 콜로니를 2 ml 미니배양물에서 밤새 증식시킨 후, 각 배양물 1 ml를 펠렛화하고, 세척하고 초음파처리했다. 그 다음 추출물에 RDhl 기질(1-클로로부탄)을 첨가한 후, 염화이온의 방출을 촉매하는 추출물의 능력을 분석했다. 염화이온 방출 활성은 클로닝된 유전자를 포함하지 않은 배양물에서는 없었으며, 클로닝된 유전자가 있는 배양물은 IPTG 첨가에 의해 이 유전자의 전사 활성을 증가시켰을 때 염화이온 방출 활성이 증가되는 것으로 나타났다. 따라서, 탈할로겐화 효소 활성은 pRDhlKO2.3-pEXPROK 제작물이 들어있는 재조합 대장균의 밤샘 배양물에서 유도될 수 있었다.
<실시예 2>
이 탈할로겐화 효소를 코딩하는 유전자를 단리하여, 박테리아인 대장균으로 클로닝했다. DNA 서열의 분석 결과, 이 단리된 유전자가 다른 공지된 탈할로겐화 효소와 높은 서열 유사성을 갖는 단백질을 코딩한다는 것이 밝혀졌다. 공업적으로 의미있는 수준으로 생합성 (즉 "발현") 수준을 증가시키기 위해, 대장균에서 이종 단백질을 다량 생산할 수 있는 것으로 보고된 많은 계를 검사했다.
pEXPROK-RDhl 발현 벡터를 제조하기 위해서, pEXPROK 플라스미드를 제한효소 Nco I/Nhe I로 소화시킨 후, QIAquick 겔 추출 키트 (Qiagen, Inc., 미국 캘리포니아주 캐츠워쓰 소재)로 정제했다. RDhl 오픈 리딩 프레임을 순방향 프라이머로서 RDHL 5.4 프라이머 (번역 개시를 지시하는 Nco I 위치를 포함함)를, 역방향 프라이머로서 RDHL 3.12 (Nhe I 위치 포함)를 써서 증폭시켰다. 증폭된 DNA를 Nco I 및 Nhe I으로 소화시키고, 이 유전자를 pEXPROK 벡터 내에 라이게이션시켰다. 그 다음 이 새 제작물로 대장균 AG1 감응 세포를 형질전환시키고, 암피실린 내성 콜로니를 선별했다. RDhl 유전자를 포함하는 플라스미드를 분석적 제한 효소 소화로 동정했으며, 이를 pEXPROK-RDhl 제작물로 명명했다. pEXPROK-RDhl 플라스미드 지도는 도 3에 나타냈다.
pRSET-RDhl 및 pTrcHis-RDhl 발현 벡터의 제작
pRSET-RDhl 및 pTrcHis-RDhl 발현 벡터를 제작하기 위해서, RDhl 5.4 및 RDhl 3.13 올리고뉴클레오타이드 프라이머 및 표준 PCR 조건을 사용하여 RDhl 유전자를 pEXPROK-RDhl로부터 증폭시켰다. 증폭 생성물은 아가로오즈 겔 상에서 분리했으며, 표준 절차에 따라서 정제했다.
pRSET 및 pTrcHis 벡터는 둘 다 IPTG 유도성 발현 벡터이며, 클로닝 벡터 pU18 및 19 시리즈로부터 유도된 것이다. 이들은 둘 다 인비트로젠 (Invitrogen Corp., 미국 캘리포니아주 샌디에고 소재)에서 구입한 것이고, 다음과 같은 특징이 있다.
(a) 둘다 높은 수준의 단백질 발현을 위해 설계되었으며, 암피실린 내성 유전자를 보유한다.
(b) 둘다 6개 히스티딘 잔기를 코딩하는, N-말단 융합 펩티드를 코딩하는 서열을 포함한다. 이들 잔기는 금속 결합 도메인으로 기능하며, 이로 인해 이후에 재조합 단백질을 친화성 크로마토그래피로 정제할 수 있다.
(c) 이 두 벡터는 탈할로겐화 효소 코딩 영역의 다운스트림에, 항-FLAG 항체에 의해 검출될 수 있고 그 항체에 고정될 수 있도록 하는 엔테로키나제 절단 인식 서열 (FLAG 및(또는) EXFLAG 펩티드)을 코딩하고 있다.
pRSET 벡터의 고수준 발현 특징은 이종 유전자의 업스트림에 존재하는 T7 프로모터로부터 연유한다. 그러나 대장균은 T7 중합효소가 없으므로, T7 RNA 중합효소 유전자가 있는 M13 파아지가 단백질 발현에 필요하다. 사실상 T7 프로모터의 조절하에 이종 유전자를 포함하는 박테리아에서 이종 단백질의 생산은 재조합 대장균을 T7 RNA 중합효소가 있는 T7 파아지로 감염시켜서 유도한다. 이와 달리 안정하게 T7 RNA 중합효소를 발현하는 시판 대장균 (즉, BL21)을 pRSET 제작물로 형질전환시킬 수 있다.
pRSET-RDhl 발현 벡터는 제한 효소 Nco I/Hind III로 플라스미드 pRSET를 소화시킨 후 5' 말단에 Nco I 위치가 있고, 3' 말단에 Hind III 위치가 포함된 RDhl 유전자 단편을 도입함으로써 제조했다. 이 새 제작물로 대장균 JM109 감응 세포를 형질감염시키고, 암피실린 내성 콜로니를 선별했다. RDhl 유전자가 포함된 플라스미드는 분석적 제한 효소 소화를 통해 동정했으며, 이를 pRSET-RDhl 제작물로 명명했다. pRSET-RDhl 발현 제작물을 도 6에 나타냈다. 그런 클론 (클론 16-4) 하나를 써서 pRSET계를 사용한 단백질 발현의 특징을 분석했다.
pTrcHis 벡터는 또다른 고수준 전사 프로모터인 trc 프로모터 (특징이 잘 알려진 trp 프로모터 및 lac 프로모터의 융합)가 들어있다. pTrcHis 벡터는 또한 이종 유전자의 업스트림에, 다중 클로닝 사이트에 클로닝된 단백질 번역의 매우 효율적인 반복 개시를 제공하는 미니-시스트론을 갖고 있다.
유사한 방법을 써서, 본 발명자들은 pTrcHis 벡터내로 RDhl 유전자 단편을 클로닝해서 pTrcHis-RDhl 발현 벡터를 제조했다. 발현 연구를 위해 대장균 TOP 10' 감응 세포를 pTrcHis 새 제작물로 형질전환시켰다. pRSET-RDhl 및 pTrcHis-RDhl 발현 벡터는 둘다 11개 아미노산의 EXFLAG 펩티드를 Nhe I 위치의 다운스트림에 포함하고 있다.
EXFLAG 펩티드 서열은 클로닝된 단백질의 오픈 리딩 프레임의 프레임내 (in-frame)에 있으며, 분석적 검출 및 친화성 정제에 유용하다. 도 7은 완성된 pTrcHis-RDhl 발현 제작물의 지도를 보여준다. 그러한 클론 (클론 18-3)은 고발현 클론으로 밝혀졌으며, TrcHis 발현계의 추가 특징 분석에 사용했다.
pTrxFus-RDhl 발현 벡터의 제작
ThioFusion (상표) 발현계 (Invitrogen Corp., 미국 캘리포니아주 샌디에고 소재)는 pTrxFus 발현 벡터 내에서 이종 단백질을 코딩하는 유전자를 대장균 단백질인 티오레독신을 코딩하는 유전자에 융합시킴으로써 이종 단백질을 다량 발현시킬 수 있는 수단이 된다. 티오레독신 부분은 그의 융합 파트너에게 가용성 및 열안정성을 부여할 수 있어서, 삼투압 충격이나 열 처리에 의한 정제를 가능하게 하는 새로운 선택권을 열어준다. 발현 벡터인 pTrxFus는 외래 유전자가 그것의 다중 클로닝 위치에 삽입되도록 허용한다. 이 벡터는 박테리오파아지 람다에서 얻은 PL프로모터를 써서 발현을 유도하며, 마찬가지로 박테리오파이지 람다에서 얻은 cl 리프레서 (repressor)를 써서 전사의 수준을 통제한다. cl 리프레서 유전자의 발현은 trp 프로모터 및 리프레서의 조절을 받는다. 외래 유전자의 발현은 트립토판을 배지에 첨가하여, cl 리프레서 합성을 중단시키고 PL프로모터에 의한 전사를 허용함으로써 유도된다.
Trx2++ 및 Trx- 프라이머 (DNA 프라이머 설계 참조)는 RDhl 유전자 단편을 TrxFus 다중 클로닝 위치에 독특한 효소 제한 위치로 변형시키도록 설계되었다. pEXPROK-RDhl 플라스미드를 주형을 사용하고, Trx2++ 및 Trx- 프라이머를 써서 PCR 하여 유전자 단편을 제조했으며, 이를 통해 5' 말단에 BamH I 위치를, 3' 말단에 Pst I 위치를 추가했다. 이 단편을 QIAquick PCR 정제 키트를 써서 정제했다. pTrxFus 벡터 및 유전자 단편을 모두 효소로 소화시키고, 아가로오즈 겔로 정제했고, 라이게이션시켰다. 이 새 제작물 pTrxFus-RDhl (도 8)을, 제조업자의 지시에 따라 제조한 Gl174 전기감응 세포 (Invitrogen Corp.)로 도입했다.
발현 분석
세포 배양물의 증식 및 발현유도 : 발현 연구를 위해, 적절한 DNA 제작물을 포함하는 것으로 밝혀진 클론을 15 ml 둥근바닥 폴리프로필렌 배양 튜브 내의 50 ㎍/ml 암피실린이 함유된 루리아 배양액 (LB) 또는 SOB 배지 (Difco, 미국 미시간주 디트로이트 소재) 3 ml에서 배양했다. 이들 배양 튜브를 진탕시키면서(회전 진탕기 200 회전/분) 37 ℃에서 밤새 인큐베이션시키거나 OD600이 0.6이 될 때까지 증식시켰다. 그 후 IPTG가 함유된 새 배지 2 ml를 (최종 IPTG 농도가 1 mM이 되게) 첨가하고, 튜브를 37 ℃에서 일정하게 진탕시키면서 약 4-5 기간 동안 더 인큐베이션시켰다. pRSET 재조합 클론의 경우는 IPTG 유도 1 시간 후, 세포 배양물을 이미 적정된 M13/T7 파아지로 감염시킨 후, 상기한 바와 같이 계속 인큐베이션시켰다.
pTrxFus 재조합 클론의 경우에는 RDhl 유전자 포함 클론을 100 ㎍/ml 암피실린이 함유된 1 ml RM 배지에서 배양시키고, 30 ℃에서 진탕시키면서 (회전식 진탕기 200 회전/분) 밤새 인큐베이션시켰다. 다음날 9 ml 새 유도 배지를 첨가하고, 30 ℃에서 증식을 OD550이 0.5가 될 때까지 계속했다. 그런 다음 세포 배양물에 트립토판을 (최종 농도가 100 ㎍/ml가 되게) 첨가하여 발현을 유도하고, 37 ℃ 인큐베이터로 옮겨서, 추가로 2-4 시간 동안 200 rpm으로 진탕시켰다.
세포 유리 추출 제제: 단백질 분석을 위해서 발현유도된, 밤샘 세포 배양물을 4 ℃에서 원심분리 (Sorvall SS-34 로터로 10 분 동안 5000 rpm으로)하여 펠렛화했다. 세포 펠렛을 1 mM 이나트륨 EDTA가 함유된 차가운 10 mM 트리스 황산염 완충액 (pH 7.5)으로 세척한 후 다시 원심분리했다. pEXPROK, pRSET 및 pTrcHis의 클론에 대해서는, 소형팁 초음파처리 프로브 (Soniprep 150, MSE Ltd., 석쎄스 클로울리 소재)를 써서 14 Hz로 얼음상에서 20초 "켜짐", 30초 "꺼짐" 체계를 3회 반복하면서 최종 현탁액을 초음파처리했다. 불용성 잔해를 10 분 동안 10,000 rpm으로 원심분리하여 제거했다. 그 다음 세포 유리 상층물을 깨끗한 폴리프로필렌 튜브로 옮기고, 적절한 분석을 수행했다. pTrxFus 클론으로 얻은 최종 세포 현탁액을 3회 10초 파열을 위해 초음파처리를 한 후, 드라이아이스/에탄올조에서 순간 냉동시켰다. 냉동 직후, 세포 용해물을 37 ℃에서 급속 해동하고, 신속한 초음파처리-냉동-해동 주기를 2회 이상 수행했다. 마지막 해동 후에, 세포 및 불용성 잔해를 제거하기 위한 상기한 절차를 계속했다.
pEXPROK-RDhl의 발현 및 정제
도 9의 좌측 (레인 2-5)은 pEXPROK-RDhl 클론 12-4의 세포 용해물 샘플의 Pro-Blue(상표) 염색 SDS-PAGE 겔을 보여주며, 우측 (레인 8-11)에는 부분적으로 정제된 rRDhl 효소의 것을 보여준다. 레인 1은 분자량 표준을 포함하며, 레인 6 및 7은 분자량 55 kD인 FLAG-펩티드 단백질의 60 ng 및 180 ng 단일 밴드를 포함하고 있다. 레인 2-5는 세포 유리 추출물로부터 얻은 모든 가용성 단백질을 보여준다. rRDhl 효소는 추출물 중에서 주요한 단백질이 아니기 때문에, 동일한 겔의 면역 블롯을 수행하여 이 재조합 효소의 존재를 확인했다. 도 10은 예상 분자량 약 35 kD에서 항-FLAG 항체로 인식시킨 각 샘플 레인의 이 재조합 효소 밴드를 보여준다. 도 10의 레인 6 및 7은 FLAG 펩티드 단백질 각각 20 ng 및 60 ng에 해당한다. 친화성 정제 재조합 효소를 Pro-Blue(상표) 염색 SDS-PAGE 겔 및 면역 블롯 막 상에서 분석했다. 친화성 정제된 rRDhl 효소의 연속 4개 분획을 도 10에서 나타낸 Pro-Blue(상표) 염색 SDS-PAGE 겔의 레인 8-11에서 영동시켰다. 약 35 kD 분자량에서의 뚜렷한 밴드 이외에도, 다른 단백질 밴드를 겔 상에서 육안으로 확인할 수 있다. 그러나 부분적으로 정제된 효소 (도 10, 레인 8-11)의 면역블롯 결과, 약 35 kD의 재조합 효소가 항-FLAG 항체로 염색되는 유일한 단백질로 확인되었으므로 그것이 적절히 번역된 rRDhl 단백질인 것으로 보인다. 이 데이타는, rRDhl 효소가 대장균 세포내 환경과 정제 과정 전반에서 안정하다는 것을 암시한다.
pRSET-RDhl 및 pTrc-His-RDhl의 발현
pRSET 재조합 효소 발현계 및 pTrcHis 재조합 효소 발현계의 클론으로부터 얻은 세포 유리 추출물을 재조합 RDhl 단백질의 존재 여부에 대해 분석했다. 정확한 크기의 Nco I/Hind III DNA 단편이 들어있는 5개의 클론을 동정하고, 밤새 배양하고, 용해시키고, SDS-PAGE 겔을 통해 rRDhl 발현에 대해 분석했다 (도 11). 레인 1은 분자량 표준을 보여주며, 레인 7 및 8은 분자량 55 kD에서 FLAG-펩티드 단백질의 60 ng 및 80 ng 단일 밴드를 포함하고 있다. 레인 2-6은 5개의 클론으로부터 얻은 세포 유리 추출물 1 ㎕ 샘플을 보여주며, 레인 9-12는 세포 유리 추출물의 0.1 ㎕ 샘플을 보여준다. 이들 추출물의 면역블롯 결과는 항-FLAG 항체를 면역블롯 염색에 사용했을 때, 각 샘플 레인에서 이중 밴드 (35 kD 및 38 kD)를 나타낸다 (도 12). 이는 pRSET-RDhl계는 2개의 출발 코돈이 있음을 의미한다. 제1 출발 코돈은 본래 pRSET 벡터계에서 실제 클로닝 위치의 약 40개 아미노산 (123 bp) 앞에 있도록 설계되어, Met ATG 코돈에서 번역이 개시되어 6개의 히스티딘이 그 다음에 따르도록 한다. 제2 출발 코돈은 Nco I 클로닝 위치 자체에 발생하며, RDhl 유전자 단편의 본래 5' 말단 프라이머내에 설계되었다. 그러나, 항-FLAG 항체 반응성 밴드의 존재로 rRDhl 효소의 존재가 확인된다.
도 13은 pTrcHis계로부터 얻은 세포 유리 추출물의 Pro-Blue(상표)-염색 SDS-PAGE 겔을 보여주며, 도 14는 동일한 SDS-PAGE 겔의 면역블롯을 나타낸다. pTrcHis계의 모든 클론은 약 35 kD의 분자량에서 과로딩된 항-FLAG 반응 밴드를 나타내며, 이를 통해 추출물 내의 rRDhl 효소의 존재를 확인했다. 초기 배양물 및 세포 유리 추출물 제제의 부피가 3개의 모든 계에서 동일하기 때문에, 이 과로딩된 밴드는 pTrcHis계에서 더 많은 효소 생성이 이루어졌음을 나타내는 지표이다.
pTrxFus-RDhl의 발현
pTrxFus계로부터 얻은 가용성 단백질, 세포 유리 추출물을 환원 SDS-PAGE를 써서 rRDhl 효소의 존재 여부에 대해 검사했다. 도 15는 Pro-Blue(상표)로 염색된 겔을 보여준다. 레인 12는 분자량 표준을 나타내며, 레인 11은 분자량 55 kD에서 FLAG 펩티드 단백질의 150 ng 단일 밴드를 보여준다. 티오레독신 융합 밴드는 47 kD의 분자량에서 레인 1 내지 9의 주요 단백질로서 명백하게 육안으로 확인할 수 있다. 이 크기는 티오레독신 12 kD 및 rRDhl 효소 35 kD에 상응한다. 반대로 레인 10은 세포 용해물로부터 얻은 불용성 물질 샘플을 포함하는데, 여기에는 고수준 발현 티오레독신 융합 단백질의 흔적이 전혀 없다. 이는 모든 융합 단백질이 가용성 상태임을 입증한다. 다른 실험에서 얻은 데이타는 이 융합 단백질 밴드가 면역블롯 막내의 동일한 분자량에서 항-FLAG 항체에 의해 인식될 수 있음을 나타냈다 (데이타를 도시하지 않음).
가수분해성 탈할로겐화 활성의 분석
재조합 효소의 가수분해성 탈염소화 활성을 정량하기 위해 460 nm에서의 비색계 염소이온 방출량 분석법을 썼다.
재조합 단백질 활성은 적절한 양의 세포 유리 추출물 (상기한 바와 같이 제조)을 유리병에 든 반응 완충액 6.0 ml에 첨가하여 측정했다. 100 mM 글리신산 나트륨 완충액 (pH 9.0)을 1,4-디클로로부탄 (DCB) (Aldrich Chemical Co.)에 대한 활성을 측정하는데 사용했으며, 100 mM 트리스 황산염 완충액 (pH 7.0)을 1,2,3-트리클로로프로판 (TCP)에 대한 활성을 측정하는데 사용했다. 할로겐화 기질 (6 ㎕) 및 마이크로 교반바를 추가하고, 유리병의 마개를 막았다. 마개로 막은 유리병을 교반시키면서 30 ℃ 수조에서 인큐베이션시켰다.
주기적으로 1.0 ml 샘플을 꺼내어 유리 염화이온을 분석했다. 시약 1 (5.25 N 과염소산 중의 0.375 M 질산제2철 (10%v/v))을 첨가하여 가수분해 반응을 중지시키고, 시약 2 (에탄올 중의 포화 티오시안산수은 (10%v/v))를 첨가하여 색을 발생시켰다. 최종 샘플을 Perkin-Elmer 552A UV/VIS 분광기로 460 nm에서 판독했다. 블랭크에 대해 비효소적 가수분해를 보정한 후 속도를 결정했다.
재조합 로도코쿠스 탈할로겐화 효소의 탈할로겐화 활성
앞의 데이타는 재조합 탈할로겐화 효소가 야생형 로도코쿠스에서 보다 대장균에서 더 높은 수준으로 합성될 수 있음을 제기하기는 하지만, 발현된 단백질의 활성을 제공하지는 않는다. 사실상 탈염소화 효소의 생산량 향상이 이 연구의 핵심적 목표이다. 이런 이유로 본 발명자들은 상기 제작물 각각으로부터 대표적인 클론에서 탈할로겐화 효소 활성의 상대량을 검사했다. 활성은 유리 염화이온 방출량 분석을 통해 측정했으며, 도 13-15에 나타낸 단백질 발현과 비교했다. 단백질 발현은 고해상도 스캐닝 농도계로 SDS-PAGE 겔 상에서 정량했으며, rRDhl의 측정량은 총 가용성 단백질의 백분률로 나타냈다. 다음의 표는 탈할로겐화 활성과 모든 4개의 발현계 중에서 총 가용성 단백질 중의 rRDhl 효소의 백분율 사이의 관계를 보여준다.
| 발현계 | 총 가용성 단백질의 백분율 | 배양물 1 ml당 DCB*활성 | 클론 명 |
| pEXPROK | 약 3 | 0.3 x 10-2 | EXPROK-RDhl |
| pRSET | 약 10 | 0.8 x 10-2 | RSET RDhl 클론 16-4 |
| pTrcHis | 약 15 | 2.4 x 10-2 | TrcHis RDhl 클론 18-3 |
| pTrxFus | 약 30 | 4.8 x 10-2 | TrxFus RDhl 클론 4 |
| *DCB 단위는 효소가 1,4-디클로로부탄을 탈염소화할 때 지시약 색변화도 (ΔOD/분)로 측정되었다. |
이 데이타는 rRDhl 단백질 발현량과 관찰된 탈할로겐화 효소 활성 사이의 강력한 연관관계를 드러낸다.
이 실시예에서는, 로도코쿠스 할로알칸 탈할로겐화 효소가 시험한 4개의 발현계 중 3 개의 대장균내에서 높은 수준으로 발현될 수 있다. 재조합 로도코쿠스 탈할로겐화 효소는 4개 발현계에서 전부 안정하게 발현되며, 항-FLAG 항체에 의해 예상 분자량에서 인식된다. 이 재조합 효소는 이종 단백질 발현량과 비례하는, 야생형과 유사한 수준의 탈할로겐화 효소 활성을 나타낸다.
<실시예 3>
다공성 알루미나 지지체의 제조
22 TCP 단위의 활성을 나타내는 단백질 (385 mg)을 4 ℃에서 주말 동안 온화하게 교반시키면서 휘발물질이 없는 알루미나 (k-4 알루미나의 lot # 1587, UOP 제품, 미국 일리노이주 데시플레인즈 소재) 2.0 g 상에 고정시켰다. 그 절차는 폴리에틸렌이민 코딩의 GIA-활성화, 물 세척 및 효소 부가로 이루어진 UOP의 표준 방식을 따랐다. 중탕 (bathing) 용액을 가만히 따르고, 지지체를 2 mM 트리스/1 mM EDTA (pH 7.5)로 5회 세척했다.
효소 정제 및 고정화용 제제
재조합 로도코쿠스 탈할로겐화 효소는 pTrcHis 발현계를 써서 대장균내에서 생산했다. 모든 고정화 연구에 사용되는 효소 제제는 우선 황산암모늄 침전법으로 처리하고, 4 ℃에서 45 내지 75 % 포화도의 침전분을 사용하여, 10 mM 트리스 황산염, 1 mM EDTA (pH 7.5) 중에서 투석 및 정화시켜, 부분적으로 정제했다. 이 염기성 완충액을 모든 정제 단계에서 줄곧 사용했다. 이들 제제는 280 nm에서 흡광도를 측정한 바에 따르면 세포 용해물 보다 대개 4.5 배 정도 정제되었으며, SDS-PAGE에 의하면 탈할로겐화 효소 단백질의 순도가 30 내지 35 %인 것으로 평가되었다. 더욱 고도로 정제된 효소 제제는 0 내지 400 mM 황산암모늄 구배로 용출하는 추가의 DEAE-세파로오즈 크로마토그래피 단계에 의해 얻어졌다. 이를 통해서 세포 용해물 보다 10 배 정도 정제되었으며, 이 때 효소 순도는 85 내지 90 %였다. 이 단계 다음에는 더 협소한 0-120 mM 황산암모늄 구배를 써서 QAE 세파로오즈 FF 크로마토그래피 를 수행하여, 세포 용해물보다 약 12 배 정도 정제되었으며, SDS-PAGE로 효소 균일도가 입증되었다. TrcHis RDhl 발현계로부터 정제된 RDhl는 본원에서 대개 "rRDhl"로 명명한다.
지지체의 제조
모든 음이온 교환 지지체를 제조업자의 지시 (필요한 경우)에 따라서 완전히 수화시킨 후, 철저히 세척해서 에탄올을 제거하고, 10 mM 트리스 황산염, 1 mM EDTA로 계속 세정하여 황산염 형태로 교환했다. 이 동일한 완충액을 효소 제제를 로딩하는 내내 사용했다.
무기 지지체는 잘 정립된 프로토콜 (미국 특허 제4,268,410호, (Mosbach, Immobilized Enzymes, in 44 Methods in Enzymology, (1976) (Academic Press NY)))을 따라서 폴리에틸렌이민 및 글루타르알데히드로 변형시켰다. 건조한 지지체 샘플의 중량을 달고, 마개가 달린 12 ml 유리병에 분배했다. 2.5 % 폴리에틸렌이민 수용액을 지지체 1 g 당 총 10 ml가 되도록 첨가했다. 유리병의 마개를 막은 후, 실온에서 1 시간 동안 요동식 진탕기에서 온화하게 교반시켰다. 샘플을 작은 부크너 깔대기로 옮겨서 온화한 진공에 의해 액체를 제거했다. 지지체를 시계 접시로 옮겨서 실온에서 밤새 (약 18 시간) 공기 건조되도록 했다. 샘플을 새 유리병으로 옮기고, 여기에 새로운 융해 용액, 25 % 글루타르알데히드 수용액을 지지체 1 g당 20 ml의 비율로 첨가했다. 이 혼합물을 뚜껑을 막고 1 시간 동안 후드에서 간헐적으로 진탕시켰다. 글루타르알데히드를 가만히 따라내어 제거하고, 푹신 시험을 통해 알데히드가 전혀 검출되지 않을 때까지 물로 철저히 세척했다. 효소 고정화 전에, 지지체를 가만히 따라냈으나, 건조시키지는 않았다.
효소의 고정화
모든 효소 고정화는 요동식 진탕기를 써서 온화하게 교반시키면서 4 ℃의 냉장실에서 수행했다. 효소 제제가 지지체에 결합하는데 드는 시간은 이온 교환 지지체의 경우 1 시간에서, PEI-GIA 변형 무기 지지체 실험의 경우 최대 4일까지 소요된다. 완충액 교환은 단지 셀라이트 R 648 결합 용량 연구에서만 하며, 여기서 트리스 완충액은 예비팩키지 세파덱스 G-25 컬럼 상에서 10 mM 인산칼륨, 1 mM EDTA (pH 7.0) 완충액으로 교체되었다.
이온 교환 지지체에서 효소의 분리
수지 슬러리의 250 ㎕ 분액 두 세트를 효소 11.1 DCB U (Toyopearl (등록상표)) 또는 6.63 DCB U (PEI 셀룰로오즈)과 밤새 결합시켰다. 결합 상층물을 조심스럽게 제거하고 분석했다. 수지를 8 분 동안 6,000 rpm으로 원심분리로 침전시켰다. 추가의 상층물을 제거하고, 수지를 100 mM 글리신산나트륨 완충액 (pH 9)으로 2회 세척했다. 각 세트에서 하나의 튜브를 5.0 M (NH4)2SO4로 1 시간 동안 처리하여 지지체로부터 효소를 분리시켰다. 이들 수지를 다시 완충액으로 세정했다. 수지 및 상층물을 기질로 DCB를 써서 활성을 분석했다.
이온 교환 지지체
음이온 교환 크로마토그래피를 야생형 및 재조합 탈할로겐화 효소 둘 다의 정제 및 특징분석에 확대 사용했다. 효소는 중성 pH (탈할로겐화 반응이 일어나는 지점)에서 음이온성이며, 음이온 교환 지지체는 종종 그러한 단백질을 고정시키는 웰로 기능한다. 이런 방법은 또한 효소의 동시 정제 및 고정화가 가능하기 때문에도 매력적이다. 이런 잠재적인 유용성을 확인하기 위해서, 음이온 및 양이온 교환 수지에 대한 rRDhl 단백질의 결합 및 용출을 광범위한 pH 범위에서 시험했다. 도 2는 DEAE 세파로오즈 음이온 교환 수지에서 5 pH 단위 범위에 걸쳐 탈할로겐화 효소의 가까스로 양적인 보유율을 보여준다. 이와 대조적으로 CM-세파로오즈는 pH 5 이상에서 그의 결합 용량을 급속하게 상실한다.
고정화
많은 지지체 물질을 rRDhl을 고정화시키는 그 효능에 대해 시험했다. 이 연구에서 탈할로겐화 효소의 40-70 % 황산암모늄 침전분을 사용했다. 이온 교환 지지체 13개 각각에 고정시킨 2벌의 효소 세트를 제조했다. 각 세트 중의 하나를 염화이온 방출량 분석법으로 탈할로겐화 효소 활성에 대해 즉시 분석했다. 두번째 것은 45 ℃에서 1 시간 동안 TCP-포화 10 mM 트리스 황산염 (pH 7.5)으로 처리했다. 이 처리 다음에는, 상층물을 제거하고, 이 세트를 표준 염화이온법으로 분석했다. 표 4에 이들 분석 결과를 요약했다.
| 지지체 | 공급사 | Lot/Batch# | TCP 처리 후의 활성도 (%) |
| 실리카 겔 PEI-실리카 | 시그마 | 24H0810 | 0 |
| DEAE 세파덱스 A-50 | 시그마 | 24H0485 | 19 |
| PEI 셀룰로오즈 (중간 메쉬 | 시그마 | 94H7200 | 54 |
| 글래스 아미노프로필 | 시그마 | 34H8260 | 43 |
| 토요오펄 (등록상표) 슈퍼 Q-650M | 토소하스 | 65QAM02RM | 79 |
| DEAE 트리스아크릴 플러스-M | 시그마 | 92H0861 | 21 |
| 스펙트라/겔 이온 교환 1x8 | 스펙트럼 | 16865 | 14 |
| Dowex (등록상표) 1x8-200 이온 교환 수지 | 알드리치 | 12627-85-9 | 54* |
| DE52 | 와트만 | 1152032 | 50 |
| 4급 암모늄 셀룰로오즈 | 와트만 | 9852032 | 2 |
| DEAE 세파로오즈 | 시그마 | 53H0177 | 30 |
| AG 3X4 100-200 | 바이오-래드 | 52594A | 18 |
| AG 4X4 100-200 | 바이오-래드 | 47426A | 9 |
| * 37 ℃에서 인큐베이션 |
이 결과는 탈할로겐화 효소를 위한 지지체로서 이들 매트릭스의 효능이 현저하게 불균일함을 지시한다. 유사한 불균일성이 유사한 반응을 촉매하는 유사한 탈할로겐화 효소에 대해서도 관찰될 것이다.
최상의 후보 4개를 TCP의 존재하에 시간에 따른 안정성에 대해 스크리닝했다. PEI 셀룰로오즈, 토요오펄 (등록상표) 슈퍼 Q-650M, 글래스 아미노프로필 및 DEAE 세파로오즈가 그것이다. 세트 2벌을 준비해서, 하나는 초기 염화이온 검출 분석에 사용하고, 두번째 것은 TCP에 노출된 후의 분석에 사용했다. 표 5는 처음 24 시간 동안 3/4의 상당한 활성 손실이 있지만, 초기 손실 이후에는 7일 이상 안정한 활성이 유지되었음을 보여준다. 토요오펄 (등록상표)은 유사하지만 48-120 시간에서의 지연된 손실을 거친 후 안정화되는 것으로 나타났다.
| 지지체 | 시간에 따른 활성도(%) | |||
| 24 시간 | 48 시간 | 120 시간 | 192 시간 | |
| PEI셀룰로오즈 (중간 메쉬) 시그마 | 83 | 79 | 78 | 78 |
| 글래스, 아미노프로필 시그마 | 78 | 87 | 75 | 66 |
| 토요오펄(등록상표) Q-650M 토소하스 | 100 | 100 | 78 | 82 |
| DEAE 세파로오즈 시그마 | 76 | 79 | 73 | 62 |
4개의 수지 모두 탈할로겐화 효소를 고정시키는데 있어 훌륭한 후보인 것으로 나타났으며, 효소 활성의 지속을 위한 적절한 표면을 제공하는 것으로 보인다.
트레실-활성 폴리아크릴 중합체에 공유 커플링
펜던트 아미노기를 통해 rRDhl를 임의의 지지체에 공유결합으로 커플링시킬 수 있는 용이성을 측정하기 위해서, 활성화 수지인 트레실-토요오펄을 평가했다. 이 활성화 수지는 다음과 같이 효소와의 안정한 2차 아미노기 결합을 제공한다.
이 연구에 사용되는 rRDhl 제제는 항-FLAG 항체 컬럼을 써서 대장균 용해물로부터 친화성 정제했고, SDS-PAGE로 측정한 결과 약 20 % 순도였다. 효소 0.35 단위 (총 단백질 1.96 mg)를 제조자가 설명한 조건에서 트레실-토요오펄 40 mg에 커플링시켰다. 3 시간 후, A280에서 관찰된 흡광도 감소에 의해 측정된 바로는 단백질 93%가 커플링되었다. 수지 10 mg을 추가로 첨가했으며, 1 시간 동안 커플링을 계속하여 단백질 > 98 %를 결합시켰다. 탈할로겐화 효소에 대한, 세척된 겔의 재분석 결과는 0.11 단위의 활성 (31 %)이 회복되었음을 입증했다. 동일한 효소 제제 2.6 단위와 활성화 수지 1.0 g을 사용하는 2차 시험에서는 활성이 37 % 회복되임 입증되었다. 제조자의 기록에 따르면, 이 지지체에 커플링되는 효소로부터 활성의 회복율은 대개 40 - 60 % 범위이므로, 31-37%는 합당한 값을 나타내며, 이는 효소를 그 아미노기를 통해 벤취 규모 또는 공업용 반응기에 사용하기 위한 고정화 지지체 물질에 커플링시키는 것을 공업적으로 실용하기에 충분한 값이다.
또한, 친수성 수지에 대한 이런 공유결합은 탈할로겐화 효소를 고정화시키는 효과적인 수단이다.
글루타르알데히드와 가교결합된 폴리에틸렌이민 함침 무기 지지체
무기 지지체는 또한 입수용이성, 저비용, 높은 로딩 용량, 재생 용이성, 재활용 용이성 및 넓은 범위의 공극 크기 때문에 공업적인 효소 활용분야에 광범위한 유용성이 있는 것으로 밝혀져 있다. 다공성 알루미나, 실리카 및 셀라이트는 고정된 효소용 지지체로서 광범위한 유용성이 있는 것으로 밝혀져 있으며, 티탄 및 탄소 기재 지지체는 이 보다 용도가 제한되어 있다.
효소는 무기 지지체에 3가지 기작을 통해서 고정될 수 있다. 효소는 이온성 상호작용을 통해 무기 지지체에 회합할 수 있거나 또는 무기 지지체 내로 함침된 이온성 중합체에 이온 교환 기작을 통해서 결합하거나, 또는 이관능성 화학 링커를 써서 이온성 중합체에 가교결합될 수 있다. 첫번째 기작은 약한 이온성 상호작용이 자주 효소 침출을 유발하기 때문에 광범위하게 응용되지는 않았다. 폴리에틸렌이민 (PEI)은 비용이 낮아서 함침에 선택되는 중합체이다. 아미노기에는 폭넓은 가교결합 화학 방법이 적용될 수 있다. 글루타르알데히드는 지금까지 가장 잘 연구된 저가의 가교결합제이다. rRDhl에 관한 연구는 전적으로 이 커플링 화학법에 집중되어 있다.
PEI 함침 다공성 지지체의 제조 후, 글루타르알데히드 가교결합을 위해 정립된 방법을 사용했다 (미국 특허 제4,268,410호, 및 Mosbach, Immobilized Enzyme, in 44 Methods in Enzymology (1976) (Academic Press, NY)). rRDhl 활성 회복율을 처음에 2개의 지지체에 대해서 스크리닝했다. PEI로 함침되어 있는 다공성 실리카를 시그마사로부터 구입했다 (기명 공극 크기 250 Å). 셀라이트 R-648은 맨빌 (Manville)사에서 구입했고 (기명 공극 크기 약 150 Å), 미국 특허 제4,268,410호의 방법에 따라서 시그마사로부터 구입한 PEI (평균 50,000 MW)로 함침시켰다. 두 지지체를 글루타르알데히드 (GIA)로 처리한 다음 물로 철저히 세척했다. 고도로 정제된 rRDhl 효소 제제 5.5 단위 (0.55 mg 단백질/ml에서 1.0 ml)를 써서 글루타르알데히드 처리한 두 개의 PEI-함침 지지체 각각 500 mg에 커플링시켰다. 이 로딩량 (0.11 %w/w)은 이 지지체들의 공지된 로딩 용량 보다 적어도 2 자리수 아래였다. 효소를 지지체와 함께 4 ℃에서 밤새 (18 시간) 온화하게 진탕시키면서 인큐베이션시킨 후, 철저히 세척하여 비결합된 단백질을 제거했다. DCB를 이용한 두 지지체의 재분석 결과, PEI-셀라이트 R-648의 경우 40 % 회복율을, PEI-실리카의 경우 31 %의 회복율이 입증되었다. 이들 샘플을 실온의 반응 조건하에서 (포화 DCB) 1 주일 동안 보관하고, 재분석했다. 셀라이트 고정 효소 제제는 일주일 안에 활성의 49 %를 상실한 반면, 실리카 고정 효소 제제는 그 활성의 28 %만을 상실했다.
어떤 종류의 무기 지지체가 최적의 rRDhl 활성 회복율을 제공하는지 신속하게 결정하기 위해서, 여러가지 시판되는 다공성 지지체를 스크리닝했다. 로딩 용량, 공극 크기 등과 무관하게 활성 회복량만을 기초로 지지체를 비교하기 위해서, 상기한 실험에서와 같이, 고도로 정제된 rRDhl 효소의 로딩량은 지지체의 예상 로딩 용량 보다 크기의 3 자리수 이상 작게 (0.0055 %w/w) 설정되었다.
3개의 다공성 알루미나, 3개의 다공성 실리카 및 2개의 다공성 탄소를 스크리닝했다. 또한, 시그마 PEI-실리카 및 셀라이트 R-648 (앞의 스크리닝에서 평가됨)을 동일한 조건에서 재평가했다. 모든 지지체를 PEI로 함침시키고, 글루타르알데히드로 상기한 바와 같이 처리했다. 효소 제제 (13.8 ㎍) 25 ㎕를 각각의 지지체와 함께, 최대한의 로딩량을 보장하기 위해 4 ℃에서 72 시간 동안 온화하게 교반시키면서 인큐베이션시켰다. 중탕 용액 내에서 효소 로딩을 24 시간과 72 시간에서 A280을 측정함으로써 관찰했다. 그 다음 72 시간 인큐베이션 후에 중탕 용액 (미결합)내에서와 세척된 겔 (결합) 상에서 DCB에 대한 활성을 측정했다. 표 6 및 7은 이 연구의 결과를 보여준다.
| 지지체 | 24 시간에서 로딩% | 72 시간에서 로딩% |
| 알루미나-Davison Low SA | 83 % | 62 % |
| 알루미나- Norton SA 6176 | 86 % | 84 % |
| 알루미나- Calcicat Type C | 84 % | 67 % |
| 실리카- Calcicat S-88-473 Type A | 69 % | 72 % |
| 실리카- Shell 5980-F | 81 % | 93 % |
| 실리카- Davison 952-08-5X | 91 % | 92 % |
| 탄소 - Borecker Subunit | 77 % | 91 % |
| 탄소 - AmCy 5701-Sn | 90 % | 95 % |
| 셀라이트 - Manville R648 | 82 % | 95 % |
| PEI-실리카- Sigma | 85 % | 93 % |
| 지지체 | 결합율(%) | 비결합율(%) | 손실율(%)* |
| 알루미나-Davison Low SA | 7 % | 38 % | 55 % |
| 알루미나- Norton SA 6176 | 3 % | 17 % | 80 % |
| 알루미나- Calcicat Type C | 7 % | 34 % | 59 % |
| 실리카- Calcicat S-88-473 Type A | 12 % | 28 % | 60 % |
| 실리카- Shell 5980-F | 12 % | 8 % | 80 % |
| 실리카- Davison 952-08-5X | 17 % | 11 % | 72 % |
| 탄소 - Borecker Subunit | 5 % | 9 % | 86 % |
| 탄소 - AmCy 5701-Sn | 7 % | 5 % | 88 % |
| 셀라이트 - Manville R648 | 21 % | 5 % | 74 % |
| PEI-실리카- Sigma | 6 % | 7 % | 87 % |
| *손실율(%) = 100 % -(결합율(%) + 비결합율(%)) |
각각의 지지체는 72 시간 후에 62 내지 95 %의 획득량 범위에 걸쳐 서로 다른 획득량 경향을 보인다. 대부분의 계에 대해서, 72 시간은 4 ℃에서 이룰 수 있는 단백질 최대 로딩을 획득하는데 적당하다. 그러나, 3 개의 알루미나 계는 실질적으로 72 시간에서 보다 24 시간에서 더 큰 획득량을 보였다. 결합 효소 활성의 72 시간에서의 회복율은 비처리된 가용성 효소 비교용과 비교했을 때 3 내지 21 %의 범위였다. 시험한 모든 계에서 55 % 내지 87 %의 범위에 해당하는 상당한 양의 활성을 설명할 수 없거나 또는 손실되었다. 또한 앞서 실행한 지지체 (시그마 PEI-실리카 및 맨빌 셀라이트 R648)는 더 열악한 결합시 회복율을 나타냈다. 이는 이 실험에서 사용되는 효소 로딩비가 적거나 또는 인큐베이션 시간이 짧았기 때문일 것이다. 결합된 효소 활성의 회복율 및 결합 효율이 주어진다면, 셀라이트, 실리카, 탄소 및 알루미나는 모두 본 발명에서 효과적인 고정화 지지체 물질로 기능하지만, 셀라이트 및 실리카가 알루미나 및 탄소의 성능을 능가한다. 그러나, 안정성과 관련해서는 알루미나 지지체가 성능이 더 나은 것으로 보인다 (아래 참조).
결합된 샘플을 장기간 안정성 연구에 투입했다. 기질로서 DCB를 사용한 분석법에 따라서, 기지체를 세정하고, TCP 포화 완충액에 담갔다. 소정의 시점에서, TCP 완충액을 제거하고, 지지체를 다시 세정하고, DCB로 분석했다.
| 지지체 | 유지되는 활성도 (%) | |
| 41 시간 | 136 시간 | |
| 알루미나 1 | 38 | 57 |
| 알루미나 2 | 66 | 67 |
| 알루미나 3 | 58 | 75 |
| 실리카 1 | 76 | 81 |
| 실리카 2 | 79 | 46 |
| 실리카 3 | 60 | 30 |
| 탄소 1 | 75 | 0 |
| 탄소 2 | 37 | 48 |
| 셀라이트 | 57 | 12 |
| PEI-실리카 | 43 | 60 |
고정화 반응에서 중간정도의 회복율을 보였던 두 개의 지지체, 실리카 및 알루미나는 시간에 따른 최적의 안정성을 갖는 것으로 증명되었다. 이들 지지체를 모두 PEI 또는 GIA 변형없이 직접 효소에 결합하는 이들의 능력에 대해서 스크리닝했다. 그러나, 결합율이 매우 낮은데다 재생이 불가능했기 때문에, 세척을 통해 지지체로부터 효소를 쉽게 제거했다.
이온 교환에 의해 결합된 효소를 갖는 폴리에틸렌이민-함침 무기 지지체
PEI의 분자량도 고정된 효소의 전체 수율 및 안정성에 대해 영향을 주는 것으로 알려져 있다. 또한, PEI는 다양한 지지체 상의 이온 교환 리간드로서 또는 글루타르알데히드 가교결합 수용기(acceptor)로서 기능할 수 있다. 이런 이유 때문에, 두 개의 다른 분자량을 갖는 PEI를 상기 단락에서 설명한 방법을 따라서 각종 다공성 무기 지지체 내로 함침시켰다. 그러나 이들 실험에서는 효소 (1-2 U/ml이 함유된 반정제 제제)를 이온 교환에 의해 결합시키고, GIA 가교결합 단계는 생략했다. 샘플을 안정성 스크리닝에 투입해서 PEI의 크기가 중요한 요소인지를 결정했다.
| 지지체 | 공급사 | PEI 분자량 | 유지된 활성도 (%) | ||
| 24 시간 | 120 시간 | ||||
| 1 | 알루미나 | Norton SA 6176 | 50,000 | 70 | 62 |
| 2 | 알루미나 | Calcicat Type C | 50,000 | 61 | 42 |
| 3 | 실리카 | Calcicat S-88-473 Type A | 50,000 | 101 | 64 |
| 4 | 실리카 | Shell 5980-F | 50,000 | 80 | 55 |
| 5 | 탄소 | Borecker Subunit | 50,000 | 41 | 32 |
| 6 | 탄소 | AmCy 5701-Sn | 50,000 | 39 | 17 |
| 7 | 셀라이트 | Manville R648 | 50,000 | 83 | 50 |
| 8 | 알루미나 | Norton SA 6176 | 2000 | 82 | 55 |
| 9 | 알루미나 | Calcicat Type C | 2000 | 91 | 61 |
| 10 | 실리카 | Calcicat Type C | 2000 | 94 | 57 |
| 11 | 실리카 | Shell 5980-F | 2000 | 76 | 55 |
| 12 | 탄소 | Borecker Subunit | 2000 | 44 | 50 |
| 13 | 탄소 | AmCy 5701-Sn | 2000 | 42 | 21 |
| 14 | 셀라이트 | Manville R648 | 2000 | 58 | 2 |
셀라이트를 제외하면, PEI의 분자량 차이가 효소의 고정화 효율 또는 안정성에 주요한 영향을 미치는 것으로 나타나지 않았다.
<실시예 4>
pRSET-RDhl.Nde의 제작
pRSET-RDhl.Nde 발현 벡터는 플라스미드 pRSET RDhl 클론 16-4를 제한 효소인 NdeI 및 Hind III로 소화시킨 후, 이 제작물 내로, 5' 말단에 Nde I 위치가, 3' Hind III 위치가 있는 RDhl 유전자 단편을 도입하여 제조했다. 그 다음 새 제작물로 대장균 JM109 감응 세포 (Invitrogen 제품, 미국 캘리포니아주 칼스바드 소재)를 형질전환시키고, 암피실린 내성 콜로니를 선별했다. RDhl 유전자가 포함된 플라스미드를 분석적 제한 효소 소화를 통해 동정해 냈으며, 이를 pRSET-RDhl.Nde 제작물로 명명했다.
재조합 RDhl 단백질의 제조
두 개의 새 제작물인 pRSET-RDhl.Nde 및 pTrcHis-RDhl로 대장균 B834 (DE3) 감응 세포 (Novagen, Inc. 미국 위스콘신주 매디슨 소재)를 형질전환시켰다. 활성 탈할로겐화 효소의 생산을 탈할로겐화 효소 활성 분석을 통해 확인했으며, 효소 생산량은 PAGE로 측정했다. 탈할로겐화 효소 활성은 460 nm에서 비색계 염화이온 방출 분석법으로 1,4-디클로로부탄 (DCB)에 대한 효소적 탈염소화 활성을 평가함으로써 측정했다.
본 발명자들은, 이 숙주 대장균 B834 (DE3) 감응 세포에서 재조합 RDhl 효소의 생산이 향상되었음을 관찰했다. 다음 표는 상이한 발현계 및 숙주 세포 사이에서, 탈할로겐화 효소 활성과 총 가용성 단백질 중의 rRDhl 효소의 백분율 사이의 관계를 보여준다.
| 발현계 | 감응 숙주 세포 | 가용성 단백질 중의 rRDhl (%) | 배양물 1 ml당 DCB*활성 ( x 102) |
| pEXPROK | 대장균 AG 1** | 약 3 | 약 0.3 |
| pRSET | 대장균 JM 109 | 약 10 | 약 0.8 |
| pTrcHis | 대장균 TOP 10F'** | 약 15 | 약 2.4 |
| pTrxFus | 대장균 Gl 174** | 약 30 | 약 4.8 |
| pTrcHis | 대장균 B834 (DE3) | 약 42 | 약 4.5 - 12.5 |
| pRSET | 대장균 B834 (DE3) | 약 48 | 약 14.8 |
| *DCB 단위는 1,4-디클로로부탄 (DCB)에 대한 탈염소화 활성의 척도이다. | |||
| ** 대장균 AG 1 화학적 감응 세포는 스트라타젠 (미국 캘리포니아주 라졸라 소재)에서 구입한 것이고, 대장균 TOP 10 F' 화학적 감응 세포는 인비트로젠 (미국 캘리포니아주 칼스바드 소재)에서 구입한 것이고, 대장균 Gl 174 세포는 인비트로젠(미국 캘리포니아주 칼스바드)에서 구입해서, 공급자의 지시에 따라 전기감응시켰다. |
<실시예 5>
변형된 로도코쿠스 탈할로겐화 효소
TrcHis RDhl 제작물로 생산된 로도코쿠스 탈할로겐화 효소의 아미노 및 카르복시 말단 모두를 추가의 아미노산으로 변형시켰기 때문에, 이러한 변형마다 효소의 활성에 미칠 수 있는 영향을 시험하기 위해서 플라스미드 제작물을 제조했다. pTrcHis RDhl 18-3 플라스미드를 Nco I 및 Age I로 효소적 소화시키고, 생긴 틈에 17 bp 올리고를 라이게이션시켜서 아미노 말단 폴리히스티딘 테일을 제거했다.
그 올리고 쌍의 DNA 서열은 다음과 같다.
RDhl 델타 His-6-F : 5'-CATGGGTGAAATAGGTA-3'
RDhl 델타 His-6-R : 5'-CCGGTACCTATTTCACC-3'
표준 분자생물학 프로토콜을 써서, His-6-F 및 His-6-R 올리고뉴클레오타이드를 어닐링하고, 소화된 18-3 제작물로 라이게이션시키고, 이것으로 감응 대장균 TOP10 F' 세포를 형질전환시켰다. 형질전환된 콜로니를 LB/Amp 아가 플레이트에서 증식시켜서 선별했다. 생성된 아미노 말단 서열은 다음과 같다.
(본래의 비변형 서열의 아미노산 번호를 나타내었음)
소화 및 재라이게이션 결과, Ala-293 Ser-294 서열 (도 2)이 Ala-293 Arg-294 서열로 변화된 제작물이 생겼다. Arg 코딩 코돈 다음에는 본래 서열의 염기 927-979에서 TGA 뉴클레오타이드 트리머에 상응하는 중지 코돈이 있다.
카르복시 말단 EXFLAG는 pTrcHis RDhl 18-3을 Avr II 및 Nhe I로 소화시키고 플라스미드를 재라이게이션시켜서 제거했다.
개별 클론을 효소적 소화 및 겔 전기영동을 통해 스크리닝했다. 후보 콜로니를 5 ml 배양물에의 37 ℃에서 증식시키고, IPTG로 발현을 유도하고, 초음파처리로 세포를 용해시켰다. 이 용해물을 PAGE, 웨스턴 블롯, 염화이온 검출 분석을 통해 분석했다. 아미노 말단 폴리-히스티딘 또는 카르복시 말단 EXFLAG가 없는 이 클론은 본래 제작물과 동일한 촉매 활성을 나타냈다.
<실시예 6>
pTrcHis RDhl-S-Tag 및 pRSET RDhl-S-Tag의 제작
재료 및 방법:
CTERM S-Tag F (순방향) 및 CTERM S-Tag R (역방향)은 FLAG 폴리펩티드 (11개의 아미노산 서열)를 S-Tag 폴리펩티드 (15 개의 아미노산 서열)로 바꾸도록 설계된 2개의 프라이머이다. 이들 올리고뉴클레오타이드의 서열은 다음과 같다 (S-Tag 단편의 가닥마다 밑줄을 그었다).
pTrcHis RDhl-S-Tag의 제작
pTrcHis RDhl-S-Tag 플라스미드를 제조하기 위해서, 플라스미드 pTrcHis RDhl 클론 18-3을 제한 효소 Avr II 및 Not I으로 소화시키고, S-Tag 단편과 라이게이션시켰다 (S-Tag 단편은 프라이머 CTERM S-Tag F 및 프라이머 CTERM S-Tag R을 함께 실온에서 어닐링시켜서 제조했다). 새 제작물 pTrcHis RDhl-S-Tag을 대장균 AG 1 감응 세포 (Stratagene 제품, 미국 캘리포니아주 라졸라 소재) 내로 도입하고, 암피실린 내성 콜로니를 선별했다. S-Tag 단편이 들어있는 플라스미드를 분석적 제한 효소 소화를 통해 동정했다.
pRSET RDhl-S-Tag의 제작
pTrcHis RDhl-S-Tag를 제작하는데 사용된 것과 동일한 방법을 써서 pRSET RDhl-S-Tag을 제작했으나, 플라스미드 pRSET RDhl 클론 16-4로 시작하여 제한 효소 Avr II 및 Not I으로 소화시키고, 이 제작물을 상기한 S-Tag 단편에 라이게이션시켰다.
반(半)정제 rRDhl (TrcHis RDhl 클론 18-3에서 유래된 EXFLAG-태그 단백질)을 이 실시예에서 제조된 반정제 RDhl-S-Tag 단백질과 동력학적으로 비교했다. 염화이온 방출 활성을 0 mM 내지 5 mM의 TCP 농도에 걸쳐 시험했다. 도 19에 나타낸 바와 같이, S-Tag 변형 단백질은 EXFLAG 변형 단백질을 능가하는 Vmax에서 약 15 %정도 일정한 증가를 보였다. S-Tag 단백질 단백질은 EXFLAG 단백질 보다 TCP에 대해 약 25 % 더 낮은 Km을 나타냈다. 이런 결과는 TDhl 효소의 C 말단에서의 변화를 효소의 활성의 조정 및 개선에 사용할 수 있음을 확인시켜 준다.
<실시예 7>
반응기 설계 및 성능
반응기 설정:
벤취규모 반응기를 쉘 및 튜브 설계에서 1/4 인치 ID를 갖는 모든 316 스테인레스 스틸을 써서 조립했다. 반응기 입구 및 출구 배관도 마찬가지로 스테인레스 스틸이었다. 라우다(Lauda) 회전 수조 (자동온도조절장치가 있음)를 사용해서 반응기를 30 ℃로 유지했다. 반응기를 상승류 방향으로 움직이는 고정된 rRDhl 효소로 채웠다. 고정된 rRDhl 효소는 우선 PEI 함침 알루미나 (UOP 제품, ISP 4000 등급)(25 %(w/v) 글루타르알데히드로 2 시간 동안 사전에 처리했음)상으로 부분 정제 효소 제제 (SDS-PAGE로 측정할 때 대략 70 % 순도)를 로딩시키고, 증류수로 완전히 세척하여 제조했다. 충분한 단백질을 알루미나에 공급하여 지지체 1 g당 단백질이 300 mg이 되게 했다 (로우리 방법). 실온에서 밤새 결합을 일으켰다. 결합된 효소 활성은 중탕 용액내에서 미결합 효소 활성을 측정하거나 280 nm에서 흡광도를 측정함으로써 평가했다.
고정된 rRDhl 효소를 입구 및 출구에 스페이서로서 2 mm 유리알을 사용한 반응기로 옮겼다. 예온된 10 mM 인산나트륨/10 μM EDTA 완충액 (pH 7.0) 수성 공급액를 써서 흐름을 개시했다. 여러 시간 동안 세척하여 미결합된 효소를 모두 제거한 후, 수성 공급액을 1,2,3-트리클로로프로판 (TCP)로 포화시키고, 0.15 ml/분의 유속으로 연속 교반 용액으로서 운반했다. 반응기를 약 2 잔류시간 동안 평형을 유지하도록 하고, 반응물 TCP 및 생성물 2,3-디클로로-1-프로판올 (DCH) 농도를 GC로 분석하기 위해 입구 및 출구 스트림에서 샘플을 채취했다. 이 GC용 샘플을 제조하기 위해 각 샘플을 우선 황산나트륨으로 포화시킨 후, 두 개의 내부 표준 (1,1,1,2-테트라클로로에탄 및 3-클로로-1-프로판올)을 각각 10 mM씩 함유하는 클로로포름 (2 부피)으로 추출했다. 그 다음 내부 표준 방법을 써서 TCP 및 DCH의 양을 GC 데이타로부터 추정해서 얻었으며, 이로부터 생산성 (1 시간 마다 1 부피당 수율 백분율)을 계산했다. 이 초기 생산성을 초기 효소 활성의 척도로 사용했다.
벤취 규모 rRDhl 생물반응기의 생산성
이 생물 반응기를 3개월 동안 연속 운전하면서, 상기한 바와 같이 입구 및 출구 스트림에서 주기적으로 샘플을 채취했다. 효소의 용적계 생산성 (1 분마다 유체 부피당 생성물 중량)을 각 시점에서 측정했으며, 이 시간 동안 전환율 (%)은 약 60 % 내지 약 40 %였다. 측정 결과를 도 16에 나타냈다. 이 데이타를 기초로, 고정된 효소의 반감기는 약 3500 시간으로 평가되었다. 이는 지금까지 보고된 가장 안정한 단백질 촉매 사이에 고정된 탈할로겐화 효소가 포함됨을 입증한다.
<실시예 8>
EPPCR에 의한 탈할로겐화 효소의 유도 진화
아가로오즈 겔 전기영동에 의해 정제하고, 겔에서 추출해 둔 pTrc/His RDhl 18-3 플라스미드의 Age I- 및 NheI- 소화물 상에 오류 발생 PCR 돌연변이를 유발시켰다. EPPCR 생성물을 Age I 및 Nhe I 절단 위치가 있는 발현 벡터에 라이게이션시켰다. 생성된 플라스미드로 감응 AG 1 세포를 형질전환시키고, 암피실린을 보충한 아가로오즈 상에서 콜로니로 증식시켰다. 생성된 세포 클론 "pTric/His RDhl" EPPCR 라이브러리를 다음과 같이 pH 변화를 검출하는 RDhl 효소 활성 측정 방법을 써서 시험했다. 96 웰 마이크로플레이트에서 200 ㎕ SOB/Amp 배양액이 각기 들어있는 B1 내지 H12 웰을 pTrc/His RDhl EPPCR 라이브러리로부터 얻은 단일 콜로니로 접종했다. A1 - A6 웰은 음성 비교용으로서 배지만이 들어있었으며, A7 - A12는 양성 비교용으로서 야생형 pTrc/His RDhl 18-3 콜로니로 접종했다. 대표적인 결과를 도 17 및 18에 나타냈다.
이 결과에 따르면, EPPCR 돌연변이 유발에 의해 생성된 대부분의 클론은 TrcHis RDhl 클론 18-3에 의해 생성된 야생형 RDhl의 활성 범위 이하의 활성을 나타낸다. 그러나, EPPCR 라이브러리에서 무작위로 선택된 84개 클론을 탈할로겐화 효소 활성에 대해 분석한 경우에는 각 96 웰 플레이트에서 몇 개가 야생형 효소의 활성 보다 훨씬 더 큰 활성을 나타냈다.
부다페스트 조약에 따라서, 1998년 2월 3일에 3개의 플라스미드 pTrcHis RDhl 클론 18-3, pRSET RDhl 클론 16-4 및 pTrxFus RDhl 클론 4를 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션 (ATCC)에 기탁했으며, 기탁 번호 ATCC 209609, ATCC 209610, ATCC 209611을 부여받았다. 1998년 2월 3일 세포 배양물 대장균 TrxFus RDhl 클론 4도 부다페스트 조약에 따라 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션 (ATCC)에 기탁했으며, 기탁 번호 ATCC 202087을 부여받았다.
1998년 1월 30일 두 개의 세포 배양물, 대장균 TrcHis RDhl 클론 18-3 및 대장균 RSET RDhl 클론 16-4를 부다페스트 조약에 따라서 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션 (ATCC)에 기탁했으며, 기탁 번호 ATCC202086, ATCC 202085를 부여받았다.
본 발명의 다른 실시태양은 본 명세서 또는 본 명세서에 개시된 본 발명의 실시를 고려하면 당업자에게 분명하게 이해될 것이다. 명세서 및 실시예는 단지 예시한 것 뿐이며, 본 발명의 진정한 범위 및 사상은 다음의 청구 범위로 규정된다.
Claims (45)
- 도 2의 잔기 1-292의 아미노산 서열과 실질적으로 상동인 폴리펩티드를 포함하는, 할로겐화 지방족 탄화수소를 할로히드린으로 전환할 수 있는 효소.
- 제1항에 있어서, 도 2의 잔기 1-292의 아미노산 서열과 적어도 약 90 % 내지 100 %의 상동성이 있는 아미노산 서열을 포함하는 효소.
- 제2항에 있어서, 도 2의 잔기 1-292의 아미노산 서열과 적어도 약 95 % 이상의 상동성이 있는 아미노산 서열을 포함하는 효소.
- 도 2의 잔기 1-292의 아미노산 서열과 실질적으로 상동이며 할로겐화 지방족 탄화수소를 할로히드린으로 전환시킬 수 있는 폴리펩티드를 발현시킬 수 있는 DNA 서열.
- 제4항에 있어서, 상기 폴리펩티드가 도 2의 잔기 1-292의 아미노산 서열과 적어도 약 90 % 내지 100 %의 상동성이 있는 것인 DNA 서열.
- 제5항에 있어서, 상기 폴리펩티드가 도 2의 잔기 1-292의 아미노산 서열과 적어도 약 95 % 이상의 상동성이 있는 것인 DNA 서열.
- 도 2의 염기 37-912의 뉴클레오타이드 서열과 실질적으로 상동이며 할로겐화 지방족 탄화수소를 할로히드린으로 전환시킬 수 있는 폴리펩티드를 발현시킬 수 있는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 DNA 서열.
- 제7항에 있어서, 상기 폴리뉴클레오타이드가 도 2의 염기 37-912의 뉴클레오타이드 서열과 적어도 90 % 내지 100 %의 상동성이 있는 것인 DNA 서열.
- 제8항에 있어서, 상기 폴리뉴클레오타이드가 도 2의 염기 37-912의 뉴클레오타이드 서열과 적어도 95 %의 상동성이 있는 것인 DNA 서열.
- 도 2의 잔기 1-292의 아미노산 서열과 실질적으로 상동인 폴리펩티드를 포함하는 효소의 합성을 유도할 수 있는 재조합 플라스미드가 들어있는 미생물.
- 제10항에 있어서, 에스케리키아 (Escherichia), 피키아 (Pichia), 바실러스 (Bacillus), 사카로미세스 (Saccharomyces), 슈도모나스 (Pseudomonas), 로도코쿠스 (Rhodococcus), 악티노미세스 (Actinomyces) 또는 아스페르길러스 (Aspergillus) 속(屬)에 속하는 것인 미생물.
- 제11항에 있어서, 에스케리키아 속에 속하는 미생물.
- 도 2의 잔기 1-292의 아미노산 서열과 실질적으로 상동인 폴리펩티드를 코딩하는 DNA 서열을 포함하는 발현 벡터.
- 할로지방족 탈할로겐화 효소 활성이 있고 고체 지지체에 부착된, 할로알칸 탈할로겐화 효소를 갖는 고정된 효소.
- 제14항에 있어서, 할로겐화 지방족 탄화수소, 할로겐화 지방족 알코올, 할로겐화 지방족 폴리올 분자 및 기로 이루어진 군에서 선택된 분자 또는 기로부터 할로겐 치환체 하나 이상을 가수분해에 의해 제거할 수 있는 효소.
- 제15항에 있어서, 상기 분자 또는 기가 하나 이상의 할로겐 원자, 및 이 할로겐 원자 하나 또는 수 개로 서로 독립적으로 치환된 2 내지 10개의 탄소원자를 갖되, 이 분자 또는 기가 알코올 또는 폴리올인 경우에는 히드록시 치환체를 갖는 그의 탄소 원자 중 어떤 것도 할로겐 치환체를 갖고 있지 않은 것인 효소.
- 제16항에 있어서, 상기 분자 또는 기가 할로겐 원자를 두 개 이상 포함하는 것인 효소.
- 제17항에 있어서, 상기 분자 또는 기가 1,2-디할로 분자 또는 기인 효소.
- 제17항에 있어서, 상기 분자 또는 기가 1,2-디할로에탄, 1,2-디할로프로판, 1,2-디할로부탄 및 1,2,3-트리할로프로판으로 이루어진 군에서 선택된 것인 효소.
- 제19항에 있어서, 상기 분자 또는 기가 각기 1,2-디클로로에탄, 1,2-디클로로프로판, 1,2-디클로로부탄, 1,2-디브로모-3-클로로프로판 및 1,2,3-트리클로로프로판으로 이루어진 군에서 선택된 것인 효소.
- 제20항에 있어서, 상기 분자 또는 기가 2-클로로-에탄올, 1-클로로-2-프로판올, 2-클로로-1-프로판올, 1-클로로-2-부탄올, 2-클로로-1-부탄올, 1-브로모-3-클로로-2-프로판올, 2-브로모-3-클로로-1-프로판올, 2,3-디브로모-1-프로판올, 1,2-디클로로-3-프로판올 및 1,3-디클로로-2-프로판올 중에서 선택된 하나 이상의 생성물 분자 또는 생성물 기로 전환되는 것인 효소.
- 제14항에 있어서, 상기 할로알칸 탈할로겐화 효소가 로도코쿠스에서 얻은 것인 효소.
- (1) 도 2의 잔기 1-292의 아미노산 서열과 실질적으로 상동인 폴리펩티드를 발현시킬 수 있는 폴리뉴클레오타이드가 포함된 DNA 조각을 제공하는 단계,(2) 상기 DNA 조각을 발현 제작물에 삽입하는 단계,(3) 상기 발현 제작물로 숙주 세포를 형질감염시키는 단계, 및(4) 상기 숙주 세포가 상기 폴리펩티드를 발현하는 환경에 상기 숙주 세포를 두는 단계를 포함하는 상기 폴리펩티드가 포함된 효소의 제조 방법.
- 제23항에 있어서, 상기 방법의 (4) 단계 이후에 상기 효소를 정제하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
- (1) 도 2의 잔기 1-292의 아미노산 서열과 실질적으로 상동인 폴리펩티드를 포함하는 효소를 제공하는 단계,(2) 하나 이상의 반응성 기를 갖는 링커가 부착된 고체 지지체를 제공하는 단계 및(3) 상기 반응성 기가 상기 폴리펩티드에 공유결합된 아미노, 카르복시, 히드록시, 또는 술프히드릴기와 반응하여 공유결합을 형성하는 생물상용성 조건하에서 상기 링커와 상기 효소를 접촉시키는 단계를 포함하는,고체 지지체에 공유결합된, 도 2의 잔기 1-292의 아미노산 서열과 실질적으로 상동인 폴리펩티드를 포함하는 고정된 효소의 제조 방법.
- 제25항에 있어서, 상기 링커가 디알데히드, 이중산, 디아민, 디이소시아네이트, 시아네이트, 디이미드 및 카르보디이미드 중에서 선택된 하나 이상의 기를 갖되, 단 디아민이 카르보디이미드와 함께 사용되지는 않는 것인 방법.
- 제25항의 방법에 따라 제조된 고정된 효소.
- (1) 도 2의 잔기 1-292의 아미노산 서열과 실질적으로 상동인 폴리펩티드를 포함하는 효소를 제공하는 단계,(2) 하나 이상의 반응성 기를 갖는 링커가 부착된 고체 지지체를 제공하는 단계,(3) 상기 반응성 기가 상기 폴리펩티드에 공유결합된 아미노, 카르복시, 히드록시, 또는 술프히드릴기와 반응하여 공유결합을 형성하는 생물상용성 조건하에서 상기 링커와 상기 효소를 접촉시켜서, 고정된 효소를 형성시키는 단계 및(4) 상기 효소가 할로겐화 지방족 탄화수소를 알코올 또는 할로히드린으로 전환시킬 수 있는 조건에서 할로겐화 지방족 탄화수소를 상기 고정된 효소와 접촉시키는 단계를 포함하는,할로겐화 지방족 탄화수소를 알코올 또는 할로히드린으로 전환하는 방법.
- 제28항에 있어서, 상기 효소가 상기 제2 또는 3항의 효소인 방법.
- 하나 또는 2개의 말단 폴리펩티드 테일을 갖는 융합 단백질인 제1 내지 3항 중 어느 한 항에 따른 효소.
- 제30항에 있어서, 상기 융합 단백질이 6개 이상의 연속 히스티딘 잔기 서열을 포함하는 30개 이하의 아미노산으로 이루어진 단일 아미노 말단 테일을 갖는 것인 효소.
- 제30항에 있어서, 상기 융합 단백질이 150개 이하의 아미노산으로 이루어진 단일 카르복시 말단 테일을 갖는 것인 효소.
- 제32항에 있어서, 상기 카르복시 말단 테일이 친수성인 효소.
- 제30항에 있어서, 상기 융합 단백질이 30개 이하의 아미노산으로 이루어진 아미노 말단 테일과 150개 이하의 아미노산으로 이루어진 카르복시 말단 테일을 둘다 갖는 것인 효소.
- 제34항에 있어서, 상기 아미노 말단 테일이 6개 이상의 연속 히스티딘 잔기의 서열을 포함하는 것인 효소.
- 제34항에 있어서, 상기 카르복시 말단 테일이 EXFLAG 폴리펩티드, S-Tag 폴리펩티드, 헥사히스티딘-서열 포함 폴리펩티드, 및 셀룰로오즈 결합 도메인으로 이루어진 군에서 선택된 폴리펩티드를 포함하는 것인 효소.
- 친족(related) DNA 서열로부터 유도 진화(directed evolution) 방법으로 그 DNA 서열이 유래되었으며, 친족 DNA 서열의 것보다 더 큰 탈할로겐화 활성을 갖는, 할로겐화 지방족 탈할로겐화 효소 활성이 있는 효소.
- 제37항에 있어서, 상기 친족 DNA 서열이 야생형 또는 재조합 탈할로겐화 효소를 코딩하는 것인 효소.
- 제38항에 있어서, 상기 친족 DNA 서열이 야생형 또는 재조합 할로알칸 탈할로겐화 효소를 코딩하는 것인 효소.
- 제39항에 있어서, 상기 친족 DNA 서열이 야생형 또는 재조합 로도코쿠스 할로알칸 탈할로겐화 효소를 코딩하는 것인 효소.
- 제37항에 있어서, 상기 유도 진화 방법이 오류 발생 (error prone) PCR을 수행하는 것을 포함하는 것인 효소.
- 제37항에 있어서, 하나 또는 두 개의 말단 폴리펩티드 테일을 갖는 융합 단백질인 효소.
- 제42항에 있어서, 하나의 테일 또는 두 테일 모두가 유도 진화 방법에 의해 변형된 것인 효소.
- ATCC 209609, ATCC 209610 및 ATCC 209611로 이루어진 군에서 선택된 발현 벡터.
- ATCC 202085, ATCC 202086 및 ATCC 202087로 이루어진 군에서 선택된 세포 배양물.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US3818197P | 1997-02-13 | 1997-02-13 | |
| US60/038,181 | 1997-02-13 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| KR20000071014A true KR20000071014A (ko) | 2000-11-25 |
Family
ID=21898514
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| KR1019997007280A KR20000071014A (ko) | 1997-02-13 | 1998-02-13 | 재조합 할로지방족 탈할로겐화 효소 |
Country Status (9)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0970224A1 (ko) |
| JP (1) | JP2001512317A (ko) |
| KR (1) | KR20000071014A (ko) |
| CN (1) | CN1252100A (ko) |
| AU (1) | AU6324998A (ko) |
| CA (1) | CA2281931A1 (ko) |
| IL (1) | IL131209A0 (ko) |
| PL (1) | PL335144A1 (ko) |
| WO (1) | WO1998036080A1 (ko) |
Families Citing this family (35)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6309883B1 (en) | 1994-02-17 | 2001-10-30 | Maxygen, Inc. | Methods and compositions for cellular and metabolic engineering |
| US20060257890A1 (en) | 1996-05-20 | 2006-11-16 | Maxygen, Inc. | Methods and compositions for cellular and metabolic engineering |
| US6326204B1 (en) | 1997-01-17 | 2001-12-04 | Maxygen, Inc. | Evolution of whole cells and organisms by recursive sequence recombination |
| DK1717322T3 (da) | 1997-01-17 | 2012-10-22 | Codexis Mayflower Holdings Llc | Udvikling af hele celler og organismer ved rekursiv sekvensrekombination |
| BR9910174A (pt) | 1998-05-01 | 2001-03-06 | Maxygen Inc | Processo para se obter um gene recombinante otimizado de resistência à praga, biblioteca, e, processo para se obter um organismo que seja patogênico a uma praga de vegetal |
| EP1104459A1 (en) | 1998-08-12 | 2001-06-06 | Maxygen, Inc. | Dna shuffling of monooxygenase genes for production of industrial chemicals |
| JP2002526107A (ja) | 1998-10-07 | 2002-08-20 | マキシジェン， インコーポレイテッド | マイコトキシンの解毒のための核酸を生成するためのｄｎａシャッフリング |
| WO2000028018A1 (en) | 1998-11-10 | 2000-05-18 | Maxygen, Inc. | Modified adp-glucose pyrophosphorylase for improvement and optimization of plant phenotypes |
| US6376246B1 (en) | 1999-02-05 | 2002-04-23 | Maxygen, Inc. | Oligonucleotide mediated nucleic acid recombination |
| US6917882B2 (en) | 1999-01-19 | 2005-07-12 | Maxygen, Inc. | Methods for making character strings, polynucleotides and polypeptides having desired characteristics |
| US6436675B1 (en) | 1999-09-28 | 2002-08-20 | Maxygen, Inc. | Use of codon-varied oligonucleotide synthesis for synthetic shuffling |
| EP1062614A1 (en) | 1999-01-19 | 2000-12-27 | Maxygen, Inc. | Methods for making character strings, polynucleotides and polypeptides |
| US7024312B1 (en) | 1999-01-19 | 2006-04-04 | Maxygen, Inc. | Methods for making character strings, polynucleotides and polypeptides having desired characteristics |
| US6961664B2 (en) | 1999-01-19 | 2005-11-01 | Maxygen | Methods of populating data structures for use in evolutionary simulations |
| JP2003524394A (ja) | 1999-02-11 | 2003-08-19 | マキシジェン， インコーポレイテッド | ハイスループット質量分析法 |
| US6531316B1 (en) | 1999-03-05 | 2003-03-11 | Maxyag, Inc. | Encryption of traits using split gene sequences and engineered genetic elements |
| US7430477B2 (en) | 1999-10-12 | 2008-09-30 | Maxygen, Inc. | Methods of populating data structures for use in evolutionary simulations |
| US6686515B1 (en) | 1999-11-23 | 2004-02-03 | Maxygen, Inc. | Homologous recombination in plants |
| US7115712B1 (en) | 1999-12-02 | 2006-10-03 | Maxygen, Inc. | Cytokine polypeptides |
| AU2001268716A1 (en) | 2000-06-23 | 2002-01-08 | Maxygen, Inc. | Novel chimeric promoters |
| US7094875B2 (en) | 2000-06-23 | 2006-08-22 | Maxygen, Inc. | Co-stimulatory polypeptides |
| US6858422B2 (en) | 2000-07-13 | 2005-02-22 | Codexis, Inc. | Lipase genes |
| JP2002199890A (ja) * | 2000-10-23 | 2002-07-16 | Inst Of Physical & Chemical Res | 生分解性ポリエステル合成酵素の改変方法 |
| AU2006235875B8 (en) * | 2000-12-01 | 2011-04-14 | Basf Enzymes Llc | Enzymes having dehalogenase activity and methods of use thereof |
| KR20030051897A (ko) | 2000-12-01 | 2003-06-25 | 다이버사 코포레이션 | 데할로게나제 활성을 가진 효소 및 이의 사용 방법 |
| US20060166315A1 (en) * | 2002-12-26 | 2006-07-27 | Masatoshi Murai | Process for producing pnpase |
| EP2341134B1 (en) | 2003-01-31 | 2014-08-27 | Promega Corporation | Covalent tethering of functional groups to proteins |
| US7429472B2 (en) | 2003-01-31 | 2008-09-30 | Promega Corporation | Method of immobilizing a protein or molecule via a mutant dehalogenase that is bound to an immobilized dehalogenase substrate and linked directly or indirectly to the protein or molecule |
| US7425436B2 (en) | 2004-07-30 | 2008-09-16 | Promega Corporation | Covalent tethering of functional groups to proteins and substrates therefor |
| EP2374875B1 (en) | 2006-10-30 | 2015-09-02 | Promega Corporation | Mutant hydrolase proteins with enhanced kinetics and funcitional expression |
| US10344286B2 (en) | 2015-05-13 | 2019-07-09 | Samsung Electronics Co., Ltd. | Microorganism including gene encoding protein having hydroxylase activity and method of reducing concentration of fluorinated methane in sample using the same |
| US10150080B2 (en) | 2015-10-23 | 2018-12-11 | Samsung Electronics Co., Ltd. | Microorganism including gene encoding protein having dehalogenase activity and method of reducing concentration of fluorinated methane in sample using the same |
| EP3178922B1 (en) | 2015-12-07 | 2019-05-22 | Samsung Electronics Co., Ltd. | Bacterial cytochrome p450 protein variant and method of reducing concentration of fluorinated methane in sample using the same |
| KR20180063752A (ko) * | 2016-12-02 | 2018-06-12 | 삼성전자주식회사 | 배기 가스 분해 장치, 및 이를 포함하는 배기 가스 분해 시스템 |
| CN112592929A (zh) * | 2021-01-07 | 2021-04-02 | 遵义医科大学 | 一种卤化酶重组表达载体制备方法及其应用 |
Family Cites Families (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| GB8701706D0 (en) * | 1987-01-27 | 1987-03-04 | Ici Plc | Immobilisation of enzymes |
| GB9206667D0 (en) * | 1992-03-27 | 1992-05-13 | Ici Plc | Purification process |
| US5372944A (en) * | 1993-10-14 | 1994-12-13 | The Dow Chemical Company | Method for conversion of halogenated hydrocarbons to halohydrins |
-
1998
- 1998-02-13 CA CA002281931A patent/CA2281931A1/en not_active Abandoned
- 1998-02-13 KR KR1019997007280A patent/KR20000071014A/ko not_active Application Discontinuation
- 1998-02-13 CN CN98804107A patent/CN1252100A/zh active Pending
- 1998-02-13 AU AU63249/98A patent/AU6324998A/en not_active Abandoned
- 1998-02-13 IL IL13120998A patent/IL131209A0/xx unknown
- 1998-02-13 EP EP98907444A patent/EP0970224A1/en not_active Withdrawn
- 1998-02-13 JP JP53593198A patent/JP2001512317A/ja active Pending
- 1998-02-13 PL PL98335144A patent/PL335144A1/xx unknown
- 1998-02-13 WO PCT/US1998/002776 patent/WO1998036080A1/en not_active Application Discontinuation
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| AU6324998A (en) | 1998-09-08 |
| CN1252100A (zh) | 2000-05-03 |
| WO1998036080A1 (en) | 1998-08-20 |
| EP0970224A1 (en) | 2000-01-12 |
| IL131209A0 (en) | 2001-01-28 |
| CA2281931A1 (en) | 1998-08-20 |
| JP2001512317A (ja) | 2001-08-21 |
| PL335144A1 (en) | 2000-04-10 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| KR20000071014A (ko) | 재조합 할로지방족 탈할로겐화 효소 | |
| US8535910B2 (en) | Halohydrin dehalogenases and related polynucleotides | |
| JP5069032B2 (ja) | 改良型ニトリルヒドラターゼ | |
| US7588928B2 (en) | Halohydrin dehalogenases and related polynucleotides | |
| WO2012169203A1 (ja) | 改良型ニトリルヒドラターゼ | |
| JP6741093B2 (ja) | 改良型ニトリルヒドラターゼ | |
| US7541171B2 (en) | Halohydrin dehalogenases and related polynucleotides | |
| CN112831483B (zh) | 5-氨基乙酰丙酸合成酶突变体及其宿主细胞和应用 | |
| CN111172142B (zh) | 一种热稳定性高的头孢菌素c酰化酶突变体 | |
| CN112481244B (zh) | 天冬氨酸酶突变体及其编码基因、载体、重组菌与应用 | |
| JP5226509B2 (ja) | 改良型ハロヒドリンエポキシダーゼ | |
| WO2002050282A1 (en) | Novel thermostable galactose isomerase and tagatose production thereby | |
| CN108277216A (zh) | 高活性s-氰醇裂解酶及其应用 | |
| JP2009089649A (ja) | クロストリジウム・クルベリのジアホラーゼ遺伝子およびその利用 | |
| WO2018180568A1 (ja) | 変異型２－デオキシ－シロ－イノソース合成酵素 | |
| CN111051506A (zh) | 青霉素g酰化酶 | |
| CN109280651B (zh) | 一种乳酸脱氢酶突变体基因LbLDH1及其在大肠杆菌中高效表达的发酵方法 | |
| MXPA99007523A (en) | Recombinant haloaliphatic dehalogenases | |
| WO2015033636A1 (ja) | ３－ヒドロキシプロリンの分析方法、コラーゲンの測定方法、およびそれに用いる新規δ１－ピロリン－２－カルボン酸還元酵素 | |
| AU2015203199B2 (en) | Improved nitrile hydratase | |
| CN116265579A (zh) | 环己胺氧化酶突变体及其在制备右美沙芬中间体中的应用 | |
| CN117683742A (zh) | 非那西丁降解酶及其应用 | |
| CN117143931A (zh) | 多酶偶联转化芳香族化合物的方法 | |
| JP2009207441A (ja) | グルコース脱水素酵素及びそれをコードする遺伝子 | |
| WO2006088110A1 (ja) | 新規な炭酸固定促進タンパク質、及び該タンパク質を用いた炭酸固定方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| WITN | Application deemed withdrawn, e.g. because no request for examination was filed or no examination fee was paid |