CN117143931A - 多酶偶联转化芳香族化合物的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了多酶偶联转化芳香族化合物的方法。该方法以羧化‑双加氧偶联反应为核心，克服了酶催化羧化反应的热力学可逆性，极大地提高了固定CO2的效率，并以此为核心搭建了新的萘降解反应路径，萘经过加氧酶生成1‑萘酚，再经过羧化‑双加氧偶联反应生成2‑羧基苯并丙酮酸，再经过醛缩反应生成邻羧基苯甲醛或醛缩‑脱氢偶联反应生成邻苯二甲酸，实现了萘的裂解开环和CO2固定，以及邻羧基苯甲醛和邻苯二甲酸的制备。

Description

多酶偶联转化芳香族化合物的方法
技术领域
本发明涉及生物化学领域，具体涉及一种多酶偶联转化芳香族化合物的方法。
背景技术
多环芳香烃(Polycyclic aromatic hydrocarbons，PAH)是一类结构中由多个苯环组成的化合物，具有致癌性、致突变活性，在世界范围内受到严格的检疫。多环芳香烃(PAH)大多是化石能源的副产品。由于化石能源是人类社会经济活动的能源基础，因此在可预见的未来，PAH危害仍然受到广泛的关注。由于π电子共轭，芳香烃类化合物的分子势能较低，化学性质异常的稳定。而且芳香类化合物是非极性物质，大多数微溶或不溶于水。随着结构中苯环个数的增加，芳香烃类化合物的稳定性越强，极性越弱。所以，芳香类物质的降解是一个缓慢、复杂的过程。
萘是结构最简单的PAH类物质，由两个苯环构成分子结构。萘及其衍生物都是重要的化工原料，在杀虫剂合成、印染和橡胶等工艺中具有广泛的应用。石油轻质化和煤焦化过程中可以产生大量含有萘及其衍生物的轻质循环油(LCO)，原油产业LCO的年产量为5000万吨。LCO是有价值的物质资源，裂解之后生成轻质芳烃(苯、甲苯和二甲苯)，同时LCO也是生态和健康的重大威胁。基于石油化工的可持续发展、以及环境保护理念的贯彻，萘等芳香烃的产生、治理都受到了严格的监管。然而，石化行业中产生的萘等芳香环物质主要使用高温、高压环境中的金属催化裂解，这种方法工艺复杂，并存在高污染、高耗能的缺点。相比较而言，生物法裂解PAH能耗低，环境友好。
化石能源使用引起的另一个严重的环境威胁就是CO2排放和温室效应。由于温室效应全球气候反常，极端的气象灾害发生的频率明显的增加。因此，减少CO2的排放或者提高CO2固定效率成为迫切的需求。通过非氧化型羧化酶催化，在酚类物质的羟基邻位插入羧基(Kolbe–Schmitt反应)是一类典型的固碳反应。Kolbe–Schmitt反应的逆反应显著，反应的转化率非常的低，通常使用高温、高压(～90bar,120–300℃)，提高反应的转化率。这种工艺的能耗高，污染严重，而且碳排放非常的明显。酶催化这一过程，可以在温和的条件下进行，不需要大量的能量输入，但是逆反应明显，转化率低的问题难以避免。如果要提高酶催化反应固定CO2的效率，必须解决逆反应的限制。
邻羧基苯甲醛是合成清热阵痛药物的一种重要的中间体。通常邻羧基苯甲醛由苯酚经溴化、水解而得。将苯酚加热、通入溴反应，然后加入水，进行水解，冷却，析出邻羧基苯甲醛。该工艺的步骤繁琐、可控性差，邻羧基苯甲醛的收率低、纯度差。邻苯二甲酸是燃料、聚酯树脂、涤纶、药物及增塑剂的中间体。传统上邻苯二甲酸的制备工艺比较复杂，使用林甲基苯甲酸、邻二甲苯或萘为原料，经过金属催化和强氧化剂制备。萘可用于制备邻羧基苯甲醛和邻苯二甲酸，然而工艺安全性和经济性还要进一步提高。
发明内容
本发明的目的是提供一种多酶偶联转化芳香族化合物的方法。
第一方面，本发明要求保护一种芳香族化合物的开环方法。
本发明要求保护的芳香族化合物的开环方法，可包括如下步骤：
(A1)芳香族化合物经单加氧酶催化，反应生成对应酚类化合物；
(A2)所述酚类化合物经羧化酶催化，反应生成含羧基芳香族化合物；
(A3)所述含羧基芳香族化合物经双加氧酶催化，反应生成羧酸类化合物；
(A4)所述羧酸类化合物经醛缩酶催化，反应生成丙酮酸和芳香醛酸类化合物；
(A5)所述丙酮酸和芳香醛酸类化合物经脱氢酶催化，反应生成二元羧酸类化合物。
在所述方法中，若所述芳香族化合物含有酚羟基，则跳过步骤(A1)，直接进行步骤(A2)。
在所述方法中，各种酶的催化反应通过如下任一方式进行：1)向反应体系中直接加入相应酶；2)向反应体系中加入能够表达相应酶的细胞。
在本发明的具体实施方式中，能够表达所述单加氧酶的细胞为能够表达所述单加氧酶的大肠杆菌，如BL21 Gold(DE3)；能够表达所述羧化酶的细胞为能够表达所述羧化酶的大肠杆菌，如BL21 Gold(DE3)；能够表达所述双加氧酶的细胞为能够表达所述双加氧酶的大肠杆菌，如BL21 Gold(DE3)；能够表达所述醛缩酶的细胞为能够表达所述醛缩酶的大肠杆菌，如BL21 Gold(DE3)；能够表达所述脱氢酶的细胞为能够表达所述脱氢酶的大肠杆菌，如BL21 Gold(DE3)。
在步骤(A1)中，需要以NAD(P)H提供还原力。
进一步地，所述以NAD(P)H提供还原力可通过如下任一方式实现：1)向反应体系中直接加入NAD(P)H；2)在所述反应体系中形成辅酶NAD(P)H/NAD(P)+循环。
更进一步地，在所述反应体系中形成辅酶NAD(P)H/NAD(P)+循环可通过如下任一方式实现：1)向反应体系中加入醇脱氢酶ADH和NAD(P)+；2)向反应体系中加入能够表达醇脱氢酶ADH的细胞和NAD(P)+；3)向反应体系中加入醇脱氢酶ADH和NAD(P)H；4)向反应体系中加入能够表达醇脱氢酶ADH的细胞和NAD(P)H；5)当步骤(A1)和步骤(A5)在同一反应体系中完成时，向反应体系中加入NAD(P)H或NAD(P)+。对于5)，单加氧酶催化可使NAD(P)H转化为NAD(P)+，脱氢酶催化可使NAD(P)+转化为NAD(P)H，步骤(A1)有单加氧酶，步骤(A5)有脱氢酶，因此当步骤(A1)与步骤(A5)在同一反应体系中可以形成辅酶循环，只需再提供NAD(P)H或者NAD(P)+即可。下同。
在本发明的具体实施方式中，所述能够表达醇脱氢酶ADH的细胞为能够表达醇脱氢酶ADH的大肠杆菌，如BL21 Gold(DE3)。所述能够表达醇脱氢酶ADH的细胞在所述反应体系中的加入量为0.5g细胞湿重/mL，NAD(P)+或NAD(P)H的加入量为30mM。
在步骤(A2)中，以HCO3 -或CO2作为另一底物。
在步骤(A5)中，所述反应需要NAD(P)+。
进一步地，所述反应中的NAD(P)+可通过如下任一方式引入：1)向反应体系中直接加入NAD(P)+；2)在所述反应体系中形成辅酶NAD(P)H/NAD(P)+循环。
更进一步地，在所述反应体系中形成辅酶NAD(P)H/NAD(P)+循环可通过如下方式实现：1)向反应体系中加入NAD(P)H氧化酶和NAD(P)+；2)向反应体系中加入NAD(P)H氧化酶和NAD(P)H；3)当步骤(A1)和步骤(A5)在同一反应体系中完成时，向反应体系中加入NAD(P)H或NAD(P)+。
在本发明的具体实施方式中，所述NAD(P)H氧化酶(Nox)的加入量为4.5U/mL，NAD(P)+的加入量为0.5mM。
其中，所述芳香族化合物可为芳香烃化合物。
进一步地，所述芳香烃化合物可为多环芳香烃；
更进一步地，所述多环芳香烃可为萘。
在本发明的具体实施方式中，所述芳香族化合物为萘。
第二方面，本发明要求保护一种降解萘和/或固定CO2的方法。
本发明要求保护的降解萘和/或固定CO2的方法，可包括如下步骤：
(a1)萘经单加氧酶催化，反应生成1-萘酚；
(a2)1-萘酚经羧化酶催化，反应生成1-羟基-2-苯甲酸；
(a3)1-羟基-2-苯甲酸经双加氧酶催化，反应生成2-羧基苯并丙酮酸；
(a4)2-羧基苯并丙酮酸经醛缩酶催化，反应生成邻羧基苯甲醛；
(a5)邻羧基苯甲醛经脱氢酶催化，反应生成邻苯二甲酸。
在步骤(a1)中，需要以NAD(P)H提供还原力。
进一步地，所述以NAD(P)H提供还原力可通过如下任一方式实现：1)向反应体系中直接加入NAD(P)H；2)在所述反应体系中形成辅酶NAD(P)H/NAD(P)+循环。
更进一步地，在所述反应体系中形成辅酶NAD(P)H/NAD(P)+循环可通过如下任一方式实现：1)向反应体系中加入醇脱氢酶ADH和NAD(P)+；2)向反应体系中加入能够表达醇脱氢酶ADH的细胞和NAD(P)+；3)向反应体系中加入醇脱氢酶ADH和NAD(P)H；4)向反应体系中加入能够表达醇脱氢酶ADH的细胞和NAD(P)H；5)当步骤(a1)和步骤(a5)在同一反应体系中完成时，向反应体系中加入NAD(P)H或NAD(P)+。对于5)，单加氧酶催化可使NAD(P)H转化为NAD(P)+，脱氢酶催化可使NAD(P)+转化为NAD(P)H，步骤(a1)有单加氧酶，步骤(a5)有脱氢酶，因此当步骤(a1)与步骤(a5)在同一反应体系中可以形成辅酶循环，只需再提供NAD(P)H或者NAD(P)+即可。
在本发明的具体实施方式中，所述能够表达醇脱氢酶ADH的细胞为能够表达醇脱氢酶ADH的大肠杆菌，如BL21 Gold(DE3)。所述能够表达醇脱氢酶ADH的细胞在所述反应体系中的加入量为0.5g细胞湿重/mL，NAD(P)+或NAD(P)H的加入量为30mM。
在步骤(a2)中，以HCO3 -或CO2作为另一底物。
在所述方法中，各种酶的催化反应可通过如下任一方式进行：1)向反应体系中直接加入相应酶；2)向反应体系中加入能够表达相应酶的细胞。
在步骤(a5)中，所述反应需要NAD(P)+。
进一步地，所述反应中的NAD(P)+可通过如下任一方式引入：1)向反应体系中直接加入NAD(P)+；2)在所述反应体系中形成辅酶NAD(P)H/NAD(P)+循环。
更进一步地，在所述反应体系中形成辅酶NAD(P)H/NAD(P)+循环可通过如下方式实现：1)向反应体系中加入NAD(P)H氧化酶和NAD(P)+；2)向反应体系中加入NAD(P)H氧化酶和NAD(P)H；3)当步骤(a1)和步骤(a5)在同一反应体系中完成时，向反应体系中加入NAD(P)H或NAD(P)+。
在本发明的具体实施方式中，所述NAD(P)H氧化酶(Nox)的加入量为4.5U/mL，NAD(P)+的加入量为0.5mM。
在所述方法中，步骤(a1)-(a3)可以在同一个反应体系中经一步反应完成，所述反应体系记为反应体系I。
进一步地，所述反应体系I中含有1)萘、2)单加氧酶或能够表达所述单加氧酶的细胞、3)羧化酶或能够表达所述羧化酶的细胞、4)双加氧酶或能够表达所述双加氧酶的细胞、5)NAD(P)H、6)HCO3 -或CO2、7)反应缓冲液I。
更进一步地，在所述反应体系I中，萘的终浓度为15mM、NAD(P)H的终浓度为60mM、HCO3 -的终浓度为50mM或在反应过程中向所述反应体系I中持续性通入CO2。所述单加氧酶0.5mg/mL或能够表达所述单加氧酶的细胞0.5g细胞湿重/mL、所述羧化酶0.03-1U/mL(如1U/mL、0.03U/mL、0.14U/mL)或能够表达所述羧化酶的细胞0.5g细胞湿重/mL、所述双加氧酶9U/mL或能够表达所述双加氧酶的细胞0.5g细胞湿重/mL；余量为所述反应缓冲液I。
更进一步地，所述反应缓冲液I的pH可为6.5-8.0(如pH7.0-7.5)。具体可为磷酸钾缓冲液(pH7.0或pH7.5，100mM)。
更进一步地，所述反应的温度可为25-35℃(如30℃)，反应时间为可3-12h(如12h)。
在所述方法中，步骤(a4)-(a5)可以在同一个反应体系中经一步反应完成，所述反应体系记为反应体系II。
进一步地，所述反应体系II中含有1)2-羧基苯并丙酮酸、2)醛缩酶或能够表达所述醛缩酶的细胞、3)脱氢酶或能够表达所述脱氢酶的细胞、4)NAD(P)H、5)KHCO3、6)反应缓冲液II。
在本发明的具体实施方式中，所述反应体系II中还含有NAD(P)H氧化酶，但是NAD(P)H氧化酶不是必须的，其作用是产生NAD(P)+，具体是脱氢酶催化的同时会将NAD(P)+转化为NAD(P)H，如果NAD(P)+不够需要NAD(P)H氧化酶催化NAD(P)H来产生。
更进一步地，在所述反应体系II中，2-羧基苯并丙酮酸的终浓度为10mM、NAD(P)H的终浓度为15mM、KHCO3的终浓度为50mM。所述醛缩酶的浓度为0.75mg/ml、所述脱氢酶的浓度为18U/ml；余量为所述反应缓冲液II。
在本发明的具体实施方式中，在所述反应体系II中，所述NAD(P)H氧化酶的浓度为4.5U/ml。
更进一步地，所述反应缓冲液II的pH为6.5-8.0(如pH7.0-7.5)。具体可为磷酸钾缓冲液(pH7.0或pH7.5，100mM)。
更进一步地，所述反应的温度可为25-35℃(如30℃)，反应时间为3-12h(如5.5h)。
在所述方法中，步骤(a2)-(a5)可以在同一个反应体系中经一步反应完成，所述反应体系记为反应体系III。
进一步地，所述反应体系III中含有1)1-萘酚、2)羧化酶或能够表达所述羧化酶的细胞、3)双加氧酶或能够表达所述双加氧酶的细胞、4)醛缩酶或能够表达所述醛缩酶的细胞、5)脱氢酶或能够表达所述脱氢酶的细胞、6)NAD(P)H氧化酶或能够表达所述NAD(P)H氧化酶的细胞、7)NAD(P)+、8)KHCO3、9)反应缓冲液III。
更进一步地，在所述反应体系III中，所述1-萘酚的终浓度为7.5mM、所述NAD(P)+的终浓度为0.5mM、所述KHCO3的终浓度为90mM。所述羧化酶的浓度为所述羧化酶0.03-1U/mL(如1U/mL、0.03U/mL、0.14U/mL)或能够表达所述羧化酶的细胞0.5g细胞湿重/mL、所述双加氧酶9U/mL或能够表达所述双加氧酶的细胞0.5g细胞湿重/mL、所述醛缩酶的浓度为0.75mg/ml、所述脱氢酶的浓度为18U/ml、所述NAD(P)H氧化酶的浓度为4.5U/ml；余量为所述反应缓冲液III。
更进一步地，所述反应缓冲液III的pH为6.5-8.0(如pH7.0-7.5)。具体可为磷酸钾缓冲液(pH7.0或pH7.5，100mM)。
更进一步地，所述反应的温度为25-35℃(如30℃)，反应时间为3-12h(如12h)。
第三方面，本发明要求保护如下任一方法：
方法I：一种以萘为底物生成邻羧基苯甲醛的方法，包括前文第二方面所述方法的步骤(a1)-(a4)；
方法II：一种以萘为底物生成邻苯二甲酸的方法，包括前文第二方面所述方法的步骤(a1)-(a5)；
方法III、一种以1-萘酚为底物生成邻羧基苯甲醛的方法，包括前文第二方面所述方法的步骤(a2)-(a4)；
方法IV：一种以1-萘酚为底物生成邻苯二甲酸的方法，包括前文第二方面所述方法的步骤(a2)-(a5)。
第四方面，本发明要求保护成套酶。
本发明要求保护的成套酶为如下(B1)或(B2)或(B3)或(B4)：
(B1)由羧化酶、双加氧酶和醛缩酶组成；
(B2)由单加氧酶、醇脱氢酶ADH、羧化酶、双加氧酶和醛缩酶组成；
(B3)由羧化酶、双加氧酶、醛缩酶、脱氢酶和NAD(P)H氧化酶组成；
(B4)由单加氧酶、醇脱氢酶ADH、羧化酶、双加氧酶、醛缩酶、脱氢酶和NAD(P)H氧化酶组成。
第五方面，本发明要求保护成套细胞。
本发明要求保护的成套细胞，为如下(C1)或(C2)或(C3)或(C4)：
(C1)由能够表达羧化酶的细胞、能够表达双加氧酶的细胞、能够表达醛缩酶的细胞组成；
(C2)由能够表达单加氧酶细胞、能够表达醇脱氢酶ADH细胞、能够表达羧化酶的细胞、能够表达双加氧酶的细胞、能够表达醛缩酶的细胞组成；
(C3)由能够表达羧化酶的细胞、能够表达双加氧酶的细胞、能够表达醛缩酶的细胞、能够表达脱氢酶的细胞和能够表达NAD(P)H氧化酶的细胞组成；
(C4)由能够表达单加氧酶的细胞、能够表达醇脱氢酶ADH的细胞、能够表达羧化酶的细胞、能够表达双加氧酶的细胞、能够表达醛缩酶的细胞、能够表达脱氢酶的细胞和能够表达NAD(P)H氧化酶的细胞组成。
第六方面，本发明要求保护如下P1-P2中任一应用：
P1、前文第一方面所述方法或前文第四方面所述成套酶或前文第五方面所述成套细胞在降解芳香族化合物和/或固定CO2和/或制备邻羧基苯甲醛和/或邻苯二甲酸中的应用；
P2、前文第一方面所述方法或前文第四方面所述成套酶或前文第五方面所述成套细胞在降解萘和/或固定CO2和/或制备邻羧基苯甲醛和/或邻苯二甲酸中的应用。
在上述各方面中，所述单加氧酶可为来源于巨大芽孢杆菌(Bacillusmegaterium)的单加氧酶突变体[P450 BM-3(A74G/F87V/L188Q)]。进一步地，所述来源于巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)的单加氧酶突变体[P450 BM-3(A74G/F87V/L188Q)]的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。
在上述各方面中，所述羧化酶可为来源于米曲霉(Aspergillus oryzae)的羧化酶，来源于根瘤菌(Rhizobium sp.)的羧化酶，或来源于念珠毛孢子菌(Trichosporonmoniliiforme)的羧化酶。进一步地，所述来源于米曲霉(Aspergillus oryzae)的羧化酶的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示；所述来源于根瘤菌(Rhizobium sp.)的羧化酶的氨基酸序列如SEQ ID No.3所示；所述来源于念珠毛孢子菌(Trichosporon moniliiforme)的羧化酶的氨基酸序列如SEQ ID No.4所示。
在上述各方面中，所述双加氧酶可为来源于范巴伦氏分枝杆菌(Mycobacteriumvanbaalenii PYR-1)的双加氧酶。进一步地，所述来源于范巴伦氏分枝杆菌(Mycobacterium vanbaalenii PYR-1)的双加氧酶的氨基酸序列如SEQ ID No.5所。
在上述各方面中，所述醛缩酶可为来源于恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)的醛缩酶。进一步地，所述来源于恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)的醛缩酶的氨基酸序列如SEQ ID No.6所示。
在上述各方面中，所述脱氢酶可为来源于诺卡氏菌(Nocardioides sp.KP7)的脱氢酶。进一步地，所述来源于诺卡氏菌(Nocardioides sp.KP7)的脱氢酶的氨基酸序列如SEQ ID No.7所示。
在上述各方面中，所述NAD(P)H氧化酶可为来源于副兰乳杆菌(Lactiplantibacillus pentosus)的NAD(P)H氧化酶。进一步地，所述来源于副兰乳杆菌(Lactiplantibacillus pentosus)的NAD(P)H氧化酶的氨基酸序列如SEQ ID No.8所示。
在上述各方面中，所述醇脱氢酶ADH的氨基酸序列如SEQ ID No.17所示。
在本发明中，所述单加氧酶、所述羧化酶、所述双加氧酶、所述醛缩酶、所述脱氢酶和NAD(P)H氧化酶均是利用大肠杆菌作为宿主菌进行原核表达，然后进行Ni柱纯化后得到的。具体可按照包括如下步骤的方法制备得到的：将表达所述单加氧酶、所述羧化酶、所述双加氧酶、所述醛缩酶、所述脱氢酶或NAD(P)H氧化酶的大肠杆菌(如BL21 Gold(DE3))用终浓度为50μM的IPTG进行诱导表达，表达条件为20～30℃诱导24h；离心收集细胞，重悬后破碎细胞，离心收集上清，过滤后进行Ni柱纯化，脱盐，冷冻干燥，即得。
本发明公开了一种CO2固定和萘裂解偶联反应的方法，该方法以羧化-双加氧偶联反应为核心，克服了酶催化羧化反应的热力学可逆性，极大地提高了固定CO2的效率，并以此为核心搭建了新的萘降解反应路径，萘经过加氧酶生成1-萘酚，再经过羧化-双加氧偶联反应生成2-羧基苯并丙酮酸，再经过醛缩反应生成邻羧基苯甲醛或醛缩-脱氢偶联反应生成邻苯二甲酸，实现了萘的裂解开环和CO2固定，以及邻羧基苯甲醛和邻苯二甲酸的制备。
与现有的非氧化型羧化反应相比，本发明具有以下优势：
1、通过羧化酶和加氧酶偶联，消除了产物抑制，羧化酶催化反应在正常的环境条件下即可进行，加大降低了羧化酶固定C的成本，提高了效率。
2、以萘为底物，构建了新的反应路径，将萘的降解和CO2的固定偶联起来。
3、以萘为底物，设计了一种绿色、温和的合成邻羧基苯甲醛和邻苯二甲酸的方法。
4、本发明方法中不依赖底物和温度的驱动，反应条件温和、操作便利。
附图说明
图1为SDS-PAGE电泳检测酶纯化效果。A为实施例2涉及的五个酶的纯化效果；B为实施例10涉及的三个酶的纯化效果。图中，M：标准蛋白marker；L1：P450BM-3(A74G/F87V/L188Q)；L2：2,3-DHBD；L3：1HNDO；L4：SAD；L5：2,6-DHBD；L6：NsaE；L7：Nox；L8：PhdK。箭头处为目的蛋白。
图2为液质联用检测2-羧基苯并丙酮酸纯品和液相检测1-萘酚标品。A为液质联用检测2-羧基苯并丙酮酸纯品；B为液相检测1-萘酚标品。
图3为液相检测羧化酶2,3-DHBD和双加氧酶1HNDO偶联催化1-萘酚裂解(直接酶反应法)。
图4为液相检测羧化酶2,6-DHBD和双加氧酶1HNDO偶联反应催化1-萘酚裂解(直接酶反应法)。
图5为液相检测羧化酶SAD和双加氧酶1HNDO偶联反应催化1-萘酚裂解(直接酶反应法)。
图6为液相检测羧化酶2,3-DHBD和双加氧酶1HNDO偶联催化1-萘酚裂解(静息细胞反应法)。
图7为液相检测羧化酶2,3-DHBD和双加氧酶1HNDO偶联催化1-萘酚裂解并固定CO2(直接酶反应法)。
图8为液相检测单加氧酶P450 BM-3(A74G/F87V/L188Q)、羧化酶2,3-DHBD和双加氧酶1HNDO偶联催化萘降解(直接酶反应法)。
图9为液相检测单加氧酶P450 BM-3(A74G/F87V/L188Q)、羧化酶2,3-DHBD和双加氧酶1HNDO偶联催化萘降解(静息细胞辅酶循环反应法)。
图10为液相检测邻羧基苯甲醛标品和醛缩酶NsaE催化2-羧基苯并丙酮酸裂解生成邻羧基苯甲醛。A为液相检测邻羧基苯甲醛标品；B为液相检测醛缩酶NsaE催化2-羧基苯并丙酮酸裂解生成邻羧基苯甲醛。
图11为离子色谱检测标准品丙酮酸和邻苯二甲酸。
图12为离子色谱检测醛缩酶NsaE、脱氢酶PhdK和NAD(P)H氧化酶催化2-羧基苯并丙酮酸裂解生成的邻苯二甲酸和丙酮酸。
图13为离子色谱检测羧化酶2,3-DHBD、双加氧酶1-HNDO、醛缩酶NsaE、脱氢酶PhdK和NAD(P)H氧化酶催化1-萘酚裂解生成邻苯二甲酸和丙酮酸。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1、表达宿主构建
经过基因优化，委托苏州金唯智生物技术有限公司人工合成来源于巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)单加氧酶突变体[P450 BM-3(A74G/F87V/L188Q)]的编码基因如SEQ IDNo.9所示(SEQ ID No.9编码SEQ ID No.1所示蛋白质)，将该基因插入到pET28a的NdeⅠ酶切位点，获得的重组载体经测序验证正确后命名为pET28a::bm3。
合成来源于米曲霉(Aspergillus oryzae)羧化酶(2,3-DHBD)的编码基因如SEQID No.10所示(SEQ ID No.10编码SEQ ID No.2所示蛋白质)，将该基因插入pRSFDuet1载体(New England Biolabs公司)的NcoⅠ酶切位点，获得的重组载体经测序验证正确后命名为pRSFDuet1::2,3-dhnd。
合成来源于根瘤菌(Rhizobium sp.)的羧化酶(2,6-DHBD)的编码基因如SEQ IDNo.11所示(SEQ ID No.11编码SEQ ID No.3所示蛋白质)，将该基因插入pRSFDuet1载体(New England Biolabs公司)的NcoⅠ酶切位点，获得的重组载体经测序验证正确后命名为pRSFDuet1::2,6-dhnd。
合成来源于念珠毛孢子菌(Trichosporon moniliiforme)的羧化酶(SAD)的编码基因如SEQ ID No.12所示(SEQ ID No.12编码SEQ ID No.4所示蛋白质)，将该基因插入pRSFDuet1载体(New England Biolabs公司)的NcoⅠ酶切位点，获得的重组载体经测序验证正确后命名为pRSFDuet1::sad。
合成来源于范巴伦氏分枝杆菌(Mycobacterium vanbaalenii PYR-1)的双加氧酶(1HNDO)的编码基因如SEQ ID No.13所示(SEQ ID No.13编码SEQ ID No.5所示蛋白质)，将该基因插入pRSFDuet1载体(New England Biolabs公司)的NcoⅠ酶切位点，获得的重组载体经测序验证正确后命名为pRSFDuet1::1hndo。
上述各表达载体载体转化入大肠杆菌BL21 Gold(DE3)，于含卡那霉素的LB平板上筛选阳性克隆并培养，抽提质粒，测序确定载体构建成功。
实施例2、酶的表达纯化
将实施例1构建的各阳性工程菌分别接种于5mL LB培养基中，以37℃、200r/min培养12h，转接1mL种子菌液到新鲜的100mL LB培养基中，37℃、220r/min培养约2h至OD600达到0.4～0.6时，加入终浓度为50μM的IPTG进行诱导表达，表达条件为20～30℃低温诱导，220r/min，24h。
表达结束离心收集细胞，用Binding buffer重悬细胞，细胞悬浮液的体积浓缩20倍，高压均质破碎细胞，12000rpm/min离心，收集上清，经过0.45μm滤膜过滤，即可进行Ni柱上样，Washing buffer洗脱杂蛋白，Eution buffer洗脱回收酶，然后脱盐，冷冻干燥，-80℃保存酶。其中，Ni柱纯化蛋白质buffer如表1所示。
表1、Ni柱纯化蛋白质buffer
Buffer 组成
Binding buffer 20mM磷酸盐、0.5M NaCl、20mM咪唑、pH 8.0
Washing buffer 20mM磷酸盐、0.5M NaCl、40mM咪唑、pH 8.0
Elution buffer 20mM磷酸盐、0.5M NaCl、500mM咪唑、pH 8.0
本实施例中涉及的五个酶的纯化效果见图1中A。由图可见，除P450 BM-3(A74G/F87V/L188Q)外，其余四个酶纯度均达到90％以上，满足实验所需。单加氧酶[P450BM-3(A74G/F87V/L188Q)]纯度为70％。
另外，对纯化后产物进行酶活力测定，检测方法使用荧光法，持续检测反应样品的荧光信号的改变，激发光350nm，发射光420nm。羧化酶：反应样品中含KHCO3的终浓度200mM，1-萘酚的终浓度10mM，加入适量的羧化酶，用磷酸钾缓冲液(pH7.0或pH7.5，100mM)将体积补足120μL，转移至96孔荧光酶标板中，使用酶标仪检测荧光的增加(产物1-羟基-2-萘甲酸具有荧光特性)，定义：每分钟生成1μM 1-羟基-2-萘甲酸所需要的酶活为1U。双加氧酶：反应样品中含1-羟基-2-萘甲酸的终浓度0.2mM，加入适量的羧化酶，用磷酸钾缓冲液(pH7.0或pH7.5，100mM)将体积补足120μL，转移至96孔荧光酶标板中，使用酶标仪检测荧光的减少。定义：每分钟转化1μM 1-羟基-2-萘甲酸所需要的酶活为1U。酶活力结果：2,3-DHBD：0.65U/mg蛋白，SAD：0.09U/mg蛋白，2,6-DHBD：0.002U/mg蛋白，1HNDO：12U/mg蛋白。单加氧酶经测定活性很低，后续进行反应一般采用全细胞。
实施例3、2,3-DHBD和1HNDO偶联反应固碳
1、称量1-萘酚用N,N-二甲基甲酰胺(DMF)溶解，配制成浓度为500mM的溶液。配制磷酸钾缓冲液(pH7.0，100mM)。配制3M KHCO3溶液。
2、制备酶液，将实施例2制备的羧化酶2,3-DHBD和双加氧酶1HNDO分别用磷酸钾缓冲液(pH7.0，100mM)溶解。
3、将反应各组分预混配制成反应液，如表2所示。
表2、偶联反应液(1mL)
注：表中各物质的浓度为在反应液中的终浓度。
反应条件：200rpm，30℃反应12h。
高效液相色谱法检测反应结果。
谱柱：PAH；
洗脱剂：A：5mM醋酸铵，B：乙腈；
洗脱程序：如表3。
表3、高效液相色谱洗脱程序1
时间 速率(ml/min) ％B(流速比)
0.0 0.6 5.0
7.0 0.6 5.0
12.0 0.8 45.0
24.0 0.8 50.0
30.0 0.6 5.0
检测：紫外吸光法，300nm。
对2-羧基苯并丙酮酸和1-萘酚标品的液相检测结果见图2(A：制备的2-羧基苯并丙酮酸经过分离提纯之后，使用LC-MS鉴定结果，物质的结构分子量正确无误；B：1-萘酚标品的液相检测结果)。
结果如图3所示，对照图2，可见底物1-萘酚几乎全部转化为产物2-羧基苯并丙酮酸。
实施例4、2,6-DHBD和1HNDO偶联反应固碳
1、称量1-萘酚用N,N-二甲基甲酰胺(DMF)溶解，配制成浓度为500mM的溶液。配制磷酸钾缓冲液(pH7.0，100mM)，配制3M KHCO3溶液。
2、制备酶液，将实施例2制备的羧化酶2,6-DHBD和双加氧酶1HNDO分别用磷酸钾缓冲液(pH7.0，100mM)溶解。
3、将反应各组分预混配制成反应液，如表4所示。
表4、偶联反应液(1mL)
注：表中各物质的浓度为在反应液中的终浓度。
反应条件：200rpm，30℃反应12h。
高效液相色谱法检测反应结果(具体检测方法同实施例3)。
结果如图4所示，对照图2，可见仅部分底物1-萘酚转化为产物2-羧基苯并丙酮酸。
实施例5、SAD和1HNDO偶联反应固碳
1、称量1-萘酚用N,N-二甲基甲酰胺(DMF)溶解，配制成浓度为500mM的溶液。配制磷酸钾缓冲液(pH7.0，100mM)，配制3M KHCO3溶液。
2、制备酶液，将实施例2制备的羧化酶SAD和双加氧酶1HNDO分别用磷酸钾缓冲液(pH7.0，100mM)溶解。
3、将反应各组分预混配制成反应液，如表5所示。
表5、偶联反应液(1mL)
组分 浓度
1-萘酚 15mM
KHCO3 45mM
羧化酶SAD 0.14U/mL
双加氧酶(1HNDO) 9U/mL
磷酸钾缓冲液(pH7.0，100mM) 补足1mL
注：表中各物质的浓度为在反应液中的终浓度。
反应条件：200rpm，30℃反应12h。
高效液相色谱法检测反应结果(具体检测方法同实施例3)。
结果如图5所示，对照图2，可见仅少量底物1-萘酚转化为产物2-羧基苯并丙酮酸。
实施例6、2,3-DHBD和1HNDO偶联反应固碳——静息细胞
1、称量1-萘酚用N,N-二甲基甲酰胺(DMF)溶解，配制成浓度为500mM的溶液。配制磷酸钾缓冲液(pH7.0，100mM)，配制3M KHCO3溶液。
2、准备静息细胞，将2,3-DHBD和1HNDO的表达细胞(实施例1构建的表达2,3-DHBD和1HNDO的大肠杆菌BL21 Gold(DE3))分别使用磷酸钾缓冲液(pH7.0，100mM)重悬均匀。
3、将反应各组分预混配制成反应液，如表6所示。
表6、偶联反应液(1mL)
组分 浓度
1-萘酚 15mM
KHCO3 45mM
2,3-DHBD细胞 0.5g细胞湿重/mL
1HNDO细胞 0.5g细胞湿重/mL
磷酸钾缓冲液(pH7.0，100mM) 补足1mL
注：表中各物质的浓度为在反应液中的终浓度。
反应条件：30℃反应12h。
高效液相色谱法检测反应结果(具体检测方法同实施例3)。
结果如图6所示，对照图2，可见全部的1-萘酚转化为产物2-羧基苯并丙酮酸。
实施例7、2,3-DHBD和1HNDO偶联反应固碳——CO2
1、称量1-萘酚用N,N-二甲基甲酰胺(DMF)溶解，配制成浓度为500mM的溶液。配制磷酸钾缓冲液(pH7.5，100mM)。
2、制备酶液，将实施例2制备的羧化酶2,3-DHBD和双加氧酶1HNDO分别用磷酸钾缓冲液(pH7.5，100mM)溶解。
3、将反应各组分预混配制成反应液，如表7所示。
表7、偶联反应液(1mL)
组分 浓度
1-萘酚 15mM
羧化酶(2,3-DHBD) 1U/mL
双加氧酶(1HNDO) 9U/mL
磷酸钾缓冲液(pH7.5，100mM) 补足1mL
注：表中各物质的浓度为在反应液中的终浓度。
反应条件：200rpm，30℃反应12h，反应过程持续通入CO2。
高效液相色谱法检测反应结果(具体检测方法同实施例3)。
结果如图7所示，对照图2，可见底物1-萘酚几乎全部转化为产物2-羧基苯并丙酮酸。可见，CO2可以很好的代替HCO3 -进行反应，本发明对于提高固定CO2的效率具有重要意义。
实施例8、萘的芳香环的打开
1、称量萘用N,N-二甲基甲酰胺(DMF)溶解，配制成浓度为500mM的溶液。配制磷酸钾缓冲液(pH7.0，100mM)，配制3M KHCO3溶液。
2、制备酶液，将实施例2制备的P450 BM-3(A74G/F87V/L188Q)、2,3-DHBD和1HNDO分别用磷酸钾缓冲液(pH7.0，100mM)溶解。
3、将反应的各组分预混配制成反应液，如表8所示。
表8、偶联反应液(1mL)
组分 浓度
萘 15mM
NADH 60mM
KHCO3 50mM
单加氧酶(P450BM-3(A74G/F87V/L188Q)) 0.5mg/mL
羧化酶(2,3-DHBD) 1U/mL
双加氧酶(1HNDO) 9U/mL
磷酸钾缓冲液(pH7.0，100mM) 补足1mL
注：表中各物质的浓度为在反应液中的终浓度。
反应条件：200rpm，30℃反应12h。
高效液相色谱法检测反应结果(具体检测方法同实施例3，仅洗脱程序不同，本实施例洗脱程序见表9)：
表9、高效液相色谱洗脱程序2
时间 速率(ml/min) ％B(流速比)
0.0 0.5 1.0
10.0 0.5 20.0
15.0 0.8 80.0
24.0 0.8 80.0
30.0 0.5 10.0
结果如图8所示，对照图2，可见在仅有萘和HCO3 -作为底物的情况下，经过本发明设计的反应路线，成功检测到了2-羧基苯并丙酮酸的生成，证明了本路线在降解萘和固定碳方面的成效。
实施例9、萘的芳香环的打开——辅酶循环
1、称量萘用N,N-二甲基甲酰胺(DMF)溶解，配制成浓度为500mM的溶液。配制磷酸钾缓冲液(pH7.0，100mM)，配制3M KHCO3溶液。
2、准备静息细胞，将P450 BM-3(A74G/F87V/L188Q)、2,3-DHBD和1HNDO的表达细胞(实施例1构建的表达P450 BM-3(A74G/F87V/L188Q)、2,3-DHBD和1HNDO的表达细胞的大肠杆菌BL21 Gold(DE3))分别使用磷酸钾缓冲液(pH7.0，100mM)重悬均匀。制备醇脱氢酶ADH静息细胞(按照实施例1的方法，将醇脱氢酶ADH编码基因插入pET21b质粒的NdeI位点，基因序列如SEQ ID No.18所示，氨基酸序列如SEQ ID No.17所示)导入大肠杆菌BL21 Gold(DE3)后得到的重组菌)，用于NADH的再生和循环(降低反应的成本)。
3、将反应的各组分预混配制成反应液，如表10所示。
表10、偶联反应液(1mL)
组分 浓度
萘 15mM
NAD+ 30mM
异丙醇 30mM
KHCO3 50mM
P450BM-3(A74G/F87V/L188Q)细胞 0.5g细胞湿重/mL
ADH细胞 0.5g细胞湿重/mL
2,3-DHBD细胞 0.5g细胞湿重/mL
1HNDO细胞 0.5g细胞湿重/mL
磷酸钾缓冲液(pH7.0，100mM) 补足1mL
注：表中各物质的浓度为在反应液中的终浓度。
反应条件：30℃反应12h。
高效液相色谱法检测反应结果(具体检测方法同实施例3，仅洗脱程序不同，本实施例洗脱程序见表9)。
结果如图9所示，对照图2，可见在仅有萘和HCO3 -作为底物的情况下，使用氧化型辅酶NAD+，经过本发明设计的反应路线，成功检测到了2-羧基苯并丙酮酸的生成，证明了本路线在降解萘和固定碳方面的成效和辅酶循环系统的作用。
实施例10、表达宿主构建
经过基因优化，委托苏州金唯智生物技术有限公司人工合成来源于恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)的醛缩酶(NsaE)的编码基因如SEQ ID No.14所示(SEQ ID No.14编码SEQ ID No.6所示蛋白质)，将基因插入pRSFDuet1载体(New England Biolabs公司)的NcoⅠ酶切位点。所得表达载体命名为pRSFDuet1::nsae。
合成来源于诺卡氏菌(Nocardioides sp.KP7)的脱氢酶(PhdK)的编码基因如SEQID No.15所示(SEQ ID No.15编码SEQ ID No.7所示蛋白质)，将基因插入pRSFDuet1载体(New England Biolabs公司)的NcoⅠ酶切位点。所得表达载体命名为pRSFDuet1::phdk。
合成来源于副兰乳杆菌(Lactiplantibacillus pentosus)的NAD(P)H氧化酶(Nox)的编码基因如SEQ ID No.16所示(SEQ ID No.16编码SEQ ID No.8所示蛋白质)，将基因插入pRSFDuet1载体(New England Biolabs公司)的NcoⅠ酶切位点。所得表达载体命名为pRSFDuet1::nox。
将pRSFDuet1::nsae，pRSFDuet1::phdk和pRSFDuet1::nox分别转化大肠杆菌，获得工程菌，将构建的各阳性工程菌分别接种于5mL LB培养基中，以37℃、200r/min培养12h，转接1mL种子菌液到新鲜的100mL LB培养基中，37℃、220r/min培养约2h至OD600达到0.4～0.6时，加入终浓度为50μM的IPTG进行诱导表达，表达条件为20～30℃低温诱导，220r/min，24h。
表达结束离心收集细胞，用Binding buffer重悬细胞，细胞悬浮液的体积浓缩20倍，高压均质破碎细胞，12000rpm/min离心，收集上清，经过0.45μm滤膜过滤，即可进行Ni柱上样，Washing buffer洗脱杂蛋白，Elution buffer洗脱回收酶，然后脱盐，冷冻干燥，-80℃保存酶。其中，Ni柱纯化蛋白质buffer如前文表1所示。
本实施例中涉及的三个酶的纯化效果见图1中B。由图可见，NsaE、PhdK和Nox纯化成功。
醛缩酶(NsaE)：在KPB(pH 7.0，100mM)缓冲液中加入适量的NsaE、10mM2’-羧基苄亚甲基丙酮酸、90mM KHCO3和4％(v/v)DMF，终体积为1ml，30℃，反应3h，色谱法检测裂解产物邻羧基苯甲醛。定义：每分钟生成1μmol邻羧基苯甲醛所需要的酶活为1U。活性测定中发现有逆反应，很难得到精准测定结果。
邻羧基苯甲醛脱氢酶(PhdK)：在KPB(pH 7.0，100mM)缓冲液中加入适量的PhdK、2mM邻羧基苯甲醛、2mM NAD+和4％(v/v)DMF，终体积为120μL，使用酶标仪检测NADH(A340)生成。定义：每分钟生成1μmol邻苯二甲酸所需要的酶活为1U。检测纯化后酶活力为24U/mg。
NADH氧化酶(Nox)：在KPB(pH 7.0，100mM)缓冲液中加入适量的Nox、2mM NADH，终体积为120μL，使用酶标仪检测NADH(A340)消耗。定义：每分钟生成1μmol邻苯二甲酸所需要的酶活为1U。检测纯化后酶活性为6U/mg。
实施例11、醛缩酶催化2-羧基苯并丙酮酸裂解
1、称量2-羧基苯并丙酮酸用50mM KHCO3溶液溶解，配制成浓度为50mM的溶液。配制磷酸钾缓冲液(pH7.5，100mM)。
2、制备酶液，将实施例10制备的醛缩酶NsaE用磷酸钾缓冲液(pH7.5，100mM)溶解。
3、将反应各组分预混配制成反应液，如表11所示。
表11、反应液
组分 浓度/酶含量
2-羧基苯并丙酮酸 10mM
KHCO3 50mM
醛缩酶(NsaE) 0.75mg
磷酸钾缓冲液(pH7.5，100mM) 补足1.05mL
注：表中各物质的浓度为在反应液中的终浓度。
反应条件：200rpm，30℃反应7h。
高效液相色谱法检测反应结果(具体检测方法同实施例3)。
结果如图10所示，由图可见2-羧基苯并丙酮酸裂解为邻羧基苯甲醛，根据化学反应的质量守恒，2-羧基苯丙酮酸裂解的产物为邻羧基苯甲醛和丙酮酸，且丙酮酸和邻羧基苯甲醛的浓度相等。
实施例12、醛缩酶和脱氢酶协同催化2-羧基苯并丙酮酸的裂解
1、称量2-羧基苯并丙酮酸用50mM KHCO3溶液溶解，配制成浓度为50mM的溶液。配制磷酸钾缓冲液(pH7.5，100mM)。
2、制备酶液，将实施例10制备的醛缩酶NsaE和脱氢酶PhdK分别用磷酸钾缓冲液(pH7.5，100mM)溶解。
3、将反应各组分预混配制成反应液，如表12所示。
表12、偶联反应buffer
注：表中各物质的浓度为在反应液中的终浓度。
反应条件：200rpm，30℃反应5.5h。
离子色谱液相色谱法检测反应结果。
高效液相色谱法检测反应结果。
谱柱：毛细管柱；
洗脱剂：A：ddH2O，B：NaOH(5M)；
洗脱程序：如表13。
表13、离子色谱洗脱程序
时间 速率(ml/min) ％B(流速比)
0.0 1.0 1.0
10.0 1.0 1.0
20.0 1.0 15.0
30.0 1.0 30.0
35.0 1.0 60.0
38.0 1.0 60.0
45.0 1.0 1.0
检测：电导检测器和电化学检测器。
结果如图12所示，对照图11的标准品丙酮酸和邻苯二甲酸检测，可见，2-羧基苯并丙酮酸裂解为邻苯二甲酸和丙酮酸。
实施例13、羧化酶、双加氧酶、醛缩酶、脱氢酶和NAD(P)H氧化酶协同催化1-萘酚的裂解
1、称量1-萘酚用N,N-二甲基甲酰胺(DMF)溶解，配制成浓度为375mM的溶液。配制磷酸钾缓冲液(pH7.5，100mM)。
2、制备酶液，将实施例2制备的羧化酶2,3-DHBD、双加氧酶1HNDO、实施例10制备的醛缩酶NsaE和脱氢酶PhdK和NAD(P)H氧化酶Nox分别用磷酸钾缓冲液(pH7.5，100mM)溶解。
3、将反应各组分预混配制成反应液，如表13所示。
表13、偶联反应液(1mL)
组分 浓度
1-萘酚 7.5mM
羧化酶(2,3-DHBD) 1U/mL
双加氧酶(1HNDO) 9U/mL
醛缩酶(NsaE) 0.75mg/mL
脱氢酶(PhdK) 18U/mL
NAD(P)H氧化酶(Nox) 4.5U/mL
NAD+ 0.1mM
KHCO3 90mM
磷酸钾缓冲液(pH7.5，100mM) 补足1mL
注：表中各物质的浓度为在反应液中的终浓度。
反应条件：200rpm，30℃反应12h。
离子液相色谱法检测反应结果(具体检测方法同实施例12)。
结果如图13所示，对照图11，可见底物1-萘酚几乎全部转化为产物邻苯二甲酸。可见，可以使用一锅法反应，以CO2固定的方式裂解1-萘酚，合成邻苯二甲酸，本发明对于固定CO2和合成邻苯二甲酸具有重要意义。
以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。
<110> 中国科学院天津工业生物技术研究所
<120> 多酶偶联转化芳香族化合物的方法
<130> GNCLN221037
<160> 18
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 1051
<212> PRT
<213> Artificial sequence
<400> 1
Met Gly Met Thr Ile Lys Glu Met Pro Gln Pro Lys Thr Phe Gly Glu
1 5 10 15
Leu Lys Asn Leu Pro Leu Leu Asn Thr Asp Lys Pro Val Gln Ala Leu
20 25 30
Met Lys Ile Ala Asp Glu Leu Gly Glu Ile Phe Lys Phe Glu Ala Pro
35 40 45
Gly Arg Val Thr Arg Tyr Leu Ser Ser Gln Arg Leu Ile Lys Glu Ala
50 55 60
Cys Asp Glu Ser Arg Phe Asp Lys Asn Leu Ser Gln Gly Leu Lys Phe
65 70 75 80
Val Arg Asp Phe Ala Gly Asp Gly Leu Val Thr Ser Trp Thr His Glu
85 90 95
Lys Asn Trp Lys Lys Ala His Asn Ile Leu Leu Pro Ser Phe Ser Gln
100 105 110
Gln Ala Met Lys Gly Tyr His Ala Met Met Val Asp Ile Ala Val Gln
115 120 125
Leu Val Gln Lys Trp Glu Arg Leu Asn Ala Asp Glu His Ile Glu Val
130 135 140
Pro Glu Asp Met Thr Arg Leu Thr Leu Asp Thr Ile Gly Leu Cys Gly
145 150 155 160
Phe Asn Tyr Arg Phe Asn Ser Phe Tyr Arg Asp Gln Pro His Pro Phe
165 170 175
Ile Thr Ser Met Val Arg Ala Leu Asp Glu Ala Met Asn Lys Gln Gln
180 185 190
Arg Ala Asn Pro Asp Asp Pro Ala Tyr Asp Glu Asn Lys Arg Gln Phe
195 200 205
Gln Glu Asp Ile Lys Val Met Asn Asp Leu Val Asp Lys Ile Ile Ala
210 215 220
Asp Arg Lys Ala Ser Gly Glu Gln Ser Asp Asp Leu Leu Thr His Met
225 230 235 240
Leu Asn Gly Lys Asp Pro Glu Thr Gly Glu Pro Leu Asp Asp Glu Asn
245 250 255
Ile Arg Tyr Gln Ile Ile Thr Phe Leu Ile Ala Gly His Glu Thr Thr
260 265 270
Ser Gly Leu Leu Ser Phe Ala Leu Tyr Phe Leu Val Lys Asn Pro His
275 280 285
Val Leu Gln Lys Ala Ala Glu Glu Ala Ala Arg Val Leu Val Asp Pro
290 295 300
Val Pro Ser Tyr Lys Gln Val Lys Gln Leu Lys Tyr Val Gly Met Val
305 310 315 320
Leu Asn Glu Ala Leu Arg Leu Trp Pro Thr Ala Pro Ala Phe Ser Leu
325 330 335
Tyr Ala Lys Glu Asp Thr Val Leu Gly Gly Glu Tyr Pro Leu Glu Lys
340 345 350
Gly Asp Glu Leu Met Val Leu Ile Pro Gln Leu His Arg Asp Lys Thr
355 360 365
Ile Trp Gly Asp Asp Val Glu Glu Phe Arg Pro Glu Arg Phe Glu Asn
370 375 380
Pro Ser Ala Ile Pro Gln His Ala Phe Lys Pro Phe Gly Asn Gly Gln
385 390 395 400
Arg Ala Cys Ile Gly Gln Gln Phe Ala Leu His Glu Ala Thr Leu Val
405 410 415
Leu Gly Met Met Leu Lys His Phe Asp Phe Glu Asp His Thr Asn Tyr
420 425 430
Glu Leu Asp Ile Lys Glu Thr Leu Thr Leu Lys Pro Glu Gly Phe Val
435 440 445
Val Lys Ala Lys Ser Lys Lys Ile Pro Leu Gly Gly Ile Pro Ser Pro
450 455 460
Ser Thr Glu Gln Ser Ala Lys Lys Val Arg Lys Lys Ala Glu Asn Ala
465 470 475 480
His Asn Thr Pro Leu Leu Val Leu Tyr Gly Ser Asn Met Gly Thr Ala
485 490 495
Glu Gly Thr Ala Arg Asp Leu Ala Asp Ile Ala Met Ser Lys Gly Phe
500 505 510
Ala Pro Gln Val Ala Thr Leu Asp Ser His Ala Gly Asn Leu Pro Arg
515 520 525
Glu Gly Ala Val Leu Ile Val Thr Ala Ser Tyr Asn Gly His Pro Pro
530 535 540
Asp Asn Ala Lys Gln Phe Val Asp Trp Leu Asp Gln Ala Ser Ala Asp
545 550 555 560
Glu Val Lys Gly Val Arg Tyr Ser Val Phe Gly Cys Gly Asp Lys Asn
565 570 575
Trp Ala Thr Thr Tyr Gln Lys Val Pro Ala Phe Ile Asp Glu Thr Leu
580 585 590
Ala Ala Lys Gly Ala Glu Asn Ile Ala Asp Arg Gly Glu Ala Asp Ala
595 600 605
Ser Asp Asp Phe Glu Gly Thr Tyr Glu Glu Trp Arg Glu His Met Trp
610 615 620
Ser Asp Val Ala Ala Tyr Phe Asn Leu Asp Ile Glu Asn Ser Glu Asp
625 630 635 640
Asn Lys Ser Thr Leu Ser Leu Gln Phe Val Asp Ser Ala Ala Asp Met
645 650 655
Pro Leu Ala Lys Met His Gly Ala Phe Ser Thr Asn Val Val Ala Ser
660 665 670
Lys Glu Leu Gln Gln Pro Gly Ser Ala Arg Ser Thr Arg His Leu Glu
675 680 685
Ile Glu Leu Pro Lys Glu Ala Ser Tyr Gln Glu Gly Asp His Leu Gly
690 695 700
Val Ile Pro Arg Asn Tyr Glu Gly Ile Val Asn Arg Val Thr Ala Arg
705 710 715 720
Phe Gly Leu Asp Ala Ser Gln Gln Ile Arg Leu Glu Ala Glu Glu Glu
725 730 735
Lys Leu Ala His Leu Pro Leu Ala Lys Thr Val Ser Val Glu Glu Leu
740 745 750
Leu Gln Tyr Val Glu Leu Gln Asp Pro Val Thr Arg Thr Gln Leu Arg
755 760 765
Ala Met Ala Ala Lys Thr Val Cys Pro Pro His Lys Val Glu Leu Glu
770 775 780
Ala Leu Leu Glu Lys Gln Ala Tyr Lys Glu Gln Val Leu Ala Lys Arg
785 790 795 800
Leu Thr Met Leu Glu Leu Leu Glu Lys Tyr Pro Ala Cys Glu Met Lys
805 810 815
Phe Ser Glu Phe Ile Ala Leu Leu Pro Ser Ile Arg Pro Arg Tyr Tyr
820 825 830
Ser Ile Ser Ser Ser Pro Arg Val Asp Glu Lys Gln Ala Ser Ile Thr
835 840 845
Val Ser Val Val Ser Gly Glu Ala Trp Ser Gly Tyr Gly Glu Tyr Lys
850 855 860
Gly Ile Ala Ser Asn Tyr Leu Ala Glu Leu Gln Glu Gly Asp Thr Ile
865 870 875 880
Thr Cys Phe Ile Ser Thr Pro Gln Ser Glu Phe Thr Leu Pro Lys Asp
885 890 895
Pro Glu Thr Pro Leu Ile Met Val Gly Pro Gly Thr Gly Val Ala Pro
900 905 910
Phe Arg Gly Phe Val Gln Ala Arg Lys Gln Leu Lys Glu Gln Gly Gln
915 920 925
Ser Leu Gly Glu Ala His Leu Tyr Phe Gly Cys Arg Ser Pro His Glu
930 935 940
Asp Tyr Leu Tyr Gln Glu Glu Leu Glu Asn Ala Gln Ser Glu Gly Ile
945 950 955 960
Ile Thr Leu His Thr Ala Phe Ser Arg Met Pro Asn Gln Pro Lys Thr
965 970 975
Tyr Val Gln His Val Met Glu Gln Asp Gly Lys Lys Leu Ile Glu Leu
980 985 990
Leu Asp Gln Gly Ala His Phe Tyr Ile Cys Gly Asp Gly Ser Gln Met
995 1000 1005
Ala Pro Ala Val Glu Ala Thr Leu Met Lys Ser Tyr Ala Asp Val
1010 1015 1020
His Gln Val Ser Glu Ala Asp Ala Arg Leu Trp Leu Gln Gln Leu
1025 1030 1035
Glu Glu Lys Gly Arg Tyr Ala Lys Asp Val Trp Ala Gly
1040 1045 1050
<210> 2
<211> 338
<212> PRT
<213> Artificial sequence
<400> 2
Met Leu Gly Lys Ile Ala Leu Glu Glu Ala Phe Ala Leu Pro Arg Phe
1 5 10 15
Glu Glu Lys Thr Arg Trp Trp Ala Ser Leu Phe Ser Thr Asp Ala Glu
20 25 30
Thr His Val Lys Glu Ile Thr Asp Ile Asn Lys Ile Arg Ile Glu His
35 40 45
Ala Asp Lys His Gly Val Gly Tyr Gln Ile Leu Ser Tyr Thr Ala Pro
50 55 60
Gly Val Gln Asp Ile Trp Asp Pro Val Glu Ala Gln Ala Leu Ala Val
65 70 75 80
Glu Ile Asn Asp Tyr Ile Ala Glu Gln Val Arg Val Asn Pro Asp Arg
85 90 95
Phe Gly Ala Phe Ala Thr Leu Ser Met His Asn Pro Lys Glu Ala Ala
100 105 110
Asp Glu Leu Arg Arg Cys Val Glu Lys Tyr Gly Phe Lys Gly Ala Leu
115 120 125
Val Asn Asp Thr Gln Arg Ala Gly Pro Asp Gly Asp Asp Met Ile Phe
130 135 140
Tyr Asp Asn Ala Asp Trp Asp Ile Phe Trp Gln Thr Cys Thr Glu Leu
145 150 155 160
Asp Val Pro Phe Tyr Met His Pro Arg Asn Pro Thr Gly Thr Ile Tyr
165 170 175
Glu Lys Leu Trp Ala Asp Arg Lys Trp Leu Val Gly Pro Pro Leu Ser
180 185 190
Phe Ala His Gly Val Ser Leu His Val Leu Gly Met Val Thr Asn Gly
195 200 205
Val Phe Asp Arg His Pro Lys Leu Gln Ile Ile Met Gly His Leu Gly
210 215 220
Glu His Val Pro Phe Asp Met Trp Arg Ile Asn His Trp Phe Glu Asp
225 230 235 240
Arg Lys Lys Leu Leu Gly Leu Ala Glu Thr Cys Lys Lys Thr Ile Arg
245 250 255
Asp Tyr Phe Ala Glu Asn Ile Trp Ile Thr Thr Ser Gly His Phe Ser
260 265 270
Thr Thr Thr Leu Asn Phe Cys Met Ala Glu Val Gly Ser Asp Arg Ile
275 280 285
Leu Phe Ser Ile Asp Tyr Pro Phe Glu Thr Phe Ser Asp Ala Cys Glu
290 295 300
Trp Phe Asp Asn Ala Glu Leu Asn Gly Thr Asp Arg Leu Lys Ile Gly
305 310 315 320
Arg Glu Asn Ala Lys Lys Leu Phe Lys Leu Asp Ser Tyr Lys Asp Ser
325 330 335
Ser Ala
<210> 3
<211> 327
<212> PRT
<213> Artificial sequence
<400> 3
Met Gln Gly Lys Val Ala Leu Glu Glu His Phe Ala Ile Pro Glu Thr
1 5 10 15
Leu Gln Asp Ser Ala Gly Phe Val Pro Gly Asp Tyr Trp Lys Glu Leu
20 25 30
Gln His Arg Leu Leu Asp Ile Gln Asp Thr Arg Leu Lys Leu Met Asp
35 40 45
Ala His Gly Ile Glu Thr Met Ile Leu Ser Leu Asn Ala Pro Ala Val
50 55 60
Gln Ala Ile Pro Asp Arg Arg Lys Ala Ile Glu Ile Ala Arg Arg Ala
65 70 75 80
Asn Asp Val Leu Ala Glu Glu Cys Ala Lys Arg Pro Asp Arg Phe Leu
85 90 95
Ala Phe Ala Ala Leu Pro Leu Gln Asp Pro Asp Ala Ala Thr Glu Glu
100 105 110
Leu Gln Arg Cys Val Asn Asp Leu Gly Phe Val Gly Ala Leu Val Asn
115 120 125
Gly Phe Ser Gln Glu Gly Asp Gly Gln Thr Pro Leu Tyr Tyr Asp Leu
130 135 140
Pro Gln Tyr Arg Pro Phe Trp Gly Glu Val Glu Lys Leu Asp Val Pro
145 150 155 160
Phe Tyr Leu His Pro Arg Asn Pro Leu Pro Gln Asp Ser Arg Ile Tyr
165 170 175
Asp Gly His Pro Trp Leu Leu Gly Pro Thr Trp Ala Phe Ala Gln Glu
180 185 190
Thr Ala Val His Ala Leu Arg Leu Met Ala Ser Gly Leu Phe Asp Glu
195 200 205
His Pro Arg Leu Asn Ile Ile Leu Gly His Met Gly Glu Gly Leu Pro
210 215 220
Tyr Met Met Trp Arg Ile Asp His Arg Asn Ala Trp Val Lys Leu Pro
225 230 235 240
Pro Arg Tyr Pro Ala Lys Arg Arg Phe Met Asp Tyr Phe Asn Glu Asn
245 250 255
Phe His Ile Thr Thr Ser Gly Asn Phe Arg Thr Gln Thr Leu Ile Asp
260 265 270
Ala Ile Leu Glu Ile Gly Ala Asp Arg Ile Leu Phe Ser Thr Asp Trp
275 280 285
Pro Phe Glu Asn Ile Asp His Ala Ser Asp Trp Phe Asn Ala Thr Ser
290 295 300
Ile Ala Glu Ala Asp Arg Val Lys Ile Gly Arg Thr Asn Ala Arg Arg
305 310 315 320
Leu Phe Lys Leu Asp Gly Ala
325
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<212> PRT
<213> Artificial sequence
<400> 4
Met Arg Gly Lys Val Ser Leu Glu Glu Ala Phe Glu Leu Pro Lys Phe
1 5 10 15
Ala Ala Gln Thr Lys Glu Lys Ala Glu Leu Tyr Ile Ala Pro Asn Asn
20 25 30
Arg Asp Arg Tyr Phe Glu Glu Ile Leu Asn Pro Cys Gly Asn Arg Leu
35 40 45
Glu Leu Ser Asn Lys His Gly Ile Gly Tyr Thr Ile Tyr Ser Ile Tyr
50 55 60
Ser Pro Gly Pro Gln Gly Trp Thr Glu Arg Ala Glu Cys Glu Glu Tyr
65 70 75 80
Ala Arg Glu Cys Asn Asp Tyr Ile Ser Gly Glu Ile Ala Asn His Lys
85 90 95
Asp Arg Met Gly Ala Phe Ala Ala Leu Ser Met His Asp Pro Lys Gln
100 105 110
Ala Ser Glu Glu Leu Thr Arg Cys Val Lys Glu Leu Gly Phe Leu Gly
115 120 125
Ala Leu Val Asn Asp Val Gln His Ala Gly Pro Glu Gly Glu Thr His
130 135 140
Ile Phe Tyr Asp Gln Pro Glu Trp Asp Ile Phe Trp Gln Thr Cys Val
145 150 155 160
Asp Leu Asp Val Pro Phe Tyr Leu His Pro Glu Pro Pro Phe Gly Ser
165 170 175
Tyr Leu Arg Asn Gln Tyr Glu Gly Arg Lys Tyr Leu Ile Gly Pro Pro
180 185 190
Val Ser Phe Ala Asn Gly Val Ser Leu His Val Leu Gly Met Ile Val
195 200 205
Asn Gly Val Phe Asp Arg Phe Pro Lys Leu Lys Val Ile Leu Gly His
210 215 220
Leu Gly Glu His Ile Pro Gly Asp Phe Trp Arg Ile Glu His Trp Phe
225 230 235 240
Glu His Cys Ser Arg Pro Leu Ala Lys Ser Arg Gly Asp Val Phe Ala
245 250 255
Glu Lys Pro Leu Leu His Tyr Phe Arg Asn Asn Ile Trp Leu Thr Thr
260 265 270
Ser Gly Asn Phe Ser Thr Glu Thr Leu Lys Phe Cys Val Glu His Val
275 280 285
Gly Ala Glu Arg Ile Leu Phe Ser Val Asp Ser Pro Tyr Glu His Ile
290 295 300
Asp Val Gly Cys Gly Trp Tyr Asp Asp Asn Ala Lys Ala Ile Met Glu
305 310 315 320
Ala Val Gly Gly Glu Lys Ala Tyr Lys Asp Ile Gly Arg Asp Asn Ala
325 330 335
Lys Lys Leu Phe Lys Leu Gly Lys Phe Tyr Asp Ser Glu Ala
340 345 350
<210> 5
<211> 361
<212> PRT
<213> Artificial sequence
<400> 5
Met Ser Thr Ala Glu Ser Ser Glu Leu Arg Glu Phe Asp Val Glu Leu
1 5 10 15
Glu Ala Ala Asn Leu Arg Gly Gln Trp Ile Tyr Asp Asp Met Leu Glu
20 25 30
Ser Val Val Gly Gly Pro Lys Pro Ala Gly Val Pro Phe Leu Trp Arg
35 40 45
Trp His Asp Val Tyr Ala Lys Leu Leu Lys Ser Cys Asp Val Met Pro
50 55 60
Glu Ser Leu Thr Ala Arg Arg Asn Leu Ser Phe Ile Asn Pro Asp Ala
65 70 75 80
Arg Gly Thr Thr His Thr Ile Asn Met Gly Met Gln Met Leu Lys Pro
85 90 95
Gly Glu Ile Ala Tyr Ala His Arg His Thr Met Ala Ala Leu Arg Phe
100 105 110
Ala Ile Gln Gly Gly Pro Gly Leu Val Thr Val Val Asp Gly Glu Pro
115 120 125
Cys Gln Met Asp Thr Tyr Asp Leu Val Leu Thr Pro Arg Trp Thr Trp
130 135 140
His Asp His Glu Asn Ala Thr Ser Glu Asn Val Val Trp Leu Asp Val
145 150 155 160
Leu Asp Ile Gly Leu Val Leu Gly Leu Asn Val Pro Phe Tyr Glu Pro
165 170 175
Tyr Gly Glu Met Arg Gln Pro Gln Arg Glu Asp Pro Gly Glu His Leu
180 185 190
Ala Asp Arg Gly Gly Met Leu Arg Pro Ala Trp Glu Gln Val Lys Ala
195 200 205
Ala Asn Phe Pro Tyr Arg Tyr Pro Trp Arg Asp Val Glu Arg Gln Leu
210 215 220
Gln Arg Met Ala Gly Leu Ala Gly Ser Pro Tyr Asp Gly Val Val Leu
225 230 235 240
Arg Tyr Ala Asn Pro Val Thr Gly Gly Ser Thr Met Pro Thr Leu Asp
245 250 255
Cys Trp Val Gln Leu Leu Arg Pro Gly Gln Gln Thr Glu Ala His Arg
260 265 270
His Thr Ser Ser Ala Val Tyr Phe Val Val Arg Gly Glu Gly Thr Thr
275 280 285
Val Val Asp Gly Val Glu Leu Asp Trp Gly Pro His Asp Ser Phe Val
290 295 300
Val Pro Asn Trp Ser Thr His His Phe Val Asn Arg Ser Ala Glu Asn
305 310 315 320
Ala Leu Leu Phe Ser Val Asn Asp Ile Pro Thr Leu Lys Ala Leu Asp
325 330 335
Leu Tyr Tyr Glu Glu Pro Glu Leu Ser Leu Gly Thr Gln Pro Phe Pro
340 345 350
Pro Val Pro Ala Asn Leu Arg Ala Arg
355 360
<210> 6
<211> 334
<212> PRT
<213> Artificial sequence
<400> 6
Met Ser Asn Lys Ile Met Lys Thr Ser Arg Leu Thr Ala Glu Asp Ile
1 5 10 15
Asn Gly Ala Trp Thr Ile Met Pro Thr Pro Ser Thr Pro Asp Ala Ser
20 25 30
Asp Trp Arg Ser Thr Ala Thr Val Asp Leu Glu Glu Thr Ala Arg Ile
35 40 45
Val Glu Glu Leu Ile Ala Ala Gly Val Asn Gly Ile Leu Ser Met Gly
50 55 60
Thr Phe Gly Glu Cys Ala Thr Leu Thr Trp Asp Glu Lys Arg Asp Tyr
65 70 75 80
Val Ser Thr Ile Val Glu Thr Ile Arg Gly Arg Val Pro Tyr Phe Cys
85 90 95
Gly Thr Thr Ala Leu Asn Thr Arg Glu Val Ile Arg Gln Thr Arg Glu
100 105 110
Leu Ile Asp Ile Gly Ala Asn Gly Thr Met Leu Gly Val Pro Met Trp
115 120 125
Val Lys Met Asp Leu Pro Thr Ala Val Gln Phe Tyr Arg Asp Val Ala
130 135 140
Asp Ala Val Pro Glu Ala Ala Ile Ala Ile Tyr Ala Asn Pro Glu Ala
145 150 155 160
Phe Lys Phe Asp Phe Pro Arg Pro Phe Trp Ala Glu Met Ser Lys Ile
165 170 175
Pro Gln Val Val Thr Ala Lys Tyr Leu Gly Ile Gly Met Leu Asp Leu
180 185 190
Asp Leu Arg Leu Ala Pro Asn Ile Arg Phe Leu Pro His Glu Asp Asp
195 200 205
Tyr Tyr Ala Ala Ala Arg Ile Asn Pro Glu Arg Ile Thr Ala Phe Trp
210 215 220
Ser Ser Gly Ala Met Cys Gly Pro Ala Thr Ala Ile Met Leu Arg Asp
225 230 235 240
Glu Val Val Arg Ala Lys Ser Thr Gly Asp Trp Ala Lys Ala Lys Ala
245 250 255
Ile Ser Asp Asp Met Arg Ala Ala Asp Ser Thr Leu Phe Pro Arg Gly
260 265 270
Asp Phe Ser Glu Phe Ser Lys Tyr Asn Ile Gly Leu Glu Lys Ala Arg
275 280 285
Met Asp Ala Ala Gly Trp Leu Lys Ala Gly Pro Cys Arg Pro Pro Tyr
290 295 300
Asn Leu Val Pro Glu Asp Tyr Leu Ala Gly Ala Gln Lys Ser Gly Lys
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Ala Trp Ala Ala Leu His Ala Lys Tyr Ser Asn Glu Leu Lys
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<212> PRT
<213> Artificial sequence
<400> 7
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115 120 125
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130 135 140
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145 150 155 160
Ala Ser Lys Val Ala Ala Pro Leu Met Ala Gly Asn Ser Val Ile Leu
165 170 175
Lys Ala Pro Asp Gln Thr Pro Leu Ser Ser Leu Arg Leu Ala Glu Val
180 185 190
Ala Ala Glu Val Leu Pro Gln Asn Leu Leu Ile Thr Ile Ser Gly Arg
195 200 205
Gly Arg Val Ala Gly Arg Ala Ile Val Arg His Pro Gln Ile Lys Arg
210 215 220
Ile Gly Phe Ile Gly Ser Thr Asp Thr Gly Arg Ser Ile Gln Arg Asp
225 230 235 240
Ala Ala Glu Val Ala Val Lys His Ile Ser Leu Glu Leu Gly Gly Lys
245 250 255
Asn Ala Gln Ile Val Phe Ala Asp Ala Asp Leu Glu Gln Ala Ala Leu
260 265 270
Gly Ala Val Asn Gly Met Asn Phe Thr Trp Thr Ala Gly Gln Ser Cys
275 280 285
Gly Ser Thr Ser Arg Leu Leu Val His Glu Ser Val Ala Asp Gln Val
290 295 300
Ile Ala Arg Val Val Glu Leu Val Ser Ala Ile Ala Val Gly Pro Pro
305 310 315 320
Leu Asp Glu Asn Ala Gln Met Gly Pro Leu Val Ser Gln Ala Gln Tyr
325 330 335
Asp Lys Ser Val His Ala Ile Gly Glu Gly Ile Arg Glu Gly Ala Lys
340 345 350
Val Val Ala Gly Gly Gly Arg Pro Glu Gly Val Gly Glu Gly Gly Trp
355 360 365
Tyr Leu Ala Pro Thr Val Leu Ala Asp Val Arg Pro Gly Ser Phe Ile
370 375 380
Glu Gln Asn Glu Ile Phe Gly Pro Val Leu Ser Val Ile Ile Phe Ala
385 390 395 400
Thr Asp Asp Glu Ala Val Ala Ile Ala Asn Gly Val Glu Tyr Gly Leu
405 410 415
Thr Ala Ser Val Trp Thr Ser Asp Ile Thr Arg Ala His Leu Ile Ala
420 425 430
Arg Arg Val Glu Ala Gly Tyr Val Leu Val Asn Gly Gly Ser Arg His
435 440 445
Tyr Trp Gly Leu Pro Phe Gly Gly Val Lys Ser Ser Gly Val Gly Ser
450 455 460
Glu Glu Ser Met Glu Glu Leu Ile Ser Tyr Thr Glu Thr Lys Thr Thr
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Thr Val Val Leu Gly
485
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<211> 450
<212> PRT
<213> Artificial sequence
<400> 8
Met Lys Val Ile Val Ile Gly Cys Thr His Ala Gly Thr Ala Ala Val
1 5 10 15
Asn Gln Ile Leu Ala Ser Asn Pro Glu Thr Asp Val Thr Ile Tyr Glu
20 25 30
Arg Asn Asp Asn Val Ser Phe Leu Ser Cys Gly Ile Ala Leu Tyr Leu
35 40 45
Gly Gly Glu Val Ala Asp Pro Gln Gly Leu Phe Tyr Ser Ser Pro Glu
50 55 60
Gln Leu Ala Lys Leu Gly Ala Asn Val His Met Gln His Asp Val Thr
65 70 75 80
Asp Val Asp Thr Glu Asn His Glu Ile Thr Val Thr Asp Leu Lys Thr
85 90 95
Gly Glu Ser Lys Lys Asp Tyr Tyr Asp Lys Leu Val Val Thr Thr Gly
100 105 110
Ser Trp Pro Val Ile Pro Pro Ile Asp Gly Ile Asp Ser Pro Asn Val
115 120 125
Tyr Leu Cys Lys Asn Trp Thr His Ala Gln Ser Leu Trp Glu Ala Ala
130 135 140
Lys Pro Ala Lys Arg Val Ile Val Ile Gly Gly Gly Tyr Ile Gly Thr
145 150 155 160
Glu Leu Val Glu Ala Tyr Gln Lys Gln Gly Lys Glu Val Thr Leu Ile
165 170 175
Asp Gly Leu Pro Arg Ile Leu Asn Lys Tyr Leu Asp Lys Gly Phe Thr
180 185 190
Asp Arg Val Glu Lys Asp Phe Val Asp His Gly Ile Lys Met Ala Leu
195 200 205
Asn Gln Met Val Lys Gly Phe Ser Asp Asp Gly Lys Glu Val Thr Val
210 215 220
Lys Thr Asp Lys Gly Ser Tyr Thr Ala Asp Met Ala Ile Leu Cys Val
225 230 235 240
Gly Phe Arg Pro Asn Thr Ser Leu Leu Lys Gly Lys Val Asp Met Asn
245 250 255
Pro Asn Gly Ser Ile Lys Thr Asn Asp Tyr Met Gln Thr Ser Asp Pro
260 265 270
Asp Ile Tyr Gly Ala Gly Asp Ser Val Ala Val His Tyr Asn Pro Thr
275 280 285
Lys Lys Asp Ala Tyr Ile Pro Leu Ala Thr Asn Ala Val Arg Gln Gly
290 295 300
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305 310 315 320
Thr Gln Ser Thr Ser Gly Leu Met Leu Phe Gly Lys Thr Ile Val Ser
325 330 335
Ser Gly Met Thr Leu Glu His Ala Gln Ala Glu Lys Val Pro Ala Glu
340 345 350
Ala Val Thr Phe Glu Asp Asn Tyr Arg Pro Glu Phe Met Pro Thr Thr
355 360 365
Lys Pro Val Leu Met Gln Leu Val Tyr Asn Pro Glu Thr Arg Glu Ile
370 375 380
Leu Gly Ala Gln Phe Met Ser Glu His Asp Val Ser Gln Ser Ala Asn
385 390 395 400
Val Ile Ser Val Met Ile Gln Asn His Asn Thr Ile Asp Asp Leu Gly
405 410 415
Phe Val Asp Met Phe Phe Gln Pro Ile Tyr Asp Arg Pro Phe Asn Tyr
420 425 430
Leu Asn Leu Leu Gly Gln Ala Ala Ile Ala His Ala Ala Glu Lys Val
435 440 445
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450
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<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 9
atgggcatga caattaaaga aatgcctcag ccaaaaacgt ttggagagct taaaaattta 60
ccgttattaa acacagataa accggttcaa gctttgatga aaattgcgga tgaattagga 120
gaaatcttta aattcgaggc gcctggtcgt gtaacgcgct acttatcaag tcagcgtcta 180
attaaagaag catgcgatga atcacgcttt gataaaaact taagtcaagg tcttaaattt 240
gtacgtgatt ttgcaggaga cgggttagtg acaagctgga cgcatgaaaa aaattggaaa 300
aaagcgcata atatcttact tccaagcttc agtcagcagg caatgaaagg ctatcatgcg 360
atgatggtcg atatcgccgt gcagcttgtt caaaagtggg agcgtctaaa tgcagatgag 420
catattgaag taccggaaga catgacacgt ttaacgcttg atacaattgg tctttgcggc 480
tttaactatc gctttaacag cttttaccga gatcagcctc atccatttat tacaagtatg 540
gtccgtgcac tggatgaagc aatgaacaag cagcagcgag caaatccaga cgacccagct 600
tatgatgaaa acaagcgcca gtttcaagaa gatatcaagg tgatgaacga cctagtagat 660
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ctaaacggaa aagatccaga aacgggtgag ccgcttgatg acgagaacat tcgctatcaa 780
attattacat tcttaattgc gggacacgaa acaacaagtg gtcttttatc atttgcgctg 840
tatttcttag tgaaaaatcc acatgtatta caaaaagcag cagaagaagc agcacgagtt 900
ctagtagatc ctgttccaag ctacaaacaa gtcaaacagc ttaaatatgt cggcatggtc 960
ttaaacgaag cgctgcgctt atggccaact gctcctgcgt tttccctata tgcaaaagaa 1020
gatacggtgc ttggaggaga atatccttta gaaaaaggcg acgaactaat ggttctgatt 1080
cctcagcttc accgtgataa aacaatttgg ggagacgatg tggaagagtt ccgtccagag 1140
cgttttgaaa atccaagtgc gattccgcag catgcgttta aaccgtttgg aaacggtcag 1200
cgtgcgtgta tcggtcagca gttcgctctt catgaagcaa cgctggtact tggtatgatg 1260
ctaaaacact ttgactttga agatcataca aactacgagc tggatattaa agaaacttta 1320
acgttaaaac ctgaaggctt tgtggtaaaa gcaaaatcga aaaaaattcc gcttggcggt 1380
attccttcac ctagcactga acagtctgct aaaaaagtac gcaaaaaggc agaaaacgct 1440
cataatacgc cgctgcttgt gctatacggt tcaaatatgg gaacagctga aggaacggcg 1500
cgtgatttag cagatattgc aatgagcaaa ggatttgcac cgcaggtcgc aacgcttgat 1560
tcacacgccg gaaatcttcc gcgcgaagga gctgtattaa ttgtaacggc gtcttataac 1620
ggtcatccgc ctgataacgc aaagcaattt gtcgactggt tagaccaagc gtctgctgat 1680
gaagtaaaag gcgttcgcta ctccgtattt ggatgcggcg ataaaaactg ggctactacg 1740
tatcaaaaag tgcctgcttt tatcgatgaa acgcttgccg ctaaaggggc agaaaacatc 1800
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gaacatatgt ggagtgacgt agcagcctac tttaacctcg acattgaaaa cagtgaagat 1920
aataaatcta ctctttcact tcaatttgtc gacagcgccg cggatatgcc gcttgcgaaa 1980
atgcacggtg cgttttcaac gaacgtcgta gcaagcaaag aacttcaaca gccaggcagt 2040
gcacgaagca cgcgacatct tgaaattgaa cttccaaaag aagcttctta tcaagaagga 2100
gatcatttag gtgttattcc tcgcaactat gaaggaatag taaaccgtgt aacagcaagg 2160
ttcggcctag atgcatcaca gcaaatccgt ctggaagcag aagaagaaaa attagctcat 2220
ttgccactcg ctaaaacagt atccgtagaa gagcttctgc aatacgtgga gcttcaagat 2280
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gtagagcttg aagccttgct tgaaaagcaa gcctacaaag aacaagtgct ggcaaaacgt 2400
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gatgaaaaac aagcaagcat cacggtcagc gttgtctcag gagaagcgtg gagcggatat 2580
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gtaatggaac aagacggcaa gaaattgatt gaacttcttg atcaaggagc gcacttctat 3000
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gctgacgttc accaagtgag tgaagcagac gctcgcttat ggctgcagca gctagaagaa 3120
aaaggccgat acgcaaaaga cgtgtgggct gggtaa 3156
<210> 10
<211> 1017
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 10
atgctgggta aaatcgctct ggaagaagct ttcgctctgc cgcgtttcga agaaaaaacc 60
cgttggtggg cttctctgtt ctctaccgac gctgaaaccc acgttaaaga aatcaccgac 120
atcaacaaaa tccgtatcga acacgctgac aaacacggtg ttggttacca gatcctgtct 180
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gaaatcaacg actacatcgc tgaacaggtt cgtgttaacc cggaccgttt cggtgctttc 300
gctaccctgt ctatgcacaa cccgaaagaa gctgctgacg aactgcgtcg ttgcgttgaa 360
aaatacggtt tcaaaggtgc tctggttaac gacacccagc gtgctggtcc ggacggtgac 420
gacatgatct tctacgacaa cgctgactgg gacatcttct ggcagacctg caccgaactg 480
gacgttccgt tctacatgca cccgcgtaac ccgaccggta ccatctacga aaaactgtgg 540
gctgaccgta aatggctggt tggtccgccg ctgtctttcg ctcacggtgt ttctctgcac 600
gttctgggta tggttaccaa cggtgttttc gaccgtcacc cgaaactgca gatcatcatg 660
ggtcacctgg gtgaacacgt tccgttcgac atgtggcgta tcaaccactg gttcgaagac 720
cgtaaaaaac tgctgggtct ggctgaaacc tgcaaaaaaa ccatccgtga ctacttcgct 780
gaaaacatct ggatcaccac ctctggtcac ttctctacca ccaccctgaa cttctgcatg 840
gctgaagttg gttctgaccg tatcctgttc tctatcgact acccgttcga aaccttctct 900
gacgcttgcg aatggttcga caacgctgaa ctgaacggta ccgaccgtct gaaaatcggt 960
cgtgaaaacg ctaaaaaact gttcaaactg gactcttaca aagactcttc tgcttaa 1017
<210> 11
<211> 984
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 11
atgcagggta aagttgctct ggaagaacac ttcgctatcc cggaaaccct gcaggactct 60
gctggtttcg ttccgggtga ctactggaaa gaactgcagc accgtctgct ggacatccag 120
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cgtatcctgt tctctaccga ctggccgttc gaaaacatcg accacgcttc tgactggttc 900
aacgctacct ctatcgctga agctgaccgt gttaaaatcg gtcgtaccaa cgctcgtcgt 960
ctgttcaaac tggacggtgc ttaa 984
<210> 12
<211> 1053
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 12
atgcgtggta aagtttctct ggaagaagct ttcgaactgc cgaaattcgc tgctcagacc 60
aaagaaaaag ctgaactgta catcgctccg aacaaccgtg accgttactt cgaagaaatc 120
ctgaacccgt gcggtaaccg tctggaactg tctaacaaac acggtatcgg ttacaccatc 180
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gctcgtgaat gcaacgacta catctctggt gaaatcgcta accacaaaga ccgtatgggt 300
gctttcgctg ctctgtctat gcacgacccg aaacaggctt ctgaagaact gacccgttgc 360
gttaaagaac tgggtttcct gggtgctctg gttaacgacg ttcagcacgc tggtccggaa 420
ggtgaaaccc acatcttcta cgaccagccg gaatgggaca tcttctggca gacctgcgtt 480
gacctggacg ttccgttcta cctgcacccg gaaccgccgt tcggttctta cctgcgtaac 540
cagtacgaag gtcgtaaata cctgatcggt ccgccggttt ctttcgctaa cggtgtttct 600
ctgcacgttc tgggtatgat cgttaacggt gttttcgacc gtttcccgaa actgaaagtt 660
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ctgaaattct gcgttgaaca cgttggtgct gaacgtatcc tgttctctgt tgactctccg 900
tacgaacaca tcgacgttgg ttgcggttgg tacgacgaca acgctaaagc tatcatggaa 960
gctgttggtg gtgaaaaagc ttacaaagac atcggtcgtg acaacgctaa aaaactgttc 1020
aaactgggta aattctacga ctctgaagct taa 1053
<210> 13
<211> 1086
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 13
atgtctaccg ctgaatcttc tgaactgcgt gaattcgacg ttgaactgga agctgctaac 60
ctgcgtggtc agtggatcta cgacgacatg ctggaatctg ttgttggtgg tccgaaaccg 120
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cgtggtacca cccacaccat caacatgggt atgcagatgc tgaaaccggg tgaaatcgct 300
tacgctcacc gtcacaccat ggctgctctg cgtttcgcta tccagggtgg tccgggtctg 360
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cgttacgcta acccggttac cggtggttct accatgccga ccctggactg ctgggttcag 780
ctgctgcgtc cgggtcagca gaccgaagct caccgtcaca cctcttctgc tgtttacttc 840
gttgttcgtg gtgaaggtac caccgttgtt gacggtgttg aactggactg gggtccgcac 900
gactctttcg ttgttccgaa ctggtctacc caccacttcg ttaaccgttc tgctgaaaac 960
gctctgctgt tctctgttaa cgacatcccg accctgaaag ctctggacct gtactacgaa 1020
gaaccggaac tgtctctggg tacccagccg ttcccgccgg ttccggctaa cctgcgtgct 1080
cgttaa 1086
<210> 14
<211> 1005
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 14
atgtctaaca aaatcatgaa aacctctcgt ctgaccgctg aagacatcaa cggtgcttgg 60
accatcatgc cgaccccgtc taccccggac gcttctgact ggcgttctac cgctaccgtt 120
gacctggaag aaaccgctcg tatcgttgaa gaactgatcg ctgctggtgt taacggtatc 180
ctgtctatgg gtaccttcgg tgaatgcgct accctgacct gggacgaaaa acgtgactac 240
gtttctacca tcgttgaaac catccgtggt cgtgttccgt acttctgcgg taccaccgct 300
ctgaacaccc gtgaagttat ccgtcagacc cgtgaactga tcgacatcgg tgctaacggt 360
accatgctgg gtgttccgat gtgggttaaa atggacctgc cgaccgctgt tcagttctac 420
cgtgacgttg ctgacgctgt tccggaagct gctatcgcta tctacgctaa cccggaagct 480
ttcaaattcg acttcccgcg tccgttctgg gctgaaatgt ctaaaatccc gcaggttgtt 540
accgctaaat acctgggtat cggtatgctg gacctggacc tgcgtctggc tccgaacatc 600
cgtttcctgc cgcacgaaga cgactactac gctgctgctc gtatcaaccc ggaacgtatc 660
accgctttct ggtcttctgg tgctatgtgc ggtccggcta ccgctatcat gctgcgtgac 720
gaagttgttc gtgctaaatc taccggtgac tgggctaaag ctaaagctat ctctgacgac 780
atgcgtgctg ctgactctac cctgttcccg cgtggtgact tctctgaatt ctctaaatac 840
aacatcggtc tggaaaaagc tcgtatggac gctgctggtt ggctgaaagc tggtccgtgc 900
cgtccgccgt acaacctggt tccggaagac tacctggctg gtgctcagaa atctggtaaa 960
gcttgggctg ctctgcacgc taaatactct aacgaactga aataa 1005
<210> 15
<211> 1458
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 15
atgaccaccc cgcgtaaatt cgacgaatac cgttggaacg ttctggttga cggtgttccg 60
ctgaacgttg aatctcgtta cccgatctct gacccgtcta ccggtcgtta cctgacccag 120
gttccggact gcgctgaagc tgacgttgac cgtgctgttc aggcttctcg tcaggctcag 180
gctgaatggg gtgctctgcc gccgcgtgct cgtgctgcta aactgcgtga actgatcacc 240
ctgctgcgtg aacaccgtga agaattcgct atgctggacg ctatcgacgg tggtttcccg 300
atctctatga tgcgtaacga cgttgacgct gctctggaac tgatggacat cttcgctgac 360
atggctctgg acctgggtgg taaaactata ccggtaagca ccaacctgca cttcaccacc 420
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gcttctaaag ttgctgctcc gctgatggct ggtaactctg ttatcctgaa agctccggac 540
cagaccccgc tgtcttctct gcgtctggct gaagttgctg ctgaagttct gccgcagaac 600
ctgctgatca ccatctctgg tcgtggtcgt gttgctggtc gtgctatcgt tcgtcacccg 660
cagatcaaac gtatcggttt catcggttct accgacaccg gtcgttctat ccagcgtgac 720
gctgctgaag ttgctgttaa acacatctct ctggaactgg gtggtaaaaa tgcgcagatc 780
gtattcgcgg acgctgacct ggaacaggct gctctgggtg ctgttaacgg tatgaacttc 840
acctggaccg ctggtcagtc ttgcggttct acctctcgtc tgctggttca cgaatctgtt 900
gctgaccagg ttatcgctcg tgttgttgaa ctggtttctg ctatcgctgt tggtccgccg 960
ctggacgaaa acgctcagat gggtccgctg gtttctcagg ctcagtacga caaatctgtt 1020
cacgctatcg gtgaaggtat ccgtgaaggt gctaaagttg ttgctggtgg tggtcgtccg 1080
gaaggtgttg gtgaaggtgg ttggtacctg gctccgaccg ttctggctga cgttagacca 1140
ggtagcttca tcgaacagaa tgaaatcttc ggtccggttc tgtctgttat catcttcgct 1200
accgacgacg aagctgttgc tatcgctaac ggtgttgaat acggtctgac cgcttctgtt 1260
tggacctctg acatcacccg tgctcacctg atcgctcgtc gtgttgaagc tggttacgtt 1320
ctggttaacg gtggttctcg tcactactgg ggtctgccgt tcggtggtgt taaatcttct 1380
ggtgttggtt ctgaagaatc tatggaagaa ctgatctctt acaccgaaac caaaaccacc 1440
accgttgttc tgggttaa 1458
<210> 16
<211> 1353
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 16
atgaaagtta tcgtaattgg ttgtactcat gccggaactg ctgctgtaaa tcaaatcttg 60
gcgtcaaatc cagaaacaga cgtcacgatt tatgaacgga atgacaatgt gtcatttctc 120
tcctgtggga ttgccctcta tcttggtggc gaagttgccg atccacaagg gctcttctat 180
tccagtccag aacaattagc caaattaggc gcgaatgttc atatgcaaca tgatgtgacc 240
gacgtggata ccgaaaatca tgaaattacc gttactgatt tgaagaccgg cgaatccaag 300
aaagattatt acgacaaatt agttgtcaca actggttcat ggcctgtaat tccaccaatc 360
gatggtatcg acagcccgaa cgtttacctc tgcaagaact ggacgcatgc ccaaagttta 420
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gaattagtcg aagcttatca gaagcaaggt aaggaagtta ccttaattga tggcttacca 540
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attaagacaa atgactacat gcaaacatct gaccctgata tctacggtgc tggtgattcc 840
gttgcggttc actacaaccc aactaagaag gatgcctaca ttccattagc cactaacgcg 900
gttcgccaag ggactttagt tggtttgaac atcttcaagc caacccggaa gtacatgggg 960
acgcaatcaa cttctggttt aatgttattc ggcaagacga tcgtttcttc tgggatgacc 1020
ttggaacatg ctcaagctga aaaggtacct gcagaagccg ttacctttga agataactac 1080
cgtccagaat ttatgccaac cacgaaacca gttctgatgc aattggttta caacccagag 1140
acgcgtgaaa tcttaggggc ccaattcatg agtgaacatg acgtttcaca atcggctaac 1200
gtgatctcag tgatgattca aaatcacaac acgatcgatg acttaggctt tgttgacatg 1260
ttcttccagc caatctatga ccgtccattc aactacttga acttattagg ccaagcagcc 1320
atcgctcatg cggctgaaaa agtgactgaa taa 1353
<210> 17
<211> 363
<212> PRT
<213> Artificial sequence
<400> 17
Met Thr Thr Ser Thr Thr Gln Lys Val Ala Thr Met Lys Thr Phe Val
1 5 10 15
Met Lys Gln Ile Gly Glu Thr Ala Trp Ile Asp Lys Glu Lys Pro Glu
20 25 30
Ala Gly Pro Arg Asp Ala Ile Leu Arg Pro Ile Ala Ile Ala Pro Cys
35 40 45
Thr Ser Asp Ile His Thr Val Tyr Glu Gly Gly Ile Gly Glu Arg Gln
50 55 60
Asn Leu Val Leu Gly His Glu Ala Val Gly Glu Val Ile Glu Val Gly
65 70 75 80
Ser Lys Val Glu Asp Phe Arg Ser Gly Asp Arg Val Ile Val Pro Ala
85 90 95
Ile Thr Pro Asp Trp Tyr Asn Thr Asp Ile Gln Asp Asn Tyr His Gln
100 105 110
His Ser Asn Gly Met Leu Phe Gly Phe Gln Phe Ala Asn Leu Lys Asp
115 120 125
Gly Val Phe Ser Glu Tyr Phe His Val Asn Asp Ala Asp Leu Asn Leu
130 135 140
Ala His Leu Pro Asp Glu Ile Ser Pro Glu Ala Ala Val Met Leu Thr
145 150 155 160
Asp Met Val Thr Thr Gly Leu His Gly Ala Glu Leu Ala Asp Ile Glu
165 170 175
Phe Gly Asp Ser Val Ala Val Ile Gly Ile Gly Pro Val Gly Leu Met
180 185 190
Ala Ile Ala Gly Ala Lys Leu Arg Gly Ala Ser Arg Leu Phe Gly Ala
195 200 205
Gly Ser Arg Glu Val Cys Ala Glu Val Ala Ser Asp Phe Gly Met Thr
210 215 220
Asp Gln Ile Asn Tyr Lys Glu Val Pro Ile Ser Glu Gln Ile Asp Ser
225 230 235 240
Leu Thr Tyr Gly Lys Gly Val Asp Ala Thr Ile Ile Ala Gly Gly Asp
245 250 255
Ser Asp Val Leu Thr Thr Ala Val Glu Ile Thr Lys Pro Gly Gly Asn
260 265 270
Ile Ser Asn Ile Asn Tyr Phe Ser Ile Gly Glu Ser Leu Pro Ile Pro
275 280 285
Arg Leu Ala Trp Gly Asn Gly Met Ala His Lys Thr Ile Lys Gly Gly
290 295 300
Leu Cys Pro Gly Gly Arg Ile Arg Met Glu Arg Leu Ala Asn Leu Val
305 310 315 320
Thr Thr Gly Arg Leu Asn Pro Glu Lys Leu Ile Thr His His Tyr Asn
325 330 335
Lys Phe Glu Asp Ile Glu Glu Ala Phe Lys Leu Met Lys Asp Lys Pro
340 345 350
Arg Asp Leu Ile Lys Pro Val Val Thr Ile Asp
355 360
<210> 18
<211> 1092
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 18
atgacaacat ctacaacaca aaaagtagct acaatgaaaa cattcgtcat gaaacagatc 60
ggtgaaacag cttggataga caaagaaaag ccagaagcag gaccaagaga tgccattctt 120
cgccccatag ctatagctcc atgcacctca gacattcata ccgtctatga aggtggtata 180
ggcgaaagac aaaacttagt attaggacat gaagcagtgg gagaagtcat agaagtcgga 240
agcaaagttg aagattttag atcaggagac agagttatag ttccggccat cacaccggat 300
tggtacaata ctgatattca ggataactat catcaacact ccaatggcat gctatttggc 360
tttcaatttg ccaacttgaa ggatggtgtt ttttctgagt attttcacgt taacgatgca 420
gatcttaacc tggctcacct tccagatgag atcagtcctg aagccgctgt aatgttaaca 480
gatatggtta ccacaggctt acacggtgca gagttggctg atatagaatt tggtgacagt 540
gttgcagtaa taggaattgg tccagtagga ctaatggcaa tagctggagc caaattacgt 600
ggtgcatcta gactatttgg agctggcagt agagaggttt gtgctgaggt tgctagcgat 660
tttgggatga ctgaccaaat taattacaaa gaagtcccaa taagcgaaca aattgacagt 720
ttaacttatg gtaaaggcgt tgatgctact atcattgccg gtggcgacag cgatgtacta 780
acaactgcag ttgaaataac aaaacccgga ggcaatattt caaatattaa ttacttcagc 840
attggagaat cacttcccat accacgttta gcatggggaa atggaatggc ccacaaaaca 900
atcaagggcg gactatgtcc cgggggacgc attagaatgg aaagattagc aaatctagtt 960
acaacaggca ggttaaatcc agaaaagctt atcactcatc attacaataa gtttgaagat 1020
attgaagaag catttaagtt aatgaaagat aaaccacgag acttaatcaa accagtagta 1080
actatagact ag 1092

Claims (10)

1.一种芳香族化合物的开环方法，包括如下步骤：
(A1)芳香族化合物经单加氧酶催化，反应生成对应酚类化合物；
(A2)所述酚类化合物经羧化酶催化，反应生成含羧基芳香族化合物；
(A3)所述含羧基芳香族化合物经双加氧酶催化，反应生成羧酸类化合物；
(A4)所述羧酸类化合物经醛缩酶催化，反应生成丙酮酸和芳香醛酸类化合物
(A5)所述芳香醛酸类化合物经脱氢酶催化，反应生成二元羧酸类化合物。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：若所述芳香族化合物含有酚羟基，则跳过步骤(A1)，直接进行步骤(A2)；
和/或
所述方法中，各种酶的催化反应通过如下任一方式进行：1)向反应体系中直接加入相应酶；2)向反应体系中加入能够表达相应酶的细胞。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤(A1)中，以NAD(P)H提供还原力；
进一步地，所述以NAD(P)H提供还原力通过如下任一方式实现：1)向反应体系中直接加入NAD(P)H；2)在所述反应体系中形成辅酶NAD(P)H/NAD(P)+循环；
更进一步地，在所述反应体系中形成辅酶NAD(P)H/NAD(P)+循环通过如下任一方式实现：1)向反应体系中加入醇脱氢酶ADH和NAD(P)+；2)向反应体系中加入能够表达醇脱氢酶ADH的细胞和NAD(P)+；3)向反应体系中加入醇脱氢酶ADH和NAD(P)H；4)向反应体系中加入能够表达醇脱氢酶ADH的细胞和NAD(P)H；5)当步骤(A1)和步骤(A5)在同一反应体系中完成时，向反应体系中加入NAD(P)H或NAD(P)+；
和/或
步骤(A2)中，以HCO3 -或CO2作为另一底物；
和/或
步骤(A5)中，所述反应需要NAD(P)+；
进一步地，所述反应中的NAD(P)+通过如下任一方式引入：1)向反应体系中直接加入NAD(P)+；2)在所述反应体系中形成辅酶NAD(P)H/NAD(P)+循环；
更进一步地，在所述反应体系中形成辅酶NAD(P)H/NAD(P)+循环通过如下任一方式实现：1)向反应体系中加入NAD(P)H氧化酶和NAD(P)+；2)向反应体系中加入NAD(P)H氧化酶和NAD(P)H；3)当步骤(A1)和步骤(A5)在同一反应体系中完成时，向反应体系中加入NAD(P)H或NAD(P)+。
4.根据权利要求1-3中任一所述的方法，其特征在于：所述芳香族化合物为芳香烃化合物；
进一步地，所述芳香烃化合物为多环芳香烃；
更进一步地，所述多环芳香烃为萘。
5.一种降解萘和/或固定CO2的方法，包括如下步骤：
(a1)萘经单加氧酶催化，反应生成1-萘酚；
(a2)1-萘酚经羧化酶催化，反应生成1-羟基-2-苯甲酸；
(a3)1-羟基-2-苯甲酸经双加氧酶催化，反应生成2-羧基苯并丙酮酸；
(a4)2-羧基苯并丙酮酸经醛缩酶催化，反应生成邻羧基苯甲醛；
(a5)邻羧基苯甲醛经脱氢酶催化，反应生成邻苯二甲酸。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：步骤(a1)中，以NAD(P)H提供还原力；
进一步地，所述以NAD(P)H提供还原力通过如下任一方式实现：1)向反应体系中直接加入NAD(P)H；2)在所述反应体系中形成辅酶NAD(P)H/NAD(P)+循环；
更进一步地，在所述反应体系中形成辅酶NAD(P)H/NAD(P)+循环通过如下任一方式实现：1)向反应体系中加入醇脱氢酶ADH和NAD(P)+；2)向反应体系中加入能够表达醇脱氢酶ADH的细胞和NAD(P)+；3)向反应体系中加入醇脱氢酶ADH和NAD(P)H；4)向反应体系中加入能够表达醇脱氢酶ADH的细胞和NAD(P)H；5)当步骤(a1)和步骤(a5)在同一反应体系中完成时，向反应体系中加入NAD(P)H或NAD(P)+；
和/或
步骤(a2)中，以HCO3 -或CO2作为另一底物；
和/或
所述方法中，各种酶的催化反应通过如下任一方式进行：1)向反应体系中直接加入相应酶；2)向反应体系中加入能够表达相应酶的细胞；
和/或
步骤(a5)中，所述反应需要NAD(P)+；
进一步地，所述反应中的NAD(P)+通过如下任一方式引入：1)向反应体系中直接加入NAD(P)+；2)在所述反应体系中形成辅酶NAD(P)H/NAD(P)+循环；
更进一步地，在所述反应体系中形成辅酶NAD(P)H/NAD(P)+循环通过如下方式实现：1)向反应体系中加入NAD(P)H氧化酶和NAD(P)+；2)向反应体系中加入NAD(P)H氧化酶和NAD(P)H；3)当步骤(a1)和步骤(a5)在同一反应体系中完成时，向反应体系中加入NAD(P)H或NAD(P)+。
7.根据权利要求5或6所述的方法，其特征在于：步骤(a1)-(a3)在同一个反应体系中经一步反应完成，所述反应体系记为反应体系I；
进一步地，所述反应体系I中含有1)萘、2)单加氧酶或能够表达所述单加氧酶的细胞、3)羧化酶或能够表达所述羧化酶的细胞、4)双加氧酶或能够表达所述双加氧酶的细胞、5)NAD(P)H、6)HCO3 -或CO2、7)反应缓冲液I；
更进一步地，在所述反应体系I中，萘的终浓度为15mM、NAD(P)H的终浓度为60mM、HCO3 -的终浓度为50mM或在反应过程中向所述反应体系I中持续性通入CO2；和/或
更进一步地，所述反应缓冲液I的pH为6.5-8.0；和/或
更进一步地，所述反应的温度为25-35℃，反应时间为3-12h；
和/或
步骤(a4)-(a5)在同一个反应体系中经一步反应完成，所述反应体系记为反应体系II；
进一步地，所述反应体系II中含有：1)2-羧基苯并丙酮酸、2)醛缩酶或能够表达所述醛缩酶的细胞、3)脱氢酶或能够表达所述脱氢酶的细胞、4)NAD(P)+、5)KHCO3、6)反应缓冲液II；
更进一步地，在所述反应体系II中，2-羧基苯并丙酮酸的终浓度为10mM、NAD(P)H的终浓度为15mM、KHCO3的终浓度为50mM；和/或
更进一步地，所述反应缓冲液II的pH为6.5-8.0；和/或
更进一步地，所述反应的温度为25-35℃，反应时间为3-12h；
和/或
步骤(a2)-(a5)在同一个反应体系中经一步反应完成，所述反应体系记为反应体系III；
进一步地，所述反应体系III中含有1)1-萘酚、2)羧化酶或能够表达所述羧化酶的细胞、3)双加氧酶或能够表达所述双加氧酶的细胞、4)醛缩酶或能够表达所述醛缩酶的细胞、5)脱氢酶或能够表达所述脱氢酶的细胞、6)NAD(P)H氧化酶或能够表达所述NAD(P)H氧化酶的细胞、7)NAD(P)+、8)KHCO3、9)反应缓冲液III；
更进一步地，在所述反应体系III中，所述1-萘酚的终浓度为7.5mM、所述NAD(P)+的终浓度为0.5mM、所述KHCO3的终浓度为90mM；和/或
更进一步地，所述反应缓冲液III的pH为6.5-8.0；和/或
更进一步地，所述反应的温度为25-35℃，反应时间为3-12h。
8.如下任一方法：
方法I：一种以萘为底物生成邻羧基苯甲醛的方法，包括权利要求5-7中任一所述方法的步骤(a1)-(a4)；
方法II：一种以萘为底物生成邻苯二甲酸的方法，包括权利要求5-7中任一所述方法的步骤(a1)-(a5)；
方法III、一种以1-萘酚为底物生成邻羧基苯甲醛的方法，包括权利要求5-7中任一所述方法的步骤(a2)-(a4)；
方法IV：一种以1-萘酚为底物生成邻苯二甲酸的方法，包括权利要求5-7中任一所述方法的步骤(a2)-(a5)。
9.成套酶，为如下(B1)或(B2)或(B3)或(B4)：
(B1)由羧化酶、双加氧酶和醛缩酶组成；
(B2)由单加氧酶、醇脱氢酶ADH、羧化酶、双加氧酶和醛缩酶组成；
(B3)由羧化酶、双加氧酶、醛缩酶、脱氢酶和NAD(P)H氧化酶组成；
(B4)由单加氧酶、醇脱氢酶ADH、羧化酶、双加氧酶、醛缩酶、脱氢酶和NAD(P)H氧化酶组成；
或
成套细胞，为如下(C1)或(C2)或(C3)或(C4)：
(C1)由能够表达羧化酶的细胞、能够表达双加氧酶的细胞、能够表达醛缩酶的细胞组成；
(C2)由能够表达单加氧酶细胞、能够表达醇脱氢酶ADH细胞、能够表达羧化酶的细胞、能够表达双加氧酶的细胞、能够表达醛缩酶的细胞组成；
(C3)由能够表达羧化酶的细胞、能够表达双加氧酶的细胞、能够表达醛缩酶的细胞、能够表达脱氢酶的细胞和能够表达NAD(P)H氧化酶的细胞组成；
(C4)由能够表达单加氧酶的细胞、能够表达醇脱氢酶ADH的细胞、能够表达羧化酶的细胞、能够表达双加氧酶的细胞、能够表达醛缩酶的细胞、能够表达脱氢酶的细胞和能够表达NAD(P)H氧化酶的细胞组成；
或
如下P1-P2中任一应用：
P1、权利要求1-4中任一所述方法或所述成套酶或所述成套细胞在降解芳香族化合物和/或固定CO2和/或制备邻羧基苯甲醛和/或邻苯二甲酸中的应用；
P2、权利要求1-4中任一所述方法或所述成套酶或所述成套细胞在降解萘和/或固定CO2和/或制备邻羧基苯甲醛和/或邻苯二甲酸中的应用。
10.根据权利要求1-9中任一所述的方法或成套酶或成套细胞或应用，其特征在于：所述单加氧酶为来源于巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)的单加氧酶；
进一步地，所述来源于巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)的单加氧酶的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示；
和/或
所述羧化酶为来源于米曲霉(Aspergillus oryzae)的羧化酶，来源于根瘤菌(Rhizobium sp.)的羧化酶，或来源于念珠毛孢子菌(Trichosporon moniliiforme)的羧化酶；
进一步地，所述来源于米曲霉(Aspergillus oryzae)的羧化酶的氨基酸序列如SEQ IDNo.2所示；所述来源于根瘤菌(Rhizobium sp.)的羧化酶的氨基酸序列如SEQ ID No.3所示；所述来源于念珠毛孢子菌(Trichosporon moniliiforme)的羧化酶的氨基酸序列如SEQID No.4所示；
和/或
所述双加氧酶为来源于范巴伦氏分枝杆菌(Mycobacterium vanbaalenii PYR-1)的双加氧酶；
进一步地，所述来源于范巴伦氏分枝杆菌(Mycobacterium vanbaalenii PYR-1)的双加氧酶的氨基酸序列如SEQ ID No.5所示；
和/或
所述醛缩酶为来源于恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)的醛缩酶；
进一步地，所述来源于恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)的醛缩酶的氨基酸序列如SEQ ID No.6所示；
和/或
所述脱氢酶为来源于诺卡氏菌(Nocardioides sp.KP7)的脱氢酶；
进一步地，所述来源于诺卡氏菌(Nocardioides sp.KP7)的脱氢酶的氨基酸序列如SEQID No.7所示；
和/或
所述NAD(P)H氧化酶为来源于副兰乳杆菌(Lactiplantibacillus pentosus)的NAD(P)H氧化酶；
进一步地，所述来源于副兰乳杆菌(Lactiplantibacillus pentosus)的NAD(P)H氧化酶的氨基酸序列如SEQ ID No.8所示；
和/或
所述醇脱氢酶ADH的氨基酸序列如SEQ ID No.17所示。
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