CN112481244B

CN112481244B - 天冬氨酸酶突变体及其编码基因、载体、重组菌与应用

Info

Publication number: CN112481244B
Application number: CN202011423170.2A
Authority: CN
Inventors: 徐建中; 王金玉; 张伟国
Original assignee: Jiangnan University
Current assignee: Jiangnan University
Priority date: 2020-12-08
Filing date: 2020-12-08
Publication date: 2022-05-17
Anticipated expiration: 2040-12-08
Also published as: CN112481244A

Abstract

本发明涉及一种天冬氨酸酶突变体及其编码基因、载体、重组菌与应用。本发明通过对来自Bacillus sp.YM55‑1的天冬氨酸酶进行突变，将318位Ser突变成Thr，能够使天冬氨酸脱氨反应效率极大降低，也使富马酸胺化反应变化不大，这可能解决工业上富马酸转化率低的问题。

Description

天冬氨酸酶突变体及其编码基因、载体、重组菌与应用

技术领域

本发明涉及酶工程技术领域，尤其涉及一种天冬氨酸酶突变体及其编码基因、载体、重组菌与应用。

背景技术

天冬氨酸酶(Aspartase)，也叫天冬氨酸氨裂解酶。它主要催化延胡索酸(富马酸)向天冬氨酸这一可逆反应。天冬氨酸酶催化天冬氨酸脱氨形成延胡索酸和氨，是微生物氮源代谢调控的关键步骤。目前研究最多以及最广的是来自大肠杆菌的天冬氨酸酶aspA以及来自Bacillus sp.YM55-1的天冬氨酸酶aspB。研究表明aspB是一种由三个结构域组成的亚单位的同源四聚体，与被二价金属阳离子和L-天冬氨酸激活的大肠杆菌天冬氨酸酶aspA相比，它没有变构作用，但活性是大肠杆菌酶的四倍。天门冬氨酸酶与富马酸酶C、精氨酸琥珀酸裂解酶、腺苷酸琥珀酸裂解酶、d-晶体蛋白和3-羧基-顺式、顺式粘酸乳糖化酶具有序列同源性，这些酶被归类为天冬氨酸酶富马酸酶超家族。许多研究涉及定点突变、化学修饰和基于机理的失活，以确定天冬氨酸酶的重要催化残基。V.Puthan Veetil等的研究描述了BsAsp的晶体结构，并在BsAsp、EcAsp和EcFum的结构比较的基础上，研究了天冬氨酸酶和富马酸酶家族中底物识别、催化反应、热稳定性和变构激活机制。已有研究表明天冬氨酸酶aspB的318位丝氨酸是天冬氨酸脱氨形成延胡索酸的关键催化位点。由于底物与酶结合后，SS-LOOP环闭合，使得318位丝氨酸靠近天冬氨酸C3质子，由于Ser的羟基被周围氨基酸脱质子化，就会在天冬氨酸C3位实现质子提取。这一过程使天冬氨酸脱质子重排形成一种更稳定的中间体形式，这更有利于分子进一步重排而脱氨形成延胡索酸。V.Puthan Veetil等将318位Ser突变成Ala，发现酶完全失活，更是验证这一观点

工业上有很多通过天冬氨酸酶转化富马酸和氨形成天冬氨酸，以及将天冬氨酸酶与天冬氨酸脱羧酶共表达来生产唯一天然存在的β型氨基酸，β-丙氨酸。但由于天冬氨酸酶催化的是可逆反应，使得整个过程仍然存在富马酸转化率不够高的问题。

发明内容

为解决上述技术问题，本发明首次将来自Bacillus sp.YM55-1编码天冬氨酸酶的基因的318位Ser突变成Thr，并在大肠杆菌中进行过表达。结果发现突变酶催化天冬氨酸脱氨反应效率极大降低，以及催化富马酸胺化形成天冬氨酸的效率与野生型相差不大。

本发明的第一个目的是提供一种天冬氨酸酶突变体，所述的天冬氨酸酶突变体是将氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的亲本序列的318位丝氨酸突变成苏氨酸。

本发明的第二个目的是提供一种所述的天冬氨酸酶突变体的编码基因。

进一步地，所述的编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

本发明的第三个目的是提供一种携带所述的编码基因的表达载体。

进一步地，所述的载体为细菌质粒、噬菌体、酵母质粒、植物细胞病毒或哺乳动物细胞病毒。

本发明的第四个目的是提供一种表达所述的天冬氨酸酶突变体的重组菌。

进一步地，所述的重组菌是是以细菌、真菌、植物、昆虫或动物细胞为宿主细胞。

本发明的第五个目的是提供所述的天冬氨酸酶在催化生产天冬氨酸或β-丙氨酸中的应用。

本发明的第六个目的是提供一种包含所述的天冬氨酸酶的酶制剂。

进一步地，所述的酶制剂为固态酶制剂或液态酶制剂。

借由上述方案，本发明至少具有以下优点：

本发明通过对来自Bacillus sp.YM55-1的天冬氨酸酶进行突变，将318位Ser突变成Thr，能够使天冬氨酸脱氨反应效率极大降低，也使富马酸胺化反应变化不大，这可能解决工业上富马酸转化率低的问题。

上述说明仅是本发明技术方案的概述，为了能够更清楚了解本发明的技术手段，并可依照说明书的内容予以实施，以下以本发明的较佳实施例并配合详细附图说明如后。

附图说明

图1为aspB在BL21(DE3)中的表达

泳道说明：M泳道为蛋白质分子量标准Marker；1-2号泳道为BL21(DE3)PET-28a；3-4号泳道为BL21(DE3)PET-aspB；

图2为突变酶酶活。

具体实施方式

下面结合实施例，对本发明的具体实施方式作进一步详细描述。以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

在本发明中，出发菌BL21(DE3)是野生型大肠杆菌

底物与产物的定性与定量分析以及菌体生长情况的监测：菌液浓度测定：吸取样品菌液，用蒸馏水稀释一定倍数，以蒸馏水作为空白对照，采用分光光度计于1cm光程测定OD₆₀₀ _nm。延胡索酸在280nm处有吸光值，采用酶标仪测定吸光值，并参照标准曲线来测定其含量。天冬氨酸含量可以通过高效液相色谱仪测定。粗酶液根据PET-28a上的His标签，经亲和层析柱纯化。

实施例1：表达质粒PET-aspB的构建

来源于Bacillus sp.YM55-1天冬氨酸酶aspB由苏州金唯智生物科技有限公司合成,并对序列进行密码子优化,将其通过限制性酶切位点BamHI和SalI连接在PET-28a质粒上。

实施例2：将质粒转化至大肠杆菌BL21(DE3)进行表达

重组表达质粒PET-aspB化转至BL21(DE3)，37℃培养条件下经LB+Kan固体培养基培养筛选出重组表达菌株。将出发菌株与重组菌株接种至液体TB培养基，IPTG诱导后收集菌体经超声波破碎后，将上清液和沉淀进行SDS-PAGE电泳，结果检测到一条分子量约50kDa的特异性条带(图2)，与报道的目标蛋白大小一致，说明aspB可以在BL21(DE3)中正确表达。

实施例3：将突变质粒转化至大肠杆菌BL21(DE3)，测突变后酶活和酶的动力学参数

设计引物将aspB 318位氨基酸突变，如表1所示。以PEC-aspB为模板通过点突变试剂盒进行突变。将获得的含有突变基因的质粒转化进入大肠杆菌BL21(DE3)。将BL21PEC-aspB318在LB 10ml液体小瓶培养9-10h，然后取1ml转接进入TB培养基，37℃培养至OD₆₀₀在0.5～0.6之间，加入终浓度为0.1mMol/L IPTG，在16℃诱导表达24h。表达过后收集菌体，用PBS缓冲液洗涤两次，将菌体悬浮并控制在相同OD₆₀₀，然后用超声破碎仪破碎菌体，离心取上清获得粗酶液。

正反应酶活测定反应体系：1ml反应液里面包含了600μL 0.1M磷酸缓冲液pH7.0，200μL100mmol L^-1延胡索酸溶液(用氨水调至pH 7.0)，200μL粗酶液，30℃反应5min。酶活测定反应体系：1ml反应液里面包含了600μL 0.1M磷酸缓冲液pH7.0，200μL 50mmol L^-1天冬氨酸溶液(用2mol/LNaOH调至pH 7.0)，200μL粗酶液，30℃反应5min。反应结束取上清读取吸光度值，测定延胡索酸含量；天冬氨酸通过高效液相色谱仪测定其产物含量。正反应酶活单位(U)定义为在上述反应条件下每分钟催化生成1nmol天冬氨酸所需的酶量；逆反应酶活单位(U)定义为在上述反应条件下每分钟催化生成1nmol富马酸所需的酶量，结果如图2所示。从图2中发现当318位氨基酸突变成Thr，正向反应催化效率变化不大，逆向反应效率降低90％，然而突变成Ala，酶完全失活，所以无法测得酶活。

表1PCR扩增所需引物序列

实施例4：将酶进行纯化，并测定其动力学参数

将上述突变酶表达获得的粗酶液用亲和层析柱纯化。分别配制质量浓度为1.6mg/m L、2.0mg/m L、2.5mg/m L、3.0mg/m L、5.0mg/m L、10.0mg/m L的天冬氨酸溶液(用2mol/LNaOH调至pH 7.0)和100mmol L^-1延胡索酸溶液(用氨水调至pH 7.0)加入1mg纯化后的酶，100mmol L^-1延胡索酸溶液(用氨水调至pH 7.0)，根据Lineweaver-Burk双倒数法作图，可计算出以富马酸和天冬氨酸为底物时天冬氨酸酶的米氏常数(Km)、最大反应速率(Vmax)以及催化常数。结果发现突变318位氨基酸成Thr可以有效降低天冬氨酸激酶催化天冬氨脱氨，还对富马酸胺化反应影响不大，如表2，表3所示。根据以上结果可知318位是天冬氨酸酶重要的催化位点，中间体的形成与羟基脱质子化以及在C3位进行质子提取有很大关系，所以有可能将其位点突变成其他含羟基或者可被脱质子化的氨基酸有可能对酶催化效率产生很大影响，这酶的研究以及工业生产上有很大影响。

表2天冬氨酸脱氨反应中天定氨酸酶的动力学参数

注:ND，未测定(灵敏度分析的保守估计表明,与野生型AspB相比，kcat/Km减少至少106倍)

表3富马酸胺化反应中天冬氨酸酶的动力学参数

注:ND，未测定(灵敏度分析的保守估计表明,与野生型AspB相比，kcat/Km减少至少106

以上仅是本发明的优选实施方式，并不用于限制本发明，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和变型，这些改进和变型也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110> 江南大学

<120> 天冬氨酸酶突变体及其编码基因、载体、重组菌与应用

<160> 6

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 468

<212> PRT

<213> （人工序列）

<400> 1

Met Asn Thr Asp Val Arg Ile Glu Lys Asp Phe Leu Gly Glu Lys Glu

1 5 10 15

Ile Pro Lys Asp Ala Tyr Tyr Gly Val Gln Thr Ile Arg Ala Thr Glu

20 25 30

Asn Phe Pro Ile Thr Gly Tyr Arg Ile His Pro Glu Leu Ile Lys Ser

35 40 45

Leu Gly Ile Val Lys Lys Ser Ala Ala Leu Ala Asn Met Glu Val Gly

50 55 60

Leu Leu Asp Lys Glu Val Gly Gln Tyr Ile Val Lys Ala Ala Asp Glu

65 70 75 80

Val Ile Glu Gly Lys Trp Asn Asp Gln Phe Ile Val Asp Pro Ile Gln

85 90 95

Gly Gly Ala Gly Thr Ser Ile Asn Met Asn Ala Asn Glu Val Ile Ala

100 105 110

Asn Arg Ala Leu Glu Leu Met Gly Glu Glu Lys Gly Asn Tyr Ser Lys

115 120 125

Ile Ser Pro Asn Ser His Val Asn Met Ser Gln Ser Thr Asn Asp Ala

130 135 140

Phe Pro Thr Ala Thr His Ile Ala Val Leu Ser Leu Leu Asn Gln Leu

145 150 155 160

Ile Glu Thr Thr Lys Tyr Met Gln Gln Glu Phe Met Lys Lys Ala Asp

165 170 175

Glu Phe Ala Gly Val Ile Lys Met Gly Arg Thr His Leu Gln Asp Ala

180 185 190

Val Pro Ile Leu Leu Gly Gln Glu Phe Glu Ala Tyr Ala Arg Val Ile

195 200 205

Ala Arg Asp Ile Glu Arg Ile Ala Asn Thr Arg Asn Asn Leu Tyr Asp

210 215 220

Ile Asn Met Gly Ala Thr Ala Val Gly Thr Gly Leu Asn Ala Asp Pro

225 230 235 240

Glu Tyr Ile Ser Ile Val Thr Glu His Leu Ala Lys Phe Ser Gly His

245 250 255

Pro Leu Arg Ser Ala Gln His Leu Val Asp Ala Thr Gln Asn Thr Asp

260 265 270

Cys Tyr Thr Glu Val Ser Ser Ala Leu Lys Val Cys Met Ile Asn Met

275 280 285

Ser Lys Ile Ala Asn Asp Leu Arg Leu Met Ala Ser Gly Pro Arg Ala

290 295 300

Gly Leu Ser Glu Ile Val Leu Pro Ala Arg Gln Pro Gly Ser Ser Ile

305 310 315 320

Met Pro Gly Lys Val Asn Pro Val Met Pro Glu Val Met Asn Gln Val

325 330 335

Ala Phe Gln Val Phe Gly Asn Asp Leu Thr Ile Thr Ser Ala Ser Glu

340 345 350

Ala Gly Gln Phe Glu Leu Asn Val Met Glu Pro Val Leu Phe Phe Asn

355 360 365

Leu Ile Gln Ser Ile Ser Ile Met Thr Asn Val Phe Lys Ser Phe Thr

370 375 380

Glu Asn Cys Leu Lys Gly Ile Lys Ala Asn Glu Glu Arg Met Lys Glu

385 390 395 400

Tyr Val Glu Lys Ser Ile Gly Ile Ile Thr Ala Ile Asn Pro His Val

405 410 415

Gly Tyr Glu Thr Ala Ala Lys Leu Ala Arg Glu Ala Tyr Leu Thr Gly

420 425 430

Glu Ser Ile Arg Glu Leu Cys Ile Lys Tyr Gly Val Leu Thr Glu Glu

435 440 445

Gln Leu Asn Glu Ile Leu Asn Pro Tyr Glu Met Ile His Pro Gly Ile

450 455 460

Ala Gly Arg Lys

465

<210> 2

<211> 1407

<212> DNA

<213> （人工序列）

<400> 2

atgaacaccg atgtgcgcat cgaaaaggat ttcctgggcg aaaaggaaat cccaaaggat 60

gcatactacg gcgtgcagac catccgcgca accgaaaact tcccaatcac cggctaccgc 120

atccaccctg aactgatcaa gtccctgggc atcgtgaaga agtccgcagc actggcaaac 180

atggaagtgg gcctgctgga taaggaagtg ggtcagtaca tcgtgaaggc agcagatgaa 240

gtgatcgaag gcaagtggaa cgatcagttc atcgtcgatc caatccaagg cggcgccggc 300

acctccatca acatgaacgc aaacgaagtg atcgcaaacc gcgcactgga actgatgggc 360

gaagaaaagg gcaactactc caagatctcc ccaaactccc acgtgaacat gtctcagtcc 420

accaacgatg cattcccaac cgcaacccac atcgcagtgc tgtccctgct gaatcagctg 480

atcgaaacca ccaagtacat gcagcaagaa ttcatgaaga aggcagatga attcgccggc 540

gtgatcaaga tgggccgcac ccacctgcaa gatgcagtgc caatcctgct gggccaagaa 600

ttcgaagcat acgcacgcgt gatcgcacgc gatatcgaac gcatcgcaaa cacccgcaac 660

aacctgtacg atatcaacat gggcgcaacc gcagtgggca ccggcctgaa cgcagatcct 720

gaatacatct ccatcgtgac cgaacacctg gcaaagttct ccggccaccc actgcgctcc 780

gcacagcacc tggtggatgc aactcagaac accgattgct acaccgaagt gtcctccgca 840

ctgaaggtgt gcatgatcaa catgtccaag atcgcaaacg atctgcgcct gatggcatcc 900

ggcccacgcg ccggcctgtc cgaaatcgtg ctgcctgcac gtcagcctgg ctccaccatc 960

atgcctggca aggtgaaccc tgtgatgcct gaagtgatga accaagtggc attccaagtg 1020

ttcggcaacg atctgaccat cacctccgca tccgaagccg gtcagttcga actgaacgtg 1080

atggaacctg tgctgttctt caacctgatt cagtccatct ccatcatgac caacgtgttc 1140

aagtccttca ccgaaaactg cctgaagggc atcaaggcaa acgaagaacg catgaaggaa 1200

tacgtggaaa agtccatcgg catcatcacc gcaatcaacc cacacgtggg ctacgaaacc 1260

gcagcaaagc tggcacgcga agcatacctg accggcgaat ccatccgcga actgtgcatc 1320

aagtacggcg tgctgaccga agaacagctg aacgaaatcc tgaacccata cgaaatgacc 1380

caccctggca tcgccggccg caagtaa 1407

<210> 3

<211> 43

<212> DNA

<213> （人工序列）

<400> 3

ctggcacctc catcatgcct ggcaaggtga accctgtgat gcc 43

<210> 4

<211> 37

<212> DNA

<213> （人工序列）

<400> 4

catgatggag gtgccaggct gacgtgcagg cagcacg 37

<210> 5

<211> 43

<212> DNA

<213> （人工序列）

<400> 5

ctggcgcatc catcatgcct ggcaaggtga accctgtgat gcc 43

<210> 6

<211> 37

<212> DNA

<213> （人工序列）

<400> 6

catgatggat gcgccaggct gacgtgcagg cagcacg 37

Claims

1.一种天冬氨酸酶突变体，其特征在于，所述的天冬氨酸酶突变体是将氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的亲本序列的318位丝氨酸突变成苏氨酸。

2.一种权利要求1所述的天冬氨酸酶突变体的编码基因。

3.根据权利要求2所述的编码基因，其特征在于，所述的编码基因的核苷酸序列如SEQID NO.2所示。

4.一种携带权利要求3所述的编码基因的表达载体。

5.根据权利要求4所述的表达载体，其特征在于，所述的载体为细菌质粒、噬菌体、酵母质粒、植物细胞病毒或哺乳动物细胞病毒。

6.一种表达权利要求1所述的天冬氨酸酶突变体的重组菌。

7.根据权利要求6所述的重组菌，其特征在于，所述的重组菌是以细菌或真菌为宿主细胞。

8.权利要求1所述的天冬氨酸酶突变体在催化生产天冬氨酸或β-丙氨酸中的应用。

9.一种包含权利要求1所述的天冬氨酸酶突变体的酶制剂。

10.根据权利要求9所述的酶制剂，其特征在于，所述的酶制剂为固态酶制剂或液态酶制剂。