ES2598037T3

ES2598037T3 - Pectato liasas, ácidos nucleicos que las codifican y métodos para su preparación y uso

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Publication number: ES2598037T3
Application number: ES10180846.7T
Authority: ES
Inventors: Janne Kerovuo; Arne Solbak; Kevin Gray; Ryan Mccann; Shalaka Purohit; Joel Gerendash; Giselle Janssen; Samun Dahod
Original assignee: BASF Enzymes LLC
Current assignee: BASF Enzymes LLC
Priority date: 2003-04-04
Filing date: 2004-04-02
Publication date: 2017-01-24
Anticipated expiration: 2024-04-02
Also published as: DK2341136T3; US8067222B2; EP1613733B1; EP2341136B1; HUE030493T2; US20060210971A1; US7592434B2; EP1613733A4; WO2004090099A2; WO2004090099A3; PL2341136T3; EP1613733A2; US20100021988A1; CA2521402A1; EP2341136A1; DK1613733T3; CA2521402C; ES2545639T3; PL1613733T3; MXPA05010681A

Abstract

Un ácido nucleico aislado, sintético, o recombinante que comprende (a) una secuencia de ácidos nucleicos como se establece en la SEC ID Nº: 99; (b) una secuencia de ácidos nucleicos que tiene una identidad de secuencia de al menos un 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, o mayor con la SEQ Nº: 99, donde el ácido nucleico codifica al menos un polipéptido que tiene una actividad de pectato liasa, (c) un ácido nucleico que se hibrida en condiciones de hibridación rigurosas con un ácido nucleico que comprende una secuencia como se establece en la SEC ID Nº: 99, donde las condiciones de hibridación rigurosas comprenden una etapa de lavado que comprende un lavado en 0,2X SSC a una temperatura de aproximadamente 65 ºC durante aproximadamente 15 minutos, y donde el ácido nucleico codifica al menos un polipéptido que tiene una actividad de pectato liasa; (d) un ácido nucleico que codifica un polipéptido que tiene una secuencia como se establece en la SEC ID Nº: 100, donde el ácido nucleico codifica un polipéptido que tiene una actividad de pectato liasa; (e) la secuencia de ácidos nucleicos de (a), (b), (c) o (d) pero que carece de una secuencia de ácidos nucleicos que codifica una secuencia señal; (f) la secuencia de ácidos nucleicos de cualquiera de (a) a (e), que comprende además una secuencia de ácidos nucleicos que codifica un péptido o polipéptido heterólogo; o g) una secuencia de ácidos nucleicos completamente complementaria a cualquiera de (a) a (f).

Description

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DESCRIPCIÓN

Pectato liasas, ácidos nucleicos que las codifican y métodos para su preparación y uso

5 Campo técnico

La presente invención se refiere a biología molecular y celular, bioquímica y biotecnología. En particular, la invención se refiere a polipéptidos que tienen una actividad de pectato liasa, por ejemplo, una pectinasa, polinucleótidos que codifican los polipéptidos, y métodos para la preparación y uso de estos polinucleótidos y polipéptidos. Los polipéptidos de la invención se pueden usar como pectato liasas para catalizar la beta-eliminación o hidrólisis de pectina y/o ácido poligalacturónico, tal como ácido alfa-D-galacturónico unido en la posición 1,4. Se pueden usar en una diversidad de aplicaciones industriales, por ejemplo, para tratar paredes de células vegetales, tales como las de algodón u otras fibras naturales. En otra aplicación industrial a modo de ejemplo, los polipéptidos de la invención se pueden usar como limpiadores textiles.

15 Antecedentes

La fibra de algodón consta de una pared celular primaria y una pared celular secundaria. La pared celular secundaria es prácticamente celulosa pura, mientras que la pared celular primaria es una estructura reticular compleja de pectina, proteína, ceras, pigmentos, hemicelulosa y celulosa. En la limpieza textil de materiales de celulosa (por ejemplo, tejido de algodón de punto o tejido), se necesitan condiciones alcalinas (hasta un 10 % de NaOH) y temperaturas elevadas (hasta 100 ºC) para una eliminación eficaz de los componentes de la pared celular primaria. Este tratamiento químico riguroso da como resultado pérdidas de materias primas y carga ambiental sustancial. Existen varias enzimas diferentes que tienen la capacidad de degradar la pectina; estas son las pectinasas, pectina

25 metilesterasas, pectina liasas y pectato liasas.

"Apresto" es el nombre dado a la sustancia o mezcla de sustancias que se aplica al hilo de urdimbre antes de tejer. El apresto forma un revestimiento alrededor de la superficie del hilo antes de tejer. Este revestimiento proporciona lubricación y evita la rotura del hilo de urdimbre durante la operación de tejido. Algunas sustancias químicas habituales que se usan para preparar aprestos son Ácido Poliacrílico (PA), Alcohol Polivinílico (PVA), Almidón y Almidón Modificado. A las fibras celulósicas que incluyen algodón, rayón y mezcla de éstos con fibras sintéticas tales como poliéster, por lo general se les da apresto con aprestos a base de almidón. El proceso de retirar el apresto elimina el apresto antes del teñido, estampado y/o acabado. Los aprestos de almidón se pueden eliminar mediante lavado con ácido caliente, que hidrolizará el almidón. Sin embargo, la hidrólisis ácida da como resultado la pérdida

35 de materia prima ya que la celulosa también es propensa a la hidrólisis ácida. Los aprestos de almidón también se pueden eliminar mediante el uso de peróxido de hidrógeno para degradar el almidón por oxidación. La retirada del apresto también puede ser un proceso enzimático. Durante muchos años se han usado amilasas en la industria textil para la eliminación de aprestos de almidón. Las condiciones (por ejemplo, pH y temperatura) para la retirada enzimática de apresto son dictadas por las condiciones de funcionamiento de la enzima. La mayoría de las amilasas usadas en la solicitud son relativamente termoestables, sin embargo, son enzimas óptimas neutras o ácidas.

La "limpieza" es un proceso en el que el tejido de algodón al que se le retira el apresto se procesa para solubilizar y extraer material no celulósico indeseado encontrado de forma natural en el algodón y también para retirar impurezas aplicadas tales como lubricantes de maquinaria. La limpieza usa agentes altamente alcalinos para retirar el material

45 no celulósico, que tiene un grave impacto ambiental. Además, los agentes químicos degradan parcialmente la celulosa en la fibra de algodón que causa una pérdida de resistencia de la fibra y materias primas y como tal no es un proceso óptimo. La etapa final en el proceso de tratamiento previo del tejido de algodón es el blanqueado en el que los pigmentos naturales y la materia presentes en la fibra se blanquean. Una enzima pectinolítica alcalina termoestable que podría tener como objetivo de forma específica el material no celulósico podría reducir o eliminar el uso de agentes químicos rigurosos que disminuyen la carga en el entorno a la vez que mantienen la integridad y resistencia de la fibra de algodón.

Sumario

55 La invención proporciona ácidos nucleicos sintéticos o recombinantes, aislados, que comprenden una secuencia de ácidos nucleicos a) como se establece en SEC Nº:99 o b) una secuencia de ácidos nucleicos que tiene una identidad de secuencia de al menos un 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, o mayor con la SEC Nº:99, que codifica al menos un polipéptido que tiene una actividad de pectato liasa. Las identidades de secuencias pueden determinarse por análisis con un algoritmo de comparación de secuencias o por inspección visual.

Los ácidos nucleicos ejemplares de la invención también incluyen ácidos nucleicos aislados o recombinantes que codifican un polipéptido que tiene una secuencia como la indicada en la SEC ID Nº: 100. En un aspecto, el polipéptido tiene una actividad de pectato liasa.

65 La reivindicación 1 menciona otros ácidos nucleicos de la invención. 2

imagen2

La divulgación proporciona ácidos nucleicos que codifican pectato liasa aislados a partir de cultivos mixtos que comprenden una secuencia de ácidos nucleicos, por ejemplo, que tiene una identidad de secuencia de al menos aproximadamente un 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 5 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, o mayor, o una identidad de secuencia completa (del 100%) con las SEC ID Nº: 1, SEC ID Nº: 3, SEC ID Nº: 5, SEC ID Nº: 7, SEC ID Nº: 9, SEC ID Nº: 11, SEC ID Nº: 13, SEC ID Nº: 15, SEC ID Nº: 17, SEC ID Nº: 19, SEC ID Nº: 21, SEC ID Nº: 23, SEC ID Nº: 25, SEC ID Nº: 27, SEC ID Nº: 29, SEC ID Nº: 31, SEC ID Nº: 33, SEC ID Nº: 35, SEC ID Nº: 37, SEC ID Nº: 39, SEC ID Nº: 41, SEC ID Nº: 43, SEC ID Nº: 45, SEC ID Nº: 47, SEC ID Nº: 49, SEC ID Nº: 51, SEC ID Nº: 53, SEC ID Nº: 55, SEC ID Nº: 57, SEC ID Nº: 59, SEC ID Nº: 61, SEC ID Nº: 63, SEC ID Nº: 65, SEC ID Nº: 67, SEC ID Nº: 69, SEC ID Nº: 71, SEC ID Nº: 73, SEC ID Nº: 75, SEC ID Nº: 77, SEC ID Nº: 79, SEC ID Nº: 81, SEC ID Nº: 83, SEC ID Nº: 85, SEC ID Nº: 87, SEC ID Nº: 89, SEC ID Nº: 91, SEC ID Nº: 93, SEC ID Nº: 95, SEC ID Nº: 97, SEC ID Nº: 99, SEC ID Nº: 101, SEC ID Nº: 103, SEC ID Nº: 105, SEC ID Nº: 107, SEC ID Nº: 109, SEC ID Nº: 111, SEC ID Nº:

15 113, SEC ID Nº: 115, SEC ID Nº: 117, SEC ID Nº: 119, SEC ID Nº: 121, SEC ID Nº: 123, SEC ID Nº: 125, SEC ID Nº: 127, SEC ID Nº: 129, SEC ID Nº: 131, SEC ID Nº: 133, SEC ID Nº: 131, SEC ID Nº: 133, sobre una región de al menos aproximadamente 50, 75, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000, 1050, 1100, 1150, o mayor.

Los ácidos nucleicos que codifican pectato liasa tienen una novedad común en cuanto a que se derivan de fuentes ambientales, por ejemplo, fuentes ambientales mixtas. Los ácidos nucleicos que codifican pectato liasa se aíslan a partir de fuentes ambientales, por ejemplo, fuentes ambientales mixtas, que comprenden una secuencia que tiene una identidad de secuencia de al menos aproximadamente un 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%,

25 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, o mayor, o una identidad de secuencia completa (del 100%) con un ácido nucleico ejemplar de la divulgación sobre una región de al menos aproximadamente 50, 75, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000, 1050, 1100, 1150, 1200, o más restos, donde el ácido nucleico codifica al menos un polipéptido que tiene una actividad de pectato liasa, y las identidades de secuencias se determinan por análisis con un algoritmo de comparación o por inspección visual.

En un aspecto, el algoritmo de comparación de secuencias es un algoritmo BLAST en la versión 2.2.2 en el que una configuración de filtrado se ajusta para blastall -p blastp -d "nr pataa" -F F, y todas las otras opciones se ajustan por defecto.

35 Un ácido nucleico aislado o recombinante puede incluir al menos 10 bases consecutivas de una secuencia de ácidos nucleicos de la invención, secuencias básicamente idénticas a la misma y las secuencias complementarias a la misma.

En un aspecto, la actividad de pectato liasa comprende catálisis de beta-eliminación (trans-eliminación) o hidrólisis de pectina o ácido poligalacturónico (pectato). La actividad de pectato liasa puede comprender la descomposición o disolución de paredes celulares vegetales. La actividad de pectato liasa puede comprender beta-eliminación (transeliminación) o hidrólisis de ácido alfa-D-galacturónico unido en la posición 1,4. La actividad de pectato liasa puede comprender catálisis de beta-eliminación (trans-eliminación) o hidrólisis de ácido galacturónico esterificado con 45 metilo. La actividad de pectato liasa puede ser de acción exo o de acción endo. En un aspecto, la actividad de pectato liasa tiene actuación endo y actúa en sitios aleatorios dentro de una cadena del polímero para dar una mezcla de oligómeros. En un aspecto, la actividad de pectato liasa tiene actuación exo y actúa desde un extremo de una cadena de polímero y produce en monómeros o dímeros. La actividad de pectato liasa puede catalizar la escisión aleatoria de enlaces alfa-1,4-glicosídicos en el ácido péctico (ácido poligalacturónico) mediante transeliminación por hidrólisis. La actividad de pectato liasa puede comprender una actividad igual o similar a la de la pectato liasa (EC 4.2.2.2), poli(1,4-alfa-D-galacturónido) liasa, poligalacturonato liasa (EC 4.2.2.2), pectina liasa (EC 4.2.2.10), poligalacturonasa (EC 3.2.1.15), exo-poligalacturonasa (EC 3.2.1.67), exo-poligalacturonato liasa (EC 4.2.2.9) o exo-poli-alfa-galacturonosidasa (EC 3.2.1.82). La actividad de pectato liasa puede comprender betaeliminación (trans-eliminación) o hidrólisis de galactano en galactosa o galactooligómeros. La actividad de pectato

55 liasa puede comprender beta-eliminación (trans-eliminación) o hidrólisis de una fibra vegetal. La fibra vegetal puede comprender fibra de algodón, fibra de cáñamo o fibra de lino.

En un aspecto, el ácido nucleico aislado o recombinante codifica un polipéptido que tiene una actividad de pectato liasa que es termoestable. El polipéptido puede mantener una actividad de pectato liasa en condiciones que comprenden un intervalo de temperatura entre aproximadamente 37 ºC y aproximadamente 95 ºC; entre aproximadamente 55 ºC y aproximadamente 85 ºC, entre aproximadamente 70 ºC y aproximadamente 95 ºC, o, entre aproximadamente 90 ºC y aproximadamente 95 ºC.

En otro aspecto, el ácido nucleico aislado o recombinante codifica un polipéptido que tiene una actividad de pectato

65 liasa que es termotolerante. El polipéptido puede mantener una actividad de pectato liasa después de la exposición a una temperatura en el intervalo de superior a 37 ºC a aproximadamente 95 ºC o en cualquier parte en el intervalo de superior a 55 ºC a aproximadamente 85 ºC. En un aspecto, el polipéptido mantiene una actividad de pectato liasa después de exposición a una temperatura en el intervalo de superior a 90 ºC a aproximadamente 95 ºC a pH 4,5.

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La invención proporciona ácidos nucleicos aislados, sintéticos o recombinantes que comprenden una secuencia que

5 se hibrida en condiciones rigurosas a un ácido nucleico que comprende una secuencia como la indicada en la SEC ID Nº: 99, donde el ácido nucleico codifica un polipéptido que tiene una actividad de pectato liasa. Las condiciones rigurosas incluyen una etapa de lavado que comprende un lavado en 0,2X SSC a una temperatura de aproximadamente 65 ºC durante aproximadamente 15 minutos.

Una sonda de ácido nucleico para identificar un ácido nucleico que codifica un polipéptido que tiene una actividad de pectato liasa comprende al menos aproximadamente 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000 o más, bases consecutivas de una secuencia que comprende una secuencia de la invención, o fragmentos o subsecuencias de la misma, en la que la sonda identifica el ácido nucleico mediante unión o hibridación. La sonda puede comprender un

15 oligonucleótido que comprende al menos de aproximadamente 10 a 50, de aproximadamente 20 a 60, de aproximadamente 30 a 70, de aproximadamente 40 a 80, o de aproximadamente 60 a 100 bases consecutivas de una secuencia que comprende una secuencia de la invención, o fragmentos o subsecuencias de la misma.

Una sonda de ácido nucleico para identificar un ácido nucleico que codifica un polipéptido que tiene una actividad de pectato liasa comprende un ácido nucleico que comprende una secuencia de al menos aproximadamente 10, 15, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000 o más restos, que tiene una identidad de secuencia de al menos aproximadamente un 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%,

25 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, o mayor, o una identidad de secuencia completa (del 100%) con un ácido nucleico de la invención, donde las identidades de secuencias se determinan por análisis con un algoritmo de comparación de secuencias o por inspección visual.

La sonda puede comprender un oligonucleótido que comprende al menos de aproximadamente 10 a 50, de aproximadamente 20 a 60, de aproximadamente 30 a 70, de aproximadamente 40 a 80, o de aproximadamente 60 a 100 bases consecutivas de una secuencia de ácidos nucleicos de la invención o una subsecuencia de la misma.

Un par de la secuencia cebadora de amplificación para amplificar un ácido nucleico que codifica un polipéptido que tiene una actividad de pectato liasa es capaz de amplificar un ácido nucleico que comprende una secuencia de la

35 invención, o fragmentos o subsecuencias de la misma. Uno o cada miembro del par de la secuencia cebadora de amplificación puede comprender un oligonucleótido que comprende al menos de aproximadamente 10 a 50 bases consecutivas de la secuencia.

Los métodos para la amplificación de un ácido nucleico que codifica un polipéptido que tiene una actividad de pectato liasa comprenden la amplificación de un ácido nucleico molde con un par de la secuencia cebadora de amplificación capaz de amplificar una secuencia de ácidos nucleicos de la invención, o fragmentos o subsecuencias de la misma.

La invención proporciona casetes de expresión que comprenden un ácido nucleico de la invención o una

45 subsecuencia del mismo. En un aspecto, el casete de expresión puede comprender el ácido nucleico que se une de forma operativa a un promotor. El promotor puede ser un promotor viral, bacteriano, mamífero o vegetal. En un aspecto, el promotor vegetal puede ser un promotor de patata, arroz, maíz, trigo, tabaco o cebada. El promotor puede ser un promotor constitutivo. El promotor constitutivo puede comprender CaMV35S. En otro aspecto, el promotor puede ser un promotor inducible. En un aspecto, el promotor puede ser un promotor específico de tejido o un promotor regulado de forma ambiental o un promotor regulado por el desarrollo. Por lo tanto, el promotor puede ser, por ejemplo, un promotor específico de semilla, uno específico de hoja, uno específico de raíz, uno específico de tallo o un promotor inducido por abscisión. En un aspecto, el casete de expresión puede comprender adicionalmente un vector de expresión vegetal o de virus vegetal.

55 La invención proporciona vehículos de clonación que comprenden un casete de expresión (por ejemplo, un vector) de la invención o un ácido nucleico de la invención. El vehículo de clonación puede ser un vector viral, un plásmido, un fago, un fagémido, un cósmido, un fósmido, un bacteriófago o un cromosoma artificial. El vector viral puede comprender un vector de adenovirus, un vector retroviral o un vector viral adeno-asociado. El vehículo de clonación puede comprender un cromosoma artificial bacteriano (BAC), un plásmido, un vector derivado de bacteriófago P1 (PAC), un cromosoma artificial de levadura (YAC), o un cromosoma artificial de mamífero (MAC).

La invención proporciona célula transformada que comprende un ácido nucleico de la invención o un casete de expresión (por ejemplo, un vector) de la invención, o un vehículo de clonación de la invención. En un aspecto, la célula transformada puede ser una célula bacteriana, una célula de mamífero, una célula fúngica, una célula de

65 levadura, una célula de insecto o una célula vegetal. En un aspecto, la célula vegetal puede ser una célula de patata, trigo, arroz, maíz, tabaco o cebada. 4

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La invención proporciona animales no humanos transgénicos que comprenden un ácido nucleico de la invención o un casete de expresión (por ejemplo, un vector) de la invención. En un aspecto, el animal es un ratón.

5 Las plantas transgénicas comprenden un ácido nucleico de la invención o un casete de expresión (por ejemplo, un vector) de la invención. La planta transgénica puede ser una planta de maíz, una planta de patata, una planta de tomate, una planta de trigo, una planta de colza oleaginosa, una planta de colza, una planta de soja, una planta de arroz, una planta de cebada o una planta de tabaco.

10 Las semillas transgénicas pueden comprender un ácido nucleico de la invención o un casete de expresión (por ejemplo, un vector) de la invención. La semilla transgénica puede ser una semilla de maíz, una semilla de trigo, una semilla de colza oleaginosa, una semilla de colza, una semilla de soja, una semilla de palma, una semilla de girasol, una semilla de sésamo, una semilla de cacahuete o una semilla de planta de tabaco.

15 Un oligonucleótido antisentido puede comprender una secuencia de ácidos nucleicos complementaria o capaz de hibridarse en condiciones rigurosas con un ácido nucleico de la invención. Los métodos para inhibir la traducción de un mensaje de pectato liasa en una célula comprenden la administración a la célula o la expresión en la célula de un oligonucleótido antisentido que comprende una secuencia de ácidos nucleicos complementaria o capaz de hibridarse en condiciones rigurosas con un ácido nucleico de la invención.

20 La invención proporciona un polipéptido aislado, sintético o recombinante que comprende (a) una secuencia de aminoácidos como la indicada en la SEC ID Nº: 100 o (b) una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de secuencia de al menos un 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, o mayor, con la SEC ID Nº: 100, donde el polipéptido tiene actividad de liasa. En la reivindicación 6 se presentan otros

25 polipéptidos de la invención. Los polipéptidos ejemplares también incluyen fragmentos de al menos aproximadamente 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 75, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600 o más restos de longitud, o sobre la longitud completa de una enzima. Un péptido puede ser, por ejemplo, un fragmento inmunogénico, un motivo (por ejemplo, un sitio de unión), una secuencia señal, una secuencia prepro o un sitio activo. Las secuencias de polipéptidos o péptidos a modo de ejemplo de la invención incluyen secuencia codificada

30 por un ácido nucleico de la invención. Las secuencias de polipéptidos o péptidos a modo de ejemplo incluyen polipéptidos o péptidos que se unen de forma específica mediante un anticuerpo de la divulgación. En un aspecto, el polipéptido aislado o recombinante de la invención (con o sin secuencia señal) tiene actividad de pectato liasa.

Un polipéptido o péptido aislado o recombinante puede incluir al menos 10 bases consecutivas de una secuencia de

35 polipéptidos o péptidos de la invención, secuencias sustancialmente idénticas a la misma, y las secuencias complementarias a la misma.

En un aspecto, la actividad de pectato liasa comprende catálisis de beta-eliminación (trans-eliminación) o hidrólisis de pectina o ácido poligalacturónico (pectato). La actividad de pectato liasa puede comprender la descomposición o 40 disolución de paredes celulares vegetales. La actividad de pectato liasa puede comprender beta-eliminación (transeliminación) o hidrólisis de ácido alfa-D-galacturónico unido en la posición 1,4. La actividad de pectato liasa puede comprender catálisis de beta-eliminación (trans-eliminación) o hidrólisis de ácido galacturónico esterificado con metilo. La actividad de pectato liasa puede ser de acción exo o de acción endo. En un aspecto, la actividad de pectato liasa tiene actuación endo y actúa en sitios aleatorios dentro de una cadena del polímero para dar una 45 mezcla de oligómeros. En un aspecto, la actividad de pectato liasa tiene actuación exo y actúa desde un extremo de una cadena de polímero y produce monómeros o dímeros. La actividad de pectato liasa puede catalizar la escisión aleatoria de enlaces alfa-1,4-glicosídicos en el ácido péctico (ácido poligalacturónico) mediante trans-eliminación o hidrólisis. La actividad de pectato liasa puede comprender una actividad igual o similar a la de la pectato liasa (EC 4.2.2.2), poli(1,4-alfa-D-galacturónido) liasa, poligalacturonato liasa (EC 4.2.2.2), pectina liasa (EC 4.2.2.10),

50 poligalacturonasa (EC 3.2.1.15), exo-poligalacturonasa (EC 3.2.1.67), exo-poligalacturonato liasa (EC 4.2.2.9) o exopoli-alfa-galacturonosidasa (EC 3.2.1.82). La actividad de pectato liasa puede comprender beta-eliminación (transeliminación) o hidrólisis de galactano en galactosa o galactooligómeros. La actividad de pectato liasa puede comprender beta-eliminación (trans-eliminación) o hidrólisis de una fibra vegetal. La fibra vegetal puede comprender fibra de algodón, fibra de cáñamo o fibra de lino.

55 En un aspecto, la actividad de pectato liasa es termoestable. El polipéptido puede mantener una actividad de pectato liasa en condiciones que comprenden un intervalo de temperatura de entre aproximadamente 37 ºC y aproximadamente 95 ºC; entre aproximadamente 55 ºC y aproximadamente 85 ºC, entre aproximadamente 70 ºC y aproximadamente 95 ºC, o, entre aproximadamente 90 ºC y aproximadamente 95 ºC. En otro aspecto, la actividad

60 de pectato liasa puede ser termotolerante. El polipéptido puede mantener una actividad de pectato liasa después de la exposición a una temperatura en el intervalo de superior a 37 ºC a aproximadamente 95 ºC o en el intervalo de superior a 55 ºC a aproximadamente 85 ºC. En un aspecto, el polipéptido puede mantener una actividad de pectato liasa después de la exposición a una temperatura en el intervalo de superior a 90 ºC a aproximadamente 95 ºC a pH 4,5.

65 En un aspecto, el polipéptido aislado o recombinante puede comprender el polipéptido de la invención que carece de una secuencia señal. En un aspecto, el polipéptido aislado o recombinante puede comprender el polipéptido de la invención que comprende una secuencia señal heteróloga, tal como una señal de secuencia de pectato liasa o no de pectato liasa heteróloga.

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5 Las proteínas quiméricas pueden comprender un primer dominio que comprende una secuencia señal de la invención (por ejemplo, como se establece en la Tabla 2, que sigue a continuación) y al menos un segundo dominio. La proteína puede ser una proteína de fusión. El segundo dominio puede comprender una enzima. La enzima puede ser una pectato liasa.

10 En un aspecto, la actividad de pectato liasa comprende una actividad específica a aproximadamente 37 ºC en el intervalo de aproximadamente 100 a aproximadamente 1000 unidades por miligramo de proteína. En otro aspecto, la actividad de pectato liasa comprende una actividad específica de aproximadamente 500 a aproximadamente 750 unidades por miligramo de proteína. Como alternativa, la actividad de pectato liasa comprende una actividad

15 específica a 37 ºC en el intervalo de aproximadamente 500 a aproximadamente 1200 unidades por miligramo de proteína. En un aspecto, la actividad de pectato liasa comprende una actividad específica a 37 ºC en el intervalo de aproximadamente 750 a aproximadamente 1000 unidades por miligramo de proteína. En otro aspecto, la termotolerancia comprende la retención de al menos la mitad de la actividad específica de la pectato liasa a 37 ºC después de ser calentada a la temperatura elevada. Como alternativa, la termotolerancia puede comprender la

20 retención de la actividad específica a 37 ºC en el intervalo de aproximadamente 500 a aproximadamente 1200 unidades por miligramo de proteína después de ser calentada a la temperatura elevada.

La invención proporciona el polipéptido aislado o recombinante de la invención, en la que el polipéptido comprende al menos un sitio de glicosilación. En un aspecto, la glicosilación puede ser una glicosilación unida a N. En un

25 aspecto, el polipéptido se puede glicosilar después de su expresión en una P. pastoris o una S. pombe.

En un aspecto, el polipéptido puede mantener una actividad de pectato liasa en condiciones que comprenden aproximadamente pH 6,5, pH 6, pH 5,5, pH 5, pH 4,5 o pH 4. En otro aspecto, el polipéptido puede mantener una actividad de pectato liasa en condiciones que comprenden aproximadamente pH 7, pH 7,5 pH 8,0, pH 8,5, pH 9, pH

30 9,5, pH 10, pH 10,5 o pH 11.

En un aspecto, el polipéptido aislado o recombinante puede comprender el polipéptido de la invención que carece de una secuencia señal y/o un dominio prepro. En un aspecto, el polipéptido aislado o recombinante puede comprender el polipéptido de la invención que comprende una secuencia señal heteróloga y/o dominio prepro, tal como una

35 secuencia señal de pectato liasa heteróloga.

Una secuencia señal puede comprender un péptido que comprende/ que consiste en una secuencia como se expone en los restos 1 a 12, 1 a 13, 1 a 14, 1 a 15, 1 a 16, 1 a 17, 1 a 18, 1 a 19, 1 a 20, 1 a 21, 1 a 22, 1 a 23, 1 a 24, 1 a 25, 1 a 26, 1 a 27, 1 a 28, 1 a 28, 1 a 30, 1 a 31, 1 a 32, 1 a 33, 1 a 34, 1 a 35, 1 a 36, 1 a 37, 1 a 38, 1 a 39,

40 1 a 40, 1 a 41, 1 a 42, 1 a 43, 1 a 44 de un polipéptido de la invención. Las proteínas quiméricas comprenden un primer dominio que comprende tal secuencia señal y al menos un segundo dominio. La proteína puede ser una proteína de fusión. El segundo dominio puede comprender una enzima. La enzima puede ser una pectato liasa, por ejemplo, una enzima de la divulgación.

45 Los polipéptidos quiméricos pueden comprender al menos un primer dominio que comprende péptido señal (SP), un dominio prepro, un dominio catalítico (CD), o un sitio activo de una pectato liasa de la invención y al menos un segundo dominio que comprende un polipéptido o péptido heterólogo, en el que el polipéptido o péptido heterólogo no está asociado de forma natural con el péptido señal (SP), dominio prepro o dominio catalítico (CD). En un aspecto, el polipéptido o péptido heterólogo no es una pectato liasa. El polipéptido o péptido heterólogo puede ser

50 amino terminal con respecto a, carboxi terminal con respecto a o estar en ambos extremos del péptido señal (SP), dominio prepro o dominio catalítico (CD).

La invención proporciona preparaciones de proteína que comprenden un polipéptido de la invención, en la que la preparación de proteína comprende un líquido, un sólido o un gel.

55 Los heterodímeros pueden comprender un polipéptido de la invención y un segundo dominio. En un aspecto, el segundo dominio puede ser un polipéptido y el heterodímero puede ser una proteína de fusión. En un aspecto, el segundo dominio puede ser un epítopo o una marca. Los homodímeros pueden comprender un polipéptido de la invención.

60 La invención proporciona polipéptidos inmovilizados que tienen una actividad de pectato liasa, en la que el polipéptido comprende un polipéptido de la invención, un polipéptido codificado por un ácido nucleico de la invención, o un polipéptido que comprende un polipéptido de la invención y un segundo dominio. En un aspecto, el polipéptido puede estar inmovilizado en una célula, un metal, una resina, un polímero, una cerámica, un vidrio, un

65 microelectrodo, una partícula de grafito, una perla, un gel, una placa, una matriz o un tubo capilar.

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Las matrices pueden comprender un ácido nucleico inmovilizado de la invención. Las matrices pueden comprender un anticuerpo de la invención.

La invención proporciona anticuerpos aislados o recombinantes que se unen de forma específica a un polipéptido de

5 la invención o a un polipéptido codificado por un ácido nucleico de la invención. El anticuerpo puede ser un anticuerpo monoclonal o un anticuerpo policlonal. Los hibridomas pueden comprender un anticuerpo de la invención, por ejemplo, un anticuerpo que se une de forma específica a un polipéptido de la invención o a un polipéptido codificado por un ácido nucleico de la invención.

La invención proporciona suplementos alimenticios para un animal que comprenden un polipéptido de la invención, por ejemplo, un polipéptido codificado por el ácido nucleico de la invención. En un aspecto, el polipéptido en el suplemento alimenticio puede estar glicosilado. La invención proporciona matrices de administración de enzimas comestibles que comprenden un polipéptido de la invención, por ejemplo, un polipéptido codificado por el ácido nucleico de la invención. En un aspecto, la matriz de administración comprende un gránulo. En un aspecto, el

15 polipéptido puede estar glicosilado. En un aspecto, la actividad de pectato liasa es termotolerante. En otro aspecto, la actividad de pectato liasa es termoestable.

Un método para aislar o identificar un polipéptido que tiene una actividad de pectato liasa comprende las etapas de:

(a) proporcionar un anticuerpo de la invención; (b) proporcionar una muestra que comprende polipéptidos; y (c) poner en contacto la muestra de la etapa (b) con el anticuerpo de la etapa (a) en condiciones en las que el anticuerpo se puede unir de forma específica con el polipéptido, aislando o identificando de este modo un polipéptido que tiene una actividad de pectato liasa.

Los métodos para preparar un anticuerpo anti-pectato liasa comprenden la administración a un animal no humano

25 de un ácido nucleico de la invención o un polipéptido de la invención o subsecuencias del mismo en una cantidad suficiente para generar una respuesta inmune humoral, preparando de este modo un anticuerpo anti-pectato liasa. Los métodos para preparar una anti-pectato liasa inmune comprenden la administración a un animal no humano de un ácido nucleico de la invención o un polipéptido de la invención o subsecuencias del mismo en una cantidad suficiente para generar una respuesta inmune.

La invención proporciona métodos para producir un polipéptido recombinante que comprenden las etapas de: (a) proporcionar un ácido nucleico de la invención unido de forma operativa a un promotor; y (b) expresar el ácido nucleico de la etapa (a) en condiciones que permiten la expresión del polipéptido, produciendo de este modo un polipéptido recombinante. En un aspecto, el método puede comprender adicionalmente la transformación de una

35 célula hospedadora con el ácido nucleico de la etapa (a) seguido de la expresión del ácido nucleico de la etapa (a), produciendo de este modo un polipéptido recombinante en una célula transformada.

Los métodos para identificar un polipéptido que tiene una actividad de pectato liasa comprenden las siguientes etapas: (a) proporcionar un polipéptido de la invención; o un polipéptido codificado por un ácido nucleico de la invención; (b) proporcionar un sustrato de pectato liasa; y (c) poner en contacto el polipéptido o un fragmento o variante del mismo de la etapa (a) con el sustrato de la etapa (b) y detectar una disminución en la cantidad de sustrato o un aumento en la cantidad de un producto de reacción, en los que una disminución en la cantidad del sustrato o un aumento en la cantidad del producto de reacción detecta un polipéptido que tiene una actividad de pectato liasa.

45 Los métodos para identificar un sustrato de pectato liasa comprenden las siguientes etapas: (a) proporcionar un polipéptido de la invención; o un polipéptido codificado por un ácido nucleico de la invención; (b) proporcionar un sustrato de ensayo; y (c) poner en contacto el polipéptido de la etapa (a) con el sustrato de ensayo de la etapa (b) y detectar una disminución en la cantidad de sustrato o un aumento en la cantidad de producto de reacción, en los que una disminución en la cantidad del sustrato o un aumento en la cantidad de un producto de reacción identifica el sustrato de ensayo como un sustrato de pectato liasa.

Los métodos para determinar si un compuesto de ensayo se une de forma específica a un polipéptido comprenden las siguientes etapas: (a) expresar un ácido nucleico o un vector que comprende el ácido nucleico en condiciones 55 que permiten la traducción del ácido nucleico a un polipéptido, en los que el ácido nucleico comprende un ácido nucleico de la invención, o, proporcionar un polipéptido de la invención; (b) proporcionar un compuesto de ensayo;

(c) poner en contacto el polipéptido con el compuesto de ensayo; y (d) determinar si el compuesto de ensayo de la etapa (b) se une de forma específica al polipéptido.

Los métodos para identificar un modulador de una actividad de pectato liasa comprenden las siguientes etapas: (a) proporcionar un polipéptido de la invención o un polipéptido codificado por un ácido nucleico de la invención; (b) proporcionar un compuesto de ensayo; (c) poner en contacto el polipéptido de la etapa (a) con el compuesto de ensayo de la etapa (b) y medir una actividad en la pectato liasa, en los que un cambio en la actividad de pectato liasa medido en presencia del compuesto de ensayo en comparación con la actividad en ausencia del compuesto de 65 ensayo proporciona una determinación de que el compuesto de ensayo modula la actividad de pectato liasa. En un aspecto, la actividad de pectato liasa se puede medir proporcionando un sustrato de pectato liasa y detectando una

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disminución en la cantidad del sustrato o un aumento en la cantidad de un producto de reacción, o, un aumento en la cantidad del sustrato o una disminución en la cantidad de un producto de reacción. Una disminución en la cantidad del sustrato o un aumento en la cantidad del producto de reacción con el compuesto de ensayo en comparación con la cantidad de sustrato o producto de reacción sin el compuesto de ensayo identifican el compuesto de ensayo como

5 un activador de la actividad de pectato liasa. Un aumento en la cantidad del sustrato o una disminución en la cantidad del producto de reacción con el compuesto de ensayo en comparación con la cantidad de sustrato o producto de reacción sin el compuesto de ensayo identifican el compuesto de ensayo como un inhibidor de la actividad de pectato liasa.

Los sistemas informáticos pueden comprender un procesador y un dispositivo de almacenamiento de datos en los que dicho dispositivo de almacenamiento de datos ha almacenado en el mismo una secuencia de polipéptidos o una secuencia de ácidos nucleicos de la invención (por ejemplo, un polipéptido codificado por un ácido nucleico de la invención). En un aspecto, el sistema informático puede comprender adicionalmente un algoritmo de comparación de secuencias y un dispositivo de almacenamiento de datos que tiene al menos una secuencia de referencia 15 almacenada en el mismo. En otro aspecto, el algoritmo de comparación de secuencias comprende un programa informático que indica polimorfismos. En un aspecto, el sistema informático puede comprender adicionalmente un identificador que identifica una o más características en dicha secuencia. Los medios de lectura en soporte informático pueden tener almacenada en el mismo una secuencia de polipéptidos o una secuencia de ácidos nucleicos de la invención. Los métodos para identificar una característica en una secuencia comprenden las etapas de: (a) lectura de la secuencia usando un programa informático que identifica una o más características en una secuencia, en el que la secuencia comprende una secuencia de polipéptidos o una secuencia de ácidos nucleicos de la invención; y (b) identificación de una o más características en la secuencia con el programa informático. Los métodos para comparar una primera secuencia con una segunda secuencia comprenden las etapas de: (a) lectura de la primera secuencia y la segunda secuencia a través del uso de un programa informático que compara

25 secuencias, en el que la primera secuencia comprende una secuencia de polipéptidos o una secuencia de ácidos nucleicos de la invención; y (b) determinación de diferencias entre la primera secuencia y la segunda secuencia con el programa informático. La etapa de determinación de diferencias entre la primera secuencia y la segunda secuencia puede comprender adicionalmente la etapa de identificación de polimorfismos. En un aspecto, el método puede comprender adicionalmente un identificador que identifica una o más características en una secuencia. En otro aspecto, el método puede comprender la lectura de la primera secuencia usando un programa informático e identificación de una o más características en la secuencia.

Los métodos para aislar o recuperar un ácido nucleico que codifica un polipéptido que tiene una actividad de pectato liasa a partir de una muestra ambiental comprenden las etapas de: (a) proporcionar una secuencia cebadora de

35 amplificación para amplificar un ácido nucleico que codifica un polipéptido que tiene una actividad de pectato liasa, en la que el par cebador es capaz de amplificar un ácido nucleico de la invención; (b) aislar un ácido nucleico a partir de la muestra ambiental o tratar la muestra ambiental de modo que el ácido nucleico en la muestra es accesible a la hibridación con el par cebador de amplificación; y, (c) combinar el ácido nucleico de la etapa (b) con el par cebador de amplificación de la etapa (a) y amplificar ácido nucleico a partir de la muestra ambiental, aislando o recuperando de este modo un ácido nucleico que codifica un polipéptido que tiene una actividad de pectato liasa a partir de una muestra ambiental. Uno o cada miembro de la secuencia cebadora de amplificación puede comprender un oligonucleótido que comprende al menos de aproximadamente 10 a 50 bases consecutivas de una secuencia de la invención.

45 Los métodos para aislar o recuperar un ácido nucleico que codifica un polipéptido que tiene una actividad de pectato liasa a partir de una muestra ambiental comprenden las etapas de: (a) proporcionar una sonda de polinucleótidos que comprende un ácido nucleico de la invención o una subsecuencia del mismo; (b) aislar un ácido nucleico a partir de la muestra ambiental o tratar la muestra ambiental de modo que el ácido nucleico en la muestra es accesible para hibridación con una sonda de polinucleótidos de la etapa (a); (c) combina el ácido nucleico aislado o la muestra ambiental tratada de la etapa (b) con la sonda de polinucleótidos de la etapa (a); y (d) aislar un ácido nucleico que se hibrida en forma específica con la sonda de polinucleótidos de la etapa (a), aislando o recuperando de este modo un ácido nucleico que codifica un polipéptido que tiene una actividad de pectato liasa a partir de una muestra ambiental. La muestra ambiental puede comprender una muestra de agua, una muestra de líquido, una muestra de suelo, una muestra de aire o una muestra biológica. En un aspecto, la muestra biológica se puede derivar de una célula

55 bacteriana, una célula de protozoo, una célula de insecto, una célula de levadura, una célula vegetal, una célula fúngica o una célula de mamífero.

Los métodos para generar una variante de un ácido nucleico que codifica un polipéptido que tiene una actividad de pectato liasa comprenden las etapas de: (a) proporcionar un ácido nucleico molde que comprende un ácido nucleico de la invención; y (b) modificar, suprimir o añadir uno o más nucleótidos en la secuencia molde, o una combinación de los mismos, para generar una variante del ácido nucleico molde. El método puede comprender adicionalmente la expresión de la variante de ácido nucleico para generar una variante de polipéptido pectato liasa. Las modificaciones, adiciones o supresiones se pueden introducir mediante un método que comprende PCR propensa a error, redistribución, mutagénesis dirigida a oligonucleótidos, PCR de ensamblaje, mutagénesis de PCR sexual, 65 mutagénesis in vivo, mutagénesis de casete, mutagénesis de conjunto recursiva, mutagénesis de conjunto exponencial, mutagénesis específica de sitio, reensamblaje génico, mutagénesis por saturación de sitio génico

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(GSSM™), reensamblaje de ligamiento sintético (SLR) o una combinación de los mismos. Las modificaciones, adiciones o supresiones se pueden introducir mediante un método que comprende recombinación, recombinación de secuencias recursiva, mutagénesis de ADN modificada con fosfotioato, mutagénesis de molde que contiene uracilo, mutagénesis de dúplex con huecos, mutagénesis de reparación de falta de coincidencia de puntos, mutagénesis de

5 cepa hospedadora con déficit de reparación, mutagénesis química, mutagénesis radiogénica, mutagénesis de supresión, mutagénesis de restricción-selección, mutagénesis de restricción-purificación, síntesis de genes artificiales, mutagénesis de conjunto, creación de multímeros de ácidos nucleicos quiméricos y una combinación de los mismos.

El método se puede repetir de forma repetitiva hasta que se produce una pectato liasa que tiene una actividad alterada o diferente o una estabilidad alterada o diferente de la de un polipéptido codificado por el ácido nucleico molde. La variante de polipéptido pectato liasa puede ser termotolerante, y mantiene una cierta actividad después de su exposición a una temperatura elevada. O, la variante de polipéptido pectato liasa puede presentar un aumento de glicosilación en comparación con la pectato liasa codificada por un ácido nucleico molde. Como alternativa, la

15 variante de polipéptido pectato liasa tiene una actividad de pectato liasa a una temperatura elevada, en la que la pectato liasa codificada por el ácido nucleico molde no es activa a la temperatura elevada. Como alternativa, el método se puede repetir de forma repetitiva hasta que se produce una secuencia de codificación de pectato liasa que tiene un uso de codón alterado con respecto a la del ácido nucleico molde. Como alternativa, el método se puede repetir de forma repetitiva hasta que se produce un gen de pectato liasa que tiene un nivel de expresión de mensajes mayor o menor o estabilidad que la del ácido nucleico molde.

Los métodos para modificar codones en un ácido nucleico que codifica un polipéptido que tiene una actividad de pectato liasa, para aumentar su expresión en una célula hospedadora, comprenden las siguientes etapas: (a) proporcionar un ácido nucleico de la invención que codifica un polipéptido que tiene una actividad de pectato liasa; y,

25 (b) identificar un codón no preferente o uno menos preferente en el ácido nucleico de la etapa (a) y sustituirlo con un codón usado preferente o usado de forma neutra que codifica el mismo aminoácido que el del codón sustituido, en los que un codón preferente es un codón que se sobrerrepresenta en secuencias de codificación en genes en la célula hospedadora y un codón no preferente o menos preferente es un codón que se subrepresenta en secuencias de codificación en genes en la célula hospedadora, modificando de este modo al ácido nucleico para aumentar su expresión en una célula hospedadora.

Los métodos para modificar codones en un ácido nucleico que codifica un polipéptido que tiene una actividad de pectato liasa comprenden las siguientes etapas: (a) proporcionar un ácido nucleico de la invención; y, (b) identificar un codón en el ácido nucleico de la etapa (a) y sustituirlo con un codón diferente que codifica el mismo aminoácido

35 que el del codón sustituido, modificando de este modo los codones en un ácido nucleico que codifica una pectato liasa.

Los métodos para modificar codones en un ácido nucleico que codifica un polipéptido que tiene una actividad de pectato liasa para aumentar su expresión en una célula hospedadora, comprenden las siguientes etapas: (a) proporcionar un ácido nucleico de la invención que codifica un polipéptido pectato liasa; y, (b) identificar un codón no preferente o uno menos preferente en el ácido nucleico de la etapa (a) y sustituirlo con un codón usado preferente o usado de forma neutra que codifica el mismo aminoácido que el del codón sustituido, en los que un codón preferente es un codón que se sobrerrepresenta en secuencias de codificación en genes en la célula hospedadora y un codón no preferente o menos preferente es un codón que se subrepresenta en secuencias de codificación en genes en la

45 célula hospedadora, modificando de este modo al ácido nucleico para aumentar su expresión en una célula hospedadora.

Los métodos para modificar un codón en un ácido nucleico que codifica un polipéptido que tiene una actividad de pectato liasa para disminuir su expresión en una célula hospedadora comprenden las siguientes etapas: (a) proporcionar un ácido nucleico de la invención; y (b) identificar al menos un codón preferente en el ácido nucleico de la etapa (a) y sustituirlo con un codón no preferente o menos preferente que codifica el mismo aminoácido que el del codón sustituido, en los que un codón preferente es un codón que se sobrerrepresenta en secuencias de codificación en genes en una célula hospedadora y un codón no preferente o menos preferente es un codón que se subrepresenta en secuencias de codificación en genes en la célula hospedadora, modificando de este modo al ácido

55 nucleico para disminuir su expresión en una célula hospedadora. En un aspecto, la célula hospedadora puede ser una célula bacteriana, una célula fúngica, una célula de insecto, una célula de levadura, una célula vegetal o una célula de mamífero.

Los métodos para producir una biblioteca de ácidos nucleicos que codifican una pluralidad de sitios activos de pectato liasa modificados o sitios de unión al sustrato, en los que los sitios activos modificados o sitios de unión a sustrato se derivan de un primer ácido nucleico que comprende una secuencia que codifica un primer sitio activo o un primer sitio de unión a sustrato, comprenden las siguientes etapas: (a) proporcionar un primer ácido nucleico que codifica un primer sitio activo o primer sitio de unión a sustrato, en los que la primera secuencia de ácidos nucleicos comprende una secuencia que se hibrida en condiciones rigurosas con un ácido nucleico de la invención, y el ácido 65 nucleico codifica un sitio activo de pectato liasa o un sitio de unión a sustrato y pectato liasa; (b) proporcionar un conjunto de oligonucleótidos mutagénicos que codifican variantes de aminoácidos de origen natural en una pluralidad de codones dirigidos en el primer ácido nucleico; y, (c) usar el conjunto de oligonucleótidos mutagénicos para generar un conjunto de variantes de ácidos nucleicos que codifican sitio activo o que codifican sitio de unión a sustrato que codifica una serie de variaciones de aminoácidos en cada codón del aminoácido que se sometió a mutagénesis, produciendo de este modo una biblioteca de ácidos nucleicos que codifican una pluralidad de sitios 5 activos de pectato liasa o sitios de unión a sustrato. En una apsecto, el método comprende la mutagénesis del primer ácido nucleico de la etapa (a) mediante un método que comprende un sistema de evolución dirigida optimizado, mutagénesis por saturación de sitio génico (GSSM™), reensamblaje de ligamiento sintético (SLR), PCR propensa a error, redistribución, mutagénesis dirigida a oligonucleótidos, PCR de ensamblaje, mutagénesis de PCR sexual, mutagénesis in vivo, mutagénesis de casete, mutagénesis de conjunto recursiva, mutagénesis de conjunto 10 exponencial, mutagénesis específica de sitio, reensamblaje génico, mutagénesis por saturación de sitio génico (GSSM™), reensamblaje de ligamiento sintético (SLR) y una combinación de los mismos. En otro aspecto, el método comprende la mutagénesis del primer ácido nucleico de la etapa (a) o variantes mediante un método que comprende recombinación, recombinación de secuencias recursiva, mutagénesis de ADN modificada con fosfotioato, mutagénesis de molde que contiene uracilo, mutagénesis de dúplex con huecos, mutagénesis de

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15 reparación de falta de coincidencia de puntos, mutagénesis de cepa hospedadora con déficit de reparación, mutagénesis química, mutagénesis radiogénica, mutagénesis de supresión, mutagénesis de restricción-selección, mutagénesis de restricción-purificación, síntesis de genes artificiales, mutagénesis de conjunto, creación de multímeros de ácidos nucleicos quiméricos y una combinación de los mismos.

20 Los métodos para preparar una molécula pequeña comprenden las siguientes etapas: (a) proporcionar una pluralidad de enzimas biosintéticas capaces de sintetizar o modificar una molécula pequeña, en los que una de las enzimas comprende una enzima pectato liasa codificada por un ácido nucleico de la invención; (b) proporcionar un sustrato para al menos una de las enzimas de la etapa (a); y (c) hacer reaccionar el sustrato de la etapa (b) con las enzimas en condiciones que facilitan una pluralidad de reacciones biocatalíticas para generar una molécula pequeña

25 mediante una serie de reacciones biocatalíticas. Los métodos para modificar una molécula pequeña comprenden las siguientes etapas: (a) proporcionar una enzima pectato liasa, en los que la enzima comprende un polipéptido de la invención, o, un polipéptido codificado por un ácido nucleico de la invención, o una subsecuencia del mismo; (b) proporcionar una molécula pequeña; y (c) hacer reaccionar la enzima de la etapa (a) con la molécula pequeña de la etapa (b) en condiciones que facilitan una reacción enzimática catalizada por la enzima pectato liasa, modificando de

30 este modo una molécula pequeña mediante una reacción enzimática de pectato liasa. En un aspecto, el método puede comprender una pluralidad de sustratos de molécula pequeña para la enzima de la etapa (a), generando de este modo una biblioteca de moléculas pequeñas modificadas producida mediante al menos una reacción enzimática catalizada por la enzima pectato liasa. En un aspecto, el método puede comprender una pluralidad de enzimas adicionales en condiciones que facilitan una pluralidad de reacciones biocatalíticas mediante las enzimas

35 para formar una biblioteca de moléculas pequeñas modificadas producida mediante la pluralidad de reacciones enzimáticas. En otro aspecto, el método puede comprender adicionalmente la etapa de someter a ensayo la biblioteca para determinar si una molécula pequeña modificada en particular que presenta una actividad deseada está presente dentro de la biblioteca. La etapa de someter a ensayo la biblioteca puede comprender adicionalmente las etapas de eliminar de forma sistemática todas excepto una de las reacciones biocatalíticas usadas para producir

40 una parte de la pluralidad de las moléculas pequeñas modificadas dentro de la biblioteca sometiendo al ensayo la parte de la molécula pequeña modificada para la presencia o ausencia de la molécula pequeña modificada en particular con una actividad deseada, e identificar al menos una reacción biocatalítica específica que produce la molécula pequeña modificada en particular de actividad deseada.

45 Los métodos para determinar un fragmento funcional de una enzima pectato liasa comprenden las etapas de: (a) proporcionar una enzima pectato liasa, en los que la enzima comprende un polipéptido de la invención, o un polipéptido codificado por un ácido nucleico de la invención, o una subsecuencia del mismo; y (b) suprimir una pluralidad de restos de aminoácidos de la secuencia de la etapa (a) y someter a ensayo la subsecuencia restante para una actividad de pectato liasa, determinando de este modo un fragmento funcional de una enzima pectato liasa.

50 En un apspecto, la actividad de pectato liasa se mide proporcionando un sustrato de pectato liasa y detectando una disminución en la cantidad del sustrato o un aumento en la cantidad de un producto de reacción.

Los métodos para ingeniería de células completas de fenotipos nuevos o modificados mediante el uso de análisis de flujo metabólico en tiempo real comprenden las siguientes etapas: (a) preparar una célula modificada mediante la 55 modificación de la composición genética de una célula, en los que la composición genética se modifica mediante la adición a las células de un ácido nucleico de la invención; (b) cultivar la célula modificada para generar una pluralidad de células modificadas; (c) medir al menos un parámetro metabólico de la célula controlando el cultivo celular de la etapa (b) en tiempo real; y, (d) analizar los datos de la etapa (c) para determinar si el parámetro medido difiere de una medida comparable en una célula sin modificar en condiciones similares, identificando de este modo 60 un fenotipo modificado por ingeniería en la célula usando análisis de flujo metabólico en tiempo real. En un aspecto, la composición genética de la célula se puede modificar mediante un método que comprende la supresión de una secuencia o la modificación de una secuencia en la célula, o, genosupresión de la expresión de un gen. En un aspecto, el método puede comprender adicionalmente seleccionar una célula que comprende un fenotipo recién modificado por ingeniería. En otro aspecto, el método puede comprender el cultivo de la célula seleccionada,

65 generando de este modo una nueva cepa celular que comprende un fenotipo recién modificado por ingeniería.

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Los métodos para aumentar la termotolerancia o la termoestabilidad de un polipéptido pectato liasa, comprenden la glicosilación de un polipéptido pectato liasa, en los que el polipéptido comprende al menos treinta aminoácidos contiguos de un polipéptido de la invención; o un polipéptido codificado por una secuencia de ácidos nucleicos de la invención, aumentando de este modo la termotolerancia o la termoestabilidad del polipéptido pectato liasa. En un

5 aspecto, la actividad específica de pectato liasa puede ser termoestable o termotolerante a una temperatura en el intervalo de superior a aproximadamente 37 ºC a aproximadamente 95 ºC.

Los métodos para sobreexpresar una polipéptido pectato liasa recombinante en una célula comprenden la expresión de un vector que comprende un ácido nucleico que comprende un ácido nucleico de la invención o una secuencia de ácidos nucleicos de la invención, en los que las identidades de las secuencias se determinan por análisis con un algoritmo de comparación de secuencias o mediante inspección visual, en los que la sobreexpresión se realiza mediante el uso de un promotor de actividad elevada, un vector dicistrónico o mediante la amplificación génica del vector.

15 Los métodos para preparar una planta transgénica comprenden las siguientes etapas: (a) introducir una secuencia de ácidos nucleicos heteróloga en la célula, en los que la secuencia de ácidos nucleicos heteróloga comprende una secuencia de ácidos nucleicos de la invención, produciendo de este modo una célula vegetal transformada; y (b) producir una planta transgénica a partir de la célula transformada. En un aspecto, la etapa (a) puede comprender adicionalmente la introducción de la secuencia de ácidos nucleicos heteróloga mediante electroporación o microinyección de protoplastos de célula vegetal. En otro aspecto, la etapa (a) puede comprender adicionalmente la introducción de la secuencia de ácidos nucleicos heteróloga directamente a tejido vegetal mediante bombardeo de partículas de ADN. Como alternativa, la etapa (a) puede comprender adicionalmente la introducción de la secuencia de ácidos nucleicos heteróloga en el ADN de célula vegetal usando un hospedador de Agrobacterium tumefaciens. En un aspecto, la célula vegetal puede ser una célula de patata, maíz, arroz, trigo, tabaco, o cebada.

25 Los métodos para expresar una secuencia de ácidos nucleicos heteróloga en una célula vegetal comprenden las siguientes etapas: (a) transformar la célula vegetal con una secuencia de ácidos nucleicos heteróloga unida de forma operativa a un promotor, en los que la secuencia de ácidos nucleicos heteróloga comprende un ácido nucleico de la invención; (b) cultivar la planta en condiciones en las que la secuencia de ácidos nucleicos heteróloga se expresa en la célula vegetal.

Una secuencia de señal aislada o recombinante comprende o consiste en péptidos señal (SP) como se establece en la Tabla 2. La secuencia de señal aislada o recombinante puede consistir en una secuencia como se establece en los restos de 1 a 15, de 1 a 16, de 1 a 17, de 1 a 18, de 1 a 19, de 1 a 20, de 1 a 21, de 1 a 22, de 1 a 23, de 1 a 24, 35 de1a25,de1a26,de1a27,de1a28,de1a28,1a30,1a31,1a32,1a33,1a34,1a35,1a36,1a37,1a 38, 1 a 39, de 1 a 40, de 1 a 41, de 1 a 42, de 1 a 43, y/o de 1 a 44, de la SEC ID Nº: 2, SEC ID Nº: 4, SEC ID Nº: 6, SEC ID Nº: 8, SEC ID Nº: 10, SEC ID Nº: 12, SEC ID Nº: 14, SEC ID Nº: 16, SEC ID Nº: 18, SEC ID Nº: 20, SEC ID Nº: 22, SEC ID Nº: 24, SEC ID Nº: 26, SEC ID Nº: 28, SEC ID Nº: 30, SEC ID Nº: 32, SEC ID Nº: 34, SEC ID Nº: 36, SEC ID Nº: 38, SEC ID Nº: 40, SEC ID Nº: 42, SEC ID Nº: 44, SEC ID Nº: 46, SEC ID Nº: 48, SEC ID Nº: 50, SEC ID Nº: 52, SEC ID Nº: 54, SEC ID Nº: 56, SEC ID Nº: 58, SEC ID Nº: 60, SEC ID Nº: 62, SEC ID Nº: 64, SEC ID Nº: 66, SEC ID Nº: 68, SEC ID Nº: 70, SEC ID Nº: 72, SEC ID Nº: 74, SEC ID Nº: 76, SEC ID Nº: 78, SEC ID Nº: 80, SEC ID Nº: 82, SEC ID Nº: 84, SEC ID Nº: 86, SEC ID Nº: 88, SEC ID Nº: 90, SEC ID Nº: 92, SEC ID Nº: 94, SEC ID Nº: 96, SEC ID Nº: 98, SEC ID Nº: 100, SEC ID Nº: 102, SEC ID Nº: 104, SEC ID Nº: 106, SEC ID Nº: 108, SEC ID Nº: 110, SEC ID Nº: 112, SEC ID Nº: 114, SEC ID Nº: 116, SEC ID Nº: 118, SEC ID Nº: 120, SEC ID Nº: 122, SEC ID Nº:

45 124, SEC ID Nº: 126, SEC ID Nº: 128 o SEC ID Nº: 130, SEC ID Nº: 132, SEC ID Nº: 134.

Los péptidos aislados o recombinantes pueden consistir en un dominio de pectina metil esterasa (PED) o un dominio catalítico (CD) como se establece en la Tabla 2.

Los polipéptidos quiméricos pueden comprender al menos un primer dominio que comprende péptido señal (SP), un dominio de pectina metil esterasa (PED) o un dominio catalítico (CD) como se establece en la Tabla 2 y al menos un segundo dominio que comprende un polipéptido o péptido heterólogo, en los que el polipéptido o péptido heterólogo no está asociado de forma natural con el péptido señal (SP), dominio de pectina metil esterasa (PED) o dominio catalítico (CD). En un aspecto, el polipéptido o péptido heterólogo no es una pectato liasa. El polipéptido o péptido

55 heterólogo puede ser amino terminal con respecto a, carboxi terminal con respecto a o estar en ambos extremos del péptido señal (SP), dominio de pectina metil esterasa (PED) o dominio catalítico (CD).

Los ácidos nucleicos aislados o recombinantes pueden codificar un polipéptido quimérico, en los que el polipéptido quimérico comprende al menos un primer dominio que comprende péptido señal (SP), un dominio de pectina metil esterasa (PED) o un dominio catalítico (CD) como se establece en la Tabla 2 y al menos un segundo dominio que comprende un polipéptido o péptido heterólogo, en los que el polipéptido o péptido heterólogo no está asociado de forma natural con el péptido señal (SP), dominio de pectina metil esterasa (PED) o dominio catalítico (CD).

Un método para aumentar la termotolerancia o la termoestabilidad de una pectato liasa comprende la glicosilación 65 de una pectato liasa, en los que el polipéptido comprende al menos treinta aminoácidos contiguos de un polipéptido de la invención, aumentando de este modo la termotolerancia o la termoestabilidad de la pectato liasa. 11

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Los métodos para la sobreexpresión de una pectato liasa recombinante en una célula comprenden la expresión de un vector que comprende un ácido nucleico de la invención, en los que la sobreexpresión se ve influida por el uso de un promotor de actividad elevada, un vector dicistrónico o mediante la amplificación génica del vector.

5 Los métodos para preparar una planta transgénica comprenden las siguientes etapas: (a) introducir una secuencia de ácidos nucleicos heteróloga en la célula, en la que la secuencia de ácidos nucleicos heteróloga comprende un ácido nucleico de la invención, produciendo de este modo una célula vegetal transformada; (b) producir una planta transgénica a partir de la célula transformada. En un aspecto, la etapa (a) comprende adicionalmente la introducción

10 de la secuencia de ácidos nucleicos heteróloga mediante electroporación o microinyección de protoplastos de célula vegetal. La etapa (a) puede comprender la introducción de la secuencia de ácidos nucleicos heteróloga directamente en tejido vegetal mediante bombardeo de partículas de ADN o mediante el uso de un hospedador de Agrobacterium tumefaciens.

15 Los métodos para expresar una secuencia de ácidos nucleicos heteróloga en una célula vegetal comprenden las siguientes etapas: (a) transformar la célula vegetal con una secuencia de ácidos nucleicos heteróloga unido de forma operativa a un promotor, en los que la secuencia de ácidos nucleicos heteróloga comprende una secuencia de la invención; (b) cultivar la planta en condiciones en las que la secuencia de ácidos nucleicos heteróloga se expresa en la célula vegetal.

20 La invención proporciona métodos para hidrolizar, descomponer o alterar una composición que comprende pectina o pectato (ácido poligalacturónico) que comprenden las siguientes etapas: (a) proporcionar un polipéptido de la invención que tiene una actividad de pectato liasa, o un polipéptido codificado por un ácido nucleico de la invención;

(b) proporcionar una composición que comprende una pectina o un pectato; y (c) poner en contacto el polipéptido de

25 la etapa (a) con la composición de la etapa (b) en condiciones en las que el polipéptido hidroliza, descompone o altera la composición que comprende pectina o pectato. En un aspecto, la composición comprende una pared de célula vegetal o una pared de célula bacteriana. La planta puede ser una planta de algodón, una planta de cáñamo o una planta de lino.

30 La invención proporciona métodos para licuar o retirar una pectina o pectato (ácido poligalacturónico) de una composición que comprende las siguientes etapas: (a) proporcionar un polipéptido de la invención que tiene una actividad de pectato liasa, o un polipéptido codificado por un ácido nucleico de la invención; (b) proporcionar una composición que comprende una pectina o pectato (ácido poligalacturónico); y (c) poner en contacto el polipéptido de la etapa (a) con la composición de la etapa (b) en condiciones en las que el polipéptido retira o licúa la pectina o

35 pectato (ácido poligalacturónico).

La invención proporciona composiciones de detergente que comprenden un polipéptido de la invención, o un polipéptido codificado por un ácido nucleico de la invención, en las que el polipéptido tiene una actividad de pectato liasa. En un aspecto, la pectato liasa es una pectato liasa que no tiene superficie activa o una pectato liasa de

40 superficie activa. La pectato liasa se puede formular en una composición líquida no acuosa, un sólido fundido, una forma granular, una forma en partículas, un comprimido formado por compresión, una forma de gel, una pasta o una forma de suspensión.

La invención proporciona métodos para lavar un objeto que comprende las siguientes etapas: (a) proporcionar una

45 composición que comprende un polipéptido de la invención que tiene una actividad de pectato liasa; (b) proporcionar un objeto; y (c) poner en contacto el polipéptido de la etapa (a) y el objeto de la etapa (b) en condiciones en las que la composición puede lavar el objeto.

La invención proporciona textiles o tejidos que comprenden un polipéptido de la invención, o un polipéptido

50 codificado por un ácido nucleico de la invención. La invención proporciona métodos para la limpieza de fibra, hilo, textil o tejido que comprenden las siguientes etapas: (a) proporcionar un polipéptido de la invención que tiene una actividad de pectato liasa, o un polipéptido codificado por un ácido nucleico de la invención; (b) proporcionar una fibra, un hilo, un textil o un tejido; y (c) poner en contacto el polipéptido de la etapa (a) y el textil o tejido de la etapa

(b) en condiciones en las que la pectato liasa puede limpiar la fibra, hilo, textil o tejido. En un aspecto, la pectato

55 liasa es una pectato liasa alcalina activa y termoestable. Los tratamientos para retirar el apresto y limpieza se pueden combinar en un solo baño. El método puede comprender adicionalmente la adición de una amilasa alcalina y termoestable en la puesta en contacto de la etapa (c). Los tratamientos para retirar el apresto o limpieza pueden comprender condiciones entre aproximadamente pH 8,5 y pH 10,0 y temperaturas de aproximadamente 40 ºC. El método puede comprender adicionalmente la adición de una etapa de blanqueado. Los tratamientos para retirar el

60 apresto, limpieza y blanqueado se pueden realizar de forma simultánea o de forma secuencial en un recipiente de un solo baño. El tratamiento de blanqueado puede comprender peróxido de hidrógeno o al menos un compuesto peroxi que puede generar peróxido de hidrógeno cuando se disuelve en agua, o combinaciones de los mismos, y al menos un activador del blanqueado. La fibra, hilo, textil o tejido pueden comprender un material celulósico. El material celulósico puede comprender una fibra en bruto, un hilo, un textil tejido o de punto, un algodón, un hilo de lino, una

65 fibra de lino, un ramio, un rayón, un cáñamo, un yute o una mezcla de fibras naturales o sintéticas.

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La invención proporciona comidas o alimentos que comprenden un polipéptido de la invención, o un polipéptido codificado por un ácido nucleico de la invención. La invención proporciona métodos para mejorar la extracción de un material vegetal rico en aceite que comprenden las siguientes etapas: (a) proporcionar un polipéptido de la invención que tiene una actividad de pectato liasa, o un polipéptido codificado por un ácido nucleico de la invención; (b)

5 proporcionar un material vegetal rico en aceite; y (c) poner en contacto el polipéptido de la etapa (a) y el material vegetal rico en aceite. En un aspecto, el material vegetal rico en aceite comprende una semilla rica en aceite. El aceite puede ser un aceite de soja, un aceite de oliva, un aceite de colza (canola) o un aceite de girasol.

La invención proporciona métodos para preparar un zumo, jarabe, puré o extracto de frutas o vegetales que comprenden las siguientes etapas: (a) proporcionar un polipéptido de la invención que tiene una actividad de pectato liasa, o un polipéptido codificado por un ácido nucleico de la invención; (b) proporcionar una composición o un líquido que comprende un material de fruta o vegetal; y (c) poner en contacto el polipéptido de la etapa (a) y la composición, preparando de este modo el zumo, jarabe, puré o extracto de frutas o vegetales.

15 La invención proporciona papeles o productos de papel o pastas de papel que comprenden una pectato liasa de la invención, o un polipéptido codificado por un ácido nucleico de la invención. La invención proporciona métodos para el tratamiento de un papel o una pasta de papel o de madera que comprenden las siguientes etapas: (a) proporcionar un polipéptido de la invención que tiene una actividad de pectato liasa, o un polipéptido codificado por un ácido nucleico de la invención; (b) proporcionar una composición que comprende un papel o una pasta de papel o de madera; y (c) poner en contacto el polipéptido de la etapa (a) y la composición de la etapa (b) en condiciones en las que la pectato liasa puede tratar el papel o pasta de papel o de madera.

La invención proporciona composiciones farmacéuticas que comprenden un polipéptido de la invención, o un polipéptido codificado por un ácido nucleico de la invención. La composición farmacéutica puede actuar como una

25 ayuda digestiva.

La invención proporciona productos para el cuidado oral que comprenden un polipéptido de la invención, o un polipéptido codificado por un ácido nucleico de la invención. El producto para el cuidado oral puede comprender una pasta dentífrica, una crema dental, un gel o un polvo para dientes, una sustancia odóntica, un enjuague bucal, una formulación de aclarado para antes o después del cepillado, un chicle, una pastilla para chupar o un caramelo.

La divulgación proporciona ácidos nucleicos aislados o recombinantes que tienen una secuencia que comprende una modificación de la secuencia de la SEC ID Nº: 131, en la que la modificación de la SEC ID Nº: 131 comprende uno más de los siguientes cambios: los nucleótidos en los restos 352 a 354 son CAT o CAC, los nucleótidos en los

35 restos 544 a 546 son GTG, GTT, GTC, o GTA, los nucleótidos en los restos 568 a 570 son TTG, TTA, CTT, CTC, CTA, o CTG, los nucleótidos en los restos 589 a 591 son GGT, GGC, GGA, o GGG, los nucleótidos en los restos 622 a 624 son AAG o AAA, los nucleótidos en los restos 655 a 657 son ATG, los nucleótidos en los restos 667 a 669 son GAG o GAA, los nucleótidos en los restos 763 a 765 son CGG, CGT, CGC, CGA, AGA, AGG, los nucleótidos en los restos 787 a 789 son AAG o AAA, los nucleótidos en los restos 823 a 825 son TAT o TAC, los nucleótidos en los restos 925 a 927 son TGG, o los nucleótidos en los restos 934 a 936 son GTT, GTG, GTC, o GTA. En un aspecto, el ácido nucleico codifica un polipéptido que tiene una actividad de pectato liasa, que puede ser termotolerante o termoestable.

La divulgación proporciona ácidos nucleicos aislados o recombinantes que tienen una secuencia que comprende la

45 modificación de la secuencia de un ácido nucleico de la divulgación (por ejemplo, SEC ID Nº: 1, SEC ID Nº: 3, SEC ID Nº: 5, SEC ID Nº: 7, SEC ID Nº: 9, SEC ID Nº: 11, SEC ID Nº: 13, SEC ID Nº: 15, SEC ID Nº: 17, SEC ID Nº: 19, SEC ID Nº: 21, SEC ID Nº: 23, SEC ID Nº: 25, SEC ID Nº: 27, SEC ID Nº: 29, SEC ID Nº: 31, SEC ID Nº: 33, SEC ID Nº: 35, SEC ID Nº: 37, SEC ID Nº: 39, SEC ID Nº: 41, SEC ID Nº: 43, SEC ID Nº: 45, SEC ID Nº: 47, SEC ID Nº: 49, SEC ID Nº: 51, SEC ID Nº: 53, SEC ID Nº: 55, SEC ID Nº: 57, SEC ID Nº: 59, SEC ID Nº: 61, SEC ID Nº: 63, SEC ID Nº: 65, SEC ID Nº: 67, SEC ID Nº: 69, SEC ID Nº: 71, SEC ID Nº: 73, SEC ID Nº: 75, SEC ID Nº: 77, SEC ID Nº: 79, SEC ID Nº: 81, SEC ID Nº: 83, SEC ID Nº: 85, SEC ID Nº: 87, SEC ID Nº: 89, SEC ID Nº: 91, SEC ID Nº: 93, SEC ID Nº: 95, SEC ID Nº: 97, SEC ID Nº: 99, SEC ID Nº: 101, SEC ID Nº: 103, SEC ID Nº: 105, SEC ID Nº: 107, SEC ID Nº: 109, SEC ID Nº: 111, SEC ID Nº: 113, SEC ID Nº: 115, SEC ID Nº: 117, SEC ID Nº: 119, SEC ID Nº: 121, SEC ID Nº: 123, SEC ID Nº: 125, SEC ID Nº: 127, SEC ID Nº: 129), en los que la modificación de la secuencia comprende

55 uno o más de los siguientes cambios: los nucleótidos en la posición equivalente de los restos 352 a 354 de la SEC ID Nº: 131 se cambian a CAT o CAC, los nucleótidos en la posición equivalente de los restos 544 a 546 de la SEC ID Nº: 131 se cambian a GTG, GTT, GTC, o GTA, los nucleótidos en la posición equivalente de los restos 568 a 570 de la SEC ID Nº: 131 se cambian a TTG, TTA, CTT, CTC, CTA, o CTG, los nucleótidos en la posición equivalente de los restos 589 a 591 de la SEC ID Nº: 131 se cambian a GGT, GGC, GGA, o GGG, los nucleótidos en la posición equivalente de los restos 622 a 624 de la SEC ID Nº: 131 se cambian a AAG o AAA, los nucleótidos en la posición equivalente de los restos 655 a 657 de la SEC ID Nº: 131 se cambian a ATG, los nucleótidos en la posición equivalente de los restos 667 a 669 de la SEC ID Nº: 131 son GAG o GAA, los nucleótidos en la posición equivalente de los restos 763 a 765 de la SEC ID Nº: 131 se cambian a CGG, CGT, CGC, CGA, AGA, AGG, los nucleótidos en la posición equivalente de los restos 787 a 789 de la SEC ID Nº: 131 se cambian a AAG o AAA, los

65 nucleótidos en la posición equivalente de los restos 823 a 825 de la SEC ID Nº: 131 se cambian a TAT o TAC, los nucleótidos en la posición equivalente de los restos 925 a 927 de la SEC ID Nº: 131 se cambian a TGG, o los nucleótidos en la posición equivalente de los restos 934 a 936 de la SEC ID Nº: 131 se cambian a GTT, GTG, GTC,

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o GTA. En un aspecto, el ácido nucleico codifica un polipéptido que tiene una actividad de pectato liasa, que puede ser termotolerante o termoestable.

5 La divulgación proporciona polipéptidos aislados o recombinantes que tienen una secuencia que comprende una modificación de la secuencia de la SEC ID Nº: 132, en los que la modificación de la SEC ID Nº: 132 comprende una

o más de las siguientes mutaciones: la alanina en la posición del aminoácido 118 es histidina, la alanina en la posición del aminoácido 182 es valina, la treonina en la posición del aminoácido 190 es leucina, la alanina en la posición del aminoácido 197 es glicina, la serina en la posición del aminoácido 208 es lisina, la treonina en la posición del aminoácido 219 es metionina, la treonina en la posición del aminoácido 223 es ácido glutámico, la serina en la posición del aminoácido 255 es arginina, la serina en la posición del aminoácido 263 es lisina, la asparagina en la posición del aminoácido 275 es tirosina, la tirosina en la posición del aminoácido 309 es triptófano, o, la serina en la posición del aminoácido 312 es valina. En un aspecto, el polipéptido tiene una actividad de pectato liasa, que puede ser termotolerante o termoestable.

15 La divulgación proporciona polipéptidos aislados o recombinantes que tienen una secuencia que comprende una modificación de la secuencia de un polipéptido de la divulgación (por ejemplo, SEC ID Nº: 2, SEC ID Nº: 4, SEC ID Nº: 6, SEC ID Nº: 8, SEC ID Nº: 10, SEC ID Nº: 12, SEC ID Nº: 14, SEC ID Nº: 16, SEC ID Nº: 18, SEC ID Nº: 20, SEC ID Nº: 22, SEC ID Nº: 24, SEC ID Nº: 26, SEC ID Nº: 28, SEC ID Nº: 30, SEC ID Nº: 32, SEC ID Nº: 34, SEC ID Nº: 36, SEC ID Nº: 38, SEC ID Nº: 40, SEC ID Nº: 42, SEC ID Nº: 44, SEC ID Nº: 46, SEC ID Nº: 48, SEC ID Nº: 50, SEC ID Nº: 52, SEC ID Nº: 54, SEC ID Nº: 56, SEC ID Nº: 58, SEC ID Nº: 60, SEC ID Nº: 62, SEC ID Nº: 64, SEC ID Nº: 66, SEC ID Nº: 68, SEC ID Nº: 70, SEC ID Nº: 72, SEC ID Nº: 74, SEC ID Nº: 76, SEC ID Nº: 78, SEC ID Nº: 80, SEC ID Nº: 82, SEC ID Nº: 84, SEC ID Nº: 86, SEC ID Nº: 88, SEC ID Nº: 90, SEC ID Nº: 92, SEC ID Nº: 94, SEC ID Nº: 96, SEC ID Nº: 98, SEC ID Nº: 100, SEC ID Nº: 102, SEC ID Nº: 104, SEC ID Nº: 106, SEC ID Nº: 108, SEC ID

25 Nº: 110, SEC ID Nº: 112, SEC ID Nº: 114, SEC ID Nº: 116, SEC ID Nº: 118, SEC ID Nº: 120, SEC ID Nº: 122, SEC ID Nº: 124, SEC ID Nº: 126, SEC ID Nº: 128, SEC ID Nº: 130), en los que la modificación de la secuencia comprende uno o más de los siguientes cambios: el aminoácido en la posición equivalente de la alanina en el resto 118 de la SEC ID Nº: 132 se cambia por una histidina, el aminoácido en la posición equivalente de la alanina en el resto 182 de la SEC ID Nº: 132 se cambia por una valina, el aminoácido en la posición equivalente de la treonina en el resto 190 de la SEC ID Nº: 132 se cambia por una leucina, el aminoácido en la posición equivalente de la alanina en el resto 197 de la SEC ID Nº: 132 se cambia por una glicina, el aminoácido en la posición equivalente de la serina en el resto 208 de la SEC ID Nº: 132 se cambia por una lisina, el aminoácido en la posición equivalente de la treonina en el resto 219 de la SEC ID Nº: 132 se cambia por una metionina, el aminoácido en la posición equivalente de la treonina en el resto 223 de la SEC ID Nº: 132 se cambia por una ácido glutámico, el aminoácido en la posición

35 equivalente de la serina en el resto 255 de la SEC ID Nº: 132 se cambia por una arginina, el aminoácido en la posición equivalente de la serina en el resto 263 de la SEC ID Nº: 132 se cambia por una lisina, el aminoácido en la posición equivalente de la asparagina en el resto 275 de la SEC ID Nº: 132 se cambia por una tirosina, el aminoácido en la posición equivalente de la tirosina en el resto 309 de la SEC ID Nº: 132 se cambia por un triptófano, o, el aminoácido en la posición equivalente de la serina en el resto 312 de la SEC ID Nº: 132 se cambia por una valina. En un aspecto, el polipéptido tiene una actividad de pectato liasa, que puede ser termotolerante o termoestable.

Los métodos para generar un ácido nucleico que codifica una pectato-liasa modificada comprenden la preparación de una o más modificaciones de la secuencia en un ácido nucleico que codifica pectato-liasa, en los que los cambios 45 en el ácido nucleico que codifica una pectato-liasa son equivalentes a uno o más de los siguientes: cambio de nucleótidos en la posición equivalente de los restos 352 a 354 de la SEC ID Nº: 131 por CAT o CAC, cambio de nucleótidos en la posición equivalente de los restos 544 a 546 de la SEC ID Nº: 131 por GTG, GTT, GTC, o GTA, cambio de nucleótidos en la posición equivalente de los restos 568 a 570 de la SEC ID Nº: 131 por TTG, TTA, CTT, CTC, CTA, o CTG, cambio de nucleótidos en la posición equivalente de los restos 589 a 591 de la SEC ID Nº: 131 por GGT, GGC, GGA, o GGG, cambio de nucleótidos en la posición equivalente de los restos 622 a 624 de la SEC ID Nº: 131 por AAG o AAA, cambio de nucleótidos en la posición equivalente de los restos 655 a 657 de la SEC ID Nº: 131 por ATG, cambio de nucleótidos en la posición equivalente de los restos 667 a 669 de la SEC ID Nº: 131 por GAG o GAA, los nucleótidos en la posición equivalente de los restos 763 a 765 de la SEC ID Nº: 131 por CGG, CGT, CGC, CGA, AGA, AGG, cambio de nucleótidos en la posición equivalente de los restos 787 a 789 de la SEC 55 ID Nº: 131 por AAG o AAA, cambio de nucleótidos en la posición equivalente de los restos 823 a 825 de la SEC ID Nº: 131 por TAT o TAC, cambio de nucleótidos en la posición equivalente de los restos 925 a 927 de la SEC ID Nº: 131 por TGG, o cambio de nucleótidos en la posición equivalente de los restos 934 a 936 de la SEC ID Nº: 131 por GTT, GTG, GTC, o GTA. En un aspecto, la actividad de pectato liasa modificada tiene una actividad termotolerante o termoestable. En un aspecto, el ácido nucleico que codifica una pectato-liasa comprende un ácido nucleico que tiene una secuencia como se establece en las SEC ID Nº: 1, SEC ID Nº: 3, SEC ID Nº: 5, SEC ID Nº: 7, SEC ID Nº: 9, SEC ID Nº: 11, SEC ID Nº: 13, SEC ID Nº: 15, SEC ID Nº: 17, SEC ID Nº: 19, SEC ID Nº: 21, SEC ID Nº: 23, SEC ID Nº: 25, SEC ID Nº: 27, SEC ID Nº: 29, SEC ID Nº: 31, SEC ID Nº: 33, SEC ID Nº: 35, SEC ID Nº: 37, SEC ID Nº: 39, SEC ID Nº: 41, SEC ID Nº: 43, SEC ID Nº: 45, SEC ID Nº: 47, SEC ID Nº: 49, SEC ID Nº: 51, SEC ID Nº: 53, SEC ID Nº: 55, SEC ID Nº: 57, SEC ID Nº: 59, SEC ID Nº: 61, SEC ID Nº: 63, SEC ID Nº: 65, SEC ID Nº: 67, SEC ID Nº: 69, 65 SEC ID Nº: 71, SEC ID Nº: 73, SEC ID Nº: 75, SEC ID Nº: 77, SEC ID Nº: 79, SEC ID Nº: 81, SEC ID Nº: 83, SEC ID Nº: 85, SEC ID Nº: 87, SEC ID Nº: 89, SEC ID Nº: 91, SEC ID Nº: 93, SEC ID Nº: 95, SEC ID Nº: 97, SEC ID Nº: 99,

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SEC ID Nº: 101, SEC ID Nº: 103, SEC ID Nº: 105, SEC ID Nº: 107, SEC ID Nº: 109, SEC ID Nº: 111, SEC ID Nº: 113, SEC ID Nº: 115, SEC ID Nº: 117, SEC ID Nº: 119, SEC ID Nº: 121, SEC ID Nº: 123, SEC ID Nº: 125, SEC ID Nº: 127, SEC ID Nº: 129, SEC ID Nº: 131 o SEC ID Nº: 133.

5 Los métodos para generar una pectato liasa modificada comprenden preparar una o más modificaciones de secuencia en una pectato liasa, en los que los cambios en la pectato liasa son equivalentes a uno o más de los siguientes cambios: el aminoácido en la posición equivalente de la alanina en el resto 118 de la SEC ID Nº: 132 se cambia por una histidina, el aminoácido en la posición equivalente de la alanina en el resto 182 de la SEC ID Nº: 132 se cambia por una valina, el aminoácido en la posición equivalente de la treonina en el resto 190 de la SEC ID Nº: 132 se cambia por una leucina, el aminoácido en la posición equivalente de la alanina en el resto 197 de la SEC ID Nº: 132 se cambia por una glicina, el aminoácido en la posición equivalente de la serina en el resto 208 de la SEC ID Nº: 132 se cambia por una lisina, el aminoácido en la posición equivalente de la treonina en el resto 219 de la SEC ID Nº: 132 se cambia por una metionina, el aminoácido en la posición equivalente de la treonina en el resto 223 de la SEC ID Nº: 132 se cambia por una ácido glutámico, el aminoácido en la posición equivalente de la serina en el resto

15 255 de la SEC ID Nº: 132 se cambia por una arginina, el aminoácido en la posición equivalente de la serina en el resto 263 de la SEC ID Nº: 132 se cambia por una lisina, el aminoácido en la posición equivalente de la asparagina en el resto 275 de la SEC ID Nº: 132 se cambia por una tirosina, el aminoácido en la posición equivalente de la tirosina en el resto 309 de la SEC ID Nº: 132 se cambia por un triptófano, o, el aminoácido en la posición equivalente de la serina en el resto 312 de la SEC ID Nº: 132 se cambia por una valina. En un aspecto, la pectato liasa comprende una secuencia de la divulgación (por ejemplo, SEC ID Nº: 2, SEC ID Nº: 4, SEC ID Nº: 6, SEC ID Nº: 8, SEC ID Nº: 10, SEC ID Nº: 12, SEC ID Nº: 14, SEC ID Nº: 16, SEC ID Nº: 18, SEC ID Nº: 20, SEC ID Nº: 22, SEC ID Nº: 24, SEC ID Nº: 26, SEC ID Nº: 28, SEC ID Nº: 30, SEC ID Nº: 32, SEC ID Nº: 34, SEC ID Nº: 36, SEC ID Nº: 38, SEC ID Nº: 40, SEC ID Nº: 42, SEC ID Nº: 44, SEC ID Nº: 46, SEC ID Nº: 48, SEC ID Nº: 50, SEC ID Nº: 52, SEC ID Nº: 54, SEC ID Nº: 56, SEC ID Nº: 58, SEC ID Nº: 60, SEC ID Nº: 62, SEC ID Nº: 64, SEC ID Nº: 66, SEC ID Nº: 68,

25 SEC ID Nº: 70, SEC ID Nº: 72, SEC ID Nº: 74, SEC ID Nº: 76, SEC ID Nº: 78, SEC ID Nº: 80, SEC ID Nº: 82, SEC ID Nº: 84, SEC ID Nº: 86, SEC ID Nº: 88, SEC ID Nº: 90, SEC ID Nº: 92, SEC ID Nº: 94, SEC ID Nº: 96, SEC ID Nº: 98, SEC ID Nº: 100, SEC ID Nº: 102, SEC ID Nº: 104, SEC ID Nº: 106, SEC ID Nº: 108, SEC ID Nº: 110, SEC ID Nº: 112, SEC ID Nº: 114, SEC ID Nº: 116, SEC ID Nº: 118, SEC ID Nº: 120, SEC ID Nº: 122, SEC ID Nº: 124, SEC ID Nº: 126, SEC ID Nº: 128 o SEC ID Nº: 130). En un aspecto, la actividad de pectato liasa modificada tiene una actividad termotolerante o termoestable.

La invención proporciona formulaciones que comprenden al menos una enzima de la invención que comprenden dosificaciones en el intervalo entre aproximadamente 1 gramo por ton y 100 o más gramos por ton (por ton de material tratado, por ejemplo, por ton de tejido, tela o similar), entre aproximadamente 10 gramos por ton y 90

35 gramos por ton, entre aproximadamente 20 gramos por ton y 80 gram por ton, entre aproximadamente 30 gramos por ton y 70 gramos por ton, entre aproximadamente 40 gramos por ton y 50 gramos por ton. Por ejemplo, algunas formulaciones a modo de ejemplo comprenden de aproximadamente 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, etc. a 100, 200, 300, 400, 500, etc. o más gramos por ton.

Como alternativa, la invención proporciona formulaciones que comprenden al menos una enzima de la invención que comprenden dosificaciones en el intervalo de entre aproximadamente 1 µg por gramo y 100 o más µg por gramo (por gramo de material tratado, por ejemplo, por gramo de tejido, tela o similares), entre aproximadamente 10 µg por gramo y 90 µg por gramo, entre aproximadamente 20 µg por gramo y 80 µg por gramo, entre aproximadamente

45 30 µg por gramo y 70 µg por gramo, entre aproximadamente 40 µg por gramo y 50 µg por gramo. Por ejemplo, algunas formulaciones a modo de ejemplo comprenden de aproximadamente 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, etc. a 100, 200, 300, 400, 500, etc. o más µg por gramo (por ejemplo, por gramo de tejido, tela o similares).

Como alternativa, la invención proporciona formulaciones que comprenden al menos una enzima de la invención que comprenden dosificaciones en el intervalo de entre aproximadamente 0,5 mg por libra y 50 o más mg por libra (por libra de material tratado, por ejemplo, por libra de tejido, tela o similares), entre aproximadamente 1 mg por libra y 45 mg por libra, entre aproximadamente 5 mg por libra y 40 mg por libra, entre aproximadamente 10 mg por libra y 35 mg por libra, entre aproximadamente 15 mg por libra y 30 mg por libra. Por ejemplo, algunas formulaciones a

55 modo de ejemplo comprenden de aproximadamente 0,5, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, etc. a 50 o más mg por libra (por ejemplo, por libra de tejido, tela o similares).

La invención proporciona formulaciones que comprenden al menos una enzima de la invención que comprenden dosificaciones que comprenden una potencia enzimática entre aproximadamente 100 y 40.000 unidades/ml, de 200 a 30.000 unidades/ml, de 500 a 30.000 unidades/ml, de 1000 a 20.000 unidades/ml, de 1000 a 25.000 unidades/ml, de 1000 a 15.000 unidades/ml, de 1000 a 10.000 unidades/ml, de 1000 a 5000 unidades/ml, entre aproximadamente 2000 y 20.000 unidades/ml, entre aproximadamente 2000 y 15.000 unidades/ml, entre aproximadamente 2000 y

10.000 unidades/ml, o entre aproximadamente 2000 y 4000 unidades/ml, o, entre aproximadamente 200 y 25.000

65 unidades/ml, de 200 a 20.000 unidades/ml, de 200 a 15.000 unidades/ml, de 200 a 10.000 unidades/ml, entre aproximadamente 400 y 8000 unidades/ml, entre aproximadamente 600 y 6000 unidades/ml, entre

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5 En un aspecto, la formulación comprende una enzima liofilizada (por ejemplo, una enzima de la invención), o, la formulación es una formulación basada en agua que comprende una enzima de la invención. En un aspecto, la formulación comprende una enzima liofilizada resuspendida en agua. En un aspecto, una formulación de la invención comprende adicionalmente un glicerol, sacarosa, cloruro sódico, dextrina, propilenglicol, sorbitol, sulfato sódico o TRIS, o un equivalente. En un aspecto, una formulación de la invención comprende adicionalmente un tampón, por ejemplo, un tampón que comprende un pH 7, glicerol al 35 %, benzoato sódico al 0,1 %, sorbato potásico al 0,1 %; pH 7, glicerol al 35 %, 300 ppm de proxel; pH 7, cloruro sódico al 10 %, glicerol al 25 %, benzoato sódico al 0,1 %, sorbato potásico al 0,1 %; pH 7, cloruro sódico al 10 %, glicerol al 25 %, 300 ppm de proxel; pH 5,5, glicerol al 35 %, benzoato sódico al 0,1 %, sorbato potásico al 0,1 %; pH 5,5, glicerol al 35 %, 300 ppm de proxel; pH 5,5, cloruro sódico al 10 %, glicerol al 25 %, benzoato sódico al 0,1 %, sorbato potásico al 0,1 %; o, tampón acetato

15 20 mM, pH 5,5, glicerol al 35 %; MOPS 20 mM, pH 7 o MOPS 25 mM, NaCl 50 mM, pH 7,5; pH 5,0, TRIS 40 mM; pH 7,0, TRIS 40 mM; pH 8,0, TRIS 40 mM; pH 7,5, glicerol al 50 %; pH 7,5, NaCl al 20 %; pH 7,5, propilenglicol al 30 %; pH 7,5, sulfato sódico 100 mM; pH 5,5, glicerol al 35 %; o, cualquier combinación de los mismos, o equivalentes de los mismos.

La invención proporciona procesos de biolimpieza que comprenden las siguientes etapas: (a) proporcionar una pectato liasa de la invención; (b) proporcionar un material que comprende pectina o ácido poligalacturónico; (c) poner en contacto la pectato liasa de (a) con el material de (b) en condiciones alcalinas, por ejemplo, a pH superior a 7,5, o, condiciones que comprenden entre aproximadamente pH 8 y pH 9 o superior, por ejemplo, pH 8,5, en tampón de bicarbonato o equivalente. En un aspecto, el método también comprende un agente humectante no iónico, por

25 ejemplo, a aproximadamente 1 g/l. En un aspecto, la proporción de pectato liasa se encuentra en un baño enzimático entre aproximadamente 10:1 y 50:1 l de pectato liasa:kg de material. En un aspecto, la dosis de pectato liasa está entre aproximadamente 0,1 y 0,2 ml de un extracto concentrado por kg de material, o equivalente. Como alternativa, la dosis de pectato liasa está entre aproximadamente 0,1 ml y 1 ml de un extracto concentrado por kg de material, o equivalente. En un aspecto, el intervalo de temperatura está entre aproximadamente 50 ºC y 70 ºC. En un aspecto, el tiempo de tratamiento es de aproximadamente 20 min. En un aspecto de los procesos de biolimpieza de la invención, el material comprende un tejido o una tela. En un aspecto, la dosis de pectato liasa es de aproximadamente 0,137 ml de un extracto concentrado por kg de material, o equivalente. En un aspecto, la etapa de poner en contacto comprende adicionalmente el uso de un agente quelante, en la que el agente quelante se excluye del baño enzimático y se añade después de aproximadamente 20 minutos de tratamiento enzimático y se mantiene

35 durante aproximadamente 10 minutos antes del baño de descarga.

Otros aspectos adicionales de la invención se exponen en las reivindicaciones adjuntas.

Los detalles de una o más realizaciones de la invención se exponen en las figuras adjuntas en la descripción que sigue a continuación. Otras características, objetos, y ventajas de la invención serán evidentes a partir de la descripción y las figuras, y a partir de las reivindicaciones.

Descripción de las figuras

45 La patente o archivo de solicitud contiene al menos una figura realizada en color. Las copias de esta patente o publicación de solicitud de patente con figura o figuras en color las proporcionará la Oficina previa solicitud y pago de la tasa necesaria.

La Figura 1 es un diagrama de bloque de un sistema informático. La Figura 2 es un diagrama de flujo que ilustra un aspecto de un proceso para comparar una nueva secuencia de nucleótidos o de proteínas con una base de datos de secuencias para determinar los niveles de homología entre la nueva secuencia y las secuencias en la base de datos. La Figura 3 es un diagrama de flujo que ilustra un aspecto de un proceso en un ordenador para determinar si dos secuencias son homólogas.

55 La Figura 4 es un diagrama de flujo que ilustra un aspecto de un proceso identificador 300 para detectar la presencia de una característica en una secuencia. La Figura 5 es un resumen gráfico de la especificidad relativa del sustrato, valor relativo de la especifidad del sustrato, temperatura de la actividad de caracterización, pH de la actividad de caracterización, actividad enzimática, descripción por caracterización y caracterización de sustrato de algunas pectato liasas a modo de ejemplo de la invención. La Figura 6 es un resumen de polipéptido pectato liasas, caracterizadas como "mutantes positivos", como se analiza con detalle a continuación. La Figura 7 es una tabla que resume temperaturas de fusión a modo de ejemplo y actividades específicas (SA) de enzimas a modo de ejemplo de la invención a diversas temperaturas.

65 La Figura 8 resume datos de ensayos de actividad de enzimas termotolerantes a modo de ejemplo de la invención, como se describe en el Ejemplo 4, que sigue a continuación. 16

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Los símbolos de referencia similares en las diversas figuras indican elementos similares.

Descripción detallada

5 La invención proporciona polipéptidos que tienen una actividad de pectato liasa, polinucleótidos que codifican los polipéptidos, y métodos para preparar y usar estos polinucleótidos y polipéptidos. En un aspecto, las pectato liasas de la invención se usan para catalizar la beta-eliminación (trans-eliminación) y/o hidrólisis de pectina y/o ácido poligalacturónico (pectato) u otros componentes de la pared vegetal, por ejemplo, homogalacturonano o ramnogalacturonano, incluyendo ácido alfa-D-galacturónico unido en la posición 1,4. Las pectato liasas de la invención también se pueden usar para la hidrólisis de paredes de célula vegetal, por ejemplo, en el tratamiento de fibras naturales que comprenden pectina, por ejemplo, fibras de algodón.

El uso de las pectato liasas de la invención para hidrolizar pectina de la pared celular primaria puede eliminar la

15 necesidad de agentes cáusticos y temperaturas elevadas en la limpieza de fibra de algodón. El uso de las pectato liasas de la invención también puede reducir de forma significativa la cantidad de agua usada para aclarar fibras tratadas, por ejemplo, tejido de algodón de punto o tejido, después de la limpieza química. El uso de las pectato liasas de la invención también puede reducir pérdidas de materia prima en la limpieza química. En un aspecto, una pectato liasa de la invención, por ejemplo, una pectato liasa alcalina y/o termoestable, se usa para biolimpieza. Por lo tanto, la invención proporciona procesos en los que se procesan tejidos de algodón sin apresto para solubilizar y extraer material no celulósico indeseado en tejidos y otros materiales celulósicos usando una enzima de la invención. Los procesos de la invención se pueden usar para solubilizar y/o extraer materiales encontrados de forma natural en el algodón y/o para retirar impurezas aplicadas, tales como lubricantes de maquinaria.

25 Las Figuras 5 y 7 son resúmenes gráficos, entre otros, de la especificidad relativa del sustrato, valor relativo de la especificidad del sustrato, temperatura de la actividad de caracterización, pH de la actividad de caracterización, actividad enzimática, descripción de la caracterización y caracterización del sustrato de las pectato liasas a modo de ejemplo.

Las preparaciones de pectato liasa de la invención (incluyendo aquéllas para el tratamiento o procesamiento de comidas o alimentos, tratamiento de fibras y textiles, tratamientos de residuos, tratamientos de vegetales, y similares) pueden comprender adicionalmente una o más enzimas, por ejemplo, proteasas, celulasas (endo-beta1,4-glucanasas), beta-glucanasas (endo-beta-1,3(4)-glucanasas), lipasas, cutinasas, peroxidasas, lacasas, amilasas, pectato liasas, pectinasas, reductasas, oxidasas, fenoloxidasas, ligninasas, pululanasas, arabinanasas,

35 hemicelulasas, mananasas, xiloglucanasas, xilanasas, pectin acetil esterasas, ramnogalacturonano acetil esterasas, poligalacturonasas, ramnogalacturonasas, galactanasas, pectin liasas, pectin metilesterasas, celobiohidrolasas, transglutaminasas; o mezclas de las mismas.

Definiciones

La expresión "pectato liasa" incluye todos los polipéptidos que tienen una actividad de pectato liasa, o pectinasa, incluyendo la beta-eliminación (trans-eliminación) y/o hidrólisis de pectina y/o ácido poligalacturónico (pectato) u otros componentes de la pared vegetal, por ejemplo, homogalacturonano o ramnogalacturonano, incluyendo ácido alfa-D-galacturónico unido en la posición 1,4. En un aspecto, la actividad de pectato liasa incluye catálisis de la 45 escisión de uniones glicosídicas de sustancias pécticas, por ejemplo, catálisis de la beta-eliminación (transeliminación) y/o hidrólisis de paredes de células vegetales (por ejemplo, la descomposición o disolución de paredes celulares que comprenden pectina, por ejemplo, paredes de células vegetales). En un aspecto, la actividad de pectato liasa incluye la catálisis de la beta-eliminación (trans-eliminación) y/o hidrólisis de ácido galacturónico esterificado con metilo, incluyendo ácido poligalacturónico esterificado con metilo parcial o completamente. En un aspecto, la actividad de pectato liasa es principalmente de actuación endo, por ejemplo, cortando el polímero (por ejemplo, ácido poligalacturónico) en sitios aleatorios dentro de una cadena para dar una mezcla de oligómeros, o la actividad de pectato liasa puede ser de actuación exo, atacando desde un extremo del polímero y produciendo monómeros o dímeros, o, una combinación de los mismos. En un aspecto, la actividad de pectato liasa comprende la catálisis de la escisión aleatoria de enlaces alfa-1,4-glicosidídicos en el ácido péctico (ácido poligalacturónico)

55 mediante trans-eliminación. En un aspecto, la actividad de la pectato liasa incluye polipéptidos que tienen una actividad igual o similar a la de la pectato liasa (EC 4.2.2.2), poli(1,4-alfa-D-galacturónido) liasa, poligalacturonato liasa (EC 4.2.2.2), pectina liasa (EC 4.2.2.10), poligalacturonasa (EC 3.2.1.15), exo-poligalacturonasa (EC 3.2.1.67), exo-poligalacturonato liasa (EC 4.2.2.9) y/o exo-poli-alfa-galacturonosidasa (EC 3.2.1.82).

Un polipéptido se puede someter a ensayo de forma rutinaria para la actividad de pectato liasa (por ejemplo, sometido a ensayo para observar si la proteína está dentro del alcance de la invención) mediante cualquier método, por ejemplo, un ensayo de PGA para pectato liasas. En este ensayo, la actividad de pectato liasa se mide a la temperatura y pH deseados usando ácido poligalacturónico al 0,2 % (Sigma, P3850) en tampón de Tris HCl 25 mM -Glicina NaOH 25 mM. Una unidad de actividad enzimática se define como la cantidad de proteína que produce 1 65 µmol de oligogalacturónidos insaturados por minuto equivalente a 1 µmol de digalacturónido insaturado, usando el valor del coeficiente de extinción molecular de 4600 M-1 cm -1 a 235 nm para el dímero. La proteína se puede

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determinar para proteína purificada homogénea mediante la medida de la absorbancia a 280 nm, usando el valor del coeficiente de extinción específico para cada proteína basándose en la secuencia.

El término "anticuerpo" incluye un péptido o polipéptido derivados de, modelados después de o básicamente 5 codificados por un gen de inmunoglobulina o genes de inmunoglobulina, o fragmentos de los mismos, capaces de unirse de forma específica a un antígeno o epítopo, véase, por ejemplo Fundamental Immunology, Tercera Edición,

W.E. Paul, ed., Raven Press, N.Y. (1993); Wilson (1994) J. Immunol. Methods 175: 267-273; Yarmush (1992) J. Biochem. Biophys. Methods 25: 85-97. El término anticuerpo incluye partes de unión a antígeno, es decir, "sitios de unión a antígeno", (por ejemplo, fragmentos, subsecuencias, regiones que determinan la complementariedad (CDR)) que mantienen la capacidad de unirse al antígeno, incluyendo (i) un fragmento de Fab, un fragmento monovalente que consiste en los dominios VL, VH, CL y CH1; (ii) un fragmento de F(ab')2, un fragmento bivalente que comprende dos fragmentos de Fab unidos por un puente disulfuro en la región bisagra; (iii) un fragmento de Fd que consiste en los dominios VH y CH1; (iv) un fragmento de Fv que consiste en los dominios VL y VH de una sola rama de un anticuerpo, (v) un fragmento de dAb (Ward et al., (1989) Nature 341: 544-546), que consiste en un dominio VH; y (vi)

15 una región aislada que determina la complementariedad (CDR). En el término "anticuerpo" también se incluyen por referencia anticuerpos de una sola cadena.

Los términos "matriz" o "micromatriz" o "biochip" o "chip" como se usan en el presente documento se refieren a una pluralidad de elementos diana, comprendiendo cada elemento diana una cantidad definida de uno o más polipéptidos (incluyendo anticuerpos) o ácidos nucleicos inmovilizados en una zona definida de una superficie del sustrato, como se analiza con más detalle a continuación.

Como se usa en el presente documento, los términos "ordenador", "programa informático" y "procesador" se usan en sus contextos generales más amplios e incorporan todos estos dispositivos, como se describe con detalle a

25 continuación. Una "secuencia de codificación de" o una "secuencia que codifica" un polipéptido o proteína en particular, es una secuencia de ácidos nucleicos que se transcribe y traduce en un polipéptido o proteína cuando se coloca bajo el control de las secuencias reguladoras apropiadas.

La expresión "casete de expresión", como se usa en el presente documento, se refiere a una secuencia de nucleótidos que es capaz de realizar la expresión de un gen estructural (es decir, una secuencia que codifica proteínas, tal como una pectato liasa de la invención) en un hospedador compatible con tales secuencias. Los casetes de expresión incluyen al menos un promotor unido de forma operativa con la secuencia que codifica polipéptidos; y, opcionalmente, con otras secuencias, por ejemplo, señales de terminación de la transcripción. También se pueden usar factores adicionales necesarios o útiles en la realización de la expresión, por ejemplo,

35 potenciadores. Por lo tanto, los casetes de expresión también incluyen plásmidos, vectores de expresión, virus recombinantes, cualquier forma de vector de "ADN desnudo" recombinante, y similares.

"Unido de forma operativa", como se usa en el presente documento, se refiere a una relación funcional entre dos o más segmentos de ácido nucleico (por ejemplo, ADN). Por lo general, se refiere a la relación funcional de la secuencia reguladora de la transcripción con respecto a una secuencia transcrita. Por ejemplo, un promotor se une de forma operativa a una secuencia de codificación, tal como un ácido nucleico de la invención, si estimula o modula la transcripción de la secuencia de codificación en una célula hospedadora apropiada u otro sistema de expresión. Por lo general, las secuencias reguladoras de la transcripción promotoras que se unen de forma operativa a una secuencia transcrita son físicamente contiguas a la secuencia transcrita, es decir, son de actuación cis. Sin

45 embargo, no es necesario que algunas secuencias reguladoras de la transcripción, tales como potenciadores, estén físicamente contiguas o estén localizadas en las proximidades de las secuencias de codificación cuya transcripción potencian.

Un "vector" comprende un ácido nucleico que puede infectar, transfectar, transducir de forma transitoria o permanente una célula. Se observará que un vector puede ser un ácido nucleico desnudo, o un ácido nucleico que forma complejos con proteínas o lípidos. El vector comprende opcionalmente ácidos nucleicos virales o bacterianos y/o proteínas, y/o membranas (por ejemplo, una membrana celular, una envoltura lipídica viral, etc.). Los vectores incluyen, pero no se limitan a replicones (por ejemplo, replicones de ARN, bacteriófagos) a los que se pueden unir fragmentos de ADN y se llegan a replicar. Por lo tanto, los vectores incluyen, pero no se limitan a ARN, ADN o ARN

55 circular o lineal de autorreplicación autónoma (por ejemplo, plásmidos, virus, y similares, véase, por ejemplo, la Patente de Estados Unidos Nº 5.217.879), e incluyen los plásmidos tanto de expresión como de no expresión. Cuando se describe un microorganismo recombinante o cultivo celular como hospedador de un "vector de expresión", éste incluye tanto ADN extra-cromosómico circular o lineal como ADN que se ha incorporado en el cromosoma o cromosomas hospedadores. Cuando una célula hospedadora está manteniendo un vector, el vector se puede replicar de forma estable por las células durante la mitosis como una estructura autónoma, o se incorpora dentro del genoma del hospedador.

Como se usa en el presente documento, el término "promotor" incluye todas las secuencias capaces de dirigir la transcripción de una secuencia de codificación en una célula, por ejemplo, una célula vegetal. Por lo tanto, los 65 promotores usados en los constructos de la invención incluyen elementos de control de la transcripción de actuación cis y secuencias reguladoras que están implicadas en la regulación o la modulación del momento y/o tasa de

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transcripción de un gen. Por ejemplo, un promotor puede ser un elemento de control de la transcripción de actuación cis, incluyendo un potenciador, un promotor, un terminador de la transcripción, un origen de replicación, una secuencia de integración cromosómica, regiones sin traducir en las posiciones 5' y 3', o una secuencia intrónica, que están implicadas en la regulación de la transcripción. Estas secuencias de actuación cis por lo general interactúan

5 con proteínas u otras biomoléculas para realizar (activar/desactivar, regular, modular, etc.) la transcripción. Los promotores "constitutivos" son los que dirigen la expresión de forma continua en la mayoría de las condiciones ambientales y estados de desarrollo o diferenciación celular. Los promotores "inducibles" o "regulables" dirigen la expresión del ácido nucleico de la invención bajo la influencia de condiciones ambientales o condiciones de desarrollo. Los ejemplos de condiciones ambientales que pueden influir en la transcripción mediante promotores inducibles incluyen condiciones anaerobias, temperatura elevada, sequía, o la presencia de luz.

Los promotores "específicos de tejido" son elementos para el control de la transcripción que solamente son activos en células o tejidos u órganos en particular, por ejemplo, en plantas o animales. La regulación específica de tejido se puede conseguir mediante ciertos factores intrínsecos que aseguran que se expresen los genes que codifican

15 proteínas específicas para un tejido dado. Se sabe que tales factores existen en mamíferos y plantas de modo que permiten que se desarrollen tejidos específicos.

El término "planta" incluye plantas completas, partes de plantas (por ejemplo, hojas, tallos, flores, raíces, etc.), protoplastos de plantas, semillas y células vegetales y progenie de los mismos. La clase de plantas que se puede usar en el método de la invención es generalmente tan amplia como la clase de plantas superiores susceptibles de técnicas de transformación, incluyendo angiospermas (plantas monocotiledóneas y dicotiledóneas), así como gimnospermas. El término incluye plantas de una diversidad de niveles de ploidía, incluyendo poliploide, diploide, haploide y estados hemicigoto. Como se usa en el presente documento, la expresión "planta transgénica" incluye plantas o células de plantas en las que se ha insertado una secuencia de ácidos nucleicos heteróloga, por ejemplo,

25 los ácidos nucleicos y diversos constructos recombinantes (por ejemplo, casetes de expresión) de la invención.

Los "plásmidos" pueden estar disponibles en el mercado, a disposición del público sin restricciones, o se pueden construir a partir de plásmidos disponibles de acuerdo con procedimientos publicados. En la técnica se conocen plásmidos equivalentes a los que se describen en el presente documento y serán evidentes para los expertos habituales en la materia.

El término "gen" incluye una secuencia de ácidos nucleicos que comprende un segmento de ADN implicado en la producción de un producto de transcripción (por ejemplo, un mensaje), que a su vez se traduce para producir una cadena polipeptídica, o regula la transcripción, la reproducción o la estabilidad génica. Los genes pueden incluir

35 regiones que preceden y siguen a la región de codificación, tales como el director y transporte, promotores y potenciadores, así como, en su caso, secuencias intermedias (intrones) entre segmentos de codificación individuales (exones).

Las expresiones "ácido nucleico" o "secuencia de ácidos nucleicos" incluyen oligonucleótido, nucleótido, polinucleótido, o un fragmento de cualquiera de los mismos, de ADN o ARN (por ejemplo, ARNm, ARNr, ARNt) de origen genómico o sintético que puede ser monocatenario o bicatenario y puede representar una hebra sentido o antisentido, para ácido nucleico peptídico (PNA), o para cualquier material similar al ADN o similar al ARN, de origen natural o sintético, que incluye, por ejemplo, ARNi, ribonucleoproteínas (por ejemplo, iRNP). Las expresiones incluyen ácidos nucleicos, es decir, oligonucleótidos, que contienen análogos conocidos de nucleótidos naturales.

45 Las expresiones también incluyen estructuras similares a los ácidos nucleicos con estructuras principales sintéticas, véase por ejemplo, Mata (1997) Toxicol. Appl. Pharmacol. 144: 189-197; Strauss-Soukup (1997) Biochemistry 36: 8692-8698; Samstag (1996) Antisense Nucleic Acid Drug Dev 6: 153-156.

"Aminoácido" o "secuencia de aminoácido" incluyen un oligopéptido, péptido, polipéptido, o secuencia de proteínas,

o un fragmento, parte, o subunidad de cualquiera de los mismos, y moléculas de origen natural o sintético. Los términos "polipéptido" y "proteína" incluyen aminoácidos unidos entre sí mediante enlaces peptídicos o enlaces peptídicos modificados, es decir, isoésteres peptídicos, y pueden contener aminoácidos modificados distintos de los aminoácidos codificados de 20 genes. El término "polipéptido" también incluye péptidos y fragmentos de polipéptido, motivos y similares. El término también incluye polipéptidos glicosilados. Los péptidos y polipéptidos de la invención

55 también incluyen todas las formas " miméticas" y "peptidomiméticas", como se describe con más detalle a continuación.

El término "aislado" incluye un material retirado de su entorno original, por ejemplo, el entorno natural si es de origen natural. Por ejemplo, un polinucleótido o polipéptido de origen natural presente en un animal vivo no está aislado, pero el mismo polinucleótido o polipéptido, separado de algunos o todos los materiales coexistentes en el sistema natural, se aísla. Tales polinucleótidos podrían ser parte de un vector y/o tales polinucleótidos o polipéptidos podrían ser parte de una composición, y además ser aislados en un vector o composición tal que no forma parte de su entorno natural. Como se usa en el presente documento, un material o composición aislado también puede ser una composición "purificada", es decir, no necesita una pureza absoluta; en su lugar, se pretende como una definición 65 relativa. Los ácidos nucleicos individuales obtenidos a partir de la biblioteca se pueden purificar de forma convencional hasta homogeneidad electroforética. En aspectos alternativos, la invención proporciona ácidos

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nucleicos que se han purificado a partir de ADN genómico o a partir de otras secuencias en una biblioteca u otro entorno con al menos uno, dos, tres, cuatro, cinco o más órdenes de magnitud.

Como se usa en el presente documento, el término "recombinante" puede incluir ácidos nucleicos adyacentes a un

5 ácido nucleico de la "estructura principal" que no es adyacente en su entorno natural. En un aspecto, los ácidos nucleicos representan un 5 % o más del número de insertos de ácido nucleico en una población de "moléculas de la estructura principal" de ácido nucleico. Las "moléculas de la estructura principal" de acuerdo con la invención incluyen ácidos nucleicos tales como vectores de expresión, ácidos nucleicos de autorreplicación, virus, ácidos nucleicos de integración, y otros vectores o ácidos nucleicos usados para mantener o manipular un inserto de ácido nucleico de interés. En un aspecto, los ácidos nucleicos enriquecidos representan un 10 %, 15 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 95 %, 98 % o más del número de insertos de ácido nucleico en la población de moléculas de la estructura principal recombinantes. Polipéptidos o proteínas "recombinantes" se refiere a polipéptidos o proteínas producidos mediante técnicas de ADN recombinante; por ejemplo, producidos a partir de células transformadas mediante un constructo de ADN exógeno que codifica el polipéptido o proteína deseados. Los

15 polipéptidos o proteínas "sintéticos" son los preparados mediante síntesis química, como se describe con más detalle a continuación.

Una secuencia promotora se puede "unir de forma operativa a" una secuencia de codificación cuando la ARN polimerasa que inicia la transcripción en el promotor transcribe la secuencia de codificación en el ARNm, como se analiza con más detalle a continuación.

"Oligonucleótido" incluye cualquiera de un polidesoxinucleótido monocatenario o dos hebras de polidesoxinucleótido complementarias que se pueden sintetizar de forma química. Tales oligonucleótidos sintéticos no tienen fosfato en la posición 5' y por lo tanto no se ligarán con otro oligonucleótido sin añadir un fosfato con un ATP en presencia de una

25 quinasa. Un oligonucleótido sintético se puede ligar con un fragmento que no se ha desfosforilado.

La expresión "básicamente idéntico" en el contexto de dos ácidos nucleicos o polipéptidos, puede hacer referencia a dos o más secuencias que tienen, por ejemplo, al menos aproximadamente un 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, o más identidad de (secuencia) de restos de nucleótidos o aminoácidos, cuando se compara y se alinea para la correspondencia máxima, como se mide usando cualquier algoritmo de comparación de secuencias conocido, como se analiza con detalle a continuación, o mediante inspección visual. En aspectos alternativos, la divulgación proporciona secuencias de ácidos nucleicos y polipéptidos que tienen una identidad 35 sustancial con una secuencia de la divulgación a modo de ejemplo, por ejemplo, SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:17, SEQ ID NO:19, SEQ ID NO:21, SEQ ID NO:23, SEQ ID NO:25, SEQ ID NO:27, SEQ ID NO:29, SEQ ID NO:31, SEQ ID NO:33, SEQ ID NO:35, SEQ ID NO:37, SEQ ID NO:39, SEQ ID NO:41, SEQ ID NO:43, SEQ ID NO:45, SEQ ID NO:47, SEQ ID NO:49, SEQ ID NO:51, SEQ ID NO:53, SEQ ID NO:55, SEQ ID NO:57, SEQ ID NO:59, SEQ ID NO:61, SEQ ID NO:63, SEQ ID NO:65, SEQ ID NO:67, SEQ ID NO:69, SEQ ID NO:71, SEQ ID NO:73, SEQ ID NO:75, SEQ ID NO:77, SEQ ID NO:79, SEQ ID NO:81, SEQ ID NO:83, SEQ ID NO:85, SEQ ID NO:87, SEQ ID NO:89, SEQ ID NO:91, SEQ ID NO:93, SEQ ID NO:95, SEQ ID NO:97, SEQ ID NO:99, SEQ ID NO:101, SEQ ID NO:103, SEQ ID NO:105, SEQ ID NO:107, SEQ ID NO:109, SEQ ID NO:111, SEQ ID NO:113, SEQ ID NO:115, SEQ ID NO:117, SEQ ID NO:119, SEQ ID NO:121, SEQ ID NO:123, SEQ ID NO:125, SEQ ID NO:127, SEQ ID 45 NO:129, SEQ ID NO:131, SEQ ID NO:133 (ácidos nucleicos) SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:18, SEQ ID NO:20, SEQ ID NO:22, SEQ ID NO:24, SEQ ID NO:26, SEQ ID NO:28, SEQ ID NO:30, SEQ ID NO:32, SEQ ID NO:34, SEQ ID NO:36, SEQ ID NO:38, SEQ ID NO:40, SEQ ID NO:42, SEQ ID NO:44, SEQ ID NO:46, SEQ ID NO:48, SEQ ID NO:50, SEQ ID NO:52, SEQ ID NO:54, SEQ ID NO:56, SEQ ID NO:58, SEQ ID NO:60, SEQ ID NO:62, SEQ ID NO:64, SEQ ID NO:66, SEQ ID NO:68, SEQ ID NO:70, SEQ ID NO:72, SEQ ID NO:74, SEQ ID NO:76, SEQ ID NO:78, SEQ ID NO:80, SEQ ID NO:82, SEQ ID NO:84, SEQ ID NO:86, SEQ ID NO:88, SEQ ID NO:90, SEQ ID NO:92, SEQ ID NO:94, SEQ ID NO:96, SEQ ID NO:98, SEQ ID NO:100, SEQ ID NO:102, SEQ ID NO:104, SEQ ID NO:106, SEQ ID NO:108, SEQ ID NO:110, SEQ ID NO:112, SEQ ID NO:114, SEQ ID NO:116, SEQ ID NO:118, SEQ ID NO:120, SEQ ID NO:122, SEQ ID NO:124, SEQ ID NO:126, SEQ ID NO:128, SEQ ID NO:130, SEQ ID

55 NO:132, SEQ ID NO:134 (polipéptidos), sobre una región de al menos aproximadamente 10, 20, 30, 40, 50, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000 o más restos, o una región que varía entre aproximadamente 50 restos con respecto a la longitud completa del ácido nucleico o polipéptido. Las secuencias de ácidos nucleicos pueden ser básicamente idénticas con respecto a la longitud total de una región que codifica polipéptido.

Una secuencia de aminoácidos "básicamente idéntica" también puede incluir una secuencia que difiere de una secuencia de referencia en una o más sustituciones, supresiones, o inserciones de aminoácidos conservativas o no conservativas, en particular cuando tal sustitución se produce en un sitio que no es el sitio activo de la molécula, y con la condición de que el polipéptido mantenga básicamente sus propiedades funcionales. Por ejemplo, una 65 sustitución de aminoácido conservativa, sustituye un aminoácido por otro de la misma clase (por ejemplo, sustitución de un aminoácido hidrófobo, tal como isoleucina, valina, leucina, o metionina, por otro, o sustitución de un

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aminoácido polar por otro, tal como sustitución de arginina por lisina, ácido glutámico por ácido aspártico o glutamina por asparagina). Uno o más aminoácidos se pueden suprimir, por ejemplo, de una pectato liasa, dando como resultado la modificación de la estructura del polipéptido, sin alterar de forma significativa su actividad biológica. Por ejemplo, se pueden eliminar los aminoácidos amino o carboxilo terminales que no son necesarios para la actividad

5 de pectato liasa.

"Hibridación" incluye el proceso mediante el que una hebra de ácido nucleico se une con una hebra complementaria a través de emparejamiento de bases. Las reacciones de hibridación pueden ser sensibles y selectivas de modo que se puede identificar una secuencia de interés en particular incluso en muestras en las que está presente a concentraciones bajas. Las condiciones rigurosas se pueden definir, por ejemplo, mediante las concentraciones de sal o formamida en las soluciones de hibridación previa y de hibridación, o mediante la temperatura de hibridación, y son bien conocidas en la técnica. Por ejemplo, la rigurosidad se puede aumentar reduciendo la concentración de sal, aumentando la concentración de formamida, o elevando la temperatura de hibridación, alterando el tiempo de hibridación, como se describe con detalle a continuación. En aspectos alternativos, los ácidos nucleicos de la

15 invención se definen por su capacidad para hibridarse en diversas condiciones de rigurosidad (por ejemplo, elevada, media, y baja), como se establece en el presente documento.

"Variante" incluye polinucleótidos o polipéptidos de la invención modificados en uno o más pares de bases, codones, intrones, exones, o restos de aminoácidos (respectivamente) que aún mantienen la actividad biológica de una pectato liasa de la invención. Las variantes se pueden producir mediante cualquier número de medios incluidos en los métodos tales como, por ejemplo, PCR propensa a error, redistribución, mutagénesis dirigida a oligonucleótidos, PCR de ensamblaje, mutagénesis de PCR sexual, mutagénesis in vivo, mutagénesis de casete, mutagénesis de conjunto recursiva, mutagénesis de conjunto exponencial, mutagénesis específica de sitio, reensamblaje génico, GSSM™ y cualquier combinación de los mismos. En el presente documento se incluyen técnicas para producir

25 variante de pectato liasa que tiene actividad a un pH o temperatura, por ejemplo, que es diferente de una pectato liasa de tipo silvestre.

La expresión "mutagénesis por saturación" o "GSSM™" incluye un método que usa cebadores de oligonucleótidos degenerados para introducir mutaciones puntuales en un polinucleótido, como se describe con detalle a continuación.

La expresión "sistema de evolución dirigida optimizado" o "evolución dirigida optimizada" incluye un método para el reensamblaje de fragmentos de secuencias de ácidos nucleicos relacionados, por ejemplo, genes relacionados, y se explica con detalle a continuación.

35 La expresión "reensamblaje de ligamiento sintético" o "SLR" incluye un método de ligamiento de fragmentos de oligonucleótidos de una manera no estocástica, y se explica con detalle a continuación.

Generación y Manipulación de Ácidos Nucleicos

La divulgación proporciona ácidos nucleicos aislados y recombinantes, por ejemplo, polinucleótidos que tienen una identidad de secuencias con la SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:17, SEQ ID NO:19, SEQ ID NO:21, SEQ ID NO:23, SEQ ID NO:25, SEQ ID NO:27, SEQ ID NO:29, SEQ ID NO:31, SEQ ID NO:33, SEQ ID NO:35, SEQ ID NO:37, SEQ ID 45 NO:39, SEQ ID NO:41, SEQ ID NO:43, SEQ ID NO:45, SEQ ID NO:47, SEQ ID NO:49, SEQ ID NO:51, SEQ ID NO:53, SEQ ID NO:55, SEQ ID NO:57, SEQ ID NO:59, SEQ ID NO:61, SEQ ID NO:63, SEQ ID NO:65, SEQ ID NO:67, SEQ ID NO:69, SEQ ID NO:71, SEQ ID NO:73, SEQ ID NO:75, SEQ ID NO:77, SEQ ID NO:79, SEQ ID NO:81, SEQ ID NO:83, SEQ ID NO:85, SEQ ID NO:87, SEQ ID NO:89, SEQ ID NO:91, SEQ ID NO:93, SEQ ID NO:95, SEQ ID NO:97, SEQ ID NO:99, SEQ ID NO:101, SEQ ID NO:103, SEQ ID NO:105, SEQ ID NO:107, SEQ ID NO:109, SEQ ID NO:111, SEQ ID NO:113, SEQ ID NO:115, SEQ ID NO:117, SEQ ID NO:119, SEQ ID NO:121, SEQ ID NO:123, SEQ ID NO:125, SEQ ID NO:127, SEQ ID NO:129, SEQ ID NO:131 or SEQ ID NO:133; ácidos nucleicos que codifican polipéptidos SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:18, SEQ ID NO:20, SEQ ID NO:22, SEQ ID NO:24, SEQ ID NO:26, SEQ ID NO:28, SEQ ID NO:30, SEQ ID NO:32, SEQ ID NO:34, SEQ ID NO:36, SEQ ID NO:38, SEQ ID

55 NO:40, SEQ ID NO:42, SEQ ID NO:44, SEQ ID NO:46, SEQ ID NO:48, SEQ ID NO:50, SEQ ID NO:52, SEQ ID NO:54, SEQ ID NO:56, SEQ ID NO:58, SEQ ID NO:60, SEQ ID NO:62, SEQ ID NO:64, SEQ ID NO:66, SEQ ID NO:68, SEQ ID NO:70, SEQ ID NO:72, SEQ ID NO:74, SEQ ID NO:76, SEQ ID NO:78, SEQ ID NO:80, SEQ ID NO:82, SEQ ID NO:84, SEQ ID NO:86, SEQ ID NO:88, SEQ ID NO:90, SEQ ID NO:92, SEQ ID NO:94, SEQ ID NO:96, SEQ ID NO:98, SEQ ID NO:100, SEQ ID NO:102, SEQ ID NO:104, SEQ ID NO:106, SEQ ID NO:108, SEQ ID NO:110, SEQ ID NO:112, SEQ ID NO:114, SEQ ID NO:116, SEQ ID NO:118, SEQ ID NO:120, SEQ ID NO:122, SEQ ID NO:124, SEQ ID NO:126, SEQ ID NO:128, SEQ ID NO:130, SEQ ID NO:132 or SEQ ID NO:134.

Los ácidos nucleicos también pueden comprender casetes de expresión, tales como vectores de expresión, en los que en un aspecto, codifican a un polipéptido de la divulgación. La divulgación incluye también métodos para 65 descubrir nuevas secuencias de pectato liasa usando los ácidos nucleicos. La divulgación incluye también métodos para inhibir la expresión de genes de pectato liasa, transcritos y polipéptidos usando los ácidos nucleicos. Se

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propocionan también métodos para modificar los ácidos nucleicos, por ejemplo, mediante reensamblaje de ligamiento sintético, sistema de evolución dirigida optimizado y/o mutagénesis por saturación de sitio génico (GSSM™).

5 Los ácidos nucleicos se pueden preparar, aislar y/o manipular, por ejemplo, mediante clonación y expresión de bibliotecas de ADNc, amplificación de mensajes o ADN genómico mediante PCR, y similares. En la puesta en práctica de los métodos, los genes homólogos se pueden modificar mediante manipulación de un ácido nucleico molde, como se describe en el presente documento. Esto se puede poner en práctica en conjunto con cualquier método o protocolo o dispositivo conocido en la técnica, que se describen bien en la bibliografía científica y de

10 patente.

Técnicas Generales

Los ácidos nucleicos, bien ARN, iARN (es decir, ARNi), ácido nucleico antisentido, ADNc, ADN genómico, vectores,

15 virus o híbridos de los mismos, se pueden aislar a partir de una diversidad de fuentes, se pueden modificar por ingeniería genética, amplificar, y/o expresar/generar de forma recombinante. Los polipéptidos recombinantes generados a partir de estos ácidos nucleicos se pueden aislar o clonar de forma individual y someter a ensayo para una actividad deseada. Se puede usar cualquier sistema de expresión recombinante, incluyendo sistemas de expresión bacteriana, mamífero, levadura, insecto o célula vegetal.

20 Como alternativa, estos ácidos nucleicos se pueden sintetizar in vitro mediante técnicas de síntesis química bien conocidas, como se describe, por ejemplo, en Adams (1983) J. Am. Chem. Soc. 105: 661; Belousov (1997) Nucleic Acids Res. 25: 3440-3444; Frenkel (1995) Free Radic. Biol. Med. 19: 373-380; Blommers (1994) Biochemistry 33: 7886-7896; Narang (1979) Meth. Enzymol. 68: 90; Brown (1979) Meth. Enzymol. 68: 109; Beaucage (1981) Tetra.

25 Lett. 22: 1859; documento de Patente de Estados Unidos Nº 4.458.066.

Las técnicas para la manipulación de ácidos nucleicos, tales como, por ejemplo, subclonación, sondas de marcado (por ejemplo, marcado de cebador aleatorio usando Klenow polimerasa, traducción de la cabeza, amplificación), secuenciación, hibridación y similares se describen bien en la bibliografía científica y de patente, véase, por ejemplo,

30 Sambrook, ed., MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL (2ª ED.), Vols. 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory, (1989); CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, Ausubel, ed. John Wiley & Sons, Inc., Nueva York (1997); LABORATORY TECHNIQUES IN BIOCHEMISTRY AND MOLECULAR BIOLOGY: HYBRIDIZATION WITH NUCLEIC ACID PROBES, Parte I. Theory and Nucleic Acid Preparation, Tijssen, ed. Elsevier, N.Y. (1993).

35 Otro medio útil para obtener y manipular ácidos nucleicos usados en la práctica de los métodos es clonar a partir de muestras genómicas, y, si se desea, identificar sistemáticamente volver a clonar insertos aislados o amplificados de, por ejemplo, clones genómicos o clones de ADNc. Las fuentes de ácidos nucleicos usados en los métodos incluyen bibliotecas genómicas o de ADNc contenidas, por ejemplo, en cromosomas artificiales de mamífero (MAC), véase,

40 por ejemplo, los documentos de Patente de Estados Unidos Nºs 5.721.118; 6.025.155; cromosomas artificiales humanos, véase, por ejemplo, Rosenfeld (1997) Nat. Genet. 15: 333-335; cromosomas artificiales de levadura (YAC); cromosomas artificiales bacterianos (BAC); cromosomas artificiales P1, véase, por ejemplo, Woon (1998) Genomics 50: 306-316; vectores derivados de P1 (PAC), véase, por ejemplo, Kern (1997) Biotechniques 23: 120124; cósmidos, virus recombinantes, fagos o plásmidos.

45 En un aspecto, un ácido nucleico que codifica un polipéptido se ensambla en una fase apropiada con una secuencia directora capaz de dirigir la secreción del polipéptido traducido o fragmentos del mismo.

La divulgación proporciona proteínas de fusión y ácidos nucleicos que las codifican. Un polipéptido de la divulgación

50 se puede fusionar con un péptido o polipéptido heterólogo, tales como péptidos de identificación N-terminal que transmiten características deseadas, tales como aumento de la estabilidad o purificación simplificada. Los péptidos y polipéptidos de la divulgación también se pueden sintetizar y expresar como proteínas de fusión con uno o más dominios adicionales unidos a los mismos para, por ejemplo, producir un péptido más inmunogénico, para aislar más fácilmente un péptido sintetizado de forma recombinante, para identificar y aislar anticuerpos y linfocitos B que

55 expresan anticuerpo, y similares. Los dominios que facilitan detección y purificación incluyen, por ejemplo, péptidos quelantes de metales tales como tramos de polihistidina y módulos de histidina-triptófano que permiten la purificación sobre metales inmovilizados, dominios de proteína A que permiten la purificación sobre inmunoglobulina inmovilizada, y el dominio usado en el sistema de purificación por extensión/afinidad FLAGS (Immunex Corp, Seattle WA). La inclusión de una secuencia conectora de escisión tal como Factor Xa o enteroquinasa (Invitrogen, San

60 Diego CA) entre un dominio de purificación y el péptido o polipéptido que comprende motivo para facilitar la purificación. Por ejemplo, un vector de expresión puede incluir una secuencia de ácidos nucleicos que codifica epítopos unidos a seis restos de histidina seguido de una tiorredoxina y un sitio de escisión de enteroquinasa (véase por ejemplo, Williams (1995) Biochemistry 34: 1787-1797; Dobeli (1998) Protein Expr. Purif. 12: 404-414). Los restos de histidina facilitan la detección y purificación mientras que el sitio de escisión de enteroquinasa proporciona un

65 medio para purificar el epítopo del resto de la proteína de fusión. La tecnología perteneciente a vectores que codifican proteínas de fusión y la aplicación de proteínas de fusión se describen bien en la bibliografía científica y de patente, véase por ejemplo, Kroll (1993) DNA Cell. Biol., 12: 441-53.

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Secuencias de control de transcripción y traducción

5 La divulgación proporciona secuencias de ácidos nucleicos (por ejemplo, ADN) unidas de forma operativa a secuencia o secuencias de control de expresión (por ejemplo, transcripción o traducción), por ejemplo, promotores o potenciadores, para dirigir o modular la síntesis/expresión del ARN. La secuencia de control de expresión puede ser un vector de expresión. Los promotores bacterianos a modo de ejemplo incluyen lacI, lacZ, T3, T7, gpt, lambda PR, PL y tip. Los promotores eucariotas a modo de ejemplo incluyen promotor inmediato temprano de CMV, timidina quinasa de VHS, SV40 temprano y tardío, LTR de retrovirus, y metalotioneína I de ratón.

Los promotores adecuados para la expresión de un polipéptido en bacterias incluyen los promotores de lac o trp E. coli, el promotor lacI, el promotor lacZ, el promotor T3, el promotor T7, el promotor gpt, el promotor lambda PR, el

15 promotor lambda PL, los promotores de operones que codifican enzimas glicolíticas tales como 3-fosfoglicerato quinasa (PGK), y el promotor de fosfatasa ácida. Los promotores eucariotas incluyen el promotor temprano inmediato de CMV, el promotor de timidina quinasa de VHS, promotores de choque térmico, el promotor SV40 temprano y tardío, LTR de retrovirus, y el promotor de metalotioneína I de ratón. También se pueden usar otros promotores conocidos porque controlan la expresión de genes en células procariotas o eucariotas o sus virus.

Promotores Vegetales Específicos de Tejido

La divulgación proporciona casetes de expresión que se pueden expresar de una manera específica de tejido, por ejemplo, que pueden expresar una pectato liasa de la divulgación de una manera específica de tejido. La divulgación

25 también proporciona plantas o semillas que expresan una pectato liasa de la divulgación de una manera específica de tejido. La especificidad de tejido puede ser específica de semilla, específica de tallo, específica de hoja, específica de raíz, específica de fruta y similares.

En un aspecto, un promotor constitutivo tal como el promotor CaMV 35S se puede usar para expresión en partes específicas de la planta o semilla o por toda la planta. Por ejemplo, para sobreexpresión, se puede usar un fragmento de promotor vegetal que dirigirá la expresión de un ácido nucleico en algunos o todos los tejidos de una planta, por ejemplo, una planta regenerada. En el presente documento tales promotores se denominan promotores "constitutivos" y son activos en la mayoría de las condiciones ambientales y estados de desarrollo o diferenciación celular. Los ejemplos de promotores constitutivos incluyen la región de inicio de la transcripción del virus del mosaico

35 de la coliflor (CaMV) 35S, el promotor 1' o 2' derivados de T-ADN de Agrobacterium tumefaciens y cualquier otra región de inicio de la transcripción de diversos genes vegetales conocidos por los expertos. Tales genes incluyen, por ejemplo, ACT11 de Arabidopsis (Huang (1996) Plant Mol. Biol. 33: 125-139); Cat3 de Arabidopsis (GenBank Nº U43147, Zhong (1996) Mol. Gen. Genet. 251: 196-203); el gen que codifica la proteína desaturasa vehículo de estearoíl-acilo de Brassica napus (Genbank Nº X74782, Solocombe (1994) Plant Physiol. 104: 1167-1176); GPc1 de maíz (GenBank Nº X15596; Martinez (1989) J. Mol. Biol 208: 551-565); el Gpc2 de maíz (GenBank Nº U45855, Manjunath (1997) Plant Mol. Biol. 33: 97-112); promotores vegetales que se describen en los documentos de Patente de Estados Unidos Nºs 4.962.028; 5.633.440.

La divulgación usa promotores específicos de tejido o constitutivos derivados de virus que pueden incluir, por

45 ejemplo, el promotor subgenómico de tobamovirus (Kumagai (1995) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92: 1679-1683; el virus baciliforme del tungro del arroz (RTBV), que se replica solamente en células del floema en plantas de arroz infectadas, con su promotor que dirige una fuerte expresión del gen indicador específico del floema; el promotor del virus del mosaico de la vena de la yuca (CVMV), con su actividad más elevada en elementos vasculares, en células del mesófilo de la hoja, y en puntas de las raíces (Verdaguer (1996) Plant Mol. Biol. 31: 1129-1139).

Como alternativa, el promotor vegetal puede dirigir la expresión del ácido nucleico que expresa pectato liasa en un tejido, órgano o tipos celulares específicos (es decir, promotor específico de tejidos) o de otro modo puede estar bajo un control ambiental o de desarrollo más preciso o bajo el control de un promotor inducible. Los ejemplos de condiciones ambientales que pueden influir en la transcripción incluyen condiciones anaeróbicas, temperatura

55 elevada, la presencia de luz, o pulverizaciones con agentes químicos/hormonas. Por ejemplo, la divulgación incorpora el promotor inducible de la sequía del maíz (Busk (1997) mencionado anteriormente); el promotor del frío, sequía, y alto contenido salino inducible de la patata (Kirch (1997) Plant Mol. Biol. 33: 897 909).

Los promotores específicos de tejido pueden estimular la transcripción solamente dentro de un cierto marco de tiempo de la etapa de desarrollo dentro de ese tejido. Véase, por ejemplo, Blazquez (1998) Plant Cell 10: 791-800, que caracteriza el promotor del gen LEAFY de Arabidopsis. Véase también Cardon (1997) Plant J 12: 367-77, que describe el factor de transcripción SPL3, que reconoce un motivo de secuencia conservada en la región del promotor del gen AP1 de identidad del meristemo floral de A. thaliana; y Mandel (1995) Plant Molecular Biology, Vol. 29, pp 995-1004, que describe el promotor del meristemo eIF4. Se pueden usar promotores específicos de tejido que son 65 activos durante todo el ciclo de vida de un tejido particular. En un aspecto, los ácidos nucleicos se unen de forma operativa a un promotor activo principalmente solo en células de fibra de algodón. En un aspecto, los ácidos nucleicos se unen de forma operativa a un promotor activo principalmente durante las etapas de elongación de la célula de fibra de algodón, por ejemplo, como se describe en Rinehart (1996) mencionado anteriormente. Los ácidos nucleicos se pueden unir de forma operativa al promotor del gen Fbl2A para que se expresen de forma preferente en células de fibra de algodón (en el mismo lugar). Véase también, John (1997) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 57695 5773; John, et al., documentos de Patente de Estados Unidos Nºs 5.608.148 y 5.602.321, que describen promotores específicos de fibra de algodón y métodos para la construcción de plantas de algodón transgénicas. También se pueden usar promotores específicos de raíz para expresar los ácidos nucleicos. Los ejemplos de promotores específicos de raíz incluyen el promotor del gen de la alcohol deshidrogenasa (DeLisle (1990) Int. Rev. Cytol. 123: 39-60). Otros promotores que se pueden usar para expresar los ácidos nucleicos incluyen, por ejemplo, promotores específicos de óvulo, específicos de embrión, específicos de endospermo, específicos de integumento, específicos de revestimiento de semillas, o algunas combinaciones de los mismos; un promotor específico de hoja (véase, por ejemplo, Busk (1997) Plant J. 11: 1285 1295, que describe un promotor específico de hoja en maíz); el promotor ORF13 de Agrobacterium rhizogenes (que presenta una actividad elevada en raíces, véase, por ejemplo, Hansen (1997) mencionado anteriormente); un promotor específico del polen de maíz (véase, por ejemplo, Guerrero (1990) 15 Mol. Gen. Genet. 224: 161 168); se puede usar un promotor del tomate activo durante la maduración del fruto, senescencia y abscisición de las hojas y, en menor medida, de las flores (véase, por ejemplo, Blume (1997) Plant J.

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12: 731 746); un promotor específico de pistilo del gen SK2 de la patata (véase, por ejemplo, Ficker (1997) Plant Mol. Biol. 35: 425 431); el gen Blec4 del guisante, que es activo en el tejido epidérmico de ápices de raíz vegetativos y florales de alfalfa transgénica lo que lo convierte en una herramienta útil para dirigir la expresión de genes extraños a la capa epidérmica de fibras o brotes con crecimiento activo; el gen BEL1 específico de óvulo (véase, por ejemplo, Reiser (1995) Cell 83: 735-742, GenBank Nº U39944); y/o, el promotor en Klee, documento de Patente de Estados Unidos Nº 5.589.583, que describe una región promotora de planta que es capaz de transmitir niveles elevados de transcripción en el tejido meristemático y/o células que se dividen rápidamente.

25 Como alternativa, los promotores de plantas que son inducibles después de su exposición a hormonas de plantas, tales como auxinas, se usan para expresar los ácidos nucleicos. Algunos ejemplos son el fragmento del promotor E1 de elementos de respuesta a auxina (AuxREs) en la semilla de soja (Glycine max L.) (Liu (1997) Plant Physiol. 115: 397-407); el promotor GST6 de Arabidopsis sensible a auxina (también sensible al ácido salicílico y al peróxido de hidrógeno) (Chen (1996) Plant J. 10: 955-966); el promotor parC inducible por auxina del tabaco (Sakai (1996) 37: 906-913); un elemento de respuesta a biotina en plantas (Streit (1997) Mol. Plant Microbe Interact. 10: 933-937); y, el promotor sensible al ácido abscísico de la hormona del estrés (Sheen (1996) Science 274: 1900-1902).

Los ácidos nucleicos también se pueden unir de forma operativa a promotores de plantas que son inducibles después de su exposición a reactivos químicos que se pueden aplicar a la planta, tales como herbicidas o 35 antibióticos. Por ejemplo, se puede usar el promotor In2-2 del maíz, activado por protectores del herbicida de bencenosulfonamida (De Veylder (1997) Plant Cell Physiol. 38: 568-577); la aplicación de diferentes protectores de herbicidas induce distintos patrones de expresión génica, incluyendo la expresión en la raíz, hidatodos, y en el meristemo apical de la raíz. La secuencia de codificación puede estar bajo el control de, por ejemplo, un promotor inducible por tetraciclina, por ejemplo, como se describe con plantas de tabaco transgénicas que contienen el gen de la arginina descarboxilasa de Avena sativa L. (avena) (Masgrau (1997) Plant J. 11: 465-473); o, un elemento sensible al ácido salicílico (Stange (1997) Plant J. 11: 1315-1324). Usando promotores inducidos de forma química (por ejemplo, hormona o pesticida), es decir, promotor sensible a un agente químico que se puede aplicar a la planta transgénica en el campo, la expresión de un polipéptido de la divulgación se puede inducir en una etapa del desarrollo de la planta en particular. Por lo tanto, esto también proporciona plantas transgénicas que contienen un

45 gen inducible que codifica polipéptidos de la divulgación cuya gama de hospedadores se limita a especies vegetales diana, tales como maíz, arroz, cebada, trigo, patata u otros cultivos, inducible en cualquier etapa del desarrollo del cultivo.

Un experto reconocerá que un promotor vegetal específico de tejido puede dirigir la expresión de secuencias unidas de forma operativa en tejidos distintos del tejido diana. Por lo tanto, un promotor específico de tejido es uno que dirige la expresión preferentemente en el tejido diana o tipo de célula, pero también puede conducir a una cierta expresión en otros tejidos.

Los ácidos nucleicos también se pueden unir de forma operativa a promotores vegetales que son inducibles después

55 de su exposición a reactivos químicos. Estos reactivos incluyen, por ejemplo, herbicidas, auxinas sintéticas, o antibióticos que se pueden aplicar, por ejemplo, pulverizar, en plantas transgénicas. La expresión inducible de los ácidos nucleicos que producen pectato liasa permitirá al cultivador seleccionar plantas con la expresión y/o actividad de pectato liasa óptima. El desarrollo de partes de plantas se puede controlar de este modo. Esto proporciona los medios para facilitar la cosecha de plantas y partes de plantas. Por ejemplo, en diversas realizaciones, se usa el promotor In2-2 del maíz, activado por protectores de herbicidas de bencenosulfonamida (De Veylder (1997) Plant Cell Physiol. 38: 568-577); la aplicación de diferentes protectores de herbicidas induce distintos patrones de expresión génica, que incluyen la expresión en la raíz, hidatodos, y en el meristemo apical de la raíz. Las secuencias de codificación también están bajo el control de un promotor inducible por tetraciclina, por ejemplo, como se describe con plantas de tabaco transgénicas que contienen el gen de la arginina descarboxilasa de la Avena sativa L. (avena)

65 (Masgrau (1997) Plant J. 11: 465-473); o, un elemento sensible al ácido salicílico (Stange (1997) Plant J. 11: 13151324). 24

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Si se desea una expresión apropiada del polipéptido, se debería incluir una región de poliadenilación en el extremo en la posición 3' de la región de codificación. La región de poliadenilación se puede derivar del gen natural, a partir de una diversidad de otros genes vegetales, o de genes en el T-ADN de Agrobacterial.

5

Vectores de expresión y vehículos de clonación

Los vectores de expresión y vehículos de clonación comprenden ácidos nucleicos de la divulgación, por ejemplo, secuencias que codifican las pectato liasas de la divulgación. Los vectores de expresión y vehículos de clonación pueden comprender partículas virales, baculovirus, fago, plásmidos, fagémidos, cósmidos, fósmidos, cromosomas artificiales bacterianos, ADN viral (por ejemplo, vaccinia, adenovirus, virus de la viruela aviar, pseudorrabia y derivados de SV40), cromosomas artificiales basados en P1, plásmidos de levadura, cromosomas artificiales de levadura, y cualquier otro vector específico de hospedadores específicos de interés (tales como Bacillus, Aspergillus y levadura). Los vectores pueden incluir secuencias de ADN cromosómico, no cromosómico y sintético. Los expertos

15 en la materia conocen grandes números de vectores adecuados, y están disponibles en el mercado. Los vectores a modo de ejemplo incluyen: bacterianos: vectores pQE (Qiagen), plásmidos pBluescript, vectores pNH, (vectores lambda-ZAP (Stratagene); ptrc99a, pKK223-3, pDR540, pRIT2T (Pharmacia); Eucariotas: pXT1, pSG5 (Stratagene), pSVK3, pBPV, pMSG, pSVLSV40 (Pharmacia). Sin embargo, se puede usar cualquier otro plásmido u otro vector siempre y cuando se puedan replicar y sean viables en el hospedador. Se pueden usar vectores con número de copias bajo o número de copias elevado.

El vector de expresión puede comprender un promotor, un sitio de unión a ribosoma para inicio de la traducción y un terminador de la transcripción. El vector también puede incluir secuencias apropiadas para la amplificación de la expresión. Los vectores de expresión de mamíferos pueden comprender un origen de replicación, cualesquiera sitios

25 de unióna ribosomas necesarios, un sitio de poliadenilación, sitios donantes y aceptores de corte y empalme, secuencias de terminación de la transcripción, y secuencias no transcritas de flanqueo en la posición 5'. En algunos aspectos, las secuencias de ADN derivadas de los sitios de corte y empalme y poliadenilación de SV40 se pueden usar para proporcionar los elementos genéticos no transcritos necesarios.

En un aspecto, los vectores de expresión contienen uno o más genes marcadores que se pueden seleccionar para permitir la selección de células hospedadoras que contienen el vector. Tales marcadores seleccionables incluyen genes que codifican la dihidrofolato reductasa o genes que confieren resistencia a neomicina para cultivo de células eucariotas, genes que confieren resistencia a tetraciclina o ampicilina en E. coli, y el gen TRP1 de S. cerevisiae. Las regiones promotoras se pueden seleccionar a partir de cualquier gen deseado usando vectores de cloramfenicol

35 transferasa (CAT) u otros vectores con marcadores seleccionables.

Los vectores para expresión del polipéptido o fragmento del mismo en células eucariotas también pueden contener potenciadores para aumentar los niveles de expresión. Los potenciadores son elementos de ADN de actuación cis, normalmente de aproximadamente 10 pb a aproximadamente 300 pb de longitud que actúan sobre un promotor para aumentar su transcripción. Los ejemplos incluyen el potenciador SV40 en el lado tardío del origen de replicación de 100 pb a 270 pb, el potenciador del promotor temprano del citomegalovirus, el potenciador de polioma en el lado tardío del origen de replicación, y los potenciadores de adenovirus.

Una secuencia de ácidos nucleicos se puede insertar en un vector mediante una diversidad de procedimientos. En

45 general, la secuencia se liga con la posición deseada en el vector después de la digestión del inserto y el vector con endonucleasas de restricción apropiadas. Como alternativa, se pueden ligar extremos romos tanto en el inserto como en el vector. En la técnica se conoce una diversidad de técnicas de clonación, por ejemplo, como se describe en Ausubel y Sambrook. Se considera que tales procedimientos y otros están dentro del alcance de los expertos en la materia.

El vector puede estar en forma de un plásmido, una partícula viral, o un fago. Otros vectores incluyen secuencias de ADN cromosómico, no cromosómico y sintético, derivados de SV40; plásmidos bacterianos, ADN de fagos, baculovirus, plásmidos de levadura, vectores derivados de combinaciones de plásmidos y ADN de fagos, ADN viral tal como vaccinia, adenovirus, virus de la viruela aviar, y pseudorrabia. Una diversidad de vectores de clonación y

55 expresión para uso con hospedadores procariotas y eucariotas se describen, por ejemplo, en Sambrook.

Los vectores bacterianos en particular que se pueden usar incluyen los plásmidos disponibles en el mercado que comprenden elementos genéticos del vector de clonación bien conocido pBR322 (ATCC 37017), pKK223-3 (Pharmacia Fine Chemicals, Uppsala, Suecia), GEM1 (Promega Biotec, Madison, WI, USA) pQE70, pQE60, pQE-9 (Qiagen), pD10, psiX174 pBluescript II KS, pNH8A, pNH16a, pNH18A, pNH46A (Stratagene), ptrc99a, pKK223-3, pKK233-3, DR540, pRIT5 (Pharmacia), pKK232-8 y pCM7. Los vectores eucariotas en particular incluyen pSV2CAT, pOG44, pXT1, pSG (Stratagene) pSVK3, pBPV, pMSG, y pSVL (Pharmacia). Sin embargo, se puede usar cualquier otro vector siempre y cuando se pueda replicar y sea viable en la célula hospedadora.

65 Los ácidos nucleicos se pueden expresar en casetes de expresión, vectores o virus y se pueden expresar de forma transitoria o estable en células vegetales y semillas. Un sistema de expresión transitorio a modo de ejemplo usa sistemas de expresión episomales, por ejemplo, ARN viral del virus del mosaico de la coliflor (CaMV) generado en el núcleo por transcripción de un minicromosoma episomal que contiene ADN superenrollado, véase, por ejemplo, Covey (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 1633-1637. Como alternativa, se pueden insertar secuencias de codificación, es decir, todos o subfragmentos de secuencias en un genoma de célula hospedadora vegetal que se

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5 convierte en parte integral del ADN cromosómico del hospedador. Los transcritos sentido o antisentido se pueden expresar de esta manera. Un vector que comprende las secuencias (por ejemplo, promotores o regiones de codificación) de ácidos nucleicos de la divulgación puede comprender un gen marcador que confiere un fenotipo seleccionable en una célula vegetal o una semilla. Por ejemplo, el marcador puede codificar resistencia a biocidas, en particular resistencia a antibióticos, tal como resistencia a la kanamicina, G418, bleomicina, higromicina, o resistencia a herbicidas, tal como resistencia a clorosulfurón o Basta.

En la técnica se conocen bien vectores de expresión capaces de expresar ácidos nucleicos y proteínas en plantas, y pueden incluir, por ejemplo, vectores de Agrobacterium spp., virus X de la patata (véase, por ejemplo, Angell (1997) EMBO J. 16: 3675-3684), virus del mosaico del tabaco (véase, por ejemplo, Casper (1996) Gene 173: 69-73), virus 15 del enanismo arbustivo del tomate (véase, por ejemplo, Hillman (1989) Virology 169: 42-50), virus del grabado del tabaco (véase, por ejemplo, Dolja (1997) Virology 234: 243-252), luz del mosaico dorado de la judía (véase, por ejemplo, Morinaga (1993) Microbiol Immunol. 37: 471-476), virus del mosaico de la coliflor (véase, por ejemplo, Cecchini (1997) Mol. Plant Microbe Interact. 10: 1094-1101), elemento de transposición Ac/Ds del maíz (véase, por ejemplo, Rubin (1997) Mol. Cell. Biol. 17: 6294-6302; Kunze (1996) Curr. Top. Microbiol. Immunol. 204: 161-194), y el elemento de transposición supresor-mutador (Spm) del maíz (véase, por ejemplo, Schlappi (1996) Plant Mol. Biol.

32: 717-725); y derivados de los mismos.

En un aspecto, el vector de expresión puede tener dos sistemas de replicación para permitir que se mantenga en dos organismos, por ejemplo en células de mamífero o de insecto para expresión y en un hospedador procariota

25 para clonación y amplificación. Además, para lectores de expresión de integración, el vector de expresión puede contener al menos una secuencia homóloga con el genoma de la célula hospedadora. Puede contener dos secuencias homólogas que flanquean el constructo de expresión. El vector de integración se puede dirigir a un locus específico en la célula hospedadora por selección de la secuencia homóloga apropiada para inclusión en el vector. Los constructos para vectores de integración se conocen bien en la técnica.

Los vectores de expresión también pueden incluir un gen marcador seleccionable para permitir la selección de cepas bacterianas que se han transformado, por ejemplo, genes que hacen que la bacteria sea resistente a fármacos tales como ampicilina, cloramfenicol, eritromicina, kanamicina, neomicina y tetraciclina. Los marcadores seleccionables también pueden incluir genes biosintéticos, tales como los que se encuentran en las rutas biosintéticas de histidina,

35 triptófano y leucina.

Células hospedadoras y células transformadas

Una célula transformada comprende una secuencia de ácidos nucleicos de la divulgación, por ejemplo, una secuencia que codifica una pectato liasa de la divulgación, o un vector de la divulgación. La célula hospedadora puede ser cualquiera de las células hospedadoras familiares para los expertos en la materia, que incluyen células procariotas, células eucariotas, tales como células bacterianas, célula fúngicas, células de levadura, células de mamífero, células de insecto, o células vegetales. Las células bacterianas a modo de ejemplo incluyen E. coli, Streptomyces, Bacillus subtilis, Bacillus cereus, Salmonella typhimurium y diversas especies dentro de los géneros 45 Bacillus, Streptomyces, yStaphylococcus. Las células de insecto a modo de ejemplo incluyen S2 de Drosophila y Sf9 de Spodoptera. Las células de levadura a modo de ejemplo incluyen Pichia pastoris, Saccharomyces cerevisiae

oSchizosaccharomyces pombe. Las células animales a modo de ejemplo incluyen CHO, COS o melanoma de Bowes o cualquier línea celular de ratón o humana. La selección de un hospedador apropiado está dentro de las capacidades de los expertos en la materia. Las técnicas para transformar una gran diversidad de especies de plantas superiores se conocen bien y se describen en la bibliografía técnica y científica. Véase, por ejemplo, Weising (1988) Ann. Rev. Genet. 22: 421-477, documento de Patente de Estados Unidos Nº 5.750,870.

El vector se puede introducir en las células hospedadoras usando cualquiera de una diversidad de técnicas, que incluyen transformación, transfección, transducción, infección viral, pistolas de genes, o transferencia de genes

55 mediada por Ti. Los métodos en particular incluyen transfección con fosfato cálcico, transfección mediada con DEAE-Dextrano, lipofección, o electroporación (Davis, L., Dibner, M., Battey, I., Basic Methods in Molecular Biology, (1986)).

En un aspecto, los ácidos nucleicos o vectores se introducen en las células para la identificación sistemática, de este modo, los ácidos nucleicos entran en las células de una manera adecuada para expresión posterior del ácido nucleico. El método de introducción va dictado en gran medida por el tipo de célula a la que se dirige. Los métodos a modo de ejemplo incluyen precipitación con CaPO4, fusión de liposomas, lipofección (por ejemplo, LIPOFECTIN™), electroporación, infección viral, etc. Los ácidos nucleicos candidatos se pueden integrar de forma estable en el genoma de la célula hospedadora (por ejemplo, con introducción retroviral) o pueden existir de forma transitoria o de 65 forma estable en el citoplasma (es decir a través del uso de plásmidos tradicionales, usando secuencias reguladoras convencionales, marcadores de selección, etc.). Dado que muchas identificaciones sistemáticas farmacéuticamente

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importantes requieren dianas celulares humanas o de mamífero modelo, son preferentes los vectores retrovirales capaces de transfectar tales dianas.

Cuando sea apropiado, las células hospedadoras modificadas por ingeniería se pueden cultivar en medios nutrientes

5 convencionales modificados cuando sea apropiado para activación de promotores, selección de transformantes o amplificación de los genes de la divulgación. Después de la transformación de una cepa hospedadora adecuada y crecimiento de la cepa hospedadora hasta una densidad celular apropiada, el promotor seleccionado se puede inducir mediante medios apropiados (por ejemplo, desplazamiento de temperatura o inducción química) y las células se pueden cultivar durante un periodo adicional para permitir que produzcan el polipéptido o fragmento del mismo deseados.

Las células se pueden cosechar por centrifugación, interrumpir mediante medios físicos o químicos, y el extracto en bruto resultante se mantiene para purificación adicional. Las células microbianas usadas para expresión de proteínas se pueden interrumpir mediante cualquier método conveniente, que incluye ciclo de congelación

15 descongelación, sonicación, interrupción mecánica, o uso de agentes de lisado celular. Tales métodos son bien conocidos por los expertos en la materia. El polipéptido expresado o fragmento del mismo se puede recuperar y purificar a partir de cultivos de células recombinantes mediante métodos que incluyen precipitación con sulfato de amonio o etanol, extracción con ácido, cromatografía de intercambio aniónico o catiónico, cromatografía con fosfocelulosa, cromatografía por interacción hidrófoba, cromatografía por afinidad, cromatografía con hidroxilapatito y cromatografía con lectina. Se pueden usar etapas de replegamiento de proteínas, cuando sea necesario, para completar la configuración del polipéptido. Si se desea, se puede usar cromatografía líquida de alto rendimiento (HPLC) para las etapas de purificación final.

También se pueden usar diversos sistemas de cultivo de células de mamífero para expresar proteína recombinante.

25 Los ejemplos de sistemas de expresión de mamífero incluyen las líneas COS-7 de fibroblastos de riñón de mono y otras líneas celulares capaces de expresar proteínas a partir de un vector compatible, tal como las líneas celulares C127, 3T3, CHO, HeLa y BHK.

Los constructos en las células hospedadoras se pueden usar de manera convencional para producir el producto génico codificado por la secuencia recombinante. Dependiendo del hospedador usado en un procedimiento de producción recombinante, los polipéptidos producidos por las células hospedadoras que contienen el vector pueden estar glicosilados o pueden estar no glicosilados. Los polipéptidos de la divulgación también pueden incluir o no un resto inicial del aminoácido metionina.

35 También se pueden usar sistemas de traducción libres de células para producir un polipéptido de la divulgación. Los sistemas de traducción libres de células pueden usar ARNm transcritos a partir de un constructo de ADN que comprende un promotor unido de forma operativa a un ácido nucleico que codifica el polipéptido o fragmentos del mismo. En algunos aspectos, el constructo de ADN se puede linealizar antes de la realización de una reacción de transcripción in vitro. A continuación, el ARNm transcrito se incuba con un extracto de traducción libre de células apropiado, tal como un extracto de reticulocitos de conejo, para producir el polipéptido deseado o fragmento del mismo.

Los vectores de expresión pueden contener uno o más genes marcadores seleccionables para proporcionar un rasgo fenotípico para selección de células hospedadoras transformadas tales como dihidrofolato reductasa o

45 resistencia a neomicina para cultivo celular eucariota, o tal como resistencia a tetraciclina o ampicilina en E. coli.

Amplificación de Ácidos Nucleicos

Los ácidos nucleicos de la divulgación que codifican las pectato liasas de la divulgación, o ácidos nucleicos modificados de la divulgación, se pueden reproducir mediante amplificación. La amplificación también se puede usar para clonar o modificar los ácidos nucleicos. Por lo tanto, la divulgación proporciona secuencias cebadoras de amplificación para amplificar ácidos nucleicos de la divulgación. Un experto en la materia puede diseñar secuencias cebadoras de amplificación para cualquier parte o la longitud completa de estas secuencias. La divulgación proporciona un ácido nucleico amplificado mediante tal par cebador, por ejemplo un par cebador como se establecen 55 mediante aproximadamente los primeros (la posición 5') 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, o 25 restos de un ácido nucleico de la divulgación, y aproximadamente los primeros (la posición 5') 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, o 25 restos de la hebra complementaria (por ejemplo, de la SEC ID Nº: 1, SEC ID Nº: 3, SEC ID Nº: 5, SEC ID Nº: 7, SEC ID Nº: 9, SEC ID Nº: 11, SEC ID Nº: 13, SEC ID Nº: 15, SEC ID Nº: 17, SEC ID Nº: 19, SEC ID Nº: 21, SEC ID Nº: 23, SEC ID Nº: 25, SEC ID Nº: 27, SEC ID Nº: 29, SEC ID Nº: 31, SEC ID Nº: 33, SEC ID Nº: 35, SEC ID Nº: 37, SEC ID Nº: 39, SEC ID Nº: 41, SEC ID Nº: 43, SEC ID Nº: 45, SEC ID Nº: 47, SEC ID Nº: 49, SEC ID Nº: 51, SEC ID Nº: 53, SEC ID Nº: 55, SEC ID Nº: 57, SEC ID Nº: 59, SEC ID Nº: 61, SEC ID Nº: 63, SEC ID Nº: 65, SEC ID Nº: 67, SEC ID Nº: 69, SEC ID Nº: 71, SEC ID Nº: 73, SEC ID Nº: 75, SEC ID Nº: 77, SEC ID Nº: 79, SEC ID Nº: 81, SEC ID Nº: 83, SEC ID Nº: 85, SEC ID Nº: 87, SEC ID Nº: 89, SEC ID Nº: 91, SEC ID Nº: 93, SEC ID Nº: 95, SEC ID Nº: 97, SEC ID Nº: 99, SEC ID Nº: 101, SEC ID Nº: 103, SEC ID Nº: 105, SEC ID Nº: 107, SEC ID Nº: 109, SEC ID

65 Nº: 111, SEC ID Nº: 113, SEC ID Nº: 115, SEC ID Nº: 117, SEC ID Nº: 119, SEC ID Nº: 121, SEC ID Nº: 123, SEC ID Nº: 125, SEC ID Nº: 127, SEC ID Nº: 129, SEC ID Nº: 131, SEC ID Nº: 133). 27

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También se pueden usar reacciones de amplificación para cuantificar la cantidad de ácido nucleico en una muestra (tal como la cantidad de mensaje en una muestra de célula), marcar el ácido nucleico (por ejemplo, para aplicarlo a una matriz o una transferencia), detectar el ácido nucleico, o cuantificar la cantidad de un ácido nucleico específico

5 en una muestra. Se puede amplificar el mensaje aislado a partir de una célula o una biblioteca de ADNc.

El experto en la materia puede seleccionar y diseñar cebadores de amplificación de oligonucleótidos adecuados. En la técnica también se conocen métodos de amplificación, e incluyen, por ejemplo, reacción en cadena de la polimerasa, PCR (véase, por ejemplo, PCR PROTOCOLS, A GUIDE TO METHODS AND APPLICATIONS, ed. Innis, Academic Press, N.Y. (1990) y PCR STRATEGIES (1995), ed. Innis, Academic Press, Inc., N.Y., reacción en cadena de ligasa (LCR) (véase, por ejemplo, Wu (1989) Genomics 4: 560; Landegren (1988) Science 241: 1077; Barringer (1990) Gene 89:117); amplificación de la transcripción (véase, por ejemplo, Kwoh (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 1173); y, replicación de secuencias autosostenida (véase, por ejemplo, Guatelli (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 1874); amplificación de la Q Beta replicasa (véase, por ejemplo, Smith (1997) J. Clin. Microbiol.

15 35: 1477-1491), ensayo de amplificación automatizada de la Q-beta replicasa (véase, por ejemplo, Burg (1996) Mol. Cell. Probes 10: 257-271) y otras técnicas mediadas por la ARN polimerasa (por ejemplo, NASBA, Cangene, Mississauga, Ontario); véase también Berger (1987) Methods Enzymol. 152: 307-316; Sambrook; Ausubel; Patentes de Estados Unidos Nº 4.683.195 y 4.683.202; Sooknanan (1995) Biotechnology 13: 563-564.

Determinación del grado de identidad de secuencias

La divulgación proporciona ácidos nucleicos que comprenden secuencias que tienen una identidad de secuencia de al menos aproximadamente un 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 25 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, o mayor, o una identidad de secuencia completa (del 100%) con un ácido nucleico ejemplar de SEC ID Nº: 1, SEC ID Nº: 3, SEC ID Nº: 5, SEC ID Nº: 7, SEC ID Nº: 9, SEC ID Nº: 11, SEC ID Nº: 13, SEC ID Nº: 15, SEC ID Nº: 17, SEC ID Nº: 19, SEC ID Nº: 21, SEC ID Nº: 23, SEC ID Nº: 25, SEC ID Nº: 27, SEC ID Nº: 29, SEC ID Nº: 31, SEC ID Nº: 33, SEC ID Nº: 35, SEC ID Nº: 37, SEC ID Nº: 39, SEC ID Nº: 41, SEC ID Nº: 43, SEC ID Nº: 45, SEC ID Nº: 47, SEC ID Nº: 49, SEC ID Nº: 51, SEC ID Nº: 53, SEC ID Nº: 55, SEC ID Nº: 57, SEC ID Nº: 59, SEC ID Nº: 61, SEC ID Nº: 63, SEC ID Nº: 65, SEC ID Nº: 67, SEC ID Nº: 69, SEC ID Nº: 71, SEC ID Nº: 73, SEC ID Nº: 75, SEC ID Nº: 77, SEC ID Nº: 79, SEC ID Nº: 81, SEC ID Nº: 83, SEC ID Nº: 85, SEC ID Nº: 87, SEC ID Nº: 89, SEC ID Nº: 91, SEC ID Nº: 93, SEC ID Nº: 95, SEC ID Nº: 97, SEC ID Nº: 99, SEC ID Nº: 101, SEC ID Nº: 103, SEC ID Nº: 105, SEC ID Nº: 107, SEC ID Nº: 109, SEC ID Nº: 111, SEC ID Nº: 113, SEC ID Nº: 115, SEC ID Nº: 117, SEC ID Nº: 119, SEC ID Nº: 121, SEC ID Nº: 35 123, SEC ID Nº: 125, SEC ID Nº: 127, SEC ID Nº: 129, SEC ID Nº: 131, SEC ID Nº: 133, y ácidos nucleicos que codifican las SEC ID Nº: 2, SEC ID Nº: 4, SEC ID Nº: 6, SEC ID Nº: 8, SEC ID Nº: 10, SEC ID Nº: 12, SEC ID Nº: 14, SEC ID Nº: 16, SEC ID Nº: 18, SEC ID Nº: 20, SEC ID Nº: 22, SEC ID Nº: 24, SEC ID Nº: 26, SEC ID Nº: 28, SEC ID Nº: 30, SEC ID Nº: 32, SEC ID Nº: 34, SEC ID Nº: 36, SEC ID Nº: 38, SEC ID Nº: 40, SEC ID Nº: 42, SEC ID Nº: 44, SEC ID Nº: 46, SEC ID Nº: 48, SEC ID Nº: 50, SEC ID Nº: 52, SEC ID Nº: 54, SEC ID Nº: 56, SEC ID Nº: 58, SEC ID Nº: 60, SEC ID Nº: 62, SEC ID Nº: 64, SEC ID Nº: 66, SEC ID Nº: 68, SEC ID Nº: 70, SEC ID Nº: 72, SEC ID Nº: 74, SEC ID Nº: 76, SEC ID Nº: 78, SEC ID Nº: 80, SEC ID Nº: 82, SEC ID Nº: 84, SEC ID Nº: 86, SEC ID Nº: 88, SEC ID Nº: 90, SEC ID Nº: 92, SEC ID Nº: 94, SEC ID Nº: 96, SEC ID Nº: 98, SEC ID Nº: 100, SEC ID Nº: 102, SEC ID Nº: 104, SEC ID Nº: 106, SEC ID Nº: 108, SEC ID Nº: 110, SEC ID Nº: 112, SEC ID Nº: 114, SEC ID Nº: 116, SEC ID Nº: 118, SEC ID Nº: 120, SEC ID Nº: 122, SEC ID Nº: 124, SEC ID Nº: 126, SEC ID Nº: 128, SEC ID Nº: 130, SEC

45 ID Nº: 132 o SEC ID Nº: 134 sobre una región de al menos aproximadamente 50, 75, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000, 1050, 1100, 1150, 1200, 1250, 1300, 1350, 1400, 1450, 1500, 1550 o más restos. La divulgación proporciona polipéptidos que comprenden secuencias que tienen una identidad de secuencia de al menos aproximadamente un 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, o mayor, o una identidad de secuencia completa (del 100%) con un polipéptido ejemplar. El alcance de la identidad de la secuencia (homología) se puede determinar usando cualquier programa informático y parámetros asociados, que incluyen los que se describen en el presente documento, tal como BLAST 2.2.2, o FASTA versión 3.0t78, con los parámetros por defecto.

55 Las secuencias homólogas también incluyen secuencias de ARN en las que las uridinas sustituyen a las timinas en las secuencias de ácidos nucleicos. Las secuencias homólogas se pueden obtener usando cualquiera de los procedimientos que se describen en el presente documento o pueden resultar de la corrección de un error de secuenciación. Se observará que las secuencias de ácidos nucleicos como se establece en el presente documento se pueden representar en el formato de caracteres individuales tradicional (véase, por ejemplo, Stryer, Lubert. Biochemistry, 3ª Ed., W. H Freeman & Co., Nueva York) o bien cualquier otro formato que registre la identidad de los nucleótidos en una secuencia.

En el presente documento se usan diversos programas de comparación de secuencias identificados. Las

65 identidades (homologías) de las secuencias de proteínas y/o ácidos nucleicos se pueden evaluar usando cualquiera de la diversidad de algoritmos de comparación de secuencias y programas conocidos en la técnica. Tales algoritmos y programas incluyen, pero no se limitan a, TBLASTN, BLASTP, FASTA, TFASTA, y CLUSTALW (Pearson y Lipman, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85 (8): 2444-2448, 1988; Altschul et al., J. Mol. Biol. 215 (3): 403-410, 1990; Thompson et al., Nucleic Acids Res. 22 (2): 4673-4680, 1994; Higgins et al., Methods Enzymol. 266: 383-402, 1996; Altschul et al., J. Mol. Biol. 215 (3): 403-410, 1990; Altschul et al., Nature Genetics 3: 266-272, 1993).

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5 La homología o identidad se puede medir usando software de análisis de secuencia (por ejemplo, el Paquete de Software de Análisis de Secuencias del Grupo de Informática Genética, Centro de Biotecnología de la Universidad de Wisconsin, 1710 University Avenue, Madison, WI 53705). Tal software empareja secuencias similares mediante la asignación de grados de homología a diversas supresiones, instituciones y otras modificaciones. Los términos "homología" e "identidad" en el contexto de dos o más secuencias de ácidos nucleicos o polipéptidos, se refieren a dos o más secuencias o subsecuencias que son las mismas o tienen un porcentaje de restos de aminoácidos o nucleótidos especificado que son los mismos cuando se comparan y alinean para una correspondencia máxima sobre una ventana de comparación o región designada como se mide usando cualquier número de algoritmos de comparación de secuencias o mediante alineación manual e inspección visual. Para comparación de secuencias,

15 una secuencia puede actuar como una secuencia de referencia, por ejemplo, una secuencia de la divulgación, con la que se comparan las secuencias de ensayo. Cuando se usa un algoritmo de comparación de secuencias, las secuencias de ensayo y de referencia se introducen en un ordenador, se designan las coordenadas de la subsecuencia, si fuera necesario, y se designan los parámetros del programa de algoritmo de secuencias. Se pueden usar parámetros del programa por defecto, o parámetros alternativos. El algoritmo de comparación de secuencias calcula a continuación el porcentaje de identidades de secuencias para las secuencias de ensayo con respecto a la secuencia de referencia, basándose en los parámetros del programa.

Una "ventana de comparación", como se usa en el presente documento, incluye referencia a un segmento de uno cualquiera de los números de restos contiguos. Por ejemplo, los restos contiguos que varían en cualquier parte de 25 20 a la longitud completa de una secuencia de polipéptidos o ácidos nucleicos a modo de ejemplo se comparan con una secuencia de referencia del mismo número de posiciones contiguas después de haber alineado las dos secuencias de forma óptima. Si la secuencia de referencia tiene el requisito de identidad de secuencia con una secuencia de polipéptidos o ácidos nucleicos a modo de ejemplo, por ejemplo, una identidad de secuencias de un 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, o superior con una secuencia, esa secuencia está dentro del alcance deseado. En realizaciones alternativas, las subsecuencias que varían de aproximadamente 20 a 600, de aproximadamente 50 a 200, y de aproximadamente 100 a 150 se comparan con una secuencia de referencia del mismo número de posiciones contiguas después de haber alineado las dos secuencias de forma 35 óptima. En la técnica se conocen bien métodos para alineación de secuencias para comparación. La alineación de secuencias óptima para comparación se puede realizar, por ejemplo, mediante el algoritmo de homología local de Smith y Waterman, Adv. Appl. Math. 2: 482, 1981, mediante el algoritmo de alineación de homología de Needleman y Wunsch, J. Mol. Biol. 48: 443, 1970, mediante la búsqueda del método de similitud de Person y Lipman, Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 85: 2444, 1988, mediante implementaciones computarizadas de estos algoritmos (GAP, BESTFIT, FASTA, y TFASTA en el Paquete de Software de Genética de Wisconsin, Grupo de Informática Genética, 575 Science Dr., Madison, WI), o mediante alineación manual e inspección visual. Otros algoritmos para determinar la homología o identidad incluyen, por ejemplo, además de un programa BLAST (Herramienta de Búsqueda de Alineación Local Básica en el Centro Nacional para Información Biológica), ALIGN, AMAS (Análisis de Múltiples Secuencias Alineadas), AMPS (Alineación de Múltiples Secuencias de Proteínas), ASSET (Herramienta de 45 Evaluación Estadística de Segmentos Alineados), BANDS, BESTSCOR, BIOSCAN (Nodo de Análisis Comparativo de Secuencias Biológicas), BLIMPS (Buscador BLocks IMProved), FASTA, Intervals & Points, BMB, CLUSTAL V, CLUSTAL W, CONSENSUS, LCONSENSUS, WCONSENSUS, Smith-Waterman algorithm, algoritmo DARWIN Las Vegas, FNAT (Herramienta de Alineación Forzada de Nucleótidos), Framealign, Framesearch, DYNAMIC, FILTER, FSAP (Paquete de Análisis de Secuencias de Fristensky), GAP (Programa de Alineación Global), GENAL, GIBBS, GenQuest, ISSC (Comparación Sensible de Secuencias), LALIGN (Alineación de Secuencia Local), LCP (Programa de Contenido Local), MACAW (Mesa de Laboratorio de Construcción de Alineaciones múltiples y Análisis), MAP (Programa de Alineación Múltiple), MBLKP, MBLKN, PIMA (Alineación Multi-secuencia Inducida por Patrón), SAGA (Alineación de Secuencias mediante Algoritmo Genético) y WHAT-IF. Tales programas de alineación también se pueden usar para identificar sistemáticamente bases de datos del genoma para identificar secuencias de 55 polinucleótidos que tienen secuencias básicamente idénticas. Una serie de bases de datos del genoma están disponibles, por ejemplo, una parte básica del genoma humano está disponible como parte del Proyecto de Secuenciación del Genoma Humano (Gibbs, 1995). Se han secuenciado varios genomas, por ejemplo, M. genitalium et al., 1995), M. jannaschii (Bult et al., 1996), H. influenzae (Fleischmann et al., 1995), E. coli (Blattner et al., 1997), y levadura (S. cerevisiae) (Mewes et al., 1997), y D. melanogaster (Adams et al., 2000). También se han realizado progresos significativos en la secuenciación de los genomas de organismos modelo, tales como ratón, C. elegans, y Arabadopsis sp. Las bases de datos que contienen información genómica anotada con alguna información funcional se mantienen mediante diferente organización, y se puede acceder a ellas a través de internet.

Se usan también los algoritmos BLAST, BLAST 2.0 y BLAST 2.2.2. Éstos se describen, por ejemplo, en Altschul

65 (1977) Nuc. Acids Res. 25: 3389-3402; Altschul (1990) J. Mol. Biol. 215: 403-410. El software para realizar análisis BLAST está disponible al público a través del Centro Nacional para Información de Biotecnología. Este algoritmo

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implica primero la identificación de pares de secuencias con alta puntuación (HSP) mediante la identificación de palabras cortas de longitud W en la secuencia de consulta, que se empareja o satisface alguna puntuación de umbral con valor positivo T cuando se alinea con una palabra de la misma longitud en una secuencia de bases de datos. T se refiere al umbral de puntuación de la palabra vecina (Altschul (1990) mencionado anteriormente). Estos 5 aciertos en la palabra vecina inicial actúan como semillas para iniciar búsquedas para encontrar HSP de mayor longitud que las contienen. Los aciertos de palabras se extienden en ambas direcciones a lo largo de cada secuencia tan lejos como se pueda aumentar la puntuación de alineación acumulativa. Las puntuaciones acumulativas se calculan usando, para las secuencias de nucleótidos, los parámetros M (puntuación de recompensa para un par de restos coincidentes; siempre >0). Para secuencias de aminoácidos, se usa una matriz de puntuación 10 para calcular la puntuación acumulativa. La extensión de los aciertos de palabra en cada dirección se detienen cuando: la puntuación de la alineación acumulativa disminuye en la cantidad X desde su valor máximo conseguido; la puntuación acumulativa va a cero o inferior, debido a la acumulación de una o más alineaciones de restos de puntuación negativa; o se alcanza el extremo de cualquier secuencia. Los parámetros del algoritmo BLAST, W, T, y X, determinan la sensibilidad y la velocidad de la alineación. El programa BLASTN (para secuencias de nucleótidos) 15 usa como defectos una longitud de palabra (W) de 11, una expectativa (E) de 10, M = 5, N = -4 y una comparación de ambas hebras. Para secuencias de aminoácidos, el programa BLASTP usa como defectos una longitud de palabra de 3, y expectativas (E) de 10, y la matriz de puntuación de BLOSUM62 (véase Henikoff y Henikoff (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 10915) alineaciones (B) de 50, expectativa (E) de 10, M = 5, N = -4, y una comparación de ambas hebras. El algoritmo BLAST también realiza un análisis estadístico de la similitud entre dos 20 secuencias (véase, por ejemplo, Karlin y Altschul (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 5873). Una medida de la similitud proporcionada por el algoritmo BLAST es la probabilidad de la suma más pequeña (P(N)), que proporciona una indicación de la probabilidad mediante la que se podría producir un emparejamiento entre dos secuencias de nucleótidos o aminoácidos por casualidad. Por ejemplo, un ácido nucleico se considera similar a una secuencia de referencias si la probabilidad de la suma más pequeña en una comparación del ácido nucleico de ensayo con el 25 ácido nucleico de referencia es inferior a aproximadamente 0,2, más preferentemente inferior a aproximadamente 0,01, y lo más preferentemente inferior a aproximadamente 0,001. En un aspecto, las homologías de las secuencias de proteínas y ácidos nucleicos se evalúan usando la Herramienta de Búsqueda de Alineación Local Básica ("BLAST"). Por ejemplo, se pueden usar cinco programas BLAST específicos para realizar la siguiente tarea: (1) BLASTP y BLAST3 comparan una secuencia de consulta de aminoácidos frente a una base de datos de secuencias 30 de proteínas; (2) BLASTN compara una secuencia de consulta de nucleótidos frente a una base de datos de secuencias de nucleótidos; (3) BLASTX compara los productos de traducción conceptual de seis marcos de una secuencia de nucleótidos de consulta (ambas hebras) frente a una base de datos de secuencias de proteínas; (4) TBLASTN compara una secuencia de proteínas de consulta frente a una base de datos de secuencias de nucleótidos traducida en los seis marcos de lectura (ambas hebras); y, (5) TBLASTX compara las traducciones de 35 los seis marcos de una secuencia de consulta de nucleótidos frente a las traducciones de los seis marcos de una base de datos de secuencias de nucleótidos. Los programas BLAST identifican secuencias homólogas mediante la identificación de segmentos similares, que en el presente documento se denominan "pares de segmentos de puntuación elevada", entre una secuencia de consulta de aminoácidos o ácidos nucleicos y una secuencia de ensayo que se obtiene preferentemente a partir de una base de datos de secuencias de proteínas o de ácidos 40 nucleicos. Los pares de segmentos de puntuación elevada se identifican preferentemente (es decir, se alinean) por medio de una matriz de puntuación, muchas de las cuales se conocen en la técnica. Preferentemente la matriz de puntuación usada es la matriz BLOSUM62 (Gonnet et al., Science 256: 1443-1445, 1992; Henikoff y Henikoff, Proteins 17: 49-61, 1993). Menos preferentemente, también se pueden usar las matrices PAM o PAM250 (véase, por ejemplo, Schwartz y Dayhoff, eds., 1978, Matrices for Detecting Distance Relationships: Atlas of Protein

45 Sequence and Structure, Washington: National Biomedical Research Foundation).

Para determinar si un ácido nucleico tiene la identidad de secuencias necesaria para estar dentro del alcance deseado, se usa el programa NCBI BLAST 2.2.2, opciones por defecto a blastp. Existen aproximadamente 38 opciones de ajuste en el programa BLAST 2.2.2. En este ejemplo, se usan todos los valores por defecto excepto

50 para el ajuste de filtro por defecto (es decir, todos los parámetros se ajustan por defecto excepto el filtro que se ajusta en OFF); en su lugar se usa un ajuste "-F F", que desactiva el filtro. El uso del filtro por defecto a menudo da como resultado violaciones de Karlin-Altschul debido a la longitud corta de la secuencia.

Los valores por efecto usados incluyen:

55 "Filtro para complejidad baja: ON Tamaño de Palabra: 3 Matriz: Blosum62 Costes de Huecos: Existencia: 11

60 Extensión:1"

Otros ajustes por defecto pueden ser: filtro para baja complejidad OFF, tamaño de palabra de 3 para proteína, matriz BLOSUM62, penalización por existencia de huecos de -11 y una penalización de extensión de huecos de -1. Un ajuste del programa NCBI BLAST 2.2.2 a modo de ejemplo tiene la opción por defecto "-W" en 0. Esto significa que,

65 si no se realiza al ajuste, el tamaño de palabra tiene un defecto de 3 para proteínas y de 11 para nucleótidos.

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Sistemas informáticos y productos de programas informáticos

Para determinar e identificar identidades de secuencias, homologías estructurales, motivos y similares hechos mediante simulación computacional, la secuencia de la divulgación se puede almacenar, registrar, y manipular en

5 cualquier medio que se pueda leer y al que se pueda acceder mediante un ordenador. Por consiguiente, la divulgación proporciona ordenadores, sistemas informáticos, medios de lectura en ordenador, productos de programas informáticos y similares pueden tener registradas o almacenadas en los mismos las secuencias de ácidos nucleicos y polipéptidos de la divulgación. Como se usa en el presente documento, los términos "registrado" y "almacenado" se refieren a un proceso para almacenar información en un medio informático. Un experto en la materia puede adoptar fácilmente cualquier método conocido para registrar información en un medio de lectura en ordenador para generar preparaciones que comprenden una o más de las secuencias de ácidos nucleicos y/o polipéptidos de la divulgación.

Otro aspecto de la divulgación es un medio de lectura en ordenador que puede tener registrado en el mismo al

15 menos una secuencia de ácidos nucleicos y/o polipéptidos de la divulgación. Los medios de lectura en ordenador incluyen medios de lectura por vía magnética, medios de lectura por vía óptica, medios de lectura por vía electrónica y medios magnéticos/ópticos. Por ejemplo, los medios de lectura por ordenador pueden ser un disco duro, un disquete, una cinta magnética, CD-ROM, Disco Versátil Digital (DVD), Memoria de Acceso Aleatorio (RAM), o Memoria de Solo Lectura (ROM) así como otros tipos u otros medios conocidos por los expertos en la materia.

Los aspectos incluyen sistemas (por ejemplo, sistemas basados en internet), particularmente sistemas informáticos, que almacenan y manipulan las secuencias y la información de las secuencias que se describen en el presente documento. Un ejemplo de un sistema informático 100 se ilustra en forma de diagrama del bloque en la Figura 1. Como se usa en el presente documento, "sistema informático" se refiere a los componentes del hardware,

25 componentes del software, y componentes de almacenamiento de datos usados para analizar una secuencia de nucleótidos o polipéptidos. El sistema informático 100 puede incluir un procesador para procesar, acceder y manipular los datos de la secuencia. El procesador 105 puede ser cualquier tipo bien conocido de unidad de procesamiento central, tal como, por ejemplo, el Pentium III de Intel Corporation, o procesador similar de Sun, Motorola, Compaq, AMD o International Business Machines. El sistema informático 100 es un sistema con finalidad general que comprende el procesador 105 y uno o más componentes internos de almacenamiento de datos 110 para almacenamiento de datos, uno o más dispositivos de recuperación de datos para recuperar los datos almacenados en los componentes de almacenamiento de datos. Un experto en la materia puede observar fácilmente que son adecuados uno cualquiera de los sistemas informáticos disponibles en la actualidad.

35 En un aspecto, el sistema informático 100 incluye un procesador 105 conectado a un puerto que se conecta a una memoria principal 115 (preferentemente implementada como RAM) y uno o más dispositivos internos de almacenamiento de datos 110, tales como un disco duro y/u otros medios de lectura en ordenador que tienen datos registrados en los mismos. El sistema informático 100 puede incluir adicionalmente uno o más dispositivos de recuperación de datos 118 para la lectura de los datos almacenados en los dispositivos internos de almacenamiento de datos 110. El dispositivo de recuperación de datos 118 puede de representar, por ejemplo, una unidad de disquete, una unidad de disco compacto, una unidad de cinta magnética, o un módem capaz de conexión a un sistema remoto de almacenamiento de datos (por ejemplo, a través de internet) etc. En algunas realizaciones, el dispositivo de almacenamiento de datos interno 110 es un medio de lectura en ordenador extraíble tal como un disquete, un disco compacto, una cinta magnética, etc. que contiene lógica de control y/o datos registrados en el

45 mismo. El sistema informático 100 puede incluir de forma ventajosa o se puede programar mediante un software apropiado para la lectura de la lógica de control y/o los datos desde el componente de almacenamiento de datos una vez insertado en el dispositivo de recuperación de datos. El sistema informático 100 incluye una pantalla 120 que se usa para presentar la salida a un usuario del ordenador. También se debería indicar que el sistema informático 100 se puede unir a otros sistemas informáticos 125a-c en una red o red de área amplia para proporcionar acceso centralizado al sistema informático 100. El software para acceder y procesar las secuencias de nucleótidos o de aminoácidos puede residir en la memoria principal 115 durante la ejecución. En algunos aspectos, el sistema informático 100 puede comprender adicionalmente un algoritmo de comparación de secuencias para comparar una secuencia de ácidos nucleicos. El algoritmo y la secuencia o secuencias se pueden almacenar en un medio de lectura en ordenador. Un "algoritmo de comparación de secuencias" se refiere a uno o más programas que se

55 implementan (de forma local o de forma remota) en el sistema informático 100 para comparar una secuencia de nucleótidos con otras secuencias de nucleótidos y/o compuestos almacenados dentro de un medio de almacenamiento de datos. Por ejemplo, el algoritmo de comparación de secuencias puede comparar las secuencias de nucleótidos de la divulgación almacenadas en un medio de lectura en ordenador con secuencias de referencia almacenadas en un medio de lectura en ordenador para identificar homologías o motivos estructurales.

Los parámetros usados con los algoritmos mencionados anteriormente se pueden adaptar dependiendo de la longitud de la secuencia y el grado de homología estudiados. En algunos aspectos, los parámetros pueden ser los parámetros por defecto usados por los algoritmos en ausencia de instrucciones del usuario. La Figura 2 es un diagrama de flujo que ilustra un aspecto de un proceso 200 para comparar una nueva secuencia de nucleótidos o 65 proteínas con una base de datos de secuencias para determinar los niveles de homología entre la nueva secuencia y las secuencias en la base de datos. La base de datos de secuencias puede ser una base de datos privada almacenada dentro del sistema informático 100, o una base de datos pública tal como GENBANK que está disponible a través de Internet. El proceso 200 comienza en un estado de partida 201 y a continuación se mueve hasta un estado 202 en el que la nueva secuencia a comparar se almacena en una memoria en un sistema informático 100. Como se ha analizado anteriormente, la memoria podría ser cualquier tipo de memoria, incluyendo 5 RAM o un dispositivo de almacenamiento interno. El proceso 200 a continuación se mueve hasta un estado 204 en el que se abre una base de datos de secuencias para análisis y comparación. A continuación, el proceso 200 se mueve hasta un estado 206 en el que la primera secuencia almacenada en la base de datos se lee en una memoria en el ordenador. A continuación se realiza una comparación en un estado 210 para determinar si la primera secuencia es la misma que la segunda secuencia. Es importante indicar que esta etapa no se limita a la realización 10 de una comparación exacta entre la nueva secuencia y la primera secuencia en la base de datos. Los expertos en la materia conocen métodos bien conocidos para comparar dos secuencias de nucleótidos o de proteínas, incluso si no son idénticas. Por ejemplo, se pueden introducir huecos en una secuencia para aumentar el nivel de homología entre las dos secuencias sometidas a ensayo. Los parámetros que controlan si los huecos u otras características se introducen en una secuencia durante la comparación se introducen de forma normal por el usuario del sistema 15 informático. Una vez que se ha realizado una comparación de las dos secuencias en el estado 210, se realizó una determinación en el estado de decisión 210 si las dos secuencias son las mismas. Por supuesto, el término "mismas" no se limita a secuencias que son absolutamente idénticas. Las secuencias que están dentro de los parámetros de homología introducidos por el usuario se marcarán como "mismas" en el proceso 200. Si se realiza una determinación de que dos secuencias son las mismas, el proceso 200 se mueve a un estado 214 en el que se 20 presenta al usuario el nombre de la secuencia de la base de datos. Este estado notifica al usuario que la secuencia con el nombre presentado satisface las restricciones de homología que se introdujeron. Una vez que se presenta al usuario el nombre de la secuencia almacenada, el proceso 200 se mueve hasta un estado de decisión 218 en el que se realiza una determinación de si existen más secuencias en la base de datos. Si no existen más secuencias en la base de datos, entonces el proceso 200 termina en un estado final 220. Sin embargo, si existen más secuencias en 25 la base de datos, entonces el proceso 200 se mueve hasta un estado 224 en el que un puntero se mueve hasta la siguiente secuencia en la base de datos de modo que se puede comparar con la nueva secuencia. De este modo, la nueva secuencia se alinea y se compara con cada secuencia de la base de datos. Se debería indicar que sí se había realizado una determinación en el estado de decisión 212 de que las secuencias no fueran homólogas, entonces el proceso 200 se movería inmediatamente al estado de decisión 218 para determinar si cualquier otra 30 secuencia estaba disponible en la base de datos para comparación. Por consiguiente, un sistema informático comprende un procesador, un dispositivo de almacenamiento de datos que tiene almacenados en el mismo una secuencia de ácidos nucleicos de la divulgación y un comprador de secuencias para realizar la comparación. El comparador de secuencias puede indicar un nivel de homología entre las secuencias comparadas o identificar motivos estructurales, o puede identificar motivos estructurales en secuencias que se comparan con estos códigos 35 de ácidos nucleicos y códigos de polipéptidos. La Figura 3 es un diagrama de flujo que ilustra una realización de un proceso 250 en un ordenador para determinar si las dos secuencias son homólogas. El proceso 250 comienza en un estado de inicio 252 y a continuación se mueve hasta un estado 254 en el que se almacena una primera secuencia a comparar con una memoria. La segunda secuencia a comparar se almacena a continuación en una memoria en un estado 256. El proceso 250 se mueve a continuación hasta un estado 260 en el que el primer carácter en la primera 40 secuencia se lee y a continuación hasta un estado 262 en el que se lee el primer carácter de la segunda secuencia. Se debería entender que si la secuencia es una secuencia de nucleótidos, entonces el carácter sería normalmente cualquiera de A, T, C, G o U. Si la secuencia es una secuencia de proteínas, entonces puede ser un código de aminoácidos de una sola letra de modo que la primera y segunda secuencias se pueden comparar fácilmente. A continuación se realiza una determinación en un estado de decisión 264 sobre si los dos caracteres son los mismos. 45 Si son los mismos, entonces el proceso 250 se mueve hasta un estado 268 en el que se leen los siguientes caracteres en la primera y segunda secuencias. A continuación se realizó la determinación de si los siguientes caracteres son los mismos. Si lo son, entonces el proceso 250 continúa este bucle hasta que dos caracteres no son los mismos. Si se realiza una determinación de que los siguientes dos caracteres no son los mismos, el proceso 250 se mueve hasta un estado de decisión 274 para determinar si existe algún carácter más en cualquier secuencia

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50 paralela. Si no hay ningún carácter más para leer, entonces el proceso 250 se mueve hasta un estado 276 en el que el nivel de homología entre la primera y segunda secuencias se presenta al usuario. El nivel de homología se determina calculando la proporción de caracteres entre las secuencias que eran las mismas sobre el número total de secuencias en la primera secuencia. Por lo tanto, si cada carácter en la primera secuencia de 100 nucleótidos se alinea con cada carácter en una segunda secuencia, el nivel de homología sería de un 100 %.

55 Como alternativa, el programa informático puede comparar una secuencia de referencia con una secuencia de la divulgación para determinar si las secuencias difieren en una o más posiciones. El programa puede registrar la longitud e identidad de los restos de nucleótidos o aminoácidos insertados, suprimidos o sustituidos con respecto a la secuencia de cualquiera de la referencia o la divulgación. El programa informático puede ser un programa que

60 determina si una secuencia de referencia contiene polimorfismo de un solo nucleótido (SNP) con respecto a una secuencia de la divulgación, o, si una secuencia de la divulgación comprende un SNP de una secuencia conocida. Por lo tanto, en algunos aspectos, el programa informático es un programa que identifica los SNP. El método se puede implementar mediante los sistemas informáticos que se han descrito anteriormente y el método ilustrado en la Figura 3. El método se puede realizar mediante la lectura de una secuencia de la divulgación y las secuencias de

65 referencia a través del uso del programa informático y la identificación de diferencias con el programa informático.

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En otros aspectos, el sistema basado en ordenador comprende un identificador para identificar características dentro de un ácido nucleico o polipéptido de la divulgación. Un "identificador" se refiere a uno o más programas que identifican ciertas características dentro de una secuencia de ácidos nucleicos. Por ejemplo, un identificador puede comprender un programa que identifica un marco de lectura abierto (ORF) en una secuencia de ácidos nucleicos. La 5 Figura 4 es un diagrama de flujo que ilustra un aspecto de un proceso identificador 300 para detectar la presencia de una característica en una secuencia. El proceso 300 comienza en un estado de partida 302 y a continuación se mueve hasta un estado 304 en el que una primera secuencia que se va a comprobar para características se almacena en la memoria 115 en el sistema informático 100. El proceso 300 a continuación se mueve hasta un estado 306 en el que se abre una base de datos de características de secuencia. Tal base de datos incluiría una lista de cada uno de los atributos de las características junto con el nombre de la característica. Por ejemplo, un nombre de característica podría ser "Codón de Inicio" y el atributo sería "ATG". Otro ejemplo sería el nombre de la característica "Caja TAATAA" y el atributo de la característica sería "TAATAA". Un ejemplo de tal base de datos se produce en el Grupo de Informática Genética de la Universidad de Wisconsin. Como alternativa, las características pueden ser motivos de polipéptidos estructurales tales como hélices alfa, láminas beta, o motivos de polipéptidos 15 funcionales tales como sitios activos enzimáticos, motivos de hélice-giro-hélice u otros motivos conocidos por los expertos en la materia. Una vez que la base de datos de características se abre en el estado 306, el proceso 300 se mueve hasta un estado 308 en el que la primera característica se lee desde la base de datos. A continuación se realizó una comparación del atributo de la primera característica con la primera secuencia en un estado 310. A continuación se realiza una determinación en un estado de decisión 316 sobre si el atributo de la característica se encontró en la primera secuencia. Si el atributo se encontró, entonces el proceso 300 se mueve hasta un estado 318 en el que el nombre de la característica encontrada se presenta al usuario. El proceso 300 se mueve a continuación hasta un estado de decisión 320 en el que se realizó una determinación de si existen características que se mueven en la base de datos. Si no existen más características, entonces el proceso 300 termina en un estado final 324. Sin embargo, si existen más características en la base de datos, entonces el proceso 300 lee la siguiente característica

25 de la secuencia en un estado 326 y hace un bucle de nuevo hasta el estado 310 en el que el atributo de la siguiente característica se compara frente a la primera secuencia. Si el atributo de la característica no se encuentra en la primera secuencia en el estado de decisión 316, el proceso 300 se mueve directamente al estado de decisión 320 para determinar si existen algunas características más en la base de datos. Por lo tanto, en un aspecto, el programa informático identifica marcos de lectura abiertos (ORF).

et al., J. Mol. Biol.

215: 403, 1990), FASTA (Pearson y Lipman, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85: 2444, 1988), FASTDB (Brutlag et al., Comp. App. Biosci. 6: 237-245, 1990), Catalyst (Molecular Simulations Inc.), Catalyst/SHAPE (Molecular Simulations Inc.), Cerius2.DBAccess (Molecular Simulations Inc.), HypoGen (Molecular Simulations Inc.), Insight II, (Molecular Simulations Inc.), Discover (Molecular Simulations Inc.), CHARMm (Molecular Simulations Inc.), Felix (Molecular

45 Simulations Inc.), DelPhi, (Molecular Simulations Inc.), QuanteMM, (Molecular Simulations Inc.), Homology (Molecular Simulations Inc.), Modeler (Molecular Simulations Inc.), ISIS (Molecular Simulations Inc.), Quanta/Protein Design (Molecular Simulations Inc.), WebLab (Molecular Simulations Inc.), WebLab Diversity Explorer (Molecular Simulations Inc.), Gene Explorer (Molecular Simulations Inc.), SeqFold (Molecular Simulations Inc.), la base de datos de MDL Available Chemicals Directory, la base de datos de MDL Drug Data Report, la base de datos de Comprehensive Medicinal Chemistry, la base de datos del Índice de Fármacos Mundiales de Derwent, la base de datos de BioByteMasterFile, la base de datos de Genbank, y la base de datos de Genseqn. Otros muchos programas y bases de datos serían evidentes para un experto en la materia dada la presente divulgación.

Los motivos que se pueden detectar usando los programas mencionados anteriormente incluyen secuencias que

55 codifican cremalleras de leucina, motivos de hélice-giro-hélice, sitios de glicosilación, sitios de ubiquitinación, hélices alfa, y láminas beta, secuencias señal que codifican péptidos señal que dirigen la secreción de las proteínas codificadas, secuencias implicadas en la regulación de la transcripción tales como homeocajas, tramos ácidos, sitios activos enzimáticos, sitios de unión a sustrato y sitios de escisión enzimática.

Hibridación de ácidos nucleicos

Los ácidos nucleicos aislados o recombinantes se hibridan en condiciones rigurosas con una secuencia ejemplar de SEC ID Nº: 1, SEC ID Nº: 3, SEC ID Nº: 5, SEC ID Nº: 7, SEC ID Nº: 9, SEC ID Nº: 11, SEC ID Nº: 13, SEC ID Nº: 15, SEC ID Nº: 17, SEC ID Nº: 19, SEC ID Nº: 21, SEC ID Nº: 23, SEC ID Nº: 25, SEC ID Nº: 27, SEC ID Nº: 29, 65 SEC ID Nº: 31, SEC ID Nº: 33, SEC ID Nº: 35, SEC ID Nº: 37, SEC ID Nº: 39, SEC ID Nº: 41, SEC ID Nº: 43, SEC ID Nº: 45, SEC ID Nº: 47, SEC ID Nº: 49, SEC ID Nº: 51, SEC ID Nº: 53, SEC ID Nº: 55, SEC ID Nº: 57, SEC ID Nº: 59,

imagen33

SEC ID Nº: 61, SEC ID Nº: 63, SEC ID Nº: 65, SEC ID Nº: 67, SEC ID Nº: 69, SEC ID Nº: 71, SEC ID Nº: 73, SEC ID Nº: 75, SEC ID Nº: 77, SEC ID Nº: 79, SEC ID Nº: 81, SEC ID Nº: 83, SEC ID Nº: 85, SEC ID Nº: 87, SEC ID Nº: 89, SEC ID Nº: 91, SEC ID Nº: 93, SEC ID Nº: 95, SEC ID Nº: 97, SEC ID Nº: 99, SEC ID Nº: 101, SEC ID Nº: 103, SEC ID Nº: 105, SEC ID Nº: 107, SEC ID Nº: 109, SEC ID Nº: 111, SEC ID Nº: 113, SEC ID Nº: 115, SEC ID Nº: 117, 5 SEC ID Nº: 119, SEC ID Nº: 121, SEC ID Nº: 123, SEC ID Nº: 125, SEC ID Nº: 127, SEC ID Nº: 129, SEC ID Nº: 131, SEC ID Nº: 133, o un ácido nucleico que codifica un polipéptido de SEC ID Nº: 2, SEC ID Nº: 4, SEC ID Nº: 6, SEC ID Nº: 8, SEC ID Nº: 10, SEC ID Nº: 12, SEC ID Nº: 14, SEC ID Nº: 16, SEC ID Nº: 18, SEC ID Nº: 20, SEC ID Nº: 22, SEC ID Nº: 24, SEC ID Nº: 26, SEC ID Nº: 28, SEC ID Nº: 30, SEC ID Nº: 32, SEC ID Nº: 34, SEC ID Nº: 36, SEC ID Nº: 38, SEC ID Nº: 40, SEC ID Nº: 42, SEC ID Nº: 44, SEC ID Nº: 46, SEC ID Nº: 48, SEC ID Nº: 50, SEC ID 10 Nº: 52, SEC ID Nº: 54, SEC ID Nº: 56, SEC ID Nº: 58, SEC ID Nº: 60, SEC ID Nº: 62, SEC ID Nº: 64, SEC ID Nº: 66, SEC ID Nº: 68, SEC ID Nº: 70, SEC ID Nº: 72, SEC ID Nº: 74, SEC ID Nº: 76, SEC ID Nº: 78, SEC ID Nº: 80, SEC ID Nº: 82, SEC ID Nº: 84, SEC ID Nº: 86, SEC ID Nº: 88, SEC ID Nº: 90, SEC ID Nº: 92, SEC ID Nº: 94, SEC ID Nº: 96, SEC ID Nº: 98, SEC ID Nº: 100, SEC ID Nº: 102, SEC ID Nº: 104, SEC ID Nº: 106, SEC ID Nº: 108, SEC ID Nº: 110, SEC ID Nº: 112, SEC ID Nº: 114, SEC ID Nº: 116, SEC ID Nº: 118, SEC ID Nº: 120, SEC ID Nº: 122, SEC ID Nº:

15 124, SEC ID Nº: 126, SEC ID Nº: 128, SEC ID Nº: 130, SEC ID Nº: 132 o SEC ID Nº: 134. Las condiciones rigurosas pueden ser condiciones altamente rigurosas, condiciones de rigurosidad media y/o condiciones de rigurosidad baja, que incluyen las condiciones de rigurosidad elevada y reducida que se describen en el presente documento. En un aspecto, es la rigurosidad de las condiciones de lavado que establece las condiciones que determinan si un ácido nucleico está dentro del alcance deseado, como se analiza a continuación.

20 En realizaciones alternativas, los ácidos nucleicos como se definen por su capacidad para hibridarse en condiciones de rigurosidad pueden tener una longitud de aproximadamente cinco restos y la longitud completa del ácido nucleico; por ejemplo, pueden tener una longitud de al menos 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35,40, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 90, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000, o más restos.

25 También se incluyen ácidos nucleicos más cortos que los de la longitud completa. Estos ácidos nucleicos pueden ser útiles, por ejemplo, como sondas de hibridación, sondas de marcado, sondas de oligonucleótidos para PCR, ARNi, antisentido o secuencias que codifican péptidos de unión a anticuerpo (epítopos), motivos, sitios activos y similares.

30 En un aspecto, los ácidos nucleicos son definidos por su capacidad para hibridarse en condiciones que comprenden rigurosidad elevada de formamida aproximadamente al 50 % a aproximadamente de 37 ºC a 42 ºC. En un aspecto, los ácidos nucleicos son definidos por su capacidad para hibridarse en condiciones que comprenden rigurosidad reducida de formamida de aproximadamente un 35 % a un 25 % a aproximadamente de 30 ºC a 35 ºC.

35 Como alternativa, los ácidos nucleicos son definidos por su capacidad para hibridarse en condiciones que comprenden rigurosidad elevada a 42 ºC en formamida al 50 %, 5X SSPE, SDS al 0,3 %, y una secuencia repetitiva que bloquea ácido nucleico, tal como ADN de cot-1 o de esperma de salmón (por ejemplo, 200 n/ml de ADN de esperma de salmón cizallado y desnaturalizado). En un aspecto, los ácidos nucleicos son definidos por su capacidad para hibridarse en condiciones de rigurosidad reducida que comprenden formamida al 35 % a una temperatura

40 reducida de 35 ºC.

Después de la hibridación, el filtro se puede lavar con 6X SSC, SDS al 0,5 % a 50 ºC. Se considera que estas condiciones son condiciones "moderadas" de formamida por encima de un 25 % y condiciones "bajas" de formamida por debajo de un 25 %. Un ejemplo específico de condiciones de hibridación "moderadas" es cuando la hibridación

45 mencionada anteriormente se realiza en formamida al 30 %. Un ejemplo específico de condiciones de hibridación de "rigurosidad baja" es cuando la hibridación anterior se realiza en formamida al 10 %.

El intervalo de temperatura que corresponde a un nivel de rigurosidad en particular se puede estrechar adicionalmente mediante el cálculo de la proporción de purina a pirimidina del ácido nucleico de interés y ajustando

50 la temperatura en consecuencia. Los ácidos nucleicos también se definen por su capacidad para hibridarse en condiciones de rigurosidad elevada, media, y baja como se establece en Ausubel y Sambrook. En la técnica se conocen bien variaciones de los intervalos y condiciones mencionados anteriormente. A continuación se analizan adicionalmente las condiciones de hibridación.

55 El procedimiento anterior se puede modificar para identificar ácidos nucleicos que tienen disminución de los niveles de homología con la secuencia de la sonda. Por ejemplo, para obtener ácidos nucleicos con disminución de la homología con la sonda detectable, se pueden usar condiciones menos rigurosas. Por ejemplo, la temperatura de hibridación puede disminuir en incrementos de 5 ºC de 68 ºC a 42 ºC en un tampón de hibridación que tiene una concentración de Na+ de aproximadamente 1 M. Después de la hibridación, el filtro se puede lavar con 2X SSC, SDS

60 al 0,5 % a la temperatura de hibridación. Se considera que estas condiciones son condiciones "moderadas" por encima de 50 ºC y condiciones "bajas" por debajo de 50 ºC. Un ejemplo específico de condiciones de hibridación "moderadas" es cuando la hibridación mencionada anteriormente se realiza a 55 ºC. Un ejemplo específico de condiciones de hibridación de "rigurosidad baja" es cuando la hibridación mencionada anteriormente se realiza a 45 ºC.

65 Como alternativa, la hibridación se puede realizar en tampones, tales como 6X SSC, que contienen formamida a una temperatura de 42 ºC. En este caso, la concentración de formamida en el tampón de hibridación se puede reducir en incrementos de un 5 % desde un 50 % a un 0 % para identificar clones que tienen disminución de los niveles de homología con la sonda. Después de la hibridación, el filtro se puede lavar con 6X SSC, SDS al 0,5 % a 50 ºC. Se

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5 considera que estas condiciones son condiciones "moderadas" por encima de un 25 % de formamida y condiciones "bajas" por debajo de un 25 % de formamida. Un ejemplo específico de condiciones de hibridación "moderadas" es cuando la hibridación mencionada anteriormente se realiza en formamida al 30 %. Un ejemplo específico de condiciones de hibridación de "rigurosidad baja" es cuando la hibridación mencionada anteriormente se realiza en formamida al 10 %.

Sin embargo, la selección de un formato de hibridación no es crítica – lo es la rigurosidad de las condiciones de lavado que establecen las condiciones que determinan si un ácido nucleico está dentro del alcance deseado. Las condiciones de lavado usadas para identificar ácidos nucleicos incluyen, por ejemplo: una concentración de sal de aproximadamente 0,02 molar a pH 7 y una temperatura de al menos aproximadamente 50 ºC o de aproximadamente

15 55 ºC a aproximadamente 60 ºC; o, una concentración de sal de aproximadamente NaCl 0,15 M a 72 ºC durante aproximadamente 15 minutos; o, una concentración de sal de aproximadamente 0,2X SSC a una temperatura de al menos aproximadamente 50 ºC o de aproximadamente 55 ºC a aproximadamente 60 ºC durante aproximadamente 15 a aproximadamente 20 minutos; o, el complejo de hibridación se lava dos veces con una solución con una concentración de sal de aproximadamente 2X SSC que contiene SDS al 0,1 % a temperatura ambiente durante 15 minutos y a continuación se lava dos veces con 0,1X SSC que contiene SDS al 0,1 % a 68 ºC durante 15 minutos; o, condiciones equivalentes. Véase Sambrook, Tijssen y Ausubel para una descripción de tampón de SSC y condiciones equivalentes.

Estos métodos se pueden usar para aislar los ácidos nucleicos de la divulgación.

25 Sondas de oligonucleótidos y métodos para su uso

La divulgación también proporciona sondas de ácido nucleico que se pueden usar, por ejemplo, para identificar a ácidos nucleicos que codifican un polipéptido con una actividad de pectato liasa o fragmentos del mismo o para identificar genes de pectato liasa. En un aspecto, la sonda comprende al menos 10 bases consecutivas de un ácido nucleico de la divulgación. Como alternativa, una sonda puede ser al menos aproximadamente 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 150 o aproximadamente de 10 a 50, aproximadamente de 20 a 60, aproximadamente de 30 a 70 bases consecutivas de una secuencia como se establece en un ácido nucleico de la divulgación. Las sondas identifican un ácido nucleico mediante unión y/o hibridación. Las sondas se

35 pueden usar en matrices, véase el análisis que sigue a continuación, que incluyen, por ejemplo, matrices capilares. Las sondas también se pueden usar para aislar otros ácidos nucleicos o polipéptidos.

Las sondas se pueden usar para determinar si una muestra biológica, tal como una muestra de suelo, contiene un organismo que tiene una secuencia de ácidos nucleicos de la divulgación o un organismo a partir del que se obtuvo el ácido nucleico. En tales procedimientos, se obtiene una muestra biológica que alberga potencialmente al organismo a partir del que se aisló el ácido nucleico y los ácidos nucleicos se obtienen a partir de la muestra. Los ácidos nucleicos se ponen en contacto con la sonda en condiciones que permiten que la sonda se hibride de forma específica con cualquier secuencia complementaria presente en la muestra. Cuando sea necesario, las condiciones que permiten que la sonda se hibride de forma específica con secuencias complementarias se puede determinar

45 colocando la sonda en contacto con secuencias complementarias a partir de muestras conocidas porque contienen la secuencia complementaria, así como secuencias de control que no contienen la secuencia complementaria. Las condiciones de hibridación, tales como la concentración de sal del tampón de hibridación, la concentración de formamida del tampón de hibridación, o la temperatura de hibridación, se pueden variar para identificar condiciones que permitan que la sonda se hibride de forma específica con ácidos nucleicos complementarios (véase el análisis sobre condiciones de hibridación específicas).

Si la muestra contiene el organismo a partir del que se aisló el ácido nucleico, entonces se detecta una hibridación específica de la sonda. La hibridación se puede detectar marcando la sonda con un agente detectable tal como un isótopo radiactivo, un colorante fluorescente o una enzima capaz de catalizar la formación de un producto

55 detectable. Muchos métodos para el uso de las sondas marcadas para detectar la presencia de ácidos nucleicos complementarios en una muestra son familiares para los expertos en la materia. Éstos incluyen Transferencias de Southern, Transferencias de Northern, procedimientos de hibridación de colonias, y transferencias puntuales. Los protocolos para cada uno de estos procedimientos se proporcionan en Ausubel y Sambrook.

Como alternativa, se puede usar más de una sonda (al menos una de las cuales es capaz de hibridarse de forma específica con cualquier secuencia complementaria que esté presente en la muestra de ácido nucleico), en una reacción de amplificación para determinar si la muestra contiene un organismo que contiene secuencias de ácidos nucleicos de la divulgación (por ejemplo, un organismo a partir del que se aisló el ácido nucleico). En un aspecto, las sondas comprenden oligonucleótidos. En un aspecto, la reacción de amplificación puede comprender una reacción 65 de PCR. Algunos protocolos de PCR se describen en Ausubel y Sambrook (véase el análisis sobre las reacciones de amplificación). En tales procedimientos, los ácidos nucleicos en la muestra se ponen en contacto con las sondas,

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se realiza la reacción de amplificación, y se detecta cualquier producto de amplificación resultante. El producto de amplificación se puede detectar realizando electroforesis en gel con los productos de reacción y tiñendo el gel con un intercalador tal como bromuro de etidio. Como alternativa, una o más de las sondas se pueden marcar con un isótopo radiactivo y la presencia de un producto de amplificación radiactivo se puede detectar mediante

5 autorradiografía después de electroforesis en gel.

Las sondas derivadas de secuencias cerca de los extremos en las posiciones 3' o 5' de una secuencia de ácidos nucleicos de la divulgación también se pueden usar en procedimientos de avance de cromosomas para identificar clones que contienen, por ejemplo, secuencias genómicas adicionales. Tales métodos permiten el aislamiento de genes que codifican proteínas de interés adicionales del organismo hospedador.

En un aspecto, las secuencias de ácidos nucleicos de la divulgación se usan como sondas para identificar y aislar ácidos nucleicos relacionados. En algunos aspectos, los ácidos nucleicos relacionados identificados de este modo pueden ser ADNc o ADN genómicos de organismos distintos del que se aisló primero el ácido nucleico de la

15 divulgación. En tales procedimientos, una muestra de ácido nucleico se pone en contacto con la sonda en condiciones que permiten que la sonda se hibride de forma específica con secuencias relacionadas. La hibridación de la sonda con ácidos nucleicos a partir del organismo relacionado se detecta a continuación usando cualquiera de los métodos que se han descrito anteriormente.

En las reacciones de hibridación de ácidos nucleicos, las condiciones usadas para conseguir un nivel de rigurosidad en particular pueden variar, dependiendo de la naturaleza de los ácidos nucleicos que se están hibridando. Por ejemplo, la longitud, grado de complementariedad, composición de la secuencia de nucleótidos (por ejemplo, contenido de GC con respecto al de AT), y tipo de ácido nucleico (por ejemplo, ARN con respecto a ADN) de las regiones de hibridación de los ácidos nucleicos se pueden considerar en la selección de las condiciones de 25 hibridación. Una consideración adicional es si uno de los ácidos nucleicos está inmovilizado, por ejemplo, en un filtro. La hibridación se puede realizar en condiciones de rigurosidad baja, rigurosidad moderada o rigurosidad elevada. Como un ejemplo de hibridación de ácidos nucleicos, en primer lugar una membrana de polímero que contiene ácidos nucleicos desnaturalizados inmovilizados se hibrida previamente durante 30 minutos a 45 ºC en una solución que consiste en NaCl 0,9 M, NaH2PO4 50 mM, pH 7,0, Na2EDTA 5,0 mM, SDS al 0,5 %, 10X de solución de Denhardt, y 0,5 mg/ml de ácido polirriboadenílico. A continuación se puede añadir a la solución aproximadamente 2 X 107 cpm (actividad específica de 4-9 X 108 cpm/ug) de sonda de oligonucleótido marcado en su extremo con 32P. Después de 12-16 horas de incubación, la membrana se lava durante 30 minutos a temperatura ambiente (TA) en 1X SET (NaCl 150 mM, clorhidrato de Tris 20 mM, pH 7,8, Na2EDTA 1 mM) que contiene SDS al 0,5 %, seguido de un lavado de 30 minutos en 1X SET recién preparado a Tf-10 ºC para la sonda de oligonucleótido. A continuación, la

35 membrana se expone a una película auto-radiográfica para la detección de señales de hibridación.

Variando la rigurosidad de las condiciones de hibridación usadas para identificar ácidos nucleicos, tales como ADNc

o ADN genómico, que se hibridan con la sonda detectable, se pueden identificar y aislar ácidos nucleicos que tienen diferentes niveles de homología con la sonda. La rigurosidad se puede variar mediante la realización de la hibridación a temperaturas variables por debajo de las temperaturas de fusión de las sondas. La temperatura de fusión, Tf, es la temperatura (bajo una fuerza iónica y pH definidos) a la que un 50 % de la secuencia diana se hibrida con una sonda perfectamente complementaria. Las condiciones muy rigurosas se seleccionan para que sean iguales a o aproximadamente 5 ºC menores que la Tf para una sonda en particular. La temperatura de fusión de la sonda se puede calcular usando las siguientes fórmulas a modo de ejemplo. Para las sondas entre 14 y 70

45 nucleótidos de longitud, la temperatura de fusión (Tf) se calcula usando la fórmula: Tf = 81,5 + 16,6(log [Na+]) + 0,41(fracción de G+C) -(600/N) en la que N es la longitud de la sonda. Si la hibridación se realiza en una solución que contiene formamida, la temperatura de fusión se cree calcular usando la ecuación: Tm = 81,5 + 16,6(log [Na+]) + 0,41(fracción de G+C) -(formamida al 0,63 %) -(600/N) en la que N es la longitud de la sonda. La hibridación previa se puede realizar en 6X SSC, 5X reactivo de Denhardt, SDS al 0,5 %, 100 µg de ADN de esperma de salmón fragmentado y desnaturalizado o 6X SSC, 5X reactivo de Denhardt, SDS al 0,5 %, 100 µg de ADN de esperma de salmón fragmentado y desnaturalizado, formamida al 50 %. Las fórmulas para SSC y reactivo de Denhardt y otras soluciones se enumeran, por ejemplo, en Sambrook.

La hibridación se realiza mediante la adición de la sonda detectable a las soluciones de hibridación previa

55 enumeradas anteriormente. Cuando la sonda comprende ADN bicatenario, se desnaturaliza antes de la adición de la solución de hibridación. El filtro se pone en contacto con la solución de hibridación durante un periodo de tiempo suficiente para permitir que la sonda se hibride con los ADNc o ADN genómicos que contienen secuencias complementarias con los mismos u homólogas a los mismos. Para sondas con una longitud superior a 200 nucleótidos, la hibridación se puede realizar a 15-25 ºC por debajo de la Tf. Para sondas más cortas, tales como sondas de oligonucleótidos, la hibridación se puede realizar a 5-10 ºC por debajo de la Tf. En un aspecto, las hibridaciones en 6X SSC se realizan a aproximadamente 68 ºC. En un aspecto, las hibridaciones en soluciones que contienen formamida al 50 % se realizan a aproximadamente 42 ºC. Se consideraría que todas las hibridaciones mencionadas anteriormente están en condiciones de rigurosidad elevada.

65 Después de la hibridación, el filtro se lava para retirar cualquier sonda detectable unida de forma no especifica. La rigurosidad usada para lavar los filtros también puede variar dependiendo de la naturaleza de los ácidos nucleicos que se están hibridando, la longitud de los ácidos nucleicos que se están hibridando, el grado de complementariedad, la composición de la secuencia de nucleótidos (por ejemplo, contenido de GC con respecto al de AT), y el tipo de ácido nucleico (por ejemplo, ARN con respecto al ADN). Algunos ejemplos de lavados en condiciones de rigurosidad progresivamente más elevada son los que siguen a continuación: 2X SSC, SDS al 0,1 %

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5 a temperatura ambiente durante 15 minutos (rigurosidad baja); 0,1X SSC, SDS al 0,5 % a temperatura ambiente de 30 minutos a 1 hora (rigurosidad moderada); 0,1X SSC, SDS al 0,5 % de 15 a 30 minutos entre la temperatura de hibridación y 68 ºC (rigurosidad elevada); y NaCl 0,15 M de 15 minutos a 72 ºC (rigurosidad muy elevada). Se puede realizar un lavado final de rigurosidad baja en 0,1X SSC a temperatura ambiente. Los ejemplos mencionados anteriormente son simplemente ilustrativos de un conjunto de condiciones que se pueden usar para lavar los filtros. Un experto en la materia conocería que existen numerosas fórmulas para diferentes lavados con rigurosidad.

Los ácidos nucleicos que se han hibridado con la sonda se pueden identificar mediante autorradiografía u otras técnicas convencionales. El procedimiento mencionado anteriormente se puede modificar para identificar ácidos nucleicos que tienen una disminución de los niveles de homología con la secuencia de la sonda. Por ejemplo, para

15 obtener ácidos nucleicos de disminución de la homología con la sonda detectable, se pueden usar condiciones menos rigurosas. Por ejemplo, la temperatura de hibridación puede disminuir en incrementos de 5 ºC de 68 ºC a 42 ºC en un tampón de hibridación que tiene una concentración de Na+ de aproximadamente 1 M. Después de la hibridación, el filtro se puede lavar con 2X SSC, SDS al 0,5 % a la temperatura de hibridación. Se considera que estas condiciones son condiciones "moderadas" por encima de 50 ºC y condiciones "bajas" por debajo de 50 ºC. Un ejemplo de condiciones de hibridación "moderadas" es cuando la hibridación mencionada anteriormente se realiza a 55 ºC. Un ejemplo de condiciones de hibridación de " rigurosidad baja" es cuando la hibridación mencionada anteriormente se realiza a 45 ºC.

Como alternativa, la hibridación se puede realizar en tampones, tales como 6X SSC, que contiene formamida a una

25 temperatura de 42 ºC. En este caso, la concentración de formamida en el tampón de hibridación se puede reducir en incrementos de un 5 % desde un 50 % a un 0 % para identificar clones que tienen una disminución de los niveles de homología con la sonda. Después de la hibridación, el filtro se puede lavar con 6X SSC, SDS al 0,5 % a 50 ºC. Se considera que estas condiciones son condiciones "moderadas" por encima de un 25 % de formamida y condiciones "bajas" por debajo de un 25 % de formamida. Un ejemplo específico de condiciones de hibridación "moderada" es cuando la hibridación mencionada anteriormente se realiza en un 30 % de formamida. Un ejemplo específico de condiciones de hibridación de "rigurosidad baja" es cuando la hibridación mencionada anteriormente se realiza en un 10 % de formamida.

Estas sondas y métodos se pueden usar para aislar ácidos nucleicos que tienen una secuencia con una homología

35 de al menos aproximadamente un 99 %, 98 %, 97 %, al menos un 95 %, al menos un 90 %, al menos un 85 %, al menos un 80 %, al menos un 75 %, al menos un 70 %, al menos un 65 %, al menos un 60 %, al menos un 55 %, o al menos un 50 % con las secuencias de ácidos nucleicos de la divulgación que comprenden al menos aproximadamente 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 75, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000, o más bases consecutivas de los mismos, y las secuencias complementarias a las mismas. La homología se puede medir usando un algoritmo de alineación, como se analiza en el presente documento. Por ejemplo, los polinucleótidos homólogos pueden tener una secuencia de codificación que es una variante alélica de origen natural de una de las secuencias de codificación que se describen en el presente documento. Tales variantes alélicas pueden tener una sustitución, supresión o adición de uno o más nucleótidos cuando se comparan con un ácido nucleico de la divulgación.

45 Además, las sondas y métodos se pueden usar para aislar ácidos nucleicos que codifican polipéptidos que tienen una identidad de secuencia (homología) de al menos aproximadamente un 99 %, al menos un 95 %, al menos un 90 %, al menos un 85 %, al menos un 80 %, al menos un 75 %, al menos un 70 %, al menos un 65 %, al menos un 60 %, al menos un 55 %, o al menos un 50 % con un polipéptido de la divulgación que comprende al menos 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 75, 100, o 150 aminoácidos consecutivos, como se determina usando un algoritmo de alineación de secuencias (por ejemplo, tal como el algoritmo de la versión 3,0t78 de FASTA con los parámetros por defecto, o un programa BLAST 2.2.2 con ajustes a modo de ejemplo como se establece en el presente documento).

Inhibición de la Expresión de Pectato liasa

55 Los ácidos nucleicos pueden ser complementarios con (por ejemplo, secuencias antisentido para) las secuencias de ácidos nucleicos de la divulgación. Las secuencias antisentido son capaces de inhibir el transporte, corte y empalme

o transcripción de genes que codifican pectato liasa. La inhibición se puede realizar a través de la dirección del ADN genómico o del ARN mensajero. La transcripción o función del ácido nucleico al que se dirige se puede inhibir, por ejemplo, mediante hibridación y/o escisión. Un conjunto de inhibidores particularmente útil incluye oligonucleótidos que son capaces de unirse a genes de pectato liasa o de realizar mensajes, en cualquier caso previniendo o inhibiendo la producción o la función de pectato liasa. La asociación se puede realizar a través de hibridación específica de secuencias. Otra clase de inhibidores útiles incluye oligonucleótidos que causan la inactivación o escisión de mensajes de pectato liasa. El oligonucleótido puede tener una actividad enzimática que causa tal

65 escisión, tal como ribozimas. El oligonucleótido se puede modificar químicamente o conjugar con una enzima o composición capaz de escindir el ácido nucleico complementario. Una combinación de muchos de tales oligonucleótidos diferentes se puede identificar sistemáticamente para aquellos que tienen la actividad deseada. Esto proporciona diversas composiciones para inhibición de la expresión de pectato liasa en un ácido nucleico y/o nivel de proteína, por ejemplo, antisentido, ARNi, y ribozimas que comprenden secuencias de pectato liasa de la divulgación y los anticuerpos anti-pectato liasa de la divulgación.

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5 La inhibición de la expresión de pectato liasa puede tener una diversidad de aplicaciones industriales. Por ejemplo, la inhibición de la expresión de pectato liasa puede ralentizar o prevenir el deterioro por "putrefacción blanda". El deterioro por "putrefacción blanca" se produce cuando la pectina, un polisacárido estructural principal en la pared de célula vegetal, se degrada de forma enzimática. Esto puede conducir al deterioro, o putrefacción, de frutas y verduras. En un aspecto, el uso de composiciones que inhiben la expresión y/o actividad de pectato liasas, por ejemplo, anticuerpos, oligonucleótidos antisentido, ribozimas y ARNi, se usan para ralentizar o prevenir el deterioro por "putrefacción blanda". Esto proporciona métodos y composiciones que comprenden la aplicación sobre una planta o producto vegetal (por ejemplo, una fruta, semilla, raíz, hoja, etc.) de anticuerpos, oligonucleótidos antisentido, ribozimas y ARNi para ralentizar o prevenir la descomposición por "putrefacción blanda". Estas

15 composiciones también se pueden expresar por la planta (por ejemplo, una planta transgénica) u otro organismo (por ejemplo, una bacteria u otro microorganismo transformado con un gen de pectato liasa de la divulgación).

Erysiphe cichoracearum del oídio. Esta resistencia al oídio representa una forma de resistencia a enfermedades basada en la pérdida de un gen necesario durante una interacción compatible en lugar de la activación de las rutas de defensa del hospedador conocidas. Véase, por ejemplo, Vogel (2002) Plant Cell 14: 20952106. Esto proporciona métodos y composiciones que comprenden la aplicación en una planta o producto vegetal (por ejemplo, una fruta, semilla, raíz, hoja, etc.) de anticuerpos, oligonucleótidos antisentido, ribozimas y ARNi para ralentizar o prevenir el crecimiento del patógeno del oídio.

25

Oligonucleótidos Antisentido

Los oligonucleótidos antisentido pueden ser capaces de unirse a mensajes de pectato liasa que pueden inhibir la actividad proteolítica mediante la dirección del ARNm. Las estrategias para diseñar oligonucleótidos antisentido se describen bien en la bibliografía científica y de patentes, y el experto en la materia puede diseñar tales oligonucleótidos de pectato liasa usando los nuevos reactivos de la divulgación. Por ejemplo, en la técnica se conocen bien protocolos de avance génico / formación de mapas de ARN para identificar sistemáticamente oligonucleótidos antisentido eficaces, véase, por ejemplo, Ho (2000) Methods Enzymol. 314: 168-183, que describe un ensayo de formación de mapas de ARN, que se basa en técnicas moleculares convencionales para proporcionar

35 un método fácil y de confianza para la selección de secuencias antisentido potentes. Véase también Smith (2000) Eur. J. Pharm. Sci. 11: 191-198.

Los ácidos nucleicos de origen natural se usan como oligonucleótidos antisentido. Los oligonucleótidos antisentido pueden tener cualquier longitud; por ejemplo, en aspectos alternativos, los oligonucleótidos antisentido tienen entre aproximadamente 5 y 100, de aproximadamente 10 a 80, de aproximadamente 15 a 60, de aproximadamente 18 a

40. La longitud óptima se puede determinar mediante identificación sistemática de rutina. Los oligonucleótidos antisentido pueden estar presentes en cualquier concentración. La concentración óptima se puede determinar mediante identificación sistemática de rutina. Se conoce una amplia diversidad de nucleótidos de origen natural, sintéticos y análogos de ácidos nucleicos que pueden abordar este problema potencial. Por ejemplo, se pueden usar

45 estructuras principales no iónicas que contienen ácidos nucleicos peptídicos (PNA), tales como unidades de N-(2aminoetil) glicina. También se pueden usar oligonucleótidos antisentido que tienen enlaces de fosforotioato, como se describe en el documento WO 97/03211; documento WO 96/39154; Mata (1997) Toxicol Appl Pharmacol 144:189197; Antisense Therapeutics, ed. Agrawal (Humana Press, Totowa, N.J., 1996). Los oligonucleótidos antisentido que tienen análogos de estructura principal de ADN sintético proporcionados también pueden incluir ácidos nucleicos con fosforo-ditioato, metilfosfonato, fosforamidato, fosfotriéster de alquilo, sulfamato, 3'-tioacetal, metilen(metilimino), 3'N-carbamato, y carbamato de morfolino, como se ha descrito anteriormente.

Se puede usar metodología de química combinatoria para crear grandes números de oligonucleótidos que se pueden identificar sistemáticamente de forma rápida para oligonucleótidos específicos que tienen afinidades de

55 unión y especificidades apropiadas hacia cualquier diana, tal como las secuencias sentido y antisentido de pectato liasa de la divulgación (véase, por ejemplo, Gold (1995) J. of Biol. Chem. 270: 13581-13584).

Ribozimas Inhibitorias

Las ribozimas son capaces de unirse a mensaje de pectato liasa. Estas ribozimas pueden inhibir la actividad de pectato liasa, por ejemplo, mediante dirección de ARNm. Las estrategias para diseñar ribozimas y seleccionar la secuencia antisentido específica de pectato para la dirección se describen bien en la bibliografía científica y de patente, y el experto en la materia puede diseñar tales ribozimas usando los nuevos reactivos de la divulgación. Las ribozimas actúan mediante la unión a un ARN diana a través de la parte de unión al ARN diana de una ribozima que 65 se mantiene en una proximidad cercana a una parte enzimática del ARN que escinde el ARN diana. Por lo tanto, la ribozima reconoce y se une a un ARN diana a través de emparejamiento de bases complementarias, y una vez

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unido el sitio correcto, actúa de forma enzimática para escindir e inactivar el ARN diana. La escisión de un ARN diana de tal modo destruirá su capacidad para dirigir la síntesis de una proteína codificada si la escisión se produce en la secuencia de codificación. Después de que una ribozima se ha unido y escindido de su diana de ARN, se puede liberar de ese ARN para unir y escindir nuevas dianas repetidamente.

5 En algunas circunstancias, la naturaleza enzimática de una ribozima puede ser ventajosa sobre otras tecnologías, tales como tecnología antisentido (cuando una molécula de ácido nucleico se une simplemente a una diana de ácido nucleico para bloquear su transcripción, traducción o asociación con otra molécula) ya que la concentración eficaz de ribozima necesaria para realizar un tratamiento terapéutico puede ser inferior a la de un oligonucleótido antisentido. Esta ventaja potencial refleja la capacidad de la ribozima para actuar de forma enzimática. Por lo tanto, una sola molécula de ribozima es capaz de escribir muchas moléculas de ARN diana. Además, una ribozima es por lo general un inhibidor altamente específico, con la especificidad de inhibición dependiendo no solamente del mecanismo de unión de emparejamiento de bases, sino también del mecanismo mediante el que la molécula inhibe la expresión del ARN al que se une. Es decir, la inhibición está causada por la escisión de la diana de ARN y por lo

15 tanto la especificidad se define como la proporción de la tasa de escisión del ARN dirigido sobre la tasa de escisión del ARN no dirigido. Este mecanismo de escisiones depende de factores adicionales a los implicados en el emparejamiento de bases. Por lo tanto, la especificidad de acción de una ribozima puede ser superior a la de la unión de oligonucleótido antisentido del mismo sitio de ARN.

La ribozima de la divulgación, por ejemplo, una molécula de ARN de ribozima enzimática, se puede formar en un motivo de cabeza de martillo, un motivo de horquilla, como un motivo del virus de la hepatitis delta, un motivo de intrón del grupo I y/o un ARN de tipo RNasaP en asociación con una secuencia guía de ARN. Algunos ejemplos de motivos de cabeza de martillo se describen, por ejemplo, en Rossi (1992) Aids Research and Human Retroviruses 8: 183; motivos de horquilla en Hampel (1989) Biochemistry 28: 4929, y Hampel (1990) Nuc. Acids Res. 18: 299; el

25 motivo del virus de la hepatitis delta en Perrotta (1992) Biochemistry 31: 16; el motivo de RNasaP en Guerrier-Takada (1983) Cell 35: 849; y el intrón del grupo I en la Patente de Estados Unidos Nº 4.987.071 de Cech. La mención de estos motivos específicos no pretende ser limitante. Los expertos en la materia reconocerán que una ribozima tal, por ejemplo, una molécula de ARN enzimático, puede tener un sitio de unión a sustrato específico complementario con una o más de las regiones del ARN del gen diana. Una ribozima puede tener una secuencia de nucleótidos dentro o rodeando ese sitio de unión a sustrato que transmite una actividad de escisión del ADN a la molécula.

ARN de interferencia (ARNi)

35 Una molécula inhibitoria de ARN, una molécula denominada "ARNi", comprende una secuencia de pectato liasa de la divulgación. La molécula de ARNi comprende una molécula de ARN bicatenario (ARNds). El ARNi puede inhibir la expresión de un gen de pectato liasa. En un aspecto, el ARNi tiene una longitud de aproximadamente 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25 o más nucleótidos dúplex. El ARNi puede entrar en una célula y provocar la degradación de un ARN monocatenario (ARNss) de secuencia similares o idénticas, que incluyen ARNm endógenos. Cuando una célula se expone a un ARN bicatenario (ARNds), el ARNm del gen homólogo se degrada de forma selectiva mediante un proceso denominado interferencia de ARN (ARNi). Un posible mecanismo básico más allá del ARNi es la ruptura de un emparejamiento de ARN bicatenario (ARNds) de una secuencia de genes específicos en piezas cortas denominadas ARN de interferencia corto, que desencadena la degradación del ARNm que empareja su secuencia. En un aspecto, los ARNi se usan en terapia de silenciamiento génico, véase, por ejemplo, Shuey (2002)

45 Drug Discov. Today 7: 1040-1046. Esto proporciona métodos para degradar el ARN de forma selectiva usando los ARNi. El proceso se puede poner en práctica in vitro, ex vivo o in vivo. En un aspecto, las moléculas de ARNi se pueden usar para generar una mutación de pérdida de función en una célula, un órgano o un animal. En la técnica se conoce bien métodos para preparar y usar moléculas de ARNi para degradar el ARN de forma selectiva, véase, por ejemplo, los documentos de patente de Estados Unidos Nº 6.506.559; 6.511.824; 6.515.109; 6.489.127.

Modificación de Ácidos Nucleicos

Los métodos pueden generar variantes de los ácidos nucleicos de la divulgación, por ejemplo, los que codifican una pectato liasa, y la divulgación proporciona las variantes de ácidos nucleicos generados con estos métodos (por

55 ejemplo, SEC ID Nº: 133) y polipéptidos codificados por ellos (por ejemplo, SEC ID Nº: 134, como se analiza a continuación). Estos métodos se pueden repetir o usar en diversas combinaciones para generar pectato liasas que tienen una actividad alterada o diferente o una estabilidad alterada o diferente de la de una pectato liasa codificada por el molde de ácido nucleico. Estos métodos también se pueden repetir o usar en diversas combinaciones, por ejemplo, para generar variaciones en expresión génica/mensajera, traducción de mensajes o estabilidad del mensaje. En otro aspecto, la composición genética de una célula se vio alterada, por ejemplo, por la modificación de un gen homólogo in vitro, in vivo o ex vivo, seguido de su reinserción en la célula.

Un ácido nucleico se puede alterar mediante cualquier medio. Por ejemplo, métodos aleatorios o estocásticos, o, métodos no estocásticos, o métodos de "evolución dirigida", véase, por ejemplo, el documento de Patente de 65 Estados Unidos Nº 6.361.974. En la técnica se conocen bien métodos para mutación aleatoria de genes, véase, por ejemplo, el documento de Patente de Estados Unidos Nº 5.830.696. Por ejemplo, se pueden usar algunos agentes

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mutágenos para mutar de forma aleatoria un gen. Los agentes mutágenos incluyen, por ejemplo, luz ultravioleta o radiación gamma, o un agente mutágeno químico, por ejemplo, mitomicina, ácido nitroso, psoralenos fotoactivados, solos o en combinación, para inducir rupturas de ADN susceptibles de reparación por recombinación. Otros agentes mutágenos químicos incluyen, por ejemplo, bisulfito sódico, ácido nitroso, hidroxilamina, hidrazina o ácido fórmico.

5 Otros agentes mutágenos son análogos de precursores de nucleótidos, por ejemplo, nitrosoguanidina, 5bromouracilo, 2-aminopurina, o acridina. Estos agentes se pueden añadir a una reacción de PCR en lugar del precursor de nucleótidos, mutando la secuencia de este modo. Se pueden usar agentes de intercalado tales como proflavina, acriflavina, quinacrina y similares.

Se puede usar cualquier técnica de biología molecular, por ejemplo, mutagénesis de PCR aleatoria, véase, por ejemplo, Rice (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 5467-5471; o, mutagénesis de casete múltiple combinatorio, véase, por ejemplo, Crameri (1995) Biotechniques 18: 194-196. Como alternativa, los ácidos nucleicos, por ejemplo, genes, se pueden reensamblar después de fragmentación aleatoria, o "estocástica", véanse, por ejemplo, los documentos de la patente de Estados Unidos Nº 6.291.242; 6.287.862; 6.287.861; 5.955.358; 5.830.721; 5.824.514; 15 5.811.238; 5.605.793. En aspectos alternativos, se introducen modificaciones, adiciones o supresiones por PCR propensa a error, redistribución, mutagénesis dirigida a oligonucleótidos, PCR de ensamblaje, mutagénesis de PCR sexual, mutagénesis in vivo, mutagénesis de casete, mutagénesis de conjunto recursiva, mutagénesis de conjunto exponencial, mutagénesis específica de sitio, reensamblaje génico, mutagénesis por saturación de sitio génico (GSSM™), reensamblaje de ligamiento sintético (SLR), recombinación, recombinación de secuencias recursiva, mutagénesis de ADN modificada con fosfotioato, mutagénesis de molde que contiene uracilo, mutagénesis de dúplex con huecos, mutagénesis de reparación de falta de coincidencia de puntos, mutagénesis de cepa hospedadora con déficit de reparación, mutagénesis química, mutagénesis radiogénica, mutagénesis de supresión, mutagénesis de restricción-selección, mutagénesis de restricción-purificación, síntesis de genes artificiales, mutagénesis de conjunto, creación de multímeros de ácidos nucleicos quiméricos, y/o una combinación de estos y

25 otros métodos.

Las siguientes publicaciones describen una diversidad de procedimientos de recombinación y/o métodos recursivos que se pueden incorporar en los métodos de la divulgación: Stemmer (1999) "Molecular breeding of viruses for targeting and other clinical properties" Tumor Targeting 4: 1-4; Ness (1999) Nature Biotechnology 17: 893-896; Chang (1999) "Evolution of a cytokine using DNA family shuffling" Nature Biotechnology 17: 793-797; Minshull (1999) "Protein evolution by molecular breeding" Current Opinion in Chemical Biology 3: 284-290; Christians (1999) "Directed evolution of thymidine kinase for AZT phosphorylation using DNA family shuffling" Nature Biotechnology

17: 259-264; Crameri (1998) "DNA shuffling of a family of genes from diverse species accelerates directed evolution" Nature 391: 288-291; Crameri (1997) "Molecular evolution of an arsenate detoxification pathway by DNA shuffling", 35 Nature Biotechnology 15: 436-438; Zhang (1997) "Directed evolution of an effective fucosidase from a galactosidase by DNA shuffling and screening" Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94: 4504-4509; Patten et al. (1997) "Applications of DNA Shuffling to Pharmaceuticals and Vaccines" Current Opinion in Biotechnology 8: 724-733; Crameri et al. (1996) "Construction and evolution of antibody-phage libraries by DNA shuffling" Nature Medicine 2: 100-103; Gates et al. (1996) "Affinity selective isolation of ligands from peptide libraries through display on a lac repressor ’headpiece dimer"' Journal of Molecular Biology 255: 373-386; Stemmer (1996) "Sexual PCR and Assembly PCR" In: The Encyclopedia of Molecular Biology. VCH Publishers, Nueva York. pp. 447-457; Crameri y Stemmer (1995) "Combinatorial multiple cassette mutagenesis creates all the permutations of mutant and wildtype cassettes" BioTechniques 18: 194-195; Stemmer et al. (1995) "Single-step assembly of a gene and entire plasmid form large numbers of oligodeoxyribonucleotides" Gene, 164: 49-53; Stemmer (1995) "The Evolution of Molecular Computation"

45 Science 270: 1510; Stemmer (1995) "Searching Sequence Space" Bio/Technology 13: 549-553; Stemmer (1994) "Rapid evolution of a protein in vitro by DNA shuffling" Nature 370: 389-391; y Stemmer (1994) "DNA shuffling by random fragmentation and reassembly: In vitro recombination for molecular evolution". Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 10747-10751.

Los métodos de mutación para generar diversidad incluyen, por ejemplo, mutagénesis dirigida al sitio (Ling et al. (1997) "Approaches to DNA mutagenesis: an overview" Anal Biochem. 254 (2): 157-178; Dale et al. (1996) "Oligonucleotide-directed random mutagenesis using the phosphorothioate method" Methods Mol. Biol. 57: 369-374; Smith (1985) "In vitro mutagenesis" Ann. Rev. Genet. 19: 423-462; Botstein y Shortle (1985) "Strategies and applications of in vitro mutagenesis" Science 229: 1193-1201; Carter (1986) "Site-directed mutagenesis" Biochem. J. 55 237:1-7; y Kunkel (1987) "The efficiency of oligonucleotide directed mutagenesis" en Nucleic Acids & Molecular Biology (Eckstein, F. y Lilley, D. M. J. eds., Springer Verlag, Berlín)); mutagénesis usando moldes que contienen uracilo (Kunkel (1985) "Rapid and efficient site-specific mutagenesis without phenotypic selection" Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82: 488-492; Kunkel et al et al. (1988) "Mutant Trp repressors with new DNA-binding specificities" Science 242: 240-245); mutagénesis dirigida a oligonucleótidos (Methods in Enzymol. 100: 468-500 (1983); Methods in Enzymol. 154: 329-350 (1987); Zoller y Smith (1982) "Oligonucleotide-directed mutagenesis using M13-derived vectors: an efficient and general procedure for the production of point mutations in any DNA fragment" Nucleic Acids Res. 10: 6487-6500; Zoller y Smith (1983) "Oligonucleotide-directed mutagenesis of DNA fragments cloned in M13 vectors" Methods in Enzymol. 100: 468-500; y Zoller y Smith (1987) Oligonucleotide-directed 65 mutagenesis: a simple method using two oligonucleotide primers and a single-stranded DNA template" Methods in Enzymol. 154: 329-350); mutagénesis de ADN modificada con fosforotioato (Taylor et al. (1985) "The use of phosphorothioate-modified DNA in restriction enzyme reactions to prepare nicked DNA" Nucl. Acids Res. 13: 87498764; Taylor et al. (1985) "The rapid generation of oligonucleotide-directed mutations at high frequency using phosphorothioate-modified DNA" Nucl. Acids Res. 13: 8765-8787 (1985); Nakamaye (1986) "Inhibition of restriction endonuclease Nci I cleavage by phosphorothioate groups and its application to oligonucleotide-directed 5 mutagenesis" Nucl. Acids Res. 14: 9679-9698; Sayers et al et al. (1988) "Strand specific cleavage of phosphorothioate-containing DNA by reaction with restriction endonucleases in the presence of ethidium bromide" Nucl. Acids Res. 16: 803-814); mutagénesis usando ADN dúplex con huecos (Kramer et al. (1984) "The gapped duplex DNA approach to oligonucleotide-directed mutation construction" Nucl. Acids Res. 12: 9441-9456; Kramer y

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10 Fritz (1987) Methods in Enzymol. "Oligonucleotide-directed construction of mutations via gapped duplex DNA" 154: 350-367; Kramer et al. (1988) "Improved enzymatic in vitro reactions in the gapped duplex DNA approach to oligonucleotide-directed construction of mutations" Nucl. Acids Res. 16: 7207; y Fritz et al. (1988) "Oligonucleotidedirected construction of mutations: a gapped duplex DNA procedure without enzymatic reactions in vitro" Nucl. Acids Res. 16: 6987-6999).

15 Los protocolos adicionales que se pueden usar para poner en práctica los métodos incluyen reparación de falta de coincidencia puntual (Kramer (1984) "Point Mismatch Repair" Cell 38: 879-887), mutagénesis usando cepas hospedadoras con deficiencia de reparación (Carter et al. (1985) "Improved oligonucleotide site-directed mutagenesis using M13 vectors" Nucl. Acids Res. 13: 4431-4443; y Carter (1987) "Improved oligonucleotide-directed

20 mutagenesis using M13 vectors" Methods in Enzymol. 154: 382-403), mutagénesis de supresión (Eghtedarzadeh (1986) "Use of oligonucleotides to generate large deletions" Nucl. Acids Res. 14: 5115), restricción-selección y restricción-selección y restricción-purificación (Wells et al. (1986) "Importance of hydrogen-bond formation in stabilizing the transition state of subtilisin" Phil. Trans. R. Soc. Lond. A 317: 415-423), mutagénesis mediante síntesis génica total (Nambiar et al. (1984) "Total synthesis and cloning of a gene coding for the ribonuclease S protein"

25 Science 223: 1299-1301; Sakamar y Khorana (1988) "Total synthesis and expression of a gene for the a-subunit of bovine rod outer segment guanine nucleotide-binding protein (transducin)" Nucl. Acids Res. 14: 6361-6372; Wells et al. (1985) "Cassette mutagenesis: an efficient method for generation of multiple mutations at defined sites" Gene 34: 315-323; y Grundstrom et al. (1985) "Oligonucleotide-directed mutagenesis by microscale 'shot-gun' gene synthesis" Nucl. Acids Res. 13: 3305-3316), reparación de la ruptura de la doble hebra (Mandecki (1986); Arnold (1993)

30 "Protein engineering for unusual environments" Current Opinion in Biotechnology 4: 450-455, "Oligonucleotidedirected double-strand break repair in plasmids of Escherichia coli: a method for site-specific mutagenesis" Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 83: 7177-7181). Detalles adicionales de muchos de los métodos mencionados anteriormente se pueden encontrar en el Volumen 154 de Methods in Enzymology, que también describe controles útiles para problemas de resolución de problemas con diversos métodos de mutagénesis.

35 Los protocolos que se pueden usar se describen, por ejemplo, en el documento de Patente de Estados Unidos Nº

5.605.793 de Stemmer (25 de febrero de 1997), "Methods for In Vitro Recombination"; documento de Patente de Estados Unidos Nº 5.811.238 de Stemmer et al. (22 de septiembre de 1998) "Methods for Generating Polynucleotides having Desired Characteristics by Iterative Selection and Recombination"; documento de Patente de

40 Estados Unidos Nº 5.830.721 de Stemmer et al. (3 de noviembre de 1998), "DNA Mutagenesis by Random Fragmentation and Reassembly"; documento de Patente de Estados Unidos Nº 5.834.252 de Stemmer, et al. (10 de noviembre de 1998) "End-Complementary Polymerase Reaction"; documento de Patente de Estados Unidos Nº

5.837.458 de Minshull, et al. (17 de noviembre de 1998), "Methods and Compositions for Cellular and Metabolic Engineering"; documento de patente WO 95/22625, Stemmer y Crameri, "Mutagenesis by Random Fragmentation 45 and Reassembly"; documento de patente WO 96/33207 de Stemmer y Lipschutz "End Complementary Polymerase Chain Reaction"; documento de patente WO 97/20078 de Stemmer y Crameri "Methods for Generating Polynucleotides having Desired Characteristics by Iterative Selection and Recombination"; documento de patente WO 97/35966 de Minshull y Stemmer, "Methods and Compositions for Cellular and Metabolic Engineering"; documento de patente WO 99/41402 de Punnonen et al. "Targeting of Genetic Vaccine Vectors"; documento de 50 patente WO 99/41383 de Punnonen et al. "Antigen Library Immunization"; documento de patente WO 99/41369 de Punnonen et al. "Genetic Vaccine Vector Engineering"; documento de patente WO 99/41368 de Punnonen et al. "Optimization of Immunomodulatory Properties of Genetic Vaccines"; documento de patente EP 752008 de Stemmer y Crameri, "DNA Mutagenesis by Random Fragmentation and Reassembly"; documento de patente EP 0932670 de Stemmer "Evolving Cellular DNA Uptake by Recursive Sequence Recombination"; documento de patente WO 55 99/23107 de Stemmer et al., "Modification of Virus Tropism and Host Range by Viral Genome Shuffling"; documento de patente WO 99/21979 de Apt et al., "Human Papillomavirus Vectors"; documento de patente WO 98/31837 de del Cardayre et al. "Evolution of Whole Cells and Organisms by Recursive Sequence Recombination"; documento de patente WO 98/27230 de Patten y Stemmer, "Methods and Compositions for Polypeptide Engineering"; documento de patente WO 98/27230 de Stemmer et al., "Methods for Optimization of Gene Therapy by Recursive Sequence 60 Shuffling and Selection", documento de patente WO 00/00632, "Methods for Generating Highly Diverse Libraries", documento de patente WO 00/09679, "Methods for Obtaining in Vitro Recombined Polynucleotide Sequence Banks and Resulting Sequences", documento de patente WO 98/42832 de Arnold et al., "Recombination of Polynucleotide Sequences Using Random or Defined Primers", documento de patente WO 99/29902 de Arnold et al., "Method for Creating Polynucleotide and Polypeptide Sequences", documento del patente WO 98/41653 de Vind, "An in Vitro

65 Method for Construction of a DNA Library", documento de patente WO 98/41622 de Borchert et al., "Method for Constructing a Library Using DNA Shuffling", y documento de patente WO 98/42727 de Pati y Zarling, "Sequence Alterations using Homologous Recombination."

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Los protocolos que se pueden usar (que proporcionan detalles con respecto a diversos métodos de generación de

5 diversidad) se describen, por ejemplo, en la solicitud de Patente de Estados Unidos con Nº de serie. (USSN) 09/407,800, "SHUFFLING OF CODON ALTERED GENES" de Patten et al. presentada el 28 de septiembre de 1999; "EVOLUTION OF WHOLE CELLS AND ORGANISMS BY RECURSIVE SEQUENCE RECOMBINATION" de del Cardayre et al., documento de patente de Estados Unidos Nº 6.379.964; "OLIGONUCLEOTIDE MEDIATED NUCLEIC ACID RECOMBINATION" de Crameri et al., s 6.319.714; 6.368.861; 6.376.246; 6.423.542; 6.426.224 y documento PCT/US00/01203; "USE OF CODON-VARIED OLIGONUCLEOTIDE SYNTHESIS FOR SYNTHETIC SHUFFLING" de Welch et al., documento de patente de Estados Unidos Nº 6.436.675; "METHODS FOR MAKING CHARACTER STRINGS, POLYNUCLEOTIDES & POLYPEPTIDES HAVING DESIRED CHARACTERISTICS" de Selifonov et al., presentado el 18 de enero de 2000, (PCT/US00/01202) y, por ejemplo "METHODS FOR MAKING CHARACTER STRINGS, POLYNUCLEOTIDES &

15 POLYPEPTIDES HAVING DESIRED CHARACTERISTICS" de Selifonov et al., presentado el 18 de julio de 2000 (documento de Estados Unidos con Nº de Serie 09/618.579); "METHODS OF POPULATING DATA STRUCTURES FOR USE IN EVOLUTIONARY SIMULATIONS" de Selifonov y Stemmer, presentado el 18 de enero de 2000 (documento PCT/US00/01138); y "SINGLE-STRANDED NUCLEIC ACID TEMPLATE-MEDIATED RECOMBINATION AND NUCLEIC ACID FRAGMENT ISOLATION" de Affholter, presentado el 6 de septiembre de 2000 (documento de Estados Unidos con Nº de Serie 09/656.549); y documentos de patente de Estados Unidos Nºs 6.177.263; 6.153.410.

Los métodos no estocásticos, o de "evolución dirigida", incluyen, por ejemplo, mutagénesis por saturación (GSSM™), reensamblaje de ligamiento sintético (SLR), o una combinación de los mismos se usan para modificar los

25 ácidos nucleicos para generar pectato liasas con propiedades nuevas o alteradas (por ejemplo, actividad en condiciones altamente ácidas o alcalinas, temperaturas elevadas, y similares). Los polipéptidos codificados por los ácidos nucleicos modificados se pueden identificar sistemáticamente para una actividad antes de someter a ensayo la actividad proteolítica u otra actividad. Se puede usar cualquier modalidad o protocolo de ensayo, por ejemplo, usando una plataforma de matriz capilar. Véanse, por ejemplo, los documentos de patente de Estados Unidos Nºs 6.361.974; 6.280.926; 5.939.250.

Mutagénesis por saturación, o, GSSM™

En un aspecto, se usan cebadores de codón que contienen una secuencia de N,N,G/T degenerada para introducir

35 mutaciones puntuales en un polinucleótido, por ejemplo, una pectato liasa o un anticuerpo de la divulgación, con el fin de generar un conjunto de polipéptidos de la progenie en los que se representa una gama total de sustituciones de aminoácidos individuales en cada posición del aminoácido, por ejemplo, un resto de aminoácido en un sitio activo enzimático o unión de ligandos dirigida al sitio a modificar. Estos oligonucleótidos pueden comprender una primera secuencia homóloga contigua, una secuencia de N,N,G/T degenerada, y, ocasionalmente, una segunda secuencia homóloga. Los productos de traducción de la progenie corriente abajo a partir del uso de tales oligonucleótidos se incluyen todos los posibles cambios de aminoácidos en cada sitio de aminoácidos a lo largo del polipéptido, porque la degeneración de la secuencia de N,N,G/T incluye codones para los 20 aminoácidos. En un aspecto, uno de tales oligonucleótidos degenerados (que consiste por ejemplo en un casete de N,N,G/T degenerado) se usa para someter cada codón original en un molde de polinucleótido precursor a una gama completa de sustituciones de codón. En

45 otro aspecto, se usan al menos dos casetes degenerados – en el mismo oligonucleótido o no, para someter al menos a dos codones originales en un molde de polinucleótido precursor a una gama completa de sustituciones de codón. Por ejemplo, más de una secuencia de N,N,G/T puede estar contenida en un oligonucleótido para introducir mutaciones de aminoácidos en más de un sitio. Esta pluralidad de secuencias de N,N,G/T puede ser directamente contigua, o puede estar separada por una o más secuencias de nucleótidos adicionales. En otro aspecto, se pueden usar oligonucleótidos que sirven para introducir adiciones y supresiones solos o en combinación con los codones que contienen una secuencia de N,N,G/T, para introducir cualquier combinación o permutación de adiciones, supresiones, y/o sustituciones de aminoácidos.

En un aspecto, se realiza la mutagénesis simultánea de dos o más posiciones de aminoácidos contiguas usando un

55 oligonucleótido que contiene tripletes de N,N,G/T contiguos, es decir una secuencia (N,N,G/T)n degenerada. En otro aspecto, se usan casetes degenerados que tienen menos degeneración que la secuencia de N,N,G/T. Por ejemplo, en algunos casos puede ser deseable usar (por ejemplo, en un oligonucleótido) una secuencia de triplete degenerado que consiste solamente en un N, en el que dicho N puede estar en la primera, segunda o tercera posición del triplete. Se puede usar cualquier otra base que incluye cualquier combinación y permutación de la misma en las dos posiciones restantes del triplete. Como alternativa, en algunos casos puede ser deseable usar (por ejemplo, en un oligo) una secuencia de triplete de N,N,N degenerado.

En un aspecto, el uso de tripletes degenerados (por ejemplo, tripletes de N,N,G/T) permite una generación sistemática y fácil de una gama total de posibles aminoácidos naturales (para un total de 20 aminoácidos) en todas y 65 cada una de las posiciones de los aminoácidos en un polipéptido (en aspectos alternativos, los métodos también incluyen generación de menos de todas las posibles sustituciones por resto de aminoácido, o codón, posición). Por

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ejemplo, para un polipéptido de 100 aminoácidos, se pueden generar 2000 especies distintas (es decir 20 aminoácidos posibles por posición X 100 posiciones de aminoácidos). A través del uso de un oligonucleótido o conjunto de oligonucleótidos que contienen un triplete degenerado N,N,G/T, 32 secuencias individuales pueden codificar los 20 aminoácidos naturales posibles. Por lo tanto, en un recipiente de reacción en el que una secuencia

5 de polinucleótidos precursora se somete a mutagénesis por saturación usando al menos uno de tales oligonucleótidos, se generan 32 polinucleótidos de progenie distinta que codifican 20 polipéptidos distintos. Por el contrario, el uso de un oligonucleótido no degenerado en mutagénesis dirigida al sitio conduce solamente a un producto de polipéptido de la progenie por recipiente de reacción. Los oligonucleótidos no degenerados se pueden usar opcionalmente junto con los cebadores degenerados que se desvelan; por ejemplo, los oligonucleótidos no degenerados se pueden usar para generar mutaciones puntuales específicas en un polinucleótido de trabajo. Esto proporciona un medio para generar mutaciones puntuales silenciosas específicas, mutaciones puntuales que conducen a los correspondientes cambios de aminoácidos, y mutaciones puntuales que producen la generación de codones de parada y la correspondiente expresión de fragmentos de polipéptidos.

15 En un aspecto, cada recipiente de reacción de mutagénesis por saturación contiene polinucleótidos que codifican al menos 20 moléculas de polipéptidos de la progenie (por ejemplo, pectato liasas) de modo que los 20 aminoácidos naturales se representan en una posición específica del aminoácido que corresponde a la posición del codón sometido a mutagénesis en el polinucleótido precursor (otros aspectos usan menos de las 20 combinaciones naturales). Los polipéptidos de la progenie degenerada de 32 veces generados a partir de cada recipiente de reacción de mutagénesis por saturación se pueden someter a la amplificación clonal (por ejemplo, se pueden clonar en un hospedador adecuado, por ejemplo, hospedador de E. coli, usando, por ejemplo, un vector de expresión) y se pueden someter a identificación sistemática de expresión. Cuando un polipéptido de la progenie individual se identifica mediante identificación sistemática para presentar un cambio favorable en las propiedades (cuando se compara con el polipéptido precursor, tal como un aumento de la actividad proteolítica en condiciones alcalinas o

25 ácidas), se puede secuenciar para que identifique la sustitución de aminoácido correspondientemente favorable contenida en el mismo.

En un aspecto, después de la mutagénesis de todas y cada una de las posiciones del aminoácido en un polipéptido precursor usando mutagénesis por saturación como se desvela en el presente documento, se pueden identificar cambios favorables de aminoácidos en una o más posiciones de la misma. Se pueden generar una o más moléculas de nueva progenie que contienen una combinación de todas o parte de estas subtituciones de aminoácidos favorables. Por ejemplo, si 2 cambios de aminoácidos favorables específicos identifican en cada una de las posiciones de 3 aminoácidos en un polipéptido, las permutaciones incluyen 3 posibilidades en cada posición (sin cambio del aminoácido glicina, y cada uno de dos cambios favorables) y 3 posiciones. Por lo tanto, existen 3 x 3 x 3

35 o 27 posibilidades totales, incluyendo 7 que se examinaron anteriormente -6 mutaciones puntuales individuales (es decir 2 en cada una de las tres posiciones) y ningún cambio en posición alguna.

En otro aspecto, se puede usar mutagénesis de saturación de sitio junto con otros medios estocásticos o no estocásticos para variar la secuencia, por ejemplo, reensamblaje de ligamiento sintético (véase a continuación), redistribución, quimerización, recombinación y otros procesos de mutagénesis y agentes de mutagénesis. Esto proporciona el uso de cualquier proceso o procesos de mutagénesis, incluyendo mutagénesis por saturación, de una manera repetitiva.

Reensamblaje de Ligamiento Sintético (SLR)

45 Un sistema de modificación génica no estocástico denominado "reensamblaje de ligamiento sintético", o simplemente "SLR", un "proceso de evolución dirigida", puede ser utilizado para generar polipéptidos, por ejemplo, pectato liasas o anticuerpos, con propiedades nuevas o alteradas. El SLR es un método de ligamiento de fragmentos de oligonucleótidos en conjunto de forma no estocástica. Este método se diferencia de la redistribución de oligonucleótidos estocástica en que los componentes básicos del ácido nucleico no se redistribuyen, concatenan

o quimerizan de forma aleatoria, sino que en su lugar se ensamblan de forma no estocástica. Véase, por ejemplo, la solicitud de Patente de Estados Unidos con Nº de Serie (USSN) 09/332.835 con el título "Reensamblaje de Ligamiento Sintético en Evolución Dirigida" y presentada el 14 de junio de 1999 ("USSN 09/332.835"). En un aspecto, el SLR comprende las siguientes etapas: (a) proporcionar un polinucleótido molde, en el que el

55 polinucleótido molde comprende secuencia que codifica un gen homólogo; (b) proporcionar una pluralidad de polinucleótidos como componentes básicos, en el que los polinucleótidos como componentes básicos se diseñan para reensamblaje cruzado con el polinucleótido molde en una secuencia determinada previamente, y un polinucleótido como componente básico comprende una secuencia que es una variante del gen homólogo y una secuencia homóloga con el polinucleótido molde que flanquea la secuencia variable; (c) combinar un polinucleótido como componente básico con un polinucleótido molde de modo que el cruce del polinucleótido como componente básico se reensambla con el polinucleótido molde para generar polinucleótidos que comprenden variaciones de secuencias de genes homólogos.

El SLR no depende de la presencia de niveles elevados de homología entre polinucleótidos a redistribuir. Por lo

65 tanto, este método se puede usar para bibliotecas (o conjuntos) generadas de forma no estocástica de moléculas de la progenie que comprenden más de 10100 quimeras diferentes. El SLR se puede usar para generar bibliotecas que comprenden aproximadamente 101000 quimeras de la progenie diferentes. Por lo tanto, los aspectos incluyen métodos no estocásticos para producir un conjunto de moléculas de ácidos nucleicos quiméricas finalizadas que tienen un orden de ensamblaje global que se elige mediante el diseño. Este método incluye las etapas de generar mediante el diseño de una pluralidad de componentes básicos de ácidos nucleicos específicos que tienen extremos

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5 que se pueden ligar mutuamente compatibles útiles, y ensamblar estos componentes básicos del ácido nucleico, de manera que se consigue una orden de montaje global diseñada.

Se considera que los extremos que se pueden ligar mutuamente compatibles de los componentes básicos del ácido nucleico a ensamblar son "útiles" para este tipo de conjunto ordenado si permiten que los componentes básicos se acoplen en órdenes predeterminadas. Por lo tanto, el orden general de ensamblaje en el que los componentes básicos del ácido nucleico se pueden acoplar se especifica mediante el diseño de los extremos que se pueden ligar. Si se va a usar más de una etapa de ensamblaje, entonces el orden general de ensamblaje en el que se pueden acoplar los componentes básicos del ácido nucleico también se especifica mediante el orden secuencial de la etapa

o etapas de ensamblaje. En un aspecto, las piezas de componentes básicos hibridados se tratan con una enzima, tal

15 como una ligasa (por ejemplo, T4 ADN ligasa), para conseguir la unión covalente de las piezas de los componentes básicos.

En un aspecto, el diseño de los componentes básicos de los oligonucleótidos se obtiene mediante el análisis de un conjunto de moldes de secuencias de ácidos nucleicos precursores que sirven como base para la producción de un conjunto de la progenie de polinucleótidos quiméricos finalizados. Por lo tanto, estos moldes de oligonucleótidos precursores sirven como una fuente de información de la secuencia que ayuda en el diseño de los componentes básicos del ácido nucleico que se van a someter a mutagénesis, por ejemplo, quimerizar o redistribuir. En un aspecto de este método, las secuencias de una pluralidad de moldes de ácido nucleico precursor se alinean con el fin de seleccionar uno o más puntos de demarcación. Los puntos de demarcación pueden estar situados en una 25 zona de homología, y constan de uno o más nucleótidos. Estos puntos de demarcación se comparten preferentemente por al menos dos de los moldes precursores. Por lo tanto, los puntos de demarcación se pueden usar para delinear los límites de los componentes básicos de los oligonucleótidos que se generan con el fin de reordenar los polinucleótidos precursores. Los puntos de demarcación identificados y seleccionados en las moléculas precursoras sirven como puntos potenciales de quimerización en el ensamblaje de las moléculas finales de la progenie quiméricas. Un punto de demarcación puede ser una zona de homología (que consiste en al menos una base nucleotídica homóloga) compartida por al menos dos secuencias de polinucleótidos precursores. Como alternativa, un punto de demarcación puede ser una zona de homología que se comparte por al menos la mitad de las secuencias de polinucleótidos precursores, o, puede ser una zona de homología que se comparte por al menos dos tercios de las secuencias de polinucleótidos precursores. Incluso más preferentemente un punto de

35 demarcación útil es una zona de homología que se comparte por al menos tres cuartas partes de las secuencias de polinucleótidos precursores, o, se puede compartir por casi todas las secuencias de polinucleótidos precursores. En un aspecto, un punto de demarcación es una zona de homología que se comparte por todas las secuencias de polinucleótidos precursores.

En un aspecto, un proceso de reensamblaje de ligamiento se realiza de forma exhaustiva con el fin de generar una biblioteca exhaustiva de polinucleótidos quiméricos de la progenie. En otras palabras, todas las combinaciones ordenadas posibles de los componentes básicos del ácido nucleico se representan en el conjunto de moléculas de ácido nucleico quimérico finalizado. Al mismo tiempo, en otro aspecto, el orden de montaje (es decir, el orden de montaje de cada componente básico en la secuencia en las posiciones 5' a 3' de cada ácido nucleico quimérico

45 finalizado) en cada combinación se realiza mediante diseño (o no estocástico) como se ha descrito anteriormente. Debido a la naturaleza no estocástica de esta invención, la posibilidad de productos secundarios no deseados se reduce en gran medida.

En otro aspecto, el método de reensamblaje de ligamiento se realiza de forma sistemática. Por ejemplo, el método se realiza con el fin de generar una biblioteca sistemáticamente compartimentada de moléculas de la progenie, con compartimentos que se pueden seleccionar de forma sistemática, por ejemplo, uno a uno. En otras palabras, esta invención proporciona que, a través del uso selectivo y con criterio de componentes básicos de ácidos nucleicos específicos, junto con el uso selectivo y con criterio de reacciones de ensamblaje en etapas secuencialmente, se puede conseguir un diseño, en el que los conjuntos específicos de productos de la progenie se producen en cada 55 uno de varios recipientes de reacción. Esto permite que se realice un procedimiento de examen sistemático y de identificación sistemática. Por lo tanto, estos métodos permiten el examen sistemático de un número potencialmente muy grande de moléculas de la progenie sistemáticamente en grupos más pequeños. Debido a su capacidad para realizar quimerizaciones de una manera que es altamente flexible pero exhaustiva y sistemática también, en particular cuando hay un bajo nivel de homología entre las moléculas precursoras, estos métodos proporcionan la generación de una biblioteca (o conjunto) formada por un gran número de moléculas de la progenie. Debido a la naturaleza no estocástica del reensamblaje de ligamiento instantáneo, las moléculas de la progenie generadas preferentemente comprenden una biblioteca de moléculas de ácido nucleico quimérico finalizado que tienen un orden de ensamblaje global que se elige mediante el diseño. También se pueden usar métodos de mutagénesis por saturación y de evolución dirigida optimizada para generar diferentes especies moleculares de la progenie. Se 65 observa que esto proporciona una libertad de elección y control con respecto a la selección de puntos de demarcación, el tamaño y número de los componentes básicos del ácido nucleico, y el tamaño y el diseño de los

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acoplamientos. Se observa, además, que el requisito de homología intermolecular es altamente relajado para la operatividad. De hecho, incluso los puntos de demarcación se pueden elegir en zonas con poca o ninguna homología intermolecular. Por ejemplo, a causa de la oscilación del codón, es decir, la degeneración de los codones, se pueden introducir sustituciones de nucleótidos en los componentes básicos del ácido nucleico sin alterar el

5 aminoácido codificado originalmente en el correspondiente molde precursor. Como alternativa, un codón se puede alterar de modo que se altera la codificación de un aminoácido original. Esto proporciona que tales sustituciones se pueden introducir en el componente básico del ácido nucleico con el fin de aumentar la incidencia de puntos de demarcación homóloga intermoleculares y por lo tanto para permitir un aumento del número de acoplamientos a conseguir entre los componentes básicos, que a su vez permite que se genere un mayor número de moléculas quiméricas de la progenie.

En otro aspecto, la naturaleza sintética de la etapa en la que se generan los componentes básicos permite el diseño e introducción de nucleótidos (por ejemplo, uno o más nucleótidos, que pueden ser, por ejemplo, codones o intrones

o secuencias reguladoras) que más tarde se pueden retirar opcionalmente en un proceso in vitro (por ejemplo, por

15 mutagénesis) o en un proceso in vivo (por ejemplo, mediante el uso de la capacidad de corte y empalme de genes de un organismo hospedador). Se observa que en muchos casos la introducción de estos nucleótidos también puede ser deseable por muchas otras razones además del beneficio potencial de crear un punto de demarcación útil.

En un aspecto, un componente básico de ácido nucleico se usa para introducir un intrón. Por lo tanto, se introducen intrones funcionales en un gen artificial preparado de acuerdo con los métodos que se describen en el presente documento. El intrón o intrones introducidos artificialmente pueden ser funcionales en una célula hospedadora para corte y empalme de genes mucho más en la forma en la que los intrones de origen natural sirven funcionalmente en el corte y empalme de genes.

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Sistema Optimizado de Evolución Dirigida

Un sistema de modificación génica no estocástico denominado "sistema de evolución dirigida optimizado" puede generar polipéptidos, por ejemplo, pectato liasas o anticuerpos, con propiedades nuevas o alteradas. La evolución dirigida optimizada se refiere al uso de ciclos repetidos de redistribución reductora, recombinación y selección que permite la evolución molecular dirigida de los ácidos nucleicos a través de recombinación. La evolución dirigida optimizada permite la generación de una gran población de secuencias quiméricas evolucionadas, en la que la población generada se enriquece de forma significativa para las secuencias que tienen un número predeterminado de sucesos de cruce.

35 Un suceso de cruce es un punto en una secuencia quimérica en el que se produce un cambio en la secuencia a partir de una variante precursora a otra variante precursora. Tal punto se encuentra normalmente en la unión en la que los oligonucleótidos de dos precursores se unen entre sí para formar una sola secuencia. Este método permite el cálculo de las concentraciones correctas de secuencias de oligonucleótidos para que la población quimérica final de las secuencias se vea enriquecida para el número elegido de sucesos de cruce. Esto proporciona un mayor control sobre la elección de variantes quiméricas que tienen un número predeterminado de sucesos de cruce.

Además, este método proporciona un medio conveniente para explorar una enorme cantidad del posible espacio de la variante de proteína en comparación con otros sistemas. Anteriormente, si se generaban, por ejemplo, 1013 45 moléculas quiméricas durante una reacción, sería extremadamente difícil someter a ensayo un gran número de variantes quiméricas para una actividad en particular. Por otra parte, una porción significativa de la población de la progenie tendría un número muy elevado de sucesos de cruce que daría como resultado proteínas que sería menos probable que tuvieran un aumento de los niveles de una actividad en particular. Mediante el uso de estos métodos, la población de moléculas quiméricas se puede enriquecer para aquellas variantes que tienen un número de sucesos de cruce en particular. Por lo tanto, aunque todavía se pueden generar 1013 moléculas quiméricas durante una reacción, cada una de las moléculas elegidas para el análisis adicional tiene de forma más probable, por ejemplo, solamente tres sucesos de cruce. Dado que la población de la progenie resultante se puede sesgar para que tenga un número predeterminado de sucesos de cruce, los límites de la variedad funcional entre las moléculas quiméricas se reducen. Esto proporciona un número más manejable de variables cuando se calcula el

55 oligonucleótido a partir de que los polinucleótidos precursores originales podrían ser responsables de influir en un rasgo en particular.

Un método para la creación de una secuencia de polinucleótidos de la progenie quimérica es crear oligonucleótidos que corresponden a fragmentos o partes de cada secuencia precursora. Cada oligonucleótido incluye preferentemente una región única de solapamiento de modo que la mezcla de los oligonucleótidos juntos da lugar a una nueva variante que tiene cada fragmento de oligonucleótido ensamblado en el orden correcto. También se puede encontrar información, por ejemplo, en el documento USSN 09/332.835; documento de Patente de Estados Unidos Nº 6.361.974.

65 El número de oligonucleótidos generados para cada variante precursora tiene una relación con el número total de cruces resultantes en la molécula quimérica que se crea en última instancia. Por ejemplo, se podrían proporcionar tres variantes de secuencias de nucleótidos precursoras para someterse a una reacción de ligamiento con el fin de encontrar una variante quimérica que tiene, por ejemplo, mayor actividad a temperatura elevada. Como un ejemplo, se puede generar un conjunto de 50 secuencias de oligonucleótidos que corresponde a cada una de las porciones de cada variante precursora. Por consiguiente, durante el proceso de reensamblaje de ligamiento se podrían

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5 producir hasta 50 sucesos de cruce dentro de cada una de las secuencias quiméricas. La probabilidad de que cada uno de los polinucleótidos quiméricos generados contenga oligonucleótidos de cada variante precursora en orden alternativo es muy baja. Si cada fragmento de oligonucleótido está presente en la reacción de ligamiento en la misma cantidad molar es probable que en algunas posiciones los oligonucleótidos del mismo polinucleótido precursor se liguen entre sí y por lo tanto no se producirá como resultado un suceso de cruce. Si la concentración de cada oligonucleótido de cada precursor se mantiene constante durante cualquier etapa de ligamiento en este ejemplo, existe una posibilidad de un 1/3 (suponiendo 3 progenitores) de que un oligonucleótido de la misma variante precursora se ligue dentro de la secuencia quimérica y no se produzca cruce.

Por consiguiente, se puede determinar una función de densidad de probabilidad (PDF) para predecir la población de

15 sucesos de cruce que se pueden producir durante cada etapa de una reacción de ligamiento dado un número determinado de variantes de los precursores, una serie de oligonucleótidos que corresponden a cada variante, y las concentraciones de cada variante durante cada etapa en la reacción de ligamiento. Las estadísticas y las matemáticas detrás de la determinación de la PDF se describen a continuación. Mediante el uso de estos métodos, se puede calcular una función de densidad de probabilidad, y por lo tanto enriquecer la población de la progenie quimérica para un número predeterminado de sucesos de cruce resultantes de una reacción de ligamiento en particular. Por otra parte, se puede determinar previamente un número objetivo de sucesos de cruce, y el sistema programado a continuación para calcular las cantidades de partida de cada oligonucleótido precursor durante cada etapa en la reacción de ligamiento para dar como resultado una función de densidad de probabilidad que se centra en el número predeterminado de sucesos de cruce. Estos métodos se dirigen al uso de ciclos repetidos de

25 redistribución reductora, recombinación y selección que permite la evolución molecular dirigida de un ácido nucleico que codifica un polipéptido a través de recombinación. Este sistema permite la generación de una gran población de secuencias quiméricas evolucionadas, en la que la población generada se enriquece significativamente para las secuencias que tienen un número predeterminado de sucesos de cruce. Un suceso de cruce es un punto en una secuencia quimérica, en el que se produce un cambio en la secuencia a partir de una variante precursora por otra variante precursora. Tal punto se encuentra normalmente en la unión de oligonucleótidos, en la que dos de los precursores se ligan entre sí para formar una sola secuencia. El método permite el cálculo de las concentraciones correctas de secuencias de oligonucleótidos para que la población quimérica final de las secuencias se enriquezca para el número elegido de sucesos de cruce. Esto proporciona un mayor control sobre la elección de variantes quiméricas que tienen un número predeterminado de sucesos de cruce.

35 Además, estos métodos proporcionan un medio conveniente para explorar una enorme cantidad de espacio variable posible de la proteína en comparación con otros sistemas. Mediante el uso de los métodos que se describen en el presente documento, la población de moléculas quiméricas se puede enriquecer para las variantes que tienen un número de sucesos de cruce en particular. Por lo tanto, aunque todavía se pueden generar 1013 moléculas quiméricas durante una reacción, cada una de las moléculas elegida para el análisis adicional tiene de forma más probable, por ejemplo, solamente tres sucesos de cruce. Dado que la población de la progenie resultante se puede sesgar para que tenga un número predeterminado de sucesos de cruce, los límites de la variedad funcional entre las moléculas quiméricas se reduce. Esto proporciona un número de variables más manejable cuando se calcula el oligonucleótido de los polinucleótidos precursores originales que podría ser responsable de influir en un rasgo en

45 particular.

En un aspecto, el método crea una secuencia de polinucleótidos de la progenie quimérica mediante la creación de oligonucleótidos correspondientes a fragmentos o partes de cada secuencia precursora. Cada oligonucleótido incluye preferentemente una región única de solapamiento de manera que la mezcla de los oligonucleótidos juntos da lugar a una nueva variante que tiene cada fragmento de oligonucleótido ensamblado en el orden correcto. Véase también el documento USSN 09/332.835.

Determinación de Sucesos de Cruce

55 Un sistema y un software pueden recibir una función deseada de densidad de probabilidad de cruce (PDF), el número de genes precursores a reensamblar, y el número de fragmentos en el reensamblaje como entradas. La salida de este programa es una "PDF de fragmento" que se puede usar para determinar una fórmula para producir genes reensamblados, y la PDF de cruce estimada de esos genes. El procesamiento que se describe en el presente documento se realiza preferentemente en MATLAB™ (The Mathworks, Natick, Massachusetts), un lenguaje de programación y entorno del desarrollo para informática técnica.

Procesos Repetitivos

Estos procesos se pueden repetir de forma reiterada. Por ejemplo, un ácido nucleico (o, el ácido nucleico)

65 responsable de un fenotipo de pectato liasa alterado o nuevo se identifica, se vuelve a aislar, se modifica de nuevo, se vuelve a someter a ensayo para su actividad. Este proceso se puede repetir de forma reiterada hasta que se modifica por ingeniería un fenotipo deseado. Por ejemplo, toda una ruta anabólica o catabólica bioquímica se puede modificar por ingeniería en una célula, incluyendo, por ejemplo, actividad de hidrólisis de epóxido.

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De forma análoga, si se determina que un oligonucleótido en particular no ha influido en absoluto en el rasgo

5 deseado (por ejemplo, un fenotipo de pectato liasa nuevo), se puede eliminar como una variable mediante la síntesis de oligonucleótidos precursores más grandes que incluyen la secuencia a eliminar. Dado que la incorporación de la secuencia dentro de una secuencia más grande evita cualquier suceso de cruce, ya no se producirá variación alguna en esta secuencia en los polinucleótidos de la progenie. Esta práctica repetitiva para determinar qué oligonucleótidos están más relacionados con el rasgo deseado y cuáles no están relacionados, permite una exploración más eficaz de todas las posibles variantes de proteínas a las que se podría proporcionar un rasgo o actividad en particular.

Redistribución in vivo

La redistribución in vivo de moléculas se usa en métodos que proporcionan variantes de polipéptidos de la

15 divulgación, por ejemplo, anticuerpos, pectato liasas y similares. La redistribución in vivo se puede realizar usando la propiedad natural de las células para multímeros recombinantes. Aunque la recombinación in vivo ha proporcionado la ruta natural principal para la diversidad molecular, la recombinación genética sigue siendo un proceso relativamente complejo que implica 1) el reconocimiento de homologías; 2) escisión de la hebra, invasión de la hebra, y etapas metabólicas que conducen a la producción de quiasma recombinante; y por último 3) la resolución del quiasma en moléculas recombinadas discretas. La formación del quiasma requiere el reconocimiento de secuencias homólogas.

En un aspecto, esto proporciona un método para producir un polinucleótido híbrido a partir de al menos un primer polinucleótido (por ejemplo, una pectato liasa de la divulgación) y un segundo polinucleótido (por ejemplo, una 25 enzima, tal como una pectato liasa de la divulgación o cualquier otra pectato liasa, o, una marca o un epítopo). Esto puede ser utilizado para producir un polinucleótido híbrido mediante la introducción de al menos un primer polinucleótido y un segundo polinucleótido que comparten al menos una región de homología de secuencia parcial en una célula hospedadora adecuada. Las regiones de homología de secuencia parcial estimulan procesos que dan como resultado una reorganización de la secuencia produciendo un polinucleótido híbrido. La expresión "polinucleótido híbrido", como se usa en el presente documento, es cualquier secuencia de nucleótidos que resulta del método y que contiene la secuencia de al menos dos secuencias de polinucleótidos originales. Tales polinucleótidos híbridos pueden resultar de sucesos de recombinación intermolecular que estimulan la integración de secuencias entre moléculas de ADN. Además, tales polinucleótidos híbridos pueden resultar de procesos de reorganización reductora intramolecular que usan secuencias repetidas para alterar una secuencia de nucleótidos

35 dentro de una molécula de ADN.

Producción de variantes de secuencias

La divulgación también proporciona métodos adicionales para preparar variantes de secuencias de las secuencias de ácidos nucleicos (por ejemplo, pectato liasa). La divulgación también proporciona métodos adicionales para aislar pectato liasas usando los ácidos nucleicos y polipéptidos de la divulgación. En un aspecto, esto proporciona variantes de una secuencia que codifica pectato liasa (por ejemplo, un gen, ADNc o mensaje) que se pueden alterar mediante cualquier medio, que incluye, por ejemplo, métodos aleatorios o estocásticos, o, no estocásticos, o métodos de "evolución dirigida", como se ha descrito anteriormente.

45 Las variantes aisladas pueden ser de origen natural. También se pueden crear variantes in vitro. Las variantes se pueden crear usando técnicas de ingeniería genética tales como mutagénesis dirigida al sitio, mutagénesis química aleatoria, procedimientos de supresión de Exonucleasa III, y técnicas de clonación convencionales. Como alternativa, tales variantes, fragmentos, análogos, o derivados se pueden crear usando procedimientos de síntesis o de modificación química. Otros métodos para preparar variantes también son familiares para los expertos en la materia. Estos incluyen procedimientos en los que las secuencias de ácidos nucleicos obtenidas a partir de aislados naturales se modifican para generar ácidos nucleicos que codifican polipéptidos que tienen características que aumentan su valor en aplicaciones industriales o de laboratorio. En tales procedimientos, se genera y se caracteriza un gran número de secuencias de variantes que tienen una o más diferencias en los nucleótidos con respecto a la

55 secuencia obtenida a partir del aislado natural. Estas diferencias de nucleótidos pueden dar como resultado cambios de aminoácidos con respecto a los polipéptidos codificados por los ácidos nucleicos a partir de los aislados naturales.

Por ejemplo, se pueden crear variantes usando PCR propensa a error. En la PCR propensa a error, la PCR se realiza en condiciones en las que la fidelidad de la copia de la ADN polimerasa es baja, de modo que se obtiene una tasa elevada de mutaciones puntuales a lo largo de toda la longitud del producto de PCR. La PCR propensa a error se describe, por ejemplo, en Leung, D.W., et al., Technique, 1: 11-15, 1989) y Caldwell, R. C. y Joyce G.F., PCR Methods Applic., 2: 28-33, 1992. En resumen, en tales procedimientos, los ácidos nucleicos a someter a mutagénesis se mezclan con cebadores de PCR, tampón de reacción, MgCl2, MnCl2, Taq polimerasa y una 65 concentración apropiada de dNTP para conseguir una tasa elevada de mutaciones puntuales a lo largo de toda la longitud del producto de PCR. Por ejemplo, la reacción se puede realizar usando 20 fmoles de ácido nucleico a

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2 7mM, MnCl2 0,5mM, 5 unidades de Taq polimerasa, dGTP 0,2 mM, dATP 0,2 mM, dCTP 1 mM, y dTTP 1 mM. La PCR se puede realizar durante 30 ciclos de 94 ºC durante 1 min, 45 ºC durante 1 min, y 72 ºC durante 1 min. Sin embargo, se observará que estos parámetros se pueden variar

5 cuando sea apropiado. Los ácidos nucleicos sometidos a mutagénesis se clonan en un vector apropiado y se evalúan las actividades de los polipéptidos codificados por los ácidos nucleicos sometidos a mutagénesis.

También se pueden crear variantes usando mutagénesis dirigirá a oligonucleótidos para generar mutaciones específicas de sitio en cualquier ADN clonado de interés. La mutagénesis de oligonucleótido se describe, por

10 ejemplo, en Reidhaar-Olson (1988) Science 241: 53-57. En resumen, en tales procedimientos, una pluralidad de oligonucleótidos bicatenarios que portan una o más mutaciones a introducir en el ADN clonado se sintetizan e insertan en el ADN clonado a someter a mutagénesis. Los clones que contienen ADN sometido a mutagénesis se recuperan y se evalúan las actividades de los polipéptidos que codifican.

15 Otro método para generar variantes es la PCR de ensamblaje. La PCR de ensamblaje implica el ensamblaje de un producto de PCR de una mezcla de fragmentos pequeños de ADN. Un gran número de diferentes reacciones de PCR se producen en paralelo en el mismo vial, con los productos de una reacción que ceba los productos de otra reacción. La PCR de ensamblaje se describe, por ejemplo, en el documento de Patente de Estados Unidos Nº

5.965.408.

20 Además, otro método para generar variantes es la mutagénesis de PCR sexual. En la mutagénesis de PCR sexual, se produce una recombinación homóloga forzada entre moléculas de ADN de secuencias de ADN diferentes pero muy relacionadas in vitro, como resultado de la fragmentación aleatoria de la molécula de ADN basándose en homología de secuencias, seguido de fijación del cruce por la extensión del cebador en una reacción de PCR. La

25 mutagénesis de PCR sexual se describe, por ejemplo, en Stemmer (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 1074710751. En resumen, en tales procedimientos, una pluralidad de ácidos nucleicos recombinantes se digieren con DNasa para generar fragmentos que tienen un tamaño medio de 50-200 nucleótidos. Los fragmentos del tamaño medio deseado se purifican y se vuelven a suspender en una mezcla de PCR. La PCR se realiza en condiciones que facilitan la recombinación entre los fragmentos de ácido nucleico. Por ejemplo, la PCR se puede realizar mediante

30 resuspensión de los fragmentos purificados a una concentración de 10-30 ng/:l en una solución 0,2 mM de cada dNTP, MgCl2 2,2 mM, KCl 50 mM, Tris HCl 10 mM, pH 9,0, y Triton X-100 al 0,1 %. Se añaden 2,5 unidades de Taq polimerasa por 100:1 de mezcla de reacción y se realiza la PCR usando el siguiente régimen: 94 ºC durante 60 segundos, 94 ºC durante 30 segundos, 50-55 ºC durante 30 segundos, 72 ºC durante 30 segundos (30-45 veces) y 72 ºC durante 5 minutos. Sin embargo, se observará que estos parámetros se pueden variar cuando sea apropiado.

35 En algunos aspectos, los oligonucleótidos se pueden incluir en las reacciones de PCR. En otros aspectos, el fragmento de Klenow de la ADN polimerasa I se puede usar en un primer conjunto de reacciones de PCR y la Taq polimerasa se puede usar en un conjunto de reacciones de PCR posteriores. Las secuencias recombinantes se aíslan y las actividades de los polipéptidos que codifican se evalúan.

40 También se pueden crear variantes mediante mutagénesis in vivo. En algunos aspectos, las mutaciones aleatorias en una secuencia de interés se generan mediante la propagación de la secuencia de interés en una cepa bacteriana, tal como una cepa de E. coli, que porta mutaciones en una o más de las rutas de reparación de ADN. Tales cepas "mutadoras" tienen una tasa de mutación aleatoria más elevada que la de una precursora de tipo silvestre. La propagación del ADN en una de estas cepas en ocasiones generará mutaciones aleatorias dentro del ADN. Las

45 cepas mutadoras adecuadas para usar en la mutagénesis in vivo se describen, por ejemplo, en la Publicación de PCT con Nº WO 91/16427.

También se pueden generar variantes usando mutagénesis de casete. En la mutagénesis de casete, una pequeña región de una molécula de ADN bicatenario se sustituye con un "casete" de oligonucleótido sintético que difiere de la

50 secuencia nativa. A menudo, el oligonucleótido contiene secuencias nativas total y/o parcialmente aleatorias.

También se puede usar mutagénesis de conjunto recursiva para generar variantes. La mutagénesis de conjunto recursiva es un algoritmo para ingeniería de proteínas (mutagénesis de proteínas) desarrollado para producir diversas poblaciones de mutantes relacionados fenotípicamente cuyos miembros se diferencian en la secuencia de

55 aminoácidos. Este método usa un mecanismo de retroalimentación para controlar rondas sucesivas de mutagénesis de casete combinatoria. La mutagénesis de conjunto recursiva se describe, por ejemplo, en Arkin (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 7811-7815.

En algunos aspectos, las variantes se crean usando mutagénesis de conjunto exponencial. La mutagénesis de

60 conjunto exponencial es un proceso para generar bibliotecas combinatorias con un porcentaje elevado de mutantes únicos y funcionales, en el que pequeños grupos de restos se clasifican al azar en paralelo para identificar, en cada posición alterada, aminoácidos que conducen a proteínas funcionales. La mutagénesis de conjunto exponencial se describe, por ejemplo, en Delegrave (1993) Biotechnology Res. 11: 1548-1552. La mutagénesis aleatoria y dirigida al sitio se describe, por ejemplo, en Arnold (1993) Current Opinion in Biotechnology 4: 450-455.

65 En algunos aspectos, las variantes se crean usando procedimientos de redistribución en los que las partes de una pluralidad de ácidos nucleicos que codifican distintos polipéptidos se fusionan entre sí para crear secuencias de ácidos nucleicos quiméricos que codifican polipéptidos quiméricos como se describe, por ejemplo, en los documentos de Patente de Estados Unidos Nºs 5.965.408; 5.939.250 (véase también el análisis, mencionado

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5 anteriormente).

Las variantes de polipéptidos de la divulgación (por ejemplo, pectato liasas) pueden comprender secuencias en las que uno o más de los restos de aminoácido (por ejemplo, de un polipéptido a modo de ejemplo) se sustituyen con un resto de aminoácido conservado o no conservado (por ejemplo, un resto de aminoácido conservado) y tal resto de aminoácido sustituido puede ser uno codificado o no por el código genético. Las sustituciones conservativas son aquellas que sustituyen un aminoácido dado en un polipéptido por otro aminoácido de características similares. Por lo tanto, los polipéptidos de la divulgación incluyen aquellos que tienen sustituciones conservativas de secuencias, por ejemplo, los polipéptidos a modo de ejemplo de la divulgación, que incluyen, pero no se limitan a, las siguientes sustituciones: sustituciones de un aminoácido alifático tal como Alanina, Valina, Leucina e Isoleucina con otro

15 aminoácido alifático; sustitución de una Serina con una Treonina o viceversa; sustitución de un resto ácido tal como Ácido Aspártico y Glutámico con otro resto ácido; sustitución de un resto que porta un grupo amida, tal como Asparagina y Glutamina, con otro resto que porta un grupo amida; intercambio de un resto básico tal como Lisina y Arginina con otro resto básico; y sustitución de un resto aromático tal como Fenilalanina, Tirosina con otro resto aromático. Otras variantes son aquéllas en las que uno o más de los restos de aminoácidos de los polipéptidos incluye un grupo sustituyente.

Otras variantes dentro del alcance deseado son aquéllas en las que el polipéptido está asociado con otro compuesto, tal como un compuesto para aumentar la vida media del polipéptido, por ejemplo, polietilenglicol.

25 Las variantes adicionales en las que los aminoácidos adicionales se fusionan con el polipéptido, tales como una secuencia directora, una secuencia secretora, una secuencia de proproteína o una secuencia que facilita la purificación, enriquecimiento, o estabilización del polipéptido.

En algunos aspectos, las variantes, fragmentos, derivados y análogos de los polipéptidos mantienen la misma función o actividad biológica que los polipéptidos a modo de ejemplo, por ejemplo, actividad de pectato liasa, como se describe en el presente documento. En otros aspectos, la variante, fragmento, derivado, o análogo incluye una proproteína, de modo que la variante, fragmento, derivado, o análogo se puede activar por escisión de la parte de proproteína para producir un polipéptido activo.

35 Optimización de codones para conseguir niveles elevados de expresión de proteínas en células hospedadoras

Los métodos pueden modificar ácidos nucleicos que codifican pectato liasa para modificar el uso del codón. En un aspecto, esto proporciona métodos para la modificación de codones en un ácido nucleico que codifica una pectato liasa para aumentar o disminuir su expresión en una célula hospedadora. Esto también proporciona ácidos nucleicos que codifican una pectato liasa modificada para aumentar su expresión en una célula hospedadora, la pectato liasa modificada de esta forma y métodos para fabricar las pectato liasas modificadas. El método comprende la identificación de un codón "no preferente" o un codón "menos preferente" en ácido nucleico que codifica pectato liasa y sustitución de uno o más de estos codones no preferentes o menos preferentes con un "codón preferente" que codifica el mismo aminoácido que el del codón sustituido y al menos un codón no preferente o menos preferente

45 en el ácido nucleico se ha sustituido con un codón preferente que codifica al mismo aminoácido. Un codón preferente es un codón que se sobrerrepresenta en secuencias de codificación en genes en la célula hospedadora y un codón no preferente o menos preferente es un codón que se subrepresenta en secuencias de codificación en genes en la célula hospedadora.

Las células hospedadas para expresar los ácidos nucleicos, casetes de expresión y vectores incluyen bacterias, levadura, hongos, células vegetales, células de insecto y células de mamífero. De esta manera, esto proporciona métodos para la optimización del uso del codón en todas estas células, ácidos nucleicos con codones alterados y polipéptidos obtenidos mediante los ácidos nucleicos con codones alterados. Las células hospedadoras a modo de ejemplo incluyen bacterias gram negativas, tales como Escherichia coli; bacterias gram positivas, tales como

55 cualquiera de Streptomyces Lactobacillus gasseri, Lactococcus lactis, Lactococcus cremoris, cualquier Bacillus, por ejemplo, Bacillus subtilis, Bacillus cereus. Las células hospedadoras a modo de ejemplo también incluyen organismos eucariotas, por ejemplo, diversas levaduras, tales como Saccharomyces sp., que incluyen Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharomyces pombe, Pichia pastoris, y Kluyveromyces lactis, Hansenula polimorpha, Aspergillus niger, y células y líneas celulares de mamífero y células y líneas celulares de insecto. Por lo tanto, esto también incluye ácidos nucleicos y polipéptidos optimizados para expresión en estos organismos y especies.

Por ejemplo, los codones de un ácido nucleico que codifica una pectato liasa aislados de una célula bacteriana se modifican de modo que el ácido nucleico se expresa de forma óptima en una célula bacteriana diferente de la 65 bacteria de la que se derivó la pectato liasa, una levadura, un hongo, una célula vegetal, una célula de insecto o una célula de mamífero. Los métodos para optimizar codones se conocen bien en la técnica, véase, por ejemplo, el

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documento de Patente de Estados Unidos Nº 5.795.737; Baca (2000) Int. J. Parasitol. 30: 113-118; Hale (1998) Protein Expr. Purif. 12: 185-188; Narum (2001) Infect. Immun. 69: 7250-7253. Véase también Narum (2001) Infect. Immun. 69: 7250-7253, que describe la optimización de codones en sistemas de ratón; Outchkourov (2002) Protein Expr. Purif. 24: 18-24, que describe la optimización de codones en levadura; Feng (2000) Biochemistry 39: 15399

5 15409, que describe la optimización de codones en E. coli; Humphreys (2000) Protein Expr. Purif. 20: 252-264, que describe la optimización del uso de codones que influye en la secreción en E. coli.

Reensamblaje génico sintético

10 Un método no estocástico denominado reensamblaje génico sintético (por ejemplo, GeneReassembly™, véase, por ejemplo, el documento de Patente de Estados Unidos Nº 6.537.776) puede ser, por ejemplo, para modificar pectato liasas de la divulgación o para preparar nuevas pectato liasas dentro del alcance de la divulgación. GeneReassembly™ difiere de la redistribución estocástica en que los componentes básicos del ácido nucleico no se redistribuyen ni concatenan ni quimerizan de forma aleatoria, sino que en su lugar se ensamblan de forma no

15 estocástica.

El método de reensamblaje génico sintético no depende de la presencia de un nivel elevado de homología entre polinucleótidos a redistribuir. Esto se puede usar para generar de forma no estocástica bibliotecas (o conjuntos) de moléculas de la progenie que comprenden más de 10100 quimeras diferentes. Posiblemente, el reensamblaje génico

20 sintético se puede usar incluso para generar bibliotecas que comprenden aproximadamente 101000 quimeras de la progenie diferentes.

Por lo tanto, esto proporciona un método no estocástico para producir un conjunto de moléculas de ácido nucleico quimérico finalizado que tiene un orden de ensamblaje global que se dirige mediante diseño, este método consiste

25 en las etapas de generar mediante diseño una pluralidad de componentes básicos de ácidos nucleicos específicos que tienen extremos que se pueden ligar mutuamente compatibles útiles y ensamblaje de estos componentes básicos de ácido nucleico, de modo que se consigue un orden de ensamblaje global diseñado.

En un aspecto, el reensamblaje génico sintético comprende un método para: 1) preparar una generación de

30 molécula o moléculas de la progenie (incluyendo una molécula que comprende una secuencia de polinucleótidos, por ejemplo, una molécula que comprende una secuencia de codificación de polipéptidos), que se somete a mutagénesis para conseguir al menos una mutación, adición, supresión, y/o formación de quimeras puntuales, de uno o más moldes de generación ancestral o precursora; 2) identificar sistemáticamente la molécula o moléculas de la generación de la progenie, por ejemplo, usando un método de alto rendimiento, para al menos una propiedad de

35 interés (tal como una mejora en una actividad enzimática); 3) opcionalmente obtener y/o catalogar información estructural y/o y funcional con respecto a las moléculas de la generación precursora y/o de la progenie; y 4) opcionalmente repetir cualquiera de las etapas 1) a 3). En un aspecto, se genera (por ejemplo, a partir de un molde de polinucleótido precursor), en lo que se denomina "mutagénesis por saturación del sitio del codón", una generación de polinucleótidos de la progenie, cada uno de los cuales tiene al menos un conjunto de hasta tres

40 Mutaciones puntuales contiguas (es decir, diferentes bases que comprenden un nuevo codón), de modo que cada codón (o cada familia de codones degenerados que codifica al mismo aminoácido) se representa en cada posición del codón. Con respecto a, y codificado por, esta generación de polinucleótidos de la progenie, también se genera un conjunto de polipéptidos de la progenie, cada uno de los cuales tiene al menos una mutación puntual de un solo aminoácido. En un aspecto, se genera, en lo que se denomina "mutagénesis por saturación del sitio del

45 aminoácido", uno de tales polipéptidos mutantes para cada una de las 19 sustituciones de alfa-aminoácidos que forman polipéptidos codificados de forma natural en todas y cada una de las posiciones del aminoácido a lo largo del polipéptido. Esto produce, para todas y cada una de las posiciones de aminoácidos a lo largo del polipéptido precursor, un total de 20 polipéptidos de la progenie distintos que incluyen el aminoácido original, o potencialmente más de 21 polipéptidos de la progenie distintos si se usan aminoácidos adicionales en lugar de o además de los 20

50 aminoácidos codificados de forma natural.

Por lo tanto, en un otro aspecto, este enfoque también es útil para generar mutantes que contienen, además de y/o en combinación con los 20 alfa-aminoácidos que forman polipéptidos codificados de forma natural, otros aminoácidos y derivados de aminoácidos raros y/o no codificados de forma natural. En aún otro aspecto, este

55 enfoque también es útil para generar mutantes mediante el uso de, además de y/o en combinación con sistemas de reconocimiento de codones naturales o sin alterar de hospedadores adecuados, sistemas de reconocimiento de codones alterados, sometidos a mutagénesis, y/o de diseño (tal como en una célula hospedadora con una o más moléculas de ARNt alterado.

60 En aún otro aspecto, esto se refiere a recombinación y de forma más específica a un método para preparar polinucleótidos que codifican un polipéptido mediante un método de reclasificación de secuencias de polinucleótidos in vivo que contienen regiones de homología parcial, ensamblar los polinucleótidos para formar al menos un polinucleótido e identificar sistemáticamente los polinucleótidos para la producción de polipéptido o polipéptidos que tienen una propiedad útil.

65 En aún otro aspecto, esto es útil para analizar y clasificar, con respecto a cualquier otra propiedad molecular (por ejemplo, una actividad enzimática) o combinación de propiedades permitidas por la tecnología actual, los efectos de cualquier cambio mutacional conseguido (incluyendo en particular la mutagénesis por saturación). Por lo tanto, se proporciona un método integral para determinar el efecto del cambio de cada aminoácido en un polipéptido

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5 precursor con cada una de las al menos 19 sustituciones posibles. Esto permite la caracterización y clasificación de cada aminoácido en un polipéptido precursor de acuerdo con su espectro de efectos potenciales en una propiedad que se puede medir del polipéptido.

En un aspecto, se puede introducir un intrón en una molécula de la progenie quimérica mediante un componente

10 básico de ácido nucleico. A menudo, los intrones tienen secuencias consenso en ambos extremos para hacerlos operativos. Además, para permitir el corte y empalme génico, los intrones pueden servir como un fin adicional proporcionando sitios de homología con otros ácidos nucleicos para permitir la recombinación homóloga. Para este fin, y potencialmente para otros, en ocasiones puede ser deseable generar un componente básico de ácido nucleico grande para introducir un intrón. Si el tamaño es demasiado grande para generar fácilmente mediante síntesis

15 química directa dos oligos monocatenarios, tal componente básico de ácido nucleico especializado también se puede generar mediante síntesis química directa de más de dos oligos monocatenarios o usando una reacción de amplificación basada en polimerasa.

Se considera que los extremos que se pueden ligar mutuamente compatibles de los componentes básicos del ácido

20 nucleico a ensamblar son "útiles" para este tipo de ensamblaje ordenado y permiten que los componentes básicos se acoplen en órdenes predeterminados. Por lo tanto, en un aspecto, el orden de ensamblaje global en el que se pueden acoplar los componentes básicos del ácido nucleico se especifica mediante el diseño de los extremos que se pueden ligar y, si se va a usar más de una etapa de ensamblaje, entonces el orden de ensamblaje global en el que se pueden acoplar los componentes básicos del ácido nucleico también se especifica mediante el orden

25 secuencial de la etapa o etapas de ensamblaje. En un aspecto, las piezas básicas hibridadas se tratan con una enzima, tal como una ligasa (por ejemplo, T4 ADN ligasa) para conseguir la unión covalente de las piezas básicas.

El acoplamiento se puede producir de una forma que no hace uso de cada nucleótido en un saliente que participa. Es bastante probable que el acoplamiento sobreviva (por ejemplo, en un hospedador transformado) si el 30 acoplamiento reforzado por el tratamiento con una enzima ligasa para formar lo que se puede denominar un "ligamiento del hueco" o un "ligamiento con huecos". Este tipo de acoplamiento puede contribuir a la generación de producto o productos de fondo no deseados, pero también se puede usar de forma ventajosa para aumentar la diversidad de la biblioteca de la progenie generada por el reensamblaje de ligamiento diseñado. Ciertos salientes son capaces de experimentar autoacoplamiento para formar un acoplamiento palindrómico. Un acoplamiento se 35 refuerza sustancialmente si se refuerza por tratamiento con una enzima ligasa. La falta de fosfatos en la posición 5' en estos salientes se puede usar de forma ventajosa para evitar este tipo de autoligamiento palindrómico. Por consiguiente, esto proporciona que se puedan preparar (u ordenar) componentes básicos de ácidos nucleicos por vía química, que carecen de un grupo fosfato en la posición 5'. Como alternativa, se pueden eliminar, por ejemplo por tratamiento con una enzima fosfatasa, tal como una fosfatasa alcalina intestinal de ternero (CIAP), para prevenir

40 autoligaciones palindrómicas en los procesos de reensamblaje de ligamiento.

Animales no humanos transgénicos

Los animales no humanos transgénicos pueden comprender un ácido nucleico, un polipéptido (por ejemplo, una

45 pectato liasa), un casete o vector de expresión o una célula transformada o transfectada de la divulgación. La divulgación también proporciona métodos para preparar y usar estos animales no humanos transgénicos.

Los animales no humanos transgénicos pueden ser, por ejemplo, cabras, conejos, ovejas, cerdos, vacas, ratas y ratones, que comprenden los ácidos nucleicos de la divulgación. Estos animales se pueden usar, por ejemplo, como 50 modelos in vivo para estudiar la actividad de pectato liasa, o, como modelos para identificar sistemáticamente agentes que cambien la actividad de pectato liasa in vivo. Las secuencias de codificación para los polipéptidos para expresar en los animales no humanos transgénicos se pueden diseñar para que sean constitutivas, o, bajo el control de factores reguladores de la transcripción específicos de tejido, específicos de desarrollo o inducibles. Los animales no humanos transgénicos se pueden diseñar y generar usando cualquier método conocido en la técnica; véanse, por 55 ejemplo, los documentos de Patente de Estados Unidos Nºs 6.211.428; 6.187.992; 6.156.952; 6.118.044; 6.111.166; 6.107.541; 5.959.171; 5.922.854; 5.892.070; 5.880.327; 5.891.698; 5.639.940; 5.573.933; 5.387.742; 5.087.571, que describen la preparación y uso de células y embriones transformados ratones, ratas, conejos, ovejas, cerdos y vacas transgénicos. Véanse también, por ejemplo, Pollock (1999) J. Immunol. Methods 231: 147-157, que describe la producción de proteínas recombinantes en la leche de animales para lácteos transgénicos; Baguisi (1999) Nat. 60 Biotechnol. 17: 456-461, que demuestra la producción de cabras transgénicas. El documento de Patente de Estados Unidos Nº 6.211.428, describe la preparación y uso de mamíferos no humanos transgénicos que expresan en sus cerebros un constructo de ácido nucleico que comprende una secuencia de ADN. El documento de Patente de Estados Unidos Nº 5.387.742, describe la inyección de secuencias de ADN recombinante o sintético clonado en embriones de ratón fertilizados, implantando los embriones inyectados en hembras pseudopreñadas, y crecimiento a 65 término de ratones transgénicos cuyas células expresan proteínas relacionadas con la patología de la enfermedad

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de Alzheimer. El documento de Patente de Estados Unidos Nº 6.187.992, describe la preparación y uso de un ratón transgénico cuyo genoma comprende una alteración del gen que codifica una proteína precursora amiloide (APP).

También se pueden usar "animales genosuprimidos" para poner en práctica los métodos de la divulgación. Por

5 ejemplo, en un aspecto, los animales transgénicos o modificados comprenden un "animal genosuprimido", por ejemplo, un "ratón genosuprimido", modificado por ingeniería para que no expresen un gen endógeno, que se sustituye con un gen que expresa una pectato liasa de la divulgación, o, una proteína de fusión que comprende una pectato liasa de la divulgación.

10 Plantas y Semillas Transgénicas

La divulgación proporciona plantas y semillas transgénicas que comprenden un ácido nucleico, un polipéptido (por ejemplo, una pectato liasa), un casete de expresión o un vector o una célula transformada o transfectada de la divulgación. La divulgación también proporciona productos de plantas, por ejemplo, aceites, semillas, hojas, 15 extractos y similares, que comprenden un ácido nucleico y/o un polipéptido (por ejemplo, una pectato liasa) de la divulgación. La planta transgénica puede ser dicotiledónea (una dicot) o monocotiledónea (una monocot). La divulgación también proporciona métodos para preparar y usar estas plantas y semillas transgénicas. La planta o célula vegetal transgénica que expresa un polipéptido de la presente divulgación se puede construir de acuerdo con cualquier método conocido en la técnica. Véase, por ejemplo, el documento de Patente de Estados Unidos Nº

20 6.309.872.

Los ácidos nucleicos y constructos de expresión de la divulgación se pueden introducir en una célula vegetal mediante cualquier medio. Por ejemplo, los ácidos nucleicos o constructos de expresión se pueden introducir en el genoma de un hospedador de planta deseado, o, los ácidos nucleicos o constructos de expresión pueden ser 25 episomas. La introducción en el genoma de una planta deseada se puede realizar de modo que la producción de la pectato liasa del hospedador se regula mediante elementos de control de la transcripción o de la traducción endógenos. Esto también proporciona "plantas genosuprimidas" en las que la inserción de la secuencia génica, por ejemplo, mediante recombinación homóloga, ha alterado la expresión del gen endógeno. Los medios para generar plantas "genosuprimidas" se conocen bien en la técnica, véanse, por ejemplo, Strepp (1998) Proc Natl. Acad. Sci.

30 USA 95: 4368-4373; Miao (1995) Plant J 7:359-365. Véase el análisis sobre plantas transgénicas que sigue a continuación.

Los ácidos nucleicos de la divulgación se pueden usar para conferir rasgos deseados en cualquier parte esencial de la planta, por ejemplo, en plantas que producen almidón, tales como patata, trigo, arroz, cebada, y similares. Los

35 ácidos nucleicos de la divulgación se pueden usar para manipular rutas metabólicas de una planta para optimizar o para alterar la expresión del hospedador de pectato liasa. Pueden cambiar la actividad de pectato liasa en una planta. Como alternativa, una pectato liasa de la divulgación se puede usar en la producción de una planta transgénica para producir un compuesto no producido de forma natural por la planta. Esto puede reducir los costos de producción o puede crear un producto nuevo.

40 En un aspecto, la primera etapa en la producción de una planta transgénica implica la preparación de un constructo de expresión para la expresión en una célula vegetal. Estas técnicas se conocen bien en la técnica. Pueden incluir la selección y clonación de un promotor, una secuencia de codificación para facilitar una unión eficaz de ribosomas a ARNm y selección de las secuencias terminadas de genes apropiados. Un promotor constitutivo a modo de ejemplo

45 es CaMV35S, del virus del mosaico de la coliflor, que generalmente da como resultado un grado elevado de expresión en plantas. Otros promotores son más específicos y responden a señales en el entorno interno o externo de la planta. Un promotor inducible por la luz a modo de ejemplo es el promotor del gen cab, que codifica las proteínas de unión a clorofila a/b principal.

50 En un aspecto, el ácido nucleico se modifica para conseguir una mayor expresión en una célula vegetal. Por ejemplo, es probable que una secuencia de la divulgación tenga un porcentaje más elevado de pares de nucleótidos A-T en comparación con el observado en una planta, algunas de las cuales prefieren pares de nucleótidos G-C. Por lo tanto, los nucleótidos A-T en la secuencia de codificación se pueden sustituir con nucleótidos G-C sin cambiar de forma significativa la secuencia de aminoácidos para aumentar la producción del producto génico en células

55 vegetales.

Se pueden añadir genes marcadores seleccionables al constructo génico para identificar células o tejidos vegetales que se han integrado de forma satisfactoria en el transgén. Esto puede ser necesario porque la consecución de la incorporación y la expresión de genes en células vegetales es un suceso raro, que se produce solamente en un 60 pequeño tanto por ciento de los tejidos o células dirigidas. Los genes marcadores que se pueden seleccionar codifican proteínas que proporcionan resistencia a agentes que normalmente son tóxicos para las plantas, tales como antibióticos o herbicidas. Solamente sobrevivirán las células vegetales que han integrado el gen marcador seleccionable cuando se cultiven en un medio que contiene el antibiótico o herbicida apropiado. Al igual que para otros genes insertados, los genes marcadores también necesitan secuencias promotoras y de terminación para un

65 funcionamiento apropiado.

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En un aspecto, la preparación de plantas o semillas transgénicas comprende la incorporación de secuencias de la divulgación y, opcionalmente, genes marcadores en un constructo de expresión diana (por ejemplo, un plásmido), junto con la colocación del promotor y las secuencias terminadoras. Esto puede implicar la transferencia del gen modificado en la planta a través de un método adecuado. Por ejemplo, se puede introducir un constructo 5 directamente en el ADN genómico de la célula vegetal usando técnicas tales como electroporación y microinyección de protoplastos de células vegetales, o los constructos se pueden introducir directamente en tejido vegetal usando métodos balísticos, tales como bombardeo de partículas de ADN. Por ejemplo, véase, por ejemplo, Christou (1997) Plant Mol. Biol. 35: 197-203; Pawlowski (1996) Mol. Biotechnol. 6: 17-30; Klein (1987) Nature 327: 70-73; Takumi (1997) Genes Genet. Syst. 72: 63-69, que analizan el uso del bombardeo de partículas de para introducir transgenes en trigo; y Adam (1997) mencionado anteriormente, para uso del bombardeo de partículas para introducir YAC en células vegetales. Por ejemplo, Rinehart (1997) mencionado anteriormente, usó bombardeo de partículas para generar plantas de algodón transgénicas. El aparato para acelerar partículas se describe en el documento de Patente de Estados Unidos Nº 5.015,580; y, el instrumento de aceleración de partículas PDS-2000 de BioRad (Biolistics) disponible en el mercado; véase también, John, documento de Patente de Estados Unidos Nº 5.608.148;

15 y Ellis, documento de Patente de Estados Unidos Nº 5.681.730, que describe la transformación de gimnospermas mediada por partículas.

En un aspecto, los protoplastos se pueden inmovilizar e inyectar con ácidos nucleicos, por ejemplo, un constructo de expresión. Aunque la regeneración de plantas a partir de protoplastos no es tan fácil como con los cereales, la regeneración de plantas es posible en legumbres usando embriogénesis somática a partir de callo derivado de protoplasto. Los tejidos organizados se pueden transformar con ADN desnudo usando técnicas de pistola de genes, en la que el ADN se recubre en microproyectiles de tungsteno, con disparos de 1/100ª del tamaño de las células, que portan el ADN profundo en células y orgánulos. A continuación, el tejido transformado se induce para su regeneración, normalmente mediante embriogénesis somática. Esta técnica ha sido satisfactoria en varias especies

25 de cereales que incluyen maíz y arroz.

Los ácidos nucleicos, por ejemplo, constructos de expresión, también se pueden introducir en células vegetales usando virus recombinantes. Las células de plantas se pueden transformar usando vectores virales, tales como, por ejemplo, vectores derivados del virus del mosaico del tabaco (Rouwendal (1997) Plant Mol. Biol. 33: 989-999), véase Porta (1996) "Use of viral replicons for the expression of genes in plants", Mol. Biotechnol. 5: 209-221.

Como alternativa, Los ácidos nucleicos, por ejemplo, un constructo de expresión, se pueden combinar con regiones de flanqueo de T-ADN adecuadas y se pueden introducir en un vector hospedador de Agrobacterium tumefaciens. Las funciones de virulencia del hospedador de Agrobacterium tumefaciens dirigirán la inserción del constructo y el 35 marcador adyacente en el ADN de la célula vegetal cuando la célula se infecta con las bacterias. En la bibliografía científica se describen bien técnicas de transformación mediadas por Agrobacterium tumefaciens, incluyendo el desarme y uso de vectores binarios. Véanse, por ejemplo, Horsch (1984) Science 233: 496-498; Fraley (1983) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80: 4803 (1983); Gene Transfer to Plants, Potrykus, ed. (Springer-Verlag, Berlín 1995). El ADN en una célula de A. tumefaciens está contenido en el cromosoma bacteriano así como en otra estructura conocida como un plásmido Ti (inductor tumoral). El plásmido Ti contiene un tramo de ADN denominado T-ADN (~20 kb de longitud) que se transfiere a la célula vegetal en el proceso de infección y una serie de genes de vir (virulencia) que dirigen el proceso de infección. A. tumefaciens solamente puede infectar a una planta a través de heridas: cuando una raíz o tallo de la planta está herido emite ciertas señales químicas, como respuesta a lo cual, los genes vir de A. tumefaciens se activan y dirigen una serie de sucesos necesarios para transferencia del T-ADN desde el plásmido Ti

45 al cromosoma de la planta. Entonces, el T-ADN entra en la célula vegetal a través de la herida. Una especulación es que el T-ADN espera hasta que el ADN de la planta se está replicando o transcribiendo, entonces se introduce a sí mismo en el ADN expuesto de la planta. Para usar A. tumefaciens como un vector de transgén, la sección que induce el tumor de T-ADN se tiene que retirar, a la vez que se mantienen las regiones del límite del T-ADN y los genes vir. A continuación, el transgén se inserta entre las regiones del límite del T-ADN, en las que se transfiere a la célula vegetal y se integra en los cromosomas de la planta.

La divulgación proporciona la transformación de plantas monocotiledóneas usando los ácidos nucleicos de la divulgación, que incluyen cereales importantes, véase Hiei (1997) Plant Mol. Biol. 35: 205-218. Véase también, por ejemplo, Horsch, Science (1984) 233: 496; Fraley (1983) Proc. Natl Acad. Sci USA 80: 4803; Thykjaer (1997)

55 mencionado anteriormente; Park (1996) Plant Mol. Biol. 32: 1135-1148, que analiza la integración del T-ADN en el ADN genómico. Véase también D'Halluin, documento de Patente de Estados Unidos Nº 5.712.135, que describe un proceso para la integración estable de un ADN que comprende un gen que es funcional en una célula de un cereal, u otra planta monocotiledónea.

En un aspecto, la tercera etapa puede implicar la selección y regeneración de plantas completas capaces de transmitir el gen diana incorporado a la siguiente generación. Tales técnicas de regeneración se basan en la manipulación de ciertas fitohormonas en un medio de crecimiento de cultivo tisular, por lo general basándose en un marcador biocida y/o herbicida que se ha introducido junto con las secuencias de nucleótidos deseadas. La regeneración de plantas a partir de protoplastos cultivados se describe en Evans et al., Protoplasts Isolation and 65 Culture, Handbook of Plant Cell Culture, pp. 124-176, MacMillilan Publishing Company, Nueva York, 1983; y Binding, Regeneration of Plants, Plant Protoplasts, pp. 21-73, CRC Press, Boca Raton, 1985. La regeneración también se

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puede obtener a partir de callos, explantes, órganos de plantas, o partes de las mismas. Por lo general, tales técnicas de regeneración se describen en Klee (1987) Ann. Rev. of Plant Phys. 38: 467-486. Para obtener plantas completas a partir de tejidos transgénicos tales como embriones inmaduros, se pueden cultivar en condiciones ambientales controladas en una serie de medios que contienen nutrientes y hormonas, un proceso conocido como

5 cultivo tisular. Una vez que las plantas se generan y producen semillas, comienza la evaluación de la progenie.

Después de incorporar el casete de expresión de forma estable en plantas transgénicas, se puede introducir en otras plantas mediante cruce sexual. Se puede usar cualquiera de las técnicas convencionales de reproducción, dependiendo de las especies a cruzar. Dado que la expresión transgénica de los ácidos nucleicos conduce a 10 cambios fenotípicos, las plantas que comprenden los ácidos nucleicos recombinantes de la divulgación se pueden cruzar sexualmente con una segunda planta para obtener un producto final. Por lo tanto, la semilla se puede derivar de un cruce entre dos plantas transgénicas, o un cruce entre una planta de la divulgación y otra planta. Los efectos deseados (por ejemplo, expresión de los polipéptidos de la divulgación para producir una planta en la que el comportamiento de floración está alterado) se pueden aumentar cuando ambas plantas precursoras expresan los

15 polipéptidos (por ejemplo, una pectato liasa) de la divulgación. Los efectos deseados se pueden pasar a generaciones futuras de plantas mediante medios de propagación convencionales.

Los ácidos nucleicos y polipéptidos de la divulgación se expresan en o se insertan en cualquier planta o semilla. Las plantas más transgénicas pueden ser dicotiledóneas o monocotiledóneas. Algunos ejemplos de plantas transgénicas 20 monocotiledóneas son hierbas, tales como hierba de la pradera (blue grass, Poa), hierba forrajera tal como festuca, lolium, tierra templada, tal como Agrostis, y cereales, por ejemplo, trigo, arena, centeno, cebada, arroz, sorgo y maíz (maíz). Algunos ejemplos de plantas transgénicas dicotiledóneas son tabaco, legumbres, tales como altramuces, patata, remolacha azucarera, guisante, judía y soja, y plantas crucíferas (familia Brassicaceae), tales como coliflor, semilla de colza, y el organismo modelo muy relacionado Arabidopsis thaliana. Por lo tanto, las plantas y semillas 25 transgénicas incluyen una amplia variedad de plantas, que incluyen, pero no se limitan a, especies de los géneros Anacardium, Arachis, Asparagus, Atropa, Avena, Brassica, Citrus, Citrullus, Capsicum, Carthamus, Cocos, Coffea, Cucumis, Cucurbita, Daucus, Elaeis, Fragaria, Glycine, Gossypium, Helianthus, Heterocallis, Hordeum, Hyoscyamus, Lactuca, Linum, Lolium, Lupinus, Lycopersicon, Malus, Manihot, Majorana, Medicago, Nicotiana, Olea, Oryza, Panieum, Pannisetum, Persea, Phaseolus, Pistachia, Pisum, Pirus, Prunus, Raphanus, Ricinus, Secale,

30 Senecio, Sinapis, Solanum, Sorghum, Theobromus, Trigonella, Triticum, Vicia, Vitis, Vigna, y Zea.

En realizaciones alternativas, los ácidos nucleicos se expresan en plantas que contienen células de fibra, que incluyen, por ejemplo, algodón de seda (Kapok, Ceiba pentandra), Sauce del desierto, arbusto de la creosota, winterfat, balsa, ramio, kenaf, cáñamo, hibisco, yute, sisal, abacá y fibra de lino. En realizaciones

35 alternativas, las plantas transgénicas pueden ser miembros del género Gossypium, que incluye miembros de cualquiera de las especies Gossypium, tales como G. arboreum; G. herbaceum, G. barbadense, y G. hirsutum.

La divulgación también proporciona el uso de plantas transgénicas para la producción de grandes cantidades de los polipéptidos (por ejemplo, una pectato liasa o anticuerpo) de la divulgación. Por ejemplo, véase Palmgren (1997)

40 Trends Genet. 13: 348; Chong (1997) Transgenic Res. 6: 289-296 (producción de beta-caseína de proteína de leche humana en plantas de patata transgénicas usando un promotor de manopina sintasa bidireccional, inducible con auxina, (mas1',2') con métodos de transformación de disco de hoja mediado por Agrobacterium tumefaciens).

Usando procedimientos conocidos, un experto puede identificar sistemáticamente plantas de la divulgación

45 detectando el aumento o disminución de ARNm del transgén o proteína en plantas transgénicas. En la técnica se conocen bien medios para detectar y cuantificar ARNm o proteínas.

Polipéptidos y péptidos

50 En un aspecto, la divulgación proporciona polipéptidos aislados o recombinantes que tienen una identidad de secuencia (por ejemplo, una identidad de secuencia de al menos aproximadamente un 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, o superior, o completa (100%)) con la SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:6, SEQ

55 ID NO:8, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:18, SEQ ID NO:20, SEQ ID NO:22, SEQ ID NO:24, SEQ ID NO:26, SEQ ID NO:28, SEQ ID NO:30, SEQ ID NO:32, SEQ ID NO:34, SEQ ID NO:36, SEQ ID NO:38, SEQ ID NO:40, SEQ ID NO:42, SEQ ID NO:44, SEQ ID NO:46, SEQ ID NO:48, SEQ ID NO:50, SEQ ID NO:52, SEQ ID NO:54, SEQ ID NO:56, SEQ ID NO:58, SEQ ID NO:60, SEQ ID NO:62, SEQ ID NO:64, SEQ ID NO:66, SEQ ID NO:68, SEQ ID NO:70, SEQ ID NO:72, SEQ ID NO:74, SEQ ID NO:76, SEQ ID

60 NO:78, SEQ ID NO:80, SEQ ID NO:82, SEQ ID NO:84, SEQ ID NO:86, SEQ ID NO:88, SEQ ID NO:90, SEQ ID NO:92, SEQ ID NO:94, SEQ ID NO:96, SEQ ID NO:98, SEQ ID NO:100, SEQ ID NO:102, SEQ ID NO:104, SEQ ID NO:106, SEQ ID NO:108, SEQ ID NO:110, SEQ ID NO:112, SEQ ID NO:114, SEQ ID NO:116, SEQ ID NO:118, SEQ ID NO:120, SEQ ID NO:122, SEQ ID NO:124, SEQ ID NO:126, SEQ ID NO:128, SEQ ID NO:130, SEQ ID NO:132, SEQ ID NO:134. En un aspecto, el polipéptido tiene una actividad de pectato liasa (por ejemplo, pectinasa).

65 La identidad puede ser sobre la longitud completa del polipéptido, o, la identidad puede ser sobre una región de al menos aproximadamente 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 100, 125, 150, 175, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700 o más restos. Los polipéptidos también pueden ser más cortos que la longitud completa de los polipéptidos a modo de ejemplo. En aspectos alternativos, esto proporciona polipéptidos

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5 (péptidos, fragmentos) que tienen un tamaño que varía entre aproximadamente 5 y la longitud completa de un polipéptido, por ejemplo, una enzima, tal como una pectato liasa; algunos tamaños a modo de ejemplo son de aproximadamente 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 100, 125, 150, 175, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700 o más restos, por ejemplo, restos contiguos de una pectato liasa a modo de ejemplo. Los péptidos pueden ser útiles, por ejemplo, como sondas de marcado, antígenos, tolerágenos, motivos, sitios activos de pectato liasas, dominios de unión a carbohidrato, y similares. Los polipéptidos también incluyen anticuerpos capaces de unirse a una enzima de la divulgación.

Los polipéptidos incluyen pectato liasas en una forma activa o inactiva. Por ejemplo, los polipéptidos incluyen proproteínas antes de la "maduración" o procesamiento de secuencias prepro, por ejemplo, mediante una enzima de

15 procesamiento de proproteína, tal como una proproteína convertasa para generar una proteína madura "activa". Los polipéptidos incluyen pectato liasas inactivas por otras razones, por ejemplo, antes de "activación" mediante un suceso de procesamiento posterior a la traducción, por ejemplo, una acción de endo o exo-peptidasa o proteinasa, un suceso de fosforilación, una amidación, una glicosilación o una sulfatación, un suceso de dimerización, y similares. En la técnica se conocen bien métodos para identificar secuencias de dominio "prepro" y secuencias señal, véase, por ejemplo, Van de Ven (1993) Crit. Rev. Oncog. 4 (2): 115-136. Por ejemplo, para identificar una secuencia prepro, la proteína se purifica a partir del espacio extracelular y la secuencia de proteína N-terminal se determina y se compara con la forma sin procesar.

Los polipéptidos incluyen todas las formas activas, incluyendo subsecuencias activas, por ejemplo, dominios

25 catalíticos o sitios activos, de una enzima de la divulgación. En un aspecto, esto proporciona dominios catalíticos o sitios activos como se expone a continuación. En un aspecto, un péptido o polipéptido comprende o consiste en un dominio de sitio activo como se predice a través del uso de una base de datos tal como Pfam (que es una gran colección de múltiples alineaciones de secuencias y modelos de Markov ocultos que cubren muchas familias de proteínas comunes, La base de datos de familias de proteínas Pfam, A. Bateman, E. Bimey, L. Cerruti, R. Durbin, L. Etwiller, S.R. Eddy, S. Griffiths-Jones, K.L. Howe, M. Marshall, y E.L.L. Sonnhammer, Nucleic Acids Research, 30 (1): 276-280, 2002) o equivalentes.

La divulgación incluye polipéptidos con o sin una secuencia señal y/o una secuencia prepro. La divulgación incluye polipéptidos con secuencias señal y/o secuencias prepro heterólogas. La secuencia prepro (que incluye una

35 secuencia usada como un dominio prepro heterólogo) se puede localizar en el extremo amino terminal o en el extremo carboxi terminal de la proteína. La divulgación también incluye secuencias señal aisladas o recombinantes, secuencias prepro y dominios catalíticos (por ejemplo, "sitios activos") que comprenden secuencias de la divulgación.

Los polipéptidos y péptidos se pueden aislar de fuentes naturales, pueden ser polipéptidos sintéticos, o pueden ser polipéptidos generados de forma recombinante. Los péptidos y proteínas se pueden expresar de forma recombinante in vitro o in vivo. Los péptidos y polipéptidos se pueden preparar y aislar usando cualquier método conocido en la técnica. Los polipéptidos y péptidos también se pueden sintetizar, total o parcialmente, usando métodos químicos bien conocidos en la técnica. Véase, por ejemplo, Caruthers (1980) Nucleic Acids Res. Symp.

45 Ser. 215-223; Horn (1980) Nucleic Acids Res. Symp. Ser. 225-232; Banga, A.K., Therapeutic Peptides and Proteins, Formulation, Processing and Delivery Systems (1995) Technomic Publishing Co. Lancaster, PA. Por ejemplo, la síntesis de péptidos se puede realizar usando diversas técnicas en fase sólida (véase por ejemplo, Roberge (1995) Science 269: 202; Merrifield (1997) Methods Enzymol. 289: 3-13) y la síntesis automatizada se puede conseguir, por ejemplo, usando el Sintetizador de Péptidos ABI 431A (Perkin Elmer) de acuerdo con las instrucciones proporcionadas por el fabricante.

Los péptidos y polipéptidos también se pueden glicosilar. La glicosilación se pueda añadir después de la traducción ya sea de forma química o mediante mecanismos de biosíntesis celular, en los que el último incorpora el uso de motivos de glicosilación conocidos, que pueden ser nativos para la secuencia o se pueden añadir como un péptido o 55 se pueden añadir en la secuencia de codificación del ácido nucleico. La glicosilación puede ser unida a O o unida a

N.

Los péptidos y polipéptidos, como se ha definido anteriormente, incluyen todas las formas "miméticas" y "peptidomiméticas". Los términos "mimético" y "peptidomimético" se refieren a un compuesto químico sintético que tiene básicamente las mismas características estructurales y/o funcionales de los polipéptidos de la divulgación. El mimético puede estar formado totalmente de análogos de aminoácidos sintéticos, no naturales, o, es una molécula quimérica de aminoácidos peptídicos parcialmente naturales y análogos de aminoácidos parcialmente no naturales. El mimético también puede incorporar cualquier cantidad de sustituciones conservativas de aminoácidos naturales siempre y cuando tales sustituciones tampoco alteren básicamente la estructura y/o actividad del mimético. Al igual 65 que con los polipéptidos de la divulgación que son variantes conservativas, la experimentación de rutina determinará si un mimético está dentro del alcance deseado, es decir, que su estructura y/o función no está alterada

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básicamente. Por lo tanto, en un aspecto, una composición mimética está dentro del alcance deseado si tiene una actividad de pectato liasa.

Las composiciones miméticas de polipéptidos pueden contener cualquier combinación de componentes

5 estructurales no naturales. En un aspecto alternativo, las composiciones miméticas incluyen uno o los tres grupos estructurales siguientes: a) grupos de unión a restos distintos de los enlaces de unión amida natural ("enlace peptídico"); b) restos no naturales en lugar de restos de aminoácidos de origen natural; o c) restos que inducen una mimética estructural secundaria, es decir, para inducir o estabilizar una estructura secundaria, por ejemplo, un giro beta, giro gamma, lámina beta, conformación de hélice alfa, y similares. Por ejemplo, un polipéptido se puede

10 caracterizar como un mimético cuando todos o algunos de sus restos se unen mediante un medio químico distinto de los enlaces peptídicos naturales. Los restos peptidomiméticos individuales se pueden unir mediante enlaces peptídicos, otros enlaces químicos o medios de acoplamiento, tales como, por ejemplo, glutaraldehído, ésteres de Nhidroxisuccinimida, maleimidas bifuncionales, N,N'-diciclohexilcarbodiimida (DCC) o N,N'-diisopropilcarbodiimida (DIC). Los grupos de unión que pueden ser una alternativa a los enlaces de unión de amida tradicional ("enlace

15 peptídico") incluyen, por ejemplo, cetometileno (por ejemplo, -C(=O)-CH2-para -C(=O)-NH-), aminometileno (CH2-NH), etileno, olefina (CH=CH), éter (CH2-O), tioéter (CH2-S), tetrazol (CN -), tiazol; retroamida, tioamida, o éster (véase, por ejemplo, Spatola (1983) en Chemistry and Biochemistry of Amino Acids, Peptides and Proteins, Vol. 7, pp 267-357, "Peptide Backbone Modifications", Marcell Dekker, NY).

20 Un polipéptido también se puede caracterizar como un mimético al contener todos o algunos restos no naturales en lugar de restos de aminoácidos de origen natural. Los restos no naturales se describen bien en la bibliografía científica y de patente; a continuación se describen unas pocas composiciones no naturales a modo de ejemplo útiles como miméticos de restos de aminoácidos naturales y directrices. Se pueden generar miméticos de aminoácidos aromáticos por sustitución, por ejemplo, con D-o L-nafilalanina; D-o L-fenilglicina; D-o L-2

25 tienoilalanina; D-o L-1, -2, 3-, o 4-pirenoilalanina; D-o L-3 tienoilalanina; D-o L-(2-piridinil)-alanina; D-o L-(3piridinil)-alanina; D-o L-(2-pirazinil)-alanina; D-o L-(4-isopropil)-fenilglicina; D-(trifluorometil)-fenilglicina; D(trifluorometil)-fenilalanina; D-p-fluoro-fenilalanina; D-o L-p-bifenilfenilalanina; D-o L-p-metoxi-bifenilfenilalanina; D

o L-2-indol(alquil)alaninas; y, D-o L-alquilaninas, en los que el alquilo puede ser metilo, etilo, propilo, hexilo, butilo, pentilo, isopropilo, iso-butilo, sec-isotilo, iso-pentilo sustituido o sin sustituir, o un aminoácido no ácido. Los anillos

30 aromáticos de un aminoácido no natural incluyen, por ejemplo, tiazolilo, tiofenilo, pirazolilo, benzoimidazolilo, naftilo, furanilo, pirrolilo, y anillos aromáticos de piridilo.

Se pueden generar miméticos de aminoácidos ácidos mediante sustitución, por ejemplo, con aminoácidos que no son carboxilato a la vez que se mantiene una carga negativa; (fosfono)alanina; treonina sulfatada. Los grupos 35 laterales carboxilo (por ejemplo, aspartilo o glutamilo) también se pueden modificar en forma selectiva por reacción con carbodiimidas (R'-N-C-N-R') tales como, por ejemplo, 1-ciclohexil-3(2-morfolinil-(4-etil)carbodiimida o 1-etil-3(4azonia-4,4-dimetolpentil)carbodiimida. El aspartilo o el glutamilo también se pueden convertir en restos de asparaginilo y glutaminilo por reacción con iones amonio. Se pueden generar miméticos de aminoácidos básicos por sustitución, por ejemplo, (además de lisina y arginina) con los aminoácidos ornitina, citrulina, o ácido (guanidino)40 acético, o ácido (guanidino)alquil-acético, en el que el alquilo se ha definido anteriormente. El derivado de nitrilo (por ejemplo, que contiene el resto CN en lugar de COOH) puede ser sustituido por asparagina o glutamina. Los restos de asparaginilo y glutaminilo se pueden desaminar a los correspondientes restos de aspartilo o glutamilo. Se pueden generar miméticos de restos de arginina haciendo reaccionar arginilo con, por ejemplo, uno o más reactivos convencionales, que incluyen, por ejemplo, fenilglioxal, 2,3-butanodiona, 1,2-ciclohexanodiona, o ninhidrina, 45 preferentemente en condiciones alcalinas. Se pueden generar miméticos de restos de tirosina haciendo reaccionar tirosilo, por ejemplo, con compuestos de diazonio aromáticos o tetranitrometano. Se puede usar N-acetilimidizol y tetranitrometano para formar especies de O-acetil tirosilo y derivados 3-nitro, respectivamente. Se pueden generar miméticos de restos de cisteína haciendo reaccionar restos de cisteinilo, por ejemplo, con alfa-haloacetatos tales como ácido 2-cloroacético o cloroacetamida y las aminas correspondientes; para dar carboximetilo o derivados de 50 carboxiamidometilo. También se pueden generar miméticos de restos de cisteína haciendo reaccionar restos de cisteinilo, por ejemplo, con bromo-trifluoroacetona, ácido alfa-bromo-beta-(5-imidozoil) propiónico; fosfato de cloroacetilo, N-alquilmaleimidas, disulfuro de 3-nitro-2-piridilo; disulfuro de metil 2-piridilo; p-cloromercuribenzoato; 2cloromercuri-4nitrofenol; o, cloro-7-nitrobenzo-oxa-1,3-diazol. Se pueden generar miméticos de lisina (y los restos amino terminales se pueden alterar) haciendo reaccionar lisinilo, por ejemplo, con ácido succínico u otros anhídridos 55 de ácido carboxílico. También se pueden generar miméticos de lisina y otros restos que contienen alfa-amino por reacción con imidoésteres, tales como picolinimidato de metilo, fosfato de piridoxal, piridoxal, cloroborohidruro, ácido trinitrobencenosulfónico, O-metilisourea, 2,4, pentanodiona, y reacciones catalizadas por transamidasa con glioxilato. Se pueden generar miméticos de metionina por reacción, por ejemplo, con sulfóxido de metionina. Los miméticos de prolina incluyen, por ejemplo, ácido pipecólico, ácido tiazolidina carboxílico, 3-o 4-hidroxi prolina, 60 deshidroprolina, 3-o 4-metilprolina, o 3,3,-dimetilprolina. Se pueden generar miméticos de restos de histidina haciendo reaccionar histidilo, por ejemplo, con dietilprocarbonato o bromuro de para-bromofenacilo. Otros miméticos incluyen, por ejemplo, los generados por hidroxilación de prolina y lisina; fosforilación de los grupos hidroxilo de restos de serilo o treonilo; metilación de los grupos alfa-amino de lisina, arginina e histidina; acetilación de la Nterminal amina; metilación de restos de amida de cadena principal o sustitución con N-metil aminoácidos; o

65 amidación de grupos carboxilo C-terminales.

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Un resto, por ejemplo, un aminoácido de un polipéptido de la divulgación también se puede sustituir con un aminoácido (o resto peptidomimético) de la quiralidad opuesta. Por lo tanto, cualquier aminoácido de origen natural en la configuración L (que también se puede denominar como R o S, dependiendo de la estructura de la entidad química) se puede sustituir con el aminoácido del mismo tipo de estructura química o un peptidomimético, pero de la

5 quiralidad opuesta, denominado D-aminoácido, pero también denominado como forma R o S.

La divulgación también proporciona métodos para modificar los polipéptidos ya sea mediante procesos naturales, tales como procesamiento posterior a la traducción (por ejemplo, fosforilación, acilación, etc), o mediante técnicas de modificación química, y los polipéptidos modificados resultantes. Se pueden producir modificaciones en cualquier parte en el polipéptido, incluyendo la estructura principal del péptido, las cadenas laterales del aminoácido y los extremos amino o carboxilo. Se observara que el mismo tipo de modificación puede estar presente en el mismo o grados variables en diversos sitios en un polipéptido dado. También, un polipéptido dado puede presentar muchos tipos de modificaciones. Las modificaciones incluyen acetilación, acilación, ADP-ribosilación, amidación, unión covalente de flavina, unión covalente de un resto heme, unión covalente de un nucleótido o derivado de nucleótido,

15 unión covalente de un lípido o derivado de lípido, unión covalente de un fosfatidilinositol, ciclación por reticulación, formación de enlaces disulfuro, desmetilación, formación de reticulaciones covalentes, formación de cisteína, formación de piroglutamato, formilación, gamma-carboxilación, glicosilación, formación de anclas de GPI, hidroxilación, yodación, metilación, miristoilación, oxidación, pegilación, procesamiento proteolítico, fosforilación, prenilación, racemización, selenoilación, sulfatación, y adición mediada por ARN de transferencia de aminoácidos a proteínas tal como arginilación. Véase, por ejemplo, Creighton, T.E., Proteins -Structure and Molecular Properties 2ª Ed., W.H. Freeman and Company, Nueva York (1993); Posttranslational Covalent Modification of Proteins, B.C. Johnson, Ed., Academic Press, Nueva York, pp. 1-12 (1983).

También se pueden usar métodos de síntesis química de péptidos en fase sólida para sintetizar el polipéptido o

25 fragmentos. Tal método se ha conocido en la técnica desde el comienzo de 1960 (Merrifield, R. B., J. Am. Chem. Soc., 85: 2149-2154, 1963) (Véase también Stewart, J. M. y Young, J. D., Solid Phase Peptide Synthesis, 2ª Ed., Pierce Chemical Co., Rockford, Ill., pp. 11-12)) y se han usado recientemente en kits de diseño y síntesis de péptidos de laboratorio disponibles en el mercado (Cambridge Research Biochemicals). Tales kits de laboratorio disponibles en el mercado por lo general han usado las enseñanzas de H. M. Geysen et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 81: 3998 (1984) y proporcionan la síntesis de péptidos sobre las puntas de una multitud de "varillas" o "sujeciones" todos los cuales se conectan a una sola placa. Cuando se usa tal sistema, una placa de varillas o sujeciones se invierte y se inserta en una segunda placa de pocillos o depósitos correspondientes, que contienen soluciones para que un aminoácido apropiado se una o se ancle a la punta de la sujeción o la varilla. Mediante la repetición de tal etapa del proceso, es decir, mediante la inversión e inserción de las puntas de la varilla y la sujeción

35 en soluciones apropiadas, los aminoácidos se preparan en péptidos deseados. Además, está disponible un número de sistemas de síntesis de péptidos de FMOC. Por ejemplo, el ensamblaje de un polipéptido o fragmento se puede realizar en un soporte sólido usando un sintetizador de péptidos automatizado de Applied Biosystems, Inc. Modelo 431A™. Tal equipo proporciona un acceso fácil a los péptidos, ya sea por síntesis directa o por síntesis de una serie de fragmentos que se pueden acoplar usando otras técnicas conocidas.

La divulgación incluye pectato liasas con y sin señal. El polipéptido que comprende una secuencia señal puede ser una pectato liasa de la divulgación u otra pectato liasa u otra enzima u otro polipéptido.

La divulgación incluye pectato liasas inmovilizadas, anticuerpos anti-pectato liasa y fragmentos de los mismos. La

45 divulgación proporciona métodos para inhibir la actividad de pectato liasa, por ejemplo, usando mutantes negativos dominantes o anticuerpos anti-pectato liasa de la divulgación. La divulgación incluye heterocomplejos, por ejemplo, proteínas de fusión, heterodímeros, etc., que comprenden las pectato liasas de la divulgación.

Los polipéptidos pueden tener una actividad de pectato liasa en diversas condiciones, por ejemplo, extremas en pH y/o temperatura, agentes oxidantes, y similares. La divulgación proporciona métodos que conducen a preparaciones alternativas de pectato liasa con diferentes eficacias catalíticas y estabilidades, por ejemplo, hacia temperatura, agentes oxidantes y cambios en las condiciones de lavado. En un aspecto, se pueden producir variantes de pectato liasa usando técnicas de mutagénesis dirigida al sitio y/o mutagénesis aleatoria. En un aspecto, se puede usar evolución dirigida para producir una gran diversidad de variantes de pectato liasa con especificidades y estabilidad

55 alternativas.

Las proteínas de la divulgación también son útiles como reactivos de investigación para identificar moduladores de pectato liasa, por ejemplo, activadores o inhibidores de actividad de pectato liasa. En resumen, las muestras de ensayo (compuestos, caldos de cultivo, extractos, y similares) se añaden a ensayos de pectato liasa para determinar su capacidad para inhibir la escisión del sustrato. Los inhibidores identificados de este modo se pueden usar en la industria y en investigación para reducir o prevenir la proteólisis no deseada. Al igual que con las pectato liasas, los inhibidores se pueden combinar para aumentar el espectro de actividad.

También se proporcionan métodos para descubrir nuevas pectato liasas usando los ácidos nucleicos, polipéptidos y

65 anticuerpos de la divulgación. En un aspecto, se identifican sistemáticamente bibliotecas de fagos lambda para descubrimiento basado en la expresión de pectato liasas. En un aspecto, esto usa bibliotecas de fago lambda en la identificación sistemática para permitir la detección de clones tóxicos; aumento del acceso al sustrato; reducción de la necesidad de modificación por ingeniería de un hospedador, derivando el potencial de cualquier sesgo resultante de la escisión de masa de la biblioteca; y, crecimiento más rápido a bajas densidades de clones. La identificación sistemática de bibliotecas de fagos lambda se puede realizar en fase líquida o en fase sólida. En un aspecto, esto

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5 proporciona identificación sistemática en fase líquida. Esto proporciona una mayor flexibilidad en condiciones de ensayo; flexibilidad del sustrato adicional; sensibilidad más elevada para clones débiles; y facilidad de automatización sobre identificación sistemática en fase sólida.

La divulgación proporciona métodos de identificación sistemática que usan las proteínas y ácidos nucleicos de la

10 divulgación y la automatización robótica para permitir la ejecución de muchos miles de reacciones biocatalíticas y ensayos de identificación sistemática en un breve periodo de tiempo, por ejemplo, al día, así como asegurar un nivel elevado de precisión y reproducibilidad (véase el análisis de matrices, a continuación). Como resultado, se puede producir una biblioteca de compuestos derivados en cuestión de semanas. Para enseñanzas adicionales sobre modificación de moléculas, incluyendo moléculas pequeñas, véase el documento PCT/US94/09174.

15 La divulgación incluye enzimas pectato liasa que son variantes de carbonilo hidrolasa de origen no natural (por ejemplo, variantes de pectato liasa) que tienen una actividad proteolítica, estabilidad, especificidad de sustrato, perfil de pH y/o rendimiento diferentes en comparación con la carbonil hidrolasa precursora a partir de la que se deriva la secuencia de aminoácidos de la variante. De forma específica, tales variantes de pectato liasa tienen una secuencia

20 de aminoácidos que no se encuentra en la naturaleza, que se deriva por sustitución de una pluralidad de restos de aminoácidos de una pectato liasa precursora con diferentes aminoácidos. La pectato liasa precursora puede ser una pectato liasa de origen natural o una pectato liasa recombinante. Las variantes de pectato liasa útiles incluyen la sustitución de cualquiera de los L-aminoácidos de origen natural en las posiciones designadas de los restos de aminoácidos.

25 Variantes de mutagénesis de saturación de sitio génico (GSSM™)

La divulgación proporciona variantes de pectato liasa y los ácidos nucleicos que las codifican. En un aspecto, esto proporciona la SEC ID Nº: 134, codificada por la SEC ID Nº: 133, respectivamente. La SEC ID Nº: 133 es una

30 variante de ácido nucleico generada por mutagénesis por saturación de sitio génico (GSSM™) de la SEC ID Nº: 131 (que codifica la SEC ID Nº: 132). La SEC ID Nº: 131 y la SEC ID Nº: 132 son variaciones truncadas del ácido nucleico como se establece en la SEC ID Nº: 77, que codifica la SEC ID Nº: 78, respectivamente. La siguiente Tabla 1 resume los cambios de aminoácidos resultantes de las variaciones generadas por GSSM™ en sus respectivos ácidos nucleicos de codificación (la SEC ID Nº: 78 de longitud completa codificada por la SEC ID Nº: 77,

35 y la SEC ID Nº: 132 "precursora" truncada codificada por la SEC ID Nº: 131:

Tabla 1 posición del aminoácido que incluye mutación en las SEC ID Nºs: 131, 132: Posición del nucleótido en el gen de tipo silvestre truncado (SEC ID Nºs: 131, 132) Posición del nucleótido en el gen de tipo silvestre de longitud completa (SEC ID Nºs: 77, 78) Posición del aminoácido en el gen de tipo silvestre de longitud completa (SEC ID Nºs: 77, 78)

A118H: 352-354 1423-1425 475

A182V: 544-546 1615-1617 539

T190L: 568-570 1639-1641 547

A197G: 589-591 1660-1662 554

S208K: 622-624 1693-1695 565

T219M: 655-657 1726-1728 576

T223E: 667-669 1738-1740 580

S255R: 763-765 1834-1836 612

S263K: 787-789 1858-1860 620

N275Y: 823-825 1894-1896 632

Y309W: 925-927 1996-1998 666

S312V: 934-936 2005-2007 669

La Figura 6 es una tabla que resume cambios en la secuencia a modo de ejemplo en los polipéptidos pectato liasa, caracterizados como "mutantes positivos". Los mutantes positivos identificados como A-S son mutantes positivos 40 combinatorios (cada uno tiene varios cambios generados por GSSM™). Los mutantes positivos identificados como AA-LL son mutantes positivos individuales (cada uno con un cambio generado por GSSM™).

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La Figura 7 es una tabla que resume temperaturas de fusión y actividades específicas a modo de ejemplo (SA) de enzimas a modo de ejemplo a diversas temperaturas. La actividad específica (U/mg de enzima pura) se midió a diferentes temperaturas a pH 9,5 en Glicina NaOH 25 mM, tampón Tris HCl 25 mM. Una unidad de actividad enzimática se definió como la cantidad de enzima que producía 1 µmol de oligogalacturónidos insaturados

5 equivalente a 1 µmol de digalacturónido insaturado por minuto. Las concentraciones de proteína de las preparaciones de enzimas puras se midieron a A280 usando un coeficiente de extinción molar de 73800 M-1 cm -1 (1 A280 equiv. para 0,50 mg/ml). Las temperaturas de fusión se determinaron con un calorímetro de barrido diferencial.

10 En estas Figuras, el mutante "N" tiene una secuencia como se establece en la SEC ID Nº: 134, codificada por la SEC ID Nº: 133.

Secuencias señal de pectato liasa, dominios de pectina metil esterasa y dominios catalíticos, módulos de unión a carbohidratos y dominios prepro

15 La divulgación proporciona secuencias señal (por ejemplo, péptidos señal (SP)), dominios prepro y dominios catalíticos (CD). Los SP, dominios prepro y/o CD pueden ser péptidos aislados o recombinantes o pueden formar parte de una proteína de fusión, por ejemplo, como un dominio heterólogo en una proteína quimérica. La divulgación proporciona ácidos nucleicos que codifican estos dominios catalíticos (CD), dominios prepro y secuencias señal (SP,

20 por ejemplo, un péptido que tiene una secuencia que comprende/que consiste en restos terminales amino de un polipéptido de la divulgación).

La divulgación proporciona secuencias señal de pectato liasa (por ejemplo, péptidos señal (SP)) y ácidos nucleicos que codifican estas secuencias señal, por ejemplo, un péptido que tiene una secuencia que comprende/que consiste 25 en restos terminales amino de un polipéptido de la divulgación, por ejemplo, péptidos señal (SP) como se establece en la Tabla 2, que sigue a continuación. En un aspecto, esto proporciona una secuencia señal que comprende un péptido que comprende/que consiste en una secuencia como se establece en los restos de 1 a 15, de 1 a 16, de 1 a 17, de 1 a 18, de 1 a 19, de 1a 20, de 1 a 21, de 1 a 22, de1 a 23, de 1 a 24, de 1 a 25, de 1 a 26, de 1 a 27, de 1 a 28, de 1 a 28, de 1 a 30, de 1a 31, de 1 a 32, de 1 a 33, de1 a 34, de 1 a 35, de 1 a 36, de 1 a 37, de 1 a 38, de 1 a 30 39,de1a40,de1a41,de1a42,de1a43,de1a44deunpolipéptido,porejemplo,SECIDNº:2,SECIDNº:4, SEC ID Nº: 6, SEC ID Nº: 8, SEC ID Nº: 10, SEC ID Nº: 12, SEC ID Nº: 14, SEC ID Nº: 16, SEC ID Nº: 18, SEC ID Nº: 20, SEC ID Nº: 22, SEC ID Nº: 24, SEC ID Nº: 26, SEC ID Nº: 28, SEC ID Nº: 30, SEC ID Nº: 32, SEC ID Nº: 34, SEC ID Nº: 36, SEC ID Nº: 38, SEC ID Nº: 40, SEC ID Nº: 42, SEC ID Nº: 44, SEC ID Nº: 46, SEC ID Nº: 48, SEC ID Nº: 50, SEC ID Nº: 52, SEC ID Nº: 54, SEC ID Nº: 56, SEC ID Nº: 58, SEC ID Nº: 60, SEC ID Nº: 62, SEC ID Nº: 64,

35 SEC ID Nº: 66, SEC ID Nº: 68, SEC ID Nº: 70, SEC ID Nº: 72, SEC ID Nº: 74, SEC ID Nº: 76, SEC ID Nº: 78, SEC ID Nº: 80, SEC ID Nº: 82, SEC ID Nº: 84, SEC ID Nº: 86, SEC ID Nº: 88, SEC ID Nº: 90, SEC ID Nº: 92, SEC ID Nº: 94, SEC ID Nº: 96, SEC ID Nº: 98, SEC ID Nº: 100, SEC ID Nº: 102, SEQ NO:104 SEC ID Nº: 106, SEC ID Nº: 108, SEC ID Nº: 110, SEC ID Nº: 112, SEC ID Nº: 114, SEC ID Nº: 116, SEC ID Nº: 118, SEC ID Nº: 120, SEC ID Nº: 122, SEC ID Nº: 124, SEC ID Nº: 126, SEC ID Nº: 128, SEC ID Nº: 130, SEC ID Nº: 132, SEC ID Nº: 134.

40 Esto también proporciona dominios de pectato liasa pectina metil esterasa (PED) y dominios catalíticos (CD) como se establece en la Tabla 2, que sigue a continuación.

Las secuencias señal de pectato liasa (SP), CD, y/o secuencias prepro pueden ser péptidos aislados, o, secuencias

45 unidas a otra hidrolasa o un polipéptido que no es pectato liasa, por ejemplo, como una proteína de fusión (quimérica). En un aspecto, esto proporciona polipéptidos que comprenden secuencias señal de pectato liasa. En un aspecto, los polipéptidos que comprenden secuencias señal de pectato liasa SP, CD, y/o prepro de la divulgación comprenden secuencias heterólogas para pectato liasas de la divulgación (por ejemplo, una proteína de fusión que comprende una SP, CD, y/o prepro y secuencias de otra pectato liasa o una proteína que no es pectato liasa). En un

50 aspecto, esto proporciona pectato liasas de la divulgación con secuencias SP, CD, y/o prepro heterólogas, por ejemplo, secuencias con una secuencia señal de levadura. Una pectato liasa de la divulgación puede comprender un SP heterólogo y/o prepro en un vector, por ejemplo, un vector de la serie pPIC (Invitrogen, Carlsbad, CA).

La Tabla 2 resume secuencias señal (es decir, señales de péptidos en su forma aislada), dominios catalíticos,

55 módulos de unión a carbohidratos y dominios de pectina metil esterasa. Por ejemplo, la Tabla 2 describe: en la fila 1, un péptido señal (SP) en los restos de 1 a 28 de la SEC ID Nº: 102 (codificados por la SEC ID Nº: 101) y un dominio catalítico (CD) en los restos 78-459 de la SEC ID Nº: 102; en la fila 2, un péptido señal (SP) en los restos de 1 a 21 de la SEC ID Nº: 2 (codificados por la SEC ID Nº: 1), un dominio de pectina metil esterasa (PED) en los restos 28308, y un dominio catalítico (CD) en los restos 309-638; en la fila 3, etc.

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Tabla 2

SEC ID Nº:: Módulos (SP = péptido señal, CD = dominio catalítico, CBM = módulo de unión a

carbohidrato, PED = dominio de pectina metil esterasa)

101, 102: SP,1-28, CD; 78-459

1, 2: SP; 1-21, PED; 28-308, CD; 309-638

103, 104: SP; 1-26, CD; 27-366

105, 106: SP; 1-43, CD; 44-400

107, 108: SP; 1-31, CD; 32-357

109, 110: SP; 1-21, PED; 28-308, CD309-637

11, 12: CD; 1-388

111, 112: SP; 1-27, CD; 82-461

113, 114: SP; 1-18, CD; 19-388

115, 116: CD; 1-331

117, 118: SP; 1-24, CD; 25-574

119, 120: CBM; 1-61, CBM; 134-257, CD; 258-615

121, 122: SP; 1-29, CD; 30-348

123, 124: SP; 1-21, CD; 22-390

125, 126: CD; 24-325

127, 128: SP; 1-24, CD; 125-482

129, 130: CD; 38-326

13, 14: SP; 1-22, CD; 23-354

15, 16: SP; 1-33, CD; 34-359

17, 18: CD; 1-348

19, 20: CD; 1-373

21, 22: SP; 1-23, CD; 24-422

23, 24: SP; 1-18, CD; 19-393

25, 26: SP; 1-15, CD; 16-397

27, 28: SP; 1-21, PED; 28-308, CD; 309-638

29, 30: SP; 1-27, CD; 77-459

3, 4: SP; 1-28, CD; 81-476

31, 32: CD; 1-348

33, 34: SP; 1-18, CD; 19-346

35, 36: CD; 1-356

37, 38: SP; 1-35, CD; 36-387

39, 40: SP; 1-32, CD; 33-358

41, 42: SP; 1-21, CD; 22-359

43, 44: CBM; 4-89, CBM; 152-275, CD; 277-633

45, 46: SP; 1-20, CD; 21-328

47, 48: SP; 1-21, CD; 22-358

49, 50: SP; 1-16, CD; 17-340

5, 6: CD; 1-358

51, 52: CD; 1-376

53, 54: SP; 1-31, CBM; 32-124, CBM; 180-303, CD; 304-658

55, 56: CD; 1-374

57, 58: CD; 1-389

59, 60: SP; 1-24, CD; 25-359

61, 62: CD; 90-407

63, 64: SP; 1-16, CD; 17-340

65, 66: SP; 1-28, CD; 29-436

67, 68: SP; 1-32, CBM; 33-126, CBM; 184-307, CD; 308-664

69, 70: SP; 1-22, CD; 23-344

7, 8: CD; 1-374

71, 72: SP; 1-20, CD; 21-345

73, 74: SP; 1-22, CD; 23-406

75, 76: SP; 1-34, CD; 110-555

77, 78: SP; 1-33, CBM; 34-126, CBM; 199-322, CD; 323-680

79, 80: SP; 1-28, CD; 81-458

81, 82: SP; 1-30, CD; 31-354

83, 84: PED; 268-556, CD; 782-1164

85, 86: CD; 1-383

87, 88: SP; 1-32, CD; 33-375

89, 90: SP; 1-31, CD; 32-459

9, 10: SP; 1-29, CD; 30-371

91, 92: CD; 1-374

93, 94: CD; 1-353

95, 96: SP; 1-31, CD; 32-357

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SEC ID Nº: Módulos (SP = péptido señal, CD = dominio catalítico, CBM = módulo de unión a carbohidrato, PED = dominio de pectina metil esterasa) 97, 98 PED; 45-333, CD; 336-698 99, 100 SP; 1-35, CD; 36-593

En un aspecto, los SP, CD, y/o las secuencias prepro se identifican después de la identificación de nuevos polipéptidos pectato liasa. Las rutas mediante las que las proteínas se clasifican y se transportan a su propia ubicación celular a menudo se denominan rutas de dirección de proteína. Uno de los elementos más importantes de 5 todos estos sistemas de dirección es una secuencia corta de aminoácidos en el extremo amino de un polipéptido recién sintetizado denominada secuencia señal. Esta secuencia señal dirige una proteína a su ubicación apropiada en la célula y se retira durante el transporte o cuando la proteína alcanza su destino final. La mayoría de las proteínas lisosomales, de membrana, o secretadas tienen una secuencia señal amino-terminal que las marca para translocación en el lumen del retículo endoplasmático. La longitud de las secuencias señal puede variar de 13 a 45 o

10 más restos de aminoácidos. Los expertos en la materia conocen diversos métodos de reconocimiento de secuencias señal. Por ejemplo, en un aspecto, se identifican nuevas señales de péptidos señal de pectato liasa mediante un método denominado SignalP. El SignalP usa una red neural combinada que reconoce tanto péptidos señal como sus sitios de escisión. (Nielsen, et al., " Identification of prokaryotic and eukaryotic signal peptides and prediction of their cleavage sites". Protein Engineering, vol. 10, no. 1, p. 1-6 (1997).

15 En algunos aspectos, las pectato liasas no tienen SP y/o secuencias prepro, y/o dominios catalíticos (CD). En un aspecto, esto proporciona polipéptidos (por ejemplo, pectato liasas) que carecen de todo o parte de un SP, un CD y/o un dominio prepro. En un aspecto, esto proporciona secuencias de ácidos nucleicos que codifican una secuencia señal (SP), un CD, y/o prepro de una pectato liasa unida de forma operativa a secuencias de ácidos nucleicos de

20 una pectato liasa diferente u, opcionalmente, puede ser deseable una secuencia señal (SP) y/o dominio prepro de una proteína que no es pectato liasa.

La divulgación también proporciona polipéptidos aislados o recombinantes que comprenden secuencias señal (SP), dominios prepro, dominios de pectina metil esterasa (PED) y dominios catalíticos (CD) y secuencias heterólogas. 25 Las secuencias heterólogas son secuencias no asociadas de forma natural (por ejemplo, a una pectato liasa) con una SP, dominio prepro, PED, y/o CD. La secuencia a la que la SP, dominios prepro, PED y/o CD no se asocian de forma natural puede estar en el extremo amino terminal, extremo carboxi terminal, y/o en ambos extremos de la SP, del dominio prepro, de PED, y/o de CD de la SP, dominio prepro, PED y/o CD. En un aspecto, esto proporciona un polipéptido aislado o recombinante que comprende (o que consiste en) un polipéptido que comprende una secuencia 30 señal (SP), dominio prepro, dominio de pectina metil esterasa (PED) y/o dominio catalítico (CD) con la condición de que no esté asociado con ninguna secuencia con la que se asocia de forma natural (por ejemplo, una secuencia de pectato liasa). De forma análoga en un aspecto, esto proporciona ácidos nucleicos aislados o recombinantes que codifican estos polipéptidos. Por lo tanto, en un aspecto, el ácido nucleico aislado o recombinante comprende secuencia de codificación para una secuencia señal (SP), dominio prepro, dominio de pectina metil esterasa (PED)

35 y/o dominio catalítico (CD) y una secuencia heteróloga (es decir, una secuencia no asociada de forma natural con la secuencia señal (SP), dominio prepro, dominio de pectina metil esterasa (PED) y/o dominio catalítico (CD)). La secuencia heteróloga puede estar en el extremo terminal en la posición 3', en el extremo terminal en la posición 5', y/o en ambos extremos de la secuencia de codificación de SP, dominio prepro, PED y/o CD.

40 Glicosilación

Los péptidos y polipéptidos (por ejemplo, pectato liasas, anticuerpos) también pueden estar glicosilados, por ejemplo, en un aspecto, comprendiendo al menos un sitio de glicosilación, por ejemplo, una glicosilación unida a N o unida a O. En un aspecto, el polipéptido se puede glicosilar después de su expresión en una cepa de P. pastoris o

45 de S. pombe. La glicosilación se puede añadir después de la traducción por vía química o mediante cualquier mecanismo de biosíntesis celular, en la que el último incorpora el uso de motivos de glicosilación conocidos, que pueden ser nativos para la secuencia o se pueden añadir como un péptido o se pueden añadir en la secuencia de codificación de ácido nucleico.

50 Bibliotecas de pectato liasas y péptidos híbridos (quiméricos)

En un aspecto, la divulgación proporciona pectato liasas y proteínas de fusión híbridas, que incluyen bibliotecas de péptidos, que comprenden secuencias de la divulgación. Las bibliotecas de péptidos se pueden usar para aislar moduladores de péptidos (por ejemplo, activadores o inhibidores) de dianas, tales como sustratos de pectato liasa,

55 receptores, enzimas. Las bibliotecas de péptidos se pueden usar para identificar asociados de unión de dianas adecuados, tales como ligandos, por ejemplo, citoquinas, hormonas y similares. En un aspecto, esto proporciona proteínas quiméricas que comprenden una secuencia señal (SP), dominio de pectina metil esterasa (PED) y/o dominio catalítico (CD) y una secuencia heteróloga (véase anteriormente).

60 En un aspecto, las proteínas de fusión (por ejemplo, el resto peptídico) se estabilizan de forma convencional (con respecto a péptidos lineales) para permitir una afinidad de unión más elevada para las dianas. Esto proporciona fusiones de pectato liasas y otros péptidos, que incluyen péptidos conocidos y aleatorios. Se pueden fusionar de un modo tal que la estructura de las pectato liasas no se ve alterada de forma significativa y el péptido se estabiliza conformacionalmente de forma metabólica o estructural. Esto permite la creación de una biblioteca de péptidos que se controla fácilmente tanto para su presencia dentro de las células como su cantidad.

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5 Las variantes de secuencias de aminoácidos se pueden caracterizar mediante una naturaleza de la variación determinada previamente, una característica que las diferencia de una forma de origen natural, por ejemplo, una variación alélica o interespecie de una secuencia de pectato liasa. En un aspecto, las variantes presentan la misma actividad biológica cualitativa que el análogo de origen natural. Como alternativa, las variantes se pueden seleccionar para que tengan características modificadas. En un aspecto, cuando el sitio o región para la introducción

10 de una variación de la secuencia de aminoácidos se determina previamente, no es necesario que la mutación, per se, se determine previamente. Por ejemplo, para optimizar el rendimiento de una mutación en un sitio dado, se puede realizar mutagénesis aleatoria en el codón o región diana y las variantes de pectato liasa expresadas se pueden identificar sistemáticamente para identificar la combinación óptima de actividad deseada. Se conocen bien técnicas para preparar mutaciones de sustitución en sitios determinados previamente en el ADN que tiene la

15 secuencia conocida, como se analiza en el presente documento, por ejemplo, mutagénesis del cebador M13 y mutagénesis de PCR. La identificación sistemática de los mutantes se puede realizar usando ensayos de actividades proteolíticas. En aspectos alternativos, las sustituciones de aminoácidos pueden ser restos individuales; las inserciones pueden ser del orden de aproximadamente de 1 a 20 aminoácidos, aunque se pueden realizar inserciones considerablemente mayores. Las supresiones pueden variar de aproximadamente 1 a aproximadamente

20 20, 30, 40, 50, 60, 70 restos o más. Para obtener un derivado final con las propiedades óptimas, se pueden usar sustituciones, supresiones, inserciones o cualquier combinación de las mismas. Generalmente, estos cambios se realizan en unos pocos aminoácidos para minimizar la alteración de la molécula. Sin embargo, se pueden tolerar cambios mayores en ciertas circunstancias.

25 La divulgación proporciona pectato liasas en las que la estructura de la cadena principal de polipéptido, la estructura secundaria o la estructura terciaria, por ejemplo, una estructura alfa-helicoidal o de lámina beta, se ha modificado. En un aspecto, se ha modificado la carga o hidrofobia. En un aspecto, se ha modificado el tamaño de una cadena lateral. Se realizan cambios sustanciales en la función o identidad inmunológica seleccionando sustituciones que son menos conservativas. Por ejemplo, se pueden realizar sustituciones que influyen de forma más significativa: la

30 estructura de la cadena principal de polipéptido en la zona de la alteración, por ejemplo una estructura alfa-helicoidal

o una lámina beta; una carga o un sitio hidrófobo de la molécula, que pueden estar en un sitio activo; o una cadena lateral. Esto proporciona sustituciones en polipéptidos de la divulgación en los que (a) un resto hidrófilo, por ejemplo serilo o treonilo, se sustituye por (o con) un resto hidrófobo, por ejemplo leucilo, isoleucilo, fenilalanilo, valilo o alanilo; (b) una cisteína o prolina se sustituye por (o con) cualquier otro resto; (c) un resto que tiene una cadena

35 lateral electropositiva, por ejemplo lisilo, arginilo, o histidilo, se sustituye por (o con) un resto electronegativo, por ejemplo glutamilo o aspartilo; o (d) un resto que tiene una cadena lateral grande, por ejemplo fenilalanina, se sustituye por (o con) una que no tiene una cadena lateral, por ejemplo glicina. Las variantes pueden presentar la misma actividad biológica cualitativa (es decir, actividad de pectato liasa) aunque se pueden seleccionar variantes para modificar las características de las pectato liasas cuando sea necesario.

40 En un aspecto, las pectato liasas comprenden epítopos o marcas de purificación, secuencias señal u otras secuencias de fusión, etc. En un aspecto, las pectato liasas se pueden fusionar con un péptido aleatorio para formar un polipéptido de fusión. En el presente documento, con "fusionado" o "unido de forma operativa" se hace referencia a que el péptido aleatorio y la pectato liasa se unen en conjunto, de un modo tal que se minimiza la alteración de la

45 estabilidad de la estructura de la pectato liasa, por ejemplo, mantiene la actividad de pectato liasa. El polipéptido de fusión (o polinucleótido de fusión que codifica el polipéptido de fusión) también puede comprender componentes adicionales, que incluyen múltiples péptidos en múltiples bucles.

En un aspecto, los péptidos y los ácidos nucleicos que los codifican son aleatorios, ya sea totalmente aleatorios o

50 están sesgados en su aleatorización, por ejemplo en la frecuencia de nucleótidos/restos generalmente o por posición. "Aleatorio" se refiere a que cada ácido nucleico y péptido consiste básicamente en nucleótidos y aminoácidos aleatorios, respectivamente. En un aspecto, los ácidos nucleicos que dan lugar a los péptidos se pueden sintetizar de forma química, y por lo tanto pueden incorporar cualquier nucleótido en cualquier posición. Por lo tanto, cuando los ácidos nucleicos se expresan para formar péptidos, se puede incorporar cualquier resto de

55 aminoácido en cualquier posición. El proceso de síntesis se puede diseñar para generar ácidos nucleicos aleatorios, para permitir la formación de todas o la mayoría de las posibles combinaciones en la longitud del ácido nucleico, formando de este modo una biblioteca de ácidos nucleicos aleatorios. La biblioteca puede proporcionar una población estructuralmente diversa de forma suficiente de productos de expresión aleatorios para influir en un intervalo probabilísticamente suficiente de respuestas celulares para proporcionar una o más células que presentan

60 una respuesta deseada. Por lo tanto, esto proporciona una biblioteca de interacción suficientemente grande como para que al menos uno de sus miembros tenga una estructura que le proporciona afinidad hacia alguna molécula, proteína, u otro factor.

Metodologías de Identificación Sistemática y Dispositivos de Control "En línea" 65

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En la práctica de los métodos, se puede usar una diversidad de aparatos y metodologías en conjunto con los polipéptidos y ácidos nucleicos de la divulgación, por ejemplo, para identificar sistemáticamente polipéptidos para identificar la actividad de pectato liasa, para identificar sistemáticamente compuestos como moduladores potenciales, por ejemplo, activadores o inhibidores, de una actividad de pectato liasa, para anticuerpos que se unen

5 a un polipéptido de la divulgación, para ácidos nucleicos que hibridan a un ácido nucleico de la divulgación, para identificar sistemáticamente células que expresan un polipéptido de la divulgación y similares.

Matrices Capilares

10 Las matrices capilares, tales como la GIGAMATRIX™, Diversa Corporation, San Diego, CA, se pueden usar en los métodos. Los ácidos nucleicos o polipéptidos se pueden inmovilizar en o aplicar a una matriz, incluyendo matrices capilares. Las matrices se pueden usar para identificar sistemáticamente o para controlar bibliotecas de composiciones (por ejemplo, moléculas pequeñas, anticuerpos, ácidos nucleicos, etc.) para determinar su capacidad para unirse a o modular la actividad de un ácido nucleico o un polipéptido. Las matrices capilares proporcionan otro

15 sistema para mantener e identificar sistemáticamente muestras. Por ejemplo, un aparato de identificación sistemática de muestras puede incluir una pluralidad de capilares formados en una matriz de capilares adyacentes, en la que cada capilar comprende al menos una pared que define un lumen para retener una muestra. El aparato puede incluir adicionalmente material intersticial colocado entre capilares adyacentes en la matriz, y uno o más indicios de referencia formados dentro del material intersticial. Un capilar para identificar sistemáticamente una

20 muestra, en la que el capilar se adapta para que se una en una matriz de capilares, puede incluir una primera pared que define un lumen para retener la muestra, y una segunda pared formada por un material de filtro, para filtrar la energía de excitación proporcionada al lumen para excitar la muestra.

Un polipéptido o ácido nucleico, por ejemplo, un ligando, se puede introducir en un primer componente en al menos

25 una parte de un capilar de una matriz capilar. Cada capilar de la matriz capilar puede comprender al menos una pared que define un lumen para retener el primer componente. Una burbuja de aire se puede introducir en el capilar detrás del primer componente. Un segundo componente se puede introducir en el capilar, en el que el segundo componente se separa del primer componente mediante la burbuja de aire. Una muestra de interés se puede introducir como un primer líquido marcado con una partícula detectable en un capilar de una matriz capilar, en el que

30 cada capilar de la matriz capilar comprende al menos una pared que define un lumen para retener el primer líquido y la partícula detectable, y en el que al menos una pared se reviste con material de unión para unir la partícula detectable a la al menos una pared. El método puede incluir adicionalmente la eliminación del primer líquido del tubo capilar, en el que la partícula detectable unida se mantiene dentro del capilar, y la introducción de un segundo líquido en el tubo capilar.

35 La matriz capilar puede incluir una pluralidad de capilares individuales que comprenden al menos una pared externa que define un lumen. La pared externa del capilar puede ser una o más paredes fusionadas en conjunto. De forma análoga, la pared puede definir un lumen que es cilíndrico, cuadrado, hexagonal o de cualquier otra forma geométrica siempre y cuando las paredes formen un lumen para la retención de un líquido o muestra. Los capilares

40 de la matriz capilar se pueden mantener en conjunto en las proximidades para formar una estructura plana. Los capilares se pueden unir en conjunto, mediante su fusión (por ejemplo, en el que los capilares están hechos de vidrio), pegado, unión, o sujetos lado a lado. La matriz capilar puede estar formada por cualquier número de capilares individuales, por ejemplo, una serie de 100 a 4.000.000 capilares. Una matriz capilar puede formar una placa de microtitulación que tiene aproximadamente 100.000 o más capilares individuales unidos en conjunto.

45 Matrices, o "Biochips"

Los ácidos nucleicos o polipéptidos se pueden inmovilizar en o aplicar a una matriz. Las matrices se pueden usar para identificar sistemáticamente o para controlar bibliotecas de composiciones (por ejemplo, moléculas pequeñas, 50 anticuerpos, ácido sulfúrico, etc.) para su capacidad para unirse o para modular la actividad de un ácido nucleico o un polipéptido de la divulgación. Por ejemplo, en un aspecto, un parámetro controlado es la expresión del transcrito de un gen de pectato liasa. Uno o más, o, todos los transcritos de una célula se pueden medir mediante hibridación de una muestra que comprende transcritos de la célula, o, ácidos nucleicos representativos o complementarios de transcritos de una célula, mediante hibridación con ácidos nucleicos inmovilizados en una matriz, o "biochip". 55 Mediante el uso de una "matriz" de ácidos nucleicos en un microchip, algunos o todos los transcritos de una célula se pueden cuantificar de forma simultánea. Como alternativa, también se pueden usar matrices que comprenden ácido nucleico genómico para determinar el genotipo de una cepa recién modificada por ingeniería preparada con los métodos de la divulgación. También se pueden usar "matrices de polipéptidos" para cuantificar de forma simultánea una pluralidad de proteínas. Esto se puede poner en práctica con cualquier "matriz" conocida, también

60 denominada una "micromatriz" o "matriz de ácido nucleico" o "matriz polipeptídica" o "matriz de anticuerpo " o "biochip", o variación de las mismas. Las matrices son genéricamente una pluralidad de "sitios" o "elementos diana", comprendiendo cada elemento diana una cantidad definida de una o más moléculas biológicas, por ejemplo, oligonucleótidos, inmovilizadas en una zona definida de una superficie del sustrato para unión específica a una molécula de muestra, por ejemplo, transcritos de ARNm.

65

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En la práctica de los métodos, se puede incorporar cualquier matriz y/o método conocidos para preparar y usar matrices total o parcialmente, o variaciones de los mismos, como se describe, por ejemplo, en los documentos de Patente de Estados Unidos Nºs 6.277.628; 6.277.489; 6.261.776; 6.258.606; 6.054.270; 6.048.695; 6.045.996; 6.022.963; 6.013.440; 5.965.452; 5.959.098; 5.856.174; 5.830.645; 5.770.456; 5.632.957; 5.556.752; 5.143.854; 5 5.807.522; 5.800.992; 5.744.305; 5.700.637; 5.556.752; 5.434.049; véase también, por ejemplo, el documento de patente WO 99/51773; documento de patente WO 99/09217; documento de patente WO 97/46313; documento de patente WO 96/17958; véase también, por ejemplo, Johnston (1998) Curr. Biol. 8: R171-R174; Schummer (1997) Biotechniques 23: 1087-1092; Kern (1997) Biotechniques 23: 120-124; Solinas-Toldo (1997) Genes, Chromosomes & Cancer 20: 399-407; Bowtell (1999) Nature Genetics Supp. 21: 25-32. Véanse también las solicitudes de Patente

10 de Estados Unidos publicadas Nºs 20010018642; 20010019827; 20010016322; 20010014449; 20010014448; 20010012537; 20010008765.

Métodos de identificación sistemática de anticuerpos y basados en anticuerpos

15 La divulgación proporciona anticuerpos aislados o recombinantes que se unen de forma específica a una pectato liasa de la divulgación. Estos anticuerpos se pueden usar para aislar, identificar o cuantificar las pectato liasas de la divulgación o polipéptidos relacionados. Estos anticuerpos se pueden usar para aislar otros polipéptidos dentro del alcance deseado u otras pectato liasas relacionadas. Los anticuerpos se pueden diseñar para que se unan a un sitio activo de una pectato liasa. De esta manera, esto proporciona métodos para la inhibición de pectato liasas usando

20 los anticuerpos.

Los fragmentos de las enzimas incluyen fragmentos inmunogénicos de un polipéptido de SEC ID Nº: 2, SEC ID Nº: 4, SEC ID Nº: 6, SEC ID Nº: 8, SEC ID Nº: 10, SEC ID Nº: 12, SEC ID Nº: 14, SEC ID Nº: 16, SEC ID Nº: 18, SEC ID Nº: 20, SEC ID Nº: 22, SEC ID Nº: 24, SEC ID Nº: 26, SEC ID Nº: 28, SEC ID Nº: 30, SEC ID Nº: 32, SEC ID Nº: 34, 25 SEC ID Nº: 36, SEC ID Nº: 38, SEC ID Nº: 40, SEC ID Nº: 42, SEC ID Nº: 44, SEC ID Nº: 46, SEC ID Nº: 48, SEC ID Nº: 50, SEC ID Nº: 52, SEC ID Nº: 54, SEC ID Nº: 56, SEC ID Nº: 58, SEC ID Nº: 60, SEC ID Nº: 62, SEC ID Nº: 64, SEC ID Nº: 66, SEC ID Nº: 68, SEC ID Nº: 70, SEC ID Nº: 72, SEC ID Nº: 74, SEC ID Nº: 76, SEC ID Nº: 78, SEC ID Nº: 80, SEC ID Nº: 82, SEC ID Nº: 84, SEC ID Nº: 86, SEC ID Nº: 88, SEC ID Nº: 90, SEC ID Nº: 92, SEC ID Nº: 94, SEC ID Nº: 96, SEC ID Nº: 98, SEC ID Nº: 100, SEC ID Nº: 102, SEC ID Nº: 104, SEC ID Nº: 106, SEC ID Nº: 108, 30 SEC ID Nº: 110, SEC ID Nº: 112, SEC ID Nº: 114, SEC ID Nº: 116, SEC ID Nº: 118, SEC ID Nº: 120, SEC ID Nº: 122, SEC ID Nº: 124, SEC ID Nº: 126, SEC ID Nº: 128 o SEC ID Nº: 130, SEC ID Nº: 132, SEC ID Nº: 134. Los péptidos inmunogénicos (por ejemplo, los fragmentos inmunogénicos de SEC ID Nº: 2, SEC ID Nº: 4, SEC ID Nº: 6, SEC ID Nº: 8, SEC ID Nº: 10, SEC ID Nº: 12, SEC ID Nº: 14, SEC ID Nº: 16, SEC ID Nº: 18, SEC ID Nº: 20, SEC ID Nº: 22, SEC ID Nº: 24, SEC ID Nº: 26, SEC ID Nº: 28, SEC ID Nº: 30, SEC ID Nº: 32, SEC ID Nº: 34, SEC ID Nº: 36, 35 SEC ID Nº: 38, SEC ID Nº: 40, SEC ID Nº: 42, SEC ID Nº: 44, SEC ID Nº: 46, SEC ID Nº: 48, SEC ID Nº: 50, SEC ID Nº: 52, SEC ID Nº: 54, SEC ID Nº: 56, SEC ID Nº: 58, SEC ID Nº: 60, SEC ID Nº: 62, SEC ID Nº: 64, SEC ID Nº: 66, SEC ID Nº: 68, SEC ID Nº: 70, SEC ID Nº: 72, SEC ID Nº: 74, SEC ID Nº: 76, SEC ID Nº: 78, SEC ID Nº: 80, SEC ID Nº: 82, SEC ID Nº: 84, SEC ID Nº: 86, SEC ID Nº: 88, SEC ID Nº: 90, SEC ID Nº: 92, SEC ID Nº: 94, SEC ID Nº: 96, SEC ID Nº: 98, SEC ID Nº: 100, SEC ID Nº: 102, SEC ID Nº: 104, SEC ID Nº: 106, SEC ID Nº: 108, SEC ID Nº: 110,

40 SEC ID Nº: 112, SEC ID Nº: 114, SEC ID Nº: 116, SEC ID Nº: 118, SEC ID Nº: 120, SEC ID Nº: 122, SEC ID Nº: 124, SEC ID Nº: 126, SEC ID Nº: 128 o SEC ID Nº: 130, SEC ID Nº: 132, SEC ID Nº: 134) pueden comprender adicionalmente adyuvantes, vehículos y similares.

Los anticuerpos se pueden usar en inmunoprecipitación, tinción, columnas de inmunoafinidad, y similares. Si se

45 desea, se pueden generar secuencias de ácidos nucleicos que codifican antígenos específicos mediante inmunización seguido de aislamiento del polipéptido o ácido nucleico, amplificación o clonación e inmovilización de polipéptidos en una matriz. Como alternativa, los métodos se pueden usar para modificar la estructura de un anticuerpo producido por una célula a modificar, por ejemplo, una afinidad de un anticuerpo se puede aumentar o disminuir. Además, la capacidad para preparar o modificar anticuerpos puede ser un fenotipo modificado por

50 ingeniería en una célula por los métodos.

Los expertos en la materia conocen métodos de inmunización, producción y aislamiento de anticuerpos (policlonales y monoclonales) y se describen en la bibliografía científica y de patente, véase, por ejemplo, Coligan, CURRENT PROTOCOLS IN IMMUNOLOGY, Wiley/Greene, NY (1991); Stites (eds.) BASIC AND CLINICAL IMMUNOLOGY (7ª 55 ed.) Lange Medical Publications, Los Altos, CA ("Stites"); Goding, MONOCLONAL ANTIBODIES: PRINCIPLES AND PRACTICE (2ª ed.) Academic Press, Nueva York, NY (1986); Kohler (1975) Nature 256: 495; Harlow (1988) ANTIBODIES, A LABORATORY MANUAL, Cold Spring Harbor Publications, Nueva York. Los anticuerpos también se pueden generar in vitro, por ejemplo, usando bibliotecas de presentación de fagos que expresan sitio de unión a anticuerpo recombinante, además de los métodos in vivo tradicionales usando animales. Véase, por ejemplo,

60 Hoogenboom (1997) Trends Biotechnol. 15: 62-70; Katz (1997) Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 26: 27-45.

Se pueden usar polipéptidos o péptidos para generar anticuerpos que se unen de forma específica a los polipéptidos, por ejemplo, las pectato liasas. Los anticuerpos resultantes se pueden usar en procedimientos de cromatografía por inmunoafinidad para aislar o purificar el polipéptido o para determinar si el polipéptido está 65 presente en una muestra biológica. En tales procedimientos, una preparación de proteína, tal como un extracto, o

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una muestra biológica se pone en contacto con un anticuerpo capaz de unirse de forma específica a uno de los polipéptidos de la divulgación.

En los procedimientos de inmunoafinidad, el anticuerpo se une a un soporte sólido, tal como una perla u otra matriz

5 de columna. La preparación de proteínas se coloca en contacto con el anticuerpo en condiciones en las que el anticuerpo se une de forma específica a uno de los polipéptidos de la divulgación. Después de un lavado para retirar las proteínas no unidas de forma específica, los polipéptidos unidos de forma específica se eluyen.

La capacidad de las proteínas en una muestra biológica para unirse al anticuerpo se puede determinar usando cualquiera de una diversidad de procedimientos familiares para los expertos en la materia. Por ejemplo, la unión se puede determinar marcando el anticuerpo con una marca detectable tal como un agente fluorescente, una marca enzimática, o un radioisótopo. Como alternativa, la unión del anticuerpo a la muestra se puede detectar usando un anticuerpo secundario que tiene tal marca detectable en el mismo. Los ensayos concretos incluyen ensayos de ELISA, ensayos de sándwich, radioinmunoensayos, y Transferencias de Western.

15 Se pueden obtener anticuerpos policlonales generados frente a los polipéptidos de la divulgación por inyección directa de los polipéptidos en un animal o mediante la administración de los polipéptidos a un animal no humano. El anticuerpo obtenido de este modo se unirá al polipéptido en sí mismo. De esta manera, se puede usar incluso una secuencia que codifica solamente un fragmento del polipéptido para generar anticuerpos que se pueden unir a todo el polipéptido nativo. Tales anticuerpos se pueden unir a continuación para aislar el polipéptido de células que expresan ese polipéptido.

Para la preparación de anticuerpos monoclonales, se puede usar cualquier técnica que proporciona anticuerpos producidos mediante cultivos continuos de líneas celulares. Los ejemplos incluyen la técnica del hibridoma, la

25 técnica del trioma, la técnica del hibridoma de linfocitos B humanos, y la técnica del hibridoma de EBV (véase, por ejemplo, Cole (1985) en Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc., pp. 77-96).

Las técnicas descritas para la producción de anticuerpos de una sola cadena (véase, por ejemplo, el documento de Patente de Estados Unidos Nº 4.946.778) se pueden adaptar para producir anticuerpos de una sola cadena para los polipéptidos de la invención. Como alternativa, se pueden usar ratones transgénicos para expresar anticuerpos humanizados para estos polipéptidos o fragmentos de estos.

Se pueden usar anticuerpos generados frente a los polipéptidos en la identificación sistemática de polipéptidos similares (por ejemplo, pectato liasas) a partir de otros organismos y muestras. En tales técnicas, los polipéptidos del

35 organismo se ponen en contacto con el anticuerpo y se detectan esos polipéptidos que se unen de forma específica al anticuerpo. Se puede usar cualquiera de los procedimientos que se han descrito anteriormente para detectar la unión al anticuerpo.

Kits

Los kits pueden comprender las composiciones, por ejemplo, ácidos nucleicos, casetes de expresión, vectores, células, semillas o plantas o partes de plantas transgénicas, polipéptidos (por ejemplo, pectato liasas) y/o anticuerpos de la divulgación. Los kits también pueden contener material con instrucciones que enseña las metodologías y usos industriales, como se describe en el presente documento.

45 Medida de Parámetros Metabólicos

Los métodos proporcionan la evolución de la célula completa, o la modificación por ingeniería de la célula completa, de una célula para desarrollar una nueva cepa celular que tiene un nuevo fenotipo, por ejemplo, una actividad de pectato liasa nueva o modificada, mediante la modificación de la composición genética de la célula. La composición genética se puede modificar mediante la adición a la célula de un ácido nucleico de la divulgación. Para detectar el nuevo fenotipo, al menos un parámetro metabólico de una célula modificada se controla en la célula en un marco de "tiempo real" o de tiempo "en línea". En un aspecto, una pluralidad de células, tal como un cultivo celular, se controla en "tiempo real" o "en línea". En un aspecto, una pluralidad de parámetros metabólicos se controla en "tiempo real" o

55 "en línea". Los parámetros metabólicos se pueden controlar usando las pectato liasas de la divulgación.

El análisis de flujo metabólico (MFA) se basa en un marco bioquímico conocido. Se construye una matriz metabólica linealmente independiente basándose en la ley de conservación de masa y en la hipótesis del estado pseudoestacionario (PSSH) en los metabolitos intracelulares. En la práctica de los métodos, se establecen redes metabólicas, que incluyen la:

•: identidad de todos los sustratos, productos y metabolitos intermedios de la ruta

•: identidad de todas las reacciones químicas que interconvierten los metabolitos de la ruta, la estequiometría de

las reacciones de la ruta, 65 • identidad de todas las enzimas que catalizan las reacciones, la cinética de la reacción enzimática,

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•: las interacciones reguladoras entre los componentes de la ruta, por ejemplo interacciones alostéricas, interacciones enzima-enzima etc,

•: compartimentalización intracelular de enzimas o cualquier otra organización supramolecular de las enzimas, y,

• la presencia de cualquier gradiente de concentración de metabolitos, enzimas o moléculas efectoras o barreras 5 de difusión para su movimiento.

Una vez que se construye la red metabólica de una cepa dada, se puede introducir una presentación matemática por concepto de matriz para estimar los flujos metabólicos intracelulares si están disponibles los datos de metaboloma en línea. El fenotipo metabólico se basa en los cambios de toda la red metabólica dentro de una célula. El fenotipo metabólico se basa en el cambio de utilización del uso de la ruta con respecto a condiciones ambientales, regulación genética, estado de desarrollo y el genotipo, etc. En un aspecto, después del cálculo de MFA en línea, el comportamiento dinámico de las células, su fenotipo y otras propiedades se analizan mediante la investigación del uso de la ruta. Por ejemplo, si el suministro de glucosa aumenta y el de oxígeno disminuye durante la fermentación de la levadura, el uso de las vías respiratorias se reducirá y/o detendrá, y el uso de las rutas fermentativas dominará.

15 El control del estado fisiológico de los cultivos celulares será posible después del análisis de la ruta. Los métodos pueden ayudar a determinar cómo manipular la fermentación mediante la determinación de cómo cambiar el suministro de sustrato, temperatura, uso de inductores, etc., para controlar el estado fisiológico de las células para moverse a lo largo de la dirección deseable. En la práctica de los métodos, los resultados del MFA también se pueden comparar con datos de transcriptoma y proteoma para diseñar experimentos y protocolos para ingeniería metabólica o redistribución de genes, etc.

En la práctica de los métodos, cualquier fenotipo modificado o nuevo se puede consultar y detectar, incluyendo características nuevas o mejoradas en la célula. Se puede controlar cualquier aspecto del metabolismo o crecimiento.

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Control de la expresión de un transcrito de ARNm

En un aspecto, el fenotipo modificado por ingeniería comprende el aumento o disminución de la expresión de un transcrito de ARNm (por ejemplo, un mensaje de pectato liasa) o generación de nuevos transcritos (por ejemplo, pectato liasa) en una célula. Este aumento o disminución de la expresión se puede trazar sometiendo a ensayo la presencia de una pectato liasa de la divulgación o mediante ensayos de actividad de pectato liasa. También se pueden detectar transcritos de ARNm, o mensajes, y cuantificar mediante cualquier método conocido en la técnica, que incluye, por ejemplo, transferencias de Northern, reacciones de amplificación cuantitativa, hibridación a matrices, y similares. Las reacciones de amplificación cuantitativa incluyen, por ejemplo, PCR cuantitativa, que 35 incluye, por ejemplo, reacción en cadena de la polimerasa por transcripción inversa cuantitativa, o RT-PCR; RT-PCR en tiempo real cuantitativa, o "RT-PCR cinética en tiempo real" (véase, por ejemplo, Kreuzer (2001) Br. J. Haematol.

114: 313-318; Xia (2001) Transplantation 72: 907-914).

En un aspecto, el fenotipo modificado por ingeniería se genera por genosupresión de la expresión de un gen homólogo. La secuencia que codifica el gen o uno o más elementos de control de la transcripción se pueden genosuprimir, por ejemplo, promotores o potenciadores. Por lo tanto, la expresión de un transcrito se puede suprimir completamente o solamente se puede disminuir.

En un aspecto, el fenotipo modificado por ingeniería comprende el aumento de la expresión de un gen homólogo.

45 Esto se puede realizar mediante genosupresión de un elemento de control negativo, incluyendo un elemento regulador de la transcripción que actúa en cis o trans, o, en la mutagénesis de un elemento de control positivo. Uno

o más, o, todos los transcritos de una célula se pueden medir por hibridación de una muestra que comprende transcritos de la célula, o, ácidos nucleicos representativos de o complementarios para transcritos de una célula, por hibridación con ácidos nucleicos inmovilizados en una materia.

Control de la expresión de polipéptidos, péptidos y aminoácidos

En un aspecto, el fenotipo modificado por ingeniería comprende el aumento o la disminución de la expresión de un polipéptido (por ejemplo, una pectato liasa) o la generación de nuevos polipéptidos en una célula. Este aumento o 55 disminución de la expresión se puede trazar mediante la determinación de la cantidad de pectato liasa presente o mediante ensayos de actividad de pectato liasa. También se pueden detectar y cuantificar polipéptidos, péptidos y aminoácidos mediante cualquier método conocido en la técnica, que incluye, por ejemplo, resonancia magnética nuclear (RMN), espectrofotometría, radiografía (radiomarcado de proteínas), electroforesis, electroforesis capilar, cromatografía líquida de alto rendimiento (HPLC), cromatografía en capa fina (TLC), cromatografía de hiperdifusión, diversos métodos inmunológicos, por ejemplo inmunoprecipitación, inmunodifusión, inmunoelectroforesis, radioinmunoensayos (RIA), ensayos de inmunoabsorción ligada a enzimas (ELISA), ensayos de inmunofluorescencia, electroforesis en gel (por ejemplo, SDS-PAGE), tinción con anticuerpos, clasificación celular activada por fluorescencia (FACS), espectrometría de masas por pirólisis, Espectrometría de Infrarrojos con Transformada de Fourier, espectrometría de Raman, GC-MS, y LC-Electronebulización y espectrometrías de masas 65 con electronebulización de protección-LC-tándem, y similares. Las nuevas bioactividades también se pueden identificar sistemáticamente usando métodos, o variaciones de los mismos, que se describen en el documento de

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Patente de Estados Unidos Nº 6.057.103. Además, como se analiza a continuación en detalle, uno o más, o, todos los polipéptidos de una célula se pueden medir usando una matriz de proteína.

Aplicaciones industriales 5

Composiciones de Detergente

Las composiciones de detergente comprenden uno o más polipéptidos (por ejemplo, pectato liasas) de la divulgación, y la divulgación incluye métodos para preparar y usar estas composiciones, véase, por ejemplo, los documentos de Patente de Estados Unidos Nºs 6.413.928; 6.399.561; 6.365.561; 6.380.147. Las composiciones de detergente pueden ser una composición acuosa de una y dos partes, una composición líquida no acusa, un sólido fundido, una forma granular, una forma de partículas, un comprimido formado por compresión, un gel y/o una pasta y una forma de suspensión. Las pectato liasas también se pueden usar como un producto aditivo para detergente en una forma sólida o una forma líquida. Se pretende que tales productos aditivos complementen o refuercen el

15 rendimiento de composiciones de detergente convencionales y se pueden añadir en cualquier etapa del proceso de limpieza.

También se proporcionan métodos capaces de eliminar tierra de alimentos recién recogidos, películas de restos de alimentos y otras composiciones de alimentos secundarias usando estas composiciones de detergente. Las pectato liasas pueden facilitar la eliminación de manchas de almidón por medio de hidrólisis catalítica o trans-eliminación de pectinas, incluyendo la alteración de paredes celulares de vegetales y bacterianas. Las pectato liasas se pueden usar en detergentes para lavavajillas en detergentes para lavado de textiles.

El contenido de enzima activa real depende del método de preparación de una composición de detergente y no es

25 crítico, suponiendo que la solución de detergente tenga la actividad enzimática deseada. En un aspecto, la cantidad de pectato liasa presente en la solución final varía de aproximadamente 0,001 mg a 0,5 mg por gramo de la composición de detergente. La enzima en particular elegida para uso en el proceso y productos de la presente divulgación depende de las condiciones del uso final, incluyendo la forma física del producto, pH de uso, temperatura de uso, y tipos de suelo a degradar o alterar. La enzima se puede elegir para que proporcione una actividad y estabilidad óptimas para cualquier conjunto de condiciones de utilidad dadas. En un aspecto, las pectato liasas de la presente divulgación son activas en los intervalos de pH de aproximadamente 4 a aproximadamente 12 y en el intervalo de temperatura de aproximadamente 20 ºC a aproximadamente 95 ºC. Los detergentes pueden comprender tensioactivos catiónicos, no iónicos semipolares o zwitteriónicos; o, mezclas de los mismos.

35 Las pectato liasas se pueden formular en detergentes en polvo y líquidos que tienen un pH entre 4,0 y 12,0 a niveles de aproximadamente un 0,01 % a aproximadamente un 5 % (preferentemente de un 0,1 % a un 0,5 %) en peso. Estas composiciones de detergente también pueden incluir otras enzimas tales como proteasas, celulasas, lipasas o endoglicosidasas, endo-beta-1,4-glucanasas, beta-glucanasas, endo-beta-1,3(4)-glucanasas, cutinasas, peroxidasas, lacasas, amilasas, glucoamilasas, pectinasas, reductasas, oxidasas, fenoloxidasas, ligninasas, pululanasas, arabinanasas, hemicelulasas, mananasas, xiloglucanasas, xilanasas, pectina acetil esterasas, ramnogalacturonano acetil esterasas, poligalacturonasas, ramnogalacturonasas, galactanasas, pectina liasas, pectina metilesterasas, celobiohidrolasas y/o transglutaminasas. Estas composiciones de detergente también pueden incluir aditivos y estabilizantes.

45 La adición de las pectato liasas a composiciones de limpieza convencionales no crea ninguna limitación especial en uso. En otras palabras, cualquier temperatura y pH adecuados para el detergente también son adecuados para las composiciones siempre y cuando la enzima sea activa en o tolerante para el pH y/o temperatura del uso pretendido. Además, las pectato liasas se pueden usar en una composición de limpieza sin detergentes, de nuevo solas o en combinación con aditivos y estabilizantes.

Las composiciones de limpieza incluyen composiciones de detergente para la limpieza de superficies duras, composiciones de detergente para la limpieza de tejidos, composiciones para lavavajillas, composiciones para limpieza oral, composiciones para limpieza de dentaduras, y soluciones para limpieza de lentes de contacto.

55 Un método para lavar un objeto comprende poner en contacto el objeto con un polipéptido de la divulgación en condiciones suficientes para lavado. Una pectato liasa se puede incluir como un aditivo de detergente. La composición de detergente, por ejemplo, se puede formular como una composición de detergente lavado a mano o a máquina que comprende un polipéptido de la divulgación. Un aditivo para lavandería adecuado para tratamiento previo de tejidos manchados puede comprender un polipéptido de la divulgación. Una composición suavizante de tejido puede comprender una pectato liasa de la divulgación. Como alternativa, una pectato liasa se puede formular como una composición de detergente para uso en operaciones de limpieza de superficies duras del hogar en general. En aspectos alternativos, los aditivos detergentes y las composiciones de detergente pueden comprender una u otras enzimas más tales como una proteasa, una lipasa, una cutinasa, otra pectato liasa, una carbohidrasa, una celulasa, una pectinasa, una mananasa, una arabinasa, una galactanasa, una xilanasa, una oxidasa, por

65 ejemplo, una lactasa, y/o una peroxidasa (véase también, la mencionada anteriormente). Las propiedades de la enzima o enzimas de la divulgación se eligen para que sean compatibles con el detergente seleccionado (es decir, pH óptimo, compatibilidad con otros ingredientes enzimáticos y no enzimáticos, etc.) y la enzima o enzimas están presentes en cantidades eficaces. En un aspecto, las enzimas de pectato liasa se usan para retirar materiales de tejidos con malos olores. Diversas composiciones de detergente y métodos para prepararlas se describen, por ejemplo, en los documentos de Patente de Estados Unidos Nºs 6.333.301; 6.329.333; 6.326.341; 6.297.038;

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5 6.309.871; 6.204.232; 6.197.070; 5.856.164.

Cuando se formulan como composiciones adecuadas para su uso en un método de lavado de ropa a máquina, las pectato liasas pueden comprender un compuesto tanto tensioactivo como aditivo. Pueden comprender adicionalmente uno o más componentes detergentes, por ejemplo, compuestos poliméricos orgánicos, agentes de blanqueado, enzimas adicionales, supresores de espuma, agentes dispersantes, agentes dispersantes de cal-jabón, agentes de suspensión y agentes anti-redeposición de suciedad e inhibidores de la corrosión. Las composiciones de limpieza también pueden contener agentes suavizantes, como componentes adicionales de detergente. Tales composiciones que contienen carbohidrasa pueden proporcionar limpieza de tejidos, eliminación de manchas, mantenimiento de la blancura, suavizado, aspecto de color, inhibición de la transferencia del tinte y desinfección

15 cuando se formulan como composiciones de detergente para lavado de ropa.

La densidad de las composiciones de detergente para lavado de ropa puede variar de aproximadamente 200 a 1500 g/litro, o, de aproximadamente 400 a 1200 g/litro, o, de aproximadamente 500 a 950 g/litro, o, de 600 a 800 g/litro, de composición; esto se puede medir a aproximadamente 20 ºC.

La forma "compacta" de las composiciones de detergente para lavado de ropa se refleja de la mejor manera mediante la densidad y, en términos de composición, mediante la cantidad de sal de carga inorgánica. Las sales de carga inorgánica son ingredientes convencionales de las composiciones de detergente en forma de polvo. En las composiciones de detergente convencionales, las sales de carga están presentes en cantidades básicas, por lo

25 general de un 17 % a un 35 % en peso de la composición total. En un aspecto de las composiciones compactas, la sal de carga está presente en cantidades que no superan un 15 % de la composición total, o, que no superan un 10 %, o, no superan un 5 % en peso de la composición. Las sales de carga inorgánica se pueden seleccionar a partir de las sales de metales alcalinos y alcalinotérreos de sulfatos y cloruros, por ejemplo, sulfato sódico.

Las composiciones de detergente líquido se puede presentar en una "forma concentrada". En un aspecto, las composiciones de detergente líquido pueden contener una cantidad menor de agua, en comparación con los detergentes líquidos convencionales. En aspectos alternativos, el contenido de agua del detergente líquido concentrado es inferior a un 40 %, o, inferior a un 30 %, o, inferior a un 20 % en peso de la composición de detergente. Los compuestos de detergente pueden comprender formulaciones como se describen en el documento

35 WO 97/01629.

Tratamiento de fibras y textiles

Los métodos para el tratamiento de fibras, tejidos o cualquier material que comprende pectato o ácido poligalacturónico usutilizan una o más pectato liasas de la divulgación. Las pectato liasas se pueden usar en cualquier método de tratamiento de fibra o tejido, que se conocen bien en la técnica, véanse, por ejemplo, los documentos de Patente de Estados Unidos Nºs 6.261.828; 6.077.316; 6.024.766; 6.021.536; 6.017.751; 5.980.581; Publicación de Patente de Estados Unidos Nº 20020142438 A1. Por ejemplo, las pectato liasas se pueden usar en limpieza de fibra y/o tejido. En un aspecto, la sensación y el aspecto de un tejido mejora con un método que

45 comprende poner en contacto el tejido con pectato liasa de la divulgación en una solución. En un aspecto, el tejido se trata con la solución a presión. Por ejemplo, las pectato liasas se pueden usar en la eliminación de manchas.

En un aspecto, las pectato liasas se aplican durante o después del tejido de textiles, o durante la etapa de retirada del apresto, o durante una o más etapas adicionales del procesamiento del tejido. Durante el tejido de textiles, los hilos se exponen a una tensión mecánica considerable. Antes del tejido en telares mecánicos, los hilos de urdimbre a menudo se revisten con almidón o derivados de almidón para encolado para aumentar su resistencia a la tracción y para evitar la ruptura. Después de haber tejido los textiles, un tejido puede evolucionar a una etapa de retirada del apresto. Esto puede ir seguido de una o más etapas adicionales de procesamiento del tejido. La retirada del apresto es el acto de eliminar la "cola" de los textiles. Después del tejido, el revestimiento de encolado se debe eliminar

55 antes del procesamiento adicional del tejido con el fin de garantizar un resultado homogéneo y a prueba de lavado.

Las enzimas de la divulgación se pueden usar para limpiar tejidos o cualquier material que comprende pectato o ácido poligalacturónico, que incluye tejidos que contienen algodón, como aditivos detergentes, por ejemplo, en composiciones acuosas. Para la fabricación de ropa, el tejido se puede cortar y coser en ropa o prendas de vestir. Estas se pueden acabar antes o después del tratamiento. En particular, para la fabricación de pantalones vaqueros, se han desarrollado diferentes métodos de acabado enzimático. El acabado de prendas vaqueras comienza con una etapa de retirada del apresto enzimática, durante la que las prendas se someten a la acción de enzimas amilolíticas para proporcionar suavidad al tejido y hacer que el algodón sea más accesible a las etapas de acabado enzimático posteriores. Esto proporciona métodos de acabado de prendas vaqueras, retirada enzimática del apresto y

65 proporcionan suavidad a los tejidos mediante el uso de cualquier combinación de enzimas, tales como amilasas, endoglucanasas, y una pectato liasa de la divulgación. 68

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En un aspecto, una amilasa alcalina y termoestable y la pectato liasa se combinan en una retirada del apresto y biolimpieza en un solo baño. Entre las ventajas de la combinación de la retirada del apresto y limpieza en una etapa se encuentran la reducción de costes y el impacto ambiental menor debido a ahorros de energía y uso de agua y

5 una producción de residuos menor. Las condiciones de aplicación para la retirada del apresto y biolimpieza pueden estar entre aproximadamente pH 8,5 y pH 10,0 y temperaturas a aproximadamente 40 ºC y superiores. Se pueden usar dosificaciones enzimáticas bajas (por ejemplo, aproximadamente 5 g por una tonelada de algodón) y tiempos de reacción cortos (por ejemplo, aproximadamente 15 minutos) para obtener una retirada del apresto y limpieza eficaces sin calcio añadido.

10 Las pectato liasas se pueden usar en combinación con otras enzimas que degradan carbohidratos, por ejemplo, celulasa, arabinanasa, xiloglucanasa, pectinasa, xilanasa, y similares, para la preparación de fibras o para la limpieza de fibras. Las proteasas también se pueden usar en combinación. Estas se pueden usar en combinación con detergentes. En un aspecto, las pectato liasas se pueden usar en tratamientos para evitar la aparición de

15 colores grises en textil.

Las pectato liasas se pueden usar para tratar cualquier material celulósico, incluye fibras (por ejemplo, fibras de algodón, cáñamo, fibra de lino o hilo de lino), tejidos cosidos y sin coser, por ejemplo, tejidos de punto, tejidos, pantalones vaqueros, hilos y toallas, hechos de algodón, mezclas de algodón o agentes celulósicos naturales o 20 hechos por el hombre (por ejemplo, que proceden de fibras de celulosa que contienen xilano tales como de pasta de madera) o mezclas de los mismos. Algunos ejemplos de mezclas son mezclas de algodón o rayón/viscosa con uno o más materiales de compañía tales como lana, fibras sintéticas (por ejemplo fibras de poliamida, fibras acrílicas, fibras de poliéster, fibras de alcohol de polivinilo, fibras de cloruro de polivinilo, fibras de cloruro de polivinilideno, fibras de poliuretano, fibras de poliurea, fibras de aramida), y fibras que contienen celulosa (por ejemplo

25 rayón/viscosa, ramio, cáñamo, lino/hilo de lino, yute, fibras de acetato de celulosa, lyocell).

Los procesos de tratamiento de textiles (por ejemplo, limpieza usando las pectato liasas) se pueden usar en combinación con otros tratamientos textiles, por ejemplo, retirada del apresto y blanqueado. La limpieza es la retirada del material no celulósico de la fibra de algodón, por ejemplo, la cutícula (que consiste principalmente en 30 ceras) y la pared celular primaria (que consiste principalmente en pectina, proteína y xiloglucano). Una eliminación de cera apropiada es necesaria para obtener una alta humectabilidad. Esto es necesario para el teñido. La eliminación de las paredes celulares primarias con los procesos mejora la eliminación de cera y asegura un teñido más uniforme. El tratamiento de textiles con los procesos puede mejorar la blancura en el proceso de blanqueado. El producto químico principal usado en la limpieza es el hidróxido sódico en concentraciones elevadas y a

35 temperaturas elevadas. El blanqueado comprende la oxidación del textil. Por lo general, el blanqueado implica el uso de peróxido de hidrógeno como el agente oxidante para obtener ya sea un tejido totalmente blanqueado (blanco) o para garantizar un tono limpio del colorante.

Un proceso de un solo baño puede ser para retirar el apresto, limpieza y blanqueado de materiales celulósicos. En

40 un aspecto, la retirada del apresto, limpieza y blanqueados se realizan en un solo baño poniendo en contacto los materiales celulósicos de forma simultánea o secuencialmente en un recipiente (un "solo baño") con un sistema enzimático y un sistema de blanqueado que comprende peróxido de hidrógeno o al menos un compuesto peroxi que puede generar peróxido de hidrógeno cuando se disuelve en agua, o combinaciones de los mismos, y al menos un activador del blanqueado. Los materiales celulósicos que incluyen fibras en bruto, hilo, o textiles tejidos o de punto,

45 hechos de algodón, hilo de lino, fibra de lino, ramio, rayón, cáñamo, yute, o mezclas de estas fibras entre sí o con otras fibras naturales o sintéticas, se pueden tratar con los procesos.

Esto también proporciona pectinasas alcalinas (pectato liasas activas en condiciones alcalinas). Estas tienen amplias aplicaciones en el procesamiento de textiles, desgomado de fibras vegetales (por ejemplo, fibras del líber de

50 la planta), tratamiento de aguas residuales pécticas, fabricación de papel, y fermentaciones de café y té. Véase, por ejemplo, Hoondal (2002) Applied Microbiology and Biotechnology 59: 409-418.

Tratamiento de alimentos y procesamiento de alimentos

55 Las pectato liasas de la divulgación tienen numerosas aplicaciones en la industria de procesamiento de alimentos. Por ejemplo, en un aspecto, las pectato liasas se usan para mejorar la extracción de aceite de materiales de plantas ricas en aceite, por ejemplo, semillas ricas en aceite, por ejemplo, aceite de semilla de soja de semillas de soja, aceite de oliva de aceitunas, aceite de colza de colza y/o aceite de girasol de semillas de girasol.

60 Las pectato liasas se pueden usar para separación de componentes de materiales de células vegetales. Por ejemplo, las pectato liasas se pueden usar en la separación de materiales ricos en pectina (por ejemplo, paredes celulares), azúcar o material de plantas rico en almidón en componentes, por ejemplo, sacarosa de remolacha azucarera o almidón o azúcares de la patata, pulpa o fracciones de cáscara. En un aspecto, las pectato liasas se pueden usar para separar cultivos ricos en proteínas o ricos en aceite en fracciones valiosas de proteína y aceite y

65 cáscara. El proceso de separación se puede realizar mediante el uso de métodos conocidos en la técnica.

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Las pectato liasas se pueden usar en la preparación de zumos, jarabes, extractos de frutas o verduras y similares para aumentar el rendimiento. Las pectato liasas se pueden usar en el tratamiento enzimático (por ejemplo, hidrólisis de pectinas y/o ácido poligalacturónico, tal como ácido alfa-D-galacturónico unido en la posición 1,4) de diversos materiales derivados de la pared de célula vegetal o materiales de desecho, por ejemplo de la producción de vino o 5 zumo, o restos agrícolas tales como cáscaras de vegetales, cáscaras de judía, pulpa de remolacha azucarera, pulpa de aceituna, pulpa de patata, y similares. Las pectato liasas se pueden usar para modificar la consistencia y aspecto de frutas o verduras procesados. Por ejemplo, las pectato liasas se pueden usar en la producción de zumos transparentes, por ejemplo, de manzanas, peras o bayas; para enturbiar zumos estables, por ejemplo, de manzanas, peras, bayas, cítricos o tomates; y para tratar purés, por ejemplo, de zanahorias y tomates, y para tratar sirope de dátil (véase, por ejemplo, Sidhu (2002) Food Chemistry 79: 215-220). En estos procesos, las pectato liasas se pueden usar con otras enzimas (por ejemplo, celulasas, amilasas, etc.) u otras composiciones. Por ejemplo, en un aspecto, se usan enzimas de pectinasa y celulasa para mejorar el rendimiento, estabilidad y calidad del zumo de una fruta, por ejemplo, un higo chumbo. Una pectinasa de la divulgación puede aumentar el rendimiento, estabilidad y color (ensayo de color a medida como liberación de antocianinas o carotenoides) y claridad de un zumo. En un

15 aspecto, se usa una combinación de pectinasa y celulasa; pectinasa a un 0,50 % en v/p puede producir un rendimiento elevado, un zumo transparente libre de sedimentos y zumo de alta calidad. Véase, por ejemplo, Essa, Hesham A., et al., 2002, Nahrung, 46 (4): 245-250,

En un aspecto, una enzima o preparación enzimática de la divulgación se usa para la despectinación y reducción de la viscosidad en zumo de verduras y/o frutas, por ejemplo, en zumos de manzana o pera u otras preparaciones alimentarias de manzana o pera (por ejemplo, salsas). En un aspecto, el zumo de frutas o verduras se trata con una preparación enzimática de la divulgación en una cantidad eficaz para degradar el material que contiene pectina contenido en el zumo de frutas o verduras.

25 En un aspecto, la enzima o preparación enzimática se usa en el tratamiento de puré de frutas y verduras para mejorar la capacidad de extracción o de degradación del puré. La preparación enzimática se puede usar en el tratamiento de puré de manzanas y peras para producción de zumo, y en el tratamiento del puré de uvas para producción de vino.

Las pectato liasas se pueden usar para tratar materiales vegetales para facilitar el procesamiento del material vegetal, incluyendo alimentos, para facilitar la purificación o extracción de los componentes vegetales tales como galactanos, pectinas y/o ácidos poligalacturónicos. Las pectato liasas se pueden usar para purificar pectinas de cítricos, para aumentar el valor alimentario, disminuir la capacidad de unión a agua, aumentar la capacidad de degradación en plantas de agua residual y/o aumentar la conversión de material vegetal para ensilado, y similares.

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Alimentos y comida o aditivos alimentarios para animales

Los métodos para el tratamiento de alimentos o comidas y aditivos de comida y alimentarios de animales utilizan las pectato liasas de la divulgación, para animales que incluyen mamíferos (por ejemplo, seres humanos), pájaros, peces y similares. Los alimentos, comidas, y aditivos para animales comprenden las pectato liasas de la divulgación. En un aspecto, el tratamiento de alimentos, comidas y aditivos para animales usando las pectato liasas puede ayudar en la disponibilidad de nutrientes, por ejemplo, almidón, en el alimento o aditivo para animales. Esto puede dar como resultado la liberación de nutrientes y azúcares absorbidos digeribles y de fácil absorción.

45 Las pectato liasas de la divulgación, en la modificación del alimento o una comida para un animal, pueden procesar el alimento o la comida in vitro (modificando los componentes del alimento o comida) o in vivo. Las pectato liasas se pueden añadir a composiciones para alimento o comida para animales que contienen cantidades elevadas de arabinogalactanos o galactanos, por ejemplo alimento o comida que contiene material vegetal a partir de semilla de soja, semilla de colza, altramuz y similares. Cuando la pectato liasa se añade al alimento o comida aumenta de forma significativa la descomposición in vivo del material de la pared de célula vegetal, por lo que se consigue un mejor uso de los nutrientes de la planta por el animal (por ejemplo, ser humano). En un aspecto, la tasa de crecimiento y/o proporción de conversión del alimento (es decir, el peso del alimento ingerido con respecto al aumento de peso) del animal aumenta. Por ejemplo el galactano que no se puede digerir se degrada con la pectato liasa, por ejemplo en combinación con beta-galactosidasa, en galactosa o galactooligómeros. Estos productos de

55 digestión enzimática son más digeribles por el animal. Por lo tanto, pueden contribuir a la energía disponible del alimento. Además, mediante la degradación del galactano, la pectato liasa puede aumentar la capacidad de digestión y absorción de los componentes del alimento que no son carbohidrato tales como proteína, grasa y minerales.

En otro aspecto, la pectato liasa se puede proporcionar mediante la expresión de las enzimas directamente en cultivos de alimentos transgénicos (como por ejemplo, plantas transgénicas, semillas y similares), tales como maíz, semilla de soja, semilla de colza, altramuz y similares. Como se ha analizado anteriormente, esto proporciona plantas transgénicas, partes de plantas y células vegetales que comprenden secuencias de ácidos nucleicos que codifican un polipéptido de la divulgación. En un aspecto, el ácido nucleico se expresa de modo que la pectato liasa 65 se produce en cantidades recuperables. Las pectato liasas se pueden recuperar de cualquier planta o parte de planta. Como alternativa, la planta o parte de planta que contiene el polipéptido recombinante se puede usar como

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tal para aumentar la calidad de un alimento o comida, por ejemplo, aumentando el valor nutricional, sabor, y propiedades reológicas, o para destruir un factor antinutritivo.

Tratamiento de papel o pasta

5 Las pectato liasas se pueden encontrar en el tratamiento de papel o pasta o eliminación de tinta del papel. Por ejemplo, un proceso de tratamiento de papel utiliza las pectato liasas de la divulgación. En un aspecto, las pectato liasas se pueden usar para modificar pectina y/o ácido poligalacturónico, tal como ácido alfa-D-galacturónico unido en la posición 1,4. En otro aspecto, los componentes del papel de papel fotocopiado reciclado durante procesos de eliminación de tinta químicos y enzimáticos. En un aspecto, las pectato liasas se pueden usar en combinación con celulasas. El papel se puede tratar mediante los siguientes tres procesos: 1) disgregación en presencia de las pectato liasas, 2) disgregación con un agente químico de eliminación de tinta y pectato liasas, y/o 3) disgregación después de empapar con las pectato liasas. El papel reciclado tratado con las pectato liasas puede tener un brillo más elevado debido a la eliminación de partículas de tóner en comparación con el papel tratado solamente con

15 celulasa. El efecto de las pectato liasas se puede deber a su comportamiento como agentes de superficie activa en suspensión de pasta.

Los métodos para el tratamiento de papel y pasta de papel utilizan una o más pectato liasas de la divulgación. Las pectato liasas se pueden usar en cualquier método de tratamiento de papel o pasta, que se conocen bien en la técnica, véase, por ejemplo, el documento de Patente de Estados Unidos Nº 6.241.849; 6.066.233; 5.582.681. Por ejemplo, un método para eliminar la tinta y decolorar un papel impreso que contiene colorantes, comprende la preparación de pasta de un papel impreso para obtener una suspensión de pasta, y retirar una tinta de la suspensión de pasta en presencia de las pectato liasas (también se pueden añadir otras enzimas). En otro aspecto, un método para aumentar la liberación de la pasta, por ejemplo, pasta preparada a partir de fibra secundaria, es mediante la

25 adición de una mezcla enzimática que comprende las pectato liasas (también puede incluir otras enzimas, por ejemplo, las enzimas celulasa, amilasa o glucoamilasa) a la pasta y para el tratamiento en condiciones que provocan una reacción para producir una pasta tratada de forma enzimática. La liberación de la pasta tratada de forma enzimática aumenta desde la liberación inicial de la pasta de fibras secundarias sin una pérdida del brillo.

Repulpado: tratamiento de materiales lignocelulósicos

Un método para el tratamiento de fibras lignocelulósicas, utiliza las pectato liasas de la divulgación, en una cantidad que es eficaz para la mejora de las propiedades de la fibra. Las pectato liasas también se pueden usar en la producción de materiales lignocelulósicos, tales como pasta, papel y cartón, a partir de papel usado reforzado con

35 almidón y cartón, especialmente cuando el repulpado se produce a pH superior a 7 y en el que pectato liasas pueden facilitar la disgregación del material de desecho a través de la degradación de las paredes celulares. Las pectato liasas pueden ser útiles en un proceso para producir una pasta de fabricación de papel a partir de papel impreso revestido con almidón. El proceso se puede realizar como se describe, por ejemplo, en el documento WO 95/14807.

Un proceso a modo de ejemplo comprende la disgregación del papel para producir una pasta, mediante el tratamiento con una enzima que degrada pectina antes, durante o después de la disgregación, y separando las partículas de tinta de la pasta después de la disgregación y el tratamiento enzimático. Véase también el documento de Patente de Estados Unidos Nº 6.309.871 y otros documentos de patente de Estados Unidos mencionados en el

45 presente documento. Por lo tanto, esto incluye un método para eliminación enzimática de tinta de la pasta de papel reciclado, en el que las pectato liasas se aplican en una cantidad que es eficaz para la eliminación de tinta de la superficie de la fibra.

Tratamiento de residuos

Las pectato liasas se pueden usar en una diversidad de otras aplicaciones industriales, por ejemplo, en el tratamiento de residuos. Por ejemplo, un proceso de digestión de residuos sólidos utiliza las pectato liasas de la divulgación. Los métodos pueden comprender la reducción de la masa y el volumen de los residuos sólidos básicamente sin tratar. Los residuos sólidos se pueden tratar con un proceso digestivo enzimático en presencia de 55 una solución enzimática (incluyendo las pectato liasas) a una temperatura controlada. Esto da como resultado una reacción sin fermentación bacteriana apreciable a partir de microorganismos añadidos. El residuo sólido se convierte en un residuo licuado y cualquier residuo sólido residual. El residuo licuado resultante se puede separar de cualquier residuo solidificado residual mencionado. Véase, por ejemplo, el documento de Patente de Estados Unidos Nº

5.709.796.

Productos para el cuidado oral

Los productos para el cuidado oral pueden comprender pectato liasas de la divulgación. Los productos para el cuidado oral a modo de ejemplo incluyen pastas dentífricas, cremas dentales, geles o polvos para dientes, agentes

65 odónticos, enjuagues bucales, formulaciones de aclarado para antes o después del cepillado, gomas de mascar, pastillas para chupar, o caramelos. Véase, por ejemplo, el documento de Patente de Estados Unidos Nº 6.264.925.

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Fabricación de cerveza y fermentación

Los métodos de fabricación de cerveza (por ejemplo, fermentación) pueden comprender las pectato liasas de la

5 divulgación. En un proceso a modo de ejemplo, las materias primas que contienen almidón se desintegran y se procesan para formar una malta. La pectato liasa se usa en cualquier punto en el proceso de fermentación. Por ejemplo, las pectato liasas se pueden usar en el procesamiento de malta de cebada. La materia prima principal de la fabricación de cerveza es la malta de cebada. Se puede tratar de un proceso de tres etapas. En primer lugar, el grano de cebada se puede impregnar para aumentar el contenido de agua, por ejemplo, hasta aproximadamente un

10 40 %. En segundo lugar, el grano se puede germinar mediante incubación de 15 ºC a 25 ºC de 3 a 6 días cuando la síntesis enzimática se estimula bajo el control de giberelinas. En un aspecto, las pectato liasas se añaden en esta etapa (o cualquier otra) del proceso. La acción de las pectato liasas da como resultado un aumento de azúcares de reducción fermentables. Esto se puede expresar como la potencia diastática, DP, que puede aumentar de aproximadamente 80 a 190 en 5 días a 12 ºC. Las pectato liasas se pueden usar en cualquier proceso de

15 producción de cerveza o bebida alcohólica, como se describe, por ejemplo, en los documentos de patente de Estados Unidos Nºs 5.762.991; 5.536.650; 5.405.624; 5.021.246; 4.788.066.

Otras aplicaciones industriales

20 La divulgación también proporciona un método para aumentar el flujo de fluidos de producción a partir de una formación subterránea retirando un fluido dañino, que contiene pectina, viscoso formado durante las operaciones de producción y que se encuentra dentro de la formación subterránea que rodea una perforación del pozo completada que comprende permitir a los fluidos de producción que fluyan desde la perforación del pozo; reducir el flujo de fluidos de producción desde la formación por debajo de caudales esperados; formular un tratamiento enzimático

25 mezclando en conjunto un fluido acuoso y un polipéptido de la divulgación; bombear el tratamiento enzimático a una ubicación deseada dentro de la perforación del pozo; permitir que el tratamiento enzimático degrade el fluido dañino, que contiene pectina, viscoso, mediante el cual el fluido se puede retirar de la formación subterránea a la superficie del pozo; y en el que el tratamiento enzimático es eficaz para atacar la pectina en paredes celulares.

30 La invención se describirá adicionalmente con referencia a los siguientes ejemplos; sin embargo, se debe entender que la invención no se limita a tales ejemplos.

Ejemplos

35 EJEMPLO 1: Ensayos de actividad de pectato liasa

El siguiente ejemplo describe ensayos de actividad de pectato liasa a modo de ejemplo para determinar la actividad catalítica de una pectato liasa. Estos ensayos a modo de ejemplo se pueden usar para determinar si un polipéptido está dentro del alcance de la invención.

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Ensayo de viscosidad de la unidad APSU

Unidades APSU: El ensayo de la unidad APSU es una medida de viscosidad que usa el ácido poligalacturónico sustrato sin calcio añadido.

45 La sal sódica del ácido poligalacturónico al 5 % sustrato (Sigma P-1879) se solubiliza en tampón de glicina 0,1 M a pH 10. Los 4 ml de sustrato se incuban previamente durante 5 min a 40 ºC. La enzima se añade (en un volumen de 250 µl) y se mezcla durante 10 segundos en una mezcladora a velocidad máxima, a continuación se incuba durante 20 min a 40 ºC. Para una determinación doble de una curva estándar de una dilución de concentración de enzima en

50 el intervalo de 5 APSU/ml hasta superior a 100 APSU/ml con un mínimo de 4 concentraciones entre 10 y 60 APSU por ml. La viscosidad se puede medir usando un MIVI600™ (Sofraser, Villemandeur, Francia). La viscosidad se puede medir como mV después de 10 segundos. El programa Prism PRISM™ de GRAFPAD, que usa un ajuste no lineal con una desintegración exponencial de una fase con una meseta, se puede usar para los cálculos. La meseta más el lapso es el mV obtenido sin enzima. Véase, por ejemplo, la Patente de Estados Unidos Nº 6.368.843.

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Ensayo de beta-eliminación

Un ensayo de liasa a modo de ejemplo (a 235 nm) para la determinación de la actividad de beta-eliminación mide aumentos en la absorbancia a 235 nm. La sal sódica del ácido poligalacturónico al 0,1 % sustrato (Sigma P-1879) se 60 solubiliza en tampón de glicina 0,1 M a pH 10. Para el cálculo de la tasa catalítica, un aumento de 5,2 de absorbancia a 235 unidades por min corresponde a la formación de 1 µmol de producto insaturado (véase, por ejemplo, Nasuna (1966) J. Biol. Chem. 241: 5298-5306; Bartling (1995) Microbiology 141: 873-881). La condición en el estado estacionario se mide usando una cubeta de 0,5 ml con una trayectoria de la luz de 1 cm en un espectrofotómetro de matriz de diodo HP en un soporte de cubeta con temperatura controlada con la medida 65 continua de la absorbancia a 235 nm. Para el estado estacionario, se puede usar un aumento lineal durante al

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Ensayo de Agar

5 La actividad de pectato liasa se puede medir mediante un ensayo de agar. Una solución de ensayo se aplica a agujeros de 4 mm perforados en placas de agar (por ejemplo, LB agar), que contienen poligalacturonato sódico al 0,7 % en p/v (Sigma P 1879). A continuación, las placas se incuban durante 6 h a una temperatura en particular (por ejemplo, 75 ºC.). A continuación, las placas se empapan en cualquiera de (i) CaCl2 1 M durante 0,5 h o (ii) Br de

10 alquil trimetilamonio mixto al 1 % (MTAB, Sigma M-7635) durante 1 h. Ambos procedimientos provocan la precipitación del poligalacturonato dentro del agar. La actividad de pectato liasa se puede detectar mediante la aparición de zonas trasparentes dentro de un fondo de poligalacturonato precipitado. La sensibilidad del ensayo se calibra usando dilución de una preparación estándar de pectato liasa.

15 Análisis del Punto Final --Trans-eliminación a 235 nm para Pectato Liasas (Método de Calcio Elevado: Calcio 1 mM en la Mezcla de Incubación Final). En este método, el sustrato y la enzima se incuban durante 20 min a 37 ºC seguido de la medida a 235 nm de la formación de uniones dobles. Por último, la tasa de la degradación se calcula basándose en el coeficiente de extinción molar en términos de Unidades Trans.

20 Procedimiento: Mezcla de 0,5 ml de dilución enzimática con 0,5 ml de solución de sustrato. Sustrato: Ácido poligalacturónico de Sigma P-1879, lote 77H3784, Tampón 2x de Glicina 0,1 M a pH 10+, 2,0 mmol de CaCl2, Reactivo de parada: H3PO4 0,02 M, Temperatura de incubación 37 ºC, Tiempo de reacción 20 min. Coeficiente de extinción de la trans-eliminación 0,0052 µmol cm-1. Enzima diluida en agua libre de iones de 0,5 a 5 APSU por ml. Valor principal por duplicado de 0,5 ml. El sustrato al 2 % en p/v en tampón 2x se mezcla con 0,5 ml de enzima

25 diluida. Ambos se incuban previamente durante 5 min en un baño de agua a 37 ºC. Incubar durante 20 min. Detener usando 5 ml de reactivo de parada y mezclar. Blanco mezclar la enzima y el reactivo de parada primero y a continuación añadir el sustrato, todo en el mismo volumen.

Enzima 0,5 ml

Sustrato 0,5 ml

Parada 5 ml

Volumen Total 6 ml

30 Medir la absorbancia a 235 nm en una cubeta de 1 cm. Calcular la formación de la trans-eliminación por min usando el coeficiente de extinción de 0,0052 µmol cm-1. Véase, por ejemplo, la Patente de Estados Unidos Nº 6.368.843.

EJEMPLO 2: Ensayo de Aplicación de Bio-Limpieza en Algodón

35 El siguiente ejemplo describe un Ensayo de Aplicación de Limpieza en Algodón a modo de ejemplo usando las enzimas pectato liasa de la invención. El uso de las pectato liasas de la invención para hidrolizar la pectina de la pared celular primaria ("biolimpieza") puede eliminar la necesidad de agentes cáusticos y temperaturas elevadas en la limpieza de fibra de algodón.

40 Preparación de los Materiales:

•: Requiere tampón de Bicarbonato Sódico 50 mM a pH óptimo

•: Dilución a 1:10 del tensioactivo Calloway 1663

•: Tampón fosfato 50 mM a pH 6

45 Mezclar 43,3 ml de Na-P monobásico 1,0 M, 6,6 ml de Na-P dibásico 1,0 M, ajustar el volumen a 1 l con agua D.I. Ajustar el pH a 6

• Rojo de Rutenio (R-2751 SIGMA) Añadir 0,5 g de Rojo de Rutenio a 1 l de Tampón Fosfato produciendo una concentración final de 0,05 %.

• NaOAc (5 g/l a pH 5) 50 • Tejido de algodón 400R (Testfabrics Inc.) al que se le quita el apresto antes de la limpieza

Procedimiento de Limpieza:

1. Colocar 1,0 g de tejido de algodón sin apresto (en cada vaso de precipitados Labomat).

: 55 2. Cada experimento debería usar un algodón sin tratar, como blanco (sin enzimas añadidas).

3.: Añadir 50 ml de tampón de Bicarbonato Sódico 50 mM a pH 8,5-9 a cada vaso de precipitados y 2,5 ml de dilución a 1:10 de Tensioactivo Calloway 1663.

4.: Ajustar las tapas usando una llave Allen e instalar los vasos de precipitados en el Labomat, asegurándose de que los vasos de precipitados se distribuyen de manera uniforme en la rejilla giratoria. Conectar el vaso de precipitados 1 con el cable detector de temperatura al conector en la parte media de la rejilla.

5.: Elevar la temperatura hasta la temperatura deseada y mantener durante 10 minutos.

: 5 6. Añadir 50-200 ul de enzima (por ejemplo, una pectato liasa de la invención) a una concentración diluida previamente a 0,1 ug/ul a través del tabique de separación en el vaso de precipitados usando una jeringa. La concentración enzimática total usada para limpiar 1 gramo de tejido de algodón puede estar entre 5-20 ug.

7.: Realizar la reacción en el Labomat a temperatura durante 15 minutos.

8.: Aclarar el tejido de algodón dos veces poniendo el tejido de algodón en la mano y apretando el algodón seco, colocar el algodón de nuevo en el vaso de precipitados y rellenar el vaso de precipitados con agua D.I. y repetir esta etapa de nuevo, acabar escurriendo el exceso de agua del algodón.

9.: Empapar el tejido de algodón en NaOAc (5 g/l de pH 5) durante 2 minutos.

10.: Repetir el ciclo de aclarado 2X en la etapa 8.

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11. Colocar el tejido de algodón en bandejas de pesada y permitir que el tejido se seque durante una noche en 15 las biocampanas de flujo laminar.

Procedimiento de Teñido:

1.: Colocar el tejido de algodón tratado en los vasos de precipitados Labomat.

2.: Añadir 100 ml de Rojo de Rutenio al 0,05 %, tampón de Na-P a pH 6 a cada vaso de precipitados.

3.: Ajustar las tapas usando una llave Allen e instalar los vasos de precipitados en el Labomat asegurándose de que los vasos de precipitados se distribuyen de manera uniforme en la rejilla giratoria. Conectar el vaso de precipitados 1 con el cable detector de temperatura al conector en la parte media de la rejilla.

4.: Elevar la temperatura hasta 50 ºC y mantener durante 30 minutos.

25 5. Aclarar el tejido dos veces poniendo el algodón en la mano y apretando el algodón seco, colocar el tejido de nuevo en el vaso de precipitados y rellenar el vaso de precipitados con agua D.I. y repetir esta etapa de nuevo, acabando con la retirada del exceso de agua del tejido.

6.: Colocar el tejido teñido en el vaso de precipitados y añadir 100 ml de agua D.I.

7.: Ajustar las tapas usando una llave Allen e instalar los vasos de precipitados en el Labomat asegurándose de que los vasos de precipitados se distribuyen de manera uniforme en la rejilla giratoria.

8.: Elevar la temperatura a 100 ºC y mantener durante 10 minutos; enfriar los vasos de precipitados hasta 60 ºC.

9.: Repetir el ciclo de aclarado 2X en la etapa 5.

10.: Colocar el tejido teñido en bandejas de pesada y permitir que el tejido se seque durante una noche en las

biocampanas de flujo laminar. 35

Cuantificación de la Limpieza Enzimática:

1.: Calibrar el GretagMacbeth Color Eye 7000A seleccionando el Icono de Color Eye en el escritorio del ordenador.

2.: Colocar la lente de color negro sobre el orificio y pulsar enter cuando el programa solicite la calibración del umbral negativo.

3.: Colocar el filtro de color blanco sobre el edificio y pulsar enter cuando el programa solicite la calibración del equilibrio de color blanco.

4.: Colocar el tejido teñido seco sobre el orificio y pulsar F4 para leer la blancura del tejido.

45 5. Registrar el número L*, dar la vuelta al tejido para leer el otro lado y registrar el número L*. Calcular el número medio L* para cada muestra.

6. Hacer el gráfico del L delta para cada muestra de algodón limpiada restando el número L* de las muestras con el L* del tejido sin tratar.

EJEMPLO 3: Un proceso de un solo baño para retirar el apresto y limpieza

El siguiente ejemplo describe un proceso de un solo baño a modo de ejemplo para retirar el apresto y limpieza. La invención proporciona métodos y composiciones para retirar el apresto, limpiar y blanquear los materiales celulósicos poniendo en contacto los materiales celulósicos de forma simultánea o secuencial en un proceso de un

55 solo baño con un sistema enzimático que comprende una pectato liasa de la invención. El proceso de un solo baño puede comprender adicionalmente un sistema de blanqueado que comprende peróxido de hidrógeno o al menos un compuesto peroxi que genera peróxido de hidrógeno cuando se disuelve en agua, o combinaciones de los mismos, y al menos un activador del blanqueado.

Los materiales celulósicos incluyen fibras en bruto, hilo, o textiles tejidos o de punto, hechos de algodón, hilo de lino, fibra de lino, ramio, rayón, cáñamo, yute, o mezclas de estas fibras entre sí o con otras fibras naturales o sintéticas, se pueden tratar mediante este proceso de un solo baño de la invención. En un aspecto, un peso de tejido se carga en un recipiente, que se rellena posteriormente con una solución tampón (por ejemplo, tampón de fosfato Na 20 mM, pH 9,2) que comprende una pectato liasa de la invención (por ejemplo, 3000 APSU/kg por fibra de pectato liasa), 65 agente humectante (por ejemplo, 0,5 g/l), H2O2 (por ejemplo, 1,7 g/l) y agente estabilizante (por ejemplo, 0,75 g/l). El tejido se puede tratar, por ejemplo, a 55 ºC durante aproximadamente 15 min, tras lo que la temperatura se elevó de

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5 ºC/min a 70 ºC durante 1 h. A continuación, el tejido se lava minuciosamente con agua para retirar los agentes químicos residuales y se seca a temperatura ambiente durante una noche.

EJEMPLO 4: Ensayo para detectar enzimas termotolerantes

5 El siguiente ejemplo describe un ensayo a modo de ejemplo para detectar enzimas termotolerantes que se puede usar para determinar si una enzima está dentro del alcance de la invención. Este ejemplo describe un ensayo de identificación sistemática basada en la absorbancia ("descubrimiento) para detectar enzimas termotolerantes, que, en un aspecto, se pueden caracterizar como "mutantes positivos" para un gen de pectato liasa "precursora". Este protocolo a modo de ejemplo se puede usar para variantes, o mutantes, generados por mediante cualquiera de los métodos de GSSM™ o combinatorios.

Materiales y preparaciones

15 a. Ácido Poligalacturónico (PGA), y [Sigma P-3889] al 2 %

b.: Placas de Fondo Plano de 96 Pocillos (resistentes a) UV [Thomson Instrument 931801B]

c.: Placas de 96 Pocillos COSTAR

d.: Sellados de Papel de Aluminio para PCR Adhesivos [Marsh AB-0626]

e.: B-PER [PIERCE 78248]

f.: LBamp100 o LBcarb100

g.: TRIS a pH 8,0 (250 mM, 10X)

h.: Glicina (250 mM, 10X)

i.: Sustrato de Ácido Poligalacturónico al 0,2 % para detección de la actividad enzimática: 100 ml de cada uno de los siguientes: 10X Tris, 10X Glicina, y PGA al 2 %, más 700 ml de agua sagrada.

25 j. Placas: alícuotas de 200 µl de medio, LBamp100 o LBcarb100, en los pocillos tanto de las placas COSTAR como de las de fondo plano de 96 pocillos resistentes a UV.

Selección de colonias y replicación de placas

Colonias de clones GSSM™ o mutantes combinatorias se seleccionaron con un seleccionador de colonias Autogen (Framingham, MA) y la células se inocularon en medio Lamp100. Un total de 168 clones GSSM™ se identificaron sistemáticamente por sitio de residuo o se identificaron sistemáticamente 13.000 clones de la biblioteca combinatoria 2328. Los clones mutados se seleccionaron en las filas A, B, C, E, F, G, y H de la placa de 96 pocillos. Los clones de tipo silvestre (wt) (SEC ID Nº: 132, codificados por la SEC ID Nº: 131) se seleccionaron en la fila D como un control.

35 Después de finalizar la selección de las colonias, las placas se incubaron durante una noche (aproximadamente 18 horas) a 37 ºC, agitando a 150 RPM. A partir de este momento se hará referencia a estas placas como las placas madre.

Se prepararon copias de cada placa madre en placas resistentes a UV (ahora denominadas "placas de ensayo") usando el replicador de placas automatizado. Una vez que la replicación fue completa, las placas de ensayo se colocaron en una incubadora humidificada a 30 ºC durante una noche.

Ensayo Primario

45 Las densidades celulares en cada pocillo de todas las placas se determinaron a DO600 usando un sistema SPECTRAMAX™ (Molecular Devices Corporation, Sunnyvale CA). A continuación, todas las placas de ensayo se sellaron con Sellos de Papel de Aluminio para PCR y a continuación se centrifugaron a 2200 rpm en una centrifugadora Eppendorf durante 10 minutos. Usando el sistema PowerWasher, el sobrenadante se aspiró a continuación fuera de las placas de ensayo dejando solamente las células. A continuación se añadieron 20 µl de B-PER™ (Pierce Biotechnology, Rockford, IL) a cada pocillo y las placas de ensayo se volvieron a sellar. A continuación, las placas se colocaron en un agitador de placas durante 10 minutos con el fin de garantizar la lisis celular apropiada. A continuación, las placas se colocaron en una incubadora calentada previamente a 50 ºC durante 50 minutos para el ensayo GSSM™ o a 70 ºC durante 25 minutos para el ensayo de mutante positivo combinatorio. A continuación, las placas de ensayo se retiraron de la incubadora después del tiempo de estimulación

55 por calor apropiado y se enfriaron rápidamente a temperatura ambiente. El SPECTRAMAX™ se usó para leer la cinética a la longitud de onda de 235 nm durante un periodo de 2 minutos. Cualquier supuesto acierto que se realizaba mejor que el de tipo silvestre se liberaba para un ensayo secundario. La Figura 8 ilustra un residuo con múltiples aciertos positivos. En la Figura 8, la Fila D contiene la actividad residual del tipo silvestre (wt), SEC ID Nº: 132, y las filas A, B, C, E, F, G, H son los clones GSSM™ del sitio de mutación 182.

Ensayo Secundario

Se identificaron todos los pocillos que presentaban un aumento de la tasa enzimática en comparación con el rendimiento de tipo silvestre y los clones de la respectiva placa madre se liberaron. Usando técnicas a sépticas, se 65 usó un palillo estéril en el pocillo de un supuesto acierto de la placa madre. Las células que se adhieren al palillo se transfirieron a una nueva placa seleccionando un nuevo pocillo con 200 µl de LBamp100. Además, del mismo modo,

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la fila D se llenó con WT de cada placa liderada. Las placas madres secundarias se colocaron en la incubadora humidificada a 30 ºC durante una noche. Las placas madres secundarias se manipularon con un alfiler en placas de 96 pocillos resistentes UV. Las placas de ensayo secundarias se colocaron a continuación en una incubadora humidificada a 30 ºC durante una noche. Las densidades celulares en cada pocillo de todas las placas se

5 determinaron a DO600 usando los sistemas SpectraMax. A continuación, todas las placas de ensayos se sellaron con Sellos de Papel de Aluminio para PCR y a continuación se centrifugaron a 2200 rpm en una centrifugadora Eppendorf durante 10 minutos. Las etapas restantes del ensayo secundario fueron las mismas que se indican para el ensayo primario. Cualquier acierto confirmado con un rendimiento mejor que el del tipo silvestre se separó y se sometió a ensayo de nuevo en el ensayo terciario.

Ensayo Terciario

Se tomaron alícuotas de 5 µl de cultivo de pocillos que confirmaban un aumento de la actividad de termotolerancia a partir del clon de tipo silvestre en una placa de Petri LBcarb100 pequeña para preparar placas sembradas en estrías.

15 También se usaron 5 µl de uno de los pocillos de control de "tipo silvestre" (wt) (SEC ID Nº: 132, codificada por la SEC ID Nº: 131) para preparar una placa sembrada en estrías. Las placas sembradas en estrías se incubaron a 37 ºC durante una noche. Se raspó una pequeña sección de una colonia individual y se inocularon 5 ml de LBcarb100 a las células. Se permitió que el cultivo creciera durante una noche a 37 ºC a 200 RPM. El acierto confirmado se diluyó a continuación hasta DO600 = 0,2. Se tomaron alícuotas de 200 µl de un clon confirmado en un pocillo, rellenando una fila entera en la placa resistente a UV de 96 pocillos. Lo mismo se realizó para un control de wt. A continuación, todas las placas se sellaron y se centrifugaron a 2000 rpm en la centrifugadora Eppendorf durante 10 minutos. Las etapas restantes del ensayo terciario fueron las mismas que las que se indican para el ensayo primario. Al final, todos los aciertos supuestos con un rendimiento mejor que el del tipo silvestre se enviaron para secuenciación. También se prepararon reservas de glicerol.

25 EJEMPLO 5: Procesos y formulaciones para enzimas de la invención

El siguiente ejemplo describe procesos a modo de ejemplo (por ejemplo, un proceso de biolimpieza) y formulaciones de la invención. Las composiciones y procesos se sometieron a ensayo usando la pectato liasa que tiene una secuencia como se establece en la SEC ID Nº: 134, codificada, por ejemplo, por la SEC ID Nº: 133 ("SEC ID Nº: 134").

Definición de unidad:

35 La actividad de pectato liasa (SEC ID Nº: 78) se midió de forma rutinaria usando ácido poligalacturónico al 0,2 % (p/v) (Sigma, P3850) en Tris HCl 25 mM – tampón de Glicina NaOH 25 mM. Una unidad de actividad enzimática se definió como la cantidad de proteína que producía 1 µmol de oligogalacturónidos insaturados por minuto equivalente a 1 µmol de digalacturónido insaturado, usando el valor del coeficiente de extinción molecular de 4600 M-1 cm -1 a 235 nm para el dímero.

El aparato SpectraMax se usó en placas de UV de 96 pocillos.

Potencia de la formulación:

45 Las enzimas de la invención se pueden formular en cualquier dosificación para ajustarse a una necesidad en particular; en la técnica se conocen ensayos para determinar la dosificación óptima de cualquier formulación en particular, y varios se describen en el presente documento. En aspectos alternativos, las formulaciones de la invención pueden tener una potencia baja entre aproximadamente 2000 y 4000 u/ml (en las que u = unidad). Esto es comparable con los otros productos que hay en el mercado. En un aspecto, la formulación mínima es de aproximadamente 1000 u/ml, y, en otro aspecto, la formulación máxima es de aproximadamente 10.000 u/ml, por ejemplo, la formulación puede comprender una enzima de la invención en una cantidad entre aproximadamente 1000 u/ml y 10.000 u/ml.

Los estudios de solubilidad con producto liofilizado (SEC ID Nº: 134) resuspendido en agua indicaban que la

55 solubilidad de la enzima puede ser tan elevada como 25000 u/ml a 4 ºC. Por lo tanto, en un aspecto, la invención proporciona formulaciones que tienen un nivel tan elevado como aproximadamente 25000 u/ml, o superior. En un aspecto la invención proporciona formulaciones que comprenden una enzima de la invención en una cantidad entre aproximadamente 100 u/ml y 25000 u/ml, 30000 u/ml, 35000 u/ml o 40000 u/ml, o superior.

Diseño de la formulación:

La invención proporciona formulaciones que comprenden al menos una enzima de la invención, y, en aspectos alternativos, comprende adicionalmente cualquier aditivo o aditivos. Las formulaciones de la invención se pueden basar en aditivos conocidos en otras formulaciones enzimáticas, por ejemplo, análogas. Por ejemplo, las 65 formulaciones de la invención pueden comprender los aditivos y/o condiciones que se exponen en las Tablas 3, 4, 5 y 6, que siguen a continuación, o cualquier variación de las mismas. Por ejemplo, las formulaciones de la invención

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pueden comprender glicerol, sacarosa, cloruro sódico, dextrina, propilenglicol, sorbitol, sulfato sódico o TRIS, o un equivalente. En un aspecto, una formulación de la invención puede ser una formulación basada en agua, o, una formulación

5 basada en aceite. Se realizaron dos fases de estudios de estabilidad de la formulación; estos estudios usaron la enzima a modo de ejemplo de la SEC ID Nº: 134.

10 Estudio de estabilidad acelerada a 37 ºC Nota: se trata de formulaciones basadas en tampón.

• Identificar sistemáticamente diversos aditivos 15 • Someter a ensayo diferentes valores de pH

•: Formulaciones a aproximadamente 2000 u/ml.

•: La SEC ID Nº: 78 fue la enzima a modo de ejemplo sometida a ensayo Tabla 3 (SN = número de muestra)

SN: pH Glicerol Sacarosa Cloruro sódico Dextrina Propilen glicol sorbitol Sulfato sódico Conc. Eficaz de TRIS

1: 5 40 mM

2: 6 40 mM

3: 7 40 mM

4: 8 40 mM

5: 7,5 35 % 20 mM

6: 7,5 50 % 20 mM

7: 7,5 35 % 20 mM

8: 7,5 20 % 20 mM

9: 7,5 10 % 20 mM

10: 7,5 30 % 20 mM

11: 7,5 100 mM 20 mM

12: 7,5 35 % 20 mM

13: 5,5 35 % 40 mM

14: 5,5 50 % 40 mM

20 Formulaciones con el mayor rendimiento (usando la SEC ID Nº: 134 como una enzima a modo de ejemplo de la invención) basadas en el aspecto físico y en la retención de actividad superior a un 80 %:

Tabla 4

Formulación Aditivo 1 pH 5,0, TRIS 40 mM 3 pH 7,0, TRIS 40 mM 4 pH 8,0, TRIS 40 mM 6 pH 7,5, glicerol al 50 % 8 pH 7,5, NaCl al 20 %

10 pH 7,5, propilenglicol al 30 % 11 pH 7,5, sulfato sódico 100 mM 13 pH 5,5, glicerol al 35 %

25 En aspectos alternativos, las formulaciones de la invención pueden tener aproximadamente 10.000 u/ml, o estar en una cantidad entre aproximadamente 100 u/ml, 200 u/ml, 300 u/ml, 400 u/ml o 500 u/ml y 10.000 u/ml, 15.000 u/ml,

20.000 u/ml, 25000 u/ml, 30000 u/ml, 35000 u/ml o 40000 u/ml, o superior. En aspectos alternativos, las

formulaciones de la invención pueden ser de aproximadamente 500 a 30.000 unidades/ml, de 1000 a 25.000 30 unidades/ml, o, entre aproximadamente 1000 y 20.000 unidades/ml, de 1000 a 15.000 unidades/ml, de 1000 a 10000 unidades/ml, de 1000 a 5000 unidades/ml, entre aproximadamente 2000 y 20000 unidades/ml, entre aproximadamente 2000 y 15000 unidades/ml, entre aproximadamente 2000 y 10000 unidades/ml, o entre aproximadamente 2000 y 4000 unidades/ml. En aspectos alternativos, las formulaciones de la invención pueden comprender una formulación basada en agua, por ejemplo, cuando no es factible ningún tampón; se puede usar cualquier sistema tampón basado en agua.

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Tabla 5: Se pueden usar tapones adicionales en una formulación de la invención: MOPS 20 mM, pH 7 o MOPS 25 mM, NaCl 50 mM, pH 7,5.

ESTUDIO EN FASE II ESTABILIDAD DE LA FORMULACIÓN DE PECTATO LIASA

No Formulación: pH Tampón ADITIVOS

1: pH 7,0 ND imagen78 imagen79 benzoato sódico al 0,1%, sorbato potásico al 0,1 %

2: pH 7,0 ND imagen80 imagen81 300 ppm de proxel

3: pH 7,0 ND cloruro sódico al 15% imagen82 benzoato sódico al 0,1%, sorbato potásico al 0,1 %

4: pH 7,0 ND cloruro sódico al 15% imagen83 300 ppm de proxel

5: pH 7,0 ND imagen84 glicerol 35% benzoato sódico al 0,1%, sorbato potásico al 0,1 %

6: pH 7,0 ND imagen85 glicerol 35% 300 ppm de proxel

7: pH 7,0 ND cloruro sódico al 10% glicerol 25% benzoato sódico al 0,1%, sorbato potásico al 0,1 %

8: pH 7,0 ND cloruro sódico al 10% glicerol 25% 300 ppm de proxel

9: pH 5,5 ND imagen86 imagen87 benzoato sódico al 0,1%, sorbato potásico al 0,1 %

10: pH 5,5 ND imagen88 300 ppm de proxel imagen89

11: pH 5,5 ND cloruro sódico al 15% imagen90 benzoato sódico al 0,1%, sorbato potásico al 0,1 %

12: pH 5,5 ND cloruro sódico al 15% imagen91 300 ppm de proxel

13: pH 5,5 ND imagen92 glicerol 35% benzoato sódico al 0,1%, sorbato potásico al 0,1 %

14: pH 5,5 ND imagen93 glicerol 35% 300 ppm de proxel

15: pH 5,5 ND cloruro sódico al 10% glicerol 25% benzoato sódico al 0,1%, sorbato potásico al 0,1 %

16: pH 5,5 ND cloruro sódico al 10% glicerol 25% 300 ppm de proxel

CONTROLES

17: pH 7,0 TRIS imagen94 glicerol 35% benzoato sódico al 0,1%, sorbato potásico al 0,1 %

18: pH 5,5 TRIS imagen95 glicerol 35% benzoato sódico al 0,1%, sorbato potásico al 0,1 %

19: pH 7,0 Acetato imagen96 glicerol 35% benzoato sódico al 0,1%, sorbato potásico al 0,1 %

20: pH 5,5 Acetato imagen97 glicerol 35% benzoato sódico al 0,1%, sorbato potásico al 0,1 %

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Formulaciones con el mayor rendimiento (usando la SEC ID Nº: 134 como una enzima a modo de ejemplo de la invención) basadas en el aspecto físico y en la retención de actividad superior a un 80 %:

Tabla 6

Formulación Nº: Detalles

5: pH 7, glicerol al 35 %, benzoato sódico al 0,1 %, sorbato potásico al 0,1 %

6: pH 7, glicerol al 35 %, 300 ppm de proxel

7: pH 7, cloruro sódico al 10 %, glicerol al 25 %, benzoato sódico al 0,1 %, sorbato potásico al 0,1 %

8: pH 7, cloruro sódico al 10 %, glicerol al 25 %, 300 ppm de proxel

13: pH 5,5, glicerol al 35 %, benzoato sódico al 0,1 %, sorbato potásico al 0,1 %

14: pH 5,5, glicerol al 35 %, 300 ppm de proxel

15: pH 5,5, cloruro sódico al 10 %, glicerol al 25 %, benzoato sódico al 0,1 %, sorbato potásico al 0,1 %

20*: tampón acetato 20 mM, pH 5,5, glicerol al 35 %

10 Por ejemplo, la invención proporciona formulaciones que comprenden al menos una enzima de la invención y que comprenden un tampón (formulación) de: pH 7, glicerol al 35 %, benzoato sódico al 0,1 %, sorbato potásico al 0,1 %; pH 7, glicerol al 35 %, 300 ppm de proxel; pH 7, cloruro sódico al 10 %, glicerol al 25 %, benzoato sódico al 0,1 %, sorbato potásico al 0,1 %; pH 7, cloruro sódico al 10 %, glicerol al 25 %, 300 ppm de proxel; pH 5,5, glicerol al 35 %,

15 benzoato sódico al 0,1 %, sorbato potásico al 0,1 %; pH 5,5, glicerol al 35 %, 300 ppm de proxel; pH 5,5, cloruro sódico al 10 %, glicerol al 25 %, benzoato sódico al 0,1 %, sorbato potásico al 0,1 %; o, tampón acetato 20 mM, pH 5,5, glicerol al 35 %; MOPS 20 mM, pH 7 o MOPS 25 mM, NaCl 50 mM, pH 7,5; pH 5,0, TRIS 40 mM; pH 7,0, TRIS 40 mM; pH 8,0, TRIS 40 mM; pH 7,5, glicerol al 50 %; pH 7,5, NaCl al 20 %; pH 7,5, propilenglicol al 30 %; pH 7,5, sulfato sódico 100 mM; pH 5,5, glicerol al 35 %; o, cualquier combinación de los mismos, o, con equivalentes de los

20 mismos.

Aplicación de Biolimpieza a modo de Ejemplo

• En un aspecto, el pH es pH 8,5 (tampón de bicarbonato) 25 • Agente humectante no iónico (1 g/l) [por ejemplo: Apollowet NFW]

•: Proporción de agua madre en el baño en el baño enzimático: de 10:1 a 50:1 (l de agua madre:kg de tejido)

•: Dosis de enzima: 0,137 ml del extracto concentrado por kg de tejido

•: Intervalo de temperatura: entre aproximadamente 50 ºC y 70 ºC

•: Tiempo de tratamiento de aproximadamente 20 min

30 • Los agentes quelantes se deberían excluir del baño enzimático, y solamente se deberían añadir después de 20 minutos de tratamiento enzimático y mantener durante 10 minutos antes del baño de descarga.

Por lo tanto, la invención proporciona un proceso de biolimpieza que usa al menos una enzima de la invención que comprende al menos, varias o todas las siguientes etapas/limitaciones: el pH es pH 8,5, en tampón de bicarbonato,

35 que comprende un agente humectante no iónico (a, por ejemplo, 1 g/l), en la que la proporción de agua madre en el baño enzimático es de aproximadamente 10:1 a 50:1 (l de agua madre:kg de tejido), en la que la dosis enzimática está entre aproximadamente 0,1 y 0,2 ml, por ejemplo, a aproximadamente 0,137 ml del extracto concentrado por kg de tejido, a un intervalo de temperatura entre aproximadamente 50 ºC y 70 ºC; con un tiempo de tratamiento de aproximadamente 20 min; y, en un aspecto, comprende agentes quelantes, que se deberían excluir del baño

40 enzimático y solamente se debían añadir después de 20 minutos de tratamiento enzimático y mantener durante 10 minutos antes del baño de descarga.

La enzima de la SEC ID Nº: 134 funcionó bien en el intervalo de 5 a 25 gramos de enzima pura por tonelada de tejido tratado.

45

Claims

imagen1

REIVINDICACIONES

1. Un ácido nucleico aislado, sintético, o recombinante que comprende

5 (a) una secuencia de ácidos nucleicos como se establece en la SEC ID Nº: 99;

(b)

una secuencia de ácidos nucleicos que tiene una identidad de secuencia de al menos un 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, o mayor con la SEQ Nº: 99, donde el ácido nucleico codifica al menos un polipéptido que tiene una actividad de pectato liasa,

(c)

un ácido nucleico que se hibrida en condiciones de hibridación rigurosas con un ácido nucleico que comprende una secuencia como se establece en la SEC ID Nº: 99, donde las condiciones de hibridación rigurosas comprenden una etapa de lavado que comprende un lavado en 0,2X SSC a una temperatura de aproximadamente 65 ºC durante aproximadamente 15 minutos, y donde el ácido nucleico codifica al menos un polipéptido que tiene una actividad de pectato liasa;

(d) un ácido nucleico que codifica un polipéptido que tiene una secuencia como se establece en la SEC ID Nº: 15 100, donde el ácido nucleico codifica un polipéptido que tiene una actividad de pectato liasa;

(e)

la secuencia de ácidos nucleicos de (a), (b), (c) o (d) pero que carece de una secuencia de ácidos nucleicos que codifica una secuencia señal;

(f)

la secuencia de ácidos nucleicos de cualquiera de (a) a (e), que comprende además una secuencia de ácidos nucleicos que codifica un péptido o polipéptido heterólogo; o

(g)

una secuencia de ácidos nucleicos completamente complementaria a cualquiera de (a) a (f).
2. Un casete de expresión o un vector que comprende el ácido nucleico de la reivindicación 1.
3.

Una célula aislada o transformada que comprende (a) el ácido nucleico de la reivindicación 1 o (b) el casete de 25 expresión o vector de la reivindicación 2.
4.

Un método para producir un polipéptido recombinante que comprende las etapas de: (a) proporcionar un ácido nucleico de la reivindicación 1; y (b) expresar el ácido nucleico de la etapa (a) en condiciones que permitan la expresión del polipéptido, produciéndose de esta manera un polipéptido recombinante.
5.

Un animal no humano transgénico que comprende (a) el ácido nucleico de la reivindicación 1 o (b) el casete de expresión o vector de la reivindicación 2.
6.

Un polipéptido aislado, sintético o recombinante, que comprende: 35

(a)

una secuencia de aminoácidos como se establece en la SEC ID Nº: 100;

(b)

una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de secuencia de al menos un 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% con la SEQ Nº: 100, donde el polipéptido tiene una actividad de pectato liasa,

(c)

un polipéptido que tiene una actividad de pectato liasa codificado por el ácido nucleico de la reivindicación 1;

(d)

una secuencia de aminoácidos de (a), (b) o (c) que tiene una actividad de pectato liasa, y que tiene al menos una sustitución conservativa de restos de aminoácido que comprende sustituir un aminoácido por otro de características similares, donde todas las sustituciones son conservativas y el polipéptido retiene básicamente la actividad de pectato liasa;

45 (e) la secuencia de aminoácidos de cualquiera de (a) a (d), pero que carece de una secuencia señal;

(f)

la secuencia de aminoácidos de cualquiera de (a) a (e) que comprende además un péptido o polipéptido heterólogo; o

(g)

el polipéptido de cualquiera de (a) a (f), donde el polipéptido comprende al menos un sitio de glicosilación o está glicosilado.
7. Una composición que comprende un polipéptido como se establece en la reivindicación 6, donde la composición se selecciona de: una composición detergente, un alimento, una comida, una composición alimentaria, una composición de pienso, una fibra, hilo, material textil, tejido, papel, producto de papel, pasta de papel, pasta de madera y material celulósico.

55
8.

Un anticuerpo aislado o recombinante que se une específicamente a un polipéptido que consiste en la secuencia de aminoácidos como se establece en la SEC ID Nº: 100.
9.

Un método para hidrolizar, descomponer o alterar una composición que comprende pectina, pectato (ácido poligalacturónico), homogalacturonano, ramnogalacturonano o pared de célula vegetal, que comprende las siguientes etapas:

(a) proporcionar el polipéptido de la reivindicación 6, o un polipéptido codificado por el ácido nucleico de la reivindicación 1; 65 (b) proporcionar una composición que comprende una pectina, un pectato, un homogalacturonano, un

ramnogalacturonano o pared de célula vegetal; y 205

imagen2

(c) poner en contacto el polipéptido de la etapa (a) con la composición de la etapa (b) en condiciones en las que el polipéptido hidroliza, descompone o altera dicha composición.
10. Un método para licuar o retirar una composición que comprende una pectina, un pectato (ácido

5 poligalacturónico), un homogalacturonano o un ramnogalacturonano a partir de una composición, que comprende las siguientes etapas:

(a)

proporcionar el polipéptido de la reivindicación 6, o un polipéptido codificado por el ácido nucleico de la reivindicación 1;

(b)

proporcionar una composición que comprende una pectina, un pectato (ácido poligalacturónico), un homogalacturonano o un ramnogalacturonano; y

(c)

poner en contacto el polipéptido de la etapa (a) con la composición de la etapa (b) en condiciones en las que el polipéptido elimina o licúa la pectina, pectato (ácido poligalacturónico), homogalacturonano o un ramnogalacturonano.

15
11.

Una formulación para tratar un material con una pectato liasa que comprende un polipéptido de la reivindicación 6, o un polipéptido codificado por el ácido nucleico de la reivindicación 1, donde la formulación comprende una dosificación de pectato liasa comprendida entre aproximadamente 0,1 ml y aproximadamente 1 ml por kg de material.
12.

Un proceso de biolimpieza que comprende las siguientes etapas:

(a) proporcionar un polipéptido de la reivindicación 6, o un polipéptido codificado por el ácido nucleico de la reivindicación 1;

25 (b) proporcionar un material que comprende pectina, ácido poligalacturónico (pectato), homogalacturonano, ramnogalacturonano o pared de célula vegetal;

(c) poner en contacto la pectato liasa de (a) con el material de (b) en condiciones que comprenden

i) un pH entre aproximadamente 8,5 y aproximadamente 10,0, ii) un tampón bicarbonato, iii) un agente humectante no iónico a aproximadamente 1 g/l, iv) una relación de agua madre entre aproximadamente 10:1 y 50:1, en litro de agua madre:kg de material, v) una dosis entre aproximadamente 0,1 y aproximadamente 1 ml por kg de material, o equivalente, vi) un intervalo de temperatura entre aproximadamente 70 ºC y aproximadamente 95 ºC,

35 vii) un tiempo de tratamiento de aproximadamente 20 min, o

viii) una combinación de cualquiera de i) a vii); que comprende además el uso de un quelante, donde el quelante se excluye del baño enzimático y se añade después de aproximadamente 20 minutos de tratamiento enzimático y se mantiene durante aproximadamente 10 minutos antes del baño de descarga.
13. Un método para lavar un objeto que comprende:

(a) proporcionar un polipéptido de la reivindicación 6, o un polipéptido codificado por un ácido nucleico de la

reivindicación 1; 45 (b) proporcionar un objeto; y

(c) poner en contacto el polipéptido de la etapa (a) y el objeto de la etapa (b) en condiciones en las que la composición pueda lavar el objeto.
14. Un método para preparar un zumo, jarabe, puré o extracto de frutas o verduras que comprende las siguientes etapas:

(a)

proporcionar un polipéptido de la reivindicación 6, o un polipéptido codificado por un ácido nucleico de la reivindicación 1;

(b)

proporcionar una composición o un líquido que comprende material de frutas o verduras; y

55 (c) poner en contacto el polipéptido de la etapa (a) y la composición, preparando de esta manera el zumo, jarabe, puré o extracto de frutas o verduras.
15. Un método para tratar un papel, un producto de papel, una pasta de madera o un material celulósico, que comprende las siguientes etapas:

(a)

proporcionar un polipéptido de la reivindicación 6, o un polipéptido codificado por un ácido nucleico de la reivindicación 1;

(b)

proporcionar una composición que comprende un papel, un producto de papel, una pasta de madera o un material celulósico; y

65 (c) poner en contacto el polipéptido de la etapa (a) y la composición de la etapa (b) en condiciones en las que la pectato liasa pueda tratar el papel, producto de papel, pasta de papel, pasta de madera o material celulósico.

206

imagen3
16. Un método para mejorar la extracción de aceite a partir de un material vegetal rico en aceite, que comprende las siguientes etapas:

5 (a) proporcionar un polipéptido de la reivindicación 6, o un polipéptido codificado por un ácido nucleico de la reivindicación 1;

(b)

proporcionar un material vegetal rico en aceite; y

(c)

poner en contacto el polipéptido de la etapa (a) y el material vegetal rico en aceite.

10 17. Un método de limpieza de fibra, hilo, material textil, tejido o material celulósico que comprende las siguientes etapas:

(a) proporcionar un polipéptido de la reivindicación 6, o un polipéptido codificado por un ácido nucleico de la

reivindicación 1; 15 (b) proporcionar una fibra, un hilo, un material textil, un tejido o un material celulósico; y

(c) poner en contacto el polipéptido de la etapa (a) y la fibra, hilo, material textil, tejido o material celulósico de la etapa (b) en condiciones en las que la pectato liasa pueda limpiar la fibra, hilo, material textil, tejido o material celulósico.

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