CN112120012B - 一种car-t细胞冻存方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开一种CAR‑T细胞冻存方法，包括以下步骤：(1)泊洛沙姆配置成质量浓度1～2.5％的水溶液；将泊洛沙姆水溶液、DMSO与RPMI‑1640培养基混合，得混合培养液；(2)用步骤(1)的混合培养液悬浮CAR‑T细胞，细胞在0～2℃预冻15～30min；保温加入氯化钠、西兰花多糖和瓜儿豆蛋白，混合后将细胞悬液转入‑20～‑30℃放置30～50min，‑50～‑60℃放置2～5h，然后液氮冻存。本发明提供的CAR‑T细胞的冻存方法，采用阶梯型的冻存模式并同时结合合理的冻存液选择及冻存液使用方法，使得CAR‑T细胞冻存后细胞活率、增殖能力以及清除肿瘤细胞能力等均明显优于常规的冻存方法。

Description

一种CAR-T细胞冻存方法
技术领域
本发明涉及CAR-T细胞技术领域，具体涉及一种CAR-T细胞冻存方法。
背景技术
CAR-T细胞是将人工设计的外源性嵌合抗原受体(CAR)导入到T细胞内后得到的一种改造过的T细胞，这种T细胞具有特异性地结合肿瘤抗原的能力，经体外规模化增殖后，以适合的剂型回输至患者体内，即能发挥识别并清除肿瘤细胞的作用。近年来，CAR-T细胞因在白血病、淋巴瘤、多发性骨髓瘤等多种疾病中表现出积极且持续有效的治疗效果而成为当今肿瘤治疗药物研究领域中的主要热点之一。
提取-制备-扩增获得CAR-T细胞的时间较长，在获得CAR-T细胞后，容易因治疗因素发生变化导致不能及时使用新鲜制得的CAR-T细胞，因此CAR-T细胞通常会进行冻存。但CAR-T细胞作为一类特殊的免疫细胞，其贮存具有特殊性，不合理的贮藏方式不仅可能导致CAR-T细胞丧失其生物学效应，而且可能对受体产生危害。因此，如何使CAR-T细胞获得长期有效的保存是值得关注的问题。
发明内容
鉴于现有技术的不足，本发明提供一种CAR-T细胞冻存方法。
本发明方案包括以下方面：
一种CAR-T细胞冻存方法，包括以下步骤：
(1)泊洛沙姆配置成质量浓度1～2.5％的水溶液；将泊洛沙姆水溶液、DMSO与RPMI-1640培养基混合，得混合培养液；
(2)用步骤(1)的混合培养液悬浮CAR-T细胞，细胞在0～2℃预冻15～30min；保温加入氯化钠、西兰花多糖和瓜儿豆蛋白，混合后将细胞悬液转入-20～-30℃放置30～50min，-50～-60℃放置2～5h，然后液氮冻存。
优选的，CAR-T细胞在混合培养液中的密度是106～107个/mL。
优选的，所述泊洛沙姆为泊洛沙姆108。
优选的，泊洛沙姆水溶液、氯化钠、西兰花多糖、瓜儿豆蛋白、DMSO和RPMI-1640培养基的质量比为1～2:1～2:17～25:5～10:5～15：46～71。
另一方面，本发明提供一种CAR-T细胞冻存液，包括以下质量比的组份：泊洛沙姆水溶液、氯化钠、西兰花多糖、瓜儿豆蛋白、DMSO和RPMI-1640培养基的质量比为1～2:1～2:17～25:5～10:5～15：46～71。
优选的，所述的CAR-T细胞冻存液包括以下质量比的组份：泊洛沙姆水溶液、氯化钠、西兰花多糖、瓜儿豆蛋白、DMSO和RPMI-1640培养基的质量比为1:1:25:10:15:48。
本发明实施例中所使用的西兰花多糖是通过以下方法制得的：取西兰花干燥粉碎脱脂后，按料液比1:30～50mL加水，50～70℃超声提取1～2h，离心取上清，减压浓缩至体积减少70～85％，加入体积分数85～90％乙醇醇沉12～14h，抽滤，取固体干燥。
本发明实施例中所使用的瓜儿豆蛋白是通过以下方法制得的：取瓜儿豆粉碎脱脂，加0.01～0.02M氢氧化钠溶液提取，料液比1:30～50mL，25～30℃且80～100rpm搅拌1～2h，离心弃沉淀，加0.01～0.02M盐酸溶液25～30℃静置沉淀，料液比1:30～50mL，离心弃上清，水洗，干燥；按料液比1:30～50mL加水，25～30℃且80～100rpm搅拌1～2h，离心，取上清，干燥。
当然，本领域技术人员也可以将其他常规方法制得的或市售的西兰花多糖、瓜儿豆蛋白应用于本发明所述的冻存方法和冻存液中。
本发明另一方面还提供一种CAR-T细胞制剂，该制剂至少包括CAR-T和本发明所述的的细胞冻存液。
本发明所取得的有益效果：
冻存方法是影响细胞复苏后活性的重要因素，优异的冻存方法是保证CAR-T细胞复苏后活性及生物性能的关键。本发明提供的CAR-T细胞冻存方法，采用阶梯型的冻存模式并同时结合合理的冻存液选择及冻存液使用方法，使得CAR-T细胞冻存后，细胞活率、增殖能力以及清除肿瘤细胞能力等均明显优于常规的冻存方法。
本发明冻存过程中，未额外添加动物蛋白，极大的保证了CAR-T细胞使用的安全性问题。
本发明方法操作简便、成本低，有利于产业化推广使用。
具体实施方式
为了更好理解本发明技术内容，下面提供具体实施例，对本发明做进一步的说明。
本发明实施例所用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
本发明实施例所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1
一种CAR-T细胞冻存方法，包括以下步骤：
(1)泊洛沙姆108配置成质量浓度2.5％的水溶液；将泊洛沙姆水溶液、DMSO与RPMI-1640培养基混合，得混合培养液；
(2)用步骤(1)的混合培养液悬浮CAR-T细胞(密度是106个/mL)，细胞在2℃预冻30min；保温加入氯化钠、西兰花多糖和瓜儿豆蛋白，混合后将细胞悬液置于冻存袋中转入-30℃放置50min，-50℃放置5h，然后-196℃液氮冻存。
泊洛沙姆水溶液、氯化钠、西兰花多糖、瓜儿豆蛋白、DMSO和RPMI-1640培养基的质量比为1:2:25:10:5:57。
实施例2
一种CAR-T细胞冻存方法，包括以下步骤：
(1)泊洛沙姆108配置成质量浓度1％的水溶液；将泊洛沙姆水溶液、DMSO与RPMI-1640培养基混合，得混合培养液；
(2)用步骤(1)的混合培养液悬浮CAR-T细胞(密度是107个/mL)，细胞在0℃预冻15min；保温加入氯化钠、西兰花多糖和瓜儿豆蛋白，混合后将细胞悬液置于冻存袋中转入-20℃放置30min，-60℃放置2h，然后-196℃液氮冻存。
泊洛沙姆水溶液、氯化钠、西兰花多糖、瓜儿豆蛋白、DMSO和RPMI-1640培养基的质量比为1:2:25:10:5:57。
实施例3
本例与实施例1的区别是：
泊洛沙姆水溶液、氯化钠、西兰花多糖、瓜儿豆蛋白、DMSO和RPMI-1640培养基的质量比为1:1:25:10:15:48。
实施例4
本例与实施例1的区别是：
泊洛沙姆水溶液、氯化钠、西兰花多糖、瓜儿豆蛋白、DMSO和RPMI-1640培养基的质量比为2:1:17:5:15:60。
对比例1
本例与实施例1的区别是：
一种CAR-T细胞冻存方法，包括以下步骤：
(1)泊洛沙姆108配置成质量浓度2.5％的水溶液；将泊洛沙姆水溶液、DMSO与RPMI-1640培养基混合，得混合培养液；
(2)用步骤(1)的混合培养液悬浮CAR-T细胞(密度是106个/mL)，细胞在2℃预冻30min；保温加入氯化钠、西兰花多糖和瓜儿豆蛋白，混合后将细胞悬液置于冻存袋中转入-50℃放置5h，然后-196℃液氮冻存。
对比例2
本例与实施例1的区别是：
一种CAR-T细胞冻存方法，包括以下步骤：
(1)泊洛沙姆108配置成质量浓度2.5％的水溶液；将泊洛沙姆水溶液、氯化钠、西兰花多糖、瓜儿豆蛋白DMSO与RPMI-1640培养基混合，得混合培养液；
(2)用步骤(1)的混合培养液悬浮CAR-T细胞(密度是106个/mL)，将细胞悬液置于冻存袋中转入2℃预冻30min，-30℃放置50min，-50℃放置5h，然后-196℃液氮冻存。
对比例3
本例与实施例1的区别是：
西兰花多糖和瓜儿豆蛋白替换为胎牛血清。
实验例：
本发明中CAR-T细胞的制备、质量管理过程参照CMBA/T 004.1-2018《嵌合抗原受体修饰T细胞(CAR-T细胞)制剂制备质量管理规范标准》进行。CAR-T细胞的制备方法可参照现有技术，例如李鹏等的《CD19-CART治疗B细胞血液恶性肿瘤的临床前研究》。
1.实验方法：
取出实施例和对比例冻存2个月后的细胞，37℃快速解冻复苏。1200r/min离心10min，弃冻存液，用含体积分数10％胎牛血清的RPMI-1640培养基(Gibco公司)重悬细胞。
1.1细胞活率检测：
取单细胞悬浮液，稀释，0.4％台酚蓝操作液与单细胞悬液按1:9混匀；光学显微镜观察，活细胞无染色，死细胞被染色。细胞活率＝(总细胞数-死细胞数)/总细胞数×100％。对照组为未冻存细胞，空白组为培养液。
1.2细胞增殖效果检测：
1×105/mL细胞悬液加入至细胞培养板中，100uL/孔。共设置4个培养板，每个培养板分组。每隔24h取出一块培养板，加入20uL/孔MTS溶液，37℃、5％CO2培养箱孵育2h，酶标仪检测OD492nm。对照组为未冻存细胞，空白组为培养液。
1.3CAR-T细胞体外清除肿瘤细胞的能力检测：
以NALM-6细胞为靶细胞，通过靶细胞CFSE稀释测定法进行检测。对照组为未冻存细胞。
2.实验结果
2.1细胞活率检测结果：
表1细胞活率(％)
实施例1 实施例2 实施例3 实施例4 对比例1 对比例2 对比例3 对照组 空白组
90.0±2.8 90.3±1.3 96.3±2.7 94.5±1.1 85.3±2.3 79.3±2.3 68.3±1.6 98.3±2.1 -
结果显示：经2个月冻存后，实施例冻存后的CAR-T细胞能够保持较高活率，冻存细胞活率大于90％。其中，实施例3方法冻存后的细胞活达到最佳，其细胞活率与未冻存细胞相当，无统计学差异。
2.2细胞增殖效果检测结果：
表2细胞增殖效果(OD值)
0h 24h 48h 72h
实施例1 0.28±0.12 0.33±0.10 1.25±0.18 2.11±0.09
实施例2 0.30±0.09 0.36±0.16 1.23±0.15 2.06±0.08
实施例3 0.31±0.16 0.42±0.11 1.42±0.10 2.22±0.12
实施例4 0.27±0.13 0.29±0.14 1.11±0.13 2.09±0.10
对比例1 0.21±0.15 0.26±0.06 0.79±0.11 1.25±0.16
对比例2 0.20±0.17 0.26±0.08 0.67±0.12 1.25±0.17
对比例3 0.16±0.11 0.27±0.30 0.55±0.17 1.26±0.09
对照组 0.36±0.13 0.44±0.10 1.67±0.18 2.36±0.15
空白组 - - - -
增殖能力是判断细胞活性的重要指标，表2结果显示：实施例组细胞复苏培养48h其增殖能力就表现出统计学意义的增加，而对比例组细胞复苏后的增殖能力明显不如实施例组，说明本发明方法能够有效保持CAR-T细胞活力。
2.3CAR-T细胞体外清除肿瘤细胞的能力检测结果：
表3细胞毒性百分比(效靶比E:T＝3:1)
实施例1 实施例2 实施例3 实施例4 对比例1 对比例2 对比例3 对照组
40.3±1.2 40.0±1.4 43.3±1.0 39.8±1.5 34.2±1.1 32.3±1.0 26.3±1.7 44.3±2.0
结果显示：实施例方法冻存2个月后，CAR-T细胞清除肿瘤细胞的能力明显优于对比例组。
本发明CAR-T细胞冻存方法保存的CAR-T细胞未发现安全性问题。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (6)

1.一种CAR-T细胞冻存方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）泊洛沙姆配置成质量浓度1~2.5%的水溶液；将泊洛沙姆水溶液、DMSO与RPMI-1640培养基混合，得混合培养液；
（2）用步骤（1）的混合培养液悬浮CAR-T细胞，细胞在0~2℃预冻15~30min；保温加入氯化钠、西兰花多糖和瓜儿豆蛋白，混合后将细胞悬液转入-20~-30℃放置30~50min，-50~-60℃放置2~5h，然后液氮冻存；
其中，泊洛沙姆水溶液、氯化钠、西兰花多糖、瓜儿豆蛋白、DMSO和RPMI-1640培养基的质量比为1~2:1~2:17~25:5~10:5~15:46~71。
2.根据权利要求1所述的CAR-T细胞冻存方法，其特征在于，CAR-T细胞在混合培养液中的密度是106~107个/mL。
3.根据权利要求1所述的CAR-T细胞冻存方法，其特征在于，所述泊洛沙姆为泊洛沙姆108。
4.根据权利要求1所述的CAR-T细胞冻存方法，其特征在于，包括以下质量比的组分：泊洛沙姆水溶液、氯化钠、西兰花多糖、瓜儿豆蛋白、DMSO和RPMI-1640培养基的质量比为1:1:25:10:15:48。
5.根据权利要求1所述的CAR-T细胞冻存方法，其特征在于，西兰花多糖通过以下方法制得：取西兰花干燥粉碎脱脂后，按料液比1:(30~50)mL加水，50~70℃超声提取1~2h，离心取上清，减压浓缩至体积减少70~85%，加入体积分数85~90%乙醇醇沉12~14h，抽滤，取固体干燥。
6.根据权利要求1所述的CAR-T细胞冻存方法，其特征在于，瓜儿豆蛋白通过以下方法制得：取瓜儿豆粉碎脱脂，加0.01~0.02M氢氧化钠溶液提取，料液比1:30~50mL，25~30℃且80~100rpm搅拌1~2h，离心弃沉淀，加0.01~0.02M盐酸溶液25~30℃静置沉淀，料液比1:30~50mL，离心弃上清，水洗，干燥；按料液比1:30~50mL加水，25~30℃且80~100rpm搅拌1~2h，离心，取上清，干燥。
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