CN113337542A - 高效表达利什曼原虫pepck的人复制缺陷型重组腺病毒载体 - Google Patents

高效表达利什曼原虫pepck的人复制缺陷型重组腺病毒载体 Download PDF

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Abstract

本发明属于生物技术领域，针对目前利什曼病的现状公开了一种高效表达利什曼原虫磷酸烯醇丙酮酸羧化激酶(PEPCK)的人复制缺陷型重组腺病毒载体。具体为将修饰后的PEPCK基因与pShuttle‑CMV载体构建的重组载体pShuttle‑CMV‑Leish‑PEPCK和pAdEasy‑1载体进行同源重组，得到的质粒载体pAd5‑L.m‑PEPCK经过PacI切割，转染进人胚肾细胞293而获得复制缺陷型重组腺病毒载体Ad5‑L.m‑PEPCK。经考马斯亮蓝R250染色和特异抗体抗His标签抗体的Western blot分析表明重组腺病毒载体Ad5‑L.m‑PEPCK能够高效表达PEPCK蛋白。由于利什曼原虫磷酸烯醇丙酮酸羧化激酶(PEPCK)是最近发现的最有免疫优势的利什曼病抗原。因此本发明重组腺病毒载体Ad5‑L.m‑PEPCK可用于利什曼病的疫苗，从而有助于利什曼病的防控。

Description

高效表达利什曼原虫PEPCK的人复制缺陷型重组腺病毒载体
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体为一种高效表达利什曼原虫PEPCK的人复制缺陷型重组腺病毒载体。
背景技术
利什曼病(leishmaniasis)，又称黑热病。它的病原体是几种趋内脏的利什曼原虫。原虫主要寄生于病人体内的巨噬细胞里，由双翅目昆虫白蛉为传播媒介。临床特征主要表现为长期不规则的发热、脾脏肿大、贫血、消瘦、白细胞减少和血清球蛋白的增加。如不予合适的治疗，患者大都在得病后1-2年内因并发其它疾病而死亡。
世界卫生组织把黑热病列为再度回升的一种寄生虫病。黑热病的分布极广，波及亚、欧、非及拉美四大洲。全球超过88个国家有黑热病流行，约有3.5亿人口生活在疫区，每年有新感染病例10万左右，各地黑热病的流行病学特征不尽相同。中国一直受到黑热病的困扰，黑热病在我国长江以北的16个省、直辖市、自治区曾广泛流行，包括辽宁、河北、北京市、山东、江苏、安徽、河南、湖北、陕西、山西、四川、甘肃、青海、宁夏、内蒙古和新疆。在新疆、甘肃、四川、陕西、山西和内蒙古6省、自治区，黑热病从来没有消失过。
防治利什曼病，世界卫生组织把疫苗的研发列为重要策略任务。过去有三代抗利什曼原虫疫苗曾经进入到或正在临床试验阶段，但目前均没有证据达到世界卫生组织的有效性。第一代抗利什曼原虫疫苗包括三个主要类型：完整杀死寄生虫、部分分离利什曼原虫抗原、减毒活病原体。完整杀死利什曼原虫疫苗成本低，在人体内成功应用于I期和II期临床试验，充分证明了其安全性和免疫原性；然而，该疫苗未能在随机临床试验(RCT)的III期取得令人满意的结果。部分分离利什曼原虫抗原疫苗和减毒活病原体疫苗主要用于犬利什曼病的防控。通过基因工程细胞产生的重组蛋白被称为“第二代疫苗”。典型代表是LEISH-F1，原名Leish-111f，已进入临床二期。这种人工蛋白是由三个基因编码：硕大利什曼原虫的真核硫醇特异性抗氧剂(L.major homologue of eukaryotic thiol-specificantioxidant,TSA)，硕大利什曼原虫应激诱导蛋白1(L.major stress-inducibleprotein-1,LmSTI1)，和L.braziliensis伸长和起始因子(L.braziliensis elongationand initiation factor,LeIF)。LEISH-F3是另一种多组分疫苗，由两种蛋白质组成：核苷水解酶(nucleoside hydrolase,NH)和甾醇24-c-甲基转移酶(sterol 24-c-methyltransferase,SMT)。第三代疫苗的代表是ChAd63，一种猿猴腺病毒载体疫苗(ChAd63)可以有效地诱导广泛的CD8+T细胞。这种疫苗编码KH基因，由两个杜氏利什曼原虫抗原基因组成：KMP-11和HASPB。研究表明，ChAd63-KH能有效诱导干扰素-γ的产生和树突状细胞的活化。
利什曼原虫蛋白，即利什曼原虫糖体磷酸烯醇丙酮酸羧化激酶(glycosomalphosphoenolpyruvate carboxykinase，PEPCK)是糖异生的关键酶，是最近发现的最有免疫优势的利什曼病抗原。在利什曼原虫感染的高峰期，所有利什曼原虫的反应性T细胞中，近20％T细胞是PEPCK特异性的。此外，该研究发现，从人畜共患的利什曼原虫感染中恢复的人的外周血单核细胞(PBMC)识别出PEPCK，表达高水平的干扰素γ(IFN-γ)和颗粒酶B，提示具有潜在的临床益处。PEPCK是主要利什曼原虫的关键代谢酶和关键毒力因子。在利什曼原虫的代谢、毒力和免疫致病性中起关键作用。PEPCK的靶向丢失会导致利什曼原虫增殖受损和致病性高度减弱。因此这个蛋白目前成为控制利什曼原虫感染的首选靶标。
自将近半个世纪的发现以来，复制缺陷的腺病毒载体(Adenovirus vector，AdV)已迅速成为疫苗开发的有吸引力的平台。具有优异的安全性记录、广泛的组织嗜性。腺病毒是高度免疫原性的，能够驱动编码抗原的健壮持久的免疫应答。在诱导有效的CD8以及在诱导CD4 T细胞应答方面特别有效。这使它成为针对细胞内病原体的疫苗的诱人平台。
因此考虑将利什曼原虫蛋白，即利什曼原虫糖体磷酸烯醇丙酮酸羧化激酶(glycosomal phosphoenolpyruvate carboxykinase，PEPCK)与复制缺陷的腺病毒载体结合起来，构建一种高效表达PEPCK的人复制缺陷型重组病毒载体将有助于对利什曼病的防治。
发明内容
针对上述问题本发明提供了一种高效表达PEPCK的人复制缺陷型重组腺病毒载体。
为了达到上述目的，本发明采用了下列技术方案：
本发明提供了一种高效表达利什曼原虫PEPCK的人复制缺陷型重组腺病毒载体Ad5-L.m-PEPCK，具体通过以下步骤制备得到：
步骤1，根据PEPCK基因(NCBI GenBank数据库条目XM_003721939.1；Leishmaniamajor strain Friedlin)的编码序列，合成携带在羧基末端含6x His标签的PEPCK全长编码基因；
步骤2，对步骤1合成的羧基末端含6x His标签的PEPCK基因进行修饰，即在PEPCK基因羧基末端添加11个额外的修饰氨基酸；
步骤3，将步骤2修饰后的PEPCK-His基因和pShuttle-CMV载体通过NotI和EcoRV双酶切，构建重组载体pShuttle-CMV-Leish-PEPCK；
步骤4，根据AdEasy腺病毒载体系统，将步骤3构建的重组载体pShuttle-CMV-Leish-PEPCK与pAdEasy-1载体进行同源重组，以生成所述重组腺病毒载体Ad5-L.m-PEPCK；
步骤5，重组腺病毒载体Ad5-L.m-PEPCK的分离纯化。
进一步，所述步骤2中11个额外的修饰氨基酸的序列为GRALEHHHHHH。
进一步，所述步骤3的具体过程为：将经过步骤2修饰后的PEPCK基因和pShuttle-CMV载体分别通过NotI和EcoRV进行双酶切，然后用DNA连接酶连接，将连接产物转染进大肠杆菌DH5α中，涂布在含有50μg/ml卡那霉素的LB琼脂糖平板上，37℃培养过夜，挑选抗性细菌克隆，增值培养后提取质粒DNA，通过DNA序列测定鉴定出重组载体pShuttle-CMV-Leish-PEPCK。
进一步，所述步骤4的具体过程为：
用PmeI限制性内切酶切割重组载体pShuttle-CMV-Leish-PEPCK，然后用碱性磷酸酶在37℃处理30min，使用琼脂糖进行分离、纯化；
将上述分离、纯化后的pShuttle-CMV-Leish-PEPCK载体和pAdEasy-1载体按质量比10：1在冰上混合后，使用电转化仪器转入感受态BJ5183细菌中进行同源重组；
将上述转化的细菌涂布在含50μg/ml卡那霉素的LB琼脂糖平板，37℃培养过夜，挑选抗性细菌克隆，增值培养后提取质粒DNA，提取的DNA再转化大肠杆菌DH5α，小量扩增培养，再提取质粒DNA，用限制酶切和DNA测序鉴定出同源重组的质粒pAd5-L.m-PEPCK
提取重组腺病毒质粒pAd5-L.m-PEPCK的DNA，经PacI酶切，通过苯酚提取和乙醇沉淀或DNA纯化试剂盒纯化后，使用磷酸钙共沉淀法将DNA转染到293细胞，以生成所述重组腺病毒载体Ad5-L.m-PEPCK。
进一步，所述步骤5重组腺病毒载体Ad5-L.m-PEPCK的分离纯化的具体过程为：
收集步骤4中含有病毒空斑的293细胞，保留2ml细胞培养液，反复冻融3次，2000rpm离心15分钟，去除沉淀物，将含有Ad5-L.m-PEPCK的上清作为原代载体；
将293细胞用上述原代载体Ad5-L.m-PEPCK感染，感染复数为1个噬菌斑形成单位，感染后48小时，收集感染的细胞并冷冻融化3次，将细胞裂解物用1.2和1.4g/ml CsCl进行逐步梯度离心，并以35,000rpm(Revolutions Per Minute)超速离心2h，收获主要条带，然后透析到透析液中，-80°冻存。
更进一步，所述透析液为100mM蔗糖；10mM Tris-HCl,PH 8.0；2mM MgCl2；所述透析具体为在4℃，每6h更换一次透析液，透析24h。
本发明提供一种高效表达利什曼原虫PEPCK的人复制缺陷型重组腺病毒载体的应用，用于利什曼病的疫苗。
与现有技术相比本发明具有以下优点：
1、本发明提供了一种高效表达利什曼原虫PEPCK的人复制缺陷型重组腺病毒载体，该人腺病毒载体是复制缺陷型，安全性高，而且容易在短时间内制备大量高滴度表达载体；
2、本发明腺病毒载体表达的利什曼原虫PEPCK蛋白可以在人体细胞中高效长时持续表达；能同时刺激体液和细胞免疫，为抗人和动物的利什曼原虫疫苗提供了一种优良的候选方案。
附图说明
图1为本发明重组腺病毒载体的基因组结构和PEPCK的修饰DNA编码序列。
图2为293细胞的病毒空斑示意图。左边为阴性对照；右边为感染重组腺病毒载体Ad5-L.m-PEPCK的示意图，图中圈出的为典型的病毒空斑。
图3为重组腺病毒载体Ad5-L.m-EPCK的分离纯化结果图。
图4为PEPCK蛋白的考马斯亮蓝R250染色图。从左到右每列依次代表蛋白Mark、细胞裂解液1、细胞裂解液2、His-标签纯化蛋白。
图5为PEPCK蛋白的Western blot分析结果图。从左到右每列依次代表蛋白Mark、细胞裂解液1、细胞裂解液2、His-标签纯化蛋白。
具体实施方式
下面结合本发明实施例和附图，对本发明实施例中的技术方案进行具体、详细的说明。应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干变型和改进。例如(包括但不限于)将PEPCK基因置于其它不同类型的启动子和表达调控元件之下，以改变蛋白表达的量或时空；将PEPCK基因和相关表达调控元件重组进其它品种或类型的病毒载体中等等，这些也应视为属于本发明的保护范围。
实施例1
重组腺病毒载体Ad5-L.m-PEPCK的制备:
1、根据利什曼原虫PEPCK基因(NCBI GenBank数据库条目XM_003721939.1；Leishmania major strain Friedlin)的编码序列(共计1575核苷酸，nucleotides，编码525个氨基酸)合成编码羧基末端含6x Histidine(6xHis)的全长PEPCK基因。在起始密码子ATG的前面增加含有NotI限制性酶切位点的序列GCGGCCGCACC；在终止密码子TGA前面增加编码6x His的序列，后面增加EcoRV限制性酶切位点序列GATATC(图1)。
2、在羧基末端含有6x His标签的PEPCK基因的羧基末端添加11个额外的修饰氨基酸GRALEHHHHHH，使表达出的蛋白共计含有536个氨基酸。
3、通过使用NotI和EcoRV双酶切，将上述修饰后的PEPCK基因和穿梭载体pShuttle-CMV(AdEasy腺病毒载体系统，Clontech Laboratories Inc)进行同样切割，然后用DNA连接酶连接，从而将修饰后的PEPCK-His基因插入pShuttle-CMV载体构建重组载体pShuttle-CMV-Leish-PEPCK，使基因的表达处在巨细胞病毒早期启动子P-CMV的控制下(图1)。具体步骤为：将连接产物转染进大肠杆菌DH5α中，涂布在含有卡那霉素(50μg/ml,kanamycin)的LB琼脂糖平板上，37℃培养过夜，挑选抗性细菌克隆，增值培养后提取质粒DNA，通过DNA序列测定鉴定出重组载体pShuttle-CMV-Leish-PEPCK。
4、重组腺病毒载体Ad5-L.m-PEPCK的生成：
(1)用PmeI限制性内切酶切割重组载体pShuttle-CMV-Leish-PEPCK，然后在37℃用碱性磷酸酶处理被切割的DNA 30min，使用琼脂糖分离线性化、去磷酸化的穿梭载体，纯化出来。
(2)将1μg线性化、去磷酸化的穿梭载体和0.1μg pAdEasy-1(AdEasy腺病毒载体系统，Clontech Laboratories Inc)超螺旋载体混合并保持在冰上。使用Gene Pulser XcellTotal System电转化仪器(Bio-Rad，转化条件参数:C＝25μF；PC＝200ohm；V＝1.8kV；用0.1cm转化杯)穿孔转入感受态BJ5183细菌中。
(3)转化的细菌涂布在含卡那霉素(50μg/ml)的LB琼脂糖平板，37℃培养过夜，挑选抗性细菌克隆，增值培养后提取质粒DNA。提取的DNA再转化大肠杆菌DH5α，小量扩增培养，再提取质粒DNA用限制酶切和DNA测序鉴定出同源重组的质粒pAd5-L.m-PEPCK。这个质粒含有表达PEPCK蛋白的基因框架和全部复制缺陷型的人腺病毒基因组。
(4)用PacI消化5μg重组腺病毒质粒pAd5-L.m-PEPCK的DNA。通过苯酚提取/乙醇沉淀或使用类似的DNA纯化试剂盒，纯化被切割的质粒DNA，在无菌条件下，将DNA重悬在dH2O中。然后使用磷酸钙共沉淀法将分离重组腺病毒DNA转染到293细胞中，生成重组Ad5-L.m-PEPCK(图2)。收集含有病毒空斑的293细胞，保留2ml细胞培养液，反复冻融3次，离心(2000rpm)15分钟，去除沉淀物，含有Ad5-L.m-PEPCK的上清保存在-80℃。做为原代载体用于实施例2中的大量培养纯化。
实施例2
Ad5-L.m-PEPCK分离纯化：
为了获得大量纯化重组腺病毒载体，将293细胞用实施例1中的原代载体Ad5-L.m-PEPCK感染，感染复数(MOI)为1个噬菌斑形成单位(PFU)。感染48小时后，收集感染的细胞并冷冻融化3次。将细胞裂解物用1.2和1.4g/ml CsCl进行逐步梯度离心，并以35,000rpm超速离心2h。收获主要条带(图3中箭头所示位置)，然后透析到透析液中(100mM蔗糖；10mMTris-HCl,PH 8.0；2mM MgCl2)中，-80℃冻存。透析在4℃温度下，透析24小时，每6小时更换一次透析液，每次2-3升透析液。
实施例3
Ad5-L.m-PEPCK在细胞中表达蛋白(PEPCK)的纯化和免疫鉴定：
将293细胞用实施例2保存的Ad5-L.m-PEPCK感染，感染复数(MOI)为1个噬菌斑形成单位(PFU)。感染48小时后，收集感染的细胞，用4℃磷酸盐缓冲盐水(PBS，137mM NaCl；2.7mM KCl；10mM Na2HPO4；1.8mM KH2PO4)洗涤，在含有50mM NaH2PO4的缓冲液[pH7.4，300mMNaCl，10mM咪唑，0.5％Triton X-100、10％甘油和蛋白酶抑制剂鸡尾酒片(Roche)]中溶解，然后在4℃下以22,000×g离心30min。将Ni-次氮基三乙酸(NTA)琼脂糖(Qiagen)添加到澄清的上清液中，并在4℃下温育2小时，以捕获带His标签的蛋白质。沉淀的蛋白质用250mM咪唑溶液洗脱，在10％聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)上分离蛋白，用考马斯亮蓝R250染色(图4)和用特异抗体抗His标签抗体进行Western blot分析(图5)。纯化的蛋白用25mMNaH2PO4(pH7.4)，150mM NaCl和10％(体积百分比)甘油透析，然后保存在-80℃下。
图4显示Ad5-L.m-PEPCK感染的293细胞中能纯化出一个75kDa的特异蛋白(箭头所指)，和预期的PEPCK-His的大小一致。而且这条特异的蛋白可以被抗His标签抗体识别(图5)。结果表明这个构建的人复制缺陷型重组腺病毒载体Ad5-L.m-PEPCK能在人源细胞中高效表达利什曼原虫PEPCK。
此外，应当理解，虽然本说明书按照实施方式加以描述，但并非每个实施方式仅包含一个独立的技术方案，说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见，本领域技术人员应当将说明书作为一个整体，各实施例中的技术方案也可以经适当组合，形成本领域技术人员可以理解的其他实施方式。

Claims (7)

1.一种高效表达利什曼原虫PEPCK的人复制缺陷型重组腺病毒载体，其特征在于，所述重组腺病毒载体为Ad5-L.m-PEPCK，具体通过以下步骤制备得到：
步骤1，合成携带在羧基末端含6x His标签的PEPCK全长编码基因；
步骤2，对步骤1合成的羧基末端含6x His标签的PEPCK基因进行修饰，即在PEPCK基因羧基末端添加11个额外的修饰氨基酸；
步骤3，构建重组载体pShuttle-CMV-Leish-PEPCK；
步骤4，将步骤3构建的重组载体pShuttle-CMV-Leish-PEPCK与pAdEasy-1载体进行同源重组，生成所述重组腺病毒载体Ad5-L.m-PEPCK；
步骤5，重组腺病毒载体Ad5-L.m-PEPCK的分离纯化。
2.根据权利要求1所述的高效表达利什曼原虫PEPCK的人复制缺陷型重组腺病毒载体，其特征在于：所述步骤2中11个额外的修饰氨基酸为GRALEHHHHHH。
3.根据权利要求1所述的高效表达利什曼原虫PEPCK的人复制缺陷型重组腺病毒载体，其特征在于，所述步骤3的具体过程为：将经过步骤2修饰后的PEPCK基因和pShuttle-CMV载体分别通过NotI和EcoRV进行双酶切，然后用DNA连接酶连接，将连接产物转染进大肠杆菌DH5α中，涂布在含有50μg/ml卡那霉素的LB琼脂糖平板上，37℃培养过夜，挑选抗性细菌克隆，增值培养后提取质粒DNA，通过DNA序列测定鉴定出重组载体pShuttle-CMV-Leish-PEPCK。
4.根据权利要求1所述的高效表达利什曼原虫PEPCK的人复制缺陷型重组腺病毒载体，其特征在于，所述步骤4的具体过程为：
用PmeI限制性内切酶切割重组载体pShuttle-CMV-Leish-PEPCK，然后用碱性磷酸酶在37℃处理30min，使用琼脂糖进行分离、纯化；
将上述分离、纯化后的pShuttle-CMV-Leish-PEPCK载体和pAdEasy-1载体按质量比10：1在冰上混合后，使用电转化仪器转入感受态BJ5183细菌中进行同源重组；
将上述转化的细菌涂布在含50μg/ml卡那霉素的LB琼脂糖平板，37℃培养过夜，挑选抗性细菌克隆，增值培养后提取质粒DNA，提取的DNA再转化大肠杆菌DH5α，小量扩增培养，再提取质粒DNA，用限制酶切和DNA测序鉴定出同源重组的质粒pAd5-L.m-PEPCK
提取重组腺病毒质粒pAd5-L.m-PEPCK的DNA，经PacI酶切，通过苯酚提取和乙醇沉淀或DNA纯化试剂盒纯化后，使用磷酸钙共沉淀法将DNA转染到293细胞，以生成所述重组腺病毒载体Ad5-L.m-PEPCK。
5.根据权利要求1所述的高效表达利什曼原虫PEPCK的人复制缺陷型重组腺病毒载体，其特征在于：所述步骤5重组腺病毒载体Ad5-L.m-PEPCK的分离纯化的具体过程为：
收集步骤4中含有病毒空斑的293细胞，保留2ml细胞培养液，反复冻融3次，2000rpm离心15分钟，去除沉淀物，将含有Ad5-L.m-PEPCK的上清作为原代载体；
将293细胞用上述原代载体Ad5-L.m-PEPCK感染，感染复数为1个噬菌斑形成单位，感染48小时后，收集感染的细胞并冷冻融化3次，将细胞裂解物用1.2和1.4g/ml CsCl进行逐步梯度离心，并以35000rpm超速离心2h，收获主要条带，然后透析到透析液中，-80°保存。
6.据权利要求5所述的高效表达利什曼原虫PEPCK的人复制缺陷型重组腺病毒载体，其特征在于：所述透析液为100mM蔗糖；10mM Tris-HCl,PH 8.0；2mM MgCl2；所述透析具体为在4℃，每6h更换一次透析液，透析24h。
7.一种高效表达利什曼原虫PEPCK的人复制缺陷型重组腺病毒载体的应用，其特征在于：可用于利什曼病的疫苗。
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