PT1624063E - Gene quimérico que codifica os determinantes antigénicos das quatro proteínas de l. infantum - Google Patents

Description

DESCRIÇÃO GENE QUIMÉRICO QUE CODIFICA OS DETERMINANTES ANTIGÉNICOS DAS QUATRO PROTEÍNAS DE L. infantum

OBJECTO DA INVENÇÃO A presente especificação refere-se a uma aplicação para uma Patente de Invenção, relativa a um gene quimérico formado das sequências de ADN que codificam os determinantes antigénicos de quatro proteínas de L. infantum, e as proteínas codificadas pelo dito gene quimérico, útil para a prevenção ou para o tratamento da leishmaniose, em particular leishmaniose canina. A finalidade óbvia desta assenta na utilização da sequência do gene ou da proteína obtida do gene quimérico para prover composições farmacêuticas para prevenir ou tratar a leishmaniose, em particular a leishmaniose canina, que pode estar presente no corpo de um doente, por exemplo como uma vacina ou como uma preparação de anticorpos monoclonais. Este doente não tem forçosamente de ser um cão mas pode também ser um humano que sofre de doenças que envolve imunodepressão. Para o obter, vai ser produzido um gene quimérico que codifica uma proteína chamada PQ constituída por um produto quimérico originado de uma síntese in vitro de um gene quimérico construído adhoc, que contém cinco dos determinantes antigénicos de quatro proteínas diferentes. 0 produto é configurado como altamente sensível e específico para por exemplo, gerar uma resposta imune protectora contra a leishmaniose canina, ou para preparar os anticorpos contra a leishmaniose canina.

CAMPO DA INVENÇÃO

Esta invenção é de grande utilidade na Indústria dedicada ao fabrico de produtos farmacêuticos em geral. 1/59

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO O protozoário parasítico do género Leishmania é o agente etiológico que provoca a leishmaniose, um leque de doenças que têm uma distribuição mundial e que são caracterizadas por originarem uma ampla variedade de sintomas clinicos.

Na natureza as formas principais de leishmaniose são zoonóticas e os humanos são consideradas como hospedeiros secundários.

As espécies denotadas L. infantum, amplamente distribuídas em muitas áreas mediterrâneas são a causa da leishmaniose visceral (LV) nos humanos e cães.

De facto, os cães infectados com L. infantum são a principal reserva animal deste parasita, particularmente durante o longo período de incubação antes que os sintomas clínicos possam ser observados.

Os dados epidemiológicos indicam que há uma correlação directa entre a prevalência da leishmaniose canina e a transmissão do parasita aos humanos. Por esta razão, é crucial que a doença ou a infecção seja detectada precocemente nas campanhas existentes para controlar a expansão da doença. 0 parasita é transmitido ao hospedeiro vertebrado como um promastigota flagelado, através de uma picada de uma mosca da família Phlebotominae, e o parasita entra nas células dos fagos mononucleares onde ele se diferencia e se reproduz como amastigotas, dentro da estrutura fagolisosomal.

As células infectadas estão reunidas em certos tecidos, principalmente baço, fígado e gânglios linfáticos. Calcula-se que cerca de 15 milhões de pessoas estejam infectadas com leishmaniose, e no mundo em cada ano, aparecem 500 000 novos 2/59 casos clínicos, principalmente nos países subdesenvolvidos e desenvolvidos.

Nos Países Ocidentais do Sul da Europa, a leishmaniose visceral (VL) , é uma doença zoonótica provocada pelas espécies L. infantum, como anteriormente mencionado. Os dados recentes derivados dos estudos epidemiológicos indicam que há uma incidência alarmante desta infecção.

Em Itália os dados relatados para a incidência de VL varia entre 14.4% e 37% de acordo com a região.

Em Portugal, mais detalhadamente na área à volta de Lisboa, foram descobertas taxas de seropositivos de 8.4% e na região dos Alpes Marítimos franceses, foram descobertos diferentes centros de prevalência que variavam entre 3.2% e 17.1%.

Em Espanha, a prevalência da leishmaniose depende da zona estudada. Na Catalunha foi observado uma incidência com uma taxa média de 9.3% ainda que nalgum ponto crítico foi descoberto que a prevalência de cães infectados era de 18%.

Na ilha de Maiorca, a taxa de incidência foi de 14%, e outras taxas que foram encontradas são: 2.4% em Múrcia, 8.8% em Granada, entre 10 e 15% em Salamanca, 5.25% na província de Madrid, e 14% em Cáceres.

Apesar de o número de casos de VL nos humanos causados pela L. infantum possa ser considerado relativamente baixo, a percentagem elevada de doentes com imunodepressão que foram infectados por Leishmania poderá estar relacionada com o nível elevado desta doença nos cães.

De facto, no Sul da Europa, 50% dos adultos que estão infectados por leishmaniose são também doentes infectados pelo vírus VIH.

Por outro lado, de acordo com estes dados da co-infecção 3/59

Leishmania/VIR, foi calculado que o nivel da infecção (por parasitas) pode ser de uma ou duas ordens de magnitude maior do que esta figura devido à existência de um grande número de infecções não detectadas.

Uma caracteristica comum aos diferentes tipos de infecção de Leishmania é que ela induz uma forte resposta humoral no hospedeiro. Assim, os métodos de diagnóstico baseados nas técnicas serológicas são actualmente os mais usados.

Foi descrito que estes anticorpos foram detectados mesmo durante a fase assintomática da doença nas infecções naturais e experimentais. A sensibilidade e a especificidade destes métodos dependem do tipo, fonte e pureza do antigénio usado. Nos processos imunológicos que são habitualmente, comercializados, os promastigotas completos e preparações mais ou menos preparadas a partir destes são usadas como uma fonte de antigénio. Este método normalmente leva a reacções cruzadas com o soro dos pacientes que sofrem de lepra, tuberculose, tripanossomíase africana, doença de Chagas, malária e outras parasitoses. A sensibilidade e a especificidade dos métodos sorológicos dependem do tipo, fonte e pureza do antigénio empregue. Nos últimos anos um grande número de antigénios de Leishmania foram caracterizados, alguns deles podem ser considerados como proteínas especificas do parasita.

Entre estas proteínas especificas do parasita, merecem ser mencionadas a protease de superfície GP63, a glicoproteina de superfície gp46 e o lipofosfoglicano associado à proteina KMP-11. 4/59

Um grupo adicional de antigénios de Leishmania foi formado das proteínas conservadas evolutivamente, tais como a cinesina, proteínas induzidas por meio de calor, a actina e a tubulina.

Como parte de uma estratégia para desenvolver um sistema de diagnóstico serológico especifico para leishmaniose canina, foi desenvolvido no laboratório um projecto para identificar os antigénios de L. infantum, através de uma pesquisa de imunodetecção de uma biblioteca de expressão para os genes de L. infantum usando soro de cão com leishmaniose visceral activa.

Foi observado que a maior parte dos antigénios isolados por este método pertencem à familia das proteínas conservadas durante o decorrer da evolução. No entanto, a identificação dos epitopos B destes antigénios indica que em todos os casos os determinantes antigénicos foram localizados nas regiões que não estavam bem conservadas.

Em particular, as proteínas ribossómicas acidicas LiP2a e LiP2b são reconhecidas por mais de 80% de VL em soros.

Foi confirmado que estas proteínas contêm os determinantes antigénicos específicos da doença, e que as proteínas recombinantes LiP2a e LiP2b, das quais um fragmento foi removido poderão ser usadas como um instrumento específico capaz de distinguir entre VL e a doença de Chagas.

Também foi mostrado que a proteína ribossómica PO de L. infantum, muito altamente conservada na escala evolucionária, é reconhecida por uma elevada percentagem VL em soros de cão.

Além disso, os determinantes antigénicos foram exclusivamente descobertos no terminal C da proteína, isto é, na região que foi mal conservada durante o decorrer da evolução. 5/59

Foi observado que em 7 8% da VL em soro de cão, os anticorpos contra a proteina H2A estão também presentes, e foi confirmado que apesar da identidade da sequência em todas as proteinas H2A entre organismos eucarióticos, a resposta humoral para esta proteina de VL em soros é particularmente provocada por determinantes especificos à proteina de Leishmania H2A.

Nas duas extremidades da proteina H2A foram descobertos os determinantes antiqénicos reconhecidos pelo VL em soro de cão. A solução óbvia ao problema habitualmente encontrado nesta técnica, será o de ter uma invenção que permita a ensamblagem de um gene quimérico sintético que contenha as regiões de ADN que codificam os determinantes antigénicos especificos para as proteinas LiP2a, LiP2b, LiPO, e H2A, com o fim de construir uma proteina rica em determinantes antigénicos.

No entanto, tanto quanto sabe o Titular desta invenção, actualmente não há nenhuma invenção que contenha as caracteristicas descritas como óptimas, com o fim de atingir o objectivo desejado. Este objectivo é a construção de uma proteina rica em determinantes antigénicos, proveniente da ensamblagem de um gene quimérico sintético, que contém as regiões de ADN que codificam os determinantes antigénicos especificos para as proteinas anteriormente mencionadas.

DESCRIÇÃO DA INVENÇÃO

Num primeiro aspecto, a invenção refere-se a um gene quimérico formado pelas sequências de ADN que codificam os determinantes antigénicos das quatro proteínas de L. ínfantum, úteis para a prevenção ou para o tratamento da leishmaniose canina.

Noutro aspecto, a invenção refere-se a uma proteína codificada pelo dito gene quimérico, que contém um ou mais dos 6/59 determinantes antigénicos das quatro proteínas de L. infantum codificadas pelo gene quimérico. A invenção refere-se ainda a um método para a prevenção e/ou para o tratamento da leishmaniose canina num humano ou num animal. Neste método terapêutico, pode ser usado o gene quimérico da invenção ou a proteína codificada por ele. Também, podem ser usados os anticorpos contra a proteína codificada pelo gene quimérico da invenção, ou uma parte antigénica deles como por exemplo um epítopo.

Noutros aspectos, a invenção refere-se a composições farmacêuticas para a prevenção e/ou para o tratamento, da leishmaniose, nos humanos e/ou nos animais, que compreendem uma substância activa derivada ou dirigidas contra o gene quimérico da invenção e/ou a proteína por ele codificada, ou partes dele. Preferencialmente a substância activa é para que possa ser usada numa composição farmacêutica para o tratamento e/ou para a prevenção da leishmaniose.

Em particular, a composição farmacêutica será na forma de uma vacina, que contém a proteína codificada pelo gene quimérico da invenção, ou uma ou mais partes dele, que contém um ou mais dos determinantes antigénicos da proteína codificada pelo gene quimérico da invenção.

Assim, noutro aspecto a invenção refere-se a uma composição farmacêutica para a prevenção e para o tratamento, da leishmaniase humana ou animal, formada: a) pela quimera da proteína Q, ou uma variante desta proteína que contém modificações ou substituições de aminoácidos preservados administrados a um sujeito (humano ou animal), ou 7/59 b) pela proteína Q na forma isolada ou combinada com qualquer adjuvante fisiológico pela via intraperitoneal, subcutânea ou intramuscular. A invenção refere-se também a uma vacina que seja capaz de estimular a produção de anticorpos que reconheçam o parasita de Leishmania, formados: a) pela quimera da proteína Q ou uma variante desta proteína que é diferente da proteína Q nos aminoácidos preservados, administrados a um sujeito (humano ou animal), ou b) pela proteína Q na forma isolada ou combinada com um adjuvante fisiológico pela via intraperitoneal subcutânea ou intramuscular.

Além disso, a invenção refere-se a uma composição farmacêutica para a prevenção e para o tratamento, num humano ou num animal, da leishmaniose formada: a) pela proteína Q, ou uma variante desta proteína que contém modificações ou substituições de aminoácidos preservados, combinada com a proteína LiHsp70, completa ou fragmentada, administrada a um sujeito (humano ou animal), ou b) pela proteína Q na forma isolada ou combinada com um adjuvante fisiológico pela via intraperitoneal, subcutânea ou intramuscular.

Ainda noutro aspecto, a invenção refere-se a uma composição farmacêutica para a prevenção e para o tratamento da leishmaniose, humana ou animal, formada: a) por qualquer vector de ADN que contém a sequência que codifica a quimera da proteína Q, ou uma variante desta sequência que contém modificações ou substituições dos 8/59 nucleotídeos que codificam os aminoácidos preservados, administrados a um sujeito (humano ou animal), ou b) por um vector de ADN que contém a proteina Q combinada com um adjuvante fisiológico, administrado pela via intraperitoneal, intramuscular ou subcutânea.

Outro aspecto da invenção refere-se a uma composição farmacêutica para a prevenção e para o tratamento da leishmaniose, humana ou animal, formada: a) por qualquer vector de ADN que contém: 1) a sequência que codifica a quimera da proteina Q, ou uma variante desta sequência que contém modificações ou substituições dos nucleotídeos que codificam os aminoácidos preservados, e 2) a sequência de nucleotídeos que codifica a proteína LiHsp70 ou variantes dela que é diferente dos aminoácidos preservados, administrados a um sujeito (humano ou animal), ou b) por qualquer vector que contém a sequência de ADN que codifica a proteína Q como o definido na alínea a) administrado com um adjuvante fisiológico pela via intraperitoneal, intramuscular ou subcutânea.

Noutra forma de realização, a composição farmacêutica da invenção compreende anticorpos dirigidos a uma proteína codificada pelo gene quimérico da invenção, ou partes destes.

As preparações farmacêuticas da invenção podem ainda conter todos os adjuvantes conhecidos, solventes, tampões etc. conhecidos per se para composições farmacêuticas e/ou vacinas. 9/59

Noutro aspecto, a invenção refere-se a um método para o tratamento ou para a prevenção da leishmaniose, usando uma composição farmacêutica ou uma vacina de acordo com a invenção, ou uma preparação que compreende anticorpos dirigidos contra a proteína codificada pelo gene quimérico da invenção.

Este método compreenderá geralmente a administração de uma substância activa dirigida contra o gene quimérico ou contra a proteína a um humano ou a um animal, como por exemplo um cão, -numa quantidade farmacologicamente activa.

Para a prevenção da leishmaniose, uma vacina que compreende a proteína codificada pelo gene quimérico, ou que codifica uma ou mais partes da dita proteína que compreende um ou mais dos determinantes antigénicos, serão administrados a um ser humano para eliciar uma resposta imune protectora. A Administração das preparações, dos anticorpos e/ou das vacinas da invenção pode ser efectuada de uma maneira conhecida por se como via oral, intramuscular, intravenosa, subcutânea, por infusão (gotejamento) etc.

Preferencialmente, a preparação ou uma vacina é injectada, enquanto que com uma preparação de anticorpos, pode ser usada uma infusão. É de salientar que quando neste documento, se faz referência ao gene quimérico da invenção, esta expressão também abrange as sequências de ácidos nucleicos que podem hibridar com a sequência abaixo mencionada em condições moderadas ou severas de hibridação.

Neste contexto, as condições de hibridação heteróloga podem ser como segue: hibridação em 6 x SSC (20xSSC por 1000 ml: 175.3 g

NaCl, 107.1 g citrato de sódio. 5H20, pH 7.0), 0.1% SDS, 0.05% pirofosfato de sódio, 5* solução de Denhardt (100 x solução de 10/59

Denhardt por 500 ml: 10 g Ficoll-400, 10 g polivinilpirrolidona, 10 g Albumina de Soro Bovino (Pentax fracção V) e 20 μg/ml de ADN de esperma de arenque desnaturado a 56 °C durante 18-24 horas seguida de duas lavagens de 30 minutos em 5 x SSC, 0.1% SDS a 56 °C e duas lavagens de 30 minutos em 2 x SSC, 0.1% SDS a 56 °C.

Por exemplo, as sequências que podem hibridar com a sequência abaixo mencionada incluem sequências de ADN mutantes que codificam as proteinas com a mesma função biológica como proteina codificada pela sequência abaixo mencionada neste documento abaixo.

Estas sequências mutantes podem compreender uma ou mais deleções, substituições e/ou adições do nucleotideo à sequência abaixo mencionada. Preferencialmente, as sequências mutantes têm ainda pelo menos 50%, mais preferencialmente pelo menos 70%, ainda mais preferencialmente mais do que 90% de homologia do nucleotideo com a sequência abaixo dada neste documento. A expressão gene quimérico como é utilizada na presente invenção também abrange sequências de ácidos nucleicos que compreendem uma ou mais partes da sequência mencionada abaixo neste documento.

Preferencialmente, estas sequências compreendem pelo menos 10%, mais preferencialmente pelo menos 30%, mais preferencialmente pelo menos 50% da sequência de nucleotideos dada abaixo neste documento. Estas sequências podem compreender um fragmento contiguo da sequência mencionada abaixo neste documento, ou dois ou mais fragmentos da sequência dada abaixo que foi combinada e/ou incorporada numa única sequência de ADN. É de salientar que quando neste documento, se faz referência a uma proteina codificada pelo gene quimérico da invenção, esta 11/59 expressão também inclui proteínas mutantes que ainda têm essencialmente a mesma função biológica. Estas proteínas mutantes podem compreender uma ou mais deleções, substituições e/ou adições de aminoácidos comparadas à da proteína codificada pela sequência abaixo mencionada.

Preferencialmente, as proteínas mutantes têm ainda pelo menos 50%, mais preferencialmente pelo menos 70%, mesmo mais preferencialmente mais do que 90% de homologia do aminoácido com a sequência dada abaixo neste documento. O termo proteína também abrange os fragmentos da proteína codificada pelo gene quimérico da invenção.

Preferencialmente, estes fragmentos mostram ainda a actividade biológica da proteína completa. Preferencialmente, estas proteínas compreendem pelo menos 30%, mais preferencialmente pelo menos 50% da sequência de aminoácidos da proteína completa. Também, dois ou mais fragmentos da proteína completa codificada pelo gene quimérico da invenção podem ser combinados para formar uma única proteína.

Mais especificamente, a invenção refere-se a um gene quimérico formado pelas sequências de ADN que codificam os determinantes antigénicos das quatro proteínas de L. infantum, codificando uma proteína útil para fins farmacológicos, em particular para a prevenção e/ou para o tratamento da leishmaniose, especificamente a leishmaniose canina, e para a obtenção do produto final ou para a construção do gene quimérico que codifica um polipetídeo que contém todos os determinantes antigénicos seleccionados, caracterizado por ela usar uma estratégia de clonagem na qual o clone que expressa a proteína rLiPO-Ct-Q é usado como um vector inicial, e para este vector, através do uso de sítios de restrição adequados, os fragmentos de ADN são sequencialmente adicionados que codificam as proteínas LiP2a-Q, LiP2b-Q, LiH2A-Ct-Q, LiH2A-Nt-Q, e depois de 12/59 cada fase de clonagem a orientação correcta de cada um dos insertos é deduzida e o tamanho dos produtos de expressão, a sequência deduzida completa de aminoácidos da proteína de fusão final, pPQV, expressa no vector pMal é: MBP IEGRPLTPRSAKKAVRKSGSKSAKCGLIFPVGRVGGMMRRGYARRIGA 50 SGAPRISEFSVKAAAQSGKKRCRLNPRTVMLAARHDDDIGTLLKNVTLSHSGW 140 PMISKAMAKKKGGKKGKATPSAPEFGDSSRPMSTKYLAAYALASLSKASPSQAD 157 VEAICKAVHIDVDQATLAFVMESVTGRDVATLIAEGAAKMSAMPAASSGAAAGV 211 TASAAGDAAPAAAAAKKDEPEEEADDDMGPSVRDPMQYLAAYALVALSGKTPSK 265 STAGAGAGAVAEAKKEEPEEEEADDDMGPVDLQPAAAAPAAPSAAAKAAPEESD 374 EDDFGMGGLF {SEQ ID NO.3) A invenção refere-se também a uma composição farmacêutica para a prevenção e para o tratamento da leishmaniose nos humanos ou nos animais, formada: a) pela quimera da proteína Q, ou uma variante desta proteína que contém modificações ou substituições dos aminoácidos conservados, administrada a um sujeito (humano ou animal), tanto b) na forma isolada ou junta com qualquer adjuvante fisiológico via intraperitoneal subcutânea ou intramuscular.

Também, a invenção refere-se a uma vacina capaz de estimular a produção de anticorpos que reconheçam o parasita da Lelshmania, formado a) pela quimera da proteína Q ou uma variante desta proteína que é diferente da proteína Q nos aminoácidos conservados administrada a um sujeito (humano ou animal), tanto b) na forma isolada ou junta com qualquer adjuvante fisiológico via intraperitoneal subcutânea ou intramuscular. 13/59

Outro aspecto da invenção compreende uma composição farmacêutica para a prevenção e para o tratamento, da leishmaniose nos humanos ou nos animais, formada: a) pela proteína Q, ou uma variante desta proteína que contém modificações ou substituições dos aminoácidos conservados, ligadas à proteína LiHsp70, completa ou fragmentada, administrada a um sujeito (humano ou animal), tanto b) na forma isolada ou junta com qualquer adjuvante fisiológico via intraperitoneal subcutânea ou intramuscular.

Outra composição farmacêutica da invenção para a prevenção e para o tratamento de leishmaniose nos humanos ou animais, pode ser formada: a) por qualquer vector de ADN que transporta a sequência que codifica a quimera da proteína Q, ou uma variante desta sequência que contém modificações ou substituições de nucleotídeos que codificam os aminoácidos conservados administrados a um sujeito (humano ou animal), tanto b) pela via intramuscular como pela via subcutânea.

Ainda noutro aspecto, a invenção refere-se a uma composição farmacêutica para a prevenção e para o tratamento, da leishmaniose nos humanos ou nos animais, formada: a) por qualquer vector de ADN que transporte: 1- a sequência que codifica a quimera da proteína Q, ou uma variante desta sequência que contém modificações ou substituições dos nucleotídeos que codificam os aminoácidos conservados, e 14/59 2- a sequência que codifica a proteína LiHsp70, ou variantes desta que é diferente dos aminoácidos conservados, administrada a um sujeito (humano ou animal), tanto b) pela, via intramuscular subcutânea ou intramuscular. A invenção refere-se também a uma sequência de nucleotideos e a uma proteina útil para fins farmacológicos, em particular para a prevenção e/ou para o tratamento da leishmaniose, especificamente da leishmaniose canina, tendo como o abaixo mostrado o ADN e a sequência de aminoácidos expressos no vector PQ31. A sequência de aminoácidos contém um fragmento do vector (AA 1-37) . A parte restante da sequência de aminoácidos é idêntica à SEQ ID NO. 3 excepto no meio e nos primeiros sete aminoácidos de MBP (AA 1-7) : 1 45 ATG AGA GGA TCT CAC CAC CAC CAC CAC CAC ACG GAT CCG CAT GCG Met Arg Gly Ser His His His His His His Thr Asp Pro His Ala 5 10 15 46 90 AGC TCG AAC AAC AAC AAC AAT AAC AAT AAC AAC AAC CTC GGG ATC Ser Ser Asn Asn Asn Asn Asn Asn Asn Asn Asn Asn Leu Gly Ile 20 25 30 15/59 91 135 GAG GGA AGG CCT TTA GCT ACT CCT CGC AGC GCC AAG AAG GCC GTC Glu Gly Arg Pro Leu Ala Thr Pro Arg Ser Ala Lys Lys Ala Vai 35 40 45 136 180 CGC AAG AGC GGC TCC AAG TCC GCG AAA TGT GGT CTG ATC TTC CCG Arg Lys Ser Gly Ser Lys Ser Ala Lys Cys Gly Leu Ile Phe Pro 50 55 60 181 225 GTG GGC CGC GTC GGC GGG ATG ATG CGC CGC GGC CAG TAC GCT CGC Vai Gly Arg Vai Gly Gly Met Met Arg Arg Gly Gin Tyr Ala Arg 65 70 75 226 270 CGC ATC GGT GCC TCT GGC GCC CCC AGG ATT TCA GAA TTC TCC GTG Arg Ile Gly Ala Ser Gly Ala Pro Arg Ile Ser Glu Phe Ser Vai 80 85 90 271 315 AAG GCG GCC GCG CAG AGC GGG AAG AAG CGG TGC CGC CTG AAC CCG Lys Ala Ala Ala Gin Ser Gly Lys Lys Arg Cys Arg Leu Asn Pro 95 100 105 316 360 CGC ACC GTG ATG CTG GCC GCG CGC CAC GAC GAC GAC ATC GGC ACG Arg Thr Vai Met Leu Ala Ala Arg His Asp Asp Asp Ile Gly Thr 110 115 120 496 540 ACC AAG TAC CTC GCC GCG TAC GCT CTG GCC TCC CTG AGC AAG GCG Thr Lys Tyr Leu Ala Ala Tyr Ala Leu Ala Ser Leu Ser Lys Ala 170 175 180 541 585 TCC CCG TCT CAG GCG GAC GTG GAG GCT ATC TGC AAG GCC GTC CAC Ser Pro Ser Gin Ala Asp Vai Glu Ala Ile Cys Lys Ala Vai His 185 190 195 596 630 ATC GAC GTC GAC CAG GCC ACC CTC GCC TTT GTG ATG GAG AGC GTT Ile Asp Vai Asp Gin Ala Thr Leu Ala Phe Vai Met Glu Ser Vai 200 205 210 641 675 ACG GGA CGC GAC GTG GCC ACC CTG ATC GCG GAG GGC GCC GCG AAG Thr Gly Arg Asp Vai Ala Thr Leu Ile Ala Glu Gly Ala Ala Lys 215 220 225 676 720 ATG AGC GCG ATG CCG GCG GCC AGC TCT GGT GCC GCT GCT GGC GTC Met Ser Ala Met Pro Ala Ala Ser Ser Gly Ala Ala Ala Gly Vai 230 235 240 16/59 721 ACT GCT TCC GCT GCG GGT GAT GCG Gly Asp Ala Ala Pro 245 Ala Ala Ala 766 AAG AAG GAC GAG CCC GAG GAG GAG Thr Ala Ser Ala Ala 260 Glu Glu Glu 811 TCT AGA GTC GAC CCC ATG CAG TAC Ser Arg Vai Asp Pro 275 Met Gin Tyr 856 GCG CTG TCT GGC AAG ACG CCG TCG Ala Leu Ser Gly Lys 290 Thr Pro Ser 901 CTG AAG GCC GCC GGC GTT GCC GTG Leu Lys Ala Ala Gly 305 Vai Ala Vai 946 GTC TTC CAG GAG GTG GAG GGC AAG Vai Phe Gin Glu Vai 320 Glu Gly Lys 991 GAG GGC CGC ACG AAG CTG GTG GGC Glu Gly Arg 335 Thr Lys 340 Leu Vai Gly 345 1036 GGC GCT GTC TCC ACT GCT GGT GCC Gly Ala Vai Ser Thr 350 Ala Gly Ala 1081 GCG AAG AAG GAG GAG CCC GAG GAG Ala Lys Lys Glu Glu 365 Pro Glu Glu 1136 GGC CCC GTC GAC CTG CAG CCC GCC Gly Pro Vai Asp Leu 380 Gin Pro Ala 1171 AGC GCC GCT GCC AAG GAG GAG CCG Ser Ala Ala Ala Lys 395 Glu Glu Pro 765 GCT CCG GCT GCC GCC GCC GCG Ala Ala Lys Lys Asp Glu Pro 250 255 810 GCC GAC GAC GAC ATG GGC CCC Ala Asp Asp Asp Met Gly Pro 265 270 855 CTC GCC GCG TAC GCC CTC GTG Leu Ala Ala Tyr Ala Leu Vai 280 285 900 AAG GCG GAC GTT CAG GCT GTC Lys Ala ASP Vai Gin Ala Vai 295 300 945 GAT GCC TCC CGC GTG GAT GCC Asp Ala Ser Arg Vai Asp Ala 315 315 990 AGC TTC GAT GCG CTG GTG GCC Ser Phe Asp Ala Leu Vai Ala 325 330 1035 TCT GGC TCT GCC GCT CCT GCT Ser Gly Ser Ala Ala Pro Ala 1080 GGC GCT GGC GCG GTG GCC GAG Gly Ala Gly Ala Vai Ala Glu 355 360 1125 GAG GAG GCC GAT GAT GAC ATG Glu Glu Ala Asp Asp Asp Met 370 375 1170 GCT GCC GCG CCG GCC GCC CCT Ala Ala Ala Pro Ala Ala Pro 385 390 1215 GAG GAG AGC GAC GAG GAC GAC Glu Glu Ser Asp Glu Asp Asp 400 405 17/59 1256 TTC GGC ATG GGC GGT CTC TTC TAAGCGACTC GCCATCTCTT Phe Gly Met Gly Gly Leu Phe 410 412 1257 AGCCTCCTTG TGGTGCGCTT GAGGTGCTCT CGCTCTGCTT CTCCTTGCAG 1306 1307 TGTTGGCTGA CTCTGGCGGG TATGTGCCGT CGCATTACAC CCACCTCTCC 1356 1357 CACCCCTTTG CCCTACGCGC TCGCATGCGC AATCCGTGAA TCATCGAGGG 1406 1407 AAGTCTCTCT GGGTGGCAGT GGGTAAGCTT 1436 (SEQIDNO.l E SEQIDNO.2) ou um mutante ou um seu fragmento que pode ser usado para gerar uma resposta imune protectora num humano ou num animal contra a leishmaniose, e para uma composição farmacêutica para a prevenção e para o tratamento da leishmaniose nos humanos ou nos animais que compreende esta proteína ou um mutante ou seu fragmento que pode ser usada para gerar uma resposta imune protectora contra a leishmaniose num humano ou num animal. Esta proteína é derivada da inserção do gene PQV no vector de expressão pQE31. Aqui o dito gene quimérico preferencialmente codifica um polipeptídeo gerado com um peso molecular de 38 kD e um ponto isoeléctrico de 7.37.

Também, a invenção refere-se a uma vacina capaz de estimular a produção de anticorpos que reconhecem o parasita da Leishmania, que compreende a proteína acima mencionada ou um mutante ou fragmento dela que pode ser usada para gerar uma resposta imune protectora à leishmaniose num humano ou num animal.

Noutro aspecto a invenção abrange uma composição farmacêutica para a prevenção e para o tratamento, de leishmaniose nos humanos ou nos animais, que compreende anticorpos dirigidos contra a proteína acima mencionada ou um mutante ou um fragmento 18/59 desta, contendo preferencialmente um ou mais dos determinantes antigénicos como por exemplo um epítopo. A invenção refere-se também a um método para a prevenção ou para o tratamento de leishmaniose num humano ou num animal, que compreende a administração ao humano ou ao animal de uma composição farmacêutica como a acima descrita, ou a um método para prevenir a leishmaniose num humano ou num animal, que compreende a administração ao humano ou ao animal de uma vacina como a acima descrita. 0 gene quimérico formado das sequências de ADN que codificam os determinantes antigénicos das quatro proteínas de L. infantum e a proteína obtida, útil para prevenir e/ou para tratar a leishmaniose, que a invenção propõe, e ela própria constitui uma novidade óbvia dentro deste campo da aplicação, de acordo com a invenção, é produzido um gene quimérico sintético que é obtido por ensamblagem, que contém a região de ADN que codifica os determinantes antigénicos específicos para as proteínas LiP2a, LiP2b, LiPO e H2A, construindo assim uma proteína rica em determinantes antigénicos. 0 gene quimérico obtido é expresso em Escherichía coli e o produto foi analisado enquanto às suas propriedades antigénicas. Os resultados confirmaram que esta proteína quimérica mantém todos os determinantes antigénicos das proteínas mãe e que constitui um elemento relevante farmaceuticamente útil para a VL canina, com uma sensibilidade que oscila entre 80% e 93%, e uma especificidade entre 96% e 100%.

Mais particularmente, o gene quimérico formado pelas sequências de ADN que codifica os determinantes antigénicos das quatro proteínas de L. infantum e a proteína por eles codificada, útil para a prevenção e/ou para o tratamento da leishmaniose canina e proteína obtida objecto da invenção, são produzidos com as fases seguintes a saber: 19/59 - Construção do gene quimérico. Metodologia.

Estratégia de clonagem.

Clonagem das sequências de ADN que codificam os determinantes antigénicos da proteína de histona H2A.

Clonagem das sequências que codificam rLiP2a-Q e rLiP2b-Q. Clonagem da sequência rLiPO-Q.

Clonagem do gene quimérico. - Construção do gene quimérico a partir da construção de produtos intermediários.

Clonagem dos epítopos específicos para os antigénios L. infantum. - Construção do produto final

Construção do gene quimérico que codifica um polipeptídeo que contém todos os determinantes antigénicos seleccionados. - Expressão opcional da sequência assim obtida. - Avaliação do produto final.

Soro.

Purificação das proteínas

Electroforese das proteínas e imuno-análise.

Medidas por Fast-ELISA - Avaliação do produto final.

Propriedades antigénicas.

Sensibilidade e especificidade da proteína quimérica CP no diagnóstico do em soro do VL canino. A estratégia seguida pela clonagem das sequências de ADN que codificam cada um dos determinantes antigénicos seleccionados é a mesma para todos os casos, e numa primeira fase, a sequência 20/59 de interesse é amplificada com um PCR e com o uso de oligonucleotideos específicos que nas extremidades contêm marcadores para as enzimas de restrição.

Para a fase de clonagem, o produto amplificado é dirigido com a enzima de restrição apropriada e é inserido no sítio de restrição correspondente ao plasmídeo pUC18.

Após a sequenciação do ADN, o inserto é recuperado e subclonado para o sítio de restrição correspondente ao plasmídeo modificado denominado pMAL-c2. A modificação é feita com a inserção de um codão de terminação a jusante do marcador HindiII no polylinker de pMal-c2, denominando-se o plasmídeo resultante pMAL-c2*.

Relativamente à clonagem da sequência de ADN que codifica os determinantes antigénicos da proteína de histona H2A, salientamos que o ADNc do clone cL71, que codifica a histona H2A de L. infantum, é usado como um modelo para as reacções do PCR, e para a amplificação do ADN, que codifica a região terminal N da histona H2A, mais exactamente rLiH2A-Nt-Q, os seguintes oligonucleotideos: sentido 5'-CCTTTAGCTACTCCTCGCAGCGCCAAG-3' (posição 84-104 da sequência cL71); anti-sentido 5'CCTGGGGGCGCCAGAGGCACCGATGCG-3' (inverso e complementar para posição 204-224 da sequência cL71).

As sequências que são incluídas nos oligonucleotideos para a clonagem e que não estão presentes na sequência mãe cL-71 estão marcadas a negrito. O fragmento de ADN amplificado é clonado directamente desde o sítio de restrição Xmnl de pMAI-c2*. 21/59 0 fragmento é sequenciado com o iniciador #1234 malE e a região terminal C antigénica da histona H2A, em particular rLiH2A-Ct-Q, é amplificada com os oligonucleotideos seguintes. Estes são:

Sentido, 5'-GAATTCTCCGTAAGGCGGCCGCGCAG-3' (posição 276-296 da sequência cL71).

Anti-sentido, 5'-GAATTCGGGCGCGCTCGGTGTCGCCTTGCC-3' (inverso e complementar às posições 456- 476 do plasmideo cL71).

Um trio que codifica a prolina (indicado como GGG a seguir às letras sublinhadas) está incluído no oligonucleotídeo anti-sentido, o sítio de restrição EccRI que está incluído nos dois oligonucleotideos para a clonagem está sublinhado.

Enquanto à clonagem das sequências que codificam rLiP2a-Q, salientamos que as regiões de interesse são amplificadas por PCR dos ADNc que codificam LiP2a e LiP2b.

Os oligonucleotideos que foram usados para a construção do clone de expressão LiP2a-Q, foram os seguintes.

Sentido, 5'-GTCGACCCCATGCAGTACCTCGCCGCGTAC-3'.

Anti-sentido, 5'-GTCGACGGGGCCCATGTCATCATCGGCCTC-3'.

Salientamos que os sítios de restrição Sall adicionados nas extremidades 5' dos oligonucleotideos estão sublinhados.

Aquando da construção do clone de expressão LiP2b-Q, os oligonucleotideos usados foram:

Sentido, 5'-TCTAGACCCGCCATGTCGTCGTCTTCCTCGCC-3'.

Anti-sentido, TCTAGAGGGGCCATGTCGTCGTCGGCCTC-3'. 22/59 sítios de

Nas extremidades 5' dos oligonucleotídeos os restrições estão incluídos para a enzima Xbal (sublinhada) , e devido às necessidades de clonagem, um trio adicional, que codifica um resíduo de prolina, foi incluído a jusante do sítio de restrição.

Relativamente à clonagem da sequência rLiPO-Q, salientamos que a clonagem da sequência de ADN da região terminal C da proteína PO de L. infantum é efectuada pela amplificação de um clone de ADNc chamado L27 e pelos oligonucleotídeos seguintes:

Sentido, 5'-CTGCAGCCCGCCGCTGCCGCGCCGGCCGCC-3' (posições 1-24 de L27 ADNc) e o iniciador da sequência pUC18 (#1211), o ADN amplificado é dirigido pelas enzimas PstI+HindIII, com a inserção posterior no plasmídeo pMAL-c2. 0 clone resultante é denominado pPQI e salientamos que o sítio de restrição PstI está incluído no nucleotídeo com sentido (sequência sublinhada) e que o marcador de restrição HindIII está presente no ADNc L27.

Enquanto à clonagem do gene quimérico, salientamos que as sequências de ADN que codificam os cinco determinantes antigénicos são ensamblados num gene quimérico, e esta ensamblagem é efectuada no clone pPQI, para o qual as regiões que codificam as regiões antigénicas LiP2a-Q são adicionadas sequencialmente na direcção 3' (nomeadamente os resultados de clonagem pPQII), LiP2b-Q (clone pPQIII), LiH2a-Ct-Q (clone pPQIV) e LiH2A-Nt-Q (clone pPQV).

Por último, o inserto obtido depois da digestão SacI+HindIII do clone final pPQV é inserido no plasmídeo de expressão pQE31, nomeadamente o clone resultante pPQ.

DESCRIÇÃO DOS DESENHOS 23/59

Para completar a descrição que tem vindo a ser feita e com a finalidade de ajudar à melhor compreensão das características da invenção, a presente invenção é acompanhada, como uma parte íntegra, por um conjunto de planos de natureza ilustrativa que não são limitativos. Em, que o seguinte está representado: A figura 1 corresponde à expressão (A) , purificação em colunas de amilose (B) e a antigenicidade (C: Western blot; D: ELISA) de cada uma das proteínas recombinantes fundida com uma proteína de ligação de maltose. A figura D também apresenta a reactividade no ELISA de cada uma das proteínas recombinantes para a proteína completa. A figura 2 é uma representação gráfica dos diferentes vectores considerados para obter o gene quimérico objecto da invenção, ao qual será extraído a proteína pertinente destinada a realizar um diagnóstico preciso nos animais ou nos humanos que mostrem sintomas de leishmaniose. A figura 3 corresponde à identificação de uma proteína obtida de um gene quimérico fundido com a proteína MBP, cuja preparação está representada na figura 2. A figura 4 corresponde à expressão (A) , purificação em colunas de amilose (B) e a antigenicidade (C: Western blot; F: ELISA) dos intermediários e da proteína quimérica final fundida com uma proteína de ligação de maltose (PQI- PGV). Esta figura também representa a expressão da proteína quimérica (D fila 1), purificação em colunas de agarose Ni-Nt (D fila 2) e a antigenicidade da proteína purificada contra um VL em soro (E: Western blot) e contra um conjunto de soros (F: PQ em ELISA). A figura 5 mostra por último uma representação gráfica sintetizada da reactividade de uma ampla variedade de soros caninos, divididos em três grupos. 0 primeiro grupo continha 24/59 animais com uma infecção real por L. infantum. 0 segundo grupo incluia soro obtido de cães com vários sintomas clinicos mas que não estavam infectados com Leishmania, e um terceiro grupo feito com quinze soros de controlo de cães sadios. Esta figura demonstra o valor da invenção para efectuar diagnósticos serológicos de VL.

FORMA PREFERIDA DE REALIZAR A INVENÇÃO 0 gene quimérico formado das sequências de ADN que codificam os determinantes antigénicos das quatro proteínas de L. infantum, útil para o diagnóstico serológico da leishmaniose canina e a proteina obtida que tem vindo a ser proposta são constituídos a partir da construção de produtos intermediários. Num primeiro exemplo, é efectuada a clonagem dos epitopos específicos para os antigénios de L. infantum, que é configurada baseada nos estudos anteriores sobre as propriedades antigénicas das quatro proteínas antigénicas de L. infantum (LiP2a, PiPO, LiP2b, LiH2a), as quais permitem a existência de epitopos B a serem definidos por essas proteínas, e que são especificamente reconhecidos pelo soro canino de VL.

Com o fim de melhorar a especificidade antigénica destes antigénios em relação às proteínas de L. infantum, os determinantes específicos antigénicos são clonados dessas proteínas. Depois de deletar certas regiões destas proteínas eles podem ser reconhecidos por soros de animais que são portadores de VL e outras doenças diferentes.

Com o uso dos oligonucleotídeos específicos e com a amplificação por PCR das regiões específicas aos genes LiP2a, LiP2b, PO e H2A, vários clones são construídos que expressam as proteínas recombinantes rLiPO-Ct-Q, rLiP2a-Q, rLiP2b-Q, rLiH2A-Ct-Q e rLiH2A-Nt-Q, que foram justamente detalhadas na descrição da invenção onde está detalhada a metodologia, em que são descritos os pormenores da clonagem. 25/59

As proteínas recombinantes usadas são as seguintes -rLiPO-Ct-Q, que corresponde a 30 resíduos terminal C da proteína ribossómica LiPO. rLiP2a-Q e rLiP2b-Q, que são derivados das proteínas ribossómicas LiP2a e LiP2b respectivamente. duas sub-regiões de histona H2A, que correspondem a 46 resíduos terminal N (xLiH2A-Nt-Q), e a 67 resíduos terminal C (resíduos (xLiH2A-Ct-Q).

Cada uma das proteínas recombinantes fundidas com a proteína de ligação de maltose (MBP) é expressa em E. coli, como o representado na figura número IA, e elas foram purificadas por cromatografia de afinidade numa coluna de amilose B. Depois do processo de purificação a electroforese foi efectuada nas proteínas recombinantes (fila de 1 a 5) .

Com o objectivo de analisar se as proteínas recombinantes foram reconhecidas pelo soro canino de VL, um Western blot foi incubado, que continha as proteínas recombinantes numa mistura de três soros caninos de VL. Supondo que todos estas proteínas são reconhecidas pelo soro, concluímos que os determinantes antigénicos presentes nas proteínas mãe são mantidas nas proteínas recombinantes (C) .

As propriedades antigénicas das proteínas recombinantes são comparadas com os determinantes antigénicos dos antigénios pai com um FAST ELISA, testados em relação a uma recolha de 26 soros caninos de VL, tal como o mostrado na secção da figura número 1D, e devido ao facto que o soro mostrou um valor de reactividade similar, ambos contra as regiões antigénicas seleccionadas e as correspondentes proteínas completas, 26/59 demonstra que durante o procedimento de clonagem nenhuma alteração se deu no epítopo antigénico.

Relativamente à construção do produto final, mais exactamente do gene quimérico que codifica um polipeptídeo que contém todos os determinantes antigénicos seleccionados, é de salientar que a estratégia da clonagem está indicada na seguinte figura número 2 secção A.

Os produtos intermediários gerados durante o processo são mostrados.

Um clone que expressa as proteínas rLiPO-Ct-Q (pPQI) é usado como vector inicial, e os fragmentos de ADN que codificam as proteínas rLiPO-Ct-Q, rLiP2a-Q, rLiP2b-Q, rLiH2A-Ct-Q e rLiH2A-Nt-Q são adicionados sequencialmente usando sitios de restrição apropriados.

Depois de cada fase de clonagem, a orientação correcta de cada um dos insertos é deduzida do tamanho dos produtos de expressão, e finalmente a sequência de nucleotideos completa do clone final pPQV é determinada e a sequência de aminoácidos deduzida da sequência representada na figura número 3. 0 polipeptideo gerado tem uma massa molecular de 38 kD, com um ponto isoeléctrico de 7.37, incluindo as sequências separadoras que codificam a prolina, sublinhada na figura número 3. 0 objectivo disto é para separar eficazmente os dominios antigénicos e evitar possíveis conformações terciárias que poderiam interferir na estabilidade e na antigenicidade do produto final. A expressão e a recuperação de cada um dos produtos intermediários são mostradas na figura número 4, nas caixas A e B. como o esperado, depois de cada adição, o tamanho do produto 27/59 de expressão no vector pMAL aumenta gradualmente até atingir um peso molecular de 80 kDa, observando-se um certo grau de ruptura durante a purificação. O gene quimérico foi também clonado no plasmideo pQE, um vector que permite a expressão de proteinas com um fragmento de 6 histidinas na extremidade terminal N. O clone resultante e as proteinas recombinantes foram denominadas pPQ e PQ respectivamente. O nivel de expressão da proteina na bactéria transformada com o plasmideo pPQ e as proteinas purificadas são mostradas na figura número 4, referidas em particular com um D, com a proteina PQ, purificado por cromatografia de afinidade a qual em condições desnaturadas é mais estável do que a proteina recombinante pPQV representada na figura número 4, na caixa D linha 2.

Para avaliar o produto final uma série de materiais foram usados, e obviamente algumas técnicas, como as abaixo descritas.

Foram usados soros de VL obtidos de cães com origens diferentes. Os animais foram clinica e analiticamente avaliados no laboratório pertinente, geralmente num Departamento de Parasitologia, e todos os soros positivos foram examinados para imunofluorescência indirecta (IIF). A presença de amastigotas dos parasitas destes animais foi confirmada pela observação directa dos gânglios linfáticos popliteos e pré-escapulares, e um segundo grupo de 33 soros de VL soro originários de outras regiões, deram um diagnóstico positivo no ELISA contra os extractos da proteina total do parasita e/ou por IIF.

Os soros dos cães afectados por outras doenças que não era a VL foram obtidos de diferentes origens. Neste grupo de soros as infecções seguintes foram encontradas: 28/59

Mesocestoides spp.

Dyphylidium caninum Uncinaria stenocephala Toxo cara canis Dipetalonema dranunculoides Demodex canis Babesia canis Ehrlichi a cannís Ricketsia ricketsiae. 0 resto dos soros foram obtidos de cães que exibiam vários sintomas clínicos que não estavam relacionados com nenhum processo infeccioso, e os controlos de soro foram obtidos de quinze animais sadios cuidadosamente controlados. A purificação das proteínas recombinantes expressas pelos clones pMAl-c2 foram efectuadas por cromatografia de afinidade em colunas de amilose, e a purificação da proteína recombinante expressa pelo clone pPQ foi efectuada em colunas de resina Ni-NTA em condições desnaturadas (Qiagen).

Para a análise das proteínas, foi efectuada a electroforese em géis de poliacrimida 10% na presença de SDS em condições Standard. A análise imunológica das proteínas separadas pela electroforese foi efecutada em membranas de nitrocelulose para as quais as proteínas foram transferidas. As proteínas 29/59 transferidas foram bloqueadas com 5% leite desnatado seco num tampão PBS com 0.5% de Tween 20.

Os filtros foram sequencialmente postos em contacto com um antisoro primário e secundário em soluções de bloqueio e um imunoconjugado marcado com peroxidase foi usado como segundo anticorpo, visualizando a ligação especifica com um sistema ECL. A figura 4E mostra um Western blot da proteina PQ.

Em vez da ELISA clássica foi utilizado o Fast-ELISA, e a sensibilização do antigénio foi efectuada durante 12 horas à temperatura ambiente.

As placas foram sensibilizadas com 100 pl de antigénio cuja concentração em todos os casos era de 2 pg/ml.

Depois da sensibilização dos poços as placas foram incubadas durante 1 hora com solução de bloqueio (0.5% leite desnatado em pó dissolvido em PBS-0.5% Tween 20 e os soros foram diluídos trezentas vezes na solução de bloqueio).

Os poços foram incubados com soro durante 2 horas à temperatura ambiente, e depois da exposição dos anticorpos os poços foram lavados com PBS-Tween 20.

Os anticorpos marcados com peroxidase foram usados como segundos anticorpos a uma diluição de 1:2000 e a cor da reacção foi desenvolvida usando como substrato a ortofenilenodiamina, sendo a absorção medida em 450 nm.

Enquanto à avaliação do produto final, salientamos que as propriedades antigénicas foram determinadas com o estudo pertinente da reactividade do VL em soro canino contra a proteína quimérica e contra cada um dos produtos intermediários num ensaio Western blot. Durante todo o processo de clonagem, 30/59 todos os produtos intermediários assim como o produto final pPQV mantiveram a sua antigenicidade (figura 4C).

Salientamos também que a proteina recombinante expressa pelo plasmideo pPQ foi reconhecida pelo VL em soro. Com o fim de analisar com uma grande precisão as propriedades antigénicas da proteina quimérica e dos produtos intermediários, uma análise da reactividade de uma grande variedade de VL em soros caninos foi executada com um fast-ELISA contra as proteínas recombinantes, como o mostrado na secção F da figura número 4. Destacamos que a sensibilidade dos diferentes produtos intermediários da clonagem aumenta depois de cada fase de adição. Salientamos também que a proteina pQI é reconhecida pela maioria de VL em soro e a proteina PQII igualmente pela maioria dos soros. Esta proporção é maior para a proteina PQIII e as proteínas PQIV, PQV e PQ são praticamente reconhecidas por todos os soros.

De acordo com o que foi até agora discutido, a percentagem de reconhecimento mostrada pelos soros foi idêntica tanto no caso dos ensaios das proteínas quiméricas PQV e PQ, como nos ensaios de uma mistura de proteínas recombinantes rLiPO- Ct-Q, rLiP2a, rLiP2b e rLiH2A. Foi visto que as propriedades antigénicas de cada uma das 5 regiões antigénicas seleccionadas estavam presentes no produto de expressão PQ, e portanto este produto pode ser usado para o diagnóstico em vez de uma mistura de antigénios expressos individualmente.

Com o fim de determinar se a proteína quimérica pode ser usada para o diagnóstico VL em soro canino, e de acordo com a análise pertinente de uma grande variedade de soros caninos contra esta proteína, tendo em consideração que de acordo com as características clínicas dos animais, os soros caninos foram classificados em três grupos. Um primeiro grupo constituído por soros de cães com uma infecção real de L. infantum. Um segundo grupo estava composto por soros de cães que tinham vários sintomas clínicos sem estarem infectados com Leishmania, 31/59 diferentes da com incluindo cães infectados com parasitas Leishmania, e que poderiam exibir sintomas clínicos que poderiam ser confundidos com aqueles observados durante leishmaniose. 0 terceiro grupo foi feito com soros de controlo, originários de cães sadios.

Na figura número 5 os valores médios de reactividade são mostrados para cada grupo de soros, a reactividade do VL em soros atingiu um valor médio de reactividade de 0.8 (S. D. 0.4).

Neste grupo, a reactividade de 12 soros foi positiva mas menor do que 0.35, enquanto que a reactividade de 10 soros atingiu valores entre 0.35 e 0.5. Foi observado que a reactividade de 23 soros variou entre 0.5 e 1.0, com 14 soros mostrando uma reactividade maior do que 1.0. O valor de absorção média dos soros do segundo grupo, isto é, o grupo infectado com parasitas diferentes dos parasitas de Leishmania, foi 0.2 (S. D. = 0.05) e a reactividade dos soros de controlo, isto é, o terceiro grupo, foi 0.1 (S. D. = 0.003) . Somente dois soros do grupo 2 mostraram reactividade entre 0.35 e 0.40.

Os dados acima apresentados indicam que a proteína quimérica PQ no FAST ELISA têm uma sensibilidade de 80% para o diagnóstico VL, se o valor de corte é definido como o valor da reactividade média dos soros do grupo 2 mais três de S. D. (isto é 0.35). A sensibilidade do grupo testado atinge 93%, se o valor de corte é definido pelos valores da reactividade do grupo de controlo. A proteína Q tem uma especificidade de 96% para o diagnóstico V, quando o valor de corte é definido pelo soro anteriormente mencionado do grupo 2. No ensaio 100% da especificidade foi atingida quando foram considerados os valores da reactividade de cães sadios. 32/59 0 processo a ser usado é o seguinte: 1. As placas de microtitulação são cobertas com anticorpos por 100 μΐ incubados de uma solução que contém 1 pg/ml de antigénio dissolvido num tampão PBS-0.5% de Tween 20-5% leite desnatado (tampão A). A incubação é efectuada durante 12 horas à temperatura ambiente, e seguidamente as placas são lavadas três vezes com o mesmo tampão que não contém antigénio. As placas com antigénios secos poderão ser mantidas à temperatura ambiente. 2. A primeira incubação dos poços foi efectuada com o soro de um animal com uma diluição de 1/200 no tampão A. A incubação durou 1 hora. 3. Como o descrito no ponto 1, os poços foram lavados três vezes com o tampão A, com um matraz de lavagem. 4. Eles foram incubados com um segundo anticorpo (IgG marcados com peróxido) diluídos 1: 2000 num tampão A, sendo a incubação efectuada durante 1 hora. 5. Os poços foram lavados três vezes outra vez com tampão A, como o indicado na terceira secção, isto é com um matraz de lavagem. 6. A reactividade é revelada usando o substrato com ortofenilenodiamina e a absorção foi medida a 450 nm. A proteína usada para o diagnóstico extraída do gene quimérico é identificada, e a sequência de nucleotídeos que codifica a dita proteína, é a seguinte: 33/59 1 45 ATG AGA GGA TCT CAC CAC CAC CAC CAC CAC ACG GAT CCG CAT GCG Met Arg Gly Ser His His His His His His Thr Asp Pro His Ala 5 10 15 46 90 AGC TCG AAC AAC AAC AAC AAT AAC AAT AAC AAC AAC CTC GGG ATC Ser Ser Asn Asn Asn Asn Asn Asn Asn Asn Asn Asn Leu Gly Ile 20 25 30 91 135 GAG GGA AGG CCT TTA GCT ACT CCT CGC AGC GCC AAG AAG GCC GTC Glu Gly Arg Pro Leu Ala Thr Pro Arg Ser Ala Lys Lys Ala Vai 35 40 45 136 180 CGC AAG AGC GGC TCC AAG TCC GCG AAA TGT GGT CTG ATC TTC CCG Arg Lys Ser Gly Ser Lys Ser Ala Lys Cys Gly Leu Ile Phe Pro 50 55 60 181 225 GTG GGC CGC GTC GGC GGG ATG ATG CGC CGC GGC CAG TAC GCT CGC Vai Gly Arg Vai Gly Gly Met Met Arg Arg Gly Gin Tyr Ala Arg 65 70 75 226 270 CGC ATC GGT GCC TCT GGC GCC CCC AGG ATT TCA GAA TTC TCC GTG Arg Ile Gly Ala Ser Gly Ala Pro Arg Ile Ser Glu Phe Ser Vai 80 85 90 34/59 271 315 AAG GCG GCC GCG CAG AGC GGG AAG AAG CGG TGC CGC CTG AAC CCG Lys Ala Ala Ala Gin Ser Gly Lys Lys Arg Cys Arg Leu Asn Pro 95 100 105 316 360 CGC ACC GTG ATG CTG GCC GCG CGC CAC GAC GAC GAC ATC GGC ACG Arg Thr Vai Met Leu Ala Ala Arg Bis Asp Asp Asp Ile Gly Thr 110 115 120 361 405 CTT CTG AAG AAC GTG ACC TTG TCT CAC AGC GGC GTT GTG CCG AAC Leu Leu Lys Asn Vai Thr Leu Ser His Ser Gly Vai Vai Pro Asn 125 130 135 406 450 ATC AGC AAG GCG ATG GCA AAG AAG AAG GGC GGC AAG AAG GGC AAG Ile Ser Lys Ala Met Ala Lys Lys Lys Gly Gly Lys Lys Gly Lys 140 145 150 391 495 GCG ACA CCG AGC GCG CCC GAA TTC GGA TCC TCT AGA CCC ATG TCC Ala Thr Pro Ser Ala Pro Glu Phe Gly Ser Ser Arg Pro Met Ser 155 160 165 496 540 ACC AAG TAC CTC GCC GCG TAC GCT CTG GCC TCC CTG AGC AAG GCG Thr Lys Tyr Leu Ala Ala Tyr Ala Leu Ala Ser Leu Ser Lys Ala 170 175 180 541 585 TCC CCG TCT CAG GCG GAC GTG GAG GCT ATC TGC AAG GCC GTC CAC Ser Pro Ser Gin Ala Asp Vai Glu Ala Ile Cys Lys Ala Vai His 185 190 195 596 630 ATC GAC GTC GAC CAG GCC ACC CTC GCC TTT GTG ATG GAG AGC GTT Ile Asp Vai Asp Gin Ala Thr Leu Ala Phe Vai Met Glu Ser Vai 200 205 210 641 675 ACG GGA CGC GAC GTG GCC ACC CTG ATC GCG GAG GGC GCC GCG AAG Thr Gly Arg Asp Vai Ala Thr Leu Ile Ala Glu Gly Ala Ala Lys 215 220 225 676 720 ATG AGC GCG ATG CCG GCG GCC AGC TCT GGT GCC GCT GCT GGC GTC Met Ser Ala Met Pro Ala Ala Ser Ser Gly Ala Ala Ala Gly Vai 230 235 240 721 765 ACT GCT TCC GCT GCG GGT GAT GCG GCT CCG GCT GCC GCC GCC GCG Gly Asp Ala Ala Pro Ala Ala Ala Ala Ala Lys Lys Asp Glu Pro 245 250 255 35/59 766 810 AAG AAG GAC GAG ccc GAG GAG GAG GCC GAC GAC GAC ATG GGC CCC Thr Ala Ser Ala Ala Glu Glu Glu Ala Asp Asp Asp Met Gly Pro 260 265 270 811 855 TCT AGA GTC GAC ccc ATG CAG TAC CTC GCC GCG TAC GCC CTC GTG Ser Arg Vai Asp Pro Met Gin Tyr Leu Ala Ala Tyr Ala Leu Vai 275 280 285 856 900 GCG CTG TCT GGC AAG ACG CCG TCG AAG GCG GAC GTT CAG GCT GTC Ala Leu Ser Gly Lys Thr Pro Ser Lys Ala ASP Vai Gin Ala Vai 290 295 300 901 945 CTG AAG GCC GCC GGC GTT GCC GTG GAT GCC TCC CGC GTG GAT GCC Leu Lys Ala Ala Gly Vai Ala Vai Asp Ala Ser Arg Vai Asp Ala 305 315 315 946 990 GTC TTC CAG GAG GTG GAG GGC AAG AGC TTC GAT GCG CTG GTG GCC Vai Phe Gin Glu Vai Glu Gly Lys Ser Phe Asp Ala Leu Vai Ala 320 325 330 991 1035 GAG GGC CGC ACG AAG CTG GTG GGC TCT GGC TCT GCC GCT CCT GCT Glu Gly Arg Thr Lys Leu Vai Gly Ser Gly Ser Ala Ala Pro Ala 335 340 345 1036 1080 GGC GCT GTC TCC ACT GCT GGT GCC GGC GCT GGC GCG GTG GCC GAG Gly Ala Vai Ser Thr Ala Gly Ala Gly Ala Gly Ala Vai Ala Glu 350 355 360 1081 1125 GCG AAG AAG GAG GAG CCC GAG GAG GAG GAG GCC GAT GAT GAC ATG Ala Lys Lys Glu Glu Pro Glu Glu Glu Glu Ala Asp Asp Asp Met 365 370 375 1136 1170 GGC CCC GTC GAC CTG CAG CCC GCC GCT GCC GCG CCG GCC GCC CCT Gly Pro Vai Asp Leu Gin Pro Ala Ala Ala Ala Pro Ala Ala Pro 380 385 390 1171 1215 AGC GCC GCT GCC AAG GAG GAG CCG GAG GAG AGC GAC GAG GAC GAC Ser Ala Ala Ala Lys Glu Glu Pro Glu Glu Ser Asp Glu Asp Asp 395 400 405 TTC GGC ATG GGC GGT CTC TTC TAAGCGACTC GCCATCTCTT 1256 Phe Gly Met Gly Gly Leu Phe 410 412 36/59 1258 AGCCTCCTTG TGGTGCGCTT GAGGTGCTCT CGCTCTGCTT CTCCTTGCAG 1306 1307 TGTTGGCTGA CTCTGGCGGG TATGTGCCGT CGCATTACAC CCACCTCTCC 1356 1357 CACCCCTTTG CCCTACGCGC TCGCATGCGC AATCCGTGAA TCATCGAGGG 1406 1407 AAGTCTCTCT GGGTGGCAGT GGGTAAGCTT 1436 (SEQ ID NO. 1 E SEQ ID NO.2) Não consideramos necessário alongar esta descrição para que um técnico especializado possa compreender o âmbito da invenção e as vantagens que ela confere.

Os materiais, forma, tamanho e disposição dos elementos são susceptiveis de serem mudados, mas a sua modificação não supõe uma mudança na essência da invenção.

Os termos sob a qual esta descrição foi escrita deverão ser sempre considerados no seu sentido mais lato e não como limitativos da invenção.

Vacina contra Leishmanía A imunidade intensa que se segue a uma recuperação de leishmaniose cutânea tem dado um grande impulso ao desenvolvimento das vacinas profilácticas contra esta doença. Esta imunidade é derivada da indução de uma resposta T a qual tem associada a produção das citoquinas inflamatórias que activam os macrófagos e destroem os parasitas. A memória imunológica nos casos de infecção é provavelmente mantida pela presença persistente do parasita no hospedeiro num processo conhecido como imunidade concomitante. 37/59

Os primeiros estudos referentes à vacinação contra Leishmania na década dos anos 40 usavam como imunogenes parasitas vivos. Estes estudos conduziram à produção de vacinas que produziram uma protecção significativa contra uma reinfecção subsequente. No entanto, o conhecimento da possibilidade que organismos vivos podiam produzir infecções reais conduziu a que estes programas de vacinação não fossem realizados durante muito tempo e, pelo contrário, o interesse foi enfocado para as vacinas baseadas nos parasitas mortos. Esses estudos forneceram a primeira evidência sobre a possibilidade da produção de vacinas eficazes por inoculação de parasitas.

As vacinas de subunidade têm sido fortemente enfocadas nos antigénios da proteina porque estes são fáceis de identificar, isolar e clonar. No entanto, é necessário ter em consideração que nem todas as moléculas da vacina potencial têm de ser proteínas. De facto, a lipofosfoglicana (LPG) desempenha um papel fundamental no estabelecimento da infecção. O problema principal com o uso das subunidades pode ser devido ao facto de que pode não haver uma resposta a um único antigénio numa população geneticamente diferente. A Vacinação com ácidos nucleicos que transportam genes que codificam as proteínas da Leishmania envolvem a administração de material genético do parasita ao hospedeiro. O primeiro vector de ADN que foi administrado como vacina continha o gp63. Também, o gene PSA-2 foi introduzido num plasmídeo e tem sido observado que gera uma resposta Th-1 e indução de protecção.

Uma proteína artificial denominada Q foi recentemente descrita pelo nosso grupo, esta está composta por vários fragmentos antigénicos de 4 proteínas de Leishmania infantum (mais especificamente, Lip2a, Lip2b, PO e H2A), as quais, depois de 38/59 terem sido usadas como antigénio, provaram que tinham um valor importante para o diagnóstico da leishmaniose canina, com 93% de sensibilidade e 100% de especificidade quando comparada com os soros dos animais de controlo que não estavam infectados. Igualmente, o nosso grupo tem demonstrado que a proteína Hsp70 de Leishmania infantum é um marcador importante da resposta imune nas infecções provocadas pela infecção com este parasita.

Com o fim de explorar a possibilidade que a proteína Q pode ser usada para desenhar sistemas de protecção contra a infecção por Leishmania infantum, tanto ela própria ou em combinação com Hsp70, três séries de experiências foram desenhadas usando como cobaia um hamster. Uma experiência foi desenhada para verificar se a imunização com proteína Q protege os animais contra infecção a curto prazo, outra para controlar se a imunização os protege a longo prazo e o terceiro foi para verificar este efeito protector após a imunização com as duas proteínas juntas. Foi depois observado que tanto na a curto prazo assim como na análise a longo prazo, que a proteína Q foi capaz de extrair uma resposta imune a qual reduz a carga parasítica tanto no fígado como no baço depois da infecção por Leishmania infantum na maioria dos animais imunizados, e que a imunização com as proteínas Q+Hsp70 também induz a uma resposta significativa contra as duas proteínas e conduz a uma redução significativa da carga parasítica na maioria dos animais imunizados.

Exemplo 1: Imunização com a proteína Q 4 animais foram imunizados com 5 microgramas da proteína Q dissolvida em 40 microlitros de adjuvante de Freund, e outros 4 animais foram imunizados com a mesma quantidade de adjuvante emulsionado com 40 microlitros de solução salina PBS sem a proteína. Na primeira imunização, o adjuvante completo de Freund foi empregue combinado com a proteína, enquanto que nas duas imunizações subsequentes, foram usados o adjuvante incompleto de

Freund misturado com a proteína na mesma proporção de 39/59 proteína/adjuvante. Três imunizações via intraperitoneal foram efectuadas com intervalos de 15 dias. Começando a partir da segunda semana depois de cada imunização e durante o período total de imunização, foram extraídas amostras de sangue para medir a resposta humoral contra a proteína Q nos ensaios ELISA. Foi observado que já na segunda semana após a primeira imunização havia uma resposta de IgG positiva contra a proteína Q, e que esta resposta foi alta depois da segunda semana a seguir à infecção, e aumentava com tempo de imunização atingindo títulos de 1/100.000. Foi igualmente observado que a resposta imune contra a proteína Q não sofreu uma modificação significativa depois da infecção com o parasita da figura 1.

Quinze dias depois da terceira imunização, os animais foram infectados com uma dose de 105 parasitas promastigotas, diferenciados dos amastigotas infecciosos originados a partir de um hamster infectado. Tinha sido previamente verificado que o inoculo era capaz de induzir uma parasitemia severa juntamente com a doença quatro meses depois de os parasitas terem sido administrados, em 100% dos animais infectados. O quadro 1 indica o nível de parasitemia por mg tanto dos tecidos do fígado como do baço nos animais de controlo e nos animais vacinados. É possível observar que em todos os animais vacinados a carga parasítica no fígado diminui em relação aos controlos, e que isto acontece de uma maneira muito significativa em 75% deles. Quando a carga parasítica no baço foi examinada, foi possível observar que também em 75% dos animais esta carga foi significativamente mais baixa do que a dos controlos, atingindo o RPL 83%-86%. O animal em que o RPL no fígado era 20% , no baço era 48%. 40/59

Quadro 1. Carga parasítica no fígado e no baço dos hamsters vacinados com proteína Q via intraperitoneal. Depois de quatro semanas de infecção, a carga parasítica foi medida com o método de diluição limite (curto prazo). A carga parasítica está expressa como parasitas por miligrama de tecido. RPL = redução na carga parasítica em %.

Hamsters imunizados com a proteína Q

Hamster Figado (RPL) Baço (RPL) 1 4 ±1 (71%) 4 9± 3 (83%) 2 3 ±2 (78%) 39± 2 (86%) 3 5 ±1 (64%) 50± 4 (83%) 4 11 ±3 (20%) 153119 (48%)

Os números representam a média de três determinações

Controlos 4 hamsters 14 ±5 295 ± 30 O número representa a média de 4 animais.

Exemplo 2

Para verificar o efeito da vacinação com a proteína Q na redução da carga parasítica a longo largo, usando outra via de inoculação, 4 animais foram injectados subcutaneamente com 5 microgramas de proteína Q dissolvidas em 40 microlitros de PBS e misturado com 40 microlitros de adjuvante de Freund. Na primeira imunização, foi empregue o adjuvante completo de Freund, enquanto que nas duas imunizações subsequentes foi usado o

adjuvante incompleto de Freund como o acima indicado. A vacinação foi administrada em três doses com intervalos de 15 dias. Quinze dias depois da terceira imunização foi-lhes administrado um inoculo de 105 parasitas infecciosos. Durante todo o período de imunização e durante a totalidade da infecção 41/59 (cinco meses) foram extraídas amostras de sangue para determinar o tipo de resposta humoral contra a proteína Q e contra as proteínas totais do parasita. A figura 2 mostra que já depois da segunda semana de imunização, a resposta contra a proteína Q foi positiva, como no caso anterior, em três dos ratos, e que a resposta contra a proteína era muito elevada passadas duas semanas depois da primeira imunização. A resposta continuou a ser muito alta depois das imunizações restantes, atingindo uma concentração de 1/75.000 na semana seguinte à terceira imunização. Num dos animais a resposta contra proteína Q foi mais lenta em relação ao tempo, apesar de que a resposta atingiu o nível que a dos outros animais no final da experiência. Consequentemente, a partir dos dados derivados dos exemplos 1 e 2, é possível concluir que o grau da resposta imune contra a proteína, pelas duas vias, intraperitoneal e subcutânea, é muito rápida, apesar de que a resposta via intraperitoneal conseguiu títulos mais altos no mesmo tempo (1/75.000 versus 1/30.000). A figura 3 indica a resposta contra proteína Q nos animais de controlo. É possível observar que a reactividade contra esta proteína é detectada entre a 12a. e a 14a. semana depois da infecção, que é quando os primeiros sintomas atribuíveis a uma potencial leishmaniose começam a ser detectados nos animais infectados. O quadro 2 mostra os níveis de parasitemia no fígado e no baço nos animais de controlo e nos animais vacinados. Podemos ver que 50% dos animais estavam protegidos ao nível do fígado, no sentido que a redução no nível de parasitemia era muito elevada (87-89%). Um dos animais não estava protegido, enquanto que nos outros animais a redução da carga parasítica foi de 22%. Pelo contrário, a redução da carga parasítica foi de 98-99% em 100% dos animais ao nível do baço. 42/59

Quadro 2. Carga parasítica no fígado e no baço dos hamsters vacinados com proteína Q por via subcutânea. Depois de 20 semanas de infecção, a carga parasítica foi medida pelo método de diluição limite (longo prazo). A carga parasítica está expressa em parasitas por miligrama de tecido. RPL = redução na carga parasítica em %.

Hamsters imunizados com a proteína Q

Hamster Figado (RPL) Baço (RPL) 1 1.4xl06 (22%) 1.0x107 (98%) 2 2.0x105 (89%) 4.9x105 (99.9%) 3 2.4x105 (87%) 3.3x105 (99.9%) 4 2.4xl06 (0%) 6.3x105 (99.9%) 0 número representa a média de três determinações Controlos 4 hamsters. 1.8xl06 ±1.2105 5.2108 ± 2 . 610 7 Os números representam a média da carga parasítica dos 4 animais Com o objectivo de testar se a proteína Q poderia ser usada para desenhar sistemas de protecção nas formulações que continham a proteína LiHsp70 de Leishmania infantum, uma experiência foi efectuada em ratos Balb/c. Foi observado que depois da imunização, a carga parasítica tanto no fígado como no baço foi reduzida significativamente, sendo em alguns animais, de uma ordem de magnitude 4 vezes inferior.

Exemplo 3: imunizações com proteína Q + proteína Hsp70 em adjuvante de Freund.

Cada um dos 4 hamsters foi injectado intraperitonealmente com 5 microgramas de proteína Q e 5 microgramas de proteína LiHsp70 dissolvidas em 40 microlitros de PBS e emulsionadas em 40 microlitros de adjuvante de Freund. Na primeira imunização, foi 43/59 empregue o adjuvante completo de Freund, enquanto nas duas imunizações seguintes foi usado o adjuvante incompleto de Freund como acima indicado. A vacinação foi administrada em três doses com intervalos de 15 dias.

Quinze dias depois da terceira imunização foi-lhes administrado um inoculo de 106 parasitas infecciosos via intracardiaca e foram sacrificados na 22a semana. De duas semanas em duas semanas, durante todo o período de imunização e da totalidade da infecção, foi-lhes extraído o sangue para determinar o grau de resposta humoral contra proteína Q e contra a proteína LiHsp70.

No quadro 3 está mostrada a carga parasítica relativa entre os ratos imunizados com a proteína Q mais LiHsp70. Foi observado que todos os animais estavam altamente protegidos e nalguns deles, no baço, a redução foi cerca três a duas ordens de magnitude.

Quadro 3. Carga parasítica relativa de ratos Balb/c imunizados com a proteína Q mais proteína LiHsp70 depois de 4 meses de infecção.

Ratos imunizados com a proteína Q e com a proteína LiHsp70

Rato Fígado (RPL) Baço (RPL) 1 1.5x103 (97%) 1.5xl04 (99%) 2 0.9x103 (98%) 1.4xl03 (99%) 3 2.0x104 (60%) 5.6xl04 (99%) 4 0.8x104 (84%) 1.2xl05 (96%)

Os números representam a média das três determinações.

Controlos 4 ratos 5.1x104±2x103 3.2xl06±8xl04

Os números representam a média da carga parasítica dos 4 animais. 44/59

Os quadros 4 e 5 mostram que todos os animais dos exemplos 1 e 2 respondem imunologicamente à proteína Q, e que começando na segunda semana depois da imunização a resposta contra a proteína Q foi alta e esta resposta aumentou depois da segunda imunização (4a. semana). 0 quadro 6 mostra que a resposta contra a proteína LiHsp70 durante a toda a experiência foi também positiva, apesar de ser mais baixa do que a resposta no exemplo 3 contra a proteína Q . Os quadros 4 e 5, mostram a resposta imune em 4 hamsters injectados intraperitonealmente com 5 microgramas de proteína Q (quadro 4 - exemplo 1, curto prazo) e a resposta imune em 4 hamsters injectados subcutaneamente com 5 microgramas de proteína Q (Quadro 5 exemplo 2, longo prazo).

Quadro 4: Exemplo 1, curto prazo.

Ratos imunizados com a proteína Q (curto prazo) resposta imune contra a proteína Q Semana Rato 1 Rato 2 Rato 3 Rato 4 2 0,8 0,2 0,3 0, 6 4 1, 9 2,3 1,1 2,1 6 infectados 3 3 2,4 2, 9 8 3 3 2,9 3 10 3 3 3 3

Mostrando os soros (diluídos 1/200) uma densidade óptica de 3 tendo um título maior do que 1/45.000.

Ratos de controlo 45/59

Resposta imune contra a proteína Q (curto prazo). Semana Rato 1 Rato 2 Rato 3 Rato 4 2 0 0 0 0 4 0 0 0 0 6 0 0 0 0 8 0 0 0 0 10 0 0 0 0

Os soros foram diluídos 1/200

Quadro 5: Exemplo 2, longo prazo. Ratos imunizados com a proteína Q (longo prazo) . Resposta imune contra a proteína Q. Semana Rato 1 Rato 2 Rato 3 Rato 4 2 1,8 1,3 1, 9 0,4 4 2,1 1,8 2,2 0,7 6 2,5 2,7 2,5 LO O 8 2,8 2,2 2,2 O CO 10 3 2, 9 2,5 0,7 12 3 3 3 0, 9 14 3 3 3 1 16 3 3 2, 9 1,5 18 3 3 3 1,7 20 3 3 3 2,2 22 3 3 3 2, 6 24 3 3 3 3 26 3 3 3 3 Mostrando os soros (diluídos 1/200) uma densidade óptica de 3 tendo uma concentração maior do que 1/45.000. Ratos de controlo Resposta imune contra a proteína Q (longo prazo). Semana Rato 1 Rato 2 Rato 3 Rato 4 2 0 0 0 0 46/59 4 0 0 0 0 6 0 0 0 0 8 0 0 0 0 10 0 0 0 0 12 0,2 \—1 o 0,3 \—1 o 14 0,3 0,5 0,4 0,2 16 0,4 0,5 0,7 0,3 18 0, 9 1,1 1,7 0, 6 20 1,1 1,3 LO \—1 O co 22 2,5 2,3 2,7 1, 9 24 2,3 2,1 1,8 2,2 26 1, 9 2,2 2,3 2,7 Os soros foram diluídos 1/200

Quadro 6. Mostra a resposta imune em 4 hamsters injectados intraperitonealmente com 5 microgramas de proteína Q mais 5 microgramas de proteína LÍHSP70 (exemplo 3, longo prazo). 47/59

Ratos imunizados com a proteína Q + proteína Hsp70 Resposta imune contra a proteína Q. Semana Rato 1 Rato 2 Rato 3 Rato 4 2 0,4 0, 6 LO O 0,4 4 1, 6 1,1 1, 6 1,7 6 3 2 1, 9 1, 9 8 3 2,4 2, 6 2,5 10 3 2, 9 3 2, 9 12 2,7 2, 9 2, 9 2, 9 14 2,5 2, 6 2, 9 2,7 16 2, 6 2,5 2,5 2,4 18 2,8 2,7 2,7 2,5 20 2,5 2,8 2,4 2,7 22 2,5 2,4 2,8 2, 9

Os soros foram diluídos 1/800 Ratos de controlo Resposta imune contra a proteína Q Semana Rato 1 Rato 2 Rato 3 Rato 4 2 0 0 0 0 4 0 0 0 0 6 0 0 0 0 8 0 0 0 0 10 0 0 0 0 12 0 0,1 CM V O 0,1 14 0,3 0,4 CM V O LO O 16 0,5 0, 6 0,7 0,7 18 0,8 1,4 1,7 1,5 20 1,8 1, 6 1,8 2,2 Os soros foram diluídos 1/200 Ratos imunizados com a proteína Q + Hsp70 Resposta imune contra a proteína Hsp70 Semana Rato 1 Rato 2 Rato 3 Rato 4 2 0,1 0,2 0,1 0,4 4 0,4 0, 6 0,3 0,5 6 O co 0,7 0,4 00 0 1 _ 8 0,7 1,1 1,2 0,5 10 1,2 1,4 1,5 0,8 12 1,9 1,9 2 1,2 14 2 1,8 2,2 1,7 16 1,9 2 2,2 1,9 18 2 2,1 2 2 20 2 2,1 2,2 1,9 22 2,4 2,3 2,1 1,9 Os soros foram diluídos 1/800 Ratos de controlo Resposta imune contra a proteína Hsp70 Semana Rato 1 Rato 2 Rato 3 Rato 4 2 0 0 0 0 48/59 4 0 0 0 0 6 0 0 0 0 8 0 0 0 0 10 0 0 0 0 12 0,1 0 0,3 0 14 0,3 CM O 0,5 0,4 16 LO O 0, 6 0, 6 0,3 18 0,7 0, 6 0,7 LO O 20 1 00 o 0,5 1,2 22 1,7 1,4 00 o 1,1 Os soros foram diluídos 1/200

Exemplo 4: Imunização com proteína Q + BCG nos ratos Balb/c A quatro ratos Balb/c foram injectadas intraperitonealmente 5 microgramas de proteína Q e 106 unidades formadoras de colónias (Colony Formíng Units CFU) de BCG (bacilo de Calmette-Guérin) dissolvidas em 40 microlitros de PBS. A imunização foi efectuada em três doses, com 15 dias de intervalo. 15 dias depois da terceira imunização, foi-lhes administrado via intracardiaca um inoculo de parasitas infecciosos de 105 BCN150 de L. Infantum. De duas em duas semanas, durante todo o tempo de imunização e durante a infecção, foi-lhes tiradas amostras de sangue para testar o grau da resposta humoral à proteína Q. Na 8a. semana depois da infecção os animais foram sacrificados. O quadro 7 (a e b) mostra que os animais imunizados responderam positivamente à proteína Q começando a partir da segunda semana e que a resposta aumenta progressivamente até que em muitos casos atinge valores de 400,000. O quadro 8 mostra a diferença da carga parasitária entre o fígado e baço dos animais vacinados e dos animais de controlo. 49/59

Quadro 7: Resposta imune à proteína Q nos ratos Balb/c imunizados com 5 microgramas de proteína Q e 106 CFU de ratos BCG 1, 2, 3, 4 ratos imunizados 5, 6, 7, ratos de controlo não imunizados.

Quadro 7: Reacção à proteína Q

Semana Rato 1 Rato 2 Rato 3 Rato Pré-imune 0 0 0 0 1a. imunização 1 0 0,2 \—1 O 0 2 a. imunização 3 LO O 0,7 o co 0, 9 3a. imunização 6 1, 6 2,1 2, 6 2,7 7 1,8 2,3 2,4 2,1 9 2,1 2,6 2,5 1, 9 11 2,7 2,9 3 3 13 3 3 3 3 Semana Rato 5 Rato 6 Rato 7 Rato Pré-imune 0 0 0 0 1a. imunização 1 0 0 0 0 2 a. imunização 3 0 0 0 0 3a. imunização 6 0 0 0 0 7 0 0 0 0 9 0 0 0 0 11 0 0 0 0 13 0 0 0 0 0 número 3 é equivalente a um excedente no sistema de medição Os soros foram tirados no início de cada uma das semanas indicadas 50/59 A Ia. imunização foi efectuada no dia 0 a 2a. no 15°. dia e a 3a. no 30°. dia

Quadro 8. Carga parasitária no figado e no baço dos ratos Balb/c vacinados subcutaneamente com a proteina Q + 106 de BCG. 8 semanas depois da infecção, a carga parasitária foi medida por microscopia óptica de impressões de tecido com a medição de campos diferentes contendo 7000 células nucleadas. A carga parasitária está representada como a quantidade de parasitas por miligrama de tecido, tendo sido previamente calculado que 1 parasita por 1000 células nucleadas é equivalente a uma quantidade aproximada de 210 parasitas por miligrama de tecido. RPB = redução de carga parasitária, %.

Rato Figado (RPB) Baço (RPB) 1 72 (82%) 457 (89%) 2 40 (90%) 207 (95%) 3 48 (88%) n.d. (100%) 4 n.d. (100%) 90 (98%)

Controlos 4 animais Média 400115 4155130 n.d. parasitas que não puderam ser detectados em 5000 células nucleadas 51/59

LISTAGEM DAS SEQUÊNCIAS <110> C.B.F. Leti, SA <12 0> Gene quimérico formado das sequências de ADN que codificam os determinantes antigénicos das quatro proteínas de L. Infantum <130> P042418EP1 <140> PCT <141> 1999-12-23 <160> 12 <17 0> Patentln Ver. 2.1 <210> 1 <211> 412 <212> PRT <213> Sequência artificial <22 0> <223> PQ31 descrição da sequência artificial: proteína Q expressa em <4 0 0> 1 52/59

Met Arg Gly Ser His His His His His His Thr Asp Pro His Ala Ser 1 5 10 15 Ser Asn Asn Asn Asn Asn Asn Asn Asn Asn Asn Leu Gly Ile Glu Gly 20 25 30 Arg Pro Leu Ala Thr Pro Arg Ser Ala Lys Lys Ala Vai Arg Lys Ser 35 40 45 Gly Ser Lys Ser Ala Lys Cys Gly Leu Ile Phe Pro Vai Gly Arg Vai 50 55 60 Gly Gly Met Met Arg Arg Gly Gin Tyr Ala Arg Arg Ile Gly Ala Ser 65 70 75 80 Gly Ala Pro Arg Ile Ser Glu Phe Ser Vai Lys Ala Ala Ala Gin Ser 85 90 95 Gly Lys Lys Arg Cys Arg Leu Asn Pro Arg Thr Vai Met Leu Ala Ala 100 105 110 Arg His Asp Asp Asp Ile Gly Thr Leu Leu Lys Asn Vai Thr Leu Ser 115 120 125 His Ser Gly Vai Vai Pro Asn Ile Ser Lys Ala Met Ala Lys Lys Lys 130 135 140 Gly Gly Lys Lys Gly Lys Ala Thr Pro Ser Ala Pro Glu Phe Gly Ser 145 150 155 160 Ser Arg Pro Met Ser Thr Lys Tyr Leu Ala Ala Tyr Ala Leu Ala Ser 53/59 165 170 175

Leu Ser Lys Ala Ser Pro Ser Gin Ala Asp Val Glu Ala Ile Cys Lys 180 185 190 Ala Vai His Ile Asp Val Asp Gin Ala Thr Leu Ala Phe Val Met Glu 195 200 205 Ser Vai Thr Gly Arg Asp Vai Ala Thr Leu Ile Ala Glu Gly Ala Ala 210 215 220 Lys Met Ser Ala Met Pro Ala Ala Ser Ser Gly Ala Ala Ala Gly Val 225 230 235 240 Thr Ala Ser Ala Ala Gly Asp Ala Ala Pro Ala Ala Ala Ala Ala Lys 245 250 255 Lys Asp Glu Pro Glu Glu Glu Ala Asp Asp Asp Met Gly Pro Ser Arg 260 265 270 Vai Asp Pro Met Gin Tyr Leu Ala Ala Tyr Ala Leu Val Ala Leu Ser 275 280 285 Gly Lys Thr Pro Ser Lys Ala Asp Val Gin Ala Val Leu Lys Ala Ala 290 295 300 Gly Vai Ala val Asp Ala Ser Arg Val Asp Ala Val Phe Gin Glu Val 305 310 315 320 Glu Gly Lys Ser Phe Asp Ala Leu Val Ala Glu Gly Arg Thr Lys Leu 325 330 335 Vai Gly Ser Gly Ser Ala Ala Pro Ala Gly Ala Val Ser Thr Ala Gly 340 345 350 Ala Gly Ala Gly Ala Val Ala Glu Ala Lys Lys Glu Glu Pro Glu Glu 355 360 365 Glu Glu Ala Asp Asp Asp Met Gly Pro Val Asp Leu Gin Pro Ala Ala 370 375 380 Ala Ala Pro Ala Ala Pro Ser Ala Ala Ala Lys Glu Glu Pro Glu Glu 385 390 395 400 Ser Asp Glu Asp Asp Phe Gly Met Gly Gly Leu Phe 405 410

<210> 2 <211> 1436 <212> ADN <213> Sequência artificial <22 0>

<223> descrição da sequência artificial: ADN que codifica a proteína Q 54/59 <400> 2 atgagaggat ctcaccacca aacaataaca ataacaacaa 120 gccaagaagg ccgtccgcaa 180 gtgggccgcg tcggcgggat 240 ggcgccccca ggatttcaga 300 tgccgcctga acccgcgcac 360 cttctgaaga acgtgacctt 420 gcaaagaaga agggcggcaa 480 tctagaccca tgtccaccaa 540 tccccgtctc aggcggacgt 600 gccaccctcg cctttgtgat 660 gagggcgccg cgaagatgag 720 actgcttccg ctgcgggtga 780 gaggaggagg ccgacgacga 840 gcgtacgccc tcgtggcgct 900 ctgaaggccg ccggcgttgc 960 gagggcaaga gcttcgatgc 1020 tctgccgctc ctgctggcgc 1080 gcgaagaagg aggagcccga 1140 cagcccgccg ctgccgcgcc 1200 agcgacgagg acgacttcgg 1260 tccttgtggt gcgcttgagg 1320 ggcgggtatg tgccgtcgca 1380 atgcgcaatc cgtgaatcat 1436 ccaccaccac acggatccgc cctcgggatc gagggaaggc gagcggctcc aagtccgcga gatgcgccgc ggccagtacg attctccgtg aaggcggccg cgtgatgctg gccgcgcgcc gtctcacagc ggcgttgtgc gaagggcaag gcgacaccga gtacctcgcc gcgtacgctc ggaggctatc tgcaaggccg ggagagcgtt acgggacgcg cgcgatgccg gcggccagct tgcggctccg gctgccgccg catgggcccc tctagagtcg gtctggcaag acgccgtcga cgtggatgcc tcccgcgtgg gctggtggcc gagggccgca tgtctccact gctggtgccg ggaggaggag gccgatgatg ggccgcccct agcgccgctg catgggcggt ctcttctaag tgctctcgct ctgcttctcc ttacacccac ctctcccacc cgagggaagt ctctctgggt atgcgagctc gaacaacaac 60 ctttagctac tcctcgcagc aatgtggtct gatcttcccg ctcgccgcat cggtgcctct cgcagagcgg gaagaagcgg acgacgacga catcggcacg cgaacatcag caaggcgatg gcgcgcccga attcggatcc tggcctccct gagcaaggcg tccacatcga cgtcgaccag acgtggccac cctgatcgcg ctggtgccgc tgctggcgtc ccgcgaagaa ggacgagccc accccatgca gtacctcgcc aggcggacgt tcaggctgtc atgccgtctt ccaggaggtg cgaagctggt gggctctggc gcgctggcgc ggtggccgag acatgggccc cgtcgacctg ccaaggagga gccggaggag cgactcgcca tctcttagcc ttgcagtgtt ggctgactct cctttgccct acgcgctcgc ggcagtgggt aagctt

<210> 3 <211> 328 <212> PRT <213> Sequência artificial <22 0> 55/59 <223> Descrição da Sequência artificial: proteina Q expressa em pMal <400> 3

Ile Glu Gly Arg Pro Leu Thr Pro Arg Ser Ala Lys Lys Ala Vai Arg 1 5 10 15 Lys Ser Gly Ser Lys Ser Ala Lys Cys Gly Leu Ile Phe Pro Vai Gly 20 25 30 Arg Vai Gly Gly Met Met Arg Arg Gly Tyr Ala Arg Arg Ile Gly Ala 35 40 45 Ser Gly Ala Pro Arg Ile Ser Glu Phe Ser Vai Lys Ala Ala Ala Gin 50 55 60 Ser Gly Lys Lys Arg Cys Arg Leu Asn Pro Arg Thr Vai Met Leu Ala 65 70 75 80 Ala Arg His Asp Asp Asp Ile Gly Thr Leu Leu Lys Asn Vai Thr Leu 85 90 95 Ser His Ser Gly Vai Vai Pro Asn Ile Ser Lys Ala Met Ala Lys Lys 100 105 110 Lys Gly Gly Lys Lys Gly Lys Ala Thr Pro Ser Ala Pro Glu Phe Gly 115 120 125 Asp Ser Ser Arg Pro Met Ser Thr Lys Tyr Leu Ala Ala Tyr Ala Leu 130 135 140 Ala Ser Leu Ser Lys Ala Ser Pro Ser Gin Ala Asp Vai Glu Ala Ile 145 150 155 160 Cys Lys Ala Vai His Ile Asp Vai Asp Gin Ala Thr Leu Ala Phe Vai 165 170 175 Met Glu Ser Vai Thr Gly Arg Asp Vai Ala Thr Leu Ile Ala Glu Gly 180 185 190 Ala Ala Lys Met Ser Ala Met Pro Ala Ala Ser Ser Gly Ala Ala Ala 195 200 205 Gly Vai Thr Ala Ser Ala Ala Gly Asp Ala Ala Pro Ala Ala Ala Ala 210 215 220 Ala Lys Lys Asp Glu Pro Glu Glu Glu Ala Asp Asp Asp Met Gly Pro 225 230 235 240 Ser vai Arg Asp Pro Met Gin Tyr Leu Ala Ala Tyr Ala Leu Vai Ala 245 250 255 Leu Ser Gly Lys Thr Pro Ser Lys Ser Thr Ala Gly Ala Gly Ala Gly 260 265 270 Ala Vai Ala Glu Ala Lys Lys Glu Glu Pro Glu Glu Glu Glu Ala Asp 275 280 285 56/59

Asp Asp Met Gly Pro Vai Asp Leu Gin Pro Ala Ala Ala Ala Pro Ala 290 295 300 Ala Pro Ser Ala Ala Ala Lys Ala Ala Pro Glu Glu Ser Asp Glu Asp 305 310 315 320 Asp Phe Gly Met Gly Gly Leu Phe 325 <210> 4 <211> 27 <212> ADN <213> Sequência artificial <22 0> <223> Descrição da sequência artificial: oligonucleotideo <4 0 0> 4 cctttagcta ctcctcgcag cgccaag 27 <210> 5 <211> 27 <212> ADN <213> Sequência artificial <22 0> <223> Descrição da sequência artificial: oligonucleotideo <4 0 0> 5 cctgggggcg ccagaggcac cgatgcg 27 <210> 6 <211> 26 <212> ADN <213> Sequência artificial <22 0> <223> Descrição da sequência artificial: oligonucleotideo 57/59 <4Ο0> 6 gaattctccg taaggcggcc gcgcag 26

<210> 7 <211> 30 <212> ADN <213> Seguência artificial <22 0> oligonucleotideo <223> Descrição da seguência artificial: <400> 7 gaattcgggc gcgctcggtg tcgccttgcc 30

<210> 8 <211> 30 <212> ADN <213> Seguência artificial <22 0> oligonucleotideo <223> Descrição da seguência artificial: <400> 8 gtcgacccca tgcagtacct cgccgcgtac 30

<210> 9 <211> 30 <212> ADN <213> Seguência artificial <22 0> oligonucleotideo <223> Descrição da seguência artificial: <400> 9 gtcgacgggg cccatgtcat catcggcctc 30 58/59 <210> 10 <211> 32 <212> ADN <213> Sequência artificial <22 0> <223> Descrição da sequência artificial: oligonucleotideo <4 0 0> 10 tctagacccg ccatgtcgtc gtcttcctcg cc 32 <210> 11 <211> 29 <212> ADN <213> Sequência artificial <22 0> <223> Descrição da sequência artificial: oligonucleotideo <4 0 0> 11 tctagagggg ccatgtcgtc gtcggcctc 29 <210> 12 <211> 30 <212> ADN <213> Sequência artificial <22 0> <223> Descrição da sequência artificial: oligonucleotideo <4 0 0> 12 ctgcagcccg ccgctgccgc gccggccgcc 30

Lisboa, 59/59

Claims (10)

1. REIVINDICAÇÕES 1. Uma composição farmacêutica para a prevenção e para o tratamento da leishmaniose nos humanos e nos animais caracterizada por esta compreender: a. uma proteina Q que tem a sequência de aminoácidos como a mostrada na SEQ ID NO: 1 ou tendo pelo menos 90% de identidade de aminoácidos com a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:l e a qual gera uma resposta imune contra leishmaniose combinada com b. a proteina LiHsp70 completa ou fragmentada.
2. 2. A composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 1, caracterizada por a proteina Q estar ligada à proteina LiHsp70.
3. 3. Uma composição farmacêutica para a prevenção e para o tratamento da leishmaniose num humano e num animal caracterizada por esta compreender: a. um vector que contém a sequência que codifica a proteina Q como o definido na Ia reivindicação e b. um vector que contém a sequência que codifica a proteina LiHsp70 como o definido na Ia reivindicação.
4. 4. A composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 3, caracterizada por um mesmo vector conter ambas sequências como o definido na 3a. reivindicação.
5. 5. A composição farmacêutica de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 4, caracterizada por esta ser adequada para ser administrada intraperitoneal, subcutânea ou intramuscularmente. 1/2
6. 6. A composição farmacêutica de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 5, caracterizada por esta adicionalmente compreender um adjuvante fisiológico adequado para ser administrado intraperitoneal subcutânea ou intramuscularmente.
7. 7. A composição farmacêutica de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 6, caracterizada por esta ser uma vacina.
8. 8. A composição farmacêutica de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 7, caracterizada por esta ser usada para gerar uma resposta imune.
9. 9. 0 uso de uma composição farmacêutica de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 8, caracterizada por esta ser utilizada para a preparação de um medicamento para a prevenção ou para o tratamento da leishmaniose num humano ou num animal.
10. 10. O uso de acordo com a reivindicação 9, caracterizado por o medicamento ser uma vacina. Lisboa, 2/2