BRPI9916549B1

BRPI9916549B1 - Composição farmacêutica, proteína, polinucleotídeo

Info

Publication number: BRPI9916549B1
Application number: BRPI9916549-0A
Authority: BR
Inventors: Carlos Bedate Alonso
Original assignee: C.B.F. Leti, S.A.
Priority date: 1998-12-23
Filing date: 1999-12-23
Publication date: 2018-10-02
Also published as: BG105725A; ATE429498T1; CN1335889A; IL143956A0; CY1105331T1; HRP20010554A2; MXPA01006548A; HUP0104743A3; LU93259I2; ATE327332T1; NL300830I1; PT1624063E; NL300830I2; ES2326174T3; ES2273519T3; TR200102655T2; AU759316B2; EP1141305B1; CY2016033I1; AU2434200A

Abstract

"composição farmacêutica, vacina, proteína, e, método para a prevenção ou tratamento de leishmaniose em um humano ou animal". a presente invenção se refere a uma composição farmacêutica para a prevenção e tratamento, humano ou animal, de leishmaniose. a composição farmacêutica contém a proteína quimera q, que é o produto de um gene quimérico codificando a determinação antigênica de quatro proteínas de leishmaniose infantum.

Description

(54) Título: COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA, PROTEÍNA, POLINUCLEOTÍDEO (51) lnt.CI.: C12N 15/30; C12N 15/62; C07K 14/44; C07K 16/20; A61K 31/70; A61K 38/16; A61K 39/395; A61P 33/02 (30) Prioridade Unionista: 23/12/1998 CA 2,256,124, 23/12/1998 US 60/113,825 (73) Titular(es): C.B.F. LETI, S.A.

(72) Inventor(es): CARLOS BEDATE ALONSO (85) Data do Início da Fase Nacional: 22/06/2001 “COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA,

POLINUCLEOTÍDEO”.

OBJETO DA INVENÇÃO

PROTEÍNA,

O presente relatório descritivo diz respeito a um pedido pSfã - v’’ uma Patente de Invenção, com respeito a um gene quimérico formado das seqüências de DNA que codificam os determinantes antigênicos de quatro proteínas de L. infantum, e a proteínas codificadas por dito gene quimérico, útil para a prevenção ou tratamento da leishmaniose, em particular da leishmaniose canina. A finalidade óbvia disto situa-se no uso da seqüência do gene ou da proteína obtida do gene quimérico para prover composições farmacêuticas para prevenir ou tratar da leishmaniose, em particular a leishmaniose canina, que pode estar presente no corpo de um paciente, por exemplo como uma vacina ou uma preparação de anticorpos monoclonais. Este paciente não tem de ser um cão, mas também pode ser um ser humano que soffa de doenças que envolvam a imunodepressão. Para se obter isto, será produzido um gene quimérico que codifique uma proteína denominada PQ, consistindo de um produto quimérico originário de uma síntese “zn vitro” de um gene quimérico construído “ad hoc”, que contenha cinco dos determinantes antigênicos de quatro diferentes proteínas. O produto é configurado como altamente sensível e específico para, por exemplo, gerar uma resposta imune protetora contra a leishmaniose canina, ou para preparar anticorpos contra a leishmaniose canina.

CAMPO DA INVENÇÃO

Esta invenção é de utilidade dentro da indústria dedicada à fabricação de produtos farmacêuticos em geral.

FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO

Os protozoários parasíticos do gênero Leishmania são os agentes etiológicos que causam a leishmaniose, uma faixa de doenças que $3

têm uma distribuição mundial e que são caracterizadas no fato de que elas dão origem a uma ampla variedade de sintomas clínicos.

As principais formas de leishmaniose são zoonóticas por natureza e os seres humanos são considerados como hospedeiros 5 secundários.A espécie denotada como L. infantum, amplamente distribuída na totalidade de muitas áreas do Mar Mediterrâneo, é a causa da leishmaniose visceral (LV) nos seres humanos e em cães.

De fato, os cães infectados com L. infantum são a principal reserva animal deste parasita, particularmente durante longo período de 0 incubação antes que os sintomas clínicos possam ser observados.

Os dados epidemiológicos indicam que existe uma correlação direta entre a prevalência da leishmaniose canina e a transmissão do parasita aos seres humanos. Por esta razão, é crucial detectar a doença ou a infecção prematuramente em campanhas empreendidas para controlar a expansão da 15 doença.

O parasita é transmitido ao vertebrado hospedeiro como um promastigoto flagelar, por meio de uma picada de um mosquito da família “Phlebotominae”, e o parasita entra nas células dos fagos mononucleares em _ que eles se diferenciam e reproduzem como amastigotos dentro da estrutura IΣΣ2Ο fagolisossômica.

As células infectadas se agrupam em certos tecidos, principalmente no baço, no fígado e nos linfonodos. Estima-se que cerca de

- 15 milhões de pessoas sejam infectadas com a leishmaniose, e a cada ano, no , mundo, 500.000 novos casos clínicos apareçam no mundo, principalmente no mundo subdesenvolvido e em desenvolvimento.

Nos países do sudoeste da Europa, a leishmaniose visceral (VL) é uma doença zoonótica causada pela espécie L. Infantum, como foi anteriormente mencionado. Dados recentes derivados de estudos epidemiológicos indicam que existe uma incidência alarmante desta infecção.

Na Itália, os dados relatados quanto à incidência de VL variam de 14,4% a 37%, de acordo com a região.

Em Portugal, mais particularmente na área ao redor de Lisboa, os índices de soropositivos de 8,4% têm sido observados, e na região dos Alpes Marítimos Franceses têm sido observados diferentes centros de predominância que variam entre 3,2% e 17,1%.

Na Espanha, a predominância da leishmaniose depende da zona em estudo. Na Catalunha, um índice médio de incidência de 9,3% tem sido observado, não obstante em alguns pontos quentes uma predominância de cães infectados de até 18% tenha sido observada.

Na Ilha de Malorca, o índice de incidência é de 14%, e outros índices que têm sido observados são: 2,4% em Murcia, 8,8% em Granada, de 10 a 15% em Salamanca, 5,25% na província de Madri, e de 14% em Cáceres.

Embora o número de casos de VL em seres humanos, causados por L. infantum possam ser considerados relativamente baixos, o elevado percentual de pacientes com imunodepressão que se tomaram infectados por leishmânia pode estar relacionado ao alto nível desta doença | em cães.

|20 De fato, no Sul da Europa, 50% dos adultos que são infectados por leishmaniose são também pacientes infectados com o vírus de HIV. Por outro lado, de acordo com estes dados de infecção simultânea de leishmâniaHIV, tem-se estimado que o nível de infecção (por parasitas) pode ser de uma ou duas ordens de grandeza mais elevado do que este número, devido à existência de um grande número de infecções não detectadas.

Uma característica comum dos diferentes tipos de infecção de

Leishmânia é que ela induz a uma forte resposta humoral no hospedeiro.

Portanto, os processos de diagnóstico com base em técnicas sorológicas são presentemente os mais amplamente usados.

Foi descrito que estes anticorpos são detectados mesmo durante a fase assintomática da doença em infecções naturais e experimentais.

φ20

A sensibilidade e especificidade destes processos dependem do tipo, da fonte e da pureza do antígeno usado. Em processos imunológicos que são correntemente comercializados, promastigotos completos e preparações mais ou menos preparadas destes, são usadas como uma fonte de antígeno. Este processo normalmente conduz a reações cruzadas com o soro de pacientes que estejam padecendo de lepra, tuberculose, tripanosomíase, doença de Chagas, malária e outras parasitoses.

A sensibilidade e especificidade dos processos sorológicos dependem do tipo, da fonte e da pureza do antígeno empregado. Durante os últimos anos, um grande número de antígenos da Leishmânia tem sido caracterizado, alguns deles podendo ser considerados como proteínas específicas para o parasita.

Entre estas proteínas específicas para o parasita, a protease de superfície GP63, a glicoproteína gp46 de superfície e a proteína KMP-11 associada com lipofosfoglicano, merecem uma menção.

Um grupo adicional de antígenos da Leishmânia é formado de proteínas evolucionariamente conservadas, tais como a cinesina, as proteínas termicamente induzidas, a actina e a tubulina.

Como parte de uma estratégia para desenvolver um sistema diagnóstico sorológico específico para a leishmaniose canina, um projeto com base em laboratório foi empreendido para identificar os antígenos de L. infantum, por meio de uma pesquisa de imunodetecção de uma biblioteca de expressão para genes de L. infanctum, usando-se soro de cães com leishmaniose visceral ativa.

Foi observado que a maioria dos antígenos isolados por este processo pertence à família de proteínas conservadas no decurso de evolução.

φ20

Α identificação dos epítopos B destes antígenos indica, no entanto, que, em todos os casos, os determinantes antigênicos foram localizados em regiões que não eram bem conservadas.

Em particular, as proteínas ribossômicas ácidas LiP2a e LiP2b são reconhecidas por mais do que 80% dos soros de VL.

Tem sido confirmado que estas proteínas contêm determinantes antigênicos específicos da doença, e que as proteínas recombinantes LiP2a e LiP2b, das quais um fragmento tenha sido removido, podem ser usadas como um instrumento específico capaz de distinguir entre a VL e a doença de Chagas.

Tem sido observado também que a proteína ribossômica PO de L. infantum, muito altamente conservada na escala evolucionária, é reconhecida por um alto percentual de soros de VL de cães. Além disso, os determinantes antigênicos são observados exclusivamente no término C da proteína, o que eqüivale a dizer, na região em que foi fracamente conserva no decurso da evolução.

Foi observado que, em 78% dos soros de VL de cães, os anticorpos contra a proteína H2A estão também presentes, e foi confirmado que, a despeito da identidade da seqüência em todas as proteínas H2A entre os organismos eucaripticos, a resposta humoral a esta proteína nos soros de VL é particularmente provocada por determinantes específicos à proteína H2A da Leishmânia.

Os determinantes antigênicos reconhecidos pelos soros de VL de cães são encontrados em ambos os términos da proteína H2A.

A solução óbvia para o problema correntemente encontrado nesta técnica deveria ser possuir-se uma invenção que permitisse a montagem de um gene quimérico sintético que contivesse as regiões de DNA codificando os determinantes antigênicos específicos para as proteínas LiP2a,

LiP2b, LiPO e H2A, com vistas a construir uma proteína rica em *

^Υ

φ20 determinantes antigênicos.

No entanto, tanto quanto seja do conhecimento do requerente, não existe presentemente nenhuma invenção que contenha as características descritas como ideais, com vistas a alcançar-se o objetivo desejado. Este objetivo é a construção de uma proteína rica em determinantes antigênicos, que se originem da montagem de um gene sintético quimérico que contenha as regiões de DNA codificando os determinantes antigênicos específicos às proteínas acima mencionadas.

DESCRIÇÃO DA INVENÇÃO

Em um primeiro aspecto, a invenção diz respeito a um gene quimérico formado pelas sequências de DNA que codificam determinantes antigênicos de quatro proteínas de L. infantum, úteis para prevenir ou tratar a leishmaniose canina.

Em um outro aspecto, a invenção diz respeito a uma proteína codificada pelo dito gene quimérico, contendo um ou mais dos determinantes antigênicos de quatro proteínas de L. infantum codificadas pelo gene quimérico.

A invenção ainda diz respeito a um processo para prevenir e/ou tratar leishmaniose canina em um ser humano ou um animal. Neste processo terapêutico, o gene quimérico da invenção ou a proteína codificada por ele podem ser usados. Igualmente, os anticorpos contra a proteína codificada pelo gene quimérico da invenção, ou uma sua parte antigênica, tal como um epítopo, podem ser usadas.

Em outros aspectos, a invenção diz respeito a composições farmacêuticas para a prevenção e/ou tratamento, em seres humanos e/ou animais, de leishmaniose, compreendendo uma substância ativa derivada, ou direcionada contra, o gene quimérico da invenção e/ou a proteína codificada por ele, ou partes dele. A substância ativa é preferivelmente tal que ela pode ser usada em uma composição farmacêutica para o tratamento e/ou prevenção da leishmaniose.

Em particular, a composição farmacêutica será em uma forma de uma vacina, contendo a proteína codificada pelo gene quimérico da invenção, ou uma ou mais de suas partes, contendo um ou mais dos determinantes antigênicos da proteína codificados pelo gene quimérico da invenção.

φ20 *

Assim sendo, em um outro aspecto, a invenção diz respeito a uma composição farmacêutica para a prevenção e tratamento, de seres humanos ou de animais, de leishmaniose, formada:

a) pela proteína Quimera Q, ou uma variante desta proteína contendo modificações ou substituições de aminoácidos preservados administrados a um paciente (humano ou animal), ou

b) pela proteína Q na forma isolada ou combinada com qualquer adjuvante fisiológico pela via intraperitoneal, subcutânea ou intramuscular.

A invenção também diz respeito a uma vacina que seja capaz de estimular a produção de anticorpos que reconheçam o parasita da leishmânia, formada:

a) pela proteína Quimera Q ou uma variante desta proteína, que difira da proteína Q nos aminoácidos preservados, administrada a um paciente (humano ou animal), ou

b) pela proteína Q na forma isolada ou combinada com um adjuvante fisiológico pela via intraperitoneal, subcutânea ou intramuscular.

Além disso, a invenção diz respeito a uma composição farmacêutica para a prevenção e tratamento, de ser humano ou animal, de leishmaniose, formada:

a) pela proteína Q, ou uma variante desta proteína contendo modificações ou substituições de aminoácidos preservados, combinada com a proteína LiHsp70, completa ou fragmentada, administrada a um paciente

I

φ20 (humano ou animal), ou

Em ainda outro aspecto, a invenção diz respeito a uma composição farmacêutica para a prevenção e tratamento, de ser humano ou animal, de leishmaniose, formada:

a) por qualquer vetor de DNA conduzindo a seqüência que codifica para a proteína Quimera Q, ou uma variante daquela seqüência que contenha modificações ou substituições de nucleotídeos que codificam para aminoácidos preservados, administrado a um paciente (humano ou animal), ou

b) por um vetor de DNA que contenha a proteína Q combinada com um adjuvante fisiológico, administrado pela via intraperitoneal, intramuscular ou subcutânea.

Outro aspecto da invenção diz respeito a uma composição farmacêutica para a prevenção e tratamento, de ser humano ou de animal, da leishmaniose, formada:

a) por qualquer vetor de DNA carregando:

1) a seqüência que codifica para a proteína Quimera Q, ou uma variante daquela seqüência que contenha modificações ou substituições de nucleotídeos que codificam para os aminoácidos preservados, e

2) a seqüência de nucleotídeos que codifica para a proteína LiHsp70 ou variantes desta que difiram com respeito aos aminoácidos preservados, administrada a um paciente (ser humano ou animal), ou

b) por qualquer vetor que contenha a seqüência de DNA que codifica para a proteína Q como definido sob a), administrado com um adjuvante fisiológico pela via intraperitoneal, intramuscular ou subcutânea.

Em uma outra modalidade, a composição farmacêutica da invenção compreende anticorpos direcionados à proteína codificada pelo iúú

φ20 gene quimérico da invenção, ou partes deste.

As preparações farmacêuticas da invenção podem ainda conter todos os adjuvantes, solventes, tampões etc., por si conhecidos para composições farmacêuticas e/ou vacinas.

Em um outro aspecto, a invenção diz respeito a um processo para o tratamento ou prevenção da leishmaniose, usando-se uma composição farmacêutica ou uma vacina de acordo com a invenção, ou uma preparação que compreenda anticorpos dirigidos contra a proteína codificada pelo gene quimérico da invenção.

Este processo geralmente compreenderá administrar uma substância ativa dirigida contra o gene quimérico ou a proteína a um ser humano ou animal, tal como um cão, em uma quantidade farmaceuticamente ativa.

Para a prevenção da leishmaniose, uma vacina compreendendo a proteína codificada pelo gene quimérico, ou codificando uma ou mais partes da dita proteína compreendendo um ou mais dos determinantes antigênicos, será administrada a um ser humano para eliciar uma resposta imune protetora.

A administração das preparações, anticorpos e/ou vacinas da invenção podem ser realizadas em uma maneira por si conhecida, tal como oralmente, intramuscularmente, intravenosamente, subcutaneamente, por infusão (gotejamento), etc. Preferivelmente, a preparação ou uma vacina é injetada, enquanto, quanto a uma preparação de anticorpos, uma infusão pode ser usada.

Deve ser observado que, quando é aqui feita referência ao gene quimérico da invenção, esta expressão também abrange as seqüências de ácido nucleico que podem hibridizar com a seqüência mencionada abaixo sob condições de hibridização moderadas ou severas.

Neste contexto, as condições de hibridização heteróloga

φ20 podem ser como segue: hibridização em 6 x SSC (20xSSC por 1000 ml : 175,3 g de NaCl, 107,1 g de citrato de sódio.5H₂O, pH 7,0), SDS 0,1%, pirofosfato de sódio a 0,05%, 5* solução de Denhardt [100 x solução de Denhardt por 500 ml: 10 g de Ficoll-400, 10 g de poli vinil pirrolidona, 10 g de soro albumina bovino (Pentax Fraction V)] e 20 pg/ml de DNA de esperma de arenque desnaturado a 56°C por 18 a 24 horas, seguido por duas lavagens de 30 minutos em 5 x SSC, SDS a 0,1% a 56°C e duas lavagens de 30 minutos em 2 x SSC, SDS 0,1% a 56°C.

Por exemplo, as seqüências que podem hibridizar com a seqüência mencionada abaixo incluem as seqüências de DNA mutante que codificam as proteínas com a mesma função biológica da proteína codificada pela seqüência aqui abaixo mencionada. Tais seqüências mutantes podem compreender uma ou mais deleções, substituições e/ou adições de nucleotídeos às seqüências mencionadas abaixo. Preferivelmente, as seqüências mutantes ainda terão pelo menos 50%, mais preferivelmente pelo menos 70%, ainda mais preferivelmente mais do que 90% de homologia de nucleotídeos com a seqüência aqui fornecida abaixo.

A expressão gene quimérico como aqui empregada também abrange as seqüências de ácido nucleico que compreendem uma ou mais partes da seqüência aqui abaixo mencionada. De preferência, tais seqüências compreendem pelo menos 10%, mais preferivelmente pelo menos 30%, mais preferivelmente pelo menos 50% da seqüência de nucleotídeos dada abaixo. Tais seqüências podem compreender um fragmento contíguo da seqüência aqui abaixo mencionada, ou dois ou mais fragmentos da seqüência dada abaixo que tenham sido combinados e/ou incorporados em uma seqüência singular de DNA.

Deve ser observado que, quando é aqui feita referência a uma proteína codificada pelo gene quimérico da invenção, este termo também inclui proteínas mutantes que ainda tenham essencialmente a mesma função

lz>>>

biológica. Tais proteínas mutantes podem compreender uma ou mais deleções, substituições e/ou adições de aminoácidos, em comparação com a proteína codificada pela seqüência mencionada abaixo. Preferivelmente, as proteínas mutantes ainda têm pelo menos 50%, mais preferivelmente pelo menos 70%, ainda mais preferivelmente mais do que 90% de homologia de aminoácido com a seqüência aqui abaixo fornecida.

O termo proteína também abrange fragmentos da proteína codificada pelo gene quimérico da invenção. Tais fragmentos preferivelmente ainda apresentam a atividade biológica da proteína completa. Preferivelmente, tais proteínas compreendem pelo menos 30%, mais preferivelmente pelo menos 50% da seqüência de aminoácidos da proteína completa. Igualmente, dois ou mais fragmentos da proteína completa codificados pelo gene quimérico da invenção podem ser combinados para formar uma proteína singular.

Mais especificamente, a invenção diz respeito a um gene quimérico formado pelas seqüências de DNA que codificam determinantes antigênicos de quatro proteínas de L. infantutn, codificando uma proteína útil para fins farmacológicos, em particular para a prevenção e/ou tratamento da leishmaniose, em particular a leishmaniose canina, e obtenção do produto final ou a construção do gene quimérico que codifica um polipeptídeo que contenha todos os determinantes antigênicos selecionados, caracterizado pelo fato de que usa uma estratégia de clonagem em que o clone que expressa a proteína rLiPO-Ct-Q seja usado como um vetor inicial, e a este vetor, por meio do uso de sítios de restrição adequados, fragmentos de DNA sejam subseqüentemente adicionados, que codifiquem as proteínas LiP2a-Q, LiP2bQ, LiH2A-Ct-Q, LiH2a-Nt-Q e, após cada etapa de clonagem, a orientação correta de cada um dos insertos seja deduzida e o tamanho dos produtos de expressão, a seqüência de aminoácidos deduzida completa da proteína de fusão final, pPQV, expressa no vetor pMAl, seja:

f» * MBP IEGRPLTPRSAKKAVRKSGSKSAKCGIjIFPVGRVGGMMRRGYARRIGA 50

SGAPRJSEFSVKAAAQSGKKRCRLNPRTVMLAARHDDDIGTLJjKNVTLSHSGW 14 0 PNISKAMAKKKGGKECGKATPSAPEFWSSRPMSTKYLAAYAIASIiSKASPSQAD 157 VEAICKAVHIDVDQATLAFVMES VTGRDVATLIAEGAAKMSAMPAASSGAAAGV 211 TASAAGnAAPAAAAAKKDEPEEEADDDMGPSVRDPMQYIAAYALVALSGKTPSK 265 STAGAGAGAVAEAKKEEPEEEEADDDMGPVDLQPAAAAPAAPSAAAKAAPEESD 374 EDDFGMGGLF (SEQ ID NO.3) %

e

A invenção também diz respeito a uma composição farmacêutica para a prevenção e tratamento, em seres humanos ou em animais, da leishmaniose, formada:

a - pela proteína Quimera Q, ou uma variante desta proteína, que contenha modificações ou substituições de aminoácidos conservados, administrada a um paciente (humano ou animal), ou b - na forma isolada ou junto com qualquer adjuvante fisiológico através das vias intraperitoneal, subcutânea ou intramuscular.

Igualmente, a invenção diz respeito a uma vacina capaz de estimular a produção de anticorpos que reconheçam o parasita da Leishmânia, formada:

a - pela proteína Quimera Q, ou uma variante desta proteína, que difira da proteína Q nos aminoácidos conservados, administrada a um paciente (humano ou animal), ou b - na forma isolada ou junto com qualquer adjuvante fisiológico através das vias intraperitoneal, subcutânea ou intramuscular.

Outro aspecto da invenção compreende uma composição farmacêutica para a prevenção e tratamento, em seres humanos ou animais, de leishmaniose, formada:

a - pela proteína Q, ou uma variante desta proteína, que contenha modificações ou substituições de aminoácidos conservados, ligados à proteína LiHsp70, completa ou fragmentada, administrada a um paciente (humano ou animal), ou

ItfM

φ20 b - na forma isolada ou junto com qualquer adjuvante fisiológico através das vias intraperitoneal, subcutânea ou intramuscular.

Uma outra composição farmacêutica da invenção para a prevenção e tratamento, em seres humanos ou animais, da leishmaniose, pode ser formada:

a - por qualquer vetor de DNA carregando a seqüência que codifica a proteína Quimera Q, ou uma variante desta seqüência, que contenha modificações ou substituições de nucleotídeos que codificam para os aminoácidos conservados, administrado a um paciente (humano ou animal), ou b - pelas vias intramuscular ou subcutânea.

Em outro aspecto, a invenção diz respeito a uma composição farmacêutica para a prevenção e tratamento, em seres humanos ou animais, de leishmaniose, formada:

a - por qualquer vetor de DNA carregando 1) a seqüência que codifica a proteína Quimera Q, ou uma variante desta seqüência que contenha modificações ou substituições de nucleotídeos que codificam para aminoácidos conservados, e 2) a seqüência que codifica a proteína LiHsp70, ou variantes dela, que difira nos aminoácidos conservados, administrada a um paciente (humano ou animal), ou b - pela via intramuscular, subcutânea ou intramuscular.

A invenção igualmente diz respeito a uma seqüência de nucleotídeos e a uma proteína útil para fins farmacológicos, em particular para a prevenção e/ou tratamento da leishmaniose, em particular a leishmaniose canina, tendo a seqüência de DNA e de aminoácidos mostrada abaixo, expressa no vetor PQ31. A seqüência de aminoácidos contém um fragmento do vetor (AA 1 a 37). O restante da seqüência de aminoácidos é idêntica àquela da SEQ ID NO: 3, exceto na porção de MBP e nos primeiros sete aminoácidos (AA 1 a 7):

45

ATG Met

AGA GGA TCT Arg Gly Ser

CAC Bis 5

CAC CAC CAC His His Bis

CAC CAC ACG GAT CCG CAT GCG

Bis

Bis 10

Thr Asp

Pro Bis

Ala 15

46

90

AGC

•SCO

AAC

AAT

AAC

AAT

AAC

CTC

GGG

ATC

Ser

Asa

Asn

Leu

Gly

Zle

20

25

30

91

135

GAG

GGA

AGG

CCT

TTA

GCT

ACT

CCT

CGC

AGC

GCC

AAG

GCC

GTC

Glu

Gly Arg

Pro

Leu

Ala

Thr

Pro

Arg

Ser

Ala

Lys

Ala

Val

35

40

45

136

180

CGC

AAG

AGC

GGC

TCC

AAG

TCC

GCG

AAA

TGT

GGT

CTG

ATC

TTC

CCG

Arg

Lys

Ser

Gly

Ser

Lys

Ser

Ala

Lys

Cys

Gly

Leu

zle

Phe

Pro

50

55

60

181

225

gtg

GGC

CGC

GTC

GGC

GGG

AXG

ATG

CGC

GGC

CAG

TAC

GCT

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Val

Gly Arg

val

Gly

Met

Arg

Gly

Gin

Tyr

Ala

Arg

65

70

75

226

270

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ATC

GGT

GCC

TCT

GGC

GCC

CCC

AGG

ATT

TCA

GAA

TTC

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GTG

Arg

Ila

Gly

Ala

Ser

Gly

Ala

Pro

Arg

Zle

Ser

Glu

Phe

Ser

Val

80

85

90

271

315

AAG

GCG

GCC

GCG

CAG

AGC

GGG

AAG

CGG

TGC

CGC

CTG

AAC

CCG

Lys

Ala

Gin

Ser

oiy

Lys

Arg

Cys

Arg

Leu

Asn

Pro

/

95

100

105

Λ *

316

360

β

CGC

ACC

GTG

ATG

CTG

GCC

GCG

CGC

CAC

GAC

ATC

GGC

ACG

Arg

Thr

Vai

Mete

Leu

Ala

Arg

Ris

Asp

Ile

Gly

Thr

110

115

120

361

405

CTT

CTG

AAG

AAC

GTG

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TCT

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AGC

GGC

GTT

GTG

CCG

AAC

Leu

Lys

Asn

Vai

Thr

Leu

Ser

Ris

Ser

Gly

Vai

Pro

Asn

125

130

135

406

450

ATC

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AAG

GCG

ATG

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AAG

GGC

AAG

GGC

AAG

11α

Ser

Lys

Ala

Met

Ala

Lys

Gly

Lys

Gly

Lys

140

145

150

%

391

495

GCG

ACA

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GCG

CCC

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GGA

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AGA

CCC

ATG

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Ala

Thr

Pro

Ser

Ala

Pro

Glu

Phe

Gly

Ser

Arg

Pro

Mete

Ser

155

160

165

496

540

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CTC

GCC

GCG

TAC

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GCC

TCC

CTG

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AAG

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Thr

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Tyr

Leu

Ala

Tyr

Ala

Leu

Ala

Ser

Leu

Ser

Lys

Ala

170

175

180

541

585

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CCG

TCT

CAG

GCG

GAC

GTG

GAG

GCT

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GTC

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Pro

Ser

Gin

Ala

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Vai

Glu

Ala

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Lys

Ala

Vai

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185

190

195

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GAC

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Ile

Aap

Vai

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Gin

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Leu

Ala

Phe

Vai

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Ser

Vai

200

205

210

•

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675

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GGA

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GAC

GTG

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GAG

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GCC

GCG

AAG

φ

Thr

Gly

Arg

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Thr

Leu

Ile

Ala

Glu

Gly

Ala

Lys

215

220

225

676

720

ATG

AGC

GCG

ATG

CCG

GCG

GCC

AGC

TCT

GGT

GCC

GCT

GGC

GTC

Mete

Ser

Ala

Mete

Pro

A1A

Ala

Ser

Gly

Ala

Gly

Vai

*

230

235

240

721

765

*

ACT

GCT

TCC

GCT

GCG

GGT

GAT

GCG

GCT

CCG

GCT

GCC

GCG

Gly Asp

Ala

Pro

Ala

Lys

Asp

Glu

Pro

245

250

255

-

766

810

AAG AAG

GAC

GAG

CCC

GAG

GCC

GAC

ATG

GGC

CCC

Thr

Ala

Ser

Ala

Glu

Ala

Asp

Mete

Gly

Pro

260

265

270

ivy

811

B55

TCT

AGA

GTC

GAC

CCC

ATG

CAG

TAC

CTC

GCC

GCG

TAC

GCC

CTC GTG

Ser

Arg

Vai

Asp

Pro

Met

Gin

Tyr

Leu

Ala

Tyr

Ala

Leu Vai

275

280

285

856

900

GCG

CTG

TCT

GGC

AAG

ACG

CCG

TCG

AAG

GCG

GAC

GTT

CAG

GCT GTC

Ala

Leu

Ser

Gly

Lys

Thr

Pro

Ser

Lys

Ala

ASP

Vai

Gin

Ala Vai

290

295

300

901

945

CTG

AAG

GCC

GGC

GTT

GCC

GTG

GAT

GCC

TCC

CGC

GTG

GAT GCC

Leu

Lya

Ala

Gly

Vai

Ala

Vai

Asp

Ala

Ser

Arg

Vai

Asp Ala

305

315

946

990

GTC

TTC

CAG

GAG

GTG

GAG

GGC

AAG

AGC

TTC

GAT

GCG

CTG

GTG GCC

Vai

Phe

Gin

Glu

Vai

Glu

Gly

Lys

Ser

Phe

Asp

Ala

Leu

Vai Ala

320

325

330

991

1035

GAG

GGC

CGC

ACG

AAG

CTG

GTG

GGC

TCT

GGC

TCT

GCC

GCT

CCT GCT

Glu

Gly Arg

Thr

Lys

Leu

Vai

Gly

Ser

Gly

Ser

Ala

Pro Ala

335

340

345

1036

1080

GGC

GCT

GTC

TCC

ACT

GCT

GGT

GCC

GGC

GCT

GGC

GCG

GTG

GCC GAG

Gly Ala

Vai

Ser

The

Ala

Gly

Ala

Gly

Ala

Gly

Ala

Vai

Ala Glu

350

355

360

1081

1125

GCG

AAG

GAG

CCC

GAG

GCC

GAT

GAC ATG

Ala

Lys

Glu

Pro

Glu

Ala

Asp

Asp Met

365

370

375

1136

1170

GGC

CCC

GTC

GAC

CTG

CAG

CCC

GCC

GCT

GCC

GCG

CCG

GCC

GCC CCT

Gly Pro

Vai

Asp

Leu

Gin

Pro

Ala

Pro

Ala

Ala Pro

380

385

390

1171

-

1215

AGC

GCC

GCT

GCC

AAG

GAG

CCG

GAG

AGC

GAC

GAG

GAC GAC

Ser

Ala

Lys

Glu

Pro

Glu

Ser

Asp

Glu

Asp Asp

395

400

405

TTC	GGC	ATG	GGC	GGT	CTC	TTC TAAGCGACTC GCCATCTCTT	1256
Phe	Gly	Met	Gly	Gly	Leu	Phe
				410		412

1257

AGCCTCCTTG TGGTGCGCTT GAGGTGCTCI CGCTCTGCTT CTCCTTGCAG 1306 1307

TGTTGGCTGA CTCTGGCGGG TATGTGCCGT CGCATTACAC CCACCTCTCC 1356 1357

CACCCCTTTG CCCTACGCGC TCGCATGCGC AATCCGTGAA TCATCGAGGG 1406

1407

AACTCTCTCT CGGTGGCAGT GGGTAAGCTT 1436 (SEQ IO NO.l and SEQ ID K0.2)

.4

ou um seu mutante ou fragmento que possam ser usados para gerar uma resposta imune protetora em um ser humano ou animal contra a leishmaniose, e a uma composição farmacêutica para a prevenção e tratamento, em seres humanos ou animais, da leishmaniose, compreendendo esta proteína ou um seu mutante ou fragmento que possam ser usados para gerar uma resposta imune protetora em um ser humano ou animal, contra a leishmaniose. Esta proteína é derivada da inserção do gene PQV no vetor de expressão pQE31. Aqui, dito gene quimérico preferivelmente codifica um polipeptídeo gerado com um peso molecular de 38 kD e um ponto isoelétrico de 7,37.

Igualmente, a invenção diz respeito a uma vacina capaz de estimular a produção de anticorpos que reconheçam o parasita da Leishmânia, compreendendo a proteína mencionada acima ou um seu mutante ou fragmento que possam ser usados para gerar uma resposta imune protetora em um ser humano ou animal, contra a leishmaniose.

Um outro aspecto da invenção abrange uma composição farmacêutica para a prevenção e tratamento, em seres humanos ou animais, de leishmaniose, compreendendo anticorpos dirigidos contra a proteína acima mencionada ou um seu mutante ou fragmento, preferivelmente contendo um ou mais determinantes antigênicos, tais como um epítopo.

A invenção ainda diz respeito a um processo para a prevenção ou tratamento da leishmaniose em um ser humano ou animal, compreendendo administrar ao ser humano ou animal uma composição farmacêutica como descrito acima, ou a um processo para prevenir a leishmaniose em um ser humano ou animal, compreendendo administrar ao ser humano ou animal uma vacina conforme descrito acima.

O gene quimérico formado das seqüências de DNA que

codificam os determinantes antigênicos de quatro proteínas de L. infantum e a proteína obtida, útil para prevenir e/ou tratar a leishmaniose, que a invenção propõe, por seu direito nato, constitui uma novidade óbvia dentro de seu campo de aplicação, já que, de acordo com a invenção, um gene quimérico sintético é produzido, o qual é obtido por montagem, contendo a região de DNA que codifica os determinantes antigênicos específicos às proteínas LiP2a, LiP2b, LiPO e H2A, assim construindo uma proteína rica em determinantes antigênicos. O gene quimérico obtido é expresso em Escherichia coli e o produto foi analisado em relação às suas propriedade antigênicas. Os resultados confirmam que esta proteína quimérica mantém todos os determinantes antigênicos das proteínas precursoras e que ela constitui um elemento relevante farmaceuticamente útil para VL canina, com uma sensibilidade que oscila entre 80% a 93%, e uma especificidade entre 96% a 100%.

Mais particularmente, o gene quimérico formado pelas seqüências de DNA que codificam os determinantes antigênicos de quatro proteínas de L. infantum e a proteína codificada por ele, úteis para a prevenção e/ou tratamento de leishmaniose canina, e a proteína obtida objeto da invenção, é produzida por meio dos seguintes estágios, a saber:

- Construção do gene quimérico. Metodologia.

Estratégia de clonagem.

Clonagem de seqüências de DNA que codificam determinantes antigênicos da proteína histona H2A.

Clonagem das seqüências que codificam rLiP2a-Q e rLiP2bQ.

Clonagem da seqüência rLiPO-Q.

Clonagem do gene quimérico.

- Construção do gene quimérico da construção de produtos intermediários.

11Ζ9

φ20

Clonagem de epitopos específicos aos antígenos de L.

infantum.

- Construção do produto final.

Construção do gene quimérico que codifica um polipeptídeo que contém todos os determinantes antigênicos selecionados.

- opcionalmente, expressão da seqüência assim obtida.

- Avaliação do produto final.

Soros.

Purificação de proteínas

Eletroforese de proteínas e imunoanálise.

Medição por Fast ELISA.

- Avaliação do produto final.

Propriedades antigênicas.

Sensibilidade e especificidade da proteína quimérica CP no diagnóstico do soro de VL canina.

A estratégia seguida pela clonagem de seqüências de DNA que codifica cada um dos determinantes antigênicos selecionados é a mesma em todos os casos, e em uma primeira etapa, a seqüência de interesse é ampliada por meio de uma PCR e do uso de oligonucleotídeos específicos que contenham alvos para as enzimas de restrição nos extremos.

Quanto à etapa de clonagem, o produto amplificado é dirigido por meio da enzima de restrição apropriada e é inserido no sítio de restrição .correspondente do plasmídeo pUC18.

Após a sequenciar o DNA, o inserto é recuperado e subclonado ao sítio de restrição correspondente do plasmídeo modificado denominado pMAL-c2. A modificação é produzida por inserção de um códon de terminação a jusante do alvo HindIII no poli-ligador de pMal-c2, designando o plasmídeo resultante pMAL-c2’,

Quanto à clonagem da seqüência de DNA que codifica os lll

t

determinantes antigênicos da proteína histona H2A, deve ser salientado que o cDNA do clone cL71, que codifica a histona H2A de L. infantum, é usado como um gabarito para as reações de PCR, e para a amplificação de DNA, que codifica a região N-terminal da histona H2A, mais exatamente rLiH2ANt-Q, os seguintes oligonucleotídeos são usados: sentido 5’-CCTTTAGCTA CTCCTCGCAGCGCCAAG-3’ (posição 84 a 104 da seqüência cL71); antisentido 5’-CCTGGGGGCGCCAGAGGCACCGATGCG-3’ (inverso e complementar às posições 204 a 224 da seqüência cL71).

As seqüências que são incluídas nos oligonucleotídeos para a clonagem e que não estão presentes na seqüência precursora cL-71, estão marcadas com tipos em negrito.

O fragmento de DNA amplificado é cionado diretamente do sítio de restrição Xmnl de pMAI-c2’.

O fragmento é sequenciado por meio do iniciador #1234 malE, e da região C-terminal antigênica da histona H2A, em particular rLiH2A-Ct-Q, é amplificado com os seguintes oligonucleotídeos. Estes são:

Sentido, 5 ’-GAATTÇTCCGTAAGGCGGCCGCGCAG-3 ’ (posição 276 a 296 da seqüência cL71).

Anti-sentido, 5 ’-GAATTCGGGCGCGCTCGGTGTCGCC TTGCC-3’ (inverso e complementar às posições 456 a 476 do plasmídeo cL71).

Um tripleto que codifica a prolina (indicado como GGG após as letras sublinhadas) é incluído no oligonucleotídeo anti-sentido, o sítio de restrição EccRI que é incluído em ambos os oligonucleotídeos para clonagem é indicado pelo sublinhado.

Com respeito à clonagem das seqüências que codificam rLiP2a-Q, deve ser salientado que as regiões de interesse são ampliadas por

PCR a partir dos cDNAs que codificam LiP2a e LiP2b.

Os oligonucleotídeos que são usados para construir o clone de

expressão LiP2a-Q, são os seguintes:

Sentido, 5 ’-GTÇGAÇCCCATGCAGTACCTCGCCGCGTAC-3 ’ Anti-sentido, 5’-GTÇGAÇGGGGCCCATGTCATCATCGGCC TC-3’.

Deve ser salientado que os sítios de restrição Sall adicionados aos extremos 5’ dos oligonucleotídeos foram sublinhados.

Quando da construção do clone de expressão LiP2b-Q, os oligonucleotídeos usados foram:

Sentido, 5’-TCTAGACCCGCCATGTCGTCGTCTTCCTCGC C-3’. Anti-sentido, TCTAGAGGGGCCATGTCGTCGTCGGCCTC-3’.

Nos extrémos 5’ dos oligonucleotídeos, os sítios de restrições são incluídos para a enzima Xbal (sublinhados), e devido às necessidades de clonagem, um tripleto adicional, codificando um resíduo de prolina, é incluído a jusante do sítio de restrição.

Com respeito à clonagem da seqüência rLiPO-Q, deve ser salientado que a clonagem da seqüência de DNA da região C-terminal da proteína PO de L. infantum é realizada pela amplificação de um clone de cDNA denominado L27, e os seguintes oligonucleotídeos:

Sentido, 5 ’-CTGCAGCCCGCCGCTGCCGCGCCGGC CGCC-3’ (posições de 1 a 24 do cDNA L27) e o iniciador da seqüência pUC18 (#1211), o DNA amplificado é dirigido pelas enzimas PstI+HindIII, com a última inserção no plasmídeo pMAL-c2.

O clone resultante é denominado pPQI e deve ser observado que o sítio de restrição PstI é incluído no nucleotídeo com sentido (seqüência sublinhada) e que o alvo de restrição HindIII está presente no cDNA L27.

Com respeito à clonagem do gene quimérico, deve ser salientado que as seqüências de DNA que codificam os cinco determinantes antigênicos são montados em um gene quimérico, e esta montagem é realizada no clone pPQI, para o qual as regiões codificadoras para as regiões antigênicas LiP2a-Q são adicionadas seqüencialmente na direção 3’

1<L3

(designando os resultados da clonagem de pPQII), LiP2b-Q (clone pPQIII),

LiH2a-Ct-Q (clone pPQIV) e LiH2A-Nt-Q (clone pPQV).

Finalmente, o inserto obtido após a digestão de SacI+HindIII do clone final pPQV é inserido no plasmídeo de expressão PQE31, designando o clone resultante de pPQ.

DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

Para completar a descrição que está sendo feita, e com o objetivo de ajuvante o entendimento das características da invenção, o presente relatório é acompanhado, como uma sua parte integral, por um 0 conjunto de desenhos de natureza ilustrativa, que não são limitativos. O seguinte é representado:

Figura 1. Corresponde à expressão (A), à purificação nas colunas de amilose (B) e à antigenicidade (C: mancha do Oeste; D: ELISA) de cada uma das proteínas recombinantes fundidas à proteína de ligação da 15 maltose. A figura sob D também apresenta a reatividade no ELISA de cada uma das proteínas recombinantes relativas à proteína completa.

Figura 2. Representação gráfica dos diferentes vetores considerados para se obter o gene quimérico objeto da invenção, do qual a proteína pertinente destinada a realizar um diagnóstico preciso em animais ou seres humanos que apresentem sintomas de leishmaniose, será extraída.

Figura 3. Corresponde à identificação da proteína obtida do gene quimérico fundido à proteína MBP, cuja preparação é representada na Figura 2.

Figura 4. Corresponde à expressão (A), purificação em 25 colunas de amilose (B) e a antigenicidade (C: mancha do Oeste; F: ELISA) dos intermediários e da proteína quimérica final fundida à proteína de ligação da maltose (PQI-PGV). A figura também representa a expressão da proteína quimérica (D coluna 1), purificação em colunas de agarose Ni-Nt (D coluna 2) e a antigenicidade da proteína purificada contra um soro da VL (E: mancha

4Λ.Μ

do Oeste) e contra uma coleção de soros (F: PQ no ELISA).

Figura 5. Mostra finalmente uma representação gráfica sintetizada da reatividade de uma ampla variedade de soros caninos, dividida em três grupos. O primeiro grupo contém animais com infecção real por L. infantum. O segundo grupo inclui soro obtido de cães com vários sintomas clínicos, mas que não se acham infectados com Leishmânia, e um terceiro grupo é composto de quinze soros de controle de cães saudáveis. Esta figura demonstra o valor da invenção para realizar diagnóstico sorológico da VL. MODALIDADE PREFERIDA DA INVENÇÃO

O gene quimérico formado das seqüências de DNA que codificam os determinantes antigênicos de quatro proteínas de L. infantum, úteis para o diagnóstico sorológico de leishmaniose canina, e a proteína obtida que está sendo proposta, são constituídas da construção de produtos intermediários. Em um primeiro exemplo, a clonagem de epítopos específicos aos antígenos de L. infantum é realizada, o que é configurado na base de estudos anteriores sobre as propriedades antigênicas de quatro antígenos protéicos de L. infantum (LiP2a, PiPO, LiP2b, LiH2a), que possibilitam a existência de epítopos B a serem definidos para estas proteínas, e que são especificamente reconhecidos pelos soros caninos de VL.

Com vistas a melhorar a especificidade destes antígenos com respeito às proteínas de L. infantum, os determinantes antigênicos específicos são clonados destas proteínas. Após deletar certas regiões destas proteínas, estas podem ser reconhecidas por soros de animais que sejam portadores da VL e de outras doenças diferentes.

Mediante o uso dos oligonucleotídeos específicos e da amplificação por PCR de regiões específicas aos genes LiP2a, LiP2b, PO e

H2A, são construídos diversos clones que expressam as proteínas recombinantes rLiPO-Ct-Q, rLiP2a-Q, rLiP2b-Q, rLiH2A-Ct-Q e rLiH2A-NtQ, justamente como foi detalhado na descrição da invenção quanto à

metodologia, onde os detalhes da clonagem são descritos.

As proteínas recombinantes usadas são as seguintes:

- rLiPO-Ct-Q, que corresponde aos 30 resíduos C-terminais da proteína ribossômica LiPO.

- rLiP2a-Q e rLiP2b-Q, que são derivadas das proteínas ribossômicas LiP2a e LiP2b, respectivamente.

- Duas sub-regiões da histona H2A, que correspondem aos 46 resíduos de término N (xLiH2A-Nt-Q), e aos 67 resíduos de término C [resíduos (xLiH2A-Ct-Q)].

Cada uma das proteínas recombinantes fundidas à proteína de ligação da maltose (MBP) é expressa em E. coli, conforme representado na Figura número IA, e elas foram purificadas por cromatografia de afinidade em uma coluna B de amilose. Depois, o processo de eletroforese de purificação foi realizado nas proteínas recombinantes (colunas 1 a 5).

Com o objetivo de analisar se as proteínas recombinantes foram reconhecidas pelos soros caninos de VL, um Western-blot foi incubado, contendo as proteínas recombinantes em uma mistura de três soros caninos de VL. Dado que todas estas proteínas são reconhecidas pelos soros, conclui-se que os determinantes antigênicos presentes nas proteínas precursoras são mantidos nas proteínas recombinantes (C).

As propriedades antigênicas das proteínas recombinantes são comparadas com os determinantes antigênicos dos antígenos precursores, por meio de um FAST ELISA, testando em relação a uma coleção de 26 soros caninos de VL, justamente como é mostrado na seção da Figura número 1D, e o fato de que os soros mostraram um valor de reatividade semelhante, ambos em relação às regiões antigênicas selecionadas e às proteínas completas correspondentes, demonstra que nenhuma alteração ao epítopo antigênico havia ocorrido durante o procedimento de clonagem.

Com respeito à construção do produto final, mais exatamente

k20 do gene quimérico que codifica um polipeptídeo que contém todos os determinantes antigênicos selecionados, deve ser salientado que a estratégia de clonagem é indicada em seguida à Figura número 2, seção A. Os produtos intermediários gerados durante o processo são mostrados.

Um clone que expressa as proteínas rLiPO-Ct-Q (pPQI) é usado como o vetor inicial, e os fragmentos de DNA que codificam as proteínas rLiPO-Ct-Q, rLiP2a-Q, rLiP2b-Q, rLiH2A-Ct-Q e rLiH2A-Nt-Q são adicionados seqüencialmente usando-se sítios de restrição apropriados.

Após cada etapa de clonagem, a orientação correta de cada um dos insertos é deduzida do tamanho dos produtos de expressão, e finalmente a seqüência completa de nucleotídeos do clone final pPQV é determinada e a seqüência de aminoácidos deduzida da seqüência representada na Figura número 3.

O polipeptídeo gerado tem uma massa molecular de 38 kD, com um ponto isoelétrico de 7,37, incluindo as seqüências espaçadoras codificando a prolina, sublinhadas na Figura número 3. O objetivo de assim proceder é separar eficientemente os domínios antigênicos e evitar possíveis conformações terciárias que poderíam interferir com a estabilidade e antigenicidade do produto final.

A expressão e recuperação de cada um dos produtos intermediários são mostradas na Figura número 4, quadros A e B. Como era esperado, após cada adição, o tamanho do produto de expressão no vetor pMAL gradualmente aumenta até alcançar um peso molecular de 80 kDa, observando-se um certo grau de ruptura durante a purificação.

O gene quimérico também foi clonado no plasmídeo pQE, um vetor que permite a expressão de proteínas com um fragmento de 6 histidinas no término N extremo. O clone resultante e as proteínas recombinantes são denominadas pPQ e PQ, respectivamente.

O nível de expressão da proteína nas bactérias transformadas ' 25

LVY

k20 com o plasmídeo pPQ e as proteínas purificadas são mostradas na Figura número 4, referida em particular com um D, com a proteína PQ, purificada por cromatografia de afinidade em condições de desnaturação, sendo mais estável do que a proteína recombinante pPQV representada na Figura número 4, no quadro D, coluna 2.

De modo a avaliar o produto final, uma série de materiais foi usada, e, obviamente, algumas técnica, como é descrito abaixo.

Os soros de VL obtidos de cães de diferentes origens são usados. Os animais são avaliados clínica e analiticamente no laboratório pertinente, geralmente em um Departamento de Parasitologia, e todos os soros positivos são ensaiados quanto à imunofluorescência indireta (IIF).

A presença de amastigotos dos parasitas destes animais é confirmada por observação direta dos linfonodos poplíteos e pré-escapulares, e a um segundo grupo de 33 soros de VL originários de outras regiões, foram dados diagnósticos positivos no ELISA em relação aos extratos protéicos totais do parasita e/ou por IIF.

Os soros de cães afetados por diferentes doenças que não eram VL, são obtidos de diferentes origens. Dentro deste grupo, soros das seguintes infecções são encontrados:

Mesocestoides spp.

Dyphylidium caninum

Uncinaria stenocephala

Toxocara canis

Dipetalonema dranunculoides

Demodex canis

Babesia canis

Ehrlichia cannis

Ricketsia ricketsiae

O restante dos soros foram obtidos de cães que apresentavam

Μ

_k20 vários sintomas clínicos que não eram relacionados com qualquer processo infeccioso, e os controles do soro foram obtidos de quinze animais saudáveis cuidadosamente controlados.

A purificação das proteínas recombinantes expressas pelos clones pMAl-c2 é realizada por cromatografia de afinidade em colunas de amilose, e a purificação da proteína recombinante expressa pelo clone pPQ foi realizada em colunas de resina Ni-NTA em condições de desnaturação (Qiagen).

Para analisar as proteínas, a eletroforese em géis de poliacrilamida a 10% na presença de SDS foi realizada sob condições padrão. A análise imunológica das proteínas separadas por eletroforese foi realizada sobre membranas de nitrocelulose, para as quais as proteínas haviam sido transferidas. As proteínas transferidas foram bloqueadas com leite desnatado a 5% seco em um tampão de PBS com Tween 20 a 0,5%.

Os filtros foram seqüencialmente colocados em contato com anti-soro primário e secundário em soluções de bloqueio e um imunoconjugado ligado a peroxidase foi usado como segundo anticorpo, visualizando-se a ligação específica por meio de um sistema ECL. A Figura 4E mostra um Western-blot da proteína PQ.

O Fast-ELISA foi usado no lugar do ELISA clássico, e a sensibilização do antígeno foi realizado por 12 horas em temperatura ambiente.

As placas foram sensibilizadas com 100 μΐ de antígeno, cuja concentração, em todos os casos, foi de 2 gg/ml.

Após a sensibilização, os reservatórios das placas foram incubados por 1 hora com solução de bloqueio (leite desnatado em pó a 0,5% dissolvido em PBS - Tween 20 a 0,5% e os soros foram diluídos trezentas vezes em solução de bloqueio).

Os reservatórios foram incubados com soro durante 2 horas

Ll/5 %0 φ20

S ’ 25 em temperatura ambiente, e após exposição ao anticorpo eles foram lavados com PBS-Tween 20.

Os anticorpos ligados a peroxidase foram usados como segundos anticorpos em uma diluição de 1:2000 e a cor da reação foi desenvolvida usando-se o substrato ortofenilenodiamina, medindo-se a absorção em 450 nm.

Com referência à avaliação do produto final, deve ser salientado que as propriedades antigênicas foram determinadas por meio do estudo pertinente da reatividade dos soros caninos de VL contra a proteína quimérica e contra cada um dos produtos intermediários em um ensaio de “FFestera-ó/oZ”. Todos os produtos intermediários mantiveram sua antigenicidade, assim como o produto final pPQV, durante todo o processo da clonagem (Figura 4C).

Deve-se salientar que a proteína recombinante expressa pelo plasmídeo pPQ foi reconhecida pelos soros de VL. Com vistas a analisar com maior precisão as propriedades antigênicas da proteína quimérica e dos produtos intermediários, uma análise da reatividade de uma ampla variedade de soros caninos de VL foi realizada por meio de um fast-ELISA em comparação com as proteínas recombinantes, como é mostrado na seção F da Figura número 4. Pode-se dar realce ao fato de que a sensibilidade dos produtos intermediários de clonagem diferentes aumenta após cada etapa de adição. Deve igualmente ser salientado que a proteína pQI é reconhecida pela maioria dos soros de VL e a proteína PQII igualmente pela maioria dos soros. Esta proporção é maior quanto à proteína PQIII, e as proteínas PQIV, PQV e PQ são reconhecidas por praticamente todos os soros.

De acordo com o que foi examinado acima, o percentual de reconhecimento apresentado pelos soros foi semelhante tanto no caso de ensaios das proteínas quiméricas PQV e PQ, quando de ensaios de uma mistura de proteínas recombinantes rLiPO-Ct-Q, rLiP2a, rLiP2b e rLiH2A.

,20

Foi observado que as propriedades antigênicas de cada uma das 5 regiões antigênicas selecionadas estão presentes no produto de expressão de PQ e, portanto, este produto pode ser usado para diagnóstico, ao invés de uma mistura dos antígenos expressos individualmente.

Com vistas a determinar se a proteína quimérica pode ser usada para o diagnóstico de soros de VL caninos, e de acordo com a análise pertinente de uma ampla variedade de soros caninos em comparação com esta proteína, tendo em mente que, de acordo com as características clínicas dos animais, os soros caninos foram classificados em três grupos. Um primeiro grupo consistiu de soros de cães com uma real infecção de L. infantum. Um segundo grupo foi composto de soros de cães que tinham vários sintomas clínicos sem serem infetados com a leishmânia, incluindo cães infetados com parasitas diferentes da leishmânia, e que apresentassem sintomas clínicos que pudessem ser confundidos com aqueles observados durante a leishmaniose.

O terceiro grupo foi composto de soros de controle, originados de cães saudáveis.

Na Figura número 5, os valores médios de reatividade são mostrados para cada grupo de soros, a reatividade dos soros de VL alcançando um valor de reatividade média de 0,8 (S.D. = 0,4).

Dentro deste grupo, a reatividade de 12 soros foi positiva, mas menor do que 0,35, enquanto a reatividade alcançou valores entre 0,35 e 0,5. Foi observado que a reatividade de 23 soros varia entre 0,5 e 1,0, com 14 soros apresentando uma reatividade maior do que 1,0.

O valor médio de absorção dos soros do segundo grupo, isto é, do grupo infetado com parasitas diferentes dos parasitas de leishmânia, é de 0,2 (S.D. = 0,05), e a reatividade dos soros de controle, isto é, do terceiro grupo, é de 0,1 (S.D. = 0,003). Apenas dois soros do grupo 2 apresentaram reatividade entre 0,35 e 0,40.

Os dados apresentados acima indicam que a proteína '5

quimérica PQ no FAST ELISA tem uma sensibilidade de 80% para o diagnóstico da VL, se o valor de corte for definido como o valor médio da reatividade dos soros do grupo 2, mais três S.D.’s (isto é, 0,35).

A sensibilidade do grupo ensaiado alcança os 93%, se o valor de corte for definido pelos valores da reatividade do grupo de controle. A proteína Q tem uma especificidade de 96% para o diagnóstico de VL, quando o valor do corte for definido pelos soros acima mencionados do grupo 2. 100% de especificidade no ensaio foram obtidos quando os valores da reatividade de cães saudáveis foram considerados.

O processo a ser usado é o seguinte:

1. As placas de microtitulação são cobertas com anticorpos por 100 μΐ incubados de uma solução que contém 1 pg/ml de antígeno dissolvido em um tampão de PBS - Tween-20 0,5% - leite desnatado 5% (tampão A).

A incubação é realizada por 12 horas em temperatura ambiente e, depois, as placas são lavadas por três vezes como o mesmo tampão sem qualquer antígeno. As placas com antígeno secas podem ser mantidas em temperatura ambiente.

2. Uma primeira incubação dos reservatórios foi realizada com o soro de animal em uma diluição de 1/200 no tampão A. A incubação dura 1 hora.

3. Os reservatórios são lavados com tampão A, como descrito no ponto 1, por três vezes com um frasco de lavagem.

4. Eles são incubados com um segundo anticorpo (IgG ligado a peroxidase) diluído a 1:2000 em tampão A, realizando a incubação por 1 hora.

5. Os reservatórios são lavados mais uma vez com tampão A por três vezes, como foi indicado na terceira seção, isto é, com um frasco de lavagem.

6. A reatividade é revelada usando-se o substrato ortofenilenodiamina e a absorção é medida em 450 nm.

A proteína usada para o diagnóstico, extraída do gene quimérico, identificada, e a seqüência de nucleotídeos, são como segue:

ATG

Met

AGC

Ser

AGA GGA TCT CAC CAC CAC CAC CAC CAC ACG GAT CCG CAT GCG Arg Gly Sor His His Bis Bis Bis Bis Thr Asp Pro His Ala

S 10 15

TCG AAC AAC AAC AAC AAT AAC AAT AAC AAC AAC CTC GGG ATC Ser Asn Asn Asn Asn Asn Asn Asn Asn Asn Asn Leu Gly Ile

25 30

135

1Λ5

( <

* <

•

GAG Glu	6GA AGG CCT	TTA Leu 35	GCT ACT CCT CGC AGC GCC AAG AAG GCC GTC
Gly	Axg	9X0	Ala	Thx 9xo	Axg	Sex 40	Ala	Lys	Lys Ala Vai •45
136											280
CGC	AAG	AGC	GGC	tcc	AAG	TCC GCG	AAA	TGT	GGT	CTG	ATC TTC CCG
Xrg	Lys	Sax	Gly	Sax	Lys	Sex Ala	Lys	Cys	Gly	Leu	Ile Phe 9xo
				SO				55			60
181											225
GTG	GGC	CGC	GTC	GGC	GGG	ATG ATG	CGC	CGC	GGC	CAG	TAC GCT CGC
Vai	Gly	Axg	Vai	Gly	Gly	Met Mat	Axg	Axg	Gly	Gin	Tyx Ala Axg
				65				70			75
226											270
CGC	AXC	GGT	GCC	TCT	GGC	GCC CCC	AGG	ATT	TCA	GAA	TTC TCC GTG
Axg	Ile	Gly	Ala	Sex	Gly	Ala 9x0	Axg	ila	Ser	Glu	Phe Sex Vai
				80				85			90
271											315
AAG	GCG	GCC	GCG	CAG	AGC	GGG AAG	AAG	CGG	TGC	CGC	CTG AAC CCG
Lys	Ala	Ala	Ala	Gin	Sex	Gly Lys	Lys	Axg	Cys	Axg	Leu Asn 9xo
				95				100			10S
316											360
CGC	ACC	gtg	ATG	CTG	GCC	GCG CGC	CAC	GAC	GAC	GAC	ATC GGC ACG
Axg	Thx	Vai	Mat	Leu	Ala	Ala Axg	His	Asp	Asp Asp	Ila Gly Thx
				110				115			120
361											40S
CTT	CTG	AAG	AAC	GTG	ACC	TTG TCT	CAC	AGC	GGC	GTT	GTG CCG AAC
Leu	Leu	Lys	Asn	Vai	Thx	Leu Sex	Bis	Sax	Gly	Vai	Vai 9xo Asn
				125				130			135
406											450
ATC	AGC	AAG	GCG	ATG	GCA	AAG AAG AAG	GGC	GGC	AAG	AAG GGC AAG
Ile	Sex	Lys	Ala	Met	Ala	Lys Lys	Lys	Gly	Gly	Lys	Lys Gly Lys
				140				145			150
391											495
GCG	ACA	CCG	AGC	GCG	CCC	GAA TTC	GGA	TCC	TCT	AGA	CCC ATG TCC
Ala	Thx	fxo	Sax	Ala	9X0	Glu 9he	Gly	Sax	Sax	Axg	9xo Mat Sex
				155				160			165
496											540
ACC	AAG	TAC	CTC	GCC	GCG	TAC GCT	CTG	GCC	TCC	CTG	AGC AAG GCG
Thr	Lys	Tyx	Leu	Ala	Ala	Tyx Ala	Leu	Ala	Sax	Leu	Sex Lys Ala
				170				175			180
541											585
TCC	CCG	TCT	CAG	GCG	GAC	GTG GAG	GCT	ATC	TGC	AAG	GCC GTC CAC
Sex	9X0	5er	Gin	Ala	Asp	Vai Glu	Ala	ila	Cys	Lys	Ala Vai Bis
				185				190			195
596											630
ATC	GAC	GTC	GAC	CAG	GCC	ACC CTC	GCC	TTT	GTG	ATG	GAG AGC GTT
Ila	Asp	Vai	Asp	Gin	Ala	Thx Leu	Ala	Pha	Vai	Met	Glu Sex Vai
				200				205			210

1-ΛΗ

-	641 ACG GGA Thr Gly	CGC Arg	GAC GTG GCC Asp Vai Ala 215
w	676
	ATO	AGC	GCG	ATC	CCG	GCG
	Mat	Ser	Ala	Met	Pro	Ala
	721				230
	ACT	GCT	TCC	GCT	GCG	GGT
	Gly Asp	Ala	Ala	Pro	Ala
					245
	766
	AAG	AAG	GAC	GAG	CCC	GAS
	Thr	Ala	Ser	Ala	Ala	Glu
					260
%	811
	TCT	AGA	GTC	GAC	CCC	ATG
	Ser	Arg	Vai	Asp	Pro	Met
				275
	856
	GCG	CTG	TCT	GGC	AAG	ACG
	Ala	Leu	Ser	Gly	Lys	Thr
	901				290
	CTC	AAG	GCC	GCC	GGC	GTT
	Leu	Lys	Ala	Ala	Gly	Vai
					305
	946
	GTC	TTC	CAG	GAS	GTG	GAG
	Vai	Phe	Gin	Glu	Vai	GlU
					320
•	991
	GAG	GGC	CGC	ACG	AAG	CTG
•	GlU	Gly	Arg	Thr	Lys 335	Leu
	1036
	GGC	GCT	GTC	TCC	ACT	GCT
	Gly Ala	Vai	Ser	Thr	Ala
-	1081				350
*	GCG AAG	AAG	GAG	GAG	CCC
	Ala Lys	Lys	Glu	Glu	Pro
				365
-	1136 GGC	CCC	GTC	GAC	CTG	CAG
	Gly	Pro	Vai	Asp	Leu	Gin

	675
ACC	CTG	ATC	GCG	GAG	GGC	GCC	GCG	AAG
Thr	Leu	Zle	Ala	Glu	Gly	Ala	Ala	Lys
			220				225
								720
GCC	AGC	TCT	GGT	GCC	GCT	GCT	GGC	GTC
Ala	Ser	Ser	Gly	Ala	Ala	Ala	Gly	Vai
			235				240
								765
GAT	GCG	GCT	CCG	GCT	GCC	GCC	GCC	GCG
Ala	Ala	Ala	Ala	Lys	Lys	Asp	Glu	Pro
			250				255
								810
GAG	GAS	GCC	GAC	GAC	GAC	ATG	GGC	CCC
Glu	Glu	Ala	Asp	Asp	Asp	Met	Gly	Pro
			265					270
								855
CAG	TAC	CTC	GCC	GCG	TAC	GCC	CTC	GTG
Gin	T^r	Leu	Ala	Ala	Tyr	Ala	Leu	Vai
		280				285
								900
CCG	TCG	AAG	GCG	GAC	GTT	CAG	GCT	GTC
Pro	Ser	Lys	Ala	ASP	Vai	Gin	Ala	Vai
			295					300
								945
GCC	GTG	GAT	GCC	TCC	CGC	GTG	GAT	GCC
Ala	Vai	Asp	Ala	Ser	Arg	Vai	Asp	Ala
			315				315
								990
GGC	AAG	AGC	TTC	GAT	GCG	CTG	GTG	GCC
Gly	Lys	Ser	Phe	Asp	Ala	Leu	Vai	Ala
			325				330
							1035
GTG	GGC	TCT	GGC	TCT	GCC	GCT	CCT	GCT
Vai	Gly	Ser	Gly	Ser	Ala	Ala	Pro	Ala
			340					345
							1080
GGT	GCC	GGC	GCT	GGC	GCG	GTG	GCC	GAG
Gly	Ala	Gly	Ala	Gly	Ala	Vai	Ala	Glu
		355				360
							1125
GAG	GAG	GAG	GAG	GCC	GAT	GAT	GAC	ATG
Glu	Glu	Glu	GlU	Ala	Asp	Asp	Asp Met
			370				375
							1170
CCC	GCC	GCT	GCC	GCG	CCG	GCC	GCC	CCT
Pro	Ala	Ala	Ala	Ala	Pro	Ala	Ala	Pro
			385					390

380

1171 1215 AGC GCC GCT GCC AAG GAG GAG CCG GAG GAG AGC GAC GAG GAC GAC Ser Ala Ala Ala Lya Glu Glu Pro Glu Glu Ser Aap Glu Aap Aap

395 400 405

XXC GGC ATG GGC GGX CXC TXC TAAGCGACTC GCCATCTCTT 1256

Phe Gly Met Gly Gly Leu Phe

	410	412
125Θ AGCCTCCTTG	TGGTGCGCTT	GAGGTGCTCT	CGCTCTGCTT	ctccttgcag	1306
1307 TGTTGGCTGA	CTCXGGCGGG	TATGTGCCGX	CGCATTACAC	ccacctctcc	1356
1357 CACCCCTTTG	CCCTACGCGC	TCGCATGCGC	aatccgtgaa	TCATCGAGGG	1406
1407
AAGTCTCTCT	GGGTGGCAGT	GGGTAAGCTT	1436

(SEQ XD NO.l e SEQ ID NO.2)

Não se considera necessário estender esta descrição para que alguém versado na técnica possa entender o escopo da invenção e as vantagens que ela confere.

Os materiais, a forma, o tamanho e a disposição dos elementos 5 são suscetíveis de mudança, contanto que isso não suponha uma mudança na . essência da invenção.

Os termos em que este relatório descritivo foi escrito devem sempre ser considerados bem amplos por natureza, e não limitativos.

VACINA CONTRA A LEISHMANIA

FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO

Os parasitas protozoários do gênero Leishmania são responsáveis pela leishmaniose, uma doença sintomaticamente complexa que afeta essencialmente os homens e os animais nas regiões tropicais e subtropicais. Estima-se que o número de novos casos de leishmaniose visceral humana possa alcançar a cifra de 500.000, estando afetadas um mínimo de várias dezenas de milhões de pessoas. Adicionalmente, o número de leishmaniose cutânea e mucocutânea pode ser da ordem de 2.000.000 por ano (Modabber., 1990). Não obstante as pessoas em risco de contrair os . diferentes tipos de leishmaniose possa ser estimado em cerca de 350 milhões, o número de pessoas com a real infecção pode ser muito maior, devido ao fato de que não existem estimativas claras dos casos reais de infecções assintomáticas e por causa da existência de infecções crípticas. De fato, a leishmaniose pode ser considerada dentro do contexto global como uma infecção/doença de natureza endêmica, situada entre os 4² e 5² lugares na classificação das doenças parasíticas com repercussão mundial.

|10 Três formas principais de leishmaniose podem ser consideradas: a cutânea, a mucocutânea e a visceral, cujas características principalmente dependem da localização do parasita, da espécie à qual ele pertence e das manifestações clínicas que ele produz. As espécies distribuídas ao longo da Ásia e de certas regiões da área do Mar Mediterrâneo dão ensejo à presença da forma cutânea, com ulceração localizada que, em muitos casos, se cura espontaneamente. Estas manifestações são causadas por L. major e L. tropica. A L. aethiopica (Mar Mediterrâneo, Ásia, África) também induz à forma cutânea de leishmaniose, embora sua manifestação seja mais difundida. Na América, a espécie L. mexicana produz a forma cutânea com uma localização generalizada que comumente não se cura espontaneamente. A forma mucocutânea da doença em seres humanos é causada pela L. brasiliensis e é caracterizada pela presença de lesões cutâneas nas regiões oronasais e faríngea, acarretando a destruição das mucosas. Na América, Europa, África e Ásia, a forma mais ffeqüente de leishmaniose é a forma visceral, causada por L. chagasi, L. donovani e L. infantum. Esta forma de leishmaniose é caracterizada por sintomas clínicos associados a febre, anemia e uma intensa hepatosplenomegalia, que é letal se não for tratada adequadamente no tempo certo. Na forma avançada da doença, o hóspede é incapaz de desenvolver uma resposta imune efetiva. Todas estas formas de

Uv

Ho _k20 leishmaniose são também detectadas em canídeos e alguns roedores que, de fato, constituem os principais reservatórios do parasita. O problema de saúde gerado pela L. infantum na bacia do Mediterrâneo é sério, porque existe uma alta incidência da infecção/doença em cães, e o inseto vetor e muito propagado. Calcula-se que entre 7% e 20% de todos os canídeos estejam infectados pela Leishmânia, alcançando os 30% em algumas áreas da Espanha, onde ela é endêmica. Este fato constitui um sério problema veterinário que, adicionalmente, aumenta o risco de contágio, fundamentalmente por pessoas imunossupressivas. Na Europa, existem alguns 11 milhões de cães em risco de infecção por Leishmania.

A L. infantum, como o restante das espécies no gênero, tem um ciclo biológico dimórfico. Os hospedeiros intermediários são insetos da família dos Psychodidae, gênero Phlebotomus. Na área européia do Mediterrâneo, foi demonstrado que as espécies P. arias e P. perniciosus são os vetores principais, embora os vetores P. papatosi, P. longicuspis e P. sergenti também estejam presentes. Quando o parasita é ingerido pelo vetor junto com o sangue de um hospedeiro vertebrado, ele se localiza no tubo digestivo em uma forma extracelular, transforma-se em um promastigoto e se divide. As formas infecciosas migram em direção à faringe e ao probóscide, de onde elas serão inoculadas em um novo hospedeiro vertebrado. Os promastigotos são caracterizados no fato de que eles têm um flagelo e uma forma alongada de alguns 15 a 20 pm de comprimento, com uma extremidade posterior arredondada e uma extremidade anterior pontuda. O núcleo fica situado na posição central e o cinetoplasto na extremidade anterior. Em meios de cultura, os parasitas apresentam um certo grau de variabilidade morfológica. Após a inoculação dos promastigotos na pela do hospedeiro vertebrado, o estabelecimento, ou não, da infecção depende essencialmente de dois fatores: a existência de uma população celular adequada macrófagos - e outras células do sistema mononuclear fagocítico, e a ' 25

capacidade do parasita de sobreviver e multiplicar-se no interior destas células.

A primeira etapa na penetração de Leishmania nos macrófagos é a aproximação e aderência à membrana plasmática da célula alvo. Estudos in viíro parecem indicar que não existe qualquer atração quimiostática direta dos promastigotos sobre os macrófagos. Dentro do ambiente dos tecidos, os promastigotos livres ativam o complemento pela trajetória alternativa, realizando a formação de um gradiente de concentração da fração C5a, que atrai os macrófagos e outras células inflamatórias em direção ao sítio de inoculação. Uma vez o promastigoto esteja dentro de um vacúolo parasitóforo, os lisossomas se fundem a ele formando um fagolisossomo. Em infecções causadas por outros microorganismos, o fagolisossomo é a organela responsável pela lise e eliminação por meio de vários mecanismos, tais como a produção de radicais tóxicos de oxigênio, por um processo metabólico oxidativo, a ação de enzimas lisossômicas hidrolíticas, proteínas catiônicas, e pH baixo. A sobrevivência do parasita no fagolisossomo é uma função de sua capacidade para resistir e evitar ditos mecanismos.

A existência de uma resposta imune contra a parasitação por Leishmania, que é tanto humoral quanto celular, foi descoberta a partir dos primeiros momentos em que a doença foi estudada, e tem sido revista em numerosas ocasiões. O tipo de resposta humoral depende da forma de leishmaniose. Na forma cutânea, a resposta humoral é muito fraca, enquanto no tipo visceral uma alta resposta de anticorpos é observada. Nas afecções cutâneas, existe uma notável resposta de mediação celular, detectável tanto in vivo por meio de testes de hipersensibilidade do tipo retardado (DTH), quanto in viíro por meio de testes de transformação linfoblástica e testes de inibição da migração de macrófagos. Nestes casos, o título dos anticorpos do soro é normalmente baixo e diretamente relacionado com a seriedade do processo. Uma vez os amastigotos estejam dentro dos macrófagos, a resolução da ' 25

U3 infecção depende essencialmente dos mecanismos imunes de mediação celular. A resposta celular é determinada pela ação de junção dos . macrófagos, das células B, das várias subpopulações de células T, e das diferentes linfocinas secretadas por todos eles. O macrófago parasitado processa os antígenos da Leishmania e expressa-os em sua superfície por um processo mediado pelo Complexo Principal de Histocompatibilidade classe II (CPH-II). Adicionalmente, o macrófago secreta IL-1, que atua como um segundo sinal ativador para o linfócito T. Nos seres humanos, a leishmaniose visceral ou calazar é caracterizada por uma resposta celular ausente, )10 detectável tanto pela ausência da hipersensibilidade retardada (DTH) quanto pelos processos de proliferação celular. A ausência de proliferação de células T é detectada até na presença de mitógenos tais como a concanavalina A ou a fitoemaglutinina e da inibição na produção de IL-2 pelas células T estimuladas.

Em camundongos, a população de linfócitos T (fenótipo CD4) é heterogênea e pode ser dividida em pelo menos duas subpopulações de acordo com as linfocinas que eles produzem. Estas células são essenciais no desenvolvimento de imunidade protetora contra a leishmaniose cutânea | (subpopulação Th-1) e são, ao mesmo tempo, envolvidas na supressão da 20 resposta imune protetora (subpopulação Th-2), as células T induzidas em camundongos resistentes C57BL/6 ou camundongos BALB/C curados são predominantemente do tipo Th-1 ou Th-2. Em geral, as linfocinas secretadas por estas células favorecem o desenvolvimento da linhagem celular que as produz e tem um efeito antagônico sobre o desenvolvimento da outra subpopulação. Assim sendo, IL-4 e IL-10 produzidos pelas células Th-2 contribuem para a progressão da infecção, favorecendo o desenvolvimento desta linhagem. Adicionalmente, elas podem atuar diretamente sobre o macrófago, não permitindo sua ativação. Entretanto, em camundongos suscetíveis de infecção por Leishmania, deficientes no gene que codifica IL39

4, resultados contraditórios têm sido obtidos. Em alguns casos, tem sido observado que a ausência desta citocina redireciona a resposta e aumenta a resistência à infecção, enquanto, em outros, nenhuma diferença é observada no nível de infecção dos camundongos. Em camundongos geneticamente resistentes, tem sido observado que a ausência de expressão dos genes de IFN-γ ou seu receptor, CD40 ou o ligando de CD40, aumenta a suscetibilidade à infecção. A interação de CD40 e seu ligando é necessária para a produção da do IFN-γ da citocina necessário para orientar a resposta em direção a Th-1. Os camundongos com uma base genética resistente, que desenvolvem uma resposta do tipo Th-1, se tomam suscetíveis se eles forem deficientes na expressão da IL-12, desenvolvendo uma resposta do tipo Th-2. Dados recentes sugerem que a produção de IL-12 seja importante para orientar a resposta em direção a Th-1, e que a ausência de IL-4 pode evitar a resposta de Th-2.

Existe um grande número de proteínas de Leishmania que têm um caráter antigênico essencialmente caracterizado por processos de “Western-bloT. No soro de pacientes e cães infectados por Leishmania, tem sido possível detectar a presença de anticorpos contra as proteínas da membrana, tais como a gp63, gp46, PSA e KPM-11. Adicionalmente, vários antígenos de localização intracelular citoplasmática têm sido caracterizados, tais como: Hsp70, Hsp83, LIP2a, LIP2b, LILIPO, H2A, H3 e uma proteína relacionada à cinesina, a K39 de L. chagasi. A reatividade dos anticorpos, que reconhecem as proteínas conservadas presentes no soro de cães infectados por L. infantum, é orientada em direção a áreas pouco conservadas destas proteínas. Algumas das proteínas de membranas são muito antigênicas em infecções naturais. Em todos os casos de infecção natural, existe uma grande restrição na resposta humoral contra as proteínas, porque os anticorpos desenvolvidos durante o processo infeccioso reconhecem muitas áreas restritas dele. Os níveis de IgG normalmente correspondem à í-òi5

intensidade da infecção, refletem o grau e a duração do estímulo antigênico determinado pela carga parasitária. O antígeno de uma Leishmânia homólogo aos receptores da cinase do tipo C (LACK) foi descrito recentemente, o qual produz uma resposta prematura do tipo Th-2. Em camundongos transgênicos quanto ao antígeno LACK e com uma formação genética suscetível à infecção, a indução de tolerância a este antígeno protege contra a infecção pela Leishmânia major. Os anticorpos znti-Leishmania podem destruir os promastigotos in vitro na presença de complemento, promover a fagocitose e induzir a aderência de várias partículas à superfície dos promastigotos e amastigotos.

A reação patológica parece caminhar em paralelo com a densidade dos macrófagos parasitados. Na leishmaniose visceral, os macrófagos geralmente se distribuem de uma maneira difusa na totalidade dos diferentes tecidos orgânicos. O tipo de inflamação é constituído por um importante filtrado celular com uma predominância de linfócitos e células plasmáticas junto com hiperplasia das células fagocíticas. A inflamação produz alterações na fisiologia dos órgãos afetados, produzindo sérias alterações sistêmicas. Em algumas ocasiões, a inflamação granulomatosa local ocorre, com o aparecimento de granulomas e microgranulomas nos diferentes órgãos. Estes granulomas são constituídos por macrófagos e histiócitos (afetados ou não por parasitas) circundados por células plasmáticas e linfócitos e, em alguns casos, por fibroblastos. Este processo inflamatório é acompanhado por uma reação orgânica com a aparência de lesões características nos órgãos afetados. Alguns autores observaram depósitos de substância amilóide virtualmente na totalidade dos órgãos. Alguns autores formularam a hipótese de que os danos produzidos pela doença não são diretamente atribuíveis ao agente etiológico, mas à reação orgânica deflagrada.

VACINA CONTRA A LEISHMÂNIA ' 25

1?»

Ιο

Α imunidade intensa que segue a recuperação da leishmaniose cutânea tem dado um grande impulso ao desenvolvimento de vacinas profiláticas contra esta doença. Esta imunidade é derivada da indução de uma resposta T que tem associada a ela a produção de citocinas inflamatórias que ativam os macrófagos e destroem os parasitas. A memória imunológica nos casos de infecção é provavelmente mantida pela presença persistente do parasita no hospedeiro em um processo conhecido como imunidade concomitante.

Os primeiros estudos com respeito à vacinação contra a Leishmania na década dos anos 40 usaram parasitas vivos como imunógenos. Estes estudos conduziram à produção de vacinas que produziam proteção significativa contra a re-infecção subseqüente. No entanto, o conhecimento da possibilidade de que organismos vivos poderíam produzir infecções reais fizeram com que tais programas de vacinação não tivessem lugar por muito tempo e, ao contrário, levaram ao interesse focalizado em vacinas com base em parasitas mortos. Estes estudos proporcionaram a primeira evidência sobre a possibilidade de produzir vacinas eficazes pela inoculação dos parasitas.

Os exames clínicos que usaram a imunização com promastigotos mortos da Leishmania também começaram na década dos anos 40. Estas vacinas tiveram notável sucesso já que um certo grau de proteção foi observado, que poderia oscilar entre 0 e 82%, dependendo da população. Estas vacinas tinham um efeito menor do que as vacinas de parasitas vivos. O isolamento de clones avirulentos de L. major, que protegem camundongos contra a infecção, também demonstrou que uma vacina atenuada é possível. Entretanto, a ignorância das mutações que conduzem à perda de virulência e ao risco de produção de revertantes virulentos toma este tipo de vacinação correntemente inaceitável.

Recentemente tem havido um importante progresso em ’ 25

133 %0

relação à identificação de vacinas candidatas molecularmente definidas, tais como gp63, gp46/M2, o antígeno de superfície relacionado ao último ? antígeno conhecido como PSA-2 e as proteínas dp72 e gp70-2, a proteína LACK e Kmpl 1. Especificamente, os epitopos T presentes na proteína gp63 foi identificado, resultando em que apenas alguns deles fossem capazes de induzir uma resposta T, tanto de Th-1 quanto de Th-2. Estes antígenos induzem proteção significativa em animais de modelo, quando eles são administrados com adjuvantes. A proteína PSA-2 de Leishmania é capaz de proteger contra a infecção por L. major mediante indução de uma resposta Th-1. Para avaliar o mecanismo de proteção desta proteína como uma vacina contra a Leishmania em seres humanos, sua capacidade para induzir proliferação da célula T foi estudada em pacientes que haviam sofrido de leishmaniose e se haviam recuperado dela. Foi observado que a proteína é capaz de produzir uma intensa proliferação das células T destes indivíduos, mas não dos controles sem qualquer história anterior de infecção. A resposta foi do tipo Th-1, tendo sido demonstrada pelo padrão de indução da citocina.

Vacinas subunitárias têm sido focalizadas intensamente nos antígenos, porque eles são fáceis de se identificar, isolar e clonar. No entanto, é necessário levar em conta que nem todas as moléculas da vacina potenciais têm se ser proteínas. De fato, o lipofosfoglicano (LPG) desempenha um papel essencial no estabelecimento da infecção. A vacinação com LPG pode proteger contra a infecção pela L. major. A despeito da existência de um dogma que estabelece que as células T não reconhecem antígenos não proteináceos, a molécula de LPG parece ser apresentada às células T pelas células de Langerhans da pele. Adicionalmente, existe a evidência que tem demonstrado que os glicolipídeos microbianos e outras moléculas não proteináceas possam reconhecer as células T quando elas são apresentadas através da via CD-I. Embora não existe nenhuma evidência clara de que a proteína KMP11 associada com LPG induza uma resposta protetora, foi • 25 %0

agora provado que a fração proteinácea associada a LPG é capaz de induzir uma resposta T e IFN-γ, enquanto a fração LPG sem proteína não o é.

É normalmente aceito que as vacinas subunitárias, embora protetoras, apenas induzem uma imunidade de curto prazo. Este problema pode não ser importante em áreas endêmicas, onde os pacientes podem ser periodicamente reforçados por causa de infecções naturais. Um problema principal na utilização de subunidades pode surgir do fato de que pode não existir uma resposta a um antígeno único em uma população geneticamente diversa. Um coquetel de antígenos contendo indutores B e T pode superar este inconveniente. Foi recentemente publicado que um extrato de proteínas das membranas de Leishmania infantum, quando injetado por via imtraperitoneal, é capaz de conferir proteção contra as formas virulentas dos promastigotos deste parasita, e que esta proteção é maior quando as proteínas são encapsuladas em lipossomas positivamente carregados. Adjuvanticidade e imunidade protetora eliciada por antígenos de Leishmania donovani encapsulados em lipossomas positivamente carregados.

A vacinação com ácidos nucleicos carregando genes que codificam as proteínas da Leishmania envolve a administração de material genético do parasita, ao hospedeiro. Este DNA é absorvido pelas células e é introduzido no núcleo, onde ele é transcrito e subseqüentemente traduzido no citoplasma. A vantagem deste tipo de vacinação é ser possível direcionar a resposta imune por meio da via MHC-I ou MHC-II. Os antígenos produzidos intracelularmente são processados na célula e os peptídeos gerados são apresentados na superfície celular em associação com as moléculas MHC-I. A conseqüência deve ser que estas moléculas devem dar origem à indução de células T citotóxicas. Os antígenos produzidos em um ambiente extracelular devem ser especialmente absorvidos por células especializadas de apresentação a antígenos, processadas e apresentadas em sua superfície ligada às moléculas MHC-II, resultando na indução e ativação de células » 25 %0 ^^20 • .25

CD4+ que secretam citocinas que regulam os mecanismos efetores de outras células do sistema imune.

O primeiro vetor de DNA a ser administrado como uma vacina continha o gene gp63. Igualmente, o gene PS A-2 foi introduzido em um plasmídeo e foi observado que ele gera uma resposta Th-1 e indução de proteção. A vacinação com os plasmídeos de DNA que contêm Ag-2 induz uma resposta Th-1 e protege contra a infecção com L. major, enquanto Ag-2 nos complexos imune estimulatórios elicia uma resposta Th-1 e Th-2 combinada e não protege, a despeito do fato que IFN-γ é induzido. Igualmente, o gene que codifica a proteína LACK foi administrada por via subcutânea a camundongos BALB/c, em um vetor de expressão que expressa a proteína sob controle do promotor do citomegalovírus, e a proteção contra a infecção por L. major foi observada. Em quase todos os casos em que o DNA foi administrado, a via tem sido intramuscular, não obstante a injeção intradérmica de DNA particulado possa também ser explorada, já que ela requer uma quantidade menor de DNA. Outros sistemas de imunização usa vetores tais como Salmonella, BCG ou o vírus da Vaccinia. É interessante observar que a inclusão do gene gp63 no BCG é capaz de induzir proteção contra L. major.

O gene que codifica a proteína gp63 também foi introduzido no gene delta araC sob o controle do promotor rac em uma Salmonella typhimurium atenuada. A administração oral de 1 x 10⁹ colônias da bactéria transformada induz uma resposta T dentro do escopo tanto das células Th-1 quanto das células citotóxicas contra as células de mastocitomas que expressam gp63. A proteína gp63 na forma do complexo gp63-ISCOMs induz proteção em camundongos, evidenciada pela redução na inflamação e supressão das lesões. No soro, existem anticorpos do tipo IgG2a e, adicionalmente, é possível observar uma resposta Th-1 por indução de IL-2, IFN-γ e IL-10. Nenhuma resposta de DTH foi observada. A Salmonella typhi

Nramp 1 transformada com gp63 elicia uma resposta Th-1 com indução de

IL-2 e IFN-γ, e uma forte resolução das lesões é detectada. Uma proteína de • L. pifanoi conhecida como P-4 induz proteção significativa contra infecção por Leishmania. Estudos recentes em seres humanos com leishmaniose cutânea indicam que esta proteína ou os peptídeos dela derivados, são capazes de fazer as células T proliferarem. Não existe nenhuma indução de IL-4, enquanto o IFN-γ é induzido. Os mutantes Aro-A e Aro-D de Salmonella typhi transformados com IL-2, IFN-γ e TNF-α, administrados oralmente, podem ser vir como sistemas terapêuticos contra infecção por L.

|0 major. É interessante observar que, nestes pacientes, existe uma indução maior de iNOS. O gene gp&3 foi também clonado em Aro-A e Aro-D, e tem sido observado que, após a administração oral, a proteína codificada é capaz de induzir proteção significativa contra a infecção por L. major. Esta mesma proteína é capaz de induzir proteção quando ela é administrada fundida a vários promotores em variedades específicas (GID105 e GID106) de Salmonella.

Uma proteína artificial denominada Q foi recentemente descrita por nosso grupo, a qual é composta de vários fragmentos antigênicos de 4 proteínas de Leishmania infantum (mais especificamente, Lip2a,Lip2b,

PO e H2A), que, após ter sido usada como antígeno, provou um importante valor para o diagnóstico da leishmaniose canina, com uma sensibilidade de 93% e uma especificidade de 100% em comparação com os soros de animais de controle que não haviam sido infectados. Igualmente nosso grupo demonstrou que a proteína hsp70 de Leishmania infantum é um importante alvo da resposta imune em infecções causadas pela infestação com este parasita.

Com o objetivo de explorar a possibilidade de que a proteína Q possa ser usada para projetar sistemas de proteção contra a infecção por Leishmania infantum, tanto em si quanto em combinação com Hsp70, três tò'Y %ο φ20 • 25 séries de experiências foram planejadas usando-se o hamster como um modelo. Uma experiência foi planejada para verificar se a imunização com a Proteína Q protegia os animais contra a infecção a curto prazo, outra para verificar se a imunização os protegia a longo prazo e a terceira foi para verificar este efeito protetor após a imunização com as duas proteínas juntas. Foi, após isso, observado tanto da análise a curto prazo quanto da análise a longo prazo, que a proteína Q era capaz de eliciar uma resposta imune que reduzisse a carga parasítica tanto no fígado quanto no baço, após a infecção por Leishmania infantum na maior parte dos animais infectados, e que a imunização com as proteínas Q+Hsp70 também induziam uma resposta significativa contra ambas as proteínas e levavam a uma redução significativa da carga parasítica na maioria dos animais imunizados.

EXEMPLO 1: IMUNIZAÇÃO COM A PROTEÍNA Q animais foram imunizados com 5 microgramas de proteína Q dissolvidos em 40 microlitros de adjuvante de Freund, e outros 4 animais foram imunizados com a mesma quantidade de adjuvante emulsificado com 40 microlitros de solução salina PBS sem a proteína. Na primeira imunização foi empregado adjuvante completo de Freund combinado com a proteína, enquanto nas duas imunizações subseqüentes, o adjuvante incompleto de Freund foi usado misturado com a proteína na mesma proporção de proteína/adjuvante. Três imunizações intraperitoneais foram realizadas em intervalos de 15 dias. Começando-se da segunda semana após cada imunização e durante o período completo de imunização, amostras de sangue foram extraídas para medir a resposta humoral em relação à proteína Q nos ensaios ELISA. Foi observado que já na segunda semana após a primeira imunização, existia uma resposta IgG positiva em relação à proteína Q, e que esta resposta era elevada após a segunda semana depois da infecção, e aumentava com o tempo de imunização, alcançando os títulos de 1/100.000. Igualmente, foi observado que a resposta imune em relação à proteína Q não '•J yv>

Fls.»2~

Rub:_u.

•z.

era modificada significativamente após a infecção com o parasita da Tabelâ O/^ 4.

Quinze dias após a terceira imunização, os animais foram infectados com uma dose de 10⁵ parasitas promastigotos, diferenciados dos amastigotos infecciosos originários de um hamster infectado. Foi previamente verificado que o inóculo era capaz de induzir uma forte parasitemia junto com a doença quatro meses após ter-se administrado os parasitas, em 100% dos animais infetados. A Tabela 1 indica o nível de parasitemia por mg de tecido, tanto no fígado quanto no baço, dos animais de controle e dos vacinados. E possível observar que, em todos os animais vacinados, a carga parasítica no fígado decresce em relação aos controles, e que isto acontece de uma maneira muito significativa em 75% deles. Quando a carga parasítica no baço é examinada, é possível observar que também em 75% dos animais esta carga foi significativamente menor do que aquela dos controles, a RPL alcançando os 83% a 86%. O animal em que a RPL foi de 20% no fígado, teve uma RPL de 48% no baço.

TABELA 1. Carga parasítica no fígado e no baço de hamsters vacinados com a proteína Q através da via intraperitoneal. Após quatro semanas da infecção, a carga parasítica foi medida pelo processo de diluições limites (curto prazo). A carga parasítica é expressa como parasitas por miligrama de tecido. RPL = redução na carga parasítica em %.

HAMSTER IMUNIZADO COM A PROTEÍNA Q

Hamster	Fígado	(RPL)	Baço	(RPL)
1	4±1	(71%)	49 ±3	(83%)
2	3±2	(78%)	39 ±2	(86%)
3	5±1	(64%)	50 ±4	(83%)
4	11 ±3	(20%)	153 ±19	(48%)

Os números representam a média de três determinações. Controles hamsters 14 ± 5 295 ± 30

O número representa a média dos 4 animais. EXEMPLO 2

De modo a verificar o efeito da vacinação com a proteína Q na redução da carga parasítica em longo prazo, usando-se outra via de inoculação, 4 animais receberam por injeção subcutânea 5 microgramas de proteína Q dissolvida em 40 microlitros de PBS e misturados com 40 microlitros de adjuvante de Freund. Na primeira imunização, o adjuvante completo de Freund foi empregado, enquanto nas duas subseqüentes, foi utilizado adjuvante incompleto de Freund, como indicado acima. A vacinação foi administrada em três doses espaçadas em intervalos de 15 dias. Quinze dias após a terceira imunização, foi-lhes administrado um inóculo de 10⁵ parasitas infecciosos. Durante todo o período de imunização e durante toda a infecção (cinco meses), foi extraído sangue para se determinar a espécie de resposta humoral em relação à proteína Q e em relação às proteínas totais dos parasitas. A Tabela 5 mostra que já após a segunda semana de imunização, a resposta em relação à proteína Q foi positiva, como no caso anterior, em três dos camundongos, e que a resposta em relação à proteína foi muito elevada após duas semanas da primeira imunização. A resposta mantida em muito elevada após as imunizações remanescentes, alcançou um título de 1/75.000 na semana seguinte à terceira imunização. Em um dos animais, a resposta em relação à proteína Q foi mais lenta em relação a tempo, embora a resposta tivesse alcançado o nível daquela nos outros animais pelo final da experiência. Conseqüentemente, a partir dos dados derivados tanto do Exemplo 1 quando do Exemplo 2, é possível concluir que o grau da resposta imune em relação à proteína, por ambas as vias, intraperitoneal e subcutânea, é muito rápido, não obstante a resposta através da via intraperitoneal tivesse alcançado títulos mais elevados nos mesmos tempos (1/75.000 versus 1/30.000). A Tabela 6 indica a resposta em relação à proteína Q nos animais de controle. E possível observar que a reatividade em relação a esta proteína

é detectada nas 12^â às 14^â semanas após a infecção, que é quando os primeiros sintomas atribuíveis a uma leishmaniose potencial começam a ser detectados nos animais infectados. A Tabela 2 mostra os níveis de parasitemia no fígado e no baço dos animais de controle e vacinados. Pode ser observado que 50% dos animais foram protegidos no nível do fígado, no sentido em que a redução no nível de parasitemia tenha sido muito elevada (87 a 89%). Um dos animais não foi protegido, enquanto em outros dos animais a redução da carga parasítica foi de 22%. Ao contrário, a redução da carga parasítica foi de 98 a 99% em 100% dos animais ao nível do baço. TABELA 2. Carga parasítica no fígado e no baço de hamsters vacinados com a proteína Q através da via subcutânea. Após 20 semanas da infecção, a carga parasítica foi medida pelo processo de diluições limites (longo prazo). A carga parasítica é expressa como parasitas por miligrama de tecido. RPL = redução na carga parasítica em %.

HAMSTERS IMUNIZADOS COM A PROTEÍNA Q

Hamster	Fígado	(RPL)	Baço	(RPL)
1	1,4 χ 10⁶	(22%)	1,0 χ 10⁷	(98%)
2	2,0 χ 10⁵	(89%)	4,9 x 10⁵	(99,9%)
3	2,4 x 10⁵	(87%)	3,3 χ 10⁵	(99,9%)
4	2,4 x 10⁶	(0%),	6,3 χ 10⁵	(99,9%)

Os números representam a média de três determinações.

Controles hamsters 1,8 χ 10⁶ ± 1,2 χ 10⁵ 5,2 χ 10⁸ ± 2,6 χ 10⁷

Os números representam a média da carga parasítica dos 4 animais.

Com o objetivo de testar se a proteína Q poderia ser usada para projetar sistemas de proteção em formulações que contivessem a proteína LiHsp70 de Leishmania infantum, uma experiência foi realizada em camundongos Balb/c. Observou-se que, após a imunização, a carga parasítica, tanto no fígado quanto no baço, havia sido significativamente . 20

reduzida, sendo, em alguns dos animais, de quatro ordens de grandeza inferior.

EXEMPLO 3: IMUNIZAÇÕESO COM A PROTEÍNA Q + A PROTEÍNA

Hsp70 EM ADJUVANTE DE FREUND.

Cada um dos 4 hamsters recebeu por injeção intraperitoneal 5 microgramas de proteína Q e 5 microgramas de proteína LiHsp70 dissolvidos em 40 microlitros de PBS e emulsificados em 40 microlitros de adjuvante de Freund. Na primeira imunização, o adjuvante completo de Freund foi empregado, enquanto nas duas subseqüentes, o adjuvante incompleto de Freund foi usado como indicado acima. A vacinação foi administrada em três doses espaçadas em intervalos de 15 dias.

Quinze dias após a terceira imunização, administrou-se-lhes um inóculo de 10⁶ parasitas infecciosos através da via intracardíaca, e foram sacrificados na semana 22. A cada duas semanas, para todo o período de imunização e durante toda a infecção, extraiu-se sangue deles para determinar o grau de resposta humoral em relação à proteína Q e em relação à proteína LiHsp70.

A carga parasítica relativa entre os camundongos imunizados com a proteína Q mais LiHsp70 é mostrada na Tabela 3. Foi observado que todos os animais foram altamente protegidos e, em alguns deles, no baço, a redução chegou perto de duas a três ordens de grandeza.

TABELA 3. CARGA PARASÍTICA RELATIVA DE CAMUNDONGOS BALB/c IMUNIZADOS COM A PROTEÍNA Q MAIS LiHsp70 APÓS 4 MESES DE INFECÇÃO

CAMUNDONGOS IMUNIZADOS COM A PROTEÍNA Q E LiHsp70

Camundongo Fígado (RPL)	Baço	(RPL)
1	1,5 x 10³ (97%)	1,5 χ 10⁴	(99%)
2	0,9 χ 10³ (98%)	1,4 χ 10³	(99%)
3	2,0 χ 10⁴ (60%)	5,6 χ 10⁴	(99%)
4	0,8 χ 10⁴ (84%)	1,2 χ 10⁵	(96%)

Os números representam a média de três determinações.

Controles camundongos 5,1 χ 10⁴ ± 2 χ 10³3,2 χ 10⁶ ± 8 χ 10⁴

Os números representam a média da carga parasítica dos 4 animais.

As Tabelas 4 e 5 mostram que todos os animais dos Exemplos e 2 respondem imunologicamente à proteína Q, e que, partindo-se da segunda semana após a imunização, a resposta em relação à proteína Q foi alta e esta resposta aumentada após a segunda imunização (semana 4). A Tabela 6 mostra que a resposta em relação à proteína LiHsp70, durante todo o tempo da experiência, também foi positiva, embora inferior à resposta do Exemplo 3 em relação à proteína Q.

TABELAS 4 e 5. Mostram a resposta imune em 4 hamsters que receberam a injeção intraperitoneal com 5 microgramas de proteína Q (Tabela 4 Exemplo 1, curto prazo) e a resposta imune em 4 hamsters que receberam a injeção subcutânea com 5 microgramas de proteína Q (Tabela 5 - Exemplo 2, longo prazo).

TABELA 4: EXEMPLO 1, CURTO PRAZO

Camundongos imunizados com a proteína Q (curto prazo)

Resposta imune em relação à proteína Q

Semana	Camundongo 1	Camundongo 2	Camundongo 3	Camundongo 4
2	0,8	0,2	0,3	0,6
4	1,9	2,3	1,1	2,1
6	3	3	2,4	2,9
Infectado
8	3	3	2,9	3
10	3	3	3	3

Os soros (diluídos a 1/200) que apresentam uma densidade ótica de 3 têm um título mais elevado do que 1/45.000

Camundongos de controle -

Semana	Camundongo 1	Camundongo 2	Camundongo 3	Camundongo 4
2	0	0	0	0
4	0	0	0	0
6	0	0	0	0
8	0	0	0	0
10	0	0	0	0

Os soros foram diluídos a 1/200.

TABELA 5: EXEMPLO 2, LONGO PRAZO

RESPOSTA IMUNE EM RELAÇÃO À PROTEÍNA Q

Semana	Camundongo 1	Camundongo 2	Camundongo 3	Camundongo 4
2	1,8	1,3	1,9	0,4
4	2,1	1,8	2,2	0,7
6	2,5	2,7	2,5	0,5
8	2,8	2,2	2,2	0,8
10	3	2,9	2,5	0,7
12	3	3	3	0,9
14	3	3	3	1
16	3	3	2,9	1,5
18	3	3	3	1,7
20	3	3	3	2,2
22	3	3	3	2,6
24	3	3	3	3
26	3	3	3	3

Camundongos de controle

Resposta imune contra proteína Q (a longo prazo)

1ΜΗ

Semana	Camundongo 1	Camundongo 2	Camundongo 3	Camundongo 4
2	0	0	0	0
4	0	0	0	0
6	0	0	0	0
S	0	0	0	0
10	0	0	0	0
12	0,2	0,1	0,3	0,1
14	0,3	0,5	0,4	0,2
16	0,4	0,5	0,7	0,3
18	0,9	1,1	1,7	0,6
20	1,1	1,3	1,5	0,8
22	2,5	2,3	2,7	1,9
24	2,3	2,1	1,8	2,2
26	1,9	2,2	2,3	2,7

Os soros foram diluídos a 1/200.

TABELA 6. Mostram a resposta imune em 4 hamsters que receberam a injeção intraperitoneal com 5 microgramas de proteína Q mais 5 microgramas de proteína LiHSP 70 (Exemplo 3, longo prazo).

Camundongos imunizados com a proteína Q + Hsp70

Resposta imune em relação à proteína Q

Semana	Camundongo 1	Camundongo 2	Camundongo 3	Camundongo 4
2	0,4	0,6	0,5	0,4
4	1,6	1,1	1,6	1,7
6	3	2	1,9	1,9
8	3	2,4	2,6	2,5
10	3	2,9	3	2,9
12	2,7	2,9	2,9	2,9
14	2,5	2,6	2,9	2,7
16	2,6	2,5	2,5	2,4
18	2,8	2,7	2,7	2,5
20	2,5	2,8	2,4	2,7
22	2,5	2,3	2,8	2,9

Os soros foram diluídos a 1/200.

Camundongos de controle

Resposta imune contra a proteína Q

Semana	Camundongo 1	Camundongo 2	Camundongo 3	Camundongo 4
2	0	0	0	0
4	0	0	0	0
6	0	0	0	0
8	0	0	0	0
10	0	0	0	0
12	0	0,1	0,2	0,1
14	0,3	0,4	0,2	0,5
16	0,5	0,6	0,7	0,7
18	0,8	1,4	1,1	1,5
20	1,8	1,6	1,8	2,2

O soro foi diluído 1/200.

Camundongos foram imunizados com a proteína Q + Hsp70

Resposta imune contra a proteína Hsp70

Semana	Camundongo 1	Camundongo 2	Camundongo 3	Camundongo 4
2	0,1	0,2	0,1	0,4
4	0,4	0,6	0,3	0,5
6	0,8	0,7	0,4	0,3
8	0,7	1,1	1,2	0,5
10	1,2	1,4	1,5	0,8
12	1,9	1,9	2	1,2
14	2	1,8	2,2	1,7
16	1,9	2	2,2	1,9
18	2	2,1	2	2
20	2	2,1	2,2	1,9
22	2,4	2,3	2,1	1,9

Os soros foram diluídos 1/800

Camundongos de controle

Resposta imune contra a proteína Hsp70

Semana	Camundongo 1	Camundongo 2	Camundongo 3	Camundongo 4
2	0	0	0	0
4	0	0	0	0
6	0	0	0	0
8	0	0	0	0
10	0	0	0	0
12	0,1	0	0,3	0
14	0,3	0,2	0,5	0,4
16	0,5	0,6	0,6	0,3
18	0,7	0,6	0,7	0,5
20	1	0,8	0,5	1,2
22	1,7	1,4	0,8	1,1

Os soros foram diluídos 1/200

EXEMPLO 4: IMUNIZAÇÃO COM PROTEÍNA Q + BCG EM

W6

CAMUNDONGOS BALB/c

Quatro camundongos Balb/c receberam, cada um, a injeção intraperitoneal com 5 microgramas de proteína Q e 10⁶ Unidades Formadoras de Colônia (CFU) de BCG (bacilo Calmette-Guérin) dissolvidos em 40 microlitros de PBS. A imunização foi efetuada em três doses, 15 dias de intervalo. 15 dias após a terceira imunização, eles receberam um inóculo de parasitas infecciosos de 10⁵ BCN150 de L. infantum pela via intracardíaca. A cada duas semanas, por todo o tempo de imunização e na totalidade da infecção, amostras de sangue foram tomadas deles para testar o grau de resposta humoral à proteína Q. Os animais foram sacrificados na semana 8 após a infecção.

A Tabela 7 (a e b) mostra que os animais imunizados respondem positivamente à proteína Q, começando da segunda semana, e que a resposta aumenta progressivamente até, em muitos casos, que ela alcance valores de 400.000.

A Tabela 8 mostra a diferença na carga parasitica entre o fígado e o baço dos animais vacinados e de controle.

TABELA 7: Resposta imune à proteína Q em camundongos Balb/c imunizados com 5 microgramas de proteína Q e 10⁶ CFU de BCG

Camundongos 1, 2, 3,4 imunizados

Camundongos 5, 6, 7, 8 controles não imunizados TABELA 7: REAÇÃO À PROTEÍNA Q

Semana	Camundongo 1	Camundongo 2	Camundongo 3	Camundongo 4
pré-imune	0	0	0	0
l^s imunização
1	0	0,2	0,1	0
2* imunização
3	0,5	0,7	0,8	0,9
3a imunização
6	1,6	2,1	2,6	2,7
7	1,8	2,3	2,4	2,1
9	2,1	2,6	2,5	1,9
11	2,7	2,9	3	3
13	3	3	3	3
Semana	Camundongo S	Camundongo 6	Camundongo 7	Camundongo 8
pré-imune	0	0	0	0

l¹ imunização

0 0

2’ imunização

0 0

3a imunização

0 0

o número 3 é eqüivalente a superabundância no sistema de medição, os soros foram tomados no início de cada uma das semanas indicadas a primeira imunização foi efetuada no dia 0, a segunda, no dia 15, e a terceira, no dia 30.

TABELA 8. Carga parasítica no fígado e no baço de camundongos Balb/c vacinados com a proteína Q subcutaneamente + 10⁶ de BCG. 8 semanas após a infecção a carga parasítica foi medida por microscopia ótica das impressões dos do tecido pela medição de diferentes campos contendo 7000 células nucleadas. A carga parasítica é representada como a quantidade de parasitas por miligrama de tecido, tendo sido anteriormente calculado que 1 parasita por 1000 células nucleadas é eqüivalente a uma quantidade aproximada de

210 parasitas por miligrama de tecido. RPB = redução da carga parasítica, %.

Camundongo	Fígado	(RPB)	Baço	(RPB)
1	72	(82%)	457	(89%)
2	40	(90%)	207	(95%)
3	48	(88%)	n.d.	(100%)
4	n.d.	(100%)	90	(98%)
Controles
4 animais. Média		400 ± 15	4155 ±30

n.d. parasitas que não puderam ser detectados em 5000 células nucleadas.

1/1

Claims

REIVINDICAÇÕES

1. Composição farmacêutica caracterizada pelo fato de ser para a prevenção de Leishmaniose em humanos e animais, compreendendo um polinucleotídeo consistindo da sequência de nucleotídeos da SEQ ID No.: 2, e

5 um adjuvante fisiológico apropriado para administração intraperitoneal, subcutânea ou intramuscular.
2. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que compreende ainda uma proteína LiHsp70, completa ou fragmentada, ou variantes da mesma.

10 3. Proteína, caracterizada pelo fato de que consiste da sequência de aminoácidos da SEQ ID No.: 1.

4. Polinucleotídeo, caracterizado pelo fato de que consiste da sequência de nucleotídeo da SEQ ID No.: 2.

1/6

Ui

Fig 1a _kDa Hjt 1 2 3 4 S

12 3 4 5

Fig 1c

1 2 3 4 5

2/6

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4/6

Fig 3

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104

157

211

2 65

319

374

Fig 4a

Fig 4b kDa

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11S97 — 56—

4,5MT 1 2 3 4 5

29 —
5/6

Fig 4c

Fig 4d

Fig 4e

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6/6

Fig 4f

Fig 5