ES2205059T3 - Antigenos de leishmania para usarse en la terapia y diagnostico de leshmaniasis. - Google Patents

Abstract

SE DESCRIBEN COMPOSICIONES Y PROCEDIMIENTOS PARA PREVENIR, TRATAR Y DETECTAR LA LEISHMANIASIS Y ESTIMULAR LAS RESPUESTAS INMUNES EN PACIENTES. LOS COMPUESTOS DESCRITOS INCLUYEN POLIPEPTIDOS QUE CONTIENEN AL MENOS UNA PORCION INMUNOGENICA DE UNO O MAS ANTIGENOS DE LEISHMANIA O UN VARIANTE DE ESTOS. TAMBIEN SE DESCRIBEN VACUNAS Y COMPOSICIONES FARMACEUTICAS QUE INCLUYEN DICHOS POLIPEPTIDOS Y PUEDEN UTILIZARSE, POR EJEMPLO, PARA LA PREVENCION Y LA TERAPIA DE LA LEISHMANIASIS, ASI COMO PARA LA DETECCION DE UNA INFECCION POR LEISHMANIA.

Description

Antígenos de Leishmania para usarse en la terapia y diagnóstico de Leishmaniasis.

La presente invención se refiere generalmente a composiciones y métodos para evitar, tratar y detectar Leishmaniasis, y para estimular respuestas inmunes en pacientes. La invención más particularmente se refiere a polipéptidos que comprenden una porción inmunogénica de un antígeno de Leishmania o variante o una variante del mismo, y a vacunas y composiciones farmacéuticas que comprenden uno o más de dichos polipéptidos. Las vacunas y composiciones farmacéuticas, se pueden utilizar, por ejemplo, para la prevención y terapia de Leishmaniasis; así como para la detección de infección por Leishmania en pacientes y suministros sanguíneos.

Antecedentes de la invención

Los organismos de Leishmania son parásitos protozoarios intracelulares de macrófagos que causan una amplia escala de enfermedades clínicas en seres humanos y otros animales, principalmente perros. En algunas infecciones, el parásito puede estar inactivo durante muchos años. En otros casos, el huésped puede desarrollar uno de una variedad de formas de Leishmaniasis. Por ejemplo la enfermedad puede ser asintomática o puede manifestarse como Leishmaniasis visceral subclínica, que se caracteriza por síntomas moderados de malasia, diarrea y hepatomegalia intermitente. Los pacientes con la enfermedad subclínica o asintomática usualmente tienen bajas titulaciones de anticuerpos, haciendo difícil de detectar la enfermedad con técnicas normales. Alternativamente, la Leishmaniasis puede manifestarse como una enfermedad cutánea, que es un problema médico severo, pero generalmente se autolimita, o como una enfermedad de la mucosa altamente destructiva, que no se limita así misma. Finalmente, y más seriamente, la enfermedad puede manifestarse como una infección visceral aguda implicando el vaso, hígado y nodos linfáticos la cual cuando no se trata, generalmente es una enfermedad fatal. Los síntomas de Leishmaniasis visceral agudo, incluyen hepatoespienomegalia, fiebre, leucopenia, anemia e hipergamaglobulinemia.

La Leishmaniasis es un problema serio en la mayor parte del mundo, incluyendo Brasil, China, África de Este, India y áreas del este medio. La enfermedad también es endémica en la región del Mediterráneo, incluyendo el Sur de Francia, Italia, Grecia, España, Portugal y África del Norte. El número de casos de Leishmaniasis se ha incrementado dramáticamente en los últimos 20 años, y millones de casos de esta enfermedad existen ahora por todo el mundo. Alrededor de 2 millones de nuevos se diagnostican, 25% de los cuales son Leishmaniasis visceral. Sin embargo, no hay vacunas o tratamientos efectivos actualmente disponibles. El diagnóstico preciso de Leishmaniasis también es frecuentemente difícil de lograr. Hay 20 especies de Leishmaniasis que infectan humanos, incluyendo L. donovani, L. chagasi, L. infantum, L. major, L. amazonensis, L. braziliensis, L. panamensis, L. trópica, y L. guyanensis, y no hay signos distintivos o síntomas que indiquen inambiguamente la presencia de infección por Leishmania. Se han utilizado métodos de detección de parásitos, pero dichos métodos no son sensibles o tácticos. Las pruebas serológicas actuales (utilizando, por ejemplo las técnicas de ELISA o inmunofluorescencia) y las pruebas de la piel normalmente utilizan parásitos enteros o lisados. Dichas pruebas generalmente son insensibles, irreproducibles y propensas a la reacción cruzada con una variedad de otras enfermedades. Además, las preparaciones empleadas en dicha prueba con frecuencia son inestables.

Consecuentemente, existe una necesidad en la técnica de vacunas para evitar la Leishmaniasis en seres humanos y perros y para composiciones terapéuticas mejoradas para el tratamiento de Leishmaniasis. También existe una necesidad para métodos mejorados de detección de infección por Leishmania en pacientes y en suministros sanguíneos. La presente invención cumple con estas necesidades y además provee otras ventajas relacionadas.

Resumen de la invención

Brevemente, la presente invención provee composiciones y métodos para evitar, tratar y detectar Leishmaniasis, así como para estimular respuestas inmunes en pacientes. En un aspecto se proveen polipéptidos, comprendiendo por lo menos una porción inmunogénica de una antígeno de Leishmania, o una variante de dicho antígeno que difiere únicamente en substituciones conservadas y/o modificaciones conservadoras. En una modalidad de este aspecto, el antígeno de Leishmania tiene la secuencia de aminoácidos recitada en SEC ID NO:2. En otra modalidad, el antígeno de Leishmania tiene la secuencia de aminoácidos recitada en SEC ID NO:4. También se proveen las secuencias de ADN que codifican los polipéptidos anteriores, vectores de expresión recombinantes comprendiendo estás secuencias de ADN y células huésped transformadas o transfectadas con dichos vectores de expresión.

En aspectos relacionados, la presente invención provee composiciones farmacéuticas que comprenden por lo menos una porción inmunogénica de una antígeno de Leishmania (o una variante de dicho antígeno que difiere únicamente en substituciones y/o modificaciones conservadores) como se describió en la presente y un vehículo fisiológicamente aceptado. Además, también se proveen las vacunas que comprenden por lo menos una porción inmunogénica de un antígeno de Leishmania (o una variante de dicho antígeno que difiere únicamente en substituciones y/o modificaciones conservadoras) como se describió en la presente en un incrementador de respuesta inmune no específico. En una modalidad de estos aspectos, el antígeno de Leishmania tiene la secuencia de aminoácidos recitada en SEC ID NO:2. En otra modalidad, el antígeno de Leishmania tiene la secuencia de aminoácidos reactivada en SEC ID NO:4.

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En modalidades aún más además relacionadas, las composiciones farmacéuticas y vacunas comprenden por lo menos dos polipéptidos diferentes seleccionados del grupo que consiste de (a) un polipéptido que comprende una porción inmunogénica de un antígeno de Leishmania que tiene la secuencia de aminoácidos recitada en SEC ID NO:2, o una variante de dicho antígeno que difiere únicamente en substituciones y/o modificaciones conservadoras; (b) un polipéptido que comprende una porción inmunogénica de un antígeno de Leishmania que tiene la secuencia de aminoácidos recitada en SEC ID NO:4, o una variante de dicho antígeno que difiere únicamente en substituciones y/o modificaciones conservadoras; (c) un polipéptido que contiene una porción inmunogénica de un antígeno de Leishmania que tiene la secuencia de aminoácidos recitada en SEC ID NO:6, o una variante de dicho antígeno que difiere únicamente en substituciones y/o modificaciones conservadoras; (d) un polipéptido que comprende una porción inmunogénica de un antígeno de Leishmania que tiene la secuencia de aminoácidos recitada en SEC ID NO:8, o una variante de dicho antígeno que difiere únicamente en substituciones y/o modificaciones conservadoras; y (e) un polipéptido que comprende una porción inmunogénica de un antígeno de Leishmania que tiene la secuencia de aminoácidos recitada en SEC ID NO:10, o una variante de dicho antígeno que difiere únicamente en substituciones y/o modificaciones conservadoras.

En otras modalidades relacionadas, las composiciones farmacéuticas y vacunas comprenden antígenos de Leishmania solubles.

En otro aspecto, la presente invención provee métodos para inducir inmunidad protectora contra Leishmaniasis en un paciente, comprendiendo administrar a un paciente una composición o vacuna farmacéuticas como se describió antes.

En aspectos adicionales, se proveen métodos y equipos de diagnóstico para detectar infección por Leishmania en un paciente. Los métodos comprenden: (a) poner en contacto células dérmicas de un paciente con una composición farmacéutica como se describió antes; y (b) detectar una respuesta inmune sobre la piel del paciente y así detectar la infección por Leishmania en el paciente. Los equipos de diagnóstico comprenden: (a) una composición farmacéutica como se describió antes; y (b) un aparato suficiente para poner en contacto una composición farmacéutica con las células dérmicas de un paciente.

En aspectos adicionales, la presente invención provee métodos para estimular una respuesta inmune celular y/o humoral en un paciente, comprendiendo administrar a un paciente una composición farmacéutica o vacuna, como se describió antes.

En un aspecto relacionado, se proveen aspectos para tratar a un paciente que sufre con una enfermedad que responde a estimulación de IL-12, comprendiendo administrar a un paciente, una composición farmacéutica o vacuna como se describió antes.

Estos y otros aspectos de la presente invención serán evidentes por referencia a la siguiente descripción detallada y dibujos anexos. Todas las referencias descritas en la presente se incorporan aquí por referencia en su totalidad como si cada una fuera incorporada individualmente.

Breve descripción de los dibujos

La Figura 1, muestra la estimulación de proliferación de células T obtenidas de ratones BALB/C inmunizados con L. donovani (representado por el índice de estimulación) por macrófagos infectados con L. donovani después de la incubación durante 24, 48 y 72 horas.

La Figura 2, ilustra perfiles de CLAR representativos de péptidos aislados de moléculas de MHC clase 11 de macrófagos P388D1. El panel A muestra péptidos aislados de macrófagos no infectados y paneles B muestra péptidos aislados de macrófagos infectados por L. donovani. Las flechas en el panel B indican picos de péptidos presentes únicamente en la preparación de macrófagos infectados.

La Figura 3, ilustra la expresión y purificación de Ldp23 como una proteína de fusión recombinante. El panel A muestra un gel SDSPAGE teñido con azul una Coomassie de E. coli lisados sin (línea 1) y con (línea 2) inducción de IPTG de expresión de Ldp23. La flecha indica la proteína de fusión recombinante. El panel B muestra la proteína de fusión después de escisión de un gel de SDS-PAGE preparativo, electroelución, diálisis contra PBS y SDS-PACE analítico.

La Figura 4, presenta un análisis de manchas Northern de ARN total preparado de L. donovani, L. majar, L. amazonensis y L. pifanoi con un gen Ldp23 marcado con ^{32}p. 1, 2, y 3 se refieren a ARN obtenido de promastigotes en la fase de crecimiento logarítmico, promastigotes en la fase de crecimiento estacionario y formas de amastigotes, respectivamente.

La Figura 5, muestra un análisis de manchas Western de antígenos de promastigotes de L. donovani incubados con suero de conejo preinmunes (línea A) o con antisuero de conejo o anti-Ldp23 (línea B).

La Figura 6, ilustra la expresión superficial de Ldp23 en promastigotes de L. donovani ilustrativos. La línea punteada muestra la inmunofluorescencia directa realizada utilizando suero de ratón preinmune y la línea sólida muestra el resultado obtenido con antisuero de anti-GST-Ldp23 de ratón. La intensidad de fluorescencias se analizó por FACScan.

La Figura 7, muestra la estimulación de proliferación de células T específicas para Leishmania por Ldp23. Los resultados son presentados como número de células relativas como una función de intensidad de fluorescencia. Las células T (10^{5}/pozo) se purificaron de nodos linfáticos de ratones BALB/c inmunizados en las almohadillas de la pata con promastigotes de L. donovani en AFC y se cultivaron con varias concentraciones Ldp23 recombinante purificado en presencia de células mononucleares del bazo de BALB/c normales tratadas con 2 x 10^{5} mitomicina C. La proliferación de células T se midió a las 27 horas del cultivo. Los valores se expresan como cpm y representan la media de incorporación de [3H]TdR de cultivos por triplicado.

La Figura 8, ilustra la producción de citoquina inducida por Ldp23 por células de nodos linfáticos de ratones BALB/c. Los cultivos se incubaron con cantidades variables de Ldp23 o lisato de Leishmania, presentados como \mug/mL, y se analizaron por ELISA para la producción de interferon-\gamma (panel A) o interleucina-4 (panel B), ambos de los cuales se muestran como ng/mL.

La Figura 9, muestra la amplificación de RCP de ARNm de citoquina aislado de CMSP de pacientes LM (Panel A) y LC (panel B) antes y después de la estimulación con polipéptidos representativos de la presente invención. Las líneas 0 y - indican el nivel de productos de RCP y la iniciación de cultivo y después de 72 horas de cultivo, respectivamente, en ausencia de polipéptido agregado; las líneas Lb, 83a y 83b indican el nivel de productos de RCP después del cultivo de CMSP con lisato de L. braziliensis. Lbhsp83a y Lbhsp83b, respectivamente.

La Figura 10, presenta una comparación de niveles de interferon-\gamma (panel A) y TNF-\alpha (panel B) en los sobrenadantes de cultivos de CMSP de 72 horas de individuos infectados por Leishmania y de control en respuesta a la estimulación con lisato de parásitos o los polipéptidos indicados.

La Figura 11, ilustra los niveles de IL-10 p40 ( en pg/mL) en el sobrenadante de cultivos de CMSP de individuos infectados por L. braziliensis y controles no infectados 72 horas después de la estimulación con lisato de promastigote de parásito (Lb), Lbhsp83a o Lbhsp83b.

La Figura 12, presenta las reactividades de suero de infección por L. braziliensis de pacientes con polipéptidos representativos de la presente invención en una ELISA normal. Los valores se expresan con absorbancia a 405 nm.

Las Figuras 13A y 13B, ilustran el nivel de IL-4 y IFN-\gamma secretados (en pg/mL) estimulados en cultivos de nodos linfáticos de ratón por la adición de polipéptidos representativos de la presente invención.

La Figura 14, muestra el nivel de IFN-\gamma (en pg/mL) secretados por CMSP de humano infectado por Leishmania, estimulado por M15, comparado con los niveles estimulados por lisato de L. major y LRack, un antígeno que parece ser no conocido por humanos infectados por Leishmania.

La Figura 15, muestra el nivel de IFN-\gamma (en pg/mL) secretado por las CMSP de humanos infectados o no infectados estimuladas por antígenos de Leishmania solubles (antígenos S) comparado con los estimulados por lisato de L. major y L-Rack.

La Figura 15, ilustra la proliferación de cultivos de nodos linfáticos de murinos estimulados por la adición de polipéptidos representativos de la presente invención. Los valores se expresan como cpm.

La Figura 17, muestra la proliferación de CMSP de humanos, preparadas de individuos inmunes para Leishmania y no infectados, estimulados por M15 comparados con la proliferación estimulada por lisato de L. major y L-Rack. Los valores se expresan como cpm.

La Figura 18, ilustra la proliferación de CMSP de humanos, preparadas de individuos infectados o no infectados, estimulados por antígenos de Leishmania solubles comparado con la proliferación estimulada por el medio de cultivo, lisato de L. major y L-Rack. Los valores se expresaron como cpm.

La Figura 19, presenta una comparación de una secuencia de Lbhsp83 con secuencias homologas de L. Amazo- nensis (Lahsp83), T. cruzi (Tchsp83) y humanos (Huhsp89).

Descripción detallada de la invención

Como se observó antes, la presente invención generalmente se dirige a composiciones y métodos para evitar, tratar, y detectar Leishmaniasis, así como para estimular respuestas inmunes en pacientes. Las composiciones de la presente invención incluyen polipéptidos que comprenden por lo menos una porción inmunogénica de un antígeno de Leishmania; o una variante de dicho antígeno que difiere únicamente en substituciones y/o modificaciones conservadoras. En una modalidad preferida, las composiciones de la presente invención incluyen múltiples polipéptidos seleccionados de tal manera que provean protección mejorada contra una variedad de especies de Leishmania.

Los polipéptidos dentro del alcance de la presente invención incluyen, pero no están limitados a polipéptidos que comprenden porciones inmunogénicas de antígeno de Leishmania que tienen la secuencias recitadas en SEC ID NO:2 (denominada en la presente como M15), SEC ID NO:4 (denominada en la presente como Ldp23), SEC ID NO:6 (denominada en la presente como Lbhasp83), SEC ID NO:8 (denominada en la presente como Lt-210) y SEC ID NO:10 (denominada en la presente como LbeIF4A). Como se usa en la presente el término "polipéptido" abarca cadenas de aminoácidos de cualquier longitud incluyendo proteínas de longitud completa (es decir, antígenos), en donde los residuos de aminoácidos están ligados por enlaces covalentes. Por lo tanto, un polipéptido que comprende una porción inmunogénica de uno de los antígenos anteriores puede consistir completamente de la porción inmunogénica, o puede contener secuencias adicionales. Las secuencias adicionales pueden derivarse del antígeno de Leishmania nativo o puede ser heterólogo y dichas secuencias pueden, (pero no necesariamente), ser inmunogénicas. Un antígeno "que tiene" una secuencia particular es un antígeno que contiene, dentro de su secuencia de longitud completa, las secuencia recitada. El antígeno nativo puede o no contener una secuencia de aminoácidos adicionales.

Una porción inmunogénica de un antígeno de Leishmania es una porción que es capaz de producir una respuesta inmune (es decir celular y/o humoral en un paciente actual o previamente infectado por Leishmania) tal como un ser humano o un perro (y/o) en cultivos de células de nodos linfático o células mononucleares de sangre periférica (CMSP) aisladas de individuos actual o previamente infectados por Leishmania. Las células en las cuales se producen una respuesta pueden comprender una mezcla de tipos de células o pueden contener células de componentes aislados (incluyendo, pero no limitado a células T, células NK, macrófagos, monocitos y/o células B). En particular las porciones inmunogénicas son capaces de inducir la proliferación de células T y/o una respuesta de citoquina dominante del tipo de Thl dominantemente (v.gr., producción de IL-2, IFN-\gamma, y/o TNF-\alpha células T y/o NK y/o producción de IL-12 por monocitos como macrófagos y/o células B). Las porciones inmunogénicas de los antígenos descritos en la presente generalmente se pueden identificar utilizando técnicas conocidas por los de experiencia ordinaria en la técnica, tales como los métodos representativos provistos en la presente.

Las composiciones y métodos de la presente invención también abarcan variedades de los polipéptidos anteriores. Una "variante", como se usa en la presente, es un polipéptido que difiere del antígeno nativo solamente en substituciones y/o modificaciones conservadoras, tales como la capacidad del polipéptido para inducir una respuesta inmune si es retenido. Dichas variantes generalmente se pueden identificar modificando una de las secuencias de polipéptidos anteriores y evaluando las propiedades inmunogénicas del polipéptido modificado, utilizando por ejemplo, los procedimientos representativos descritos en la presente.

Una "substitución conservadora" es una en la cual se substituye un aminoácido por otro aminoácido que tiene propiedades similares, de manera que alguien con experiencia en la técnica de la química de péptidos podría esperar que estuviera substancialmente sin cambiar la estructura secundaria y naturales hidropática del polipéptido. En general, los siguientes grupos aminoácidos representan cambios conservadores: (1) ala, pro, gly, glu, asp, gin, asn, ser, thr; (2) cys, ser, tyr, thr; (3) val, ile, leu, met, ala, phe; (4) lys, arg, his; y (5) phe, tyr, trp, his.

También (o alternativamente) las variantes podrían modificarse por ejemplo por la supresión o adición de aminoácidos que tienen influencia mínima sobre las propiedades inmunogénicas, estructuras secundarias e hidropáticas naturales del polipéptido. Por ejemplo, un polipéptido se puede conjugar con una secuencia de señal (o lida) en el extremo N-terminal de la proteína que dirige cotranslacional o post-translacionalmente la transferencia de la proteína. El polipéptido también se puede conjugar a un entrelazador y otra secuencia para facilidad de síntesis, purificación o identificación del polipéptido (v.gr., poli-His), o para aumentar la unión del polipéptido a un soporte sólido. Por ejemplo, se puede conjugar un polipéptido a una región de Fc de inmunoglobulina.

"Polipéptidos" como se describió en la presente, también incluyen polipéptidos de combinación. Un "polipéptido de combinación" es un polipéptido que comprende por lo menos una de las porciones inmunogénicas anteriores y una o más secuencias de Leishmania inmunogénicas adicionales, vía una ligadura de péptidos en una sola cadena de aminoácidos. Las secuencias se pueden unir directamente (es decir, sin la intervención de aminoácidos) o se pueden unir a manera de una secuencia de unión (v.gr., Gly-Cys-Gly) que no disminuye significativamente las propiedades inmunogénicas de los polipéptidos de componentes.

En general, los antígenos de Leishmania que tienen propiedades inmunogénicas, y secuencias de ADN que codifican dichos antígenos, se pueden preparar utilizando cualquiera de una variedad de procedimientos de una o más especies de Leishmania incluyendo pero no limitado a L. donovani, L. chagasi, L. infantum, L. majar, L. amazonensis, L. braziliensis, L. panamensis, L. tropica, y L. guyanensis. Dichas especies están disponibles, por ejemplo, de ATCC, Rockville, MD. Por ejemplo, los péptidos aislados de moléculas de clase II MHC de macrófagos infectados con una especie de Leishmania se pueden utilizar para rescatar los antígenos o modelos de Leishmania correspondientes. Las moléculas clase II MHC se expresan principalmente por células de sistema inmune, incluyendo macrófagos. Estas moléculas presentan péptidos, que usualmente son de 13-17 aminoácidos de largo, derivado de antígenos extraños que se degradan en vesículas celulares. Los antígenos de péptidos unidos se reconocen entonces por células T CD4. Consecuentemente, los péptidos extraños aislados o moléculas de clase II MHC por ejemplo, de macrófagos de murinos infectados por Leishmania se pueden utilizar para identificar proteínas de Leishmania.

Nuevamente, los péptidos derivados de antígenos de Leishmania se pueden aislar comparando el perfil de CLAR de fase inversa de péptidos extraídos de macrófagos infectados con el perfil de péptidos extraídos de células no infectadas. Los péptidos que dan origen a picos diferentes de CLAR únicos para macrófagos infectados entonces pueden secuenciarse utilizando, por ejemplo, la química Edman, como se describe en Edman and Berg, Eur J. Biochem, 80:116-132 (1967). Un fragmento de ADN que corresponde a una porción de un gen de Leishmania que codifica el péptido entonces se puede amplificar de un marco de ADNc de Leishmania utilizando un iniciador de sentido oligonucleasa derivado de una secuencia de péptidos y un iniciador de contrasentido de oligonucleótido. El fragmento de ADNc resultante entonces se puede utilizar como una sonda para tamizar un banco de Leishmania para una longitud completa de ADNc o clon genómico que codifica el antígeno de Leishmania. Dichos tamices generalmente se pueden realizar utilizando técnicas bien conocidas para los de experiencia ordinaria en la técnica, tales como aquellos descritos en Sambrook y otros, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratories, Cold Spring Harbor, NY (1989).

Este enfoque se puede utilizar para identificar un antígeno de Leishmania donovani de 23 kD (denominado en la presente como Ldp23). Las secuencia de una molécula de ADN que codifica Ldp23 se provee en la secuencia de la SEC ID NO:3 y la secuencia de aminoácidos de Ldp23 se provee en la SEC ID NO:4. Utilizando los métodos descritos en la presente se ha mostrado que Ldp23 induce una respuesta inmune de Th1 en células T preparadas de ratones infectados por Leishmania.

Alternativamente, se puede tamizar un banco de expresión de ADNc o genómico de Leishmania con suero de un individuo infectado con Leishmania, utilizando técnicas bien conocidas con aquellos con experiencia ordinaria en la materia. Las moléculas de ADN que codifican antígenos reactivos se pueden utilizar entonces para expresar el antígeno recombinante para la purificación. Las propiedades inmunogénicas de los antígenos con Leishmania purificados entonces pueden evaluarse utilizando, los métodos representativos descritos en la presente.

Por ejemplo, el suero de ratones infectados por Leishmania se puede utilizar para tamizar un banco de ADNc preparado de amastigotes de Leishmania. Los clones reactivos entonces pueden expresarse y las proteínas recombinantes pueden analizarse para la capacidad de estimular células T o células de NK derivadas de individuos inmunes a Leishmania (es decir, individuos que tienen evidencia de infección, como se documenta por la reactividad serológica positiva con anticuerpos específicos para Leishmania y/o una respuesta de HTR específico para Leishmania sin síntomas clínicos de Leishmaniasis). Este procedimiento se puede utilizar para obtener una molécula de ADN recombinante que codifica el antígeno de Leishmania designado M15. La secuencia de dicha molécula de ADN se provee en SEC ID NO:1, y la secuencia de aminoácidos de la proteína codificada se provee en SEC ID NO:2.

Un enfoque similar se puede utilizar para aislar una molécula de ADN genómico que codifica un antígeno de Leishmania braziliensis, denominado en la presente Lbhsp83. Más específicamente, se puede aislar un clon genómico que codifica Lbhsp83 tamizando un banco de expresión de L. braziliensis con suero de un individuo infectado por Leishmania. El ADN que codifica Lbhsp83 es un homólogo al gen que codifica la proteína de choque por calor eucariótica de 83 kD. La secuencia de una molécula de ADN codifica casi todo el Lbhsp83 se presenta en SEC ID NO:5, y la secuencia de aminoácidos codificada se provee en la SEC ID NO:6. Utilizando los métodos descritos enseguida, se ha encontrado que Lbhsp83 estimaba la proliferación y un perfil mezclado de citoquina de Th1 y Th2, en CMSP aisladas de pacientes infectados por L. braziliensis. Subsecuentemente, Lbhasp83 es un antígeno de Leishmania inmunogénico. Se ha encontrado que las regiones de Lbhsp83 que no se conservan con el gen de mamíferos son particularmente potentes para la estimulación de células T y unión de anticuerpos. Dichas regiones se pueden identificar, como por ejemplo por inspección visual de la comparación de secuencias provista en la Figura 19.

Este enfoque también puede utilizar aislar una molécula de ADN que codifica un antígeno de L. tropica inmunogénico de 210 kD, denominado en la presente como Lt-210. La preparación y caracterización de Lt-210 y porciones inmunogénicas del mismo (tal como Lt-1 y secuencias de repetición y sin repetición inmunogénica), como se describió en la Solicitud de Patente US No. 08/511,872, presentada el 4 de Agosto de 1995. La secuencia de una molécula de ADN que codifica Lt-1. se provee en SEC ID NO:7 y la secuencia de aminoácidos codificada se presenta en SEC ID NO:8.

El enfoque anterior además se puede utilizar para aislar una molécula de ADN que codifica un antígeno de L. braziliensis denominado en la presente como LbeIF4A. En resumen, dicho clon se puede aislar para tamizar un banco de expresión de L. braziliensis con suero obtenido de un paciente que sufre de Leishmaniasis mucosa y analizando los antígenos reactivos para la capacidad de estimular respuestas proliferativas y producción de citoquina de Th1 preferencia en CMSP aisladas de pacientes infectados por Leishmania, como se describe más adelante. La preparación y caracterización de LbeIF4A se describe en detalle en las Solicitudes de Patente US N° 08/454,036 y 08/488,386, las cuales son continuaciones en parte de la Solicitud de Patente US N° 08/232,534, presentada el 22 de abril de 1994. La secuencia de una molécula de ADN que codifica LbeIF4A se provee en la SEC ID NO:9 y secuencia de aminoácidos codificada se presenta en la SE ID NO:10. Homólogos de LbelIF4A, tal como el que se encuentra en L. major, también se puede aislar utilizando este enfoque y estando dentro del alcance de la presente invención.

Las composiciones de la presente invención también, o alternativamente, pueden contener antígenos solubles de Leishmania. Como se usa en la presente "antígenos solubles de Leishmania" se refiere a una mezcla de por lo menos 8 diferentes antígenos de Leishmania que se pueden aislar de la sobrenadante de promastigotes de Leishmania de cualquier especie desarrollada durante 8-12 horas en medio libre de proteína. En resumen, los organismos se desarrollan a la fase log tardía en medio complejo con suero hasta que cada densidad de 2-3 x 10^{7} organismos viables por mL de medio. Los organismos se lavan concienzudamente para remover los componentes del medio y se vuelve a suspender a 2-3 x 10^{7} organismos viables por mL de medio libre de suero definido que consiste de partes iguales de RPMI 1640 y medio 199, ambos de Gibco BRL Gaithersburg, M D. Después de 8-12 horas, el sobrenadante que contiene antígenos solubles de Leishmania se remueve, se concentra 10 veces y se dializa contra solución sanguínea con pH regulado con fosfato durante 24 horas. La presencia de por lo menos ocho antígenos diferentes dentro de la mezcla de antígenos de Leishmania se puede confirmar utilizando SDS-PAGE (es decir, a través de la observación de por lo menos 8 bandas diferentes). Las propiedades inmunogénicas de los antígenos solubles de Leishmania se pueden confirmar evaluando la capacidad de la preparación para producir una respuesta inmune en cultivos de células del nodo linfático y/o o células mononucleares de la sangre periférica (CMSP) aisladas del individuos presente o previamente infectados por Leishmania. Dicha evaluación puede realizarse, como se describe más adelante.

Sin importar el método de preparación, los antígenos descritos en la presente son inmunogénicos. Y en otras palabras, los antígenos (y porciones inmunogénicas de los mismos) son capaces de producir una respuesta inmune en péptidos de células de nodo linfático y/o células mononucleares de sangre periférica (CMSP) aisladas de individuos presente o previamente infectados por Leishmania. Más específicamente, los antígenos y porciones inmunogénicas de los mismos, tienen la capacidad de inducir la proliferación de células T y/o producir una respuesta de citoquina del tipo de Th1 dominantemente (es decir, producción de IL-2, IFN-\gamma, y/o TNF-\alpha por células T y/o células NK; y/o producción de IL-12 por monocitos, macrófagos y/o células B) en células aisladas de individuos presente o previamente infectados por Leishmania. Un individuo infectado por Leishmania puede sufrir con una forma de Leishmaniasis (tal como subclínica, cutánea, mucosal o visceral activa) o puede ser asintomática. Dichos individuos pueden identificarse utilizando métodos conocidos por aquellos con experiencia ordinaria en la materia. Los individuos con Leishmaniasis pueden identificarse basándose en hallazgos clínicos asociados con por lo menos uno de los siguientes: aislamiento de parásitos de lesiones, una prueba positiva para la piel con lisato de Leishmania o una prueba serológica positiva. Los individuos asintomáticos son individuos infectados quienes no tienen signos o síntomas de la enfermedad, pero dichos individuos se pueden identificar basado en una prueba serológica positiva y/o prueba de la piel con lisato de Leishmania.

El término "CMSP" que se refiere a una preparación de células uncleadas que están presentes en sangre periférica, abarca tanto mezclas de células como preparaciones de uno o más tipos celulares purificados. Se puede aislarse en CMSP por métodos conocidos por los expertos en la materia. Por ejemplo, se puede aislar CMSP por centrifugación de densidad a través de por ejemplo, FicolI^{TM} (Winthop Laboratories, New York). Los cultivos de nodos linfáticos generalmente se pueden preparar inmunizando ratones BALB/c (v.gr., en la almohadilla de la pata posterior) con promastigotes de Leishmania emulsificados en adyuvante de Freünd completo. Los nodos linfáticos drenados pueden extirparse después de la inmunización y las células T pueden purificarse en una columna de Ig anti-ratón para remover las células B, seguido por un pasaje a través de una columna Sephadex G10 para remover los macrófagos. Similarmente, las células del nodo linfático se pueden aislar de un ser humano siguiendo biopsia o remoción quirúrgica de un nodo linfático.

La capacidad de un polipéptido (v.gr., una antígeno de Leishmania o una porción u otra variante del mismo) de inducir una respuesta en cultivos de CMSP o células de nodo linfático o se puede evaluar teniendo en cuenta las células con un polipéptido y midiendo una respuesta adecuada. En general, la cantidad de polipéptido que es suficiente para la evaluación de aproximadamente 2 x 10^{5} células variada de aproximadamente 10 ng a alrededor de 100 \mug y preferiblemente es de aproximadamente 1-10 \mug. La incubación de polipéptido con células se realiza normalmente a 37°C durante aproximadamente 1-3 días. Después de la incubación con polipéptido, las células se analizan para una respuesta apropiada. Si la respuesta es una respuesta proliferativa se puede emplear cualquiera de una variedad de técnicas bien conocidas por los de experiencia ordinaria en la materia. Por ejemplo, las células se pueden exponer a un pulso de timidina radioactiva y medir la incorporación de la marca en ADN celular. En general, un polipéptido que da como resultado por lo menos un crecimiento de 3 veces en el refuerzo de proliferación anterior (es decir, la proliferación observada para células cultivadas sin polipéptido) se considera capaz de inducir la proliferación.

Alternativamente, la respuesta que será medida puede ser la secreción de una o más citoquinas (tal como
interferon-\gamma (IFN-\gamma), interleucina (IL-4), interleucina 12 (p70 y/o p40), interleucina-2 (IL2) y/o factor de necrosis tumoral-a (TNF-\alpha) o el nivel de ARNm que codifica uno o más citoquinas específicas. En particular, la secreción de interferon-\gamma, interleucina-2, factor de necrosis tumoral-\alpha y/o interleucina-12 indica una respuesta de Th1, que es responsable para el efecto protector contra Leishmania. Los análisis para cualquiera de las citoquinas anteriores generalmente se pueden generar utilizando métodos conocidos por los de experiencia ordinaria en la matera, tales como un análisis inmunosorbente ligado a enzima (ELISA). Los anticuerpos adecuados para usarse en dichos análisis se pueden obtener de una variedad de fuentes tales como Chemicon, Tamucula, CA and PharMingen, San Diego,, CA, y generalmente se pueden utilizar de acuerdo con instrucciones del fabricante. El nivel de ARNm que codifican uno o más citoquinas específicas puede evaluarse mediante, por ejemplo, la amplificación de reacción de cadena de polimerasa (RCP). En general, un polipéptido que es capaz de inducir, en una preparación de aproximadamente 1-3 x 10^{5} células, la producción de 30 pg/mL de IL12, IL-4, IFN-\gamma, TNF-\alpha o IL-12 p40, o 10 pg/mL de IL-12 p70, se considera que pese estímulo de producción de una citoquina.

Las porciones inmunogénicas de los antígenos descritos en la presente se pueden preparar e identificar utilizando técnicas bien conocidas, tales como aquellas resumidas en Paul, Fundamental Immunology, 3a. ed., 243-247 (Rayen Press, 1993) y las referencias citadas en la presente. Dichas técnicas incluyen tamizar polipéptidos derivados del antígeno nativo para propiedades inmunogénicas utilizando, por ejemplo, las técnicas representativas descritas en la presente. Una porción inmunogénica de un polipéptido es una porción que, dentro de dichos análisis representativos, genera una respuesta inmune (v.gr., proliferación y/o producción de citoquina) que es substancialmente similar a la generada por un antígeno de longitud completa. En otras palabras una porción inmunogénica de un antígeno puede generar por lo menos aproximadamente 25%, y preferiblemente por lo menos a alrededor de 50% de la respuesta generada por el antígeno de longitud completa en los análisis de modelo descritos en la presente.

Se pueden generar porciones u otras variantes de antígenos de Leishmania inmunogénicos por medios sintéticos o recombinantes. Los polipéptidos sintéticos, que tienen menos de aproximadamente 100 aminoácidos y generalmente menos de aproximadamente 50 aminoácidos pueden generarse utilizando técnicas bien conocidas para los de experiencia ordinaria en la materia. Por ejemplo, dichos polipéptidos se pueden sintetizar utilizando cualquiera de las técnicas en fase sólida comercialmente disponibles tales como, el método de síntesis de fase sólida Merrifield en donde los aminoácidos se agregan secuencialmente a una cadena creciente de aminoácidos, ver Merrifield, J. Am. Chem. Soc. 85:2146, 1963. El equipo para síntesis automática de polipéptidos está comercialmente disponible de proveedores tales como Applied BioSystems, Inc., Foster City, CA, y se puede operar de acuerdo con las instrucciones del fabricante.

Los polipéptidos recombinantes que contienen porciones y/o variantes de un antígeno nativo pueden prepararse fácilmente de una secuencia de ADN que codifica el antígeno. Por ejemplo, los sobrenadantes de sistemas adecuados de huésped/vector secretan. proteína recombinante en medio de cultivo pueden concentrarse primero utilizando un filtro comercialmente disponible. Después de la concentración, se puede aplicar el concentrado a una matriz de purificación adecuada tal como una matriz de afinidad o una resina de intercambio iónico. Finalmente, se pueden emplear uno o más pasos de CLAR de fase inversa para purificar además una proteína recombinante.

En general, cualquiera de una variedad de vectores de expresión conocidos por los de experiencia ordinaria en la materia se puede emplear para expresar polipéptidos recombinantes de está invención. La expresión puede lograrse en cualquier célula huésped apropiada que ha sido transformada o transfectada con un vector de expresión que contiene una molécula de ADN que codifican polipéptido recombinante. Las células huésped adecuadas incluyen procariotes, levadura y células eucarísticas superiores. Preferiblemente, las células huésped empleadas son E. coli, levadura o una línea de células de mamíferos tales como COS o CHO. Las secuencias de ADN expresadas en esta forma pueden codificar antígenos presentes en la naturaleza, porciones de antígenos presentes en la naturaleza otras variantes de los mismos. Por ejemplo, las variantes de un antígeno nativo pueden prepararse generalmente utilizando técnicas de mutagénesis normales, tales como mutagénesis específica para sitio dirigidos a oligonucleótidos y secciones de la secuencia de ADN se pueden remover para permitir la preparación de polipéptidos truncados.

En ciertos aspectos de la presente invención, descritos en detalle más adelante, los polipéptidos y/o antígenos solubles de Leishmania se pueden incorporar en composiciones farmacéuticas o vacunas. Las composiciones farmacéuticas comprenden uno o más polipéptidos, cada uno de los cuales puede contener una o más de las secuencias anteriores (o variantes de las mismas), y un vehículo fisiológicamente aceptable. Las vacunas comprenden uno o más de los péptidos anteriores y un incrementador de respuesta inmune no específica, tal como un auxiliar (v.gr., LbeIF4A, interleucina-12 u otras citoquinas) o un liposima (en el cual se incorpora el polipéptido). Adicionalmente las vacunas pueden contener un vehículo de suministro, tal como una microesfera biodegradable (descrita, por ejemplo, en las Patentes US N° 4,897,268 y 5,075,109). Las composiciones farmacéuticas y vacunas dentro del alcance de la presente invención también pueden contener otros antígenos de Leishmania, ya sea incorporados a una combinación de polipéptidos o presente dentro de uno o más polipéptidos separados.

Alternativamente, una vacuna puede contener ADN que codifica uno o más de los polipéptidos como se describió antes, de manera que el polipéptido se genera in situ. En muchas vacunas, el ADN puede estar presente dentro del cualquiera de una variedad de sistemas de suministro conocidos por los expertos en la materia, incluyendo sistemas de expresión de ácidos nucleicos, bacterias y sistemas de expresión viral. Los sistemas de expresión de ácidos nucleicos apropiados contienen las secuencias de ADN necesarias para la expresión en pacientes (tales como un promotor adecuado y señal de terminación). Los sistemas de suministro bacteriano implican la administración de una bacteria (tal como Bacillus-Calmette-Guerrin) que exprese una porción inmunogénica del polipéptido sobre su superficie celular. En una modalidad, preferida, el ADN se puede introducir utilizando un sistema de expresión viral (v.gr., vaccinia u otro pox virus, retrovirus, o adenovirus) que puede implicar el uso de un virus competente de replicación no patogénico (defectuoso). Las técnicas para incorporar ADN en dichos sistemas de expresión son bien conocidos por aquellos con experiencia ordinaria en la materia. El ADN también puede ser "puro", como se describió, por ejemplo, en Ulmer y otros, Science 259:1745-1749 (1993) y se revisó por Cohen, Science 259:1691-1692 (1993). La absorción del ADN puro puede incrementarse revistiendo el ADN en perlas biodegradables, las cuales son transportadas eficientemente en las células.

Mientras cualquier vehículo adecuado conocidos para los de experiencia ordinaria en la técnica pueden emplearse en composiciones farmacéuticas de esta invención, el tipo de vehículo variará dependiendo del modo de administración. Para la administración parenteral, tal como inyección subcutánea, el vehículo preferiblemente comprende agua, solución salina, alcohol, una grasa, una cera o una solución reguladora de pH. Para la administración oral, se pueden emplear cualquiera de los vehículos anteriores o un vehículo sólido tal como manitol, lactosa, almidón, estearato de magnesio, sacarina de suero, talco, celulosa, glucosa, sacarosa, y carbonato de magnesio. Las microesferas biodegradables (v.gr., galactido poliláctico) también se pueden emplear como vehículos de las composiciones farmacéuticas de esta invención. Les microesferas biodegradables adecuadas se describen, por ejemplo, en las Patentes US N° 4,897,268 y 5,075,109.

Cualquiera de una variedad de auxiliares puede emplearse en las vacunas de está invención para incrementar no específicamente la respuesta inmune. La mayoría de los auxiliares contienen una sustancia designada para proteger al antígeno de catabolismo rápido tal como hidróxido de aluminio o aceite mineral y un estimulador no específico de respuestas inmunes, tal como el lípido A, Bordella pertussis o Mycobacterium tubérculosis. Dichos auxiliares están comercialmente disponibles, por ejemplo, auxiliar incompleto y auxiliar completo de Freund (Difco Laboratories, Detroit, MI) auxiliar 65 Merck (Merck and Company, Inc., Rahway, NJ), aluminio, microesferas biodegradables, lípido A y quil A de monofosforilo. Los auxiliares preferidos incluyen el LbeIF4A, IL-13 y otras citoquinas tales como IFN-\gamma o colonia de granulocitosmacrofágos que estimulan el factor (GM-CSF). En virtud de esta capacidad de inducir una respuesta inmune de exclusiva, es particularmente preferido el uso de LbeIF4A, y variantes del mismo como un auxiliar en las vacunas de la presente invención.

En una modalidad preferida, las composiciones de la presente invención incluyen polipéptidos múltiples seleccionados de manera que proveen protección mejorada contra una variedad de especie de Leishmania. Dichos polipéptidos se pueden seleccionar basado en las especies de origen del antígeno nativo o basarse en un alto grado de conservación de secuencia de aminoácidos entre diferentes especies de Leishmania. Puede ser particularmente efectiva una combinación de polipéptidos individuales como una vacuna profiláctica y/o terapéutica debido a (1) la estimulación de proliferación y/o producción de citoquina por polipéptidos individuales puede ser aditiva, (2) la estimulación de la proliferación y/o producción de citoquina por polipéptidos individuales puede ser sinergística, (3) los polipéptidos individuales pueden estimular los perfiles de citoquina en tal forma que sean complementadas unas con otras y/o (4) los polipéptidos individuales pueden ser complementarios unos con otros cuando ciertos de ellos se expresan más abundantemente en las especies individuales o cepas de Leishmania responsables de la infección. Una combinación preferida contiene polipéptidos que comprenden porciones inmunogénicas de M15, Ldp23, Lbhsp83, Lt-1 y LbeIF4A. Alternativamente, o en además, la combinación puede comprender antígenos solubles de Leishmania.

Las composiciones farmacéuticas anteriores y vacunas pueden utilizarse por ejemplo, para inducir inmunidad protectora contra Leishmania en paciente, tal como un ser humano o un perro, para evitar la Leishmaniasis. Las dosis apropiadas y métodos de administración para estos propósitos se describen en detalle más adelante.

Las composiciones farmacéuticas y vacunas descritas en la presente también se pueden utilizar para estimular una respuesta inmune, que puede ser celular y/o humoral en un paciente. Para pacientes infectados por Leishmania, las respuestas inmunes que pueden generarse incluyen una respuesta inmune de Th1 preferencial (es decir, una respuesta caracterizada por la producción de las citoquinas interleucina 1, interleucina-2, interleucina-12 y/o interferon-\gamma, así como factor-\alpha de necrosis tumoral). Para pacientes no infectados, la respuesta inmune puede ser la producción de interleucina-12 y/o interleucina-2, o la estimulación de células T gama delta. En cualquier categoría del paciente, la respuestas simulada puede incluir la producción de IL-12. Dichas respuestas también pueden producirse en muestras biológicas de CMSP o componentes de las mismas derivadas de individuos infectados por Leishmania o no infectados. Como se observó antes, los análisis para cualquiera de las citoquinas anteriores generalmente se pueden generar utilizando métodos conocidos por los expertos en la materia, tales como un análisis inmunoabsorbente ligado a enzima (ELISA).

Las composiciones farmacéuticas adecuadas y vacunas para usarse en este aspecto de la presente invención son aquellos que contienen por lo menos un polipéptido que comprende una porción inmunogénica de LbeIF4A (o una variante del mismo), M15, antígenos solubles de Leishmania y/o Ldp23 (o una variante del mismo). Los polipéptidos que contienen una porción inmunogénica del Lbhsp83 y/o Lt-1 también se pueden utilizar en combinación con un polipéptido contiene por lo menos una porción inmunogénica de LbeIF4A. Preferiblemente, los polipéptidos empleados en las composiciones farmacéuticas y vacunas son complementarios, como se describió antes. Una combinación particularmente preferida contiene polipéptidos que comprenden porciones inmunogénicas de M15, Ldp23, Lbhsp83, Lt-1 y LbeIF4A. Los antígenos solubles de Leishmania con o sin polipéptidos adicionales también pueden emplearse.

Las composiciones farmacéuticas y vacunas descritas en la presente también se pueden utilizar para tratar a un paciente que sufre una enfermedad que responde a la estimulación de IL-12. El paciente puede ser cualquier animal de sangre caliente, tal como un ser humano o un perro. Dichas enfermedades incluyen infecciones (que pueden ser, por ejemplo, bacterianas, vírales o protozoarios) o enfermedades tales como cáncer. En una modalidad, enfermedad es Leishmaniasis y el paciente puede exhibir síntomas clínicos o puede ser asintomático. En general, la respuesta de una enfermedad particular a la estimulación de IL-12 puede determinarse evaluando el efecto de tratamiento con una composición farmacéutica o vacuna de la presente invención o correlaciones clínicas de inmunidad. Por ejemplo, si el tratamiento da como resultado una respuesta de Th1 elevada o la conversión de un perfil de Th2 a Th1, con mejora clínica que acompaña al paciente tratado, la enfermedad responde a la estimulación de IL-12. La administración de polipéptidos puede ser como se describe más adelante para extenderse durante un tiempo más largo dependiendo de una indicación. Preferiblemente, los polipéptidos empleados en las composiciones farmacéuticas y vacunas son complementarios como se describo antes. Una combinación particularmente preferida contiene polipéptidos que comprenden porciones inmunogénicas de M15, Ldp23, Lbhasp83, Lt-1 y LbeIF4A. Los antígenos solubles de Leishmania, con o sin polipéptidos adicionales pueden emplearse.

Las rutas y frecuencia de administración, así como dosis, para los aspectos anteriores de la presente invención variarán de individuo a individuo y pueden ser paralelas a aquellas que se están utilizando actualmente en inmunización contra otras infecciones, incluyendo infecciones por protozoarios, virales y bacterianas. En general, las composiciones farmacéuticas y vacunas pueden administrarse por inyección (v.gr., intracutánea, intramuscular, intravenosa o subcutánea), intranasalmente (v.gr., por aspiración) u oralmente. Se pueden administrar entre 1 y 12 dosis durante un período de un año. Para la vacunación terapéutica (es decir el tratamiento de un individuo infectado), preferiblemente se administran 12 dosis en intervalos de un mes. Para uso profiláctico, preferiblemente se administran 3 dosis, en intervalos de 3 meses. En cualquier caso, se pueden dar periódicamente después vacunas de refuerzo. Los protocolos alternativos pueden ser apropiados para pacientes individuales. Una dosis adecuada es una cantidad de polipéptido o ADN que, cuando se administra como se describió antes, es capaz de elevar una respuesta inmune en un paciente inmunizado suficiente para proteger al paciente de Leishmaniasis durante por lo menos de 1-2 años. En general, la cantidad de polipéptido presente en una dosis (o producto in situ por el ADN en una dosis) varia de aproximadamente 100 ng a alrededor de 1 mg por kg de huésped, normalmente de aproximadamente 10 \mug, a alrededor de 100 \mug. Los tamaños de dosis adecuados variarán con el tamaño del paciente, pero normalmente variarán de aproximadamente 0,1 mL a alrededor de 5mL.

En otro aspecto, la invención provee métodos para usar uno o más de los polipéptidos descritos antes para diagnosticar una infección por Leishmania en un paciente utilizando una prueba de pie. Como se uso en la presente, una "prueba de piel" es cualquier análisis utilizado directamente sobre un paciente en el cual se mide una reacción de hipersensibilidad de tipo retardado (HTR) (tal como una induración y enrojecimiento acompañante) después de la inyección intradérmica uno o más polipéptidos como se describió antes. Dichas inyección puede lograrse utilizando cualquier dispositivo adecuado suficiente para poner en contacto el polipéptido o polipéptidos con células dérmicas del paciente, tal como una jeringa de tuberculina o una jeringa de 1 mL. Preferiblemente la reacción se midió por lo menos 48 horas después de la inyección, más preferiblemente 72 horas después de la inyección.

La reacción de HTR es una respuesta inmune mediada por células, que es mayor en pacientes que han sido expuestos previamente a un antígeno de prueba (es decir, una porción inmunogénica de un polipéptido empleado, o una variante del mismo). La respuesta puede medirse visualmente, utilizando una regla. En general, la induración que es mayor que aproximadamente 0.5 cm de diámetro, preferiblemente mayor a aproximadamente 1.0 cm de diámetro, es una respuesta positiva que indica la infección por Leishmania que puede o no manifestarse como una enfermedad activa.

Los polipéptidos de esta invención preferiblemente se formulan, para utilizase en una prueba de la piel, composiciones farmacéuticas que contienen por lo menos un polipéptido y un vehículo fisiológicamente aceptable, como se describió antes. Normalmente dichas composiciones contienen uno o más de los polipéptidos anteriores en una cantidad que variará de 1 \mug a 100 \mug, preferiblemente de aproximadamente 10 \mug a 50 \mug, en un volumen de 0,1 mL. Preferiblemente, el vehículo empleado en dichas composiciones farmacéuticas en una solución salina con conservadores apropiados, tal como fenol y/o Tween 80^{TM}.

Los siguientes ejemplos se ofrecen a manera de ilustración y no de limitación.

Ejemplos Ejemplo 1 Preparación de M15

Este ejemplo ilustra la preparación de un antígeno M15 de Leishmania que tiene las secuencia provista en SEC ID NO:2.

Un banco de expresión de ADNc de amastigote de L. major (cepa Fiedlan) en el vector \lambdaZAP II(Stratagene, La Jolla, CA) se tamizó de acuerdo con las instrucciones del fabricante utilizando suero obtenido de ratones BALB/c infectados por L. major (8 semanas después de la inoculación). Aproximadamente 40,000 placas se tamizaron y cuatro clones que expresan antígenos reactivos se purificaron a homogeneidad por dos vueltas subsecuentes de tamizado de baja densidad. Los insertos de fagémidos Bluescript se extirparon de clones positivos para análisis adicional. Un fragmento de restricción de EcoRI/Sstll del extremo 5' de un inserto de ADNc parcial aislado durante la primera vuelta de tamizado (pLmal-1) se utilizo subsecuentemente como una sonda para lograr tamizar los clones que contienen insertos de ADNc de longitud completa. La sonda se marcó para actividad específica alta (\sim10^{9} cpm/\mug) con [\alpha-^{32}P]dCTP utilizando el método de iniciador aleatorio y se utilizó para tamizar aproximadamente 10,000 placas del banco de expresión de L. major descrito antes. Se compararon clones positivos por digestión de la enzima de restricción y el clon con el inserto más largo (pfl1-1) se eligió para análisis subsecuente.

Se realizaron análisis de secuencias de ADN en una secuencia de automático Applied Biosystems utilizando polimerasa Taq y colorante acoplado con terminadores ddNTP o iniciadores de secuencia marcados con colorante. La secuencia completa del inserto del 2685 pb se determinó utilizaron una combinación de secuenciación dirigida a iniciador y secuenciando una serie de subclones de supresión de Exonucleasa III de traslapamiento generados utilizando un sistema de base Erase-a (Promega, Madison, WI). La secuencia de este inserto se proveyó en SEC ID NO:1, y la secuencia de aminoácido deducida se proveyó en SEC ID NO:2.

El inserto completo del clon pfl-1 se extirpó por digestión con BamHl/Kpnl y se subclonó en bastidor en BamHl/
Kpnl pQE31 digerido BamHl/Kpnl (QUIAGEN) para generar la construcción pM151A. La E. coli que contiene está construcción expresó induciblemente altos niveles del antígeno de L. major codificado por pfil-1 (designado como M15) con la adición de una etiqueta de 6-histidina en las terminaciones amino. Los cultivos de grandes volúmenes (500 ml) de células huésped E. coli que contiene una construcción de pM151A se indujeron para expresar proteínas recombinante por la adición de 2mM IPTG en la fase log media de crecimiento. El crecimiento continua de 4 a 5 horas y las bacterias se formaron en pellas y se lavaron una vez con PBS frío. Las bacterias se resuspendieron en 20 ml de solución reguladora de pH (50 mM Na_{2}HPO_{4}, pH 8.0, 300 mM NaCI, 10 mM \beta-mercaptoetanol) conteniendo 20 mg de lisozima y se lisaron por incubación de 1 hora a 4°C seguido por breve tratamiento con sonido. El material insoluble se removió por centrifugación a 10,000xg durante 10 minutos y aunque la proteína recombinante se encontró distribuida uniformemente entre las fracciones solubles o insolubles, el material soluble se descartó en este punto. La proteína recombinante que contiene la etiqueta histidina terminal amino se purifico por afinidad utilizando resina de Ni-NTA (QIAGEN) de acuerdo con las recomendaciones del fabricante. En resumen 8 ml de resina Ni-NTA resuspendida en solución reguladora de pH de lisis se agregó a la fracción de lisato soluble y se llevó a cabo la unión con mezclado constante durante una hora a 4°C. La mezcla se cargo entonces en una columna de flujo de gravedad y el material no unido se dejó fluir a través de la misma. La matriz de Ni-NTA se lavó 3 veces con 25 ml de solución reguladora de pH de lavado (50mM Na_{2}HPO_{4}, pH 5.0, 300 mM NaCI, 10mM \beta-mercaptoetanol) y el material unido se eluyó a 24 ml de solución reguladora de pH de elusión (50mM Na_{2}HPO_{a}, pH 6.0, 300 mM. NaCI, 10mM \beta-mercaptoetanol). El material diluido se dializó contra 3 cambios de PBS, se filtró estéril y se almaceno a -20°C. El análisis de SDS-PAGE mostró que la proteína recombinante purificada es libre de cualquier cantidad significativa de proteína de E. coli. Se supuso que un número pequeño de bandas de peso molecular inferior es producto proteolítico de antígeno de L. major basado en su reactividad por análisis de manchas Western. Se generó un antisuero policlonal con alta titulación contra M15 en conejos mediante inyección subcutánea repetida de proteína recombinante. El análisis de manchas Western de lisatos de promastigote y amastigotes de L. major utilizando este antisuero indicó que la proteína se expresa constitutivamente a través del ciclo de vida del parásito.

Ejemplo 2 Preparación de Ldp23

Este ejemplo ilustra la preparación de un antígeno de Leishmania Ldp23, teniendo la secuencia provista en SEC ID NO:4.

A. Purificación de péptidos asociados con MHC Clase 11 de macrófagos P388D1 infectados con L. donovani

Para asegurar que la infección in vitro de macrófagos podría cargar sus moléculas de MHC clase 11 con péptidos de parásitos, se llevaron a cabo experimentos iniciales para probar la capacidad de la línea celular de macrófagos P388D1 infectados con L. donovani para presentar antígenos de parásitos a las células T específicas de L. donovani. Esta línea celular de macrófagos se eligió dado que tiene el mismo haplotipo H-2 que el ratón BALB/c, que es una cepa de ratón moderadamente susceptible a infección de L. donovani y se seleccionó para llevar a cabo experimentos in vivo. Utilizando una proporción de 3-5 parásitos por célula y una incubación inicial a la temperatura ambiente durante
4-6 horas después a 37°C durante 24-48 horas, casi el 90% de los macrófagos fueron infectados. El nivel de expresión molecular de MHC clase II, como se determina por análisis de FACS indicó que la infección no ocasionó un efecto sobre los niveles de expresión de MHC clase II cuando se compararon con células de control no infectadas.

Para probar la capacidad de las células de P388D1 infectadas por L. donovani para presentar antígenos de parásitos, se infectaron macrófagos como se indico antes y se incubo a 26°C durante 6 horas, y después a 37°C durante 24, 48 ó 72 horas. En cada uno de estos puntos de tiempo, las células no adherentes y parásitos libres se lavaron y las células adherentes se descargaron mecánicamente, se lavaron y se fijaron paraformaldehido. Estas células después se utilizaron como células que presentan antígeno (CPA) para las células T del nodo linfático purificadas de ratones BALB/c inmunizadas con promastigotes de L. donovani. Para generar estas células T específicas para anti.- L. donovani, los ratones BALB/c (H-2^{d}) de ambos sexos (The Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME) se inmunizaron a las 8 a 14 semanas de edad en la almohadilla de la pata trasera con 5-10 x 10^{6} promastigotes de L. donovani emulsificadas en auxiliar de Freünd completo (AFC) (Difco Laboratories, madison MI) como se describió en Rodrigues y otros., Parasite lmmunol. 14:49 (1992). Los nodos linfáticos ya drenados se extirparon 8 días después de la inmunización y las células T se purificaron en una columna de Ig anti-ratón para remover las células B, como se describió en Bunn, Moreno and Campos-Neto, J. lmmunol. 127:427 (1981), seguido por un pasaje a través de una columna Sephadex G10 para remover los macrófagos.

Se calculó en índice de estimulación dividiendo el cpm obtenido para las células cultivadas en presencia de macrófagos de P388D1 infectados por el cpm obtenido para las células cultivadas en presencia de macrófagos no infectados, pero sometidas a las mismas condiciones que los macrófagos infectados. Los resultados mostrados en la Figura 1 indican que el macrófago P388D1 infectado por L. donovani y procesa antígenos de parásito y que la presentación óptima ocurre después de 48 horas de infección. No se observó estimulación de las células T por los macrófagos no infectados.

Para aislar los MHC clase II asociados con péptidos de L. donovani, se infectaron macrófagos de P388D1 con promastigotes de L. donovani para una incubación inicial de 6 horas a temperatura ambiente. Los cultivos se transfectaron luego a 37°C para el resto del período de incubación de 48 horas. En una relación de 3-5 parásitos por macrófago casi el 90% de los macrófagos fueron infectados después de 24 horas de incubación a 37°C.

Las moléculas de MHC clase 11 fueron purificadas por afinidad. Aproximadamente de 1,5 x 10^{10} macrófagos P338D1 infectados por L. donovani y un número igual de no infectados se utilizaron para cada purificación. Las células se recogieron, se lavaron con PBS y se incubaron durante 30 minutos en solución reguladora de pH de lisis fría (PBS, 1% Nonidet P40, 25mM yodoacetamida, 0,04% de azida de sodio, 1 mM de aprotinina y 1 mM de PMSF). El material insoluble se removió por centrifugación a 40,000 g durante 1 hora y el sobrenadante se recicló durante la noche a 4°C sobre una columna de Sepharose de 5ml de moléculas anti-MHC clase II (H-2^{d}) (columna de Sepharose de Proteína G a la cual se ha unido el anticuerpo o monoclonal MK-D6). Los sobrenadantes del cultivo de células de hibridoma de MK-D6 (American Type Culture Collection, Rockville, MD) se emplearon como la fuente de anticuerpo monoclonal anti-MHC clase II, (H-2^{d}). La columna se lavó con 50ml de solución reguladora de pH lisis y después con 50 ml de PBS conteniendo 0,5% de detergente de glucopiranosido de octilo. Las moléculas unidas se eluyeron de ]a columna con ácido acético 1 M en 0,2% de NaCI. Las moléculas de MHC/péptidos se separaron del IgG (anticuerpo monoclonal de MK-D6) utilizando una unidad de filtro Centricon 100 (Amicon Division, W.R. Grace & Co., Beverly, MA). Los péptidos después se disociaron de las moléculas clase II por la adición de ácido acético a 2,5 M, seguido por la separación utilizando una unidad de filtro Centricon 10. La preparación de péptidos resultantes presente en la muestra de peso molecular alto, después se secó utilizando un concentrador de vacío acelerado (Savant Instrument Inc., Farmingdale, NY).

Los péptidos se redisolvieron en 200 \mul de 0,05% TFA y se separaron por cromatografía de líquido de alto rendimiento de fase inversa (CLAR-FI) utilizando una columna de 2,1 mm x 25 cm Vydac C-18 a un régimen de flujo de 0,15 ml/min empleando un gradiente de acetonitrilo de 1 a 30% (60 min) seguido de un gradiente de 30 a 60% (30 min) y a continuación un gradiente de 60 a 80% (90-110 min). Las células de P388D1 no infectadas se procesaron similarmente para procesaron similarmente para servir como control de refuerzo para péptidos asociados endógenos de MHC clase II. La Figura 2 muestra un experimento representativo; se indican cuatro picos distintos que están presentes solo en el material aislado de los macrófagos infectados (panel B) y ningún material aislado de macrófagos no infectados (panel A).

Fuera de tres raciones de péptidos independientes, veinticinco picos de péptidos de CLAR distintos se aislaron de macrófagos infectados por L. donovani y se sometieron a análisis de secuencia de proteínas utilizando degradación de Edman automatizada en un secuenciador de proteínas de fase gaseosa de Applied Biosystems 477. Las secuencia de proteína y análisis de aminoácidos se llevaron a cabo por el W. M. Keck Foundation, Biotechnology Resource Laboratory, Yale University, New Haven, CT. En prácticamente todas las determinaciones, no se pudo hacer una asignación para la primera posición. También en la mayoría de los casos la definición de residuos de aminoácido de las posiciones 10-15 se basó en la dominancia cuantitativa de un residuo sobre otros. Utilizando esté enfoque las secuencias obtenidas para varios péptidos mostraron la presencia de 3-6 residuos diferentes en muchos de los ciclos de 10-15 secuencias analizados para cada determinación, reflectando una mezcla de péptidos. Además, las secuencias no podrán obtenerse para algunos picos dado que se bloquearon los péptidos. De todos modos, se determinaron tres secuencias de péptidos. Las secuencias de aminoácidos se buscaron para identidad con proteína en la base de datos GenBank utilizando los programas GENPETP, PIR y SWISSPROT. El análisis de secuencia de base de datos reveló que uno de los péptidos fue altamente homólogo a gliceraldehido-3-fosfato deshidrogenasa de varias especies. Otro péptido tuvo homología con factor de elongación de varias especies, incluyendo Leishmania. La tercera secuencia no se relacionó claramente con algunas de las proteínas conocidas, y se muestra en seguida:

XQXPQ(L/K)VFDEXX.

B. Clonación y secuenciación del gen Ldp23p.

Con el fin de recuperar la proteína de L. donovani que proceso en un péptido asociado con moléculas de MHC
clase 11 de macrófagos infectados, la secuencia de péptidos de origen incierto se eligió para guiar la estrategia de
clonación del gen de parásitos correspondientes. Un fragmento de ADN se amplificó inicialmente de ADNc
de promastigote de L. donovani por RCP. El iniciador de sentido fue un oligonucleótido derivado de péptido
(5'>GGAATTCCCCInCAGCTInGTInTTCGAC <3') conteniendo un sitio de endonucleasa de restricción EcoRI (subrayado). Las bases se seleccionaron siguiendo el uso preferencial del codon de L. donovani, como se describió en Langford y otros, Exp. Parasitol. 74:360 (1992). Se utilizó inosina para los residuos de las posiciones 4, 6 y 7 dado la seguridad del uso del codon bajo para los aminoácidos correspondientes. Además, no se incluyo ácido Lglutámico carboxilo terminal para el diseño del iniciador. El iniciador de contrasentido fue un oligonucleótido de poli-timidina (oligo dT, iniciador corriente a bajo) conteniendo un sitio de endonucleasa de restricción Xhol.

El fragmento de genes se amplificó de una ADNc de promastigote de L. donovani utilizando las siguientes condiciones de reacción: un ciclo de 3 minutos a 94°C siguiendo inmediatamente 35 ciclos de 1 minutos a 94°C, 1 minuto 45°C y 1 minuto a 72°C. Se preparó ADNc de L. donovani de 5 x 10^{7} formas de promastigote lavadas recopiladas en la fase de crecimiento log (3 días de cultivo). El ADNc se obtuvo utilizando un equipo Invitrogen cDNA cycle^{TM} (Invitrogen Co., San Diego Ca). Los iniciadores de Oligonucleótidos se sintetizaron the DNA Synthesis Laboratory, Department of Pathology, Yale University School of Medicine.

Los productos de RCP se analizaron por electroforesis en gel. Solamente se obtuvo una banda de aproximadamente 300 bp. Este fragmento se clonó y su secuencia confirmó la secuencia del iniciador basado en péptidos incluyendo el codon de ácido glutámico, no incluido deliberadamente en la secuencia del iniciador.

El fragmento del gen amplificado de RCP se ligó en el vector de pCR^{TM} utilizando el sistema de clonación de TA (Invitrogen Co., San Diego CA). Se seleccionaron transformantes en medio LB conteniendo 100p,g/ml de ampicilina el ADN de plásmido se aisló utilizando el equipo de purificación de ADN Wizard TM Minipreps (Promega Co., Madison, WI). Se liberó el ADN del inserto con las enzimas de restricción EcoRI y Xhot (New England Biolabs, Beverly, MA), purificado de una electroforesis en gel de agarosa y marcado con ^{32}P utilizando un método de iniciación aleatorio (Megaprime Labeling Kit, Amersham Life Science, Buckinghamshire, England).

Este fragmento de ADN se utilizó como sonda para tamizar un banco ADNc de promastigote de L. donovani como se describió en Skeiky y otros, Infect. Immun. 62:1643 (1994). Se extirpó un ADNc de aproximadamente 650 pb (Ldp23) del fagemido por extirpación in vivo utilizando el protocolo de Stratagene. Se llevó a cabo secuenciación de ADN utilizando el sistema de Sequenase versión 2 (equipo de secuenciación de ADN) en presencia o ausencia de 7-deaza-GTP (United States Biochemical, Cleveland, OH). La secuencia se provee como SEC ID NO:3, y muestra homología completa con el fragmento de RCP original de 300 pb. Un marco de lectura abierto de 525bp conteniendo un codon de ATG que sigue las 4 bases de la secuencia líder dividida y se identificaron 3 codones de tensión adyacente a la cola de poli A. Este marco también codifica la secuencia terminal de carboxilo (KVFDE) del péptido asociado de MHC clase II purificado. El análisis de la secuencia de la secuencia de proteínas deducida reveló un sitio de glicosilación potencial (Asn-Cys-Ser) en las posiciones 68-70.

El análisis de secuencia se llevó a cabo utilizando programas de grupo para computadora de genética en la Universidad de Wisconsin y las bases de datos GenBank y EMBL de secuencias de proteínas de ADN. La buscada de homología del gen Ldp23 con secuencias conocidas no reveló homología significativa.

C. Expresión bacteriana y purificación de proteínas recombinantes

La proteína donadora de péptidos de L. donovani recombinante se produjo en E. coli transformado con el vector de expresión pGEX 2T en el cual el gen de Ldp23 se subclonó en el marco. RCP se utilizó para subclonar el gen clonado en marco en él vector de expresión pGEX 2T. Los iniciadores conteniendo enzimas del sitio de restricción apropiadas, codones de iniciación y terminación fueron: 5' > GGATCCATGGTCAAGTCCCA CTACATCTGC <3' para el iniciador corriente arriba y 5' > GATTCAGACCGGATAGAAA TAAGCCAATGAAA >3' para el iniciador corriente abajo (sitios de restricción de BamHl y EcoRI son subrayados respectivamente). Las condiciones de RCP fueron como se indicó antes para la amplificación del fragmento de ADN relacionado del péptido original. El modelo utilizado fue plásmido pBluescript conteniendo el gen clonado del banco de ADNc.

Las sobreexpresión de la proteína de fusión recombinantes se logro desarrollando la E. coli transformada (DH5\alpha) e induciendo el promotor tac con 1mM de isopropil-\beta-tioglactopiranosido (IPTG) (Stratagene, La Jolla, CA). Se recopilaron células, se centrifugaron y se analizaron para la presencia de la proteína de fusión por SDSPAGE. Se produjo una proteína de fusión de glutationa-S-transferasa de 43-44 k D, indicando una proteína de Leishmania de aproximadamente 18 kD, dado que la glutationa-S-transferasa (GST) tiene un PM de 26 kD. Sin embargo, la proteína de fusión fue muy insoluble y por lo tanto no se podía purificar por cromatografía de afinidad utilizando una columna de glutationa. El uso de bajas concentraciones de detergentes como SDS, sarcosilo, desoxicolato y octilglucopiranosido durante los pasos de extracción fue eficiente para solubilizar la proteína pero desafortunadamente evitó su unión a la columna de glutationa. Otras maniobras, tales como el crecimiento de E. coli e incubación e inducción de promotor tac con IPTG a 33°C, no mejoró la solubilidad de proteínas. Sin embargo, se logró la purificación mediante SDS-PAGE preparativa. La banda se visualizó con KCl 0,1M, cortó y electroeluyó de gel después de la diálisis extensiva contra PBS y concentración en filtros Centricon 10.

Aproximadamente 500 \mug se obtuvieron de proteína purificada. La proteína purificada se muestra en la Figura 3. En el panel A, la E. coli (DH5\alpha) transformada con el vector de expresión pGEX 2T conteniendo el gen Ldp23 se desarrollo en medio LB y el promotor tac se indujo con IPTG durante 3 horas. Las células se formaron en pellas, se resuspendieron en solución reguladora de pH de carga y se presentaron al ADS-PAGE (10%) bajo condición reductora. El gel se tiño con azul de Coomassie. La línea 1 muestra la E. coli no inducida y la línea 2 muestra la E. coli inducida. La flecha indica la proteína recombinante. El panel B muestra la proteína preparada como en el panel A y se sometió a una SDS-PAGE preparativa. La banda que corresponde a la proteína de fusión recombinante sobreexpresada se identificó por KCI, se cortó, se electroeluyó de la tira de gel, se dializó contra PBS y se sometió a SDS-PAGE analítico (12%). Los números de lado izquierdo indican los pesos moleculares de los marcadores. No tuvieron éxito los intentos para purificar más la proteína de Leishmania separándola de la proteína de fisión GST con trombina.

D. Expresión de Ldp23

Para asegurarse de que el péptido de Ldp23 se expresó en organismos de Leishmania, se realizó un análisis de manchas Northern utilizando ARN preparado de diferentes fases de crecimiento de promastigotes (logarítmicas y estacionarias) y de la forma de mastigote de estos parásitos.

El ARN se preparó de 2 x 10^{7} células de parásitos utilizando el equipo de aislamiento de ARN micro (Stratagene, La Jolla, CA) de acuerdo con las instrucciones recomendadas por la compañía. Se preparó ARN de promastigotes de L. donovani (fase de crecimiento logarítmica); de promastigotes de L. major (fases de crecimiento logarítmica y estacionaria); de promastigotes de L. amazonensis (fases de crecimiento logarítmica y estacionaria) y amastigotes purificados de ratones infectados por CBA/J; y de L. pifanoi, tanto promastigotes (fases de crecimiento logarítmica y estacionaria) y amastigotes (del medio de cultivo axenico). Los promastigotes de L. donovani (cepa 1S), L. amazonensis (MHOM/BR/77/LTB0016), L. majar (MHOM/IR/79/LRC-L251) y L. pifanoi (MHOM/VE/60/Ltrod) se desarrollaron y mantuvieron a 26°C en medio de Schneider conteniendo 20% de GCS y 50 \mug/ml de gentamicina. Las formas de amastigote de L. amazonensis se obtuvieron por centrifugación diferencia]. de una lesión en la almohadilla de la pata "similar a pus" de un ratón CBA/J infectado durante 6 meses con este parásito. Se obtuvieron amastigotes de L. pifanoi del cultivo axenico como se reportó previamente por Pan y otros, J. Euk, Microbiol. 40:213 (1993).

Se llevó a cabo la hibridización a 45°C en presencia de 50% de formamida, solución de Denhardt 5x. 0,1% de SDS, 100 \mug/ml de ADN de esperma de salmón de una sola hilera y 5x SSPE utilizando 0,45 \mug de filtros de membrana Nytran (Schleicher & Schuell, Keene, NH). La sonda fue el gen de Ldp23 marcado con ^{32}p.

La Figura 4 muestra que se observó una banda de ARN sencilla de 680 bp para todas las fases de crecimiento y formas de todas las Leishmania probadas. Dentro de la figura 4, los números 1, 2, y 3 se refieren a ARN obtenidos de promastigotes en la fase de crecimiento logarítmica, promastigotes en la fase de crecimiento estacionaria y formas de amastigotes, respectivamente, y los números del lado izquierdo indican los pesos moleculares de los mercados en pares de base. Este resultado concuerda con el tamaño de gen correspondiente (525 bp) y con el peso molecular de la proteína expresada y los puntos de la distribución ubícuota y expresión de esté gen dentro del genero Leishmania.

E. Inducción de respuesta de anticuerpos anti-L donovani en ratones y conejos por proteína recombinante purificada

Con el fin de evaluar la inmunogenicidad de la proteína de Leishmania recombinante y para investigar está expresión en los parásitos, se inmunizaron ratones y conejos con la proteína de fusión de GST en AFC. Los ratones BALB/c se inmunizaron en la almohadilla de la pata trasera con 510ug de proteína emulsificada en AFC. Se determinó la concentración de proteína utilizando el reactivo del análisis de proteína Bio-Rad (Bio-Rad Laboratories, Richmond, CA). Se les puso un refuerzo a los ratones 7 días después con 5-10 \mug de proteína emulsificada en auxiliar de Freünd incompleto (AFI) inoculado en la cavidad peritoneal. Los ratones se sangraron 7 días después de la segunda inmunización. Se inmunizaron conejos blancos New Zealand (Milibrook Farm. Amherst, MA) de acuerdo con el siguiente protocolo: una inyección intramuscular (IM) de 25-30 \mug de proteína recombinante purificada emulsificada en AFC en cada muslo una vez al día; una inyección IM de 25-30 \mug de proteína purificada emulsificada en AFI en cada hombro en el día 7; en el día 15, 25-30 \mug de la proteína purificada en PBS se inyectó en el tejido subcutáneo. El conejo se sangró 7 días después de la última inmunización.

Se prepararon sueros y la respuesta de anticuerpos anti-Leishmania se midió por análisis de manchas Western por un FACScan. En ambos casos se utilizaron promastigotes de L. donovani como antígeno. Aproximadamente 2 x 10^{6} promastigotes de L. donovani se desarrollaron en medio Schneider durante 3 días (fase log), en donde se lavaron con PBS, se lisaron con solución reguladora de pH de carga de SDS-PAGE y se sometieron a electroferesis bajo condiciones de reducción utilizando un gen de poliacrilamida al 15%. Las proteínas se transfirieron en membrana de transferencia de 0,45 \mu, lmmobilon-P (Millipore Co., Bedford, MA) utilizando un formador de manchas electrónico de tipo húmedo (Mini Trans-Blot Electrophoretic Transfer Cell, Bio Rad Life Science Division, Richmond, CA) durante 2 horas a 50 V. Las membranas se bloquearon durante la noche a temperatura ambiente con PBS conteniendo 3% de suero de cabra normal (SCN), 0,2% de Tween-20 y 0,05% de azida de sodio, seguido por 3 lavados con PBS. Las manchas después se incubaron durante 3-4 horas a 4°C con una dilución de 1/200 de suero de conejo preinmune (línea A Figura 5) o con la misma dilución de antisuero de conejo de proteína antifusión (línea B, Figura 5). El suero se absorbió previamente 2 veces con Mycobacterium tuberculosis H-37 RA de secado no viable (Disco Laboratories, Detroit, MI) y se diluyó en PBS conteniendo 1% de NGS y 5% de leche de bovino sin grasa en polvo (Carnation, Nestlé Food Company, Glendale, CA). Las membranas se lavaron entonces con PBS se incubaron durante 1 hora a temperatura ambiente con anticuerpo IgG anticuerpo de cabra conjugado con fosfatasa alcalina (Promega, Madison, WI), se lavo una vez con PBS y dos veces con solución reguladora de pH veronal pH 9.4. La reacción se visualizó utilizando la mezcla de substrato 5-bromo-4-cloro-3-indoilfosfatoterazolio de nitroazul (Kirkegaard & Perry Laboratories Inc., Gaithersburg, MD) de acuerdo con las instrucciones del fabricante.

La Figura 5 muestra que el antisuero de proteína antirecombinante de conejo detecta una sola proteína de 23 kDa (Ldp23) en la preparación de antígeno de extracto crudo de Leishmania. No se observaron bandas cuando se utilizo el antisuero anti-GST (no mostrado). Además, el análisis de FACScan (figura 6) muestra que el anticuerpo induje las reacciones de Ldp23 recombinantes con promastigotes de L. donovani vivos intactos, señalando así una expresión de superficie de celular de está molécula sobre estos organismos. La línea punteada en la Figura 6 muestra la inmunofluorescencia indirecta realizada utilizando suero de ratón preinmune y la línea sólida en la Figura 6 muestra el resultado obtenido con antisuero anti-GST-Ldp23 de ratón. Ambos sueros se diluyeron a 1/100. Los parásitos se lavaron con solución reguladora de pH de tinción y se incubaron con anticuerpo de inmunoglobulina antiratón de cabra conjugado de FITC. Se analizó la intensidad de fluorescencia por FACScan.

F. Reconocimiento de Ldp23 recombinante por células T del nodo linfático específico para Leishmania

Para probar la respuesta de células T a la proteína de Ldp23, se realizaron dos grupos de experimentos. En el primer experimento, las células T del nodo linfático (10^{5}/pozos) de ratones BALB/c inmunizados con promastigotes de L. donovani (como se describo antes) se estimularon para proliferar con 2 x 10^{5} células del bazo Mononucleares (CBM) normales tratadas con Mitomicina C y se pulsaron con la proteína de fusión recombinante purificada. La proliferación de células T se mido a las 72 horas de cultivo. Los valores se expresan en la Figura 7 como cpm y representan la media de la incorporación de [^{3}H]TdR de cultivos por triplicado. El cpm anterior de las células (células T + CPA) cultivadas en presencia del me- dio solo fue 1291. La Figura 7 muestra las células T específicas de Leishmania que proliferan y en una manera la respuesta de dosis al Ldp23 recombinante. Se observo respuesta cuando se agrego GST purificado en lugar de proteína de fusión recombinante ni cuando se estimularon las células T del nodo linfático de ratones inmunizados con AFC solo para proliferar en presencia de la proteína de fusión de Leishmania (no mostrada).

El reconocimiento de la proteína Ldp23 recombinantes las células T específicas de Leishmania, también se probaron utilizando dos modelos de murinos de Leishmaniasis, los ratones BALB/c susceptibles altamente al L. major y los ratos CBA/J susceptibles a L. amazonensis como se describió en Champsi and McMahon-Pratt, Infect. Immun. 56:3272 (1988). Se seleccionaron estos modelos para investigar el patrón de citoquina inducido por Ldp23. En el modelo de ratones de Leishmaniasis, se asoció la resistencia con citoquinas de Th1 mientras que se ligo la susceptibilidad de respuestas de Th2.

Se obtuvieron células del nodo linfático 3 semanas después de la iniciación de infección de ratones BALB/c con el L. major y la capacidad de células para reconocer el Ldp23 recombinante se midió mediante la proliferación y la producción de las citoquinas IFN-\gamma y IL4. Se obtuvieron 2 x 10^{6} células del nodo linfático popliteal de drenado de ratones infectados se cultivaron durante 72 horas en presencia de Ldp23 recombinante o lisato de Leishmania. Se midieron los niveles de IFN-\gamma y IL-4 en sobrenadantes de cultivo por ELISA como se describió previamente en (Chatelain y otros, J. Immunol. 148:1172 (1992), Curry y otros., J. Immunol. Meth. 104:137 (1987), y Mossman and Fong, J. Immunol. Meth. 116:151 (1989)) utilizando anticuerpos monocionales anti lFN-\gamma y IL-4 específicos (PharMingen; San Diego,CA).

El Ldp23 estimuló estas células para proliferar (no mostradas) e indujo un tipo de Th1 normal de respuesta de citoquina como se indico por la producción de altos niveles de IFN-\gamma (panel A de la Figura 8) y no IL-4 (panel B de la Figura 8). La estimulación de estas células con un lisato crudo de Leishmania produjo un perfil de citoquina de Th mezclado. Exactamente se obtuvo el mismo patrón de producción de citoquina a partir de ratones CBA/J infectados con L. amazonensis (no mostrados). Estos resultados indican claramente que Ldp23 es un activador potente y selectivo de las citoquinas Th1 de células de ratones.

Ejemplo 3 Preparación de Hsp83

Este ejemplo ilustra la preparación de un Hsp83 de antígeno de Leishmania que tiene la secuencia provista en SEC ID NO:6. Se construyo un banco de expresión genómica con ADN compartido de L. braziliensis (MHOM/BR/75/
M2903) en el bacteriófago XZAP II (Stratagene, La Jolla, CA). El banco de expresión se tamizó con Escherichia coli preabsorbido de suero de un animal infectado por L. braziliensis con LM. Las placas inmunoreactivas se purificaron y el fagemido pBSK(-) se extirpó mediante los protocolos sugeridos por el fabricante. Las supresiones anidadas se llevaron a cabo con exonucleasa III para generar supresiones translapantes para preparaciones de modelos de un solo hilo y secuenciación. Los modelos de un solo hilo se aislaron siguiendo la expresión con fago auxiliar de VCSM13 como se recomendó por el fabricante (Stratagene, La Jolla, CA) y se secuenció por el método terminador de cadena didesoxi o por el sistema de terminador de colorante Taq utilizando el secuenciador automatizado de Applied Biosystemas modelo 373A.

Los antígenos recombinantes producidos por estos clones se purificaron con 500 ml de cultivos inducidos por isopropil-\beta-D-tiogalctopiranosido (IPTG) como se describió en Skeiky y otros, J. Exp. Med. 176:201-211 (1992). Estos antígenos se analizaron para la capacidad de estimular CMSP de individuos infectados por Leishmania para proliferar y secretar citoquina. La sangre periférica se obtuvo de individuos que viven en una área (Corte de Pedra, Bahía, Brazil) en donde L. braziliensis es endémico y en donde los estudios epidemiológicos, clínicos e inmunológicos se han llevado a cabo durante una década y en donde se aisló CMSP de sangre entera por centrifugación por densidad a través de Ficoll (Winthrop Laboratories, New York, N.Y.). Para los análisis de proliferación in vitro, se cultivaron de 2 X 10^{5} a 4 X 10^{5} células por pozo en medio completo (RPMI 1640 suplementado con gentamicina, 2mercaptoetanol, L-glutamina, y 10% de suero humano A + seleccionado tamizado, Trimar, Hollywood, Calif.) en placas de fondo plano de 96 pozos con o sin 10 \mug de los antígenos indicados por ml o 5 \mug de fitohemaglutinina por ml (Sigma Immunochemicals, St. Louis, Mo.) durante 5 días. Las células después se pulsaron con 1 \muCi de [3H]timidina durante las 18 horas finales del cultivo. Para determinar la producción de citoquina se cultivaron de 0,5 a 1 ml de CMSP a 1 X 10^{6} a 2 X 10^{6} células por ml con o sin antígenos de Leishmania durante 48 y 72 horas.

Los sobrenadantes y las células se recopilaron y analizaron para citoquina secretada y ARNm de citoquina. Se analizaron alícuotas de los sobrenadantes para interferon gamma (IFN-\gamma), factor de necrosis tumoral alfa (TNF-\alpha), interleucina-4 (IL-4), y IL-10 como se describió en Skeiky y otros, J. Exp. Med. 181:1527-1537 (1995). Para el análisis de RCP de ARNm de citoquina se aisló el ARN total de PMBC y se sintetizó ADNc utilizando poli (dT) (Pharmacia, Piscataway NJ) y transcriptasa inversa de virus de miclobastosis de aves. Después de la normalización para B-actina, se amplificó el ADNc diluido por RCP utilizando polimerasa de Taq (Perkin-Elmer Cetus, Foster City, CA) con concentraciones de 0.2 \muM de los iniciadores externos 5' y 3' respectivos en un volumen de reacción de 50 \mul. Las secuencias de nucleótidos de los pares primarios y las condiciones de RCP usadas fueron como se describió en Skeiky y otros., J. Exp. Med. 181:15271537 (1995). Verificamos que nuestras condiciones de RCP estuvieran dentro de la escala semicuantitativa realizando inicialmente dilusiones en serie de los ADNc y variando el número de ciclos utilizados para RCP. Los plásmidos que contienen las secuencias humano para IL-2, IFN-\gamma, IL-4, IL-10, y \beta-actina donde se digirieron, y los insertos de ADN se purificaron después de la separación en geles de agarosa al 1%. Se prepararon sondas marcadas con ^{32}p mediante el método de iniciación aleatoria. Se analizaron productos de RCP por electroforesis en geles de agarosa al 1,5%, se transfieren a membranas de nilón y se probaron con el inserto de ADN marcado con ^{32}P apropiados.

Se identificó un clon recombinante en los análisis anteriores el cual, después de la comparación de secuencias de sus secuencias de aminoácidos prevista con secuencias de otras proteínas, se identificó como un homólogo de Leishmania braziliensis de la proteína de choque por calor 83 kD eucariótica (Lbhsp83). La secuencia del clon se proveyó en SEC ID NO:5 y la secuencia de proteína deducida se proveyó en a SEC ID NO:6. Sobre la base de la homología, este clon, designado Lbhsp83a, parece carecer del los primeros 47 residuos de los residuos de 703 aminoácidos de longitud completa. Lbhsp83 tuvo una homología global de 94% (identidad del 91% y substitución conservadora de 3%), 91% (identidad del 84% y substitución conservadora de 7%) y 77% (identidad de 61% y substitución conservadora de 16%) con hsp83 de L. amazonensis, hsp89 de T. cruzi y hsp83 de humanos, respectivamente. También se aisló un segundo clon (designando Lbhsp83b), que contuvo la porción C terminal de 43 kD de hsp83 (residuos 331 a 703). La Figura 19 presenta la comparación de la secuencia de Lbhsp83 con hsp83 de L. amazonensis (Lahsp83), hsp83 de T. cruzi (Tchsp83) y hsp89 de humanos (Huhsp89).

Los resultados de análisis de proliferación utilizando Lbhsp83a se muestran en la Tabla 1. Las células de todos los pacientes con Leishmaniasis mucosal (LM) poliferaron fuertemente en respuesta a Lbhasp83a, con índices de estimulación (IE) variando de 19 A 558 (comparado con 20 a 1,634 para lisatos de parásito). La proliferación de CMSP de pacientes con Leishmaniasis cutánea (LC) fue variable y excepto por los niveles en dos pacientes (IV y VII), los niveles fueron significativamente inferiores que aquellos de pacientes con LM. Por comparación, las respuestas proliferativas de individuos con LC autocurable a Lbhsp83a fueron similares a aquellas de individuos con LM. Sin embargo, las respuestas de los seis individuos autocurados para Lbhsp83 fueron consistemente superiores a aquellos para Lbhsp83b. Esto sugiere que las CMSP de pacientes con LC autocurable reconocen preferentemente una o más epítopes de células T localizadas dentro de la porción amino de Lbhsp83.

(Tabla pasa a página siguiente)

TABLA 1 Proliferación in vitro de CMSP de individuos infectados con L. brazilienzis en respuesta a Lbhsp83

1

Un análisis más detallado de patrones de citoquina de CMSP de pacientes con LM se llevó a cabo por RCP de transcriptasa inversa. Los ARNm de citoquina se evaluaron las células antes del cultivo (Figura 9, líneas 0) o después del cultivo en ausencia (líneas -) o presencia del antígeno indicado para 48 y 72 horas. La Figura 4A muestra los resultados para cinco de los seis pacientes con LM cuyas CMSP fueron avanzados. En aproximadamente la mitad de los pacientes con MI, las CMSP no cultivadas (restantes) tuvieron niveles detectables de ARNm para IFN-\gamma,
IL-2, y IL-4 pero no IL-10. Sin embargo, las CMSP de pacientes con LC tuvieron ARNm de IL-10 en el estado en reposo además de ARNm para las otras citoquinas probadas (Figura 4B). Después del cultivo in vitro sin antígeno, los niveles de ARNm para IFN-\gamma, IL-2 y IL-4 en células en reposo de pacientes LM disminuyó a niveles anteriores mientras aumentaron los niveles de ARNm de IL-10. En contraste, las CMSP de la mayoría de los pacientes Cl tuvieron ARNm de IL-10 estables o incrementados; mientras que los ARNm para IL-2, IF-\gamma y IL-4 se redujeron a niveles casi detectables en ausencia de estimulación de antígenos.

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En CMSP de tres pacientes con MI, la estimulación con lisado dió como resultado la expresión incrementada de ARNm para IFN-\gamma, IL-2 y IL-4 pero no IL-10. En comparación, ambos polipéptidos de Lbhsp83 dieron la producción de ARNm para IFN-y y IL-2 de todos las CMSP de pacientes con LM probados. En contraste los perfiles de ARNm para IL-10 y IL-4 difirieron de los dos polipéptidos de hsp83. Lbhsp83a estimuló la producción de IL-10 pero no IL-4 (pacientes 1, 11, II, y IV), mientras que Lbhsp83b estimuló la producción de IL-4 pero no ARNm de IL-10 en los seis pacientes.

Todos los pacientes con LC probados respondieron tanto a los polipéptidos de Lbhsp83 como al lisato de parásitos regulando ascendentemente las síntesis de ARNm para IL-2 y IFN-\gamma, y en dos de cuatro pacientes (I y IV), el nivel de ARNm de IL-4 también un incremento indicando la estimulación para citoquinas Th1 y Th2. Interesantemente y como en el caso de CMSP no cultivadas de pacientes con LM que no tienen niveles detectables de ARNm de IL10, Lbhsp83a y no Lbhsp83b estimularon CMSP de un paciente con LC (IV) para sintetizar ARNm de IL-10. Sin embargo, en los otros tres pacientes (I, II y III) con niveles restantes de ARNm de IL-10, ambos polipéptidos de rLbhsp83 así como el lisato de parásitos regularon descendentemente la expresión de ARNm de IL-10.

Los sobrenadantes de CMSP también se analizaron para la presencia de IFN-\gamma, TNF-\alpha, IL-4, y IL-10. Las células de todos los pacientes con LM y LC autocurable (siete y seis pacientes, respectivamente) y de cuatro de siete pacientes con LC se analizaron para IFN-\gamma secretado siguiendo la estimulación con polipéptidos rLbhsp83, lisato de parásitos y Lbhsp70, una proteína de L. braziliensis homóloga a la proteína de choque por calor de 70kD eucariótica (Figura l0A). En general, rLbhsp83a estimuló las CMSP de pacientes para secretar niveles superiores de IFN-\gamma que el rLbhsp83b (de 0,2 a 36 y de 0,13 a 28 ng/ml, respectivamente). La presencia de IFN-\gamma se correlaciono bien con el ARNm correspondiente detectado por RCP.

Las CMSP de cuatro de cinco pacientes con LM (I, II, V y VII) tuvo niveles de TNF-\alpha de sobrenadante (de 0,8 a 2,2 ng/ml) superiores aquellos detectados en cultivos de CMSP de controles no infectados siguiendo la estimulación con lisato de parásitos (Figura 10B). Similarmente, las mismas CMSP se estimularon por rLbhsp83 para producir niveles de TNF-a en sobrenadante que varía de 0,61 a 2,9 ng/ml. Comparado con aquellos controles no infectados, las CMSP de tres (I, V y VI), cinco (I, II, IV, V y VI), y dos (II y V) de seis individuos analizados produjeron niveles superiores de TNF-\alpha en respuesta al lisato de parásito, rLbhsp83a y rLbhsp83b, respectivamente. Los niveles de TNF-\alpha producidos por CMSP de pacientes con LC en respuesta a lisato de parásitos fueron comparables con aquellos producidos por controles no infectados. Sin embargo, rLbhsp83 estimuló la producción de TNF-a en las CMSP de dos de estos pacientes. rLbhsp83a estimulo niveles superiores de producción de TNF-a que el rLbhsp83b. En ausencia de estimulación de antígeno, solo las CMSP de pacientes con LM (cinco de seis) produjeron niveles detectables de TNF-a en sobrenadante (de 60 a 190 pg/ml).

De acuerdo con el ARNm de IL-10, IL-10 se detectó por ELISA en los sobrenadantes de cultivo de CMSP estimuladas con antígeno de pacientes con LM y LC. Los niveles (de 49 a 190 pg) fueron significativamente superiores (hasta 10 veces) siguiendo la estimulación con rLbhsp83a comparado con aquellos después de la estimulación paralela de las mismas células con rLbhsp83b (Figura 11). El lisato de parásitos también estimula PMBC de algunos de los pacientes para producir IL-10. Aunque rLbhsp83 estimuló el PMBC de individuos no infectados para producir IL-10, con una excepción los niveles fueron inferiores que aquellos observados con PMBC de pacientes. IL-4 no se detectó en cualquiera de los sobrenadantes analizados. Por lo tanto, el nivel de cualquier IL-4 secretado está por debajo del límite de detección de la ELISA empleada (50 pg/ml). En conjunto los resultados demuestran que un perfil de citoquina del tipo de Th1 predominante está asociado con PMBC de individuos infectados con L. brazitiensis siguiendo la estimulación con polipéptidos de rLbhsp83.

Para determinar la correlación entre las respuestas de células T observadas y producción de anticuerpos para Lbhsp83, comparamos las reacciones del anticuerpo (inmunoglobulina G) a Lbhsp83 en suero de los tres grupos de pacientes (Figura 12). La reacciones de ELISA de sueros de pacientes con LM con rLbhsp83a fueron comparadas con aquellas observadas con lisato de parásitos y en general, hubo una correlación directa entre la titulación de anticuerpos anti-Lbhsp83 de pacientes con LM y la proliferación de células T. De 23 muestras de suero de pacientes con LM analizados, 22 fueron positivas (\sim96%) con valores de absorbancia de 0,20 a >3,0. Once de las muestras de suero de pacientes con LM tuvieron valores de densidad óptica que fueron >1. En general, los pacientes con LC tuvieron titulaciones de anticuerpo anti-Lbhsp83 significativamente inferiores (x = 0,74; error normal de [SEM] media = 0,1) comparado con aquellos de pacientes con LM. Por lo tanto, las titulaciones de anticuerpos antirhsp83 de pacientes con LM y LC se correlacionaron son sus respuestas proliferativas de células T respectivas. Las titulaciones de Anti-rLbhsp83 fueron significativamente superiores en pacientes con LM (x = 1,5; SEM = 0,2) que en pacientes con LC autocurable (x = 0,35; SEM = 0,056), aunque sus respuestas proliferativas de células T fueron similares. De hecho, las titulaciones de anticuerpo anti-Lbhsp83 en suero de pacientes con LC autocurables fueron comparables con aquellas de controles no infectados (x = 0,24; SEM = 0,028). Utilizando dos desviaciones normales mayores al valor de absorbancia medio de control no infectado (0.484) como un criterio para reactividad positiva para Lbhsp83, fueron negativas ocho de nueve de las muestras de suero de pacientes autocurables.

\newpage

Ejemplo 4 Preparación de clones que codifican Lt-210

Este Ejemplo ilustra la preparación de clones que codifican porciones del antígeno de Lt-210 de Leishmania y que tiene la secuencia provista en SEC ID NO:8.

Se construyó un banco de expresión de ADN genómico de L. tropica (MHOM/SA/91/WR1063C). El ADN se aisló solubilizando promastigotes de L. tropica en l0mM de Tris-HCI, pH 8.3, 50mM de EDTA, 1% de SDS y tratando con 100 \mum/ml de RNaseA y 100 \mug/ml de proteinasa K. La muestra entonces se extrajo secuencialmente con un volumen igual de fenol, fenol: cloroformo (1:1), y cloroformo. Se precipitó el ADN agregando 0,1 volúmenes de acetato de sodio 3M (pH 5.2) y 2,5 en volumen de etanol al 95%. El precipitado se resuspendió en 10uM de Tris, 1mM de EDTA. El ADN se dividió por el paso a través de una hoja de calibre 30 a una escala de tamaño 2-6 kilobase, y se reparó por incubación con PI y de ADN en presencia de 1001M cada uno de dATP, dCTP, dGTP, y dTTP. Los adaptadores de EcoRI se ligaron a los fragmentos de ARN. Después de la remoción de adaptadores no ligados mediante el paso en una columna SephadeX^{TM} G-25 los fragmentos se insertaron en ZapII Lambda de corte EcoRI (Stratagene, La Jolla, CA).

Aproximadamente 43,000 pfu se sembraron en plantas y se tamizaron con suero aislados de pacientes con Leishmaniasis viscerotrópica (LVT). El suero de pacientes de LVT recibieron de los Doctores M. Grogl y A. Magill. El grupo de pacientes de LVT incluyó ocho individuos de cuyos parásitos se aislaron y cultivaron, siete de los cuales tuvieron infección confirmada con L. tropica. Otros cuatro pacientes fueron cultivos negativos, pero aún se consideraron que están infectados basado en su análisis de RCP o una porción de anticuerpos monoclonal positivo (Dr. Max Grogl, comunicación personal). Las muestras de suero de los 11 pacientes infectados se seleccionaron y se removieron reactividad anti-E. coli por cromatografía de afinidad (Sambrook y otros, supra, p. 12.27-12.28). El fago Lambda que expresa proteínas reactivas se detectaron después de unir anticuerpos por peroxidasa de rábano de proteína A y substrato de ABTS.

Se identificaron y purificaron tres clones, Lt-1, Lt-2 y Lt-3, conteniendo una porción del gen Lt-210. Los clones variaron en tamaño de 1,4 a 3,3 kb y codificaron los polipéptidos de 75 kD, 70 kD y 120 kD, respectivamente. Estos tres clones contienen secuencias parciales del gen Lt-210. Lt-1 y Lt-2 son los clones traslapantes y se eligieron para estudio adicional.

Se determinaron las secuencias de ADN de Lt-1 y Lt-2. La digestión de Exonucleasa III se usó para, crear supresiones traslapantes de los clones (Heinikoff, Gene 28:351-359, 1984). Se preparó un modelo de un solo hilo y la secuencia se determinó con un Secuenciador Automático de Applied Biosystems modelo 373A o por secuenciación de didesoxi Sanger. Se determinó la secuencia en ambos hilos de la porción de codificación del clon Lt-1. Se determinó la secuencia parcial de un hilo del clon Lt-2.

La SEC ID NO:7 presenta la secuencia de ADN de Lt-1, y la SEC ID NO:8 provee la secuencia de aminoácidos predicha del marco de lectura abierto. La secuencia de ADN de la porción de codificación del clon Lt-1 incluye una secuencia de nucleótidos repetida en la porción 5' del clon que contiene ocho copias de una repetición de 99 pb, tres copias de una unidad de repetición de 60 pb; que es parte de la repetición más larga de 99 pb, y 800 pb de la secuencia sin repeticiones. La secuencia de aminoácidos deducida de la repetición de 99 pb, contiene degeneraciones limitadas. La masa de la proteína recombinante predicha es de 67,060 Daltons. Una búsqueda de base de datos de PIR con la secuencia de aminoácidos predicha del marco de lectura abierto no produjo homología significativa a las secuencias previamente presentadas. La estructura secundaria predicha de la porción de repetición del clon es completamente
\alpha-helicoidal.

El análisis de hibridización confirmó que rLt-2 y rLt-1 contienen secuencias traslapantes. Los ADN genómicos de varias especies de Leishmania se restringieron con una variedad de enzimas, separadas por electroforesis de gel de agarosa y graficadas en el filtro de membrana de Nytran (Schleicher & Schuell, Keene, NH). Los insertos de rLt-1 y rLt-2 se marcaron con ^{32}P-CTP por transcriptasa inversa de iniciadores de oligonucleótidos aleatorios y se usaron como sondas después de la separación de núcleotidos no incorporados en una columna Sephadex G-50. Las hibridizaciones usando la sonda rLt-1 o rLt-2 se realizaron en NaH_{2}PO_{4} 0,2M/NaCl 3,6M a 65°C, mientras que la hibridización usando la sonda rLt-1 r se llevó a cabo NaH_{2}PO_{4} 0,2M/ NaCl 3.6M a 60°C durante la noche. Los filtros se lavaron en NaCl 0,075M/citrato de sodio 0,005M pH 7.0 (NaCl 0,15M/citrato de sodio 0,015M para la sonda de Lt-Ir), más 0.5% de SDS a la misma temperatura que la hibridización.

El ADN genómico de un número de especies de Leishmania incluyendo L. tropica se analizaron por manchas Southern como se describió antes usando los insertos de Lt-1, Lt-2 y Lt-Ir por separado como sondas. Colectivamente, varias digestiones de ADN de L. tropica indican que este gen tiene un número de copias inferior. Un patrón traslapante similar se observó usando los insertos Lt-1 o Lt-2 como una sonda, que concuerda con la premisa de que estos dos clones contienen secuencias cercanas o traslapándose unas a otras. Además, las secuencias que se hibridizan con estos clones están presentes en otra especie de Leishmania.

Los aislados de L. tropica tienen heterogeneidad limitada. Se llevaron a cabo análisis de Southern de ADN genómico digerido de cuatros cepas de parásitos de L. tropica aisladas de pacientes con BTL y tres cepas de parásitos de
L. tropica aisladas de casos de LC (dos seres humanos, un canino). El inserto de Lt-Ir descrito más adelante se marcó y usó como una sonda. Los siete diferentes aislados de L. tropica dieron intensidades similares y patrones de restricción, con solo un polimorfismo de longitud del fragmento de restricción entre los aislados. Estos datos, junto con los análisis Southern con enzimas adicionales, indican heterogeneidad limitada en esta región entre los aislados de L. tropica.

Las proteínas recombinantes de Lt-1 y Lt-2 se expresaron y purificaron. El grupo de supresión anidado de Lt-1 formado para secuenciación incluyó un clon denominado como Lt-lr, el cual contiene uno y un tercio de repeticiones. Este polipéptido también se expresó y purificó. La extirpación in vivo del fagémido SK- de pBluescript de Lambda Zap II se llevó a cabo de acuerdo con el protocolo del fabricante. Se usaron partículas de virus fagémidos para infectar E. coli XL-1 Blue. La producción de proteína se, indujo por la adición de IPTG. Se recuperó proteína lisando primero pellas de bacterias inducidas en una solución reguladora de pH (LB, 50 mM Tris-HCI, pH 8.0, 100 mM NaCl, 10 mM EDTA) usando una combinación de lisozima (750 \mug/ml) y tratamiento con sonido. Se recuperaron rLt-1, rLt-2 y rLt-Ir de los cuerpos de inclusión después de la solubilización en urea 8M (rLt-1 y rLt-2) o urea 4M (rLt-Ir). Las proteínas rLt-1 y rLt-2 fueron enriquecidas y separadas por precipitación con sulfato de amonio al 25%-40% y rLt-Ir fue enriquecido por la precipitación con sulfato de amonio al 10%-25%. Las proteínas se purificaron además por electroforesis preparativa en SDS-PAGE al 10%. Las proteínas recombinantes se eluyeron de los geles y dializaron en solución salina con pH regulado de fosfato (SPF). La concentración se midió por el análisis de BCA de Pierce (Rockford, IL) y se evaluó la pureza por tinción de azul Coomassie después de SDS-PAGE.

Ejemplo 5 Preparación de LbeIF4A

Este ejemplo ilustra la clonación molecular de una secuencia de ADN que codifica el LbeIF4A del antígeno ribosomal de L. braziliensis.

Un banco de expresión genómica se construyó con ADN dividido de L. braziliensis (MHOM/BR/75/M2903) en el bacteriófago \lambdaZAPII (Strategene, La Jolla, CA). El banco de expresión se tamizó con suero de pacientes preadsorbido con E. coli de un individuo infectado con L. braziliensis con Leishmaniasis mucosal. Las placas que contienen antígenos recombinantes inmunoreactivos se purificaron y le extirparon fagémidos pBSK(-) usando los protocolos del fabricante. Se llevaron a cabo supresiones anidadas con Exonucleasa III para generar supresiones traslapantes para preparaciones de patrones de un solo hilo y secuenciación. Los patrones de un solo hilo se aislaron siguiendo la infección con fago auxiliar BCSM13 como se recomendó por el fabricante (Strategene, La Jolla, CA) y se secuenciaron por el método de terminador de cadena didesoxi o por el sistema terminador de colorante Taq usando el Secuenciador Automatizado de Applied Biosystems Modelo 373A.

Los antígenos recombinantes inmunoreactivos se analizaron entonces en análisis de células T de pacientes para su capacidad de estimular una producción proliferativa y de citoquina, como se describe en los siguientes Ejemplos 7 y 8.

Un clon recombinante se identificó en los análisis anteriores los cuales, siguiendo la comparación de secuencias de su secuencia de aminoácidos predicha con las secuencias de otras proteínas, se identificó como un homólogo de Leishmania braziliensis del factor de iniciación eucariótico 4A (elF4A). El clon aislado (pLeIF.l) careció de los primeros 48 residuos de aminoácidos (144 nucleótidos) para la secuencia de proteínas de longitud completa. El inserto de pLeIF.1 se usó subsecuentemente para aislar la secuencia genómica de longitud completa.

La SEC ID NO:7 muestra toda la secuencia de nucleótidos del polipéptido LbeIF4A de longitud completa. El marco de lectura abierto (nucleótidos 115 a 1323) codifica una proteína de 403 aminoácidos con un peso molecular predicho de 45,3 kD. Una comparación de la secuencia de proteínas predicha de LbeIF4A con las proteínas homólogas de tabaco (TeIF4A), ratón (meIF4A) y levadura (YeIF4A) muestra homología de secuencias extensa, con los primeros 20-30 aminoácidos siendo los más variables. Son similares las longitudes (403, 413, 407, y 395 aminoácidos), pesos moleculares (45,3, 46,8, 46,4 y 44,7 kDa) y puntos isoeléctricos (5,9, 5,4. 5,5 y 4,9) de LbeIF4A, TeIF4A, McIF4A, y YeIF4A, respectivamente. LbeIF4A, muestra una homología global de 75,5% (identidad del 57%, substitución conservadora del 18,5%) con TeIF4A, 68,6% (identidad del 50%, substitución conservadora del 18,6%) con McIF4A y 67,2% (identidad del 47,6%, substitución conservadora 19.6%) con YeIF4A.

Ejemplo 6 Preparación de antígenos solubles de Leishmania.

Este Ejemplo ilustra la preparación de antígenos solubles de Leishmania de un sobrenadante de cultivos de L. major. Los promastigotes de L. major se desarrollan en la fase log tardía en medio complejo con suero útil para alcanzar una densidad de 2-3 x l0^{7} organismos viables por ml de medio. Los organismos se lavaron concienzudamente para remover componentes del medio y se resuspendieron a 2-3 x 10^{7} organismos viables por ml de medio libre de suero definido consistiendo de partes iguales de RPMI 1640 y medio 199, ambos de Gibco BRL, Githersburg, MD. Después de 8-12 horas, el sobrenadante se removió, se concentró 10 veces y se dializó contra solución salina con pH regulado con fosfato durante 24 horas. La concentración de proteína se determinó luego y la presencia de por lo menos ocho antígenos diferentes se confirmó por SDS-PAGE. Esta mezcla se denominó en la presente como "antígenos solubles de Leishmania ".

Ejemplo 7 Comparación de Interleucina-4 y producción de Interferon-ti estimulada por antígenos de Leishmania

Este Ejemplo ilustra las propiedades inmunogénicas de los antígenos preparados de acuerdo con los Ejemplos 1, 2, 5 y 6, como se determinó por su capacidad de estimular IL-4 y IFN-\gamma en cultivos del codo linfático de ratones infectados y en preparaciones de CMSP de humanos. Los cultivos del nodo linfático para usarse en estos estudios se prepararon de ratones BALB/c infectados con L. major 10 días después de la infección, como se describió en el Ejemplo 2. Las CMSP se prepararon usando sangre periférica obtenida de individuos con infecciones curadas de L. donovani quienes respondieron inmunológicamente a Leishmania. El diagnóstico de los pacientes se hicieron por hallazgos clínicos asociados con por lo menos uno de lo siguiente: aislamiento de parásitos de lesiones, una prueba de piel positiva con lisato de Leishmania o una prueba serológica positiva. Se identificaron individuos no infectados basado en una falta de signos o síntomas clínicos, una falta de historia de exposición o viaje a áreas endémicas y la ausencia de una respuesta serológica o celular a antígenos de Leishmania. La sangre periférica se recopiló y las CMSP se aislaron por centrifugación de densidad a través de Ficol1^{TM} (Winthrop Laboratories, New York).

Los sobrenadantes de cultivos se analizaron para los niveles de IL-4 secretados y IFN-\gamma. IFN-\gamma se cuantificó por una ELISA de doble emparedado usando mAb de IFN-\gamma anti humano de ratón (Chemicon, Temucula, CA) y suero de IFN-\gamma anti-humano de conejo policlonal. Se utilizó rIFN-\gamma humano (Genetech Inc., San Francisco, CA) para generar una curva normal. IL-4 se cuantificó en sobrenadantes por una ELISA de doble emparedado usando un mAb de IL-4 anti humano de ratón (MI) y un suero de IL-4 antihumano de conejo policlonal (P3). Se usó IL-4 humano (Immunex Corp., Seattle, WA) para generar una curva normal que varía de 50 pg/ml a 1 ng/ml.

Las Figuras 13A y 13B, ilustran el nivel medio de IL-4 y IFN-\gamma secretados, respectivamente, 72 horas después de la adición de 10 \mug/mL de cada uno de los siguientes antígenos para un cultivo de nodos linfáticos preparado como se describió antes: el antígeno soluble de Leishmania (es decir, un extracto preparado de promastigotes rotos que contiene membrana y antígenos internos (SLA)), Ldp23, LbeIF4A (LeIF), Lbhsp83, M15 y LmeIF (el homólogo de L. major de LbeIF4A). También se muestran los niveles de IL-4 y IFN-\gamma secretados en medio solo (es decir, no estimulados). Mientras que SLA produce una respuesta predominantemente de Th2 de las células del nodo linfático de ratones infectados por Leishmania, Ldp23, LbeIF4A, Lbhsp83 y M15 produjeron relativamente poco IL-4 y grandes cantidades de IFN-\gamma, que concuerda con un perfil de respuesta de Th1.

La Figura 14, muestra el nivel de IFN-\gamma secretado en filtrado de cultivo de preparaciones de CMSP de humanos infectados y no infectados 72 horas después de la adición de 10 \mug/mL. El lisato de L. major, M15 o L-Rack, un antígeno de Leishmania inmunodominante en Leishmaniasis de murinos. Similarmente, la Figura 15 ilustra el nivel de IFN-\gamma secretado en filtrado del cultivo de preparaciones de CMSP de humanos infectados y no infectados 72 horas después de la adición de 10 pg/mL de lisato de L. major, antígenos solubles de Leishmania (preparados como se describió en el Ejemplo 6) o L-Rack. Estos resultados indican que M15 y antígenos solubles de Leishmania, pero no L-Rack, son estimuladores potentes de producción de IFN-\gamma en PMC de pacientes pero no en CMSP obtenidas de individuos no infectados. Por lo tanto, M15 y antígenos de Leishmania produce un perfil de citoquina de TH1 dominante tanto en ratones como seres humanos infectados con Leishmania.

Ejemplo 8 Comparación de proliferación estimulada por antígenos de Leishmania

Este Ejemplo ilustra las propiedades inmunogénicas de los antígenos preparados de acuerdo con los Ejemplos 1, 2, 5 y 6, como se determinó por su capacidad de estimula la preparación en cultivos del nodo linfático de ratones infectados y en preparaciones de CMSP de seres humanos.

Para los análisis de proliferación in vitro, 2-4 x 10^{5} células/pozos se cultivaron en medio completo (RPMI 1640 suplementado con gentamicina, 2-ME, L-gluamina, y 10% de suero humano A+ seleccionado tamizado; Trimar, Hollywood, CA) en placas de fondo plano de 96 pozos con o sin 10 \mug/ml de los antígenos indicados o 5 \mug/ml PHA (Sigma Immunochemicals, St. Louis, MO) durante cinco días. Las células se pulsaron entonces con 1 \muCi de timidina [^{3}H] durante las 18 horas finales del cultivo.

La Figura 16 ilustra la proliferación observada después de la adición de 10 \mug/mL o 20 \mug/mL de cada uno de los siguientes antígenos a un cultivo de nodo linfático preparado como se describió en el Ejemplo 7: SLA, Ldp23, Ldp23, LbeIF4A, Lbhsp83, y M15. También se muestra el nivel de proliferación sin la adición de antígeno. Los datos se representaron como cpm medio. Estos resultados demuestran que una variedad de antígenos de Leishmania son capaces de proliferación estimulatoria de células del nodo linfático de ratones infectados por Leishmania.

Las Figuras 17 y 18 ilustran la proliferación observada en preparaciones de CMSP de seres humanos de individuos inmunes a Leishmania y no infectados siguiendo la adición de 10 \mug/mL de M15 y antígenos solubles de Leishmania, respectivamente. Estos valores se compararon con la proliferación observada siguiendo la adición del medio de cultivo, lisato de L. major y L-Rack. Los resultados muestran que M15 y antígenos solubles de Leishmania estimulan la proliferación en CMSP inmunes para Leishmania, pero no en CMSP obtenidas de individuos no infectados, demostrando que M15 y antígenos solubles (pero no L-Rack) se reconocen por CMSP de individuos inmunes para Leishmania debido a una infección previa.

(1) INFORMACION GENERAL:

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(i)

SOLICITANTE: Reed, Steven G.

\hskip0.3cm

Campos-Neto, Antonio

\hskip0.3cm

Webb, John T.

\hskip0.3cm

Dillon, Davin C.

\hskip0.3cm

Skeiky, Yasir A.W.

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(ii)

TITULO DE LA INVENCION: ANTIGENOS DE LEISMANIA PARA USARSE EN LA TERAPIA Y DIAGNOSTICO DE LEISHMANIASIS

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(iii)

NUMERO DE SECUENCIAS: 10

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(iv)

DIRECCION DE CORRESPONDENCIA:

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(A)

DESTINATARIO: SEED and BERRY

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(B)

CALLE: 6300 Columbia Center, 701 Fifth Avenue

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(C)

CIUDAD: Seattle

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(D)

ESTADO: Washington

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(E)

PAIS: EUA

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(F)

ZP: 98104-7092

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(v)

FORMA LEIBLE EN COMPUTADORA:

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(A)

TIPO DE MEDIO: Disco suave

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(B)

COMPUTADORA: PC compatible IBM

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(C)

SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS

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(D)

SOFTWARE: Patentln Release #1.0, Versión #1.30

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(vi)

DATOS DE SOLICITUD ACTUAL:

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(A)

NUMERO DE SOLICITUD: EUA

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(B)

FECHA DE PRESENTACIÓN: 22-SEP-1995

\vskip0.333000\baselineskip

(C)

CLASIFICACION:

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(viii)

INFORMACION DE APODERADO/AGENTE

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(A)

NOMBRE: Maki, David J.

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(B)

NUMERO DE REGISTRO: 31,392

\vskip0.333000\baselineskip

(C)

NUMERO DE REFERENCIA/CASO: 210121.420

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(ix)

INFORMACION DE TELECOMUNICACION:

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(A)

TELEFONO: (206) 622-4900

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

TELEFAX: (206) 682-6031

\vskip0.333000\baselineskip

(C)

TELEX: 3723836 SEEDANDBERRY

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(2) INFORMACION PARA SEC ID NO: 1:

\vskip0.666000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 3134 pares de base

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(B)

TIPO: ácido nucléico

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(C)

TIPO DE HILO: sencillo

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(D)

TOPOLOGIA: lineal

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(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: CDS

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

UBICACION: 421..2058

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(xi)

DESCRIPCION DE SECUENCIA: SEC ID NO. 1:

2

3

4

5

6

7

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(2) INFORMACION PARA SEC ID NO: 2:

\vskip0.666000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

LONGITUD 546 aminoácidos

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.333000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLECULA: proteína

\vskip0.666000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCION DE SECUENCIA: SEC ID NO: 2:

8

9

90

10

100

11

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACION PARA SEC ID NO:3:

\vskip0.666000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

LONGITUD 676 pares de bases

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucléico

\vskip0.333000\baselineskip

(C)

FORMA DE HILO: sencilla

\vskip0.333000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: CDS

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

UBICACIÓN: 26..550

\vskip0.666000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCION DE SECUENCIA: SEC ID NO: 3

12

13

14

\newpage

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACION PARA SEC ID NO:4:

\vskip0.666000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 175 aminoácidos

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.333000\baselineskip

(C)

TOPOLOGIA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLECULA: proteína

\vskip0.666000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCION DE SECUENCIA: SEC ID NO: 4:

15

16

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACION PARA SEC ID NO:5:

\vskip0.666000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

LONGITUD 2040 pares de bases

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucléico

\vskip0.333000\baselineskip

(C)

FORMA DE HILO: sencilla

\vskip0.333000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: CDS

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

UBICACIÓN: 62..2029

\vskip0.666000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCION DE SECUENCIA: SEC ID NO: 5:

17

18

19

20

21

22

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACION PARA SEC ID NO:6:

\vskip0.666000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 656 aminoácidos

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.333000\baselineskip

(D)

TOPOLOGIA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLECULA: proteína

\vskip0.666000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCION DE SECUENCIA: SEC ID NO: 6:

23

24

240

25

250

26

260

27

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACION PARA SEC ID NO:7:

\vskip0.666000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

LONGITUD 1771 pares de bases

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucléico

\vskip0.333000\baselineskip

(C)

FORMA DE HILO: sencilla

\vskip0.333000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: CDS

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

UBICACIÓN: 1..1698

\vskip0.666000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCION DE SECUENCIA: SEC ID NO: 7:

28

29

30

31

32

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACION PARA SEC ID NO:8:

\vskip0.666000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 566 aminoácidos

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.333000\baselineskip

(D)

TOPOLOGIA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLECULA: proteína

\vskip0.666000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCION DE SECUENCIA: SEC ID NO: 8:

33

34

340

35

350

36

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACION PARA SEC ID NO:9:

\vskip0.666000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

LONGITUD 1618 pares de bases

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucléico

\vskip0.333000\baselineskip

(C)

FORMA DE HILO: sencilla

\vskip0.333000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: CDS

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

UBICACIÓN: 115..1323

\vskip0.666000\baselineskip

(ix)

DESCRIPCION DE SECUENCIA: SEC ID NO: 9:

37

38

39

40

41

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACION PARA SEC ID NO:10:

\vskip0.666000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 403 aminoácidos

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.333000\baselineskip

(D)

TOPOLOGIA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLE:CULA: proteína

\vskip0.666000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCION DE SECUENCIA: SEC ID NO: 10:

42

43

430

44

Claims (13)

1. Un polipéptido que comprende una porción inmunogénica de un antígeno de Leishmania que tiene la secuencia de aminoácidos recitada en SEC ID NO:2, o una variante de dicho antígeno que difiere solo en substituciones y/o modificaciones conservadoras.

2. Un polipéptido de la reivindicación 1, comprendiendo los aminoácidos 1-546 de SEC ID NO:2.

3. Una molécula de ADN aislada comprendiendo una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido de acuerdo con la reivindicación 1.

4. La molécula de ADN de la reivindicación 3, en donde la secuencia de nucleótidos se selecciona del grupo que consiste de:

a)

nucleótidos 421 a 2058 de SEC ID NO:1; y

b)

secuencias de ADN que hibridizan a una secuencia de nucleótidos complementaria a los nucleótidos 421 a 2058 de la SEC ID NO: 1 bajo condiciones moderadamente estrictas.

5. Un vector de expresión recombinante comprendiendo la molécula de ADN de la reivindicación 3.

6. Una célula huésped transformada o transfectada con el vector de expresión de la reivindicación 5.

7. Una composición farmacéutica que comprende un polipéptido aislado de acuerdo con la reivindicación 1, y un vehículo fisiológicamente aceptable.

8. Una composición farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 7 que comprende antígenos solubles de Leishmania.

9. Una vacuna que comprende un polipéptido aislado de acuerdo con la reivindicación 1 y un incrementador de respuesta inmune no específica.

10. Una vacuna de acuerdo con la reivindicación 9 que además comprende antígenos solubles de Leishamania.

11. Una vacuna de acuerdo con la reivindicación 9 en donde el mejorador de respuesta inmune no específica es una porción inmunogénica de un antígeno de Leishmania que tiene la secuencia de aminoácidos recitada en la SEC ID NO:10, o una variante de dicho antígeno que difiere solo en substituciones y/o modificaciones conservadoras.

12. Una vacuna de acuerdo con las reivindicaciones 9 u 11 que comprende además un vehículo de suministro.

13. El polipéptido de la reivindicación 1 para su uso como medicamento.