WO2007074188A1 - NUEVOS PEPTIDOS DETERMINANTES ANTIGENICOS T COLABORADORES (DTh) - Google Patents

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Francisco Borras Cuesta
Juan José LASARTE SAGASTIBELZA
Marta Ruiz Egozcue
Pablo Sarobe Ugarriza
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Definitions

  • the present invention is within the field of the determination of antigenic peptides, capable of stimulating collaborative T responses (LTh).
  • LTh can also act directly as effector cells, an activity mediated by direct cell contact or lymphokine release (IFN- ⁇ , TNF- ⁇ , etc.). Therefore, the stimulation of collaborative T responses (Th) is a very relevant aspect for vaccine development.
  • LTh recognizes through specific receptors (TCR) located on its surface, complexes formed between MHC Class II molecules and antigenic peptides. These peptides that bind to MHC Class II molecules, also known as Th epitopes or Th antigenic determinants (DTh), usually have sizes between 11 and 22 amino acids, and more frequently between 13 and 16 amino acids.
  • TCR specific receptors
  • DTh Th antigenic determinants
  • epitope-based vaccines offer the opportunity to include chimeric DThs that have been manufactured to modulate their stimulatory potency, either by increasing their binding capacity to the MHC molecules of the main histocompatibility complex, or by modifying contact residues. with TCR T cell receptors, or by modifying both characteristics.
  • the human MHC Class II comprises 3 pairs of genes (each pair with its chain ⁇ and ⁇ ), called HLA-DR, HLA-DP and HLA-DQ, which give rise to 4 basic types of HLA Class II molecules.
  • peptides whose sequence conformed to the formula were synthesized: I) ai-a 2 -YRa 5 -Ma 7 -Ra 9 -RAAA; where Y is Tyr; R is Arg; M is Met; A is Ala; a x is Phe or Tyr; a2 is Lys or Arg; Thus, 7 and 9 are any of the 20 natural amino acids.
  • V SEQ. ID. NO: 21, in which the amino acids were varied in 3 of the initially fixed positions, keeping methionine in position 6.
  • the present invention relates to a chimeric peptide capable of binding at least one allelic form of the HLA-DR molecule, characterized in that its amino acid sequence conforms to a formula selected from: a) ai-a 2 -Ya 4 -a5-a 6 -a 7 -a 8 -a 9- aio-AAA; and b) SEQ. ID. NO: 21; ,
  • a second aspect of the present invention relates to a chimeric peptide capable of binding at least one allelic form of the HLA-DR molecule whose amino acid sequence conforms to one of the formulas I), II), III ), and IV) defined above.
  • chimeric peptide of the invention or as "peptide of the invention”.
  • said allelic form HLA-DR corresponds to the serotype HLA-DR1, HLA-DR2, HLA-DR3, HLA-DR4, HLA-DR7, HLA-DR8 or HLA-DRIl.
  • the chimeric peptide of the invention binds strongly to at least 2 allelic forms of HLA-DR of different serotypes, and preferably to 3, 4, 5, 6 or even 7 of these allelic forms.
  • the chimeric peptide of the invention may also bind to other isotypes of HLA Class II molecules, for example HLA-DP or HLA-DQ. In a particular embodiment they also bind to some allelic forms of HLA-DQ.
  • the chimeric peptide of the invention behaves as an epitope or Th antigenic determinant (DTh).
  • epitope Th or DTh are used interchangeably and mean that said peptide, attached to the HLA molecule, is recognized by Th lymphocytes, and is capable of inducing the activation of said Th helper cells or T cells (Th response). This activation is evidenced by its ability to induce the proliferation of Th lymphocytes and to induce the production of specific lymphokines of these Th lymphocytes, such as IL-4, IFN- ⁇ or TNF- ⁇ .
  • the induced Th response may be a ThI, Th2, or a mixed ThO response. This ability to act as DTh is possible in the context of at least one of the forms of HLA-DR, HLA-DP or HLA-DQ indicated.
  • the chimeric peptide of the invention is also capable of inducing a humoral or cytotoxic effector immune response.
  • said response is a Tc response.
  • the chimeric peptide of the invention is a SEQ sequence peptide. ID. NO: 1, SEQ. ID. NO: 4, SEQ. ID. NO: 5, SEQ. ID. NO: 6, SEQ. ID. NO: 7, SEQ. ID. NO: 10, SEQ. ID. NO: 11, SEQ. ID. NO: 12, SEQ. ID. NO: 13,, SEQ. ID. NO: 14, SEQ. ID. NO: 15, SEQ. ID. NO: 16, SEQ. ID. NO: 17, SEQ. ID. NO: 20 or SEQ. ID.
  • the chimeric peptides of the invention may be obtained by conventional methods for example, by chemical synthesis techniques solid phase; purified by high performance liquid chromatography (HPLC); and, if desired, can be analyzed by conventional techniques, for example, by sequencing and mass spectrometry, amino acid analysis, nuclear magnetic resonance, etc.
  • the peptides of the invention can also be obtained by recombinant DNA technology.
  • the chimeric peptides of the invention could be used for administration to a subject (a man, a woman or any other mammalian animal) for immunoprophylactic or immunotherapeutic purposes. Therefore, in another aspect the invention also relates to a pharmaceutical composition containing a chimeric peptide of the invention (or a plurality thereof) and a pharmaceutically acceptable excipient.
  • a chimeric peptide of the invention (or a plurality thereof) can be administered in an immunostimulatory combination together with another or other immunogens other than the chimeric peptides of the invention.
  • This combination may be presented in the form of a single pharmaceutical composition or separate pharmaceutical compositions for combined administration, by simultaneous or sequential administration, by the same route of administration or by different routes.
  • the present invention also relates to a pharmaceutical composition characterized in that it comprises a chimeric peptide of the invention and another immunogen.
  • immunogen refers to a molecule that is capable of inducing a specific immune response against said immunogen (humoral: antibody production; or cellular: Th lymphocyte activation, Tc lymphocyte activation, etc.).
  • the immunogen could be almost any molecule: for example, polypeptides, lipopeptides, oligosaccharides, polysaccharides, nucleic acids, lipids, or other chemical compounds such as drugs.
  • said immunogen can come, for example, from a pathogen (virus, bacteria, fungus, parasite, etc.), from a tumor cell, from synthesis (drugs or other synthetic compounds) or from any other origin (for example allergens ).
  • said immunogen is a protein antigenic determinant, for example a Th antigenic determinant or a Tc antigenic determinant.
  • the pharmaceutical composition of the invention contains a cytotoxic T determinant (DTc) and a chimeric peptide of the invention (or a plurality of them) that acts as a collaborative T determinant (DTh).
  • DTc cytotoxic T determinant
  • DTh collaborative T determinant
  • the pharmaceutical composition contains a chimeric peptide of the invention and another or other immunogens
  • these can be presented as separate molecules or forming conjugates, for example by covalent bonds.
  • the conjugation can be carried out by various conventional methods described for example in: "The current protocols in protein chemistry”, published by John Wiley & Sons (periodically updated; Last updated May 1, 2005); “Immobilized affinity ligand Techniques", GT Hermanson, AK Mallia and PK Smith, Academic Press, Inc. San Diego, CA, 1992; EP0876398; among others.
  • composition comprising a chimeric peptide of the invention may additionally contain vehiculizers, excipients, and other known pharmaceutically acceptable ingredients.
  • the invention relates to the use of a chimeric peptide of the invention (or a plurality of them) in the preparation of an immunostimulatory pharmaceutical composition.
  • This pharmaceutical composition can be used to induce a specific immune response against an immunogen administered in combination with a chimeric peptide, within the same composition or in separate compositions as described above.
  • the chimeric peptide of the invention is used to induce a Th (Th lymphocyte activation) response in a subject to which the pharmaceutical composition is administered.
  • Said response may be a ThI, Th2 or a mixed ThO response.
  • this Th response cooperates in the activation of B lymphocytes, so that the pharmaceutical composition with the chimeric peptide is useful for inducing a humoral immune response.
  • the Th response collaborates in the activation of Tc lymphocytes, so that the pharmaceutical composition is useful for inducing a cytotoxic Tc cellular T response.
  • the immunostimulatory pharmaceutical composition with the chimeric peptide of the invention could have other uses, such as for example In vitro treatment or pre-conditioning of dendritic cells for therapeutic purposes.
  • the immunostimulatory pharmaceutical composition containing a chimeric peptide of the invention is useful for the treatment and prophylaxis of an infectious disease (bacterial, viral, fungal, or parasitic), tumor or allergic.
  • the immunostimulatory pharmaceutical composition of the invention can be applied to any animal or human subject: eg mammals (human or not), birds and the like.
  • any suitable route of administration can be used in accordance with the conventional methods known in the common art.
  • a review of the different pharmaceutical forms of drug administration and of the excipients necessary to obtain them can be found, for example, in "Pharmaceutical Technology”, by JL ViIa Jato, 1997 VoIs I y II, Ed. S ⁇ ntesis, Madrid ; or in "Handbook of pharmaceutical manufacturing formulations", by S. K. Niazi, 2004 VoIs I to VI, CRC Press, Boca Ratón.
  • the pharmaceutical composition is administered parenterally (for example, intravenously, subcutaneously, intramuscularly, intraperitoneally), transdermally, mucosa or the like.
  • the invention also provides a therapeutic and / or prophylactic method that includes administering to a subject a pharmaceutical composition that includes a chimeric peptide of the invention (or a plurality thereof).
  • This method allows to activate Th lymphocytes in said subject by inducing a Th response that collaborates well in stimulating a humoral response for production of antibodies, or in the stimulation of a cytotoxic response by the activation of specific Tc lymphocytes against an immunogen.
  • Said method may be a method for therapeutic or prophylactic treatment of an infectious disease (bacterial, viral, fungal, or parasitic), tumor or allergic.
  • Figure 1 Ability to bind chimeric peptides to different HLA-DR molecules. It is expressed as a percentage of relative binding (% U R ), in terms relative to the binding of the non-biotinylated HA (306-320) control peptide: APKYVKQNTLKLATG. The density of the grids represents an increasing order of percentage, according to the key at the bottom of the figure.
  • FIG. 1 Biotinylated p45 peptide binding to the HLA-DR4 cell line. HLA-DR4 cells were incubated with different concentrations of biotinylated peptide and their fluorescence (expressed as arbitrary fluorescence units) was measured, which is directly proportional to the concentration of the biotinylated p45 peptide that has been bound.
  • Figure 3 Percentage of inhibition of the binding of biotinylated p45 peptide to cells expressing HLA-DR4, in the presence of specific anti-HLA antibodies: aDR, anti-HLA-DR; aDP, anti-HLA-DP; aDQ, anti-HLA-DQ; and anti-HLA Class I.
  • FIG. 4 Induction of T helper responses in HLA-DR4 transgenic mice immunized with different peptides (50 nanomoles): p37, p45, p ⁇ l, p62 and FATHER. Responses to each peptide were evaluated at 15 days: lymphocyte proliferation, IFN- ⁇ production, and IL-4 production.
  • biotinylated peptides were also used: the HA (306-320) (APKYVKQNTLKLATG) peptide from the influenza virus hemagglutinin and p45. These peptides were synthesized manually and conjugated with biotin (EZ-Link Sulfo-NHS-LC-Biotin; Pierce Biotechnology, Inc, Rockford, USA). For this, once the peptide synthesis, this remained bound to the resin and 10 washes ⁇ were performed with a DMF-water mixture (7.5: 2.5) to prepare the resin to this new solvent. Biotin dissolved in this solvent was added, in proportion (1: 1) with the milliequivalents of the initial resin.
  • the PADRE peptide was synthesized for comparative purposes. This is a peptide similar to another previously developed (Alexander J et al. Immunity, 1994, 1: 751-761) in order to induce T helper responses in a wide variety of HLA-DR molecules. This PADRE peptide differs from the peptide described above in that it was synthesized with the amino acid phenylalanine instead of the original cyclohexylalanine.
  • Example 2 Peptide binding assays to different HLA molecules. HLA-DR molecule binding
  • B lymphocyte lines transformed by the Epstein-Barr virus (EBV-BLCL) were used, each of them homozygous for different HLA-DR molecules:
  • B lymphocytes with different HLA-DR molecules were matched overnight with biotinylated HA (306-320) and non-biotinylated HA (306-320) (1006M) on the one hand, or with biotinylated HA (306-320) (10 ⁇ M) and the peptide to be tested (100 ⁇ M) on the other.
  • Incubation was performed in complete MC medium (RPMI 1640 with 10% fetal calf serum, 2mM glutamine, 100 U / ml penicillin, 100 ⁇ g / ml streptomycin, 5xlO "5 M 2-mercaptoethanol, and 0 , 5% (v / v) sodium pyruvate)
  • the next day 2 washes were performed with 200 ⁇ l of Fac's medium (2.5% PBS of fetal calf serum); they were resuspended at 5 ⁇ g / ml of conjugate of Streptavidin-fluorescein (Pierce) in 100 ul of FACS medium and incubated at 4 0 C for 30 minutes.
  • F PéP tido is the fluorescence measured for the peptide to be tested
  • F b i co is the fluorescence measured without added peptide (white)
  • F ctr i.biot is the fluorescence measured for the biotinylated control peptide [HA (306-320)].
  • HA (306-320) was used as a reference control, instead of the CPKYVKQNTLKLATG peptide described previously (Rothbard JB; Degenerate binding of immmunogenic peptides. Int Immunol 1990; 2: 443-451), in order to prevent the formation of potential bridges disulfide via cysteine - NH 2 terminal.
  • the percentage of relative binding (% U R ) was also calculated according to the following formula:
  • Binding of p45 to HLA-DR, HLA-DP- and HLA-DQ p45 molecules proved to be quite insoluble.
  • HLA-DR binding assays were performed on the different cell lines, incubated with biotinylated p45 at different concentrations. To avoid the possible crystallization of the peptide, it was solubilized with the help of a sonicator. Fluorescence of the cell surface was measured by flow cytometry in a FACScan analyzer as seen in example 2, although no competition with the non-biotinylated p45 peptide was performed.
  • Figure 2 shows the fluorescence measured in the binding assays in the line expressing HLA-DR4. As can be seen, peptide binding is dose-dependent in the range of concentrations tested.
  • the HLA-DR4 cell line was incubated in the presence of the biotinylated p45 peptide and antibodies selected for their specificity against HLA-DR, HLA-DP, HLA-DQ and HLA Class I respectively ( Figure 3).
  • the HLA-DR4 cell line (already defined above) was seeded in a 96-well plate with a U-bottom;
  • F b i co is the measured fluorescence when cells were cultured without adding peptide or antibodies (white)
  • F p45 is the measured fluorescence when incubated with the biotinylated p45 peptide alone
  • F P 45 + aH L ⁇ is the measured fluorescence when incubated with biotinylated p45 together with the corresponding anti-HLA antibodies.
  • biotinylated p45 peptide bound to HLA-DR1 although p45 without biotinylation does not detectably bind to this HLA molecule (see Fig. 1).
  • This phenomenon of greater biotinylated peptide binding is also observed in biotinylated HA (306-320) peptide relative to non-biotinylated HA (30 ⁇ -320). This could indicate that biotin stabilizes the binding to the HLA molecule additionally or that the sensitivity of the detection of binding is increased with respect to measurement by competition with the non-biotinylated peptide.
  • the rest of the peptides under study were not biotinylated, so there is a possibility that they could also bind HLA-DQ.
  • transgenic mice were immunized for the HLA-DR4 molecule with some of the peptides that had demonstrated ability to bind with various HLA-DR molecules.
  • p37, p45, p ⁇ 1 and p62 were chosen, also using the PADRE peptide as a control. All these peptides showed binding capacity to several HLA-DR molecules, while showing different degrees of binding to HLA-DR4.
  • the inducing capacity Th was assessed by measuring the ability that the peptides had to induce cell proliferation and induce the production of IFN- ⁇ and IL4 in lymphocytes extracted from immunized mice.
  • HLA-DR4 female transgenic mice obtained from Taconic (Germantown, NY, USA) were used, which were maintained in pathogen-free conditions and treated according to the standards of our institution.
  • groups of 3 mice 4-6 weeks of age were subcutaneously immunized with 200 ⁇ l of a 1: 1 emulsion of Freund's complete adjuvant and saline containing 50 nanomoles of the corresponding peptide.
  • Immunized animals were sacrificed two weeks after immunization and popliteal, inguinal and periaortic lymph nodes were removed. The nodules were homogenized with a syringe and washed three times with washing medium (RPMI 1640 medium) at 4 0 C.
  • washing medium RPMI 1640 medium
  • 5xlO 7 cells / ml were pulsed in MC for 2 hours at 37 0 C with 10 ⁇ M of the corresponding peptide. Subsequently, they were centrifuged and resuspended, and 2xlO 6 cells / ml were grown in a volume of 2 ml, in a 24-well plate, in an oven, at 37 ° C with 5% CO2. Seven days later, the cells were washed and 5xlO 5 T cells per well were cultured with 2xlO 5 syngeneic spleen cells per well, treated with mitomycin-C, in the absence or presence of the corresponding antigen. 50 ⁇ l of the supernatant was collected to measure IFN- ⁇ and IL-4 as in the previous section. Cell proliferation was measured.
  • IFN- ⁇ and IL-4 were measured by commercial ELISA (OPTEIA Mouse IFN- ⁇ Set, Pharmingen, San Diego, United States and OPTEIA Mouse IL-4 Set, Pharmingen, San Diego, United States) according to the manufacturer's instructions The results were expressed as pg / ml using a standard curve of known amounts of cytokines.
  • mice transgenic for HLA-DR4 were immunized with p37, p45, p ⁇ l, p62 or with the PADRE control peptide, together with the SIINFEKL peptide [OVA (257-264)].
  • SIINFEKL is a cytotoxic T determinant (DTc) that binds to the class I molecule H-2 K b .
  • mice For the induction of cytotoxic responses, groups of two mice from 4 to 6 weeks of age were subcutaneously immunized with 200 ⁇ l of a 1: 1 emulsion of incomplete Freund's adjuvant and saline, containing 50 nanomoles of the SIINFEKL peptide, plus the peptide to be tested as DTh in varying amounts. Between 10 and 12 days after immunization, the animals were sacrificed to remove the popliteal, inguinal and periaortic lymph nodes. These were homogenized with a syringe to obtain a cell suspension and washed three times with RPMI 1640.
  • the cells obtained were incubated with the cytotoxic determinant SIINFEKL (10 ⁇ M) for 2 hours at 37 ° C, washed twice and cultured in plates.
  • Brunner KT "Quantitative assay of the lytic action of immune lymphoid cells on 51 -Cr-labeled allogeneic target cells in vitro; inhibition by isoantibody and by drugs "; Immunology, 1968; 14: 181).
  • Cytotoxic activity was assessed by measuring the release of 51 Cr from the previously labeled target cells.
  • the target cells used were thymoma cells (H-2 b ) EL-4 (ATCC Reference: TIB-39).
  • 50 ⁇ Ci of 51 Cr0 4 Na2 were added for every 10 6 target cells in a final volume of 100 ⁇ l and incubated in the absence or presence of SIINFEKL peptide (at a concentration of 10 ⁇ M) for 2 hours at 37 ° C . After three washes in RPMI 1640, they were resuspended in 1 ml of MC. The assay was performed on 96-well plates with a U-bottom. Effector cells and target cells were added separately to each well.
  • % Li sis speci fies 100 X ((cpm exper i m ⁇ ental taneously CPM) / ⁇ Cpm m aximum ⁇ CpiTlespontánea /)
  • the percentage of lysis indicated corresponds to the net lysis: value of the lysis against the cells of immunized animals to which the lysis observed is subtracted from the cells of unimmunized animals.
  • the extracted cells were purified by the ficoll method (Noble PB, Cutts JH, Carroll, KK; Ficoll flotation for the separation of blood leukocyte types; Blood, 1968; 31: 66-73). Once purified, the cells (3xlO 6 cells / ml) were pulsed for two hours with 10 ⁇ M of the peptide under study. Pulsed cells were washed and plated (10 5 cells / well) in 96-well flat bottom plates. On days 3 and 7, IL-2 was added. Fifteen days later, the cells of each well were subdivided into two, to confront them respectively with cells (10 5 cells / well) treated with mitomycin C, with or without each of the peptides p37, p45, p62 or FATHER.
  • DNA extraction was performed from peripheral blood mononuclear cells of each donor.
  • the QIAmp DNA Mini Kit Kit was used (Qiagen, Valencia, USA) and the protocol indicated by the manufacturer was followed.
  • the Inno-Lipa HLA-DRBl Plus Kit (Innogenetics, Ghent, Belgium) was used, following the protocol indicated by the manufacturer.
  • Table 3 shows the number of positive wells for each peptide and donor. Only those wells that showed a stimulation index equal to or greater than 3 were considered positive.
  • the stimulation index (IE) was expressed as the ratio between counts per minute between the well with peptide and the well without peptide.

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Abstract

La presente invención se refiere a un péptido quimérico con capacidad de unirse al menos a una forma alélica de la molécula HLA-DR. Asimismo, la invención se refiere a una composición farmacéutica que comprende dicho péptido, asi como a distintos usos del mismo.

Description

NUEVOS PEPTIDOS DETERMINANTES ANTIGENICOS T COLABORADORES
(DTh)
CAMPO DE IA TÉCNICA La presente invención se encuentra dentro del campo de la determinación de péptidos antigénicos, capaces de estimular las respuestas T colaboradoras (LTh) .
ESTADO DE LA TÉCNICA ANTERIOR A LA INVENCIÓN Los linfocitos T colaboradores (LTh) realizan diversas funciones importantes en la inmunidad frente a patógenos. En primer lugar, la inducción de una respuesta inmune efectora eficaz, bien sea una respuesta humoral o una respuesta celular citotóxica, requiere de la activación de LTh, y más concretamente de subpoblaciones especificas de LTh (ThI, Th2, ThO) . En segundo lugar, los LTh pueden actuar también directamente como células efectoras, una actividad mediada por contacto celular directo o por la liberación de linfoquinas (IFN-γ, TNF-α, etc.). Por tanto, la estimulación de respuestas T colaboradoras (Th) constituye un aspecto muy relevante para el desarrollo de vacunas.
Es bien conocido como para lograr su efecto estimulador, los LTh reconocen, a través de receptores específicos (TCR) situados en su superficie, a complejos formados entre moléculas MHC de Clase II y péptidos antigénicos . Estos péptidos que se unen a las moléculas MHC Clase II, conocidos también como epitopos Th o determinantes antigénicos Th (DTh) , tienen habitualmente tamaños entre 11 y 22 aminoácidos, y más frecuentemente entre 13 y 16 aminoácidos. En los últimos años, las vacunas basadas en epítopos han despertado un interés considerable como posible herramienta en f ej. desarrollo de nuevas vacunas y estrategias inmunoterapéuticas . Una cuidada selección de epitopos para células B y T deberla permitir dirigir las respuestas inmunes hacia epitopos conservados de ciertos patógenos caracterizados por una gran variabilidad de secuencia (por ejemplo malaria, virus de la hepatitis C, VIH, etc. ) . Por otra parte, las vacunas basadas en epitopos ofrecen la oportunidad de incluir DTh quiméricos que han sido fabricados para modular su potencia estimuladora, bien sea aumentando su capacidad de unión a las moléculas MHC del complejo principal de histocompatibilidad, o bien modificando los residuos de contacto con los receptores TCR de células T, o bien modificando ambas características. Debido a la naturaleza quimérica de estos péptidos, existen muy pocas posibilidades de que su secuencia esté contenida en antigenos propios, por lo que si tras su utilización se indujeran anticuerpos frente a los péptidos habria poca probabilidad de inducir respuestas indeseadas contra antigenos propios.
La predicción y selección de los epitopos apropiados tropieza sin embargo con un obstáculo importante: el gran número de polimorfismos existente entre las moléculas MHC, que afectan muy particularmente a las regiones de unión al epitopo y de reconocimiento de los LTh. Este polimorfismo se produce como resultado del carácter poligénico del complejo principal de histocompatibilidad MHC y del gran número de variantes alélicas existentes para cada uno de estos loci genéticos. Asi por ejemplo, el MHC Clase II humano comprende 3 pares de genes (cada par con su cadena α y β) , denominados HLA-DR, HLA-DP y HLA-DQ, que dan lugar a 4 tipos básicos de moléculas HLA Clase II. Una revisión general puede encontrarse en el manual: Immunobiology - The immune system in health and disease; Janeway CA Jr and Travers P Eds . ; Current Biology Ltd / Garland Publishing Inc., London, 1997 3rd Ed. Este polimorfismo da lugar por tanto a la expresión de muchas moléculas MHC distintas, cada una de ellas con rangos diferentes de especificidad para la unión de epitopos (restricción MHC) .
Aunque los residuos polimórficos específicos de alelo que bordean el surco de unión al epitopo otorgan a la molécula MHC la capacidad de unirse a un cierto conjunto de péptidos, hay bastantes casos en los que un mismo péptido es capaz de unirse a más de una forma alélica de la molécula MHC. Esto se ha constatado de modo particular para las moléculas HLA-DR, donde varias formas alélicas HLA-DR pueden reconocer motivos similares de péptidos, al mismo tiempo que se ha comprobado que ciertos péptidos son reconocidos por diferentes moléculas HLA-DR. Esto ha llevado al concepto de que ciertos péptidos podrían representar epitopos promiscuos o universales.
Asi, la utilización de diferentes algoritmos ha permitido definir diversos motivos útiles para la selección de epitopos, habiéndose identificado algunos epitopos universales reconocidos por un buen número de isoformas de las moléculas HLA, y más particularmente de las HLA-DR (WO95/07707; Alexander J et al. Immunity, 1994, 1:751-761; WO98/32456) .
Este último tipo de péptidos más promiscuos, podrían ser de gran utilidad para inducir respuestas humorales y celulares en una gran diversidad de individuos sanos, lo que evitarla tener que elegir péptidos especiales según fuera el HLA-DR de dichos individuos . Aunque se disponga ya de un conjunto de estos péptidos promiscuos, como los péptidos PADRE (Alexander J et al. Immunity, 1994, 1:751-761), sigue siendo interesante identificar nuevos péptidos quiméricos promiscuos. Esto es debido a que a pesar de que todos estos péptidos comparten el ser reconocidos por varios HLA-DR, unos péptidos podrían resultar mejores que otros para el reconocimiento por un HLA-DR en concreto. Por consiguiente, seria de gran utilidad disponer de una batería más amplia de péptidos promiscuos para asi cubrir mejor la inducción de respuestas frente a la totalidad de los HLA-DR. Además, es también deseable identificar péptidos que se unan y puedan ser reconocidos en el contexto del resto de isotipos HLA-DP y HLA-DQ. Esto permitirla generar vacunas y productos inmunoterapéuticos para un espectro más amplio de personas.
EXPLICACIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN
Con el propósito de identificar nuevos péptidos quiméricos que tuvieran el potencial de unirse fuertemente a diferentes moléculas HLA-DR, y en consecuencia, ser capaces de proporcionar ayuda para la inducción de anticuerpos y también de respuestas T citotóxicas, se sintetizaron un conjunto de péptidos de 13 aminoácidos. Para ello, se establecieron unas fórmulas o patrones de secuencia ideados tomando como referencia de partida un motivo de 8 aminoácidos descrito por los propios inventores (Borras-Cuesta F. et al.; Specific and general HLA-DR binding raotifs: comparison algorithms; Human Immunol . , 2000; 61:265-278).
Primeramente se sintetizaron péptidos cuya secuencia se ajustaba a la fórmula: I ) ai-a2-Y-R-a5-M-a7-R-a9-R-A-A-A; donde Y es Tyr; R es Arg; M es Met; A es Ala; ax es Phe o Tyr; a2 es Lys o Arg; as, a7 y a9 son cualquiera de los 20 aminoácidos naturales.
En todos los casos se utilizó una tirosina como ancla primaria en el tercer residuo (primer residuo del motivo anteriormente referenciado) . Además, para alcanzar la longitud típica de 13 aminoácidos en la mayoría de los DTh (Chicz R.M. et al.; Predominant naturally processed peptides bound to HLA-DRl are derived from MHC-related molecules and are heterogeneous in size; Nature, 1992; 358: 764-768), al núcleo de 8 aminoácidos se le agregaron tres alaninas en su extremo C-terminal y otros dos aminoácidos en su extremo N-terminal: un aminoácido aromático (fenilalanina o tirosina) en el primer residuo y un aminoácido con carga positiva (usina o arginina) en el segundo residuo. La utilización de fenilananina o tirosina en el primer residuo proporciona un punto de anclaje adicional.
Además, en dicha fórmula se fijaron los aminoácidos que ocuparían las posiciones 4, 6, 8 y 10 de los péptidos .
A partir de esta primera fórmula se establecieron otras fórmulas para la síntesis y evaluación de péptidos, en las que se dejó abierta la posibilidad de variar dos de los cuatro aminoácidos fijados en las posiciones 4, β, 8 y 10 anteriormente indicadas. Las fórmulas ensayadas fueron las siguientes: I I ) ai-a2-Y-R-a5-M-a7-a8-ag-aio-A-A-A;
I I I ) ai-a2-Y-a4-a5-M-a7-a8-ag-R-A-A-A;
IV ) ai-a2-Y-R-a5-a6-a7-a8-a9-R-A-A-A;
donde Y es Tyr; R es Arg; M es Met; A es Ala; ai es Phe o Tyr; a2 es Lys o Arg; a4 es cualquiera de los 20 aminoácidos naturales distinto de Arg; as, a7 y a9 son cualquiera de los 20 aminoácidos naturales; aβ es cualquiera de los 20 aminoácidos naturales distinto de Met; as es cualquiera de los 20 aminoácidos naturales distinto de Arg; y aχo es cualquiera de los 20 aminoácidos naturales distinto de Arg.
Igualmente se sintetizó un péptido de secuencia:
V ) SEQ. ID. NO: 21, en el que se variaron los aminoácidos en 3 de las posiciones fijadas inicialmente, manteniendo la metionina en la posición 6.
Con fines comparativos se sintetizaron también algunos péptidos cortos de 8 y 9 aminoácidos que también tenían como ancla primaria tirosina y en la mayoría de las posiciones restantes del núcleo, aminoácidos que favorecen la unión a HLA-DR.
Una vez sintetizados se evaluó su capacidad para unirse fuertemente a distintas formas alélicas de la molécula HLA-DR, resultando que la mayoría de ellos era capaz de unirse fuertemente al menos a una de las formas alélicas .
De lo anterior se obtuvo una secuencia general. Asi, en una primera realización, la presente invención se refiere a un péptido quimérico con capacidad para unirse al menos a una forma alélica de la molécula HLA-DR, caracterizado porque su secuencia de aminoácidos se ajusta a una fórmula seleccionada entre: a) ai-a2-Y-a4-a5-a6-a7-a8-a9-aio-A-A-A; y b) SEQ. ID. NO: 21; ,
donde Y es Tyr; A es Ala; ai es Phe o Tyr; a2 es Lys o Arg; a4 es Arg, excepto cuando a§ y aio son Met y Arg, respectivamente, donde a4 puede ser cualquiera de los aminoácidos naturales; as, a7 y ag son cualquiera de los 20 aminoácidos naturales; a6 es Met excepto cuando a^ y aio son Arg, caso en el que aε es cualquiera de los aminoácidos naturales; as es Arg, excepto cuando a4 es Arg, Tyr o His, ae es Met o Val y aio es Met, His o Arg, caso en el que a& es cualquiera de los aminoácidos naturales; y aio es Arg, excepto cuando a4 es Arg o His y aζ es Met, caso en el que aio es cualquiera de los aminoácidos naturales .
Por tanto, un segundo aspecto de la presente invención se refiere a un péptido quimérico con capacidad para unirse al menos a una forma alélica de la molécula HLA-DR cuya secuencia de aminoácidos se ajusta a una de las fórmulas I) , II) , III) , y IV) definidas anteriormente. En adelante nos referiremos a él como "péptido quimérico de la invención" o como "péptido de la invención". En una realización particular dicha forma alélica HLA-DR corresponde al serotipo HLA-DRl, HLA-DR2, HLA-DR3, HLA-DR4, HLA-DR7, HLA-DR8 o HLA-DRIl.
En una realización particular, el péptido quimérico de la invención se une fuertemente al menos a 2 formas alélicas de HLA-DR de distinto serotipo, y preferentemente a 3, 4, 5, 6 o incluso 7 de estas formas alélicas. En algunos casos, el péptido quimérico de la invención puede unirse también a otros isotipos de moléculas HLA Clase II, por ejemplo HLA-DP o HLA-DQ. En una realización particular se unen también a algunas formas alélicas de HLA-DQ.
En una realización preferente, el péptido quimérico de la invención se comporta como un epitopo o determinante antigénico Th (DTh) . Los términos epitopo Th o DTh se utilizan indistintamente y significan que dicho péptido, unido a la molécula HLA, es reconocido por linfocitos Th, y es capaz de inducir la activación de dichos linfocitos o células T colaboradoras Th (respuesta Th) . Esta activación se evidencia por su capacidad para inducir la proliferación de linfocitos Th y para inducir la producción de linfoquinas especificas de estos linfocitos Th, como la IL-4, el IFN-γ o el TNF-α. La respuesta Th inducida puede ser una respuesta ThI, Th2, o una respuesta mixta ThO. Esta capacidad de actuar como DTh es posible en el contexto de al menos una de las formas de HLA-DR, HLA-DP o HLA-DQ indicadas.
De modo preferente, el péptido quimérico de la invención es capaz también de inducir una respuesta inmunitaria efectora humoral o T citotóxica. En una realización dicha respuesta es una respuesta Tc. En una realización particular, el péptido quimérico de la invención es un péptido de secuencia SEQ. ID. NO: 1, SEQ. ID. NO: 4, SEQ. ID. NO: 5, SEQ. ID. NO: 6, SEQ. ID. NO: 7, SEQ. ID. NO: 10, SEQ. ID. NO: 11, SEQ. ID. NO: 12, SEQ. ID. NO: 13, , SEQ. ID. NO: 14, SEQ. ID. NO: 15, SEQ. ID. NO: 16, SEQ. ID. NO: 17, SEQ. ID. NO: 20 o SEQ. ID. NO: 22. Los péptidos quiméricos de la invención pueden obtenerse por métodos, convencionales, por ejemplo, mediante técnicas de síntesis química en fase sólida; purificarse mediante cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) ; y, si se desea, se pueden analizar mediante técnicas convencionales, por ejemplo, mediante secuenciación y espectrometría de masas, análisis de aminoácidos, resonancia magnética nuclear, etc. Alternativamente, los péptidos de la invención pueden también obtenerse mediante la tecnología del ADN recombinante .
Los péptidos quiméricos de la invención podrían utilizarse para administración a un sujeto (un hombre, una mujer o cualquier otro animal mamífero) con fines inmunoprofilácticos o inmunoterapéuticos . Por tanto, en otro aspecto la invención se refiere también a una composición farmacéutica que contiene un péptido quimérico de la invención (o una pluralidad de ellos) y un excipiente farmacéuticamente aceptable. En una realización particular, un péptido quimérico de la invención (o una pluralidad de ellos) puede ser administrado en una combinación inmunoestimuladora junto con otro u otros inmunógenos distintos de los péptidos quiméricos de la invención. Esta combinación puede presentarse en forma de una única composición farmacéutica o de composiciones farmacéuticas separadas para administración combinada, mediante una administración simultánea o secuencial, por la misma vía de administración o por vías distintas. Así, la presente invención se refiere también a una composición farmacéutica caracterizada porque comprende un péptido quimérico de la invención y otro inmunógeno . El término "inmunógeno" se refiere a una molécula que es capaz de inducir una respuesta inmunológica especifica frente a dicho inmunógeno (humoral: producción de anticuerpos; o celular: activación de linfocitos Th, activación de linfocitos Tc, etc.) . Por su naturaleza quimica el inmunógeno podría ser casi cualquier molécula: por ejemplo, polipéptidos, lipopéptidos, oligosacáridos, polisacáridos, ácidos nucleicos, lipidos, u otros compuestos químicos como fármacos. Por su origen, dicho inmunógeno puede proceder por ejemplo de un patógeno (virus, bacteria, hongo, parásito, etc.), de una célula tumoral, de síntesis (fármacos u otros compuestos de síntesis) o de cualquier otro origen (por ejemplo alérgenos) . En algunos casos dicho inmunógeno es un determinante antigénico proteico, por ejemplo un determinante antigénico Th o un determinante antigénico Tc.
En una realización más particular la composición farmacéutica de la invención contiene un determinante T citotóxico (DTc) y un péptido quimérico de la invención (o una pluralidad de ellos) que actúa como determinante T colaborador (DTh) .
Cuando la composición farmacéutica contiene un péptido quimérico de la invención y otro u otros inmunógenos, estos pueden presentarse como moléculas separadas o formando conjugados, por ejemplo mediante enlaces covalentes. La conjugación puede realizarse por diversos métodos convencionales que se describen por ejemplo en: "The current protocols in protein chemistry", publicado por John Wiley & Sons (actualizado periódicamente; Última actualización 1 de mayo de 2005) ; "Immobilized affinity ligand Techniques", GT Hermanson, AK Mallia and PK Smith, Academic Press, Inc. San Diego, CA, 1992; EP0876398; entre otros.
La composición farmacéutica que comprende un péptido quimérico de la invención puede contener adicionalmente vehiculizantes, excipientes, y otros ingredientes farmacéuticamente aceptables conocidos.
Todavía en otro aspecto adicional la invención se refiere al uso de un péptido quimérico de la invención (o una pluralidad de ellos) en la preparación de una composición farmacéutica inmunoestimuladora. Esta composición farmacéutica puede emplearse para inducir una respuesta inmunitaria especifica frente a un inmunógeno administrado en combinación con un péptido quimérico, dentro de la misma composición o en composiciones separadas como se ha descrito anteriormente. De esta manera, el péptido quimérico de la invención se emplea para inducir una respuesta Th (activación de linfocitos Th) en un sujeto al que se le administra la composición farmacéutica. Dicha respuesta puede ser una respuesta ThI, Th2 o una respuesta mixta ThO.
En una realización concreta, esta respuesta Th coopera en la activación de linfocitos B, de manera que la composición farmacéutica con el péptido quimérico es útil para inducir una respuesta inmunitaria humoral. En otra realización, la respuesta Th colabora en la activación de linfocitos Tc, de manera que la composición farmacéutica es útil para inducir una respuesta celular T citotóxica Tc.
Adicionalmente, la composición farmacéutica inmunoestimuladora con el péptido quimérico de la invención podria tener otros usos, como por ejemplo el tratamiento o pre-condicionamiento in vitro de células dendríticas con fines terapéuticos .
En consecuencia, la composición farmacéutica inmunoestimuladora que contiene un péptido quimérico de la invención es útil para el tratamiento y profilaxis de una enfermedad infecciosa (bacteriana, viral, fúngica, o parasitaria), tumoral o alérgica.
La composición farmacéutica inmunoestimuladora de la invención puede aplicarse a cualquier sujeto animal o humano: p.ej. mamíferos (humanos o no), aves y similares.
Para ello puede emplearse cualquier vía de administración adecuada de acuerdo con los métodos convencionales conocidos de la técnica común. Una revisión de las distintas formas farmacéuticas de administración de medicamentos y de los excipientes necesarios para la obtención de las mismas puede encontrarse, por ejemplo, en "Tecnología farmacéutica", de J. L. ViIa Jato, 1997 VoIs I y II, Ed. Síntesis, Madrid; o en "Handbook of pharmaceutical manufacturing formulations", de S. K. Niazi, 2004 VoIs I a VI, CRC Press, Boca Ratón. En una realización concreta, la composición farmacéutica se administra por vía parenteral (por ejemplo, intravenosa, subcutánea, intramuscular, intraperitoneal) , transdérmica, mucosa o similares.
La invención proporciona también un método terapéutico y/o profiláctico que incluye administrar a un sujeto una composición farmacéutica que incluye un péptido quimérico de la invención (o una pluralidad de ellos) . Este método permite activar los linfocitos Th en dicho sujeto induciendo una respuesta Th que colabora bien en la estimulación de una respuesta humoral para la producción de anticuerpos, o bien en la estimulación de una respuesta citotóxica por la activación de linfocitos Tc especificos frente a un inmunógeno. Dicho método puede ser un método para tratamiento terapéutico o profiláctico de una enfermedad infecciosa (bacteriana, viral, fúngica, o parasitaria) , tumoral o alérgica.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS
Figura 1. Capacidad de unión de péptidos quiméricos a diferentes moléculas HLA-DR. Se expresa como porcentaje de unión relativa (%UR) , en términos relativos a la unión del péptido control HA (306-320) no biotinilado: APKYVKQNTLKLATG. La densidad de las cuadriculas representa un orden creciente de porcentaje, de acuerdo con la clave al pie de la figura.
Figura 2. Unión del péptido p45 biotinilado a la linea celular HLA-DR4. Se incubaron células HLA-DR4 con diferentes concentraciones de péptido biotinilado y se midió su fluorescencia (expresada como unidades arbitrarias de fluorescencia) , que es directamente proporcional a la concentración del péptido p45 biotinilado que se haya unido.
Figura 3. Porcentaje de inhibición de la unión del péptido p45 biotinilado a células que expresan HLA-DR4, en presencia de anticuerpos anti-HLA especificos: aDR, anti-HLA-DR; aDP, anti-HLA-DP; aDQ, anti-HLA-DQ; y anti- HLA Clase I.
Figura 4. Inducción de respuestas T helper en ratones transgénicos HLA-DR4 inmunizados con diferentes péptidos (50 nanomoles) : p37, p45, pβl, p62 y PADRE. Las respuestas frente a cada péptido, se evaluaron a los 15 dias : proliferación linfocitaria, producción de IFN-γ, y producción de IL-4.
Figura 5. Inducción de respuestas T citotóxicas en ratones transgénicos HLA-DR4 inmunizados con un péptido DTc [50 nanomoles de OVA (257-264)] solo o junto con uno de los péptidos a ensayar como DTh: p37, p45, pβl, pβ2 ó PADRE. Los ensayos se repitieron con diferentes concentraciones de péptido a ensayar: A) 50 nanomoles; B) 5 nanomoles; C) 0,5 nanomoles.
MODO DE REALIZACIÓN DE LA INVENCIÓN
Ejemplo 1. Síntesis de péptidos
Los péptidos para los ensayos de unión a moléculas HLA y de inducción de respuestas T colaboradoras (Th) y T citotóxicas (Tc) se sintetizaron manualmente por el método de fase sólida de Merrifield, utilizando la tecnología Fmoc [ (Merrifield RB; Solid phase synthesis. I. J Am Chem Soc, 1963; 85:2149); (Atherton E Procedures for solid phase synthesis. J Chem Soc Perkin Trans, 1989; 1:538)] . Tanto los péptidos a ensayar como los péptidos utilizados como control se sintetizaron por este mismo método (Tabla 1) . Tabla 1. Péptidos sintetizados para los ensayos de unión a moléculas HLA y de inducción de respuestas T colaboradoras (Th) y citotóxicas (Tc) .
Nombre Secuencia SEQ. ID. NO: p45 FKYRMMMRMRAAA 1 p44 YRMMMRMRA 2 p43 YRMMMRMR 3 pβl FRYRMMMRMRAAA 4 pβ2 YRYRMMMRMRAAA 5 p53 FKYRWMMRWRAAA 6 p52 FKYRRMMRKRAAA 7 p41 YRAMRAMRA 8 p40 YRAMRAMR 9 p46 FKYRMMMAPMAAA 10 p42 FKYRAMRAMRAAA 11 p49 FKYRAMRCMRAAA 12 p50 FKYRAMRRRRAAA 13 p51 FKYRRMRRRRAAA 14 p57 FKYRWMRAMRAAA 15
P37 FKYRQMMAPHAAA 16 p48 FKYRAMRRRHAAA 17 p39 YRQMMAPHA 18 p47 YRAMRRRHA 19 p58 FKYYAMRCMRAAA 20 p56 FKYHQMMAPHAAA 21 p60 FKYRWVRALRAAA 22
PADRE AKFVAAWTLKAAA 23
HA(306-320) APKYVKQNTLKLATG 24
OVA(257-264) SIINFEKL 25
Para algunos ensayos se utilizaron también péptidos biotinilados: el péptido HA (306-320) (APKYVKQNTLKLATG) de la hemaglutinina del virus de la Influenza y p45. Estos péptidos se sintetizaron manualmente y se conjugaron con biotina (EZ-Link Sulfo-NHS-LC-Biotin; Pierce Biotechnology, Inc, Rockford, EEUU) . Para ello, una vez terminada la síntesis del péptido, este se mantuvo unido a Ia^ resina y se realizaron 10 lavados con una mezcla DMF-agua (7,5:2,5) para preparar la resina a este nuevo solvente. Se añadió biotina disuelta en este solvente, en proporción (1:1) con los miliequivalentes de la resina inicial. La mezcla se dejó reaccionar hora y media. A continuación, la resina se lavó 20 veces con DMF, y se repitió el proceso de reacción hasta 3 veces. Para comprobar que el péptido estaba biotinilado, se realizó el test de Kaiser (Kaiser, 1970; Color test for detection of free terminal amino groups in the solid- phase synthesis of peptides. Anal Biochem. 1970; 34:595- 598) . Se procedió al corte de la resina, liofilización y análisis por HPLC como en el apartado anterior. [ (Merrifield RB; Solid phase synthesis. I. J Am Chem Soc, 1963; 85:2149); (Atherton E Procedures for solid phase synthesis. J Chem Soc Perkin Trans, 1989; 1:538)].
El péptido PADRE se sintetizó con fines comparativos. Este, es un péptido similar a otro desarrollado anteriormente (Alexander J et al. Immunity, 1994, 1:751-761) con el fin de inducir respuestas T helper en una amplia variedad de moléculas HLA-DR. Este péptido PADRE se diferencia del péptido descrito anteriormente en que se sintetizó con el aminoácido fenilalanina en lugar de la ciclohexilalanina original.
Ejemplo 2. Ensayos de unión de los péptidos a diferentes moléculas HLA. Unión a moléculas HLA-DR
La medida de unión de los péptidos se llevó a cabo como describen Busch y cois. (Busch R, Rothbard J: Degenerate binding' of immunogenic peptides to HLA-DR proteins on B cell surfaces. Int Immunol, 1990; 144:1849) .
En los experimentos de la presente invención se utilizaron las siguientes lineas de linfocitos B transformados por el virus de Epstein-Barr (EBV-BLCL) , cada una de ellas homocigóticas para moléculas HLA-DR diferentes:
Tipaje Linea ECACC No. Tipaje molecular serologico
H0M-2 88052005 DRBl*0101 DRl
WT8 88052017 DRB1*15O1 DR2
RSH 88052021 DRBl*0302/DRB3* 0101 DR3
BOLETH 88052031 DRBl* 0401/DRB4*0101 DR4
MOU 88052050 DRB1*O701/DRB4* 0101 DR7
OLGA 88052100 DRBl*0802 DR8
SWEIG 88052037 DRBl*1101/DRB3*0202 DRlI Todas las lineas celulares se obtuvieron de la Colección Europea de Cultivos Celulares Animales (ECACC, PHLS, Salisbury, UK) .
Brevemente, linfocitos B con diferentes moléculas HLA-DR (a 2,5xlO5 células/pocilio) se coincubaron toda la noche con HA(306-320) biotinilado (10 μM) y HA(306-320) (100 μM) no biotinilado por un lado, ó con HA (306-320) (10 μM) biotinilado y el péptido a ensayar (100 μM) por otro. La incubación se realizó en medio completo MC (RPMI 1640 con 10% de suero de ternera fetal, 2mM de glutamina, 100 U/ml de penicilina, 100 μg/ml de estreptomicina, 5xlO"5 M de 2 β-mercaptoetanol, y 0,5% (v/v) de piruvato sódico) . Al dia siguiente se realizaron 2 lavados con 200 μl de medio de Fac' s (PBS al 2,5% de suero fetal de ternera) ; se resuspendieron a 5 μg/ml de conjugado de estreptavidina-fluoresceína (Pierce) en 100 μl de medio de Fac's y se incubaron a 4 0C durante 30 minutos. A continuación se realizaron 2 lavados y las células se resuspendieron en 200 μl de medio de Fac's. La fluorescencia de la superficie celular se midió por citometria de flujo en un analizador FACScan (Becton Dickinson Immunocytochemistry System, Mountain, USA) . Se determinó la media de fluorescencia de 5.000 células marcadas . Se obtuvo una señal de fluorescencia proporcional al número de moléculas de HLA-DR expuestas en el exterior de la célula.
Para cuantificar la capacidad de unión de cada péptido (% UniónPéPtido) se utilizó la siguiente fórmula:
% Uniónpéptido = 100 x ( ( Fpéptido - Fbico ) / ( Fctri .biot - Fbico ) )
donde FPéPtido es la fluorescencia medida para el péptido a ensayar; Fbico es la fluorescencia medida sin péptido añadido (blanco) ; y Fctri.biot es la fluorescencia medida para el péptido control [HA (306-320) ] biotinilado.
Del mismo modo se calculó el porcentaje de unión utilizando como péptido a ensayar el péptido control [HA(30β-320) ] no biotinilado (%Uniónctri) :
%Uniónctri = 100 x ( ( Fctri . nobiot . - Fbico ) / ( Fctn .biot . - Fbico ) )
Se utilizó HA (306-320) como control de referencia, en lugar del péptido CPKYVKQNTLKLATG descrito previamente (Rothbard JB; Degenerate binding of immmunogenic peptides. Int Immunol 1990; 2:443-451), al objeto de impedir la formación de potenciales puentes disulfuro via cisteina - NH2 terminal. Se calculó también el porcentaje de unión relativa (% UR) según la siguiente fórmula:
% UR = 100 x (% Uniónpéptido / % Uniónctri)
donde % UniónPéPtido es el porcentaje de unión del péptido a ensayar; y donde % Uniónctri es el porcentaje de Unión del péptido control HA (306-320) no biotiriilado.
Todos los ensayos se realizaron por triplicado. La variación de las intensidades de fluorescencia de los triplicados estuvo siempre comprendida dentro del rango 5-10%.
De esta manera se pudo obtener una valoración de la capacidad de unión de los distintos péptidos a las moléculas HLA-DRl, HLA-DR2, HLA-DR3, HLA-DR4, HLA-DR7, HLA-DR8, HLA-DRIl, expresada en términos relativos a la unión del péptido HA(306-320) no biotinilado: APKYVKQNTLKLATG (Fig. 1) . De la Figura 1 se puede concluir que: - la mayoría de los péptidos se unen con muy buena afinidad por lo menos a dos moléculas HLA-DR; en particular los péptidos p45, pβl y pβ2 se unen con buena afinidad a casi todas las moléculas HLA-DR estudiadas. Los péptidos p45, pβl y pβ2 exhibieron una capacidad de unión comparable o incluso superior al péptido PADRE ensayado .
Unión de p45 a moléculas HLA-DR, HLA-DP- y HLA-DQ p45 resultó ser bastante insoluble. Al objeto de caracterizar mejor su capacidad de unión, y para descartar un posible efecto tóxico del péptido, se decidió realizar algunos ensayos complementarios utilizando p45 biotinilado.
En primer lugar se realizaron ensayos de unión a HLA-DR en las diferentes lineas celulares, incubadas con p45 biotinilado a distintas concentraciones. Para evitar la posible cristalización del péptido, éste se solubilizó con la ayuda de un sonicador. Se midió la fluorescencia de la superficie celular por citometria de flujo en un analizador FACScan tal como se ve en el ejemplo 2, aunque no se realizó competición con el péptido p45 no biotinilado. La figura 2 muestra la fluorescencia medida en los ensayos de unión en la linea que expresa HLA-DR4. Como puede comprobarse, la unión del péptido es dosis-dependiente en el rango de concentraciones ensayado.
En segundo lugar, se incubó la linea celular HLA-DR4 en presencia del péptido p45 biotinilado y anticuerpos seleccionados por su especificidad frente a HLA-DR, HLA- DP, HLA-DQ y HLA Clase I respectivamente (figura 3) .
En una placa de 96 pocilios con fondo en U se sembró la linea celular HLA-DR4 (ya definida anteriormente) ;
(2xlO5 por pocilio) , añadiendo también péptido p45 biotinilado (10 μM) , sólo ó junto con sobrenadante de los hibridomas L243 anti-HLA-DR (ATCC Ref: HB-55) , ó W6/32 anti-Clase I (ATCC Ref: HB-95) ó los anticuerpos 33.1 anti-HLA-DQ , ó anti-HLA-DP B7/21, que fueron proporcionados por Dra . Ghislaine Sterkers . Todos fueron diluidos a (1/500) en un volumen final de 100 μl de RPMI con 2,5 % de FBS. Al dia siguiente se realizaron 2 lavados con 200 μl de medio de Fac's, se resuspendieron a 5 μg/ml de conjugado de estreptavidina-fluoresceina (Pierce) en 100 μl de medio de Fac's, y se incubaron a 40C durante 30 minutos. A continuación se realizaron 2 lavados y las células se resuspendieron en 200 μl de medio de Fac's. La fluorescencia de la superficie celular se midió por citometria de flujo en un analizador FACScan. Se determinó la media de fluorescencia de 5.000 células marcadas, de manera que se obtuvo una señal de fluorescencia proporcional al número de moléculas de HLA expuestas en el exterior de la célula. Para cuantificar la disminución de la unión al añadir los anticuerpos, se utilizó la siguiente fórmula:
% Inhibición = 100 x ( ( Fp45+3HLA - Fbico) / ( Fp45 - Fbioo) )
donde Fbico es la fluorescencia medida cuando se cultivaron las células sin añadir péptido o anticuerpos (blanco) , Fp45 es la fluorescencia medida cuando se incubó con el péptido p45 biotinilado solo, y FP45+aHLñ es la fluorescencia medida cuando se incubó con p45 biotinilado junto con los anticuerpos anti-HLA correspondientes.
Todos los ensayos se realizaron por triplicado. La variación de las intensidades de fluorescencia de los triplicados estuvo siempre comprendida dentro del rango 5-10%. Como se puede observar en la Figura 3, la incubación con anticuerpos anti-HLA-DR o anti-HLA-DQ produce inhibición fuerte de la unión, lo que indica que p45 se une tanto a HLA-DR como a HLA-DQ, pero no a HLA-DP.
Del mismo modo, estos ensayos se repitieron sobre las lineas celulares HLA-DRl, HLA-DR3, HLA-DR7, HLA-DR8, HLA-DRIl. Los porcentajes de inhibición obtenidos se recogen en la Tabla 2. Como puede observarse, al incubar las células con p45 biotinilado en presencia de anti-HLA-DR o anti-HLA-DQ se produce una fuerte inhibición en todos los casos, lo que indica que p45 biotinilado tiene una alta capacidad de unión a HLA-DR y a HLA-DQ en todas las lineas celulares.
El péptido p45 biotinilado se unió a HLA-DRl, aunque p45 sin biotinilar no se une en forma detectable a esta molécula HLA (ver Fig 1) . Este fenómeno de mayor unión del péptido biotinilado se observa también en el péptido HA(306-320) biotinilado respecto al HA(30β-320) no biotinilado. Ello podría indicar que la biotina estabiliza la unión a la molécula HLA en forma adicional o que se aumenta la sensibilidad de la detección de la unión respecto a la medición por competición con el péptido sin biotinilar. El resto de los péptidos en estudio no se biotinilaron, por lo que existe la posibilidad de que pudieran también unirse a HLA-DQ.
Tabla 2. Inhibición (%) de la unión de p45 biotinilado a las moléculas HIiA de distintas lineas celulares.
Porcentaje de inhibición (%)
Linea Serotipo Tipaje molecular celular HIxA-DR HLA-DR - HLA-DQ aDR aDP aDQ aCH
HOM2 DRl DRBl*0101 - DQBl*0501 78 23 75 13
RSH DR3 DRBl*0302 - DQBl*0402 86 28 98 6
BOLETH DR4 DRBl*0401 - DQBl*0302 59 7 75 1
MOU DR7 DRBl*0701 - DQBl*0201 71 13 98 0
OLGA DR8 DRBl*0802 - DQBl*0402 92 4 88 5
SWEIG DRIl DRB1*11O11 - DQBl*0301 89 0 83 0 Nota: El grado de unión a las diferentes moléculas se midió por competición con anticuerpos (aDR: anti-HLA-DR; aDP: anti-HLA-DP; aDQ: anti-HLA-DQ; aCH : anti-Clase I).
Ejemplo 3. Inducción de respuestas T colaboradoras (Th) .
Con el fin de comprobar si los péptidos sintetizados tenian capacidad de inducir respuestas Th in vivo, se inmunizaron ratones transgénicos para la molécula HLA-DR4 con algunos de los péptidos que hablan demostrado capacidad de unión con diversas moléculas HLA-DR. Para ello se eligieron p37, p45, pβl y p62, utilizando también el péptido PADRE como control. Todos estos péptidos mostraron capacidad de unión a varias moléculas HLA-DR, a la vez que mostraban diferentes grados de unión a HLA- DR4. La capacidad inductora Th se valoró midiendo la capacidad que los péptidos tenian de inducir proliferación celular y de inducir la producción de IFN-γ • e IL4 en linfocitos extraídos de los ratones inmunizados.
Inmunización
Se utilizaron ratones transgénicos hembras HLA-DR4 obtenidos de Taconic (Germantown, NY, USA) , que se mantuvieron en condiciones libres de patógenos y tratados de acuerdo a las normas de nuestra institución. Para la inducción de respuestas Th, se inmunizaron subcutáneamente grupos de 3 ratones (4-6 semanas de edad) con 200 μl de una emulsión 1:1 de adyuvante completo de Freund y suero salino que contenia 50 nanomoles del péptido correspondiente. Los animales inmunizados, se sacrificaron dos semanas después de la inmunización y se extrajeron los nodulos linfáticos popliteales, inguinales y periaórticos . Los nodulos se homogeneizaron con una jeringa y se lavaron tres veces con medio de lavado (medio RPMI 1640) a 4 0C. A continuación, 5xlO7 células/ml se pulsaron en MC durante 2 horas a 37 0C con 10 μM del péptido correspondiente. Posteriormente se centrifugaron y se resuspendieron, y se cultivaron 2xlO6 células/ml en un volumen de 2 mi, en placa de 24 pocilios, en estufa, a 37 °C con 5% de CO2. Siete dias más tarde, las células se lavaron y 5xlO5 células T por pocilio se cultivaron con 2xlO5 células de bazo singénicas por pocilio, tratadas con mitomicina-C, en ausencia o presencia del antigeno correspondiente. Se recogieron 50 μl del sobrenadante para medir IFN-γ e IL-4 como en el apartado anterior. Se midió la proliferación celular.
, Medida de proliferación celular
Tras 48 horas en cultivo, las células fueron pulsadas con 0,5 μCi de timidina tritiada durante 18 horas, se cosecharon y se determinó la incorporación de timidina en un contador de centelleo (Top-count; Packard, Meridan, CT, USA) .
Medida de la producción de IFN-γ e IL-4
Las cantidades de IFN-γ e IL-4 se midieron mediante ELISA comercial (OPTEIA Mouse IFN-γ Set, Pharmingen, San Diego, Estados Unidos y OPTEIA Mouse IL-4 Set, Pharmingen, San Diego, Estados Unidos) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Los resultados se expresaron como pg/ml utilizando una curva estándar de cantidades conocidas de citoquinas . Resultados
Los resultados (Figura 4) ponen de manifiesto que la mayor proliferación (mayor incorporación de timidina tritiada) y producción de IFN-γ se produce en aquellos ratones inmunizados con los péptidos p45 y PADRE. El péptido p45 estimuló notablemente la producción de IFN-γ y poco o nada la producción de IL-4, mientras que el péptido PADRE estimuló tanto la producción de IFN-γ como de IL-4. Estas observaciones permiten concluir que para la restricción HLA-DR4, p45 y PADRE inducen respuestas T colaboradoras correspondientes a perfiles de citoquinas ThI y ThO respectivamente. Los péptidos p37, pβl y p62 no dieron lugar a proliferación, ni a la producción de IFN-γ. Sin embargo, p37 y p62 dieron lugar a la producción de IL-4.
Ejemplo 4. Inducción de respuestas T citotóxicas (Tc).
Con el propósito de estudiar la capacidad de los péptidos para colaborar en la inducción de respuestas efectoras Tc, se inmunizaron ratones (transgénicos para HLA-DR4) con p37, p45, pβl, p62 o con el péptido control PADRE, conjuntamente con el péptido SIINFEKL [OVA(257-264) ] . SIINFEKL es un determinante T citotóxico (DTc) que se une a la molécula de clase I H-2 Kb.
Inmunización y medida de lisis
Para la inducción de respuestas citotóxicas, se inmunizaron subcutáneamente grupos de dos ratones de 4 a 6 semanas de edad con 200 μl de una emulsión 1:1 de adyuvante incompleto de Freund y suero salino, que contenia 50 nanomoles del péptido SIINFEKL, más el péptido a ensayar como DTh en cantidades variables. Entre 10 y 12 dias después de la inmunización, se sacrificaron los animales para extraer los nodulos linfáticos popliteales, inguinales y periaórticos . Estos fueron homogeneizados con una jeringa para obtener una suspensión celular y se lavaron tres veces con RPMI 1640.
Las células obtenidas se incubaron con el determinante citotóxico SIINFEKL (10 μM) durante 2 horas a 37 °C, se lavaron 2 veces y se cultivaron en placas de
24 pocilios a una concentración de 7,5xlO6 células/pocilio. Dos días después se añadió al cultivo 2,5 U/ml de IL-2 y cinco días después se midió la actividad citotóxica, siguiendo la metodología descrita por Brunner (Brunner KT; "Quantitative assay of the lytic action of immune lymphoid cells on 51-Cr-labelled allogeneic target cells in vitro; inhibitάon by isoantibody and by drugs"; Immunology, 1968; 14:181).
La actividad citotóxica se valoró por la medida de la liberación de 51Cr de las células diana, previamente marcadas. Las células diana utilizadas fueron células de timoma (H-2b)EL-4 (Referencia ATCC: TIB-39) . Para su mareaje se añadieron 50 μCi de 51Cr04Na2 por cada 106 células diana en un volumen final de 100 μl y se incubaron en ausencia o presencia de péptido SIINFEKL (a una concentración de 10 μM) durante 2 horas a 37 °C. Después de tres lavados en RPMI 1640, se resuspendieron en 1 mi de MC. El ensayo se realizó en placas de 96 pocilios con fondo en U. A cada pocilio se le añadieron por separado las células efectoras y las células diana
(3000 por pocilio) . Se ensayaron diferentes proporciones de células efectoras respecto a las células diana, en diluciones seriadas (100, 33, 11 y 3) . Cada ensayo se realizó por triplicado. El volumen final de cada pocilio fue de 200 μl.
Se incubaron ,,las placas durante 4 horas a 37 °C. Posteriormente, se extrajeron 50 μl de sobrenadante de cada pocilio y la radiactividad se contó en un contador de centelleo.
El porcentaje de lisis especifica se calculó según la siguiente fórmula:
% Li sis especi fica = 100 X ( ( cpmexperimental ~ CpmeSpontánea ) / { Cpmmáxima ~ CpiTlespontánea / )
La lisis máxima se determinó midiendo las cpm (cuentas por minuto) de 3000 células diana incubadas con un 5% de Tritón X-100 y la lisis espontánea a partir de células incubadas en ausencia de células efectoras .
El porcentaje de lisis que se indica, corresponde a la lisis neta: valor de la lisis frente a las células de animales inmunizados al que se le substrae la lisis observada frente a las células de animales sin inmunizar.
Resultados
Los resultados, representados en la Figura 5, muestran que todos los péptidos menos pβl y PADRE proporcionaron colaboración Th para la inducción de linfocitos Tc específicos de SIINFEKL. Además, se pudo observar un efecto dosis-respuesta de forma que cada péptido actúa mejor a una dosis diferente. Ejemplo 5. Inducción de respuestas T helper in vitro en donantes .
Con el fin de determinar si los péptidos p37, p45 y pβ2 podian ser reconocidos por los linfocitos Th humanos de una población variada, se realizaron experimentos con células mononucleares de sangre periférica extraídas de cordones umbilicales de donantes.
Las células extraídas se purificaron mediante el método del ficoll (Noble PB, Cutts JH, Carroll, KK; Ficoll flotation for the separation of blood leukocyte types; Blood, 1968; 31:66-73). Una vez purificadas, las células (3xlO6 células/ml) se pulsaron durante dos horas con 10 μM del péptido en estudio. Las células pulsadas se lavaron y se plaquearon (105 células/pocilio) en placas de 96 pocilios de fondo plano. A los dias 3 y 7 se añadió IL-2. Quince dias mas tarde, las células de cada pocilio se subdividieron en dos, para enfrentarlas respectivamente a células (105 células/pocilio) tratadas con mitomicina C, con o sin cada uno de los péptidos p37, p45, p62 ó PADRE. Al cabo de dos dias se recogieron 50 μl de cada sobrenadante y se mantuvieron congelados a -20 0C hasta el momento en que se cuantificó la cantidad de IFN-γ mediante ELISA. Las células se pulsaron al tercer dia, durante 18 horas con 0,5 μCi de timidina tritiada. Posteriormente se cosecharon y se midió la incorporación de timidina en un contador de centelleo.
Tipaje HLA-DR de donantes
Primeramente se realizó la extracción de ADN a partir de células mononucleares de sangre periférica de cada donante. Se utilizó el Kit QIAmp DNA Mini Kit de (Qiagen, Valencia, EEUU) y se siguió el protocolo indicado por el fabricante.
Para la realización del tipaje a partir del ADN extraído, se utilizó el Kit Inno-Lipa HLA-DRBl Plus (Innogenetics, Ghent, Bélgica) , siguiendo el protocolo indicado por el fabricante.
Resultados
En la Tabla 3 se indica el número de pocilios positivos para cada péptido y donante. Se consideraron positivos, sólo aquellos pocilios que mostraron un Índice de estimulación igual o superior a 3. El índice de estimulación (IE) se expresó como el cociente entre las cuentas por minuto entre el pocilio con péptido y el pocilio sin péptido.
Tabla 3. Reconocimiento de péptidos por linfocitos de donantes humanos. El número máximo de pocilios positivos posibles era 48 por péptido y donante. N indica el total de pocilios positivos frente a cada péptido tomando los 16 donantes. n° de pocilios
Donantes positivos para cada péptido
N° Tipaje molecular p37 p45 p62 PADRE
1 DRB1*O3 DRB1*O4 4 22 11 4 2 7 31 6 34
3 DRBl*01 DRB1*O3 7 5 1 3
4 DRB1*O3 DRB1*13 / DRB1*O3 DRB1*15 - 1 - 1
5 DRBl*01 DRB1*O8 4 3 14 8
6 DRBl*07 DRB1*O11 1 - - -
7 DRB1*O7 DRBl* 10 2 - - 1
8 DRBl*01 DRB1*O3 - - - 1
9 DRB1*O7 DRBl*11 1 - - - 10 DRB1*O4 DRB1*13 / DRB1*O4 DRB1*14 1 3 1
11 - 1 - -
12 DRBl*01 DRB1*O4 1 - - -
13 DRBl*01 DRB1*15 - 1 1 1
14 DRBl*01 DRB1*13 / DRBl*01 DRB1*14 2 1 1 2
15 DRB1*O3 DRB1*O7 - - 2 5
16 1 - 8 4
N=31 N=65 N=47 N=65
De la Tabla 3 se puede deducir que: los péptidos p45 y PADRE fueron los mejor reconocidos por los linfocitos de 16 donantes; y que todos son reconocidos por al menos el 50% de los individuos . '

Claims

REIVINDICACIONES
1.- Un péptido quimérico con capacidad para unirse al menos a una forma alélica de la molécula HLA-DR, caracterizado porque su secuencia de aminoácidos se ajusta a una fórmula seleccionada entre: a) ai-a2-Y-a4-a5-a6-a7-a8-a9-aio-A-A-A; y b) la SEQ. ID. NO: 21;
donde Y es Tyr; A es Ala; ai es Phe o Tyr; a2 es Lys o Arg; a4 es Arg, excepto cuando a6 y aio son Met y Arg, respectivamente, donde a4 puede ser cualquiera de los aminoácidos naturales; .as, a7 y ag son cualquiera de los 20 aminoácidos naturales; a6 es Met excepto cuando a4 y aio son Arg, caso en el que a.$ es cualquiera de los aminoácidos naturales; as es Arg, excepto cuando a4 ES Arg, Tyr o His, &β es Met o Val y aio es Met, His o Arg, caso en el que as es cualquiera de los aminoácidos naturales; y aio es Arg, excepto cuando a4 es Arg o His, y a6 es Met, caso en el que aio es cualquiera de los aminoácidos naturales.
2.- Un péptido quimérico con capacidad para unirse al menos a una forma alélica de la molécula HLA-DR según la reivindicación 1, caracterizado porque su fórmula está seleccionada entre:
I ) ai-a2-Y-R-a5-M-a7-R-a9-R-A-A-A;
II ) ai-a2-Y-R-a5-M-a7-a8-ag-aio-A-A-A;
III ) ai-a2-Y-a4-a5-M-a7-ag-a9-R-A-A-A; y IV ) ai-a2-Y-R-a5-a6-a7-a8-a9-R-A-A-A; donde Y es Tyr; R es Arg; M es Met; A es Ala; ai es Phe o Tyr; a2 es Lys o Arg; a4 es cualquiera de los 20 aminoácidos naturales distinto de Arg; as, a7 y ag son cualquiera de los 20 aminoácidos naturales; ae es cualquiera de los 20 aminoácidos naturales distinto de Met; as es cualquiera de los 20 aminoácidos naturales distinto de Arg; y aχo es cualquiera de los 20 aminoácidos naturales distinto de Arg.
3.- Un péptido según una de las reivindicaciones 1 o 2, donde dicha forma alélica HLA-DR está seleccionada entre: HLA-DRl, HLA-DR2 , HLA-DR3, HLA-DR4, HLA-DR7, HLA-DR8 O HLA-DRIl.
4.- Un péptido según una de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizado porque se une al menos a 2 formas alélicas de HLA-DR.
5.- Un péptido según una de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizado porque induce la activación de células T colaboradoras Th.
6.- Un péptido según una de las reivindicaciones 1 a 5, caracterizado porque induce la activación de células T citotóxicas Tc.
7.- Un péptido según una de las reivindicaciones 1 a 6, caracterizado porque posee una secuencia seleccionada entre SEQ. ID. NO: 1, SEQ. ID. NO: 4, SEQ. ID. NO: 5, SEQ. ID. NO: 6, SEQ. ID. NO: 7, SEQ. ID. NO: 10, SEQ. ID. NO: 11, SEQ. ID. NO: 12, SEQ. ID. NO: 13, SEQ. ID. NO: 14, SEQ. ID. NO: 15, SEQ. ID. NO: 16, SEQ. ID. NO: 17, SEQ. ID. NO: 20 y SEQ. ID. NO: 22.
8.- Una composición farmacéutica caracterizada porque comprende al menos un péptido descrito en una de las reivindicaciones 1 a 7 y un excipiente farmacéuticamente aceptable.
9.- Una composición farmacéutica según la reivindicación 8, caracterizada porque comprende además otro inmunógeno.
10.- Una composición farmacéutica según una de las reivindicaciones 8 o 9, caracterizada porque comprende un determinante T citotóxico (DTc) y un determinante T colaborador (DTh) , donde el determinante DTh es un péptido descrito en una de las reivindicaciones 1 a 7.
11.- Uso de un péptido descrito en una de las reivindicaciones 1 a 7 en la preparación de una composición farmacéutica útil para estimular la respuesta inmune .
12.- Uso de un péptido según la reivindicación 11, caracterizado porque dicha composición farmacéutica es útil para inducir la activación de células T colaboradoras Th (ThI, Th2 o ThO) .
13.- Uso de un péptido según la reivindicación 11, caracterizado porque dicha composición farmacéutica es útil para inducir una respuesta inmune T citotóxica (CTL) .
14.- Uso de un péptido según la reivindicación 11, caracterizado porque dicha composición farmacéutica es útil para inducir una respuesta inmune humoral.
15.- Un método para estimular y potenciar la activación de células T colaboradoras caracterizado porque comprende administrar a un sujeto una dosis terapéuticamente eficaz de una composición farmacéutica descrita en' una de las reivindicaciones 9 o 10.
16.- Un método para estimular y potenciar la activación de células T citotóxicas caracterizado porque comprende administrar a un sujeto una dosis terapéuticamente eficaz de una composición farmacéutica descrita en una de las reivindicaciones 9 o 10.
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