BRPI0620243A2 - peptìdeo quimérico capaz de se ligar à pelo menos uma forma alélica da molécula hla-dr, composição farmaceutica e uso do peptìdeo - Google Patents
peptìdeo quimérico capaz de se ligar à pelo menos uma forma alélica da molécula hla-dr, composição farmaceutica e uso do peptìdeo Download PDFInfo
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Abstract
<UM>PEPTIDEO QUIMéRICO CAPAZ DE SE LIGAR A PELO MENOS UMA FORMA ALéLICA DA MOLECULA HLA-DR, COMPOSIçAO FARMACeUTICA E USO DO PEPTIDEO.<MV> A presente invenção refere-se a um peptídeo quimérico, capaz de se ligar a pelo menos uma forma alélica da molécula HLA-DR. A invenção diz respeito ainda a uma composição farmaceutica contendo o referido peptídeo, assim como aos diferentes usos da mesma.
Description
"PEPTÍDEO QUIMÉRICO CAPAZ DE SE LIGAR À PELO MENOS UMA FORMA ALÉLICA DA MOLÉCULA HLA-DR, COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA E
USO DO PEPTÍDEO"
CAMPO DA INVENÇÃO
A presente invenção situa-se na área de determinação de peptideos antigenos, capazes de estimular respostas T de ajuda (Thl).
ESTADO DA TÉCNICA
Os linfócitos T de ajuda (Thl) desempenham diversas funções importantes na imunidade aos patógenos. Em primeiro lugar, a indução de uma resposta imuno efetora eficaz, seja uma resposta humoral ou uma resposta citotóxica celular, requer a ativação de Thl, e mais especificamente de sub- populações especificas de Thl (Thl, Th2, ThO) . Em segundo lugar, o Thl pode ainda atuar diretamente como células efetoras, uma atividade mediada pelo contato celular direto ou pela liberação de linfoquinas (IFN-γ, TNF-α, etc). Portanto a estimulação de respostas T de ajuda (Th) constitui um aspecto muito relevante para o desenvolvimento de vacinas.
É bem conhecido que, para alcançar um efeito estimulante, o Thl reconhece, por meio de receptores específicos (CTR), situados em sua superfície, complexos formados entre moléculas MHC Classe II e peptideos antigênicos. Esses peptideos que se ligam às moléculas MHC Classe II também conhecidos como epitopos Th ou determinantes antigênicos Th (Thd) tipicamente apresentam dimensões entre 11 e 22 aminoácidos e mais freqüentemente entre 13 e 16 aminoácidos.
Nos últimos anos, vacinas baseadas em epitopos tem provocado interesse considerável como uma possível ferramenta no desenvolvimento de novas vacinas e estratégias imunoterapêuticas. Uma seleção cuidadosa de epitopos para células BeT deve permitir direcionar as respostas imuno para epitopos conservados de certos patógenos, caracterizada por grande variabilidade seqüencial (por exemplo, malária,vírus da hepatite C, HIV, etc).
Além disso, vacinas baseadas em epitopos oferecem a oportunidade de incluir Thd quiméricos que foram manufaturados para modular seu potencial estimulante, seja aumentando sua capacidade de ligação com as moléculas MHC do principal complexo histocompatível, ou modificando os resíduos de contato com os receptores TCR das células T de ajuda, ou modificando ambas essas características. Devido à natureza quimérica desses peptídeos, há muito poucas probabilidades de que sua seqüência esteja contida em antígenos próprios, razão pela qual, se após o uso das mesmas, seus anticorpos fossem induzidos contra os peptídeos, haveria uma probabilidade muito pequena de induzir respostas indesejadas contra antígenos próprios.
A predição e seleção de epitopos adequados se depara, no entanto, com um importante obstáculo: o elevado número de polimorf ismos existentes entre as moléculas MHC, que afetam de modo muito particular as regiões de ligação ao epitopo e reconhecimento Thl. Este polimorfismo é produzido como resultado do caráter poligênico da histocompatibilidade MHC e o elevado número de variantes alélicas existentes para cada um destes loci genéticos. Assim, por exemplo, MHC humano Classe II compreende 3 pares de genes (cada par com suas cadeias α e β) , denominadas HIjA-DR, HLA-DP e HLA-DQ, que dão origem a quatro tipos básicos de moléculas HLA Classe II. Uma revisão geral pode ser encontrada no manual: Immunobiology - The immune system in health and disease; Janeway CA Jr e Travers P Eds.; Current Biology Ltd. / Garland Publishing Inc., Londres, 1997, 3 a Edição. Este polomorfismo é responsável pela expressão de muitas moléculas MHC diferentes, cada uma delas possuindo diferentes faixas de especificidade para a ligação dos epitopos (restrição MHC).
Embora os resíduos polimórficos alélicos específicos que envolvem o canal de ligação ao epitopo forneçam para a molécula MHC a capacidade de ligar-se a um certo conjunto de peptídeos, existem diversos casos em que um mesmo peptídeo pode se ligar a mais de uma forma alélica da molécula MHC. Isto tem sido particularmente observado no caso de moléculas HLA-DR, nas quais diversas formas alélicas HLA-DR podem reconhecer padrões de peptídeo similar, ao mesmo tempo em que tem sido verificado que certos peptídeos são reconhecidos por diferentes moléculas HLA-DR. Isto levou ao conceito de que certos peptídeos poderiam representar epitopos promíscuos ou universais.
Assim, o uso de algoritmos diferentes tem permitido definir diversos padrões úteis para a seleção de epitopos, tendo sido identificados alguns epitopos universais reconhecidos por um bom número de isoformas das moléculas HLA, e mais especificamente de HLA-DR (W095/07707; Alexander J. et al., Immunity, 1994, 1:751-761; W098/32456).
Este último tipo de peptídeo mais promíscuo pode ser muito útil na indução de resposta humoral e celular em uma grande variedade de indivíduos saudáveis, o que evitaria ter de escolher peptídeos especiais dependendo no HLA-DR de tais indivíduos.
Embora um conjunto destes peptídeos promíscuos PADRE esteja já disponível (Alexander J et al. Immunity, 1994, 1:751-761), continua a haver interesse na identificação de novos peptídeos promíscuos quiméricos. Isto se deve ao fato de que, apesar de todos estes peptídeos serem reconhecidos por diversos HAL-DR, alguns peptídeos podem ser melhores que outros para um HLA-DR específico. Conseqüentemente, seria de grande utilidade ter uma bateria maior de peptídeos promíscuos para desta forma cobrir melhor a indução a respostas em comparação com a totalidade de HLA-DR. Além disso, é também desejável que se identifiquem outros peptídeos que são ligados e podem ser reconhecidos no contexto de outros isótopos HLA-DP e HLA- DQ. Isto permitiria a geração de vacinas e produtos imunoterapêuticos para uma gama maior de pessoas.
EXPLICAÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO
Com o objetivo de identificar novos peptídeos quiméricos capazes de se ligar fortemente a diferentes moléculas HLA-DR e, consequentemente, serem capazes de fornecer ajuda para a indução de anticorpos e ainda respostas T citotóxicas, um conjunto de peptídeos de 13 aminoácidos foi sintetizado. Para tanto, fórmulas ou gabaritos de sequencias foram determinados, criados a partir de um padrão de 8 aminoácidos descrito pelos próprios inventores como referência de partida (Borrás- Cuesta F. et al. ; Specific and General HLA-DR binding motifs: comparison algorithms; Human Immunol., 2000; 61:266-278).
Inicialmente, foram sintetizados peptídeos cuja seqüência é adaptada à fórmula:
I) ai-a2-Y-R-a5-M-a7-R-a9-R-A-A-A; em que Y é Tyr; R é Arg; M é Met; A é Ala; ai é Phe ou Tyr ; SL2 é Lys ou Arg; a5, a7 e a9 são qualquer um de 20 aminoácidos naturais.
Em todos os casos, uma tirosina foi usada como âncora primária no terceiro resíduo (primeiro resíduo do padrão acima). Além disso, para alcançar o comprimento típico de 13 aminoácidos da maioria dos Thd (Chicz R.M. et al. ; Predominant naturally processed peptides bound to HLA-DRl são derivados de moléculas relacionadas ao MHC e tem dimensões heterogêneas; Nature, 1992; 358: 764-768), três alaninas foram adicionadas ao núcleo de 8 aminoácidos em sua extremidade C-terminal e outros dois aminoácidos em sua extremidade N-terminal: um aminoácido aromático (fenilalanina ou tirosina) no primeiro resíduo e um aminoácido com carga positiva (lisina ou arginina) no segundo resíduo. 0 uso de fenilalanina ou tirosina no primeiro resíduo provê um ponto de ancoragem adicional. Além disso, os aminoácidos que ocupam as posições 4, 6, 8 e 10 dos peptídeos foram fixados na referida fórmula.
Outras fórmulas para a síntese e avaliação de peptídeos foram estabelecidas a partir do primeiro gabarito, nas quais foi mantida a possibilidade de variar dois dos quatro aminoácidos fixados nas posições acima citadas, 4, 6, 8 e 10. As fórmulas testadas foram as seguintes:
II) ai-a2-Y-R-a5-M-a7-a8-a9-a10-A-A-A;
III) a1-a2-Y-a4-a5-M-a7-a8-a9-R-A-A-A;
IV) ai-a2-Y-R-a5-a6-a7-a8-a9-R-A-A-A;
Em que Y é Tyr; R é Arg; M é Met; A é Ala; ax é Phe ou Tyr; a2 é Lys ou Arg; a4 é qualquer um de 20 aminoácidos naturais, a5, a7 e a9 são qualquer um de 20 aminoácidos naturais; a6 é qualquer um de 20 aminoácidos naturais com exceção de Met; a8 é qualquer um de 20 aminoácidos naturais com exceção de Arg; e ai0 é qualquer um de 20 aminoácidos naturais com exceção de Arg.
Um peptídeo da seqüência abaixo também foi sintetizado:
V) SED. ID. No: 21,
Em que os aminoácidos foram variados em 3 das posições fixadas inicialmente, mantendo a metionina na posição 6. Para efeitos de comparação, peptídeos curtos de 8 e 9 aminoácidos foram também sintetizados os quais também possuíam tirosina como âncora primária e na maioria das posições restantes do núcleo, aminoácidos que favorecem a ligação ao HLA-DR. Uma vez sintetizado, sua capacidade de ligar fortemente às diferentes formas alélicas da molécula HLA-DR foi avaliada, com o resultado de que a maioria era capaz de ligar fortemente à pelo menos uma das formas alélicas.
Uma seqüência geral foi obtida a partir dos dados acima. Assim, em uma primeira modalidade, a presente invenção diz respeito a um peptídeo quimérico capaz de ligar à pelo menos uma forma alélica da molécula HLA-DR, caracterizado pelo fato de que sua seqüência de aminoácidos adapta-se a uma fórmula selecionada de:
a) a1-a2-Y-a4-a5-a6-a7-a8-a9-aio-A-A-A; e
b) SEQ.ID. No: 21;
Em que Y é Tyr; A é Ala; ai é Phe ou Tyr; a2 é Lys ou Arg; a4 é Arg, exceto quando a6 e ai0 são Met e Arg respectivamente, onde a4 pode ser qualquer um dos aminoácidos naturais; a6 é Met exceto quando a4 e ai0 são Arg, quando a6 é qualquer um dos aminoácidos naturais; a8 é Arg exceto quando a4 é Arg, Tyr ou His; a6 é Met ou Val e aio é Met, His ou Arg, quando a8 é qualquer um dos aminoácidos naturais; e a10 é Arg, exceto quando a4 é Arg ou His e a6 é Met, quando ai0 será qualquer um dos aminoácidos naturais.
Portanto, um segundo aspecto da presente invenção diz respeito a um peptídeo quimérico capaz de se ligar a pelo menos uma forma alélica da molécula HLA-DR cuja seqüência de aminoácidos se adapta a uma das fórmulas previamente definidas I, II), III), e IV). Doravante, nos referimos a isto como um "peptídeo quimérico da invenção" ou "peptídeo da invenção" . Em uma modalidade particular, a forma alélica HLA-DR corresponde a um serotipo HLA-DRl, HLA-DR2, HLA-DR3, HLA-DR4, HLA-DR7, HLA-DR8 OU HLA-DRll.
Em uma modalidade particular, o peptídeo quimérico da invenção se liga fortemente a pelo menos duas formas alélicas de HLA-DR de serótipos diferentes, e preferivelmente a 3, 4, 5, 6 ou até mesmo 7 destas formas alélicas.
Em alguns casos, o peptídeo quimérico da invenção pode também se ligar a outros isótopos de moléculas HLA Classe II, por exemplo, HLA-DP ou HLA-DQ. Em uma modalidade particular, podem também se ligar a algumas formas alélicas de HLA-DQ.
Em uma modalidade preferida, o peptídeo quimérico da invenção comporta-se como um epitopo antigênico Th ou determinante (Thd) . As expressões, determinante Th ou Thd são usadas indistintamente e significam que o referido peptídeo, ligado à molécula HLA, é reconhecido pelos linfócitos Th e é capaz de induzir a ativação de tais linfócitos Th ou células T de ajuda (resposta Th) . Esta ativação é observada pela sua capacidade de induzir a proliferação de linfócitos Th e de induzir a produção de linfoquinas específicas destes linfócitos Th, tais como IL- 4, IFN-γ ou TFN-α. A resposta Th induzida pode ser uma resposta Thl ou Th2, ou uma resposta mista ThO. Esta capacidade de agir como Thd é possível no contexto de pelo menos uma das formas de HLA-DR, HLA-DP ou HLA-DQ indicadas. Preferivelmente, o peptídeo quimérico da invenção é ainda capaz de induzir uma resposta efetiva humoral ou citotóxica Τ. Em uma modalidade a referida resposta é uma resposta CT.
Em uma modalidade particular, o peptídeo quimérico da invenção é um peptídeo de seqüência SEQ.ID.N0:1, SEQ . ID . NO : 4 , SEQ. ID . NO : 5 , SEQ. ID. NO: 6 , SEQ. ID . NO: 7 , SEQ. ID . NO : 10 , SEQ . ID . NO: 11, SEQ. ID . NO: 12 , SEQ. ID. NO: 13 , SEQ. ID . NO : 14 , SEQ . ID . NO : 15 , SEQ . ID. NO: 16 , SEQ. ID . NO: 17 , SEQ. ID . NO: 2 0 OU SEQ.ID.NO:2 2.
Os peptídeos quiméricos da invenção podem ser obtidos fpor métodos convencionais, por exemplo, através de técnicas de síntese química de fase sólida; purificação por cromatografia líquida de alto desempenho (HPLC) ; e, se desejado, podem ser analisados utilizando técnicas convencionais, por exemplo, por espectrometria de massa ou sequenciamento, análise de aminoácidos, ressonância magnética nuclear, etc. Alternativamente, os peptídeos da invenção podem ainda ser obtidos através da tecnologia de DNA recombinante.
Os peptídeos quiméricos da invenção poderiam ser usados para a administração a um sujeito (homem, mulher ou qualquer outro mamífero) com objetivos imunoprofiláticos ou imunoterapêuticos. Portanto, em outro aspecto, a invenção também diz respeito a uma composição farmacêutica que contém um peptídeo quimérico da invenção (ou uma pluralidade destes) e um excipiente farmaceuticamente aceitável.
Em uma modalidade específica, um peptídeo quimérico da invenção (ou uma pluralidade destes) , pode ser administrado em uma combinação imunoestimuladora juntamente com outro ou outros imunogenos diferentes que os peptídeos quiméricos da invenção. Esta combinação pode ser apresentada sob a forma de uma única composição farmacêutica ou composições farmacêuticas separadas para administração combinada, através de administração simultânea ou seqüencial, pelo mesmo caminho de administração ou por caminhos diversos. Portanto, a presente invenção também diz respeito a uma composição farmacêutica caracterizada pelo fato de compreender um peptideo quimérico da invenção e outros imunogenos.
A expressão imunógeno refere-se a uma molécula capaz de induzir uma resposta imunológica específica ao referido imunógeno (humoral: produção de anticorpos; ou celular: ativação de linfócitos Th, ativação de linfócitos CT, etc) .
Devido â sua natureza química, o imunógeno pode ser praticamente qualquer molécula: por exemplo, polipeptídeos, lipopeptídeos, oligossacarídeos, polissacarídeos, ácidos nucléicos, lipídeos ou outros compostos químicos como drogas. Em vista de sua origem o imunógeno pode advir, por exemplo, de um patógeno (vírus, bactéria, fungo, parasita, etc.), de uma célula de tumor, de síntese (drogas ou outros compostos sintéticos) ou de qualquer outra origem (por exemplo, alergenos). Em alguns casos, o referido imunogeno é um determinante antigênico protéico, por exemplo em um determinante antigênico Th ou um determinante antigênico CT.
Em uma modalidade mais específica, a composição farmacêutica da invenção contém um determinante citotóxico C (CTd) e um peptideo quimérico da invenção (ou uma pluralidade destes) que atua como determinante T de ajuda (Thd).
Quando a composição farmacêutica contém um peptídeo quimérico da invenção e outro ou outros imunógenos, estes podem ser apresentados como moléculas separadas ou em forma conjugada, por exemplo, por ligações covalentes. A conjugação pode ser efetuada através de diversos métodos convencionais que estão descritos, por exemplo, em "The current protocols in protein chemistry", publicado por John Wiley & Sons (atualizado periodicamente; última atualização em 01.05.2005); "Immobilized affinity ligand Techniques", GT Hermanson, AK Mallia e PK Smith, Academic Press, Inc., San Diego, CA, 1992; EP0876398; entre outros.
A composição farmacêutica que compreende um peptídeo quimérico da invenção pode conter ainda, carregadores, excipientes e outros ingredientes farmaceuticamente aceitáveis.
Em ainda outra modalidade, a invenção diz respeito ao uso de um peptídeo quimérico da invenção (ou uma pluralidade destes), no preparo de uma composição farmacêutica imunoestimuladora. Esta composição
farmacêutica pode ser usada para induzir uma resposta imuno específica a um imunógeno administrado em combinação com um peptídeo quimérico, dentro da mesma composição, ou em composições separadas, conforme descrito anteriormente. Desta maneira, o peptídeo quimérico da invenção é usado para induzir uma resposta Th (ativação de linfócitos Th) em um sujeito ao qual foi administrada a composição farmacêutica. A referida resposta pode ser uma resposta Thl, ou Th2 ou uma resposta mista ThO.
Em uma modalidade particular, esta resposta Th coopera na ativação de linfócitos B, de modo que a composição farmacêutica com o peptídeo quimérico é útil para induzir uma resposta imuno humoral.
Em outra modalidade, a resposta Th colabora na ativação de linfócitos Th, de modo que a composição farmacêutica é útil na indução de uma resposta celular citotóxica C (CT).
Adicionalmente, a composição farmacêutica imunoestimuladora com o peptídeo quimérico da invenção pode ter outros usos, tais como, por exemplo, o tratamento in vitro ou o pré-condicionamento de células dendríticas com objetivos terapêuticos.
Conseqüentemente, a composição farmacêutica imunoestimuladora a qual contém o peptídeo quimérico da invenção, é útil para o tratamento e profilaxia de uma doença infecciosa (bacterial, virótica, fungai ou parasítica), tumoral ou alérgica.
A composição farmacêutica imunoestimuladora da invenção pode ser aplicada em qualquer sujeito animal ou humano: por exemplo, mamíferos (humanos ou não), pássaros e similares. Para tanto, qualquer caminho de administração adequado pode ser usado de acordo com os métodos conhecidos convencionais do estado da técnica. Uma revisão das diferentes formas farmacêuticas de administração de drogas e excipientes necessários para sua produção pode ser encontrada, por exemplo, em "Tecnologia farmacêutica", por J.L. Vila Jato, 1997, Vols. I e II, Ed. Synthesis, Madrid; ou em wHandbook of pharmaceutical manufacturing formulations", por S. K. Niazi, 2004 Vols. I a VI, CRC Press, Boca Raton. Em uma modalidade particular, a composição farmacêutica é administrada por rota parenteral (isto é, intravenosa, subcutânea, intramuscular, intraperitoneal, transdermal, mucosal ou similar).
A invenção prevê ainda um método terapêutico e/ou profilático que inclui a administração de uma composição farmacêutica a um sujeito que inclui um peptideo quimérico da invenção (ou uma pluralidade destes) . Este método permite ativar os linfócitos Th no referido sujeito usando uma resposta Th que funciona bem na estimulação de uma resposta humoral para a produção de anticorpos, ou na estimulação de uma resposta citotóxica pela ativação de linfócitos específicos CT contra um imunógeno. 0 referido método pode ser um método para o tratamento profilático ou terapêutico de uma doença infecciosa (bacterial, virótica, fungai ou parasítica, tumoral ou alérgica.
BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS
FIGURA 1. Capacidade de ligação de peptídeos quiméricos a diferentes moléculas HLA-DA. È expressa como uma porcentagem de ligação relativa (%Br) , em termos relativos à ligação do peptideo de controle HÁ não biotinilado (306-320) : APKYVKQNTLKATG. A densidade de grelhas representa um aumento de ordem percentual, de acordo com a chave aos pés da figura.
FIGURA 2. Ligação do peptideo biotinilado P45 à linha celular HLA-DR4. Células HLA-DR4 foram incubadas com diferentes concentrações de peptídeo biotinilado e sua fluorescência foi medida (expressa em unidades arbitrárias de fluorescência) que é diretamente proporcional à concentração dos peptideos biotinilados P45 que foram ligados.
FIGURA 3. Porcentagem de inibição da ligação do peptideo biotinilado P45 às células que expressam HLA-DR4, na presença de anticorpos específicos anti-HLA: aDR, anti- HLA-DR, aDP, anti-HLA-DP; aDQ, anti-HLA-DQ, e anti-HLA Classe I.
FIGURA 4. Indução de respostas T de ajuda em camundongos transgênicos HLA-DR4 imunizados com peptideos diferentes (50 nanomoles) : P3 7, P45, p61, p62 e PADRE. As respostas a cada peptídeo foram avaliadas após 15 dias: proliferação linfócita, produção de IFN-γ, e produção de IL-4.
FIGURA 5. Indução de respostas citotóxicas T em camundongos transgênicos HLA-DR4 imunizados com um peptídeo CTd [50 nanomoles de OVA (257-264)] sozinho ou em conjunto com um dos peptideos para teste como Thd: p37, p45, p61f p62 ou PADRE. Os ensaios foram repetidos com diferentes concentrações de peptideos para testar: A) 50 nanomoles; B) 5 nanomoles; C) 0.5 nanomoles.
MODALIDADE DA INVENÇÃO
EXEMPLO 1. Síntese de peptídeo
Os peptideos para os ensaios de ligação às moléculas HLA e indução de T de ajuda (Th) e respostas citotóxicas T (CT) foram sintetizados manualmente pelo método Merrifield de fase sólida, usando tecnologia Fmoc [(Merrifield RB; Solid phase synthesis. I. J Am Chem Soe, 1963; 85:2149); (Atherton E Procedure for solid phase synthesis. J Chem Soc Perkin Trans, 1989; 1:538)]. Tanto os peptídeos para teste como os peptídeos usados como controle foram sintetizados usando este mesmo método (Tabela I) .
TABELA I. Peptídeos sintetizados para os ensaios de ligação para moléculas HLA e indução de respostas T de ajuda (Th) e citotóxicas.
Nome Seqüência SEQ. ID. N°: p45 FKYRMMMRMRAAA 1 p44 YRMMMRMRA 2 p43 YRMMMRMR 3 p61 FRYRMMMRMRAAA 4 p62 YR YRMMMRM RAAA 5 p53 FKYRWMMRWRAAA 6 p52 FKYRRMMRKRAAA 7 p41 YRAMRAMRA 8 p40 YRAMRAMR 9 p46 FKYRMMMAPMAAA 10 p42 FKYRAMRAMRAAA 11 p49 FKYRAMRCMRAAA 12 p50 FKYRAMRRRRAAA 13 p51 FKYRRMRRRRAAA 14 p57 FKYRWMRAMRAAA 15 p37 FKYRQMMAPHAAA 16 p48 FKYRAMRRRHAAA 17 p39 YRQMMAPHA 18 p47 YRAMRRRHA 19 p58 FKYYAMRCMRAAA 20 p56 FKYHQMMAPHAAA 21 p60 FKYRWVRALRA AA 22 PADRE AKFV AA WTLKAAA 23 HA(306-320) APKYVKQNTLKLATG 24 OVA(257-264) SIINFEKL 25 Peptídeos biotinilados foram ainda usados para alguns ensaios: o peptídeo HÁ (306-320) (APKYVKQNTLKLATG) da hemoglutinina do virus da Influenza e P45. Estes peptídeos foram sintetizados manualmente e conjugados com biotina (EZ-Link Sulfo-NHS-LC-Biotin; Pierce Biotechnology, Inc., Rockford, USA) . Para tanto, uma vez que a síntese do peptídeo estava concluída, esta permaneceu ligada à resina e 10 lavagens foram efetuadas com uma mistura de água-DMF (7.5:2.5) para preparar a resina para este novo solvente. A Biotina dissolvida neste solvente foi adicionada, na proporção (1:1) com os miliequivalentes da resina inicial. A mistura foi deixada em repouso para reagir por uma hora e meia. Em seguida, a resina foi lavada 20 vezes com DMF, e o processo de reação foi repetido até 3 vezes. Para assegurar que o peptídeo havia sido biotinilado, o teste Kaiser foi efetuado (Kaiser, 1970: Color test for detection of free terminal amino groups in the solid-phase synthesis of peptides. Anal Biochem. 1970; 34:595-598). A resina foi cortada, liofilizada e analisada por HPLC como na seção anterior. [(Merrifield RB; Solid phase synthesis. I. J Am Chem Soe, 1963; 85:2149); (Atherton E Procedures for solid phase synthesis, J Chem Soc Perkin Trans, 1989; 1:538)].
O peptídeo PADRE foi sintetizado para efeitos de comparação. Este é um peptídeo similar a outro previamente desenvolvido (Alexander J et al. Immunity, 1994, 1:751-761) com o objetivo de induzir respostas T de ajuda em uma ampla variedade de moléculas HLA-DA. Este peptídeo PADRE foi diferenciado do peptídeo previamente descrito pelo fato de que foi sintetizado com o aminoácido fenilalanina ao invés da ciclohexilalanina original.
EXEMPLO 2. Ensaios de ligação dos peptídeos para diferentes moléculas HLA.Ligando as moléculas HLA-DA.
A ligação dos peptídeos foi medida conforme descrito por Busch et al. (Busch R, Tothbard J: Degenerate binding of immunogenic peptides to DLA-DR proteins on B cell surfaces. Int Immunol, 1990; 144:1849).
Nos experimentos da presente invenção, as seguintes 10 linhas de linfócitos B foram usadas transformadas pelo vírus Epstein-Barr (EBV-BLCL), sendo cada uma delas homozigótica para diferentes moléculas HLA-DA:
<table>table see original document page 18</column></row><table>
Todas as linhas de célula foram obtidas da Coleção Européia de Culturas de Células Animais (ECACC, PHLS, Salisbury, UK).
Em resumo, linfócitos B com moléculas HLA-DA diferentes (a razão de 2.5xl05 células/poço) foram coincubadas durante uma noite com HÁ biotinilado (306-320) (10μΜ) e HÁ não biotinilado (306-320) (100μΜ) de um lado, e com HÁ biotinilado (306-320) (10μΜ) e o peptídeo para teste (100μΜ) de outro lado. A incubação foi efetuada em meio completo MC (RPMI 1640 com 10% soro fetal de bezerro, 2nM de glutamina, 100 U/ml de penicilina, 100μ9 de estreptomicina, 5x10^5 de 2-p-mercaptoetanol, e 0.5% (v/v) de ácido piruvico sal de sódio). No dia seguinte foram efetuadas duas lavagens com 200 μl de meio FACS (2.5% PBS de soro fetal de bezerro); 5μg/ml de fluoresceina- estreptavidina (Pierce) em 100μl de meio FACS e estas foram incubadas a 40C por 30 minutos. Em seguida, 2 lavagens foram efetuadas e as células foram resuspensas em 200 μl de meio FACS.
A fluorescência da superfície celular foi medida pelo fluxo da citometria em um analisador FACScan (Becton Dickinson Immunocitochemistry System, Mountain, USA) . A fluorescência média de 5,000 células etiquetadas foi medida. Um sinal de fluorescência foi obtido proporcional ao número de moléculas HLA-DR expostas no exterior da célula.
A fórmula abaixo foi usada para quantificar a capacidade de ligação de cada peptídeo (% Ligaçãopeptídeo):
% LigaçãOpeptídeo= 100x ((Fpeptideo - Fblnk) / (Fctribiot-Fblnk) )
em que Fpeptídeo é a fluorescência medida pelo peptídeo de teste Fbink é a fluorescência medida sem a adição do peptídeo (em branco) ; e Fctri. Biot é a fluorescência medida para o peptídeo biotinilado de controle [(HA306-320) ] .
Dessa forma a porcentagem de ligação foi calculada usando o peptídeo não-biotinilado de controle [(HA3 06- 320)] como peptídeo de teste (%Ligaçãoctir) :
%Ligaçãoctlr=100x ((Fctrl.não-biot.-Fbink)/(Fctrl.biot.-Fbink)). ΗΑ3 06-320 foi usado como controle de referência, ao invés do peptídeo CPKYVKQNTLKLATG conforme descrito anteriormente (Rothbard JB; Degenerate binding of immunogenic peptides. Int Immunol 1990; 2:443-451), de forma a evitar a formação de potenciais pontes de ligações duplas de enxofre via terminal Cisteina-NH2.
As porcentagens de ligação relativas (%Br) foram ainda calculadas de acordo com a fórmula abaixo:
%Br = 100 χ (%Ligaçãopeptídeo / %Ligaçãoctrl)
em que %LigaçãOpeptideo é a porcentagem de ligação do peptídeo de teste; e em que %Ligaçãoctri é a porcentagem de ligação do peptídeo de controle não-biotinilado do peptídeo de controle HÁ(306-320).
Todos os ensaios foram efetuados em triplicata. A variação nas intensidades de fluorescência das triplicatas esteve sempre na faixa de 5-105.
Dessa forma foi possível obter uma avaliação da capacidade de ligação dos diferentes peptídeos às moléculas HLA-DA1, HLA-DR2, HLA-DR3, HLA-DR4, HLA-DR7, HLA-DR8, HLA- DR11, expressa em termos relativos à ligação do peptídeo não-biotinilado HÁ: APKYVKQNTLKLATG (Figura 1). A partir da Figura 1 pode-se concluir que:
a maioria dos peptídeos se liga com boa afinidade a pelo menos 2 moléculas HLA-DA.
- Particularmente, os peptídeos p45, p61 e p62 se ligam com boa afinidade a quase todas as moléculas HLA-DA pesquisadas. Os peptídeos p45, p61 e p62 demonstraram uma capacidade de ligação comparável a ou até mesmo maior do que o peptídeo PADRE testado.
Ligação de p45 às moléculas HLA-DA, HLA-DP e HLA-DQ
O P45 mostrou-se praticamente insolúvel. De forma, para melhor caracterizar sua capacidade de ligação, e evitar um possível efeito tóxico do peptídeo, decidiu-se efetuar alguns testes complementares usando p45 biotinilado.
Em primeiro lugar, os testes foram efetuados para ligar HLA-DR em diferentes linhas celulares, incubadas com p4 5 biotinilado em diferentes concentrações. Para evitar a possível cristalização do peptídeo, isto foi solubilizado com a ajuda de um sonicador. A fluorescência da superfície celular foi medida pelo fluxo citométrico em uma analisador FACScan conforme visto no exemplo 2, embora não haja competição com o peptídeo não-biotinilado p45. A Figura 2 mostra a fluorescência medida nos testes de ligação na linha expressa por HLA-DR4. Conforme pode ser verificado, a ligação do peptídeo é dependente-de-dose nas faixas de concentração testadas.
Em segundo lugar, a linha celular HLA-DR4 foi incubada na presença de peptídeos biotinilados p45 e anticorpos selecionados em vista de sua especificidade ao HLA-DR, HLA- DP, HLA-DQ e HLA Classe I respectivamente (Figura 3) .
Em uma placa de 96 poços com fundo em formato de U, a linha celular HLA-DR4 foi disseminada (já definido); (2 χ 10"5 por poço), adicionando ainda peptídeos P45 biotinilados (10μΜ) , sozinho ou em conjunto com o sobrenadante dos hibridomas: L243 anti-HLA-DR (ATCC Ref: HB-55) , ou W6/32 anti-Classe I (ATCC Ref: HB-95) ou os anticorpos 33.1 anti- HLA-Dq ou anti-HLA-DP B7/21, que foram fornecidos pela Dra. Ghislaine Sterkers. Todos foram diluídos a (1/500) em uma volume final de 100 μΐ de RPMI com 2.5% de FBS. No dia seguinte, 2 lavagens foram efetuadas com 200μ1 de meio FACS, 5μg/ml de conjugado de fluoresceína-estreptavidina (Pierce) em 100μ1 de FACS, e então foram incubadas a 4aC por 3 0 minutos. Em seguida, 2 lavagens foram efetuadas e as células foram resuspensas em 200μ1 de meio FACS. A fluorescência da superfície celular foi medida por citometria de fluxo em um analisador FACScan. A fluorescência média de 5,000 células etiquetadas foi medida. Um sinal de fluorescência foi obtido proporcional ao número de moléculas HLA-DR expostas no exterior da célula.
A fórmula seguinte foi usada par quantificar a diminuição na capacidade de ligação ao se adicionar os anticorpos:
%Inibição = 100x ( (Fp45-HaHiA-Fbink) / (Fp45-Fblnk) )
em que FbInk é a fluorescência medida quando as células foram cultivadas sem a adição de peptídeo ou anticorpos (em branco), Fp45 é a fluorescência medida quando incubada com os peptídeos biotinilados p45 sozinhos, e Fp45+aHLA é a fluorescência medida quando medida com p45 biotinilado combinado com os anticorpos HLA correspondentes.
Todos os ensaios foram efetuados em triplicata. A variação nas intensidades de fluorescência das triplicatas esteve sempre na faixa de 5-105. Conforme pode ser visto na Figura 3, a incubação com anticorpos anti-HLA-DR ou anti-HLA-DQ produz forte inibição da ligação, o que indica que p45 se liga tanto a HLA-DR como a HLA-DQ, mas não a HLA-DP.
Dessa forma, estes testes foram repetidos nas linhas celulares HAL-DRl, HLA-DR3, HLA-DR7, HLA-DR8 e HLA-DRll. As porcentagens de inibição obtidas estão demonstradas na Tabela 2. Conforme pode ser observado, quando as células foram incubadas com p45 biotinilado na presença de anti- HLA-DR ou anti-HLA-DQ, uma forte inibição ocorre em todos os casos, o que indica que o p45 biotinilado possui alta capacidade de ligação ao HLA-DR e ao HLA-DQ em todas as linhas celulares.
Os peptídeos biotinilados P45 se ligam ao HLA-DRl, embora p45 não-biotinilado não se liga de forma notável a esta molécula HLA (Ver Figura 1) . Este fenômeno de maior ligação do peptídeo biotinilado também foi observado no peptídeo biotinilado HÁ (306-320) com relação ao HÁ (306- 320) não-biotinilado. Isto poderia indicar que a biotina estabiliza a ligação a molécula HLA de forma adicional ou que aumenta a sensibilidade da detecção da ligação com respeito â medição para competição com o peptídeo não- biotinilado. Os outros peptídeos da pesquisa foram não- biotinilados, o que significa que existe a possibilidade que também possam se ligar ao HLA-DQ.
TABELA 2. Inibição (%) de ligação de p45 biotinilado às moléculas HLA de diferentes linhas celulares. <table>table see original document page 24</column></row><table>
Observação: O grau de ligação às diferentes moléculas foi medido para competição com anticorpos (aDR: anti-HLA-DR; aDP: anti-HLA-DP; aDQ: anti-HLA-DQ; aCII: anti-Classe I).
EXEMPLO 3. Indução de respostas T de ajuda (Th).
De forma a verificar se os peptídeos sintetizados possuíam a capacidade de induzir respostas Th in vivo, camundongos transgênicos foram imunizados para a molécula HLA-DR4 com alguns dos peptídeos que haviam demonstrado capacidade de ligação com diversas moléculas HLA-DA. Para tanto, p37, p45, p61 e p62 foram escolhidos, usando ainda peptídeos PADRE para controle. Todos estes peptídeos demonstraram capacidade de ligação a diversas moléculas HLA-DA, enquanto apresentaram diferentes graus de ligação ao HLA-DR4. A capacidade de induzir Th foi avaliada através da medição da capacidade do peptídeo de induzir a proliferação celular e de induzir a produção de IFN-γ e IL4 em linfócitos extraídos dos camundongos imunizados.
Imunização
Camundongos fêmeas transgênicas HLA-DR4 obtidas da Taconic foram usadas (Germantown, NY, USA) as quais foram mantidas em condições livres de patógenos e testadas de acordo com os padrões de nossa instituição.
Para a indução de respostas Thi grupos de 3 camundongos foram imunizados (4-6 semanas de idade) com 200μl de uma emulsão 1:1 de adjuvante Freund completo e solução salina a qual continha 50 nanomoles do peptideo correspondente. Os animais imunizados foram sacrificados duas semanas após a imunização e os nodos linfáticos poplíteo, inguinal e periaórtico foram extraídos. Os nodos foram homogeneizados com uma seringa e lavados 3 vezes em um meio de lavagem (meio 1640 RPMI) a 4 °C. Em seguida, 5 χ 107 células/ml foram pulsadas em MC durante 2 horas a 37°C com 10 μΜ do peptideo correspondente.
Em seguida, foram centrifugadas e resuspensas e 2 χ 106 células/ml foram cultivadas em um volume de 2ml, em uma placa de 24 poços, em um forno a 37ºC com 5% CO2. Após 7 dias, as células foram lavadas e 5 χ 105 células T foram cultivadas por poço com 2 χ 105 células de baço singênico por poço, tratadas com mitomicina-C, na ausência ou presença do antígeno correspondente. 50μ1 do sobrenadante foram coletados para medir IFN-γ e IL-4 como na seção anterior. A proliferação celular foi medida. Medição da proliferação celular.
Após 48 horas em cultura, as células foram pulsadas com 0.5 μCi de timidina tritiada durante 18 horas, sendo então colhidas e a incorporação de timidina foi determinada em um contador de cintilação (Top-count, Packard, Meridan, CT, USA). Medição de IFN-χ e produção de IL-4
As quantidades de IFN-γ e IL-4 foram medidas usando ELISA comercial (OPTEIA Mouse IFN-γ Set, Pharmingen, San Diegof USA e OPTEIA Mouse IL-4 Set, Pharmingen, San Diego, USA) de acordo com as instruções do fabricante. Os resultados foram expressos em pg/ml usando uma curva padrão das quantidades conhecidas de citoquinas. Resultados
Os resultados (Figura 4) revelam que a maior proliferação (maior incorporação de timidina tritiada) e produção de IFN-γ é produzida naqueles camundongos imunizados com os peptídeos p45 e PADRE. 0 peptldeo P45 estimulou consideravelmente a produção de IFN-γ e pouco ou nada a produção de IL-4, enquanto que o peptideo PADRE estimulou tanto a produção de IFN-γ como a de IL-4. Estas observações permitem concluir que para a restrição HLA-DR4, p45 e PADRE induzem respostas T de ajuda correspondentes aos perfis das citoquinas Thl e ThO respectivamente. Os peptídeos p3 7, p61 e p62 não produziram proliferação, nem a produção de IFN-γ. No entanto, p37 e p62 provocaram a produção de IL-4.
EXEMPLO 4. Indução de respostas T citotóxicas (CT).
De forma a estudar a capacidade dos peptídeos de colaborar na indução de respostas efetoras CT, camundongos (transgênicos para HLA-DR4) foram imunizados com p37, p45, p61, p62 ou com peptideo de controle PADRE, juntamente com peptideo SIINFEKL [OVA(257-264)] . SIINFEKL é um determinante T citotóxico (CTd) que se liga à molécula H- 2kb Classe I. Imunização e medição de Iise
Para induzir resposta citotóxica, dois camundongos de 4 a 6 semanas de idade foram imunizados subcutâneamente com 200μl de uma emulsão 1:1 de adjuvante Freund incompleto e solução salina que continha 50 nanomoles do peptídeo correspondente.
Os animais foram sacrificados entre 10 e 12 dias após a imunização para extrair os nodos linfáticos popliteo, inguinal e periaórtico. Estes nodos foram homogeneizados com uma seringa para obter uma suspensão celular e foram lavados 3 vezes em 1640 RPMI.
As células obtidas foram incubadas com o determinante citotóxico SIINFELK (10μΜ) durante 2 horas a 37°C, foram lavadas 2 vezes e cultivadas em placas de 24 poços a uma concentração de .5 x 10"6 células/poço. Dois dias mais tarde, 2.5 U/ml de IL-2 foram adicionados à cultura e cinco dias após a atividade citotóxica foi medida, seguindo a metodologia descrita por Brunner (Brunner KT; "Quantitative assay of the lytic action of immune lymphoid cells on 51- Cr-Iabelled allogeneic target cells in vitro; inhibition by isoantibody and by drugs"; Immunology, 1968; 14:181).
A atividade citotóxica foi testada pela medição da liberação de 51Cr das células alvo, previamente etiquetadas. As células alvo usadas foram células do timo (H-2b) El-4 (Referência ATCC: TIB-39). Para sua marcação,5ΟμCi de 51Cr04Na2 foram adicionados para cada 106 células alvo em um volume final de 100μl e foram incubadas na ausência ou presença do peptídeo SIINFELK (a uma concentração de 10μΜ) durante 2 horas a 37°C. Após 3 lavagens em 1640 RPMI, foram resuspensas em 1 ml de MC. 0 teste foi efetuado em placas de 96 poços com fundo em formato de U. As células efetoras e as células alvo foram adicionadas separadamente (3000 por poço). Diferentes proporções de células efetoras foram testadas com relação às células alvo, em diluições em série (100, 33, 11 e 3). Cada teste foi feito em triplicata. 0 volume final de cada poço era 2 00μ1.
As placas foram incubadas durante 4 horas a 37°C. Em seguida, 50μ1 de sobrenadante foi extraído de cada poço e a radioatividade foi medida em um contador de cintilação.
A percentagem de Iise específica foi calculada de acordo com a fórmula abaixo:
<formula>formula see original document page 28</formula>
O li se máximo foi determinado medindo-se o cpm (contagem por minuto) de 3 000 células alvo incubadas com 5% Triton X-100 e a Iise espontânea de células incubadas na ausência de células efetoras.
A porcentagem de Iise indicada corresponde ao Iise neto: valor do Iise contra as células animais imunizadas nas quais o substrato de Iise foi observado contra as células animais sem imunização. Resultados
Os resultados, apresentados na Figura 5, mostra que todos os peptídeos com exceção de p61 e PADRE fornecem colaboração Th para a indução de linfócitos específicos para SIINFEKL CT. Além disso, foi possível observar um efeito de dose-resposta de modo que cada peptídeo atua melhor a uma dosagem diferente.
EXEMPLO 5. Indução de respostas T de ajuda in vitro em doadores.
De modo a determinar se os peptídeos p37, p4 5 e p62 poderiam ser reconhecidos pelos linfócitos humanos Th de uma população variada, foram feitos experimentos com células mononucleares de sangue periférico extraído do cordão umbilical de doadores.
As células extraídas foram purificadas usando o método Ficoll (Noble PB, Cutts JH, Carroll, KK; Ficoll flotation for the separation of blood leukocyte types; Blood, 1968; 31:66-73). Uma vez purificadas, as células (3 x 10"6 células/ml) foram pulsadas por 2 horas com 10 μΜ do peptídeo em questão. As células pulsadas foram lavadas e dispostas em placa (10"5 células/poço) em placas de 96 poços de fundo plano. No terceiro e sétimo dias foi adicionado IL-2. Quinze dias mais tarde, as células de cada poço foram subdivididas em dois, para contrastar respectivamente com células (IO5 células/poço) tratadas com mitomicina C, com ou sem cada um dos peptídeos p37, p45, p62 ou PADRE. Após 2 dias foi coletado 50μ1 de cada sobrenadante e mantido congelado a -20°C até o momento em que a quantidade de IFN- γ foi quantificada por ELISA. As células foram pulsadas no terceiro dia, durante 18 horas com 0.5μCi de timidina tritiada. Foram então colhidas e a incorporação da timidina foi medida em um contador de cintilação. Tipificação de doadores HLA-DR
Primeiro, o DNA foi extraído das células mononucleares de sangue periférico de cada doador. 0 mini Kit DNA QIAmp (Qiagen, Valenciaf USA) foi usado e o protocolo indicado pelo fabricante foi seguido.
Para a modalidade da tipificação do DNA extraído o kit Plus Inno-Lipa HLA-DRBl (Innogeneticsf Ghent, Bélgica) foi usado, seguindo o protocolo indicado pelo fabricante.
Resultados
A Tabela 3 indica o número de poços positivos para cada peptídeo e doador. Somente aqueles poços que mostraram um índice de simulação igual ou maior que 3 foram considerados positivos. O índice de simulação (SI) foi expresso como o quociente entre as contagens por minuto entre o poço com o peptídeo e o poço sem o peptídeo.
Tabela 3. Reconhecimento de peptídeos por linfócitos de doadores humanos. O número máximo de poços positivos possível foi 48 por peptídeo e doador. N indica o total de poços positivos contra cada peptídeo, considerando os 16 doadores.
TABELA 3
<table>table see original document page 30</column></row><table> <table>table see original document page 31</column></row><table>
A partir da Tabela 3 pode ser concluído que:
- os peptídeos p45 e PADRE foram mais facilmente reconhecidos pelos linfócitos dos 16 doadores; e que
- todos foram reconhecidos ao menos por 50% dos indivíduos. LISTAGEM DE SEQÜÊNCIA
<110> PROYECTO DE BIOMEDICINA CIMA S.L.
<120> NOVOS PEPTÍDEOS DETERMINANTES ANTÍGENOS DE RESPOSTAS - DE AJUDA (THD)
<130> PNPOOl 125
<140> PI0620243-8 <141> 2008-06-23
<150> SPAIN P200503169 <151> 2005-12-23
<160> 25
<170> Versão PatentIn 3.1
<210> 1 <211> 13 <212> PRT
<213> Seqüência artificial <220>
<223> Estrutura Sintética; Peptídeo Quimérico <400> 1
Phe Lys Tyr Arg Met Met Met Arg Met Arg Ala Ala Ala 1 5 10
<210> 2 <211> 9 <212> PRT
<213> Seqüência artificial
<220>
<223> Estrutura Sintética; Peptídeo Quimérico <400> 2
Tyr Arg Met Met Met Arg Met Arg Ala 1 5
<210> 3 <211> 8 <212> PRT
<213> Seqüência artificial <220>
<223> Estrutura Sintética; Peptídeo Quimérico <400> 3
Tyr Arg Met Met Met Arg Met Arg 1 5
<210> 4 <211> 13 <212> PRT
<213> Seqüência artificial <220>
<223> Estrutura Sintética; Peptídeo Quimérico <400> 4
Phe Arg Tyr Arg Met Met Met Arg Met Arg Ala Ala Ala 1 5 10
<210> 5 <211> 13 <212> PRT
<213> Seqüência artificial <220>
<223> Estrutura Sintética; Peptídeo Quimérico <400> 5
Tyr Arg Tyr Arg Met Met Met Arg Met Arg Ala Ala Ala 1 5 10
<210> 6
<211> 13
<212> PRT
<213> Seqüência artificial
<220>
<223> Estrutura Sintética; Peptídeo Quimérico <400> 6
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<210> 7 <211> 13 <212> PRT <213> Seqüência artificial <220>
<223> Estrutura Sintética; Peptídeo Quimérico <400> 7
Phe Lys Tyr Arg Arg Met Met Arg Lys Arg Ala Ala Ala 1 5 10
<210> 8 <211> 9 <212> PRT
<213> Seqüência artificial
<220>
<223> Estrutura Sintética; Peptídeo Quimérico <400> 8
Tyr Arg Ala Met Arg Ala Met Arg Ala 1 5
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<213> Seqüência artificial <220>
<223> Estrutura Sintética; Peptídeo Quimérico <400> 9
Tyr Arg Ala Met Arg Ala Met Arg 1 5
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<220>
<223> Estrutura Sintética; Peptídeo Quimérico <400> 10
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<210> 11 <211> 13 <212> PRT
<213> Seqüência artificial
<220>
<223> Estrutura Sintética; Peptídeo Quimérico
<400> 11
Phe Lys Tyr Arg Ala Met Arg Ala Met Arg Ala Ala Ala 1 5 10
<210> 12 <211> 13 <212> PRT
<213> Seqüência artificial
<220>
<223> Estrutura Sintética; Peptídeo Quimérico
<400> 12
Phe Lys Tyr Arg Ala Met Arg Cys Met Arg Ala Ala Ala 1 5 10
<210> 13
<211> 13
<212> PRT
<213> Seqüência artificial
<220>
<223> Estrutura Sintética; Peptídeo Quimérico
<400> 13
Phe Lys Tyr Arg Ala Met Arg Arg Arg Arg Ala Ala Ala 1 5 10
<210> 14
<211> 13
<212> PRT
<213> Seqüência artificial <220>
<223> Estrutura Sintética; Peptídeo Quimérico
<400> 14
Phe Lys Tyr Arg Arg Met Arg Arg Arg Arg Ala Ala Ala 1 5 10 <210> 15 <211> 13 <212> PRT
<213> Seqüência artificial <220>
<223> Estrutura Sintética; Peptídeo Quimérico <400> 15
Phe Lys Tyr Arg Trp Met Arg Ala Met Arg Ala Ala Ala 1 5 10
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<213> Seqüência artificial
<220>
<223> Estrutura Sintética; Peptídeo Quimérico <400> 16
Phe Lys Tyr Arg Gln Met Met Ala Pro His Ala Ala Ala 1 5 10
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<213> Seqüência artificial
<220>
<223> Estrutura Sintética; Peptídeo Quimérico <400> 17
Phe Lys Tyr Arg Ala Met Arg Arg Arg His Ala Ala Ala 1 5 10
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<213> Seqüência artificial <220>
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<223> Estrutura Sintética; Peptídeo Quimérico <400> 19
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<220>
<223> Estrutura Sintética; Peptídeo Quimérico <400> 20
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<210> 21 <211> 13 <212> PRT
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<220> <223> Estrutura Sintética; Peptídeo Quimérico <400> 22
Phe Lys Tyr Arg Trp Val Arg Ala Leu Arg Ala Ala Ala 1 5 10
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<220>
<223> Estrutura Sintética; Peptídeo Quimérico <400> 23
Ala Lys Phe Val Ala Ala Trp Thr Leu Lys Ala Ala Ala 1 5 10
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<213> Seqüência artificial
<220>
<223> Estrutura Sintética; Peptídeo Sintético <400> 24
Ala Pro Lys Tyr Val Lys Gln Asn Thr Leu Lys Leu Ala Thr Gly 15 10 15
<210> 25 <211> 8 <212> PRT
<213> Seqüência artificial
<220>
<223> Estrutura Sintética; Peptídeo Sintético <400> 25
Ser Ile Ile Asn Phe Glu Lys Leu 1 5
Claims (14)
1. Peptídeo quimérico capaz de se ligar à pelo menos uma forma alélica da molécula HLA-DR, caracterizado pelo fato de que sua seqüência de aminoácidos tem a fórmula : a1-a2-Y-Ra4-a5-M-a7-R-a9-R-A-A-A em que Y é Tyr; R é Arg; M é Met; A é Ala; ai é Phe ou Tyr; a2 é Lys ou Arg e a5, a7 e a9 são qualquer um dos 20 aminoácidos naturais.
2. Peptideo quimérico, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a forma alélica HLA-DR é selecionada entre: HLA-DRl, HLA-DR2, HLA- DR3, HLA-DR4, HLA-DR7, HLA-DR8 OU HLA-DRll.
3. Peptideo quimérico, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que é capaz de se ligar a pelo menos duas formas alélicas de HLA-DR.
4. Peptideo quimérico, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que induz a ativação de células T de ajuda (Th).
5. Peptideo quimérico, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que induz a ativação de células T citotóxicas (CT).
6. Peptideo quimérico, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que possui uma seqüência selecionada entre SEQ.ID.NO:1, SEQ.ID.N0:4, SEQ.ID.NO:5, SEQ.ID.N0:7, SEQ.ID.NO:11, SEQ.ID.NO:13, e SEQ.ID.NO:14.
7. Peptideo quimérico, de acordo com a reivindicação 1, catacterizado pelo fato de que possui uma seqüência selecionada entre SEQ. ID NO: 1, SEQ. ID. NO: 4 e SEQ. ID. NO:5.
8. Composição farmacêutica, caracterizada pelo fato de compreender pelo menos um peptideo conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 7 e um excipiente farmaceuticamente aceitável.
9. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 8, caracterizada pelo fato de compreender outro imunógeno.
10. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 8, caracterizada pelo fato de compreender um determinante T citotóxico (CTd) e um determinante T de ajuda (Thd) , em que o determinante Thd é um peptideo conforme descrito em uma das reivindicações 1 a 7.
11. Uso de um peptideo quimérico conforme descrito na reivindicação 1, caracterizado por ser para o preparo de uma composição farmacêutica útil para estimular a resposta imuno.
12. Uso de um peptideo quimérico, de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo fato de que a referida composição farmacêutica é útil para induzir a ativação de células T de ajuda Th (Thl, Th2 ou ThO) .
13. Uso de um peptideo quimérico, de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo fato de que a referida composição farmacêutica é útil para induzir uma resposta citotóxica T imuno (CTL) .
14. Uso de um peptideo quimérico, de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo fato de que a referida composição farmacêutica é útil para induzir uma resposta imuno humoral.
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