MX2008008036A - Nuevos peptidos determinantes antigenicos t coloaboradores (dth) - Google Patents

Abstract

La presente invención se refiere a un péptido quimérico con capacidad de unirse al menos a una forma alélica de la molécula HLA-DR. Asimismo, la invención se refiere a una composición farmacéutica que comprende dicho péptido, asícomo a distintos usos del mismo.

Description

NUEVOS PEPTIDOS DETERMINANTES ANTIGENICOS T COLABORADORES (DTh) CAMPO DE LA TÉCNICA La presente invención se encuentra dentro del campo de la determinación de péptidos antigénicos, capaces de estimular las respuestas T colaboradoras (LTh) .

ESTADO DE LA TÉCNICA ANTERIOR A LA INVENCIÓN Los linfocitos T colaboradores (LTh) realizan diversas funciones importantes en la inmunidad frente a patógenos. En primer lugar, la inducción de una respuesta inmune efectora eficaz, bien sea una respuesta humoral o una respuesta celular citotóxica, requiere de la activación de LTh, y más concretamente de subpoblaciones específicas de LTh (Thl, Th2 , ThO) . En segundo lugar, los LTh pueden actuar también directamente como células efectoras, una actividad mediada por contacto celular directo o por la liberación de linfoquinas (IFN-?, TNF-a, etc.). Por tanto, la estimulación de respuestas T colaboradoras (Th) constituye un aspecto muy relevante para el desarrollo de vacunas. Es bien conocido como para lograr su efecto estimulador, los LTh reconocen, a través de receptores específicos (TCR) situados en su superficie, a complejos formados entre moléculas MHC de Clase II y péptidos antigénicos. Estos péptidos que se unen a las moléculas MHC Clase II, conocidos también como epítopos Th o determinantes antigénicos Th (DTh) , tienen habitualmente tamaños entre 11 y 22 aminoácidos, y más frecuentemente entre 13 y 16 aminoácidos.

En los últimos años, las vacunas basadas en epítopos han despertado un interés considerable como posible herramienta en el desarrollo de nuevas vacunas y estrategias inmunoterapéuticas . Una cuidada selección de epítopos para células B y T debería permitir dirigir las respuestas inmunes hacia epítopos conservados de ciertos patógenos caracterizados por una gran variabilidad de secuencia (por ejemplo malaria, virus de la hepatitis C, VIH, etc.) . Por otra parte, las vacunas basadas en epítopos ofrecen la oportunidad de incluir DTh quiméricos que han sido fabricados para modular su potencia estimuladora, bien sea aumentando su capacidad de unión a las moléculas MHC del complejo principal de histocompatibilidad, o bien modificando los residuos de contacto con los receptores TCR de células T, o bien modificando ambas características. Debido a la naturaleza quimérica de estos péptidos, existen muy pocas posibilidades de que su secuencia esté contenida en antígenos propios, por lo que si tras su utilización se indujeran anticuerpos frente a los péptidos habría poca probabilidad de inducir respuestas indeseadas contra antígenos propios. La predicción y selección de los epítopos apropiados tropieza sin embargo con un obstáculo importante: el gran número de polimorfismos existente entre las moléculas MHC, que afectan muy particularmente a las regiones de unión al epítopo y de reconocimiento de los LTh. Este polimorfismo se produce como resultado del carácter poligénico del complejo principal de histocompatibilidad MHC y del gran número de variantes alélicas existentes para cada uno de estos loci genéticos. Así por ejemplo, el MHC Clase II humano comprende 3 pares de genes (cada par con su cadena a y ß) , denominados HLA-DR, HLA-DP y HLA-DQ, que dan lugar a 4 tipos básicos de moléculas HLA Clase II. Una revisión general puede encontrarse en el manual : Immunobiology - The immune system in health and disease; Jane ay CA Jr and Travers P Eds.; Current Biology Ltd / Garland Publishing Inc., London, 1997 3rd Ed. Este polimorfismo da lugar por tanto a la expresión de muchas moléculas MHC distintas, cada una de ellas con rangos diferentes de especificidad para la unión de epítopos (restricción MHC) .

Aunque los residuos polimórficos específicos de alelo que bordean el surco de unión al epítopo otorgan a la molécula MHC la capacidad de unirse a un cierto conjunto de péptidos, hay bastantes casos en los que un mismo péptido es capaz de unirse a más de una forma alélica de la molécula MHC. Esto se ha constatado de modo particular para las moléculas HLA-DR, donde varias formas alélicas HLA-DR pueden reconocer motivos similares de péptidos, al mismo tiempo que se ha comprobado que ciertos péptidos son reconocidos por diferentes moléculas HLA-DR. Esto ha llevado al concepto de que ciertos péptidos podrían representar epítopos promiscuos o universales. Así, la utilización de diferentes algoritmos ha permitido definir diversos motivos útiles para la selección de epítopos, habiéndose identificado algunos epítopos universales reconocidos por un buen número de isoformas de las moléculas HLA, y más particularmente de las HLA-DR ( O95/07707; Alexander J et al. Immumty, 1994, 1:751-761; W098/32456) . Este último tipo de péptidos más promiscuos, podrían ser de gran utilidad para inducir respuestas humorales y celulares en una gran diversidad de individuos sanos, lo que evitaría tener que elegir péptidos especiales según fuera el HLA-DR de dichos individuos. Aunque se disponga ya de un conjunto de estos péptidos promiscuos, como los péptidos PADRE (Alexander J et al. Immunity, 1994, 1:751-761), sigue siendo interesante identificar nuevos péptidos quiméricos promiscuos. Esto es debido a que a pesar de que todos estos péptidos comparten el ser reconocidos por varios HLA-DR, unos péptidos podrían resultar mejores que otros para el reconocimiento por un HLA-DR en concreto. Por consiguiente, sería de gran utilidad disponer de una batería más amplia de péptidos promiscuos para así cubrir mejor la inducción de respuestas frente a la totalidad de los HLA-DR. Además, es también deseable identificar péptidos que se unan y puedan ser reconocidos en el contexto del resto de isotipos HLA-DP y HLA-DQ. Esto permitiría generar vacunas y productos inmunoterapéuticos para un espectro más amplio de personas.

EXPLICACIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN Con el propósito de identificar nuevos péptidos quiméricos que tuvieran el potencial de unirse fuertemente a diferentes moléculas HLA-DR, y en consecuencia, ser capaces de proporcionar ayuda para la inducción de anticuerpos y también de respuestas T citotóxicas, se sintetizaron un conjunto de péptidos de 13 aminoácidos. Para ello, se establecieron unas fórmulas o patrones de secuencia ideados tomando como referencia de partida un motivo de 8 aminoácidos descrito por los propios inventores (Borras-Cuesta F. et al.; Specific and general HLA-DR binding motifs: comparison algorithms; Human Immunol . , 2000; 61:266-278). Primeramente se sintetizaron péptidos cuya secuencia se ajustaba a la fórmula: I ) a?-a2-Y-R-a5-M-a7-R-a9-R-A-A-A; donde Y es Tyr; R es Arg; M es Met; A es Ala; ax es Phe o Tyr; a2 es Lys o Arg; a5/ a7 y a9 son cualquiera de los 20 aminoácidos naturales. En todos los casos se utilizó una tirosina como ancla primaria en el tercer residuo (primer residuo del motivo anteriormente referenciado) . Además, para alcanzar la longitud típica de 13 aminoácidos en la mayoría de los DTh (Chicz R.M. et al.; Predominant naturally processed peptides bound to HLA-DR1 are derived from MHC-related molecules and are heterogeneous in size; Nature, 1992; 358: 764-768), al núcleo de 8 aminoácidos se le agregaron tres alaninas en su extremo C-terminal y otros dos aminoácidos en su extremo N-terminal : un aminoácido aromático (fenilalanina o tirosina) en el primer residuo y un aminoácido con carga positiva (lisina o arginina) en el segundo residuo. La utilización de fenilananina o tirosina en el primer residuo proporciona un punto de anclaje adicional. Además, en dicha fórmula se fijaron los aminoácidos que ocuparían las posiciones 4, 6, 8 y 10 de los péptidos. A partir de esta primera fórmula se establecieron otras fórmulas para la síntesis y evaluación de péptidos, en las que se dejó abierta la posibilidad de variar dos de los cuatro aminoácidos fijados en las posiciones 4, 6, 8 y 10 anteriormente indicadas . Las fórmulas ensayadas fueron las siguientes : II ) a?-a2-Y-R-a5-M-a7-a8-a9-a?o-A-A-A; III ) a?-a2-Y-a4-a5-M-a7-a8-a9-R-A-A-A; IV ) a?-a2-Y-R-a5-a6-a7-a8-a9-R-A-A-A; donde Y es Tyr; R es Arg; M es Met; A es Ala; ai es Phe o Tyr; a2 es Lys o Arg; a4 es cualquiera de los 20 aminoácidos naturales distinto de Arg; a5, a7 y a9 son cualquiera de los 20 aminoácidos naturales; a6 es cualquiera de los 20 aminoácidos naturales distinto de Met; a8 es cualquiera de los 20 aminoácidos naturales distinto de Arg; y a10 es cualquiera de los 20 aminoácidos naturales distinto de Arg.

Igualmente se sintetizó un péptido de secuencia: V ) SEQ. ID. NO: 21, en el que se variaron los aminoácidos en 3 de las posiciones fijadas inicialmente, manteniendo la metionina en la posición 6. Con fines comparativos se sintetizaron también algunos péptidos cortos de 8 y 9 aminoácidos que también tenían como ancla primaria tirosina y en la mayoría de las posiciones restantes del núcleo, aminoácidos que favorecen la unión a HLA-DR. Una vez sintetizados se evaluó su capacidad para unirse fuertemente a distintas formas alélicas de la molécula HLA-DR, resultando que la mayoría de ellos era capaz de unirse fuertemente al menos a una de las formas alélicas. De lo anterior se obtuvo una secuencia general. Así, en una primera realización, la presente invención se refiere a un péptido quimérico con capacidad para unirse al menos a una forma alélica de la molécula HLA-DR, caracterizado porque su secuencia de aminoácidos se ajusta a una fórmula seleccionada entre: a) a?-a2-Y-a4-a5-a6-a7-a8-a9-a?o-A-A-A; y b) SEQ. ID. NO: 21; donde Y es Tyr; A es Ala; ai es Phe o Tyr; a2 es Lys o Arg; a4 es Arg, excepto cuando a6 y ai0 son Met y Arg, respectivamente, donde a4 puede ser cualquiera de los aminoácidos naturales; a5, a7 y a9 son cualquiera de los 20 aminoácidos naturales; a6 es Met excepto cuando a y a10 son Arg, caso en el que ae es cualquiera de los aminoácidos naturales; a8 es Arg, excepto cuando a4 es Arg, Tyr o His, a6 es Met o Val y a?0 es Met, His o Arg, caso en el que a8 es cualquiera de los aminoácidos naturales; y a10 es Arg, excepto cuando a4 es Arg o His y a6 es Met, caso en el que ai0 es cualquiera de los aminoácidos naturales . Por tanto, un segundo aspecto de la presente invención se refiere a un péptido quimérico con capacidad para unirse al menos a una forma alélica de la molécula HLA-DR cuya secuencia de aminoácidos se ajusta a una de las fórmulas I) , II), III), y IV) definidas anteriormente. En adelante nos referiremos a él como "péptido quimérico de la invención" o como "péptido de la invención" . En una realización particular dicha forma alélica HLA-DR corresponde al serotipo HLA-DR1, HLA-DR2, HLA-DR3 , HLA-DR4, HLA-DR7 , HLA-DR8 o HLA-DR11. En una realización particular, el péptido quimérico de la invención se une fuertemente al menos a 2 formas alélicas de HLA-DR de distinto serotipo, y preferentemente a 3, 4, 5, 6 o incluso 7 de estas formas alélicas. En algunos casos, el péptido quimérico de la invención puede unirse también a otros isotipos de moléculas HLA Clase II, por ejemplo HLA-DP o HLA-DQ. En una realización particular se unen también a algunas formas alélicas de HLA-DQ. En una realización preferente, el péptido quimérico de la invención se comporta como un epítopo o determinante antigénico Th (DTh) . Los términos epítopo Th o DTh se utilizan indistintamente y significan que dicho péptido, unido a la molécula HLA, es reconocido por linfocitos Th, y es capaz de inducir la activación de dichos linfocitos o células T colaboradoras Th (respuesta Th) . Esta activación se evidencia por su capacidad para inducir la proliferación de linfocitos Th y para inducir la producción de linfoquinas específicas de estos linfocitos Th, como la IL-4, el IFN-? o el TNF-a. La respuesta Th inducida puede ser una respuesta Thl, Th2 , o una respuesta mixta ThO . Esta capacidad de actuar como DTh es posible en el contexto de al menos una de las formas de HLA-DR, HLA-DP o HLA-DQ indicadas. De modo preferente, el péptido quimérico de la invención es capaz también de inducir una respuesta inmunitaria efectora humoral o T citotóxica. En una realización dicha respuesta es una respuesta Te. En una realización particular, el péptido quimérico de la invención es un péptido de secuencia SEQ. ID. NO: 1, SEQ. ID. NO: 4, SEQ. ID. NO: 5, SEQ. ID. NO: 6, SEQ. ID. NO: 7, SEQ. ID. NO: 10, SEQ. ID. NO: 11, SEQ. ID. NO: 12, SEQ. ID. NO: 13, , SEQ. ID. NO: 14, SEQ. ID. NO: 15, SEQ. ID. NO: 16, SEQ. ID. NO: 17, SEQ. ID. NO: 20 o SEQ. ID. NO: 22. Los péptidos quiméricos de la invención pueden obtenerse por métodos convencionales, por ejemplo, mediante técnicas de síntesis química en fase sólida; purificarse mediante cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) ; y, si se desea, se pueden analizar mediante técnicas convencionales, por ejemplo, mediante secuenciación y espectrometría de masas, análisis de aminoácidos, resonancia magnética nuclear, etc. Alternativamente, los péptidos de la invención pueden también obtenerse mediante la tecnología del ADN recombinante . Los péptidos quiméricos de la invención podrían utilizarse para administración a un sujeto (un hombre, una mujer o cualquier otro animal mamífero) con fines inmunoprofilácticos o inmunoterapéuticos . Por tanto, en otro aspecto la invención se refiere también a una composición farmacéutica que contiene un péptido quimérico de la invención (o una pluralidad de ellos) y un excipiente farmacéuticamente aceptable. En una realización particular, un péptido quimérico de la invención (o una pluralidad de ellos) puede ser administrado en una combinación inmunoestimuladora junto con otro u otros inmunógenos distintos de los péptidos quiméricos de la invención. Esta combinación puede presentarse en forma de una única composición farmacéutica o de composiciones farmacéuticas separadas para administración combinada, mediante una administración simultánea o secuencial, por la misma vía de administración o por vías distintas. Así, la presente invención se refiere también a una composición farmacéutica caracterizada porque comprende un péptido quimérico de la invención y otro inmunógeno. El término "inmunógeno" se refiere a una molécula que es capaz de inducir una respuesta in unológica específica frente a dicho inmunógeno (humoral: producción de anticuerpos; o celular: activación de linfocitos Th, activación de linfocitos Te, etc.) . Por su naturaleza química el inmunógeno podría ser casi cualquier molécula: por ejemplo, polipéptidos, lipopéptidos, oligosacáridos, polisacáridos, ácidos nucleicos, lípidos, u otros compuestos químicos como fármacos. Por su origen, dicho inmunógeno puede proceder por ejemplo de un patógeno (virus, bacteria, hongo, parásito, etc.), de una célula tumoral, de síntesis (fármacos u otros compuestos de síntesis) o de cualquier otro origen (por ejemplo alérgenos) . En algunos casos dicho inmunógeno es un determinante antigénico proteico, por ejemplo un determinante antigénico Th o un determinante antigénico Te. En una realización más particular la composición farmacéutica de la invención contiene un determinante T citotóxico (DTc) y un péptido quimérico de la invención (o una pluralidad de ellos) que actúa como determinante T colaborador (DTh) . Cuando la composición farmacéutica contiene un péptido quimérico de la invención y otro u otros inmunógenos, estos pueden presentarse como moléculas separadas o formando conjugados, por ejemplo mediante enlaces covalentes. La conjugación puede realizarse por diversos métodos convencionales que se describen por ejemplo en: "The current protocols in protein chemistry" , publicado por John Wiley & Sons (actualizado periódicamente; Última actualización 1 de mayo de 2005); "Immobilized affinity ligand Techniques" , GT Hermanson, AK Mallia and PK Smith, Academic Press, Inc. San Diego, CA, 1992; EP0876398; entre otros.

La composición farmacéutica que comprende un péptido quimérico de la invención puede contener adicionalmente vehiculizantes , excipientes, y otros ingredientes farmacéuticamente aceptables conocidos. Todavía en otro aspecto adicional la invención se refiere al uso de un péptido quimérico de la invención (o una pluralidad de ellos) en la preparación de una composición farmacéutica inmunoestimuladora . Esta composición farmacéutica puede emplearse para inducir una respuesta inmunitaria específica frente a un inmunógeno administrado en combinación con un péptido quimérico, dentro de la misma composición o en composiciones separadas como se ha descrito anteriormente. De esta manera, el péptido quimérico de la invención se emplea para inducir una respuesta Th (activación de linfocitos Th) en un sujeto al que se le administra la composición farmacéutica. Dicha respuesta puede ser una respuesta Thl, Th2 o una respuesta mixta ThO . En una realización concreta, esta respuesta Th coopera en la activación de linfocitos B, de manera que la composición farmacéutica con el péptido quimérico es útil para inducir una respuesta inmunitaria humoral . En otra realización, la respuesta Th colabora en la activación de linfocitos Te, de manera que la composición farmacéutica es útil para inducir una respuesta celular T citotóxica Te. Adicionalmente, la composición farmacéutica inmunoestimuladora con el péptido quimérico de la invención podría tener otros usos, como por ejemplo el tratamiento o pre-condicionamiento in vi tro de células dendríticas con fines terapéuticos. En consecuencia, la composición farmacéutica inmunoestimuladora que contiene un péptido quimérico de la invención es útil para el tratamiento y profilaxis de una enfermedad infecciosa (bacteriana, viral, fúngica, o parasitaria), tumoral o alérgica. La composición farmacéutica inmunoestimuladora de la invención puede aplicarse a cualquier sujeto animal o humano: p.ej. mamíferos (humanos o no), aves y similares. Para ello puede emplearse cualquier vía de administración adecuada de acuerdo con los métodos convencionales conocidos de la técnica común. Una revisión de las distintas formas farmacéuticas de administración de medicamentos y de los excipientes necesarios para la obtención de las mismas puede encontrarse, por ejemplo, en "Tecnología farmacéutica", de J.L. Vila Jato, 1997 Vols I y II, Ed. Síntesis, Madrid; o en "Handbook of pharmaceutical manufacturing formulations" , de S.K. Niazi, 2004 Vols I a VI, CRC Press, Boca Ratón. En una realización concreta, la composición farmacéutica se administra por vía parenteral (por ejemplo, intravenosa, subcutánea, intramuscular, intraperitoneal), transdérmica, mucosa o similares. La invención proporciona también un método terapéutico y/o profiláctico que incluye administrar a un sujeto una composición farmacéutica que incluye un péptido quimérico de la invención (o una pluralidad de ellos) . Este método permite activar los linfocitos Th en dicho sujeto induciendo una respuesta Th que colabora bien en la estimulación de una respuesta humoral para la producción de anticuerpos, o bien en la estimulación de una respuesta citotóxica por la activación de linfocitos Te específicos frente a un inmunógeno. Dicho método puede ser un método para tratamiento terapéutico o profiláctico de una enfermedad infecciosa (bacteriana, viral, fúngica, o parasitaria), tumoral o alérgica .

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS Figura 1. Capacidad de unión de péptidos quiméricos a diferentes moléculas HLA-DR. Se expresa como porcentaje de unión relativa (%UR) , en términos relativos a la unión del péptido control HA(306-320) no biotinilado: APKYVKQNTLKLATG . La densidad de las cuadrículas representa un orden creciente de porcentaje, de acuerdo con la clave al pie de la figura.

Figura 2. Unión del péptido p45 biotinilado a la línea celular HLA-DR4. Se incubaron células HLA-DR4 con diferentes concentraciones de péptido biotinilado y se midió su fluorescencia (expresada como unidades arbitrarias de fluorescencia) , que es directamente proporcional a la concentración del péptido p45 biotinilado que se haya unido.

Figura 3. Porcentaje de inhibición de la unión del péptido p45 biotinilado a células que expresan HLA-DR4, en presencia de anticuerpos anti-HLA específicos: aDR, anti-HLA-DR; aDP, anti-HLA-DP; aDQ, anti-HLA-DQ; y anti-HLA Clase I.

Figura 4. Inducción de respuestas T helper en ratones transgénicos HLA-DR4 inmunizados con diferentes péptidos (50 nanomoles) : p37, p45, p61, p62 y PADRE. Las respuestas frente a cada péptido, se evaluaron a los 15 días: proliferación linfocitaria, producción de IFN-?, y producción de IL-4.

Figura 5. Inducción de respuestas T citotóxicas en ratones transgénicos HLA-DR4 inmunizados con un péptido DTc [50 nanomoles de OVA (257-264)] solo o junto con uno de los péptidos a ensayar como DTh: p37, p45, p61, p62 ó PADRE. Los ensayos se repitieron con diferentes concentraciones de péptido a ensayar: A) 50 nanomoles; B) 5 nanomoles; C) 0,5 nanomoles .

MODO DE REALIZACIÓN DE LA INVENCIÓN Ejemplo 1. Síntesis de péptidos Los péptidos para los ensayos de unión a moléculas HLA y de inducción de respuestas T colaboradoras (Th) y T citotóxicas (Te) se sintetizaron manualmente por el método de fase sólida de Merrifield, utilizando la tecnología Fmoc [(Merrifield RB; Solid phase synthesis. I. J Am Chem Soc, 1963; 85:2149); (Atherton E Procedures for solid phase synthesis. J Chem Soc Perkin Trans, 1989; 1:538)]. Tanto los péptidos a ensayar como los péptidos utilizados como control se sintetizaron por este mismo método (Tabla 1) .

Tabla 1. Péptidos sintetizados para los ensayos de unión a moléculas HLA y de inducción de respuestas T colaboradoras (Th) y citotóxicas (Te) .

Nombre Secuencia SEQ. ID. NO: p45 FKYRMMMRMRAAA 1 p44 YRMMMRMRA 2 p43 YRMMMRMR 3 p61 FRYRMMMRMRAAA 4 p62 YRYRMMMRMRAAA 5 p53 FKYRWMMR RAAA 6 p52 FKYRRMMRKRAAA 7 p41 YRAMRAMRA 8 p40 YRAMRAMR 9 p46 FKYRMMMAPMAAA 10 p42 FKYRAMRAMRAAA 11 p49 FKYRAMRCMRAAA 12 p50 FKYRAMRRRRAAA 13 p51 FKYRRMRRRRAAA 14 P57 FKYRWMRAMRAAA 15 P37 FKYRQMMAPHAAA 16 p48 FKYRAMRRRHAAA 17 p39 YRQMMAPHA 18 p47 YRAMRRRHA 19 p58 FKYYAMRCMRAAA 20 p56 FKYHQMMAPHAAA 21 p60 FKYR VRALRAAA 22 PADRE AKFVAA TLKAAA 23 HA(306-320) APKYVKQNTLKLATG 24 OVA(257-264) SIINFEKL 25 Para algunos ensayos se utilizaron también péptidos biotinilados: el péptido HA (306-320) (APKYVKQNTLKLATG) de la hemaglutinina del virus de la Influenza y p45. Estos péptidos se sintetizaron manualmente y se conjugaron con biotina (EZ-Link Sulfo-NHS-LC-Biotin; Pierce Biotechnology, Inc, Rockford, EEUU) . Para ello, una vez terminada la síntesis del péptido, este se mantuvo unido a la resina y se realizaron 10 lavados con una mezcla DMF-agua (7,5:2,5) para preparar la resina a este nuevo solvente. Se añadió biotina disuelta en este solvente, en proporción (1:1) con los miliequivalentes de la resina inicial. La mezcla se dejó reaccionar hora y media. A continuación, la resina se lavó 20 veces con DMF, y se repitió el proceso de reacción hasta 3 veces. Para comprobar que el péptido estaba biotinilado, se realizó el test de Kaiser (Kaiser, 1970; Color test for detection of free terminal amino groups in the solid-phase synthesis of peptides. Anal Biochem. 1970; 34:595-598). Se procedió al corte de la resina, liofilización y análisis por HPLC como en el apartado anterior. [(Merrifield RB; Solid phase synthesis. I. J Am Chem Soc, 1963; 85:2149); (Atherton E Procedures for solid phase synthesis. J Chem Soc Perkin Trans, 1989; 1:538) ] . El péptido PADRE se sintetizó con fines comparativos. Este, es un péptido similar a otro desarrollado anteriormente (Alexander J et al. I munity, 1994, 1:751-761) con el fin de inducir respuestas T helper en una amplia variedad de moléculas HLA-DR. Este péptido PADRE se diferencia del péptido descrito anteriormente en que se sintetizó con el aminoácido fenilalanina en lugar de la ciclohexilalanina original .

Ejemplo 2. Ensayos de unión de los péptidos a diferentes moléculas HLA. Unión a moléculas HLA -DR La medida de unión de los péptidos se llevó a cabo como describen Busch y cois. (Busch R, Rothbard J: Degenerate binding of immunogenic peptides to HLA-DR proteins on B cell surfaces. Int Immunol , 1990; 144:1849). En los experimentos de la presente invención se utilizaron las siguientes líneas de linfocitos B transformados por el virus de Epstein-Barr (EBV-BLCL) , cada una de ellas homocigóticas para moléculas HLA-DR diferentes: Tipaje Línea ECACC No. Tipaje molecular serológico HOM-2 88052005 DRB1 * 0101 DR1 T8 88052017 DRB1 *1501 DR2 RSH 88052021 DRB1*0302 /DRB3*0101 DR3 BOLETH 88052031 DRB1 *0401 /DRB4*0101 DR4 MOU 88052050 DRBl * 070l/DRB4*0101 DR7 OLGA 88052100 DRB1 *0802 DR8 SWEIG 88052037 DRB1 *1101/DRB3 *0202 DR11 Todas las líneas celulares se obtuvieron de la Colección Europea de Cultivos Celulares Animales (ECACC, PHLS, Salisbury, UK) . Brevemente, linfocitos B con diferentes moléculas HLA-DR (a 2,5xl05 células/pocilio) se coincubaron toda la noche con HA(306-320) biotinilado (10 µM) y HA(306-320) (100 µM) no biotinilado por un lado, ó con HA(306-320) (10 µM) biotinilado y el péptido a ensayar (100 µM) por otro. La incubación se realizó en medio completo MC (RPMI 1640 con 10% de suero de ternera fetal, 2mM de glutamina, 100 U/ml de penicilina, 100 µg/ml de estreptomicina, 5xl0"5 M de 2 ß-mercaptoetanol , y 0,5% (v/v) de piruvato sódico) . Al día siguiente se realizaron 2 lavados con 200 µl de medio de Fac's (PBS al 2,5% de suero fetal de ternera); se resuspendieron a 5 µg/ml de conjugado de estreptavidina-fluoresceína (Pierce) en 100 µl de medio de Fac's y se incubaron a 4 °C durante 30 minutos. A continuación se realizaron 2 lavados y las células se resuspendieron en 200 µl de medio de Fac's. La fluorescencia de la superficie celular se midió por citometría de flujo en un analizador FACScan (Becton Dickinson Immunocytochemistry System, Mountain, USA) . Se determinó la media de fluorescencia de 5.000 células marcadas. Se obtuvo una señal de fluorescencia proporcional al número de moléculas de HLA-DR expuestas en el exterior de la célula. Para cuantificar la capacidad de unión de cada péptido (% UniónPéPt?do) se utilizó la siguiente fórmula: % UnÍÓnpépt?do = 100 X ( ( Fpéptido _ Fb?co) / ( Fctrl biot _ Fblco) ) donde FPéPt?do es la fluorescencia medida para el péptido a ensayar; Fb?co es la fluorescencia medida sin péptido añadido (blanco) ; y Fctr?.blot es la fluorescencia medida para el péptido control [HA (306-320) ] biotinilado. Del mismo modo se calculó el porcentaje de unión utilizando como péptido a ensayar el péptido control [HA(306-320) ] no biotinilado (%Uniónctr?) : %Uniónctr? = 100 x ( ( Fctr? nobiot . - Fb?co) / ( Fctr? .blot - Fb?co) ) Se utilizó HA (306-320) como control de referencia, en lugar del péptido CPKYVKQNTLKLATG descrito previamente (Rothbard JB; Degenerate binding of immmunogenic peptides. Int Immunol 1990; 2:443-451), al objeto de impedir la formación de potenciales puentes disulfuro vía cisteína - NH2 terminal . Se calculó también el porcentaje de unión relativa (% UR) según la siguiente fórmula: % UR = 100 x (% UniónPéptido / % Uniónctr?) donde % UniónPéPtido es el porcentaje de unión del péptido a ensayar; y donde % Uniónctr? es el porcentaje de Unión del péptido control HA(306-320) no biotinilado. Todos los ensayos se realizaron por triplicado. La variación de las intensidades de fluorescencia de los triplicados estuvo siempre comprendida dentro del rango 5-10%. De esta manera se pudo obtener una valoración de la capacidad de unión de los distintos péptidos a las moléculas HLA-DR1, HLA-DR2, HLA-DR3 , HLA-DR4 , HLA-DR7, HLA-DR8, HLA-DR11, expresada en términos relativos a la unión del péptido HA(306-320) no biotinilado: APKYVKQNTLKLATG (Fig. 1) . De la Figura 1 se puede concluir que: la mayoría de los péptidos se unen con muy buena afinidad por lo menos a dos moléculas HLA-DR; en particular los péptidos p45, p61 y p62 se unen con buena afinidad a casi todas las moléculas HLA-DR estudiadas . Los péptidos p45, p61 y p62 exhibieron una capacidad de unión comparable o incluso superior al péptido PADRE ensayado.

Unión de p45 a moléculas HLA-DR, HLA-DP y HLA-DQ p45 resultó ser bastante insoluble. Al objeto de caracterizar mejor su capacidad de unión, y para descartar un posible efecto tóxico del péptido, se decidió realizar algunos ensayos complementarios utilizando p45 biotinilado. En primer lugar se realizaron ensayos de unión a HLA-DR en las diferentes líneas celulares, incubadas con p45 biotinilado a distintas concentraciones. Para evitar la posible cristalización del péptido, éste se solubilizó con la ayuda de un sonicador. Se midió la fluorescencia de la superficie celular por citometría de flujo en un analizador FACScan tal como se ve en el ejemplo 2, aunque no se realizó competición con el péptido p45 no biotinilado. La figura 2 muestra la fluorescencia medida en los ensayos de unión en la línea que expresa HLA-DR4. Como puede comprobarse, la unión del péptido es dosis-dependiente en el rango de concentraciones ensayado. En segundo lugar, se incubó la línea celular HLA-DR4 en presencia del péptido p45 biotinilado y anticuerpos seleccionados por su especificidad frente a HLA-DR, HLA-DP, HLA-DQ y HLA Clase I respectivamente (figura 3) .

En una placa de 96 pocilios con fondo en U se sembró la línea celular HLA-DR4 (ya definida anteriormente) ; (2xl05 por pocilio) , añadiendo también péptido p45 biotinilado (10 µM) , sólo ó junto con sobrenadante de los hibridomas L243 anti-HLA-DR (ATCC Ref: HB-55), ó W6/32 anti-Clase I (ATCC Ref: HB-95) ó los anticuerpos 33.1 anti-HLA-DQ ó anti-HLA-DP B7/21, que fueron proporcionados por Dra . Ghislaine Sterkers. Todos fueron diluidos a (1/500) en un volumen final de 100 µl de RPMI con 2,5 % de FBS . Al día siguiente se realizaron 2 lavados con 200 µl de medio de Fac's, se resuspendieron a 5 µg/ml de conjugado de estreptavidina-fluoresceína (Pierce) en 100 µl de medio de Fac's, y se incubaron a 4°C durante 30 minutos. A continuación se realizaron 2 lavados y las células se resuspendieron en 200 µl de medio de Fac's. La fluorescencia de la superficie celular se midió por citometría de flujo en un analizador FACScan. Se determinó la media de fluorescencia de 5.000 células marcadas, de manera que se obtuvo una señal de fluorescencia proporcional al número de moléculas de HLA expuestas en el exterior de la célula. Para cuantificar la disminución de la unión al añadir los anticuerpos, se utilizó la siguiente fórmula: % Inhibición = 100 x ( (Fp45+aHLA - Fb?co) / (Fp45 - Fblco) ) donde Fb?co es la fluorescencia medida cuando se cultivaron las células sin añadir péptido o anticuerpos (blanco) , Fp45 es la fluorescencia medida cuando se incubó con el péptido p45 biotinilado solo, y Fp45+aHA es la fluorescencia medida cuando se incubó con p45 biotinilado junto con los anticuerpos anti-HLA correspondientes. Todos los ensayos se realizaron por triplicado. La variación de las intensidades de fluorescencia de los triplicados estuvo siempre comprendida dentro del rango 5-10%. Como se puede observar en la Figura 3, la incubación con anticuerpos anti -HLA-DR o anti -HLA-DQ produce inhibición fuerte de la unión, lo que indica que p45 se une tanto a HLA-DR como a HLA-DQ, pero no a HLA-DP.

Del mismo modo, estos ensayos se repitieron sobre las líneas celulares HLA-DR1, HLA-DR3 , HLA-DR7, HLA-DR8, HLA-DR11. Los porcentajes de inhibición obtenidos se recogen en la Tabla 2. Como puede observarse, al incubar las células con p45 biotinilado en presencia de anti-HLA-DR o anti-HLA-DQ se produce una fuerte inhibición en todos los casos, lo que indica que p45 biotinilado tiene una alta capacidad de unión a HLA-DR y a HLA-DQ en todas las líneas celulares. El péptido p45 biotinilado se unió a HLA-DR1, aunque p45 sin biotinilar no se une en forma detectable a esta molécula HLA (ver Fig 1) . Este fenómeno de mayor unión del péptido biotinilado se observa también en el péptido HA (306-320) biotinilado respecto al HA(306-320) no biotinilado. Ello podría indicar que la biotina estabiliza la unión a la molécula HLA en forma adicional o que se aumenta la sensibilidad de la detección de la unión respecto a la medición por competición con el péptido sin biotinilar. El resto de los péptidos en estudio no se biotinilaron, por lo que existe la posibilidad de que pudieran también unirse a HLA-DQ.

Tabla 2. Inhibición (%) de la unión de p45 biotinilado a las moléculas HLA de distintas líneas celulares.

Porcentaje de inhibición (%) Línea celular Serotipo Tipaje molecular HLA-DR HLA-DR - HLA-DQ aDR aDP aDQ aCH HOM2 DR1 DRB1*0101 - DQB1*0501 78 23 75 13 RSH DR3 DRB1*0302 - DQB1*0402 86 28 98 6 BOLETH DR4 DRB1*0401 - DQB1*0302 59 7 75 1 MOU DR7 DRB1*0701 - DQB1*0201 71 13 98 0 OLGA DR8 DRB1*0802 - DQB1*0402 92 4 88 5 SWEIG DR11 DRB1*11011 - DQB1*0301 89 0 83 0 Nota: El grado de unión a las diferentes moléculas se midió por competición con anticuerpos (aDR: anti -HLA-DR; aDP: anti- HLA-DP; aDQ: anti-HLA-DQ; aCH: anti-Clase I).

Ejemplo 3. Inducción de respuestas T colaboradoras (Th) . Con el fin de comprobar si los péptidos sintetizados tenían capacidad de inducir respuestas Th in vivo, se inmunizaron ratones transgénicos para la molécula HLA-DR4 con algunos de los péptidos que habían demostrado capacidad de unión con diversas moléculas HLA-DR. Para ello se eligieron p37, p45, p61 y p62, utilizando también el péptido PADRE como control. Todos estos péptidos mostraron capacidad de unión a varias moléculas HLA-DR, a la vez que mostraban diferentes grados de unión a HLA-DR4. La capacidad inductora Th se valoró midiendo la capacidad que los péptidos tenían de inducir proliferación celular y de inducir la producción de IFN-? e IL4 en linfocitos extraídos de los ratones inmunizados.

Inmunización Se utilizaron ratones transgénicos hembras HLA-DR4 obtenidos de Taconic (Germantown, NY, USA) , que se mantuvieron en condiciones libres de patógenos y tratados de acuerdo a las normas de nuestra institución. Para la inducción de respuestas Th, se inmunizaron subcutáneamente grupos de 3 ratones (4-6 semanas de edad) con 200 µl de una emulsión 1:1 de adyuvante completo de Freund y suero salino que contenía 50 nanomoles del péptido correspondiente. Los animales inmunizados, se sacrificaron dos semanas después de la inmunización y se extrajeron los nodulos linfáticos popliteales, inguinales y periaórticos . Los nodulos se homogeneizaron con una jeringa y se lavaron tres veces con medio de lavado (medio RPMI 1640) a 4 °C . A continuación, 5xl07 células/ml se pulsaron en MC durante 2 horas a 37 °C con 10 µM del péptido correspondiente.

Posteriormente se centrifugaron y se resuspendieron, y se cultivaron 2xl06 células/ml en un volumen de 2 mi, en placa de 24 pocilios, en estufa, a 37 °C con 5% de C02. Siete días más tarde, las células se lavaron y 5xl05 células T por pocilio se cultivaron con 2xl05 células de bazo singénicas por pocilio, tratadas con mitomicina-C, en ausencia o presencia del antígeno correspondiente. Se recogieron 50 µl del sobrenadante para medir IFN-? e IL-4 como en el apartado anterior. Se midió la proliferación celular.

Medida de proliferación celular Tras 48 horas en cultivo, las células fueron pulsadas con 0,5 µCi de timidina tritiada durante 18 horas, se cosecharon y se determinó la incorporación de timidina en un contador de centelleo (Top-count; Packard, Meridan, CT, USA).

Medida de la producción de IFN-? e IL-4 Las cantidades de IFN-? e IL-4 se midieron mediante ELISA comercial (OPTEIA Mouse IFN-? Set, Pharmingen, San Diego, Estados Unidos y OPTEIA Mouse IL-4 Set, Pharmingen, San Diego, Estados Unidos) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Los resultados se expresaron como pg/ml utilizando una curva estándar de cantidades conocidas de citoquinas .

Resul tados Los resultados (Figura 4) ponen de manifiesto que la mayor proliferación (mayor incorporación de timidina tritiada) y producción de IFN-? se produce en aquellos ratones inmunizados con los péptidos p45 y PADRE. El péptido p45 estimuló notablemente la producción de IFN-? y poco o nada la producción de IL-4, mientras que el péptido PADRE estimuló tanto la producción de IFN-? como de IL-4. Estas observaciones permiten concluir que para la restricción HLA-DR4 , p45 y PADRE inducen respuestas T colaboradoras correspondientes a perfiles de citoquinas Thl y ThO respectivamente. Los péptidos p37, p61 y p62 no dieron lugar a proliferación, ni a la producción de IFN-?. Sin embargo, p37 y p62 dieron lugar a la producción de IL-4.

Ejemplo 4. Inducción de respuestas T citotóxicas (Te). Con el propósito de estudiar la capacidad de los péptidos para colaborar en la inducción de respuestas efectoras Te, se inmunizaron ratones (transgénicos para HLA-DR4) con p37, p45, pdl, p62 o con el péptido control PADRE, conjuntamente con el péptido SIINFEKL [OVA (257-264) ] . SIINFEKL es un determinante T citotóxico (DTc) que se une a la molécula de clase I H-2 Kb.

Inmunización y medida de lisis Para la inducción de respuestas citotóxicas, se inmunizaron subcutáneamente grupos de dos ratones de 4 a 6 semanas de edad con 200 µl de una emulsión 1:1 de adyuvante incompleto de Freund y suero salino, que contenía 50 nanomoles del péptido SIINFEKL, más el péptido a ensayar como DTh en cantidades variables. Entre 10 y 12 días después de la inmunización, se sacrificaron los animales para extraer los nodulos linfáticos popliteales, inguinales y periaórticos . Estos fueron homogeneizados con una jeringa para obtener una suspensión celular y se lavaron tres veces con RPMI 1640. Las células obtenidas se incubaron con el determinante citotóxico SIINFEKL (10 µM) durante 2 horas a 37 °C, se lavaron 2 veces y se cultivaron en placas de 24 pocilios a una concentración de 7,5xl06 células/pocilio. Dos días después se añadió al cultivo 2,5 U/ml de IL-2 y cinco días después se midió la actividad citotóxica, siguiendo la metodología descrita por Brunner (Brunner KT; "Quantitative assay of the lytic action of immune lymphoid cells on 51-Cr-labelled allogeneic target cells in vitro; inhibition by isoantibody and by drugs" ; Immunology, 1968; 14:181). La actividad citotóxica se valoró por la medida de la liberación de 51Cr de las células diana, previamente marcadas. Las células diana utilizadas fueron células de timoma (H-2b)EL-4 (Referencia ATCC: TIB-39) . Para su mareaje se añadieron 50 µCi de 51Cr04Na2 por cada 106 células diana en un volumen final de 100 µl y se incubaron en ausencia o presencia de péptido SIINFEKL (a una concentración de 10 µM) durante 2 horas a 37 °C. Después de tres lavados en RPMI 1640, se resuspendieron en 1 mi de MC . El ensayo se realizó en placas de 96 pocilios con fondo en U. A cada pocilio se le añadieron por separado las células efectoras y las células diana (3000 por pocilio) . Se ensayaron diferentes proporciones de células efectoras respecto a las células diana, en diluciones seriadas (100, 33, 11 y 3) . Cada ensayo se realizó por triplicado. El volumen final de cada pocilio fue de 200 µl . Se incubaron las placas durante 4 horas a 37 °C. Posteriormente, se extrajeron 50 µl de sobrenadante de cada pocilio y la radiactividad se contó en un contador de centelleo . El porcentaje de lisis específica se calculó según la siguiente fórmula: % Li s i s especí f ica = 100 X ( ( Cpmexperimental " Cpiltespontánea) / \ Cpn naxima - Cprr gpon ánea La lisis máxima se determinó midiendo las cpm (cuentas por minuto) de 3000 células diana incubadas con un 5% de Tritón X-100 y la lisis espontánea a partir de células incubadas en ausencia de células efectoras. El porcentaje de lisis que se indica, corresponde a la lisis neta: valor de la lisis frente a las células de animales inmunizados al que se le substrae la lisis observada frente a las células de animales sin inmunizar.

Resul tados Los resultados, representados en la Figura 5, muestran que todos los péptidos menos p61 y PADRE proporcionaron colaboración Th para la inducción de linfocitos Te específicos de SIINFEKL. Además, se pudo observar un efecto dosis-respuesta de forma que cada péptido actúa mejor a una dosis diferente.

Ejemplo 5. Inducción de respuestas T helper ip vitro en donantes . Con el fin de determinar si los péptidos p37, p45 y p62 podían ser reconocidos por los linfocitos Th humanos de una población variada, se realizaron experimentos con células mononucleares de sangre periférica extraídas de cordones umbilicales de donantes. Las células extraídas se purificaron mediante el método del ficoll (Noble PB, Cutts JH, Carroll, KK; Ficoll flotation for the separation of blood leukocyte types; Blood, 1968; 31:66-73). Una vez purificadas, las células (3xl06 células/ml) se pulsaron durante dos horas con 10 µM del péptido en estudio. Las células pulsadas se lavaron y se plaquearon (105 células/pocilio) en placas de 96 pocilios de fondo plano. A los días 3 y 7 se añadió IL-2. Quince días mas tarde, las células de cada pocilio se subdividieron en dos, para enfrentarlas respectivamente a células (105 células/pocilio) tratadas con mitomicina C, con o sin cada uno de los péptidos p37, p45, p62 ó PADRE. Al cabo de dos días se recogieron 50 µl de cada sobrenadante y se mantuvieron congelados a -20 °C hasta el momento en que se cuantificó la cantidad de IFN-? mediante ELISA. Las células se pulsaron al tercer día, durante 18 horas con 0,5 µCi de timidina tritiada. Posteriormente se cosecharon y se midió la incorporación de timidina en un contador de centelleo.

Tipaj e HLA-DR de donantes Primeramente se realizó la extracción de ADN a partir de células mononucleares de sangre periférica de cada donante. Se utilizó el Kit QIAmp DNA Mini Kit de (Qiagen, Valencia, EEUU) y se siguió el protocolo indicado por el fabricante. Para la realización del tipaje a partir del ADN extraído, se utilizó el Kit Inno-Lipa HLA-DRB1 Plus (Innogenetics, Ghent, Bélgica), siguiendo el protocolo indicado por el fabricante.

Resul tados En la Tabla 3 se indica el número de pocilios positivos para cada péptido y donante. Se consideraron positivos, sólo aquellos pocilios que mostraron un índice de estimulación igual o superior a 3. El índice de estimulación (IE) se expresó como el cociente entre las cuentas por minuto entre el pocilio con péptido y el pocilio sin péptido.

Tabla 3. Reconocimiento de péptidos por linfocitos de donantes humanos. El número máximo de pocilios positivos posibles era 48 por péptido y donante. N indica el total de pocilios positivos frente a cada péptido tomando los 16 donantes . n° de pocilios Donantes positivos para cada péptido N° Tipaje molecular p37 p45 p62 PADRE 1 DRB1*03 DRB1*04 4 22 11 4 2 7 31 6 34 3 DRB1*01 DRB1*03 7 5 1 3 4 DRB1*03 DRB1*13 / DRB1*03 DRB1*15 - 1 - 1 5 DRB1*01 DRB1*08 4 3 14 8 6 DRB1*07 DRB1*011 1 - - - 7 DRB1*07 DRB1* 10 2 - - 1 8 DRB1*01 DRB1*03 - - - 1 9 DRB1*07 DRB1*11 1 - - - 10 DRB1*04 DRB1*13 / DRB1*04 DRB1*14 1 - 3 1 11 12 DRB1*01 DRB1*04 13 DRB1*01 DRB1*15 1 1 1 14 DRB1*01 DRB1*13 / DRB1*01 DRB1*14 1 1 2 15 DRB1*03 DRB1*07 2 5 16 8 4 N=31 N=65 N=47 N=65 De la Tabla 3 se puede deducir que: los péptidos p45 y PADRE fueron los mejor reconocidos por los linfocitos de 16 donantes; y que todos son reconocidos por al menos el 50% de los individuos .

Claims (16)

REIVINDICACIONES

1.- Un péptido quimérico con capacidad para unirse al menos a una forma alélica de la molécula HLA-DR, caracterizado porque su secuencia de aminoácidos se ajusta a una fórmula seleccionada entre: a) a?-a2-Y-a4-a5-a6-a7-a8-a9-a?o-A-A-A; y b) la SEQ. ID. NO: 21; donde Y es Tyr; A es Ala; ax es Phe o Tyr; a2 es Lys o Arg; a4 es Arg, excepto cuando a6 y a10 son Met y Arg, respectivamente, donde a4 puede ser cualquiera de los aminoácidos naturales; a5, a7 y a9 son cualquiera de los 20 aminoácidos naturales; a6 es Met excepto cuando a4 y a?0 son Arg, caso en el que a6 es cualquiera de los aminoácidos naturales; a8 es Arg, excepto cuando a4 ES Arg, Tyr o His, a6 es Met o Val y aio es Met, His o Arg, caso en el que a8 es cualquiera de los aminoácidos naturales; y a?0 es Arg, excepto cuando a4 es Arg o His, y a6 es Met, caso en el que a10 es cualquiera de los aminoácidos naturales.

2. - Un péptido quimérico con capacidad para unirse al menos a una forma alélica de la molécula HLA-DR según la reivindicación 1, caracterizado porque su fórmula está seleccionada entre: I ) a?-a2-Y-R-a5-M-a7-R-a9-R-A-A-A; II ) a?-a2-Y-R-a5-M-a7-a8-a9-a?o-A-A-A; III ) a?-a2-Y-a4-a5-M-a7-a8-a9-R-A-A-A; y IV ) a?-a2-Y-R-a5-a6-a7-a8-a9-R-A-A-A; donde Y es Tyr; R es Arg; M es Met; A es Ala; ax es Phe o Tyr; a es Lys o Arg; a4 es cualquiera de los 20 aminoácidos naturales distinto de Arg; a5, a7 y a9 son cualquiera de los 20 aminoácidos naturales; ag es cualquiera de los 20 aminoácidos naturales distinto de Met; a8 es cualquiera de los 20 aminoácidos naturales distinto de Arg; y a10 es cualquiera de los 20 aminoácidos naturales distinto de Arg.

3. - Un péptido según una de las reivindicaciones 1 o 2, donde dicha forma alélica HLA-DR está seleccionada entre: HLA-DR1, HLA-DR2, HLA-DR3, HLA-DR4 , HLA-DR7, HLA-DR8 o HLA-DR11.

4.- Un péptido según una de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizado porque se une al menos a 2 formas alélicas de HLA-DR.

5.- Un péptido según una de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizado porque induce la activación de células T colaboradoras Th.

6.- Un péptido según una de las reivindicaciones 1 a 5, caracterizado porque induce la activación de células T citotóxicas Te.

7.- Un péptido según una de las reivindicaciones 1 a 6, caracterizado porque posee una secuencia seleccionada entre SEQ. ID. NO: 1, SEQ. ID. NO: 4, SEQ. ID. NO: 5, SEQ. ID. NO: 6, SEQ. ID. NO: 7, SEQ. ID. NO: 10, SEQ. ID. NO: 11, SEQ. ID. NO: 12, SEQ. ID. NO: 13, SEQ. ID. NO: 14, SEQ. ID. NO: 15, SEQ. ID. NO: 16, SEQ. ID. NO: 17, SEQ. ID. NO: 20 y SEQ. ID. NO: 22.

8.- Una composición farmacéutica caracterizada porque comprende al menos un péptido descrito en una de las reivindicaciones 1 a 7 y un excipiente farmacéuticamente aceptable.

9.- Una composición farmacéutica según la reivindicación 8, caracterizada porque comprende además otro inmunógeno.

10.- Una composición farmacéutica según una de las reivindicaciones 8 o 9, caracterizada porque comprende un determinante T citotóxico (DTc) y un determinante T colaborador (DTh) , donde el determinante DTh es un péptido descrito en una de las reivindicaciones 1 a 7.

11.- Uso de un péptido descrito en una de las reivindicaciones 1 a 7 en la preparación de una composición farmacéutica útil para estimular la respuesta inmune.

12.- Uso de un péptido según la reivindicación 11, caracterizado porque dicha composición farmacéutica es útil para inducir la activación de células T colaboradoras Th (Thl, Th2 o ThO) .

13.- Uso de un péptido según la reivindicación 11, caracterizado porque dicha composición farmacéutica es útil para inducir una respuesta inmune T citotóxica (CTL) .

14.- Uso de un péptido según la reivindicación 11, caracterizado porque dicha composición farmacéutica es útil para inducir una respuesta inmune humoral .

15.- Un método para estimular y potenciar la activación de células T colaboradoras caracterizado porque comprende administrar a un sujeto una dosis terapéuticamente eficaz de una composición farmacéutica descrita en una de las reivindicaciones 9 o 10.

16.- Un método para estimular y potenciar la activación de células T citotóxicas caracterizado porque comprende administrar a un sujeto una dosis terapéuticamente eficaz de una composición farmacéutica descrita en una de las reivindicaciones 9 o 10.