JPH05506039A

JPH05506039A - 治療に有用なペプチドおよびペプチド断片

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Publication number: JPH05506039A
Application number: JP50509792A
Authority: JP
Inventors: ゴーダーナック、グスタフ; ゲッド―ダール・デ・イー、トビアス; エリクセン、ヨン・アムンド
Original assignee: ノルスク・ヒドロ・アクシェセルスカープ
Priority date: 1991-02-26
Filing date: 1992-02-21
Publication date: 1993-09-02
Anticipated expiration: 2012-12-17
Also published as: JP2690814B2

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】治療に有用なベブチドおよびベブチド断片発明の該用本発明は、合成ペプチド，およびＴ細胞性免疫を誘導するオンコジーン蛋白質産物の断片、ならびに前記ペプチドもしくは前記ペプチド断片を含む癌ワクチンおよび抗癌治療用組成物に関する．従来技術欧州特許第２７２，３２１号明細書により、オンコジーン蛋白質産物またはその断片を用いてオンコジーン蛋白質に特異的な免疫グロブリンを生産させ、その後、癌治療に使用される、前記免疫グロブリンと抗癌剤との配合体を形成する方法が公知となっている．欧州特許第１７７．８０号明細書および第１７５，３６０号明細書により、正常蛋白質産物とは１２位のアミノ酸ただ一つだけが異なる、ラスのｐ２１蛋白質等のオンコジーン蛋白質産物に対する抗体の生産を促す方法が公知となっている．これらの抗体は診断もしくは治療を目的として用いられることができる．ｐ２１ラス蛋白質の免疫原住ペプチド断片を得るため、蛋白質担体が接合されるようにシステイン残基が１６位と１７位の間に挿入される．さらに、欧州特許第２５３，３２５号明細書により、オンコジーンによりコードされたアミノ酸配列部分を含むオンコジーン関与ペプチド、および該ペプチドに対する抗体が公知となっている。

また、免疫学的癌治療に対する一つのアプローチとして、インターロイキン２（ＩＬ−２）の投与が行われていることも知られているが，その際に該インターロイキン２は、リンフォ力イン活性型キラー細胞（ＬＡＫ細胞）、もしくは腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ細胞）と呼ばれる特異的リンパ球と組み合わせて投与される！？定の癌に罹病した患者で達成される良好な効果は、一般的なものではない。

さらに、一部の患者に現れる副作用は非常に不快なものであり、時には深刻なものである［５ｔｅｖｅｎ＾、　ＲｏｓｅｎｂｅｒＦｌ、　５ｃｉｅｎｔｉｆｉｃ　Ａｍｅｒｉｃａｎ、　Ｍａｙ　１９９０．癌に適用できる免疫療法（＾ｃｌｏｐｔｉｖｅ　Ｌ＋＋ｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ　ｆｏｒ　Ｃａｎｃｅｒ）］。

また、患者自身の癌細胞または該細胞の不溶性破片、またはそのような細胞とＢＣＧ、インターフェロン（ＩＦＮ）もしくはインターロイキン等の、別の免疫系の非特異的刺激物との混合物の注射による、癌ワクチンを開発する試みも行われていることが知られている。

Ｄ、Ｊ、　Ｐｅａｃｅらは、Ｆｅｃｌ、３ｍ、　Ｓａｃ、　Ｅｘｐ、Ｂｉｏｌ、（１９９０）　Ｊ４（７）、＾２０１３頁抄訳番号１８５４において、Ｔ細胞応答を引き起こす、１２位のグリシンがアルギニンで置換されたｐ２１ラス蛋白質の、５〜１６位の断片を用いたマウス免疫の結果を公表している。この応答は免疫したペプチドに対する特異的なものであり、Ｔ細胞は同じく１２位アルギニン置換体を有する全ての蛋白質に応答することが可能であった。これらの結果は、ラスペプチドがこれらの実験に用いられたＣ５７ＢＬ／６系統のマウスのＨ−２分子に間して免疫原性を有すること、またこのマウス系統の細胞に投与する抗原は、Ｐ２１ラスを処理して、免疫に用いられた合成ペプチドと交差反応性を有する断片を産生ずることができることを示している。

以下の理由により、マウス系統が免疫され得るという発見は、本発明とは関連が無い：マウスにおいては、異なるＨ−２型の系統間で同一蛋白質由来の異なるペプチドセットが認識されることが一般的に観察されるので［Ｓ、Ｓ、Ｚｉｍｖｉｌ　ｅｔ　ａｌ、　Ｊ。

Ｅｘｐ、　Ｍｅｄ、　Ｖｏｌ、　１６８．　（１９８８）、　１１８１−１１８６コ、あるマウス系統で免疫応答を引き起こすペプチドも、他の近縁なマウス系統由来のＴ細胞を刺激しない可能性がある。また実験モデルにおいては、マウス、ラットおよびヒト由来のＴｉ胞は、同一蛋白質の、共通部のない、異なるエピトープと認識していることが知られている。この事実に対する説明として、生物種により抗原処理８！構およびそのＭＨＣ分子のペプチド結合能の違いが存在すると考えられている。

５ｔｅｆａｎ　Ｊｕｎｇおよび）Ｉｅｒｍａｎｎ　Ｊ、　５ｃｈｌｅｕｓｅｎｅｒは、Ｊ、　Ｅｘｇ、　Ｍｅｄ、、　Ｖｏｌ、１７３゜Ｊａｎ、　１９９１において、１２位のアミノ酸としてグリシンの代わりにバリンを有するｐ２１ラス蛋白質の５〜１６位アミノ酸の合成ペプチド断片は、二人の健常者由来のヒトＣＤ　４　”Ｔ細胞により認識されること、および、正常Ｐ２１ラス蛋白質から誘導された前記断片に相応するペプチドと交差反応しないこれらのＴ細胞は、抗原特異的Ｔ細胞系として発生させられた可能性があることを報告している。

この報告において、ヒトの免疫系が、この一本ｇ合成ペプチド断片を認識することが示された。

しかし、Ｔａ！胞の合成ペプチドに対する反応性が、ペプチドが誘導された元の蛋白質全体に対する反応性と異なる可能性があるので、この知見の関連は不明であるにの食い違いに対する説明は、合成ペプチドと均等なものは生体内における蛋白質の加水分解的な分割／処理の途中に胆或吏へｌとというものである。従って、用いられるペプチド断片が、特異的Ｔ細胞応答を引き起こすか、または処理により生じ、そして癌細胞および他の抗原により細胞に与えられる真のオンコジーン蛋白質断片に対して応答するＴメモリー細胞の応答を誘発することは非常に重要なことである。このようなペプチドの同定は、Ｔ細胞免疫に基づく癌ワクチンおよび癌治療の開発にとって欠かすことのできないものである。

挾五煎宣章癌発現の遺伝的背景はプロトオンコジーンおよびオンコジーンである。プロトオンコジーンは潜在的にオンコジーンに成り得る、細胞内の正常遺伝子である。

全てのオンコジーンは蛋白質をコードしており、蛋白質を通して機能する。多くの場合、それらの蛋白質は形質導入経路の信号成分として示されている。オンコジーンは、点突然変異もしくは転移を経てプロトオンコジーンから自然に発生し、それにより突然変異を有する細胞を形質転換された状態にする。癌は幾つかの突然変異性の事象およびオンコジーンを含む多段階プロセスを経て発達する。

オンコジーンの最も簡単な形態では、プロトオンコジーン内の一つの塩基の置換が、得られる遺伝子産物の一つのアミノ酸を異なるものとしている原因かもし分子を経由してこれらのペプチドを認識するＴ細胞は、腫瘍細胞を殺し、それにより宿主から腫瘍を排除することができる（Ｂｏｏｎ、　Ｔ、　ｅｔ　ａｔ、　Ｃｅ１ｌ、　１９８９．　Ｖｏｌ。

５８、　ｐ　２９３−３０３）　。

ヒト癌免疫学の分野では、最近２０年間、真の癌特異的抗原を特性付けるために多大な努力が払われている。

特に、ヒト腫瘍抗原に対する抗体の分析に努力が費やされて来た。従来技術は、そのような抗体は診断および治療の両方を目的として、実際に抗癌剤と共に用い免疫系に基づく癌の治療法を産み出す努力は、期待された程の成功を収めていな異常ペプチドを、腫瘍細胞表面でＭＨＣ分子を経由して認識し、実質的に、異常ペプチドを有する腫瘍細胞を排除するために働くことができる。

子が病気に対する耐性もしくは感受性と決定する。

Ｔ細胞は、種々の機構により、癌の発達および生長を制御している可能性がある。細胞障害性Ｔｍ胞である、ＨＬＡクラス■のうちＣＤ８°であるもの（）ＩＬ＾ｃｌａｓｓ　Ｉ　ｒｅｓｔｒｉｃｔｅｄ　ＣＤ８”）およびＨＬＡクラス■のうちＣＤ４°であるものは共に、適当な腫瘍抗原を有する腫瘍ｍ胞を直接殺すことができる。ＣＤ４°ヘルパーＴ細胞は、抗体反応と同様に、細胞障害性Ｔ細胞応答、およびマクロファージの誘導、並びにＬＡＫ細胞による腫瘍細胞の破壊に必要とされる。

従来技術は多くのオンコジーンおよびその蛋白質産物と同定しており、最近発表された研究は健康なヒトのＴ細胞レパートリ−があるｐ２１ラス遺伝子産物から誘導された合成ペプチド断片に対する特異性を有するＴ細胞を含むことを示しているが、現在のところ、腫瘍特異的Ｔ細胞系免疫と引き起こす正確な抗原または抗原決定基の位置を定めた研究はない。

従って本発明は、癌と戦う為に可能性のある他のアプローチには特異的Ｔ細胞による免疫応答の活性化および増強を通じて、生体自身の免疫系を用いる手段もある、というアイデアに基づいている。

良咀Ω定鳳本発明により、オンコジーンを有する癌細胞に対する特異的Ｔ細胞応答を誘導する、合成ペプチドならびにオンコジーン蛋白質のペプチド断片が見いだされている。

本発明によるペプチドおよび断片は次のように特徴付けられ、それらは。

ａ）プロトオンコジーン蛋白質の相応する断片と比較して、突然変異点もしくは転移点を有し；かつｂ）癌細胞または他の抗原提供細胞（ＡＰＣ）により提供されるような、処理されたオンコジーン蛋白質断片であるか、または該断片を完全に包含する断片に相応し；かつＣ）細胞による処理で生産され、且つＨＬＡ分子に提供される、真のオンコジーン蛋白質断片に応答する特異的Ｔ細胞を誘導するものである。

これらの突然変異はオンコジーンの形質転換能力を引き起こすので、それらは癌の発達における中枢である。これらの突然変異に対する特異的Ｔ細胞応答を起こさせることにより、突然変異を有する腫瘍細胞の発達および増殖の制御が可能である。これにより、腫瘍性細胞の特異的遺伝変化に対する予防法および治療法を開発することが、初めて可能となった。

及呵Ｑ葺囮ｌ説朋本発明の一つの目的は、オンコジーンの遺伝子産物に対するＴ細胞免疫を生じさせるオンコジーン蛋白質の合成ペプチドまたはペプチド断片に部分的もしくは全面的に基づいたワクチンを開発して、最も広範に観察されるオンコジーン突然変異を有する癌の定着を妨げることである。

本発明の他の目的は、本発明によるペプチドを用いて試験官内または生体内の両方または一方で患者のＴ細胞免疫を刺激することにより患者に誘導され得るＴ細胞免疫に基づき、そのプロトオンコジーンに前記突然変異を有する癌に対する癌治療法を産み出すことである。

特異的Ｔ細胞免疫に基づく特異的癌治療のための癌ワクチンおよび方法が有効であるためには、三つの条件が満たされなければならない：１、用いられるペプチドが、癌細胞または他の抗原提供細胞により提供されるような処理されたオンコジーン蛋白質断片の活性断片を完全に包含および／または相応する必要があり、２、用いられるペプチドが、免疫原性の形慧でＨＬＡ分子と結合される必要があり、３、ＨＬＡペプチド複合体を認識してそれに応答し得るＴ細胞が被治療者の循環系内に提供される必要がある。

本発明によるペプチドのために、これらの条件すべてが満たされ、確立された。

本発明によるペプチドは、試験管内で特異的Ｔ、１ｌｌｌ胞免疫応答を引き起こす、それぞれのペプチドと結合し得るＨＬＡ分子が決定された。さらに、純性ＨＬＡ−ＤＲおよびＨＬＡ−ＤＱ分子を用いた直接結合検定において、ラスペプチドとＨＬＡ−ＤＲおよびＨＬＡ−ＤＱ分子との一般的な結合の証拠が得られた１本発明による合成ペプチドまたはペプチド断片は処理されたオンコジーン蛋白質断片に相応することが確立された。このことは、６１位に突然変異を有する合成 ρ２１ラスペプチド断片を用いて実証される。特異的Ｔｍ胞メモリ一応答がこれらの合成ペプチドにより試験管内で引き起こされた。これは、癌患者のＴ細胞が、前記合成ペプチドと同一もしくは酷似のペプチド断片により、生体内で活性化されている明瞭な指標である。

近年、健常者のＴ細胞レパートリ−が１２位に突然変異を有する一つの合成ペプチドに対する特異性を有するＴｒｉｌｌ胞を包含することが立証され、これが一般的に自然な現象かどうかさらに調査された。かくして、１２位、１３位および６１位における公知の一般的なＰ２１ラス突然変異を供与する一群のペプチド全てが、これらのペプチド断片により活性化されるＴ細胞の探索試験に供された。

本明細書および請求の範囲において、アミノ酸はその名前または従来公知の３文字略号の両方または一方で表される。

失態５盪本発明によるペプチドは合成ペプチドであり、これは癌細胞または他の抗原提供細胞により提供される処理されたペプチドに相応および／またはこれを包含し、オンコジーン突然変異に相応する一つ又は複数の位置の突然変異を含み、オンコジーン蛋白質に対するＴ細胞免疫を引き起こす、突然変異点に位置するアミノ酸は、正常な１０トオンコジーンによりコードされる蛋白質中に見いだされるアミノ酸以外の全てのアミノ酸であり得るが、オンコジーン蛋白質中に見いだされるアミノ酸であることが好ましい。

さらに、本発明によるペプチドは突然変異点または転移点の側方に一つもしくは複数のアミノ酸置換を有する断片な含む。

形質転換したラス遺伝子は最も高い頻度でヒト癌中に同定されるオンコジーンであり、種々の知見からその頻度は１０〜２０％前後と推定される。形質転換した遺伝子は、ラス遺伝子産物であるｐ２１の１２位、１３位および６１位に突然変異を有する。

本発明の一つの見地によれば、合成ペプチドはオンコジーン蛋白質ラスｐ２Ｌの１２位、１３位および６１位のうちの、少なくとも一つと含み、前記蛋白質と同一のアミノ酸配列を有する断片である。

１２位のアミノ酸は、配列残部が正常プロトオンコジーンに相応している場合には、グリシン以外であれば、プロトオンコジーンによりコードされた蛋白質産物中に見いだされるどのアミノ酸であってもよい０表８にそのアミノ酸配列を示す本発明による好ましいペプチドの一群はｐ１１３〜ｐ１１９のペプチドもしくはその断片であり、それらはオンコジーンの蛋白質産物に対するＴｍ胞応答を引１３位のアミノ酸は、グリシン以外であれば、プロトオンコジーンによりコードされた蛋白質産物中に見いだされるどのアミノ酸であってもよい０表８にそのアミノ酸配列を示す本発明による好ましいペプチドの一群はｐ１２０およびｐ１２１のペプチドもしくはその断片であり、それらはオンコジーンの蛋白質産物に対するＴ細胞応答を引き起こす。

６１位のアミノ酸は、グルタミン以外であれば、１０トオンコジーンによりコードされた蛋白質産物中に見いだされるどのアミノ酸であってもよい９本発明による好ましいペプチドの一群は、表９に示されたペプチドおよびその断片であり、それらはオンコジーンの蛋白質産物に対するＴｉ１ｌ胞応答を引き起こす。

本発明による好ましいペプチドは、１〜２５位のアミノ酸から選択され、且つ１２位および／または１３位に少なくとも一つの突然変異を有する、Ｐ２１ラス蛋白質のペプチドまたは断片である。１２位および１３位の両方にグリシンを有する正常なＰ２１ラス蛋白質の１〜２５位のアミノ酸配列を表６に示す。

本発明による他の好ましいペプチドは、４５〜７２位のアミノ酸、特に５１〜６７位のアミノ酸から選択され、６１位に少なくとも一つの突然変異を有するｐ２１ラス蛋白質のペプチドまたは断片である。６１位にグルタミンを有する正常なｐ２１ラス蛋白質の４５〜７２位のアミノ酸配列を表６に示す。

本発明による他のペプチドは、少なくとも２７３位に突然変異を含むｐ５３のペプチド断片であり、その位置には、アルギニン以外のどのアミノ酸が配！されていてもよい。

さらに、本発明によるペプチドは、ｂａｒエクソン３とａｂ！エクソン２が連結されたｂｃｒ−ａｂｌ！ｉ合蛋白質（ｆｕｓｉｏｎ　ｐｒｏｔｅｉｎ）　Ｐ　２１０およびｐ１９０のペプチド断片、またはｂｃｒエクソン２とａｂｌエクソン２が連結された融合蛋白質ｐ２１０のペプチド断片である。

他のペプチドは、ｂｃｒエクソンｃ３およびａｂｌエクソン２が連結された、ｂａｒ−ａｂｌ散合蛋白質のペプチド断片である。

この群の好ましいペプチドは、次の断片またはその一部を含む：１１ｅ−Ｐｒｏ −Ｌｅｕ−Ｔｈｒ−１１ｅ−＾５ｎ−Ｌｙｓ−に１ｕ−Ｇｌｕ−＾１ａ−Ｌｅｕ −Ｇｌｎ−＾ｒｇ−Ｐｒｏ−Ｖａｔ−＾Ｉａ|Ｓｅｒ−＾５ｐ− Ｐｈｅ−にＩｕ＾１ａ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ−Ｇ［ｎ−５ｅｒ−５ｅｒ−［、ｙｓ −＾１ａ−Ｌｅｕ−Ｇｌｎ−＾ｒｇ−Ｐｒｏ−Ｖａ　Ｉ−＾Pａ−５ｅｒ−＾５ｐ− Ｐｈｅ−Ｇ！ｕ＾１ａ−Ｐｈｅ−＾５ｐ−ｈｌ−Ｌｙｓ−＾１ｎ−Ｌｅｕ−ＣＩｎ−＾ｒｇ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ−Ａｌａ−５ｅｒ−＾５ｐ−Ｐｈｅ−にＩｕさらに別の好ましいペプチドはｒｅｔｍ合蛋白質の断片であり、次の配列またはその一部を含む：　Ｌｅｕ−＾ｒｇ−Ｌｙｓ−＾１ａ−Ｓｅｒ−Ｖａｔ−Ｔｈｒ−Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−＾５ｐ−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ−Ｔｒｐ−１１：１ｕ−Ｐｈｅさらに別の好ましいペプチドはＥＧＦ受容体融合蛋白質の断片であり、次の配列またはその一部を含む：　５ｅｒ−＾ｒｇ−＾１ａ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｃ１ｕ− Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−にＩｙ−＾ｓｎ？−Ｔｙｒ−Ｖａｌ−Ｖａｌ−丁ｈｒ−＾５ｐ −Ｈｉｓ−Ｇｌｙさらに別の好ましいペプチドは、レチノール受容体融合蛋白質であり、次の配列またはその一部を含む：　Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−５ｅｒ−Ｃｙｓ− Ｉｌｅ−Ｔｈｒ−にＩｎ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−＾１ａ−１１ｅ−Ｇｌｕ−Ｔｈｒ− ＧＩｎ−Ｓｅｒ−５ｅｒ−５ｅｒ−Ｓｅｒ−［：１ｕ−Ｇｌｕ本発明はさらに、Ｎ末端およびＣ末端の両方または一方に僅かなアミノ酸置換を有するより大きな断片分含むが、それは、そのようなペプチドは適当な特異性を有するＴ細胞クローンを誘導し得ることが確かめられているからである。

本発明によるペプチドまたは断片はオンコジーン蛋白質中で突然変異が見いだされた位１を中心として、対称的であっても、非対称的であってもよい。

さらに、技術的に公知のごとく、ペプチドはシトキン（ｃｙｔｏｋｉｎｅｓ）、即ちインターロイキン−２またはその類似物等の化合物と同時にまたは別々に、免疫応答を強化するために、併用して投与することができるものと考えられる。

本発明は、これらの特異的ペプチド、および証明された活性を保持または強調するアミノ酸置換を有するペプチドを含み、かつこれらの配列またはそのバリエーションを全てもしくは部分的に含む合成ペプチドを包含するが、それだけに限定されるものではない。

本発明によるペプチドは単独で、または他の物質と組合せて、例えば技術的に公知の通り高親和性の細胞障害性Ｔリンパ球を誘導し得る脂質ペプチド共役体の形ｖ１．［Ｋ、　Ｄｅｒｅｓ、　Ｎａｔｕｒｅ、　Ｖｏｌ、３４２．　（Ｎｏｖ、１９８９）　］で、ワクチンもしくは治ｇ！組成物に用いることができる。

本発明によるペプチドまたはペプチド断片は、合成ペプチドおよび組換え断片の両方または一方と基にしたワクチンに含まれることができ、有用である。

本発明のペプチドはどちらのタイプの免疫も安全に引き起こし得るワクチンに用いるのに、特に適しており：（１）ペプチドは人工的に生産され、従って、形質転換した癌遺伝子、または別の、有害な効果を生じる可能性のある部位もしくは物質を含まず、（２）ペプチドは細胞性免疫分誘導するために単独で用いられることができ、（３）別の望まない応答である副作用と伴わずにある特定のタイプのＴ［胞応答を狙うことができる。

本発明によるペプチドまたは断片は、技術的に公知な通常の添加剤、希釈剤、安定剤等と共に治療組成物またはワクチンに含まれることができる。

本発明によれば、治療組成物もしくはワクチンは、ペプチドまたは断片を単独で、もしくは医薬的に許容される担体または希釈剤の少なくとも一種雇と組み合わせて、含むことができる。

さらに、ワクチン組成物は、オンコジーン蛋白質中に見いだされる最も一般的な突然変異を有するペプチドの中から選択したものを含有することができる。

さらに、ワクチン組成物は特定の癌のために選択されたペプチドを含むことができ、このワクチンは前記特殊な癌のために危険が大きい患者に投与される。

本発明によるペプチドおよびペプチド断片は技術的に公知の慣用法により製造することができ、このことは合成に関する後述の記載において明らかにされる。

上述のとおり、本発明による癌ワクチンは、一つまたは幾つかのオンコジーンに関連する、ある同定された癌のために危険が大きい患者に投与することができる。ヒトの腫瘍において見いだされたオンコジーンの例を表５に示した。

さらに、本発明による癌ワクチンは、例えば種々の一般的な癌に対するＴ細胞免疫を誘発するペプチドの混合物等として、広く一般の人に投与することができる。

本発明による癌治療は、患者が悩まされる癌のタイプの原因となるオンコジーンの遺伝子産物に対する特異的Ｔ＃ｌｌ胞系もしくはクローンを誘導することを主目的として、生体内、または試験管内で施されることができる。

工惣主煎試俄図面の簡単な説明図１は、正常な提供者におけるｐ２１ラスペプチド特異的Ｔ細胞応答を試験管内で誘発し、そのような細胞をクローニングするためのプロトコルである。リンフォブレップ（Ｌｙｍｐｈｏｐｒｅｐ、　Ｎｙｃｏｍｅｄ、　０ｓｌｏ、　Ｎｏｒｗａｙ）を用いた遠心分離により、ｍ維素除去血から末梢血由来単核細胞（ＰＢＭＣ）が分離された。洗浄されたＰＢＭＣは、Ｌ　ＯＯｒＵ／ｍｌのペニシリン、スズレアトマイシン（１００ｕｒ／ｍｌ）および１５％自系血清、ならびに既知量の合成ペプチドを添加したＲＰＭＩ　１６４０（Ｇｉｂｃｏ、　Ｐａ１ｓｌｙ、　５ｃｏｔｔｌａｎｄ）中に再懸濁され、３７℃の５％二酸化炭素培養器中で培養された。用いられたペプチドの構造が表１に示されている。１２位および１３位に突然変異を与えられたペプチドは全て、そのＣ末端に付加されたアラニンまたはバリンを含有する。

Ｔ＋Ｊ胞をクローニングする手法として、幼若Ｔ細胞が、テラサキプレート中の上記ペプチドを含む培地そのものに、ウェル当たり１または１０紺胞の割合で植菌された。各ウェルは、２５，０００個の（２００ＯＲ）照射された自系ＰＢＭＣを養育細胞として含有し、総量２０μｌ中に最終濃度２０Ｕ／ｍｌの割合で組換えヒトＩＬ−２（＾ｍｅｒｓｈａｓ、　Ｅｎｇｌａｎｄ）が添加された。Ｔｍ胞の生長は一日に５〜６回、謬鏡的に評価された後、９６ウエルプレート（Ｃｏｓｔａｒ、　Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、　Ｍａ、　ＵＳＡ）に植え継がれた。各ウェルは、総量１２０μｌ中に、１００．０００個の新鮮な、照射された自系ＰＢＭＣを養育細胞として含み、同様にペプチドおよびＩＬ−２も含んでいた。さらに生長したクローンは９６ウエルプレートに植え継いでから３〜５日後に、上記と同様にして、２４のウェルプレートに増殖しくｅｘｐａｎｃｌｅｄ）、−週闇毎に、新鮮な照射された養育細胞、ペプチドおよびＩＬ−２で再刺激された。さらにクローンの増殖はＩＬ−２だけを含む培地中で行われ、最終的にはペプチドもしくはＩＬ−２を含まない培地中で行われた。

図２および図２ａ〜２ｅは、Ｔｍ胞増殖検定におけるＴ細胞クローンエ、Ｂ、ＥおよびＦの特異性を示している。検定は、刺激抗原として元のペプチド混合物中に存在した５種類のペプチドを用いて、９６ウエル中に３組準備された。ウェルは５０，０００個の（８０００Ｒ＞照射された自系ＥＢＶ転換Ｂａ［ｌ胞を抗原提供細胞（ＡＰＣ）として含有していた。

培養細胞は３７℃の５％二酸化炭素培養器中で２日間培養され、細胞自動収穫ｔｆｉ（Ｓｃａｔｏｒｎ、　Ｌｉｅｒ−ｂｙｅｎ、　Ｎｏｒｗａｙ）によりグラスファ不バーフィルター上で収穫される前に、ウェル当たり１μＣｉの３Ｈ−チミジン（Ａｍｅｒｓｈａａｅ、　Ｅｎｇｌａｎｄ）で−晩ノ〜ルスされた。ＤＮＡ内に取り込まれたチミジンはＬＫＢ　１２０５ベ一タプレート液体シンチレイション計測器を用いた液体シンチレイション計測により測量された。

データは３組の培養細胞の中央値として与えられた。対照群は培養Ｔ細胞クローンを単独またはペプチドを欠（ＡＰＣと共に含有していた。パネルは陽性応答の大きさに応じて描かれている。

図３ａ〜３ｄは、ＨＬＡ−ＤＲに対して特異的なモノクローナル抗体Ｌ２４３およびＨＬＡ−ＤＱに対して特異的なモノクローナル抗体ＦＮ８１．１．１．を用いたクローン■、Ｂ−ＥおよびＦのブロック試験の結果を示している。培養混合物にＴｍ胞およびペプチドを添加する前に既知濃度のモノクローナル抗体を加えたＡＰＣを３７℃で３０分間予備培養した以外は区２について記述したと同一条件で、クローン増殖検定を行った。

区４は、指陣および応答細胞としてクローンＴをもちいたペプチド阻害試験を示している。試験条件は、１０μＭ濃度の刺激ペプチド（ペプチド４２）および２５０μＭ濃度の阻害ペプチドが用いられた以外、図２について記述したと同様であった、刺激ペプチドおよびＴ細胞の添加前に１．Ａ　Ｐ　Ｃを阻害ペプチドと共に３７℃で３０分間予備培愛した。データは区２と同様に表現されている。［註＝２５０μＭ濃度のペプチド４２はクローンＩに対する阻害を示す。このことはまた、クローンＩとペプチド４２との腋用量反応曲線からも明らかである（データ示さず）、］図５は図４と頭似の結果ご示しており、今回はペプチド４３に対するクローンＥの応答の阻害が記録されている。その他の試験条件は図４について記述しｔ：と同一であった。

図６は、切断された形態のへブチド４３に対するクローンＥの反応と示している。ペプチドは、表２に見られるようにＮ末端およびＣ末端から切断される。検定条件は図２について記述したと同様であった。各ペプチドは１０ｄＭの濃度で提供され、応答Ｔ細胞およびＡＰＣの数は５０，０００であった。

図７は指標応答細胞としてクローンＥを用い、かつ図６と同一の切断された形態のペプチド４３を使用１−な、ペプチド阻害試験を示している。５μＭ濃度の刺激ペプチド（ペプチド４３）および２５０ｄＭの阻害ペプチドが用いられた。その他の試験条件は図４について記述したと同一であった。註、ペプチド６５および８１は１０ｄＭの濃度では刺激性が無いがく図６＞、２５０ｄＭの濃度では刺激性を有する。

図８は、切断された形態のペプチド４５に対するクローンＦの応答を示している。ペプチドの構造を表２に示す、検定条件は図６について記述したものと、正確に同一であった。

図９はｐ２１ラスより誘導されたペプチドの全てを用いて、Ｐ胞状甲状癌に罹患した患者由来のＰＢＭＣを刺激した結果を示している。９６ウエルプレート中で、ｔｏｏ、ｏ、ｏｏ細胞／ウェルのＰＢＭＣはそれぞれのペプチド１００μｇ／１１と共に、１　［１／ｍｌの組換えヒトＩＬ−２の存在下（上段）もしくは存在なしく下段）で培養された。培養６日目に（１μＣｉの）ｆｆＨ−チミジンが添加され、培養細胞は７日目に、図２について記述したように、収穫および処理された。試験結果は３組の中央値として与えられる。対照群はＰＢＭＣＥ単独で、もしくは組換えＩＬ−２の存在下で、培養したものであった。

図】、０は、ＩＬ−２が存在するもしくは不在である場合の、図９におけると同一提供者由来のＰＢＭＣのペプチド２３に対する応答を示している。試験条件は、ＰＢＭＣの量を２００，０００細胞／ウエルとし、同様にしてペプチドの量を倍に変更した以外は図９において記述されたものと同一であった。

図１１は、正常および突然変異ｐ２１ラス蛋白質の６１位周辺のアミノ酸配列を供与された５種頭のペプチドに対する、図９および１０に記述した患者から誘導した二次Ｔｌｓ胞培養細胞の応答を示している。

試験条件は、応答細胞であるａｂｄ　ＡＰＣが２５，０００添加され、およびペプチド濃度が２００　ｐｇ／ｍｌであった以外は、図２において記述されたと同一であった。

口１２は、Ｔａ！胞クワクローン１０４、〕、５および２３のペプチド２３に対する活性を示している。検定条件は、ＡＰＣとして、照射された。異質遺伝子型ＨＬＡ−ＤＱと等しいＰＢＭＣを５０，０００用い、ペプチド濃度が５０ｄｇ／ｍ　ｌであった以外は図２において記述されたものと同一であった。

図１３はＨＬＡ−ＤＱに対して特異的なモノクローナル抗体ＦＮ８１．１．１゜を用いたクローン１４のブロック試験の結果を示している。試験条件は図２および３において記述されたものと同一であった。

図１４は、切断された形態のペプチド２３に対するクローン１５の応答を示している。ペプチドは表７に見られるように、そのＮ末端およびＣ末端から切断された０本検定の条件は、各ペプチドが最終濃度２０．５０および１００μＭで用いられた以外は、図２において記述されたものと同一であった。応答細胞およびＡＰＣの数は５０，０００であった。

区１５は、ペプチド２３に見いだされたものと同様に６１位の突然変異を有する合成ペプチドの新規セットに対するクローン１４の応答を示している０表６に見られるように、これらの新規ペプチドは、ラス配列の５１−６７位、５２−６７位、５３−６７位、５１−６５位、５２−６５位および５３−６５位の配列と包含している。これらのペプチド配列は表７に示され、試験条件は、図１４において記述されたものと同一であった。

図１６は、クローンＦのペプチド４５およびペプチド８８〜９１に対する供与量応答曲線を示している。ペプチドの構造を表２に示す、ペプチド濃度は図示の如くであり、一方、検定条件は図６において記述されたものと同一であった。

図１７は切断された形態のペプチド４３に対するクローンＢの応答、および切断された形態のペプチド４２に対するクローンＩの応答を示している０表２に見られる如く、ペプチドはそのＮ末端およびＣ末端から切断された。各−ペプチドは最終濃度２０．５０および１００μＭの、異なる３通りの供与ｌで使用された。

応答ａｍおよびＡＰＣの数は５０，０００個であった。検定条件は、図２において記述されたものと同一であった。

図１８ａ−１８ｄは、長鎖ペプチドの組合せ（ｐａｎｅｌ　）によってクローンＢ、１、ＥおよびＦが刺激された試験の結果を示している。各ペプチドは、最終濃度２０．５０および１００μＭの、異なる３通りの供与量で使用された。クローンは、それらのクローンを誘導する為に用いられたペプチド４２．４３．４４および４５を用いて刺激された。応答細胞およびＡＰＣの数は、５０，０００個であった。一方、試験条件は図２において記述されたものと同一であった。

図１９は、健康な提供者から誘導された二種頭のＴ細胞クローン、ＫＢ１５およびＫＢ　２３の、長鎖ペプチド（ｐ−１１２、ｐ−１１３、ｐ−１１４、ｐ−１１５およびｐ−１１６）の混合物による反復刺激後の応答を示している。

培養条件は、図１において記述されたものと本質的に同一であった。

図２０は、クローン１４を効果細胞（ｅｆｆｅｃｔｏｒ　ｃｅｌｌｓ）として用いた、ＩＦＮ−γ処理されたＨＴ２９結腸腫細胞（＾ＴＣＣ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ　ＭＤ）の増殖阻害試験の結果と示している。各マイクロウェルに蒔かれた凛的細胞の数は２０，０００個であり、図に示される通り、その細胞は（２，０００ラドで）照射された効果細胞の添加前に、三日間に亙って５００Ｕ／ｍｌの組換えヒトＩＦＮ（Δｍｅｒｓｈａｍ、　［ＩＫ）で処理された。ペプチド処理された細胞は、最終濃度１０μｇｅｍ　Ｉで、Ｉ！に後の２４時間、ペプチド１０６と共に培養された。効果細胞の添加後、区２において記述された如く、培養細胞は収穫前にウェル当たり１μＣｉの３Ｈ−チミジンで一晩パルスされた。特異的増殖阻害は、ペプチドを添加しなかった対照培養細胞の取り込みデータから計算された。

試験管　での−次　によるラス特異的Ｔ細　の誘導本発明者らは最初に、正常な健康ヒトのＴ細胞レパートリが、突然変異ｐ２１ラスから誘導されたアミノ酸配列を有するペプチド全体に対して認識および応答できるＴ細胞を包含しているかどうかを調査した。

図１において記述されたように、健康な提供者がらの末梢血単核、ｌ１ｌｌｌｌａは本発明による合成ｐ２１ラスペプチドの混合物により試験管内で刺激された。

これらの試験の幾つかの結果を表３に示す。ペプチド混合物に対する一次応答はまったく観察されなかった。１５名の健康な提供者を個々のペプチドで刺激した全ての組み合わせを用いた同様の試験もまた、これらのペプチドに対する一次応答の完全な欠如を示した（データ提示なし）、これらの結果はどちらも、健常人においては応答性細胞の頻度が非常に低いことを明示している。しかし、ペプチドおよび細胞に供給される新鮮な、照射された抗原により反復して刺激される試験管内培養においては、相応するペプチドに対する強い応答が観察された（表３）。

これらのデータは、突然変異オンコジーンから誘導されたアミノ酸配列を有するペプチドによる試験管内での適切な免疫の後に、特異的Ｔ細胞応答が得られることを明瞭に表している。つまり、本発明者らはまた、ｐ２１ラスから誘導されたペプチドに対する特異性を有するＴ細胞が正常Ｔ細胞レパートリ中に存在し、この提供者はこのようなペプチドと結合し得るＨＬＡ分子を宥することをも示した。

次に本発明者らは、ｐ２１ラスペプチドを認識可能なＴ細胞の良好な特異性セ調査し、そして、これらのペプチドと結合して、応答するＴ、！胞に該ペプチドを供与するＨＬＡ分子を同定しようとした。この目的で、ペプチドＰ−４２〜Ｐ− ４６を含む混合物に応答した培養細胞中の活性型ＴＩＩＩＩ胞をクローニングした。クローニングの手法は図４において記述した如くであった。クローニング試験で得られたデータは表４にまとめられた。さらなる研究のために、一つのペプチドに対して特異性を示すクローンのうちの４系統が選択された。

クローンＩは、１２位のアミノ酸としてリジンを含むペプチド４２に対して強い特異性を示した。リジンと幾つかの他のアミノ酸との置換は、応答を完全に阻害したく図２ａ）。

ペプチド４２に対する応答は、ＨＬＡ−ＤＲに対する対照モノクローナル抗体Ｌ２４３により完全にブロックされるが、ＨＬＡ−ＤＱおよびＨＬＡ−ＤＰに対するモノクローナル抗体ではブロックされず、これは、この特別の提供者においてはペプチド４２がＨＬＡ−ＤＲに結合されることを明示している（図３ａ）。

クローンＢは、１２位のアミノ酸としてアルギニンを含むペプチド４４に対して強い特異性を示した。他のペプチドは一つも認識されなかった（図２ｂ）。

クローンｒ同様、クローンＢもまたＨＬＡ−ＤＲとのみ応答することが、モノクローナル抗体を用いたブロック試験により明らかにされた（［Ｊ３　ｂ　）　。

クローンＥは１３位のアミノ酸としてバリンを含むペプチド４３に対して強い特異性を示した６他のペプチドは一つも認識されなかったく図２Ｃ）。

ペプチド４２および４４を認識するクローンとは対称的に、このクローンは抗ＨＬＡ−ＤＲモノクローナル抗体によりブロックされず、かわりにＨＬＡ−ＤＱを認識するモノクローナル抗体でブロックされたく図３０）、抗ＨＬＡ−ＤＰは効果がなかった。これらのデータは、この特定の提供者においてペプチド４３はＨＬＡ−ＤＱに結合されることを示している。

クローンＦは異なる反応性のパターンを示した。クローンＦは、元のペプチド混合物中に存在した、１２位にアラニンを含むペプチド４５に対して非常に強く応答した。混合物中の他のペプチドに対しては無反応であったが（図２ｄ）、別のペプチドに対しては種々の程度に反応した（区２ｅ）、１３位のグリシンとアスパラギン酸またはバリンとの１換が応答を完全に阻害したことがら、このクローンの反応性は１３位のアミノ酸としてグリシンを有することに強く依存しているように思われる。１２位のグリシンの、塩基性アミノ酸であるリジンまたはアルギニンによる置換は、このような置換がＴ細胞受容体結合部位に干渉することを示す弱い応答または無応答を生じる。クローンＥの場合のように、このクローンも、モノクローナル抗体によるブロックにより明示されたようにＨＬＡ−ＤＱとのみ応答した（ＩＩＵ３ｄ）、１２位に塩基性アミノ酸を有し、ＨＬＡ−ＤＱとのみ応答するクローンＦ　（ＨＬＡ−ＤＱ　ｒｅｓｔｒｉｃｔｅｄ　ｃｌｏｎｅ　Ｆ）を刺激できない二つのペプチドが、共にＨＬＡ−ＤＲと結合することができ、そしてクローンＩおよびＢの二つにより相互的に認識されるという観察は、興味深いものである。

１”　ＨＬＡ−ＤＲおよびＨＬＡ−ＤＱに結合するペプチドの地図を作製するため、寸　指示システムとしてクローンＩの刺激を用いてペプチド４２とＨＬＡ− ＤＲとの１　結合を阻害する能力を探り、指示システムとしてクローンＥの刺激を用いてペプチド４３とＨＬＡ−ＤＱとの阻害を探るために、非刺激性ｐ２１ラスペプチドを試験した。

ペプチド４２とＩ（ＬＡ−ＤＲとの結合は、２５ホルトの過剰のペプチド３９− ’　４０．４１．４３．４４および４５により強く阻害された（図４）、他のペプチドは結合を少しだけ阻害した。注目すべきことに、６１位のアミノ酸を有するべゝ　プチドは全て、ＨＬＡ−ＤＲとの結合およびクローンＩの後の活性化を充分に阻害することができなかった０反対に、全てのペプチドがペプチド４５とＨＬＡ−Ｅ　ＤＱとの結合およびクローンＥの後の活性化を阻害した（図５）、従って、（１２ユ　位および１３位にグリシンを有する）突然変異していない６〜１９位の配列を有よ　するペプチドおよび（６１位にグルタミンを有する）突然変異していない５４〜１　６９位の配列を有するペプチドと含む、ｐ２１ラスから誘導されたアミノ酸配列を有する全てのペプチドはＨＬＡ−ＤＱと結合することができた。つまり、これらのペプチドは全てＨＬＡ−ＤＱに関しては免疫原性であることができ、さらに幾つかのペプチドはペプチド４２およびペプチド４４並びに１２位にバリンを含り　むペプチドにおいてすでに示されたように、ＨＬＡ−ＤＲに関しても免疫原性であることができる可能性がある（Ｊｕｎｇ　＆　５ｃｈｌｕｅｓｅｎｅｒ、　１９９１）。

’　ＨＬＡ−ＤＱとのみ応答するＴ細胞クローンＥおよびＦによるペプチド認識の１　ためにはどのアミノ酸が必要であるかを調査するために、本発明者らは表２に示したように、切断された形態のペプチド４３および４５を合成した。ペプチドはＮ末端およびＣ末端の両側から切断された。第一の重要な疑問点は、試験管内における免疫に用いたペプチドのＣ末端部分におけるアミノ酸、アラニンおよび口≧　イシンの重複付加が重要であるかどうかであった０図６および８に示した結果は、）　二つの付加アミノ酸をクローンＥにより認識される部位に限界的に分配したことおよびクローンＦによるペプチド認識にはまったく重要でないこと３表している。

）　従って、重複アミノ酸を欠くペプチド７９らクローンＦを刺激する点では等しく効果的であった。ペプチド６４．７９および８０は濃度１０μｌでクローンＥ’ｌｒ刺激する。ペプチド６５および８１は２５０μｌの濃度て７１激性となる。ペプチド６６．６７．６８．８２および８３は、この濃度で阻害しく図７）、従って、Ｆ（ＬＡ−ＤＱと結合可能である。ペプチド６９．７０．７４．７５および７６ば１０μｍの濃度でクローンＦを刺激する。

図６〜８の一連のデータは、１２位にアラニン、もしくは１３位にバリンを有する種々の長さの幾つかのペプチドが、クローンＥおよびＦにより認識されることができることを示している。クローンＥおよびＦを用いた結果における詔著な対称性は、８位のバリンおよび１７位のセリンのアミノ酸がこれらのＴ細胞クローンの刺激にとって絶対に欠くことのできないものであることを明示している。

従って、クローンＥの刺激のための予測される最小ペプチドはＶａ　Ｉ　−Ｖａ　Ｉ（：Ｉ　Ｙ−＾１ａ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ｖａｌ−に１ｙ−Ｌｙｓ−Ｓｅｒ配列を有し、クローンＦについてはＶａｌ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−＾１楓−＾１ａ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ｓｅｒ配列を有する。１２位にアラニンを有する８〜１７位の予測される最小ペプチド（べ７チド８８）が合成され、図１６に描写された通り、そのクローンＦＷＪ激能がペプチド４５および他の幾つかのペプチドと比較された。ペプチド８８についての施用量曲線はその刺激能を保証するが、このクローンを誘導するために用いたペプチドよりはるかに低い効力である。より短いペプチドもＨＬＡ−ＤＱと結合するが、これらのＴｉ胞クローンにより認識されるために不可欠なアミノ酸を失っている０本発明者らは、これらのペプチドが試験管内でＴ細胞を刺激するために使用された場合には、わずかに異なる特異性を有するＴ細胞クローンの新規なセットを誘導できるのではないかと期待している。

ＨＬＡ−ＤＱとのみ応答するＴ細胞クローンによるペプチド認識にとって重要であるとして同定されたアミノ酸は、ＨＬＡ−ＯＲとのみ応答するクローンＢおよび■による認識にとっても不可欠なものであるかどうかを調査するために、表２に示す如く、本発明者らは切断された形態のペプチド４２および４４ｔ！：合成した。該ペプチドはＮ末端およびＣ末端の両方で切断された１図１７の結果により、アラニンおよびロイシンの重複アミノ酸はこれらのＴｍｍツクローンよる認識にとっては重要でないことが確認された。１６位のリジンの除去がペプチド応答を阻害することから、両クローンにとってこのアミノ酸は絶対に必要不可欠なものである。この二つのクローンは７位のバリンの存在に対する必要性を異にしており、このアミノ酸はクローンＢｃｒ）刺激のためには不可欠であるのに、このアミノ酸の存在はクローン■に対する応答には阻害的な影響を及ぼすようである１図１７の結果から、クローンＢおよびＩの刺激のための最小ペプチドは、Ｖａｌ−１／ａｌ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−＾１ａ−＾ｒｇ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ− ＬｙｓおよびＶａ　ｌ　−Ｖａ　Ｉ　−Ｇ　ｌ　ｙ−八１ａ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ| Ｖａｌ−Ｇｌｙ− Ｌｙｓである。

ペプチド処理の疑問点を扱うために、本発明者らは１〜２５位のアミノ酸残基を含むｐ２１ラスペプチドを合成した。恐らく、ＡＰＣに供与した際に、これらのペプチドは自然に処理されたペプチドの生成を許すだろう。この一連の試験の結果を図４８に示した。１２位および１３位における修正アミノ酸置換が存在したならば、全てのクローンは１〜２５位のペプチドに応答することが可能であった。−次剰激に用いられたペプチドに対する応答と比較して、長鎖ペプチドはクローンＢおよびＦをより効果的に刺激した。クローンＥおよび工は反対の反応性パターンを示した。これらの結果は、長鎖ペプチドの処理がクローンの生成に用いたペプチドと異なるペプチドを生じ得ることを示している可能性がある。

本発明者らのＴ細胞クローンの内の四種類だけを用いて得られた結果をまとめる：１、ペプチド４５．４１．４０．３９、（および３７）並びにペプチド４３はそれぞれ、Ｔ、ｌ１ｌｌ胞クローンＦおよびＥに識され得る。ペプチド４２および４４はそれぞれクローンＴおよびＢにより認識され、従って、最も一般的な、１２位がグリシンのものおよび１３位がグリシンのものの、二種類のｐ２１ラス突然変異以外の全てのものは、−人の提供者の正常なレパートリ−中に存在するＴａｌ胞前駆体から誘導されたＴ、［ｌ胞りローンの限られたセットにより認諾され得る。

２、ＨＬＡ−ＤＲとのみ応答する（クローンＩおよびＢを用いる）方法、およびＨＬＡ−ＤＱとのみ応答する（クローンＥおよびＦを用いる）方法でペプチドが認識されることから、ペプチドはＨＬＡ−ＤＲおよびＨＬＡ−ＤＱ分子の両方と結合可能である。

３、切断されたペプチドを用いて、ＨＬＡ−ＤＱとのみ応答するクローンおよびＨＬＡ−ＤＲとのみ応答するクローンである、本発明のＴ細胞クローンの刺激に必要とされる推定最小配列を同定した。全てのクローンは、８〜１６位にわたるコア配列の存在を必要とし、この配列の側面に位１するアミノ酸の必要性においてわずかに異なる。

４、ＨＬＡ−ＤＱとのみ応答するクローンおよびＨＬＡ−ＤＲとのみ応答するクローンは共に、短鎖コア配列から２５個のアミノ酸配列までの種々の長さのペプチドに応答することができる。

５、本発明のＴ細胞クローンはまた、それらのペプチドには有効な反応性クローンはないという、重要な洞察を我々に提供した。かくして、２５〜５ｏボルドの過剰のペプチド、および標識反応細胞としてクローンＥ、Ｆおよび工を用いたブロック試験により、本発明者らは図５に示したように、６１位のアミノ酸にラス突然変異を表すペプチドを含む本研究の全ての合成ペプチドはＨＬＡ−ＤＱと結合可能であり、才な、それらのペプチドの幾つかはＨＬＡ−ＤＲと結合可能であること分明示した。

健康な提供者において（ペプチド４２．４３．４４．４５の）より短いペプチドによる試験管内での一次免疫により応答が獲得されたこと、およびこれらのペプチドを用いた刺激により誘導されたＴ細胞クローンは、恐らく処理の必要な、より長いペプチドに応答可能であるという観察から、本発明者らは長鎖ペプチドら、一時刺激後にＴ細胞応答を誘導することができるのがどうかを調査した。これらの試験のなめに、本発明者らはラスペプチドと結合することが予め知られていないＨＬＡ分子を有するＩＩｔＦ！Ｒな提供者を選んだ、これらの試験結果３図１９に示す、ペプチド１１４および１１５は特異的Ｔ細胞応答を刺激することが可能であり、これらのペプチドを認識するＴ細胞クローンはバルク培養から生成することができた。従って、１〜２５位の配列にわたり、且つ１２位のアミノｖｉ置換を含むペプチドもまた免疫原性である。また、本発明の結果は、ラスペプチドの応答性は一つのＨＬＡハブロタイブに制限されるものではないことを示している。

ＨＬＡ分子に結合したラスペプチドの一般的な性質を調査するために、精製ＨＬＡ−ＤＲおよびＨＬＡ−ＤＱ分子と結合したペプチドを測定する結合検定法を確立した。ラスペプチドの結合を標準的な高親和性結合ペプチドと比較するために、本発明者らは最初にｙｉｆ製ＨＬＡ−ＤＲ１分子に対する放射線標識インフルエンザマトリックスペプチドの阻害を調べた０表１１に示した結果は、調べられた全てのペプチドがＨＬＡ−ＤＲＩと結合可能であったことを明示している。指示ペプチドの結合阻害能による測定では、ラスペプチドの結合の強さはインフルエンザマトリックスペプチドのそれと同程度であった。これらのデータは、Ｔ細胞の刺激に用いたペプチドの結合能を確認し、また非刺激性ペプチドもＨＬＡ− ＤＲと結合できることを明示している。さらにこれらのデータは、ラスペプチドと結合できるＨＬＡ−ＤＲ分子についての本発明者らの認識をＨＬＡ−ＤＲＩも含めることまでひろげるものである。ペプチドと精製ＨＬＡ−ＤＱ分子の結合に関する観察は、本発明者らによる細胞研究を確認し、ペプチドと精製ＨＬＡ−ＤＱ分子との直接結合に間する初めての例示を提供した。

ラスから誘導されたペプチドの結合は、恐らくは潜在的に有害なラス突然変異を有する細胞を排除するＨＬＡ／Ｔ細胞系の重要な監視機能を反映する一般的な現象であろう。

本発明のＴ細胞応答は、細胞培養への外生ＩＬ−２の添加なしに得られるものであり、従って前記応答は、Ｔ細胞提供者における、特異的増殖応答を誘導する、本発明の合成ペプチドの個々の能力に依存することを記しておかねばならない。

これは末梢血（ＬＡＫ細胞）もしくは腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ細胞）由来ＩＬ −２を大量に使用して癌患者からの細胞増殖を試験管内で誘導する近年の技術を凌駕する、大きな利点を与える。このＴ（およびＮＫ）細胞活性化の非特異的手法は、ＬＡＫ細胞またはＴＩＬ細胞製剤で治療される患者にみられる深刻な副作用の一図である。

ｌｉ＆康な個人のＴ細胞レパートリ−が、ヒト癌のラスオンコジーンにおいて通常見いだされる突然変異を幾つか含むペプチドを特異的に認識し得るＴ細胞を含むという新知見は、癌の治療および予防ワクチンによる癌の予防にとり重要なものである。さらに、ペプチドブロック試験において明示したように、ラスオンコジーン由来合成ペプチドの全てがＨＬＡ遺伝子産物と結合し得ることも重要である。

以下に示す如く、この知見の最も重要な点は、甲状腺のＰ胞状癌の患者由来の末梢血が、この癌形態において広範に見い出されるラス突然変異の一つにより供与されるラスｐ２１合成ペプチドに対する古典的記憶応答３与え得るリンパ球？含むことである。このような応答は、患者の＆［ｃΔ二同−もしくは酷似のペプチド断片に前以て暴露される経験を有するＴ細胞なしでは期待できないものである。

もし患者の癌細胞が６１位のアミノ酸のこの特異的突然変異を有していれば、このようなｊ％露は容易に起こり得る。

声、東　におけるラスペプチド、メモ１−Ｔ　の試験管内の一次免疫によるラスペプチド特異的Ｔ細胞の誘導に用いた合成ペプチドは、生体内の蛋白質分解酵素による突然変異ラス遺伝子産物処理により形成され、天然に発生するラスペプチドの組成物の明確な知識なしに構成された。

本発明者らは、各のクローンがラスから別々に同定されたペプチドの異なる突然変異を表す個々のペプチドに対する特異性と示し、突然変異形態と表すアミノ酸がＴ細胞により認識される部位の必要不可欠な部分を形成すること、および各クローンが同一の突然変異産物から誘導された異なる長さの幾つかのペプチドを認識する可能性があることを示したが、明らかにされるべき重大な間圧点が残っている。（例えば予防および治療を目的として）生体内の機能に関する能力を保持するために、合成ペプチドの特異的刺激により誘導されたＴ、ｆｌＢ胞／クローンは、その特異性において癌細胞から誘導されたペプチドとオーバーラツプしなければならない。

従って本発明者らは、（例えばメモリーＴ細胞応答などの）ラス由来ペプチドの先行認識の証拠を得る目的で、ラス突然変異の高い発生率が報告されている腫瘍を有する幾人かの癌患者由来のＰＢＭＣを試験した。そしてさらなる研究のために、先行Ｔ細胞刺激の証拠を示した幾人かの患者の内から一人が選ばれた０図９に記録された結果は、Ｐ胞状甲状腺癌を有する患者はペプチド２３に応答することができることを示している。応答は、組換えヒトＩＬ−２の添加により共働的に強調される。より多くの細胞およびより高い濃度のペプチド２３を用いた二回目の試験で、該応答が確認された（図１０）、培養細胞はペプチド２３による刺激の一週間後に再刺激されたが、その際にはラスの６１位のアミノ酸周辺から誘導された５種類の異なるペプチドが用いられた。ペプチド２３だけが細胞３再刺激することができ、このペプチドに対する強い特異性と示したく図１１）。

患者由来のＴ細胞クローンは、［Ｊｌに概略を記した７０トコルを用いた再刺激の３日目にバルク培養細胞からクローニングされた。数百のＴ細胞クローンが得られ、これらのクローンの内の四種類のクローンの結果が図１２に示されている。

クローン１０．１４．１５および２３は全て、ペプチド２３に強く応答した０本発明者らの行った、ＨＬＡ−ＤＱとのみ応答するクローンＥを用いたペプチド２３のへブチドブロック試験（図７）から予測されるように、クローンは、ＨＬＡ −ＤＱとのみ応答した［ｍＡｂ　ＦＮ　８１．１．１による阻！（［Ｊｌ３）、データ例示なし］、古典的メモリーＴ細胞検定での癌患者におけるペプチド２３の強いＴ細胞応答誘導能力は、生体内でＴ細胞が同一あるいは酷似のペプチドと遭遇したことを強く示唆している。

このことをさらに調査するために、本発明者らは一連の切断された形態のペプチド２３を合成し、該合成ペプチドのクローン１５に対する刺激能を試験した。

図１４に与えられたデータは、Ｎ末端に位置するアミノ酸である５４位のアスパラギン酸および５５位のインロイシンがクローン１５による認識にとって決定的に重要であることを示している。５４位のアスパラギン酸の除去は応答を大幅に減少させ、そして５５位のイソロイシンの除去は完全に応答を阻害した０図１４に示した如く、クローン１５はＣ末端に位置するアミノ酸である６９位のアスパラギン酸、６８位のアルギニン、６７位のメチオニンおよび６６位のアラニンの除去に対しては非感受性であった。６５位のセゾンの除去は応答を大幅に減少させた。これらのデータは共に、生体内でこれらのＴ細胞を最初に刺激した処理されたｐ２１ラスペプチドが、ラス蛋白質のＮ末端配列からの付加アミノ酸を含んでいる可能性を示している。よって、本発明者らは、ＴＨｉ胞認識に関与しないことが判明しているＣ末端のアミノ酸を幾つか欠くが、新たなアミノ酸である５３位および５２位のロイシン並びに５１位のシスティンを含む、天然Ｐ２１ラス配列から誘導された新規ペプチドを合成した。このペプチドセットを用いたクローン１４の刺激を示すデータが図１５に与えられている。最適な刺激は５１〜６７位の配列を含むペプチド１０６を用いたときに認められた。試験管内でのクローンの起源Ｔｍ胞の刺激に用いたペプチドと非常に異なる配列を有するペプチドにより、一様な、より強い応答が達成されたという観察は、ペプチド１０６がペプチド２３よりも、癌細胞に処理され、かつ独創的に免疫応答を引き起こすペプチドを代表していることを強く示している。

患者の疵種が６１位のラス突然変異の高発生率が報告されているものだけであったことは注目するに値する。従って、１休δ監ａ■工、突然変異ラス蛋白質の処理が本発明による合成ペプチドに酷似あるいはまったく同一のペプチドに帰着するに違いないことを示している。よって、区牧ｉΔ但８’ｔｌ”Ｃ癌患者にあらかじめ存在するＴ［胞応答を増強するために合成ペプチドを使用することは実現可能性が高い、このように試験管内で増殖されたラス特異的Ｔ［胞は、精製された　しＡＫ／ＴＩＬ細胞によるアプローチにより、患者由来のラス突然変異を有する腫瘍細胞を根絶する一助となる可能性がある。

本発明者らにとって有益な癌患者由来のオンコジーン特異的Ｔａｌ胞を用いて、次に、試験管内における癌細胞の増殖を律する際の、このような細胞の果し得る役割の調査を試みた。すなわち、本発明者らは、６１位のロイシンに特異的なＴ細胞であるクローン１４のヒト結腸癌細胞ＨＴ２９系の増殖における効果を試験管内で試験した。この細胞系は、組換えＩＦＮ−γ暴露後の癌患者に認められると同様に、その細胞表面に同一のＨＬＡ−ＤＱ分子を表現するように誘導されることができる０図２０の結果は、オンコジーンペプチドであるペプチド１０６で予備培養されたＩＦＮ−γ処理癌細胞の増殖は、このペプチドをＨＬＡ−ＤＱを経由して認識するＴａ胞の存在により強く阻害されることを示している。この阻害は培養細胞に添加された細胞の数および使用したペプチドの濃度に依存していた。ＩＦＮ−γ単独処理された対暇癌細胞はこのクローンの存在に影響されなかった。さらに、これらの機能的な研究は癌治療に用いるための本発明によるペプチドの有用性を示している。

合成ペプチドは連続流固相ペプチド合成（ｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓ　ｆｌｏｗ　５ｏｌｉｄ　ｐｈａｓｅ　ｐｅｐｔｉｄｅｓｙｎｔｈｅｓｉｓ；　Ｂｉｏｌｙｎｘ　４１７０５ｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒ、　Ｐｈａｒｍａｃｉａ　ＬＫＢ）を用いて合成された。

［５ｅｒ（ｔ１３ｕ）、　Ｔｈｒ（ｔＢｕ）、　乙ｙｓ（Ｂｏａ）、　）ｌｉｓ（Ｔｒｔ）、　Ａｒｇ（Ｐｔａｃ）、　Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）、@Ａｓｐ（０−ｔＢｕ）、Ｃ１ｕ（０−ｔＢｕ）　ｊ等と適当にｒＭＨ保護したＮ−ａ−Ｆｍｏｃ−アミノ酸と用いた。

Ｆｍｏｃ−アミノ酸はカップリングに先立って、ＴＢＴＵにより活性化された。

各カップリングの後、Ｆｍｏｃの選択的除去にＤＭＦ中の２０％ピペリジンが用いられた。樹脂からの剥離および側鏝保護物の最終除去は９５％のＴＦＡ　（水溶液）により実施された。ペプチドは精製されて、逆相（Ｃ１８）　ＨＰ　Ｌ　Ｃ（Ｓｈ　ｉｍａｄｚｕＬＣ８＾）にて分析された。アミノ酸分析はＰＩＣＯ− Ｔａｇ法（Ｗａｔｅｒｓ　ＭｉｌｌｉｐｏｒｅＩｎｃ、）と用いて実施された。

この方法により、以下のペプチドおよびペプチド断片が合成された：Ａｔ）　１２位または１３位に突然変異点を有する以下の配列のラスペプチド：Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｖａｌ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−＾１ａ−に１ｙ−Ｖａｔ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ｓｅｒ−へＩａ−Ｌｅｕ正常ラスペプチドの１〜２５位の配列を有するが、１２位または１３位に突然変異を有する、他の合成ペプチドを表８に示す。

Ａ２）　１２位または１３位に突然変異点およびラス蛋白質の天然配列に属さない付加アミノ酸を一端に有する以下の配列のラスペプチド：６　７　８　９　１０　１１　１２　１３　１４　１５’　１８　１７　１８　１９　２０　２１Ｌｅｕ−Ｖａ１４ａｌ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−＾１ａ−Ｇｊｚ−阻ｚ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ −Ｌｙｓ−Ｓｅｒ−＾１ａ−Ｌｅｕ−＾１４−ＬｅｕＬｅｕ−Ｖａｌ−Ｖａｌ− Ｖａｌ−Ｇｌｙ−＾１ａ−酎狙−１；Ｉｙ−Ｖａｌ−（：１ｙ−Ｌｙｓ−Ｓｅｒ −＾１ａ−Ｌｅｕ−＾１ａ−Ｌｅ■ Ｌｅｕ−ＶａｌＶａｌ−Ｖｉｌ−Ｇｌｙ−＾１ａ−Ｖａｌ−Ｃ［ｙ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ｓｅｒ−＾１ａ−Ｌｅｕ−＾１ａ−ＬｅｕＬｅｕ−Ｖａｌ−Ｖａｌ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−＾１ａ−リ互−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ｓｅｒ −＾１ａ−Ｌｅｕ−＾１ａ−ＬｅｕＬｅｕ−ＶａｌＶａｌ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−＾１ａ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｖａｔ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ｓｅｒ−＾１ａ−Ｌｅｕ−＾Ｉａ−ＬｅｕＬｅｕ−Ｖａｌ−ｖａｌ−Ｖａｔ−Ｇｌｙ−＾１ａ−―−Ｇｌｙ− Ｖａｔ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ｓｅｒ−＾１ａ−Ｌｅｕ−＾１ａ−４ｅｕＬｅｕ−ＶａｉＶａｌ−Ｖａｌ（＋ｌｙ−八ｌａへヘニ１−Ｃ１ｙ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ｓｅｒ−＾１ａ−Ｌｅｕ−＾１ａ−ＬｅｕＬｅｕ−Ｖａｌ−Ｖａｌ−Ｖａｌ −Ｃｌｙ−＾１ａ−酊ａ−Ｇｌｙ−Ｖａｔ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ｓｅｒ−＾１ａ− Ｌｅｕ−＾１ａ−ＬｅｕＬｅｕ−Ｖａｌ−Ｖａｔ−Ｖａｌ−にＩｙ−＾１ａ−（：１ｙ−Ｖａｔ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−［、ｙｓ−５ｅｒ−＾１ａ−Ｌｅｕ−＾１ａ −Ｌ■■ Ｌｅｕ−Ｖａｔ−Ｖａｌ−Ｖａｔ−Ｇｌｙ−＾１ａ−Ｇｌｙ−酎１−Ｖａｌに１ｙ−Ｌｙｓ−Ｓｅｒ−＾１ａ−Ｌｅｕ−＾１ａ−ＬｅｕＡ３）　１２位または１３位に突然変異点を有し、且つ切断されたＮ末端またはＣ末端２有する以下の配列のラスペプチド。

Ｖａｌ−Ｖａｌ−Ｖａｔ−Ｇｌｙ−＾Ｉｔ逼垣−に１ｙ−Ｖａｉ（：１ｙ−Ｌｙｓ−Ｓｅｒ−＾１ａＶａｌ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−＾１ａ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ −Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ｓｅｒ−＾１ａＶａｌ−Ｖａｌ−Ｖａｔ−Ｇｌｙ−＾１ａ− ＡＩ’ｉＪ：Ｉｙ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−５ｅｒＶａｌ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ− ＾Ｉａ−Ａｌａ−１：１ｙ−１／ａｌ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−５ｅｒＬｅｕ−Ｖａｌ −Ｖａｌ−Ｖｉｌ−Ｇｌｙ−＾１ａ−Ａ　１ａ−Ｇ　１ｙ−Ｖａｌ　−Ｇ　ｌｙ −［、ｙｓ−５ｅｒ−＾１ａＬｅｕ−Ｖａｌ−Ｖａｌ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−＾１ａ −Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−５ｅｒＬｅｕ−Ｖａｌ−Ｖａｌ− Ｖａｌ−（：Ｉｙ−＾Ｉａ−Ａｌａ−（：１ｙ−Ｖａｌ−にＩｙ−ＬｙｓＬｅｕ −Ｖａｌ−Ｖａｉ’／ａｌ−Ｇｌｙ−＾１ａ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−ＧｌｙＶａｌ−Ｖａｌ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−＾１ａ−へＩａ−（：１ｙ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ −Ｌｙｓ−Ｓｅｒ−＾１ａ−Ｌｅｕ−＾１ａ−ＬｅｕＶａ　Ｉ　−Ｖａ　ｌ　− Ｇ　ｌ　ｙ−＾Ｉａ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−３ｅｒ−＾１ａ−Ｌｅｕ−＾１ａ−ＬｅｕＶｉｌ−Ｇｌｙ−＾１ａ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ −Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ｓｅｒ−＾１ａ−Ｌｅｕ−＾１ａ−［、ｅｕＧｌｙ−＾１ａ −Ａｌｔ（：１ｙ−Ｖａｌ　−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ｓｅｒ−＾１ａ−Ｌｅｕ−＾Ｉａ−Ｌｅｕ＾１ａ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ｓｅｒ−＾Ｉｔ −Ｌｅｕ−＾１ａ−ＬｅｕＬｅｕ−Ｖａｌ−Ｖａｌ−Ｖａｌ−１１；Ｉｙ−＾１ａ−Ｃ１ｙ−Ｖａｌ−Ｖａｌ−（：１ｙ−Ｌｙｓ−Ｓｅｒ−＾１ａＬｅｕ−Ｖａｌ−Ｖａｌ−Ｖａｌ−Ｃ１ｙ−＾１ｍ−に！ｙＪａｌ−Ｖａｌ−Ｇ！ｙ−Ｌｙｓ −ＳｅｒＬｅｕ−Ｖａｌ−Ｖａｌ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−＾１ａ−Ｃ１ｙ−Ｖｉｌ− Ｖａｌ−Ｇｌｙ−ＬｙｓＬｅｕ−Ｖａｌ−Ｖａｌ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−＾１ｉ−（：１ｙ−Ｖａｌ−Ｖａｌ−ＧｌｙＶａｌ−Ｖａｌ−Ｖａｉにｌｙ−＾１ｘ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ｖａｌ−Ｃｌｙ−Ｌｙｓ−Ｓｅｒ−＾Ｉａ−Ｌｅｕ−＾１ａ−ＬｅｕＶａｌ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−＾１ａ−Ｃｌｙ−Ｖａｔ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ −Ｓｅｒ−＾Ｉｔ−Ｌｅｕ−＾！ａ−ＬｅｕＶａｔ−Ｇｌｙ−＾１ｔ−Ｇｌｙ− Ｖａｌ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ｓｅｒ−＾１ａ−Ｌｅｕ−＾１ａ−Ｌｅｕ八１ａ−Ｃ１ｙ逐ａｌ−Ｖｘｌ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ｓｅｒ−＾１ａ−Ｌｅｕ−＾１ａ−ＬｅｕＢ）　６１位に突然変異を有するラスペプチド：＾５ｐ−ＩＬｅ−Ｌｅｕ−＾５ｐ−Ｔｈｒ−＾１ａ−Ｇｌ　ｙ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｃ１ｕ−Ｔｙｒ− Ｓｅｒ−＾１ａ−Ｍｅｔ−＾ｒｇ−八ｓ■ ＾ｓｐ−ＩＬｅ−Ｌｅｕ−＾５ｐ−Ｔｈｒ−＾Ｉａ−Ｇｌｙ−ｂ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｔｙｒ−Ｓｅｒ−＾１ａ−Ｎｅｔ−＾ｒｇ−＾ｓｐ＾５ｐ−ＩＬｅ−Ｌｅｕ −Ａｓｐ−丁ｈｒ−＾１ａ−Ｇｌｙ−７−Ｇｌｕ−Ｃｌｕ−Ｔｙｒ−Ｓｅｒ−＾１ａ−Ｍｅｔ−＾ｒｇ−＾ｓｐ＾５ｐ−ＩＬｅ−Ｌｅｕ−＾５ｐ−Ｔｈｒ−八Ｉａ−Ｇｌｙ−Ｈｉｓ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｔｙｒ−Ｓｅｒ−＾Ｉａ−Ｍｅｔ−＾「ｇ−＾５ｐＣ）　ａｂ　１−ｂｅ　ｒｉｄ合遺伝子ペプチド：ＩＬｅ−Ｐｒｏ− Ｌｅｕ−Ｔｈｒ−ＩＬｅ−＾５ｎ−Ｌｙｓ−Ｃｌｕ−Ｃ１ｕ−Ａｌｘ−Ｌｅｕ− Ｃｌｎ−＾ｒｇ−Ｐｒｏ−Ｖａ　ｌ−＾１＝|Ｓｅｒ−＾５ｐ− Ｐｂｅ−Ｇｌｕ＾１ａ−Ｔｈｒ−ＧＩｙ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ（；Ｉｎ−５ｅｒ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ− ＾１ａ−Ｌｅｕ−Ｇｌｎ−＾ｒｇ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ−＾１ａ|Ｓｅｒ−八５ｐ− Ｐｈｅ−ＧｌｕＤ）　ｅｇｆ受容体ペプチドおよびレチノイド受容体ペプチド５ｅｒ−＾「ｇ− ＾Ｉａ−ＬｅｕにＩｕ−Ｇｌｕ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−＾５ｎ−Ｔｙｒ−Ｖａｌ−Ｖａｌ−Ｔｈｒ−＾５ｐ−Ｈｉｓ−fｌｙＬｅｕ−Ｓｅｒ−５ｅｒ−Ｃｙｓ　−Ｉ　Ｌｅ−Ｔｈ　ｒ−Ｇ　Ｉ　ｎ　−Ｇ　Ｉ　ｙ　−Ｌｙｓ　−Ａ　Ｉ　ａ　−ＩＬｅ−Ｇ　Ｉ　ｕ　|Ｔｈ　ｒ−Ｇ　Ｉ　ｎ−Ｓｅｒ−３ｅｒ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｇｌｕ−Ｃ１ｕペプチドの親和性精製ＨＬＡ分子との結合は、放射線でラベルされた指標ペプチドの結合を、それらのペプチドが阻害する能力により試験された。ペプチドのＤＱＷ６との結合を試験するために、指標ペプチドとしてヨウ素処理されたＰ２Ｏ３が用いられた。（インフルエンザ構造蛋白質ａａ１７〜２９より誘導された）ヨウ素処理されたＰ３４が、ペプチドのＤＲＩとの結合を試験する際の指標ペプチドとして用いられた。表中には、指標ペプチドの結合の５０％阻害濃度（ＩＣ５０）が示されている。低いＩＣ５０値は、良好な結合能力を意味する。ペプチドは０．３３〜１０μＭの範囲の濃度で試験された。

プロトコル：５種類のｐ２１ラスペプチド２０μｇ１週間 ↓ 再刺激：ｌＸ１０’個の照射された自系養育細胞／ｍｌおよび２０μｇの各ペプチド最終希釈液１週間 ↓ 再刺激（上記と同様の方法による）１週間 ↓ クローニング：ウェル当たり１幼若細胞のテラサキプレート　２０個↓ ６００ウエルから５１種類のクローンクローン性の信頼度：９７．８％４５クローンを増殖２９クローンを特性付は図１要約抗癌治療の為の癌ワクチンならびに組成物に用いられる、合成ペプチドおよびＴ細胞性免疫を誘導するオンコジーン蛋白質産物の断片。

Claims

【特許請求の範囲】

１．ペプチドであって、ａ）プロトオンコジーン蛋白質の相応する断片と比較して、突然変異点もしくは転移点を有し；かつｂ）癌細胞または他の抗原提供細胞（ＡＰＣ）により提供されるような、処理されたオンコジーン蛋白質断片または該断片を完全に包含する断片に相応し；かつｃ）細胞による処理で生産され、ＨＬＡ分子に提供される、真のオンコジーン蛋白質断片に応答する特異的Ｔ細胞を誘導することを特徴とする、ペプチド。
２．１２位および／または１３位のグリシン残基、および／または６１位のグルタミン残基が他のアミノ酸により置き換えられている以外は、天然ｐ２１ラス蛋白質と同一のアミノ酸配列を有する、請求項１に記載のペプチド。
３．下記のａ、ｂおよびｃからなるグループから選択される、請求項２に記載のペプチド；ａ）表８に示すｐ−１１３〜ｐ−１１９のペプチドもしくはその断片；ｂ）表８に示すｐ−１２０〜ｐ−１２１のペプチドもしくはその断片；ｃ）表９に示すｐ −１５８、ｐ−１６６、ｐ−１６８およびｐ−１６７のペプチドもしくはその断片。
４．請求項１〜３のいずれかに記載のペプチドおよび医薬的に許容される担体または希釈剤を含有する医薬組成物。
５．請求項１〜３のいずれかに記載のペプチドおよび医薬的に許容される担体または希釈剤を含有する癌ワクチン。
６．腫瘍に対するＴ細胞免疫を誘導する医薬組成物を製造するための、請求項１〜３のいずれかに記載のペプチドの使用。
７．請求項１〜３のいずれかに記載のペプチドを用いた生体内での刺激によりオンコジーン蛋白質に対するＴ細胞免疫を導入することからなる、癌の恐れのある人の予防接種方法。
８．請求項１〜３のいずれかに記載のペプチドを用いた、試験管内または生体内での刺激によりオンコジーン蛋白質に対するＴ細胞免疫を導入することからなる、癌患者の治療方法。