TW202114732A - 遞送b型肝炎病毒(hbv)疫苗之脂質奈米顆粒或脂質體 - Google Patents

Abstract

本發明描述含有B型肝炎病毒(hepatitis B virus；HBV)疫苗及脂質之醫藥組合物。本發明亦描述尤其在患有慢性HBV感染之個體中使用所揭示之醫藥組合物來誘導針對HBV之免疫反應或治療HBV誘發之疾病的方法。

Description

遞送B型肝炎病毒(HBV)疫苗之脂質奈米顆粒或脂質體

B型肝炎病毒(HBV)係編碼四個開放閱讀框架及七種蛋白質的3.2 kb親肝性小DNA病毒。約2.4億人患有慢性B型肝炎感染(慢性HBV)，其特徵為病毒及亞病毒粒子持久存在於血液中超過6個月(Cohen等人J. Viral Hepat. (2011) 18(6), 377-83)。持久的HBV感染經由病毒肽及循環抗原長期刺激HBV特異性T細胞受體而產生循環及肝內HBV特異性CD4+及CD8+ T細胞的T細胞耗盡。因此，T細胞多功能性減弱(亦即，IL-2、腫瘤壞死因子(TNF)-α、IFN-γ含量降低，及增殖缺乏)。

自20世紀80年代以來，已獲得針對HBV感染之安全且有效的預防性疫苗，且其為B型肝炎預防之支柱(World Health Organization, Hepatitis B: Fact sheet第204號[Internet] 2015年3月)。世界衛生組織(World Health Organization)建議所有嬰兒接受疫苗接種，且在存在較低或中等B型肝炎地方性流行的國家中，建議所有兒童及青少年(＜18歲)以及處於風險群體類別的某些人接受疫苗接種。由於接受疫苗接種，使得全世界感染率大幅下降。不過，預防性疫苗不能治癒已確定之HBV感染。

慢性HBV當前係用IFN-α及核苷或核苷酸類似物進行治療，但由於在感染之肝細胞中存留有作為病毒RNA之模板且因此新病毒粒子起重要作用的稱為共價閉合環狀DNA (cccDNA)之細胞內病毒複製中間物而最終無法治癒。普遍認為，誘發病毒特異性T細胞及B細胞反應可以有效地除去載有cccDNA之肝細胞。當前靶向HBV聚合酶之療法抑制病毒血症，但對存在於核中之cccDNA及相關之循環抗原產生的作用有限。最嚴格的治癒形式可以除去生物體中之HBV cccDNA，此既不為觀察到的自然發生之結果，亦非任何治療性干預之結果。然而，HBV表面抗原(HBsAg)之喪失係臨床上可信的治癒等效結果，因為疾病復發僅在嚴重免疫抑制情況下才會發生，而此可接著藉由預防性治療加以預防。因此，至少自臨床觀點看，HBsAg之喪失與針對HBV之最嚴格的免疫重建形式相關。

舉例而言，經證實，利用聚乙二醇化干擾素(pegIFN)-α進行之免疫調節在維持有限治療療程之治療結束後反應方面優於核苷或核苷酸療法。除直接抗病毒作用以外，據報導，IFN-α對細胞培養物及人類化小鼠的cccDNA起到表觀遺傳抑制作用，其使得病毒粒子產率降低及轉錄物減少(Belloni等人. J. Clin. Invest. (2012) 122(2), 529-537)。然而，此療法仍伴隨副作用且部分由於IFN-α對HBV特異性T細胞僅具有較弱的調節作用，總體反應相當低。詳言之，治癒率較低(＜10%)且毒性較高。同樣，直接作用於HBV之抗病毒劑，即HBV聚合酶抑制劑恩替卡韋(entecavir)及替諾福韋(tenofovir)，作為單藥療法有效誘導病毒抑制作用且針對耐藥性突變體之出現具有較高基因屏障作用且由此預防肝病之進展。然而，利用此類HBV聚合酶抑制劑很少實現由HBsAg喪失或血清轉化定義的慢性B型肝炎之治癒。因此，該等抗病毒劑理論上需要無限期投與以預防肝病之復發，與針對人類免疫缺陷病毒(HIV)之抗反轉錄病毒療法類似。

治療性疫苗接種有可能自長期感染患者消除HBV (Michel等人. J. Hepatol. (2011) 54(6), 1286-1296)。已經研究許多策略，但迄今為止，尚未證實治療性疫苗接種之成功性。

因此，由於具有較高治癒率的良好耐受之治療方法有限，對於B型肝炎病毒(HBV)，特別是慢性HBV治療之醫療需求尚未得到滿足。本發明藉由提供用於誘發針對B型肝炎病毒(HBV)感染之免疫反應的醫藥組合物或組合物及方法來滿足此需求。本發明之免疫原性組合物/組合及方法可以用於向個體，諸如患有慢性HBV感染之個體提供治療性免疫。

在一通用態樣中，本申請案係關於包含一或多種編碼HBV抗原之聚核苷酸的醫藥組合物，其係用於治療有需要之個體之HBV感染。

在一個實施例中，本申請案之醫藥組合物包含： i)以下中之至少一者： a) 包含編碼截短HBV核心抗原之第一聚核苷酸序列的第一非天然存在之核酸分子，該截短HBV核心抗原由與SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4至少95%，諸如至少95%、96%、97%、98%、99%或100%一致的胺基酸序列組成；及 b)        包含編碼HBV聚合酶抗原之第二聚核苷酸序列的第二非天然存在之核酸分子，該HBV聚合酶抗原具有與SEQ ID NO: 7至少90%，諸如至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致的胺基酸序列，其中該HBV聚合酶抗原不具有逆轉錄酶活性及核糖核酸酶H活性；及 ii)陽離子脂質，諸如本文所述之彼等脂質。

在一個實施例中，截短HBV核心抗原由SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4之胺基酸序列組成，且HBV聚合酶抗原包含SEQ ID NO:7之胺基酸序列。

在一個實施例中，醫藥組合物包含以下中之至少一者：包含編碼截短HBV核心抗原之第一聚核苷酸序列的第一非天然存在之核酸分子，及包含編碼HBV聚合酶抗原之第二聚核苷酸序列的第二非天然存在之核酸分子。在某些實施例中，第一非天然存在之核酸分子進一步包含編碼可操作地連接至截短HBV核心抗原之N端的信號序列的聚核苷酸序列，且第二非天然存在之核酸分子進一步包含編碼可操作地連接至HBV聚合酶抗原之N端的信號序列的聚核苷酸序列，較佳地，信號序列獨立地包含SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:15之胺基酸序列，更佳地，信號序列分別由SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:14之聚核苷酸序列編碼。

在某些實施例中，第一聚核苷酸序列包含與SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:3具有至少90%，諸如至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性之聚核苷酸序列。

在某些實施例中，第二聚核苷酸序列包含與SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:6具有至少90%，諸如至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性之聚核苷酸序列。

在某些實施例中，脂質之實例、包含脂質之醫藥組合物、製備脂質或調配包含脂質及核酸分子之醫藥組合物的方法及使用用於治療或預防疾病之醫藥組合物的方法描述於美國或國際專利申請公開案，諸如US2017/0190661、US2006/0008910、US2015/0064242、US2005/0064595、WO/2019/036030、US2019/0022247、WO/2019/036028、WO/2019/036008、WO/2019/036000、US2016/0376224、US2017/0119904、WO/2018/200943、WO/2018/191657、WO/2018/118102、US20180169268、WO2018118102、WO2018119163、US2014/0255472及US2013/0195968中，其各者之相關內容以全文引用之方式併入本文中。

在一個實施例中，本申請案之醫藥組合物包含： a) 包含編碼截短HBV核心抗原之第一聚核苷酸序列的第一非天然存在之核酸分子，該截短HBV核心抗原由與SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4至少95%，諸如至少95%、96%、97%、98%、99%或100%一致的胺基酸序列組成； b)        包含編碼HBV聚合酶抗原之第二聚核苷酸序列的第二非天然存在之核酸分子，該HBV聚合酶抗原具有與SEQ ID NO:7至少90%，諸如至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致的胺基酸序列，其中該HBV聚合酶抗原不具有逆轉錄酶活性及核糖核酸酶H活性； c) 陽離子脂質；及 d)        選自由以下組成之群的至少一者：陰離子脂質、兩性離子脂質、中性脂質、類固醇、聚合物結合脂質、磷脂、糖脂及其組合， 其中該第一及第二非天然存在之核酸分子囊封或包涵於脂質奈米顆粒或脂質體中，該脂質奈米顆粒或脂質體包含陽離子脂質及至少一種選自由以下組成之群的其他脂質：陰離子脂質、兩性離子脂質、中性脂質、類固醇、聚合物結合脂質、磷脂、糖脂及其組合。

較佳地，醫藥組合物包含a)第一非天然存在之核酸分子，其包含編碼截短HBV核心抗原之第一聚核苷酸序列，該截短HBV核心抗原由SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4之胺基酸序列組成；及b)第二非天然存在之核酸分子，其包含編碼HBV聚合酶抗原之第二聚核苷酸序列，該HBV聚合酶抗原具有SEQ ID NO:7之胺基酸序列，囊封或包涵於脂質奈米顆粒或脂質體中。

較佳地，醫藥組合物包含第一非天然存在之核酸分子，其包含與SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:3具有至少90%，諸如至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性之聚核苷酸序列，及第二非天然存在之核酸分子，其包含與SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:6具有至少90%，諸如至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性之聚核苷酸序列。

更佳地，醫藥組合物包含a)第一非天然存在之核酸分子，其包含SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:3之第一聚核苷酸序列；b)第二非天然存在之核酸分子，其包含SEQ ID NO:5或6之第二聚核苷酸序列；及c)該第一及第二非天然存在之核酸分子充分包涵於脂質奈米顆粒或脂質體中，該脂質奈米顆粒或脂質體包含陽離子脂質及至少一種選自由以下組成之群的其他脂質：陰離子脂質、兩性離子脂質、中性脂質、類固醇、聚合物結合脂質、磷脂、糖脂及其組合。

在一個實施例中，第一及第二非天然存在之核酸分子中之各者為DNA分子，DNA分子較佳為DNA質體或線性閉合型小型DNA。

在另一實施例中，第一及第二非天然存在之核酸分子中之各者為RNA分子，較佳mRNA或自我複製RNA分子。

在一些實施例中，第一及第二非天然存在之核酸分子中之各者獨立地與脂質奈米顆粒(LNP)調配。

在一些實施例中，第一及第二非天然存在之核酸分子中之各者獨立地用脂質體調配。

在另一通用態樣中，本申請案係關於包含本申請案之醫藥組合物的套組。

本申請案亦係關於用於誘發針對B型肝炎病毒(HBV)之免疫反應的本申請案之醫藥組合物或套組；以及本申請案之醫藥組合物、組合物或套組在製造用於誘發針對B型肝炎病毒(HBV)之免疫反應的藥物中的用途。該用途可進一步包含與另一免疫原性藥劑或治療劑，較佳另一HBV抗原或另一HBV療法之組合。較佳地，該個體患有慢性HBV感染。

本申請案進一步係關於一種用於治療有需要之個體的HBV誘發之疾病的本申請案之醫藥組合物或套組；及本申請案之醫藥組合物或套組在用於製造用於治療有需要之個體的HBV誘發之疾病的藥劑中的用途。該用途可以進一步包含與另一治療劑，較佳地另一抗HBV抗原之組合。較佳地，該個體患有慢性HBV感染，且該HBV誘發之疾病係選自由晚期纖維化、肝硬化及肝細胞癌(HCC)組成之群。

本申請案亦係關於一種誘發針對HBV之免疫反應的方法或一種治療HBV感染或HBV誘發之疾病的方法，其包含向有需要之個體投與根據本發明之實施例的醫藥組合物。

自以下揭示內容，包括本發明之詳細說明及其較佳實施例以及所附申請專利範圍，將易於瞭解本發明之其他態樣、特徵及優勢。

相關申請之交叉參考 本申請案主張2019年6月20日申請之美國臨時申請案第62/863,958號之優先權，其揭示內容以全文引用之方式併入本文中。

對以電子方式提交之序列表之引用 本申請案含有序列表，該序列表係以2020年6月11日創建的檔案名稱為「065814.11213/7TW1 Sequence Listing」且大小為45.4 kb之ASCII格式序列表經由EFS-Web以電子方式提交。此經由EFS-Web提交之序列表係說明書之一部分且以全文引用的方式併入本文中。

先前技術及本說明書通篇引用或描述各種出版物、文章及專利；該等參考文獻各自以全文引用的方式併入本文中。本說明書中所包括的文獻、操作、材料、器件、文章或類似物之論述係出於提供本發明之內容的目的。此類論述並非承認任何或所有此等內容形成關於所揭示或所主張之任何發明之現有技術的一部分。

除非另外定義，否則本文所用的所有技術及科學術語均具有與本發明所屬領域的一般技術者通常所理解相同的含義。另外，本文中使用之某些術語具有如本說明書中所述之含義。本文中引用的所有專利、公開之專利申請案及出版物均以引用的方式併入，就如同在本文中完整闡述一般。

必須注意的是，除非上下文另外明確指示，否則如本文及所附申請專利範圍中所使用，單數形式「一個(種)(a/an)」及「該(the)」包括複數個(種)指示物。

除非另外指示，否則在一系列要素之前的術語「至少」應理解為指系列中之每一要素。熟習此項技術者將認識到或能夠僅使用常規實驗即可確定本文所描述之本發明特定實施例的許多等效物。本發明意欲涵蓋此類等效物。

在整個本說明書及隨後之申請專利範圍中，除非上下文另外要求，否則詞語「包含(comprise)」及諸如「包含(comprises/comprising)」之變化形式應理解為暗示包括陳述整體或步驟或者整體或步驟之群組但不排除任何其他整體或步驟或步驟或者整體或步驟之群組。當在本文中使用時，術語「包含」可以用術語「含有」或「包括」取代，或有時當在本文中使用時，用術語「具有」取代。

當在本文中使用時，「由……組成」排除所主張要素中未規定之任何要素、步驟或成分。當在本文中使用時，「基本上由……組成」不排除不會實質上影響技術方案之基本及新穎特徵之材料或步驟。每當本文中在本申請案之態樣或實施例之上下文中使用時，前述術語「包含」、「含有」、「包括」及「具有」中之任一個可以用術語「由……組成」或「基本上由……組成」置換以改變本發明之範圍。

如本文中所用，多個所述要素之間的合取術語「及/或」理解為涵蓋個別及組合選項。舉例而言，當兩個要素藉由「及/或」連結時，第一個選擇係指第一要素之適用性，不含第二要素。第二個選擇係指第二要素之適用性，不含第一要素。第三個選擇係指第一要素與第二要素一起之適用性。此等選擇中之任一個應理解為在該含義之範圍內，且因此滿足如本文所使用之術語「及/或」之要求。該等選擇中多於一個之同時適用性亦應理解為在該含義之範圍內，且因此滿足術語「及/或」之要求。

除非另外規定，否則任何數值，諸如本文所描述之濃度或濃度範圍，應理解為在所有情況下以術語「約」修飾。因此，一個數值通常包括所述值之±10%。舉例而言，1 mg/mL濃度包括0.9 mg/mL至1.1 mg/mL。同樣，1 mg/mL至10 mg/mL之濃度範圍包括0.9 mg/mL至11 mg/mL。除非上下文另外明確地指示，否則如本文所使用，使用的數字範圍明確地包括所有可能的子範圍、在該範圍內的所有個別數值，包括該等範圍內之整數及該等值之分數。

當參照胺基酸序列使用時，與構成胺基酸序列之總長度的胺基酸殘基之數量相比，短語「序列一致性百分比(%)」或「一致性%」或「與……一致%」描述兩個或更多個比對之胺基酸序列中匹配(「相配(hit))」的一致胺基酸之數量。在其他方面，當比較且比對序列達到最大對應性，使用此項技術中已知之序列比較演算法量測時，或當手動地比對並目視檢查時，使用比對，對於兩個或更多個序列，可以確定該等序列中相同胺基酸殘基之百分比(例如相對於胺基酸序列全長之90%、91%、92%、93%、94%、95%、97%、98%、99%或100%一致性)。因此，供比較以確定序列一致性的序列可能因胺基酸之取代、添加或缺失而不同。適合用於比對蛋白質序列之程式係熟習此項技術者已知的。蛋白質序列之序列一致性百分比可用諸如CLUSTALW、Clustal Omega、FASTA或BLAST之程式，例如使用NCBI BLAST演算法確定(Altschul SF等人(1997),Nucleic Acids Res . 25:3389-3402)。

如本文所用，在向個體投與兩種或更多種療法或組分之情形下，將術語及片語「組合」、「與...組合」、「共遞送」及「與...一起投與」之係指同時投與或連續投與兩種或更多種療法或組分，諸如兩種載體，例如DNA質體、肽或醫藥組合物及佐劑。「同時投與」可至少在同一天內投與兩種或更多種療法或組分。當兩種組分係「一起投與」或「組合投與」時，其可以在較短時間段內，諸如在24、20、16、12、8或4小時內或在1小時內以獨立組合物依序投與，或其可以單一組合物形式同時投與。「連續投與」可在同一天或在單獨天數投與兩種或更多種療法或組分。使用術語「與……組合」並不限定向個體投與療法或組分之次序。舉例而言，第一療法或組分(例如編碼HBV抗原之第一經脂質體囊封之DNA質體)可以在投與第二療法或組分(例如編碼HBV抗原之第二DNA質體)之前(例如5分鐘至一小時之前)、伴隨地或同時地，或之後(例如5分鐘至一小時之後)投與。在一些實施例中，第一療法或組分(例如編碼HBV抗原之第一經脂質體囊封之DNA質體)及第二療法或組分(例如編碼HBV抗原之第二經脂質體囊封之DNA質體)係以相同組合物投與。在其他實施例中，在獨立組合物，諸如兩種獨立組合物中投與第一療法或組分(例如編碼HBV抗原之第一經脂質體囊封之DNA質體)及第二療法或組分(例如編碼HBV抗原之第二經脂質體囊封之DNA質體)。

如本文所使用，「非天然存在之」核酸或多肽係指自然界中不存在的核酸或多肽。「非天然存在之」核酸或多肽可以為經合成、處理、製造及/或以其他方式在實驗室及/或製造環境中操作。在一些條件下，非天然存在之核酸或多肽可以包含經處理、加工或操作而展現在處理之前天然存在之核酸或多肽中不存在之特性的天然存在之核酸或多肽。如本文所使用，「非天然存在之」核酸或多肽可以為自發現其之天然來源分離或分開的核酸或多肽，且其與在天然來源中與其關聯之序列不具有共價鍵。「非天然存在之」核酸或多肽可以重組方式或其他方法，諸如化學合成製備。

如本文所用，「個體」意謂將利用根據本申請案之實施例的方法治療或已利用該方法治療的任何動物，較佳為哺乳動物，最佳為人類。如本文所用，術語「哺乳動物」涵蓋任何哺乳動物。哺乳動物之實例包括但不限於牛、馬、綿羊、豬、貓、狗、小鼠、大鼠、兔、天竺鼠、非人類靈長類動物(NHP)諸如猴或猿、人類等，更佳為人類。

如本文所使用，術語「可操作地連接」係指鍵聯或併接，其中如此描述之組分係呈允許其以其預期方式發揮作用的關係。舉例而言，可操作地連接至相關核酸序列之調控序列能夠引導相關核酸序列之轉錄，或可操作地連接至相關胺基酸序列之信號序列能夠將相關胺基酸序列分泌或轉位至膜上。

為了幫助本申請案之讀者，說明書分成各種段落或部分，或針對本申請案之各種實施例。此等分離不應認為一個段落或部分或實施例之物質與另一段或部分或實施例之物質無關聯。相反，熟習此項技術者應理解，本說明書具有廣闊應用且涵蓋可以涵蓋之各種部分、段落及語句之所有組合。任何實施例之論述僅意欲為例示性的，且並不意欲表明本發明之範疇，包括申請專利範圍，侷限於此等實例。舉例而言，儘管本文所描述的本申請案之HBV載體(例如質體DNA或病毒載體)之實施例可以含有按特定次序佈置之特定組分，包括但不限於某些啟動子序列、強化子或調控序列、信號肽、HBV抗原編碼序列、聚腺苷酸化信號序列等，但一般熟習此項技術者應瞭解，本文所揭示之概念可以同等地應用於按可以在本申請案之HBV載體中使用的其他次序佈置之其他組分。本申請案涵蓋使用具有可以用於本申請案之HBV載體中之任何序列的呈任何組合形式之可應用組分中之任一種，無論是否明確地描述特定組合。本發明大體上係關於一種醫藥組合物，其包含一或多種HBV抗原及一或多種脂質。

B 型肝炎病毒 (HBV) 如本文所使用，「B型肝炎病毒」或「HBV」係指肝DNA病毒科之病毒。HBV為編碼四個開放閱讀框架及七種蛋白質的親肝性小(例如3.2 kb)DNA病毒。HBV編碼之七種蛋白質包括小(S)、中等(M)及大(L)表面抗原(HBsAg)或包膜(Env)蛋白質、前核心蛋白、核心蛋白、病毒聚合酶(Pol)及HBx蛋白質。HBV表現三種表面抗原，或包膜蛋白，即L、M及S，其中S最小且L最大。M及L蛋白質中之額外域分別命名為前S2及前S1。核心蛋白為病毒核衣殼之亞單元。Pol為合成病毒DNA(逆轉錄酶、核糖核酸酶H及引子)所需，其發生在位於受感染肝細胞之細胞質的核衣殼中。前核心蛋白係具有N端信號肽之核心蛋白且在自感染細胞分泌之前，在其N及C端經蛋白水解加工為所謂的B型肝炎抗原(HBeAg)。HBx蛋白質係共價閉合環狀DNA(cccDNA)高效轉錄所需的。HBx並非病毒結構蛋白。除共有mRNA之核心及聚合酶外，HBV之所有病毒蛋白均具有其自身mRNA。除前核心蛋白之外，該等HBV病毒蛋白均不經歷轉譯後蛋白質水解加工。

HBV病毒粒子含有病毒包膜、核衣殼，及部分呈雙股之DNA基因體的單一複本。核衣殼包含120個核心蛋白二聚體且經內嵌有S、M及L病毒包膜或表面抗原蛋白質之衣殼膜覆蓋。在進入細胞之後，病毒去殼且與病毒聚合酶共價結合的含衣殼之鬆環DNA(rcDNA)遷移至核中。在該過程期間，核心蛋白磷酸化誘導結構變化，暴露出核定位信號，使得衣殼能夠與所謂的輸入蛋白(importin)相互作用。該等輸入蛋白介導核心蛋白與核孔複合物之結合，在該結合後，衣殼解離且聚合酶/rcDNA複合物釋放至核中。在核內，rcDNA變得去蛋白化(移除聚合酶)且經宿主DNA修復機構轉變成共價閉合環狀DNA(cccDNA)基因體，自該基因體，重疊之轉錄本編碼HBeAg、HBsAg、核心蛋白、病毒聚合酶及HBx蛋白質。核心蛋白、病毒聚合酶及前基因體RNA(pgRNA)在細胞質中締合並自組裝成不成熟的含pgRNA之衣殼粒子，該等衣殼粒子進一步轉化成為成熟rcDNA-衣殼且充當共同中間物，經包覆且以感染病毒粒子形式分泌，或轉運回到核中以補充及維持穩定cccDNA池。

迄今為止，HBV基於包膜蛋白上存在之抗原性抗原決定基而分成四種血清型(adr、adw、ayr、ayw)，且基於病毒基因體之序列而分成八種基因型(A、B、C、D、E、F、G及H)。HBV基因型分佈在不同地理區域上。舉例而言，亞洲最流行基因型為基因型B及C。基因型D主要存在於非洲、中東及印度，而基因型A在北歐、撒哈拉沙漠以南非洲(sub-Saharan Africa)及西非較為普遍。

HBV 抗原 如本文所用，術語「HBV抗原」、「HBV之抗原性多肽」、「HBV抗原性多肽」、「HBV抗原蛋白質」、「HBV免疫原性多肽」及「HBV免疫原」皆指能夠在個體中誘發針對HBV之免疫反應，例如體液及/或細胞介導之反應的多肽。HBV抗原可以為HBV多肽、其片段或抗原決定基，或多個HBV多肽、其部分或衍生物之組合。HBV抗原能夠在宿主中產生保護性免疫反應，例如誘發針對病毒性疾病或感染之免疫反應，及/或在個體中產生針對病毒性疾病或感染之免疫(亦即，接種疫苗)，由此保護個體免受病毒性疾病或感染影響。舉例而言，HBV抗原可以包含源於任何HBV基因型，例如基因型A、B、C、D、E、F、G及/或H之任何HBV蛋白質，諸如HBeAg、前核心蛋白、HBsAg(S、M或L蛋白質)、核心蛋白、病毒聚合酶或HBx蛋白質，或其組合的多肽或其免疫原性片段。

(1) HBV 核心抗原 如本文所使用，術語「HBV核心抗原」、「HBc」及「核心抗原」均係指能夠在個體中誘發針對HBV核心蛋白之免疫反應，例如體液及/或細胞介導之反應的HBV抗原。術語「核心」、「核心多肽」及「核心蛋白」均係指HBV病毒核心蛋白。全長核心抗原通常係183個胺基酸長度且包括組裝域(胺基酸1至149)及核酸結合域(胺基酸150至183)。34個殘基之核酸結合域係前基因體RNA衣殼化所需的。此域亦用作核輸入信號。其包含17個精胺酸殘基且具有較高鹼性，與其功能相符。HBV核心蛋白在溶液中呈二聚體形式，且該二聚體自組裝成二十面體衣殼。每個核心蛋白二聚體具有在任一側上側接一個α-螺旋域的四個α-螺旋束。不含該核酸結合域的截短之HBV核心蛋白亦能夠形成衣殼。

在本申請案之一個實施例中，HBV抗原係截短HBV核心抗原。如本文所使用，「截短HBV核心抗原」係指不含全長之HBV核心蛋白但能夠在個體中誘發針對HBV核心蛋白之免疫反應的HBV抗原。舉例而言，HBV核心抗原可以經修飾成使核心抗原中通常含有十七個精胺酸(R)殘基的帶大量正電荷(富含精胺酸)之C端核酸結合域的一或多個胺基酸缺失。本申請案的截短HBV核心抗原較佳為不包含HBV核心核輸入信號的C端截短之HBV核心蛋白及/或已缺失C端HBV核心核輸入信號的截短之HBV核心蛋白。在一個實施例中，截短HBV核心抗原包含C端核酸結合域中之缺失，諸如缺失C端核酸結合域之1至34個胺基酸殘基，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33或34個胺基酸殘基，較佳缺失全部34個胺基酸殘基。在較佳實施例中，截短HBV核心抗原包含C端核酸結合域中之缺失，較佳所有34個胺基酸殘基之缺失。

本申請案之HBV核心抗原可以為源於多種HBV基因型(例如基因型A、B、C、D、E、F、G及H)之共同序列。如本文所使用，「共同序列」意謂基於同源蛋白質之胺基酸序列比對，例如藉由比對(例如使用Clustal Omega)同源蛋白質之胺基酸序列所測定的人工胺基酸序列。其可以為基於來自至少100個天然HBV分離株之HBV抗原(例如核心、pol等)之序列計算的在序列比對中各位置處所發現的最常見胺基酸殘基之次序。共同序列可以為非天然存在的且不同於原生病毒序列。共同序列可以藉由使用多序列比對工具比對來自不同來源之多個HBV抗原序列，且在有變化之比對位置選擇最常見的胺基酸來設計。較佳地，HBV抗原之共同序列係源於HBV基因型B、C及D。術語「共同抗原」用以指具有共同序列之抗原。

根據本申請案的例示性截短HBV核心抗原不具有核酸結合功能，且能夠在哺乳動物中誘發針對至少兩種HBV基因型之免疫反應。較佳地，截短HBV核心抗原能夠在哺乳動物中誘發針對至少HBV基因型B、C及D之T細胞反應。更佳地，截短HBV核心抗原能夠在人類個體中誘發針對至少HBV基因型A、B、C及D之CD8 T細胞反應。

較佳地，本申請案之HBV核心抗原為共同抗原，較佳為源於HBV基因型B、C及D之共同抗原，更佳為源於HBV基因型B、C及D之截短之共同抗原。根據本申請案之例示性截短之HBV核心共同抗原由與SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4至少90%一致，諸如與SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、95.5%、96%、96.5%、97%、97.5%、98%、98.5%、99%、99.1%、99.2%、99.3%、99.4%、99.5%、99.6%、99.7%、99.8%、99.9%或100%一致之胺基酸序列組成。SEQ ID NO:2及SEQ ID NO:4為源於HBV基因型B、C及D之核心共同抗原。SEQ ID NO:2及SEQ ID NO:4各自含有天然核心抗原之帶大量正電荷(富含精胺酸)之核酸結合域的34-胺基酸C端缺失。

在本申請案之一個實施例中，HBV核心抗原係由SEQ ID NO:2之胺基酸序列組成的截短之HBV抗原。在另一實施例中，HBV核心抗原係由SEQ ID NO:4之胺基酸序列組成的截短之HBV抗原。在另一實施例中，HBV核心抗原另外含有可操作地連接至成熟HBV核心抗原序列之N端的信號序列，諸如SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4之胺基酸序列。較佳地，信號序列具有SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:15之胺基酸序列。

(2) HBV 聚合酶抗原 如本文所使用，術語「HBV聚合酶抗原」、「HBV Pol抗原」或「HBV pol抗原」係指能夠在個體中誘發針對HBV聚合酶的免疫反應，例如體液及/或細胞介導之反應的HBV抗原。術語「聚合酶」、「聚合酶多肽」、「Pol」及「pol」均係指HBV病毒DNA聚合酶。HBV病毒DNA聚合酶具有四個域，自N端至C端，包括充當負股DNA合成之引子的末端蛋白質(TP)域；對於聚合酶功能不重要的間隔子；用於轉錄之逆轉錄酶(RT)域；以及核糖核酸酶H域。

在本申請案之一個實施例中，HBV抗原包含HBV Pol抗原，或其任何免疫原性片段或組合。HBV Pol抗原可以含有改善該抗原之免疫原性的其他修飾，諸如藉由將突變引入聚合酶及/或RNA酶域之活性位點中以降低或基本上除去某些酶活性。

較佳地，本申請案之HBV Pol抗原不具有逆轉錄酶活性及核糖核酸酶H活性，且能夠在哺乳動物中誘發針對至少兩種HBV基因型之免疫反應。較佳地，HBV Pol抗原能夠在哺乳動物中發針對至少HBV基因型B、C及D之T細胞反應。更佳地，HBV Pol抗原能夠在人類個體中誘發針對至少HBV基因型A、B、C及D之CD8 T細胞反應。

因此，在一些實施例中，HBV Pol抗原係失活之Pol抗原。在一個實施例中，失活之HBV Pol抗原在聚合酶域之活性位點中包含一或多個胺基酸突變。在另一個實施例中，失活之HBV Pol抗原在核糖核酸酶H域之活性位點中包含一或多個胺基酸突變。在一個較佳實施例中，失活之HBV pol抗原在聚合酶域及核糖核酸酶H域兩者之活性位點中包含一或多個胺基酸突變。舉例而言，可以例如藉由用天冬醯胺殘基(N)置換一或多個天冬胺酸殘基(D)，消除或降低金屬配位功能，使HBV pol抗原之聚合酶域中核苷酸/金屬離子結合所需之「YXDD」基元突變，由此降低或實質上消除逆轉錄酶功能。作為「YXDD」基元突變之置換或除該突變之外，可以例如藉由用天冬醯胺殘基(N)置換一或多個天冬胺酸殘基(D)及/或用麩醯胺酸(Q)置換麩胺酸殘基(E)，使HBV pol抗原之核糖核酸酶H域中Mg2+配位所需之「DEDD」基元突變，由此降低或實質上消除核糖核酸酶H功能。在一個特定實施例中，HBV pol抗原係藉由以下方式修飾：(1)使聚合酶域之「YXDD」基元中的天冬胺酸殘基(D)突變成天冬醯胺殘基(N)；以及(2)使核糖核酸酶H域之「DEDD」基元中的第一個天冬胺酸殘基(D)突變成天冬醯胺殘基(N)及使麩胺酸殘基(E)突變成麩醯胺酸殘基(N)，由此降低或實質上消除pol抗原之逆轉錄酶及核糖核酸酶H功能。

在本申請案之一個較佳實施例中，HBV pol抗原為共同抗原，較佳為源於HBV基因型B、C及D之共同抗原，更佳為源於HBV基因型B、C及D的失活之共同抗原。根據本申請案之例示性HBV pol共同抗原包含與SEQ ID NO:7至少90%一致，諸如與SEQ ID NO:7至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、95.5%、96%、96.5%、97%、97.5%、98%、98.5%、99%、99.1%、99.2%、99.3%、99.4%、99.5%、99.6%、99.7%、99.8%、99.9%或100%一致；較佳地為與SEQ ID NO:7至少98%一致，諸如與SEQ ID NO:7至少98%、98.5%、99%、99.1%、99.2%、99.3%、99.4%、99.5%、99.6%、99.7%、99.8%、99.9%或100%一致之胺基酸序列SEQ ID NO:7為在聚合酶及核糖核酸酶H域之活性位點中包含四個突變的源於HBV基因型B、C及D之pol共同抗原。詳言之，該四個突變包括聚合酶域之「YXDD」基元中的天冬胺酸殘基(D)突變成天冬醯胺殘基(N)；以及核糖核酸酶H域之「DEDD」基元中的第一個天冬胺酸殘基(D)突變成天冬醯胺殘基(N)及麩胺酸殘基(E)突變成麩醯胺酸殘基(Q)。

在本申請案之一個特定實施例中，HBV pol抗原包含SEQ ID NO:7之胺基酸序列。在本申請案之其他實施例中，HBV pol抗原由SEQ ID NO:7之胺基酸序列組成。在另一實施例中，HBV pol抗原另外含有可操作地連接至成熟HBV核心抗原序列之N端的信號序列，諸如SEQ ID NO:7之胺基酸序列。較佳地，信號序列具有SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:15之胺基酸序列。

(3) HBV 核心抗原與 HBV 聚合酶抗原之融合 如本文所使用，術語「融合蛋白」或「融合物」係指具有至少兩個通常不存在於單一天然多肽中之多肽域的單一多肽鏈。

在本申請案之一個實施例中，HBV抗原包含融合蛋白，該融合蛋白包含較佳地經由連接子將截短HBV核心抗原可操作地連接至HBV Pol抗原或將HBV Pol抗原可操作地連接至截短HBV核心抗原。

舉例而言，在含有第一多肽及第二異源多肽之融合蛋白中，連接子主要用作該第一與第二多肽之間的間隔子。在一個實施例中，連接子係由經肽鍵連接在一起的胺基酸構成，較佳由經肽鍵連接的1至20個胺基酸構成，其中胺基酸係選自20種天然存在之胺基酸。在一個實施例中，1至20個胺基酸係選自甘胺酸、丙胺酸、脯胺酸、天冬醯胺、麩醯胺酸及離胺酸。較佳地，連接子係由大量無空間位阻之胺基酸，諸如甘胺酸及丙胺酸構成。例示性連接子係聚甘胺酸，尤其是(Gly)5、(Gly)8；聚(Gly-Ala)及聚丙胺酸。如以下實例中所示的一種例示性適合連接子係(AlaGly)n，其中n係2至5之整數。

較佳地，本申請案之融合蛋白能夠在哺乳動物中誘發針對至少兩種HBV基因型之HBV核心及HBV Pol的免疫反應。較佳地，融合蛋白能夠在哺乳動物中誘發針對至少HBV基因型B、C及D之T細胞反應。更佳地，融合蛋白能夠在人類個體中誘發針對至少HBV基因型A、B、C及D之CD8 T細胞反應。

在本申請案之一個實施例中，融合蛋白質包含具有與SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4至少90%，諸如至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、95.5%、96%、96.5%、97%、97.5%、98%、98.5%、99%、99.1%、99.2%、99.3%、99.4%、99.5%、99.6%、99.7%、99.8%、99.9%或100%一致之胺基酸序列的截短HBV核心抗原；連接子；及具有與SEQ ID NO:7至少90%，諸如至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、95.5%、96%、96.5%、97%、97.5%、98%、98.5%、99%、99.1%、99.2%、99.3%、99.4%、99.5%、99.6%、99.7%、99.8%、99.9%或100%一致之胺基酸序列的HBV Pol抗原。

在本申請案之一個較佳實施例中，融合蛋白包含由SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4之胺基酸序列組成之截短HBV核心抗原；包含(AlaGly)n之連接子，其中n為2至5之整數；及具有SEQ ID NO:7之胺基酸序列的HBV Pol抗原。更佳地，根據本申請案之實施例的融合蛋白包含SEQ ID NO:16之胺基酸序列。

在本申請案之一個實施例中，融合蛋白進一步包含可操作地連接至融合蛋白之N端的信號序列。較佳地，信號序列具有SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:15之胺基酸序列。在一個實施例中，融合蛋白包含SEQ ID NO:17之胺基酸序列。

可用於本發明之HBV疫苗的額外揭示內容描述於2018年12月18日申請之美國專利申請案第16/223,251號中，本申請案之內容，更佳本申請案之實例以全文引用的方式併入本文中。

聚核苷酸及載體 在另一通用態樣中，本申請案提供編碼根據本申請案之實施例適用於本發明之HBV抗原的非天然存在之核酸分子，及包含非天然存在之核酸的載體。第一或第二非天然存在之核酸分子可以包含編碼可用於本申請案之HBV抗原的任何聚核苷酸序列，其可以根據本發明使用此項技術中已知之方法製備。較佳地，第一或第二聚核苷酸編碼本申請案之截短HBV核心抗原及HBV聚合酶抗原中的至少一種。聚核苷酸可以呈藉由重組技術(例如選殖)獲得或合成地製造(例如化學合成)之RNA形式或DNA形式。DNA可以為單股或雙股的，或者可以含有雙股及單股序列之部分。DNA可以例如包含基因體DNA、cDNA或其組合。聚核苷酸亦可為DNA/RNA雜合體。本申請案之聚核苷酸及載體可以用於製造重組蛋白、在宿主細胞中表現蛋白質或製造病毒粒子。較佳地，聚核苷酸為DNA。

在本申請案之一個實施例中，第一非天然存在之核酸分子包含編碼截短HBV核心抗原的第一聚核苷酸序列，該截短HBV核心抗原由與SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4至少90%一致，諸如與SEQ ID NO:2至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、95.5%、96%、96.5%、97%、97.5%、98%、98.5%、99%、99.1%、99.2%、99.3%、99.4%、99.5%、99.6%、99.7%、99.8%、99.9%或100%一致，較佳地與SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4 98%、99%或100%一致之胺基酸序列組成。在本申請案之一個特定實施例中，第一非天然存在之核酸分子包含編碼截短HBV核心抗原的第一聚核苷酸序列，該截短HBV核心抗原由SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4之胺基酸序列組成。

編碼截短HBV核心抗原的由以下SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4之胺基酸序列組成的本申請案之聚核苷酸序列之實例包括但不限於：聚核苷酸序列，其與SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:3至少90%一致，諸如與SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:3至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、95.5%、96%、96.5%、97%、97.5%、98%、98.5%、99%、99.1%、99.2%、99.3%、99.4%、99.5%、99.6%、99.7%、99.8%、99.9%或100%一致，較佳與SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:3 98%、99%或100%一致。編碼截短HBV核心抗原的例示性非天然存在之核酸分子具有SEQ ID NO:1或3之聚核苷酸序列。

在另一實施例中，第一非天然存在之核酸分子進一步包含可操作地連接至該HBV核心抗原序列之N端的信號序列之編碼序列。較佳地，信號序列具有SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:15之胺基酸序列。更佳地，信號序列之編碼序列包含SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:14之聚核苷酸序列。

在本申請案之一個實施例中，第二非天然存在之核酸分子包含編碼HBV聚合酶抗原之第二聚核苷酸序列，該HBV聚合酶抗原包含與SEQ ID NO:7至少90%一致，諸如與SEQ ID NO:7至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、95.5%、96%、96.5%、97%、97.5%、98%、98.5%、99%、99.1%、99.2%、99.3%、99.4%、99.5%、99.6%、99.7%、99.8%、99.9%或100%一致，較佳地與SEQ ID NO:7 100%一致胺基酸序列。在本申請案之一個特定實施例中，第二非天然存在之核酸分子包含編碼HBV聚合酶抗原之第二聚核苷酸序列，該HBV聚合酶抗原由SEQ ID NO:7之胺基酸序列組成。

編碼包含與SEQ ID NO:7至少90%一致之胺基酸序列的HBV Pol抗原的本申請案之聚核苷酸序列之實例包括但不限於以下聚核苷酸序列：與SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:6至少90%一致，諸如與SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:6至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、95.5%、96%、96.5%、97%、97.5%、98%、98.5%、99%、99.1%、99.2%、99.3%、99.4%、99.5%、99.6%、99.7%、99.8%、99.9%或100%一致，較佳與SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:6 98%、99%或100%一致。編碼HBV pol抗原之例示性非天然存在之核酸分子具有SEQ ID NO:5或6之聚核苷酸序列。

在另一個實施例中，第二非天然存在之核酸分子進一步包含信號序列之編碼序列，該信號序列可操作地連接至HBV pol抗原序列，諸如SEQ ID NO:7之胺基酸序列之N端。較佳地，信號序列具有SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:15之胺基酸序列。更佳地，信號序列之編碼序列包含SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:14之聚核苷酸序列。

在本申請案之另一實施例中，非天然存在之核酸分子編碼包含將截短HBV核心抗原可操作地連接至HBV Pol抗原或將HBV Pol抗原可操作地連接至截短HBV核心抗原的融合蛋白。在一個特定實施例中，本申請案之非天然存在之核酸分子編碼截短HBV核心抗原，該截短HBV核心抗原由以下組成：與SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4至少90%一致，諸如與SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、95.5%、96%、96.5%、97%、97.5%、98%、98.5%、99%、99.1%、99.2%、99.3%、99.4%、99.5%、99.6%、99.7%、99.8%、99.9%或100%一致，較佳地與SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4 100%一致，更佳地與SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4 100%一致之胺基酸序列；連接子；及HBV聚合酶抗原，其包含與SEQ ID NO:7至少90%一致，諸如與SEQ ID NO:7至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、95.5%、96%、96.5%、97%、97.5%、98%、98.5%、99%、99.1%、99.2%、99.3%、99.4%、99.5%、99.6%、99.7%、99.8%、99.9%或100%一致，較佳地與SEQ ID NO:7 98%、99%或100%一致之胺基酸序列。在本申請案之一個特定實施例中，非天然存在之核酸分子編碼融合蛋白，該融合蛋白包含由SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4之胺基酸序列組成的截短HBV核心抗原；包含(AlaGly)n之連接子，其中n為2至5之整數；以及包含SEQ ID NO:7之胺基酸序列的HBV Pol抗原。在本申請案之一個特定實施例中，非天然存在之核酸分子編碼包含SEQ ID NO:16之胺基酸序列的HBV抗原融合蛋白。

編碼HBV抗原融合蛋白之本申請案之聚核苷酸序列之實例包括但不限於與SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:3至少90%一致，諸如與SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:3至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、95.5%、96%、96.5%、97%、97.5%、98%、98.5%、99%、99.1%、99.2%、99.3%、99.4%、99.5%、99.6%、99.7%、99.8%、99.9%或100%一致，較佳地與SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:3 98%、99%或100%一致之胺基酸序列，其可操作地連接至與SEQ ID NO:11至少90%一致，諸如與SEQ ID NO:11至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、95.5%、96%、96.5%、97%、97.5%、98%、98.5%、99%、99.1%、99.2%、99.3%、99.4%、99.5%、99.6%、99.7%、99.8%、99.9%或100%一致，較佳與SEQ ID NO:11 98%、99%或100%一致之連接子編碼序列，該聚核苷酸序列進一步可操作地連接至與SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:6至少90%一致，諸如與SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:6至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、95.5%、96%、96.5%、97%、97.5%、98%、98.5%、99%、99.1%、99.2%、99.3%、99.4%、99.5%、99.6%、99.7%、99.8%、99.9%或100%一致，較佳地與SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:6 98%、99%或100%一致之聚核苷酸序列。在本申請案之特定實施例中，編碼HBV抗原融合蛋白之非天然存在之核酸分子包含SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:3，其可操作地連接至SEQ ID NO:11，其進一步可操作地連接至SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:6。

在另一實施例中，編碼HBV融合體之非天然存在之核酸分子進一步包含可操作地連接至HBV融合序列，諸如SEQ ID NO:16之胺基酸序列之N端的信號序列的編碼序列。較佳地，信號序列具有SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:15之胺基酸序列。更佳地，信號序列之編碼序列包含SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:14之聚核苷酸序列。在一個實施例中，具有信號序列之經編碼融合蛋白包含SEQ ID NO:17之胺基酸序列。

本申請案亦關於一種載體，其包含第一及/或第二非天然存在之核酸分子。如本文所使用，「載體」係用於將遺傳物質載運至另一細胞中的核酸分子，在該另一細胞中，其可以複製及/或表現。根據本發明，熟習此項技術者已知之任何載體均可以使用。載體之實例包括但不限於質體、病毒載體(噬菌體、動物病毒及植物病毒)、黏質體及人工染色體(例如YAC)。較佳地，載體為DNA質體。載體可以為DNA載體或RNA載體。一般熟習此項技術者可以根據本發明，經由標準重組技術構築本申請案之載體。

本申請案之載體可以為表現載體。如本文所使用，術語「表現載體」係指包含編碼能夠轉錄之RNA之核酸的任何類型之基因構築體。表現載體包括(但不限於)用於重組蛋白表現之載體，諸如DNA質體或病毒載體；及用於將核酸遞送至個體中以在該個體之組織中表現的載體，諸如DNA質體或病毒載體。熟習此項技術者應瞭解，表現載體之設計可取決於諸如待轉型宿主細胞之選擇、所需蛋白質之表現量等因素。

本申請案之載體可以含有多種調控序列。如本文所使用，術語「調控序列」係指允許、促成或調控核酸分子之功能性調控，包括宿主細胞或生物體中核酸或其衍生物之一(亦即，mRNA)之複製、重複、轉錄、剪接、轉譯、穩定性及/或運輸的任何序列。在本發明之上下文中，此術語涵蓋啟動子、強化子及其他表現控制元件(例如聚腺苷酸化信號及影響mRNA穩定性之元件)。

在本申請案之一些實施例中，載體係非病毒載體。非病毒DNA載體之實例包括但不限於RNA質體、細菌人工染色體、酵母人工染色體、閉合線性去氧核糖核酸，例如線性共價閉合DNA，例如線性共價閉合之雙股DNA分子等。非病毒RNA載體之實例包括但不限於RNA複製子、mRNA複製子、經修飾之mRNA複製子或自擴增mRNA。較佳地，非病毒載體係DNA質體。

「DNA質體」與「DNA質體載體」、「質體DNA」或「質體DNA載體」可互換使用，意思指能夠在適合宿主細胞中自主複製的大體上呈圓形的雙股DNA序列。用於表現編碼之聚核苷酸的DNA質體通常包含複製起點、多選殖位點及可選擇標記物，該可選擇標記物例如可以為抗生素抗性基因。可以使用的適合DNA質體之實例包括但不限於用於熟知表現系統(包括原核及真核系統兩種)中的可商購之表現載體，諸如pSE420 (Invitrogen, San Diego, Calif.)，其可以用於在大腸桿菌中產生及/或表現蛋白質；pYES2 (Invitrogen, Thermo Fisher Scientific)，其可以用於在酵母菌株釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)中產生及/或表現；MAXBAC®完全桿狀病毒表現系統(Thermo Fisher Scientific)，其可以用於在昆蟲細胞中產生及/或表現；pcDNA^TM 或pcDNA3^TM (Life Technologies, Thermo Fisher Scientific)，其可以用於在哺乳動物細胞中高水準組成性蛋白質表現；以及pVAX或pVAX-1 (Life, Thermo Fisher Scientific)，其可以用於在大部分哺乳動物細胞中高水準短暫表現相關蛋白質。任何可商購之DNA質體的主鏈均可藉由使用常規技術及容易得到的起始物質進行修飾以使宿主細胞中蛋白質之表現達到最佳，以便逆轉某些元件(例如複製起點及/或抗生素抗性卡匣)之取向，置換質體內源性啟動子(例如抗生素抗性卡匣中之啟動子)，及/或置換編碼轉錄蛋白質之聚核苷酸序列(例如抗生素抗性基因之編碼序列)。(參見例如，Sambrook等人, Molecular Cloning a Laboratory Manual, Second Ed. Cold Spring Harbor Press (1989))。

較佳地，DNA質體係適於在哺乳動物宿主細胞中表現蛋白質的表現載體。適於在哺乳動物宿主細胞中表現蛋白質的表現載體包括但不限於pcDNATM、pcDNA3TM、pVAX、pVAX-1、ADVAX、NTC8454等。較佳地，表現載體係基於pVAX-1，其可以進一步經修飾以使哺乳動物細胞中蛋白質之表現達到最佳。pVAX-1係DNA疫苗中之常用質體，且含有較強的人即刻早期巨細胞病毒(CMV-IE)啟動子，隨後為牛生長激素(bGH)源性聚腺苷酸化序列(pA)。pVAX-1還含有pUC複製起點及由允許細菌質體繁殖之小原核生物啟動子驅動的卡那黴素抗性基因。

本申請案之載體亦可為病毒載體。一般而言，病毒載體係載運經修飾病毒DNA或RNA的經遺傳工程改造之病毒，該病毒DNA或RNA已呈現非感染性，但仍含有病毒啟動子及轉殖基因，由此允許經由病毒啟動子轉譯轉殖基因。由於病毒載體常常缺乏感染性序列，故其需要輔助病毒或包裝株來進行大規模轉染。可以使用的病毒載體之實例包括但不限於腺病毒載體、腺相關病毒載體、痘病毒載體、腸病毒載體、委內瑞拉馬腦炎病毒(Venezuelan Equine Encephalitis virus)載體、勝利基森林病毒(Semliki Forest Virus)載體、菸草鑲嵌病毒載體、慢病毒載體等。可使用之病毒載體之實例包括但不限於沙粒狀病毒(arenavirus)的病毒載體、複製缺陷型沙粒狀病毒的病毒載體或複製勝任型沙粒狀病毒之病毒載體、二片段或三片段沙粒狀病毒、感染性沙粒狀病毒之病毒載體、包含沙粒狀病毒基因體區段且該基因體區段之一個開放閱讀框架缺失或功能失活(且經編碼如本文所描述之HBV抗原之核酸置換)的核酸、沙粒狀病毒，諸如淋巴細胞性脈絡叢腦膜炎病毒(LCMV)，例如純系13病毒株或MP病毒株，以及沙粒狀病毒，諸如胡寧病毒(Junin virus)，例如Candid #1病毒株，該載體亦可為非病毒載體。

較佳地，病毒載體係腺病毒載體，例如重組腺病毒載體。重組腺病毒載體可以例如源於人類腺病毒(HAdV或AdHu)，或猴腺病毒，諸如黑猩猩或大猩猩腺病毒(ChAd、AdCh或SAdV)或恆河猴腺病毒(rhAd)。較佳地，腺病毒載體係重組人類腺病毒載體，例如重組人類腺病毒血清型26，或重組人類腺病毒血清型5、4、35、7、48中之任一種等。在其他實施例中，腺病毒載體係rhAd載體，例如rhAd51、rhAd52或rhAd53。用於本申請案中之重組病毒載體可以根據本發明使用此項技術中已知之方法製備。舉例而言，考慮到遺傳密碼之簡併性，可以設計出編碼相同多肽之若干核酸序列。編碼本申請案之HBV抗原的聚核苷酸可以視情況經密碼子優化以確保在宿主細胞(例如細菌或哺乳動物細胞)中適當表現。密碼子優化係此項技術中廣泛應用之技術，且根據本發明，用於獲得經密碼子優化之聚核苷酸的方法將為熟習此項技術者所熟知。

載體亦可為線性共價閉合之雙股DNA載體。如本文所用，「線性共價閉合之雙股DNA載體」係指在結構上不同於質體DNA之閉合線性去氧核糖核酸(DNA)。其具有諸多質體DNA之優點以及與RNA策略類似之最小卡匣尺寸。舉例而言，其可為載體卡匣，其一般包含經編碼抗原序列、啟動子、聚腺苷酸化序列及端粒末端。無質體構築體可在不需要細菌序列之情況下經由酶方法合成。適合的線性共價閉合DNA載體之實例包括但不限於可商購之表現載體，諸如「Doggybone™ closed linear DNA」(dbDNA™) (Touchlight Genetics Ltd.; London, England)。參見例如Scott等人，Hum Vaccin Immunother . 2015年8月; 11(8): 1972-1982，其全部內容以引用之方式併入本文中。線性共價閉合之雙股DNA載體、用於產生此類載體及使用此類載體遞送DNA分子(諸如本發明之活性分子)之組合物及方法的一些實例描述於US2012/0282283、US2013/0216562及US2018/0037943中，其各者的相關內容特此以全文引用之方式併入。

本申請案之載體，例如DNA質體或病毒載體(特定言之，腺病毒載體)可以包含任何調控元件以產生載體之習知功能，包括但不限於由該載體之聚核苷酸序列編碼的HBV抗原之複製及表現。調控元件包括但不限於啟動子、強化子、聚腺苷酸化信號、轉譯終止密碼子、核糖體結合元件、轉錄終止子、選擇標記物、複製起點等。載體可以包含一或多個表現卡匣。「表現卡匣」係載體中引導細胞機構製備RNA及蛋白質的部分。表現卡匣通常包含三種組分：啟動子序列、開放閱讀框架及視情況包含聚腺苷酸化信號之3'非轉譯區(UTR)。開放閱讀框架(ORF)為含有自起始密碼子至終止密碼子之相關蛋白質(例如HBV抗原)之編碼序列的閱讀框架。表現卡匣之調控元件可以可操作地連接至編碼相關HBV抗原之聚核苷酸序列。如本文所使用，術語「可操作地連接」係以最廣泛合理的內容解釋，且指呈功能關係的聚核苷酸元件之連接。當聚核苷酸放置成與另一聚核苷酸具有功能關係時，其係「可操作地連接」。舉例而言，若啟動子影響編碼序列之轉錄，則其係可操作地連接至該編碼序列。適用於本文所描述之表現卡匣中的任何組件可以任何組合形式且按任何次序使用以製備本申請案之載體。

載體可以包含啟動子序列，較佳地在表現卡匣內包含啟動子序列，用以控制相關HBV抗原之表現。術語「啟動子」係以習知意義使用，且指起始可操作地連接之核苷酸序列之轉錄的核苷酸序列。啟動子係與其轉錄之核苷酸序列位於相同股上，且鄰近該核苷酸序列。啟動子可以組成性、誘導性或阻遏性的。啟動子可以為天然存在的或合成的。啟動子可以源於包括病毒、細菌、真菌、植物、昆蟲及動物之來源。啟動子可為同源啟動子(亦即，源於與載體相同之基因來源)或異源啟動子(亦即，源於不同載體或基因來源)。舉例而言，若欲採用之載體係DNA質體，則啟動子可以對於質體為內源性的(同源)或源於其他來源(異源)。較佳地，該啟動子係位於表現卡匣內編碼HBV抗原之聚核苷酸的上游。

可以使用的啟動子之實例包括但不限於來自猴病毒40(SV40)之啟動子、小鼠乳癌病毒(MMTV)啟動子、人類免疫缺陷病毒(HIV)啟動子諸如牛免疫缺陷病毒(BIV)長末端重複序列(LTR)啟動子、莫洛尼病毒(Moloney virus)啟動子、禽類白血病病毒(ALV)啟動子、巨細胞病毒(CMV)啟動子諸如CMV即刻早期啟動子(CMV-IE)、埃-巴二氏病毒(Epstein Barr virus，EBV)啟動子或勞斯肉瘤病毒(Rous sarcoma virus，RSV)啟動子。啟動子亦可為來自人類基因，諸如人類肌動蛋白、人類肌凝蛋白、人類血紅蛋白、人類肌肉肌酸或人類金屬硫蛋白之啟動子。啟動子亦可為天然或合成的組織特異性啟動子，諸如肌肉或皮膚特異性啟動子。

較佳地，啟動子為強真核啟動子，較佳為巨細胞病毒即刻早期(CMV-IE)啟動子。例示性CMV-IE啟動子之核苷酸序列展示於SEQ ID NO:18或SEQ ID NO:19中。

載體可以包含使表現之轉錄物穩定，促進RNA轉錄物之核輸出及/或改善轉錄-轉譯偶聯之另外的聚核苷酸序列。此類序列之實例包括聚腺苷酸化信號及強化子序列。聚腺苷酸化信號通常位於載體之表現卡匣內相關蛋白質(例如HBV抗原)之編碼序列的下游。強化子序列係當經轉錄因子結合時促進相關聯之基因之轉錄的調控性DNA序列。強化子序列較佳在載體之表現卡匣內位於編碼HBV抗原之聚核苷酸序列的上游，但在啟動子序列的下游。

根據本發明，熟習此項技術者已知之任何聚腺苷酸化信號均可使用。例如，聚腺苷酸化信號可為SV40聚腺苷酸化信號、LTR聚腺苷酸化信號、牛生長激素(bGH)聚腺苷酸化信號、人類生長激素(hGH)聚腺苷酸化信號或人類β-血球蛋白聚腺苷酸化信號。較佳地，聚腺苷酸化信號係牛生長激素(bGH)聚腺苷酸化信號或SV40聚腺苷酸化信號。例示性bGH聚腺苷酸化信號之核苷酸序列展示於SEQ ID NO:20中。例示性SV40聚腺苷酸化信號之核苷酸序列展示於SEQ ID NO:13中。

根據本發明，熟習此項技術者已知之任何強化子序列均可使用。舉例而言，強化子序列可以為人類肌動蛋白、人類肌凝蛋白、人類血紅蛋白、人類肌肉肌酸，或病毒強化子，諸如來自CMV、HA、RSV或EBV之強化子。特定強化子之實例包括但不限於土拔鼠HBV轉錄後調控元件(WPRE)、源於人類載脂蛋白A1前驅體(ApoAI)之內含子/外顯子序列、1型人類T細胞白血病病毒(HTLV-1)長末端重複序列(LTR)之非轉譯R-U5域、剪接強化子、合成兔β-血球蛋白內含子或其任何組合。較佳地，強化子序列係HTLV-1 LTR之非轉譯R-U5域、兔β-血球蛋白內含子及剪接強化子三個連續元件構成的複合序列，在本文中稱作「三強化子序列」。例示性三強化子序列之核苷酸序列展示於SEQ ID NO:10中。另一例示性強化子序列為SEQ ID NO:12中所示之ApoAI基因片段。

載體可以包含編碼信號肽序列之聚核苷酸序列。較佳地，編碼信號肽序列之聚核苷酸序列係位於編碼HBV抗原之聚核苷酸序列的上游。信號肽通常引導蛋白質之定位，促進產生蛋白質之細胞分泌蛋白質，及/或改善抗原表現及交叉呈現至抗原呈現細胞。當自載體表現時，信號肽可以存在於HBV抗原之N端，但例如在自細胞分泌時，經信號肽酶裂解。信號肽已裂解的經表現蛋白質通常稱為「成熟蛋白」。根據本發明，此項技術中已知之任何信號肽均可使用。舉例而言，信號肽可以為胱抑素S信號肽；免疫球蛋白(Ig)分泌信號，諸如Ig重鏈γ信號肽SPIgG或Ig重鏈ε信號肽SPIgE。

較佳地，信號肽序列係胱抑素S信號肽。胱抑素S信號肽之例示性核酸及胺基酸序列分別展示於SEQ ID NO:8及9中。免疫球蛋白分泌信號之例示性核酸及胺基酸序列分別展示於SEQ ID NO:14及15中。

載體，諸如DNA質體亦可包括細菌複製起點及用於在細菌細胞，例如大腸桿菌中選擇及維持質體的抗生素抗性表現卡匣。細菌複製起點及抗生素抗性卡匣可以與編碼HBV抗原之表現卡匣相同之取向或以相反(逆向)取向定位於載體中。複製起點(ORI)係這樣一種序列，在該序列處，複製起始，使得質體能夠在細胞內複製及存活。適用於本申請案中之ORI的實例包括(但不限於)ColE1、pMB1、pUC、pSC101、R6K及15A，較佳為pUC。pUC ORI之例示性核苷酸序列展示於SEQ ID NO:21中。

用於在細菌細胞中選擇及維持之表現卡匣通常包括可操作地連接至抗生素抗性基因之啟動子序列。較佳地，可操作地連接至抗生素抗性基因之啟動子序列不同於可操作地連接至編碼相關蛋白質，例如HBV抗原之聚核苷酸序列的啟動子序列。抗生素抗性基因可經密碼子優化，且抗生素抗性基因之序列組合物通常針對細菌，例如大腸桿菌之密碼子使用進行調整。根據本發明，熟習此項技術者已知之任何抗生素抗性基因均可使用，包括(但不限於)卡那黴素抗性基因(Kanr)、安比西林(ampicillin)抗性基因(Ampr)及四環素抗性基因(Tetr)，以及賦予對氯黴素(chloramphenicol)、博萊黴素(bleomycin)、大觀黴素(spectinomycin)、卡本西林(carbenicillin)等之抗性的基因。

較佳地，載體抗生素表現卡匣中之抗生素抗性基因係卡那黴素抗性基因(Kanr)。Kanr基因之序列展示於SEQ ID NO: 22中。較佳地，Kanr基因經密碼子優化。經密碼子優化之Kanr基因的例示性核酸序列顯示於SEQ ID NO:23中。Kanr可以可操作地連接至其天然啟動子，或Kanr基因可以連接至異源啟動子。在一個特定實施例中，Kanr基因可操作地連接至安比西林抗性基因(Ampr)啟動子，稱為bla啟動子。bla啟動子之例示性核苷酸序列展示於SEQ ID NO:24中。

在本申請案之一個特定實施例中，載體為DNA質體，其包含包括編碼選自由以下組成之群之至少一個HBV抗原的聚核苷酸的表現卡匣：HBV pol抗原，其包含的胺基酸序列與SEQ ID NO: 7至少90%，諸如90%、91%、92%、93%、94%、95%、96、97%，較佳地至少98%諸如至少98%、98.5%、99%、99.1%、99.2%、99.3%、99.4%、99.5%、99.6%、99.7%、99.8%、99.9%或100%一致；及截短HBV核心抗原，其由與SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4至少95%，諸如95%、96%、97%，較佳至少98%，諸如至少98%、98.5%、99%、99.1%、99.2%、99.3%、99.4%、99.5%、99.6%、99.7%、99.8%、99.9%或100%一致之胺基酸序列組成；可操作地連接至編碼HBV抗原(包含5'端至3'端)之聚核苷酸的上游序列、啟動子序列(較佳為SEQ ID NO:18之CMV啟動子序列)、強化子序列(較佳為SEQ ID NO:10之三強化子序列)，及編碼信號肽序列(較佳具有SEQ ID NO:9之胺基酸序列的胱抑素S信號肽)之聚核苷酸序列；及可操作地連接至編碼HBV抗原之聚核苷酸的下游序列，該HBV抗原包含聚腺苷酸化信號，較佳SEQ ID NO:20之bGH聚腺苷酸化信號。此類載體進一步包含抗生素抗性表現卡匣，該抗生素抗性表現卡匣包括滿足以下條件之聚核苷酸：編碼抗生素抗性基因，較佳Kan^r 基因，更佳與SEQ ID NO:23至少90%一致，諸如與SEQ ID NO:23至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、95.5%、96%、96.5%、97%、97.5%、98%、98.5%、99%、99.1%、99.2%、99.3%、99.4%、99.5%、99.6%、99.7%、99.8%、99.9%或100%一致，較佳與SEQ ID NO:23 100%一致的經密碼子優化之Kan^r 基因；可操作地連接至SEQ ID NO:24之Ampr (bla)啟動子，該啟動子在編碼抗生素抗性基因之聚核苷酸的上游且可操作地連接至該聚核苷酸；以及複製起點，較佳為SEQ ID NO:21之pUC ori。較佳地，抗生素抗性卡匣及複製起點相對於HBV抗原表現卡匣以逆向取向存在於質體中。

在本申請案之另一特定實施例中，載體為病毒載體，較佳為腺病毒載體，更佳為Ad26或Ad35載體，包含表現卡匣，該表現卡匣包括編碼選自由以下組成之群的HBV抗原中之至少一者的聚核苷酸：HBV pol抗原，其包含與SEQ ID NO:7至少90%，諸如90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%，較佳地為至少98%，諸如至少98%、98.5%、99%、99.1%、99.2%、99.3%、99.4%、99.5%、99.6%、99.7%、99.8%、99.9%、或100%一致之胺基酸序列，及截短HBV核心抗原，其由SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4至少95%、諸如95%、96%、97%、較佳至少98%、諸如至少98%、98.5%、99%、99.1%、99.2%、99.3%、99.4%、99.5%、99.6%、99.7%、99.8%、99.9%或100%一致之胺基酸序列組成；可操作地連接至編碼HBV抗原之聚核苷酸的上游序列，該HBV抗原包含5'端至3'端之啟動子序列，較佳地SEQ ID NO:19之CMV啟動子序列，強化子序列，較佳SEQ ID NO:12之ApoAI基因片段序列，及編碼信號肽序列之聚核苷酸序列，較佳地具有SEQ ID NO:15之胺基酸序列的免疫球蛋白分泌信號；及可操作地連接至編碼HBV抗原之聚核苷酸的下游序列，該HBV抗原包含聚腺苷酸化信號，較佳SEQ ID NO:13之SV40聚腺苷酸化信號。

在本申請案之一個實施例中，載體，諸如質體DNA載體或病毒載體(較佳為腺病毒載體，更佳為Ad26或Ad35載體)編碼具有SEQ ID NO:7之胺基酸序列的HBV Pol抗原。較佳地，該載體包含HBV Pol抗原之編碼序列，其與SEQ ID NO:5或6之聚核苷酸序列至少90%一致，諸如與SEQ ID NO:5或6 90%、91%、92%、93%、94%、95%、95.5%、96%、96.5%、97%、97.5%、98%、98.5%、99%、99.1%、99.2%、99.3%、99.4%、99.5%、99.6%、99.7%、99.8%、99.9%或100%一致，較佳與SEQ ID NO:5或6 100%一致。

在本申請案之一個實施例中，載體，諸如質體DNA載體或病毒載體(較佳為腺病毒載體，更佳為Ad26或Ad35載體)編碼由SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4之胺基酸序列組成的截短HBV核心抗原。較佳地，載體包含截短HBV核心抗原之編碼序列，其與SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:3之聚核苷酸序列至少90%一致，諸如與SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:3 90%、91%、92%、93%、94%、95%、95.5%、96%、96.5%、97%、97.5%、98%、98.5%、99%、99.1%、99.2%、99.3%、99.4%、99.5%、99.6%、99.7%、99.8%、99.9%或100%一致，較佳與SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:3 100%一致。

在本申請案之又一實施例中，載體，諸如質體DNA載體或病毒載體(較佳為腺病毒載體，更佳為Ad26或Ad35載體)編碼融合蛋白，該融合蛋白包含具有SEQ ID NO:7之胺基酸序列的HBV Pol抗原及由SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4之胺基酸序列組成的截短HBV核心抗原。較佳地，該載體包含融合物之編碼序列，其含有滿足以下的截短HBV核心抗原之編碼序列：與SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:3至少90%一致，諸如與SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:3至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、95.5%、96%、96.5%、97%、97.5%、98%、98.5%、99%、99.1%、99.2%、99.3%、99.4%、99.5%、99.6%、99.7%、99.8%、99.9%或100%一致，較佳與SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:3 98%、99%或100%一致，更佳SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:3；可操作地連接至HBV Pol抗原之編碼序列，其與SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:6至少90%一致，諸如與SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:6至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、95.5%、96%、96.5%、97%、97.5%、98%、98.5%、99%、99.1%、99.2%、99.3%、99.4%、99.5%、99.6%、99.7%、99.8%、99.9%或100%一致，較佳與SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:6 98%、99%或100%一致，更佳SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:6。較佳地，截短HBV核心抗原之編碼序列經由連接子之編碼序列可操作地連接至HBV Pol抗原之編碼序列，該連接子之編碼序列與SEQ ID NO:11至少90%一致，諸如至少與SEQ ID NO:11 90%、91%、92%、93%、94%、95%、95.5%、96%、96.5%、97%、97.5%、98%、98.5%、99%、99.1%、99.2%、99.3%、99.4%、99.5%、99.6%、99.7%、99.8%、99.9%或100%一致，較佳與SEQ ID NO:11 98%、99%或100%一致。在本申請案之特定實施例中，載體包含融合物之編碼序列，該融合物之編碼序列具有SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:3可操作地連接至SEQ ID NO:11，其進一步可操作地連接至SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:6。

編碼本申請案之HBV抗原的聚核苷酸及表現載體可以根據本發明，利用此項技術中已知之任何方法製備。舉例而言，可以使用熟習此項技術者熟知的標準分子生物學技術，例如聚合酶鏈反應(PCR)等將編碼HBV抗原之聚核苷酸引入或「選殖」至表現載體中。

細胞、多肽及抗體 本申請案亦提供包含本文所描述之聚核苷酸及載體中之任一種的細胞，較佳為分離之細胞。該等細胞可以例如用於產生重組蛋白或用於產生病毒粒子。

因此，本申請案之實施例亦係關於製備本申請案之HBV抗原的方法。該方法包括用包含可操作地連接至啟動子的編碼本申請案之HBV抗原之聚核苷酸的表現載體轉染宿主細胞，使經轉染之細胞在適於表現HBV抗原之條件下生長，及視情況純化或分離該細胞中表現之HBV抗原。HBV抗原可以藉由此項技術中已知之任何方法，包括親和層析法、尺寸排阻層析法等自細胞分離或收集。根據本發明，用於表現重組蛋白之技術將為一般熟習此項技術者熟知的。亦可在不純化或分離所表現之蛋白質的情況下，例如藉由分析用編碼HBV抗原之表現載體轉染且在適於表現HBV抗原之條件下生長之細胞的上清液來研究所表現之HBV抗原。

因此，亦提供編碼與SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:7之胺基酸序列至少90%一致之胺基酸序列的非天然存在或重組型多肽。如上下文所描述，編碼該等序列的分離之核酸分子、包含該等序列可操作地連接至啟動子之載體及包含該多肽、聚核苷酸或載體之組合物亦涵蓋在本申請案內。

在本申請案之實施例中，重組多肽編碼與SEQ ID NO:2之胺基酸序列至少90%一致，諸如與SEQ ID NO:2 90%、91%、92%、93%、94%、95%、95.5%、96%、96.5%、97%、97.5%、98%、98.5%、99%、99.1%、99.2%、99.3%、99.4%、99.5%、99.6%、99.7%、99.8%、99.9%或100%一致之胺基酸序列。較佳地，非天然存在或重組多肽編碼SEQ ID NO:2之胺基酸序列。

在本申請案之另一實施例中，非天然存在或重組多肽編碼與SEQ ID NO:4之胺基酸序列至少90%一致，諸如與SEQ ID NO:4 90%、91%、92%、93%、94%、95%、95.5%、96%、96.5%、97%、97.5%、98%、98.5%、99%、99.1%、99.2%、99.3%、99.4%、99.5%、99.6%、99.7%、99.8%、99.9%或100%一致之胺基酸序列。較佳地，非天然存在或重組多肽編碼SEQ ID NO:4之胺基酸序列。

在本申請案之另一實施例中，非天然存在或重組多肽編碼與SEQ ID NO:7之胺基酸序列至少90%一致，諸如與SEQ ID NO:7 90%、91%、92%、93%、94%、95%、95.5%、96%、96.5%、97%、97.5%、98%、98.5%、99%、99.1%、99.2%、99.3%、99.4%、99.5%、99.6%、99.7%、99.8%、99.9%或100%一致之胺基酸序列。較佳地，非天然存在或重組多肽編碼SEQ ID NO:7之胺基酸序列。

亦提供特異性結合至本申請案之非天然存在之多肽的抗體或其抗原結合片段。在本申請案之一個實施例中，對本申請案之非天然HBV抗原具有特異性的抗體不特異性結合至另一HBV抗原。舉例而言，特異性結合至具有SEQ ID NO:7之胺基酸序列的HBV Pol抗原的本申請案之抗體將不會特異性結合至不具有SEQ ID NO:7之胺基酸序列的HBV Pol抗原。

如本文所使用，術語「抗體」包括多株抗體、單株抗體、嵌合抗體、人類化抗體、Fv抗體、Fab抗體及F(ab')2抗體；雙功能雜合體(例如Lanzavecchia等人, Eur. J. Immunol. 17:105, 1987)、單鏈抗體(Huston等人, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879, 1988；Bird等人, Science 242:423, 1988)；以及具有改變之恆定區的抗體(例如美國專利第5,624,821號)。

如本文所使用，「特異性結合至」抗原的抗體係指以 1×10^-7 M或更小之KD結合至抗原的抗體。較佳地，「特異性結合至」抗原之抗體以1×10^-8 M或更小，更佳5×10^-9 M或更小、1×10^{- 9} M或更小、5×10^{- 10} M或更小、或1×10^{- 10} M或更小之KD結合至抗原。術語「KD」係指解離常數，其係由Kd與Ka之比率(亦即，Kd/Ka)得到且以莫耳濃度(M)表示。抗體之KD值可以根據本發明，使用此項技術中之方法測定。舉例而言，抗體之KD可以藉由使用表面電漿子共振，諸如藉由使用生物感測器系統，例如Biacore®系統，或藉由使用生物膜層干涉測量術，諸如Octet RED96系統測定。

抗體KD值越小，則該抗體結合至靶抗原之親和力越高。

組合物、醫藥組合物及疫苗 本申請案亦係關於組合物、醫藥組合物，更特定言之套組及疫苗，其包含根據本申請案之一或多種HBV抗原、聚核苷酸及/或編碼一或多種HBV抗原之載體。本文所描述之本申請案之HBV抗原、聚核苷酸(包括RNA及DNA)及/或載體中之任一者可用於本申請案之組合物、醫藥組合物或套組及疫苗中。

在本申請案之一個實施例中，組合物包含經分離或非天然存在之核酸分子(DNA或RNA)，其包含編碼截短HBV核心抗原的聚核苷酸序列，該截短HBV核心抗原由與SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4至少90%一致之胺基酸序列組成，或HBV聚合酶抗原，其包含與SEQ ID NO:7至少90%一致之胺基酸序列，包含經分離或非天然存在之核酸分子的載體，及/或由經分離或非天然存在之核酸分子編碼之經分離或非天然存在之多肽。

在本申請案之一個實施例中，組合物包含一種經分離或非天然存在之核酸分子(DNA或RNA)，其包含編碼HBV Pol抗原之聚核苷酸序列，該HBV Pol抗原包含與SEQ ID NO:7至少90%一致，較佳與SEQ ID NO:7 100%一致之胺基酸序列。

在本申請案之一個實施例中，組合物包含編碼截短HBV核心抗原的經分離或非天然存在之核酸分子(DNA或RNA)，該截短HBV核心抗原由與SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4至少90%一致，較佳與SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4 100%一致之胺基酸序列組成。

在本申請案之一個實施例中，組合物包含經分離或非天然存在之核酸分子(DNA或RNA)，其包含編碼截短HBV核心抗原的聚核苷酸序列，該截短HBV核心抗原由與SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4至少90%一致，較佳與SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4 100%一致之胺基酸序列組成；及包含編碼HBV Pol抗原之聚核苷酸序列的經分離或非天然存在之核酸分子(DNA或RNA)，該HBV Pol抗原包含與SEQ ID NO:7至少90%一致，較佳與SEQ ID NO:7 100%一致之胺基酸序列。截短HBV核心抗原及HBV Pol抗原之編碼序列可存在於同一分離或非天然存在之核酸分子(DNA或RNA)中，或兩個不同的經分離或非天然存在之核酸分子(DNA或RNA)中。

在本申請案之一個實施例中，組合物包含含有編碼截短HBV核心抗原之聚核苷酸的載體，較佳DNA質體或病毒載體(諸如腺病毒載體)，該截短HBV核心抗原由與SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4至少90%一致，較佳與SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4 100%一致之胺基酸序列組成。

在本申請案之一個實施例中，組合物包含載體，較佳DNA質體或病毒載體(諸如腺病毒載體)，該等載體包含編碼HBV Pol抗原之聚核苷酸，該HBV Pol抗原包含與SEQ ID NO:7至少90%一致，較佳與SEQ ID NO:7 100%一致之胺基酸序列。

在本申請案之一個實施例中，組合物包含載體，較佳DNA質體或病毒載體(諸如腺病毒載體)，該等載體包含編碼截短HBV核心抗原之聚核苷酸，該截短HBV核心抗原由與SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4至少90%一致，較佳與SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4 100%一致之胺基酸序列組成；及包含編碼HBV Pol抗原之聚核苷酸的載體，較佳為DNA質體或病毒載體(諸如腺病毒載體)，該HBV Pol抗原包含與SEQ ID NO:7至少90%一致，較佳與SEQ ID NO:7達100%一致之胺基酸序列。包含截短HBV核心抗原之編碼序列的載體及包含HBV Pol抗原之編碼序列的載體可以為相同載體，或兩個不同載體。

在本申請案之一個實施例中，組合物包含載體，較佳為DNA質體或病毒載體(諸如腺病毒載體)，該等載體包含編碼融合蛋白之聚核苷酸，該融合蛋白包含由與SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4至少90%一致，較佳與SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4 100%一致之胺基酸序列組成的截短HBV核心抗原，可操作地連接至包含與SEQ ID NO:7至少90%一致，較佳與SEQ ID NO:7 100%一致之胺基酸序列的HBV Pol抗原，或反之亦然。較佳地，該融合蛋白進一步包含將截短HBV核心抗原可操作地連接至HBV Pol抗原或將HBV Pol抗原可操作地連接至截短HBV核心抗原的連接子。較佳地該連接子具有胺基酸序列(AlaGly)n，其中n係2至5之整數。

在本申請案之一個實施例中，組合物包含一種經分離或非天然存在之截短HBV核心抗原，其由與SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4至少90%一致，較佳與SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4 100%一致之胺基酸序列組成。

在本申請案之一個實施例中，組合物包含一種經分離或非天然存在之HBV Pol抗原，其包含與SEQ ID NO:7至少90%一致，較佳與SEQ ID NO:7 100%一致之胺基酸序列。

在本申請案之一個實施例中，組合物包含一種經分離或非天然存在之截短HBV核心抗原，其由與SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4至少90%一致，較佳與SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4 100%一致之胺基酸序列組成；及包含與SEQ ID NO:7至少90%一致，較佳與SEQ ID NO:7 100%一致之胺基酸序列的經分離或非天然存在之HBV Pol抗原。

在本申請案之一個實施例中，組合物包含一種包含截短HBV核心抗原的分離或非天然存在之融合蛋白，該截短HBV核心抗原由與SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4至少90%一致，較佳與SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4 100%一致之胺基酸序列組成，可操作地連接至包含與SEQ ID NO:7至少90%一致，較佳與SEQ ID NO:7 100%一致之胺基酸序列的HBV Pol抗原。較佳地，該融合蛋白進一步包含將截短HBV核心抗原可操作地連接至HBV Pol抗原或將HBV Pol抗原可操作地連接至截短HBV核心抗原的連接子。較佳地該連接子具有胺基酸序列(AlaGly)n，其中n係2至5之整數。

本申請案亦係關於醫藥組合物或套組，其包含表現根據本申請案之實施例之截短HBV核心抗原及HBV pol抗原的聚核苷酸。編碼本文所描述之本申請案之HBV核心及pol抗原的任何聚核苷酸及/或載體均可用於本申請案之醫藥組合物或套組中。

在本申請案之一個特定實施例中，醫藥組合物或套組包含：i)第一非天然存在之核酸分子，其包含編碼截短HBV核心抗原的第一聚核苷酸序列，該截短HBV核心抗原由與SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4至少95%一致之胺基酸序列組成； ii)包含編碼HBV聚合酶抗原之第二聚核苷酸序列的第二非天然存在之核酸分子，該HBV聚合酶抗原具有與SEQ ID NO:7至少90%一致之胺基酸序列，其中該HBV聚合酶抗原不具有逆轉錄酶活性及核糖核酸酶H活性；其中該第一及/或第二非天然存在之核酸分子一起或單獨地完全涵蓋於一或多個脂質奈米顆粒或脂質體載劑中。

根據本申請案之實施例，疫苗組合或套組中之聚核苷酸可以連接或分開，由此使自此類聚核苷酸表現之HBV抗原融合在一起或作為獨立蛋白質產生，無論自相同抑或不同聚核苷酸表現。在一個實施例中，第一及第二聚核苷酸係存在於獨立載體，例如DNA質體或病毒載體中，以同一組合物或獨立組合物形式組合使用，由此使所表現之蛋白質亦為獨立蛋白質，但組合使用。在另一個實施例中，由第一及第二聚核苷酸編碼的HBV抗原可以由同一載體表現，由此產生HBV核心-pol融合抗原。視情況，核心及pol抗原可以藉由短連接子接合或融合在一起。或者，由第一及第二聚核苷酸編碼的HBV抗原可以使用在核心與pol抗原編碼序列之間的核糖體滑移位點(又稱為順式水解酶位點)，獨立地由單一載體表現。此策略產生雙順反子表現載體，其中個別核心及pol抗原係由單一mRNA轉錄物產生。取決於mRNA轉錄物上編碼序列之次序，由此類雙順反子表現載體產生之核心及pol抗原可以具有另外的N或C末端殘基。可用於此目的的核糖體滑移位點之實例包括但不限於來自口蹄疫病毒(FMDV)之FA2滑移位點。另一種可能係由第一及第二聚核苷酸編碼之HBV抗原可以獨立地由兩個獨立載體表現，一個載體編碼HBV核心抗原且一個編碼HBV pol抗原。

在一個較佳實施例中，第一及第二聚核苷酸係存在於獨立載體，例如DNA質體或病毒載體中。較佳地，該等獨立載體係存在於同一組合物中。

根據本申請案之較佳實施例，醫藥組合物或套組包含存在於第一載體中之第一聚核苷酸、存在於第二載體中之第二聚核苷酸。第一載體及第二載體可相同或不同。較佳地，載體為DNA質體。

在本申請案之一個特定實施例中，第一載體係第一DNA質體，第二載體係第二DNA質體。該第一及第二DNA質體各自包含複製起點，較佳為SEQ ID NO:21之pUC ORI，及抗生素抗性卡匣，其較佳包含具有與SEQ ID NO:23至少90%一致之聚核苷酸序列的經密碼子優化之Kan^r 基因，該基因較佳處於bla啟動子，例如SEQ ID NO:24中顯示之bla啟動子的控制下。第一DNA質體及第二DNA質體各自獨立地進一步包含以下至少一個：啟動子序列、強化子序列，及編碼可操作地連接至第一聚核苷酸序列或第二聚核苷酸序列之信號肽序列的聚核苷酸序列。較佳地，第一及第二DNA質體中之各者包含可操作地連接至第一聚核苷酸或第二聚核苷酸之上游序列(其中上游序列包含來自5'端至3'端的序列)、SEQ ID NO:18或19之啟動子序列、強化子序列及編碼具有SEQ ID NO:9或15之胺基酸序列之信號肽序列的聚核苷酸序列。第一DNA質體及第二DNA質體中之各者亦可包含位於HBV抗原編碼序列下游的聚腺苷酸化信號，諸如SEQ ID NO:20之bGH聚腺苷酸化信號。

在本申請案之一個特定實施例中，第一載體為病毒載體且第二載體為病毒載體。較佳地，病毒載體病毒載體為腺病毒載體，更佳為Ad26或Ad35載體，包含表現卡匣，該表現卡匣包括編碼本申請案之HBV pol抗原或截短HBV核心抗原的聚核苷酸；可操作地連接至編碼HBV抗原之聚核苷酸的上游序列，該HBV抗原包含5'端至3'端之啟動子序列，較佳地SEQ ID NO:19之啟動子序列、強化子序列，較佳SEQ ID NO:12之ApoAI基因片段序列，及編碼信號肽序列之聚核苷酸序列，較佳地具有SEQ ID NO:15之胺基酸序列的免疫球蛋白分泌信號；及可操作地連接至編碼HBV抗原之聚核苷酸的下游序列，該HBV抗原包含聚腺苷酸化信號，較佳SEQ ID NO:13之SV40聚腺苷酸化信號。

在另一較佳實施例中，第一及第二聚核苷酸係存在於單一載體，例如DNA質體或病毒載體中。較佳地，單一載體係腺病毒載體，更佳係Ad26載體，其包含表現卡匣，該表現卡匣包括編碼本申請案之HBV pol抗原及截短HBV核心抗原，較佳編碼呈融合蛋白形式的本申請案之HBV pol抗原及截短HBV核心抗原的聚核苷酸；可操作地連接至編碼HBV pol及截短之核心抗原之聚核苷酸的上游序列，該等聚核苷酸包含5'端至3'端之啟動子序列，較佳SEQ ID NO:19之CMV啟動子序列、強化子序列，較佳SEQ ID NO:12之ApoAI基因片段序列及編碼信號肽序列之聚核苷酸序列，較佳具有SEQ ID NO:15之胺基酸序列的免疫球蛋白分泌信號；及可操作地連接至編碼HBV抗原之聚核苷酸的下游序列，該HBV抗原包含聚腺苷酸化信號，較佳SEQ ID NO:13之SV40聚腺苷酸化信號。

當本申請案之醫藥組合物包含第一載體(諸如DNA質體或病毒載體)及第二載體(諸如DNA質體或病毒載體)時，第一及第二載體中之各者之量不受特別限制。舉例而言，第一DNA質體及第二DNA質體可以按重量計以10:1至1:10，諸如按重量計以10:1、9:1、8:1、7:1、6:1、5:1、4:1、3:1、2:1、1:1、1:2、1:3、1:4、1:5、1:6、1:7、1:8、1:9或1:10之比率存在。較佳地，第一及第二DNA質體按重量計係以1:1之比率存在。本申請案之醫藥組合物可以進一步包含編碼適用於治療HBV感染之第三活性劑的第三載體。

本申請案之組合物及醫藥組合物可包含編碼其他HBV抗原之其他聚核苷酸或載體及/或其他HBV抗原或其免疫原性片段，諸如HBsAg、HBV L蛋白質或HBV包膜蛋白，或編碼其之聚核苷酸序列。然而，在特定實施例中，本申請案之組合物及醫藥組合物不包含某些抗原。

在一個特定實施例中，本申請案之組合物或醫藥組合物或套組不包含HBsAg或編碼HBsAg之聚核苷酸序列。

在另一特定實施例中，本申請案之組合物或醫藥組合物或套組不包含HBV L蛋白或編碼HBV L蛋白之聚核苷酸序列。

在本申請案之又一特定實施例中，本申請案之組合物或醫藥組合物不包含HBV包膜蛋白或編碼HBV包膜蛋白之聚核苷酸序列。

本申請案之組合物及醫藥組合物亦可包含醫藥學上可接受之載劑。醫藥學上可接受之載劑係無毒的且不應干擾活性成分之功效。醫藥學上可接受之載劑可包括一或多種賦形劑，諸如黏合劑、崩解劑、膨潤劑、懸浮劑、乳化劑、潤濕劑、潤滑劑、調味劑、甜味劑、防腐劑、染料、增溶劑及包覆劑。醫藥學上可接受之載劑可包括媒劑，諸如脂質奈米顆粒(LNP)。載劑或其他材料之確切性質可取決於投與途徑，例如肌肉內、皮內、皮下、經口、靜脈內、皮膚、黏膜內(例如腸)、鼻內或腹膜內途徑。對於液體可注射製劑，例如懸浮液及溶液，適合的載劑及添加劑包括水、乙二醇、油、醇、防腐劑、著色劑及其類似物。對於固體口服製劑，例如散劑、膠囊、囊片、膠囊錠及錠劑，適合的載劑及添加劑包括澱粉、糖、稀釋劑、成粒劑、潤滑劑、黏合劑、崩解劑及其類似物。對於鼻噴霧劑/吸入劑混合物，水溶液/懸浮液可包含水、乙二醇、油、潤滑劑、穩定劑、潤濕劑、防腐劑、芳族化合物、調味劑及其類似物作為適合的載劑及添加劑。

本申請案之組合物及醫藥組合物可以適合於向個體投與之任何物質調配以促進投與及改善功效，包括但不限於經口(經腸)投與及非經腸注射。非經腸注射包括靜脈內注射或輸注、皮下注射、皮內注射及肌肉內注射。本申請案之組合物亦可調配用於其他投藥途徑，包括經黏膜、眼、直腸、長效植入、舌下投與(即在舌頭下方，自口腔黏膜投與，繞過門脈循環)、吸入或鼻內投與。

在本申請案之一個較佳實施例中，本申請案之組合物及醫藥組合物係調配用於非經腸注射，較佳經皮下、皮內注射或肌肉內注射，更佳肌肉內注射。

根據本申請案之實施例，供投與之組合物及醫藥組合物通常將包含於醫藥學上可接受之載劑，例如水性載劑中之緩衝溶液，諸如緩衝生理食鹽水及類似物，例如磷酸鹽緩衝生理食鹽水(PBS)。視需要，組合物及醫藥組合物亦可含有醫藥學上可接受之物質以接近生理條件，諸如pH調節及緩衝劑。舉例而言，包含質體DNA之本申請案之組合物或醫藥組合物可含有磷酸鹽緩衝生理食鹽水(PBS)作為醫藥學上可接受之載劑。質體DNA可以為例如0.5 mg/mL至5 mg/mL，諸如為0.5 mg/mL、1 mg/mL、2 mg/mL、3 mg/mL、4 mg/mL或5 mg/mL，較佳為1 mg/mL之濃度存在。

本申請案之組合物及醫藥組合物可根據此項技術中熟知之方法調配為疫苗(亦稱為「免疫原性組合物」)。此類組合物可以包括用以增強免疫反應之佐劑。根據本發明，調配物中各組分之最佳比率可以藉由熟習此項技術者熟知之技術測定。

在本申請案之一個特定實施例中，組合物或醫藥組合物為DNA疫苗。DNA疫苗通常包括含有處於強真核啟動子控制下的編碼相關抗原之聚核苷酸的細菌質體。在將質體遞送至宿主之細胞質中之後，即產生並內源性加工編碼之抗原。所得抗原通常誘發體液及細胞介導之免疫反應。DNA疫苗有利至少係由於其提供改良之安全性，具有溫度穩定性，可以容易地用於表現抗原變異體且易於製造。可以使用本申請案之DNA質體中之任一種製備此類DNA疫苗。

在本申請案之其他特定實施例中，組合物或醫藥組合物為RNA疫苗。RNA疫苗通常包含至少一個編碼相關抗原，例如根據本申請案之融合蛋白或HBV抗原之單股RNA分子。與DNA疫苗類似，在將RNA遞送至宿主之細胞質中之後，即產生並內源性加工編碼之抗原，誘發體液及細胞介導之免疫反應。RNA序列可以經密碼子優化以提高轉譯效率。RNA分子可以根據本發明，藉由此項技術中已知之任何方法，諸如藉由添加例如具有至少30個腺苷殘基之多聚腺苷酸尾；及/或用經修飾之核糖核苷酸，例如7-甲基鳥苷帽對5端加帽進行修飾以增進穩定性及/或轉譯，該經修飾之核糖核苷酸可以在RNA合成期間併入或在RNA轉錄之後以酶方式進行工程改造。RNA疫苗亦可為由α病毒表現載體開發之自我複製RNA疫苗。自我複製RNA疫苗包含源於屬於α病毒科之病毒的複製酶RNA分子，其具有控制融合蛋白或HBV抗原RNA複製之亞基因體啟動子，隨後為位於該複製酶下游的人工聚腺苷酸尾。

在某些實施例中，另一佐劑可包括於本申請案之組合物或醫藥組合物中，或與本申請案之組合物或醫藥組合物共同投與。另一佐劑之使用係可選的，且當組合物係用於疫苗接種目的時，其可以進一步增強免疫反應。適於共投與或包括在根據本申請案之組合物中的其他佐劑應較佳地為可能安全、具有良好耐受性且在人類中有效之佐劑。佐劑可以為小分子或抗體，包括但不限於免疫檢查點抑制劑(例如抗PD1、抗TIM-3等)、鐸樣受體促效劑(例如TLR7促效劑及/或TLR8促效劑)、RIG-1促效劑、IL-15超級促效劑(Altor Bioscience)、突變IRF3及IRF7基因佐劑、STING促效劑(Aduro)、FLT3L基因佐劑及IL-7-hyFc。舉例而言，佐劑可為例如選自在以下中之抗HBV劑：HBV DNA聚合酶抑制劑；免疫調節劑；鐸樣受體7調節劑；鐸樣受體8調節劑；鐸樣受體3調節劑；干擾素α受體配體；玻尿酸酶抑制劑；IL-10調節劑；HBsAg抑制劑；鐸樣受體9調節劑；親環蛋白抑制劑；HBV預防性疫苗；HBV治療性疫苗；HBV病毒進入抑制劑；靶向病毒mRNA之反義寡核苷酸，更特定言之抗HBV反義寡核苷酸；短干擾RNA (siRNA)，更特定言之抗HBV siRNA；核酸內切酶調節劑；核糖核苷酸還原酶抑制劑；B型肝炎病毒E抗原抑制劑；靶向B型肝炎病毒之表面抗原的HBV抗體；HBV抗體；CCR2趨化因子拮抗劑；胸腺素促效劑；細胞介素，諸如IL12；衣殼組裝調節劑、核蛋白抑制劑(HBV核心或衣殼蛋白抑制劑)；核酸聚合物(NAP)；視黃酸誘導性基因1之刺激劑；NOD2刺激劑；重組胸腺素α-1；B型肝炎病毒複製抑制劑；PI3K抑制劑；cccDNA抑制劑；免疫檢查點抑制劑，諸如PD-L1抑制劑、PD-1抑制劑、TIM-3抑制劑、TIGIT抑制劑、Lag3抑制劑及CTLA-4抑制劑；在免疫細胞(更特定言之T細胞)上表現之共刺激受體，諸如CD27、CD28等的促效劑；BTK抑制劑；用於治療HBV之其他藥物；IDO抑制劑；精胺酸酶抑制劑；以及KDM5抑制劑。

在某些實施例中，第一及第二非天然存在之核酸分子中之各者獨立地與脂質奈米顆粒(LNP)調配。

本申請案亦提供製備本申請案之組合物及醫藥組合物的方法。一種製造組合物或醫藥組合物之方法，其包含將編碼本申請案之HBV抗原、載體及/或多肽的經分離聚核苷酸與一或多種醫藥學上可接受之載劑混合。一般熟習此項技術者將熟悉用於製備此類組合物之習知技術。

脂質體及脂質奈米顆粒 在本申請案之某些實施例中，投與方法為脂質組合物，諸如脂質奈米顆粒(LNP)或脂質體。可用於遞送治療產物(諸如本發明之一或多個核酸分子)之脂質組合物，較佳脂質奈米顆粒或脂質體，包括但不限於脂質體或脂質囊泡，其中水性體積經兩性脂質雙層囊封，或其中脂質塗層內部包含治療產物；或脂質聚集物或微胞，其中經脂質囊封之治療產物內含於相對無序脂質混合物內。

脂質組合物可提供具有完全囊封、部分囊封或兩者之治療產物(諸如一或多個本發明之核酸分子)。在較佳實施例中，將治療產物完全囊封於脂質顆粒中(例如以形成LNP)。

本發明之脂質組合物可包含一或多種選自以下之脂質：陽離子脂質、陰離子脂質、兩性離子脂質、中性脂質、類固醇、聚合物結合脂質、磷脂、糖脂及前述之任何組合。脂質可為飽和或不飽和的。混合物可包含飽和及不飽和脂質兩者。脂質組合物可實質上不含脂質體或可含有脂質體。較佳使用至少一種不飽和脂質用於製備脂質體。若不飽和脂質具有兩個尾，則兩個尾可為不飽和的，或其可具有一個飽和尾及一個不飽和尾。脂質及核酸分子可混合且組態於任何適合之結構中。

在特定實施例中，脂質組合物包含陽離子脂質以囊封及/或促進將核酸分子(諸如本發明之DNA或RNA分子)遞送至靶細胞中。陽離子脂質可為在所選pH值(諸如生理pH值)下之攜帶淨正電荷之任何脂質物種。不希望受理論束縛，陽離子脂質(諸如可電離胺基脂質)促進組分自組裝成囊封該核酸(DNA及/或RNA)之大分子奈米顆粒。藉由內飲作用將含核酸之奈米顆料有效吸收至靶細胞中。一旦處於核內體內部，帶正電荷之脂質奈米顆粒與帶負電之核內體膜相互作用，引起隔室破壞且將核酸分子釋放至細胞質中，在細胞質中可表現核酸分子。

若干陽離子脂質已描述於文獻中，其中許多為可商購的。舉例而言，適用於本發明之組合物及方法之陽離子脂質包括1,2-二油醯基-3-三甲基銨基-丙烷(DOTAP)、1,2-二亞油氧基-、N,N-二甲基胺基丙烷(DLinDMA)及1,2-二亞麻氧基-N,N-二甲基胺基丙烷(DLenDMA)。調配陽離子脂質之pKa與脂質顆粒遞送核酸之有效性相關(參見Jayaraman等人,Angewandte Chemie, International Edition (2012), 51(34), 8529-8533; Semple等人, Nature Biotechnology 28, 172-176 (2010))。較佳pKa範圍為約5至約7。

在一個實施例中，陽離子脂質為式(I)化合物：

式(I) 其中R₁ 為由10至31個碳組成之經取代之烷基，R₂ 為由2至20個碳組成之直鏈烷基、烯基或炔基，R₃ 為由1至6個碳組成之直鏈或分支鏈烷，R₄ 與R₅ 相同或不同，各自為氫或由1至6個碳組成之直鏈或分支鏈烷基； L₁ 與L₂ 相同或不同，各自為具有1至20個碳之直鏈烷烴或具有2至20個碳之直鏈烯烴，且X₁ 為S或O；或其鹽或溶劑合物。例示性式(I)之化合物、其合成及其用途描述於US2018/0169268中，其均以引用之方式併入本文中。

在另一實施例中，陽離子脂質為式(II)化合物：

式(II) 其中R₁ 為具有8、9、10、11、12、13、14、16、17、18、19、20、21或22個碳之分支鏈、非環狀烷基或烯基；L₁ 為具有1至15個碳之直鏈烷烴；R₂ 為具有5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15個碳之直鏈烷基或烯基，或具有8、9、10、11、12、13、14、16、17、18、19、20、21或22個碳之分支鏈、非環狀烷基或烯基； L₂ 為具有4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15個碳之直鏈烷烴；X為O或S；R₃ 為具有1、2、3、4、5或6個碳之直鏈烷烴；且R₄ 與R₅ 相同或不同，各自為具有1、2、3、4、5或6個碳之直鏈或分支鏈非環狀烷基；或其醫藥學上可接受之鹽或溶劑合物。例示性式(II)化合物、其合成及用途描述於US2018/0170866中，其全部以引用之方式併入本文中。

在另一實施例中，陽離子脂質為式(III)、(IV)或(V)之化合物：

其中R包含生物活性分子，且L₁ 、L₂ 及L₃ 在每次出現時獨立地包含選自由以下組成之群的配位體：碳水化合物、多肽或親脂基；其醫藥學上可接受之鹽；或其醫藥組合物。例示性式(II)、(IV)及(v)之化合物、其合成及用途描述於US2017/0028074中，其全部以引用之方式併入本文中。

在另一實施例中，陽離子脂質為式(VI)之化合物：

式(VI) 其中X為直鏈或分支鏈伸烷基或伸烯基、單環、雙環或三環芳烴或雜芳烴；Y為鍵、乙烯或未經取代或經取代之芳族或雜芳族環；Z為S或O；L為具有1至6個碳之直鏈或分支鏈伸烷基；R₃ 及R₄ 獨立地為具有1至6個碳之直鏈或分支鏈烷基；R₁ 及R₂ 獨立地為具有1至20個碳之直鏈或分支鏈烷基或烯基；r為0至6；且m、n、p及q獨立地為1至18；其中當n=q，m=p且R₁ =R₂ 時，則X及Y不同；其中當X=Y，n=q，m=p時，則R₁ 及R₂ 不同；其中當X=Y，n=q，且R₁ =R₂ 時，則m及p不同；且其中當X=Y，m=p，且R₁ =R₂ 時，則n及q不同；或其醫藥學上可接受之鹽。例示性式(VI)之化合物、其合成及用途描述於US2017/0190661中，其全部以引用之方式併入本文中。

在另一實施例中，陽離子脂質為式(VII)之化合物：

式(VII) 或其醫藥學上可接受之鹽、前藥或立體異構體，其中：G¹ 或G² 中之一者在每次出現時為-O(C═O)-、-(C═O)O-、-C(═O)-、-O-、-S(O)_y −、-S-S-、-C(═O)S-、SC(═O)-、-N(R^a )C(═O)-、-C(═O)N(R^a )-、-N(R^a )C(═O)N(R^a )-、-OC(═O)N(R^a )-或-N(R^a )C(═O)O-，且G¹ 或G² 中之另一者在每次出現時為-O(C═O)-、-(C═O)O-、-C(═O)-、-O-、-S(O)_y −、-S-S'、-C(═O)S-、-SC(═O)-、-N(R^a )C(═O)-、-C(═O)N(R^a )-、-N(R^a )C(═O)N(R^a )-、-OC(═O)N(R^a )-或-N(R^a )C(═O)O-或直接鍵；L在每次出現時為˜O(C═O)-，其中˜表示X之共價鍵；X為CR^a ；當n為1時，Z為烷基、環烷基或包含至少一種極性官能基之單價部分；或當n大於1時，Z為伸烷基、伸環烷基或包含至少一種極性官能基之多價部分；R^a 在每次出現時獨立地為H、C₁ -C₁₂ 烷基、C₁ -C₁₂ 羥基烷基、C₁ -C₁₂ 胺基烷基、C₁ -C₁₂ 烷基胺基烷基、C₁ -C₁₂ 烷氧基烷基、C₁ -C₁₂ 烷氧基羰基、C₁ -C₁₂ 烷基羰氧基、C₁ -C₁₂ 烷基羰氧基烷基或C₁ -C₁₂ 烷基羰基；R在每次出現時獨立地為：(a) H或C₁ -C₁₂ 烷基；或(b)R連同與其結合之碳原子一起，與相鄰之R及與其結合之碳原子一起形成碳-碳雙鍵；R¹ 及R² 在每次出現時分別具有以下結構：

； a¹ 及a² 在每次出現時獨立地為3至12之整數；b¹ 及b² 在每次出現時獨立地為0或1；c¹ 及c² 在每次出現時獨立地為5至10之整數；d¹ 及d² 在每次出現時獨立地為5至10之整數；y在每次出現時獨立地為0至2之整數；且n為1至6之整數，其中各烷基、伸烷基、羥基烷基、胺基烷基、烷基胺基烷基、烷氧基烷基、烷氧基羰基、烷基羰氧基、烷基羰氧基烷基及烷基羰基視情況經一或多個取代基取代。

在另一實施例中，陽離子脂質為式(VIII)化合物：

式(VIII) 或其醫藥學上可接受之鹽、前藥或立體異構體，其中：G¹ 或G² 中之一者在每次出現時為-O(C═O)-、-(C═O)O-、-C(═O)-、-O-、-S(O)_y −、-S-S-、-C(═O)S-、SC(═O)-、-N(R^a )C(═O)-、-C(═O)N(R^a )-、-N(R^a )C(═O)N(R^a )-、-OC(═O)N(R^a )-或-N(R^a )C(═O)O-，且G¹ 或G² 中之另一者在每次出現時為-O(C═O)-、-(C═O)O-、-C(═O)-、-O-、-S(O)_y −、-S-S-、-C(═O)S-、-SC(═O)-、-N(R^a )C(═O)-、-C(═O)N(R^a )-、-N(R^a )C(═O)N(R^a )-、-OC(═O)N(R^a )-或-N(R^a )C(═O)O-或直接鍵；L在每次出現時為˜O(C═O)-，其中˜表示X之共價鍵；X為CR^a ；當n為1時，Z為烷基、環烷基或包含至少一種極性官能基之單價部分；或當n大於1時，Z為伸烷基、伸環烷基或包含至少一種極性官能基之多價部分；R^a 在每次出現時獨立地為H、C₁ -C₁₂ 烷基、C₁ -C₁₂ 羥基烷基、C₁ -C₁₂ 胺基烷基、C₁ -C₁₂ 烷基胺基烷基、C₁ -C₁₂ 烷氧基烷基、C₁ -C₁₂ 烷氧基羰基、C₁ -C₁₂ 烷基羰氧基、C₁ -C₁₂ 烷基羰氧基烷基或C₁ -C₁₂ 烷基羰基；R在每次出現時獨立地為：(a) H或C₁ -C₁₂ 烷基；或(b)R連同與其結合之碳原子一起，與相鄰之R及與其結合之碳原子一起形成碳-碳雙鍵；R¹ 及R² 在每次出現時分別具有以下結構：

； R'在每次出現時獨立地為H或C₁ -C₁₂ 烷基；a¹ 及a² 在每次出現時獨立地為3至12之整數；b¹ 及b² 在每次出現時獨立地為0或1；c¹ 及c² 在每次出現時獨立地為2至12之整數；d¹ 及d² 在每次出現時獨立地為2至12之整數；y在每次出現時獨立地為0至2之整數；且n為1至6之整數，其中a¹ 、a² 、c¹ 、c² 、d¹ 及d² 經選擇以使得a¹ +c¹ +d¹ 之總和為18至30之整數，且a² +c² +d² 之總和為18至30之整數，且其中各烷基、伸烷基、羥基烷基、胺基烷基、烷基胺基烷基、烷氧基烷基、烷氧基羰基、烷基羰氧基、烷基羰氧基烷基及烷基羰基視情況經一或多個取代基取代。

例示性式(VII)及(VIII)化合物、其合成及其用途描述於US20190022247中，其皆以引用之方式併入本文中。

可用於本申請案之組合物中之其他陽離子脂質包括但不限於WO2019/036030、WO2019/036028、WO2019/036008、WO2019/036000、US2016/0376224、US2017/0119904、WO2018/200943及WO2018/191657中所述之彼等，脂質、其合成及用途之相關內容以引用之方式併入本文中。

脂質奈米顆粒可藉由包括採用一或多種陽離子脂質、非陽離子脂質及經聚乙二醇(PEG)修飾或聚乙二醇化脂質之不同比率之多組分脂質混合物來製備，亦即脂質藉由聚乙二醇之共價連接來修飾。PEG提供具有可賦予有利藥物動力學特徵之塗層的脂質體，例如其可增加穩定性且防止脂質體之非特異性吸附。在某些實施例中，PEG之平均分子量為1 kDa至12 kDa，諸如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12 kDa。舉例而言，據報導，PEG之長度可影響囊封RNA之活體內表現，且分子量低於1 kDa(例如500或750 Da)之PEG不會形成穩定脂質體。參見例如US2014/0255472，其相關內容以引用之方式併入本文中。

脂質調配物可包括陰離子脂質。陰離子脂質可為在所選pH值(諸如生理pH值)下的攜帶淨負電荷之任何脂質物種。當與陽離子脂質組合時，陰離子脂質用於降低LNP及脂質體之總體表面電荷且引入LNP或脂質體雙層結構之pH依賴性破壞，促進核苷酸釋放。若干陰離子脂質已描述於文獻中，其中許多為可商購的。舉例而言，適用於本發明之組合物及方法之陰離子脂質包括1,2-二油醯基-sn-3-磷酸乙醇胺(DOPE)、磷脂醯甘油、心磷脂、二醯基磷脂醯絲胺酸、二醯基磷脂酸、N-十二醯基磷脂醯乙醇胺、N-丁二醯基磷脂醯乙醇胺、N-戊二醛磷脂醯乙醇胺、賴氨醯磷脂醯甘油及棕櫚醯氧基磷脂醯甘油(POPG)。

脂質調配物亦可包括脂質雙層穩定組分。雙層穩定組分可用於抑制LNP之聚集，但雙層穩定組分不限於此功能。舉例而言，可使用諸如聚乙二醇脂質結合物及陽離子聚合物-脂質結合物之結合脂質抑制LNP或脂質體之聚集。藉由控制雙層穩定組分之組合物及濃度，吾人可控制雙層穩定組分自脂質體交換之速率且轉而控制脂質體變得促融之速率。術語「促融」係指脂質體或其他藥物遞送系統與細胞之膜融合之能力。舉例而言，當使用聚乙二醇-磷脂醯乙醇胺結合物或聚乙二醇-神經醯胺結合物作為雙層穩定組分時，脂質體變得促融之速率可例如藉由改變雙層穩定組分之濃度、藉由改變聚乙二醇之分子量或藉由改變磷脂醯乙醇胺或腦醯胺上之醯基鏈基團之鏈長及飽和度而變化。另外，包括例如pH值、溫度、離子強度等之其他變數可用於改變及/或控制脂質體變得促融之速率。在閱讀本發明後，可用於控制脂質體變得促融之速率的其他方法對於熟習此項技術者將變得顯而易見。

LNP及脂質體可鑒於本發明使用此項技術中已知之方法製備。舉例而言，LNP可使用乙醇注射或稀釋、薄膜水合、凍融、法式壓碎機(French press)或膜擠壓、透濾、音波處理、清潔劑透析、醚輸注及逆相蒸發來製備。一種製備脂質體之適用方法涉及混合(i)脂質之乙醇溶液(ii)核酸之水溶液及(iii)緩衝液，隨後混合、平衡、稀釋及純化。本發明之較佳脂質體，例如具有較佳直徑之脂質體，可藉由此混合製程獲得。為獲得具有所需直徑之脂質體，可使用如下文所描述之方法進行混合，其中將水性核酸溶液之兩個進料流組合於具有一個乙醇脂質溶液流之單個混合區域中，所有均在相同流動速率下，例如在微流體通道中。產生脂質體之其他實例、組合物及方法描述於US 2014/0255472中，其以全文引用的方式併入本文中。

脂質、脂質組合物及產生用於遞送活性核酸分子(諸如本發明之彼等)之脂質載體的方法之一些實例描述於：US2017/0190661、US2006/0008910、US2015/0064242、US2005/0064595、WO/2019/036030、US2019/0022247、WO/2019/036028、WO/2019/036008、WO/2019/036000、US2016/0376224、US2017/0119904、WO/2018/200943、WO/2018/191657、US2014/0255472及US2013/0195968，其各者之相關內容以全文引用之方式併入本文中。

脂質體為包括至少一個同心脂質雙層之微觀小泡。選擇小泡形成脂質以達成指定程度之最終複合物流動性或硬度。在特定實施例中，脂質體提供脂質組合物，其為包圍多孔奈米顆粒之外層。

脂質體可為中性(膽固醇)或雙極性且包括磷脂，諸如膽鹼磷脂(PC)、磷脂醯乙醇胺(PE)、磷脂醯環己六醇(PI)及鞘磷脂(SM)及其他類型之雙極性脂質，包括二油醯基磷脂醯乙醇胺(DOPE)，其中烴鏈長在14-22之範圍內，且飽和或具有一或多個C=C鍵。能夠單獨或與其他脂質組分組合產生穩定脂質體之脂質之實例為磷脂，諸如氫化大豆膽鹼磷脂(HSPC)、卵磷脂、磷脂醯乙醇胺、溶血卵磷脂、溶血磷脂醯乙醇胺、磷脂醯絲胺酸、磷脂醯環己六醇、鞘磷脂、腦磷脂、心磷脂、磷脂酸、腦苷脂、二硬脂醯基磷脂醯乙醇胺(DSPE)、二油醯基磷脂醯膽鹼(DOPC)、二棕櫚醯基磷脂醯膽鹼(DPPC)、棕櫚醯油醯基磷脂醯膽鹼(POPC)、棕櫚醯氧基磷酸乙醇胺(POPE)及二油醯基磷脂醯乙醇胺4-(N-馬來醯亞胺基-甲基)環己烷-1-甲酸酯(DOPE-mal)。可併入脂質體中之其他含非磷的脂質包括硬脂胺、十二烷胺、十六烷胺、十四烷酸異丙酯、三乙醇胺月桂基硫酸酯、烷基芳基硫酸酯、棕櫚酸乙醯基酯、蓖麻油酸甘油酯、硬脂酸十六酯、兩性丙烯酸聚合物、聚氧基化脂肪酸醯胺、DDAB、二(十八烷基)二甲基氯化銨(DODAC)、1,2-二肉豆蔻醯基-3-三甲銨丙烷(DMTAP)、DOTAP、DOTMA、DC-Choi、磷脂酸(PA)、二棕櫚醯基磷脂醯甘油(DPPG)、二油醯基磷脂醯丙三醇、DOPG及二鯨蠟基磷酸酯。在特定實施例中，用於產生本文揭示之脂質體的脂質包括膽固醇、經氫化之大豆膽鹼磷脂(HSPC)及衍生之小泡形成脂質PEG-DSPE。

形成脂質體之方法描述於例如美國專利第4,229,360號、第4,224,179號、第4,241,046號、第4,737,323號、第4,078,052號、第4,235,871號、第4,501,728號及第4,837,028號以及Szoka等人Ann. Rev. Biophys. Bioeng. 9:467 (1980)及Hope等人, Chem. Phys. Lip. 40:89 (1986)中。

誘導免疫反應或治療 HBV 感染之方法 本申請案亦提供在有需要之個體中誘發針對B型肝炎病毒(HBV)之免疫反應的方法，其包含向該個體投與免疫原性有效量的本申請案之組合物或免疫性組合物。本文所描述之本申請案之組合物及醫藥組合物中之任一者可用於本申請案之方法中。

如本文所使用，術語「感染」係指致病原對宿主之侵襲。當致病原能夠侵襲宿主，且在宿主內複製或繁殖時，認為其具有「感染性」。感染物之實例包括病毒，例如HBV及某些物種之腺病毒、朊病毒、細菌、真菌、原蟲及類似物。「HBV感染」特指HBV對宿主生物體，諸如宿主生物體之細胞及組織之侵襲。

當關於本文所描述之方法使用時，短語「誘發免疫反應」涵蓋在有需要之個體中引起針對感染，例如HBV感染之所需免疫反應或作用。「誘發免疫反應」亦涵蓋提供針對病原體，例如HBV之治療性免疫以進行治療。如本文所使用，術語「治療性免疫」或「治療性免疫反應」意思指經疫苗接種之個體能夠控制該疫苗接種所針對之病原體感染，例如藉由用HBV疫苗進行疫苗接種引起針對HBV感染之免疫。在一個實施例中，「誘發免疫反應」意謂在有需要之個體中產生免疫，例如以提供針對疾病，諸如HBV感染之治療作用。在某些實施例中，「誘發免疫反應」係指引起或改善針對HBV感染之細胞免疫，例如T細胞反應。在某些實施例中，「誘發免疫反應」係指引起或改善針對HBV感染之體液免疫反應。在某些實施例中，「誘發免疫反應」係指引起或改善針對HBV感染之細胞及體液免疫反應。

如本文所使用，術語「保護性免疫」或「保護性免疫反應」意思指經疫苗接種之個體能夠控制該疫苗接種所針對之病原體感染。通常，產生「保護性免疫反應」之個體僅產生輕度至中度臨床症狀或完全無症狀。通常，針對某一病原體具有「保護性免疫反應」或「保護性免疫」之個體將不會死於該病原體感染。

通常，本申請案之組合物及醫藥組合物之投與將具有治療目的以在HBV感染或發展HIV感染特有之症狀之後產生針對HBV之免疫反應，例如用於治療性疫苗接種。

如本文所使用，「免疫原性有效量」或「免疫有效量」意謂足以在有需要之個體中誘發所需免疫作用或免疫反應的組合物、聚核苷酸、載體或抗原之量。免疫原性有效量可以為足以在有需要之個體中誘發免疫反應的量。免疫原性有效量可以為足以在有需要之個體中產生免疫性，例如針對疾病，諸如HBV感染提供治療作用的量。免疫原性有效量可以取決於多種因素而變化，諸如個體之身體狀況，年齡、體重、健康狀況等；具體應用，例如提供保護性免疫或治療性免疫；以及免疫需要針對之具體疾病，例如病毒感染。一般熟習此項技術者根據本發明可以容易地確定免疫原性有效量。

在本申請案之具體實施例中，免疫原性有效量係指足以達成以下效果中之一個、兩個、三個、四個或更多個之組合物或醫藥組合物之量：(i)降低或改善HBV感染或其相關症狀之嚴重程度；(ii)減少HBV感染或其相關症狀之持續時間；(iii)預防HBV感染或其相關症狀之進展；(iv)使得HBV感染或其相關症狀消退；(v)預防HBV感染或其相關症狀之發展或發作；(vi)預防HBV感染或其相關症狀復發；(vii)減少患有HBV感染之個體住院；(viii)降低患有HBV感染之個體之住院時長；(ix)提高患有HBV感染之個體之存活率；(x)消除個體中之HBV感染；(xi)抑制或降低個體中之HBV複製；及/或(xii)增強或改善另一療法之預防性或治療效果。

免疫原性有效量亦可為足以減小HBsAg含量以符合臨床血清轉化之發展；利用個體之免疫系統實現持久HBsAg清除以及減少受感染肝細胞；誘導HBV抗原特異性活化之T細胞群體；及/或在12個月內實現持久的HBsAg喪失的量。目標指標之實例包括下限HBsAg低於500個複本之HBsAg國際單位(IU)之臨限值及/或較高CD8計數。

作為通用指導，當參考DNA質體使用時，免疫原性有效量可以在約0.1 mg/mL至10 mg/mL總DNA質體範圍內，諸如為0.1 mg/mL、0.25 mg/mL、0.5 mg/mL、0.75 mg/mL、1 mg/mL、1.5 mg/mL、2 mg/mL、3 mg/mL、4 mg/mL、5 mg/mL、6 mg/mL、7 mg/mL、8 mg/mL、9 mg/mL或10 mg/mL。較佳地，DNA質體之免疫原性有效量小於8 mg/mL，更佳小於6 mg/mL，甚至更佳為3-4 mg/mL。免疫原性有效量可以來自一個載體或質體，或來自多個載體或質體。作為其他通用指導，在參考肽使用時，免疫原性有效量可在每次投與約10 μg至1 mg範圍內，諸如每次投與10、20、50、100、200、300、400、500、600、700、800、9000或1000 μg。免疫原性有效量可以經單一組合物或經多種組合物，諸如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10種組合物(例如錠劑、膠囊或可注射劑，或適於皮內遞送，例如適於使用皮內遞送貼片皮內遞送的任何組合物)投與，其中多個膠囊或多次注射液的投與總體地向個體提供免疫原性有效量。舉例而言，當使用兩個DNA質體時，免疫原性有效量可以為3-4 mg/mL，具有1.5-2 mg/mL各質體。亦可按所謂的初打-加打方案，向個體投與免疫原性有效量，且隨後向該個體投與另一劑免疫原性有效量。此初打-加打方案之一般概念係熟習疫苗領域之技術者熟知的。視需要，可以視情況在該方案中添加進一步的追加劑投與。

可藉由將兩個DNA質體，例如編碼HBV核心抗原之第一DNA質體及編碼HBV pol抗原之第二DNA質體混合並將混合物遞送至單一解剖部位來將包含該兩個質體的醫藥組合物投與個體。或者，可進行兩次單獨的免疫接種，分別遞送單一表現質體。在此類實施例中，無論兩個質體係作為混合物以單次免疫接種投與抑或兩次獨立的免疫接種投與，第一DNA質體及第二DNA質體均可按重量計以10:1至1:10，諸如按重量計以10:1、9:1、8:1、7:1、6:1、5:1、4:1、3:1、2:1、1:1、1:2、1:3、1:4、1:5、1:6、1:7、1:8、1:9或1:10之比率投與。較佳地，第一及第二DNA質體係以按重量計1:1之比率投與。

較佳地，根據本申請案之方法的待治療個體係感染HBV之個體，特別是患有慢性HBV感染之個體。急性HBV感染之特徵在於先天免疫系統之高效活化加上隨後的廣泛適應性反應(例如HBV特異性T細胞、中和抗體)，由此通常引起複製之成功抑制或受感染肝細胞之移除。相比之下，此類反應由於高病毒及抗原負荷而減弱或減小，例如HBV包膜蛋白大量產生且可以相對於感染性病毒1,000倍過量釋放於亞病毒粒子中。

慢性HBV感染係分階段描述的，以病毒負荷、肝酶含量(壞死性炎症活動)、HBeAg或HBsAg負荷，或者針對該等抗原之抗體之存在表徵。cccDNA含量保持相對恆定，每個細胞有約10至50個複本，即使病毒血症可能變化極大。cccDNA物種之存留導致慢性。更具體言之，慢性HBV感染各階段包括：(i)免疫耐受期，以高病毒負荷及正常或升高極小之肝酶為特徵；(ii)免疫活化HBeAg陽性期，在此階段觀察到較低或下降水準之病毒複製及明顯升高之肝酶；(iii)非活動性HBsAg攜帶期，該階段係具有較低病毒負荷之低複製狀態且在血清中具有可以遵循HBeAg血清轉化之正常肝酶含量；以及(iv)HBeAg陰性期，在該階段中，定期發生病毒複製(再活化)且伴隨肝酶含量之波動，在前核心及/或基礎核心啟動子中之突變係常見的，使得受感染細胞無法產生HBeAg。

如本文所使用，「慢性HBV感染」係指個體中可偵測到HBV存在超過6個月。患有慢性HBV感染之個體可以處於慢性HBV感染之任何階段。慢性HBV感染係根據其在該領域中之一般含義理解。慢性HBV感染可例如以急性HBV感染之後HBsAg存留達6個月或更長時間為特徵。舉例而言，本文所提及的慢性HBV感染遵循疾病控制與預防中心(Centers for Disease Control and Prevention，CDC)所公開之定義，根據該定義，慢性HBV感染可藉由實驗室標準表徵，諸如：(i)針對B型肝炎核心抗原之IgM抗體呈陰性(IgM抗HBc)及針對B型肝炎表面抗原(HBsAg)、B型肝炎e抗原(HBeAg)或有關B型肝炎病毒DNA之核酸測試呈陽性；或(ii)針對HBsAg或有關HBV DNA之核酸測試呈陽性，或間隔至少6個月兩次針對HBeAg呈陽性。

較佳地，免疫原性有效量係指足以治療慢性HBV感染的本申請案之組合物或醫藥組合物之量。

在一些實施例中，患有慢性HBV感染之個體正在經歷核苷類似物(NUC)治療，且受NUC抑制。如本文所使用，「受NUC抑制」係指個體具有不可偵測之HBV病毒含量及穩定丙胺酸轉胺酶(ALT)含量達至少六個月。核苷/核苷酸類似物治療之實例包括HBV聚合酶抑制劑，諸如恩替卡韋及替諾福韋。較佳地，患有慢性HBV感染之個體不會患上晚期肝纖維化或肝硬化。此類個體通常會具有小於3分的針對纖維化之METAVIR評分及小於9 kPa之肝纖維化掃描(fibroscan)結果。METAVIR評分係藉由B型肝炎患者之肝切片之組織病理學評價來評估炎症及纖維化程度的一種常用評分系統。該評分系統指定兩個標準化數值：一個反映炎症之程度且一個反映纖維化之程度。

咸信消除或減輕慢性HBV可以允許包括病毒誘發肝硬化及肝細胞癌在內之重度肝病的早期疾病攔截。因此，本申請案之方法亦可用作治療HBV誘發之疾病的療法。HBV誘發疾病之實例包括但不限於肝硬化、癌症(例如肝細胞癌)及纖維化，特別是以針對纖維化之METAVIR分數係3分或更高為特徵的晚期纖維化。在此類實施例中，免疫原性有效量係足以在12個月內達成HBsAg之持久喪失且明顯減輕臨床疾病(例如肝硬化、肝細胞癌等)的量。

根據本申請案之實施例的方法進一步包含向有需要之個體投與另一免疫原性藥劑(諸如另一HBV抗原或其他抗原)或另一抗HBV劑(諸如核苷類似物或其他抗HBV劑)與本申請案之組合物的組合。舉例而言，另一抗HBV劑或免疫原性劑可以為小分子或抗體，包括但不限於免疫檢查點抑制劑(例如，抗PD1、抗TIM-3等)、鐸樣受體促效劑(例如，TLR7促效劑及/或TLR8促效劑)、RIG -1促效劑、IL-15超級促效劑(Altor Bioscience)、突變IRF3及IRF7基因佐劑、STING促效劑(Aduro)、FLT3L基因佐劑、IL12基因佐劑IL-7-hyFc；與HBV env結合之CAR-T(S-CAR細胞)；衣殼裝配調節劑；cccDNA抑制劑、HBV聚合酶抑制劑(例如恩替卡韋及替諾福韋)。該一種或其他抗HBV活性劑可以例如為小分子、抗體或其抗原結合片段、多肽、蛋白質或核酸。一或其他抗HBV劑可例如選自以下中：HBV DNA聚合酶抑制劑；免疫調節劑；鐸樣受體7調節劑；鐸樣受體8調節劑；鐸樣受體3調節劑；干擾素α受體配體；玻尿酸酶抑制劑；IL-10調節劑；HBsAg抑制劑；鐸樣受體9調節劑；親環蛋白抑制劑；HBV預防性疫苗；HBV治療性疫苗；HBV病毒進入抑制劑；靶向病毒mRNA之反義寡核苷酸，更特定言之抗HBV反義寡核苷酸；短干擾RNA (siRNA)，更特定言之抗HBV siRNA；核酸內切酶調節劑；核糖核苷酸還原酶抑制劑；B型肝炎病毒E抗原抑制劑；靶向B型肝炎病毒之表面抗原的HBV抗體；HBV抗體；CCR2趨化因子拮抗劑；胸腺素促效劑；細胞介素，諸如IL12；衣殼組裝調節劑、核蛋白抑制劑(HBV核心或衣殼蛋白抑制劑)；核酸聚合物(NAP)；視黃酸誘導性基因1之刺激劑；NOD2刺激劑；重組胸腺素α-1；B型肝炎病毒複製抑制劑；PI3K抑制劑；cccDNA抑制劑；免疫檢查點抑制劑，諸如PD-L1抑制劑、PD-1抑制劑、TIM-3抑制劑、TIGIT抑制劑、Lag3抑制劑及CTLA-4抑制劑；在免疫細胞(更特定言之T細胞)上表現之共刺激受體，諸如CD27、CD28等的促效劑；BTK抑制劑；用於治療HBV之其他藥物；IDO抑制劑；精胺酸酶抑制劑；以及KDM5抑制劑。

遞送方法 本申請案之組合物及醫藥組合物可藉由此項技術中已知之任何方法，根據本發明投與個體，包括但不限於非經腸投與(例如肌肉內、皮下、靜脈內或皮內注射)、經口投與、經皮投與及經鼻投與。較佳地，組合物及醫藥組合物係非經腸(例如藉由肌肉內注射或皮內注射)或經皮投與。

在組合物或醫藥組合物包含一或多個DNA質體之本申請案之一些實施例中，投與可藉由經皮注射，例如肌肉內或皮內注射，較佳肌肉內注射進行。肌肉內注射可以與電穿孔組合，亦即，施加電場以有助於DNA質體遞送至細胞中。如本文所使用，術語「電穿孔」係指使用跨膜電場脈衝在生物膜中誘導產生微觀路徑(孔)。在活體內電穿孔期間，向細胞施加適當幅值及持續時間之電場，誘導短暫的細胞膜滲透性增強狀態，由此實現無法獨自跨越細胞膜之分子的細胞吸收。藉由電穿孔產生此類孔有助於諸如質體、寡核苷酸、siRNA、藥物等生物分子穿過細胞膜之一側到達另一側。經顯示，利用活體內電穿孔來遞送DNA疫苗使宿主細胞對質體之吸收明顯增加，但亦會在注射部位引起輕度至中度炎症。因此，相較於習知注射，利用皮內或肌肉內電穿孔使轉染效率及免疫反應顯著改良(例如分別增加1,000倍及100倍)。

在一個典型實施例中，將電穿孔與肌肉內注射組合。然而，亦可將電穿孔與其他非經腸投與形式，例如皮內注射、皮下注射等組合。

經由電穿孔投與本申請案之組合物、醫藥組合物或疫苗可以使用電穿孔器件實現，該等電穿孔器件可經組態以將有效引起細胞膜中形成可逆孔的能量脈衝遞送至所希望的哺乳動物組織。電穿孔器件可以包括電穿孔組件及電極總成或手柄總成。電穿孔組件可以包括以下電穿孔器件組件中之一或多個：控制器、電流波形產生器、阻抗測試儀、波形記錄器、輸入元件、狀態報告元件、通信端口、記憶體組件、電源及電源開關。電穿孔可以使用活體內電穿孔器件實現。可以有助於遞送本申請案之組合物及醫藥組合物，特別是包含DNA質體的電穿孔器件及電穿孔方法之實例包括CELLECTRA®(Inovio Pharmaceuticals, Blue Bell, PA)、Elgen電穿孔器(Inovio Pharmaceuticals, Inc.) Tri-GridTM遞送系統(Ichor Medical Systems, Inc., San Diego, CA 92121)及描述於以下中之彼等：美國專利第7,664,545號、美國專利第8,209,006號、美國專利第9,452,285號、美國專利第5,273,525號、美國專利第6,110,161號、美國專利第6,261,281號、美國專利第6,958,060號及美國專利第6,939,862號、美國專利第7,328,064號、美國專利第6,041,252號、美國專利第5,873,849號、美國專利第6,278,895號、美國專利第6,319,901號、美國專利第6,912,417號、美國專利第8,187,249號、美國專利第9,364,664號、美國專利第9,802,035號、美國專利第6,117,660號及國際專利申請公開案WO2017172838，其皆以全文引用之方式併入本文中。活體內電穿孔器件之其他實例描述於與本申請案同一天提交的題為「用於遞送B型肝炎病毒(HBV)疫苗之方法及裝置(Method and Apparatus for the Delivery of Hepatitis B Virus(HBV)Vaccines)」的代理人案號為688097-405WO之國際專利申請案中，其內容以全文引用的方式併入本文中。用於遞送本申請案之組合物及醫藥組合物的應用亦涵蓋使用脈衝電場，例如如例如美國專利第6,697,669號中所描述，其以全文引用之方式併入本文中。

在組合物或醫藥組合物包含一或多個DNA質體之本申請案之其他實施例中，投與方法係經皮投與。經皮投與可以與表皮磨蝕組合以有助於將DNA質體遞送至細胞。舉例而言，可以使用皮膚貼片進行表皮磨蝕。在移除皮膚貼片後，組合物或醫藥組合物可沈積於經磨蝕之皮膚上。

遞送方法不限於上述實施例，且用於細胞內遞送之任何手段均可使用。本申請案之方法所涵蓋的其他細胞內遞送方法包括但不限於脂質體囊封、脂質奈米顆粒(LNP)等。

佐劑 在本申請案之一些實施例中，誘發針對HBV之免疫反應的方法進一步包含投與佐劑。術語「佐劑」與「免疫刺激劑」在本文中可互換地使用，且定義為刺激免疫系統之一或多種物質。在此情形下，佐劑係用於增強針對本申請案之HBV抗原及抗原性HBV多肽之免疫反應。

根據本申請案之實施例，佐劑可以存在於本申請案之醫藥組合物或組合物中，或以獨立組合物形式投與。佐劑可以為例如小分子或抗體。適用於本申請案之佐劑之實例包括但不限於免疫檢查點抑制劑(例如抗PD1、抗TIM-3等)、鐸樣受體促效劑(例如TLR7促效劑及/或TLR8促效劑)、RIG-1促效劑、IL-15超級促效劑(Altor Bioscience)、突變IRF3及IRF7基因佐劑、STING促效劑(Aduro)、FLT3L基因佐劑、IL12基因佐劑及IL-7-hyFc。佐劑之實例可例如選自在以下中之抗HBV劑：HBV DNA聚合酶抑制劑；免疫調節劑；鐸樣受體7調節劑；鐸樣受體8調節劑；鐸樣受體3調節劑；干擾素α受體配體；玻尿酸酶抑制劑；IL-10調節劑；HBsAg抑制劑；鐸樣受體9調節劑；親環蛋白抑制劑；HBV預防性疫苗；HBV治療性疫苗；HBV病毒進入抑制劑；靶向病毒mRNA之反義寡核苷酸，更特定言之抗HBV反義寡核苷酸；短干擾RNA (siRNA)，更特定言之抗HBV siRNA；核酸內切酶調節劑；核糖核苷酸還原酶抑制劑；B型肝炎病毒E抗原抑制劑；靶向B型肝炎病毒之表面抗原的HBV抗體；HBV抗體；CCR2趨化因子拮抗劑；胸腺素促效劑；細胞介素，諸如IL12；衣殼組裝調節劑、核蛋白抑制劑(HBV核心或衣殼蛋白抑制劑)；核酸聚合物(NAP)；視黃酸誘導性基因1之刺激劑；NOD2刺激劑；重組胸腺素α-1；B型肝炎病毒複製抑制劑；PI3K抑制劑；cccDNA抑制劑；免疫檢查點抑制劑，諸如PD-L1抑制劑、PD-1抑制劑、TIM-3抑制劑、TIGIT抑制劑、Lag3抑制劑及CTLA-4抑制劑；在免疫細胞(更特定言之T細胞)上表現之共刺激受體，諸如CD27、CD28等的促效劑；BTK抑制劑；用於治療HBV之其他藥物；IDO抑制劑；精胺酸酶抑制劑；以及KDM5抑制劑。

本申請案之組合物及醫藥組合物亦可與至少一種其他抗HBV劑組合投與。適合用於本申請案的抗HBV劑之實例包括但不限於小分子、抗體，及/或結合HBV env之CAR-T療法(S-CAR細胞)、衣殼組裝調節劑、TLR促效劑(例如TLR7及/或TLR8促效劑)、cccDNA抑制劑、HBV聚合酶抑制劑(例如恩替卡韋及替諾福韋)及/或免疫檢查點抑制劑等。

至少一種抗HBV劑可例如選自以下中：HBV DNA聚合酶抑制劑；免疫調節劑；鐸樣受體7調節劑；鐸樣受體8調節劑；鐸樣受體3調節劑；干擾素α受體配體；玻尿酸酶抑制劑；IL-10調節劑；HBsAg抑制劑；鐸樣受體9調節劑；親環蛋白抑制劑；HBV預防性疫苗；HBV治療性疫苗；HBV病毒進入抑制劑；靶向病毒mRNA之反義寡核苷酸，更特定言之抗HBV反義寡核苷酸；短干擾RNA (siRNA)，更特定言之抗HBV siRNA；核酸內切酶調節劑；核糖核苷酸還原酶抑制劑；B型肝炎病毒E抗原抑制劑；靶向B型肝炎病毒之表面抗原的HBV抗體；HBV抗體；CCR2趨化因子拮抗劑；胸腺素促效劑；細胞介素，諸如IL12；衣殼組裝調節劑、核蛋白抑制劑(HBV核心或衣殼蛋白抑制劑)；核酸聚合物(NAP)；視黃酸誘導性基因1之刺激劑；NOD2刺激劑；重組胸腺素α-1；B型肝炎病毒複製抑制劑；PI3K抑制劑；cccDNA抑制劑；免疫檢查點抑制劑，諸如PD-L1抑制劑、PD-1抑制劑、TIM-3抑制劑、TIGIT抑制劑、Lag3抑制劑及CTLA-4抑制劑；在免疫細胞(更特定言之T細胞)上表現之共刺激受體，諸如CD27、CD28等的促效劑；BTK抑制劑；用於治療HBV之其他藥物；IDO抑制劑；精胺酸酶抑制劑；以及KDM5抑制劑。此類抗HBV劑可以與本申請案之組合物及醫藥組合物同時或依序投與。

初打 / 加打免疫接種方法

本申請案之實施例亦涵蓋在所謂的初打-加打方案中，向個體投與免疫原性有效量之組合物或治療組合，且隨後向該個體投與另一劑量之免疫原性有效量之組合物或治療組合。因此，在一個實施例中，本申請案之組合物或治療組合係用於引發免疫反應之初打疫苗。在另一個實施例中，本申請案之組合物或治療組合係用於增強免疫反應之加打疫苗。本申請案之初打及加打疫苗可以用於本文所描述的本申請案之方法中。此初打-加打方案之一般概念係熟習疫苗領域之技術者熟知的。本文所描述之本申請案之組合物及治療組合中之任一種可以用作初打及/或加打疫苗以引發及/或增強針對HBV之免疫反應。

在本申請案之一些實施例中，本申請案之組合物或治療組合可以投與用於初打免疫接種。組合物或治療組合可以再投與用於加打免疫接種。視需要，該組合物或疫苗組合之進一步加打投與可以視情況添加至該方案中。佐劑可以存在於用於加打免疫接種的本申請案之組合物中，存在於欲投與本申請案之組合物或治療組合一起投與以用於加打免疫接種的獨立組合物中，或獨自投與作為加打免疫接種。在該方案中包括佐劑的該等實施例中，佐劑較佳用於加打免疫接種。

初打-加打方案之說明性且非限制性實例包括向個體投與單次劑量的免疫原性有效量之本申請案之組合物或治療組合以引發免疫反應；且隨後投與另一劑量之免疫原性有效量的本申請案之組合物或治療組合以增強免疫反應，其中該加打免疫接種首次係在初始投與初打免疫接種之後約兩至六週，較佳四週投與。視情況，在初始投與初打免疫接種之後約10至14週，較佳12週，投與組合物或治療組合或其他佐劑之其他加打免疫接種。

套組

本文亦提供一種套組，其包含本申請案之治療組合。套組可包含一或多種獨立組合物中之第一聚核苷酸、第二聚核苷酸及脂質奈米顆粒及/或脂質體載體，或套組可包含單一組合物中之第一聚核苷酸、第二聚核苷酸及脂質奈米顆粒及/或脂質體載體。套組可以進一步包含一或多種佐劑或免疫刺激劑，及/或其他抗HBV劑。

在投與動物或人類生物體中時誘發或刺激抗HBV免疫反應的能力可以使用此項技術中之多種標準分析法在活體外或活體內評價。有關可用於評價免疫反應之起始及活化之技術的大體描述，參見例如Coligan等人(1992年及1994年, Current Protocols in Immunology; ed. J Wiley & Sons Inc, National Institute of Health)。細胞免疫之量測可藉由量測由活化之效應細胞，包括源於CD4+及CD8+ T細胞之該等細胞所分泌之細胞介素曲線(例如藉由ELISPOT定量產生IL-10或IFN γ之細胞)、藉由確定免疫效應細胞之活化狀態(例如藉由經典的[3H]胸苷吸收或基於流式細胞測量術進行之T細胞增殖分析)、藉由分析致敏個體中之抗原特異性T淋巴細胞(例如細胞毒性分析中之肽特異性溶解等)進行。

刺激細胞及/或體液反應之能力可藉由抗體結合及/或結合之競爭測定(參見例如Harlow, 1989, Antibodies, Cold Spring Harbor Press)。舉例而言，可以藉由酶聯結免疫吸附分析法(ELISA)量測響應於提供免疫原之組合物之投與而產生之抗體的力價。亦可藉由中和抗體分析法量測免疫反應，其中病毒之中和定義為經由特異性抗體對該病毒之反應/抑制/中和引起之感染性損失。免疫反應亦可藉由抗體依賴性細胞吞噬作用(ADCP)分析法量測。

實施例 本發明亦提供以下非限制性實施例。

實施例1為一種用於治療有需要之個體之B型肝炎病毒(HBV)感染之醫藥組合物，其包含： i)以下中之至少一者： a)     包含編碼截短HBV核心抗原之第一聚核苷酸序列的第一非天然存在之核酸分子，該截短HBV核心抗原由與SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4至少95%，諸如至少95%、96%、97%、98%、99%或100%一致的胺基酸序列組成；及 b)     包含編碼HBV聚合酶抗原之第二聚核苷酸序列的第二非天然存在之核酸分子，該HBV聚合酶抗原具有與SEQ ID NO:7至少90%，諸如至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致的胺基酸序列；及 ii)陽離子脂質；及 iii)選自由以下組成之群的至少一者：陰離子脂質、兩性離子脂質、中性脂質、類固醇、聚合物結合脂質、磷脂、糖脂及其組合。

實施例2為一種用於治療有需要之個體之B型肝炎病毒(HBV)感染之醫藥組合物，其包含： i) 以下中之至少一者： a. 第一非天然存在之核酸分子，其包含編碼截短HBV核心抗原之第一聚核苷酸序列，該截短HBV核心抗原由與SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4至少95%一致之胺基酸序列組成；及 b. 第二非天然存在之核酸分子，其包含編碼HBV聚合酶抗原之第二聚核苷酸序列，該HBV聚合酶抗原具有與SEQ ID NO:7至少90%一致之胺基酸序列，其中該HBV聚合酶抗原不具有逆轉錄酶活性及核糖核酸酶H活性；及 ii)        陽離子脂質；及 iii)      結合脂質； 視情況，醫藥組合物進一步包含選自由以下組成之群的至少一者：陰離子脂質、兩性離子脂質、中性脂質、類固醇、磷脂、糖脂及其組合。

實施例3為如實施例1或2之醫藥組合物，其中該醫藥組合物包含一或多種中性脂質，其選自DSPC、DPPC、DMPC、DOPC、POPC、DOPE及SM，較佳DSPC。

實施例3a為如實施例1至3中任一項之醫藥組合物，其中該醫藥組合物包含類固醇，較佳該類固醇為膽固醇。

實施例3b為如實施例1至3a中任一項之醫藥組合物，其中結合脂質為藉由聚乙二醇共價修飾之脂質(聚乙二醇化脂質)，較佳地，聚乙二醇化脂質為PEG-DAG、PEG-PE、PEG-S-DAG、PEG-cer或PEG二烷基氧基丙基胺基甲酸酯。

實施例3c為如實施例1至3b中任一項之醫藥組合物，其中該陽離子脂質係選自由以下組成之群的化合物：式(I)至式(VIII)，或其醫藥學上可接受之鹽、前藥或立體異構體。

實施例3d為描述於以下中之例示性陽離子脂質中之任一者的醫藥組合物：US2017/0190661、US2006/0008910、US2015/0064242、US2005/0064595、WO/2019/036030、US2019/0022247、WO/2019/036028、WO/2019/036008、WO/2019/036000、US2016/0376224、US2017/0119904、WO/2018/200943、WO/2018/191657、WO/2018/118102、US20180169268、WO2018118102、WO2018119163、US2014/0255472及US2013/0195968，其各者以全文引用的方式併入本文中。

實施例4為如實施例1-3d中任一項之醫藥組合物，其中該第一非天然存在之核酸分子進一步包含編碼可操作地連接至該截短HBV核心抗原之N端的信號序列的聚核苷酸序列。

實施例4a為如實施例1-3d中任一項之醫藥組合物，其中該第二非天然存在之核酸分子進一步包含編碼可操作地連接至該HBV聚合酶抗原之N端的信號序列的聚核苷酸序列。

實施例4b為如實施例4或4a之醫藥組合物，其中該信號序列獨立地包含SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:15之胺基酸序列。

實施例4c為如實施例4或4a之醫藥組合物，其中該信號序列獨立地由SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:14之聚核苷酸序列編碼。

實施例5為如實施例1-4c中任一項之醫藥組合物，其中該HBV聚合酶抗原包含與SEQ ID NO:7至少98%，諸如至少98%、98.5%、99%、99.1%、99.2%、99.3%、99.4%、99.5%、99.6%、99.7%、99.8%、99.9%或100%一致之胺基酸序列。

實施例5a為如實施例5之醫藥組合物，其中該HBV聚合酶抗原包含SEQ ID NO:7之胺基酸序列。

實施例5b為如實施例1至5a中任一項之醫藥組合物，其中且截短HBV核心抗原由與SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4至少98%，諸如至少98%、98.5%、99%、99.1%、99.2%、99.3%、99.4%、99.5%、99.6%、99.7%、99.8%、99.9%或100%一致之胺基酸序列組成。

實施例5c為如實施例5b之醫藥組合物，其中該截短之HBV抗原由SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4之胺基酸序列組成。

實施例6為如實施例1-5c中任一項之醫藥組合物，其中該第一及第二非天然存在之核酸分子中之各者為DNA分子。

實施例6a為如實施例6之醫藥組合物，其中DNA分子存在於DNA載體上。

實施例6b為如實施例6a之醫藥組合物，其中該DNA載體係選自由DNA質體、細菌人工染色體、酵母人工染色體及封閉線性去氧核糖核酸組成之群。

實施例6c為如實施例1-5c中任一項之醫藥組合物，其中該第一及第二非天然存在之核酸分子中之各者為DNA分子。

實施例6d為如實施例6c之醫藥組合物，其中RNA分子為RNA複製子，較佳自我複製RNA複製子、mRNA複製子、經修飾之mRNA複製子或自我擴增mRNA。

實施例6e為如實施例1至6d中任一項之醫藥組合物，其中第一及第二非天然存在之核酸分子中之各者獨立地與脂質組合物，較佳脂質奈米顆粒(LNP)調配。

實施例7為如實施例1-6e中任一項之醫藥組合物，其包含相同非天然存在之核酸分子中的第一非天然存在之核酸分子及第二非天然存在之核酸分子。

實施例8為如實施例1-6e中任一項之醫藥組合物，其包含兩種不同非天然存在之核酸分子中的第一非天然存在之核酸分子及第二非天然存在之核酸分子。

實施例9為如實施例1-8中任一項之醫藥組合物，其中該第一聚核苷酸序列包含與SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:3具有至少90%、諸如至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性之聚核苷酸序列。

實施例9a為如實施例9之醫藥組合物，其中該第一聚核苷酸序列包含與SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:3具有至少98%，諸如至少98%、98.5%、99%、99.1%、99.2%、99.3%、99.4%、99.5%、99.6%、99.7%、99.8%、99.9%或100%序列一致性之聚核苷酸序列。

實施例10為如實施例9a之醫藥組合物，其中該第一聚核苷酸序列包含SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:3之聚核苷酸序列。

實施例11為如實施例1-10中任一項之醫藥組合物，其中該第二聚核苷酸序列包含與SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:6具有至少90%，諸如至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性之聚核苷酸序列。

實施例11a為如實施例11之醫藥組合物，其中該第二聚核苷酸序列包含與SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:6具有至少98%，諸如至少98%、98.5%、99%、99.1%、99.2%、99.3%、99.4%、99.5%、99.6%、99.7%、99.8%、99.9%或100%序列一致性之聚核苷酸序列。

實施例12為如實施例11a之醫藥組合物，其中該第二聚核苷酸序列包含SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:6之聚核苷酸序列。

實施例13為如實施例1-12中任一項之醫藥組合物，其中該第一及第二非天然存在之核酸分子中之至少一者囊封於脂質奈米顆粒中。

實施例14為如實施例2-12中任一項之醫藥組合物，其中第一及第二非天然存在之核酸分子中之至少一者囊封於脂質顆粒中，該脂質顆粒包含：(a)含有核酸分子、陽離子脂質及視情況存在之第二脂質的實質上實心核心；及(b)包圍該核心之聚乙二醇化脂質。

實施例15為如實施例2-12中任一項之醫藥組合物，其中第一及第二非天然存在之核酸分子中之至少一者囊封於脂質體中，該脂質體包含：(a)含有核酸分子之水性核心，(b)包含陽離子脂質及視情況存在之第二脂質的脂質層；及(c)在脂質體之外表面上聚乙二醇化脂質。

實施例15a為如實施例1至15中任一項之醫藥組合物，其中該第一及第二非天然存在之核酸分子為RNA。

實施例15b為如實施例1至15中任一項之組合物，其中該第一及第二非天然存在之核酸分子為自我複製RNA分子。

實施例15c為如實施例1至15中任一項之組合物，其中該第一及第二非天然存在之核酸分子為DNA。

實施例15d為如實施例1至15中任一項之組合物，其中該第一及第二非天然存在之核酸分子係存在於一或多個DNA質體或一或多個線性閉合型小型DNA分子上。

實施例16為一種套組，其包含如實施例1至15d中任一項之醫藥組合物及在有需要之個體中使用該醫藥組合物治療B型肝炎病毒(HBV)感染之說明書。

實施例17為一種治療有需要之個體之B型肝炎病毒(HBV)感染之方法，其包含向該個體投與如實施例1至15d中任一項之醫藥組合物。

實施例17a為如實施例17之方法，其中治療誘發有需要之個體中針對B型肝炎病毒之免疫反應，較佳該個體患有慢性HBV感染。

實施例17b為如實施例17或17a之方法，其中該個體患有慢性HBV感染。

實施例17c為如實施例17-17b中任一項之方法，其中該個體需要治療選自由晚期纖維化、肝硬化及肝細胞癌(HCC)組成之群的HBV誘發之疾病。

實施例18為如實施例17-17c中任一項之方法，其中該醫藥組合物係藉由注射經由皮膚投與，例如肌肉內或皮內注射，較佳肌肉內注射。

實施例19為如實施例18之方法，其中該醫藥組合物包含第一及第二非天然存在之核酸分子中之至少一者。

實施例19a為如實施例19之方法，其中該醫藥組合物包含第一及第二非天然存在之核酸分子。

實施例20為如實施例19或19a之方法，其中非天然存在之核酸分子係以脂質組合物形式，較佳以脂質奈米顆粒形式向該個體投與。

實例 熟習此項技術者應瞭解，在不脫離本發明之較寬廣發明理念之情況下，可對上述具體實例作出改變。因此，應理解，本發明不限於所揭示之特定實施例，而是意圖涵蓋在本發明說明所限定的本發明精神及範圍內之修改。

實例 1. HBV 核心質體及 HBV pol 質體 pDK-pol及pDK-核心載體之示意性表示分別展示於圖1A及1B中。使用標準分子生物學技術將含有CMV啟動子(SEQ ID NO:18)、剪接強化子(參複合序列) (SEQ ID NO:10)、胱抑素S前驅體信號肽SPCS(NP_0018901.1) (SEQ ID NO:8)及pol(SEQ ID NO:5)或核心(SEQ ID NO:1)基因之編碼序列的HBV核心或pol抗原最佳化之表現卡匣引入至pDK質體主鏈中。

藉由西方墨點分析，使用核心及pol特異性抗體，針對核心及pol抗原表現在活體外測試該等質體，且顯示其以提供針對細胞及所分泌之核心及pol抗原的一致表現圖譜(資料未顯示)。

實例 2 ： 表現截短 HBV 核心抗原與 HBV Pol 抗原之融合物的腺病毒載體之產生 產生一種經設計為自單一開放閱讀框架表現融合蛋白的腺病毒載體。亦可設想例如使用兩個獨立表現卡匣，或使用2A樣序列分開兩個序列以表現兩種蛋白質之其他組態。

有關腺病毒載體之表現卡匣的設計 表現卡匣(圖解於圖2A及圖2B中)包含CMV啟動子(SEQ ID NO:19)、內含子(SEQ ID NO:12)(源於人類ApoAI基因之片段-Genbank寄存號X01038鹼基對295-523，帶有ApoAI第二內含子)，隨後為在人類免疫球蛋白分泌信號編碼序列(SEQ ID NO:14)之後的經優化編碼序列，即單獨核心或核心與聚合酶融合蛋白，且隨後為SV40聚腺苷酸化信號(SEQ ID NO:13)。

包括分泌信號係歸因於過去一些含有分泌型轉殖基因的腺病毒載體顯示可製造性之改良，同時不影響所引發之T細胞反應的經驗(小鼠實驗)。

核心蛋白的最後兩個殘基(VV)及聚合酶蛋白質之前兩個殘基(MP)若融合，則產生接合序列(VVMP)，其存在於人類多巴胺受體蛋白(D3同功異型物)以及側接同源序列上。

核心與聚合酶序列之間AGAG連接子之插入消除此同源序列且恢復成在人類蛋白質組之Blast中無其他匹配(hit)。

實例 3. 小鼠中之 DNA 疫苗之活體內免疫原性研究 在小鼠中測試含有編碼HBV核心抗原或HBV聚合酶抗原之DNA質體的免疫治療性DNA疫苗。本研究之目的係設計用於偵測該疫苗在經由電穿孔肌肉內遞送至BALB/c小鼠中之後誘發的T細胞反應。初始免疫原性研究集中在確定由引入之HBV抗原引發的細胞免疫反應。

詳言之，測試質體包括pDK-Pol質體及pDK-核心質體，分別如圖1A及圖1B中所示且如上文在實例1中所描述。pDK-Pol質體編碼具有SEQ ID NO:7之胺基酸序列的聚合酶抗原，且pDK-核心質體編碼具有SEQ ID NO:2之胺基酸序列的核心抗原。首先，個別地測試由各質體誘發之T細胞反應。使用適合用於小鼠模型中之脛前肌中的可商購之 TriGrid^TM 遞送系統-肌肉內(TDS-IM)，將DNA質體(pDNA)疫苗經由電穿孔肌肉內遞送至Balb/c小鼠中。有關藉由電穿孔將DNA肌肉內遞送至小鼠之方法及裝置的其他描述，參見國際專利申請公開案WO2017172838，及2017年12月19日申請之標題為「用於遞送B型肝炎病毒(HBV)疫苗之方法及裝置(Method and Apparatus for the Delivery of Hepatitis B Virus(HBV)Vaccines)」的美國專利申請案第62/607,430號，其揭示內容以全文引用的方式併入本文中。詳言之，將具有電極之間之間距為2.5 mm及電極直徑為0.030吋之電極陣列的TDS-IM v1.0裝置之TDS-IM陣列經皮插入選定之肌肉中，其中導電長度為3.2 mm及有效穿透深度為3.2 mm，且其中電極之菱形組態的長軸平行於肌纖維取向。在電極插入之後，起始注射以將DNA(例如0.020 ml)分配於肌肉中。在完成IM注射之後，在約400 ms之總持續時間內，以10%工作循環(亦即，在約400 ms持續時間內，有效地施加電壓總計約40 ms)局部施加250 V/cm電場(施加之電壓為59.4-65.6 V，施加電流之限值小於4 A，0/16 A/sec)，總計6次脈衝。在完成電穿孔程序之後，移除TriGridTM陣列且使動物恢復。如表1中所概述，向BALB/c小鼠投與高劑量(20 µg)。向六隻小鼠投與編碼HBV核心抗原之質體DNA(pDK-核心；第1組)，向六隻小鼠投與編碼HBV Pol抗原之質體DNA(pDK-pol；第2組)，且兩隻小鼠接受空載體作為陰性對照。動物間隔兩週接受兩次DNA免疫接種且在最後一次免疫接種之後一週收集脾細胞。表 1 ： 預備試驗之小鼠免疫接種實驗設計 .

組	N	pDNA	單側投與部位 ( 每側 交替投與 )	劑量	體積	投與天數	終點 ( 收集脾 ) 日
1	6	核心	CT + EP	20 µg	20 µL	0, 14	21
2	6	Pol	CT + EP	20 µg	20 µL	0, 14	21
3	2	空載體(陰性對照)	CT + EP	20 µg	20 µL	0, 14	21

CT，脛前肌；EP，電穿孔。

藉由IFN-γ酶聯免疫斑點(ELISPOT)分析及定量抗原特異性反應。在此分析法中，將自經免疫接種之動物分離的脾細胞與包含核心蛋白、Pol蛋白質或小肽前導序列及接合序列(每種肽2 μg/ml)的肽池一起培育隔夜。該等池由重疊11個殘基之15聚體肽組成，該等殘基匹配核心及Pol疫苗載體之基因型BCD共同序列。將較大的94 kDa HBV Pol蛋白質自中間分裂至兩個肽池中。用同源肽池刺激抗原特異性T細胞且使用ELISPOT分析法評估IFN-γ陽性T細胞。利用適當抗體且隨後顯色偵測來觀測在微量盤上呈有色斑點(稱為斑點形成細胞(SFC))形式的單一抗原特異性T細胞釋放之IFN-γ。

在用DNA疫苗質體pDK-核心(第1組)免疫接種之小鼠中獲得針對HBV核心之顯著T細胞反應，達到每10⁶ 個細胞1,000個SFC(圖3)。針對Pol 1肽池的Pol T細胞反應較強(每10⁶ 個細胞約1,000個SFC)。針對Pol-2之抗Pol細胞反應較弱可能歸因於小鼠中有限之MHC多樣性，此現象稱為T細胞免疫顯性，定義為一種抗原中之不同抗原決定基的不等識別。進行確證研究以確證本研究中獲得的結果(資料未顯示)。

以上結果展示，用編碼HBV抗原之DNA質體疫苗進行疫苗接種誘發針對在小鼠中投與之HBV抗原的細胞免疫反應。亦用非人類靈長類動物獲得類似結果(資料未展示)。

應理解，本文所描述之實例及實施例僅出於說明之目的，且在不背離其廣義發明概念情況下，可以對以上描述之實施例作出改變。因此，應理解，本發明不限於所揭示之特定實施例，而是意圖涵蓋在所附申請專利範圍所限定之本發明精神及範圍內之修改。

當結合隨附圖式閱讀時，將更好地理解本申請案之前述發明內容以及較佳實施例之以下詳細描述。然而應理解，本申請案不限於附圖中顯示之精確實施例。

圖 1A 及圖 1B 顯示根據本申請案之實施例的DNA質體之示意性表示；圖 1A 顯示根據本申請案之實施例之編碼HBV核心抗原之DNA質體；圖 1B 顯示根據本申請案之實施例之編碼HBV聚合酶(pol)抗原之DNA質體；HBV核心及pol抗原係在CMV啟動子之控制下表現，該CMV啟動子具有在自細胞分泌後自所表現之抗原裂解的N端胱抑素S信號肽；該質體之轉錄調控元件包括位於CMV啟動子與編碼HBV抗原之聚核苷酸序列之間的強化子序列及位於編碼HBV抗原之聚核苷酸序列下游的bGH聚腺苷酸化序列；以反向取向包括於該質體中之第二表現卡匣，該之體包括處於Ampr(bla)啟動子控制下之卡那黴素抗性基因；亦包括反向取向之複製起點(pUC)。

圖 2A 及圖 2B 顯示根據本申請案之實施例的腺病毒載體中之表現卡匣之示意性表示；圖 2A 顯示截短HBV核心抗原的表現卡匣，其含有CMV啟動子、內含子(源於人類ApoAI基因之片段-GenBank寄存編號X01038鹼基對295-523，帶有ApoAI第二內含子)、人類免疫球蛋白分泌信號，隨後為截短HBV核心抗原的編碼序列及SV40聚腺苷酸化信號；圖 2B 顯示將截短HBV核心抗原可操作地連接至HBV聚合酶抗原之融合蛋白的表現卡匣，除HBV抗原外，其在其他方面與截短HBV核心抗原之表現卡匣一致。

圖 3 顯示如實例3中所述，用表現HBV核心抗原或HBV pol抗原之不同DNA質體免疫接種之Balb/c小鼠的ELISPOT反應；用於刺激自各種經疫苗接種動物組分離之脾細胞的肽池以灰度階指示；反應性T細胞之數目在Y軸上表示為每10⁶ 個脾細胞之斑點形成細胞(SFC)。

Claims (18)

1. 一種用於治療有需要個體中B型肝炎病毒(hepatitis B virus；HBV)感染之醫藥組合物，其包含： i) 以下中之至少一者： a) 第一非天然存在之核酸分子，其包含編碼截短HBV核心抗原之第一聚核苷酸序列，該截短HBV核心抗原由與SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4至少95%一致之胺基酸序列組成；及 b) 第二非天然存在之核酸分子，其包含編碼HBV聚合酶抗原之第二聚核苷酸序列，該HBV聚合酶抗原具有與SEQ ID NO:7至少90%一致之胺基酸序列，其中該HBV聚合酶抗原不具有逆轉錄酶活性及核糖核酸酶H活性；及 ii) 陽離子脂質，較佳地，該陽離子脂質係選自由以下組成之群： (1) 式(I)之化合物：

   

   式(I) 其中R₁ 為由10至31個碳組成之經取代之烷基，R₂ 為由2至20個碳組成之直鏈烷基、烯基或炔基，R₃ 為由1至6個碳組成之直鏈或分支鏈烷烴，R₄ 與R₅ 相同或不同，各自為氫或由1至6個碳組成之直鏈或分支鏈烷基； L₁ 與L₂ 相同或不同，各自為具有1至20個碳之直鏈烷烴或具有2至20個碳之直鏈烯烴，且X₁ 為S或O；或其鹽或溶劑合物； (2) 式(II)之化合物：

   

   式(II) 其中R₁ 為具有8、9、10、11、12、13、14、16、17、18、19、20、21或22個碳之分支鏈、非環狀烷基或烯基；L₁ 為具有1至15個碳之直鏈烷烴；R₂ 為具有5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15個碳之直鏈烷基或烯基，或具有8、9、10、11、12、13、14、16、17、18、19、20、21或22個碳之分支鏈、非環狀烷基或烯基； L₂ 為具有4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15個碳之直鏈烷烴；X為O或S；R₃ 為具有1、2、3、4、5或6個碳之直鏈烷烴；且R₄ 與R₅ 相同或不同，各自為具有1、2、3、4、5或6個碳之直鏈或分支鏈非環狀烷基；或其醫藥學上可接受之鹽或溶劑合物； (3) 式(III)、(IV)或(V)之化合物：

   

   其中R包含生物活性分子，且L₁ 、L₂ 及L₃ 在每次出現時獨立地包含選自由以下組成之群的配位體：碳水化合物、多肽或親脂基；其醫藥學上可接受之鹽；或其醫藥組合物； (4) 式(VI)之化合物：

   

   式(VI) 其中X為直鏈或分支鏈伸烷基或伸烯基、單環、雙環或三環芳烴或雜芳烴；Y為鍵、乙烯或未經取代或經取代之芳族或雜芳族環；Z為S或O；L為具有1至6個碳之直鏈或分支鏈伸烷基；R₃ 及R₄ 獨立地為具有1至6個碳之直鏈或分支鏈烷基；R₁ 及R₂ 獨立地為具有1至20個碳之直鏈或分支鏈烷基或烯基；r為0至6；且m、n、p及q獨立地為1至18；其中當n=q，m=p且R₁ =R₂ 時，則X及Y不同；其中當X=Y，n=q，m=p時，則R₁ 及R₂ 不同；其中當X=Y，n=q，且R₁ =R₂ 時，則m及p不同；且其中當X=Y，m=p，且R₁ =R₂ 時，則n及q不同；或其醫藥學上可接受之鹽； (5)式(VII)之化合物：

   

   式(VII) 其中：G¹ 或G² 中之一者在每次出現時為-O(C═O)-、-(C═O)O-、-C(═O)-、-O-、-S(O)_y −、-S-S-、-C(═O)S-、SC(═O)-、-N(R^a ) C(═O)-、-C(═O)N(R^a )-、-N(R^a )C(═O)N(R^a )-、-OC(═O)N(R^a )-或-N(R^a )C(═O)O-，且G¹ 或G² 中之另一者在每次出現時為-O(C═O)-、-(C═O)O-、-C(═O)-、-O-、-S(O)_y −、-S-S'、-C(═O)S-、-SC(═O)-、-N(R^a )C(═O)-、-C(═O)N(R^a )-、-N(R^a )C(═O)N(R^a )-、-OC(═O)N(R^a )-或-N(R^a )C(═O)O-或直接鍵；L在每次出現時為˜O(C═O)-，其中˜表示至X之共價鍵；X為CR^a ；當n為1時，Z為烷基、環烷基或包含至少一種極性官能基之單價部分；或當n大於1時，Z為伸烷基、伸環烷基或包含至少一種極性官能基之多價部分；R^a 在每次出現時獨立地為H、C₁ -C₁₂ 烷基、C₁ -C₁₂ 羥基烷基、C₁ -C₁₂ 胺基烷基、C₁ -C₁₂ 烷基胺基烷基、C₁ -C₁₂ 烷氧基烷基、C₁ -C₁₂ 烷氧基羰基、C₁ -C₁₂ 烷基羰氧基、C₁ -C₁₂ 烷基羰氧基烷基或C₁ -C₁₂ 烷基羰基； R在每次出現時獨立地為：(a) H或C₁ -C₁₂ 烷基；或(b)R連同與其結合之碳原子一起，與相鄰之R及與其結合之碳原子一起形成碳-碳雙鍵；R¹ 及R² 在每次出現時分別具有以下結構：

   

   ； a¹ 及a² 在每次出現時獨立地為3至12之整數；b¹ 及b² 在每次出現時獨立地為0或1；c¹ 及c² 在每次出現時獨立地為5至10之整數；d¹ 及d² 在每次出現時獨立地為5至10之整數；y在每次出現時獨立地為0至2之整數；且n為1至6之整數，其中各烷基、伸烷基、羥基烷基、胺基烷基、烷基胺基烷基、烷氧基烷基、烷氧基羰基、烷基羰氧基、烷基羰氧基烷基及烷基羰基視情況經一或多個取代基取代；及 (6) 式(VIII)之化合物：

   

   式(VIII) 其中：G¹ 或G² 中之一者在每次出現時為-O(C═O)-、-(C═O)O-、-C(═O)-、-O-、-S(O)_y −、-S-S-、-C(═O)S-、SC(═O)-、-N(R^a ) C(═O)-、-C(═O)N(R^a )-、-N(R^a )C(═O)N(R^a )-、-OC(═O)N(R^a )-或-N(R^a )C(═O)O-，且G¹ 或G² 中之另一者在每次出現時為-O(C═O)-、-(C═O)O-、-C(═O)-、-O-、-S(O)_y −、-S-S-、-C(═O)S-、-SC(═O)-、-N(R^a )C(═O)-、-C(═O)N(R^a )-、-N(R^a )C(═O)N(R^a )-、-OC(═O)N(R^a )-或-N(R^a )C(═O)O-或直接鍵；L在每次出現時為˜O(C═O)-，其中˜表示至X之共價鍵；X為CR^a ；當n為1時，Z為烷基、環烷基或包含至少一種極性官能基之單價部分；或當n大於1時，Z為伸烷基、伸環烷基或包含至少一種極性官能基之多價部分；R^a 在每次出現時獨立地為H、C₁ -C₁₂ 烷基、C₁ -C₁₂ 羥基烷基、C₁ -C₁₂ 胺基烷基、C₁ -C₁₂ 烷基胺基烷基、C₁ -C₁₂ 烷氧基烷基、C₁ -C₁₂ 烷氧基羰基、C₁ -C₁₂ 烷基羰氧基、C₁ -C₁₂ 烷基羰氧基烷基或C₁ -C₁₂ 烷基羰基； R在每次出現時獨立地為：(a) H或C₁ -C₁₂ 烷基；或(b)R連同與其結合之碳原子一起，與相鄰之R及與其結合之碳原子一起形成碳-碳雙鍵；R¹ 及R² 在每次出現時分別具有以下結構：

   

   ； R'在每次出現時獨立地為H或C₁ -C₁₂ 烷基；a¹ 及a² 在每次出現時獨立地為3至12之整數；b¹ 及b² 在每次出現時獨立地為0或1；c¹ 及c² 在每次出現時獨立地為2至12之整數；d¹ 及d² 在每次出現時獨立地為2至12之整數；y在每次出現時獨立地為0至2之整數；且n為1至6之整數，其中a¹ 、a² 、c¹ 、c² 、d¹ 及d² 經選擇以使得a¹ +c¹ +d¹ 之總和為18至30之整數，且a² +c² +d² 之總和為18至30之整數，且其中各烷基、伸烷基、羥基烷基、胺基烷基、烷基胺基烷基、烷氧基烷基、烷氧基羰基、烷基羰氧基、烷基羰氧基烷基及烷基羰基視情況經一或多個取代基取代， 或其醫藥學上可接受之鹽、前藥或立體異構體。
2. 如請求項1之醫藥組合物，其中該陽離子脂質係選自以下中所述之陽離子脂質：US2017/0190661、US2006/0008910、US2015/0064242、US2005/0064595、WO/2019/036030、US2019/0022247、WO/2019/036028、WO/2019/036008、WO/2019/036000、US2016/0376224、US2017/0119904、WO/2018/200943、WO/2018/191657、WO/2018/118102、US20180169268、WO2018118102、WO2018119163、US2014/0255472及US2013/0195968，其各自之相關內容以全文引用之方式併入本文中。
3. 如請求項1之醫藥組合物，其進一步包含選自由以下組成之群的至少一者：陰離子脂質、兩性離子脂質、中性脂質、類固醇、聚合物結合脂質、磷脂、糖脂及其組合。
4. 如請求項3之醫藥組合物，其進一步包含聚合物結合脂質，較佳該聚合物結合脂質為藉由聚乙二醇共價修飾之脂質(聚乙二醇化脂質)。
5. 如請求項1至4中任一項之醫藥組合物，其包含以下中之至少一者： i) 該第一非天然存在之核酸分子；及 ii) 該第二非天然存在之核酸分子； 其中該第一及第二非天然存在之核酸分子中之至少一者囊封於包含該陽離子脂質之脂質顆粒中。
6. 如請求項5之醫藥組合物，其中該第一及第二非天然存在之核酸分子中之至少一者囊封於脂質奈米顆粒中，該脂質奈米顆粒包含：(a)含有該等核酸分子、該陽離子脂質及視情況存在之第二脂質的實質上實心核心；及(b)圍繞該核心之該聚乙二醇化脂質。
7. 如請求項5之醫藥組合物，其中該第一及第二非天然存在之核酸分子中之至少一者囊封於脂質奈米顆粒或脂質體中，該脂質體包含：(a)含有該等核酸分子之水性核心，(b)包含該陽離子脂質及視情況存在之第二脂質的脂質層；及(c)在該脂質奈米顆粒或脂質體之外表面上的聚乙二醇化脂質。
8. 如請求項1至4中任一項之醫藥組合物，其中該第一非天然存在之核酸分子進一步包含編碼可操作地連接至該截短HBV核心抗原之N端的信號序列的聚核苷酸序列，且該第二非天然存在之核酸分子進一步包含編碼可操作地連接至該HBV聚合酶抗原之N端的信號序列的聚核苷酸序列，較佳地，該信號序列獨立地包含SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:15之胺基酸序列，較佳該信號序列獨立地由SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:14之聚核苷酸序列編碼。
9. 如請求項1至4中任一項之醫藥組合物，其中 a) 該截短HBV核心抗原由SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4之胺基酸序列組成；且 b) 該HBV聚合酶抗原包含SEQ ID NO:7之胺基酸序列。
10. 如請求項1至4中任一項之醫藥組合物，其中該第一及第二非天然存在之核酸分子中之各者為DNA分子，較佳該DNA分子係存在於質體上。
11. 如請求項1至4中任一項之醫藥組合物，其包含在相同非天然存在之核酸分子中之該第一非天然存在之核酸分子及該第二非天然存在之核酸分子。
12. 如請求項1至4中任一項之醫藥組合物，其包含在兩種不同的非天然存在之核酸分子中之該第一非天然存在之核酸分子及該第二非天然存在之核酸分子。
13. 如請求項1至4中任一項之醫藥組合物，其中該第一聚核苷酸序列包含與SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:3具有至少90%序列一致性之聚核苷酸序列。
14. 如請求項13之醫藥組合物，其中該第一聚核苷酸序列包含SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:3之聚核苷酸序列。
15. 如請求項1至4中任一項之醫藥組合物，其中該第二聚核苷酸序列包含與SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:6具有至少90%序列一致性之聚核苷酸序列。
16. 如請求項15之醫藥組合物，其中該第二聚核苷酸序列包含SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:6之聚核苷酸序列。
17. 一種套組，其包含如請求項1至16中任一項之醫藥組合物及使用該醫藥組合物治療有需要個體中B型肝炎病毒(HBV)感染之說明書。
18. 一種如請求項1至16中任一項之醫藥組合物之用途，其用於製造用以治療有需要個體中B型肝炎病毒(HBV)感染之藥物。

Images