JP2006509026A - 安定化させた免疫原性HBcキメラ粒子 - Google Patents
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Abstract
Description
本出願は、仮特許出願60/432,123号(2002年12月10日出願)の優先権を主張する。本出願は、米国特許出願10/080,299号(2002年2月21日出願)及び同10/082,014号(2002年2月21日出願)の部分継続出願としての米国特許出願10/274,616号(2002年10発21日出願)の部分継続出願である。
本発明は、免疫学及びタンパク質工学の学際的分野に関し、特に肝炎ウイルス(HBV)ヌクレオキャプシドタンパク質(HBc)キメラに関する。前記はワクチンの免疫原として有用であり、C-末端及びN-末端のシステイン残基の一方又は両方、並びにHBcの天然の配列の48位及び107位に存在するシステインの一方又は両方の置換を含む。
哺乳類のB型肝炎ウイルス(HBV又はヘパドナウイルス)のヌクレオキャプシド又はコアは、ウイルスのサブタイプにより183又は185個のアミノ酸残基配列を含むが、一方、アヒルのウイルスキャプシドは262個のアミノ酸残基を含む。いくつかのヘパドナウイルス科のB型肝炎コアタンパク質モノマーは、感染細胞内で自己会合して、B型肝炎コアタンパク質粒子(HBc粒子)として知られる安定な凝集物を形成する。HBc粒子について2つの三次元構造が報告されている。小集団を構成する第一のものは、ダイマーとして90コピーのHBcサブユニットタンパク質、又は180の個々のモノマータンパク質を含み、第二のものは主要集団であり、ダイマーとして120コピーのHBcサブユニットタンパク質、又は240の個々のモノマータンパク質を含む。これらの粒子はそれぞれT=3又はT=4粒子と称され、この場合 “T”は三角形の形成数である。ヒトに感染するウイルス(ヒトウイルス)のこれらHBc粒子は、直径がそれぞれ約30又は34nmである(Pumpens et al. (1995) Intervirology 38:63-74;Metzger et al. (1998) J. Gen. Virol. 79:587-590)。
B型肝炎ヌクレオキャプシド又はウイルスコアタンパク質(HBc)は、免疫された宿主動物のT細胞応答を刺激する免疫原性担体成分として開示された。例えば米国特許4,818,527号、同4,882,145号及び同5,143,726号を参照されたい。この担体の特に有用な応用は、そのイムノドミナントループ部位に外来又は異種B細胞エピトープを提示する能力である。前記ループは約70‐90残基部位に存在し、より一般的には前記タンパク質のアミノ末端(N-末端)から約75から85位であると記載されている(Clarke et al. (1991)F. Brown et al. eds., Vaccines 91, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York, pp. 313-318)。
HBcAgは、異種エピトープの担体であると提唱されているB型肝炎ウイルス由来の粒状タンパク質である。HBsAg(HBs)の相対的免疫原性がHBcAg(HBc)と比較され、種々の遺伝的背景において免疫応答を惹起するそれぞれの能力が比較された(Milich et al. Science 234(4782):1398-1401 (1986))。前記のデータは、HBsよりもHBcの免疫原性が高く、更に遺伝的背景に関係なくHBcに対して普遍的な応答性が存在することを強調した。 例えば、HBcは、BALB/cマウスでHBsよりも300倍高い免疫原性を有し、更に、B10.S及びB10.MはともにHBsに対して無反応マウスであるが、調べた各株がHBcに対して反応する。これらの結果はワクチン担体としてのHBcの適切性、特にHBsよりも優れていることを再確認し、したがって異種エピトープの担体としてHBsではなくHBcを選択することの適切性が更に確認される。
ワクチンの担体成分として応用する場合、HBVヌクレオキャプシドは宿主由来の核酸と結合しないことが好ましい。Birnbaumら(J. Virol. 64:3319-3330 (1990))は、HBVヌクレオキャプシドのプロタミン様C-末端ドメインは、ウイルス様粒子に会合するタンパク質の能力を損なうことなく欠落させることができることを示した。したがって、約144位に短縮されたタンパク質(すなわち1位から約144位のHBc配列を含む)は自己会合することができるが、残基139を超える欠落はキャプシドの会合を停止させる(Birnbaum et al. (1990) J. Virol. 64:3319-3330;Seifer et al. (1995) Intervirology 38:47-62)。
更に最近、Metzgerら(J. Gen. Virol. 79:587-590 (1998))は、ヒトのウイルス配列の138位のプロリン(Pro-138又はP138)が粒子形成に必要であることを報告した。前記の著者らはまた、カルボキシ末端において142残基及び140残基の長さに短縮した粒子の会合能力は影響を受けるが、139及び137残基の長さを生じる短縮では会合能力は完全に失われることを報告した。
切端粒子は標準的なB型肝炎コア粒子と比べて安定性の低下を示すことをいくつかのグループが示した(Galena et al. (1998) J. Virol. 63:4645-4652;Inada et al. (1989) Virus Res. 14:27-48)。前記は、粒子サイズの変動性、及び精製調製物中に粒子フラグメントが存在することによって証明された(Massen et al. (1994) Arch. Virol. 135:131-142)。したがって、上記のMetzgerらの報告の前に、Pumpensら(Intervirology 38:63-74 (1995))は、自己会合に必要なHBc配列のためのカルボキシ末端の境界はアミノ酸残基130及び144の間に位置し、最初の2つ又は3つのアミノ末端残基を他の配列に置き換えることができるが4つ又は11のアミノ末端残基の排除は、形質転換した大腸菌細胞でのキメラタンパク質の完全な消失をもたらすことを記載して文献の報告を要約した。
そのようなHBcキメラは、電子顕微鏡で分析したとき、異種エピトープを欠く粒子と比較してしばしば秩序の低い構造を有するようである(Schodel et al. (1994) J. Exp. Med. 180:1037-1046)。いくつかの事例では、異種エピトープのC-末端切端HBc粒子への挿入は、異種発現後にハイブリッド粒子を回収できないほど劇的な安定化喪失の影響を与える(Schodel et al. (1994) Infect. Immunol. 62:1669-1676)。したがって、多くのキメラHBc粒子は不安定で精製中に破壊され、その程度は、前記粒子が回収不能であるか又は極めて低い安定性を示すほどであり、ワクチン開発を困難にしている。
上記の文献(Pumpens et al. (1995) Intervirology 38:63-74)は、挿入されたポリペプチド配列がN-末端、C-末端及び末端間に存在する粒子形成キメラを列挙している。前記文献に報告されている挿入物の長さはN-末端で24から50残基、内部で7から43残基、C-末端で11から741残基である。
米国特許5,990,085号は、(i)カルボキシ末端切端HBcのイムノドミナントループに残基78と79の間で、及び(ii)カルボキシ末端切端HBcの残基144の後に融合された抗原性ウシインヒビンペプチドから形成された2つの融合タンパク質について記載している。発現された融合タンパク質は、宿主動物に投与されたとき抗インヒビン抗体の産生を誘発すると記載された。前記特許で報告された免疫後30日の力価は比較的低く、ループ挿入を有する融合タンパク質については1:3000から15000で、残基144の後に挿入されたものについては1:100から125である。
米国特許6,231,864号は、ハプテンと結合させた、戦略的に改変したB型肝炎コアタンパク質の製造及び使用を教示する。前記改変コアタンパク質は、ハプテンが付加されている化学的に反応性を有するアミノ酸残基を含む長さが1から約40残基の挿入物を含む。
公開されたPCT出願WO01/98333は、C-末端のシステイン残基を維持しながら、天然のHBcのC-末端に存在する4つのアルギニンリピートの1つ又は2つ以上の欠落を教示している。前記出願はまた、前記欠落領域をHBc以外のタンパク質のエピトープによって置き換え、前記のようにして形成された分子のHBc部分が添加されたエピトープのための担体として機能できるようにすることを開示している。
本発明の1つのWO02/13765A2及びWO02/14478A2に対応する公開されたPCT出願は、C-末端切端HBc粒子の安定化は、前記粒子が組み立てられるキメラタンパク質で1つ又は2つ以上の添加システイン残基の使用により達成できることを開示している。前記添加されたシステイン残基は、キメラタンパク質のC-末端に存在するか、又はC-末端近くに存在することが示されている。
上記の4つのPCT出願公開は、Ulrichらによって開示された潜在的な問題の克服に用いることができる教示を含んでいるように思われる。以下で開示されるように、本発明は、予期に反して高力価の抗体を提供し、更にある特徴ではまたHBcキメラの安定性に関する問題を解決するとともに核酸結合能力のない構築物を提供するまた別のHBcキメラを提供する。更にまた、意図される組換えキメラは、既に存在する抗HBc抗体に対し(もし存在するとすれば)最小限の抗原性を示す。
N-末端切端形のHBcキメラ分子に関する上記の粒子の不安定性に関する発見にもかかわらず、Neirynckら(Nature Med. 5(10):1157-1163, 1999(October))は、完全長のHBcの残基5に融合されているインフルエンザM2タンパク質のN-末端24残基部分を含むHBcキメラの粒子形成が大腸菌発現で生じたことを報告した。HBcの残基4はM2配列の残基24と同一であり、したがって、前記研究者らは残基1から3を欠落させたこともまた記載することができた。
他の研究者らは、野生型ヘパドナウイルスコア抗原では、HBcAg開始コドンの上流のシステイン残基は粒子形成の防止に直接関与することを報告した(Schodel et al. (Jan. 15, 1993), J. Biol. Chem. 268(2):1332-1337;Wasenauer et al. (Mar. 1993), J. Virol. 67(3):1315-1322;Nassal et al. (Jul. 1993), J. Virol. 67(7):4307-4315)。前記3グループはいずれも、野生型HBeAgでは、プレコア配列の-7位のシステイン残基(前記は、コア遺伝子が-30位に存在する上流のイニシエーターメチオニンから翻訳されるときに存在する)が粒子形成の防止に必要で、したがって粒子状HBcAgから分泌非粒子状HBeAgへの変化に必要であることを報告した。
前記のキメラタンパク質は粒子を形成し、ポリペプチド又はタンパク質ハプテンと結合することができると記載されている。大腸菌発現粒子はゲルろ過及びヒドロキシアパタイトカラムによって精製された。粒子の正確な会合は、アガロースゲル電気泳動で臭化エチジウム又はクマシーブルー染色を用いたとき単一バンドの存在によって証明されると記載されている。しかしながら、提供された図の精査によれば、天然のHBc粒子と比較したとき改変HBcキメラについては少なくとも2つの染みが示されているようである。前記文献で示された各SDS-PAGEは還元条件下で実施され、したがって会合粒子及び担体と比較したとき置換及び非置換キメラモノマーだけしか見ることができない。
以下で開示するように、本発明は、構築物の核酸結合能力の実質的欠如と同様にHBcキメラの安定性の問題に対する1つの解決を提供し、一方、強力な免疫原性を有する物質を提供する。
本発明は、宿主細胞による発現後に自己会合して粒子を形成する、組換えによって作製されたヘパドナウイルスのヌクレオキャプシドタンパク質(すなわちB型肝炎コア(HBc)キメラタンパク質、本明細書ではリコンビナントキメラHBcタンパク質分子、キメラB型肝炎コアタンパク質分子、HBcキメラ分子又は単にキメラとも称される)を含むワクチン又は接種物のための免疫原を目的とする。意図されるキメラ分子は、通常は約183位の残基で終了する天然のコア分子に比して少なくともC-末端で切り縮められているであろう。
意図されるリコンビナントキメラB型肝炎コア(HBc)タンパク質分子は、長さが約600までのアミノ酸残基である。このキメラは、(a)HBc分子のN-末端183アミノ酸残基、好ましくは163アミノ酸残基、より好ましくはHBc分子のN-末端156アミノ酸残基、もっとも好ましくはHBc分子のN-末端149アミノ酸残基の少なくとも約125のHBc配列を含み、残基4位から約75位及び約85位から約140位のHBc配列を含み、ここで48位及び107位のシステイン残基の一方又は両方が別の残基によって置換されれている。
意図されるキメラ分子はまた、(b)(i)HBcプレコア配列の配列以外の配列中で配列番号:1のHBc配列のN-末端からアミノ酸-20位から約+1位に対応するキメラ分子のアミノ酸位に存在する1つから3つのシステイン残基(N-末端システイン残基)、及び(ii)HBc配列のC-末端残基から分子のC末端にむかい、キメラ分子のC-末端側から約30残基内の1つから3つのシステイン残基(C-末端システイン残基)の一方又は両方を含む。
前記キメラ分子は、HBc配列内に約20%までの置換されたアミノ酸残基を含みことができ、更に、以下で考察されるように、リン酸緩衝食塩水(pH7.4)中で粒子が280nmから260nmで好ましくは0.9から約1.7、より好ましくは約1.2から約1.7の吸収比を示すことができるように、宿主細胞による発現時に自己会合して核酸と実質的に結合しない粒子を形成する。前記粒子は、20mMのリン酸ナトリウム緩衝液(pH6.8)で1ヶ月間37℃で保存した後、48位及び107位の両方のシステイン残基を含みその他の点では同一であるHBcキメラ分子から形成される粒子よりも典型的には安定であり、更に、HBcの48位及び107位にシステインを含む粒子よりも典型的には高収量で発現される。
そのような意図されるキメラ分子は、(c)HBc配列内の約20%までが置換されたアミノ酸残基を含み、更に(d)宿主細胞での発現時に自己会合して、下記で考察されるように、採集時、精製時及び溶解時に、280nmから260nmにおいて0.9から約1.7、より好ましくは約1.2から約1.7の吸収比を示す。
前記の自己会合粒子は、20mMのリン酸ナトリウム緩衝液(pH6.8)で1ヶ月間37℃で保存した後、48位及び107位の両方のシステイン残基を含みその他の点で同一であるHBcキメラ分子から形成された粒子よりも典型的にはより安定である。したがって、残基48位及び107位に存在する一方のシステイン、より好ましくは両方のシステインの欠如は、N-末端もしくはC-末端システイン又は両方のシステインによってまた別のやり方で安定化された粒子の保存安定性を強化することができる。これらシステイン残基の一方又は両方の置換によってキメラ分子の粒子の発現もまた強化することができる。
前記キメラ分子のドメインIは約72から約150アミノ酸残基を含み、前記の配列は(i)少なくともHBcの4位から75位までの残基の配列、(ii)48位のシステイン残基の例えばセリンのようなまた別の残基による置換(置き換え)、(iii)HBcプレコア配列の配列以外の配列中で配列番号:1のHBc配列のN-末端からアミノ酸-20位から約+1に対応するキメラ分子のアミノ酸位に存在する0から3つのシステイン残基(N-末端システイン残基)、(iv)HBc残基2‐4の1つにペプチド結合した、約75までのアミノ酸残基を含む随意の免疫原性エピトープを含む。
前記キメラ分子のドメインIIは、ドメインIのHBc残基約75とペプチド結合した約85アミノ酸残基までを含み、前記では、(i)HBcの約76位から約85位までの配列中の0から全ての残基が存在するか又は置換されてあり、更にHBcループとは異種で免疫原を構成する1つから約75アミノ酸残基、又は抗抗原若しくは複合ハプテンのための化学反応性リンカー残基を構成する1つから約4 0残基の配列とペプチド結合しているか、又は(ii)約76位から約85位のHBcの配列が存在し、欠落及び異種残基の添加を含まない。
キメラのドメインIIIは、ドメインIIの残基約85にペプチド結合した約86位から約135位のまでのHBc配列であり、前記ドメインでは107位のシステインが別の残基で置換されている。
(i)ドメインIIIの135位の残基にペプチド結合した、約136位から約163位まで、好ましくは約156位まで、もっとも好ましくは149位までの5から30残基、
(ii)キメラ分子のC-末端から約30残基内の0から3つのシステイン残基(C-末端システイン残基)、及び
(iii)163位、好ましくは156位、より好ましくは149位からC-末端までのHBcに存在する配列以外の配列の0から約75アミノ酸残基。HBc150位からキメラ分子のC-末端までのキメラ分子の配列は、約10より少ないアルギニン、リジン残基又は両残基の混合物を含む。
この好ましいキメラ分子は、(i)キメラのHBc配列の約10%までのアミノ酸残基が置換されているアミノ酸残基配列を有し、(ii)ドメインI及びIVに記載の0から3つのシステイン残基に由来する少なくとも1つのシステイン残基を有し、更に(iii)宿主細胞による発現時に自己会合して粒子を形成する。上記のようにして形成された粒子は、核酸との結合を好ましくは実質的に含まず、更に好ましくは、48位及び107位の両方のシステイン残基を含みその他の点では同一であるHBcキメラ分子から形成された粒子よりも、20mMのリン酸ナトリウム緩衝液(pH6.8)で1ヶ月間37℃で保存された後でより安定である。
意図されるワクチン又は接種物は、医薬的に許容できる希釈組成物(典型的にはまた水を含む)に溶解又は分散された免疫応答誘発量の前述の自己会合キメラ分子粒子を含む。意図されるキメラ分子のドメインI、II及びIVの1つ又は2つ以上に存在する特に好ましい非HBcエピトープは、マラリアCSタンパク質由来の免疫原性配列、インフルエンザA M2タンパク質のアミノ末端24由来の配列、B型肝炎表面たんぱく質(HBs)のプレS1又はプレS2領域由来の配列、又は米国特許5,124,726号(Thorton et al.)(更にその親特許4,882,145号)に開示されたHBc由来の追加T細胞刺激配列、例えば約85位から約100位の配列もしくは約93位から約100位のより狭い領域である。特に好ましいリンカー残基はリジン残基である。
本発明の特別な利点は、好ましいキメラ粒子免疫原は、典型的には、48位及び/又は107位に置換されたシステイン残基を含みその他の点では同一のHBcキメラ粒子よりも調製時にはるかに高い安定性を示すということである(一方、核酸を実質的に含まない)。
本発明の長所は、48位及び107位にシステイン以外の残基を含むキメラから形成された粒子は、48位及び107位にシステインを含むキメラタンパク質が会合した粒子よりも迅速にジスルフィド含有粒子を形成するということである。
本発明のまた別の利点は、リコンビナント免疫原は容易に及び周知の細胞培養技術を用いて調製されるということである。
本発明のまた別の利点は、前記免疫原は周知のリコンビナント技術を用いて容易に調製されるということである。
本発明の更に別の利点は、粒子の発現は、48位及び107位の両方にシステインを含む同様なキメラ分子と比較して強化されるということである。
本発明の更に別の利点は、発現された粒子は、48位及び107位にシステインを含む粒子よりも容易に性状を(例えば品質確認の目的のために)調べることができるということである。
更に別の利点及び長所は下記の開示から当業者には明白であろう。
HBcキメラとの関係で使用される数字は、配列番号:1のHBc aywのアミノ酸残基配列内の位置を、前記について付加又は欠落が存在するか否かにかかわらず表示される(HBcキメラでは1つ又は2つ以上の残基が前記配列に付加され又は前記配列から欠落している)。したがって、HBc149はキメラが残基149で終了することを表示し、一方、HBc149+C150は、当該キメラが、配列番号:1の配列内番号に対応してHBc150位にシステイン残基を含むことを示す。
“抗体”という用語は、免疫グロブリンと称されるグリコシル化タンパク質類のメンバーである分子(前記は特異的に抗原と結合することができる)を指す。
“抗原”という語は、歴史的に抗体又は受容体と結合する物質を意味するために、更に抗体の産生を誘発する物質を意味するために用いられてきた。より最近の使用は、抗原の意味を抗体又は受容体と結合する物質に限定し、一方、“免疫原”という語が抗体産生を誘発するか、又は受容体と結合する物質に用いられる。本明細書で考察される物質が免疫原性であり、更に抗原性を有する 場合は、免疫原又は抗原のいずれとして言及するかは、その意図される使用にしたがって行われる。
“抗原決定基”は、抗体結合部位又はT細胞受容体が免疫学的に結合する抗原の実際の構造部分を指す。前記用語はまた“エピトープ”と互換的に用いられる。したがって、抗原決定基は、抗体産生又はT細胞活性化を刺激する構造であり、そのような構造の存在は、どの構造に抗体が結合するか、又はT細胞活性化を誘発するかを決定することによって確認することができる。
本明細書で用いられる“保存的置換”という用語は、あるアミノ酸残基が別の生物学的に類似の残基によって置換されれたことを意味する。保存的置換の例には、1つの疎水性残基(例えばイソロイシン、バリン、ロイシン又はメチオニン)によるもう1つの疎水性残基の置換、又は1つの極性残基によるもう1つの極性残基の置換(例えばアルギニンとリジン、グルタミン酸とアスパラギン酸又はグルタミンとアスパラギンなど)が含まれる。意図される“保存的置換”に含まれるものは、ある哺乳動物のHBc配列(例えば図1の配列)に由来する残基を用いて、別の哺乳動物のHBc配列の同じ位置の残基を置き換えるものである。
ペプチド配列に関して用いられる“対応する(一致する)”という用語は、記載のペプチド配列に約3つまでのアミン酸残基がアミノ末端又はカルボキシ末端の一方又は両方に付加され又は前記から削除されたもので、更に前記ポリペプチド配列の個々のアミノ酸残基に保存的置換のみを含む前記ペプチド配列を意味する。
本明細書では“ドメイン”という用語は、Galibertら(Nature 281:646-650 (1979))が報告したHBcAg サブタイプayw(配列番号:1)の位置番号に対応する残基位置番号付与によって特定される、リコンビナントHBcキメラ分子の部分を指すために用いられる。少なくともキメラドメインI、II及びIIIのポリペプチド部分は、天然に存在するHBcAgの対応する配列と類似の三次構造で存在すると考えられる。
本明細書で用いられる“B型肝炎”という語句は、上記で考察されたようにそのもっとも広い意味で哺乳類のヘパドナウイルス科の任意のメンバーを指す。
“ポリペプチド”及び“ペプチド”という語は本明細書では互換的に用いられ、隣接するアミノ酸のα-アミノ基とカルボキシ基との間でペプチド結合によって一方が他方に連結された一連の直鎖状アミノ酸残基を指す。ポリペプチドは種々の長さを有することができ、それらの天然の形態(荷電をもたない)でも、塩の形態でもよい。アミノ酸残基配列は酸性基及び塩基性基を含むこと、及び、ペプチドが示す個々のイオン化状態は、前記ペプチドが溶液の場合は周囲の媒体のpH値に、又は前記ペプチドが固体の場合は前記ペプチドが得られた媒体のpH値に左右されることは当業者にはよく理解されていよう。したがって、“ポリペプチド”又はそれに匹敵する用語には、関連する適切なアミノ酸残基配列が含まれる。ペプチド又はポリペプチドは、本明細書では常に左から右に、アミノ末端(N-末端)からカルボキシ末端(C-末端)の方向で示される。
本発明は、免疫原性HBcタンパク質、前記タンパク質を含む安定化免疫原性粒子、及び前記安定化粒子を含むワクチン又は接種物を目的とする。意図されるキメラ分子は、好ましくは、天然のコア分子(そのC-末端は、通常は図1の天然のaywサブタイプの残基183位である)に比して少なくともC-末端で切り縮められている。本発明のキメラ分子を含む粒子は、天然のHBcタンパク質(図1)の残基48位及び107位に存在するシステイン残基の一方又は両方の置換、並びにC-末端及びN-末端の一方若しくは両方に又は前記の近くに位置する付加されたシステイン残基の存在によって安定化される。そのような粒子は、以下で考察されるように、好ましくは実質的に核酸との結合を含まない。
より具体的には、本発明のキメラ分子は、ペプチド結合した約600までのαアミノ酸残基、より好ましくは約380残基、もっとも好ましくは約200残基までの長さを有する。前記のように意図されるキメラ分子は、HBcのN-末端183アミノ酸残基、好ましくは163アミノ酸残基、より好ましくはN-末端156アミノ酸残基、もっとも好ましくはN-末端149アミノ酸残基の少なくとも約125、より好ましくは少なくとも約135を含む。存在する前記HBc配列は、残基4位から約75位まで及び約85位から約140位までを含み、前記配列では48位及び107位の一方、好ましくは両方のシステイン残基が別の残基によって置換されれている。
前記形成された粒子は、下記で考察されるように、リン酸緩衝食塩水(pH7.4)中において0.9から約1.7の280nmから260nmの吸収比を示し、核酸結合を含まないことは、より好ましくは、リン酸緩衝食塩水(pH7.4)において約1.2から約1.7の280nmから260nmの吸収比を示すことによって明示される。形成された粒子は、典型的には及び好ましくは、48位及び107位の両方のシステイン残基を含みその他の点で同一であるHBcキメラ分子から形成された粒子よりも、20mMのリン酸ナトリウム緩衝液(pH6.8)で1ヶ月間37℃で保存した後で(単離後に)より安定である。更にまた、前記キメラは場合によって、キメラのN-末端、HBcイムノドミナントループ内(すなわち残基約76位から約85位の間;HBcループ又は単にループ)、又はC-末端の1つ又は2つ以上にペプチド結合した異種アミノ酸残基配列を含む。分子のN-末端に存在する異種配列は、長さが約75アミノ酸残基までを有することができ、一方、分子のC-末端に存在する異種配列は約100アミノ酸残基までの長さを有することができる。前記分子のN-末端又はC-末端のどちらかに存在するときは、前記異種配列は通常はB-細胞又はT-細胞免疫原性エピトープ、又は前記の両方を含み、好ましくは約75までのアミノ酸残基を含む。HBcループ内に存在する異種配列は、下記に考察するように約245アミノ酸残基までの配列を含むことができる。
複合ハプテンのためのリンカー残基を含む約40残基までの異種アミノ酸残基配列は、したがって、抗抗原性残基又は配列が存在できるようにHBcループ内に存在することができる。抗抗原性残基若しくは配列、又は複合ハプテンのための化学的に反応性のリンカー残基を含む残基若しくは配列は、各々好ましくは1つから約40アミノ酸残基を含み、より好ましくは1つから約5残基を含み、もっとも好ましくはただ1つの残基を含む。HBcループ内に存在する前記異種エピトープ含有免疫原配列は、好ましくは約75残基まで、より好ましくは約50残基まで、もっとも好ましくは約25残基までを含むが、上記に記載したように約245残基までは含むことができる。
本明細書で用いられる“抗抗原”という用語は、個々の配列の抗原性(すなわち抗体によって結合される当該配列の能力)を崩壊させることを意味しようとするものである。したがって、抗抗原は免疫原性ループ内に存在することができ、前記が存在するときは、当該残基又は配列は抗体と前記ループとの結合を崩壊させる。前記抗体は、モノクローナル抗体でもポリクローナル抗体でもよいが、市場(Institute of Immunology Co., Ltd., Tokyo, Japan)から入手可能な3105と称されるようなモノクローナル抗体を除く。前記モノクローナル抗体はHBc免疫原性ループの先端でアミノ酸残基と結合すると考えられている。複合ハプテンのための化学的に反応性を有するリンカー残基は、ループと結合する抗体の破壊で抗抗原として機能することができる。しかしながら簡便なように、本明細書では、抗抗原性残基又は配列は、化学的に反応性を有する残基(例えばリジン又はシステイン)を欠き、更に抗抗原として機能する残基又は配列であると考えられる。
意図される免疫原性粒子は、リコンビナントB型肝炎コア(HBc)キメラタンパク質分子を含み、前記キメラタンパク質分子は長さが約600アミノ酸残基までである。前記キメラタンパク質分子は、(a)HBc分子のN-末端183アミノ酸残基、好ましくは163アミノ酸残基、より好ましくはN-末端156残基、もっとも好ましくはN-末端149残基の少なくとも約125、より好ましくは少なくとも約135残基のHBc配列を含み、前記は、残基4位から約75位及び約85位から約140位のHBc配列を含み、前記配列では48位及び107位の一方、好ましくは両方のシステイン残基が別の残基、例えばセリンで置換されれている。セリンの他に、他の意図されるHBc48位及び107位のシステインの置換にはシステイン以外の任意の残基が含まれる。前記任意の残基には特にグルタミン、アスパラギン、セリン、アラニン、スレオニン及びリジンが含まれる。
HBcキメラ分子配列は、上記で考察したように、場合によって以下を含む:(a')キメラのN-末端、HBcイムノドミナントループ内、C-末端の1つ又は2つ以上に免疫原性配列を含むペプチド結合した異種アミノ酸配列、又は(b')1つから約40アミノ酸残基の長さを有し、複合ハプテンのための化学反応性リンカー残基を含むHBcイムノドミナントループ内の異種挿入物、又は(c')HBc76位から85位の配列の0から全ての残基。
前記キメラ分子はまた、(a')HBcプレコア配列の配列以外の配列で配列番号:1のHBc配列のN-末端からアミノ酸-20位から約+1位に対応するキメラ分子のアミノ酸位の1つから3つのシステイン残基(N-末端システイン残基)、及び(b')HBc配列のC-末端残基からキメラ分子のC-末端側で更に前記キメラ分子のC-末端から約30残基内の1つから約3つのシステイン残基(C-末端システイン残基)の一方又は両方を含む。
したがって、キメラタンパク質は、N-末端、HBc免疫原性(イムノドミナント)ループ又はC-末端に1つ若しくは2つ以上の免疫原性エピトープ、又はイムノドミナントループにリンカー(例えばB細胞又はT細胞エピトープのための)を提示することができ、又は76位から約85位の残基の0から全てを有する。ある実施態様では、キメラタンパク質は、形成時に更なる安定性強化を自己会合粒子に付与することができる1つ又は2つ以上のN-末端システイン残基を含む。別の実施態様では、前記キメラタンパク質はまた、形成時に更なる安定性強化を自己会合粒子に付与することができる1つ又は2つ以上のC-末端システイン残基を含む。意図されるキメラタンパク質分子はまた、N-末端及びC-末端に、又は前記末端近くにシステイン残基を含むことができる。すなわち、キメラタンパク質分子は、上記に定義したようにN-末端システイン残基及びC-末端システイン残基の両方を含むことができる。
考察を容易にするために、本明細書で言及する意図されるキメラ配列及び配列の残基位置番号は、配列番号:1に示されるヒトB型肝炎コアタンパク質サブタイプayw(Galibert et al. (1979) Nature 281:646-650)の配列及び位置番号付けを基準にしている。しかしながら、哺乳類のヘパドナウイルスキャプシドタンパク質配列間の強い類似性及びこれらタンパク質によって示される類似の粒子形成のために(前記は当業者には周知である)、ヒトHBcサブタイプaywに関する考察は、ウッドチャック及び地上性リスのタンパク質と同様にadwサブタイプにも適用できることは理解されよう。このような強い類似性の結果として、本明細書では別に記載がなければ、HBc配列は “HBc”配列として一般的に記載される。
キメラタンパク質分子配列はまた、(a')HBcプレコア配列の配列以外の配列で配列番号:1のHBc配列のN-末端からアミノ酸-20位から約+1位に対応するキメラ分子のアミノ酸位の1つから3つのシステイン残基(N-末端システイン残基)、及び(b')HBc配列のC-末端残基からキメラ分子のC-末端側で更に前記キメラ分子のC-末端から約30残基内の1つから約3つのシステイン残基(C-末端システイン残基)の一方又は両方を含む。
キメラ分子はまた、HBc配列内で約20%までの置換されたアミノ酸残基を含み、更に、宿主細胞による発現時に核酸との結合を実質的に含まない粒子に自己会合する。好ましくは前記粒子は、48位及び107位の両方のシステイン残基を含みその他の点では同一であるHBcキメラ分子から形成される粒子よりも、20mMのリン酸ナトリウム緩衝液(pH6.8)で1ヶ月間37℃で保存した後でより安定である。意図されるキメラ分子はまた、好ましくは発現量の強化を示す。
上記で述べたように、意図されるキメラ分子は、(i)図1及び配列番号:1に示されたHBcのN-末端に対して約-20位から約+1位、又は(ii)HBc配列のC-末端残基から分子のC-末端側でキメラ分子のC-末端から約30残基内のどちらか又は両方に位置する少なくとも1つのシステイン残基を含む。負のアミノ酸位の考えは通常はリーダー配列、例えばHBcのプレコア配列に付随する。前記の考えは、あるキメラ分子配列を配列番号:1の配列と単純にアラインメントして、HBcの+1位の開始メチオニン残基の位置に対応するキメラの位置を決定することができるように本明細書では同様に用いられる。アミノ酸残基配列に関する限り、通常は左から右に、N-末端からC-末端の方向で示され、HBc開始メチオニンが占有することができる位置から左へアラインメントされるキメラ分子残基はいずれも負の位置を有する。意図されるシステイン残基は、HBcの開始メチオニンに対応する位置に対してアラインメントされた前記開始メチオニンから左に約20残基の位置に存在することができる。
前記キメラ分子のドメインIは約72から約160アミノ酸残基を構成し、その配列は、(i)少なくともHBcの4位から約75位までの残基の配列、(ii)HBcプレコア配列の配列以外の配列において配列番号:1のHBc配列のN-末端からアミノ酸-20位から約+1位、好ましくはアミノ酸-14位から約+1位に対応するキメラ分子のアミノ酸位の0から3つのシステイン残基(N-末端システイン残基)、(iii)HBc残基2‐4の1つにペプチド結合した、免疫原性エピトープ(免疫原)を構成する約75アミノ酸残基までを含む随意の配列を含む。前記免疫原性エピトープは、存在するときは、典型的にはB細胞免疫応答を誘発するために用いられるエピトープである。
本キメラ又は別のキメラでHBc約76位から約85の配列中の残基が存在せず、HBcにとって異種である1つから約50アミノ酸残基にペプチド結合している状況では、前記の残基は存在せず、約75位のHBc残基は、異種配列のN-末端に直接結合し、そのC-末端残基はHBc約86位の残基とペプチド結合する。HBc約76‐85の全ての残基が存在しない状況は好ましくなく、前記配列から少なくとも4つの残基が存在するのが好ましく、更に10個の残基全て又は置換が存在するのが好ましい。
ある好ましい実施態様では、76位から85位の10残基の配列(76‐85位配列)が存在するが、前記は、1つから約50残基の免疫原含有配列、又は1つから約40残基の抗抗原含有若しくはリンカー含有配列によって中断される。別の実施態様では、HBc76‐85位の前記10個配列が、HBc76位及び82位に2つのシステイン残基置換とともに存在し、更に上記のとおりの50残基までの中断配列を含む。
ドメインIIIは、ドメインIIの残基85にペプチド結合した86位から135位までのHBc配列である。
キメラ分子のドメインIVは以下を含む:(i)ドメインIIIの135位の残基とペプチド結合した、136位から約149位のHBcアミノ酸残基配列の5から約14残基、(ii)キメラ分子のC-末端から約30残基内の0から3つのシステイン残基(C-末端システイン残基)、及び(iii)HBc約150位からC-末端までのHBcには存在しない免疫原性配列中の0から約75アミノ酸残基。
HBc約136位から約163位の配列がドメインIVに存在することができるが、キメラのHBc部分は配列の156位で停止するのが好ましい。好ましくは、ドメインIVは、HBcの前記位置には存在しない配列中に0から約50アミノ酸残基の配列を含み、より好ましくは、前記配列は0から約25残基である。したがって、約163位から183位の領域に存在しないHBc由来の更なる配列の使用はドメインIVについて意図される。そのような配列の1つはHBc85位から100位又は93位から100位のT細胞エピトープである。ドメインIVはまた、好ましくは1つのシステイン残基を分子のC-末端に、又はC-末端近くに含む。
ある特徴では、意図されるキメラ分子は、HBc残基2‐4の1つとN-末端でペプチド結合したエピトープを含む配列を含む。別の特徴では、意図されるキメラ分子は、イムノドミナントループ内のHBc残基76と85の間に位置する分子の中央近くでペプチド結合した、免疫原含有、抗抗原又はリンカー残基含有配列を含む。更に別の特徴では、免疫原含有配列は、HBc残基136‐149の1つ又は残基140‐156の1つ又は残基140‐163の1つとペプチド結合してキメラ分子のC-末端部分に位置する。
更にまた他の特徴では、2つ若しくは3つの免疫原含有配列が上記の位置に存在するか、又は1つ若しくは2つの免疫原含有配列がエピトープのためのリンカー残基と一緒に存在する。多重免疫原が2つ又は3つの位置で同じであっても、又は特定の免疫原のダイマー又はトリマーが1つ又は2つ以上に存在してもよい。これらのキメラ分子の各々は、上記で考察したように、N-末端又はC-末端システイン残基の一方又は両方を含む。これら免疫原、キメラ分子及びぞれらの自己会合粒子のいくつかの具体的な例は以下で考察される。
ドメインIはまた、HBcプレコア配列の配列以外の配列において配列番号:1のHBc配列のN-末端からアミノ酸-20位から約+1、好ましくはアミノ酸-14位から約+1位に対応するキメラ分子のアミノ酸位に0から3つのシステイン残基(N-末端システイン残基)を含む。
ドメインI又はドメインIIのイムノドミナントループに存在することができる異種免疫原性免疫原は、好ましくは約15から約50残基を含み(ただし約6アミノ酸残基の短いエピトープが抗体を誘発することができ更に抗体によって認識され、したがって有用である)、更にドメインIのN-末端に約75残基の配列が存在することができる。
76位から85位までのドメインIIのHBc残基の全てが存在するのが好ましい(ただし1つ又は2つ以上の他の残基によって中断されている)。ドメインIIは好ましくは少なくとも4つの残基を含む(前記は発現又は使用に干渉しない任意の配列であろう)が、これら残基は、好ましくは75位と85位の残基の間の配列の一部分である。ある実施態様では、ループ76位と82位の残基は変異が誘発され、システイン残基によって置換されれてその結果更なるループの安定化を達成することができる。
ドメインIVは少なくとも5残基の配列を含み、前記配列は、(i)残基135にペプチド結合した、HBc136位から140位、又は残基163まで、好ましくは156位まで、より好ましくは149位まで;(ii)0から3つのシステイン残基を含み;更に(iii)場合によって、特にHBc配列が残基140で終わるとき、約75残基までの免疫原性エピトープの配列を含むことができるが、約25残基までの短い配列がより好ましい。
前記ドメインIV免疫原性配列は好ましくは、約163位からHBcC-末端に由来するHBcの配列にとって異種である。前記免疫原性配列は、ドメインIVに存在するときは好ましくはT細胞エピトープであるが、ドメインI及びIIの一方又は他方に通常存在するB細胞エピトープでもよい。HBc配列由来の、HBsのpreS1及びpreS2由来の、並びに他の供給源由来のB細胞及びT細胞エピトープ例は、以下の表A及びBで提供される。
ドメインIVはまた0から3つのシステイン残基を含むことができ、これらのシステイン残基はキメラ分子のカルボキシ末端(C-末端)の約30残基内に存在する。好ましくは1つのシステイン(Cys)残基が存在し、好ましくは前記Cysは、T細胞エピトープがドメインIVの部分として存在しない場合はカルボキシ末端(C-末端)残基として存在する。そのようなT細胞エピトープが存在するときは、好ましいCysはHBcキメラのC-末端の最後の5残基内に好ましくは存在する。
キメラ分子が免疫原性エピトープ配列をドメインIIに含む実施態様では、前記配列は1つ又は2つ以上のB細胞エピトープを含み、アミノ酸残基76と85の間のHBc配列は存在するが、免疫原性エピトープによって中断されてあり、キメラは更に1つ又は2つ以上のT細胞エピトープをHBc残基140‐156の1つとペプチド結合したドメインIV内に含むのが好ましい。
この同じ好ましい形態は、複合エピトープのための異種リンカー残基がドメインIIに存在するキメラ分子についても維持され、それによってドメインIIで1つ又は2つ以上の免疫原性エピトープを提供し、残基76と85は存在するが異種リンカー残基によって中断され、T細胞エピトープはHBc残基140‐156の1つとペプチド結合して存在する。そのようなキメラ分子から形成される粒子は、典型的には約1:4から1:1の複合エピトープ対C-末端ペプチド結合T細胞エピトープの比を含み、約1:2の比が一般的である。
意図される好ましいHBcキメラ分子は、約135から約360残基の配列を含む。各々が約15から約75残基の好ましい長さを有する1つ又は2つの免疫原性エピトープ及び約140から約156残基の好ましい長さのHBc部分を含む好ましいHBcキメラ分子は、約170から約280アミノ酸残基の配列長を有する。1つ又は2つの免疫原性エピトープを含む特に好ましいキメラ分子は、約190から約225残基の長さを有する。追加される免疫原性エピトープを含まない特に好ましいキメラ分子は、約140から約156残基の長さを有する。N-末端及びC-末端HBc部分の長さの多様性並びに免疫原性ループに挿入できるいくつかの意図されるエピトープの種々の長さを考慮して、広い範囲のキメラ分子の長さが意図されることは理解されるところである。
意図されるキメラ粒子は上記で考察したキメラ分子を含む。より広く、そのようなキメラ粒子は、N-末端163残基の少なくとも約125、好ましくは少なくとも約135の配列を有し、更に(i)N-末端、C-末端又はイムノドミナントループの1つ若しくは2つ以上とペプチド結合した免疫原性エピトープ、又はイムノドミナントループ内のエピトープのための異種リンカー残基、及び(ii)上記で述べたようにN-末端及びC-末端の一方又は両方に1つから3つのシステイン残基、並びに135位から少なくとも1つの5HBc残基配列を含む、キメラC-末端切端HBcタンパク質を含む。
意図される粒子は、ドメインIVのアルギニン及び/又はリジン残基を好ましくはほとんど含まず、その結果自己会合粒子は実質的に核酸結合を含まず、以下で考察するように約0.9から約1.7、より好ましくは約1.2から約1.7の280/260吸収比を示す。したがって、好ましいキメラタンパク質は163位から183位の間でHBc配列を含まず、より好ましいキメラタンパク質は156位から183位の間でHBc配列を含まない。特に好ましいHBcキメラ分子は、HBc149位からキメラ分子のC-末端まで9つ未満のアルギニン及びリジン並びにそれらの混合物を含む。
したがって、残基150‐183(又は150‐185)位(当業者には時にプロタミン領域と称される)にアルギニン富裕及びリジン富裕配列を含む、組換えにより発現させた完全長のHBc粒子又はキメラHBc粒子は、約0.8の280nm吸収対260nm吸収比(280/260吸収比)を示す。163位までのHBc配列を含む粒子は約0.9から約1.0の280/260吸収比を示し、核酸のために臭化エチジウムで陽性に染色される。
他方、ドメインIVにアルギニン及びリジンをほとんど含まず、その結果自己会合した粒子が核酸結合を実質的に含まない粒子、例えば天然に存在するHBcのアルギニン富裕核酸結合領域を含まない粒子(3つ未満のアルギニン又はリジン又はそれらの混合物を互いに隣接して含むもの、又はHBc残基約140位から149位で終わる天然の配列又はキメラ配列を有するもの)は、約1.2から約1.7の280/260吸収比を示す。より典型的な280/260吸収比は約1.4から約1.7である。前記の範囲は、大半が、与えられたキメラHBc粒子のドメインII及びIVに存在する芳香族アミノ酸残基の数に依るものである。
意図される粒子は、典型的及び好ましくは、48位及び107位の両方のシステイン残基を含みその他の点で同一であるHBcキメラ分子から形成された粒子よりも、20mMのリン酸ナトリウム緩衝液(pH6.8)で1ヶ月間37℃で保存された後でより安定である。安定性の強化の例は下記の実施例で更に詳細に考察される。意図される好ましいキメラHBcタンパク質のドメインIは、少なくともアミノ酸残基4位から75位で始まるHBcのアミノ酸残基配列を構成し、ドメインIIIは86位から135位のHBc配列を構成する。前記ドメインは、図1に示される天然の配列に存在するシステイン残基について48位及び107位の一方又は両方で別の残基による少なくとも1つの置換を含む。哺乳類のヘパドナウイルスいずれの配列もドメインI及びIIIのどちらかのために用いることができ、2つ又は3つ以上のウイルス由来の配列を1つのキメラで用いることができるが、48位及び107位の一方又は両方のシステイン残基の記載の置換は用いられるいずれの配列とも合致する。好ましくは、更に構築の容易さのために、ヒトのayw配列がキメラの全体を通して用いられる。
HBcの最初の5つのN-末端残基の1つとペプチド結合したN-末端エピトープ配列は、ただ1つのシステイン残基、又は免疫原性配列を含む約30残基までの配列を含むことができる。1つから3つのシステイン残基が前記配列内の都合のよい位置に存在することができるが、典型的には、付加されるN-末端のシステイン残基が、配列番号:1に示されるようにHBcのN-末端に対して約-20から約+1位に存在するように、より好ましくは約-14から約+1位に存在するように、付加される配列のC-末端近くに存在する。典型的な配列は、B細胞又はT細胞エピトープ、例えば以下で考察及び例示されるようなもの(それぞれ表A及び表B)、2つのシステイン残基を含む上記のNeirynckらのインフルエンザM2タンパク質由来の23残基ポリペプチド、及び少なくとも約6残基を含む前記配列の変種、使用発現系の結果として融合タンパク質として生じるまた別の(異種)タンパク質の配列(例えばβ-ガラクトシダーゼ)、又は別のB型肝炎関連配列、例えばPreS1若しくはPreS2領域又は主要HBsAg免疫原性配列である。
より具体的には、イムノドミナントループに存在する異種配列は、(i)エピトープ、例えばB細胞又はT細胞エピトープのための異種リンカー残基、又は抗抗原残基若しくは配列を含む約40までの残基の配列、又は(ii)好ましくは6から50、より好ましくは約15から約50、もっとも好ましくは約20から約30アミノ酸残基を含む免疫原性B又はT細胞エピトープを構成することができる。これら1つ又は2つ以上の残基は、0又は好ましくは少なくとも4、より好ましくは少なくとも8残基、又はHBc配列の76位から85位の残基の全ての間でペプチド結合できるように配置される。免疫原性B細胞エピトープ配列は好ましくはHBc配列にペプチド結合されるか、又は前記文献は参照により本明細書に含まれる位置でリンカー残基によって結合される。B細胞エピトープの使用は以下で例証しながら考察する。
HBcループ配列に付加される1つから約245残基はHBc配列にとって異種であっても、又は約76‐85位のHBc配列以外の1つ又は2つ以上の免疫原性部分に一致していてもよい。したがってそのような配列はHBcの挿入位置にとって異種である。ただ1つの付加される異種残基は、上記で考察したように、B細胞エピトープ又は抗抗原のための異種リンカー残基であってもよい。より長い配列、典型的には少なくとも6残基の長さから50アミノ酸残基の長さまで、より好ましくは約15から約50残基の長さまでが(ただし制限部位によってコードされる異種残基を除く)、上記で述べたように、免疫原(例えばB細胞又はT細胞エピトープ)を含む配列内に存在する。
意図されるキメラの発現後のリンカー残基への結合のため、及びキメラのN-末端、免疫原性ループ内又はC-末端の1つ若しくは2つ以上でのHBcキメラ内での発現のために有用な典型的ペプチドB細胞エピトープは下記の表Aに、前記配列が得られた遺伝子に与えられた一般名称、発表されたエピトープの引用文献若しくは特許、及び配列番号とともに例示されている。
残基X1からX8は欠如しているか又は存在し、存在する場合は、M2タンパク質配列に天然に存在する残基で、それぞれメチオニン、セリン、ロイシン、ロイシン、スレオニン又はプロリン、グルタミン酸、バリン及びグルタミン酸であるが、ただし下付文字を有する1つのX残基が存在するときは、より大きな8までの下付数字をもつ残余の下付文字の有るXもまた存在することを条件とし、
X10は存在し、プロリン、ロイシン又はヒスチジンであり、
X11は存在し、イソロイシン又はスレオニンであり、
X13は存在し、アスパラギン又はセリンであり、
X14は存在し、グルタミン酸又はグリシンであり、
残基X15及びX16は存在するか又は欠如し、存在する場合はそれぞれトリプトファン及びグリシン、又はグルタミン酸であり、
残基X17及びX19は存在するか又は欠如し、存在する場合はそれぞれ別個にシステイン、セリン、又はアラニンであり、
残基X18は存在するか又は欠如し、存在する場合はアルギニン又はリジンであり、更に
残基X20からX24までは存在するか又は欠如し、存在する場合は、M2タンパク質配列に天然に存在する残基であって、それぞれアスパラギン又はセリン、アスパラギン酸又はグリシン、セリン、セリン及びアスパラギン酸であり、ただしただし下付文字を有する1つのX残基が存在するときは、より小さな15までの下付数字をもつ残余の下付文字の有るXもまた存在することを条件とする。
同様に、配列番号:39の上記の好ましいインフルエンザA M2配列では:
残基X1からX8は欠如しているか又は存在し、存在する場合は、M2タンパク質配列に天然に存在する残基で、それぞれメチオニン、セリン、ロイシン、ロイシン、スレオニン、グルタミン酸、バリン及びグルタミン酸であるが、ただし下付文字を有する1つのX残基が存在するときは、より大きな8までの下付数字をもつ残余の下付文字の有るXもまた存在することを条件とし、
X15及びX16は存在するか又は欠如し、存在する場合はそれぞれトリプトファン及びグリシンであり、
残基X17及びX19は存在するか又は欠如し、存在する場合はそれぞれ別個にシステイン、セリン、又はアラニンであり、
残基X18は存在するか又は欠如し、存在する場合はアルギニンであり、更に
残基X20からX24までは存在するか又は欠如し、存在する場合は、M2タンパク質配列に天然に存在する残基であって、それぞれアスパラギン、アスパラギン酸、セリン、セリン及びアスパラギン酸であり、ただしただし下付文字を有する1つのX残基が存在するときは、より小さな15までの下付数字をもつ残余の下付文字の有るXもまた存在することを条件とする。
複数のグリシン残基を含み、更に上記記載の髄膜炎菌(Neisseria meningitidis)B細胞エピトープ配列のC-末端でペプチド結合した約5から約9残基の長さを有する短い親水性ペプチドが、前記配列を含むキメラ粒子の発現で役立つことが判明した。有用な短いペプチドは、文献(Karpenko et al. (2000) Amino Acids 18:329-337)に開示されもので、配列番号:169のGSGDGEGGの配列を有する。
既に述べたように、複合エピトープのための異種リンカーはHBc配列のアミノ酸76位と85位との間の位置でペプチド結合される。免疫原性エピトープでの事例のように、残基76から85のHBc配列は好ましくは存在するが、複合エピトープのための異種リンカーによって中断される。このキメラは、好ましくは、キメラタンパク質のN-末端又はC-末端近くのシステイン残基とともに4位から少なくとも140位のHBc配列を含む。より好ましくは、2位から149位のHBc配列は存在するが、残基76と85の間で複合エピトープのための異種リンカー残基によって中断され、更にキメラ分子はC-末端システインを含む。
更にまた、意図されるHBcキメラに存在する免疫原性エピトープ含有配列はまた、免疫原性(エピトープ)配列の一方又は両側にある(フランキングしている)“可撓性リンカーアーム”によって分離できることもまた特記される。これは、特に、前記免疫原性配列が約30アミノ酸残基を超える長さである場合である。典型的な可撓性リンカーアーム配列は、典型的には約4から約10のグリシン残基を含み、前記は、そうでなければいっぱいになっているループ配列を外側に膨れ上がらせ、更なる安定性を前記構築物に付加することを可能にする。これらの可撓性リンカーアームは、髄膜炎菌B細胞エピトープ配列(例えば配列番号:125のペプチド)に関して上記で考察したものと類似する。他の可撓性リンカーアーム配列の例は文献(Kratz et al. (March 1999) Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 96:1915-1920)に開示され、以下のアミノ酸残基配列によって表される:
GGGGSGGGGT 配列番号:170
GGGGSGGGG 配列番号:171
直ぐ下の配列は、挿入されるエピトープ含有配列のC-末端で利用され、一方、その後の配列は、挿入される免疫原性配列のN-末端及びC-末端の各々で用いられる:
GSGDEGG 配列番号:172
GGGGSGGG 配列番号:173
ドメインIVは、(i)約136位から約140位までのHBc配列、場合によって149位まで、156位まで、又は低優先的に163位まで、又は183位までのHBc配列を含む配列、(ii)0から約3つまでのシステイン(Cys)残基を含む配列、及び(iii)163位から、より好ましくは156位からC-末端までのHBcにとって好ましくは異種である免疫原性配列中の約75までのアミノ酸残基を含む配列を収納し、ただし、ドメインIVはHBc配列の136位から140位までの少なくとも5つのアミノ酸残基を含むことを条件とする。ドメインIVの免疫原性配列はより好ましくは約50アミノ酸残基を含み、もっとも好ましくは約25アミノ酸残基を含む。したがって、ドメインIVの配列は、約163位からC-末端までのC-末端HBc配列を除く実質的に任意の配列である。
ドメインIV配列は0から3つまでのCys残基を含むことができる。Cysが存在する場合は、1つ又は2つ以上のCys残基は、キメラ分子のC-末端から約30残基内に、好ましくはキメラタンパク質分子のC-末端に又は約5アミノ酸残基内に存在することが好ましい。更にまた、2つ以上のCys残基がドメインIV配列内に存在する場合は、前記Cys残基は互いに隣接するのが好ましい。
ドメインIV配列は、目的のキメラを免疫原として用いようとしている生物のための1つのT細胞エピトープ、複数のT細胞エピトープ(同じ又は異なっている)、又は更に追加のB細胞エピトープを含むのが好ましい。典型的なドメインIVのT細胞エピトープ配列は下記の表Bに、表Aのように下線を付した例示の付加C-末端システイン残基(C)とともに提供されている。
残基4位から少なくとも140位までのHBcのアミノ酸配列が、好ましくは意図されるキメラ分子及び粒子に存在する。より好ましくは2位から149位及び約163位までの配列が存在する。B細胞エピトープは、(前記が存在する場合は)好ましくは残基76と85の間に存在する。通常HBcの48位及び107位に存在するシステイン残基の一方又は両方が、別の残基によって置換されれる(置換される)。既に記載したように、少なくとも1つのシステイン残基がドメインIのN-末端に若しくはその近くに存在し、又は以前に考察したようにC-末端若しくはその近くに存在する。1つ又は2つ以上のT細胞エピトープもまた、HBc配列へのN-末端又はC-末端付加として存在できる。意図されるリコンビナントHBcキメラは実質的に結合核酸を含まない。通常HBcの48位及び107位に存在するシステイン残基の一方又は両方が置換されているキメラ粒子は、前記置換を含まない類似の粒子(すなわち、48位及び107位にシステインを含むキメラ)よりも安定である。
意図されるリコンビナントHBcキメラ分子は、典型的には自己会合粒子として存在し、使用される。これらの粒子は180から240キメラ分子(90又は120ダイマー対)、通常は240キメラ分子を含み、前記はジスルフィド還元剤(例えば2-メルカプトエタノール)の存在下でタンパク質分子に分離され、個々の分子はしたがって主としてジスルフィド結合によって粒子中に一緒に結合していると考えられる。観察された安定性の強化は48位及び107位のシステインの一方又は両方の欠如のためと考えられる。
上記に記載したように、HBcイムノドミナントループは、通常は無傷のタンパク質のアミノ末端(N-末端)から約75位から約85位に位置するといわれている。ドメインIIの免疫原性エピトープ含有配列は前記イムノドミナントループ配列中に配置される。前記配置は実質的にHBcの免疫原性及びHBcループ配列の抗原性を除去するが、一方、前記免疫原性配列又はリンカー残基を会合キメラ粒子の極めて免疫原性の高い位置に提示する。
上記で考察したN-末端及びC-末端の短縮、種々のエピトープ及びスペーサーの挿入の他に、目的のキメラ分子はまた、HBcドメインI、II、III及びIVを構成するアミノ酸残基で保存的置換を含むことができる。保存的置換は以前に定義したとおりである。保存的置換の例示は、2位及び3位の残基(アスパラギン酸及びイソロイシン;DI)のグルタミン酸及びロイシン(EL)残基による置換で認められる(前記EL残基は、所望のN-末端エピトープ(N-末端システイン残基を含む)をコードする核酸を付加するために用いられるEcoRI制限部位によってコードされる)。更に別の例は、7位及び97位のリジン残基のアルギニンによる置換、並びに48位及び107位のシステインのセリン残基による置換である。
より稀なものでは、“非保存的”変更、例えばグリシンのトリプトファンによる置換、又はシステインのアラニン残基による置換が意図される。類似の軽微な変化にはまたアミノ酸の欠落、挿入又は前記の両方が含まれよう。生物学的活性又は粒子形成を停止させることなく、どのアミノ酸残基を置換、挿入又は欠落させることができるかの決定は、当分野で周知のコンピュータプログラム、例えばLASERGENEソフト(DNASTAR Inc., Madison, Wis)を用いて見つけることができる。
上記に記載した本発明のキメラ分子のHBc部分が2位から約183位に対応する哺乳類のHBc分子の配列以外を有する場合、前記アミノ酸残基の約20%までが、2位から183位、好ましくは2位から163位までの配列番号:1に匹敵するように置換される。約10%まで、より好ましくは約5%まで、もっとも好ましくは約3%までのアミノ酸残基が、配列番号:1の2位から163位に匹敵するように置換される。
HBc配列が163位を超えてC-末端で又はN-末端で短縮されている場合、又はイムノドミナントループ内に1つ又は2つ以上の欠落を含む場合、配列の全長が163残基未満であるために置換される残基数は比例的に減少する。分子のどこか別の場所での欠落は、計算のために保存的置換と考えられ、その結果、例えばドメインIIIが135位の代わりに133位にC-末端を有することができ、2つの残基は計算のために存在すると仮定されるであろう。
目的のキメラHBc免疫原は、典型的には周知のリコンビナントDNA技術を用いて製造される。したがって、具体的なポリペプチド配列をコードする核酸配列が、HBcをコードする前駆体配列に付加され又は前記前駆体配列から欠落されて、目的のキメラをコードする核酸が形成される。
目的のキメラ免疫原の例では、典型的にはN-末端システインとしてインフルエンザA M2配列に存在するシステインが利用される。HBc分子をコードするポリヌクレオチドのin vitro変異導入によるそのようなキメラ分子の製造のためのプライマーは以下で考察される。システイン含有M2ポリペプチドエピトープがN-末端に存在しない場合は、N-末端システインは、単にM2ポリペプチドのシステイン含有部分をコードするプライマー又は単純なN-末端開始配列(例えばMet-Cys-又はMet-Gly-Cys-)を用いてin vitro変異導入により提供することができる。
上記に記載したように、HBcイムノドミナントループは、無傷のタンパク質のアミノ末端(N-末端)から約75位から85位に通常位置するといわれている。
前記例示のインフルエンザAM2 B細胞エピトープ含有配列をドメインIIのイムノドミナントループ配列に配置することができる。前記配置は、実質的にHBcの免疫原性及びHBcループ配列の抗原性を減少させ、一方、会合キメラ粒子の極めて免疫原性の強い位置にインフルエンザAM2 B細胞エピトープを提示する。
ループ配列内に異種エピトープ配列を配置するためには2つの手法のうち1つが好ましい。第一の手法は置き換えと称され、前記ではイムノドミナントループの部分をコードするDNAが切り出され、異種エピトープ(例えばB細胞エピトープ)をコードするDNAで置換されれる。第二の手法は挿入と称され、前記では異種エピトープはループ内の隣り合う残基間に挿入される。
また別には、ただ1つ又は2つの制限部位を前記領域に導入し、DNAを制限酵素で切断し、“粘着”又は平滑端を提供し、適切な粘着端又は平滑端をもつ異種DNAセグメントを前記切断領域に連結することができる。このタイプのHBcへの配列置換の例は、以下の文献に報告された実験で見出すことができる:Schodel et al. (1991) F. Brown et al. eds., Vaccines 91, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York, pp.319-325;Schodel et al. Behring Inst. Mitt. 1997(98): p.114-119;Schodel et al. J. Exp. Med. (1994) 180(3):1037-4。後者の2つの文献は、それぞれマラリアの病原体、P.イエーリー(P. yoelii)及びP.ベルゲイ(berghei)に対するワクチンの製造を論じている。イムノドミナントループから正味の残基の除去をもたらす置換手法は通常本明細書では用いない。
HBc免疫原性ループ内の挿入位置及びループ残基の存在は、免疫原の活性にとって重要である。したがって、公開されたPCT出願、PCT/US01/25625及びPCT/US01/41759に説明されているとおり、HBc残基78と79との間におけるマラリアのB細胞エピトープの置き換えは、残基76と81の間を切り出して置き換えた領域内に同じ免疫原を配置したものより10倍から1000倍強い免疫原性を有する粒子状免疫原を提供する。更にまた、残基78と79の間に同じマラリア免疫原を配置したものは、残基77と78の間に配置したものと比較して、予期に反して約15倍の免疫原性の強化を提供した。
制限酵素による切断、異種B細胞エピトープ配列をコードするDNAの連結、及びHBcキメラ形成のための発現時に、HBcループアミノ酸配列は、そのN-末端側で5'制限部位によりコードされる2つの残基によって、続いてC-末端側で異種B細胞エピトープによって、続いて3'制限部位によりコードされる更に2つの異種非ループ残基、続いてループ配列の残余によって中断されるのが認められる。この同じ手法を用いて、Neirynckら(Nature Med. 5(10):1157-1163 (1999))が報告したように、ドメインIにN-末端システイン又はN-末端配列を挿入し、又はドメインIVにT細胞エピトープ又は1つ若しくは2つ以上のシステイン残基を挿入することができる。残基82と83の間の挿入を用いる類似の手法が報告された(Schodel et al. (1990) F. Brown et al. eds., Vaccines 90, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York, pp.193-198)。
類似の手法が、システイン含有配列、例えば326位から345位のP.ファルシパルム(falciparum)CSタンパク質配列(本明細書ではPF/CS326-345(Pf-UTC)と称する)を含むマラリアT細胞エピトープのドメインIVへの挿入に用いることができる。ここでは、EcoRI及びHindIII制限部位を149位のアミノ酸残基の後に作出する。EcoRI及びHindIIIによる消化の後、T細胞エピトープコード配列、1つ又は2つ以上の終止コドン及び3'AGCTオーバーハングがその後に続く上記のAATT5'オーバーハングを有する合成DNAを前記消化した配列に連結し、HBc1‐149残基とそれに続く2つの異種残基(GI)、異種T細胞エピトープ、終止コドン及びHindIII部位をコードする配列を形成する。
類似の技術を用いて、B細胞エピトープの複合のための異種リンカー残基をループ領域配列に配置することができる。意図されるリンカー残基には、リジン(Lys)(前記は特に好ましい)、アスパラギン酸(Asp)、グルタミン酸(Glu)、システイン(Cys)及びチロシン(Tyr)が含まれる。
配列番号:1で示されるアミノ酸残基はGlu及びAsp残基を77位及び78位に含むことを記載しておく。それにもかかわらず、更に追加される異種カルボキシル含有残基の導入が意図される。現存のグルタミン酸及びアスパラギン酸の化学反応性は他の要因によって低下するであろう。例えば、近傍のプロリン(例えば79位に見出されるようなもの)は、基部のカルボキシル基の化学反応性を中和しこれを低下させることができる。
ここでは、第一に記載した挿入手法を用い、5つの異種残基をループ配列に配置する。すなわち、1つはB細胞エピトープを複合させるための異種リンカー残基であり、前記1つの残基のいずれかの側で隣接する2つの残基であってそれら自身もまたループ配列残基に隣接し、更に挿入された制限部位の発現生成物(制限酵素の人工産物)である残基。B細胞エピトープのための異種リンカー残基をコードするただ1つのコドンをHBcループ配列に付加するために位置特異的変異導入をまた用いることができることを記載しておく。
タバコ(Nicotiana tabacum)の59残基のリブロースビス-ホスフェートカルボキシラーゼ-オキシゲナーゼシグナルペプチドをコードする177塩基対のDNAの合成について米国特許5,656,472で考察され説明されているように、所望のリコンビナントHBcキメラ核酸の全部又は一部を周知の合成方法を用いて合成できることもまた書き留めておく。例えば、ドメインIII及びIVに連結することができる平滑端又は“粘着端”を用いてドメインI及びIIを合成し、意図されるHBcキメラ(B細胞エピトープのN-末端側に0から3つの付加残基及びC-末端側に又はドメインII/III結合部に又は他のいくつかの所望位置に0から3つの付加残基を含む)を発現する構築物を提供することができる。
また別の挿入技術は文献に報告された:Clarke et al. (1991) F. Brown et al. eds., Vaccines 91, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York, pp.3131-318)。ここでは遺伝暗号の縮退を利用し、前記研究者らは、残基80及び81位に本来存在する残基をコードする残基80及び81に一致するただ1つの制限部位を作出した。したがって彼らが発現させたHBcキメラは制限部位コード残基を含まず、挿入配列のすぐ隣のHBcループ残基を含んでいた。
上記に記載したHBcキメラ分子又は前記コード配列の相補物もまた本発明に包含される。いくつかの好ましい実施態様では、そのような核酸セグメントは単離又は精製形中に存在する。
高ストリンジェンシー条件は、約50℃−55℃の温度で6XSSC中でのハイブリダイゼーション、及び68℃の温度で1−3XSSC中での最終的洗浄を含むと定義できる。中等度のストリンジェンシー条件は、約50℃から約65℃の温度で0.2から0.3MのNaCl中でのハイブリダイゼーション、続いて約50℃から約55℃で0.2XSSC、0.1%SDS(ドデシル硫酸ナトリウム)中での洗浄を含む。
(1)それ自体又はその相補鎖がコードする核酸配列(DNA配列又はRNA配列)、残基4位から136位のそのHBc部分が(存在する場合には)配列番号:1、2、3、4、5又は6であり、更に(2)配列番号:234、235、236、237、238又は239のDNA配列と少なくとも中等度のストリンジェンシー(下記を参照されたい)でハイブリダイズするキメラ分子;更に(3)そのHBc配列が少なくとも80%、より好ましくは少なくとも90%、更に好ましくは少なくとも95%、もっとも好ましくは100%の同一性を配列番号:234、235、236、237、238及び239のDNA配列と共有するキメラ分子はDNA変種配列と定義される。周知のように、例えば本発明の核酸のような核酸配列は、本明細書のいずれかの場所で考察されるように適切なプロモーターと機能的に連結されたとき適切な発現系で発現する。
種々の宿主がしばしば個々のアミノ酸残基をコードするために用いられるそれぞれのコドンに対して優先性を有する。そのようなコドンの優先性は周知であり、所望のキメラ配列をコードするDNA配列はin vitro変異導入を用いて変更し、それによって前記酵素が発現される宿主に優先的なコドンを個々の宿主のために利用することができる。更にまた、遺伝暗号の縮退を用いて、配列番号:1、2、3、4、5若しくは6のDNA又はそれらの相補鎖との実質的な同一性を回避した配列番号:234、235、236、237、238及び239の配列のHBc部分をコードすることができる。したがって、有用な同族DNA配列は、配列番号:234、235、236、237、238及び239のヌクレオチド配列又は相補鎖と中等度のストリンジェンシー条件下でハイブリダイズするとは限らないが、なお目的のキメラ分子を提供することができる。
更に意図されるものは、配列番号:1、2、3、4、5又は6の配列のHBc部分と少なくとも80%同一、より好ましくは90%同一、もっとも好ましくは95%同一性を有するHBcキメラ部分のアミノ酸残基をコードする同族体核酸配列であるDNAセグメントに機能的に連結された、宿主細胞でのキメラの発現を駆動させるためのプロモーターを含むベクターを構成するリコンビナントDNA分子である。前記リコンビナントDNA分子は、適切なトランスフェクション及び宿主細胞による発現時に目的のキメラ分子を提供する。
地上リスのHBcの30アミノ酸残基のN-末端配列は他のいずれのHBc配列ともアラインメントすることができないことを記載しておく。前記の配列及びそのコード核酸配列並びにそれらの相補鎖は上記の同一性のパーセンテージに含まれず、ハイブリダイゼーションの測定で用いられる前記30残基配列又はその相補鎖をコードする核酸の部分でもない。同様に、HBcのN-末端及びC-末端のどちらか又は両端で短縮された配列は同一性の計算に含まれず、イムノドミナントループの残基が異種エピトープの挿入のために除去されるそれら配列でもない。したがって、キメラ分子に存在する前記HBc-コード塩基又はHBc配列残基のみが同一性の百分率の計算に含まれ、アラインメントされる核酸又はアミノ酸残基配列と比較される。
当分野で周知のように、要求される核酸(明示すればDNA配列)(開始及び終止シグナルを含む)が存在する限り、追加される塩基対は通常は前記セグメントのどちらかの末端に存在することができ、前記セグメントはなおタンパク質発現に利用することができる。前記の場合、もちろんのこと、発現を抑制したり、発現されるべき所望の酵素を消費する更なる生成物を発現させたり、当該所望の酵素によって精製される所望される反応生成物を消費する生成物を発現したり、又は別の態様で前記DNAセグメントの遺伝子の発現に干渉したりする機能的に連結されたDNA配列が前記セグメントに存在しないと仮定される。
したがって、前記DNAセグメントがそのような干渉DNAセグメントを含まない限り、本発明のDNAセグメントは長さが約500から約15000塩基対であろう。リコンビナントDNA分子、特に発現ベクターの最大サイズは、複製及び発現(所望される場合)に必要な最小限のDNA配列の全てが存在するならば、主に便利さ及び宿主細胞に収容できるベクターサイズによって決定される。最小限のベクターサイズは周知である。そのような長いDNAセグメントは好ましくはないが用いることができる。
目的のHBcキメラは多くの形質転換宿主系、典型的に宿主細胞で製造する(発現させる)ことができるが、ただし無細胞(in vitro)系発現もまた意図される。前記の宿主細胞系には以下が含まれる(ただしこれらに限定されない):微生物、例えばリコンビナントファージ、プラスミド、又はコスミドDNA発現ベクターで形質転換された細菌;酵母発現ベクターで形質転換された酵母;ウイルス発現ベクター(例えばバキュロウイルス)を感染させた昆虫細胞系;ウイルス発現ベクター(例えばカリフラワーモザイクウイルス;タバコモザイクウイルス)又は細菌発現ベクター(例えばTiプラスミド)で形質転換した植物細胞系;又は適切に形質転換させた動物細胞系、例えばCHO、VERO又はCOS細胞。本発明はまた用いられる宿主細胞系によって制限されない。
HBcキメラをコードする遺伝子を含むDNAセグメントは、好ましくは前記遺伝子を含むリコンビナントDNA分子(プラスミドベクター)から得られる。キメラ遺伝子をHBcキメラタンパク質に発現させることができるベクターは、本明細書では“発現ベクター”と称される。
原核細胞(例えば大腸菌)での使用に好ましいプロモーターはRec7プロモーターであり、前記は外因的に供給されるナリジクス酸によって誘発することができる。より好ましいプロモーターはプラスミドベクターJHEX25(Promega Corp.から入手できる)に存在し、前記は、外因的に供給されるイソプロピル-β-D-チオガラクト-ピラノシド(IPTG)によって誘発することができる。更に好ましいプロモーター、tacプロモーターはプラスミドベクターpKK223-3に存在し、外因的に供給されるIPTGによってまた誘発することができる。PKK233-3プラスミドは、多数の大腸菌株、例えばXL-1、TB1、BL21及びBLRで、約25から約100μMのIPTGを誘発に用いて良好に発現させることができる。驚くべきことには、約25から約50μMのIPTG濃度が2Lのシェーカーフラスコ及び発酵装置で最適結果を提供することが判明した。
真核細胞に適合する発現ベクター、例えば酵母細胞に適合するもの又は高等植物若しくは哺乳動物細胞に適合するものもまた本明細書で意図される。そのような発現ベクターもまた本発明のリコンビナントDNA分子の生成に用いることができる。酵母、例えばビール酵母菌(S. cerevisiae)又はピキア=パストリス(Pichia pastoris)で使用されるベクターは、周知のように染色体外に存在しても、又は組み込まれてもよい。真核細胞発現ベクターは当分野では周知で、いくつかの市場供給元から入手できる。通常は、そのようなベクターは1つ又は2つ以上の便利な制限部位を所望のDNAセグメント及びプロモーター配列の挿入のために含んでいる。場合によって、そのようなベクターは真核細胞での使用に特異的な選別性マーカーを含む。ビール酵母菌で使用される典型的なプロモーターには、ビール酵母菌のホスホグリセリン酸キナーゼ(PGK)プロモーター及び派生プロモーターGAL10及びGAL1が含まれ、一方、アルコールオキシダーゼ遺伝子(AOX1)はピキア=パストリスのための有用なプロモーターである。
より具体的には、Creggら(Biotechnology 5:479-485 (1987)及びMolecular and Cellular Biology 12:3376-3385 (1987))の記載した形質転換及び発現系を用いることができる。キメラV12.Pf3.1のための遺伝子をアルコールオキシダーゼ遺伝子(AOX1)プロモーターの下流及び同じAOX1遺伝子の転写ターミネーター配列の上流に配置する。続いて前記遺伝子及びそのフランキング調節領域をプラスミドに導入する。前記プラスミドは、P.パストリスHIS4遺伝子及びP.パストリスARS配列(自律的複製配列)の両遺伝子を含み、それらはP.パストリス細胞内でのプラスミドの複製を可能にする(Cregg et al. (1987) Molecular and Cellular Biology 12:3376-3385)。
ベクターはまたプラスミド(例えばpBR322)の適切な部分を含み、大腸菌細胞内でのプラスミドの増殖を可能にする。キメラ遺伝子とともに上記に記載した種々の付加エレメントを含む得られたプラスミドは、例示のようにP.パストリスを形質転換してhis4変異体、すなわち機能的なヒスチジノールデヒドロゲナーゼ遺伝子を欠く株細胞が得られる。
形質転換コロニーをヒスチジンを欠く培地上で選別した後、Creggら(Molecular and Cellular Biology 12:3376-3385 (1987))の記載にしたがって細胞をヒスチジンを欠くがメタノールを含む培地で増殖させて、AOX1プロモーターを誘発する。誘発されたAOX1プロモーターは、P.パストリスでキメラタンパク質の発現及びキメラ粒子の生成を引き起こす。
哺乳動物細胞でのリコンビナントDNA発現によるキメラ粒子の産生は、チャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞でキメラ遺伝子を発現することができるリコンビナントDNAベクターを用いて例示のように実施される。前記は、当分野で周知であり、文献(Sambrook et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd ed. Cold Spring Harbor Laboratories (1989))に詳細に記載された方法を用いて達成される。
ある例では、サルウイルス(SV40)系発現ベクター、pKSV-10(Pharmacia Fine Chemicals, Piscataway, NJ)が、NcoI及びHindIIによる制限エンドヌクレアーゼ消化に付される。実施例1に記載したように調製した所望のHBcキメラをコードするNcoI/HindIII配列フラグメントを発現プラスミドに連結し、それによって、pSV-Pfと称される環状リコンビナント発現プラスミドが生成される。
前記発現プラスミドpSV-PFは完全な大腸菌アンピシリン耐性遺伝子を含む。大腸菌RR101(Bethesda Research Laboratories, Gaithersburg, MD)は、したがってpSV-PFで形質転換されたとき、前記プラスミドを含む細菌のためにアンピシリン耐性を基準に選別することができる。続いてプラスミド含有細菌をクローニングし、続いて前記発現ベクターへの挿入コード遺伝子の適切な向きについてクローンをスクリーニングする。
キメラの発現は、pSV-Pfを哺乳動物の細胞、例えばCHO細胞にGrahamら(Virol. 52:456 (1973))のリン酸カルシウム仲介トランスフェクション法又は類似の技術を用いて導入することにより達成できる。
最大効率のpSV-Pfの培養CHO細胞への導入を担保するために、Southernら(J. Mol. Appl. Genet. 1:327 (1982))の記載にしたがって、トランスフェクションは第二のプラスミド、pSV2NEO(ATCC#37149)及び細胞毒性薬剤G418(GIBCO Laboratories, Grand Island, N.Y.)の存在下で実施される。G418に耐性の前記CHO細胞を培養し、(両プラスミド(pSV2NEO及びpSV-Pf)を獲得した)CHO/pSV-PF細胞と称する。pSV-Pf発現ベクターの遺伝的構造のために、キメラは得られたCHO/pSV-PF細胞で発現され、これら細胞の細胞質で検出され、前記細胞質から精製される。得られた細胞タンパク質含有組成物は本明細書の別の箇所で考察されるようにカラムで分離される。
どの発現ベクター、及び最終的にどのプロモーターにキメラコード配列を機能的に連結するかの選択は、所望される機能的特性、例えばタンパク質発現の場所及び時期、並びに形質転換される宿主細胞に直接的に左右される。前記はリコンビナントDNA分子の構築分野でよく知られている固有の限定事項である。しかしながら、本発明の実施に有用なベクターは、前記に機能的に連結されているDNAセグメントに含まれているキメラ遺伝子の複製、好ましくはまた発現(発現ベクターのために)を指令することができる。
原核細胞レプリコンを含むこれらベクターはまた、目的のHBcキメラ遺伝子の発現を、前記で形質転換された宿主細胞、例えば大腸菌で指令することができる原核細胞プロモーター領域を含むことができる。細菌宿主に適合するプロモーター配列は、目的のDNAセグメントの挿入のために典型的には1つ又は2つ以上の便利な制限部位を含むプラスミドベクターで提供される。そのようなベクタープラスミドの典型的なものは、pUC8、pUC9及びpBR329(Biorad Laboratories(Richmond, CA)から入手できる)並びにpRL及びpKK223-3(Pharmacia(Piscataway, NJ)から入手できる)である。
高等植物及び哺乳類由来の細胞で遺伝子発現に有用な典型的ベクターは当分野で周知であり、Rogersら(Meth. in Enzymol. 153:253-277 (1987))記載のアグロバクテリウム=ツメファシエンス(Agrobacterium tumefaciens)の腫瘍誘発(Ti)プラスミド由来の植物ベクター、及び哺乳動物発現ベクター、pKSV-10(上記)及びpCI-neo(Promega Corp., #E1841, Madison, WI)が含まれる。しかしながら、いくつかの他の発現ベクター系も植物で機能することが知られており、Frommら(Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82:58-24 (1985))記載のpCaMVCNトランスファーコントロールベクターが含まれる。プラスミドpCaMVCN(Pharmacia(Piscataway, NJ)から入手できる)は、カリフラワーモザイクウイルスCaMVの35Sプロモーターを含む。
上記植物発現系は典型的には挿入されたトランスジーンの系統的又は構成的発現を提供する。系統的発現は、植物のほとんど又は全てが目的のキメラ分子又は生成粒子の供給源として用いられる場合、又は植物の大部分が経口用ワクチンの供給に用いられる場合に有用であろう。しかしながら、キメラ分子又は粒子を植物の貯蔵器官、例えば根、種子又は果実で発現させることが更に有効であろう(前記から粒子をより容易に単離又は摂取することができる)。
典型的な植物貯蔵器官にはニンジン、タロイモ又はキャッサバの根、ジャガイモの塊茎、果肉、例えばバンジロウ、トケイソウの果実、マンゴ、パパイヤ、トマト、アボカド、サクランボ、ミカン、マンダリンオレンジ、ヤシの実、メロン、例えばマスクメロン及びスイカ及び他の多肉質果実、例えばカボチャ、キュウリ、マンゴ、アプリコット、モモとともに、トウモロコシの種子(コーン)、ダイズ、米、ナタネなどが含まれる。
上記の21-bpセグメントを含む同様な根強化プロモーターは、CAMV35Sプロモーター自体の-90から+8領域である。米国特許5,110,732号は、切端CaMV35Sプロモーターは、根及び発芽根、根となるべき組織で発現強化を提供することを開示した。前記プロモーターもまた本発明で有用である。
また別の根強化プロモーターは、PCT/GB92/00416(WO91/13922、公開1991年9月19日)で開示されたナタネ(Brassica napus L.)遺伝子の-1616から-1のプロモーターである。プラスミドpRlambdaS4及び前記プロモーターを含むバクテリオファージλ.β.1を保有する大腸菌DH5.αは公的機関(National Collection of Industrial and Marine Bacteria, Aberdeen, GB)に1990年3月8日に寄託され、アクセッション番号NCIMB40265及びNCIMB40266を有する。前記プロモーターの有用な部分は、HaeIIIで前記プラスミドを切断することにより1.0kbフラグメントとして得ることができる。
好ましい根強化プロモーターは、DiRita & Gelvin(Mol. Gen. Genet. 207:233-241 (1987))記載のプラスミドpKan2に存在するマンノピンシンターゼ(mas)プロモーターである。前記プロモーターはそのプラスミドpKan2からXbaI‐XbaIIフラグメントとして取り出すことができる。
好ましいマンノピンシンターゼ根強化プロモーターは、-138位までのコアマンノピンシンターゼ(mas)プロモーター領域及び138位から-213位までのマンノピンシンターゼアクチベーターを含み、包括的にAmasPmasと称される。前記プロモーターは、葉の発現レベルと比較して、タバコの根で約10から約100倍に酵素の産生を増加させることが判明した。
また別の有用な貯蔵器官特異的プロモーターは、トマト(Lycopersicon esculentum)の果実成熟遺伝子E8の5'及び3'フランキング領域である。これらの領域及びそれらのcDNA配列は、Deikmanら(EMBO J. 7(11):3315-3320 (1988);及びPlant Physiol. 100:2013-2017 (1992))が記載し考察した。
E8遺伝子の発現を制御するように思われる3つの領域が、前記遺伝子の5'フランキング配列の2181bp及びポリ(A)付加部位側の522bp配列に位置する。-2181から-1088までの領域は、エチレンによる未成熟果実でのE8遺伝子の転写の活性化に要求され、更に成熟時の転写に寄与する。2つの更に別の領域(-1088から-863及び409から-263)は、未成熟果実におけるエチレン反応性を付与することができないが、成熟中のE8遺伝子発現には十分である。
また別の典型的な組織特異的プロモーターはレクチンプロモーターである。前記は種子特異的である。ダイズ種子のレクチンタンパク質は、種子の成熟時にのみ発現され、種子の全mRNAの約2から約5%になる、単一遺伝子(Le1)によってコードされる。レクチン遺伝子及び種子特異的プロモーターは完全に性状が決定され、トランスジェニックなタバコの植物体で種子特異的発現を誘導するために用いられた。例えば以下を参照されたい:Vodkin et al. (1983) Cell 34:1023;及びLindstrom et al. (1990) Developmental Genetics 11:160。
特に好ましい塊茎特異的発現プロモーターはジャガイモのパパチン遺伝子の5'フランキング領域である。前記プロモーターの使用はTwellら(Plant Mol. Biol. 9:365-375 (1987))が記載している。前記プロモーターはバクテリオファージLPOTIの406bpフラグメントに存在する。前記LPOTIプロモーターは、他の4つのパパチンプロモーターと90%を超える相同性、及びパパチンプロモーターPGT5と400塩基の全てにわたって約95%の相同性を有する領域をもつ。これらプロモーターの各々が本発明で有用である。以下もまた参照されたい:Wenzler et al. (1989) Plant Mol. Biol. 12:41-50。
利用されるプロモーター配列のいずれも細胞内のキメラ分子又は粒子の量によって実質的に影響を受けない。本明細書で用いられるように、“実質的に影響を受けない”という用語は、前記プロモーターが、形質転換細胞又はトランスジェニック植物に蓄積されたキメラ分子又は粒子により直接的フィードバック制御(抑制)に反応しないことを意味する。
アグロバクテリウム=ツメファシエンスを用いる植物細胞のトランスフェクションは、典型的には双子葉植物でもっとも良好に実施される。単子葉類は、通常はプロトプラストのいわゆる直接遺伝子移転によりもっとも容易に形質転換される。直接遺伝子移転は通常エレクトロポレーション、ポリエチレングリコール仲介移転、又は必要なDNAを運ぶ微少発射体による細胞の爆撃によって実施される。前記のトランスフェクションの方法は等分やでは周知で、ここで更に考察する必要はない。トランスフェクトした細胞及びプロトプラストから完全な植物を再生する方法もまた、所望のタンパク質を植物組織から得る技術と同様に周知である。例えばまた、米国特許5,618,988号及び5,679,880号及びその中に引用された文献を参照されたい。
アグロバクテリウム=ツメファシエンス、エレクトロポレーション又は他の方法を用いて形成されたトランスジェニック植物は、典型的には1つの染色体上にただ1つの遺伝子を含む。そのようなトランスジェニック植物は、前記付加した遺伝子についてヘテロ接合であると称することができる。しかしながら、“ヘテロ接合”という用語の使用は、通常は、一対の染色体の第二の染色体の同じ座位に相補的な遺伝子が存在することを暗示し、しかもそのような遺伝子はこの場合のように付加遺伝子を含む植物には存在しないので、前記のような植物のためのより正確な名称は独立分離体(セグリガント)であると考えられる。なぜならば前記の付加された外因性キメラ分子コード遺伝子は、有糸分裂及び減数分裂時に独立して分離されていくからである。目的のHBcキメラ分子をコードするただ1つの構造遺伝子を駆動する器官強化プロモーターを含むトランスジェニック植物(すなわち独立セグリガント)は好ましいトランスジェニック植物である。
異なる2つのトランスジェニック植物を交配して、2つの別個に分離されていく付加外因性(異種)遺伝子を含む子孫を生産することができることもまた理解されよう。適切な子孫の自殖によって、キメラHBc分子をコードする両方の付加外因性遺伝子についてホモ接合である植物を生産することができる。親植物への戻し交配及び非トランスジェニック植物との雑種交配もまた意図される。
したがって、本発明のトランスジェニック植物は、目的のキメラHBc分子をコードする異種構造遺伝子を含む。好ましいトランスジェニック植物は、付加された異種キメラHBc構造遺伝子について独立セグリガントであり、前記遺伝子をその子孫に伝達することができる。より好ましいトランスジェニック植物は前記異種遺伝子についてホモ接合であり、前記遺伝子をその全ての子孫に有性交配で伝達する。
“同じタイプ”又は“同じ株”という語句は、非形質転換植物と同じ雑種又はクローン植物を指すために本明細書では用いられる。交配された兄弟間の対立形質変種が少ない場合(強度の近親交配の場合のように)、兄弟間の比較を用いるか、又はいくつかの兄弟を用いて得られた平均を用いることができる。そうでなければ、クローンが比較のために好ましい。
トランスジェニック植物の種子を野外の温室又は窓台などで生育させ、得られた性成熟トランスジェニック植物を自家受粉させて標準育種植物を作出する。これらの植物の子孫は、キメラHBc分子粒子の蓄積について一定範囲の環境条件下(好ましくは野外)で評価される標準育種株となる。
キメラHBc分子粒子の蓄積についてホモ接合のトランスジェニック植物を他の所望の属性を有する親植物と交配する。子孫(キメラHBc分子粒子の蓄積についてへテロ接合であるか又は独立して分離することができる)を、キメラHBc分子粒子の蓄積及び他の所望の属性を示すある親又は別の親と戻し交配する。多数の所望の属性を有するトランスジェニック植物得るために、親と子孫との前記戻し交配は2度以上繰り返す必要があるだろう。
キメラをコードする配列は、ウイルスの非必須領域、例えばポリヘドリン遺伝子でクローニングし、ポリヘドリンプロモーターの制御下に置くことができる。キメラ配列の挿入の成功によって、ポリヘドリン遺伝子は不活化され、コートタンパク質を欠くリコンビナントウイルスが産生される。続いて前記リコンビナントウイルスを用いて、その中でHBcキメラが発現することができる、例えばS. フルギペルダ(S. frugiperda)細胞又はトリコプルシア(Trichoplusia)の幼虫を感染させる(E. Engelhard et al. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91:3224-3227;及びV. Luckow Insect Cell Expression Technology pp.183-218, in Protein Engineering: Principles and Practice, J.L. Chelamd et. al. eds., Wiley-Liss,Inc. 1996)。オートグラファ=カリフォルニカ(Autographa californica)核多角体病ウイルス(AcNPV)のポリヘドリンプロモーターの制御下に置かれた異種遺伝子は、感染後期にしばしば高レベルで発現される。
キメラ遺伝子を含むリコンビナントバキュロウイルスは、バキュロウイルスシャトルベクター系(Luckow et al. (1993) J. Virol. 67:4566-4579)を用いて構築される。前記はBac-To-Bac(登録商標)バキュロウイルス発現系として市販されている(Life Technologies)。標準的なプロトコルによってリコンビナントウイルスのストックを調製し、リコンビナントタンパク質の発現をモニターする(O'Reilly et al. Baculovirus Expression Vectors: A Laboratory Manual, W.H. Freeman and Company, New York, 1992;及びKing et al. The Baculovirus Expression System: A Laboratory Guide, Chapman & Hall, London, 1992)。
また別には、1つ又は2つ以上の制限エンドヌクレアーゼ部位を含む合成リンカーを用いてDNAセグメントを発現ベクターに上記で述べたように結合させることができる。前記合成リンカーは、平滑端DNA分子の連結を触媒することができる酵素(例えばバクテリオファージT4DNAリガーゼ)の存在下で、大過剰の合成リンカー分子とともに平滑端をもつDNAセグメントをインキュベートすることによって平滑端DNAセグメントに結合させる。したがって、反応生成物は、それらの末端に合成リンカー配列を有するDNAセグメントである。続いてこれらのDNAセグメントを適切な制限エンドヌクレアーゼで切断し、更に、合成リンカーの末端と適合する末端を作製する酵素で切断しておいた発現ベクターと連結する。多様な制限エンドヌクレアーゼ部位を含む合成リンカーが、多くの供給元(New England Biolabs(Beverly, MA)を含む)から市場で入手できる。
所望のDNAセグメントはまたPCR技術を用いて入手することができる。前記技術では、遺伝子をベクターに挿入できるように、フォワード及びリバースプライマーは増幅後に切断することができる所望の制限部位を含む。また別には、当分野で周知のように、PCR生成物は、T-オーバーハングを含むベクター(Promega Corp., A3600, Madison, WI)に直接クローニングすることもできる。
発現されたキメラタンパク質は、単細胞宿主であれ多細胞宿主であれ、宿主細胞内で自己会合して粒子を形成する。粒子を含む細胞は標準的な方法を用いて採集され、フレンチプレス、リゾチーム、ソニケーター、ビーズビーター又は超小型液化装置(microfluidizer)(Microfluidics International Corp., Newton MA)を用いて溶解される。溶解物を清澄にした後、粒子を45%硫酸アンモニウムで沈殿させ、20mMのリン酸ナトリウム(pH6.8)に再懸濁し、同じ緩衝液に対して透析する。前記透析物質を簡単な遠心で清澄にし、上清をセファロース(登録商標)CL-4Bを用いてゲルろ過クロマトグラフィーに付す。粒子含有分画を特定し、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーに付し、硫酸アンモニウムで再度沈殿させ、その後で透析、滅菌ろ過し、-70℃で保存する。
B細胞又はT細胞応答が所望される任意のハプテン(免疫原)を目的のHBcキメラ又はキメラ粒子(例えば異種リンカー残基(例えばリジン、グルタミン酸、アスパラギン酸、システイン又はチロシン)をドメインIIのループ領域内に含み、更に付加されたシステイン残基をドメインIのN-末端近くに有する)に結合させ、HBcキメラ複合物を形成することができる。問題のハプテンは典型的にはB細胞免疫原である。ハプテンはポリペプチド、タンパク質、炭水化物(糖類、すなわちオリゴ糖又は多糖類)、又は非ポリペプチド、非炭水化物性化学物質(例えば2,4-ジニトロベンゼン)又は医薬物質(例えばコカイン又はニコチン)であろう。例示的糖類化合物には、NTHi又はM. cat.のリポオリゴ糖(LOS)が含まれる(Sun et al. (2000) Vaccime 2000, 18(13):1264-1272;及びJiaro et al. (2002) Infect. Immun. 70(11):5982-5989)。LOSは、疎水性脂質A部分及び親水性コアオリゴ糖部分から成り、グラム陰性細菌の外側膜の主要成分の1つである。無毒化したLOS(dLOS)分子は脱-O-アシル化又は脱-N-アシル化され又はその両方であり、Hochstein(Clinical application of the Limulus amoebocyte lysate test, R.B. Prior, ed. CRC Press, Inc., Boca Raton, FL, Pages 38-49)が記載したリィムルス(Limulus)アメーボサイト溶解物アッセイ(LAL)において出発のLOSと比較して100倍から約10000倍低下した内毒素毒性を示す。
大きな多糖類は、末端活性化(Anderson et al. (1986) J. Immunol. 137:1181-1186)又は多糖類鎖のいくつかの官能基のランダムな活性化(Chu et al. (1983) Infect. Immun. 40:245-256;Gordon, U.S. Patent No. 4,619,828 (1986);Marburg, U.S. Patent No. 4,882,317 (1989))のどちらかによって複合させることができる。多糖類鎖のいくつかの官能基のランダムな活性化は、多糖類鎖に沿ったランダムな結合のために高度に架橋された複合物を生じる。多糖類対担体タンパク質の最適比は個々の多糖類、担体タンパク質及び使用される複合物に左右される。
糖類と担体タンパク質の複合方法の詳しい概論は以下で見出すことができる:Dick et al. in Contributions to Microbiology and Immunology, vol.10, Cruse et al., eds., (S. Karger: 1989), Pages 48-114;Jennings et al. in Neoglycoconjugates: Preparation and Applications, Lee et al.., eds., (Academic Press: 1994), pages 325-371;Aplin et al. (1981) CRC Crit. Rev. Biochem. 10:259-306;及びStowell et al. (1980) Adv. Carbohydr. Chem. Biochem. 37:225-281。
いくつかのオリゴ糖(合成、半合成及び天然のもの)は、本発明のHBc複合物の製造で使用される意図されるハプテンであるオリゴ糖の例として下記の節で考察される。
インフルエンザ菌(Haemophilus influenza)b型(Hib)の治療用ワクチンの製造に適したオリゴ糖ハプテンは、D-リボース-D-リビトール-ホスフェート(I、下記)、D-リビトール-ホスフェート-D-リボース-(II、下記)、又はホスフェート-D-リボース-D-リビトール(III、下記)の2から20の繰り返しから作製される(Eduard C. Beuvery et al. EP-0276516-B1)。
Petersonら(Infect. Immun. 66(8):3848-3855(1998))は三糖類ハプテン、αKdo(2 4)αKdo(2 4)αKdoを開示する。前記はクラミジア=ニューモニエ(Chlamydia pneumoniae)に対する防御を提供する。クラミジア=ニューモニエは、咽頭炎から致死的な肺炎までヒトの呼吸器感染の原因である。Kdoは3-デオキシ-D-マンノ-オクタ-2-ウロソン酸である。
Anderssonら(EP-0126043-A1)は、肺炎連鎖球菌(Streptococci pneumoniae)によって引き起こされる細菌感染の治療、予防又は診断に用いることができる糖類を開示している。有用な糖類のあるクラスは二糖類GlcNAcβ1 3Galに由来する。Anderssonら(上掲書)はまた、ネオラクトテトラオシルセラミドが有用であると報告した。前記は、Galβ1 4GlcNAcβ1 3galβ1 4Glc-cerである。
McKenneyら(Science 284:1523-1527 (1999))は多糖類、ポリ-N-スクシニルβ1 6GlcN(PNSG)を開示している。前記は黄色ブドウ球菌(Staphylococcus aureus)に対する防御を提供する。黄色ブドウ球菌は、集団感染(心内膜炎、骨髄炎、敗血症性関節炎、肺炎及び膿瘍を含む)の共通原因である。
欧州特許0157899-B1は、本発明に有用な肺炎球菌の多糖類の単離を開示している。下記の表は、本発明のハプテンとして有用な莢膜多糖類を産生する肺炎球菌培養型のリストである。
B群連鎖球菌(GBS)はヒトで敗血症、髄膜炎、及び関連の神経学的疾患を引き起こす。莢膜多糖類特異的抗体は幼児を感染から護ることが知られている(米国特許5,795,580号(Jennings et al.))。GBS莢膜多糖類II型の反復単位は以下のとおりである:4)-β-D-GlcpNAc-(1 3)-[β-D-Galp(1 6)]-β-D-Galp(1 4)-β-D-Glcp-(1 3)-β-D-Glcp-(1 2)-[α-D-NeupNAc(2 3)]-β-D-Galp-(1、式中、括弧部分は直後の括弧にくくられていないサブユニットと連結された分枝である。GBS莢膜多糖類V型の反復単位は以下のとおりである:4)-[α-D-NeupNAc-(2 3)-α-D-Galp(1 4)-β-D-GlcpNAc-(1 6)-α-D-Glcp-(1 4)-[β-D-Glcp-(1 3)]-β-D-Galp-(1 4)-β-D-Glcp-(1。
欧州特許出願EU-0641568-A1(Brade)は、クラミジア=トラコーマチス、ニューモニエ及びシッタシー(Chlamydia trachomatis、pneumoniae及びpsittaci)由来のはしご様縞模様抗原を入手する方法を開示する。
Solvinら(Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 96(10):5710-5715 (1999))は、前立腺癌に対して用いられるワクチンの製造で、担体としてKLHに結合させた合成オリゴ糖、globo Hの使用を報告している。同様に、Hellingら(Cancer Res. 55:2783-2788 (July 1995))は、メラノーマ患者治療用ワクチンでKLH結合GM2の使用を報告している。後者のワクチンは、セラミド二重結合のオゾン切断、アルデヒド基の導入及びKLHへの還元的アミノ化によって製造された。同様な方法を目的のキメラ粒子に用いることができる。
正常な細胞と同様に他の腫瘍細胞(例えばメラノーマ、神経芽腫)及び健康な脳細胞の表面に存在する、スフィンゴ脂質(例えばグロボシド及びガングリオシド)のオリゴ糖部分も同様にハプテンとして本発明で用いることができる。グロボシドのオリゴ糖部分グロボHはFucα-(1 2)-Galβ(1 3)-GalNAcβ-(1 3)-Galα-(1 4)-Galβ-(1 4)Glcの構造を有し、一方、ガングリオシドの糖部分GM2、GM1及びGD1aはそれぞれ以下の構造を有する:GalNAcβ-(1 4)-[NeuAcα-(2 3)]-Galβ-(1 4)-Glc;Galβ-(1 3)-GalNAcβ-(1 4)-[NeuAcα-(2 3)]-Galβ-(1 4)-Glc;及びNeuAc-(2 3)-Galβ-(1 3)]-GalNAcβ-[NeuAcα-(2 3)]-Galβ-(1 4)-Glc。
したがって、“ハプテン”という用語は、本明細書では通常よりも幾分広く、それ自体は免疫反応を誘発しない小分子を、しばしばそれ自体が免疫反応を誘発するより大きな分子(例えばタンパク質)と同様に含むことが理解されよう。そのようにして形成されたHBcキメラ粒子複合物は以下で考察されるように接種物又はワクチンとして有用である。キメラタンパク質は発現後に自己会合し、複合物は発現後に形成されるので、複合物の形成は、遊離タンパク質分子に対応して、典型的には会合粒子を用いて実施される。
個々のハプテン(免疫原)をタンパク質又はポリペプチドに前記タンパク質又はポリペプチドのアミノ酸側鎖を介して機能的に結合させて、懸垂結合した免疫原性複合物(例えば分枝鎖ポリペプチドポリマー)を形成するための方法は当分野では周知である。前記方法は、種々の側鎖上の1つ又は2つ以上のタイプの官能基を介する結合を含み、ハプテンと懸垂結合--共有結合(複合)--しているが、少なくとも1つの側鎖によって分離されている粒子内に担体タンパク質のポリペプチド骨格(ここではHBcキメラ)を生じる。
更にまた、当分野で周知のように、HBcタンパク質及びポリペプチドハプテンの両方をそれらの本来の形態で用いるか、又はそれらの官能基成分をリジン残基のスクシニル化によって、若しくはシステイン‐チオラクトンとの反応によって改変することもできる。スルフヒドリル基もまた担体たんぱく質又は複合物のどちらかに、アミノ官能基と2-イミノチオラン、3-(3-ジチオピリジル)-プロピオネートのN-ヒドロキシスクシンンイミドエステル、又は当分野で公知の他の試薬との反応によって取り込むことができる。
HBcキメラ又はハプテンは又、スペーサーアーム(例えばヘキサメチレンジアミン又は別の二官能性分子)を取り込んで改変させ、懸垂結合を促進することができる。そのような方法は以下で考察される。
-N-ヒドロキシスクシンイミドエステル(ICN Biochemicals, Inc., Costa Mesa, CA)又はスクシンイミジル4-(N-マレイミドメチル)シクロヘキサン-1-カルボキシレート(SMCC)(Pierce Chemical Co., Rockford, IL)を適切なHBcキメラと反応させて活性化担体を形成する。続いて、前記活性化担体をハプテン、例えばスルフヒドリルの末端をもつハプテン又は末端システインを含むか、若しくは更に付加されたアミノ若しくはカルボキシ末端システイン残基が付加されているポリペプチドと反応させて共有結合HBcキメラ複合物を形成する。また別の例として、ポリペプチドハプテンのアミノ基を先ずN-スクシンイミジル3-(2-ピリジルチオ)プロピオネート(SPDP)(Pharmacia, Piscataway, NJ)と反応させ、更に前記チオール含有ポリペプチドを還元後に活性化担体と反応させることができる。もちろんのこと、前記硫黄含有成分及び二重結合含有ミカエル受容体は入れ替えることができる。これらの反応は供給元の文献に記載されてあり、更に以下の文献にも記載されている:Kitagawa et al. (1976) J. Biochem. 79:233;及びLachmann et al. in 1986 Synthetic Peptides as Antigens, (Ciba Foundation Symposium 119), pp. 25-40 (Wiley, Chichester: 1986)。更に図5も参照されたい。
多数のヘテロ二官能性物質が特に有用で、前記は一方の官能基端と他方のアミド結合でジスルフィド結合を形成する。前記にはN-スクシンイミジル-3-(2-ピリジルジチオ)-プロピオネート(SPDP)が含まれる(それ自体とHBcキメラ又はハプテン内のチオールとの間でジスルフィド結合を作出することが上記で考察された)。典型的な試薬は、ポリペプチドハプテン内にシステイン残基及び複合パートナー上にアミン(例えばリジンのε-アミン又は担体タンパク質の他の遊離アミノ基)を含む。そのような種々のジスルフィド/アミド形成物質は公知である。例えば以下を参照されたい:Immun. Rev. (1982) 62:185。
他の二官能性複合試薬はジスルフィド結合ではなくチオエーテルを形成する。これらチオエーテル形成物質の多くは市場で入手でき、6-マレイミドカプロン酸、2-ブロモ酢酸、2-ヨード酢酸、4-(N-マレイミドメチル)シクロヘキサン-1-カルボン酸などの反応性エステルが含まれる。前記カルボキシル基は、スクシンジイミド又は1-ヒドロキシ-2-ニトロ-4-スルホン酸のナトリウム塩とそれらを結合させることによって活性化することができる。本発明の方法のために特に好ましい複合試薬は、スクシンイミジル4-(マレイミドメチル)シクロヘキサン-1-カルボキシレート(SMCC)である(Pierce Chemical Co. (Rockford, IL)から入手できる)。また別のヘテロ二官能性架橋剤は、N-(γ-マレイミドブチロキシ)スクシンイミドエステル(GMBS)及びそのスルホン酸塩(Sulfo-GMBS)並びにピアスケミカル社(Pierce Chemical Co., Rockford, IL)から入手できる類似の化合物である。前述のリストは包括的なものではなく、更に、列挙した化合物の改変も明らかに実施できる。図5は、SMCCを用いたHBc活性化担体の形成(I)及びそれに続く前記活性化担体とスルフヒドリル-末端化ハプテンとの反応(II)を示す模式図(スキームI)を提供する。
典型的なポリペプチドハプテンは前述の表A及びBに示されている。これらのポリペプチドの各々はそのN-末端アミノ基を介して、又は別に付加されたN-末端システイン(前記表には示されていない)を使用することによって利用することができる。
関連する化学反応を用いて、“化合物”と称することができるものと担体タンパク質とを複合させる。典型的には、複合のための適切な官能基が前記化合物中にデザインされる。それに対して誘発された抗体が肺炎連鎖球菌を予防する典型的な化学的ハプテンは、6-O-ホスホコリンヒドロキシヘキサノエートである(Fischer et al. (1995) J. Immunol. 154:3373-3382)。下記の表は典型的な更に別の化学的ハプテンを提供する。
有用なハプテンに関する更に別の説明例は、前述した、現時点では公表されている米国特許出願09/930,915号及び他の親出願で見出すことができる。
本発明の更に別の実施態様では、HBcキメラ粒子又はハプテンとのHBcキメラ粒子複合物は患者又は適切な動物宿主(例えばチンパンジー、マウス、ラット、ウマ、ヒツジなど)で接種物又はワクチンの免疫原として用いられる。接種物はB細胞若しくはT細胞応答(刺激)、例えば免疫原性エピトープ又はハプテンと免疫反応する抗体の産生又はT細胞活性化を誘発し、一方、ワクチンは、B細胞若しくはT細胞応答の一方又は両者を介して免疫原が由来した物質に対して防御を提供する。
T細胞活性化は種々の技術によって測定することができる。通常の実施では、宿主動物は目的のHBcキメラ粒子ワクチン又は接種物を接種され、抹消単核血球(PMBC)がその後で採集される。続いて、前記PMBCをin vitroでT細胞免疫原の存在下で約3から5日間培養する。更に前記培養PMBCを増殖又はサイトカイン分泌(例えばIL-2、GM-CSF又はIFN-γ)についてアッセイする。T細胞活性化についてのアッセイは当分野では周知である。例えば米国特許5,478,726号及び前記で引用された文献を参照されたい。
見本として抗体形成を用いた場合、目的の接種物又はワクチンは、医薬的に許容できる希釈組成物(典型的にはまた水を含む)に溶解又は懸濁させた、免疫原として有効な量のHBcキメラ粒子又はHBcキメラ粒子複合物を含む。免疫を必要とする、又は抗体の誘発が所望される宿主動物、例えば哺乳動物(例えばマウス、イヌ、ヤギ、ヒツジ、ウマ、ウシ、サル、尾無しサル又はヒト)に投与したとき、接種物は、遺伝子的に結合されたか又は複合(懸垂結合)されたハプテンと免疫返納する抗体を誘発する。前記抗体はまた、好ましくはB細胞免疫原のタンパク質又は糖類と結合する。
ワクチン又は接種物は典型的には、接種物当たり約1マイクログラムから約1ミリグラム(ユニットドース)のリコンビナントHBcキメラ免疫原濃度、好ましくは約10マイクログラムから約50マイクログラム/ユニットドースのリコンビナントHBcキメラ免疫原濃度を含む。“ユニットドース”という用語は、本発明のワクチン又は接種物に関する場合、動物に対する分割できない投与量として適切な物理的に分離されたユニットを指し、各ユニットは、必要な希釈剤と一緒に所望の免疫原としての効果を個々に又は総合的に生じるように計算した予め定めた量の活性物質を含む。
ワクチン又は接種物は、典型的には回収されたリコンビナントHBcキメラ免疫原から、好ましくは粒状形の前記免疫原を、生理学的に耐性が示される(許容される)希釈ビヒクル(例えば水、食塩水、リン酸緩衝食塩水(PBS)、酢酸緩衝食塩水(ABS)、リンゲル液など)中で懸濁して水性組成物を形成することによって調製される。前記希釈ビヒクルはまた、以下で考察されるように油性物質、例えばピーナツ油、スクァラン又はスクァレンを含むことができる。
活性成分としてタンパク質性物質を含む接種物又はワクチンの調製もまた当分野ではよく理解されている。典型的にはそのような接種物又はワクチンは非経口薬として、溶液又は懸濁液のどちらかとして調製される。注射前の液体として溶液又は懸濁液に適した固形物もまた調製できる。前記調製物は乳化してもよく、乳化が特に好ましい。
有利には意図されるワクチン又は接種物はまたアジュバントを含む。本発明のワクチン及び接種物のために適切なアジュバントは、キメラのB細胞エピトープに対して抗体応答を強化することができるアジュバントとともに、キメラに含まれるT細胞エピトープに対して細胞仲介応答を強化することができるアジュバントを含む。アジュバントは当分野で周知である(例えば以下を参照されたい:Vaccine Design-The Subunit and Adjubant Approach, 1995 Pharmaceutical Biotechnology, Vol.6, M.F. Powell and M.J. Newman, Plenum Press, New York and London, ISBN 0-306-44867-X)。
典型的なアジュバントには、完全フロイントアジュバント(CFA)(前記は人間には使用されない)、不完全フロイントアジュバント(IFA)、スクァレン、スクァラン及びミョウバン(例えばアルヒドロゲル(Alhydrogel(登録商標))(Superfos, Denmark))が含まれる。前記は当分野で周知であり、いくつかの供給元から市販されている。
本発明の免疫原で使用されるまた別の特に好ましいアジュバントはエマルジョンである。意図されるエマルジョンは水中油エマルジョン又は油中水エマルジョンである。免疫原性キメラタンパク質の他に、そのようなエマルジョンは、周知のスクァレン、スクァラン、ピーナツ油などの油相及び分散剤を含む。非イオン性分散剤が好ましく、そのような物質には、ソルビタン並びにマンニドのモノ-及びジ-C12-C24-脂肪酸エステル、例えばソルビタンモノ-ステアレート、ソルビタンモノ-オレエート及びマンニドモノ-オレエートが含まれる。免疫原含有エマルジョンはエマルジョンとして投与される。
本明細書では小分子アジュバントの使用もまた意図される。本発明で有用な小分子アジュバントのあるものは、米国特許4,539,205号、同4,643,992号、同5,011,828号及び同5,093,318号に記載された7-置換-8-オキソ-又は8-スルホ-グアノシン誘導体である(前記文献は参照により本明細書に含まれる)。これらの物質のうちで、7-アリル-8-オキソグアノシン(ロキソリビン)が特に好ましい。前記分子は抗原(免疫原)特異的応答の誘発に特に有効であることが示された。
ムラミルジペプチドアジュバントもまた意図され、N-アセチル-ムラミル-L-スレオニル-D-イソグルタミン(thur-MDP)、N-アセチル-nor-ムラミル-L-アラニル-D-イソグルタミン(CGP11637、nor-MDPと称される)、及びN-アセチルムラミル-L-アラニル-D-イソグルタミル-L-アラニン-2-(1'-2'-ジパルミトリル-sn-グリセロ-3-ヒドロキシホスホリルオキシ)エチルアミン((CGP)1983A、MTP-PEと称される)が含まれる。いわゆるムラミルジペプチド類似体は米国特許4,767,842号に記載されている。
アジュバントはアジュバント量で用いられ、前記の量は、アジュバント、哺乳動物及びリコンビナントHBcキメラ免疫原に応じて変動することができる。典型的な量は各免疫当たり約1μgから1mgで変動することができる。適切な濃度又は量は容易に決定できることは当業者には理解されよう。
接種物又はワクチン組成物は、溶液、懸濁液、錠剤、ピル、カプセル、徐放性製剤又は散剤の形態を有し、活性成分として免疫学的に有効な量のHBcキメラ又はHBcキメラ複合物を好ましくは粒子として含む。典型的な組成物では、好ましいHBcキメラ又はHBcキメラ複合物粒子の免疫学的に有効な量は、上記に記載したように単位用量当たり約1μgから約1mg、より好ましくは単位用量当たり約5μgから約50μgの活性成分である。
ワクチンは、典型的には非経口投与のために製剤化される。典型的な免疫は皮下(SC)、筋肉内(IM)、静脈内(IV)、腹腔内(IP)又は皮内(ID)に実施される。しかしながら、経口ルート及び鼻腔ルートのワクチン接種もまた意図される。
更に別の実施態様では、目的のHBcキメラをコードする遺伝子が適切に弱毒化された腸内細菌(例えば腸チフス菌、ネズミチフス菌、ネズミチフス菌-大腸菌ハイブリッド又は大腸菌)にトランスフェクトされているワクチン又は接種物が意図される。典型的な弱毒化又は無毒化腸チフス菌及びネズミチフス菌及びネズミチフス菌-大腸菌ハイブリッドが上記で提供した引用文献で考察されている。これらのワクチン及び接種物は特に、鼻粘膜、腸粘膜及び生殖管を介して感染又は伝達される疾患(例えばインフルエンザ、酵母(例えばアスペルギルス及びカンジダ)、ウイルス(例えばポリオ、口蹄疫、A型肝炎)及び細菌(例えばコレラ、サルモネラ及び大腸菌)に対して使用するために、更に粘膜IgA反応がIgG全身反応に加えて又は前記に代わって所望される場合に意図される。
腸内細菌は凍結乾燥し、医薬的に許容できる乾燥希釈剤と混合し、摂取のために錠剤又はカプセルにし、通常の固形医薬のように宿主動物に投与又は摂取させることができる。更にまた、これら細菌ワクチンの水性調製物は、経口、鼻腔、直腸又は膣投与のように粘膜免疫で使用するために応用される。
接種物又はワクチンは、投薬製剤に適合した態様及び治療的に有効で免疫を誘発する量で投与される。投与されるべき量は、治療される対象者、対象者の免疫系の抗体合成能力、及び所望される防御の程度に左右される。投与に要求される活性成分の正確な量は、医師の判定に依存し、各人に固有である。しかしながら、適切な投薬範囲は個体当たり数十マイクログラムの規模である。初回投与及びブースター注射のための適切な治療計画もまた変動可能であるが、典型的には初回投与に間隔をあけて(数週又は数ヶ月)その後の注射又は別の投与が続く。
いったん免疫されたら、当該哺乳動物は、リコンビナントHBcキメラ免疫原が問題の抗原(例えばマラリアワクチンのためのスポロゾイト)と結合する十分な力価の抗体の産生を誘発するために十分な時間維持される。例示の抗スポロゾイト抗体の産生のための維持期間は典型的には約3から約12週間続き、ブースター又は2回目のワクチン免疫投与を含むことができる。所望の場合は、3回目の免疫もまた初回免疫後24週から5年で意図される。いったん防御レベルの抗体力価が得られたら、約1から約5年の間隔で周期的ブースター免疫によって、ワクチン接種哺乳動物は好ましくは前記抗体力価で又は抗体力価近くで維持される。
誘発抗体、例えば抗CS抗体又は抗インフルエンザ抗体は接種された宿主動物の血液から周知の技術を用いて単離し、続いて、受動免疫用の第二のワクチンにこれもまた周知のように再構成することができることを記載しておく。同様な技術が人間のガンマ-グロブリン免疫のために用いられる。例えば、1つ又は多数の免疫宿主由来の抗血清を硫酸アンモニウム水溶液(典型的には40−50%飽和で)で沈殿させ、前記沈殿抗体をアフィニティークロマトグラフィー[(NANP)5又はインフルエンザM2ポリペプチドがクロマトグラフィーカラム上に固定される抗原として用いられる]の使用によりクロマトグラフィーで精製することができる。したがって、例えば1つの接種物をウマ又はヒツジで用いて、また別の動物(例えばヒト)での受動免疫で使用するためにマラリアの1つの種に対する抗体産生を誘発することができる。
本発明の別の実施態様は、動物宿主に接種物を接種する工程を含む、抗体、活性化T細胞又はその両方を前記動物宿主で誘発する方法である。前記方法で用いられる接種物は、医薬的に許容できる希釈剤に溶解又は懸濁された免疫誘発量の前述のHBcキメラ粒子又はHBcキメラ粒子複合物を含む。前記動物宿主は、抗体又は活性化T細胞の誘発に十分な時間(周知の技術によってアッセイできる、典型的には周知のように数週間又は数ヶ月が要求される)維持される。この維持期間に複数のそのような免疫が意図される。
ジスルフィド結合の予測はプログラムSS-BOND(Hazes et al. Protein Eng. 2:119-25(1988))を用いて実施した(前記プログラムは対象のタンパク質について三次元構造情報を要求する)。HBc構造座標をタンパク質データバンクからロードし(前記はWynneらによって解像された3.3Å構造である)、最後の3つのモノマーの座標は、この構造が2つのダイマーのための情報を含んでいるので欠落させた。
標準的なパーソナルコンピュータで実行したとき、前記プログラムは、ジスルフィド結合の予測時に考慮される以下の3つのパラメータについてもっともストリンジェントな用件を自動的に選択する:(1)χ-3の角度、前記はSγ-Sγ結合周囲の回転である(理想は±90°でこの角度の偏差は0°に設定される)、(2)結合の形成に要求される最大エネルギー(理想は10kcal/mol未満)、及び(3)与えられた結合について可能なもっとも低いエネルギー構成を超えて許容されるエネルギーの差(推奨される最大値は5kcal/molである)。しかしながら、イムノドミナントループヘリックス(ILH)1(アミノ酸残基50−73)とILH2(アミノ酸79−110)との間でジスルフィド結合の形成についていずれのヒットを得るためにも、前記の要件は緩和されねばならなかった。リナックス操作系からプログラムを実行する場合、前記のパラメータを編集することができる。
後者の2つのパラメータを緩和することによっては更なるヒットは得られなかった。しかしながらχ-3の角度の緩和によって、結合周囲で30°の回転を許容したとき5つの可能なキメラが得られた(表)。29°と72°の間では更なるヒットは得られず (この場合最大許容偏差は90°である)、したがってこのヒットはこの実験には含めなかった。このようにして作製された出力の側鎖の位置を続いてプログラムGRASP(Nicholls et al. Proteins 30:9686-97 (1991))を用いて、近接アミノ酸の目視によって精査した。72°のヒットを除き、全てが空間的に基部に存在するように見え、したがってこれらのキメラをクローニングした。29°で得られたヒット(ただしいずれのILH内ではないが)もまた、これらの残基が実際のイムノドミナントループ内に存在するので含めた。エピトープの挿入はアミノ酸残基D78とP79の間で実施し、したがって架橋はエピトープの塩基で生じているであろう。
A.プラスミドベクターpKK223-3N及びシステイン置換
Zhengら(J. Biol. Chem. 267:9422-9429 (1992))は、HBc183モノマー配列中に存在する4つのシステイン残基の2つはジスルフィド結合に必要とされないことを見出した。システイン48は与えられたサンプル中で部分的に共有結合していることが判明し、システイン107は遊離チオールとして存在することが分かった。これらのシステインの変異は粒子の会合又は安定性に影響を与えることは認められず、更にスルフヒドリル反応性は検出されず、システイン61及びシステイン183は完全にジスルフィド結合しているという決定的証拠を提供した。
システイン残基C48及びC107の両方をセリン残基に変異させて、導入されたシステインを含む粒子のスルフヒドリル含有量が容易に定量された。セリンはシステインと化学的に極めて類似するアミノ酸であるので、前記は保存的変異である((ヒドロキシルR基に対してスルフヒドリル基であることを除いてそれらは同一である)。このキメラはこの後の全てのキメラのための鋳型として用いられた。鋳型の2つの変型が作製された。1つはV149で終わり(HBc149(C48S/C107S))、他方は追加のシステインをC-末端に保持している(HBc149(C48S/C107S)+C)。
HBc遺伝子は最初にpKK223-3ベクター(Pharmacia Biotech(Piscataway, NJ)から入手できる)でクローニングした。PCRを用いてNcoI部位を含むようにマルチクローニング部位を改変した。全てのPCR反応はミニサイクラー(Minicycler(登録商標))(MJ Research(Waltham, MA)から入手できる)を用いて実施した。全ての実験のPCR反応条件は以下のとおりであった:
工程1−94℃で3分
工程2−92℃で1分
工程3−50℃で1分
工程4−72℃で40秒
工程5−工程2まで14回
工程6−72℃で5分
工程7−4℃で10分
工程8−終了
各キメラのDNA配列はSequi-Net(Fort Collins, CO)への外部供給による自動配列決定によって確認された。プラスミドストックは、キアゲン(Qiagen; Valencia, CA)のプラスミド単離用ミディキット(Midi Kit)を用いて作製した。PCRを用いて作製した全てのキメラの完全な遺伝子ヌクレオチド配列は配列リストに提供されている。
プライマー配列は下記の表2に示され、前記表では、HBcアミノ酸残基は、フォワードプライマーのためのヌクレオチド配列の上及びリバースプライマーの下に示されている。太字のイタリック体で示されたアミノ酸残基及び塩基は置換を示している。問題の制限部位は太字で示されている。全ての配列は5'から3'の方向に記載されている。
ベクターpKK223-3(図2)をプライマー1及び2を用いて増幅させた。続いてPCR生成物及び親ベクターをSphI及びHindIIIで消化し、キアゲン(Qiagen)のQIAEX IIゲル抽出系を用い1.25%のアガロースゲル(Gibco BRLG(Gaithersburg, MD)のゲル装置)から精製した(全てのクローニングはこれらの装置及び試薬を用いて実施された)。消化したとき、480塩基対は親ベクターから切り出され、このフラグメントを廃棄し、ベクターを458塩基対のPCR生成物と連結する。このクローン(pKK233-3N、図2)は、今やNcoIとHindIII部位によってフランキングされる挿入物を受容することができる。pKK223-3ベクターに対するこの改変の結果は、マルチクローニング部位の全ての制限部位が欠落し、プライマー2に由来するNcoI−EcoRI−HindIII配列のみがtacプロモーターと5SのrRNA領域との間に残存するということである。
HBVのaywサブタイプゲノム(NCBIから入手できる)を用いてHBc遺伝子をクローニングした。プライマー3及び4を用いて、フランキングするNcoI及びHindIII部位を、アミノ酸149の後の終止コドンとともに添加した。続いて、pKK223-3Nベクター及びPCR生成物をNcoI及びHindIIIで消化した。ベクターから遊離した12塩基対フラグメントを廃棄した。ベクターをほぼ450塩基対のPCRフラグメントとともに連結してキメラHBc149を得た。HBc149+C(CV-1123)を同じ方法で作製したが、ただしリバースプライマー9(配列番号:248)を用いて、バリン149と終止コドンとの間にシステイン残基を挿入した。
48位及び107位でシステインからセリンへの変異(C48S/C107S)を含むこれら2つのキメラを作製するために、いくつかのPCR反応が必要であった。C107S変異を先ず初めに内因性EarI部位を利用して実施した。5'片をプライマー3及びプライマー5を用いて作製した(前記プライマーはC107S変異を導入した)。3'片を完全マッチプライマー6及び4を用いて調製した。これらのフラグメント(それぞれ約320及び130塩基対)をEarIで消化し、連結した。
続いてこの連結物を鋳型として用いてC48S変異を導入した。HhaI部位をサイレント変異としてA54に導入し、この変異を可能にした。再びPCRを2つの半分部分で実施した。5'片はプライマー3及び7を用いて導入し、一方、3'片はプライマー8及び4を用いて作製した。これらの生成物(それぞれ約165及び295塩基対)を続いてHhaIで消化して連結した。続いて連結生成物をプライマー3及びプライマー4(V149の後ろに終止コドンを配置)又はプライマー9(V149の後ろにシステインを付加)のどちらかとともに増幅し、続いて終止コドンを付加した。生成物(約450塩基対をNcoI及びHindIIIで消化し、上記のように調製したpKK223-3Nベクターに連結してキメラHBc149(C48S/C107S)及びHBc149(C48S/C107S)+Cを得た。
5つのジスルフィドキメラの4つのパネルの構築はC48S/C107Sキメラと類似の態様で実施した。第一の変異は2つの半分部分のPCRによって導入され、続いて第二の変異は、第一の連結物を鋳型として用いて2つの半分部分に導入された。全てのジスルフィドキメラはC-末端システインを用いて作製され、全ての最初のPCRは鋳型としてHBc149(C48S/C107S)+Cを用いて実施された。
サイレントCac8I部位をHBcの残基E64辺りに導入して、L55C変異を作製した。プライマー3及び12を用いて5'半分を増幅し、更にプライマー13及び9を用いて3'半分を増幅した。続いてこれらPCR生成物をCac8Iで消化し連結した。続いて連結物を2つの半分部分で増幅した。5'半分(プライマー3及び10を用いて作製)にはH104C変異を導入し、C48S/C107キメラの構築で先に用いたEarI部位を用いて鋳型中のC107S変異は維持された。3'半分は完全なマッチプライマー6及び9を用いた。EarIのよる消化の後で、フラグメントを連結し、プライマー3及び9で再度増幅した。この生成物をNcoI及びHindIIIで消化し、上記のように調製したpKK223-3Nでクローニングした。
キメラHBc149(C48S/C107S)A58C/L100C+C
A58C変異を導入する5'半分を導入したCac8I部位を用い上記のL55C変異と同じ方法で作製した。プライマー3及び14を用いA58C変異を作製し、一方、プライマー13及び9から作製した同じ3'PCR生成物(上記L55C/H104C参照)をこの連結に用いた。しかしながら、L100C変異を作製するために、内因性Sau96I部位を利用した。5'半分を完全マッチプライマー3及び15を用いて作製し、一方、プライマー16及び9を用いてL100C変異を3'半分に導入した。PCR生成物をSau96Iで消化して連結し、続いてプライマー3及び9で再度増幅し、更に上記のようにpKK223-3Nでクローニングした。
キメラHBc149(C48S/C107S)A69C/V89C+C
A69C変異は、プライマー3及び17並びに内因性BstNI部位を用いて5'PCRに導入した。3'PCRには完全マッチプライマー18及び9を用いた。生成物をBstNIで消化し連結した。続いて前記連結物を用いて5'PCR半分にV89C変異を作製し、前記は再度遺伝しないに天然に存在するSau96I部位を利用した(プライマー3及び11)。3'PCRは完全マッチプライマー19及び9によりなんらの変異も導入しない。生成物をSau96Iで消化し、連結し、プライマー3及び9で再増幅し、更にpKK223-3で上記のようにクローニングした。
L55C及びA58Cの場合のように、W62C変異をCac8I部位から作製した。プライマー3及び20により5'半分に前記変異を導入し、一方、L55C及びA58C変異を作製するために用いた同じ3'PCR生成物を個々で用いた。生成物をCac8Iで消化し、連結し、更に第2回目のPCRに付した。Sau96I部位を再び利用してプライマー21及び9により3'F97C変異を作製し、一方、5'プライマー3及び15は完全マッチであった。このキメラの作製に必要なPCRは、更に別のCac8I部位がF97C変異の作製時に導入できるように前記の順序で実施される必要があることを特記する。Sau96Iで消化した後、生成物を連結し、プライマー3及び9で再び増幅し、更にpKK223-3でクローニングした。
キメラHBc149(C48S/C107S)L67C/R82C+C
HBcループ内のA80−S81配列にサイレンと変異を作製することによって、NheI部位をループ内に導入し、ほんの2回のPCRでこのキメラを作製することが可能になる。5'片にプライマー3及び22を用いてL67C変異を導入し、3'片にプライマー23及び9を用いてR82Cを導入した。PCR生成物(それぞれ約245及び222塩基対)をNheIで消化し、連結した。続いて、連結物をプライマー3及び9を用いて増幅し、標準的な450塩基対フラグメントを得た。前記をNcoI及びHindIIで消化し、pKK223-3Nでクローニングした。
エンジニアリング技術により作製した5つのシステインを含むキメラの4つがHBc粒子への会合に成功した。したがってこれらの全てをイムノドミナントループに外来エピトープを受容する能力についてアッセイした。更にまた、導入システインを全くもたないキメラを会合能力(更に後で安定性能力)の比較のためのコントロールとして用いた。エピトープはHBcアミノ酸のアスパラギン酸78とプロリン79との間に挿入された。全てのエピトープが、5'端でGly及びIle(EcoRI制限部位によってコードされる)並びに3'端でGlu及びLeu(SacI制限部位によってコードされる)とフランキングするように、新規な制限部位EcoRI及びSacIを導入した。したがって、HBc149(C48S/C107S)L55C/H104C+C(会合粒子を形成することができなかった)を除く全てのシステインキメラでベクターを作製し、HBc配列のアミノ酸残基D78とP79との間に異種エピトープを受容することができた。
改変HBc149(V2及びV16)又はHBc183(V8)遺伝子(イムノドミナントループ領域に合成dsDNAフラグメントの方向性挿入を受容できる)を、PCRを用いて構築した(D78とP79との間で挿入物を受容しV149に短縮されたプラスミドをV2と呼び、追加されたシステインをV149の後にもつ同じプラスミドをV16と呼び、D78とP79との間に挿入物を受容しC183で終わるプラスミドをV8と呼んだ)。HBc149及びHBc183遺伝子は、2つのPCRプライマー対(そのうちの1つはアミノ末端を増幅し、他方はカルボキシル末端を増幅する)を用いて2つの半分部分で増幅した。V2の場合、PCR反応の生成物は249bpフラグメント(N-末端)及び243bpフラグメント(C-末端)であり、V16の場合、生成物は249bpフラグメント(N-末端)及び246bpフラグメント(C-末端)であり、V8の場合、生成物は249bpフラグメント(N-末端)及び349bpフラグメント(C-末端)である。
調製したN-末端フラグメントをNcoI及びEcoRIで消化し、C-末端フラグメントをEcoRI及びHindIIIで消化した。続いてV2、V16及びV8のフラグメント対を共通のEcoRIオーバーハングで一緒に連結した。得られたNcoI−HindIIIフラグメントを続いてpKK223-3Nベクターに連結した(前記ベクターはNcoI及びHindIIIによる消化で既に調製されてあった)。
B細胞エピトープをV2、V16及びV8プラスミドに挿入するために、適切なプラスミドをEcoRI及びSacI制限酵素で消化した。5'EcoRI及び3'SacIオーバーハングを有する合成dsDNAフラグメントを続いて挿入した。全ての事例V2、V16及びV8で、グリシン-イソロイシン(EcoRI)及びグルタミン酸-ロイシン(SacI)アミノ酸対は挿入されたB細胞エピトープとフランキングする。挿入された制限部位は下記のプライマーで下線を付されている。
HBc149/NcoI-F
5'-TTGGGCCATGGACATCGACCCTTA 配列番号:263
HBc-D78/EcoRI-R
5'-GCGGAATTCCATCTTCCAAATTAACACCCAC 配列番号:264
HBc-P79/EcoRI-SacI-R
5'-CGCGAATTCAAAAAGAGCTCCCAGCGTCTAGAGACCTAG 配列番号:265
HBc149/HindIII-R
5'-CGCAAGCTTAAACAACAGTAGTCTCCGGAAG 配列番号:266
V16
HBc149/NcoI-F
5'-TTGGGCCATGGACATCGACCCTTA 配列番号:263
HBc-D78/EcoRI-R
5'-GCGGAATTCCATCTTCCAAATTAACACCCAC 配列番号:264
HBc-P79/EcoRI-SacI-F
5'-CGCGAATTCAAAAAGAGCTCCCAGCGTCTAGAGACCTAG 配列番号:265
HBc149+C/HindIII-R
5'-CGCAAGCTTACTAGCAAACAACAGTAGTCTCCGGAAG 配列番号:267
V8
HBc149/NcoI-F
5'-GGGCCATGGACATCGACCCTTA 配列番号:263
HBc-D78/EcoRI-R
5'-GCGGAATTCCATCTTCCAAATTAACACCCAC 配列番号:264
HBc-P79/EcoRI-SacI-F
5'-CGCGAATTCAAAAAGAGCTCCCAGCGTCTAGAGACCTAG 配列番号:265
HBc183/HindIII-R
5'-GGAAAGCTTACTAACATTGAGATTCCCG 配列番号:268
システイン変異がループに近いために、特にキメラHBc149(C48S/C107S)L76C/R82C+Cのためにプライマーセットをデザインする必要があったが、一方、他の全てのキメラは同じプライマーセットを用いた(以下の表2及び表3)。5'半分は、プライマー3及び22(HBc149(C48S/C107S)L76C/R82C+Cの場合にはプライマー23)を用い、EcoRI部位を3'端に付加することにより作製した。3'半分は、プライマー24(HBc149(C48S/C107S)L76C/R82C+Cの場合にはプライマー25)及び9を用いて作製した(前記によって、これらのフラグメントにEcoRI部位及び下流のSacIが付加された)。続いて、全てのPCR生成物をEcoRIで消化し、各々対応する半分と連結し、プライマー3及び9を用いて再び増幅した。続いて、これらの生成物をNcoI及びHindIIIで消化し、準備したプラスミドpKK223-3Nでクローニングした。各クローンの配列は、上記で述べたように自動DNA配列決定によって実証した。
オリゴヌクレオチド配列は、アニールさせたときに上記のように調製したシステイン操作ベクターに連結することができる一本鎖粘着端を上部鎖及び下部鎖が保有するようにデザインされた。オリゴ鎖アニーリングは、ミニサイクラー(Mj Research)を用いて、等モル量のオリゴ(10μMの各上部及び下部オリゴ)を添加し、95℃で5分加熱し、続いて75℃まで毎分1℃ずつ下げることによって実施した。アニールさせたオリゴ含有溶液を続いてTE緩衝液で1:20に希釈した。この方法をプライマー対、26及び27、28及び29、30及び31、並びに32及び33について実施した。各ジスルフィドベクターは、EcoRI及びSacIによる消化、続いて生じた小フラグメントからベクターを除いて調製した。続いてアニールさせたオリゴの各々の1μLを用意したベクターと連結した。更にクローンの配列は配列決定によって実証した、
配列を確認した後、キメラでpREP4(Qiagen)(lacリプレッサーを発現するプラスミド)とともに大腸菌のBLR株(Novagen, Madison, WI)を同時形質導入した。細胞を塩化カルシウム調製物によってコンピテントにした(Sambrook et al. Molecular Cloning: a laboratory manual, 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)。プラスミドpKK223-3はtacプロモーターを保有するがlacリプレッサーはコードせず、したがってこのタンパク質はpREP4によってtransで供給され、IPTGの添加によって誘発されるまでHBc遺伝子の発現を抑制する。形質転換体は、いずれのプラスミドの消失も防ぐために50μg/Lのアンピシリン(pKK223-3はアンピシリン耐性マーカーを有する)及び10μg/Lのカナマイシン(pREP4はカナマイシン耐性マーカーを有する)を補充したLBプレートで平板培養される。
続いて、同じ濃度の抗生物質を含む3mLのTBドライ培地(Doc Frugal, San Diego, CA)の開始培養へ形質転換体を釣り上げ、一晩増殖させた。続いて各開始培養の1mLを用いて同じ抗生物質を含む500mLのTBドライ培地に接種し、0.6−1.0のOD600まで培養を増殖させ、続いて25μMのIPTGで誘発した。培養を16−24時間増殖させ、15000XGで10分遠心して細胞を採集した。
上清を廃棄し、ペレットを5mLの溶解緩衝液に再懸濁させ、続いて透析チューブ(分子量カット8000ダルトン)に移した。サンプルを1Lの溶解緩衝液に対して少なくとも3時間透析し、0.45μmの注射筒フィルターでろ過し、続いて、2.5X100cmのXK26カラムに充填してアクタプライム(Akta Prime)FPLC(全てPharmacia Biotech)につないだセファロースCL-4B樹脂を用いてサイズ排除クロマトグラフィーに付した。
カラムは20mMのリン酸ナトリウム(pH6.8)及び0.02%アジ化ナトリウムで予備平衡化し、同じ緩衝液約800mLを1.5mL/分の流速でポンプでカラムに通し、6−8mLの分画を採集した。粒子の生成は、カラムを通過する物質の最初の狭い第一のピークに続く特徴的なピークについて溶出プロフィールを調べることによって評価した。
続いてプールを0.45μmのフィルターに通し、更にHPLC(PerSeptive BiosystemsのBioCad、 Framingham, MA)の溶媒ラインからMonoQ(登録商標)HR10/10陰イオン交換カラム(Pharmacia Biotech)にロードした。カラムは、25mMトリス-HCl及び0.02%のアジ化ナトリウムで平衡化させ、サンプルをいったんロードしたら同じ緩衝液で洗浄した。粒子は、25mMのトリス-HCl中の0−3MのNaClの直線状グラディエントで溶出させた。ピーク分画をプールし、飽和硫酸アンモニウムで1:1に希釈して再沈殿させ、穏やかに1時間4℃で攪拌し、続いて17500XGで30分遠心した。得られたペレットを20mMのリン酸ナトリウム(pH6.8)の最小容積に再懸濁させ、透析チューブに移し、同じ緩衝液に対して十分に透析した。続いて、最終的な精製サンプルを0.45μmのフィルターに通し、前記を凍結する前に4℃で24時間インキュベート(維持)した。タンパク質濃度はBCAアッセイ(Sigma(St. Louis, MO)から入手できる)によって決定した。
精製タンパク質は、それらの天然の配座にある粒子を調べるために2つの方法(分析的サイズ排除及びエルマン(Ellman's)テスト)を用いて性状を決定した(非還元条件下での変性粒子を調べたもの(非還元SDS-PAGE)、及びモノマーの完全性を調べたもの(還元SDS-PAGE))。
粒子状対非粒子状物質を評価するために、精製タンパク質サンプルを解析用サイズ排除クロマトグラフィーを用いて分析した。前記の方法では、各サンプルの50−90μgをスーパーロース6HR10/30カラム(Pharmacia Biotech)上に注入し、HPLC(BioCad)又はアクタピューリファイア(Akta Purifier)(Pharmacia Biotech)のどちらかとつないだ。20mMのリン酸ナトリウム(pH6.8)をポンプで0.5mL/分の流速でカラムに通した。粒子の完全性はピークの溶出プロフィールの可視化によって評価した。この場合、約7mLの溶出位置の1つのピークの存在は完全に形成された粒子の存在である。後のピークは非粒子構造、例えばダイマー及びモノマーを示す。
ジスルフィド結合形成は、Zhengら(J. Biol. Chem. 267:9422-9429 (1992))が記載した方法と類似の方法を用いて判定した。したがって、粒子は、ELISAプレートのウェルで20mMリン酸ナトリウム(pH6.8)及び0.1%SDS中で最終濃度1mg/mLに希釈された。続いて、エルマン試薬(Sigma)のストック溶液をジメチルスルホキシド(DMSO)中で200mMの濃度で作製した。続いてこの溶液を20mMリン酸ナトリウム(pH6.8)中で1:200に希釈し、HBcサンプルに最終濃度0.1mMに添加した。反応は室温で15分進行させた。プレートをスペクトラマックス(Spectramax(登録商標);Molecular Devices, Sunnyvale, CA)で412nmで読み取った。続いて比色分析を実施してジスルフィド結合形成を決定した。この場合、エルマン試薬と遊離スルフヒドリルとの反応性は黄色を生じ、サンプル中の完全なジスルフィド結合は発色を生じなかった。
ゲルは、提供されたプロトコルにしたがい200Vで30−40分泳動し、続いてシンプリーブルー=セーフステイン(SimplyBlue SafeStain(登録商標); Invitrogen, Carlsbad, CA)で染色した。非還元サンプルの架橋は、モノマー及びダイマー種の存在及びゲルの最上部にスメァとして認識することができる高分子量タンパク質の存在によって確認された。モノマーの完全性は、既知の標準物と同じ分子量(約17kDa)をもつ1本の限局バンドの存在によって確認された。
粒子の安定性は、種々の温度(4℃,室温及び37℃)で一定時間(0、3、7及び14日で分析のためにサンプルを採集)インキュベートしたサンプルについて上記の方法を用いて評価した。
2つの発現ベクター(V2.Pf1(N-MGCELDP)及びV2.Pf1(N-MGCDIDP))を調製して、N-末端システイン残基のキメラ粒子安定化能力を決定した。ベクターV2.Pf1(N-MGCELDP)を作製するために、オリゴヌクレオチド、HBc(MGCELDP)-NcoI-F及びHBc149/HindIII-Rを用いてベクターV2.pF1からハイブリッドHBc遺伝子を増幅させる。得られた528bpフラグメントをNcoI及びHindIIIで切断し、pKK-223-3N(既に同じ2つの酵素で切断されている)に挿入する。
ベクターV2.Pf1(N-MGCDIDP)を作製するために、オリゴヌクレオチド、HBc(MGCDIDP)-NcoI-F及びHBc149/HindIII-Rを用いてベクターV2.pF1からハイブリッドHBc遺伝子を増幅させる。得られた528bpフラグメントをNcoI及びHindIIIで切断し、pKK-223-3N(既に同じ2つの酵素で切断されている)に挿入する。
HBc(MGCELDP)-NcoI-F
M G C E L D P Y K E F G 配列番号:277
5'-GCGCCATGGGGTGTGAGCTCGACCCTTATAAAGAATTTGG 配列番号:278
HBc(MGCDIDP)-NcoI-F
M G C D I D P Y K E F G 配列番号:279
5'-GCGCCATGGGGTGTGACATCGACCCTTATAAAGAATTTGG 配列番号:280
T細胞エピトープをHBcキメラC-末端に融合させるために、新規なベクターを構築した。固有のEcoRI及びSacI制限部位をバリン149とHindIII部位との間に挿入し、合成dsDNAのEcoRI-HindIII(又はEcoRI-SacI)制限部位への定方向性挿入を容易にした。下記のPCRプライマー対を用いて、アミノ末端にNcoI制限部位並びにカルボキシル末端にEcoRI、SacI及びHindIII部位を有するHBc149遺伝子を増幅させた。前記PCR反応生成物(479bp)をNcoI及びHindIIIで消化し、pKK223-3NでクローニングしV7を形成した。
T細胞エピトープを挿入するために、プラスミド(V7)をEcoRI及びHindIII(又はEcoRI及びSacI)で消化し、EcoRI/HindIII(又はEcoRI/SacI)オーバーハングを有する合成dsDNAフラグメントをV7に連結した。全てのV7構築物のために、天然のHBcの最後のアミノ酸(バリン149)及び挿入されるT細胞エピトープの最初のアミノ酸を、EcoRI制限部位を形成するヌクレオチドによってコードされるグリシン-イソロイシン二ペプチド配列によって分離させた。EcoRI/SacIに挿入されるエピトープの場合、T細胞エピトープの後ろ、終止コドンの前にSacI部位によって提供される付加グルタミン酸-ロイシン残基が存在する。表示のプライマーでは制限部位に再び下線が付されている。
HBc149/NcoI-F
5'-TTGGGCCATGGACATCGACCCTTA 配列番号:263
HBc149/SacI-EcoRI-H3-R
5'-CGCAAGCTTAGAGCTCTTGAATTCCAACAACAGTAGTCTCCG 配列番号:281
V12ベクターをV2及びV7ベクターから構築する。V12ベクターは、アミノ酸78と79の間にB細胞エピトープを含むとともに、バリン149の下流にT細胞エピトープを含む。EcoRI/HindIIIに挿入されたT細胞エピトープを含むV7ベクターのカルボキシル末端を2つのPCRプライマー(HBc-P79/SacI-F及びpKK223-3/4515-32R)を用いて増幅し、SacI及びHindIII制限部位によってフランキングされたアミノ酸79−149及びT細胞エピトープに対応するdsDNAフラグメントを提供する。
前記PCR生成物をSacI及びHindIIIで切断し、続いて、同じ2つの酵素で切断して用意した所望のV2ベクターにクローニングする。前記PCRプライマーは、HBc遺伝子のアミノ酸149の後ろに存在するT細胞エピトープに関係なく、全てのV7遺伝子のカルボキシル末端の増幅に使いやすい。
制限部位には下線が付されている。
HBc-P79/SacI-F
5'-CGCGAGCTCCCAGCGTCTAGAGACCTAG 配列番号:282
pKK223-3/4515-32R
5'-GTATCAGGCTGAAAATC 配列番号:283
V2及びV7構築物のためには、対象のB細胞(V2)又はT細胞(V7)エピトープをコードする合成dsDNAフラグメントをEcoRI/SacI制限部位に挿入する。対象のB細胞又はT細胞エピトープをコードする合成dsDNAフラグメントは、相補性の一本鎖DNAオリゴヌクレオチドを等モル濃度で混合し、95℃に5分加熱し、続いて-1℃/分の速度で室温に冷却することによって調製する。このアニーリング反応はTE緩衝液中で実施される。二本鎖DNAは、上部に示したコードされるエピトープ配列とともに下記に示されている。ポンド記号(#)は、以下のアミノ酸配列のいくつかで終止コドンの存在を示すために用いられる。
A.インフルエンザA M2のN-末端ドメインのV2、V7、V8、V16、V34、V47、V48、V54及びV55クローニングベクターへの挿入:
V2、V7、V8、V16、V34及びV55構築物のためには、M2エピトープ(インフルエンザA M2の残基2−24;配列番号:9)をコードする合成dsDNAフラグメントをEcoRI/SacI制限部位に挿入し、一方、V47、V48及びV54構築物のためには、同一物の残基1−24をNcoI/SacI制限部位に挿入した。合成dsDNAフラグメントは相補性一本鎖DNAオリゴヌクレオチドを等モル濃度で混合し、95℃で5分加熱し、続いて-1℃/分の速度で室温に冷却することによって調製した。このアニーリング反応はTE緩衝液中で実施した。二本鎖DNAは、上部に示したコードされるエピトープ配列とともに下記に示されている。
M2タンパク質の残基1−24をコードする、17位又は19位のどちらかのシステインがセリンに変異したアニールDNAフラグメントを下記に示す。前記は上記のパートAに記載したようにV47のNcoI/SacI制限部位に挿入された。
V8及びV16構築物のためには、システインからセリンへの2つの変異を保有し、M2エピトープ(インフルエンザA M2タンパク質の残基2−24)をコードする合成dsDNAフラグメントをEcoRI/SacI制限部位に挿入し、一方、V47、V48及びV54構築物のためには、同一物の残基1−24をNcoI/SacI制限部位に挿入した。合成dsDNAフラグメントは上記のパートAに記載したように調製した。
天然のM2配列[M2(1-24/C17S)]又は変異M2配列[M2(1-24/C17S, C19S)]のどちらかの更に別のコピーを現存のM2(1-24)配列のN-末端でクローニングした。これらのクローンの構築では、付加されたコピーがただ1つのイニシエーターメチオニンを供給することができるように本来のメチオニンを除去した。PCRを用いて2つのフラグメントで構築物を作製した。2つの天然M2コピーを含むクローン[M2(1-24)/V54.M2(2-24)]を作製するために、鋳型V54.M2(1-24)を用いて、先ず初めにN-末端フラグメント(生成フラグメントは353bp)を増幅し(前記はXhoI部位(したがってグルタミン酸の後ろにアミノ酸ロイシン)をM2配列のD24の後ろに挿入する)、続いてC-末端フラグメント(生成フラグメントは538bp)を増幅した(前記はM2配列のS2のN-末端にXhoIを挿入し、したがってメチオニンを除去する)。M2の天然のコピーの後ろに変異を含むクローン[M2(1-24)/C17S、C19S/V54.M2(2-24)]を作製するために、鋳型V54.M2(1-24/C17S, C19S)を用いてN-末端フラグメントを作出し、一方、C-末端フラグメントは上記のものと同一である(生成フラグメントサイズもまた同一である。
調製されたN-末端フラグメントをBamHI及びXhoIで消化し、C-末端フラグメントはXhoI及びHindIIIで消化した。続いてフラグメント対を共通のXhoIオーバーハングで一緒に連結し、生成されたBamHI-HindIIIフラグメントを続いてpKK223-3Nベクター(BamHI及びHindIIIで予め消化されていた)に連結した。
変異M2配列の更に別の2つのコピーを現存のM2(1-24)配列のN-末端でクローニングした。繰り返せば、前記遺伝子の1位でイニシエーターメチオニンを温存して、構築物M2(1-24)/C17S, C19S/M2(2-24)/C17S, C19S/V54.M2(2-24)を得た。更に繰り返せば、前記クローンは2つのPCRフラグメントで生成された。鋳型V54.M2(1-24/C17S, C19S)を用いてN-末端フラグメント(生成フラグメントは353bp)を増幅した(前記はPstI部位(したがってグルタミンの後ろにアミノ酸ロイシン)を変異M2配列のD24の後ろに挿入する)。上記に由来する鋳型M2(1-24)/C17S, C19S/V54.M2(2-24)を用いて、C-末端フラグメント(生成フラグメントは613bp)を作製した(前記は変異M2配列のS2のN-末端にPstI部位を挿入し、したがってメチオニンを除去する)。
調製されたN-末端フラグメントをBamHI及びPstIで消化し、C-末端フラグメントはPstI及びHindIIIで消化した。続いてフラグメント対を共通のPstIオーバーハングで一緒に連結した。生成されたBamHI-HindIIIフラグメントを続いてpKK223-3Nベクター(BamHI及びHindIIIで予め消化されていた)に連結した。
pKK-BamHI-F
5'-CGTAGAGGATCCGGAGCTTATCGACTGCACGG 配列番号:365
M2-D24/XhoI-R
5'-GCGCTCGAGATCACTTGAATCGTT 配列番号:366
M2-XhoI/S2-R
5'-GCGCTCGAGAGCTTATTGACCGAAGTTGAAACC 配列番号:367
HBc149+C/HindIII-R
5'-CGCAAGCTTACTAGCAAACAACAGTACTCTCCGGAAG 配列番号:267
M2(1-24/C17S, C19S)/M2(2-24/C17S, C19S)/V54.M2(2-24)
pKK-BamHI-F
5'-CGTAGAGGATCCGGAGCTTATCGACTGCACGG 配列番号:365
M2-D24/PstI-R
5'-GCGCTGCAGATCACTTGAATCGTT 配列番号:368
M2-PstI/S2-F
5'-GCGCTGCAGTCTCTGCTGACCGAAG 配列番号:369
HBc149+C/HindIII-R
5'-CGCAAGCTTACTAGCAAACAACAGTAGTCTCCGGAAG 配列番号:267
183残基(完全長HBc配列)を含む本来のM2-HBc構築物(Neirynck et al. (1999) Nature Med. 5(10):1157-1163:WO99/07839)をV149まで短縮し、全遺伝子をpKK223-3発現ベクターに移した。前記を達成するために、プラスミド3453(University of Gentより提供された)を鋳型としてPCR反応で用い、523bpの生成物を得た。前記生成物を制限酵素AflIII及びHindIIIで消化し、続いてpKK223-3Nベクター(NcoI及びHindIIIで予め消化した)に連結した。
AflIII-M2-F
5'-CGCGACATGTCTCTGCTGACCG 配列番号:370
HBc-HindIII-R
5'-CGCAAGCTTAAACAACAGTAGTCTCCGGAAG 配列番号:371
部分的切端HBc粒子を発現するための発現プラスミドを調製するために、ただ1つのアミノ末端オリゴヌクレオチドPCRプライマーを(HBc149/NcoI-F)を固有のC-末端プライマーと一緒に用いた。例えば、HBc156(E.cR;CV-1600粒子)発現プラスミドを調製するために、プラーマーHBc149/NcoI-F及びHBc156(E.cR)-H3-Rを用いる。プライマーHBc149/NcoI-F及びHBc156(E.cR)-H3-Rを用いてHBc156(E.cR)+C(CV-1601粒子)発現プラスミドを調製した。用いた全てのプラーマーの配列は下記に示す。
粒子の切端及びいくつかの事例ではC-末端システイン残基の取り込みに加えて、大腸菌での発現に最適であるコドンもまた用いた。いくつかのアルギニンコドン(特にAGA及びAGG)は大腸菌ではほとんど用いられず、更に翻訳時のポリペプチド合成を失速させ、不完全な終了をもたらすことによって大腸菌でのタンパク質の効率的な発現の障害となると考えられていることは周知である。HBcの150から183の間の16のアルギニンのコドンのうち、7つは稀なAGAコドンによってコードされ、2つは非常に稀なAGGコドンによってコードされる。したがって、この実験では、全てのAGA及びAGGコドンを、大腸菌でより頻繁に用いられるコドンで置換した。
稀なアルギニンコドンの連続的な置換を可能にするために、HBc156遺伝子を先ず初めに合成し(CV−1600及びCV-1601粒子)、続いてHBc163構築物(CV-1634及びCV-1632粒子)のための鋳型として用いた。HBc163構築物はその後HBc171構築物(CV-1642及びCV-1643粒子)のための鋳型として用い、最後にHBc171構築物をアルギニンコドン最適化HBc182及びHBc183構築物のための鋳型として用いる。非最適化HBc182構築物(CV-1575)もまたコントロールのために調製した。全てのPCR生成物は制限酵素NcoI及びHindIIIで切断し、発現ベクターpKK223-3N(上記述べたように同じ酵素で既に切断されている)でクローニングした。
アミノ末端プライマー配列(NcoI制限部位は下線を付されている)は以下のとおりである:
HBc149/NcoI-F
5'-TTGGGCCATGGACATCGACCCTTA 配列番号:263
カルボキシル末端プライマー配列(HindIII制限部位は下線を付されている)は以下のとおりである:
HbC156(E.cR)-H3-R
5'-GCGAAGCTTACTAAGGGGAGCGGCCTCGTCGACGAACAACAGTAGTCTCCGG
配列番号:372
HBc156C(E.cR)-H3-R
5'-GCGAAGCTTACTAACAAGGGGAGCGGCCTCGTCGACGAACAACAGTAGT-
CTCCGG 配列番号:373
HBc163(E.Cr)-H3-R
5'-GCGAAGCTTACTAAGGCGAGGGAGTGCGCCGACGAGGGGAGCGGCCTCG
配列番号:374
HBc163C(E.cR)-H3-R
5'-GCGAAGCTTACTAACAAGGCGAGGGAGTGCGCCGACGAGGGGAGCGGCCTCG
配列番号:375
HBC171(E.cR)-H3-R
5'-GCGAAGCTTACTACGGCGATTGAGAGCGTCGACGGCGAGGCGAGGGAGT
配列番号:376
HBc171C(E.cR)-H3-R
5'-GCGAAGCTTACTAACACGGCGATTGAGAGCGTCGACGGCGAGGCGAGGGAGT
配列番号:377
HBc183(E.cR)-H3-R
5'-GCGAAGCTTACTAACATTGAGATTCCCGAGATTGAGATCGCCGGCGACGCGG-
CGATTGAGAGCGTC 配列番号:378
HBc182-H3-R
5'-GCGAAGCTTACTATTGAGATTCCCGAGATTGA 配列番号:379
HBc183-H3-R
5'-GGAAAGCTTACTAACATTGAGATTCCCG 配列番号:380
HBC149/HindIII-R
5'-CGCAAGCTTAAACAACAGTAGTCTCCGGAAG 配列番号:266
HBc149+C/HindIII-R
5'-CGCAAGCTTACTAGCAAACAACAGTAGTCTCCGGAAG 配列番号:267
表
構築物名称 配列 配列番号
HBc183 VRRRGRSPRRRTPSPRRRRSQSPRRRRSQSRESQC 381
HBc182 VRRRGRSPRRRTPSPRRRRSQSPRRRRSQSRESQ 382
HBc171(E.cR)+C VRRRGRSPRRRTPSPRRRRSQSPC 383
HBc171(E.cR) VRRRGRSPRRRTPSPRRRRSQSP 384
HBc163(E.cR)+C VRRRGRSPRRRTPSPC 385
HBc163(E.cR) VRRRGRSPRRRTPSP 386
HBc156(E.cR)+C VRRRGRSPC 387
HBc156(E.cR) VRRRGRSP 388
A.抗原性
1.粒子ELISA
精製粒子を被覆緩衝液(50mM重炭酸ソーダ、pH9.6)中で2μg/mLの濃度に希釈し、ELISAストリップのウェルを被覆した(100μL/ウェル)。前記ELISAストリップを室温で一晩インキュベートした(約18時間)。次の朝、前記ウェルをELISA洗浄緩衝液(EWB)(リン酸緩衝食塩水(PBS)、pH7.4、0.05%トゥイーン(Tween(登録商標))-20)で洗浄し、更にPBS中の3%BSAで1時間ブロックした(200μL/ウェル)。ELISAストリップを乾燥状態で-20℃で必要になるまで保存した。
粒子の抗原性を決定するために、抗血清をEWB中の1%BSAを用いて希釈し、100μL/ウェルを抗原被覆ELISAウェルに添加した。血清を1時間インキュベートし、ELISA洗浄緩衝液(上記)で洗浄し、抗マウス(IgG)-HRP(The Binding Site, San Diego, CA; HRP=セイヨウワサビペルオキシダーゼ)複合物又は他の適切な抗体を1時間用いて探索した。ELISA洗浄緩衝液で洗浄した後、前記反応物をTMブルー基質の添加によって(100μL/ウェル)可視化した。10分後に1NのH2SO4(100μL/ウェル)を添加して反応を停止させ、ELISAプレート読取装置で450nmで読み取った。
2.合成ペプチドELISA
20アミノ酸残基の合成ペプチド((NANP)5)又は24アミノ酸残基の合成ペプチドM2を被覆緩衝液(50mM重炭酸ソーダ、pH9.6)中で1μg/mLの濃度に希釈し、ELISAストリップのウェルを被覆した(100μL/ウェル)。一晩(約18時間)37℃のインキュベーターでインキュベートすることによってウェル上のペプチドを乾燥させる。次の朝、前記ウェルをELISA洗浄緩衝液(リン酸緩衝食塩水(PBS)、pH7.4、0.05%トゥイーン(Tween(登録商標))-20)で洗浄し、更にPBS中の3%BSAで1時間ブロックした(200μL/ウェル)。ELISAストリップを乾燥状態で-20℃で必要になるまで保存した。
粒子の抗原性を決定するために、抗血清(モノクローナル又はポリクローナル)をEWB中の1%BSAを用いて希釈し、100μL/ウェルをペプチド被覆ELISAウェルに添加した。血清を1時間インキュベートし、ELISA洗浄緩衝液で洗浄し、抗マウス(IgG)-HRP複合物(上記のように100μL/ウェルで)又は他の適切な抗体を1時間用いて探索し、再びELISA洗浄緩衝液で洗浄し、続いてTMブルー基質の添加によって(100μL/ウェル)可視化した。10分後に1NのH2SO4(100μL/ウェル)を添加して反応を停止させ、ELISAプレート読取装置で450nmで読み取った。
B.粒子の免疫原性
粒子の免疫原性をアッセイするために、選択アジュバント中の10又は20μgの粒子でマウスをIPで免疫し、4週間して同じアジュバント中の10μgの粒子でブースター免疫した。マウスを2、4、6及び8週で採血した。
精製粒子の280:260吸収比を決定するために、粒子を20mMのリン酸ナトリウム緩衝液(pH6.8)で約0.2mg/mLの濃度に希釈し、260及び280nmの波長で吸収値を測定した。280nmで測定された吸収を260nmの値で割って、280:260比を決定した。前記の比をいくつかのサンプル(天然粒子(HBc183)、残基149位の後ろで切端したHBc粒子(HBc149)、及び本明細書のいずれかの場所で明らかにしたいくつかのHBcキメラを含む)について得た。前記の比は下記の表に示されている。完全長粒子CV-1559は、Neirynckら(Nature Med. 5(10):1157-1163)が最初に報告した粒子調製物で、一方、完全長粒子CV-1607は同様な粒子であるが、ポリペプチドの17位及び19位のM2ポリペプチドシステイン(配列番号:9のX17及びX19)がセリン残基に変異している。
表
NT:テスト実施せず。*CV-1159はNeirynck (1999)が記載したIM2-HBcと同一である。
精製粒子は、50mMのNaPO4(pH6.8)を用いて0.5−1mg/mLの濃度に希釈し、4℃、室温又は37℃でインキュベートした。サンプルを種々の時点で採取し、SDS-PAGEサンプル緩衝液(還元型)と混合し、10%SDS-PAGEゲルで泳動した。ゲルをシンプリーブルー=セーフステイン(SimplyBlue SafeStain; Invitrogen, Carlsbad, CA)を用いて染色してから分析した。
25mLのスーパーロース(Superrose(登録商標))6HR10/30クロマトグラフィーカラム(Amersham Pharmacia #17-0537-01)及びBioCAD(登録商標)SPRINT還流クロマトグラフィーシステムを用いて、精製ハイブリッドHBc粒子の解析的ゲルろ過分析を実施した。UV検出装置を280nmの波長のモニターのために設定する。カラムは、3カラム容積(CV;約75mL)の緩衝液(20mM NaPO4(pH6.8))を流速0.50mL/分で用いて平衡化した。
分析するべき粒子を20mMのNaPO4(pH6.8)を用いて1mg/mLの濃度に希釈した。続いて200マイクロリットル(μL)のサンプルを前記カラムにロードした。流速0.50mL/分で20mMのNaPO4(pH6.8)を用いてサンプルをカラムから溶出させた。
N-末端システイン残基を含む粒子又はそのようなシステインを含まない同様な粒子を上記の方法を用いて解析した。280nmのトレースの積分はBioCAD(登録商標)ソフト(PerSeptive(登録商標))を用いて実施した。
最近、Neirynckら(Nature Med. 5(10):1157-1163 (1999)及びWO99/07839)は、M2の24アミノ酸残基の細胞外ドメインと完全長HBc粒子(HBc183)(アミノ酸残基1−4を欠く)のN-末端との融合を報告した。本明細書でIM2HBcと称する前記構築物の模式図は下記に示されている。前記模式図では前記24量体はHBcのN-末端と連結されている。
IM2HBc
MSLLTEVETPIRNEWGCRCNDSSD-HBc(5-183) 配列番号:389
ある説明例では、M2エピトープはB型肝炎コアのイムノドミナントループに挿入され、CV-1475と称される粒子は良好に発現され、そのような挿入及び精製のために以前に考察された技術を用いて精製することができた。M2エピトープの変異型(M2の天然の17位及び19位の2つのシステイン残基はアラニン残基によって置換されている)もまたイムノドミナントループで発現され(CV-1473粒子)、生じた粒子は精製された。これら2つの粒子を下記に模式的に示す。
CV-1475
HBc(1-78)-GI-SLLTEVETPIRNEWGCRCNDSSD-EL-HBc(79-149) 配列番号:390
CV-1473
HBc(1-78)-GI-SLLTEVETPIRNEWGARANDSSD-EL-HBc(79-149)-C 配列番号:391
M2のN-末端24量体エピトープがC-末端切端B型肝炎コア粒子のN-末端と融合された粒子もまた調製された。前記構築物(CV-1438)はまたN-末端プレコア配列(配列番号:259)を含んでいた。ハイブリッドタンパク質(CV-1492)の末端(この事例ではHBc遺伝子のVal-149の直後)にただ1つのシステイン残基を含む同様な構築物を調製した。これらの構築物を下記に模式的に示す。
CV-1438
MGISLLTEVETPIRNEWGCRCNDSSDELLGWLWGI-HBc(2-149) 配列番号:392
CV-1492
MGISLLTEVETPIRNEWGCRCNDSSDELLGWLWGI-HBc(2-149)-C 配列番号:393
本来のイニシエーターメチオニンからの翻訳開始を防止するために、前記残基のコドンを省略したことは特記されるべきである。EcoRI(GI)及びSacI(EL)制限部位によって付与された残基には下線が付されている。プレコア配列は下線を付されたEL残基と“-HBc(2-149)”の間に挙げられている。
SDS-PAGEによる分析によって、CV-1438モノマー構築物は、SDS-PAGEゲルで分子量コントロールとして添加されたCV-1492(HBc149を含む)、CV-1475及びCV-1473と比較して調製時に不安定であることが示された。CV-1438モノマーの不安定性は粒子の解析的ゲルろ過を用いたときは明瞭ではなかった。
CV-1475及びCV1473は両方とも、CV-1438及びCV-1492よりもわずかに小さな分子量を有すると期待された。なぜならば、前者の2つはイムノドミナントループに直接挿入されたM2エピトープを含み、したがってCV-1438及びCV-1492に存在するプレコア配列(配列番号:259)を欠くからである。期待通り、CV-1492はCV-1475及びCV-1473よりも大きかったが、CV-1438(CV-1492と同一であるが、C-末端のシステイン残基を確保している)は、明白な切断のためにCV-1475及びCV-1473より明らかに大きくはない。
HBcのN-末端(ドメインI)又はループ(ドメインII)に連結された以前に考察したM2のN-末端細胞外配列を含み、更にまた、HBcのループ(ドメインII)又はC-末端(ドメインIV)に連結されたM2タンパク質C-末端配列を含む構築物(例えば配列番号:11の配列(表A参照))もまた意図される。意図されるそのような構築物はまた、本明細書のいずれかの箇所で考察したように少なくとも1つの安定化C-末端システイン残基を含む。
V2.Pf1(N-M2(17-24/C19S))を作製するために、オリゴヌクレオチドM2(17-24/C19S)-NcoI-F及びHBc149/HindIII-Rを用いて、ベクターV2.Pf1のハイブリッドHBc遺伝子を増幅する。得られた540bpフラグメントをNcoI及びHindIIIで切断し、pKK223-3N(同じ2つの酵素によってその前に切断されている)に挿入する。
C-末端が残基149で短縮されたHBcのN-末端で、又はN-末端近くでペプチド結合したインフルエンザA M2タンパク質の残基1−24を含む、一連のHBcキメラ分子含有粒子を調製した。前記キメラタンパク質分子は種々のN-末端配列を含んでいた。前記配列はM2配列又は変種を含み、更にいくつかはC-末端システイン残基を含んでいた。
以下の表9A−9Cに挙げた全ての精製粒子は、解析用サイズ排除クロマトグラフィーによって分析して、精製に続いて粒子状構造の維持を評価した。CV-1603と称される粒子(N-末端システイン残基を含まない)は、亜粒子状構造への分解を示す証拠を提示した。その理由は、タンパク質が1500秒の範囲で溶出したからである(粒子はほぼ1000秒で溶出する)。
粒子CV-1590(天然のN-末端M2配列の2つのセリン残基がシステイン残基に変異していることを除いてCV-1603粒子と同様である)の同様な分析では、前記構築物は精製の後粒状構造を維持することが示され、溶出は約1000秒で生じ、これはハイブリッド粒子にとって典型的である(図4)。CV-1590粒子については分解の証拠は存在しなかった。
CV-1560粒子(そのキメラタンパク質は又2つのN-末端システイン残基を有する)は、前記もまた精製後に粒子状構造を有することを示したが、前記はある程度の分解も示し、安定化はCV-1590粒子ほどは強固でないことを示唆した。CV-1590とCV-1560粒子のN-末端立体配置の比較(以下の表11)によって、CV-1560粒子の2つのシステイン残基の相対的な位置は、3つのアミノ酸残基(DEL)の欠落のためにCV-1590粒子と比較して3アミノ酸残基だけシフトしていることが示された。前記は、システイン残基は、最適な架橋を可能にするためにコア遺伝子の開始部から最小限の距離であることが必要である可能性を示している。
CV-1603粒子は、精製後迅速に分解することが図4で示された。CV-1605粒子を含むHBcキメラ分子は、CV-1605の成分キメラ分子がただ1つのC-末端安定化システインを有することを除いてCV-1603粒子の分子と類似する。C-末端システイン残基のCV-1603への付加がタンパク質により高い安定性を付与することができるか否かを決定するために、CV-1605粒子の発現を誘導するプラスミドを作製した。精製に続いて、CV-1605粒子を解析的サイズ排除クロマトグラフィーを用いて分析した。
前記実験の結果によって、粒子の安定化はCV-1603粒子の場合よりも完全であるが、CV-1590粒子よりも不完全であることが示された(CV-1590粒子は2つのアミノ末端システイン残基を含みC-末端安定化システインを含まない)。顕著な量のCV-1605は粒子構造のままであったが、広い範囲にわたって溶出する亜粒子構造をもつ不均質な混合物の存在を示す証拠があった。これらの観察は、このハイブリッド粒子(CV-1603)の場合、CV-1605で見出されるようなC-末端安定化は、CV-1590粒子で見出されるN-末端安定化よりも不完全であることが示唆される。
ハイブリッド粒子のアミノ末端及びカルボキシ末端システインの安定化合体の両立性を調べるために、CV-1604粒子の発現を誘導する発現プラスミドを構築した。CV1604粒子の成分キメラ分子は、(CV-1590のように)天然のM2ポリペプチド配列に存在する2つのアミノ末端安定化システイン残基を、(CV-1605のように)C-末端安定化システインと同様に含む。CV-1604粒子の分析によって、前記粒子は精製後均質な粒子状態を維持することが示され、前記2つの安定化の方法は補完的であり、互いに協調的に用いられることを示した。
HBcのN-末端とN-末端システイン残基との間のまた別のリンカー配列をCV-1438粒子及びCV-1492粒子を用いて究明した。これら粒子は両方とも、アミノ酸配列ELLGWLWGIDI(配列番号:398)をM2融合部とHBcのアミノ酸D4との間に含んでいる。アミノ酸残基LGWLWGIDIはHBcのプレコアのアミノ酸-6からアミノ酸I3に由来し、この位置から翻訳が開始するのを防ぐためにHBcのイニシエーターコドンが欠落している(前記は本実験の妥協の産物である)。HBプレコア配列は-7位にシステインを含んでいる。
これらの粒子は、CV-1438の成分キメラ分子はHBcの149位で終了するが、CV-1492の成分キメラ分子はHBcの149位で終了し、配列番号:1のHBcに対応する150位に末端システインを含むという点でのみ相違していた。また別の方法であるが上記で考察したものと類似の方法(それによれば粒子は約10分で溶出する)を用いて解析的ゲルろ過によって分析したとき、両構築物は精製後に粒子状態であることが示された。この実験は、切端粒子のアミノ末端及びカルボキシル末端システイン安定化の両立性、並びにアミノ酸配列における実質的変動性及びN-末端システイン残基とHBc遺伝子の開始部間の距離に対する寛容性を示した。
表10
構築物番号 配列 配列番号
HBeAg SKLCLGWLWGMDID 399
CV-1438/CV-1492 MGISLLTEVETPIRNEWGCRCNDSSDELLGWLWGIDID 400
CV-1560 MSLLTEVETPIRNEWGCRCNDSSD 401
CV-1590/CV-1604/CV-1606 MSLLTEVETPIRNEWGCRCNDSSDELD 402
CV-1603/CV-1605/CV-1607 MSLLTEVETPIRNEWGSRSNDSSDELD 403
CV-1671 MSLLTEVETPIRNEWGSRCNDSSDELD 404
CV-1672 MSLLTEVETPIRNEWGCRSNDSSDELD 405
CV-1816 MSLLTEVETPIRNEWGCRCNDSSDLESLLTEVET-
PIRNEWGCRCNDSSDELD 406
CV-1817 MSLLTEVETPIRNEWGSRSNDSSDLESLLTEVET-
PIRNEWGCRCNDSSDELD 407
CV-1818 MSLLTEVETPIRNEWGSRSNDSSDLQSLLTEVET-
PIRNEWGSRSNDSSDLESLLTEVETPIRNEWGCRCNDSSDELD 408
モノクローナル抗体14C2に対する種々の粒子の抗原性をELISAを用いて調べた。それらの本来の構造で粒子が維持されていることを担保するために、ELISAプレートを粒子を捕捉するポリクローナル抗体(ウサギ)で先ず初めに被覆し、続いて14C2モノクローナル抗体又は、HBc粒子のイムノドミナントループに対して特異性を有する抗HBcモノクローナル抗体のどちらかの種々の希釈で調べた。下記の表に提示したデータは、HBcのイムノドミナントループにおけるM2eの提示は、N-末端での提示と比較して、14C2モノクローナル抗体のM2eエピトープのアクセス能力を顕著には変化させないことを示している(IM2HBc/CV-1559及びCV-1604)。これらの観察は驚くべきことではない。なぜならば、14C2は、N-末端に結合するのではなくM2eの内部領域(M2のアミノ酸8、10、11及び14)と結合することが以前に示されたからである(Zebedee et al. (1988) J. Virol. 62(8):2762-2727)。
更に、CV-1569を除く全ての粒子が抗HBcモノクローナル抗体3105に対する抗原性を維持していた。3105による認識の低下は、イムノドミナントループに挿入された配列を有する粒子について以前に観察された現象であり、これは典型的には免疫後にこれら粒子に対する抗HBc応答の低下に転化される。モノクローナル抗体3105はInstitute of Immunology(Tokyo, Japan)から購入した。
種々のM2e-HBc構築物(10μg/マウス)及び種々のアジュバントをアッセイしたいくつかの実験の要約。約1/2を腹腔投与し、約1/2を鼻内投与した。各群(14匹マウス)について、血清をプールし、抗M2e IgGサブクラス抗体の力価を決定した。結果は第二のブースター後1週間で採取した血清から得られた。IgG2a力価が104を超えるマウスについて、IgG2Aの力価は104(*)であった。
アジュバントは、ワクチンに対するそれらの免疫応答の強さ及び持続期間の強化能力が免疫応答のTh1/Th2偏向の調節能力とともにだんだんと解明されていった。多くの実験的アジュバントは研究中であるが、ミョウバンは、米国でFDA承認ワクチンの成分であるただ1つのアジュバントである。典型的にはミョウバンは免疫応答をTh2型に偏向させる(前記偏向はマウスでの高レベルのIgG1抗体産生によって示される)。
ミョウバンによって製剤化されたM2e-HBc粒子は顕著にIgG1応答を誘発するが、IgG2a及びIgG2b抗体(Th1インジケーターである)もまた誘発される。Th1型IgGサブクラスの産生を強化させるために、RC529を補充したアルヒドロゲル(Alhydrogel(登録商標))製剤粒子(RC529はコリキサ社(Corixa Corporation)が開発したMPLの合成誘導体である)をマウスでテストした。これらの実験によって、アルヒドロゲル(登録商標)製剤へのRC529の包含は、抗M2e IgG2a:IgG1比を約10倍高めて、抗M2e IgG2a力価の劇的な強化をもたらすことが明らかにされた。両群の全てのマウスが致死的攻撃から完全に防御されたが、しかしながら、アルヒドロゲル(登録商標)単独に対して、アルヒドロゲル(登録商標)+RC529で製剤化されたCV-1569で免疫したマウスで罹患率の低下(体温降下及び体重減少)が示唆された。
サイズ排除クロマトグラフィーの溶出プロフィルの分析によって、前記5つの予想システイン変異キメラのうちの4つが良好に粒子に会合した。C48及びC107のセリンへの変異は粒子会合に影響がないことを確認するために、HBc149及びHBc149(C48S/C107S)を、C-末端システイン保有ペア、HBc149+C及びHBc149(C48S/C107S)+Cとともに使用した。これらの構築物の包含はまた、粒子の安定性の比較及び変異粒子のジスルフィド結合の程度の決定のために必要であった。
全ての発現粒子を精製し、最終収量を以下に一覧表にした。粒子収量は、非操作HBc149と比較して一般的に非常に高く、導入変異は粒子会合に大きな衝撃を与えなかったことが示唆された。第1回目の粒子産生における高い成功により、キメラの全てを異種ループ挿入物を受容するように同様に改変したが、ただし不成功の粒子HBc149(C48S/C107S)L55C/H104C+Cは除外した。
表12:システイン変異を保有するキメラの精製タンパク質収量
*:この段階で粒子は典型的には75%以上純粋である。NA=会合無し
各キメラの約2mgが性状決定実験に必要であると決定された。そこで、多くの事例で、最大約50AU(半精製タンパク質25mg)を陰イオン交換カラムに適用し、過剰ローディングを回避した。したがって、最終精製タンパク質収量は、HAクロマトグラフィー工程の後で廃棄された物質量を基準に予想される収量を表す。
ジスルフィド結合形成は時間及び温度の関数であることが判明した。その天然の配座が改変操作された各粒子の解析的サイズ排除クロマトグラフィーによる分析では、4℃、室温及び37℃で実施し0、3、7及び14日で分析した2週間におよぶ安定性実験で粒子間に相違は示されなかった。与えられた粒子について全ての溶出プロフィルは実質的に同一であってので、簡潔にするために、37℃で0日及び14日(もっとも厳しい条件)のプロフィルのみが記載されている。C-末端システインを欠く2つのコントロール粒子(HBc149及びHBc(C48S/C107S))は、それらの粒子状構造を完全には保持できず、それらの溶出プロフィルは低次構造の別個の集団を示した。
粒子の架橋についての更なる解析は、粒子/タンパク質の非還元SDS-PAGEゲルへの泳動能力の判定によって評価された。ジスルフィド結合は、ほとんどの粒子(コントロールを含む)で0日目に不完全で、この実験の間中4℃で不完全のままであることが示された。モノマー及びダイマーバンドの濃度の低下、及び高次マルチマーの出現における対応する増加によって判定されるように、室温でのインキュベーションはジスルフィド結合を強化した。
重要なことには、37℃でインキュベートされた全ての粒子(C-末端非安定化コントロールを除く)が7日後に完全にジスルフィド結合された。特に注目すべきことは、C-末端安定化C48S/C107Sキメラは0日目に完全にジスルフィド結合されるようで、そのC48/C107の対応物はジスルフィド結合を生じず、前記実験期間中にはC48S/C107Sキメラが達成した同じレベルの架橋には到達しなかった。更にまた、改変操作粒子、HBc149(C48S/C107S)W62C/F97C+Cは0日目に同じ高レベルの架橋を示した。
前記安定性実験の全時点で全ての粒子について遊離チオールの存在を測定し、ジスルフィド結合形成の程度を確定した。遊離チオールはエルマン試薬と反応するが、ジスルフィド結合に必要とされるものは、エルマン試薬と反応しない。これらの実験によって、遊離チオールの存在は時間経過にしたがって減少し、37℃でインキュベートされたサンプルでは室温及び4℃でインキュベートされたサンプルと比較して加速されることが示された。前記の観察は、非還元SDS-PAGEゲル(前記ゲルでは構築物の泳動は遊離チオールのレベルの減少に比例して低下する)を用いた粒子の解析で得られた観察と一致する。
Zhengら(上掲書)の観察と一致して、野生型のC48及びC107を含む前記2つのコントロール粒子は、全ての時点及び温度で遊離チオールの存在を示し、これらのシステイン残基はほとんどが還元状態のままであることが確認された。これらのシステインがセリンに変異している対応する粒子では、遊離チオールの反応性は消失し、あらためてC61及びC150は完全にジスルフィド結合されているという事実が立証された。改変操作された粒子は精製工程の終了時に完全には架橋されなかったが、非還元SDS-PAGEゲルでの遊離モノマー及びダイマーの存在によって証明されたように、いずれも37℃7日でほとんど検出不能レベルの遊離チオールを示した。
第一に、全てのC48S/C107Sエピトープ保有粒子は、それらの野生型の対応物と類似の態様で反応し、前記の変異は粒子の会合に影響を与えないことを示したことは記載されるべきである。β-アミロイドエピトープ(前記は改変操作された非ジスルフィド粒子で安定な粒子に会合することができない)もまた4つの全ての改変操作システインベクターで会合に失敗し、システインがイムノドミナントループと架橋してモノマーをその所望の立体配置に維持することができないことを示した。ASP-1エピトープは改変操作ベクターで同様な態様を示したが、ただし付加システインをもたないコントロールベクターは低レベルの会合粒子を生成した。炭疽エピトープ(PA)(コントロール粒子で会合に失敗した)は、実際A58C/L100Cベクターでは低レベルの会合粒子を生成したが、他のベクターでは生成できなかった。最後に、インフルエンザエピトープ(高レベルの会合HBcをコントロールベクターゼ生じた)は、4つの改変操作粒子のうち2つ(L76C/R82Cキメラ及びW62C/F97Cキメラ)で中等度のレベルの会合ベクターを生成した。全てのキメラの粒子収量の要約は下記の表3に示されている。良好に会合した粒子は下線を付されている。
*:粒子はこの段階で典型的には75%以上純粋である。“HBc149(C48S/C107S)+C”は、簡潔にするために改変操作ジスルフィド粒子名から省略した。
インフルエンザの粒子セットがもっとも完全であったので、前記は安定性実験のためのただ1つの粒子組立てセットであった。精製は最適ではないようであったが(4種の粒子のうち2種の回収は非常に低かった)、前記材料を(以前に見出されたようにジスルフィド結合促進のために)37℃でインキュベートし、最初の安定性実験に用いた同じ解析方法を用いてこれら粒子の性状を調べた。最初この実験は以前に記載したように2週間実施するためにセットアップしたが、0、3及び7日で採集したサンプルがパターンの観察に十分であった。
IA(M2)2C/2Sエピトープに関する最近の研究では、ループで提示されるとき、このエピトープは切断されやすいことが判明した。したがって、N-末端配列決定は約半分で切断されたフラグメントを示し、前記は挿入エピトープ内の位置で切断されている。したがって、モノマーは単純に個々のエピトープの性質のためにループの安定化に関係なく切断されるのであろうと考えられる。他のエピトープを含むループの安定性の更なる解明が進行中である。
タンパク質モノマー当たり1つ又は2つ以上の複合事象を可能にするために、HBc担体を考案及び構築した。本明細書で意図された複合反応は、糖類、ペプチド、脂質又は糖脂質を第一アミンに結合させる。担体タンパク質CV-1843はただ1つのリジン残基を含み、前記残基は、HBcイムノドミナントループのHBc77位に存在する付加されたリジンである。リジンマイナス変異体(CV-1842)に関する実験によって、ある種のハプテン(特にペプチド)はN-末端に複合することができるが、オリゴ糖、ジアシル-LOSは複合させることができないことが示された。前記の相違はおそらくハプテンタイプの幾何学構造及び/又は親水性における相違のためであろう。この固有の合成にはヘルパーT細胞エピトープの付加は必要とされないが、ただしヘルパーT細胞エピトープは融合タンパク質として担体に複合させるか、又は前記とともに発現させることができる。
したがって、CV-1843タンパク質は、リジンコドンAAAをアルギニンコドン(CGC)で置き換えることにより7位で、リジンコドンAAGをアルギニンコドンAGGで置き換えることにより97位で、更にシステインコドン(TGT)をセリンコドン(TCT)で置き換えることのより48位及び107位でHBcコアの4つのアミノ酸変異を含んでいる。リジンコドンの1つの挿入はHBc遺伝子のアミノ酸L76とE77との間で実施された。上記の位置特異的変異導入は、出発プラスミドCV-1123をクィックチェンジ(QuickChange(登録商標))XL位置特異的変異導入キット(Stratagene)とともに用いて達成した。
各変異導入又は挿入に2つのオリゴヌクレオチドプライマーを用いた。一方のプライマーは他方の相補鎖である。全ての変異導入反応のためのオリゴヌクレオチドプライマーは、変異コドンが、基部ヌクレオチド(変異部位にもっとも近い)としてG又はCと併せて、変異コドンのどちらかの側に存在する16から20ヌクレオチドのフランキング配列と一緒に存在できるように考案された。Pfuターボ(Turbo(登録商標))DNAポリメラーゼを変異導入PCRに用い、DpnIを親DNAプラスミドの消化に用いた。
用いたプライマーセットは下記に示されている。ここで与えられた位置の本来の残基は一文字名で最初に記され、続いて置換位置の番号、続いて置換のための一文字名が記載されている。77位のリジン(K)の挿入のためのプライマーは、ただ1つの残基が前記の位置に挿入されるだけであるので本来の残基も置換残基も含んでいない。
K7R-フォワード
CCATGGACATCGACCCTTATCGCGAATTTGGAGCTACTGTGGAG 配列番号:440
K7R-リバース
CTCCACAGTAGCTCCAAATTCGCGATAAGGGTCGATGTCCATGG 配列番号:441
97位のためのプライマー
K97R-フォワード
CACTAATATGGGCCTAAGGTTCAGGCAACTCTTGTGG 配列番号:442
K97R-リバース
CCACAAGAGTTGCCTGAACCTTAGGCCCATATTAGTG 配列番号:443
48位のためのプライマー
C48S-フォワード
GCCTTAGAGTCTCCTGAGCATTGTTCACCTCACCATACTGC 配列番号:444
C48S-リバース
GCAGTATGGTGAGGTGAAGAATGCTCAGGAGACTCTAAGGC 配列番号:445
107位のためのプライマー
C107S-フォワード
GGCAACTCTTGTGGTTTCACATTTCTTGTCTCACTTTTGGAAGAG 配列番号:446
C107S-リバース
CTCTTCCAAAAGTGAGAGAAGAAATGTGAAACCACAAGAGTTGCC 配列番号:447
77位にリジン挿入のためのプライマー
K77-フォワード
CCTGGGTGGGTGTTAATTTGAAAGAAGATCCAGCGTCTAGAG 配列番号:448
K77-リバース
CTCTAGACGCTGGATCTTCTTTCAAATTAACACCCACCCAGG 配列番号:449
リコンビナントプラスミドは大腸菌BLRで増殖させ、0.5mMのIPTGで誘発し、更に一晩(約18時間)増殖させた。細胞を遠心で採集し、ミクロ液化によって溶解させた。可溶性物質を2度硫安沈殿させ、セファロースCL-4Bカラム(Amersham)にロードした。カラムから溶出した第二のピークをセラミックヒドロキシアパタイトカラムにロードし、溶出させ、硫安で再度沈殿させた。タンパク質を水に再懸濁し、解析と複合のために50mMのリン酸ナトリウム(pH6.8)に対して透析した。
CV-1843タンパク質及びCV-1123タンパク質を以下の実験に用いた。アジピン酸ジヒドラジド(ADH)誘導9274dLOSはXin-Xing Gu博士(National Institute of Health, Bethesda, MD)から供給され、2つの方法の各々によりHBcの各タイプと別々に複合させた。第一の方法は、CV-1123上の酸性残基との直接的なカルボジイミド結合であった。第二は、ADH誘導スクシンイミジル3-[2-ピリジルジチオ]プリピオンアミド(SPDP)-N-[γ-マレイミドブチリルオキシ]スクシンイミドエステル(GNBS)(販売元の指示に従って調製)を用いて7、77及び97位のリジンとの結合であった。
したがって、ADH誘導dLOSをN-スクシンイミジル-3-[2-ピリジルジチオ]プロピオネート(SPDP)と反応させ、混合ジスルフィドを生成し、更にN-[γ-マレイミドブチリルオキシ]スクシンイミドエステル(GNBS)をHBcタンパク質のN-末端アミン又はε-アミノリジンと反応させ手HBc誘導スクシンイミドエステルを生成した。SPDP混合ジスルフィドのジチオスレイトールとの反応、それに続く透析によって3-チオプロピオンヒドラジド-dLOS誘導体が提供され、前記をHBc誘導スクシンイミドエステルと反応させて所望の複合物を生成した。
上記で調製した複合物を用い、食塩水溶液又は食塩水とともにミョウバンへの複合物の予備吸着のどちらかを用いてマウスを免疫した(各群に5匹)。マウスを3回3週間離して免疫した。提示した力価は最後の追加免疫後2週間である。各投与用量は5μgの炭水化物を含んでいた。ELISA条件は文献から採用した(Sun et al. (2000) Vaccine 18(13):1264-1272)。以前から存在する力価を示した抗体クラスはIgMのみであった。全ての構築物で力価は1log高められた。
IgG2b力価はワクチンのミョウバンへの吸着を止めたときに顕著に低下した。これは炭水化物の脱アシル化又は加水分解によるものであろう(Sturgess et al. (1999) Vaccine 17(9-10):1169-1178)。いずれのマウスも測定可能な力価のIgG2aを示さなかった。IgG1誘発(Th2反応の特徴)はHBc上のより長い架橋物による免疫で減速したが、最終的には残りの動物と同じレベルまで上昇した。IgG3レベルは類似していた。
CV-1843及びCV-1842タンパク質から調製された粒子にペプチドを複合させた。前記ペプチドは、アミノ酸配列SLLTEVETPIRNEWGCRCNDSSD(配列番号:450)を有し、リンカーN-[γ-マレイミドブチリルオキシ]-スルホスクシンイミドエステル(スルホ-GMBS、Pierce Chemical Co.)を用いて複合させた。最適化後、複合の結果は所望のリジンとの結合を示し、更に下記に考察するようにアミノ末端との結合もまた示した。
したがって、CV-1843タンパク質から調製された粒子の銀染色還元SDS-PAGE分析は、約22000ダルトンの完全に還元されたHBcポリペプチド鎖のモノマーバンド、その上に1リピート(1ペプチド付加)バンド及び前記1リピートバンドの上に2リピート(2ペプチド付加)バンドを示した。約44000ダルトンの領域には、更にまた1つの主要バンド及び2つの複合バンドが存在した。CV-1842タンパク質から調製された粒子の場合、モノマー及びダイマーバンドが、モノマー及びダイマーの他に単一ポリペプチドが存在する場合のバンドのように存在した。したがって、CV-1843タンパク質から調製された粒子の場合は、前記ペプチドは7位及びN-末端の付加リジンの両者に複合されたが、リジン残基をもたないCV-1842タンパク質から調製された粒子の場合、前記ペプチドはN-末端にのみ複合された。モノマー及びダイマーは完全な還元は不能とみなされ、複合後2つの22000ダルトンのモノマーに分離する。これらの結果は、精製粒子はペプチドを前記精製粒子と複合させることができることを明瞭に示している。
本明細書に引用した特許及び論文は各々参照により本明細書に含まれる。英文中の冠詞“a”又は“an”は1つ又は2つ以上を含むことを意図する。
前述の説明及び実施例は例示的であり、限定と解されるべきではない。本発明には他の変型がなお可能であり、当業者には容易に類推されるであろう。
Claims (46)
- 長さが約600アミノ酸残基までのリコンビナントキメラB型肝炎コア(HBc)タンパク質分子であって、
(a)残基4位から約75位及び約85位から約140位のHBc配列を含み、48位及び107位のシステイン残基の一方又は両方が別の残基によって置換されているHBc分子のN-末端183アミノ酸残基の少なくとも約125のHBc配列を含み;
(b)場合によって、前記キメラのN-末端、約76位から約85位の間(HBcイムノドミナントループ中)、又はC-末端の1つ又は2つ以上にペプチド結合した異種アミノ酸残基を含み、ここで(i)前記HBcイムノドミナントループ中の配列の0から全ての残基が存在するかもしくは置換されており、更に免疫原を構成する前記1つから約245アミノ酸の異種アミノ酸残基配列、又は抗抗原若しくは複合ハプテンのための化学的に反応性のリンカー残基を構成する約40残基までの配列とペプチド結合されているか、又は(ii)76位から85位のHBcの配列が存在し、更に欠落及び異種残基を含まないか、又は(iii)残基76位から85位の1つ又は2つ以上が欠如しているか又は置換されれてあり;
(c)(i)HBcプレコア配列の配列以外の配列で配列番号:1のHBc配列のN-末端からアミノ酸-20位から約+1位に対応するキメラ分子のアミノ酸位の1つから3つのシステイン残基(N-末端システイン残基)、及び(ii)前記HBc配列のC-末端残基からキメラ分子のC-末端側で更に前記キメラ分子のC-末端から約30残基内の1つから3つのシステイン残基(C-末端システイン残基)の一方又は両方を含み;
前記キメラ分子が(i)HBc配列内に約20%まで置換されたアミノ酸残基を含み、(ii)発現後に自己会合して核酸結合を実質的に含まない粒子を形成する、前記リコンビナントキメラB型肝炎コアタンパク質分子。 - 前記N-末端配列が、免疫原エピトープを含む、HBc残基2‐4の1つにペプチド結合した約75アミノ酸残基までを含む異種配列を含む、請求項1に記載のリコンビナントキメラB型肝炎コアタンパク質分子。
- 76位から85位のHBcの配列が存在し、更に欠落及び異種残基を含まない、請求項1に記載のリコンビナントキメラB型肝炎コアタンパク質分子。
- 76位から85位のHBc配列中の0から全ての残基が存在し、更にHBcにとって異種であり、異種エピトープを構成する1つから約245アミノ酸残基とペプチド結合している、 請求項1に記載のリコンビナントキメラB型肝炎コアタンパク質分子。
- 残基76から85の1つ若しくは2つ以上が欠如しているか又は置換されれている、請求項1に記載のリコンビナントキメラB型肝炎コアタンパク質分子。
- 前記C-末端配列が、HBcに対して異種である配列中に免疫原性エピトープを含む約100アミノ酸残基までを含む、請求項1に記載のリコンビナントキメラB型肝炎コアタンパク質分子。
- 76位及び82位の各々のHBc残基がシステイン残基で置換されれる、請求項1に記載のリコンビナントキメラB型肝炎コアタンパク質分子。
- HBc分子のN-末端163アミノ酸残基の少なくとも約125のHBc配列を含む、請求項1に記載のリコンビナントキメラB型肝炎コアタンパク質分子。
- 長さが約380アミノ酸残基までの、請求項1に記載のリコンビナントキメラB型肝炎コアタンパク質分子。
- HBc分子のN-末端163アミノ酸残基の少なくとも約135を含む、請求項1に記載のリコンビナントキメラB型肝炎コアタンパク質分子。
- 長さが約380アミノ酸残基までのリコンビナントキメラB型肝炎コア(HBc)タンパク質分子であって、
(a)残基4位から約75位及び約85位から約140位までのHBc配列を含み、48位及び107位のシステイン残基の一方又は両方が別の残基によって置換されれているHBc分子のN-末端163アミノ酸残基の少なくとも約125のHBc配列を含み;
(b)場合によって下記の(i)、(ii)の1つ又は2つ以上を含むか:(i)前記キメラのN-末端、HBcイムノドミナントループ、及びC-末端(前記C-末端の配列は163位から天然のHBcのC-末端までのHBcの配列以外の配列である)の1つ又は2つ以上にペプチド結合した約75残基までの異種配列、(ii)存在しているか若しくは置換されれてあって、更に免疫原を構成する約75アミノ酸残基までの前記異種配列、又は抗抗原若しくは複合ハプテンのための化学的に反応性のリンカー残基を構成する1つから約40アミノ酸残基の配列とペプチド結合している約76位から約85位までの配列の0から全ての残基;又は約76位から85位のHBcの配列が存在し、更に欠落及び異種残基を含まないか、又は残基76位から85位の1つ若しくは2つ以上が欠如しているか又は置換されており;
(c)(i)HBcプレコア配列の配列以外の配列で配列番号:1のHBc配列のN-末端からアミノ酸-20位から約+1位に対応するキメラ分子のアミノ酸位に存在するか(N-末端システイン残基)、又は(ii)HBc配列のC-末端残基からキメラ分子のC-末端側で更に前記キメラ分子のC-末端から約30残基内に存在するか(C-末端システイン残基)、又は(i)及び(ii)の両方の位置に存在する1つから3つのシステイン残基を含み;
(d)前記HBc配列内に約20%まで置換されたアミノ酸残基を含み、更に
(e)発現後に自己会合して、採集、精製及び溶解時に280nmから260nmで0.9から約1.7の吸収比を示す粒子を形成する、前記リコンビナントキメラB型肝炎コアタンパク質分子。 - 1つから3つのC-末端システイン残基を含む、請求項11に記載のリコンビナントキメラB型肝炎コアタンパク質分子。
- HBcのN-末端163アミノ酸残基の少なくとも約135を含む、請求項11に記載のリコンビナントキメラB型肝炎コアタンパク質分子。
- HBc分子のN-末端156アミノ酸残基の少なくとも約135のHBc配列を含む、請求項13に記載のリコンビナントキメラB型肝炎コアタンパク質分子。
- 76位及び82位の各々のHBcの残基が、システイン残基によって置換されている、請求項11に記載のリコンビナントキメラB型肝炎コアタンパク質分子。
- 約75残基までの前記ペプチド結合配列が、存在する、請求項11に記載のリコンビナントHBcキメラタンパク質分子。
- 約75残基までの前記ペプチド結合配列が、前記キメラのN-末端に結合している、請求項16に記載のリコンビナントHBcキメラタンパク質分子。
- 約75残基までの前記ペプチド結合配列が、前記キメラのHBcイムノドミナントループに結合して存在する、請求項16に記載のリコンビナントHBcキメラタンパク質分子。
- 約75残基までの前記ペプチド結合配列が、前記キメラのC-末端に結合している、請求項16に記載のリコンビナントHBcキメラタンパク質分子。
- 約75残基までの前記第一ペプチド結合配列が結合した位置とは異なる位置で、前記キメラのN-末端、HBcイムノドミナントループ又はC-末端と結合して存在する約75残基までの第二のペプチド結合配列を含む、請求項16に記載のリコンビナントHBcキメラタンパク質分子。
- 約75残基までの前記第一のペプチド結合配列が、B細胞エピトープを含む、請求項20に記載のリコンビナントHBcキメラタンパク質分子。
- 約75残基までの前記第二のペプチド結合配列が、T細胞エピトープを含む、請求項21に記載のリコンビナントHBcキメラタンパク質分子。
- 48位及び107位の両システイン残基が別の残基で置換されている、請求項11に記載のリコンビナントHBcキメラタンパク質分子。
- 各システインのための置換残基が、グルタミン、アスパラギン、セリン、アラニン、スレオニン及びリジンから成る群から選択される、請求項23に記載のリコンビナントHBcキメラタンパク質分子。
- 約135から約365アミノ酸残基の長さを有し、更にドメインI、II、III及びIVと称されるN-末端からの4つのペプチド結合アミノ酸残基配列ドメインを含むリコンビナントB型肝炎ウイルスコア(HBc)タンパク質キメラ分子であって、ここで、
ドメインIは約72から約150アミノ酸残基を含み、その配列は、
(i)少なくともHBcの4位から75位までの残基の配列、
(ii)48位のシステイン残基の別の残基による置換、
(iii)HBcプレコア配列の配列以外の配列において配列番号:1のHBc配列のN-末端からアミノ酸-20位から約+1に対応するキメラ分子のアミノ酸位の0から3つのシステイン残基(N-末端システイン残基)、
(iv)HBc残基2‐4の1つにペプチド結合した、約75アミノ酸残基までを含む随意の免疫原性エピトープ、
を含み;
ドメインIIは、ドメインIのHBc残基75とペプチド結合した約85アミノ酸残基までを含み、ドメインIIでは、
(i)HBcの約76位から約85位の配列中の0から全ての残基が存在しているか又は置換されており、更にHBcループとは異種で免疫原を構成する1つから約75アミノ酸残基、又は抗抗原若しくは複合ハプテンのための化学的に反応性のリンカー残基を構成する1つから約40アミノ酸残基までの配列とペプチド結合しているか、又は
(ii)76位から85位のHBcの配列が存在し、更に欠落及び異種残基の付加を含まず;
ドメインIIIは、ドメインIIの残基85にペプチド結合した86位から135位までのHBc配列であり、前記ドメインでは107位のシステインが別の残基で置換されており;
ドメインIVは、
(i)ドメインIIIの135位の残基とペプチド結合した、約136位から約163位までのHBcアミノ酸残基配列の5から約30残基、
(ii)キメラ分子のC-末端から約30残基内の0から3つのシステイン残基(C-末端システイン残基)、
(iii)165位からC-末端までのHBcに存在する配列以外の配列中の0から約75アミノ酸残基、
を含み、
HBc150位からキメラ分子のC-末端までのキメラ分子の配列は、約10より少ないアルギニン、リジン残基又は両残基の混合物を含み;
前記キメラ分子は、(i)キメラのHBc配列の約10%までのアミノ酸残基が置換されているアミノ酸残基配列を有し、(ii)ドメインI及びIVの前記0から3つのシステイン残基に由来する少なくとも1つのシステイン残基を有し、更に(iii)宿主細胞による発現時に自己会合して粒子を形成し、そのようにして形成された粒子は実質的に核酸との結合を含まず、更に48位及び107位の両方のシステイン残基を含みその他の点では同一のHBcキメラ分子から形成された粒子よりも、20mMのリン酸ナトリウム緩衝液(pH6.8)で37℃で1ヶ月間保存された後でより安定である、前記リコンビナントB型肝炎ウイルスコア(HBc)タンパク質キメラ分子。 - 1つから3つのC-末端システイン残基を含む、請求項25に記載のリコンビナントキメラB型肝炎コアタンパク質分子。
- HBcのN-末端156アミノ酸残基の少なくとも約135を含む、請求項25に記載のリコンビナントキメラB型肝炎コアタンパク質分子。
- HBc分子のN-末端149アミノ酸残基の少なくとも約135のHBc配列を含む、請求項27に記載のリコンビナントキメラB型肝炎コアタンパク質分子。
- 76位及び82位の各々のHBc残基がシステイン残基によって置換されている、請求項25に記載のリコンビナントキメラB型肝炎コアタンパク質分子。
- 約75残基までのペプチド結合配列が存在する、請求項25に記載のリコンビナントHBcキメラタンパク質分子。
- 前記約75残基までのペプチド結合配列が前記キメラのN-末端で結合している、請求項30に記載のリコンビナントHBcキメラタンパク質分子。
- 前記約75残基までのペプチド結合配列が前記キメラのHBcイムノドミナントループ内で結合して存在する、請求項30に記載のリコンビナントHBcキメラタンパク質分子。
- 前記約75残基までのペプチド結合配列が前記キメラのC-末端に結合している、請求項30に記載のリコンビナントHBcキメラタンパク質分子。
- 約75残基までの前記第一のペプチド結合配列が結合した位置とは異なる位置で、前記キメラのN-末端、HBcイムノドミナントループ又はC-末端と結合している約75残基までの第二のペプチド結合配列を含む、請求項30に記載のリコンビナントHBcキメラタンパク質分子。
- 約75残基までの前記第一のペプチド結合配列が、B細胞エピトープを含む、請求項34に記載のリコンビナントHBcキメラタンパク質分子。
- 前記B細胞エピトープが、アミノ酸残基76と85の間のHBc配列のある位置でペプチド結合し、更に76位から85位のHBc配列の少なくとも5残基が存在する、請求項35に記載のリコンビナントHBcキメラタンパク質分子。
- アミノ酸残基76と85の間のHBc配列は存在するが、前記B細胞エピトープによって中断されている、請求項36に記載のリコンビナントHBcキメラタンパク質分子。
- 約75残基までの前記第二のペプチド結合配列が、T細胞エピトープを含む、請求項35に記載のリコンビナントHBcキメラタンパク質分子。
- 前記T細胞免疫原性エピトープが、C-末端のHBcアミノ酸残基とペプチド結合している、請求項38に記載のリコンビナントHBcキメラタンパク質分子。
- 前記C-末端システイン残基の少なくとも1つが存在する、請求項39に記載のリコンビナントHBcキメラタンパク質分子。
- 前記キメラが、4位から少なくとも140位までの中断されていないHBcアミノ酸残基配列とともにHBcキメラタンパク質分子のC-末端のシステイン残基を含む、請求項25に記載のリコンビナントHBcキメラタンパク質分子。
- 前記キメラが、4位から149位までの中断されていないHBcアミノ酸残基配列を含む、請求項41に記載のリコンビナントHBcキメラタンパク質分子。
- 前記キメラが、HBcイムノドミナントループ内に存在する複合エピトープのための異種リンカー残基を含む、請求項25に記載のリコンビナントHBcキメラタンパク質分子。
- 前記複合エピトープのための異種リンカー残基が、アミノ酸残基76と85の間のHBc配列のある位置でペプチド結合し、更に76位から85位までのHBc配列の少なくとも4残基が存在する、請求項43に記載のリコンビナントHBcキメラタンパク質分子。
- アミノ酸残基76と85の間のHBc配列は存在するが、前記複合エピトープのための異種リンカー残基によって中断されている、請求項44に記載のリコンビナントHBcキメラタンパク質分子。
- 48位及び107位の各システインを置換する残基が、グルタミン、アスパラギン、セリン、アラニン、スレオニン及びリジンからなる群から独立に選択される、請求項25に記載のリコンビナントHBcキメラタンパク質分子。
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