KR101209484B1 - 인플루엔자 면역원 및 백신 - Google Patents

인플루엔자 면역원 및 백신 Download PDF

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Abstract

본원에서는 인플루엔자 M2 단백질에 대한 항체 생산을 유도하기 위한 면역원을 함유하는 키메라, 카복시-말단 절단된 B형 간염 바이러스 뉴클레오캡시드(HBc) 단백질이 기술된다. 2개 내지 4개의 복사체내의 면역원성 인플루엔자 서열은 바람직하게는 N 말단에서 또는 그 근처에서 또는 HBc 면역원성 루프 서열 내에서 발현된다. 바람직하게는 HBc 키메라는 인플루엔자 특이적 T 세포 에피토프를 포함하며, 바람직하게는 자가-조립 입자의 증진된 안정성 및 이들 키메라성 입자의 증진된 수율을 위해 조작된다. 당해 키메라의 제조 및 사용 방법 또한 개시되어 있다.
Figure R1020067011453
A형 인플루엔자 M2 폴리펩타이드, 재조합 B형 간염 바이러스 코어(HBc) 단백질 키메라 분자, 백신, 접종물, 에피토프, 면역원, 항체, 항원

Description

인플루엔자 면역원 및 백신{Influenza immunogen and vaccine}
관련 출원에 대한 상호 참조
본 출원은 2002년 2월 21일자로 출원된 출원 번호 제10/082,014호의 부분연속출원 및 2002년 2월 21일자로 출원된 출원 번호 제10/080,299호(이들은 각각 2001년 8월 15일자로 출원된 출원 일련 번호 제09/930,915호의 부분연속출원이다)의 부분연속출원으로서, 2002년 10월 21일자로 출원된 출원 제10/274,616호에 대한 우선권을 주장하는 2003년 2월 21일자로 출원된 특허 제PCT/US03/05196호에 대한 우선권을 주장하는 2003년 12월 10일자로 출원된 출원번호 제10/732,862호의 부분연속출원이다.
본 발명은 면역학 및 단백질 공학 분야의 교차점, 및 특히 A형 인플루엔자 바이러스에 의한 인플루엔자 감염의 예방에 유용한 면역원 및 백신에 관한 것이다.
헤파드나비리대(hepadnaviridae) 과는 사람에서 B형 간염을 유발할 수 있는 외피 보유 DNA-함유 동물 바이러스(HBV)이다. 헤파드나비리대 과에는 기타 포유동물의 B형 간염 바이러스, 예를 들면, 우드척{woodchuck(WHV)} 및 땅다람쥐(GSHV)의 B형 간염 바이러스 및 오리(DHV) 및 왜가리(HeHV)에서 발견되는 조류 바이러스가 포함된다. 본원에 사용된 B형 간염 바이러스(HBV)는 비포유동물 바이러스의 구체적 예에 관한 논의가 아닌 한, 조류 숙주를 감염시키는 바이러스 보다는 포유동물을 감염시키는 헤파드나비리대 과의 구성원을 지칭한다.
포유동물 B형 간염 바이러스(HBV 또는 헤파드나바이러스)의 뉴클레오캡시드 또는 코어는 바이러스의 아유형에 따라 183개 또는 185개의 아미노산 잔기 서열을 포함하는 반면, 오리 바이러스 캡시드는 262개의 아미노산 잔기를 포함한다. 몇몇의 헤파드나비리대의 B형 간염 코어 단백질 단량체는 감염된 세포 내에서 B형 간염 코어 단백질 입자(HBc 입자)로 공지된 안정한 집합체로 자가 조립된다. C-말단 절단된 HBc 입자에 대한 2가지 3차원 구조가 보고되어 있다. 소수 집단을 포함하는 제1 구조는 이량체 또는 180개의 개별 단량체 단백질로서의 HBc 아단위 단백질의 90개의 복사체를 포함하며, 주 집단을 포함하는 제2 구조는 이량체 또는 240개의 개별 단량체 단백질로서 HBc 아단위 단백질의 120개의 복사체를 함유한다. 이들 입자는 각각 T = 4 또는 T = 3 입자로 지칭되며, 여기서, "T"는 삼각측정수(trianglualr number)이다. 사람-감염 바이러스(사람 바이러스)의 이들 HBc 입자는 직경이 각각 약 30 또는 34nm이다[참조: Pumpens et al. (1995) Intervirology, 38:63-74; 및 Metzger et al.(1998) J. Gen. Viol., 79:587-590].
문헌[참조: Conway et al., (1997) Nature, 386:91-94]은 저온전자현미경으로 측정한 바와 같이, 분해능 9Å에서의 사람 HBc 입자의 구조를 기술한다. 문헌[참조: Bottcher et al. (1997), Nature, 386:88-91]은 사람 HBc 단량체에 대한 폴 리펩타이드 접힘을 기술하며 알파-나선 영역에서의 아미노산 잔기에 대한 대략의 번호인자 구조 및 이들의 연결 루프 영역 형태를 제공한다. 문헌[참조: Zheng et al., (1992) J. Biol. Chem., 267(13):9422-9429]에는 하나 이상의 시스테인이 결여된 돌연변이 단백질에 대한 이들의 연구 및 C-말단-절단 단백질을 사용한 다른 이들의 논문에 기초하여, 코어 입자 형성이 아르기닌-풍부 C-말단 도메인, 핵산의 결합 또는 이황화결합의 형성에 의존하지 않음이 보고되어있다(문헌[참조: Birnbaum et al., (1990) J. Virol. 64, 3319-3330]). 문헌[참조: Conway et al., (1997) 및 Bottcher et al., (1997)]에 의해 보고된 HBc 입자의 저분해능 구조는 문헌[참조: Wynne et al., (1999) Mol. Cell, 3(6):70-80]에 의해 보고된 T=4 입자의 3.3Å 분해능 결정 구조로 확인되었다.
B형 간염 뉴클레오캡시드 또는 바이러스 코어 단백질(HBc)은 면역화된 숙주 동물의 T 세포 반응을 자극하는 면역원성 담체 잔기로서 개시되어 왔다. 예를 들면, 미국 특허 제4,818,527호, 제4,882,145호 및 제5,143,726호를 참조한다. 당해 담체의 특히 유용한 적용은 당해 단백질의 아미노-말단(N-말단)으로부터 약 70 내지 90번의 잔기 위치에 존재하고, 보다 일반적으로는 약 75 내지 85번 위치에 위치하는 면역우세 루프의 부위에 외래 또는 이종성 B 세포 에피토프를 제시하는 이의 능력이다. 문헌[참조: Clarke et al. (1991) F. Brown et al. eds., Vaccines 91, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York, pp. 313-318].
바이러스 복제 중, HBV 뉴클레오캡시드는 복제 적격성 코어를 형성하기 위해 바이러스 RNA 프리-게놈, 바이러스 역전사효소(Pol) 및 말단 단백질(Pol로부터 유래한)과 결합한다. 뉴클레오캡시드 및 바이러스 RNA 프리-게놈 사이의 결합은 카복실-말단(C-말단)에서 아르기닌-풍부 도메인에 의해 매개된다. 이. 콜라이(E. Coli)와 같은, 바이러스 RNA 프리-게놈이 존재하지 않는 이종성 발현 시스템에서 발현하는 경우, 프로타민-유사 C-말단; 즉, 위치 150 내지 183에서의 잔기가 이. 콜라이 RNA와 결합할 수 있다. 문헌[참조: Zhang et al. (1992) JBC, 267(13) 9422-29].
HBcAg는 이종성 에피토프에 대한 담체로서 제안된 B형 간염 바이러스로부터 유래한 미립자 단백질이다. HBsAg(HBs)의 상대적 면역원성 및 상이한 유전학적 배경에서 면역 반응을 일으키는 각각의 능력은 HBcAg(HBc)와 비교되어 왔다(문헌[참조: Milich et al., Science, (1986) 234(4782): 1398-1401]). 이들 데이타는 유전학적 배경에 상관 없이 HBs에 비하여 높은 HBc의 면역원성 및 HBc에 대한 보편적 반응성을 강조한다.
예를 들면, HBc는 BALB/c 마우스에서, HBs보다 300배 이상 더 면역원성이 있으며, B10.S 및 B10.M 마우스 둘다가 HBs에 대한 비반응자임에도 불구하고, 시험된 모든 균주가 HBc에 반응을 보였다. 이들 결과는 백신 담체로서의 HBc의 적합성 및 구체적으로 이의 HBs 이상의 우수성, 이에 따른 이종성 에피토프를 운반하는 HBs과 대조적인 HBc의 선택을 재차 강조한다. HBc의 이러한 일면이 인플루엔자 백신 개발에 중요할 것으로 사료되는데, 이는 이들이 유전학적 제한 및 부적합 항체 역가의 문제에 초점을 맞추고 있기 때문이다.
HBc 담체의 다른 이점은 효능을 위해 복합 보조제를 필요로하지 않을 수 있 다는 사실이다. 이는 당해 입자의 고도의 고유한 면역원성에 기인한다. HBc-피. 베르게이(P. berghei) 입자의 면역원성 비교는 사람 사용이 승인된 백반이 IFA 또는 CFA 보다 더 효과적이었음을 나타내었다(문헌[참조: Schodel et al., J. Exp. Med., (1994) 180(3): p. 1037-46]). 당해 관찰의 중요성은 최근 SKB 말라리아 백신 후보물질의 임상 시험에서 보고된 바와 같은, 신규하고, 보다 복합적인 보조제와 관련된 독성 문제로 인해 강조된다(문헌[참조: SStoute et al., N. Engl. J. Med., [1997] 336(2): p. 86-91]).
백신 담체 잔기로서의 적용에서, HBV 뉴클레오캡시드가 숙주로부터 유래한 핵산에 결합하지 않는 것이 바람직할 수 있다. 문헌[참조: Birnbaum et al. (1990) J. Virol., 64:3319-3330])은 HBV 뉴클레오캡시드의 프로타민-유사 C-말단 도메인을 단백질의 바이러스-유사 입자로의 조립 능력을 방해하지 않으면서 결실시킬 수 있음을 나타내었다. 따라서 약 144번 위치까지 절단된 단백질, 즉, 1번 위치 내지 약 144번 위치의 HBc 서열을 포함하는 단백질은 자가 조립이 가능한 반면, 139번 잔기 이후로의 결실은 캡시드 조립을 차단한다(문헌[참조: Birnbaum et al., (1990) J. Virl., 64:3319-30]).
문헌[참조: Zlotnick et al., (1997) Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 94:9556-9561])은 입자로의 전체길이 HBc 단백질 및 절단된 HBc 단백질의 조립을 연구하였다. 전체길이 분자를 논의하는 것 외에, 이들 저자들은 48, 61 및 107번 위치의 시스테인을 각각 알라닌으로 치환하고, C-말단(150번 위치)에 시스테인 잔기를 첨가한 1번에서 149번 위치의 HBc 서열을 포함하는 절단된 단백질의 제조를 기록하였다. C-말단 머캅탄은 전자 현미경에서 표지용 금원자 금속편에 결합시키기 위해 사용하였다.
보다 최근에, 문헌[Metzger et al. (1998) J. Gen. Viol., 79:587-590]은 사람 바이러스 서열의 138번 위치의 프롤린(Pro-138 또는 P138)이 입자 형성에 필요함을 보고하였다. 이들 저자들은 또한 카복시 말단에서 142개 및 140개 잔기의 길이로 절단된 입자의 조립 능력이 영향을 받게되는 한편, 139개 및 137개 잔기의 길이가 되도록 절단하면 조립 능력이 완전히 상실됨을 보고하였다.
몇 개의 그룹은 절단 입자가 표준 B형 코어 입자에 비하여 감소된 안정성을 나타내는 것을 제시하였고(문헌[참조: Gallian et al. (1989) J. Virol., 63:4645-4652; Inada, et al. (1989) Virus Res., 14:27-48]), 이는 입자 크기의 다양성 및 정제된 제제 중의 입자 단편의 존재에 의해 명백해진다(문헌[참조: Maassen et al., (1994) Arch. Virol., 135:131-142]). 따라서, 상기한 저자 Metzger 등의 보고 이전에, 문헌[참조: Pumpens et al., (1995) Intervirology, 38:63-74])은 자가 조립에 필요한 HBc 서열에 대한 카복시 말단 경계가 아미노산 잔기 139 및 144 사이에 위치해 있으며, 처음의 2개 또는 3개의 아미노 말단 잔기를 다른 서열로 치환시킬 수 있지만, 4개 또는 11개의 아미노산 말단 잔기의 제거는 형질전환된 이. 콜라이 세포 내의 키메라 단백질의 완전한 소멸을 초래함을 언급하며 당해 문헌 보고서를 요약하였다.
다양한 삽입된 폴리펩타이드 서열을 포함하는 내부 삽입부를 보유한 재조합적으로 생산된 하이브리드 HBc 입자(당해 분야에서 HBc 키메라 입자 또는 HBc 키메 라로 지칭됨)는 이. 콜라이, 비. 서브틸리스(B. Subtilis), 백시니아(Vaccinia), 살모넬라 티피무리움(Salmonella typhimurium), 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae)를 포함하는 매우 다양한 유기체에서 이종성 발현으로 제조하여 왔다. 예를 들면, 문헌[Pumpens et al. (1995) Intervirology, 38:63-74] 및 몇 가지 조사 그룹의 논문을 언급하고 있는 본원의 참조문헌을 참조한다. 천연 HBc 입자는 또한 식물에서 생산된다(문헌[참조: Tsuda et al., 1998, Vox Sang, 74(3):148-155]).
이러한 HBc 키메라는 흔히 전자 현미경으로 분석하는 경우, 이종성 에피토프가 결여된 입자에 비하여 덜 정련된 구조를 갖는 것으로 보인다(문헌[참조: Schodel et al. , (1994) J. Exp. Med., 180:1037-1046]). 일부 경우에 C-말단 절단된 HBc 입자로의 이종성 에피토프의 삽입은 하이브리드 입자가 이종성 발현 후에 복구될 수 없도록 하는 매우 극적인 불안정화 영향력을 갖는다(문헌[참조: Schodel et al. (1994) Infect. Immunol., 62:1669-1676]). 따라서, 많은 키메라 HBc 입자는 이들이 백신 개발에 있어 문제가 될 만큼 회복 불가능하거나 매우 불량한 안정성을 나타낼 정도로 너무 불안정하기 때문에 이들을 정제 기간 동안 분열시켜 놓는다.
상기한 문헌[참조: Pumpens et al. (1995) Intervirology, 38:63-74]은 삽입된 폴리펩타이드 서열이 N-말단, C-말단 및 말단들 사이에 위치하는 입자-형성 키메라의 목록을 보고한다. 당해 문헌에 보고된 삽입 길이는 N-말단에서 24 내지 50개 잔기, 중간에서는 7 내지 43개 잔기 및 C-말단에서는 11 내지 741개 잔기이다.
문헌[참조: Kratz et al., (1999) Proc. Natl. Acad. Sci., U.S.A., 96:1915-1920]은 최근에 238개 잔기의 녹색 형광 단백질(GFP)에 내부적으로 융합된 절단 HBc 서열로 구성된 키메라 HBc 입자의 이. 콜라이 발현을 기술하였다. 당해 키메라는 HBc의 아미노산 잔기 79 및 80이 치환된 글리신-풍부 연성 링커 암(arm) 쌍이 양쪽 측면에 접해 있는 삽입된 GFP 서열을 포함한다. 이들 입자는 숙주 동물인 토끼에서 천연 GFP에 대한 항체를 효과적으로 유도하는 것으로 알려졌다.
미국 특허 제5,990,085호는 (i) 잔기 78 및 79 사이의 면역원성 루프내로 및 (ii) 카복시-말단 절단된 HBc의 잔기 144 이후에 융합된 항원성 소 인히빈 펩타이드로부터 형성된 2개의 융합 단백질을 기술하고 있다. 발현된 융합 단백질은 숙주 동물에 투여하였을 때 항-인히빈 항체의 생성을 유도하는 것으로 알려졌다. 당해 특허에 기록된 면역화 30일 후의 역가는 루프 삽입을 갖는 융합 단백질에 대해 1:3000 내지 15,000 및 잔기 144 이후로의 삽입에 대해 1:100 내지 125으로 상대적으로 낮았다.
미국 특허 제6,231,864호는 합텐에 연결된, 전략적으로 변형시킨 B형 간염 코어 단백질의 제조 및 용도를 교시한다. 변형된 코어 단백질은 합텐이 늘어진 채 연결된 화학반응성 아미노산 잔기를 포함하는 약 40개 잔기 길이의 1개의 삽입물을 포함한다.
최근 국제공개공보 제WO 01/27281호는 HBc에 대한 면역 반응이 천연 분자의 C-말단 시스테인-포함 서열의 존재 또는 부재하에 각각 Th1 반응에서 Th2 반응으로 변형될 수 있음을 교시한다. 당해 문헌은 또한 C-말단 시스테인에 의한 이황화 형 성이 입자를 안정화시키는 데 도움을 줄 수 있다는 의견을 개진한다. C-말단 시스테인의 바로 상부의 천연 HBc 서열의 몇 가지 잔기의 존재가 바람직하지만, 필수적이지는 않다. 절단된 C-말단 HBc 서열을 치환하는 데 사용될 수 있는 이러한 대안에는 C-말단 시스테인 및 HBc 이외의 것으로부터 에피토프를 정의하는 임의의 서열이 포함된다.
PCT 출원 국제공개공보 제WO 01/98333호는 C-말단 시스테인 잔기를 유지하는 천연 HBc의 C-말단에 존재하는 4개의 아르기닌 반복체 중 하나 이상의 결실을 교시한다. 당해 출원은 또한 결실된 영역을 HBc 이외의 단백질로부터의 에피토프로 치환시켜, 이렇게 형성된 당해 분자의 HBc 부분이 첨가된 에피토프에 대한 담체로서 작용할 수 있음을 교시한다.
국제공개공보 제WO 02/13765 A2호 및 제WO 02/14478 A2호에 상응하는 PCT 출원은 입자를 조립하는 키메라 단백질 내의 하나 이상의 첨가된 시스테인 잔기를 사용하여 C-말단 절단된 HBc 입자의 안정성을 성취할 수 있음을 교시한다. 이들 첨가된 시스테인 잔기는 키메라 단백질의 C-말단 또는 그 근처에 위치하는 것으로 교시되어 있다.
전체길이 HBc 입자의 핵산 결합 능력을 방해하면서 전체길이 HBc 입자의 안정성을 유지할 수 있는 구조적 특성이 헤파드나바이러스 뉴클레오캡시드 전달 시스템을 사용하는 백신 개발에 매우 유용할 것이다. 사실, 외래 에피토프에 대한 담체로서 HBc 키메라의 용도에 대한 최근 서평(문헌[참조: Adv. Virus Res., 50: 141-182(1998) Academic Press])에서 저자[Ulrich] 등은 사람 백신에서 이들 키메 라를 사용하기 위해 해결해야 할 3가지의 잠정적인 문제를 언급하고 있다. 첫번째 잠정적 문제는 키메라 백신 내의 핵산의 면역화된 숙주로의 부주의한 전달이다. 두번째 잠정적 문제는 HBc에 대한 기존의 면역성의 간섭이다. 세번째 가능한 문제는 장기간 저장에 또한 견딜 수 있는 온전한 키메라 입자의 재생가능한 제조법의 필요성에 관한 것이다.
상기한 4건의 PCT 출원은 저자[Ulrich] 등에 의해 개시된 잠정적 문제를 극복하는 데 사용할 수 있는 교시를 포함하고 있는 것으로 드러났다. 이후에 개시된 바와 같이, 본 발명은 인플루엔자에 대한 항체의 예기치 않게 높은 역가를 제공하는 또 다른 HBc 키메라를 제공하며, 다른 측면에서는 또한 HBc 키메라 안정성 문제 및 당해 작제물의 핵산 결합 능력의 실질적인 부재에 대한 해결책을 제공한다. 추가로, 고안한 재조합 키메라는 기존의 항-HBc 항체에 대해 감소된 항원성을 나타낸다.
N-말단 절단된 HBc 키메라 분자에 관한 상기한 입자 불안정성 발견에도 불구하고, 문헌[참조: Neirynck et al. , (October 1999) Nature Med. , 5 (10): 1157-1163]은 잔기 5 내지 전체길이 HBc에 융합된, 인플루엔자 M2 단백질(M2e)의 N-말단 24-잔기 부위(개시 메티오닌을 포함함)를 포함하는 HBc 키메라의 이. 콜라이 발현시에 나타난 입자 형성을 보고하였다.
Bachmann과 그의 동료(문헌[참조: Jegerlehner et al., (2002) Vaccine, 20:3104-3112])는 상기한 Neirynck 등의 것과 실질적으로 동일한 융합 작제물을, A형 인플루엔자의 M2 단백질의 외부 23-잔기(메티오닌 잔기의 생체내 제거 후)를 또 한 48번 및 107번 위치의 시스테인 잔기가 세린 잔기로 치환된 C-말단 절단된 HBc(1-149) 내의 루프 내로 조작한 라이신 잔기에 링커를 통해 커플링시킨, 미국 특허 제6,231,864호에 개시된 것과 유사한 커플링된 작제물과 비교하였다. 이들 결과는 N-말단 융합 단백질 이상으로 커플링된 작제물에 대한 항-M2 역가가 증가되고 생존율(6/6 대 0/3)이 증진되었음을 제시하였다.
앞에서 논의한 백신 적용을 위한 C-말단이 절단된 하이브리드 HBc 단백질의 사용은 증진된 발현 수준 및 결합된 이. 콜라이 RNA의 결여를 포함하여, 이들의 전체길이 대응물보다 우수한 몇 가지 이점을 제공한다. 그러나, 이종성 에피토프를 제시하도록 조작된 C-말단이 절단된 입자는 흔히 불안정하여, 발현 후 안정한 미립자 구조로의 결합 또는 정제 도중 및/또는 정제 후 비-미립자 구조 내로의 용이한 해리에 실패한 입자를 산출한다. 이러한 안정성 결여는 HBc 149번 위치까지 C-말단 절단되고 또한 A형 인플루엔자 M2 단백질의 상부 잔기 2-24를 포함하는 키메라 HBc 분자로 이루어진 입자에 의해 나타난다.
기타 문헌은 야생형 헤파드나바이러스 코어 항원에서 HBcAg 시작 코돈 상부의 시스테인 잔기가 입자 형성 방지에 직접적으로 관여함을 보고한다(문헌[참조: Schodel et al. (Jan. 15, 1993) J. Biol. Chem., 268(2):1332-1337; Wasenauer et al. (Mar. 1993) J. Virol., 67(3):1315-1322; and Nassal et al. (Jul. 1993) J. Virol., 67(7):4307-4315]). 3개의 그룹 모두 야생형 HBeAg 내에, 코어 유전자가 위치 - 30에서 상부 개시자 메티오닌으로부터 해독되는 경우 존재하는, 프리-코어 서열의 -7번 위치의 시스테인 잔기가 입자 형성을 방지하는데 관여하며, 따라서 미립자 HBcAg로부터 분비된 비미립자 HBeAg로의 전이를 촉진시킴을 보고하였다.
상기한 3개의 문헌을 기초로 하여, HBc의 개시자 메티오닌 이전 위치, 즉, 서열번호 1의 서열의 N-말단에 대하여 하나 미만의 잔기 위치에 하나 이상의 시스테인 잔기를 포함하는 것은 실질적으로 C-말단 절단된 하이브리드 입자를 안정화시키기보다는 불안정화시킬 것으로 예상될 것이다. 아래의 논의로부터 알수 있는 바와 같이, 본 발명은 이들 기대와 상반되는 결과를 제공한다.
본 발명의 개요
본 발명은 A형 인플루엔자 M2 단백질(M2e)의 세포외 도메인에 대한 항체를 유도하기 위한 헤파드나 바이러스계 면역원, 및 생리학적으로 허용되는 희석제에 분산된 면역원을 포함하는 접종물 및 백신을 고찰한다. 이후로, 명칭 "M2" 및 "M2e"는 상호교환하여 사용한다. 의도된 면역원은 재조합체 B형 간염 바이러스 코어(HBc) 키메라 단백질 분자로 이루어진 자가 조립 입자이다. 이들 분자 각각은 약 150개 내지 약 375개의 아미노산 잔기의 길이를 가지며, 서열번호 9의 6개 내지 약 24개의 잔기의 서열을 포함하며, 도메인 I, II, III 및 IV로 명명된 N-말단으로부터의 4개의 펩타이드-연결 아미노산 잔기 서열 도메인을 포함한다.
첫번째 도메인인 도메인 I은 약 75개 내지 약 160개의 아미노산 잔기를 포함한다. 당해 도메인의 서열은 적어도 HBc의 4번 위치 내지 약 75번 위치의 잔기의 서열을 포함한다. 1개 내지 3개의 시스테인 잔기는 또한 서열번호 1의 HBc의 N-말단에 대하여 약 1번 내지 -55번, 바람직하게는 약 -30번, 보다 바람직하게는 약 -20번의 키메라 분자내 위치에 존재한다[N-말단 시스테인 잔기(들)]. N-말단 시스테인 잔기는 HBc의 프리-코어 서열 외의 서열내에 존재한다. 도메인 I의 시스테인 잔기는 또한 HBc 서열의 N-말단의 약 15개 잔기에 펩타이드 결합되어 있거나 그 내부에 있는 서열번호 10의 바람직한 폴리펩타이드 X1X2X3X4X5X6X7X8TPIRNEX15Xl6Xl7Xl8Xl9X20-X21X22X23X24와 같은 서열번호 9의 A형 인플루엔자 M2 폴리펩타이드 X1X2X3X4X5X6X7X8TX10XllXl2Xl3Xl4Xl5Xl6Xl7Xl8X19X2OX21-X22X23X24의 약 6개 내지 약 24개의 잔기의 서열 2개 내지 4개, 및 HBc 잔기 1-4 중 하나 이상에 존재할 수 있으며, 아래 첨자가 있는 X 잔기는 아래에 정의되어 있다.
두번째 도메인인 도메인 II는, (i) HBc의 서열내 76번 위치 내지 85번 위치에 존재하는 0개 내지 10개의 모든 잔기가 (ii) 상기한 서열번호 9의 A형 인플루엔자 M2 폴리펩타이드의 하나 이상의 반복체를 구성하는 약 6개 내지 약 48개 잔기의 임의의 서열에 펩타이드 결합된, 도메인 I의 약 75번 잔기에 펩타이드 결합된 약 0개 내지 약 60개의 아미노산 잔기를 포함한다.
세번째 도메인, 도메인 III는 잔기 약 85번에 펩타이드 결합되어 있는 약 86번 위치 내지 약 135번 위치의 HBc 서열이다.
네번째 도메인, 도메인 IV는 (i) 도메인 III의 약 135번 위치의 잔기에 펩타이드 결합된, HBc 아미노산 잔기 서열의 위치 136번의 잔기 내지 140번과 141번 위치 내지 149번 위치의 9개 이하의 잔기, (ii) 0개 내지 3개의 시스테인 잔기, (iii) 4개 미만의 아르기닌 또는 라이신 잔기 또는 서로 인접한 이의 혼합물, 및 (iv) 164번 위치에서 C-말단까지의, HBc에 이종성인 서열, 및 바람직하게는 156번 위치에서 C-말단까지의, HBc에 이종성인 서열 내의 약 100개 이하의 아미노산 잔기를 포함한다.
당해 키메라 분자는 (i) HBc 서열내에 대략 10% 이하의 보존적으로 치환된 아미노산 잔기를 포함하고, (ii) 숙주 세포 내에서의 발현시 실질적으로 핵산에 결합하지 않는 입자로서, 당해 N-말단 시스테인 잔기(들)이 결여되어 있거나 당해 키메라 분자내에 존재하는 N-말단 시스테인 잔기가 다른 잔기로 치환되었다는 점 이외에는 동일한 동일한 HBc 키메라로부터 형성된 입자보다 형성시 더욱 안정하다.
도메인 I의 HBc 서열이 4번 위치 내지 75번 위치의 잔기에 더하여 최소한 N-말단 시스테인 잔기를 포함하는 것이 바람직하다. 추가로 당해 면역원이 도메인 IV 내에만 또는 164번 위치에서 C-말단까지의 HBc의 서열에 이종성인 아미노산 서열 내에 1개의 시스테인 잔기를 포함하는 것이 바람직하다. 이종성 서열이 A형 인플루엔자의 T 세포 에피토프를 포함하는 것이 특히 바람직하다.
기타 양태는 통상 또한 물을 함유하는 약제학적으로 허용되는 희석제 조성물 내에 용해되거나 분산된 상기한 HBc 키메라 입자를 포함하는 접종물 또는 백신을 포함한다. 포유동물 또는 조류와 같은 동물에 면역학적 유효량을 투여하는 경우, 접종물은 키메라 입자와 특이적으로 면역반응하는 항체를 유도한다. 이렇게 유도된 항체는 또한 M2 단백질의 N-말단 부위와 특이적으로 면역반응한다(이에 결합한다).
본 발명은 여러 유용성 및 이점을 가진다.
본 발명의 특히 유용한 점은 백신으로 이를 사용하면 A형 인플루엔자에 대한 상당한 항체 역가를 제공한다는 것이다.
본 발명의 이점은 사람에게 사용되도록 승인된 보조제의 도움으로 매우 높은 항체 역가가 생산된다는 것이다.
본 발명의 다른 유용성은 재조합 면역원을 형질전환된 숙주 세포를 성장시키는 널리 공지된 세포 배양 기법을 사용하여 용이하게 대량으로 제조할 수 있다는 것이다.
본 발명의 다른 이점은 당해 면역원을 널리 공지된 재조합 기법을 사용하여 용이하게 제조할 수 있다는 것이다.
본 발명의 다른 이점은 바람직한 면역원이 기타 HBc 키메라보다 높은 온도에서 우수한 안정성을 나타낸다는 것이다.
본 발명의 다른 유용성은 당해 면역원이 실질적으로 핵산을 함유하지 않다는 것이다.
추가의 이점 및 유용성은 다음의 개시내용으로부터 통상의 숙련가에게 명백해질 것이다.
본원의 일부를 형성하는 도면에서,
도 1A 및 도 1B로서 2개의 패널에 도시된 도 1은 6개의 바이러스로부터의 포유동물 HBc 단백질에 대한 6개의 공개된 서열의 배열을 제공한다. 첫번째(서열번 호 1), 사람 바이러스 서열은 ayw 아유형의 것이며, 문헌[참조: Galibert et al. (1983) Nature, 281: 646-650]에 공개되어 있고; adw 아유형의 두번째 사람 바이러스 서열(서열번호 2)은 문헌[참조: Ono et al. (1983) Nucleic Acids Res., 11(6): 1747-1757]에 개시되어 있으며; 세번째 사람 바이러스 서열(서열번호 3)은 adw2 아유형의 것이며 문헌[참조: Valenzuela et al., Animal Virus Genetics, Field et al. eds., Academic Press, New York (1980)pages 57-70]에 개시되어 있고; 4번째 사람 바이러스 서열(서열번호 4)은 문헌[참조: Pasek et al. (1979) Nature, 282: 575-579]에 개시된 adyw 아유형의 것이며, 5번째 서열(서열번호 5)은 문헌[참조: Galibert et al. (1982) J. Virol., 41 : 51-65]에 공개된 우드척 바이러스의 것이며, 6번째 포유동물 서열(서열번호 6)은 문헌[참조: Seeger et al. (1984) J. Virol., 51: 367-375]에 의해 공개된 땅다람쥐의 것이다.
도 2는 재조합체 HBc 키메라의 제조용으로 본원에 사용한 플라스미드 벡터 pKK223-3N의 제조시 시판되는 플라스미드 벡터 pKK223-3에 가해진 변형을 나타낸다. 변형된 서열(서열번호 7)은 시판되는 벡터의 서열(서열번호 8) 아래에 나타내어져 있다. 첨가된 NcoI 부위의 염기들은 소문자로 나타내었고, 첨가된 염기들은 이중 밑줄로 표시한 반면, 결실된 염기들은 대시(dash)로 나타내었다. 당해 서열의 당해 절편 내에 존재하는 2개의 제한 부위(NcoI 및 HindIII)가 나타내어져 있다.
도 3은 280nm에서의 흡광도를 종좌표 상에 나타내고 초 단위의 시간을 횡좌표 상에 나타낸 ICC-1603 입자에 대한 분석 크기 배제 크로마토그래피 용리 프로필 이다.
도 4는 도 3에 논의한 바와 같은 ICC-1590 입자에 대한 분석 크기 배제 크로마토그래피 용리 프로필이다.
도 5는 도 3에 논의한 바와 같은 ICC-1560 입자에 대한 분석 크기 배제 크로마토그래피 용리 프로필이다.
도 6은 도 3에 논의한 바와 같은 ICC-1605 입자에 대한 분석 크기 배제 크로마토그래피 용리 프로필이다.
도 7은 도 3에 논의한 바와 같은 ICC-1604 입자에 대한 분석 크기 배제 크로마토그래피 용리 프로필이다.
도 8은 도 3에 논의한 바와 같은 ICC-1438 입자에 대한 분석 크기 배제 크로마토그래피 용리 프로필이다.
도 9는 도 3에 논의한 바와 같은 ICC-1492 입자에 대한 분석 크기 배제 크로마토그래피 용리 프로필이다.
도 10은 ICC-1438 단량체 작제물(2번 레인)이 추가의 분자량 대조군으로 제공한 ICC-1492 작제물(3번 레인), HBc-149(1번 레인), ICC-1475(4번 레인) 및 ICC-1473(5번 레인)에 비하여 숙성 후 불안정함을 나타내는 입자 제조 후 환원 조건 하의 SDS-PAGE 분석의 사진이다.
2개의 패널의 도 11은 실온(RT; 도 11A) 및 37℃(도 11B)에서 각각의 칼럼 상에 나타낸 바와 같이, pH 7.2의 20mM 인산나트륨 입자 저장 완충액 중 0, 1, 2, 5 및 10mM EDTA를 사용한 안정성 연구 후, M2e 폴리펩타이드의 3개의 연속적으로 연결된 복사체를 포함하는 CV-1818 입자의 SDS-PAGE 분석의 사진을 나타내며, EDTA(1-10mM)의 첨가로 인한 절단이 없음을 보여준다. 대조군 (C)는 사용 직전 동결 저장고로부터 회수한 동일한 입자의 샘플이었다.
2개의 패널의 도 12는 도 11의 대조군의 실온(RT)에서 저장, 1.5시간 또는 3시간 동안의 가열 처리 후(도 12A) 또는 1주간 저장 후(도 12B)의, CV-1818 입자의 단량체의 감소된 단백질분해를 입증하는 SDS-PAGE 분석의 사진을 나타낸다.
2개의 패널의 도 13은 처리 직후(도 13A) 및 실온에서 1주 동안 유지한 후(도 13B) 열처리한(3시간) 입자의 분석을 나타내는 일련의 중첩 SEC 그래프를 나타낸다.
도 14는 가열 단계를 포함하는 기술된 과정(1번 레인) 및 가열 단계가 없는 기술된 과정(2번 레인)을 사용하여 정제한 후의 CV-1906 입자 단량체를 나타내는 환원성 SDS-PAGE 겔의 사진이다.
도 15는 149번 위치 이후로 절단된 HBc 입자의 N-말단에 직렬로 융합된, 발현된 M2e의 0개(1123, 1번 레인), 1개(1604, 2번 레인), 2개(1817, 3번 및 4번 레인), 및 3개의 (1818, 5번 및 6번 레인) 복사체를 함유하고, 150번 위치에 첨가된 시스테인 잔기를 포함하는 입자의 환원성 SDS-PAGE 겔 분석의 사진이다.
도 16은 도 15의 다양한 M2e-포함 HBc 키메라로 면역화시킨 마우스 또는 A형 인플루엔자 바이러스를 사용한 치사 챌린지(challenge) 후의 당해 도면에 언급된 대조군의 생존률을 나타내는 그래프이다.
도 17은 도 16의 마우스 및 A형 인플루엔자 바이러스로 챌린지한 마우스와 당해 도면에 언급한 마우스의 체온을 나타내는 그래프이다.
도 18은 A형 인플루엔자 바이러스로 챌린지한 상기한 마우스의 체중을 나타내는 그래프이다.
정의
HBc 키메라와의 관련하여 사용된 숫자는 아미노산 잔기 서열로의 첨가 또는 결실이 존재하는지의 여부와 관계 없이, 하나 이상의 잔기가 당해 서열에 첨가되었거나 결실된, 서열번호 1의 HBc ayw 아미노산 잔기 서열내 위치를 나타낸다. 따라서, HBc149는 당해 키메라가 잔기 149번에서 종결됨을 나타내는 반면, HBc149 + C150은 동일한 키메라가 서열번호 1의 서열번호에 대해 HBc 잔기 150번에 시스테인 잔기를 포함함을 나타낸다.
용어 "항체"는 항원에 특이적으로 결합할 수 있는, 면역글로불린이라 지칭되는 글리코실화 단백질 계열의 구성원인 분자를 지칭한다.
용어 "항원"은 역사적으로 항체 또는 수용체에 의해 결합된 물질을 명명하고 또한 항체의 생성을 유도하는 실재물을 명명하는데 사용되어 왔다. 보다 최근의 사용은 항원의 의미를 항체 또는 수용체에 의해 결합되는 실재물로 제한하는 반면, 용어 "면역원"은 항체 생성을 유도하거나 수용체에 결합하는 실재물에 사용된다. 본원에 논의된 실재물이 면역원성이며 항원성인 경우, 이에 대한 면역원 또는 항원으로서의 언급은 통상 이의 의도된 용도에 따라 사용된다.
"항원성 결정인자"는 항체 결합 부위 또는 T-세포 수용체에 면역학적으로 결합된 항원의 실제 구조적 부분을 지칭한다. 당해 용어는 또한 "에피토프"와 상호 교환적으로 사용된다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "접합체"는 아미노산 잔기 측쇄를 통해 담체 단백질에 작동적으로 연결된 합텐을 지칭한다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "보존적 치환"은 하나의 아미노산 잔기가 다른 생물학적으로 유사한 잔기에 의해 치환됨을 나타내기 위해 사용된다. 보존적 치환의 예에는 이소류신, 발린, 류신 또는 메티오닌과 같은 하나의 소수성 잔기의 다른 잔기로의 치환, 또는 아르기닌과 라이신 사이, 글루탐산과 아스파르트산 사이 또는 글루타민과 아스파라긴 사이 등과 같은 하나의 극성 잔기의 다른 잔기로의 치환이 포함된다.
펩타이드 서열과 관련되어 사용되는 이의 각종 문법적 형태에서 용어 "상응하는"은 기술된 펩타이드 서열이 아미노- 및 카복시-말단 중 하나 또는 그 둘 다에서 최대 3개의 아미노산 잔기가 가감되고, 폴리펩타이드 서열을 따라 특정 아미노산 잔기에 오직 보존적 치환만을 포함함을 의미한다.
본원에 사용된 용어 "도메인"은 (i) 문헌[참조: Galibert et al. , (1979) Nature, 281: 646-650]에 보고된 바와 같은 HBcAg 아유형 ayw의 위치 번호(서열번호 1)에 비교하여 번호를 매긴 잔기 위치에 의해 확인할 수 있는 재조합체 HBc 키메라 분자의 부위를 의미한다. 적어도 키메라 도메인 I, II 및 III에서의 폴리펩타이드 부위가 자연적으로 발생한 HBcAg의 상응하는 서열에 유사한 3차 형태로 존재한다고 사료된다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "융합 단백질"은 이들의 각각의 카복시- 및 아미노-말단 아미노산 잔기 사이의 펩타이드 결합에 의해 말단 대 말단(머리-대-꼬리)으로 함께 작동적으로 연결된, 정상적으로는 사실상 함께 결합된 상태로 발견되지 않는 2개 이상의 아미노산 잔기 서열을 포함하는 폴리펩타이드를 지칭한다. 본 발명의 융합 단백질은 당해 융합 단백질의 폴리펩타이드 부위와 아미노산 잔기 서열이 상응하는 폴리펩타이드와 면역반응하는 항체의 생산을 유도하는 HBc 키메라 분자이다.
본원에 사용된 바와 같은 구 "B형 간염"은 앞에서 논의한 바와 같이, 이의 최대한의 범주에서 포유동물 헤파드나비리대 과의 임의의 구성원을 지칭한다.
용어 "폴리펩타이드" 및 "펩타이드"는 본 명세서에서 상호교환적으로 사용되며, 인접한 아미노산의 알파-아미노 및 카복시 그룹 사이의 펩타이드 결합에 의해 서로 연결된 선형의 연속적 아미노산 잔기를 지칭한다. "폴리펩타이드"는 다양한 길이일 수 있으며, 중성(전하를 띄지 않은) 형태 또는 염 형태일 수 있다. 아미노산 잔기 서열이 산성 및 염기성 그룹을 포함하며, 펩타이드에 의해 제시되는 특정 이온화 상태는 펩타이드가 용액 중에 있을 경우 주위 매질의 pH 수치에 의존하거나, 펩타이드가 고체 형태인 경우 당해 펩타이드가 수득된 매질의 pH 수치에 의존함이 당해 분야에 널리 공지되어 있다. 따라서, "폴리펩타이드“ 또는 이의 동의어는 언급한 적합한 아미노산 잔기 서열을 포함할 것을 의도한다. 펩타이드 또는 폴리펩타이드는 본원에 항상 좌측에서 우측으로, 아미노-말단(N-말단)에서 카복시-말단(C-말단)의 방향으로 나타내었다.
용어 "잔기"는 구 아미노산 잔기와 교환 사용가능하다. 본원에 정의된 모 든 아미노산 잔기는 천연 형태 또는 L-형이다. 표준 폴리펩타이드 명명법(문헌[참조: J. Biol. Chem., 243, 3557-59(1969)])을 준수하여, 아미노산 잔기에 대한 약자를 다음의 상응성 표에 나타내었다.
Figure 112006040715748-pct00001
본 발명은 면역원, 및 A형 인플루엔자 바이러스에 대한 면역원을 포함하는 백신 또는 접종물을 의도한다. 당해 면역원은 도메인 I, II, III 및 IV로 명명된 N-말단으로부터 4개의 펩타이드-연결된 아미노산 잔기 서열 도메인을 포함하는 약 150개 내지 약 375개, 및 바람직하게는 약 150개 내지 약 235개의 아미노산 잔기 길이의 재조합체 B형 간염 바이러스 코어(HBc) 단백질 키메라 분자로 이루어진 입자이다. 1개 내지 3개의 시스테인 잔기가 당해 키메라의 N-말단 또는 그 근처에 존재하며 아래에 정의한 바와 같이, 서열번호 10의 것과 같은 서열번호 9의 A형 인플루엔자 M2 세포외 도메인(또는 M2e) 폴리펩타이드의 6개 내지 약 24개의 잔기를 포함하는 2개 내지 4개의 폴리펩타이드가 당해 키메라 분자에 펩타이드 결합(융합)되어 있다.
사람, 조류 및 돼지 A형 인플루엔자 바이러스의 M2e 서열은 매우 유사한 것으로 알려져 있다. 따라서, 사람 및 조류 바이러스의 잔기 1-9가 동일하며, 사람 및 돼지 바이러스의 잔기 1-7 및 9-10이 동일하다. 3종류의 바이러스 모두 2개의 시스테인 위치(17 및 19)를 공유하며 위치 22-24에서 동일한 잔기를 갖는다. 다른 위치는 M2e의 다른 위치에서 상이한 잔기를 포함할 수 있지만, 사람 서열이 3종류 모두의 바이러스에 대한 컨센서스 서열(consensus sequence)을 나타낼 정도로 사람 서열의 잔기가 상이한 유리체 내에 존재하는 것으로 밝혀졌다.
당해 면역원성 키메라 입자에서, (a) 도메인 I은 적어도 HBc의 4번 위치에서 약 75번 위치의 잔기의 서열을 포함하는 서열의 약 75개내지 약 160개의 아미노산 잔기를 포함한다. 1개 내지 3개의 시스테인 잔기(들)가 또한 서열번호 1의 HBc의 N-말단에 대하여 약 1번 내지 약 -55번, 바람직하게는 약 -30번, 보다 바람직하게는 약 -20번의 당해 키메라 분자내 위치에 존재한다[N-말단 시스테인 잔기(들)]. N-말단 시스테인 잔기(들)는 HBc의 프리-코어 서열 이외의 서열내에 존재한다.
도메인 I의 시스테인 잔기는 또한 임의로, 그러나 바람직하게는 HBc 서열의 N-말단의 약 15개의 잔기에 펩타이드-결합되어 있거나 그 내부에 있는 서열번호 9의 X1X2X3X4X5X6X7X8TX10XllXl2Xl3Xl4Xl5Xl6Xl7Xl8X19X2OX21-X22X23X24 또는 서열번호 10의 X1X2X3X4X5X6X7X8TPIRNEX15Xl6Xl7Xl8Xl9X20-X21X22X23X24와 같은 바람직한 폴리펩타이드와 같은 상기한 A형 인플루엔자 M2 폴리펩타이드의 6 내지 약 24개의 잔기의 서열 2개 내지 4개(표 4를 참조), 및 (ii) 하나 이상의 HBc 잔기 1-4에 존재할 수 있다.
이러한 A형 인플루엔자 M2 폴리펩타이드 서열에서,
잔기 X1 내지 X8은 부재하거나 존재하며, 존재하는 경우 당해 잔기들은 각각 메티오닌, 세린, 류신, 트레오닌 또는 프롤린, 글루탐산, 발린 및 글루탐산 또는 아스파르트산인, M2e 단백질 서열내에 천연적으로 존재하는 잔기이며, 단, 아래 첨자가 있는 1개의 X 잔기가 존재하는 경우, 8 이하의 더 큰 아래첨자 숫자를 갖는 임의의 나머지 아래 첨자가 있는 X가 또한 존재하고,
X10이 존재하며 이는 프롤린, 류신 또는 히스티딘이고,
X11이 존재하며 이는 이소류신 또는 트레오닌이고,
X12가 존재하며 이는 아르기닌 또는 라이신이고,
X13이 존재하며 이는 아스파라긴 또는 세린이고,
X14가 존재하며 이는 글루탐산 또는 글리신이고,
잔기 X15 및 X16은 존재 또는 부재하며, 존재하는 경우 각각 트립토판 및 글리신 또는 글루탐산이고,
잔기 X17 및 X19가 존재 또는 부재하며, 존재하는 경우 독립적으로 시스테인, 세린 또는 알라닌이고,
잔기 X18이 존재 또는 부재하며, 존재하는 경우 아르기닌 또는 라이신이고,
잔기 X20 내지 X24가 존재 또는 부재하며, 존재하는 경우 각각 아스파라긴, 글리신 또는 세린, 아스파르트산 또는 글리신, 세린, 및 아스파르트산인 M2 단백질 서열 내에 천연적으로 존재하는 잔기이며, 단, 하나의 아래 첨자를 갖는 1개의 X 잔기가 존재하는 경우, 15 이하의 더 작은 아래 첨자 숫자를 갖는 임의의 나머지 아래 첨자를 갖는 X 잔기가 또한 존재한다.
(b) 도메인 II는 약 잔기 75에 펩타이드 결합된 약 0개 내지 약 60개의 아미노산 잔기를 포함한다. 이들 서열은 (ii) 서열번호 9의 상기한 A형 인플루엔자 M2 폴리펩타이드의 6 내지 약 24 잔기의 하나 이상의 반복체를 구성하는 약 6 내지 약 48 잔기의 임의의 서열과 펩타이드 결합된 (i) HBc 76번 내지 85번 위치의 HBc 서열의 0개 내지 10개 모두의 잔기를 포함한다.
(c) 도메인 III은 약 잔기 85에 펩타이드 결합된 약 86번 위치 내지 약 135번 위치의 HBc 서열이다.
(d) 도메인 IV는 (i) 도메인 III의 135번 위치의 잔기에 펩타이드 결합된, HBc 아미노산 잔기 서열의 136번 내지 140번 위치의 잔기와 141번 내지 156번 위치의 16개 이하의 잔기, (ii) 0개 내지 3개의 시스테인 잔기, (iii) 4개 미만의 아르기닌 또는 라이신 잔기, 또는 서로 인접한 이의 혼합물, 및 (iv) 156번 위치에서 C-말단까지의, HBc에 이종성인 서열내의 약 100개 이하의 아미노산 잔기를 포함한다. 따라서, 도메인 IV는 136번 내지 140번 위치의 적어도 5개의 잔기를 포함한다.
당해 키메라 분자는 (i) HBc 서열내에 약 10% 이하의 보존적으로 치환된 아미노산 잔기를 포함하며, (ii) 숙주 세포에서의 발현시 실질적으로 핵산에 결합하지 않는 입자로서, N-말단 시스테인 잔기(들)이 결여되어 있거나 키메라 분자내에 존재하는 N-말단 시스테인 잔기가 다른 잔기로 치환되었다는 점 이외에는 동일한 HBc 키메라로부터 형성된 입자보다 형성시 더욱 안정한 입자로 자가 조립된다.
바람직한 키메라 분자는 도 1 및 서열번호 1에 도시한 바와 같이 HBc의 N-말단에 대하여 약 -50 내지 약 +1의 위치에 존재하는 시스테인 잔기를 포함한다. 네가티브 아미노산 위치의 개념은 일반적으로 HBc의 프리-코어 서열과 같은 리더 서열과 연관되어 있다. 당해 개념은 HBc의 +1 위치의 출발 메티오닌 잔기에 상응하는 키메라의 위치를 결정하기 위해 서열번호 1의 서열과 주어진 키메라 분자 서열을 단순히 정렬할 수 있는 것으로 본원에 유사하게 사용되고 있다. 아미노산 잔기 서열을 일반적으로 왼쪽에서 오른쪽으로, 그리고 N-말단에서 C-말단의 방향으로 나타내는 바와 같이, HBc 출발 메티오닌에 의해 점유된 위치의 좌측에 정렬된 키메라 분자 잔기는 네가티브 위치를 갖는다. 당해 시스테인 잔기는 출발 메티오닌의 위치에 상응하는 위치에 대해 HBc의 정렬된 출발 메티오닌의 좌측에 약 20개 잔기의 위치에서 발생할 수 있다
당해 HBc 키메라 길이의 조사에서, 당해 재조합 단백질은 약 150개 내지 약 325개의 아미노산 잔기의 길이를 가질 수 있다. 바람직하게는, 이의 길이는 약 150 내지 약 235 잔기이다. 보다 바람직하게는, 당해 길이는 약 170 내지 약 215개 잔기이다. 이러한 길이의 차이는 도메인 I, II 및 IV의 길이의 변화, 특히 존재하는 M2 폴리펩타이드의 수 및 HBc에 이종성인 C-말단 서열이 존재하는지 여부에 변화를 초래한다.
처음 3개의 아미노-말단(N-말단) 잔기의 결실 하나 이상을 포함하는 도메인 I을 갖는 HBc 키메라가 이. 콜라이 세포 내의 HBc 키메라 단백질의 완전한 소멸을 초래함이 보고되었다. 문헌[참조: Pumpens et al., (1995) Intervirology, 38: 63-74]. 반면, 인플루엔자 M2 단백질로부터의 면역원성 23-mer 폴리펩타이드를 HBc N-말단 서열에 융합시킨 최근의 연구는 천연 HBc 서열의 잔기 1-4가 치환된 경우, 수득된 융합 단백질이 입자를 형성함을 보고하였다. 문헌[참조: Neirynck et al. (October 1999) Nature Med., 5 (10): 1157-1163] 및 특허 출원 국제공개공보 제WO 9907839호. 따라서, 당해 문헌은 첨가된 아미노산 서열이 HBc의 잔기 1-5 중 하나 이상에 펩타이드 결합하는 경우 입자를 형성할 수 있는 반면, 어떠한 첨가 서열도 존재하지 않고 1개 내지 3개 이상의 잔기가 HBc의 N-말단으로부터 결실된 경우 입자는 형성되지 않음을 교시한다.
HBc의 최초의 5개의 N-말단 잔기 중 하나에 펩타이드 결합된 N-말단 서열은 HBc에 이종성인 약 40개 이하의 잔기의 서열을 포함할 수 있으며, 즉, 프리-코어 서열의 부위가 당해 키메라 분자 내에 존재할 수 있다. 예시적 서열은 이후로 논의되는 바와 같이, A형 인플루엔자 B 세포 또는 T 세포 에피토프, 및 발현 시스템을 사용한 결과로서 융합 단백질 내에 발생할 수 있는 β-갈락토시다아제와 같은 기타(이종성) 단백질의 서열을 포함한다.
도메인 I은 바람직하게는 HBc의 위치 2번, 3번 또는 4번 내지 75번 위치의 잔기의 서열을 갖는다. 도메인 I은 또한 1개 내지 3개, 바람직하게는 1개의 첨가된 시스테인 잔기(들)을 포함하며, 또한 바람직하게는 본원의 아래에 논의되어 있는 바와 같은 아미노-말단에서 펩타이드-결합된 A형 인플루엔자 M2e 단백질의 세포외 영역의 서열의 약 6개 내지 약 24개 잔기의 2개 내지 4개의 서열을 포함한다. 따라서 도메인 I은 통상적으로 적어도 HBc의 1번 위치의 하나 이상의 메티오닌 잔기의 결실을 포함하며, HBc 위치 2, 3 및 4번에 잔기의 결실을 포함할 수 있다.
1개 내지 3개의 시스테인 잔기는(들은) 서열번호 1의 HBc의 N-말단에 대하여 약 1번 내지 약 -55번, 바람직하게는 약 -30번, 보다 바람직하게는 약 -20번 위치의 키메라 분자내 위치에 존재한다[N-말단 시스테인 잔기(들)]. 따라서, 참조 위치로서 서열번호 1의 서열을 사용하여, N-말단 시스테인 잔기(들)을 서열번호 1의 위치 1의 메티오닌에 상응하는 위치, 또는 당해 위치로부터 상부로 약 50개 이하의 잔기의 위치에서 키메라 분자 내에 위치시킨다. 가장 바람직하게는, N-말단 시스테인을 서열번호 1의 위치 1에 대하여 약 1 내지 -14의 위치에 위치시킨다.
하나 이상의 N-말단 시스테인 잔기가 HBc 프리-코어 서열 외의 서열 내에 존재한다. 상기한 바와 같이, HBeAg 분자는 시스테인 잔기를 포함하는 프리-코어 서열을 포함한다. 당해 분자는 입자를 형성하지 않지만, 입자는 본원에서 목적되는 것이다. 따라서, N-말단 시스테인 잔기가 프리-코어 서열에 인접할 수 있더라도, 이러한 잔기는 프리-코어 서열 또는 당해 키메라 분자 내에 존재하지 않는다.
도메인 I은 약 160개의 잔기의 길이를 가질 수 있다. 바람직하게는, 도메인 I은 약 95 내지 약 145개의 아미노산 잔기의 길이를 가지며, 2개 내지 4개, 및 바람직하게는 3개의 서열번호 10의 서열과 같은 서열번호 9의 A형 인플루엔자 M2 폴리펩타이드 에피토프 서열을 포함하며, 이는 바람직하게는 서열번호 9의 M2 폴리펩타이드의 C-말단 19개의 잔기를 포함한다.
최근의 연구는 최초의 글루탐산 잔기로부터 상부에 있는 N-말단 잔기들(상기한 서열의 잔기 X5와 X6 사이)이 제조 및 발현 도중에, 세린 프로테아제[페닐메탄설포닐 플루오라이드(PMSF)에 의해 활성을 억제할 수 있는] 또는 메탈로프로테아제[에틸렌디아민테트라-아세트산(EDTA)에 의해 활성을 억제할 수 있는]를 포함하는 것으로 사료되는 지금까지 공지되지 않은 하나 이상의 프로테아제에 의해 절단되거나 절단될 수 있음을 제시하였다. 따라서, 일부 바람직한 양태는 하나 이상의 19-mer 또는 N-말단 잔기가 서열번호 9 내의 X6에서 글루탐산인 보다 짧은 M2 서열을 사용한다.
보다 바람직하게는, 키메라 입자의 완충 용액을 약 50℃ 내지 약 70℃의 온도로 약 1.5 내지 약 3시간 동안 가열함으로써 프로테아제의 활성을 최소화 및 제거할 수 있음을 발견하였다. 또한 프로테아제-억제량의 EDTA(예를 들면, 약 1-10mM) 또는 유사한 격리제를 함유하는 수성 조성물 내에 당해 입자를 유지시켜 당해 프로테아제의 효과를 최소화 또는 제거할 수 있다. 기타 유용한 메탈로프로테아제-억제적 격리제(킬레이트화제)의 예시적 그룹에는 2, 2'-바이피리딜, 디머캅토프로판올, 에틸렌글라이콜-비스-(2-아미노에틸)-N,N,N',N''-테트라아세트산(EGTA), 니트릴로트리아세트산(NTA), 오르토-페난트롤린, 살리실산, 트리에탄올아민(TEA), 베스타틴 및 포스포라미돈이 포함된다. 격리제 및 프로테아제는 그 밖의 정제된 입자를 크기-배제 또는 유사 칼럼 상에 통과시킨 후, 투석 또는 유사한 처리를 함으로써 당해 조성물로부터 제거할 수 있다. 당해 프로테아제는 또한 키메라 입자의 격리제-함유 수성 조성물을 유사하게 가열함으로써 다룰 수 있다.
2개 또는 3개의 M2e 서열이 서로 펩타이드 결합되어 있고, 이에 따라 연속적으로 연결되어 있는 경우, 천연 M2 서열의 위치 17 및 19 중 하나에 또는 그 둘다에 존재하는 시스테인 잔기는 부재할 수 있으며, 당해 N-말단 시스테인 잔기는 첨가된 M2 서열과 HBc 서열의 N-말단 사이에 존재할 수 있다. 바람직하게는, 당해 N-말단 시스테인이 천연 서열의 위치 17 및 19 중 하나 또는 그 둘 다에서 하나 이상의 M2 서열 내에 존재한다. 시스테인은 2개 또는 3개의 M2 서열 각각, N-말단 M2 서열(약 위치 -52번 또는 -54번에서), 3개 중 중간 서열(약 위치 -30 또는 -32에서) 또는 HBc 서열에 연결된 서열(약 위치 -6 또는 -8에서)에 존재할 수 있다. 2개 또는 3개의 M2 서열이 존재하는 경우, 1개 또는 2개의 시스테인, 바람직하게는 2개의 시스테인이 HBc 서열에 펩타이드 결합된 M2 서열, 즉, HBc 서열에 직접 결합된 또는 당해 분자의 N-말단으로부터 멀리 위치한 M2 서열 내에 존재할 수 있다.
잔기 약 75번에 펩타이드 결합된 도메인 II는 약 0개 내지 약 60개의 아미노산 잔기를 포함한다. 당해 도메인은 약 76번 위치 내지 약 85번 위치에 0개(무), 바람직하게는 4개 이상의 잔기, 보다 바람직하게는 8개 이상 내지 10개 모두의 HBc 서열 잔기를 포함한다. 도메인 II는 또한 임의로 서열번호 9의 상기한 A형 인플루엔자 M2 폴리펩타이드의 하나 이상의 반복체를 구성하는 약 6개 내지 약 48개의 잔기의 서열을 포함한다. A형 인플루엔자 M2 폴리펩타이드 서열이 존재하는 경우, 이는 바람직하게는 HBc 잔기 78번과 79번 사이에 펩타이드 결합하며, 76번 위치부터 85번 위치까지의 모든 HBc 서열이 존재한다.
당해 재조합 HBc 키메라의 도메인 I 또는 II, 또는 둘 다의 내로 삽입시키기에 바람직한 A형 인플루엔자 M2 폴리펩타이드 서열을 아래의 표 A에 열거하였다. 메티오닌 잔기(M)으로 시작하는 서열은 도메인 I의 N-말단 내로의 삽입을 위한 N-말단 서열이 되도록 설계한 반면, N-말단 M 잔기가 없는 서열은 도메인 II 내로의 삽입용으로 설계하였다.
표 A
Figure 112006040715748-pct00002
Figure 112006040715748-pct00003
Figure 112006040715748-pct00004
서열번호 9의 폴리펩타이드에서, 잔기 X1 내지 X8이 부재하거나 존재하며, 존재하는 경우 각각 메티오닌, 세린, 류신, 트레오닌 또는 프롤린, 글루탐산, 발린 및 글루탐산 또는 아스파르트산인 M2 단백질 서열내에 천연적으로 존재하는 잔기이며, 단, 아래 첨자가 있는 1개의 X 잔기가 존재하는 경우, 8 이하의 더 큰 아래 첨자 숫자를 갖는 임의의 나머지 아래 첨자가 있는 X가 또한 존재하며,
X10이 존재하며 이는 프롤린, 류신 또는 히스티딘이고,
X11이 존재하며 이는 이소류신 또는 트레오닌이고,
X12가 존재하며 이는 아르기닌 또는 라이신이고,
X13이 존재하며 이는 아스파라긴 또는 세린이고,
X14가 존재하며 이는 글루탐산 또는 글리신이고,
잔기 X15 및 X16은 존재 또는 부재하며, 존재하는 경우 각각 트립토판 및 글리신 또는 글루탐산이고,
잔기 X17 및 X19가 존재 또는 부재하며, 존재하는 경우 독립적으로 시스테인, 세린 또는 알라닌이고,
잔기 X18이 존재 또는 부재하며, 존재하는 경우 아르기닌 또는 라이신이고,
잔기 X20 내지 X24가 존재 또는 부재하며, 존재하는 경우 각각 아스파라긴, 글리신 또는 세린, 아스파르트산 또는 글리신, 세린, 및 아스파르트산인 M2 단백질 서열내에 천연적으로 존재하는 잔기이며, 단, 아래 첨자가 있는 1개의 X 잔기가 존재하는 경우, 15 이하의 더 작은 아래 첨자 숫자를 갖는 임의의 나머지 아래 첨자가 있는 X 잔기가 또한 존재한다.
서열번호 10의 유사한 폴리펩타이드에서, X1 내지 X8이 부재 또는 존재하며, 존재하는 경우 보고된 M2 단백질 서열 내에 천연적으로 존재하는 잔기, 즉, 각각 메티오닌, 세린, 류신, 트레오닌, 글루탐산 또는 아스파르트산, 발린 및 글루탐산이며, 단, 하나의 아래 첨자 X 잔기가 존재하는 경우, 8 이하의 더 높은 아래 첨자 숫자를 갖는 임의의 나머지 아래 첨자 X가 또한 존재한다. 따라서, X1이 존재하는 경우, X2 내지 X8 각각이 또한 존재한다. 유사하게는, X3이 존재하는 경우, X4 내지 X8 각각이 또한 존재하는 등이다. 반면, X8은 존재하는 보다 작은 값의 아래 첨자 숫자를 갖는 임의의 다른 나머지 X 잔기가 없이 존재할 수 있다. 잔기 X15 및 X16이 존재 또는 부재하며, 존재하는 경우 각각 트립토판 및 글리신 또는 글루탐산이다. 잔기 X17 및 X19가 존재 또는 부재하며, 존재하는 경우 독립적으로 시스테인, 세린 또는 알라닌이다. 특히 M2 폴리펩타이드 에피토프가 키메라 분자의 N-말단에 존재하는 경우, X17 및 X19 중 하나 이상이 시스테인인 것이 바람직하다. 다수의 M2e 서열이 존재하는 경우, 2개의 시스테인이 존재하고, 이들 2개의 시스테인이 HBc 서열 부위의 N-말단 잔기에 가장 근접한 M2 서열 내에 존재하는 것이 보다 바람직하다. 잔기 X18이 존재 또는 부재하며, 존재하는 경우 아르기닌 또는 라이신이다. 잔기 X20 내지 X24가 존재 또는 부재하며, 존재하는 경우, 보고된 M2 단백질 서열 내에 천연적으로 존재하는 잔기, 즉, 각각 아스파라긴, 글리신 또는 세린, 아스파르트산 또는 글리신, 세린, 세린 및 아스파르트산이며, 단, 아래 첨자가 있는 1개의 X가 존재하는 경우, 15 이하의 더 작은 아래 첨자 숫자를 갖는 임의의 나머지 X 잔기가 또한 존재한다. 따라서, 예를 들면, X23이 존재하는 경우, 잔기 X15 내지 X22도 각각 존재한다.
도메인 III은 이의 N-말단에서 약 85번 위치에 펩타이드 결합된 약 86번 위치에서 약 135번 위치의 HBc 서열을 포함한다.
네번째 도메인인 도메인 IV는 164번 위치 또는 바람직하게는 156번 위치에서 C-말단까지의, HBc에 이종성인 서열에 (i) 136번 위치 내지 140번 위치의 잔기와 141번 위치 내지 156번 위치의 HBc 아미노산 잔기 서열의 16개 이하의 잔기, 바람직하게는 도메인 III의 약 135번 위치의 잔기에 펩타이드 결합된 149번 위치까지의 9개의 잔기, (ii) 0개 내지 3개의 시스테인 잔기, 바람직하게는 1개의 시스테인 잔기, (iii) 4개 미만의 아르기닌 또는 라이신 잔기, 또는 서로 인접한 이의 혼합물, 및 (iv) 약 100개 이하의 아미노산 잔기, 바람직하게는 50개 이하의 아미노산 잔기, 보다 바람직하게는 약 25개 이하의 잔기를 포함한다.
도메인 IV가 잔기 135에 펩타이드 결합된 136번 위치 내지 149번 위치의 HBc 서열, 즉, 136번 위치의 잔기에서 시작하여 149번 위치까지 계속될 수 있는 HBc 서열의 14개 이하의 잔기를 포함하는 것이 바람직하다. 따라서, 148번 위치의 잔기가 존재하는 경우, 이는 위치 136번 내지 147번의 잔기의 서열이거나, 잔기 141이 존재하는 경우, 이는 위치 136번 내지 140번의 잔기의 서열이다.
도메인 IV는 또한 0개 내지 3개의 시스테인 잔기를 포함할 수 있으며, 이들 Cys 잔기는 키메라 분자의 카복시-말단(C-말단)의 약 30개의 잔기 내에 존재한다. 바람직하게는, 1개의 시스테인(Cys) 잔기가 존재하며, 인플루엔자 T 세포 에피토프가 도메인 IV의 일부로서 존재하지 않는 경우, 당해 Cys는 바람직하게는 카복시-말단(C-말단) 잔기로서 존재한다. 이러한 T 세포 에피토프가 존재하는 경우, 바람직한 Cys는 바람직하게는 HBc 키메라의 C-말단 마지막 5개의 잔기 내에 존재한다.
상기한 N-말단 시스테인 잔기(들)의 존재는 당해 키메라 분자의 안정한 면역원성 입자(이후에 논의되어 있는) 형성 능력의 기대치 않은 증진을 제공한다. 따라서, 당해 HBc 키메라 면역원은 분석 크기 배제 크로마토그래피에 의해 측정된 바와 같이 수집 및 초기 정제시 함께 체류하는 입자를 형성하는 경향이 있으며, 이의 세부 사항은 아래에 논의되어 있다.
당해 입자는 또한 시스테인 잔기가 결여된 유사한 키메라 입자보다 숙성시킨 후, 37℃에서 분해에 보다 안정적일 수 있다. 증진된 안정성의 이러한 후자의 유형은 샘플 완충액(환원성)에 분산시킨 입자를 사용한 15% SDS-PAGE 겔을 사용하여 측정할 수 있다. 겔을 쿠마시 블루(Coomassie Blue)를 사용하여 염색한 후, 분석한다. 이러한 유형의 안정성은 가수분해에 대항하여 나타나는 반면, 크기 배제 크로마토그래피에 의해 측정된 안정성은 초기 입자 형성에 대해 나타나는 것으로 사료된다.
부가적으로 하나 이상의 C-말단 시스테인 잔기를 포함하는 입자는 형성 및 또한 숙성시 분해에 대해 증진된 안정성을 나타내며, 이때 N- 및 C-말단 시스테인 둘 다를 포함하는 일부 입자는 일반적으로 오직 N- 또는 C-말단에 첨가된 시스테인만을 갖는 이들 입자보다 측정시 보다 큰 안정성을 나타낸다.
도메인 IV는 4개 미만의 아르기닌 또는 라이신 잔기, 또는 서로 인접한 이들의 혼합물을 포함한다. 아르기닌 및 라이신은 천연 분자의 156번 위치에서 C-말단까지 뻗어 있는 HBc의 C-말단 영역 내에 존재한다. 당해 영역은 때로 당해 분자의 "프로타민" 또는 "아르기닌-풍부" 영역으로 지칭되며, 핵산에 결합한다. 당해 HBc 키메라 분자 및 입자는 실질적으로 핵산과 결합하지 않는다.
실질적인 핵산 결합의 부재는 280 및 260nm 둘 다에서 측정한 수용액 중 입자의 흡광도를 비교함으로써, 즉, 280/260 흡광 비율로 용이하게 측정할 수 있다. 당해 입자는 단백질을 발현시키는데 사용되는 유기체의 세포내에 일반적으로 존재하는 올리고머성 및/또는 중합체성 DNA 및 RNA 종류인 핵산에 실질적으로 결합하지 않는다. 이러한 핵산은 260nm에서의 흡광도 및 280nm에서의 상대적으로 낮은 흡광도를 나타내는 반면, 당해 키메라와 같은 단백질은 260nm에서 상대적으로 덜 흡수하며 280nm에서 보다 큰 흡광도를 갖는다.
따라서, 잔기 위치 150번 내지 183번(또는 150-185)에서 아르기닌 풍부 서열을 포함하는 재조합적으로 발현된 HBc 입자 또는 키메라 HBc 입자는 약 0.8의 280nm에서의 흡광도 대 260nm에서의 흡광도의 비율(280:260 흡광도 비율)을 나타내는 반면, 4개 미만의 아르기닌 또는 라이신 잔기 또는 서로 인접한 이의 혼합물을 포함하는 입자 또는 약 HBc 잔기 140번 위치 내지 149번 위치에서 종결되는 천연 또는 키메라 서열을 갖는 입자와 같은 천연적으로 발생한 HBc의 아르기닌-풍부 핵산 결합 영역이 없는 입자는 약 1.2 내지 약 1.6의 280:260 흡광도 비율을 나타낸다.
본 발명의 키메라 HBc 입자는 실질적으로 핵산과 결합하지 않으며 약 1.2 내지 약 1.7, 보다 일반적으로는 약 1.4 내지 약 1.6의 280:260 흡광도 비율을 나타낸다. 이러한 범위는 대부분 주어진 키메라 HBc 입자의 도메인 II 및 IV 내에 존재하는 방향족 아미노산 잔기의 수에 기인한다. 이러한 범위는 또한 부분적으로는 의도되는 키메라의 도메인 IV의 Cys의 존재에 기인하며, 이의 존재는 현재는 알려지지 않은 이유로 인해서 관찰된 비율을 약 0.1 감소시킬 수 있다.
당해 키메라 Hbc 입자는 동일한 펩타이드-연결된 도메인 II, III 및 IV 서열 및 1개 내지 3개의 시스테인 잔기[N-말단 시스테인 잔기(들)]가 부재하거나 존재하는 단일 N-말단 잔기가 알라닌 잔기와 같은 다른 잔기에 의해 치환된 점 이외에는 동일한 도메인 I 서열을 포함하는 HBc 키메라로부터 형성된 입자보다 약 2주 내지 약 1달의 기간 동안 37℃에서 수성 완충액에서 보다 안정적이다.
따라서, 예를 들면, 2개의 시스테인 잔기를 포함하는 도메인 I내의 A형 M2e 폴리펩타이드를 포함하는 입자[예를 들면, ICC-1590 입자]는 N-말단 M2 변이체 서열이 시스테인 잔기 대신 세린 잔기를 포함하는 키메라 분자로부터 조립되었다는 점 이외에는 동일한 입자[ICC-1603 입자]보다 더 안정하다. 유사하게, 상기한 도메인 I 내의 세린-포함 인플루엔자 B 세포 에피토프 및 C-말단의 1개의 시스테인을 포함하는 입자[ICC-1605 입자]는 시스테인이 부재하는 점 이외에는 동일한 입자보다 더 안정적이지만, 2개의 N-말단 시스테인을 포함하는 입자인 ICC-1590 입자 또는 N-말단 및 C-말단 시스테인 둘 다를 포함하는 입자[ICC-1604 입자]보다는 덜 안정적이다.
입자 및 이들을 구성하는 키메라 분자는 접두어 “ICC-" 또는 접두어 ”CV-" 뒤에 4자리의 아라비아 숫자를 붙이거나 접두어 없이 4자리의 아라비아 숫자만으로 상호교환적으로 지칭함이 주지된다. 따라서, 상기한 ICC-1590 입자는 또한 CV-1590 입자 또는 단지 1590 입자로 지칭할 수 있다. 각각의 명칭은 동일한 의미를 갖는다.
N-말단 시스테인 잔기를 포함하는 당해 입자는 또한 일반적으로 N-말단 시스테인이 결여된 키메라 분자로부터 조립된 입자보다 큰 수율로 제조된다.
HBc에 의해 도움을 받을 수 있는 T 세포가 백신접종 후 "운반되어진" 면역원성 서열에 대한 항체 반응(즉, B 세포-매개된 반응)을 증진시키는 데 매우 효과적이지만, HBc는 B 세포 에피토프 포함 서열이 T 세포 에피토프도 포함하는 제한된 유기체를 제외하고는 인자인플루엔자-특이적 T 세포를 활성화시키지 않는다. 인플루엔자-특이적 T 헬퍼 세포의 보편적인 초회감작(priming)을 보장하기 위해, B 세포 이외에 하나 이상의 인플루엔자-특이적 T 헬퍼 세포 에피토프를 바람직하게는 당해 면역원에 도입시켰으며 당해 면역원의 도메인 IV에 위치시켰다.
다수의 상기한 또는 기타 T 세포 에피토프가 도메인 IV 내에 존재할 수 있거나 기타 B 세포 에피토프가 존재할 수 있다. 바람직한 입자에서, 도메인 IV는 HBc에 이종성인 서열 내에 약 50개 이하의 잔기를 갖는다. 보다 바람직하게는, 당해 서열은 약 25개 이하의 잔기를 가지며, T 세포 에피토프를 포함한다.
M2가 감염된 세포 내에 풍부하게 발현되기 때문에, 인플루엔자-특이적 CTL 활성에 대한 표적으로 제공할 수 있는 가능성을 갖는다. 세포외 도메인은 항체에 대한 가능한 부착 위치이며, 이는 치료학적 약물 아만타딘에 대한 유사성 방법으로, 또는 항체-의존성 세포성 세포독성(ADCC) 및/또는 보체-의존성 세포독성(CDC)의 활성화를 통해 M2의 기능을 무력화시키는 작용을 할 수 있다.
사실, M2의 세포외 도메인은 문헌[참조: Jameson et al., (1998) J. Virol., 72(11):8682-8689]의 7면 내지 15면 및 문헌[참조: Gianfrani er al., (2000) Hum. Immunol., 61(5):438-352]의 3면 내지 11면의 2개 이상의 개별적 사람 CTL에피토프를 포함하는 것으로 제시되어 있다. ADCC 및/또는 CDC를 통한 인플루엔자-감염된 세포의 항-M2e 매개된 용해는 CTL에 비하여 표적 세포용해의 바람직한 메커니즘일 수 있는데, 그 이유는 CTL과 달리, 이들이 MHC 제한에 해당되지 않기 때문이다. 따라서, 필요한 IgG 아부류 프로필을 나타내는 항-M2 항체의 충분한 역가를 일으키는 능력, 및 M2e 특이성은 다양한 집단에 걸쳐 폭넓은 보호를 일으킨다.
생물학적 효과를 갖는 M2의 세포외 도메인에 대한 항체의 능력은 처음 Zebedee와 Lamb에 의해 기술되었으며, 이들은 모노클로날 항-M2 항체 14C2가 배양 중 바이러스의 성장을 둔화시킴을 보였다(문헌[참조: Zebedee et al, (1988) J Virol, 62(8):2762-2772]). 1990년, Treanor와 그의 동료들은 동일한 모노클로날 항체가 마우스에서 A형 인플루엔자 바이러스 복제를 성공적으로 억제하였음을 보였다(문헌[참조: Treanor et al., (1990) J. Virol., 64(3):1375-1377]). Palladino 등은 14C2가 생체내에서 바이러스 중화성이 아니었지만, 감염된 세포에 결합하고 시험관내에서 바이러스의 성장을 억제한다고 결론을 내렸지만, 감염을 치료하는데는 실패하였다(문헌[참조: Palladino et al., (1995) J. Virol., 69(4):2075-2081]). 마지막 논문의 저자들은 14C2가 IgG1 아부류 항체이며, IgG2a 및 IgG2b가 보체를 고정시키는데 가장 효과적이며; 이들은 또한 NK 세포 상의 FcγRIII 수용체에 대한 결합에 있어 IgG1보다 우수함을 정식으로 언급하였다. 사실, 이후에 제시한 바와 같이, Th1 면역 반응의 전형인, 마우스에서의 IgG2a 항체의 고 역가가 보호와 상관 관계가 있는 것으로 나타난다. 따라서 ADCC 및/또는 CDC를 통한 인플루엔자-감염된 세포의 항-M2e 매개된 용해를 제공할 수 있는 면역 반응이 바람직한 반응이다.
면역기억성 항-M2 반응이 HBc-M2 입자로 미리 면역화시킨 마우스의 챌린지 후 반복적으로 관찰되었으며, 이는 M2-특이적 T 세포를 초회감작시키는 M2e-HBc 입자를 암시하는 것이다. 이를 조사하기 위해, 면역화된 마우스로부터의 림프구가 시험관내에서 M2e 펩타이드에 의해 소환(recall)될 수 있는지의 여부를 조사하는 예비 연구를 수행하였다. 인터페론-감마 분비 세포의 수의 현저한 증가가 M2, HBc p85-100, 및 재조합 HBcAg로부터 유래한 펩타이드를 사용하여 소환된 후 관찰되었지만, HBc로부터의 p100-120으로는 관찰되지 않았다. HBcAg를 사용한 소환이 가장 우세하였으며, 이는 이것이 BALB/c 마우스에 대한 많은 기능적 T 세포 에피토프를 포함하는 잠재적 T 세포 면역원이기 때문에 기대되는 것이다(문헌[참조: Saito et al., (2001) Vaccine., 20(1-2):125-133]).
모든 항원을 사용한 소환은 ICC-1569 입자에 비하여 ICC-1604 입자로 면역화된 마우스로부터 분리한 림프구의 경우 보다 더 강한 것으로 나타났다. 이러한 결과는 ICC-1604 입자가 ICC-1569 입자에 비교하여 보다 우수한 T 세포 면역원일 수 있음을 나타낸다. 그러나, 이들 연구에 대한 M2 소환 항원이 M2e(2-24)었고, 이것이 17 및 19에서 시스테인 잔기를 포함하며, 따라서 오직 ICC-1604 입자에 대해서만 정확하게 상동성이며 ICC-1569 입자에 대해서는 상동성이 아닌데, 이는 ICC-1569 입자가 2개의 시스테인 잔기 대신 세린 잔기를 포함하고 있기 때문임을 유념하는 것이 중요하다.
ICC-1569 입자 대 ICC-1604 입자-면역화 마우스에 대한 M2e를 사용한 재자극의 감소된 수준은 17번 및/또는 19번 위치의 시스테인 잔기가 하나 이상의 T 세포 에피토프(들)의 성분인 경우 설명 가능하다. 그러나, 시스테인 잔기-포함 T　세포 에피토프의 존재는 HBc-유래 항원으로 인한 재자극의 감소 수준은 설명하지 못한다.
M2e-HBc-면역화 마우스의 바이러스 면역성 시험 후의 항-M2e 역가에 관한 2차 면역 반응의 관찰은 M2e 도메인(2-24번 위치) 내의 하나 이상의 T-헬퍼 세포 에피토프의 존재를 제시하는 것으로 보인다.
사람에서 폭넓은 반응성을 가지며 또한 BALB/c 마우스 내에서 기능을 갖는 인플루엔자 핵단백질(NP 206-229)로부터 유래한 에피토프(HLA-DR1, HLA-DR2, HLA-DRw13)(문헌[참조: Brett et al., (1991) J. Immunol., 147(3):984-991])를 본원에서 T 세포 에피토프로 사용하고자 의도하였다. HBc 입자의 C-말단에 융합된 당해 에피토프를 갖는 입자를 발현 및 정제하였다. NP 341-362, NP 297-318 및 NP 182-205와 같은 추가의 인플루엔자 Th 에피토프를 또한 고려하였으며(문헌[참조: Brett et al., (1991) J. Immunol., 147(3):984-991]); 이들 서열은 궁극적으로 M2e-발현 입자의 C-말단에서 연속적으로 연결될 수 있다. 이들 예시적 서열이 아래에 제공되어 있다.
Figure 112006040715748-pct00005
당해 재조합 HBc 키메라 분자가 통상 자가 조립 입자로서 면역원 또는 백신 내에 존재하며 사용된다. 이들 입자는 2-머캅토에탄올과 같은 이황화 환원제 및 SDS와 같은 변성제의 존재 하에 단백질 분자내로 해리되는 180개 내지 240개의 키메라 분자로 이루어진다. 개별 분자는 단백질-단백질 상호작용에 의해 입자 내로 함께 결합되며, 이들 상호작용은 이황화결합의 존재에 의해 안정화된다. 이들 입자는 HBV로 감염된 환자에게서 관찰되는 입자와 유사하지만, 이들 입자는 비감염성이다. 각종 원핵 및 진핵 숙주에서의 발현시, 개개의 재조합 HBc 키메라 분자는 숙주에서 숙주 세포로부터 용이하게 수거할 수 있는 입자로 조립된다.
이전에 논의된 N-말단 및 C-절단 및 인플루엔자 M2 폴리펩타이드 에피토프의 삽입 외에, 당해 키메라 분자는 또한 HBc 도메인 I, II, III 및 IV을 구성하는 아미노산 잔기 내에 보존적 치환을 포함할 수 있다. 보존적 치환은 위에서 정의한 바와 같다.
보다 드물게, "비보존적" 변화, 예를 들면, 글리신의 트립토판으로의 치환이 고려된다. 유사한 소수의 변형에는 또한 아미노산 결실 또는 삽입 또는 둘 다가 포함된다. 생물학적 활성을 소멸시키지 않으면서 아미노산 잔기가 치환, 삽입 또는 결실될 수 있는지를 결정하는데 있어서의 지침은 당해 분야에 널리 공지된 컴퓨터 프로그램, 예를 들면, LASERGENE 소프트웨어(제조사[DNASTAR Inc.], 위스콘신주 매디슨 소재)를 사용하여 확인할 수 있다.
본 발명의 키메라 분자의 HBc 부분[첨가한 에피토프의 서열 이외의 것을 갖는 HBc 서열 또는 제한 효소 인공물인 이종성 잔기(들)을 갖는 부위]이 존재하는 경우, 가장 바람직하게는 도 1에 나타낸 아유형 ayw의 2번 위치에서 149번 위치까지의 아미노산 잔기 서열(서열번호 1)을 갖는다. 다소 덜 바람직한 것은 도 1에 나타낸 아유형 adw, adw2 및 adyw의 상응하는 아미노산 잔기 서열(서열번호 2, 서열번호 3 및 서열번호 4)이다. 또한 덜 바람직한 것은 도 1의 마지막 두 서열(서열번호 5 및 서열번호 6)인 정렬된 2번에서 149번 위치까지의 우드척 및 땅다람쥐의 서열이다. 언급된 다른 경우와 마찬가지로, 상이한 포유동물 HBc 단백질로부터의 상이한 서열의 부분을 단일 키메라에 함께 사용할 수 있다.
본 발명의 키메라 분자의 HBc 부위가 존재하는 경우, 이들이 2번 위치에서 156번 위치 또는 149번 위치까지의 포유동물 HBc 분자의 서열 이외의 서열을 가질 때, 하나 이상의 보존적 치환이 일어나기 때문에 서열번호 1과 비교하여 2번 위치 내지 149번 또는 156번 위치에서 10% 이하, 및 보다 바람직하게는 5% 이하, 및 가장 바람직하게는 3% 이하의 아미노산 잔기가 치환되는 것이 바람직하다. 따라서 149개의 HBc 잔기의 당해 키메라는 2번 위치에서 149번 위치에서 서열번호 1의 잔기와 상이한 약 15개 또는 16개 이하, 및 바람직하게는 약 7개 또는 8개의 잔기를 포함할 수 있다. 보다 바람직하게는, 약 5개 이하의 잔기가 2번-149번 잔기 위치에서 ayw 서열(서열번호 1)과 상이하다. HBc 서열이 하나 또는 양쪽 말단에서 추가로 절단되는 경우, 치환된 잔기의 수는 비례적으로 상이하다. 당해 분자 내의 다른 곳에서의 결실은, 예를 들면, 도메인 I이 135번 대신 133번 위치에서 C-말단을 가진다면, 2개의 잔기(134 및 135)가 계산의 목적으로 존재한다고 가정할 수 있도록 계산의 목적상 보존적 치환인 것으로 고려한다.
키메라 제조
당해 키메라성 면역원은 널리 공지된 재조합 DNA 공학 기법을 사용하여 제조한다. 따라서, 특정 폴리펩타이드 서열을 암호화하는 핵산의 서열을 HBV를 암호화하는 전구 서열에 첨가하거나 그로부터 결실시킨다.
당해 키메라성 면역원은 통상 N-말단 시스테인으로서 M2 서열 내에 존재하는 시스테인 잔기를 사용한다. HBc 분자를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드의 시험관내 돌연변이에 의한 이러한 키메라 분자의 제조용의 프라이머는 아래에 논의 되어 있다. 시스테인-포함 M2 폴리펩타이드 에피토프가 N-말단에 존재하지 않는 경우, N-말단 시스테인을 단지 M2 폴리펩타이드의 시스테인-포함 부위 또는 Met-Cys- 또는 Met-Gly-Cys-와 같은 간단한 N-말단 출발 서열만을 암호화하는 프라이머를 사용하는 시험관내 돌연변이에 의해 제공할 수 있다.
이미 언급한 바와 같이, 일반적으로 HBc 면역우세 루프는 온전한 단백질의 아미노-말단(N-말단)으로부터 약 75번 내지 85번 위치에 위치한다고 언급된다. A형 인플루엔자 M2 B 세포 에피토프-포함 서열을 도메인 II의 면역우세 루프 서열 내에 위치시킬 수 있다. 이러한 배치는 HBc 루프 서열의 HBc 면역원성 및 항원성을 현저히 제거하면서, 조립된 키메라 입자 내의 극도의 면역원성 위치에 A형 인플루엔자 M2 B 세포 에피토프를 제시한다.
2가지 널리 공지된 전략 중 하나는 A형 인플루엔자 M2 B 세포 서열을 잔기 78과 79 사이와 같은 목적하는 위치에서 루프 서열 내로 배치시키는 데 특히 유용하다. 첫 번째, 덜 성공적인 전략은 루프의 부위를 암호화하는 DNA를 절단해내고 A형 인플루엔자 M2 B 세포 서열을 암호화하는 DNA로 치환하는 치환법이다. 두 번째 전략은 A형 인플루엔자 M2 B 세포 서열을 루프 내의 인접한 잔기들 사이에 삽입시키는 삽입법이다.
폴리머라제 연쇄 반응(PCR)을 사용하는 부위-지시된 돌연변이유발을, 하나의 제한 부위가 면역우세 루프-암호화 DNA의 각각의 말단 근처에 있는 한 쌍의 상이한 제한 부위(예를 들면, EcoRI 및 SacI)를 암호화하는 키메라 HBc DNA 서열을 제공하기 위해 예시적 치환법에서 사용한다. 치환된 예시적 잔기는 76에서 81까지이다. 루프-암호화 부위를 절단하고, 적절한 HBc 서열 잔기가 각각의 측면에 접해 있는 A형 인플루엔자 M2 B 세포 에피토프-암호화 서열을 제한 부위에 연결시키고, 수득한 DNA를 HBc 키메라를 발현시키는 데 사용한다. 예를 들면, 유사한 기법의 예시적 용도에 대해 문헌[Pumpens et al., (1995) Intervirology, 38:63-74]의 표 2를 참조한다.
대안적으로, 단일 제한 부위 또는 2개의 부위를 당해 영역 내로 암호화시킬 수 있으며, 당해 DNA를 제한 효소(들)로 절단하여 “점착성” 말단을 생성하고, 적합한 점착성- 또는 평활-말단 이종성 DNA 절편을 절단 영역에 연결시킨다. 이러한 유형의 HBc내로의 서열 치환법의 예를 문헌[참조: Schodel et al., (1991) F. Brown et al. eds., Vaccines 91, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York, pp.319-325, Schodel et al., Behring Inst. Mitt., 1997(98):114-119 and Schodel et al., J. Exp. Med., (1994) 180(3): p. 1037-4]에 보고된 논문에서 찾을 수 있으며, 마지막 2개의 논문은 각각 말라리아 병원체 피. 요엘리(P. yoelii) 및 피. 베르게이(P. berghei)에 대한 백신의 제조법을 논의한다. 면역우세 루프로부터 잔기의 완전한 삭제를 초래하는 치환 전략은 일반적으로 본원에 사용되지 않는다.
삽입법이 바람직하다. 삽입 전략의 예시적 예에서, 부위-지시적 돌연변이를 서로에 인접해 있고 78번 및 79번 잔기 위치에서와 같은 인접 아미노산 잔기를 암호화하는 코돈 사이에 있는 2개의 제한 부위를 만드는 데 사용한다. 당해 기법은 이전에는 HBc 루프 내에 인접해 있던 잔기 사이에 4개의 아미노산 잔기(각각의 제한 부위에 대해 2개)를 암호화하는 12개의 염기쌍을 첨가한다.
제한 효소를 사용한 절단, 예시적 A형 인플루엔자 M2 서열을 암호화하는 DNA의 연결 및 HBc 키메라를 형성하기 위한 DNA의 발현시, HBc 루프 아미노산 서열이 5‘ 제한 부위에 의해 암호화된 2개의 잔기에 의해 이의 N-말단 측면에서 중단된 후, A형 인플루엔자 M2 B 세포 에피토프에 의해 C-말단에서 중단되고, 3’ 제한 부위에 의해 암호화된 2개 이상의 이종성 비-루프 잔기에 의해 중단된 이후, 나머지 루프 서열에 의해 중단되는 것으로 나타난다. 이러한 동일한 전략을 또한 바람직하게는 T 세포 에피토프의 도메인 IV 또는 T 세포 에피토프의 일부가 아닌 하나 이상의 시스테인 잔기 내로의 삽입을 위해 사용한다. 잔기 82와 83 사이의 삽입을 사용하는 유사한 전략이 문헌[참조: Schoedel et al., (1990) F. Brown et al. eds., Vaccines 90, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York, pp. 193-198]에 보고되어 있다.
예를 들면, C-말단 절단된 HBc 서열(HBc149)을 암호화하는 DNA 서열을 잔기 78과 79 사이의 인접한 EcoRI 및 SacI 위치를 포함하도록 조작한다. 효소 둘 다를 사용한 DNA의 절단은 3'-말단에 EcoRI 점착성 말단을 가지는 HBc 1-78번 위치를 암호화하는 한 단편을 생성하는 반면, 다른 단편은 5’-말단 SacI 점착성 말단을 가지며 79-149번 위치의 잔기를 암호화한다. 5‘ AATT 돌출부에 이은 목적하는 A형 인플루엔자 M2 B세포 에피토프를 암호화하는 서열과 AGCT 3' 돌출부를 갖는 합성 핵산의 연결은 EcoRI 위치는 파괴하고 SacI 위치는 보존하면서, 잔기 78과 79 사이의 2개의 이종성 잔기(GI 및 EL, 각각)와 각각의 측면에 접해 있는 B 세포 에피토프를 암호화하는 HBc 키메라 서열을 생성한다.
C-말단 시스테인-포함 서열의 삽입을 위해 유사한 전략을 사용할 수 있다. 여기서, EcoRI 및 HindIII 제한 부위가 아미노산 잔기 149번 위치 이후의 HBc DNA 서열 내에 있도록 조작한다. EcoRI 및 HindIII로 절단한 후, 상기한 AATT 5' 돌출부에 이은 T 세포 에피토프-암호화 서열, 정지 코돈 및 3' AGCT 돌출부를 갖는 합성 DNA를 절단한 서열 내로 연결하여 HBc 잔기 1-149에 이은 2개의 이종성 잔기(GI), 정지 코돈 및 HindIII 위치를 암호화하는 서열을 형성한다.
SacI 제한 부위에 이은 79번 잔기 위치에서 시작하는 HBc를 암호화하는 서열을 갖는 전방향 프라이머를 사용하여 PCR 증폭시킨 후 SacI 및 HindIII로 절단하여 79-149번 HBc 위치와 2개의 첨가된 잔기 및 C-말단에 T 세포 에피토프를 암호화하는 서열을 생성한다. 당해 작제물을 SacI으로 분해하고 연결하여 N-말단으로부터 HBc 1-78번 위치, 2개의 첨가된 잔기, B 세포 에피토프를 포함하는 A형 인플루엔자 M2-서열, 2개의 첨가된 잔기, HBc 79-149번 위치, 2개의 첨가된 잔기 및 T 세포 에피토프를 갖는 목적하는 재조합 HBc 키메라 면역원을 암호화하는 완전한 유전자를 생성한다.
B 세포 또는 T 세포 에피토프를 포함하는 이종성 면역원성 서열의 (측면에 접한) 한쪽 측면의 2개의 이종성 잔기의 바람직한 용도가 편의상의 문제임을 유념한다. 마찬가지로, 또한 삽입된 서열의 한쪽 측면 또는 양쪽 측면의 HBc 서열의 일부가 아닌 0개 내지 3개 또는 그 이상의 첨가된 잔기를 사용할 수 있다. 삽입물 및 HBc 핵산의 한쪽 또는 양쪽 말단을 적합한 뉴클레아제(예를 들면, S1 뉴클레아제)를 사용하여 "뒤로 뜯어내어(chewed back)" 함께 연결할 수 있는 평활 말단을 생성할 수 있다. 삽입한 B 세포 또는 T 세포 에피토프의 일부도 HBc 서열의 일부도 아닌 첨가된 이종성 잔기는 언급한 도메인 내에 존재하는 잔기들의 수로 계수하지 않았다.
또한 니코티아나 타바쿰(Nicotiana tabacum)의 59개 잔기 리불로스 이인산 카복실라제-옥시게나제 신호 펩타이드를 암호화하는 177개 염기쌍 DNA의 합성에 대한 미국 특허 제5,656,472호에 논의 및 예시된 바와 같은 널리 공지된 합성 방법을 사용하여 목적하는 재조합 HBc 키메라 핵산 전부 또는 일부를 합성할 수 있음을 또한 유념해야 한다. 예를 들면, 도메인 III 및 IV에 연결할 수 있는 평활 또는 "점착성" 말단을 갖는 도메인 I 및 II를 합성하여 B 세포 에피토프의 N-말단에 0개의 첨가 잔기 및 C-말단측 또는 도메인 II/III 접합점 또는 일부 기타 목적하는 위치에 0개 내지 3개의 첨가 잔기를 포함하는 당해 HBc 키메라를 발현하는 작제물을 생성할 수 있다.
상기한 HBc 키메라 분자를 암호화하는 핵산 서열(절편) 또는 암호화 서열의 상보체도 또한 본원에서 의도된다. 일부 바람직한 양태에서는 이러한 핵산 절편이 분리되고 정제된 형태로 존재한다.
살아있는 유기체에서, 단백질 또는 폴리펩타이드의 아미노산 잔기 서열은 당해 단백질을 암호화하는 유전자의 데옥시리보핵산(DNA) 서열에 대한 유전자 코드를 통해서 직접적으로 관련된다. 따라서, 널리 공지된 당해 유전자 코드 부가 DNA 및 상응하는 RNA 서열(핵산)을 변형시켜 동일한 키메라 아미노산 잔기 서열은 암호화하지만, 2개의 서열이 높은 엄격도로는 하이브리드화하지 않지만, 중간 정도의 엄격도로 하이브리드화하는 상기한 유전자 서열과는 충분히 상이한 목적한 바의 서열을 제조할 수 있다.
높은 엄격도 조건은 6XSSC에서 약 50℃-55℃의 온도에서의 하이브리드화 및 1-3XSSC에서 68℃의 온도에서의 최종 세척을 포함하는 것으로 정의될 수 있다. 중간 정도의 엄격도 조건은 0.2 내지 0.3M NaCl에서 약 50℃ 내지 약 65℃의 온도에서 하이브리드화한 후, 0.2X SSC, 0.1% SDS(도데실 황산나트륨) 중에 약 50℃ 내지 약 55℃에서 세척함을 포함한다.
(1) 그 자체로 또는 이의 상보체가, 존재하는 경우, 1번 잔기 위치 내지 136번 잔기 위치로부터의 HBc 부위가 서열번호 1, 2, 3, 4, 5 또는 6의 서열인 키메라 분자를 암호화하고 (2) 서열번호 43, 44, 45, 46, 47 또는 48의 DNA 서열과 적어도 중간 정도의 엄격도(상기하였음)로 하이브리화하며; (3) HBc 서열이 서열번호 43, 44, 45, 46, 47 및 48의 DNA 서열과 80% 이상, 및 보다 바람직하게는 90% 이상 및 보다 더 바람직하게는 95% 이상, 가장 바람직하게는 100%의 동일성을 공유하는 키메라 분자를 암호화하는 핵산 서열(DNA 서열 또는 RNA 서열)이 DNA 변형체 서열로 정의된다. 널리 공지된 바와 같이, 당해 핵산 서열과 같은 핵산 서열은 본원의 다른 곳에서 논의한 바와 같이 적합한 발현 시스템에서 적합한 프로모터에 작동적으로 연결된 경우 발현된다.
당해 키메라 분자를 암호화하는 유사체 또는 유사 핵산(DNA 또는 RNA) 서열 또한 본 발명의 일부로 고려된다. 키메라 유사체 핵산 서열 또는 이의 상보성 핵산 서열은 서열 변호 1, 2, 3, 4, 5 및 6에 나타낸 1번 잔기 위치에서 136번 잔기 위치까지의 HBc 서열 부위와 80% 이상, 보다 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상 동일한 HBc 아미노산 잔기 서열을 암호화한다. 당해 DNA 또는 RNA는 본원에서 서열번호 43, 44, 45, 46, 47 및 48의 핵산 서열의 "유사체" 또는 이에 "유사한" 것으로 지칭되며, 서열번호 43, 44, 45, 46, 47 및 48의 핵산 서열 또는 이들의 보체와 중간 정도의 엄격도 하이브리드화 조건 하에 하이브리드화한다. 적합한 형질감염 및 발현시, 유사 서열을 암호화하는 핵산 또한 당해 키메라를 생산한다.
상이한 숙주는 흔히 특정 아미노산 잔기를 암호화하는 데 사용되는 특정 코돈에 대한 선호도를 갖는다. 이러한 코돈 선호도는 널리 공지되어 있으며 목적하는 키메라 서열을 암호화하는 DNA 서열을 예를 들면, 시험관내 돌연변이유발을 사용하여 변경시켜 숙주-선호 코돈을 효소가 발현되는 특정 숙주에 대해 사용할 수 있다. 추가로, 서열번호 43, 44, 45, 46, 47 또는 48의 DNA 또는 이의 상보체와 상당한 동일성을 회피하는 서열번호 1, 2, 3, 4, 5 또는 6의 HBc 부위를 암호화하는 유전자 코드의 변형을 사용할 수 있다. 따라서, 유용한 유사 DNA 서열은 서열번호 43, 44, 45, 46, 47 또는 48의 뉴클레오타이드 서열 또는 상보체와 중간 정도의 엄격도의 조건 하에 하이브리드화할 필요는 없지만, 여전히 당해 키메라 분자를 제공할 수 있다.
Figure 112006040715748-pct00006
Figure 112006040715748-pct00007
상기한 바와 같은 당해 키메라를 암호화하는 유전자를 정의하는 외인성 핵산 단편(예를 들면, DNA 절편 또는 서열)에 작동적으로 연결된 벡터 및 적합한 숙주 유기체 내의 유전자의 발현을 유도하는데 적합한 프로모터를 포함하는 DNA 분자와 같은 재조합 핵산 분자를 또한 본 발명에서 고찰한다. 보다 특히, 키메라의 HBc 부위에 대한 유전자를 정의하는 DNA 절편 또는 서열번호 43, 44, 45, 46, 47 또는 48의 키메라 유전자와 90% 이상의 동일성을 갖는 DNA 변이체에 작동적으로 연결된 숙주 유기체 세포 내에서 당해 키메라의 발현을 유도하는 프로포터를 포함하는 벡터를 포함하며, 중간 정도의 엄격도 조건 하에 유전자와 하이브리드화하는 재조합 DNA 분자를 또한 고찰한다.
추가로 서열번호 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6의 서열의 HBc 부위와 80% 이상, 보다 바람직하게는 90%, 및 가장 바람직하게는 95% 동일한 HBc 키메라 부위의 아미노산 잔기 서열을 암호화하는 유사체 핵산 서열인 DNA 절편에 작동적으로 연결된 숙주 유기체 세포 내에서 키메라의 발현을 유도하는 프로모터를 포함하는 벡터를 포함하는 재조합 DNA 분자를 고찰한다. 적합한 형질감염 및 숙주 세포 내에서의 발현에 따라 당해 재조합 DNA 분자는 당해 키메라 분자를 제공한다.
땅다람쥐 HBc의 N-말단 서열의 30개의 아미노산 잔기는 다른 HBc 서열의 임의의 잔기에 맞추어 조정되지 않기 때문에, 당해 서열 및 이의 암호화 핵산 서열 및 이의 보체는 상기한 %의 동일성으로 포함되지 않으며, 하이브리드화 결정에 사용되는 30개 잔기 서열 또는 이의 보체를 암호화하는 핵산의 일부도 아님이 주지된다. 유사하게, HBc N- 와 C-말단 중 하나 또는 둘 다에서 절단된 서열은 동일성 계산에 포함되지 않으며, 면역우세 루프의 잔기는 이종성 에피토프의 삽입을 위해 제거된 서열도 아니다. 따라서, 오직 키메라 분자 내에 존재하는 HBc-암호화 염기 또는 HBc 서열 잔기만을 동일성 % 계산에 포함시키며 정렬된 핵산 또는 아미노산 잔기 서열과 비교한다.
본원에 개시한 유전자에 대한 암호화 서열만을 서열번호 43, 44, 45, 46, 47 및 48로 예시하였으며, 유전자에 대한 초기 ATG 코돈에서 시작하고 각각의 유전자에 대한 정지 코돈에서 또는 그 바로 하부에서 종결되는 분리한 핵산 단편, 바람직하게는 DNA 서열, 변형체 및 이의 유사체를 당해 분야에 널리 공지되고 문헌[참조: Current Protocols In Molecular Biology, Ausabel et al. eds. , John Wiley & Sons (New York: 1987) p. 8.1.1-8.1.6]에 개시된 시험관내 돌연변이유발법으로 제조할 수 있다. 따라서, 목적하는 제한 부위를 개시 코돈에서 또는 그 상부, 및 정지 코돈에서 또는 그 하부에서 조작하여 다른 유전자를 제조, 절단 및 분리할 수 있다.
당해 분야에 널리 공지된 바와 같이, 필요한 핵산, 예시적 DNA 서열(시작 및 정지 신호를 포함한)이 존재하는 한, 예시적으로 추가의 염기 쌍이 절편의 어느 한 말단에 존재하도록 할 수 있으며, 당해 절편은 여전히 당해 단백질을 발현시키는 데 사용할 수 있다. 물론 이는 발현을 억제하고, 발현되어야 할 효소를 소비하는 추가의 생성물을 발현하고, 목적하는 효소에 의해 생성된 목적하는 반응 생성물을 소비하는 생성물을 발현하거나 이와는 달리 DNA 절편의 유전자의 발현을 방해하는, 작동적으로 연결된 DNA 서열의 단편의 부재를 가정한다.
따라서, DNA 절편이 이러한 방해 DNA 서열을 함유하지 않는 한, 본 발명의 DNA 절편은 약 500개 내지 약 15,000개의 염기쌍의 길이를 가질 수 있다. 재조합 DNA 분자의 최대 크기, 특히 발현 벡터는 대부분 편의성 및 숙주 세포에 순응될 수 있는 벡터 크기에 의해 좌우되며, 일단 목적되는 경우, 복제 및 발현에 필요한 최소 DNA 서열 모두가 존재한다. 최소 벡터 크기가 널리 공지되어 있다. 이러한 긴 DNA 절편은 바람직하지 않지만 사용될 수는 있다.
상기한 키메라를 암호화하는 DNA 절편을 예를 들면, 문헌[참조: Matteucci et al. (1981)J. Am. Chem.Soc., 103: 3185]의 포스포트리에스테르 방법과 같은 화학적 기법으로 합성할 수 있다. 물론, 암호화 서열을 화학적으로 합성함으로써, 천연 아미노산 잔기 서열을 암호화하는 염기에 대해 적합한 염기를 치환함으로써 간단히 임의의 목적하는 변형을 생성할 수 있다. 그러나, 상기한 서열을 포함하는 DNA 절편이 바람직하다.
당해 HBc 키메라를 다수의 형질전환된 숙주 시스템, 통상 숙주 세포에서 생산(발현)할 수 있으며, 세포내에서의 발현이지만, 시험관내 시스템도 또한 고려된다. 이들 숙주 세포 시스템은 재조합 박테리오파지, 플라스미드 또는 코스미드 DNA 발현 벡터로 형질전환된 세균과 같은 미생물, 효모 발현 벡터로 형질전환된 효모; 바이러스 발현 벡터(예를 들면, 배큘로바이러스)로 감염시킨 곤충 세포 시스템; 바이러스 발현 벡터(에를 들면, 꽃양배추 모자이크 바이러스; 담배 모자이크 바이러스) 또는 세균 발현 벡터(예를 들면, Ti 플라스미드)로 형질전환시킨 식물 세포 시스템; 또는 CHO 또는 COS와 세포와 같은 적합하게 형질전환시킨 동물 세포 시스템을 포함한다. 본 발명은 사용한 숙주 세포에 제한되지 않는다.
HBc 키메라를 암호화하는 유전자를 포함하는 DNA 절편을 바람직하게는 당해 유전자를 포함하는 재조합 DNA 분자(플라스미드 벡터)로부터 수득한다. 키메라 유전자의 HBc 키메라의 단백질로의 발현을 지시할 수 있는 벡터를 본원에서 "발현 벡터"로 지칭한다.
발현 벡터는 프로모터를 포함하는 발현 제어 요소를 포함한다. 키메라-암호화 유전자를 발현 벡터에 작동적으로 연결하여 프로모터 서열이 RNA 폴리머라제 결합 및 키메라-암호화 유전자의 발현을 지시하도록 할 수 있다. 문헌[참조: Poszkowski et al. (1989) EMBO J., 3: 2719 및 Odell et al.(1985) Nature, 313: 810]에 기술된 바와 같은 유도성, 바이러스성, 합성, 구성성이며, 문헌[참조: Chua et al.(1989) Science, 244: 174-181]에 기술된 바와 같이 일시적, 공간적, 시공간적으로 조절되는 프로모터가 폴리펩타이드 암호화 유전자의 발현에 유용하다.
이. 콜라이와 같은 원핵성 세포에 사용하기에 바람직한 프로모터는 외인성으로 공급된 날리딕스산에 의해 유도성 Rec7 프로모터이다. 보다 바람직한 프로모터가 외인성으로 공급된 이소프로필-β-D-티오갈락토-피라노시드(IPTG)에 의해 유도가능한 플라스미드 벡터 JHEX25(제조원[Promega]로부터 구입 가능) 내에 존재한다. 보다 바람직한 프로모터인 tac 프로모터는 플라스미드 벡터 pKK223-3 내에 존재하며, 또한 외인성으로 공급된 IPTG에 의해 유도가능하다. pKK223-3 플라스미드를 유도용 IPTG 약 25 내지 100μM을 사용하여 다수의 이. 콜라이 균주(예를 들면, XL-1, TB1, BL21 및 BLR) 내에서 성공적으로 발현할 수 있다. 놀랍게도, 약 25 내지 약 50μM IPTG 농도가 2L들이 진탕 플라스크 및 발효조에서 최적 결과를 나타냄을 발견하였다.
살모넬라 유사 에스. 티피(S. typhi) 및 에스. 티피무리움(S. typhimurium) 및 에스. 티피무리움-이. 콜라이 하이브리드와 같은 기타 미생물, 에스. 세리비지애(S. cerivisiae) 또는 피키아 파스토리스(Pichia pastoris)와 같은 효모, 중국 햄스터 난소(CHO) 세포와 같은 포유동물 세포, 일반적으로는 외자엽 및 쌍자엽 식물 세포 둘 다 및 특히 뿌리, 씨 또는 열매와 같은 쌍자엽 식물 저장 기관(경구 백신 또는 접종물이 바람직한 경우) 및 오토그라파 칼리포르니카(Autographa californica) 핵 다각체 바이러스(AcNPV) 또는 바쿨로바이러스를 사용한 에스. 프루기페르다(S. Frugiperda) 세포 또는 트리초플루시아(Trichoplusia)와 같은 곤충 세포 내에서의 당해 키메라 분자의 발현이 상기한 모출원 및 국제공개공보 제WO 02/14478 A2호에 상세히 개시되어 있다. 따라서, 비록 고찰하였지만, 이들 발현 방법을 본원에 추가로 개시하지는 않을 것이다.
상보적 점착성 말단 또는 평활 말단을 통해 DNA를 벡터에 작동적으로 연결시키는 다양한 방법이 개발되어 왔다. 예를 들면, 상보적 단독중합체 구역을 벡터 DNA 내로 삽입될 DNA 절편에 첨가할 수 있다. 이어서 당해 벡터 및 DNA 절편을 상보적 단독중합체 꼬리 사이에 수소결합으로 연결시켜 재조합 DNA 분자를 형성한다.
대안적으로, 상기한 바와 같이, 하나 이상의 제한 엔도뉴클레아제 위치를 포함하는 합성 링커를 사용하여 DNA 절편을 발현 벡터에 연결시킬 수 있다. 박테리오파지 T4 DNA 리가아제와 같은 평활-말단 DNA 분자의 연결을 촉진시킬 수 있는 효소의 존재 하에 평활-말단 DNA 절편을 과량의 합성 링커 분자와 함께 항온처리하여 합성 링커를 평활-말단 DNA 절편에 부착한다.
따라서, 반응 생성물은 이들의 말단에 합성 링커 서열을 수반하는 DNA 절편이다. 이어서 이들 DNA 절편을 적합한 제한 엔도뉴클레아제로 절단하고 합성 링커의 말단과 상보적인 말단을 생산하는 효소로 절단한 발현 벡터 내로 연결한다. 각종 제한 엔도뉴클레아제 부위를 포함하는 합성 링커는 제조원[New England BioLabs, 메사추세츠주 베버리 소재]을 포함한 다수의 공급원으로부터 구입한다. 목적하는 DNA 절편은 또한 전방향 및 역방향 프라이머가 유전자를 벡터 내로 삽입시킬 수 있도록 증폭 후 절단할 수 있는 목적하는 제한 부위를 포함하는 PCR 기법을 사용하여 수득할 수 있다. 대안적으로 PCR 생성물을 T-돌출부를 포함하는 벡터(제조원[Promega Corp., A3600], 위스콘신주 매디슨 소재) 내로 직접 클로닝시킬 수 있으며, 이는 당해 분야에 널리 공지되어 있다.
발현된 키메라 단백질은 단세포이든 다세포 숙주의 세포이든, 숙주 세포 내에서 입자로 자가 조립된다. 입자-포함 세포를 표준 과정을 사용하여 수거하고, 당해 세포를 프렌치 압착 세포, 리소자임, 초음파분해, 구슬 타해기 또는 미세유동화기(제조원[Microfluidics International Corp.], 메사추세츠주 뉴튼 소재)를 사용하여 용해한다. 세포 용해물을 정화한 후, 입자를 45% 황산암모늄으로 침전시키고, pH 6.8의 20mM 인산나트륨에 재현탁시키고 동일한 완충액에 대해 투석시킨다. 투석된 물질을 짧게 원심분리하여 정화하고 상층액을 SepharoseR CL-4B를 사용하여 겔 여과 크로마토그래피에 적용시킨다. 입자 포함 분획을 확인하고, 수산화인회석 크로마토그래피에 적용시키고 황산암모늄으로 재침전시킨 후 재현탁, 투석 및 멸균 여과하고 -70℃에서 보관한다.
접종물 및 백신
바람직하게는 미립자 형태의 상기한 재조합 HBc 키메라 면역원을 면역원 또는 백신을 형성하기 위해 바람직하게는 수성인 약제학적으로 허용되는 비히클 조성물 내에 유효량으로 용해 또는 분산시킨다. 포유동물(예를 들면, 마우스, 개, 염소, 양, 말, 소, 원숭이, 유인원 또는 사람) 또는 조류(예를 들면, 닭, 칠면조, 오리 또는 거위)와 같이 면역화가 필요하거나 항체를 유도하는 것이 바람직한 숙주 세포 내로 투여하는 경우, 접종물은 면역원 내에 존재하는 A형 인플루엔자 M2 B 세포와 면역반응하는 항체를 유도한다. 백신에서, 이들 유도된 항체는 또한 생체내에서 바이러스 또는 바이러스 감염 세포와 면역반응(이에 결합)을 하며 병원체성 인플루엔자 감염으로부터 숙주를 보호하는 것으로 사료된다. 한 동물 내의 백신인 조성물이 다른 숙주에 대한 접종물이 될 수 있으며, 여기서 항체가 A형 인플루엔자에 감염되지 않은 제2의 숙주에서 유도된다.
각각의 면역화에 사용된 재조합 HBc 키메라 면역원의 양을 면역원성 유효량으로 지칭하며 이는 하기한 바와 같이, 무엇보다도 재조합 HBc 키메라 면역원, 면역화시킬 동물 숙주 및 백신 내의 보조제의 존재에 따라 광범위하게 달라질 수 있다. 백신 및 접종물에 대한 면역원성 유효량은 이전에 논의한 보호 또는 항체 활성을 제공한다.
백신 또는 접종물은 통상 접종(용량 단위) 당 약 1마이크로그램 내지 약 1밀리그램, 및 바람직하게는 용량 단위 당 약 10마이크로그램 내지 약 50마이크로그램 농도의 재조합 HBc 키메라 면역원을 포함한다. 마우스 내에서의 면역화는 통상 10 또는 20㎍의 키메라 입자를 포함한다.
본 발명의 백신 또는 접종물에 적용되는 용어 "단위 용량"은 동물에 대한 단일 투여량으로서 적합한 물리학적 이산 단위를 지칭하며, 각각의 단위는 필요한 희석제; 즉, 담체 또는 비히클과 연관되어 개별적으로 또는 종합적으로 목적하는 면역 효과를 나타내도록 계산된 활성 물질의 예정량을 포함한다. 1회 단위 용량 또는 다회 단위 용량을 사용하여 재조합 HBc 키메라 면역원 입자의 면역원성 유효량을 제공할 수 있다.
백신 또는 접종물은 통상 당해 입자를 물, 인산염-완충된 염수(PBS), 아세테이트-완충된 염수(ABS), 링거액 등과 같은 생리학적으로 수용가능한(허용되는) 희석제 비히클에 분산시켜 수성 조성물을 형성시킴으로써 회수한 재조합 HBc 키메라 면역원 입자로부터 제조한다. 희석제 비히클은 또한 하기한 바와 같이 땅콩유, 스쿠알란 또는 스쿠알렌과 같은 유성 물질을 포함할 수 있다.
면역원성 활성 성분은 흔히 약제학적으로 허용가능하며 활성 성분과 상용성인 부형제와 혼합시킨다. 적합한 부형제는 예를 들면, 물, 염수, 덱스트로스, 글리세롤, 에탄올 등 및 이의 배합물이다. 추가로, 경우에 따라, 접종물 또는 백신은 당해 조성물의 면역 효과를 증진시키는 습윤제 또는 유화제, pH 완충제와 같은 소량의 보조 물질을 함유할 수 있다.
당해 백신 또는 접종물은 또한 유리하게 보조제를 포함한다. 본 발명의 백신 또는 접종물에 적합한 보조제는 존재하는 경우, 키메라의 B 세포 에피토프에 대한 항체 반응을 증진시킬 수 있는 보조제 및 당해 키메라 내에 포함된 T 세포 에피토프에 대한 세포 매개 반응을 증진시킬 수 있는 보조제를 포함한다. 보조제는 당해 분야(예를 들면, 문헌[Vaccine Design - The Subunit and Adjuvant Approach, 1995, Pharmaceutical Biotechnology, Volume 6, Eds. Powell, M.F., and Newman, M.J., Plenum Press, New York and London, ISBN 0-306-44867-X]을 참조한다)에 널리 공지되어 있다.
예시적 보조제는 사람에게 사용하지 않는 완전 프로인트(Freund) 보조제(CFA), 불완전 프로인트 보조제(IFA), 스쿠알렌, 스쿠알란 및 백반[예를 들면, AlhydrogelTM(제조원; Superfos, 덴마크)]을 포함하며, 이는 당해 분야에 널리 공지된 물질이고 여러 공급원에서 시판되고 있다.
본 발명의 면역원과 함께 사용하기에 바람직한 보조제는 알루미늄염 또는 칼슘염(예를 들면, 수산화물 또는 인산염)을 포함한다. 본원에 사용하기에 특히 바람직한 염은 AlhydrogelTM과 같은 수산화알루미늄 겔이다. 수산화알루미늄 겔(백반)의 경우, 키메라 단백질을 보조제와 혼합하여 약 50 내지 약 800마이크로그램, 바람직하게는 약 400 내지 약 600마이크로그램의 알루미늄이 용량 당 존재하도록 한다. 인산칼륨 나노입자(CAP)는 제조원[Biosante, INC](일리노이주 링컨셔)에 의해 개발된 보조제이다. 흥미로운 면역원은 입자 외부로 피복되거나 내부에 봉입될 수 있다(문헌[참조: He et al. (Nov. 2000) Clin. Diagn. Lab. Immunol., 7 (6): 899-903]).
본 발명의 면역원으로 사용하기에 특히 바람직한 기타 보조제는 에멀젼이다. 당해 에멀젼은 수중유 에멀젼 또는 유중수 에멀젼일 수 있다. 면역원성 키메라 단백질 입자 외에, 이러한 에멀젼은 널리 공지된 바와 같이 공지된 스쿠알렌, 스쿠알란, 땅콩유 등의 오일 상 및 분산제를 포함한다. 비이온성 분산제가 바람직하며 이러한 물질은 소르비탄 모노-스테아레이트, 소르비탄 모노-올리에이트 및 만니드 모노-올리에이트와 같은 소르비탄 및 만니드의 모노- 및 디-C12-C24-지방산 에스테르를 포함한다. 면역원 포함 에멀젼을 에멀젼으로서 투여한다.
바람직하게는, 이러한 에멀젼은 수성 층에서 키메라 단백질 입자로 유화된, 만니드 모노-올리에이트(ArlacelTM A)와 같은 스쿠알렌, 글리세롤 및 계면활성제를 포함하는(임의로는 스쿠알란과 함께) 유중수 에멀젼이다. 오일 상은 바람직하게는 약 0.1 내지 약 10%, 보다 바람직하게는 약 0.2 내지 약 1%의 백신을 포함한다. 오일 상의 대안적 성분에는 알파-토코페롤, 혼합 쇄 디- 및 트리-글리세리드 및 소르비탄 에스테르가 포함된다. 이러한 에멀젼의 널리 공지된 예에는 MontanideTM ISA-720 및 MontanideTM ISA 703(제조원: Seppic, 프랑스 카스트르 소재)가 포함되며, 이들 각각은 스쿠알렌 및 스쿠알란 둘 다를 함유하는 데 각각에서 스쿠알렌을 더 많이 함유하지만, MontanideTM ISA 703에 보다 적은 양이 함유된 것으로 알려져 있다. 가장 바람직하게는, MontanideTM ISA-720을 사용하며, 오일 대 물을 7:3의 비율로 사용한다. 기타 바람직한 수중유 에멀젼 보조제에는 국제공개공보 제WO 95/17210호 및 유럽특허 제WP 0 399 843호에 개시된 것이 포함된다.
소분자 보조제의 용도 또한 본원에서 고찰하고 있다. 본원에 유용한 소분자 보조제의 한 유형은 본원에 참조로 인용되어 있는 문헌인 미국 특허 제4,539,205호, 제4,643,992호, 제5,011,828호 및 제5,093,318호에 기술된 7-치환된-8-옥소- 또는 8-설포-구아노신 유도체이다. 이들 물질 중, 7-알릴-8-옥소구아노신(록소리빈)이 특히 바람직하다. 당해 분자는 항원- (면역원-) 특이적 반응을 유도하는 데 특히 효과적인 것으로 나타났다.
바람직한 유용한 보조제에는 시애틀의 제조원[Corixa Corp.], 예전의 [Ribi Immunochem, 몬타나주 해밀턴 소재]에서 제조된 널리 공지된 보조제인 모노포스포릴 지질 A(MPLR), 3-데아실 모노포스포릴 지질 A(3D-MPLR)가 포함된다. 당해 보조제는 2% 스쿠알렌/TweenR 80 에멀젼 중에 세균으로부터 추출된 3가지 성분: 모노포스포릴 지질(MPL) A, 트레할로스 디미콜레이트(TDM) 및 세포벽 골격(CWS)(MPL+TDM+CWS)을 함유한다. 당해 보조제는 제GB 2122204B호에 교시된 방법에 따라 제조할 수 있다. 3-데-O-아실화 모노포스포릴 지질 A의 바람직한 형태는 직경 0.2μm 미만의 작은 입자 크기를 갖는 에멀젼 형태이다(유럽 특허 제EP 0 689 454 B1호).
가장 바람직한 것은 상표명 RC-529TM 보조제 하에 제조원[Corixa Corp]로부터 구입가능한 보조제와 같은 아미노알킬 글루코사미드 포스페이트(AGP)로 지칭되는 MPLR 보조제와 구조적으로 관련된 화합물{2-[(R)-3-테트라-데카노일옥시테트라데카노일아미노]-에틸-2-데옥시-4-O-포스포노-3-O-[(R)-3-테트라데카노일옥시테트라데카노일]-2-[(R)-3-테트라-데카노일옥시테트라데카노일]-아미노]-p-D-글루코피라노시드 트리에틸암모늄 염}이다. RC-529 보조제는 제조원[Corixa Corp.]로부터 RC-529SE로 시판되는 스쿠알렌 에멀젼 및 RC-529AF로 시판되는 수성 형태로 구입할 수 있다(예를 들면, 미국 특허 제6,355, 257호 및 제 6,303, 347호; 제6,113,918호 및 미국 공보 제03-0092643호를 참조한다).
추가로 고려되는 보조제는 제조원[Coley Pharmaceutical Group]으로부터 구입가능한 CpG 뉴클레오타이드 모티프(플랭킹 서열과 함께)를 1회 이상 포함하는 합성 올리고뉴클레오타이드 보조제를 포함한다. 제조원[Aquila Biopharmaceuticals, Inc.]로부터 시판되는 QS21로 명명된 보조제는 남아메리카 나무[Quillaja Saponaria Molina(예를 들면, QuilTM A)]의 껍질로부터 유래된 보조제 활성을 갖는 면역학적으로 활성인 사포닌 분획이며, 이의 제조 방법이 미국 특허 제5,057,540호에 개시되어 있다. QuilTM A의 유도체, 예를 들면, QS21(또한 QA21로 공지된 QuilTM A의 HPLC 정제 분획 유도체) 및 QA17과 같은 기타 분획이 또한 개시되어 있다. 미국 특허 제5,977,081호 및 제6,080,725호에 기술된 바와 같은 Qillaja Saponaria Molina 사포닌의 반-합성 및 합성 유도체도 또한 유용하다. 제조원[Chiron Corp.]로부터 구입 가능한 MF59로 명명된 보조제가 미국 특허 제5,709,879호 및 제6,086,901호에 기술되어 있다.
무라밀 디펩타이드 보조제가 또한 의도되며 이는 N-아세틸-무라밀-L-트레오닐-D-이소글루타민(thur-MDP), N-아세틸-노르-무라밀-L-알라닐-D-이소글루타민[CGP 11637, 노르-MDP로 지칭됨] 및 N-아세틸무라밀-L-알라닐-D-이소글루타미닐-L-알라닌-2-(1'-2'-디팔미토일-sn-글리세로-3-하이드록시포스포릴옥시)에틸아민[(CGP) 1983A, MTP-PE로 지칭됨]을 포함한다. 소위 무라밀 디펩타이드 유사체가 미국 특허 제4,767,842호에 기술되어 있다.
바람직한 보조제 혼합물은 3D-MPL 및 QS21의 배합물(유럽 특허원 제0 671 948 B1호), 3D-MPL 및 QS21을 포함하는 수중유 에멀젼(국제공개공보 제WO 95/17210호 PCT/EP98/05714), 기타 담체와 함께 제형화한 3D-MPL(유럽 특허원 제 0 689 454 B1호), 콜레스테롤-함유 리포좀 내에 제형화된 QS21(국제공개공보 제WO 96/33739호), 또는 면역자극성 올리고뉴클레오타이드(국제공개공보 제WO 96/02555호)를 포함한다. 수중유 에멀젼 중에 QS21 및 MPL을 함유하는 SKB(현 Glaxo-SmithKline)으로부터 구입 가능한 보조제 SBAS2(현 AS02)도 또한 유용하다. 대안적 보조제는 국제공개공보 제WO 99/52549호에 기술된 물질 및 폴리옥시에틸렌 에테르의 비미립자 현탁액(영국 특허 제9807805.8호)을 포함한다.
MPLR 보조제와 같은 톨-유사 수용체-4(toll-like-recepter-4: TLR-4)에 대한 하나 이상의 작용제 또는 RC-529TM 보조제 또는 지질 A 모방체와 같은 구조적으로 관련된 화합물를 단독으로 또는 비-메틸화 올리고 데옥시뉴클레오타이드-함유 CpG 모티프와 같은 TLR-9에 대한 작용제와 함께 포함하는 보조제의 사용이 특히 바람직하다. 이러한 보조제는 당해 면역원성 HBc-포함 입자와 함께 혼합하거나 이러한 면역원과 화학적으로 연결시키는 경우, 감마-생성 CD 8+, CD 4+ T 세포 및 세포독성 림프구의 생성을 증진시킨다. 백반도 또한 이러한 보조제 혼합물 내에 존재할 수 있다. 초기 결과는 HBc 입자가 면역원을 포함하는 경우와 같이, T 세포 면역원이 존재하는 경우, 백반이 IgG1-형 항체의 생성에 유리한 Th2 면역반응을 증진시키는 반면, RC-529-형 보조제는 IgG2a 및 IgG2b 항체의 생산에 유리한 Th1 면역반응 및 T 세포 반응에 유리한 경향이 있음을 나타낸다.
가장 바람직한 보조제 혼합물은 추가로 미국 특허 제6,113,918호에 기술된 아미노알킬 글루코사민 포스페이트를 함유하는 안정한 유중수 에멀젼을 포함한다. 아미노알킬 글루코사민 포스페이트 중, RC-529{2-[(R-3-테트라-데카노일옥시테트라데카노일아미노]-에틸-2-데옥시-4-O-포스포노-3-O-[(R)-3-테트라데카노일옥시테트라데카노일-2-[(R)-3-테트라데카노일옥시테트라-데카노일아미노]-p-D-글루코피라노시드 트리에틸암모늄 염}으로 공지된 분자가 가장 바람직하다. 바람직한 유중수 에멀젼이 국제공개공보 제WO 9956776호에 기술되어 있다.
보조제는 보조제으로 사용하며, 이는 보조제, 숙주 동물 및 재조합 HBc 키메라 면역원에 따라 매우 다양할 수 있다. 통상적인 양은 면역화 당 약 1㎍ 내지 약 1mg으로 다양할 수 있다. 당해 분야의 숙련가들은 적합한 농도 또는 양을 용이하게 결정할 수 있을 것이다.
접종물 및 백신은 통상 예를 들면, 피하 또는 근육 내로 주입하여 비경구 투여한다. 기타 투여 방법에 적합한 추가 제형은 좌약 및, 일부 경우에, 경구 제형 또는 비강 스프레이를 포함한다. 좌제의 경우, 전통적인 결합제 및 담체는 예를 들면, 폴리알칼렌 글리콜 또는 트리글리세리드를 포함할 수 있으며, 이러한 좌제는 0.5% 내지 10%, 바람직하게는 1 내지 2% 범위의 활성 성분을 함유하는 혼합물로부터 형성할 수 있다. 경구 제형은 이러한 정상적으로 사용되는 부형제(예를 들면, 만니톨, 락토스, 전분, 마그네슘 스테아레이트, 나트륨 사카린, 셀룰로스, 탄산마그네슘 등)를 포함한다.
접종물 또는 백신 조성물은 용제, 현탁제, 정제, 환제, 캡슐제, 서방성 제형 또는 산제의 형태를 취하며, 면역원적 유효량의 HBc 키메라를 바람직하게는 입자, 활성 성분으로서 함유한다. 전형적인 조성물에서, 바람직한 HBc 키메라 입자의 면역학적 유효량은 상기한 바와 같이, 용량 당 약 1㎍ 내지 약 1mg, 및 보다 바람직하게는 약 5㎍ 내지 약 50㎍의 활성 성분이다.
백신 또는 접종물은 통상 비강내(IN) 또는 비경구 투여용으로 제형화한다. 예시적 면역화는 피하(SC), 근육내(IM), 정맥내(IV), 복강내(IP) 또는 진피내(ID)로 수행한다.
HBc 키메라 입자 및 HBc 키메라 입자 접합체를 중성 또는 염 형태로 백신 내로 제형화할 수 있다. 약제학적으로 허용되는 염은 산 부가 염(단백질 또는 합텐의 유리 아미노 그룹으로 형성한)을 포함하며 무기산(예를 들면, 염산 또는 인산) 또는 유기산(예를 들면, 아세트산, 옥살산, 타르타르산, 만델산 등)으로 형성한다. 유리 카복실 그룹으로 형성한 염은 또한 무기 염기(예를 들면, 나트륨, 칼륨, 암모늄, 칼슘 또는 수산화제2철) 및 유기 염기(예를 들면, 이소프로필아민, 트리메틸아민, 2-에틸아미노 에탄올, 히스티딘, 프로카인 등)으로부터 유래된 형태일 수 있다.
접종물 또는 백신을 투여 제형과 상용가능한 방식으로 치료학적으로 유효하고 면역성인 양으로 투여한다(경우에 따라, 항체-유도량 또는 보호량). 투여량은 치료할 피검체, 피검체의 면역계의 항체 생산 능력 및 목적하는 방어 정도에 따른다. 투여에 요구되는 활성 성분의 정확한 양은 전문가의 판단에 따르며 각각의 개체에 따라 다르다. 그러나, 적합한 투여 범위는 개체당 약 수백 마이크로그램의 활성 성분이다. 초기 투여 및 부스터 접종에 적합한 투약계획도 다양하지만, 초기 투여 후 간격(수주 또는 수개월)으로 후속 주사 또는 기타 투여를 하는 것이 통상적이다.
일단 면역화한 후, 숙주 동물을 재조합 HBc 키메라 면역원이 M2 단백질에 결합하는 충분한 역가의 항체를 생산하도록 유도하는 데 충분한 기간 동안 유지시킨다. 항-M2 항체의 생성을 위한 유지 기간은 통상 약 3주 내지 약 12주의 기간 동안 지속되며, 부스터, 백신의 2차 면역화 투여를 포함할 수 있다. 경우에 따라, 1차 면역화 후 수 주 내지 5년째에 3차 면역화를 또한 고려한다. 특히 일단 항체의 보호 수준 역가가 수득되면, 백신 접종한 숙주 동물을 바람직하게는 약 1년 내지 약 5년의 기간 후에 투여한 정기적 부스터 면역화에 의한 항체 역가 또는 그 근처로 유지시킨다.
항체 생성은 면역화한 숙주로부터 혈장 또는 혈청 샘플을 수득하고 하기한 ELISA 검정 또는 당해 분야에 널리 공지된 웨스턴 블롯(Western blot)과 같은 기타 면역검정법으로 합성 M2 폴리펩타이드 항원에 대한 이들의 결합 능력을 검정하여 용이하게 확인한다.
이렇게 유도한 상기한 항체를 널리 공지된 기법을 사용하여 숙주의 혈액으로부터 분리한 후, 또한 널리 공지된 수동 면역화를 위한 2차 백신으로 재구성할 수 있음을 유념한다. 유사한 기법이 사람의 감마-글로불린 면역화에 사용된다. 예를 들면, 하나 또는 다수의 면역화된 숙주로부터의 항혈청을 수성 황산암모늄(통상 40 내지 50%의 포화도)으로 침전시키고, 침전된 항체를 M2 폴리펩타이드가 크로마토그래프 칼럼에 고정된 항원으로 사용되는 친화성 크로마토그래피를 사용하여 크로마토그래피로 정제한다.
접종물은 실질적으로 백신과 동일한 제제이지만, 인플루엔자에 대한 항체가 유도되는 것이 바람직하지만 인플루엔자로부터의 보호가 바람직하지 않은 숙주 동물에 사용된다.
추가의 노력 없이도, 당해 분야의 숙련가는 전술한 명세서 및 아래의 상세한 실시예를 사용하여 본 발명을 최대한 사용할 수 있을 것으로 사료된다. 따라서, 다음의 바람직한 특이적 양태는 단지 예시이며, 어떠한 방법으로도 본원의 나머지 부분을 제한하지 않는 것으로 해석되어야 한다.
실시예 1: B 세포 에피토프-포함 키메라 제조
A. 플라스미드 벡터 pKK223-3N, pKK223-3의 변형된 형태의 제조
플라스미드 벡터 pKK223-3(Pharmacia)에 고유한 NcoI 제한 부위를 정착시켜, HBc 유전자가 NcoI-HindIII 제한 단편으로 삽입되고 이어서 이. 콜라이 숙주 세포 내에서 발현될 수 있도록 변형시켰다. pKK223-3 플라스미드 벡터를 변형시키기 위해, 신규한 SphI-HindIII 단편을 PCR 프라이머 pKK223-3/433-452-F 및 pKK223-NcoI-mod-R 및 주형으로서 pKK223-3을 사용하여 제조하였다.
당해 PCR 단편을 제한 효소 SphI 및 HindIII로 절단한 후 원형의 480 bp SphI-HindIII 단편을 효과적으로 치환시킨 pKK223-3 벡터의 4106 bp 단편과 연결한 467bp 단편을 제공하였다. 따라서 수득한 플라스미드(pKK223-3N; 4573bp)는 본 플라스미드보다 13bp 짧으며 도입된 NcoI 위치의 상부 변형된 뉴클레오타이드 서열을 포함한다(도 2를 참조하며, 여기서 대시는 결실된 염기를 나타낸다). 플라스미드 pKK223-3N 내의 제한 부위가 도 2에 제시되어 있으며 pKK223-3 모 플라스미드에 가해진 뉴클레오타이드 변화는 아래에 나타낸 바와 같이 밑줄로 표시되어 있다.
Figure 112006040715748-pct00008
B. V2, V16 및 V8 클로닝 벡터의 제조
합성 dsDNA 단편의 면역우세 루프 영역 내로의 방향성 삽입이 허용되도록 변형된 HBc149(V2 및 V16) 또는 HBc183(V8) 유전자를 PCR을 사용하여 작제하였다. (D78 및 P79 사이의 삽입물을 수용하고 V149까지 절단된 플라스미드를 V2로 명명하 였고, V149 이후로 추가의 시스테인을 갖는 동일한 플라스미드를 V16으로 명명하였으며, D78과 P79 사이에 삽입물을 수용하고 C183에서 종결된 플라스미드를 V8로 명명하였다.) HBc149 및 HBc183 유전자를 2개의 PCR 프라이머 쌍을 사용하여 이등분으로 증폭시는데, 하나는 아미노 말단을 증폭시키고, 다른 하나는 카복시 말단을 증폭시킨다. V2의 경우, PCR 반응 생성물은 249bp(N 말단) 및 243bp(C 말단)이며; V16의 경우, 당해 생성물은 249bp(N 말단) 및 246bp 단편(C 말단)이고; V8에 대하여, 당해 생성물은 249 bp(N 말단) 및 349bp 단편(C 말단)이다.
제조된 N-말단 단편을 NcoI 및 EcoRI으로 분해시켰고, C-말단 단편을 EcoRI 및 HindIII로 분해시켰다. 이어서 V2, V16 및 V8 단편 쌍을 공통된 EcoRI 돌출부에서 함께 연결시켰다. 이어서, 수득된 NcoI-HindIII 단편을 NcoI 및 HindIII로 절단하여 제조한 pK223-3N 벡터에 연결시켰다.
B 세포 에피토프를 V2, V16 및 V8 플라스미드 내로 삽입하기 위해, 적합한 플라스미드를 EcoRI 및 SacI 제한 효소로 절단하였다. 이어서 5' EcoRI 및 3'SacI 돌출부를 포함하는 합성 dsDNA 단편을 삽입시켰다. V2, V16 및 V8의 모든 경우에, 글리신-이소류신(EcoRI) 및 글루탐산-류신(SacI) 아미노산 쌍은 삽입된 B 세포 에피토프의 양쪽 측면에 위치한다. 삽입된 제한 부위는 아래의 프라이머에 밑줄로 표시한다.
Figure 112006040715748-pct00009
Figure 112006040715748-pct00010
Figure 112006040715748-pct00011
C. V34 및 V55 클로닝 벡터의 제조
합성 dsDNA 단편이 프리-코어 서열 LGWLWG에 대해 5'로 N-말단 영역으로 방향성 삽입될 수 있도록 하는 변형된 HBc149 유전자를, PCR을 사용하여 작제하였다. (V149에서 종결된 HBc 서열을 암호화하는 플라스미드를 V34로 명명한 반면, V149의 C-말단에 추가의 시스테인을 포함하는, HBc 서열을 암호화하는 플라스미드는 V55로 명명하였다.) HBc149 유전자를 2개의 PCR 프라이머 쌍을 사용하여 이등분으로 증폭하였는데, 하나는 아미노 말단을 증폭시키고, 다른 하나는 카복시 말단을 증폭시킨다. V34의 경우, PCR 반응 생성물은 293bp(N-말단) 단편 및 484bp(C-말단) 단편이었으며, V55의 경우, 동일한 N-말단 단편을 사용하였고 490bp C-말단 단편을 제조하였다.
PCR에 의해 제조된 N-말단 단편을 NcoI 및 SacI으로 분해시켰고, C-말단 단편은 SacI 및 HindIII로 분해시켰다. 이어서 V34 및 V55 단편 쌍을 공통된 SacI 돌출부에서 함께 연결하였다. 이어서, 수득한 NcoI-HindIII 단편을 NcoI 및 HindIII로 분해시켜 제조한 pKK223-3N 벡터에 연결하였다.
B 세포 에피토프-포함 삽입은 V2, V16 및 V8 클로닝 벡터에 대해 위에서 약술한 동일한 과정으로 성취하였다. 제한 부위는 아래의 올리고뉴클레오타이드 프라이머에 밑줄로 표시되어 있다.
Figure 112006040715748-pct00012
D. V47, V48 및 V54 클로닝 벡터의 제조
합성 dsDNA 단편의 아미노산 잔기 I3 및 D4 사이의 N-말단 영역내로의 방향성 삽입을 허용할 수 있는 변형된 HBc149 및 HBc183 유전자를 PCR을 사용하여 작제하였다. (V149에서 종결된 HBc 키메라를 암호화하는 플라스미드를 V47로 명명하였고, V149에 대해 C-말단에 추가의 시스테인을 포함하는 HBc 키메라를 암호화하는 플라스미드를 V54로 명명하였고, C183에서 종결되는 HBc 키메라를 암호화하는 플라스미드를 V48로 명명하였다) V47, V48 및 V54에 대해, PCR 프라이머 쌍을 사용하여 HBc 유전자에 선행하는 서열을 포함하는 주형 HBc149로부터 아미노-말단 단편을 증폭하였다. 수득한 PCR 단편은 190bp를 가진다. V47의 C-말단 단편의 경우, HBc 유전자를 PCR 프라이머 쌍을 사용하여 증폭시켜 469bp 단편을 수득하였고, V54에 대해, C-말단 단편은 475bp이다. V48의 C-말단의 경우, HBc183 유전자를 PCR 프라이머 쌍을 사용하여 증폭시켜 574bp 단편을 수득하였다.
이 시점으로부터 사용된 클로닝 과정은 클로닝 벡터 V34 및 V55에 대해 전술한 바와 동일하다.
V47, V48 및 V54 플라스미드 내로 이종성 서열을 삽입하기 위해, 플라스미드를 우선 NcoI 및 SacI 제한 효소를 사용하여 분해시켰다. 이어서 5' AflIII 및 3' SacI 돌출부를 포함하는 합성 dsDNA 단편을 삽입하였다(제한 효소 AflIII 및 NcoI은 상보적 돌출부를 남긴다는 것을 주의한다). V47, V48 및 V54의 모든 경우에, HBc 잔기 D2 및 I3를 결실시켜 이종성 면역원성 서열이 잔기 M1 바로 뒤에 따르도록 하였고; SacI 제한 부위를 암호화하는 글루탐산-류신(EL) 아미노산 쌍은 삽입된 에피토프 다음에 위치하도록 하였다. 삽입된 제한 부위는 아래의 올리고뉴클레오타이드 프라이머에 밑줄로 표시되어 있다.
Figure 112006040715748-pct00013
E. V7 클로닝 벡터의 제조
HBc 키메라의 C 말단에 T 세포 에피토프를 융합시키기 위해, 신규한 벡터, V7을 작제하였다. 고유한 EcoRI 및 SacI 제한 부위를 발린-149 및 HindIII 부위 사이에 삽입시켜 EcoRI-HindIII(또는 EcoRI-SacI) 제한 부위 내로의 합성 dsDNA의 방향성 삽입을 촉진시켰다. 아래의 PCR 프라이머 쌍을 사용하여 아미노-말단에 NcoI 제한 부위를 갖고 카복시-말단에 SacI 및 HindIII 위치를 갖는 HBc 149 유전자를 증폭시켰다. PCR 반응 생성물(479bp)을 NcoI/HindIII로 분해시키고 pKK223-3N으로 클로닝시켜 V7을 형성하였다.
T 세포 에피토프를 삽입시키기 위해, 플라스미드(V7)를 EcoRI-HindIII(또는 EcoRI-SacI)으로 분해시키고 EcoRI/HindIII(또는 EcoRI/SacI)을 갖는 합성 dsDNA 단편을 V7에 연결하였다. 모든 V7 작제물에 대해, 천연 HBc의 마지막 아미노산(발린-149) 및 삽입된 T 세포 에피토프의 최초의 아미노산을 EcoRI 제한 부위를 형성하는 뉴클레오타이드에 의해 암호화되는 글리신-이소류신 디펩타이드 서열로 분리한다. EcoRI/SacI에서 삽입된 에피토프에 대해, SacI 부위에 의해 제공된 종결 코돈 이전의 T 세포 에피토프 뒤에 추가의 글루탐산-류신 잔기가 있다. 제한 부위는 하기 제시한 프라이머에 다시 밑줄로 표시되어 있다.
Figure 112006040715748-pct00014
F. 부분적으로 절단된 입자를 발현하기 위한 발현 벡터의 합성
절단된 HBc 입자에 대한 발현 플라스미드를 제조하기 위해, 단일 아미노 말단 올리고뉴클레오타이드 PCR 프라이머(HBc149/NcoI-F)를 고유한 C-말단과 함께 사용하였다. 예를 들면, HBc156(E.cR) 발현 플라스미드를 제조하기 위해, 프라이머 HBc149/NcoI-F 및 HBc156(E.cR)-H3-R을 사용하였다. HBc156(E.cR)+C 발현 플라스미드를 제조하기 위해, 프라이머 HBc149/NcoI-F 및 HBc156(E.cR)-H3-R을 사용하였 다. 입자를 절단하는 것 - 및 일부 경우, C-말단 시스테인 잔기를 도입시키는 것- 이외에, 이. 콜라이 내에서의 발현에 최적인 코돈을 또한 사용하였다. 천연 HBc 서열 내에서 발견되는 희귀 아르기닌 코돈의 순차적 치환을 가능하게 하기 위해, HBc156 유전자를 먼저 합성한 후, HBc163 작제물에 대한 주형으로 사용하고; 이어서 HBc163 작제물을 HBc171 작제물에 대한 주형으로 사용하였다. 사용한 모든 프라이머의 서열이 아래에 제시한다. 모든 PCR 생성물을 제한 효소 NcoI 및 HindIII로 절단하고, 동일한 효소로 절단한 발현 벡터 pKK223-3N으로 클로닝시켰다.
Figure 112006040715748-pct00015
Figure 112006040715748-pct00016
실시예 2: A형 인플루엔자 M2 폴리펩타이드 서열을 포함하는 키메라의 제조
A. A형 인플루엔자 M2 N-말단 도메인의 V2, V7, V8, V16, V34, V47, V48, V54 및 V55 클로닝 벡터 내로의 삽입
V2, V7, V8, V16, V34 및 V55 작제물에 대하여, M2e-서열을 암호화하는 합성 dsDNA 단편(A형 인플루엔자 M2 단백질의 잔기 2-24; 서열번호 9)을 EcoRI/SacI 제한 부위 내로 삽입시킨 반면, V47, V48 및 V54 작제물에 대하여, 동일한 단백질의 잔기 1-24를 NcoI/SacI 제한 부위로 삽입시켰다. 합성 dsDNA 단편을 동일 몰농도의 상보적 일본쇄 DNA 올리고뉴클레오타이드와 혼합하고 95℃에서 5분 동안 가열한 후, 분당 -1℃의 속도로 실온까지 냉각시켜 제조하였다. 이러한 어닐링(annealing) 반응은 TE 완충액 중에서 수행하였다. 이중쇄 DNA를 위에 나타낸 암호화된 에피토프 서열과 함께 아래에 나타내었다.
Figure 112006040715748-pct00017
B. 개별 시스테인-돌연변이된 A형 인플루엔자 M2의 N-말단 도메인[M2(1-24/C17S), M2(1-24/C19S)]의 V47 발현 벡터 내로의 삽입
17번 또는 19번 위치의 시스테인을 세린으로 돌연변이된 M2 단백질의 잔기 1-24를 암호화하는 어닐링된 DNA 단편이 아래에 나타내어져 있다. 이들을 상기한 A. 부분에 기술한 바와 같이 NcoI/SacI 제한 부위 내로 삽입시켰다.
Figure 112006040715748-pct00018
C. 시스테인-돌연변이 A형 인플루엔자 M2 N-말단 도메인[M2(2-24/C17S, C19S)]의 발현 벡터 V8, V16, V47, V48 및 V54 내로의 삽입
V8 및 V16 작제물에 대하여, 2개의 시스테인이 세린으로 돌연변이되고 M2e 면역원성 서열(A형 M2 단백질의 잔기 2-24)을 암호화하는 합성 dsDNA를 EcoRI/SacI 제한 부위 내로 삽입한 반면, V7, V48 및 V54 작제물에 대해서는, A형 M2 단백질의 잔기 1-24를 NcoI/SacI 제한 부위 내로 삽입시켰다. 합성 dsDNA 단편은 위의 A부에 기술한 바와 같이 제조하였다.
Figure 112006040715748-pct00019
D. A형 인플루엔자 M2 N-말단의 부가적 복사체 도메인의 발현 벡터 V54.M2(1-24)의 N-말단으로의 삽입
천연 M2 서열[M2(1-24)] 또는 돌연변이된 M2 서열[M2(1-24/C17S, C19S)]의 하나의 부가 복사체를 N-말단에서 기존의 M2(1-24) 서열로 클로닝하였다. 이들 클론의 작제에서, 본래의 메티오닌을 제거하여 첨가된 복사체가 단 하나의 개시 메티오닌만을 공급하도록 하였다. PCR을 사용하여 당해 작제물을 2개의 단편으로 제조하였다. 2개의 천연 M2 복사체[M2(1-24)/V54.M2(2-24)]를 포함하는 클론을 제조하기 위해, 주형 V54.M2(2-24)를 사용하여 우선 M2 서열의 D24 뒤에 XhoI 부위를 삽입하는(따라서, 아미노산 류신 다음에 글루탐산 잔기가 있게 되는) N-말단 단편을 증폭시켰고(수득된 단편은 353bp이다), XhoI 부위를 M2 서열의 S2의 N-말단에 삽 입시켜 메티오닌을 제거하는 C-말단 단편을 증폭시켰다(수득된 단편은 538bp이다). M2의 천연 복사체가 후속하는 돌연변이체를 포함하는 클론[M2(1-24/C17S, C19S/V54.M2(2-24)]을 제조하기 위해, 주형 V54.M2(1-24/C17S, C19S)를 사용하여 N-말단 단편을 제조하는 한편, C-말단 단편은 상기한 바와 동일하다(수득된 단편 크기 또한 동일하다).
제조한 N-말단 단편을 BamHI 및 XhoI으로 절단하고, C-말단 단편을 XhoI 및HindIII로 분해시켰다. 이어서 단편 쌍을 공통된 XhoI 돌출부에서 함께 연결하였다. 이어서 수득된 BamHI-HindIII 단편을 BamHI 및 HindIII로 분해하여 제조한 pKK223-3N 벡터 내로 연결하였다.
돌연변이된 M2 서열의 2개의 부가적 복사체를 N-말단에서 기존의 M2(2-24) 서열로 클로닝하였다. 다시, 단 하나의 개시 메티오닌만이 유전자의 위치 1번에 보존되도록 하여 작제물 M2(1-24/C17S, C19S/M2(2-24/C17S, C19S/V54.M2(2-24)를 산출하였다. 다시, 당해 클론을 2개의 PCR 단편으로 제조하였다. 주형 V54.M2(1-24/C17S, C19S)를 사용하여, 돌연변이체 M2 서열의 잔기 D24 뒤에 PstI 부위를 삽입하는(따라서, 아미노산 류신이 다음에 글루타민이 있게되는) N-말단 단편을 제조하였다(수득된 단편은 353bp이다). 상기한 주형 M2(1-24/C17S, C19S/V54.M2(2-24)를 사용하여, PstI 부위를 돌연변이체 M2 서열의 S2에 대해 N-말단에 삽입시켜 메티오닌을 제거하는 C-말단 단편을 제조하였다(수득된 단편은 613bp이다).
제조된 N-말단 단편을 BamHI 및 PstI으로 분해시켰고, C-말단 단편을 PstI 및 HindIII로 분해시켰다. 이어서 단편 쌍을 공통된 PstI 돌출부에서 함께 연결시 켰다. 이어서 수득된 BamHI-HindIII 단편을 BamHI 및 HindIII로 분해시켜 제조한 pKK223-3N 벡터에 연결하였다.
Figure 112006040715748-pct00020
E. 천연 M2-HBc의 절단형의 작제물
183-잔기, 전체길이 HBc 서열을 포함하는 본래 M2-HBc 작제물(문헌[참조: Neirynck et al. , (October 1999) Nature Med. , 5 (10): 1157-1163: WO 99/07839]를 V149까지 절단하고, 전체 유전자를 pKK223-3 발현 벡터로 이동시켰다. 이를 수행하기 위해, Gent 대학에서 제공받은 플라스미드 3453을 PCR 반응을 위한 주형으로 사용하여 523bp의 생성물을 산출하였다. 당해 생성물을 제한 효소 AflIII 및 HindIII로 절단한 후, NcoI 및 HindIII로 분해하여 제조한 pKK223-3N 벡터 내로 연결하였다.
Figure 112006040715748-pct00021
Figure 112006040715748-pct00022
실시예 3: 검정 과정
A. 항원성
1. 입자 ELISA
정제한 입자를 피복 완충액(50mM 중탄산나트륨, pH 9.6) 중에 10㎍/ml의 농도로 희석시키고 ELISA 스트립 또는 플레이트의 웰에 도포하였다(50㎕/웰). ELISA 스트립을 실온에서 밤새(약 18시간) 항온처리하였다. 다음날 아침, 웰을 ELISA 세척 완충액[인산염 완충된 염수(PBS), pH 7.4, 0.05% TweenR-20]으로 세척하고 PBS 중의 3% BSA로 1시간 동안 차단시켰다(75㎕/웰). ELISA 스트립을 필요시까지 -20℃에서 저장, 건조시켰다.
입자의 항원성을 측정하기 위해, 항혈청을 PBS 중의 1% BSA을 사용하여 희석하고 항원-피복된 ELISA 웰에 웰당 50㎕씩 첨가하였다. 혈청을 1시간 동안 항온처리하고, ELISA 세척 완충액(상기 기술함)으로 세척하고 항-마우스(IgG)-HRP(제조원: The Binding Site, 캘리포니아주 샌디에고 소재; HRP = 서양고추냉이 퍼옥사다제) 접합체(50㎕/웰) 또는 기타 적합한 2차 항체를 사용하여 30분 동안 프로빙하였다. ELISA 세척 완충액으로 세척한 후, TM 청색 기질(50㎕/웰)을 첨가하여 반응을 가시화하였다. 10분 후, 1N H2SO4(100㎕/웰)을 첨가하여 반응을 중지시키고 450nm에서 ELISA 플레이트 판독기 상에서 판독하였다.
2. 합성 펩타이드 ELISA
24개 아미노산 잔기의 합성 펩타이드 M2를 피복 완충액(50mM 중탄산나트륨, pH 9.6) 중에서 2㎍/ml의 농도로 희석하고 ELISA 스트립의 웰에 피복하였다(50㎕/웰). 배기관이 장착된 후드에서 밤새(약 18시간) 항온처리하여 펩타이드를 웰 상에서 건조시켰다. 다음날 아침, 웰을 ELISA 세척 완충액[인산염 완충된 염수, pH 7.4, 0.05% TweenR-20]으로 세척하고 PBS 중의 3% BSA로 1시간 동안 차단시켰다(75㎕/웰). ELISA 스트립을 필요시까지 -20℃에서 저장, 건조시켰다.
입자의 항체 결합을 측정하기 위해, 항혈청(모노클로날 또는 폴리클로날)을 PBS 중의 1% BSA을 사용하여 희석하고 항원-포복된 ELISA 웰에 웰당 50㎕씩 첨가하였다. 혈청을 1시간 동안 항온처리하고, ELISA 세척 완충액으로 세척하고, 항-마우스(IgG)-HRP 접합체 또는 기타 적합한 2차 항체(상기한 바와 같이 50㎕/웰)를 사용하여 30분 동안 프로빙하고, 다시 ELISA 세척 완충액으로 세척한 후, TM 청색 기질(50㎕/웰) 또는 기타 적합한 기질을 첨가하여 반응을 가시화하였다. 10분 후, 1N H2SO4(100㎕/웰)을 첨가하여 반응을 중지시키고 450nm에서 ELISA 플레이트 판독기 상에서 판독하였다.
B. 입자의 면역원성
입자의 면역원성을 검정하기 위해, 마우스를 선택한 보조제 중 입자 10㎍을 복강 내 주입하여 면역화시킨 후, 3주 간격으로 1회 또는 2회 동일한 보조제 10㎍으로 부스터하였다. 마우스를 면역화 전 및 면역화 2, 4, 6 및 8주 후에 채혈하였다.
실시예 4: 280:260 흡광도 비의 측정
정제한 입자의 280:260 흡광도 비를 측정하기 위해, 입자를 pH 6.8의 인산나트륨 완충액 20mM에 약 0.2mg/ml의 농도로 희석하고, 260 및 280nm의 파장에서 흡광도 수치를 측정하였다. 280nm에서 측정한 흡광도를 260nm에서의 수치로 나누어 280:260 비를 결정하였다. 당해 비를 천연 입자(HBc183), 잔기 위치 149번 뒤에서 절단한 HBc 입자(HBc149) 및 본원의 다른 부분에서 정의한 수개의 HBc 키메라를 포함하는 여러 샘플에서 수득하였고, 아래의 표 1에 나타내었다. 전체길이 입자 ICC-1559는 문헌[참조: Neirynck et al. , (Oct 1999) Nature Med., 5 (10): 1157-1163] 및 특허 출원 제W0 9907839호에 처음 보고된 입자 제제인 반면, 전체길이 입자 ICC-1670은 폴리펩타이드 위치 17번 및 19번(서열번호 9의 X17 및 X19)의 M2 폴리펩타이드 시스테인이 세린 잔기로 돌연변이된 유사 입자이다.
Figure 112006040715748-pct00023
NT, 시험하지 않음. *CV-1159는 문헌에 기술된 IM2-HBc와 동일하다.
실시예 5: 열안정성 프로토콜
정제된 입자를 50mM NaPO4, pH 6.8을 사용하여 1mg/ml의 농도로 희석하고 아지드화나트륨을 0.02%의 최종 농도로 첨가하여 세균 성장을 방지하였다. 샘플을 SDS-PAGE 샘플 완충액(환원성)과 혼합하고 15% SDS-PAGE 겔에서 전개시켰다. 겔을 쿠마시 블루 용액을 사용하여 염색한 후 분석하였다.
실시예 6: 하이브리드 입자의 분석적 겔 여과 분석
정제된 하이브리드 HBc 입자의 분석적 겔 여과 분석을 SuperoseR 6 HR 10/30 크로마토그래프 칼럼(Amersham Pharmacia # 17-0537-01) 25ml 및 BioCADTM SPRINT 관류 크로마토그래피 시스템을 사용하여 수행하였다. UV 검출기는 280nm의 파장을 모니터링하도록 설정하였다. 칼럼을 0.75ml/분의 유속으로 완충액(50mM NaPO4, pH 6.8)의 3 칼럼 용적(CV; 약 75ml)으로 평형화시켰다.
분석할 입자를 pH 6.8의 50mM NaPO4를 사용하여 1mg/ ml의 농도로 희석하였다. 이어서, 당해 샘플 200마이크로리터(㎕)를 200㎕ 루프에 적재하고 칼럼에 주입하였다. 당해 샘플을 pH 6.8의 50mM NaPO4를 사용하여 0.75ml/분의 유속으로 칼럼으로부터 용출시켰다.
N-말단 시스테인 잔기를 포함하는 입자 또는 이러한 시스테인을 포함하지 않는 유사한 입자를 상기한 과정으로 분석하였다. BioCADTM 소프트웨어(PerSeptiveTM)을 사용하여 280nm 트레이스(trace)의 통합을 수행하여 결과를 도출하였다.
실시예 7; 인플루엔자 M2 작제물
최근, 문헌[참조; Neirynck et al., (1999년 10월) Nature Med., 5 (10): 1157-1163] 및 국제공개공보 제WO 99/07839호는 아미노산 잔기 1-4가 결실된, 전체길이 HBc 입자(HBc183)의 N-말단에 대한 M2의 24개 아미노산 세포외 도메인의 융합을 보고하였다. 본원에 IM2HBc로 지칭한 작제물의 도식을 아래에 나타내었으며, 여기서 24-mer는 HBc의 N-말단에 연결되어 있다.
Figure 112006040715748-pct00024
한 예시적 제조에서, M2 에피토프를 B형 간염 코어의 면역우세 루프로 삽입시켰고, ICC-1475로 명명한 입자를 이러한 삽입 및 정제에 대해 상기한 기법을 사용하여 정제하였다. M2 17번 및 19번의 본래 위치의 2개의 시스테인 잔기가 알라닌 잔기로 치환된 M2 에피토프의 돌연변이형도 또한 면역우세 루프(ICC-1473 입자)에서 발현되었으며, 수득된 입자를 정제하였다. 이들 2가지 입자를 하기에 도식적으로 예시한다.
Figure 112006040715748-pct00025
ICC-1473 입자 작제물은 천연 서열(ICC-1475)와 비교하였을 때, 약 7배 이상의 정제된 입자를 산출하였다. 시스테인 잔기의 돌연변이가 당해 입자의 보호 잠재력을 변화시키는지를 결정해야 한다. 그러나, HBc의 면역우세 루프에 전달된 에피토프는 일반적으로 이들이 다른 영역(N-말단을 포함하여)에 융합되는 경우와 비교하였을 때 현저히 더 큰 면역원성을 나타내며, 수득된 입자는 감소된 항-HBc 면역원성을 나타낸다.
또한, M2 N-말단 24-mer 서열을 C-말단 절단된 B형 간염 코어 입자의 N-말단에 융합시킨 입자를 제조하였다. 당해 작제물(ICC-1438)은 또한 N-말단 프리-코어 서열(서열번호 66)을 포함하였다. 하이브리드 단백질(ICC-1492)의 말단에 단일 시스테인 잔기를 포함하는, 이번 경우에는 HBc 유전자의 Val-149의 바로 뒤에 포함하는 유사한 작제물을 제조하였다. 이들 작제물은 아래에 도식적으로 나타낸다.
Figure 112006040715748-pct00026
천연 HBc 개시 메티오닌으로부터의 번역 개시를 막기 위해, 당해 잔기에 대한 코돈을 이소류신 잔기를 암호화하도록 돌연변이시켰음이 주지된다. EcoRI(GI) 및 SacI(EL) 제한 부위에 의해 제공된 잔기는 밑줄로 표시되어 있다. 프리-코어 서열은 밑줄로 표시된 EL 잔기와 "-HBc(2-149)" 사이에 열거되어 있다.
본원의 다른 부분에서 논의한 바와 같은 SDS-PAGE에 의한 분석은, 제조시에 ICC-1438 단량체 작제물(2번 레인)이 도 10에 SDS-PAGE 겔 상의 추가의 분자량 대조군으로서 사용한 ICC-1492(3번 레인), HBc-149(1번 레인), ICC-1475(4번 레인) 및 ICC-1473(5번 레인)에 비하여 불안정하였음을 나타냈다. ICC-1438 단량체의 불안정성은 입자의 분석적 겔 여과를 사용하였을 때는 분명하지 않았다.
ICC-1475(도 10, 4번 레인) 및 ICC-1473(도 10, 5번 레인) 둘 다가 ICC-1438 및 ICC-1492보다 다소 작은 분자량을 가질 것으로 예상하였는데, 이는 전자 2개가 면역우세 루프내로 직접 삽입된 M2 서열을 포함하며 따라서 ICC-1438 및 ICC-1498 내에 존재하는 프리-코어 서열(서열번호 66)이 결여되어 있기 때문이다. 예상한 바와 같이, ICC-1492는 ICC-1475 및 ICC-1473보다 컸지만, C-말단 시스테인 잔기를 제외하고는 ICC-1492와 동일한 ICC-1438은 명백한 절단 때문에 ICC-1475 및ICC-1473보다 명백하게 크지는 않았다.
상기한 바와 같이 HBc N-말단(도메인 I) 또는 루프(도메인 II)에 연결되어 있으며 또한 HBc의 C-말단(도메인 IV)에 시스테인 잔기를 포함하는 M2 N-말단 세포외 서열을 포함하는 작제물을 또한 의도한다.
면역우세 루프 융합물을 포함하는 하이브리드 HBc 입자의 아미노-말단이 시스테인 잔기 및 최소 M2-유래 서열을 포함하도록 변형시키기 위해, 일련의 합성 올리고뉴클레오타이드를 합성하였다. V2.Pf1(N-M2(17-24/C17S)를 제조하기 위해, 올리고뉴클레오타이드 M2(17-24/C17S)-NcoI-F 및 HBc149/HindIII-R을 사용하여 벡터 V2.Pf1으로부터 하이브리드 HBc 유전자를 증폭시켰다. 수득한 546bp 단편을 NcoI 및 HindIII로 절단하고 동일한 2개의 효소로 절단한 pKK223-3N으로 삽입시켰다.
V2.Pf1(N-M2(17-24/C19S)를 제조하기 위해, 올리고뉴클레오타이드 M2(17-24/C19S)-NcoI-F 및 HBc149/HindIII-R을 사용하여 벡터 V2.Pf1으로부터 하이브리드 HBc 유전자를 증폭시켰다. 수득한 540bp 단편을 NcoI 및 HindIII로 절단하고 동일한 2개의 효소로 절단한 pKK223-3N에 삽입시켰다.
Figure 112006040715748-pct00027
실시예 8: N- 및 C-말단 시스테인 잔기 둘 다를 갖거나 갖지 않은 HBc 키메라 분자
C-말단이 149번 잔기에서 절단된 HBc의 N-말단에 또는 그 근처에 A형 인플루엔자 M2 단백질의 잔기 1-24를 포함하는 일련의 HBc 키메라 분자-포함 입자를 제조하였다. 키메라 단백질 분자의 성분은 M2 서열 또는 변이체를 포함하는 상이한 N-말단 서열을 포함하며, 일부는 C-말단 시스테인 잔기를 포함하였다.
아래의 표 2에 열거한 모든 정제 입자를 분석 크기 배제 크로마토그래피로 분석하여, 정제 후의 미립자 구조의 유지를 평가하였다. 어떤한 N-말단 시스테인 잔기도 포함하지 않는 ICC-1603으로 명명된 입자는 하위-미립자 구조로 다시 분해된다는 증거가 나타났는데(도 3), 그 이유는 당해 단백질을 1500초 범위 내에서 용출시켰기 때문이다(올바르게 형성된 입자는 약 1000초에서 용출된다).
N-말단 M2 서열에서 2개의 세린 잔기의 시스테인 잔기로의 돌연변이를 제외하고는 ICC-1603 ICC-입자와 유사한 입자 ICC-1590의 유사한 분석은 당해 작제물이 하이브리드 입자에 대해 통상적인 약 1000초에서 발생한 용출을 사용한 정제 후 미립자 상태를 유지함을 나타내었다(도 4). ICC-1590 입자에 대한 분해의 증거는 없었다.
키메라 단백질이 또한 2개의 N-말단 시스테인 잔기를 갖는 ICC-1560 입자의 분석은 이 역시 정제 후에 미립자였지만, 이는 어느 정도의 분해를 보였음을 나타내었는데(도 5), 이는 안정화가 ICC-1590 입자에서만큼 확실하게 확고하지는 않았음을 제시하는 것이다. ICC-1590 및 ICC-1560 입자의 N-말단 형태의 비교(아래의 표 2)는 ICC-1560 입자 내의 2개의 시스테인 잔기의 상대적 위치가 3개의 아미노산 잔기(DEL)의 결실로 인해 ICC-1590 입자에 비하여 3개 아미노산 잔기만큼 위치가 변경되었음을 보이고 있는데, 이는 시스테인 잔기가 최적의 교차-결합을 가능하게 하는 코어 유전자의 출발 지점으로부터 최소한의 거리를 필요로 할 수 있음을 나타내는 것이다.
실시예 9: M2 또는 M2 변이체 서열 및 C-말단 시스테인 잔기를 갖는 입자
정제 후 용이하게 분해되는 ICC-1603 입자를 도 3에 나타내었다. ICC-1605 입자를 포함하는 HBc 키메라 분자는 ICC-1605 성분 키메라 분자가 단일 C-말단 안정화 시스테인을 갖는 것만 제외하고 ICC-1603 입자의 것과 유사하다. C-말단 시스테인 잔기의 ICC-1603 입자로의 첨가가 입자에 보다 큰 안정성을 부여할 수 있는지를 조사하기 위해 플라스미드가 ICC-1605 입자의 발현을 지시할 수 있도록 제조하였다. 정제 후, ICC-1605 입자를 분석 크기 배제 크로마토그래피를 사용하여 분석하였다(도 6).
당해 연구의 결과는 입자 안정화가 ICC-1603 입자에 비해서는 보다 완전하지만, 2개의 아미노-말단 시스테인 잔기는 포함하지만 C-말단 안정화 시스테인은 포함하지 않는 C-1590 입자에 비해서는 불완전하였음을 입증하였다. 상당량의 ICC-1605가 미립자를 남겼지만, 넓은 범위에 걸쳐 용출시킨 하위-미립자 구조의 이종성 혼합물의 증거가 있었다. 이들 관찰은 이들 하이브리드 입자(ICC-1603)에 대하여, ICC-1605 입자에서 발견되는 C-말단 안정화가 ICC-1590 입자에서 발견되는 N-말단 안정화에 비하여 보다 불완전하였음을 제안한다.
하이브리드 입자의 배합된 아미노 및 카복시-말단 시스테인 안정화의 양립성을 조사하기 위해, 발현 플라스미드가 ICC-1604 입자의 발현을 지시하도록 작제하였다. ICC-1604 입자의 키메라 분자의 성분은 천연 M2 폴리펩타이드 서열(ICC-1590에서와 같이) 내에 존재하는 2개의 아미노-말단 안정화 시스테인 잔기 및 C-말단 안정화 시스테인(ICC-1605 입자에서와 같이) 둘 다를 포함한다. ICC-1604 입자의 분석은 이들이 정제 후 상동성 미립자를 유지함을 보였는데(도 7), 이는 2가지 안정화 방법이 보완적이며 서로 제휴하여 사용할 수 있음을 나타내는 것이다.
HBc의 N-말단 및 N-말단 시스테인 잔기 사이의 선택적 링커 서열을 입자 ICC-1438 및 ICC-1492를 사용하여 조사하였다. 이들 입자 둘다는 HBc의 M2 융합 및 아미노산 D4 사이의 아미노산 서열 ELLGWLWGIDI(서열번호 103)을 포함한다. 아미노산 잔기 LGWLWGIDI는 당해 위치로부터 번역 개시를 막기 위해 이소류신을 돌연변이시킨 HBc의 개시 코돈을 갖는, HBc의 아미노산 I3에 대한 프리-코어의 아미노산 -6번으로부터 유래하였으며, 이는 본 연구를 절충할 것이다. HB 프리-코어 서열은 -7번 위치에 시스테인을 포함한다.
이들 입자는 ICC-1438 성분 키메라 분자는 HBc의 149번 위치에서 종결되는 반면, ICC-1492 성분 키메라 분자는 HBc의 149번에서 종결되며 서열번호 1의 HBc에 관하여 150번 위치에 말단 시스테인을 포함한다는 사실만 다르다. 상기한 바의 대안이지만 유사한 방법을 사용하여 분석적 겔 여과로 분석한 경우(입자들을 약 10분에 용출시킨다), 작제물 둘 다 정제 후 미립자로 이루어진 것으로 나타났다(도 8에서 ICC-1438 및 도 10에서 ICC-1492). 당해 연구는 절단된 입자의 아미노- 및 카복시-말단 시스테인 안정성의 양립성 및 N-말단 시스테인 잔기 및 HBc 유전자의 출발점 사이의 아미노산 서열의 실질적인 가변성 및 거리의 허용도를 입증하였다. 여러 연구로부터의 데이타를 아래의 표 2A, 2B 및 2C에 나타낸다.
Figure 112006040715748-pct00028
Figure 112006040715748-pct00029
Figure 112006040715748-pct00030
아래의 표 3은 HBeAg의 N-말단 및 N-말단 융합을 내포하는 입자의 배위를 예시하는 정렬을 나타낸다. 서열은 모든 작제물이 공유하고 있는 서열번호 1의 HBc의 N-말단으로부터 아미노산 잔기 4번 위치를 따라 정렬되어 있다. 존재하는 경우, N-말단 시스테인 잔기는 밑줄로 표시한다.
Figure 112006040715748-pct00031
아래의 표 4는 본원에서 고찰한 N-말단 A형 인플루엔자 M2 서열 또는 변이체를 포함하는 입자에 대해 평가한 안정성 결과표를 제공한다. 나타낸 바와 같이, 안정한 입자는 서열번호 1의 HBc 서열의 N-말단에 대해 마이너스 14번(-14) 위치의 N-말단 시스테인 잔기부터 대략 N-말단 자체를 포함하는 HBc 키메라 분자로부터 제조하였다.
Figure 112006040715748-pct00032
* 제2의 N-말단 M2 복사체로부터
실시예 10: M2-포함 입자의 수율 및 핵산 결합
수율은 500ml 배양액으로부터 정제된 입자의 밀리그램으로 표현되어있다. 결합된 핵산의 존재는 정제된 입자의 A280:A260 비율을 측정하여 결정하였다. 1.0 이상의 비율은 결합된 핵산이 없음을 나타내며, 1.0 미만의 비율은 결합된 핵산의 존재를 나타낸다. 저자 Fiers와 그의 동료들(문헌[참조: Neirynck et al., (1999) Nat. Med., 5 (10): 1157-1163, 및 특허 출원 제W0 9907839호])에 의해 기술된 본래의 전체길이 IM2HBc는 ICC-1559와 동일하다.
입자 M2e 서열 삽입 부위 C-말단 결합된 핵산 수율(mg/500mL)
1123(HBc149+C)
 없음 NA 절단된/안정화된 없음 16.6
1559(IM2HBc) M2(1-24) N-말단 전체길이 있음 3.2
1604 M2(1-24) N-말단 절단된/안정화된 없음 16.7
1569 M2(224)
(C17S, C19S)		 면역우세 루프(D78과 P79 사이) 절단된/안정화된 없음 11.2
1475 MS(2-24) 면역우세 루프(D78과 P79 사이) 절단된/안정화된 없음 1.1
실시예 11: 다양한 M2-포함 입자의 항원성
모노클로날 항체 14C2에 대한 다양한 입자의 항원성은 ELISA를 사용하여 시험하였다. 입자의 그들의 천연 형태로의 보존을 확보하기 위해, ELISA 플레이트를 우선 폴리클로날 항체(토끼)를 사용하여 피복시켜 당해 입자를 포획하였고, 이어서 14C2 모노클로날 항체 또는 HBc 입자의 면역우세 루프 영역에 대한 특이성을 갖는 2개의 항-HBc 모노클로날 항체의 다양한 희석물로 탐사하였다. 아래의 표에 나타낸 데이타는 HBc의 면역우세 루프 내의 M2e의 존재가 N-말단에서의 제시에 관하여, 142C 모노클로날 항체에 대한 M2e 에피토프의 접근성을 변형시키지 않음을 입증한다(IM2HBc/ICC-1559 및 ICC-1604). 이들 관측은 이미 14C2가 M2e의 내부 영역(N-말단에 반하여, M2의 아미노산 8, 10, 11 및 14)에 결합함을 보였기 때문에 놀라운 것이 아니었다(문헌[참조: Zebedee et al. , (1988)J.Virol., 62 (8):2762-2772].
추가로, ICC-1569를 제외한 모든 입자는 항-HBc 모노클로날 항체 3120 및 3105에 대한 항원성을 보유하였다. 3105에 의한 인식의 소실은 면역원 루프 내로 삽입된 서열을 갖는 입자에 대해 이미 관측된 현상이며, 이는 통상 면역화 후 이들 입자에 대한 항-HBc 반응을 감소시키키는 것으로 해석된다. 모노클로날 항체 3105 및 3120은 일본의 제조원[Tokyo Institute of Immunology]로부터 구입하였다.
Figure 112006040715748-pct00033
실시예 12: 다양한 M2-포함 입자의 면역원성
ICC-1604 및 ICC-1569의 면역원성을 마우스에서 조사하였다. 2가지 입자 사이의 항-M2e 역가에는 근소한 차이가 있었던 반면, 항-HBc 역가의 중요한 차이가 2가지의 입자 사이에서 관측되었다. 천연 면역우세 루프를 가지며, IM2HBc와 유사한 항-HBc 역가를 끌어내는 ICC-1604 입자는 ICC-1569 입자에 대한 역가보다 약 100배 높았다. 이들 데이타는 에피토프 삽입에 의한 HBc의 면역우세 루프의 파괴가 HBc 모노클로날 항체 3105에 의한 인식 상실을 초래하여 항-HBc 항체 반응을 극적으로 감소시킴을 재강조한다. 역으로, 입자 둘 다 유사한 항-M2e 항체 반응을 도출하며 약 1:100,000의 종말점 역가를 갖는 IM2HBc/ICC-1559에 대하여 상기한 바와 비교할만 하였다.
입자를 AlhydrogelTM 상에서 제형화시켰고, 10마리의 마우스의 그룹을 0(영)일 및 28일째에 제형화한 입자 2회의 10㎍ 용량으로 면역화시켰다. 수집한 혈청은 항-HBc에 대한 2차 주사 및 ELISA 검정을 사용한 항-M2e 항체 반응 후 2주째에 분석하였다. 부스터 2주 후에 10마리의 마우스로부터 수집한 혈청을 포획 항원으로 제공한 M2e(2-24) 합성 펩타이드 및 재조합 HBc(ICC-1123)를 사용하여 ELISA로 분석하였다.
마우스 치사 면역성 시험 모델에서의 ICC-1569 및 ICC-1604 입자의 직접 비교는 입자 둘 다 AlhydrogelTM 상에서 제형화한 경우, 치사 면역성 시험 용량으로부터 완전히 방어할 수 있음을 나타내었다. 따라서 이들 결과는 입자 둘 다 항-M2e 항체의 유사한 역가를 도출한다는 관측과 일치한다.
Ghent 대학의 Fiers와 그의 동료들에 의한 다중 마우스 연구로부터의 데이타의 상이한 입자 및 보조제의 배열을 사용한 편집은 IgG2a 아부류의 항-M2e의 역가와 방어 효능 사이의 가능한 상관관계의 증거를 나타낸다. 104 이상의 항-M2e IgG2a 역가를 나타내는 마우스는 치사량의 면역성 시험으로부터 확실하게 보호된 반면, 104 이하의 항-M2e IgG2a 역가, 그러나 104 이상의 IgG1 역가를 나타낸 마우스는 통상 보다 불완전한 보호를 나타낸다. 이들 데이타는 이들이 항-M2e 항체가 단순히 M2의 기능을 막는 것이 아니라, 방어가 IgG 아부류 바이어스에 독립적임을 제안하는 잠재적 방어 메카니즘에 관련성을 갖는다. 마우스 IgG2a(및 IgG2b)가 NK 세포에 의해 발현되는, 보체 고정 및 FcγRIII 수용체 결합에 가장 효과적인 아부류이기 때문에(문헌[참조: Ravetch et al. , (1991)Annu. Rev. Immunol., 9:457-492]), 당해 데이타는 CDC 및/또는 ADCC를 포함하는 면역 메카니즘을 제안한다.
실시예 13: 항체 아부류 및 보호
각종 M2e-HBc 작제물(10㎍/마우스) 및 각종 보조제를 검정한 여러 연구의 요약이다. 약 절반은 복강내 주입하였으며 약 절반은 비강내로 주입하였다. 각각의 그룹에 대해(14마리 마우스), 혈청을 수집하였고, 항-M2e IgG 아부류 항체의 역가를 결정하였다. 당해 결과는 2차 부스터 1주 후에 혈청으로부터 얻은 것이다. IgG2a 역가가 104 이상인 마우스에 대해, IgG1 역가는 104(*)이었다.
IgG2a 그룹의 수 보호율(%)
104 8 100
<104* 4 70 내지 95
보조제의 백신에 대한 면역 반응의 규모 및 지속력을 증진시키는 능력 및 면역 반응의 Th1/Th2 바이어스의 조절 능력이 점차 많이 조사되어 왔다. 비록 많은 실험 보조제가 조사되고 있지만, 백반이 미국 내에서 FDA-승인된 백신 성분인 유일한 보조제로 남아있다. 통상적으로, 백반은 면역 반응을 Th2 유형으로 기울게 하며, 이는 마우스에서의 IgG1 항체의 높은 수준의 생성에 의해 증명된다.
백반-제형화된 M2e-HBc 입자는 중요한 IgG1 반응을 유도하지만, Th1 지시자인 IgG2a 및 IgG2b 항체도 또한 유도함이 밝혀졌다. Th1-유형 IgG 아유형의 생성을 증진시키려는 시도에서, 제조원[Corixa Corporation]에서 개발한 MPLR과 구조적으로 관련된 화합물인 RC-529로 보충한 AlhydrogelTM-제형화 입자의 면역원성을 마우스에서 시험하였다. 이들 연구는 AlhydrogelTM-제형의 RC-529의 함유물이 항-M2e IgG2a:IgG1 비를 약 10배 증가시키는, 항-M2e IgG2a 역가의 극적인 증진을 초래함을 보여주었다. 둘 다의 그룹 내의 모든 마우스는 치사량의 면역성 시험에서 완전하게 보호되었지만, AlhydrogelTM만으로 제형화한 것에 비하여 AlhydrogelTM+ RC-529로 제형화한 ICC-1569로 면역화시킨 마우스에서 감소된 사망률의 증거가 있었다.
실시예 14: 부분 절단 HBc 입자: 부분 절단 입자의 발현용 발현 벡터의 합성
부분적으로 절단된 HBc 입자를 발현시키기 위한 발현 플라스미드를 제조하기 위해, 단일 아미노 말단 올리고뉴클레오타이드 PCR 프라이머(HBc149/NcoI-F)를 유일한 C-말단 프라이머와 함께 사용하였다. 예를 들면, HBc156(E.Cr; ICC-1600 입자) 발현 플라스미드를 제조하기 위해, 프라이머 HBc149/NcoI-F 및 HBc156(E.cR)-H3-R을 사용하였다. 프라이머 HBc149/NcoI-F 및 HBc156C(E.cR)-H3-R을 사용하여 HBc156(E.cR) +C(ICC-1601 입자) 발현 플라스미드를 제조하였다. 사용된 모든 프라이머의 서열을 아래에 나타내었다.
입자 절단 - 및 임의의 경우, C-말단 시스테인 잔기의 혼입- 외에, 이. 콜라이 내에서의 발현에 최적인 코돈을 또한 사용하였다. 수개의 아르기닌 코돈, 특히 AGA 및 AGG는 이.콜라이에 의해 드물게 사용되며, 번역 중 폴리펩타이드 합성 속임을 주도하여 미성숙 종결을 초래함으로써 이. 콜라이에서의 효과적인 단백질 발현에 문제가 되는 것으로 사료됨이 공지되어 있다. HBc 150과 183 사이의 16개의 아르기닌 코돈 중, 7은 드문 AGA 코돈에 의해 암호화되며, 2는 매우 드문 AGG 코돈에 의해 암호화된다. 따라서, 당해 연구에서, 모든 AGA 및 AGG 코돈을 이. 콜라이에서 보다 흔히 사용되는 코돈으로 치환하였다.
드문 아르기닌 코돈의 순차적 치환을 가능하게 하기 위해, HBc156 유전자를 우선 합성하고(ICC-1600 및 HBc156+C ICC-1601 입자), 이어서 HBc163 작제물(ICC-1634 및 HBc163+C ICC-1632 입자)에 대한 주형으로 사용하며; 그 후 HBc163 작제물은 HBc171 작제물(ICC-1642 및 HBc171+C ICC1643 입자)에 대한 주형으로 사용하고, 마지막으로, HBc171 작제물은 HBc182 및 HBc183 작제물에 최적화된 아르기닌 코돈에 대한 주형으로 사용한다. 비최적화 HBc182 작제물(ICC-1575)을 또한 대조의 목적으로 제조한다. 모든 PCR 생성물을 제한 효소 NcoI 및 HindIII로 절단하고 상기한 바와 동일한 효소로 절단한 발현 벡터 pKK223-3N 내로 클로닝시켰다.
아미노 말단 프라이머 서열(NcoI 제한 부위는 밑줄로 표시한다):
Figure 112006040715748-pct00034
카복시-말단 프라이머 서열(HindIII 제한 부위는 밑줄로 표시한다):
Figure 112006040715748-pct00035
Figure 112006040715748-pct00036
아래의 표 5는 전체길이 HBcAg(HBc183)의 C-말단의 형태를 예시하는 정렬선을 나타내며, 모든 입자는 C-말단 절단을 내포한다. 서열은 모든 작제물에 의해 공유되어 있는 서열번호 1의 HBc의 N-말단으로부터 아미노산 잔기 149번 위치에 따라 정렬되어 있다. C-말단 시스테인 잔기는, 존재하는 경우 밑줄을 그어 놓았다.
Figure 112006040715748-pct00037
실시예 15: N-말단 시스테인의 유무하에 HBc 키메라를 사용한 입자 형성 및 안정성
0개(입자 1891), 1개(입자 1892 및 1893) 또는 2개(입자 1890) 시스테인 잔기를 포함하는, 149번 위치에서 절단된 B형 간염 핵의 아미노산 D4에 짧은 N-말단 융합물을 포함하는 일련의 4개의 키메라 단백질을 제조하였다. 당해 키메라를 분석 크기 배제 크로마토그래피(SEC)를 사용하여 분석하여 정제 후 입자 보전성을 검정하였다. 이들 N-말단 융합물의 서열 및 분리된 수율을 아래의 표 6에 나타내었다.
Figure 112006040715748-pct00038
하나 이상의 시스테인을 포함하는 3개의 키메라 단백질을 세포 배양물 500ml 당 1.9 내지 6.8mg의 범위의 수율로 성공적으로 정제하였다. 개시자 메티오닌으로부터 3번 및 5번 위치에 2개의 시스테인(입자 1890), 3번 위치에 단일 시스테인(입자 1893)을 포함하는 키메라는 5번 위치에 단일 시스테인을 갖는 키메라(입자 1892)에 비하여 높은 수율로 정제되었다. 시스테인 3도 5도 포함하지 않는 키메라 단백질은 입자로 정제되지 않았으며, 이는 키메라 단백질 분자는 안정한 입자를 형성하지 않음을 제시하는 것이다.
분석적 SEC로 분석한 경우, 모든 3개의 단백질은 약 5-8ml에서 우세한 용리 피크를 나타내었는데, 이는 입자를 나타낸다. 이러한 발견은 입자들 의 혼합물 및 저차원 구조(비-미립자 물질)로 존재하는 키메라 입자 ICC-1048과 같은 N-말단 시스테인(들)이 결실된 키메라 단백질 분자 입자와 대조적인 것이다. SEC 프로필의 보다 상세한 분석은 키메라 단백질 분자 1890이 검출가능한 저차원 구조를 갖지 않는 상위 입자를 형성하는 반면, 키메라 1892는 소량의 비-미립자 물질을 나타내며, 키메라 1893도 여전히 비-미립자 물질을 나타냄을 드러낸다.
N-말단 시스테인 잔기의 이종성 에피토프를 제시하는 입자를 안정화시키는 능력을 조사하기 위해, 피. 팔시파룸(P. falciparum)으로부터의 CS-반복체(NANPNVDPNANPNANPNANP; 서열번호 128)를 갖는, 키메라 1890과 동일한 N-말단 형태를 포함하는 키메라 단백질 분자를 작제하였다. 정제 후, 수득한 키메라(1894)로부터의 입자(1894)의 보전성을 N-말단 융합이 결실된 유사한 키메라 단백질의 입자(1045)와 비교하였다.
이들 작제물의 SEC 분석은 키메라 1045가 입자 및 저차원 구조 둘 다에 대한 피크를 나타냄을 보였다. 키메라 1894에 대한 데이타의 유사한 분석은 조사한 입자 형성의 설명되지 않은 결실을 보였다.
실시예 16: 연속적으로 연결된 N-말단 M2 펩타이드를 갖는 입자의 면역원성
N-말단에 융합된 M2의 다양한 복사체[1, 1604(실시예 12); 2, 1817(실시예 9); 또는 3, 1818(실시예 9)]를 포함하도록 유전학적으로 조작한 입자의 면역원성을 토끼에서 검정하였다. 이들 입자를 제조한 후, 위에서 그리고 다음 실시예에 기술한 바와 같이, 존재하는 것으로 사료되는 프로테아제의 효과를 최소화시키기 위해 동결시켰다. 4마리 토끼 그룹을 근육내 경로를 통해 AlhydrogelTM(용량 당 알루미늄 500㎍)/RC-529-AF(용량 당 25㎍)으로 제형화한 입자의 3회 용량(25㎍/용량)으로 면역화시켰다. 0, 28 및 56일째에 토끼를 면역화시키고 0(전채혈), 14, 28, 56 및 70일째에 채혈하였다. 혈청을 ELISA를 사용하여 항-M2e 항체 수준에 대해 검사하였다.
M2e(2-24/C17S,C19S) 펩타이드(2㎍/ml, 약 18시간 동안)을 사용하여 피복한 미세역가 플레이트를 사용하여 ELISA를 수행하고 3% BSA로 차단시켰다. 혈청을 플레이트에 2회 첨가하고, 1:100 희석율에서 출발하여 전혈만 제외하고 3배 희석으로 계속하였고, 이를 3회 분석하였다. 고정된 항체를 검출하기 위해, 항-토끼 IgG HRP 접합체를 첨가한 후 발색성 기질 TM 블루를 첨가하였다. 전혈 데이터를 사용하여, 0일에 각각의 토끼에 대해 각각의 혈청 희석에서 배경과 전혈 혈청 샘플의 표준 편차를 더한 값을 측정하여 '절단'을 계산하였다. 주어진 혈청 희석액으로서 절단보다 큰 흡광도 수치를 제공한 마지막 혈청 희석액을 확인하여 종말점 역가를 결정하였다. 개별 토끼가 다른 토끼가 검출가능한 역가(즉, >0)를 제공하는 그룹 내의 비반응자(즉, 역가 0)인 경우, 비반응자에는 당해 그룹에 대한 기하 평균 역가(GMT)의 계산이 가능하도록 10의 역가를 할당하였다.
놀랍게도, N-말단에 융합된 M2e의 단 하나의 복사체를 갖는 입자(1604)는 검출가능항 항-M2e 반응(표 11)을 내는 데 실패하였지만, 입자 1817 및 1818은 초기 주입 후 단 14일만에 검출가능한 항-M2e 면역 반응을 내었다(표 7). 14,030의 1817 입자에 대한 피크 역가는 70일째에 관측된 반면, 24,300의 1818 입자에 대한 피크 역가는 56일째에 관측되었다. 항-M2e 역가는 1, 2, 또는 3회 투여 후, 1604로 면역화시킨 임의의 토끼에서 검출되지 않았다.
다양한 M2e-함유 입자로 면역화된 토끼의 GMT
입자 14일 28일 56일 70일
1604 0 0 0 0
1817 0 1,559 6,155 14,030
1818 684 14,030 24,300 8,100
실시예 17: 내인성 프로테아제 활성의 회피
계속되는 문헌은 M2-포함 입자가 메탈로프로테아제인 것으로 보이는 비공지된 프로테아제에 의한 절단의 대상이 되며, 이는 이들 입자의 단백질분해가 당해 입자의 분리 및 저장용으로 사용되는 완충액 중 10mM EDTA의 혼입에 의해 예방될 수 있기 때문임을 보인다. 저농도의 EDTA가 또한 효과적인지의 여부를 확인하기 위해, 실시예 9 및 상기한 바와 같이 제조한 ICC-1818 입자를 사용하여 안정성 시험을 수행하였다. 이들 입자를 pH 7.2의 20mM 인산나트륨 및 0, 1, 2, 5 또는 10mM의 EDTA를 함유하는 저장 완충액에 두었다. 도 11에 나타낸 결과는 1mM EDTA가 단백질분해의 예방에 10mM EDTA만큼 효과적임을 분명히 보여준다. 사실, 1mM 미만의 농도도 또한 효과적일 수 있다.
놀랍게도, EDTA가 부재하는 경우, 단백질분해는 실온에서의 항온처리에 비해 37℃에서 감소되었다. 이러한 관측은 당해 프로테아제가 매우 불안정할 수 있으며, 따라서 상대적으로 낮은 온도(40 내지 60℃)에서 불활성화될 수 있음을 제안하였다. 따라서, 열 처리에 의해 입자의 안정성은 유지되면서, 단백질분해 활성을 파괴할 수 있는지의 여부를 결정하기 위한 연구를 개시하였다.
프로테아제 불활성화를 위한 가열 단계의 사용 가능성을 평가하기 위해, 입자를 40, 50, 60 또는 70℃로 1.5 또는 3시간 동안 가열하였다. SDS-PAGE를 사용하여 측정한 단량체의 안정성(도 12A) 및 당해 데이터는 열 처리 후 모든 단량체가 유사하게 나타남을 보인다. 도 12B에 나타낸 두 번째 겔은 비처리 입자는 실온(RT)에서 1주 후에 완전히 절단된 반면, 40℃에서 열처리한 입자는 감소된 절단을 보이고, 50℃에서 항온처리한 입자는 최소 절단을 보이며, 60 또는 70℃에서 항온처리한 입자는 항온처리하지 않은 대조군과 구별이 불가능한 것으로 나타남을 분명히 보인다.
입자 안정성에 대한 열 처리의 효과를 평가하기 위해, 열 처리한 입자를 분석 SEC를 사용하여 분석하였다. 도 13A에 나타낸 데이터는 주 입자 피크 뒤에서 용리되는 단량체/이량체 피크에서의 미세한 증가를 증거로 하여, 60도 및 70℃에서의 열 처리가 입자 안정성에 미세한 영향을 주는 것을 보인다. 50℃ 이하에서의 열-처리는 SEC 용리 프로필에 뚜렷한 효과를 주지 않으며, 이는 입자가 어떠한 부작용도 없이 가열 단계를 견뎌냈음을 제시하는 것이다.
1주 동안 실온에서 항온처리한 후의 가열 처리한 입자의 SEC 분석은 입자 피크의 증가된 용리 시간을 증거로 하여, 비열처리 대조군의 단백질분해를 분명히 보여준다(도 13B, 실온 샘플). 이는 SDS-PAGE를 사용하여 관찰한 단백질분해와 상응하는 것이며(도 12B), 당해 입자로부터의 M2e 절단이 감소된 입자 크기의 감소를 초래함을 제시한다. 열처리 샘플은 모두 우세한 완전한 입자 피크를 나타내며, 이는 다시 SDS-PAGE로 나타내어진 절단 결실과 상응한다(도 12).
이들 데이터는 M2e-포함 입자 절단의 원인인 단백질분해 활성을 불활성화시키는 데 사용되는 열-처리가 단백질분해 제한에 대한 실행가능한 대안이 될 수 있음을 제시한다. 선행 연구는 55 내지 60℃에서 3시간 동안의 항온처리가 입자 안정성은 유지하면서 단백질분해는 불활성화하는 데 최적임을 제시한다. 추가로, 제조 과정의 견지에서, 가열 단계의 결과로서 방출된 단량체 및 이량체가 효과적으로 제거되도록 가열 단계를 SepharoseR CL-4B 단계 전에 수행하는 것이 바람직할 것이다. 이러한 방법의 사용은 입자를 EDTA 없이 저장하도록 할 수 있다.
실시예 18: 안정한 입자를 초래하는 EDTA 및 가열 단계를 사용하는 정제
상기한 데이터를 토대로 하여, EDTA 혼입 원형 정제 과정 및 M2e를 절단하는 프로테아제 활성의 가열 불활성화를 잔기 4(아스파르트산)에서 출발하며 48번 및 107번 위치의 시스테인이 세린 잔기로 치환하였으며, 149번 위치에 대한 C-말단 잔기를 제거하기 위해 절단하고, 시스테인 잔기를 150번 위치에 첨가한 HBc 서열(HBc149C48S/C107S,C150)에 연결된 ICC-1818 입자로서 M2e의 3개의 N-말단 복사체를 포함하는 CV-1906 입자를 사용하여 시험하였다. M2e의 3개의 복사체 내에 존재할 수 있는 6개의 시스테인 잔기 중, 사실상 HBc 서열에 가장 근접한 M2e 서열 중의 단 2개의 시스테인만이 존재하고, 다른 4개의 시스테인은 세린 잔기로 치환된다.
정제 과정은 프로테아제가 가열 처리를 통해 불활성화 될 때까지 모든 완충액 중 10mM EDTA의 사용을 포함하며, 여기서 EDTA는 SepharoseR CL-4B 크로마토그래피 처리 도중에 제거하였다. 가열 불활성화 단계를 포함시키거나 뺀 과정의 비교를 수행하였다. 사용한 과정은 아래에 상술되어 있다:
·트리스/EDTA 완충액 중에서 미세유동화제를 사용하여 용해
·원심분리
·20% 황산암모늄 침전
·원심분리
·1M NaCl/10mM EDTA 중에 펠렛의 재현탁
·EDTA의 존재 하의 페닐 HIC(~300mM NaCl에서 용리)
·+/- 가열 불활성화(60℃, 3시간)
·EDTA 부재하의 SepharoseR CL-4B
·세라믹 HA 크로마토그래피
당해 비교 연구는 예상한 바와 같이, 가열 단계를 거치지 않은 CV-1906 입자는 EDTA를 제거하자마자(즉, SepharoseR CL-4B 후에) 절단되기 시작했음을 보여주었다(도 14, 2번 레인). 대조적으로 가열 단계를 포함한 과정을 사용하여 정제한 CV-1906은 손상되지 않은 채로 유지되었다(도 14, 1번 레인)
실시예 19: 1개, 2개 또는 3개의 탠덤 M2 펩타이드를 포함하는 키메라를 사용한 크기 연구
HBc의 N-말단에 융합된 M2e의 0, 1, 2 또는 3개의 탠덤 복사체를 갖는 하이브리드 HBc-M2e 입자를 이. 콜라이에서 발현시키고 정제하였다(표 8). 또한 이들을 제조한 후 이들 입자를 상기한 바와 같이 동결하고 사용 직전에 해동하였다. 다양한 단량체 크기를 환원 SDS-PAGE를 사용하여 비교하였다(도 15). M2e-HBc 하이브리드의 상대적 가동성은 이들의 예상 분자량과 상응하였다(표 8).
복사체 M2e 아미노산 총 개수 단량체의 예상 분자량(kDa)
1123 0 150 16.95
1604 1 173 19.57
1817 2 198 22.39
1818 3 223 25.20
실시예 20: 1개, 2개 또는 3개의 탠덤 M2 펩타이드를 포함하는 키메라를 사용한 면역원성 연구
N-말단에 융합된 M2[1, 1604; 2, 1817; 또는 3, 1818]의 다양한 복사체를 포함하도록 유전학적으로 조작한 입자의 면역원성 및 방어 효능을 치사의 면역성 시험 모델을 사용하여 BALB/c 마우스에서 비교하였다. 병원체가 없는 암컷 BALB/c 마우스를 제조원[Charles River](독일)에서 입수하여 생후 8주째에 면역화에 사용하였다. 당해 동물들을 12시간 명/암 주기로 온도 조절을 한 환경에서 사육하고, 음식과 물을 자유롭게 제공하였다.
모든 마우스(그룹 당 14마리)를 다음의 면역화 프로토콜을 사용하여 백신 100㎕를 사용하여 복강내로 백신접종하였다: 1차 백신접종, AlhydrogelTM(100㎍/용량) 및 RC-539-AF(10㎍/용량)를 사용하여 제형화한 M2e-HBc 입자 10㎍을 사용하여 3주 간격으로 1차 및 2차 부스터. 이들 입자를 제조한 후 또한 동결시키고 사용 직전에 해동하여 프로테아제의 영향을 최소화하였다. 각각의 면역화 전 또는 2주 후, 복부 꼬리 정맥을 천공시켜 혈액 샘플을 수집하였다. 마지막 채혈은 심장 천공으로 수행하였다. 37℃에서 30분 동안 혈액이 응고되게 하였고, 2회의 연속한 원심분리로부터 상층액을 취하여 혈청을 수집하였다. M2e-특이적 IgG의 역가는 ELISA로 측정하였다.
1817 또는 1818 입자를 사용하여 면역화한 마우스는 치사성 챌린지 후 완전한 생존을 나타낸 반면, 1604 입자로 면역화한 마우스는 약간의 사망률을 나타내었다(도 16을 참조). M2e를 포함하지 않는 입자(1123) 또는 PBS로 면역화한 마우스는 100% 사망률을 나타내었으며(도 16), 이는 면역성 시험의 고도의 엄격도를 강조하는 것이다. 1817 및 1818 입자로 면역화한 마우스에서의 증진된 방어는 1604 입자에 비하여 감소된 사망률(체중 감소 및 체온 감소)에 의해 보완되었으며, 이는 단 하나(1604)만을 발현하는 입자로 면역화한 마우스에 비하여 M2e의 2개 또는 3개의 복사체를 발현하는 입자(1817 및 1818)로 면역화한 마우스에서 방어가 보다 더 확고함을 나타내는 것이다(도 17 및 도 18).
항-M2e 역가는 ELISA를 사용하여 측정하였다. ELISA 플레이트를 pH 9.7의 중탄산나트륨 완충액 50mM 중 M2e 펩타이드 용액 2㎍/ml 50마이크로리터를 사용하여 37℃에서 밤새(약 18시간) 도포하였다. 미세역가 플레이트(제II형 F96 MaxiSorpTM)를 사용하였다. 플레이트를 세척한 후, PBS + 2% BSA 용액 200㎕를 차단에 사용하였다. 항온처리 1시간 후, 1/50 희석으로 시작한, 상이한 혈청 샘플의 연속 1/3 희석을 펩타이드-피복 웰 상에 적재하였다. 결합된 항체를 각각 PBS + 1% BSA + 0.05% TweenR-20 중 1/6000으로 희석된, 마우스 IgG1 및 IgG2a(제조원[Southern Biotechnology Associates, Inc.])로 유도된 퍼옥시다제-표지 항체로 검출하였다. 세척한 후, 미세역가 플레이트를 TMB 기질과 함께 5분 동안 항온처리하였다. 당해 반응은 1M H3PO4를 첨가하여 중지시켰고 450nm에서의 흡광도를 측정하였다. M2e에 대한 특이적 결합에 대한 수치를 얻기 위해, 상응하는 희석액에서 면역 혈청에 대해 수득된 흡광도에서 면역 전 혈청에 대해 수득된 흡광도를 감하였다.
ELISA 데이터는 입자 1817 및 1818이 각각 1604 입자에 대해 관측된 것보다 10.4- 및 8.4배 높은 항-M2e IgG1 역가를 유도하였음을 나타내었다. 유사하게, 입자 1817 및 1818은 각각 1604에 대해 관측된 것보다 5.5- 및 7.6배 높은 항-M2e IgG2a 역가를 유도하였다(표 9).
입자 1604, 1817 및 1818*의 항-M2e 역가의 비교(IgG1 및 IgG2 아부류)

입자		 항-M2e
IgG1 IgG2a
1604 149,850
(82,901)		 9,100
(7,386)
1817 1,564,546
(605,630)		 50,469
(24,228)
1818 1,261,731
(654,156)		 69,161
(48,556)
* 개개의 마우스로부터의 혈청 샘플을 검정하였다. 표준 편차는 괄호 안에 나타내었다.
항-HBc 측정을 위해, ELISA 플레이트(제II형 F96 MaxiSorpTM)을 HBc에 대해 지시되는 폴리클로날 토끼 항체(DAKO) 10㎍/ml 용액 100㎕으로 피복시켰다. 플레이트를 세척한 후, PBS + 3% BSA 용액을 차단에 사용하였다. 세척한 후, 1시간 동안 HBc 항원(중탄산 완충액 중 10㎍/ml)을 포획하였다. 세척 후, 1/1000 희석율로 시작한, 상이한 혈청 샘플의 일련의 1/3 희석액을 펩타이드-피복 웰 상에 적재하였다. 결합된 항체를 각각 PBS + 1% BSA 중 1/10,000으로 희석된, 마우스 IgG(제조원[Sigma])로 지시된 알칼리성 포스파타제-표지 항체로 검출하였다. 추가로 세척한 후, 미세역가 플레이트를 기질과 함께 30분 동안 항온처리하였다. 415nm에서의 흡광도를 측정하였다.
B형 간염 코어 항원에 대한 특이적 반응성에 대한 값을 수득하기 위해, 상응하는 희석액에서 면역 혈청에 대해 수득된 흡광도에서 면역 전 혈청에 대해 수득된 흡광도를 감하였다. 개별적 샘플에 대한 IgG1 항-HBc-역가 측정을 위해, 결합된 항체를 PBS + 0.5% BSA + 0.05% TweenR-20 중 1/6000으로 희석된, 마우스 IgG1(제조원[Southern Biotechnology Associates, Inc.])로 지시된 퍼옥시다제-표지 항체로 검출하였다. 세척 후, 미세역가 플레이트를 TMB 기질과 함께 5분 동안 항온처리하였다. 당해 반응을 1M H3PO4를 첨가하여 중지시켰고 450nm에서의 흡광도를 측정하였다.
ELISA 데이터는 입자 1817 및 1818이 각각 1604 입자에 대해 관측된 것보다 2.4- 및 10.1배 낮은 항-HBc IgG1 역가를 유도하였음을 나타내었다(표 10). 이들 데이타는 HBc 입자의 표면에서의 증가된 M2e 밀도가 HBc 담체에 대한 항체 반응을 역동적으로 억제함을 나타낸다. 따라서, 항-M2e:항-HBc 비율(IgG1)이 1604 입자에 비교하여, 1818 입자에 비해 75배 높았으며, 1817 입자에 비해서는 23배 높았다(표 10). 따라서, 백신 접종한 숙주에서 인플루엔자 M2e에 대한 면역 반응은 심지어 고도의 면역원성인 것으로 공지된 HBc 담체 입자에 대한 면역 반응보다도 높다.
항-M2e 및 항-HBc 역가*의 비교(IgG1 아부류)
항-M2e 항-HBc 항-M2e: 항-HBc 비율
1604 149,850
(82,901)		 4,264,650
(1940769)		 0.04
1817 1,564,546
(605,630)		 1,766,423
(473443)		 0.89
1818 1,261,731
(654,156)		 420,577
(248052)		 3.00
* 개별 마우스로부터의 혈청 샘플을 시험하였다.
* 표준 편차는 괄호 안에 나타내었다.
본원에 언급한 특허 및 논문 각각이 참조로서 인용되어 있다. 부정관사("a" 또는 "an")의 사용은 하나 이상을 포함한다.
전술한 명세서 및 실시예는 예시하고자 한 것이며 제한하는 것으로 받아들여져서는 안 된다. 본 발명의 취지 및 범주내에서 기타 변형이 가능하며 당해 분야의 숙련가들에게 용이하게 제기될 것이다.
<110> APOVIA, INC. VLAAMS INTERUNIVERSITAIR INSTITUUT VOOR BIOTECHNOLOGIE <120> Influenza immunogen and vaccine <130> 4564/93457 <150> US 10/732,862 <151> 2003-12-10 <150> US 10/787,734 <151> 2004-02-26 <160> 140 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 183 <212> PRT <213> Hepatitis B virus, human ayw subtype <400> 1 Met Asp Ile Asp Pro Tyr Lys Glu Phe Gly Ala Thr Val Glu Leu Leu 1 5 10 15 Ser Phe Leu Pro Ser Asp Phe Phe Pro Ser Val Arg Asp Leu Leu Asp 20 25 30 Thr Ala Ser Ala Leu Tyr Arg Glu Ala Leu Glu Ser Pro Glu His Cys 35 40 45 Ser Pro His His Thr Ala Leu Arg Gln Ala Ile Leu Cys Trp Gly Glu 50 55 60 Leu Met Thr Leu Ala Thr Trp Val Gly Val Asn Leu Glu Asp Pro Ala 65 70 75 80 Ser Arg Asp Leu Val Val Ser Tyr Val Asn Thr Asn Met Gly Leu Lys 85 90 95 Phe Arg Gln Leu Leu Trp Phe His Ile Ser Cys Leu Thr Phe Gly Arg 100 105 110 Glu Thr Val Ile Glu Tyr Leu Val Ser Phe Gly Val Trp Ile Arg Thr 115 120 125 Pro Pro Ala Tyr Arg Pro Pro Asn Ala Pro Ile Leu Ser Thr Leu Pro 130 135 140 Glu Thr Thr Val Val Arg Arg Arg Gly Arg Ser Pro Arg Arg Arg Thr 145 150 155 160 Pro Ser Pro Arg Arg Arg Arg Ser Gln Ser Pro Arg Arg Arg Arg Ser 165 170 175 Gln Ser Arg Glu Ser Gln Cys 180 <210> 2 <211> 185 <212> PRT <213> Hepatitis B virus, human adw subtype <400> 2 Met Asp Ile Asp Pro Tyr Lys Glu Phe Gly Ala Thr Val Glu Leu Leu 1 5 10 15 Ser Phe Leu Pro Ser Asp Phe Phe Pro Ser Val Arg Asp Leu Leu Asp 20 25 30 Thr Ala Ser Ala Leu Tyr Arg Glu Ala Leu Glu Ser Pro Glu His Cys 35 40 45 Ser Pro His His Thr Ala Leu Arg Gln Ala Ile Leu Cys Trp Gly Glu 50 55 60 Leu Met Thr Leu Ala Thr Trp Val Gly Asn Asn Leu Gln Asp Pro Ala 65 70 75 80 Ser Arg Asp Leu Val Val Asn Tyr Val Asn Thr Asn Met Gly Leu Lys 85 90 95 Ile Arg Gln Leu Leu Trp Phe His Ile Ser Cys Leu Thr Phe Gly Arg 100 105 110 Glu Thr Val Leu Glu Tyr Leu Val Ser Phe Gly Val Trp Ile Arg Thr 115 120 125 Pro Pro Ala Tyr Arg Pro Pro Asn Ala Pro Ile Leu Ser Thr Leu Pro 130 135 140 Glu Thr Thr Val Val Arg Arg Arg Asp Arg Gly Arg Ser Pro Arg Arg 145 150 155 160 Arg Thr Pro Ser Pro Arg Arg Arg Arg Ser Gln Ser Pro Arg Arg Arg 165 170 175 Arg Ser Gln Ser Arg Glu Ser Gln Cys 180 185 <210> 3 <211> 185 <212> PRT <213> Hepatitis B virus, human adw2 subtype <400> 3 Met Asp Ile Asp Pro Tyr Lys Glu Phe Gly Ala Thr Val Glu Leu Leu 1 5 10 15 Ser Phe Leu Pro Ser Asp Phe Phe Pro Ser Val Arg Asp Leu Leu Asp 20 25 30 Thr Ala Ser Ala Leu Tyr Arg Glu Ala Leu Glu Ser Pro Glu His Cys 35 40 45 Ser Pro His His Thr Ala Leu Arg Gln Ala Ile Leu Cys Trp Gly Glu 50 55 60 Leu Met Thr Leu Ala Thr Trp Val Gly Asn Asn Leu Glu Asp Pro Ala 65 70 75 80 Ser Arg Asp Leu Val Val Asn Tyr Val Asn Thr Asn Val Gly Leu Lys 85 90 95 Ile Arg Gln Leu Leu Trp Phe His Ile Ser Cys Leu Thr Phe Gly Arg 100 105 110 Glu Thr Val Leu Glu Tyr Leu Val Ser Phe Gly Val Trp Ile Arg Thr 115 120 125 Pro Pro Ala Tyr Arg Pro Pro Asn Ala Pro Ile Leu Ser Thr Leu Pro 130 135 140 Glu Thr Thr Val Val Arg Arg Arg Asp Arg Gly Arg Ser Pro Arg Arg 145 150 155 160 Arg Thr Pro Ser Pro Arg Arg Arg Pro Ser Gln Ser Pro Arg Arg Arg 165 170 175 Arg Ser Gln Ser Arg Glu Ser Gln Cys 180 185 <210> 4 <211> 183 <212> PRT <213> Hepatitis B virus, human adyw subtype <400> 4 Met Asp Ile Asp Pro Tyr Lys Glu Phe Gly Ala Thr Val Glu Leu Leu 1 5 10 15 Ser Phe Leu Pro Ser Asp Phe Phe Pro Ser Val Arg Asp Leu Leu Asp 20 25 30 Thr Ala Ala Ala Leu Tyr Arg Asp Ala Leu Glu Ser Pro Glu His Cys 35 40 45 Ser Pro His His Thr Ala Leu Arg Gln Ala Ile Leu Cys Trp Gly Asp 50 55 60 Leu Met Thr Leu Ala Thr Trp Val Gly Thr Asn Leu Glu Asp Pro Ala 65 70 75 80 Ser Arg Asp Leu Val Val Ser Tyr Val Asn Thr Asn Val Gly Leu Lys 85 90 95 Phe Arg Gln Leu Leu Trp Phe His Ile Ser Cys Leu Thr Phe Gly Arg 100 105 110 Glu Thr Val Leu Glu Tyr Leu Val Ser Phe Gly Val Trp Ile Arg Thr 115 120 125 Pro Pro Ala Tyr Arg Pro Pro Asn Ala Pro Ile Leu Ser Thr Leu Pro 130 135 140 Glu Thr Thr Val Val Arg Arg Arg Gly Arg Ser Pro Arg Arg Arg Thr 145 150 155 160 Pro Ser Pro Arg Arg Arg Arg Ser Gln Ser Pro Arg Arg Arg Arg Ser 165 170 175 Gln Ser Arg Glu Ser Gln Cys 180 <210> 5 <211> 183 <212> PRT <213> woodchuck <400> 5 Met Asp Ile Asp Pro Tyr Lys Glu Phe Gly Ser Ser Tyr Gln Leu Leu 1 5 10 15 Asn Phe Leu Pro Leu Asp Phe Phe Pro Asp Leu Asn Ala Leu Val Asp 20 25 30 Thr Ala Thr Ala Leu Tyr Glu Glu Glu Leu Thr Gly Arg Glu His Cys 35 40 45 Ser Pro His His Thr Ala Ile Arg Gln Ala Leu Val Cys Trp Asp Glu 50 55 60 Leu Thr Lys Leu Ile Ala Trp Met Ser Ser Asn Ile Thr Ser Glu Gln 65 70 75 80 Val Arg Thr Ile Ile Val Asn His Val Asn Asp Thr Trp Gly Leu Lys 85 90 95 Val Arg Gln Ser Leu Trp Phe His Leu Ser Cys Leu Thr Phe Gly Gln 100 105 110 His Thr Val Gln Glu Phe Leu Val Ser Phe Gly Val Trp Ile Arg Thr 115 120 125 Pro Ala Pro Tyr Arg Pro Pro Asn Ala Pro Ile Leu Ser Thr Leu Pro 130 135 140 Glu His Thr Val Ile Arg Arg Arg Gly Gly Ala Arg Ala Ser Arg Ser 145 150 155 160 Pro Arg Arg Arg Thr Pro Ser Pro Arg Arg Arg Arg Ser Gln Ser Pro 165 170 175 Arg Arg Arg Arg Ser Gln Cys 180 <210> 6 <211> 217 <212> PRT <213> ground squirrel <400> 6 Met Tyr Leu Phe His Leu Cys Leu Val Phe Ala Cys Val Pro Cys Pro 1 5 10 15 Thr Val Gln Ala Ser Lys Leu Cys Leu Gly Trp Leu Trp Asp Met Asp 20 25 30 Ile Asp Pro Tyr Lys Glu Phe Gly Ser Ser Tyr Gln Leu Leu Asn Phe 35 40 45 Leu Pro Leu Asp Phe Phe Pro Asp Leu Asn Ala Leu Val Asp Thr Ala 50 55 60 Ala Ala Leu Tyr Glu Glu Glu Leu Thr Gly Arg Glu His Cys Ser Pro 65 70 75 80 His His Thr Ala Ile Arg Gln Ala Leu Val Cys Trp Glu Glu Leu Thr 85 90 95 Arg Leu Ile Thr Trp Met Ser Glu Asn Thr Thr Glu Glu Val Arg Arg 100 105 110 Ile Ile Val Asp His Val Asn Asn Thr Trp Gly Leu Lys Val Arg Gln 115 120 125 Thr Leu Trp Phe His Leu Ser Cys Leu Thr Phe Gly Gly His Thr Val 130 135 140 Gln Glu Phe Leu Val Ser Phe Gly Val Trp Ile Arg Thr Pro Ala Pro 145 150 155 160 Tyr Arg Pro Pro Asn Ala Pro Ile Leu Ser Thr Leu Pro Glu His Thr 165 170 175 Val Ile Arg Arg Arg Gly Gly Ser Arg Ala Ala Arg Ser Pro Arg Arg 180 185 190 Arg Thr Pro Ser Pro Arg Arg Arg Arg Ser Gln Ser Pro Arg Arg Arg 195 200 205 Arg Ser Gln Ser Pro Ala Ser Asn Cys 210 215 <210> 7 <211> 51 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> modified plasmid pkk223 <400> 7 ttcacacagg aaacagaatt cccggggatc cgtcgacctg cagccaagct t 51 <210> 8 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> plasmid pkk223 <400> 8 ttcacataag gaggaaaaaa ccatgggatc cgaagctt 38 <210> 9 <211> 24 <212> PRT <213> Influenza A virus <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(1) <223> Xaa at position 1 is methionine or absent. If methionine then Xaa in position 2 through 8 are not absent. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (2)..(2) <223> Xaa at position 2 is serine or absent. If serine then Xaa in position 3 through 8 are not absent. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (3)..(3) <223> Xaa at position 3 is leucine or absent. If leucine then Xaa in position 4 through 8 are not absent. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (4)..(4) <223> Xaa at position 4 is leucine or absent. If leucine then Xaa in position 5 through 8 are not absent. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (5)..(5) <223> Xaa at position 4 is threonine or proline or absent. If threonine or proline then Xaa in position 6 through 8 are not absent. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (6)..(6) <223> Xaa at position 6 is glutamic acid or absent. If glutamic acid then Xaa in position 7 through 8 are not absent. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (7)..(7) <223> Xaa at position 7 is valine or absent. If valine then Xaa in position 8 is not absent. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (8)..(8) <223> Xaa at position 8 is glutamic acid or aspartic acid or absent. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (10)..(10) <223> Xaa at position 10 is proline, leucine or histidine. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (11)..(11) <223> Xaa at position 11 is isoleucine or threonine. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (12)..(12) <223> Xaa at position 12 is arginine or lysine. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (13)..(13) <223> Xaa at position 13 is asparagine or serine. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (14)..(14) <223> Xaa at position 14 is glutamic acid or glycine. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (15)..(15) <223> Xaa at position 15 is tryptophan or absent. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (16)..(16) <223> Xaa at position 16 is glycine, glutamic acid or absent. If glycine or glutamic acid then Xaa in position 16 is not absent. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (17)..(17) <223> Xaa at position 17 is absent or present, if present Xaa in position 17 is cysteine, serine or alanine. If Xaa in position 17 is present then positions 15 through 16 are not absent. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (18)..(18) <223> Xaa at position 18 arginine, lysine or absent. If arginine or lysine then Xaa in positions 15 through 17 are not absent. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (19)..(19) <223> Xaa at position 19 is absent or present, if present Xaa in position 19 is cysteine, serine or alanine. If Xaa is position 19 is present then positions 15 through 18 are not absent. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (20)..(20) <223> Xaa at position 20 is asparagine, serine, glycine or absent. If asparagine or serine or glycine then Xaa is positions 15 through 19 are not absent. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (21)..(21) <223> Xaa at position 21 is aspartic acid, glycine or absent. If aspartic acid or glycine then Xaa is positions 15 through 20 are not absent. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (22)..(22) <223> Xaa at position 22 is serine or absent. If serine then Xaa is positions 15 through 21 are not absent. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (23)..(23) <223> Xaa at position 23 is serine or absent. If serine then Xaa is positions 15 through 22 are not absent. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (24)..(24) <223> Xaa at position 24 is aspartic acid or absent. If aspartic acid then Xaa is positions 15 through 23 are not absent. <400> 9 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Thr Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 1 5 10 15 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 20 <210> 10 <211> 24 <212> PRT <213> Influenza A virus <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(1) <223> Xaa at position 1 is methionine or absent. If methionine then Xaa in positions 2 through 8 are not absent <220> <221> MISC_FEATURE <222> (2)..(2) <223> Xaa at position 2 is serine or absent. If serine then Xaa in positions 3 through 8 are not absent. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (3)..(3) <223> Xaa at position 3 is leucine or absent. If leucine then Xaa in positions 4 through 8 are not absent. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (4)..(4) <223> Xaa at position 4 is leucine or absent. If leucine then Xaa in positions 5 through 8 are not absent. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (5)..(5) <223> Xaa at position 5 is threonine or absent. If threonine than Xaa in positions 6 through 8 are not absent. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (6)..(6) <223> Xaa at position 6 is glutamic acid or absent. If glutamic acid then Xaa in positions 7 through 8 are not absent. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (7)..(7) <223> Xaa at position 7 is valine or absent. If valine then Xaa in position 8 is not absent. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (8)..(8) <223> Xaa at position 8 is glutamic acid or absent. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (15)..(15) <223> Xaa at position 15 is tryptophan or absent. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (16)..(16) <223> Xaa at position 16 is glycine or absent. If glycine then Xaa in position 15 is not absent. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (17)..(17) <223> Xaa at position 17 is absent or present, if present Xaa in position 17 is cysteine, serine or alanine. If Xaa in position 17 is present then positions 15 through 16 are not absent. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (18)..(18) <223> Xaa at position 18 is arginine or absent. If arginine then Xaa in positions 15 through 17 are not absent. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (19)..(19) <223> Xaa at position 19 is absent or present, if present Xaa in position 19 is cysteine, serine or alanine. If Xaa in position 19 is present then positions 15 through 18 are not absent. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (20)..(20) <223> Xaa at position 20 is asparagine or absent. If asparagine then Xaa in positions 15 through 19 are not absent. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (21)..(21) <223> Xaa at position 21 is aspartic acid or absent. If aspartic acid then Xaa in positions 15 through 20 are not absent. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (22)..(22) <223> Xaa at position 22 is serine or absent. If serine then Xaa in positions 15 through 21 are not absent. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (23)..(23) <223> Xaa at position 23 is serine or absent. If serine then Xaa in positions 15 through 22 are not absent. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (24)..(24) <223> Xaa at position 24 is aspartic acid or absent. If aspartic acid then Xaa in positions 15 through 23 are not absent. <400> 10 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Thr Pro Ile Arg Asn Glu Xaa Xaa 1 5 10 15 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 20 <210> 11 <211> 23 <212> PRT <213> Influenza A virus <400> 11 Ser Leu Leu Thr Glu Val Glu Thr Pro Ile Arg Asn Glu Trp Gly Cys 1 5 10 15 Arg Cys Asn Gly Ser Ser Asp 20 <210> 12 <211> 23 <212> PRT <213> Influenza A virus <400> 12 Ser Leu Leu Thr Glu Val Glu Thr Pro Ile Arg Asn Glu Trp Gly Cys 1 5 10 15 Arg Cys Asn Asp Ser Ser Asp 20 <210> 13 <211> 23 <212> PRT <213> Influenza A virus <400> 13 Ser Leu Leu Thr Glu Val Glu Thr Pro Ile Arg Asn Glu Trp Gly Ala 1 5 10 15 Arg Ala Asn Asp Ser Ser Asp 20 <210> 14 <211> 23 <212> PRT <213> Influenza A virus <400> 14 Ser Leu Leu Thr Glu Val Glu Thr Pro Ile Arg Asn Glu Trp Gly Ser 1 5 10 15 Arg Ser Asn Asp Ser Ser Asp 20 <210> 15 <211> 23 <212> PRT <213> Influenza A virus <400> 15 Ser Leu Leu Thr Glu Val Glu Thr Pro Ile Arg Asn Glu Trp Gly Ser 1 5 10 15 Arg Cys Asn Asp Ser Ser Asp 20 <210> 16 <211> 23 <212> PRT <213> Influenza A virus <400> 16 Ser Leu Leu Thr Glu Val Glu Thr Pro Ile Arg Asn Glu Trp Gly Cys 1 5 10 15 Arg Ser Asn Asp Ser Ser Asp 20 <210> 17 <211> 23 <212> PRT <213> Influenza A virus <400> 17 Ser Leu Leu Thr Glu Val Glu Thr Pro Ile Arg Asn Glu Trp Gly Cys 1 5 10 15 Arg Ala Asn Asp Ser Ser Asp 20 <210> 18 <211> 23 <212> PRT <213> Influenza A virus <400> 18 Ser Leu Leu Thr Glu Val Glu Thr Pro Ile Arg Asn Glu Trp Gly Ala 1 5 10 15 Arg Cys Asn Asp Ser Ser Asp 20 <210> 19 <211> 24 <212> PRT <213> Influenza A virus <400> 19 Met Ser Leu Leu Thr Glu Val Glu Thr Pro Ile Arg Asn Glu Trp Gly 1 5 10 15 Cys Arg Cys Asn Asp Ser Ser Asp 20 <210> 20 <211> 24 <212> PRT <213> Influenza A virus <400> 20 Met Ser Leu Leu Thr Glu Val Glu Thr Pro Ile Arg Asn Glu Trp Gly 1 5 10 15 Ser Arg Ser Asn Asp Ser Ser Asp 20 <210> 21 <211> 35 <212> PRT <213> Influenza A virus <400> 21 Met Gly Ile Ser Leu Leu Thr Glu Val Glu Thr Pro Ile Arg Asn Glu 1 5 10 15 Trp Gly Cys Arg Cys Asn Asp Ser Ser Asp Glu Leu Leu Gly Trp Leu 20 25 30 Trp Gly Ile 35 <210> 22 <211> 24 <212> PRT <213> Influenza A virus <400> 22 Met Ser Leu Leu Thr Glu Val Glu Thr Pro Ile Arg Asn Glu Trp Gly 1 5 10 15 Ala Arg Ala Asn Asp Ser Ser Asp 20 <210> 23 <211> 24 <212> PRT <213> Influenza A virus <400> 23 Met Ser Leu Leu Thr Glu Val Glu Thr Pro Ile Arg Asn Glu Trp Gly 1 5 10 15 Cys Arg Ala Asn Asp Ser Ser Asp 20 <210> 24 <211> 24 <212> PRT <213> Influenza A virus <400> 24 Met Ser Leu Leu Thr Glu Val Glu Thr Pro Ile Arg Asn Glu Trp Gly 1 5 10 15 Ala Arg Cys Asn Asp Ser Ser Asp 20 <210> 25 <211> 24 <212> PRT <213> Influenza A virus <400> 25 Met Ser Leu Leu Thr Glu Val Glu Thr Pro Ile Arg Asn Glu Trp Gly 1 5 10 15 Cys Arg Ser Asn Asp Ser Ser Asp 20 <210> 26 <211> 24 <212> PRT <213> Influenza A virus <400> 26 Met Ser Leu Leu Thr Glu Val Glu Thr Pro Ile Arg Asn Glu Trp Gly 1 5 10 15 Ser Arg Cys Asn Asp Ser Ser Asp 20 <210> 27 <211> 46 <212> PRT <213> Influenza A virus <400> 27 Ser Leu Leu Thr Glu Val Glu Thr Pro Ile Arg Asn Glu Trp Gly Ser 1 5 10 15 Arg Ser Asn Asp Ser Ser Asp Ser Leu Leu Thr Glu Val Glu Thr Pro 20 25 30 Ile Arg Asn Glu Trp Gly Ser Arg Ser Asn Asp Ser Ser Asp 35 40 45 <210> 28 <211> 69 <212> PRT <213> Influenza A virus <400> 28 Ser Leu Leu Thr Glu Val Glu Thr Pro Ile Arg Asn Glu Trp Gly Ser 1 5 10 15 Arg Ser Asn Asp Ser Ser Asp Ser Leu Leu Thr Glu Val Glu Thr Pro 20 25 30 Ile Arg Asn Glu Trp Gly Ser Arg Ser Asn Asp Ser Ser Asp Ser Leu 35 40 45 Leu Thr Glu Val Glu Thr Pro Ile Arg Asn Glu Trp Gly Cys Arg Cys 50 55 60 Asn Asp Ser Ser Asp 65 <210> 29 <211> 46 <212> PRT <213> Influenza A virus <400> 29 Ser Leu Leu Thr Glu Val Glu Thr Pro Ile Arg Asn Glu Trp Gly Ala 1 5 10 15 Arg Ala Asn Asp Ser Ser Asp Ser Leu Leu Thr Glu Val Glu Thr Pro 20 25 30 Ile Arg Asn Glu Trp Gly Cys Arg Cys Asn Asp Ser Ser Asp 35 40 45 <210> 30 <211> 69 <212> PRT <213> Influenza A virus <400> 30 Ser Leu Leu Thr Glu Val Glu Thr Pro Ile Arg Asn Glu Trp Gly Ala 1 5 10 15 Arg Ala Asn Asp Ser Ser Asp Ser Leu Leu Thr Glu Val Glu Thr Pro 20 25 30 Ile Arg Asn Glu Trp Gly Ala Arg Ala Asn Asp Ser Ser Asp Ser Leu 35 40 45 Leu Thr Glu Val Glu Thr Pro Ile Arg Asn Glu Trp Gly Cys Arg Cys 50 55 60 Asn Asp Ser Ser Asp 65 <210> 31 <211> 19 <212> PRT <213> Influenza A virus <400> 31 Glu Val Glu Thr Pro Ile Arg Asn Glu Trp Gly Ser Arg Cys Asn Asp 1 5 10 15 Ser Ser Asp <210> 32 <211> 38 <212> PRT <213> Influenza A virus <400> 32 Glu Val Glu Thr Pro Ile Arg Asn Glu Trp Gly Ser Arg Cys Asn Asp 1 5 10 15 Ser Ser Asp Glu Val Glu Thr Pro Ile Arg Asn Glu Trp Gly Ser Arg 20 25 30 Cys Asn Asp Ser Ser Asp 35 <210> 33 <211> 57 <212> PRT <213> Influenza A virus <400> 33 Glu Val Glu Thr Pro Ile Arg Asn Glu Trp Gly Ser Arg Cys Asn Asp 1 5 10 15 Ser Ser Asp Glu Val Glu Thr Pro Ile Arg Asn Glu Trp Gly Ser Arg 20 25 30 Cys Asn Asp Ser Ser Asp Glu Val Glu Thr Pro Ile Arg Asn Glu Trp 35 40 45 Gly Cys Arg Cys Asn Asp Ser Ser Asp 50 55 <210> 34 <211> 47 <212> PRT <213> Influenza A virus <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(1) <223> Xaa at position 1 is methionine or absent. If methionine then Xaa in positions 2 through 8 are not absent <220> <221> MISC_FEATURE <222> (2)..(2) <223> Xaa at position 2 is serine or absent. If serine then Xaa in positions 3 through 8 are not absent. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (3)..(3) <223> Xaa at position 3 is leucine or absent. If leucine then Xaa in positions 4 through 8 are not absent. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (4)..(4) <223> Xaa at position 4 is leucine or absent. If leucine then Xaa in positions 5 through 8 are not absent. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (5)..(5) <223> Xaa at position 5 is threonine or absent. If threonine than Xaa in positions 6 through 8 are not absent. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (6)..(6) <223> Xaa at position 6 is glutamic acid or absent. If glutamic acid then Xaa in positions 7 through 8 are not absent. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (7)..(7) <223> Xaa at position 7 is valine or absent. If valine then Xaa in position 8 is not absent. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (8)..(8) <223> Xaa at position 8 is glutamic acid or absent. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (15)..(15) <223> Xaa at position 15 is tryptophan or absent. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (16)..(16) <223> Xaa at position 16 is glycine or absent. If glycine then Xaa in position 15 is not absent. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (17)..(17) <223> Xaa at position 17 is absent or present, if present Xaa in position 17 is cysteine, serine or alanine. If Xaa in position 17 is present then positions 15 through 16 are not absent. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (18)..(18) <223> Xaa at position 18 is arginine or absent. If arginine then Xaa in positions 15 through 17 are not absent. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (19)..(19) <223> Xaa at position 19 is absent or present, if present Xaa in position 19 is cysteine, serine or alanine. If Xaa in position 19 is present then positions 15 through 18 are not absent. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (20)..(20) <223> Xaa at position 20 is asparagine or absent. If asparagine then Xaa in positions 15 through 19 are not absent. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (21)..(21) <223> Xaa at position 21 is aspartic acid or absent. If aspartic acid then Xaa in positions 15 through 20 are not absent. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (22)..(22) <223> Xaa at position 22 is serine or absent. If serine then Xaa in positions 15 through 21 are not absent. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (23)..(23) <223> Xaa at position 23 is serine or absent. If serine then Xaa in positions 15 through 22 are not absent. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (24)..(24) <223> Xaa at position 24 is aspartic acid or absent. If aspartic acid then Xaa in positions 15 through 23 are not absent. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (25)..(25) <223> -- Xaa at position 25 is serine or absent. If serine then Xaa in positions 26 through 31 are not absent. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (26)..(26) <223> Xaa at position 26 is leucine or absent. If leucine then Xaa in positions 27 through 31 are not absent. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (27)..(27) <223> Xaa in position 27 is leucine or absent. If leucine then Xaa in positions 28 through 31 are not absent. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (28)..(28) <223> Xaa in position 28 is threoninie or absent. If threonine then Xaa in positions 29 through 31 are not absent. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (29)..(29) <223> Xaa at position 29 is glutamic acid or absent. If glutamic acid then Xaa in positions 30 through 31 are not absent. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (30)..(30) <223> Xaa at position 30 is valine or absent. If valine then Xaa in position31 is not absent. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (31)..(31) <223> Xaa at position 31 is glutamic acid or absent. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (38)..(38) <223> Xaa at position 38 is tryptophan or absent <220> <221> MISC_FEATURE <222> (39)..(39) <223> Xaa at position 39 is glycine or absent. If glycine then Xaa in position 38 is not absent. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (40)..(40) <223> Xaa at position 40 is absent or present, if present Xaa in position 40 is cysteine, serine or alanine. If Xaa in position 17 is present then positions 38 through 39 are not absent. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (41)..(41) <223> Xaa at position 40 is arginine or absent. If arginine then Xaa in positions 38 through 40 are not absent. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (42)..(42) <223> Xaa at position 42 is absent or present, if present Xaa in position 42 is cysteine, serine or alanine. If Xaa in position 42 is present then positions 38 through 41 are not absent. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (43)..(43) <223> Xaa at position 43 is asparagine or absent. If asparagine then Xaa in positions 38 through 42 are not absent. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (44)..(44) <223> Xaa at position 44 is aspartic acid or absent. If aspartic acid then Xaa in positions 38 through 43 are not absent. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (45)..(45) <223> Xaa at position 45 is serine or absent. If serine then Xaa in positions 38 through 44 are not absent. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (46)..(46) <223> Xaa at position 46 is serine or absent. If serine then Xaa in positions 38 through 45 are not absent. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (47)..(47) <223> Xaa at position 47 is aspartic acid or absent. If aspartic acid then Xaa in positions 38 through 46 are not absent. <400> 34 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Thr Pro Ile Arg Asn Glu Xaa Xaa 1 5 10 15 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Thr 20 25 30 Pro Ile Arg Asn Glu Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 35 40 45 <210> 35 <211> 70 <212> PRT <213> Influenza A virus <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(1) <223> Xaa at position 1 is methionine or absent. If methionine then Xaa in positions 2 through 8 are not absent <220> <221> MISC_FEATURE <222> (2)..(2) <223> Xaa at position 2 is serine or absent. If serine then Xaa in positions 3 through 8 are not absent. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (3)..(3) <223> Xaa at position 3 is leucine or absent. If leucine then Xaa in positions 4 through 8 are not absent. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (4)..(4) <223> Xaa at position 4 is leucine or absent. If leucine then Xaa in positions 5 through 8 are not absent. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (5)..(5) <223> Xaa at position 5 is threonine or absent. If threonine than Xaa in positions 6 through 8 are not absent. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (6)..(6) <223> Xaa at position 6 is glutamic acid or absent. If glutamic acid then Xaa in positions 7 through 8 are not absent. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (7)..(7) <223> Xaa at position 7 is valine or absent. If valine then Xaa in position 8 is not absent. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (8)..(8) <223> Xaa at position 8 is glutamic acid or absent. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (15)..(15) <223> Xaa at position 15 is tryptophan or absent. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (16)..(16) <223> Xaa at position 16 is glycine or absent. If glycine then Xaa in position 15 is not absent. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (17)..(17) <223> Xaa at position 17 is absent or present, if present Xaa in position 17 is cysteine, serine or alanine. If Xaa in position 17 is present then positions 15 through 16 are not absent. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (18)..(18) <223> Xaa at position 18 is arginine or absent. If arginine then Xaa in positions 15 through 17 are not absent. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (19)..(19) <223> Xaa at position 19 is absent or present, if present Xaa in position 19 is cysteine, serine or alanine. If Xaa in position 19 is present then positions 15 through 18 are not absent. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (20)..(20) <223> Xaa at position 20 is asparagine or absent. If asparagine then Xaa in positions 15 through 19 are not absent. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (21)..(21) <223> Xaa at position 21 is aspartic acid or absent. If aspartic acid then Xaa in positions 15 through 20 are not absent. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (22)..(22) <223> Xaa at position 22 is serine or absent. If serine then Xaa in positions 15 through 21 are not absent. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (23)..(23) <223> Xaa at position 23 is serine or absent. If serine then Xaa in positions 15 through 22 are not absent. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (24)..(24) <223> Xaa at position 24 is aspartic acid or absent. If aspartic acid then Xaa in positions 15 through 23 are not absent. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (25)..(25) <223> Xaa at position 25 is serine or absent. If serine then Xaa in positions 26 through 31 are not absent <220> <221> MISC_FEATURE <222> (26)..(26) <223> Xaa at position 26 is leucine or absent. If leucine then Xaa in positions 27 through 31 are not absent. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (27)..(27) <223> Xaa at position 27 is leucine or absent. If leucine then Xaa in positions 28 through 31 are not absent. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (28)..(28) <223> Xaa at position 28 is threonine or absent. If threonine than Xaa in positions 29 through 31 are not absent. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (29)..(29) <223> Xaa at position 29 is glutamic acid or absent. If glutamic acid then Xaa in positions 30 through 31 are not absent. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (30)..(30) <223> Xaa at position 30 is valine or absent. If valine then Xaa in position 31 is not absent. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (31)..(31) <223> Xaa at position 31 is glutamic acid or absent. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (38)..(38) <223> Xaa at position 38 is tryptophan or absent. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (39)..(39) <223> Xaa at position 39 is glycine or absent. If glycine then Xaa in position 38 is not absent. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (40)..(40) <223> Xaa at position 40 is absent or present, if present Xaa in position 40 is cysteine, serine or alanine. If Xaa in position 40 is present then positions 38 through 39 are not absent. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (41)..(41) <223> Xaa at position 41 is arginine or absent. If arginine then Xaa in positions 38 through 40 are not absent. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (42)..(42) <223> Xaa at position 42 is absent or present, if present Xaa in position 42 is cysteine, serine or alanine. If Xaa in position 42 is present then positions 38 through 41 are not absent. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (43)..(43) <223> Xaa at position 43 is asparagine or absent. If asparagine then Xaa in positions 38 through 42 are not absent. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (44)..(44) <223> Xaa at position 44 is aspartic acid or absent. If aspartic acid then Xaa in positions 38 through 43 are not absent. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (45)..(45) <223> Xaa at position 45 is serine or absent. If serine then Xaa in positions 38 through 44 are not absent. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (46)..(46) <223> Xaa at position 46 is serine or absent. If serine then Xaa in positions 38 through 45 are not absent. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (47)..(47) <223> Xaa at position 47 is aspartic acid or absent. If aspartic acid then Xaa in positions 38 through 46 are not absent. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (48)..(48) <223> Xaa at position 48 is serine or absent. If serine then Xaa in positions 49 through 54 are not absent. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (49)..(49) <223> Xaa at position 49 is leucine or absent. If leucine then Xaa in positions 50 through 54 are not absent. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (50)..(50) <223> Xaa at position 50 is leucine or absent. If leucine then Xaa in positions 51 through 54 are not absent. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (51)..(51) <223> Xaa at position 51 is threonine or absent. If threonine than Xaa in positions 52 through 54 are not absent. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (52)..(52) <223> Xaa at position 52 is glutamic acid or absent. If glutamic acid then Xaa in positions 53 through 54 are not absent. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (53)..(53) <223> Xaa at position 53 is valine or absent. If valine then Xaa in position 54 is not absent. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (54)..(54) <223> Xaa at position 54 is glutamic acid or absent <220> <221> MISC_FEATURE <222> (61)..(61) <223> Xaa at position 61 is tryptophan or absent. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (62)..(62) <223> Xaa at position 62 is glycine or absent. If glycine then Xaa in position 61 is not absent. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (63)..(63) <223> Xaa at position 63 is absent or present, if present Xaa in position 63 is cysteine, serine or alanine. If Xaa in position 63 is present then positions 61 through 62 are not absent. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (64)..(64) <223> Xaa at position 64 is arginine or absent. If arginine then Xaa in positions 61 through 63 are not absent <220> <221> MISC_FEATURE <222> (65)..(65) <223> Xaa at position 65 is absent or present, if present Xaa in position 65 is cysteine, serine or alanine. If Xaa in position 65 is present then positions 61 through 64 are not absent. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (66)..(66) <223> Xaa at position 66 is asparagine or absent. If asparagine then Xaa in positions 61 through 65 are not absent. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (67)..(67) <223> Xaa at position 67 is aspartic acid or absent. If aspartic acid then Xaa in positions 61 through 66 are not absent. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (68)..(68) <223> Xaa at position 68 is serine or absent. If serine then Xaa in positions 61 through 67 are not absent. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (69)..(69) <223> Xaa at position 69 is serine or absent. If serine then Xaa in positions 61 through 68 are not absent. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (70)..(70) <223> Xaa at position 70 is aspartic acid or absent. If aspartic acid then Xaa in positions 61 through 69 are not absent. <400> 35 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Thr Pro Ile Arg Asn Glu Xaa Xaa 1 5 10 15 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Thr 20 25 30 Pro Ile Arg Asn Glu Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 35 40 45 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Thr Pro Ile Arg Asn Glu Xaa Xaa Xaa Xaa 50 55 60 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 65 70 <210> 36 <211> 47 <212> PRT <213> Influenza A virus <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(1) <223> Xaa at position 1 is methionine or absent. If methionine then Xaa in position 2 through 8 are not absent. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (2)..(2) <223> Xaa at position 2 is serine or absent. If serine then Xaa in position 3 through 8 are not absent. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (3)..(3) <223> Xaa at position 3 is leucine or absent. If leucine then Xaa in position 4 through 8 are not absent. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (4)..(4) <223> Xaa at position 4 is leucine or absent. If leucine then Xaa in position 5 through 8 are not absent. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (5)..(5) <223> Xaa at position 4 is threonine or absent. If threonine then Xaa in position 6 through 8 are not absent. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (6)..(6) <223> Xaa at position 6 is glutamic acid or absent. If glutamic acid then Xaa in position 7 through 8 are not absent. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (7)..(7) <223> Xaa at position 7 is valine or absent. If valine then Xaa in position 8 is not absent. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (8)..(8) <223> Xaa at position 8 is glutamic acid or aspartic acid or absent. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (10)..(10) <223> Xaa at position 10 is proline, leucine or histidine. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (11)..(11) <223> Xaa at position 11 is isoleucine or threonine. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (12)..(12) <223> Xaa at position 12 is arginine or lysine. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (13)..(13) <223> Xaa at position 13 is asparagine or serine. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (14)..(14) <223> Xaa at position 14 is glutamic acid or glycine. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (15)..(15) <223> Xaa at position 15 is tryptophan or absent. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (16)..(16) <223> Xaa at position 16 is glycine, glutamic acid or absent. If glycine or glutamic acid then Xaa in position 16 is not absent. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (17)..(17) <223> Xaa at position 17 is absent or present, if present Xaa in position 17 is cysteine, serine or alanine. If Xaa in position 17 is present then positions 15 through 16 are not absent. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (18)..(18) <223> Xaa at position 18 arginine, lysine or absent. If arginine or lysine then Xaa in positions 15 through 17 are not absent. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (19)..(19) <223> Xaa at position 19 is absent or present, if present Xaa in position 19 is cysteine, serine or alanine. If Xaa is position 19 is present then positions 15 through 18 are not absent. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (20)..(20) <223> Xaa at position 20 is asparagine, serine or glycine or absent. If asparagine or serine then Xaa is positions 15 through 19 are not absent. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (21)..(21) <223> Xaa at position 21 is aspartic acid, glycine or absent. If aspartic acid or glycine then Xaa is positions 15 through 20 are not absent. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (22)..(22) <223> Xaa at position 22 is serine or absent. If serine then Xaa is positions 15 through 21 are not absent. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (23)..(23) <223> Xaa at position 23 is serine or absent. If serine then Xaa is positions 15 through 22 are not absent. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (24)..(24) <223> Xaa at position 24 is aspartic acid or absent. If aspartic acid then Xaa is positions 15 through 23 are not absent. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (25)..(25) <223> Xaa at position 25 is serine or absent. If serine then Xaa in positions 26 through 31 are not absent. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (26)..(26) <223> Xaa at position 26 is leucine or absent. If leucine then Xaa in positions 27 through 31 are not absent. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (27)..(27) <223> Xaa at position 27 is leucine or absent. If leucine then Xaa in positions 28 through 31 are not absent. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (28)..(28) <223> Xaa at position 28 is threonine, proline or absent. If threonine or proline then Xaa in positions 29 through 31 are not absent. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (29)..(29) <223> Xaa at position 29 is glutamic acid or absent. If glutamic acid then Xaa in positions 30 through 31 are not absent. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (30)..(30) <223> Xaa at position 30 is valine or absent. If valine then Xaa in position 31 is not absent. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (31)..(31) <223> Xaa at position 31 is glutamic acid or aspartic acid or absent. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (33)..(33) <223> Xaa at position 33 is proline, leucine or histidine. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (34)..(34) <223> Xaa at position 34 is isoleucine or threonine <220> <221> MISC_FEATURE <222> (35)..(35) <223> Xaa at position 35 is arginine or lysine. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (36)..(36) <223> Xaa at position 36 is asparagine or serine. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (37)..(37) <223> Xaa at position 37 is glumatic acid or glycine. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (38)..(38) <223> Xaa at position 38 is tryptophan or absent. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (39)..(39) <223> Xaa at position 39 is glycine, glutamic acid or absent. If glycine or glutamic acid then Xaa in position 38 is not absent. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (40)..(40) <223> Xaa at position 40 is absent of present, if present Xaa in position 40 is cysteine, serine or alanine. If Xaa in position 40 is present then positions 38 through 39 are not absent. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (41)..(41) <223> Xaa at position 41 is arginine, lysine or absent. If arginine or lysine than Xaa in positions 38 through 40 are not absent. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (42)..(42) <223> Xaa at position 42 is absent or present, if present Xaa in position 42 is cysteine, serine or alanine. If Xaa in position 42 is present then positions 38 through 41 are not absent. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (43)..(43) <223> Xaa at position 43 is asparagine, serine or absent. If asparagine or serine then Xaa in positions 38 through 42 are not absent. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (44)..(44) <223> Xaa at position 44 is aspartic acid, glycine or absent. If aspartic acid or glycine then Xaa in positions 38 through 43 are not absent. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (45)..(45) <223> Xaa at position 45 is serine or absent. If serine then Xaa in positions 38 through 44 are not absent. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (46)..(46) <223> Xaa at position 46 is serine or absent. If serine then Xaa in positions 38 through 45 are not absent. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (47)..(47) <223> Xaa at position 47 is aspartic acid or absent. If aspartic acid then Xaa in positions 38 through 46 are not absent. <400> 36 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Thr Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 1 5 10 15 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Thr 20 25 30 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 35 40 45 <210> 37 <211> 70 <212> PRT <213> Influenza A virus <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(1) <223> Xaa at position 1 is methionine or absent. If methionine then Xaa in position 2 through 8 are not absent. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (2)..(2) <223> Xaa at position 2 is serine or absent. If serine then Xaa in position 3 through 8 are not absent. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (3)..(3) <223> Xaa at position 3 is leucine or absent. If leucine then Xaa in position 4 through 8 are not absent. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (4)..(4) <223> Xaa at position 4 is leucine or absent. If leucine then Xaa in position 5 through 8 are not absent. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (5)..(5) <223> Xaa at position 5 is threonine or absent. If threonine then Xaa in position 6 through 8 are not absent. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (6)..(6) <223> Xaa at position 6 is glutamic acid or absent. If glutamic acid then Xaa in position 7 through 8 are not absent. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (7)..(7) <223> Xaa at position 7 is valine or absent. If valine then Xaa in position 8 is not absent. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (8)..(8) <223> Xaa at position 8 is glutamic acid or absent. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (10)..(10) <223> Xaa at position 10 is proline, leucine or histidine. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (11)..(11) <223> Xaa at position 11 is isoleucine or threonine. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (12)..(12) <223> Xaa at position 12 is arginine or lysine. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (13)..(13) <223> Xaa at position 13 is asparagine or serine. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (14)..(14) <223> Xaa at position 14 is glutamic acid or glycine. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (15)..(15) <223> Xaa at position 15 is tryptophan or absent. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (16)..(16) <223> Xaa at position 16 is glycine, glutamic acid or absent. If glycine or glutamic acid then Xaa in position 16 is not absent. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (17)..(17) <223> Xaa at position 17 is absent or present, if present Xaa in position 17 is cysteine, serine or alanine. If Xaa in position 17 is present then positions 15 through 16 are not absent. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (18)..(18) <223> Xaa at position 18 arginine, lysine or absent. If arginine or lysine then Xaa in positions 15 through 17 are not absent. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (19)..(19) <223> Xaa at position 19 is absent or present, if present Xaa in position 19 is cysteine, serine or alanine. If Xaa is position 19 is present then positions 15 through 18 are not absent. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (20)..(20) <223> Xaa at position 20 is asparagine, serine, glycine or absent. If asparagine or serine then Xaa is positions 15 through 19 are not absent. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (21)..(21) <223> Xaa at position 21 is aspartic acid, glycine or absent. If aspartic acid or glycine then Xaa is positions 15 through 20 are not absent. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (22)..(22) <223> Xaa at position 22 is serine or absent. If serine then Xaa is positions 15 through 21 are not absent. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (23)..(23) <223> Xaa at position 23 is serine or absent. If serine then Xaa is positions 15 through 22 are not absent. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (24)..(24) <223> Xaa at position 24 is aspartic acid or absent. If aspartic acid then Xaa is positions 15 through 23 are not absent. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (25)..(25) <223> Xaa at position 25 is serine or absent. If serine then Xaa in positions 26 through 31 are not absent. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (26)..(26) <223> Xaa at position 26 is leucine or absent. If leucine then Xaa in positions 27 through 31 are not absent. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (27)..(27) <223> Xaa at position 27 is leucine or absent. If leucine then Xaa in positions 28 through 31 are not absent. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (28)..(28) <223> Xaa at position 28 is threonine, proline or absent. If threonine or proline then Xaa in positions 29 through 31 are not absent. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (29)..(29) <223> Xaa at position 29 is glutamic acid or absent. If glutamic acid then Xaa in positions 30 through 31 are not absent. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (30)..(30) <223> Xaa at position 30 is valine or absent. If valine then Xaa in position 31 is not absent. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (31)..(31) <223> Xaa at position 31 is glutamic acid or aspartic acid or absent. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (33)..(33) <223> Xaa at position 33 is proline, leucine or histidine. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (34)..(34) <223> Xaa at position 34 is isoleucine or threonine <220> <221> MISC_FEATURE <222> (35)..(35) <223> Xaa at position 35 is arginine or lysine. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (36)..(36) <223> Xaa at position 36 is asparagine or serine. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (37)..(37) <223> Xaa at position 37 is glumatic acid or glycine. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (38)..(38) <223> Xaa at position 38 is tryptophan or absent. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (39)..(39) <223> Xaa at position 39 is glycine, glutamic acid or absent. If glycine or glutamic acid then Xaa in position 38 is not absent. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (40)..(40) <223> Xaa at position 40 is absent of present, if present Xaa in position 40 is cysteine, serine or alanine. If Xaa in position 40 is present then positions 38 through 39 are not absent. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (41)..(41) <223> Xaa at position 41 is arginine, lysine or absent. If arginine or lysine than Xaa in positions 38 through 40 are not absent. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (42)..(42) <223> Xaa at position 42 is absent or present, if present Xaa in position 42 is cysteine, serine or alanine. If Xaa in position 42 is present then positions 38 through 41 are not absent. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (43)..(43) <223> Xaa at position 43 is asparagine, serine, glycine or absent. If asparagine or serine or glycine then Xaa in positions 38 through 42 are not absent. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (44)..(44) <223> Xaa at position 44 is aspartic acid, glycine or absent. If aspartic acid or glycine then Xaa in positions 38 through 43 are not absent. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (45)..(45) <223> Xaa at position 45 is serine or absent. If serine then Xaa in positions 38 through 44 are not absent. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (46)..(46) <223> Xaa at position 46 is serine or absent. If serine then Xaa in positions 38 through 45 are not absent. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (47)..(47) <223> Xaa at position 47 is aspartic acid or absent. If aspartic acid then Xaa in positions 38 through 46 are not absent. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (48)..(48) <223> Xaa at position 48 is serine or absent. If serine then Xaa in positions 49 through 54 are not absent. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (49)..(49) <223> Xaa at position 49 is leucine or absent. If leucine then Xaa in positions 50 through 54 are not absent. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (50)..(50) <223> Xaa at position 50 is leucine or absent. If leucine then Xaa in positions 51 through 54 are not absent. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (51)..(51) <223> Xaa at position 51 is threonine, proline or absent. If threonine or proline then Xaa in positions 52 through 54 are not absent. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (52)..(52) <223> Xaa at position 52 is glutamic acid or absent. If glutamic acid then Xaa in positions 53 through 54 are not absent. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (53)..(53) <223> Xaa at position 53 is valine or absent. If valine then Xaa in position 54 is not absent. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (54)..(54) <223> Xaa at position 54 is glutamic acid or aspartic acid or absent <220> <221> MISC_FEATURE <222> (56)..(56) <223> Xaa at position 56 is proline, leucine or histidine. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (57)..(57) <223> Xaa at position 57 is isoleucine or threonine. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (58)..(58) <223> Xaa at position 58 is arginine or lysine. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (59)..(59) <223> Xaa at position 59 is asparagine or serine. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (60)..(60) <223> Xaa at position 60 is glumatic acid or glycine. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (61)..(61) <223> Xaa at position 61 is tryptophan or absent. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (62)..(62) <223> Xaa at position 62 is glycine, glutamic acid or absent. If glycine or glutamic acid then Xaa in position 61 is not absent. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (63)..(63) <223> Xaa at position 63 is absent of present, if present Xaa in position 63 is cysteine, serine or alanine. If Xaa in position 63 is present then positions 61 through 62 are not absent. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (64)..(64) <223> Xaa at position 64 is arginine, lysine or absent. If arginine or lysine than Xaa in positions 61 through 63 are not absent. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (65)..(65) <223> Xaa at position 65 is absent or present, if present Xaa in position 65 is cysteine, serine or alanine. If Xaa in position 65 is present then positions 61 through 64 are not absent. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (66)..(66) <223> Xaa at position 66 is asparagine, serine, glycine or absent. If asparagine or serine or glycine then Xaa in positions 61 through 65 are not absent. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (67)..(67) <223> Xaa at position 67 is aspartic acid, glycine or absent. If aspartic acid or glycine then Xaa in positions 61 through 66 are not absent. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (68)..(68) <223> Xaa at position 68 is serine or absent. If serine then Xaa in positions 61 through 67 are not absent. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (69)..(69) <223> Xaa at position 69 is serine or absent. If serine then Xaa in positions 61 through 68 are not absent. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (70)..(70) <223> Xaa at position 70 is aspartic acid or absent. If aspartic acid then Xaa in positions 61 through 69 are not absent. <400> 37 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Thr Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 1 5 10 15 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Thr 20 25 30 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 35 40 45 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Thr Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 50 55 60 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 65 70 <210> 38 <211> 17 <212> PRT <213> Influenza B virus <400> 38 Asn Asn Ala Thr Phe Asn Tyr Thr Asn Val Asn Pro Ile Ser His Ile 1 5 10 15 Arg <210> 39 <211> 24 <212> PRT <213> Influenza A virus <400> 39 Phe Trp Arg Gly Glu Asn Gly Arg Lys Thr Arg Ser Ala Tyr Glu Arg 1 5 10 15 Met Cys Asn Ile Leu Lys Gly Lys 20 <210> 40 <211> 22 <212> PRT <213> Influenza A virus <400> 40 Leu Arg Val Leu Ser Phe Ile Arg Gly Thr Lys Val Ser Pro Arg Gly 1 5 10 15 Lys Leu Ser Thr Arg Gly 20 <210> 41 <211> 22 <212> PRT <213> Influenza A virus <400> 41 Ser Leu Val Gly Ile Asp Pro Phe Lys Leu Leu Gln Asn Ser Gln Val 1 5 10 15 Tyr Ser Leu Ile Arg Pro 20 <210> 42 <211> 24 <212> PRT <213> Influenza A virus <400> 42 Ala Val Lys Gly Val Gly Thr Met Val Met Glu Leu Ile Arg Met Ile 1 5 10 15 Lys Arg Gly Ile Asn Asp Arg Asn 20 <210> 43 <211> 549 <212> DNA <213> Hepatitis B virus <400> 43 atggacatcg acccttataa agaatttgga gctactgtgg agttactctc gtttttgcct 60 tctgacttct ttccttcagt acgagatctt ctagataccg cctcagctct gtatcgggaa 120 gccttagagt ctcctgagca ttgttcacct caccatactg cactcaggca agcaattctt 180 tgctgggggg aactaatgac tctagctacc tgggtgggtg ttaatttgga agatccagcg 240 tctagagacc tagtagtcag ttatgtcaac actaatatgg gcctaaagtt caggcaactc 300 ttgtggtttc acatttcttg tctcactttt ggaagagaaa cagttataga gtatttggtg 360 tctttcggag tgtggattcg cactcctcca gcttatagac caccaaatgc ccctatccta 420 tcaacacttc cggagactac tgttgttaga cgacgaggca ggtcccctag aagaagaact 480 ccctcgcctc gcagacgaag gtctcaatcg ccgcgtcgca gaagatctca atctcgggaa 540 tctcaatgt 549 <210> 44 <211> 555 <212> DNA <213> Hepatitis B virus <400> 44 atggacattg acccttataa agaatttgga gctactgtgg agttactctc gtttttgcct 60 tctgacttct ttccttccgt acgagatctc ctagacaccg cctcagctct gtatcgagaa 120 gccttagagt ctcctgagca ttgctcacct caccatactg cactcaggca agccattctc 180 tgctgggggg aattgatgac tctagctacc tgggtgggta ataatttgca agatccagca 240 tccagagatc tagtagtcaa ttatgttaat actaacatgg gtttaaagat caggcaacta 300 ttgtggtttc atatatcttg ccttactttt ggaagagaga ctgtacttga atatttggtc 360 tctttcggag tgtggattcg cactcctcca gcctatagac caccaaatgc ccctatctta 420 tcaacacttc cggaaactac tgttgttaga cgacgggacc gaggcaggtc ccctagaaga 480 agaactccct cgcctcgcag acgcagatct caatcgccgc gtcgcagaag atctcaatct 540 cgggaatctc aatgt 555 <210> 45 <211> 555 <212> DNA <213> Hepatitis B virus <400> 45 atggacattg acccttataa agaatttgga gctactgtgg agttactctc gtttttgcct 60 tctgacttct ttccttccgt cagagatctc ctagacaccg cctcagctct gtatcgagaa 120 gccttagagt ctcctgagca ttgctcacct caccatactg cactcaggca agccattctc 180 tgctgggggg aattgatgac tctagctacc tgggtgggta ataatttgga agatccagca 240 tctagggatc ttgtagtaaa ttatgttaat actaacgtgg gtttaaagat caggcaacta 300 ttgtggtttc atatatcttg ccttactttt ggaagagaga ctgtacttga atatttggtc 360 tctttcggag tgtggattcg cactcctcca gcctatagac caccaaatgc ccctatctta 420 tcaacacttc cggaaactac tgttgttaga cgacgggacc gaggcaggtc ccctagaaga 480 agaactccct cgcctcgcag acgcagatct ccatcgccgc gtcgcagaag atctcaatct 540 cgggaatctc aatgt 555 <210> 46 <211> 549 <212> DNA <213> Hepatitis B virus <400> 46 atggacattg acccttataa agaatttgga gctactgtgg agttactctc gtttttgcct 60 tctgacttct ttccttccgt acgagatctt ctagataccg ccgcagctct gtatcgggat 120 gccttagagt ctcctgagca ttgttcacct caccatactg cactcaggca agcaattctt 180 tgctggggag acttaatgac tctagctacc tgggtgggta ctaatttaga agatccagca 240 tctagggacc tagtagtcag ttatgtcaac actaatgtgg gcctaaagtt cagacaatta 300 ttgtggtttc acatttcttg tctcactttt ggaagagaaa cggttctaga gtatttggtg 360 tcttttggag tgtggattcg cactcctcca gcttatagac caccaaatgc ccctatccta 420 tcaacgcttc cggagactac tgttgttaga cgacgaggca ggtcccctag aagaagaact 480 ccctcgcctc gcagacgaag atctcaatcg ccgcgtcgca gaagatctca atctcgggaa 540 tctcaatgt 549 <210> 47 <211> 549 <212> DNA <213> woodchuck <400> 47 atggctttgg ggcatggaca tagatcctta taaagaattt ggttcatctt atcagttgtt 60 gaattttctt cctttggact tctttcctga tcttaatgct ttggtggaca ctgctactgc 120 cttgtatgaa gaagaactaa caggtaggga acattgctct ccgcaccata cagctattag 180 acaagcttta gtatgctggg atgaattaac taaattgata gcttggatga gctctaacat 240 aacttctgaa caagtaagaa caatcattgt aaatcatgtc aatgatacct ggggacttaa 300 ggtgagacaa agtttatggt ttcatttgtc atgtctcact ttcggacaac atacagttca 360 agaattttta gtaagttttg gagtatggat caggactcca gctccatata gacctcctaa 420 tgcacccatt ctctcgactc ttccggaaca tacagtcatt aggagaagag gaggtgcaag 480 agcttctagg tcccccagaa gacgcactcc ctctcctcgc aggagaagat ctcaatcacc 540 gcgtcgcag 549 <210> 48 <211> 651 <212> DNA <213> ground squirrel <400> 48 atgtatcttt ttcacctgtg ccttgttttt gcctgtgttc catgtcctac tgttcaagcc 60 tccaagctgt gccttggatg gctttgggac atggacatag atccctataa agaatttggt 120 tcttcttatc agttgttgaa ttttcttcct ttggactttt ttcctgatct caatgcattg 180 gtggacactg ctgctgctct ttatgaagaa gaattaacag gtagggagca ttgttctcct 240 catcatactg ctattagaca ggccttagtg tgttgggaag aattaactag attaattaca 300 tggatgagtg aaaatacaac agaagaagtt agaagaatta ttgttgatca tgtcaataat 360 acttggggac ttaaagtaag acagacttta tggtttcatt tatcatgtct tacttttgga 420 caacacacag ttcaagaatt tttggttagt tttggagtat ggattagaac tccagctcct 480 tatagaccac ctaatgcacc cattttatca actcttccgg aacatacagt cattaggaga 540 agaggaggtt caagagctgc taggtccccc cgaagacgca ctccctctcc tcgcaggaga 600 aggtctcaat caccgcgtcg cagacgctct caatctccag cttccaactg c 651 <210> 49 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Amplification primer containing a restriction endonuclease site <400> 49 ggtgcatgca aggagatg 18 <210> 50 <211> 55 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> plasmid pkk223 <400> 50 gcgaagcttc ggatcccatg gttttttcct ccttatgtga aattgttatc cgctc 55 <210> 51 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> primer <400> 51 ttgggccatg gacatcgacc ctta 24 <210> 52 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> primer <400> 52 gcggaattcc atcttccaaa ttaacaccca c 31 <210> 53 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> primer <400> 53 cgcgaattca aaaagagctc ccagcgtcta gagacctag 39 <210> 54 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> primer <400> 54 cgcaagctta aacaacagta gtctccggaa g 31 <210> 55 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Amplification primer containing a restriction endonuclease site <400> 55 cgcaagctta ctagcaaaca acagtagtct ccggaag 37 <210> 56 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Amplification primer containing a restriction endonuclease site <400> 56 ggaaagctta ctaacattga gattcccg 28 <210> 57 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Amplification primer containing a restriction endonuclease site <400> 57 gcgggatccg gagcttatcg a 21 <210> 58 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Amplification primer containing a restriction endonuclease site <400> 58 gcggagctct ttttgaattc ccatggtttt ttcctcctta t 41 <210> 59 <211> 49 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Amplification primer containing a restriction endonuclease site <400> 59 gcggagctcc ttgggtggct ttggggcatt gacatcgacc cttataaag 49 <210> 60 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Amplification primer containing a restriction endonuclease site. <400> 60 gcataattcg tgtcgctc 18 <210> 61 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Amplification primer containing a restriction endonuclease site. <400> 61 gcggaattcc gatgtccatg gttttttcct 30 <210> 62 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Amplification primer containing a restriction endonuclease site. <400> 62 gcggaattca aaaagagctc gacccttata aagaatttgg a 41 <210> 63 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Amplification primer containing a restriction endonuclease site <400> 63 cgcaagctta gagctcttga attccaacaa 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75 <211> 70 <212> DNA <213> Influenza A <400> 75 catcacttga atcgttacat ctgcaccccc attcgtttct gataggggtt tcaacttcgg 60 tcagcagaga 70 <210> 76 <211> 26 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Influenza A mutant <400> 76 Met Ser Leu Leu Thr Glu Val Glu Thr Pro Ile Arg Asn Glu Trp Gly 1 5 10 15 Ser Arg Cys Asn Asp Ser Ser Asp Glu Leu 20 25 <210> 77 <211> 78 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Amplification primer containing a restriction endonuclease site <400> 77 catgtctctg ctgaccgaag ttgaaacccc tatcagaaac gaatgggggt ctagatgtaa 60 cgattcaagt gatgagct 78 <210> 78 <211> 70 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Amplification primer containing a restriction endonuclease site <400> 78 catcacttga atcgttacat ctagaccccc attcgtttct gataggggtt tcaacttcgg 60 tcagcagaga 70 <210> 79 <211> 26 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Influenza A mutant <400> 79 Met Ser Leu Leu Thr Glu Val Glu Thr Pro Ile Arg Asn Glu Trp Gly 1 5 10 15 Cys Arg Ser Asn Asp Ser Ser Asp Glu Leu 20 25 <210> 80 <211> 78 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Amplification primer containing a restriction endonuclease site <400> 80 catgtctctg ctgaccgaag ttgaaacccc tatcagaaac gaatgggggt gcagatcgaa 60 cgattcaagt gatgagct 78 <210> 81 <211> 70 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Amplification primer containing a restriction endonuclease site <400> 81 catcacttga atcgttcgat ctgcaccccc attcgtttct gataggggtt tcaacttcgg 60 tcagcagaga 70 <210> 82 <211> 26 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Influenza A mutant <400> 82 Ile Ser Leu Leu Thr Glu Val Glu Thr Pro Ile Arg Asn Glu Trp Gly 1 5 10 15 Ser Arg Ser Asn Asp Ser Ser Asp Glu Leu 20 25 <210> 83 <211> 78 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Amplification primer containing a restriction endonuclease site <400> 83 aatttctctg ttaaccgaag tggagacgcc gattcgtaac gaatggggta gccgctctaa 60 tgatagctct gacgagct 78 <210> 84 <211> 70 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Amplification primer containing a restriction endonuclease site <400> 84 cgtcagagct atcattagag cggctacccc attcgttacg aatcggcgtc tccacttcgg 60 ttaacagaga 70 <210> 85 <211> 26 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Influenza A mutant <400> 85 Met Ser Leu Leu Thr Glu Val Glu Thr Pro Ile Arg Asn Glu Trp Gly 1 5 10 15 Ser Arg Ser Asn Asp Ser Ser Asp Glu Leu 20 25 <210> 86 <211> 78 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Amplification primer containing a restriction endonuclease site <400> 86 catgtctctg ctgaccgaag ttgaaacccc tatcagaaac gaatgggggt ctagatcgaa 60 cgattcaagt gatgagct 78 <210> 87 <211> 70 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Amplification primer containing a restriction endonuclease site. <400> 87 catcacttga atcgttcgat ctagaccccc attcgtttct gataggggtt tcaacttcgg 60 tcagcagaga 70 <210> 88 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> pkk-BamHI-F-2 <400> 88 cgtagaggat ccggagctta tcgactgcac gg 32 <210> 89 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Amplification primer containing a restriction endonuclease site <400> 89 gcgctcgaga tcacttgaat cgtt 24 <210> 90 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Amplification primer containing a restriction endonuclease site <400> 90 gcgctcgaga gcttattgac cgaagttgaa acc 33 <210> 91 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Amplification primer containing a restriction endonuclease site <400> 91 gcgctgcaga tcacttgaat cgtt 24 <210> 92 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Amplification primer containing a restriction endonuclease site <400> 92 gcgctgcagt ctctgctgac cgaag 25 <210> 93 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Amplification primer containing a restriction endonuclease site <400> 93 cgcgacatgt ctctgctgac cg 22 <210> 94 <211> 203 <212> PRT <213> Hepatitis B virus <400> 94 Met Ser Leu Leu Thr Glu Val Glu Thr Pro Ile Arg Asn Glu Trp Gly 1 5 10 15 Cys Arg Cys Asn Asp Ser Ser Asp Pro Tyr Lys Glu Phe Gly Ala Thr 20 25 30 Val Glu Leu Leu Ser Phe Leu Pro Ser Asp Phe Phe Pro Ser Val Arg 35 40 45 Asp Leu Leu Asp Thr Ala Ser Ala Leu Tyr Arg Glu Ala Leu Glu Ser 50 55 60 Pro Glu His Cys Ser Pro His His Thr Ala Leu Arg Gln Ala Ile Leu 65 70 75 80 Cys Trp Gly Glu Leu Met Thr Leu Ala Thr Trp Val Gly Val Asn Leu 85 90 95 Glu Asp Pro Ala Ser Arg Asp Leu Val Val Ser Tyr Val Asn Thr Asn 100 105 110 Met Gly Leu Lys Phe Arg Gln Leu Leu Trp Phe His Ile Ser Cys Leu 115 120 125 Thr Phe Gly Arg Glu Thr Val Ile Glu Tyr Leu Val Ser Phe Gly Val 130 135 140 Trp Ile Arg Thr Pro Pro Ala Tyr Arg Pro Pro Asn Ala Pro Ile Leu 145 150 155 160 Ser Thr Leu Pro Glu Thr Thr Val Val Arg Arg Arg Gly Arg Ser Pro 165 170 175 Arg Arg Arg Thr Pro Ser Pro Arg Arg Arg Arg Ser Gln Ser Pro Arg 180 185 190 Arg Arg Arg Ser Gln Ser Arg Glu Ser Gln Cys 195 200 <210> 95 <211> 176 <212> PRT <213> Hepatitis B virus <400> 95 Met Asp Ile Asp Pro Tyr Lys Glu Phe Gly Ala Thr Val Glu Leu Leu 1 5 10 15 Ser Phe Leu Pro Ser Asp Phe Phe Pro Ser Val Arg Asp Leu Leu Asp 20 25 30 Thr Ala Ser Ala Leu Tyr Arg Glu Ala Leu Glu Ser Pro Glu His Cys 35 40 45 Ser Pro His His Thr Ala Leu Arg Gln Ala Ile Leu Cys Trp Gly Glu 50 55 60 Leu Met Thr Leu Ala Thr Trp Val Gly Val Asn Leu Glu Asp Gly Ile 65 70 75 80 Ser Leu Leu Thr Glu Val Glu Thr Pro Ile Arg Asn Glu Trp Gly Cys 85 90 95 Arg Cys Asn Asp Ser Ser Asp Glu Leu Pro Ala Ser Arg Asp Leu Val 100 105 110 Val Ser Tyr Val Asn Thr Asn Met Gly Leu Lys Phe Arg Gln Leu Leu 115 120 125 Trp Phe His Ile Ser Cys Leu Thr Phe Gly Arg Glu Thr Val Ile Glu 130 135 140 Tyr Leu Val Ser Phe Gly Val Trp Ile Arg Thr Pro Pro Ala Tyr Arg 145 150 155 160 Pro Pro Asn Ala Pro Ile Leu Ser Thr Leu Pro Glu Thr Thr Val Val 165 170 175 <210> 96 <211> 177 <212> PRT <213> Hepatitis B virus <400> 96 Met Asp Ile Asp Pro Tyr Lys Glu Phe Gly Ala Thr Val Glu Leu Leu 1 5 10 15 Ser Phe Leu Pro Ser Asp Phe Phe Pro Ser Val Arg Asp Leu Leu Asp 20 25 30 Thr Ala Ser Ala Leu Tyr Arg Glu Ala Leu Glu Ser Pro Glu His Cys 35 40 45 Ser Pro His His Thr Ala Leu Arg Gln Ala Ile Leu Cys Trp Gly Glu 50 55 60 Leu Met Thr Leu Ala Thr Trp Val Gly Val Asn Leu Glu Asp Gly Ile 65 70 75 80 Ser Leu Leu Thr Glu Val Glu Thr Pro Ile Arg Asn Glu Trp Gly Ala 85 90 95 Arg Ala Asn Asp Ser Ser Asp Glu Leu Pro Ala Ser Arg Asp Leu Val 100 105 110 Val Ser Tyr Val Asn Thr Asn Met Gly Leu Lys Phe Arg Gln Leu Leu 115 120 125 Trp Phe His Ile Ser Cys Leu Thr Phe Gly Arg Glu Thr Val Ile Glu 130 135 140 Tyr Leu Val Ser Phe Gly Val Trp Ile Arg Thr Pro Pro Ala Tyr Arg 145 150 155 160 Pro Pro Asn Ala Pro Ile Leu Ser Thr Leu Pro Glu Thr Thr Val Val 165 170 175 Cys <210> 97 <211> 183 <212> PRT <213> Hepatitis B virus <400> 97 Met Gly Ile Ser Leu Leu Thr Glu Val Glu Thr Pro Ile Arg Asn Glu 1 5 10 15 Trp Gly Cys Arg Cys Asn Asp Ser Ser Asp Glu Leu Leu Gly Trp Leu 20 25 30 Trp Gly Ile Asp Ile Asp Pro Tyr Lys Glu Phe Gly Ala Thr Val Glu 35 40 45 Leu Leu Ser Phe Leu Pro Ser Asp Phe Phe Pro Ser Val Arg Asp Leu 50 55 60 Leu Asp Thr Ala Ser Ala Leu Tyr Arg Glu Ala Leu Glu Ser Pro Glu 65 70 75 80 His Cys Ser Pro His His Thr Ala Leu Arg Gln Ala Ile Leu Cys Trp 85 90 95 Gly Glu Leu Met Thr Leu Ala Thr Trp Val Gly Val Asn Leu Glu Asp 100 105 110 Pro Ala Ser Arg Asp Leu Val Val Ser Tyr Val Asn Thr Asn Met Gly 115 120 125 Leu Lys Phe Arg Gln Leu Leu Trp Phe His Ile Ser Cys Leu Thr Phe 130 135 140 Gly Arg Glu Thr Val Ile Glu Tyr Leu Val Ser Phe Gly Val Trp Ile 145 150 155 160 Arg Thr Pro Pro Ala Tyr Arg Pro Pro Asn Ala Pro Ile Leu Ser Thr 165 170 175 Leu Pro Glu Thr Thr Val Val 180 <210> 98 <211> 184 <212> PRT <213> Hepatitis B virus <400> 98 Met Gly Ile Ser Leu Leu Thr Glu Val Glu Thr Pro Ile Arg Asn Glu 1 5 10 15 Trp Gly Cys Arg Cys Asn Asp Ser Ser Asp Glu Leu Leu Gly Trp Leu 20 25 30 Trp Gly Ile Asp Ile Asp Pro Tyr Lys Glu Phe Gly Ala Thr Val Glu 35 40 45 Leu Leu Ser Phe Leu Pro Ser Asp Phe Phe Pro Ser Val Arg Asp Leu 50 55 60 Leu Asp Thr Ala Ser Ala Leu Tyr Arg Glu Ala Leu Glu Ser Pro Glu 65 70 75 80 His Cys Ser Pro His His Thr Ala Leu Arg Gln Ala Ile Leu Cys Trp 85 90 95 Gly Glu Leu Met Thr Leu Ala Thr Trp Val Gly Val Asn Leu Glu Asp 100 105 110 Pro Ala Ser Arg Asp Leu Val Val Ser Tyr Val Asn Thr Asn Met Gly 115 120 125 Leu Lys Phe Arg Gln Leu Leu Trp Phe His Ile Ser Cys Leu Thr Phe 130 135 140 Gly Arg Glu Thr Val Ile Glu Tyr Leu Val Ser Phe Gly Val Trp Ile 145 150 155 160 Arg Thr Pro Pro Ala Tyr Arg Pro Pro Asn Ala Pro Ile Leu Ser Thr 165 170 175 Leu Pro Glu Thr Thr Val Val Cys 180 <210> 99 <211> 18 <212> PRT <213> Influenza A virus <400> 99 Met Gly Ser Arg Cys Asn Asp Ser Ser Asp Ile Asp Pro Tyr Lys Glu 1 5 10 15 Phe Gly <210> 100 <211> 59 <212> DNA <213> Influenza A virus <400> 100 ggcgccatgg ggtctagatg taacgattca agtgacatcg acccttataa agaatttcg 59 <210> 101 <211> 16 <212> PRT <213> Influenza A virus <400> 101 Met Gly Cys Asn Asp Ser Ser Asp Ile Asp Pro Tyr Lys Glu Phe Gly 1 5 10 15 <210> 102 <211> 52 <212> DNA <213> Influenza A virus <400> 102 gcgccatggg gtgtaacgat tcaagtgaca tcgaccctta taaagaattt gg 52 <210> 103 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> xxx <400> 103 Glu Leu Leu Gly Trp Leu Trp Gly Ile Asp Ile 1 5 10 <210> 104 <211> 14 <212> PRT <213> Hepatitis B virus <400> 104 Ser Lys Leu Cys Leu Gly Trp Leu Trp Gly Met Asp Ile Asp 1 5 10 <210> 105 <211> 38 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> chimera of influenza A and hepatitis B <400> 105 Met Gly Ile Ser Leu Leu Thr Glu Val Glu Thr Pro Ile Arg Asn Glu 1 5 10 15 Trp Gly Cys Arg Cys Asn Asp Ser Ser Asp Glu Leu Leu Gly Trp Leu 20 25 30 Trp Gly Ile Asp Ile Asp 35 <210> 106 <211> 24 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> chimera of influenza A and hepatitis B <400> 106 Met Ser Leu Leu Thr Glu Val Glu Thr Pro Ile Arg Asn Glu Trp Gly 1 5 10 15 Cys Arg Cys Asn Asp Ser Ser Asp 20 <210> 107 <211> 27 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> chimera of influenza A and hepatitis B <400> 107 Met Ser Leu Leu Thr Glu Val Glu Thr Pro Ile Arg Asn Glu Trp Gly 1 5 10 15 Cys Arg Cys Asn Asp Ser Ser Asp Glu Leu Asp 20 25 <210> 108 <211> 27 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> chimera of hepatitis B and influenza A <400> 108 Met Ser Leu Leu Thr Glu Val Glu Thr Pro Ile Arg Asn Glu Trp Gly 1 5 10 15 Ser Arg Ser Asn Asp Ser Ser Asp Glu Leu Asp 20 25 <210> 109 <211> 27 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> chimera of influenza A and hepatitis B <400> 109 Met Ser Leu Leu Thr Glu Val Glu Thr Pro Ile Arg Asn Glu Trp Gly 1 5 10 15 Ser Arg Cys Asn Asp Ser Ser Asp Glu Leu Asp 20 25 <210> 110 <211> 27 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> chimera of hepatitis B and influenza A <400> 110 Met Ser Leu Leu Thr Glu Val Glu Thr Pro Ile Arg Asn Glu Trp Gly 1 5 10 15 Cys Arg Ser Asn Asp Ser Ser Asp Glu Leu Asp 20 25 <210> 111 <211> 52 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> chimera of hepatitis B and influenza A <400> 111 Met Ser Leu Leu Thr Glu Val Glu Thr Pro Ile Arg Asn Glu Trp Gly 1 5 10 15 Cys Arg Cys Asn Asp Ser Ser Asp Leu Glu Ser Leu Leu Thr Glu Val 20 25 30 Glu Thr Pro Ile Arg Asn Glu Trp Gly Cys Arg Cys Asn Asp Ser Ser 35 40 45 Asp Glu Leu Asp 50 <210> 112 <211> 52 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> chimera of influenza A and hepatitis B <400> 112 Met Ser Leu Leu Thr Glu Val Glu Thr Pro Ile Arg Asn Glu Trp Gly 1 5 10 15 Ser Arg Ser Asn Asp Ser Ser Asp Leu Glu Ser Leu Leu Thr Glu Val 20 25 30 Glu Thr Pro Ile Arg Asn Glu Trp Gly Cys Arg Cys Asn Asp Ser Ser 35 40 45 Asp Glu Leu Asp 50 <210> 113 <211> 77 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> chimera of hepatitis B and influenza A <400> 113 Met Ser Leu Leu Thr Glu Val Glu Thr Pro Ile Arg Asn Glu Trp Gly 1 5 10 15 Ser Arg Ser Asn Asp Ser Ser Asp Leu Gln Ser Leu Leu Thr Glu Val 20 25 30 Glu Thr Pro Ile Arg Asn Glu Trp Gly Ser Arg Ser Asn Asp Ser Ser 35 40 45 Asp Leu Glu Ser Leu Leu Thr Glu Val Glu Thr Pro Ile Arg Asn Glu 50 55 60 Trp Gly Cys Arg Cys Asn Asp Ser Ser Asp Glu Leu Asp 65 70 75 <210> 114 <211> 66 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Amplification primer containing a restriction endonuclease site <400> 114 gcgaagctta ctaacattga gattcccgag attgagatcg ccggcgacgc ggcgattgag 60 agcgtc 66 <210> 115 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Amplification primer containing a restriction endonuclease site <400> 115 gcgaagctta ctattgagat tcccgagatt ga 32 <210> 116 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Amplification primer containing a restriction endonuclease site <400> 116 ggaaagctta ctaacattga gattcccg 28 <210> 117 <211> 35 <212> PRT <213> Hepatitis B virus <400> 117 Val Arg Arg Arg Gly Arg Ser Pro Arg Arg Arg Thr Pro Ser Pro Arg 1 5 10 15 Arg Arg Arg Ser Gln Ser Pro Arg Arg Arg Arg Ser Gln Ser Arg Glu 20 25 30 Ser Gln Cys 35 <210> 118 <211> 34 <212> PRT <213> Hepatitis B virus <400> 118 Val Arg Arg Arg Gly Arg Ser Pro Arg Arg Arg Thr Pro Ser Pro Arg 1 5 10 15 Arg Arg Arg Ser Gln Ser Pro Arg Arg Arg Arg Ser Gln Ser Arg Glu 20 25 30 Ser Gln <210> 119 <211> 24 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> mutant of hepatitis B <400> 119 Val Arg Arg Arg Gly Arg Ser Pro Arg Arg Arg Thr Pro Ser Pro Arg 1 5 10 15 Arg Arg Arg Ser Gln Ser Pro Cys 20 <210> 120 <211> 23 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> hepatitis B mutant <400> 120 Val Arg Arg Arg Gly Arg Ser Pro Arg Arg Arg Thr Pro Ser Pro Arg 1 5 10 15 Arg Arg Arg Ser Gln Ser Pro 20 <210> 121 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> hepatitis B mutant <400> 121 Val Arg Arg Arg Gly Arg Ser Pro Arg Arg Arg Thr Pro Ser Pro Cys 1 5 10 15 <210> 122 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> hepatitis B mutant <400> 122 Val Arg Arg Arg Gly Arg Ser Pro Arg Arg Arg Thr Pro Ser Pro 1 5 10 15 <210> 123 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> hepatitis B mutant <400> 123 Val Arg Arg Arg Gly Arg Ser Pro Cys 1 5 <210> 124 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> hepatitis B mutant <400> 124 Val Arg Arg Arg Gly Arg Ser Pro 1 5 <210> 125 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> chimer protein N-terminal fusion <400> 125 Met Gly Cys Arg Cys Asn Asp Ser Ser 1 5 <210> 126 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> N-terminal fusion protein <400> 126 Met Gly Ser Arg Ser Asn Asp Ser Ser 1 5 <210> 127 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> N-terminal fusion protein <400> 127 Met Gly Ser Arg Cys Asn Asp Ser Ser 1 5 <210> 128 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> N-terminal fusion protein <400> 128 Met Gly Cys Arg Ser Asn Asp Ser Ser 1 5 <210> 129 <211> 20 <212> PRT <213> P. falciparum <400> 129 Asn Ala Asn Pro Asn Val Asp Pro Asn Ala Asn Pro Asn Ala Asn Pro 1 5 10 15 Asn Ala Asn Pro 20 <210> 130 <211> 92 <212> PRT <213> Influenza <400> 130 Ser Leu Leu Thr Glu Val Glu Thr Pro Ile Arg Asn Glu Trp Gly Ser 1 5 10 15 Arg Ser Asn Asp Ser Ser Asp Ser Leu Leu Thr Glu Val Glu Thr Pro 20 25 30 Ile Arg Asn Glu Trp Gly Ser Arg Ser Asn Asp Ser Ser Asp Ser Leu 35 40 45 Leu Thr Glu Val Glu Thr Pro Ile Arg Asn Glu Trp Gly Ser Arg Ser 50 55 60 Asn Asp Ser Ser Asp Ser Leu Leu Thr Glu Val Glu Thr Pro Ile Arg 65 70 75 80 Asn Glu Trp Gly Cys Arg Cys Asn Asp Ser Ser Asp 85 90 <210> 131 <211> 115 <212> PRT <213> Influenza <400> 131 Ser Leu Leu Thr Glu Val Glu Thr Pro Ile Arg Asn Glu Trp Gly Ser 1 5 10 15 Arg Ser Asn Asp Ser Ser Asp Ser Leu Leu Thr Glu Val Glu Thr Pro 20 25 30 Ile Arg Asn Glu Trp Gly Ser Arg Ser Asn Asp Ser Ser Asp Ser Leu 35 40 45 Leu Thr Glu Val Glu Thr Pro Ile Arg Asn Glu Trp Gly Ser Arg Ser 50 55 60 Asn Asp Ser Ser Asp Ser Leu Leu Thr Glu Val Glu Thr Pro Ile Arg 65 70 75 80 Asn Glu Trp Gly Ser Arg Ser Asn Asp Ser Ser Asp Ser Leu Leu Thr 85 90 95 Glu Val Glu Thr Pro Ile Arg Asn Glu Trp Gly Cys Arg Cys Asn Asp 100 105 110 Ser Ser Asp 115 <210> 132 <211> 93 <212> PRT <213> Influenza <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(1) <223> Xaa at position 1 is methionine or absent. If methionine then Xaa in position 2 through 8 are not absent <220> <221> MISC_FEATURE <222> (2)..(2) <223> Xaa at position 2 is serine or absent. If serine then Xaa in position 3 through 8 are not absent. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (3)..(3) <223> Xaa at position 3 is leucine or absent. If leucine then Xaa in position 4 through 8 are not absent. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (4)..(4) <223> Xaa at position 4 is leucine or absent. If leucine then Xaa in position 5 through 8 are not absent. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (5)..(5) <223> Xaa at position 5 is threonine or proline or absent. If threonine then Xaa in position 6 through 8 are not absent. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (6)..(6) <223> Xaa at position 6 is glutamic acid or absent. If glutamic acid then Xaa in position 7 through 8 are not absent. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (7)..(7) <223> Xaa at position 7 is valine or absent. If valine then Xaa in position 8 is not absent. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (8)..(8) <223> Xaa at position 8 is glutamic acid or aspartic acid or absent. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (9)..(9) <223> Xaa at position 8 is glutamic acid or absent. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (10)..(10) <223> Xaa at position 10 is proline, leucine or histidine. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (11)..(11) <223> Xaa at position 11 is isoleucine or threonine. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (12)..(12) <223> Xaa at position 12 is arginine or lysine. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (13)..(13) <223> Xaa at position 13 is asparagine or serine. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (14)..(14) <223> Xaa at position 14 is glutamic acid or glycine. <220> <221> misc_feature <222> (15)..(15) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (16)..(16) <223> Xaa at position 16 is glycine, glutamic acid or absent. If glycine or glutamic acid then Xaa in position 16 is not absent. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (17)..(17) <223> Xaa at position 17 is absent or present, if present Xaa in position 17 is cysteine, serine or alanine. If Xaa in position 17 is present then positions 15 through 16 are not absent. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (18)..(18) <223> Xaa at position 18 arginine, lysine or absent. If arginine or lysine then Xaa in positions 15 through 17 are not absent. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (19)..(19) <223> Xaa at position 19 is absent or present, if present Xaa in position 19 is cysteine, serine or alanine. If Xaa is position 19 is present then positions 15 through 18 are not absent. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (20)..(20) <223> Xaa at position 20 is asparagine, serine, glycine or absent. If asparagine or serine or glycine then Xaa is positions 15 through 19 are not absent. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (21)..(21) <223> Xaa at position 21 is aspartic acid, glycine or absent. If aspartic acid or glycine then Xaa is positions 15 through 20 are not absent. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (22)..(22) <223> Xaa at position 22 is serine or absent. If serine then Xaa is positions 15 through 21 are not absent. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (23)..(23) <223> Xaa at position 23 is serine or absent. If serine then Xaa is positions 15 through 22 are not absent. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (24)..(24) <223> Xaa at position 24 is aspartic acid or absent. If aspartic acid then Xaa is positions 15 through 23 are not absent. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (25)..(25) <223> Xaa at position 25 is serine or absent. If serine then Xaa in positions 26 through 31 are not absent. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (26)..(26) <223> Xaa at position 26 is leucine or absent. If leucine then Xaa in positions 27 through 31 are not absent. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (27)..(27) <223> Xaa at position 27 is leucine or absent. If leucine then Xaa in positions 28 through 31 are not absent. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (28)..(28) <223> Xaa at position 28 is threonine, proline or absent. If threonine or proline then Xaa in positions 29 through 31 are not absent. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (29)..(29) <223> Xaa at position 29 is glutamic acid or absent. If glutamic acid then Xaa in positions 30 through 31 are not absent. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (30)..(30) <223> Xaa at position 30 is valine or absent. If valine then Xaa in position 31 is not absent. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (31)..(31) <223> Xaa at position 31 is glutamic acid or aspartic acid or absent. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (33)..(33) <223> Xaa at position 33 is proline, leucine or histidine. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (34)..(34) <223> Xaa at position 34 is isoleucine or threonine <220> <221> MISC_FEATURE <222> (35)..(35) <223> Xaa at position 35 is arginine or lysine. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (36)..(36) <223> Xaa at position 36 is asparagine or serine. <220> <221> misc_feature <222> (37)..(37) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (38)..(38) <223> Xaa at position 38 is tryptophan or absent. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (39)..(39) <223> Xaa at position 39 is glycine, glutamic acid or absent. If glycine or glutamic acid then Xaa in position 38 is not absent. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (40)..(40) <223> Xaa at position 40 is absent of present, if present Xaa in position 40 is cysteine, serine or alanine. If Xaa in position 40 is present then positions 38 through 39 are not absent. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (41)..(41) <223> Xaa at position 41 is arginine, lysine or absent. If arginine or lysine than Xaa in positions 38 through 40 are not absent. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (42)..(42) <223> Xaa at position 42 is absent or present, if present Xaa in position 42 is cysteine, serine or alanine. If Xaa in position 42 is present then positions 38 through 41 are not absent. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (43)..(43) <223> Xaa at position 43 is asparagine, serine, glycine or absent. If asparagine or serine or glycine then Xaa in positions 38 through 42 are not absent. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (44)..(44) <223> Xaa at position 44 is aspartic acid, glycine or absent. If aspartic acid or glycine then Xaa in positions 38 through 43 are not absent. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (45)..(45) <223> Xaa at position 45 is serine or absent. If serine then Xaa in positions 38 through 44 are not absent. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (46)..(46) <223> Xaa at position 46 is serine or absent. If serine then Xaa in positions 38 through 45 are not absent. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (47)..(47) <223> Xaa at position 47 is aspartic acid or absent. If aspartic acid then Xaa in positions 38 through 46 are not absent. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (48)..(48) <223> Xaa at position 48 is serine or absent. If serine then Xaa in positions 49 through 54 are not absent. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (49)..(49) <223> Xaa at position 49 is leucine or absent. If leucine then Xaa in positions 50 through 54 are not absent. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (50)..(50) <223> Xaa at position 50 is leucine or absent. If leucine then Xaa in positions 51 through 54 are not absent. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (51)..(51) <223> Xaa at position 51 is threonine, proline or absent. If threonine or proline then Xaa in positions 52 through 54 are not absent. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (52)..(52) <223> Xaa at position 52 is glutamic acid or absent. If glutamic acid then Xaa in positions 53 through 54 are not absent. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (53)..(53) <223> Xaa at position 53 is valine or absent. If valine then Xaa in position 54 is not absent. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (54)..(54) <223> Xaa at position 54 is glutamic acid or aspartic acid or absent <220> <221> MISC_FEATURE <222> (56)..(56) <223> Xaa at position 56 is proline, leucine or histidine. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (57)..(57) <223> Xaa at position 57 is isoleucine or threonine. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (58)..(58) <223> Xaa at position 58 is arginine or lysine. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (59)..(59) <223> Xaa at position 59 is asparagine or serine. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (60)..(60) <223> Xaa at position 60 is glumatic acid or glycine. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (61)..(61) <223> Xaa at position 61 is tryptophan or absent. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (62)..(62) <223> Xaa at position 62 is glycine, glutamic acid or absent. If glycine or glutamic acid then Xaa in position 61 is not absent. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (63)..(63) <223> Xaa at position 63 is absent of present, if present Xaa in position 63 is cysteine, serine or alanine. If Xaa in position 63 is present then positions 61 through 62 are not absent. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (64)..(64) <223> Xaa at position 64 is arginine, lysine or absent. If arginine or lysine than Xaa in positions 61 through 63 are not absent. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (65)..(65) <223> Xaa at position 65 is absent or present, if present Xaa in position 65 is cysteine, serine or alanine. If Xaa in position 65 is present then positions 61 through 64 are not absent. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (66)..(66) <223> Xaa at position 66 is asparagine, serine, glycine or absent. If asparagine or serine or glycine then Xaa in positions 61 through 65 are not absent. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (67)..(67) <223> Xaa at position 67 is aspartic acid, glycine or absent. If aspartic acid or glycine then Xaa in positions 61 through 66 are not absent. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (68)..(68) <223> Xaa at position 68 is serine or absent. If serine then Xaa in positions 61 through 67 are not absent. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (69)..(69) <223> Xaa at position 69 is serine or absent. If serine then Xaa in positions 61 through 68 are not absent. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (70)..(70) <223> Xaa at position 70 is aspartic acid or absent. If aspartic acid then Xaa in positions 61 through 69 are not absent. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (71)..(71) <223> Xaa at position 71 is serine or absent. If serine then Xaa in positions 72 through 77 are not absent. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (72)..(72) <223> Xaa at position 72 is leucine or absent. If leucine then Xaa in positions 73 through 77 are not absent. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (73)..(73) <223> Xaa at position 73 is leucine or absent. If leucine then Xaa in positions 74 through 77 are not absent. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (74)..(74) <223> Xaa at position 74 is threonine, proline or absent. If threonine or proline then Xaa in positions 75 through 77 are not absent. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (75)..(75) <223> Xaa at position 75 is glutamic acid or absent. If glutamic acid then Xaa in positions 76 through 77 are not absent. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (76)..(76) <223> Xaa at position 76 is valine or absent. If valine then Xaa in position 77 is not absent. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (77)..(77) <223> Xaa at position 77 is glutamic acid or aspartic acid or absent <220> <221> MISC_FEATURE <222> (79)..(79) <223> Xaa at position 79 is proline, leucine or histidine. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (80)..(80) <223> Xaa at position 80 is isoleucine or threonine. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (81)..(81) <223> Xaa at position 81 is arginine or lysine. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (82)..(82) <223> Xaa at position 82 is asparagine or serine. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (83)..(83) <223> Xaa at position 83 is glumatic acid or glycine. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (84)..(84) <223> Xaa at position 84 is tryptophan or absent. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (85)..(85) <223> Xaa at position 85 is glycine, glutamic acid or absent. If glycine or glutamic acid then Xaa in position 84 is not absent. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (86)..(86) <223> Xaa at position 86 is absent of present, if present Xaa in position 86 is cysteine, serine or alanine. If Xaa in position 86 is present then positions 84 through 85 are not absent. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (87)..(87) <223> Xaa at position 87 is arginine, lysine or absent. If arginine or lysine than Xaa in positions 84 through 86 are not absent. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (88)..(88) <223> Xaa at position 88 is absent or present, if present Xaa in position 88 is cysteine, serine or alanine. If Xaa in position 88 is present then positions 84 through 87 are not absent. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (89)..(89) <223> Xaa at position 89 is asparagine, serine, glycine or absent. If asparagine or serine or glycine then Xaa in positions 84 through 88 are not absent. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (90)..(90) <223> Xaa at position 90 is aspartic acid, glycine or absent. If aspartic acid or glycine then Xaa in positions 84 through 89 are not absent. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (91)..(91) <223> Xaa at position 91 is serine or absent. If serine then Xaa in positions 84 through 90 are not absent. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (92)..(92) <223> Xaa at position 92 is serine or absent. If serine then Xaa in positions 84 through 91 are not absent. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (93)..(93) <223> Xaa at position 93 is aspartic acid or absent. If aspartic acid then Xaa in positions 84 through 92 are not absent. <400> 132 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Thr Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 1 5 10 15 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Thr 20 25 30 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 35 40 45 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Thr Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 50 55 60 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Thr Xaa Xaa 65 70 75 80 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 85 90 <210> 133 <211> 93 <212> PRT <213> Influenza <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(1) <223> Xaa at position 1 is methionine or absent. If methionine then Xaa in positions 2 through 8 are not absent <220> <221> MISC_FEATURE <222> (2)..(2) <223> Xaa at position 2 is serine or absent. If serine then Xaa in positions 3 through 8 are not absent <220> <221> MISC_FEATURE <222> (3)..(3) <223> Xaa at position 3 is leucine or absent. If leucine then Xaa in positions 4 through 8 are not absent. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (4)..(4) <223> Xaa at position 4 is leucine or absent. If leucine then Xaa in positions 5 through 8 are not absent. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (5)..(5) <223> Xaa at position 5 is threonine or absent. If threonine than Xaa in positions 6 through 8 are not absent. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (6)..(6) <223> Xaa at position 6 is glutamic acid or absent. If glutamic acid then Xaa in positions 7 through 8 are not absent. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (7)..(7) <223> Xaa at position 7 is valine or absent. If valine then Xaa in position 8 is not absent. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (8)..(8) <223> Xaa at position 8 is glutamic acid or absent. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (15)..(15) <223> Xaa at position 15 is tryptophan or absent. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (16)..(16) <223> Xaa at position 16 is glycine or absent. If glycine then Xaa in position 15 is not absent. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (17)..(17) <223> Xaa at position 17 is absent or present, if present Xaa in position 17 is cysteine, serine, or alanine. If Xaa in position 17 is present then positions 15 through 16 are not absent. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (18)..(18) <223> Xaa at position 18 is arginine or absent. If arginine then Xaa in positions 15 through 17 are not absent. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (19)..(19) <223> Xaa at position 19 is absent or present, if present Xaa in position 19 is cysteine, serine or alanine. If Xaa in position 19 is present then positions 15 through 18 are not absent. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (20)..(20) <223> Xaa at position 20 is asparagine or absent. If asparagine then Xaa in positions 15 through 19 are not absent. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (21)..(21) <223> Xaa at position 21 is aspartic acid or absent. If aspartic acid then Xaa in positions 15 through 20 are not absent. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (22)..(22) <223> Xaa at position 22 is serine or absent. If serine then Xaa in positions 15 through 21 are not absent. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (23)..(23) <223> Xaa at position 23 is serine or absent. If serine then Xaa in positions 15 through 22 are not absent. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (24)..(24) <223> Xaa at position 24 is aspartic acid or absent. If aspartic acid then Xaa in positions 15 through 23 are not absent. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (25)..(25) <223> Xaa at position 25 is serine or absent. If serine then Xaa in positions 26 through 31 are not absent <220> <221> MISC_FEATURE <222> (26)..(26) <223> Xaa at position 26 is leucine or absent. If serine then Xaa in positions 27 through 31 are not absent <220> <221> MISC_FEATURE <222> (27)..(27) <223> Xaa at position 27 is leucine or absent. If leucine then Xaa in positions 28 through 31 are not absent. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (28)..(28) <223> Xaa at position 28 is threonine or absent. If threonine than Xaa in positions 29 through 31 are not absent. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (29)..(29) <223> Xaa at position 29 is glutamic acid or absent. If glutamic acid then Xaa in positions 30 through 31 are not absent. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (30)..(30) <223> Xaa at position 30 is valine or absent. If valine then Xaa in position 31 is not absent. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (31)..(31) <223> Xaa at position 31 is glutamic acid or absent. . <220> <221> MISC_FEATURE <222> (32)..(32) <223> Xaa at position 38 is tryptophan or absent. <220> <221> misc_feature <222> (38)..(38) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (39)..(39) <223> Xaa at position 39 is glycine or absent. If glycine then Xaa in position 38 is not absent. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (40)..(40) <223> Xaa at position 40 is absent or present, if present Xaa in position 40 is cysteine, serine or alanine. If Xaa in position 40 is present then positions 38 through 39 are not absent. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (41)..(41) <223> Xaa at position 41 is arginine or absent. If arginine then Xaa in positions 38 through 40 are not absent <220> <221> MISC_FEATURE <222> (42)..(42) <223> Xaa at position 42 is absent or present, if present Xaa in position 42 is cysteine, serine or alanine. If Xaa in position 42 is present then positions 38 through 41 are not absent. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (43)..(43) <223> Xaa at position 43 is asparagine or absent. If asparagine then Xaa in positions 38 through 42 are not absent. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (44)..(44) <223> Xaa at position 44 is aspartic acid or absent. If aspartic acid then Xaa in positions 38 through 43 are not absent. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (45)..(45) <223> Xaa at position 45 is serine or absent. If serine then Xaa in positions 38 through 44 are not absent. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (46)..(46) <223> Xaa at position 46 is serine or absent. If serine then Xaa in positions 38 through 45 are not absent. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (47)..(47) <223> Xaa at position 47 is aspartic acid or absent. If aspartic acid then Xaa in positions 38 through 46 are not absent. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (48)..(48) <223> Xaa at position 48 is serine or absent. If serine then Xaa in positions 49 through 54 are not absent. <220> <221> misc_feature <222> (49)..(49) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (50)..(50) <223> Xaa at position 50 is leucine or absent. If leucine then Xaa in positions 51 through 54 are not absent. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (51)..(51) <223> Xaa at position 51 is threonine or absent. If threonine than Xaa in positions 52 through 54 are not absent. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (52)..(52) <223> Xaa at position 52 is glutamic acid or absent. If glutamic acid then Xaa in positions 53 through 54 are not absent. <220> <221> misc_feature <222> (53)..(53) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (54)..(54) <223> Xaa at position 54 is glutamic acid or absent <220> <221> MISC_FEATURE <222> (61)..(61) <223> Xaa at position 61 is tryptophan or absent. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (62)..(62) <223> Xaa at position 62 is glycine or absent. If glycine then Xaa in position 61 is not absent. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (63)..(63) <223> Xaa at position 63 is absent or present, if present Xaa in position 63 is cysteine, serine or alanine. If Xaa in position 63 is present then positions 61 through 62 are not absent. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (64)..(64) <223> Xaa at position 64 is arginine or absent. If arginine then Xaa in positions 61 through 63 are not absent <220> <221> MISC_FEATURE <222> (65)..(65) <223> Xaa at position 65 is absent or present, if present Xaa in position 65 is cysteine, serine or alanine. If Xaa in position 65 is present then positions 61 through 64 are not absent. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (66)..(66) <223> Xaa at position 66 is asparagine or absent. If asparagine then Xaa in positions 61 through 65 are not absent. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (67)..(67) <223> Xaa at position 67 is aspartic acid or absent. If aspartic acid then Xaa in positions 61 through 66 are not absent. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (68)..(68) <223> Xaa at position 68 is serine or absent. If serine then Xaa in positions 61 through 67 are not absent. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (69)..(69) <223> Xaa at position 69 is serine or absent. If serine then Xaa in positions 61 through 68 are not absent. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (70)..(70) <223> Xaa at position 70 is aspartic acid or absent. If aspartic acid then Xaa in positions 61 through 69 are not absent. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (71)..(71) <223> Xaa at position 71 is serine or absent. If serine then Xaa in positions 72 through 77 are not absent <220> <221> MISC_FEATURE <222> (72)..(72) <223> Xaa at position 72 is leucine or absent. If serine then Xaa in positions 73 through 77 are not absent <220> <221> MISC_FEATURE <222> (73)..(73) <223> Xaa at position 73 is leucine or absent. If leucine then Xaa in positions 74 through 77 are not absent. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (74)..(74) <223> Xaa at position 74 is threonine or absent. If threonine than Xaa in positions 75 through 77 are not absent. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (75)..(75) <223> Xaa at position 75 is glutamic acid or absent. If glutamic acid than Xaa in positions 76 through 77 are not absent. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (76)..(76) <223> Xaa at position 76 is valine or absent. If valine then Xaa in position 77 is not absent. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (77)..(77) <223> Xaa at position 77 is glutamic acid or absent. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (84)..(84) <223> Xaa at position 84 is tryptophan or absent. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (85)..(85) <223> Xaa at position 85 is glycine or absent. If glycine then Xaa in position 84 is not absent. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (86)..(86) <223> Xaa at position 86 is absent or present, if present Xaa in position 86 is cysteine, serine or alanine. If Xaa in position 86 is present then positions 84 through 85 are not absent. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (87)..(87) <223> Xaa at position 87 is arginine or absent. If arginine then Xaa in positions 84 through 86 are not absent <220> <221> MISC_FEATURE <222> (88)..(88) <223> Xaa at position 88 is absent or present, if present Xaa in position 88 is cysteine, serine or alanine. If Xaa in position 88 is present then positions 84 through 87 are not absent. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (89)..(89) <223> Xaa at position 89 is asparagine or absent. If asparagine then Xaa in positions 84 through 88 are not absent. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (90)..(90) <223> Xaa at position 90 is aspartic acid or absent. If aspartic acid then Xaa in positions 84 through 89 are not absent. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (91)..(91) <223> Xaa at position 91 is serine or absent. If serine then Xaa in positions 84 through 90are not absent. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (92)..(92) <223> Xaa at position 92 is serine or absent. If serine then Xaa in positions 84 through 91 are not absent. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (93)..(93) <223> Xaa at position 93 is aspartic acid or absent. If aspartic acid then Xaa in positions 84 through 92 are not absent. <400> 133 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Thr Pro Ile Arg Asn Glu Xaa Xaa 1 5 10 15 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Thr 20 25 30 Pro Ile Arg Asn Glu Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 35 40 45 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Thr Pro Ile Arg Asn Glu Xaa Xaa Xaa Xaa 50 55 60 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Thr Pro Ile 65 70 75 80 Arg Asn Glu Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 85 90 <210> 134 <211> 23 <212> PRT <213> Influenza <400> 134 Ser Leu Leu Thr Glu Val Glu Thr Pro Thr Arg Asn Glu Trp Gly Cys 1 5 10 15 Arg Cys Asn Asp Ser Ser Asp 20 <210> 135 <211> 23 <212> PRT <213> Influenza <400> 135 Ser Leu Leu Thr Glu Val Glu Thr Pro Thr Arg Asn Gly Trp Gly Cys 1 5 10 15 Arg Cys Asn Asp Ser Ser Asp 20 <210> 136 <211> 23 <212> PRT <213> Influenza <400> 136 Ser Leu Leu Thr Glu Val Glu Thr Pro Ile Arg Asn Glu Trp Glu Cys 1 5 10 15 Arg Cys Asn Gly Ser Ser Asp 20 <210> 137 <211> 23 <212> PRT <213> Influenza <400> 137 Ser Leu Leu Thr Glu Val Glu Thr Pro Thr Lys Asn Glu Trp Glu Cys 1 5 10 15 Arg Cys Asn Asp Ser Ser Asp 20 <210> 138 <211> 23 <212> PRT <213> Influenza <400> 138 Ser Leu Leu Thr Glu Val Glu Thr Pro Thr Arg Asn Gly Trp Glu Cys 1 5 10 15 Lys Cys Ser Asp Ser Ser Asp 20 <210> 139 <211> 23 <212> PRT <213> Influenza <400> 139 Ser Leu Leu Thr Glu Val Asp Thr Leu Thr Arg Asn Gly Trp Gly Cys 1 5 10 15 Arg Cys Ser Asp Ser Ser Asp 20 <210> 140 <211> 23 <212> PRT <213> Influenza <400> 140 Ser Leu Leu Thr Glu Val Glu Thr Leu Thr Arg Asn Gly Trp Glu Cys 1 5 10 15 Lys Cys Arg Asp Ser Ser Asp 20

Claims (53)

  1. (a) (i) 서열이 적어도 B형 간염 바이러스 코어(hepatitis B virus core; HBc)의 4번 위치 내지 75번 위치의 잔기의 서열을 포함하는 75개 내지 160개의 아미노산 잔기, (ii) 서열번호 1의 HBc의 N-말단에 대하여 1번 내지 -55번의 키메라 분자내 위치에 존재하는 1개 내지 3개의 시스테인 잔기 [N-말단 시스테인 잔기] (하나 이상의 상기 N-말단 시스테인 잔기는 HBc의 프리-코어 서열 이외의 서열내에 존재한다) 및 (iii) HBc 서열의 N-말단의 15개의 잔기에 펩타이드 결합되어 있거나 그 내부에 있는 서열번호 10의 A형 인플루엔자 M2 폴리펩타이드의 6개 내지 24개 잔기의 서열 2개 내지 4개를 포함하는 도메인 I;
    (b) 75번 잔기에 펩타이드 결합된 0개 내지 60개의 아미노산 잔기를 포함하며, 여기서 (i) HBc의 서열의 76번 위치 내지 85번 위치의 서열이 0개 내지 모두 존재하고, (ii) 서열번호 10의 A형 인플루엔자 M2 폴리펩타이드의 6개 내지 24개의 잔기의 반복체 하나 이상을 구성하는 6개 내지 48개의 잔기의 임의의 서열을 포함하는 도메인 II;
    (c) 85번 잔기에 펩타이드 결합된 86번 위치 내지 135번 위치의 HBc 서열인 도메인 III; 및
    (d) (i) 도메인 III의 135번 위치의 잔기에 펩타이드 결합된, HBc 아미노산 잔기 서열의 136번 위치 내지 140번 위치의 잔기와 141번 위치 내지 156번 위치의 16개 이하의 잔기, (ii) 0개 내지 3개의 시스테인 잔기 및 (iii) 156번 위치에서 HBc C-말단까지의, HBc에 이종성인 서열의 100개 이하의 아미노산 잔기를 포함하는 도메인 IV로 명명된 N-말단으로부터의 펩타이드-연결된 아미노산 잔기 서열 도메인 4개를 포함하는 키메라 분자로서,
    당해 키메라는 숙주 세포 내에서 발현시 핵산에 결합하지 않는 입자로 자가 조립되며, 당해 입자는 상기 N-말단 시스테인 잔기가 결여되었거나 키메라 분자내에 존재하는 상기 N-말단 시스테인 잔기가 다른 잔기로 치환되었다는 점 이외에는 동일한 HBc 키메라로부터 형성된 입자보다 형성시 더욱 안정한 입자인,
    150개 내지 375개의 아미노산 잔기의 길이를 갖는 재조합 B형 간염 바이러스 코어(HBc) 단백질 키메라 분자.
  2. 제1항에 있어서, 서열번호 10의 M2 폴리펩타이드들 중 하나의 잔기 X17 및 X19 중 1개가 시스테인인 재조합 HBc 단백질 키메라 분자.
  3. 제1항에 있어서, 서열번호 10의 M2 폴리펩타이드들 중 하나의 잔기 X17 및 X19가 세린 또는 알라닌인 재조합 HBc 단백질 키메라 분자.
  4. 제1항에 있어서, 서열번호 10의 M2 폴리펩타이드들이 잔기 X2 내지 X24를 포함하는 재조합 HBc 단백질 키메라 분자.
  5. 제1항에 있어서, 서열번호 10의 M2 폴리펩타이드들 중 하나의 잔기 X17 및 X19 두 개가 시스테인인 재조합 HBc 단백질 키메라 분자.
  6. 제1항에 있어서, 도메인 I이 2번 위치 내지 75번 위치의 HBc 서열을 포함하는 재조합 HBc 단백질 키메라 분자.
  7. 제1항에 있어서, 도메인 IV가 시스테인 잔기를 포함하지 않는 재조합 HBc 단백질 키메라 분자.
  8. 제1항에 있어서, 도메인 IV가 156번 위치에서 HBc C-말단까지의, HBc에 이종성인 서열을 함유하지 않는 재조합 HBc 단백질 키메라 분자.
  9. 제1항에 있어서, 도메인 IV가 140번 잔기에 펩타이드 결합된 141번 잔기 위치에서 149번 위치까지의 HBc 서열의 9개의 아미노산 잔기의 서열을 포함하는 재조합 HBc 단백질 키메라 분자.
  10. 제1항에 있어서, 도메인 I이 하나의 N-말단 시스테인 잔기를 포함하는 재조합 HBc 단백질 키메라 분자.
  11. 제1항에 있어서, 도메인 IV가 하나의 C-말단 시스테인 잔기를 포함하는 재조합 HBc 단백질 키메라 분자.
  12. 제1항에 있어서, 도메인 I이 M2 폴리펩타이드 서열 3개를 포함하는 재조합 HBc 단백질 키메라 분자.
  13. 제1항에 있어서, 도메인 I이 M2 폴리펩타이드 2개를 포함하는 재조합 HBc 단백질 키메라 분자.
  14. 제1항에 있어서, 도메인 II가 76번 위치 내지 85번 위치의 HBc의 서열의 아미노산 잔기를 포함하는 재조합 HBc 단백질 키메라 분자.
  15. 제9항에 있어서, 서열번호 10의 M2 폴리펩타이드들 중 하나의 잔기 X17 및 X19 중 하나가 시스테인인 재조합 HBc 단백질 키메라 분자.
  16. 제9항에 있어서, 170 내지 215개의 잔기의 길이를 갖는 재조합 HBc 단백질 키메라 분자.
  17. 삭제
  18. 삭제
  19. 삭제
  20. 삭제
  21. 삭제
  22. 삭제
  23. 제1항에 있어서, 서열번호 10의 M2 폴리펩타이드가 잔기 X6 내지 X24를 포함하는 재조합 HBc 단백질 키메라 분자.
  24. 삭제
  25. 제1항에 있어서, 도메인 II가 서열번호 10의 A형 인플루엔자 M2 폴리펩타이드의 6개 내지 23개의 잔기를 추가로 포함하는 76번 위치 내지 85번 위치의 HBc 서열의 아미노산 잔기를 포함하는 재조합 HBc 단백질 키메라 분자.
  26. 삭제
  27. 삭제
  28. 제1항에 따르는 재조합 B형 간염 바이러스 코어(HBc) 단백질 키메라 분자로 구성되는 입자.
  29. 제28항에 있어서, 서열번호 10의 A형 인플루엔자 M2 폴리펩타이드의 C-말단 19개의 잔기를 포함하는, 재조합 B형 간염 바이러스 코어(HBc) 단백질 키메라 분자로 구성되는 입자.
  30. 삭제
  31. 삭제
  32. 약제학적으로 허용되는 희석제에 용해 또는 분산된, 제28항에 따르는 면역학적 유효량의 면역원성 입자를 포함하는 면역원성 조성물.
  33. 삭제
  34. 제32항에 있어서, 재조합 키메라 HBc 단백질 분자 입자가 식물 조직 내에 존재하는 면역원성 조성물.
  35. 제32항에 있어서, 보조제를 추가로 포함하는 면역원성 조성물.
  36. 제35항에 있어서, 보조제가 백반인 면역원성 조성물.
  37. 제35항에 있어서, 보조제가 무라밀 디펩타이드, 7-치환된-8-옥소- 또는 8-설포-구아노신 유도체, 모노포스포릴 지질 A, 알루미늄염 또는 칼슘염으로 이루어진 그룹 중에서 선택된 소분자인 면역원성 조성물.
  38. 제35항에 있어서, 보조제가 면역원성 입자 및 약제학적으로 허용되는 희석제로 유화된 오일인 면역원성 조성물.
  39. 제38항에 있어서, 에멀젼이 수성 상 및 오일 상을 갖는 유중수 에멀젼인 면역원성 조성물.
  40. 제38항에 있어서, 에멀젼이 수성 상 및 오일 상을 갖는 수중유 에멀젼인 면역원성 조성물.
  41. 제40항에 있어서, 에멀젼의 오일 상이 스쿠알렌 또는 스쿠알란을 포함하는 면역원성 조성물.
  42. 삭제
  43. 제38항에 있어서, 에멀젼의 수성 상 및 오일 상이 소르비탄 또는 만니드 C12-C24 지방산 에스테르인 유화제로 유화되는 면역원성 조성물.
  44. 삭제
  45. 삭제
  46. 제1항에 따르는 재조합 HBc 단백질 분자 또는 이의 상보체를 암호화하는 핵산.
  47. 삭제
  48. 제1항에 따르는 재조합 HBc 단백질 분자를 암호화하는 유전자를 정의하는 핵산 단편 또는 이의 상보체, 및 적합한 숙주 유기체에서의 당해 유전자 발현을 유도하기에 적합한 프로모터에 작동적으로 연결된 벡터를 포함하는 재조합 핵산 분자.
  49. 삭제
  50. 제48항에 따르는 재조합 핵산 분자로 형질전환된 숙주 세포.
  51. 제50항에 있어서, 숙주 세포가 이. 콜라이(E. coli), 에스. 타이피(S. typhi), 에스. 티피무리움(S. typhimurium) 및 에스. 티피무리움-이. 콜라이 하이브리드로 이루어진 그룹 중에서 선택된, 형질전환된 숙주 세포.
  52. 삭제
  53. 삭제
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