HU217420B - Új immunogén polipeptidek, ezeket tartalmazó vakcina, és eljárás a fenti anyagok előállítására és felhasználására - Google Patents

Abstract

A találmány tárgya (1) aminősavszekvenciájú, imműnőgén pőlipeptidMAKSMLSGIVFAGLVAAAAA SSANSAANVSVLESGPAVQE VPARTVTARLAKPLLLLSALAATLAAAFLVLQCFNIISSN NQQTSVRRLAAGGACGDEED ADEGTSQQASRRRRKPDTPAADKYDFVGGTPVSVTEPNVD EVLIQIRNKQIFLKNPWTGQ(1) EEQVLVLERQSEEPILIVARTRQTLEGYLGSQALAQDGKT AKEEKVEGGKTHRRYKVKSS DPGYGFPYTTVLDGVPVGTDEDGYVVEVLMKTGPHGGVDM MTSTASQGKFCGVLMDDGKG NLVDGQGRKITAVIGMLTQPDTEFRSGPGDDEDDE (SEQ ID NO: 1) és imműnőgén fragmensei, amelyek azEimeria parazitákkal szemben imműnválaszt képesek indűkálni ésmentesek az Eimeria paraziták által termelt egyéb prőteinektől,mimellett a fenti aminősavszekvencia 1–183 helyzetűaminősavszekvenciáját vagy annak részleges szekvenciáját tartalmazófragmensek az alábbi specifikűs fragmensek kivételével ki vannakzárva: SNNQQTSV (2) (SEQ ID NO: 3), CGDEEDADEGTSQQASRRRRKPDTPAADK (3) (SEQ ID NO: 4). PNV (4) (SEQ ID NO: 5), RNKQIF (5) (SEQ ID NO: 6), NPWTGQEE (6) (SEQ ID NO: 7), RQSEE (7) (SEQ ID NO: 8), TRQTLE (8) (SEQ ID NO: 9), QDGKTAKEEKVEGGKTHRRYKVKSSDPGYG (9) (SEQ ID NO: 10), TDEDG (1) (SEQ ID NO: 11), TGPHG (11) (SEQ ID NO: 12), ASQGK (12) (SEQ ID NO: 13), DDGKGNLVDGQGRK (13) (SEQ ID NO: 14), vagy TQPDTEFRSGPGDDEDDE (14) (SEQ ID NO: 15). Ez a pőlipeptid az Eimeriaparazitákkal szembeni imműnválasz indűkálására képes. A DNS a fentipőlipeptideket kódőlja. A találmány tővábbá a fenti pőlipeptidelőállítási eljárására vőnatkőzik. A találmány szerinti pőlipeptidkőkcidiózis elleni védettség kialakítása céljából beadható tisztapőlipeptidként vagy a pőlipeptidet kódőló, DNS-t tartalmazó, alkalmasvírűsvektőr mint vírűsvakcina főrmájában. ŕ

Description

Ez a találmány az Eimeria protozoa paraziták egy új antigénjére vonatkozik. Ez az antigén többféle módon beadva használható baromfi kokcidiózis elleni védelmére.

A találmány tárgya közelebbről új immunogén polipeptidek, ezeket tartalmazó vakcina és eljárás a fenti anyagok előállítására és felhasználására.

A kokcidiózis egy baromfibetegség, melyet az Eimeria nemzetségbe tartozó intracelluláris protozoa paraziták okoznak. A betegség helyi járványokat okoz (eudémiás) nagy baromfitenyészetekben. A betegség kemoterápiás kontrolljának felbecsült költségei csak az Amerikai Egyesült Államokban elérik az évi 100 millió dollárt. Az ismert kokcidiózissal szembeni gyógyszerek ellen kifejlődő rezisztencia szükségessé teszi további új ágensek folyamatos fejlesztését, miközben egyidejűleg a gyógyszerkutatások egyre növekvő mértékben drágulnak, és az állati táplálékokban elfogadott gyógyszermaradványok alsó határa egyre csökken.

A természetes kokcidiózisfertőzés elleni védő immunitást megfelelő szakirodalomban már leírták. Kisszámú életképes cocysta néhány hétig tartó ellenőrzött napi beadása bizonyítottan teljes immunitáshoz vezet egy normál virulens dózis által okozott fertőzéssel szemben [Rose et al.: Parasitology 73:25 (1976); Rose et al.: Parasitology 88:199 (1984)]. A fertőzés ellen szerzett rezisztencia példája felveti egy vakcina kidolgozásának lehetőségét, amely fiatal csirkékben immunitást fejleszt ki, szükségtelenné téve ezzel a kémiai coccidiostatikumokat. Tulajdonképpen egy ilyen elmélet eredményeként született a Sterwin Laboratóriumok, Opelika, AL által előállított „Coccivac” készítmény.

Kokcidiózisvakcina előállításának céljából, Murray és társai: a 167 443 számú európai közrebocsátási irat szerint sporozoitákból vagy Eimeria tenella sporulázott oocystáiból kivonatokat készítettek, melyek legalább 15 polipeptidet tartalmaztak, nagyrészt a sporozoitok felszínéhez kötötten. Ezeknek a kivonatoknak csirkékbe történő befecskendezése lecsökkentette a virulens E. tenella spórás cocysták szájon keresztüli beadását követő vakbélbántalmakat.

Még újabban Schenkel et al.: a 4650676 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírásban (a továbbiakban: „Schenkel-szabadalom”) E. tenella merozoitok elleni monoklonális antitestek előállítását ismertették. Ezeknek az antitesteknek a felhasználásával a fenti szabadalmi leírás szerint bizonyos számú antigént azonosítottak, amelyek ellen az antitestek irányultak. Ezekkel az antitestekkel előinkubált E. tenella sporozoitok csirke vakbelébe való bejuttatásával Schenkel és társai a vakbélbántalmakkal járó esetek csökkenését tudták kimutatni a kezeletlen sporozoitkontrollokkal szemben. A 4650676 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírásban ismertetett, úgynevezett Schenkelfehéije különbözik a találmányunk szerinti polipeptidtől. A Schenkel-fehéije molekulatömege 18 kilodalton, tehát jelentősen kisebb a találmányunk szerinti polipeptideknél. Ezenkívül a Schenkel-fehérjéhez kötődő monoklonális antitestek a találmányunk szerinti polipeptidekhez nem kötődnek.

Rekombináns DNS-technikával Newman és társai (164176 számú európai közrebocsátási irat) egy sporozoitstádiumból való gént klónoztak, amely Eimeria tenellából származó, 25 000 daltonos antigént kódol. Elölt E. tenella sporozoitokkal ismételten immunizált csirkék szérumával kicsapták ezt az antigént jódozott sporocysta- és sporozoitmembrán-preparátumokból. Még újabban Jenkins [Nucleic Acids Rés. 76/9863 (1988)] leírt egy cDNS-t, amely egy Eimeria acervulinából származó, 250 000 daltonos merozoit felszíni fehérje egy részét kódolja. E cDNS expressziós termékét az organizmus elleni antiszérum által azonosították.

A rekombináns DNS-technika haladása egy másik megközelítést tett lehetővé: egy alegységvakcinát. Ilyen alegységvakcinák példáit ismerteti a 324048, 337 589 és 944 608 számú európai közrebocsátási irat.

Találmányunk célkitűzése értékes tulajdonságokkal rendelkező, új kokcidiózisvakcinák kifejlesztése.

Találmányunk tárgya Eimeria parazitákkal szemben immunválasz indukálására képes, az Eimeria paraziták által termelt egyéb proteinektől lényegében mentes polipeptid és immunogén fragmensei, a fent említett immunogén polipeptidet vagy részleges szekvenciáját kódoló DNS-szekvencia, azt tartalmazó rekombináns vektorok, a fenti polipeptidet tartalmazó kokcidiózissal szembeni védelemre szolgáló vakcina, eljárás a fenti polipeptid és immunogén fragmensei előállítására, eljárás a fenti polipeptidet kódoló DNS-szekvencia és azt tartalmazó rekombináns vektor előállítására, valamint eljárás a fenti polipeptidet magában foglaló vakcina készítésére.

A találmány tárgya (1) aminosavszekvenciájú immunogén polipeptid

MAKSMLSGIVFAGLVAAAAA

SSANSAANVSVLESGPAVQE

VPARTVTARLAKPLLLLSAL

AATLAAAFLVLQCFNIISSN

NQQT SVRRLAAGGACGDEED

ADEGTSQQASRRRRKPDTPA

ADKYDFVGGTPVSVTEPNVD

EVLIQIRNKQIFLKNPWTGQ (1)

EEQVLVLERQSEEPILIVAR

TRQTLEGYLGSQALAQDGKT

AKEEKVEGGKTHRRYKVKS S

DPGYGF PYTTVLDGVPVGTD

EDGYWEVLMKTGPHGGVDM

MT S TASQGKFCGVLMDDGKG

NLVDGQGRKITÁVIGMLTQP

DTEFRSGPGDDEDDE (SEQIDNO: 1) és immunogén fragmensei, amelyek az Eimeria parazitákkal szemben immunválaszt képesek indukálni és lényegében mentesek az Eimeria paraziták által termelt egyéb proteinektől, mimellett a fenti specifikus aminosavszekvencia 1-183 helyzetű aminosavszekvenciáját vagy annak részleges szekvenciáját tartalmazó fragmensek az alábbi specifikus fragmensek kivételével ki vannak zárva:

SNNQQTSV (2) (SEQ ID NO: 3),

CGDEEDADEGTSQQASRRRRKPDTPAADK (3) (SEQIDNO: 4).

HU 217 420 Β

PNV (4) (SEQ IDNO: 5),

RNKQIF (5) (SEQ ID NO: 6),

NPWTGQEE (6) (SEQ ID NO: 7),

RQSEE (7) (SEQ ID NO: 8),

TRQTLE (8) (SEQ ID NO: 9),

QDGKTAKEEKVEGGKTHRRYKVKSSDPGYG (9) (SEQ IDNO: 10),

TDEDG(l) (SEQ IDNO: 11),

TGPHG (11) (SEQ IDNO: 12),

ASQGK (12) (SEQ ID NO: 13), DDGKGNLVDGQGRK (13) (SEQ ID NO: 14), VAGY

TQPDTEFRSGPGDDEDDE (14) (SEQ ID NO: 15).

A találmány szerinti Eimeria merozoit felszíni antigénprekurzor fehérjéjének a szekvenciája megfelel az (1) (SEQ IDNO: 1) szekvenciának.

ATGGCTAAGTCTATGCTTTCTGGAATTGTTTTTGCTGGTCTTGTTGCTGCTGCAGCG

GCCAGTTCGGCCAACAGCGCCGCCAACGTCTCCGTTTTGGAGAGTGGGCCCGCTGTG

CAGGAAGTGCCAGCGCGCACGGTCACAGCTCGCCTGGCGAAGCCTTTGCTGCTTCTT

TCTGCTCTTGCTGCGACTTTGGCAGCAGCTTTCCTCGTTTTGCAATGCTTCAACATC

ATCTCCAGCAACAACCAGCAAACCAGCGTCAGGAGACTGGCCGCCGGAGGTGCATGC

GGAGATGAGGAAGATGCAGATGAGGGAACTTCACAGCAGGCCAGCCGGAGGAGGAGA

AAACCTGATACCCCTGCAGCAGATAAATACGATTTTGTTGGCGGAACTCCAGTTTCG

GTCACTGAGCCGAATGTTGATGAAGTCCTTATCCAAATTAGAAATAAACAAATCTTT

TTGAAGAACCCATGGACTGGACAAGAAGAACAAGTTCTAGTACTGGAACGACAAAGT

GAAGAACCCATTCTGATTGTGGCGAGGACAAGACAAACACTTGAAGGATATCTTGGT

AGTCAAGCTCTTGCACAGGACGGAAAGACTGCTAAAGAAGAGAAAGTTGAAGGAGGC

AAAACTCACAGAAGATATAAAGTCAAGAGCAGCGACCCAGGATATGGATTCCCATAC

ACCACGGTGCTCGACGGGGTTCCTGTGGGAACAGACGAAGACGGATACGTCGTCGAA

GTTCTTATGAAAACCGGACCCCATGGAGGAGTCGACATGATGACTAGCACAGCATCA

CAAGGAAAATTCTGCGGAGTGCTTATGGATGACGGAAAAGGAAACCTAGTCGATGGA

CAAGGGAGAAAAATTACCGCCGTTATCGGCATGCTAACTCAACCGGATACCGAGTTT

AGAAGCGGACCAGGAGACGACGAGGACGACGAGTGA vagy annak egy részé, mint a (B) nukleotidszekvencia, ami megfelel az (A) (SEQ ID NO: 2) nukleotidszekvenciának, csak a szignálpeptidet kódoló nukleotidszekvencia hiányzik róla. Egy ATG kodont előnyösen kapcsolnak - a szakterületen jól ismert módszerekkel - egy olyan DNS-szekvencia elejéhez, amely az (A) (SEQ ID NO: 2) nukleotidszekvenciájú DNS egy részszekvenciájából áll. A jelen találmány vonatkozik továbbá rekombináns vektorokra, amelyek a fent említett DNS-szekvenciát tartalmazzák, illetve képesek annak kifejezését irányítani kompatibilis gazdaszervezetben és ilyen vektorokat tartalmazó mikroorganizmusokban.

A találmány tárgya továbbá eljárás meghatározott polipeptidek előállítására oly módon, hogy

a) a fenti polipeptidet vagy fragmensét kódoló nukleotidszekvenciát magában foglaló DNS-t tartalmazó rekombináns vektort magában foglaló transzformált mikroorganizmust a DNS kifejezésére alkalmas körülmények között tenyésztünk és

b) a polipeptidet vagy a fragmenst a tenyészetből izoláljuk.

Ez a találmány továbbá vonatkozik még bizonyos alanyok (például ember vagy állatok) kokcidiózissal szembeni védelmére alkalmas vakcinákra, amelyek a találmány szerinti egy vagy több polipeptid hatásos mennyiséget és fiziológiásán elfogadható hordozót tarA jelen találmány szerinti legelőnyösebb polipeptid egy immunogén polipeptid (1) (SEQ ID NO: 1) aminosavszekvenciával, de az N-terminális szignálpeptidszekvencia nélkül. A jelen találmány vonatkozik továb5 bá egy funkcionálisan ekvivalens polipeptidre, amelynek aminosavszekvenciája a fent említett aminosavszekvenciától törlések, beillesztések és helyettesítések miatt különbözik, az említett polipeptid immunológiai tulajdonságait tekintve lényeges változások nélkül. Az előnyös ffagmenseket a jelen szabadalmi leírás további részében ismertetjük.

A találmány a továbbiakban vonatkozik még egy DNS-re, amely teljesen vagy részben kódolja az Eimeria merozoit felszíni antigénprekurzor fehéijéjét; ilyen az (A) (SEQ ID NO: 2) nukleotidszekvenciájú DNS, talmaznak. A fenti alany előnyösen szárnyas és baromfi (például csirkék vagy pulykák). Más alanyok lehetnek háziállatok, úgymint nyulak vagy juhok.

A találmány tárgya továbbá a fenti állatok kokcidiózissal szembeni védelmére alkalmas olyan vakcinák, amelyek egy, a jelen találmány szerinti polipeptidet kódoló DNS-szekvenciát magában foglaló, a fent említett DNS-szekvencia kifejezésére képes rekombináns vírust és egy fiziológiásán elfogadható hordozót tartalmaznak.

A találmány vonatkozik továbbá állatok kokcidiózissal szembeni védelmére szolgáló eljárásra, amely alkalmas a találmány szerinti vakcina hatásos mennyiségben való beadására egy állatba, mint amilyen egy kokcidiózisra hajlamos, fiatal szárnyas.

A jelen találmány szerinti Eimeria polipeptidek fontos vakcinaantigének, mert kokcidiózisorganizmus ellen immunizált, és azzal szemben kifejlett immunitással bíró állati szérumokban levő antitestek felhasználásával azonosították őket. Ezért a legvalószínűbb, hogy ezek a polipeptidek jelentős szerepet játszanak a baromfi kokcidiózissal szembeni védelmében.

Az ábrák rövid leírása

A találmány jóval könnyebben megérthető az ábrák áttekintésével, amelyek közül az 1. ábra nyúlból származó antigénszelekciós antitestekkel és immunizált csirkeszérummal kimutatott Eimeria prekurzor proteint

HU 217 420 Β kódoló 1,2 kb-os cDNS-molekulanukleotidszekvenciáját mutatja. Ahogyan az az 1. ábrán látható, a fent említett prekurzorfehéijét kódoló nukleotidszekvencia a 68-as ATG nukleotid és a 1013-as stop kodon TAA nukleotid között található (315 aminosavat kódol). Az 1. ábra az előbb említett nukleotidszekvencia által meghatározott Eimeria prekurzor protein aminosavszekvenciáját is mutatja. Nukleotidok és aminosavak jelölésére standard, egybetűs rövidítéseket használunk. Ezeknek a rövidítéseknek a jelentése megtalálható standard biokémiai szövegkönyvekben, mint például Lehninger: Principles of Biochemistry (1984), Worth Publishers, Inc., New York, 96. oldal, 798.

A 2. ábra többféle Eimeria merozoit-fehérje SDS PAGE-analízisének eredményét mutatja. Az A lemez egy kontroll (a) vagy antigénszelekciós (b) antitestekkel azonosított, teljes merozoitfehéijék immunoblotja. A nyíl az A lemezen körülbelül 23 kilodaltonos molekulatömegű fehérjét tartalmazó sáv helyzetét jelöli. A B lemez egy ¹²⁵I-dal felszínen jelzett merozoitproteinek autoradiogramja, amely proteineket kontroll (a) vagy antigénszelekciós (b) antitestekkel immunológiailag kicsaptunk. A C lemez merozoit polyA mRNS in vitro transzlációja révén előállított termékek teljes keverékét (c) és transzlációs termékeket mutat, amelyeket lambda 5-7 klón felhasználásával szelektált antitestekkel kicsaptunk (b), illetve antitesteket, amelyeket egy másik fág-klón felhasználásával szelektáltunk, amely klón anti-merozoit szérummal reagáló fehérjéket termel (a), és nem rekombináns fág felhasználásával merozoitszérumból szelektált kontrollantitesteket (d) mutat. A sávokat fluorográfiával tettük láthatóvá. Az ábra jobb oldalán ábrázoltuk a kilodaltonban (kDa) megadott molekulatömeg jelzőinek helyzetét.

A 3. ábra Eimeria tenella spórás oocysta DNS-genom Southern Blot-analízisének eredményét mutatja be, amely DNS-t Pvull- (1. oszlop), Hincll- (2. oszlop), Pstl- (3. oszlop), Sphl- (4. oszlop) vagy Sacl-gyel (5. oszlop) emésztettünk, EcoRl 5-7 inzertált génjét szondaként használva a később leírt módon. A kb-ban megjelölt méretű standard DNS-ek pozícióját az ábra jobb oldala mutatja.

A 4. ábra a pDS56/RBSII (nem arányosan kicsinyített rajz) plazmid vázlatos rajzát mutatja. Ezen a diagramon és a 6., 8. és 10. ábrán a rövidítések és Β, E, Η, P, S, X és Xb szimbólumok BamHI, EcoRl, HindlII, Pstl, Sáli, Xhol és Xbal restrikci ós enzimek számára hasítási helyet jelölnek rendre. L Kíí a szabályozható N25OPSN25OP29 promoter/operátor elemet jelöli. ES23 RBSII, RBSH(-1) vagy RBSII(-2) riboszómakötőhelyet jelöli. -► ezen riboszóma-kötőhelyek kontrollja alatt álló kódolórégiókat jelöli. HIÍlllillllllJ vagy TI terminátorokat jelöli. ^— * E. coliban (repl.) replikálandó DNS-régiót jelöli. * chloramphenicol aciltranszferáz (cat) és béta-laktamáz (nla) kódolórégióját jelöli.

Az 5. ábra a pDS56/RBSII plazmid teljes nukleotidszekvenciáját mutatja be. Ebben a szekvenciában a 4. ábrán bemutatott restrikciós enzim által felismert szekvenciák jelzettek. A látható aminosavszekvencia az

RBSII riboszóma-kötőhely ellenőrzése alatt álló nyitott leolvasási keretet jelöli.

A 6. ábra a pDS56/RBSII(-l) plazmid vázlatos rajzát ábrázolja (nem arányosan kicsinyített rajz).

A 7. ábra a pDS56/RBSII(-l 1) plazmid teljes nukleotidszekvenciáját mutatja be. Ebben a szekvenciában a 6. ábrán bemutatott restrikciós enzim által felismert szekvenciákat tüntettük fel. A látható aminosavszekvencia az RBSII(-l) riboszóma-kötőhely ellenőrzése alatt álló nyitott leolvasási keretet jelöli.

A 8. ábra a pDS56/RBSII(-2) plazmid vázlatos rajzát ábrázolja (nem arányosan kicsinyített rajz).

A 9. ábra a pDS56/RBSII(-2) plazmid teljes nukleotidszekvenciáját mutatja be. Ebben a szekvenciában a 8. ábrán bemutatott restrikciós enzim által felismert szekvenciákat tüntettük fel. A látható aminosavszekvencia az RBSII(-2) riboszóma-kötőhely ellenőrzése alatt álló nyitott leolvasási keretet jelöli.

A 10. ábra a pDMI plazmid vázlatos rajzát mutatja (nem arányosan kicsinyített rajz). A szimbólumok és rövidítések jelentései megegyeznek a 4. ábrához tartozó magyarázatban leírtakkal, de H·» lac represszort (lacl) és neomycin-foszfotranszferázt kódoló régiókat jelöli rendre.

A1IA., 1 IB. és 11C. ábrák a pDMI. 1. plazmid teljes nukleotidszekvenciáját mutatja. Ebben a szekvenciában a 10. ábrán bemutatott restrikciós enzim által felismert szekvenciákat tüntetjük fel. A látható aminosavak magukba foglalják a neomycin-foszfotranszferázt (Met-től Phe-ig) és a lac represszort (Met-től Gln-ig) kódoló nyitott leolvasási kereteket (fontos észrevenni ezen gén fordított irányát).

A 12. ábra a pUC8-TK-7.5K plazmid vázlatos rajza. Ezen a diagramon és a 12., illetve 15. ábrán a TK rövidítés a vakcinavírus timidinkináz gén szekvenciáját jelöli, a 7.5K a vakcina vírus 7.5K promoterét jelöli, lac Z tartalmat szabályozó szekvenciákat és kódol információt a béta-galaktozidáz gén N-terminálisa egy részébe, őri DNS E. coliban replikálandó régióját jelöli, és AmpR béta-laktamáz gént kódoló régiót jelöli.

A13. ábra a pR3 rekombináns plazmid vázlatos rajza.

A 14. ábra a pR3 rekombináns teljes nukleotidszekvenciáját mutatja. A látható aminosavszekvencia a vakcina 7.5K promoter kontrollja alatt álló nyitott leolvasási keretet mutatja.

A 75. ábra a pR4 plazmid vázlatos rajza. ML a malária vezető-szekvenciát jelöli.

A találmány leírása

Az itt használt szakkifejezések a következő jelentéssel bírnak:

„Eimeria felszíni antigén” egy körülbelül 23 kilodaltonos - SDS PAGE szerint - fehéqét jelent, amely Eimeria tenella merozoitstádiumát képviseli. Úgy tűnik, hogy ezt a fehérjét az 1. ábrán bemutatott cDNSszekvenciájú gén in vivő kifejezett kifejezési termékének poszttranszlációs átalakítása termeli.

„Prekurzorfehérje” egy körülbelül 33 kilodaltonos - SDS PAGE szerint - fehérjét jelent. Valószínűleg ez a fehérje in vivő proteolízis útján alakul Eimeria felszíni antigénjévé. A prekurzorfehérjét kódoló cDNS-mo4

HU 217 420 Β lekula nukleotidszekvenciáját és az az -által meghatározott aminosavszekvenciát mutatja az 1. ábra.

„Az (1) aminosavszekvenciájú immunogén polipeptidek képesek egy Eimeria paraziták elleni immunreakciót kiváltani” kifejezés azt jelenti, hogy a polipeptidek képesek Eimeria paraziták elleni B- és/vagy T-sejtes védő immunválaszt kiváltani, amely paraziták az immunogén polipeptidek szekvenciáinak megfelelő, fent említett merozoit felszíni antigént tartalmazzák. Az említett immunogén polipeptidek lehetnek az érett, többi Eimeria szérumfehérjétől megtisztított Eimeria merozoit felszíni antigénfehéijéi, vagy az említett Eimeria felszíni antigénfehéije fragmensei, amelyek még képesek Eimeria parazitával fertőzött állatok szérumaiban jelenlevő antitestek specifikus kötésére. Ezek a polipeptidek megfelelnek a fent meghatározott Eimeria felszíni antigénjének megfelelő T-sejt és B-sejt epitópoknak. A jelen találmány polipeptidjei funkcionálisan is lehetnek az említett Eimeria merozoit felszíni antigénfehéije ekvivalensei, ezek a polipeptidek az 1. ábrán látható aminosavszekvenciától aminosavhelyettesítések révén eltérő aminosavszekvenciájúak, amely helyettesítések lényegében nem változtatják meg az immunológiai aktivitást (azaz lényegében nem teszik tönkre az immunaktív és/vagy az antigéndeterminánsokat).

Egy példa egy fragmensre egy immunogén polipeptid, amely (1) (SEQ ID NO:1) aminosavszekvenciájú, azzal az eltéréssel, hogy a szignálpeptidet alkotó első 20 - körülbelül 100 aminosav hiányzik róla. Egy másik példa egy immunogén polipeptid, amelynek a molekulatömege SDS-poliakrilamid gélen mérve 23 kilodalton. Előnyös ffagmensek a következők:

SNNQQTSV (2)(SEQ ID NO: 3)

CGDEEDADEGTSQQASRRRRKPDTPAADK (3) (SEQIDNO: 4)

PNV (4) (SEQIDNO: 5)

RNKQIF (5) (SEQ ID NO: 6)

NPWTGQEE (6) (SEQ ID NO: 7)

RQSEE (7) (SEQIDNO: 8)

TRQTLE (8) (SEQ ID NO: 9)

QDGKTAKEEKVEGGKTHRRYKVKSSDPGYG (9) (SEQIDNO: 10)

TDEDG (10) (SEQIDNO: 11)

TGPHG (11) (SEQIDNO: 12)

ASQGK( 12) (SEQIDNO: 13)

DDGKGNLVDGQGRK (13) (SEQ ID NO: 14) és

TQPDTEFRSGPGDDEDDE (14) (SEQ ID NO : 15).

A találmányban leírt fragmensek, mint az (1) (SEQ ID NO: 1) szekvenciájú immunogén polipeptid, képesek egy állatban kokcidiózis ellen immunválaszt kiváltani. Előnyös állatok különböző szárnyasok, mint amilyen a csirke.

Ismertek olyan aminosavhelyettesítések fehérjékben, amelyek lényegében nem változtatják meg a biológiai és immunológiai aktivitást. Megfelelő irodalmi helyek például az alábbiak: Neurath és társai: „The Proteins”, Academic Press, New York (1979), kifejezetten a 6. ábrán all. oldalon. A leggyakrabban megfigyelt aminosav-helyettesítések az Ala/Ser, Val/Ile, Asp/Glu, Thr/Ser, Ala/Gly, Ala/Thr, Ser/Asn, Ala/Val,

Ser/Gly, Tyr/Phe, Ala/Pro, Lys/Arg, Asp/Asn, Leu/Ile, Leu/Val, Ala/Glu, Asp/Gly és fordítva.

Mivel a genetikai kód degenerált, az (1) (SEQ ID NO: 1) aminosavszekvenciát több potenciális (funkcionálisan ekvivalens) nukleotidszekvencia kódolhatja. A jelen találmányban leírt vektorokba beépített DNSszekvenciák és fragmensek nukleotidszekvenciái továbbá tartalmazhatnak olyan nukleotidokat, amelyek az aktuális struktúrgéneknek nem részei, mindaddig, amíg az ilyen szekvenciák nagy fragmenseket tartalmazó rekombináns vektorok képesek a megfelelő gazdaszervezetben a jelen találmány szerinti polipeptid termelésének irányítására.

A fenti Eimeria merozoita felületi antigén funkcionális ekvivalensének tekinthető polipeptideket kódoló DNS-szekvenciák könnyen előállíthatok megfelelő szintetikus oligonukleotidek felhasználásával primer-irányított helyspecifikus mutagenezissel a találmány szerinti példaszerűen említett (SEQ ID NO: 2) cDNS-en: lásd (SEQ ID NO: 2) Morinaga és társai [Biotechnology 2:636(1984)].

Fragmensek vagy az Eimeria merozoit felszíni antigénfehéijének részei vagy az ezeket kódoló DNS előállíthatok nagyobb molekulák enzimatikus hasításával, DNS esetén restrikciós endonukleázok és a fehérjék esetén proteázok használásával. A találmány szerinti fragmensek azonban nem korlátozódnak bármely enzimatikus hasítás termékeire, hanem olyan szekvenciarészeket is magukban foglalnak, amelyek terminálisai nem felelnek meg egyik enzimatikus hasítási pontnak sem. Ilyen fragmensek előállíthatok például kémiai szintézissel, az itt megadott szekvenciára vonatkozó adatok felhasználásával. DNS-fragmensek előállíthatok még komplementer DNS (cDNS) inkomplett szintézisével izolált messenger RNS-ből (mRNS). Fehérjefragmensek szintén előállíthatok a fehérjefragmenseket kódoló DNS fragmensek kifejezésével. Ilyen fehérjefragmensek a jelen találmány esetében felhasználhatók, ha elegendő számú aminosavat tartalmaznak egy immunreaktív és/vagy antigéndetermináns alkotására. Általában 7 vagy 8 aminosav szükséges. Az alábbiakban leírtak szerint szükséges lehet az ilyen fragmensek egy immunogén karriermolekulával való összekapcsolása azért, hogy immunológiailag reaktívak legyenek.

Az immunreaktivitás magában foglalja mind a Bsejtek antitesttermelését (humorális immunitás), mind a T-sejtek aktivációját (celluláris immunitás). A találmány szerinti polipeptidek B-sejt antigéndeterminánsokat vagy epitópokat és T-sejt-epitópokat tartalmaznak. Humorális immunitás demonstrálható B-sejt in vivő vagy in vitro antitesttermelésének kiváltásával. Sejtmediált immunitás demonstrálható T-sejt-aktiválással, például a T-sejt megnövekedett fehérjeszintézise révén, vagy B-sejtek aktivált T-sejtekkel való stimulálása révén. Mindkétféle immunitásról szóló leírások jól ismertek a szakterületen.

A jelen találmány szerinti polipeptidek előállíthatok a szakterületen jól ismert módszerekkel, mint amilyen a rekombináns DNS-technika, a kémiai szintézis vagy Eimeria-preparátumokból való izolálás. Amikor az

HU 217 420 Β (1)(SEQ ID NO: 1) szekvenciájú polipeptidet vagy annak fragmenseit a jelen találmánynak megfelelően termeljük, azok az Eimeria paraziták által termelt más fehérjéktől lényegében mentesek.

A jelen találmány szerinti fehérjék előállításához szükséges DNS kémiailag szintetizálható a (SEQ ID NO: 2)-ben és az ábrákon megadott nukleotidszekvencia információja szerint. Ilyen kémiai szintézis kivitelezhető bármely ismert módszer felhasználásával, mint amilyen Matteucci és társai [J. Am. Chem. Soc. 103:3185 (1981)] foszforamidit szilárd alapú módszere.

Alternatívaként cDNS Eimeria mRNS-ből is előállítható. Messenger RNS-t Eimeria merozoitokból lehet izolálni standard technikák felhasználásával. Ezek az mRNS-minták felhasználhatók kettősszálú cDNS készítésére, ahogyan Maniatis és társai (Molecular Cloning: A Laboratory Manuel, 1982, Cold Spring Harbor, NY) leírták. Ez a cDNS azután beépíthető egy arra alkalmas klónozóvektorba, amely segítségével egy megfelelő gazdaszervezetet (például E. coli) transzformálni lehet egy cDNS-könyvtár termelésére.

A cDNS-könyvtár screenelhető a jelen találmány klónozott génjének vagy annak a fragmenseinek szondaként való felhasználásával. Az ilyen gént vagy ffagmenseket a szondaként való felhasználás érdekében meg lehet jelölni, például áltranszlációval Pol l.DNS polimeráz használatával a négy dezoxiribonukleotid jelenlétében, melyek egyike alfa-helyzetben ³²P-t tartalmaz (Maniatis és társai, Supra, p. 109). A szondákat elő lehet állítani oligonukleotid szintézisével is, amely az Eimeria felszíni antigén cDNS-ének ismert szekvenciáján alapul.

Bár az Eimeria tenellát használtuk mRNS-forrásként az alábbiakban leírt példákban, az ebből a fajból származó klónozott gének szondaként használhatók gének Eimeria más fajaiból való izolálására, a DNS-szekvencia különböző fajok közötti homológiájának köszönhetően.

A jelen találmány szerint azonosított és izolált Eimeria-DNS-eket egy megfelelő hordozóba vagy vektorba építjük be, amely a beépített génszekvenciák transzkripciójához és transzlációjához szükséges elemeket tartalmazza. A klónozásnál előnyös hordozó kromoszomális, nemkromoszomális és szintetikus DNSszekvenciák szegmentjeiből áll, ilyenek az ismert különböző bakteriális plazmidok, vírus-DNS, például fágDNS, plazmidok és vírus, vagy fág-DNS kombinációi, például a plazmidok, amelyeket fág-DNS vagy más kifejező kontrollszekvenciák vagy élesztőplazmidok felhasználására módosítottunk. Klónozásban használható specifikus hordozók lehetnek - de nem csak ezekre korlátozódnak - a pEV-vrf plazmidok [pEV-vrfl-t, -2-t és -3-t leírták Crowl és társai: Gene 38:31 (1985)]; SV40; adenovírus, élesztővektorok; lambda-B; Charon 4A és 28; lambda-gt-2; M13-származékvektorok, mint pUC8, 9, 18 és 19, pBR313, 322 és 425; pAC105; pVA51; pACY177; pKH47; pACYC184; pUBllO; pMB9; colEl; pSCIOl; pML21; RSF2124; pCRl vagy RP4; epithelioma contagiosum; a herpeszviruscsalád vakcinája vagy egy tagja.

Az Eimeria gének egy klónozóvektorba való beépítése könnyen elvégezhető, ha mind a géneket, mind a kívánt, klónozáskor használt hordozókat ugyanazzal a restrikciós enzimmel vagy enzimekkel hasítjuk, minthogy ezáltal a komplementer DNS-terminálisok keletkeznek. Ha ez nem kivitelezhető, szükséges lehet a hasítási végek, melyeket az egyszálú DNS tompa végek előállításának érdekében történő hasításával alakítunk ki, módosítása, vagy ugyanezt az eredményt lehet elérni az egyszálú terminális megfelelő DNS polimeráz segítségével való feltöltése révén. Ily módon a tompa véggel való összekapcsolás kivitelezhető egy enzimmel, mint amilyen a T4 DNS-ligáz. Alternatívaként bármilyen kívánt végződés előállítható nukleotidszekvenciák (linkerek) DNS-terminálisokhoz való kapcsolásával. Ilyen linkerek specifikus oligonukleotidszekvenciát alkotnak, amelyek restrikciós helyet felismerő szekvenciákat kódolnak. A hasított vektor és az Eimeria gének vagy ffagmensek egyaránt módosíthatók kopolimer farok kialakításával, ahogyan ezt Morrow [Methods in Enzymology 68:3 (1979)] leírta.

A jelen találmánnyal kapcsolatosan felhasználható több, klónozásnál használt hordozó rendelkezhet egy vagy több markerakti vitás sál, mely felhasználható kívánt transzformánsok elkülönítésére, mint amilyen az ampicillin-, és tetraciklinrezisztencia pBR322-ben, ampicillinrezisztencia és béta-galaktozidáz-aktivitás pCU8-ban és ampicillinrezisztencia a pEV-vrf plazmidokban. A gazdasejtek, melyekbe ilyen vektorokat építettünk be, szelekciója nagymértékben leegyszerűsített, ha a gazdasejtekből máskülönben hiányzik a vektorok által hordozott aktivitás.

A klónozóhordozó valamely kiválasztott helyére beépített Eimeria gének nukleotidszekvenciái tartalmazhatnak olyan nukleotidokat, melyek nem részei az aktuális struktúrgéneknek. Alternatívaként a gének tartalmazhatnak olyan nukleotidokat, melyek nem részei az aktuális struktúrgéneknek. Alternatívaként a gének tartalmazhatják a teljes vadtípusú gén csupán egy részét. Követelmény mindössze az, hogy a génfragmensek a klónozási hordozóba való beépülés után képesek legyenek megfelelő gazdaszervezetben az Eimeria felszíni antigén legalább egy immunreaktív és/vagy antigén determinánsát tartalmazó polipeptid vagy fehérje termelésének irányítására. Ennek megfelelően a jelen találmány szerinti, valamely fehéijét kódoló, nukleotid szekvenciájú DNS-t tartalmazó rekombináns vektorok oly módon állíthatók elő, hogy

a) az említett proteint kódoló nukleotidszekvenciájú DNS-t egy vektorba beillesztjük;

b) az említett vektort egy mikroorganizmusban replikáljuk; és

c) a rekombináns vektort a mikroorganizmusból izoláljuk.

A megfelelő gazdaszervezet kiválasztását a szakterületen jól ismert, számos tényező befolyásolja. E tényező lehet például a kiválasztott vektorral való kompatibilitás, a hibrid plazmid által kódolt proteinek toxicitása, a kívánt fehéije kinyerésének egyszerűsége, kifejezési tulajdonságok, biológiai biztonság és költsé6

HU 217 420 Β gek. Ezen tényezők egyensúlyát figyelembe kell venni, és nyilvánvalóan egy bizonyos rekombináns DNS-molekula mindegyik gazdaszervezetben nem fejezhető ki azonos hatékonysággal.

A jelen találmány szerint felhasználható megfelelő gazdamikroorganizmusok lehetnek - de nemcsak ezekre korlátozódnak - emlős- vagy élesztősejtek, baktériumok, úgymint Escherichia coli, Bacillus subtilis, Bacillus stearothermophilus és Actinomyces. Felhasználható az Escherichia coli MCI061 törzse, melyet Casadaban és társai [J. Mól. Bioi. 138:179 (1980)] írtak le; vagy bármely más, az E. coli K-l2 törzsei közül, melyek pRK248 clts plazmidot tartalmazzák. A más E. coli K-12 törzsekben használható pRK248 clts plazmidot Berhard és társai [Meth. of Enzymol. 68:482 (1979)] leírták, és rendelkezésre is áll az American Type Culture Collection No. ATCC33766 tenyészetében. Az E. coli MCI061 törzse kereskedelmi úton beszerezhető például a CLONTECH Laboratóriumokból, Inc., Palo Alto, CA, USA, és szintén elérhető az American Type Culture Collection No. ATCC53338 tenyészetében. Az E. coli Ml5 törzsében használatos pDMI.l, pDS56/RBSII, -1 vagy -2 plazmidok leírása lejjebb megtalálható.

A rekombináns klónozóvektor bejuttatása a gazdasejtbe többféle úton kivitelezhető. Az adott választott vektor/gazdasejt rendszertől függően ilyen transzfer megvalósítható transzformáció, transzdukció, transzfekció és elektroporáció útján. Az így előállított módosított gazdasejtet kultúrákban lehet tenyészteni és a fehérj ekifej ezési terméket a tenyészetekből izolálni lehet.

Az Eimeria felszíni antigén prekurzorfehérjéjét termelő transzformált kiónokat E. tenella glutáraldehiddel fixált sporozoitjai vagy merozoitjai ellen immunizált állatokból nyert szérummal láthatóvá téve azonosítjuk. Az alábbi példák esetében nyúl anti-merozoit szérumát használtuk a géntermék screenelésére és jellemzésére. Immunizált csirke szérumával történő párhuzamos immunológiai screeneléssel eredményesen végezhető el a merozoit felszíni antigén prekurzorát kódoló cDNS független izolálása.

Az immunológiai screeneléshez vagy immunológiai kicsapáshoz felhasznált antiszérumok specifikussága fokozható Hall és társai [Natúré 311:379 (1984)] különböző antitestszelekciós módszerével. A továbbiakban ismertetésre kerülő fenti módszer során kiónok segítségével előállított Eimeria fehérjékre specifikus antitesteket szűrőkön adszorbeálunk.

Kiónokat termelő Eimeria antigén detektálása elvégezhető jól ismert standard assay-módszerek felhasználásával, mint amilyen az immunológiai kicsapás, az enzimkötés immunoassay- (ELISA) és radioimmunoassaytechnikák, melyeket a szakirodalomban részletesen leírtak [lásd például Kennet és társai (szerkesztők), Monoclonal Antibodies and Hydridomas: A New Dimension in Biological Analyses, 1980, Plenum Press, New York, 376-384. oldal],

A rekombináns vektorok, amelyek a jelen találmány szerinti Eimeria felszíni antigén különféle polipeptidjeit kódoló DNS-t tartalmaznak, előállíthatok a szakterületen jól ismert módszerekkel, például helyspecifikus mutagenezissel.

A jelen találmány szerint rekombináns Eimeria polipeptidek nagy mennyiségben előállíthatok az ily módon nyert transzformált mikroorganizmusok tenyésztésével a szükséges tápanyagokat tartalmazó fermentációs közegben olyan körülmények között, amely alkalmas a rekombináns DNS kifejezésére. E. coliban való termelés esetén a rekombináns Eimeria polipeptidek általában a baktériumok citoplazmájában vagy zárványtesteiben találhatók. így a fehéqék kiszabadításához a baktériumok külső membránjának roncsolása szükséges. Ez elvégezhető nagy frekvenciájú hanghullámok felhasználásával vagy más, a membránt mechanikailag roncsoló eszközökkel, úgymint French pressure cell (sejt) vagy Gaulin homogenizáló használatával [Charm és társai: Meth. Enzymol. 22, 476-556 (1971)].

A sejtek felszakítása megvalósítható még kémiai vagy enzimatikus módszerekkel. Mivel két vegyértékű kationok gyakran szükségesek a sejtmembrán integritásához, megfelelő kelátképző ágensekkel, úgymint EDTA vagy EGTA való kezelés megfelelőnek bizonyulhat sejtek felszakítására, amely elősegíti a sejtből a fehérjék kijutását. Hasonlóan enzimeket - mint a lysozim - is felhasználhatunk ugyanilyen eredmény elérésére. Ez az enzim a sejtfal proteoglikán vázát bontja hidrolízissel.

Ozmotikus sokk szintén alkalmazható. Röviden: ezt az eljárást úgy végezzük el, hogy először a sejteket hipertóniás oldatba helyezzük, amely miatt azok vizet veszítenek és zsugorodnak. Ezt követően a sejtek egy hipotóniás „sokk”-oldatba való helyezése víz gyors beáramlásához vezet a sejtekbe, a kívánt fehérjék kilökődésével egyidejűleg.

A sejtekből való kiszabadulás után az Eimeria fehérjéket betöményítjük sókkal, például nátrium- vagy ammónium-kloriddal történő kicsapással, ultraszűréssel vagy más, a szakterületen jól ismert módszerekkel. További tisztítás elvégezhető szokásos fehérjetisztítási módszerekkel, melyek közé tartozik - de nem csak ezekre korlátozódnak - a gélszűrés, ioncserélő kromatográfia, preparatív disc-gél vagy fuggönyelektroforézis, izoelektromos fokuszálás, alacsony hőmérsékletű szerves oldószerrel történő ffakcionálás vagy ellenáramlásos megoszlásos eljárás. A tisztítás elvégezhető immunoaffmitás-kromatográfiával is.

Specifikus módszerek Eimeria fehérjék gazdaszervezetekből való tisztítására jól ismertek a szakterületen (lásd például Neuman és társai: 164 176 számú európai közrebocsátási irat).

A jelen találmány szerinti fehérjék vagy azok fragmensei kémiailag is szintetizálhatok egy arra alkalmas módszerrel, mint amilyen a kizárólagosan szilárd fázisú szintézis, a részlegesen szilárd fázisú módszer, a fragmenskondenzáció vagy a klasszikus oldatban történő szintézis. A Merrifield [J. Am. Chem. Soc. 85:2149 (1963)] által leírt szilárd fázisú szintézis előnyös.

Ilyen szintézis kivitelezhető az alfa-amino-terminálison védett aminosavakkal. Labilis oldallánccal rendelkező, háromfunkciós csoportú aminosavakat megfelelő

HU 217 420 Β csoportokkal védjük, amelyek megakadályozzák kémiai reakció bekövetkezését ezen a helyen a peptid felhalmozódása miatt. Az alfa-amino-védócsoport szelektív eltávolítása lehetővé teszi további reakciók lejátszódását az amino-végcsoporton. Az alfa-amino-védőcsoport eltávolításához szükséges körülmények nem okozzák az oldalcsoportok védőcsoportjainak lehasítását.

Az alfa-amino-védőcsoportok a lépésenkénti peptidszintézis témakörében ismert módon hasznosak. Ilyenek az acil típusú védőcsoportok (például formil, trifluoro-acetil, acetil), aromás uretán típusú védőcsoportok [például benzil-oxi-karbonil (Cbz) és szubsztituált benzil-oxi-karbonil], alifás metán-védőcsoportok [például tercier butiloxikarbonil (Boc), izopropiloxikarbonil, ciklohexiloxikarbonil] és alkil típusú védőcsoportok (például benzil, trifenilmetil). Előnyös védőcsoport a Boc Oldalláncot védőcsoportok Tyr esetében lehetnek tetrahidropiranil, tercier butil, triil, benzil, Cbz, 4-Br-Cbz és 2,6-diklór-benzil. Az előnyös oldalláncot védő csoport Tyr esetén a 2,6-diklór-benzil. Oldalláncot védő csoportok Asp esetén a következők: benzil, 2,6-diklór-benzil, metil, etil, ciklohexil. Az előnyös oldalláncot védő csoport Asp esetén a ciklohexil. Oldalláncot védő csoportok Thr és Ser esetén a következők: acetil, benzoil, tritil, tetrahidropiranil, benzil, 2,6-diklór-benzil és Cbz. Az előnyös oldalláncot védő csoport Thr és Ser esetén a benzil. Oldalláncot védő csoportok Arg esetén a nitro, Tos, Cbz, adamantil-oxikarbonil vagy a Boc. Az előnyös védőcsoport Arg számára a Tos. Lys oldalláncát védeni lehet Cbz-, 2ClCbz-, Tos- vagy Boc-val. Lys esetében az előnyös védőcsoport a 2-ClCbz. Az oldalláncot védő csoport kiválasztása a következőkön alapul:

Követelmény, hogy az oldalláncot védő csoport a kapcsolódás ideje alatt sértetlen maradjon és az aminoterminálison levő védőcsoport eltávolítása vagy a kapcsolódási körülmények során ne hasadjon le. Az oldalláncot védő csoportnak eltávolíthatónak kell lennie a peptid végső formája szintézisének befejezése után, olyan reakciókörülményeket használva, amely nem változtatja meg a kívánt peptidet.

A szilárd fázisú szintézist általában a karboxiterminálistól végezzük úgy, hogy a védett (oldalláncon védett) alfa-aminosavat egy erre alkalmas szilárd hordozóhoz kötjük. Klór-metilezett vagy hidroxi-metil-gyantához való kapcsolás során észterkötés jön létre, és a végtermék peptid vagy szabad karboxilcsoporttal rendelkezik a C-terminálison. Alternatívaként használható egy benzhidrilamin- vagy p-metilbenzhidrilamin-gyanta, amely esetben egy amidhíd jön létre, és a végtermék peptid C-terminálisán egy karboxiamid-csoport lesz jelen. Ezen a gyanták kereskedelmi úton beszerezhetők, és készítésüket Stewart és társai: „Solid Phase Peptide Synthesis” (2. kiadás, Pierce Chemical Co., Rockford, IL, 1984) leírták.

A C-terminális aminosavat, Arg-t, amely oldallánca Tos-szal és alfa-amino funkciós csoportja Boc-val védett, benzhidrilamin gyantához kapcsoljuk különböző aktiválóágensek felhasználásával, mint amilyen a diciklohexilkarbodiimid (DCC), az /VjV'-diizopropilkarbodiimid és a karbonildiimidazol. A gyanta hordozóhoz való kötést követően az alfa-amino-védőcsoportot eltávolítjuk trifluor-ecetsavat (TFA) vagy sósavat használva, dioxánban 0 °C és 25 °C közötti hőmérsékleten. A TFA-hoz dimetilszulfidot adunk metionin (Met) hozzáadása után, ily módon megakadályozva a lehetséges S-alkilezést. Az alfa-amino-védőcsoport eltávolítása után a megmaradó védett aminosavakat lépésről lépésre kapcsoljuk a kívánt peptidszekvencia eléréséhez szükséges sorrendben.

Különböző aktiválóágensek használhatók a kapcsolóreakciókhoz, úgymint: DDC, MA’-diizopropilkarbodiimid, benzo-triazol-l-il-oxi- trisz-(dimetilamino)-foszfonium hexafluorfoszfát (BOP) és DCC-hidroxibenzotriazol (BOBt). Minden egyes védett aminosavat fölöslegben (>2,5 ekvivalens) használunk. A kapcsolásokat általában dimetil-formamidban, diklór-metánban vagy ezek elegyében végezzük el. A kapcsolási reakció végbemenetelének mértékét minden egyes szinten ninhidrinreakcióval követjük nyomon, ahogy ezt Kaieser és társai [Anal. Biochem. 34:595 (1970)] leírták. Minden olyan esetben, amikor a kapcsolódás nem tökéletes, a kapcsolási reakciót megismételjük. A kapcsolási reakciók automatikusan végrehajthatók Vega 250-en, Applied Biosystem szintetizálón, vagy más, kereskedelmi úton beszerezhető berendezéssel. A célpeptid létrehozása után a peptidgyantáról a védőcsoportokat lehasítjuk TFA/ditioetánnal és ezután lehasítjuk egy reagenssel, mint amilyen a folyékony hidrogén-fluorid, 1-2 óra alatt 0 °C-on, ez lehasítja a peptidet a gyantáról és eltávolítja az összes védőcsoportot.

A szilárd hordozón történő oldallánc oldallánchoz való ciklizációja ortogonális védőelrendeződést kíván meg, amely lehetővé teszi a savas aminosavak (például Asp) és a bázikus aminosavak (például Lys) oldallánca funkciós csoportjának szelektív hasítását. Erre a célra használható Asp oldallánca esetén a 9-fluoronilmetil(OFm)-védőcsoport és Lys oldallánca esetén a 9-fluorenil-metoxikarbonil-(Fmoc)-védőcsoport. Ezekben az esetekben a Boc-val védett peptid-gyanta oldalláncot védő csoportjai szelektíven eltávolíthatók piperidinnel DMF-ben. A szilárd hordozón a ciklizáció elérhető különböző aktiválóágensek használatával, úgymint DCC, DCC/HOBt vagy BOP. A HF-reakciót a fent leírt módon ciklizált peptid-gyantán hajtjuk végre.

A szintetikus fehérjék tisztítása és screenelése rekombináns módszerekkel termelt fehéqék esetében a fent leírt módon kivitelezhető.

Eimeria fehérjék szintén visszanyerhetők organizmusokból, membránproteinek kivonatából. Ilyen módszerek teljes, vadtípusú fehéijéket termelnek. Monoklonális antitestek erre a célra előállíthatók szintetikus vagy természetes Eimeria proteinek antigénként való felhasználásával, ahogyan Köhler és Milstein [Natúré 256:495 (1975)] leírták. Ezek a módszerek alkalmazhatók a jelen találmány szerinti 23 kd-os Eimeria felszíni antigén tisztítására.

A jelen találmány szerinti egy vagy több polipeptid vakcinákká alakítható, amelyek a polipeptideket és egy

HU 217 420 Β fiziológiásán elfogadható hordozót foglalnak magukban. Alkalmas hordozó lehet például 0,01-0,1 M semleges pH-jú foszfátpuffer vagy fiziológiás konyhasóoldat.

Fokozott kokcidiózis elleni immunitás kétféleképpen is kialakítható. Először is: egy hatásjavító anyag vagy immunopotenciátor adható a vakcinához. Másodszor : a jelen találmány szerinti fehéijéket a nagyobb méretekben immunizálandó állatok számára alkalmazzuk keresztkötéses komplexként vagy hordozómolekulához kötve.

Az állatok vakcinálásánál felhasznált előnyös hatásjavító szerek - nem kizárólagos jelleggel - az alábbiak lehetnek: Adjuvant 65 (amely tartalmaz amerikaimogyoró-olajat, mannid-monooleátot és alumínium-monosztearátot); ásványi gélek, úgymint alumínium-hidroxid, alumínium-foszfát és timsó; felületaktív anyagok, úgymint hexadecilamin, oktadecilamin, lizolecitin, dimetildioktadecil-ammónium-bromid, /V,A-dioktadccil-V’,Vbisz(2-hidroximetil)-propanediamin, metoxihexadecilglicerol és pluromicpoliolok; polianionok, úgymint pirán, dextrán-szulfát, poli IC, poliakrilsav és karbopol; peptidek, mint a muramil-dipeptid, dimetilglicin és tuftsin; és olajemulzió. A fehéijék beadhatók még liposzómákba vagy más mikrohordozókba való beépítést követően.

A liposzómákba vagy más mikrohordozókba való beépítés egy olyan terméket biztosít, amely révén a vakcinák felszabadulása elnyújtott időtartamon keresztül fenntartható. Használható ugyanerre a célra egy pumpa, mint amilyen egy Alza ozmotikus pumpa.

A jelen találmány szerinti polipeptidek, különösen a kisebb fragmensek immunogenitása fokozható egy immunogén hordozómolekulához való keresztkötéssel vagy kapcsolással (egy olyan, a gazdaállatban immunreakciót függetlenül kiváltó tulajdonsággal bíró makromolekuláról van szó, amelyhez a találmány szerinti fehéijéket és fehéijeffagmenseket kovalensen lehet kötni). Egy hordozómolekulához való keresztkötés vagy konjugáció szükséges lehet, mert a kis fehérjefragmensek néha hapténként viselkednek (a haptének olyan molekulák, amelyek képesek specifikusan kötődni egy antitesthez, de nem képesek antitest termelésének kiváltására, azaz nem immunogének). Ilyen fragmenseknek egy immunogén hordozómolekulához való konjugációja a fragmenseket immunogénné teszi, amely jelenség köztudottan „hordozóeffektus”.

Alkalmas hordozómolekulák lehetnek például a fehérjék és természetes vagy szintetikus polimerizált vegyületek, úgymint polipeptidek, poliszacharidok, lipopoliszacharidok stb. Előnyös hordozó egy Quol A nevű glikozid, melyet Morein és társai [Natúré 308:457 (1984)] már leírtak. Különösen előnyös fehérje-hordozómolekulák lehetnek - de nem csak ezekre korlátozódnak - emlősszérum-proteinek, úgymint (keyhole limpet) hemocianin, humán vagy szarvasmarha-gammaglobulin, humán, szarvasmarha- vagy nyúlszérumalbumin vagy ilyen fehérjék metilezett vagy más származékai. Más fehéijehordozók megfelelnek a szakterületen alkalmazottaknak. Előnyös, de nem szükségszerű, hogy fehérjehordozó a gazdaállat számára, amelyben az

Eimeria fehérjék ellen antitestek termelődnek, idegen legyen.

Hordozómolekulához való kovalens kapcsolás kivitelezhető a szakterületen jól ismert módszerek felhasználásával, amelyek pontos kiválasztását a használt hordozómolekula természete szabja meg. Ha az immunogén hordozómolekula egy fehérje, a találmányban leírt fehérjék vagy fragmensek kapcsolhatók például vízoldékony karbodiimidek felhasználásával, mint amilyen a diciklohexilkarbodiimid vagy glutáraldehid.

Kapcsolóágensek, mint ezek, használhatók még fehéijék és fragmensek önmagukhoz történő keresztkötésére különálló hordozómolekula használata nélkül. Ilyen keresztkötések fehéije- vagy fehérjeffagmens aggregátumokban szintén fokozhatják az immunogenitást.

A jelen találmány szerinti vakcinák hatásos mennyiségének beadása védelmet nyújthat kokcidiózis ellen, ahogyan például E. tenella-fertőzés vagy más Eimeria fajok általi fertőzés okozta E. tenella antigének elleni monoklonális antitestek in vitro keresztreakcióba lépnek E. acervulinával és E. maximával. Előnyös állat a baromfi, mint a csirkék, ez a találmány alkalmazása kiterjed más állatokra is. A találmánynak megfelelően vakcina bármilyen hatásos mennyisége felhasználható. A hatásos mennyiséget az alábbiakban ismertetésre kerülő módszerekkel elvégzett rutinkísérletekkel határozzuk meg. A jelen találmány által leírt polipeptidek és fragmensek hatásos mennyisége szempontjából előnyös a körülbelül 5 és körülbelül 50 mikrogramm/kg közötti tartomány, ahol a „kg” a beoltott alany testtömegének 1 kg-ját jelenti, különösen előnyös a körülbelül 25-50 pg/kg dózis. A kezdeti oltásokat előnyös, ha emlékeztető oltások követik, 1-től több hétig teijedő időtartammal később. Lehetséges többször is emlékeztető oltást beadni. Ilyen emlékeztető oltások dózisa általában 5-től 50 pg/kg-ig teijedő tartományban van, előnyösen 20-50 pg/kg körül. Beoltás standard úton történhet, mint amilyen a szubkután, intradermális, intramuszkuláris, szájon keresztüli, análisan vagy in ovo történő beoltás (direkt injekció embriókba). Egyszeri vagy többszöri emlékeztető oltást egy kismértékű kokcidiózisfertőzés indukálása követhet, amely fokozhatja a védettséget.

A jelen találmány szerinti kokcidiózisantigének beadása az állatok, például baromfi immunrendszere számára elvégezhető az antigéneket kódoló gének baktériumokban (például E. coli vagy Salmonella) vagy vírusokban (például himlővírus vagy herpeszvírus) történő klónozásával és az élő vektorrendszemek vagy annak inaktív formájának - amikor ez megfelelő - az állatokba való beadásával szájon át, injekcióval vagy más általánosan használt módokon. Carbit és társai (a Vaccinesban, 1987, Cold Sprin Harbor Laboratory, pp. 68-71) E. coli használatát írták le, amíg Clements [Pathol. Immunopathol. Rés. 6:137 (1987)] Salmonella használatát írta le. Moss és társai [Ann. Rév. Immunoi. 5:305 (1987)] rekombináns himlővírusok használatával történő vírus eredetű vektorrendszerek használatát írta le.

Egyfajta himlővírus, vacciniavírus, felhasználható kokcidiózisantigének sejtkultúrákba és állatokba való

HU 217 420 Β bejuttatásának tesztelésére. A madárhimlővírus egy másik olyan himlőhordozó, amelyik felhasználható a jelen találmány végrehajtása során. Analitikai tanulmányozások céljára vacciniavírus előnyösebbnek bizonyult, mint a madárhimlő vírusa. Ennek az az oka, hogy a vacciniavírus jóval gyorsabban sokszorozódik, mint a madárvírus és gazdaszervezetei nem korlátozódnak madársejtekre. Nagy mennyiségű, idegen eredetű DNS építhető be a vacciniavírus genomjába anélkül, hogy ez gátolná a vírus érését és fertőzőképességét [Smith és társai: Gene 25:21 (1983)]. A vírusokba beépített, megsokszorozott, idegen eredetű gének a fertőzött állatokban kifejezésre kerülnek, és antitest termelését váltják ki [Perkus és társai: Science 229:981 (1985)].

Rekombináns vacciniavírusok előállítására használt technikák könnyedén adaptálhatók madárvírus- vagy herpeszvírusrendszerekre rutineljárások révén. Egy rekombináns vírus, amely a jelen találmány szerinti valamely fehérjét kódoló nukleotidszekvenciájú DNS-t tartalmazza, oly módon állítható elő, hogy

a) az említett proteint kódoló, nukleotidszekvenciájú DNS-t a vírus genomjába építjük be anélkül, hogy ez a vírus érését és fertőzőképességét gátolná;

b) a kapott rekombináns vírust egy sejtkultúrában amplifikáljuk és

c) a rekombináns vírust a tenyészetből tisztítjuk.

Rekombináns vírusok hordozóként való használata kokcidiózis elleni vakcinákban különösen előnyös, mivel a beoltott baromfiban immunitás fejlődik ki mind a kokcidiózisantigén, mind a virális hordozó ellen (azaz az ilyen vakcinák bivalensek). Ilyen vakcinák hasznossága tovább fokozható járulékos géneknek a hordozóvírusba történő beépítésével. Például a Newcastle-betegség vírusgenomjának részei egy kokcidiózisantigén génjével együtt himlő vírusába beépíthetők, és így egyetlen vakcinával immunitás alakítható ki Newcastle-betegség, kokcidiózis és madárhimlő ellen.

A találmány szerint élő vektor-vakcinák beadása kivitelezhető számos, a szakterületen jól ismert módszerrel. Például alkalmazható a közismerten használt „stick”-módszer szárnyasok madárhimlő vírusa elleni beoltására.

Ez a módszer abból áll, hogy egy, a vakcinába mártott éles tűvel átszúrjuk a szárny bőrét. A tűnek általában van egy szeme a hegyéhez közel, mint a varrógéptűnek, amely egy vakcinát hordoz. Alternatívaként az élő vakcinák szubkutáns vagy intradermálisan injekcióval beadhatók a szárnyba vagy más helyre.

A rekombináns élő vektorok ivóvízhez is adhatók vagy a beoltandó alanyokra, mint amilyenek a csirkék, permetezhetők spray-vel. Szintén beadhatók táplálékba, előnyösen védőkapszulával való borítás után [Balancon és társai: Natúré 322:373 (1986)] vagy in ovo. Az utóbbi módszer során a virális vakcinát direkt embriókba fecskendezik, különösen csirkeembriókba [Sharma, Árián Dis. 25,1155 (1985)].

Ha más kikötés nincs, az alábbiakban megadott százalékok szilárd keverékben levő szilárd anyagra, folyadékban levő folyadékokra és folyadékokban levő szilárd anyagra rendre tömeg/tömeg, térfogat/térfogat, illetve tömeg/térfogat%-ban értendők. Továbbá, ha más kikötés nincs, az alábbiakban említett reagensek és berendezések megadott forrásai nem kötelezőek. A végrehajtó személy abban a helyzetben van, hogy hasonló reagenseket és berendezéseket választhat más forrásokból.

1. példa

Merozoitok tisztítása

E. tenella merozoitjait 50 fertőzött csirke vakbeléből nyertük ki (3 hetes szárnyasok; Hubbard Cross; Avian Services, Frenchtown, NJ, USA) madaranként 50000, a fent említett spórás oocystával való fertőzés után 5 nappal. Más forrásból származó hasonló csirkék is használhatók. A vakbeleket eltávolítottuk, és mágneses keverőn 15 percig foszfátpufferes konyhasóoldattal átmostuk. Az epiteliális törmeléket alacsony fordulatszámú centrifugálással (50 xg) részlegesen eltávolítottuk, és a nyers merozoitokat 2000 xg-n, 4 °C-on történő 10 perces centrifugálással nyertük vissza. Az üledéket újra szuszpendáltuk Lysing-pufferben (8,29 g/1 NH₄C1, 0,372 g/1 Na₂ EDTA, 1,0 g/1 KHCO₃, pH 7,6), és 30 percig jégen inkubáltuk. A merozoitokat centrifugálással gyűjtöttük össze, TBS-ben egyszer átmostuk, és keresztülvezettük egy szeparálócsőben levő 1,0 g fonott nejlonszálat tartalmazó (Scrub Nylon Fiber, Fenwall Laboratories, Deerfield, IL) oszlopon. A merozoitokat az előbbihez hasonló módon centrifugálással összegyűjtöttük, és szárazjégen RNS-izolálás céljából megfagyasztottuk, vagy Western blot-analízis céljából tovább tisztítottuk dietilaminoetil-cellulózban (DEAE, Whatman DE52, Whatman Bio System, Inc., Clifton, NJ, USA).

DEAE cellulózban való tisztítás céljából lxlO⁹ merozoitot PBS-ben egy 10 ml űrtartalmú oszlopra vittünk fel és PBS-szel eluáltuk. A merozoitokat az első 100 ml átfolyt folyadékból nyertük vissza; a vörösvérsejtektől és más sejtes törmeléktől lényegében megtisztítottuk.

Immunológiai kicsapás ^,2SI-dal jelzett felszíni fehérjékkel

A tisztított merozoitok felszíni fehérjéit ^l25I-dal jelöltük az IODOGEN™ módszer révén (Pierce Chemical Co.) vagy IODOBEADS™ (Pierce Chemical Co.) felhasználásával. Az utóbbi módszer során a 4 IODOBEADS™-et 3-szor átmostuk 7,5 pH-jú 0,2 M nátriumfoszfáttal, és hozzáadtunk 1 -3 mCi ^l25I-NA-ot, illetve 5 percig inkubáltuk szobahőmérsékleten. (3 χ 10⁸) tisztított merozoitot, 200 ml 7,0 pH-jú PBS-ben, hozzáadtunk az üvegcsében levő reakcióelegyhez, majd 15 percig folytattuk az inkubálást. Az inkubálás végén a végső 5 mM-os koncentráció elérése céljából fenilmetánszulfonil-fluoridot adunk a reakcióelegyhez.

A jelölt merozoitokat 12000 xg-n 30 percig tartó centrifugálással nyertük vissza az inkubációs keverékből, és PBS-ben levő 1 ml 1%-os Triton X-100-ban vagy 1 ml 2%-os nátrium-dodecil-szulfátban (5DS), 7,0 pH-η tettük oldhatóvá. Az oldhatatlan anyagot 10000 xg-n 3 percig tartó centrifugálással távolítottuk el. Az oldható fehérjéket 3 liter 7,0 pH-jú PBS-szel

HU 217 420 Β szemben 4 °C-on dializáltuk 3500-as molekulatömegig áteresztő membrán használatával, a szabad ¹²⁵I-felesleg eltávolítása céljából. ^,25I-dal jelölt fehérjéket (jellegzetesen fehérjébe beépülve körülbelül l,5-xl08 cpm) a felhasználásig 4 °C-on tároltuk. A TCA-s kicsapással kimutatott radioaktivitás jellegzetesen a teljes radioaktivitása 95%-át tette ki.

Glutáraldehiddel rögzített merozoiták elleni nyúlantiszérumot a következők szerint állítottunk elő:

Körülbelül 1 χ 10⁹ tisztított merozoitot szuszpendáltunk PBS-ben levő 1%-os glutáraldehidben, és 5 percig szobahőmérsékleten inkubáltuk. A fixált parazitákat 5 percig 2000 xg-n történő centrifugálással nyertük, háromszor átmostuk PBS-szel, és 1 ml PBS-ben újraszuszpendáltuk. Uj-zélandi fehér nyulak hátbőrébe intradermális injekcióként többször beadtunk 0,5 ml teljes térfogatú, fixált parazitaoldatot, melyet 0,5 ml teljes Freund-adjuvánssal emulgeáltunk. A nyulak nem teljes Freund-adjuvánsban levő ugyanazon parazitafehérjét tartalmazó 2 emlékeztető injekciót kaptak kéthetes időközökkel. Két héttel az utolsó emlékeztető oltás után vért vettünk a fülvénából, és az antitesteket tartalmazó szérumot koaguáltatott vérminták 15 percig 2500 xg-n történő centrifugálással nyertük.

A jelölt fehéijék mintáit immunológiai kicsapás céljából (5 ml, 5χ 10⁵ cpm tartalmú) 100 ml IP pufferrel hígítottuk (0,25% NP-40, 20 mM Tris-HCl, 7,5 pH-n, 0,15 MNaCl), előtisztítottuk jégen 5 mg Steph-A proteinnel történő 20 perces inkubálással (Pansorbin™, Calbiochem, Corp., San Diego, CA), és 4 °C-on néhány órát inkubáltuk 5-10 ml nyúl-antimerozoit szérummal. Az antitestkomplexeket 5 mg Staph-A proteinnel jégen 20 percig történő második inkubálással összegyűjtöttük, és 15 percig Eppendorf-centrifügában centrifugáltuk. Az üledékeket négyszer átmostuk IP pufferrel, és az antitestreagenssel immunológiailag kicsapott, jelölt fehérjéket a komplexből SDS gél mintapufferben (65 mM Tris 6,8-as pH-n, 0,5% SDS, 5% béta-merkaptoetanol, 10% glicerin, 0,1% brómfenol-kék) 5 percre 100 °C-ra való hevítéssel eluáltuk. Az SDS poliakrilamid gélelektroforézist (SDS PAGE) úgy hajtottuk végre, ahogy azt Laemmli leírta [Natúré 227:680 (1970)].

A nyúlantiszérummal elért eredményeket immun csirkeszérum felhasználásával erősítettük meg, melyet a következők szerint készítettünk:

Csirkéket csiraképes E. tenella spórás oocystáival történő ismételt fertőzéssel immunizáltunk (100000 oocystával, 3-szor 2 hetes időközönként adva). A vért szívpunctióval nyertük, és az antitesteket tartalmazó szérumot az olvadt törmeléktől 2500 xg-n 5 percig tartó centrifugálással különítettük el.

Összehasonlító vizsgálatokat végeztünk, amelyek során mind az antimerozoita nyúlszérumot, mind az immun csirkeszérumot felhasználtuk a ¹²⁵I-dal felszínen jelölt Eimeria merozoita fehérjék és poli-A-tartalmú merozoita-RNS in vitro transzlációs termékeinek immunológiai kicsapására. A kicsapott fehérjéket SDS PAGE-nek vetettük alá, és standard fluorográfiás technikák és reagensek használatával fluorográfiával tettük láthatóvá.

A vizsgálatok azt mutatták, hogy mindkét forrásból származó fehéqéket mindkét szérum kicsapott. így mindkét szérumot felhasználhattuk Eimeria proteinek kifejezésére alkalmas genetikai rekombinánsok screenelésére. Egyszerűség kedvéért a nyúl-antimerozoita szérumot használtuk először az alábbiakban leírt screenelőelj árasokban. Immun csirkeszérumot használtunk azonban cDNS-könyvtár párhuzamos screenelésére, az alábbiakban leírtak szerint. Ez lényeges volt a fertőző organizmusok elleni immunválaszban valószínűleg fontos fehéijék azonosításában, mert csak a csirkeszérum termelődött élő organizmus általi kihívásra kialakuló válaszreakcióként. Csak az immunizált csirkék voltak demonstrálhatóan ellenállók ilyen organizmusokkal szemben.

Nyúl-antimerozoita szérum Eimeria fehétjékre való specifitásának növelése céljából antitestszelekciót Hall és társai [Natúré, 311:379 (1984)] által lényegében leírt szérumokon hajtottunk végre. Röviden: antitesteket, amelyek specifikusak a rekombináns fág-klón (lásd az alábbiakban) kifejezésével kialakított prekurzorfehérjékre, nyúl-antimerozoita szérumtól a következők szerint tisztítottunk meg.

A pozitív fágokból nagy sűrűségű lemeztenyészetet készítettünk, amelyet 42 °C-on 3,5 órán át növesztettünk. A fúziós fehérjék kifejezését a lemez 10 mM-os izopropil-tioglaktoziddal (IPTG) telített nitro-cellulózszűrővel történő lefedésével indukáltuk, és az inkubációt 37 °C-on 6-8 órán át folytattuk. Az antigénnel telített szűrőket TBS-ben (20 mM Tris-HCl 8,0-as pH-n, 150 mM NaCl) átmostuk, és 8-10 órán át 4 °C-on inkubáltuk antimerozoita szérum feleslegével, amelyet E. coli gazdabaktériummal előabszorbeáltunk. A szűrőket 3-szor átmostuk azért, hogy a nemspecifikus antitesteket eltávolítsuk.

A szűrőkön levő fúziós proteinekhez specifikusan kötődő antitesteket 2,0 ml, 2,6 pH-jú, 0,1 M-os glicerinnel, 0,15 M NaCl-dal eluáltuk (15 percig 20 °C-on). Az eluált antitesteket azonnal semlegesítettük azonos mennyiségű, 8,0 pH-jú, 0,1 M-os Tris-HCl-al. Ezután a szelektált antitesteket (a továbbiakban „antigénszelekciós antitestek”) felszínen jelzett merozoitok vagy in vitro transzlációs termékek immunológiai kicsapására használtuk, vagy szondákként teljes merozoita-fehéijék Western blotjaiban. Kontrollszérumokat az antigén-szelekciós eljárások során nem rekombináns fágot használva készítettünk.

A Western biot és az immunbiológiai kicsapásanalízisek, melyekhez antigénszelekciós antitesteket használtak, eredményeit a 2. ábra mutatja. A jelölt fehéijék immunológiai kicsapásának termékeit fluorográfiával tettük láthatóvá, ahogyan ezt Bonner és társai [Eur. J. Biochem, 46:83 (1984)] leírták. Az ábra jobb oldalához tartozó számok a molekulatömeget jelölő fehérjék helyzetét mutatják, a jelzett tömeget kilodaltonban mérve.

A 2. ábra „A” lemeze a teljes merozoita-fehéijék immunoblotját mutatja, melyhez kontroll (a) vagy antigénszelekciós antitestet (b) használtunk szondaként. A „B” lemez ¹²⁵I-dal felszínen jelölt merozoitafehérjéket mutat, melyeket kontroll (a) vagy antigénszelekciós antitesttel (b) immunológiailag kicsaptunk.

HU 217 420 Β

Merozoit mRNS izolálása és in vitro transzlációja

Az 1 χ 10⁹-1 χ 10¹⁰ organizmust tartalmazó fagyasztott merozoita-üledékeket 1 mM-os ditiothreitolt (DTT) és 300 egységnyi RNasint (Promega Biotec, Madison, WI) tartalmazó 10 ml TEL/SDS pufferben [0,2 M TrisHC1, 0,1 M LiCl, 25 mM EDTA, 1% (tömeg/térfogat) nátrium-dodecil-szulfát (SDS) 8,8 pH-η] felolvasztottuk, és egy teflonborítású szövethomogenizálóban 10-12 fordulattal homogenizáltuk. Az oldhatatlan törmeléket 3000 xg-n hidegen történő centrifugálással különítettük el. A felül úszó folyadékot kétszer kivontuk TEL pufferrel ekvilibrált fenol: kloroform: izoamilalkohol (24:24:1, térfogat/térfogat) eleggyel.

A vizes fázist 100 mg/ml proteináz K-val 37 °C-on 30 percig emésztettük, és azonos térfogatnyi fenol:kloroform (1:1) eleggyel újra kivontuk, és a nukleinsavat 2 térfogategységnyi etanollal kicsaptuk 1 óra alatt szárazjégen vagy fél nap alatt -20 °C-on. Az üledéket 10000 xg-n 1 órás centrifugálás után TE-ben (10 mM Tris-HCl 7,5 pH-n, 2 mM EDTA) újraszuszpendáltuk, és egy 4 ml CsCl-pámán (5,7 M CsCl, 0,1 MEDTA) keresztül 150000 xg-n 20 órát 15 °C-on centrifugáltuk. Az RNS-üledéket 0,2 M kálium-acetátból 2,5 térfogategységnyi etanollal újra kicsaptuk. Ezt a teljes RNS-t egyszer oligo-dT cellulózon keresztülvittük poli(A)+RNSvel való dúsítás céljából, ahogyan Maniatis leírta: Supra, 197. oldal 5xl0⁹ merozoitból származó 1,9 mg teljes RNS-termék körülbelül 20 pg poli(A)+RNS-t tartalmaz.

0,1 és 0,5 pg közötti mennyiségű mRNS-t használtunk in vitro fehérjeszintézis végrehajtására nukleázkezelt nyúl retikulocyta lizátumban (Mersham Corp., Arlington Heights, IL, USA vagy Promega Biotec), melyet a reakcióelegy 20 ml-eiként 10-20 mCi 35Smetioninnal egészítettünk ki. Az in vitro transzlációs termékeket immunológiai kicsapással analizáltuk, melyet SDS PAGE követett, és a fent leírt fluorográfíával tettük láthatóvá. Az eredményeket a 2. ábra C lemeze mutatja.

A C lemez c oszlopa a poli(A) tartalmú merozoit RNS révén előállított termékek teljes keverékét mutatja. A b, a és d oszlop transzlációs termékeket mutat, melyeket immunológiailag kicsaptunk egy lambda 5-7-nek elnevezett rekombináns fág-klónnal (lásd alábbiakban; ez a klón egy, a 33 kilodaltonos Eimeria prekurzorfehéijét kódoló gént fejez ki), egy másik, antimerozoita szérummal reagáló fág-klónnal és egy nem rekombináns lambda gtll ki ónnal szelektált antitestek révén.

Megjegyezzük, hogy a 33 kilodalton körüli molekulatömeggel rendelkező fő fehéije a 2. ábra C lemezének a és b oszlopaiban látható. Ez a fehérje nincs jelen az antigénszelekciós antitestekkel szondázott teljes merozoit fehérjéket tartalmazó oszlopban (A lemez, b oszlop), de egy 23 kilodaltonos sáv látható ezen a gélen (a nyíl az A lemez b oszlopában). A 23 kilodaltonos fehérjét antigénszelekciós antitestekkel szintén kicsaptuk a ^,25I-dal jelölt merozoit fehérjékből, ahogy a 2. ábra B lemezének b oszlopa mutatja. Ezek a megfigyelések együttesen arra utalnak, hogy a 33 kilodaltonos prekurzorfehéije érett merozoitokban proteolitikus hasítással 23 kilodaltonos felszíni antigénné alakítható át.

Egy merozoit cDNS-kifejező könyvtár elkészítése

A kettős szálú cDNS-t 6 pg merozoit poli(A)+RNSből szintetizáltuk, ahogy Gubler és társai: Gene 25:263 (1983) leírták, reverz transzkriptázt (BRL, Gaithersburg, MD, USA) használva egy oligo (dT) primerből való elongáció céljából, és E. coli DNS-polimeráz 1-et használva (New England Biolabs, Beverly, MA, USA) a komplementer lánc szintézise céljából. Ezután a kettős szálú cDNS-t tompa végűvé alakítottuk (blunt-end) T4 DNS-polimerázzal (BRL) és Eco Rí linkereket (GGAATTCC, Collaborative Research Inc., Bedford, MA, USA) csatlakoztattunk Eco Rí metilázzal való kezelés után (New England Biolabs) az előállítók eljárásszabályzatát követve.

EcoRI-vei való emésztés után a cDNS-eket Biogel A-50M-ben frakcionáltuk, a linkermolekulák fölöslegének és a körülbelül 300 bp-nél kisebb cDNS-ek eltávolítása céljából, ahogyan Huynt és társai, infra, leírták. A cDNS-t ezután etanolból való kicsapással koncentráltuk.

A könyvtárat Ágt 11-ben (Stratagene Cloning Systems, San Diego, CA) készítettük el, ahogyan Huynt és társai leírták [D. Glover-ben (ed.), DNA Cloning,

I. kötet, A Practical Approach (1985), IRL Press, Washington, DC, USA, 49-78. oldal]. Az EcoRI cDNS fragmenseket EcoRI-emésztctt, defoszforilált Ágtll karokhoz kapcsoltuk (Stratagene Cloning Systems), és a végtermék-DNS-t fágba csomagoltuk Gigapack™ kittel (Stratagene Cloning Systems) a gyártó eljárásszabályzatát követve.

A kapott könyvtárat Y1088 (ATCC 37195) gazdasejtekre téve lemezen sokszoroztuk. A rekombinánsok százalékos arányát a kék és színtelen foltok arányában körülbelül 90%-ra becsültük X-gal lemezen (Maniatis, Supra, 24. oldal) izopropil-tiogalaktozid jelenlétében (IPTG, Sigma Chemical Co.).

A cDNS-könyvtár immunológiai screenelése

A Ágtll merozoit cDNS expressziós könyvtárat Y1090 sejtekre telepítve lemeztenyészetet készítettünk 150 mm-es lemezenként körülbelül 10000 foltnyi sűrűséggel. Hat ilyen lemezt 3,5 órán át 42 °C-on inkubáltunk, lefedtük a béta-galaktozidáz fúziós fehérje expressziójának indukálása céljából előzetesen 10 mM IPTG-vel átitatott nitro-cellulóz-szűrőkkel, és további 4-5 órától fél napig terjedő időtartamig, 37 °C-on inkubáltuk. A szűrőket eltávolítottuk a lemezekről, és néhányszor szakaszosan (20 mM Tris-HCl 8,0 pH-n, 0,15 M NaCl) átmostuk. A nem specifikus foetusszérummal szobahőmérsékleten 1 órán át tartó inkubálással blokkoltuk.

A szűrőket ezután 1 órán át inkubáltuk nyúl-antimerozoit szérummal, melyet Y1090 (ATCC 37197) sejtekkel előadszorbeáltunk 20%-ban borjúszérumot tartalmazó TBS-ben 1:100 arányban hígítva. A nem specifikus antitesteket egymás után elvégzett TBS-es mosásokkal, melyek közül egy tartalmazott 0,1% NP40-et, távolítottuk el. A szűrőket szobahőmérsékleten 1 órán át inkubáltuk kecske anti-nyúl peroxidáz konju12

HU 217 420 Β gátummal (BioRad, Richmond, CA) TBS és botjúszérum-keverékben 1:100 arányban hígítva. A színreakciót 4-klór-l-naftollal (BioRad) hoztuk létre, a gyártó eljárásszabályzatát követve.

A screeneléshez immunizált csirkék szérumát is használtuk. Ezt a szérumot Y1090 sejtekkel előadszorbeáltuk, és a nyúlszérummal megegyezően hígítva használtuk. A nyúl anti-csirke antitesteket szekunder antitestekként használtuk, és a kecske anti-nyúl torma-peroxidáz konjugátumot detektáló antitestként használtuk. Az egyes plague-okat másodlagos ernyőn (screen) különítettük el, ugyanazokat a reagenseket használva.

Egy lambda 5-7 elnevezésű klón egy olyan fehérjét termel, amely erősen reagált nyúlszérumból származó antitestekkel. Egy második 1-5 izolátumot immuncsirke szérummal történő screenelés révén azonosítottunk, és bebizonyítottuk, hogy ugyanolyan méretű beépült cDNS-t tartalmaz, mint az 5-7 klón. A DNS-analízis kimutatta, hogy ezek a fág-klónok ugyanazt a merozoitantigént kódolják.

A lambda 5-7 cDNS kifejezése E. coliban

Lambda 5-7-ből származó 1,2 kb-os beépült részt EcoRI emésztéssel és agaróz gélelektrofozésissel izoláltunk (Maniatis és társai, Supra, 157-170. oldal). Az EcoRI-végeket Klenow-polimerázzal hoztuk helyre dATP és dTTP jelenlétében, és BamHI linkereket (GGGATCCC) kapcsoltunk mindkét véghez. A módosított fragmenseket három expressziós vektorba építettük be: pDS56/RBSII, pDS56/RBSII, -1 és pDS56/RBSII, -2 vektorokba a BamHI helyen. Ennek a három vektornak a leírása az alábbiakban olvasható. A beépített fragmenseket mindkét lehetséges orientációban tartalmazó plazmidokat a kompatibilis pDMI.l. plazmidot hordozó E. coli Ml5 törzsébe transzformáltuk, ahogyan Mandel és társai [J. Mól. Bioi. 53:159 (1970)] leírták. Az M15 E. coli törzs által hordozott pDS56/RBSII és pDMI. 1. plazmidokat a 316 695 számú európai közrebocsátási iratban ismertették.

Plazm idkonstrukció

Általában a pDS56/RBSII, -1 és -2 plazmidok tartalmazzák a regulációs promoter/operátor elemeket N25OPSN35OP29 és az RBSII, RBSII(-l) RBSII(-2) kötőhelyeket rendre. Ezek a riboszóma-kötőhelyek az E. coli fág 15 P_G25 promoterének riboszóma-kötőhelyéből származnak (207 459 számú európai közrebocsátási irat) és DNS-szintézissel állították őket elő.

A kifejezés nagy hatásfokának köszönhetően a fent említett plazmidokat E. coli sejtekben csak akkor lehet fenntartani, ha a promoter/operátor egység egy lac represszomak az operátorhoz való kötődésével represszált. A lac represszor a lacl génben kódolt. N25OPSN35OP29 csak akkor represszálható hatásosan, ha elegendő számú represszormolekula van jelen a sejtekben. Ezért a lac h-allélt használtuk, amely egy, a represszor gén megnövekedett pressziójáért felelős mutáns promotert tartalmaz. Ez a lac 1 u-allél a pDMI.l plazmidon jelen van, ahogy az alábbiakban olvasható.

A pDMI. 1. plazmid hordozza - a lac 1 génen kívül a neomicin-foszfotranszferáz gént, amely kanamicin-rezisztenciát biztosít a baktériumoknak és amelyet szelekciós markerként használtunk. A pDMI. 1. kompatibilis a pDS56/RBSII, -1 és -2 plazmidokkal. E. coli sejteknek, melyeket pDS56/RBSn, -1 és -2 expressziós vektorokkal transzformáltunk, tartalmazniuk kell pDMI.l.-et, amely biztosítja, hogy az expressziós vektor a sejtben stabilan tartott legyen. A rendszert IPTG-nek a médiumhoz való adásával indukáltuk.

pDS5 6/RBSII plazmid

A pDS56/RBSII-nek az a része, amelyik a két Xbal és Xhol extrikciós hasítási hely között fekszik, és amelyik a béta-laktamáz számára (ez a sejteknek ampicillinrezisztenciát kölcsönöz) a gént és replikációs helyet tartalmaz (4. és 5. ábra), eredetileg a pBR322 plazmidból származtattuk le [Bolivár és társai: Gene 2:95-113 (1977); Sutchiffe, Cold Spring Harbor Symp. Quant. Bioi. 43:77-90 (1979)]. A béta-laktamáz génjét azonban módosítottuk a HincII és PstI restrikciós enzimek hasítási helyeinek eliminálásával. Ezek a változások a DNS-szekvenciában nincsenek hatással a béta-laktamáz aminosavszekvenciájára. A plazmid megmaradó része hordozza az N25OPSOP29 regulációs promoter/operátor egységet, amelyet az RBSII riboszóma-kötőhely, amely egy EcoRI/BamHI fragmens része, Sáli, PstI és HindlII restrikciós enzimek hasítási helyei, E. coli lambda-fágjának terminációs helye [Schwarz és társai: Natúré 272:410-414 (1978)], a klóramfenicol acetiltranszferáz promotermentes génje [Marcoli és társai: FEBS Letters, 110:11:14 (1980)] és az E. coli rmB operonjának TI terminátora [Brosins és társai: J. Mól. Bioi. 148:107-127 (1981)] követ.

pDS56RBSII(-l) plazmid

A pDS56/RBSS(-l) plazmid (6. és 7. ábra) hasonló a pD56/RBSII plazmidhoz, de RBSII(-l) riboszómakötőhelyet tartalmaz.

pDS56/RBSII(-2) plazmid

A pDS56/RBSII(-2) plazmid (8. és 9. ábra) hasonló a pD56/RBSII plazmidhoz, de RBSII(-2) riboszómakötőhelyet tartalmaz.

A különbség e három plazmid között az, hogy az ATG start kodont követő egy nukleotidban eltérnek egymástól, mindhárom potenciális leolvasási kerettől fehérjeexpressziót eredményezve.

pDMI. 1. plazmid

A pDMI. 1. plazmid a Tn5 transzpozonból származó neomicin-foszfotranszferáz génjét hordozza [Beck és társai: Gene 19:327-336 (1982)], amely kanamicin-rezisztenciát kölcsönöz az E. coli sejteknek, és hordozza a lacl gént [Farabough: Natúré 274:765-769 (1978)], a promoter N mutációval [Calos: Natúré 274:162-765 (1987)], amely a lac represszort kódolja. Továbbá a pDMI.l. plazmid tartalmazza a pACYC184 plazmid egy régióját [Chang és Cohen: J. Bacteriol. 134:1141-1156 (1978)] amely tartalmazza az összes szükséges információt a replikációhoz és a leánysejtbe való biztos átörökítéshez.

Rámutatunk arra, hogy bármely E. coli-expressziós rendszert a fent említett plazmiddal összehozva felhasználható ebben a kísérletben.

A transzformált baktériumokat 37 °C-on LB tápközegben (Maniatis és társai, Supra, 68. oldal) tenyésztet13

HU 217 420 Β tűk, és a fehéqe kifejezését 1 mM IPTG-nek a tápközben való hozzáadásával indukáltuk. 1 órás inkubálás után 1 ml-es mintákat vettünk, és a mintákban levő sejteket centrifugálással gyűjtöttük össze. A sejtes üledékeket Crowl és társai alábbi leírása szerint kezeltük, és a lizátumokat SDS PAGE-nek vetettük alá. Az elektroforézist követően a gélekben levő fehéijéket vagy Coomassie briliáns kékkel megfestettük, vagy nitro-cellulóz-membránokra vittük át a fent leírt nyúl-antimerozoit szérum felhasználásával történő Western blot-analízis céljából [Towbin és társai: Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76:4350 (1979); Bumetti: Anal. Biochem. 112:195 (1981)].

Az analízis azt mutatta, hogy az 1,2 kb cDNS-molekula mind a három leolvasási keretben egy orientációban kódolt egy fehérjét, amelynek a molekulatömege SDS PAGE-s mérés szerint 33 kilodalton és a nyúlantimerozoit szérumból származó antitestekkel reagált.

DNS-szekvencia analízise

Általában 1 ml telített, egyéjszakás kultúrákból származó plazmid-DNS kis léptékű izolálását Bimbóim és társai [Nucleic Acid Research 7:1513 (1979)] eljárását alkalmazva végeztük el. Ez az eljárás lehetővé teszi DNS egy kis mennyiségének analitikai célokból történő izolálását egy baktériumkolóniából. A plazmid-DNS nagyobb mennyiségeit 1 literes kultúrák felhasználásával állítottuk elő cézium-klorid-gradienssel működő centrifugálással a standard jegyzőkönyvet követve (Maniatis és társai, feljebb, 93. oldal).

A lambda 5-7-ből származó 1,2 kb-os EcoRI cDNS-inzert DNS-szekvenciáját a következők szerint határoztuk meg: az inzertet EcoRI-vel hasítottuk, gélelektroforézissel tisztítottuk, és EcoRI-val hasított pEVvrf plazmidhoz kapcsoltuk, ahogyan Crow és társai leírták [Gene 38:31 (1985)]. A plazmidot pEV/5-7-nek neveztük el, és felhasználtuk az 1,2 kb-os cDNS-inzert hibridizációs analízisre (lásd alábbiakban a leírást) való alkalmassá tételére és előzetesen DNS-szekvencia-analízisre Zagursky és társai módszere szerint [Gene Anal. Tech. 2:89(1983)].

A teljes DNS-szekvencia meghatározásához az 1,2 kb cDNS-inzertet a pEV/5-7-ből, tovább szubklónoztuk az Ml3 mpl9 egyszálú fágvektorban BIORAD™ M13 Cloning Kit-et és a SEQUENASE™ szekventáló Kit-et használva. A szekvenciát didezoxi láncterminációval határoztuk meg, Sanger és társai módszere szerint [Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74:5463 (1977)] a SEQUENASE™ Kit-ben javasolt jegyzőkönyvet követve (United States Biochemical Corp., Cleveland, OH, USA).

A pEV/5-7-ből származó 1,2 kb cDNS, amely magában foglalja az 5’ és 3’ le nem fordított régiókat is, teljes nukleotidszekvenciáját az 1. ábra mutatja.

A cDNS-szekvencia szerint a 68-as helyzetben levő ATG és a 1013-as helyzetben levő TGA stop kodonok között 315 aminosavat kódoló nyílt leolvasási keret van, ahogyan az 1. ábra mutatja.

Erre a proteinre vonatkozó 33,375 dalton elméleti méret korrelál a merozoit mRNS in vitro transzlációs termékével (lásd 2. ábra, C lemez, a sáv), melyet antigén-szelekciós antitest felhasználásával a fent leírt E.

coli-expressziós vektorokban cDNS kifejezésével előállított proteinnel immunológiailag kicsaptunk.

A lambda 5-7 cDNS-inzert által kódolt fehéije kikövetkeztetett aminosavszekvenciájának analízise (1. ábra) szerint a kikövetkeztetéshez használt algoritmustól függően az első 20 vagy 75-től 95-ig teijedő amino-terminális aminosavmaradék összességében hidrofób tulajdonságú, szignálpeptid-funkció lehetőségét jelezve. A szignálpeptid-szekvencia tehát akár az első körülbelül száz aminoterminális aminosavból állhat. Azt mutattuk ki, hogy a polipeptid, melyet merozoit mRNS in vitro transzlációjával állítottunk elő és immunológiai kicsapással tisztítottunk, körülbelül 35 kDa molekulatömegű a prekurzor formájában és körülbelül 23 kDA az érett formában. Ahogy azt a fentiekben említettük, a prekurzor forma mérete jól egyezik a protein elméleti méretével. Mindamellett az érett forma képviselheti egy belső vagy /V-terminális ffagmensét is a prekurzor molekulának. Az aminoterminális pontosan meghatározható jól ismert módszerekkel.

A megadott aminosavszekvenciájú számos polipeptid-tartományban epitópok rendelhetők a hidrofllíai kritériumok - J. P. Hopp és K. K. Woods [Proc. Natl. Acad. Sci., USA 78:3824-9828 (1981)] - és a másodlagos szerkezeti kritériumok - P. Y. Chon és G. D. Fasman szerint [Advances in Enzymology 47:45-148 (1987)] - kombinációja alapján.

Az alábbi tartományok antitestek számára lehetséges epitópokat tartalmaznak:

S₇₉-V₈₆ (SEQIDNO: 3)

C₉₅-K₁₂₃ (SEQ IDNO: 4)

Pi37-V,₃₉ (SEQIDNO: 5)

R_i47-F₁₅₂ (SEQ IDNO: 6)

N,₅₅-E₁₆₂ (SEQ IDNO: 7)

R₁₆₉-E₁₇₃ (SEQIDNO: 8)

T₁₈₁-E₁₈₆ (SEQIDNO: 9)

Qi96-G₂₂₅ (SEQ IDNO: 10)

T_?39-G₂₄₃ (SEQIDNO: 11)

T₂₅₂-G₂₅₆ (SEQ IDNO: 12)

A₂₆₅-K₂₆₉ (SEQ IDNO: 13)

D₂₇₆-K₂₈₉ (SEQ IDNO: 14)

T₂₉₈-E₃₁₅ (SEQIDNO: 15)

Ezenkívül T-sejt-epitópok elméleti alapokon származtathatók le Berzofsky amfifilicitási kritériumai szerint [Good és társai: Science 236, 1059-1062 (1962)]. T-sejt-epitópokat antigénekből készítettük el [Η. M. Grey és R. Chestnut, Immunoi. Today 6:101-106 (1985)], intracellulárisan transzportáltuk [Schwartz A. L.: Ann. Rév. Immun. 8:195-229 (1990)], és T-sejt receptorkomplex révén azonosítottuk. Bár némelyik algoritmust elsődlegesen II. osztályú antigénhelyek azonosítására terveztek, az I. osztályú peptidekkel való interakciókkal mutatott hasonlóság miatt citotoxikus T lymphocyták célpeptidjeinek azonosítására is alkalmazhatók [Feller és de la Cruz: Natúré 349:720-727 (1991)].

Ezenkívül egy potenciális glikozilációs hely van a 20-as helyzetű (D₂o) aszparagin-aminosavnál. Köztudott, hogy a szénhidrátcsoportok fontos adottságokat biztosítanak, úgymint konformációs stabilitást, proteá14

HU 217 420 Β zokkal szemben ellenállást, töltést és vízkötő kapacitást. Megjegyzendő azonban, hogy a D₂₀ is része a vezető szekvenciának, és így előfordulhat, hogy nincs jelen az érett fehérjében. A szénhidrátcsoportok biológiai felismerésben betöltött fontos szerepének áttekintése céljából lásd J. C. Paulson, TIBS 14:272-276 (1989).

Hibridizációs analízis

A DNS-t izoláltuk excisztált és spormulázott spórás oocystákból tripszinnel, epével történő kezelés és PBS-szel való mosás után, a következők szerint: a parazitatartalmú anyagot (körülbelül 10⁹ oocysta) szuszpendáltuk 20 ml 8,0 pH-jú, 0,5% sarcosil-tartalmú, 0,5 M EDTA-ban (Sigma, St. Louis, MO, USA), és proteináz K-val emésztettük (Boehringer-Mannheim, FRG), 0,1 mg/ml koncentráción 2 órán át 50 °C-on, RNase-zal (10 mg/ml) 1 órán át 37 °C-on és újra proteináz K-val 1 órán át 50 °C-on. A fehérjét eltávolítottuk két 20 mM 7,5 pH-jú TrisHCl-, 1 mM EDTA-val (TE) telített fenolos kivonással és egy fenol/kloroform (1: l)-os kivonással. A vizes fázist alaposan dializáltuk TE-vel szemben, és etanolos kicsapással koncentráltuk. 1 χ 10⁶ oocystánként 0,4 mg jellegzetes mennyiségű DNS-t nyertünk.

A parazita DNS-t különféle restrikciós endonukleázzal hasítottuk a gyártók protokolljait követve, és a kapott DNS-fragmenseket 40 V-on 2,5 órán át 0,8% agaróztartalmú Leoning-pufferben (4,7 g NaH₂PO₄, 4,36 g Tris-bázis, 0,372 g Na₂EDTA/liter, 7,6-os pH-n) elektroforézissel oldottuk. A gélt 0,25 M HCl-al 30 percig kezeltük, és 0,4 M NaOH-ban fél napra egy Zeta-Probe-membránba (BIO-RAD™) juttattunk. A szűrőt 2xSSC (6,8-os pH)-ban semlegesítettük, és 80 °C-on 1 órát vákuum alatt hevítettük.

A szűrőt 65 °C-on 3 órán át 7%-os, 1% BSA (Boehringer, V frakció) 0,5 M-os, 7,2 pH-jú Na₂HPO₄ pufferben előhibridizáltuk. Az 5-7 gén beépített EcoRI fragmenst géllel izoláltuk a pEV/5-7 plazmid EcoRIvel történő - fent leírt - hasítását követően, és Klenowfragmensekkel történő ³²P-val jelzett dezoxinukleotidok jelenlétében random-priming útján jelöltük. A jelzett beillesztett fragmenseket elkülönítettük a nem beépült nukleotidoktól Spin-Column-okban (BIO-RAD™), denaturáltuk, és hozzáadtuk a hibridizációs oldathoz. 12 órán át 65 °C-on történő inkubálást követően háromszor átmostuk 2xSSC/0,l% SDS-szel és kétszer 0,1 xSSC/0,1% SDS-szel 65 °C-on. A genom szondához hibridizálódó DNS-fragmenseit autoradiográfiával detektáltuk. Bár itt a pEV/5-7 plazmidot használtuk, nyilvánvaló, hogy bármely ekvivalens vektor, amely a merozoit 5-7 gén 1,2 kb-os cDNS-fragmensét tartalmazza, szintén megfelelően viselkedik.

Ennek az analízisnek az eredményét a 3. ábra mutatja, ahol a Pvull-(l), Hincll-(2), Pstl-(2), Sphl-(4) vagy Sacl-es-(5) eredményei láthatók.

A genom 6,5 és 3,5 kb-os DNS-fragmenseit Pvullés Sacl-gyel való hasítást követően detektáltuk az 1, illetve 5 oszlopokban. Mivel a cDNS-klónban ezekre az enzimekre nincsenek hasítási helyek, az Eimeria gén maximális mérete 3,6 kb-ra tehető.

Három fragmenst Pstl-gyel (3 oszlop) való hasítást követően detektáltunk. Két Pstl-hasítási helyre következtettünk a cDNS-szekvenciából, amely egy 306 bp-s belső fragmenst (ebben a Southern blot-ban a detektáláshoz túl kicsi) és két kapcsolófragmenst szolgáltat. Egy harmadik nagy Pstl-fragmens megjelenése a legjobban a belső Pstl-helyek közötti intron jelenlétével magyarázható.

Az Sphl (4 oszlop) révén előállított fragmensek mintája, amely szintén kétszer hasít a cDNS-ben, nem szolgáltat határozott információt. A kis, 604 bp-s belső Sphl-fragmens, melyre a cDNS-szekvenciából következtettünk, nem volt detektálható ebben a gélben.

A genom-DNS EcoRI-vel történő hasítása egy 1,2 kb-os genomból származó fragmenst eredményezett, amely méretét tekintve megfelel a cDNS-fragmensnek. Hlncll- és EcoRI-vel való kettős hasítás 0,9 kb-os fragmenst (nem bemutatott) eredményezett. Egy, a merozoitokból izolált poli(A)-tartalmú mRNS Northern blotanalízisében [Alwine és társai: proc. Natl. Acad. Sci. USA 74:5350 (1977)] a lambda 5-7 gén 1,2 kb-os cDNS-fragmensét egy körülbelül 1,3 kb hosszúságú, egyetlen mRNS-fajtához hibridizáltunk. A méret korrelációjából nyilvánvaló, hogy az 5-7 klón a fent említett 1-5 izolátumból meghatározott 5’ kiterjesztéssel együtt a cDNS szekvenciájának teljes hosszát képviseli, az 5’vég nukleotidjainak lehetséges eltéréseivel együtt.

2. példa

Csirkék E. tenella merozoit 5-7 antigénnel való immunizálásának egy hatásosabb módja kialakítása céljából, a fent említett 1,2 kb-os cDNS-t vaccinia(tehénhimlő) vírusban klónoztuk. Az ily módon előállított vacciniavírust alegységnyi kokcidiózisvakcinaként használtuk csirkék beoltására.

A vektor szerkesztése

Az előállított rekombináns vacciniavírus (rVV) összes formája virális timidin-kináz lokuszba történő homológ rekombináción alapul, ahogyan azt Macket és társai [Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79:7415 (1982)] leírták. A TK lokuszt a vacciniavírus (VV) HindlII J-fragmenséhez igazítottuk [Hruby és társai: J. Virol. 43:403 (1982)], és ennek a fragmensnek egy részét szekvenciáltuk [Weirés társai: J. Virol. 46:530 (1983)].

A pUC8-TK-7,5K rekombinációra szánt vektor konstrukcióját alapjaiban a 344808 számú közrebocsátási irat közli. Röviden: a vektor tartalmaz egy pUC8 plazmidvázat, amely a vacciniavírus TK-gént tartalmazza a W7,5K promoterrel megszakítva [Venkatesan és társai: Cell 25:805 (1981)]. A promotertől lefelé, a transzkripció iránya szerint, egy többszörös klónozási helyet szerkesztettünk a génexpresszió megkezdésének lehetővé tételére. A 12. ábra a pUC8-TK-7,5K plazmid vázlatos rajzát mutatja.

Konstrukciónk előállítása céljából a merozoit 5-7 gént kódoló EcoRI-fragmenst klónoztuk a 12. ábrán látható alapvektor által tartalmazott polilinker EcoRI-helyénél. A fragmenst helyes orientációban tartalmazó szerkezeteket szaporítottuk és módosítottuk, ahogyan az alábbiakban olvasható, a merozoit 5-7 gén

HU 217 420 Β természetes start kodonjától 97 nukleotiddal feljebb elhelyezkedő kereten belüli start kodon törlése céljából. Ennek érdekében a plazmidot Smal és BglII restrikciós enzimekkel hasítottuk. A BglII hasítási hely tompává tétele után, a négy dezoxiribonukleotid jelenlétében Klenow-enzimmel a plazmidot újra összekapcsoltuk, és a várható törlési helyet tartalmazó pR3 konstrukciót (13. ábra) szaporítottuk, és a vacciniavírusba történő rekombinációra használtuk. A 14. ábra ennek a rekombinációs plazmidnak a teljes szekvenciáját mutatja.

Ezenkívül az 5-7 merozoitgént beillesztettük a Dral-Hindlll malária fő antigént tartalmazó vektorral rekombináció céljából. Ez a vektor, melyet a 344 808 számú európai közrebocsátási iratban írtak le, a pUC8-TK7,5K vektoron alapul, de ezenfelül tartalmazza a 7,5K promotertől lefelé a 190 kDa-os malária vezető (leader) antigénszekvenciáját. Ezzel a vezető szekvenciával szomszédosán egy többszörös klónozóhelyet szerkesztettünk, lehetővé téve a génkifejezés megkezdését. A kapott VV7,5K promoterrel vezetett transzkriptumot az ,V-terminálisán a 190 kDa-os malária vezető antigént hordozó fehérjébe fordítjuk le. A vezető szekvencia potenciális hasítási helyénél történő in vivő feldolgozás az érett fehérjéhez vezet. A 15. ábra az 5-7 merozoitgént tartalmazó pR4 szerkezet vázlatos rajzát mutatja.

A rekombináns vacciniavírus szerkesztése cm²-es lemeztenyészet-kultúrákba telepített CV1 sejteket 33 °C-hoz szélesztünk, és 80-90% egybefolyásig növeltünk, majd megfertőztünk a vacciniavírus hőmérséklet-érzékeny ts N7 mutánsának sejtenként 0,1 plakk-képző egységével (pfu) [Drillien R. és Spehner D.: Virology 131:385-393 (1983)]. Egy CO2 inkubátorban a 33 °C-os hőmérsékleten eltöltött 2 óra után [Kieny és társai: Natúré 312:163 (1984)] a sejteket keresztfertőztük 0,25 ml kalcium-foszfátos DNSprecipitátummal, ahogyan Weir és társai leírták [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 79:1210-1214 (1982)]. A kalcium-foszfátos DNS-precipitátum-keverék tartalmaz: 0,8% NaCl-, 0,038% KC1-, 0,0134 M Na2HPO42H2O-, 0,1% glukózt 7,0 pH-η és 125 mM CaCl2-, 200 ng vaccinia-DNS vadtípusát (WR-törzs) és 100 ng megfelelő pR³ és pR⁴ rekombináns plazmidot. Szobahőmérsékleten eltöltött 1 óra után további tápközeget adtunk a lemeztenyészethez, amelyet 2 órás 39,5 °C-on egy 5% CO2 inkubátorban történő inkubálás követett. Ezen a hőmérsékleten a ts N7 vírus nem replikálódhat, szelekcióit eredményezve így azoknak a vírusoknak, amelyek legalább a ts 7 helynél rekombinálódtak.

39,5 °C-on 2 napos inkubálás után a sejteket összegyűjtöttük a lemezről lekaparva, és a szuszpenziót tovább roncsoltuk magas frekvenciájú hanghullámokkal. Ezt a homogenizátumot felhasználtuk TK negatív vírus (TK ) előállítására humán TK 143 sejteken 30 pg/ml-es bróm-deoxiuridin (BUdk) jelenlétében történő títrálással. A plakkokat összegyűjtöttük, és a vírust tovább tisztítottuk csoportonként (plakkonként) kétszer humán TK 143 sejtekben 30 pg/ml-es BUdR jelenlétében. Ezután vírustörzsoldatokat készítettünk CV1 sejtekben BUdR távollétében. A rekombináns R3,2, illetve R4,1 vacciniavírust a TK génbe beépített 1,2 kb-os merozoit gén cDNS-ének jelenlétére ellenőriztük a virális DNS HindlII-mal valóshasítása révén és az rVV DNSmintának ugyanazon restrikciós enzimmel hasított vadtípusú (WR) vaccinia DNS-mintájával való összehasonlítása útján. Ha rekombináció történt, a HindlII J DNS-fragmensben egy eltolódás látható egy 1%-os agaróz gélben való elektroforézis után. Ezt valóban megfigyeltük. Az eltolódás korrelációt mutatott az inzert méretéből kikövetkeztetett értékekkel.

Kifejezés ellenőrzése

A merozoit 5-7 antigén kifejezésének a rekombináns vírussal való ellenőrzése céljából CV1 sejteket fertőztünk meg rVV R3,2-vel vagy rW R4,1-gyel, és 48 órán belül összegyűjtöttük azokat. A sejtek centrifugálása után, az üledékeket Laemmli-mintapufferben [Natúré 227:680 (1970)] béta-merkaptoetanol mint redukálóágensjelenlétében oldhatóvá tettük, 5 perces forralás után a mintákat egy 12,5% SDS-PAGE géllemezre töltöttük. Az elektroforetikus elválasztás után a fehérjéket blot-eljárás céljából nitrocellulóz-membránokhoz (Trans-Blot, BIO RÁD) kötöttük Blot-pufferben: 25 mM Tris-HCl, 0,19 M glicin; 8,3-as pH-jú, 20%-os (térf./térf.) metanol, 80 V állandó feszültségen egy Transblot transzfersejtben (BIO RÁD Laboratories) 4 °C-on 2 órára [Towbin és társai: Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76:4350-4365 (1979)].

Immunológiai detektálás céljából a nitro-cellulózt TBS-ben (20 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, 8-as pH-ra beállítva) 5%, zsírt nem tartalmazó tejporral előkezeltük 45 percig, és 2 órán keresztül vagy egy éjszakán át szobahőmérsékleten inkubáltuk TBS-pufferben - amely 20% (térf./térf.) magzati borjúszérumot tartalmaz - 1:50 arányban hígított nyúl-anti E. Tenella merozoit szérummal. Ezután a nitrocellulózt háromszor 10 percig átmostuk TBS-ben, amely 0,1% NP40-et tartalmazott, majd szobahőmérsékleten 2 órán keresztül inkubáltuk TBS és 5%, zsírt nem tartalmazó tejpor keverékében 1:1000 arányban hígított affinitástisztított kecske-anti-nyúl IgG (H+L) peroxidáz konjugátummal (H + L az IgG nehéz- és könnyűláncot jelenti). Ezután a biotokat háromszor átmostuk a fent említett módon. A peroxidáz-konjugátum kötődését a nitro-cellulóz 0,018% 4-klór-l-naftollal 6% metanolt tartalmazó vízben és 0,02% (térfogat/térfogat) hidrogén-peroxiddal való reagáltatásával detektáltuk. A reakciót a biot vízzel történő alapos mosásával állítottuk le.

Azt találtuk, hogy a nyúl anti E. tenella merozoit szérum az Estem blot-eljárás során (Towbin és társai: Supra) rVV R3,2-vel fertőzött CV1 sejtekkel, két elkülönülő, 33 kDa-os, illetve 23 kDa-os sávokba tartozó fehérjékkel reagált. BIO RÁD előfestett SDS-PAGE molekulatömeg-standardokat (alacsony fokozat) használtunk vonatkoztatási alapként. A vadtípusú WR vacciniavirussal fertőzött CV1 sejtek nem reagálnak a nyúl anti E. tenella merozoitszérummal. A 33 kDa-os fehérje mérete korrelál a prekurzorfehérje - 2. ábrán látható, C lemez, b oszlop - elméletileg várt méretével. A kisebb, 23 kDa feltehetően a fent említett prekurzorfehérje feldolgozott formája, amely szintén látható a merozoit felszínén (lásd 2. ábra, A és B lemez, b osz16

HU 217 420 Β lop). Ugyanazokat az eredményeket figyeltük meg rVV R4,l-gyel fertőzött cVl sejtek esetében.

Western blot-analízissel továbbá azt is kimutattuk, hogy sporulázott E. tenella oocystákkal fertőzött csirkék immunizált széruma felismerte a merozoit 5-7 fehérjéket (33 kDa és 23 kDa), melyeket R3,2, illetve R4,l vacciniavírus-rekombinánsokkal fertőzött CVl sejtekben fejeztünk ki.

Vírus termelése

A WR-törzs vírusa majdnem minden sejttípusban sokszorozható [Drillien és társai: J. Virology 28:843 (1978)], és szaporodásuk közvetlenül megfigyelhető plakkok kialakítása révén. A legtöbb esetben CVl sejteket használtunk nagy vírustörzsoldatok készítésére.

A fertőzés céljából a sejttenyészet-táptalajt a 175 cm²-es tenyésztőlombikban (például Falcon 3028) növekvő, 80-90%-ban összefüggő CVl sejtekről eltávolítottuk, és a sejteket a vírust tartalmazó PBS-oldatban (0,1 pfu/ml, 0,01 ml/cm²) inkubáltuk egy órán keresztül (20 °C-on) szobahőmérsékleten. Friss sejtkultúraközeget adtunk hozzá (0,2 ml/cm²), és a lombikokat 2-3 napig 37 °C-on inkubáltuk, amíg a sejtek körülbelül 80%-a nem lizált. Az így nyert törzsoldatot közvetlenül az eredeti tenyésztőlombikokba a sejtekkel és közeggel együtt tároltuk -30 °C-on a vírusok megtisztítását megelőzően.

A következő tisztítási lépéseket használtuk a vírus a gazdasejt specifikus komponenseitől mentes formájának előállítására. A -30 °C-on tárolt, fertőzött sejtkultúrát felolvasztottuk, és a maradék sejteket a lombik felszínéről rázással és kaparással választottuk le. A sejteket és vírusokat kicentrifugáltuk a közegből (Sorvall centrifuge GSA rotor, 5000 rpm-en 1 órát 10 °C-on). A sejtek üledékét a vírusrészecskékkel együtt PBP-ben újraszuszpendáltuk (az üledékhez képest 10-20-szoros térfogatnyi PBS), és a fent leírt módon centrifugáltuk. Ezután ezt az üledéket 10-szeres térfogatnyi RSB-pufferben (10 mM Tris-HCl 8,0 pH-ra beállítva, 10 mM KC1, 1 mM MgCl₂) újraszuszpendáltuk. A megmaradt ép sejtek lizálása és a vírus sejtmembránokból való felszabadítása céljából a fent leírt szuszpenziót magas frekvenciájú hanghullámokkal történő kezelésnek vetettük alá (kétszer, 10 másodpercig 60 watton, szobahőmérsékleten egy hangerősítőben, például Labsonic 1510 egy 4 mm-es szondával). A keveréket egy Sorval GSA rotorban 3 percig 3000 rpm-en 10 °C-on centrifugáltuk. így vírusszuszpenziót állítottunk elő, amely mentes volt a sejtmagoktól és a nagyobb sejttörmelékektől. A felülúszót óvatosan eltávolítottuk, és az üledéket RBS-pufferben újraszuszpendáltuk, és a fent említett módon magas frekvenciájú hanghullámokkal kezeltük, majd centrifugáltuk.

A második felülúszót az elsővel kombináltuk, egy 10 ml 35% szukrózpámára (10 mM Tris-HCl-ben 8,0 pH-η) rétegeztük, és 90 percig 14000 rpm-en egy Beckman SW 27 rotorban 10 °C-on centrifugáltuk. A felülúszót leszívtuk, és a vírusrészecskék üledékét 10 ml 10 mM Tris-HCl-ben 8,0 pH-η újraszuszpendáltuk, magas frekvenciájú hanghullámokkal besugározva homogenizáltuk a keveréket (2-szer 10 másodpercig szobahőmérsékleten a fent említett módon), és gradiens szerint lépésenként továbbtisztítottuk.

A gradiensfokozatokat szacharóz 5 ml-es adagjai 10 mM Tris-HCl-ben alkotják a következő koncentrációkban: 20%, 25%, 30%, 35% és 40%. Ilyen gradienssel egy Beckman SW 27 rotorban 35 percig 14 000 rpm-en 10 °C-on centrifugáltuk. Több, vírusrészecskéket tartalmazó sáv volt látható a 30%- és 40%-os szacharóztartományban. A gradiensnek ezt a tartományát eltávolítottuk, és RBS-szel hígítottuk, majd a vírusrészecskéket szedimentáltuk (Beckman SW 27 rotor 90 percig 14000 rpm-en 10 °C-on). A szinte kizárólag vírusrészecskéket tartalmazó üledéket PBS-ben újraszuszpendáltuk azért, hogy a víruskoncentráció átlag 0,5-1 χ ΙΟ'» pfu/ml legyen.

A víruskoncentráció és a vírustörzsoldat tisztaságának meghatározására két módszert használtunk. A vírusrészecskék abszolút koncentrációját meghatároztuk a törzsoldat optikai sűrűségének (OD) mérésével spektrofotométeren 260 nm-es (OD/260 nm) hullámhosszon, ahol 1 OD/260 nm egyenlő körülbelül 1,2x10'° részecskével ml-enként [Joklik: Virology 18:9 (1962)]. A víruskoncentrációt meghatároztuk továbbá a vírus titrálásával sejteken (plaque assay), feltételezve, hogy 60 vírusrészecskéből csak egy fertőz meg egy sejtet.

A víruskoncentráció titerének meghatározása céljából tenyésztett sejteken csirkeembrió fibroblastjait (CEF) növeltük sejtkultúraközegben 8 cm²-es tenyésztőlemezeken (Falcon 3001). Miután a sejtek 80-90% egybeolvadást elértek, a közeget eltávolítottuk, 2 ml, PBSben hígított vírusoldattal helyettesítettük, és szobahőmérsékleten egy órán át állni hagytuk. A vírustörzsoldatot 10-szeres léptékben hígítottuk. 2 ml, 1% agaróztartalmú, félszilárd sejtkultúraközeget adtunk hozzá mindegyik lemezhez, és a lemezeket 16-24 órára egy CO₂ inkubátorba helyeztük 37 °C-on. Ezt követően 2 ml, 0,2% neutrál vöröstartalmú félszilárd sejtkultúraközeget rétegeztünk rá az élő sejtek megfestése céljából, és a lemezeket további 16-24 órát inkubáltuk. Ezután a színtelen foltokat mikroszkóp alatt megszámoltuk.

3. példa

Csirke-immunizálás

Annak meghatározása céljából, hogy az 5-7 merozoitgént hordozó rVV-R3,2 vacciniavírus-vektor megvédheti-e a csirkéket E. tenella patogén törzsének spórás oocystái ellen, a következő beoltásokat végeztük el.

A WARREN fajtájú tojó kis kakasait, melyeket E. Wuetrich keltető biztosított Belpből (Svájc), drótpadlós ketrecben tartottunk kereskedelmi brojler típusú tápon, amely főként kukoricát, búzát és szójababot tartalmazott. A 17. napon a csirkéket 3χ 10⁸ pfu R3,2 rekombináns vacciniavírussal 100 μΐ PBS-ben beoltottuk, 50 μΐ-t szubkután fecskendeztünk a számybőrbe, egy másik 50 μΐ-t pedig íntramuszkulárisan a mellkasba adtunk. Egyhetes időközökkel az eljárást kétszer megismételtük, de egy kezelt csoport esetében az utóbbi vírus-injekciót E. tenella virulens törzséből (például T7776/21 törzs) 5000 spórás oocystával történő orális be17

HU 217 420 Β oltással helyettesítettük, azért, hogy elősegítsük a csirkék kokcidiózisfertőzésnek való kitételét a természetes körülményeknek megfelelő módon. Egy éttel az utolsó immunizálás után vért vettünk a csirkéktől analitikai célra, és további egy héttel később (45. nap) a madarakat E. tenella (például T7-776/21-törzs) 50 000 spórás oocystájával megfertőztük. Hagytuk, hogy a paraziták befejezzék 7 napos fejlődési ciklusukat, és az 52. napon a csirkéktől vért vettünk, feláldoztuk és felboncoltuk őket. A fertőzött vakbelet eltávolítottuk, a paraziták fejlődésének köszönhető elváltozásokat felmértük, és az egész szövetet homogenizáltuk az oocystatartalom meghatározása céljából. Ezenfelül a csirkék gyarapodását feljegyeztük (napi testtömeg-növekedés és tápanyag-hasznosítás) .

Védelemmel kapcsolatos kísérlet

Az 1. táblázat adatai világosan mutatják, hogy az

R3,2 rekombináns vacciniavírussal történő beoltásnak jelentős védőhatása volt kokcidiózis súlyos kihívása ellen. A beoltás a sérülések mértékét 18%-kal és az oocysta-tartalmat a vakbélben 35%-kal csökkentette a fertőzött kontrolihoz képest. A gyarapodást tekintve, amely gazdasági szempontból a legfontosabb paraméter, a napi testtömeg-növekedés 62%-kal és a tápanyaghasznosítás 56%-kal javult. Amikor azonban az utolsó vírusinjekciót egy enyhe kokcidiózisfertőzéssel helyettesítettük, a csirkék kokcidiózis elleni védettsége közel tökéletes lett. Ezeknek a csirkéknek a gyarapodása megegyezett a nem fertőzött kontrollállatokéval, és a sérülések mértéke, illetve az oocystatartalom a vakbél10 ben egyaránt alacsony volt. Mivel E. tenellával való egyszeri beoltásról még sohasem mutatták ki, hogy ilyen magas fokú védettséget biztosítana, arra a következtetésre jutottunk, hogy a víruson alapuló oltás erős elsődleges immunizációt jelentett a csirkék immun15 rendszerében, és így az azt követő enyhe kokcidiózisfertőzés emlékeztető hatást válthatott ki, ami egy ilyen hatásos kokcidiózis elleni immunológiai védettség eredménye.

A csirkék humorális állapota

A csirkék humorális állapotát közvetett ELISA-val és Western blot-elj árassal analizáltuk a következő módon.

1. táblázat

Az 50000 E. tenella oocystáival való fertőzés után rVV-R3,2 rekombináns vacciniavírussal beoltott csirkék gyarapodása és parazitológiai paramétereik

Kezelés	Csoportok száma/ csirkék száma	Összes testtömeg (g) 45. napon	Összes testtömeg (g) 52.napon	Napi testtömeg- növekedés (g) 45-től 52. napig	Összes tápanyag- hasznosítás 45.-től 52. napig	Vakbél- elváltozás mértéke	Vakbél oocysta- tartalma (Mio/g vakbél)
l. immuni- záció*	2. immunizáció*	3. immunizáció*	E. tenella oocystákkal fertőzve
-	-	-	-	3/12	788,2	985,8	28,2	3,66	0	0
V	V	V	+	3/12	778,1	860,4	11,8	5,19	1,58	1,73
V	V	c	+	3/12	779,3	960,6	25,9	2,98	0,75	0,18
-	-	-	+	3/12	783,0	834,3	7,3	11,88	1,92	2,67

* V=csirkénként 100 μΙ-bcn 3 χ 10⁸ PFU rekombináns vírussal történő injekció C=csirkénként 5000 E. tenella oocystával való beoltás

A Western blot-analízist a fent leírt módon végeztük el, kivéve azt, hogy a csirkeszérum-minták előállítását megelőzően további inkubációs lépést iktattunk be. Ez a lépés a blottolt nitro-cellulóz hiperimmun nyúl anti-vaccinia szérummal való inkubálásából áll (2 órán át szobahőmérsékleten, 1:50 arányú hígítással) az összes vaccinia-specifikus protein eltakarása céljából.

A közvetett ELISA céljából E. tenella harmadik generációs merozoitjait használtuk, melyeket in vitro elsődleges csirkemáj-sejtkultúrákból nyertünk. A mikrotiter-lemezeket 100 ml nátrium-karbonát-bikarbonátpufferben (9,6-s pH) jól feloldott, lemezenkénti 3000 merozoittal bevontuk, és fél napig 4 °C-on inkubáltuk. A lemezeket háromszor átmostuk jódmentesített vízzel, és 200 ml blokkolópufferrel (HCl-dal 6,5-s pHra beállított 0,1 M Na₂HPO₄, 1% BSA, 0,5 g/1 nátriumetilmerkuriszalicilát) újratöltöttük. A blokkolás 4 °C-on fél napig tartott. Állatonként két szérummintát teszteltünk. Az első mintát az utolsó immunizálás után egy héttel vettük, a másodikat csak az állatok feláldozása előtt. A mintákat kétszeres lépésekben hígítottuk 3% tejportartalmú PBS-ben, 1-től 50-szeres hígításig.

4 órán át 37 °C-on (110 ml) inkubáltuk. A lemezeket a fent említett módon lemostuk, majd mélyedésenként 100 ml, peroxidázzal (1:2000 aranyban hígítva 3% tejportartamú PBS-ben) jelzett kecske anti-nyúl (H+L) konjugátumot adtunk hozzá. 2 órán át 37 °C-on inku55 báltuk. Az antitest-antigén komplexeket 100 ml TMBszubsztrát hozzáadásával tettük láthatóvá. A TMBszubsztrát egy rész TMB-ből (0,24 g tetrametil-benzidin 5 ml acetonban feloldva és metanollal 50 ml-re feltöltve) és 20 rész szubsztrátból (0,2 M citromsav 4,0-s pH-n, 275 ml/1 30% H₂O₂) áll.

HU 217 420 Β

A reakciót 0,5 M H₂SO₄-gyel állítottuk le, mielőtt a lemezeket egy ELISA leolvasóban (Titertek Multiskan MCC/340, Flow Labhoratories) 450 nm-en leolvastuk.

A csirkék R3,2 és R4,l rekombináns vírusokkal történő beoltása után a kokcidiózis merozoitokkal szem- 5 ben csak egy gyenge humorális antitestreakciót figyeltünk meg, a spórás oocysták kis dózisával immunizált kontrollállatokhoz (átlag titer > 1:1600) viszonyítva.

Ez arra utal, hogy a pozitív védettséget és a beoltott csirkék által mutatott adatokat (lásd 1. táblázatot és a 10 fent tárgyalt eredményeket) sejt által közvetített effektormechanizmus eredményezheti.

A merozoit 5-7 antigén elleni specifikus antitestek jelenlétét bizonyítandó az ELISA szerint legmagasabb antitesttiterű vérmintákat Western blottal teszteltük, 15 rVV 3,2-vel mint antigénforrással, fertőzött Cvl-sejteket használva. Minden szérum a 33 kDa-os, illetve 23 kDa-os fehérjét felismerte, és ez azt mutatja, hogy az immunizálás sikeres volt.

A jelen találmány sok módosítása és variációja el- 20 végezhető annak szellemétől és teijedelmétől való eltérés nélkül, a szakember által ismert módon. Az itt leírt specifikus megvalósításokat csak példálódzó jelleggel mutattuk be, és a találmányt csak az igénypontokban szereplő kifejezések szerinti feltételek korlátozzák.

Szekvencialista (1) Általános információ:

(i) Bejelentő:

(A) Név: F. Hoffmann-La Roche AG.

(B) Utca: Rencacherstrasse 124 (C) Város: Bázel (D) Tartomány: BS (E) Ország: Svájc (F) Postai kód (ZIP): CH-4002 (G) Telefon: 061-6882403 (H) Telefax: 061-688 13 95 (I) Telex: 962292/965542 hlrchh (ii) A találmány címe: Coccidiosis oltóanyag (iii) A szekvencia száma: 15 (iv) Számítógépes adatfeldolgozás:

(A) Közvetítőeszköz: floppy disk (B) Számítógép: kompatibilis IBM PC (C) Operátorrendszer: PC-DOS/MS-DOS (vi) A bejelentés elsőbbségi adatai:

(A) Bejelentés száma: US 07/729,099 (B) A bejelentés dátuma: 1991. júl. 12.

(2) A SEQ IDNO: 1-re vonatkozó információk:

(i) (A) Hossz: 315 aminosav (B) Típus: aminosav (C) Topológia: ismeretlen (ii) Molekulatípus: fehéije (iii) Feltételezés: nincs 25 (vi) A minta eredete:

(A) Organizmus: Eimeria tenella (B) Fejlődési stádium: Merozoita (xi) A SEQ ID NO: 1 szekvencia leírása:

Me t 1	Al a	Ly s	Ser	Me t 5	Leu	Ser	Gly
Alá	Al a	Al a	Al a 20	Ser	Ser	Al a	As n
Glu	Ser	Gly 35	Pro	Al a	Val	Gin	Glu 40
Arg	Leu 50	Al a	Ly s	Pro	Leu	Leu 55	Leu
Al a 65	Al a	Al a	Phe	Leu	Va 1 70	Leu	Gin
Asn	Gin	Gin	Thr	Ser 85	Va 1	Arg	Arg
As p	Glu	Glu	As p 100	Al a	As p	Glu	Gly
Arg	Arg	Ly s 115	Pro	As p	Thr	Pro	Al a 120
Gly	Thr 130	Pro	Val	Ser	Va 1	Thr 135	Glu
Gin 145	I le	Arg	Asn	Ly s	Gin 150	I 1 e	Phe
Glu	Glu	Gin	Val	Leu 165	Va 1	Leu	Glu
I le	Val	Alá	Arg 180	Thr	Arg	Gin	Thr
Al a	Leu	Al a 195	Gin	Asp	Gly	Ly s	Thr 200
Gly	Ly s 210	Thr	Hi s	Arg	Arg	Tyr 215	Ly s
Gly 225	Phe	Pro	Tyr	Thr	Thr 230	Va 1	Leu

I le	Va 1 10	Phe	Al a	Gly	Leu	Va 1 1 5	Al a
Ser 25	Al a	Al a	Asn	Va 1	Ser 30	Va 1	Leu
Val	Pro	Al a	Arg	Thr 45	Va 1	Thr	Al a
Leu	Ser	Al a	Leu 60	Al a	Al a	Thr	Leu
Cy s	Phe	Asn 75	I le	11 e	Ser	Ser	As n 80
Leu	Al a 90	Al a	Gly	Gly	Al a	Cy s 95	Gly
Thr 105	Ser	Gin	Gin	Al a	Ser 1 10	Arg	Arg
Al a	As p	Ly s	Tyr	As p 125	Phe	Va 1	Gly
Pro	As n	Va 1	As p 140	Glu	Va 1	Leu	11 e
Leu	Ly s	Asn 155	Pro	Trp	Thr	Gly	Gin 160
Arg	Gin 170	Ser	Glu	Glu	Pro	11 e 175	Leu
Leu 185	Glu	Gly	Tyr	Leu	Gly 190	Ser	Gin
Al a	Ly s	Glu	Glu	Ly s 205	Val	Glu	Gly
Va 1	Ly s	Ser	Ser 220	As p	Pro	Gly	Tyr
As p	Gly	Va 1 235	Pro	Va 1	Gly	Thr	As p 240

HU 217 420 Β

Glu	As p	Gly	Tyr	Va 1 245	Val	Glu	Va 1
Gly	Va 1	As p	Me t 260	Me t	Thr	Ser	Thr
Va 1	Leu	Me t 275	As p	As p	Gly	Ly s	Gly 280
Ly s	I le 290	Thr	Al a	Val	I 1 e	Gly 295	Me t
Arg 305	Ser	Gly	Pro	Gly	As p 310	As p	Glu

Leu	Me t	Ly s	Thr	Gly	Pro	Hi s	G1	y
	250					255
Al a	Ser	G1 n	Gly	Lys	Phe	Cy s	G1	y
265					270
Asn	Leu	Val	As p	Gly	G1 n	Gly	Ar	g
				285
Leu	Thr	Gin	Pro	As p	Thr	Glu	Ph	e
			300
As p	As p	Glu
		315

(2) A SEQ ID NO: 2-re vonatkozó információk:

(i) Szekvencia jellemzői:

(A) Hossz: 948 bázispár (B) Típus: nukleinsav (C) Összefonódottság: szóló (D) Topológia: lineáris

ATGGCTAAGT CTATGCTTTC TGGAATTGTT AGTTCGGCCA ACAGCGCCGC CAACGTCTCC GTGCCAGCGC GCACGGTCAC AGCTCGCCTG GCTGCGACTT TGGCAGCAGC TTTCCTCGTT AACCAGCAAA CCAGCGTCAG GAGACTGGCC GCAGATGAGG GAACTTCACA GCAGGCCAGC GCAGATAAAT ACGATTTTGT TGGCGGAACT GAAGTCCTTA TCCAAATTAG AAATAAACAA GAAGAACAAG TTCTAGTACT GGAACGACAA ACAAGACAAA CACTTGAAGG ATATCTTGGT GCTAAAGAAG AGAAAGTTGA AGGAGGCAAA GACCCAGGAT ATGGATTCCC ATACACCACG GAAGACGGAT ACGTCGTCGA AGTTCTTATG ATGACTAGCA CAGCATCACA AGGAAAATTC AACCTAGTCG ATGGACAAGG GAGAAAAATT GATACCGAGT TTAGAAGCGG ACCAGGAGAC (2) A SEQ ID NO: 3-ra vonatkozó információk:

(i) Szekvencia jellemzői:

(A) Hossz: 8 aminosav 35 (B) Típus: aminosav (D) Topológia: lineáris (ii) Molekulatípus: peptid (v) Fragmens típusa: intemális (vi) A minta eredete: 40 (A) Organizmus: Eimeria tenella (xi) A SEQ ID NO: 3 leírása Ser Asn Asn Gin Gin Thr Ser Va 1 1 5

Cys Gly Asp Glu Glu Asp Alá Asp 1 5

Arg Arg Arg Arg Lys Pro Asp Thr 20 (2) A SEQ ID NO: 5-re vonatkozó információk:

(i) Szekvencia jellemzői:

(A) Hossz: 3 aminosav (B) Típus: aminosav (C) Topológia: lineáris (ii) Molekulatípus: peptid (v) Fragmenstípus: intemális (vi) A minta eredete:

(A) Organizmus: Eimeria tenella (xi) A SEQ ID NO: 5 leírása Pro Asn Va1 1 (ii) Molekulatípus: cDNS (iii) Hipotézis: nincs (iv) A minta eredete:

(A) Organizmus: Eimeria tenella (xi) SEQ ID NO: 2 leírása

TTTGCTGGTC TTGTTGCTGC TGCAGCGGCC 60 GTTTTGGAGA GTGGGCCCGC TGTGC’AGGAA 120 GCGAAGCCTT TGCTGCTTCT TTCTGCTCTT 180 TTGCAATGCT TCAACATCAT CTCCAGCAAC 240 GCCGGAGGTG CATGCGGAGA TGAGGAAGAT 300 CGGAGGAGGA GAAAACCTGA TACCCCTGCA 360 CCAGTTTCGG TCACTGAGCC GAATGTTGAT 420 ATCTTTTTGA AGAACCCATG GACTGGACAA 480 AGTGAAGAAC CCATTCTGAT TGTGGCGAGG 540 AGTCAAGCTC TTGCACAGGA CGGAAAGACT 600 ACTCACAGAA GATATAAAGT CAAGAGCAGC 660 GTGCTCGACG GGGTTCCTGT GGGAACAGAC 720 AAAACCGGAC CCCATGGAGG AGTCGACATG 780 TGCGGAGTGC TTATGGATGA CGGAAAAGGA 840 ACCGCCGTTA TCGGCATGCT AACTCAACCG 900 GACGAGGACG ACGAGTGA 948 (2) A SEQ ID NO: 4-re vonatkozó információk (i) Szekvencia jellemzői:

(A) Hossz: 29 aminosav (B) Típus: aminosav (C) Topológia: lineáris (ii) Molekulatípus: peptid (v) Fragmenstípus: intemális (vi) A minta eredete:

(A) Organizmus: Eimeria tenella (xi) SEQ ID NO: 4 leírása:

Glu Gly Thr Ser Gin Gin Alá Ser 10 15

Pro Alá Alá Asp Lys 25 (2) Információk a SEQ ID NO: 6-ról (i) A szekvencia jellemzői:

(A) Hossz: 6 aminosav (B) Típus: aminosav (C) Topológia: lineáris (ii) Molekulatípus : peptid (v) Fragmenstípus: intemális (vi) A minta eredete:

(A) Organizmus: Eimeria tenella (xi) A SEQ ID NO: 6 leírása:

Arg Asn Lys Gin Lle Phe

1 5

HU 217 420 Β

Információ a SEQ ID NO: 7-ről (i) A szekvencia jellemzése:

(A) Hossz: 8 aminosav (B) Típus: aminosav (C) Topológia: lineáris (ii) Molekulatípus: peptid (v) Fragmenstípus: intemális (vi) A minta eredete:

(A) Organizmus: Eimeria tenella (xi) A SEQ ID NO: 7 leírása:

Asn Pro Trp Thr Gly Gin Glu Glu 1 5

Információ a SEQ ID NO: 8-ról (i) A szekvencia jellemzői:

(A) Hossz: 5 aminosav (D) Topológia: lineáris (ii) Molekulatípus: peptid (v) Fragmenstípus: intemális (vi) A minta eredete:

(A) Organizmus: Eimeria tenella (xi) A SEQ ID NO: 8 leírása Arg Gin Ser Glu Glu 1 5 (2) Információ a. SEQ ID NO: 9-ről (i) A szekvencia jellemzői:

(A) Hossz: 6 aminosav (B) Típus: aminosav (C) Topológia: lineáris (ii) Molekulatípus: peptid (v) Fragmenstípus: intemális (vi) A minta eredete:

(A) Organizmus: Eimeria tenella 10 (xi) A SEQ ID NO: 9 leírása

Thr Arg Gin Thr Leu Gli 1 5 (2) Információ a SEQ ID NO: 10-ről (i) A szekvencia jellemzői:

(A) Hossz: 30 aminosav (B) Típus: aminosav (D) Topológia: lineáris (ii) Molekulatípus: peptid (v) Fragmenstípus: intemális (vi) A minta eredete:

(A) Organizmus: Eimeria tenella (xi) ASEQIDNO: 10 leírása

Gin	As p	Gly	Ly s	Thr Alá
1				5
Thr	Hi s	Arg	Tyr	Lys Val
				20
(2) Információ a	SEQ ID NO:	11-ről

(i) A szekvencia jellemzése:

(A) Hossz: 5 aminosav (B) Típus: aminosav (C) Topológia: lineáris (ii) Molekula típusa: peptid (v) Fragmens típusa: intemális (vi) A minta eredete:

(A) Organizmus: Eimeria tenella (xi) A SEQ ID NO: 11 leírása:

Thr Asp Glu Asp Gly 1 5 (2) Információ a SEQ ID NO: 12-ről (i) A szekvencia jellemzése:

(A) Hossz: 5 aminosav (B) Típus: aminosav (C) Topológia: lineáris (ii) Molekula típusa: peptid (v) Fragmens típusa: intemális (vi) A minta eredete:

(A) Organizmus: Eimeria tenella (xi) A SEQ ID NO: 12 leírása Thr Gly Pro Hi s Gly 1 5

Asp Asp Gly Lys Gly Asn 1 5 (2) Információ a SEQ ID NO: 15-ről (i) A szekvencia jellemzői:

(A) Hossz: 18 aminosav (B) Típus: aminosav

Ly s

Ly s

Glu	Glu	Ly s 10	Val	Glu	Gly	Gly	Ly s 15
Ser	Ser	As p	Pro	Gly	Tyr	Gly
	25					30

Leu (2) Információ a SEQ ID NO: 13-ról (i) A szekvencia jellemzése:

(A) Hossz: 5 aminosav (B) Típus: aminosav (C) Topológia: lineáris (ii) Molekulatípus: peptid (v) Fragmenstípus: intemális (vi) A minta eredete:

(A) Organizmus: Eimeria tenella (xi) ASEQIDNO: 13 leírása Alá Ser Gin Gly Lys 1 5 (2) Információ a SEQ ID NO: 14-ről (i) A szekvencia jellemzése:

(A) Hossz: 14 aminosav (B) Típus: aminosav (C) Topológia: lineáris 45 (ii) Molekulatípus: peptid (v) Fragmenstípus: intemális (vi) A minta eredete:

(A) Organizmus: Eimeria tenella (xi) A SEQ ID NO: 14 leírása:

Val Asp Gly Gin Gly Arg Lys 10 (C) Topológia: lineáris (ii) Molekulatípus: peptid (v) Fragmenstípus: C-terminális (vi) A SEQ ID NO: 15 leírása:

HU 217 420 Β

Thr Gin Pro Asp Thr Glu Phe 1 5

Asp Asp Glu

Claims (23)

1. SZABADALMI IGÉNYPONTOK

   1. Eljárás az (1) aminosavszekvenciájú immunogén polipeptid

   MAKSML SGIVFAGLVAAAAA

   SSANSAANVSVLESGPAVQE

   VPARTVTARLAKPLLLLSAL

   AATLAAAFLVLQCFNIISSN

   NQQT SVRRLAAGGACGDEED

   ADEGTSQQASRRRRKPDTPA

   ADKYDFVGGT PVSVTE PNVD

   EVLIQIRNKQIFLKNPWTGQ (1)

   EEQVLVLERQS EE ΡILIVAR

   TRQTLEGYLGSQALAQDGKT

   AKEEKVEGGKTHRRYKVKS S

   DPGYGF PYTTVLDGVPVGTD

   EDGYWEVLMKTGPHGGVDM

   MTSTASQGKFCGVLMDDGKG

   NLVDGQGRK I TÁV I GMLTQP

   DTEFRSGPGDDEDDE (SEQIDNO: 1) és immunogén fragmensei előállítására, amelyek az Eimeria parazitákkal szemben immunválaszt indukálni képesek, és lényegében mentesek az Eimeria paraziták által termelt egyéb proteinektől, mimellett a fenti specifikus aminosavszekvencia 1-183 helyzetű aminosavszekvenciáját vagy annak részleges szekvenciáját tartalmazó fragmensek az alább specifikus fragmensek kivételével ki vannak zárva

   SNNQQTSV (2) (SEQ ID NO: 3),

   CGDEEDADEGTSQQASRRRRKPDTPAADK (3) (SEQ IDNO: 4),

   PNV(4) (SEQIDNO: 5),

   RNKQIF (5) (SEQ ID NO: 6),

   NPWTGQEE (6) (SEQ ID NO: 7),

   RQSEE (7) (SEQ IDNO: 8),

   TRQTLE (8) (SEQ ID NO: 9), QDGKTAKEEKVEGGKTHRRYKVKSSDPGYG (9) (SEQIDNO: 10),

   TDEDG (10) (SEQ IDNO: 11),

   TGPHG (11) (SEQ ID NO: 12),

   ASQGK (12) (SEQ ID NO: 13), DDGKGNLVDGQGRK (13) (SEQ ID NO: 14), vagy TQPDTEFRSGPGDDEDDE (14) (SEQ ID NO: 15), azzal jellemezve, hogy a

   a) a fenti polipeptidet vagy fragmensét kódoló nukleotidszekvenciát magában foglaló DNS-t tartalmazó rekombináns vektort magában foglaló transzformált mikroorganizmust a DNS kifejezésére alkalmas körülmények között tenyésztünk; és

   b) a polipeptidet vagy a fragmenst a tenyészetből izoláljuk.
2. 2. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a transzformált mikroorganizmus olyan DNSszekvenciát tartalmazó rekombináns vektort foglal mag Ser Gly Pro Gly Asp Asp Glu 10 20 gában, amely az első 20 és 100 aminosav közötti szekvencia nélküli, 1. igénypont szerinti (SEQ ID NO: 1) immunogén polipeptidffagmenst kódolja.
3. 3. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az immunogén polipeptid képes a T-sejt által közvetített immunválasz kiváltására.
4. 4. Eljárás immunogén polipeptidfragmensek előállítására, amelyek aminosavszekvenciája az alábbi szekvenciák valamelyike

   SNNQQTSV (2) (SEQ ID NO: 3),

   CGDEEDADEGTSQQASRRRRKPDTPAADK (3) (SEQIDNO: 4),

   PNV (4) (SEQIDNO: 5),

   RNKQIF (5) (SEQ ID NO: 6),

   NPWTGQEE (6) (SEQ ID NO: 7),

   RQSEE (7) (SEQ ID NO: 8),

   TRQTLE (8) (SEQ ID NO: 9), QDGKTAKEEKVEGGKTHRRYKVKSSDPGYG (9) (SEQIDNO: 10),

   TDEDG (10) (SEQ IDNO: 11),

   TGPHG (11) (SEQ IDNO: 12),

   ASQGK (12) (SEQ IDNO: 13), DDGKGNLVDGQGRK (13) (SEQ ID NO: 14), vagy TQPDTEFRSGPGDDEDDE (14) (SEQ ID NO: 15), azzal jellemezve, hogy a peptidet szokásos peptidszintetizálási módszerrel állítjuk elő, majd homogénné tisztítjuk.
5. 5. Eljárás az 1. vagy 2. igénypont szerinti polipeptidet kódoló nukleotidszekvenciát magában foglaló DNS-t tartalmazó rekombináns vektor előállítására, azzal jellemezve, hogy

   a) a fenti polipeptid kódolására alkalmas nukleotidszekvenciát tartalmazó DNS-t a vektorba beillesztjük;

   b) a vektort egy mikroorganizmusban replikáljuk és

   c) a rekombináns vektort a mikroorganizmusból izoláljuk.
6. 6. Eljárás az 1. vagy 2. igénypont szerinti polipeptid kódolására alkalmas nukleotidszekvenciájú DNS-t tartalmazó rekombináns vírus előállítására, azzal jellemezve, hogy

   a) a polipeptid kódolására alkalmas nukleotidszekvenciájú DNS-t egy vírus genomjába illesztjük anélkül, hogy gátolnánk a vírus érését és fertőzőképességét;

   b) a rekombináns vírust egy sejtkultúrában amplifikáljuk és

   c) a rekombináns vírust a tenyésztőközegtől megtisztítjuk.
7. 7. Eljárás az 1. vagy 2. igénypont szerinti polipeptid termelésére alkalmas transzformált mikroorganizmus előállítására, azzal jellemezve, hogy

   a) egy mikroorganizmust a polipeptid kódolására alkalmas nukleotidszekvenciájú DNS-t tartalmazó rekombináns vektorral transzformálunk és

   b) a transzformált mikroorganizmust alkalmas tápközegben tenyésztjük.

   HU 217 420 Β
8. 8. Eljárás kokcidiózis elleni vakcina előállítására, azzal jellemezve, hogy az 1. vagy 2. igénypont szerinti immunogén polipeptidet összekeveijük egy farmakológiailag megfelelő vivőanyaggal.
9. 9. Eimeria parazitákkal szemben immunválasz indukálására képes, az (1) aminosavszekvenciájú immunogén polipeptid

   MAKSMLSGIVFAGLVAAAAA

   SSANSAANVSVLESGPAVQE

   VPARTVTARLAKPLLLLSAL

   AATLAAAFLVLQCFNIISSN

   NQQTSVRRLAAGGACGDEED

   ADEGTSQQASRRRRKPDTPA

   ADKYDFVGGTPVSVTEPNVD

   EVLIQIRNKQIFLKNPWTGQ (1) EEQVLVLERQSEEPILIVAR TRQTLEGYLGSQALAQDGKT AKEEKVEGGKTHRRYKVKS S

   5 DPGYGFPYTTVLDGVPVGTD

   EDGYWEVLMKTGPHGGVEM MT S TASQGKFCGVLMDDGKG NLVDGQGRKI TÁV IGMLTQP DTE FRSGPGDDEDDE
10. 10 (SEQIDNO:1) vagy alszekvenciái kódolására képes DNS. (Oltalmi idő kezdete: 1994.07.01.)

    10. Az alábbi nukleotidszekvenciát

    ATGGCTAAGTCTATGCTTTCTGGAATTGTTTTTGCTGGTCTTGTTGCTGCTGCAGCG

    GCCAGTTCGGCCAACAGCGCCGCCAACGTCTCCGTTTTGGAGAGTGGGCCCGCTGTG

    CAGGAAGTGCCAGCGCGCACGGTCACAGCTCGCCTGGCGAAGCCTTTGCTGCTTCTT

    TCTGCTCTTGCTGCGACTTTGGCAGCAGCTTTCCTCGTTTTGCAATGCTTCAACATC

    ATCTCCAGCAACAACCAGCAAACCAGCGTCAGGAGACTGGCCGCCGGAGGTGCATGC

    GGAGATGAGGAAGATGCAGATGAGGGAACTTCACAGCAGGCCAGCCGGAGGAGGAGA

    AAACCTGATACCCCTGCAGCAGATAAATACGATTTTGTTGGCGGAACTCCAGTTTCG

    GTCACTGAGCCGAATGTTGATGAAGTCCTTATCCAAATTAGAAATAAACAAATCTTT

    TTGAAGAACCCATGGACTGGACAAGAAGAACAAGTTCTAGTACTGGAACGACAAAGT

    GAAGAACCCATTCTGATTGTGGCGAGGACAAGACAAACACTTGAAGGATATCTTGGT

    AGTCAAGCTCTTGCACAGGACGGAAAGACTGCTAAAGAAGAGAAAGTTGAAGGAGGC

    AAAACTCACAGAAGATATAAAGTCAAGAGCAGCGACCCAGGATATGGATTCCCATAC

    ACCACGGTGCTCGACGGGGTTCCTGTGGGAACAGACGAAGACGGATACGTCGTCGAA

    GTTCTTATGAAAACCGGACCCCATGGAGGAGTCGACATGATGACTAGCACAGCATCA

    CAAGGAAAATTCTGCGGAGTGCTTATGGATGACGGAAAAGGAAACCTAGTCGATGGA

    CAAGGGAGAAAAATTACCGCCGTTATCGGCATGCTAACTCAACCGGATACCGAGTTT

    AGAAGCGGACCAGGAGACGACGAGGACGACGAGTGA vagy annak funkcionális ekvivalensét teljes egészében vagy részben tartalmazó DNS. (Oltalmi idő kezdete: 1994. 07.01.)
11. 11. Az 1. vagy 2. igénypont szerinti polipeptid kódolására képes nukleotidszekvenciájú DNS-t tartalmazó rekombináns vektor, amely megfelelő gazdaszervezetben DNS-kifejezésének irányítására képes. (Oltalmi idő kezdete: 1994. 07. 01.)
12. 12. A 11. igénypont szerinti rekombináns vektor, azzal jellemezve, hogy E. coli vektor. (Oltalmi idő kezdete: 1994. 07.01.)
13. 13. Az 1. vagy 2. igénypont szerinti polipeptid kódolására alkalmas nukleotidszekvenciájú DNS-t tartalmazó rekombináns vírus, azzal jellemezve, hogy a rekombináns vírus megfelelő gazdaszervezetben DNSkifejezésének irányítására képes. (Oltalmi idő kezdete: 1994. 07. 01.)
14. 14. Az 1. vagy 2. igénypont szerinti polipeptid kódolására alkalmas nukleotidszekvenciájú DNS-t magában foglaló rekombináns vektort tartalmazó transzformáit mikroorganizmus, azzal jellemezve, hogy a mikroorganizmus a DNS kifejezésére képes. (Oltalmi idő kezdete: 1994. 07. 01.)
15. 15. (1) aminosavszekvenciájú immunogén polipeptid

    MAKSML SGIVFAGLVAAAAA

    S SANSAANVSVLESGPAVQE

    VPARTVTARLAKPLLLLSAL

    AATLAAAFLVLQCFNIISSN (A) (SEQ IDNO: 2) NQQTSVRRLAAGGACGDEED ADEGTSQQASRRRRKPDTPA ADKYDFVGGTPVSVTEPNVD EVLIQIRNKQIFLKNPWTGQ (1) EEQVLVLERQSEEPILIVAR TRQTLEGYLGSQALAQDGKT AKEEKVEGGKTHRRYKVKS S DPGYGF PYTTVLDGVPVGTD EDGYWEVLMKTGPHGGVEM MT S TASQGKFCGVLMDDGKG NLVDGQGRKITÁVIGMLTQP DTE FRSGPGDDEDDE (SEQ IDNO: 1) és immunogén fragmensei, amelyek az Eimeria parazitákkal szemben immunválaszt képesek indukálni, és lényegében mentesek az Eimeria paraziták által termelt egyéb proteinektől, mimellett a fenti specifikus aminosavszekvencia 1-183 helyzetű aminosavszekvenciáját vagy annak részleges szekvenciáját tartalmazó fragmensek az alább specifikus fragmensek kivételével ki vannak zárva:

    SNNQQTSV (2) (SEQ ID NO: 3),

    CGDEEDADEGTSQQASRRRRKPDTPAADK (3) (SEQ IDNO: 4),

    PNV (4) (SEQ IDNO: 5),

    RNKQIF (5) (SEQ ID NO: 6),

    NPWTGQEE (6) (SEQ ID NO: 7),

    RQSEE (7) (SEQ ID NO: 8),

    HU 217 420 Β

    TRQTLE (8) (SEQ ID NO: 9),

    QDGKTAKEEKVEGGKTHRRYKVKSSDPGYG (9) (SEQIDNO: 10),

    TDEDG (10) (SEQIDNO: 11),

    TGPHG (11) (SEQIDNO: 12),

    ASQGK (12) (SEQIDNO: 13), DDGKGNLVDGQGRK (13) (SEQ ID NO: 14), vagy TQPDTEFRSGPGDDEDDE (14) (SEQ ID NO: 15).

    (Oltalmi idő kezdete: 1994. 07. 01.)
16. 16. A 15. igénypont szerinti immunogén polipeptid, azzal jellemezve, hogy a 15. igénypont szerinti immunogén polipeptid ffagmense, amelyből e polipeptidnek az első 20 és körülbelül 100 aminosav közötti szekvencia hiányzik. (Oltalmi idő kezdete: 1994. 07. 01.)
17. 17. A 15. igénypont szerinti immunogén polipeptid, azzal jellemezve, hogy a 15. igénypont szerinti immunogén polipeptid fragmense és látszólagos móltömege SDS-PAGE-val mérve 23 kilodalton. (Oltalmi idő kezdete: 1994.07.01.)
18. 18. A 15. igénypont szerinti immunogén polipeptid, azzal jellemezve, hogy T-sejt által közvetített immunválasz kiváltására képes. (Oltalmi idő kezdete: 1994. 07. 01.)
19. 19. A 15. igénypont szerinti immunogén polipeptid, azzal jellemezve, hogy a peptid az alábbi aminosavszekvenciát tartalmazza:

    SNNQQTSV (2) (SEQ ID NO: 3),

    CGDEEDADEGTSQQASRRRRKPDTPAADK (3) (SEQ IDNO: 4),

    PNV (4) (SEQIDNO: 5),

    RNKQIF (5) (SEQ ID NO: 6),

    NPWTGQEE (6) (SEQ ID NO: 7),

    RQSEE (7) (SEQ IDNO: 8),

    TRQTLE (8) (SEQ ID NO: 9),

    QDGKTAKEEKVEGGKTHRRYKVKSSDPGYG (9) (SEQIDNO: 10),

    TDEDG (10) (SEQ IDNO: 11),

    TGPHG (11) (SEQ IDNO: 12),

    ASQGK (12) (SEQ IDNO: 13), DDGKGNLVDGQGRK (13) (SEQ ID NO: 14), vagy TQPDTEFRSGPGDDEDDE (14) (SEQ ID NO: 15).

    (Oltalmi idő kezdete: 1994.07.01.)
20. 20. A (SEQ ID NO: 1) szekvenciát tartalmazó immunogén polipeptidet vagy részleges szekvenciáját kódoló izolált DNS-molekula, amely polipeptid Eimeria parazitákkal szembeni immunválasz kiváltására képes. (Oltalmi idő kezdete: 1994. 07. 01.)
21. 21. A 15-17. igénypontok bármelyike szerinti immunogén polipeptid, egyedeknek kokcidiózissal szemben történő immunizálására. (Oltalmi idő kezdete: 1994. 07.01.)
22. 22. Egyedeknek kokcidiózissal szemben történő megvédésére szolgáló vakcina, azzal jellemezve, hogy valamely, a 15-17. igénypontok bármelyike szerinti polipeptidet és gyógyászatilag alkalmas hordozóanyagot vagy adjuvánst tartalmaz. (Oltalmi idő kezdete: 1994. 07.01.)
23. 23. Egyedeknek kokcidiózissal szemben történő megvédésére szolgáló vakcina, azzal jellemezve, hogy valamely, a 15-17. igénypontok bármelyike szerinti polipeptidet kódoló, nukleotidszekvenciát tartalmazó DNS-t magában foglaló, kompatibilis gazdaszervezetben a DNS kifejezésének irányítására képes rekombináns vírust és gyógyászatilag alkalmas hordozóanyagot vagy adjuvánst tartalmaz. (Oltalmi idő kezdete: 1994. 07.01.)