SK281606B6 - Imunogénne polypeptidy schopné vyvolať imunitnú odpoveď proti parazitom rodu eimeria, dna kódujúca tieto polypeptidy, rekombinantné vektory a transformované mikroorganizmy, spôsoby ich prípravy a vakcína proti kokcidióze - Google Patents

Abstract

Polypeptid so sekvenciou aminokyselín a jeho fragmenty, ktoré sú schopné vyvolať imunitnú odpoveď proti parazitom rodu Eimeria, DNA kódujúca tieto polypeptidy a rekombinantné vektory. Ďalej je opísaný spôsob prípravy polypeptidu, rekombinantného vektora, rekombinantného vírusu a transformovaného mikroorganizmu. Imunogénny polypeptid je použiteľný na imunizáciu subjektu proti kokcidióze. Vakcína obsahujúca opísaný polypeptid, rekombinantný vírus a fyziologicky prijateľný nosič alebo adjuvant.ŕ

Description

Vynález sa týka nového antigénu protozoových parazitov rodu Eimeria. Tento antigén sa môže používať na ochranu hydiny proti kokcidióze, pričom spôsob podávania môže byť rôzny.

Doterajší stav techniky

Kokcidióza je choroba hydiny spôsobená intracelulárnymi protozoovými parazitmi rodu Eimeria. Pri intenzívnom chove hydiny vo veľkých hydinárňach je táto choroba endemická. Odhadované výdaje na potlačenie tejto choroby pomocou chemoterapie presahujú 100 miliónov dolárov ročne len v Spojených štátoch amerických. Vývoj odolnosti na známe antikokcidioticky pôsobiace lieky vyžaduje neustále vyvíjanie nových činidiel v čase, keď je vývoj liekov stále drahší a znižuje sa prijateľnosť rezíduí z liekov v mastných zvieratách zo strany konzumentov.

Ochranná imunita na prirodzenú kokcidiózovú infekciu bola už dobre opísaná. Ukázalo sa, že riadené denné podávanie malého množstva živých oocýst počas niekoľkých týždňov spôsobí kompletnú imunitu na provokačnú infekciu vyvolanú normálne virulentnou dávkou (Rose a ďalší, Parasitology 73:25 (1976); Rose a ďalší, Parasitology 88:199 (1984)). Táto demonštrácia získanej odolnosti proti infekcii ukazuje možnosť skonštruovania vakcíny na indukciu imunity mladých kurčiat, čím by sa obišla potreba chemických kokcidiostatík. Prakticky bolo toto pojatie otestované v prípravku Coccivac^(R) vyrobenom v Sterwin Laboratories, Opelika, AL.

Murray a ďalší, Európska patentová prihláška číslo 167 443, s úmyslom vytvoriť vakcínu proti kokcidióze, pripravili extrakty zo sporozoí alebo sporulovaných oocýst druhu Eimeria tenella, ktoré obsahovali aspoň 15 polypeptidov, z ktorých mnohé boli pripojené na povrch sporozoí. Injekčná aplikácia týchto extraktov kurčatám redukovala cekálne lézie, spôsobené orálnou inokuláciou pomocou virulentných sporulovaných oocýst druhu E. tenella.

Nedávno Schenkel a ďalší, americký patent číslo 4 650 676, opísali produkciu monoklonálnych protilátok proti merozoiám druhu E. tenella. Pomocou týchto protilátok Schenkel a ďalší identifikovali rad antigénov, proti ktorým boli tieto protilátky zamerané. Preinkubáciou sporozoi E. tenella s týmito protilátkami a zavedením týchto preinkubovaných sporozoi do ciek kurčiat mohli Schenkel a ďalší ukázať určitú redukciu veľkosti cekálnych lézií v porovnaní s kontrolnými zvieratami s nepreinkubovanými sporozoovými bunkami.

Pomocou rekombinantnej DNA metodológie Newman a ďalší (Európska patentová prihláška číslo 164 176) klonovali gén zo sporozoového štádia, ktorý kódoval antigén z Eimeria tenella s veľkosťou 25 000 daltonov. Séra z kurčiat imunizovaných opakovanou imunizáciou usmrtenými sporozoovými bunkami E. tenella imunoprecipitujú tento antigén z jodidovaných sporocýst a sporozoových membránových prípravkov. Ďalej Jenkins (Nucleic Acids Res. 16:9863 (1988)) opísal cDNA, kódujúcu časť merozoového povrchového proteínu s veľkosťou 250 000 daltonov z Eimeria acervulína. Exprimovaný produkt tejto cDNA bol poznaný antisérom proti tomuto organizmu.

Pokroky v DNA rekombinantnou technológiou umožnili iný prístup, t. j. podjednotkovú vakcínu. Príklady takých podjednotkových vakcín sú opísané napr. v Európskych patentových prihláškach č. 324 648, 337 589 a 344 808.

Podstata vynálezu

Predmetom vynálezu sú imunogénne polypeptidy majúce sekvenciu aminokyselín (1) (Sekv. id. č.: 1)

MAKSMLSGIVFAGLVAAAAA

SSANSAANVSVLESGPAVQE

VPARTVTARLAKPLLLLSAL

AATLAAAFLVLQCFNirsSN

NQQTSVRRLAAGGACGDEED

ADEGTSQQASRRRRKPDTPA

ADKYDFVGGTPVSVTEPNVD

EVLIQIRNKQIFLKNPWTGO

EEQVLVLERQSEEPILIVAR

TRQTLEGYLGSQALAQDGKT

AKEEKVEGGKTHRRYKVKSS

DPGYGFPYTTVLDGVPVGTD

EDGYVVEVLMKTGPHGGVDM

MTSTASQGKPCGVLMDDGKG

HLVDGQGRKITAVIGMLTQP

DTEFRSGPGDDEDDE (sekv. id. č. 1) , pričom tieto polypeptidy sú schopné indukovať imunitnú odpoveď proti parazitom rodu Eimeria napríklad pri kurčatách. Tu opísaný proteínový prekurzor antigénu z povrchu merozoí rodu Eimeria má sekvencie, ktoré zodpovedajú sekvencií (1) (Sekv. id. č.: 1).

Prednostným polypeptidom podľa tohto vynálezu je imunogénny polypeptid so sekvenciou aminokyselín (1) (Sekv. id. č.: 1), ktorý ale nemá sekvenciu signálneho peptidu naN-konci. Predmetom vynálezu je tiež funkčne ekvivalentný polypeptid majúci aminokyselinovú sekvenciu, ktorá sa vytvorí z uvedenej aminokyselinovej sekvencie pomocou delécií, inzercií alebo substitúcií bez zásadnej zmeny imunologických vlastností tohto polypeptidu.

Predmetom vynálezu je ďalej DNA kódujúca celý proteínový prekurzor antigénu z povrchu merozoí rodu Eimeria alebo jeho časť, ako je DNA majúca nukleotidovú sekvenciu (A) (sekv. id. č.: 2) atggctaagtctatgotttctggaattgtttttgctggtcttgttgctgctgcagcg gccagttcggccaacagcgccgccaacgtctccgttttggagägtgggcccgctgtg caggaagtgccagcgcgcacggtcacagctcgcctggcgaagcctttgctgcttctt tctgctcttgctgcgactttggcagcagctttcctcgttttgcaatgcttcaacatc atctccagcaacaaccagcaaaccagcgtcaggagactggccgccggaggtgcatgc ggagatgaggaagatgcagatgägggaacttcacagcaggccagccggaggaggaga aaacctgätacccctgcagcagataaatacgattttgttggcggaactccagtttcg gtcactgagccgaatgttgatgaagtccttatccaaattagaaataaacaäatcttt ttgaagaacccatggactggacaagaagaacaagttctagtactggaacgacaaagt GAAGAACCCAT'TCTGATTGT'GGCGAGGACAAGACAAACACTTGAAGGATÄTCTTGGT AGTCAAGCTCTTGCACAGGACGGAAAGACTGCTAAAGAAGAGAAAGTTGAAGGAGGC AAAACTCACAGAAGATATAAAGTCÄAGAGCAGCGACCCAGGATATGGATTCCCATAC ACCACGGTGCTCGACGGGGTTCCTGTGGGAACAGACGAAGACGGATACGTCGTCGAA GTTCTTATGAAAACCGGACCCCATGGAGGAGTCGACATGATGACTAGCACäGCATCA CAAGGAAAATTCTGCGGAGTGCTTATGGATGACGGAAAÄGGAAACCTAGTCGATGGA cäagggagaaaaatiaccgccgttatcggcatgctaactcaaccggataccgagttt AGAAGCGGACCAGGAGACGACGAGGACGACGAGTGA alebo jej časti, ako je nukleotidová sekvencia (B), ktorá zodpovedánukleotidovej sekvencií (A) (Sekv. id. Č.: 2), ale nemá sekvenciu nukleotidov, kódujúcu sekvenciu signálneho peptidu. ATG kodón sa prednostne pridá na začiatok DNA, obsahujúci čiastočnú sekvenciu DNA s nukleotidovou sekvenciou (A) (Sekv. id. č.: 2), pomocou spôsobov dobre známych v tomto odbore. Predmetom vynálezu sú ďalej rekombinantné vektory, ktoré obsahujú uvedenú DNA a sú schopné riadiť jej expresiu v kompatibilných hostiteľských organizmoch, a mikroorganizmy obsahujúce tieto vektory.

Predmetom vynálezu je ďalej spôsob produkcie uvedených polypeptidov, ktorého podstata spočíva v tom, že sa

a) kultivuje mikroorganizmus, obsahujúci rekombinantný vektor s DNA s nukleotidovou sekvenciou, kódujúcou uvedený polypeptid, ako je DNA s nukleotidovou sekvenciu (A) (Sekv. id. č.: 2) alebo jej fragment, ako je nukleotidová sekvencia (B), za podmienok, pri ktorých sa DNA sekvencia alebo jej fragment exprimuje; a

b) izoluje sa rekombinantný polypeptid z kultúry. Predmetom vynálezu sú ďalej vakcíny na ochranu subjektov (napr. ľudí alebo zvierat) proti kokcidióze, ktoré obsahujú účinné množstvo jedného alebo viacerých polypeptidov podľa tohto vynálezu a fyziologicky vhodný nosič. Prednostným subjektom je hydina (napr. kurčatá alebo moriaci). Inými subjektmi môžu byť domáce zvieratá, ako sú králičí alebo ovce.

Predmetom vynálezu sú ďalej vakcíny na ochranu subjektov proti kokcidióze, obsahujúce rekombinantný vírus s DNA sekvenciou, ktorá kóduje polypeptid podľa tohto vynálezu, a tento rekombinantný virus je schopný vyvolať expresiu uvedenej sekvencie DNA, a fyziologicky vhodný nosič.

Predmetom vynálezu je tiež spôsob ochrany subjektov proti kokcidióze, ktorý zahŕňa podávanie účinného množstva vakcíny podľa tohto vynálezu subjektu, ako je mladá hydina, ktorá je náchylná na kokcidiózu.

Polypeptidy rodu Eimeria podľa tohto vynálezu sú dôležitými vakcínovými antigénmi, pretože boli identifikované použitím protilátok obsiahnutých v sérach zvierat, ktoré boli imunizované proti kokcidiózovým organizmom a ktoré si tak vytvorili proti nim imunitu. Preto je veľmi pravdepodobné, že tieto polypeptidy hrajú významnú rolu v ochrane hydiny proti kokcidióze.

Prehľad obrázkov na výkresoch

Obr. 1 ukazuje nukleotidovú sekvenciu cDNA s veľkosťou molekuly 1,2 kb, ktorá kóduje proteínový prekurzor rodu Eimeria rozpoznávaný antigén-selektívnymi králičími protilátkami alebo protilátkami zo séra imúnnych kurčiat. Ako je z obr. 1 zrejmé, nukleotidová sekvencia, kódujúca uvedený proteínový prekurzor, leží medzi ATG kodónom na nukleotidovej pozícii 68 a stop kodónom TAA na nukleotidovej pozícii 1013 (kóduje 315 aminokyselín). Obr. 1 tiež ukazuje sekvenciu aminokyselín proteínového prekurzora rodu Eimeria predpovedanú podľa uvedenej nukleotidovej sekvencie. Nukleotidy a aminokyseliny sú vyjadrené štandardnými jednopísmenovými skratkami. Význam týchto skratiek sa dá zistiť v štandardných biochemických učebniciach, ako je napríklad Lehninger, Princípy biochémie, 1984, Worth Publishers, Inc., New York, str. 96, 798.

Obr. 2 ukazuje výsledky analýzy SDS PAGE rôznych merozoových proteínov rodu Eimeria. Okienko A je imunoblot celkového množstva merozoových proteínov s kontrolnou próbou (a) alebo s próbou v podobe antigén-selektívnych protilátok (b). Šípka v okienku A ukazuje umiestnenie pása, obsahujúceho proteín s molekulovou hmotnosťou asi 23 kilodaltonov. Okienko B je autorádiogram merozoových proteínov povrchovo označených ^12SI, ktoré sú imunoprecipitované s kontrolnou próbou (a) alebo s antigén-selektívnymi protilátkami (b). Okienko C ukazuje kompletnú zmes produktov získaných transláciou in vitro merozoovej polyA mRNA (c) a translačné produkty imunoprecipitované s protilátkami selektovanými s použitím lambda 5-7 klonu (b), protilátky selektované s použitím iného fágového klonu, produkujúceho proteíny reagujúce s antimerozoovým sérom (a) a kontrolné protilátky selektované z merozoového séra s použitím nerekombinantného fágu (d). Pásy boli vizualizované flórograficky. Umiestnenie markerov molekulovej hmotnosti, majúcich vyznačenú molekulovú hmotnosť v kilodaltonoch (kDa), je ukázané napravo od obrázku.

Obr. 3 ukazuje výsledky analýzy Southem Blot. Analýze bola podrobená genómová DNA zo sporulovanej oocysty druhu Eimeria tenella, ktorá bola štiepená enzýmami PvuII (pás 1), HincII (pás 2), PstI (pás 3), Sphl (pás 4) alebo Sací (pás 5) s použitím EcoRI inzertu obsahujúceho 5-7 gén. Inzert je ďalej opísaný ako próba. Umiestnenie štandardných častí DNA s vyznačenou veľkosťou v kb je ukázané napravo od obrázku.

Obr. 4 ukazuje schematickú kresbu plazmidu pDS56/RBSII (nie je nakreslená v mierke). Na tomto diagrame a na obrázkoch 6, 8 a 10 skratky a symboly označujú miesta štiepenia na reštrikčné enzýmy: B na BamHI, E na EcoRI, H na HindlII, P na PstI, S na Sali, X na Xhol a Xb na Xbal. Značka *- vyjadruje regulovateľný promótor/operátorový element N250PSN250P29; značka vyjadruje ribozómové väzné miesta RBSII,

RBSII(-l) alebo RBSII(-2) podľa vyznačenia; značka označuje kódujúce oblasti pod kontrolou týchto ribosomových väzných miest; značka vyjadruje terminátory toto alebo TI podľa vyznačenia; značka ► označuje oblasť nutnú na replikáciu DNA v E. coli (repl.); značka označuje kódujúce oblasti na chlóramfenikolacetyltransferázu (cat) a na beta-laktamasu (bla).

Obr. 5 udáva kompletnú nukleotidovú sekvenciu plazmidu pDS56/RBSII. V tejto sekvencií sú vyznačené rôžpoznávacie sekvencie reštrikčných enzýmov opísané ^tá obr. 4. Ukázaná aminokyselinová sekvencia vyjadruje oWrený čítací rámec pod kontrolou ribozómového väznéífe miesta RBSII.

Obr. 6 je schematická kresba plazmidu pDS56/RBSII(-1) (nie je nakreslená v mierke).

Obr. 7 ukazuje kompletnú nukleotidovú sekvenciu plazmidu pDS56/RBSII(-l). V tejto sekvencií sú vyznačené rozpoznávacie sekvencie reštrikčných enzýmov opísané na obr. 6. Ukázaná aminokyselinová sekvencia vyjadruje otvorený čítací rámec pod kontrolou ribozómového väzného miesta RBSII(-l).

Obr. 8 je schematická kresba plazmidu pDS56/RBSII(-2) (nie je nakreslená v mierke).

Obr. 9 ukazuje kompletnú nukleotidovú sekvenciu plazmidu pDS56/RBSH(-2). V tejto sekvencií sú vyznačené rozpoznávacie sekvencie reštrikčných enzýmov opísané na obr. 8. Ukázaná aminokyselinová sekvencia vyjadruje otvorený čítací rámec pod kontrolou ribozómového väzného miesta RBSII(-2).

Obr. 10 je schematická kresba plazmidu pDMI.l (nie je nakreslená v mierke). Symboly a skratky majú rovnaký význam, ako je uvedené v legende k obr. 4, ale značka vyjadruje kódujúce oblasti na lac represor (lacl) a neomycínfosfotransferázu (neo).

Obr. 11, to je obr. 11 A, 1 IB a 11C, ukazuje kompletnú nukleotidovú sekvenciu plazmidu pDMI. 1. V tejto sekvencii sú vyznačené rozpoznávacie sekvencie reštrikčných enzýmov opísané na obr. 10. Ukázaná aminokyselinová sekvencia zahŕňa otvorené čítacie rámce, kódujúce neomycínfosfo-trasferázu (od aminokyseliny Met k Phe) a lac represor (od aminokyseliny Met ku Glu; prosím všimnite si obrátenú orientáciu tohto génu).

SK 281606 BĎ

Obr. 12 je schematická kresba plazmidu pUC8-TK-7,5K. V tomto diagrame a na obr. 13 a 15 skratka TK označuje sekvenciu génu tymidínkinázy z vakcinia vírusu, skratka 7,5K znamená 7,5K promótor vakcinia vírusu, značka lac Z vyjadruje regulátorové sekvencie, kódujúce informáciu pre časť Ň-konca génu na beta-galaktosidázu, skratka ori vyjadruje oblasť nutnú na replikáciu DNAv E. coli a skratka AmpR znamená kódujúcu oblasť génu na beta-laktamázu.

Obr. 13 je schematická kresba rekombinantného plazmidu pR3.

Obr. 14 ukazuje kompletnú nukleotidovú sekvenciu rekombinantného plazmidu pR3. Ukázaná aminokyselinová sekvencia vyjadruje otvorený čítací rámec pod kontrolou 7,5K vakcíniového promótora.

Obr. 15 je schematická kresba plazmidu pR4. Skratka ML vyjadruje maláriovú vedúcu sekvenciu.

Nasleduje podrobnejší opis tohto vynálezu.

Všetky uvedené citácie nahradzujú prenesenie celého ich obsahu do opisu tohto vynálezu.

Nasledujúce termíny tu v texte majú tieto významy:

„Povrchový antigén rodu Eimeria“ značí proteín so zdanlivou molekulovou hmotnosťou okolo 23 kilodaltonov, zistenou pomocou SDS PAGE, ktorý je prítomný v merozoovom štádiu v bunkách Eimeria tenella. Tento proteín sa zrejme tvorí pri posttranslačných procesoch, ktorým podlieha in vivo expresný produkt kódováný génom, ktorého cDNA sekvencia j e ukázaná na obr. 1.

„Proteínový prekurzor“ znamená proteín so zdanlivou molekulovou hmotnosťou okolo 33 kilodaltonov, zistenou pomocou SDS PAGE. Tento proteín zrejme vzniká in vivo proteolýzou z povrchového antigénu rodu Eimeria. Nukleotidová sekvencia molekuly cDNA, kódujúca proteínový prekurzor, a podľa nej predpovedaná aminokyselinová sekvencia sú ukázané na obr. 1.

Termín „imunogénne polypeptidy majúce sekvenciu aminokyselín (1), pričom tieto polypeptidy sú schopné indukovať imunitnú odpoveď proti parazitom rodu Eimeria“ znamená polypeptidy schopné vyvolať ochrannú imunitnú odpoveď, spostredkovanú B-bunkami a/alebo T-bunkami, proti parazitom rodu Eimeria, obsahujúcim uvedený merozoový povrchový antigén, ktotý korešponduje so sekvenciami imunogénnych polypeptidov. Uvedené imunogénne polypeptidy môžu byť tvorené zrelým merozoovým povrchovým proteínovým antigénom rodu Eimeria prirodzene neobsahujúcim iné proteíny rodu Eimeria alebo to môžu byť fragmenty uvedeného povrchového proteínového antigénu rodu Eimeria, ktoré sú stále ešte schopné sa špecificky viazať na protilátky, prítomné v sérach zvierat infikovaných parazitmi rodu Eimeria. Tieto polypeptidy zodpovedajú epitopom T-buniek a B-buniek povrchového antigénu rodu Eimeria definovaného v texte. Polypeptidy podľa tohto vynálezu tiež môžu byť funkčnými ekvivalentmi uvedeného merozoového povrchového proteínového antigénu rodu Eimeria, pričom tieto polypeptidy majú aminokyselinovú sekvenciu odvodenú od aminokyselinovej sekvencie na obr. 1 substitúciami aminokyselín. Tieto substitúcie ale zásadne nemenia imunologickú aktivitu (t. j. zásadne neničia imunoreaktívne a/alebo antigénne determinanty).

Príkladom fragmentu je imunogénny polypeptid, ktorý má aminokyselinovú sekvenciu (1) (Sckv. id. č.: 1), ale nemá v podstate prvých 20 až asi 100 aminokyselinových zostatkov, tvoriacich sekvenciu signálneho peptidu. Ďalším príkladom je imunogénny polypeptid s molekulovou hmotnosťou 23 kilodaltonov, zistenou pomocou analýzy na SDS-polyakrylamídovom géli. Prednostné fragmenty sú uvedené ďalej

SNNQQTSV (2)<sekv. id. č. 3) CGDEEDADEGTSQQASRRRRKPDTPAADK (3)(Sekv. id. č. 4) PRV (4)(Sekv. id. č. 5) RNKQ1E (5)(Sekv. id. č. 6) NPWTGQEE (6)(Sekv. ld. C. 7) RQSEE (7)(Sekv. id. č. B) TRQTLE (8)(Sekv. id. č. 9) QDGKTAKEEKVEGGKTHRRYKVKSSDPGYG (9)(Sekv. ld. č. 10) TDEDG (10)(Sekv. id. č. 11)

TGPHG (11)(Sekv. id. č. 12)

ASQGK (12)(Sekv. id. č. 13)

DDGKGNLVDGQGRK (13)(Sekv. ld. č. 14) a TQPDTEFRSGPGDDEDDE (14)(Sekv. ld. č. 15).

Fragmenty podľa tohto vynálezu, ako napríklad imunogénny polypeptid so sekvenciou (1) (Sekv. id. č. 1), sú schopné vyvolať imunitnú odpoveď proti kokcidióze v subjekte. Prednostným subjektom je hydina, napríklad kurčatá.

Výskyt aminokyselinových substitúcií v proteínoch, ktoré zásadne nemenia biologické a imunologické aktivity, je známy a opísaný napr. Neurath a ďalší, „The Proteins“ (Proteíny), Academic Press, New York (1979), najmä na obr. 6 str. 14. Najčastejšie pozorované aminokyselinové substitúcie sú Ala/Ser, Val/lle, Asp/Glu, Thr/Ser, Ala/Gly, Ala/Thr, Ser/Asn, Ala/Val, Ser/Gly, Tyr/Phe, AlaZPro, Lys/Arg, Asp/Asn, Leu/Ile, Leu/Val, Aia/Glu, Asp/Gly a opačne.

Kvôli degenerovanosti genetického kódu je zrejmé, že existuje veľa možných nukleotidových sekvencií (funkčných ekvivalentov), ktoré by mohli kódovať aminokyselinovú sekvenciu (1) (Sekv. id. č. 1). Tiež by malo byť zrejmé, že nukleotidové sekvencie DNA sekvencií a fragmentov podľa vynálezu inzertované do vektorov môžu obsahovať nukleotidy, ktoré nie sú časťou vlastných štruktúrnych génov, pokiaľ rekombinantné vektory, obsahujúce takú sekvenciu alebo fragmenty, sú schopné riadiť produkciu polypeptidu podľa vynálezu vo vhodnom hostiteľskom organizme.

Sekvencia DNA, kódujúca polypeptidy, ktoré sú funkčnými ekvivalentmi uvedeného merozoového povrchového antigénu rodu Eimeria, sa môžu vhodne pripraviť s použitím vhodných syntetických oligonukleotidov pri primérom riadenej miestne-špecifickej mutagenézii napríklad cDNA podľa vynálezu (Sekv. id. č. 2). Tento typ mutagenézie opísal Morinaga a ďalší (Biotechnology 2:636 (1984)). Fragmenty alebo časti merozoového povrchového proteínového antigénu z buniek rodu Eimeria alebo DNA, ktorá ich kóduje, sa môžu vytvoriť enzýmovým štiepením väčších molekúl pomocou reštrikčných endonukleáz na DNA a proteáz na proteíny. Fragmenty podľa vynálezu sa ale neobmedzujú na produkty akejkoľvek formy enzýmového štiepenia, ale zahŕňajú subsekvencie, ktorých konce nezodpovedajú žiadnym miestam enzýmového štiepenia. Tieto fragmenty sa môžu vyrobiť napr. chemickou syntézou s použitím sekvenčných údajov tu uvedených. Fragmenty DNA sa tiež môžu vytvoriť nekompletnou syntézou komplementárnou DNA (cDNA) z izolovanej messenger RNA (mRNA). Proteínové fragmenty sa tiež môžu vytvoriť expresiou fragmentov DNA, kódujúcich proteínové fragmenty. Také proteínové fragmenty môžu byť užitočné v tomto vynáleze, keď obsahujú dostatočný počet aminokyselinových zostatkov, aby vytvorili imunoreaktívny a/alebo antigénny determinant. Všeobecne je nutných aspoň 7 alebo 8 zostatkov. Ako je vysvetlené ďalej v texte, môže byť nutné viazať také fragmenty na imunogénnu nosičovu molekulu, aby sa stali imunoreaktívnymi.

SK 281606 Β6

Imunitná reaktivita môže zahŕňať ako produkciu protilátok B-bunkami (humorálna imunita), tak aktiváciu T-buniek (bunečná imunita). Polypeptidy podľa tohto vynálezu zahŕňajú antigénne determinanty alebo epitopy B-buniek a epitopy T-buniek. Humorálna imunita sa môže demonštrovať indukciou produkcie protilátok B-bunkami in vivo alebo in vitro. Bunkami sprostredkovaná imunita sa môže demonštrovať aktiváciou T-buniek napríklad zvýšenou syntézou proteínu T-buniek alebo stimuláciou B-buniek aktivovanými T-bunkami. Stanovenie obidvoch typov imunity je v odbore dobre známe.

Polypeptidy podľa vynálezu sa môžu získať spôsobmi v odbore známymi, ako je metodológia rekombinantnej DNA, chemická syntéza alebo izolácia prípravkov z buniek rodu Eimeria. Polypeptid so sekvenciou 1 (Sekv. id. č. 1) a jeho fragmenty, pokiaľ sa pripravia v súlade s postupom podľa tohto vynálezu, sú zásadne zbavené iných proteínov, ktoré produkujú paraziti rodu Eimeria.

DNA potrebná na tvorbu proteínov podľa tohto vynálezu sa môže chemicky syntetizovať s použitím poskytnutých informácií s nukleotidovou sekvenciou (Sekv. id. č. 2) a na obrázkoch. Taká chemická syntéza sa môže robiť s použitím akéhokoľvek známeho spôsobu, ako je napr. spôsob využívajúci fosforamiditový pevný nosič, ktorý opísal Matteucci a ďalší (J. Am. Chem. Soc. 103:3185 (1981)).

Alternatívne sa môže cDNA pripraviť pomocou mRNA z buniek rodu Eimeria. Messenger RNA sa môže izolovať z merozoi rodu Eimeria pomocou štandardných spôsobov. Tieto vzorky mRNA sa môžu použiť na vytvorenie dvojvláknovej cDNA, ako opísal Maniatis a ďalší (Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Molekulárne klonovanie: Laboratórna príručka), 1982, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY). Táto cDNA sa môže vložiť do vhodného klonujúceho vektora, ktorý sa môže použiť na transformáciu vhodného hostiteľského organizmu (napr. E. Coli), aby sa vytvorila knižnica cDNA.

Knižnica cDNA sa môže testovať s použitím klonového génu podľa tohto vynálezu alebo jeho fragmentov ako prób. Na užitie ako prób sa taký gén alebo fragmenty môžu označiť napr. nick-transláciou pomocou Pol I DNA polymerázy v prítomnosti štyroch deoxyribonukleotidov, z ktorých jeden obsahuje 32P v polohe alfa (Maniatis a ďalší, pozri v texte, str. 109). Próby sa tiež môžu pripraviť syntézou oligonukleotidov, ktorá je založená na známej sekvencií cDNA povrchového antigénu buniek rodu Eimeria.

Aj keď v uvedených príkladoch sa ako zdroj mRNA používal druh Eimeria tenella, klonované gény z tohto druhu sa môžu použiť ako próby na izoláciu génov z iných druhov rodu Eimeria vzhľadom na sekvenčnú homológiu medzi rôznymi druhmi.

Už identifikované a izolované časti DNA z buniek rodu Eimeria sa vložia do vhodného expresného prostriedku alebo vektora, ktorý obsahuje elementy nutné na transkripciu a transláciu vložených génových sekvencií. Užitočné klonujúce prostriedky sa môžu skladať zo segmentov chromozomálnych, nechromozomálnych a syntetických DNA sekvencií, ako sú rôzne bakteriálne plazmidy, vírusové DNA, napríklad fágové DNA, kombinácie plazmidov a vírusové alebo fágové DNA, ako sú plazmidy modifikované tak, aby obsahovali fágovú DNA alebo iné sekvencie kontrolujúce expresiu, alebo kvasnicové plazmidy. Špecifické klonujúce prostriedky, ktoré sa môžu použiť, obsahuje nasledujúce vymenúvanie, ale možnosť použitia sa neobmedzuje len na ne: pEV-vrf plazmidy (pEV-vrfl, -2, a -3, ktoré opísal Crowl a ďalší, Gene 38:31 (1985)); SV40; adenovírus; kvasnicové vektory; lambda gt-WES-lambda B; Charon 4A a 28; lambda-gt-2; od M13 odvodené vektory, ako sú pUC8, 9, 18 a 19, pBR313, 322 a 325; pAC105; pVA51; pACY177; pKH47; pACYC184; pUBllO; pMB9; coIEl; pSCIOl; pML21; RSF2124; pCRl alebo RP4; diftérie hydiny; vakcínia alebo člen herpesvírus rodiny.

Inzercia génov rodu Eimeria do klonujúceho vektora sa ľahko uskutoční, keď ako gény, tak žiadaný klonujúci prostriedok sa štepia rovnakým reštrikčným enzýmom alebo enzýmami, pretože tým sa vytvoria komplementárne DNA konce. Keď sa táto operácia nemôže uskutočniť, môže byť nutné modifikovať vzniknuté „strihnuté konce“ (cut ends) spätným štiepením jednovláknovej DNA za vzniku tupých koncov alebo na dosiahnutie rovnakého výsledku doplniť jednovláknové konce vhodnou DNA polymerázou. V tomto prípade sa môže uskutočniť ligácia „natupo“ (blunt-end ligation) pomocou enzýmu, ako je T4 DNA ligasa. Alternatívnym spôsobom je vytvorenie akéhokoľvek žiadaného miesta na DNA koncoch pomocou ligačných nukleotidových sekvencií (linkerov). Tieto linkeiy môžu obsahovať špecifické oligonukleotidové sekvencie, ktoré kódujú rozpoznávacie sekvencie reštrikčného miesta. Rozštiepený vektor a gény alebo fragmenty z buniek rodu Eimeria sa môžu tiež modifikovať spôsobom „homopolymeric tailing“, ktorý opísal Morrow (Methods in Enzymology 68:3 (1979)).

Veľa klonujúcich prostriedkov, ktoré sa môžu používať v tomto vynáleze, obsahuje jednu alebo viac markerových aktivít, ktoré sa môžu použiť na výber žiadaných transformantov, napr. rezistenciu na ampicilín a tetracyklín v pBR322, rezistenciu na ampicilín a β-galaktosidázovú aktivitu v pUC8 a rezistenciu na ampicilín v pEV-vrf plazrnidoch. Selekcia hostiteľských buniek, do ktorých sa tieto vektory vkladajú, je veľmi uľahčená, keď hostiteľské bunky samé nemajú aktivity poskytnuté týmito vektormi.

Je nutné si uvedomiť, že nukleotidové sekvencie génov buniek rodu Eimeria vložené na vybranom mieste do klonujúcich prostriedkov môžu obsahovať nukleotidy, ktoré nie sú časťou vlastných štruktúrnych génov. Alternatívne gény môžu obsahovať len časť kompletného génu divokého typu. Je len nutné, aby fragmenty génu po inzercii do klonujúceho prostriedku boli schopné riadiť vo vhodnom hostiteľskom organizme produkciu polypeptidu alebo proteínu, ktorý obsahuje aspoň jeden imunoreaktívny a/alebo antigénny determinant povrchového antigénu buniek rodu Eiméria, takže rekombinantné vektory, obsahujúce DNA s nukleotidovou sekvenciou, ktorá kóduje proteín podľa tohto vynálezu, sa môžu pripraviť:

a) inzerciou DNA s nukleotidovou sekvenciou kódujúcou uvedený proteín do vektora;

b) replikáciou tohto vektora v mikroorganizme; a

c) izoláciou rekombinantného vektora z mikroorganizmu.

Výber vhodného hostiteľského organizmu je ovplyvnený radom faktorov, známych v odbore. Tieto faktory zahŕňajú napríklad kompatibilitu s vybratým vektorom, toxicitu proteínov kódovaných hybridným plazmidom, ľahkosť získania žiadaného proteínu, expresné charakteristiky, biobezpečnosť a náklady. Vyrovnanosť týchto faktorov sa musí zvážiť a musí sa zobrať na vedomie, že nie všetci hostitelia budú rovnako efektívni pri expresii konkrétnej rekombinantnej molekuly DNA.

Skupina vhodných hostiteľských mikroorganizmov, ktoré sa môžu použiť v tomto vynáleze, zahŕňa, ale neobmedzuje sa na rastlinné, živočíšne alebo kvasnicové bunky a baktérie ako napríklad Escherichia coli, Bacillus subtilis, Bacillus stearotermofilus a Actinomyces. Môže sa použiť Escherichia coli kmeň MC 1061, ktorý opísal Casadaban a ďalší (J. Mol. Biol. 138:179 (1980)), alebo akýkoľvek iný

SK 281606 Β6 kmeň E. coli K-12 obsahujúci plazmid pRK248clts. Plazmid pRK248clts používaný v iných E. coli K-12 kmeňoch opísal Bemhard a ďalší (Meth. of Enzymol. 68:482 (1979)) a je tiež dostupný v Americkej zbierke typov kultúr pod číslom ATCC 33766. E. coli kmeň MC 1061 je komerčne dostupný napr. od CLONTECH Laboratories, Inc., Palo Alto, CA, USA a tiež v Americkej zbierke typov kultúr (Američan Type Culture Collection) pod číslom ATCC 53338. Plazmidy pDMI.l, pDS56/RBSTI, -1 alebo -2 používané v E. coli kmeni M15 sú opísané ďalej v texte.

Prevod rekombinantného klonujúceho vektora do hostiteľskej bunky sa môže uskutočniť rôznymi spôsobmi. V závislosti od konkrétneho zvoleného systému vektor/hostiteľská bunka sa môže tento prevod uskutočniť transformáciou, transdukciou, transfekciou alebo elektroporáciou. Keď sa vytvorí taká modifikovaná hostiteľská bunka, môže sa kultivovať a z kultúry sa môže izolovať proteínový expresný produkt.

Transformované klony, produkujúce proteínový prekurzor povrchového antigénu buniek rodu Eimeria, sa identifikujú testovaním pomocou séra zvierat imunizovaných proti sporozoovým alebo merozoovým bunkám E. tenella, ktoré boli fixované glutazaldehydom. V uvedených príkladoch sa na testovanie a charakterizáciu génového produktu použilo králičie anti-merozoové sérum. Výsledkom paralelného imunologického testovania pomocou imunitného kuracieho séra bola nezávislá izolácia cDNA, kódujúca merozoový povrchový antigénny prekurzor.

Špecifičnosť antisér použitých pri iminologickom testovaní alebo imunoprecipitácii sa môže zvýšiť použitím modifikovaného spôsobu výberu protilátok, pozri Halí a ďalší (Náture 311:379 (1984)). Pri tomto spôsobe, ktorý je podrobnejšie opísaný ďalej v texte, sa protilátky špecifické na proteíny buniek rodu Eimeria, ktoré vytvorili uvedené klony, adsorbujú zo séra na filtre.

Detekcia klonov produkujúcich antigén buniek rodu Eimeria sa môže robiť použitím dobre známych štandardných stanovení vrátane imunoprecipitácie, enzýmového imunostanovenia (ELISA) a rádioimunostanovenia, ktoré sú opísané v literatúre (pozri napr. Kennet a ďalší (editorovia), Monoclonal Antibodies and Hybridomas: A new Dimension in Biological Analyses (monoklonálne protilátky a hybridomy:

Nová dimenzia v biologických analýzach), 1980, Plénum Press, New York, str. 376 - 384).

Rekombinantné vektory obsahujúce DNA, ktorá kóduje variantný polypeptid povrchového antigénu buniek rodu Eimeria podľa tohto vynálezu, sa môžu pripraviť spôsobmi dobre známymi v odbore napr. miestne špecifickou mutagenéziou.

Veľké množstvá rekombinantných polypeptidov z buniek rodu Eimeria podľa tohto vynálezu sa môžu pripraviť pestovaním transformovaných mikroorganizmov, takto získaných, vo fermentačnom médiu, ktoré obsahuje nutné živiny, za podmienok vhodných na expresiu rekombinantnej DNA. Pri produkcii v bunkách E. coli sú rekombinantné polypeptidy buniek rodu Eimeria prítomné obyčajne v cytoplazme alebo v inklúziách baktérii. Na uvoľnenie proteinov je preto nutné rozbiť vonkajšiu membránu baktérii. To sa uskutočňuje sonikáciou alebo inými prostriedkami mechanickej dezintegrácie, ako je napr. použitie Frenchovej tlakovej cely alebo Gaulinovho homogenizátora (Charm a ďalší, Meth. Enzymol. 22, 476-556 (1971)).

Rozbitie buniek sa tiež môže uskutočňovať chemicky alebo enzymaticky. Pretože na integritu bunkovej membrány sú často potrebné dvoj väzné kationty, môže byť účinkom vhodných chelatačných činidiel, ako je EDTA alebo

EGTA, membrána dostatočne rozbitá, takže uľahčí uvoľnenie proteínov z buniek. Na vyvolanie rovnakého účinku sa podobne môžu použiť enzýmy napr. lysozým. Tento enzým hydrolizuje peptidoglykanovú kostru bunkovej steny.

Tiež sa môže použiť ozmotický šok. Jednoducho povedané ozmotický šok sa môže uskutočniť umiestnením buniek najprv do hypertonického roztoku, ktorý spôsobí stratu vody a zoschnutie buniek. Nasledovné premiestnenie buniek do hypotonického „šokového“ roztoku potom vedie na rýchly prísun vody do buniek s vylučovaním žiadaných proteínov.

Akonáhle sú proteíny buniek rodu Eimeria uvoľnené z buniek, môžu sa skoncentrovať zrážaním soľami ako napr. síranom sodným alebo amónnym, ultrafiltráciou alebo inými spôsobmi dobre známymi odborníkom v odbore. Ďalšie čistenie sa môže uskutočňovať bežnými purifikačnými postupmi na proteíny, ktoré zahŕňajú, ale sa neobmedzujú na gélovú filtráciu, intomeničovú chroinatografiu, preparatívnu elektroforézu na diskovitom géli alebo záclonovú (eurtain) elektroforézu, izoelektrickú fokuzáciu, frakcionáciu organickými rozpúšťadlami za nízkej teploty alebo protiprúdovú distribúciu. Purifíkácia sa tiež môže uskutočňovať imunoafmitnou chromatografiou.

Špecifické spôsoby purifikácie proteínov z buniek rodu Eimeria z mikroorganizmov sú v odbore známe (pozri napr. Newman a ďalší, Európska patentová prihláška č. 164 176).

Proteíny podľa tohto vynálezu alebo ich fragmenty sa môžu chemicky syntetizovať vhodným spôsobom, ako je syntéza výlučne v pevnej fáze, spôsoby využívajúce čiastočne pevnú fázu, kondenzácia fragmentov alebo klasická syntéza v roztoku. Prednosť sa dáva syntéze v pevnej fáze, ktorú opísal Merrifield (J. Am. Chem. Soc. 852149 (1963)).

Táto syntéza sa uskutočňuje s aminokyselinami, ktoré sú na konci s α-aminoskupinou chránené. Trifúnkčné aminokyseliny s nestabilnými bočnými reťazcami sa tiež chránia vhodnými skupinami, ktoré zabraňujú výskytu chemickej reakcie na tomto mieste počas tvorby peptidu. Skupina chrániaca koniec s α-aminoskupinou sa selektívne odstráni, aby sa umožnila nasledovná reakcia, ktorá sa odohráva na aminoskupine. Podmienky na odstránenie skupiny chrániacej α-aminoskupinu nespôsobia odstránenie chrániacich skupín z bočného reťazca.

Skupinami chrániacimi α-aminoskupiny sú známe skupiny užitočné v postupnej syntéze peptidov. Medzi tieto skupiny patria chrániace skupiny acylového typu (napr. formylskupina, triflóracetylskupina, acetylskupina), chrániace skupiny aromatického uretanového typu (napr. benzyloxykarbonyl skupina (Cbz) a substituovaná benzyloxykarbonyl skupina), alifatické chrániace skupiny uretanového typu (napr. t-butyloxykarbonyl skupina (Boe), izopropyloxykarbonyl skupina, cyklohexyloxykarbonyl skupina) a chrániace skupiny alkylového typu (napr. benzyl skupina, trifenylmetyl skupina). Prednostnou chrániacou skupinou je Boe. Chrániace skupiny bočného reťazca aminokyseliny Tyr sú okrem iného tetrahydropyranylskupina, terciálna butylskupina, tritylskupina, benzylskupina, Cbz, 4-Br-Cbz a 2,6-dichlórbenzylskupina. Prednostnou chrániacou skupinou bočného reťazca aminokyseliny Tyr je 2,6-dichlórbenzylskupina. Medzi chrániace skupiny bočného reťazca aminokyseliny Asp patria benzylskupina, 2,6-dichlórbenzylskupina, metylskupina, etylskupina a cyklohexylskupina. Prednostnou chrániacou skupinou bočného reťazca aminokyseliny Asp je cyklohexylskupina. Medzi chrániace skupiny bočného reťazca aminokyseliny Thr a Ser patrí acetylskupina, benzoylskupina, tritylskupina, tetrahydropyranylskupina, benzylskupina, 2,6-dichlórbenzylskupina a Cbz. Prednostnou chrániacou skupinou bočného reťazca amino

SK 281606 Β6 kyseliny Thr a Ser je benzylskupina. Medzi chrániace skupiny bočného reťazca aminokyseliny Arg patrí nitroskupina, Tos, Cbz, adamantylkarbonylskupina alebo Boe. Prednostnou chrániacou skupinou aminokyseliny Arg je Tos. Aminoskupina v bočnom reťazci aminokyseliny Lys sa môže chrániť Cbz, 2-ClCbz, Tos alebo Boe skupinou.

Prednostnou chrániacou skupinou aminokyseliny Lys je 2-Cl-Cbz skupina. Výber chrániacej skupiny bočných reťazcov sa zakladá na nasledujúcich faktoch: Chrániace skupiny bočných reťazcov musia zostať nedotknuté počas priebehu reakcie a nesmú sa odštiepovať počas odstraňovania skupiny chrániacej koniec s aminoskupinou alebo za podmienok priebehu syntézy. Chrániace skupiny bočného reťazca musia byť odstrániteľné po dokončení syntézy finálneho peptidu za reakčných podmienok nemeniacich cieľový peptid.

Syntéza v pevnej fáze sa obvykle uskutočňuje od konca s karboxyskupinou naviazaním aminokyseliny s chránenou aminoskupinou (s chráneným bočným reťazcom) na vhodný pevný nosič. Keď sa taká aminokyselina zakotví na živici obsahujúcej chlórmetylskupiny a hydroxymetylskupiny, vytvorí sa esterová väzba. Výsledný cieľový proteín bude mať voľnú karboxylovú skupinu na C-konci. Alternatívne sa môže použiť živica obsahujúca benzylhydrylaminoskupiny a p-metylbenzhydrylaminoskupiny na vytvorenie amidovej väzby a výsledný cieľový peptid bude mať karboxamídovú skupinu na C-konci. Tieto živice sú komerčne dostupné a ich príprava je opísaná, pozri Steward a ďalší, Syntéza peptidov v pevnej fáze (Solid Phase Peptide Synthesis) (2. vydanie, Pierce Chemical Co., Rockford, IL, 1984).

Aminokyselina Arg na C-konci, chránená na bočnom reťazci pomocou Tos a s α-aminoskupinou chránenou pomocou Boe, sa viaže na živicu s benzhydrylamínovými skupinami s použitím rôznych aktivačných činidiel, medzi ktoré patrí dicyklohexylkarbodiimid (DCC), N,N-diizopropylkarbodiimid a karbonyldiimidazol. Po pripojení na živičný nosič sa odstráni skupina chrániaca a-aminoskupinu použitím triflóroctovej kyseliny (TFA) alebo HC1 v dioxane pri teplote medzi 0 °C a 25 °C. Po zavedení metionínu (Met) sa do roztoku TFA pridá dimetylsulfid, aby sa zamedzilo možnej S-alkylácii. Po odstránení skupiny chrániacej α-aminoskupinu sa postupne navážajú ostatné chránené aminokyseliny v požadovanom poradí, aby sa získala žiadaná sekvencia peptidu.

Na spájacie reakcie pri syntéze peptidu sa môžu použiť rôzne aktivačné činidlá vrátane DDC, Ν,Ν-diizopropylkarbodiimidu, benzotriazol-1 -yl-oxy-tris(dimetylamino)-fosfónium hexaílórfosfátu (BOP) a DCC-hydroxybenzotriazolu (HOBt). Každá chránená aminokyselina sa používa v prebytku (>2,5 ekvivalentného množstva) a pripájanie sa obvykle uskutočňuje v roztoku DMF, CH₂C1₂ alebo ich zmesi. Dokončenie spájacej reakcie sa sleduje v každom stupni ninhydrínovou reakciou, ktorú opísal Kaiser a ďalší (Anál. Biochem. 34:595 (1970)). V prípade, že je zistené neúplné pripojenie, spájacia reakcia sa opakuje. Spájacie reakcie sa môžu uskutočňovať automaticky na syntetizátore Vega 250, Applied Biosystems synthetizer alebo na inom dostupnom prístroji. Po skončení tvorby cieľového peptidu sa z komplexu peptid-živica odstránia chrániace skupiny zmesí TFA/ditioetán a potom sa tento komplex štiepi činidlom, ako je kvapalný HF pri teplote 0 °C počas 1 až 2 hodín, pričom sa odštiepi peptid od živice a odstránia sa všetky skupiny chrániace bočné reťazce.

Cyklizácia bočných reťazcov s bočnými reťazcami na pevnej podložke vyžaduje použitie otogonálnej chrániacej schémy, ktorá umožňuje selektívne odštiepenie skupín chrániacich bočné reťazce kyslých aminokyselín (napr. Asp) a bázických aminokyselín (napr. Lys). Na tento účel sa môže použiť 9-flórenylmetylová chrániaca skupina (OFm) na bočný reťazec aminokyseliny Asp a 9-flórenylmetoxykarbonylová chrániaca skupina (Fmoc) na bočný reťazec aminokyseliny Lys. V týchto prípadoch sa chrániace skupiny bočných reťazcov komplexu peptid-živica chráneného Boe selektívne odstránia piperidínom v roztoku DMF. Cyklizácia na pevnej podložke sa dosiahne použitím rôznych aktivačných činidiel vrátane DCC, DCC/HOBt alebo BOP. Odštiepenie cyklizovaného peptidu od živice pomocou HF sa uskutočňuje spôsobom opísaným v texte.

Čistenie a testovanie syntetických proteínov sa môže uskutočňovať spôsobmi opísanými v texte na rekombinantnými postupmi vytvorené proteíny.

Proteíny rodu Eimeria sa môžu tiež získať z organizmov, z extraktov membránových proteínov. Týmito postupmi sa môžu pripraviť kompletné proteíny divokého typu. Monoklonálne protilátky sa na tento cieľ môžu pripraviť spôsobom, ktorý opísal Kohler a Milstein (Náture 256:495 (1975)) s použitím syntetických alebo prírodných proteínov rodu Eimeria ako antigénu. Tieto spôsoby sa môžu použiť na čistenie povrchového antigénu s veľkosťou 23 kd z buniek rodu Eimeria podľa tohto vynálezu.

Z jedného alebo viacerých polypeptidov podľa tohto vynálezu sa môžu vytvoriť vakcíny obsahujúce polypeptidy a fyziologicky vhodný nosič. Medzi vhodné nosiče patrí napr. fosfátový pufer s koncentráciou 0,01 až 0,1 M s neutrálnym pH alebo fyziologický roztok.

Zvýšenie imunity proti kokcidióze sa môže docieliť jedným z dvoch spôsobov. Za prvé sa do vakcíny môže pridať adjuvant alebo imunopotenciátor. Za druhé sa proteíny podľa tohto vynálezu môžu podávať subjektu, ktorý má byť imunizovaný, vo väčšej forme buď ako zosieťoyaný komplex alebo konjugované s nosičovou molekulou. ,

Skupina vhodných adjuvantov na podávanie vakcín subjektom zahŕňa, ale neobmedzuje sa na Adjuvant 65 (obsahujúci arašidový olej, monooleát mannídu a monostearát hlinitý); minerálne gély, ako je hydroxid hlinitý, fosforečnen hlinitý a oxid hlinitý; surfaktanty, ako je hexadecylamín, oktadecylamín, lysolecitín, dimetyldiokatadecylammóniumbromid, N,N-dioktadecyl-N,N-bis(2-hydroxymetyl)propandiamín, polyoly typu metoxyhexadecylglycerolu a pluronic; polyanionty, ako je pyrán, síran dextránu, poly IC, polyakrylová kyselina a karbopol; peptidy, ako je muramyldipeptid, dimetylglycín a tuftsín; a olejové emulzie. Proteíny by sa tiež mohli podávať po inkorporácii do lipozómov alebo iných mikronosičov.

Inkorporácia do lipozómov alebo iných mikronosičov poskytuje prostriedok, ktorým je možné predĺžiť čas uvoľňovania účinných látok z vakcín. Na rovnaký cieľ sa môžu použiť čerpadlá, ako je ozmotické čerpadlo Alza.

Imunogenicita polypeptidov podľa vynálezu, najmä menších fragmentov, sa môže zvýšiť zosieťovaním alebo pripojením na imunogénnu nosičovu molekulu (t. j. na makromolekulu majúcu schopnosť nezávisle vyvolať imunologickú odpoveď v hostiteľskom zvieracom organizme). Na túto makromolekulu sa môžu proteíny a proteínové fragmenty podľa vynálezu kovalentne viazať. Zosieťovanie alebo konjugácia s nosičovou molekulou môže byť žiaduca, pretože malé proteínové fragmenty sa môžu niekedy chovať ako haptény (molekuly, ktoré sú schopné špecificky sa viazať na protilátku, ale neschopné vyvolať produkciu protilátok, t. j. nie sú imunogénne). Konjugácia týchto fragmentov s imunogénnou nosičovou molekulou robí fragmenty imunogénnymi, čo je všeobecne známe ako „nosičový efekt“.

SK 281606 Β6

Medzi vhodné nosičové molekuly patria napr. proteíny a prírodné alebo syntetické polyméme zlúčeniny, ako sú polypeptidy, polysacharidy, lipopolysacharidy atď. Užitočným nosičom je glykosid nazývaný Quil A, ktorý opísal Morein a ďalší (Náture 308:457 (1984)). Prednostné sú najmä proteínové nosičové molekuly, ktoré zahŕňajú, ale neobmedzujú sa na savčie sérum proteínov, ako je hemokyanín z organizmov rodu Fissurellidae, ľudský alebo hovädzí gammaglobulín, ľudský, hovädzí alebo králičí sérový albumín alebo metylované alebo iné deriváty týchto proteínov. Odborníci v odbore samozrejme poznajú aj iné proteínové nosiče. Prednostne, ale nie nevyhnutne, je proteínový nosič cudzí pre zvieracieho hostiteľa, v ktorom sa má vyvolať tvorba protilátok proti proteínom z buniek rodu Eimeria.

Kovalentné pripojenie na nosičovú molekulu sa môže uskutočňovať spôsobmi dobre známymi v odbore, ich presná voľba je určená povahou použitej nosičovej molekuly. Keď je, imunogénnou nosičovou molekulou proteín, môžu sa proteíny alebo fragmenty proteínov podľa vynálezu pripojiť napr. s použitím karbodiimidov rozpustných vo vode, ako je dicyklohexylkarbodiimid alebo glutaraldehyd.

Pripojovacie činidlá tohto typu sa tiež môžu použiť na zosieťovanie samotných proteínov a proteínových fragmentov bez použitia separátnej nosičovej molekuly. Toto zosieťovanie, ktorým vzniknú agregáty proteínu alebo proteínových fragmentov, môže tiež zvýšiť imunogenicitu.

Podávanie účinného množstva vakcín podľa vynálezu môže chrániť proti kokcidióze napr. spôsobenej infekciou druhom E. tenella alebo infekciou inými druhmi rodu Eimeria. Monoklonálne protilátky proti antigénom z E. tenella krížovo reagujú in vitro s antigénmi z E. acervulina a E. maxima. Prednostným subjektom je hydina, napr. kurčatá, ale iné subjekty tiež spadajú do rozsahu tohto vynálezu. V súlade s týmto vynálezom sa môže použiť akékoľvek účinné množstvo vakcíny. Účinné množstvo sa môže určiť rutinnými experimentmi pomocou metód, opísaných ďalej v texte. Účinné množstvo polypeptidov a ich fragmentov podľa vynálezu, ktoré sa pohybuje v rozmedzí od asi 5 do asi 50 mikrogramov/kg telesnej hmotnosti subjektu, ktorému sa dáva vakcína, je prednostné. Zvlášť prednostná je dávka okolo 25 až 50 gg/kg. Prednostne po prvom podávaní vakcíny nasleduje opakované podávanie vakcíny, uskutočnené o jeden alebo niekoľko týždňov neskoršie. Vakcína sa môže podávať veľakrát za sebou. Dávky sa pri tomto opakovanom podávaní pohybujú v rozmedzí od asi 5 do 50 pg/kg, prednostne asi od 20 do 50 gg/kg. Môžu sa použiť štandardné spôsoby podávania, ako je podkožné, intradermálne, intramuskuláme, orálne, análne alebo in ovo podávanie (priama injekcia do embryí).

Jednoduché alebo mnohonásobne opakované podávanie vakcín môže byť sprevádzané indukovanou nevýznamnou infekciou kokcidiózy, ktorá môže zvýšiť ochranu.

Podávanie kokcidiózových antigénov podľa vynálezu do imunitných systémov subjektov, napr. hydiny, sa môže tiež uskutočňovať pomocou klonujúcich génov, kódujúcich antigény v baktériách (napr. v E. coli alebo v rode Salmonella) alebo vo vírusoch (napr. v poxvírusoch alebo herpesvlrusoch) a podávaním živého bektorového systému alebo, ak je to vhodné ako inaktivované formy subjektom orálne, injekčné alebo iným všeobecne známym spôsobom. Carbit a ďalší (vo Vaccines (Vakcíny), 1987, Cold Spring Harbor Laboratory, str. 68 - 71) opísal použitie buniek E. coli, zatiaľ čo Clements (Pathol. Immunopathol. Res. 6:137 (1987)) opísal použitie buniek rodu Salmonella. Moss a ďalší (Ann. Rev. Immunol. 5:305 (1987)) urobili prehľad použitia vírusových vektorových systémov, ktoré využívajú rekombinantný poxvírus.

Jeden druh poxvírusu, vakcínia vírus, sa môže použiť na testovanie dodania kokcidiózových antigénov v bunkovej kultúre a vo zvieratách. Vírus diftérie hydiny je ďalší poxvírusový nosič, ktorý sa môže použiť na uskutočnenie tohto vynálezu. Zistilo sa, že na analytické štúdie je praktickejšie použiť vakcínia vírus ako vírus hydinovej diftérie. To je spôsobené tým, že vakcínia vírus sa množí rýchlejšie ako vtáčí vírus a jeho hostiteľmi nemusia byť len vtáčie bunky. Do genómu vakcínia vírusu sa môžu vložiť veľké množstvá heterológnej DNA bez inhibičného účinku na zrenie vírusu a jeho infekčnosť (Smith a ďalší, Gene 25:21 (1983)). Zmnožené heterogénne gény vložené do tohto vírusu sa exprimujú v infikovaných zvieratách a vyvolajú tvorbu protilátok (Perkus a ďalší, Science 229:981 (1985)).

Spôsoby používané na tvorbu rekombinantných vakcínia vírusov sa môžu ľahko prispôsobiť rutinným postupom na systémy vírusov hydinovej diftérie a herpesvírusov. Rekombinantný virus, obsahujúci DNA s nukleotidovou sekvenciou kódujúcou proteín podľa tohto vynálezu sa môže pripraviť:

a) vložením DNA s nukleotidovou sekvenciou kódujúcou uvedený proteín do genómu vírusu bez inhibovania zrenia a infekčnosti vírusu;

b) amplifíkáciou uvedeného rekombinantného vírusu v bunkovej kultúre; a

c) vyčistením rekombinantného vírusu z kultúry. Použitie rekombinantných vírusov ako nosičov vo vakcínach proti kokcidióze je zvlášť výhodné preto, že hydina si vyvinie imunitu ako proti kokcidiózovému antigénu, tak proti vírusovému nosiču (t. j. také vakcíny sú bivalentné). Užitočnosť takých vakcín sa môže ďalej zvýšiť vložením prídavných génov do nosičového vírusu. Napríklad do vírusu hydinovej diftérie sa môže spoločne s génom na kokcidiózový antigén vložiť vírusový genóm „Newcastle“ choroby. Tak sa môže jednoduchou vakcínou spôsobiť imunita na „Newcastle“ choroby, kokcidiózu a hydinovú diftériu.

Podávanie vakcín so živými vektormi podľa tohto vynálezu sa môže uskutočňovať mnohými spôsobmi, známymi v odbore. Napríklad sa môže použiť „bodacia“ („stick“) metóda obvykle užívaná na podávanie vakcín proti vírusom hydinovej diftérie. Táto metóda spočíva v bodnutí alebo napichnutí koži tkaniva krídla ostrou ihlou namočenou vo vakcíne. Táto ihla má obvykle blízko špičky očko ako ihla šijacieho stroja, ktoré nesie kvapku vakcíny. Alternatívne sa môžu živé vakcíny aplikovať injekčné podkožné alebo intradermálne do tkaniva krídla alebo akéhokoľvek iného miesta.

Rekombinantné vakcíny so živým vektorom sa tiež môžu pridávať do pitnej vody alebo dokonca sa môžu sprejovo striekať na subjekty, ktorým sa majú podávať vakcíny, ako sú napr. kurčatá. Vakcíny sa tiež môžu podávať v krmive, prednostne po ochrannom obalení (Balancou a ďalší, Náture 322:373 (1986)) alebo in ovo. Pri in ovo podávaní sa vírusové vakcíny injekčné aplikujú priamo do embryí, najmä kuracích embryí (Sharma, Avian Dis. 25:1155 (1985)).

Pokiaľ nie jc uvedené inak, percentá udávané ďalej v texte tuhých látok v tuhých zmesiach sú hmotnostné, kvapalín v kvapalných zmesiach sú objemové a údaje tuhých látok v kvapalinách sú uvádzané v g/1. Ďalej, pokiaľ nie je uvedené inak, použitie konkrétnych reagencií a prístrojov, ktoré je ďalej v texte uvedené, nie je myslené ako povinné. Odborník si môže vybrať podobné reagencie alebo prístroje od iných dodávateľov.

SK 281606 Β6

Príklady uskutočnenia vynálezu

Príklad 1

Čistenie merozoových buniek

Merozoové bunky E. tenella sa získajú z cieka 50 infikovaných kurčiat (3 týždne starých Hubbard Cross; Avian Services, Frenchtown, NJ, USA) po 5 dňoch od infikovania dávkou 50 000 skôr sporulovaných oocýst na kurča. Môžu sa použiť podobné kurčatá z iných zdrojov. Cieky sa odstránia a premývajú sa fyziologickým roztokom pufŕovaným fosfátovým pufrom (PBS) počas 15 minút za miešania magnetickým miešadlom. Zostatky epitelu sa odstránia odstredením pri pomalej rýchlosti (50 x g) a surové merozoové bunky sa získajú odstredením pri 2000 g, počas 10 minút, pri teplote 4 °C. Peleta sa resuspenduje v lýzovacom pufri (so zložením: 8,29 g/1 NH₄C1, 0,372 g/1 Na₂EDTA, 1,0 g/1 KHCO₃; s pH 7,6) a inkubuje sa v ľadovom kúpeli 30 minút. Merozoové bunky sa zhromaždia odstredením, raz sa premyjú PBS a nechajú sa prejsť kolónou, obsahujúcou 1,0 g pradených nylonových vlákien (výrobka Scrub Nylon Fiber, Fenwall Laboratories, Deerfield, IL), v separačnom lieviku. Merozoové bunky sa zhromaždia odstredením za rovnakých podmienok ako v predchádzajúcom prípade a zmrazia sa suchým ľadom na izoláciu RNA alebo na ďalšie čistenie v dietylaminoetylcelulóze (DEAE, Whatman DE52, Whatman Bio Systems, Inc., Clifton, NJ, USA) na Western Blot analýzu.

Na čistenie v DEAE celulóze sa na kolónu s mŕtvym objemom 10 ml nanesie približne 1 x 10⁹ merozoových buniek v PBS roztoku a eluuje sa roztokom PBS. Merozoové bunky sa získajú v prvých 100 ml eluátu, zásadne zbavenej červených krviniek a iných bunkových zostatkov.

Imunoprecipitácia povrchových proteínov, označených ^l25I.

Povrchové proteíny vyčistených merozoových buniek sa označia ^l25I metódou IODOGEN(R) (Pierce Chemical Co.) alebo sa použijú IODOBEADS(R) (jódoguličky) (Pierce Chemical Co.). Pri spôsobe využívajúcom IODOBEADS sa 4 IODOBEADS trikrát premyjú roztokom fosforečnanu sodného s koncentráciou 0,2 M a pH 7,5, pridá sa ^l25I Na a zmes sa 5 minút inkubuje pri teplote miestnosti. Do reakčnej ampuly sa pridajú vyčistené merozoové bunky (v množstve 3 x 108 buniek) v 200 ml PBS s pH 7,0 a pokračuje sa v inkubácii počas 15 minút. Na konci inkubácie sa pridá fenylmetánsulfonylchlorid (PMSF) tak, aby jeho konečná koncentrácia bola 5 mM.

Označené merozoové bunky sa získajú z inkubačnej zmesi odstredením pri 12 000 g počas 30 s a solubilizáciou v 1 ml buď roztoku dodecyl sulfátu sodného (SDS) s koncentráciou 20 g/1 alebo v 1 %-nom Tritóne X-100 v PBS s pH 7,0. Nerozpustný materiál sa odstráni odstredením pri 12 000 g počas 3 minút. Solubilizované proteíny sa dialyzujú proti 3 1 PBS s pH 7,0 pri teplote 4 °C, s použitím membrány s deliacim rozhraním molekulovej hmotnosti 3500, aby sa odstránil všetok ostatný voľný ^l2SI, proteíny označené ^l25l (typicky je do proteínu inkorporované množstvo asi 1,5 x 10⁸ cpm ^l25I) sa skladujú pred použitím pri teplote 4 °C. TCA precipitovateľná rádioaktivita je obvykle vyššia ako 95 %, vztiahnuté na celkovú rádioaktivitu.

Králičie antisérum proti merozoovým bunkám, fixovaným glutaraldehydom, sa pripraví nasledujúcim postupom: Približne 1 x 10⁹ vyčistených merozoových buniek sa suspenduje v roztoku glutaraldehydu v PBS s koncentráciou 1 % a inkubuje sa 5 min. pri teplote miestnosti. Fixované parazitické bunky sa zoberú odstredením pri 2000 g, min., trikrát sa premyjú PBS a resuspendujú v 1 ml PBS. Novozélandskí bieli králici dostanú niekoľkonásobnú intradermálnu injekciu do kože na chrbte s celkovým množstvom 5,0 ml roztoku s fixovaným parazitickým proteínom, emulgovaného v 0,5 ml kompletného Freundovho adjuvantu. Králici dostanú dve opakované injekcie, obsahujúce rovnaký parazitický proteín v nekompletnom Freundovom adjuvante, v intervale dvoch týždňov. Krv sa získa z ušnej žily dva týždne po poslednej injekcii a sérum obsahujúce protilátky sa získa odstredením koagulovaných krvných vzoriek pri 2500 g počas 15 minút.

Vzorky označených proteínov na imunoprecipitáciu (s objemom 5 ml, obsahujúce 5 x 10⁵ cpm 1251) sa zriedia do 100 ml IP pufra (so zložením: 0,25 % NP-40, 20 mM Tris-HCl s pH 7,5, 0,15 M NaCl), predčistia sa inkubáciou v ľadovom kúpeli s 5 mg StapH-A proteínu (výrobca Pansorbin, Calbiochem Corp., San Diego, CA) počas 20 minút. Potom sa vzorky inkubujú niekoľko hodín s 5 až 10 ml králičieho anti-merozoového séra, pri teplote 4 °C. Komplexy protilátok sa zhromaždia druhou inkubáciou s 5 mg StapH-A proteínu v ľadovom kúpeli, 20 min. a odstredením v Eppendorfovej centrifiigačnej skúmavke počas 15 s. Pelefy sa 4krát premyjú IP pufrom a označené proteíny imunoprecipitované protilátkami sa eluujú z komplexu zahrievaním pri 100 °Č, počas 5 min., v SDS gélovom pufri. so vzorkou (zloženie SDS gólového pufra: 65 mM Tris s ,pH 6,8, 0,5 SDS, 5 % β-merkaptoetanol, 10 % glycerolu, 0,1 % brómfenolovej modrosti). SDS elektroforéza v polyakrylamidovom géli (SDS PAGE) sa uskutočňuje spôsobom, ktorý opísal Laemmli (Náture 227:680 (1970)).

Výsledky získané pomocou králičieho antiséra sa potvrdia použitím imunitného kurčacieho séra, ktoré sa pripraví nasledujúcim spôsobom: _;Í1

Kurčatá sa imunizujú opakovanou injekciou so živými, sporulovanými oocystami E. tenella (množstvo 100 000. oocýst podané trikrát v intervale dvoch týždňov). Krv^sa pozberá srdcovou punkciou a sérum obsahujúce protilátky sa oddelí od koagulovaných bunkových zostatkov následným odstredením pri 2500 g počas 5 minút.

Urobia sa porovnávacie štúdie, pri ktorých sa ako antimerozoové králičie sérum, tak imunitné kurčacie sérum použijú na imunoprecipitáciu povrchových merozoových proteínov rodu Eimeria označených ¹²⁵I a produktov in vitro translácie poly(A)-obsahujúce merozoové RNA. Precipitované proteíny sa podrobia analýze na SDS PAGE a vizualizujú sa flórograficky s použitím štandardných flórografických postupov a reagencií.

Tieto štúdie ukazujú, že veľa proteínov z obidvoch zdrojov sa precipituje pomocou obidvoch sér. Takže na testovanie genetických rekombinantov, ktoré sa exprimujú ako proteíny rodu Eimeria, sa môžu použiť obidve séra. Králičie anti-merozoové sérum sa na testovanie, opísané ďalej v texte, použije skôr pre svoju výhodnosť. Ale sérum imúnnych kurčiat sa použije pri paralelnom testovaní cDNA knižnice, opísanej ďalej v texte. To je zásadné na identifikáciu proteínov, pravdepodobne dôležitých v imunitnej odpovedi na infekčný organizmus, pretože len kuracie sérum sa získa ako odpoveď na provokačnú infekciu živými organizmami. Len imunizované kurčatá sú preukázateľne odolné na také organizmy.

Aby sa zvýšila špecifita králičieho anti-merozoového séra na proteíny z buniek rodu Eimeria, uskutoční sa v sére výber protilátok podľa všeobecného návodu, ktorý opísal Halí a ďalší (Náture 311:379 (1984)). Stručne povedané, protilátky špecifické na proteínový prekurzor exprimovaný rekombinantným fágovým klonom (pozri ďalej v texte) sa čistia z králičieho antimerozoového séra nasledujúcim spôsobom.

Pozitívny fág sa husto naočkuje na misku a pestuje sa

3.5 hodiny pri teplote 42 °C. Expresia tuzovaného proteínu sa vyvolá prevrstvením misky nitrocelulózovým filtračným materiálom nasýteným roztokom izopropyltiogalaktosídu (IPTG) s koncentráciou 10 mM. V inkubácii sa pokračuje ďalších 6 až 8 hodín, pri teplote 37 °C. Filtračný materiál napustený antigénom sa premyje v roztoku TBS (so zložením: 20 mM Tris-HCl s pH 8,0, 150 mM NaCl) a inkubuje sa po 8 až 10 hodín, pri teplote 4 °C s prebytkom antimerozoového séra, preadsorbovaným pomocou hostiteľských baktérií E. coli. Filtračný materiál sa trikrát premyje roztokom TBS, aby sa odstránili nešpecifické protilátky.

Protilátky, špecificky naviazané na fuzovaný proteín na filtračnom materiáli, sa eluujú 2,0 ml glycínu s koncentráciou 0,1 M v roztoku NaCl s koncentráciou 0,15 M s pH

2.6 (15 min, pri teplote 20 °C). Eluované protilátky sa ihneď neutralizujú rovnakým objemom roztoku Tris-HCl s koncentráciou 0,1 M a pH 8,0. Vybraté protilátky (tu uvádzané ako „antigénom vybraté protilátky“) sa potom použijú pri imunoprecipitácii povrchovo označených merozoových buniek alebo in vitro translačných produktov alebo ako próby pri Westem blot analýze celého merozoového proteínu. Kontrolné séra sa pripravia s použitím rekombinantného fágu antigén-selektívnym postupom.

Výsledky Westem blot a imunoprecipitačných analýz s použitím antigén-selektívnych protilátok ukazuje obr. 2. Produkty imunoprecipitácie označených proteínov sa vizualizujú flórograficky spôsobom, ktorý opísal Bonner a ďalší (Eur. J. Biochem. 46:83 (1974)). Čísla vpravo od obrázku ukazujú umiestnenie markerových proteínov s molekulovou hmotnosťou, udanou v kilodaltonoch.

Okienko A na obr. 2 ukazuje imunoblot celkových merozoových proteínov testovaný próbou v podobe kontroly (a) alebo antigénom vybratých protilátok (b). Okienko B ukazuje povrchové merozoové proteíny označené ¹²⁵I imunoprecipitované s kontrolou (a) alebo antigénom vybratými protilátkami (b).

Izolácia a in vitro translácia merozoovej mRNA

Zmrazené merozoové pelety obsahujúce 1 x 10⁹ až 1 x x 10^w organizmov sa nechajú rozpustiť v 10 ml TEL/SDS pufri (so zložením: 0,2 M Tris-HCl, 0,1 M LiCl, 25 mM EDTA, 10 g/1 dodecylsulfát sodný (SDS), pH 8,8), ktorý obsahuje 1 mM ditiotreitolu (DTT) a 300 jednotiek RNazín (Promega Biotec, Madison, Wl) a homogenizujú sa 10 až 12 údermi v tkanivovom homogenizátore pokrytom teflónom. Nerozpustné bunkové zvyšky sa odstránia odstredením za chladu, pri 3000 g. Supematant sa dvakrát extrahuje zmesou fenol : chloroform : izoamylalkohol (24 : 24 : 1, objemové diely), uvedenou do rovnovážneho stavu TEL pufrom.

Vodná fáza sa štiepi 30 minút proteinázou K s koncentráciou 100 mg/ml pri teplote 37 °C a reextrahuje sa rovnakým objemom zmesi fenol : chloroform (1 : 1). Nukleová kyselina sa zráža 1 hodinu dvoma objemami etanolu v suchom ľade alebo cez noc pri teplote -20 °C. Peleta, po odstredení 1 hodinu pri 10 000 g, sa resuspenduje v TE (so zložením: 10 mM Tris.HCl s pH 7,5, 2 mM EDTA) a zvlákňuje sa cez clonu z 4 ml chloridu cestného (5,7 M CsCl, 0,1 M EDTA) pri 150 000 g, 20 hodín, pri teplote 15 °C. Peleta RNA sa znovu vyzráža z roztoku octanu draselného, s koncentráciou 0,2 M, 2,5 objemami etanolu. Toto celkové množstvo RNA sa nechá prejsť raz cez oligodT celulózu, aby sa zvýšil obsah poly(A)⁺ RNA, ako opísal

Maniatis, pozri v texte, str. 197. Obvyklý výťažok 1,9 mg celkovej RNA z 5 x 10⁹ merozoových buniek obsahuje približne 20 pg poly(A)⁺ RNA.

Na naprogramovanie in vitro syntézy proteínu v lyzáte králičích retikulocytov ošetrených nukleázou (Amersham Corp., Arlington Heights, IL, USA alebo Promega Biotec) s prídavkom metionínu, označeného ³⁵S v množstve 10 - 20 mCi na 20 ml reakčnej zmesi, sa použije množstvo mRNA pohybujúce sa medzi 0,1 a 0,5 pg. In vitro translačné produkty sa analyzujú imunoprecipitáciou a ďalej SDS PAGE a vizualizujú sa flórograficky, ako je opísané. Výsledky ukazuje obr. 2, okienko C.

Pás C v okienku C ukazuje kompletnú zmes produktov, programovaných merozoovou poly(A)-obsahujúcou RNA. Pásy b, a a d ukazujú translačné produkty imunoprecipitované protilátkami vybratými pomocou rekombinantného fágového klonu označeného lambda 5-7 (pozri ďalej v texte; tento kloň exprimuje gén, kódujúci proteínový prekurzor buniek rodu Eimeria s veľkosťou 33 kilodaltonov) (pás b), pomocou ďalšieho fágového klonu reagujúceho s antimerozoovým sérom (pás a) a pomocou nerekombinantného lambda gtll klonu (pás d).

Je nutné poznamenať, že hlavný proteín s molekulovou hmotnosťou okolo 33 kilodaltonov sa môže sledovať v pásoch a a b, obr. 2, okienko C. Tento proteín nie je prítomný v páse obsahujúcom celkové množstvo merozoových proteínov testovaných próbou v podobe entigénom vybratých protilátok (okienko A, pás b), ale v tomto géli (okienko A, pás b, označené šípkou) sa môže sledovať pás s hmotnosťou 23 kilodaltonov. Proteín s hmotnosťou 23 kilodaltonov sa tiež imunoprecipituje antigénovo vybratými protilátkami z merozoových proteínov označených ¹²⁵I, ako je ukázané na obr. 2, okienko B, pás b. Z týchto pozorovaní dohromady vzniká predpoklad, že z prekurzorového proteínu s hmotnosťou 33 kilodaltonov sa proteolytickým štiepením v zrelých merozoových bunkách vytvára povrchový antigén s hmotnosťou 23 kilodaltonov.

Príprava knižnice na expresiu merozoovej cDNA Dvojvláknová cDNA sa syntetizuje zo 6 pg merozoovej poly(A)⁺RNA, ako opísal Gubler a ďalší, Gene 25:263 (1983), s použitím reverznej transkriptázy (BRL, Gaithersburg, MD, USA) na predĺženie z oligo(dT) priméru a RNázy H (BRL) a DNA polymerázy I z E. coli (New England Biolabs, Beverly, MA, USA) na syntézu komplementárneho vlákna. Dvojvláknová cDNA sa potom vybaví „tupými koncami“ pomocou T4 DNA polymerázy (BRL). Po pôsobení EcoRI metylázy (New England Biolabs) sa pridajú Eco Rl linkery (zloženie GGAATTCC, výrobca Collaboralive Research Inc., Bedford, MA, USA) podľa predpisu výrobcu.

Po štiepení pomocou EcoRI sa časti cDNA frakcionujú v prípravku Biogél A-50M, aby sa odstránil prebytok linkerových molekúl a časti cDNA menšie ako približne 300 bp, ako opísal Huynh a ďalší, pozri ďalej v texte. cDNA sa potom skoncentruje vyzrážaním etanolom.

Knižnica sa pripraví vo fágu gtll (výrobca Stratagene Cloning Systems, San Diego, CA), ako opísal Huynh a ďalší v D. Glover (ed.), DNA Cloning Vol. I: A Practical Approach (Klonovanie DNA, zv. I: Praktický prístup), 1985, IRL Press, Washington, D. C., USA, str. 49 až 78. EcoRI cDNA fragmenty sa ligáciou spoj a s defosforylovanými ramienkami gtll, rozštiepenými pomocou EcoRI (Stratagene Cloning Systems). Výsledná DNA sa zabalí do fágu pomocou Gigapack súpravy (Stratagene Cloning Systems) podľa predpisu výrobcu.

Výsledná knižnica sa amplifikuje naočkovaním na misku s Y 1088 hostiteľskými bunkami. Počet percent rekom

SK 281606 Β6 binantov, odhadnutý z pomeru modrých k bezfarebným plakom na miskách s X-gal médiom (Maniatis, pozri v texte, str. 24) v prítomnosti izopropyltiogalaktosídu (IPTG, Sigma Chemicals Co.), je asi 90 %.

Imunologické testovanie cDNA knižnice

Knižnica na expresiu merozoovej cDNA vo fágu gtll sa naočkuje na misky s bunkami Y 1090 s hustotou asi 10 000 plakov na misku s priemerom 150 mm. Šesť takých misiek sa inkubuje 3,5 hodiny pri teplote 42 °C, prekryje sa nitrocelulózovým filtračným materiálom dopredu máčaným v IPTG s koncentráciou 10 mM, aby sa indukovala expresia β-galaktosidázového fúzovaného proteínu. Misky sa ďalej inkubujú 4 až 5 hodín až cez noc, pri teplote 37 °C.

Filtračný materiál sa z misiek odstráni a niekoľkokrát sa vsádzkovo premyje roztokom TBS (so zložením: 20 mM Tris HC1 s pH 8,0, 0,15 mM NaCl). Nešpecifické väzné miesta proteínu sa zablokujú inkubáciou v 20 %-nom fetálnom teľacom sére (FCS) v TBS počas 1 hodiny, pri teplote miestnosti.

Filtračný materiál sa potom inkubuje 1 hodinu s bunkami Y 1090, na ktorých je dopredu naadsorbované králičie anti-merozoové sérum, pri zriedení 1 : 100 v TBS, obsahujúcom 20 % teľacieho séra. Nešpecifické protilátky sa odstránia následným premývaním TBS, pričom jeden premývací roztok TBS obsahuje 0,1 % NP-40. Filtračný materiál sa inkubuje s kozím anti-králičím peroxidázovým konjugátom (BioRad, Richmond, C A), pri zriedení 1 : 1000 v TBS s teľacím sérom, 1 hodinu, pri teplote miestnosti. Podľa pokynov výrobcu sa vyvinie farebná reakcia s 4-chlór-1 -naftólom (BioRad).

Na testovanie sa tiež použije sérum z imúnnych kurčiat. Toto sérum sa najprv adsorbuje na bunky Y 1090 a použije sa v rovnakom zriedení ako králičie sérum. Králičia antikurčacia protilátka sa použije ako sekundárna protilátka a kozí anti králičí chreň-peroxidázový konjugát sa použije ako detekčná protilátka. Jednotlivé plaky sa izolujú pri sekundárnom testovaní s použitím rovnakých reagencií.

Jeden kloň, označený lambda 5-7, produkuje proteín silno reaktívny s protilátkami z králičieho séra. Druhý izolát 1-5 sa identifikuje testovaním s imunitným kurčacim sérom a dokáže sa, že obsahuje cDNA inzert s rovnakou veľkosťou ako 5-7 kloň. DNA sekvenčná analýza ukazuje, že tieto fágové klony kódujú rovnaký merozoový proteín.

Expresia cDNA z fágu lambda 5-7 v E. coli

Inzert z fágu lambda 5-7 s veľkosťou 1,2 kb sa izoluje štiepením pomocou EcoRi a elektroforézou v agarosovom géli (Maniatis a ďalší, pozri v texte, str. 157 - 170). Konce, vzniknuté štiepením pomocou EcoRI sa opravia účinkom Klenowovej polymerázy v prítomnosti dATP a dTTP. Na obidva konce sa ligáciou pripoja BamHI linkery (GGGATCCC). Do každého z troch expresných vektorov pDS56/RBSII, pDS56/RBSII,-l a pDS56/RBSII,-2 sa na BamHI mieste vloží tento modifikovaný fragment. Plazmidy, obsahujúce inzerty v obidvoch možných orientáciách, sa transformujú, ako opísal Mandel a ďalší (J. Mol. Biol. 53:159 (1970)) do buniek E. coli kmeň M15, ktoré nesú kompatibilný plazmid pDMI.l. E. coli kmeň M15, nesúci plazmidy pDS56/RBSII a pDMI.l, je opísaný v Európskej patentovej prihláške č. 316 695.

Konštrukcia plazmidu

Všeobecne plazmidy pDS56/RBSII,-l a -2 obsahujú regulovateľný promótor/operátorový element N250PSN250P29 a po rade ribosómové väzné miesta RBSII, RBSII(-l) a RBSII(-2). Tieto ribozómové väzné miesta sa odvodzujú od ribozómových väzných miest promótora PG25 fágu T5 buniek E. coli (Európska patentová prihláška č. 207 459) a získajú sa syntézou DNA.

Vzhľadom na svoju vysokú účinnosť sa uvedené plazmidy môžu uchovávať v bunkách E. coli len v prípade, že promótor/operátorový element sa reprimuje naviazaním lac represora na operátor. Lac represor je kódovaný lacl génom. Element N250PSN250P29 môže byť účinne reprimovaný len keď je v bunkách prítomný dostatočný počet represorových molekúl. Preto sa použije lacíq alela, ktorá obsahuje mutant promótora, zodpovedný za zvýšenú expresiu represorového génu. Táto lacíq alela je prítomná na plazmide pDMI. 1, ako je opísané ďalej v texte.

Plazmid pDMI.l nesie, okrem lacl génu, gén na neomycínfosfotransferázu, ktorý baktériám poskytuje rezistenciu na kanamycín a ktorý sa používa ako selekčný marker. Plazmid pDMI.l je kompatibilný s pDS56/RBSII,-l a -2 plazmidmi. E. coli bunky, ktoré sú transformované expresnými vektormi pDS56/RBSII,-l a -2 musia obsahovať pDMI. 1 plazmid, aby sa zaručilo, že expresný vektor zostane v bunkách stabilný. Indukcia tohto systému sa docieli prídavkom IPTG do média.

Plazmid pDS56/RBSII

Časť plazmidu pDS56/RBSII, ktorá leží medzi reštrikčnými miestami na enzýmy Xbal a Xhol a ktorá obsahuje replikačnú oblasť a gén β-laktamasy (ktorý bunkám dáya« rezistenciu na ampicilín) (obr. 4 a 5), sa odvodzuje pôvod-·* ne od plazmidu pBR322 (Bolivar a ďalší, Gene 2:95-1-13 (1977)); Sutcliffe, Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biel. 43:77-90 (1979)). Ale gén β-laktamasy je modifikovaný elimináciou miest na štiepenie pomocou reštrikčných enzýmov HincII a Pstl. Tieto zmeny v sekvencií DNA nemajú žiadny vplyv na aminokyselinovú sekvenciu β-laktamázy. Zostávajúca časť plazmidu nesie regulovateľný promótor/operátorový element N250PSOP29, ďalej nasleduje ribozómové väzné miesto RBSII, ktoré je časťou EcoRI/BamHI fragmentu, miesta štiepenia reštrikčných enzýmov Sali, Pstl a HindlII, terminátor fágu lambda buniek E. coli (Schwarz a ďalší, Náture 272:410-414 (1978)), gén bez promótora na chlóramfenikolacetyltransferázu (Marcoli a ďalší, FEBS Letters, 110:11-14 (1980)) a terminátor TI rmB operónu E. coli (Brosius a ďalší, J. Mol. Biol. 148:107-127(1981)).

Plazmid pDS56/RBSII(-l)

Plazmid pDS56/RBSII(-l) (obr. 6 a 7) je podobný plazmidu pDS56/RBSII, ale obsahuje ribozómové väzné miesto RBSII(-l).

Plazmid pDS56/RBSII(-2)

Plazmid pDS56/RBSII(-2) (obr. 8 a 9) je podobný plazmidu pDS56/RBSII, ale obsahuje ribosómové väzné miesto RBSII(-2).

Rozdiel medzi týmito tromi plazmidmi spočíva v tom, že sa líšia jedným nukleotidom, ktorý nasleduje za ATG štartovacím kodónom, ktorý začína expresiu proteínu podľa všetkých troch možných čítacích rámcov.

SK 281606 Β6

Plazmid pDMl.l

Plazmid pDMl.l (obr. 10 a 11) nesie gén na neomycínfosfotransferázu z transpozónu Tn5 (Beck a ďalší, Gene 19:327-336 (1982)), ktorý dodáva kanamycínovú rezistenciu bunkám E. coli a lacl gén (Farabough, Náture 274:765-769 (1978)) s mutovaným promótorom I^q (Calos, Náture 274:762-765 (1978)), ktorý kóduje lac represor. Okrem toho plazmid pDMl.l obsahuje oblasť plazmidu pACYC184 (Chang a Cohen, J. Bavteriol. 134:1141-1156 (1978)), ktorá obsahuje celú informáciu požadovanú na replikáciu a stabilnú transmisiu dcériných buniek.

Malo by byť zrejmé, že okrem uvedeného plazmidu sa pravdepodobne v tomto pokuse môže použiť akýkoľvek expresný systém buniek E. coli.

Bakteriálne transformanty sa pestujú pri teplote 37 °C v LB médií (pozri Maniatis a ďalší, v texte, str. 68) a expresia proteínu sa indukuje prídavkom 1 mM IPTG do média. Po hodinovej inkubácii sa odoberú vzorky s objemom 1 ml a bunky vo vzorkách sa zhromaždia odstredením. Na bunkové pelety sa pôsobí tak, ako to opísal Crowl a ďalší, pozri v texte, a lyzáty sa analyzujú pomocou SDS PAGE. Po elektroforéze sa proteíny v géli buď zafarbia modravou Coomassie brilliant blue alebo sa prevedú na nitrocelulózové membrány na Westem blot analýzu (Towbin a ďalší, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76:4350 (1979)); Bumetti, Anál. Biochem. 112:195 (1981)), ktorá sa uskutočňuje s použitím opísaného králičieho antimerozoového séra.

Uvedená analýza ukazuje, že molekula cDNA s veľkosťou 1,2 kb kóduje v jednej svojej orientácii vo všetkých troch čítacích rámcoch proteín, ktorý migruje pri analýze SDS PAGE ako proteín s molekulovou hmotnosťou asi 33 kilodaltonov, a že tento proteín reaguje s protilátkami z králičieho anti-merozoového séra.

Analýza sekvencie DNA

Všeobecne sa izolácia plazmidovej DNA v malej mierke z 1 ml kultúr saturovaných cez noc uskutočňuje podľa postupu, ktorý opísal Bimboim a ďalší (Nucleic Acids Research 7:1513 (1979)). Tento postup umožňuje izoláciu malého množstva DNA z bakteriálnej kolónie na analytické účely. Väčšie množstvo plazmidovej DNA sa pripraví s použitím kultúr s objemom 1 1 podľa štandardného postupu odstredením a za pôsobenia gradientu chloridu cestného (Maniatis a ďalší, pozri vyššie, str. 93).

DNA sekvencia EcoRI cDNA inzertu s veľkosťou 1,2 kb z plazmidu lambda 5-7 sa stanoví nasledujúcim postupom. Inzert sa štiepi pomocou EcoRI, čistí sa gélovou elektroforézou a ligáciou sa spojí s pEV-vrf plazmidom, ktorý bol štiepený EcoRI, ako opísal Crowl a ďalší (Gene 38:31 (1985)). Tento plazmid sa pomenuje pEV/5-7 a použije sa na propagáciu inzertu cDNA s veľkosťou 1,2 kb na hydratačnú analýzu (ako je opísané ďalej) a na predbežnú analýzu sekvencie DNA spôsobom, ktorý opísal Zagursky a ďalší (Gene Anál. Tech. 2:89 (1983)).

Na určenie kompletnej sekvencie DNA sa cDNA inzert s veľkosťou 1,2 kb z pEV/5-7 ďalej klonuje do jednovláknového fágového vektora ml3 mpl9 pomocou Ml3 klonovacej súpravy firmy BIO-RAD a sekvenovacej súpravy SEQUENASE. Sekvencia sa urči dideoxami reťazovou metódou podľa Sangera a ďalších (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74:5463 (1977)) spôsobom, ktorý sa doporučuje v súprave SEQUENASE (United States Biochemical Corp., Cleveland OH, USA).

Kompletnú nukleotidovú sekvenciu cDNA s veľkosťou 1,2 kb z pEV/5-7 vrátane 5 a 3 nepreložených oblastí ukazuje obr. 1.

Táto cDNA sekvencia predurčuje otvorený čítací rámec začínajúci od ATG kodónu na mieste 68 až na TGA stop kodónu na mieste 1013 a kóduje 315 aminokyselinových zostatkov, ako ukazuje obr. 1.

Teoretická veľkosť tohto proteínu, 33 375 daltonov, zodpovedá imunoprecipitačnému produktu z in vitro translácie merozoovej mRNA (pozri obr. 2, okienko C, pás a), získanému imunoprecipitáciou antigén-selektívneho reagentu a proteínu exprimovanému z cDNA v expresných vektoroch buniek E. coli, opísaných v texte.

Analýza odvodenej sekvencie aminokyselín proteínu, ktorý je kódovaný lambda 5-7 cDNA inzertom ukazuje, že v závislosti od algoritmu použitého na predurčenie sekvencie má prvých 20 alebo 75 až 95 aminokyselinových zostatkov na N-konci celkovo hydrofobný charakter, čo ukazuje na možnú funkciu signálneho peptidu. Sekvencia signálneho peptidu sa teda môže skladať až z asi prvých sto aminokyselinových zostatkov na N-konci. Toto so zreteľom na skutočnosť, že sa zistilo, že polypeptid získaný po in vitro translácii merozoovej mRNA čistený imunoprecipitáciou má molekulovú hmotnosť okolo 35 kDa vo svojej prekurzorovej forme a že v zrelej podobe má tento polypeptid molekulovú hmotnosť okolo 23 kDa. Ako je uvedené, veľkosť prekurzorovej formy je v dobrom súhlase s teoretickou veľkosťou proteínu. Ale zrelá podoba proteínu môže tiež obsahovať vnútorný alebo N-koncový fragment prekurzorovej molekuly. Presný N-koniec sa môže určiť známymi spôsobmi.

Pre rad oblastí tohto polypeptidu s uvedenou aminokyselinovou sekvenciou sa môžu označiť epitopy založené na kombinácii hydrofilných kritérií podľa J. P. Hoppa a K. R. Woodsa (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:3824-3828 (1981)) a kritérií sekundárnej štruktúry podľa P. Y. Choua a G. D. Fasmana (Advances in Enzymology 47:45-148 (1987)). Nasledujúce oblasti obsahujú pravdepodobné epitopy na protilátky:

S₇₉-V₈₆ (Sekv. id. č. 3) C₉₅ - Kj23 (Sekv. id. č. 4) P|37- ^vi39 (Sekv. id. č. 5) R147 - F152 (Sekv. id. č. 6) N_]55 - E₁₆₂ (Sekv. id. č. 7) R-169 Ei73 (Sekv. id. č. 8) T₁₈₁ - E_1S6 (Sekv. id. č. 9) Qi96 - G₂2s (Sekv. id. č. 10) T239-G243 (Sekv. id. č. 11) T252 - G256 (Sekv. id. č. 12) A₂₆₅ - K₂₆₉ (Sekv. id. č. 13) D₂₇₆ - K₂?9 (Sekv. id. č. 14) T_298;E₃₁₅ (Sekv. id. č. 15)

Ďalej epitopy T-buniek sa môžu teoreticky odvodiť podľa Berzofského amfifilného kritéria (Good a ďalší , Science 235, 1059-1062 (1987)). Epitopy T-buniek sa odvodzujú od antigénov (H. M. Grey a R. Chestnut, Immunol. Today 6:101-106 (1985)), transportujú intraceluláme (Schwarz A. L., Ann. Rev. Immun. 8:195-229 (1990)) a rozpoznávajú sa receptorovým komplexom T-buniek. Aj keď niektoré algoritmy sa vytvárajú primáme na identifikáciu antigénových miest triedy II, kvôli podobnostiam s peptidovými interakciami triedy I, sa tiež zdajú byť užitočné na identifikáciu cieľových miest peptidu na cytotoxické T-lymfocyty (Feller a de la Cruz, Náture 349:720-721 (1991)).

Ďalej možné glykosylačné miesto je umiestnené na aminokyseline asparagínu na mieste 20 (D₂₀). Cukomé skupiny sú známe tým, že majú dôležité fyzikálne vlastnosti, ako je konformačná stabilita, odolnosť na proteázy, náboj a kapacita na viazanie vody. Ale D₂₀ je častou vedúcej sekvencie a nemusí preto byť prítomná v zrelom proteíne. Prehľad dôležitých rolí cukomých skupín v biologickom rozpoznávaní uvádza J. C. Paulson, TIBS 14:272-276 (1989).

Hydratačná analýza

DNA sa izoluje z rozbitých sporulovaných oocystových buniek po pôsobení trypsínu a žlči a premytí roztokom PBS nasledujúcim spôsobom.

Parazitický materiál (približne 1 x 10’ oocystových buniek) sa suspenduje v 20 ml roztoku obsahujúceho 0,5 M EDTA s pH 8,0 a 0,5 % sarkosylu (Sigma, St. Louis, MO, USA) a štiepi sa proteínázou K (Boehringer-Mannheim, FRG) s koncentráciou 0,1 mg/ml, 2 hodiny, pri teplote 50 °C. Proteín sa odstráni dvoma extrakciami fenolom nasýteným 20 mM Tris HC1 s pH 7,5 a 1 mM EDTA (TE) a jednou extrakciou zmesí fenol/chloroform (1 : 1). Vodná fáza sa dialyzuje proti TE a skoncentruje sa etanolovým zrážaním. Získa sa typický výťažok 0,4 mg DNA z 1 x 10⁶ oocystových buniek.

Parazitická DNA sa štiepi rôznymi reštrikčnými endonukleázami podľa pokynov výrobcu a výsledné DNA fragmenty sa rozlíšia elektroforézou pri 40 V, 2,5 hodiny v agaróze s koncentráciou 0,8 % v Loeningovom pufri (zloženie: 4,7 g NaH₂PO₄, 4,36 g Tris bázy, 0,372 g Na2EDTA na liter, pH 7,6). Na gél sa 30 min. pôsobí roztokom HC1 s koncentráciou 0,25 M a DNA sa prevádza cez noc na Zeta Próbe (BIO-RAD) membránu v roztoku s koncentráciou NaOH 0,4 M. Filtračný materiál sa neutralizuje vo dvoch kúpeľoch SSC (pH 6,8) a 1 hodinu sa pri teplote 80 °C zapeká vo vákuu.

Filter sa 3 hodiny prehybridizuje pri teplote 65 °C v roztoku, obsahujúcom 7 % SDS, 1 % BSA (Boehringer, frakcia V) v pufri s koncentráciou 0,5 M NaHPO₄ s pH 7,2. Po vyštiepení z pEV/5-7 plazmidu spôsobom, opísaným v texte, pomocou enzýmu EcoRl sa 5-7 génový EcoRl inzert izoluje na géli a označí sa metódou „random-priming“ pomocou Klenowovho fragmentu v prítomnosti deoxynukleotidov označených ³²P. Označený inzert sa oddelí od neinkorporovaných nukleotidov ku kolóne „Spin-Columns“ (firma BIO-RAD), denaturuje sa a pridá sa do hybridizačného roztoku. Po inkubácii počas 12 hodín pri teplote 65 °C sa filtre trikrát premyjú roztokom so zložením 2 X SSC/0,1 SDS a dvakrát roztokom so zložením 0,1 X SSC/0,1 % SDS pri teplote 65 °C. Fragmenty genómovej DNA, ktoré sa hybridizujú s uvedenou próbou, sa detegujú autorádiograficky. Aj keď sa tu používa pEV/5-7 plazmid, je zrejmé, že sa môže vhodne použiť akýkoľvek ekvivalentný vektor, obsahujúci cDNA inzert, s veľkosťou 1,2 kb, merozoového 5-7 génu.

Výsledky tejto analýzy ukazuje obr. 3, na ktorom sú tiež vidieť výsledky štiepenia pomocou enzýmov PvuII (1), HincII (2), PstI (3), Sphl (4) alebo Sací (5).

Fragment genómovej DNA s veľkosťou 6,5 kb po vyštiepení enzýmom PvuII je detegovaný v páse 1 a fragment s veľkosťou 3,6 kb po vyštiepení enzýmom Sací v páse 5. Pretože v cDNA klonc nie sú žiadne reštrikčné miesta na tieto enzýmy, môžeme maximálnu veľkosť Eimeria génu odhadnúť na asi 3,6 kb.

Po vyštiepení enzýmom PstI je možné detegovať tri fragmenty (pás 3). Dve reštrikčné miesta na PstI enzým sa dajú predpovedať zo sekvencie cDNA. Prítomnosť týchto dvoch miest spôsobí vznik vnútorného fragmentu s veľko sťou 306 bp (príliš malého, aby sa dal detegovať pri tejto analýze „Southem blot“) a dvoch pripojených fragmentov. Výskyt tretieho veľkého PstI fragmentu sa najlepšie vysvetlí prítomnosťou intrónu umiestneného medzi vnútornými PstI miestami.

Charakter fragmentov, vzniknutých štiepením enzýmom Sphl (pás 4), ktorý tiež štiepi cDNA na dvoch miestach, neposkytuje žiadne určité informácie. Malý vnútorný Sphl fragment s veľkosťou 604 bp, zistiteľný zo sekvencie cDNA, sa v tomto géli nemôže detegovať.

Štiepením genómovej DNA enzýmom EcoRl vznikne genómový fragment s veľkosťou 1,2 kb, ktorého veľkosť zodpovedá cDNA fragmentu. Dvojitým štiepením enzýmami HincII a EcoRl vznikne fragment s veľkosťou 0,9 kb (nie je ukázaný na obrázkoch).

Pri analýze „Northem blot“ (Alwine a ďalší, Proc. Natl. Acad. Sci USA 74:5350 (1977)) poly(A)-obsahujúci mRNA, izolované z merozoových buniek, sa cDNA fragment lambda 5-7 génu s veľkosťou 1,2 kb hybridizuje s jednovláknovými druhmi mRNA približne s dĺžkou 1,3 kb. Z korelácie veľkosti je zrejmé, že 5-7 kloň dohromady s predĺžením na 5 konci, určenom z 1-5 izolátu uvedeného vyššie v texte, predstavuje sekvenciu cDNA v celej dĺžke s možnou výnimkou nukleotidov na 5 konci.

Príklad 2

Na vytvorenie efektívnejšieho spôsobu imunizácie kurčiat merozoovým antigénom 5-7 z buniek E. teneila sa opisaná cDNA s veľkosťou 1,2 kb, klonuje do vírusu vakcinia.a,

Rekombinantný vakcinia vírus, získaný týmto spôsobom^ sa použije ako podjednotka vakcíny proti kokcidióze na vakcináciu kurčiat.>

Konštrukcia vektora

Všetky vytvorené formy rekombinantného vakcinia vírusu (rW) sa zakladajú na homológnej rekombinácii do la-i kusu vírusovej tymidínkinázy (TK), ako opísal Macket a ďalší (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79:7415 (1982)). TK lokus bol zmapovaný vo vakcinia víruse (W) pomocou Hindlll J fragmentu (Hrubý a ďalší, J. Virol. 43:403 (1982)) a časť tohto fragmentu bola sekvenovaná (Weir a ďalší, J. Virol. 46:530(1983)).

Konštrukcia vektora na rekombináciu pUC8-TK-7,5K je zásadne opísaná v Európskej patentovej prihláške č. 344 808. Stručne povedané, vektor sa skladá z kostry tvorenej pUC8 plazmidom, ktorá nesie TK gén vakcinia vírusu prerušený W 7,5K promótorom (Venkatesan a ďalší, Celí 25:805 (1981)). Ďalej od promótora v smere transkripcie bolo vytvorené mnohonásobné klonovacie miesto, ktoré umožňuje zavedenie génu, ktorý sa má exprimovať. Obr. 12 ukazuje schematický nákres pUC8-TK-7,5K plazmidu.

Na vytvorenie nášho konštruktu sa EcoRl fragment, kódujúci merozoový 5-7 gén, klonuje na EcoRl miesto polylinkera, ktorý je súčasťou základného vektora, ukázaného na obr. 12. Konštrukty, obsahujúce fragment v správnej orientácii, sa množia a modifikujú spôsobom ďalej opísaným v texte, aby sa vypustil v čítacom rámci obsiahnutý štart kodón, umiestnený 97 nukleotidov proti smeru transkripcie od prirodzeného štart kodónu merozoového 5-7 génu. Za týmto cieľom sa plazmid štiepi reštrikčnými enzýmami Smal a BglII. Po upravení „tupého“ konca (blunt) BglII miesta pomocou Klenowovho fragmentu v prítomnosti štyroch deoxyribonukleotidov sa plazmid znovu spojí ligáciou. Konštrukt pR3 (obr. 13), s očakávanou deléciou, sa množí a použije sa na rekombináciu do vakcinia vírusu.

SK 281606 Β6

Obr. 14 ukazuje kompletnú sekvenciu tohto rekombinantného plazmidu.

Okrem toho sa merozoový 5-7 gén zavádza tiež do vektora na rekombináciu, ktorý obsahuje vedúcu sekvenciu Dral-Hindlll maláriového antigénu. Tento vektor, opísaný v Európskej patentovej prihláške č. 344 808, je zásadne vektorom pUC8-TK-7,5K, ale obsahuje okrem toho v smere transkripcie od 7,5K promótora vedúcu sekvenciu maláriového antigénu s veľkosťou 190 kDa. Vedľa tejto vedúcej sekvencie bolo skonštruované mnohonásobné klonovacie miesto, ktoré umožňuje zavedenie génu, ktorý sa má exprimovať. Výsledný transkript, ktorého vznik je riadený W 7,5K promótorom, sa preloží ako proteín, obsahujúci na N-konci vedúcu sekvenciu maláriového antigénu s veľkosťou 190 kDa. Zmeny v možnom mieste štiepenia tejto vedúcej sekvencie vedú in vivo na zrelý proteín. Obr. 15 ukazuje schematický nákres konštruktu pR4, obsahujúceho merozoový 5-7 gén.

Konštrukcia rekombinantného vakcínia vírusu

Bunky CV1, naočkované na kultivačnú misku s povrchom 8 cm², sa adaptujú na teplotu 33 °C a pestujú sa až k 80 až 90 % konfluencii. Potom sa infikujú vakcínia vírusom v množstve 0,1 plak tvoriacich jednotiek (pfú) na bunku. Použije sa teplotné senzitívny mutant vírusu ts N7 (Drillien, R. a Spchner, D. Virology 131:385.393 (1983)). Po dvoch hodinách pri dobre znášanej teplote 33 °C v C02 inkubátore (Kieny a ďalší, Náture 312:163 (1984)) sa bunky transfekujú 0,25 ml roztoku, ktorý obsahuje precipitát DNA s fosforečnanom vápenatým, ako opísal Weir a ďalší (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79:1210-1214 (1982)). Zmes precipitátu DNA s fosforečnanom vápenatým obsahuje roztok so zložením: 0,8 % NaCl, 0,038 % KC1, 0,0134 M Na₂HPO₄. 2H₂O, 0,1 % glukózy, s pH 7,0 a 125 mM CaCl₂, 200 ng DNA divokého typu vírusu vakcínia (WR kmeň) a 100 ng vhodného rekombinantného plazmidu pR3 alebo pR4. Po jednej hodine inkubácie pri teplote miestnosti sa pridá ďalšie médium na misku; nasleduje dvojhodinová inkubácia pri teplote 39,5 °C v inkubátore pri obsahu CO₂ 5 %. Pri tejto teplote sa ts N7 vírus nemôže replikovať, a tým sa uskutočňuje selekcia vírusov, ktoré sú rekombinované aspoň v ts 7 lokusu.

Po dvoch dňoch inkubácie pri teplote 39,5 °C sa bunky pozberajú zoškrabaním. Bunky v suspenzii sa ďalej rozbijú sonikáciou. Tento homogenát sa potom použije na získanie TK negatívneho (TK-) vírusu titráciou na ľudské TK- 143 bunky v prítomnosti brómdeoxyuridínu (BUdR) s koncentráciou 30 pg/ml. Plaky sa zoberú a vírus sa ďalej plakovo čistí ešte dvakrát v ľudských TK- 143 bunkách v prítomnosti 30 pg/ml BudR. Zásobná kultúra vírusu sa vytvorí v CV1 bunkách za neprítomnosti BudR. Rekombinantné vakcínia vírusy R3,2 a R4,l sa jednotlivo testujú na prítomnosť cDNA merozoového génu s veľkosťou 1,2 kb, vloženého do TK génu. Testovanie sa uskutočňuje štiepením vírusovej DNA enzýmom HindlII a porovnaním rW DNA matrice s matricou DNA divokého typu (WR) vakcínia vírusu, pričom táto DNA bola štiepená rovnakým reštrikčným enzýmom. Pri výskyte rekombinácie sa po elektroforéze v 1 % agarosovom géli objaví posun v HindlII J DNA fragmente. Toto skutočne bolo pozorované. Posun zodpovedá vypočítaným hodnotám, odvodeným z veľkosti inzertu.

Testovanie expresie

Na testovanie expresie merozoového 5-7 antigénu rekombinantným vírusom sa CV1 bunky infikujú buď rW R3,2 vírusom alebo rW R4,l vírusom. Bunky sa pozberajú 48 hodín po infikovaní. Po odstredení buniek sa pelety solubilizujú v „Laemmli sample“ pufri (Náture 227:680 (1979)) v prítomnosti β-merkaptoetanolu ako redukčného činidla. Po 5 min. varu sa vzorky nanesú na 12,5 % SDS-PAGE gélovú doštičku. Po elektroforetickej separácii sa proteíny prenesú technikou „blotting“ na nitrocelulózové membrány (Trans-Blot, Bio RAD) v Blot-pufri so zložením: 25 mM Tris-HCl, 0,19 M glycín; pH 8,3 a v prítomnosti 20 (obj.) metanolu, pri konštantnom napätí 80 V v Transblot transfer cele (BIO RAD Laboratories), čas prevádzania 2 hodiny pri teplote 4 °C (Towbin a ďalší, Proc. Natl. Acad. Sci: USA 76:4350-4354 (1979)).

Na potreby imunodetekcie sa nitrocelulózové membrány napred inkubujú 45 minút s 5 % mliečneho prášku bez tuku v TBS pufri (zloženie: 20 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, upravené na pH 0,8) a potom sa inkubujú 2 hodiny alebo cez noc pri teplote miestnosti s králičím anti-E. tenella merozoovým sérom pri zriedení 1 : 50, v TBS pufri, obsahujúcom 20 % (obj.) fetálneho hovädzieho séra. Nitrocelulózové membrány sa ďalej trikrát premyjú, vždy počas 10 minút, v TBS pufri, obsahujúcom 0,1 % NP₄O. Nasleduje dvojhodinová inkubácia pri teplote miestnosti s konjugátom kozieho-anti-králičieho IgG (H+L) s peroxidom (BIO-RAD) (konjugát je čistený afmitnou chromatografiou) pri zriedení 1 : 1000 v TBS pufri a v prítomnosti 5 mliečneho prášku bez tuku (skratka H+L znamená ťažké (H) a ľahké (L) reťazce imunoglobínu IgG). Bloty sa ďalej trikrát premyjú, ako je opísané v texte. Väzba peroxidázového konjugátu sa deteguje reakciou nitrocelulózovej membrány v roztoku, obsahujúcom 0,018 4-chlór-l-naftolu v 6 % nom metanole vo vode, v prítomnosti 0,02 % (obj.) H₂O₂. Reakcia sa zastaví mohutným premytím blotu vo vode.

Zistilo sa, že králičie anti-E. tenella merozoové sérum reaguje pri analýze „Westem blot“ (Towbin a ďalší, pozri v texte) uskutočňovanej s CV1 bunkami, infikovanými rW R3,2, jednotlivo s odlišnými proteínovými pásmi s veľkosťou 33 kDa a s veľkosťou 23 kDa. Ako porovnávacie vzorky sa použijú štandardy molekulovej hmotnosti dopredu zafarbené na SDS-PAGE firmy BIO-RAD (štandardy s malými molekulovými hmotnosťami (low range)). CV1 bunky infikované divokým typom WR vakcínia vírusu nereagujú s králičím anti-E. tenella merozoovým sérom. Veľkosť proteínu 33 kDa zodpovedá teoreticky očakávanej hodnote prekurzorového proteínu pozri obr. 2, okienko C, pás b. Menší proteín s veľkosťou 23 kDa by mohol byť upravená verzia prekurzorového proteínu, ako je uvedené, ktorý je tiež zreteľný na povrchu merozoových buniek (pozri obr. 2, okienko A a B, pás b). Rovnaké výsledky sa pozorujú, keď sa CV1 bunky infikujú vírusom rW R4,1.

Okrem toho sa môže ďalej ukázať analýzou „Westem blot“, že imunitné sérum z kurčiat, infikovaných sporulovanými oocystami E. tenella, rozpoznáva merozoové 5-7 proteíny (s veľkosťami 33 kDa a 23 kDa) exprimované v CV1 bunkách, infikovaných jednotlivo rekombinantnými vakcínia vírusmi R3,2 a R4,1.

Produkcia vírusu

Vírus kmeňa WR sa môže množiť v takmer všetkých typoch buniek (Drillien a ďalší, J. Virology 28:843 (1978)) a jeho množenie sa môže priamo pozorovať ako tvorba pla14

SK 281606 Β6 kov. Vo väčšine prípadoch používame na prípravu zásobných kultúr vírusu bunky CV1.

S cieľom infikovať sa kultivačné médium oddelí od 80 - 90 % konfluentných CV1 buniek, pestovaných v kultivačných bankách s povrchom 175 cm² (napr. Falcon 3028 bunky), a bunky sa inkubujú 1 hodinu pri teplote miestnosti (20 °C) v PBS roztoku, obsahujúcom vírus (0,1 pfu/ml, 0,01 ml/cm²). Potom sa pridá čerstvé kultivačné médium (0,2 ml/cm²) a banky sa inkubujú pri teplote 37 ’C, 2 až 3 hodiny, dokiaľ asi 80 % buniek nezlýzuje. Vzniknutý zásobný roztok sa skladuje priamo s bunkami a médiom v pôvodných kultivačných bankách pri teplote -30 °C, pokiaľ sa vírus čistí.

Nasledujúce čistiace kroky sa uskutočňujú, aby sa získal vírusový prípravok bez špecifických komponentov hostiteľských buniek. Infikované bunkové kultúry, skladované pri teplote -30 ’C, sa rozmrazia a ostatné bunky sa odstránia z povrchu baniek otrepaním alebo zoškrabaním. Bunky a vírusy sa odstredia z média (na centrifúge Sorvall s rotorom GSA, podmienky odstreďovania: 1 hodina, 5000 ot/min., teplota 10 °C). Peleta buniek s vírusovými časticami sa resuspenduje v PBS roztoku (množstvo PBS roztoku - 10 až 20 násobný objem pelety) a odstred’uje sa za uvedených podmienok. Peleta sa resuspenduje v 10 násobnom objeme RSB pufri (so zložením: 10 mM Tris-HCl s pH 8,0,10 mM KC1,1 mM mgCl₂).

Vytvorená suspenzia sa podrobí sonikácii (dvakrát za sebou, 10 s pri výkone 60 W, pri teplote miestnosti, v sonifikátore napr. Labsonic 1510 s próbou s priemerom 4 mm), a tým sa dosiahne lýzia intaktných buniek a uvoľnenie vírusu z bunkových membrán. Vzniknutá zmes sa odstred’uje 3 min., pri 3000 ot/min., pri teplote 10 ’C v odstredivke Sorvall s rotorom GSA. Tak sa získa suspenzia vírusu zbavená bunkových jadier a veľkých bunkových zostatkov. Supernatant sa opatrne odstráni a peleta sa resuspenduje v RSB pufri, podrobí sa sonikácii a odstredí sa za rovnakých podmienok.

Druhý supernatant sa spojí s prvým, prevrství sa na 10 ml roztoku s koncentráciou sacharózy 35 % (v 10 mM Tris-HCl pufri s pH 8,0) a 90 min. sa odstreďuje pri 14 000 ot/min. v odstredivke Beckman s rotorom SW 27, pri teplote 10 °C. Supernatant sa dekantuje a peleta vírusových častíc sa resuspenduje v 10 ml 10 mM Tris-HCl s pH 8,0 a sonikuje sa, aby sa peleta homogenizovala (dvakrát počas 10 sekúnd, pri teplote miestnosti, ako je opísané) a nanesie sa do kyviet obsahujúcich roztoky, ktoré tvoria „krokový gradient“, čim sa uskutočňuje ďalšie čistenie.

Roztoky, tvoriace „krokový gradient“, obsahujú 5 ml alikvotného množ.stva sacharózy v pufri s koncentráciou 10 mM Tris-HCl a pH 8,0, pri koncetráciách sacharózy: 20, 25, 30, 35 a 40 percent. Kyvety s týmto gradientom sa odstreďujú na odstredivke Beckman s rotorom SW 27, 35 minút pri 14000 ot/min., pri teplote 10 °C. V oblasti, kde je koncentrácia sacharózy 30 až 40 %, je viditeľných niekoľko pásov, ktoré obsahujú vírusové častice. Tieto oblasti gradientu sa odstránia a zriedia roztokom PBS. Vírusové častice sa odstredia (odstredivka Beckman s rotorom SW 27, 90 minút, 14 000 ot/min., teplota 10 °C). Peleta, obsahujúca takmer výhradne vírusové častice, sa resuspenduje v roztoku PBS tak, aby koncentrácia vírusu bola v priemere 0,5 až 1 krát 1010 pfu/ml. Tento zásobný vírus sa používa buď priamo alebo zriedený roztokom PBS.

Na stanovenie koncentrácie vírusu a čistoty zásobného vírusu sa používajú dva spôsoby. Absolútna koncentrácia vírusových častíc sa výhodne zistí meraním optickej denzity (OD) zásobného roztoku na spektrofotometre pri vlnovej dĺžke 260 nm (OD/260 nm), pričom 1 OD/260 zodpo vedá množstvu asi 1,2 x 10¹⁰ častic/ml (Joklik, Virology 18:9 (1962)). Koncentrácia vírusu sa tiež zisťuje titráciou vírusu na bunky (plaková skúška) za predpokladu, že len jedna zo 60 vírusových častíc môže infikovať bunku.

Na titráciu vírusovej koncentrácie na kultivovaných bunkách sa v kultivačnom médiu pestujú fibroblasty z kurčacích embryí (CEF) na miskách s povrchom 8 cm² (Falcon 3001). Keď bunky dosiahnu 80 až 90 % konfluencie, médium sa odstráni a nahradí sa 0,2 ml zriedeného vírusového roztoku v PBS a nechajú sa inkubovať hodinu pri teplote miestnosti. Zásobná kultúra vírusu sa zriedi 10 krát. Na každú misku sa pridajú 2 ml polotuhého kultivačného média, ktoré obsahuje 1 % agarózy a misky sa umiestnia na 16 až 24 hodín do CO₂ inkubátora, pri teplote 37 ’C. Potom sa misky prelejú 2 ml polotuhého kultivačného média, ktoré obsahuje 0,2 % neutrálnej červene, aby sa zafarbili živé bunky a misky sa ďalej inkubujú 16 až 24 hodín. Bezfarebné plaky sa potom spočítajú pod mikroskopom.

Príklad 3

Imunizácia kurčiat

Nasledujúca vakcinácia sa uskutočňuje, aby sa stanovilo, či vektor rW-R3,2 vírusu vakcinia, obsahujúci merozoový 5-7 gén, môže chrániť kurčatá proti provokačnej infekcii sporulovanými oocystami patogénneho kmeňa E. tenella.

Kohúti WARREN, dodaní z liahne E. Wuethrich. v Belpe (Švajčiarsko), sa chovajú v klietkach s drôteným dnom a kŕmia bežným krmivom pre bojlerov, skladajúcim sa hlavne z kukurice, pšenice a sójových bôbov. Sedem- násty deň sa kurčatá očkujú množstvom 3 x 10⁸ pfú rekotnbinantného vírusu vakcinia R3,2 v 100 μί PBS, pričom t μί tohto roztoku sa injekčné očkuje podkožné do zástavy, krídla a ďalších 50 μί sa aplikuje vnútrosvalovo do hrude; S prestávkou vždy jeden týždeň sa tento postup dvakrát opa- . >

kuje, ale u inej pokusnej skupine sa posledná injekcia vírusu nahradí orálnym podaním 5000 sporulovaných oocýst vírusovolentného kmeňa E. tenella (napr. kmeňa T7-776/21), aby sa simulovala prirodzená expozícia kurčiat infekčným kokcidiám v poľných podmienkach. leden týždeň po poslednej imunizácii sa všetkým kurčatám odoberie krv na analytické účely a ďalší týždeň (45. deň) sa kurčatá infikujú provokačne 50 000 sporulovanými oocystami E. tenella (napr. kmeňa T7-776/21). Vývojový cyklus parazitov trvá 7 dní a potom 52. deň sa kurčatám odoberie krv, usmrtia sa a pitvajú. Infikovaná cieka sa odstráni, lézie spôsobené vývojom parazitov sa spočítajú a celé tkanivo sa homogenizuje, aby sa určil obsah oocýst. Okrem toho sa zaznamenáva výstav kurčiat (denný prírastok hmotnosti a využitie krmiva).

Ochranný pokus

Údaje v tabuľke 1 ukazujú jasne, že vakcinácia rekombinantným vírusom vakcinia R3,2 má významný chrániaci účinok proti krutej kokcidiózovej provokačnej infekcii. Počty lézií sa znížia o 18 % a obsah oocýst v cieku o 35 % v porovnaní s infikovanou kontrolou. Výstav, čo je ekonomicky najdôležitejší parameter, sa zlepší o 62 % v ukazovateli denného prírastku hmotnosti a o 56 % vo využití krmiva. Keď sa ale posledná injekcia vírusu nahradí miernou kokcidiózovou infekciou, ochrana kurčiat proti kokcidióze je takmer dokonalá. Výstav týchto kurčiat je ekvivalentný s neinfikovanou kontrolnou skupinou a počet lézií rovnako ako obsah oocýst v cieku je nízky. Pretože ešte nikdy ne15

SK 281606 Β6 bolo ukázané, že by samotná inokulácia bunkami E. tenella spôsobovala taký stupeň ochrany, usudzuje sa, že vakcinácia pomocou vírusu veľmi povzbudila imunitný systém kurčiat tak, že následná mierna kokcidiózová infekcia mohla vyvolať zosilňovací efekt, ktorého výsledkom je takto účinná imunitná ochrana proti kokcidióze.

Humorálny stav kurčiat

Humorálny stav kurčiat sa analyzuje nepriamo metódou ELISA a analýzou Westem blot podľa nasledujúceho postupu.

Tabuľka 1

Výstav a parazitologické parametre kurčiat, podrobených vakcinácii rekombinantným vírom vakcínia rVV-R3,2, po provokačnej infekcii 50 000 ooxystami E. tenella

Druh zásahu	Počet	Stredná telesná hmotnojf (K) 45. der	Stredná telesná hmotnosť ω 52. deá	Denný prírastok hmotnosti (s) 45. až 52. deí	Stredné využitie 4$ až 52. deň	Počet cekáJ- lézií	Počet oocýst vcéku (Mio/g céla)
	2. ímu- *)	3 imunizácia •i	luéná
				3/12	788,2	985.8		2.66		0
V i v	V	+	3/12	778,1	160.4	11.8	5.19	1.58	1.73
v 1 v	C		3/12	7793	960.6	2S.9	2.98	0.75	0.18
• 1			3/12	783,0	8343	73	11,88	1,92	2,67

Analýza Westem blot sa uskutoční, ako je opísané, okrem jedného prídavného inkubačného kroku predtým, ako sa pridajú vzorky kuracích sér. Tento krok spočíva v inkubácii „blotov“ nitrocelulózových membrán s hyperimunitným králičím anti-vakcíniovým sérom (2 hodiny pri teplote miestnosti, pri zriedení 1 : 50), aby sa zachytili všetky vakcínia-špecifické proteíny.

Na nepriame stanovenie ELISA sa použije tretia generácia merozoových buniek E. tenella, pozbieraná z in vitro pestovaných primárnych buniek kurčacích ľadvín. Do jamiek mikrotitračných platní sa naplní po 3000 merozoových buniek, rozpustených v 100 ml pu&a so zložením uhličitan-hydrogenuhličitan sodný s pH 9,6 a inkubuje sa cez noc pri teplote 4 °C. Platne sa trikrát premyjú deionizovanou vodou a znovu sa naplnia 200 ml „blokovacieho“ pufra (so zložením: 0,1 M Na₂HPO₄, pH upravené na 6,5 pomocou HC1, 1 % BSA, 0,5 g/1 etylmerkuri-tiosalicytátu sodného). Blokovanie prebieha cez noc pri teplote 4 °C. Z jedného zvieraťa sa testujú dve vzorky séra. Prvá vzorka sa odoberie týždeň po poslednej imunizácii a druhá tesne po usmrtení zvieraťa. Vzorky sa zriedia dvakrát PBS roztokom, obsahujúcim 3 % mliečneho prášku: počiatočné zriedenie je 1 až 50 krát. Inkubácia prebiaha 4 hodiny pri teplote 37 °C (v objeme 100 ml). Platňa sa premyje, ako je opísané, a pridá sa 100 ml konjugátu kozieho anti-kurčacieho (H+L) imunoglobulínu označeného peroxidázou na jamku (konjugát je zriedený 1 : 2000 v roztoku PBS, obsahujúcom 3 % mliečneho prášku). Inkubácia pri teplote 37 °C trvá 2 hodiny. Komplexy antigén-protilátka sa vizualizujú prídavkom 100 ml TMB substrátu. TMB substrát sa skladá z jednej časti TMB (0,24 g tetrametýlbenzidínu rozpusteného v 5 ml acetónu a doplneného na 50 ml metanolom) a 20 častí substrátu (0,2 M kyselina citrónová, pH 4,0, 275 ml/130 %-ného H₂O₂).

Reakcia sa zastaví prídavkom 0,5 M II₂SO₄ pred tým, ako sa platne „prečítajú“ v ELISA „čítacom zariadení“ (Titertek Multiskan MCC/340, Flow Laboratories) pri 450 nm.

Po vakcinácii kurčiat rekombinantnými vírusmi R3,2 a R4,l sa pozoruje len slabá humorálna protilátková odpoveď na merozoové bunky kokcidiokokov (priemerný ti ter 1 : 100) v porovnaní s kontrolnými živočíchmi (priemerný titer > 1 : 1600), imunizovanými nízkymi dávkami sporulovaných oocýst. Tento fakt naznačuje, že príčinou získania pozitívnych údajov, vzťahujúcich sa na ochranu kurčiat, a údajov, týkajúcich sa výstavu vakcinovaných kurčiat (pozri tabuľka 1 a diskutované výsledky) môže byť efektorovo pracujúci mechanizmus sprostredkovaný bunkami.

Aby sa potvrdila prítomnosť špecifických protilátok proti merozoovému 5-7 antigénu, testujú sa krvné vzorky s najvyšším titrom protilátok, zisteným pomocou ELISA stanovenia, analýzou Westem blot. Pri tejto analýze sa používajú CV1 bunky infikované rVV-R3,2 ako zdroj antigénov. Všetky séra rozpoznali jednotlivo dva proteíny s veľkosťou 33 kDa a 23 kDa, čo dokazuje, že uskutočnená imunizácia bola úspešná.

V tomto vynáleze sa môže uskutočniť veľa úprav a variácií bez toho, že by sa to dotklo jeho zmyslu a rozsahu, ako je zrejmé odborníkovi v odbore. Tu opísané špecifické postupy sa mienia len ako príklad a vynález je obmedzený len rozsahom pripojených patentových nárokov.

ZOZNAM SEKVENCII (1) VŠEOBECNÉ INFORMÁCIE (i) PRIHLASOVATEĽ:

(A) Názov: F. HOFFMANN-LA ROCHE AG (B) Ulica: Grenzacherstrasse 124 (C) Mesto: Bazilej (D) Okres: BS (E) Štát: Švajčiarsko (F) Poštovný kód: CH-4002 (G) Telefón: 061 - 688 24 03 (H) Telefax: 061 - 688 13 95 (I) Telex: 962292/965542 hlrchh (ii) NÁZOV VYNÁLEZU: Vakcíny proti kokcidióze (iii) POČET SEKVENCII: 15 (iv) POČÍTAČOVO ČITATEĽNÁ PODOBA:

(A) Typ média: Floppy disk (B) Počítač: IBM PC kompatibilný (C) Operačný systém: PC-DOS/MS-DOS (D) Softvér: Patentln Release č. 1,0, verzia

č. 1,25 (EPO) (v) ÚDAJE O PREDLOŽENEJ PRIHLÁŠKE:

Prihláška číslo:

(vi) ÚDAJE O PREDCHÁDZAJÚCEJ PRIHLÁŠKE:

(A) Číslo prihlášky: US 07/729 099 (B) Dátum podania: 12. júla 1991 (2) INFORMÁCIE O SEKVENCII ID. Č. 1 (i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:

(A) Dĺžka: 315 aminokyselín (B) Typ: aminokyselina (D) Topológia: neznáma (ii) TYP MOLEKULY: proteín (iii) HYPOTETICKÁ: nie (vi) PÔVODNÝ ZDROJ:

(A) Organizmus: Eimeria tenella (D) Vývojové štádium: merozoové (xi) OPIS SEKVENCIE: sekv. id. č. 1:

SK 281606 Β6

Met

Ala

Lys

ser

Met

Leu

Ser

Gly

íle

Val

Phe

Ala

Gly

Leu

val

Ala

1

5

10

15

Ala

Ala

Ala

Ala

Ser

Ser

Ala

Ans

Ser

Ala

Ala

Asn

Val

Ser

val

Leu

20

25

30

Glu

ser

Cly

Pro

Ala

Val

Gin

Glu

Val

Pro

Ala

Arg

Thr

Val

Thr

Ala

35

40

45

Arg

Leu

Ala

Lys

Pre

Leu

Leu

Leu

Leu

Ser

Ala

Leu

Ala

Ala

Thr

Leu

50

55

60

Ala

Ala

Ala

Phe

Leu

Val

Leu

Gin

Cys

Phe

Asn

íle

íle

ser

ser

Asn

65

70

75

80

Asn

Gin

Gin

Thr

Ser

Val

Arg

Arg

Leu

Ala

Ala

Gly

Gly

Ala

Cys

Gly

85

90

95

ACAAGACAAA GCTAAAGAAG GACCCAGGAT GAAGACGGAT ATGACTAGCA AACCTAGTCG GATACCGAGT

CACTTGAAGG AGAAAGTTGA ATGGATTCCC ACGTCGTCGA CAGCATCACA ATGGACAAGG TTAGAAGCGG

ATATCTTGGT AGGAGGCAAA ATACACCACG AGTTCTTATG AGGAAAATTC GAGAAAAATT ACCAGGAGAC

AGTCAAGCTC ACTCACAGAA GTGCTCGACG AAAACCGGAC TGCGGAGTGC ACCGCCGTTA GACGAGGACG

TTGCACAGGA GATATAAAGT GGGTTCCTGT CCCATGGAGG TTATGGATGA TCGGCATGCT ACGAGTGA

CGGAAAGACT CAAGAGCAGC GGGAACAGAC AGTCGACATG CGGAAAAGGA AACTCAACCG

Asp

Glu

Glu

Asp

Ala

Asp

Glu

Gly

Thr

Ser

Gin

Gin

Ala

Ser

Arg

Arg

100

105

110

Arg

Arg

Lys

Pro

ASP

Thr

Pro

Ala

Ala

Asp

Lys

Tyr

Asp

Phe

Val

Gly

115

120

125

Gly

Thr

Pro

val

Ser

Val

Thr

Glu

Pro

Ans

val

Asp

Glu

Val

Leu

íle

130

135

140

Gin

íle

Arg

Asn

Lys

Gin

íle

Phe

Leu

Lys

Asn

Pro

Trp

Thr

Gly

Gin

145

150

155

160

Glu

Glu

Gin

Val

Leu

Val

Leu

Glu

Arg

Gin

Ser

Glu

Glu

Pro

íle

Leu

165

170

17S

íle

Val

Ala

Arg

Thr

Arg

Gin

Thr

Leu

Glu

Gly

Tyr

Leu

Gly

Ser

Gin

1SO

185

190

Ala

Leu

Ala

Gin

ASP

Gly

Lys

Thr

Ala

Lys

Glu

Glu

Lys

Val

G1U

Gly

195

200

208

Gly

Lye

Thr

His

Arg

Arg

Tyr

Lys

Val

Lye

Ser

Ser

ASP

Pro

Gly

Tyr

210

215

220

Gly

Phe

Pro

Tyr

Thr

Thr

Val

Leu

Asp

Gly

Val

pro

Val

Gly

Thr

Asp

225

230

235

240

Glu

Asp

Gly

Tyr

Val

Val

Glu

Val

Leu

Met

Lys

Thr

Gly

Pro

His

Gly

245

250

255

Gly

val

Asp

Met

Met

Thr

Ser

Thr

Ala

Ser

Gin

Gly

Lys

Phe

Cys

Gly

260

265

270

Val

Leu

Met

Asp

Asp

Gly

Lys

Gly

Asn

Leu

Val

Asp

Gly

Gin

Gly

Arg

275

2BD

28S

(2) INFORMÁCIA O SEKVENCII ID. Č. 3:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:

(A) Dĺžka: 8 aminokyselín (B) Typ. aminokyselina (D) Topológia: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: peptid (iii) HYPOTETICKÁ: áno (v) TYP FRAGMENTU: vnútorný (vi) PÔVODNÝ ZDROJ:

(A) Organizmus: Eimeria tenella (xi) OPIS SEKVENCIE: sekv. id. č. 3:

Ser Asn Asn Gin Gin Thr Ser Val

5 (2) INFORMÁCIA O SEKVENCII ID. Č. 4:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:

(A) Dĺžka: 29 aminokyselín (B) Typ: aminokyselina (D) Topológia: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: peptid (iii) HYPOTETICKÁ: áno (v) TYP FRAGMENTU: vnútorný (vi) PÔVODNÝ ZDROJ:

(A) Organizmus: Eimeria tenella (xi) OPIS SEKVENCIE: sekv. id. č. 4:

Cys	Gly	Asp	Glu	Glu	Asp	Ala	Asp	Glu	Gly	Thr Ser Gin Gin
1				5					10
Ala	Ser	Arg	Arg	Arg	Arg	Lys	Pro	Asp	Thr	Pro Ala
15					20					25
Ala	ASp	Lys

Lys íle Thr Ala val íle Gly Met Leu

Thr Gin Pro Asp Thr Glu Phe

290

295

300

Arg Ser Gly Pro Gly Asp

Asp Glu Asp Aap Glu

305

310

315 (2) INFORMÁCIA O SEKVENCII ID. Č. 2:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:

(A) Dĺžka: 948 párov báz (B) Typ: nukleová kyselina (C) Počet vlákien: jedno (D) Topológia: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: cDNA (iii) HYPOTETICKÁ: nie (iv) ΑΝΤΙ-ZMYSEL: nie (vi) PÔVODNÝ ZDROJ:

(A) Organizmus: Eimeria tenella (xi) OPIS SEKVENCIE: sekv. id. č. 2:

ATGGCTAAGT CTATGCTTTC TGGAATTGTT TTTGCTGGTC TTGTTGCTGC TGCAGCGGCC AGTTCGGCCA ACAGCGCCGC CAACGTCTCC GTTTTGGAGA GTGGGCCCGC TCTGCAGGAA GTGCCAGCGC GCACGGTCAC AGCTCGCCTO GCGAAGCCTT TGCTGCTTCT TTCTGCTCTT GCTGCGACTT TGGCAGCAGC TTTCCTCGTT TTGCAATGCT TCAACATCAT CTCCAGCAAC AACCAGCAAA CCAGCGTCAG GACACTGGCC GCCGGAGGTC CATGCGGAGA TGAGGAAGAT GCAGATGAGG GAACTTCACA GCAGGCCAGC CGGAGGAGGA GAAAACCTGA TACCCCTGCA GCAGATAAAT ACGATTTTGŤ ‘TGGČÔGAACT CCAGTTTCGG TCACTGAGCC GAATGTTGAT GAAGTCCTTA TCCAAATTAG AAATAAACAA ATCTTTTTGA AGAACCCATG GACTGGACAA GAAGAACAAG TTCTAGTACT GGAACGÄCAA AGTGAAGAAC CCATTCTGAT TGTGGCGAGG (2) INFORMÁCIA O SEKVENCII ID. Č. 5:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:

(A) Dĺžka: 3 aminokyseliny (B) Typ: aminokyselina (D) Topológia: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: peptid (iii) HYPOTETICKÁ: áno (v) TYP FRAGMENTU: vnútorný (vi) PÔVODNÝ ZDROJ:

(A) Organizmus: Eimeria tenella (xi) OPIS SEKVENCIE: sekv. id. č. 5:

Pro Ans Val (2) INFORMÁCIA O SEKVENCII ID. Č. 6:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:

(A) Dĺžka: 6 aminokyselín (B) Typ: aminokyselina (D) Topológia: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: peptid (iii) HYPOTETICKÁ: áno (v) TYP FRAGMENTU: vnútorný (vi) PÔVODNÝ ZDROJ:

(A) Organizmus: Eimeria tenella (xi) OPIS SEKVENCIE: sekv. id. č. 6:

SK 281606 Β6

Arg Asn Lys Gin íle Phe

5 (2) INFORMÁCIA O SEKVENCIÍ ID. Č. 7:

(1) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:

(A) Dĺžka: 8 aminokyselín (B) Typ: aminokyselina (D) Topológia: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: peptid (iii) HYPOTETICKÁ: áno (v) TYP FRAGMENTU: vnútorný (vi) PÔVODNÝ ZDROJ:

(A) Organizmus: Eimeria tenella (xi) OPIS SEKVENCIE: sekv. id. č. 7:

Asn Pro Trp Thr Gly Gin Glu Glu

5 (2) INFORMÁCIA O SEKVENCIÍ ID. Č. 8:

(1) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:

(A) Dĺžka: 5 aminokyselín (B) Typ: aminokyselina (D) Topológia: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: peptid (iii) HYPOTETICKÁ: áno (v) TYP FRAGMENTU: vnútorný (vi) PÔVODNÝ ZDROJ:

(A) Organizmus: Eimeria tenella (xi) OPIS SEKVENCIE: sekv. id. č. 8:

Arg Gin Ser Glu Glu

5 (2) INFORMÁCIA O SEKVENCIÍ ID. Č. 9:

(1) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:

(A) Dĺžka: 6 aminokyselín (B) Typ: aminokyselina (D) Topológia: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: peptid (iii) HYPOTETICKÁ: áno (v) TYP FRAGMENTU: vnútorný (vi) PÔVODNÝ ZDROJ:

(A) Organizmus: Eimeria tenella (xi) OPIS SEKVENCIE: sekv. id. č. 9:

Thr Arg Gin Thr Leu Glu

5 (2) INFORMÁCIA O SEKVENCIÍ ID. Č. 10:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:

(A) Dĺžka: 30 aminokyselín (B) Typ: aminokyselina (D) Topológia: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: peptid (iii) HYPOTETICKÁ: áno (v) TYP FRAGMENTU: vnútorný (vi) PÔVODNÝ ZDROJ:

(A) Organizmus: Eimeria tenella (xi) OPIS SEKVENCIE: sekv. id. č. 10:

Gin	Asp	Gly	Lys	Thr	Ala	Lys	Glu	Glu	Lya Val	Glu	Gly
1				5					10
Gly	Lys	Thr	His	Arg	Arg	Tyr	Lys	Val	Lys Ser	Ser	Asp
	15					20				25
Pro	Gly	Tyr	Gly
			30

(2) INFORMÁCIA O SEKVENCIÍ ID. Č. 11:

(1) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:

(A) Dĺžka: 5 aminokyselín (B) Typ: aminokyselina (D) Topológia: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: peptid (iii) HYPOTETICKÁ: áno (v) TYP FRAGMENTU: vnútorný (vi) PÔVODNÝ ZDROJ:

(A) Organizmus: Eimeria tenella (xi) OPIS SEKVENCIE: sekv. id. č. 11:

Thr Asp Glu Asp Gly

5 (2) INFORMÁCIA O SEKVENCIÍ ID. Č. 12:

(1) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:

(A) Dĺžka: 5 aminokyselín (B) Typ: aminokyselina (D) Topológia: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: peptid (iii) HYPOTETICKÁ: áno (v) TYP FRAGMENTU: vnútorný (vi) PÔVODNÝ ZDROJ:

(A) Organizmus: Eimeria tenella (xi) OPIS SEKVENCIE: sekv. id. č. 12:

Thr Gly Pro His Gly

5 (2) INFORMÁCIA O SEKVENCIÍ ID. Č. 13:

(1) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:

(A) Dĺžka: 5 aminokyselín (B) Typ: aminokyselina (D) Topológia: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: peptid (iii) HYPOTETICKÁ: áno (v) TYP FRAGMENTU: vnútorný (vi) PÔVODNÝ ZDROJ:

(A) Organizmus: Eimeria tenella (xi) OPIS SEKVENCIE: sekv. id. č. 13:

Ala Ser Gin Gly Lys

5 (2) INFORMÁCIA O SEKVENCIÍ ID. Č. 14:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:

(A) Dĺžka: 14 aminokyselín (B) Typ: aminokyselina (D) Topológia: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: peptid (iii) HYPOTETICKÁ: áno (v) TYP FRAGMENTU: vnútorný (vi) PÔVODNÝ ZDROJ:

(A) Organizmus: Eimeria tenella (xi) OPIS SEKVENCIE: sekv. id. č. 14:

Asp Asp Gly Lys Gly Asn Leu Val Asp Gly Gin Gly Arg Lys

10 (2) INFORMÁCIA O SEKVENCIÍ ID. Č. 15:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:

(A) Dĺžka: 18 aminokyselín (B) Typ: aminokyselina (D) Topológia: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: peptid (iii) HYPOTETICKÁ: áno (v) TYP FRAGMENTU: C-terminálny (vi) PÔVODNÝ ZDROJ:

(A) Organizmus: Eimeria tenella (xi) OPIS SEKVENCIE: sekv. id. č. 15:

Thr Gin Pro Asp Thr Glu Phe Arg Ser Gly Pro Gly Asp

10

Asp Glu A>p Asp Glu

Claims (16)

1 Imunogénne polypeptidy so sekvenciou aminokyselín

MAKSMLSGIVFAGLVAAAAA

SSANSAANVSVLESGPAVQE

VPARTVTARLAKPLLLLSAL·

AATLAAAFLVLQCFNIISSN NQQTSVRRLAAGGACGDEED ADEGTSQQASRRRRKPDTPA ADKYDFVGGTPVSVTEPNVD EVLIQIRNKQIFLKNPWTGQ EEQVLVLERQSEEPILIVAR TRQTLEGYLGSQALAQDGKT AKEEKVEGGKTHRRYKVKSS DPGYGFPYTTVLDGVPVGTD EDGYVVEVLMKTG P H G G V D M MTSTASQGKFCGVLMDDGKG NLVDGQGRKITAVIGMLTQP DTEFRSGPGDDEDDE (1) (sekv. id. č. 1) alebo ich fragmenty, ktoré sú schopné vyvolať imunitnú odpoveď proti parazitom rodu Eimeria, pričom uvedený polypeptid a jeho fragmenty neobsahujú iné proteíny produkované parazitmi rodu Eimeria.

2. Imunogénne polypeptidy, ktoré sú fragmentom imunogénneho polypeptidu podľa nároku 1, ktoré nemajú prvých dvadsať aminokyselín uvedeného polypeptidu.

3. Imunogénne polypeptidy, ktoré sú fragmentom imunogénneho polypeptidu podľa nároku 1 a majú zdanlivú molekulovú hmotnosť, nameranú metódou SDS-PAGE, 23 kilodaltonov.

4. Imunogénne polypeptidy podľa nároku 1, ktoré sú schopné vyvolať imunitnú odpoveď sprostredkovanú T-bunkami.

5. Imunogénne polypeptidy podľa nároku 1, ktoré sú peptidom vybratým zo skupiny peptidov, obsahujúcich sekvenciu aminokyselín:

SNNQQTSV (2)(Sekv. id. č. 3)

CGDEEDADEGTSQQASRKBKKPDTPAADK (3) (Sekv. ld. C. 4) PNV (4)(Sekv. id. č. 5)

RNKQIF (5)(sekv. id. č. 6)

HPWTGQEE (6)(Sekv. id. č. 7)

RQSEE (7)(Sekv. id. č. 8)

TRQTLE (8)(Sekv. id. č. 9) aDGKTAKEEKVEGGKTHRBYKVKSSDPGYG (9)(Sekv. ld. č. 10)

TDEDG (10)(Sekv. id. é. 11) TGPHG (ll)(sekv. id. č. 12) ASQGK (12)(sekv. id. č. 13)

DDGKGNLVDGQGRK (13)(Sekv. id. č. 14), alebo TQPDTEFRSGPGDDEDDE (14)(Sekv. id. č. 15).

6. Izolovaná molekula DNA, kódujúca imunogénny polypeptid so sekvenciou (sekv. id. č. 1) alebo jej časťou podľa nároku 1, pričom taký polypeptid je schopný vyvolať imunitnú odpoveď proti parazitom rodu Eimeria.

7. Izolovaná molekula DNA, majúca celú nukleotidovú sekvenciu alebo časť tejto sekvencie

ATGGCTAAGTCTATGCTTTCTGGAATTGTTTTTGCTOGTCTTGTTGCTGCTGCAGCC

GCCAGTTCGGCCAACAGCGCCGCCAACGTCTCCGTTTTGGAGAGTGGGCCCGCTGTG CAGGAAGTGCCAGCGCGCACGGTCACAGCTCCCCTGGCGAAGCCTnGCTGCTTCTT TCTGCTCTTGCTGCGACTrTGGCAGCAGCTTTCCTCGTTTTGCAATGCTTCAACATC ATCTCCAGCAACAACCAGCAAACCAGCGTCAGGAGACTGGCCGCCGGAGGTGCATGC GGAGAIGAGGAAGA’TGCAGATGAGGGAACTTCACAGCAGGCCAGCCGGAGGAGGAGA AAACCiGATACCCCTGCAGCAGATAAATACGATTTreTTGGCGGAACTCCAGTTTCG CTCACTGAGCCGAATGTTCATGAAGTCCTTATCCAAATTAGAAATAAACAAATCTTT TTGAAGAACCCATGGACTGGACAAGAAGAACAAGTTCTAGTACTCGAACGACAAAGT GAAGAACCCATTCTGATTGTGGCGAGGACAAGACAAACACTTGAAGGATATCTTGGT AGTCAAGCTCTTCCACAGGACCCAAAGACTGCTAAAGAAGAGAAAGTICAAGGAGGC AAAACTCACACAAGATATAAACTCAAGAGCAGCCACCCAGGATATCCA'rrCCCATAC ACCACCGTGCTCGACCGCCTTCCTCTCCGAACAGACGAAGACGOATACGTCGTCCAA CTTCTrA'rcAAAACCGGACCCCATGGACGAGTCGACATGATGACTAGCACACCATCA CAACGAAAATTCTGCGGAGTGCnATGGATGACGGAAAAGGAAACCTAGTCGATGGA CAAGGGAGAAAAATTÄCCGCCGTTATCGGCATCCTAACTCAACCGGATACCGAGTTT AGAAGCGGACCAGGAGACGACGAGGACGACGAGTGA (A) (sekv. ld. č. 2) alebo jej funkčný ekvivalent, kódujúci imunogénny polýpeptid podľa nároku 1, schopný vyvolať imunitnú odpoveď proti parazitom rodu Eimeria.

8. Rekombinantný vektor, obsahujúci DNA molekulu podľa nároku 6, pričom tento rekombinantný vektor je schopný riadiť expresiu uvedenej DNA v kompatibilnom hostiteľskom organizme.

9. Imunogénne polypeptidy podľa akéhokoľvek z nárokov 1 až 3, na použitie na imunizáciu subjektu proti kokcidióze.

10. Spôsob prípravy polypeptidov podľa akéhokoľvek z nárokov 1 až 3, vyznačujúci sa tým, že zahŕňa:

a) kultiváciu transformovaného mikroorganizmu, obsahujúceho rekombinantný vektor zahŕňajúci DNA s nukleotidovou sekvenciu, ktorá kóduje uvedený polypeptid za podmienok, pri ktorých sa DNA exprimuje; a

b) izoláciu peptidu alebo jeho fragmentu z kultúry.

11. Spôsob prípravy rekombinantného vektora, ktorý obsahuje DNA s nukleotidovou sekvenciou kódujúcou polypeptid podľa akéhokoľvek z nárokov laž 3, vyznačujúci sa tým, že zahŕňa:

a) inzerciu DNA s nukleotidovou sekvenciou, kódujúcou uvedený polypeptid do vektora;

b) replikáciu uvedeného vektora v mikroorganizme; a

c) izoláciu rekombinantného vektora z mikroorganizmu.

12. Spôsob prípravy rekombinantného vírusu, ktorý obsahuje DNA s nukleotidovou sekvenciou, kódujúcou polypeptid podľa akéhokoľvek z nárokov 1 až 3, v y z n a čujúci sa tým, že zahŕňa

SK 281606 Β6

a) inzerciu DNA s nukleotidovou sekvenciou, kódujúcou uvedený polypeptid do genómu vírusu bez inhibície vírusového zrenia a infektivity;

b) amplifikáciu uvedeného rekombinantného vírusu v bunkovej kultúre a

c) purifikáciu rekombinantného vírusu z kultivačného média.

13. Spôsob prípravy transformovaného mikroorganizmu, ktorý je schopný produkovať polypeptid podľa akéhokoľvek z nárokov 1 až 3, vyznačujúci sa t ý m , že zahŕňa:

a) transformáciu mikroorganizmu rekombinantným vektorom, ktorý obsahuje DNA s nukleotidovou sekvenciou, kódujúcou uvedený polypeptid; a

b) pestovanie transformovaného mikroorganizmu vo fermentačnom médiu.

14. Vakcína na ochranu subjektu proti kokcidióze, vyznačujúca sa tým, že obsahuje polypeptid podľa akéhokoľvek z nárokov 1 až 3 a fyziologicky vhodný nosič alebo adjuvant.

15. Vakcína na ochranu subjektu proti kokcidióze, vyznačujúca sa tým, že obsahuje rekombinantný vírus, zahŕňajúci DNA s nukleotidovou sekvenciou, ktorá kóduje polypeptid podľa akéhokoľvek z nárokov 1 až 3, pričom rekombinantný vírus je schopný riadiť expresiu DNA v kompatibilnom hostiteľskom organizme, a fyziologicky vhodný nosič alebo adjuvant.

16. Použitie polypeptidu podľa akéhokoľvek z nárokov 1 až 3 na prípravu vakcíny schopnej chrániť subjekt proti kokcidióze.

33 výkresov

SK 281606 Β6

OBR. 1 a gcttttgcgtcggagätagtcgttgtgtgtttgcgcgatcacccgcgaacttctctacca i--------+---------+--------—+-----——+---------+--———-+ 6Q

CGAAAACGCAGCCTCTATCAGCAACACACAAACGCGCTAGTGGGCGCTTGAAGAGATGGT

ACTGäAAAIGGCTAAGTCTATGCTTTCTGGAATTGTTTTTGCTGGTCTTGTTGCTGCTGC ---------₊---------+---------+---------₊---------₊---------_{+ 120}

TGACTTTTACCGATTCAGATACGAAAGACCTTAACAAAAACGACCAGAACAACGACGACG

MAKSMLSGIVFAGLVAAA agcggccagttcggccaacagcgccgccaacgtctccgttttggagagtgggcccgctgt ---------+---------+---------+---------+---------+---------₊ JgQ tcgccggtcaagccggttgtcgcggcggttgcagaggcaaaacctctcacccgggcgaca

AASSANSAANVSVLESGPAV gcaggaagtgccagcgcgcacggtcacagctcgcctggcgaagcctttgctgcttctttc

----------—+---——+ 240 cgtccttcacggtcgcgcgtgccagtgtcgagcggaccgcttcggaaacgacgaagaaag

QEVPARTVTARLAKPLLLLS TGCTCTTGCTGCGAČTTTGGCAGCAGCTTTCCTCGTTTTGCAATGCTTCAACATCATCTC

---------+——------— +---------------+------—~+ 300 acgagaacgacgctgaaaccgtcgtcgaaaggagcaaaacgttacgaagttgtagtagag

ALAATLAAAFL V L Q C F N I IS cagcaacaaccagcaaaccagcgtcaggagactggccgccggaggtgcatgcggagatga ---------₊----—---+——------+---------+---------+---------₊ 35Q gtcgttgttggtcgtttggtcgcagtcctctgaccggcggcctccacgtacgcctctact snnqqtsvrrlaaggacgde

GGAAGATGCAGATGAGGGAACTTCACAGCAGGCCAGCCGGAGGAGGAGAAAACCTGATAC ———------+--———————+---------H------------1—————— + 4 20

CCTTCTACGTCTACTCCCTTGAAGTGTCGTCCGGTCGGCCTCCTCCTCTTTTGGACTATG

EDADEGTSQQASRRRRKPDT

CCCTGCAGCAGATAAATACGATTTTGTTGGCGGAACTCCAGTTTCGGTCACTGAGCCGAA —--------+--------+---------+---------+_--------+---------+ 43Q

GGGACGTCGTCTATTTATGCTAAAACAACCGCCTTGAGGTCAAAGCCAGTGACTCGGCTT

PAADKYDFVGGTPVSVTEPN

TGTTGATGAAGTCCTTATCCAAATTAGAAATAAACAAATCTTTTTGAAGAACCCATGGAC ---------₊---------₊---------+---------+---------+---------+ 540

ACAACTACTTCAGGAATAGGTTTAATCTTTATTTGTTTAGAAAAACTTCTTGGGTACCTG

VDEVLIQIRNKQIFLKNPWT

0ÔR. í b

TGGACAAGAAGAACAAGTľCTAGTACTGGAACGACAAAGTGAAGAACCCATTCTGATTGT

----——————4————————-------——————————4-—————————4-—————————4- 600

ACCTGTTCTTCTTGTTCAAGATCATGACCTTGCTGTTTCACTTCTTGGGTAAGACTAACA

GQEEQVLVLERQSEEP I L I V

GGCGAGGACAAGACAAACACTTGAAGGATATCTTGGTAGTCAAGCTCTTGCACAGGACGG

-----——+----------h------------------+---------+------66Q CCGC-CCTGTTCTGTTTGTGAACTTCCTATAGAACCATCAGTTCGAGAACGTGTCCTGCC

A^TRQILEGXLGSQhhhQDG aaagactgctaaagaagagaaagttgaaggaggcaaaactcacagaagatataaagtcaa

---------+----------+---------+---------+---------+---------+ 720

TTTCTGACGATTTCTTCTCTTTCAACTTCCTCCGTTTTGAGTGTCTTCTATATTTCAGTT

KľAKEEKVEGGKTHRRYKVK

GAGCAGCGACCCAGGATATGGATTCCCATACACCACGGTGCTCGACGGGGTTCCTGTGGG ---------+---------+---------+----------+---------+-----,----+ 780

CTCGľCGCTGGGTCCTATACCTAAGGGTATGTGGTGCCACGAGCTGCCCCAAGGACACCC

SSDPGYGFPYTTVLDGVPVG

AACAGACGAAGACGGATACGTCGTCGAAGTTCTTATGAAAACCGGACCCCATGGAGGAGT -------—+---------—--.—+---------+-----------+ —-—+ 84Q

TTGTCTGCTTCTGCCTATGCAGCAGCTTCAAGAATACTTTTGGCCTGGGGTACCTCCTCA

TOEDGYVVEVLMKTGPHGGV

CGAC.-.TGATGACTAGCACAGCATCACAAGGAAAATTCTGCGGAGTGCTTATGGATGACGG —-----—+---------+---------+---------+---------+---------₊ goO

GCTG“ACTACTGATCGTGTCGTAGTGTTCCTTTTAAGACGCCTCACGAATACCTACTGCC

DMMTSTASQGKFCGVLMDDG

AAAÄGGAAACCTAGTCGATGGACAAGGGAGAAAAATTACCGCCGTTATCGGCATGCTAAC ---------₊---------₊---------₊---------₊---------₊---------₊ 960 TTTTCCTTTGGATCAGCTACCTGTTCCCTCTTTTTAATGGCGGCAATAGCCGTACGATTG

KGNLVDGQGRKITAVTGMLT

TC.AACCGGATACCGAGTTTAGAAGCGGACCAGGAGACGACGAGGACGACGAGIGAGTGAG ---------₊---------₊---------+---------₊---------₊---------₊ 1020 AGTTGGCCTATGGCTCAAATCTTCGCCTGGTCCTCTGCTGCTCCTGCTGCTCACTCACTC

QPDTEFRSGPGDDEDDECGGÄGTTGGCTTTTGTCCCTGTTGATGCCGTTGCCCACTTTCGCAGCTTGCTTGTTTCCT ---------₊---------₊---------+---------+---------+---------₊ 1Q8Q

GCCTCÄACCGAAAACAGGGACAACTACGGCAACGGGTGAAAGCGTCGAACGAACAAAGGA fäZ.1 G

GGGCTTGCCTGTGCCGCGACATGCGCTTGGCGTTCCGCCTGAGTTCTTTCGGACTGTTTT

---------₊---------+---------+---------+---------₊---------+ ₁₁₄₀

CCCGAACGGACACGGCGCTGTACGCGAACCGCAAGGCGGACTCAAGÄAAGCCTGACAAAA

ÄACTTTTAATTCATTTTCTACTGCGGCAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA

1197

SK 281606 Β6

SK 281606 Β6

SK 281606 Β6

ObR. 4

N25OPSN25OP29

T1

Xhol

CTCGAGAAAT CA3ÄAÄAMVT TOOTTGCTT TGTGAGOGGA. TAACMffEKT ECORI

AMÄGMTCÄ ÄTTGTGAGCG CÄDACÄMT TCACÄCAGAA TICMTÄRAG

BaaflX Sali PstI HindlII

Ά&Ά&ΑΧΓΣ ÄACTMGAGA GGATCCGTCG ÄCCTGCAGCC AAGCTTRATT MetArg GlySerValA spbeuGlnPr oSecLeulle

AGCTGAGCTT GGACTCCTGT TGATAGATCC AGIAAIÚACC TCÄGÄACTCC Ser

ATCTGGKm GlTCAGŕACG CTCGGTTGCC GCCGGGCGTT TTTOOTGGT GÄGAATCCAA GCTMCTGG CGAGATTTTC AGGAGCTAAG GAAGCIAAAA TGGAGÄAAAA AATCACTGGA lATACCACCG TTGA1MÄTC CCÄATGGCÄT OSaAAGAAC ATTTTGAGGC ATTTCAGTCA GTTGCTCAAT GTACCIMÄA CCÄGACCGTT CtóCTCGMÄ TTACGSCCTT ITOAftaCC GTAAAGAAAA AIMGCACAA GIOTEMCCG GCCTUATTC ACATTCTTGC CCGCCTGATG AATGCTCRTC CGGÄMTKG IATGGCÄATC AAMÄCGGTG AGCTCGTGAT ATGGGMÄ3T GITC^CCCTT GTO£ACCCT TTTCCMGÄG CftAACTCÄÄA cffrmcwc gctctcgagt gäľaccrcg acgatitccg gcagiticia CACMMMT CGCAAGAICT GGCGIGTTAC GGTGSAAACC TGGCClATtT CCCmAAGGG rmiTGMÄ αταττηττίτ cgtctcägcc aatccctggg TGAGTITCAC CAGTTTTGMJ TERAACtSTGG CCAÄ.TATGGA. CAACTPCTTC GCCOCCGTIT tcaccatggg CAAATATIAT acgcmggcg acaaggtgct GMTGCCGCTG GCGATTCAGG TTCAICMGC CGTCTGTGäT GGCTTCCATG TCGGCäGAAT gctiaatcäa ttacaacagt actgcgatga gtggcagggc GGGGCCTAAT ITľflTAÄGG CNľHMTGG TGCCCTĽAAA CGCCTGGGGT AATGACTCTC TAGCTTGAEG CATCAAATAA AACGRAAGGC TCAGTCGAAA GÄCTGGGCCT TTCGlmAT ClGTTGTTTG TOCTGAACG CTCTCCTGAG Xbal

TAGGACAAAT CCGCZGCTCT AfôGCTGCCT CGCGCGTTTC GGTCATGftCG

Oblí. 5· b

GIGÄÄAACCT CTGACACATG CAGCTCCCGG AGACGGTCAC AGCTTGTCTG TAAGCGGATG CCGSÄGCAG ACAÄGCCCGT CÄGGGCGCGT CäGCGGÔTGT TOGCGGGTGT CGGGGCGCÄG CCATGACCCA GTCACGTAGC GATAGCGGAG TGTMÄCTGG CTTAACTäTG CGGCAICAGA GCAGATIGTA CIGAGnGTGC ACCA2ÄTGCG GTGTGÄAÄIA CCGCACAGAT GCGDAGGÄG AAAATACCGC ÄICAGGCGCT CTTCCGOTC CICGCTCACT GftCTCGCTGC GCTCGGTCTG TCGGCTGCGG CGAGCGGTAT CÄGCTCACTC AAAGGCGGIA ÄTACGGTTMľ CCACAGÄATC MXXSXBAC GCAGGMAGA ACATOIGAGC AAMGGOCňG CňAAAGGCCA GjAACCGTnA AÄAGGCCGCG TTGCIGGCGT TITTCCAIAG GCTCCGCCCC CCTGÄCtaeC ATCACAAAAA TCGACGCTCA AGTCAGftGCT GGCGÄAACCC GACACGACTA TftMGMÄCC AGGCGTTTCC CCCTGGAAGC TCCCTCGTGC GCTCTCCTGT TCCGACCCTC CCGCTIACCG GMRCCTSIC CGCCmCTC CCTTCGGGÄA GCGTGGCGCT TTCTCAAIGC TCMGCT3IA GOTVTCTCAG TTCGGTOIAG G1CGTTCGCT CCÄAGCTGGG CTGTGTGCftC GAACCCCCCG TTCÄGCCCGA CCGCTGCGCC TTRTCCGGTA ACTATCGTCT TGAGTCCAAC CCGGTMGAC ACGACTTATC GCCACTCGCA GOGCCACTG OTMCÄCGXr TAGCÄGACCG AGGIMCTÄG GCGGTCCTAC AGÄGTrCITG AAGTOCTGGC CKACEROGG CTJOCaCA AGGACAGTAT TTOGTATCTG CGCTCTGCTG AAGCCÄGTTA CCTTCGGAAA AAGRGTTGOT AGCTCTTGAT CCGGCAAACA ASCCACCGCT GGTÄGCGGTG GTTmiTOT TTGCAÄGCÄG CÄGATĽACGC GCAGAAAAAA ASGATCICAA GAAGMCCTT TGAICTITIC IACGGGGTCT GACGCTCAGT G&MZMAA CTCRCGTTAA GGGMTTIGG TCAIGAGMT ATCÄAAAAGG ÄľLTlťACCT AGMCCmT ΑΑΑΤΊΑΑΑΑΑ ICÄAGlTľlÄ AA.TCÄATCTA AAGTAIAĽAT GAGTAAACTT GGTCTGAĽAG TJÄCCAATGC TTAATCÄGTG AGGCACCTÄT CTCAGCGÄTC TGTCTATITC GITCATCCÄT ÄGCIGCCTGA CTCCCCGTCG TGIMÄĽAAC TACGÄTftCGG GÄGGGCTIAC CATCTGGCCC CAGIGCTGCA ÄTGMÄCCGC GAGACCCACG

SK 281606 Β6

CTCACCGGCT

AGCGCňGAAG TGITGCCGGG CGTTGTICCC TGGCTTCRTT CCCMGTTGT CSGAňGTMdS ATAATTCTCT GAGTACTCPA CTCITGCCCG TAAAÄGTGCT ATCTEACCGC CTGÄTCITCA CAGGÄÄGGCA TGAAIACTCA TmnGTcrc aamäggggt GAAäCCMTA GCCCITTCGr

CCÄGMmÄT TGGTCCIGCA ÄÔGCIRGÄGT ACTGCIACňG CňGCTCOGGT GCnAAAAAGC TTGGCCGCRG TXCIGTCATG CCAAGTCATT GCGTCAXERC CÄTCMTGGA TGTTGAGATC GCÄTCTľm AAATGCCGCA TACTCTTCCT ATGÍiGCGGÄT TCCGCGCÄCA TTATCÄTGAC CTTCAC

CAGCAA1AAA AcmarccG AAGTftGTTOG GCÄTCGTOGT TCCCAACGA.T GGmGCICC TGTTATCACT CCOCCG3ÄA CTGMÄMBG GGGASÄMÄC AAAOGTTCTT CaGTTCGAlG CTTTGmfl MMOGGSA TTTTCftAlňl ÄCMMľTTGA tttccccgäa ÄTTftACCiXT

CCÄGCCAGCC CCTCCKTCCA CCASTĽAMA GTCftCGCTCG CRAGGCGňGT

CMGGTIÄTG GATGCITTTC TGÍMGCGGC CGCGCCACAT CGGGGCGÄAA TAäCCCACTC CGITTCTGGG TAÄGGGCGAC tritgäacca ATOiamftG AAGIGCCACC AÄÄAMÄGGC

GGÄAGGGCCG GTCIKmAI gittocgcaa

TROOGATCC CGATOGTTGT GCAGCSjCTGC TCTGACTGGT GACCGAGTTG AGCAGAACTT ACTCTCAÄGG GTGCACCCAÄ TGAGCAAAAA ADGGÄAMGT WÄTCAGGG AAAAMÄÄÄC TGADGTCĽfiA GIMCACGÄG

SK 281606 Β6

SK 281606 Β6

XhQl

CTCGAGnÄAT OltóAAAAT TľÁTTTGCTT TGTGäGCGGA TAACAATTAT ECORI

AAIAGATTCA A3TGTGAGCG GMAACAATT TCACACAO3A TTCATIAAAG BanCT Sali PstI HindlII

AGGAGAAATT AACTATGftGG GATCCGTCGA CCTGCAGCCA AGCTIÄATĽA MetArg AspProSerT hrCysSerGl nAla

GCTGAGCTTO GACTCCTGTT GATAGATCCA GTÄATGACCT CAGAACTCCA TCIGGMTTG TICWÄACGC TCGGTTGCCG CCGGGCGTTT TTIMTGGIG AGAÄTCCAAG CTAGCTPGGC CÄGATTTTCA GSAGCTAAGG AAGCIÄAÄAT GGÄGÄÄAAAA ATCACTCGAT ATACCACCGT TGATATATCC CAÄTGGCATC GTAAAGAACA TTTTGAGGCA TTTCAGTCAG TTGCTCAATG IACCTAIÄÄC CAGACCGTTC AGCTGGAIAT TACGGCCTTT TIÄAAGACCG WAGAAAAA TAAGCACAAG TľHMCCGG CC'lTTAl'rCA CAl'ľC'lTGCC CGCCTGATGA ATCCTCATCC GGÁA'm'CGT ATGGCAATGA AAGACGGTGA GCTGCTGATA TGGGATAGTG TTCACCCITG TTACACCGIT TTCXÄTSM3C AAÄCTGAAAC GITTTCATCG CTCTGGAGTG AATACCACGA CGMTTCCGG CAGTTTCľAC ACATATATTC GCAAGATGTC GCGTGTTACG GTGAAAACCT GGCCTATTTC CCTAAGGGT TTATTGÄGAA ΊΑΉΊΊΊΤΓΟ GTCTCAGCCA ATCCCTCGGT GäGTTTCACC AGTmÚATT TAAACGTGGC CAATATGGAC AACTTCTTCG CCCCCGTTTT CACCATGGGC ΑΑΑΊΑΏΑΤΑ CGCAAGGCGA CAäGGTGCTG ATGCCGCTGG CGMTCAGGT TCATCATGCC GTCTGTGAIG GCTTCCATGT CGGCAGAATG CTIAAIGAAT TACAACAGTA CTGCGATGäG TGGCAGGGCG GGGCGTÄA1T TTITľAAGGC AGTTATTGGT GCCCTIAAAC GCCTGGGGTA ATGACTCTCT AGCITCAGGC ATOAMNA ACGÍÄAGGCT CAGTCGAAAG ACTGGGCCTT TCGITITATC TGTľGTITGT CGGTGAACGC TCTCCTGAGT

Xbal

AGGACAAATC CGCCGCTľĽA GAGCTGCCTC GCGCGTTTCG GTGMGACGG

TGMAACCTC AAGCG3ÄTGC GGCGGGTGTC GTATACIGGC CCATATGCGG TCäGGCGCTC CGGCTGCC-GC CACAGAATCA AÄAAGGCCAG CTCCGCCCCC GCGÄAACCCG CCCTCGTGCG Gccmcrcc CTATCTCÄGT AACCCCCCGT GAGTCCAÄCC IAACAGGMT AGTGGTGGCC GCTCTGCIGA CGGCAAACAA AGÄTĽÄCGOG ACGGGGTCTG CATffiGATIA GAAGľľľlAA. XACCÄATGCT TTCATCCATA AGGGCTZACC

TGÄCÄCAIGC CGGÄGCAGÄ GGGGCGCAGC TDACTATGC TGTGAAAIAC TTCCGCTTCC GAGCGGTATC GGGGATAACG GAACCGIAAA CTGACGAGCA. ACAGGACTAT CTCTCCTGTT CTTCGGGÍAG TCGGIGIÄGG TCAGCCCGAC CGGTMMSÄCA AGCAGAGCGA TAACTACGGC AGCCAGimC ACCACCGCTG CAGÍAAAAää ACGCTCAGTG ’ÍWAAAGGA ATCAATCTAA TAATCAGTGA GCTGCCTGAC ATCT3GCCCC

0&Z 7

AGCICCCGGA CÄAGCCCGTC CATGACCCAG GGCATCAGAG CGCACAGATG TCGCTCACTG AGCTCACTCA CAGGAAAGAA AÄGGCCGCGT TCACAAAAAT ÄAAGATACCA CCGACCCTGC CGTGGOGCTT TCGTTCGCTC CGCTOCGCCT CaCTĽMCG GtHÄTGTftGG TÄCACTftGÄA CITCGGAAAA GTAGCGGTCG GGATCTCAAG GAACGAAAAC TCTTCACCTA AGZAIATATG GGCACCIATC TCCCCGTCGT AGTCCTGCAA b

GACGGTCACA AGGGCGCGTC TCACGTAGCG CAGAITGTAC CGTAAGGÄGA ACTCGCTGCG AAGGCGG7AA CATGTGAGCA TGCIGGCGTT CGÄCGCTCAA GGCGTTTCCC OGCTTACCGG TCTCAATGCT CAAGCTGGGC IATCCGGTAA CCACTGGCAG CGGTGCTÄCft. GGACAGTÄ1T AGAGTTGGTA ττττπτεττ AAGATCCm tcacghaag GATCCTITTA AGIÄAACTTG TCAGCGATCT GTAGMÄACT TGAIACCGCG

GCTTGTCTGT AGCGGGTGTT ATAGCGGA3T TGAGAGTGCA AAMÄCCGCA CTCGGTCTGT TACGGTIATC AAAGGCCAGC TTTCCKĽAGG GTCAGAGGTG CCTGGAAGCT ATACCTGTCC CäCGCTGTAG TCTOTGCACG CTAICGTCTT CAGCCACTGG GAGTTCTTGA TGGTATCTGC GCTCITGATC TGCÄAGCAGC GATCITTTCT GGATnTOjT ΑΑΤΊΑΑΑΑΑΤ GTCTCÄCAGT GTCTArrrcG ACGATACGGG AGäCCCACGC

SK 281606 Β6

TCACCGGCTC CAGnTTĽATC AGCAMXAAC CAGCCAGCCG GSAGGGCCGA. GCGCAGAAGT GSTCCTGCÄA CTTIATCCGC CTCCATCCäG TCTATIÄATT GITGCCGGGA ΜΧΊΝΆΰΆ AGTAGTTCGC CAGTIAATnG TITGCGCÄAC GTTGTTGCCA TIGCIACAGG CATCGTGGTG TCACGCTCGT CGITPGGIÄT GGCTTCMTC A3CTCCGGTT CCCftACGATC AAGGCGÄGTT ACATGATCCC CCATGTTGTG CÄAAftAftGCG GTTAGCTCCT TCGGTCCTCC GMľCGTTGTC AGAAGTAAGT TGGCCGCAGT CTTATCACTC ATGGTIATGG CAGCACTGCA TÄATTCTCTT ACTGTCATGC CATCCGTAAG ATGCm'JCT GTGACTGGTG AGTÄCTCftAC CAAGTCATTC TGAGAA2AGT GIÄIGCGSCG ACCGňGTTCC TCTTOCCCGG CGTCAAĽACG GGMÄMÄCC GCGCCACMA GCAGAACTTT AÄAAGTGCTC ATCMTCGAA AACGTTCTTC GGGGOGRAAA CTCTCÄAGGA TCTTACCGCT GTTGäGATCC AGITCGATGT AACCCACTCG TGCACCCAAC TGATCTTCAG CATCTTHAC TTTCACCAGC GTTTCTGGGT GňGCMAAAC AGGAAGGCAA ÄAIGCCGCAA A^AAGGGAAT AAGGGCGACA CGGAAATGTT GAATACTCAT ACTCTTCCTT TTTCAATMT ATTGAAGCAT TTATCAGGGT TAITGTCTCA, TOGGSGAIA CATAnTGÄA ΊΌΤΑΓΓΕΑΞΑ AWÚAAACA ÄAIAGGGGTT CCGCGCACAT TTCCCCG?AA AGTGCCACCT GACGTCIAAG AAACCATIAT TATCATGACA TIAACCTMA AAAATAGGCG 1ATCACGAGG CCCTITCGTC TTCAC

SK 281606 Β6

O&K. 8

N250PSN250P29

SK 281606 Β6

Xhol

CTCGAGtóAT CAIAAÄÄAAT TTAITTGCTT TGTGAGCGGA TAACAATIAT ECORI

AATAGATTCA ATTGTGAGCG GATAACAATT TCACACÄGÄA TľCATTAÍAG BanHT Sali Pstl HindlII

AGGAGAAATT AACTATGAGG ATCCGTCGAC CTGCAGCCAA GCMMOTAG MetArg HeArgArgP roAlakLaLy sLeuAsn

CTGAGCTTGG ACTCCTGTIG AIAGATCCAG TAATGACCTG AGAACTCCAT CTOGRTTTGT TCAGftACGCT CGGITGCCGC CGGGCGTTIT TTA.TTGGTGA GAKKXRÄGC TAGCTTGGCG AGMTTTCAG GÄGCTAAGGA AGC33AAMG GAGAAAAAAÄ TCACTGGAIA TACCACCGTT GAĽAIATCCC AATGGCATCG TAÄÄGARCAT TTIGňGGCAT TTCÄGTCAGT TGCTCAAICT ACCIMÄACC AfiftCCGTTCA GCTGGMMT ACGGCCTITT TAAAGACCGT ΑΆΑβΑΑΆΑΜ* AAGCRCRňGT TTIÄIVCGGC CTHÄTTCAC AllVlTGCCC GCCTGÄTGÄA TGCTCATCCG GAAľľTCGlA TCGCAATSA AGACGGTGftG CTGGTGAIAT GGGMAGTGT TCACCCITCT TACACCGTTT TCCATGAGCA AACTGAAACG TITKÄTCGC TCIGGftCTGA AIACCÄOGAC GAMTCCGGC AGITTCTACA CMMÄTTCG CAAGATGTCG CGTCTTACGG TGAAAACCTG GCCTAITrCC CTAAAGGGTT TATTGAGAAT ATGTITTTCG TCTCAGCCAA TCCCTGGGTG AGTITCACCA GTmGMTT AAAOGTGGCC AAIATGGACA ACTTCTTCGC CCCCGTTTTC ACCP-TGGGCA AMÄHMÄC GCAÄGGOGAC AAGGTOCTGA TGCCGCTGGC GMTCAGGTT CATCATCCCG TCTGTGATGG CTTCCATGTC GGCAGAATGC TTAATGAATT ACÄACaGIAC IGCGNKftGT GGCäGGGCGG GGCGTAAITT TITTAAGGCA GTTMTCGTG CCCTĽVACG CCTCGGGTAA TGACTCTCTA GCIT3AGGCA TCAÄAIAAAA CGÄAAGGCTC AGTCGAAAGA CTGGGCCTTT CGITTEATCT GTTGTTTGTC GGTGAACGCT CTCCTGAGTA Xbal

GGACAAATCC GCCGCTCTAG AGCTCCCTCG CGCGITTCGG TGATGACGGT

GAAAACCTCT AGCGGMGCC GCGGGTGTCG TMACTGGCT CAIATGCGGT CAGGCGCTCT GGCTGCGGCG ACAGAATCAG AAAGGCOGG TCCGCCCCCC CGAAACCCGA CCTCCTGCGC CCTTPCTCCC TÄTCTCAGTT ACCCCCCG7T ASTCOACCC AACAGGATTA GIGGTGGCCT CTCTGCTCAA GGCAAACAÄA GATTACGCGC CGGGGICTGÄ ÄTGftGÄTEAT AAGTITĽŕAA ACCAATGCTT TCATCCAZnG GGGCTIACCA

GACACATGCA GGGAGCAGAC GGGCGCAGCC TAACTÄTGCG CHGAAAIACC TCCGCTTCCT AGCGGZATCA GGGAĽAACGC ÄACCGIAAAA TGACGäGCAT CAGGACTATA TCTCCTGTTC TTCGGGAAGC CGGTGTAGGT CAGCCCGACC GGTÄÄGACAC GCAGAGCGäG ÄACTACGGCT GCCAGTTACC CCACCGCTCG AGAAÄAAÄAG CGCTCAGTGG CAAAAÄGGAT TCAÄTCTÄAA AATCAGTGÄG CTGCCTGACT TCTGGCCCCA

0Λ2.9

GCTCCCGGfcG AAGCCCGTCA AIGACCCAGT GCATCAGAGC GCACAGATGC CGCTCACTGA GCTOOCftA ÄGGAÄAGAAC AGGCGSCGTT CACAAAAATC ÄAGMACCAG CGACCCTCCC GTGGCGCTTT CGITCGCTCC GCIGOGCCIT GAcmrccc GTMGTAGGC ACACIAGAAG TTCGGMAAA TAGCGGTGGT GATCTCAAG.\ AACGAAAACT CTTCACCTAG GTAIAIATGA GCACCIATCT CCCCGTCGTG GTGCTGCAAT b

ACGGTCACAG GGGCGCGTCA CACGTAGCGA AGMTCTACT GTÄAGGÄGAA CTCGCTOCGC AGGCGGTRM· AIGTGRGCAA GCTOGCGITT GACGCTCAAG GCGTTTCCCC GCTEACCGGA CTCAATGCTC AAGCTGGGCT ATCCGG5ÄAC CACTGGCÄGC GCTGCTACAG GACÄGmiTT GäGTTGGTAG rmrpsm AGftlCCTnG CACGTTAÄGG ATCflTľľAA GTAAACTTGG CAGCGATCTG TAGATAÄCTA GATACCGCGA

CTTGTCTGTA GCGGGTGITG TASCGGAGTG GAGAGTGCAC AATACCGCAT TCGGTCTGTC ACGGTTATCC AAGGCCftGCA TTCCATAGGC TGAGAGGTGG CTOGÄAGCTC TACCTGTCOG ACGCTGTAGG GTGTCCACGA TATCGTCTTG AGCCACTCGT AGTTCTnÄA GGXATCTGCG CTCTTGATCC GCAAGCAGCA ATC'ľľľľCTA GATTTTGGTC ATTAAAAATG TCTGACAGTT TCTATTTCGT CGATACGGGA GÄCCCACGCT

SK 281606 Β6

CACCGGCTCC ÄGATTTATCA GCAATMACC AGCGÁGCCGG AÄGGGCCGAG CGCAGftAGTG GTCCTGCAAC TTTATCCGCC TCCÄTCCftGT CIATľAATTG TTGCCGGGAA GCIAGAGIAA GTAGITCGCC AGTIAATAGT 1TGCGCAAO3 TTGTTGCCAT TGCTÄCAGGC ATCGTGGTGT CACGCTCGTC GTITGGTÄIG GCTTCATTCA GCTCCGGTTC CCAACGATCA AGGCGAGTTA CATGATCCCC CATGTTCTGC AAÄAAAGOGG TľÄGCTCCTT CGGTCCTCCG ATCGITGTCA GAAGTAAGTT GGCCGCAGTG TTATCÄCTCA TGGTIÄTGGC AGCACTGCAT AATrCTCTTA CTGTCATGCC ATCCGIAAGA TGCITITCTG TGACTGGTGA GTACTCAACC AAGTCATTCT GRGftMSCTG TATGCGGCGA CCGAGITGCT CTTGCCCGGC GTCAATACGG GMÄMACCG CGCCACÄTAG CAGnACITĽA AftfiGTGCTCA TCAITGGAÄA ACGTKľHCG GGGCGMAAC TCTCAÄGGAT CTTňCCGCTG TIGAGATCCA GTTCGGCTA ACCCACTCCT GCftCCCÄACT GATCTTCAGC ATCTTmCT TTCÄCCAGCG TTTCTOGGTG AGCAAAAACA GGAAGGCAAA AIGCCGCAAA AAAGGGAMA AGGGCGACAC GGAAATGTTO AMÄCTCKa CTCTTCUm· τκαμμίά ttgtagcait tmcagggit ATTGTCTCÄT GAGCGGMÄC AIATTTG/AT GlATnAGAA AAATAAACAA AIAGGGGTTC CGCGCÄCftTT TCCCCGAAAA GTGCCACCTG ACGTCTAGA AAGCATCATT ÄTCATCACAT TftACCTATAA AAATAGGCGT ATCACGAGGC CCTTTCGTCT TCAC

SK 281606 Β6 οε>ζ.ιι a

HindlII

AAGCTTCACG CTGČCGCAAG CACTCÄGGGC GCÄAGGGCTG CĽAAAGGAAG CGGAACACGT AGAAAGCCAG TCCGCAGÄAA CGGTGCTSAC CCCGGATGÄA TGTCAGCTAC TGGGCJÄTCT GGACAAGGGA AAACGCAAGC GCAAAGAGAA AGCAGGTAGC TTGCÄGTGGG CTZACATGGC GAIAGCTAGA CTGGGCDGTT TIMGGACAG CAAGCGAACC GGMOTGCCK GCTGGGGCGC CCTCTGGTAA GGTTGGGAAG CCCTGCAAÄG TAAACTGGAT GGdTTCTTG COGCCAW3GA TCTSATGGCG CAGGGGATCA AGATCTGATC AÄGAGACAGG ATGAGGATCG TTTCGCMXÄ TIGftACÄWÄ TGSUTGCAC GCRGGTTCTC CGGCCGCTTG

Met

GGTGGA&GG CľATTCGGCT AKÄCTGGGC ACWXGAO. ATCGGCTGCT CIGMGCCGC OGTSITCCGG CTGTCAGCGC AGGGGCGCCC GGTTCTHTr GTCAAGACCG ACCTGTCCGG TGCCCTGAAT GRACTGCAGG ACGÄGGCAGC GCGGCTATCG TGGCTGGCCA CGACGGGCGT TCCTTCCGCA GCTGTGCTCG ACGTTGTCAC IGAhGCGGGA AGGGACIGGC TGCTMTGGG CGAAGTGCCG GGGCAGGATC TCCTCItATC TCACCTTGCT CCTGCCGAGA AAOTATCCAT CATGGCIGAT GCAATGCGGC GGCTOCATAC GCTTGATCCG GCĽACCTGCC CATTCGACCA CCAAGCGÄAA CATCGCATCG AGCGAGCfiCG TACTCGGATG GäAGCCGGIC TIGTCGATCA GGATGATCTG GACGAAGAGC ATCAGGGGCT CGCGCCÄGCC GÄACIGTTCG ccaggctgaa ggcgcgcatg cccgacggcg AGGATCTCGT CGTGACCCAT GGCGATGCCT GCTTGCCGňA lÄICATGGTG GAAAATGGCC GCTTrrCTGG ATTCÄTCGAC TGTOGCCGGC TGGGTGTGGC GGACCGCXÄT CAGCaCAlAG CGTTGGCľAC CCGTCAEAIT GCTGAAGAGC TTGGCGGCGA ATSGGGDGAC CGCTTCCTCG TGCTTIäCGG TATCGCCGCT CCCGATTCGC AGCGCATCGC CTTCIATCGC CTTCTTGACG AGTTCTTCTG ?he

ÄGCGGGACTC TGGGGTTCGA AATGACCÍÄC OAGCGACGC CCAACCTGCC

SK 281606 Β6

QÔR. b

ATCAOSAGAT TTCGAITCCA CCGCCGCCTT CTMGAÄAGG TTGGGCTTCG GAATCGTTTľ CCGGGnCGCC GGCTGGATGA TCCTCCAGCG CG3GGATCTC ATOCTGGAGT TCTTCGCCCA CCCCGGGCTC GATCCCCTCG CGÄGTTGGTT CAGCTGCTGC CTGftGGCTGG ACGACCTCGC GGAGTTCTAC CGGCAGTGCA AATCCGTCGG CATCCAGGAA ACCÄGCAGCG GCTATCCGCG CATCCATCCC Sali

CCCGACTGC AGGrtGTGGGG AGGCACGAPG GCCGCTTTGG TCGACAATTC GCGCTAACTT AQATIAATTG CGTTGCC-CTC ACTGCCCGCT TTCCRGTCGG (Gin)

GAAACCTGTC GIGCCAGCTG CATIAATGAA TCGGCCÄACG CGCGGGGAGA GGCGGTTTGC GTATTGGGOG CCÄGGGTGGT ΊΤΠΏΤΓΚ: ACCAGTGAGA CGGGCAÄCRG CTGMTGCCC TTCACCGCCT GGCCCTGAGA GAGTTGCAGC AAGCGGTCCA CGCTGGTITG CCCCAGCAGG CGAAAATCCT GTTTQVIGGT GGTIAACGGC GGSMA33AC ATGAGCTGTC TTCGGTATCG TCGIMCCCA CIACCGAGAT ATCCGCACCA ACGCGCAGCC CGGACTCGGT AATGGCGCGC ÄTTGCGCCCA GCGCCATCTG ATCG1TOGCA ACCAGCATCG CAGTGGGAAC GÄTGCCCTCA TTOUSCaiTr gcaiggtitg ttgaäaaccg gacmggcac TCCAGTCGCC TTCCCGTTCC GCľATCGGCT GAATTTGATT GCGRGTGÄGA TAITTAIGCC ÄGCCAGCCAG ACGCAGACGC GCCGAGACAG AACTIAATGG GCCCGCTAAC AGCGCGMTT GCTGG1GÄCC CAATCCGACC AGATGCTCCA CGCCCAGTCG CGTACCGTCT TCÄTGGGAGA AAATAATACT GTT3ATCGGT GTCTGGTCAG ÄGACATCÄAG AÄATAACGCC GGAACAITAG TCCAGGCAGC TTCCACAGCA ATGGCATCCT GGTCATCCAG CCGATACTTA ATGATCAGCC CňCTGACGCG TTGCGCGäGä AGMTGTGCA CCGCCGCTTT ACAGGCTTCG ACGCCGCTTC GITCTACCAT CGACACCACC ACGCTGGCAC CCAGTTGATC GGCGCGAGAT TUATCGCCG CGACAATTTG CGÄCGGCGCG TGCÄGGGCCA GÄCTGGAGGT GGCAACGCCA ATCAGCRACG ACTGTTTGCC CGCCAGITCT

SK 281606 Β6

0&C 11 &

TGTGCCACGC GGTTGGGAKT GDATTCAGC TCCGCCATCG CCGCTTCCAC TITITCCCGC GTHTCGCAG AÄACGTGGCT GGCCľGGTTC ACCACGCGGG AAACGGTCTG AIAÄGMÄCÄ CO3GCMACT CTGCGACÄTC GTATAACGTT ACTGGTrrcA CATTCACCAC CCTGÁA7TGA CTCTCTTCCG GGCGC3ATCA (Me t)

TGCCATACCG CGAAAGGTTT TGCÄCCMTC GATGGTGTCA ACGTAAATGC Sali

ATCCCGCTTC GCCTTCGCGC GCGÄATTGTC GACCCTGTCC CTCCTGTTCA GCTACTGACG GGGTGGTGCG KACGGCMA AGCACCGCCG GACATCAGCG CTAGCGGAGT GIMACTOGC TIACTATGTT GGCACTGATG AGGGTGTCAG TGÄÄGTGCIT CATGTGGCAG GAGWAAAG gctgcaccgg tccgtcägca gaatatgtga täcäggatat attccgcttc ctcgctcact gactcgctac GCTCGGTCGT TCGACTGCGG CGAGCGGAAA TGGCTTACGA AOGGGGCGGA GATTTCCTGG AAGATGCCAG GAAGAIACTT AACAGGÄÄG IGAGAGGGCC GCGGCAAAGC CGTTTTTCCA TAGGCTCOGC CCCCCTGACA AGCATCACGA AATCTGACGC TCAAATCAGT GGTGGCGAAA CCCGACAGGA (ľĽAIAAAGAT ACCAGGCGTT TCCCCTGGCG GCTCCCTCGT GCGCTCTCCT GTTCCTGCCT TTCGGITEAC CGGTGTCATT CCGCTGTTM? GGCCGCGTTT GTCTCATTCC ACGCCTGÄCA CTCAGTTCCG GGTAGGCAGT TCGCTCCAAG CTCGACTGTA TGCACGACC CCCCGTTCAG TCCGACCGCT GCGCCTTATC CGGTÄACTAT CGTCTTGäGT CCÄACCCGGA. AAGACATGCA AAAGCACCAC TGGCAGCAGC CACTGGTAAT TGATTĽäSC GAGTTAGTCT TGAAGTCATG CGCCGGTIAA GGCTAAACTG AÄÄGGACAAG ITTTGGTGAC TGCGCTCCTC CAftGCCÄGTT ACCTCGGTTC AAAGAGTTGG TäGCTCäGAG AACCTTCGAA AAÄCCGCCCT GCAAGGCGGT TTTITCGTTr TCAGAGCAAG AGATIACGCG CAGACCAAAA CGATCTCAAG AAGATCATCT TATTAATCÄG ΑΙΑΑΑΑΊΑΓΤ TCTAGATTTC AGTGCAATTT ÄTCTCTTCAA ATGTAGCACC TGAAGTCAGC CCCATACGAT ÄTAAGTTGTT ÄATTCTCATG TTTGACÄGCT TATCATCGAT

SK 281606 Β6

O&R..

Obi. 13 oe&- a

TCGCGCGTTTCGGTGATGACGGTGAAAACCTCTGACACATGCAGCTCCCGGAGACGGTCA

1——-------1----------1----------<-----------ť---------+---------+ 60

AGCGCGCAAAGCCACTACTGCCACTTTTGGAGACTGTGTACGTCGAGGGCCTCTGCCAGT

CAGCTTGTCTGTAAGCGGATGCCGGGAGCAGACAAGCCCGTCAGGGCGCGTCAGCGGGTG ---------+---------+---------+-------—+---------+---------₊ 120 GTCGAACAGÄCATTCGCCTACGGCCCTCGTCTGTTCGGGCAGTCCCGCGCAGTCGCCCAC ttggcgggtgtcggggctggcttaactatgcggcatcagagcagattgtactgagagtgc -------—+——<----———+ 1Q0 aaccgcccacagccccgaccgaattgatacgccgtagtctcgtctaacatgactctcacg

Αε0ΑΤΆΤ606αΤ6ΤαΑΑΑΤΑ<Χ60Α0ΑσΑΤ6Ο6ΤΑΆ66Ά6ΑΑΑΑΤΆε06€ΑΊΌΑΟ600(Χ ---------+---------₊---------₊---------+---------+---------+ 240 tggtatacgccacactttatggcgtgtctacgcattcctcttttatggcgtagtccgcgg attcgccattcaggctgcgcaactgttgggaagggcgatcggtgcgggcctcttcgctat ----------1----—————+—------——+—————+————————i---------—+ 300 taagcggtaagtccgacgcgttgacaacccttcccgctagccacgcccggagaagcgata tacgccagctggcgaaagggggatgtgctgcaaggcgattaagttgggtaacgccagggt ————---—+——------~+----------+—---------h—————----1----——---—+ 360

ATGCGGTCGACCGCTTTCCCCCTACACGACGTTCCGCTAATTCAACCCATTGCGGTCCCA tttcccagtcacgacgttgtaaaacgacggccagtgccaagctagcttttgcgatcaata ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 420 aaagggtcagtgctggaacattttgctgccggtcacggttcgatcgaaaacgctägttat aactggatcacaaccagtatctcttäacgatgttcttcgcagatgatgattcatttttta ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 4gQ ttgacctagtgttggtcatagagaattgctacaagaagcgtctactactaagtaaaaaat agtatttggctagtcaagatgatgaatcttcattatctgatatattgcaaatcactcaat ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 54Q tcatäaaccgatcagttctactacttagaagtaatagactatataacgtttagtgagtta

ATCTAGACTTTCTGTTA'rTATTATTGATCCAATCAAAAAATAAATTAGAAGCCGTGGGTC —f-----— -----1-----------1----—------1——----——+ 500 tagatctgaaagacaataataataactaggttagttttttatttaatcttcggcacccag

ATTGTTATGAATCTCTTTCAGAGGAATACAGACAATTGACAAAATTCACAGACTTTCAAG ---------+---------+_„------₊---------+---------+---------₊ 56Q TAACAATACTTAGAGAAAGTCTCCTTATGTCTGTTAACTGTTTTAAGTGTCTGAAAGTTC

SK 281606 Β6

0B£. 14 b

ATTTTAAAAAACTGTTTAACAAGGTCCCTATTGTTACAGATGGAAGGGTCAAACTTAATA

---------+---------+---------+---------₊---------₊---------_{+ 72}o taaaattttttgacaaattgttccagggätaacaatgtctaccttcccagtttgaattat

AAGGATATTTCTTCGACTTTGTGATTAGTTTGATGCGATTCAAAAAAGAATCCTCTCTAG ---------₊---------₊---------+---------₊---------₊---------_{+ 780} ttcctataaagaagctgaaacactaatcaaactacgctaagttttttcttaggagagatc

CTACCACCGCAATAGATCCTGTTAGATACATAGATCCTCGTCGCAATATCGCATTTTCTA

---------₊---------+---------₊---------₊---------₊---------_{+ 840}

GATGGTGGCGTTATCTAGGACAATCTATGTATCTAGGAGCAGCGTTATAGCGTAAAAGAT acgtagtggatatattaaagtcgaataaagtgaacaataattaattctttattgtcatca ———----——---·-----+———————4-----—'——4——|- 900 tgcatcacctatataatttcagcttatttcacttgttattaattaagaaataacagtagt

TGAACGGCGGACATATTCAGTTGATAATCGGCCCCATGTTTTCAGGTAAAAGTACAGAAT ---------4----------+---------₊---------₊---------₊---------₊ 95Q acttgccgcctgtataagtcaactattagccggggtacaaaagtccattttcatgtctta

TAATTAGACGAGTTAGACGTTATCAAATAGCTCAATATAAATGCGTGACTATAAAATATT ---------+---------+---------4----------1----------+---------+ J020 attaatctgctcaatctgcaatagtttatcgagttatatttacgcactgatattttataa

CTAACGATAATAGATACGGAAGGGGACTATGGACGCATGATAAGAATAATTTTGAAGCAT ----------1----------+---------+---------+---------₊---------₊ 1Q30 GATTGCTATTATCTATGCCTTCCCCTGATACCTGCGTACTATTCTTATTAAAACTTCGTA

TGGAAGCAACTAAACTATGTGATGTCTTGGAATCAATTACAGATTTCTCCGTGATAGGTA ---------₊--------+---------+---------+---------+---------_{+ 1140} ACCTTCGTTGÄTTTGATACACTACAGAACCTTAGTTAATGTCTAAAGAGGCACTATCCAT

TCGACATCTATATACTATATAGTAATACCAATACTCAAGACTACGAAACTGATACAATCT ---------₊---------₊---------+---------+---------+---------₊ 1200 AGCTGTAGATATATGATATATCATTATGGTTATGAGTTCTGATGCT'TTGACTÄTGTTAGA

CTTATCATGTGGGTAATGTTCTCGATGTCGAATAGCCATATGCCGGTAGTTCGCATATAC ———————4--------—+————-----i-—————t———-------——————+ 12 60

GAATAGTACACCCATTACAAGAGCTACAGCTTATCGGTATACGGCCATCAAGCGTATATG ataaactgatcactaattccaaacccacccgctttttatagtaagtttttcaccgataaa ---------4----------₊---------4---------+---------4----------4. 1320 TATTTGACTAGTGATTAÄGGTTTGGGTGGGCGAAAAATATCATTCAAAAAGTGGCTATTT

0B£. Ak ο

TAATAAATACAATAATTAATTTCTCGTAAAAGTAGAAAATATATTCTAATTTATTGCACG ---------₊---------₊---------₊---------+---------₊---------+ 1380

ATTATTTATGTTATTAATTAAAGAGCATTTTCATCTTTTATATAAGATTAAATAACGTGC

GTAAGGAAGTAGAATCATAAAGAACAGTCAGATCGGGAATTCGGCTTTTGCGTCGGAGAT ———4.—------₊---------₊---------₊---------₊---------₊ 1440

CATTCCTTCATCTTAGTATTTCTTGTCAGTCTAGCCCTTAAGCCGAAAACGCAGCCTCTA agtcgttgtgtgtttgcgcgatcacccgcgaacttctctaccaactgaaaatggctaagt ---------₊---------₊-------—-+---------₊---------₊---------+ 1500 tcagcaacacacaaacgcgctagtgggcgcttgaagagatggttgacttttaccgattca

M A K S ctatgctttctggaattgtttttgctggtcttgttgctgctgcagcggccagttcggcca ---------J.---------4.---------₊---------+---------+---------+ 1560 gatacgaaagaccttaacaaaaacgaccagaacaacgacgacgtcgccggtcaagccggt

M L S G IVFAGLVAAAAASSAN acagcgccgccaacgtctccgttttggagagtgggcccgctgtgcaggaagtgccagcgc ————————+---—————4·——-----——i-------———+—————————+--------— + 1620 tgtcgcggcggttgcagaggcaaaacctctcacccgggcgacacgtccttcacggtcgcg

SAANVSVLESGPAVQEVPAR gcacggtcacagctcgcctggcgaagcctttgctgcttctttctgctcttgctgcgactt —— ————— H---------—4.————— —+————————+——————----1-----—————4. 1 580 cgtgccagtgtcgagcggaccgcttcggaaacgacgaagaaagacgagaacgacgctgaa tvtarlakpllllsaläatl tggcagcagctttcctcgttttgcaatgcttcaacagcatctccagcaacaaccagcaaa

---------4.---------4.---------+---------+---------4.---------+ 1740

ACCGTCGTCGAAAGGAGCAAAACGTTACGAAGTTGTgGTAGAGGTCGTTGTTGGTCGTTT

AAAF LVLQCFNTI S S N N Q Q T

CCAGCGTCAGGAGACTGGCCGCCGGAGGTGCATGCGGAGATGAGGAAGATGCAGATGAGG ---------4.---------₊---------₊-------+---------4.----------4. 1800

GGTCGCAGTCCTCTGACCGGCGGCCTCCACGTACGCCTCTACTCCTTCTACGTCTACTCC

SVRRLAAGGACGDEEDADEG

GAACTTCACAGCAGGCCAGCCGGAGGAGGAGAAAACCTGATACCCCTGCAGCAGATAAAT ---------4----------4----------1—,——4—---------1-----------1· 186Q

CTTGAAGTGTCGTCCGGTCGGCCTCCTCCTCTTTTGGACTATGGGGACGTCGTCTATTTA

TSQQASRRRRKPDTPAADKľ

ACGATTTTGTTGGCGGAACTCCAGTTTCGGTCACTGAGCCGAATGTTGATGAAGTCCTTA ---------+---------₊---------₊---------₊---------₊---------₊ 1920

TGCTAAAACAACCGCCTTGAGGTCAAAGCCAGTGACTCGGCTTACAACTACTTCAGGAAT

DFVGGTPVSVTEPNVDEVLI

TCCAAATTAGAAATAAACAAATCTTTTTGAAGAACCCATGGACTGGACAAGAAGAACÄAG ---------+---------+-----------------+---------+_-------—+ i9go

AGGTTTAATCTTTATTTGTTTAGAAAAACTTCTTGGGTACCTGACCTGTTCTTCTTGTTC

Q I R N K Q IFLKNPWTGQEEQV

TTCTAGTACTGGAACGACAAAGTGAAGAACCCATTCTGATTGTGGCGAGGACAAGACAAA ---------₊— --------₊---------₊---------₊---------+---------₊ 2040

AAGATCATGACCTTGCTGTTTCACTTCTTGGGTAAGACTAACACCGCTCCTGTTCTGTTT

LVLERQSEEP ILIVARTRQT

CACTTGAAGGATATCTTGGTAGTCAAGCTCTTGCACAGGACGGAAAGACTGCTAAAGAAG ---------------μ----------t-----------p_----f. 2100

GTGAACTTCCTATAGAACCATCAGTTCGAGAACGTGTCCTGCCTTTCTGACGATTTCTTC

LEGYLGSQALAQDGKTAKEE

AGAAAGTTGAAGGAGGCAAAACTCACAGAAGATATAAAGTCAAGAGCAGCGACCCAGGAT --------—+—— -----+—-——- ----———4----------+ 2160

TCTTTCAACTTCCTCCGTTTTGAGTGTCTTCTATATTTCAGTTCTCGTCGCTGGGTCCTA

KVEGGKTHRRYKVKSSDPGY ’íATGGATTCCCATACACCACGGTGCTCGACGGGGTTCCTGTGGGAACAGACGAAGACGGAT ----------+——-------μ 2220

TACCTAAGGGTATGTGGTGCCACGAGCTGCCCCAAGGACACCCTTGTCTGCTTCTGCCTA

GFPYTTVLDGVPVGTDEDGY

ACGTCGTCGAAGTTCTTATGAAAACCGGACCCCATGGAGGAGTCGACATGATGACTAGCA ---------.₊---------₊------—+---------+---------+---------+ 2280

TGCAGCAGCTTCAAGAATACTTTTGGCCTGGGGTACCTCCTCAGCTGTACTACTGATCGT

VVEVLMKTGPHGGVDMMTST

CAGCATCACAAGGAAAATTCTGCGGAGTGCTTATGGATGACGGAAAAGGAAACCTAGTCG ---------₊---------+---------+---------+---------+---------+ 2340

GTCGTAGTGTTCCTTTTAAGACGCCTCACGAATACCTACTGCCTTTTCCTTTGGATCAGC

ASQGKFCGVLMDDGKGNLVD

ATGGACAAGGGAGAäAAATTACCGCCGTTATCGGCÄTGCTAACTCAACCGGATACCGAGT ---------4----------4-----------f.----------1----------4------—----h 2400 tacctgttccctctttttaatggcggcaatagccgtacgattgagttggcctatggctca gqgrkitavigmltqpdtef

O&t' e·

TTAGAAGCGGACCAGGAGACGACGAGGACGACGAG1GAGTGAGCGGAGTTGGCTTTTGTC

--- -----1-----— +——------- + ------+-- 2460

AATCTTCGCCTGGTCCTCTGCTGCTCCTGCTGCTCACTCACTCGCCTCAACCGAÄAACAG RSGPGDDEDDECCTGTTGATGCCGTTGCCCACTTTCGCAGCTTGCTTGTTTCCTGGGCTTGCCTGTGCCGC ---------+---------+---------+---------+—-------+---------+ 2520

GGACAACTACGGCAACGGGTGAAAGCGTCGAACGAACAAAGGÄCCCGAACGGACACGGCG

GACATGCGCTTGGCGTTCCGCCTGAGTTCTTTCGGACTGTTTTAACTTTTAATTCATTTT ----------1----------4-----------1-----------1-----------μ---_____-4- 2580

CTGTACGCGAACCGCAAGGCGGACTCAAGAAAGCCTGACAAAATTGAAAATTAAGTAAAA

CTACTGCGGCAAAAAAAAAAAÄAAAAAAAAAAAAAAAAAACCGAATTCTGTGAGCGTATG ----------j-—————————4-—————————4·--—--—---4.--------4.-4 2640

GATGACGCCGTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTGGCTTAAGACACTCGCÄTAC

GCAAACGAAGGAAAAATAGTTATAGTAGCCGCACTCGATGGGACATTTCAACGTAAACCG ---------4.---------4.---------4.---------4.---------4.---------4- 2700

CGTTTGCTTCCTTTTTATCAATATCATCGGCGTGAGCTACCCTGTAAAGTTGCATTTGGC

TTTAATAATATTTTGAATCTTATTCCATTATCTGAAATGGTGGTAAAACTAACTGCTGTG ---------4-----------4.---------4.---------₊---------+--------—4. 2760 aaattattataaaacttagäataaggtaatagactttaccaccattttgattgacgacac

TGTATGAAATGCTTTAAGGAGGCTTCCTTTTCTAAACGATTGGGTGAGGAAACCGÄGATA — -—.-------1-----—————4—— —|——— -— ----4.----------1----------4· 2820

ACATACTTTACGAAATTCCTCCGAAGGAAAAGATTTGCTAACCCACTCCTTTGGCTCTAT

GAAATAATAGGAGGTAATGATÄTGTATCAATCGGTGTGTAGAAAGTGTTACATCGACTCA --------—4—-------4.—-------4.---------4----------+----‘-----+ 2880

CTTTATTATCCTCCATTACTATACATAGTTAGCCACACATCTTTCACAATGTAGCTGAGT

TAATATTATATTTTTTATCTAAAAAACTAAAAATAAACATTGATTAAATTTTAATATAAT ----—----4--------—4·——— 4·-----———4.— -——---4·---------4· 2940 ATTATAATATAAAAAATAGATTTTTTGATTTTTATTTGTAACTAATTTAAAATTATATTA

ACTTAAAAATGGATGTTGTGTCGTTAGATAAACCGTTTATGTATTTTGAGGAAATTGATA ----------4----------4.---------+---------4.---------+---------4. 3000

TGAATTTTTACCTACAACACAGCAATCTATTTGGCAAATACATAAAACTCCTTTAACTAT

ATGAGTTAAATTACGAACCAGAAAGTGCAAATGAGGCCGCAAAAAAACTGCCGTATCAAG -------- —4——————----4—————————4.——————___4—_________T_~—4. 3060

TACTCAATTTAATGCTTGGTCTTTCACGTTTACTCCGGCGTTTTTTTGACGGCATAGTTC

SK 281606 Β6

O&l·' 44 f gacagttaaaactattactaggagaattattttttcttagtaagttacagcgacacggta

---------+---------+---------+---------+---------+---------₊ 3120

CTGTCAATTTTGATAATGATCCTCTTAATÄAAAAAGAATCATTCAATGTCGCTGTGCCAT

TATTAGATGGTGCCACCGTAGTGTATATAGGATCTGCTCCCCGTAATCATGGTCATAGCT ---------₊---------₊---------+---------+---------₊---------_{+ 318}q ATAATCTACCACGGTGGCATCACATATATCCTAGACGAGGGGCATTAGTACCAGTATCGA

GTTTCCTGTGTGAAATTGTTATCCGCTCACAATTCCACACAACATACGAGCCGGÄAGCAT —-------—+---——3240

CAAAGGACACACTTTAACAATAGGCGAGTGTTÄAGGTGTGTTGTATGCTCGGCCTTCGTA

AAAGTGTAAAGCCTGGGGTGCCTAATGAGTGAGCTAACTCACATTAATTGCGTTGCGCTC ---------+---------₊---------+------—_+---------+---------₊ 3300 TTTCACATTTCGGACCCCACGGATTACTCACTCGATTGAGTGTAATTAACGCAACGCGAG

ACTGCCCGCTTTCCAGTCGGGAAACCTGTCGTGCCAGCTGCATTAATGAATCGGCCAACG ---------₊---------+—-------+---------+---------+—-------₊ 3360 TGACGGGCGAÄAGGTCAGCCCTTTGGACAGCACGG'ľCGACGTAATTACTTAGCCGGTTGC

CGCGGGGAGAGGCGGTTTGCGTATTGGGCGCTCTTCCGCTTCCTCGCTCACTGACTCGCT —-------_+---------+---------+---------+---------+---------+ 3420

GCGCCCCTCTCCGCCAAACGCATAACCCGCGAGAÄGGCGAÄGGAGCGAGTGACTGAGCGA

GCGCTCGGTCGTTCGGCTGCGGCGAGCGGTATCAGCTCACTCAAAGGCGGTAATACGGTT ---------+---------₊---------+---------₊--------+---------₊ 3480 CGCGAGCCAGCAAGCCGACGCCGCTCGCCATAGTCGAGTGAGTTTCCGCCATTATGCCAA

ATCCACAGAATCAGGGGATAACGCAGGAAAGAACATGTGAGCAAAAGGCCAGCAAAAGGC ---------₊---------₊---------+---------₊--------+---------₊ 354Q TAGGTGTCTTAGTCCCCTATTGCGTCCTTTCTTGTACACTCGTTTTCCGGTCGTTTTCCG

CÄGGAACCGTAAAAAGGCCGCGTTGCTGGCGTTTTTCCATAGGCTCCGCCCCCCTGACGA ———------1-------———+———------h-------———+——------f 3600

GTCCTTGGCATTTTTCCGGCGCAACGACCGCAAAAAGGTATCCGAGGCGGGGGGACTGCT

GCATCACAAAAATCGACGCTCAAGTCAGAGGTGGCGAAACCCGACAGGACTÄTAAAGATA ---------+-------------+---------+—--------+---------+ 3660 CGTAGIGTTTTTAGCTGCGAGTTCAGTCTCCACCGCTTTGGGCTGTCCTGATATTTCTAT

CCAGGCGTTTCCCCCTGGAAGCTCCCTCGTGCGCTCTCCTGTTCCGACCCTGCCGCTTAC ---------+----------t----------h—---------4.----------_b 3720 GGTCCGCAAAGGGGGACCTTCGAGGGAGCACGCGAGAGGACAAGGCTGGGACGGCGAATG

0b£. /4 g

CGGATACCTGTCCGCCTTTCTCCCTTCGGGAÄGCGTGGCGCTTTCTCAATGCTCACGCTG

-----—— 4———------+—————— ———+--------—q----------37 80

GCCTATGGACAGGCGGAAAGAGGGAAGCCCTTCGCACCGCGAAAGAGTTACGAGTGCGAC

TAGGTATCTCAGTTCGGTGTAGGTCGTTCGCTCCAAGCTGGGCTGTGTGCACGAACCCCC ----- ——+——— ------h----------H---------+——— +---—— h 38 40 ATCCATAGAGTCAAGCCACATCCAGCAAGCGAGGTTCGACCCGACACACGTGCTTGGGGG

CGTTCÄGCCCGACCGCTGCGCCTTATCCGGTAACTATCGTCTTGAGTCCAACCCGGTAAG ---------₊---------₊---------+---------₊---------₊---------₊ 3900 gcaagtcgggctggcgacgcggaataggccattgatagcagaactcaggttgggccattc acacgacttatcgccactggcagcagccactggtaacaggattagcagagcgaggtatgt ---------₊---------+---------+---------+---------+---------+ 3950 tgtgctgaatagcggtgaccgtcgtcggtgaccattgtcctaatcgtctcgctccataca

AGGCGGTGCTACAGAGTTCTTGAAGTGGTGGCCTAACTACGGCTACACTAGAAGGACAGT ---------+---------₊---------+---------+---------+---------+ 4020 TCCGCCACGATGTCTCAAGAACTTCACCACCGGATTGATGCCGATGTGATCTTCCTGTCA

ATTTGGTATCTGCGCTCTGCTGAAGCCAGTTACCTTCGGAAAAAGAGTTGGTAGCTCTTG

--——— ————4———————————————4-—————————4 —————— + ------h 4060

TAAACCÄTAGÄCGCGAGACGACTTCGGTCAATGGAAGCCTTTTTCTCAACCATCGAGAAC

ATCCGGCAAACAAACCACCGCTGGTAGCGGTGGTTTTTTTGTTTGCAAGCAGCAGATTAC ---------₊---------₊---------+---------₊---------+---------+ 4140 taggccgtttgtttggtggcgaccatcgccaccaaaaaaacaaacgttcgtcgtctaatg

GCGCAGAAAAÄAAGGATCTCAAGAAGATCCTTTGATCTTTTCTACGGGGTCTGACGCTCA ---—------j.—————————j.————————.j-----------1———------+----------1- 4200 CGCGTCTTTTTTTCCTAGAGTTCTTCTAGGAÄACTAGAAAAGATGCCCCAGACTGCGAGT

GTGGAACGAAAACTCACGTTAAGGGATTTTGGTCATGAGATTATCAAAAAGGATCTTCAC ---------₊---------+---------₊---------₊---------+---------+ 4260 CACCTTGCTTTTGAGTGCAATTCCCTAAAACCAGTACTCTAATAGTTTTTCCTAGAAGTG

CTAGATCCTTTTAAATTAAAAATGAAGTTTTAAATCAATCTAAAGTATATATGAGTAAAC ----------1----------+---------+— -—+---------+----------f. 4320 gatctaggäaaatttaatttttacttcaaaatttagttagatttcatatatactcatttg

TTGGTCTGACAGTTACCAATGCTTAATCAGTGAGGCACCTATCTCAGCGATCTGTCTATT

---+---------+----------h---------+--------—+ 4380

AACCAGACTGTCAATGGTTACGAATTAGTCAC'rCCGTGGATAGAGTCGCTAGACAGATAA

Ml· h tcg'T'tcatccatagttgcctgactccccgtcgtgtagataactacgatacgggagggctt

---------₊---------+---------+---------₊---------₊---------₊ 444Q

AGCAAGTAGGTATCAACGGACTGAGGGGCAGCACATCTÁTTGATGCTATGCCCTCCCGAA

ACCATCTGGCCCCAGTGCTGCAATGATACCGCGAGACCCACGCTCACCGGCTCCAGATTT ---------₊---------+---------₊---------+---------₊---------₊ 45QQ TGGTAGACCGGGGTCACGACGTTACTATGGCGCTCTGGGTGCGAGTGGCCGAGGTCTAAA

ATCAGCAATAAACCAGCCAGCCGGAAGGGCCGAGCGCAGAAGTGGTCCTGCAACTTTATC —--------+---------+----------+-----—--q. 455Q tagtcgttatttggtcggtcggccttcccggctcgcgtcttcaccaggacgttgaaatag

CGCCTCCATCCAGTCTATTAATTGTTGCCGGGAAGCTAGAGTAAGTAGTTCGCCAGTTAA ---------₊---------+---------₊---------₊---------₊---------+ 4 620 GCGGAGGTAGGTCAGATAATTAACAACGGCCCTTCGATCTCATTCATCAAGCGGTCAATT

TAGTTTGCGCAACGTTGTTGCCATTGCTACAGGCATCGTGGTGTCACGCTCGTCGTTTGG ----------+---------+--------~+---------+---------₊---------₊ 4 680 ATCAAACGCGTTGCAACAACGGTAACGATGTCCGTAGCACCACAGTGCGAGCAGCAAACC

TATGGCTTCATTCAGCTCCGGTTCCCAACGATCAAGGCGAGTTACATGATCCCCCATGTT ---------+---.------₊---------+---------+---------₊------.---₊ 4740 ATACCGAAGTAAGTCGAGGCCAAGGGTTGCTAGTTCCGCTCAATGTACTAGGGGGTACAA

GTGCAAAAAAGCGGTTAGCTCCTTCGGTCCTCCGATCGTTGTCAGAAGTAAGTTGGCCGC »

---------₊---------+---------+----------₊---------₊---------₊ 4800 CACGTTTTTTCGCCAATCGAGGAAGCCAGGAGGCTAGCAACAGTCTTCATTCAACCGGCG

AGTGTTATCACTCATGGTTATGGCAGCACTGCATAATTCTCTTACTGTCATGCCATCCGT ---------₊---------+— -------₊---------+---------+---------+ 4860 TCACAATAGTGAGTACCAATACCGTCGTGACGTATTAAGAGAATGACAGTACGGTAGGCA

AAGATGCTTTTCTGTGÄCTGGTGAGTACTCAACCAAGTCATTCTGAGAATAGTGTATGCG — ------------j----------+—----—+----------1 4920

TTCTACGAAAAGACACTGACCACTCATGAGTTGGTTCAGTAAGACTCTTATCACATACGC

GCGACCGAGTTGCTCTTGCCCGGCGTCAATACGGGATAATACCGCGCCACATAGCAGAAC ---—---₊---------+---------+---------+---------+---------+ 4980 CGCTGGCTCAACGAGAACGGGCCGCAGTTATGCCCTATTATGGCGCGGTGTATCGTCTTG

TTTAAAAGTGCTCATCATTGGAAAACGTTCTTCGGGGCGAAAACTCTCAAGGATCTTACC ————————i—-----------—(- 5040

AAATTTTCACGAGTAGTAACCTTTTGCAAGAAGCCCCGCTTTTGAGAGTTCCTAGAATGG

ΟδΖ. /

GCTGTTGAGATCCAGTTCGATGTAACCCACTCGTGCACCCAACTGATCTTCAGCäTCTTT

---------₊---------+---------4----------₊---------+---------+ 5100

CGACAACTCTAGGTCAAGCTACATTGGGTGAGCACGTGGGTTGACTAGAAGTCGTAGAAA

TACTTTCACCAGCGTTTCTGGGTGAGCAAAAACAGGAAGGCAAAATGCCGCAAAAAAGGG ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 5160 ATGAAAGTGGTCGCAAAGACCCACTCGTTTTTGTCCTTCCGTTTTACGGCGTTTTTTCCC

AATAAGGGCGACACGGAAATGTTGAATACTCATACTCTTCCTTTTTCAATATTATTGAAG —————————4 —r·—— 4------———4———————4—5220

TTATTCCCGCTGTGCCTTTACAACTTATGAGTATGAGAAGGAAAAAGTTATAATAACTTC

CATTTATCAGGGTTATTGTCTCATGAGCGGATACATATTTGAATGTATTTAGAAAAATAA ___ ---—+—————————-1----------4-——————4———————4-----—————4 5280

GTAAATAGTCCCAATAACAGAGTACTCGCCTATGTATAAACTTACATAAATCTTTTTATT

ACAAATAGGGGTTCCGCGCACATTTCCCCGAAAAGTGCCACCTGACGTCTAAGAAACCAT ---------4-----------f.----------(.--------—+— ——4—---------t 5340 TGTTTATCCCCAAGGCGCGTGTAAAGGGGCTTTTCACGGTGGACTGCAGATTCTTTGGTA

TATTATCATGACATTAACCTATAAAAATAGGCGTÄTCACGÄGGCCCTTTCGTC ---------4----------4----------+---------4----------4----5393

ATAATAGTACTGTAATTGGATATTTTTATCCGCATAGTGCTCCGGGAAAGCAG

SK 281606 Β6

OBíL*