KR20020073149A - 핵산 백신접종 - Google Patents
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Abstract
Muc1의 VNTR 단량체로부터의 5개 이상의 연속 아미노산 잔기를 포함하여, 이 아미노산은 글리코실화 부위인 폴리펩티드를 코드화하는 단리된 폴리누클레오티드를 포함하는 핵산 백신 구성물로서, 단리된 폴리누클레오티드가 포유동물 세포에서 발현되며, 생성된 폴리펩티드의 글리코실화가 글리코실화 부위중 한 곳 이상에서 변형되거나 억제됨을 특징으로 하는 핵산 백신 구성물에 관한 것이다.
Description
상피 세포 무친 MUC1(또한 에피시알린(episialin) 또는 폴리몰픽(polymorphic) 상피 무친, PEM으로 공지됨)은 많은 상피 세포에서 발현되는 큰 분자량의 글리코단백질이다. 상기 단백질은 세포질 테일, 트랜스멤브레인 도메인, 및 고비율의 프롤린, 세린 및 트레오닌 잔기를 함유하는 20개 아미노산 모티프의 다양한 수의 직렬 반복부(본원에서는 VNTR 단량체로 명명, 이는 또한 VNTR 에피토프 또는 VNTR 반복부로 공지된 것일 수 있음)로 구성되어 있다. 반복부의 수는 MUC1 로커스에서의 유전적 다형성으로 인해 다양하며, 가장 빈번하게는 30 내지 100개이다[참고: Swallow et al, 1987, Nature328:82-84]. 보통의 선관상피에서, MUC1 단백질은 단지 도관 루멘(duct lumen)에 노출된 세포의 윗 표면에서만 발견되었다[참고: Graham et al, 1996, Cancer Immunol Immunother42:71-80; Barratt-Boyes et al, 1996, Cancer Immunol Immunother43:142-151]. MUC1 분자의 가장 두드러진 특징중 하나는 이것의 광대한 O-연결된 글리코실화이다. 각각의 MUC1 VNTR 단량체내에는 5개의 이용가능한 O-연결된 글리코실화 부위가 있다. 도 1에서의 넘버링 시스템에 따라, Thr-6, Ser-7, Thr-11, Ser-17 및 Thr-18이 있다.
이러한 상피 세포의 종양 변형에 의해 증가되는 악성 암종에서, 여러 변화는 MUC1의 발현에 영향을 끼친다. 상기 단백질의 극성화된 발현은 손실되며, 이는 변형된 세포의 전체 표면에 걸쳐 발견된다. 또한, MUC1의 총 양이 종종 10배 이상까지 증가한다[참고: Strous & Dekker, 1992, Crit Rev Biochem Mol Biol27:57-92]. 가장 현저하게는, O-연결된 탄수화물 사슬의 정량 및 특성이 현저하게 변한다. 더 적은 세린 및 트레오닌 잔기가 글리코실화된다. 발견된 이러한 탄수화물 사슬은 비정상적으로 짧아졌으며, 종양 관련된 탄수화물 항원 STn을 생성시킨다[참고: Lloyed et al, 1996, J Biol Chem,271:33325-33334]. 이러한 글리코실화 변화의 결과, 탄수화물 사슬에 의해 미리 스크리닝된 MUC1의 펩티드 사슬의 다양한 에피토프가 이용가능해진다. 이러한 방식으로 이용가능해진 한 에피토프는 각각 20개 아미노산 VNTR 단량체에 존재하는 서열 APDTR(도 1의 Ala 8-Arg 12)에 의해 형성된다[참고: Burchell et al, 1989, Int J Cancer44:691-696].
MUC1에서의 이러한 변화는, 종양에서 발현된 형태의 MUC1에 대한 면역 시스템을 활성화시킬 수 있는 백신이 상피세포 종양 및 실제로 MUC1이 발견되는 다른 세포 유형, 예컨대, T 세포 림프구에 대해 효과적일 수 있다는 것을 의미한다는 것이 명백하다. 비정상 단백질을 발현하는 세포를 괴사시키기 위한 면역 시스템에 의해 사용된 주요 이펙터 메카니즘중 하나는 세포독성 T 림프구 면역 반응(CTL's)이며, 이러한 반응 및 항체 반응은 종양을 처리하는 백신에 바람직하다. 우수한 백신은 면역 반응의 모든 암(arm)을 활성화시킬 것이다. 그러나, 통용되는 탄수화물 및 펩티드 백신 예컨대, 테라토프(Theratope) 또는 BLP25(캐나다 에드먼튼에 소재하는 바이오미라 인코포레이티드(Biomira Inc.))는 바람직하게는, 면역 반응-각각 체액성 및 세포성 반응의 한 암을 활성화시키며, 더욱 균일한 반응을 유도하는 더욱 우수한 백신 설계가 바람직하다.
핵산 백신은 이들이 저렴하며, 대량 생산이 용이하다는 점에 있어서 통상적인 단백질 백신접종에 비해 많은 이점을 제공한다. 심지어 이들은 소량으로 강한 면역반응을 유도하는 것으로 보고되어 있으며, 세포독성 T 림프구 면역 반응 및 항체 반응을 유도할 수 있다. 그러나, MUC1에 대한 효과적인 핵산 백신의 개발을 방해하는 기술적 장애가 있다.
핵산 백신접종에서, 선택 항원을 코드화하는 핵산 분자는 숙주의 정상 세포로 삽입된다. MUC1 폴리펩티드를 코드화하는 핵산 백신이 입자 조정된 유전자 트랜스퍼에 의해 수송되는 경우(미국 특허 제 5371015 호), 가장 빈번하게 트랜스펙트된 세포로는 케라틴형성세포 또는 피부 랑게르한스 세포를 들 수 있다. 유사하게는, 핵산이 근육내 주입에 의해 수송되는 경우, 골격근 세포 및 골수 유래된 항원이 존재하는 세포가 주요 표적 세포 유형이다. 이들 각각의 세포는 생리학적으로 균형을 이루는 글리코실화 효소를 함유하며, 변형된 세포에서 발현된 비정상적으로 글리코실화된 형태에서보다 정상 상피에서의 MUC1와 더욱 유사하게 하는 방식으로 백신에 의해 코드화된 MUC1 유전자 생성물을 글리코실화시킬 것이다. 그 결과, 일부 결과를 관찰할 수 있으나, 백신은 종양 세포에 대한 면역을 최적으로 자극하는데는 실패할 것이다.
따라서, 본 발명은 VNTR 단량체 또는 이들의 반복부 또는 단편을 포함하는 폴리펩티드를 코드화하는 핵산 백신접종용 구성물로서, 코드화된 서열이 정상적인 세포 메카니즘에 의해 완전히 글리코실화되지 않는 방식으로 조작된 구성물을 제공한다. 놀랍게도, 한 양태에 있어서 본 발명자는 코드화된 폴리펩티드에서 신규한 아미노산 치환 조작에 의해 이를 달성하였다. 본 발명자는 변형된 폴리펩티드의 계속적인 면역원성에 필수적인 요소인 MUC1 에피토프의 형태를 보유한 폴리펩티드를 코드화하며, 글리코실화가 감소되어 종양에서 발현된 형태의 MUC1과 더욱 유사한 폴리누클레오티드를 포함하는 핵산 백신접종용 구성물을 생산하였다.
본 발명은 MUC1 단백질의 글리코실화 변이체인 폴리펩티드를 코드화하는 단리된 폴리누클레오티드를 포함하는 핵산 백신 구성물, 이 구성물을 포함하는 백신 조성물 및 포유동물을 백신접종시키기 위한 상기 구성물 또는 조성물의 용도에 관한 것이다.
본 발명의 한 구체예에 있어서, 하나 이상의 글리코실화 부위를 포함하는 MUC1의 VNTR 단량체로부터 5개 이상의 연속 아미노산을 포함하는 폴리펩티드를 코드화하는 단리된 폴리누클레오티드를 포함하는 핵산 백신 구성물로서, 폴리펩티드가 상기 글리코실화 부위중 한 곳 이상에서 글리코실화를 억제하거나 변형시키는 하나 이상의 아미노산 변이부를 함유함을 특징으로 하는 구성물을 제공한다.
한 양태에서, 핵산 백신 구성물에 의해 코드화된 폴리펩티드는 MUC1의 VNTR 단량체의 1개의 복사체로 구성되어 있다. 또 다른 양태에서, 핵산 백신 구성물에 의해 코드화된 폴리펩티드는 MUC1의 VNTR 단량체의 단편으로 구성되어 있다.
본 발명의 추가적인 구체예에서, 약제학적으로 허용되는 담체와 함께 본원에정의된 바와 같은 핵산 백신접종용 구성물을 포함하는 백신 조성물을 제공한다.
본 발명의 또 다른 구체예에서, 종양에 대해 포유동물의 백신접종에 사용하기 위한 본원에 정의된 바와 같은 핵산 백신접종용 구성물 또는 백신 조성물을 제공한다.
본 발명의 또 다른 구체예에서, 종양에 대한 포유동물의 백신접종용의 약제 제조에 사용하기 위한 본원에 정의된 바와 같은 핵산 백신접종용 구성물 또는 백신 조성물의 용도를 제공한다.
본 발명의 또 다른 구체예에서, 본원에 정의된 바와 같은 핵산 백신접종용 구성물 또는 백신 조성물을 포유동물에 투여하는 것을 포함하여, 종양에 대한 포유동물을 백신접종시키는 방법을 제공한다.
도면의 간단한 설명
본 발명은 도면을 참조로 하여 실례에 의해 추가로 설명될 것이다:
도 1은 하나의 MUC1 VNTR 단량체 요소(여기서는 VNTR로 명명)의 와일드형 아미노산 서열을 나타낸다.
도 2는 본 발명의 핵산 백신접종용 구성물에 포함된 바람직한 단리된 폴리누클레오티드에 의해 코드화되며, Mut5l로 명명된 하나의 폴리펩티드의 서열을 나타낸다. 와일드형 서열과 비교하여 변이부를 굵게 나타내었다. 도 2에는 이러한 폴리펩티드를 코드화하는 대표적인 누클레오티드 서열이 포함되어 있다.
도 3은 본 발명의 핵산 백신접종용 구성물에 포함된 바람직한 단리된 폴리누클레오티드에 의해 코드화되며, Mut5V로 명명된 하나의 폴리펩티드의 서열을 나타낸다. 와일드형 서열과 비교하여 변이부를 굵게 나타내었다. 도 3에는 이러한 폴리펩티드를 코드화하는 대표적인 누클레오티드 서열이 포함되어 있다.
도 4는 항체 농도 범위에 걸쳐 표 1에 기재된 와일드형 MUC1 폴리펩티드 및 변이된 폴리펩티드로의 항체 결합을 나타낸다. 이러한 결과는 비글리코실화된 폴리펩티드를 인식하는 항체 SM3(잔기 8-13에서 APDTRP 모티프를 인식)의 능력을 입증한다. Mut5P, Mut5A 및 Mut5N은 대체로 Mut5W에 대해 나타난 결과와 동일한 결과를 나타낸다.
도 5는 변이 형태의 Muc1을 함유하는 핵산 백신 구성물을 생성시키는데 이용되는 클로닝 방법을 나타낸다.
도 6은 변이 형태의 Muc1을 코드화하는 핵산 백신 구성물로 면역된 마우스로부터 취해진 항체 혈청을 나타낸다. 상기 도면은 합성 펩티드 형태의 와일드형 MUC1로의 혈청 결합을 나타낸다. 이는 본 발명의 핵산 백신 구성물이 비변이된 형태의 MUC1을 인식하는 생체내 항체를 증가시킨다는 것을 보여준다.
도 7은 변이 형태의 MUC1을 코드화하는 핵산 백신 구성물로 면역된 마우스로부터의 항체 혈청의 사람 유방암 세포로의 결합의 FACS 분석 나타낸다.
이러한 결과는 본 발명의 핵산 백신 구성물이 종양에서 발현된 형태의 MUC1을 인식하는 생체내 항체를 증가시킬 수 있다는 것을 보여준다.
도 8은 실시예 3에 설명된 pVAC1-stc의 N-말단 부분의 서열을 나타낸다.
도 9는 실시예 3에 설명된 MUT4 변이 MUC1 플라스미드를 구성하는데 사용되는 올리고누클레오티드를 나타낸다. 모든 서열은 5'에서 3'으로 기재되어 있다.밑줄친 부분은 제한 부위를 나타내며, 이탤릭체 부분은 짧은 PCR 프라이머로서 사용된 서열을 나타낸다. 소문자들은 원하는 변이부를 코드화하는데 필요한 와일드형 서열로부터의 출발 부분을 나타낸다. 'A 상', 'A 하' 등은 도 5에 도시된 방법에 관련되어 있다.
도 10은 실시예 3에 설명된 MUT5N 변이 MUC1 플라스미드를 구성하는데 사용되는 올리고누클레오티드를 나타낸다. 모든 서열은 5'에서 3'으로 기재되어 있다. 밑줄친 부분은 제한 부위를 나타내며, 이탤릭체 부분은 짧은 PCR 프라이머로서 사용된 서열을 나타낸다. 소문자들은 원하는 변이부를 코드화하는데 필요한 와일드형 서열로부터의 출발 부분을 나타낸다. 'A 상', 'A 하' 등은 도 5에 도시된 방법에 관련되어 있다.
명세서 및 청구범위에 걸쳐 다른 설명이 없는 한, "포함하다" 또는 "포함하는", "포함하여" 등과 같이 어미변화된 단어는 포함적으로 해석되며, 즉 이러한 단어의 사용은 특별히 열거되지 않은 가능한 요소 또는 전체의 포함을 내포할 것이다.
본원에 설명된 바와 같이, 본 발명은 단리된 폴리누클레오티드를 포함하는 핵산 백신 구성물로서, 종양에 대한 백신접종에 유용한 구성물에 관한 것이다. 본 발명의 용어에 있어서, "단리된"은, 폴리누클레오티드가 예를 들어, 재조합 방법 또는 물리적 합성에 의해 합성적으로 생성되거나 적어도 일부 범위로 정제되는 한, 이것의 원래 상태로 유지되지 않는다는 것을 의미한다. 따라서, 용어 "단리된"은 다른 생물학적 또는 비생물학적 물질 예컨대, 세포, 세포 또는 세포 단편의 현탁액, 단백질, 펩티드, 발현 벡터, 유기 또는 무기 용매, 또는 적합한 기타 물질과 함께 존재할 수 있는 폴리누클레오티드의 가능성을 포함하며, 단 폴리누클레오티드가 천연적으로 발견되는 상태의 상황은 배제된다.
본 발명의 핵산 백신 구성물에 포함된 단리된 폴리누클레오티드에 의해 코드화된 폴리펩티드는 명세서 및 청구범위에 걸쳐 "코드화된 폴리펩티드"로서 명명하였다. 상기 코드화된 폴리펩티드는 MUC1의 VNTR 단량체로부터의 5개 이상의 연속 아미노산 잔기를 포함하며, 상기 아미노산중 하나 이상은 글리코실화 부위이며, 글리코실화는 상기 글리코실화 부위중 한 곳 이상에서 억제되거나 변형된다. 바람직하게는, 상기 코드화된 폴리펩티드는 MUC1의 VNTR 단량체로부터의 10개 이상, 예를 들어, 13, 15, 16, 17, 18 또는 19개의 아미노산을 포함한다. 특히 바람직하게는, 상기 코드화된 폴리펩티드는 MUC1의 VNTR 단량체로부터 20개 이상의 아미노산을 포함한다. 연속 아미노산은 전체적으로 하나의 VNTR 단량체일 수 있거나, 단량체의 한 부분일 수 있으며, 예를 들어, 3개의 상기 연속 아미노산은 하나의 VNTR 단량체의 N 말단부로부터의 아미노산일 수 있으며, 다음 2개의 아미노산은 제 2 VNTR 단량체의 C 말단부로부터의 아미노산일 수 있다.
용어 "5개 이상의 연속 아미노산"은 하나 이상의 상기 아미노산이 아미노산 변이에 의해 와일드형으로부터 변형된 예를 포함한다. 따라서, 예를 들어, 와일드형 서열에 따른 3개의 아미노산, 다음 와일드형 아미노산의 아미노산 치환체 및 와일드형 서열에 따른 추가의 3개의 아미노산을 함유하는 서열을 갖는 코드화된 폴리펩티드는 MUC1 VNTR 단량체로부터 5개 이상의 연속 아미노산을 갖는 것으로 여겨진다.
본 발명은 하나 이상의 글리코실화 부위를 포함하며, 글리코실화가 글리코실화 부위중 한 곳 이상에서 억제되거나 변형되는 단량체 또는 VNTR 단량체의 단편이 교환된 폴리펩티드를 코드화하는 단리된 폴리누클레오티드를 포함하는 핵산 백신 구성물을 포함한다. 한 구체예에서, 본 발명의 핵산 백신 구성물에 포함된 단리된 폴리누클레오티드는, VNTR 단량체의 코드화된 폴리펩티드가 1 내지 10개의 복사체로 구성된 것이다. 또 다른 구체예에서, 본 발명의 핵산 백신 구성물에 포함된 단리된 폴리누클레오티드는, 코드화된 폴리펩티드가 VNTR 단량체의 10개 이상, 예를 들어, 20, 30, 50, 60, 75, 90 또는 100개 이상의 복사체의 VNTR 단량체로 구성된것이다. 추가의 구체예에서, 본 발명의 핵산 백신 구성물에 포함된 단리된 폴리누클레오티드는, 코드화된 폴리펩티드가 반복부와 단편, 예를 들어, 하나의 VNTR 단량체와 하나의 단편, 1 내지 10개의 반복부와 1 내지 10개의 단편, 10개 이상의 반복부와 10개 이상의 단편, 10개 이상의 반복부와 10개 이하의 단편, 또는 10개 이상의 단편과 10개 이하의 반복부와의 복합제로 구성된 것이다. 추가의 구체예에서, 본 발명의 핵산 백신 구성물에 포함된 단리된 폴리누클레오티드는, 코드화된 폴리펩티드가 단편, 예를 들어, 하나의 단편의 많은 복사체 또는 많은 수의 상이한 단편의 복합제로 구성된 것이다. 각각의 경우, 하나 이상의 단편이 코드화된 폴리펩티드에 존재하면, 이들 단편은 동일하거나 상이할 수 있다.
바람직한 구체예에서, 코드화된 폴리펩티드는 단일 VNTR 단량체로 구성되어 있다. 또 다른 바람직한 구체예에서, 코드화된 폴리펩티드는 VNTR 단량체의 단일단편으로 구성되어 있으며, 특히 바람직하게는, 단편이 서열 APDTRP(도 1의 잔기 8-13)를 가질 경우, 단편에서 글리코실화 부위 T는 변이될 수 있다.
바람직하게는, 글리코실화의 변형 또는 억제는 코드화된 폴리펩티드내의 글리코실화 부위를 구성하는 아미노산의 변이에 의해 달성된다. 본 명세서 및 청구범위에 걸쳐 사용된 용어 "아미노산 변이"는 코드화된 폴리펩티드의 하나 이상의 아미노산이 도 1에 도시된 와일드형 MUC1 VNTR 단량체 서열과 상이함을 의미한다. 이러한 변화는 예를 들어, 하나 이상의 아미노산의 결실, 삽입 또는 치환일 수 있다.
이러한 변이는 코드화된 폴리펩티드가 글리코실화 부위중 한 곳 이상에서 아미노산 변이부를 갖도록, 핵산 백신 구성물에 포함된 단리된 폴리누클레오티드의 서열을 설계하므로써 달성된다. 원하는 아미노산 변이가 치환인 경우, 와일드형 서열의 아미노산을 코드화하는 3개의 누클레오티드는 원하는 아미노산을 코드화하는 누클레오티드로 변할 것이다. 원하는 아미노산 변이가 결실이라면, 와일드형 서열의 아미노산을 코드화하는 3개의 누클레오티드가 결실될 것이다. 원하는 아미노산 변이가 삽입이라면, 원하는 아미노산을 코드화하는 3개의 누클레오티드가 와일드형 누클레오티드 서열로 삽입될 것이다.
당업자는 유전자 코드를 원하는 코드화된 폴리펩티드에 적용시키므로써 필요한 폴리누클레오티드의 서열을 용이하게 측정할 것이다. 필요한 서열이 측정되면, 원하는 서열을 갖는 단리된 폴리누클레오티드를 포함하는 핵산 백신 구성물이 실시예에 설명된 바와 같이 생성될 것이다. 당업자는 프라이머 및 PCT 조건과 같은 제한 요소를 용이하게 적용시킬 수 있을 것이다. 또한, 유전자 코드의 퇴화(degeneracy)에 의해, 원하는 코드화된 폴리펩티드를 생성하는데 사용될 수 있는 하나 이상의 단리된 폴리누클레오티드 서열이 잠재적으로 존재할 수 있다는 것을 당업자는 인지할 것이다.
바람직하게는, 핵산 백신 구성물은 하기 서열을 포함하는 단리된 폴리누클레오티드를 포함한다:
GC# CC# GA*G(T/U)# CG# CC#
상기 서열에서, #는 누클레오티드 A, G, C 또는 T/U일 수 있으며,
*는 누클레오티드 T/U 또는 C일 수 있다.
표기 T/U는 서열이 DNA 또는 RNA일 수 있음을 나타내는데 사용된다. 서열이 DNA인 경우, 이 지점에서 염기는 T이고, 서열이 RNA인 경우에는, 이 지점에서의 염기는 U이다.
대안적으로, 핵산 백신 구성물은 하기 서열을 포함하는 누클레오티드 서열을 포함한다:
GC# CC# GA*AT/U@ CG# CC#
상기 서열에서, #는 누클레오티드 A, G, C 또는 T/U일 수 있으며,
*는 누클레오티드 T/U 또는 C일 수 있으며,
@는 누클레오티드 T/U, A 또는 C일 수 있다.
표기 T/U는 상기와 같이 사용된다.
핵산 백신 구성물이 도 2에 도시된 서열 또는 도 3에 도시된 서열을 포함하는 누클레오티드 서열을 포함하는 것이 특히 바람직하다.
바람직한 구체예에서, 단리된 폴리누클레오티드 서열은, 아미노산 변이가 치환인 것이다. 더욱 바람직한 구체예에서, 단리된 폴리누클레오티드 서열은, 세린 또는 트레오닌 잔기가 O-연결된 글리코실화 부착 부위를 형성하는 히드록실기가 결손된 다른 아미노산으로 치환되어 아미노산 변이가 일어난 것이다. 바람직하게는, 단리된 폴리누클레오티드 서열은, 세린 또는 트레오닌이 발린, 이소루신, 알라닌, 아스파라긴, 페닐알라닌 또는 트립토판으로 대체된 것이다. 더욱 바람직하게는, 단리된 폴리누클레오티드 서열은, 트레오닌 또는 세린이 발린 또는 이소루신으로 치환된 것이다. 더욱 더 바람직하게는, 단리된 폴리누클레오티드 서열은, 트레오닌이 발린 또는 이소루신으로 치환된 것이다. 특히 바람직한 구체예에서, 단린된 폴리누클레오티드 서열은, 코드화된 폴리펩티드가 발린 또는 이소루신에 의해 치환된 트레오닌 11을 갖는 것이며, 특히 바람직한 서열은 도 2 또는 3에 도시되어 있으며, 표시된 아미노산 치환부를 갖는다. 바람직하게는, 단린된 폴리누클레오티드 서열은, 글리코실화가 폴리펩티드에 존재하는 글리코실화 부위의 60% 이상, 예를 들어, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% 또는 100%에서 변형되거나 억제되도록 코드화된 폴리펩티드가 변이된 것이다.
코드화된 폴리펩티드는 바람직하게는, 종양에서 발견된 형태의 MUC1과의 면역학적 유사성을 갖는다. 용어 "면역학적 유사성"은, 하나 이상의 아미노산의 변이에도 불구하고, 코드화된 폴리펩티드에서 하나 이상의 에피토프의 형태가 충분히비변화된채로 유지되어 종양에 발현된 형태의 MUC1의 VNTR 단량체의 에피토프를 인지하는 항체가 코드화된 폴리펩티드의 에피토프를 또한 인지하는 것을 의미한다. 용어 "면역학적 유사성"은 종양에 발현된 형태의 MUC1을 인지하는 모든 항체가 또한 코드화된 폴리펩티드를 인지한다는 상황 뿐만 아니라, 하나 이상의 에피토프가 충분하게 비변화된채로 유지되어 하나 이상의 항-MUC1 항체가 코드화된 폴리펩티드를 인지하도록 하는 상황을 내포한다. 특히 바람직하게는, 코드화된 폴리펩티드에 의해 증가된 항체들은 예를 들어, 종양 세포에 발현된 형태의 MUC1에는 결합하나 정상 세포에서 발현된 형태의 MUC1에는 결합하지 않는 것으로 구별될 수 있다.
바람직한 코드화된 폴리펩티드는, 항-MUC1 항체 SM3, ATR1, HMFG2 또는 HMFG1에 의해 인지될 수 있는 것이다. 특히 바람직한 코드화된 폴리펩티드는, 항-MUC1 항체 SM3에 의해 인지될 수 있는 것이다.
본 발명의 핵산 백신 구성물은 또한, 이종 폴리펩티드, 바람직하게는, 면역원성 폴리펩티드를 코드화하는 단리돈 폴리누클레오티드를 추가로 포함할 수 있다. 이러한 단리된 폴리누클레오티드는 핵산 백신접종용 구성물에 존재하여, 발현되는 경우, 이종 폴리펩티드가 발현된 코드화된 폴리펩티드에 연결되거나 융합된다. 바람직하게는, 이종 폴리펩티드를 코드화하는 단리된 폴리누클레오티드는 코드화된 폴리펩티드를 코드화하는 단리된 폴리누클레오티드에 인접해있다.
한 구체예에서, 코드화된 이종 폴리펩티드는 운반체(carrier)로서 작용하여 코드화된 폴리펩티드를 표적화시키며, 예를 들어, 이종 폴리펩티드가 표적 세포상의 수용체에 결합할 수 있다. 또 다른 구체예에서, 이종 폴리펩티드는 면역원으로서 작용하여 코드화된 폴리펩티드에 의해 유도된 면역 반응을 증대시킬 수 있다. 적합한 이종 폴리펩티드는 키홀 림펫 헤마시아닌(keyhole limpet haemacyanin), 오브알부민(ovalbumin), B형 간염 바이러스 표면 단백질, B형 간염 바이러스 코어 단백질, 파상풍 독소, 글루타티온 S 전이효소 또는 피죤(pigeon) 시토크롬 C를 포함한다. 바람직한 구체에에서, 이종 폴리펩티드는 파상풍 독소 또는 B형 간염 바이러스 코어 단백질이다. 이러한 폴리펩티드를 코드화하는 누클레오티드 서열은 당업자라면 용이하게 입수가능하다.
추가적으로, 핵산 백신접종용 구성물은, 포유동물 세포에서 단백질을 발현시키기 위해 올바르게 위치하는 적합한 개시제, 프로모터, 인핸서 및 기타 요소 예컨대, 필요할 수 있는 폴리아데닐화 시그널을 포함할 것이다.
프로모터는 진핵세포 프로모터, 예를 들어, CD68 프로모터, Gal1, Gal10 또는 NMT1 프로모터, 원핵세포 프로모터, 예를 들어, Tac, Trc 또는 Lac, 또는 바이러스 프로모터, 예를 들어, 세포확대바이러스 프로모터, SV40 프로모터, 폴리헤드린 프로모터, P10 프로모터, 또는 호흡 신시털(syncytial) 바이러스 LTR 프로모터일 수 있다. 바람직하게는, 프로모터가 바이러스 프로모터이다. 특히 바람직하게는, 프로모터가 세포확대바이러스 초기 프로모터이다.
전사 조절 요소는 인핸서, 예를 들어, B형 간염 표면 항원 3' 비번역된 영역, CMV 인핸서, 인트론, 예를 들어, CD68 인트론 또는 CMV 인트론 A, 또는 조절 영역, 예를 들어, CMV 5' 비번역된 영역을 포함할 수 있다.
핵산 백신 구성물 백본은 RNA 또는 DNA, 예를 들어, 플라스미드 DNA, 바이러스 DNA, 박테리아 DNA, 박테리아 인공 염색체 DNA, 효모 인공 염색체 DNA, 합성 DNA일 수 있다. 또한, 핵산 백신 구성물은 인공 핵산, 예를 들어, 포스포로티오에이트 RNA 또는 DNA일 가능성이 있다. 바람직하게는, 구성물은 DNA, 특히 바람직하게는 플라스미드 DNA이다.
코드화된 폴리펩티드를 코드화하는 핵산 백신 구성물중에 포함된 단리된 폴리누클레오티드는 RNA, 예를 들어, mRNA, 또는 DNA, 예를 들어, 게놈성 DNA, cDNA 또는 합성 DNA일 수 있다. 바람직하게는, 폴리누클레오티드는 DNA, 특히 바람직하게는, cDNA이다. 폴리누클레오티드는 바람직하게는, 핵산 백신 구성물의 프로모터에 작용가능하게 연결되어, 구성물이 포유동물 세포에 삽입되는 경우, 폴리누클레오티드가 발현되어 코드화된 폴리펩티드를 생성시킨다.
본 발명의 핵산 백신 구성물은 포유동물 세포에서 발현되는 경우, 코드화된 폴리펩티드를 생성시킨다. 상기 포유동물 세포는 시험관내의 실험배양된 세포주, 예를 들어, HEK293T, CHO, HeLa 또는 COS 세포일 수 있다. 이러한 경우, 발현된 폴리펩티드를 채취하여, 백신접종에 사용할 수 있다. 더욱 바람직하게는, 포유동물 세포는 생체내 세포이며, 핵산 백신 구성물은 포유동물 예를 들어, 마우스, 개, 고양이, 토끼, 돼지, 소, 말 또는 쥐, 또는 특히 바람직하게는 사람에 직접적으로 투여된다.
또한, 본 발명은 바람직하게는, 약제학적으로 허용되는 담체, 예컨대, 포스페이트 완충된 염수(PBS), 염수, 포도당, 물, 글리세롤, 에탄올 또는 이들의 혼합물과 함께 치료학적 유효량의 본 발명의 핵산 백신 구성물을 포함하는 백신 조성물을 포함한다. 백신 조성물은 대안적으로, 골드 비드(gold bead)내로 처리된 치료학적 유효량의 본 발명의 핵산 백신 구성물을 포함할 수 있다. 대안적으로, 상기 조성물은 리포솜으로 처리된 핵산 백신 구성물을 포함할 수 있다. 핵산 백신 구성물이 포유동물에 투여되는 경우, 폴리펩티드는 포유동물내에서 발현된다. 그 후, 발현되거나 투여된 폴리펩티드는 바람직하게는 체액성 또는 세포성 면역을 포함하는 면역 반응을 유도할 것이다.
또한, 본 발명은 예방 및 치료 둘 모두를 위해 종양에 대한 포유동물의 백신접종에 사용하기 위한 본원에 설명된 것으로서의 핵산 백신접종용 구성물 또는 백신 조성물을 포함한다. 바람직하게는, 포유동물은 사람이다. 백신접종은 MUC1를 발현하는 모든 세포유형의 종양에 대한 것이며, 따라서, 종양은 MUC1 VNTR 단량체를 인지하는 항체에 반응적일 수 있다. 한 구체에에서, 종양은 T 림프구이다. 바람직하게는, 백신접종은 상피세포의 종양에 대한 것이고, 더욱 바람직하게는, 백신접종은 유방암 또는 비소세포 폐암에 대한 것이다.
핵산 백신 구성물 및 이를 포함하는 백신 조성물은 다양한 방식 예를 들어, 경구, 비(nasal), 폐, 근육내, 피하내 또는 피내 경로로 투여될 수 있다. 이들은 주입가능한 조성물로서, 예를 들어, 멸균 수성 현탁액, 바람직하게는 등장액으로서 개체에 투여될 수 있다. 특히 바람직한 기법은 입자 충격(particle bombardment)(이는 또한, '유전자 총' 기법으로 공지되어 있으며, 미국 특허 제 5371015호에 설명되어 있음)을 포함한다. 여기서 불활성 입자(골드 비드와 같은)는 핵산으로 코팅되며, 이들은 주입 기구로부터 고압하의 방출에 의해 수령체의 표면(예를 들어,피부)으로 침투시키기에 충분한 속도로 가속된다. (본 발명의 핵산 백신 구성물로 코팅된 입자는 본 발명의 범위내에 있으며, 기구는 이러한 입자로 장전된다). 수령체에 직접적으로 핵산 백신 구성물 또는 이 구성물을 함유하는 조성물을 투여하는 또 다른 방법은 초음파, 전기 자극, 전기충격 및 US-5,697,901에 설명된 마이크로시딩을 포함한다.
본 발명의 핵산 백신 구성물은 또한, 유전자 치료에 유용한 특수화된 수송 벡터에 의해 투여될 수 있다. 유전자 치료법은 예를 들어, 문헌[Verme et al, Nature 1997,389:239-242]에 기재되어 있다. 바이러스 및 비바이러스 시스템 둘 모두가 이용될 수 있다. 바이러스 기본 시스템은 레트로바이러스, 렌티바이러스, 아데노바이러스, 아데노-결합된 바이러스, 헤르페스 바이러스 및 우두종-바이러스 기본 시스템을 포함한다. 비바이러스 기본 시스템은 핵산의 직접 투여 및 리포솜 기본 시스템을 포함한다. 예를 들어, 벡터는 리포솜에 의해 또는 폴리락티드 코-글리코리드(PLG) 입자내에 캡슐화될 수 있다.
본 발명의 핵산 백신 구성물은 또한, 변형된 세포에 의해 투여될 수 있다. 이러한 세포는 시험체로부터 채취된 세포를 포함한다. 핵산 백신 구성물은 이러한 세포로 시험관내에서 유입될 수 있으며, 그 후, 변형된 세포는 시험체에 다시 유입될 수 있다. 본 발명의 핵산 백신 구성물은 상동성 재조합에 의해 세포에 이미 존재하는 핵산으로 통합될 수 있다. 요망에 따라 변형된 세포는 시험관내에서 성장될 수 있으며, 하나 이상의 생성된 세포는 본 발명에 사용될 수 있다. 세포는 공지된 외과 또는 미세수술 기술(예를 들어, 융합, 미세-주입 등)에 의해 적합한 부위에 제공될 수 있다.
수송될 핵산 백신 구성물 또는 이를 함유하는 조성물의 양은 면역화될 포유동물의 종 및 체중, 치료/예방될 질환의 중증 정도, 적용된 백신접종 프로토콜(즉, 단일 투여 대 반복 투여 용량), 투여 경로, 및 선택된 보조제 화학물의 효능과 용량에 따라 매우 다양할 것이다. 이러한 변수를 기초로 하여, 의학 또는 수의학 처리자는 적합한 용량 수준을 용이하게 측정할 수 있을 것이며, 예를 들어, 0.5 내지 5㎍/kg의 핵산 백신 구성물 또는 이를 함유하는 조성물일 수 있다. 특히, 투여량은 투여 경로에 따라 다양할 것이다. 예를 들어, 골드 비드에 대한 피내 투여일 경우, 총 투여량은 바람직하게는, 1㎍ 내지 10ng이며, 특히 바람직하게는 10㎍ 내지 1ng이다. 핵산 백신 구성물이 직접 투여되는 경우, 일반적으로 총 투여량이 더 많아지는데, 예를 들어, 50㎍ 내지 1mg 이상이다. 상기 투여량은 평균적인 경우의 예이다. 물론, 더 많거나 적은 투여량 범위가 이로운 개체 예가 있을 수 있으며, 이는 본 발명의 범위내에 있다.
항원성 펩티드를 코드화하는 폴리누클레오티드를 포함하는 핵산 백신 구성물, 또는 핵산 백신 구성물을 포함하는 조성물은 기본적으로 일회 투여되거나, 반복적으로 예를 들어, 1 내지 7회, 바람직하게는 1 내지 4회로 약 1일 내지 약 18개월, 바람직하게는 1개월의 간격을 두고 투여되는 것이 가능하다. 그 후, 남은 환자 수명까지의 기간 동안 1 내지 12개월의 일정한 간격으로 선택적으로 투여될 수 있다. 그러나, 또한 이러한 치료 체계는 처리되는 동물의 크기 및 종, 투여되는 핵산 백신 구성물 또는 조성물의 양, 투여 경로, 사용된 보조제 화합물의 효능과용량, 및 숙련된 수의학 또는 의학 처리자에게 자명한 기타 요인에 따라 현저하게 변화될 것이다.
본 발명은 하기 실험 부분에서 실례에 의해 설명될 것이다.
본 발명의 하기 실시예에 걸쳐, 분자 및 세포 생물학의 널리 공지되고 실시된 다양한 방법들이 사용되었다. 이들의 더욱 상세한 내용은 문헌[Sambrook et al, 1998, Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Press]을 포함하는 많은 문헌에서 확인할 수 있다.
MUC1 VNTR내의 잔기의 넘버링은 도 1에 도시된 개요에 따른다.
실시예 1: O-연결된 글리코실화 부위가 손실된 MUC1 변이체의 항원 결합 능력
글리코실화 부위에 변이부를 함유하는 합성 펩티드를 설계하였다. 본 서열의 트레오닌 잔기(T11)에서 치환에 주위를 기울였다. 하기 표 1은 설계된 펩티드 및 이들의 변이된 글리코실화 부위를 나타낸다. 설계된 VNTR의 두개의 동일한 복사체를 함유하는 펩티드를 게넴드 신서시스 인코포레이티드(Genemed Synthesis Inc)(캘리포니아 샌프란시스코)에서 합성하였다. 그 후, ELISA에서 많은 항-MUC1 단일클로널 항체에 결합하는 이러한 펩티드의 능력을 스크리닝하였다.
표 1
50mM 중탄산나트륨 완충액(pH 9.6)에서 수용액으로서의 펩티드를 제조하였고, 50㎍/ml 내지 25ng/ml의 농도 범위에서 밤새 4℃에서 눈크 맥시솝(Nunc Maxisorp) 플레이트상으로 피복시켰다. TBS-트윈(Tween)(0.05%의 트윈 20을 함유하는 트리스-완충된 염수, pH7.5)으로 강하게 세척한 후, 플레이트를 2시간 동안 실온하에 차단 용액(TBS-트윈중의 3% w/v의 소 형철 알부민)으로 차단하였다. 항-MUC1 항체인 HMFG1(영국 뉴캐슬의 노보카스트라(Novocastra)), HMFG2(노보카르스라), SM3(Girling et al, 1989, Int J Cancer43:1072-1076) 및 ATR1(Bynum et al, 1995, Hybridoma14:587-591)을 차단 용액에서 희석시키고, 이를 플레이트에 첨가하고, 실온하에 1시간 동안 인큐베이팅하였다. 세척 후, 결합 항체를 차단 완충액중의 1/2000 희석비에서 HRP-컨쥬게이팅된 항-마우스 IgG(P260, 다코(Dako), 덴마크)와의 인큐베이팅에 의해 라벨링시켰다. 플레이트를 다시 세척하고, 패스트 OPD(Fast OPD) 칼라 시약(영국 풀 시그마(Sigma))을 사용하여 결합된 컨쥬게이트를 검출하였다. 3M 황산을 첨가하므로써 반응을 중단시키고, 490nm에서 흡광도를 측정하므로써 OPD 생성물을 정량하였다.
본 실시예의 결과는 표 2에 나타내었다. 각각의 항체와 펩티드 복합제에 대한 ELISA 시그널을 반정량적 스케일에 따라 분류하였으며, 여기서, +++는 매우 강한 결합, ++는 보통 결합, +는 약한 결합, -는 결합이 발견되지 않았음을 나타낸다.
표 2
이러한 데이타는, 많은 항-MUC1 항체의 결합을 유지시키는 것에 의해 입증되는 항원의 전체적인 구조의 변동없이, MUC1 VNTR 단량체의 모든 O-연결된 글리코실화 부위가 글리코실화를 억제하는 방식으로 변형된다는 것이 가능하다는 것을 보여준다. VNTR의 Mut5l 및 Mut5V 버젼은 SM3 항체에 대한 결합을 유지시킨다는 것은 특히 놀랍고 유용한 발견이다. 임상 샘플의 면역역사화학(immunohistochemical) 연구에 사용되는 경우, SM3는 주위의 정상 조직에서 발현되는 MUC1에 반하여 종양 세포에서 발현된 MUC1에 대한 강한 선택적인 착색을 나타낸다(Girling et al, 199). 이러한 발견은 종양 형태의 MUC1에 의해 형성된 에피토프와 유사한 형태(백신 면역원에 대한 매우 바람직한 특성)를 띠는 VNTR의 변이체를 유도하는 것이 가능하다는 것을 보여준다.
실시예 2: 변이 폴리펩티드에 대한 항체 결합 곡선
상기 표 1에 설명된 폴리펩티드를 본 실험에 다시 사용하였다. 방법은 실시예 1과 사실상 유사하나, 단 펩티드를 3ug/ml의 고정된 농도로 ELISA 플레이트상으로 코팅시키고, 상이한 농도의 항체 SM3를 가하였다. 결과는 도 4에 나타내었다. Mut5P, Mut5A 및 Mut5N은 Mut5W에 나타난 것과 사실상 동일한 항체 결합 패턴을 나타낸다.
도 4에 도시된 데이타는 상기 설명된 것을 확인시켜줄 뿐만 아니라, Mut5l 및 Mut5V에서 Thr-11 내지 Ile 및 Val의 변이가 펩티드에 대한 항체 SM3의 친화도를 거의 감소시키지 않는다는 것을 보여주며, 이는 비글리코실화 변이체가 실제로 천연 서열의 매우 유사한 모방체일 수 있음을 나타낸다.
실시예 3: MUC1 변이체로의 핵산 백신접종
플라스미드 제조
표 3: 사용된 프라이머
pVAC1stc 플라스미드의 구성
플라스미드 pVAC1(Thomsen et al, Immunology 95:S1, OP106, 1998)는 DNA 백신접종용으로 최적화된 진핵세포 발현 벡터이다. 이는 항원을 코드화하는 삽입부가 위치할 수 있는 다중 클로닝 부위에 작용가능하게 연결된 CMV 프로모터를 함유한다. 코작(Kozak) 번역 개시 시그널, 포유동물 분비 시그널 및 클로닝 부위를 함유하는 삽입부를, 주형으로서 플라스미드 pMNM1(Ellis et al, J.Immunology 156: 2700-2709, 1996) 및 프라이머로서 SSF 및 SSR(표 3)을 사용하여 PCR에 의해 제조하였다. PCR 단편을 Rsr ll 및 Xhol로 절단하여 120bp의 삽입부를 생성시켰으며,이는 pVAC1의 Rsr ll 내지 Xhol 부위로 클로닝되어 플라스미드 pVac-1ss2를 생성시킨다. 시퀀싱 프라이머로서 PCR 증폭 프라이머를 사용하여 DNA 서열을 확인하였다. 이차 단계는 프라이머 SSR에 의해 코드화된 SgrA l 부위에서 융합되는 유전자인 '인 프레임(in frame)' 파상풍 독소 단편 C(FrC)의 유입이며, 이는 상기 부위의 '인 프레임'에서 항원성 에피토프의 부가를 가능하게 한다. 이는 SgrA l 및 Xhol에 대한 제한 효소 부위(각각 FrCF 및 FrCR) 및 펩티드 힌지(hinge)를 코드화하는 DNA가 태깅된 프라이머를 사용하여 플라스미드 plC9Tet15(Clare et al, Methods in Molecular Biology 103:193-208, 1998)로부터 FrC 유전자의 PCR 증폭에 의해 달성된다. 1.3kb의 SgrA l/Xhol 절단된 PCR 단편을 pVac-1ss2의 SgrA l 내지 Xhol 부위로 클로닝시켜 플라스미드 pVac1stc를 생성시켰다. DNA 서열을 PCR 증폭 프라이머를 사용하여 형광 시퀀싱에 의해 확인하였으며, 내부 FrC는 서열 FrCS1 내지 FrCS6을 유도하였다(표 3). 에피토프 융합 부위를 나타내는 FrC 융합 단백질의 N 말단에서의 아미노산 서열 및 DNA 서열을 도 8에 나타내었다.
pVAC1ss2 MUC-1 2TR 단편 C 플라스미드의 구성
가열 냉각시킨 후, 플라스미드 pVac-1stc로 클로닝하여 MUC1 VNTR 에피토프의 세로로 정렬된 5개 복사체를 코드화하는 합성 올리고누클레오티드를 설계하였다(PAHGVTSAPDTRPAPGSTAP). 두개의 변이부를 설계하였다; 둘 모두는 각각의 복사체의 에피토프에서 글리코실화되는 4 또는 5개의 트레오닌 및 세린 잔기가 변형되지 않는 아미노산으로 대체된 변이부 버젼이다: PAHGVVAAPDTRPAPGAVAP, 4개 변이부(MUT4) 및 PAHGVVAAPDNRPAPGAVAP, 5개 변이부(MUT5N). 모든 경우에, MUC1서열은 분비된 FrC 융합 단백질의 일부로서 발현되도록 되어 있다. 올리고누클레오티드는 도 9 및 10에 작성되어 있다(제한 효소 SgrA 1 및 Sal1에 대한 부위는 밑줄을 쳤으며, 소문자는 와일드형 서열로부터의 변이부를 나타낸다). 세로의 반복부를 생성하는데 이용된 방법(T4 폴리누클레오티드 키나아제로 처리하여 올리고누클레오티드의 5' 말단을 포스포릴화시킨 후)은 도 5에 도시되어 있다. 상기 방법은 상동 재조합 및 5개의 반복 서열의 결실에 의해 형성된, '인 프레임'으로 FrC에 융합된 두개의 세로로 정렬된 Muc-1 MUT5N VNTR(pVAC-1stcMUC-1MUT5N)의 플라스미드를 생성시키는데 이용되었다. MUT4 VNTR을 함유하는 유사한 플라스미드를 생성하기 위해서, 리게이션 단계 후, 올리고누클레오티드를 PCR 증폭으로 처리하는 도 5에 설명된 방법의 변형 방법이 이용되었다. 사용된 프라이머는 도 9 및 10에 이탤릭체로 표기된 DNA 서열이며, PCR 조건은 94℃에서 45초, 69-75℃에서 45초 및 72℃에서 1분동안 25회 반복하는 것이다. 그 후, PCR 반응을 도 5에서와 같이 진행하였으며, 단지 가장 크고 분명한 생성물(일반적으로 약 150 내지 200bp 크기)을 겔 정제하고 클로닝하였다. 이러한 방법을 이용하여, FrC에 '인 프레임'으로 융합된 VNTR인 Muc-1 MUT4(pVAC-1stcMUC-1MUT4)의 하나 또는 반의 반복부를 함유하는 플라스미드를 PCR-조정된 가닥 점핑 및 5개의 반복 서열로부터의 결실에 의해 형성시켰다.
설명된 서열을 생성시키는 대안적인 방법은 상기 설명된 방법과 유사한 절단 및 클로닝 방법으로 더 적은 복사체의 VNTR 반복부를 함유하는 올리고누클레오티드의 합성하는 것이다.
pVAC1ss2 HepB 코어 플라스미드의 구성
플라스미드 pPA1은 E1 루프 영역에서 유일한 Nhel 부위를 갖는 HBV 코어 항원(ADW 항원형)에 대한 유전자를 함유한다(Chambers et al, J.Virol 70:4045-4052, 1996). 이러한 클로닝 부위는 외래 단백질로부터의 주요 에피토프를 코드화하는 DNA의 작은 단편의 삽입을 가능하게 한다. 상기 단백질의 E1 루프는 발현된 코어 항원의 표면에 노출된다. 조작된 HBV 코어 삽입부는 프라이머 HBV1F 및 HBV1R(표 3)를 사용하여 PCR에 의해 증폭되며, TA-오버행(overhang) 방법에 의해 pCR2.1(인비트로겐(Invitrogen))으로 클로닝시켜 pCR2.1-HepBE1을 생성시켰다. 구성물을 사용하기 전에 시퀀싱하였다.
그 후, PCR을 이용하여 pVAC-1stcMUC-1MUT4 및 pVAC-1stcMUC-1MUT5N 플라스미드로부터 MUC1 VNTR 단량체의 두개의 세로의 반복부를 코드화하는 단편을 증폭시켰다. 주형으로서 pVAC-1stcMUC-1MUT5N 및 프라이머로서 MUT5NF 및 MUT5NR을 사용하여 PCR에 의해 두개의 세로의 반복부 MUT5N 삽입부를 제조하였다(표 3).
플라스미드 pVAC-1stcMUC-1MUT4는 단지 MUC1 VNTR 단량체의 하나의 완전한 세로의 반복부를 함유하였다. 이러한 플라스미드는 일반적인 정방향 프라이머(MUT4F) 및 두개의 상이한 역방향 프라이머를 사용한 두 단계의 PCR에서 주형으로 사용되었다. 첫 번째 반응에서, 역방향 프라이머(MUT4R1)는 MUC1 서열의 MUT4 버젼의 제 2의 완전한 반복부를 생성시키는데 필요한 추가적인 서열의 일부(즉, 세로의 반복부의 반)를 존재하는 세로 반복부에 부가시켰다. 그 후, 생성된 PCR 생성물을 제 2 역방향 프라이머(MUT4R2)를 사용한 제 2 PCR에 대한 주형으로서사용하여, 요구된 Nhel 클로닝 부위와 함께 반복부를 완료하는데 필요한 잔기에 부가시켰다.
MUT4 또는 MUT5 PCR 생성물을 Nhel로 절단시키고, Nhel로 절단되는 벡터 pCR2.1 HepBE1로 클로닝하였다. 생성된 클론을 배위시키고, 서열을 형광 디데옥시 시퀀싱으로 확인하였다. 그 후, 전체 HepB 코어 + MUC-1 TR 카세트 영역을 Sall 및 Xhol을 사용하여 삭제하고, Xhol로 절단되는 pVAC1ss2로 클로닝하였다. 최종 구성물을 전체 서열 분석으로 확인하고, pVAC1.ss2.MUT4.MUC1.HepB(HBV 코어 단백질의 E1 루프에서 MUC1 VNTR 단량체의 MUT4 변이부의 두개 복사체를 코드화함) 및 pVAC1.ss2.MUT5N.MUC1.HepB(HBV 코어 단백질의 E1 루프에서 MUC1 VNTR 단량체의 MUT5N 변이부의 두개 복사체를 코드화함)를 생성시켰다.
변이 MUC1 구성물로의 DNA 백신접종
플라스미드 DNA를 염화칼슘 및 스페르미딘(spermidine)을 사용하여 2㎛ 직경의 골드 비드상으로 침전시켰다. 부하된 비드를 문헌[Eisenbraum et al, DNA Cell Biology 12:791-797, 1993; Pertmer et al, J.Virol 70:6119-6125,1996]에 설명된 바와 같이 테프젤 튜빙(Tefzel tubing)상으로 코팅하였다. 액셀 진 수송 시스템(Accell gene deliver system)(PCT WO 95/19799)을 이용하여 입자 충격을 수행하였다. 각각의 플라스미드에 대해, 5마리의 암컷 C56Bl/6 마우스를 0, 21 및 42일째에 플라스미드의 3회 투여에 의해 면역화시켰다. 각각의 투여는 DNA/골드로의 두번의 충격으로 이루어지며, 약 2.5㎍의 총 투여량의 플라스미드를 제공하였다.
1, 20, 41 및 55일째에 정맥천자에 의해 동물로부터 혈청 샘플을 수득하고, 항-MUC1 항원의 존재여부를 분석하였다. 밤새 4℃에서 3㎍/ml 중량의 MUC1 서열(2 세로 반복부에 상응하는 40mer)로 피복시킨 눈크 맥시솝을 사용하여 ELISA를 수행하였다. TBS-트윈(0.05%의 트윈 20을 함유하는 트리스-완충된 염수, pH7.4)으로 세척한 후, 플레이트를 실온하에 2시간 동안 TBS-트윈 완충액중의 3% BSA로 차단하였다. 모든 혈청을 TBS-트윈 완충액중의 RT에서 1시간 동안 1:100 희석비로 인큐베이팅하였다. TBS-트윈 완충액중의 1:2000 희석비로 HRP-컨쥬게이팅된 토끼 항-마우스 면역글로불린(덴마크 다코)을 사용하여 항체 결합을 검출하였다. 플레이트를 다시 세척하고, 패스트 OPD 컬러 시약(영국 풀 시그마)을 사용하여 결합 컨쥬게이트를 검출하였다. 3M의 황산을 첨가하므로써 반응을 중단시키고, 490nm에서 흡광도를 측정하므로써 OPD 생성물을 정량하였다.
이러한 분석 결과는 도 6에 도시하였다. 이는 본 발명의 글리코실화 변이 서열이 백신으로 사용되어 와일드형 MUC1 서열을 인지할 수 있는 면역 반응을 유도한다는 것을 보여준다.
이러한 백신에 의해 자극된 항체가 종양 세포를 인지할 수 있다는 점을 입증하기 위해, 이러함 마우스로부터의 항혈청 샘플을 사용하여 다양한 종양 세포주를 라벨링시켰으며, 라벨링은 유식세포 계측기에 의해 눈으로 확인되었다.
세포(T67-D, MCF-7, B16F0 및 B16FOMUC1;1x106)를 5% FCS가 보충된 PBS 완충액으로 세척하고, 마우스 혈정과 1:100의 희석비로 4℃에서 15분 동안 인큐베이팅시켰다. 세척 후, 세포를 동일한 조건하에 이차 항체(1:10의 희석비에서 양 항-마우스 IgG, 덴마크 다코)와 함께 인큐베이팅시켰다. 대조군 세포를 제 2 단계 시약으로 염색하기 전에 제 1 단계 항체 대신 FACS 완충액과 함께 인큐베이팅시켰다. FACScan(벡턴 디키슨(Becton Dikinson))을 이용하여 FACS 분석을 수행하였다. 샘플당 천개 세포를 SSC(통합된 광 스캐터)로서의 FSC(전방 각 광 스캐터) 및 녹색(FL1)과 적색(FL3) 형광(통합된 형광 광의 대수로서 나타냄)에 대해 동시에 측정하였다. FCS가 범위를 벗어난 집합을 제외하고는 적색 형광의 프로피듐 요오드화물-네거티브(생존가능) 세포에서 기록을 수행하였다. 종양 세포의 표면에 결합된 상이한 유형의 마우스 혈청에 대해 세포 수(Y-축) 대 형광 강도(X-축)로 나타낸 막대 그래프로서 데이타를 나타내었다.
결과를 도 7에서 확인할 수 있다. 상기 도면은, 글리코실화 변이 MUC1 구성물로 면역화된 마우스로부터의 혈청이 실제로 네거티브 세포-표면 MUC1을 발현하는 사람 및 쥐과 종양 세포 모두에 결합할 수 있는 항-MUC1 IgG를 함유한다는 것을 보여준다. T47D는 사람 종양 유방 세포주이다. B16FO는 어비 B16 세포주이며, MUC1 발현이 결여된 세포는 라벨링되지 않는다. 그러나, B16-muc1(Muc1으로 트랜스펙트된 B16FO)는 라벨링된다.
도 7에 대한 설명:
Sec only = 배경 형광 수준을 제공하기 위해 조정되는 2차 항체
Non imm = 비면역화된 동물로부터의 대조군 혈청
hepB cont = 빈 벡터(MUC1 DNA 부재)로 면역화된 동물로부터의 대조군 혈청
hepB2TR mut4 및 hepB2TR mut5는 이러한 변이 MUC1 DNA로 면역화된 동물로부터의 혈청이다.
이러한 데이타는 핵산 백신접종에서의 변이 VNTR 서열의 유용성을 확인시켜준다.
Claims (23)
- Muc1의 VNTR 단량체로부터 5개 이상의 연속 아미노산 잔기를 포함하며, 이 아미노산중 하나 이상은 글리코실화 부위인 폴리펩티드를 코드화하는 단리된 폴리누클레오티드를 포함하는 핵산 백신 구성물로서, 단리된 폴리누클레오티드는 포유동물 세포에서 발현되며, 생성된 폴리펩티드의 글리코실화가 글리코실화 부위중 한 곳 이상에서 변형되거나 억제됨을 특징으로 하는 핵산 백신 구성물.
- 제 1 항에 있어서, MUC1의 하나의 VNTR 단량체의 단편을 포함하는 폴리펩티드를 코드화하는 단리된 폴리누클레오티드를 포함함을 특징으로 하는 핵산 백신 구성물.
- 제 1 항에 있어서, MUC1의 VNTR 단량체의 하나의 복사체를 포함하는 폴리펩티드를 코드화하는 단리된 폴리누클레오티드를 포함함을 특징으로 하는 핵산 백신 구성물.
- 제 1 항 내지 제 3 항중의 어느 한 항에 있어서, 단리된 폴리누클레오티드의 서열이 변형되어 생성된 폴리펩티드에서 하나 이상의 아미노산 변이를 유도하며, 변이는 글리코실화의 변형 또는 억제를 초래함을 특징으로 하는 핵산 백신 구성물.
- 제 5 항에 있어서, 변이가 아미노산 치환임을 특징으로 하는 핵산 백신 구성물.
- 제 1 항 내지 제 5 항중의 어느 한 항에 있어서, 코드화된 폴리펩티드가 발현될 경우, 항체 SM3, ATR1, HMFG2 또는 HMFG1에 결합할 수 있음을 특징으로 하는 핵산 백신 구성물.
- 제 1 항 내지 제 6 항중의 어느 한 항에 있어서, 코드화된 폴리펩티드가 발현될 경우, 코드화된 폴리펩티드에 존재하는 글리코실화 부위의 60% 이상에서 글리코실화가 억제되거나 변형됨을 특징으로 하는 핵산 백신 구성물.
- 제 7 항에 있어서, 코드화된 폴리펩티드가 발현될 경우, 존재하는 글리코실화 부위의 80% 이상에서 글리코실화가 억제되거나 변형됨을 특징으로 하는 핵산 백신 구성물.
- 제 8 항에 있어서, 코드화된 폴리펩티드가 발현될 경우, 존재하는 글리코실화 부위의 모든 부위에서 글리코실화가 억제되거나 변형됨을 특징으로 하는 핵산 백신 구성물.
- 제 7 항 내지 제 9 항중의 어느 한 항에 있어서, 코드화된 폴리펩티드가 발현될 경우, 하나 이상의 트레오닌 또는 세린이 발린, 이소루신, 알라닌, 아스파라긴, 페닐알라닌 또는 트립토판으로 치환됨을 특징으로 하는 핵산 백신 구성물.
- 하기 서열을 포함하는 핵산 백신 구성물:GC# CC# GA*GT/U# CG# CC#상기 서열에서,#는 누클레오티드 A, G, C 또는 T/U일 수 있으며,*는 누클레오티드 T/U 또는 C일 수 있다.
- 제 11 항에 있어서, 도 3의 서열을 포함함을 특징으로 하는 핵산 백신 구성물.
- 하기 서열을 포함하는 핵산 백신 구성물:GC# CC# GA*AT/U@ CG# CC#상기 서열에서,#는 누클레오티드 A, G, C 또는 T/U일 수 있으며,*는 누클레오티드 T/U 또는 C일 수 있으며,@는 누클레오티드 T/U, A 또는 C일 수 있다.
- 제 13 항에 있어서, 도 2의 서열을 포함함을 특징으로 하는 핵산 백신 구성물.
- 제 1 항 내지 제 14 항중의 어느 한 항에 있어서, 이종 폴리펩티드를 코드화하는 폴리누클레오티드를 추가로 포함함을 특징으로 하는 핵산 백신 구성물.
- 제 15 항에 있어서, 이종 폴리펩티드가 파상풍 독소, B형 간염 바이러스 코어 단백질, B형 간염 바이러스 표면 단백질, 오브알부민(ovalbumin), 글루타티온 S 전이효소, 키홀 림펫 해마시아닌(keyhole limpet haemacyanin) 또는 피죤 시토크롬 C(pigeon cytochrome C)임을 특징으로 하는 핵산 백신 구성물.
- 약제학적으로 허용되는 담체와 함께 제 1 항 내지 제 16 항중의 어느 한 항에 따른 핵산 백신 구성물을 포함하는 백신 조성물.
- 종양에 대한 포유동물의 백신접종용으로 사용하기 위한 제 1 항 내지 제 16항중의 어느 한 항에 따른 핵산 백신 구성물 또는 제 17 항에 따른 조성물.
- 종양에 대한 포유동물의 백신접종용의 약제 제조에 사용하기 위한 제 1 항 내지 제 16항중의 어느 한 항에 따른 핵산 백신 구성물 또는 제 17 항에 따른 조성물의 용도.
- 제 18 항 또는 제 19 항에 있어서, 구성물 또는 조성물이 유전자 총(gene gun)을 사용하여 투여됨을 특징으로 하는 용도.
- 제 18 항 내지 제 20 항중의 어느 한 항에 있어서, 종양이 상피세포 종양임을 특징으로 하는 용도.
- 제 21 항에 있어서, 종양이 유방암 종양임을 특징으로 하는 용도.
- 제 1 항 내지 제 16 항중의 어느 한 항에 따른 핵산 백신 구성물 또는 제 17 항에 따른 조성물을 포유동물에 투여하는 것을 포함하여, 종양에 대해 포유동물을 백신접종시키는 방법.
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