CZ20022192A3 - Konstrukt pro vakcinaci nukleovými kyselinami a vakcina - Google Patents
Konstrukt pro vakcinaci nukleovými kyselinami a vakcina Download PDFInfo
- Publication number
- CZ20022192A3 CZ20022192A3 CZ20022192A CZ20022192A CZ20022192A3 CZ 20022192 A3 CZ20022192 A3 CZ 20022192A3 CZ 20022192 A CZ20022192 A CZ 20022192A CZ 20022192 A CZ20022192 A CZ 20022192A CZ 20022192 A3 CZ20022192 A3 CZ 20022192A3
- Authority
- CZ
- Czechia
- Prior art keywords
- nucleic acid
- acid vaccine
- vaccine construct
- construct
- polypeptide
- Prior art date
Links
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 title claims description 31
- 238000002255 vaccination Methods 0.000 title claims description 26
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 title description 22
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 title description 22
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 title description 22
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims abstract description 102
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 claims abstract description 93
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 claims abstract description 86
- 108700001237 Nucleic Acid-Based Vaccines Proteins 0.000 claims abstract description 68
- 229940023146 nucleic acid vaccine Drugs 0.000 claims abstract description 68
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 claims abstract description 45
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 claims abstract description 45
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 claims abstract description 45
- 230000013595 glycosylation Effects 0.000 claims abstract description 40
- 238000006206 glycosylation reaction Methods 0.000 claims abstract description 40
- 239000000178 monomer Substances 0.000 claims abstract description 37
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 claims abstract description 35
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 claims abstract description 7
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 claims abstract description 4
- 102100034256 Mucin-1 Human genes 0.000 claims description 71
- 101001133056 Homo sapiens Mucin-1 Proteins 0.000 claims description 70
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 claims description 37
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 claims description 33
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 claims description 30
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims description 25
- 230000035772 mutation Effects 0.000 claims description 23
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 19
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 19
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 13
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 claims description 12
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 11
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 claims description 8
- KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N Valine Natural products CC(C)C(N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- 210000002919 epithelial cell Anatomy 0.000 claims description 6
- 241000700721 Hepatitis B virus Species 0.000 claims description 5
- AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N L-isoleucine Chemical group CC[C@H](C)[C@H](N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N 0.000 claims description 5
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Chemical group OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N Threonine Natural products CC(O)C(N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- 239000004473 Threonine Substances 0.000 claims description 5
- 229960000310 isoleucine Drugs 0.000 claims description 5
- AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N isoleucine Chemical group CCC(C)C(N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- 239000004474 valine Substances 0.000 claims description 5
- 101000981773 Arabidopsis thaliana Transcription factor MYB34 Proteins 0.000 claims description 4
- 101000651887 Homo sapiens Neutral and basic amino acid transport protein rBAT Proteins 0.000 claims description 4
- AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N L-threonine Chemical group C[C@@H](O)[C@H](N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N 0.000 claims description 4
- 102100027341 Neutral and basic amino acid transport protein rBAT Human genes 0.000 claims description 4
- 108010055044 Tetanus Toxin Proteins 0.000 claims description 4
- 229940118376 tetanus toxin Drugs 0.000 claims description 4
- 125000002987 valine group Chemical group [H]N([H])C([H])(C(*)=O)C([H])(C([H])([H])[H])C([H])([H])[H] 0.000 claims description 4
- 206010006187 Breast cancer Diseases 0.000 claims description 3
- 108010015780 Viral Core Proteins Proteins 0.000 claims description 3
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 claims description 3
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 3
- 125000003607 serino group Chemical group [H]N([H])[C@]([H])(C(=O)[*])C(O[H])([H])[H] 0.000 claims description 3
- DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N Asparagine Chemical group OC(=O)C(N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 241000272201 Columbiformes Species 0.000 claims description 2
- 102000018832 Cytochromes Human genes 0.000 claims description 2
- 108010052832 Cytochromes Proteins 0.000 claims description 2
- 241000534482 Diodora aspera Species 0.000 claims description 2
- 102000005720 Glutathione transferase Human genes 0.000 claims description 2
- 108010070675 Glutathione transferase Proteins 0.000 claims description 2
- QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N L-alanine Chemical group C[C@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N 0.000 claims description 2
- DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N L-asparagine Chemical group OC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N 0.000 claims description 2
- COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N L-phenylalanine Chemical group OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N 0.000 claims description 2
- QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N L-tryptophane Chemical group C1=CC=C2C(C[C@H](N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N 0.000 claims description 2
- 108010052285 Membrane Proteins Proteins 0.000 claims description 2
- 108010058846 Ovalbumin Proteins 0.000 claims description 2
- QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N Tryptophan Chemical group C1=CC=C2C(CC(N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 235000004279 alanine Nutrition 0.000 claims description 2
- 229960001230 asparagine Drugs 0.000 claims description 2
- 235000009582 asparagine Nutrition 0.000 claims description 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 claims description 2
- 235000014705 isoleucine Nutrition 0.000 claims description 2
- 229940092253 ovalbumin Drugs 0.000 claims description 2
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 claims description 2
- COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N phenylalanine Chemical group OC(=O)C(N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 235000008729 phenylalanine Nutrition 0.000 claims description 2
- 235000014393 valine Nutrition 0.000 claims description 2
- 102400000368 Surface protein Human genes 0.000 claims 1
- 230000004075 alteration Effects 0.000 claims 1
- 230000002265 prevention Effects 0.000 claims 1
- 101100346932 Mus musculus Muc1 gene Proteins 0.000 abstract description 4
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 40
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 28
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 22
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 10
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 10
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 8
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 8
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 description 8
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 7
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 7
- 239000000047 product Substances 0.000 description 7
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 7
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 description 6
- 229920000136 polysorbate Polymers 0.000 description 6
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 6
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 5
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 5
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 5
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 5
- 230000004989 O-glycosylation Effects 0.000 description 5
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 5
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 5
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 5
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 5
- 150000001720 carbohydrates Chemical group 0.000 description 5
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 5
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 5
- PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N gold Chemical compound [Au] PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 239000010931 gold Substances 0.000 description 5
- 229910052737 gold Inorganic materials 0.000 description 5
- 125000000341 threoninyl group Chemical group [H]OC([H])(C([H])([H])[H])C([H])(N([H])[H])C(*)=O 0.000 description 5
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 5
- 101710132601 Capsid protein Proteins 0.000 description 4
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 4
- 108010008707 Mucin-1 Proteins 0.000 description 4
- 241001611408 Nebo Species 0.000 description 4
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N Sulfuric acid Chemical compound OS(O)(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 4
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 4
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 4
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 4
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 4
- MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N (2S)-2-Amino-3-hydroxypropansäure Chemical compound OC[C@H](N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N 0.000 description 3
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108700028146 Genetic Enhancer Elements Proteins 0.000 description 3
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 3
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 3
- 230000008859 change Effects 0.000 description 3
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 3
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 3
- 210000001151 cytotoxic T lymphocyte Anatomy 0.000 description 3
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 3
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 3
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 3
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 3
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 3
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 3
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 3
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 3
- 239000002502 liposome Substances 0.000 description 3
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 3
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 3
- 208000026310 Breast neoplasm Diseases 0.000 description 2
- 241000701022 Cytomegalovirus Species 0.000 description 2
- 101000934372 Homo sapiens Macrosialin Proteins 0.000 description 2
- 102100025136 Macrosialin Human genes 0.000 description 2
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 2
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 2
- UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M Sodium bicarbonate Chemical compound [Na+].OC([O-])=O UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 2
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 2
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 2
- 230000005875 antibody response Effects 0.000 description 2
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 2
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 2
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 2
- 239000013611 chromosomal DNA Substances 0.000 description 2
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 2
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 2
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 2
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 2
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 2
- 238000001943 fluorescence-activated cell sorting Methods 0.000 description 2
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 2
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 2
- 238000001415 gene therapy Methods 0.000 description 2
- 230000006801 homologous recombination Effects 0.000 description 2
- 238000002744 homologous recombination Methods 0.000 description 2
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 2
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 2
- 230000003278 mimic effect Effects 0.000 description 2
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 2
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 2
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 2
- 230000004044 response Effects 0.000 description 2
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 2
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 2
- ATHGHQPFGPMSJY-UHFFFAOYSA-N spermidine Chemical compound NCCCCNCCCN ATHGHQPFGPMSJY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 2
- 239000012128 staining reagent Substances 0.000 description 2
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 2
- 239000003656 tris buffered saline Substances 0.000 description 2
- 101100394745 Bacillus subtilis (strain 168) hepT gene Proteins 0.000 description 1
- 108020000946 Bacterial DNA Proteins 0.000 description 1
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 1
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L Calcium chloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Ca+2] UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 238000011238 DNA vaccination Methods 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 241000283073 Equus caballus Species 0.000 description 1
- 241000282326 Felis catus Species 0.000 description 1
- 238000012413 Fluorescence activated cell sorting analysis Methods 0.000 description 1
- 108010001498 Galectin 1 Proteins 0.000 description 1
- 102100021736 Galectin-1 Human genes 0.000 description 1
- 102100024637 Galectin-10 Human genes 0.000 description 1
- 101001011019 Gallus gallus Gallinacin-10 Proteins 0.000 description 1
- 101001011021 Gallus gallus Gallinacin-12 Proteins 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- 108090000288 Glycoproteins Proteins 0.000 description 1
- 102000003886 Glycoproteins Human genes 0.000 description 1
- 102100028085 Glycylpeptide N-tetradecanoyltransferase 1 Human genes 0.000 description 1
- 101000578329 Homo sapiens Glycylpeptide N-tetradecanoyltransferase 1 Proteins 0.000 description 1
- 101000740205 Homo sapiens Sal-like protein 1 Proteins 0.000 description 1
- XQFRJNBWHJMXHO-RRKCRQDMSA-N IDUR Chemical compound C1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1N1C(=O)NC(=O)C(I)=C1 XQFRJNBWHJMXHO-RRKCRQDMSA-N 0.000 description 1
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 1
- 108091092195 Intron Proteins 0.000 description 1
- ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N L-Proline Chemical compound OC(=O)[C@@H]1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N L-valine Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 1
- 101150114927 MUC1 gene Proteins 0.000 description 1
- 102000018697 Membrane Proteins Human genes 0.000 description 1
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 1
- 241001494479 Pecora Species 0.000 description 1
- 101100338762 Pedobacter heparinus (strain ATCC 13125 / DSM 2366 / CIP 104194 / JCM 7457 / NBRC 12017 / NCIMB 9290 / NRRL B-14731 / HIM 762-3) hepB gene Proteins 0.000 description 1
- 241000009328 Perro Species 0.000 description 1
- 101710182846 Polyhedrin Proteins 0.000 description 1
- 108010021757 Polynucleotide 5'-Hydroxyl-Kinase Proteins 0.000 description 1
- 102000008422 Polynucleotide 5'-hydroxyl-kinase Human genes 0.000 description 1
- ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N Proline Natural products OC(=O)C1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 1
- 101710185720 Putative ethidium bromide resistance protein Proteins 0.000 description 1
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 1
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 1
- 102100037204 Sal-like protein 1 Human genes 0.000 description 1
- 238000012300 Sequence Analysis Methods 0.000 description 1
- 101150052859 Slc9a1 gene Proteins 0.000 description 1
- 102220497176 Small vasohibin-binding protein_T47D_mutation Human genes 0.000 description 1
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 241000282898 Sus scrofa Species 0.000 description 1
- 229920006355 Tefzel Polymers 0.000 description 1
- 108091036066 Three prime untranslated region Proteins 0.000 description 1
- 206010046865 Vaccinia virus infection Diseases 0.000 description 1
- 108020005202 Viral DNA Proteins 0.000 description 1
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 1
- 230000002159 abnormal effect Effects 0.000 description 1
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 1
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 1
- 210000000612 antigen-presenting cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 1
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 1
- 239000012620 biological material Substances 0.000 description 1
- 210000001185 bone marrow Anatomy 0.000 description 1
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 1
- 239000001110 calcium chloride Substances 0.000 description 1
- 229910001628 calcium chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- 231100000504 carcinogenesis Toxicity 0.000 description 1
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 1
- 238000010366 cell biology technique Methods 0.000 description 1
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 1
- -1 cells Substances 0.000 description 1
- 230000007969 cellular immunity Effects 0.000 description 1
- 230000007248 cellular mechanism Effects 0.000 description 1
- 230000036755 cellular response Effects 0.000 description 1
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 229920001577 copolymer Polymers 0.000 description 1
- 210000005220 cytoplasmic tail Anatomy 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 239000008121 dextrose Substances 0.000 description 1
- 239000006185 dispersion Substances 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 239000012636 effector Substances 0.000 description 1
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 1
- 210000000981 epithelium Anatomy 0.000 description 1
- QHSJIZLJUFMIFP-UHFFFAOYSA-N ethene;1,1,2,2-tetrafluoroethene Chemical compound C=C.FC(F)=C(F)F QHSJIZLJUFMIFP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000010304 firing Methods 0.000 description 1
- 238000000684 flow cytometry Methods 0.000 description 1
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 1
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 1
- 238000001476 gene delivery Methods 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- 108060003552 hemocyanin Proteins 0.000 description 1
- 208000002672 hepatitis B Diseases 0.000 description 1
- 230000004727 humoral immunity Effects 0.000 description 1
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 1
- 210000004408 hybridoma Anatomy 0.000 description 1
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 1
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 1
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 1
- 229940072221 immunoglobulins Drugs 0.000 description 1
- 230000002055 immunohistochemical effect Effects 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 239000003999 initiator Substances 0.000 description 1
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 1
- 239000003049 inorganic solvent Substances 0.000 description 1
- 229910001867 inorganic solvent Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000007918 intramuscular administration Methods 0.000 description 1
- 238000010255 intramuscular injection Methods 0.000 description 1
- 239000007927 intramuscular injection Substances 0.000 description 1
- 229940065638 intron a Drugs 0.000 description 1
- 230000009191 jumping Effects 0.000 description 1
- 210000002510 keratinocyte Anatomy 0.000 description 1
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 1
- 210000001821 langerhans cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 description 1
- 230000003211 malignant effect Effects 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 1
- 238000000520 microinjection Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 238000001823 molecular biology technique Methods 0.000 description 1
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 1
- 230000010309 neoplastic transformation Effects 0.000 description 1
- 208000002154 non-small cell lung carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 1
- 239000003960 organic solvent Substances 0.000 description 1
- 229940023041 peptide vaccine Drugs 0.000 description 1
- 230000026731 phosphorylation Effects 0.000 description 1
- 238000006366 phosphorylation reaction Methods 0.000 description 1
- 229920000747 poly(lactic acid) Polymers 0.000 description 1
- 230000008488 polyadenylation Effects 0.000 description 1
- XJMOSONTPMZWPB-UHFFFAOYSA-M propidium iodide Chemical compound [I-].[I-].C12=CC(N)=CC=C2C2=CC=C(N)C=C2[N+](CCC[N+](C)(CC)CC)=C1C1=CC=CC=C1 XJMOSONTPMZWPB-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 230000002685 pulmonary effect Effects 0.000 description 1
- 230000005855 radiation Effects 0.000 description 1
- 238000010188 recombinant method Methods 0.000 description 1
- 230000022532 regulation of transcription, DNA-dependent Effects 0.000 description 1
- 230000000241 respiratory effect Effects 0.000 description 1
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 1
- 230000001177 retroviral effect Effects 0.000 description 1
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 1
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 1
- 210000002363 skeletal muscle cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000003491 skin Anatomy 0.000 description 1
- 229910000030 sodium bicarbonate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000017557 sodium bicarbonate Nutrition 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 229940063673 spermidine Drugs 0.000 description 1
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 1
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 1
- 125000001424 substituent group Chemical group 0.000 description 1
- 230000002459 sustained effect Effects 0.000 description 1
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 1
- RYYWUUFWQRZTIU-UHFFFAOYSA-K thiophosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=S RYYWUUFWQRZTIU-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- 230000014621 translational initiation Effects 0.000 description 1
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 1
- 238000011269 treatment regimen Methods 0.000 description 1
- 208000029729 tumor suppressor gene on chromosome 11 Diseases 0.000 description 1
- 238000002604 ultrasonography Methods 0.000 description 1
- 241000701161 unidentified adenovirus Species 0.000 description 1
- 208000007089 vaccinia Diseases 0.000 description 1
- 210000003462 vein Anatomy 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/0005—Vertebrate antigens
- A61K39/0011—Cancer antigens
- A61K39/001169—Tumor associated carbohydrates
- A61K39/00117—Mucins, e.g. MUC-1
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
- C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P5/00—Drugs for disorders of the endocrine system
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
- A61K2039/53—DNA (RNA) vaccination
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Public Health (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Mycology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Oncology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Zoology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Endocrinology (AREA)
- Diabetes (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Acyclic And Carbocyclic Compounds In Medicinal Compositions (AREA)
- Saccharide Compounds (AREA)
Description
Konstrukt pro vakcinaci nukleovými kyselinami a vakcina
Oblast techniky
Předkládaný vynález se týká konstruktu pro vakcinaci nukleovými kyselinami obsahujícího izolované polynukleotidy kódující polypeptidy, které jsou glykosylační varianty proteinu MUC1, vakciny s obsahem těchto konstruktů a použití konstruktů nebo prostředků pro vakcinaci savců.
Dosavadní stav techniky
Mucin MUC1 epiteliálních buněk (známý také jako episialin nebo polymorfní epiteliální mucin, PEM) je glykoprotein s velkou molekulovou hmotností exprimovaný na mnoha epiteliálních buňkách. Tento protein se skládá z cytoplasmatického konce, transmembránové domény a proměnlivého počtu tandemových opakování motivu 20 aminokyselin (zde nazývaný jako monomer VNTR, může být také znám pod názvem epitop VNTR nebo opakovaná sekvence (repeat) VNTR) obsahujícího vysoký podíl prolinových, serinových a threoninových zbytků. Počet opakování je variabilní v důsledku genetické mnohotvárnosti v místě MUC1, a nejčastěji je v rozmezí mezi 30 a 100 (Swallow a další, 1987, Nátuře 328: 82 - 84). V normálním epiteliu kanálků se protein MUC1 nalézá pouze na apikálním povrchu buněk, vystaven vnitřnímu prostoru kanálku (Graham a další, 1996, Cancer Immunol. Immunother. 42: 71 - 80; Barratt-Boyes a další, 1996, Cancer. Immunol. Immunother. 43: 142 - 151). Jedním z nejzajímavějších rysů molekuly MUC1 je výrazná O-vázaná glykosylace. Uvnitř každého monomeru VNTR MUC1 existuje pět Oglykosylačních míst. Podle systému číslování použitého na obr. 1 jde o Thr-6, Ser-7, Thr-11, Ser-17 a Thr-18.
V maligních karcinomech vznikajících neoplastickou transformací těchto epiteliálních buněk postihuje expresi MUC1 několik změn. Polarizovaná exprese proteinu se již nevyskytuje, a protein se nachází rozšířen na celém povrchu transformované buňky. Celkové množství MUC1 je rovněž zvýšeno, často desetinásobně nebo i více (Strous & Dekker, 1992, Crit. Rev. Biochem. Mol. Biol. 27: 57 - 92). Nejvýznamnější je, že se významně mění kvantita a kvalita O-vázaných uhlohydrátových řetězců. Je glykosylováno méně zbytků šeřinu a threoninu. Tyto uhlohydrátové řetězce, které se v takových buňkách nacházejí, jsou abnormálně zkrácené a vytvářejí uhlohydrátový antigen asociovaný s tumorem (tumour-associated carbohydrate antigen, STn) (Lloyd a další, 1996, J. Biol. Chem., 271: 33325 - 33334). V důsledku těchto glykosylačních změn se začnou být přístupné různé epitopy na peptidovém řetězci MUC1, které byly dříve stíněny uhlohydrátovými řetězci. Jeden z epitopů, které se tímto způsobem zpřístupní, je sekvence APDTR (Ala 8-Arg 12 na obr. 1) přítomná v každém monomeru VNTR s délkou 20 aminokyselin (Burchell a další, 1989, Int. J. Cancer 44: 691 - 696).
Je tedy zřejmé, že na základě těchto změn v proteinu MUC1 lze získat vakcinu, která může aktivovat imunitní systém proti formě MUC1 exprimované na tumorech, a která může být účinná proti tumorům epiteliálních buněk, a samozřejmě také proti typům buněk, ve kterých se MUC1 nachází, jako jsou T-buněčné lymfocyty. Jedním z hlavních efektorových mechanismů používaných imunitním systémem pro usmrcování buněk exprimujících abnormální proteiny je imunitní odpověď cytotoxických T-lymfocytů (CTL), a tato odpověď je žádoucí u vakciny pro léčení tumorů stejně jako odpověď protilátek. Dobrá vakcina bude aktivovat všechny složky imunitní odpovědi. Současné vakciny založené na uhlohydrátech a peptidech jako je Theratope nebo BLP25 (Biomira lne., Edmonton, Kanada) však preferenčně aktivují pouze jednu část imunitní odpovědi - humorální, popřípadě
- 3 • · • · buněčnou odpověď, takže by bylo vhodné získat lepší vakcinu s vyváženější odpovědí.
Vakciny na bázi nukleových kyselin poskytují proti konvenční vakcinaci proteiny řadu výhod tím, že jsou laciné a mohou být snadno vyráběny ve velkém množství. Uvádí se, že jsou schopny poskytnout silnou imunitní odpověď i při malých dávkách, a že mohou indukovat imunitní odpověď cytotoxických T-lymfocytů stejně jako odpověď protilátek. Existuje však technická překážka, která brání rozvoji účinných vakcin proti MUC1 na bázi nukleových kyselin.
Při vakcinaci nukleovou kyselinou se molekula nukleové kyseliny kódující zvolený antigen zavádí do normálních buněk hostitele. Jestliže se vakcina na bázi nukleové kyseliny kódující polypeptid MUC1 dodá přenosem genu prostřednictvím částic (particle-mediated gene transfer, US patent 5371015), nejčastějšími transfekovanými buňkami budou pravděpodobně keratinocyty nebo kožní Langerhansovy buňky. Podobně, jestliže se nukleová kyselina dodá intramuskulární injekcí, hlavními typy cílových buněk jsou buňky kosterního svalstva a buňky předkládající antigen odvozené z kostní dřeně. Každá z těchto buněk má fyziologickou rovnováhu glykosylačních enzymů, a tak bude glykosylovat genový produkt MUC1 kódovaný vakcinou takovým způsobem, aby napodobovala MUC1 v normálním epitelu, namísto odlišně glykosylované formy, která se nalézá v transformovaných buňkách. Téměř každá buňka, která je transfekována polynukleotidem kódujícím MUC1, bude glykosylovat genový produkt kódovaný touto vakcinou. Ačkoli je tedy možné pozorovat určité výsledky, vakcina nebude optimálně stimulovat imunitu proti tumorovým buňkám.
Předkládaný vynález tedy poskytuje konstrukty pro vakcinaci nukleovými kyselinami, které kódují polypeptid obsahující monomer VNTR nebo jeho opakování nebo fragmenty, které byly manipulovány tak, že kódovaná sekvence nemůže být úplně glykosylována • · · · ·
-4-*’ normálním buněčným mechanismem. Autoři vynálezu toho překvapivě dosáhli v jednom provedení vynálezu vytvořením nových aminokyselinových substitucí v kódovaném polypeptidu metodami genového inženýrství. Autoři vynálezu vytvořili konstrukty nukleové kyseliny pro vakcinaci, které obsahují polynukleotidy kódující polypeptidy, které si zachovávají konformaci epitopů MUC1, což je nezbytný požadavek pro trvalou imunogenicitu změněných polypeptidů, a které mají sníženou glykosylaci, čímž blíže napodobují formu MUC1 exprimovanou na tumorech.
Podstata vynálezu
Podle jednoho provedení předkládaného vynálezu se poskytuje konstrukt pro vakcinaci nukleovými kyselinami, který obsahuje izolovaný polynukleotid kódující polypeptid obsahující alespoň pět za sebou následujících aminokyselinových zbytků z monomeru VNTR proteinu MUC1 včetně jednoho nebo více glykosylačních míst, který se vyznačuje tím, že tento polypeptid obsahuje alespoň jednu mutaci aminokyseliny, která zabrání glykosylaci nebo změní glykosylaci na alespoň jednom z uvedených glykosylačních míst.
V jednom provedení se skládá polypeptid kódovaný konstruktem nukleové kyseliny pro vakcinaci z jedné kopie monomeru VNTR proteinu MUC1. V dalším provedení se polypeptid kódovaný konstruktem nukleové kyseliny pro vakcinaci skládá z fragmentu monomeru VNTR proteinu MUC1.
V dalším provedení vynálezu se poskytuje vakcina obsahující konstrukt nukleové kyseliny pro vakcinaci jak je zde definován, v kombinaci s farmaceuticky přijatelným nosičem.
V dalším provedení vynálezu se poskytuje konstrukt nukleové kyseliny pro vakcinaci nebo vakcina jak jsou zde definovány, pro • · · ···· · · · · ····· · · · · ·· · • »· ··· ······ · · ···· ·· « ··· g ·· ·· ·· ·· · · ···· výrobu farmaceutického prostředku pro použití při vakcinaci savce proti tumorům.
V dalším provedení vynálezu se poskytuje způsob vakcinace savce proti tumorům, který zahrnuje podávání konstruktu nukleové kyseliny pro vakcinaci nebo vakciny, jak jsou zde definovány.
Podrobný popis vynálezu
V popisu přihlášky a přiložených nárocích, pokud není uvedeno jinak, mají výrazy „zahrnovat“ a „obsahovat“ nebo jejich varianty inkluzivní význam, tj. použití těchto slov umožňuje zahrnutí celků nebo prvků, které nejsou specificky uvedeny.
Jak se zde uvádí, předkládaný vynález se týká konstruktů pro vakcinaci nukleovou kyselinou obsahujících izolované polynukleotidy, přičemž tyto konstrukty jsou použitelné při vakcinaci proti tumorům. V kontextu tohoto vynálezu má termín „izolovaný“ vyjádřit, že polynukleotid není ve svém nativním stavu, protože byl alespoň do určitého stupně vyčištěn nebo vyroben synteticky, například rekombinantními metodami nebo mechanickou syntézou. Termín „izolovaný“ proto zahrnuje možnost kombinaci polynukleotidů s jiným biologickým nebo nebiologickým materiálem, jako jsou buňky, suspenze buněk nebo buněčné fragmenty, proteiny, peptidy, expresní vektory, organická nebo anorganická rozpouštědla, nebo jiné materiály v případech, kdy je to vhodné, ale vylučuje situaci, kdy je polynukleotid ve stavu, ve kterém se nachází v přírodě.
Polypeptidy kódované izolovanými polynukleotidy obsaženými v konstruktech pro vakcinaci nukleovou kyselinou podle předkládaného vynálezu se nazývají v přihlášce a v nárocích „kódované polypeptidy“. Tyto kódované polypeptidy obsahují alespoň pět za sebou následujících aminokyselinových zbytků z monomeru VNTR glykoproteinu MUC1, přičemž jedna nebo více těchto • ·· · · ·· · • ···· · ·· · · · · • ·· · · · ······ · · ···· ·· · ··· θ ·· ·· «· ·· ······ aminokyselin je glykosylační místo, a na alespoň jednom z těchto glykosylačních míst bylo zabráněno glykosylaci nebo byla glykosylace změněna. Uvedené kódované polypeptidy obsahují s výhodou alespoň 10, například 13, 15, 16, 17, 18, nebo 19 aminokyselin z monomeru VNTR glykoproteinu MUC1. Zvláště výhodně obsahují tyto kódované polypeptidy alespoň 20 aminokyselin z monomeru VNTR MUC1. Tyto za sebou následující aminokyseliny mohou pocházet výlučně z jednoho monomeru VNTR, nebo se mohou rozprostírat přes více monomerů, například tři z uvedených za sebou následujících aminokyselin mohou být z N-konce jednoho monomeru VNTR a další dvě aminokyseliny mohou být z C-konce druhého monomeru VNTR.
Termín „alespoň pět za sebou následujících aminokyselin“ zahrnuje případ, kdy byla mutací aminokyselin změněna jedna nebo více uvedených aminokyselin ve srovnání se standardním typem. Tak například kódovaný polypeptid, který má sekvenci obsahující tři aminokyseliny ze sekvence standardního typu, potom obsahuje substituci aminokyseliny místo další aminokyseliny standardního typu, a potom následují tři aminokyseliny ze sekvence standardního typu, je pokládán za kódovaný polypeptid obsahující alespoň pět za sebou následujících aminokyselin z monomeru VNTR MUC1.
Vynález zahrnuje konstrukty pro vakcinaci nukleovými kyselinami, které obsahují izolované polynukleotidy kódující polypeptidy s jakoukoli permutací monomerů VNTR nebo fragmentů monomerů, které obsahují alespoň jedno glykosylační místo, a kde na alespoň jednom glykosylačním místě je zabráněno glykosylaci nebo je glykosylace změněna. V jednom provedení je izolovaný polynukleotid obsažený v konstruktech pro vakcinaci nukleovými kyselinami podle vynálezu takový, že se kódovaný polypeptid skládá z jedné až deseti kopií monomeru VNTR. V dalším provedení je izolovaný polynukleotid obsažený v konstruktech pro vakcinaci nukleovými kyselinami podle vynálezu takový, že se kódovaný polypeptid skládá z 10 nebo více kopií monomeru VNTR, například 20, 30, 50, 60, 75, 90 nebo 100 • · · ···· ···· • · · · · · · · · · · · • ·· · · · ······ · « ···· ·· · ··· • · · · · · nebo více kopií monomeru VNTR. V dalším provedení je izolovaný polynukleotid obsažený v konstruktech pro vakcinaci nukleovými kyselinami podle vynálezu takový, že se kódovaný polypeptid skládá z kombinace opakujících se sekvencí a fragmentů, například jednoho monomeru VNTR a jednoho fragmentu, jednoho až deseti opakování a jednoho až deseti fragmentů, deseti nebo více opakování a deseti nebo více fragmentů, deseti nebo více opakování a deseti nebo méně fragmentů nebo deseti nebo více fragmentů a deseti nebo méně opakování. V dalším provedení je izolovaný polynukleotid obsažený v konstruktech pro vakcinaci nukleovými kyselinami podle vynálezu takový, že se kódovaný polypeptid skládá z kombinace fragmentů například určitého počtu kopií jednoho fragmentu nebo určitého počtu různých fragmentů. V každém případě, pokud je v kódovaném polypeptidu přítomen více než jeden fragment, mohou být fragmenty stejné nebo různé.
Ve výhodném provedení se kódovaný polypeptid skládá z jediného monomeru VNTR. V dalším výhodném provedení se kódovaný polypeptid skládá z jediného fragmentu monomeru VNTR, přičemž zvláště výhodné je, jestliže tento fragment má sekvenci APDTRP (zbytky 8 - 13 na obr. 1), kde v tomto fragmentu může být mutováno glykosylační místo T.
Změny nebo zabránění glykosylaci se s výhodou dosáhne mutací aminokyselin tvořících glykosylační místa v kódovaných polypeptidech. Termín „mutace aminokyselin“, jak se používá v popisu a v nárocích znamená, že je jedna nebo více aminokyselin v kódovaných polypeptidech odlišných od sekvence monomeru VNTR MUC1 standardního typu tak jak je ukázána na obr. 1. Tato změna může být například delece, inzerce nebo substituce jedno nebo více aminokyselin.
Těchto mutací se dosahuje navržením sekvence izolovaného polynukleotidu obsaženého v konstruktu pro vakcinaci nukleovými ··· · · · · ···· • ···· · ·· · · · · • ·· · · · ······ · · ···· · · · · · ·
- ·· ·· ** ·· ......
kyselinami tak, že kódovaný peptid má aminokyselinové mutace na jednom nebo více glykosylačních místech. Jestliže je požadovaná aminokyselinová mutace substituce, změní se tři nukleotidy kódující tuto aminokyselinu v sekvenci standardního typu na nukleotidy kódující požadovanou aminokyselinu. Jestliže je požadovaná aminokyselinová mutace delece, tři nukleotidy kódující tuto aminokyselinu v sekvenci standardního typu se odstraní. Jestliže je požadovaná aminokyselinová mutace inzerce, tři nukleotidy kódující požadovanou aminokyselinu se vloží do nukleotidové sekvence standardního typu.
Odborník v oboru bude snadno schopen určit požadovanou sekvenci polynukleotidu použitím genetického kódu na požadovaný kódovaný polypeptid. Jakmile byla určena požadovaná sekvence, je možno vyrábět konstrukt pro vakcinaci nukleovými kyselinami obsahující izolovaný polynukleotid s požadovanou sekvencí tak, jak je popsáno v příkladech. Odborník v oboru bude snadno schopen podle potřeby upravit jakékoli parametry jako jsou primery a podmínky PCR. Odborníkovi v oboru bude také zřejmé, že v důsledku degenerace genetického kódu potenciálně existuje více než jedna izolovaná polynukleotidová sekvence, která může být použita pro produkci požadovaného kódovaného polypeptidu.
Konstrukt pro vakcinaci nukleovými kyselinami obsahuje s výhodou izolovaný polynukleotid zahrnující sekvenci
GC# CC# GA* G(T/U)# CG# CC# kde # může být nukleotid A, G, C nebo T/U, * může být nukleotid T/U nebo C.
Zápis T/U se používá pro označení, že sekvence může být DNA nebo RNA. Jestliže sekvence je DNA, báze v této poloze je T, a jestliže je sekvence RNA, báze v této poloze je U.
« ·
Konstrukt pro vakcinaci nukleovými kyselinami obsahuje alternativně nukleotidovou sekvenci zahrnující sekvenci
GC# CC# GA* AT/U@ CG# CC# kde # může být nukleotid A, G, C nebo T/U * může být nukleotid T/U nebo C @ může být nukleotid T/U, A nebo C
Zápis T/U má stejný význam jako výše.
Zvláště výhodné je, jestliže konstrukt pro vakcinaci nukleovými kyselinami obsahuje nukleotidovou sekvenci zahrnující sekvenci ukázanou v obr. 2 nebo sekvenci ukázanou v obr. 3.
Ve výhodném provedení je sekvence izolovaného polynukleotidu taková, že aminokyselinovou mutací je substituce. Ve výhodnějším provedení je sekvence izolovaného polynukleotidu taková, že mutací aminokyseliny je substituce serinového nebo threoninového zbytku jiným zbytkem postrádajícím hydroxylovou skupinu, která tvoří místo navázání O-glykosylace. S výhodou je sekvence izolovaného polynukleotidu taková, že serin nebo threonin je nahrazen valinem, isoleucinem, alaninem, asparaginem, fenylalaninem nebo tryptofanem. Výhodněji je sekvence izolovaného polynukleotidu taková, že threonin nebo serin je substituován valinem nebo isoleucinem. Ještě výhodněji je sekvence izolovaného polynukleotidu taková, že threonin je substituován valinem nebo isoleucinem. Ve zvláště výhodném provedení je sekvence izolovaného polynukleotidu taková, že kódovaný polypeptid má theronin v poloze 11 substituován valinem nebo isoleucinem, přičemž zvláště výhodné sekvence jsou ukázána na obr. 2 nebo 3 se zvýrazněnými aminokyselinovými substitucemi. S výhodou je sekvence izolovaného polynukleotidu taková, že kódované polypeptidy byly mutovány tak, že byla změněna glykosylace nebo bylo zabráněno glykosylaci na alespoň 60 %, například 70 %, • · • · · · ·
- 10 -** “ *’* ’* %, 80 %, 85 %, 90 % nebo 100 % glykosylačních míst přítomných v polypeptidech.
Kódované polypeptidy si s výhodou zachovávají imunologickou podobnost s formou MUC1 nalézanou na tumorech. Termín „imunologická podobnost“ má znamenat, že přes mutaci jedné nebo více aminokyselin zůstává konformace jednoho nebo více epitopů v kódovaném polypeptidu dostatečně nezměněná, takže protilátka rozpoznávající epitop v monomeru VNTR formy MUC1 exprimované na tumorech by také rozpoznala epitop v kódovaných polypeptidech. Termín „imunologická podobnost“ zahrnuje nejen situaci, kdy všechny protilátky rozpoznávající formu MUC1 exprimovanou na tumorech také rozpoznávají kódované polypeptidy, ale také jakoukoli situaci, kde alespoň jeden epitop zůstává dostatečně nezměněn pro rozpoznání kódovaných polypeptidů alespoň jednou protilátkou anti-MUC1. Zvláště výhodné je, jestliže protilátky vytvořené kódovanými polypeptidy mohou rozlišit mezi formou MUC1 exprimovanou na tumorových buňkách a formou MUC1 exprimovanou na normálních buňkách, například vazbou na první formu a neschopností vázat se na druhou formu.
Výhodné kódované polypeptidy jsou takové, které mohou být rozpoznány protilátkami anti-MUC1 ze skupiny SM3, ATR1, HMFG2 nebo HMFG1. Zvláště výhodné kódované polypeptidy jsou takové, které mohou být rozpoznány protilátkou anti-MUC1 SM3.
Konstrukty pro vakcinaci nukleovými kyselinami podle vynálezu mohou také obsahovat další izolovaný polynukleotid kódující heterologní polypeptid, s výhodou imunogenní polypeptid. Tento izolovaný polynukleotid je umístěn na konstruktu pro vakcinaci nukleovými kyselinami tak, že při expresi je heterologní polypeptid navázán na exprimovaný kódovaný polypeptid nebo je k němu fúzován. Izolovaný polynukleotid kódující heterologní polypeptid je • · • · • · · · • · · · · · ·· * · · * • ·· ··· ··«··· · · _ 1 ί*··* ··’ ··’ ··’ ’··’ ···· s výhodou navazující na izolovaný polynukleotid kódující kódované polypeptidy.
V jednom provedení mohou kódované heterologní polypeptidy působit jako nosiče pro směrování kódovaných polypeptidů, například se heterologní polypeptid může vázat na receptor na cílové buňce. V dalším provedení může heterologní polypeptid působit jako imunogen pro zesílení imunitní odpovědi vyvolané kódovanými polypeptidy. Mezi vhodné heterologní polypeptidy patří hemocyanin z mlže Diodora aspera, ovalbumin, povrchový protein viru hepatitidy B, jaderný protein viru hepatitidy B, tetanový toxin, glutathion S transferáza a holubí cytochrom C. Ve výhodném provedení je heterologním polypeptidem tetanový toxin nebo jaderný protein viru hepatitidy B. Nukleotidové sekvence kódující tyto polypeptidy jsou odborníkům v oboru snadno dostupné.
Konstrukt pro vakcinaci nukleovými kyselinami podle vynálezu bude navíc obsahovat vhodné iniciátory, promotory, zesilující sekvence a jiné prvky, jako jsou například polyadenylační signály, které mohou být nezbytné, a které jsou umístěny ve správné orientaci pro umožnění exprese proteinu v savčí buňce.
Promotorem může být eukaryotický promotor, například promotor CD68, Gal1, Gal10 nebo NMT1, prokaryotický promotor, například promotor Tac, Trc nebo Lac, nebo virový promotor, například promotor cytomegaloviru, promotor SV40, polyhedrinový promotor, promotor P10, nebo promotor LTR viru respiračního syncytia. Promotorem je s výhodou virový promotor. Zvláště výhodné je, jestliže je promotorem cytomegalovirový promotor brzké rané fáze.
Mezi prvky řídící transkripci mohou patřit zesilující sekvence, například 3’ nepřekládaná oblast povrchového antigenu hepatitidy B, zesilující sekvence CMV; introny, například intron CD68, nebo intron A CMV, nebo řídící oblasti, například 5’ nepřekládaná oblast CMV.
- 12 • ·
Kostra konstruktu pro vakcinaci nukleovými kyselinami může být RNA nebo DNA, například plasmidová DNA, virová DNA, bakteriální DNA, bakteriální umělá chromosomální DNA, kvasinková umělá chromosomální DNA a syntetická DNA. Je také možné, aby byl konstrukt pro vakcinaci nukleovými kyselinami umělá nukleová kyselina, například fosforthioátová RNA nebo DNA. Konstruktem je s výhodou DNA, a zvláště výhodně plasmidová DNA.
Izolovaný polynukleotid obsažený v konstruktu pro vakcinaci nukleovými kyselinami, který kóduje kódovaný polypeptid, může být RNA, například mRNA, nebo může být DNA, například genomická DNA, cDNA nebo syntetická DNA. Polynukleotidem se s výhodou DNA, zvláště výhodně cDNA. Polynukleotid je s výhodou operativně navázán na promotor na konstruktu pro vakcinaci nukleovými kyselinami tak, že jestliže se konstrukt vloží do savčí buňky, polynukleotid je exprimován za dosažení produkce kódovaného polypeptidu.
Konstrukty pro vakcinaci nukleovými kyselinami podle předkládaného vynálezu produkují při expresi v savčí buňce kódované polypeptidy. Touto savčí buňkou může být buňka in vitro, buněčná linie v laboratorní kultuře, například buňky HEK293T, CHO, HeLa nebo COS. V tomto případě mohou být exprimované polypeptidy sklízeny a jako takové použity pro vakcinaci. Výhodněji je savčí buňka in vivo, a konstrukt pro vakcinaci nukleovými kyselinami se podává přímo savci, například myši, psu, kočce, králíkovi, praseti, krávě, koni nebo kryse, nebo zvláště výhodně člověku.
Předkládaný vynález také zahrnuje vakciny (vakcinační prostředky), které obsahují terapeuticky účinné množství konstruktu pro vakcinaci nukleovými kyselinami podle vynálezu, s výhodou v kombinaci s farmaceuticky přijatelným nosičem, jako je fyziologický roztok s fosfátovým pufrem (PBS), fyziologický roztok, dextróza, voda, glycerol, ethanol nebo jejich kombinace. Vakcinační prostředek může alternativně obsahovat terapeuticky účinné množství konstruktu pro ·· · · · · t · * 0 ?·<«« * ·« · « » ·
- 13 vakcinaci nukleovými kyselinami podle vynálezu formulovaného na zlatých kuličkách. Prostředek může alternativně obsahovat konstrukty pro vakcinaci nukleovými kyselinami formulované s liposomy. Konstrukt pro vakcinaci nukleovými kyselinami bude takový, že při podání savci dojde u tohoto savce k expresi polypeptidu. Exprimovaný nebo podaný polypeptid bude potom vyvolávat imunitní odpověď, která s výhodou zahrnuje jak humorální, tak i buněčnou imunitu.
Předkládaný vynález také zahrnuje konstrukty pro vakcinaci nukleovými kyselinami, nebo vakciny pro použití při vakcinaci savce proti tumorům, a to jak preventivně, tak i terapeuticky. Savcem je s výhodou člověk. Vakcinace může být zaměřena proti tumoru jakéhokoli typu buněk, který exprimuje MUC1, a tumor tedy může reagovat na protilátky rozpoznávající monomer VNTR MUC1. V jednom provedení jsou tumory tumory T-lymfocytů. Vakcinace je s výhodou zaměřena proti tumorům epiteliálních buněk, výhodněji je vakcinace zaměřena proti rakovině mléčné žlázy nebo rakovině plic jiných než malých buněk.
Konstrukty pro vakcinaci nukleovými kyselinami a vakciny s jejich obsahem mohou být podávány řadou způsobů, například orálně, nazálně, pulmonárně, intramuskulárně, subkutánně nebo intradermálně. Mohou být podávány jednotlivci jako injekční prostředek, například jako sterilní vodná disperze, s výhodou isotonická. Zvláště výhodný způsob zahrnuje bombardování částicemi (které je také známé jako technologie „gene gun“) a popisuje se v US patentu No. 5371015). V tomto případě jsou inertní částice (jako jsou kuličky zlata) potaženy nukleovou kyselinou a urychleny na rychlosti dostatečné pro jejich penetraci povrchem příjemce (například kůží), například pomocí vystřelení za vysokého tlaku z vhodného zařízení. (Částice potažené konstrukty pro vakcinaci nukleovými kyselinami podle vynálezu spadají do rámce předkládaného vynálezu stejně jako zařízení obsahující takové částice.) Další způsoby podávání konstruktů pro vakcinaci nukleovými kyselinami nebo prostředků »« 4· *« ·· «V ►» «·, · » » « ··.« >«·«· » · , « « . · . * · · *···>« · » • * . · ’. · · · · _ 14 ;· ...... ·· ···· s obsahem uvedených konstruktů přímo příjemci zahrnují ultrazvuk, elektrickou stimulaci, elektroporaci a mikroočkování, které se popisuje v US 5,697,901.
Konstrukt pro vakcinaci nukleovými kyselinami podle předkládaného vynálezu může být také podáván pomocí specializovaných dodávacích vektorů používaných při genové terapii. Přístupy genové terapie jsou diskutovány například autory Verme a další, Nátuře 1997, 389: 239 - 242. Mohou být použity jak virové, tak i nevirové systémy. Mezi virové systémy patří retrovirové, lentivirové, adenovirové systémy, systémy založené na virech asociovaných s adenoviry, systémy založené na herpetických virech a virech vakcinie. Nevirové systémy zahrnují přímé podávání nukleových kyselin a systémy na bázi liposomů. Vektory mohou být například zapouzdřeny do liposomů nebo do částic z polylaktidglykolidových kopolymerů (PLG).
Konstrukt pro vakcinaci nukleovými kyselinami podle předkládaného vynálezu může být také podáván pomocí transformovaných buněk. Mezi tyto buňky patří buňky získané od pacienta. Konstrukt pro vakcinaci nukleovými kyselinami může být zaveden do těchto buněk in vitro a transformované buňky mohou být později do pacienta vráceny. Konstrukt pro vakcinaci nukleovými kyselinami podle vynálezu se může integrovat do nukleové kyseliny již přítomné v buňce homologními rekombinacemi. Transformovaná buňka může být v případěp potřeby pomnožena in vitro a v rámci předkládaného vynálezu mohou být použity jedna nebo více výsledných buněk. Buňky mohou být dodány do vhodného místa u pacienta známými chirurgickými nebo mikrochirurgickými technikami (například metodou štěpů, mikroinjekcemi atd.).
Množství konstruktů pro vakcinaci nukleovými kyselinami nebo prostředků s jejich obsahem, které se bude pacientovi podávat, se bude významně lišit v závislosti na druhu a hmotnosti imunizovaného
- 15 • · savce, povaze léčeného onemocnění nebo onemocnění, proti kterému se má získat ochrana, použitém vakcinačním protokolu (tj. jediné podávání proti opakovaným dávkách), způsobu podávání a účinnosti a dávce zvoleného adjuvantního prostředku. Na základě těchto proměnných bude odborník v humánním nebo veterinárním lékařství snadno schopen určit vhodné dávkování, které může být například 0,5 až 5 pg/kg konstruktu pro vakcinaci nukleovými kyselinami nebo prostředku s jeho obsahem. Dávka se bude lišit zvláště podle způsobu podávání. Například při intradermálním podávání na zlatých kuličkách bude celková dávka s výhodou 1 pg až 10 ng, zvláště výhodně bude celková dávka mezi 10 pg a 1 ng. Jestliže se bude konstrukt pro vakcinaci nukleovými kyselinami podávat přímo, celková dávka je obecně vyšší, například mezi 50 pg a jedním nebo více miligramy. Výše uvedené dávky jsou příklady použitelné v průměrném případě. Mohou samozřejmě existovat jednotlivé případy, kdy je oprávněno použití vyšších nebo nižších rozmezí dávek, které jsou také zahrnuty do rámce vynálezu.
U konstruktu pro vakcinaci nukleovými kyselinami obsahujícího polynukleotidovou sekvenci kódující antigenní peptid, nebo u prostředku obsahujícího konstrukt pro vakcinaci nukleovými kyselinami je možné jednorázové nebo opakované podávání, například mezi jeden až sedmkrát, s výhodou jeden až čtyřikrát, v intervalech přibližně 1 den až přibližně 18 měsíců, s výhodou jeden měsíc. Po tomto podání může případně následovat podávání v pravidelných intervalech 1 a 12 měsíců po dobu například až do konce života pacienta. Tento léčebný režim se však opět může značně lišit v závislosti na velikosti a druhu živočicha, množství konstruktu pro vakcinaci nukleovými kyselinami nebo prostředků, které se podávají, způsobu podávání, účinnosti a dávce případných použitých adjuvantních sloučenin a jiných faktorech, které by byly zřejmé příslušnému lékaři.
Předkládaný vynález bude nyní popsán na příkladech v následující experimentální části.
Přehled obrázků na výkresech
Vynález bude dále popsán na příkladech s odkazy na následující obrázky:
Obr. 1 ukazuje aminokyselinovou sekvenci standardního typu jednoho monomerního prvku MUC1 VNTR (označovaného zde jako VNTR).
Obr. 2 ukazuje sekvenci polypeptidu nazvaného Mut5l kódovaného výhodným izolovaným polynukleotidem obsaženým ve vakcinačním konstruktu podle vynálezu pro vakcinaci nukleovou kyselinou. Mutace v porovnání se sekvencí standardního typu jsou ukázány tučně. V obr. 2 je zahrnuta také reprezentativní nukleotidová sekvence kódující tento polypeptid.
Obr. 3 ukazuje sekvenci polypeptidu nazvaného Mut5V kódovaného výhodným izolovaným polynukleotidem obsaženým ve vakcinačním konstruktu podle vynálezu pro vakcinaci nukleovou kyselinou. Mutace v porovnání se sekvencí standardního typu jsou ukázány tučně. V obr. 3 je zahrnuta také reprezentativní nukleotidová sekvence kódující tento polypeptid.
Obr. 4. Tento obrázek ukazuje vazbu protilátek na polypeptidy MUC1 standardního typu a mutované polypeptidy ukázané v tabulce 1 v určitém rozmezí koncentrací protilátky. Tyto výsledky ukazují schopnost protilátky SM3 (která rozpoznává motiv APDTRP na zbytcích 8-13) rozpoznat neglykosylované polypeptidy. Polypeptidy Mut5P, MutSA a Mut5N ukázaly v podstatě stejné výsledky jako v případě Mut5W.
Obr. 5 ukazuje strategii klonování použitou pro produkci konstruktů vakciny na bázi nukleové kyseliny obsahující mutantní formy Muc 1.
- 17 • · • · · ·
Obr. 6. U myší imunizovaných konstrukty pro vakcinaci nukleovou kyselinou kódujícími mutantní formy MUC1 byla odebírána séra s protilátkami. Tento obrázek ukazuje vazbu těchto sér na standardní formu MUC1 ve formě syntetického peptidu. Je ukázáno, že konstrukty pro vakcinaci nukleovou kyselinou podle vynálezu mohou vyvolat tvorbu protilátek in vivo, které rozpoznávají nemutovanou formu MUC1.
Obr. 7 ukazuje analýzu FACS vazby sér s obsahem protilátek od myší imunizovaných konstrukty pro vakcinaci nukleovou kyselinou kódujícími mutantní formy MUC1 na lidské buňky karcinomu mléčné žlázy. Tyto výsledky ukazují, že konstrukty pro vakcinaci nukleovou kyselinou podle vynálezu mohou vyvolávat in vivo tvorbu protilátek, které rozpoznávají formu MUC1 exprimovanou na tumorech.
Obr. 8 ukazuje sekvenci N-koncové části pVAC1-stc, tak jak je popsána v příkladu 3.
Obr. 9 ukazuje oligonukleotidy použité pro konstrukci MUT4 mutantních plasmidů MUC1, jak je popsáno v příkladu 3. Všechny sekvence se uvádějí od 5’ do 3’. Podtržení ukazuje restrikční místa, kurzívou jsou ukázány sekvence použité jako krátké primery pro PCR. Malá písmena ukazují odchylky od sekvence standardního typu nezbytné pro kódování požadovaných mutací. Názvy ‘A Top’, ‘A Bottom’ atd. se týkají strategie ukázané v obr. 5.
Obr. 10 ukazuje oligonukleotidy použité pro konstrukci MUT5N mutantních plasmidů MUC1, jak je popsáno v příkladu 3. Všechny sekvence se uvádějí od 5’ do 3’. Podtržení ukazuje restrikční místa, kurzívou jsou ukázány sekvence použité jako krátké primery pro PCR. Malá písmena ukazují odchylky od sekvence standardního typu nezbytné pro kódování požadovaných mutací. Názvy ‘A Top’, ‘A Bottom’ atd. se týkají strategie ukázané v obr. 5.
Příklady provedení vynálezu
V následujících příkladech vynálezu se využívá různých široce známých a používaných technik molekulární a buněčné biologie. Praktické podrobnosti těchto technik je možno nalézt v řadě učebnic včetně Sambrook a další, 1989, Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Press.
Zbytky v rámci VNTR MUC1 se číslují podle schématu uvedeného v obr. 1.
io Příklad 1
Schopnost vázat protilátky variant MUC1 postrádajících O-glykosylační místa
Byly navrženy syntetické peptidy obsahující mutace v glykosylačních místech. Zvláštní pozornost byla soustředěna na substituenty na zbytku threoninu v této sekvenci (T11). Tabulka 1 dále ukazuje peptidy, které byly navrženy, a jejich mutovaná glykosylační místa. Peptidy obsahující dvě identické kopie navržené sekvence VNTR byly syntetizovány ve firmě Genemed Synthesis lne. (San Francisco, CA). Tyto peptidy byly potom prohledávány na schopnost vázat se na větší počet monoklonálních protilátek anti-MUC1 metodou ELISA.
Tabulka 1
| Peptid | Sekvence | Mutovaná glykosylační místa |
| WT | Ac-(PAHGVTSAPDTRPAPGSTAP)2-NH2 | žádné |
| Mut4 | Ac-(PAHGWAAPDTRPAPGAVAP)2-NH2 | T6, S7, S17, T18 |
| Mut5A | Ac-(PAHGWAAPDARPAPGAVAP)2-NH2 | T6, S7, T11, S17, T18 |
| Mut5l | Ac-(PAHGWAAPDIRPAPGAVAP)2-NH2 | T6, S7, T11, S17, T18 |
| Mut5N | Ac-(PAHGWAAPDNRPAPGAVAP)2-NH2 | T6, S7, T11, S17, T18 |
| Mut5P | Ac-(PAHGWAAPDPRPAPGAVAP)2-NH2 | T6, S7, T11, S17, T18 |
| Mut5V | Ac-(PAHGWAAPDVRPAPGAVAP)2-NH2 | T6, S7, T11, S17, T18 |
| Mut5W | Ac-(PAHGWAAPDWRPAPGAVAP)2-NH2 | T6, S7, T11, S17, T18 |
Peptidy byly připraveny ve formě vodných roztoků v 50 mM pufru s hydrogenuhličitanem sodným při pH 9,6 a nanášeny na desky Nunc
Maxisorp při 4 °C přes noc v rozmezí koncentrací mezi 50 pg/ml a 25 ng/ml. Po důkladném promytí pufrem TBS-Tween (fyziologický roztok s pufrem tris, pH 7,4, s obsahem 0,05% Tween20) byly destičky blokovány blokovacím roztokem (3% hmotn./obj. bovinní sérový albumin v pufru TBS-Tween) po dobu 2 hod při teplotě laboratoře. io Protilátky anti-MUC1 HMFG1 (Novocastra, Newcastle, UK), HMFG2 (Novocastra), SM3 (Girling a další, 1989, Int. J. Cancer 43: 1072 1076) a ATR1 (Bynum a další, 1995, Hybridoma 14: 587 - 591) byly naředěny v blokovacím roztoku, přidány na destičku a inkubovány při laboratorní teplotě 1 hod. Po promytí byla navázaná protilátka označena inkubací s protilátkou proti myšímu IgG konjugovanou s HRP (P260, Dako, Dánsko) při ředění 1/2000 v blokovacím pufru. Destička byla znovu promyta a navázaný konjugát byl detekován použitím barevných činidel Fast OPD (Sigma, Poole, UK). Reakce byla zastavena přidáním 3M kyseliny sírové a produkt OPD byl kvantifikován měřením adsorbnce při 490 nm.
- 20 • · • · · ·
Výsledky tohoto experimentu jsou ukázány v tabulce 2. Signál ELISA pro každou protilátku a kombinaci peptidu se hodnotí semikvantitativní stupnicí, kde +++ označují silnou vazbu, ++ označují střední vazbu, + označuje slabou vazbu a - znamená nevýznamnou vazbu.
Tabulka 2
| Peptid | Protilátka SM3 | Protilátka HMFG1 | Protilátka HMFG2 | Protilátka ATR1 |
| Standardní typ | +++ | +++ | +++ | +++ |
| Mut4 | +++ | ++ | +++ | +++ |
| Mut5A | - | ++ | - | +++ |
| Mut5l | +++ | ++ | +++ | ++ |
| Mut5N | - | - | - | +++ |
| Mut5P | - | + | - | + |
| Mut5V | +++ | - | +++ | +++ |
| Mut5W | - | - | - | ++ |
io Tyto údaje ukazují, že je možné změnit všechna O-glykosylační místa v monomeru VNTR MUC1 takovým způsobem, aby se zabránilo glykosylaci a nedošlo k narušení celkové struktury antigenů, čehož důkazem je zachování vazby řady protilátek anti-MUC1. Zvláště překvapující a užitečné zjištění je, že verze Mut5l a Mut5V monomeru
VNTR si zachovávají vazbu pro protilátku SM3. Při použití při imunohistochemických studií klinických vzorků vykazuje SM3 silné selektivní barvení pro MUC1 exprimovaný na tumorových buňkách ve srovnání s MUC1 exprimovaným na okolní normální tkáni (Girling a další, 1989). Tato zjištění jasně ukazují, že je možné odvodit varianty
VNTR, které si zachovávají podobnou konformaci jako epitopy
vytvořené tumorem z MUC1, což je pro vakcinační imunogen vysoce žádoucí vlastnost.
Příklad 2
Vazebná křivka protilátky pro mutantní polypeptidy
Při tomto experimentu byly opět použity polypeptidy popsané v tabulce 1 výše. Metodologie byla v podstatě podobná jako v příkladu 1 s tím rozdílem, že peptidy byly potaženy na destičku ELISA při pevné koncentraci 3 pg/ml a byly použity rozdílné koncentrace SM3. Výsledky jsou ukázány na obr. 4. Mut5P, Mut5A a Mut5N mají v podstatě stejné vlastnosti z hlediska vazby protilátky jako vlastnosti ukázané pro Mut5W.
Údaje v obr. 4 nejen potvrzují výše uvedené údaje, ale také ukazují, že mutace Thr-11 na lle a Val v Mut 5I a Mut5V pouze v malé míře omezuje afinitu protilátky SM3 pro peptid, což ukazuje, že neglykosylovatelné mutanty mohou velmi úzce napodobovat afinitu přirozené sekvence.
Příklad 3
Vakcinace nukleovymi kyselinami mutantami MUC1
Příprava plasmidu
Tabulka 3: Použité primery
| Název | Sekvence 5’ - 3’ |
| SSF | ATCCTACGGACCGTACAGTTACTCAGCACACACAGCACCTCAC |
| SSR | CCGCTCGAGCGCCGGCGATCTTGGACCTGGGAGTGGACACCTG |
| FrCF | ATCCTACGCCGGCGGGACCCGGACCTATGAAAAACTTAGACTGTT GGGTCGACAACGAAGAAGAC |
| FrCR | GGGCTCGAGTTAGTCGTTGGTCCAACCTTCATCGGTCGG |
| HBV1F | GATGTGGTCGACGACATTGACCCTTATAAAGAATTTGGAGC |
| HBV1R | GTAGAGCTCGAGCTAACATTGAGATTCCCGAGATTGAGATCTTCT GC |
| FrCS1 | GGCTGCGCGTTCCGAAAGTTTCTG |
| FrCS2 | CCGTGAGGACAACAACATCACTCT |
| FrCS3 | CTACTACCGACGTCTGTACAACGG |
| FrCS4 | GTTTCTTCATAGAGCTGATGATGG |
| FrCS5 | GAAGATACGGAACTTGTCGATGG |
| FrCS6 | GTAAGAAACGTACAGTTTGATGAAG |
| MUT4F | GATTGTGCTAGCCCAGCCCACGGAGTTGTTGCTGCC |
| MUT4R1 | TCGCGTATCTGGCGCTGCGACGACACCATGTGCTGGAGGGGCCAC TGCTCC |
| MUT4R2 | GATTGTGCTAGCAGGTGCTACGGCGCCGGGAGCCGGTCGCGTATC TGGCGCTGC |
| MUT5NF | GATTGTGCTAGCCCGGCGCATGGTGTCGTC |
| MUT5NR | GATTGTGCTAGCAGGGGCCACTGCTCC |
Konstrukce plasmidu pVACIstc
Plasmid pVAC1 (Thomsen a další, Immunology 95: S1, OP106, 1998) je eukaryotický expresní vektor optimalizovaný pro vakcinaci
DNA. Obsahuje CMV promotor operativně navázaný na vícečetné klonovací místo, do kterého mohou být umístěny inzerty kódující antigeny. Inzert obsahující Kozákovu sekvenci signálu zahájení translace, savčí sekreční signál a klonovací místa, byl připraven pomocí PCR s použitím plasmidu pMNM1 (Ellis a další, J. Immunology io 156: 2700 - 2709, 1996) jako templátu a SSF a SSR (tabulka 3) jako primerů. Fragment PCR byl štěpen Rsr II a Xhol za vytvoření inzertu o délce 120 bp, který byl klonován do míst Rsr II a Xho I plasmidu pVAC1 za vytvoření plasmidu pVac-1ss2. Sekvence DNA byla ověřena
použitím amplifikace PCR primerů jako sekvenačních primerů. Druhý krok byl zavedení fragmentu C tetanového toxinu (FrC), ve správném čtecím rámci, genu fúzovaného v místě SgrA I kódovaného primerem SSR, což umožnilo přidání antigenních epitopů do tohoto místa ve správném čtecím rámci. Toho bylo dosaženo amplifikací PCR genu FrC z plasmidu plC9Tet15 (Clare a další, Methods in Molecular Biology 103: 193 - 208, 1998) s použitím primerů značených DNA kódujících peptidové raménko a restrikční místa pro enzymy SgrA I a Xhol (FrCF a FrCR). Fragment PCR štěpený SgrA l/Xho I o velikosti 1,3 kb byl klonován do míst SgrA I a Xho I plasmidu pVac-1ss2 za vytvoření plasmidu pVac-1stc. Sekvence DNA byla potvrzena fluorescenčním sekvenováním s použitím amplifikačních primerů PCR a sekvencí odvozených od vnitřního FrC FrCS1 až FrCS6 (tabulka 3). Sekvence DNA a aminokyselinová sekvence na N-konci fúzního proteinu FrC zahrnující místa fúze epitopu je ukázána na obr. 8.
Konstrukce plasmidů pVAC1ss2 MUC-1 2TR fragment C
Byly navrženy sady syntetických oligonukleotidů, které budou po teplotní hybridizaci a následném klonování do plasmidu pVac-1stc schopny kódovat tandemové oblasti pěti kopií epitopu VNTR MUC1 (PAHGVTSAPDTRPAPGSTAP). Byly navrženy dvě varianty: obě byly mutantní verze, ve kterých byly čtyři z pěti threoninových a serinových zbytků podléhající glykosylaci v každé kopii epitopu nahrazeny nemodifikovatelnými aminokyselinami: PAHGVVAAPDTRPAPGAVAP, čtyři mutace, (MUT4) a PAHGVVAAPDNRPAPGAVAP, pět mutací, (MUT5N). Ve všech případech musely být sekvence MUC1 exprimovány jako součást sekrenovaného fúzního proteinu FrC. Tyto oligonukleotidy jsou uvedeny na obr. 9 a 10 (místa restrikčních enzymů SgrA 1 a Sal1 jsou podtržená, malá písmena označují mutace odlišné od sekvence standardního typu). Použitá strategie (po působení T4 polynukleotidkinázy pro fosforylaci 5’-konců • · • · • · » · • · · · · · «· · * « · • *· · · · *·»«·· · · ···· ·· · ··«.
_ 24 - ·· ·· ·· ·· ......
oligonukleotidů) pro získání tandemových opakování je ukázána na obr. 5. Tato strategie byla použita pro vytvoření plasmidu obsahujícího dvě tandemové oblasti VNTR Muc-1 MUT5N fúzované ve správném čtecím rámci do FrC (pVAC-1stcMUC-1MUT5N), vytvořené homologní rekombinací a delecí ze sekvence obsahující pětinásobné opakování. Pro vytvoření podobného plasmidu obsahujícího VNTR MUT4 byla použita modifikace strategie popsané v obr. 5, při které po kroku ligace byla provedena amplifikace oligonukleotidů pomocí PCR. Jako primery byly použity sekvence DNA naznačené na obr. 9 a 10 kurzívou za podmínek PCR 25 cyklů 94 °C 45 s, 69 - 75 °C 45 s a 72 °C 1 min. Produkty reakce PCR byly potom zpracovány jak je ukázána v obr. 5, ale pouze největší čistý produkt (obecně o velikosti přibližně 150 200 bp) byl čištěn na gelu a klonován. Použitím tohoto přístupu byl vytvořen plasmid obsahující jedno a půl opakování Muc-1 MUT4 (pVAC-1stcMUC-1 MUT4), VNTR fúzovaný ve správném čtecím rámci do FrC, získaný metodou PCR-mediated strand jumping a delecí ze sekvence s pětinásobným opakováním.
Alternativní způsob pro vytvoření popsaných sekvencí by byla přímá syntéza oligonukleotidů obsahujících menší počet kopií opakování VNTR s použitím podobné strategie štěpení a klonování jako bylo popsáno výše.
Konstrukce plasmidu pVAC1ss2 HepB Core
Plasmid pPA1 obsahuje gen pro antigen jádra HBV (sérotyp ADW) s jedinečným místem Nhel v oblasti smyčky E1 (Chambers a další, J. Virol. 70: 4045 - 4052, 1996). Toto klonovací místo umožní vložení malého fragmentu DNA kódujícího klíčový epitop z cizího proteinu. Smyčka E1 proteinu je exponována na povrchu exprimovaného antigenu jádra. Inzert jádra HBV získaný metodou genového inženýrství byl amplifikován PCR použitím primerů HBV1 F a HBV1R (tabulka 3) a klonován do plasmidu pCR2.1 (Invitrogen) • · • *· ···· ··«· ·«··· · « · « · « · • » · ··« · ····· · · _ 25.
metodou překrytí TA za vytvoření plastmidu pCR2.1-HepBE1. Tento konstrukt byl před použitím sekvenován.
PCR byla potom použita pro amplifikaci fragmentů kódujících dvě tandemová opakování monomeru MUC1 VNTR z plasmidů pVAC1stcMUC-1MUT4 a pVAC1stcMUC-1 MUT5N. Inzert obsahující dvě tandemová opakování MUT5N byl připraven PCR použitím pVAC1stcMUC-1MUT5N jako templátu a primerů MUT5NF a MUT5NR (tabulka 3).
Plasmid pVAC-1stcMUC-1MUT4 obsahoval pouze jedno úplné tandemové opakování monomeru VNTR MUC1. Tento plasmid byl použit jako templát při dvoustupňové PCR s použitím běžného dopředného (forward, 5’->3’) primeru (MUT4F) a dvou odlišných reverzních primerů. Při první reakci přidá reverzní primer (MUT4R1) část další sekvence nezbytnou pro vytvoření druhého úplného opakování verze MUT4 sekvence MUC1 (tj. polovinu tandemového opakování) k existujícímu tandemového opakování. Výsledný produkt PCR byl potom použit jako templát pro druhý cyklus PCR s použitím druhého reverzního primeru (MUT4R2) pro přidání zbytků nezbytných pro kompletaci opakování spolu s požadovaným klonovacím místem Nhel.
Produkty PCR MUT4 nebo MUT5 byly štěpeny Nhel a klonovány do vektoru pCR2.1 HepBEI štěpeného Nhel. Výsledné klony byly orientované a sekvence byla ověřena fluorescenčním dideoxysekvenováním. Úplná oblast kazety HepB core + MUC-1 TR byla potom vyříznuta pomocí Sall a Xhol a klonována do pVAC1ss2 štěpeného Xhol. Sekvence konečných konstruktů byly všechny ověřeny úplnou analýzou sekvence za vytvoření pVAC1 .ss2.MUT4.MUC1 .HepB (kóduje dvě kopie varianty MUT4 monomeru VNTR MUC1 ve smyčce E1 jaderného proteinu HBV); a pVAC1 .ss2.MUT5N.MUC1 HepB (kóduje dvě kopie varianty MUT5N monomeru VNTR MUC1 ve smyčce E1 jaderného proteinu HBV).
• *
- 26 • · • · · · · ·
Vakcinace DNA mutantními konstrukty MUC1
Plasmidová DNA byla vysrážena na zlaté kuličky o průměru 2 pm použitím chloridu vápenatého a spermidinu. Kuličky s nanesenou DNA byly potaženy na trubičku z materiálu Tefzel jak je popsáno v Eisenbraum a další, DNA Cell Biology 12: 791 - 797, 1993; Pertmer a další, J. Virol. 70: 6119 - 6125, 1996. Bombardování částicemi bylo provedeno použitím systému Accell gene delivery systém (PCT WO 95/19799). Pro každý plasmid bylo imunizováno pět samic myší C56BI/6 trojnásobným podáním plasmidu ve dnech 0, 21 a 42. Každé podání se skládalo ze dvou bombardování částicemi DNA/zlato za poskytnutí celkové dávky přibližně 2,5 pg plasmidu.
Vzorky séra byly získány od zvířat odběrem z žíly ve dnech -1, 20, 41 a 55, a byly testovány na přítomnost protilátek anti-MUC1. Metoda ELISA byla provedena s použitím destiček Nunc Maxisorp potažených přes noc při 4 °C 3 pg/ml sekvence standardního typu MUC1 (40 mer odpovídající dvěma tandemovým opakováním). Po promytí pufrem TBS-Tween (fyziologický roztok s pufrem tris, pH 7,4 s obsahem 0,05 % Tween 20) byly destičky blokovány 3% BSA v pufru TBS-Tween 2 hod při teplotě laboratoře. Všechna séra byla inkubována při ředění 1 : 100 1 hod při laboratorní teplotě v pufru TBS-Tween. Vazba protilátek byla detekována použitím králičích protilátek proti myším imunoglobulinům konjugovaných s HRP (Dako, Dánsko) při ředění 1 : 2000 v pufru TBS-Tween. Destičky byly znovu promyty a navázaný konjugát byl detekován použitím barevných činidel Fast OPD (Sigma, Pool, UK). Reakce byla zastavena přidáním 3M kyseliny sírové a produkt OPD byl kvantifikován měřením absorbance při 490 nm.
Výsledky této analýzy jsou ukázány v obr. 6. Ukazují, že glykosylačně mutované sekvence podle předkládaného vynálezu
- 27 »949 mohou být použity jako vakciny pro vyvolání imunitních odpovědí schopných rozpoznávat sekvenci MUC1 standardního typu.
Aby bylo možno ukázat, že protilátky vytvořené těmito vakcinami jsou schopné rozpoznat tumorové buňky, byly použity vzorky antisér z těchto myší pro označení různých tumorových buněčných linií, a značení bylo zviditelněno průtokovou cytometrií.
Buňky (T67-D, MCF-7, B16F0 a B16FOMUC1; 1 x 106) byly promyty v pufru PBS doplněném 5% FCS a inkubované při 4 °C 15 min s myšími séry v ředění 1 : 100. Po promytí byly buňky inkubovány s druhou protilátkou (ovčí protilátka proti myšímu IgG, Dako, Dánsko, při ředění 1 : 10) za stejných podmínek. Kontrolní buňky byly inkubovány s pufrem FACS namísto protilátky prvního stupně před barvením činidlem druhého stupně. Analýza FACS byla provedena na přístroji FACScan (Becton Dikinson). Současně bylo měřeno 1000 buněk na vzorek metodami FSC (forward angle light scatter) jako SSC (integreated light scatter) stejně jako zelené (FL1) a červené (FL3) fluorescence (vyjádřené jako logaritmus integrovaného fluorescenčního záření). Záznamy byly prováděny pouze v buňkách negativních na propidiumjodid (živých) z červené fluorescence s vyloučením agregátů, jejichž FCS byly mimo rozsah. Data byla vyjádřena jako histogramy vynesené jako počty buněk (osa Y) proti intenzitě fluorescence (osa X) pro různé typy myších sér navázané na povrch tumorových buněk.
Výsledky je možno vidět na obr. 7. Tento obrázek ukazuje, že sérum myší imunizovaných konstrukty MUC1 s mutovanou glykosylací obsahuje protilátku IgG anti-MUC1 schopnou vazby jak k lidským, tak i myším tumorovým buňkám exprimujícím nativní MUC1 buněčného povrchu. T47D je lidská buněčná linie tumoru mléčné žlázy. B16F0 je rodičovská buněčná linie B16, a tyto buňky neexprimující MUC1 nejsou označeny. Buňky B16-muc1 (B16F0 transfekované MUC1) jsou však označeny.
* * ·» * · * • * * · « <·*
- 28 *« · a · ·
Legenda k obr. 7:
Sec only = kontrola pouze s druhou protilátkou pro zjištění úrovní pozadí fluorescence.
Non imm = kontrolní séra z neimunizovaných zvířat.
hepB cont = kontrolní séra ze zvířat imunizovaných prázdným vektorem (žádná MUC1 DNA).
hepB2TR mut4 a hepB2TR mut5 jsou séra ze zvířat imunizovaných těmito mutantními DNA MUC1.
io Tyto údaje potvrzují použitelnost této varianty sekvencí VNTR při vakcinaci nukleovými kyselinami.
Claims (22)
- PATENTOVÉ NÁROKY1. Konstrukt pro vakcinaci nukleovými kyselinami obsahující5 izolovaný polynukleotid, který kóduje polypeptid obsahující alespoň pět za sebou následujících aminokyselinových zbytků z monomeru VNTR MUC1, kde jedna nebo více z těchto aminokyselin je glykosylační místo, přičemž jestliže je tento izolovaný polynukleotid exprimován v savčí buňce, je změněna io glykosylace výsledného polypeptidu nebo je zabráněno glykosylaci výsledného polypeptidu na alespoň jednom z uvedených glykosylačních míst.
- 2. Konstrukt pro vakcinaci nukleovými kyselinami podle nároku 1,15 obsahující izolovaný polynukleotid, který kóduje polypeptid obsahující fragment jednoho monomeru VNTR MUC1.
- 3. Konstrukt pro vakcinaci nukleovými kyselinami podle nároku 1, obsahující izolovaný polynukleotid, který kóduje polypeptid20 obsahující jednu kopii monomeru VNTR MUC1.
- 4. Konstrukt pro vakcinaci nukleovými kyselinami podle některého z předcházejících nároků, ve kterém byla dále změněna sekvence uvedeného izolovaného polynukleotidu za vzniku25 alespoň jedné aminokyselinové mutace ve výsledném polypeptidu, přičemž tato mutace vede k uvedené změně nebo zabránění glykosylaci.• *- 30 5. Konstrukt pro vakcinaci nukleovými kyselinami podle nároku 5, kde uvedenou mutací je substituce aminokyseliny.6. Konstrukt pro vakcinaci nukleovými kyselinami podle některého
- 5 z předcházejících nároků, jímž kódovaný polypeptid, jestliže je exprimován, může dále vázat protilátky SM3, ATR1, HMFG2 nebo HMFG1.
- 7. Konstrukt pro vakcinaci nukleovými kyselinami podle některého io z předcházejících nároků, jímž kódovaný polypeptid, jestliže je exprimován, má zamezenou nebo změněnou glykosylaci na alespoň 60 % glykosylačních míst přítomných v kódovaném polypeptidu.15
- 8. Konstrukt pro vakcinaci nukleovými kyselinami podle nároku 7, jímž kódovaný polypeptid, jestliže je exprimován, má zamezenou nebo změněnou glykosylaci na alespoň 80 % přítomných glykosylačních míst.20
- 9. Konstrukt pro vakcinaci nukleovými kyselinami podle nároku 8, jímž kódovaný polypeptid, jestliže je exprimován, má zamezenou nebo změněnou glykosylaci na všech přítomných glykosylačních místech.25
- 10. Konstrukt pro vakcinaci nukleovými kyselinami podle některého z nároků 7 až 9, jímž kódovaný polypeptid, jestliže je exprimován, má alespoň jeden threonin nebo serin substituovaný valinem, isoleucinem, alaninem, asparaginem, fenylalaninem nebo tryptofanem.- 31 • · · ·
- 11. Konstrukt pro vakcinaci nukleovými kyselinami, který obsahuje sekvenciGC# CC# GA* GT/U# CG# CC#5 kde # může být nukleotid A, G, C nebo T/U, * může být nukleotid T/U nebo C.
- 12. Konstrukt pro vakcinaci nukleovými kyselinami podle nároku 11, který obsahuje sekvenci ukázanou na obr. 3.
- 13. Konstrukt pro vakcinaci nukleovými kyselinami obsahující sekvenciGC# CC# GA* AT/U@ CG# CC# kde # může být nukleotid A, G, C nebo T/U,15 * může být nukleotid T/U nebo C, @ může být nukleotid T/U, A nebo C.
- 14. Konstrukt pro vakcinaci nukleovými kyselinami podle nároku 13, který obsahuje sekvenci ukázanou na obr. 2.
- 15. Konstrukt pro vakcinaci nukleovými kyselinami podle některého z předcházejících nároků, který dále obsahuje polynukleotid kódující heterologní polypeptid.25
- 16. Konstrukt pro vakcinaci nukleovými kyselinami podle nároku15, kde heterologní polypeptid je tetanový toxin, jaderný protein viru hepatitidy B, povrchový protein viru hepatitidy B, • · • ·- 32 ovalbumin, glutathion S transferáza, haemocyanin Diodora aspera, nebo holubí cytochrom C.
- 17. Vakcina obsahující konstrukt pro vakcinaci nukleovými 5 kyselinami podle některého z předcházejících nároků v kombinaci s farmaceuticky přijatelným nosičem.
- 18. Konstrukt pro vakcinaci nukleovými kyselinami podle některého z nároků 1 až 16 nebo vakcina podle nároku 17 pro použití při io vakcinaci savce proti tumorům.
- 19. Použití konstruktu pro vakcinaci nukleovými kyselinami podle některého z nároků 1 až 16 nebo vakciny podle nároku 17 při výrobě farmaceutického prostředku pro vakcinaci savce proti15 tumorům.
- 20. Použití podle nároku 18 nebo 19, kde konstrukt nebo vakcina se podává použitím technologie gene gun.20
- 21. Použití podle nároku 18, 19 nebo 20, kde tumory jsou tumory epiteliálních buněk.
- 22. Použití podle nároku 21, kde tumory jsou tumory mléčné žlázy.
- 25 23. Způsob vakcinace savce proti tumorům, který zahrnuje podávání konstruktu pro vakcinaci nukleovými kyselinami podle některého z nároků 1 až 16, nebo vakciny podle nároku 17 uvedenému savci.
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| GBGB9930359.6A GB9930359D0 (en) | 1999-12-22 | 1999-12-22 | Novel polypeptides |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CZ20022192A3 true CZ20022192A3 (cs) | 2002-11-13 |
Family
ID=10866857
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CZ20022192A CZ20022192A3 (cs) | 1999-12-22 | 2000-12-20 | Konstrukt pro vakcinaci nukleovými kyselinami a vakcina |
Country Status (21)
| Country | Link |
|---|---|
| US (2) | US20030133909A1 (cs) |
| EP (1) | EP1240317B1 (cs) |
| JP (1) | JP2003517845A (cs) |
| KR (1) | KR20020073149A (cs) |
| CN (1) | CN1434862A (cs) |
| AT (1) | ATE355365T1 (cs) |
| AU (1) | AU2204901A (cs) |
| BR (1) | BR0016672A (cs) |
| CA (1) | CA2395208A1 (cs) |
| CZ (1) | CZ20022192A3 (cs) |
| DE (1) | DE60033690T2 (cs) |
| ES (1) | ES2282156T3 (cs) |
| GB (1) | GB9930359D0 (cs) |
| HU (1) | HUP0203848A3 (cs) |
| IL (1) | IL150285A0 (cs) |
| MX (1) | MXPA02006313A (cs) |
| NO (1) | NO20023010L (cs) |
| NZ (1) | NZ519732A (cs) |
| PL (1) | PL356697A1 (cs) |
| WO (1) | WO2001046228A2 (cs) |
| ZA (1) | ZA200204987B (cs) |
Families Citing this family (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| GB0212036D0 (en) * | 2002-05-24 | 2002-07-03 | Glaxo Group Ltd | Vaccines |
| GB0212046D0 (en) * | 2002-05-24 | 2002-07-03 | Glaxo Group Ltd | Vaccines |
| GB0304634D0 (en) * | 2003-02-28 | 2003-04-02 | Glaxo Group Ltd | Vaccines |
| GB0321615D0 (en) * | 2003-09-15 | 2003-10-15 | Glaxo Group Ltd | Improvements in vaccination |
| BR112018013967A2 (pt) | 2016-01-19 | 2019-02-05 | Pfizer | vacinas contra o câncer |
| CN106086050B (zh) * | 2016-06-28 | 2020-01-07 | 中国人民解放军第二军医大学 | 携带muc1肿瘤抗原表位pdtrp的嵌合型病毒样颗粒及在胰腺癌中的应用 |
| CA3070468A1 (en) | 2017-09-01 | 2019-03-07 | Dana-Farber Cancer Institute, Inc. | Immunogenic peptides specific to bcma and taci antigens for treatment of cancer |
| WO2020181142A1 (en) | 2019-03-06 | 2020-09-10 | Dana-Farber Cancer Institute, Inc. | T cell receptors specific to b-cell maturation antigen for treatment of cancer |
Family Cites Families (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5695766A (en) * | 1992-10-30 | 1997-12-09 | Iowa State University Research Foundation | Highly virulent porcine reproductive and respiratory syndrome viruses which produce lesions in pigs and vaccines that protect pigs against said syndrome |
| US5744144A (en) * | 1993-07-30 | 1998-04-28 | University Of Pittsburgh University Patent Committee Policy And Procedures | Synthetic multiple tandem repeat mucin and mucin-like peptides, and uses thereof |
| AUPM322393A0 (en) * | 1993-12-24 | 1994-01-27 | Austin Research Institute, The | Mucin carbohydrate compounds and their use in immunotherapy |
| DE19516673A1 (de) * | 1995-04-28 | 1996-10-31 | Gabriele Dr Pecher | Vakzine gegen Tumorerkrankungen |
| AUPN568095A0 (en) * | 1995-09-27 | 1995-10-26 | Austin Research Institute, The | Anti-Galalpha(1,3)Gal antibody binding peptides |
| EP0923605A4 (en) * | 1996-03-20 | 2003-01-02 | Sloan Kettering Inst Cancer | CONJUGATE VACCINES CONTAINING MUCIN PEPTIDE |
| US5744177A (en) * | 1996-06-11 | 1998-04-28 | Lin; Rong-Teng | Injection molding assembly |
-
1999
- 1999-12-22 GB GBGB9930359.6A patent/GB9930359D0/en not_active Ceased
-
2000
- 2000-12-20 AU AU22049/01A patent/AU2204901A/en not_active Abandoned
- 2000-12-20 MX MXPA02006313A patent/MXPA02006313A/es unknown
- 2000-12-20 BR BR0016672-3A patent/BR0016672A/pt not_active IP Right Cessation
- 2000-12-20 AT AT00985646T patent/ATE355365T1/de not_active IP Right Cessation
- 2000-12-20 CZ CZ20022192A patent/CZ20022192A3/cs unknown
- 2000-12-20 WO PCT/GB2000/004906 patent/WO2001046228A2/en active IP Right Grant
- 2000-12-20 US US10/168,873 patent/US20030133909A1/en not_active Abandoned
- 2000-12-20 KR KR1020027008063A patent/KR20020073149A/ko not_active Application Discontinuation
- 2000-12-20 DE DE60033690T patent/DE60033690T2/de not_active Expired - Lifetime
- 2000-12-20 PL PL00356697A patent/PL356697A1/xx not_active Application Discontinuation
- 2000-12-20 JP JP2001547137A patent/JP2003517845A/ja active Pending
- 2000-12-20 NZ NZ519732A patent/NZ519732A/en unknown
- 2000-12-20 HU HU0203848A patent/HUP0203848A3/hu unknown
- 2000-12-20 CN CN00819076A patent/CN1434862A/zh active Pending
- 2000-12-20 EP EP00985646A patent/EP1240317B1/en not_active Expired - Lifetime
- 2000-12-20 ES ES00985646T patent/ES2282156T3/es not_active Expired - Lifetime
- 2000-12-20 CA CA002395208A patent/CA2395208A1/en not_active Abandoned
- 2000-12-20 IL IL15028500A patent/IL150285A0/xx unknown
-
2002
- 2002-06-20 ZA ZA200204987A patent/ZA200204987B/en unknown
- 2002-06-21 NO NO20023010A patent/NO20023010L/no not_active Application Discontinuation
-
2006
- 2006-11-02 US US11/555,793 patent/US20070269451A1/en not_active Abandoned
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| PL356697A1 (en) | 2004-06-28 |
| NO20023010D0 (no) | 2002-06-21 |
| DE60033690T2 (de) | 2007-11-08 |
| ES2282156T3 (es) | 2007-10-16 |
| WO2001046228A3 (en) | 2002-01-17 |
| CN1434862A (zh) | 2003-08-06 |
| HUP0203848A2 (hu) | 2003-03-28 |
| JP2003517845A (ja) | 2003-06-03 |
| NZ519732A (en) | 2004-03-26 |
| CA2395208A1 (en) | 2001-06-28 |
| GB9930359D0 (en) | 2000-02-09 |
| NO20023010L (no) | 2002-08-06 |
| WO2001046228A2 (en) | 2001-06-28 |
| HUP0203848A3 (en) | 2004-07-28 |
| MXPA02006313A (es) | 2002-11-29 |
| EP1240317A2 (en) | 2002-09-18 |
| US20030133909A1 (en) | 2003-07-17 |
| AU2204901A (en) | 2001-07-03 |
| US20070269451A1 (en) | 2007-11-22 |
| IL150285A0 (en) | 2002-12-01 |
| ZA200204987B (en) | 2003-09-22 |
| BR0016672A (pt) | 2002-10-08 |
| ATE355365T1 (de) | 2006-03-15 |
| DE60033690D1 (de) | 2007-04-12 |
| EP1240317B1 (en) | 2007-02-28 |
| KR20020073149A (ko) | 2002-09-19 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US7446185B2 (en) | Her2/neu target antigen and use of same to stimulate an immune response | |
| JP3581366B2 (ja) | 免疫原のリソソーム標的 | |
| US8470560B2 (en) | CR-2 binding peptide P28 as molecular adjuvant for DNA vaccines | |
| ES2387850T3 (es) | Proteína de fusión al antígeno carcinoembrionario y sus usos | |
| ES2675825T3 (es) | Vacunación tumoral que involucra una respuesta inmunitaria contra la proteína propia CLDN18.2 | |
| US6749856B1 (en) | Mucosal cytotoxic T lymphocyte responses | |
| US20070269451A1 (en) | Nucleic Acid Vaccination | |
| PT2155243E (pt) | Composição e métodos compreendendo os antigénios klk3, psca ou folh1 | |
| JP2005341969A (ja) | 小胞体シグナル配列ペプチドと少なくとも１個の他のペプチドをエンコードする核酸配列を含有する免疫原性キメラ、及びこのキメラのワクチン及び疾患の治療における使用 | |
| CZ2001789A3 (cs) | Způsob pro in vivo inhibici aktivity ligandu pro osteoprotegerin | |
| TW202039587A (zh) | 供合成胜肽免疫原作為免疫刺激劑的人工混雜t輔助細胞抗原決定位 | |
| JP2002517249A (ja) | 抗原およびＥＢＶＧｐ３５０／２２０の受容体の同時刺激によるＢ細胞活性化および免疫グロブリン分泌の増強 | |
| WO2009002418A2 (en) | T-cell peptide epitopes from carcinoembryonic antigen, immunogenic analogs, and uses thereof | |
| US20070053920A1 (en) | Nematode polypeptide adjuvant | |
| JP2021512966A (ja) | ワクチン組成物およびその使用 | |
| JP2005526520A (ja) | Ｖｎｔｒ反復ユニットの数が減少したｍｕｃ−１抗原 | |
| JP2007523610A (ja) | 癌胎児抗原をコードする合成遺伝子およびその使用 | |
| CN108025061B (zh) | 疫苗组合物及其用途 | |
| JPH11504204A (ja) | 免疫回避タンパク質 | |
| JP2005526511A (ja) | ワクチン | |
| JP2007505601A (ja) | ワクチン | |
| JP2007524352A (ja) | 上皮細胞ムチンｍｕｃ−１から誘導されるワクチン | |
| JPWO2003000894A1 (ja) | ポリヌクレオチドワクチン | |
| WO2021170111A1 (zh) | 肿瘤免疫增强剂及其制法和应用 |