JPH11504204A

JPH11504204A - 免疫回避タンパク質

Info

Publication number: JPH11504204A
Application number: JP8530807A
Authority: JP
Inventors: グラツィアマスチ，マリア
Original assignee: グラツィアマスチ，マリア
Priority date: 1995-04-10
Filing date: 1996-04-10
Publication date: 1999-04-20
Also published as: AU5284296A; CA2217977A1; US5833991A; EP0830452A1; WO1996032483A1

Abstract

(57)【要約】本発明は、所望でない免疫応答を予防するための組成物および方法を提供する。本発明において、グリシン含有アミノ酸配列、免疫系に対して実質的な不認識性を組換えタンパク質に付与するグリシン含有配列を含む組換えタンパク質が調製される。

Description

【発明の詳細な説明】免疫回避タンパク質本発明は、タンパク質を細胞免疫系に対して不認識化するための材料および方法に関する。ワクチンおよび遺伝子療法のための転移ベクターの産生のための組換えDNA技術の使用は、疾患の予防および治療の新たな可能性を開拓した。多くの遺伝子療法アプローチは、同種かまたは異種に由来する遺伝子配列を宿主の体細胞に導入することに基づいている。目的の遺伝子は、酵素、ホルモン、サイトカイン、免疫原性タンパク質（ウイルス、細菌、もしくは寄生体由来）、または遺伝子発現および細胞増殖を調節する細胞内制御タンパク質のような活性物質をコードする遺伝子を含む。いくつかの方法が、外因性遺伝子の体細胞への転移を最適化するために開発された。いくつかの最も効果的な方法は、ワクシニアウイルス、アデノウイルス、またはレトロウイルスのような天然ウイルスの遺伝子操作により得られる組換えベクターを用いる。これらのウイルスは、一般的には、内因性遺伝子の改変により非病原性にされ、そして目的の遺伝子はウイルスの遺伝性物質の一部と交換される。あるいは、目的の遺伝子をコードする、単離されたDNAフラグメントは、不活性なキャリア（例えば、リポソームベクター）によるか、またはいわゆる「遺伝子銃」法により体細胞に導入され得る。遺伝子銃法によって、DNA/RNAがコートされたキャリア（例えば、金粒子）が、皮膚細胞中に高圧で打ち込まれる。遺伝子療法における１つの潜在的な問題は、宿主免疫系が、宿主中に導入された外来治療物質として認識し得ることである。例えば、治療用タンパク質をコードする遺伝子を有する転移ベクターを用いて哺乳動物に遺伝子を導入する場合、転移ベクターの構造タンパク質または調節タンパク質に対する宿主免疫応答が誘発され得る。別の潜在的な問題は、治療用タンパク質自身に対する免疫応答の誘発である。外来タンパク質は、宿主細胞中でプロセシングされ、そしてMHCクラスIまたは MHCクラスII分子と会合して細胞表面で提示される。この様式で外来タンパク質を表わす細胞は免疫系により認識され、そして排除される。治療用タンパク質が再投与された場合、強い免疫記憶応答が活性化され、治療効率の著しい減少がもたらされる。この問題は免疫抑制剤の投与により事前に除去され得るが、このことは、重篤な副作用、例えば、日和見感染およびウイルス誘発リンパ腫の増大した危険性を有し得る。従って、免疫応答を選択的に阻害する方法を開発することの実質的な関心が存在する。この方法は、潜在的に免疫原性のタンパク質を発現する細胞の長期間の持続に好ましく、そして薬理学的に誘発される免疫抑制の必要性を除去する。従って、本発明の目的は、目的のタンパク質を標的宿主動物の細胞免疫応答に対して不認識化するための材料および方法を提供することである。本発明は、グリシンリッチ反復配列が、通常は抗原性であるタンパク質に挿入された場合、組換えタンパク質に免疫系を回避する能力を付与するという発見に基づく。従って、本発明は、組換えタンパク質を有する細胞が免疫系により排除されないことにおいて、免疫応答の選択的な阻害を可能にする。それゆえ、本発明の第１の局面により、抗原性タンパク質へのグリシンリッチ反復配列の挿入によって抗原性タンパク質を免疫系に対して不認識化する方法が提供される。用語「抗原性タンパク質」は、免疫担当細胞（すなわち、免疫系の細胞）により認識されるタンパク質をいう。免疫担当細胞の認識は、タンパク質またはエピトープがこのような細胞の活性化の引き金を引いた場合に示される。それは、増殖および／またはエフェクター機能の誘発に関して測定される。例えば、リンホカイン、サイトカインの産生、および／またはタンパク質もしくはエピトープを発現している細胞の死により測定される。従って、上記説明のように、免疫担当細胞により認識されない場合、タンパク質は非抗原性である。「免疫系に対する不認識化」または「免疫系を回避する能力」は、タンパク質がＴ細胞免疫応答（例えば、MHCクラスIまたはクラスII拘束CTL応答）を回避するかまたは阻害する能力を有することを意味し、それゆえ少なくとも最初は、インビトロ CTLアッセイにより測定され得る。用語「グリシンリッチ反復配列」は、以下に示す一般的な「反復単位」の「n 」回の隣接反復を含む任意のアミノ酸配列をいい： [Gly_aX Gly_bY Gly_cZ] ここで、aは、１、２、または３であり；bは、１、２、または３であり；cは、１、２、または３であり；各X、Y、およびZは、独立して、環状構造を有さず、そして３原子未満の側鎖を有する疎水性または極性アミノ酸であり；そしてここで、「n」は、１から66の間の整数である。明らかではあるが、各a、b、c、X、Y 、およびZは、各n回反復単位の間で同じである必要はない。好ましくは、各X、Y、およびZは、独立して、Ala、Ser、Val、Ile、Leu、またはThrである。より好ましくは、各X、Y、およびZは、独立して、AlaまたはSerである。なおさらに好ましくは、各X、Y、およびZは、Alaである。各XおよびYが、 MetまたはCysでないこともまた好ましい。好ましくは、グリシンリッチ反復配列の「n」回反復単位の７隣接反復単位において、a=2、b=1、およびc=1である。好ましくは、グリシンリッチ反復配列の９隣接反復単位において、a=2、b=1、およびc=2である。より好ましくは、グリシンリッチ反復配列の７隣接反復単位において、a=2、b =1、およびc=3である。より好ましくは、グリシンリッチ反復配列の７隣接反復単位において、a=2、b =1、およびc=2であり、そして同じグリシンリッチ反復配列のさらなる９隣接反復単位において、a=2、b=1、およびc=3である。好ましくは、合計28反復単位が存在する。最も好ましくは、グリシンリッチ反復配列は、図１に示されるものであり、それはEBNA1グリシンリッチ配列である。グリシンリッチ反復配列は、グリシンアミノ酸で完全にまたは実質的に構成され得ることもまた認識される。本発明は、１つ以上のグリシンリッチ反復配列が上記タンパク質に挿入されている状態を含むことが理解される。さらに、グリシンリッチ反復配列の挿入後にタンパク質がその生物学的機能を保持することが好ましい。本発明の第２の局面により、本発明の第１の局面の方法により形成されたタンパク質が提供される。このタンパク質は上記のグリシンリッチ反復配列を含み、ここで、上記タンパク質は免疫系に対して不認識化される。便宜上、このタンパク質を、抗原性「コアタンパク質」および「グリシンリッチ反復配列」を含むと称し得る。グリシンリッチ反復配列は、コアタンパク質のカルボキシまたはアミノ末端のいずれかに融合され得る。あるいは、グリシンリッチ反復配列はコアタンパク質内部のいずれの場所にも挿入され得る。好ましくは、グリシンリッチ反復配列はコアタンパク質内で離れて挿入され、ここで、グリシンリッチ反復配列のいずれかの末端残基は、コアタンパク質のエピトープから１〜300の間の残基で離れている。好ましくは、この距離は、１〜2 00の間の残基であり、より好ましくは10〜100残基、そして最も好ましくは１〜5 0の間の残基である。本明細書中で使用される「エピトープ」は、免疫学的に外来性として認識されるタンパク質内の約８〜20アミノ酸の抗原性領域をいう。コアタンパク質は１つ以上のエピトープを含み得る。コアタンパク質が複数のエピトープを含む場合、抗原性タンパク質の全てのエピトープは、本発明により非抗原性にされることが考えられる。好ましくは、本発明の第２の局面のタンパク質は、治療用タンパク質である。好ましくは、治療用タンパク質は、酵素、サイトカイン、リンホカイン、細胞接着分子、コスティミュレーター分子、薬剤耐性遺伝子または腫瘍抑制遺伝子のタンパク質産物からなる群より選択される。本発明のさらに好ましい実施態様では、本発明の第２の局面のタンパク質はマーカーである。好ましいマーカーは、neoR、多剤耐性遺伝子またはチミジンキナーゼ遺伝子によりコードされるマーカー、βガラクトシダーゼ、ジヒドロ葉酸（ dehydrofolate）レダクターゼ（DHFR）およびクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼを包含する。本発明のさらに好ましい実施態様では、本発明の第２の局面のタンパク質は、ウイルスベクターの免疫原性の構造タンパク質または調節タンパク質である。好ましくは、ベクターは、ワクシニアベクター、アデノウイルスベクター、ヘルペスウイルスベクター、セムリキ森林ウイルスベクター、または遺伝子療法の目的のために開発された任意のレトロウイルスベクターである。本発明のさらに好ましい実施態様では、本発明の第２の局面のタンパク質は、ウイルス、細菌、または寄生体感染の予防または治療のために使用されるワクチン、またはガンワクチンの成分である。本発明のさらに好ましい実施態様では、上記のグリシンリッチ反復配列は抗原性タンパク質に連結され、抗原性タンパク質を免疫系に対して不認識化し得る。グリシンリッチ反復配列は、化学技術を包含する任意の公知技術を用いて、抗原性タンパク質に連結され得る。本発明の第３の局面によれば、上記のグリシンリッチ反復配列をコードする核酸が提供される。好ましくは、核酸は、抗原プロセシングまたは提示の際にシス作用性の調節活性を有するポリペプチドをコードする。好ましくは、核酸は、図１に示されるエプスタインバーウイルス（B95.8株）の核抗原１（EBNA1）のアミノ酸89〜327をコードする。本発明の第４の局面によれば、本発明の第２の局面によるタンパク質をコードする核酸が提供される。本発明の第５の局面によれば、本発明の第３または第４の局面による核酸を含むベクターが提供される。好ましくは、ベクターは、さらに、ベクター中に含まれる核酸配列の発現に作用するために必要とされる制御配列を含む。このような制御配列の特性は、宿主生物に依存して異なる；原核生物においては、このような制御配列は、プロモーター、リボソーム結合部位、および転写終結配列を包含し得る；真核生物においては、このような制御配列は、プロモーターおよび転写終結配列を包含し得る。リーダー配列、エンハンサー、および遺伝子座制御領域（LCR）のような、さらなる制御配列もまた包含され得る。本発明の第６の局面によれば、本発明の第５の局面によるベクターで形質転換された宿主細胞が提供される。宿主細胞は、細菌のような原核生物細胞であり得、そして好ましくは、哺乳動物細胞のような真核生物細胞である。本発明の第７の局面によれば、グリシンリッチ反復配列について試験するための方法が提供され、この方法は、このような配列を含む抗原性タンパク質に免疫系を回避する能力を付与する。本発明の方法は、本発明の第２の局面のタンパク質を発現する宿主細胞を、上記タンパク質および参照タンパク質に共通のエピトープについて特異的な免疫系の細胞とともに、上記エピトープの免疫学的認識を可能にし得る条件下で、インキュベートする工程を包含する。ここで、上記エピトープは、上記参照タンパク質において免疫原性であることが知られているかまたは測定され、そして免疫学的認識が存在しないことは、免疫系の回避の指標である。好ましくは、上記免疫学的認識は、上記参照タンパク質またはそのエピトープを有する上記宿主細胞のMHCクラスI拘束溶解である。あるいは、上記免疫学的認識は、上記参照タンパク質またはそのエピトープを有する宿主細胞のINF、TNF、またはインターロイキンのうちの１つのようなリンホカインの産生を誘発する能力を包含する。本発明の第８の局面によれば、哺乳動物において、好ましくはヒトにおいて、免疫応答を選択的に回避する方法が提供される。この方法は、哺乳動物に本発明の第２の局面によるタンパク質を投与する工程を包含する。このタンパク質のコアタンパク質はグリシンリッチ反復配列の非存在下で免疫原性であり、そして上記グリシンリッチ反復配列の存在下では非免疫原性である。本発明の第９の局面によれば、哺乳動物において、好ましくはヒトにおいて、免疫応答を選択的に回避する方法が提供される。この方法は、哺乳動物に以下のタンパク質をコードする本発明の第４の局面による核酸を投与する工程を包含する。このタンパク質のコアタンパク質はグリシンリッチ反復配列の非存在下で免疫原性であり、そして上記グリシンリッチ反復配列の存在下では非免疫原性である。本発明の第10の局面によれば、タンパク質をコードする核酸セグメントを、本発明の第３の局面によるグリシンリッチ反復配列をコードする核酸配列の挿入によって、ヒトまたは他の種の細胞において発現されるように、改変するためのプロセスが提供される。好ましくは、上記核酸セグメントは治療用タンパク質をコードする。好ましくは、治療用タンパク質は、酵素、サイトカイン、リンホカイン、細胞接着分子、コスティミュレーター分子、薬剤耐性遺伝子または腫瘍抑制遺伝子のタンパク質産物からなる群より選択される。本発明のさらに好ましい実施態様では、核酸セグメントはマーカー遺伝子をコードする。好ましいマーカー遺伝子は、neoR、多剤耐性遺伝子、チミジンキナーゼ遺伝子、βガラクトシダーゼ、ジヒドロ葉酸（dehydrofolate）レダクターゼ（DHFR）、およびクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼを包含する。マーカー遺伝子は、ヒトのような哺乳動物の細胞内に、治療用遺伝子とともにまたは別々に挿入され得る。本発明のさらに好ましい実施態様では、核酸セグメントは、ウイルスベクターの免疫原性の構造または調節タンパク質をコードする。好ましくは、ベクターは、ワクシニアベクター、アデノウイルスベクター、ヘルペスウイルスベクター、または遺伝予療法の目的のために開発された任意のレトロウイルスベクターである。本発明のさらに好ましい実施態様では、核酸セグメントは、ウイルス、細菌、もしくは寄生体感染の予防または治療のために用いられるワクチン、またはガンワクチンの成分をコードする。本発明の第11の局面では、本発明の第２の局面のタンパク質または本発明の第４の局面の核酸を薬学的に受容可能なキャリアまたは希釈剤と組み合わせて含む薬学的組成物が提供される。本発明の第12の局面では、本発明の第２の局面のタンパク質または本発明の第４の局面の核酸が治療での使用のために提供される。本発明の第13の局面は、遺伝子療法による疾患の治療のための組成物の製造における、本発明の第２の局面のタンパク質または本発明の第４の局面の核酸の使用である。多数の疾患が、本発明の組成物を用いて治療され得る。そのような疾患は、遺伝性およびウイルス性疾患、特にゴーシェ病のような酵素障害、ガン、免疫系障害および遺伝子療法を用いて処置し得る任意の他の疾患を包含する。本発明のさらなる局面では、治療有効量の本発明の第２の局面のタンパク質または本発明の第４の局面の核酸を患者に投与する工程を包含する処置方法が提供される。本発明のさらなる局面では、上記の治療用タンパク質またはマーカー遺伝子をヒトまたは他の種に提供するためのプロセスが提供され、これは上記のグリシンリッチ反復配列を含む。本発明のさらなる局面では、本発明の第５の局面によるベクターをヒトまたは他の種に提供するためのプロセスが提供される。本発明のさらなる局面では、組換えワクチンをヒトまたは他の種に提供するためのプロセスが提供され、ここで、組換えワクチンは、上記のグリシンリッチ反復配列を含む。本発明を、添付の実施例において、以下の図を参考として例示する：図１は、B95.8 EBV株由来のEBNA1タンパク質の内部gly-ala反復のアミノ酸配列を提供する。図２は、完全長EBNA1キメラ、gly-ala欠失EBNA1キメラ、およびgly-ala含有EB NA4キメラの概略図である。EBNA4 416-424エピトープおよびEBNA1内部反復領域（IR）の制限部位および挿入の位置を、B95.8配列中のアミノ酸番号を指す垂直の矢印により示す。公知のEBNA1タンパク質ドメインを以下に示す：gly-ala反復（黒塗り部分）；gly-arg（灰色部分）；核局在化シグナル（線形部分）；DNA結合およびダイマー化ドメイン（斜線部分）。図３は、EBNA4 416-424エピトープに特異的な全ての拘束CTLにより溶解させるための、gly-ala欠失変異体および全長EBNA1キメラを発現するワクシニア組換え体で感染させたHLA A11陽性線維芽細胞の感受性化の結果を示す。gly-ala欠失キメラを発現する線維芽細胞は、完全なEBNA4を発現する線維芽細胞と同程度に効果的に溶解されたが、全長EBNA1キメラを発現する線維芽細胞は死滅しなかった。Ａ．完全なEBNA4タンパク質（Vacc-EBNA4）、またはEBNA1欠失変異体（EBNA4 41 6-424 エピトープをNcolに挿入されたもの(Vacc-E1ΔGAN-E4)、PflMIに挿入されたもの(Vacc-E1ΔGAP-E4)、もしくはBsu36Iに挿入されたもの(Vacc-E1ΔGAB-E4) を含む）を発現する線維芽細胞の溶解。４回の実験の平均および標準誤差。Ｂ．異なる時間の長さの間、完全なEBNA1キメラを含むVacc-E1ΔGAN-E4組換え体またはVacc-E1N-E4組換え体で感染させた線維芽細胞の溶解。３つを除く１つの代表的な実験におけるエフェクター：標的比が10:1での特異的溶解のパーセントを図に示す。図４は、完全なEBNA1タンパク質の過剰発現が、EBNA4のプロセシングならびに 399-408および416-424エピトープの提示を阻害しないことを示す。EBNA4、EBNA1 もしくはEBNA3を発現するか、またはEBNA1+EBNA4およびEBNA3+EBNA4を同時発現するHLA A11陽性線維芽細胞の、EBNA4 399-408(灰色部分)および416-424(黒塗り部分)エピトープに特異的なCTLによる溶解。３つを除く１つの代表的な実験におけるエフェクター：標的比が10:1での特異的溶解のパーセントを図に示す。図５は、EBNA4 399-408および416-424エピトープに特異的な全ての拘束CTLにより溶解させるための、EBNA4またはE4IRキメラを発現するHLA A11陽性細胞の感受性化の結果を示す。HLA A11陽性線維芽細胞（ＡおよびＣ）または内性EBNA4タンパク質（ＢおよびＤ）のHLA A11拘束認識を排除する変異を有するチャイニーズEBV単離物を有するQJZsp LCLを、EBNA4 399-408(白丸、黒丸)または416-424( 白三角、黒三角)エピトープに特異的なA11拘束CTLについての標的として使用する前に、Vacc-EBNA4(白三角、白丸)またはVacc-E4IR(黒塗り三角、黒塗り丸)組換え体で、ある感染多重度で示された時間（ＡおよびＢ）または示された感染多重度で12時間（ＣおよびＤ）感染させた。エフェクター：標的の組み合わせのそれぞれで行われた３つを除く１つの代表的な実験において、エフェクター：標的比が10:1で記録される特異的溶解のパーセントを図に示す。実施例実施例Iは、本発明の組換えグリシン含有配列の作製方法を記載する。実施例I Iは、このような配列をコアタンパク質に挿入して本発明の組換えタンパク質を形成する方法を記載する。実施例IIIは、本発明のグリシン含有配列を含む組換えタンパク質を、免疫応答の回避における効果について試験する方法を記載する。実施例IVは、EBNA1グリシン含有反復配列を記載する。実施例Vは、外来エピトープをEBNA1タンパク質またはグリシン含有反復配列を欠如するENBA1欠失変異体のいずれかに挿入した実験を記載し、そして非欠失EBNA1タンパク質のみが挿入された外来エピトープに非免疫原性を付与することを示す。実施例VIは、EBNA1 を別の抗原性タンパク質の存在下で過剰発現した実験を記載し、そしてEBNA1が抗原性タンパク質の免疫原性のトランス作用阻害を付与しないことを示す。実施例VIIは、EBNA1グリシン含有配列を外来タンパク質に挿入し、組換え外来タンパク質を非免疫原性にした実験を記載する。実施例Ｉ本発明による有用なグリシン含有配列本発明の組換えグリシン含有配列は、以下の性質を有する。機能的には、このような配列が組換えタンパク質内でシスで（in-cis）存在する場合、タンパク質を非免疫原性にし得る。免疫原性またはその免疫原性の欠損は、以下に記載されるインビトロおよび／またはインビボ免疫化試験で測定される特定の細胞傷害性応答を阻害する挿入配列の能力により評価され得る。組換えグリシン含有配列は、一般式に従い、構造的に定義され、そしてその好適な実施態様を本明細書中に記載する。一般式に加えて、本発明の配列は、それらが１個の疎水性アミノ酸および／または極性アミノ酸によって分散させられたグリシンの反復領域（stretch）を含有する点で特徴づけられる。介在するアミノ酸の存在は、グリシンが二次構造の形成を妨げることを必要とし得る。介在するアミノ酸は、小さな疎水性および／または極性であり得る：例えば、アラニン（これは、１つの-CH₃基からなる短い側鎖を有する）；セリン（これもまた、１個の炭素原子側鎖（-CH₂OH）を含有する）、バリン、ロイシン、スレオニン、およびイソロイシン（これらは、２〜４個の範囲の炭素を含有する基の側鎖を有する疎水性アミノ酸である）。いかなる理論にも捕らわれることなく、短い側鎖（すなわち、１〜４基）は、標的タンパク質中の二次構造の形成を阻害することが提案されている。従って、CysおよびMetは、本発明による適切なアミノ酸ではあり得ない。なぜなら、それらは、スルフヒドリル基を有するからである。 B95.8 EBV株のEBNA1タンパク質およびヒヒ（papio）EBNA1様抗原中の反復配列の比較により、本明細書中、上記に示される一般式が、ヒヒEBNA1では７回、B95 .8 EBNA1では28回反復されることを明らかにする。ヒヒでは、一般的なモチーフは、GlyGlySerGlyAlaGlyAlaの規則的な反復である。EBV EBNA1の反復は、各Ala に先行するGly残基の数が１〜３で変化する点で、規則的な反復ではない。しかし、いくつかの組合せが、より頻繁に現れる：すなわち、合計ｎ＝28の反復の内、ｎ＝９での（Gly₂AlaGly₁AlaGly₂Ala）および／または合計ｎ＝28の反復の内、ｎ＝７での（Gly₂AlaGly₁AlaGly₃Ala）。図１に示すグリシン含有配列の「機能的誘導体」（すなわち、EBV EBNA1配列）は、グリシン含有配列が挿入されたタンパク質に非免疫原性を付与し、その結果、免疫系の回避が維持される限り、種々の長さおよび組成の配列（すなわち、より長い配列またはより短い配列あるいは内部欠失配列は、機能的であり、そして下記の機能に関して試験され得る）、ならびに種々のアミノ酸組成（元のgly- ala配列部分に関して、さらなるアミノ酸が含まれるか、または交換され得る）を包含し得る任意の配列をいうことが理解される。グリシン含有配列の総残基数は、反復の基本的な残基の数によって分割され得ることが好ましい：(Gly_1-3)X₁(Gly_1-3)X₂(Gly_1-3)Z、すなわち、各反復中に存在するグリシン残基の数に依存して、５、６、７、８、９、10、または11までである。グリシン含有配列中の反復数（ｎ）は、１〜28の反復であり得る。そしてグリシン含有アミノ酸配列の残基総数は、６と314との間である。より好ましくは、ｎは２であり、この場合、上記配列の残基総数は12〜24である。あるいはｎは７であり、この場合、上記配列の残基総数は42〜84である。好ましくは、配列の総残基数は約400〜600の間であり、ｎ＝41の場合、８残基を保持して反復し、そしてｎ＝66の場合、４残基を保持して反復する。グリシン含有配列が、本発明に従って、例えば、抗原性タンパク質を非抗原性にするために抗原性タンパク質内へ挿入するために必要とされる場合、図１に示されるB95.8 EBNA1配列が、本明細書中に記載されるように提供され得る。あるいは、別のグリシン含有配列が、一般式、および本明細書中に提供されるこのような配列選択のための指針に従って選択される場合、当業者に公知のクローニングストラテジーのいずれかに従って行われ得る。２つの異なるストラテジーを以下に記載する：すなわち、原型（prototype）配列のPCR増幅によるもの、または選択された最小モチーフのオリゴマー化によるもの。この後者のストラテジーの利点は、介在するＸもしくはＹのアミノ酸またはグリシン骨格が異なる組合せで変異され得る場合、容易に改変されて反復配列を生成し得ることである。１．ＰＣＲ増幅グリシン含有配列をコードするDNAフラグメントを入手し得る場合、そのフラグメントは、以下のように、PCR増幅のために使用され得る。グリシン反復配列を含有する原型B95.8 BamHIK領域の1122bp長のXmaIフラグメント（Baerら、Nature 310:207-211，1984に記載される108117-109239に対応する）が、PCR増幅のテンプレートとして使用され得る。PCRプライマーは、反復の直前および直後で選択される。人工的なBamHIおよびEcoRIの部位が、それぞれ、 5'および3'オリゴヌクレオチドの配列内に含まれる。低いストリンジェンシー条件下およびテンプレートの反復特性下での増幅は、複数のプライミングおよび種々のサイズのPCR産物の生成を可能にする。例えば、プライマー対、5'-AAGGATCC AAGTTGCATTGGATGCAA-3'および5'-TGAATTCTCGACCCCGGCCTCCACTG-3'は、以下のPCR 反応において使用され得る：50nMの各プライマーおよび10〜20ngの各テンプレートを、50μl反応緩衝液（１mM Tris-HCl pH7.5、5mM KCl、0.15〜0.5nM MgCl₂、 0.001％ゼラチン、200μM dNTP、および２ユニットのTaq DNAポリメラーゼを含有する）中で混合する。増幅条件は、95℃での１分間の変性、45〜60℃での１分間のアニーリング、および72℃での１分間の伸長の30〜35サイクルを含む。 PCR産物を、pGEX-T2ベクターの、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ遺伝子（GST）の下流のBamHIおよびEcoRI部位にクローニングする。融合タンパク質GST -GlyAlaを、tacプロモーターを用いて細菌内で発現させる。次いで、GST遺伝子の下流にインフレームで挿入された反復を含む融合タンパク質の発現を、EBNA1G lyAla反復に特異的なアフィニティ精製されたヒトの抗体を用いて、単一の形質転換コロニー由来の溶解物のウエスタンブロットによりスクリーニングする（Di llnerら、1984，Proc．Nat．Aca．Sci．81; 4652）。スクリーニングを、150μl LB培地中で0.3mM IPTGを有するマイクロウエルプレート中で４時間生育させた個々の細菌クローンの誘導後に、実施した。80μlの細菌細胞懸濁液を、等量のS DS-PAGE負荷緩衝液と混合し、そしてドットブロット装置を用いてニトロセルロースフィルター上にドットする。フィルターを、標準的なウエスタンブロット手順に従って処理し、そしてECL（Amersham）により発色させる。 GST-GlyAlaポリペプチドを発現するコロニーを、さらに、制限エンドヌクレアーゼ分析および配列決定により、挿入物のサイズおよびコード能を決定するために特徴づけする。50、100、150、200、250、300のアミノ酸の反復挿入物を含有する融合タンパク質をコードするプラスミド（pGEX-(E1GlyAla)n）を、下記のGl yAlaコードカセットの単離のために選択する。２．選択された最小モチーフのオリゴマー化グリシン含有コアモチーフをコードする１組の相補的なオリゴヌクレオチドを、オリゴー化を可能にする5'および3'の突出を有するように合成する。このストラテジーは、別のアミノ酸を含有するために容易に改変され得る公知の配列を生成するという利点を提供する。コアモチーフGlyAlaGlyAlaGlyGlyAlaGlyおよびその改変体をコードする相補的なオリゴヌクレオチドの例を、表１に示す。転写方向に関して正方向または負方向に挿入する際に予想されるコード能を表２に示す。アニーリングして二本鎖を形成させた後、オリゴヌクレオチドは、最初のアミノ酸コドンおよびその隣接コドンの第１の塩基に対応する5'および3'の突出を含有し、連結に際して頭−尾マルチマーの形成を可能にする。アニーリングを、50μl反応（100μMの各プライマー、0.1Ｍ MgCl₂、10mM Tris-HCl pH7.4を含有する）中で実施する。反応混合物を72℃で５分間加熱し、そして65℃でさらに40分間進行させる。連結を、アニーリング混合物を、50mM Tris pH7.4、10mM MgCl₂、10mM DTT、１mMスペルミジン、１mM ATP，100ng/ml BSAに調節し、そして10uのT4 DNAリガーゼを添加することにより実施する。反応を、15℃で１、３、６、９、および12時間行う。3'陥没端の充填を、50mM Tris-HCl pH7.5、７mM MgCl₂、１mM DTT、および20μM dNTP中で、0.1uのDNAポリメラーゼのクレノウフラグメントを用いて、20分間室温で実施する。線状のマルチマー分子は、表３に示されるように、pGEX-T2ベクターのSmaI部位に平滑末端連結される。GST反復融合タンパク質を発現するクローンを、本明細書中に記載されるように、GlyAla特異的抗体との反応性により選択する。特異的抗体が利用し得ない反復を含有する融合タンパク質に関して、選択は、GST結合グルタチオン被覆のセファロースビーズでの細菌溶解物からの精製後のサイズに基づいて実施される。発現クローンを、挿入物のさらなる特徴づけのために選択する。プラスミドをBamHIおよびEcoRIで消化する。これらは、pGEX-T2ベクターのSma I部位の直前および直後で切断する。挿入物を、３％アガロースゲルでサイズ分画し、そして臭化エチジウム染色後、ＵＶ照射により可視化する。あるいは、Ba mHI/EcoRI消化後に得られるプラスミドおよび挿入フラグメントを、25μlの反応（50mM Tris-HCl pH7.5、10mM MgSO₄、１mM DTT、50μg/ml BSA Pentax画分Ｖ、２nmolのdNTP、および２pmolのα-³²P-dCTPを含有する）中で１μgのプラスミド当たり１ユニットのDNAポリメラーゼのクレノウフラグメントを用いて末端標識する。サイズ分画を、８％アクリルアミドゲルで実施する。２、４、８、12、および16個のコア反復のコード配列に対応するサイズ（それぞれ、48、96、192、2 88、384bp）の挿入物を含有するプラスミドを、配列決定によりさらに特徴付けし、挿入物のコード可能性および方向を確認する。上記の手順に従って得られるグリシン含有反復配列を、適切なベクターのポリリンカー内にサブクローニングし、唯一の上流および下流の制限部位を含有するサブクローニングカセットを生成する。例えば、pBluescript-SKベクター（Stra tagene）のBamHIおよびEcoRI部位内へのサブクローニングは、唯一の上流の部位であるSacI、BstXI、NotI、XbaI、およびSpeI、ならびに唯一の下流の部位であるHindIII、ClaI、HincII、AccI、SalI、XhoI、ApaI、DraIIおよびKpnIを含有するサブクローニングカセットを生成する。実施例ＩＩグリシン含有配列およびこのようなタンパク質をコードするキメラ遺伝子を含有する本発明の組換えタンパク質グリシン含有配列を含有する本発明の組換えタンパク質を、以下のように作製する。１．グリシン反復配列を含有するタンパク質をコードするキメラ遺伝子の構築 Gly含有配列をコードするDNAカセットを、その天然形態が免疫原性であることが考えられるか知られているタンパク質をコードする遺伝子内の選択された部位内に挿入する。候補のグリシン含有配列をコードするDNAを、従来のクローニング手順を用いて公知のエピトープから選択された距離で、目的のタンパク質をコードする遺伝子内に挿入する。gly含有配列を選択されたエピトープ（すなわち、非免疫原性にされるエピトープ）の下流（すなわち、カルボキシ末端）に挿入することが好ましい：例えば、エピトープに対して少なくとも５アミノ酸のカルボキシ末端に、より好ましくは少なくとも10〜20アミノ酸、少なくとも50アミノ酸、100アミノ酸、またはエピトープに対して少なくとも200アミノ酸のカルボキシ末端において挿入することが好ましい。もちろん、gly含有配列は、インフレーム融合によりタンパク質のカルボキシ末端に位置し得る。例として、グリシン配列をコードするDNA（一般的に、（「(GlyX)n」）という）をインフルエンザマトリックスタンパク質中へ挿入するためのクローニングストラテジーを、以下に詳細に記載する。３つの唯一の制限部位（RsaI、BamHI、およびstuI）が、(GlyX)nコードDNAカセットを、A/Puerto Rico/8/34株（Winterら、Nucl．Acids Res．8:1965，1980 ）由来のインフルエンザマトリックスタンパク質Ｉ（matrix）をコードするcDNA 内へ挿入するために使用される。さらに、Gly含有配列をコードするカセットを、遺伝子の3'末端、マトリックスコード配列の直後に挿入する。CTL特異的エピトープに拘束される免疫優勢HLA A2（GILと呼ばれる）を、この252アミノ酸長のタンパク質のアミノ酸残基58〜66（GILGFVFTL）で同定した（Bednerckら、J．Im munol．147:4047，1991）。RsaI部位は、開始ATGコドンに関して28bpに位置する。それは、GILエピトープの上流の47アミノ酸残基のところである。BamHI部位は、264bpに位置する。それは、GILエピトープの下流の22アミノ酸残基のところである。そしてStuI部位は、713bpに位置する。それは、COOH末端付近のエピトープの下流の172残基のところである。マトリックスcDNAを、pGS62（Smithら、Virol ，160:336，1987）のEcoRI消化により切り出し、そしてpGEM-9zf(-)（Promega）のEcoRI部位に再クローニングして、pGEM-matrixを得る。pGEM-matrixは、インビトロ転写／翻訳のためのSP6およびT7プロモーターにより駆動されるマトリックスタンパク質を含有する。選択されたタンパク質内の４つの異なる位置の各々に挿入された(GlyX)nコードカセットを含有するキメラ遺伝子の構築を、以下に記載する。各クローニング例において、注意して、所与のタンパク質のコード配列内でインフレームのカセット挿入を行う。当業者には、以下の示された例は、インフレームカセット挿入の代表的なクローニングストラテジーであることが理解される；候補の(GlyX)nD NAカセットおよび選択されたタンパク質をコードする遺伝子について必要とされる改変が行われる。 Gly含有配列をコードするDNAカセットを、表４に示されるように、そして以下のように、インフルエンザマトリックスタンパク質をコードする遺伝子のRsaI部位にサブクローニングする。pGEM-matrixプラスミドを、RsaIで部分消化する。p GEM-9zf(-)は、amp^R遺伝子内に位置する唯一のRsaI部位を含有する。この部位に挿入されたカセットを含有する組換え体は、このクローニング手順において、am p耐性の喪失によって選択される。(GlyX)nカセットを含有するDNAフラグメントを、BamHI消化により単離する。次いで、pGEX-T2(GlyX)nプラスミドのBamHI 3' 陥没末端を、ＡおよびＧヌクレオチドで部分的に充填する。次いで、DNAをEcoRI で消化し、そして5'突出端を、マングビーンヌクレアーゼ処理により除去する。改変されたフラグメントを、pGEM-matrixプラスミド内のマトリックスタンパク質コード領域のRsaI部位に平滑末端結合する。正方向での挿入が、配列PhePro(G lyX)nAspおよびイノフルエンザマトリックスタンパク質のアミノ酸11〜252を伴う、インフルエンザマトリックスタンパク質のアミノ酸１〜９をコードするキメラ遺伝子を生じる。 (GlyX)n DNAカセットのマトリックスタンパク質をコードする遺伝子のBamHI部位へのサブクローニングを表５に示し、そしてそのサブクローニングは以下の工程を含む。pGEM-matrixプラスミドを、BamHIで消化し、その後クレノウにより3' 陥没末端を消化する。(GlyX)nコードフラグメントを、pGEX-T2(GlyX)nから、Ban HI/EcoRI消化、その後のＡおよびＧヌクレオチドを用いた3'陥没末端の部分的な充填、および残存する5'突出端のマングビーンエキソヌクレアーゼ処理により単離する。(GlyX)n DNAフラグメントを、pGEM-matrixプラスミドの充填したBamHI 端に平滑末端連結する。正方向での挿入が、配列LeuPro(GlyX)nGluおよびインフルエンザマトリックスタンパク質のアミノ酸89〜252を伴う、インフルエンザマトリックスタンパク質のアミノ酸１〜88をコードするキメラ遺伝子を生じる。 (GlyX)n DNAカセットのマトリックスタンパク質をコードする遺伝子のStuI部位へのサブクローニングを表６に示し、そしてそのサブクローニングは以下の工程を含む。pGEM-matrixプラスミドを、StuIで消化する。Glyコードカセットを、 pGEX-2T-GlyXプラスミドのBamHI消化、その後のＡおよびＧヌクレオチドを用いた部分的な充填により単離する。次いで、プラスミドをEcoRIで消化し、そして5 '突出端をマングビーンヌクレアーゼ処理により除去する。(GlyX)nフラグメントを、pGEM-matrixプラスミドのStuI部位に平滑末端連結する。正方向での挿入が、配列ValPro(GlyX)nおよびマトリックスタンパク質アミノ酸239〜252を伴う、インフルエンザマトリックスタンパク質のアミノ酸１〜238をコードするキメラ遺伝子を生じる。カルボキシル末端の(GlyX)n配列を有する融合タンパク質はまた、本発明に従って作製され得る。(GlyX)n配列をコードするDNAカセットのインフルエンザマトリックスタンパク質遺伝子の3'末端へのサブクローニングを表７に示し、そしてそのサブクローニングは以下の工程を含む。マトリックスタンパク質をコードするDNAを、以下の個々の5'および3'のプライマーを使用してPCR増幅により調製する：5'ATAAAGCTTATGAGTCTTCTAACCGAGGTC3'および5'CGAGGATCCACTTGAACCGTTGCATC TGC3'。5'プライマーは、最初のATGの上流に人工的なHindIII部位を含有し、そして3'プライマーは、マトリックスタンパク質の最後の残基のコドンの下流にBa mHI部位を含有する。 (GlyX)n DNAカセットを、pGEX(GlyX)nのEcoRIを用いた消化により単離し、マングビーンヌクレアーゼを用いて5'突出端を除去し、そしてBamHIで消化する。マトリックスタンパク質コード配列および(GlyX)nカセットが挿入されているプラスミドは、XbaIで消化され、マングビーンヌクレアーゼで処理され、そしてHi ndIIIでさらに消化されたpGEM-9zfである。３つのこのように調製されたDNA（すなわち、マトリックスコードDNA、(GlyX) nコードDNA、およびpGEMベクター）を、HindIII末端、BamHI末端、または平滑末端を合致させる部位特異的連結による１つの反応で連結する。得られるプラスミドpGEM-matrix-(GlyX)n-COOHは、そのカルボキシル末端残基を介して(GlyX)n配列にインフレームで融合した242アミノ酸のマトリックスタンパク質をコードする。アミノ酸配列が結合される場合、２つの新しい残基（TrpおよびIle）が、Ba mHI連結により生成する。UAG停止コドンが、融合タンパク質の下流にインフレームで存在する。 (GlyX)nコード挿入物の正しい方向および読み枠配置を、DNA配列決定により決定する。キメラタンパク質の発現を、上記のように、インフルエンザマトリックスタンパク質に特異的な抗体（Smithら、Virol.，160:336，1987）およびアフィニティー精製された抗(GlyX)n抗体を用いる、インビトロ翻訳された物質のウエスタンブロットにより決定する。所望であれば、目的のタンパク質の免疫原性の阻害の最適化を、グリシン含有配列のサイズを変化させることによって、または免疫原性エピトープに関してgly含有配列の挿入位置を変化させることにより達成し得る。２．真核生物細胞におけるGly反復配列を含有するキメラタンパク質の発現外来遺伝子を真核生物細胞に導入するための送達システムは、当該分野では公知である。本発明に従ったキメラ遺伝子は、標的細胞への送達のために適切な送達ビヒクルに挿入され得る。送達ビヒクルは、ウイルスベクターまたは非ウイルスビヒクルであり得る。キメラ遺伝子が適切な核酸ベクター内に最初に挿入される場合、そのベクターは、所望すれば、プラスミド、ウイルスまたは線状DNAフラグメントであり得る。ベクターは、裸であるか、タンパク質と複合化されるか、またはリポソーム、ウイロソームなどの送達システムまたはレセプター媒介複合体内にパッケージングされる。本発明においては、特定の細胞においてgly含有配列にインフレームで結合した組換えタンパク質をコードするキメラ遺伝子を発現することが包含される。キメラ遺伝子は、インビボまたはエクスビボで発現され得る。その発現は、キメラ遺伝子を含有する遺伝性物質の細胞への導入の結果である。このような細胞には、幹細胞、マクロファージ、Ｔ細胞、樹状突起細胞、造血系の細胞、体細胞、および腫瘍細胞が包含されるが、これらに限定されない。組換えDNAをこれらの細胞に送達するための技術は、当該分野において公知である。そのような細胞は、エクスビボでトランスフェクトされ得る。すなわち、身体から取り出された後、次いで、身体に再導入され得る。あるいは、それらは、インビボで標的化され得る。本発明によるキメラ遺伝子の転移は、多くの手段により達成され得る。それらには、リン酸カルシウム共沈澱を用いるDNAトランスフェクション、標的細胞と遺伝子を含むリポソームとの融合、遺伝子を含有する赤血球ゴーストまたはスフェロプスト、プラスミドおよびウイルスベクター媒介の転移、およびDNAタンパク質複合体媒介遺伝子転移（例えば、レセプター媒介遺伝子転移）を含むが、これらに限定されない。１．エクスピボでの細胞の標的化エクスビボでの細胞へのDNAの導入に関して、種々のタイプの細胞のトランスフェクションのための多数のプロトコルが、当該分野で公知である。いくつかのトランスフェクション技術は、全細胞集団からの幹細胞の単離を含む。この技術は、例えば、欧州特許出願第0 455 482号および第0 451 611号に記載される。Ｔ細胞のトランスフェクションはまた、Kasidら、Proc．Nat．Aca．S ci.，1990，87(1):473に記載される。マクロファージのトランスフェクションは、Freasら、Human Gene Therapy，1993，4(3):283、およびKrallら、Blood，199 4，83(9)L2737に記載される。幹細胞のトランスフェクションはまた、Yuら、Pro c．Nat．Aca．Sci.，1995，92(3):699;Luら、Human Gene Therapy，1994，5:203 ；Walshら、Proc．Soc．Exp．Biol．Med.，1993，204:289；Weinthalら、Bone M arrow Transplant.，1991，8:403、Hamadaら、Jour．Immunol．Methods，1991， 141:177に記載される。アシアロ糖タンパク質でタグ化されたポリリジンを用いて、DNAを複合化および濃縮し、そして肝細胞に対して複合体を標的化する（WuおよびWu、（1987）J. Biol．Chem．262，4429；米国特許第5,166,320号）。DNA転移は、アシアロ糖タンパク質レセプターを発現するこれらの細胞のみに対して複合体を特異的に指向するアシアロ糖タンパク質タグを介して生じると考えられる。モノクローナル抗体もまた、特定の細胞タイプにDNAを標的化するために用いられ得る。これは、M achyら、（1988）Proc．Natl．Acad．Sci．85，8027-8031；Trubetskoyら、（19 92）Bioconjugate Chem．3，323-7、およびWO 91/17773、WO 92/19287に記載される。ラクトシル化ポリリジン（Midouxら、（1993）Nucleic Acids Res．21，8 71-878）およびガラクトシル化ヒストン（Chenら、（1994）Human Gene Therapy 5,429-435）は、プラスミドDNAをレクチンレセプター保有細胞に対して標的化すること、およびポリリジンに結合させたインスリン（Rosenkrantzら、（1992 ）Exp．Cell Res．199，323-329）をインスリンレセプター保有細胞に対して標的化することを示している。２．インビボでの細胞の標的化インビボでの細胞標的化は、レセプター媒介遺伝子転移を用いて本発明に従って実施され得る。レセプター媒介遺伝子転移は、細胞の表面での適切なリガンドの存在に依存する。その細胞は、所望の細胞タイプへの特異的な標的化、その後の複合体の内在化およびDNAの発現を可能にする。レセプター媒介遺伝予転移の１つの形態は、D NAベクターを抗体に結合させる場合においてである。これは、細胞表面抗原に対して高い特異性で標的化する（WongおよびHuang、1987，Proc．Nat．Aca．Sci． 84:7851；Rouxら、1989，Proc．Nat．Aca．Sci．86:9079；Trubetskoyら、1992 ，Bioconjugate Chem．3，323；およびHirschら、1993，Transplant Proceeding s 25:138）。核酸は、ポリリジンを用いて抗体分子に結合され得るか（Wagnerら、1990，Proc．Nat．Aca．Sci．87:3410；Wagnerら、1991，Proc．Nat．Aca．Sc i．89:7934）、または下記のように、リポソームを介して結合され得る。エンドソーム経路を介して細胞が取り込んだリガンド−DNA複合体から誘導されるDNAの増加した発現は、標的化複合体または標的細胞を取り囲む培地のいずれかの中に、エンドソーム崩壊剤（例えば、インフルエンザウイルスヘマグルチニン融合性（fusogenic）ペプチド）を含有することにより達成された。標的化遺伝子の送達はまた、DNA−タンパク質複合体を用いて本発明に従って達成される。そのようなDNA−タンパク質複合体は、標的細胞の表面レセプターと相互作用するリガンドで複合体化されたDNAを含む。従って、細胞表面レセプターは、選択された哺乳動物細胞への遺伝子の特異的な送達に関する天然に存在する侵入機構として利用される。多くの（すべてではない）哺乳動物細胞は、特定の生物学的分子（すなわち、リガンド）を認識し、結合し、そして内在化する細胞表面の結合部位またはレセプターを有することが知られている。これらの分子が、一旦レセプターによって認識され、そして結合すると、レセプター媒介エンドサイトシスを介して膜に限定された小胞内で、標的細胞中で内在化され得る。そのようなリガンドの例として、細胞レセプターによって認識されるために十分に露呈される官能基を有するタンパク質が挙げられるが、これらに限定されない。用いられる特定のタンパク質は、標的細胞により変化する。典型的には、露呈された末端の炭水化物基を有する糖タンパク質が使用される。しかし、他のリガンド（例えば、抗体またはポリペプチドホルホン）もまた、用いられ得る。一般的に、リガンドは、共有結合、イオン結合、または水素結合により、核酸に化学的に結合される。細胞表面レセプターに対するリガンドは、ポリカチオン（例えば、ポリリジン）に、エチリデンジアミノカルボジイミドを用いて、米国特許第5,166,320号に記載されるように結合され得る。DNAは、その組合せまたは複合体が、可溶性のままであり、レセプターにより認識され、そして細胞により内在化されるような様式で、適切なリガンドに結合され得る。DNAは、リガンドとともに細胞内に運ばれ、次いで細胞内で発現される。タンパク質結合体は、等量のタンパク質結合体とDNAとを0.25モル濃度の塩化ナトリウム中で混合することにより、トランスフェクションベクターのDNAと複合体化される。DNA／タンパク質複合体が細胞により取り込まれ、そして遺伝子が発現される。リポソームは、多くの物質（核酸、ウイルス粒子、および薬剤）の非ウイルス性送達のために使用される。多数の総説が、リポソームの生成方法論および性質の研究、治療剤のためのキャリアとしてのその使用、および種々の細胞タイプとのその相互作用を記載している。例えば、以下のものを参照のこと：「Liposome s as Drug Carriers」Wiley and Sons，NY(1988)、および「Liposomes from Bio physics to Thereutics」Marcel Dekker，NY(1987)。いくつかの方法が、DNAの細胞内へのリポソーム送達のために使用されている。それには、ポリ-L-リジン結合脂質（Zhouら、Biochem．Biophys．Acta 1065:8-14，1991）、pH感受性イムノリポソーム（Gregoriadis，G.，Liposome Technology，第I，II，III巻，CRC ，1993）、およびカチオン性リポソーム（Felgnerら、Proc．Natl．Acad．Sci. ，USA，84:7413-7417，1987）を含む。正に荷電したリポソームを用いて、異種遺伝子を真核生物細胞に転移した（Felgnerら、1987，Proc．Nat．Aca．Sci．84 :7413；Roseら、1991，Biotechniques 10:520）。カチオン性リポソームは、自発的に、溶液中でプラスミドDNAまたはRNAと複合化し、そして培養中の細胞と複合体との融合を容易にし、その結果、核酸を細胞に送達する。Philipら（1994， Mol．and Cell．Biol．14:2411）は、カチオン性リポソームを使用して、初代Ｔ細胞および培養腫瘍細胞のアデノ関連ウイルス（AAV）プラスミドトランスフェクションを容易に行えることを報告している。リポソームを用いた薬剤の送達は、疾患の非侵襲性処置を可能にする。器官または組織タイプの標的化が、イムノリポソーム（すなわち、器官特異的または組織特異的な抗原に特異的な抗体に結合されているリポソーム）を用いてより効率的に行われ得る。従って、標的化DNA送達の１つのアプローチは、リポソーム表面上での特異的抗体の取り込みにより標的特異的とされた負荷リポソームの使用である。３．ウイルスベクター媒介遺伝子送達組換えウイルスベクターならびに他のDNA転移スキームが、本発明の実施において用いられ得る。本発明の組換えウイルスベクターは、ウイルスゲノムの少なくとも一部分（その部分により、標的細胞に感染し得る）のDNAおよび転写ユニットならびに制御DNA配列を含む。「感染」とは、一般に、それによりウイルスが遺伝性物質をその宿主または標的細胞に転移するプロセスを意味する。好ましくは、本発明のベクターの構築に用いられるウイルスはまた、複製欠損にされて標的細胞でのウイルスの複製作用を除去される。このような場合、複製欠損ウイルスのゲノムが、従来技術に従って、ヘルパーウイルスによりパッケージされ得る。一般に、感染性および機能的な遺伝子転移の能力の上記基準を満たす任意のウイルスが、本発明の実施において用いられ得る。本発明の実施に適切なウイルスには、例えば、アデノウイルス、アデノ関連ウイルス、レトロウイルス、およびワクシニアウイルスが含まれるが、これらに限定されない。その代表的な例を以下に示す。本発明のキメラ遺伝子のウイルスベクターへの挿入は、当業者に公知の従来のクローニング手順を含む。ウイルスシステムは、ウイルスの感染能を利用し、高い効率で外来DNAを真核生物細胞に導入する。目的の遺伝子を、選択された宿主細胞または器官で発現し得るプロモーターの制御下にあるウイルスゲノム内にクローニングする。組換えワクシニアウイルス、レトロウイルス、およびアデノウイルスもしばしば、DNA 送達目的のために使用される。ウイルス送達ビヒクルは、その使用の公知の有利な点および不利な点に基づいて選択される。当業者は、非免疫原性組換えタンパク質の意図された治療使用について送達ビヒクルを選択する。例えば、ウイルスベクターの宿主細胞ゲノム内への組込みは、組換えレトロウイルスによる感染後に生じる。このような組込みは、形質導入された遺伝子の長期間の発現を有利にもたらす。しかし、レトロウイルスは、それらが分裂細胞のみに感染する点で、ベクターとしてのその使用が限られている。組換えアデノウイルスベクターは、分裂および分裂後の標的細胞の広範囲に感染する能力を有する。それらは、エピソーム形態で細胞内に維持されず、その結果、細胞の代謝と平行して、形質導入された遺伝子の喪失が生じる。組換えワクシニアウイルスベクターは、形質導入された遺伝子の非常に高いレベルの発現が可能であり、そして広範囲の標的細胞に感染し得る。しかし、この感染は、しばしば、生産的（pr oductive）であり、その結果、ウイルス感染細胞は急激に消滅する。組換えワクシニアウイルス、レトロウイルス、およびアデノウイルスの構築を、以下に詳細に記載する。その各々は、本発明のインフルエンザマトリックスキメラ遺伝子を有する。ａ）インフルエンザマトリックス／Gly含有配列の組換えタンパク質をコードする配列を含有する組換えワクシニアウイルスの構築 Gly含有配列にインフレームで結合された選択タンパク質コード配列（例えば、インフルエンザマトリックス１タンパク質）を有するワクシニアウイルス組換え体を、標準的な手順（RJ Murrayら、J．Exp．Med.，176:157，(1992)）に従って作製する。転移ベクターを、インフルエンザマトリックスcDNA/(GlyX)nキメラ遺伝子をウイルスベクターにクローニングすることにより構築し得る。例えば、キメラ遺伝子を、pGEM-matrix-(GlyX)nまたはpGEM-matrix-(E1 GlyX)nのEcoRIフラグメント上で単離し、そしてワクシニアp7.5の初期後期プロモーターの下流の、 pGS62のEcoRI部位にクローニングし得る。このプロモーターは、CTL認識のための標的タンパク質の発現に関して選択されたプロモーターである（BEJ Couparら、Eur．J．Immunol.，16:1479(1986)）。挿入物含有のプラスミドを、配列決定し、正しい方向および読み枠配置を決定する。組換えウイルスを、野生型WR株のワクシニアを感染させたTK-143細胞へのトランスフェクションにより生成する（ S．Chakrabatiら、Mol．Cell．Biol.，5:3403(1985)）。ワクシニアチミジンキナーゼ遺伝子（TK）内への挿入物を有する組換え体を、25μg/mlのBuDRを含む培地中で選択する。ウイルスストックを調製し、そして標準的な手順に従ってCV-1 細胞で力価を測定する。マトリックスタンパク質のカルボキシル末端でgly含有配列に融合させたマトリックスタンパク質をコードする組換えワクシニアベクターを、２つの点で異なるが、上記のように作製する。第１は、キメラ遺伝子を、HindIII-SfiI消化によりpGEM-matrix-(GlyX)n-COOHから切り出す。第２は、キメラ遺伝子フラグメントのワクシニアベクターpGS62のEcoRI部位へのクローニングを、ベクターおよび挿入物の両方の末端をクレノウフラグメントまたはT4 DNAポリメラーゼ（SfiI末端に関して）で充填した後、平滑末端連結によって実施する。ｂ）インフルエンザマトリックス／Gly配列反復キメラ遺伝子を含有する組換えレトロウイルスベクターの構築目的のタンパク質をコードする遺伝子、または本発明の組換えタンパク質をコードするキメラ遺伝子を有する組換えレトロウイルスベクターを、Trivediら（I nt．Jour．Cancer 48:794，1991）に記載されるように作製する。例として、インフルエンザマトリックスタンパク質をコードする遺伝子、またはインフルエンザマトリックス／Gly含有配列組換えタンパク質をコードする遺伝子を有する組換えレトロウイルスベクターの構築を、以下に記載する。キメラ遺伝子を、pGEM-matrix-(GlyX)nまたはpGEM-matrix-(E1GlyX)nまたはpG EM-matrix-(GlyX)nCOOHからHindIIIおよびSalI消化により切り出し、そしてpCEP 4プラスミド（Invitrogen）のHindIII-XhoI部位にサブクローニングする。その結果、SalIおよびXhoI部位の喪失が生じる。次に、pCEP4-matrixおよびPCEP4-ma trix(GlyX)nプラスミドを、SalIおよびSfiIにより切断し、マトリックス遺伝子またはインフルエンザマトリックスキメラ遺伝子（CMVプロモーターにより駆動される）を含有するフラグメントを単離する。クレノウによるSalIの3'陥没末端およびT4 DNAポリメラーゼによるSfiIの3'突出末端の改変後、単離したフラグメントをpShis4ベクターのSnabI部位に平滑末端連結する。次いで、ヘルパーウイルスを含まないウイルス上清を、標準的な手順（Millerら、Mol．Cell．Biol．6 :2895，1986）に従って、pA317パッキング細胞株にトランスフェクションにより作製する。ｃ）インフルエンザマトリックス／Gly配列キメラ遺伝子を含有する組換えアデノウイルスの構築目的のタンパク質をコードする遺伝子、または本発明の組換えタンパク質をコードするキメラ遺伝子を有する組換えアデノウイルスベクターを、以下のように作製する。例として、インフルエンザマトリックスタンパク質をコードする遺伝子、またはインフルエンザマトリックス／(GlyX)n組換えタンパク質をコードする遺伝子を有する組換えアデノウイルスベクターの構築を、以下に記載する。 CMVプロモーターを含有するSalIフラグメント、インフルエンザマトリックスc DNAまたはインフルエンザマトリックスキメラ遺伝子およびSV40ポリＡテイルを、pCEP4-matrixまたはpCEP4-matrix(Gly-X)nプラスミドから切り出し、そしてアデノウイルス転移プラスミドpΔE1sp1のsalI部位にサブクローニングする。pΔE 1sp1は、クローニング部位の両側にアデノウイルスのE1配列を含有する（Bettら、Proc．Nat．Aca．Sci．91:8802，1994）。組換えアデノウイルスを、pΔE1sp1 -matrixまたはpΔE1sp1-matrix(GlyX)nプラスミドとpJM17との相同組換えにより作製する。組換えアデノウイルスは、Ad5 E1発現293細胞への同時トランスフェクション後、部分的に端が欠損したE1を有する完全なアデノウイルスの5'ゲノムを含有する（Grahamら、J．Gen．Virol.，36:59，1977）。同時トランスフェクション、ウイルスレスキュー、および増殖を、標準的な手順に従って実施する（Gr ahamら、Gene Transfer and Expression Protocols、E.J．Murray編、Human a P ress、Clifton、NY、109〜128頁、1991）。キメラ遺伝子の発現を、免疫学的方法により検出し得る。例えば、Gly含有配列に特異的な抗体および目的のタンパク質に特異的な抗体を使用して、免疫蛍光およびイムノブロッティングにより組換えタンパク質が検出され得る。あるいは、キメラ遺伝予の発現は、そのタンパク質の生物学的活性をアッセイすることにより検出され得る；例えば、キメラ遺伝子がマーカー遺伝子（例えば、NeoRキメラまたはTKキメラ）である場合、マーカータンパク質の発現を検出し得る。実施例III 免疫系の回避についての試験方法この実施例に記載の手順により、当業者は、グリシン含有反復配列の存在が細胞性免疫系による外来タンパク質の認識に影響を及ぼすか否か；すなわち、グリシン反復配列の非存在下で、免疫原性であるタンパク質に非免疫原性を付与するか否かを決定し得る。 Gly含有反復配列を含むタンパク質の抗原性および免疫原性の試験その天然の形態において免疫原性であるタンパク質のプロセシング/提示についてのGly反復配列の存在の効果を、インビトロおよびインビボアッセイに従って試験し得る。例示として、挿入されたグリシン含有配列を含む組換えインフルエンザマトリックスタンパク質１の免疫原性を、以下にインビトロおよびインビボ試験を介して決定する。インビトロアッセイは、Levitskayaら(Nature 375:685-688,1995)に記載されるように、目的のタンパク質および/または所定のタンパク質中の同定された標的エピトープに特異的なポリクローナルＴ細胞培養物またはクローンの利用可能性に依存する。本発明の候補組換えタンパク質の試験に有用なCTLエピトープは、先行技術において公知である。CTLエピトープは、多くの異なる抗原ついて（例えば、ウイルス抗原、細菌抗原および寄生体抗原について）公知である。ヒトにおいて、このようなエピトープは以下のものを含むが、これらに限定されない： i．インフルエンザＡマトリックスタンパク質の残基57〜68に位置するHLA A2 拘束エピトープ(Gotchら、Nature,326:331-332,(1987);Mossら、Proc.Natl.Acad .Sci.USA,88:8987-8990,(1991)）； ii．それぞれ、HIV p17 Gagおよびp24 GagのHLA B27およびB8拘束エピトープ（Nixonら、Nature,336:484-487,(1988);NixonおよびMcMichael,AIDS 5:1049-10 59,(1991)); iii．EBV膜タンパク質LMP2のHLA A2拘束エピトープ(Leeら、J.Virol,67:7428- 7235,(1993));および iv．P.falciparum由来の肝臓-期-特異的抗原(LSA-1)のHLA B53拘束CTLエピトープ(Hillら、Nature,360:432-439,(1992))。マウス系におけるこのようなエピトープの例は、以下のものを含むが、これらに限定されない： i．Plasmodium berghei サーカムスポロゾイトタンパク質のアミノ酸249〜260 におけるH-2Kd拘束エピトープ(Romeroら、Nature,341:323-325,(1989))これらの CTLは寄生体感染からマウスを保護し得る;および ii．Listeria monocytogenesのリステリオシンのアミノ酸91〜99におけるH-2k D拘束エピトープ(Palmenら、Nature,353:852-855,(1991))。これらのタンパク質のプロセシング/提示におけるGly含有配列の効果を、インフルエンザマトリックスタンパク質について本明細書中に記載のストラテジーに従って行う。すなわち、既知のCTLエピトープに関するタンパク質内に挿入されたGly反復配列を含むキメラタンパク質が、ウイルスまたは非ウイルス送達系を用いて、適切なMHCクラスI型の細胞において発現される。いくつかのこのようなタンパク質が試験され得、各々は、そのタンパク質内の同じ部位に挿入された異なる配列を有するか、または既知のCTLエピトープに関する異なる位置に挿入された同じ配列を有する。従って、抗原プロセシングの阻害を達成するのに必要とされるgly含有配列の大きさおよびCTLエピトープに関するコード配列内の反復の挿入の位置の両方を決定し得る。この目的のために、異なる長さおよび/または異なる配列の反復を、所定のタンパク質に挿入する。反復を、目的のタンパク質のNH₂もしくはCOOH末端に、またはエピトープのすぐ上流またはすぐ下流から始まる既知のエピトープから種々の距離でコード配列内に挿入する。インフルエンザマトリックスタンパク質１およびグリシン含有配列を含む本発明の組換えタンパク質をコードするキメラ遺伝子を、本明細書中に記載の遺伝子送達方法に従って、HLA A2陽性線維芽細胞、EBV形質転換リンパ芽球細胞株(LCL) 、またはマイトジェン誘導芽球に導入し、そして発現する。キメラ遺伝子発現を、インフルエンザマトリックスタンパク質１に特異的な抗体およびグリシン含有配列に特異的な抗体を用いて免疫蛍光により確認する。キメラ遺伝子発現もまた、標準的な手順に従ってウエスタンブロッティングにより確認し得る。形質導入されたキメラ遺伝子を発現する宿主細胞を含む調製物を、細胞傷害アッセイにおける標的集団として使用する。細胞傷害エフェクター細胞は、記載されるように (Morrisonら、Eur.Jour.Immunol.22:903,1992)、自己インフルエンザＡウイルス感染細胞で刺激されたHLA A2陽性固体由来のポリクローナルCTL集団または58〜6 6エピトープに特異的なCTLクローンであり得る。あるいは、形質導入された標的の免疫学的認識を、Asherら、Jour.Immunol.13 8:963,1987により教示されるようなリンホカイン（例えば、TNF、INF、インターロイキンなど）の産生を誘導するこれらの細胞の能力により評価し得る。以下の TNFアッセイは、Ｔ細胞上清中のTNFの存在について試験するための標準アッセイである。L929アッセイは、TNF感受性L929細胞の増殖を阻害する関連抗原を発現する細胞とＴリンパ芽球の共培養から得られた上清の能力に基づく。あるいは、形質導入された標的細胞の免疫学的認識を、TNF特異的モノクローナル抗体に基づく市販のELISAキットを用いてELISAアッセイ(R＆D Systems,Mpls ,MN)により評価する。インビボアッセイは、Trivediら、Int.J.Cancer 48:794(1991)に記載されるように、同系宿主において形質導入されたマウス腫瘍細胞株の拒絶を誘導する目的のタンパク質の能力に基づく。例えば、本明細書に記載される、インフルエンザマトリックスタンパク質の免疫原性およびグリシン含有配列にインフレームで融合したマトリックスタンパク質の非免疫原性を、以下の通りに試験し得る。 ACAマウス(H-2f)を起源とする自発性哺乳動物腫瘍株から樹立されたS6C細胞株 (Kuzumakiら、Europ.J.Cancer 39:471,1987)を、pCEPマトリックスまたはpCEPマトリックス(GlyX)nプラスミドでトランスフェクトする。トランスフェクトされた遺伝子の高レベルの発現を、その遺伝子を駆動するCMVプロモーターを用いて達成する。ACAマウスを、以下のうち１つを有する細胞で免疫化する：(１)ベクターなし、（２）挿入キメラ遺伝子を有さないpCEPベクター、（３）インフルエンザマトリックスタンパク質１をコードする遺伝子を含むpCEPプラスミド、および（４）pCEPマトリックス(Gly)nプラスミド。Trivediら、Int.Jour.Cancer 48: 794,1991を参照のこと。10,000ラドで照射された１×10⁶細胞を、連続３週間、１週間に１回皮下に接種する。最後の免疫化の７日後、および生存細胞攻撃の24 時間前に、マウスを、非特異的免疫反応を阻害するために400ラドで照射する(Kl einら、Cold Spring Harbor Symp.Quant Biol.27;463,1962)。５〜10匹の群を、類別した生細胞/マウス（例えば、10³〜10⁶細胞/マウス）で攻撃する。腫瘍増殖は、毎週３次元のカリパス測定に従う。攻撃後、８週間、動物を観察下に置く。平均腫瘍負荷を、個々の腫瘍直径を加え、そして群におけるマウスの総数でその合計を割ることにより計算する。腫瘍の統計を、Fisherの精密検定に従って計算する。実施例IV EBNA1 グリシン含有反復配列本発明の１つの実施態様において、エプスタイン-バーウイルス核抗原(EBNA) １内部Gly-ala反復配列、またはその機能的誘導体に対応するポリペプチドをコードする反復核酸配列を、目的のタンパク質をコードする遺伝子に挿入する。次いで、この遺伝子をトランスフェクトし、そして発現される組み換えグリシン配列含有ポリペプチドが非免疫原性、すなわち細胞傷害性Ｔリンパ球により認識されないように宿主細胞中で発現される。本発明によれば、エプスタイン-バーウイルス核抗原(EBNA)１内部gly-ala反復 (表現型B95.8 EBV株のアミノ酸89〜327)に対応するポリペプチドを表１に示す。組換えタンパク質を、抗原性タンパク質の選択された部位内にこのポリペプチドを配置することにより形成し、このタンパク質を非抗原性にする。エプスタイン-バーウイルス(EBV)によりコードされる核抗原(EBNA)１は、健康なウイルスキャリアにおいて生命を持続する、潜伏的にEBV感染したＢリンパ球において発現され(Tierney,R.J.ら J.Virol.68,7374-7385 1994)、そして全ての EBV関連悪性腫瘍において規則的に検出される唯一のウイルスタンパク質である( Masucci,M.G.およびErnberg,I.Trends in Microbiology 2,125-130,1994,Klein, G.Cell 77,791-793,1994において総説される）。主要組織適合遺伝子複合体(MHC )クラスI拘束EBNA1特異的細胞傷害性Ｔリンパ球(CTL)応答は、示されておらず(M asucci,M.G.およびErnberg,I.Trends in Microbiology 2,125-130,1994,Rickins on,A.ら、A New Look at Tumour Immunology,McMichael,AおよびFranks,L編、53 〜80頁、CSHL Press,New York,1992中において総説される)、このことは、このウイルス抗原が免疫応答を逃れる能力を発達し得ることを示唆する。 EBNA1は、内部gly-ala反復を囲むarg-gly含有モチーフの反復配列によって連結される独特のＮ末端ドメインおよびＣ末端ドメイン（表現型B95.8 EBV株において、それぞれアミノ酸１〜89および327〜641）から構成されるリンタンパク質 (Rawlins,D.R.ら、Cell 42,859-868,1985)である(Baer,R.ら、Nature 310,207-2 11,1984)(図１)。異なる長さのGly-ala反復は、全てのEBV単離物中に存在し、そしてEBNA特異的抗体応答の主要標的を示すことが観察されている。しかし、gly含有配列の機能は以前は知られていなかった。以下に記載の実験を、ENBA1分子の1/3より大きなものを含む反復配列の存在が、細胞性免疫系によるEBNA1の認識に影響を与えるか否かを試験するために設計した。実施例Ｖ外来エピトープのEBNA1への挿入白人種HLA A11陽性の個人におけるEBV誘発CTL応答が、EBNA4タンパク質の残基 399-408および416-424に対応するペプチドエピトープに対するA11拘束反応性によりしばしば支配されるという観察(Gavioli，R.ら、J．Virol．67，1572-1578 ，1993，de Campos-Limas，P.O.ら、J．Exp Med．179，1297-1305,1994)を利用して、免疫優性EBNA4 416-424エピトープを、完全なEBNA1配列内またはグリシン- アラニン反復を含まないEBNA1欠失変異体内にインフレームで挿入した(図２)。B 95-8ウイルス由来のEBNA1およびEBNA4(EBNA-3Bとしても知られる)遺伝子のコード配列を有するワクシニアウイルス組換え体の産生は、以前に記載されている(M urray，R.ら、J．Exp Med．176，157-168，1992)。EBNA1(E1)内にHLA A11拘束EB NA4 416-424エピトープ(IVTDFSVIK，E4)を含むキメラタンパク質、または内部グリシン-アラニン反復領域を欠くEBNA1欠失変異体(E1△GA)を、E4エピトープに対応するオリゴヌクレオチドをEBNA1コード配列内の種々の位置に挿入することにより産生した。 pBS-E1△GAおよびpBS-E1△GAプラスミド（EBNA1遺伝子および欠失変異体のオープンリーディングフレームの全長をコードする）を、それぞれNcoII部位(ゲノム位置(gp)：108067)、またはNcoI部位、PflMI部位(gp: 109291)、またはBsu361 部位(gp: 109510)で開口させた。NcoI部位への挿入のために、２つのオリゴヌクレオチド(EIN-E4F: 5'-CATGCCATAGTAACTGACTTTAGTGTAATCAA G-3'およびE1N-E4R: 5'-CATGCTTGATTACACTTAAGTCAGTTACTAT-3')を、97℃に５分間加熱した後、50℃ に緩徐に冷却し、そしてさらに37℃で５分間インキュベートすることにより、50 mM NaCl、10mM MgCl₂、50mM tris-HCl(pH8.0)中で、容量20μLにおいて10mMの濃度で、アニールさせた。アニーリングの後、dGTPを、３UのT4 DNAポリメラーゼと共に100mMの濃度になるように添加し、そして12℃で20分間インキュベートした。次いで、EDTAを10mMになるように添加し、続いて、75℃で10分間加熱し、そして100μLの最終容量に希釈した。次いで、オリゴを、Ncol消化pBS-E1およびpB S-E1△GAに100：１の比で連結した。PflMI部位への挿入のために、オリゴE1P-E4 F(5'-CGATCGTAACTGACTTTAGTGTAATCAGG-3')およびE1P-E4R(5'-CCTTGATTACACTAAAG TCAGTTACGATCGTGC-3')を、アニールさせ、そして上記のpBS-E1△GAのPflMI部位に連結した。E1P-E4FおよびE1P-E4Rを同定の目的のために唯一のPvul部位を用いて設計した。これは、正しい方向にのみ挿入し得る。Bsu36I部位への挿入のために、オリゴE1B-E4F(5'-TAACGATCGTAACTGACTTTAGTGTAATCAAGG-3')およびE1B-E4R( 5'TTACCTTGATTACACTAAGTCAGTTACGATCG-3')をアニールさせ、そして上記のpBS-E1 DGAのBsu36I部位に連結した。エレクトロポレーションの後、挿入物を含むプラスミドをミニプレップのポリメラーゼ連鎖反応によってスクリーニングし、そして配列決定して正しい方向を決定しそして操作中の完全な忠実度を確認した。オリゴ挿入配列の単離の後、E1およびE1△GAオープンリーディングフレームを BstYIおよびHincll消化によって切り出した。単離されたDNAフラグメントの末端をT4 DNAポリメラーゼで修復し、そしてpSC11のSmaI部位に挿入した。ワクシニアウイルス複製に関するEBNA1グリシン-アラニン反復の毒性のために、P7.5プロモーターに関して逆方向に挿入されたpBS-E1キメラを含む組換え体のみを選択する。pBS-E1△GAキメラについては、正方向および逆方向の両方の挿入物を選択した。組換えワクシニアウイルスを、上記のプラスミドをWR株野生型ワクシニア感染 TK-143細胞ヘトランスフェクトすることにより産生し、そして以前に記載されたようにウイルスのストックを調製し、そしてCV-1細胞において力価測定した(Mur ray，R.ら、J．Exp．Med．176，157-168，1992)。 EBNA4 416-424エピトープ特異的CTLによる溶解に対してHLA A11陽性標的物を感受性にする組換えワクシニアウイルスの能力を、標準的な方法に従って試験した。線維芽細胞形態ドナーQJZの半集密的な単層(HLA A11 B13，B51)を96ウェルマイクロリットルプレート(costar)中で増殖させ、ウェルあたり３μ/Ci⁵¹NaCrO₄ (Amersham)の存在下で、アッセイウエルにおいて感染多重度10で12時間、感染を行った。あるいは、エフェクターの添加の24時間前から始めて異なる時間で感染を行った。HLA-A11拘束EBNA4特異的CTLクローンを、EBV血清陽性ドナーBK(HLA A2,A11 B7，B35)由来のリンパ球を自己B95.8ウイルス形質転換リンパ芽球腫細胞株(LCL)で刺激することによって得た。単一細胞のクローニングを制限希釈によって行った。 CTLクローンのEBNA4 416-424エピトープに対する特異性を、10^-10Mの対応する合成ペプチドとともに予めインキュベートしたHLA A11陽性PHA芽細胞の溶解能によって評価した。細胞傷害活性を、標準的な４時間⁵¹Cr放出アッセイにより３連でアッセイした。 his319、pro446、またはlys520位置で挿入したEBNA4 416-424エピトープを含むEBNA1欠失変異体は、B95.8配列(それぞれVacc-E1△GAN-E4、Vacc-E1△GAP-E4 およびVacc-E1△GAB-E4)と比較して、EBV特異的CTLによる溶解に対してHLA A11 陽性線維芽細胞を感受性にした(図3A)。殺傷レベルは、各場合において、EBNA4 を発現するワクシニア組換え体での感染の後に観察されたレベルに匹敵した。対照的に、his39で挿入されたEBNA4 416-424エピトープとともにキメラ全長EBNA1 を発現する線維芽細胞(Vacc-E1N-E4)はCTLによっては認識されなかった(図3B)。 Vacc-E1△GAN-E4感染細胞とVacc-E1N-E4感染細胞との異なる認識は、gly-ala反復の存在が、E1N-E4キメラが溶解に対して標的細胞を感受性にできないことに直接関与するという知見を支持する。実施例ＶＩ外来タンパク質の認識におけるEBNA1の過剰発現の影響以下の実験を、EBNA1の過剰発現が同一の標的細胞において発現される他の抗原性タンパク質の抗原のプロセシング／提示に影響し得るかどうかを試験するために行った。高レベルのEBNA1を、誘導可能T7 RNA ポリメラーゼ系(Murray，R．ら、J．Exp．Med．176，157-168，1992)の使用を介して、ワクシニアウイルス感染細胞において発現させた。Vacc-T7およびVacc-EBNA1，またはコントロールとして、Vacc-T7およびVacc-EBNA3(Murray，R.ら、J．Exp．Med．176，157-168，1 992)で12時間感染させたHLA A11陽性線維芽細胞を、Vacc-EBNA4で６時間重感染させ、次いで、399-408または416-424エピトープに特異的なCTLによる溶解に対する感受性について試験した（図４）。EBNA1またはEBNA3の過剰発現は、Vacc-E BNA4感染線維芽細胞の認識を阻害しなかったが、Vacc-EBNA4コントロールと比較して、30〜50％の溶解の減少が観察された。これはおそらく、ウイルスが細胞の転写／翻訳機構を競合したためである。従って、gly-ala反復構造は、抗原プロセシング／提示のトランス作用インヒビターとして機能しない。標的タンパク質内のGly含有配列の存在が、MHCクラスＩ抗原のプロセシングを妨げるか、あるいはMHCクラスＩ拘束提示を利用しにくい細胞区画にプロセシング産物を隔離するシグナルを生じると結論づけられる。従って、抗原プロセシングおよびMHCクラスＩ拘束提示ができないことにより、宿主のクラスＩ型から独立した免疫系の回避が可能になる。実施例ＶＩＩ EBNA1 グリシン含有配列の外来抗原性タンパク質への挿入以下の実験を、EBNA 1gly-ala反復の抗原性タンパク質への挿入が、組換えタンパク質を発現する細胞の免疫系による認識を妨げることを実証するために行った。gly-ala配列(図２)を含むキメラEBNA4タンパク質を発現する組換えワクシニアウイルスを作製した。Nocl部位(ゲノム位置(gp)：108067)からApal部位(gp：1 09261)に伸長し、アミノ側およびカルボキシル側で隣接する残基とともに内部gl y-ala反復領域(IR、B95.8EBNA1配列に相対的にアミノ酸39〜437)を含むEBNA1フラグメントを、アミノ酸残基trp624とpro625との間のEBNA4のMsel部位(gp：9730 2)に挿入することにより、pBS-E41Rプラスミドを構築した。正しい方向のクローンを配列決定し、適切なリーディングフレーム配列を確認した。EBNA4IRオープンリーディングフレーム(E4IR)を、EcoRIおよびSstIIによって切り出し、そして末端を修復し、そしてpSCllのSmal部位に連結した。P7.5プロモーターに対して逆方向のクローンを選択した。組換えワクシニアウイルスを、上記で記載したように、上記のプラスミドをWR型野生型ワクシニア感染TK-4細胞株にトランスフェクトすることによって産生し、そして以前に記載されたように、ウイルスのストックを調製し、CV-1細胞において滴定した((Murray，R.ら、J．Exp．Med．176， 157-168，1992)。Vacc-EBNA4およびVacc-E4IR組換え体を感染させたHLA A11陽性細胞を、組換えタンパク質の発現ならびにEBNA4 399-408および416-424エピトープに対して特異的なCTLによる溶解に対する感受性について評価した。広範な感染多重度にわたって実施した実験において検出された陽性細胞のパーセンテージおよび蛍光強度から判断すると、組換えタンパク質は同一の速度論および類似したレベルで発現していた(Levitskayaら、Nature 375:685-688，1995)。Vacc-EBN A4を感染したHLA A11陽性線維芽細胞は、感染多重度５で(図5C)６時間後(図5A) に最大の溶解をともなって、399-408または416-424エピトープに対して特異的な CTLクローンによる溶解に対して感受性になった。対照的に、Vacc-E4IRを感染した細胞は、６倍高い感染多重度での感染後、または長期にわたる期間の間でさえも、ごく弱くしか溶解されなかった。内因性EBNA4 399-408およ416-424エピトープの認識を中断させる選択的な変異体でのチャイニーズEBV単離物を保有するQ JZsp LCLを感染させた場合、本質的に類似した結果が得られた(図5Bおよび5D)。目的の抗原性タンパク質内のgly含有配列の存在が、標的細胞の細胞血統と独立してプロセシングおよびMHCクラスＩ拘束提示を阻害すると結論づけられる。この結果により、gly含有配列は、抗原プロセシング-提示のシス作用インヒビターとして機能することが示された。使用本発明は、組換えタンパク質(例えば、i.遺伝子療法目的のためのヒトまたは他の種の細胞において発現されるべき抗原性タンパク質；ii.上記の目的のために使用される転移ベクターの抗原性構造タンパク質または調節タンパク質；およびiii.抗原性であることが意図されないワクチンの成分)に関する所望でない免疫応答を避けるために提供される。グリシン含有ポリペプチドをコードする核酸配列、またはそれらの機能的誘導体の挿入は、治療用タンパク質をコードする遺伝子、マーカー遺伝子、ウイルスベクターの調節タンパク質、またはワクチン成分の改変のための使用され得る。哺乳類細胞において発現されるべき治療用タンパク質には、酵素、サイトカイン、リンホカイン、細胞接着分子、コスティミュレーター分子、あるいは薬剤耐性遺伝子または腫瘍抑制遺伝子のタンパク質産物が挙げられるが、これらに限定されない。マーカー遺伝子として、例えば、neoR、多剤耐性遺伝子、チミジンキナーゼ遺伝子、β-ガラクトシダーゼ、ジヒドロ葉酸レダクターゼ(DHFR)、および治療用遺伝子と共にまたは別々に細胞に挿入され得るクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼが挙げられるが、これらに限定されない。例えば、腫瘍特異的CTLはマーカー遺伝子を含み得、従って、コードされるマーカータンパク質でタグ化される。本発明のこの実施態様は、マーカータンパク質が免疫原性であり、従って、CTLの治療効果を深刻に減少させ得るような場合に有用である。一旦患者に注射されると、タグ化されたCTLの腫瘍部位への進行はマーカーを介して追跡され、そしてマーカー自身は本発明により非免疫原性にされる。マーカー遺伝予および治療用遺伝子もまた、同じであり得る。ウイルスの構造タンパク質または調節タンパク質は、しばしば患者において免疫原性である。このようなタンパク質は、遺伝子療法の目的のために使用または開発されたウイルスベクターによってしばしばコードされる；例えば、ワクシニアウイルス、アデノウイルス、ヘルペスウイルス、またはレトロウイルスに基づくベクター。本発明の組換えタンパク質として有用なワクチンの成分は、有効なワクチン接種に必要なワクチン成分を含むが、非抗原性ワクチン成分(例えば、エンベロープ、カプシドのような構造的成分、またはウイルス、細菌、または寄生体の感染の調節タンパク質、またはガンワクチンの成分)として所望される。ワクチンの特定の成分を非抗原性にすることによって、宿主免疫応答がワクチンの免疫原性成分に対してより有効になると考えられる。用量および薬学的処方物ウイルス疾患または遺伝的疾患に悩まされる患者は、インビボまたはエクソビボ法により本発明に従って処置され得る。インビボ処置の例として、本発明の組換え核酸またはタンパク質は、好ましくは生物学的に適合可能な溶液または薬学的に受容可能な送達ビヒクルによって、経口摂取、注射、吸入、または多くの他の方法によって患者に投与され得る。患者に投与される投与量は、患者によって異なり；「治療有効量」は、あらゆる危険または有害な副作用に対して均衡した、転移された遺伝性物質の機能の増強のレベルによって決定される。遺伝子導入、遺伝子発現のレベル、および／またはコードされる組換えタンパク質の存在またはレベルをモニターすることにより、投与される用量の選択および調整が補助される。一般に、本明細書中上記のような組換えタンパク質を含む組成物は、10 ng〜10μg/kg体重の範囲、好ましくは100ng〜10μg/kg体重の範囲の単回容量で投与される。他の実施態様が当業者に明らかである。上記の例が例示のためにのみ提供されることが理解されるべきである。本発明の範囲は、上記の例に制限されず、以下の請求の範囲において規定される。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号ＦＩＣ１２Ｎ 5/10 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｂ // Ａ６１Ｋ 38/00 Ａ６１Ｋ 37/02 (31)優先権主張番号０８／５２９，１９０ (32)優先日 1995年９月15日 (33)優先権主張国米国（ＵＳ） (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)，ＵＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ

Claims

【特許請求の範囲】１．抗原性タンパク質を、該タンパク質にグリシンリッチ反復配列を挿入することにより免疫系に対して不認識化する方法。２．前記グリシンリッチ反復配列が、以下の一般的な反復単位： [Gly_aX Gly_bY Gly_cZ] の「n」回の隣接反復を含む任意のアミノ酸配列であり、ここで、aは、１、２、または３であり；bは、１、２、または３であり；cは、１、２、または３であり；各X、Y、およびZは、独立して、環状構造を有さず、そして３原子未満の側鎖を有する疎水性または極性アミノ酸であり；そしてここで、「n」は、１から66 の間の整数である、請求項１に記載の方法。３．前記グリシンリッチ反復配列が、図１に示すEBNA1グリシンリッチ配列である、請求項１または請求項２に記載の方法。４．請求項１から３のいずれかに記載の方法により形成されるタンパク質。５．請求項４に記載のタンパク質をコードする核酸。６．請求項５に記載の核酸配列を含むベクター。７．請求項６に記載のベクターで形質転換した宿主細胞。８．グリシンリッチ反復配列を含む抗原性タンパク質に免疫系を回避する能力を付与する該グリシンリッチ反復配列について試験するための方法であって、該方法は、請求項４に記載のタンパク質を発現する宿主細胞を、該請求項４に記載のタンパク質および参照タンパク質に共通のエピトープに特異的な免疫系の細胞とともに、該エピトープの免疫学的認識を可能にする条件下でインキュベートする工程を包含し、ここで、該エピトープは、該参照タンパク質において免疫原性であることが公知であるか測定され、そして免疫学的認識が存在しないことは免疫系の回避であることの指標である、方法。９．請求項４に記載のタンパク質または請求項５に記載の核酸を、薬学的に受容可能なキャリアまたは希釈剤と組み合わせて含む、薬学的組成物。１０．治療において使用するための請求項４に記載のタンパク質または請求項５に記載の核酸。１１．遺伝子療法により疾患を処置するための組成物の製造における請求項４に記載のタンパク質または請求項５に記載の核酸の使用。