JP4155669B2 - 植物の発熱関連遺伝子と発熱関連タンパク質 - Google Patents
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Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
この出願の発明は、植物の発熱関連遺伝子と発熱関連タンパク質に関するものである。さらに詳しくは、この出願の発明は、低温耐性植物の開発等の植物育種分野、糖尿病や肥満等の治療に関する医学分野、植物由来の新規発熱素材開発等の工学分野において有用なザゼンソウ（Symplocarpus foetidus）由来の発熱関連遺伝子とこの遺伝子の発現産物である発熱関連タンパク質に関するものである。
【０００２】
【従来の技術とその課題】
低温、乾燥および塩ストレスは、陸棲植物が遭遇する共通の有害な環境因子である。これらのストレスのうち、低温傷害および凍結傷害を引き起こす低温は作物の生産性を制限する最も重要な因子であると考えられている（Levitt, 1980）。これらの低温ストレスに対処するために、コムギやライムギのような耐冷植物は低温馴化を導く多くの生理学的応答および代謝応答を行う（Sakai and Larcher, 1987； Steponkus, 1984； Thomashow, 1998； Uemura and Steponkus, 1997）。対照的に、ザゼンソウを含むいくつかの植物は熱発生によって冷却化を回避する特殊化された機構を有していることが知られている（Knutson, 1974； Nagy et al., 1972； Schneider and Buchenen, 1980）。
【０００３】
早春に咲くザゼンソウの肉穂花序（spadix）における花の温度は、大気温度が−15℃に低下する場合であっても＋10℃よりも高いままである（Knutson, 1974）。例えば、図１は、屋外で採取したザゼンソウを人工気象室内に移し、部屋の温度を低下させた際の肉穂花序の温度を赤外線カメラで測定した結果である。この図１からも明らかなように、ザゼンソウの肉穂花序の温度は気温が低下してもほぼ19℃を保っている。
【０００４】
このような温度維持は、12℃から氷点下の温度レベルに呼吸速度を倍増することによって達成されている。熱発生植物によって生成される熱は植物のミトコンドリアに特有の経路、すなわち代替オキシダーゼ（ＡＯＸ）によって調節されるミトコンドリアのシアン化物非感受性・非リン酸化電子輸送経路の活性増加に関連すると考えられてきた（Berthold and Siedow, 1993； Ito et al., 1997；McIntosh, 1994； Wangner and Krab, 1995）。
【０００５】
一方、哺乳動物においては、脱共役タンパク質（uncoupling protein：ＵＣＰ）と呼ばれるミトコンドリアタンパク質が熱産生において重要な役割を果たすことが示されてきた。ミトコンドリアの内膜において見出されるＵＣＰｓは、膜内にＨ+を流入させることによって、化学エネルギーを代謝熱へと散逸させるＡＴＰ合成から呼吸を脱共役する（Klaus et al., 1991； Klingenberg and Winkler, 1985； Ricquier et al., 1991）。動物においては、３つのＵＣＰが見出されている。ＵＣＰ１は主として褐色脂肪組織に分布し（Nichollus and Locke, 1984）、ＵＣＰ２は多くの組織において偏在的に見出され（Fleury et al., 1997）、ＵＣＰ３は骨格筋に極めて特異的である（Boss et al., 1997）。
【０００６】
哺乳動物ＵＣＰｓは、ミトコンドリアの他のキャリアタンパク質と同様に、６つの膜貫通セグメントから構成され、その疎水性部分は対合した両親媒性α−ヘリックス構造に由来すると考えられている（Liu et al., 1988： Maia et al.,1998）。さらに、これらのＵＣＰｓの活性は、プリンヌクレオチド（ATP、GTP、GDPおよびADP）をＣ末端領域に結合することによって低下し、遊離脂肪酸によって増加することも知られている（Jezek et al., 1998； Lin and Klingenberg, 1982； Katiyar and Shrago, 1989； Rial et al., 1983； Sluse et al., 1998）。
【０００７】
これに対して、近年、植物由来のＵＣＰ様タンパク質をコードする２つのｃＤＮＡが、ジャガイモ（ＳｔＵＣＰ：Laloi et al., 1997）およびシロイヌナズナ（ＡｔＰＵＭＰ：Maia et al., 1998）から単離された。ＳｔＵＣＰの発現は主として花および果実において検出されたため、ＡＯＸと共に、開花および果実熟成において激発する呼吸に関連し得ると仮定されている（Laloi et al., 1997）。
【０００８】
ジャガイモおよびシロイヌナズナは非熱発生植物であると考えられているが、ＳｔＵＣＰおよびＡｔＰＵＭＰの低温誘導性発現は、これらの遺伝子が熱発生に関与していることを示唆する（Laloi et al., 1997； Mala et al.,1998）。
しかしながら、ザゼンソウのような熱発生植物において、ＵＣＰ様タンパク質が媒介する熱生成の分子機構は全く同定されていない。
【０００９】
【発明が解決しようとする課題】
この出願の発明は、これまでに同定されていない熱発生植物ザゼンソウ由来の新規ＵＣＰ遺伝子を提供することを課題としている。
またこの出願は、この新規遺伝子の発現産物であるザゼンソウＵＣＰを提供することを課題としてもいる。
【００１０】
【課題を解決するための手段】
この出願は、前記の課題を解決するための発明として、ザゼンソウ由来の発熱関連遺伝子であって、ｃＤＮＡが配列番号１の塩基配列を有することを特徴とする遺伝子ＳfＵＣＰａと、ｃＤＮＡが配列番号３の塩基配列を有することを特徴とする遺伝子ＳfＵＣＰｂを提供する。
【００１１】
またこの出願は、前記の遺伝子ＳfＵＣＰａが発現する発熱関連タンパク質であって、配列番号２のアミノ酸配列を有することを特徴とするタンパク質ＳfＵＣＰＡと、前記の遺伝子ＳfＵＣＰｂが発現する発熱関連タンパク質であって、配列番号４のアミノ酸配列を有することを特徴とするタンパク質ＳfＵＣＰＢをそれぞれ提供する。
【００１２】
さらにこの出願は、配列番号１の塩基配列またはその一部配列を有するＤＮＡ断片と、配列番号３の塩基配列またはその一部配列を有するｃＮＡ断片とをそれぞれ提供する。
すなわち、この発明の遺伝子ＳfＵＣＰａは、そのｃＤＮＡが配列番号１の塩基配列を有しており、このｃＤＮＡが配列番号２のアミノ酸配列を有する推定分子量32.6kDaのタンパク質ＳfＵＣＰＡをコードしている。また、この発明の遺伝子ＳfＵＣＰｂのｃＤＮＡ（配列番号３）は、配列番号４のアミノ酸配列を有する推定分子量29.0kDaのタンパク質ＳfＵＣＰＢをコードしている。
【００１３】
この発明の遺伝子ＳfＵＣＰａおよびＳfＵＣＰｂは、低温時に肉穂花序特異的に発現するザゼンソウ遺伝子である。すなわち、公知の方法（Ito et al.,1999）により抽出したザゼンソウ全ＲＮＡについてノーザンブロッティング（Ito et al., 1994）を行った結果、図２に示したように、室温（15℃）において両遺伝子とも肉穂花序での発現が検出されたが、葉では検出されないことが確認されている。また、肉穂花序に特異的な両遺伝子の発現は、低温処理（４℃、３日間）によって誘導されることも確認されている。
【００１４】
この出願の遺伝子がそれぞれに発現するタンパク質ＳfＵＣＰＡおよびＳfＵＣＰＢのアミノ酸配列は、ホモロジー検索の結果、ヒトＵＣＰに対してよりも、植物ＵＣＰに対してより高い相同性を示す（図３）。すなわち、ＳfＵＣＰＡのアミノ酸配列は、ＳtＵＣＰ、ＡtＰＵＭＰ、ヒトＵＣＰ、ＵＣＰ２およびＵＣＰ３に対して、それぞれ、79%、75%、44%、48%および48%同一である。ＳfＵＣＰＢはＳtＵＣＰ、ＡtＰＵＭＰ、ヒトＵＣＰ、ＵＣＰ２およびＵＣＰ３に対して、それぞれ、71%、66%、41%、43%および44%同一である。
【００１５】
また、ＳfＵＣＰＡおよびＳfＵＣＰＢは互いに高い配列同一性（88%）を示すが、図３に示したように、ＳfＵＣＰＡの第204番目Thrと第238番目Valとの間のアミノ酸配列に対応する領域が、ＳfＵＣＰＢにおいては完全に欠失している。さらに、ＳfＵＣＰＡの第265番目のLeuは、ＳfＵＣＰＢではProに置換されている。
【００１６】
ＳfＵＣＰＡは、他のミトコンドリアＵＣＰタンパク質と同様の構造を有している。すなわち、ＳfＵＣＰＡは、図４に疎水性プロットを示したとおりに６カ所の膜貫通ドメインを有し、そのトポロジーは図５に示したとおりである。加えて、このＳfＵＣＰＡはミトコンドリアエネルギー伝達タンパク質に特徴的なドメイン（Boss et al., 1997； Maia et al., 1998）を３カ所に有している（図３）。一方、ＳfＵＣＰＢは、３番目のミトコンドリアエネルギー伝達タンパク質特徴的ドメインを欠損しているとともに（図３）、５番目の膜貫通ドメインが欠失しており（図３および図６）、そのトポロジーはＣ末端がミトコンドリアのマトリックス側に向いている（図７）。
【００１７】
いずれのタンパク質もＣ末端にプリンヌクレオチド結合ドメイン（ＰＮＢＤ）を有しているが（図３、図５および図７）、ＵＣＰはプリンヌクレオチドの結合によりミトコンドリア内膜における脱共役機能が抑制されることが知られている。しかし、ＳfＵＣＰＢはＣ末端がミトコンドリアのマトリックス側に向いていることから、プリンヌクレオチドの結合による活性抑制を免れている可能性がある。このようなトポロジーを有するＵＣＰは動物、植物を問わず従来全く知られていない。
【００１８】
この出願によって提供されるザゼンソウ由来の発熱関連遺伝子ＳfＵＣａおよびＳfＵＣＰｂは、例えば、遺伝子組換え技術を用いた低温耐性植物の開発に極めて有用である。また、この遺伝子の発現産物であるタンパク質ＳfＵＣＰＡおよびＳfＵＣＰＢは、ＡＴＰ合成に対する脱共役機能により、糖尿病や肥満等の治療薬の有効成分等として期待される。さらには、このような発熱関連タンパク質は植物由来の新規発熱素材としても有望である。
【００１９】
以下、各発明の実施の形態をさらに詳しく説明する。
【００２０】
【発明の実施の形態】
この発明の遺伝子ＳfＵＣＰａおよびＳfＵＣＰｂは、各々、この発明の各ｃＤＮＡ（配列番号１または３）もしくはそれらの一部配列をプロ−ブとして、ザゼンソウのゲノムＤＮＡから単離することができる。例えば、ゲノムＤＮＡから公知の方法によりゲノムライブラリーを作成し、ｃＤＮＡの任意部分の塩基配列に基づいて合成したオリゴヌクレオチドをプローブとして、公知の方法によりコロニーあるいはプラークハイブリダイゼーションによるスクリーニングを行えばよい。あるいは、染色体に対するin situハイブリダイゼーションによって目的の遺伝子領域を同定することもできる。
【００２１】
この発明の各ｃＤＮＡは、例えば、ザゼンソウのポリ(A)+ＲＮＡを鋳型として合成したｃＤＮＡライブラリーからクローン化することができる。その場合には、この発明によって提供されるｃＤＮＡの任意部分のオリゴヌクレオチドを合成し、これをプローブとして用いて、公知の方法によりコロニーあるいはプラークハイブリダイゼーションによるスクリーニングを行えばよい。また、目的とするｃＤＮＡ断片の両末端にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドを合成し、これをプライマーとして用いて、ザゼンソウ細胞から単離したｍＲＮＡからＲＴ−ＰＣＲ法により、この発明のｃＤＮＡを調製することもできる。
【００２２】
なお、一般に真核細胞の遺伝子は多型が頻繁に認められる。従って配列番号１および３において、１または複数個のヌクレオチドの付加、欠失および／または他のヌクレオチドによる置換がなされているｃＤＮＡもこの発明のｃＤＮＡに含まれる。同様に、これらの塩基の変更によって生じる１または複数個のアミノ酸の付加、欠失および／または他のアミノ酸による置換がなされているタンパク質もこの発明に含まれる。
【００２３】
この発明のｃＤＮＡには、配列番号１および３の塩基配列のいかなる部分配列を含むＤＮＡ断片（１０ｂｐ以上）も含まれる。また、センス鎖およびアンチセンス鎖からなるＤＮＡ断片も含まれる。
この発明のタンパク質ＳfＵＣＰＡおよびＳfＵＣＰＢは、それぞれ公知の方法、すなわちザゼンソウの肉穂花序などから単離する方法、この出願によって提供されるアミノ酸配列に基づいて化学合成によりペプチドを調製する方法、あるいはこの出願によって提供されるｃＤＮＡを用いて組換えＤＮＡ技術で生産する方法などにより取得することができる。例えば、組換えＤＮＡ技術によってタンパク質を取得する場合には、この発明のｃＤＮＡを保有するベクターからインビトロ転写によってＲＮＡを調製し、これを鋳型としてインビトロ翻訳を行なうことにより、タンパク質を得ることができる。またｃＤＮＡの翻訳領域を公知の方法により適当な発現ベクターに組換え、この組換えベクターで大腸菌、枯草菌、酵母、動植物細胞等を形質転換すれば、これらの形質転換体でタンパク質を大量に発現させることができる。
【００２４】
この発明のタンパク質をインビトロ翻訳で生産させる場合には、ＲＮＡポリメラーゼプロモーターを有するベクターにこの発明のｃＤＮＡの翻訳領域を組換え、プロモーターに対応するＲＮＡポリメラーゼを含むウサギ網状赤血球溶解物や小麦胚芽抽出物などのインビトロ翻訳系に添加すればよい。ＲＮＡポリメラーゼプロモーターとしては、Ｔ７、Ｔ３、ＳＰ６などが例示できる。
【００２５】
また、この発明のタンパク質を大腸菌などの微生物で発現させる場合には、微生物中で複製可能なオリジン、プロモーター、リボソーム結合部位、ｃＤＮＡクローニング部位、ターミネーター等を有する発現ベクターに、この発明のｃＤＮＡの翻訳領域を組換えて発現ベクターを作成し、この発現ベクターで宿主細胞を形質転換したのち、得られた形質転換体を培養すればよい。この際、任意の翻訳領域の前後に開始コドンと停止コドンを付加すれば、任意の領域を含むタンパク質断片を得ることができる。あるいは、他のタンパク質との融合タンパク質として発現させ、この融合タンパク質を適当なプロテアーゼで切断することによって目的とするタンパク質のみを取得することもできる。大腸菌用発現ベクターとしては、ｐＵＣ系、ｐＢluescript II、ｐＥＴ発現システム、ｐＧＥＸ発現システムなどが例示できる。
【００２６】
この発明のタンパク質を真核細胞で発現させる場合には、この発明のｃＤＮＡの翻訳領域を、プロモーター、スプライシング領域、ポリ(A)付加部位等を有する真核細胞用発現ベクターに組換え、真核細胞内に導入する。発現ベクターとしては、ｐＫＡ１、ｐＣＤＭ８、ｐＳＶＫ３、ｐＭＳＧ、ｐＳＶＬ、ｐＢＫ−ＣＭＶ、ｐＢＫ−ＲＳＶ、ＥＢＶベクター、ｐＲＳ、ｐＹＥＳ２などが例示できる。真核細胞としては、サル腎臓細胞ＣＯＳ７、チャイニーズハムスター卵巣細胞ＣＨＯなどの哺乳動物培養細胞、出芽酵母、分裂酵母、カイコ細胞、アフリカツメガエル卵細胞などが一般に用いられるが、これらに限定されるものではない。発現ベクターを真核細胞に導入するには、電気穿孔法、リン酸カルシウム法、リポソーム法、ＤＥＡＥデキストラン法など公知の方法を用いることができる。
【００２７】
上記の方法により原核細胞や真核細胞でタンパク質を発現させたのち、培養物から目的タンパク質を単離精製するためには、公知の分離操作を組み合わせて行う。例えば、尿素などの変性剤や界面活性剤による処理、超音波処理、酵素消化、塩析や溶媒沈殿法、透析、遠心分離、限外濾過、ゲル濾過、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、等電点電気泳動、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー等である。
【００２８】
この発明のタンパク質ＳfＵＣＰＡおよびＳfＵＣＰＢには、配列番号２および４のアミノ酸配列におけるいかなる部分配列を含むペプチド断片（５アミノ酸残基以上）も含まれる。また、この発明のタンパク質には、他の任意のタンパク質との融合タンパク質も含まれる。
【００２９】
【実施例】
以下、実施例を示してこの出願の発明についてさらに詳細かつ具体的に説明するが、この出願の発明は以下の例によって限定されるものではない。
実施例１：ｃＤＮＡのクローニング
ザゼンソウの肉穂花序から全ＲＮＡを抽出し、1.0%アガロースゲル電気泳動によって完全なＲＮＡを決定した（Ito et al., 1999）。ｍＲＮＡ単離キット（Pharmacia）を用いて精製したポリ(A)+ＲＮＡから、ＲＴ−ＰＣＲ法によりＵＣＰ遺伝子ファミリーの関連クローンを単離した。第１鎖ｃＤＮＡは、ポリ(A)+ＲＮＡ（0.1μg）に20pmolのｃＤＮＡプライム化プライマー（5'-TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT-3'）をアニールし、次いで10ユニットの逆転写酵素（New England Biolab）を使用して、37℃で30分間、10mM 1，4-ジチオトレイトールおよび0.5mM dNTPを含有する20μlの１×RT緩衝液中で伸長した。反応溶液の組成は以下のとおりである。
【００３０】
・10mM Tris-HCl（pH8.0）；
・50mM KCl；
・1.5mM MgCl2；
・４mM dNTP；
・0.2ユニットのEX Taqポリメラーゼ（Takara）；および
・ＵＣＰファミリーの保存されたアミノ酸配列に対応する10pmolの２つの縮重プライマー：
ＺＦ１（5'-CCIYTIGAYACIGCIAAR-3'）；
ＺＲ１（5'-ACWTTCCAISYICCIAWIC-3'）
また、ＰＣＲサイクルは以下のとおりとした。
【００３１】
（94℃：0.5分間、50℃：１分間、72℃：１分間）×３５
以上の方法により得たＰＣＲ産物のうち、約0.8kbのｃＤＮＡフラグメントの配列から推定されるアミノ酸配列は、ＵＣＰ遺伝子群の１つのリーディングフレーム配列と極めて高い相同性を示したので、このフラグメントをＴ-ベクターにクローニングし（クローンp2-1）、ライブラリースクリーニングのためのプローブとした。
【００３２】
肉穂花序から調製したポリ(A)+ＲＮＡ（５μg）を公知の方法（Sambrool et al., 1989）によってλgt11ファージに挿入し、ｃＤＮＡライブラリーを構築した。このライブラリーから前記プローブに対するポジティブクローン８個を単離し、pBluescript SKプラスミド（Stratagene）にサブクローニングした。そして、これらのクローンから、完全長のＳfＵＣＰａｃＤＮＡおよびＳfＵＣＰｂｃＤＮＡをそれぞれ保有するクローンｐｚ８−１およびｐｚ８−２を得た。
【００３３】
なお、各クローンのインサートは、BcaBest配列決定キット（Takara）ならびにT3、T7および遺伝子特異的プライマーを用い、ABI373A自動化シーケンサーにより配列決定した。配列データを、GENETYX-Homologyソフトウエアシステム・バージョン2.2.0（Software Development）を使用して解析した。
ＳfＵＣＰａのｃＤＮＡは、配列番号１に示した1,525bpの塩基配列を有しており、ＳfＵＣＰのｃＤＮＡは配列番号３に示した2,991bpの塩基配列を有していた。推定のポリアデニル化シグナル（aataaa）は、ＳfＵＣＰａのｃＤＮＡではポリ(A)配列から236bp上流で見出されたが、ＳfＵＣＰｂのｃＤＮＡでは1,171bpおよび1,243bpの位置に２つのポリアデニル化部位が認められた。ＳfＵＣＰａに比較してＳfＵＣＰｂのｃＤＮＡが長い３'非翻訳領域を含むという事実は注目に値する。
【００３４】
また、ＳfＵＣＰａのｃＤＮＡは、配列番号１に示したように、303アミノ酸をコードするオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含んでおり、このＯＲＦには配列番号２に示したアミノ酸配列を有する推定分子量32.6kDaのタンパク質ＳfＵＣＰＡがコードされていた。一方、ＳfＵＣＰｂのｃＤＮＡは、配列番号３に示したように、268アミノ酸のＯＲＦを含んでおり、このＯＲＦには推定分子量29.0kDaのタンパク質ＳfＵＣＰＢがコードされていた。
【００３５】
さらに、サザンブロット分析の結果から、ザゼンソウのゲノムはＳfＵＣＰａ遺伝子を複数コピー、ＳfＵＣＰｂ遺伝子を単一コピー含んでいることが確認された（データ示さず）。
実施例２：ｃＤＮＡのインビトロ翻訳
実施例１で得たプラスミドクローンｐｚ８−１およびｐｚ８−２を直線化し、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼまたはＴ３ ＲＮＡポリメラーゼを使用して、MAXICRIPT転写キット（Ambion）のプロトコルに従い、センスまたはアンチセンスＲＮＡを転写した。等量のＲＮＡ（４μg）を35S-メチオニン（Amersham）の存在下でコムギ胚抽出物（Promega）を用いたインビトロ翻訳反応に供した。翻訳産物はＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析した。ゲルを固定し、Amplify（Amersham）中でインキュベートした後に乾燥し、蛍光分析した。
【００３６】
その結果、図８に示したように、いずれのｃＤＮＡともセンスＲＮＡを鋳型とした時にのみ予想された分子量のタンパク質が産生されることから、実施例１で単離したｃＤＮＡの開始コドンおよび終始コドンが正しく機能していることが確認された。
【００３７】
【発明の効果】
以上詳しく説明したとおり、この出願によって、熱発生植物であるザゼンソウ由来の新規発熱関連遺伝子ＳfＵＣＰａおよびＳfＵＣＰｂ、並びにこれらの遺伝子産物である発熱関連タンパク質ＳfＵＣＰＡおよびＳfＵＣＰＢ、さらにはこれらのタンパク質を遺伝子工学的に大量生産するための遺伝子ｃＤＮＡが提供される。これらの遺伝子およびタンパク質によって、低温耐性植物の開発、糖尿病や肥満等の治療薬および治療方法の開発、植物由来の新規発熱素材の開発等が可能となる。
【００３８】
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図１】ザゼンソウの肉穂花序の温度と気温の経時的変化を示したグラフである。
【図２】室温（RT）および冷却条件（４℃、３日間）での、ザゼンソウの肉穂花序および葉におけるＳfＵＣＰａ（Ａ）およびＳfＵＣＰｂ（Ｂ）転写産物の発現プロフィールを示したノーザンブロッティングの結果である。各々の下側の図は、未分解のｒＲＮＡをエチジームブロマイド染色した結果である。
【図３】ＳfＵＣＰＡおよびＳfＵＣＰＢと、既存のジャガイモＵＣＰ（ＳtＵＣＰ）、シロイヌナズナＵＣＰ（ＡtＰＵＭＰ）およびヒトＵＣＰのアミノ酸配列比較図である。配列下段の星記号（＊）は同一アミノ酸残基を示し、点記号（．）は全ての配列内での保存的な変化を表す。太字は、ＳfＵＣＰＡとＳfＵＣＰＢとの同一配列を示す。配列アラインメントを最適化するために導入したギャップをダッシュ記号（−）で示す。アラインメントは、CLUSTAL Wプログラムを用いて行った。典型的なミトコンドリアエネルギー伝達タンパク質の特徴的ドメインを四角で囲む。配列上段の斜線横軸（Ｉ〜VI）は予測される膜貫通ドメインを示す。
【図４】ＳfＵＣＡの疎水性プロットである。縦軸は疎水性の程度を示し、予想される膜貫通ドメインをＴＭ１からＴＭ６で示した。
【図５】ミトコンドリア膜内におけるＳfＵＣＡのトポロジーの模式図である。
【図６】ＳfＵＣＢの疎水性プロットである。縦軸は疎水性の程度を示し、予想される膜貫通ドメインをＴＭ１からＴＭ４およびＴＭ６で示した。
【図７】ミトコンドリア膜内におけるＳfＵＣＢのトポロジーの模式図である。
【図８】遺伝子ＳfＵＣＰaおよびＳfＵＣＰbの各々のｃＤＮＡを鋳型とするインビトロ翻訳の結果である。（−）はコントロール、ＳはセンスＲＮＡ、ＡＳはアンチセンスＲＮＡを示す。星印記号（＊）は非特異的産物であり、白丸は小さなＯＲＦによって合成された低分子量の翻訳人工産物の位置を示す。
【参考文献】
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【発明の属する技術分野】
この出願の発明は、植物の発熱関連遺伝子と発熱関連タンパク質に関するものである。さらに詳しくは、この出願の発明は、低温耐性植物の開発等の植物育種分野、糖尿病や肥満等の治療に関する医学分野、植物由来の新規発熱素材開発等の工学分野において有用なザゼンソウ（Symplocarpus foetidus）由来の発熱関連遺伝子とこの遺伝子の発現産物である発熱関連タンパク質に関するものである。
【０００２】
【従来の技術とその課題】
低温、乾燥および塩ストレスは、陸棲植物が遭遇する共通の有害な環境因子である。これらのストレスのうち、低温傷害および凍結傷害を引き起こす低温は作物の生産性を制限する最も重要な因子であると考えられている（Levitt, 1980）。これらの低温ストレスに対処するために、コムギやライムギのような耐冷植物は低温馴化を導く多くの生理学的応答および代謝応答を行う（Sakai and Larcher, 1987； Steponkus, 1984； Thomashow, 1998； Uemura and Steponkus, 1997）。対照的に、ザゼンソウを含むいくつかの植物は熱発生によって冷却化を回避する特殊化された機構を有していることが知られている（Knutson, 1974； Nagy et al., 1972； Schneider and Buchenen, 1980）。
【０００３】
早春に咲くザゼンソウの肉穂花序（spadix）における花の温度は、大気温度が−15℃に低下する場合であっても＋10℃よりも高いままである（Knutson, 1974）。例えば、図１は、屋外で採取したザゼンソウを人工気象室内に移し、部屋の温度を低下させた際の肉穂花序の温度を赤外線カメラで測定した結果である。この図１からも明らかなように、ザゼンソウの肉穂花序の温度は気温が低下してもほぼ19℃を保っている。
【０００４】
このような温度維持は、12℃から氷点下の温度レベルに呼吸速度を倍増することによって達成されている。熱発生植物によって生成される熱は植物のミトコンドリアに特有の経路、すなわち代替オキシダーゼ（ＡＯＸ）によって調節されるミトコンドリアのシアン化物非感受性・非リン酸化電子輸送経路の活性増加に関連すると考えられてきた（Berthold and Siedow, 1993； Ito et al., 1997；McIntosh, 1994； Wangner and Krab, 1995）。
【０００５】
一方、哺乳動物においては、脱共役タンパク質（uncoupling protein：ＵＣＰ）と呼ばれるミトコンドリアタンパク質が熱産生において重要な役割を果たすことが示されてきた。ミトコンドリアの内膜において見出されるＵＣＰｓは、膜内にＨ+を流入させることによって、化学エネルギーを代謝熱へと散逸させるＡＴＰ合成から呼吸を脱共役する（Klaus et al., 1991； Klingenberg and Winkler, 1985； Ricquier et al., 1991）。動物においては、３つのＵＣＰが見出されている。ＵＣＰ１は主として褐色脂肪組織に分布し（Nichollus and Locke, 1984）、ＵＣＰ２は多くの組織において偏在的に見出され（Fleury et al., 1997）、ＵＣＰ３は骨格筋に極めて特異的である（Boss et al., 1997）。
【０００６】
哺乳動物ＵＣＰｓは、ミトコンドリアの他のキャリアタンパク質と同様に、６つの膜貫通セグメントから構成され、その疎水性部分は対合した両親媒性α−ヘリックス構造に由来すると考えられている（Liu et al., 1988： Maia et al.,1998）。さらに、これらのＵＣＰｓの活性は、プリンヌクレオチド（ATP、GTP、GDPおよびADP）をＣ末端領域に結合することによって低下し、遊離脂肪酸によって増加することも知られている（Jezek et al., 1998； Lin and Klingenberg, 1982； Katiyar and Shrago, 1989； Rial et al., 1983； Sluse et al., 1998）。
【０００７】
これに対して、近年、植物由来のＵＣＰ様タンパク質をコードする２つのｃＤＮＡが、ジャガイモ（ＳｔＵＣＰ：Laloi et al., 1997）およびシロイヌナズナ（ＡｔＰＵＭＰ：Maia et al., 1998）から単離された。ＳｔＵＣＰの発現は主として花および果実において検出されたため、ＡＯＸと共に、開花および果実熟成において激発する呼吸に関連し得ると仮定されている（Laloi et al., 1997）。
【０００８】
ジャガイモおよびシロイヌナズナは非熱発生植物であると考えられているが、ＳｔＵＣＰおよびＡｔＰＵＭＰの低温誘導性発現は、これらの遺伝子が熱発生に関与していることを示唆する（Laloi et al., 1997； Mala et al.,1998）。
しかしながら、ザゼンソウのような熱発生植物において、ＵＣＰ様タンパク質が媒介する熱生成の分子機構は全く同定されていない。
【０００９】
【発明が解決しようとする課題】
この出願の発明は、これまでに同定されていない熱発生植物ザゼンソウ由来の新規ＵＣＰ遺伝子を提供することを課題としている。
またこの出願は、この新規遺伝子の発現産物であるザゼンソウＵＣＰを提供することを課題としてもいる。
【００１０】
【課題を解決するための手段】
この出願は、前記の課題を解決するための発明として、ザゼンソウ由来の発熱関連遺伝子であって、ｃＤＮＡが配列番号１の塩基配列を有することを特徴とする遺伝子ＳfＵＣＰａと、ｃＤＮＡが配列番号３の塩基配列を有することを特徴とする遺伝子ＳfＵＣＰｂを提供する。
【００１１】
またこの出願は、前記の遺伝子ＳfＵＣＰａが発現する発熱関連タンパク質であって、配列番号２のアミノ酸配列を有することを特徴とするタンパク質ＳfＵＣＰＡと、前記の遺伝子ＳfＵＣＰｂが発現する発熱関連タンパク質であって、配列番号４のアミノ酸配列を有することを特徴とするタンパク質ＳfＵＣＰＢをそれぞれ提供する。
【００１２】
さらにこの出願は、配列番号１の塩基配列またはその一部配列を有するＤＮＡ断片と、配列番号３の塩基配列またはその一部配列を有するｃＮＡ断片とをそれぞれ提供する。
すなわち、この発明の遺伝子ＳfＵＣＰａは、そのｃＤＮＡが配列番号１の塩基配列を有しており、このｃＤＮＡが配列番号２のアミノ酸配列を有する推定分子量32.6kDaのタンパク質ＳfＵＣＰＡをコードしている。また、この発明の遺伝子ＳfＵＣＰｂのｃＤＮＡ（配列番号３）は、配列番号４のアミノ酸配列を有する推定分子量29.0kDaのタンパク質ＳfＵＣＰＢをコードしている。
【００１３】
この発明の遺伝子ＳfＵＣＰａおよびＳfＵＣＰｂは、低温時に肉穂花序特異的に発現するザゼンソウ遺伝子である。すなわち、公知の方法（Ito et al.,1999）により抽出したザゼンソウ全ＲＮＡについてノーザンブロッティング（Ito et al., 1994）を行った結果、図２に示したように、室温（15℃）において両遺伝子とも肉穂花序での発現が検出されたが、葉では検出されないことが確認されている。また、肉穂花序に特異的な両遺伝子の発現は、低温処理（４℃、３日間）によって誘導されることも確認されている。
【００１４】
この出願の遺伝子がそれぞれに発現するタンパク質ＳfＵＣＰＡおよびＳfＵＣＰＢのアミノ酸配列は、ホモロジー検索の結果、ヒトＵＣＰに対してよりも、植物ＵＣＰに対してより高い相同性を示す（図３）。すなわち、ＳfＵＣＰＡのアミノ酸配列は、ＳtＵＣＰ、ＡtＰＵＭＰ、ヒトＵＣＰ、ＵＣＰ２およびＵＣＰ３に対して、それぞれ、79%、75%、44%、48%および48%同一である。ＳfＵＣＰＢはＳtＵＣＰ、ＡtＰＵＭＰ、ヒトＵＣＰ、ＵＣＰ２およびＵＣＰ３に対して、それぞれ、71%、66%、41%、43%および44%同一である。
【００１５】
また、ＳfＵＣＰＡおよびＳfＵＣＰＢは互いに高い配列同一性（88%）を示すが、図３に示したように、ＳfＵＣＰＡの第204番目Thrと第238番目Valとの間のアミノ酸配列に対応する領域が、ＳfＵＣＰＢにおいては完全に欠失している。さらに、ＳfＵＣＰＡの第265番目のLeuは、ＳfＵＣＰＢではProに置換されている。
【００１６】
ＳfＵＣＰＡは、他のミトコンドリアＵＣＰタンパク質と同様の構造を有している。すなわち、ＳfＵＣＰＡは、図４に疎水性プロットを示したとおりに６カ所の膜貫通ドメインを有し、そのトポロジーは図５に示したとおりである。加えて、このＳfＵＣＰＡはミトコンドリアエネルギー伝達タンパク質に特徴的なドメイン（Boss et al., 1997； Maia et al., 1998）を３カ所に有している（図３）。一方、ＳfＵＣＰＢは、３番目のミトコンドリアエネルギー伝達タンパク質特徴的ドメインを欠損しているとともに（図３）、５番目の膜貫通ドメインが欠失しており（図３および図６）、そのトポロジーはＣ末端がミトコンドリアのマトリックス側に向いている（図７）。
【００１７】
いずれのタンパク質もＣ末端にプリンヌクレオチド結合ドメイン（ＰＮＢＤ）を有しているが（図３、図５および図７）、ＵＣＰはプリンヌクレオチドの結合によりミトコンドリア内膜における脱共役機能が抑制されることが知られている。しかし、ＳfＵＣＰＢはＣ末端がミトコンドリアのマトリックス側に向いていることから、プリンヌクレオチドの結合による活性抑制を免れている可能性がある。このようなトポロジーを有するＵＣＰは動物、植物を問わず従来全く知られていない。
【００１８】
この出願によって提供されるザゼンソウ由来の発熱関連遺伝子ＳfＵＣａおよびＳfＵＣＰｂは、例えば、遺伝子組換え技術を用いた低温耐性植物の開発に極めて有用である。また、この遺伝子の発現産物であるタンパク質ＳfＵＣＰＡおよびＳfＵＣＰＢは、ＡＴＰ合成に対する脱共役機能により、糖尿病や肥満等の治療薬の有効成分等として期待される。さらには、このような発熱関連タンパク質は植物由来の新規発熱素材としても有望である。
【００１９】
以下、各発明の実施の形態をさらに詳しく説明する。
【００２０】
【発明の実施の形態】
この発明の遺伝子ＳfＵＣＰａおよびＳfＵＣＰｂは、各々、この発明の各ｃＤＮＡ（配列番号１または３）もしくはそれらの一部配列をプロ−ブとして、ザゼンソウのゲノムＤＮＡから単離することができる。例えば、ゲノムＤＮＡから公知の方法によりゲノムライブラリーを作成し、ｃＤＮＡの任意部分の塩基配列に基づいて合成したオリゴヌクレオチドをプローブとして、公知の方法によりコロニーあるいはプラークハイブリダイゼーションによるスクリーニングを行えばよい。あるいは、染色体に対するin situハイブリダイゼーションによって目的の遺伝子領域を同定することもできる。
【００２１】
この発明の各ｃＤＮＡは、例えば、ザゼンソウのポリ(A)+ＲＮＡを鋳型として合成したｃＤＮＡライブラリーからクローン化することができる。その場合には、この発明によって提供されるｃＤＮＡの任意部分のオリゴヌクレオチドを合成し、これをプローブとして用いて、公知の方法によりコロニーあるいはプラークハイブリダイゼーションによるスクリーニングを行えばよい。また、目的とするｃＤＮＡ断片の両末端にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドを合成し、これをプライマーとして用いて、ザゼンソウ細胞から単離したｍＲＮＡからＲＴ−ＰＣＲ法により、この発明のｃＤＮＡを調製することもできる。
【００２２】
なお、一般に真核細胞の遺伝子は多型が頻繁に認められる。従って配列番号１および３において、１または複数個のヌクレオチドの付加、欠失および／または他のヌクレオチドによる置換がなされているｃＤＮＡもこの発明のｃＤＮＡに含まれる。同様に、これらの塩基の変更によって生じる１または複数個のアミノ酸の付加、欠失および／または他のアミノ酸による置換がなされているタンパク質もこの発明に含まれる。
【００２３】
この発明のｃＤＮＡには、配列番号１および３の塩基配列のいかなる部分配列を含むＤＮＡ断片（１０ｂｐ以上）も含まれる。また、センス鎖およびアンチセンス鎖からなるＤＮＡ断片も含まれる。
この発明のタンパク質ＳfＵＣＰＡおよびＳfＵＣＰＢは、それぞれ公知の方法、すなわちザゼンソウの肉穂花序などから単離する方法、この出願によって提供されるアミノ酸配列に基づいて化学合成によりペプチドを調製する方法、あるいはこの出願によって提供されるｃＤＮＡを用いて組換えＤＮＡ技術で生産する方法などにより取得することができる。例えば、組換えＤＮＡ技術によってタンパク質を取得する場合には、この発明のｃＤＮＡを保有するベクターからインビトロ転写によってＲＮＡを調製し、これを鋳型としてインビトロ翻訳を行なうことにより、タンパク質を得ることができる。またｃＤＮＡの翻訳領域を公知の方法により適当な発現ベクターに組換え、この組換えベクターで大腸菌、枯草菌、酵母、動植物細胞等を形質転換すれば、これらの形質転換体でタンパク質を大量に発現させることができる。
【００２４】
この発明のタンパク質をインビトロ翻訳で生産させる場合には、ＲＮＡポリメラーゼプロモーターを有するベクターにこの発明のｃＤＮＡの翻訳領域を組換え、プロモーターに対応するＲＮＡポリメラーゼを含むウサギ網状赤血球溶解物や小麦胚芽抽出物などのインビトロ翻訳系に添加すればよい。ＲＮＡポリメラーゼプロモーターとしては、Ｔ７、Ｔ３、ＳＰ６などが例示できる。
【００２５】
また、この発明のタンパク質を大腸菌などの微生物で発現させる場合には、微生物中で複製可能なオリジン、プロモーター、リボソーム結合部位、ｃＤＮＡクローニング部位、ターミネーター等を有する発現ベクターに、この発明のｃＤＮＡの翻訳領域を組換えて発現ベクターを作成し、この発現ベクターで宿主細胞を形質転換したのち、得られた形質転換体を培養すればよい。この際、任意の翻訳領域の前後に開始コドンと停止コドンを付加すれば、任意の領域を含むタンパク質断片を得ることができる。あるいは、他のタンパク質との融合タンパク質として発現させ、この融合タンパク質を適当なプロテアーゼで切断することによって目的とするタンパク質のみを取得することもできる。大腸菌用発現ベクターとしては、ｐＵＣ系、ｐＢluescript II、ｐＥＴ発現システム、ｐＧＥＸ発現システムなどが例示できる。
【００２６】
この発明のタンパク質を真核細胞で発現させる場合には、この発明のｃＤＮＡの翻訳領域を、プロモーター、スプライシング領域、ポリ(A)付加部位等を有する真核細胞用発現ベクターに組換え、真核細胞内に導入する。発現ベクターとしては、ｐＫＡ１、ｐＣＤＭ８、ｐＳＶＫ３、ｐＭＳＧ、ｐＳＶＬ、ｐＢＫ−ＣＭＶ、ｐＢＫ−ＲＳＶ、ＥＢＶベクター、ｐＲＳ、ｐＹＥＳ２などが例示できる。真核細胞としては、サル腎臓細胞ＣＯＳ７、チャイニーズハムスター卵巣細胞ＣＨＯなどの哺乳動物培養細胞、出芽酵母、分裂酵母、カイコ細胞、アフリカツメガエル卵細胞などが一般に用いられるが、これらに限定されるものではない。発現ベクターを真核細胞に導入するには、電気穿孔法、リン酸カルシウム法、リポソーム法、ＤＥＡＥデキストラン法など公知の方法を用いることができる。
【００２７】
上記の方法により原核細胞や真核細胞でタンパク質を発現させたのち、培養物から目的タンパク質を単離精製するためには、公知の分離操作を組み合わせて行う。例えば、尿素などの変性剤や界面活性剤による処理、超音波処理、酵素消化、塩析や溶媒沈殿法、透析、遠心分離、限外濾過、ゲル濾過、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、等電点電気泳動、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー等である。
【００２８】
この発明のタンパク質ＳfＵＣＰＡおよびＳfＵＣＰＢには、配列番号２および４のアミノ酸配列におけるいかなる部分配列を含むペプチド断片（５アミノ酸残基以上）も含まれる。また、この発明のタンパク質には、他の任意のタンパク質との融合タンパク質も含まれる。
【００２９】
【実施例】
以下、実施例を示してこの出願の発明についてさらに詳細かつ具体的に説明するが、この出願の発明は以下の例によって限定されるものではない。
実施例１：ｃＤＮＡのクローニング
ザゼンソウの肉穂花序から全ＲＮＡを抽出し、1.0%アガロースゲル電気泳動によって完全なＲＮＡを決定した（Ito et al., 1999）。ｍＲＮＡ単離キット（Pharmacia）を用いて精製したポリ(A)+ＲＮＡから、ＲＴ−ＰＣＲ法によりＵＣＰ遺伝子ファミリーの関連クローンを単離した。第１鎖ｃＤＮＡは、ポリ(A)+ＲＮＡ（0.1μg）に20pmolのｃＤＮＡプライム化プライマー（5'-TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT-3'）をアニールし、次いで10ユニットの逆転写酵素（New England Biolab）を使用して、37℃で30分間、10mM 1，4-ジチオトレイトールおよび0.5mM dNTPを含有する20μlの１×RT緩衝液中で伸長した。反応溶液の組成は以下のとおりである。
【００３０】
・10mM Tris-HCl（pH8.0）；
・50mM KCl；
・1.5mM MgCl2；
・４mM dNTP；
・0.2ユニットのEX Taqポリメラーゼ（Takara）；および
・ＵＣＰファミリーの保存されたアミノ酸配列に対応する10pmolの２つの縮重プライマー：
ＺＦ１（5'-CCIYTIGAYACIGCIAAR-3'）；
ＺＲ１（5'-ACWTTCCAISYICCIAWIC-3'）
また、ＰＣＲサイクルは以下のとおりとした。
【００３１】
（94℃：0.5分間、50℃：１分間、72℃：１分間）×３５
以上の方法により得たＰＣＲ産物のうち、約0.8kbのｃＤＮＡフラグメントの配列から推定されるアミノ酸配列は、ＵＣＰ遺伝子群の１つのリーディングフレーム配列と極めて高い相同性を示したので、このフラグメントをＴ-ベクターにクローニングし（クローンp2-1）、ライブラリースクリーニングのためのプローブとした。
【００３２】
肉穂花序から調製したポリ(A)+ＲＮＡ（５μg）を公知の方法（Sambrool et al., 1989）によってλgt11ファージに挿入し、ｃＤＮＡライブラリーを構築した。このライブラリーから前記プローブに対するポジティブクローン８個を単離し、pBluescript SKプラスミド（Stratagene）にサブクローニングした。そして、これらのクローンから、完全長のＳfＵＣＰａｃＤＮＡおよびＳfＵＣＰｂｃＤＮＡをそれぞれ保有するクローンｐｚ８−１およびｐｚ８−２を得た。
【００３３】
なお、各クローンのインサートは、BcaBest配列決定キット（Takara）ならびにT3、T7および遺伝子特異的プライマーを用い、ABI373A自動化シーケンサーにより配列決定した。配列データを、GENETYX-Homologyソフトウエアシステム・バージョン2.2.0（Software Development）を使用して解析した。
ＳfＵＣＰａのｃＤＮＡは、配列番号１に示した1,525bpの塩基配列を有しており、ＳfＵＣＰのｃＤＮＡは配列番号３に示した2,991bpの塩基配列を有していた。推定のポリアデニル化シグナル（aataaa）は、ＳfＵＣＰａのｃＤＮＡではポリ(A)配列から236bp上流で見出されたが、ＳfＵＣＰｂのｃＤＮＡでは1,171bpおよび1,243bpの位置に２つのポリアデニル化部位が認められた。ＳfＵＣＰａに比較してＳfＵＣＰｂのｃＤＮＡが長い３'非翻訳領域を含むという事実は注目に値する。
【００３４】
また、ＳfＵＣＰａのｃＤＮＡは、配列番号１に示したように、303アミノ酸をコードするオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含んでおり、このＯＲＦには配列番号２に示したアミノ酸配列を有する推定分子量32.6kDaのタンパク質ＳfＵＣＰＡがコードされていた。一方、ＳfＵＣＰｂのｃＤＮＡは、配列番号３に示したように、268アミノ酸のＯＲＦを含んでおり、このＯＲＦには推定分子量29.0kDaのタンパク質ＳfＵＣＰＢがコードされていた。
【００３５】
さらに、サザンブロット分析の結果から、ザゼンソウのゲノムはＳfＵＣＰａ遺伝子を複数コピー、ＳfＵＣＰｂ遺伝子を単一コピー含んでいることが確認された（データ示さず）。
実施例２：ｃＤＮＡのインビトロ翻訳
実施例１で得たプラスミドクローンｐｚ８−１およびｐｚ８−２を直線化し、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼまたはＴ３ ＲＮＡポリメラーゼを使用して、MAXICRIPT転写キット（Ambion）のプロトコルに従い、センスまたはアンチセンスＲＮＡを転写した。等量のＲＮＡ（４μg）を35S-メチオニン（Amersham）の存在下でコムギ胚抽出物（Promega）を用いたインビトロ翻訳反応に供した。翻訳産物はＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析した。ゲルを固定し、Amplify（Amersham）中でインキュベートした後に乾燥し、蛍光分析した。
【００３６】
その結果、図８に示したように、いずれのｃＤＮＡともセンスＲＮＡを鋳型とした時にのみ予想された分子量のタンパク質が産生されることから、実施例１で単離したｃＤＮＡの開始コドンおよび終始コドンが正しく機能していることが確認された。
【００３７】
【発明の効果】
以上詳しく説明したとおり、この出願によって、熱発生植物であるザゼンソウ由来の新規発熱関連遺伝子ＳfＵＣＰａおよびＳfＵＣＰｂ、並びにこれらの遺伝子産物である発熱関連タンパク質ＳfＵＣＰＡおよびＳfＵＣＰＢ、さらにはこれらのタンパク質を遺伝子工学的に大量生産するための遺伝子ｃＤＮＡが提供される。これらの遺伝子およびタンパク質によって、低温耐性植物の開発、糖尿病や肥満等の治療薬および治療方法の開発、植物由来の新規発熱素材の開発等が可能となる。
【００３８】
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図１】ザゼンソウの肉穂花序の温度と気温の経時的変化を示したグラフである。
【図２】室温（RT）および冷却条件（４℃、３日間）での、ザゼンソウの肉穂花序および葉におけるＳfＵＣＰａ（Ａ）およびＳfＵＣＰｂ（Ｂ）転写産物の発現プロフィールを示したノーザンブロッティングの結果である。各々の下側の図は、未分解のｒＲＮＡをエチジームブロマイド染色した結果である。
【図３】ＳfＵＣＰＡおよびＳfＵＣＰＢと、既存のジャガイモＵＣＰ（ＳtＵＣＰ）、シロイヌナズナＵＣＰ（ＡtＰＵＭＰ）およびヒトＵＣＰのアミノ酸配列比較図である。配列下段の星記号（＊）は同一アミノ酸残基を示し、点記号（．）は全ての配列内での保存的な変化を表す。太字は、ＳfＵＣＰＡとＳfＵＣＰＢとの同一配列を示す。配列アラインメントを最適化するために導入したギャップをダッシュ記号（−）で示す。アラインメントは、CLUSTAL Wプログラムを用いて行った。典型的なミトコンドリアエネルギー伝達タンパク質の特徴的ドメインを四角で囲む。配列上段の斜線横軸（Ｉ〜VI）は予測される膜貫通ドメインを示す。
【図４】ＳfＵＣＡの疎水性プロットである。縦軸は疎水性の程度を示し、予想される膜貫通ドメインをＴＭ１からＴＭ６で示した。
【図５】ミトコンドリア膜内におけるＳfＵＣＡのトポロジーの模式図である。
【図６】ＳfＵＣＢの疎水性プロットである。縦軸は疎水性の程度を示し、予想される膜貫通ドメインをＴＭ１からＴＭ４およびＴＭ６で示した。
【図７】ミトコンドリア膜内におけるＳfＵＣＢのトポロジーの模式図である。
【図８】遺伝子ＳfＵＣＰaおよびＳfＵＣＰbの各々のｃＤＮＡを鋳型とするインビトロ翻訳の結果である。（−）はコントロール、ＳはセンスＲＮＡ、ＡＳはアンチセンスＲＮＡを示す。星印記号（＊）は非特異的産物であり、白丸は小さなＯＲＦによって合成された低分子量の翻訳人工産物の位置を示す。
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Claims (3)
- ザゼンソウ由来の５回膜貫通型発熱関連タンパク質ＳｆＵＣＰＢをコードする発熱関連遺伝子であって、そのｃＤＮＡが配列番号３の塩基配列からなることを特徴とする遺伝子ＳｆＵＣＰｂ。
- 請求項１の遺伝子ＳｆＵＣＰｂが発現する発熱関連タンパク質であって、配列番号４のアミノ酸配列からなる５回膜貫通型タンパク質ＳｆＵＣＰＢ。
- 配列番号３の塩基配列またはその翻訳領域の塩基配列からなるＤＮＡ断片。
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