JP2009178163A - ネコｃｄ８０、ネコｃｔｌａ−４またはネコｃｄ８６をコードする外来ｄｎａを発現する組換えウイルスおよびその使用 - Google Patents

Abstract

【課題】 ネコＣＤ８０、ネコＣＴＬＡ−４またはネコＣＤ８６をコードする外来ＤＮＡを発現する組換えウイルスおよびその使用
【解決手段】 本発明は、各外来核酸がタンパク質をコードする、ウイルスのウイルス性ゲノムの非必須領域内に挿入される少なくとも１つの外来核酸を含む組換えウイルスに関する。コードされるタンパク質は、ネコＣＤ２８タンパク質またはその免疫原部分、ネコＣＤ８０タンパク質またはその免疫原部分、またはネコＣＴＬＡ−４タンパク質またはその免疫原部分から構成される群から選択される。そのタンパク質は、組換えウイルスを、適切な宿主に導入するときに発現される能力がある。本発明は、さらに、病原体から由来する免疫原をコードする外来核酸を含む組換えウイルスにも関する。本発明は、ネコにおける免疫応答を増強する能力がある組換えウイルスも含む。本発明は、ネコにおける免疫応答を抑制する能力がある組換えウイルスをも含む。
【選択図】なし

Description

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（インターフェロンγおよびその使用）
本発明では、１９９８年５月１日に提出された米国特許出願番号第０９／０７１，７１１号の優先権が主張され、そしてその内容は本明細書の一部をなす参照として本出願に組込まれる。本出願を通して、種々の刊行物が括弧内に引用される。これらの刊行物の全目録は、配列リスト部分の直前の明細書の最後に見ることができる。これらの刊行物の開示は、本発明が関連する技術の現状をいっそう十分に記述するために、その全体が本明細書の一部として本願に援用される。

発明の背景

宿主内での疾病に対する応答におけるＴ細胞活性化および増殖の刺激は、２つの相互作用に依存すると思われる。即ち、ＭＨＣクラスＩ分子に関連した免疫原ペプチドのＴ細胞レセプター（ＴＣＲ）による認識、並びに、ＣＤ８０およびＣＤ８６のようなアクセサリーリガンドと、Ｔ細胞上のそれらのコレセプターＣＤ−２８および／またはＣＴＬＡ−４との二次的相互作用である。これら２つの経路の首尾よい相互作用は、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞の両方の活性および増殖、およびＴｈ１およびＴｈ２型免疫制御サイトカインの産生の増加につながる。Ｔ細胞の適切な同時刺激の不存在下ではアネルギー状態が発生する可能性があり、それにより、Ｔ細胞はサイトカインを増殖および分泌できない。数年かかって、２つの分子がＴ細胞応答の主要なレギュレーターとして出現してきた。即ち、ＣＤ２８とそのリガンド（ＣＤ８０およびＣＤ８６）である。ＣＤ２８は、その一次Ｔ細胞の同時刺激レセプターであり、それはＣＤ８０およびＣＤ８６との相互作用により、Ｔ細胞増殖およびＴ細胞の死を防止するサイトカイン合成を増強する。ＣＴＬＡ−４（ＣＤ１５２とも呼ばれる）、ＣＤ−２８相同体も、同時刺激における重要な役割を果す。完全には理解されないが、Ｔ細胞同時刺激応答を阻害するようである。同時刺激工程でのＣＤ２８、ＣＴＬＡ−４およびそれらのリガンドＣＤ８０およびＣＤ８６の中で相互作用および相互役割は、宿主中の疾病に対する免疫応答の全体的誘導および抑制に重要である（Linsleyら、１９９１年ａ、１９９３年ａ）。

現在、ネコにおけるネコ免疫不全疾病およびネコの感染性腹膜炎疾病の予防のための成功したワクチンは存在しない。現在のネコ白血病ウイルスは入手可能ではあるが、それらの効力レベルには疑問が残り、ある場合には当該疾病を引起す可能性がある。実験的なネコ感染性腹膜炎ワクチンは防御性がないか、または、抗体媒介性増強を通して早期の死亡を起すことが示された。したがって、ワクチンが未だ存在しないこれらの疾患および他の疾病に対する保護を提供し、または現存し且つ一般に使用されるワクチンの効力を改善する薬剤および組成物が、当該技術において必要性とされている。さらに、抗体を増強する疾患の不在下において、細胞媒介性応答を誘導するワクチンおよび薬剤が、当該技術において必要とされている。そして最終的に、仔ネコのワクチン接種は、仔ネコのなかで母から受継いだ抗体を克服する能力がないので困難である。これらの障壁を克服する助けになる安全で有効な薬剤が必要とされる。

本発明では、ネコＣＤ２８、ネコＣＴＬＡ−４およびそれらのリガンド、即ちネコＣＤ８０およびネコＣＤ８６の同時刺激分子の発現を操作することによって、特定のネコの病原体またはネコの疾病症状に対する所望の免疫応答を上昇させるために、増大、抑制またはリダイレクションを介して、Ｔ細胞の応答を制御することが可能である。特に、これらの同時刺激分子は、感染性疾病に対するワクチン接種、感染性疾病の治療、および腫瘍の治療、ネコでの分解性、自己免疫性および免疫不全の症状に有用である。本発明は、上記の現在入手可能なネコワクチンの効能および有効性の欠如を克服するものである。

本発明は、ウイルスのウイルス性ゲノムにおける非必須領域内に挿入された少なくとも１つの外来核酸を含む組換えウイルスであって、このような外来核酸のそれぞれが蛋白質をコードする組換えウイルスに関する。コードされるタンパク質は、ネコＣＤ２８タンパク質またはその免疫原部分、ネコＣＤ８０タンパク質またはその免疫原部分、ネコＣＤ８６タンパク質またはその免疫原部分、またはネコＣＴＬＡ−４タンパク質またはその免疫原部分からなる群から選択される。その一部は、組換えウイルスが適切な宿主に導入されるとき発現される能力がある。

本発明はまた、病原体に由来する免疫原をコードする外来核酸をさらに含む組換えウイルスも含む。本発明は、ネコでの免疫応答を増強する能力のある組換えウイルスをも含む。本発明は、ネコでの免疫応答を抑制する能力のある組換えウイルスをも含む。

図１Ａ−１は、ネコＣＤ８０（Ｂ７−１）（ＴＡＭＵ）のＤＮＡおよびアミノ酸配列である（配列番号１および２）。 図１Ａ−２は、ネコＣＤ８０（Ｂ７−１）（ＴＡＭＵ）のＤＮＡおよびアミノ酸配列である（配列番号１および２）。 図１Ｂは、ネコＣＤ８０（Ｂ７−１）（ＴＡＭＵ）のアミノ酸配列の疎水性プロットである。 図２Ａ−１は、ネコＣＤ８０（ｂ７−１）（ＳＹＮＴＲＯ）のＤＮＡおよびアミノ酸配列である（配列番号３および４）。 図２Ａ−２は、ネコＣＤ８０（ｂ７−１）（ＳＹＮＴＲＯ）のＤＮＡおよびアミノ酸配列である（配列番号３および４）。 図２Ｂは、ネコＣＤ８０（Ｂ７−１）（ＳＹＮＴＲＯ）のアミノ酸配列の疎水性プロットである。 図３Ａ−１は、ネコＣＤ８６（Ｂ７−２）のＤＮＡおよびアミノ酸配列である（配列番号５および６）。 図３Ａ−２は、ネコＣＤ８６（Ｂ７−２）のＤＮＡおよびアミノ酸配列である（配列番号５および６）。 図３Ｂは、ネコＣＤ８６（Ｂ７−２）のアミノ酸配列の疎水性プロットである。 図４Ａは、ネコＣＤ２８のＤＮＡおよびアミノ酸配列である（配列番号７および８）。 図４Ｂは、ネコＣＤ２８のアミノ酸配列の疎水性プロットである。 図５Ａは、ネコＣＴＬＡ−４（ＣＤ１５２）のＤＮＡおよびアミノ酸配列である（配列番号９および１０）。 図５Ｂは、ネコＣＴＬＡ−４（ＣＤ１５２）のアミノ酸配列の疎水性プロットである。

発明の詳細な記述

本発明は、ウイルスのウイルス性ゲノムにおける非必須領域内に挿入された少なくとも１つの外来核酸を含む組換えウイルスであって、このような外来核酸のそれぞれが、（ａ）ネコＣＤ２８タンパク質またはその免疫原部分、ネコＣＤ８０タンパク質またはその免疫原部分、ネコＣＤ８６タンパク質またはその免疫原部分、またはネコＣＴＬＡ−４タンパク質またはその免疫原部分の群から選択されるタンパク質をコードし、そして（ｂ）前記組換えウイルスが適切な宿主に導入されたときに発現される能力があることを特徴とする組換えウイルスに関する。

上記発明の一つの実施形態では、組換えウイルスは、少なくとも２つの外来核酸を含み、各々は、ウイルスゲノムの必須でない領域内に挿入される。

本発明の別の実施形態では、組換えウイルスは、少なくとも３つの外来核酸を含み、各々は、ウイルスゲノムの必須でない領域内に挿入される。

本発明の別の実施形態では、組換えウイルスは、４つの外来核酸を含み、各々は、ウイルスゲノムの必須でない領域内に挿入される。

別の実施形態では、組換えウイルスは、それに限定されないが、アライグマ痘ウイルス、豚痘ウイルスまたはネコのヘルペスウイルスが含まれる。

上で確認される発明のさらに別の実施形態では、組換えウイルスは、１つ以上の外来核酸を含み、そして各外来核酸は、同じ非必須領域に挿入される。別の実施形態では、任意の組換えウイルスは、全外来核酸が同じ非必須領域に挿入されない、１つ以上の外来核酸を含む。

別の実施形態では、任意の組換えウイルスは、病原体から由来する免疫原をコードする外来核酸を含む。本発明の別の実施形態では、何れかの組換えウイルスは、ネコの病原体、狂犬病ウイルス病原体、クラミジア病原体、トキソプラスモシス・コンジ(Toxoplasmosis gondii)病原体、ジロフィラリア・イムニチス(Dirofilaria immitis)病原体、ノミの病原体、または細菌性病原体をコードする外来核酸を含む。本発明の別の実施形態では、組換えウイルスは、ネコの免疫不全ウイルス（ＦＩＶ）、ネコの白血病ウイルス（ＦｅＬＶ）、ネコの感染性腹膜炎ウイルス（ＦＩＰ）、ネコの汎白血球減少症ウイルス、ネコのカリチウイルス、ネコのレオウイルス３型、ネコのロタウイルス、ネコのコロナウイルス、ネコのシンシチウムウイルス、ネコの肉腫ウイルス、ネコのヘルペスウイルス、ネコのボルナ病ウイルス、またはネコの寄生生物をコードする。

本発明の別の実施形態では、組換えウイルスは、外来核酸を発現するためのプロモーターを含む少なくとも１つの外来核酸を含む。別の実施形態では、組換えウイルスは、そのウイルスに対するプロモーター外来遺伝子の制御下で少なくとも１つの外来核酸を発現する。

本発明の１つの実施形態では、組換えウイルスは、さらに、検出可能なマーカーをコードする外来核酸を含む。本発明の別の実施形態では、検出可能なマーカーは、Ｅ．ｃｏｌｉ ベータ・ガラクトシダーゼである。

本発明は、さらに、ＦＩＶｇａｇプロテアーゼ、ＦＩＶエンベロープタンパク質、ＦｅＬＶｇａｇプロテアーゼ、またはＦｅＬＶエンベロープタンパク質由来の免疫原をコードする組換えウイルスを提供する。

本発明は、さらに、ネコの免疫不全ウイルスゲノムまたはその一部をコードする核酸を含む組換えウイルスを提供する。本発明は、さらに、ネコの白血病ウイルスゲノムまたはその一部をコードする核酸を含む組換えウイルスを提供する。本発明は、さらに、ネコＩＬ１２、ＧＭ−ＣＳＦ、ｐ３５またはｐ４０をコードする核酸を含む組換えウイルスを提供する。本発明は、さらに、有効な免疫感作量のこのような組換えウイルスおよび適切な担体を含むワクチンを提供する。

本発明は、ネコのヘルペスウイルスの糖タンパク質Ｇ遺伝子である非必須領域を含む組換えネコヘルペスウイルスを提供する。本発明は、Ｓ−ＦＨＶ−０３１（ＡＴＣＣ受託番号ＶＲ−２６０４）と称される請求項１２の組換えネコヘルペスウイルスを提供する。このウイルスは、特許手続上の微生物の寄託の国際承認に関するブタペスト条約の規定の下で、アメリカ合衆国バージニア州２０１０８−０９７１、マナサス、ユニバーシティー・ブルバード１０８０１のジ・アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ）に１９９８年５月１に寄託された。

本発明は、豚痘ウイルスのＨｉｎｄＩＩＩ Ｍ断片の大型ＨｉｎｄＩＩＩからＢｇｌＩＩまでの副断片中の非必須領域を有する組換え豚痘ウイルスを提供する。本発明は、さらに、Ｓ−ＳＰＶ−２４６と称される請求項１４の組換えネコの豚痘（ＡＴＣＣ受諾番号ＶＲ−２６０３）を提供する。このウイルスは、特許手続上の微生物の寄託の国際承認に関するブタペスト条約の規定の下に、アメリカ合衆国バージニア州２０１０８、マナサス、ユニバーシティー・ブルバード１０８０１のジ・アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ）に１９９８年５月１に寄託された。

上述の発明の実施形態では、組換えウイルスは、タンパク質の可溶性部分中のＣＤ２８、ＣＤ８０またはＣＤ８６タンパク質の一部である。本発明の別の実施形態では、組換えウイルスは、ネコＣＴＬＡ−４タンパク質をコードする外来核酸を含む。

上に記述される発明は、免疫感作有効量の組換えウイルスおよび適切な担体を含むワクチンについてである。本発明の１つの実施形態では、ワクチンは、免疫感作有効量の組換えウイルスを、約１×１０^５ｐｆｕ／ｍｌ〜約１×１０^８ｐｆｕ／ｍｌ、および約 ｃｆｕ／ｍｌで含む。別の実施形態では、本発明はさらに、組換えウイルスとの混合物および有効な免疫感作量の第二の免疫原を含むワクチンを提供する。

本発明は、ネコに、免疫感作有効量の任意の上記組換えウイルスを投与することを特徴とする、ネコでの免疫応答を増強する方法を提供する。本発明は、さらに、ネコに、免疫感作有効量の任意の上記組換えウイルスを投与することによって、ネコを免疫化する方法を提供する。

本発明は、可溶性ＣＤ２８、ＣＤ８０またはＣＤ８６を含む、任意の抑制有効量の組換えウイルスをネコに投与することによって、ネコにおける免疫応答を抑制する方法を提供する。本発明は、ネコＣＴＬＡ−４タンパク質を含む、任意の抑制有効量の組換えウイルスを、ネコに投与することによって、ネコにおける免疫応答を抑制する方法を提供する。

本発明は、静脈、皮下、筋肉内、経筋肉、局所、経口または腹膜組織内経路で上述の組換えウイルスを投与することを供する。

１つの実施形態では、本発明は、ネコが、移殖臓器または組織の享受側であり、免疫応答に悩まされている場合に、ネコにおける免疫応答を抑制する方法を提供する。別の実施形態では、本発明は、（ａ）ネコＣＤ２８ｍＲＮＡ転写物、（ｂ）ネコＣＤ８０転写物、または（ｃ）ネコＣＤ８６ｍＲＮＡ転写物とハイブリダイズして、その翻訳を阻害する能力のあるアンチセンス核酸をネコに投与することを特徴とする、ネコにおける免疫応答を抑制する方法を提供する。そのアンチセンス核酸は、翻訳を阻害するのに有効な量で存在しており、それによりネコにおける免疫応答を抑制する。

１つの実施形態では、上述の発明は、腫瘍を減少または排除するのに有効な量で、ネコＣＤ８０タンパク質、ネコＣＤ８０タンパク質またはその組合せをコードする核酸を含む組換えウイルスを、ネコにおける腫瘍に投与することを特徴とする、ネコにおける腫瘍を減少させ、または排除する方法を提供する。

１つの実施形態では、本発明は、組換えウイルスがさらに含まれ、そしてネコ腫瘍に関連した抗原を発現する能力があり、そしてその投与が全身投与で行われる、ネコにおける腫瘍を減少させるかまたは排除する方法を提供する。

本発明は、ＣＤ８０またはＣＤ８６またはＣＤ２８またはＣＴＬＡ−４またはＲＮＡを部分的あるいは全体で、含むクローニングおよび発現ベクターおよびＣＤ８０コード化ベクターまたはＣＤ８６コード化ベクターまたはＣＤ２８コード化ベクターまたはＣＴＬＡ−４コード化ベクターで形質転換される細胞と同様に、ネコＣＤ８０（Ｂ７−１）リガンドまたはネコＣＤ８６（Ｂ７−２）リガンドまたはネコＣＤ２８レセプターまたはネコＣＴＬＡ−４（ＣＤ１５２）レセプターをコードする、単離および精製されたＤＮＡを提供する。ＣＤ８０またはＣＤ８６またはＣＤ２８またはＣＴＬＡ−４が、選択されるネコ種は、それに限定されないが、家ネコ、ライオン、ピューマ、ボブキャット、およびチーターを含む群からのものである。

本発明は、約９４１ヌクレオチドの単離され、そして精製されたネコＣＤ８０（Ｂ７−１）ｃＤＮＡを提供する。本発明は、約３３，４８５ｋＤａの分子量、約９．１の等電点、１０のｐＨ７．０での総荷電の生来の膜結合形態または成熟形態である、約２９２アミノ酸の単離および精製されたネコＣＤ８０ポリペプチドも提供する。同時刺激分子ＣＤ２８および腫瘍抗原、または病原体生物から得られる抗原とＣＤ８０の同時発現は、免疫刺激サイトカインの産生を含めた、Ｔリンパ球を活性化または活性を増強し、そして他の細胞型の成長を制御する能力を示す。同時刺激分子ＣＴＬＡ−４およびＣｄ８０の同時発現は、Ｔリンパ球の活性化を制御する能力を示す。

本発明は、およそ１１７６ヌクレオチドの単離および精製ネコＣＤ８６（Ｂ７−２）ｃＤＮＡを提供する。本発明はまた、およそ３２０アミノ酸の単離および精製ネコＣＤ８６ポリペプチドも提供し、そしてその生来の膜結合形態または成熟形態は、およそ３６，３９４ｋＤａの分子量、約９．１９の等電点、ｐＨ７．０で１１．２７の総荷電を示す。同時刺激分子ＣＤ２８および腫瘍抗原または病原性生物から得られる抗原とのＣＤ８６の同時発現は、免疫刺激サイトカインの産生を含めたＴリンパ球を活性化し、または活性化を減少させ、そして他の細胞型の成長を制御する能力を示す。同時刺激分子ＣＴＬＡ−４とのＣＤ８６の同時発現は、Ｔリンパ球の活性化を制御する能力を示す。

本発明によるネコＣＤ８０またはＣＤ８６は、生来のまたは組換え体源から得られる。本発明によるネコＣＤ８０またはＣＤ８６は、生来で、そして膜結合形態、または膜貫通ドメインを欠く分泌形態を含む。

本発明は、およそ６８９ヌクレオチドの単離および精製ネコＣＤ２８ｃＤＮＡを提供する。本発明は、およそ２２１アミノ酸の単離および精製されたネコＣＤ２８ポリペプチドも提供し、その生来の膜結合形態または成熟形態は、約２５，３１９ｋＤａの分子量、約９．１７の等電点、ｐＨ７．０で９．５８の総荷電を示す。

本発明は、およそ７４９ヌクレオチドの単離および精製ネコＣＴＬＡ−４ｃＤＮＡを提供する。本発明は、およそ２２３アミノ酸の単離および精製ネコＣＴＬＡ−４ポリペプチドも提供し、その本来の膜結合形態または成熟形態は、約２４，３８１ｋＤａの分子量、約６．３４の等電点、ｐＨ７．０で−０．９９の総荷電を示す。

本発明は、外来ＤＮＡを発現する組換え豚痘ウイルス提供し、その外来ＤＮＡは、ネコＣＤ８０、ネコＣＤ８６、ネコＣＤ２８、およびネコＣＴＬＡ−４ｃＤＮＡおよびポリペプチドをコードする。

本発明は、外来ＤＮＡを発現する組換えアライグマウイルスを提供し、その外来ＤＮＡは、ネコＣＤ８０、ネコＣＤ８６、ネコＣＤ２８、およびネコＣＴＬＡ−４ｃＤＮＡおよびポリペプチドをコードする。

本発明は、外来ＤＮＡを発現する組換えネコヘルペスウイルスを提供し、その外来ＤＮＡは、ネコＣＤ８０、ネコＣＤ８６、ネコＣＤ２８、およびネコＣＴＬＡ−４ｃＤＮＡおよびポリペプチドをコードする。

別の態様では、本発明は、免疫原に対するネコ科での免疫応答を増強する方法であって、免疫応答を増強するのに有効な量で、組換え豚痘ウイルスベクター、組換えアライグマ痘ウイルスベクターまたは組換えネコヘルペスウイルス中の、ネコＣＤ２８またはネコＣＴＬＡ−４を伴うかまたはこれを伴わないネコＣＤ８０またはネコＣＤ８６の前、後または実質的にこれと同時に、免疫原を投与することによって達成される方法を提供する。

別の態様では、本発明は、免疫応答を抑制するのに有効な量で、組換え豚痘ウイルスベクター、組換えアライグマ痘ウイルスベクターまたは組換えネコヘルペスウイルス中の、ネコＣＤ２８またはネコＣＴＬＡ−４を伴うかまたは伴わない、或いはネコＣＤ８０またはネコＣＤ８６、ネコＣＤ２８またはネコＣＴＬＡ−４をコードする一部または全てがアンチセンスＲＮＡまたはＤＮＡを伴う、ネコＣＤ８０またはネコＣＤ８６の前、後または実質的これとに同時に免疫原を投与することによって達成される、免疫原に対するネコ科での免疫応答を抑制する方法を提供する。

別の態様では、本発明は、免疫原、および組換え豚痘ウイルスベクター、組換えアライグマ痘ウイルスベクター、または組換えネコヘルペスウイルスベクター中の、免疫応答増強のために有効な量のネコＣＤ８０を含むことを特徴とする、免疫原に対するネコ科での免疫応答を誘導するワクチンを提供する。免疫原は、例えば、ネコ免疫不全ウイルス、ネコ白血病ウイルス、ネコバルボウイルス、ネココロナウイルス、ネコレプトウイルスなどのようなネコ病原体に由来する。

別の態様では、本発明は、免疫原のＤＮＡまたはＲＮＡ、および免疫応答を調節するのに有効な量で、タンパク質またはタンパク質の断片をコードするネコＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ２８アクセサリー分子のＤＮＡまたはＲＮＡを発現する、組換え豚痘ウイルスベクター、組換えアライグマ痘ウイルスベクター、または組換えネコヘルペスウイルスベクターを、任意の組合せで投与することによって達成される、免疫原に対するネコ科での免疫応答を誘導するワクチンを提供する。

ネコＣＤ８０タンパク質は、それぞれ、ヒトおよびマウスのタンパク質と５９％および４６％一致するアミノ酸配列を示す。ネコＣＤ８６タンパク質は、それぞれ、ヒトおよびウサギのタンパク質と６８％および６４％一致するアミノ酸配列を示す。ネコＣＤ２８タンパク質は、それぞれ、ヒトおよびマウスのタンパク質と８２％および７４％一致するアミノ酸配列を示す。ネコＣＴＬＡ−４タンパク質は、それぞれ、ヒトおよびマウスのタンパク質と８８％および７８％一致するアミノ酸配列を示す。ヒトまたはマウスのＣＤ８０またはＣＤ８６タンパク質は、ネコＣＤ８０またはＣＤ８６タンパク質を機能的に交換することができない。したがって、ネコＣＤ８０、ネコＣＤ８６、ネコＣＤ２８およびネコＣＴＬＡ−４は、ネコ科で免疫性を制御するのに必要とされる新規薬剤である。

本発明は、ネコ種から得られるＴ細胞制御アクセサリー分子ＣＤ８０（Ｂ７−１）またはＣＤ８６（Ｂ７−２）またはＣＤ２８またはＣＴＬＡ−４（ＣＤ１５２）を包含する。本発明は、生来または組換え体源の何れかから精製されるＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ２８またはＣＴＬＡ−４ポリペプチドと同様に、ネコＣＤ８０またはネコＣＤ８６またはネコＣＤ２８またはネコＣＴＬＡ−４を部分的に、または全体でコードする単離および精製核酸を提供する。本発明により産生されるネコＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ２８またはＣＴＬＡ−４は、腫瘍および病原体生物に対するネコワクチンの効力を増強するための治療剤、また、ネコにおけるウイルス性または細菌性疾病を治療する治療剤として使用される。本発明により産生されるネコＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ２８またはＣＴＬＡ−４は、過剰活性、過敏活性または方向違いの免疫応答のための疾病を緩和するのにも使用される。

＜核酸、ベクター、形質転換体＞
ネコＣＤ８０（配列番号１、３）、ネコＣＤ８６（配列番号５）、ネコＣＤ２８（配列番号７）、またはネコＣＴＬＡ−４（配列番号９）をコードする配列は、図１から５に示され、そしてネコＣＤ８０（配列番号２、４）、ネコＣＤ８６（配列番号６）、ネコＣＤ２８（配列番号８）、またはネコＣＴＬＡ−４（配列番号１０）の推定アミノ酸配列は、図１から５に示される。これらのネコポリペプチドのＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ２８またはＣＴＬＡ−４としての名称は、これらのポリペプチドのヒトまたはマウスまたはウサギ相同体に対するアミノ酸配列の部分的同一性、およびネコＣＤ２８レセプター（下に参照）に、またはＣＴＬＡ−４に結合し、そしてＴリンパ球の活性化を活性化または刺激またはさもなければ制御するＣＤ８０またはＣＤ８６ポリペプチドの能力に基づく。さらに、理論に拘束されることを望むものではないが、ネコＣＤ８０またはネコＣＤ８６ポリペプチドも、１つまたはそれ以上の以下の生物活性：ＮＫ（ナチュラルキラー）細胞の活性化、Ｂ細胞成熟化の刺激、ＭＨＣ制限内毒性Ｔリンパ球の活性化、幹細胞の増殖、サイトカインレセプターとの相互作用および免疫制御サイトカインの誘導を示すことが推定される。

遺伝コード（すなわち、ある種のアミノ酸をコードする複数コドン）の縮重のため、図１から５に示される以外のＤＮＡ配列も、図１から５に示されるネコＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ２８またはＣＴＬＡ−４アミノ酸配列をコードできる。このような他のＤＮＡとしては、例示のコドン中の１つまたはそれ以上のヌクレオチドにおける変化が、その位置でコードされるアミノ酸に改変がない「配列保存性」変異体を含むものが挙げられる。さらに、ポリペプチド中の例示アミノ酸残基は、しばしば、生来のポリペプチドの全部の配座および機能を変えることなしに変化させることができる。このような「機能保存的」変異体としては、それに限定されないが、例えば酸性、塩基性、疎水性、親水性、芳香族性のような類似の生理化学的特性を示すものにアミノ酸を置換すること（例えば、リシンをアルギニンに、アスパルテートをグルタメートに、またはグリシンをアラニンに置換すること）が挙げられる。さらに、アミノ酸配列は、分子の生物活性を破壊することなしに添加または欠失される。例えば、別のアミノ酸配列を、アミノまたはカルボキシル末端の何れかに加えて、ヒスチジンタグ（すなわち、タンパク質の１段階精製を可能にし、その後それらを、化学的に、または酵素的に除去する）のような精製タグとして働く。選択的に、追加の配列は、追加の細胞表面結合部位を付与するか、さもなければ抗体についての抗原結合部位の付加とともにのように、ネコＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ２８またはＣＴＬＡ−４の標的細胞の特異性を変える。

本発明の範囲内のネコＣＤ８０またはネコＣＤ８６またはネコＣＤ２８またはネコＣＴＬＡ−４ｃＤＮＡは、配列保存的変異体ＤＮＡ、機能保存的変異体ポリペプチドをコードするＤＮＡ配列、およびそれらの組合せのような、図１から５のものである。本発明は、単独、または他の配列または成分との組合せの何れかで、有用な程度の生物活性を示すネコＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ２８またはＣＴＬＡ−４の断片を包含する。下で説明されるとおり、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ２８またはＣＴＬＡ−４の配列を推定的に操作すること、および指示ネコＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ２８またはＣＴＬＡ−４変異体が、指示使用についての適切な安定性および生物活性を保有するかどうか、またはこれらの分子の結合活性に影響を及ぼす多様性が、有効性が増大するかどうかを確立することは、当業界での通常な技術の範囲に十分ある。ネコＣＤ８０およびＣＤ８６は、各々、コレセプターＣＤ２８に、またはコレセプターＣＴＬＡ−４に結合する。これは、組換えシステム中で変異体ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ２８またはＣＴＬＡ−４ポリペプチドを発現および精製し、そして細胞培養物中で、または動物中でそのＴ細胞刺激活性および／または成長促進活性を分析し、続いてその使用法で試験することによって達成できる。変異体ＣＤ８０を、ＣＤ２８またはＣＴＬＡ−４レセプターへの官能基結合によって、生物活性について試験する。変異体ＣＤ８６を、ＣＤ２８またはＣＴＬＡ−４レセプターへの官能基結合によって、生物活性について試験する。類似の方法で、変異体ＣＤ２８または変異体ＣＴＬＡ−４を、生物活性について試験する。

本発明は、家ネコに限定しないで、ライオン、トラ、チーター、ボブキャットなどを含めた他のネコ種から由来するネコＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ２８またはＣＴＬＡ−４ＤＮＡ（およびポリペプチド）も包含する。図１から５に示される配列のネコＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ２８またはＣＴＬＡ−４同族体は、ｃＤＮＡまたはゲノムライブラリーをスクリーニングして、図１から５の配列の全部または一部を含むプローブにハイブリット形成するクローンを確認することによって容易に同定される。代替的に、発現ライブラリーは、ネコＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ２８またはＣＴＬＡ−４を認識する抗体を使用してスクリーニングされる。理論に繋げられる望みなしに、他のネコ種から得られるＣＤ８０またはＣＤ８６遺伝子が、ネコＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ２８またはＣＴＬＡ−４遺伝子と少なくとも約７０％同一性を共有することが予想される。さらに、本発明の範囲にあるのは、ネコＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ２８またはＣＴＬＡ−４と少なくとも約２５％アミノ酸同一性を共有するポリペプチドをコードするＤＮＡと定義される、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ２８またはＣＴＬＡ−４の同族体をコードするＤＮＡである。

一般に、本発明による核酸操作では、例えば、分子クローニング、実験室マニュアル(Molecular Cloning, Alaboratory Manual)（第２版、Sambrook、FitschおよびManiatis、コールド・スプリング・ハーバー）または分子生物学における最新のプロトコール(Current Protocols in Molecular Biology)（Aufubel、Brent、Kingston、More、Feidman、SmithおよびStuhl、グリーン・パブル．アソシ．、ウイリー−インターサイエンス、ニューヨーク州ニューヨーク（ＮＹ，ＮＹ）、１９９２年）で開示されるもののような、当業界で十分に知られる方法が使用される。

本発明は、ｃＤＮＡおよびＲＮＡ配列およびセンスおよびアンチセンスを包含する。本発明は、ゲノム性ネコＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ２８またはＣＴＬＡ−４配列およびそれに限定されないが、制御配列を含めたフランキング配列も包含する。ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ２８またはＣＴＬＡ−４ポリペプチドをコードする核酸配列は、プロモーター、エンハンス（enhances）、応答要素、シグナル配列、ポリアルデヒド化配列、イントロン、５’−および３’−非コーディング領域などを含めた異種配列とも連結している。ネコＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ２８またはＣＴＬＡ−４ｃＤＮＡ配列に操作可能に結合した転写性制御要素は、それに制限せずに、原核生物の細胞、真核生物の細胞、原核生物の細胞のウイルス、真核生物の細胞のウイルス、およびその任意の組合せから由来する遺伝子の発現を指示する能力を有するものが挙げられる。他の有用な異種制御配列は、当業者に知られている。

本発明の核酸は、それらの安定性、可溶性、結合アフィニティー、および特異性を変えるために当業界で習熟したものに知られた方法によって修正される。例えば、配列は、選択的にメチル化される。本発明の核酸配列も、直接的に、または間接的に検出可能なシグナルを供する能力のある標識で修飾される。例示の標識としては、放射性アイソトープ、蛍光分子、ビオチンなどが挙げられる。

本発明は、一部に、または全体的にＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ２８またはＣＴＬＡ−４ポリペプチドをコードする核酸を含むベクターも提供する。このようなベクターとしては、例えば、多様な真核生物および原核生物の宿主中で発現するためのプラスミドベクターが挙げられる。好ましくは、ベクターとしては、ネコＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ２８またはＣＴＬＡ−４ポリペプチドコード部分に操作的に結合したプロモーターも挙げられる。コードされたネコＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ２８またはＣＴＬＡ−４ポリペプチド（類）は、ここに説明されるとおり、またはさもなければ当業者に知られる任意の適切なベクターおよび宿主細胞を使用することによって発現される。

本発明は、ネコＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ２８またはＣＴＬＡ−４ポリペプチド（類）を部分的に、または全体的にコードする核酸を含むベクターも提供する。このようなベクターとしては、例えば、多様な真核生物の宿主中での発現のため、またはＤＮＡまたはＲＮＡワクチンの発現のための生ウイルス性ベクターが挙げられる。１つの実施形態では、生ウイルス性ベクターを、遺伝子欠失によって弱毒化する。別の実施形態では、ウイルス性ベクターは、化学的処置または加熱によって不活性化される。生ウイルス性ベクターは、それに限定されないが、ヘルペスウイルス、ポックスウイルス、アデノウイルス、アデノ関連ウイルス、レトロウイルス、バキュロウイルス、アルファウイルス、ラブドウイルス、ピコルナウイルスを含む群から選択される。生ウイルス性ベクターは、それに限定されないが、ネコのヘルペスウイルス、イヌのヘルペスウイルス、鳥類のヘルペスウイルス、ウシのヘルペスウイルス、ウマのヘルペスウイルス、偽狂犬病ウイルス、豚痘ウイルス、アビポックスウイルス、鶏痘ウイルス、アライグマ痘ウイルス、カナリア痘ウイルス、ワクシニアウイルス、マロニーネズミの白血病ウイルス、シンドビスウイルスおよびセムリキフォーレストウイルスを含む群から選択される。

生ウイルス性ベクターは、部分的に、または全体的にネコＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ２８またはＣＴＬＡ−４ｃＤＮＡである外来ＤＮＡを発現する組換えウイルス性ベクターである。外来ＤＮＡは、病原性生物から得られる抗原についてのｃＤＮＡもある。組換えウイルス性ベクターは、当業者に知られている同族性組換え体またはコスミド再構築法によって構築される。好ましくは、ベクターは、ネコＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ２８またはＣＴＬＡ−４ポリペプチドコード部分に操作的に結合したプロモーターも挙げられる。プロモーターは、それに限定されないが、ネコヘルペスウイルスｇＥプロモーター、ポックスウイルス合成後期／即時型プロモーター、ヒトサイトメガロウイルス即時型プロモーター、偽狂犬病ウイルスｇＸプロモーターを含む。遺伝子発現の増進は、カセット（ｐＣＩＴＥベクター、ウイスコンシン州マディソンのノバゲン(Novagen)）内に含まれる内部リボソーム入口部位（ＩＲＥＳ）要素から得られるＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ２８またはＣＴＬＡ−４ｃＤＮＡの発現も挙げられる。ウイルス性ベクターを育成するためのセルラインとしては、それに限定されないが、クランデル・ネコ腎細胞（ＣＲＦＫ）、ニワトリの胚線維芽細胞、胚ブタ腎細胞（ＥＳＫ−４）、ブタ腎細胞（ＰＫ）が挙げられる。コードされたネコＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ２８またはＣＴＬＡ−４ポリペプチド（類）は、ここに説明されるとおり、またはさもなければ当業者に知られる任意に適切なベクターおよび宿主細胞を使用することによって発現される。

好ましい実施形態では、ネコ病原体から由来する免疫原についての遺伝子との組合せで、ネコＣＤ８０およびＣＤ２８、ＣＤ８０およびＣＴＬＡ−４、ＣＤ８６およびＣＤ２８、またはＣＤ８６およびＣＴＬＡ−４をコードする遺伝子は、単独組換えウイルス性ベクターに組み込まれ、そしてその後、生ワクチンに処方される。ネコＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ２８またはＣＴＬＡ−４遺伝子は、単独、またはネコ病原体から由来するネコ遺伝子との組合わせで、組換えウイルスに組込まれ、その結果、これらの遺伝子の発現は、適切なプロモーターによって制御される。別の実施形態では、ネコＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ２８またはＣＴＬＡ−４をコードする遺伝子は、単独で、または組合わせで、組換えウイルス性ベクターに組込まれ、そしてネコ病原体から由来する免疫原（類）についての遺伝子をコードする第二の組換えウイルス性ベクターを有するワクチンに同時投与される。これらの２つの実施形態では、所望の免疫応答の増強、抑制または再配向を達成するのと同じ細胞内で、または密接に近接する細胞内で所望の免疫応答が提供される。

免疫原は、それに限定されないが、ネコ免疫不全ウイルス、ネコ白血病ウイルス、ネコ感染性腹膜炎ウイルス、ネコ汎白血球減少症ウイルス（パルボウイルス）、ネコカリチウイルス、ネコ・レオウイルス３型、ネコロタウイルス、ネココロナウイルス（感染性腹膜炎ウイルス）、狂犬病ウイルス、ネコシンチウムのウイルス、ネコ肉腫ウイルス、ネコヘルペスウイルス（鼻気管炎ウイルス）、ネコのボルナ病ウイルス、クラミジア属（Chlamydia）、トキソプラスモシス・ゴンジ(Toxoplasmosis gondii)、ネコ寄生生物、ジロフィラリア・イミチス(Dirofilaria immitis)、ノミ、細菌性病原体などのようなネコ病原体を含む群から選択される。

ベクターまたは生ウイルス性ベクターは、しばしば、例えば、抗生物質耐性のような、宿主中の選択のための１つまたはそれ以上のマーカー、またはβ−ガラクトシダーゼ（ｌａｃＺ）またはβ−グルクロニダーゼ（ｕｉｄＡ）のような熱量測定用マーカー、または緑色蛍光タンパク質のような蛍光マーカー、および１つまたはそれ以上の発現カセットをクローニングまたは発現するための１つまたはそれ以上の複製系を包含する。挿入されたコーディング配列を、合成し、天然源がら単離し、ハイブリッドまたは同等物として作成する。転写的制御配列へのコーディング配列のライゲーションは、当業者に知られている方法によって達成される。適切な宿主細胞を、電気孔穿、ＣａＣｌ_２−またはリポソーム依存性ＤＮＡ取込み、真菌感染、微細注入、微細投影などを含めた任意の適切な方法によって形質転換／形質移入／感染させる。

本発明を実施する上で使用するための適切なベクターとしては、限定なしで、ＹＥｐ３５２、ｐｃＤＮＡＩ（カリフォルニア州カールスバッドのインビトロゲン(Invitrogen)）、ｐＲｃ／ＣＭＶ（インビトロゲン）、およびｐＳＦＶ１（メリーランド州ゲーサーズバーグのギブコ／ＢＲＬ）が挙げられる。本発明に使用するための１つの好ましいベクターは、ｐＳＦＶ１である。適切な宿主細胞としては、Ｅ．ｃｏｌｉ、酵母、ＣＯＳ細胞、ＰＣ１２細胞、ＣＨＯ細胞、ＧＨ４Ｃ１細胞、ＢＨＫ−２１細胞、および両生類メラニン細胞が挙げられる。ＢＨＫ−２１細胞は、本発明を実施する上で使用するための好ましい宿主セルラインである。裸のＤＮＡまたは遺伝的ワクチン接種の構築のための適切なベクターとしては、限定されないが、ｐＴａｒｇｅｔ（ウイスコンシン州マディソンのプロメガ）、ｐＳＩ（ウイスコンシン州マディソンのプロメガ）およびｐｃＤＮＡ（カリフォルニア州カールスバッドのインビトロゲン）が挙げられる。

ネコＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ２８またはＣＴＬＡ−４ポリペプチド（類）をコードする核酸は、組換え事象によって細胞にも導入される。例えば、このような配列は、細胞に微細注入されて、それによりポリペプチド、類縁体またはその偽遺伝子、またはネコＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ２８またはＣＴＬＡ−４ポリペプチドコード遺伝子に実質的に同一性を示す配列をコードする内在性遺伝子の部位に同族性組換えに影響をおよぼす。非同一組換え、および特に多能性細胞での同一性組換えによる内在性遺伝子の欠失のような他の組換え基本の方法も、使用される。

本発明は、免疫原に対するネコ科での免疫応答を増強する方法を提供し、それは、免疫応答を増強するのに有効な量で、ネコＣＤ２８またはネコＣＴＬＡ−４と共に、またはなしで、ネコＣＤ８０またはネコＣＤ８６の前、後または実質的に同時に免疫原を投与することによって達成される。

本発明は、免疫原に対するネコ科での免疫応答を増強する方法を提供し、そしてそれは、ネコ病原体から由来する免疫原およびネコＣＤ８０またはネコＣＤ８６アクセサリー分子を含む発現ベクターを、免疫応答を増強するのに有効な量で、ネコＣＤ２８またはネコＣＴＬＡ−４と共に、またはなしで投与することによって達成される。

本発明は、免疫原に対するネコ科での免疫応答を再配向する方法を提供し、そしてそれは、免疫応答を増強するのに有効な量で、ネコＣＤ２８またはネコＣＴＬＡ−４と共に、またはなしにネコ病原体およびネコＣＤ８０またはネコＣＤ８６アクセサリー分子から由来する免疫原を含む発現ベクターを投与することによって達成される。

本発明は、免疫原に対するネコ科での免疫応答を抑制する方法を提供し、そしてそれは、免疫応答を増強するのに有効な量で、ネコＣＤ２８またはネコＣＴＬＡ−４と共に、またはなしに、またはネコＣＤ８０またはネコＣＤ８６またはネコＣＤ２８またはネコＣＴＬＡ−４をコードするアンチセンスＲＮＡまたはＤＮＡと共に、ネコＣＤ８０またはネコＣＤ８６の前、後または実質的に同時に、免疫原を含む発現ベクターを投与することによって達成される。

本発明は、免疫応答を増強するためのネコＣＤ２８または免疫応答増強のためのネコＣＴＬＡ−４、または免疫応答抑制のためのネコＣＴＬＡ−４を伴うネコＣＤ８０またはネコＣＤ８６と共に、またはなしに、免疫原、および有効量のネコＣＤ８０またはネコＣＤ８６を含むことを特徴とする、免疫原に対するネコ科での免疫応答を誘導するためのワクチンを提供する。別の実施形態では、本発明は、ネコ病原体に対する免疫原（類）についての遺伝子、および免疫応答の増強または抑制についてのネコＣＤ２８またはネコＣＴＬＡ−４と共に、またはなしにＣＤ８０、ＣＤ８６についての遺伝子を含む発現ベクターを包含することを特徴とするワクチンを提供する。

＜ネコＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ２８またはＣＴＬＡ−４ポリペプチド＞
ネコＣＤ８０遺伝子（そのＤＮＡおよびアミノ酸配列は、図１および２に示される）は、およそ２９２アミノ酸のポリペプチドをコードする。ネコＣＤ８６遺伝子（そのＤＮＡアミノ酸配列は、図３に示される）は、およそ３２０アミノ酸のポリペプチドをコードする。ネコＣＤ２８遺伝子（そのＤＮＡおよびアミノ酸配列は、図４に示される）は、およそ２２１アミノ酸のポリペプチドをコードする。ネコＣＴＬＡ−４遺伝子（そのＤＮＡおよびアミノ酸配列は、図５に示される）は、およそ２２３アミノ酸のポリペプチドをコードする。

天然または組換え源から得られるネコＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ２８またはＣＴＬＡ−４の精製は、それに限定されないが、イオン交換クロマトグラフィー、Ｃ４カラムでの逆相クロマトグラフィー、ゲル濾過、等電点焦点法、アフィニティークロマトグラフィー、および同等物を含めて当業界でよく知られる方法によって達成される。好ましい実施形態では、大量の生物活性ネコＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ２８またはＣＴＬＡ−４は、ｐＳＦＶ１レプリコン（ギブコ／ＢＲＬ）中の６Ｃ末端ヒスチジン残基をコードする配列に枠内で融合したネコＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ２８またはＣＴＬＡ−４についてのコーディング領域を含む組換えＤＮＡ配列を構築することによって達成される。このプラスミドによってコードされるｍＲＮＡは、当業者によく知られる技術を使用して合成され、そして電気刺穿によってＢＨＫ−２１細胞に導入される。その細胞は、６Ｃ末端ヒスチジンを含む成熟グリコシル化ネコＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ２８またはＣＴＬＡ−４ポリペプチドを合成および分泌する。修飾したネコＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ２８またはＣＴＬＡ−４ポリペプチドは、ヒスチジン結合樹脂（Ｈｉｓ−結合、ウイスコンシン州マディソンのノバゲン）を使用したアフィニティークロマトグラフィーによって細胞上清から精製される。

任意の源から単離されるネコＣＤ８０またはネコＣＤ８６ポリペプチドは、当業界で知られる方法によって修飾される。例えば、ネコＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ２８またはＣＴＬＡ−４は、リン酸化または脱リン酸化、グリコシル化または脱グリコシル化などをされる。特に有用なのは、ネコＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ２８またはＣＴＬＡ−４可溶性、安定性、および結合特異性およびアフィニティーを改変する修飾である。

＜ネコＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ２８、ＣＴＬＡ−４キメラ分子＞
本発明は、任意の組合せで、ネコＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ２８およびＣＴＬＡ−４の断片から作成されるキメラ分子の産生を包含する。例えば、ＣＤ２８結合部位の場所にＣＴＬＡ−４の結合部位を導入して、免疫応答の増強を維持させながら、ＣＤ２８の結合アフィニティーを増加させること。

１つの実施形態では、ＣＴＬＡ−４およびＣＤ２８上のＣＤ８０またはＣＤ８６についての結合部位は、ＣＴＬＡ−４の結合領域によって置換される。ＣＴＬＡ−４結合領域を用いてのキメラＣＤ２８分子の効果は、ＣＤ８０またはＣＤ８６についてのＣＤ２８のアフィニティーを増大させ、そして免疫応答の増強の規模を増大させることである。代替的実施形態では、ＣＤ８０およびＣＤ２８またはＣＤ８６およびＣＤ２８のキメラ分子、またはその断片は、膜結合形態であり、そしてこれらの分子の能力を免疫増強することを改善する。代替的実施形態では、ＣＤ８０およびＣＴＬＡ−４またはＣＤ８６およびＣＴＬＡ−４のキメラ分子、またはその断片は、膜結合形態であり、そしてこれらの分子の能力を抑制する免疫を改善する。代替的実施形態では、ＣＤ８０およびＣＴＬＡ−４またはＣＤ８６およびＣＴＬＡ−４のキメラ分子、またはその断片は、膜結合形態であり、そして所望の効果を達成する免疫応答を再指向する。

代替的実施形態では、ネコＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ２８またはＣＴＬＡ−４は、別のポリペプチドとの融合タンパク質である。そのポリペプチドとしては、それに限定されないが、免疫グロブリン、抗原、腫瘍抗原、細胞表面レセプター、または細胞表面リガンダである。

抗ネコＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ２８またはＣＴＬＡ−４抗体
本発明は、上に記述されるとおり同定されるネコＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ２８またはＣＴＬＡ−４ポリペプチドに対して特異的である抗体を包含する。抗体は、ポリクローナルまたはモノクローナルであり、そしてネコＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ２８またはＣＴＬＡ−４を異なる種と識別し、機能性ドメインを同定するなどである。このような抗体は、当業者に知られる免疫学的およびハイブリドーマ技術と同様に、ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ、「抗体、実験室マニュアル」、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー、１９８８年に開示される方法および組成物を使用して好都合に作成される。天然または合成のＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ２８またはＣＴＬＡ−４由来のペプチドが、ネコＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ２８またはＣＴＬＡ−４特異的免疫応答を誘導するのに使用される場合、ペプチドは、ＫＬＨのような適切な担体と都合よく結合し、そしてフロイントのもののような適切なアジュバント中で投与される。好ましくは、選択ペプチドを、Ｔａｎ（１９８８年）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８５巻：５４０９−５４１３頁の方法によって実質的にリシンのコア担体と結合させる。生じる抗体、特に内部造影抗イデオ型抗体も、公知方法を使用して作成される。

１つの実施形態では、精製ネコＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ２８またはＣＴＬＡ−４を、免疫マウスに使用し、その後、それらの脾臓を除去し、そして脾臓細胞を、骨髄腫と細胞ハイブリッドを形成するのに使用して、当業界に水準である技術により抗体分泌細胞のクローンを得る。このような細胞によって分泌される生じるモノクローナル抗体は、以下の活性についての生体外アッセイに使用してスクリーニングする。それは、ネコＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ２８またはＣＴＬＡ−４への結合、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ２８またはＣＴＬＡ−４のレセプター結合活性の阻害、およびＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ２８またはＣＴＬＡ−４のＴ細胞刺激活性を阻害することである。

抗ネコＣＤ８０、抗ネコＣＤ８６、抗ネコＣＤ２８または抗ネコＣＴＬＡ−４抗体は、ＥＬＩＳＡ、ＲＩＡなどのような免疫アッセイを使用して、ネコＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ２８またはＣＴＬＡ−４を同定および定量するのに使用される。抗ネコＣＤ８０、抗ネコＣＤ８６、抗ネコＣＤ２８または抗ネコＣＴＬＡ−４抗体も、ネコＣＤ８０またはネコＣＤ８６またはネコＣＤ２８またはネコＣＴＬＡ−４の免疫激減抽出に使用される。さらに、これらの抗体は、様々の源からネコＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ２８またはＣＴＬＡ−４を同定、単離および精製し、そして細胞下および組織化学的局在化調査を行うのに使用できる。

使用法
本発明によって産生されるネコＣＤ８０（Ｂ７−１）リガンド、ネコＣＤ８６（Ｂ７−２）リガンド、ネコＣＤ２８レセプターまたはネコＣＴＬＡ−４（ＣＤ１５２）レセプターは、ワクチンとして有益に使用して、感染疾病を予防するか、または同一のまたは異質のネコ種での成長を促進することができる。例えば、任意の組合せで、同時刺激分子ＣＤ２８またはＣＴＬＡ−４とのＣＤ８０またはＣＤ８６の同時発現、および病原性生物から得られる腫瘍抗原または抗原である。ネコＣＴＬＡ−４レセプターとのネコＣＤ８０またはＣＤ８６の同時発現は、Ｔリンパ球の活性化を阻害し、そして免疫応答を抑制する能力を有する。特定の例は、ワクチンとして投与される時に、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔリンパ球の増殖を活性化し、増強し、または制御し、そしてＩＬ−２、ＩＦＮ−ｇ、ＩＬ−１２、ＴＮＦａ、ＩＬ−６および同等物を誘導するウイルス性ベクターまたはＤＮＡ発現ベクター中のＦＩＶ、ＦｅＬＶまたはＦＩＰ由来の免疫原とのＣＤ８０またはＣＤ８６を同時発現することである。別の特定の例は、治療剤として投与されるときに、免疫応答を制御または再指向するウイルス性ベクターまたはＤＮＡ発現ベクター中でＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ２８またはＣＴＬＡ−４を発現することである。

ＣＤ２８またはＣＴＬＡ−４とのネコＣＤ８０またはＣＤ８６の相互作用を介しての免疫の増強、またはＣＴＬＡ−４とのネコＣＤ８０またはＣＤ８６の相互作用を介しての免疫応答の阻害は、全体または長期健康上の有害な影響でさえ倍量を示しうる外来物質を加えるよりむしろ自然な方法の制御の利益を得る。ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ２８またはＣＴＬＡ−４分子を、免疫性の導入のために望ましい抗原をコードするもののような他の組換え分子と共に投与する。ネコＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ２８および／またはＣＴＬＡ−４遺伝子を、発現ベクターに挿入し、そして標的細胞に感染または形質移入し、そして標的細胞内に遺伝子産物を発現させ、その結果、それを、標的細胞または抗原顕在細胞の血漿膜に打込むか、または標的細胞または抗原顕在細胞の外側に分泌される。プラスミド、セムリキ・フォーレスト・ウイルス、ポックスウイルスまたはヘルペスウイルスのような発現ベクターは、抗原顕在細胞に遺伝子を移行させる。任意の組合せで、ネコＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ２８および／またはＣＴＬＡ−４遺伝子または遺伝子の断片を、ＤＮＡまたはＲＮＡ発現ベクターに挿入し、そしてネコ科に注入し、そして「裸の」ＤＮＡ／ＲＮＡまたは遺伝的ワクチンとしてネコ科で遺伝子産物として発現される。標的細胞またはネコ科内での免疫原と、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ２８および／またはＣＴＬＡ−４遺伝子との同時発現は、Ｔリンパ球、Ｂリンパ球および他の細胞の活性化、活性化の増強、または制御に寄与する。代替的に、発現したタンパク質を投与し、続いてプラスミド、セムリキ・フォーレスト・ウイルス、ポックスウイルスまたはヘルペスウイルスまたは他のウイルスまたは細菌ベクターのような原核生物または真核生物系で発現させることができた。ネコＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ２８またはＣＴＬＡ−４タンパク質は、血漿膜アクセサリー分子として細胞膜に打込まれながら正常に機能するが、他の形態で、特に膜アンカーなしで存在しうる。

１つの実施形態では、ネコＣＤ８０およびネコＣＤ８６は、膜貫通ドメインまたは疎水性領域を欠きながら可溶性であり、そして膜結合形態または可溶性形態の何れかで、同時刺激分子ＣＤ２８またはＣＴＬＡ−４と作用する。代替的実施形態では、ネコＣＤ８０またはネコＣＤ８６は、膜結合形態であり、そして同時刺激分子ＣＤ２８またはＣＴＬＡ−４は、膜貫通ドメインまたは疎水性領域を欠きながら可溶性形態である。代替的実施形態では、ネコＣＤ８０またはネコＣＤ８６は、膜結合形態であり、そして同時刺激分子ＣＤ２８またはＣＴＬＡ−４は、膜貫通ドメインまたは疎水性領域を欠きながら可溶性形態にある。好ましくはニ量体形態にある可溶性ＣＤ２８またはＣＴＬＡ−４は、ネコでのＴ細胞依存性免疫抑制に関連した疾病を治療するために有用である。可溶性ＣＤ２８またはＣＴＬＡ−４は、移殖組織の拒絶を防止し、そして自己免疫疾病を治療するのに使用することができる。特に可溶性ＣＤ２８またはＣＴＬＡ−４は、骨髄移殖での移殖片対宿主疾病を予防するのに有用である。可溶性ＣＤ２８またはＣＴＬＡ−４は、膜結合形態のネコＣＤ８０またはＣＤ８６を含む細胞の結合を防止する。

別の実施形態では、ネコＣＴＬＡ−４を、免疫グロブリン（Ｉｇ）に融合させる。ＣＴＬＡ−４−Ｉｇ融合は、免疫応答を抑制するか、または自己免疫疾病を治療するのに有用である。自己免疫疾病としては、それに限定されないが、関節炎、乾癬、臓器移殖拒絶、移殖片対宿主疾病が挙げられる。

１つの実施形態では、結合または可溶性形態の何れかで発現されたネコＣＤ８０、および／またはＣＤ８６タンパク質は、ネコ腫瘍の減少または排除する上での治療のために使用される。特に、ネコＣＤ８０および／またはＣＤ８６タンパク質は、ネコ腫瘍関連抗原と同時にベクター化を組合わせて、またはしないで、直接腫瘍注入を介して、または全身に投与されてウイルス性ベクターから、または裸のＤＮＡから発現される。

ネコネコＣＤ８０、ＣＤ８６ＣＤ２８またはＣＴＬＡ−４ＤＮＡおよびポリペプチドまたは生物活性ネコＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ２８またはＣＴＬＡ−４断片または副断片の配列保存性および機能保存性変異体を、サイトカイン、インターロイキン、インターフェロン、コロニー刺激因子、病原性微生物から得られる抗原、抗体、またはＥ．ｃｏｌｉ ｌａｃＺ、Ｅ．ｃｏｌｉ ｕｉｄＡ、または緑蛍光タンパク質のようなｈｉｓタグまたはレポーター遺伝子のような精製配列のような別の配列に枠内で融合させる。

＜ワクチン＞
本発明は、ネコ種での免疫応答の効力を増強するための方法および組成物を包含する。この実施形態では、ネコＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ２８またはＣＴＬＡ−４は、免疫応答を引出すことが望まれる免疫原との結合で使用される。例えば、ネコ免疫不全ウイルスおよびネコ白血病ウイルスのような病原体、およびネコパルボウイルス、ネコレプトウイルス、およびネココロナウイルスのような他の病原体から得られる免疫原を含むネコのワクチンでは、免疫応答の規模および質を制御するために、ワクチン中にネコＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ２８またはＣＴＬＡ−４を含むことが望ましい。この目的のために、上に記述されるとおりの生来の、または組換え源から精製されるネコＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ２８またはＣＴＬＡ−４は、１匹のネコ当たり、ワクチン当たり約０．０１から１００．０ｍｇまでの範囲にある濃度でワクチン処方に含まれる。代替的に、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ２８および／またはＣＴＬＡ−４を発現する組換えベクターは、１匹のネコ当たり、ワクチン当たり約０．０１から１００．０ｍｇまでの範囲にある濃度で、好ましくは、約０．２５ｍｇ／ｋｇ／日から約２５ｍｇ／ｋｇ／日までの範囲内にある濃度でワクチン処方での量で、ワクチン処方に含まれる。

ネコＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ２８またはＣＴＬＡ−４を、生（すなわち、複製する）ウイルスワクチンまたは複製しないワクチンと共同して投与する。複製するワクチンの限定なしの例は、修飾したネコヘルペスウイルスまたは修飾したアライグマ痘ウイルスのような生来のまたは組換えウイルスまたは細菌を包含するものである。ネコ宿主での複製を制限するか、または複製しないが、宿主細胞中の外来ＤＮＡ（ネコＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ２８またはＣＴＬＡ−４、またはネコ病原体から得られる免疫原のような）を発現することを示す生ウイルス性ワクチンの限定なしの例は、修飾したイノシシ痘ウイルス、修飾した豚痘ウイルスまたはセミリキ・フォーレスト・ウイルスである。複製しないウイルスの限定なしの例は、死滅または不活性化ウイルスまたは他の微生物を含むもの、またはネコ白血病ウイルスワクチンのような生来の、組換え、または合成の源から由来する粗製または精製抗原である。

ネコのワクチンの市販源は、当業者に知られ（獣医治療の概説(Compendium of Veterinary Pharmaceuticals、1997年)）そして、いっそう有効なワクチンのために本発明と組合わせて使用される。

免疫原に対するネコ科における免疫応答を誘導および制御するためのワクチンは、免疫原、および免疫応答増強のためのネコＣＤ２８またはネコＣＴＬＡ−４と共に、またはなしに有効量のネコＣＤ８０またはＣＤ８６、または免疫応答抑制のためのネコＣＴＬＡ−４と共にネコＣＤ８０またはネコＣＤ８６から構成される。

免疫原は、限定されないが、ネコ免疫不全ウイルス、ネコ白血病ウイルス、ネコ感染性腹膜炎ウイルス、ネコ汎白血球減少症ウイルス（パルボ）、ネコカルシウイルス、ネコレオウイルス３型、ネコロタウイルス、ネココロナウイルス（感染性腹膜炎）、狂犬病ウイルス、ネコシンシチウムのウイルス、ネコ肉腫ウイルス、ネコヘルペスウイルス（鼻気管炎ウイルス）、ネコボルナ病ウイルス、クラミジア、トキソプラスモシス・ゴンジ、ネコ寄生生物、ジロフィラリア・イミチス、ノミ、細菌性病原体および同等物のようなネコ病原体から構成される群から選択される。

Ｔリンパ球のような細胞型の成長の制御、または活性化の制御では、制御応答が、細胞成長を刺激するか、または抑制するかの何れかであることが示される。ネコ科での免疫応答の制御では、免疫応答が、ネコ科での疾病または感染媒体を治療するために刺激または抑制されることが示される。

好ましい実施形態では、ネコＣＤ８０とＣＤ２８、ＣＤ８０とＣＴＬＡ−４、ＣＤ８６とＣＤ２８、またはＣＤ８６とＣＴＬＡ−４をコードする遺伝子は、ネコ病原体から得られる免疫原についての遺伝子と組合わせて、単独組換えウイルス性ベクターに組込まれ、そしてその後、生ワクチンへ処方される。ネコＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ２８またはＣＴＬＡ−４遺伝子単独で、またはネコ免疫原遺伝子と組合わせて、組換えウイルスに組込まれ、その結果、これらの遺伝子の発現が、適切なプロモーターによって制御される。ワクチンの投与で、生物活性ネコＣＤ８０またはＣＤ８６リガンド、およびＣＤ２８またはＣＴＬＡ−４レセプターの発現、同じ細胞でのネコ免疫原（類）の発現を生じ、その結果、所望の免疫応答を増強するために必要とされる一次および二次同時刺激シグナルが供される。この実施形態は、ネコ免疫原に対する即時型に局在化された免疫応答、および改善された効力を示す、ネコ疾病に対するワクチンを提供する。

別の実施形態では、ネコＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ２８またはＣＴＬＡ−４単独で、または組合わせでコードする遺伝子が、組換えウイルス性ベクターに組込まれ、そしてネコ免疫原（類）についての遺伝子をコードする二次組換えウイルス性ベクターと共に、ワクチンに同時投与され、それにより、同じ細胞中で、または所望の免疫応答の増強を達成するのに密接に近接する細胞で所望の応答、および改善された効力を示すネコ疾病に対するワクチンが供される。

以下は、ネコＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ２８およびＣＴＬＡ−４の発現で使用するための、そして病原体性微生物に挑戦する改善された保護的免疫応答を生じるワクチンで使用するための組換えウイルス性ベクターの例である：
１．組換え豚痘ウイルス（任意の非必須の挿入部位への挿入）におけるネコＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ２８およびＣＴＬＡ−４単独、またはそれらの任意の組合せで、部分的にまたは全体での発現。複製なしのワクチン接種目的については、ネコ科に限定されないが、ネコ科で使用するための単独、または別のワクチンまたは治療剤（組換え、生または死滅させたもの）との組合せを使用する。

２．組換えネコヘルペスウイルス（ＦＨＶｇＥ部位、または任意の非必須の挿入部位への挿入）におけるネコＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ２８およびＣＴＬＡ−４単独、またはそれらの任意の組合せで、部分的にまたは全体での発現。複製するワクチン接種目的については、ネコ科に限定されないが、ネコ科で使用するための単独、または別のワクチンまたは治療剤（組換え、生または死滅させたもの）との組合せを使用する。

３．組換えアライグマ痘ウイルス（任意の非必須の挿入部位への挿入）におけるネコＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ２８およびＣＴＬＡ−４単独、またはそれらの任意の組合せで、部分的にまたは全体での発現。複製するワクチン接種目的については、ネコ科に限定されないが、ネコ科で使用するための単独、または別のワクチンまたは治療剤（組換え、生または死滅させたもの）との組合せで使用する。

４．ＦＩＶｇａｇ−プロテアーゼおよび／またはエンベロープのための遺伝子を含む組換え豚痘ウイルスにおけるネコＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ２８およびＣＴＬＡ−４単独、またはそれらの任意の組合せで、部分的にまたは全体での発現。

５．ＦＩＶｇａｇ−プロテアーゼおよび／またはエンベロープのための遺伝子を含む組換えネコヘルペスウイルスにおけるネコＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ２８およびＣＴＬＡ−４単独、またはそれらの任意の組合せで、部分的にまたは全体での発現。

６．ＦＩＶｇａｇ−プロテアーゼおよび／またはエンベロープのための遺伝子を含む組換えアライグマ痘ウイルスにおけるネコＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ２８およびＣＴＬＡ−４単独、またはそれらの任意の組合せで、部分的にまたは全体での発現。

７．ＦｅＬＶｇａｇ−プロテアーゼおよび／またはエンベロープのための遺伝子を含む組換え豚痘ウイルスにおけるネコＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ２８およびＣＴＬＡ−４単独、またはそれらの任意の組合せでの発現。

８．ＦｅＬＶｇａｇ−プロテアーゼおよび／またはエンベロープのための遺伝子を含む組換えネコヘルペスウイルスにおけるネコＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ２８およびＣＴＬＡ−４単独、またはそれらの任意の組合せで、部分的にまたは全体での発現。

９．ＦｅＬＶｇａｇ−プロテアーゼおよび／またはエンベロープのための遺伝子を含む組換えアライグマ痘ウイルスにおけるネコＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ２８およびＣＴＬＡ−４単独、またはそれらの任意の組合せで、部分的にまたは全体での発現。

１０．ＦｅＬＶｇａｇ−プロテアーゼおよび／またはエンベロープのためのおよびＦＩＶｇａｇ−プロテアーゼおよび／またはエンベロープのための遺伝子、またはその任意の組合せを含む組換え豚痘ウイルスにおけるネコＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ２８およびＣＴＬＡ−４単独、またはそれらの任意の組合せで、部分的にまたは全体での発現。

１１．ＦｅＬＶｇａｇ−プロテアーゼおよび／またはエンベロープのためのおよびＦＩＶｇａｇ−プロテアーゼおよび／またはエンベロープのための遺伝子、またはその任意の組合せを含む組換えネコヘルペスウイルスにおけるネコＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ２８およびＣＴＬＡ−４単独、またはそれらの任意の組合せで、部分的にまたは全体での発現。

１２．ＦｅＬＶｇａｇ−プロテアーゼおよび／またはエンベロープのためのおよびＦＩＶｇａｇ−プロテアーゼおよび／またはエンベロープのための遺伝子、またはその任意の組合せを含む組換えアライグマ痘ウイルスにおけるネコＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ２８およびＣＴＬＡ−４単独、またはそれらの任意の組合せで、部分的にまたは全体での発現。

１３．組換え豚痘ウイルスまたはアライグマ痘ウイルスにおけるネコＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ２８およびＣＴＬＡ−４単独、またはそれらの任意の組合せで、部分的にまたは全体での発現、または未精製または精製ポリペプチドを生成する目的で、それに限定されないがＥ．ｃｏｌｉ、セムリキ・フォーレストウイルスおよびバキュロウイルスを含めた任意の他の発現系。それに限定されないが、ポリクローナルおよびモノクローナル抗体の生成、および機能アッセイ開発のための薬剤の生成を含めて使用する。

１４．ＦＩＶまたはＦｅＬＶ弱毒化ウイルスベクター中でネコＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ２８およびＣＴＬＡ−４単独、または任意の組合せでの発現。１つの実施形態では、ＦＩＶまたはＦｅＬＶウイルス性ベクターを、遺伝子欠失によって弱毒化する。

１５．遺伝的ワクチンまたは裸のＤＮＡワクチンとして投与する目的のためネコ免疫原のための遺伝子（類）を含む発現ベクター中でネコＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ２８およびＣＴＬＡ−４単独、または任意の組合せで、部分的に、または全体での発現。ベクターは、それに限定されないが、ｐＴａｒｇｅｔ（ウイスコンシン州マディソンのプロメガ）、ｐｃＤＮＡ（カリフォルニア州カールスバッドのインビトロゲン）が挙げられる。（Donnelly JJら、１９９７年；HassettおよびWhitton、1996年。）
１６．ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ２８およびＣＴＬＡ−４単独、または任意の組合せでの遺伝子または遺伝子の断片は、ネコ科または他の哺乳類の染色体への挿入または形質移入されうる。レトロウイルス性ベクターで達成しうる場合これらの遺伝子のこのような組込みまたはこれらの遺伝子の断片、そして遺伝子療法の形態として使用しうる。

本発明は、医療用および／または市販目的としてネコ種の疾病に対する耐性を改善するための方法および組成物を提供する。この実施形態では、単独、または任意の組合せで、部分的または全体に、そしてネコ免疫原をコードする遺伝子との組み合わせで、またはなしに発現されるネコＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ２８またはＣＴＬＡ−４を、投与の適切な態様を用いてネコ科に使用する。成長促進または疾病耐性について、単独、または任意の組合せで発現されるネコＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ２８またはＣＴＬＡ−４を、量で、ネコ当たりワクチンあたり約０．０１から１００．０ｍｇまでの範囲にはいる濃度で処方で、好ましくは約０．２５ｍｇ／ｋｇ／日から約２５ｍｇ／ｋｇ／日までの範囲にはいる濃度で処方で投与する。成長促進または疾病耐性については、単独、または任意の組合せで、ネコＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ２８またはＣＴＬＡ−４を発現する組換えウイルス性ベクターを、量で、ネコ当たりワクチンあたり約０．０１から１００．０ｍｇまでの範囲にはいる濃度で処方で、好ましくは約０．２５ｍｇ／ｋｇ／日から約２５ｍｇ／ｋｇ／日までの範囲にはいる濃度で処方で投与する。所望の量のネコＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ２８またはＣＴＬＡ−４を、用量および頻度のマトリックスを樹立し、そして実験単位または対象の群をマトリックス内の各点と比較するこによるような、当業界でよく知られる日常的な実験によって測定することができる。

本発明により、生来のまたは組換えネコＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ２８またはＣＴＬＡ−４を、例えば、リン酸緩衝生理食塩水または脱イオン化水のような生理学上許容しうる担体と処方する。処方は、潤滑剤（類）、可塑剤（類）、吸収増強剤（類）、殺菌剤（類）および当業界でよく知られる同等物のような助剤も含有しうる。本発明のネコＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ２８またはＣＴＬＡ−４ポリペプチドを、限定なしに、静脈、皮下、筋肉内、経筋肉、局所または経口経路を含めた任意の有効な手段によって投与する。皮下投与については、例えば、用量形態は、滅菌生理学的生理食塩水中のネコＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ２８またはＣＴＬＡ−４から構成される。経口または吸入投与については、助剤と共に、またはなしでネコＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ２８またはＣＴＬＡ−４を、例えばリポソームおよびマイクロスフィア中に微小または巨大封入させる。皮下パッチ（または他の低速放出用量形態）も使用される。

＜材料および方法＞
アライグマ痘ウイルス保存サンプルの調製：
アライグマ痘ウイルス（ＲＰＶ）単離ＡＴＣＣ ＶＲ−８３８を、アライグマ痘ウイルス保存サンプルおよびアライグマ痘ウイルスゲノムＤＮＡの調製のために使用した。入手可能な別のＲＰＶ単離物は、センター・フォー・ディジース・コントロール（ＣＤＣ；ジョージア州アトランタ）から得られるＶ７１−Ｉ−８５Ａである。アライグマ痘ウイルス（ＲＰＶ）サンプルは、２ｍＭグルタミン、１００単位／ｍｌペニシリン、１００単位／ｍｌストレプトマイシン（これらの成分は、シグマまたは同等の供給業者から得られ、そして以降、ＤＭＥＭ負の培地と称される）を含むダルベッコの修飾イーグル培地中に０．０１ＰＦＵ／細胞の感染の多様性でＶＥＲＯ細胞、ＣＲＦＫ細胞、またはＭＤＣＫ細胞を感染することによって調製される。感染の前に、細胞単分子層を、一回、ＤＭＥＭ負の培地で洗浄して、仔ウシ血清の跡を除去する。その後、当初の接種に含まれるＲＰＶ（１０ｃｍ平板については０．５ｍｌ、Ｔ２２５ｃｍフラスコについて１０ｍｌ）を、２時間、細胞単分子層に吸収させ、それにより毎半時間、再分配された。この時期の後、当初の接種を、完全ＤＭＥＭ培地（５％仔ウシ血清を加えたＤＭＥＭ負の培地）を添加しながら推奨容積まで行った。細胞変性効果が完了するまで、平板を、３７℃で、５％ＣＯ_２中でインキュベートした。培地および細胞を、回収し、そして５０ｍｌ円筒スクリュー栓試験管中で−７０℃で凍結した。３７℃で解凍させて、ウイルス保存物を、１．０ｍｌバイアルに適量とり、そして−７０℃で再凍結した。滴定は、通常、約１０^６ＰＦＵ／ｍｌであった。

豚痘ウイルス保存サンプルの調製：
豚痘ウイルス（ＳＰＶ）サンプルを、イスコフの修飾ダルベッコ培地（ＩＭＤＭ）および２ｍＭグルタミン、１００単位／ｍｌペニシリン、１００単位／ｍｌストレプトマイシン（これらの成分は、シグマまたは同等の供給業者から得られ、そして以降、ＥＭＳＫ負の培地と称される）を含むＰＲＭＩ１６４０倍血の１：１混合で、０．０１ＰＦＵ／細胞の感染の多重性で、胚の豚腎臓（ＥＭＳＫ）細胞、ＥＳＫ−４細胞、ＰＫ−１５細胞またはベロ細胞を感染させることによって調製した。感染の前に、細胞単分子層を、一回、ＥＭＳＫ負の培地で洗浄して、仔ウシ血清の跡を除去する。その後、当初の接種に含まれるＳＰＶ（１０ｃｍ平板については０．５ｍｌ、Ｔ１７５ｃｍフラスコについて１０ｍｌ）を、２時間、細胞単分子層に吸収させ、それにより毎半時間、再分配された。この時期の後、当初の接種を、完全ＥＭＳＫ培地（５％仔ウシ血清を加えたＥＭＳＫ負の培地）を添加しながら推奨容積まで行った。細胞変性効果が完了するまで、平板を、３７℃で、５％ＣＯ_２中でインキュベートした。培地および細胞を、回収し、そして５０ｍｌ円筒スクリュー栓試験管中で−７０℃で凍結した。３７℃で解凍させて、ウイルス保存物を、１．０ｍｌバイアルに適量とり、そして−７０℃で再凍結した。滴定は、通常、約１０^６ＰＦＵ／ｍｌであった。

ＲＰＶまたはＳＰＶ・ＤＮＡの調製。アライグマ痘ウイルスまたは豚痘ウイルスＤＮＡ単離については、ＴＲ２２５ｃｍ^２フラスコ中のベロ細胞（ＲＰＶのための）またはＥＭＳＫ細胞（ＳＰＶのための）の融合単分子層を、アライグマ痘ウイルス（ＡＴＣＣ ＶＲ−８３８）と０．１の多様性で感染させ、そして細胞が、１００％細胞変性効果を示すまで３−５日間インキュベートした。その後、感染細胞を、その細胞を培地に擦りつけて回収し、そして臨床用遠心分離装置で５分間、３０００ｒｐｍで遠心分離した。培地を傾寫し、そして細胞ペレットを、１．０ｍｌリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ：リットルＨ_２Ｏ当たり１．５ｇＮａ_２ＨＰＯ_４、０．２ｇＫＨ_２ＰＯ_４、０．８ｇ ＮａＣｌおよび０．２ｇ ＫＣｌ）（Ｔ１７５当たり）に穏やかに再懸濁させ、そして二回の連続凍結−解凍（−７０℃から３７℃）にかけた。最後の解凍で、細胞（氷上の）を、三回、３０秒間、間に各々４５秒冷却して、超音波処理した。その後、細胞崩壊物を、４℃で、ＨＢ４ローター中で、５分間、３０００ｒｐｍで遠心分離（ソルバールＲＣ−５Ｂ超高速遠心分離装置）により取除いた。その後、上清に存在するＲＰＶビリオンを、ＳＳ３４ローター（ソルバール）中で４℃で、２０分間、１５，０００ｒｐｍで遠心分離することによってペレット化し、そして１０ｍＭトリス（ｐＨ７．５）に再懸濁させた。この画分を、３６％ショ糖勾配（１０ｍＭトリス（ｐＨ７．５）中ｗ／ｖ）上に層に形成させ、そして４℃で、ＳＷ４１ローター（ベックマン）中で６０分間、１８，０００ｒｐｍで遠心分離（ベックマンのＬ８−７０Ｍウルトラセントリフュージ）した。ビリオンペレットを、１０ｍＭトリス（ｐＨ７．５）１．０ｍｌ中に再懸濁させ、そして氷上で３０秒間、超音波処理した。この画分を、２０％から５０％の連続ショ糖勾配上に層に形成させ、そして４℃で、ＳＷ４１ローター中で６０分間、１６，０００ｒｐｍで遠心分離した。その勾配の約４分の３下手に配置されるＲＰＶビリオンバンドを回収し、２０％ショ糖で希釈し、そして４℃で、ＳＷ４１ローター中で６０分間、１８，０００ｒｐｍで遠心分離した。その後、得られたペレットを、１０ｍＭトリス（ｐＨ７．５）で一回洗浄して、ショ糖の痕跡を取除き、そして最終的に１０ｍＭトリス（ｐＨ７．５）に再懸濁させた。その後、ＲＰＶのＤＮＡを、ＥＤＴＡ、ＳＤＳ、およびプロテナーゼＫを、それぞれ２０ｍＭ、０．５％および０．５ｍｇ／ｍｌの最終濃度まで添加することによって誘導される透析（４時間、６０℃で）により精製ビリオンから抽出した。消化後、三回のフェノール：クロロホルム（１：１）抽出を行い、そしてサンプルを、２倍量の完全エタノールを添加し、そして−２０℃で、３０分間インキュベートすることによって沈殿させた。その後、サンプルを、５分間、全速力で、エフェンドルフ・小型遠心分離装置で遠心分離した。培地を傾寫し、そしてペレットを空気乾燥させ、そして４℃で、０．０１Ｍトリス（ｐＨ７．５）、１ｍＭ ＥＤＴＡ中で脱水させた。

ＦＨＶウイルス保存サンプルの調製：
Ｓ−ＦＨＶ−０００を、ＡＴＣＣ（ＡＴＣＣ番号６３６）から得、そしてＳ−ＦＨＶ−００１を、ＮＶＳＬ（ＮＶＳＬの検証ウイルス株ＳＧＥ、ロットＫＳ）から得た。ＦＨＶウイルス保存サンプルを、２ｍＭグルタミン、１００単位／ｍｌペニシリン、１００単位／ｍｌストレプトマイシン（これらの成分は、アービン・サイエンティフィックまたは同等の供給業者から得、そして以降、完全ＤＭＥ培地と称される）、それに５％仔ウシ血清を加えて含むダルベッコの修飾イーグル培地（ＤＭＥＭ）中で１．０ＰＦＵ／細胞の感染の効率でクランデルのネコ腎臓（ＣＲＦＫ）細胞を感染させることによって調製した。細胞変性効果が完了した後、培地および細胞を回収し、適量とり、そして−７０℃で凍結させた。滴定は、およそ１×１０^７から１×１０^８ＰＦＵ／ｍｌであった。

ヘルペスウイルスＤＮＡの調製：
２５ｃｍ^２フラスコまたは６０ｍｍペトリ皿中のＣＲＦＫ細胞の融合単分子層を、１００ｍｌのウイルスサンプルで感染させた。一夜インキュベーション後、または細胞が、１００％細胞変性効果を示しているときに、細胞を、培地に擦り落とした。細胞および培地を、医療用遠心分離装置で５分間３０００ｒｐｍで遠心分離した。培地を傾寫し、そして細胞ペレットを、１．５％ノニデットＰ４０（登録商標）（分子当たり平均９モルのエチレンオキシドを含むオクチルフェノールエチレンオキシド縮合物）（ＮＰ−４０（登録商標）、ミズーリ州セントルイスのシグマ・ケミカル・シーオー(Sigma Chemical Co.)から購入した）を含む０．５ｍｌ溶液に再懸濁させた。サンプルを、１０分間、室温でインキュベートした。ＲＮエースＡの保存溶液（シグマ・ケミカル・シーオー、ミズーリ州セントルイス）１０ｍｌを、添加した（保存は、１０ｍｇ／ｍｌであった。ＤＮエースを不活性化させるまで１０分間煮沸した）。サンプルを、ペレット核になるまで遠心分離した。ＤＮＡペレットを、パスツール・ピペットまたは木製スティックで取除き、排除した。上清液体を、２０％硫酸ドデシルナトリウム（シグマ）２５ｍｌ、２５ｍｌプロテイナーゼ−Ｋ（１０ｍｇ／ｍｌ；インディアナ州インディアナポリスのベーリンガー・マンハイム・バイオケミカルズ）を含む１．５ｍｌエッフェンドルフ試験管に傾寫した。サンプルを混合し、そして３０−６０分間、３７℃でインキュベートした。等量の水飽和フェノールを添加し、そしてサンプルを簡潔に混合した。サンプルを、５分間、全速力で、エッフェンドルフ小型遠心分離装置で遠心分離した。上部水層を、新たなエッフェンドルフ試験管に取り、そして２倍容量の完全エタノールを添加し、そして試験管を、３０分間、−２０℃にして、核酸を沈殿させた。サンプルを、５分間、エッフェンドルフ試験管で遠心分離した。上清を、傾寫し、そしてペレットを、空気乾燥させ、〜１６ｍｌのＨ_２Ｏで脱水させた。大量のＤＮＡの調製のために、その手段を、スケールアップして、ローラーボトルまたは１７５ｃｍ^２フラスコのＣＲＦＫ細胞で出発させた。ＤＮＡを、４℃で０．０１Ｍトリス（ｐＨ７．５）、１ｍＭ ＥＤＴＡ中に保存した。

組換えウイルスを生成するためのＤＮＡ形質移入：
方法は、以下の修飾法でGrahamおよびVan der eb［２５］のリン酸カルシウム手段に基づいている。ウイルスおよび／またはプラスミドＤＮＡを、０．０１Ｍトリス（ｐＨ７．５）、１ｍＭ ＥＤＴＡ中に２９８ｍｌまで希釈した。４０ｍｌの２ＭＣａＣｌ_２を添加し、続いて等量の２×ＨＥＰＥＳ緩衝生理食塩水（リットルＨ_２Ｏ当たり１０ｇのＮ‘’−２−エタンスルホン酸Ｎ−２−ヒドロキシエチルピペラジン（ＨＥＰＥＳ）、１６ｇのＮａＣｌ、０．７４ｇのＫＣｌ、０．２５ｇのＮａ_２ＨＰＯ_４・２Ｈ_２Ｏ、２ｇデキストロース、そしてＮａＯＨでｐＨ７．４まで平衡にした）を添加した。その後、混合物を、氷上で１０分間、インキュベートし、そしてその後、５ｍｌの培地（ＤＭＥ、それに加えて５％仔ウシ血清）下で６０ｍｍペトリ皿で成長する８０％融合単分子層のＣＲＦＫ細胞まで滴加した。細胞を、４時間、３７℃で、５％ＣＯ_２を含む湿潤インキュベーター中でインキュベートした。平板上の培地を吸引し、そして細胞を、１分間、１×ＰＢＳ（リットルＨ_２Ｏ当たり１．１５ｇのＮａ_２ＨＰＯ_４、０．２ｇのＫＨ_２ＰＯ_４、０．８ｇのＮａＣｌ、０．２ｇのＫＣｌ）中の２０％グリセロールで処理した。その細胞を、１×ＰＢＳ５ｍｌで三回洗浄し、そしてその後、５ｍｌの培地（ＤＭＥ、それに加えて５％仔ウシ血清）で育成した。ウイルスから得られた細胞変性効果が、５０−１００％であるまで細胞を、上記のとおり３７℃で、３−７日間インキュベートした。上に記述されるとおり、ウイルス保存の調製のためにウイルスを回収した。この保存は、形質移入保存と称され、そして酵素的マーカー遺伝子を発現する組換えヘルペスウイルス用のスクリーンによって、組換えウイルスについて続いてスクリーニングした。

感染細胞溶解液の調製： 細胞溶解液調製については、血清不含培地を使用した。２５ｃｍ^２フラスコまたは６０ｍｍペトリ皿中の細胞（ＶＥＲＯ、ＣＲＦＫまたはＭＤＣＫ）の融合単分子層を、ウイルスサンプル１００μｌで感染させた。細胞変性効果が完了した後、細胞および培地を、医療用遠心分離装置で５分間３０００ｒｐｍでペレットにした。細胞ペレットを、破壊緩衝液（２％硫酸ドデシルナトリウム、２％β−メルカプトエタノール）２５０μｌに再懸濁させた。そのサンプルを、３０分間、氷上で超音波処理し、そしてー２０％℃で保存した。

ウエスタンブロッティング手段： 溶解液のサンプルおよびタンパク質標準を、Ｌａｅｍｎｌｉの手段によってポリアクリルアミドゲルにかけた。ゲル電気泳動後、タンパク質を移動させ、そしてＳambrookら（１９８９年）によって加工した。一次抗体は、トリス−塩化ナトリウム中の５％非脂質乾燥ミルク、およびナトリウムアジド（ＴＳＡ：リットルＨ_２Ｏ当たり６．６１ｇトリス−ＨＣｌ、０．９７ｇトリス−塩基、９．０ｇのＮａＣｌおよび２．０ｇナトリウムアジド）で１：１０００に希釈した。二次抗体は、アルカリ性フォスファターゼ接合体であり、そしてＴＳＡで１：１００に希釈した。

分子生物学的技術。制限エンドヌクレアーゼでの消化、ゲル電気泳動、ゲルからのＤＮＡの抽出、ライゲーション、キナーゼを用いたリン酸化、フォスファターゼでの処置、細菌培養物の成長、ＤＮＡでの細菌の形質転換、および他の分子生物学上の方法のような手段を含めた細菌およびＤＮＡの操作についての技術は、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（１９８９年）および分子生物学における最新プロトコール(Current Protocols in Molecular Biology)（１９９２年）によって記述される。特に記述される場合を除き、小さな変化を伴って使用される。

ＤＮＡ配列： ＤＮＡ配列は、ＡｍｐｌｉｔａｑＤＮＡポリメラーゼ、ＦＳ（パーキン−エルマー；製造業者の指示当たり）を備えたＡＢＩプリズム染色ターミネーターサイクルシーケンシング既成反応キットを用いた蛍光標識ジデオキシシーケンシング反応によって行い、そして製造業者の指示に従って、パーキン−エルマー／アプライド・バイオシステムズの自動制御ＤＮＡシーケンサーモデル３７３Ａ上で電気泳動した。ｄＧＴＰ混合およびｄＩＴＰ混合の両方を用いた反応を行って、圧縮の領域を透明にした。代替的には、圧縮領域を、ホルムアミドゲルで溶解させた。テンプレートは、二重標準プラスミドサブクローンまたは単独標準Ｍ１３サブクローンであり、そしてプライマーを、配列されるべき挿入物のすぐ外側のベクターにするか、または先に得られた配列にするか何れかにした。得られた配列は、似ており、そしてＤＮＡＳｔａｒ ソフトウエアーを用いて比較した。

ポリメラーゼ連鎖反応を用いたクローニング： ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を使用して、種々のＤＮＡの操作について都合のよい制限部位を導入した。使用される手段は、Ｉｎｎｉｓら、（１９９０年）によって記述される。一般に、増幅断片は、寸法で５００塩基対より低く、そして増幅断片の重大な領域を、ＤＮＡシーケンシングによって確認した。各事例で使用されるプライマーは、以下の相同のベクターの構築の説明で詳述される。

組換えＲＰＶ、ＳＰＶまたはＦＨＶを生成するための相同組換え手段： この方法は、アライグマ痘ウイルスＤＮＡと形質移入プラスミド相同ベクターの両方を含む組織培養細胞中で生じるアライグマ痘ウイルスと、プラスミド相同ベクターＤＮＡとの間の相同な組換えによる。生じる相同な組換えについては、細胞（ＣＲＦＫ、ＭＤＣＫまたはＶＥＲＯ）の単分子層を、０．０１ＰＦＵ／細胞の感染の重複度で、Ｓ−ＲＰＶ−０００（ＡＴＣＣ ＶＲ−８３８）またはＳ−ＳＰＶ−００１またはＳ−ＦＨＶ−００１で感染させて、細胞へのＰＲＶの複製（すなわち、ＤＮＡ合成）を導入した。その後、プラスミド相同性ベクターＤＮＡを、感染−形質移入手段によりこれらの細胞に形質移入させた。この手段に使用される相同性ベクターの構築は、以下に記述される。

感染−形質移入手段： 約８０％融合で細胞（ＣＲＦＫ、ＭＤＣＫまたはＶＥＲＯ）の６ｃｍ平板を、ＤＭＥＭ負の培地中の０．０１ＰＦＵ／細胞の感染の重複度で、Ｓ−ＲＰＶ−０００またはＳ−ＳＰＶ−００１またはＳ−ＦＨＶ−００１で感染させ、そして２−３時間、湿潤５％ＣＯ_２環境で、３７℃でインキュベーションした。使用された形質移入手段は、リポフェクチン^ＴＭ試薬（ＢＲＬ）について基本的に推奨されるものである。簡潔には、各６ｃｍ平板については、１５μｇのプラスミドＤＮＡを、Ｈ_２Ｏで１００μｌまで希釈した。別々に、５０マイクログラムのリポフェクチン試薬を、Ｈ_２Ｏで１００μｌまで希釈した。その後、１００μｌの希釈リポフェクチン試薬を、プリスチレン５ｍｌスナップ栓試験管に含まれる希釈プラスミドＤＮＡに滴加し、そして穏やかに混合した。その後、混合液を、室温で１５−２０分間インキュベートした。この時の間、ウイルス接種物を、６ｃｍ平板から取り、そして細胞単分子層を、ＤＭＥＭ負の培地で一回洗浄した。３ｍｌのＤＭＥＭ負の培地を、プラスミドＤＮＡ／リポフェクチン混合物に添加し、そして内容物を、細胞単分子層の上にピペットで取った。細胞を、湿潤５％ＣＯ_２環境で、３７℃で一夜（約１６時間）インキュベートした。次の日に、３ｍｌのＤＭＥＭ負の培地を、除去し、そして５ｍｌＤＭＥＭ完全培地に交換した。ウイルスから得られる細胞変性効果が、８０−１００％になるまで、細胞を、３−５時間、５％ＣＯ_２環境で、３７℃でインキュベートした。ウイルス保存の調製のため、ウイルスを上に記述のとおりに回収した。この保存物は、形質移入保存物と称され、そして順次、組換えアライグマ痘ウイルス用のブルーガルのスクリーン、または組換えアライグマ痘ウイルス用のＣＰＲＧスクリーンによって組換えウイルスについてスクリーニングした。

βガラクトシダーゼ（ブルーガルおよびＣＰＲＧアッセイ）またはβグルクロニダーゼ（Ｘ−グルクアッセイ）を発現する組換えＲＰＶまたはＳＰＶまたはＦＨＶ用のスクリーン： Ｅ．ｃｏｌｉ β−ガラクトシダーゼ（ｌａｃＺ）マーカー遺伝子を、組換えウイルスに組込んだ。２つの簡単な方法の内の１つによって組換え体を含むプラークを可視化した。最初の方法では、化学的ブルーガル^ＴＭ（商標）（ライフ・サイエンス・テクノロジー、メリーランド州ベセズダ）を、プラークアッセイの間、覆い被さったアガロースに組込ませ（２００μｌ／ｍｌ）、そして活性β−ガラクトシダーゼを発現するプラークは青色になった。その後、青色プラークを、新たな細胞（ＭＤＣＫ、ＣＲＦＫまたはＶＥＲＯ）に取り、そして更に青色プラーク単離によって精製した。第二の方法では、ＣＰＲＧ（ベーリンガー・マンハイム）を、プラークアッセイの間、覆い被さったアガロースに組込ませ（４００μｌ／ｍｌ）、そして活性β−ガラクトシダーゼを発現するプラークは赤色になった。その後、赤色プラークを、新たな細胞（ＭＤＣＫ、ＣＲＦＫまたはＶＥＲＯ）に取り、そして更に赤色プラーク単離によって精製した。両方の場合に、ウイルスを、特徴的に、３から４回のプラーク精製で精製した。

Ｅ．ｃｏｌｉ β−グルクロニダーゼ（ｕｉｄＡ）マーカー遺伝子が、組換えウイルスに取り込まれるときに、組換え体を含むプラークを、色素原物質を使用することによって可視化させ、Ｘ−ベータ−Ｄ−ｇｌｕＵＡ ＣＨＸ（Ｘ−ＧＬＵＣ；５−ブロモ−４−クロロ−３−インドキシル−ベータ−Ｄ−グルクロン酸、シクロヘキシルアンモニウム塩；バイオシンスＡＧ、スイス国）を、プラークアッセイの間、覆い被さったアガロースに組込ませ（２００μｌ／ｍｌ）、そして活性β−グルクロニダーゼを発現するプラークは青色になった。その後、青色プラークを、新たな細胞（ＭＤＣＫ、ＣＲＦＫまたはＶＥＲＯ）に取り、そして更に青色プラーク単離によって精製した。

黒色プラークアッセイを用いた組換えＲＰＶでの外来遺伝子発現用のスクリーン：
組換えアライグマ痘ウイルスによって発現される外来抗原の発現を分析するために、細胞（ＭＤＣＫ、ＣＲＦＫまたはＶＥＲＯ）の単分子層を、組換えＲＰＶまたはＳＰＶまたはＦＨＶで感染させ、栄養アガロース培地で被覆させ、そしてプラーク発生を生じるために、３７℃で３−５日間インキュベートした。その後、アガロース被覆を、皿から取除き、そして細胞を、１０分間、室温で、１００％メタノールで固定し、そしてその細胞を、空気乾燥させた。細胞の固定で、表層抗原検出と同様に細胞変性抗原を生じるのに対して、特異的表層抗原発現は、非固定細胞を用いて検出することができる。その後、一次抗体を、１×ブロット（トリス−塩化ナトリウム中の５％非脂質乾燥ミルク）、およびナトリウムアジド（ＴＳＡ：リットルＨ_２Ｏ当たり６．６１ｇトリス−ＨＣｌ、０．９７ｇトリス塩基、９．０ｇＮａＣｌおよび２．０ｇナトリウムアジド）で適切な希釈率まで希釈し、室温で、２時間、細胞単分子層上でインキュベートした。その後、未結合抗体を、細胞を、室温でＴＳ緩衝液で三回細胞を洗浄することによって除去した。第二抗体であるアルカリ性フォスファターゼ接合体を、１×ブロットで１：１０００に希釈し、室温で、２時間、細胞と共にインキュベートした。その後、未結合抗体を、細胞を、室温でＴＳ緩衝液（リットルＨ_２Ｏ当たり６．６１ｇトリス−ＨＣｌ、０．９７ｇトリス塩基、９．０ｇＮａＣｌ）で三回細胞を洗浄することによって除去した。その後、細胞を、新たに調製した基質溶液（１００ｍＭのトリスＨＣｌ（ｐＨ９．５）、１００ｍＭのＮａＣｌ、５ｍＭのＭｇＣｌ_２、０．３ｍｇ／ｍｌニトロブルーテトラゾリウムおよび０．１５ｍｇ／ｍｌの５−ブロモ−４−クロロ−３−インドイル・ホスファターゼ）で、室温で、１５−３０分間インキュベートした。プラークは、正確な抗原株黒色を発現する。固定溶液（２０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ２．９）および１ｍＭのＥＤＴＡ）を使用して、色素発生反応を止めた。

黒色プラークアッセイを用いた組換えＳＰＶ、ＲＰＶまたはＦＨＶ中でのネコＣＤ８０（Ｂ７−１）およびＣＤ８６（Ｂ７−２）発現用のスクリーン： 細胞（ＭＤＣＫ、ＣＲＦＫ、ＶＥＲＯまたはＥＳＫ−４）の単分子層上の組換え豚痘ウイルス、アライグマ痘またはネコヘルペスウイルスによって発現されるＣＤ８０またはＣＤ８６同時刺激分子の発現を分析するために、ＣＤ８０またはＣＤ８６を発現する組換えＲＰＶまたはＳＰＶまたはＦＨＶウイルスに感染させ、栄養アガロース培地上に被覆し、そしてプラーク発生が起こるために、３７℃で３−５日間インキュベートした。その後、アガロース被覆をその皿から取除き、細胞を、１００％メタノールで１０分間、室温で固定して、細胞を空気乾燥させるか、または未固定物を除去し、そして１×ＰＢＳで直ぐに処理した。細胞の固定化で、表層抗原検出と同様に、細胞変性抗原を生じるのに対して、特異的表層抗原発現は、非固定細胞を用いて検出することができる。その後、ｈｕＣＴＬＡ−４／Ｆｃキメラ（アールアンドディー・システムズ、Ｍｉｎｎ．ＭＮ、カタログ番号３２５−ＣＴ）を、１×ブロット（トリス−塩化ナトリウム（ＴＳ：リットルＨ_２Ｏ当たり６．６１ｇトリス−ＨＣｌ、０．９７ｇトリス−塩基、９．０ｇのＮａＣｌ）中の５％非脂質乾燥ミルク）で、適切な希釈率まで希釈し、そして室温で、２時間、細胞単分子層上でインキュベートした。その後、未結合キメラを、室温で、ＴＳ緩衝液で三回細胞を洗浄することによって除去した。検出抗体、モノクローナル抗−ｈｕＩｇＧ１ ｆｃ アルカリ性フォスファターゼ接合体（ジメド（Ｚｙｍｅｄ）、カタログ番号０５−３３２２）を、１×ブロットで適切な濃度に希釈し、そして室温で２時間、細胞と共にインキュベートした。その後、未結合検出抗体を、室温で、ＴＳ緩衝液（リットルＨ_２Ｏ当たり６．６１ｇトリス−ＨＣｌ、０．９７ｇトリス−塩基、９．０ｇのＮａＣｌ）で三回細胞を洗浄することによって除去した。その後、細胞を、新たに調製した基質溶液（１００ｍＭのトリスＨＣｌ（ｐＨ９．５）、１００ｍＭのＮａＣｌ、５ｍＭのＭｇＣｌ_２、０．３ｍｇ／ｍｌニトロブルーテトラゾリウムおよび０．１５ｍｇ／ｍｌの５−ブロモ−４−クロロ−３−インドイル・ホスファターゼ）で、室温で、１５−３０分間インキュベートした。プラークは、ＣＤ８０またはＣＤ８６株黒色を発現する。固定溶液（２０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ２．９）および１ｍＭのＥＤＴＡ）を使用して、色素発生反応を止めた。

ＶＳＶプラーク産生を用いた組換えＳＰＶ、ＲＰＶまたはＦＨＶから発現されるネコ・インターフェロン・ガンマ生物活性用のスクリーン：
９６ウェル平板中のＣＲＦＫＳまたは適切なネコ・セルラインを、ネコＩＦＮガンマを発現する組換えウイルスに感染した細胞から得られる上清で処理した。その後、ＶＳＶウイルス（１００−１０００粒子／ウエル）を、適切なウエルに添加し、そして２４時間、または細胞のみを有する対照ウエルが完全に溶解されるまでインキュベートした。ウエルを、１×ＰＢＳで三回洗浄し、そして単分子層を、１００％メタノールで固定し、そして空気乾燥させた。結晶性バイオレットの０．０５％溶液を、室温で、１０分間、全ウエルに添加し、その後空気乾燥させた。ウエルを、紫色の染料の存在について等級分けした。感触で、健康な単分子層の細胞は、結晶性バイオレット染料を取り込む。ＩＦＮガンマ活性を有する上清は、ＣＲＦＫをＶＳＶ誘導細胞溶解から保護し、そして紫に染色する。

診断に使用するためのウイルス性糖タンパク質の精製のための手段。 ウイルス性糖タンパク質を、抗体アフィニティーカラムを用いて精製する。モノクローナル抗体を生成するために、８から１０週齢のＢＡＬＢ／ｃメスマウスに、１０^７ＰＦＵのアライグマ痘ウイルス組換え体を２から４週間隔で、７回腹膜組織内にワクチン接種した。最後のワクチン接種の３週後、マウスに、４０ｍｇの対応のウイルス性糖タンパク質を腹膜組織内に注入した。最後の抗原投与の３日後、脾臓をマウスから取り出した。

脾臓細胞を、ＯｉおよびHerzenbergから修飾した手段によって、マウスＮＳ１／Ａｇ４形質細胞腫の細胞と融合させた。脾臓細胞および形質細胞腫の細胞を、３００×ｇで、１０分間、遠心分離によって一緒にペレット化させた。ポリエチレングリコール（分子量１３００−１６００）の５０％溶液の内の１ｍｌを、１分間かけて、攪拌しながら細胞ペレットに添加する。ダルベッコの修飾イーグル培地（５ｍｌ）を３分間かけて細胞に添加する。細胞を、１０分間、３００×ｇで遠心分離によってペレット化し、１０％仔ウシ血清を有し、１００ｍＭヒポキサンチン、０．４ｍＭアミノプテリンおよび１６ｍＭチミジン（ＨＡＴ）を含む培地に再懸濁させた。細胞（１００ｍｌ）を、１００ｍｌの正常な脾臓育成層細胞を含む、８から１０の９６ウェル組織培養平板のウエルに添加し、そして３７℃でインキュベートした。細胞を、３から４日毎に新たなＨＡＴ培地で育成する。

ハイブリドーマ培養上清を、１００ｎｇのウイルス性糖タンパク質で被覆された９６ウェルウエルマイクロタイター平板でのＥＬＩＳＡアッセイによって試験する。反応性ハイブリドーマから得られる上清を、黒色プラークアッセイおよびウエスタンブロットによってさらに分析する。選択ハイブリドーマを、限定希釈によって二回クローン化する。腹水液を、５×１０^６ハイブリドーマ細胞を、プリスタン処置ＢＡＬＢ／ｃマウスへの腹膜組織内に注入することによって産生した。

アライグマ痘ウイルス組換え体から得られる細胞溶解液は、「感染細胞溶解液の調製」で記述されるとおりに得られる。糖タンパク質含有細胞溶解液（１００ｍｌ）を、２ｍｌアガロースアフィニティー樹脂を通過させ、それに２０ｍｇの糖タンパク質モノクローナル抗体は、製造業者の指示（ＡＦＣ培地、ニュージャージー州エジソンのニュー・ブルンスウィック・サイエンティフィック）に従って固定化させた。そのカラムを、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中の１００ｍｌの０．１％ノニデットＰ−４０で洗浄して、非特異的結合材料を除去する。結合糖タンパク質を、１００ｍＭ炭酸緩衝液（ｐＨ１０．６）で溶出させる（４０）。

前および後溶出画分を、ＥＬＩＳＡ系でのＲＰＶモノクローナル抗体に対する反応性によって純度について監視する。

ＥＬＩＳＡアッセイ： 標準酵素結合免疫媒体アッセイ（ＥＬＩＳＡ）プロトコールを使用して、ワクチン接種および誘発に続く動物の免疫状態を測定する。糖タンパク質抗原溶液（ＰＢＳ中ｎｇ／ｍｌで１００ｍｌ）を、４℃で、１８時間、マイクロタイター皿のウエルに吸収させる。被覆したウエルを、ＰＢＳで一回洗浄する。１％ＢＳＡ（シグマ）を含有する、２５０ｍｌのＰＢＳを添加し、３７℃で１時間インキュベートすることによってウエルを遮断する。遮断されたウエルを、０．０２％ツイーン２０を含むＰＢＳで一回洗浄する。５０ｍｌの試験血清（先に、１％ＢＳＡを含むＰＢＳ中で１：２に希釈した）を、ウエルに添加し、そして３７℃で１時間インキュベートした。抗血清を除去し、そしてウエルを、０．０２％ツイーン２０を含むＰＢＳで一回洗浄する。西洋ワサビペルオキシダーゼ（１％ＢＳＡを含むＰＢＳ中で１：５００に希釈した、キルケガード・アンド・ペリ・ラボラトリーズ，インク．（Kirkegaard and Perry Laboratories, Inc.）に結合した抗ウシＩｇＧを含む溶液５０ｍｌを、添加して、特異的抗原に対する抗体を含むウエルを可視化させる。溶液を、３７℃で１時間、インキュベートし、その後、除去し、そしてウエルを、０．０２％ツイーン２０を含むＰＢＳで三回洗浄する。１００ｍｌの基質溶液（ＡＴＢＳ、キルケガード・アンド・ペリ・ラボラトリーズ，インク．）を各ウエルに添加し、そして色を、１５分間展開させる。０．１ｍシュウ酸の添加によって、反応を終了させる。色を、自動平板読取装置で、吸光度４１０ｎｍで読み取る。

合成ポックスウイルスプロモーターの構築のための攻略法 組換え豚痘ベクターについて、合成ポックスプロモーターは、外来遺伝子発現の強度とタイミングを制御する能力を含めた幾つかの利点を供する。ワクシニアウイルスで規定されたプロモーターに基づいた３つのプロモーターカセットＬＰ１、ＥＰ１およびＬＰ２を設計した。各カセットは、任意の順番または組合せでカセットを組合わせて使用できる制限部位によって挟まれるワクシニアで定義されるＤＮＡ配列を含むように設計された。イニシエーター・メチオニンも、枠内融合が、ＥｃｏＲＩまたはＢａｍＨＩ部位の何れかで作ることができるように各カセットに設計される。全３つの読取枠内の１組の翻訳終止コドンおよび即時型翻訳終止シグナルも、枠内融合部位の下流に操作した。各カセットをコードするＤＮＡを、標準技術によって合成し、そして適切な相同性ベクターにクローン化させた。

ＣＤ８０の即時型断片の単離：
ＲＮＡｚｏｌＢのＲＮＡ抽出試薬（バイオテックス（Ｂｉｏｔｅｘｃ）、テキサス州ヒューストン）を用いてＣｏｎＡで１６時間刺激した末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）からｍＲＮＡを抽出した。最初に、３’−プライマーとしてオリゴｄＴを使用する逆転写酵素（ＲＴ）反応によって、ｃＤＮＡをこのＲＮＡから誘導した。簡単に、ＲＮＡおよびオリゴｄＴを７５℃で、３分間加熱して、二次構造を取除いた。その後、ＲＴ、ｄＮＴＰ、緩衝液および蒸留水を添加し、混合液を、１時間、４２℃でインキュベートした。このインキュベーションに続いて、サンプルを、９５℃まで、５分間加熱して、ＲＴを不活性化させた。その後、ヒトおよびネズミのＣＤ８０公表配列（ジーンバンク、マサチューセッツ州ゲーサーズバーグ）内の共通領域から誘導される変性プライマーを、遺伝子の一定ドメイン内の中央領域をコードする３４４ヌクレオチド（ｎｔｄ）断片の当初の増幅に使用した。

５’プライマーＢ７−２ ＧＧＣ ＣＣＧ ＡＧＴ Ａ（ＣＴ）Ａ ＡＧＡ ＡＣＣ ＧＧＡ Ｃ （配列番号５６）
３’プライマーＢ７−３ ＣＡＧ （ＡＴ）ＴＴ ＣＡＧ ＧＡＴ Ｃ（ＣＴ）Ｔ ＧＧＧ ＡＡＡ （ＣＴ）ＴＧ （配列番号５７）
Ｔａｑポリメラーゼを使用するホットスタートポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）プロトコールを使用して、産物を増幅させた。Ｔａｑ酵素を欠く反応混合液を、最初、ホットスタート段階で、９５℃で、５分間加熱して、プライマー二量体の形成を防止した。酵素を加えてから、温度サイクルを開始した。その後、ＰＣＲ反応液を、９５℃まで３０秒間加熱して、二本鎖ＤＮＡを融解させた。その後、反応液を、４２℃まで、３０秒間冷却して、変性プライマーのアニーリングを促進させた。低アニーリング温度を使用して、１００％相同ではないプライマーの結合を促進させた。その後、反応液を、プライマーを拡張し、そして対峙ＤＮＡ鎖をコピーするＴａｑポリメラーゼについての最適温度、７２℃まで、４５秒間加熱した。温度サイクルを、３０回繰返した。３０サイクルに続いて、７分間、７２℃の最終伸長段階を、使用して、任意の未完成産物の伸長を促進した。１％アガロースゲル上ので可視化の後、産物を、一夜、１６℃で、シーケンシングについてのＴＡクローニングベクター（カリフォルニア州サンディエゴのインビトロゲン）にライゲートした。２ｍｌのライゲート反応液を使用して、競合ＩｎｖａＦ’細胞を形質転換した。形質転換した細菌を、ｘ−ｇａｌの５０ｍｇ／ｍｌ溶液４０ｍｌで被覆したＬＢ平板（５０ｍｇ／ｍｌアンピシリン）上に画線接種した。続く日に、白色コロニーを選択し、そして１００ｍｇ／ｍｌのアンピシリンを含む５ｍｌのＬＢ培地に接種し、そして２２５ｒｐｍで振蘯させながら３７℃で一夜育成させた。

一夜、培地でミニ調製を行って、正確な挿入物を伴うプラスミドを保有したクローンを測定した。プラスミドを、標準アルカリ性溶解手段を用いて培地から抽出し、それに伴い、ＤＮＡは、さらにフェノール：クロロホルム抽出（Ｍａｎｉａｔｉｓら、１９８２年）によってさらに精製された。ＤＮＡを、２倍量のエタノールに沈殿させ、そしてその後、ＥｃｏＲＩで消化させた。消化物を、１％アガロースゲル上で可視化させて、適切な挿入物を含むプラスミドを有するコロニーを測定した。その後、プラスミドを陽性クローンから精製し、そしてシーケナーゼ基本（ＵＳＢ、オハイオ州クレーブランド）Ｓ^３５放射線標識ジデオキシターミネーターシーケンシングまたは蛍光染色ターミネーターサイクルシーケンシング（パーキン・エルマー、コネチカット州ノルウォーク）によるかの何れかを使用して配列した。ｃＤＮＡの配列から、特異的３’および５’プライマーを、ｃＤＮＡ末端反応の５’迅速増幅（ＲＡＣＥ）に使用するために、そして３‘’未翻訳領域（ＵＴＲ）から得られる変性プライマーとの接合で３’配列の誘導のために構築した。

ＣＤ８０の５’領域の単離：
マラソンのｃＤＮＡ増幅プロトコール（クローンテック、カリフォルニア州パロアルト）を使用して、その遺伝子の５’配列を誘導した。ｍＲＮＡを、１２時間、ＣｏｎＡで、そして同時発生で４時間、ＬＰＳで刺激されたＰＢＭＣから産生させた。ウルトラスペックＲＮＡ抽出試薬（バイオテックス、テキサス州ヒューストン）を用いてｍＲＮＡを抽出させた。ｃＤＮＡを、５’末端に変性ヌクレオチドを伴うアンカー・オリゴｄＴプライマーで産生させて、ポリＡ尾部の５’のほとんどの末端に対するプライマーの結合を促進させた。その後、ｃＤＮＡを、先に記述されるとおり転写させた。特異的リンカーを、Ｔ４ＤＮＡリガーゼでｃＤＮＡにライゲートさせた。先に増幅させた領域について特異的である内部３’プライマー：
Ｂ７−２８４：ＴＴＡ ＴＡＣ ＴＡＧ ＧＧＡ ＣＡＧ ＧＧＡ ＡＧ
（配列番号５８）
Ｂ７−１９０：ＡＧＧ ＣＴＴ ＴＧＧ ＡＡＡ ＡＣＣ ＴＣＣ ＡＧ
（配列番号５９）
およびライゲートしたリンカー配列に相補的なアンカープライマーを用いてｃＤＮＡ上でタッチダウンＰＣＲを行った。ＫｌｅｎＴａｑポリメラーゼ混合液（クローンテック、カリフォルニア州パロアルト）を用いてタッチダウンＰＣＲ反応についてのパラメーターは、９５℃で５分間、１サイクル；９５℃で３０秒間、７２℃で３０秒間、そして６８℃で４５秒間、５サイクル；９５℃で３０秒間、６５℃で３０秒間、そして６８℃で４５秒間、５サイクル；９５℃で３０秒間、６０℃で３０秒間、そして６８℃で４５秒間、２５サイクルであった。１ｍｌのこの反応液を、５０ｍｌの水で希釈し、そしてその後５ｍｌのこの希釈液を、リンカー特異的アンカープライマーおよび当初のプライマーの５’に配置される遺伝子特異的３’プライマーを用いて重ね合せＰＣＲ反応（ＫｌｅｎＴａｑポリメラーゼ混合液を用いて９５℃で５分間、１サイクル；９５℃で３０秒間、６５℃で３０秒間、そして６８℃で４５秒間、３０サイクル）に使用した（図６）。

Ｂ７−２０：ＴＴＧ ＴＴＡ ＴＣＧ ＧＴＧ ＡＣＧ ＴＣＡ ＧＴＧ
（配列番号６０）
Ｂ７−１３５：ＣＡＡ ＴＡＡ ＣＡＴ ＣＡＣ ＣＧＡ ＡＧＴ ＣＡＧ Ｇ
（配列番号６１）
２０ｍｌの各反応液を、１．５％アガロースゲル上で可視化させ、そして適切な断片をゲルから切取った。ｃＤＮＡを抽出し、そしてゲル・ネブライザーおよびマイクロピュアー０．２２ｍｍフィルター（アミコン、マサチューセッツ州ビバリー）を介してゲル切片を遠心分離することによってアガロースから精製した。その後、精製ＤＮＡを、染料ターミネーターサイクルシーケンシング（パーキン・エルマー、コネチカット州ノルウォーク）を用いて直接的に配列した。

ＣＤ８０の３’領域の単離：
３４４ｎｔｄ断片および先に配列された５’領域：
Ｂ７−ｓ２２０ ＧＴＣ ＡＴＧ ＴＣＴ ＧＧＣ ＡＡＡ ＧＴＡ ＣＡＡ Ｇ
（配列番号６２）
Ｂ７−５０ ＣＡＣ ＴＧＡ ＣＧＴ ＣＡＣ ＣＧＡ ＴＡＡ ＣＣＡ Ｃ
（配列番号６３）
Ｂ７−１４０ ＣＴＧ ＡＣＴ ＴＣＧ ＧＴＧ ＡＴＧ ＴＴＡ ＴＴＧ Ｇ
（配列番号６４）
Ｂ７−５５０：ＧＣＣ ＡＴＣ ＡＡＣ ＡＣＡ ＡＣＡ ＧＴＴ ＴＣＣ
（配列番号６５）
Ｂ７−６２０：ＴＡＴ ＧＡＣ ＡＡＡ ＣＡＡ ＣＣＡ ＴＡＧ ＣＴＴ Ｃ
（配列番号６６）
から得られる５遺伝子特異的プライマーを選択することによって、遺伝子の３’領域を、誘導した。

その後、変性３’プライマーを、ヒトおよびネズミのＣＤ８０３’ＵＴＲの共通領域から選択した。

Ｂ７−１２８１ Ｇ（Ａ／Ｇ）Ａ ＡＧＡ （Ａ／Ｔ）ＴＧ ＣＣＴ ＣＡＴ ＧＡ（Ｇ／Ｔ） ＣＣ
（配列番号６７）
Ｂ７−１２６０ ＣＡ（Ｃ／Ｔ） （Ａ／Ｇ）ＡＴ ＣＣＡ ＴＡＧ ＧＧ
（配列番号６８）
ｃＤＮＡを、先に記述されるとおりＣｏｎＡおよびＬＰＳで刺激したＰＢＭＣから得られるウルトラスペック（バイオテックス、テキサス州ヒューストン）で抽出されたＲＮＡから産生した。

アンカー付けしたオリゴｄＴを、ｃＤＮＡに対するＲＮＡ転写のための即時型３’プライマーとして使用した。特異的５’プライマーおよび変性３’プライマーを用いて、このｃＤＮＡでＴａｑポリメラーゼ基本のＰＣＲ反応を行った（９５℃で５分間、１サイクル；９５℃で３０秒間、４２℃で３０秒間、そして７２℃で４５秒間、３０サイクル；７２℃で７分間）。

正しい寸法の単独断片を産生する前に、２回りの重ね合せ反応を必要とした。この産物を、１．５％アガロースゲルから切り取り、先に記述されるとおりに精製し、そして染色ターミネーターサイクルシーケンシング（パーキン・エルマー、コネチカット州ノルウォーク）で配列した。

５’および３’領域の配列データから、ネコＣＤ８０遺伝子：
Ｂ７開始：ＡＴＧ ＧＧＴ ＣＡＣ ＧＣＡ ＧＣＡ ＡＡＣ ＴＧＧ
（配列番号６９）
Ｂ７−９６０：ＣＣＴ ＡＧＴ ＡＧＡ ＧＡＡ ＧＡＧ ＣＴＡ ＡＡＧ ＡＧＧ Ｃ
（配列番号７０）
の全開放読取枠をコードする領域を増幅するプライマーを構築させた。

先に産生され、そしてその遺伝子をコードするＤＮＡを含むＰＢＭＣのｃＤＮＡを使用した。このＰＣＲ反応（９５℃で５分間、１サイクル；９５℃で３０秒間、４２℃で３０秒間、そして７２℃で４５秒間、３０サイクル；７２℃で７分間）は、Ｔａｑポリメラーゼとしばしば関連してランダムな誤差を減少させる希望である程度５’エキソヌクレアーゼ活性を保持する酵素カクテルであるＫｌｅｎＴａｑＤＮＡポリメラーゼを使用した。反応液を、ＴＡクローニングベクター（カリフォルニア州サンディエゴのインビトロゲン）にクローン化され、そして先に記述されるとおり配列された９６０塩基対（ｂｐ）断片を増幅した。遺伝子の最終配列は、２つの別々の動物から得られるｃＤＮＡを含んだ。遺伝子の各塩基対を、個々のＰＣＲ反応から誘導される少なくとも３つの別々の配列で独立に立証して、ＰＣＲ誘導間違えから誘導される誤差の可能性を減少させた。

ＣＤ２８の当初の断片の単離 ｍＲＮＡを、１６時間、ＲＮＡｚｏｌＢ ＲＮＡ抽出試薬（バイオテックス、テキサス州ヒューストン）を用いてＣｏｎＡで刺激したＨＫ５末梢血リンパ球から抽出させた。オリゴｄＴを３’プライマーとして使用する逆転写酵素（ＲＴ）反応によって、当初のｃＤＮＡを、このＲＮＡから誘導した。簡潔には、ＲＮＡ、およびオリゴｄＴを、３分間、７５℃まで加熱して、二次構造を取除いた。その後、ＲＴ、ｄＮＴＰ、緩衝液および蒸留水を添加し、そしてその混合液を、１時間、４２℃でインキュベートした。このインキュベーションに続いて、サンプルを、５分間、９５℃まで加熱して、ＲＴを不活性化させた。その後、ヒト、ネズミおよびウサギＣＤ２８公表核酸配列（ジーンバンク、マサチューセッツ州ゲーサーズバーグ）の中で見られる共通領域から誘導される変性プライマーを、大半の開放読取枠をコードする６７３ｎｔｄ断片の当初の増幅のために使用した。

ＣＤ２８−１１３：ＣＡＡ ＣＣＴ ＴＡＧ ＣＴＧ ＣＡＡ ＧＴＡ ＣＡＣ
（配列番号７１）
ＣＤ２８−７６８：ＧＧＣ ＴＴＣ ＴＧＧ ＡＴＡ ＧＧＧ ＡＴＡ ＧＧ
（配列番号７２）
Ｔａｑポリメラーゼを使用するホットスタートＰＣＲプロトコールを使用して、産物を増幅させた（９５℃で５分間、１サイクル；９５℃で３０秒間、４８℃で３０秒間、そして７２℃で４５秒間、３０サイクル；７２℃で７分間、１サイクル）。その後、断片を１％アガロースゲル上で可視化させ、そしてＴＡクローニングベクター（カリフォルニア州サンディエゴのインビトロゲン）にライゲートさせ、そして先に記述されるとおり配列した。ｃＤＮＡの配列から、特異的３’プライマーを誘導し、５’ＲＡＣＥ反応に使用するために合成した。

ＣＤ２８１９０：ＣＧＧ ＡＧＧ ＴＡＧ ＡＡＴ ＴＧＣ ＡＣＴ ＧＴＣ Ｃ
（配列番号７３）
ＣＤ２８ ２３９：ＡＴＴ ＴＴＧ ＣＡＧ ＡＡＧ ＴＡＡ ＡＴＡ ＴＣＣ
（配列番号７４）
ＣＤ２８の５’領域の単離
修飾ギブコ５‘’ＲＡＣＥプロトコール（ギブコ ＢＲＬ、メリーランド州ゲーサーズバーグ）を使用して、ネコＣＤ２８分子の残りの５’配列を得た。１６時間、ＲＮＡを抽出し、ＣｏｎＡがＰＢＭＣを刺激した。３’遺伝子特異的プライマーを、最初の鎖のｃＤＮＡ合成のために使用した。ＲＮＡおよびプライマーを、７５℃まで、５分間加熱し、その後、他のＲＴ試薬を添加した。変性に続いて、混合液を、４℃に冷却し、そして反応緩衝液、塩化マグネシウム、ｄＮＴＰ、ＤＴＴおよびＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔＲＴ（ギブコ ＢＲＬ、メリーランド州ゲーサーズバーグ）を添加した。ＲＴ混合液を、４２℃で、３０分間、インキュベートし、そしてその後、１５分間、７０℃に加熱して、ＲＴを変性させた。その後、ＲＮエースカクテルを添加し、そして反応液を１０分間、５５℃でインキュベートして、残余ＲＮＡを除去し、そして誤った末端トランスフェラーゼ（ＴｄＴ）伸長を防止した。その後、グラスマックス（ギブコ ＢＲＬ、メリーランド州ゲーサーズバーグ）回転カラム上でｃＤＮＡを精製して、未取り込みｄＮＴＰおよびプライマーを除去した。その後、そのカラムから溶出される精製ｃＤＮＡに、ＴｄＴで尾部付けした。ＴｄＴを用いて、２０−３０ヌクレオチドｄＣ尾部をｃＤＮＡに添加した。精製ｃＤＮＡ、塩化マグネシウム、反応緩衝液、およびｄＣＴＰの混合液に酵素を添加し、続いて９５℃で３分間、ｃＤＮＡを変性させた。反応液を、３７℃で１０分間、インキュベートし、そしてその後、酵素を、加熱し、さらに１０分間、７０℃で不活性化させた。尾部を付けたｃＤＮＡを、Ｔａｑポリメラーゼ基本のホットスタートＰＣＲ反応（９５℃で５分間；９５℃で３０秒間、５５℃で３０秒間、７２℃で４５秒間、３５サイクル；７２℃で７分間）で増幅させた。この反応のためのプライマーとしては、ｃＤＮＡ合成プライマーの５’に配置される３’プライマー、およびｄＣリンカーに特異的で、そして主に、少数のｄＩ残基を有するｄＧから構成されるアンカープライマーが挙げられる。この反応液中の１ｍｌを、５０ｍｌの水で希釈し、そしてその後、この希釈液の内の５ｍｌを、ｄＧ／ｄＩ５’アンカープライマーおよび追加の上流遺伝子特異的３’プライマーを用いて、重ね合せＰＣＲ反応（９５℃で５分間、１サイクル；ＫｌｅｎＴａｑポリメラーゼ混合液を用いて９５℃で３０秒間、５５℃で３０秒間、そして７２℃で４５秒間、３０サイクル）に使用した。その後、３０ｍｌの重ね合せ反応液を、１．５％アガロースゲル上で可視化させ、そして適切な断片を、そのゲルから抽出させた（図１９）。先に記述されるとおり、アミコンゲル・ネブライザーおよびマイクロピュアフィルター（アミコン、マサチューセッツ州ビバリー）を用いてｃＤＮＡを精製した。精製ｃＤＮＡサンプルを、染色ターミネーターサイクルシーケンシング（パーキン・エルマー、コネチカット州ノルウォーク）により配列した。完成した断片から、共通配列を誘導した。その配列から、ネコＣＤ２８遺伝子：
ｆｅＣＤ２８ ５’：ＣＧＣ ＧＧＡ ＴＣＣ ＡＣＣ ＧＧＴ ＡＧＣ ＡＣＡ ＡＴＧ ＡＴＣ ＣＴＣ ＡＧＧ（配列番号７５）
ｆｅＣＤ２８ ３’：ＣＧＣ ＧＧＡ ＴＣＣ ＴＣＴ ＧＧＡ ＴＡＧ ＧＧＧ ＴＣＣ ＡＴＧ ＴＣＡ Ｇ（配列番号７６）
の全開放読取枠を包含するプライマー対を合成した。

これらのプライマーを使用して、全コーディング領域を含むｃＤＮＡ分子を、ＣｏｎＡ刺激ＥＫ６およびＥＤ３ ＰＢＭＣ誘導ｃＤＮＡから増幅させた。このＰＢＭＣのｃＤＮＡを、先に産生させ、そして遺伝子をコードするＲＮＡを含むことが示された。しばしばＴａｑポリメラーゼに関連したランダム間違えを減少させる望みで、ＫｌｅｎＴａｑのＤＮＡポリメラーゼを用いて、このＰＣＲ反応（９５℃で５分間、１サイクル；９５℃で３０秒間、４２℃で３０秒間、そして７２℃で４５秒間、３０サイクル；７２℃で７分間）は、７５４ｂｐ断片を産生させ、そしてそれは、ＴＡクローニングベクターにクローン化させ、そして先に記述されるとおり配列した。ＣＤ８０分子を用いるように、各ヌクレオチド部位を、少なくとも３つの独立に誘導された配列によって確認した。

相同ベクター９０２−４９．４６．プラスミド９０２−４９．４６を、外来ＤＮＡをＲＰＶに挿入する目的のために構築した。それは、ＲＰＶのＤＮＡによって挟まれたＥ．ｃｏｌｉ β−ガラクトシダーゼ（ｌａｃＺ）マーカー遺伝子を組込む。外来遺伝子の上流は、およそ９０６塩基対断片のＲＰＶのＤＮＡである。外来遺伝子の下流は、およそ８９５塩基対断片のＲＰＶのＤＮＡである。プラスミドを、「組換えＲＰＶを生成するための相同な組換え手段」によって使用する場合、外来遺伝子のためのＤＮＡコーディングを含むウイルスを生じる。β−ガラクトシダーゼ（ｌａｃＺ）マーカー遺伝子は、後期プロモーター（ＬＰ１）の制御下にあり、そして第二の外来ＤＮＡを、ＥｃｏＲＩまたはＢａｍＨＩ部位に挿入し、そして第二の外来遺伝子は、後期／即時型プロモーター（ＬＰ２ＥＰ２）の制御下にあることは注目される。それは、合成ＤＮＡ配列を有する以下の源から制限断片を結合することによって、標準組換えＤＮＡ技術（Sambrookら）を利用して構築された。プラスミドベクターは、ｐＳＰ６４（プロメガ）のおよそ２９９９塩基対ＨｉｎｄＩＩＩ制限断片から誘導される。断片１は、ＲＰＶＨｉｎｄＩＩＩ制限断片Ｕ（Knightら）のおよそ９０６塩基対のＨｉｎｄＩＩＩからＸｂａＩまでの制限副断片である。断片２は、プラスミドｐＪＦ７５１（Ferrariら）のおよそ３０１０塩基対のＢａｍＨＩからＰｖｕＩＩまでの制限断片である。断片３は、ＲＰＶＨｉｎｄＩＩＩ制限断片Ｕのおよそ８９５塩基対のＸｂａＩからＨｉｎｄＩＩＩまでの副断片である。ＮｏｔＩリンカーを用いて、断片１および３中のＸｂａＩ部位を、特徴的なＮｏｔＩ部位に変換した。

相同ベクター９０４−６３．Ｂ７．相同ベクター９０４−６３．Ｂ７を、外来ＤＮＡをＲＰＶに挿入するのに使用した。それは、ＳＰＶのＤＮＡによって挟まれたＥ．ｃｏｌｉ β−ガラクトシダーゼ（ｌａｃＺ）マーカー遺伝子およびネコ免疫不全ウイルス（ＦＩＶ）ｇａｇ／プロテアーゼおよびエンベロープ遺伝子を組込む。この相同ベクターを、「組換えＳＰＶを生成するための相同な組換え手段」によって使用する場合、外来遺伝子のためのＤＮＡコーディングを含むウイルスを生じる。β−ガラクトシダーゼ（ｌａｃＺ）マーカー遺伝子は、合成後期ポックスプロモーター（ＬＰ１）の制御下にあり、そしてＦＩＶｇａｇ／プロテアーゼおよびエンベロープ遺伝子は、別々であるが、同一の合成後期／前期ポックスプロモーター（ＬＰ２ＥＰ２）の制御下にある。ＦＩＶｇａｇ／プロテアーゼおよびＦＩＶエンベローププロモーター／遺伝子カセットは、ｇａｇ／プロテアーゼおよびエンベロープ遺伝子の転写が、互いに向かって走り、同一プロモーターの間の相同な組換えの可能性を避けるように対峙する方向に向けられる。合成ＤＮＡ配列を有する以下の源から制限断片を結合することによって、標準組換えＤＮＡ技術（Sambrookら）を利用して、相同ベクターを構築した。プラスミドベクターは、ｐＳＰ６４（プロメガ）のおよそ２９７２塩基対のＨｉｎｄＩＩＩからＢａｍＨＩまでの制限断片から誘導される。断片１は、ＳＰＶＨｉｎｄＩＩＩ断片Ｍ（２３）のおよそ１４８４塩基対のＢｇｌＩＩからＡｃｃＩまでの制限副断片である。断片２は、ＦＩＶ ＰＰＲ株を用いた逆転写（ＲＴ）およびポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）（１５、４２）によって合成されるＦＩＶエンベロープ遺伝子のおよそ２５８０塩基対のＥｃｏＲＩからＢｇｌＩＩまでの断片である。上流プライマー（５’−ＧＣＣＣＧＧＡＴＣＣＴＡＴＧＧＣＡＧＡＡＧＧＧＴＴＴＧＣＡＧＣ−３’ １０／９３．２１）（配列番号７７）は、ＦＩＶエンベロープ遺伝子の５’末端から合成し、そしてその遺伝子の５’末端にＢａｍＨＩ部位を導入する。下流プライマー（５’−ＣＣＧＴＧＧＡＴＣＣＧＧＣＡＣＴＣＣＡＴＣＡＴＴＣＣＴＣＣＴＣ−３’；１０／９３．２０）（配列番号７８）は、ＦＩＶエンベロープ遺伝子の３’末端から合成し、そしてその遺伝子の３’末端にＢａｍＨＩ部位を導入し、そして逆転写およびポリメラーゼ連鎖反応に使用される。ＰＣＲ産物を、ＢａｍＨＩで消化させて、ＦＩＶエンベロープ遺伝子に対応する長さで断片２５８０塩基対を得た。断片３は、ＦＩＶ ＰＰＲ株から得られるｃＤＮＡを用いた逆転写（ＲＴ）およびポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）（１５、４２）によって合成されるＦＩＶｇａｇ／プロテアーゼ遺伝子のおよそ１８３９塩基対のＥｃｏＲＩからＢｇｌＩＩまでの断片である。上流プライマー（５’−ＧＣＧＴＧＡＡＴＴＣＧＧＧＧＡＡＴＧＧＡＣＡＧＧＧＧＣＧＡＧＡＴ−３’；１１／９４．９）（配列番号７９）は、ＦＩＶｇａｇ／プロテアーゼ遺伝子の５’末端から合成し、そしてその遺伝子の５’末端にＥｃｏＲＩ部位を導入する。下流プライマーは、（５’−ＧＡＧＣＣＡＧＡＴＣＴＧＣＴＣＴＴＴＴＴＡＣＴＴＴＣＣＣ−３’；１１／９４．１０）（配列番号８０）であり、そしてＦＩＶｇａｇ／プロテアーゼ遺伝子の３’末端から合成し、そしてその遺伝子の３’末端にＢｇｌＩＩ部位を導入し、そして逆転写およびポリメラーゼ連鎖反応に使用された。ＰＣＲ産物を、ＥｃｏＲＩおよびＢｇｌＩＩで消化させて、ＦＩＶｇａｇ／プロテアーゼ遺伝子に対応する長さで断片およそ１８３９塩基対を得た。断片４は、プラスミドｐＪＦ７５１（Ferrariら）のおよそ３０１０塩基対のＢａｍＨＩからＰｖｕＩＩまでの断片である。断片５は、ＳＰＶ ＨｉｎｄＩＩＩ制限断片Ｍのおよそ２１４９塩基対のＡｃｃＩからＨｉｎｄＩＩＩまでの制限副断片である。合成リンカーを用いて、ＳＰＶ相同ベクター中のＡｃｃＩ部位を、特徴的なＮｏｔＩ部位に変換した。

相同ベクター９１７−６０．Ｂ９．プラスミド９１７−６０．Ｂ９を、外来ＤＮＡをＲＰＶに挿入する目的のために構築した。それは、ＳＰＶのＤＮＡによって挟まれたＥ．ｃｏｌｉ β−ガラクトシダーゼ（ｌａｃＺ）マーカー遺伝子およびネコＩＦＮ−γ遺伝子（Onionら、（１９９６年）；Argyleら、（１９９５年））を組込む。外来遺伝子の上流は、ＳＰＶのＤＮＡのおよそ１４８４塩基対断片である。外来遺伝子の下流は、ＳＰＶのＤＮＡのおよそ２１４９塩基対断片である。このプラスミドを、「組換えＳＰＶを生成するための相同な組換え手段」によって使用する場合、外来遺伝子のためのＤＮＡコーディングを含むウイルスを生じる。β−ガラクトシダーゼ（ｌａｃＺ）マーカー遺伝子は、豚痘０１Ｌプロモーターの制御下にあり、そしてネコＣＤ２８遺伝子は、合成後期／前期ポックスプロモーター（ＬＰ２ＥＰ２）の制御下にあることに注目する。以下の源から制限断片を結合することによって、標準組換えＤＮＡ技術（Sambrookら）を利用して、それを構築しうる。プラスミドベクターは、ｐＳＰ６４（プロメガ）のおよそ２９７２塩基対のＨｉｎｄＩＩＩからＢａｍＨＩまでの制限断片から誘導された。断片１は、ＳＰＶＨｉｎｄＩＩＩ制限断片Ｍのおよそ１４８４塩基対のＢｇｌＩＩからＡｃｃＩまでの制限副断片である。断片２は、テンプレートとしてＣｏｎＡ刺激ネコ脾臓細胞から得られるＲＮＡを用いた逆転写およびポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって合成されるＥｃｏＲＩからＢａｍＨＩまでの制限断片である。ネコＩＦＮ−γを合成するために、プライマー（５’−ＴＣＧＡＧＡＡＴＴＣＧＡＴＧＡＡＴＴＡＣＡＣＡＡＧＴＴＴＴＡＴＴＴＴＣＧ−３’；１／９７．４）（配列番号８１）は、ネコＩＦＮ−γ遺伝子の５’末端から合成し、その遺伝子の５’末端にＥｃｏＲＩ部位を導入する。プライマー（５’−ＴＣＧＡＧＧＡＴＣＣＴＴＡＴＴＴＣＧＡＴＧＣＴＣＴＡＣＧＧＣＣＴＣ−３’；１／９７．３）（配列番号８２）を逆転写およびＰＣＲのために使用し、そしてネコＩＦＮ−γ遺伝子の３’末端から合成し、その遺伝子の３’末端にＢａｍＨＩ部位を導入した。ＰＣＲ産物を、ＥｃｏＲＩおよびＢａｍＨＩで消化させて、ネコＩＦＮ−γ遺伝子に対応する長さで断片およそ５０４塩基対を得た。断片３は、プラスミドｐＪＦ７５１（Ferrariら）のおよそ３０１０塩基対のＥｃｏＲＩからＰｖｕＩＩまでの制限断片である。断片４は、ＳＰＶ ＨｉｎｄＩＩＩ断片Ｍのおよそ２１４９塩基対のＡｃｃＩからＨｉｎｄＩＩＩまでの副断片である。断片１および４にあるＡｃｃＩ部位を、ＮｏｔＩリンカーを使用して特徴的なＮｏｔＩ部位に変換した。

相同ベクター９２６−７６．Ｄ７．相同ベクター９２６−７６．Ｄ７を、ネコヘルペスウイルスからｇＥコーディング領域の一部を欠失し、そして外来ＤＮＡを挿入する目的のために構築した。それは、ＦＨＶのＤＮＡによって挟まれたネコＣＤ８０遺伝子を組込む。ネコＣＤ８０遺伝子は、ＦＨＶ ｇＥプロモーターの制御下にあった。それを、標準組換えＤＮＡ技術（Sambrookら）を利用して例示ＤＮＡ源から構築した。プラスミドベクターは、ｐＳＰ１８／１９のおよそ２９５８塩基対のＡｓｐ７１８ＩからＡｓｐ７１８Ｉまでの制限エンドヌクレアーゼ断片から誘導される。断片１は、ＦＨＶ ＳａｌＩ Ｂ断片のおよそ１４１５塩基対のＡｓｐ７１８ＩｋからＳｍａＩ副断片である。断片２は、「ポリメラーゼ連鎖反応を用いたクローニング」により合成されるネコＣＤ８０遺伝子のおよそ８７９塩基対のＥｃｏＲＩからＢａｍＨＩまでの断片である。ＰＣＲ反応のためのテンプレートを、ＣｏｎＡ刺激ネコ脾臓細胞から得られるＲＮＡであった。上流プライマー（５’−ＴＣＧＡＧＡＡＴＴＣＧＧＧＴＣＡＣＧＣＡＧＣＡＡＡＧＴＧＧ−３’；１／９７．４３）（配列番号５２）は、ネコＣＤ８０遺伝子の５’末端から合成し、そしてＥｃｏＲＩ部位を導入する。下流プライマー（５’−ＧＣＴＡＧＧＡＴＣＣＡＡＴＣＴＡＴＧＴＡＧＡＣＡＧＧＴＧＡＧＡＴ−３’；１／９７．６）（配列番号５３）は、ネコＣＤ８０遺伝子の３’末端から合成し、その遺伝子の３’末端にＢａｍＨＩ部位を導入し、そして逆転写およびポリメラーゼ連鎖反応のために使用した。断片３は、ＦＨＶ ＥｃｏＲＩ Ｅ断片のおよそ２２０５塩基対のＳａｌＩからＡｓｐ７１８Ｉまでの副断片である。

相同ベクター９３０−２３．Ａ１．プラスミド９３０−２３．Ａ１を、ＳＰＶに外来ＤＮＡを挿入する目的のために構築した。それは、ＳＰＶのＤＮＡによって挟まれたＥ．ｃｏｌｉ β−ガラクトシダーゼ（ｌａｃＺ）マーカー遺伝子およびネコＣＤ８０遺伝子を組込む。外来遺伝子の上流は、ＳＰＶ ＤＮＡのおよそ１４８４塩基対断片である。外来遺伝子の下流は、ＳＰＶ ＤＮＡのおよそ２１４９塩基対断片である。そのプラスミドが、「組換えＳＰＶを生成するための相同組換え手段」によって使用されるとき、外来遺伝子についてのＤＮＡコーディングを含むウイルスが生じる。β−ガラクトシダーゼ（ｌａｃＺ）マーカー遺伝子は、合成後期ポックスプロモーター（ＬＰ１）の制御下であり、そしてネコＣＤ８０遺伝子は、合成後期／前期ポックスプロモーター（ＬＰ２ＥＰ２）の制御下であることに注目すべきである。以下の源から得られる制限断片を結合することによって、標準組換えＤＮＡ技術（Sambrookら）を利用して構築した。そのプラスミドベクターは、ｐＳＰ６４（プロメガ）のおよそ２９７２塩基対のＨｉｎｄＩＩＩからＢａｍＨＩまでの制限断片から誘導された。断片１は、ＳＰＶ ＨｉｎｄＩＩＩ制限断片Ｍのおよそ１４８４塩基対のＢｇｌＩＩからＡｃｃＩまでの制限副断片である。断片２は、テンプレートとしてＣｏｎＡ刺激ネコ脾臓細胞から得られるＲＮＡを使用して、逆転写およびポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって合成されるＥｃｏＲＩからＢａｍＨＩまでの制限断片である。ネコＣＤ８０を合成するために、プライマー５’−ＴＣＧＡＧＡＡＴＴＣＧＧＧＴＣＡＣＧＣＡＧＣＡＡＡＧＴＧＧ−３’；１／９７．４３）（配列番号５２）は、ネコＣＤ８０遺伝子の５’末端から合成し、そしてその遺伝子の５’末端にＥｃｏＲＩ部位を導入する。プライマー（５’−ＧＣＴＡＧＧＡＴＣＣＡＡＴＣＴＡＴＧＴＡＧＡＣＡＧＧＴＧＡＧＡＴ−３’；１／９７．６）（配列番号５３）は、逆転写およびＰＣＲのために使用し、そしてネコＣＤ８０遺伝子の３’末端から合成し、その遺伝子の３’末端にＢａｍＨＩ部位を導入した。ＰＣＲ産物を、ＥｃｏＲＩおよびＢａｍＨＩで消化して、ネコＣＤ８０遺伝子に対応する長さでおよそ８７９塩基対の断片を得た。断片３は、プラスミドｐＪＦ７５１（Ferrariら）のおよそ３０１０塩基対のＢａｍＨＩからＰｖｕＩＩまでの制限断片である。断片４は、ＳＰＶ ＨｉｎｄＩＩＩ断片Ｍのおよそ２１４９塩基対のＡｃｃＩからＨｉｎｄＩＩＩまでの副断片である。断片１および４にあるＡｃｃＩ部位は、ＮｏｔＩリンカーを用いて特徴的なＮｏｔＩ部位に変換された。

相同ベクター９３０−２６．Ａ１．プラスミド９３０−２６．Ａ１を、ＳＰＶに外来ＤＮＡを挿入する目的のために構築した。それは、ＳＰＶのＤＮＡによって挟まれたＥ．ｃｏｌｉ β−ガラクトシダーゼ（ｌａｃＺ）マーカー遺伝子およびネコＣＤ２８遺伝子を組込む。外来遺伝子の上流は、ＳＰＶ ＤＮＡのおよそ１４８４塩基対断片である。外来遺伝子の下流は、ＳＰＶ ＤＮＡのおよそ２１４９塩基対断片である。そのプラスミドが、「組換えＳＰＶを生成するための相同組換え手段」によって使用されるとき、外来遺伝子についてのＤＮＡコーディングを含むウイルスが生じる。β−ガラクトシダーゼ（ｌａｃＺ）マーカー遺伝子は、合成後期ポックスプロモーター（ＬＰ１）の制御下であり、そしてネコＣＤ８０遺伝子は、合成後期／前期ポックスプロモーター（ＬＰ２ＥＰ２）の制御下であることに注目すべきである。以下の源から得られる制限断片を結合することによって、標準組換えＤＮＡ技術（Sambrookら）を利用して構築した。そのプラスミドベクターは、ｐＳＰ６４（プロメガ）のおよそ２９７２塩基対のＨｉｎｄＩＩＩからＢａｍＨＩまでの制限断片から誘導された。断片１は、ＳＰＶ ＨｉｎｄＩＩＩ制限断片Ｍのおよそ１４８４塩基対のＢｇｌＩＩからＡｃｃＩまでの制限副断片である。断片２は、テンプレートとしてＣｏｎＡ刺激ネコ脾臓細胞から得られるＲＮＡを使用して、逆転写およびポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって合成されるＥｃｏＲＩからＢａｍＨＩまでの制限断片である。ネコＣＤ２８を合成するために、プライマー５’−ＧＡＴＧＡＡＴＴＣＣＡＴＧＡＴＣＣＴＣＡＧＧＣＴＧＧＧＣＴＴＣＴ−３’；７／９７．１）（配列番号５４）は、ネコＣＤ２８遺伝子の５’末端から合成し、その遺伝子の５’末端にＥｃｏＲＩ部位を導入する。プライマー（５’−ＧＡＴＣＡＧＡＴＣＴＣＡＧＧＡＡＣＧＧＴＡＴＧＣＣＧＣＡＡ−３’；７／９７．２）（配列番号５５）は、逆転写およびＰＣＲのために使用し、そしてネコＣＤ２８遺伝子の３’末端から合成し、その遺伝子の３’末端にＢａｍＨＩ部位を導入した。ＰＣＲ産物を、ＥｃｏＲＩおよびＢａｍＨＩで消化して、ネコＣＤ２８遺伝子に対応する長さでおよそ６６６塩基対の断片を得た。断片３は、プラスミドｐＪＦ７５１（Ferrariら）のおよそ３０１０塩基対のＢａｍＨＩからＰｖｕＩＩまでの制限断片である。断片４は、ＳＰＶ ＨｉｎｄＩＩＩ断片Ｍのおよそ２１４９塩基対のＡｃｃＩからＨｉｎｄＩＩＩまでの副断片である。断片１および４にあるＡｃｃＩ部位は、ＮｏｔＩリンカーを用いて特徴的なＮｏｔＩ部位に変換された。

相同ベクター９３１−２１．Ａ１．相同ベクター９３１−２１．Ａ１を、ＳＰＶに外来ＤＮＡを挿入するのに使用した。それは、ＳＰＶのＤＮＡによって挟まれたＥ．ｃｏｌｉ β−グルクロニダーゼ（ｕｉｄＡ）マーカー遺伝子およびネコＣＤ８０遺伝子を組込む。このプラスミドが、「組換えＳＰＶを生成するための相同組換え手段」によって使用されるとき、外来遺伝子についてのＤＮＡコーディングを含むウイルスが生じた。β−ガラクトシダーゼ（ｌａｃＺ）マーカー遺伝子は、合成前期ポックスプロモーター（ＥＰ２）の制御下であり、そしてネコＣＤ８０遺伝子は、別々で、そして特徴的な合成後期／前期ポックスプロモーター（ＬＰ２ＥＰ２）の制御下であることに注目すべきである。その相同ベクターは、以下の源から得られる制限断片を、適切な合成ＤＮＡ配列と結合させることによって、標準組換えＤＮＡ技術（Sambrookら）を利用して構築した。そのプラスミドベクターは、ＰＮＥＢ１９３（ニュー・イングランド・バイオラボズ）のおよそ２７００塩基対のＤｒａＩ制限断片から誘導された。断片１は、ＳＰＶ ＨｉｎｄＩＩＩ断片Ｋのおよそ８８１塩基対のＤｒａＩからＥｃｏＲＩまでの制限副断片である。断片２は、「ポリメラーゼ連鎖反応でのクローニング」によって合成されるネコＣＤ８０遺伝子のおよそ８７９塩基対のＥｃｏＲＩからＢａｍＨＩまでの断片である。ＰＣＲ反応についてのテンプレートは、ＣｏｎＡ刺激ネコ脾臓細胞から得られるＲＮＡであった。上流プライマー（５’−ＴＣＧＡＧＡＡＴＴＣＧＧＧＴＣＡＣＧＣＡＧＣＡＡＡＧＴＧＧ−３’；１／９７．４３）（配列番号５２）は、ネコＣＤ８０遺伝子の５’末端から合成し、ＥｃｏＲＩ部位を導入する。下流プライマー（５’−ＧＣＴＡＧＧＡＴＣＣＡＡＴＣＴＡＴＧＴＡＧＡＣＡＧＧＴＧＡＧＡＴ−３’；１／９７．６）（配列番号５３）は、ネコＣＤ８０遺伝子の３’末端から合成し、その遺伝子の３’末端にＢａｍＨＩ部位を導入し、そして逆転写およびポリメラーゼ連鎖反応のために使用した。断片３は、プラスミドｐＲＡＪ２６０（クローンテック）のおよそ１８２３塩基対のＥｃｏＲＩからＳｍａＩまでの制限断片である。断片４は、ＳＰＶ ＨｉｎｄＩＩＩ断片Ｋのおよそ９９４塩基対のＥｃｏＲＩからＤｒａＩまでの制限副断片である。ＳＰＶ相同ベクターにあるＥｃｏＲＩ部位は、合成リンカーを用いて特徴的なＮｏｔＩ部位に変換された。

相同ベクター９３１−２２．Ａ１．プラスミド９３１−２２．Ａ１を、ＳＰＶに外来ＤＮＡを挿入する目的のために構築した。それは、ＲＰＶのＤＮＡによって挟まれたネコＣＤ８０遺伝子を組込む。外来遺伝子の上流は、ＲＰＶ ＤＮＡのおよそ９０６塩基対断片である。外来遺伝子の下流は、ＲＰＶ ＤＮＡのおよそ８９５塩基対断片である。そのプラスミドが、「組換えＲＰＶを生成するための相同組換え手段」によって使用されるとき、外来遺伝子についてのＤＮＡコーディングを含むウイルスが生じる。ネコＣＤ８０遺伝子は、後期／前期プロモーター（ＬＰ２ＥＰ２）の制御下であることに注目すべきである。それは、合成ＤＮＡ配列と共に、以下の源から得られる制限断片を結合することによって、標準組換えＤＮＡ技術（Sambrookら）を利用して構築した。そのプラスミドベクターは、ｐＳＰ６４（プロメガ）のおよそ２９９９塩基対のＨｉｎｄＩＩＩの制限断片から誘導された。断片１は、ＲＰＶ ＨｉｎｄＩＩＩ制限断片Ｕ（Knightら）のおよそ９０６塩基対のＨｉｎｄＩＩＩからＸｂａＩまでの制限副断片である。断片２は、「ポリメラーゼ連鎖反応を用いたクローニング」によって合成されるネコＣＤ８０遺伝子のおよそ８７９塩基対のＥｃｏＲＩからＢａｍＨＩまでの断片である。ＰＣＲ反応についてのテンプレートは、ＣｏｎＡ刺激ネコ脾臓細胞から得られるＲＮＡであった。上流プライマー（５’−ＴＣＧＡＧＡＡＴＴＣＧＧＧＴＴＣＡＣＧＣＡＧＣＡＡＡＧＴＧＧ−３’；１／９７．４３）（配列番号５２）は、ネコＣＤ８０遺伝子の５’末端から合成し、ＥｃｏＲＩ部位を導入する。下流プライマー（５’−ＧＣＴＡＧＧＡＴＣＣＡＡＴＣＴＡＴＧＴＡＧＡＣＡＧＧＴＧＡＧＡＴ−３’；１／９７．６）（配列番号５３）は、ネコＣＤ８０遺伝子の３’末端から合成し、その遺伝子の３’末端にＢａｍＨＩ部位を導入し、そして逆転写およびポリメラーゼ連鎖反応のために使用した。断片３は、ＲＰＶ ＨｉｎｄＩＩＩ断片Ｕのおよそ８９５塩基対のＸｂａＩからＨｉｎｄＩＩＩまでの副断片である。断片１および３にあるＸｂａＩ部位は、ＮｏｔＩリンカーを用いて特徴的なＮｏｔＩ部位に変換された。断片２および３の間の合成ＤＮＡは、ＬＰ２ＥＰ２プロモーターおよび外来ＤＮＡの挿入のためのＥｃｏＲＩ部位およびＢａｍＨＩ部位を含む。

相同ベクター９３１−３２．Ａ５．プラスミド９３１−３２．Ａ５を、ＲＰＶに外来ＤＮＡを挿入するのに使用する目的で構築した。それは、ネコＣＤ８０遺伝子およびＲＰＶのＤＮＡによって挟まれたＥ．ｃｏｌｉ β−ガラクトシダーゼ（ｌａｃＺ）マーカー遺伝子を組込む。外来遺伝子の上流は、ＲＰＶ ＤＮＡのおよそ９０６塩基対の断片である。外来遺伝子の下流は、ＲＰＶ ＤＮＡのおよそ８９５塩基対の断片である。このプラスミドが、「組換えＲＰＶを生成するための相同組換え手段」によって使用されるとき、外来遺伝子についてのＤＮＡコーディングを含むウイルスが生じる。それは、以下の源から得られる制限断片を、合成ＤＮＡ配列と結合させることによって、標準組換えＤＮＡ技術（Sambrookら）を利用して構築した。そのプラスミドベクターは、ｐＳＰ６４（プロメガ）のおよそ２９９９塩基対のＨｉｎｄＩＩＩ制限断片から誘導された。断片１は、ＲＰＶ ＨｉｎｄＩＩＩ制限断片Ｕ（Knightら）のおよそ９０６塩基対のＨｉｎｄＩＩＩからＸｂａＩまでの制限副断片である。断片２は、「ポリメラーゼ連鎖反応でのクローニング」によって合成されるネコＣＤ８０遺伝子のおよそ８７９塩基対のＥｃｏＲＩからＢａｍＨＩまでの断片である。ＰＣＲ反応についてのテンプレートは、ＣｏｎＡ刺激ネコ脾臓細胞から得られるＲＮＡであった。上流プライマー（５’−ＴＣＧＡＧＡＡＴＴＣＧＧＧＴＣＡＣＧＣＡＧＣＡＡＡＧＴＧＧ−３’；１／９７．４３）（配列番号５２）は、ネコＣＤ８０遺伝子の５’末端から合成し、ＥｃｏＲＩ部位を導入する。下流プライマー（５’−ＧＣＴＡＧＧＡＴＣＣＡＡＴＣＴＡＴＧＴＡＧＡＣＡＧＧＴＧＡＧＡＴ−３’；１／９７．６）（配列番号５３）は、ネコＣＤ８０遺伝子の３’末端から合成し、その遺伝子の３’末端にＢａｍＨＩ部位を導入し、そして逆転写およびポリメラーゼ連鎖反応のために使用した。断片３は、プラスミドｐＪＦ７５１（Ferrariら）のおよそ３０１０塩基対のＢａｍＨＩからＰｖｕＩＩまでの制限断片である。断片４は、ＲＰＶ ＨｉｎｄＩＩＩ断片Ｕのおよそ８９５塩基対のＸｂａＩからＨｉｎｄＩＩＩまでの副断片である。断片１および４にあるＸｂａＩ部位は、ＮｏｔＩリンカーを用いて特徴的なＮｏｔＩ部位に変換された。

相同ベクター９３１−５５．Ｂ１２．相同ベクター９３１−５５．Ｂ１２を、ＳＰＶに外来ＤＮＡを挿入するのに使用した。それは、ＳＰＶのＤＮＡによって挟まれたＥ．ｃｏｌｉ β−グルクロニダーゼ（ｕｉｄＡ）マーカー遺伝子およびネコＩＦＮ−γ遺伝子（Onionsら、(1996年)；Argyleら(1995年)）を組込む。この相同ベクターが、「組換えＳＰＶを生成するための相同組換え手段」によって使用されるとき、外来遺伝子についてのＤＮＡコーディングを含むウイルスが生じた。β−グルクロニダーゼ（ｕｉｄＡ）マーカー遺伝子は、合成前期ポックスプロモーター（ＥＰ２）の制御下であり、そしてネコＩＦＮ−γ遺伝子は、別々で、そして特徴的な合成後期／前期ポックスプロモーター（ＬＰ２ＥＰ２）の制御下であることに注目すべきである。その相同ベクターは、以下の源から得られる制限断片を、適切な合成ＤＮＡ配列と結合させることによって、標準組換えＤＮＡ技術（Sambrookら）を利用して構築した。そのプラスミドベクターは、ＰＮＥＢ１９３（ニュー・イングランド・バイオラボズ）のおよそ２７００塩基対のＤｒａＩ制限断片から誘導された。断片１は、ＳＰＶ ＨｉｎｄＩＩＩ断片Ｋのおよそ８８１塩基対のＤｒａＩからＥｃｏＲＩまでの制限副断片である。断片２は、テンプレートとしてＣｏｎＡ刺激ネコ脾臓細胞から得られるＲＮＡを用いて逆転写およびポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって合成されるＥｃｏＲＩからＢａｍＨＩまでの制限断片である。ネコＩＮＦ−γを合成するために、プライマー５’−ＴＣＧＡＧＡＡＴＴＣＧＡＴＧＡＡＴＴＡＣＡＣＡＡＧＴＴＴＴＡＴＴＴＴＣＧ−３’；１／９４．４）（配列番号８１）は、ネコＩＮＦ−γ遺伝子の５’末端から合成し、その遺伝子の５’末端にＥｃｏＲＩ部位を導入する。プライマー（５’−ＴＣＧＡＧＧＡＴＣＣＴＴＡＴＴＴＣＧＡＴＧＣＴＣＴＡＣＧＧＣＣＴＣ−３’；１／９７．３）（配列番号８２）は、逆転写およびＰＣＲのために使用し、そしてネコＩＮＦ−ｇ遺伝子の３’末端から合成し、その遺伝子の３’末端にＢａｍＨＩ部位を導入した。ＰＣＲ産物を、ＥｃｏＲＩおよびＢａｍＨＩで消化させて、ネコＩＮＦ−γ遺伝子に対応する長さでおよそ５０４塩基対の断片を生じた。断片３４は、プラスミドｐＲＡＪ２６０（クローンテック）のおよそ１８２３塩基対のＥｃｏＲＩからＳｍａＩまでの制限断片である。断片４は、ＳＰＶ ＨｉｎｄＩＩＩ断片Ｋのおよそ９９４塩基対のＥｃｏＲＩからＤｒａＩまでの制限副断片である。ＳＰＶ相同ベクターにあるＥｃｏＲＩ部位は、合成リンカーを用いて特徴的なＮｏｔＩ部位に変換された。

相同ベクター８４６−８８．Ｂ１７．プラスミド８６４．８８．ｂ１７を、ネコヘルペスウイルスから全ｇＥコーディング領域を欠失させ、そして外来ＤＮＡを挿入する目的のために構築した。それは、ＨＶのＤＮＡによって挟まれたＦＨＶｇＥ欠失部位に挿入されるＥ．ｃｏｌｉ β−ガラクトシダーゼ（ｌａｃＺ）マーカー遺伝子を組込む。プラスミド８４６．８８．Ｂ１７は、ＦＨＶＳａｌＩＢ断片にあるＳｍａＩ部位からＦＨＶＥｃｏＲＩＥ断片にあるＳａｌＩ部位までｇＥ遺伝子の１６３８塩基対欠失を含む。ＦＨＶＳａｌＩＢ断片にあるＳｍａＩ部位と、ＦＨＶＥｃｏＲＩ Ｅ断片にあるＳａｌＩ部位は、ｇＥ遺伝子の欠失の終点を規定する。外来遺伝子の上流は、ｇＩ遺伝子の全コーディング配列（３７０アミノ酸）を含むＦＨＶ ＳａｌＩ Ｂのおよそ１４１５塩基対のＡｓｐ７１８からＳａｍＩまでの副断片である。外来遺伝子の下流は、特徴的な短く、そして末端の繰返し配列を含むＦＨＶ ＥｃｏＲＩ Ｅ断片のおよそ２２０５塩基対のＳａｌＩからＡｓｐ ７１８までの副断片である。そのプラスミドが、「組換えＲＰＶ、ＳＰＶまたはＦＨＶを生成するための相同組換え手段」によって使用されるとき、外来ｅｎｅ（遺伝子）についてのＤＮＡコーディングを含むウイルスが生じる。Ｅ．ｃｏｌｉ ｌａｃ Ｚ遺伝子は、構造的ＦＨＶｇＥプロモーターの制御下であることに注目すべきである。それは、標準組換えＤＮＡ技術（Sambrookら）を利用して構築された。

相同ベクター９２１−６５．Ｂ５．相同ベクター９２１−６５６．Ｂ５を、ＳＰＶ １５Ｌ遺伝子（およそ２３７ｂｐ）を欠失するため、そしてＳＰＶに外来ＤＮＡを挿入するために構築した。それは、ＳＰＶのＤＮＡによって挟まれたＥ．ｃｏｌｉ β−ガラクトシダーゼ（ＬａｃＺ）マーカー遺伝子およびネコ白血病ウイルス（ＦｅＬＶ）ｇａｇ／プロテアーゼおよびエンベロープ遺伝子を組込む。この相同ベクターが、「組換えＲＰＶ、ＳＰＶまたはＦＨＶを生成するための相同組換え手段」によって使用されるとき、外来遺伝子についてのＤＮＡコーディングを含むウイルスが生じる。それは、標準組換えＤＮＡ技術（Sambrookら）を利用して構築された。βガラクトシダーゼ（ｌａｃＺ）マーカー遺伝子は、構造的後期ポックスプロモーター（Ｉ５Ｌ）の制御下にあり、そしてＦｅＬＶｇａｇ／プロテアーゼおよびＦｅＬＶエンベロープ遺伝子は、各々、異なった合成前期ポックスプロモーターＥＰ２およびＥＰ１の制御下にあることに注目すべきである。外来遺伝子挿入を挟むＳＰＶ配列は、３．２ｋｂのＨｉｎｄＩＩＩ Ｎゲノム断片から誘導された。外来遺伝子の上流配列は、ＳＰＶ １４Ｌ遺伝子の一部を含む９０３ｂｐの断片であり、そして下流配列は、ＳＰＶ １６Ｌ遺伝子の一部を含む９６６ｂｐの断片である。Ｅ．ｃｏｌｉ ｌａｃＺ遺伝子、ＦｅＬＶエンベロープおよびＦｅＬＶｇａｇ／プロテアーゼ開放読取枠は全て、ＳＰＶ１６ＬおよびＳＰＶ１４Ｌ遺伝子に関して同じ配向で作動する。

相同ベクター９４２−０３．Ｃ６．プラスミド９４２−０３．Ｃ６を、ネコヘルペスウイルスからｇＥコーディング領域の一部を欠失させ、そして３つの外来遺伝子をｇＥ欠失部位に挿入する目的のために構築した。それは、ネコＣＤ８０遺伝子（〜８７９ｂｐ）、およびＦＨＶのＤＮＡによって挟まれたＦＩＶｇａｇ／プロテアーゼ遺伝子（〜１８００ｂｐ）およびＦＩＶエンベロープ遺伝子（〜２６００ｂｐ）を組込む。ネコＣＤ８０遺伝子は、ＦＨＶｇＥプロモーターの制御下にあり、ＦＩＶｇａｇ／プロテアーゼ遺伝子は、偽狂犬病ｇＸプロモーターの制御下であり、そしてＦＩＶエンベロープ遺伝子は、サイトメガロウイルス即時型遺伝子の制御下にある。外来遺伝子の上流は、ＦＨＶ ＳａｌＩ Ｂ断片のおよそ１４１５塩基対のＡｓｐ７１８からＳａｍＩまでの副断片である。外来遺伝子の下流は、特徴的な短く、そして末端の繰返し配列を含むＦＨＶ ＥｃｏＲＩ Ｅ断片のおよそ２２０５塩基対のＳａｌＩからＡｓｐ ７１８までの副断片である。そのプラスミドが、「組換えＲＰＶ、ＳＰＶまたはＦＨＶを生成するための相同組換え手段」によって使用されるとき、外来遺伝子についてのＤＮＡコーディングを含むウイルスが生じる。相同プラスミド９４２−０３．Ｃ６は、標準組換えＤＮＡ技術（Sambrookら）を利用して構築された。

（例１Ａ）
ネコＣＤ８０（Ｂ７−１）−ＴＡＭＵ、ＣＤ８０（Ｂ７−１）−ＳＰＡＨ、Ｃ８６（Ｂ７−２）、ＣＤ２８およびＣＴＬＡ−４ｃＤＮＡのクローニング：
ネコＣＤ８０（Ｂ７−１）、Ｃ８６（Ｂ７−２）、ＣＤ２８およびＣＴＬＡ−４ｃＤＮＡを、ネコｍＲＮＡと相互作用する変性プライマーを作るのに十分保存された２つの配列の間の領域を増幅する最初のＲＴ−ＰＣＲ（逆転写酵素／ポリメラーゼ連鎖反応）によってクローン化した。ｍＲＮＡの源は、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）または少なくとも１６時間ＣｏｎＡで刺激した脾臓細胞であった。このＰＣＲ産物を配列した。その配列は、ＲＡＣＥ（ｃＤＮＡ末端の高速増幅）ＰＣＲについてのプライマーを作成するのに使用された。５’末端を、新たに配列された保存領域に相補的である下流プライマーでｃＤＮＡを最初に作成することによって増幅させた。オリゴヌクレオチドを、ｃＤＮＡ（ｍＲＮＡの５’末端に贈られる）の３’末端にライゲートさせた。この配列は、新たに配列された領域中の別の領域に対応する下流ＰＣＲプライマーに適合するＰＣＲである上流プライマーについての結合部位として役割を果した。変性プライマーを、複数回の重ね合せ反応に使用して、３’末端を得た。ＰＣＲのためのこの上流プライマーは、新たに配列された領域内の配列と反応するように設計した。産物を、直接配列するか、またはＴＡクローニングベクターにクローン化させて、プラスミドから配列するかの何れかであった。全開放読取枠は、既知配列から構築されるプライマーを用いたＰＣＲによってその全体的に増幅させることによってクローン化された。ＯＲＦをクローン化させ、そして三回配列した。Ｂ７−１ＯＲＦを、ＳＶ４０プロモーターを用いてｐＳＩプラスミドに、そしてＳＦＶプラスミドにサブクローニングした。ｐＳＩは、ネコＣＤ２８とのＢ７−１の機能的相互作用を確立するために使用された。

ネコＣＤ８０（Ｂ７−１）ｃＤＮＡのＲＴ／ＰＣＲのために使用されるＤＮＡプライマーは、
５’−プライマー：５’−ＣＧＣＧＧＡＴＣＣＧＣＡＣＣＡＴＧＧＧＴＣＡＣＧＣＡＧＣＡＡＡＧＴＧＧＡＡＡＡＣ−３’；（配列番号１１）
３’−プライマー：５’−ＣＣＴＡＧＴＡＧＡＧＡＡＧＡＧＣＴＡＡＡＧＡＧＧＣ−３’；（配列番号１２）
（ネコＣＤ８０ｃＤＮＡのためのプライマーの完全リストについて上に参照）。

ネコＣＤ２８ｃＤＮＡのＲＴ／ＰＣＲのために使用されるＤＮＡプライマーは、
５’−プライマー：５’−ＣＧＣＧＧＡＴＣＣＡＣＣＧＧＴＡＧＣＡＣＡＡＴＧＡＴＣＣＴＣＡＧＧ−３’；（配列番号１３）
３’−プライマー：５’−ＣＧＣＧＧＡＴＣＣＴＣＴＧＧＡＴＡＧＧＧＧＴＣＣＡＴＧＴＣＡＧ−３’；（配列番号１４）
（ネコＣＤ２８ｃＤＮＡのためのプライマーの完全リストについて上に参照）。

ネコＣＴＬＡ−４ｃＤＮＡのＲＴ／ＰＣＲのために使用されるＤＮＡプライマーは、
１．最初のＰＣＲ産物についての変性プライマー（６７２ｂｐ）：
Ｄｅｇ５’Ｐ：５’−ＡＴＧＧＣＴＴ（Ｃ）ＧＣＣＴＴＧＧＡＴＴＴ（Ｃ）ＣＡＧＣ（Ａ）ＧＧ−３’；（配列番号１５）
Ｄｅｇ３’Ｐ：５’−ＴＣＡＡＴＴＧ（Ａ）ＡＴＧ（Ａ）ＧＧＡＡＴＡＡＡＡＴＡＡＧＧＣＴＧ−３’；（配列番号１６）
２．ＣＴＬＡ−４の５’末端（４５５ｂｐ）：変性、遺伝子特異的（ＧＳＰ）および重ね合せ遺伝子特異的（ＮＧＳＰ）プライマー：
初回のＰＣＲ：
Ｄｅｇ５’Ｐ：５’−ＴＧＴＴＧＧＧＴＴＴＣ（Ｔ）Ｇ（Ａ）ＣＴＣＴＧ（Ａ）ＣＴＴ（Ｃ）ＣＣＴＧ−３’；（配列番号１７）
３’ＧＳＰ：５’−ＧＣＡＴＡＧＴＡＧＧＧＴＧＧＴＧＧＧＴＡＣＡＴＧ−３’；（配列番号１８）
初回のＰＣＲ産物を有する重ね合せＰＣＲ：
Ｄｅｇ５’Ｐ：５’−ＴＧＴＴＧＧＧＴＴＴＣ（Ｔ）Ｇ（Ａ）ＣＴＣＴＧ（Ａ）ＣＴＴ（Ｃ）ＣＣＴＧ−３’；（配列番号１９）
３’ＮＧＳＰ：５’−ＡＣＡＴＧＡＧＣＴＣＣＡＣＣＴＴＧＣＡＧ−３’；（配列番号２０）
３．ＣＴＬＡ−４の３’末端；アダプタープライマー１（ＡＰ１、クロノテック・ラボ，インク．、カリフォルニア州パロアルト）；重ね合せアダプタープライマー（ＡＰ２、クロノテック・ラボ）、遺伝子特異的プライマー（ＧＳＰ）、および重ね合せ遺伝子特異的プライマー（ＮＧＳＰ）：
３’ＲＡＣＥ ＰＣＲ：
ＡＰ１：５’−ＣＣＡＴＣＣＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＣ−３’；（配列番号２１）
５’ＧＳＰ：５’−ＧＴＧＡＡＴＡＴＧＧＧＴＣＴＴＣＡＧＧＣＡＡＴＧ−３’；（配列番号２２）
３’ＲＡＣＥ ＰＣＲの産物を有する３’重ね合せＲＡＣＥ ＰＣＲ：
ＡＰ２：５’−ＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＣＴＣＧＡＧＣＧＧＣ−３’；（配列番号２３）
５’ＮＧＳＰ：５’−ＧＡＡＡＴＣＣＧＡＧＴＧＡＣＴＧＴＧＣＴＧＡＧ−３’；（配列番号２４）
４．全ＣＴＬＡ−４遺伝子のためのプライマー
Ｆｅｌ ＣＴＬＡ−４ ５’プライマー：５’−ＡＡＣＣＴＧＡＡＣＡＣＴＧＣＴＣＣＣＡＴＡＡＡＧ−３’；（配列番号２５）
Ｆｅｌ ＣＴＬＡ−４ ３’プライマー：５’−ＧＣＣＴＣＡＧＣＴＣＴＴＡＧＡＡＡＴＴＧＧＡＣＡＧ−３’；（配列番号２６）
ネコＣＤ８６（Ｂ７−２）ｃＤＮＡのＲＴ／ＰＣＲのために使用されるＤＮＡプライマーは、
１．最初のＰＣＲ産物のための変性プライマー（４２３ｂｐ）：
Ｄｅｇ５’Ｐ：５’−ＴＡＧＴＡＴＴＴＴＧＧＣＡＧＧＡＣＣＡＧＣ−３’；（配列番号２７）
Ｄｅｇ３’Ｐ：５’−ＣＴＧＴＧＡＣＡＴＴＡＴＣＴＴＧＡＧＡＴＴＴＣ−３’；（配列番号２８）
２．二次ＰＣＲ産物についての変性プライマー（５７４ｂｐ）：
Ｄｅｇ５’Ｐ：５’−ＧＡ（Ｇ）ＣＡ（Ｔ）ＧＣＡＣＴ（Ａ）ＡＴＧＧＧＡＣＴＧＡＧ−３’；（配列番号２９）
Ｄｅｇ３’Ｐ：５’−ＣＴＧＴＧＡＣＡＴＴＡＴＣＴＴＧＡＧＡＴＴＴＣ−３’；（配列番号３０）
３．ＣＤ８６の５’末端：ＡＰ１、ＡＰ２（クロノテック・ラボ）、変性３’遺伝子特異的（ＧＳＰ）および３’−重ね合せ遺伝子特異的（ＮＧＳＰ）プライマー：
５’ＲＡＣＥ ＰＣＲ：
ＡＰ１：５’−ＣＣＡＴＣＣＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＣ−３’；（配列番号３１）
３’ＧＳＰ：５’−ＴＧＧＧＴＡＡＣＣＴＴＧＴＡＴＡＧＡＴＧＡＧＣＡＧＧＴＣ−３’；（配列番号３２）
５’ＲＡＣＥのＰＣＲ産物を伴う重ね合せ５’ＲＡＣＥ ＰＣＲ：
ＡＰ２：５’−ＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＣＴＣＧＡＧＣＧＧＣ−３’；（配列番号３３）
３’ＮＧＳＰ：５’−ＣＡＧＧＴＴＧＡＣＴＧＡＡＧＴＴＡＧＣＡＡＧＣＡＣ−３’；（配列番号３４）
４．Ｂ７−２の３’末端：ＡＰ１、ＡＰ２、５’ＧＳＰ、および５’ＮＧＳＰ：
３’ＲＡＣＥ ＰＣＲ：
ＡＰ１：５’−ＣＣＡＴＣＣＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＣ−３’；（配列番号３５）
５’ＧＳＰ：５’−ＧＧＡＣＡＡＧＧＧＣＡＣＡＴＡＴＣＡＣＴＧＴＴＴＣ−３’；（配列番号３６）
３’ＲＡＣＥのＰＣＲ産物を伴う重ね合せ３’ＲＡＣＥ ＰＣＲ：
ＡＰ２：５’−ＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＣＴＣＧＡＧＣＧＧＣ−３’；（配列番号３７）
５’ＮＧＳＰ：５’−ＣＡＧＴＧＣＴＴＧＣＴＡＡＣＴＴＣＡＧＴＣＡＡＣＣ−３’；（配列番号３８）
全ＣＤ８６遺伝子：
Ｆｅｌ Ｂ７２（１）５’プライマー：５’−ＣＧＧＧＡＡＴＧＴＣＡＣＴＧＡＧＣＴＴＡＴＡＧ−３’；（配列番号３９）
Ｆｅｌ Ｂ７２（１１７６）３’プライマー：５’−ＧＡＴＣＴＴＴＴＴＣＡＧＧＴＴＡＧＣＡＧＧＧＧ−３’；（配列番号４０）
である。

（例１Ｂ）
ＣＤ８０（Ｂ７−１）−シントロ／ＳＰＡＨのクローニング；プラスミド９１７−１９−８／１６：
ネコ脾臓細胞を、ネコから抽出し、そして５時間、コンカナバリンＡと共に培養し、細胞をペレット化し、ＰＢＳで洗浄し、そしてそれを使用して総ＲＮＡ（キアゲン・ＲＮエーシー・トータルＲＮＡシステム）を単離させた。総ＲＮＡを、ＲＮエースＩ（ベーリンガー・マンハイム）で処理して、ＲＮＡ調製物からＤＮＡ混入を除去した。その後、キアゲンのオリゴテックス・ビーズ（カリフォルニア州サンタクララ）およびクイックカラムを用いてメセンジャーＲＮＡを、これらの調製物から抽出した。ランダム・ヘキサマー、ｄＮＴＰ、ＲＮＡｓｉｎ、逆転写酵素（プロメガ）および逆転写酵素緩衝液（プロメガ）の存在下で、コピーＤＮＡを、ｍＲＮＡから生成し、そして４２℃で、３０分間、インキュベートし、その後ＰＣＲを使用して、センス・プライマー５／９７．５０（５’−ＡＴＧＧＧＴＣＡＣＧＣＡＧＣＡＡＡＧＴＧ−３’）；（配列番号４１）およびアンチセンスプライマー５／９７．５１（５’−ＣＴＡＴＧＴＡＧＡＣＡＧＧＴＧＡＧＡＴＣ−３’）：（配列番号４２）、ｄＮＴＰ、Ｂ７−１ｃＤＮＡ（一本鎖）、ＭｇＳＯ_４、ベントポリメラーゼ（ＢＲＬ）およびベントポリメラーゼ緩衝液（ＢＲＬ）を使用して、ネコＢ７−１開放読取枠（ＯＲＦ）の二本鎖の全長ｃＤＮＡクローンを生成した。ＰＣＲ条件は、以下のとおりであった：９４℃、１５秒の１サイクル；９４℃、３０秒間、４８℃で２分間、７２℃で２分間の３５サイクル；７２℃で１０分間の１サイクル。ＰＣＲ反応を、１％低融解アガロースゲル上で行い、そしてＢ７−１ＯＲＦの予測サイズに対応するＤＮＡ断片を単離し、ゲルを精製し（キアゲンのゲル精製キット、カリフォルニア州サンタクララ）、そしてインビトロゲンのゼロ平滑ＰＣＲクローニングキット（カリフォルニア州サンディエゴ）から得たキット試薬を用いてｐＣＲ−ＢＬＵＮＴプラスミドベクターにクローン化させた。カナマイシン耐性細菌コロニーから抽出されるＤＮＡを、特徴的なＮｈｅＩ部位（ネコＣＤ８０（Ｂ７−１）−ＴＡＭＵ中に含まれる）の存在について予備スクリーニングした。８００−９００ｂｐサイズの範囲にあり、そしてＮｈｅＩ部位を含んだ挿入物を、ＡＢＩの蛍光自動スクリーニング・プロトコールおよび装置（パーキン−エルマー−シータス；アプライド・バイオシステムズ，インク．）を用いて配列決定した。プラスミドベクターおよびＢ７−１、先にクローン化されたＢ７−１から誘導された遺伝子特異的プライマーを、ＤＮＡ配列を得た。ｐＣＲ−平滑プライマーは、１／９７．３６（５’−ＣＡＧＧＡＡＡＣＡＧＣＴＡＴＧＡＣ−３’）；（配列番号４３）および１／９７．３７（５’−ＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧ−３’）：（配列番号４４）である。

Ｂ７−１遺伝子特異的プライマーは：１２／９６．２２（５’−ＡＡＣＡＣＣＡＴＴＴＣＡＴＣＡＴＣＣＴＴＴ−３’）；（配列番号４５）、１／９７．３３（５’−ＡＴＡＣＡＡＧＴＧＴＡＴＴＴＧＣＣＡＴＴＧＴＣ−３’）：（配列番号４６）、１２／９６．２０（５’−ＡＧＣＴＣＴＧＡＣＣＡＡＴＡＡＣＡＴＣＡ−３’）；（配列番号４７）、１２／９６．２１（５’−ＡＴＴＡＧＡＡＡＴＣＣＡＧＴＴＣＡＣＴＧＣＴ−３’）：（配列番号４８）、１／９７．３２（５’−ＴＣＡＴＧＴＣＴＧＧＣＡＡＡＧＴＡＣＡＡＧ−３’）；（配列番号４９）、１１／９６．３２（５’ＡＴＴＣＡＣＴＧＡＣＧＴＣＡＣＣＧＡ−３’）：（配列番号５０）、１１／９６．３１（５’−ＡＡＧＧＣＴＧＴＧＧＣＴＣＴＧＡ−３’）；（配列番号５１）である。２つのクローンが、２つのＤＮＡ点突然変異を例外として、元のＣＤ８０配列に対応する全長ＣＤ８０配列を含むと決定された。１つのそのような点突然変異は、アミノ酸配列に影響を及ぼさなかった。第二の突然変異は、ロイシンからイソロイシンへのアミノ酸変化を生じた。生じたネコＣＤ８０クローンは、９１７−１９．８／１６（ＣＤ８０−シントロ／ＳＰＡＨ）と示された。

（例２）
Ｓ−ＳＰＶ−２２９：
Ｓ−ＳＰＶ−２２９は、少なくとも２つの外来遺伝子を発現する豚痘ウイルスである。Ｅ．ｃｏｌｉ β−ガラクトシダーゼ（ｌａｃＺ）のための遺伝子およびネコＣＤ８０のための遺伝子を、ＳＰＶゲノム断片ＨｉｎｄＩＩＩ Ｍの大型のＢｇｌＩＩからＨｉｎｄＩＩＩまでの副断片内のＳＰＶ ＡｃｃＩ部位に挿入した（特徴的なＮｏｔＩ制限部位は、特徴的なＡｃｃＩ制限部位を変換した）。ｌａｃＺ遺伝子は、合成後期プロモーター（ＬＰ１）の制御下にあり、そしてネコＣＤ８０遺伝子は、合成後期／前期プロモーター（ＬＰ２ＥＰ２）の制御下にある。

Ｓ−ＳＰＶ−２２９は、Ｓ−ＳＰＶ−００１（カザ菌株(Kasza Strain)）から誘導された。これは、「組換えＳＰＶを生成するための相同な組換え手段」で相同ベクター９３０−２３．Ａ１（「材料および方法」参照）およびウイルスＳ−ＳＰＶ−００１を利用して達成された。形質移入保存物を、「β−ガラクトシダーゼ（ＢｌｕｏｇａｌおよびＣＰＲＧアッセイ）を発現する組換えＳＰＶ用のスクリーン」によってスクリーニングした。赤色プラーク精製の最終結果は、Ｓ−ＳＰＶ−２２９と表される組換えウイルスについて分析された。「材料および方法」に記述されるとおり青色プラークアッセイおよび黒色プラークアッセイによって監視される複数継代によって、このウイルスを、β−ガラクトシダーゼ発現、純度および挿入物安定性について分析した。当初の三回の精製後、観察される全プラークは、青色であり、それにより、ウイルスが、純粋で、安定で、そしてβ−ガラクトシダーゼを発現していることが示された。（米国特許第５，３８２，４２５号は、参照してここに組込まれる。）
「組換えＳＰＶ中での外来遺伝子発現についての黒色プラークスクリーン」を使用して、Ｓ−ＳＰＶ−２２９を、β−ガラクトシダーゼ特異的抗原の発現について分析した。β−ガラクトシダーゼに対するモノクローナル抗体は、Ｓ−ＳＰＶ−２２９プラークと特異的に反応し、そしてＳ−ＳＰＶ−００１負の対照プラークとは反応しないことが示された。全Ｓ−ＳＰＶ−２２９観察プラークは、β−ガラクトシダーゼに対するモノクローナル抗体と反応し、それにより、ウイルスが、β−ガラクトシダーゼ外来遺伝子を安定に発現していることが示された。ここに記述されるアッセイは、ＥＳＫ−４細胞で行われ、それにより、ＥＳＫ−４細胞は、ＳＰＶ組換えワクチンの産生のための安定な基質であることが示された。

「黒色プラークアッセイを用いた組換えＳＰＶ、ＲＰＶまたはＦＨＶ中のネコＣＤ８０（Ｂ７−１）およびＣＤ８６（Ｂ７−２）発現のためのスクリーン」を用いて、Ｓ−ＳＰＶ−２２９を、ネコＣＤ８０特異的抗原の発現について分析した。ヒトＣＴＬＡ−４／Ｆｃキメラ抗体は、Ｓ−ＳＰＶ−２２９プラーク（ネコＣＤ８０を発現する）と特異的に反応し、Ｓ−ＳＰＶ−００１負の対照プラークとは反応しないことが示される。全Ｓ−ＳＰＶ−２２９観察プラークは、ヒトＣＴＬＡ−４／Ｆｃキメラ抗体と反応することが示され、それによりウイルスは、ネコＣＤ８０外来遺伝子を安定に発現していることが示される。

ネコＣＤ８０遺伝子産物の発現を確認するために、細胞を、Ｓ−ＳＰＶ−２２９で感染させ、そして感染細胞溶解液のサンプルを、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動に掛けた。ゲルを、ブロットにかけ、そして「ウエスタン・ブロッティング手段」を用いて分析する。

Ｓ−ＳＰＶ−２２９は、ネコ科での疾病に対するワクチンとして有用である。

Ｓ−ＳＰＶ−２２９は、単独で、またはＦＩＶ、ＦｅＬＶ、ＦＩＰまたは他のネコ疾病ワクチンとの組合せで使用されるときに、ＦＩＶ、ＦｅＬＶ、ＦＩＰまたは他のネコ疾病に対するワクチンの効力を改善する。Ｓ−ＳＰＶ−２２９は、ネコＣＤ８０ポリペプチドの発現のために有用でもある。Ｓ−ＳＰＶ−２２９感染細胞の細胞溶解液を、マウスまたはウサギに注入して、ネコＣＤ８０に対するポリクローナルで、単一特異的抗体を生成する。

（例３）
Ｓ−ＳＰＶ−２３０：
Ｓ−ＳＰＶ−２３０は、少なくとも２つの外来遺伝子を発現する豚痘ウイルスである。Ｅ．ｃｏｌｉ β−ガラクトシダーゼ（ｌａｃＺ）のための遺伝子、およびネコＣＤ２８のための遺伝子を、ＳＰＶゲノム断片ＨｉｎｄＩＩＩ Ｍ（特徴的ＮｏｔＩ制限部位は、特徴的ＡｃｃＩ制限部位に置換した）の大型のＢｇｌＩＩからＨｉｎｄＩＩＩまでの副断片内のＳＰＶＡｃｃＩ部位に挿入した。ｌａｃＺ遺伝子は、合成後期プロモーター（ＬＰ１）の制御下にあり、そしてネコＣＤ２８遺伝子は、合成後期／前期プロモーター（ＬＰ２ＥＰ２）の制御下にある。

Ｓ−ＳＰＶ−２３０は、Ｓ−ＳＰＶ−００１（カザ菌株）から誘導された。これは、「組換えＳＰＶを生成するための相同な組換え手段」で相同ベクター９３０−２６．Ａ１（「材料および方法」参照）およびウイルスＳ−ＳＰＶ−００１を利用して達成された。形質移入保存物を、「β−ガラクトシダーゼ（ＢｌｕｏｇａｌおよびＣＰＲＧアッセイ）を発現する組換えＳＰＶ用のスクリーン」によってスクリーニングした。赤色プラーク精製の最終結果は、Ｓ−ＳＰＶ−２３０と表される組換えウイルスについて分析された。「材料および方法」に記述されるとおり青色プラークアッセイによって監視される複数継代によって、このウイルスを、β−ガラクトシダーゼ発現、純度および挿入物安定性について分析した。当初の三回の精製後、観察される全プラークは、青色であり、それにより、ウイルスが、純粋で、安定で、そして外来遺伝子を発現していることが示された。

「組換えＳＰＶ中での外来遺伝子発現についての黒色プラークスクリーン」を使用して、Ｓ−ＳＰＶ−２３０を、ネコＣＤ２８特異的抗原の発現について分析した。ここに記述されるアッセイは、ＥＳＫ−４細胞で行われ、それにより、ＥＳＫ−４細胞は、ＳＰＶ組換えワクチンの産生のための安定な基質であることが示された。

ネコＣＤ２８遺伝子産物の発現を確認するために、細胞を、Ｓ−ＳＰＶ−２３０で感染させ、そして感染細胞溶解液のサンプルを、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動に掛けた。ゲルを、ブロットにかけ、そして「ウエスタン・ブロッティング手段」を用いて分析する。

Ｓ−ＳＰＶ−２３０は、ネコ科での疾病に対するワクチンとして有用である。Ｓ−ＳＰＶ−２３０は、単独で、またはＦＩＶ、ＦｅＬＶ、ＦＩＰまたは他のネコ疾病ワクチンとの組合せで使用されるときに、ＦＩＶ、ＦｅＬＶ、ＦＩＰまたは他のネコ疾病に対するワクチンの効力を改善する。Ｓ−ＳＰＶ−２３０は、ネコＣＤ２８ポリペプチドの発現のために有用でもある。Ｓ−ＳＰＶ−２３０感染細胞の細胞溶解液を、マウスまたはウサギに注入して、ネコＣＤ２８に対するポリクローナルで、単一特異的抗体を生成する。

（例４）
Ｓ−ＳＰＶ−２２５：
Ｓ−ＳＰＶ−２２５は、少なくとも２つの外来遺伝子を発現する豚痘ウイルスである。Ｅ．ｃｏｌｉ β−ガラクトシダーゼ（ｌａｃＺ）のための遺伝子、およびネコインターフェロン−γ（ネコＩＦＮ−γ）のための遺伝子を、ＳＰＶゲノム断片ＨｉｎｄＩＩＩ Ｍ（特徴的ＮｏｔＩ制限部位は、特徴的ＡｃｃＩ制限部位に置換した）の大型のＢｇｌＩＩからＨｉｎｄＩＩＩまでの副断片内のＳＰＶＡｃｃＩ部位に挿入した。ｌａｃＺ遺伝子は、豚痘０１Ｌプロモーターの制御下にあり、そしてネコＩＦＮ−γ遺伝子は、合成後期／前期プロモーター（ＬＰ２ＥＰ２）の制御下にある。

Ｓ−ＳＰＶ−２２５は、Ｓ−ＳＰＶ−００１（カザ菌株）から誘導された。これは、「組換えＳＰＶを生成するための相同な組換え手段」で相同ベクター９１７−６０．Ｂ９（「材料および方法」参照）およびウイルスＳ−ＳＰＶ−００１を利用して達成された。形質移入保存物を、「β−ガラクトシダーゼ（ＢｌｕｏｇａｌおよびＣＰＲＧアッセイ）を発現する組換えＳＰＶ用のスクリーン」によってスクリーニングした。赤色プラーク精製の最終結果は、Ｓ−ＳＰＶ−２２５と表される組換えウイルスについて分析された。「材料および方法」に記述されるとおり青色プラークアッセイによって監視される複数継代によって、このウイルスを、β−ガラクトシダーゼ発現、純度および挿入物安定性について分析した。当初の三回の精製後、観察される全プラークは、青色であり、それにより、ウイルスが、純粋で、安定で、そして外来遺伝子を発現していることが示された。

「組換えＳＰＶ中での外来遺伝子発現についての黒色プラークスクリーン」を使用して、Ｓ−ＳＰＶ−２２５を、ネコＩＦＮ−γ特異的抗原の発現について分析した。ここに記述されるアッセイは、ＥＳＫ−４細胞で行われ、それにより、ＥＳＫ−４細胞は、ＳＰＶ組換えワクチンの産生のための安定な基質であることが示された。

ネコＩＦＮ−γ遺伝子産物の発現を確認するために、細胞を、Ｓ−ＳＰＶ−２２５で感染させ、そして感染細胞溶解液のサンプルを、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動に掛けた。ゲルを、ブロットにかけ、そして「ウエスタン・ブロッティング手段」を用いて分析する。

「ＶＳＶプラーク減少を用いた組換えＳＰＶ、ＲＰＶまたはＦＨＶから発現されるネコインターフェロン・ガンマ生物活性についてのスクリーン」を用いて、Ｓ−ＳＰＶ−２２５を、生物活性ネコＩＦＮ−γの発現について分析する。

Ｓ−ＳＰＶ−２２５は、ネコ科での疾病に対するワクチンとして有用である。Ｓ−ＳＰＶ−２２５は、単独で、またはＦＩＶ、ＦｅＬＶ、ＦＩＰまたは他のネコ疾病ワクチンとの組合せで使用されるときに、ＦＩＶ、ＦｅＬＶ、ＦＩＰまたは他のネコ疾病に対するワクチンの効力を改善する。

（例５）
Ｓ−ＳＰＶ−２００：
Ｓ−ＳＰＶ−２００は、３つの外来遺伝子を発現する豚痘ウイルスである。ネコ免疫不全ウイルス（ＦＩＶ）ｇａｇ／プロテアーゼ、およびＦＩＶエンベロープ（全長）のための遺伝子、およびＥ．ｃｏｌｉ β−ガラクトシダーゼ（ｌａｃＺ）のための遺伝子を、特徴的なＮｏｔＩ制限部位に挿入した（ＮｏｔＩリンカーは、ＳＰＶ ＨｉｎｄＩＩＩ Ｍ断片の０１Ｌ ＯＲＦ中の特徴的ＡｃｃＩ制限部位に挿入した）。ＦＩＶｇａｇ／プロテアーゼおよびエンベロープ遺伝子は、別々であるが同一の合成後期／前期プロモーター（ＬＰ２ＥＰ２）の制御下にある。ｌａｃＺ遺伝子は、合成後期プロモーター（ＬＰ１）の制御下にある。

Ｓ−ＳＰＶ−２００は、Ｓ−ＳＰＶ−００１（カザ菌株）から誘導された。これは、「組換えＳＰＶを生成するための相同な組換え手段」で相同ベクター９０４−６３．Ｂ７およびウイルスＳ−ＳＰＶ−００１を利用して達成された。形質移入保存物を、「β−ガラクトシダーゼ（ＢｌｕｏｇａｌおよびＣＰＲＧアッセイ）を発現する組換えＳＰＶ用のスクリーン、および酵素的マーカー遺伝子を発現する組換えヘルペスウイルス用のスクリーン」によってスクリーニングした。赤色プラーク精製の最終結果は、Ｓ−ＳＰＶ−１５７と表される組換えウイルスであった。「材料および方法」に記述されるとおり青色プラークアッセイによって、このウイルスを、β−ガラクトシダーゼ発現について分析した。黒色プラークアッセイでのＦＩＶｇａｇおよびβ−ガラクトシダーゼの検出、およびウエスタン・ブロットアッセイでのＦＩＶｇａｇおよびエンベロープの検出を介して、５回継代後の純度および挿入物安定性の分析を行った。

Ｓ−ＳＰＶ−２００は、ＦＩＶｇａｇ／プロテアーゼおよびＦＩＶエンベロープタンパク質を発現し、そしてＦＩＶ感染に対するネコ科でのワクチンとして有用である組換え豚痘ウイルスである。Ｓ−ＳＰＶ−２００は、ＦＩＶｇａｇ／プロテアーゼおよびＦＩＶエンベロープタンパク質の発現に有用でもある。

（例６）
Ｓ−ＳＰＶ−２３３：
Ｓ−ＳＰＶ−２３３は、５つの外来遺伝子：ＦＩＶｇａｇ、ＦＩＶｅｎｖ、ネコＣＤ８０、Ｅ．ｃｏｌｉ ｌａｃＺおよびＥ．ｃｏｌｉ ｕｉｄＡを発現する豚痘ウイルスである。全長のネコＣＤ８０遺伝子、およびＥ．ｃｏｌｉ β−ガラクトシダーゼ（ｕｉｄＡ）のための遺伝子を、特徴的なＮｏｔＩ制限部位に挿入した（ＮｏｔＩリンカーは、６．７ｋｂのＳＰＶ ＨｉｎｄＩＩＩ Ｋ断片のおよそ３．２ｋｂ領域（配列番号）の範囲にある特徴的ＡｃｃＩ制限部位に挿入した）。ネコ免疫不全ウイルス（ＦＩＶ）ｇａｇ／プロテアーゼ、およびＦＩＶエンベロープ（全長）のための遺伝子、およびＥ．ｃｏｌｉ β−ガラクトシダーゼ（ｌａｃＺ）のための遺伝子を、特徴的ＮｏｔＩ制限部位に挿入した（ＮｏｔＩリンカーを、ＳＰＶ ＨｉｎｄＩＩＩ Ｍ断片の０１Ｌ ＯＲＦ中の特徴的ＡｃｃＩ限定部位に挿入した）。ＣＤ８０遺伝子は、合成後期／前期プロモーター（ＬＰ２ＥＰ２）の制御下にあり、そしてｕｉｄＡ遺伝子は、別々で、そして特徴的な合成前期プロモーター（ＥＰ２）の制御下にある。ＦＩＶｇａｇ／プロテアーゼ、およびＦＩＶエンベロープは、別々であるが、同一の合成後期／前期プロモーター（ＬＰ２ＥＰ２）の制御下である。ｌａｃＺ遺伝子は、合成後期プロモーター（ＬＰ１）の制御下にある。（ＰＣＴ国際出願ＷＯ９６／２２３６３号は、参照してここに組込まれる。）
Ｓ−ＳＰＶ−２３３は、Ｓ−ＳＰＶ−２００（ＦＩＶｇａｇ、ＦＩＶエンベロープおよびＥ．ｃｏｌｉ ｌａｃＺ遺伝子を含む）から誘導された。これは、「組換えＳＰＶを生成するための相同な組換え手段」で相同ベクター９３１−２１．Ａ１およびウイルスＳ−ＳＰＶ−２００を利用して達成された。形質移入保存物を、「β−ガラクトシダーゼを発現する組換えＳＰＶ用のスクリーン（Ｘ−ｇＬＵＣ、および酵素的マーカー遺伝子を発現する組換えヘルペスウイルス用のスクリーン）」によってスクリーニングした。青色／緑色プラーク精製の最終結果は、Ｓ−ＳＰＶ−２３３と表される組換えウイルスであった。

「組換えＳＰＶ中での外来遺伝子発現についての黒色プラークスクリーン」を使用して、Ｓ−ＳＰＶ−２３３を、ＦＩＶｇａｇ、ＦＩＶｅｎｖおよびネコＣＤ８０特異的抗原の発現について分析する。ここに記述されるアッセイは、ＥＳＫ−４細胞で行われ、それにより、ＥＳＫ−４細胞は、ＳＰＶ組換えワクチンの産生のための安定な基質であることが示された。

「黒色プラークアッセイを用いた組換えＳＰＶ、ＲＰＶまたはＦＨＶ中でのネコＣＤ８０（Ｂ７−１）およびＣＤ８６（Ｂ７−２）発現用のスクリーン」を使用して、Ｓ−ＳＰＶ−２３３を、ネコＣＤ８０特異的抗原の発現について分析する。ヒトＣＴＬＡ−４／Ｆｃキメラ抗体は、Ｓ−ＳＰＶ−２３３プラーク（ネコＣＤ８０を発現する）に特異的に反応し、Ｓ−ＳＰＶ−００１負の対照プラークとは反応しないことが示される。全てのＳ−ＳＰＶ−２３３観察プラークは、ヒトＣＴＬＡ−４／Ｆｃキメラ抗体と反応することが示され、それにより、ウイルスは、ネコＣＤ８０外来遺伝子を安定に発現することが示される。

ＦＩＶｇａｇ、ＦＩＶｅｎｖ、およびネコＣＤ８０遺伝子産物の発現を確認するために、細胞を、Ｓ−ＳＰＶ−２３３で感染させ、そして感染細胞溶解液のサンプルを、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動に掛けた。ゲルを、ブロットにかけ、そして「ウエスタン・ブロッティング手段」を用いて分析する。

Ｓ−ＳＰＶ−２３３は、ＦＩＶｇａｇ／プロテアーゼおよびＦＩＶエンベロープタンパク質を発現し、そしてＦＩＶ感染に対するネコ科でのワクチンとして有用である組換え豚痘ウイルスである。Ｓ−ＳＰＶ−２３３は、ＦＩＶｇａｇ／プロテアーゼおよびエンベロープタンパク質の発現に有用でもある。

（例７）
Ｓ−ＳＰＶ−２３５：
Ｓ−ＳＰＶ−２３５は、５つの外来遺伝子：ＦＩＶｇａｇ、ＦＩＶｅｎｖ、ネコＩＮＦ−γ、Ｅ．ｃｏｌｉ ｌａｃＺおよびＥ．ｃｏｌｉ ｕｉｄＡを発現する豚痘ウイルスである。全長のネコＩＦＮ−γ遺伝子、およびＥ．ｃｏｌｉ β−ガラクトシダーゼ（ｕｉｄＡ）のための遺伝子を、特徴的なＮｏｔＩ制限部位に挿入した（ＮｏｔＩリンカーは、６．７ｋｂのＳＰＶ ＨｉｎｄＩＩＩ Ｋ断片のおよそ３．２ｋｂ領域（配列番号）の範囲にある特徴的ＥｃｏＲＩ制限部位に挿入した）。ネコ免疫不全ウイルス（ＦＩＶ）ｇａｇ／プロテアーゼ、およびＦＩＶエンベロープ（全長）のための遺伝子、およびＥ．ｃｏｌｉ β−ガラクトシダーゼ（ｌａｃＺ）のための遺伝子を、特徴的ＮｏｔＩ制限部位に挿入した（ＮｏｔＩリンカーを、ＳＰＶ ＨｉｎｄＩＩＩ Ｍ断片の０１Ｌ ＯＲＦ中の特徴的ＡｃｃＩ制限部位に挿入した）。ＩＮＦ−γ遺伝子は、合成後期／前期プロモーター（ＬＰ２ＥＰ２）の制御下にあり、そしてｕｉｄＡ遺伝子は、別々で、そして特徴的な合成前期プロモーター（ＥＰ２）の制御下にある。ＦＩＶｇａｇ／プロテアーゼ、およびエンベロープは、別々であるが、同一の合成後期／前期プロモーター（ＬＰ２ＥＰ２）の制御下である。ｌａｃＺ遺伝子は、合成後期プロモーター（ＬＰ１）の制御下にある。

Ｓ−ＳＰＶ−２３５は、Ｓ−ＳＰＶ−２００（ＦＩＶｇａｇ、ＦＩＶエンベロープおよびＥ．ｃｏｌｉ ｌａｃＺ遺伝子を含む）から誘導された。これは、「組換えＳＰＶを生成するための相同な組換え手段」で相同ベクター９３１−５５．Ｂ１２およびウイルスＳ−ＳＰＶ−２００を利用して達成された。形質移入保存物を、「β−ガラクトシダーゼを発現する組換えＳＰＶ用のスクリーン（Ｘ−ｇＬＵＣ、および酵素的マーカー遺伝子を発現する組換えヘルペスウイルス用のスクリーン）」によってスクリーニングした。青色／緑色プラーク精製の最終結果は、Ｓ−ＳＰＶ−２３５と表される組換えウイルスである。

「組換えＳＰＶ中での外来遺伝子発現についての黒色プラークスクリーン」を使用して、Ｓ−ＳＰＶ−２３５を、ＦＩＶｇａｇ、ＦＩＶｅｎｖおよびネコＩＦＮ−γ特異的抗原の発現について分析する。ここに記述されるアッセイは、ＥＳＫ−４細胞で行われ、それにより、ＥＳＫ−４細胞は、ＳＰＶ組換えワクチンの産生のための安定な基質であることが示された。

「ＶＳＶプラーク減少を用いた組換えＳＰＶ、ＲＰＶまたはＦＨＶから発現されるネコインターフェロン・ガンマ生物活性用のスクリーン」を使用して、Ｓ−ＳＰＶ−２２５を、生物活性ネコＩＮＦ−γの発現について分析する。

ＦＩＶｇａｇ、ＦＩＶｅｎｖ、およびネコＩＮＦ−γ遺伝子産物の発現を確認するために、細胞を、Ｓ−ＳＰＶ−２３５で感染させ、そして感染細胞溶解液のサンプルを、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動に掛けた。ゲルを、ブロットにかけ、そして「ウエスタン・ブロッティング手段」を用いて分析する。

Ｓ−ＳＰＶ−２３５は、ＦＩＶｇａｇ／プロテアーゼおよびＦＩＶエンベロープタンパク質を発現し、そしてＦＩＶ感染に対するネコ科でのワクチンとして有用である組換え豚痘ウイルスである。Ｓ−ＳＰＶ−２３５は、ＦＩＶｇａｇ／プロテアーゼおよびエンベロープタンパク質の発現に有用でもある。

（例８）
Ｓ−ＳＰＶ−２２４：
Ｓ−ＳＰＶ−２２４は、３つの外来遺伝子を発現する豚痘ウイルスである。ネコ白血病ウイルス（ＦｅＬＶ）ｇａｇ／プロテアーゼ、およびＦｅＬＶエンベロープ（全長）についての遺伝子およびＥ．ｃｏｌｉ（ｌａｃＺ）についての遺伝子を、ＳＰＶ１８６９ｂｐ部分ＨｉｎｄＩＩＩ Ｎゲノム断片から由来する欠失ＳＰＶＩ５Ｌに挿入した。ＦｅＬＶｇａｇ／プロテアーゼ遺伝子は、合成前期ポックスプロモーター（ＥＰ２）の制御下にある。ＦｅＬＶエンベロープ遺伝子は、合成前期ポックスプロモーター（ＥＰ１）の制御下にある。ｌａｃＺ遺伝子は、構造的後期ＳＰＶ Ｉ５Ｌプロモーターの制御下にある。

Ｓ−ＳＰＶ−２２４は、Ｓ−ＳＰＶ−００１（カザ菌株）から誘導された。これは、「組換えＲＰＶ、ＳＰＶ、ＦＨＶを生成するための相同な組換え手段」で相同ベクター９２１−６５．Ｂ５およびウイルスＳ−ＳＰＶ−００１を利用して達成された。形質移入保存物を、「β−ガラクトシダーゼ（ブルーガルおよびＣＰＲＧアッセイ）またはβ−ガラクトシダーゼ（Ｘ−グルクアッセイズ）を発現する組換えＲＰＶまたはＳＰＶ ＦＨＶ用のスクリーン」によってスクリーニングした。赤色プラーク精製の最終結果は、Ｓ−ＳＰＶ−２２４と表される組換えウイルスであった。このウイルスは、「材料および方法」に記述されるとおり青色プラーク酸によるβ−ガラクトシダーゼについての酸であった。

「黒色プラークアッセイを用いた組換えＲＰＶ、ＳＰＶまたはＦＨＶ中での外来遺伝子発現についてのスクリーン」を使用して、Ｓ−ＳＰＶ−２２４を、ＦＩＶｇａｇ／プロテアーゼ、ＦｅＬＶｅｎｖおよびβ−ガラクトシダーゼタンパク質の発現について分析する。ここに記述されるアッセイは、ＳＰＶ組換えワクチンの産生のための安定な基質であるＥＳＫ−４細胞で行われた（１９９８年８月１４日）。

ＦＩＶｇａｇ／プロテアーゼおよびＦｅＬＶｅｎｖ遺伝子産物の発現を確認するために、細胞を、Ｓ−ＳＰＶ−２２４で感染させ、そして感染細胞溶解液のサンプルを、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動に掛けた。ゲルを、ブロットにかけ、そして「ウエスタン・ブロッティング手段」を用いて分析する。

Ｓ−ＳＰＶ−２２４は、ＦｅＬＶｇａｇ／プロテアーゼおよびＦＩＶエンベロープタンパク質を発現し、そしてＦｅＬＶ感染に対するネコ科でのワクチンとして有用である組換え豚痘ウイルスである。Ｓ−ＳＰＶ−２２４は、ＦｅＬＶｇａｇ／プロテアーゼおよびエンベロープタンパク質の発現に有用でもある。

（例９）
Ｓ−ＳＰＶ−２４６：
Ｓ−ＳＰＶ−２４６は、４つの外来遺伝子：ＦｅＬＶｇａｇ／プロテアーゼ、ＦｅＬＶｅｎｖ、ネコＣＤ８０、Ｅ．ｃｏｌｉ ｌａｃＺおよびＥ．ｃｏｌｉ ｕｉｄＡを発現する豚痘ウイルスである。全長ネコＣＤ８０遺伝子、およびＥ．ｃｏｌｉ β−ガラクトシダーゼ（ｕｉｄＡ）についての遺伝子を、特徴的なＮｏｔＩ制限部位に挿入した（ＮｏｔＩリンカーは、６．７ｋｂのＳＰＶ ＨｉｎｄＩＩＩ Ｋ断片のおよそ３．２ｋｂ領域の範囲にある特徴的ＥｃｏＲＩ制限部位に挿入した）。ＣＤ８０遺伝子は、合成後期／前期プロモーター（ＬＰ２ＥＰ２）の制御下にあり、そしてｕｉｄＡ遺伝子は、合成前期ポックスプロモーター（ＥＰ２）の制御下にある。ＦｅＬＶｇａｇ／プロテアーゼ、ＦｅＬＶエンベロープ（全長）およびＥ．ｃｏｌｉ β−ガラクトシダーゼ（ｌａｃＺ）遺伝子を、１８６９部分ＨｉｎｄＩＩＩ Ｎゲノム断片から由来する欠失Ｉ５Ｌ部位に挿入した。ＦｅＬＶｇａｇ／プロテアーゼ遺伝子は、合成前期ポックスプロモーター（ＥＰ２）の制御下である。ＦｅＬＶエンベロープ遺伝子は、合成前期ポックスプロモーター（ＥＰ１）の制御下にある。ｌａｃＺ遺伝子は、構造的後期ポックスプロモーター（Ｉ５Ｌ）の制御下にある。（ＰＣＴ国際出願ＷＯ９６／２２２６３号は、参照してここに組込まれる。）
Ｓ−ＳＰＶは、Ｓ−ＳＰＶ−２２４（ＦｅＬＶｇａｇ／プロテアーゼ、ＦｅＬＶエンベロープおよびＩ５Ｌ欠失した１８６９ｋｂ部分ＨｉｎｄＩＩＩ Ｎ断片中のＥ．ｃｏｌｉ ｌａｃＺ遺伝子を含む）から誘導された。これは、「組換えＲＰＶ、ＳＰＶまたはＦＨＶを生成するための相同な組換え手段」で相同ベクター９３１−２１．Ｂ１およびウイルスＳ−ＳＰＶ−２２４を利用して達成された。形質移入保存物を、「β−ガラクトシダーゼ（ブルーガルおよびＣＰＲＧアッセイ）またはβ−ガラクトシダーゼ（Ｘ−ＧＬＵＣアッセイ）を発現する組換えＲＰＶまたはＳＰＶまたはＦＨＶ用のスクリーン」によってスクリーニングした。青色／緑色プラーク精製の最終結果は、Ｓ−ＳＰＶ−２４６と表される組換えウイルスである。

「黒色プラークアッセイを用いた組換えＲＰＶ、ＳＰＶまたはＦＨＶ中での外来遺伝子発現についてのスクリーン」を使用して、Ｓ−ＳＰＶ−２４６を、ＦｅＬＶｇａｇ／プロテアーゼ、およびＦｅＬＶエンベロープタンパク質の発現について分析する。ここに記述されるアッセイは、ＥＳＫ−４細胞で行われ、それにより、ＥＳＫ−４細胞は、ＳＰＶ組換えワクチンの産生のための適切な基質であることが示された。

「黒色プラークアッセイを用いた組換えＳＰＶ、ＲＰＶまたはＦＨＶでのネコＣＤ８０（Ｂ７−１）およびＣＤ８６（Ｂ７−２）発現用のスクリーン」を使用して、Ｓ−ＳＰＶ−２４６を、ネコＣＤ８０特異的抗原の発現について分析する。ヒトＣＴＬＡ−４／Ｆｃキメラ抗体は、Ｓ−ＳＰＶ−２４６プラーク（ネコＣＤ８０を発現する）と特異的に反応するが、Ｓ−ＳＰＶ−００１負の対照プラークとは反応しないことが示される。全Ｓ−ＳＰＶ−２４６で観察されるプラークは、ヒトＣＴＬＡ−４／Ｆｅキメラ抗体と反応することが示され、それによりそのウイルスは、ネコＣＤ８０外来遺伝子を安定に発現していることが示される。

ＦｅＬＶｇａｇ／プロテアーゼ、ＦＩＶエンベロープ、およびネコＣＤ８０遺伝子産物の発現を確認するために、細胞を、Ｓ−ＳＰＶ−２４６で感染させ、そして感染細胞溶解液のサンプルを、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動に掛けた。ゲルを、ブロットにかけ、そして「ウエスタン・ブロッティング手段」を用いて分析する。

Ｓ−ＳＰＶ−２４６は、ＦｅＬＶｇａｇ／プロテアーゼおよびＦｅＬＶエンベロープタンパク質を発現し、そしてＦｅＬＶ感染に対するネコ科でのワクチンとして有用である組換え豚痘ウイルスである。Ｓ−ＳＰＶ−２４６は、ＦＩＶｇａｇ／プロテアーゼおよびエンベロープタンパク質の発現に有用でもある。

（例１０）
ネコ免疫不全ウイルス（ＦＩＶ）、ネコ白血病ウイルス（ＦｅＬＶ）またはネコ感染性腹膜炎（ＦＩＰ）に対するワクチンとして有用な組換え豚痘ウイルスの別の例は：
組換え豚痘ウイルスは、５つの外来遺伝子を発現する。ＦＩＶｅｎｖ遺伝子は、合成前期ポックスプロモーターＥＰＩの制御下にある。ＦＩＶｇａｇ／プロテアーゼ遺伝子は、合成前期ポックスプロモーターＥＰ２の制御下にある。Ｅ．ｃｏｌｉ ｌａｃＺ遺伝子は、豚痘プロモーターＩ５Ｌの制御下にある。ネコＣＤ８０遺伝子は、合成後期／前期ポックスプロモーターＬＰ２ＥＰ２の制御下にある。Ｅ．ｃｏｌｉ ｕｉｄＡ遺伝子は、合成前期ポックスプロモーターＥＰ２の制御下にある。ＦＩＶエンベロープ遺伝子、ＦＩＶｇａｇ／プロテアーゼおよびＥ．ｃｏｌｉ ｌａｃＺ遺伝子は、ネコＣＤ８０およびＥ．ｃｏｌｉ ｕｉｄＡ遺伝子挿入から得られる、異なり、そして区別できる非必須ＳＰＶ挿入部位に配置される。

組換え豚痘ウイルスは、５つの外来遺伝子を発現する。ＦＩＶｅｎｖ遺伝子は、合成前期ポックスプロモーターＥＰＩの制御下にある。ＦＩＶｇａｇ／プロテアーゼ遺伝子は、合成前期ポックスプロモーターＥＰ２の制御下にある。Ｅ．ｃｏｌｉ ｌａｃＺ遺伝子は、豚痘プロモーターＩ５Ｌの制御下にある。ネコＣＤ８６遺伝子は、合成後期／前期ポックスプロモーターＬＰ２ＥＰ２の制御下にある。Ｅ．ｃｏｌｉ ｕｉｄＡ遺伝子は、合成前期ポックスプロモーターＥＰ２の制御下にある。ＦＩＶエンベロープ遺伝子、ＦＩＶｇａｇ／プロテアーゼおよびＥ．ｃｏｌｉ ｌａｃＺ遺伝子は、ネコＣＤ８０およびＥ．ｃｏｌｉ ｕｉｄＡ遺伝子挿入から得られる、異なり、そして区別できる非必須ＳＰＶ挿入部位に配置される。

組換え豚痘ウイルスは、２つの外来遺伝子を発現する。ネコＣＤ８６遺伝子は、合成後期／前期ポックスプロモーターＬＰ２ＥＰ２の制御下にある。Ｅ．ｃｏｌｉ ｕｉｄＡ遺伝子は、合成前期ポックスプロモーターＥＰ２の制御下にある。このウイルスは、単独で、または他の組換えタンパク質またはワクチンと組合わせた用途を示す。

である。

ＦｅＬＶ疾病の対するワクチンの発現に有用な組換え豚痘ウイルスの別の例は、ＦＩＶ遺伝子を比較できるＦｅＬＶ特異的遺伝子に変える以外は、上に記述されるものと同じである。

ポリクローナル抗体産生および精製用のワクチンとして使用するためのタンパク質の産生に有用な組換え豚痘ウイルスの別の例は、
組換え豚痘ウイルスは、１つの外来遺伝子を発現する。膜貫通ドメインを欠くネコＣＤ８０遺伝子は、合成後期／前期ポックスプロモーターＬＰ２ＥＰ２の制御下にある。代替的には、膜貫通ドメインを欠くネコＣＤ８０遺伝子は、カルボキシル末端にヒスチジンタグ融合を有して、ニッケルアフィニティーカラムでの精製を可能にする。

組換え豚痘ウイルスは、外来遺伝子を発現する。膜貫通ドメインを欠くネコＣＤ２８遺伝子は、合成後期／前期ポックスプロモーターＬＰ２ＥＰ２の制御下にある。代替的には、膜貫通ドメインを欠くネコＣＤ２８遺伝子は、カルボキシル末端にヒスチジンタグ融合を有して、ニッケルアフィニティーカラムでの精製を可能にする。

組換え豚痘ウイルスは、１つの外来遺伝子を発現する。膜貫通ドメインを欠くネコＣＤ８６遺伝子は、合成後期／前期ポックスプロモーターＬＰ２ＥＰ２の制御下にある。代替的には、膜貫通ドメインを欠くネコＣＤ８６遺伝子は、カルボキシル末端にヒスチジンタグ融合を有して、ニッケルアフィニティーカラムでの精製を可能にする。

である。

ＣＤ８０およびＣＤ８６の両方を利用し、そしてネコ科でのＦＩＶおよびＦｅＬＶ疾病のためのワクチン開発に有用な組換え豚痘ウイルスの別の例は、
組換え豚痘ウイルスは、５つの外来遺伝子を発現する。ネコＣＤ８６遺伝子およびＣＤ８０遺伝子は、合成後期／前期ポックスプロモーターＬＰ１の制御下で、ビシストロン性カセット中で発現され、それによりＣＤ８０およびＣＤ８６の転写が起動され、そして２つの開放読取枠の間にＥＭＣＶ ＩＲＥＳ要素が含まれる。Ｅ．ｃｏｌｉ ｕｉｄＡ遺伝子は、合成前期ポックスプロモーターＥＰ２の制御下にある。ＦＩＶｇａｇ／プロテアーゼ遺伝子は、豚痘プロモーター０ＩＬの制御下にある。Ｅ．ｃｏｌｉ ｌａｃＺ遺伝子は、合成後期ポックスプロモーターＬＰ１の制御下にある。ネコＣＤ８０／ＣＤ８６およびＥ．ｃｏｌｉ ｕｉｄＡ遺伝子は、ＦＩＶｇａｇ／プロテアーゼおよびＥ．ｃｏｌｉ ｌａｃＺ遺伝子挿入から得られる、異なっており、そして区別できる非必須ＳＰＶ挿入部位に含まれる。

組換え豚痘ウイルスは、５つの外来遺伝子を発現する。ネコＣＤ８６遺伝子およびＣＤ８０遺伝子は、合成後期／前期ポックスプロモーターＬＰ１の制御下で、ビシストロン性カセット中で発現され、それによりＣＤ８０およびＣＤ８６の転写が起動され、そして２つの開放読取枠の間にＥＭＣＶ ＩＲＥＳ要素が含まれる。Ｅ．ｃｏｌｉ ｌａｃＺ遺伝子は、合成後期ポックスプロモーターＬＰ１の制御下にある。ＦＩＶエンベロープ遺伝子は、合成前期ポックス・アンダープロモーターＥＰ１の制御下にある。

Ｅ．ｃｏｌｉ ｕｉｄＡ遺伝子は、合成後期ポックスプロモーターＬＰ１の制御下にある。ＣＤ８０／ＣＤ８６およびＥ．ｃｏｌｉ ｕｉｄＡ遺伝子は、ＦＩＶｇａｇ／プロテアーゼおよびＥ．ｃｏｌｉ ｌａｃＺ遺伝子挿入から得られる、異なっており、そして区別できる非必須ＳＰＶ挿入部位に含まれる。

組換え豚痘ウイルスは、６つの外来遺伝子を発現する。ネコＣＤ８６遺伝子およびＣＤ８０遺伝子は、合成後期ポックスプロモーターＬＰ１の制御下で、ビシストロン性カセット中で発現され、それによりＣＤ８０およびＣＤ８６の転写が起動され、そして２つの開放読取枠の間にＥＭＣＶ ＩＲＥＳ要素が含まれる。Ｅ．ｃｏｌｉ ｕｉｄＡ遺伝子は、合成前期ポックスプロモーターＥＰ２の制御下にある。ＦＩＶｇａｇ／プロテアーゼ遺伝子は、合成前期ポックスプロモーターＥＰ２の制御下にある。ＦＩＶエンベロープ遺伝子は、合成前期ポックスプロモーターＥＰ１の制御下にある。Ｅ．ｃｏｌｉ ｌａｃＺ遺伝子は、構造的１５Ｌポックスプロモーターの制御下にある。ＣＤ８０／ＣＤ８６、およびＥ．ｃｏｌｉ ｕｉｄＡ遺伝子は、ＦＩＶエンベロープの挿入、ＦＩＶｇａｇ／プロテアーゼおよびＥ．ｃｏｌｉ ｌａｃＺ遺伝子挿入と異なった部位に挿入される。

である。

ネコ科でのＦｅＬＶワクチン用途の別の組換え豚痘ウイルスは、上に記述されるとおり構築され、それにより、ＦＩＶ遺伝子を比較できるＦｅＬＶ遺伝子構築物に変える。

（例１１）
ネコ免疫不全ウイルス（ＦＩＶ）、ネコ白血病ウイルス（ＦｅＬＶ）、またはネコ感染性腹膜炎（ＦＩＰ）に対するワクチンとして有用な組換えアライグマ痘ウイルスの別の例は：
組換えアライグマ痘ウイルスは、２つの外来遺伝子を発現する。ネコＣＤ８０は、合成後期／前期ポックスプロモーターＬＰ２ＥＰ２の制御下にある。Ｅ．ｃｏｌｉ ｌａｃＺ遺伝子は、後期ポックスプロモーターＬ１の制御下にある。

ワクチンとして使用するための、またはポリクローナル抗体産生および精製のためのタンパク質の産生に有用な組換えアライグマ痘ウイルスの別の例。

組換えアライグマ痘ウイルスは、１つの外来遺伝子を発現する。膜貫通ドメインを欠くネコＣＤ８０遺伝子は、合成後期／前期ポックスプロモーターＬＰ２ＥＰ２の制御下にある。代替的には、膜貫通ドメインを欠くネコＣＤ８０遺伝子は、カルボキシル末端にヒスチジンタグ融合を有して、ニッケルアフィニティーカラム上で精製させる。

組換えアライグマ痘ウイルスは、１つの外来遺伝子を発現する。膜貫通ドメインを欠くネコＣＤ２８遺伝子は、合成後期／前期ポックスプロモーターＬＰ２ＥＰ２の制御下にある。代替的には、膜貫通ドメインを欠くネコＣＤ２８遺伝子は、カルボキシル末端にヒスチジンタグ融合を有して、ニッケルアフィニティーカラム上で精製させる。

組換えアライグマ痘ウイルスは、１つの外来遺伝子を発現する。膜貫通ドメインを欠くネコＣＤ８６遺伝子は、合成後期／前期ポックスプロモーターＬＰ２ＥＰ２の制御下にある。代替的には、膜貫通ドメインを欠くネコＣＤ８６遺伝子は、カルボキシル末端にヒスチジンタグ融合を有して、ニッケルアフィニティーカラム上で精製させる。

組換えアライグマ痘ウイルスは、４つの外来遺伝子を発現する。ネコＣＤ８６遺伝子およびＣＤ８０遺伝子は、合成後期／前期ポックスプロモーターＬＰ２ＥＰ２の制御下で、ビシストロン性カセット中で発現され、それによりＣＤ８０およびＣＤ８６の転写が起動され、そして第二の下流遺伝子ＣＤ８０の翻訳を起動する２つの開放読取枠の間にＥＭＣＶ ＩＲＥＳ要素が含まれる。ＦＩＶｇａｇ遺伝子は、豚痘プロモーター０ＩＬの制御下にある。Ｅ．ｃｏｌｉ ｕｉｄＡ遺伝子は、合成前期ポックスプロモーターＥ２の制御下にある。

組換えアライグマ痘ウイルスは、４つの外来遺伝子を発現する。ネコＣＤ８６遺伝子およびＣＤ８０遺伝子は、合成後期／前期ポックスプロモーターＬＰ２ＥＰ２の制御下で、ビシストロン性カセット中で発現され、それによりＣＤ８０およびＣＤ８６の転写が起動され、そして第二の下流遺伝子ＣＤ８０の翻訳を起動する２つの開放読取枠の間にＥＭＣＶ ＩＲＥＳ要素が含まれる。ＦＩＶエンベロープ遺伝子は、合成前期ポックスプロモーターＥ１の制御下にある。Ｅ．ｃｏｌｉ ｕｉｄＡ遺伝子は、合成前期ポックスプロモーターＥＰ２の制御下にある。

組換えアライグマ痘ウイルスは、５つの外来遺伝子を発現する。ネコＣＤ８６遺伝子およびＣＤ８０遺伝子は、合成後期／前期ポックスプロモーターＬＰ２ＥＰ２の制御下で、ビシストロン性カセット中で発現され、それによりＣＤ８０およびＣＤ８６の転写が起動され、そして第二の下流遺伝子ＣＤ８０の翻訳を起動する２つの開放読取枠の間にＥＭＣＶ ＩＲＥＳ要素が含まれる。ＦＩＶｇａｇ遺伝子は、豚痘プロモーター０ＩＬの制御下にある。ＦＩＶエンベロープ遺伝子は、合成前期ポックスプロモーターＥＰ１の制御下にある。Ｅ．ｃｏｌｉ ｕｉｄＡ遺伝子は、合成前期ポックスプロモーターＥＰ２の制御下にある。

である。

ネコ免疫不全ウイルス（ＦＩＶ）、ネコ白血病ウイルス（ＦｅＬＶ）またはネコ感染性腹膜炎（ＦＩＰ）のようなネコ疾病に対するワクチンとして有用な組換えアライグマ痘ウイルスの別の例は、
組換えアライグマ痘ウイルスは、２つの外来遺伝子を発現する。ネコＣＤ８６遺伝子は、合成後期／前期ポックスプロモーターＬＰ２ＥＰ２の制御下にある。Ｅ．ｃｏｌｉ ｌａｃＺ遺伝子は、合成後期ポックスプロモーターＬＰ１の制御下にある
である。

ＣＤ８０およびＣＤ８６の両方を利用し、ネコ科におけるＦＩＶおよびＦｅＬＶ疾病のためのワクチン開発に有用である、組換えアライグマ痘ウイルスの別の例は、
組換えアライグマ痘ウイルスは、４つの外来遺伝子を発現する。ネコＣＤ８６遺伝子およびＣＤ８０遺伝子は、合成後期ポックスプロモーターＬＰ１の制御下で、ビシストロン性カセット中で発現され、それによりＣＤ８０およびＣＤ８６の転写が起動され、そして２つの開放読取枠の間にＥＭＣＶ ＩＲＥＳ要素が含まれる。ＦＩＶｇａｇ／プロテアーゼ遺伝子は、合成後期／前期ポックスプロモーターＬＰ２ＥＰ２の制御下にある。Ｅ．ｃｏｌｉ ｕｉｄＡ遺伝子は、合成前期ポックスプロモーターＥＰ２の制御下にある。Ｅ．ｃｏｌｉ ｌａｃＺ遺伝子は、合成前期ポックスプロモーターＬＰ２の制御下にある。ＣＤ８０／ＣＤ８６、ＦＩＶｇａｇ／プロテアーゼ遺伝子は、全て、単独の非必須ＲＰＶ部位に挿入される。

組換えアライグマ痘ウイルスは、４つの外来遺伝子を発現する。ネコＣＤ８６遺伝子およびＣＤ８０遺伝子は、合成後期／前期ポックスプロモーターＬＰ２の制御下で、ビシストロン性カセット中で発現され、それによりＣＤ８０およびＣＤ８６の転写が起動され、そして２つの開放読取枠の間にＥＭＣＶ ＩＲＥＳ要素が含まれる。Ｅ．ｃｏｌｉ ｌａｃＺ遺伝子は、合成前期ポックスプロモーターＥ１の制御下にある。Ｅ．ｃｏｌｉ ｕｉｄＡ遺伝子は、合成前期ポックスプロモーターＥ２の制御下にある。ＣＤ８０／ＣＤ８６、ＦＩＶエンベロープおよびｕｉｄＡ遺伝子は、全て、単独の非必須ＲＰＶ部位に挿入される。

組換えアライグマ痘ウイルスは、６つの外来遺伝子を発現する。ネコＣＤ８６遺伝子およびＣＤ８０遺伝子は、合成後期ポックスプロモーターＬＰ１の制御下で、ビシストロン性カセット中で発現され、それによりＣＤ８０およびＣＤ８６の転写が起動され、そして２つの開放読取枠の間にＥＭＣＶＩＲＩＳ要素が含まれる。Ｅ．ｃｏｌｉ ｌａｃＺ遺伝子は、合成後期ポックスプロモーターの制御下にある。Ｅ．ｃｏｌｉ ｕｉｄＡ遺伝子は、合成前期ポックスプロモーターＥ２の制御下にある。ＦＩＶｇａｇ／プロテアーゼ遺伝子は、合成前期プロモーターＥＰ２の制御下にある。ＦＩＶエンベロープ遺伝子は、合成前期ポックスプロモーターＥＰ２の制御下にある。ＦＩＶエンベロープ遺伝子は、合成前期ポックスプロモーターＥＰＩの制御下にある。Ｅ．ｃｏｌｉ ｕｉｄＡ遺伝子は、Ｅ．ｃｏｌｉ ｌａｃＺ遺伝子の制御下にあり、ＦＩＶエンベロープの挿入、ＦＩＶｇａｇ／プロテアーゼおよびＥ．ｃｏｌｉ ｕｉｄＡ遺伝子挿入から異なる部位に挿入される。

である。

ネコ科についてのＦｅＬＶワクチンとして使用するための別のアライグマ痘組換えウイルスは、上に記述されるとおり構築され、それによりＦＩＶ遺伝子を比較に値するＦｅＬＶ遺伝子に置換される。

（例１２）
Ｓ−ＦＨＶ−０２０：
Ｓ−ＦＨＶ−０２０は、全ＦＨＶｇＥ遺伝子（１６３８塩基対）の欠失を示す組換えネコヘルペスウイルスである。Ｅ．ｃｏｌｉ ｌａｃＺ遺伝子の挿入は、ｇＥ部位を欠失させる。Ｅ．ｃｏｌｉ ｌａｃＺ遺伝子は、構造的ＦＨＶｇＥプロモーターの転写制御下にある。

Ｓ−ＳＰＶ−０２０は、Ｓ−ＦＨＶ−００１（ＮＶＳＬ菌株）から誘導された。これは、「組換えＲＰＶ、ＳＰＶまたはＦＨＶを生成するための相同な組換え手段」で相同ベクター４８６−８８．Ｂ１７およびウイルスＳ−ＦＨＶ−００１を利用して達成された。形質移入保存物を、「β−ガラクトシダーゼ（ブルーガルおよびＣＰＲＧアッセイ）またはβ−ガラクトシダーゼ（Ｘ−ＧＬＵＣアッセイ）を発現する組換えＲＰＶまたはＳＰＶまたはＦＨＶ用のスクリーン」によってスクリーニングした。青色プラーク精製の最終結果は、Ｓ−ＦＪＶ−０２０と表される組換えウイルスであった。純度の分析、および５継代後の挿入安定性を、「黒色プラークアッセイを用いた組換えＲＰＶ、ＳＰＶまたはＦＨＶ中での外来遺伝子発現用のスクリーン」中でのβ−ガラクトシダーゼの検出を介して行った。

（例１３）
Ｓ−ＦＨＶ−０３１：
Ｓ−ＦＨＶ−０３１は、全１６３８塩基対ＦＨＶｇＥ遺伝子の欠失を示し、そしてｇＥ欠失部位に３つの外来遺伝子の挿入を示す組換えネコヘルペスウイルスである。ＣＤ８０遺伝子は、構造的ＦＨＶｇＥプロモーターの転写制御下にあり、欠失ｇＥ遺伝子として同じ方向に向けられる。ＦＩＶｇａｇ／プロテアーゼ遺伝子は、偽狂犬病ｇＸプロモーターの制御下にあり、ＦＩＶエンベロープ遺伝子は、サイトメガロウイルス即時型プロモーターの制御下にある。ｇａｇ／プロテアーゼおよびエンベロープ遺伝子は、互いに関して同じ方向に向けられるが、しかしＣＤ８０遺伝子に対する配向で対峙する。

Ｓ−ＦＨＶ−０３１は、Ｓ−ＦＨＶ−０２０（ｇＥプロモーターの後ろにＥ．ｃｏｌｉ ＬａｃＺ遺伝子を含む）から誘導される。これは、「相同な組換えＲＰＶ、ＳＰＶまたはＦＨＶ」で相同ベクター９４２−０３．Ｘ６（「材料および方法」参照）およびウイルスＳ−ＦＨＶ−０２０を利用して達成される。形質移入保存物を、「β−ガラクトシダーゼ（ブルーガルおよびＣＰＲＧアッセイ）またはβ−ガラクトシダーゼ（Ｘ−ＧＬＵＣアッセイ）を発現する組換えＲＰＶまたはＳＰＶまたはＦＨＶ発現用のスクリーン」によってスクリーニングする。組換えプラークを選択し、そして白色プラーク選択によって精製する。このウイルスは、制限エンドヌクレアーゼマッピングおよび「サザンブロッティングＤＮＡ」手段によって特徴付けられる。この分析では、ネコＣＤ８０、ＦＩＶ／プロテアーゼおよびＦＩＶエンベロープ遺伝子の挿入、および１６３８塩基対のＦＩＶｇＥ遺伝子の欠失を確認される。（ＰＣＴ国際出願ＷＯ９６／１３５７５は、参照してここに組込まれる）。

「ウエスタンブロッティング手段」を用いて、本実施例でのＳ−ＦＨＶ−０３１を、ネコＣＤ８０、ＦＩＶｇａｇ／プロテアーゼおよびＦＩＶエンベロープ特異的抗原の発現について分析する。ここに記述されるアッセイは、ＣＲＦＫ細胞中で行われ、それにより、ＣＲＦＫ細胞が、ＦＨＶ組換えワクチンの産生に適切な基質であることが示された。組換えネコヘルペスウイルスに感染した細胞から得られる溶解液は、ネコＣＤ８０タンパク質の予測サイズでハンドを示した。

「黒色プラークアッセイを用いた組換えＳＰＶ、ＲＰＶまたはＦＨＶ中でのネコＣＤ８０（ｂ７−１）およびＣＤ８６（Ｂ７−２）発現用のスクリーン」を用いて、本実施例でのＳ−ＦＨＶ−０３１ｉｎを、ネコＣＤ８０特異的抗原の発現について分析する。ヒトＣＴＬＡ−４／Ｆｃキメラ抗体は、組換えネコ・ヘルペスウイルス・プラーク（ネコＣＤ８０を発現する）と特異的に反応するが、ＳＦＨＶ−００１負の対照プラークとは反応しないことが示された。全組換えネコ・ヘルペスウイルス観察プラークは、ヒトＣＴＬＡ−４／Ｆｃキメラ抗体と作用することが示され、それによりウイルスは、ネコＣＤ８０外来遺伝子を安定に発現することが示される。

Ｓ−ＦＨＶ−０３１は、ＦＩＶｇａｇ／プロテアーゼを発現する組換えネコ・ヘルペスウイルスである。ＦＩＶエンベロープおよびネコＣＤ８０タンパク質は、ＦＩＶ感染に対するネコ科におけるワクチンとして有用である。

（例１４）
組換えネコ・ヘルペスウイルスは、ｇＥ遺伝子の欠失、およびｇＥ欠失部位での少なくとも１つの外来遺伝子の挿入を示す。外来遺伝子は、ネコＣＤ８６遺伝子であり、そしてＦＨＶｇＥプロモーターの転写制御下にある。

ネコＣＤ８６を発現する組換えネコ・ヘルペスウイルスは、ネコ科における疾病に対するワクチンとして有用である。組換えネコヘルペスウイルスは、単独で、またはＦＩＶ、ＦｅＬＶ、ＦＩＰまたは他のネコワクチンとの組合せで使用されるときに、ＦＩＶ、ＦｅＬＶ、ＦＩＰまたは他のネコ疾病に対するワクチンの効力を改善する。

（例１５）
ネコ免疫不全ウイルス（ＦＩＶ）、ネコ白血病ウイルス（ＦｅＬＶ）またはネコ感染性腹膜炎（ＦＩＰ）に対するワクチンとして有用な組換えネコ・ヘルペスウイルスの別の例は、
組換えネコ・ヘルペスウイルスは、ＦＨＶ ｇＥ欠失部位で３つの外来遺伝子を発現する。ＦｅＬＶｅｎｖ遺伝子は、偽狂犬病ｇＸプロモーターの制御下にある。ＦＩＶｇａｇ遺伝子は、サイトメガロウイルス即時型プロモーターの制御下にある。ネコＣＤ８０遺伝子は、ネコ・ヘルペスウイルスｇＥプロモーターの制御下にある。組換えネコ・ヘルペスウイルスは、ＦＨＶｇＥ欠失部位で３つの外来遺伝子を発現する。ＦｅＬＶｅｎｖ遺伝子は、偽狂犬病ｇＸプロモーターの制御下にある。ＦＩＶｇａｇ遺伝子は、サイトメガロウイルス即時型プロモーターの制御下にある。ネコＣＤ８６遺伝子は、ネコ・ヘルペスウイルスｇＥプロモーターの制御下にある。組換えネコ・ヘルペスウイルスは、ＦＨＶｇＥ欠失部位で３つの外来遺伝子を発現する。ＦｅＬＶｅｎｖ遺伝子は、偽狂犬病ｇＸプロモーターの制御下にある。ＦＩＶｇａｇ遺伝子は、サイトメガロウイルス即時型プロモーターの制御下にある。ネコＣＤ８６遺伝子は、ネコ・ヘルペスウイルスｇＥプロモーターの制御下にある。

組換えネコ・ヘルペスウイルスは、５つの外来遺伝子を発現する。ネコＣＤ８６遺伝子およびＣＤ８０遺伝子は、サイトメガロウイルス即時型ポックスプロモーターの制御下で、ビシストロン性カセット中で発現され、それによりＣＤ８０およびＣＤ８６の転写が起動され、そして２つの開放読取枠の間にＥＭＣＶ ＩＲＥＳ要素が含まれる。Ｅ．ｃｏｌｉ ｕｉｄＡ遺伝子は、感染性喉頭気管炎ウイルスｇｌプロモーターの制御下にある。ＣＤ８０、ＣＤ８６およびＥ．ｃｏｌｉ ｕｉｄＡ遺伝子は、非必須であると決定された部位中のＦＨＶゲノムの特徴的な長い領域に挿入される。ＦＩＶｇａｇ／プロテアーゼ遺伝子は、サイトメガロウイルス即時型プロモーターの制御下にあり、そして偽狂犬病ｇＸプロモーターの制御下にあるＥ．ｃｏｌｉ ＬａｃＺ遺伝子は、ＦＨＶｇＥ欠失部位に向けられる。

組換えネコ・ヘルペスウイルスは、５つの外来遺伝子を発現する。ネコＣＤ８６遺伝子およびＣＤ８０遺伝子は、サイトメガロウイルス即時型ポックスプロモーターの制御下で、ビシストロン性カセット中で発現され、それによりＣＤ８０およびＣＤ８６の転写が起動される。第二の下流ＣＤ８０開放読取枠の翻訳は、ＥＭＣＶ ＩＲＥＳ要素の制御下にある。Ｅ．ｃｏｌｉ ｕｉｄＡ遺伝子は、感染性喉頭気管炎ウイルスｇＩプロモーターの制御下にある。ＣＤ８０、ＣＤ８６およびＥ．ｃｏｌｉ ｕｉｄＡ遺伝子は、非必須であると決定された部位中のＦＨＶゲノムの特徴的な長い領域に挿入される。ＦＩＶエンベロープ遺伝子は、サイトメガロウイルス即時型プロモーターの制御下にあり、そして偽狂犬病ｇＸプロモーターの制御下にあるＥ．ｃｏｌｉ ｌａｃＺ遺伝子は、ＦＨＶｇＥ欠失部位に向けられる。

組換えネコ・ヘルペスウイルスは、６つの外来遺伝子を発現する。ネコＣＤ８６遺伝子およびＣＤ８０遺伝子は、サイトメガロウイルス即時型ポックスプロモーターの制御下で、ビシストロン性カセット中で発現され、それによりＣＤ８０およびＣＤ８６の転写が起動され、そして２つの開放読取枠の間にＥＭＣＶ ＩＲＥＳ要素が含まれる。Ｅ．ｃｏｌｉ ｕｉｄＡ遺伝子は、感染性喉頭気管炎ウイルスｇＩプロモーターの制御下にある。ＣＤ８０、ＣＤ８６およびＥ．ｃｏｌｉ ｕｉｄＡ遺伝子は、非必須部位中のＦＨＶゲノムの特徴的な長い試薬(reagent)に挿入される。ＦＩＶエンベロープ遺伝子は、サイトメガロウイルス即時型プロモーターの制御下にある。狂犬病ｇＸプロモーターの制御下にあるＦＩＶｇａｇ／プロテアーゼ遺伝子、およびＦＨＶｇＥプロモーターの制御下にあるＥ．ｃｏｌｉ ｌａｃＺ遺伝子は、ＦＨＶｇＥ欠失部位に向けられる。

組換えネコ・ヘルペスウイルスは、５つの外来遺伝子を発現する。ネコＣＤ８６遺伝子およびＣＤ８０遺伝子は、サイトメガロウイルス即時型ポックスプロモーターの制御下で、ビシストロン性カセット中で発現され、それによりＣＤ８０およびＣＤ８６の転写が起動され、そして２つの開放読取枠の間にＥＭＣＶ ＩＲＥＳ要素が含まれる。Ｅ．ｃｏｌｉ ｕｉｄＡ遺伝子は、感染性喉頭気管炎ウイルスｇＩプロモーターの制御下にある。ＣＤ８０、ＣＤ８６およびＥ．ｃｏｌｉ ｕｉｄＡ遺伝子は、非必須部位中のＦＨＶゲノムの特徴的な長い領域に挿入される。サイトメガロウイルス即時型プロモーターの制御下にあるＦＩＶｇａｇ／プロテアーゼ遺伝子、および狂犬病ｇＸプロモーターの制御下にあるＥ．ｃｏｌｉ ｌａｃＺ遺伝子は、ＦＨＶｇＥ欠失部位に挿入される。

組換えネコ・ヘルペスウイルスは、５つの外来遺伝子を発現する。ネコＣＤ８６遺伝子およびＣＤ８０遺伝子は、サイトメガロウイルス即時型ポックスプロモーターの制御下で、ビシストロン性カセット中で発現され、それによりＣＤ８０およびＣＤ８６の転写が起動さる。第二の下流ＣＤ８０開放読取枠の翻訳は、ＥＭＣＶ ＩＲＥＳ要素の制御下にある。Ｅ．ｃｏｌｉ ｕｉｄＡ遺伝子は、感染性喉頭気管炎ウイルスｇＩプロモーターの制御下にある。ＣＤ８０、ＣＤ８６およびＥ．ｃｏｌｉ ｕｉｄＡ遺伝子は、非必須部位中のＦＨＶゲノムの特徴的な長い領域に挿入される。サイトメガロウイルス即時型プロモーターの制御下にあるＦｅＬＶエンベロープ遺伝子、および狂犬病ｇＸプロモーターの制御下にあるＥ．ｃｏｌｉ ｌａｃＺ遺伝子は、ＦＨＶｇＥ欠失部位に挿入される。

組換えネコ・ヘルペスウイルスは、６つの外来遺伝子を発現する。ネコＣＤ８６遺伝子およびＣＤ８０遺伝子は、サイトメガロウイルス即時型ポックスプロモーターの制御下で、ビシストロン性カセット中で発現され、それによりＣＤ８０およびＣＤ８６の転写が起動され、そして２つの開放読取枠の間にＥＭＣＶ ＩＲＥＳ要素が含まれる。Ｅ．ｃｏｌｉ ｕｉｄＡ遺伝子は、感染性喉頭気管炎ウイルスｇＩプロモーターの制御下にある。ＣＤ８０、ＣＤ８６およびＥ．ｃｏｌｉ ｕｉｄＡ遺伝子は、非必須部位中のＦＨＶゲノムの特徴的な長い領域に挿入される。サイトメガロウイルス即時型プロモーターの制御下にあるＦＩＶエンベロープ遺伝子、狂犬病ｇＸプロモーターの制御下にあるＦｅＬＶ／プロテアーゼ遺伝子、およびＦＨＶｇＥプロモーターの制御下にあるＥ．ｃｏｌｉ ｌａｃＺ遺伝子は、ＦＨＶｇＥ欠失部位に挿入される。

である。

（例１７）
組換えネコ・ヘルペスウイルスは、ｇＥ欠失部位にｇＥ遺伝子の欠失、および少なくとも１つの外来遺伝子の挿入を示す。外来遺伝子は、ネコＣＤ８０遺伝子であり、そしてＦＨＶｇＥプロモーターの転写制御下にある：
組換えネコ・ヘルペスウイルスは、ＦＨＶ−００１から誘導される。これは、「組換えヘルペスウイルスを生成するための相同な組換え手段」で相同ベクター９２６−７６．Ｄ７（「材料および方法」参照）およびウイルスＳ−ＦＨＶ−００１を利用して達成される。形質移入保存物を、「酵素的マーカー遺伝子を発現する組換えヘルペスウイルス用のスクリーン」によってスクリーニングする。このウイルスは、制限エンドヌクレアーゼマッピングおよび「サザンブロッティングＤＮＡ」手段によって特徴付けられる。この分析では、ネコＣＤ８０の挿入、および１６８３塩基対のＦＨＶｇＥ遺伝子の欠失を確認される。（ＰＣＴ国際出願ＷＯ９６／１３５７５は、参照してここに組込まれる）。

「組換えＦＨＶ中の外来遺伝子発現用の黒色プラークスクリーン」を用いて、本実施例での組換えネコ・ヘルペスウイルスを、ネコＣＤ８０特異的抗原の発現について分析する。ここに記述されるアッセイは、ＣＲＦＫ細胞で行われ、それによりＣＲＦＫ細胞は、ＲＰＶ組換えワクチンの産生に適切な基質であることが示された。

「黒色プラークアッセイを用いた組換えＳＰＶ、ＲＰＶまたはＦＨＶでのネコＣＤ８０（Ｂ７−１）およびＣＤ８６（Ｂ７−２）発現用のスクリーン」を使用して、本実施例での組換えネコ・ヘルペスウイルスを、ネコＣＤ８０特異的抗原の発現について分析する。ヒトＣＴＬＡ−４／Ｆｃキメラ抗体は、組換えネコ・ヘルペスウイルス・プラーク（ネコＣＤ８０を発現する）と特異的に反応するが、Ｓ−ＦＨＶ−００１負の対照プラークとは反応しないことが示される。全組換えネコ・ヘルペスウイルスで観察されるプラークは、ヒトＣＴＬＡ−４／Ｆｅキメラ抗体と反応することが示され、それによりそのウイルスは、ネコＣＤ８０外来遺伝子を安定に発現していることが示される。

である。

ネコＣＤ８０遺伝子産物の発現を確認するために、細胞を、本実施例の組換えネコ・ヘルペスウイルスで感染させ、そして感染細胞溶解液のサンプルを、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動に掛けた。ゲルを、ブロットにかけ、そして「ウエスタン・ブロッティング手段」を用いて分析する。組換えネコ・ヘルペスウイルスで感染した細胞からえられる溶解液は、のネコＣＤ８０タンパク質の予想されるサイズでバンドを示した。

（例１８）
組換えネコヘルペスウイルスは、ｇＥ遺伝子の欠失、およびｇＥ欠失部位に少なくとも１つの外来遺伝子の挿入を示す。外来遺伝子は、ネコＣＤ８０遺伝子であり、そしてＦＨＶｇＥプロモーターの転写制御下にある：
ネコＣＤ８６を発現する組換えネコ・ヘルペスウイルスは、ネコ科での疾病に対するワクチンとして有用である。組換えネコ・ヘルペスウイルスは、単独で、またはＦＩＶ、ＦｅＬＶ、ＦＩＰまたは他のネコワクチンと組合わせて使用される場合、ＦＩＶ、ＦｅＬＶ、ＦＩＰまたは他のネコ疾病に対するワクチンの効力を改善する。

（例１９）
ネコ免疫不全ウイルス（ＦＩＶ）、ネコ白血病ウイルス（ＦｅＬＶ）またはネコ感染性腹膜炎（ＦＩＰ）に対するワクチンとして有用な組換えネコ・ヘルペスウイルスの別の例は：
組換えネコ・ヘルペスウイルスは、３つの外来遺伝子を発現する。ＦＩＶｅｎｖ遺伝子は、偽狂犬病ｇＸプロモーターの制御下にある。ＦＩＶｇａｇ遺伝子は、サイトメガロウイルス即時型プロモーターの制御下にある。ネコＣＤ８０遺伝子は、ネコ・ヘルペスウイルスｇＥプロモーターの制御下にある。

組換えネコ・ヘルペスウイルスは、３つの外来遺伝子を発現する。ＦｅＬＶｅｎｖ遺伝子は、偽狂犬病ｇＸプロモーターの制御下にある。ＦｅＬＶｇａｇ遺伝子は、サイトメガロウイルス即時型プロモーターの制御下にある。ネコＣＤ８０遺伝子は、ネコ・ヘルペスウイルスｇＥプロモーターの制御下にある。

組換えネコ・ヘルペスウイルスは、３つの外来遺伝子を発現する。ＦＩＶｅｎｖ遺伝子は、偽狂犬病ｇＸプロモーターの制御下にある。ＦＩＶｇａｇ遺伝子は、サイトメガロウイルス即時型プロモーターの制御下にある。ネコＣＤ８６遺伝子は、ネコ・ヘルペスウイルスｇＥプロモーターの制御下にある。

組換えネコ・ヘルペスウイルスは、３つの外来遺伝子を発現する。ＦｅＬＶｅｎｖ遺伝子は、偽狂犬病ｇＸプロモーターの制御下にある。ＦｅＬＶｇａｇ遺伝子は、サイトメガロウイルス即時型プロモーターの制御下にある。ネコＣＤ８６遺伝子は、ネコ・ヘルペスウイルスｇＥプロモーターの制御下にある。

組換えネコ・ヘルペスウイルスは、５つの外来遺伝子を発現する。ネコＣＤ８６遺伝子およびＣＤ８０遺伝子は、サイトメガロウイルス即時型ポックスプロモーターの制御下で、ビシストロン性カセット中で発現され、それによりＣＤ８０およびＣＤ８６の転写が起動され、そして第二の下流遺伝子ＣＤ８０の起動する２つの開放読取枠の間にＥＭＣＶ ＩＲＥＳ要素が含まれる。Ｅ．ｃｏｌｉ ｕｉｄＡ遺伝子は、感染性喉頭気管炎ウイルスｇｌプロモーターの制御下にある。ＦＩＶｇａｇ遺伝子は、サイトメガロウイルス即時型プロモーターの制御下にある。Ｅ．ｃｏｌｉ ｌａｃＺ遺伝子は、偽狂犬病ｇＸプロモーターの制御下にある。５つの外来遺伝子は、２つの別々のネコ・ヘルペスウイルス挿入部位に含まれる。

組換えネコ・ヘルペスウイルスは、５つの外来遺伝子を発現する。ネコＣＤ８６遺伝子およびＣＤ８０遺伝子は、サイトメガロウイルス即時型ポックスプロモーターの制御下で、ビシストロン性カセット中で発現され、それによりＣＤ８０およびＣＤ８６の転写が起動さる。第二の下流遺伝子ＣＤ８０の開放読取枠の翻訳は、ＥＭＣＶ ＩＲＥＳ要素の制御下にある。Ｅ．ｃｏｌｉ ｕｉｄＡ遺伝子は、感染性喉頭気管炎ウイルスｇｌプロモーターの制御下にある。ＦＩＶエンベロープ遺伝子は、サイトメガロウイルス即時型プロモーターの制御下にある。Ｅ．ｃｏｌｉ ｌａｃＺ遺伝子は、偽狂犬病ｇＸプロモーターの制御下にある。ネコＣＤ８６遺伝子およびＣＤ８０遺伝子は、サイトメガロウイルス即時型ポックスプロモーターの制御下で、ビシストロン性カセット中で発現され、それによりＣＤ８０およびＣＤ８６の転写が起動され、そして２つの開放読取枠の間のＥＭＣＶ ＩＲＥＳ要素が含まれ、第二の下流遺伝子ＣＤ８０の翻訳が起動される。Ｅ．ｃｏｌｉ ｕｉｄＡ遺伝子は、感染性喉頭気管炎ウイルスｇＩプロモーターの制御下にある。ＦＩＶｇａｇ遺伝子は、サイトメガロウイルス即時型プロモーターの制御下にある。ＦＩＶエンベロープ遺伝子は、サイトメガロウイルス即時型プロモーターの制御下にある。Ｅ．ｃｏｌｉ ｌａｃＺ遺伝子は、偽狂犬病ｇＸプロモーターの制御下にある。

組換えネコ・ヘルペスウイルスは、５つの外来遺伝子を発現する。ネコＣＤ８６遺伝子およびＣＤ８０遺伝子は、サイトメガロウイルス即時型ポックスプロモーターの制御下で、ビシストロン性カセット中で発現され、それによりＣＤ８０およびＣＤ８６の転写が起動され、そして第二の下流遺伝子ＣＤ８０の翻訳を起動する２つの開放読取枠の間にＥＭＣＶ ＩＲＥＳ要素が含まれる。Ｅ．ｃｏｌｉ ｕｉｄＡ遺伝子は、感染性喉頭気管炎ウイルスｇＩプロモーターの制御下にある。ＦＩＶｇａｇ遺伝子は、サイトメガロウイルス即時型プロモーターの制御下にある。Ｅ．ｃｏｌｉ ｌａｃＺ遺伝子は、偽狂犬病ｇＸプロモーターの制御下にある。５つの外来遺伝子は、２つの異なるネコ・ヘルペスウイルス挿入部位に含まれる。

組換えネコ・ヘルペスウイルスは、５つの外来遺伝子を発現する。ネコＣＤ８６遺伝子およびＣＤ８０遺伝子は、サイトメガロウイルス即時型ポックスプロモーターの制御下で、ビシストロン性カセット中で発現され、それによりＣＤ８０およびＣＤ８６の転写が起動される。第二の下流ＣＤ８０開放読取枠の翻訳は、ＥＭＣＶ ＩＲＥＳ要素の制御下にある。Ｅ．ｃｏｌｉ ｕｉｄＡ遺伝子は、感染性喉頭気管炎ウイルスｇＩプロモーターの制御下にある。ＦｅＬＶエンベロープ遺伝子は、サイトメガロウイルス即時型プロモーターの制御下にある。Ｅ．ｃｏｌｉ ｕｉｄＡ遺伝子は、狂犬病ｇＸプロモーターの制御下にある。

組換えネコ・ヘルペスウイルスは、６つの外来遺伝子を発現する。ネコＣＤ８６遺伝子およびＣＤ８０遺伝子は、サイトメガロウイルス即時型ポックスプロモーターの制御下で、ビシストロン性カセット中で発現され、それによりＣＤ８０およびＣＤ８６の転写が起動され、そして２つの開放読取枠の間にＥＭＣＶ ＩＲＥＳ要素が含まれ、第二の下流遺伝子の翻訳が起動される。Ｅ．ｃｏｌｉ ｕｉｄＡ遺伝子は、感染性喉頭気管炎ウイルスｇＩプロモーターの制御下にある。ＦｅＬＶｇａｇ遺伝子は、サイトメガロウイルス即時型プロモーターの制御下にある。ＦｅＬＶエンベロープ遺伝子は、サイトメガロウイルス即時型プロモーターの制御下にある。Ｅ．ｃｏｌｉ ｌａｃＺ遺伝子は、狂犬病ｇＸプロモーターの制御下にある。

である。

（例２０）
ネコＣＤ８０（Ｂ７−１）−ＴＡＭＵ、ＣＤ８６（Ｂ７−２）、ＣＤ２８、ＣＴＬＡ−４およびＣＤ８０（Ｂ７−１）−シントロ／ＳＰＡＨｃＤＮＡおよびポリペプチドの特徴付け：
およそ９４１ヌクレオチドの単離および精製されたネコＣＤ８０（Ｂ７−１）ｃＤＮＡは、およそ２９２アミノ酸のネコＣＤ８０ポリペプチドの開放読取枠をコードし、その生来の膜結合形態または成熟形態は、約３３，４８５ｋＤａの分子量、約９．１の等電点、１０．２４のｐＨ７・０での総荷電を示す。膜貫通ドメインのタンパク質は、アミノ酸およそ２４１から２７１である。

ネコＣＤ８０−ＴＡＭＵおよびＣＤ８０−シントロ／ＳＰＡＨは、２つの異なる源から独立して単離されるｃＤＮＡおよびポリペプチドであり、そしてＤＮＡおよびアミノ酸配列は、わずかに異なる。ＣＤ８０−ＴＡＭＵ ｍＲＮＡの源は、ＣｏｎＡで刺激されるネコ末梢血単核細胞であり、そしてＣＤ８０−シントロ／ＳＰＡＨ、ＲＮＡの源は、ＣｏｎＡで刺激されるネコ脾臓細胞であった。ＣＤ８０−ＴＡＭＵおよびＣＤ８０（Ｂ７−１）−シントロ／ＳＰＡＨの間のｃＤＮＡ配列における差異は、ヌクレオチド３５１でＴからＣ、そしてヌクレオチド６７０でＣからＡである。アミノ酸配列で、ヌクレオチド３５１での変化は、サイレントであり、そしてヌクレオチド６７０での変化は、アミノ酸残基２２４での中性アミノ酸ロイシンからイソロイシンへの保存的変化を生じる。

およそ１１７６ヌクレオチドの単離および精製されたネコＣＤ８６（Ｂ７−２）ｃＤＮＡは、およそ３２０アミノ酸のネコＣＤ８６ポリペプチドの開放読取枠をコードし、その生来の膜結合形態または成熟形態は、約３６，３９４ｋＤａの分子量、約９．１９の等電点、１１．２７のｐＨ７・０での総荷電を示す。

およそ６８９ヌクレオチドの単離および精製されたネコＣＤ２８ｃＤＮＡは、およそ２２１アミノ酸のネコＣＤ２８ポリペプチドの開放読取枠をコードし、その生来の膜結合形態または成熟形態は、約２５，３１９ｋＤａの分子量、約９．１７の等電点、９．５８のｐＨ７・０での総荷電を示す。

およそ７４９ヌクレオチドの単離および精製されたネコＣＴＬＡ−４ｃＤＮＡは、およそ２２３アミノ酸のネコＣＴＬＡ−４ポリペプチドの開放読取枠をコードし、その生来の膜結合形態または成熟形態は、約２４，３８１ｋＤａの分子量、約６．３４の等電点、−０．９９のｐＨ７・０での総荷電を示す。

同時刺激分子ＣＤ２８またはＣＴＬＡ−４との、および腫瘍抗原または病原体生物から得られる抗原とのＣＤ８０の同時発現は、Ｔリンパ球、いっそう特には１型リンパ球の活性化を活性または増強し、そして他の型の成長を促進する能力を示す。同時刺激分子ＣＴＬＡ−４との、および腫瘍抗原または病原体生物から得られる抗原とのＣＤ８０の同時発現は、Ｔリンパ球、いっそう特には１型リンパ球の活性化を活性または増強する能力を示す。同時刺激分子ＣＤ２８またはＣＴＬＡ−４との、および腫瘍抗原または病原体生物から得られる抗原とのＣＤ８６の同時発現は、Ｔリンパ球、いっそう特には１型リンパ球の活性化を活性または増強し、そして他の細胞型の成長を促進する能力を示す。同時刺激分子ＣＴＬＡ−４との、ＣＤ８６の同時発現は、Ｔリンパ球、いっそう特には１型リンパ球の活性化を抑制する能力を示す。

（例２１）
ワクチンでのネコＣＤ８０（Ｂ７−１）、ＣＤ８６（Ｂ７−２）、ＣＤ２８、およびＣＴＬＡ−４の使用法：
以下の実験は、ネコワクチンでのネコＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ２８、およびＣＴＬＡ−４免疫増強活性を評価するために行われる。

ネコＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ２８、およびＣＴＬＡ−４は、ネコ科での組換えタンパク質の発現に有用な組換えウイルス性ベクター（ネコ・ヘルペスウイルス、豚痘ウイルス、またはアライグマ痘ウイルスから誘導される）に挿入される（ＰＣＴ国際出願ＷＯ９６／２２３６３またはＷＯ９６／１３５７５参照）。全４つの免疫増強分子を発現するか、または選択的にはＣＤ８０とＣＤ２８、またはＣＤ８０とＣＴＬＡ−４、またはＣＤ８６とＣＤ２８、またはＣＤ８６とＣＴＬＡ−４の対方法の組合せを発現する組換えウイルス性ベクターは、８週齢にあるネコに、経口で、または筋肉内に、０．１から１０．０ｍｇまでの投与範囲で、またはおよそ１０^４から１０^９プラーク形成単位（ｐｆｕ）の投与量で、または好ましくはおよそ１０^６ｐｆｕの投与量で投与される。ＦＩＶまたはＦｅＬＶについてのサブ単位ワクチン、またはＦＩＶまたはＦｅＬＶ（上記参照）についてのウイルス性ベクターのワクチンを、最小保護容量で、免疫増強ネコＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ２８、およびＣＴＬＡ−４ベクターワクチンと同時に投与する。３から４週後、そのネコに、第二の用量のワクチンを付与した。ネコに、ＵＳＤＡ標準誘発用量レベルで、毒性ＦＩＶ菌株（ＰＰＲまたはペタルマ(Petalum)）またはＦｅＬＶリチャード菌株（ネコを免疫抑制するためにメチルプレドニソロンを投与する）を誘発させ、そしてウイルス血症の発生について１２週間常に観察する。ワクチン接種したネコの１群を、ＦｅＬＶによって引起された腫瘍の発生について１２ヶ月間まで観察する。ネコにおける疾病の発生を、ワクチンを受けない対照、または免疫増強分子なしのＦＩＶまたはＦｅＬＶワクチンと比較する。発生実験の結果は、ワクチンを受けていないで、そしてその後、ＦｅＬＶまたはＦＩＶを発生させるネコでは、６０％以上が、頑固なウイルス血症を発生する。サブユニットＦＩＶまたはＦｅＬＶワクチンでワクチン接種され、そしてその後誘発されたネコは、７５％、ウイルス血症から保護される。サブユニットＦＩＶまたはＦｅＬＶワクチン、および免疫増強ネコＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ２８、およびＣＴＬＡ−４ベクター化ワクチンの組合せを受け、そしてその後誘発されたネコは、１００％、ウイルス血症から保護される。ネコＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ２８、およびＣＴＬＡ−４ベクター化ワクチンを加える別の有益な態様は、ウイルス血症および／または腫瘍形成に対して１００％保護がある。長期間の免疫性（１年以上）；免疫性の早期発症；または２回投与ではなく単回投与一次ワクチン接種が、現在、全ての製造業者に要求されている。ウイルス性ベクター化ＦＩＶまたはＦｅＬＶワクチンでワクチン接種されたネコは、サブユニットＦＩＶまたはＦｅＬＶワクチンでワクチン接種したネコより明らかに高いレベルで、誘発から保護される。ウイルス性ベクター化ＦＩＶまたはＦｅＬＶワクチン、および免疫増強ネコＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ２８、およびＣＴＬＡ−４ベクター化ワクチンの組合せを受け、そしてその後誘発させたネコでは、１００％が、ウイルス血症から保護される。ウイルス性ベクター化ＦＩＶまたはＦｅＬＶワクチン、および免疫増強ネコＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ２８、およびＣＴＬＡ−４ベクター化ワクチンの組合せでワクチン接種たネコも、上に記述される別の有益な態様を受ける。

選択的手段では、８週齢にあるネコに、ＦＩＶｅｎｖとｇａｇ、またはＦｅＬＶｅｎｖとｇａｇについてのｃＤＮＡを含むプラスミドとの混合で、ネコＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ２８、およびＣＴＬＡ−４分子についてのｃＤＮＡを含む１００μｇのプラスミドを、筋肉内に注入するか、または代替的には、ＦＩＶｅｎｖとｇａｇ、またはＦｅＬＶｅｎｖとｇａｇについてのｃＤＮＡを含むプラスミドとの混合で、ＣＤ８０とＣＤ２８、またはＣＤ８０とＣＴＬＡ−４、またはＣＤ２８またはＣＴＬＡ−４と対にしたＣＤ８６とＣＤ２８またはＣＤ８６とＣＴＬＡ−４の対の組合せを発現するｃＤＮＡを含む１００μｇのプラスミドを筋肉内に注入する。対照ネコは、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ２８、およびＣＴＬＡ−４を受けない。ネコに、有毒なＦｅＬＶまたはＦＩＶを誘発させ、そして上に記述されるとおり疾病の徴候について観察する。誘発実験の結果は、ネコＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ２８、およびＣＴＬＡ−４を含むｃＤＮＡベクター、およびＦＩＶ遺伝子またはＦｅＬＶ遺伝子を含むｃＤＮＡベクターを受けるネコが、疾病から７５％保護を示すＦＩＶ遺伝子またはＦｅＬＶ遺伝子を含むｃＤＮＡベクターのみを受けるネコと比較して、疾病から１００％保護を示すことである。

選択的手段では、８週齢にあるネコに、ネコＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ２８、およびＣＴＬＡ−４分子についての０．１から１００ｍｇの精製タンパク質を、または代替的には、上に記述される組換えｃＤＮＡベクターから得られる、ＣＤ８０またはＣＤ８６の対の組合せで筋肉内に注入し、そしてＦＩＶｅｎｖとｇａｇ、またはＦｅＬＶｅｎｖとｇａｇを含むサブユニットワクチン０．１から１００ｍｇを筋肉内に注入する。対照ネコは、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ２８、およびＣＴＬＡ−４を受けない。ネコに、有毒なＦＩＶ菌株またはＦｅＬＶ菌株を誘発させ、そして疾病の徴候について常に観察する。誘発実験の結果は、ネコＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ２８、およびＣＴＬＡ−４についての精製タンパク質、およびＦＩＶまたはＦｅＬＶを含むサブユニットワクチンを受けるネコが、ＦＩＶまたはＦｅＬＶタンパク質を含むサブユニットワクチンのみを受けるネコと比較して、疾病の発生を明らかに減少させたことを示す。

（例２２）
疾病保護のについての予防ワクチンとしてのネコＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ２８、およびＣＴＬＡ−４の使用法：
例１７に記述されるとおり投与されるが、病原体生物からサブユニットまたはウイルス性ベクター化抗原を投与させない場合、組換え豚痘、組換えアライグマ痘、または組換えネコ・ヘルペスウイルス・ベクターにおける、ネコＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ２８、およびＣＴＬＡ−４は、ウイルス性、寄生、または細菌性病原体を誘発させる場合、保護的免疫応答を引出す免疫原および１型応答を刺激するのに有用である。選択的手段では、例３に記述されるとおり投与される場合、ウイルス性ベクター中のネコＣＴＬＡ−４と組合せたネコＣＤ８０またはＣＤ８６は、免疫応答を抑制し、そしてネコにおける自己免疾病に対して保護するのに有用である。

（例２３）
腫瘍細胞成長を阻害し、そして破壊するネコＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ２８、およびＣＴＬＡ−４の使用法：
ネコから得られる腫瘍細胞を、ＣＤ２８またはＣＴＬＡ−４と組合わせてネコＣＤ８０またはＣＤ８６を発現する組換え豚痘、組換えアライグマ痘、または組換えネコ・ヘルペスウイルス・ベクターに形質移入させた。形質移入した腫瘍細胞を、ネコに再投与し、そして腫瘍細胞の表面におけるネコＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ２８、およびＣＴＬＡ−４の存在は、形質移入および非形質移入腫瘍細胞に対する広範な免疫学上の応答を生じさせ、それにより、局在化し、そして転移した腫瘍細胞の死滅を生じさせた。選択的手段では、ＣＤ２８またはＣＴＬＡ−４と組合わせてネコＣＤ８０またはＣＤ８６を発現するベクターを、ネコにある腫瘍に直接注入し、それにより局在化し、そして転移した腫瘍細胞の死滅を生じさせる腫瘍細胞に対する広範な免疫学上の応答を生じさせる。

（例２４）
ネコにおける疾病を治療する治療薬としてのネコＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ２８、およびＣＴＬＡ−４の使用法：
例１７に記述されるとおり投与されるが、病原体生物からサブユニットまたはウイルス性ベクター化抗原を投与させない場合、組換え豚痘、組換えアライグマ痘、または組換えネコ・ヘルペスウイルス・ベクターにおける、ネコＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ２８、およびＣＴＬＡ−４は、疾病の病原体のレベルを排除するかまたは減少させるのに有用である。

支持実験データ：ＳＰＶ２４６
ＦｅＬＶｇａｇおよびエンベロープおよびネコＣＤ８０を含む組換えウイルス性ベクター化ＳＰＶワクチンの安全性および効力
組換えＳＰＶウイルス、ＳＰＶ２４６の構築は、上に記述された（元のファイルの本体で）。ＳＰＶ２４６は、２つのマーカー遺伝子β−グルクロニダーゼおよびβ−ガラクトシダーゼと同様に、ＦｅＬＶｇａｇおよびエンベロープおよびネコＣＤ８０をコードする遺伝子を含めた５つの外来遺伝子を含む。ＳＰＶ２４６で感染されたＦｅＬＶｇａｇおよびエンベロープおよびＣＤ８０の発現は、「ウエスタンブロット」分析によって確認された。特異的ＦｅＬＶｇａｇおよびエンベロープタンパク質を表すバンドを、それぞれ、ＦｅＬＶ Ｐ２７に対するヤギポリクローナル抗体（バイオデザイン、ＭＥ）およびＦｅＬＶ ｇｐ７０に対するモノクローナル抗体（バイオデザイン、ＭＥ）で検出した。ＦｅＬＶｇａｇおよびエンベロープタンパク質は、生来のウイルス性タンパク質に類似して後期翻訳で明らかに加工される。上に記述される抗体を利用する「黒色プラーク」アッセイによって純度、発現および安定性の分析を行った。ＳＰＶ２４６を、少なくとも５回、安定して継代させた。ＳＰＶ２４６で感染した細胞から発生される１００％のプラークは、ＦｅＬＶｇａｇ、エンベロープ、β−ガラクトシダーゼおよびβ−グルクロニダーゼについて陽性であった。

ネコＣＤ８０の発現は、ポリクローナル抗ヒトＣＤ８０抗体を用いて「黒色プラーク」アッセイで確認された。ネコＣＤ８０に特異的な３０ｋｄａから６０ｋｄａまでのサイズの範囲にある多重バンドを検出した。これらのバンドは、ＳＰＶおよびＥＳＫ−４細胞の内容物中で発現され、そして修飾されたＣＤ８０の選択的で複数のグリコシル化パターンを表す。

ＳＰＶ２４６および対照ウイルス、ＳＰＶ００３、並びに他の組換えＦＨＶおよびＳＰＶ ＦｅＬＶワクチン候補を、ＦｅＬＶの頑固な感染に対してネコを保護するそれらの能力について試験した。簡便には、８週齢の仔ネコ１０ネコ／群を、１ｍｌのＳＰＶ２４６、対照ウイルスまたは他の組換えウイルスを皮下にワクチン接種した（７×１０^５ｐｆｕ／ネコから１×１０^７ｐｆｕ／ネコまでの範囲内の用量）。ネコに、３週ずれて、三回ワクチン接種した。ワクチン接種に続いて、酢酸メティルプレドニソロン（デポ−メドロール(Depo-Medrol)）を用いた前処置した後、ネコを、リチャードＦｅＬＶ標準誘発菌株（１０^６．２ＴＣＩＤ_５０／ｍｌ／ネコ）で経口鼻腔経路によって誘発させた。

ネコから得られる血清を、１５週後誘発の間、週基本で、頑固なウイルス血症について分析した。継続３週間、ＦｅＬＶ ｐ２７の存在について陽性を試験した後、ネコは、頑固にウイルス血症であると考えられた。

結果：
ＳＰＶ２４６でワクチン接種したネコは、ＦｅＬＶ誘発調査でのＦｅＬＶウイルス血症から部分的に保護される。ＳＰＶ２４６で処置されるネコについての推定される防止可能な画分（ＰＦ）値は、５０％であった（表１）。

表１： 抗原接種後１５週において一貫したウイルス血漿をもつ猫の数
およびパーセンテージ。各群についての推定予防可能画分（ＰＦ）
を計算した

ＣＤ８０およびＣＤ８６を含む別の組換えウイルスの例
ＳＰＶ２８０：
ＳＰＶ２８０は、６つの外来遺伝子を発現する組換え豚痘ウイルスである。９９２−２３．６と表される相同ベクターを、以下の方法で構築した：ネコＣＤ８６遺伝子およびＣＤ８０遺伝子は、合成後期ポックスプロモーターＬＰ１の制御下で、ビシストロン性カセット中で発現され、それによりＣＤ８０およびＣＤ８６の転写が起動され、そして２つの開放読取枠の間にＥＭＣＶ ＩＲＥＳ要素が含まれる。Ｅ．ｃｏｌｉ β−グルクロニダーゼ遺伝子は、合成前期ポックスプロモーターＥＰ２の制御下にある。ＳＰＶ２８０は、ＦｅＬＶｇａｇおよびエンベロープおよびβ−ガラクトシダーゼを含むＳＰＶ２５８から誘導された。ＳＰＶ２５８は、先に、ＦｅＬＶｇａｇ／プロテアーゼ遺伝子を含むように遺伝子操作され、そして合成前期／後期ポックスプロモーターＬＰ２ＥＰ２の制御下で切断ＦｅＬＶエンベロープ（ｇｐ７０）遺伝子；Ｅ．ｃｏｌｉ β−ガラクトシダーゼ遺伝子は、構造的Ｉ５Ｌポックスプロモーターの制御下にあり、そして欠失された１８６９ｂｐ部分的ＨｉｎｄＩＩＩ Ｎ断片に挿入される。ＣＤ８０／ＣＤ８６およびＥ．ｃｏｌｉ β−グルクロニダーゼ遺伝子を、異なり、そして非必須ＳＰＶ部分的ＨｉｎｄＩＩＩ Ｋ断片中の相同なベクター９９２−２３．６にクローン化させた。

ＳＰＶ２８０は、ＳＰＶ２５８から誘導された。これは、「組換えＲＰＶ、ＳＰＶまたはＦＨＶを発生する相同な組換え手段」で相同なベクター９９２−２３．６およびウイルスＳ−ＳＰＶ−２５８を利用して達成された。形質移入保存物を、「β−ガラクトシダーゼ（ＢｌｕｏｇａｌおよびＣＰＲＧアッセイ）またはβ−グルクロニダーゼ（Ｘ−ＧＬＵＣアッセイ）を発現する組換えＳＰＶ用のスクリーン」によってスクリーニングした。複数回の青色／緑色プラーク精製の最終結果は、組換えウイルスＳＰＶ２８０であった。

「黒色プラークアッセイ」により、ＳＰＶ２８０を、ＦｅＬＶｇａｇ、ＦｅＬＶエンベロープおよびマーカー遺伝子、β−ガラクトシダーゼおよびβ−グルクロニダーゼの発現について分析した。ＦｅＬＶｇａｇについてのヤギポリクローナル抗体（バイオデザイン、ＭＥ）およびＦｅＬＶエンベロープについてのマウスのモノクローナル抗体ｇｐ７０（バイオデザイン、ＭＥ）を使用して、精製ＳＰＶ２８０で感染されたＥＳＫ−４細胞から発生される１００％のプラークは、ＦｅＬＶｇａｇおよびＦｅＬＶエンベロープを発現していると決定された。

ネコＣＤ８０およびＣＤ８６の発現を、それぞれ、ヤギのポリクローナル抗ヒトＣＤ８０およびＣＤ８６抗体（アール・アンド・ディー・システムズ、ＭＮ）を用いて、「ウエスタンブロット」分析によって確認した。ネコＣＤ８０に特異的な３０ｋｄａから６０ｋｄａまでのサイズの範囲にある多重バンドを検出し、そしてネコＣＤ８６に特異的な４０ｋｄａから７０ｋｄａまでのサイズの範囲にある多重バンドを検出した。これらのバンドは、ＥＳＫ−４細胞中のＳＰＶの内容物中で発現されたＣＤ８０およびＣＤ８６の選択的で複数のグリコシル化パターンを表す。

ＳＰＶ２８１：
ＳＰＶ２８１は、６つの外来遺伝子を発現する組換え豚痘ウイルスである。９９２−２３．６と表される相同ベクターを、上に記述されるとおり、ＳＰＶ２８０について構築した。ＳＰＶ２８１は、ＦＩＶｇａｇ／プロテアーゼおよびエンベロープおよびＥ．ｃｏｌｉ β−ガラクトシダーゼを含むＳＰＶ２２８から誘導された。ＦＩＶｇａｇ／プロテアーゼ遺伝子は、合成前期ポックスプロモーターＥＰ２の制御下にある。ＦＩＶエンベロープ遺伝子は、合成前期ポックスプロモーターＥＰ１の制御下にある。Ｅ．ｃｏｌｉ β−ガラクトシダーゼ遺伝子は、構造的Ｉ５Ｌポックスプロモーターの制御下にある。ＦＩＶｇａｇ／プロテアーゼ、エンベロープおよびＥ．ｃｏｌｉ β−ガラクトシダーゼを、ＳＰＶの欠失した１８６９ｂｐ部分的ＨｉｎｄＩＩＩ Ｎ断片に挿入させた。ＣＤ８０／ＣＤ８６およびＥ．ｃｏｌｉ β−グルクロニダーゼ遺伝子を、異なり、そして非必須ＳＰＶ部分的ＨｉｎｄＩＩＩ Ｋ断片に挿入した。

ＳＰＶ２８１は、ＳＰＶ２２８から誘導された。これは、「組換えＲＰＶ、ＳＰＶまたはＦＨＶを発生する相同な組換え手段」で相同なベクター９９２−２３．６およびウイルスＳ−ＳＰＶ−２２８を利用して達成された。形質移入保存物を、「β−ガラクトシダーゼ（ＢｌｕｏｇａｌおよびＣＰＲＧアッセイ）またはβ−グルクロニダーゼ（Ｘ−ＧＬＵＣアッセイ法）を発現する組換えＳＰＶ用のスクリーン」によってスクリーニングした。複数回の青色／緑色プラーク精製の最終結果は、組換えウイルスＳＰＶ２８１であった。

「黒色プラークアッセイ」により、ＳＰＶ２８１を、ＦｅＬＶｇａｇ、ＦｅＬＶエンベロープおよびマーカー遺伝子、β−ガラクトシダーゼおよびβ−グルクロニダーゼの発現について分析した。プラーク精製ＳＰＶ２８１で感染したＥＳＫ−４細胞から得た１００％のプラークは、ＦＩＶｇａｇ（ｐ２７）およびＦＩＶエンベロープ（ｇｐ１００）（それぞれ、カスタム・モノクローナルズ、カリフォルニアウ州；バイオデザイン・インターナショナル、メイン州）についてのマウスのモノクローナル抗体、β−ガラクトシダーゼに対するマウスのモノクローナル、およびβ−グルクロニダーゼに対するウサギのポリクローナル抗体（それぞれ、バイオデザイン・インターナショナル、メイン州、およびモレキュラー・プローブス、オレゴン州）を利用して、ＦｅＬＶｇａｇ、ＦＩＶエンベロープ、β−ガラクトシダーゼおよびβ−グルクロニダーゼを発現していると決定された。

ネコＣＤ８０およびＣＤ８６の発現を、ポリクローナル抗ヒトＣＤ８０およびＣＤ８６抗体（アール・アンド・ディー・システムズ、ＭＮ）を利用して、「ウエスタンブロット」分析によって確認した。ネコＣＤ８０に特異的な３０ｋｄａから６０ｋｄａまでのサイズの範囲にある多重バンドを検出し、そしてネコＣＤ８６に特異的な４０ｋｄａから７０ｋｄａまでのサイズの範囲にある多重バンドを検出した。これらのバンドは、ＥＳＫ−４細胞中のＳＰＶの内容物中で発現されたＣＤ８０およびＣＤ８６の選択的で複数のグリコシル化パターンを表す。ＦＩＶｇａｇおよびエンベロープ発現も、上に記述される抗体を利用して「ウエスタンブロット」分析によって確認した。ＦＩＶｇａｇおよびエンベロープは、それぞれ、Ｐ２４およびｇｐ１００に加工されるようであった。

ＦＨＶ０４３：
ＦＨＶ０４３は、５つの外来遺伝子を発現する組換え豚痘ウイルスである。９８７−５７．Ａ１と表される相同ベクターを、以下の方法で構築した。：ネコＣＤ８６およびＣＤ８０遺伝子は、サイトメガロウイルス即時型プロモーター（ＣＭＶ ＩＥ）の制御下で、ビシストロン性カセット中で発現され、それによりＣＤ８０およびＣＤ８６の転写が起動された。第二の下流ＣＤ８０の開放読取枠の翻訳は、ＥＭＣＶ ＩＲＥＳ要素の制御下にあった。Ｅ．ｃｏｌｉ β−グルクロニダーゼ遺伝子は、感染性喉頭気管炎ウイルスｇＩプロモーターの制御下にある。ＣＤ８０、ＣＤ８６およびＥ．ｃｏｌｉ β−グルクロニダーゼ遺伝子を、ＦＨＶの部分的Ｓａｌ Ｉ Ｈ断片から誘導される特徴的なＥｃｏＲＩ部位中のＦＨＶ特徴的な長い領域に挿入した。挿入は、ｇＬの間にあり、そして転写アクチベーター遺伝子に隣接した。

ＦＨＶ０４３は、ＦＩＶエンベロープおよびＥ．ｃｏｌｉ β−ガラクトシダーゼを含むＦＨＶ０１７から誘導された。ＦＩＶエンベロープ遺伝子は、ＣＭＶ ＩＥプロモーターの制御下にある。そして、イー．β−ガラクトシダーゼ遺伝子は、偽狂犬病ｇＸプロモーター要素の制御下にある。ＦＩＶエンベロープおよびＥ．ｃｏｌｉ β−ガラクトシダーゼを、ＦＨＶ ＵＳ ｇＥ欠失部位に挿入される。

ＦＨＶ０４３は、ＦＨＶ０１７から誘導された。これは、「組換えＲＰＶ、ＳＰＶまたはＦＨＶを発生する相同な組換え手段」で相同なベクター９８７−５７．Ａ１およびウイルスＦＨＶ０１７を利用して達成された。形質移入保存物を、「β−ガラクトシダーゼ（ＢｌｕｏｇａｌおよびＣＰＲＧアッセイ）またはβ−グルクロニダーゼ（Ｘ−ＧＬＵＣアッセイ法）を発現する組換えＳＰＶ用のスクリーン」によってスクリーニングした。複数回の青色／緑色プラーク精製の最終結果は、組換えウイルスＦＨＶ０４３であった。

「黒色プラークアッセイ」により、ＦＨＶ０４３を、マーカー遺伝子、β−ガラクトシダーゼおよびβ−グルクロニダーゼの発現について分析した。β−ガラクトシダーゼについてのマウスのモノクローナル抗体（バイオデザイン、メイン州）およびβ−グルクロニダーゼについてのウサギのポリクローナル抗体（モレキュラー・プローブス、オレゴン州）を利用して、プラーク精製ＦＨＶ０４３で感染されたＣＲＦＫ細胞から得られる１００％のプラークは、β−ガラクトシダーゼおよびβ−グルクロニダーゼを発現していると決定された。このウイルスは、少なくとも５継代後、安定であると決定された。

ネコＣＤ８０およびＣＤ８６の発現を、ポリクローナル抗ヒトＣＤ８０およびＣＤ８６抗体（アール・アンド・ディー・システムズ、ＭＮ）を利用して、「ウエスタンブロット」分析によって確認した。ネコＣＤ８０に特異的な３０ｋｄａから６０ｋｄａまでのサイズの範囲にある多重バンドを検出し、そしてネコＣＤ８６に特異的な４０ｋｄａから７０ｋｄａまでのサイズの範囲にある多重バンドを検出した。ＦＩＶエンベロープ（ｇｐ１３０）の発現を、ＦＩＶ感染ネコから得られる回復期ネコ血清を利用して、「ウエスタンブロット」分析で確認した。

相同ベクター１０１５−１８．８Ａ（LP1-CD86/IRES-CD80）：
相同ベクター１０１５−１８．８Ａを使用して、ＣＤ８０およびＣＤ８６を発現する組換えＲＰＶウイルスを作成した。ポックスＬＰ１プロモーター、ＥＭＣＶ ＩＲＥＳ要素、およびポックス・ポリＡ転写ターミネーターを含むプラスミドを構築した。ネコＣＤ８０遺伝子を、プライマー１／９７．６（５’−ＧＣＴＡＧＧＡＴＣＣＡＡＴＣＴＡＴＧＴＡＧＡＣＡＧＧＴＧＡＧＡＴ−３’）および３／９８．４（５’−ＴＣＧＡＧＧＡＴＣＣＧＧＧＴＣＡＣＧＣＡＧＣＡＡＡＧＴＧＧ−３’）でＰＣＲ増幅させ、そして両方が、ＢａｍＨＩクローニング部位を含んだ。ＣＤ８０を、ＬＰ１プロモーターの後ろでクローニングした。ネコＣＤ８６遺伝子を、ＭｆｅＩクローニング部位を有するプライマー１／９８．１８（５’−ＴＣＧＡＣＡＡＴＴＧＧＡＴＧＧＧＣＡＴＴＴＧＴＧＡＣＡＧ−３’）および８／９７．３１（５’−ＧＴＧＧＡＴＣＣＡＧＧＡＴＣＣＧＧＡＧＣＧＧ−３’）平滑末端でＰＣＲ増幅させた。ＣＤ８０を、ＥＭＣＶ要素の後でクローニングした。その後、カセットを、ＮｏｔＩで消化し、そして合成後期プロモーターＩ５Ｌの制御下にあるＥ．ｃｏｌｉ β−ガラクトシダーゼ遺伝子を含むＲＰＶ ＨｉｎｄＩＩＩ Ｎベクターにクローニングさせた。最終の相同ベクター１０１５−１８．８Ａを使用して、「組換えＲＰＶを発生する相同な組換え手段」によって、ＦＩＶまたはＦｅＬＶ遺伝子およびＣＤ８０およびＣＤ８６を含むウイルスを作成した。

Ｓ−ＲＰＶ−０４５：
Ｓ−ＲＰＶ−０４５は、３つの外来遺伝子を発現する組換えアライグマ痘ウイルスである。Ｓ−ＲＰＶ−０４５は、アライグマ痘ウイルスＲＰＶ−０００（ＡＴＣＣ ＶＲ−８３８）から誘導された。これは、「組換えＲＰＶを発生する相同な組換え手段」で相同なベクター１０１５−１８．８Ａおよび親のウイルスＳ−ＲＰＶ−０００を利用して達成された。形質移入保存物を、「β−ガラクトシダーゼ（ＢＬＵＯ−ＧＡＬアッセイおよび酵素的マーカー遺伝子を発現する組換えＲＰＶ用のスクリーン）を発現する組換えＲＰＶ用のスクリーン」によって組換え体についてスクリーニングした。ウイルスを、プラーク精製し、そして５回継代させた。

「黒色プラークアッセイ」により、ＲＰＶ−０４５を、β−ガラクトシダーゼの発現について分析した。ウサギのポリクローナル抗体（アイ・シー・エヌ、オハイオ州）を利用して、精製ＲＰＶ−０４５で感染されたＶＥＲＯ細胞から発生される１００％のプラークは、β−ガラクトシダーゼを発現していると決定された。

「ウエスタンブロット手段」を使用するウエスタン分析では、それぞれ、ヤギ・ポリクローナル抗ヒトＣＤ８０およびＣＤ８６抗体（アール・アンド・ディー・システムズ、ＭＮ）の発現が確認された。ネコＣＤ８０に特異的な３０ｋｄａから６０ｋｄａまでのサイズの範囲にある多重バンドを検出し、そしてネコＣＤ８６に特異的な４０ｋｄａから７０ｋｄａまでのサイズの範囲にある多重バンドを検出した。これらのバンドは、ＶＥＲＯ細胞中のＲＰＶの内容物中で発現されたＣＤ８０およびＣＤ８６の選択的で複数のグリコシル化パターンを表す。

Ｓ−ＲＰＶ−０４６：
ＲＰＶ−０４６は、５つの外来遺伝子を発現する組換えアライグマ痘ウイルスである。ＲＰＶ−０４６は、アライグマ痘ウイルスＲＰＶ−０３６から誘導された。これは、「組換えＲＰＶを発生する相同な組換え手段」で相同なベクター１０１５−１８．８Ａおよび親のウイルスＲＰＶ−０３６を利用して達成された。形質移入保存物を、「β−ガラクトシダーゼ（ＢＬＵＯ−ＧＡＬアッセイおよび「酵素的マーカー遺伝子を発現する組換えＲＰＶ用のスクリーン」）を発現する組換えＲＰＶ用のスクリーン」によって組換え体についてスクリーニングした。ウイルスを、プラーク精製し、そして５回継代させた。複数回の青色／緑色プラーク精製の最終結果は、組換えウイルスＦＨＶ０４６であった。

ＲＰＶ０４６は、合成前期／後期ポックスプロモーターＬＰ２ＥＰ２の制御下でＦＩＶｇａｇ遺伝子を、そして合成前期ポックスプロモーターＥＰ２の制御下でβ−グルクロニダーゼ遺伝子を含む。これらの遺伝子は、異なり、そして非必須の部分的ＲＰＶ ＨｉｎｄＩＩＩ Ｕ部位に含まれる。ＣＤ８０およびＣＤ８６遺伝子およびβ−ガラクトシダーゼが、特徴的で、異なる非必須の部分的ＲＰＶ ＨｉｎｄＩＩＩ Ｎ部位に含まれる。

「黒色プラーク分析」によって、ＲＰＶ−０４６を、β−ガラクトシダーゼおよびβ−グルクロニダーゼ発現について分析した。精製ＲＰＶ−０４６で感染されたＶＥＲＯ細胞から発生される１００％のプラークは、β−ガラクトシダーゼおよびβ−グルクロニダーゼを発現していると決定された。

「ウエスタンブロット手段」を使用するウエスタン分析では、それぞれ、ヤギ・ポリクローナル抗ヒトＣＤ８０およびＣＤ８６抗体（アール・アンド・ディー・システムズ、ＭＮ）の発現が確認された。ネコＣＤ８０に特異的な３０ｋｄａから６０ｋｄａまでのサイズの範囲にある多重バンドを検出し、そしてネコＣＤ８６に特異的な４０ｋｄａから７０ｋｄａまでのサイズの範囲にある多重バンドを検出した。これらのバンドは、ＶＥＲＯ細胞中のＲＰＶの内容物中で発現されたＣＤ８０およびＣＤ８６の選択的で複数のグリコシル化パターンを表す。ＦＩＶｇａｇ／プロテアーゼ発現も、ＦＩＶｇａｇについてのマウスのモノクローナル抗体（ｐ２７）（カスタム・モノクローナルズ、カリフォルニア州）を利用して「ウエスタンブロット」分析によって確認された。

Ｓ−ＲＰＶ−０４７：
ＲＰＶ−０４７は、５つの外来遺伝子を発現するアライグマ痘ウイルスである：ＨｉｎｄＩＩＩ Ｎ断片中で合成後期プロモーター（Ｉ５Ｌ）の制御下でＬＰ１−ＣＤ８０／ＩＲＥＳ−ＣＤ８０カセットおよびＥ．ｃｏｌｉ β−ガラクトシダーゼ遺伝子を含む１０１５−１８．８Ａ相同ベクターは、上に記述されるとおり構築された。ＲＰＶ−０４７は、ＲＰＶ−０４４から誘導され、それはＨｉｎｄＩＩＩ Ｎ断片中でＦＩＶｅｎｖおよびＥ．ｃｏｌｉ β−グルクロニダーゼ（β−グルクロニダーゼ）についての遺伝子を含んた。ＦＩＶｅｎｖ遺伝子は、合成前期プロモーター（ＥＰ１）の制御下にある。β−グルクロニダーゼ遺伝子は、合成後期プロモーター（ＬＰ１）の制御下にある。

Ｓ−ＲＰＶ−０４７は、アライグマ痘ウイルスＲＰＶ−０４４から誘導された。これは、「組換えＲＰＶを発生する相同な組換え手段」で相同なベクター１０１５−１８．８Ａおよび親のウイルスＳ−ＲＰＶ−０４４を利用して達成された。形質移入保存物を、「β−ガラクトシダーゼ（ＢＬＵＯ−ＧＡＬアッセイおよび酵素的マーカー遺伝子を発現する組換えＲＰＶ用のスクリーン）を発現する組換えＲＰＶ用のスクリーン」によって組換え体についてスクリーニングした。ウイルスを、プラーク精製し、そして５回継代させた。複数回の青色／緑色プラーク精製の最終結果は、組換えウイルスＦＨＶ０４７であった。

「黒色プラーク」分析により、ＲＰＶ−０４７を、β−ガラクトシダーゼの発現について分析した。ウサギのポリクローナル抗体（アイ・シー・エヌ、オハイオ州）を利用して、精製ＲＰＶ−０４７で感染されたＶｅｒｏ細胞から発生される１００％のプラークは、β−ガラクトシダーゼを発現していると決定された。

「ウエスタンブロット手段」を使用するウエスタン分析では、それぞれ、ヤギ・ポリクローナル抗ヒトＣＤ８０およびＣＤ８６抗体（アール・アンド・ディー・システムズ、ＭＮ）を使用してＣＤ８０およびＣＤ８６の発現が確認された。ネコＣＤ８０に特異的な３０ｋｄａから６０ｋｄａまでのサイズの範囲にある多重バンドを検出し、そしてネコＣＤ８６に特異的な４０ｋｄａから７０ｋｄａまでの範囲にある多重バンドを検出した。これらのバンドは、ＶＥＲＯ細胞中のＲＰＶの内容物中で発現されたＣＤ８０およびＣＤ８６の選択的で複数のグリコシル化パターンを表す。ＦＩＶｅｎｖ発現も、ＦＩＶｅｎｖについてのマウスのモノクローナル抗体（ｇｐ１００）（バイオデザイン・インターナショナル、メイン州）を利用して「ウエスタンブロット」分析によって確認された。

Ｓ−ＲＰＶ−０４８：
ＲＰＶ−０４８は、５つの外来遺伝子を発現するアライグマ痘ウイルスである。ＨｉｎｄＩＩＩ Ｎ断片中の合成後期プロモーター（Ｉ５Ｌ）の制御下でＬＰ１−ＣＤ８６／ＩＲＥＳ−ＣＤ８０カセットおよびＥ．ｃｏｌｉ β−ガラクトシダーゼ遺伝子を含む１０１５−１８．８Ａ相同ベクターを、上に記述のとおり構築した。ＲＰＶ−０４８は、アライグマ痘ウイルスＲＰＶ−０３６から誘導され、それはＲＰＶ ＨｉｎｄＩＩＩ Ｕ断片中のＦｅＬＶｇａｇ／プロテアーゼおよびＥ．ｃｏｌｉ β−グルクロニダーゼについての遺伝子を含んた。ＦｅＬＶｇａｇ／プロテアーゼ遺伝子は、合成後期／前期プロモーター（ＬＰ２ＥＰ２）の制御下にある。β−グルクロニダーゼ遺伝子は、合成後期プロモーター（ＬＰ１）の制御下にある。

ＲＰＶ−０４８は、組換えアライグマ痘ＲＰＶ−０３８から誘導された。これは、「組換えＲＰＶを発生する相同な組換え手段」で相同なベクター１０１５−１８．８Ａおよび親のウイルスＲＰＶ−０３８を利用して達成された。形質移入保存物を、「β−ガラクトシダーゼ（ＢＬＵＯ−ＧＡＬアッセイおよび「酵素的マーカー遺伝子を発現する組換えＲＰＶ用のスクリーン」）を発現する組換えＲＰＶ用のスクリーン」によって組換え体についてスクリーニングした。ウイルスを、プラーク精製し、そして５回継代させた。複数回の青色／緑色プラーク精製の最終結果は、組換えウイルスＦＨＶ０４８であった。

ＲＰＶ０４８を、黒色プラーク分析によってβ−ガラクトシダーゼ発現について分析した。ウサギのポリクローナル抗体（アイ・シー・エヌ、オハイオ州）を使用して、精製ＲＰＶ−０４６で感染されたＶｅｒｏ細胞から発生される１００％のプラークは、β−ガラクトシダーゼを発現していると決定された。

「ウエスタンブロット手段」を使用するウエスタン分析では、それぞれ、ヤギ・ポリクローナル抗ヒトＣＤ８０およびＣＤ８６抗体（アール・アンド・ディー・システムズ、ＭＮ）を使用してＣＤ８０およびＣＤ８６の発現が確認された。ネコＣＤ８０に特異的な３０ｋｄａから６０ｋｄａまでのサイズの範囲にある多重バンドを検出し、そしてネコＣＤ８６に特異的な４０ｋｄａから７０ｋｄａまでのサイズの範囲にある多重バンドを検出した。これらのバンドは、ＶＥＲＯ細胞中のＲＰＶの内容物中で発現されたＣＤ８０およびＣＤ８６の選択的で複数のグリコシル化パターンを表す。ＦＩＶｇａｇ／プロテアーゼ発現も、ＦＩＶｇａｇについてのウサギのポリクローナル抗体（ｐ２７）（バイオデサイン・インターナショナル、ＭＥ）を利用して「ウエスタンブロット」分析によって確認された。

Ｓ−ＲＰＶ−０５２：
ＲＰＶ−０５２は、６つの外来遺伝子を発現するアライグマ痘ウイルスである。ＨｉｎｄＩＩＩ Ｎ断片中の合成後期プロモーター（Ｉ５Ｌ）の制御下でＬＰ１−ＣＤ８６／ＩＲＥＳ−ＣＤ８０カセットおよびＥ．ｃｏｌｉ β−ガラクトシダーゼ遺伝子を含む１０１５−１８．８Ａ相同ベクターを、上に記述のとおり構築した。ＲＰＶ−０５２は、ＲＰＶ−０３０から誘導され、それはＲＰＶ ＨｉｎｄＩＩＩ Ｕ断片中のＦｅＬＶｇａｇ／プロテアーゼ、ＦｅＬＶｅｎｖ、およびＥ．ｃｏｌｉ β−グルクロニダーゼ（β−グルクロニダーゼ）についての遺伝子を含んた。ＦｅＬＶｇａｇ／プロテアーゼ遺伝子は、合成前期プロモーター（ＥＰ２）の制御下にある。ＦｅＬＶ遺伝子は、合成初期プロモーター（ＥＰ１）の制御下にある。β−グルクロニダーゼ遺伝子は、合成後期プロモーター（ＬＰ１）の制御下にある。

ＲＰＶ−０５２は、アライグマ痘ウイルスＲＰＶ−０３０から誘導された。これは、「組換えＲＰＶを発生する相同な組換え手段」で相同なベクター１０１５−１８．８Ａおよび親のウイルスＲＰＶ−０３０を利用して達成された。形質移入保存物を、「β−ガラクトシダーゼ（ＢＬＵＯ−ＧＡＬアッセイおよび「酵素的マーカー遺伝子を発現する組換えＲＰＶ用のスクリーン」）を発現する組換えＲＰＶ用のスクリーン」によって組換えウイルスについてスクリーニングした。ウイルスを、プラーク精製し、そして５回継代させた。複数回の青色／緑色プラーク精製の最終結果は、組換えウイルスＦＨＶ０５２であった。

ＲＰＶ０５２を、黒色プラーク分析によってβ−ガラクトシダーゼ、β−グルクロニダーゼ、ＦｅＬＶｇａｇおよびＦｅＬＶエンベロープ発現について分析した。それぞれ、ヤギのポリクローナル抗ヒトＣＤ８０およびＣＤ８６抗体（アール・アンド・ディー・システムズ、ＭＮ）を使用して、「ウエスタンブロット手段」を使用するウエスタン分析では、ＣＤ８０およびＣＤ８６の発現が確認された。ＦＩＶｇａｇ／プロテアーゼおよびＦｅＬＶエンベロープの発現も、ＦＩＶｇａｇについてのウサギのポリクローナル抗体（ｐ２７）（バイオデサイン・インターナショナル、ＭＥ）およびマウスのモノクローナル抗ＦｅＬＶｅｎｖ（ｇｐ１００）（バイオデザイン、ＭＥ）を利用して「ウエスタンブロット」分析によって確認された。

Ｓ−ＲＰＶ−０５３：
ＲＰＶ−０５３は、６つの外来遺伝子を発現するアライグマ痘ウイルスである。ＨｉｎｄＩＩＩ Ｎ断片中の合成後期プロモーター（Ｉ５Ｌ）の制御下でＬＰ１−ＣＤ８６／ＩＲＥＳ−ＣＤ８０カセットおよびＥ．ｃｏｌｉ β−ガラクトシダーゼ遺伝子を含む１０１５−１８．８Ａ相同ベクターを、上に記述のとおり構築した。ＲＰＶ−０５３は、ＲＰＶ−０３４から誘導されたが、それはＲＰＶ ＨｉｎｄＩＩＩ Ｕ断片中のＦｅＬＶｇａｇ／プロテアーゼ、ＦｅＬＶｅｎｖ、およびＥ．ｃｏｌｉ β−グルクロニダーゼについての遺伝子を含む。ＦｅＬＶｇａｇ／プロテアーゼ遺伝子は、合成前期プロモーター（ＥＰ２）の制御下にある。ＦｅＬＶ遺伝子は、合成初期プロモーター（ＥＰ１）の制御下にある。β−グルクロニダーゼ遺伝子は、合成後期プロモーター（ＬＰ１）の制御下にある。

ＲＰＶ−０５３は、アライグマ痘ウイルスＲＰＶ−０３４から誘導された。これは、「組換えＲＰＶを発生する相同な組換え手段」で相同なベクター１０１５−１８．８Ａおよび親のウイルスＲＰＶ−０３４を利用して達成された。形質移入保存物を、「β−ガラクトシダーゼ（ＢＬＵＯ−ＧＡＬアッセイおよび「酵素的マーカー遺伝子を発現する組換えＲＰＶ用のスクリーン」）を発現する組換えＲＰＶ用のスクリーン」によって組換え体についてスクリーニングした。ウイルスを、プラーク精製し、そして５回継代させた。複数回の青色／緑色プラーク精製の最終結果は、組換えウイルスＦＨＶ０５３であった。

Ｓ−ＳＰＶ２７５：
Ｓ−ＳＰＶ２７５は、５つの外来遺伝子を発現する組換え豚痘ウイルスである。９９２−２３．６と表される相同ベクターを、以下のとおり構築した：ネコＣＤ８６およびＣＤ８０遺伝子は、合成後期ポックスプロモーターＬＰ１の制御下でビシストロンＤＮＡカセット中で発現され、それにより、ＣＤ８６およびＣＤ８０の両方の転写が起動され、そして２つの開放読取枠の間にＥＭＣＶ ＩＲＥＳ要素を含んだ。Ｅ．ｃｏｌｉ β−グルクロニダーゼ遺伝子は、合成ポックス前期プロモーターＥＰ２の制御下にある。使用される親のウイルスは、Ｓ−ＳＰＶ０４６であったが、それは、合成後期／初期プロモーターＬＰ２ＥＰ２によって促進されるＦＩＶｇａｇ／プロテアーゼ遺伝子を含み、そしてβ−ガラクトシダーゼ遺伝子は、構造的ポックスプロモーター０１Ｌの制御下にある。ＦＩＶｇａｇ／プロテアーゼ、およびβ−ガラクトシダーゼ遺伝子を、ＳＰＶ部分的ＨｉｎｄＩＩＩ Ｍ断片に挿入した一方で、ＣＤ８６／ＣＤ８０およびβ−グルクロニダーゼ遺伝子を、ＳＰＶ部分的ＨｉｎｄＩＩＩ Ｋ断片に挿入した。

Ｓ−ＳＰＶ２７５は、Ｓ−ＳＰＶ０４６から誘導された。これは、「組換えＳＰＶを発生する相同な組換え手段」で相同なベクター９２２−２３．６およびＳ−ＳＰＶ０４６を利用して達成された。形質移入保存物を、「ｂ−グルクロニダーゼ（Ｘ−ＧＬＵＣアッセイ）を発現する組換えＳＰＶ用のスクリーン」によってスクリーニングした。複数回の青色／緑色プラークについての精製の最終結果は、組換えウイルスＳＰＶ２７５であった。

Ｓ−ＳＰＶ２７５を、「黒色プラーク」分析によってＦＩＶｇａｇ、およびマーカー遺伝子、β−グルクロニダーゼの発現について分析した。ＦＩＶｇａｇのためのマウスのモノクローナル抗体（カスタム・モノクローナルズ、カリフォルニア州）を使用して、精製Ｓ−ＳＰＶ２７５で感染されたＥＳＫ−４細胞で発生される１００％のプラークは、ＦＩＶｇａｇを発現していると決定され、そして５継代後に安定である。

ＦＩＶｇａｇについてのマウス・モノクローナル、およびネコＣＤ８６およびＣＤ８０についてのヤギのポリクローナル抗ヒトＣＤ８６およびＣＤ８０抗体（アール・アンド・ディー・システムズ、ＭＮ）を使用して、ＦＩＶｇａｇ、ＣＤ８６およびＣＤ８０の発現が「ウエスタンブロット」分析で確認された。２つの異なるバンドが、ＦＩＶｇａｇに特異的な５０ｋｄａおよび２７ｋｄａで検出された。ネコＣＤ８６に特異的な４０ｋＤａから７０ｋＤａまでの範囲にある多重バンドを検出し、そしてネコＣＤ８０に特異的な３０ｋＤａから６０ｋＤａまでの範囲にあるバンドを検出した。

Ｓ−ＦＨＶ０４０：
Ｓ−ＦＨＶ０４０は、５つの外来遺伝子を発現する組換えネコ・ヘルペスウイルスである。９５７−８７．Ａ１と表される相同ベクターを、以下のとおり構築した：ネコＣＤ８６およびＣＤ８０遺伝子は、サイトメガロウイルス即時型プロモーター（ＣＭＶ ＩＥ）の制御下でビシストロンＤＮＡカセット中で発現され、それにより、ＣＤ８６およびＣＤ８０の転写が起動され、そして２つの開放読取枠の間にＥＭＣＶ ＩＲＥＳ要素を含んだ。β−グルクロニダーゼ遺伝子は、感染性喉頭気管炎ウイルスｇＩプロモーターの制御下にある。ＣＤ８０、ＣＤ８６およびβ−グルクロニダーゼ遺伝子を、ｇＬの間で、そして転写アクチベーター遺伝子に隣接するＦＨＶの部分的ＳａｌＩ Ｈ断片から誘導される特徴的なＥｃｏＲＩ部位中のＦＨＶの特徴的な長い領域に挿入した。使用される親のウイルスは、ＣＭＶ ＩＥ促進ＦｅＬＶｇａｇ遺伝子、および偽狂犬病ｇＸプロモーター下にあるＥ．ｃｏｌｉ β−ガラクトシダーゼ遺伝子を含むＳ−ＦＨＶ０１９であった。両方の遺伝子は、ＦＨＶ特徴的な短い（ＵＳ）ｇＥ欠失部位に配置される。

Ｓ−ＦＨＶ０４０は、Ｓ−ＦＨＶ０１９から誘導された。これは、「組換えＦＨＶを発生する相同な組換え手段」で相同なベクター９８７−５７．Ａ１およびウイルスＳ−ＦＨＶ０１９を利用して達成された。形質移入保存物を、「ｂ−グルクロニダーゼ（Ｘ−ＧＬＵＣアッセイ）を発現する組換えＦＨＶ用のスクリーン」によってスクリーニングした。複数回の緑色／青色プラークについての精製の最終結果は、組換えウイルスＳ−ＦＨＶ０４０であった。

Ｓ−ＦＨＶ０４０を、「黒色プラーク」分析によってＦＩＶｇａｇ、およびマーカー遺伝子、β−グルクロニダーゼおよびβ−ガラクトシダーゼの発現について分析した。ＣＲＦＫ細胞で発生される１００％のプラークは、β−グルクロニダーゼおよびβ−ガラクトシダーゼを発現していると決定された。ＦｅＬＶｇａｇの発現も、ＦｅＬＶｇｐ２７（バイオデザイン、ＭＥ）に対するヤギ・ポリクローナル抗体を用いて「黒色プラーク」分析によって確認した。このウイルスは、５継代後安定しているようである。

ネコＣＤ８０、ＣＤ８６、およびＦｅＬＶｇａｇの発現が、「ウエスタンブロット」分析で確認された。ヤギのポリクローナル抗ヒトＣＤ８０およびＣＤ８６抗体（アール・アンド・ディー・システムズ、ＭＮ）を、ネコＣＤ８０およびＣＤ８６のために使用した。ネコＣＤ８０に特異的な３０ｋＤａから６０ｋＤａまでの範囲にある多重バンドを検出し、そしてネコＣＤ８６に特異的な４０ｋＤａから７０ｋＤａまでの範囲にあるバンドを検出した。ＦｅＬＶｇｐ２７に対するヤギのポリクローナル抗体バイオデザイン、ＭＥ）を使用することによって、ＦｅＬＶの発現を確認した。

Ｓ−ＦＨＶ０４２：
Ｓ−ＦＨＶ０４２は、５つの外来遺伝子を発現する組換えネコ・ヘルペスウイルスである。９５７−８７．Ａ１と表される相同ベクターを、以下のとおり構築した：ネコＣＤ８０およびＣＤ８６遺伝子は、サイトメガロウイルス即時型プロモーター（ＣＭＶ ＩＥ）の制御下でビシストロンＤＮＡカセット中で発現され、それにより、ＣＤ８０およびＣＤ８６の転写が起動され、そして２つの開放読取枠の間にＥＭＣＶ ＩＲＥＳ要素を含んだ。β−グルクロニダーゼ遺伝子は、感染性喉頭気管炎ウイルスｇＩプロモーターの制御下にある。ＣＤ８０、ＣＤ８６およびβ−グルクロニダーゼ遺伝子を、ｇＬの間で、そして転写アクチベーター遺伝子に隣接するＦＨＶの部分的ＳａｌＩ Ｈ断片から誘導される特徴的なＥｃｏＲＩ部位中のＦＨＶの特徴的な長い領域に挿入した。親のウイルスは、ＣＭＶ ＩＥ促進ＦｅＬＶエンベロープ遺伝子、および偽狂犬病ｇＸプロモーター下にあるＥ．ｃｏｌｉ β−ガラクトシダーゼ遺伝子を含むＦＨＶ０１８であった。両方の遺伝子は、ＦＨＶ特徴的な短い（ＵＳ）ｇＥ欠失部位に配置される。

Ｓ−ＦＨＶ０４２は、Ｓ−ＦＨＶ０１８から誘導された。これは、「組換えＦＨＶを発生する相同な組換え手段」で相同なベクター９８７−５７．Ａ１およびウイルスＳ−ＦＨＶ０１８を利用して達成された。形質移入保存物を、「ｂ−グルクロニダーゼ（Ｘ−ＧＬＵＣアッセイ）を発現する組換えＦＨＶ用のスクリーン」によってスクリーニングした。複数回の緑色／青色プラークについての精製の最終結果は、組換えウイルスＳ−ＦＨＶ０４２であった。Ｓ−ＦＨＶ０４２を、「黒色プラーク」分析によってＦＩＶｅｎｖ、およびマーカー遺伝子、β−グルクロニダーゼおよびβ−ガラクトシダーゼの発現について分析した。ＣＲＦＫ細胞で発生される１００％のプラークは、β−グルクロニダーゼおよびβ−ガラクトシダーゼを発現していると決定された。ＦｅＬＶｅｎｖの発現は、ＦｅＬＶｇｐ７０に対するマウスのモノクローナル抗体（バイオデザイン、ＭＥ）を用いて「黒色プラーク」分析によって確認した。このウイルスは、５継代後安定していた。

ネコＣＤ８０、ＣＤ８６、およびＦｅＬＶｅｎｖの発現が、「ウエスタンブロット」分析で確認された。ヤギのポリクローナル抗ヒトＣＤ８０およびＣＤ８６抗体（アール・アンド・ディー・システムズ、ＭＮ）を、ネコＣＤ８０およびＣＤ８６のために使用した。ネコＣＤ８０に特異的な３０ｋＤａから６０ｋＤａまでの範囲にある多重バンドを検出し、そしてネコＣＤ８６に特異的な４０ｋＤａから７０ｋＤａまでの範囲にあるバンドであった。ｇｐ７０に対するマウスのモノクローナル抗体（バイオデザイン、ＭＥ）を使用することによって、１００ｋＤａのＦｅＬＶｅｎｖバンドを確認した。

Ｓ−ＦＨＶ０４４：
Ｓ−ＦＨＶ０４４は、５つの外来遺伝子を発現する組換えネコ・ヘルペスウイルスである。９５７−８７．Ａ１と表される相同ベクターを、以下のとおり構築した：ネコＣＤ８０およびＣＤ８６遺伝子は、サイトメガロウイルス即時型プロモーター（ＣＭＶ ＩＥ）の制御下でビシストロンＤＮＡカセット中で発現され、それにより、ＣＤ８０およびＣＤ８６の転写が起動され、そして２つの開放読取枠の間にＥＭＣＶ ＩＲＥＳ要素を含んだ。β−グルクロニダーゼ遺伝子は、感染性喉頭気管炎ウイルスｇＩプロモーターの制御下にある。ＣＤ８０、ＣＤ８６およびβ−グルクロニダーゼ遺伝子を、ｇＬの間で、そして転写アクチベーター遺伝子に隣接するＦＨＶの部分的ＳａｌＩ Ｈ断片から誘導される特徴的なＥｃｏＲＩ部位中のＦＨＶの特徴的な長い領域に挿入した。親のウイルスは、ＣＭＶ ＩＥ促進ＦＩＶｇａｇ／プロテアーゼ（プロテアーゼ遺伝子の５つのプライム末端での９つのアミノ酸欠失と共に）、および偽狂犬病ｇＸプロモーター下にあるＥ．ｃｏｌｉ β−ガラクトシダーゼ遺伝子を含むＳ−ＦＨＶ０１６であった。両方の遺伝子は、ＦＨＶ特徴的な短い（ＵＳ）ｇＥ欠失部位に配置される。

Ｓ−ＦＨＶ０４４は、Ｓ−ＦＨＶ０１６から誘導された。これは、「組換えＦＨＶを発生する相同な組換え手段」で相同なベクター９８７−５７．Ａ１およびウイルスＳ−ＦＨＶ０１６を利用して達成された。形質移入保存物を、「β−グルクロニダーゼ（Ｘ−ＧＬＵＣアッセイ）を発現する組換えＦＨＶ用のスクリーン」によってスクリーニングした。複数回の緑色／青色プラークについての精製の最終結果は、組換えウイルスＳ−ＦＨＶ０４４であった。Ｓ−ＦＨＶ０４４を、「黒色プラーク」分析によってＦＩＶｇａｇ、およびマーカー遺伝子、β−グルクロニダーゼおよびβ−ガラクトシダーゼの発現について分析した。ＣＲＦＫ細胞で発生される１００％のプラークは、マウスのモノクローナル抗体（バイオデザイン、ＭＥ）を利用する両方のマーカー遺伝子を発現していると決定された。ＦｅＬＶｇａｇの発現も、ＦｅＬＶｇｐに対するマウスのモノクローナル抗体（カスタム・モノクローナル、カリフォルニア州）を用いて「黒色プラーク」分析によって確認した。このウイルスは、５継代後安定していた。

ネコＣＤ８０、ＣＤ８６、およびＦｅＬＶｇａｇの発現が、「ウエスタンブロット」分析で確認された。ヤギのポリクローナル抗ヒトＣＤ８０およびＣＤ８６抗体（アール・アンド・ディー・システムズ、ＭＮ）を、ネコＣＤ８０およびＣＤ８６のために使用した。ネコＣＤ８０に特異的な３０ｋＤａから６０ｋＤａまでの範囲にある多重バンドを検出し、そしてネコＣＤ８６に特異的な４０ｋＤａから７０ｋＤａまでの範囲にあるバンドであった。２つの異なるバンドが、モノクローナル抗体ＦＩＶｇａｇ抗体を使用して、ＦＩＶｇａｇに特異的な５０ｋＤａと２７ｋＤａであると検出した。

表２： ＣＤ８０および／またはＣＤ８６、またはＣＤ２８をコードする
遺伝子を含むＳＰＶ組換えウイルス

表３： ＣＤ８０および／またはＣＤ８６、およびＣＤ２８をコードする
遺伝子を含むＲＰＶ組換えウイルス

表４： ＣＤ８０および／またはＣＤ８６、およびＣＤ２８をコードする
遺伝子を含むＦＨＶ組換えウイルス

ＦＩＶまたはＦＥＬＶの部分的に、または全長のゲノムと共に同時ベクター化ネコＣＤ８０およびＣＤ８６などを含む別の例
注：ＦＩＶおよび／またはＦＩＶの部分または全ゲノム補体と共に、そしてネコＩＬ−１２ｐ３５およびｐ４０と共に、またはなしに、組換えウイルス中にＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＴＬＡ−４またはＣＤ２８を含む組換えウイルス性ベクター。これらの組換えウイルスは、ネコ科でのＦＩＶおよびＦｅＬＶ疾病に対するワクチンとして能力を示す。

１．ＦＩＶの全長または部分ゲノムを含む組換え豚痘ウイルス中でのネコＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ２８およびＣＴＬＡ−４単独または任意の組合せの発現。

２．ＦＩＶの全長または部分ゲノムを含む組換えネコヘルペスウイルス中でのネコＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ２８およびＣＴＬＡ−４単独または任意の組合せの発現。

３．ＦＩＶの全長または部分ゲノムを含む組換えアライグマ痘ウイルス中でのネコＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ２８およびＣＴＬＡ−４単独または任意の組合せの発現。

４．ＦｅＬＶの全長または部分ゲノムを含む組換え豚痘ウイルス中でのネコＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ２８およびＣＴＬＡ−４単独または任意の組合せの発現。

５．ＦｅＬＶの全長または部分ゲノムを含む組換えネコヘルペスウイルス中でのネコＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ２８およびＣＴＬＡ−４単独または任意の組合せの発現。

６．ＦｅＬＶの全長または部分ゲノムを含む組換えアライグマ痘ウイルス中でのネコＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ２８およびＣＴＬＡ−４単独または任意の組合せの発現。

７．ＦＩＶの全長または部分ゲノムおよびネコＩＬ１２、ＧＭ−ＣＳＦ、ｐ３５およびｐ４０についてのゲノムを含む組換え豚痘ウイルス中でのネコＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ２８およびＣＴＬＡ−４単独または任意の組合せの発現。

８．ＦＩＶの全長または部分ゲノムおよびネコＩＬ１２、ＧＭ−ＣＳＦ、ｐ３５およびｐ４０についてのゲノムを含む組換えネコヘルペスウイルス中でのネコＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ２８およびＣＴＬＡ−４単独または任意の組合せの発現。

９．ＦＩＶの全長または部分ゲノムおよびネコＩＬ１２、ＧＭ−ＣＳＦ、ｐ３５およびｐ４０についてのゲノムを含む組換えアライグマ痘ウイルス中でのネコＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ２８およびＣＴＬＡ−４単独または任意の組合せの発現。

１０．ＦｅＬＶの全長または部分ゲノムおよびネコＩＬ１２、ＧＭ−ＣＳＦ、ｐ３５およびｐ４０についてのゲノムを含む組換え豚痘ウイルス中でのネコＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ２８およびＣＴＬＡ−４単独または任意の組合せの発現。

１１．ＦｅＬＶの全長または部分ゲノムおよびネコＩＬ１２、ＧＭ−ＣＳＦ、ｐ３５およびｐ４０についてのゲノムを含む組換えネコヘルペスウイルス中でのネコＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ２８およびＣＴＬＡ−４単独または任意の組合せの発現。

１２．ＦＩＶの全長または部分ゲノムおよびネコＩＬ１２、ＧＭ−ＣＳＦ、ｐ３５およびｐ４０についてのゲノムを含む組換えアライグマ痘ウイルス中でのネコＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ２８およびＣＴＬＡ−４単独または任意の組合せの発現。

表５： ＦＩＶゲノム（ΔＬＴＲｓ）およびネコＣＤ８０および／または
ＣＤ８６をコードする遺伝子含む組換えウイルス

例。

相同ベクター１００７−７０．Ａ２（ＳＰＶ Ｎ／ＣＭＶ−ＦＩＶゲノムΔＬＴＲ／Ｉ５Ｌ−ｌａｃＺ）：
相同ベクター１００７−７０．Ａ２を使用して、外来ＤＮＡをＳＰＶのＨｉｎｄＩＩＩ Ｎ挿入部位に挿入した。それは、フランキング長末端反復（ＬＴＲ）要素なしに、Ｅ．ｃｏｌｉ β−ガラクトシダーゼマーカー遺伝子および全長のＦＩＶゲノム（８．５ｋｂ）を組み込む。このカセットは、ＳＰＶ Ｈ．ＩＩＩ Ｎ断片内の非必須部位に相同なＳＰＶ ＤＮＡによって挟まれる。この相同ベクターは、「組換えＳＰＶを生成する相同組換え手段」によって使用されたとき、外来遺伝子をコードするＤＮＡを含むウイルスを生じる。β−ガラクトシダーゼマーカー遺伝子は、構造的ポックスプロモーターＩ５Ｌの制御下にあり、そしてＦＩＶゲノム（ΔＬＴＲ）は、サイトメガロウイルス即時型（ＣＭＶ ＩＥ）の制御下にあることに注目されたい。相同ベクターは、標準組換えＤＮＡ技術（Sambrookら）を利用して構築した。ＦＩＶゲノム（ΔＬＴＲ）は、「ポリメラーゼ連鎖反応を用いてクローニング」することによって合成した。ＰＣＲ反応についてのテンプレートは、全長ＦＩＶ ＰＰＲウイルスを含むプラスミドから得られる前ウイルス性ＤＮＡであった。上流プライマー（５’−ＡＣＧＣＧＴＣＧＡＣＣＡＧＣＴＡＡＣＡＡＧＧＴＡＧＧＡＧＡＧＡＣＴＣＴ−３’；１１／２３／９８ＢＷ．３）は、Ｇａｇコーディング領域の上流のＦＩＶゲノムの５’末端から合成し、そして特徴的なＳａｌＩ部位を導入する。下流プライマー（５’−ＴＣＧＡＧＴＣＧＡＣＴＴＧＴＧＡＣＡＧＴＴＣＴＴＡＧＴＣＣＡＴＡＡＧＣ−３’；１１／１１／９８ＢＷ．１）は、第二のＲｅｖエキソンの下流のＦＩＶゲノムの３’末端から合成し、そして特徴的なＳａｌＩ部位を導入する。

最終相同ベクター１００７．７０．Ａ２を使用して、「組換えＳＰＶ、ＲＰＶおよびＦＨＶを生成する相同組換え手段」によって、ＦＩＶゲノム（ＬＴＲなし）およびネコＣＤ８０およびＣＤ８６を含むか、ＦＩＶゲノム（マイナスＬＴＲ）およびネコＣＤ８０およびＣＤ８６およびネコＩＬ−１２ゲノムｐ３５およびｐ４０を含む組換えウイルスを作成した。

相同ベクター１００５−９５．１（ＲＰＶ Ｕ／ＣＭＶ−ＦＩＶゲノム（ΔＬＴＲ）／Ｉ５Ｌ−ｌａｃＺ）：
プラスミド１００５−９５．１を、外来ＤＮＡをＲＰＶに挿入する目的のために構築した。それは、ＰＲＶ ＤＮＡによって挟まれるＦＩＶゲノム−ΔＬＴＲおよびＥ．ｃｏｌｉ β−グルクロニダーゼ遺伝子を組み込む。外来遺伝子の上流は、ＲＰＶ ＤＮＡのおよそ９０６塩基対断片である。外来遺伝子の下流は、ＲＰＶ ＤＮＡのおよそ８９５塩基対断片である。そのプラスミドは、「組換えＲＰＶを生成する相同組換え手段」によって使用されたとき、外来遺伝子をコードするＤＮＡを含むウイルスを生じる。ＦＩＶゲノム−ΔＬＴＲは、サイトメガロウイルス即時型ポックスプロモーターＥＰ２の制御下にあり、そしてＥ．ｃｏｌｉ β−グルクロニダーゼ遺伝子は、合成前期ポックスプロモーターＥＰ２の制御下にあることに注目されたい。相同ベクターは、以下の源から得られる制限断片を、合成ＤＮＡ配列と繋げることによって、標準組換えＤＮＡ技術（Sambrookら）を利用して構築した。プラスミドベクターは、ｐＳＰ６４（プロメガ）のおよそ２９９９塩基対ＨｉｎｄＩＩＩ制限断片から誘導された。断片１は、ＲＰＶ ＨｉｎｄＩＩＩ制限断片Ｕ（Ｋｎｉｇｈｔら）のおよそ９０６塩基対ＨｉｎｄＩＩＩからＸｂａＩまでの制限副断片である。断片２は、ＬＴＲ要素なしのＦＩＶゲノムのおよそ８．５ｋｂＳａｌＩ断片であり、そして「ポリメラーゼ連鎖反応を用いてクローニング」することによって合成した。ＰＣＲ反応についてのテンプレートは、全長ＦＩＶ ＰＰＲウイルスを含むプラスミドから得られる前ウイルス性ＤＮＡであった。上流プライマー（５’−ＡＣＧＣＧＴＣＧＡＣＣＡＧＣＴＡＡＣＡＡＧＧＴＡＧＧＡＧＡＧＡＣＴＣＴ−３’；１１／２３／９８ＢＷ．３）は、Ｇａｇコーディング領域の上流のＦＩＶゲノムの５’末端から合成し、そして特徴的なＳａｌＩ部位を導入する。下流プライマー（５’−ＴＣＧＡＧＴＣＧＡＣＴＴＧＴＧＡＣＡＧＴＴＣＴＴＡＧＴＣＣＡＴＡＡＧＣ−３’；１１／１１／９８ＢＷ．１）は、第二のＲｅｖエキソンの下流のＦＩＶゲノムの３’末端から合成し、そして特徴的なＳａｌＩ部位を導入する。断片３は、ＲＰＶ ＨｉｎｄＩＩＩ制限断片Ｕのおよそ８９５塩基対ＸｂａＩからＨｉｎｄＩＩＩまでの副断片である。最終相同ベクター１００５．９５．１を使用して、「組換えＳＰＶ、ＲＰＶおよびＦＨＶを生成する相同組換え手段」によって、ＦＩＶゲノム（ΔＬＴＲ）およびネコＣＤ８０およびＣＤ８６遺伝子を含む組換えウイルスを作成するか、ＦＩＶゲノム（ΔＬＴＲ）およびネコＣＤ８０およびＣＤ８６およびネコＩＬ−１２ゲノムｐ３５およびｐ４０を含む組換えウイルスを作成した。

相同ベクター１０１６−７４．Ａ６（ＦＨＶΔｇＥ／ＣＭＶ−ＦＩＶゲノム−ΔＬＴＲ／ｇＸ−ｌａｃＺ）：
相同ベクター１０１６−７４．Ａ６を、ネコ・ヘルペスウイルスからｇＥコーディング領域の一部を欠失する目的のために構築した。それは、ＦＨＶ ＤＮＡによって挟まれるＦＩＶゲノム（マイナスＬＴＲ）およびＥ．ｃｏｌｉ β−ガラクトシダーゼ遺伝子を組み込む。ＦＩＶゲノム−ΔＬＴＲは、サイトメガロウイルスＩＥプロモーターの制御下であり、そしてβ−ガラクトシダーゼマーカー遺伝子は、偽狂犬病ウイルスｇＸプロモーターの制御下にある。それは、標準組換えＤＮＡ技術（Sambrookら）を利用して例示のＤＮＡ源から構築された。プラスミドベクターは、ｐＳＰ１８／１９のおよそ２９５８塩基対Ａｓｐ７１８ＩからＡｓｐ７１８Ｉまでの制限エンドヌクレアーゼ断片である。断片１は、ＦＨＶ ＳａｌＩ Ｂ断片のおよそ１４１５塩基対のＡｓｐ７１８ＩからＳｍａＩまでの副断片である。断片２は、ＬＴＲ要素なしのＦＩＶゲノムのおよそ８．５ｋｂＳａｌＩ断片であり、そして「ポリメラーゼ連鎖反応を用いてクローニング」することによって合成した。ＰＣＲ反応についてのテンプレートは、全長ＦＩＶ ＰＰＲウイルスを含むプラスミドから得られる前ウイルス性ＤＮＡであった。上流プライマー（５’−ＡＣＧＣＧＴＣＧＡＣＣＡＧＣＴＡＡＣＡＡＧＧＴＡＧＧＡＧＡＧＡＣＴＣＴ−３’；１１／２３／９８ＢＷ．３）は、Ｇａｇコーディング領域の上流のＦＩＶゲノムの５’末端から合成する。下流プライマー（５’−ＴＣＧＡＧＴＣＧＡＣＴＴＧＴＧＡＣＡＧＴＴＣＴＴＡＧＴＣＣＡＴＡＡＧＣ−３’；１１／１１／９８ＢＷ．１）は、第二のＲｅｖエキソンの下流のＦＩＶゲノムの３’末端から合成し、そして特徴的なＳａｌＩ部位を導入する。断片３は、およそ３．５ｋｂのβ−ガラクトシダーゼ遺伝子断片である。断片４は、ＦＨＶ ＥｃｏＲＩ Ｅ断片のおよそ２２０５塩基対のＳａｌＩからＡｓｐ７１８Ｉまでの副断片である。最終相同ベクター１０１６．７４．Ａ６を使用して、「組換えＳＰＶ、ＲＰＶおよびＦＨＶを生成する相同組換え手段」によって、ＦＩＶゲノム（ΔＬＴＲ）およびネコＣＤ８０およびＣＤ８６遺伝子を含む組換えウイルスを作成するか、ＦＩＶゲノム（ΔＬＴＲ）およびネコＣＤ８０およびＣＤ８６およびネコＩＬ−１２ゲノムｐ３５およびｐ４０を含む組換えウイルスを作成した。

ＳＰＶ２８８：
ＳＰＶ２８８は、ＦＩＶゲノムに含まれるＯＲＦの全補体および４つの別の外来遺伝子を発現する組換え豚痘ウイルスである。ＳＰＶ２８８は、ＳＰＶ２８２から誘導された。ＳＰＶ２８２は、合成後期ポックスプロモーターＬＰ１の制御下でビシストロンＤＮＡカセット中で発現されるネコＣＤ８６遺伝子およびＣＤ８０遺伝子を含み、ＣＤ８０およびＣＤ８６の転写が起動され、そして２つの開放読取枠の間にＥＭＣＶ ＩＲＥＳ要素を含んだ。そして、Ｅ．ｃｏｌｉ β−グルクロニダーゼ遺伝子は、ＳＰＶ Ｈ．ＩＩＩ Ｋゲノム断片内の合成前期プロモーターＥＰ２の制御下にある。相同ベクター９９２−２３．６は、「組換えＲＰＶ、ＳＰＶまたはＦＨＶを生成する相同組換え手段」を利用して構築された。ＣＤ８０、ＣＤ８６およびＥ．ｃｏｌｉ β−グルクロニダーゼ遺伝子は、異なり、そして非必須のＳＰＶ部分ＨｉｎｄＩＩＩ Ｋ断片に挿入される。ＣＭＶ―ＦＩＶゲノムおよびβ−ガラクトシダーゼ遺伝子は、異なり、そして非必須のＳＰＶ部分ＨｉｎｄＩＩＩ Ｎ断片に挿入される。

ＳＰＶ２８８は、ＳＰＶ２８２から誘導された。これは、「組換えＲＰＶ、ＳＰＶまたはＦＨＶを発生する相同な組換え手段」で相同なベクター１００７−７０．Ａ２（上記参照）およびウイルスＳＰＶ２８２を利用して達成された。形質移入保存物を、「β−ガラクトシダーゼ（ブルーガルおよびＣＰＲＧアッセイ）またはβ−グルクロニダーゼ（Ｘ−ＧＬＵＣアッセイ）を発現する組換えＳＰＶ用のスクリーン」によってスクリーニングした。複数回の青色／緑色プラーク精製の最終結果は、組換えウイルスＳＰＶ２８８であった。

ＳＰＶ２８８を、「黒色プラーク」分析によって、ＦｅＬＶｇａｇ、ＦＩＶゲノムから得られるＦｅＬＶエンベロープおよびマーカー遺伝子、β−ガラクトシダーゼおよびβ−グルクロニダーゼの発現について分析した。精製ＳＰＶ２８０で感染したＥＳＫ−４細胞から発生される１００％のプラークは、ＦｅＬＶｇａｇについてのヤギのポリクローナル抗体（バイオデザイン、ＭＥ）およびＦｅＬＶエンベロープについてのマウスのモノクローナル抗体ｇｐ７０（バイオデザイン、ＭＥ）を利用して、ＦｅＬＶｇａｇおよびＦｅＬＶエンベロープを発現していると決定された。

ネコＣＤ８０およびＣＤ８６の発現は、それぞれ、ヤギのポリクローナル抗ヒトＣＤ８０およびＣＤ８６抗体（アール・アンド・ディー・システムズ、ＭＮ）を用いて、「ウエスタン・ブロット」分析で確認された。ネコＣＤ８０に特異的な３０ｋＤａから６０ｋＤａまでのサイズの範囲にある多重バンドを検出し、そしてネコＣＤ８６に特異的な４０ｋＤａから７０ｋＤａまでの範囲にあるバンドを検出した。これらのバンドは、ＥＳＫ−４細胞中のＳＰＶの内容物で発現されるＣＤ８０およびＣＤ８６の選択的で複数のグリコシル化パターンを表す。ＦＩＶゲノムでコードされるタンパク質の発現は、ＦＩＶで感染されたネコから得られるネコ血清を使用して、「ウエスタンブロット」分析で確認された。

ＦＨＶ０５４：
ＦＨＶ０５４は、ＦＩＶゲノムに含まれるＯＲＦの全補体および２つの別の外来遺伝子を発現する組換えネコ・ヘルペスウイルスである。１０１６−７５．Ｂ１と表される相同ベクターを、ＦＩＶゲノム（ΔＬＴＲ）およびβ−ガラクトシダーゼを、ＦＨＶ特徴的長い部分的ＳａｌＨ断片に挿入する目的のために構築した。

その挿入は、ｇＬ遺伝子と隣接の転写アクチベーター遺伝子との間にある。

ＦＩＶゲノムは、ＣＭＶ ＩＥプロモーターの制御下にある。そしてβ−ガラクトシダーゼ遺伝子は、偽狂犬病ｇＸプロモーター要素の制御下にある。

ＦＨＶ０５４は、ＦＨＶ０３０から誘導され、それは、ＦＨＶｇＥ欠失部位にネコＣＤ８０遺伝子を含んだ。これは、「組換えＲＰＶ、ＳＰＶまたはＦＨＶを発生する相同な組換え手段」で相同なベクター１０１６−７５．Ｂ１およびウイルスＦＨＶ０３０を利用して達成された。形質移入保存物を、「β−ガラクトシダーゼ（ブルーガルおよびＣＰＲＧアッセイ）またはβ−グルクロニダーゼ（Ｘ−ＧＬＵＣアッセイ法）を発現する組換えＦＨＶ用のスクリーン」によってスクリーニングした。複数回の青色／緑色プラーク精製の最終結果は、組換えウイルスＦＨＶ０５４であった。

ＦＨＶ０５４を、「黒色プラーク」分析によってβ−ガラクトシダーゼの発現について分析した。プラーク精製ＦＨＶ０５４で感染されたＣＲＦＫ細胞から得られる１００％のプラークは、マウスのモノクローナル抗体（バイオデザイン、ＭＥ）を利用するβ−ガラクトシダーゼを発現していると決定された。このウイルスは、少なくとも５継代後安定していると決定された。

ネコＣＤ８０、ＦＩＶｇａｇおよびＦＩＶエンベロープの発現は、ポリクローナル抗ヒトＣＤ８０抗体（アール・アンド・ディー・システムズ、ＭＮ）、マウスのモノクローナル抗ＦＩＶｇａｇ抗体（カスタム・モノクローナル、カリフォルニア州）およびマウスのモノクローナル抗ＩＦＶエンベロープ抗体（バイオデザイン）を利用いて、「ウエスタン・ブロット」分析で確認された。ゲノム中でコードされるＦＩＶ遺伝子の全補体の発現は、ＦＩＶ感染ネコから得られる回復期ネコ血清を利用して、「ウエスタンブロット」分析で確認された。

ＦＨＶ０５５：
ＦＨＶ０５５は、ＦＩＶゲノムに含まれるＯＲＦの全補体および３つの別の外来遺伝子を発現する組換えネコ・ヘルペスウイルスである。１０１６−７５．Ｂ１と表される相同ベクターを、ＦＩＶゲノム（ΔＬＴＲ）およびβ−ガラクトシダーゼを、ＦＨＶ特徴的長い部分的ＳａｌＨ断片に挿入する目的のために構築した。

その挿入は、ＦＨＶｇＬ遺伝子と隣接の転写アクチベーター遺伝子との間にある。

ＦＩＶゲノムは、ＣＭＶ ＩＥプロモーターの制御下にある。そしてＥ．ｃｏｌｉ β−ガラクトシダーゼ遺伝子は、偽狂犬病ｇＸプロモーター要素の制御下にある。

ＦＨＶ０５５は、ＦＨＶ０４１から誘導され、それは、ＦＨＶｇＥ欠失部位にネコＣＤ８６遺伝子およびβ−グルクロニダーゼ遺伝子を含んだ。ネコＣＤ８６は、ＦＨＶｇＥプロモーターの制御下にあり、そしてβ−グルクロニダーゼ遺伝子は、偽狂犬病ウイルスｇＸプロモーターの制御下にある。これは、「組換えＲＰＶ、ＳＰＶまたはＦＨＶを発生する相同な組換え手段」で相同なベクター１０１６−７５．Ｂ１およびウイルスＦＨＶ０４１を利用して達成された。形質移入保存物を、「β−ガラクトシダーゼ（ブルーガルおよびＣＰＲＧアッセイ）またはβ−グルクロニダーゼ（Ｘ−ＧＬＵＣアッセイ法）を発現する組換えＦＨＶ用のスクリーン」によってスクリーニングした。複数回の青色／緑色プラーク精製の最終結果は、組換えウイルスＦＨＶ０５５であった。

ＦＨＶ０５５を、「黒色プラーク」分析によってβ−ガラクトシダーゼおよびβ−グルクロニダーゼの発現について分析した。プラーク精製ＦＨＶ０５５で感染されたＣＲＦＫ細胞から得られる１００％のプラークは、それぞれ、マウスのモノクローナル抗体（バイオデザイン、ＭＥ）およびウサギのポリクローナル（モレキュラー・プローブス、オレゴン州）を利用するβ−ガラクトシダーゼおよびβ−グルクロニダーゼを発現していると決定された。このウイルスは、５継代後安定していると決定された。

ネコＣＤ８６、ＦＩＶｇａｇおよびＦＩＶエンベロープの発現は、ポリクローナル抗ヒトＣＤ８６抗体（アール・アンド・ディー・システムズ、ＭＮ）、マウスのモノクローナル抗ＦＩＶｇａｇ抗体（カスタム・モノクローナル、カリフォルニア州）およびマウスのモノクローナル抗ＩＦＶエンベロープ抗体（バイオデザイン）を利用いて、「ウエスタン・ブロット」分析で確認された。ゲノム中でコードされるＦＩＶ遺伝子の全補体の発現は、ＦＩＶ感染ネコから得られる回復期ネコ血清を利用して、「ウエスタンブロット」分析で確認された。

ＲＰＶ０５５：
ＲＰＶ０５５は、ＦＩＶゲノムに含まれるＯＲＦの全補体および４つの別の外来遺伝子を発現する組換えアライグマ痘ウイルスである。ＲＰＶ０５５は、ＲＰＶ０４５から誘導され、そしてそれは、合成後期ポックスプロモーターＬＰ１の制御下でビシストロンＤＮＡカセット中で発現されるネコＣＤ８６遺伝子およびＣＤ８０遺伝子を含み、ＣＤ８０およびＣＤ８６の転写が起動され、そして２つの開放読取枠の間にＥＭＣＶ ＩＲＥＳ要素を含んだ。そして、Ｅ．ｃｏｌｉ β−グルクロニダーゼ遺伝子は、ＲＰＶ Ｈ．ＩＩＩ Ｎゲノム部分的断片内の合成前期プロモーターＥＰ２の制御下にある。相同ベクター１００５−９５．１を使用して、「組換えＲＰＶ、ＳＰＶまたはＦＨＶを生成する相同組換え手段」を利用して構築した。ＣＤ８０、ＣＤ８６およびＥ．ｃｏｌｉ β−ガラクトシダーゼ遺伝子は、異なり、そして非必須のＲＰＶ部分的ＨｉｎｄＩＩＩ Ｎ断片に挿入される。ＣＭＶ―ＦＩＶゲノムおよびβ−グルクロニダーゼ遺伝子は、異なり、そして非必須のＲＰＶ部分的ＨｉｎｄＩＩＩ Ｕ断片に挿入される。

ＲＰＶ０５５は、ＲＰＶ０４５から誘導された。これは、「組換えＲＰＶ、ＳＰＶまたはＦＨＶを発生する相同な組換え手段」で相同なベクター１００５−９５．１およびウイルスＲ ＰＶ０４５を利用して達成された。形質移入保存物を、「β−ガラクトシダーゼ（ブルーガルおよびＣＰＲＧアッセイ）またはβ−グルクロニダーゼ（Ｘ−ＧＬＵＣアッセイ）を発現する組換えＳＰＶ用のスクリーン」によってスクリーニングした。複数回の青色／緑色プラーク精製の最終結果は、組換えウイルスＲＰＶ０５５であった。

ＲＰＶ０５５を、「黒色プラーク」分析によって、ＦｅＬＶｇａｇ、ＦＩＶゲノムから得られるＦｅＬＶエンベロープおよびマーカー遺伝子、β−ガラクトシダーゼおよびβ−グルクロニダーゼの発現について分析した。精製ＲＰＶ０５５で感染したＶＥＲＯ細胞から発生される１００％のプラークは、ＦｅＬＶｇａｇについてのヤギのポリクローナル抗体（バイオデザイン、ＭＥ）およびＦｅＬＶエンベロープについてのマウスのモノクローナル抗体ｇｐ７０（バイオデザイン、ＭＥ）を利用して、ＦｅＬＶｇａｇおよびＦｅＬＶエンベロープを発現していると決定された。

ネコＣＤ８０およびＣＤ８６の発現は、それぞれ、ヤギのポリクローナル抗ヒトＣＤ８０およびＣＤ８６抗体（アール・アンド・ディー・システムズ、ＭＮ）を利用いて、「ウエスタン・ブロット」分析で確認された。ネコＣＤ８０に特異的な３０ｋｄａから６０ｋｄａまでのサイズの範囲にある多重バンドを検出し、そしてネコＣＤ８６に特異的な４０ｋｄａから７０ｋｄａまでのサイズの範囲にある多重バンドを検出した。これらのバンドは、ＶＥＲＯ細胞中のＲＰＶの内容物中で発現されたＣＤ８０およびＣＤ８６の選択的で複数のグリコシル化パターンを表す。ＦＩＶゲノム中でコードされるタンパク質の発現は、ＦＩＶで感染されたネコから得られるネコ血清を用いて、「ウエスタン・ブロット」分析で確認された。

参照文献

Claims (36)

1. ウイルスのウイルス性ゲノムにおける非必須領域内に挿入された少なくとも１つの外来核酸を含む組換えウイルスであって、このような外来核酸のそれぞれが、（ａ）ネコＣＤ２８タンパク質またはその免疫原部分、ネコＣＤ８０タンパク質またはその免疫原部分、ネコＣＤ８６タンパク質またはその免疫原部分、またはネコＣＴＬＡ−４タンパク質またはその免疫原部分の群から選択されるタンパク質をコードし、そして（ｂ）前記組換えウイルスが適切な宿主に導入されたときに発現される能力があることを特徴とする組換えウイルス。
2. 少なくとも２つの外来核酸を含み、その各々が、前記ウイルス性ゲノムの非必須領域内に挿入される請求項１に記載の組換えウイルス。
3. 少なくとも３つの外来核酸を含み、その各々が、前記ウイルス性ゲノムの非必須領域内に挿入される請求項２に記載の組換えウイルス。
4. 少なくとも４つの外来核酸を含み、その各々が、前記ウイルス性ゲノムの非必須領域内に挿入される請求項３に記載の組換えウイルス。
5. 前記ウイルスが、アライグマ痘ウイルス、豚痘ウイルスまたはネコヘルペスウイルスである請求項１に記載の組換えウイルス。
6. １つ以上の外来核酸を含み、その各外来核酸が、同じ非必須領域に挿入される請求項１〜５の何れか１項に記載の組換えウイルス。
7. １つ以上の前記外来核酸を含み、その全ての外来核酸が同じ非必須領域に挿入される請求項１〜５の何れか１項に記載の組換えウイルス。
8. さらに、病原体に由来する免疫原をコードする外来核酸を含む請求項１〜７の何れか１項に記載の組換えウイルス。
9. 前記病原体が、ネコ病原体、狂犬病ウイルス、クラミジア、タキソプラスモシス・ゴンジ(Taxoplasmosis gondii)、ジロフィラリア・イミチス(Dirofilaria immitis)、ノミ、または細菌性病原体である請求項８に記載の組換えウイルス。
10. 前記ネコ病原体が、ネコ免疫不全ウイルス（ＦＩＶ）、ネコ白血病ウイルス（ＦｅＬＶ）、ネコ感染性腹膜炎ウイルス（ＦＩＰ）、ネコ汎白血球減少症、ネコカルシウイルス、ネコレオウイルス３型、ネコロタウイルス、ネココロナウイルス、ネコシンチウムウイルス、ネコ肉腫ウイルス、ネコヘルペスウイルス、ネコボロン病ウイルス、またはネコ寄生生物である請求項９に記載の組換えウイルス。
11. 少なくとも１つの前記外来核酸が、該外来核酸を発現するためのプロモーターを含む請求項１〜７の何れか１項に記載の組換えウイルス。
12. 少なくとも１つの前記外来核酸の発現が、前記ウイルスに対して内因性のプロモーターの制御下にある請求項１〜７の何れか１項に記載の組換えウイルス。
13. さらに、検出可能なマーカーをコードする外来核酸を含む、請求項１〜１０の何れか１項に記載の組換えウイルス。
14. 前記検出可能なマーカーが、Ｅ．ｃｏｌｉベータ・ガラクトシダーゼである請求項１３に記載の組換えウイルス。
15. 前記ネコ病原体から得られる免疫原が、ＦＩＶｇａｇプロテアーゼ、ＦＩＶエンベロープタンパク質、ＦｅＬＶｇａｇプロテアーゼ、またはＦｅＬＶエンベロープタンパク質である請求項１０に記載の組換えウイルス。
16. 前記ウイルスがネコヘルペスウイルスであり、前記非必須領域がネコヘルペスウイルスの糖タンパク質Ｇ遺伝子である、請求項１〜７の何れか１項に記載の組換えウイルス。
17. Ｓ−ＦＨＶ−０３１（ＡＴＴＣ受託番号ＶＲ−２６０４）と称される、請求項１２に記載の組換えネコヘルペスウイルス。
18. 前記ウイルスが豚痘ウイルスであり、前記非必須領域が、豚痘ウイルスのＨｉｎｄＩＩＩＭ断片の大型ＨｉｎｄＩＩＩからＢｇｌＩＩまでの副断片である請求項１〜７の何れか１項に記載の組換えウイルス。
19. Ｓ−ＳＰＶ−２４６（ＡＴＴＣ受託番号ＶＲ−２６０３）と称される、請求項１４に記載の組換えネコ豚痘ウイルス。
20. ＣＤ２８、ＣＤ８０またはＣＤ８６タンパク質の一部が、そのタンパク質の可溶性部分である請求項１〜７の何れか１項に記載の組換えウイルス。
21. 前記外来核酸が、ネコＣＴＬＡ−４タンパク質をコードする請求項１〜７の何れか１項に記載の組換えウイルス。
22. 請求項１〜１９の何れか１項に記載の組換えウイルスの免疫感作有効量、および適切な担体を含むことを特徴とするワクチン。
23. 前記組換えウイルスの免疫感作有効量が、約１×１０^５ｐｆｕ／ｍｌと約１×１０ｃｆｕ／ｍｌの間の量である請求項２２に記載のワクチン。
24. さらに、前記組換えウイルスとの混合物と混合された、免疫感作有効量の第二の免疫原を含む請求項２２に記載のワクチン。
25. ネコに、免疫感作有効量の請求項１〜１９の何れか１項の組換えウイルスを投与することを特徴とする、ネコでの免疫応答を増強する方法。
26. ネコに、免疫感作有効量の請求項１〜１９の何れか１項の組換えウイルスを投与することを特徴とする、ネコを免疫化する方法。
27. ネコに、免疫感作有効量の請求項２０または２１の組換えウイルスを投与することを特徴とする、ネコにおける免疫応答を抑制する方法。
28. 前記投与が、静脈、皮下、筋肉内、経筋肉、局所、経口または腹膜組織内投与を含む請求項２４〜２６の何れか１項の方法。
29. ネコが、移殖臓器または組織のレシピエントであるか、または免疫応答に悩まされている請求項２７に記載の方法。
30. （ａ）ネコＣＤ２８ｍＲＮＡ転写物、（ｂ）ネコＣＤ８０転写物、または（ｃ）ネコＣＤ８６ｍＲＮＡ転写物に対してハイブリダイズし、その翻訳を阻害する能力のあるアンチセンス核酸をネコに投与することを含み、前記アンチセンス核酸は前記翻訳を阻害するのに有効な量で存在し、それによりネコにおける免疫応答を抑制する、ネコにおける免疫応答を抑制する方法。
31. ネコにおける腫瘍に請求項１の組換えウイルスを投与することを含み、前記核酸は腫瘍を減少または排除するのに有効な量で、ネコＣＤ８０タンパク質、ネコＣＤ８６タンパク質またはその組合せをコードする、ネコにおける腫瘍を減少または排除する方法。
32. 前記組換えウイルスがさらに、ネコ腫瘍に関連した抗原を含み且つこれを発現する能力があり、そしてその投与が全身投与で行われる、請求項３１に記載の方法。
33. さらに、ネコ免疫不全ウイルスゲノムまたはその部分をコードする核酸を含む、請求項１に記載の組換えウイルス。
34. さらに、ネコ白血病ウイルスゲノムまたはその一部をコードする核酸を含む、請求項１に記載の組換えウイルス。
35. さらに、ネコＩＬ１２、ｐ３５またはｐ４０をコードする核酸を含む、請求項３３または３４に記載の組換えウイルス。
36. 請求項３３または３４の組換えウイルスの免疫感作有効量、および適切な担体を含むワクチン。

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