PL199359B1 - Rekombinowany wirus, zastosowanie rekombinowanego wirusa i zastosowanie antysensownego kwasu nukleinowego - Google Patents

Rekombinowany wirus, zastosowanie rekombinowanego wirusa i zastosowanie antysensownego kwasu nukleinowego

Info

Publication number
PL199359B1
PL199359B1 PL346012A PL34601299A PL199359B1 PL 199359 B1 PL199359 B1 PL 199359B1 PL 346012 A PL346012 A PL 346012A PL 34601299 A PL34601299 A PL 34601299A PL 199359 B1 PL199359 B1 PL 199359B1
Authority
PL
Poland
Prior art keywords
feline
gene
recombinant
virus
spv
Prior art date
Application number
PL346012A
Other languages
English (en)
Other versions
PL346012A1 (en
Inventor
Barbara J. Winslow
Mark D. Cochran
Ellen W. Collins
Stephen M. Hash
In-Soo Choi
Original Assignee
Schering Plough Ltd
Texas A & M Univ Sys
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Schering Plough Ltd, Texas A & M Univ Sys filed Critical Schering Plough Ltd
Publication of PL346012A1 publication Critical patent/PL346012A1/xx
Publication of PL199359B1 publication Critical patent/PL199359B1/pl

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/86—Viral vectors
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • A61P31/18—Antivirals for RNA viruses for HIV
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A61P35/02—Antineoplastic agents specific for leukemia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/04—Immunostimulants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/06—Immunosuppressants, e.g. drugs for graft rejection
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P39/00—General protective or antinoxious agents
    • A61P39/02—Antidotes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/70503—Immunoglobulin superfamily
    • C07K14/70532—B7 molecules, e.g. CD80, CD86
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/16011—Herpesviridae
    • C12N2710/16041—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2710/16043—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/24011—Poxviridae
    • C12N2710/24041—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2710/24043—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2830/00—Vector systems having a special element relevant for transcription
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2830/00—Vector systems having a special element relevant for transcription
    • C12N2830/60—Vector systems having a special element relevant for transcription from viruses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2840/00—Vectors comprising a special translation-regulating system
    • C12N2840/20—Vectors comprising a special translation-regulating system translation of more than one cistron
    • C12N2840/203—Vectors comprising a special translation-regulating system translation of more than one cistron having an IRES

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Transplantation (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • AIDS & HIV (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

Wynalazek dotyczy rekombinowanego wirusa, który obejmuje co najmniej jeden obcy kwas nu- kleinowy wprowadzony do regionu nie b ed acego podstawowym genomu wirusa, gdzie ka zdy taki obcy kwas nukleinowy koduje bia lko. Kodowane bia lko wybiera si e z grupy, sk ladaj acej si e z kociego bia lka CD28 lub jego cz esci immunogenicznej, kociego bia lka CD80 lub jego cz esci immunogenicznej, ko- ciego bia lka CD86 lub jego czesci immunogenicznej, lub kociego bia lka CTLA-4 lub jego cz esci im- munogenicznej. Rekombinowany wirus mo ze doatkowo obejmowa c obcy kwas nukleinowy, koduj acy immunogen pochodz acy od patogenu. Wynalazek obejmuje tak ze rekombinowane wirusy, które s a zdolne do wzmacniania odpowiedzi immunologicznej u kota oraz rekombinowane wirusy, które s a zdolne do hamowania odpowiedzi immunologicznej u kota. PL PL PL PL

Description

Opis wynalazku
Przedmiotem wynalazku jest rekombinowany wirus, zastosowanie rekombinowanego wirusa i zastosowanie antysensownego kwasu nukleinowego.
Stymulację aktywacji i proliferacji komórek T w odpowiedzi na chorobę u gospodarza uważa się za zależną od dwóch interakcji: rozpoznania receptora komórek T (TCR) za pomocą peptydów immunogenicznych w kontekście cząsteczek MHC klasy I i drugorzędowej interakcji ligandów pomocniczych, takich jak CD80 i CD86, z ich koreceptorami, CD-28 i/lub CTLA-4 na komórce T. Powodzenie interakcji tych dwóch szlaków prowadzi do aktywacji i proliferacji zarówno CD4+ jak i CD8+ komórek T i zwiększonej produkcji cytokin regulują cych odporność, typu Th1 i Th2. Przy nieobecno ś ci odpowiednich kostymulujących komórek T, może się rozwinąć stan anergiczny, przez co komórki T nie są w stanie proliferować i wydzielać cytokin. Przez lata, jako kluczowe regulatory odpowiedzi komórek T, wyłoniły się dwie cząsteczki CD28 i jej ligandy, CD80 i CD86. CD28 jest pierwszorzędowym receptorem kostymulatorowym komórki T i podczas interakcji z CD80 i CD86, wzmacnia proliferację komórki T i syntezę cytokin, zapobiegając ś mierci komórkowej. CTLA-4 (zwany także CD152), homolog CD-28, także odgrywa ważną rolę w kostymulacji. Chociaż nie jest to całkiem zrozumiałe, okazuje się, że hamuje on odpowiedzi kostymulatorowe komórki T. Interakcja i wzajemne oddziaływanie wśród CD28, CTLA-4 i ich ligandów CD80 i CD86 w procesach kostymulatorowych jest kluczowe dla całej indukcji i supresji odpowiedzi immunologicznej w stosunku do choroby u gospodarza. (Linsley i inni, 1991a; 1993a).
Aktualnie nie istnieją dobre szczepionki do zapobiegania kociej chorobie niedoboru odporności i kociej chorobie zakaź nego zapalenia otrzewnej u kotów. Wprawdzie szczepionki przeciwko wirusowi białaczki kociej są dostępne, lecz poziom ich skuteczności pozostaje sporny i w pewnych przypadkach mogą one powodować chorobę. Okazało się, że doświadczalne szczepionki przeciwko zakaźnemu kociemu zapaleniu otrzewnej nie zabezpieczają lub powodują wczesną śmierć przez wzmocnienie za pośrednictwem przeciwciała. Zatem, istnieje zapotrzebowanie w technice na środki i kompozycje, które zapewnią zabezpieczenie przed tymi i innymi chorobami, tam gdzie nie istnieje jeszcze szczepionka lub, które poprawią skuteczność już istniejących i powszechnie stosowanych szczepionek.
Ponadto, istnieje w technice zapotrzebowanie na szczepionki i środki, które indukują odpowiedź za pośrednictwem komórki, przy nieobecności przeciwciał wzmacniających przy chorobie. I wreszcie, szczepienie kotów jest trudne z powodu niemożliwości ominięcia macierzystych przeciwciał u kotów. Potrzebne są bezpieczne i skuteczne środki, pomagające przezwyciężyć te bariery.
W niniejszym wynalazku, manipulując ekspresją czą steczek kostymulatorowych kociego CD28, kociego CTLA-4 i ich ligandów, kociego CD80 i kociego CD86, możliwa jest regulacja odpowiedzi komórki T, poprzez osłabienie, supresję lub przekierowanie, aby wywołać pożądaną odpowiedź immunologiczną w kierunku poszczególnego kociego patogenu lub kociego stanu chorobowego. W szczególności, te cząsteczki kostymulatorowe są użyteczne do szczepienia przeciwko chorobom zakaźnym, leczenia chorób zakaźnych, i leczenia stanów nowotworowych, degeneracyjnych, autoimmunologicznych, i niedoborów odporności u kotów. Niniejszy wynalazek omija brak skuteczności aktualnie dostępnych kocich szczepionek opisanych powyżej.
Krótki opis rysunków
Figura 1A: DNA i sekwencja aminokwasowa kociego CD80 (B7-1) (TAMU). (SEQ ID Nr. 1 i 2)
Figura 1B: Wykres hydrofobowości sekwencji aminokwasowej kociego CD80 (B7-1) (TAMU).
Figura 2A: DNA i sekwencja aminokwasowa kociego CD80 (b7-1) (SYNTRO). (SEQ ID Nr. 3 i 4)
Figura 2B: Wykres hydrofobowości sekwencji aminokwasowej kociego CD80 (B7-1) (SYNTRO).
Figura 3.A: DNA i sekwencja aminokwasowa kociego CD86 (B7-2). (SEQ ID Nr. 5 i 6)
Figura 3.B: Wykres hydrofobowości sekwencji aminokwasowej kociego CD86 (B7-2).
Figura 4A: DNA i sekwencja aminokwasowa kociego CD28. (SEQ ID Nr. 7 i 8)
Figura 4B: Wykres hydrofobowości sekwencji aminokwasowej kociego CD28.
Figura 5A: DNA i sekwencja aminokwasowa kociego CTLA-4 (CD152). (SEQ ID Nr. 9 i 10)
Figura 5B: Wykres hydrofobowości sekwencji aminokwasowej kociego CTLA-4 (CD152).
Przedmiotem wynalazku jest rekombinowany wirus, który zawiera co najmniej jeden obcy kwas nukleinowy wprowadzony do regionu nie będącego podstawowym regionem genomu wirusowego wirusa, a każdy taki obcy kwas nukleinowy (a) koduje białko wybrane z grupy obejmującej białko kociego CD28 lub jego część immunogeniczną; białko kociego CD80 lub jego część immunogeniczną; białko kociego CD86 lub jego część immunogeniczną; lub białko kociego CTLA-4 lub jego część
PL 199 359 B1 immunogeniczną i (b) jest zdolny do ekspresji, gdy tego rekombinowanego wirusa wprowadza się do odpowiedniego gospodarza.
Korzystnie rekombinowany wirus zawiera co najmniej dwa obce kwasy nukleinowe, każdy wprowadzony do regionu nie będącego podstawowym regionem genomu wirusa a każdy taki obcy kwas nukleinowy (a) koduje białko wybrane z grupy obejmującej białko kociego CD28 lub jego część immunogeniczną, białko kociego CD80 lub jego część immunogeniczną; białko kociego CD86 lub jego część immunogeniczną; lub białko kociego CTLA-4 lub jego część immunogeniczną.
Także korzystnie rekombinowany wirus zawiera co najmniej trzy obce kwasy nukleinowe, każdy wprowadzony do regionu nie będącego podstawowym regionem genomu wirusa a każdy taki obcy kwas nukleinowy (a) koduje białko wybrane z grupy obejmującej białko kociego CD28 lub jego część immunogeniczną, białko kociego CD80 lub jego część immunogeniczną; białko kociego CD86 lub jego część immunogeniczną; lub białko kociego CTLA-4 lub jego część immunogeniczną.
Jeszcze bardziej korzystnie, rekombinowany wirus zawiera cztery obce kwasy nukleinowe, każdy wprowadzony do regionu nie będącego podstawowym regionem genomu wirusa a każdy taki obcy kwas nukleinowy (a) koduje białko wybrane z grupy obejmującej białko kociego CD28 lub jego część immunogeniczną, białko kociego CD80 lub jego część immunogeniczną; białko kociego CD86 lub jego część immunogeniczną; lub białko kociego CTLA-4 lub jego część immunogeniczną.
Rekombinowany wirus według wynalazku jest zwłaszcza pokswirusem szopów, pokswirusem świń, lub kocim herpeswirusem.
W rekombinowanym wirusie według wynalazku zawierają cym więcej niż jeden obcy kwas nukleinowy, każdy taki obcy kwas nukleinowy korzystnie wprowadzony jest do tego samego regionu nie będącego podstawowym.
W innym korzystnym wykonaniu, rekombinowany wirus wedł ug wynalazku zawiera wię cej niż jeden obcy kwas nukleinowy, nie wszystkie takie obce kwasy nukleinowe są wprowadzane do tego samego regionu nie będącego podstawowym.
Rekombinowany wirus wynalazku, w kolejnym wykonaniu, dodatkowo zawiera obcy kwas nukleinowy kodujący immunogen pochodzący od patogenu, którym to immunogenem korzystnie może być patogen koci, wirus wścieklizny, Chlamydia, Taxoplasmosis gondii, Dirofilaria immitis, pchła, lub patogen bakteryjny. Jeszcze bardziej korzystnym wykonaniu, kocim patogenem jest wirus kociego niedoboru odporności (FIV), wirus kociej białaczki (FeLV), wirus kociego zakaźnego zapalenia otrzewnej (FIP), koci wirus panleukopenii, koci kaliciwirus, koci reowirus typu 3, koci rotawirus, koci koronawirus, koci wirus syncytialny, koci wirus mięsaka, koci herpeswirus, wirus kociej choroby Borna, lub koci pasożyt.
W kolejnej postaci wykonania wynalazku co najmniej jeden obcy kwas nukleinowy zawarty w rekombinowanym wirusie wedł ug wynalazku obejmuje promotor dla ekspresji obcego kwasu nukleinowego, który korzystnie znajduje się pod kontrolą promotora endogennego w stosunku do wirusa.
W kolejnym wykonaniu wynalazku, rekombinowany wirus dodatkowo zawiera obcy kwas nukleinowy kodujący wykrywalny marker, którym może być korzystnie beta galaktozydaza E.coli.
Zgodnie z wynalazkiem w jego korzystnym wykonaniu immunogenem z kociego patogenu jest proteaza gag FIV, białko otoczkowe FIV, proteaza gag FeLV, lub białko otoczkowe FeLV.
Także korzystnie, wirusem jest koci herpeswirus i regionem nie będącym podstawowym jest gen glikoproteiny G kociego herpeswirusa, a bardziej korzystnie rekombinowany koci herpeswirus jest wirusem oznaczonym S-FHV-031 (numer dostępu ATCC VR-2604).
W innym korzystnym wykonaniu wirusem jest pokswirus ś wiń i regionem nie bę d ą cym podstawowym jest większy subfragment Hind III do Bgl II fragmentu M Hind III pokswirusa świń, a jeszcze bardziej korzystnie rekombinowany koci wirus ospy świń jest wirusem oznaczonym S-SPV-246 (numer dostępu ATCC VR-2603).
W rekombinowanym wirusie wedł ug wynalazku część biał ka CD28, CD80 lub CD86 jest rozpuszczalną częścią białka.
W rekombinowanym wirusie wedł ug wynalazku obcy kwas nukleinowy koduje kocie biał ko CTLA-4.
Przedmiotem wynalazku jest również szczepionka charakteryzująca się tym, że zawiera skuteczną ilość immunizującą rekombinowanego wirusa zdefiniowanego powyżej odpowiedni nośnik.
W szczepionce według wynalazku skuteczna ilość immunizującą rekombinowanego wirusa, jest to ilość wynosząca między około 1x105 pfu/ml i około 1x10 cfu/ml.
PL 199 359 B1
Szczepionka według wynalazku dodatkowo zawiera skuteczną ilość immunizującą drugiego immunogenu w domieszce do rekombinowanego wirusa.
Przedmiotem wynalazku jest również zastosowanie skutecznej ilości immunizującej rekombinowanego wirusa zdefiniowanego powyżej do wytwarzania leku do wzmacniania odpowiedzi immunologicznej u kotów, a korzystnie do wytwarzania leku do immunizacji kota.
Przedmiotem wynalazku jest także zastosowanie skutecznej ilości hamującej rekombinowanego wirusa zdefiniowanego powyżej do wytwarzania leku do hamowania odpowiedzi immunologicznej.
Lek korzystnie podaje się dożylnie, podskórnie, domięśniowo, przezmięśniowo, miejscowo, doustnie lub dootrzewnowo.
W zastosowaniu według wynalazku kot jest biorcą przeszczepianego narządu lub tkanki lub cierpi z powodu odpowiedzi immunologicznej.
Przedmiotem wynalazku jest również zastosowanie antysensownego kwasu nukleinowego zdolnego do hybrydyzacji i hamowania translacji: (a) transkryptu kociego mRNA CD28, (b) transkryptu kociego CD80, lub (c) transkryptu kociego mRNA CD86, przy czym antysensowny kwas nukleinowy jest obecny w ilości skutecznie hamującej translację do wytwarzania leku do hamowania odpowiedzi immunologicznej w kota.
Przedmiotem wynalazku jest również zastosowanie rekombinowanego wirusa zdefiniowanego powyżej, przy czym kwas nukleinowy koduje białko kociego CD80, białko kociego CD86 lub ich połączenie do wytwarzania leku do zmniejszania lub niszczenia nowotworu u kota przez podawanie leku do nowotworu.
W korzystnym wykonaniu powyżej opisanego zastosowania według wynalazku, rekombinowany wirus dodatkowo zawiera koci antygen związany z nowotworem i jest zdolny do ekspresji kociego antygenu związanego z nowotworem, i przy czym podawanie leku wykonuje się układowo.
Rekombinowany wirus według wynalazku, korzytnie charakteryzuje się tym, że dodatkowo zawiera kwas nukleinowy, kodujący genom wirusa kociego niedoboru odporności lub jego część. Także korzystnie może on dodatkowo zawierać kwas nukleinowy, kodujący genom wirusa kociej białaczki lub jego część.
Rekombinowany wirus według wynalazku także korzystnie, dodatkowo obejmuje kwas nukleinowy kodujący kocie IL12, p35 lub p40.
Przedmiotem wynalazku jest także szczepionka, która zawiera skuteczną ilość immunizującą rekombinowanego wirusa dodatkowo zawierającego kwas nukleinowy kodujący genon wirusa kociego niedoboru odporności lub jego część, korzystnie genom kociej białaczki lub część takiego genomu, którym najkorzystniej jest kwas nukleinowy kodujący kocie IL12, p35 lub p40, oraz odpowiedni nośnik.
Niniejszy wynalazek pozwala na otrzymanie wyizolowanego i oczyszczonego DNA, który koduje koci ligand CD80 (B7-1) lub koci ligand CD86 (B7-2) lub koci receptor CD28 lub koci receptor CTLA-4 (CD152), jak również klonowanie i wektory ekspresji obejmujące CD80 lub CD86 lub CD28 lub CTLA-4 lub RNA, częściowo lub w całości, i komórki transformowane wektorami kodującymi CD80 lub CD86 wektorami kodującymi lub wektorami kodującymi CD28 lub wektorami kodującymi CTLA-4. Rodzaje kotów, spośród których wybiera się CD80 lub CD86 lub CD28 lub CTLA-4 pochodzą z grupy obejmującej, koty domowe, lwy, pumy, rysie, i gepardy.
Wynalazek pozwala także na otrzymanie wyizolowanego i oczyszczonego cDNA kociego CD80 (B7-1) mającego około 941 nukleotydów, a także wyizolowanego i oczyszczonego polipeptydu kociego CD80 mającego około 292 aminokwasów, wiązanie natywne błonowe lub postać dojrzałą, która ma masę cząsteczkową wynoszącą około 33,485 kDa, punkt izoelektryczny wynoszący około 9,1 i ładunek przy pH 7,0, wynoszący 10. Koekspresja CD80 z cząsteczką kostymulatorową CD28, i antygen nowotworu lub antygen organizmu patogenicznego, umożliwia aktywację lub wzmocnienia aktywacji limfocytów T, indukując produkcję cytokiny stymulującej odporność i regulacji wzrostu innych typów komórek. Koekspresja CD80 z cząsteczką kostymulatorową CTLA-4, umożliwia regulację aktywacji limfocytów T.
Zgodnie z wynalazkiem wyizolowany i oczyszczony cDNA kociego CD86 (B7-2) ma około 1176 nukleotydów. Dalej zgodnie z wynalazkiem, wyizolowany i oczyszczony polipeptyd kociego CD86 ma około 320 aminokwasów, natywne wiązanie błonowe lub postać dojrzałą, która posiada masę cząsteczkową wynoszącą około 36,394kDa, punkt izoelektryczny wynoszący około 9,19, ładunek przy pH 7,0, wynoszący 11,27. Koekspresja CD86 z cząsteczkami kostymulatorowymi CD28 oraz antygen nowotworu lub antygen organizmu patogenicznego, posiada zdolność aktywacji lub wzmacniania aktywacji limfocytów T, indukując produkcję cytokiny stymulującej odporność i regulacji wzrostu innych
PL 199 359 B1 typów komórek. Koekspresja CD86 z cząsteczką kostymulatorową CTLA-4, umożliwia regulację aktywacji limfocytów T.
Koci CD80 lub CD86 otrzymuje się ze źródeł rodzimych lub rekomblnowanych. Koci CD80 lub CD86 według niniejszego wynalazku, obejmuje postać natywną związaną z błoną lub formę wydzieloną bez domeny transbłonowej.
Wynalazek pozwala na otrzymanie oczyszczonego cDNA kociego CD28 mającego około 689 nukleotydów, a także wyizolowanego i oczyszczonego polipeptydu kociego CD28 mającego około 221 aminokwasów, natywną postać związaną z błoną lub postać dojrzałą, który posiada masę cząsteczkową, wynoszącą około 25,319 kDa, punkt izoelektryczny wynoszący około 9,17 i ładunek przy pH 7,0 wynoszący 9,58.
Wynalazek pozwala również na otrzymanie wyizolowanego i oczyszczonego cDNA kociego CTLA-4 mającego około 749 nukleotydów, lub też oczyszczonego polipeptydu kociego CTLA-4 mającego około 223 aminokwasów, w postaci natywnej związnej z błoną lub dojrzałej, który posiada masę cząsteczkową wynoszącą około 24,381 kDa, punkt izoelektryczny wynoszący około 6,34, ładunek sieci przy pH 7,0 wynoszący -0,99.
Rekombinowany pokswirus świń według wynalazku wykazuje ekspresję obcego DNA, przy czym obcy DNA koduje koci CD80, koci CD86, koci CD28 i koci CTLA-4 i polipeptyd.
Rekombinowany pokswirus szopów według wynalazku wykazuje ekspresję obcego DNA, przy czym obcy DNA koduje koci CD80, koci CD86, koci CD28 i koci CTLA-4 i polipeptyd.
Wynalazek zastrzega rekombinowany koci herpeswirus wykazujący ekspresję obcego DNA, przy czym obcy DNA koduje koci CD80, koci CD86, koci CD28 i koci CTLA-4 i polipeptyd.
Wykorzystując wynalazek możliwe jest wzmocnienie u kotowatych odpowiedzi immunologicznej wobec immunogenu, który przeprowadza się przez podawanie immunogenu przed, po lub zasadniczo równocześnie z kocim CD80 lub kocim CD86 z kocim CD28 lub bez, lub kocim CTLA-4 w rekombinowanym wektorze pokswirusa świń, rekombinowanym wektorze pokswirusa szopów, lub rekombinowanym wektorze kociego herpeswirusa, w ilości skutecznej aby wzmocnić odpowiedź immunologiczną.
W oparciu o rekombinowanego wirusa według wynalazku moż na także przeprowadzić sposób hamowania u kotowatych odpowiedzi immunologicznej wobec immunogenu, który uzyskuje się przez podawanie immunogenu przed, po lub zasadniczo równocześnie z kocim CD80 lub kocim CD86 z kocim CD28 lub bez, lub kocim CTLA-4 lub z antysensownym RNA lub DNA, częściowo lub w cał ości, kodującym koci CD80 lub koci CD86 lub koci CD28 lub koci CTLA-4, w rekombinowanym wektorze pokswirusa świń, rekombinowanym wektorze pokswirusa szopów, lub rekombinowanym wektorze kociego herpeswirusa, w ilości skutecznie hamującej odpowiedź immunologiczną.
Kocie białko CD80 posiada sekwencję aminokwasową która jest w 59% i 46% identyczna odpowiednio z białkiem ludzkim i mysim. Kocie białko CD86 posiada sekwencję aminokwasową, która jest w 68% i 64% identyczna odpowiednio z białkiem ludzkim i króliczym. Kocie białko CD28 posiada sekwencję aminokwasową, która jest w 82% i 74% identyczna odpowiednio z białkiem ludzkim i mysim. Kocie białko CTLA-4 posiada sekwencję aminokwasową, która jest w 88% i 78% identyczna odpowiednio z białkiem ludzkim i mysim. Ludzkie lub mysie CD80 lub białko CD86 nie może funkcjonalnie zastąpić kocich białek CD80 lub CD86. Zatem, kocie CD80, kocie CD86, kocie CD28 i kocie CTLA-4 są nowymi środkami wymaganymi do regulacji odporności u kotowatych.
Niniejszy wynalazek obejmuje regulatorowe cząsteczki pomocnicze komórek T, CD80 (B7-1) lub CD86 (B7-2) lub CD28 lub CTLA-4 (CD152) pochodzące od gatunku kotów. Wynalazek zastrzega wyizolowane i oczyszczone kwasy nukleinowe kodujące, częściowo lub w całości, koci CD80 lub koci CD86 lub koci CD28 lub koci CTLA-4, jak również polipeptyd CD80, CD86, CD28 lub CTLA-4 oczyszczony z rodzimych lub rekombinowanych źródeł. Koci CD80, CD86, CD28 lub CTLA-4 wytworzony według niniejszego wynalazku stosuje się do wzmacniania skuteczności kocich szczepionek przeciwko nowotworom i organizmom patogennym i jako środek terapeutyczny do leczenia chorób wirusowych i bakteryjnych u kotów. Koci, CD86, CD28 lub CTLA-4 wytworzony zgodnie z niniejszym wynalazkiem stosuje się także do znoszenia choroby spowodowanej zbyt aktywną, nadaktywną lub źle skierowaną odpowiedzią immunologiczną.
Kwasy nukleinowe, wektory, transformanty
Sekwencje cDNA kodującego koci CD80 (SEQ ID Nr: 1, 3), koci CD86 (SEQ ID Nr: 5), koci CD28 (SEQ ID Nr: 7), lub koci CTLA-4 (SEQ ID Nr: 9), ukazuje się w fig. 1 do 5, a przewidywane sekwencje aminokwasowe kociego CD80 (SEQ ID Nr: 2, 4), kociego CD86 (SEQ ID Nr: 6), kociego CD28 (SEQ ID Nr: 8), lub kociego CTLA-4 (SEQ ID Nr: 10), ukazuje się w fig. 1 do 5. Oznaczenie tych
PL 199 359 B1 kocich polipeptydów jako CD80, CD86, CD28 lub CTLA-4 opiera się na częściowej homologii sekwencji aminokwasowej dohomologu ludzkiego lub mysiego, albo króliczego, i zdolności polipeptydów CD80 lub CD86 do wiązania z kocim receptorem CD28 (patrz poniżej) lub CTLA-4 i do aktywacji lub stymulacji lub z drugiej strony regulacji aktywacji limfocytów T. Ponadto, bez wiązania się z teorią, przewiduje się, że polipeptydy kociego CD80 lub kociego CD86 wykazują także jedną lub więcej następujących bioaktywności: aktywację komórek NK (naturalnych zabójców), stymulację dojrzewania komórek B, aktywację cytotoksycznych limfocytów T ograniczonych przez MHC, proliferację komórek tucznych, interakcję z receptorem cytokiny i indukcję cytokiny regulującej odporność.
Z powodu degeneracji kodu genetycznego (czyli tego, ż e wiele kodonów koduje pewne aminokwasy), sekwencje DNA inne niż te, które ukazano w fig. 1 do 5 mogą także kodować sekwencje aminokwasowe kociego CD80, CD86, CD28 lub CTLA-4 ukazane w fig. 1 do 5. Takie inne DNA obejmują te, które zawierają odmiany „konserwatywnej pod względem sekwencji”, w których zmiana jednego lub więcej nukleotydów w danym kodonie nie powoduje powstania zmian w aminokwasie kodowanym w tej pozycji. Ponadto, daną resztę aminokwasową w polipeptydzie często można zmienić bez zmiany całej konformacji i działania natywnego polipeptydu. Takie odmiany „konserwatywne pod względem działania” obejmują, lecz bez ograniczenia, zamianę aminokwasu na taki, który posiada podobne właściwości fizyko-chemiczne, takie jak, np., kwasowe, zasadowe, hydrofobowe, hydrofilowe, aromatyczne i inne (np. zamianę lizyny na -argininę, asparaginianu na glutaminian, lub glicyny na alaninę). Oprócz tego, sekwencje aminokwasowe dodaje się lub usuwa bez niszczenia bioaktywności cząsteczki. Przykładowo, dodaje się dodatkowe sekwencje aminokwasowe na końcach aminowych albo karboksylowych, które służą jako znaczniki przy oczyszczaniu, tak jak znaczniki histydynowe, (pozwalające na jednoetapowe oczyszczanie białka, po którym są one chemicznie lub enzymatycznie usuwane). Alternatywnie, sekwencje dodatkowe nadają dodatkowe miejsce wiązania na powierzchni komórkowej lub z drugiej strony zmieniają specyficzność komórki docelowej kociego CD80, CD86, CD28 lub CTLA-4, tak jak przy dodaniu miejsca wiązania antygenu dla przeciwciała.
cDNA kociego CD80 lub kociego CD86 lub kociego CD28 lub kociego CTLA-4 w zakresie niniejszego wynalazku, pokazano w fig. 1 do 5, DNA odmian sekwencji konserwatywnych, sekwencje DNA kodujące polipeptyd odmiany konserwatywnej pod względem działania, i ich połączenia. Wynalazek obejmuje fragmenty kociego CD80, CD86, CD28 lub CTLA-4, które wykazują użyteczny stopień bioaktywności, pojedynczo lub w połączeniu z innymi sekwencjami lub składnikami. Jak wyjaśniono poniżej, specjalista jest w stanie manipulować w sposób przewidujący, sekwencją CD80, CD86, CD28 lub CTLA-4 i ustalić czy dany wariant kociego CD80, CD86, CD28 lub CTLA-4 posiada odpowiednią stabilność i bioaktywność dla danego zastosowania, lub odmiany, które wpływają na aktywność wiązania tych cząsteczek, powodując zwiększenie skuteczności. Każdy koci CD80 i CD86 będzie się wiązał z koreceptorem CD28 lub z koreceptorem CTLA-4. Można to osiągnąć przez ekspresję i oczyszczanie polipeptydu odmiany CD80, CD86, CD28 lub CTLA-4 w ukł adzie rekombinacyjnym i testowanie jej aktywnoś ci stymulatorowej komórki T i/lub aktywno ś ci pobudzają cej wzrost w hodowli komórkowej i u zwierząt, po czym testowanie przy zastosowaniu. Odmianę CD80 testuje się pod względem bioaktywności przez funkcjonalne wiązanie z receptorem CD28 lub CTLA-4. Odmianę CD86 testuje się pod względem bioaktywności przez funkcjonalne wiązanie z receptorem CD28 lub CTLA-4. W podobny sposób, testuje się pod względem bioaktywności wariant CD28 lub wariant CTLA-4.
Niniejszy wynalazek obejmuje także DNA kociego CD80, CD86, CD28 lub CTLA-4 (oraz polipeptyd) pochodzący od innych gatunków kotów, włączając bez ograniczenia koty domowe, lwy, tygrysy, gepardy, rysie i inne. Kocie homologi CD86, CD28 lub CTLA-4 o sekwencji ukazanej w fig. 1 do 5, łatwo identyfikuje się przez skrining cDNA lub bibliotek genomowych, w celu identyfikacji klonów, które hybrydyzują z sondami obejmującymi całość lub część o sekwencji z fig. 1 do 5. Alternatywnie, przesiewa się biblioteki ekspresji przy użyciu przeciwciała, które rozpoznaje kocie CD80, CD86, CD28 lub CTLA-4. Bez wiązania się z teorią, uważa się, że geny CD80 lub CD86 innych gatunków kotów będą miały co najmniej około 70% homologii z kocimi genami CD80, CD86, CD28 lub CTLA-4. W zakresie wynalazku znajdują się DNA, które kodują homolog CD80, CD86, CD28 lub CTLA-4, określane jako DNA kodujący polipeptyd posiadający co najmniej około 25% identyczności aminokwasowej z kocim CD80, CD86, CD28 lub CTLA-4.
Generalnie, manipulacje z kwasem nukleinowym według niniejszego wynalazku stosują metody, które są dobrze znane w technice, takie jak te, które opisano np. w Molecular Cloning, A Laboratory Manual (2 wydanie., Sambrook, Fritsch i Maniatis, Cold Spring Harbor), lub Current Protocols
PL 199 359 B1 w Molecular Biology (wydawcy Aufubel, Brent, Kingston, More, Feidman, Smith i Stuhl, Greene Publ. Assoc., Wiley-Interscience, NY, NY, 1992).
Niniejszy wynalazek obejmuje sekwencje cDNA i RNA i sensowne i antysensowne. Wynalazek także obejmuje genomowe sekwencje DNA kociego CD80, CD86, CD28 lub CTLA-4 i sekwencje oskrzydlające, włączając bez ograniczenia sekwencje regulatorowe. Sekwencje kwasu nukleinowego kodujące polipeptyd (polipeptydy) kociego CD80, CD86, CD28 lub CTLA-4 są także związane z sekwencjami heterologicznymi, włączając promotory, wzmacniacze, elementy odpowiedzi, sekwencje sygnałowe, sekwencje poliadenylacji, introny, regiony nie kodujące 5' i 3', i inne. Transkrypcjonalne elementy regulatorowe, które są związane operacyjnie z sekwencją (sekwencjami) cDNA kociego CD80, CD86, CD28 lub CTLA-4, obejmują bez ograniczenia takie, które mają zdolność kierowania ekspresją genów pochodzących od komórek prokariotycznych, komórek eukariotycznych, wirusów komórek prokariotycznych, wirusów komórek prokariotycznych, i każdego ich połączenia. Inne użyteczne heterologiczne sekwencje regulatorowe są znane fachowcom.
Kwasy nukleinowe według niniejszego wynalazku modyfikuje się metodami znanymi fachowcom, aby zmienić ich stabilność, rozpuszczalność, powinowactwo wiązania, i specyficzność. Przykładowo, sekwencje selektywnie metyluje się. Sekwencje kwasu nukleinowego według niniejszego wynalazku modyfikuje się także z użyciem znacznika zdolnego do zapewnienia wykrywalnego sygnału, bezpośrednio lub nie bezpośrednio. Przykładowe znaczniki obejmują radioizotopy, cząsteczki fluorescencyjne, biotynę, i inne. Niniejszy wynalazek zastrzega także wektory, które obejmują kwasy nukleinowe, kodujące polipeptyd (polipeptydy) CD80, CD86, CD28 lub CTLA-4 częściowo lub w całości. Takie wektory obejmują, np., wektory plazmidowe do ekspresji w różnych gospodarzach eukariotycznych i prokariotycznych. Korzystnie, wektory także obejmują promotor operacyjnie połączony z częścią kodującą polipeptydu kociego CD80, CD86, CD28 lub CTLA-4. Ekspresja kodowanego kociego polipeptydu (polipeptydów) CD80, CD86, CD28 lub CTLA-4 zachodzi by przy użyciu każdego odpowiedniego wektora i komórki gospodarza, jak objaśniono w niniejszym lub z drugiej strony znanego fachowcom.
Niniejszy wynalazek zastrzega także wektory, które obejmują kwas nukleinowy kodujący polipeptyd (polipeptydy) kociego CD80, CD86, CD28 lub CTLA-4 częściowo lub w całości. Takie wektory obejmują, np., żywe wektory wirusowe do ekspresji w różnych gospodarzach eukariotycznych, lub do ekspresji szczepionek DNA lub RNA. W jednej postaci realizacji, żywy wektor wirusowy osłabia się. W innej postaci realizacji, żywy wektor wirusowy osłabia się przez delecję genową. W innej postaci realizacji, wektor wirusowy inaktywuje się przez traktowanie chemiczne lub gorącem. Żywy wektor wirusowy wybiera się z grupy obejmującej, bez ograniczenia, herpeswirus, pokswirus, adenowirus, wirus związany z adenowirusem, retrowirus, bakulowirus, alfawirus, rabdowirus, pikornawirus. Żywy wektor wirusowy wybiera się z grupy obejmującej, bez ograniczenia, koci herpeswirus, psi herpeswirus, ptasi herpeswirus, bydlęcy herpeswirus, koński herpeswirus, wirus wścieklizny rzekomej, pokswirus świń, pokswirus ptasi, pokswirus drobiu, pokswirus szopów, pokswirus kanarków, wirus krowianki, wirus małpiej białaczki Malony, Wirus Sindbis, i wirus Semliki Forest.
Żywy wektor wirusowy jest rekombinowanym wektorem wirusowym, wykazującym ekspresję obcego DNA, który oznacza cDNA kociego CD80, CD86, CD28 lub CTLA-4 częściowo lub w całości. Obcy DNA oznacza także cDNA antygenu organizmu patogenicznego. Rekombinowany wektor wirusowy konstruuje się znaną fachowcom metodą homologicznej rekonstrukcji rekombinowanej lub kosmidowej. Korzystnie, wektory obejmują także promotor operacyjnie połączony z częścią kodującą polipeptydu kociego CD80, CD86, CD28 lub CTLA-4. Promotor wybiera się z grupy obejmującej, bez ograniczenia, promotor kociego herpeswirusa gE, syntetyczny późny/wczesny promotor pokswirusa, bezpośredni wczesny promotor ludzkiego cytomegalowirusa, promotor wirusa wścieklizny rzekomej gX. Pobudzenie ekspresji genowej obejmuje także ekspresję cDNA CD80, CD86, CD28 lub CTLA-4 elementu wewnętrznego rybosomowego miejsca wejścia (IRES) zawartego w kasecie (wektor pCITE, Novagen, Madison, WI). Linie komórkowe do hodowli wektory wirusowe obejmują, lecz bez ograniczenia, komórki nerki kociej Crandell (CRFK), fibroblasty zarodków kurcząt, komórki nerki zarodków świńskich (ESK-4), komórki nerki świni (PK). Ekspresja kodowanego polipeptydu(polipeptydów) kociego CD80, CD86, CD28 lub CTLA-4 zachodzi przy użyciu każdego odpowiedniego wektora i komórek gospodarza, jak objaśniono w niniejszym, lub z drugiej strony znanymi fachowcom.
W zalecanej postaci realizacji, geny kodują ce kocie CD80 i CD28, CD80 i CTLA-4, CD86 i CD28, lub CD86 i CTLA-4, w połączeniu z genami immunogenu pochodzącego od patogenu kociego, wprowadza się do pojedynczego rekombinowanego wektora wirusowego, a następnie opracowuje
PL 199 359 B1 się do postaci żywej szczepionki. Kocie geny CD80, CD86, CD28 lub CTLA-4, pojedynczo lub w połączeniu z kocimi genami pochodzącymi od kociego patogenu, wprowadza się do rekombinowanego wirusa, tak że ekspresję tych genów kontroluje się odpowiednim promotorem. W innej postaci realizacji, geny kodujące koci CD80, CD86, CD28 lub CTLA-4, pojedynczo lub w połączeniu, wprowadza się do rekombinowanego wektora wirusowego, i podaje równocześnie w szczepionce z drugim rekombinowanym wektorem wirusowym, który koduje geny immunogenu (immunogenów), pochodzącego od kociego patogenu. Te dwie postacie realizacji zapewniają pożądane odpowiedzi immunologiczne w tej samej komórce lub w komórkach w najbliższym otoczeniu, aby uzyskać wzmocnienie, supresję lub przekierowanie pożądanej odpowiedzi immunologicznej.
Immunogen wybiera się z grupy obejmującej, bez ograniczenia, kocie patogeny, takie jak wirus kociego niedoboru odporności, wirus białaczki kociej, wirus zakaźnego kociego zapalenia otrzewnej, wirus kociej panleukopenii (parwowirus), koci kaliciwirus, koci reowirus typu 3, koci rotawirus, koci koronawirus (wirus zakaźnego zapalenia otrzewnej), wirus wścieklizny, koci wirus syncytialny, wirus kociego mięsaka, koci herpeswirus (wirus zapalenia dróg oddechowych), wirus kociej choroby Borna, Chlamydia, Toxoplasmosis gondii, kocie pasożyty, Dirodilaria immitis, pchły, patogen bakteryjny, i inne.
Wektory lub żywe wektory wirusowe będą często obejmować jeden lub więcej układów replikacji dla kloningu lub ekspresji, jeden lub więcej markerów selekcji u gospodarza tak jak, np. odporność na antybiotyki, lub markery kalorymetryczne, takie jak β-galaktozydaza (lacZ) lub β-glukuronidaza (uidA), lub markery fluorescencyjne, takie jak zielone białko fluorescencyjne, i jedną lub więcej kaset ekspresji. Wprowadzone sekwencje kodujące syntetyzuje się, izoluje ze źródeł naturalnych, wytwarza się w postaci hybryd, lub temu podobne. Ligację sekwencji kodujących z transkrypcyjnymi sekwencjami regulatorowymi uzyskuje się metodami znanymi fachowcom. Odpowiednie komórki gospodarza transformuje się/transfekuje/infekuje każdą odpowiednią metodą, włączając elektroporację, wychwyt DNA za pośrednictwem CaC2 lub liposomu, zakażenie grzybowe, mikroinjekcję, mikropociski, lub temu podobne.
Odpowiednie wektory do stosowania w praktyce niniejszego wynalazku obejmują bez ograniczenia VEp352, pcDNAI (Invitrogen, Carlsbad, CA), pRc/CMV (Invitrogen), i pSFV1 (GIBCO/BRL, Gaithersburg, MD). Wektorem zalecanym do stosowania w wynalazku jest pSFV1. Odpowiednie komórki gospodarza obejmują E. coli, drożdże, komórki COS, komórki PC12, komórki CHO, GH4C1 komórki, komórki BHK-21, i komórki melanoforowe płazów. Komórki BHK-21 są zalecaną linią komórkową gospodarza do stosowania w praktyce niniejszego wynalazku. Odpowiednie wektory do konstruowania nagiego DNA lub szczepienia genetycznego, obejmują bez ograniczenia pTarget (Promega, Madison, WI), pSI (Promege, Madison, WI) i pcDNA (Invitrogen, Carlsbad, CA).
Kwasy nukleinowe kodujące koci polipeptyd (polipeptydy) CD80, CD86, CD28 lub CTLA-4 wprowadza się także do komórek przez zdarzenia rekombinacji. Przykładowo, sekwencję taką wprowadza się przez mikroinjekcję do komórki, wykonując rekombinację homologiczną w miejscu genu endogenicznego kodującego polipeptyd, jego analog lub pseudogen, albo sekwencję z zasadniczą identycznością wobec genu kodującego polipeptyd koci CD80, CD86, CD28 lub CTLA-4. Stosuje się także inne metody oparte o rekombinację, takie jak rekombinacja nie homologiczna, i delecja genu endogenicznego przez rekombinację homologiczną, zwłaszcza w komórkach wielofunkcyjnych.
Niniejszy wynalazek zastrzega sposób wzmacniania odpowiedzi immunologicznej u kotowatych wobec immunogenu, który uzyskuje się przez podawanie immunogenu przed, po lub zasadniczo równocześnie z kocim CD80 lub kocim CD86 z kocim CD28 lub kocim CTLA-4 lub bez, w ilości skutecznej aby wzmocnić odpowiedź immunologiczną. Niniejszy wynalazek zastrzega sposób wzmacniania odpowiedzi immunologicznej u kotowatych wobec immunogenu, który uzyskuje się przez podawanie wektora ekspresji, który zawiera immunogen pochodzący od patogenu kociego i cząsteczki pomocnicze kociego CD80 lub kociego CD86 z kocim CD28 albo kociego CTLA-4 lub bez, w ilości skutecznej aby wzmocnić odpowiedź immunologiczną.
Niniejszy wynalazek zastrzega sposób przekierowywania odpowiedzi immunologicznej wobec immunogenu u kotowatych, który uzyskuje się przez podawanie wektora ekspresji, który zawiera immunogen pochodzący od patogenu kociego i cząsteczki pomocnicze kociego CD80 albo kociego CD86 z kocim CD28 lub kociego CTLA-4 lub bez, w ilości skutecznej aby wzmocnić odpowiedź immunologiczn ą .
Niniejszy wynalazek zastrzega sposób hamowania odpowiedzi immunologicznej u kotowatych wobec immunogenu, który uzyskuje się przez podawanie immunogenu przed, po lub zasadniczo
PL 199 359 B1 równocześnie z kocim CD80 lub kocim CD86 z lub bez kociego CD28 lub kociego CTLA-4 albo z antysensownym RNA lub DNA kodującym koci CD80 lub koci CD86, lub koci CD28, lub koci CTLA-4, w ilości skutecznie hamującej odpowiedź immunologiczną.
Niniejszy wynalazek zastrzega szczepionkę do indukcji odpowiedzi immunologicznej u kotowatych wobec immunogenu(immunogenów), obejmującą immunogen i skuteczną ilość kociego CD80 lub kociego CD86 z kocim CD28 lub kociego CTLA-4 lub bez, w celu wzmocnienia odpowiedzi immunologicznej, lub kociego CD80 lub kociego CD86 z kocim CTLA-4 w celu supresji odpowiedzi immunologicznej. W innej postaci realizacji wynalazek zastrzega szczepionkę obejmującą wektor ekspresji, zawierający geny immunogenu(immunogenów) wobec kociego patogenu oraz geny CD80, CD86, z kocim CD28 lub kocim CTLA-4 lub bez, w celu wzmocnienia odpowiedzi immunologicznej lub supresji.
Kocie polipeptydy CD80, CD86, CD28 lub CTLA-4
Gen kociego CD80 (DNA i jego sekwencja aminokwasowa, która jest ukazana w fig. 1 i 2) koduje polipeptyd mający około 292 aminokwasów. Gen kociego CD86 (DNA i jego sekwencja aminokwasowa, która jest ukazana w fig. 3) koduje polipeptyd, mający około 320 aminokwasów. Gen kociego CD28 (DNA i jego sekwencja aminokwasowa, która jest ukazana w fig. 4) koduje polipeptyd, mający około 221 aminokwasów. Gen kociego CTLA-4 (DNA i jego sekwencja aminokwasowa, która jest ukazana w fig. 5) koduje polipeptyd, mający około 223 aminokwasów.
Oczyszczanie kociego CD80, CD86, CD28 lub CTLA-4 ze źródeł naturalnych lub rekombinowanych uzyskuje się metodami dobrze znanymi w technice, włączając bez ograniczenia, chromatografię jono-wymienną, chromatografię z odwrotną fazą na kolumnach C4, filtrację żelową, ogniskowanie izoelektryczne, chromatografię powinowactwa, i inne. W zalecanej postaci realizacji, wielkie ilości bioaktywnego kociego CD80, CD86, CD28 lub CTLA-4 otrzymuje się przez konstruowanie rekombinowanej sekwencji DNA obejmującej region kodujący dla kociego CD80, CD86, CD28 lub CTLA-4 połączonego w ramce z sekwencją kodującą 6 C-terminalnych reszt histydynowych w replikonie pSFVl (GIBCO/BRL). mRNA kodowany przez ten plazmid syntetyzuje się przy użyciu technik dobrze znanych fachowcom i wprowadza do komórek BHK-21 przez elektroporację. Komórki syntetyzują i wydzielają dojrzały glikozylowany polipeptyd kociego CD80, CD86, CD28 lub CTLA-4, zawierający 6 C-terminalnych histydyn. Modyfikowane polipeptydy kociego CD80, CD86, CD28 lub CTLA-4 oczyszcza się z supernatantu komórkowego przez chromatografię powinowactwa przy użyciu żywicy wiążącej histydynę (His-bind, Novagen, Madison, WI).
Polipeptyd kociego CD80 lub kociego CD86 wyizolowany z jakiegokolwiek źródła modyfikuje się metodami znanymi w technice. Przykładowo, koci CD80, CD86, CD28 lub CTLA-4 fosforyluje się lub defosforyluje, glikozyluje lub deglikozyluje, i inne. Zwłaszcza użyteczne są modyfikacje, które zmieniają rozpuszczalność, stabilność, i specyficzność wiązania oraz powinowactwo kociego CD80, CD86, CD28 lub CTLA-4.
Cząsteczki chimeryczne kociego, CD86, CD-28, CTLA-4.
Niniejszy wynalazek obejmuje wytwarzanie cząsteczek chimerycznych wykonanych z fragmentów kociego CD80, CD86, CD-28 i CTLA-4 w jakimkolwiek połączeniu.
Przykładowo, wprowadzenie miejsca wiązania CTLA-4 zamiast miejsca wiązania CD-28, w celu zwiększenia powinowactwa wiązania CD28 zachowując wzmocnienie odpowiedzi immunologicznej.
W jednej postaci realizacji, miejsca wią zania dla CD80 lub CD86 na CTLA-4 i CD28 wymienia się tak, że region wiązania na CD28 zastępuje się regionem wiązania CTLA-4. Wpływ cząsteczki chimerycznej CD28 z regionem wiązania CTLA-4 ma na celu zwiększenie powinowactwa CD28 do CD80 lub CD86 i zwiększenia wielkości wzmocnienia odpowiedzi immunologicznej. W alternatywnej postaci realizacji, cząsteczki chimeryczne CD80 i CD28 lub CD86 i CD28, lub ich fragmenty, są związane z błoną i poprawiają zdolności wzmacniania odporności tych cząsteczek. W alternatywnej postaci realizacji, cząsteczki chimeryczne CD80 i CTLA-4 lub CD86 i CTLA-4, lub ich fragmenty, są związane z błoną i poprawiają zdolności hamowania odporności tych cząsteczek. W alternatywnej postaci realizacji, cząsteczki chimeryczne CD80 i CTLA- 4 lub CD86 i CTLA-4, lub ich fragmenty, są związane z błoną i przekierowują odpowiedź immunologiczną, aby uzyskać pożądany efekt.
W alternatywnej postaci realizacji, koci CD80, CD86, CD28 lub CTLA-4 jest bia ł kiem fuzyjnym z innym polipeptydem. Polipeptyd obejmuje, bez ograniczenia, immunoglobulin ę , antygen, antygen nowotworowy, receptor powierzchniowo-komórkowy, lub ligand powierzchniowo-komórkowy.
Anty-kocie przeciwciała CD80, CD86, CD28 lub CTLA-4
Niniejszy wynalazek obejmuje przeciwciała, które są specyficzne dla polipeptydu kociego CD80, CD86, CD28 lub CTLA-4 identyfikowanego jak opisano powyżej. Przeciwciała są poliklonalne lub
PL 199 359 B1 monoklonalne, i wyróżniają koci CD80, CD86, CD28 lub CTLA-4 różnych gatunków, identyfikują domeny funkcjonalne, i inne. Takie przeciwciała dogodnie wykonuje się przy użyciu metod i kompozycji opisanych w Harlow i Lane, Antibodies A - Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988, jak również znanych fachowcom technologii immunologicznych i hybrydomy. Jeśli naturalne lub syntetyczne peptydy pochodzące od kociego CD80, CD86, CD28 lub CTLA-4 stosuje się do indukcji u kota odpowiedzi immunologicznej specyficznej wobec CD80, CD86, CD28 lub CTLA-4, peptydy dogodnie sprzęga się z odpowiednim nośnikiem, takim jak KLH i podaje w odpowiednim adjuwancie, takim jak Freund'a. Korzystnie, wybrane peptydy sprzęga się z nośnikiem rdzenia lizyny, zasadniczo zgodnie z metodami od Tan (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85:5409-5413. Otrzymane przeciwciała, zwłaszcza anty-idiotypowe przeciwciała wewnętrznego obrazowania, wytwarza się także przy użyciu znanych metod.
W jednej postaci realizacji, oczyszczone kocie CD80, CD86, CD28 lub CTLA-4 stosuje się do immunizacji myszy, po czym ich śledziony usuwa się, i splenocyty stosuje do utworzenia hybryd z komórkami szpiczaka, aby otrzymać klony komórek wydzielających przeciwciało zgodnie z technikami, które są standardowe w technice. Otrzymane przeciwciała monoklonalne wydzielone przez takie komórki, przesiewa się przy użyciu testów in vitro pod względem następujących aktywności: wiązania z kocim CD80, CD86, CD28 lub CTLA-4, hamowania aktywności wiązania z receptorem CD80, CD86, CD28 lub CTLA-4, i hamowania aktywności stymulatorowej komórki T przez CD80, CD86, CD28 lub CTLA-4. Przeciwciała anty-kociemu CD80, anty-kociemu CD86, anty-kociemu CD28 lub anty-kociemu CTLA-4 stosuje się w celu identyfikacji i oceny ilościowej kociego CD80, CD86, CD28 lub CTLA-4, przy użyciu testów immunologicznych takich jak ELISA, RIA, i inne. Stosuje się także przeciwciała anty-kociemu CD80, anty-kociemu CD86, anty-kociemu CD28 lub anty-kociemu CTLA-4, w celu wyczerpania ekstraktów kociego CD80, lub kociego CD86, lub kociego CD28, lub kociego CTLA-4. Oprócz tego, te przeciwciała można stosować w celu identyfikacji, izolowania i oczyszczenia kociego CD80, CD86, CD28 lub CTLA-4 z różnych źródeł, i aby przeprowadzić badania lokalizacji subkomórkowej i histochemicznej.
Zastosowania
Koci ligand CD80 (B7-1), koci ligand CD86 (B7-2), koci receptor CD28 lub koci receptor CTLA-4 (CD152) wytworzony według niniejszego wynalazku, można stosować korzystnie jako szczepionkę do zapobiegania chorobie zakaźnej lub do pobudzania wzrostu u homologicznych lub heterologicznych gatunków kotów. Przykładowo, koekspresja CD80 lub CD86, z cząsteczkami kostymulatorowymi CD28 lub CTLA-4, w jakimkolwiek połączeniu, i antygen nowotworu lub antygen organizmu patogenicznego. Koekspresja kociego CD80 lub CD86, z receptorem kociego CTLA-4 posiada zdolność hamowania aktywacji limfocytów T i hamowania odpowiedzi immunologicznej. Konkretnym przykładem będzie koekspresja CD80 lub CD86, z immunogenami pochodzącymi od FIV, FeLV, lub FIP w wektorze wirusowym lub DNA wektorze ekspresji, który, jeśli podaje się go jako szczepionkę będzie aktywować, wzmacniać lub regulować proliferację limfocytów T CD4+ i CD8+, i indukować cytokiny regulujące odporność, takie jak IL-2, IFN-g, IL-12, TNFa, IL-6 i inne. Innym konkretnym przykładem będzie ekspresja CD80, CD86, CD28 lub CTLA-4 w wektorze wirusowym lub wektorze ekspresji DNA, który, jeśli podaje się jako środek terapeutyczny, będzie regulować lub przekierowywać odpowiedź immunologiczną.
Wzmocnienie odporności poprzez interakcję kociego CD80 lub CD86 z CD28 lub CTLA-4 lub inhibicję odpowiedzi immunologicznej poprzez interakcję kociego CD80 lub CD86 z CTLA-4 korzysta raczej z naturalnego procesu regulacji, niż dodawania obcych substancji, które mogłyby nawet zwielokrotnić szkodliwy wpływ na całe zdrowie lub przez długi okres. Cząsteczki CD80, CD86, CD28 lub CTLA-4 podaje się z innymi cząsteczkami rekombinowanymi, takimi jak te, które kodują antygeny pożądane dla indukcji odporności. Koci gen CD80, CD86, CD28 i/lub CTLA-4 wprowadza się do wektora ekspresji i zakaża lub transfekuje do komórki docelowej i powoduje ekspresję produktu genowego wewnątrz komórki docelowej tak, że jest on zakotwiczony w błonie plazmatycznej komórki docelowej lub komórki prezentującej antygen, lub wydzielony na zewnątrz komórki docelowej lub komórki prezentującej antygen. Wektor ekspresji, taki jak plazmid, wirus Semliki Forest, pokswirus lub herpeswirus, przenosi gen do komórki prezentującej antygen. Koci gen CD80, CD86, CD28 i/lub CTLA-4 lub fragmenty genów w jakimkolwiek połączeniu, wprowadza się do wektora ekspresji DNA lub RNA, wstrzykuje kotowatemu i powoduje ekspresję produktu genowego w kotowatym w postaci „nagiego” DNA/RNA lub szczepionki genetycznej. Koekspresja immunogenu i CD80, CD86, CD28 i/lub CTLA-4 wewnątrz komórki docelowej lub kotowatego, przyczynia się do aktywacji, wzmacniania aktywacji, lub
PL 199 359 B1 regulacji limfocytów T, limfocytów B i innych komórek. Alternatywnie, białko, które uległo ekspresji możnaby podać po ekspresji w systemie prokariotycznym lub eukariotycznym, takim jak plazmid, wirus Semliki Forest, pokswirus lub herpeswirus lub inny wektor wirusowy lub bakteryjny. Koci CD80, CD86, CD28, lub białko CTLA-4 normalnie działa zakotwiczone w błonie komórkowej w postaci cząsteczek pomocniczych błony plazmatycznej, lecz może być prezentowane w innych postaciach, szczególnie bez zakotwiczenia w błonie.
W jednej postaci realizacji, kocie CD80 i kocie CD86 są rozpuszczalne, bez domeny transbł onowej lub regionu hydrofobowego, i oddziaływują z cząsteczkami kostymulatorowymi CD28 lub CTLA-4, w formie zwią zanej z bł oną albo rozpuszczalnej. W alternatywnej postaci realizacji, kocie CD80 lub kocie CD86 są związane z błoną i cząsteczki kostymulatorowe CD28 lub CTLA-4 występują w postaci rozpuszczalnej, bez domeny transbłonowej lub regionu hydrofobowego. Rozpuszczalny CD28 lub CTLA-4, korzystnie w postaci dimerycznej, jest użyteczny do leczenia choroby związanej z immunosupresją u kotów, za pośrednictwem komórek T. Rozpuszczalny CD28 lub CTLA-4 zapobiega odrzuceniu przeszczepianych tkanek i można go stosować do leczenia choroby autoimmunologicznej. Konkretnie, rozpuszczalny CD28 lub CTLA-4 jest użyteczny do zapobiegania chorobie odrzucenia przeszczepu przy przeszczepie szpiku kostnego. Rozpuszczalny CD28 lub CTLA-4 zapobiega wiązaniu komórki, zawierającej związany z błoną koci CD80 lub CD86.
W innej postaci realizacji, koci CTLA-4 łączy się z immunoglobuliną (Ig). Fuzją CTLA-4-Ig jest użyteczną to hamowania odpowiedzi immunologicznej lub do leczenia choroby autoimmunologicznej . Choroby autoimmunologiczne obejmuje, bez ograniczenia, reumatoidalne zapalenie stawów, łuszczycę, odrzucenie przeszczepu, chorobę związaną z odrzuceniem przeszczepu.
W jednej postaci realizacji, koci CD80, i/lub białko CD86 o ekspresji w formie związanej lub rozpuszczalnej będzie stosowane do traktowania przy zmniejszaniu lub niszczeniu kocich nowotworów. Konkretnie, koci CD80 i/lub białka CD86 będą ulegało ekspresji od wektora wirusowego lub nagiego DNA poprzez bezpośrednie nastrzykiwanie nowotworu lub podawane układowe w połączeniu z kowektorowanymi kocimi antygenami związanymi z nowotworem, lub bez. Odmiany konserwatywne pod względem sekwencji i konserwatywne pod względem działania DNA i polipeptydy kociego CD80, CD86, CD28 lub CTLA-4 lub bioaktywny fragment kociego CD80, CD86, CD28 lub CTLA-4 lub subfragment łączy się w ramce z inną sekwencją, taką jak cytokina, interleukina, interferon, czynnik stymulacji kolonii, antygen drobnoustroju patogenicznego, przeciwciało, lub sekwencja oczyszczania, taka jak znacznik his lub gen reporterowy, taki jak lacZ E. coli, uidA E. coli, lub zielone białko fluorescencyjne.
Szczepionki
Niniejszy wynalazek obejmuje sposoby i kompozycję do wzmacniania skuteczności odpowiedzi immunologicznej u gatunków kotów. W tej postaci realizacji, koci CD80, CD86, CD28 lub CTLA-4 stosuje się w połączeniu z immunogenem dla którego pożądane jest wywołanie odpowiedzi immunologicznej. Przykładowo, w kocich szczepionkach, zawierających immunogeny patogenów takich jak wirus kociego niedoboru odporności i wirus białaczki kociej, i inne patogeny tak jak koci parwowirus, koci leptowirus, i koci koronawirus, pożądane jest zawarcie kociego CD80, CD86, CD28 lub CTLA-4 w szczepionce aby regulować wielkość i jakość odpowiedzi immunologicznej. W tym celu, koci CD80, CD86, CD28 lub CTLA-4 oczyszczony ze źródeł rodzimych lub rekombinowanych, jaki opisano powyżej występuje w preparacie szczepionki w stężeniu w zakresie, wynoszącym około 0,01 do 100,0 mg na szczepionkę, na kota. Alternatywnie, w preparacie szczepionki występuje rekombinowany wektor, wykazujący ekspresję kociego CD80, CD86, CD28 i/lub CTLA-4 i immunogen patogenu kociego w ilościach o stężeniu w zakresie wynoszącym około 0,01 do 100,0 mg na szczepionkę na kota, korzystnie w preparacie szczepionki o stężeniu w zakresie wynoszącym około 0,25 mg/kg/dzień do około 25 mg/kg/dzień. Koci CD80, CD86, CD28 lub CTLA-4 podaje się w połączeniu z żywą (czyli replikującą) szczepionką wirusową lub szczepionką nie replikującą. Nie ograniczające przykłady szczepionek replikujących to te, które obejmują natywne lub rekombinowane wirusy lub bakterie, takie jak modyfikowany koci herpeswirus lub modyfikowany pokswirus szopów. Nie ograniczające przykłady żywych szczepionek wirusowych z ograniczoną lub brakiem replikacji u gospodarza będącego kotem, lecz ekspresją obcego DNA (takiego jak koci CD80, CD86, CD28 lub CTLA-4 lub immuhogen patogenu kociego) w komórce gospodarza, jest modyfikowany pokswirus drobiu, modyfikowany pokswirus świń lub wirus Semliki Forest. Nie ograniczające przykłady szczepionek nie replikujących to te, które obejmują zabite lub inaktywowane wirusy lub inne drobnoustroje, lub surowe lub oczyszczone antygeny,
PL 199 359 B1 pochodzące z natywnych, rekombinowanych, lub syntetycznych źródeł, takich jak, np., szczepionki wirusa białaczki kociej.
Handlowe źródła szczepionek kocich są znane fachowcom (Compendium of Veterinary Pharmaceuticals, 1997) i stosuje się je w połączeniu z niniejszym wynalazkiem dla otrzymania skuteczniejszej szczepionki.
Szczepionka do indukcji i regulacji odpowiedzi immunologicznej u kotowatych wobec immunogenu, składa się z immunogenu i skutecznej ilości kociego CD80 lub kociego CD86 z kocim CD28 lub kocim CTLA-4 albo bez, w celu wzmocnienia odpowiedzi immunologicznej, lub kociego CD80 lub kociego CD86 z kocim CTLA-4 w celu zahamowania odpowiedzi immunologiczniej.
Immunogen wybiera się z grupy obejmującej, bez ograniczenia, kocie patogeny, takie jak wirus kociego niedoboru odporności, wirus białaczki kociej, wirus zakaźnego kociego zapalenia otrzewnej, wirus kociej panleukopenii (parwo), koci kaliciwirus, koci reowirus typu 3, koci rotawirus, koci koronawirus (zakaźne zapalenie otrzewnej), wirus wścieklizny, koci wirus syncytialny, koci wirus mięsaka, koci herpeswirus (wirus zapalenia dróg oddechowych), wirus kociej choroby Borna, Chlamydia, Toxoplasmosis gondii, kocie pasożyty, Dirodilaria immitis, pchły, patogeny bakteryjne, i inne. Regulacja wzrostu lub regulation aktywacji typu komórki, takiego jak limfocyt T, wskazuje, że odpowiedź regulatorowa albo stymuluje albo hamuje wzrost komórki. Regulacja odpowiedzi immunologicznej u kotowatych wskazuje, że odpowiedź immunologiczna jest albo stymulowana albo hamowana, w celu leczenia choroby lub czynnika zakaźnego w kotowatych.
W zalecanej postaci realizacji, geny kodują ce koci CD80 i CD28, CD80 i CTLA-4, CD86 i CD28, lub CD86 i CTLA-4, w połączeniu z genami immunogenu patogenu kociego, wprowadza się do pojedynczego rekombinowanego wektora wirusowego, a następnie opracowuje się do postaci żywej szczepionki. Kocie geny CD80, CD86, CD28 lub CTLA-4, pojedynczo lub w połączeniu z genami kociego immunogenu wprowadza się do rekombinowanego wirusa tak, że ekspresję tych genów kontroluje się przez odpowiedni promotor. Podawanie szczepionki powoduje powstanie ekspresji bioaktywnych ligandów kociego CD80 lub CD86, i receptora CD28 lub CTLA-4 i ekspresji kociego immunogenu (immunogenów), w tej samej komórce, zapewniając w ten sposób pierwszorzędowe i drugorzędowe sygnały kostymulatorowe, które są potrzebne do wzmacniania pożądanej odpowiedzi immunologicznej. Ta postać realizacji zapewnia wczesną, zlokalizowaną, odpowiedź immunologiczną wobec immunogenu kota i szczepionkę o ulepszonej skuteczności, przeciwko kociej chorobie.
W innej postaci realizacji, geny kodują ce koci CD80, CD86, CD28 lub CTLA-4, pojedynczo lub w połączeniu, wprowadza się do rekombinowanego wektora wirusowego, i podaje w szczepionce równocześnie z drugim rekombinowanym wektorem wirusowym, który koduje geny kociego immunogenu (immunogenów), zapewniając w ten sposób pożądane odpowiedzi w tej samej komórce lub w komórkach w najbliż szym otoczeniu, aby uzyskać wzmocnienie pożądanej odpowiedzi immunologicznej, oraz szczepionkę o ulepszonej skuteczności, przeciwko kociej chorobie.
Następujące stanowią przykłady rekombinowanych wektorów wirusowych do stosowania w ekspresji kociego CD80, CD86, CD28, i CTLA4, i do stosowania w szczepionce w celu wytworzenia ulepszonej zabezpieczającej odpowiedzi immunologicznej wobec prowokacji drobnoustrojem patogennym:
1. Ekspresja kociego CD80, CD86, CD28, i CTLA4, pojedynczo lub w jakimkolwiek ich połączeniu, częściowo lub w całości, w rekombinowanym pokswirusie świń (wprowadzonym do jakiegokolwiek miejsca insercji nie będącego podstawowym). W celu szczepienia nie replikującego, stosowana pojedynczo, lub w połączeniu z inną szczepionką lub środkiem terapeutycznym (rekombinowanym, żywym, lub zabitym) do stosowania u kotowatych, lecz bez ograniczenia do kotowatych.
2. Ekspresja kociego CD80, CD86, CD28, i CTLA4, pojedynczo lub w ich jakimkolwiek połączeniu, częściowo lub w całości, w rekombinowanym kocim herpeswirusie (wprowadzonym do miejsca FHV gE, lub jakiegokolwiek miejsca insercji nie będącego podstawowym). W celu szczepienia replikującego, stosowana pojedynczo, lub w połączeniu z szczepionką lub środkiem terapeutycznym (rekombinowana, żywa lub zabita) do stosowania u kotowatych, bez ograniczenia do kotowatych.
3. Ekspresja kociego CD80, CD86, CD28, i CTLA4, pojedynczo lub w jakimkolwiek ich połączeniu, częściowo lub w całości, w rekombinowanym wirusie ospy szopów (wprowadzonego do jakiegokolwiek miejsca insercji nie będącego podstawowym). W celu szczepienia replikującego, stosowana pojedynczo, lub w połączeniu z inną szczepionką lub środkiem terapeutycznym (rekombinowana, żywa lub zabita) do stosowania u kotowatych, bez ograniczenia do kotowatych.
PL 199 359 B1
4. Ekspresja kociego CD80, CD86, CD28, i CTLA4, pojedynczo lub w jakimkolwiek połączeniu, częściowo lub w całości, w rekombinowanym pokswirusie świń, zawierającym geny proteazy gag FIV i/lub otoczki.
5. Ekspresja kociego CD80, CD86, CD28 i CTLA4, pojedynczo lub w jakimkolwiek połączeniu, częściowo lub w całości, w rekombinowanym kocim herpeswirusie, zawierającym geny proteazy gag FIV i/lub otoczki.
6. Ekspresja kociego CD80, CD86, CD28 i CTLA4, pojedynczo lub w jakimkolwiek połączeniu, częściowo lub w całości, w rekombinowanym pokswirusie szopów, zawierającym geny proteazy gag FIV i/lub otoczki.
7. Ekspresja kociego CD80, CD86, CD28, i CTLA4, pojedynczo lub w jakimkolwiek połączeniu, w rekombinowanym pokswirusie ś wiń, zawierającym geny proteazy gag FeLV i/lub otoczki.
8. Ekspresja kociego CD80, CD86, CD28, i CTLA4, pojedynczo lub w jakimkolwiek połączeniu, częściowo lub w całości, w rekombinowanym kocim herpeswirusie, zawierającym geny proteazy gag FeLV i/lub otoczki.
9. Ekspresja kociego CD80, CD86, CD28, i CTLA4, pojedynczo lub w jakimkolwiek połączeniu, częściowo lub w całości, w rekombinowanym pokswirusie szopów, zawierającym geny proteazy gag FeLV i/lub otoczki.
10. Ekspresja kociego CD80, CD86, CD28, i CTLA4, pojedynczo lub w jakimkolwiek połączeniu, częściowo lub w całości, w rekombinowanym pokswirusie świń, zawierającym geny proteazy gag FeLV i/lub otoczki i proteazy gag FIV i/lub otoczki, lub każdego ich połączenia.
11. Ekspresja kociego CD80, CD86, CD28, i CTLA4, pojedynczo lub w jakimkolwiek połączeniu, częściowo całości, w rekombinowanym kocim herpeswirusie, zawierającym geny proteazy gag FeLV i/lub otoczki i proteazy gag FIV i/lub otoczki, lub każdego ich połączenia.
12. Ekspresja kociego CD80, CD86, CD28, i CTLA4, pojedynczo lub w jakimkolwiek połączeniu, częściowo lub w całości, w rekombinowanym pokswirusie szopów, zawierającym geny proteazy gag FeLV i/lub otoczki i proteazy gag FIV i/lub otoczki, lub każdego ich połączenia.
13. Ekspresja kociego CD80, CD86, CD28, lub CTLA4, pojedynczo lub w jakimkolwiek połączeniu, częściowo lub w całości, w pokswirusie świń lub pokswirusie szopów, lub jakimkolwiek innym układzie ekspresji, włączając bez ograniczenia E.coli, wirus Semliki forest i bakulowirus, w celu utworzenia nie oczyszczonego lub oczyszczonego polipeptydu. Stosuje, włączając bez ograniczenia tworzenie przeciwciał poliklonalnych i monoklonalnych, i tworzenie odczynnika do wykorzystywania testu funkcjonalnego.
14. Ekspresja kociego CD80, CD86, CD28, lub CTLA-4, pojedynczo lub w jakimkolwiek połączeniu w osłabionym wektorze wirusowym FIV lub FeLV. W jednej postaci realizacji wektor wirusowy FIV lub FeLV osłabia się przez delecję genową.
15. Ekspresja kociego CD80, CD86, CD28, lub CTLA-4, pojedynczo lub w jakimkolwiek połączeniu częściowo lub w całości, w wektorze ekspresji, zawierającym gen (geny) kocich immunogenów w celu podawania w postaci szczepionki genetycznej lub szczepionki nagiego DNA. Wektory obejmują lecz bez ograniczenia: pTarget (Promega, Madison, WI), pcDNA (Invitrogen, Carlsbad, CA). (Donnelly JJ, i inni, 1997; Hassett i Whitton, 1996.)
16. Geny lub fragmenty genów CD80, CD86, CD28, i CTLA-4, pojedynczo lub w jakimkolwiek połączeniu, częściowo lub w całości, można wprowadzać lub transfekować do chromosomów kotowatego lub innego ssaka. Taką integrację tych genów lub fragmentów tych genów można uzyskać z użyciem wektora retrowirusowego i można stosować jako formę terapii genowej.
Niniejszy wynalazek zastrzega sposoby i kompozycje do polepszania odporności wobec choroby gatunków kotów w celach medycznych i/lub handlowych. W tej postaci realizacji, koci CD80, CD86, CD28 lub CTLA-4, ulegający ekspresji pojedynczo lub w jakimkolwiek połączeniu, częściowo lub w cał o ś ci, i w połączeniu z genami lub bez, kodują cymi kocie immunogeny, podaje się kotowatym przy użyciu jakiegokolwiek odpowiedniego sposobu podawania. W celu pobudzenia wzrostu lub odporności wobec choroby, koci CD80, CD86, CD28 lub CTLA-4, podlegający ekspresji lub w jakimkolwiek połączeniu, podaje się w preparacie ilościowo w stężeniu w zakresie, wynoszącym około 0,01 do 100,0 mg na szczepionkę na kota, korzystnie w preparacie o stężeniu w zakresie, wynoszącym około 0,25 mg/kg/dzień do około 25 mg/kg/dzień. W celu pobudzenia wzrostu lub odporności wobec choroby, rekombinowany wektor wirusowy, wykazujący ekspresję kociego CD80, CD86, CD28 lub CTLA-4, pojedynczo lub w jakimkolwiek połączeniu, podaje się w preparacie ilościowo w stężeniu w zakresie wynoszą cym okoł o 0,01 do 100,0 mg na szczepionkę na kota, korzystnie w preparacie
PL 199 359 B1 o stężeniu w zakresie wynoszącym około 0,25 mg/kg/dzień do około 25 mg/kg/dzień. Będzie zrozumiałe, że wymaganą ilość kociego CD80, CD86, CD28 lub CTLA-4 można określić drogą rutynowego eksperymentowania dobrze znaną w technice, tak jak przez ustanowienie matrycy dawkowania i częstotliwości i porównania grupy jednostek doświadczalnych lub podmiotów w stosunku do każdego punktu w matrycy.
Zgodnie z niniejszym wynalazkiem, natywny lub rekombinowany koci CD80, CD86, CD28 lub CTLA-4 opracowuje się z fizjologicznie dopuszczalnym nośnikiem, takim jak, np., solanka buforowana fosforanem lub woda dejonizowana. Preparat może także zawierać zarobki, włączając środek(i) poślizgowy, plastyfikator(y), wzmacniacz(e) absorpcji, środek(i) bakteriobójczy, i inne które są dobrze znane w technice. Koci polipeptyd CD80, CD86, CD28 lub CTLA-4 według wynalazku podaje się każdym skutecznym sposobem, włączając bez ograniczenia drogę dożylną, podskórną, domięśniową, przezmięśniową, miejscową, lub doustną. Do podawania podskórnego, np. postać dawkowania zawiera koci CD80, CD86, CD28 lub CTLA-4 w jałowej soli fizjologicznej. Do podawania doustnego lub dooddechowego, koci CD80, CD86, CD28 lub CTLA-4, z zaróbką lub bez, zamyka się w mikro-lub makrokapsułki, np. liposomy i mikrosfery. Stosuje się także plastry (lub inne postacie dawkowania powolnego uwalniania).
Materiały i metody
Wytwarzanie próbek macierzystych pokswirusów szopów.
Izolat pokswirusa szopów (RPV) ATCC VR-838 użyto do sporządzenia próbek macierzystych pokswirusa szopów i genomowego DNA pokswirusa szopów. Inny izolat RPV V71-I-85A jest dostępny w Center for Disease Control (CDC; Atlanta, GA). Próbki pokswirusa szopów (RPV) wytworzono przez zakażenie komórek VERO, komórek CRFK lub komórek MDCK przy wielokrotności zakażenia wynoszącym 0,01 jednostek tworzących łysinkę/komórkę w Dulbecco's Modified Eagle's Medium, zawierającej 2 mM glutaminę, 100 jednostek/ml penicyliny, 100 jednostek/ml streptomycyny (składniki te otrzymano od Sigma lub równoważnego dostawcy, i w niniejszym później przytacza się je jako pożywka negatywna DMEM). Przed zakażeniem, pojedyncze warstwy komórek przemywano raz pożywką negatywną DMEM, aby usunąć ślady płodowej surowicy bydlęcej. RPV zawarty w początkowym posiewie (0,5 ml na 10 cm płytkę; 10 ml na kolbę T225 cm) pozostawiono potem na dwie godziny aby absorbowała na pojedynczej warstwie komórek, przy czym przekładano je co pół godziny. Po tym okresie, początkowy powiew sprowadzono do zalecanej objętości dodając kompletną pożywkę DMEM (pożywka negatywna DMEM plus 5% płodowa surowica bydlęca). Płytki inkubowano w temperaturze 37°C w atmosferze zawierającej 5% CO2 do wystąpienia efektu cytopatycznego. Pożywkę i komórki zebrano i zamrożono w 50 ml w stożkowej rurce z zakrętką w temperaturze -70°C. Po stopieniu w temperaturze 37°C, wyjściową masę wirusową podzielono do 1,0 ml fiolek i ponownie zamrożono w temperaturze -70°C. Miana wynosiły zwykle około 106 jednostek tworzących łysinkę/ml.
Wytwarzanie próbek macierzystych pokswirusa świń.
Wytworzono próbki pokswirusa świń (SPV) przez zakażenie komórek zarodkowych nerki świni (EMSK), komórek ESK-4, komórek PK-15 lub komórek Vero przy wielokrotności zakażenia 0,01 jednostek tworzących łysinkę/komórkę w mieszaninie 1:1 Iscove's Modified Dulbecco's Medium (IMDM) i pożywki RPMI 1640 zawierającej 2 mM glutaminę, 100 jednostek/ml penicyliny, 100 jednostek/ml streptomycyny (składniki te otrzymano od Sigma lub równoważnego dostawcy, i w niniejszym potem przytacza się je jako pożywka negatywna EMSK). Przed zakażeniem, pojedyncze warstwy komórek przemywano raz pożywką negatywną EMSK, aby usunąć ślady płodowej surowicy bydlęcej. SPV zawarty w początkowym posiewie (0,5 ml na 10 cm płytkę; 10 ml na kolbę T175 cm) pozostawiono potem na dwie godziny, aby absorbowała na pojedynczej warstwie komórek, przy czym przekładano je co pół godziny. Po tym okresie, początkowy posiew sprowadzono do zalecanej objętości, dodając kompletną pożywkę EMSK (pożywka negatywna EMSK plus 5% płodowa surowica bydlęca). Płytki inkubowano w temperaturze 37°C w atmosferze 5% CO2 do wystąpienia efektu cytopatycznego. Pożywkę i komórki zebrano i zamrożono w 50 ml w stożkowej rurce z zakrętką w temperaturze -70°C. Po stopieniu w temperaturze 37°C, wyjściową masę wirusową podzielono do 1,0 ml fiolek i ponownie zamrożono w temperaturze -70°C. Miana wynosiły zwykle około 106 jednostek tworzących łysinkę/ml.
Wytwarzanie DNA RPV lub SPV
W celu izolacji DNA pokswirusa szopów lub pokswirusa świni, konfluentną pojedynczą warstwę komórek VERO (dla RPV) lub komórek EMSK (dla SPV) w kolbie T225 cm2 zakażono przy wielokrotności 0,1 pokswirusem szopów (ATCC VR-838) i inkubowano 3-5 dni aż komórki wykazywały 100% efektu cytopatycznego. Zakażone komórki zebrano potem przez zdrapanie komórek do pożywki
PL 199 359 B1 i wirowanie przy 3000 obrotów na minutę przez 5 minut w wirówce klinicznej. Pożywkę zdekantowano, i grudkę komórkową delikatnie ponownie zawieszono w 1,0 ml Phosphate Buffer Saline (PBS: 1,5 g Na2HPO4, 0,2 g KH2PO4, 0,8 g NaCl i 0,2 g KCl na litr H2O) (na T175) i poddano dwóm kolejnym zamrażaniem i topieniom (-70°C do 37°C). Po ostatnim stopieniu, komórki (na lodzie) poddano działaniu dźwięków, dwukrotnie przez 30 sekund przy czym między nimi występowało 45 sekund okresu chłodzenia. Następnie usunięto szczątki komórkowe przez wirowanie (Sorvall RC-5B superszybka wirówka) przy 3000 obrotów na minutę przez 5 minut w HB4 wirniku w temperaturze 4°C. Wiriony RPV, obecne w supernatancie, zgranulowano potem przez wirowanie przy 15,000 obrotów na minutę przez 20 minut w temperaturze 4°C w wirniku SS34 (Sorvall) i ponownie zawieszono w 10 mM Tris (pH 7,5). Tę frakcję następnie powleczono na 36% gradiencie sacharozy (ciężar/objętość w 10 mM Tris pH 7.5) i wirowano (Beckman L8-70M Ultracentrifuge) przy 18,000 obrotów na minutę przez 60 minut w SW41 wirniku (Beckman) w temperaturze 4°C. Grudkę wirionową ponownie zawieszono w 1,0 ml 10 mM Tris pH 7,5 i poddano działaniu dźwięków na lodzie przez 30 sekund. Tę frakcję powleczono na 20% do 50% ciągłym gradiencie sacharozy i wirowano przy 16,000 obrotów na minutę przez 60 minut w wirniku SW41 w temperaturze 4°C. Zebrano wstęgę wirionu RPV położoną około trzy ćwiartki w dół gradientu, rozcieńczono z użyciem 20% sacharozy i zgranulowano przez wirowanie przy 18,000 obrotów na minutę przez 60 minut w wirniku SW41 w temperaturze 4°C. Otrzymaną grudkę następnie przemyto raz 10 mM Tris pH 7,5 aby usunąć ślady sacharozy i ostatecznie ponownie zawieszono w 10 mM Tris pH 7,5. Następnie DNA RPV ekstrahowano z oczyszczonych wirionów przez lizę (4 godziny w temperaturze 60°C) indukowano przez dodanie EDTA, SDS, i proteinazy K do ostatecznego stężenia wynoszącego odpowiednio 20 mM, 0,5% i 0,5 mg/ml. Po trawieniu, przeprowadzono trzy ekstrakcje mieszaniną fenol:chloroform (1:1) i próbkę wytrącono przez dodanie dwóch objętości absolutnego etanolu i inkubację w temperaturze -20°C przez 30 minut. Próbkę następnie wirowano w miniwirówce Eppendorf przez 5 minut przy pełnej prędkości. Supernatant zdekantowano, i grudkę wysuszono na powietrzu i ponownie uwodniono w 0,01 M Tris pH 7,5, 1 mM EDTA w temperaturze 4°C.
Wytwarzanie próbek macierzystych wirusa FHV: S-FHV-000 otrzymano z ATCC (ATCC nr 636), S-FHV-001 otrzymano z NVSL (NVSL Challenge Wirus Strain SGE, Lot KS). Próbki macierzyste wirusa FHV wytworzono przez zakażenie komórek Crandell Feline Kidney (CRFK) przy wielokrotności zakażenia 1,0 jednostek tworzących łysinkę/komórkę w Dulbecco s Modified Eagle Medium (DMEM), zawierającej 2 mM glutaminę, 100 jednostek/ml penicyliny, 100 jednostek/ml streptomycyny (składniki te otrzymano od Irvine Scientific lub równoważnego dostawcy, i w niniejszym później przytacza się je jako kompletną pożywkę DME) plus 5% płodowa surowica bydlęca. Po wystąpieniu efektu cytopatycznego, pożywkę i komórki zebrano, podzielono na równe ilości i zamrożono w temperaturze -70°C. Miana wynosiły około 1 x 107 to 1 x 108 jednostek tworzących łysinkę/ml.
Wytwarzanie DNA herpeswirusa
Konfluentną pojedynczą warstwę komórek CRFK w kolbie o 25 cm2 lub 60 mm szalce Petriego zakażono 100 ml próbką wirusa. Po całonocnej inkubacji, lub jeśli komórki wykazywały 100% efektu cytopatycznego, komórki zdrapano do pożywki. Komórki, i pożywkę wirowano przy 3000 obrotów na minutę przez 5 minut w wirówce klinicznej. Pożywkę zdekantowano, i grudkę komórkową delikatnie ponownie zawieszono w 0,5 ml roztworze, zawierającym 0,5% NONIDET P-40® (kondensat tlenku oktylofenyloetylenu, zawierającego średnio 9 moli tlenku etylenu na cząsteczkę) (NP-40G, nabyto od Sigma Chemical Co., St. Louis, MO.). Próbkę inkubowano w temperaturze pokojowej przez 10 minut. Dodano dziesięć ml roztworu macierzystego RNazy A (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO.) (roztwór macierzysty wynosił 10 mg/ml, gotowano go przez 10 minut w celu inaktywacji DNAzy). Próbkę wirowano aby zgranulować jądra. Grudkę DNA usunięto z użyciem pipety pasteurowkiej lub drewnianego patyczka, i odrzucono. Płyn superantantu zdekantowano do 1,5 ml rurki Eppendorfa, zawierającej 25 ml 20% dodecylosiarczanu sodu (Sigma) i 25 ml proteinazy K (10 mg/ml; Boehringer Mannheim Biochemicals, Indianapolis, IN). Próbkę wymieszano i inkubowano w temperaturze 37°C przez 30-60 minut. Dodano równą objętość mieszaniny woda-nasycony roztwór fenolu i próbkę krótko mieszano. Próbkę wirowano w miniwirówce Eppendorf przez 5 minut przy pełnej prędkości. Górną fazę wodną usunięto do nowej rurki Eppendorfa, i dodano dwie objętości absolutnego etanolu i rurkę umieszczono w temperaturze -20°C przez 30 minut aby wytrącić kwas nukleinowy. Próbkę wirowano w miniwirówce Eppendorf przez 5 minut. Supernatant zdekantowano, i grudkę wysuszono na powietrzu i ponownie uwodniono w ~16 ml H2O. W celu wytworzenia większych ilości DNA, procedurę zwiększono, zaczynając od walcowatych butelek lub kolb o 175 cm2 z komórkami CRFK. DNA przechowywano w 0,01 M Tris pH 7,5, 1 mM EDTA w temperaturze 4°C.
PL 199 359 B1
Transfekcja DNA w celu wytworzenia rekombinowanego wirusa
Metoda opiera się na procedurze z fosforanem wapnia Grahama i Van der eb [25] z następującymi modyfikacjami. DNA wirusowy i/lub plazmidowy rozcieńczono do 298 ml w 0,01 M Tris pH 7,5, 1 mM EDTA. Dodano czterdzieści ml 2M CaCl2, po czym równą objętość 2X solanki buforowanej HEPES (10 g kwas N-2-hydroksyetylopiperazyno-N'-2-etanosulfonowy (HEPES), 16 g NaCl, 0,748 KCl, 0,258 Na2HPO4.2H2O, 2 g dekstrozy na litr H2O i buforowano NaOH do pH 7,4). Mieszaninę następnie inkubowano na lodzie przez 10 minut, a następnie wkroplono do 80% konfluentnej pojedynczej warstwy komórek CRFK rosnących w 60 mm szalce Petriego w 5 ml pożywki (DME plus 5% płodowa surowica bydlęca). Komórki inkubowano 4 godzin w temperaturze 37°C w nawilżanym inkubatorze, zawierającym 5% CO2. Pożywki na płytkach aspirowano, i komórki traktowano 20% glicerolem w 1XPBS (1,158 Na2HPO4, 0,2 g KHPO4, 0,8 g NaCl, 0,2 g KCl na litr H2O) przez jedną minutę. Komórki przemywano trzykrotnie 5 ml 1XPBS, a następnie odżywiono 5 ml pożywki (DME plus 5% płodowa surowica bydlęca). Komórki inkubowano w temperaturze 37°C jak powyżej przez 3-7 dni aż efekt cytopatyczny wirusa wynosił 50-100%. Wirus zebrano jak opisano powyżej, w celu wytworzenia mas wyjściowych wirusa. Tę masę wyjściową przytaczano jako wyjściowa masa do transfekcji i następnie przesiewano pod względem rekombinowanego wirusa przez przesiew pod względem rekombinowanego herpeswirusa z ekspresją enzymatycznych genów markerowych.
Wytwarzanie zakażonych lizatów komórkowych.
W celu wytworzenia lizatu komórkowego, użyto pożywkę pozbawioną surowicy. Konfluentną pojedynczą warstwę komórek (VERO, CRFK, lub MDCK) w kolbie o 25 cm2 lub 60 mm szalce Petriego, zakażono 100 μl próbką wirusa. Po wystąpieniu efektu cytopatycznego, pożywkę i komórki zebrano i komórki zgranulowano przy 3000 obrotów na minutę przez 5 minut w wirówce klinicznej. Grudkę komórkową ponownie zawieszono w 250 μl buforu do rozrywania (2% dodecylosiarczan sodu, 2% β-merkaptoetanol). Próbki poddano działaniu dźwięków przez 30 sekund na lodzie i przechowywano w temperaturze -20°C.
Procedura Western Blotting
Próbki lizatów i standardy białkowe przepuszczono przez żel poliakrylamidowy zgodnie z procedurę Laemnli. Po elektroforezie w żelu białko przeniesiono i opracowano zgodnie z Sambrook i inni (1989). Pierwszorzędowe przeciwciało rozcieńczono 1:100 z użyciem 5% odtłuszczonego mleka w proszku w Tris-chlorek sodu, i azydku sodu (TSA: 6,61 g Tris-HCl, 0,97 g Tris-zasada, 9,0 g NaCl i 2,0 g azydku sodu na litr H2O). Drugorzędowe przeciwciało sprzężono z fosfatazą alkaliczną i rozcieńczono 1:1000 z użyciem TSA.
Techniki kloningu molekularnego
Techniki manipulacyjne bakterii i DNA, włączając takie procedury jak trawienie endonukleazami restrykcyjnymi, elektroforeza żelowa, ekstrakcja DNA z żelu, ligacja, fosforylacja kinazą, traktowanie fosfatazą, hodowla kultur bakteryjnych, transformacja bakterii z użyciem DNA, i inne metody biologiczno-molekularne, są opisane przez Sambrook i inni (1989) i Current Protocols w Molecular Biology (1992). Z wyjątkiem tego, co zaznaczono, stosowano je z pomniejszymi zmianami.
Sekwencjonowanie DNA
Sekwencjonowanie DNA przeprowadzono przez reakcje sekwencjonowania dideoksy ze znakowaniem fluorescencyjnym przy użyciu ABI PRISM Dye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit z użyciem polimerazy DNA Amplitaq, FS (Perkin-Elmer; instrukcje producenta) i elektroforezowano na automatycznym sekwenatorze DNA Perkin-Elmer/Applied Biosystems Model 373A, zgodnie z instrukcjami producenta. Przeprowadzono reakcje przy użyciu zarówno mieszanin dGTP jak i mieszanin dlTP, w celu wyklarowania obszarów kompresji.
Alternatywnie, skompresowane obszary rozpuszczono na żelach formamidowych. Matrycami były subklony plazmidowe o podwójnych niciach lub subklony M13 o pojedynczej nici, i primery wykonano albo do wektora bezpośrednio na zewnątrz insertu do sekwencjonowana, albo do uprzednio otrzymanej sekwencji. Otrzymaną sekwencję zmontowano i porównano przy użyciu oprogramowania DNAStar.
Kloning z użyciem reakcji łańcuchowej polimerazy. Użyto reakcji łańcuchowej polimerazy (PGR) w celu wprowadzenia miejsc restrykcyjnych wygodnych przy manipulacji różnymi DNA. Użyte procedury są opisane przez Innis, i inni (1990). Ogólnie, powielone fragmenty były mniejsze niż 500 par zasad i regiony krytyczne powielonych fragmentów potwierdzono przez sekwencjonowanie DNA. Primery stosowane w każdym przypadku wyszczególnia się w opisach konstrukcji wektorów homologii, poniżej.
PL 199 359 B1
Procedura rekombinacji homologicznej do wytwarzania rekombinowanych RPV, SPV lub FHV. Metoda ta polega na rekombinacji homologicznej między wirusem ospy szopów DNA i DNA plazmidowego wektora homologii, która zachodzi w hodowli tkankowej komórek, zawierających zarówno pokswirus szopów DNA jak i transfekowany plazmidowy wektor homologii. Aby zaszła rekombinacja homologiczna, pojedyncze warstwy komórek (CRFK, MDCK, lub VERO) zakaża się S-RPV-000 (ATCC VR-838) lub S-SPV-001 lub S-FHV-001 przy wielokrotności zakażenia 0,01 jednostek tworzących łysinkę/komórkę w celu wprowadzenia replikującego RPV (czyli syntezy DNA) do komórki. DNA plazmidowego wektora homologii następnie transfekuje się do tych komórek zgodnie z procedurą infekcji-transfekcji. Konstrukcję wektorów homologii stosowany w tej procedurze opisano poniżej.
Procedura infekcji-transfekcji cm płytki komórek (CRFK, MDCK, lub VERO) konfluentnych w około 80% zakaż ono S-RPV-000 lub S-SPV-001 lub S-FHV-001 przy wielokrotności zakażenia 0,01 jednostek tworzących łysinkę/komórkę w pożywce negatywnej DMEM i inkubowano w temperaturze 37°C w nawilżonym 5% CO2 środo-wisku przez 2-3 godziny. Stosowana procedura transfekcji jest zasadniczo taka jak rekomendowana dla LipofectinTM Reagent (BRL). W skrócie, na każdą 6 cm płytkę rozcieńczono 15 μg od plasmid DNA aż do 100 μl z użyciem H2O. Oddzielnie, rozcieńczono 50 mikrogramów Lipofectin Reagent do 100 μl z H2O. Następnie 100 μl rozcieńczonego Lipofectin Reagent wkroplono do rozcieńczonego plazmidowego DNA zawartego w polistyrenowej 5 ml rurce z zatrzaskową przykrywką i delikatnie mieszano. Mieszaninę inkubowano następnie przez 15-20 minut w temperaturze pokojowej. W tym czasie, posiew wirusa usunięto z 6 cm płytki i pojedyncze warstwy komórek przemyto raz pożywką negatywną DMEM. Następnie do mieszaniny plazmidowego DNA/lipofektyny dodaje się trzy ml pożywki negatywnej DMEM i zawartości pipetuje na pojedynczą warstwę komórek. Komórki inkubowano przez noc (około 16 godzin) w temperaturze 37°C w środowisku nawilżonym 5% CO2. Następnego dnia usunięto 3 ml pożywki negatywnej DMEM i zastąpiono 5 ml kompletną pożywką DMEM. Komórki inkubowano w temperaturze 37°C w 5% CO2 przez 3-5 dni aż efekt cytopatyczny wirusa wynosił 80-100%. Wirus zebrano jak opisano powyżej w celu wytworzenia mas wyjściowych wirusa. Tę masę wyjściową przytaczano jako masę wyjściową do transfekcji, i następnie przesiewano pod względem rekombinowanego wirusa przez przesiew BLUOGAL pod względem rekombinowanego pokswirusa szopów lub przesiew CPRG pod względem rekombinowanego pokswirusa szopów.
Przesiew pod względem rekombinowanego RPV lub SPV lub FHV z ekspresją β-galaktozydazy (testy BLUOGAL i CPRG) lub β-glukuronidazy (test X-GLUC). Gdy β-galaktozydazę E. coli (lacZ) gen markerowy wprowadzono do rekombinowanego wirusa, uwidoczniono łysinki, zawierające rekombinanty, jedną z dwóch prostych metod. W pierwszej metodzie, wprowadzono chemiczny BluogalTM (Life Sciences Technology, Bethesda, MD) (200 μg/ml) do wierzchniej warstwy agarozy podczas testu łysinek, i łysinki wykazujące ekspresję aktywnej β-galaktozydazy stały się niebieskie. Łysienki niebieskie przeniesiono następnie na świeże komórki (MDCK, CRFK lub VERO) i oczyszczono przez dodatkową izolację niebieskiej łysinki. W drugiej metodzie, do wierzchniej warstwy agarozy podczas testu łysinek wprowadzono CPRG (Boehringer Mnanheim) (400 μg/ml) i łysinki wykazujące ekspresję aktywnej β-galaktozydazy stały się czerwone. Czerwone łysinki przeniesiono następnie na świeże komórki (MDCK, CRFK lub VERO) i oczyszczono przez dodatkową izolację czerwonych łysinek. W obu przypadkach wirusy oczyszczano zazwyczaj przez trzy do czterech okrążeń oczyszczania metodą łysinek.
Gdy gen markerowy β-glukuronidazy E. coli (uidA) wprowadzono do rekombinowanego wirusa, łysinki zawierające rekombinanty uwidoczniono przy użyciu substratu chromogenicznego, X-e-D-gluUA CHX (K-GLUC; kwas 5-bromo-4-chloro-3-indoksylo-e-D-glukuronowy, sól cykloheksylammoniowa; Biosynth AG; Szwajcaria) wprowadzonego (200 μg/ml) do wierzchniej warstwy agarozy podczas testu łysinek, i łysinki wykazujący ekspresję aktywnej β-glukuronidazy stały się niebieskie. Łysinki niebieskie przeniesiono następnie na świeże komórki (MDCK, CRFK lub VERO) i oczyszczono przez dodatkowa izolację niebieskich łysinek.
Przesiew pod względem ekspresji obcego genu w rekombinowanym RPV przy użyciu testów czarnej łysinki. W celu analizy ekspresji obcych antygenów o ekspresji w rekombinowanych wirusach ospy szopów, pojedyncze warstwy komórek (MDCK, CRFK lub VERO) zakażono rekombinowanym RPV lub SPV lub FHV, nalanych z użyciem odżywczych pożywek agarozowych i inkubowano przez 3-5 dni w temperaturze 37°C do wystąpienia rozwoju łysinek. Następnie nalaną wastwę agarozową usunięto z płytki, komórki utrwalono 100% metanolem przez 10 minut w temperaturze pokojowej i komórki wysuszono na powietrzu. Utrwalenie komórek umożliwia wykrycie antygenu cytoplazmowego,
PL 199 359 B1 jak również antygenu powierzchniowego, podczas gdy specyficzną ekspresję antygenu powierzchniowego można wykryć przy użyciu komórek nie utrwalonych. Pierwszorzędowe przeciwciało następnie rozcieńczono do odpowiedniego rozcieńczenia z użyciem 1X blotto (5% odtłuszczonego mleka w proszku w Tris-chlorek sodu, i azydku sodu (TSA: 6,61 g Tris-HCl, 0,97 g Tris-zasada, 9,0 g NaCl i 2,0 g azydku sodu na litr H2O) i inkubowano pojedynczej warstwie komórkowej przez 2 godziny w temperaturze pokojowej. Nie związane przeciwciało usunięto następnie przez przemywanie komórek trzykrotnie buforem TS w temperaturze pokojowej. Drugorzędowe przeciwciało, koniugat z fosfatazą alkaliczną, rozcieńczono 1:1000 z użyciem 1X blotto i inkubowano z komórkami przez 2 godziny w temperaturze pokojowej. Nie związane drugorzędowe przeciwciało usunięto następnie przez przemywanie komórek trzykrotnie buforem TS (6,61 g Tris-HCl, 0,97 g Tris-zasada, 9,0 g NaCl na litr H2O) w temperaturze pokojowej. Komórki inkubowano następnie 15-30 minut w temperaturze pokojowej ze świeżo sporządzonym roztworem substratu (100 mM Tris HCl pH. 9,5, 100 mM NaCl, 5 mM MgCl2, 0,3 mg/ml Nitro Blue Tetrazolium i 0,15 mg/ml fosfataza 5-bromo-4-chloro-3-indoilowa). Łysinki wykazujące ekspresję prawidłowego antygenu barwią się na czarno. Roztwór utrwalający (20 mM Tris-HCl pH 2,9 i 1 mM EDTA) użyto w celu zatrzymania reakcji wywoływania barwy.
Przesiew pod względem ekspresji kociego CD80 (B7-1) i CD86 (B7-2) w rekombinowanym SPV, RPV lub FHV przy użyciu testów czarnej łysinki. Aby przeanalizować ekspresję cząsteczek kostymulatorowych CD80 lub CD86 o ekspresji w rekombinowanych pokswirusach świń, pokswirusach szopów lub kocich herpeswirusach na pojedynczych warstwach komórek (MDCK, CRFK, VERO lub ESK-4) zakażono je rekombinowanymi wirusami RPV lub SPV lub FHV wykazującymi ekspresję CD80 lub CD86, nalano odżywczymi pożywkami agarozowymi i inkubowano przez 3-5 dni w temperaturze 37°C do wystąpienia rozwoju łysinek.
Wierzchnią warstwę agarozy usunięto następnie z płytki, komórki albo utrwalono 100% metanolem przez 10 minut w temperaturze pokojowej i komórki wysuszono na powietrzu lub pozostawiono nie utrwalone lub pozostawiono nie utrwalone i traktowano bezpośrednio 1X PBS. Utrwalenie komórek umożliwia wykrycie antygenu cytoplazmowego jak również antygenu powierzchniowego podczas, gdy specyficzną ekspresję antygenu powierzchniowego można wykryć przy użyciu komórek nie utrwalonych. Następnie chimerę huCTLA-4/Fc (R&D Systems, Minn. MN, numer katalogowy 325-CT) rozcieńczono do odpowiedniego rozcieńczenia z użyciem IX blotto (5% odtłuszczonego mleka w proszku w Tris-chlorek sodu (TS: 6,61 g Tris-HCl, 0,97g Tris-zasada, 9,0 g NaCl na litr H2O) i inkubowano w pojedynczej warstwie komórkowej przez 2 godziny w temperaturze pokojowej. Nie związaną chimerę usunięto następnie przez trzykrotne przemywanie komórek buforem TS w temperaturze pokojowej. Przeciwciało do wykrywania, monoklonalny anty-hulgG1 fc koniugat z fosfatazą alkaliczną (Zymed, pozycja katalogowa 05-3322) rozcieńczono do odpowiedniego stężenia z użyciem 1X blotto i inkubowano z komórkami przez 2 godziny w temperaturze pokojowej. Nie związane przeciwciało do wykrywania usunięto następnie przez trzykrotne przemywanie komórek buforem TS 6,61 g Tris-HCl, 0,97 g Tris-zasada, 9,0 g NaCl na litr H2O) w temperaturze pokojowej. Komórki następnie inkubowano 15-30 minut w temperaturze pokojowej ze świeżo sporządzonym roztworem substratu (100 mM Tris HCl pH 9,5, 100 mM NaCl, 5 mM MgCl2, 0,3 mg/ml Nitro Blue Tetrazolium i 0,15 mg/ml 5-bromo-4-chloro-3-indoilofosfatazy). Łysinki wykazujące ekspresję CD80 lub CD86 barwią się na czarno. Roztwór utrwalający (20 mM Tris-HCl pH 2,9 i 1 mM EDTA) użyto w celu zatrzymania reakcji wywoływania barwy.
Przesiew pod względem kociego bioaktywności interferonu gamma o ekspresji w rekombinowanym SPV, RPV lub FHV przy użyciu redukcji łysinek VSV.
CRFK lub odpowiednią kocią linię komórkową w 96-studzienkowych płytkach, traktowano supernatantami komórek zakażonych rekombinowanymi wirusami, wykazującymi ekspresję kociego IFNgamma i inkubowano przez 6-12 godzin w temperaturze 37°C. Następnie do odpowiednich studzienek dodano wirus VSV (100-1000 cząstek/studzienkę) i inkubowano przez 24 godziny, lub aż studzienki kontrolne, tylko z komórkami, uległy całkowitej lizie. Studzienki przemyto trzykrotnie IX PBS i pojedyncze warstwy utrwalono 100% metanolem i wysuszono na powietrzu. Do wszystkich studzienek dodano 0,05% roztwór fioletu krystalicznego na 10 minut w temperaturze pokojowej, następnie wysuszono na powietrzu. Studzienki oceniono pod względem obecności puprurowego zabarwienia. Zdrowa, nie uszkodzona, pojedyncza warstwa komórek będzie wychwytywać barwnik fioletu krystalicznego. Supernatanty z aktywnością IFN-γ będą zapezpieczać CRFKs od lizy komórkowej indukowanej VSV, i purpurowego zabarwienia.
PL 199 359 B1
Procedura oczyszczania glikoprotein wirusowych do stosowania w diagnostyce. Glikoproteinę wirusową oczyszcza się przy użyciu kolumn powinowactwa przeciwciała. Aby wytworzyć przeciwciała monoklonalne, samice myszy BALB/c w wieku 8 do 10 tygodni szczepi się dootrzewnowo siedem razy, co dwa do czterech tygodni, 107 jednostek tworzących łysinkę rekombinantów pokswirusa szopów. Trzy tygodnie po ostatnim szczepieniu, myszom wstrzykuje się dootrzewnowe 40 mg odpowiadającej glikoproteiny wirusowej. Myszom usuwa się śledziony trzy dni po ostatniej dawce antygenu. Splenocyty łączy się z mysimi komórkami szpiczaka NS1/Ag4 z użyciem procedury modyfikowanej przez Oi i Herzenberga. Splenocyty i komórki szpiczaka granuluje się razem przez wirowanie przy 300 x g przez 10 minut. Do grudki komórkowej dodaje się jeden ml 50% roztworu glikolu polietylenowego (ciężar cząsteczkowy 1300-1600), mieszając przez jedną minutę. Do komórek dodaje się pożywkę Dulbecco's modyfikowaną przez Eagles'a (5 ml) przez trzy minuty. Komórki granuluje się przez wirowanie przy 300 x g przez 10 minut i ponownie zawiesza w pożywce z 10% płodową surowicą bydlęca i zawierającą 100 mM hipoksantynę, 0,4 mM aminopterynę i 16 mM tymidynę (HAT). Komórki (100 ml) dodaje się do studzienek ośmiu do dziesięciu 96-studzienkowych płytek do hodowli tkankowej, zawierających 100 ml warstwę odżywczą normalnych komórek śledziony i inkubuje w temperaturze 37°C. Komórki odżywia się świeżą pożywką HAT co trzy do czterech dni.
Supernatanty hodowli hybrydomy testuje się w teście ELISA w płytkach do mikromianowania o 96 studzienkach powleczonych 100 ng glikoproteiny wirusowej. Supernatanty reaktywnych hybrydom analizuje się dodatkowo testem czarnej łysinki i przez Western Błot. Wyselekcjonowane hybrydomy przez dootrzewnową injekcję 5 x 106 komórek hybrydomy myszom BALB/c traktowanych pristanem.
Lizaty komórkowe rekombinantów pokswirusa szopów otrzymuje się jak opisano w wytwarzaniu zakażonych lizatów komórkowych. Lizaty komórkowe, zawierające glikoproteinę (100 ml) przepuszcza się przez 2 ml agarozowej żywicy powinowactwa, na której unieruchomiono 20 mg glikoproteinowego przeciwciała monoklonalnego, zgodnie z instrukcjami producenta (AFC Medium, New Brunswick Scientific, Edison, N.J.). Kolumnę przemywa się 100 ml 0,1% Nonidet P-40 w solance buforowanej fosforanem (PBS) aby usunąć nie specyficznie związany materiał. Związaną glikoproteinę wymywa się 100 mM buforu węglanowego, pH 10,6 (40).
Frakcje wymyte przedtem i potem monitoruje się pod względem czystości przez reaktywność w stosunku do przeciwciał monoklonalnch RPV w systemie ELISA.
Test ELISA
Standardowy protokół testu enzymatyczno-immunologicznego (ELISA) stosuje się do określenia statusu immunologicznego zwierzęcia po szczepieniu i prowokacji. Roztwór glikoproteiny antygenu (100 ml przy ng/ml w PBS) pozostawia się do absorpcji ze studzienkami płytek do mikromianowania, na 18 godzin w temperaturze 4°C. Powleczone studzienki przepłukuje się raz PBS. Studzienki blokuje się przez dodanie 250 ml PBS zawierającej 1% BSA (sigma) i inkubowanie 1 godzinę w temperaturze 37°C. Zablokowane studzienki przepłukuje się raz PBS, zawierającą 0,02% Tween 20. Do studzienek dodaje się 50 ml surowicy testowej (uprzednio rozcieńczonej 1:2 w PBS zawierającej 1% BSA) i inkubuje 1 godzinę w temperaturze 37°C. Surowicę odpornościową usuwa się i studzienki przemywa trzykrotnie PBS, zawierającą 0,02% Tween 20. Dodaje się 50 ml roztworu, zawierającego anty-bydlęcą IgG sprzężoną z peroksydazą chrzanową (rozcieńczoną 1:500 w PBS zawierającej 1% BSA, Kirkegaard i Perry Laboratories, Inc.) w celu uwidocznienia studzienek, zawierających przeciwciało przeciwko specyficznemu antygenowi, roztwór inkubuje się 1 godzinę w temperaturze 37°C, następnie usuwa i studzienki przemywa trzykrotnie PBS zawierającą 0,02% Tween 20. Do każdej studzienki dodaje się 100 ml roztworu substratu (ATBS, Kirkegaard i Perry Laboratories, Inc.) i barwę pozostawia się do wywołania na 15 minut. Reakcję przerywa się przez dodanie 0,1 M kwasu szczawiowego. Barwę odczytuje się przy absobancji 410 nm na automatycznym czytniku płytek.
Strategia konstruowania syntetycznych promotorów wirusa ospy. Dla rekombinowanych wektorów ospy świńskiej syntetyczne promotory ospy oferują kilka zalet, włączając zdolność kontrolowania mocy i czasu trwania ekspresji obcego genu. Zaplanowano trzy kasety promotorowe LP1, EP1 i LP2 w oparciu o promotory, które zidentyfikowano w wirusie krowianki. Każdą kasetę zaplanowano tak, aby zawierała sekwencje DNA określone w krowiance, oskrzydlone przez miejsca restrykcyjne, które mogły być stosowane do łączenia kaset w jakimkolwiek porządku lub kombinacji. W każdej kasecie zaplanowano także początkowe metioniny, tak że można było wykonać fuzje w ramce albo w miejscach EcoRI albo BamHI. We wszystkich trzech ramkach odczytu skonstruowano także zbiór translacyjnych kodonów przestankowych oraz wczesny sygnał terminacji transkrypcji w dół od miejsca fuzji
PL 199 359 B1 w ramce. DNA kodujący każ d ą kasetę syntetyzowano zgodnie ze standardowymi technikami i klonowano do odpowiednich wektorów homologii.
Izolacja początkowego fragmentu CD80
Ekstrahowano mRNA komórek jednojądrzastych krwi obwodowej (PBMC) stymulowanych przez 16 godzin Gon A przy użyciu odczynnika ekstrakcyjnego RNA RNAzolB (Biotexc, Houston, TX). Początkowo, cDNA otrzymano z tego RNA przez reakcję odwrotnej transkryptazy (RT) wykorzystującej oligo dT jako primer 3'. W skrócie, RNA i oligo dT ogrzano do temperatury 75°C przez 3 minuty, aby usunąć strukturę drugorzędową. Następnie dodano RT, dNTP, bufor i wodę destylowaną i mieszaninę inkubowano przez 1 godzinę w temperaturze 42°C. Po tej inkubacji próbkę ogrzano do temperatury 95°C przez 5 minut w celu inaktywacji RT. Następnie wykorzystano zdegenerowane primery, pochodzące z regionów konsensusowych wewnątrz ludzkich i małpich opublikowanych sekwencji CD80 (GeneBank, Gaithersburg, MA), do początkowego powielenia fragmentu o 344 nukleotydach (ntd.) kodującego region centralny wewnątrz domeny stałej genu:
primer 5' B7-2 GGC CCG AGT A(CT)A AGA ACC GGA C (SEQ ID Nr 56) primer 3' B7-3 GAG (AT) TT GAG GAT C(CT)T GGG AAA (CT)TG (SEQ ID Nr 57)
Użyto protokół gorącego startu reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR), wykorzystującej polimerazę Taq aby powielić produkt. Mieszaninę reakcyjną, bez enzymu Taq, początkowo ogrzano do temperatury 95°C przez 5 minut, w etapie gorącego startu, aby zapobiec tworzeniu dimerów primerów.
Enzym dodano przed początkiem cyklu temperaturowego. Następnie reakcję PGR ogrzano do temperatury 95°C przez 30 sekund aby stopić DNA o podwójnej nici. Następnie reakcję ochłodzono do temperatury 42°C przez 30 sekund aby ułatwić hybrydyzację primerów zdegenerowanych. Wykorzystano niską temperaturę hybrydyzacji, aby ułatwić wiązanie primerów, które nie były w 100% homologiczne. Następnie reakcję ogrzano do temperatury 72°C przez 45 sekund, optymalnej temperatury dla polimerazy Taq, aby wydłużyć primer i skopiować przeciwległą nić DNA. Cykl temperaturowy powtórzono 30 razy. Po 30 cyklach, przeprowadzono końcowych etap wydłużania w temperaturze 72°C przez 7 minut aby ułatwić wydłużenie jakiegokolwiek nie zakończonego produktu. Po uwidocznieniu na żelu agarozowym, produkt poddano ligacji przez noc w temperaturze 16°C z wektorem kloningowym TA (InVitrogen, San Diego, CA) w celu sekwencjonowania. Dwa ml reakcji ligacji użyto do transformowania kompetentnych komórek InvaF. Transformowane bakterie powleczono pasmami na płytki LB (50 mg/ml ampicyliny) powleczonych 40 ml 50 mg/ml roztworu x-gal. Następnego dnia, białe kolonie wyselekcjonowano i posiano do 5 ml pożywek LB, zawierających 100 mg/ml ampicyliny i hodowano przez noc w temperaturze 37°C, wstrząsając przy 225 obrotów na minutę. Przeprowadzono operacje mini-prep na nocnych hodowlach aby określić klony, które posiadały plazmid z prawidłowym insertem. Plazmid ekstrahowano z hodowli przy użyciu a standardowej lizy alkalicznej procedury, z użyciem DNA dodatkowo oczyszczonego przez mieszaniną fenol:chloroform ekstrakcję (Maniatis i inni, 1982). DNA wytrącono w 2 objętościach etanolu, a następnie trawiono EcoRI. Produkty trawienia uwidoczniono na żelu agarozowym, aby określić kolonie z plazmidem, który zawierał prawidłowy insert. Plazmid następnie oczyszczono z klonów dodatnich i sekwencjonowano przy użyciu sekwencjonowania albo w oparciu o Sequenase (USB, Cleveland, OH) za pomocą urządzenia terminatorowego dideoksy ze znakowaniem S35 albo przez sekwencjonowanie za pomocą urządzenia terminatorowego cyklu z barwnikiem fluorescencyjnym (Perkin Elmer, Norwalk CT). Z sekwencji cDNA skonstruowano specyficzne primery 3' i 5' do stosowania w reakcjach szybkiego powielenia 5' końców cDNA (RACE) i do otrzymania sekwencji 3' w połączeniu ze zdegenerowanymi primerami nie odczytanego regionu 3' (UTR).
Izolacja regionu 5' CD80
Do otrzymania sekwencji 5' genu użyto protokół powielenia cDNA Marathon (Clonetech, Palo Alto., CA). Wytworzono mRNA z PBMC stymulowanych przez 12 godzin Gon A i równocześnie 4 godziny z użyciem LPS. mRNA ekstrahowano przy użyciu odczynnika ekstrakcyjnego RNA ULTRASPEC (Biotexc, Houston TX). cDNA wytworzono z użyciem zakotwiczonego primera oligo dT ze zdegenerowanymi nukleotydami na końcu 5' aby ułatwić wiązanie primera z najdalszym końcem 5' ogonka poli A.
Następnie cDNA poddano transkrypcji jak opisano poprzednio. Z cDNA połączono specyficzne linkery z użyciem ligazy DNA T4. Przeprowadzono wewnętrzną PCR na cDNA z użyciem wewnętrznego primera 3' specyficznego dla regionu powielonego uprzednio:
B7-284: TTA TAC TAG GGA GAG GGA AG (SEQ ID Nr 58)
B7-190: AGG CTT TGG AAA ACC TCC AG (SEQ ID Nr 59)
PL 199 359 B1 oraz primera kotwiczącego komplementarnego z połączonego z sekwencją linkerową. Parametry dla reakcji wewnętrznej PCR przy użyciu mieszaniny polimerazy KlenTaą (Clontech, Palo Alto, CA) były następujące: 1 cykl 95°C przez 5 minut; 5 cykli 95°C przez 30 sekund, 72°C przez 30 sekund i 68°C przez 45 sekund; 5 cykli 95°C przez 30 sekund, 65°C przez 30 sekund i 68°C przez 45 sekund; 25 cykli 95°C przez 30 sekund, 60°C przez 30 sekund i 68°C przez 45 sekund, l ml tej reakcji rozcieńczono w 50 ml wody i 5 ml tego rozcieńczenia stosowano następnie w reakcji nested PCR (1 cykl 95°C przez 5 minut; 30 cykli 95°C przez 30 sekund, 65°C przez 30 sekund i 68°C przez 45 sekund z uż yciem mieszaniny polimerazy KlenTaq) za pomocą primera kotwiczą cego specyficznym dla linkera i primera 3' specyficznego dla genu położonego bliżej końca 5' w stosunku do primera inicjalnego (fig. 6).
B7-20: TTG TTA TCG GTG ACG TCA GTG (SEQ ID Nr 60)
B7-135: CAA TAA CAT CAC CGA AGT CAG G (SEQ ID Nr 61) 20 ml każdej reakcji uwidoczniono na 1,5% żelu agarozowym i prawidłowy fragment odcięto od żelu. cDNA ekstrahowano i oczyszczono z agarozy przez wirowanie płatka żelu poprzez nebulizator żelowy i filtr do mikrooczyszczania 0,22 mm (Amicon, Beverly, MA). Następnie oczyszczony DNA sekwencjonowano bezpośrednio przy użyciu sekwencjonowania za pomocą terminatora cyklu z barwnikiem (Perkin Elmer, Norwalk, CN).
Izolacja regionu 3' CD80
Region 3' genu otrzymano przez wybranie 5 primerów specyficznych dla genu z fragmentu o 344 ntd. i regionu 5'sekwencjonowanego uprzednio:
B7-s220 GTC ATG TCT GGC AAA GTA CAA G (SEQ ID Nr. 62)
B7-50 CAC TGA CGT CAC CGA TAA CCA C (SEQ ID Nr 63)
B7-140 CTG ACT TCG GTG ATG TTA TTG G (SEQ ID Nr 64)
B7-550: GCC ATC AAC AGA AGA GTT TCC (SEQ ID Nr 65)
B7-620: TAT GAC AAA CAA CCA TAG CTT C (SEQ ID Nr 66)
Następnie wybrano zdegenerowane primery 3' z regionów konsensusowych ludzkich i małpich UTR 3' CD80. B7-1281 G(A/G)A AGA (A/T)TG CCT CAT GA(G/T) CC (SEQ ID Nr 67)
B7-1260 CA(C/T) (A/G)AT CCA ACA TAG GG (SEQ ID Nr 68)
Wytworzono cDNA z RNA ekstrahowanego z użyciem ULTRASPEC (Biotexc, Houston, TX) z PBMC stymulowanych Con A i LPS jak opisano poprzednio.
Użyto kotwiczącego oligo dT jako inicjującego primera 3' dla transkrypcji RNA do cDNA. Przeprowadzono reakcje PCR w oparciu o polimerazę Taq z tego cDNA przy użyciu specyficznych primerów 5' i zdegenerowanych primerów 3' (1 cykl 95°C przez 5 minut; 95°C przez 30 sekund, 42°C przez 30 sekund i 72°C przez 45 sekund 30 cykli; 72°C przez 7 minut).
Wymagane były dwa okrążenia podwójnych reakcji zanim wytworzono pojedynczy fragment o prawidłowej wielkości. Produkt ten odcięto od 1,5% żelu agarozowego, oczyszczono jak opisano poprzednio, i sekwencjonowano z użyciem terminatora cyklu z barwieniem (Perkin Elmer, Norwalk, CN).
Na podstawie danych o sekwencji regionów 5' i 3', skonstruowano primery, które powielałyby region kodujący całą otwartą ramkę odczytu kociego genu CD80:
B7 START: ATG GGT CAC GCA GCA AAG TGG (SEQ ID Nr 69)
B7-960: CCT AGT AGA GAA GAG CTA AAG AGG C (SEQ ID Nr 70)
Wykorzystano wytworzony uprzednio cDNA PBMC i o którym wiadomo, że zawiera DNA kodujący gen. Ta reakcja PCR (1 cykl 95°C przez 5 minut; 30 cykli 95°C przez 30 sekund, 42°C przez 30 sekund i 72°C przez 45 sekund; 72°C przez 7 minut) wykorzystała polimerazę DNA KlenTaq, mieszaninę enzymów, która zachowuje pewną aktywność endonukleazy 5' w nadziei redukcji przypadkowych błędów często związanych z polimerazą Taq. Reakcja powieliła fragment o 960 parach zasad (bp), który klonowano do wektora kloningowego TA (InVitrogen, San Diego, CA) i sekwencjonowano jak opisano poprzednio. Końcowa sekwencja genu obejmowała cDNA od dwóch oddzielnych zwierząt. Każdą parę zasad genu weryfikowano niezależnie w co najmniej trzech oddzielnych sekwencjach, pochodzących z poszczególnych reakcji PCR, aby zmniejszyć możliwość błędów, pochodzących z pomył ek indukowanych PCR.
Izolacja początkowego fragmentu CD28
Wyekstrahowano mRNA z limfocytów krwi obwodowej HK5 stymulowanych przez 16 godzin Con A przy użyciu odczynnika ekstrakcyjnego RNA RNAzolB (Biotexc, Houston, TX). Początkowo cDNA otrzymano z tego RNA przez reakcję odwrotnej transkryptazy (RT), wykorzystując oligo dT jako primer 3'. W skrócie, the RNA, i oligo dT ogrzano do temperatury 75°C przez 3 minuty, aby usunąć strukturę drugorzędową. Następnie dodano RT, dNTP, bufor i wodę destylowaną i mieszaninę inkubowano przez 1 godzinę w temperaturze 42°C. Po tej inkubacji, próbkę ogrzano do temperatury
PL 199 359 B1
95°C przez 5 minut w celu inaktywacji RT. Zdegenerowane primery pochodzące z regionów konsensusowych znalezionych w ludzkich, mysich i króliczych opublikowanych sekwencjach kwasu nukleinowego CD28 (GeneBank, Bethesda, MD) wykorzystano następnie do początkowego powielenia fragmentu o 673 ntd kodującego większość otwartej ramki odczytu.
CD28-113: CAA CCT TAG CTG CAA GTA CAC (SEQ ID Nr 71)
CD28-768: GGC TTC TGG ATA GGG ATA GG (SEQ ID Nr 72)
Użyto protokół PCR z gorącym startem wykorzystujący polimerazę Taq, aby powielić produkt (1 cykl 95°C przez 5 minut; 95°C przez 30 sekund, 48°C przez 30 sekund i 72°C przez 45 sekund, 30 cykli; 72°C przez 7 minut, 1 cykl). Fragment uwodoczniono następnie na żelu agarozowym i połączo z wektorem kloningowym TA (InVitrogen, San Diego, CA) i sekwencjonowano jak opisano poprzednio. Z sekwencji cDNA, specyficzne primery 3' otrzymano i syntetyzowano do stosowania w 5' reakcjach RACE.
CD28190: CGG AGG TAG AAT TGC ACT GTC C (SEQ ID Nr 73)
CD28 239: ATT TTG GAG AAG TAA ATA TCC (SEQ ID Nr 74)
Izolacja regionu 5'CD28
Wykorzystano modyfikowany protokół GIBCO 5' RACE (Gibco BRL, Gaithersburg, MD), aby otrzymać pozostałą sekwencję 5' kociej cząsteczki CD28. RNA ekstrahowano z PBMC stymulowanych 16 godzin Con A. Do syntezy pierwszej nici cDNA wykorzystano primer specyficzny dla 3'. RNA i primer ogrzano do temperatury 75°C przez 5 minut przed dodaniem innych odczynników RT. Po denaturacji, mieszaninę ochłodzono do temperatury 4°C i dodano bufor reakcyjny, chlorek magnezu, dNTP, DTT i SuperScript RT (Gibco BRL, Gaithersburg, MD). Mieszaninę inkubowano w temperaturze 42°C przez 30 minut, a następnie ogrzano do temperatury 70°C przez 15 minut w celu denaturacji RT. Następnie dodano mieszaninę RNazy i reakcję inkubowano w temperaturze 55°C przez 10 minut w celu usunięcia pozostałego RNA i zapobiegnięcia nieprawidłowemu przedłużeniu transferazy terminalnej (TdT). Następnie cDNA oczyszczono na wirującej kolumnie GlassMax (Gibco BRL, Gaithersburg, MD) aby usunąć nie połączone dNTP i primer. Oczyszczony cDNA wymyto z kolumny, następnie dołączono ogonki z użyciem TdT. TdT wykorzystano aby do cDNA dodać 20-30 nukleotydowy ogonek dC. Do mieszaniny oczyszczonego cDNA, chlorek magnezu, bufor reakcyjny, i dCTP dodano enzym po denaturacji cDNA w temperaturze 95°C przez 3 minuty. Reakcję inkubowano w temperaturze 37°C przez 10 minut i następnie enzym inaktywowano gorącem w temperaturze 70°C przez dodatkowe 10 minut. Dołączony cDNA ogonków powielono w reakcji PCRz gorącym startem w oparciu o polimerazę Taq (95°C przez 5 minut; 95°C przez 30 sekund, 55°C przez 30 sekund 72°C przez 45 sekund, 35 cykli; 72°C przez 7 minut). Primery dla tej reakcji obejmowały primer 3' położony bliżej końca 5' w stosunku do primera syntezy cDNA, i primer kotwiczący specyficzny dla linkera dC i utworzony głównie z dG z kilkoma resztami dl. Jeden ml tej reakcji rozcieńczono w 50 ml wody i następnie 5 ml tego rozcieńczenia stosowano w reakcji nested PCR (1 cykl 95°C przez 5 minut; 95°C przez 30 sekund, 55°C przez 30 sekund i 72°C przez 45 sekund, 30 cykli z użyciem mieszaniny polimerazy KlenTaq) z primerem kotwiczącym dG/dl 5' i dodatkowym specyficznym primerem 3' genu znajdującego się powyżej. Trzydzieści ml podwójnej reakcji uwodoczniono następnie na 1,5% żelu agarozowym, i prawidłowy fragment ekstrahowano z żelu (fig. 19) . cDNA oczyszczono jak opisano poprzednio z użyciem nebulizatora żelowego Amicon i filtra do mikrooczyszczania (Amicon, Beverly, MA). Oczyszczoną próbkę cDNA sekwencjonowano sekwencjonując z użyciem terminatora cyklu z barwieniem (Perkin Elmer, Norwalk, CN). Z zakończonych fragmentów, otrzymano sekwencję konsensusową. Z sekwencji, syntetyzowano parę primerów, która obejmowała całą otwartą ramkę odczytu kociego genu CD28:
feCD28 5': CGC GGA TCC ACC GGT AGC ACA ATG ATC CTC AGG (SEQ ID Nr 75) feCD28 3': CGC GGA TCC TCT GGA TAG GGG TCC ATG TCA G (SEQ ID Nr 76)
Stosując te primery, powielono cząsteczkę cDNA obejmującą cały region kodujący, z cDNA otrzymanego PBMC EKG i ED3z stymulowanych Con A. Ten cDNA PBMC wytworzono uprzednio i wykazano, że zawiera RNA kodujący gen. Ta reakcja PCR (95°C przez 5 minut, 1 cykl; 95°C przez 30 sekund, 42°C przez 30 sekund i 72°C przez 45 sekund, 30 cykli; 72°C przez 7 minut) wykorzystująca polimerazę DNA KlenTaq w nadziei redukcji przypadkowych błędów często związanych z polimerazą Taq, wytworzyła fragment o 754 bp, który klonowano z użyciem wektora kloningowego TA i sekwencjonowano jak opisano poprzednio. Jak dla cząsteczki CD80, każde miejsce nukleotydowe potwierdzono przez co najmniej trzy niezależnie otrzymane sekwencje.
PL 199 359 B1
Wektor homologii 902-49.46. Skonstruowano plazmid 902-49.46 w celu wprowadzenia obcego DNA do RPV. Wprowadza on gen markerowy β-galaktozydazy (lacZ) E. coli oskrzydlony przez RPV DNA. Powyżej obcego genu znajduje się fragment o około 906 parach zasad DNA RPV. Poniżej obcego genu znajduje się fragment o około 895 parach zasad DNA RPV. Gdy plazmid stosuje się zgodnie z procedurą rekombinacji homologicznej dla tworzenia rekombinowanego RPV, powstanie wirus zawierający DNA kodujący obce geny. Należy zauważyć, że gen markerowy e-galaktozydazy(lacZ) znajduje się pod kontrolą późnego promotora (LP1) i drugi obcy DNA wprowadza się do miejsca EcoRI lub BamHI, i drugi obcy DNA znajduje się pod kontrolą późnego/wczesnego promotora (LP2EP2). Skonstruowano go korzystając ze standardowych technik rekombinacji DNA (Sambrook, i inni), przez łączenie fragmentów restrykcyjnych z następujących źródeł z syntetycznymi sekwencjami DNA. Wektor plazmidowy otrzymano z fragmentu restrykcyjnego Hindlll o około 2999 par zasad pSP64 (Promega). Fragment 1 jest subfragmentem restrykcyjnym Hindlll do Xbal o około 906 parach zasad fragmentu restrykcyjnego U Hindlll RPV (Knight i inni). Fragment 2 jest fragmentem restrykcyjnym BamHI do PvuII o około 3010 parach zasad plazmidu pJF751 (Ferrari, i inni). Fragment 3 jest subfragmentem restrykcyjnym Xbal do Hindlll o około 895 parach zasad fragmentu U Hindlll RPV. Miejsca Xbal we fragmentach 1 i 3 zamieniono w unikatowe miejsca Notl przy użyciu linkerów Notl.
Wektor homologii 904-63.B7
Aby wprowadzić obcy DNA do SPV, użyto wektor homologii 904-63.B7. Wprowadza on gen markerowy β-galaktozydazy E. coli (lacZ) i geny gag/proteazy oraz otoczki kociego wirusa niedoboru odporności (FIV) oskrzydlone przez SPV DNA. Gdy ten wektor homologii użyto zgodnie z procedurą rekombinacji homologicznej dla tworzenia rekombinowanego SPV, powstaje wirus, zawierający DNA kodujący obce geny. Należy zauważyć, że gen markerowy β-galaktozydazy (lacZ) znajduje się pod kontrolą syntetycznego późnego promotora ospy (LPl) i geny gag/proteazy i otoczki FIV znajdują się pod kontrolą oddzielnych, lecz identycznych syntetycznych późnych/wczesnych promotorów ospy (LP2EP2). Kasety promotora/genu gag/proteazy FIV i otoczki FIV są zorientowane w przeciwnych kierunkach, tak że transkrypcja genów gag/proteazy i otoczki biegnie w kierunku jeden ku drugiemu aby uniknąć możliwości rekombinacji homologicznej między identycznymi promotorami. Skonstruowano wektor homologii, korzystając ze standardowych technik rekombinacji DNA (Sambrook, i inni), przez łączenie fragmentów restrykcyjnych z następujących źródeł z odpowiednimi syntetycznymi sekwencjami DNA. Otrzymano wektor plazmidowy z fragmentu restrykcyjnego Hindlll do BamHI o około 2972 parach zasad pSP64 (Promega). Fragment 1 jest subfragmentem restrykcyjnym Bglll do AccI o około 1484 parach zasad fragmentu M Hindlll SPV (23). Fragment 2 jest fragmentem EcoRI do Bglll o około 2580 parach zasad genu otoczki FIV syntetyzowanym przez odwrotną transkrypcję (RT) i reakcję łańcuchową polimerazy (PGR) (15,42) przy użyciu cDNA szczepu PPR FIV. Primer biegnący w górę (5'-CCCGGATCCTATGGCAGAAGGGTTTGCAGC-3' 10/93.21) (SEQ ID Nr 77) syntetyzuje od końca 5' genu otoczki FIV i wprowadza miejsce BamHI na końcu 5' genu. Primerem biegnącym w dół był (5'-CCGTGGATCCGGCACTCCATCATTCCTCCTC-3'; 10/93.20) (SEQ ID Nr 78) syntetyzujący od końca 3' genu otoczki FIV, wprowadza miejsce BamHI na końcu 3' genu, i użyto go do odwrotnej transkrypcji i reakcji łańcuchowej polimerazy. Produkt PCR trawiono BamHI uzyskując fragment o długości 2580 par zasad, odpowiadający genowi otoczki FIV. Fragment 3 jest fragmentem EcoRI do Bglll o długości około 1839 par zasad genu gag/proteazy FIV syntetyzowany przez odwrotną transkrypcję (RT) i reakcję łańcuchowa polimerazy (PCR) (15,42) przy użyciu cDNA szczepu PPR FIV. Primer biegnący w górę (5'-GCGTGAATTCGGGGAATGGACA-GGGGCGAGAT-3'; 11/94.9) (SEQ ID Nr 79) syntetyzuje od końca 5' genu gag/proteazy FIV i wprowadza miejsce EcoRI na końcu 5' genu. Primer biegnący w dół (5'-GAGCCAGATCTGCTCTTTTTACTTTCCC-3'; 11/94.10) (SEQ ID Nr 80) syntetyzuje od końca 3' genu gag/proteazy FIV, wprowadza miejsce Bglll na końcu 3' genu, i użyto go do odwrotnej transkrypcji i reakcji łańcuchowa polimerazy. Produkt PCR trawiono EcoRI i Bglll uzyskując fragment o długości około 1839 par zasad, odpowiadający genowi gag/proteazy FIV. Fragment 4 jest fragmentem restrykcyjnym BamHI do PvuII o około 3010 parach zasad, plazmidu pJF751 (Ferrari, i inni). Fragment 5 jest subfragmentem restrykcyjnym AccI do Hindlll o długości około 2149 par zasad fragmentu restrykcyjnego Hindlll SPV. Miejsce AccI w wektorze homologii SPV zamieniono na unikatowe miejsce Notl przy użyciu syntetycznych linkerów.
Wektor homologii 917-60.B9.
Skonstruowano plazmid 917-60.B9 w celu wprowadzenia obcego DNA do SPV. Wprowadza on gen markerowy β-galaktozydazy (lacZ) E. coli i gen kociego IFN-γ (Onions, i inni, (1996); Argyle, i inni, (1995)) oskrzydlony przez DNA SPV. W górę od obcych genów znajduje się fragment o długości około
PL 199 359 B1
1484 par zasad DNA SPV. Poniżej obcego genu znajduje się fragment o długości około 2149 par zasad DNA SPV. Gdy plazmid stosuje się zgodnie z procedurą rekombinacji homologicznej dla tworzenia rekombinowanego SPV, powstanie wirus zawierający DNA kodujący obce geny. Należy zauważyć, że gen markerowy β-galaktozydazy (lacZ) znajduje się pod kontrolą promotora 01L ospy świni, i gen kociego CD28 znajduje się pod kontrolą syntetycznego późnego/wczesnego promotora ospy (LP2EP2). Można go skonstruować, korzystając ze standardowych technik rekombinacji DNA (Sambrook, i inni), przez łączenie fragmentów restrykcyjnych z następujących źródeł. Wektor plazmidowy otrzymano z fragmentu restrykcyjnego Hindlll do BamHI o około 2972 parach zasad z pSP64 (Promega). Fragment 1 jest subfragmentem restrykcyjnym Bglll do AccI o około 1484 parach zasad, fragmentu restrykcyjnego Hindlll SPV. Fragment 2 jest fragmentem restrykcyjnym EcoRI do BamHI syntetyzowanym przez odwrotną transkrypcję i reakcję łańcuchową polimerazy (PCR) przy użyciu RNA z kocich komórek śledziony stymulowanych ConA, jako matrycy. Aby syntetyzować koci IFN-γ, syntetyzowano primer 5'-TCGAGAATTCGATGAATTACACAAGTTTTATTTTCG-3'; 1/97.4) (SEQ ID Nr 81) od końca 5' kociego genu IFN-γ, który wprowadził miejsce EcoRI na końcu 5' genu. Primer (5'-TCGAGGATCCTTATTTCGATGCTCTACGGCCTC-3'; 1/97.3) (SEQ ID Nr 82) użyto do odwrotnej transkrypcji i PGR i syntetyzowano od końca 3' kociego genu IFN-γ, który wprowadził miejsce BamHI na końcu 3' genu. Produkt PCR trawiono z EcoRI i BamHI, uzyskując fragment o długości około 504 par zasad, odpowiadający genowi kociego IFN-γ. Fragment 3 jest fragmentem restrykcyjnym BamHI do PvuII o około 3010 parach zasad, plazmidu pJF751 (Ferrari, i inni). Fragment 4 jest subfragmentem AccI do Hindlll o długości około 2149 par zasad fragmentu M Hindlll SPV. Miejsca AccI we fragmentach 114 zamieniono w unikatowe miejsca Notl przy użyciu linkerów Notl.
Wektor homologii 926-76.D7
Skonstruowano wektor homologii 926-76.D7 w celu usunięcia części regionu, kodującego gE kociego herpeswirusa i wprowadzenia obcego DNA. Wprowadza on koci gen CD80 oskrzydlony przez DNA FHV. Gen kociego CD80 znajdował się pod kontrolą promotora gE FHV. Skonstruowano go z zaznaczonych źródeł DNA, korzystając ze standardowych technik rekombinacji DNA (Sambrook, i inni). Wektor plazmidowy otrzymuje się z fragmentu endonukleazy restrykcyjnej Asp718l do Asp718I o długości około 2958 par zasad z pSP18/19. Fragment 1 jest subfragmentem Asp718I do Smal o długości około 1415 par zasad fragmentu SalI B FHV. Fragment 2 jest fragmentem EcoRI do BamHI o długości około 879 par zasad kociego genu CD80 syntetyzowanym przez kloning z reakcją łańcuchową polimerazy. Matrycą dla reakcji PCR był RNA z komórek śledziony stymulowanych ConA. Primer biegnący w górę (5'-TCGAGAATTCGGGTCACGCAGCAAAGTGG-3'; 1/97.43) (SEQ ID Nr 52) syntetyzuje od końca 5' kociego genu CD80 i wprowadza miejsce EcoRI. Primer biegnący w dół (5'-GCTAGGATCCAATCTATGTAGACAGGTGAGAT-3'; 1/97.6) (SEQ ID Nr 53) syntetyzuje od końca 3' kociego genu CD80, wprowadza miejsce BamHI na końcu 3' genu, i użyto go do odwrotnej transkrypcji i reakcji łańcuchowej polimerazy. Fragment 3 jest subfragmentem SalI do Asp718I o długości około 2205 par zasad fragmentu E EcoRI FHV.
Wektor homologii 930-23.A1
Skonstruowano plazmid 930-23.A1 w celu wprowadzenia obcego DNA do SPV. Wprowadza on gen markerowy β-galaktozydazy (lacZ) E. coli i gen kociego CD80 oskrzydlone przez DNA SPV. W górę od obcych genów znajduje się fragment o długości około 1484 par zasad z DNA SPV. Poniżej obcego genu znajduje się fragment o długości około 2149 par zasad z DNA SPV. Gdy plazmid stosuje się zgodnie z procedurą rekombinacji homologicznej dla tworzenia rekombinowanego SPV, powstanie wirus zawierający DNA kodujący obce geny. Należy zauważyć, że gen markerowy β-galaktozydazy (lacZ) znajduje się pod kontrolą syntetycznego późnego promotora ospy (LP1), i gen kociego CD80 znajduje się pod kontrolą syntetycznego późnego/wczesnego promotora ospy (LP2EP2). Można go skonstruować korzystając ze standardowych technik rekombinacji DNA (Sambrook, i inni), przez łączenie fragmentów restrykcyjnych z poniższych źródeł. Wektor plazmidowy otrzymano z fragmentu restrykcyjnego Hindlll do BamHI o około 2972 parach zasad z pSP64 (Promega). Fragment 1 jest subfragmentem restrykcyjnym Bglll do AccI o około 1484 parach zasad, fragmentu restrykcyjnego Hindlll SPV. Fragment 2 jest fragmentem restrykcyjnym EcoRI do BamHI syntetyzowanym przez odwrotną transkrypcję i reakcję łańcuchową polimerazy (PCR) przy użyciu RNA z komórek śledziony stymulowanych ConA, jako matrycy. Aby syntetyzować koci CD80, syntetyzowano primer 5'-TCGAGAATTCGGGTCACGCAGCAAAGTGG-3'; 1/97.43) (SEQ ID Nr 52) od końca 5' genu kociego CD80, który wprowadził miejsce EcoRI na końcu 5' genu. Primer (5'-GCTAGGATCCAATCTATGTAGACAGGTGAGAT-3'; 1/97.6) (SEQ ID Nr 53) użyto do odwrotnej transkrypcji i PGR i syntetyzowano
PL 199 359 B1 od końca 3' kociego genu CD80, wprowadził on miejsce BamHI na końcu 3' genu. Produkt PCR trawiono EcoRI i BamHI uzyskując fragment o długości około 879 par zasad odpowiadający genowi kociego CD80. Fragment 3 jest fragmentem restrykcyjnym BamHI do PvuII o około 3010 parach zasad, plazmidu pJF751 (Ferrari, i inni). Fragment 4 jest subfragmentem AccI do Hindlll o długości około 2149 par zasad, fragmentu M Hindlll SPV. Miejsca AccI we fragmentach 1 i 4 zamieniono w unikatowe miejsca Notl przy użyciu linkerów Notl.
Wektor homologii 930-26.A1
Skonstruowano plazmid 930-26.A1 w celu wprowadzenia obcego DNA do SPV. Wprowadza gen markerowy β-galaktozydazy (lacZ) E. coli i gen kociego CD28 oskrzydlone przez DNA SPV. W górę od obcych genów znajduje się fragment o długości około 1484 par zasad z DNA SPV. Poniżej obcego genu znajduje się fragment o długości około 2149 par zasad z DNA SPV. Gdy plazmid stosuje się zgodnie z procedurą rekombinacji homologicznej dla tworzenia rekombinowanego SPV, powstanie wirus, zawierający DNA kodujący obce geny. Należy zauważyć, że gen markerowy β-galaktozydazy (lacZ) znajduje się pod kontrolą syntetycznego późnego promotora ospy (LP1), i gen kociego CD28 znajduje się pod kontrolą syntetycznego późnego/wczesnego promotora ospy (LP2EP2). Można go skonstruować, korzystając ze standardowych technik rekombinacji DNA (Sambrook, i inni), przez łączenie fragmentów restrykcyjnych z poniższych źródeł. Wektor plazmidowy otrzymano z fragmentu restrykcyjnego Hindlll do BamHI o około 2972 parach zasad pSP64 (Promega). Fragment 1 jest subfragmentem Bgll do AccI o długości około 1484 par zasad, fragmentu restrykcyjnego Hindlll SPV. Fragment 2 jest fragmentem restrykcyjnym EcoRI do BamHI syntetyzowanym przez odwrotną transkrypcję i reakcję łańcuchową polimerazy (PCR) przy użyciu RNA z komórek śledziony stymulowanych ConA, jako matrycy. Aby syntetyzować koci CD28, syntetyzowano primer 5'-GATGAATTCCATGATCCTCAGGCTGGGCTTCT-3'; 7/97.1) (SEQ ID Nr 54) od końca 5' genu kociego CD28, który wprowadził miejsce EcoRI na końcu 5' genu. Primer (5'-GATCAGATCTCAGGAACGGTATGCCGCAA-3'; 7/97.2) (SEQ ID Nr 55) użyto do odwrotnej transkrypcji i PCR i syntetyzowano od końca 3' genu kociego CD28, wprowadził on miejsce BamHI na końcu 3' genu. Produkt PCR trawiono EcoRI i BamHI uzyskując fragment o długości około 666 par zasad odpowiadający genowi kociego CD28. Fragment 3 jest fragmentem restrykcyjnym BamHI do PvuII o około 3010 parach zasad, plazmidu pJF751 (Ferrari, i inni). Fragment 4 jest subfragmentem AccI do Hindlll o długości około 2149 par zasad, fragmentu M Hindlll SPV. Miejsca AccI we fragmentach 1 i 4 zamieniono w unikatowe miejsca Notl przy użyciu linkerów Notl.
Wektor homologii 931-21.A1
Aby wprowadzić obcy DNA do SPV użyto wektor homologii 931-21.A1. Wprowadza on gen markerowy β-glukuronidazy (uidA) E.coli i gen kociego CD80 oskrzydlone przez DNA SPV. Gdy ten wektor homologii stosuje się zgodnie z procedurą rekombinacji homologicznej dla tworzenia rekombinowanego SPV, powstaje wirus zawierający DNA kodujący obce geny. Należy zauważyć, że gen markerowy β-glukuronidazy (uidA) znajduje się pod kontrolą syntetycznego wczesnego promotora ospy (EP2) i gen kociego CD80 znajduje się pod kontrolą oddzielnego unikatowego syntetycznego późnego/wczesnego promotora ospy (LP2EP2). Skonstruowano wektor homologii, korzystając ze standardowych technik rekombinacji DNA (Sambrook, i inni), przez łączenie fragmentów restrykcyjnych z następujących źródeł z odpowiednimi syntetycznymi sekwencjami DNA. Wektor plazmidowy otrzymano z fragmentu z fragmentu restrykcyjnego Dral o długości około 2700 par zasad z PNED193 (New England Biolabs). Fragment 1 z fragmentu z fragmentu restrykcyjnego Dral o długości około 2700 par zasad fragmentu K Hindlll SPV. Fragment 2 jest fragmentem EcoRI do BamHI o długości około 879 par zasad kociego genu CD80 syntetyzowanym przez kloning z reakcją łańcuchową polimerazy. Matrycą dla reakcji PCR był RNA z komórek śledziony stymulowanych ConA. Primer biegnący w górę (5'-TCGAGAATTCGGGTCACGCAGCAAAGTGG-3'; 1/97.43) (SEQ ID Nr 52) syntetyzuje od końca 5' kociego genu CD80 i wprowadza miejsce EcoRI. Primer biegnący w dół (5'-GCTAGGATCCAATCTATGTAGACAGGTGAGAT-3'; 1/97.6) (SEQ ID Nr 53) syntetyzuje od końca 3' kociego genu CD80, wprowadza miejsce BamHI na końcu 3' genu, i użyto go do odwrotnej transkrypcji i reakcji łańcuchowej polimerazy. Fragment 3 jest fragmentem restrykcyjnym EcoRI do Smal o długości około 1823 par zasad, plazmidu pRAJ260 (Clonetech). Fragment 4 jest subfragmentem restrykcjnym EcoRI do Dral o długości około 994 par zasad fragmentu restrykcyjnego K Hindlll SPV. Miejsce EcoRI w wektorze homologii SPV zamieniono na unikatowe miejsce Notl przy użyciu syntetycznych linkerów.
PL 199 359 B1
Wektor homologii 931-22.A1
Skonstruowano plazmid 931-22.A1 w celu wprowadzenia obcego DNA do RPV. Wprowadza on koci gen CD80 oskrzydlony przez DNA RPV. Powyżej obcego genu znajduje się fragment o 906 parach zasad DNA RPV. Poniżej obcego genu znajduje się fragment o około 895 parach zasad DNA RPV. Gdy plazmid stosuje się zgodnie z procedurą rekombinacji homologicznej dla tworzenia rekombinowanego RPV, powstanie wirus zawierający DNA kodujący obce geny. Należy zauważyć, że gen kociego CD80 znajduje się pod kontrolą późnego/wczesnego promotora (LP2EP2). Skonstruowano go korzystając standardowych technik rekombinacyjnych DNA (Sambrook, i inni), przez łączenie fragmentów restrykcyjnych z poniższych źródeł z syntetycznymi sekwencjami DNA. Wektor plazmidowy otrzymano z fragmentu restrykcyjnego Hindlll o długości około 2999 par zasad z pSP64 (Promega). Fragment 1 jest subfragmentem restrykcyjnym Hindlll do Xbal o około 906 parach zasad fragmentu restrykcyjnego U Hindlll RPV (Knight, i inni). Fragment 2 jest fragmentem EcoRI do BamHI o długości około 879 par zasad kociego genu CD80 syntetyzowanym przez kloning z reakcją łańcuchową polimerazy. Matrycą dla reakcji PCR był RNA z komórek śledziony stymulowanych ConA. Primer biegnący w górę (5'-TCGAGAATTCGGGTCACGCAGCAAAGTGG-3'; 1/97.43) (SEQ ID Nr 52) syntetyzuje od końca 5' kociego genu CD80 i wprowadza miejsce EcoRI. Primer biegnący w dół (5'-GCTAGGATCCAATCTATGTAGACAGGTGAGAT-3'; 1/97.6) (SEQ ID Nr 53) syntetyzuje od końca 3' kociego genu CD80, wprowadza miejsce BamHI na końcu 3' genu, i stosuje się go do odwrotnej transkrypcji i reakcji łańcuchowej polimerazy. Fragment 3 jest subfragmentem restrykcyjnym Xbal do Hindlll o około 895 parach zasad, fragmentu U Hindlll RPV. Miejsca Xbal we fragmentach 1 i 3 zamieniono w unikatowe miejsca Notl przy użyciu linkerów Notl. Syntetyczny DNA między fragmentami 2 i 3 zawiera promotor L02EP2 i miejsce EcoRI i miejsce BamHI do wprowadzania obcego DNA.
Wektor homologii 931-32.A5
Skonstruowano plazmid 931-32.A5 w celu wprowadzenia obcego DNA do RPV. Wprowadza on koci gen CD80 i gen markerowy coli β-galaktozydazy (lacZ) E. oskrzydlone przez DNA RPV. W górę od obcych genów znajduje się fragment o 906 parach zasad DNA RPV. Poniżej obcego genu znajduje się fragment o około 895 parach zasad, DNA RPV. Gdy plazmid stosuje się zgodnie z procedurą rekombinacji homologicznej dla tworzenia rekombinowanego RPV, powstanie wirus zawierający DNA kodujący obce geny. Skonstruowano go korzystając ze standardowych technik rekombinacji DNA (Sambrook, i inni), przez łączenie fragmentów restrykcyjnych z poniższych źródeł, z syntetycznymi sekwencjami DNA. Otrzymano wektor plazmidowy z fragmentu restrykcyjnego Hindlll o długości około 2999 par zasad z pSP64 (Promega). Fragment 1 jest subfragmentem restrykcyjnym Hindlll do Xbal o około 906 parach zasad, fragmentu restrykcyjnego U Hindlll RPV (Knight, i inni). Fragment 2 jest fragmentem EcoRI do BamHI o długości około 879 par zasad, kociego genu CD80 syntetyzowano przez kloning z reakcją łańcuchową polimerazy. Matrycą dla reakcji PGR był RNA z komórek śledziony stymulowanych ConA. Primer biegnący w górę (5'-TCGAGAATTCGGGTCACGCAGCAAAGTGG3'; 1/97.43) (SEQ ID Nr 52) syntetyzuje od końca 5' kociego genu CD80 i wprowadza miejsce EcoRI. Primer biegnący w dół (5'-GCTAGGATCCAATCTATGTAGA-CAGGTGAGAT-3'; 1/97.6) (SEQ ID Nr 53) syntetyzuje od końca 3' kociego genu CD80, wprowadza miejsce BamHI na końcu 3' genu, i stosuje się go do odwrotnej transkrypcji i reakcji łańcuchowej polimerazy. Fragment 3 jest fragmentem restrykcyjnym BamHI do PvuII o około 3010 parach zasad, plazmidu pJF751 (Ferrari, i inni). Fragment 4 jest subfragmentem restrykcyjnym Xbal do Hindlll o około 895 parach zasad, fragmentu U Hindlll RPV. Miejsca Xbal we fragmentach 1 i 4 zamieniono w unikatowe miejsca Notl przy użyciu linkerów Notl.
Wektor homologii 931-55.B12
Aby wprowadzić obcy DNA do SPV użyto wektor homologii 931-55.212. Wprowadza on gen markerowy β-glukuronidazy (uidA) E. coli i gen kociego IFN-γ (Onions, i inni, (1996); Argyle, i inni, (1995)) oskrzydlone przez DNA SPV. Gdy ten wektor homologii stosuje się zgodnie z procedurą rekombinacji homologicznej dla tworzenia rekombinowanego SPV, powstaje wirus zawierający DNA kodujący obce geny. Należy zauważyć, że gen markerowy β-glukuro-nidaza (uidA) znajduje się pod kontrolą syntetycznego wczesnego promotora ospy (EP2) i gen kociego IFN-γ znajduje się pod kontrolą oddzielnego unikatowego syntetycznego późnego/wczesnego promotora ospy (LP2EP2). Skonstruowano wektor homologii korzystając ze standardowych technik rekombinacji DNA (Sambrook, i inni), przez łączenie fragmentów restrykcyjnych z poniższych źródeł z odpowiednimi syntetycznymi sekwencjami DNA. Wektor plazmidowy otrzymano z fragmentu restrykcyjnego Dral o długości około 2700 par zasad z PNEB193 (New England Biolabs). Fragment 1 jest subfragmentem Dral do EcoRI o długości około 881 par zasad, fragmentu K Hindlll SPV. Fragment 2 jest fragmentem restrykcyjnym
PL 199 359 B1
EcoRI do BamHI syntetyzowanym przez odwrotną transkrypcję i reakcję łańcuchową polimerazy (PCR) przy użyciu RNA z komórek śledziony stymulowanych ConA, jako matrycy. Aby syntetyzować koci IFN-γ, syntetyzowano primer 5'-TCGAGAATTCGATGAATTACACAA-GTTTTATTTTCG-3'; 1/97.4) (SEQ ID Nr 81) od końca 5' kociego genu IFN-γ, który wprowadził miejsce EcoRI na końcu 5' genu. Primer (5'-TCGAGGATCCTTATTTCGATGCTCTACGGCCTC-3'; 1/97.3) (SEQ ID Nr 82) użyto do odwrotnej transkrypcji i PCR i syntetyzowano od końca 3' kociego genu IFN-γ, wprowadził on miejsce BamHI na końcu 3' genu. Produkt PCR trawiono EcoRI i BamHI uzyskując fragment o długości około 504 par zasad odpowiadający genowi IFN-γ kota. Fragment 34 jest fragmentem restrykcyjnym EcoRI do Smal o długości około 1823 par zasad, plazmidu pRAJ260 (Clonetech). Fragment 4 jest subfragmentem restrykcjnym EcoRI do Dral o długości około 994 par zasad, fragmentu restrykcyjnego K Hindlll SPVK. Miejsce EcoRI w wektorze homologii SPV zamieniono na unikatowe miejsce Notl, przy użyciu syntetycznych linkerów.
Wektor homologii 846-88. B17
Skonstruowano plazmid 846.88.b17 w celu usunięcia całego regionu kodującego gE kociego herpeswirusa i wprowadzenia obcego DNA. Wprowadza on gen markerowy β-galaktozydazy (lacZ) E. coli wprowadzony do deletowanego miejsca gE FHV, oskrzydlony przez DNA HV. Plazmid 84688.B17 zawiera delecję o długości 1638 par zasad genu gE od miejsca Smal we fragmencie B Sall FHV do miejsca Sall we fragmencie E EcoRI FHV. Miejsce Smal we fragmencie B Sall FHV i miejsce SalI we fragmencie E EcoRI FHV określają punkty końcowe delecji genu gE. Powyżej obcego genu znajduje się subfragment Asp718 do Saml o długości około 1415 par zasad SalI B FHV, zawierający całą sekwencję kodującą genu gl (370 aminokwasów). W dół od obcego genu znajduje się subfragment SalI do Asp718 o długości około 2205 par zasad fragmentu E EcoRI FHV, który zawiera unikalną sekwencję krótką i powtórzenia końca. Gdy plazmid stosuje się zgodnie z procedurą rekombinacji homologicznej dla tworzenia rekombinowanego RPV, SPV lub FHV, powstanie wirus zawierający DNA kodujący obcy gen. Należy zauważyć, że gen lac Z E. coli znajduje się pod kontrolą konstytutywnego promotora gE FHV. Skonstruowano go korzystając ze standardowych technik rekombinacji DNA (Sambrook, i inni).
Wektor homologii 921-65.B5
Skonstruowano wektor homologii 921-656.B5, aby usunąć gen 15L SPV (około 237bp) i aby wprowadzić obcy DNA do SPV. Wprowadza on gen markerowy β-gala-ktozydazy (LacZ) E. coli i geny gag/proteazy i otoczkowe kociego wirusa białaczki (FeLV) oskrzydlone przez DNA SPV. Gdy ten wektor homologii stosowano zgodnie z procedurą rekombinacji homologicznej dla tworzenia rekombinowanego RPV, SPV lub FHV powstaje wirus zawierający DNA kodujący obce geny. Skonstruowano go korzystając ze standardowych technik rekombinacji DNA (Sambrook, i inni). Należy zauważyć, że gen markerowy β-galaktozydazy (lacZ) znajduje się pod kontrolą konstytutywnego późnego promotora ospy (I5L) i geny gag/proteazy FeLVi otoczki FeLV znajdują się pod kontrolą różnych syntetycznych wczesnych promotorów ospy, EP2 i EP1, odpowiednio. Sekwencję oskrzydlającą insercje obcego genu otrzymano z fragmentu genomowego N Hindlll o długości 3,2 kb. Sekwencją znajdując się powyżej obcych genów jest fragment o długości 903 bp, zawierający część genu 14L SPV i sekwencją znajdującą się w dół jest fragment o długości 966 bp zawierający część genu 16L SPV. Wszystkie otwarte ramki odczytu dla genu lacZ E. coli, otoczki FeLV i gag/proteazy FeLV biegły w tym samym kierunku pod względem genów 16L SPV i 14L SPV.
Wektor homologii 942-03.C6. Skonstruowano plazmid 942-03.C6 w celu usunięcia części regionu, kodującego gE kociego herpeswirusa i wprowadzenia trzech obcych genów do deletowanego miejsca gE. Wprowadza on koci gen CD80(~879 bp), i gen gag/proteazy FIV (1800 bp) i gen otoczki FIV (2600 bp) oskrzydlone przez DNA FHV. Gen kociego CD80 znajdował się pod kontrolą promotora gE FHV; gen gag/proteazy FIV znajduje się pod kontrolą promotora gX wścieklizny rzekomej i gen otoczki FIV znajduje się pod kontrolą genu bezpośrednio wczesnego cytomegalowirusa. W górę od obcych genów znajduje się subfragment Asp718 do Smal o długości około 1415 par zasad fragmentu B Sall FHV. Poniżej obcego genu subfragment Sall do Asp718 o długości około 2205 par zasad fragmentu E EcoRI FHV, który zawiera unikalną sekwencję krótką i powtórzenia końca. Gdy plazmid stosuje się zgodnie z procedurą rekombinacji homologicznej dla tworzenia rekombinowanego RPV, SPV lub FHV, powstanie wirus zawierający DNA kodujący obcy gen. Skonstruowano plazmid homologii, 942-03.C6 korzystając ze standardowych technik rekombinacji DNA (Sambrook, i inni).
PL 199 359 B1
P r z y k ł a d y
P r z y k ł a d y 1A
Kloning cDNA kociego CD80 (B7-1)-TAMU, CD80 (B7-D-SPAR, C86 (B7-2), CD28, i CTLA-4:
Koci CD80 (B7-1), CD86 (B7-2), CD28, i CTLA-4 cDNA Klonowano przez pierwszą RT-PCR (odwrotna transkryptaza/reakcja łańcuchowa polimerazy) powielając region między dwoma sekwencjami, które były wystarczająco zakonserwowane aby wytworzyć zdegenerowane primery, które oddziaływały z kocim mRNA. Źródłem mRNA były komórki jednojądrzaste z krwi obwodowej (PBMC) lub splenocyty stymulowane Con A przez co najmniej 16 godzin. Ten produkt PCR sekwencjonowano. Sekwencję użyto aby wytworzyć primery dla RACE (szybkie powielenie końców cDNA) PCR. Koniec 5' powielono najpierw przez wykonanie cDNA z użyciem primera biegnącego w -dół komplementarnego z nowo sekwencjonowanym regionem zakonserwowanym. Oligonukleotyd poddano ligacji z końcem 3' cDNA (komplementarnym z końcem 5' mRNA). Sekwencja ta służyła jako miejsce wiązania dla primera o orientacji w górę, który był zgodny w PCR z primerem PCR o orientacji w dół, odpowiadającym innemu regionowi w nowo sekwencjonowanym regionie. Zdegenerowane primery wykorzystano w wielu okrążeniach podwójnych reakcji mających na celu otrzymanie końca 3'. Ten primer o orientacji w górę dla PCR zaplanowano tak, aby reagował z sekwencją w nowo sekwencjonowanym regionie. Produkty albo sekwencjonowano bezpośrednio lub klonowano do wektora kloningowego TA i sekwencjonowano z plazmidu. Całą otwartą ramkę odczytu klonowano przez powielenie jej całej przez PCR z primery skonstruowanymi ze znanych sekwencji. ORF klonowano i sekwencjonowano trzy razy. ORF B7-1 subklonowano do plazmidu pSI z użyciem promotora SV40, i plazmidu SFV. pSI użyto do ustanowienia funkcjonalnej interakcji B7-1 z kociego CD28.
Primerami DNA stosowanymi do RT/PCR kociego cDNA (B7-1) CD80 były:
Primer 5': 5'-CGCGGATCCGCACCATGGGTCACGCAGCAAAGTGGAAAAC-3'; (SEQ ID Nr. 11)
Primer 3': 5'-CCTAGTAGAGAAGAGCTAAAGAGGC-3'; (SEQ ID Nr. 12) (Patrz powyżej pod względem listy primerów dla cDNA kociego CD80).
Primerami DNA stosowanymi do RT/PCR cDNA kociego CD28 były:
Primer 5': 5'-CGCGGATCCACCGGTAGCACAATGATCCTCAGG-3'; (SEQ ID Nr. 13)
Primer 3': 5'-CGCGGATCCTCTGGATAGGGGTCCATGTCAG-3'; (SEQ ID Nr. 14) (Patrz powyżej pod względem listy primerów dla cDNA kociego CD28).
Primerami DNA stosowanymi do RT/PCR kociego cDNA CTLA-4 były:
1. Primery zdegenerowane dla pierwszego produktu PCR (672 bp):
Deg 5' P: 5'-ATGGCTT(C)GCCTTGGATTT(C)CAGC(A)GG-3'; (SEQ ID Nr. 15)
Deg 3' P: 5'-TCAATTG(A)ATG(A)GGAATAAAATAAGGCTG-3'; (SEQ ID Nr. 16)
2. Koniec 5' CTLA-4 (455 bp): primery zdegenerowane, specyficzne dla genu (GSP) i skrócone specyficzne dla genu (NGSP):
Pierwsze okrążenie PCR:
Deg 5' P: 5'-TGTTGGGTTTC(T)G(A)CTCTG(A)CTT(C)CCTG-3'; (SEQ ID Nr. 17)
3' GSP: 5'-GCATAGTAGGGTGGTGGGTACATG-3'; (SEQ ID Nr. 18)
Nested PGR z produktem PCR pierwszego okrążenia: Deg 5' P: 5'-TGTTGGGTTTC(T)G(A)CTCTG(A)CTT(C)CCTG-3'; (SEQ ID Nr. 19)
3' NGSP: 5'-ACATGAGCTCCACCTTGCAG-3'; (SEQ ID Nr. 20)
3. Koniec 3' CTLA-4: Primer adaptorowy 1 (AP1, Clonetech Lab, Inc., Palo Alto, CA); skrócony primer adaptorowy (AP2, Clonetech Lab), primer specyficzny dla genu (GSP), i skrócony primer specyficzny dla genu (NGSP):
3' RACE PCR:
AP1: 5'-CCATCCTAATACGACTCACTATAGGGC-3'; (SEQ ID Nr. 21)
5' GSP: 5'-GTGAATAT-GGGTCTTCAGGCAATG-3'; (SEQ ID Nr. 22)
3' Nested RACE PCR z produktem 3' RACE PCR:
AP2: 5'-ACTCACTATAGGGCTCGAGCGGC-3'; (SEQ ID Nr. 23)
5' NGSP: 5'-GAAATCCGA-GTGACTGTGCTGAG-3'; (SEQ ID Nr. 24)
4. Primery dla całego genu CTLA-4
Primer 5' Fel CTLA-4: 5'-AACCTGAACACTGCTCCCATAAAG-3' (SEQ ID Nr. 25)
Primer 3' Fel CTLA-4: 5'-GCCTCAGCTCTTAGAAATTGGACAG-3' ; (SEQ ID Nr. 26)
Primerami DNA stosowanymi do RT/PCR cDNA (B7-2) kociego CD86 były:
1. Primery zdegenerowane dla pierwszego produktu PCR (423 bp):
Deg 5' P: 5'-TAGTATTTTGGCAGGACCAGG-3'; (SEQ ID Nr. 27)
PL 199 359 B1
Deg 3' P: 5'-CTGTGACATTA-TCTTGAGATTTC-3'; (SEQ ID Nr. 28)
2. Primery zdegenerowane dla drugiego produktu PCR (574 bp).
Deg 5' P : 5'-GA(G)CA(T)GCACT(A)ATGGGACTGAG-3' ; (SEQ ID Nr. 29)
Deg 3' P: 5'-CTGTGACATTATCTTGAGATTTC-3'; (SEQ ID Nr. 30)
3. Koniec 5' CD86: AP1, AP2 (Clontech Lab), primery zdegenerowane, specyficzne dla genu 3' (GSP) i skrócone specyficzne dla genu 3' (NGSP):
5' RACE PCR:
AP1: 5'-CCATCCTAATACGACTCACTATAGGGC-3'; (SEQ ID Nr. 31)
3' GSP: 5'-TGGGTAACCTTGTATAGATGAGCAGGTC-3'; (SEQ ID Nr. 32)
Nested 5' RACE PCR z produktem PCR 5' RACE: AP2: 5'-ACTCACTATAGGGCTCGAGCGGC-3'; (SEQ ID Nr. 33)
3' NGSP: 5'-CAGGTTGACTGAAGTTAGCAAGCAC-3'; (SEQ ID Nr. 34)
4. Koniec 3' B7-2: AP1, AP2, 5' GSP, i 5' NGSP:
3' RACE PCR:
AP1: 5'-CCATCCTAATACGACTCACTATAGGGC-3'; (SEQ ID Nr. 35)
GSP: 5'-GGACAA-GGGCACATATCACTGTTTC-3'; (SEQ ID Nr. 36)
Nested 3' RACE PCR z produktem PCR 3' RACE:
AP2: 5'-ACTCACTATAGGGCTCGAGC-GGC-3'; (SEQ ID Nr. 37)
5' NGSP: 5'-CAGTGCTTGCTAACTTCAGTCAACC-3'; (SEQ ID Nr. 38)
Cały gen CD86:
Primer 5' FeLB72 (1): 5'-CGGGAATGTCACTGAGCTTATAG-3'; (SEQ ID Nr. 39)
Primer 3' Fel 272 (1176): 5'-GATCTTTTTCAGGTTAGCAGGGG-3'; (SEQ ID Nr. 40)
P r z y k ł a d 1B
Kloning CD80 (B7-1)-Syntro/SPAH; Plazmid 917-19-8/16
Kocie komórki śledziony ekstrahowano od kotów i hodowano z Concanavalin A przez 5 godzin, komórki granulowano, przemyto PBS i stosowano do izolacji całego RNA (Qiagen RNeasy Total RNA System). Cały RNA traktowano DNAazą 1 (Boehringer Mannheim) aby z preparatów RNA usunąć zanieczyszczenia DNA. Następnie z tych preparatów ekstrahowano informacyjny RNA, przy użyciu paciorków Qiagen's Oligotex (Santa Clara, CA) i szybkich kolumn. Utworzono kopię DNA z mRNA, w obecności przypadkowych heksamerów, dNTP, RNAzyny, odwrotnej transkryptazy (Promega) oraz buforu odwrotnej transkryptazy (Promega) i inkubowano w temperaturze 42°C przez 30 minut. Następnie PCR stosowano do utworzenia otwartej ramki odczytu (ORF) cDNA klonu o podwójnej nici, pełnej długości kociego B7-1, przy użyciu primera sensownego 5/97.50 (5'-ATGGGTCACGCAGCAAAGTG-3'); (SEQ ID Nr. 41) i primera antysensownego 5/97.51 (5'CTATGTAGACAGGTGAGATC-3') (SEQ ID Nr. 42), dNTPs, B7-1 cDNA (pierwsza nić), MgSO4, polimeraza Vent (BRL) i bufor polimerazy Vent (BRL). Warunki PGR były następujące: 1 cykl temperatury 94°, 15 sekund; 35 cykli w temperaturze 94° przez 30 sekund, w temperaturze 48° przez 2 minuty, w temperaturze 72° przez 2 minuty; 1 cykl w temperaturze 72° przez 10 minut. Reakcje PCR przebiegał y na ż elu agarozowym o niskiej temperaturze topnienia i wyizolowano fragmenty DNA, odpowiadające oczekiwanej wielkości ORF B7-1, żel oczyszczono (Qiagen's Gel Purification Kit, Santa Clara, CA) i klonowano do wektora plazmidowego pCR-BLUNT przy użyciu odczynników z zestawu z Invitrogen's Zero Blunt PCR Kloning Kit (San Diego,CA). DNA ekstrahowany z kolonii bakteryjnych opornych na kanamycynę wstępnie przesiano pod względem obecności unikatowego miejsca Nhel (zawartego w kocim (B7-1)-TAMU CD80). Inserty, które wchodziły w zakres 800-900 wielkości i zawierały miejsce Nhel sekwencjonowano przy użyciu protokołów i urządzeń automatycznego sekwencjonowania z fluorescencją ABI (Perkin-Elmer-Cetus; Applied Biosystems, Inc.). Wektor plazmidowy i B7-1, primery specyficzne dla genu pochodzące od uprzednio klonowanego genu B7-1 stosowano do utworzenia sekwencji DNA primerów pCR-Blunt, którymi są 1/97.36 (5'-CAGGAAACAGCTATGAC-3'); (SEQ ID Nr. 43) i 1/97.37 (5'-AATACGACTCACTATAGG-3'); (SEQ ID Nr. 44).
primerami specyficznymi dla genu B7-1 są 12/96.22 (5'-AACACCATTTCATCATCCTTT-3'); (SEQ ID Nr. 45),
1/97.33 (5'-ATACAAGTGTATTTGCCATTGTC-3'); (SEQ ID Nr. 46),
12/96.20 (5'-AGCTCTGA-CCAATAACATCA-3') (SEQ ID Nr. 47)
12/96.21 (5'-ATTAGAAATCCAGTTCACTGCT-3'); (SEQ ID Nr. 48),
1/97.32 (5'-TCATGTCTGGCAAAGTACAAG-3); (SEQ ID Nr. 49),
11/96.32 (S'ATTCACTGACGTCACCGA-3) (SEQ ID Nr. 50),
PL 199 359 B1
11/96.31 (5' -AAGGCTGTGGCTCTGA- 3'); (SEQ ID Nr. 51).
Określono dwa klony, zawierające sekwencję pełnej długości CD80, odpowiadającą oryginalnej sekwencji CD80 z wyjątkiem 2 mutacji punktowych DNA. Jedna taka mutacja punktowa nie wpływała na sekwencję aminokwasową. Druga mutacja powodowała zmianę aminokwasu z leucyny na izoleucynę. Otrzymany klon kociego CD80 oznaczono 917-19.8/16. (CD80-Syntro/SPAH).
P r z y k ł a d 2
S-SPV-229
S-SPV-229 jest wirusem ospy świń, który wykazuje ekspresję co najmniej dwóch obcych genów. Gen dla β-galaktozydazy (lacZ) E. coli i gen dla kociego CD80 wprowadzono do miejsca AccI SPV w większym subfragmencie Bglll do Hindlll genomowego fragmentu M Hindlll SPV (unikatowe miejsce restrykcji Notl zastąpiło unikatowe miejsce restrykcji AccI). Gen lacZ znajduje się pod kontrolą syntetycznego późnego promotora (LP1), i gen kociego CD80 znajduje się pod kontrolą syntetycznego późnego/wczesnego promotora (LP2EP2).
S-SPV-229 otrzymano od S-SPV-001 (szczep Kasza)
Osiągnięto to korzystając z wektora homologii 930-23.A1 (patrz część „Materiały i metody”) i wirusa S-SPY-001 w procedurze rekombinacji homologicznej dla tworzenia rekombinowanego SPV. Wyjściową masę transfekcyjną przesiano stosując przesiew pod względem rekombinowanego SPV z ekspresją β-galaktozydazy (testy BLUOGAL i CPRG). Końcowym rezultatem oczyszczania metodą czerwonej łysinki był rekombinowany wirus oznaczony S-SPV-229. Wirus ten testowano pod względem ekspresji β-galaktozydazy, czystości, i stabilności insertu metodą wielokrotnych pasażów monitorowanych testem niebieskiej łysinki i testem czarnej łysinki jakie opisano w części „Materiały i metody”. Po początkowych trzech okrążeniach oczyszczania, wszystkie obserwowane łysinki były niebieskie wskazując że wirus były czysty, stabilny, i wykazujący ekspresję β-galaktozydazy. (patent U.S. 5,382,425 załącza się w niniejszym jako odniesienie). S-SPV-229 testowano pod względem ekspresji antygenów specyficznych dla β-galaktozydazy przy użyciu przesiewu metodą czarnej łysinki pod względem ekspresji obcego genu w rekombinowanym SPV. Wykazano, że przeciwciało monoklonalne wobec β-galaktozydazy reaguje specyficznie z łysinkami S-SPV-229 a nie z negatywnymi łysinkami kontrolnymi S-SPV-001. Wszystkie S-SPV-229 obserwowane łysinki reagowały z przeciwciałem monoklonalnym wobec galaktozydazy wskazując że wirus stabilnie wykazywał ekspresję obcego genu β-galaktozydazy. Opisane tu testy przeprowadzono w komórkach ESK-4, wskazując że komórki ESK-4 będą odpowiednim substratem do produkcji rekombinowanych szczepionek SPV.
S-SPV-229 testuje się pod względem ekspresji antygenów specyficznych dla kociego CD80 przy użyciu przesiewu pod względem ekspresji kociego CD80 (B7-1) i CD86 (B7-2) w rekombinowanym SPV, RPV lub FHV przy użyciu testów czarnej łysinki. Okazuje się, że ludzkie przeciwciało chimeryczne CTLA-4/Fc reaguje specyficznie z łysinkami S-SPV-229 (wykazującymi ekspresję kociego CD80), a nie z negatywnymi łysinkami kontrolnymi S-SPV-001. Wszystkie obserwowane łysinki S-SPV-229 reagują jak się okazuje z ludzkim CTLA-4/Fc przeciwciałem chimerycznym wskazując, że wirus stabilnie wykazuje ekspresję obcego genu kociego CD80.
Aby potwierdzić ekspresję produktu kociego genu CD80, komórki zakaża się S-SPV-229 i próbki zakażonych lizatów komórkowych poddano elektroforezie w żelu SDS-poliakrylamidowym. Żel odciska się i analizuje przy użyciu procedury Western blotting.
S-SPV-229 jest użyteczny jako szczepionka przeciw chorobom u kotowatych.
S-SPV-229 poprawia skuteczność szczepionek przeciwko FIV, FeLV, FIP, lub innym kocim chorobom przy stosowaniu pojedynczo lub w połączeniu z FIV, FeLV, FIP, lub innymi kocimi szczepionkami. S-SPV-229 jest także użyteczny pod względem ekspresji kociego polipeptydu CD80. Lizat komórkowy S-SPV-229 zakażonych komórek wstrzykuje się myszom lub królikom aby wzbudzić poliklonalne, monospecyficzne przeciwciała wobec kociego CD80.
P r z y k ł a d 3
S-SPV-230
S-SPV-230 jest wirusem ospy świń, który wykazuje ekspresję co najmniej dwóch obcych genów. Gen dla β-galaktozydaz (lacZ) E. coli i gen dla kociego CD28 wprowadzono do miejsca AccI SPV w większym subfragmencie Bglll do Hindlll genomowego fragmentu M Hindlll SPV (unikatowe miejsce restrykcji Notl zastąpiło unikatowe miejsce restrykcji AccI). Gen lacZ znajduje się pod kontrolą syntetycznego późnego promotora (LP1), i gen kociego CD28 znajduje się pod kontrolą syntetycznego późnego/wczesnego promotora (LP2EP2).
PL 199 359 B1
S-SPV-230 otrzymano z S-SPV-001 (szczep Kasza). Osiągnięto to, korzystając z wektora homologii 930-26.A1 (patrz część „Materiały i metody”) i wirusa S-SPV-001 w procedurze rekombinacji homologicznej dla tworzenia rekombinowanego SPV. Wyjściową masę transfekcyjną przesiano stosując przesiew pod względem rekombinowanego SPV z ekspresją β-galaktozydazy (testy BLUOGAL i CPRG). Końcowym rezultatem oczyszczania metodą czerwonej łysinki był rekombinowany wirus oznaczony S-SPV-230. Wirus ten testowano pod względem ekspresji β-galaktozydazy, czystości, i stabilności insertu, metodą wielokrotnych pasażów monitorowanych testem niebieskiej łysinki, jaki opisano w części „Materiały i metody”. Po początkowych trzech okrążeniach oczyszczania, wszystkie obserwowane łysinki były niebieskie wskazując, że wirus były czysty, stabilny, i wykazujący ekspresję obcego genu.
S-SPV-230 testuje się pod względem ekspresji antygenów specyficznych dla kociego CD28 przy użyciu przesiewu metodą czarnej łysinki, pod względem ekspresji obcego genu w rekombinowanym SPV. Opisane tu testy przeprowadzono w komórkach ESK-4, wskazując że komórki ESK-4 będą odpowiednim substratem do produkcji rekombinowanych szczepionek SPV.
Aby potwierdzić ekspresję genu kociego CD28 produktu, komórki zakaża się S-SPV-230 i próbki zakażonych lizatów komórkowych poddano elektroforezie w żelu SDS-poliakrylamidowym. Żel odciska się i analizuje przy użyciu procedury Western blotting.
S-SPV-230 jest użyteczny jako szczepionka przeciw chorobom u kotowatych. S-SPV-230 poprawia skuteczność szczepionek przeciwko FIV, FeLV, FIP, lub innym kocim chorobom, przy stosowaniu pojedynczo lub w połączeniu z FIV, FeLV, FIP, lub innymi kocimi szczepionkami. S-SPV-230 jest także użyteczny pod względem ekspresji polipeptydu kociego CD28. Lizat komórkowy S-SPV-230 zakażonych komórek wstrzykuje się myszom lub królikom aby wzbudzić poliklonalne, monospecyficzne przeciwciała wobec kociego CD28.
P r z y k ł a d 4
S-SPV-225
S-SPV-225 jest wirusem ospy świń, który wykazuje ekspresję co najmniej dwóch obcych genów. Gen dla β-galaktozydazy (lacZ) E. coli i gen dla kociego interferonu-γ (kociego IFN-γ) wprowadzono do miejsca AccI SPV w większym subfragmencie Bglll do Hindlll genomowego fragmentu M Hindlll SPV (unikatowe miejsce restrykcji Notl zastąpiło unikatowe miejsce restrykcji AccI). Gen lacZ znajduje się pod kontrolą promotora OlL ospy świń i gen kociego IFN-γ znajduje się pod kontrolą syntetycznego późnego/wczesnego promotora (LP2EP2).
S-SPV-225 otrzymano od S-SPV-001 (szczep Kasza). Osiągnięto to korzystając z wektora homologii 917-60.B9 (patrz część „Materiały i metody”) i wirusa S-SPV-001 w procedurze rekombinacji homologicznej dla tworzenia rekombinowanego SPV. Wyjściową masę transfekcyjną przesiano stosując przesiew pod względem rekombinowanego SPV z ekspresją β-galaktozydazy (testy BLUOGAL i CPRG). Końcowym rezultatem oczyszczania metodą czerwonej łysinki był rekombinowany wirus oznaczony S-SPV-225. Wirus ten testowano pod względem ekspresji β-galaktozydazy, czystości, i stabilności insertu, metodą wielokrotnych pasażów monitorowanych testem niebieskiej łysinki, jaki opisano w części „Materiały i metody”. Po początkowych trzech okrążeniach oczyszczania, wszystkie obserwowane łysinki były niebieskie wskazując, że wirus były czysty, stabilny, i wykazujący ekspresję obcego genu.
S-SPV-225 testuje się pod względem ekspresji antygenów specyficznych wobec kociego IFN-γ, przy użyciu przesiewu metodą czarnej łysinki pod względem ekspresji obcego genu w rekombinowanym SPV. Opisane tu testy przeprowadzono w komórkach ESK-4, wskazując że komórki ESK-4 będą odpowiednim substratem do produkcji rekombinowanych szczepionek SPV.
Aby potwierdzić ekspresję produktu genu kociego IFN-γ, komórki zakaża się S-SPV-225 i próbki zakażonych lizatów komórkowych poddano elektroforezie w żelu SDS-poliakrylamidowym. Żel odciska się i analizuje przy użyciu procedury Western blotting.
S-SPV-225 testuje się pod względem ekspresji bioaktywneego kociego IFN-γ przy użyciu przesiewu pod względem bioaktywności kociego interferonu gamma o ekspresji w rekombinowanym SPV, RPV lub FHV przy użyciu redukcji łysinek VSV.
S-SPV-225 jest użyteczny jako szczepionka przeciw chorobom u kotowatych. S-SPV-225 poprawia skuteczność szczepionek przeciwko FIV, FeLV, FIP, lub innym kocim chorobom, przy stosowaniu pojedynczo lub w połączeniu z FIV, FeLV, FIP, lub innymi kocimi szczepionkami.
PL 199 359 B1
P r z y k ł a d 5
S-SPV-200
S-SPV-200 jest wirusem ospy świń, który wykazuje ekspresję trzech obcych genów. Geny dla gag/proteazy (FIV) kociego wirusa niedoboru odporności, i otoczki FIV (pełnej długości) i gen dla β-galaktozydazy (lacZ) E. coli wprowadzono do unikatowego miejsca restrykcji Notl (linkery Notl wprowadzone do unikatowego miejsca AccI w ORF 01L fragmentu M Hindlll SPV). Geny gag-proteazy FIV i otoczki znajdują się pod kontrolą oddzielnego, lecz identycznego syntetycznego późnego/wczesnego promotora (LP2EP2). Gen lacZ znajduje się pod kontrolą syntetycznego późnego promotora (LP1). S-SPV-200 otrzymano od S-SPV-001 (szczep Kasza). Osiągnięto to korzystając z wektora homologii 904-63.B7 i wirusa S-SPV-001 w procedurze rekombinacji homologicznej dla tworzenia rekombinowanego SPV. Wyjściową masę transfekcyjną przesiano stosując przesiew pod względem rekombinowanego SPV z ekspresją β-galaktozydazy (testy BLUOGAL i CPRG) i przesiew pod względem rekombinowanego herpeswirusa z ekspresją enzymatycznych genów markerowych). Końcowym rezultatem oczyszczania metodą czerwonej łysinki był rekombinowany wirus oznaczony S-SPV-157. Wirus ten testowano pod względem ekspresji β-galaktozydazy testem niebieskiej łysinki, jaką opisano w części „Materiały i metody”. Przeprowadzono analizę czystości, i stabilności insertu po 5 pasażach, przez wykrywanie gag FIV i β-galaktozydazy testem czarnej łysinki i wykrywanie gag FIV i otoczki w teście western blot.
S-SPV-200 jest rekombinowanym wirusem ospy świń wykazującym ekspresję białek gag/proteazy FIV i otoczki FIV i jest użyteczny jako szczepionka u kotowatych przeciwko infekcji FIV. S-SPV-200 jest także użyteczne pod względem ekspresji białek gag/proteazy i otoczki FIV.
P r z y k ł a d 6
S-SPV-233
S-SPV-233 jest wirusem ospy świń, który wykazuje ekspresję pięciu obcych genów: FIVgag, FIVenv, kociego CD80, lacZ E. coli i uidA E. coli. Wprowadzono pełnej długości gen kociego CD80 i gen dla E. coli β-glukuronidazy (uidA) do unikatowego miejsca restrykcji Notl (linkery Notl wprowadzony do unikatowego miejsca restrykcji EcoRI w regionie o długości około 3,2 kb (SEQ ID Nr) fragmentu K Hindlll SPV o długości 6,7 kb). Geny dla gag/proteazy (FIV) kociego wirusa niedoboru odporności, i otoczki FIV (pełnej długości) i gen dla β-galaktozydazy (lacZ) E. coli wprowadzono do unikatowego miejsca restrykcji Notl (linkery Notl wprowadzone do unikatowego miejsca AccI w ORF 01L fragmentu M Hindlll SPV). Gen CD80 znajduje się pod kontrolą syntetycznego późnego/wczesnego promotora (LP2EP2) i gen uidA znajduje się pod kontrolą oddzielnego i unikatowego syntetycznego wczesnego promotora (EP2). Geny gag-proteazy FIV i otoczki znajdują się pod kontrolą oddzielnego, lecz identycznego syntetycznego późnego/wczesnego promtora (LP2EP2). Gen lacZ znajduje się pod kontrolą syntetycznego późnego promotora (LP1). (zgłoszenie międzynarodowe PCT WO 96/22363 załącza się w niniejszym jako odniesienie).
S-SPV-233 otrzymano od S-SPV-200 (zawiera geny FIVgag, otoczki FIV i E. coli lacZ). Osiągnięto to korzystając z wektora homologii 931-21.A1 i wirusa S-SPV-200 w procedurze rekombinacji homologicznej dla tworzenia rekombinowanego SPV. Wyjściową masę transfekcyjną przesiano stosując przesiew pod względem rekombinowanego SPV z ekspresją β-glukuronidazy (X-gLUC i przesiew pod względem rekombinowanego herpeswirusa z ekspresją enzymatycznych genów markerowych). Końcowym rezultatem oczyszczania metodą niebieskie/zielone będzie rekombinowany wirus oznaczony S-SPV-233.
S-SPV-233 testuje się pod względem ekspresji FIV gag, FIV env, i antygenów specyficznych dla kociego CD80 przy użyciu przesiewu metodą czarnej łysinki, pod względem ekspresji obcego genu w rekombinowanym SPV. Opisane tu testy przeprowadzono w komórkach ESK-4, wskazując że komórki ESK-4 będą odpowiednim substratem do produkcji rekombinowanych szczepionek SPV. S-SPV-233 testuje się pod względem ekspresji antygenów specyficznych dla kociego CD80, przy użyciu przesiewu pod względem kociego CD80 (B7-1) i CD86 (B7-2) ekspresji w rekombinowanym SPV, RPV lub FHV przy użyciu testów czarnej łysinki. Okazuje się, że ludzkie przeciwciało chimeryczne CTLA-4/Fc reaguje specyficznie z łysinkami S-SPV-233 (wykazującymi ekspresję kociego CD80), a nie z negatywnymi łysinkami kontrolnymi S-SPV-001. Wszystkie obserwowane łysinki S-SPV-233 reagują jak się okazuje z ludzkim przeciwciałem chimerycznym CTLA-4/Fc wskazując, że wirus stabilnie wykazuje ekspresję obcego kociego genu CD80.
PL 199 359 B1
Aby potwierdzić produkt ekspresji genu FIV gag, FIV env, i kociego CD80, komórki zakaża się
S-SPV-233 i próbki zakażonych lizatów komórkowych poddano elektroforezie w żelu SDS-poliakrylamidowym. Żel odciska się i analizuje przy użyciu procedury Western blotting.
S-SPV-233 jest rekombinowanym wirusem ospy świń wykazującym ekspresję białek gag/proteazy FIV i otoczki FIV i jest użyteczny jako szczepionka przeciwko infekcji FIV u kotowatych. S-SPV-233 jest także użyteczny pod względem ekspresji białek gag/proteazy i otoczki FIV.
P r z y k ł a d 7
S-SPV-235
S-SPV-235 jest wirusem ospy świń, który wykazuje ekspresję pięciu obcych genów: FIVag, FIVenv, kociego IFN-γ, lacZ E. coli i uidA E. coli. Wprowadzono pełnej długości gen kociego IFN-γ i gen dla β-glukuronidazy (uidA) E. coli do unikatowego miejsca restrykcji Notl (linkery Notl wprowadzone do unikatowego miejsca restrykcji EcoRI w regionie o długości około 3,2 kb (SEQ ID Nr ) fragmentu K Hindlll SPV o długości 6,7 kb). Geny dla gag/proteazy (FIV) kociego wirusa niedoboru odporności, i otoczki FIV (pełnej długości) i gen dla β-galaktozydazy (lacZ) E. coli wprowadzono do unikatowego miejsca restrykcji Notl (linkery Notl wprowadzone do unikatowego miejsca AccI w ORF 01L fragmentu M Hindlll SPV). Gen IFN-γ znajduje się pod kontrolą syntetycznego późnego/wczesnego promotora (LP2EP2) i gen uidA znajduje się pod kontrolą oddzielnego i unikatowego syntetycznego wczesnego promotora (EP2).
Geny gag-proteazy FIV i otoczki znajdują się pod kontrolą oddzielnego, lecz identycznego syntetycznego późnego/wczesnego promtora (LP2EP2). Gen lacZ znajduje się pod kontrolą syntetycznego późnego promotora (LP1).
S-SPV-235 otrzymano od S-SPV-200 (zawiera geny FIVgag, FIVotoczki i lacZ E.coli). Osiągnięto to korzystając z wektora homologii 931-55.B12 i wirusa S-SPV-200 w procedurze rekombinacji homologicznej dla tworzenia rekombinowanego SPV. Wyjściową masę transfekcyjną przesiano stosując przesiew pod względem rekombinowanego SPV z ekspresją β-glukuronidazy (X-GLUC i przesiew pod względem rekombinowanego herpeswirusa z ekspresją enzymatycznych genów markerowych). Końcowym rezultatem oczyszczania metodą niebieskie/zielone jest rekombinowany wirus oznaczony S-SPV-235.
S-SPV-235 testuje się pod względem ekspresji antygenów specyficznych wobec FIV gag, FIV env, i kociego IFN-γ przy użyciu przesiewu metodą czarnej łysinki pod względem ekspresji obcego genu w rekombinowanym SPV. Opisane tu testy przeprowadzono w komórkach ESK-4, wskazując, że komórki ESK-4 będą odpowiednim substrątem do produkcji rekombinowanych szczepionek SPV.
S-SPV-225 testuje się pod względem ekspresji bioaktywnego kociego IFN-γ przy użyciu przesiewu pod względem bioaktywności kociego interferonu gamma o ekspresji w rekombinowanym SPV, RPV lub FHV, przy użyciu redukcji łysinek VSV.
Aby potwierdzić ekspresję produktu genu FIV gag, FIV env, i kociego IFN-γ, komórki zakaża się S-SPV-235 i próbki zakażonych lizatów komórkowych poddano elektroforezie w żelu SDS-poliakrylamidowym. Żel odciska się i analizuje przy użyciu procedury Western blotting.
S-SPV-235 jest rekombinowanym wirusem ospy świń wykazującym ekspresję białek gag/proteazy FIV i otoczki FIV i jest on użyteczny jako szczepionka przeciwko infekcji FIV u kotowatych. S-SPV-235 jest także użyteczny pod względem ekspresji białek gag/proteazy i otoczki FIV.
P r z y k ł a d 8
S-SPV-224
S-SPV-224 jest wirusem ospy świń który wykazuje ekspresję trzech obcych genów. Geny dla gag/proteazy kociego wirusa białaczki (FeLV) i otoczki FeLV (pełnej długości) i gen dla E. coli (lacZ) wprowadzono do deletowanego miejsca 15L SPV pochodzącego z częściowego genomowego fragmentu N Hindlll o długości 1869 bp. Gen gag/proteazy FeLV znajduje się pod kontrolą syntetycznego wczesnego promotora ospy (EP2). Gen otoczki FeLV znajduje się pod kontrolą syntetycznego wczesnego promotora ospy (EP1). Gen lacZ znajduje się pod kontrolą konstytutywnego późnego promotora 15L SPV.
S-SPV-224 otrzymano od S-SPV-001 (szczep Kasza). Osiągnięto to korzystając z wektora homologii 921-65.25 i wirusa S-SPV-001 w procedurze rekombinacji homologicznej dla tworzenia rekombinowanego RPV, SPV, lub FHV. Wyjściową masę transfekcyjną przesiano stosując przesiew pod względem rekombinowanego RPV lub SPV FHV wykazującego ekspresję β-galaktozydazy (testy BLUOGAL i CPRG) lub β-galaktozydazy (testy X-GLUC). Ostatecznym wynikiem oczyszczania metodą
PL 199 359 B1 czerwonej łysinki był rekombinowany wirus oznaczony S-SPV-224. Wirus ten testowano pod względem ekspresji β-galaktozydazy w teście niebieskiej łysinki, jaki opisano w części „Materiały i metody”.
S-SPV-224 testuje się pod względem ekspresji białek gag/proteazy FeLV, FeLV env, i β-galaktozydazy, przy użyciu białek przy użyciu przesiewu pod względem ekspresji obcego genu w rekombinowanym RPV, SPV, lub FHV stosując testy czarnej łysinki. Opisane tu testy przeprowadzono w komórkach ESK-4, które będą odpowiednim substratem do produkcji rekombinowanych szczepionek SPV 14 sierpnia, 1998.
Aby potwierdzić ekspresję produktów genowych gag/proteazy FeLV i FeLV env, komórki zakaża się S-SPV-224 i próbki lizatów zakażonych komórek poddano elektroforezie w żelu SDS-poliakrylamidowym. Żel odciska się i analizuje przy użyciu procedury Western blotting.
S-SPV-224 jest rekombinowanym wirusem ospy świń wykazującym ekspresję białek gag/proteazy FeLV, i otoczki FeLV i jest on użyteczny jako szczepionka przeciwko infekcjom FeLV u kotowatych. S-SPV-224 jest także użyteczny pod względem ekspresji białek gag/proteazy FeLV i otoczki.
P r z y k ł a d 9
S-SPV-246
S-SPV-246 jest wirusem ospy świń, który wykazuje ekspresję pięciu obcych genów: gag/proteazy FeLV, FeLVenv, kociego CD80, lacZ E. coli i uidA E. coli. Pełnej długości gen kociego CD80 i gen dla β-galaktozydaz (uidA) E. coli wprowadzono do unikatowego miejsca restrykcji Notl (linker Not I wprowadzony do unikatowego miejsca restrykcji EcoRI, w regionie o długości około 3,2 kb fragmentu K Hindlll SPV o długości 6,7 kb). Gen CD80 znajduje się pod kontrolą syntetycznego późnego/wczesnego promotora (LP2EP2) i gen uidA znajduje się pod kontrolą syntetycznego wczesnego promotora ospy, EP2. Geny gag/proteazy FeLV, otoczki FeLV (pełnej długości) i β-galaktozydazy (lacZ) E. coli wprowadzono do deletowanego miejsca 15L, pochodzącego od częściowego fragmentu genomowego N Hindlll o długości 1869. Gen gag/proteazy FeLV znajduje się pod kontrolą syntetycznego wczesnego promotora ospy, EP2. Gen otoczki FeLV znajduje się pod kontrolą syntetycznego wczesnego promotora ospy, EP1. Gen lacZ znajduje się pod kontrolą konstytutywnego późnego promotora ospy, 15L (zgłoszenie międzynarodowe PCT WO 96/22263 załącza się w niniejszym jako odniesienie).
S-SPV otrzymano od S-SPV-224 (zawiera gen gag/proteazy FeLV, FeLV otoczki i lacZ E. coli w od częściowego fragmentu genomowego N Hindlll o długości 1869). Osiągnięto to korzystając z wektora homologii 931-21.A1 i wirusa S-SPV-224 w procedurze rekombinacji homologicznej dla tworzenia rekombinowanego RPV, SPV, lub FHV. Wyjściową masę transfekcyjną przesiano stosując przesiew pod względem rekombinowanego RPV lub SPV lub FHV z ekspresją β-galaktozydazy (testy BLUOGAL i CPRG) lub β-galaktozydazy (X-GLUC test). Końcowym rezultatem of oczyszczania metodą niebieskie/zielone będzie rekombinowany wirus oznaczony S-SPV-246.
S-SPV-246 testuje się pod względem ekspresji gag/proteazy FeLV, i otoczki FeLV białek przy użyciu przesiewu pod względem ekspresji obcego genu w rekombinowanym RPV, SPV, lub FHV stosując testy czarnej łysinki. Opisane tu testy przeprowadzono w komórkach ESK-4, wskazując, że komórki ESK-4 będą odpowiednim substratem do produkcji rekombinowanych szczepionek SPV.
S-SPV-246 testuje się pod względem ekspresji antygenu specyficznego wobec kociego CD80, przy użyciu przesiewu pod względem ekspresji kociego CD80 (B7-1) i CD86 (B7-2) w rekombinowanym SPV, RPV lub FHV, stosując testy czarnej łysinki. Okazuje się, że ludzkie CTLA-4/Fc przeciwciało chimeryczne reaguje specyficznie z łysinkami S-SPV-246 (wykazującymi ekspresję kociego CD80), a nie z S-SPV-001 negatywnymi łysinkami kontrolnymi. Wszystkie obserwowane łysinki S-SPV-246 reagują jak się okazuje, z ludzkim przeciwciałem chimerycznym CTLA-4/Fc wskazując, że wirus stabilnie wykazuje ekspresję obcego kociego genu CD80.
Aby potwierdzić ekspresję produktu genowego gag/proteazy FeLV, otoczki FeLV, i kociego CD80, komórki zakaża się S-SPV-246 i próbki zakażonych lizatów komórkowych poddaje się elektroforezie w żelu SDS-poliakrylamidowym: żel umieszcza się w butelkach i analizuje przy użyciu procedury Western blotting.
S-SPV-246 jest rekombinowanym wirusem ospy świń, wykazującym ekspresję gag/proteazy FeLV i otoczki FeLV białek i jest użyteczny jako szczepionka przeciwko infekcjom FeLV u kotowatych.
S-SPV-246 jest także użyteczne pod względem ekspresji gag/proteazy FeLV i otoczki białek.
P r z y k ł a d 10
Dodatkowymi przykładami rekombinowanego wirusa ospy świń użytecznego jako szczepionka przeciwko kociemu wirusowi niedoboru odporności (FIV), wirusa kociej białaczki (FeLV) lub kociego zakaźnego zapalenia otrzewnej (FIP) są:
PL 199 359 B1
Rekombinowany wirus ospy świń wykazuje ekspresję pięciu obcych genów. Gen FIVenv znajduje się pod kontrolą syntetycznego wczesnego promotora ospy EP1; gen gag/proteazy FIV znajduje się pod kontrolą syntetycznego wczesnego promotora ospy EP2; gen lacZ E. coli znajduje się pod kontrolą promotora 15L ospy świń; gen kociego CD80 znajduje się pod kontrolą syntetycznego późnego/wczesnego promotora ospy LP2EP2; gen uidA E. coli znajduje się pod kontrolą syntetycznego wczesnego promotora ospy EP2. Gen otoczki FIV, geny gag/proteazy FIV i lacZ E. coli leżą w innym i różnym miejscu insercji SPV nie będącym podstawowym, od insercji genowych kociego CD80 i uidA E. coli.
Rekombinowany wirus ospy świń wykazuje ekspresję pięciu obcych genów. Gen FIVenv znajduje się pod kontrolą syntetycznego wczesnego promotora ospy EP1; gen gag/proteazy FIV znajduje się pod kontrolą syntetycznego wczesnego promotora ospy EP2; gen lacZ E. coli znajduje się pod kontrolą promotora 15L ospy świń; gen kociego CD86 znajduje się pod kontrolą syntetycznego późnego/wczesnego promotora ospy LP2EP2; gen uidA E. coli znajduje się pod kontrolą syntetycznego wczesnego promotora ospy EP2. Gen otoczki FIV, geny gag/proteazy FIV i lacZ E. coli leżą w innym i różnym miejscu insercji SPV nie bę dącym podstawowym, od insercji kociego CD86 i E. coli uidA.
Rekombinowany wirus ospy świń wykazuje ekspresję dwóch obcych genów. Gen kociego CD86 znajduje się pod kontrolą syntetycznego późnego/wczesnego promotora ospy LP2EP2; gen uidA E. coli znajduje się pod kontrolą syntetycznego wczesnego promotora ospy EP2. Wirus ten ma zastosowanie pojedynczo lub w połączeniu z innymi rekombinowanymi białkami lub szczepionkami.
Dodatkowe przykłady rekombinowanego wirusa ospy świń użyteczne do wytwarzania szczepionek przeciwko chorobie FeLV będą takie same jak opisano powyżej, z wyjątkiem zastąpienia genu FIV porównywalnym specyficznymi genami FeLV.
Dodatkowe przykłady rekombinowanego wirusa ospy świń użytecznego do wytwarzania białek do stosowania jako szczepionka do wytwarzania przeciwciała poliklonalnego i oczyszczania to:
Rekombinowany wirus ospy świń wykazuje ekspresję jednego obcego genu. Gen kociego CD80 bez domeny transbłonowej znajduje się pod kontrolą syntetycznego późnego/wczesnego promotora ospy LP2EP2. Alternatywnie, gen kociego CD80 bez domeny transbłonowej posiada połączenie ze znacznikiem histydynowym na końcu karboksylowym pozwalającym na oczyszczanie na niklowej kolumnie powinowactwa.
Rekombinowany wirus ospy świń wykazuje ekspresję jednego obcego genu. Gen kociego CD28 bez domeny transbłonowej znajduje się pod kontrolą syntetycznego późnego/wczesnego promotora ospy LP2EP2. Alternatywnie, gen kociego CD28 bez domeny transbłonowej posiada połączenie ze znacznikiem histydynowym na końcu karboksylowym, pozwalającym na oczyszczanie na niklowej kolumnie powinowactwa.
Rekombinowany wirus ospy świń wykazuje ekspresję jednego obcego genu. Gen kociego CD86 bez domeny transbłonowej znajduje się pod kontrolą syntetycznego późnego/wczesnego promotora ospy LP2EP2. Alternatywnie, gen kociego CD86 bez domeny transbłonowej posiada połączenie ze znacznikiem histydynowym na końcu karboksylowym, pozwalającym na oczyszczanie na niklowej kolumnie powinowactwa.
Dodatkowe przykłady rekombinowanego wirusa ospy świń, wykorzystujące zarówno CD80 i CD86 i uż yteczne do opracowywania szczepionek przeciwko chorobie FIV i FeLV u kotowatych to:
Rekombinowany wirus ospy świń wykazuje ekspresję pięciu obcych genów. Koci gen CD86 i geny Cd-80 podlegają ekspresji w bicistronowej kasecie pod kontrolą syntetycznego póź nego/wczesnego promotora ospy LP1, kierującego transkrypcją CD80 i CD86 i obejmującego element IRES EMCV między dwoma otwartymi ramkami odczytu; gen uidA E. coli znajduje się pod kontrolą syntetycznego wczesnego promotora, EP2. Gen gag/proteazy FIV znajduje się pod kontrolą promotora ospy świń, OIL; gen lacZ E. coli znajduje się pod kontrolą syntetycznego późnego promotora ospy, LP1. Geny CD80/CD86 i uidA E. coli są zawarte w innym i różnym miejscu insercji SPV nie będącym podstawowym od insercji genowych gag/proteazy i lacZ E. coli.
Rekombinowany wirus ospy świń wykazuje ekspresję pięciu obcych genów. Koci gen CD86i geny CD80 podlegają ekspresji w bicistronowej kasecie pod kontrolą syntetycznego póź nego/wczesnego promotora ospy LP1, kierującego transkrypcją CD80 i CD86 i obejmującego element IRES EMCV między dwoma otwartymi ramkami odczytu; gen lacZ E. coli znajduje się pod kontrolą syntetycznego późnego promotora, LP1. Gen otoczki FIV znajduje się pod kontrolą syntetycznego wczesnego promotora ospy, EP1.
PL 199 359 B1
Gen uidA E. coli znajduje się pod kontrolą syntetycznego późnego promotora ospy, LP1. Geny
CD80/CD86 i uidA E. coli są zawarte w innym i różnym miejscu inercji SPV nie będącym podstawowym od insercji genowych gag/proteazy i lacZ E. coli.
Rekombinowany wirus ospy świń wykazuje ekspresję sześciu obcych genów. Koci gen Cd86i gen CD80 o ekspresji w bicistronowej kasecie pod kontrolą syntetycznego późnego promotora ospy LP1, kierującego transkrypcją CD80 i CD86 i obejmującego element IRES EMCV między dwoma otwartymi ramkami odczytu; gen uidA E. coli znajduje się pod kontrolą syntetycznego wczesnego promotora, EP2. Gen gag/proteazy FIV znajduje się pod kontrolą wczesnego promotora ospy, EP2; gen otoczki FIV znajduje się pod kontrolą syntetycznego wczesnego promotora ospy, EP1; gen lacZ E. coli znajduje się pod kontrolą konstytutywnego promotora 15L ospy. Geny CD80/CD86, i uidA E. coli wprowadza się do różnego miejsca insercji od insercji genowych otoczki FIV, gag/proteazy FIV i lacZ E. coli.
Dodatkowe wirusy ospy świń do stosowania w szczepionkach FeLV dla kotowatych będą skonstruowane jak opisano powyżej, zastępując geny FIV na porównywalne konstrukcje genowe FeLV.
P r z y k ł a d 11
Dodatkowe przykłady rekombinowanego pokswirusa szopów użytecznych jako szczepionka przeciwko kocim chorobom, tak jak koci wirus niedoboru odporności (FIV), wirus kociej białaczki (FeLV), lub kocie zakaźne zapalenie otrzewnej (FIP) to:
Rekombinowany pokswirus szopów wykazuje ekspresję dwóch obcych genów. Koci CD86 znajduje się pod kontrolą syntetycznego późnego/wczesnego promotora ospy LP2EP2; gen lacZ E. coli znajduje się pod kontrolą syntetycznego późnego promotora ospy L1.
Dodatkowe przykłady rekombinowanego pokswirusa szopów użyteczne do wytwarzania białek do stosowania jako szczepionka lub do wytwarzania przeciwciała poliklonalnego i oczyszczania.
Rekombinowany pokswirus szopów wykazuje ekspresję jednego obcego genu. Gen kociego CD80 bez domeny transbłonowej znajduje się pod kontrolą syntetycznego późnego/wczesnego promotora ospy LP2EP2. Alternatywnie, gen kociego CD80 bez domeny transbłonowej posiada połączenie ze znacznikiem histydynowym na końcu karboksylowym pozwalającym na oczyszczanie na niklowej kolumnie powinowactwa.
Rekombinowany pokswirus szopów wykazuje ekspresję jednego obcego genu. Gen kociego CD28 bez domeny transbłonowej znajduje się pod kontrolą syntetycznego późnego/wczesnego promotora ospy LP2EP2. Alternatywnie, gen kociego CD28 bez domeny transbłonowej posiada połączenie ze znacznikiem histydynowym na końcu karboksylowym pozwalającym na oczyszczanie na niklowej kolumnie powinowactwa.
Rekombinowany pokswirus szopów wykazuje ekspresję jednego obcego genu. Gen kociego CD86 bez domeny transbłonowej znajduje się pod kontrolą syntetycznego późnego/wczesnego promotora ospy LP2EP2. Alternatywnie, gen kociego CD86 bez domeny transbłonowej posiada połączenie ze znacznikiem histydynowym na końcu karboksylowym pozwalającym na oczyszczanie na niklowej kolumnie powinowactwa.
Rekombinowany pokswirus szopów wykazuje ekspresję czterech obcych genów. Koci gen CD86i gen CD80 o ekspresji w bicistronowej kasecie pod kontrolą syntetycznego późnego/wczesnego promotora ospy LP2EP2, kierującego transkrypcją CD80 i CD86 i obejmującego element IRES EMCV między dwoma otwartymi ramkami odczytu kierującego translacją drugiego genu, o orientacji w dół, CD80; gen gag FIV znajduje się pod kontrolą promotora ospy świń, OIL; gen uidA E. coli znajduje się pod kontrolą syntetycznego wczesnego promotora ospy E2.
Rekombinowany pokswirus szopów wykazuje ekspresję czterech obcych genów. Koci gen CD86- i gen CD80 o ekspresji w bicistronowej kasecie pod kontrolą syntetycznego późnego/wczesnego promotora ospy LP2EP2, kierującego transkrypcją CD80 i CD86 i obejmującego element IRES EMCV między dwoma otwartymi ramkami odczytu, kierującego translacją drugiego genu, o orientacji w dół, CD80; gen otoczki FIV znajduje się pod kontrolą syntetycznego wczesnego promotora ospy, E1; gen uidA E. coli znajduje się pod kontrolą syntetycznego wczesnego promotora ospy E2.
Rekombinowany pokswirus szopów wykazuje ekspresję pięciu obcych genów. Koci gen CD86i gen CD80 o ekspresji w bicistronowej kasecie pod kontrolą syntetycznego późnego/wczesnego promotora ospy LP2EP2, kierującego transkrypcją CD80 i CD86 i obejmującego element IRES EMCV między dwoma otwartymi ramkami odczytu, kierującego translacją drugiego genu, o orientacji w dół, CD80; gen gag FIV znajduje się pod kontrolą promotora ospy świń, OIL; gen otoczki FIV znajduje się
PL 199 359 B1 pod kontrolą syntetycznego wczesnego promotora ospy, E1; gen uidA E. coli znajduje się pod kontrolą syntetycznego wczesnego promotora ospy E2.
Dodatkowe przykłady rekombinowanego pokswirusa szopów użyteczne jako szczepionka przeciwko kociej chorobie, tak jak koci wirus niedoboru odporności (FIV), wirus kociej białaczki (FeLV), lub kocie zakaźne zapalenie otrzewnej (FIP) to:
Rekombinowany pokswirus szopów wykazuje ekspresję dwóch obcych genów. Gen kociego CD86 znajduje się pod kontrolą syntetycznego późnego/wczesnego promotora ospy LP2EP2; gen lacZ E. coli znajduje się pod kontrolą syntetycznego późnego promotora ospy LP1.
Dodatkowe przykłady rekombinowanego pokswirusa szopów wykorzystujące zarówno CD80 jak i CD86, i użyteczne do opracowywania szczepionek przeciwko chorobie FIV i FeLV u kotowatych, to:
Rekombinowany pokswirus szopów wykazuje ekspresję czterech obcych genów. Gen kociego CD86 i gen CD80 o ekspresji w bicistronowej kasecie pod kontrolą syntetycznego późnego promotora ospy LP1, kierującego transkrypcją CD80 i CD86 i obejmującego element IRES EMCV między dwoma otwartymi ramkami odczytu. Gen gag/proteazy FIV znajduje się pod kontrolą syntetycznego późnego/wczesnego promotora ospy, LP2EP2; gen uidA E. coli znajduje się pod kontrolą syntetycznego wczesnego promotora ospy EP2. Geny CD80/CD86, gag/proteazy FIV i uidA są wszystkie wprowadzone do pojedynczego miejsca RPV nie będącego podstawowym.
Rekombinowany pokswirus szopów wykazuje 4 obce geny. Koci gen CD86- i gen CD80 wykazuje ekspresję w bicistronowej kasecie pod kontrolą syntetycznego późnego/wczesnego promotora ospy LP2, kierującego transkrypcją CD80 i CD86 i obejmującego element IRES EMCV między dwoma otwartymi ramkami odczytu; gen lacZ E. coli znajduje się pod kontrolą syntetycznego wczesnego promotora ospy, E1; gen uidA E. coli znajduje się pod kontrolą syntetycznego wczesnego promotora ospy E2. Geny CD80/CD86, FIV otoczki i uidA są wszystkie wprowadzone do pojedynczych miejsc RPV nie będących podstawowymi.
Rekombinowany pokswirus szopów wykazuje ekspresję sześciu obcych genów. Kocie geny CD86 i geny CD80 o ekspresji w bicistronowej kasecie pod kontrolą syntetycznego późnego promotora ospy LP1, kierującego transkrypcją CD80 i CD86 i obejmującego element EMCVIRIS między dwoma otwartymi ramkami odczytu; gen lacZ E. coli znajduje się pod kontrolą późnego promotora ospy. Gen gag/proteazy FIV znajduje się pod kontrolą syntetycznego wczesnego promotora, EP2; gen otoczki FIV znajduje się pod kontrolą syntetycznego wczesnego promotora ospy, EP2; gen otoczki FIV znajduje się pod kontrolą syntetycznego wczesnego promotora ospy, EP1; gen uidA E. coli znajduje się pod kontrolą genu lacZ E. coli wprowadza się miejsca innego niż insercja otoczki FIV, gag/proteazy FIV i insercja genu uidA E. coli.
Dodatkowe rekombinowane wirusy ospy szopów do stosowania jako szczepionka FeLV dla kotowatych, będą skonstruowane jak opisano powyżej, zastępując genyFIV na porównywalne geny FeLV.
P r z y k ł a d 12
S-FHV-020
S-FHV-020 jest rekombinowanym kocim herpeswirusem, posiadającym delecję całego genu gE FHV (1638 par zasad), insercją genu lacZ E. coli jest deletowane miejsce gE. Gen lacZ E. coli znajduje się pod kontrolą transkrypcyjną konstytutywnego promotora gE FHV. S-FHY-020 otrzymano od S-FHV-001 (szczep NVSL). Osiągnięto to korzystając z wektora homologii 486-88.B17 i wirusa S-FHV-001 w procedurze rekombinacji homologicznej dla tworzenia rekombinowanego RPV, SPV lub FHV. Wyjściową masę transfekcyjną przesiano, stosując przesiew pod względem rekombinowanego RPV lub SPV lub FHV z ekspresją β-galaktozydazy (testy BLUOGAL i CPRG) lub β-galaktozydazy (test X-GLUC). Końcowym rezultatem oczyszczania metodą niebieskiej łysinki był rekombinowany wirus oznaczony S-FJV-020. Przeprowadzono analizę czystości, i wprowadzonej stabilności po 5 pasażach przez wykrywanie β-galaktozydazy w metodzie przesiewu pod względem ekspresji obcego genu w rekombinowanym RPV, SPV lub FHV, stosując testy czarnej łysinki.
P r z y k ł a d 13
S-FHV-031
S-FV-031 jest rekombinowanym kocim herpeswirusem, który posiada delecję całego genu gE FHV o długości 1638 par zasad i i insercję trzech obcych genów w deletowanym miejscu gE. Gen CD80 znajduje się pod kontrolą transkrypcyjną konstytutywnego promotora gE FHV i jest zorientowany w tym samym kierunku co gen deletowany gE. Gen gag/proteazy FIV znajduje się pod kontrolą promotora gX wścieklizny rzekomej i gen otoczki FIV znajduje się pod kontrolą bezpośrednio
PL 199 359 B1 wczesnego promotora cytomegalowirusa. Geny gag/proteazy i otoczki są zorientowane w tym samym kierunku względem siebie, lecz w odwrotnej orientacji w stosunku do genu CD80.
S-FHV-031 otrzymuje się od S-FHY-020 (zawiera gen lacZ E. coli za promotorem gE). Uzyskuje się to korzystając z wektora homologii 942-03.C6 (patrz część „Materiały i metody”) i wirusa S-FHV-020 w wyniku homologicznej rekombinacji RPV, SPV, lub FHV. Wyjściową masę transfekcyjną przesiewa się stosując przesiew pod względem rekombinowanego RPV lub SPV lub FHV z ekspresją β-galaktozydazy w (testy BLUOGALAND CPRG) lub β-glukuronidazy (test X-GLUC). Recombinant łysinki wybiera się i oczyszczono przez selekcję metodą białej łysinki. Wirus ten charakteryzuje się przez procedury mapowania DNA endonukleazami restrykcyjnymi i Southern blotting. Analiza ta potwierdza insercję genów kociego CD80, gag/proteazy FIV i otoczki FIV i delecję genu gE FIV o długości 1638 par zasad. (Zgłoszenie międzynarodowe PCT WO 96/13575 załącza się w niniejszym jako odniesienie) S-FHV-031 w niniejszym przykładzie testuje się pod względem ekspresji antygenów specyficznych wobec kociego CD80, gag/proteazy FIV i otoczki FIV, przy użyciu procedury Western blotting. Opisane tu testy przeprowadzono w komórkach CRFK, wskazując, że komórki CRFK będą odpowiednim substratem do produkcji rekombinowanych szczepionek FHV. Lizat z komórek zakażonych rekombinowanym kocim herpeswirusem wykazywał wstęgę białka o oczekiwanej wielkości kociego CD80, gag/proteazy FIV i otoczki FIV.
S-FHV-031 w niniejszym przykładzie testuje się pod względem ekspresji antygenów specyficznych dla kociego CD80, przy użyciu przesiewu pod względem ekspresji kociego CD80 (b7-1) i CD86 (B7-2) w rekombinowanym SPV, RPV lub FHV, stosując testy czarnej łysinki. Okazuje się, że ludzkie przeciwciało chimeryczne CTLA-4/Fc reaguje specyficznie z łysinkami rekombinowanego kociego herpeswirusa (wykazującymi ekspresję kociego CD80), a nie z negatywnymi łysinkami kontrolnymi S-FHV-001. Wszystkie obserwowane łysinki rekombinowanego kociego herpeswirusa reagują jak się okazuje, z ludzkim przeciwciałem chimerycznym CTLA-4/Fc wskazując, że wirus stabilnie wykazuje ekspresję obcego genu kociego CD80.
S-FHV-031 jest rekombinowanym kocim herpeswirusem wykazującym ekspresję białek gag/proteazy FIV, FIV otoczki i kociego CD80 i jest użyteczny jako szczepionka przeciwko infekcji FIV u kotowatych.
P r z y k ł a d 14
Rekombinowany koci herpeswirus posiada delecję genu gE i i insercję co najmniej jednego obcego genu w miejscu delecji gE. Obcy gen jest genem kociego CD86 i znajduje się pod kontrolą transkrypcyjną promotora gE FHV.
Rekombinowany koci herpeswirus wykazujący ekspresję kociego CD86 jest użyteczny jako szczepionka przeciw chorobom u kotowatych. Rekombinowany koci herpeswirus poprawia skuteczność szczepionek przeciwko FIV, FeLV, FIP, lub innym kocim chorobom, przy stosowaniu pojedynczo lub w połączeniu z FIV, FeLV, FIP, lub innymi kocimi szczepionkami.
P r z y k ł a d 15
Dodatkowymi przykładami rekombinowanego kociego herpeswirusa użytecznego jako szczepionka przeciwko kociemu wirusowi niedoboru odporności (FIV), wirusowi białaczki kociej (FeLV) lub kociego zakaźnego zapalenia otrzewnej (FIP), są:
Rekombinowany koci herpeswirus wykazuje ekspresję trzech obcych genów. W deletowanych miejscach gE FHV. Gen FeLVenv znajduje się pod kontrolą promotora gX wścieklizny rzekomej; gen gag FIV znajduje się pod kontrolą bezpośredniego wczesnego promotora cytomegalowirusa; gen kociego CD80 znajduje się pod kontrolą promotora gE kociego herpeswirusa. Rekombinowany koci herpeswirus wykazuje ekspresję trzech obcych genów w deletowanym miejscu gE FHV. Gen FeLVenv znajduje się pod kontrolą promotora gX wścieklizny rzekomej; gen gag FIV znajduje się pod kontrolą bezpośredniego wczesnego promotora cytomegalowirusa; gen kociego CD86 znajduje się pod kontrolą promotora gE kociego herpeswirusa. Rekombinowany koci herpeswirus wykazuje ekspresję trzech obcych genów. W deletowanym miejscu gE FHV. Gen FeLVenv znajduje się pod kontrolą promotora gX wścieklizny rzekomej; gen gag FeLV znajduje się pod kontrolą bezpośredniego wczesnego promotora cytomegalowirusa; gen kociego CD86 znajduje się pod kontrolą promotora gE kociego herpeswirusa.
Rekombinowany koci herpeswirus wykazuje ekspresję pięciu obcych genów. Ekspresja genu kociego CD86 i genu CD80 zachodzi w bicistronowej kasecie pod kontrolą bezpośredniego wczesnego promotora cytomegalowirusa, kierującego transkrypcją CD80 i CD86 i obejmującego element IRES EMCV między dwiema otwartymi ramkami odczytu; gen uidA E. coli znajduje się pod kontrolą promotora gl wirusa zakaźnego zapalenia krtani i tchawicy. Gen CD80, CD86 i uidA E. coli wprowadza się
PL 199 359 B1 do unikatowego długiego regionu genomu FHV w miejscu określonym jako nie będące podstawowym. Gen gag/proteazy FIV znajduje się pod kontrolą bezpośredniego wczesnego promotora cytomegalowirusa i gen lacZ E. coli, pod kontrolą promotora gX wścieklizny rzekomej, wprowadza się do deletowanego miejsca gE FHV.
Rekombinowany koci herpeswirus wykazywał ekspresję pięciu obcych genów. Geny kociego CD86 i CD80 podlegają ekspresji w bicistronowej kasecie pod kontrolą bezpośredniego wczesnego promotora cytomegalowirusa, kierującego transkrypcją CD80 i CD86. Translacja drugiej otwartej ramki odczytu o orientacji w dół od CD80 znajduje się pod kontrolą elementu IRES EMCV. Gen uidA E. coli znajduje się pod kontrolą promotora gl wirusa zakaźnego zapalenia krtani i tchawicy. Geny CD80, CD86 i uidA E. coli wprowadza się do unikatowego długiego regionu genomu FHV w miejscu określanym jako nie będące podstawowym. Gen otoczki FIV pod kontrolą bezpośrednio wczesnego promotora cytomegalowirusa i gen lacZ E. coli pod kontrolą promotora gX wścieklizny rzekomej, wprowadza się do deletowanego miejsca gE FHV.
Rekombinowany koci herpeswirus wykazuje ekspresję sześciu obcych genów. Gen kociego CD86 i geny CD80 podlegają ekspresji w bicistronowej kasecie pod kontrolą bezpośrednio wczesnego promotora cytomegalowirusa, kierującego transkrypcją CD80 i CD86 i obejmującego element IRES EMCV między dwoma otwartymi ramkami odczytu. Gen uidA E. coli znajduje się pod kontrolą promotora gl wirusa zakaźnego zapalenia krtani i tchawicy. Geny CD80, CD86 i uidA E. coli wprowadza się do unikatowego regionu genomu FHV w miejscu nie będącym podstawowym. Gen otoczki FIV pod kontrolą bezpośredniego wczesnego promotora cytomegalowirusa; gen gag/proteazy FIV pod kontrolą promotora gX wirusa wścieklizny rzekomej i gen lacZ E. coli pod kontrolą promotora gE FHV, wprowadza się do deletowanego miejsca FHV.
Rekombinowany koci herpeswirus wykazuje ekspresję pięciu obcych genów. Gen kociego CD86 i geny CD80 podlegają ekspresji w bicistronowej kasecie pod kontrolą bezpośrednio wczesnego promotora cytomegalowirusa, kierującego transkrypcją CD80 i CD86 i obejmującego element IRES EMCV między dwoma otwartymi ramkami odczytu; gen uidA E. coli znajduje się pod kontrolą promotora gl wirusa zakaźnego zapalenia krtani i tchawicy. Geny CD80, CD86 i uidA E. coli wprowadza się do unikatowego długiego regionu genomu FHV w miejscu nie będącym podstawowym. Gen gag/proteazy FeLV pod kontrolą bezpośrednio wczesnego promotora cytomegalowirusa i gen lacZ E. coli pod kontrolą promotora gX wścieklizny rzekomej, wprowadza się do deletowanego miejsca gE FHV.
Rekombinowany koci herpeswirus wykazuje ekspresję pięciu obcych genów. Gen kociego CD86 i geny CD80 podlegają ekspresji w bicistronowej kasecie pod kontrolą bezpośrednio wczesnego promotora cytomegalowirusa, kierującego transkrypcją CD80 i CD86. Translacja drugiej otwartej ramki odczytu o orientacji w dół od CD80, znajduje się pod kontrolą elementu IRES EMCV. Gen uidA E. coli znajduje się pod kontrolą promotora gl wirusa zakaźnego zapalenia krtani i tchawicy. Geny CD80, CD86 i uidA E. coli wprowadza się do unikatowego regionu genomu FHV w miejscu nie będącym podstawowym. Gen otoczki FeLV pod kontrolą bezpośrednio wczesnego promotora cytomegalowirusa i gen lacZ E. coli pod kontrolą promotora gX wścieklizny rzekomej, wprowadza się do deletowanego miejsca gE FHV.
Rekombinowany koci herpeswirus wykazuje ekspresję sześciu obcych genów. Gen kociego CD86 i geny CD80 podlegają ekspresji w bicistronowej kasecie pod kontrolą bezpośrednio wczesnego promotora cytomegalowirusa, kierującego transkrypcją CD80 i CD86 i obejmującego element IRES EMCV między dwoma otwartymi ramkami. Gen uidA E. coli znajduje się pod kontrolą promotora gl wirusa zakaźnego zapalenia krtani i tchawicy. Geny CD80, CD86 i uidA E. coli wprowadzono do unikatowego długiego regionu genomu FHV w miejscu nie będącym zasadniczym. Gen otoczki FeLV pod kontrolą bezpośrednio wczesnego promotora cytomegalowirusa; gen gag/proteazy FeLV pod kontrolą promotora gX wirusa wścieklizny rzekomej i gen lacZ E. coli pod kontrolą promotora gE FHV, wprowadza się do deletowanego miejsca gE FHV.
P r z y k ł a d y 17
Rekombinowany koci herpeswirus posiada delecję genu gE i insercję co najmniej jednego obcego genu w miejscu delecji gE. Obcym genem jest gen kociego CD80 i znajduje się pod kontrolą transkrypcyjną promotora gE FHV. Rekombinowany koci herpeswirus otrzymuje się od S-FHV-001 (szczep NVSL). Uzyskuje się to korzystając z wektora homologii 926-76.D7 (patrz część „Materiały i metody”) i wirusa S-FHBV-001 w procedurze rekombinacji homologicznej dla tworzenia rekombinowanego herpeswirusa. Wyjściową masę transfekcyjną przesiewa się stosując przesiew pod względem rekombinowanego herpeswirusa z ekspresją enzymatycznych genów markerowych. Wirus
PL 199 359 B1 ten charakteryzuje się przez procedury mapowania DNA endonukleazami restrykcyjnymi i Southern blotting. Analiza ta potwierdza insercję kociego genu CD80 i delecję genu gE FHV o długości 1638 par zasad, (zgłoszenie międzynarodowe PCT WO 96/13575 załącza się w niniejszym jako odniesienie).
Rekombinowany koci herpeswirus w niniejszym przykładzie testuje się pod względem ekspresji antygenów specyficznych dla kociego CD80 przy użyciu przesiewu metodą czarnej łysinki, pod względem ekspresji obcego genu w rekombinowanym FHV. Opisane tu testy przeprowadzono w komórkach CRFK, wskazując że komórki CRFK będą odpowiednim substratem do produkcji rekombinowanych szczepionek RPV.
Rekombinowany koci herpeswirus w niniejszym przykładzie testuje się pod względem ekspresji antygenów specyficznych dla kociego CD80, przy użyciu przesiewu pod względem kociego CD80 (B7-1) i CD86 (B7-2) ekspresji w rekombinowanym SPV, RPV lub FHV, stosując testy czarnej łysinki. Okazuje się, że ludzkie przeciwciało chimeryczne CTLA-4/Fc reaguje specyficznie z łysinkami rekombinowanego kociego herpeswirusa (wykazującymi ekspresję kociego CD80) a nie z negatywnymi łysinkami kontrolnymi S-FHV-001. Wszystkie obserwowane łysinki rekombinowanego kociego herpeswirusa reagują jak się okazuje z ludzkim przeciwciałem chimerycznym CTLA-4/Fc wskazując, że wirus stabilnie wykazuje ekspresję obcego genu kociego CD80.
Aby potwierdzić ekspresję produktu kociego genu CD80, komórki zakaża się rekombinowanym kocim herpeswirusem z niniejszego przykładu i próbki zakażonych lizatów komórkowych poddano elektroforezie w żelu SDS-poliakrylamidowym. Żel odciska się i analizuje przy użyciu procedury Western blotting. Lizat z komórek zakażonych rekombinowanym kocim herpeswirusem wykazywał wstęgę białka o oczekiwanej wielkości kociego CD80.
P r z y k ł a d 18
Rekombinowany koci herpeswirus posiada delecję genu gE i i insercję co najmniej jednego obcego genu w miejscu delecji gE. Obcy gen jest genem kociego CD86 i znajduje się pod kontrolą transkrypcyjną promotora gE FHV. Rekombinowany koci herpeswirus wykazujący ekspresję kociego CD86 jest użyteczny jako szczepionka przeciw chorobom u kotowatych. Rekombinowany koci herpeswirus poprawia skuteczność szczepionek przeciwko FIV, FeLV, FIP, lub innym kocim chorobom, przy stosowaniu pojedynczo lub w połączeniu z FIV, FeLV, FIP, lub innymi kocimi szczepionkami.
P r z y k ł a d y 19
Dodatkowe przykłady rekombinowanego kociego herpeswirusa użytecznego jako szczepionka przeciwko kociemu wirusowi niedoboru odporności (FIV), wirusowi kociej białaczki (FeLV) lub kociego zakaźnego zapalenia otrzewnej (FIP), to:
Rekombinowany koci herpeswirus wykazuje ekspresję trzech obcych genów. Gen FIVenv znajduje się pod kontrolą promotora gX wścieklizny rzekomej; gen gag FIV znajduje się pod kontrolą bezpośrednio wczesnego promotora cytomegalowirusa; gen kociego CD80 znajduje się pod kontrolą promotora gE kociego herpeswirusa.
Rekombinowany koci herpeswirus wykazuje ekspresję trzech obcych genów. Gen FeLVenv znajduje się pod kontrolą promotora gX wścieklizny rzekomej; gen gag FeLV znajduje się pod kontrolą bezpośrednio wczesnego promotora cytomegalowirusa; gen kociego CD80 znajduje się pod kontrolą promotora gE kociego herpeswirusa.
Rekombinowany koci herpeswirus wykazuje ekspresję trzech obcych genów. Gen FIVenv znajduje się pod kontrolą promotora gX wścieklizny rzekomej; gen gag FIV znajduje się pod kontrolą bezpośrednio cytomegalowirusa; gen kociego CD86 znajduje się pod kontrolą promotora gE kociego herpeswirusa.
Rekombinowany koci herpeswirus wykazuje ekspresję trzech obcych genów. Gen FeLVenv znajduje się pod kontrolą promotora gX wścieklizny rzekomej; gen gag FeLV znajduje się pod kontrolą bezpośrednio wczesnego promotora cytomegalowirusa; gen kociego CD86 znajduje się pod kontrolą promotora gE kociego herpeswirusa.
Rekombinowany koci herpeswirus wykazuje ekspresję pięciu obcych genów. Gen kociego CD86 i geny CD80 podlegają ekspresji w bicistronowej kasecie pod kontrolą bezpośrednio wczesnego promotora cytomegalowirusa, kierującego transkrypcją CD80 i CD86 i obejmującego element IRES EMCV między dwoma otwartymi ramkami odczytu, kierującego translacją drugiego genu, o orientacji w dół, CD80; gen uidA E. coli znajduje się pod kontrolą promotora gl wirusa zakaźnego zapalenia krtani i tchawicy; gen gag FIV znajduje się pod kontrolą bezpośredniego wczesnego promotora cytomegalowirusa; gen lacZ E. coli znajduje się pod kontrolą promotora gX wścieklizny rzekomej. Pięć obcych genów znajduje się w dwóch różnych miejscach insercji kociego herpeswirusa.
PL 199 359 B1
Rekombinowany koci herpeswirus wykazuje ekspresję pięciu obcych genów. Gen kociego CD86 i geny CD80 podlegają ekspresji w bicistronowej kasecie pod kontrolą bezpośrednio wczesnego promotora cytomegalowirusa, kierującego transkrypcją CD80 i CD86 Translacja drugiej otwartej ramki odczytu o orientacji w dół od CD80 znajduje się pod kontrolą elementu IRES EMCV; gen uidA E. coli znajduje się pod kontrolą promotora gI wirusa zakaźnego zapalenia krtani i tchawicy; gen otoczki FIV znajduje się pod kontrolą bezpośrednio wczesnego promotora cytomegalowirusa; gen lacZ E. coli znajduje się pod kontrolą promotora gX wścieklizny rzekomej. Rekombinowany koci herpeswirus wykazuje ekspresję sześciu obcych genów. Gen kociego CD86 i geny CD80 podlegają ekspresji w bicistronowej kasecie pod kontrolą bezpośrednio wczesnego promotora cytomegalowirusa, kierującego transkrypcją CD80 i CD86 i obejmującego element IRES EMCV między dwoma otwartymi ramkami odczytu, kierującym translacją drugiego genu, o orientacji w dół, CD80; gen uidA E. coli znajduje się pod kontrolą promotora gl wirusa zakaźnego zapalenia krtani i tchawicy; gen gag FIV znajduje się pod kontrolą bezpośrednio wczesnego promotora cytomegalowirusa; gen otoczki FIV znajduje się pod kontrolą bezpośrednio wczesnego promotora cytomegalowirusa; gen lacZ E. coli znajduje się pod kontrolą promotora gX wścieklizny rzekomej.
Rekombinowany koci herpeswirus wykazywał ekspresję pięciu obcych genów. Koci Cd86 gen i geny CD80 podlegają ekspresji w bicistronowej kasecie pod kontrolą bezpośrednio wczesnego promotora cytomegalowirusa, kierującego transkrypcją CD80 i CD86 i obejmującego element IRES EMCV między dwoma otwartymi ramkami odczytu, kierującym translacją drugiego genu, o orientacji w dół, CD80; gen uidA E. coli znajduje się pod kontrolą promotora gl wirusa zakaźnego zapalenia krtani i tchawicy; gen FeLV znajduje się pod kontrolą bezpośrednio wczesnego promotora cytomegalowirusa; gen lacZ E. coli znajduje się pod kontrolą promotora gX wścieklizny rzekomej. Pięć obcych genów znajduje się w dwóch różnych miejscach insercji kociego herpeswirusa.
Rekombinowany koci herpeswirus wykazywał ekspresję pięciu obcych genów. Gen kociego CD86 i geny CD80 podlegają ekspresji w bicistronowej kasecie pod kontrolą bezpośrednio wczesnego promotora cytomegalowirusa, kierującego transkrypcją CD80 i CD86 Translacja drugiej otwartej ramki odczytu o orientacji w dół od CD80 znajduje się pod kontrolą elementu IRES EMCV; gen uidA E. coli znajduje się pod kontrolą promotora gl wirusa zakaźnego zapalenia krtani i tchawicy; gen otoczki FeLV znajduje się pod kontrolą bezpośrednio wczesnego promotora cytomegalowirusa; gen lacZ E. coli znajduje się pod kontrolą promotora gX wścieklizny rzekomej.
Rekombinowany koci herpeswirus wykazuje ekspresję sześciu obcych genów. Gen kociego CD86 i geny CD80 podlegają ekspresji w bicistronowej kasecie pod kontrolą bezpośredniego wczesnego promotora cytomegalowirusa, kierującego transkrypcją CD80 i CD86 i obejmującego element IRES EMCV między dwoma otwartymi ramkami odczytu, kierującego translacją drugiego genu, o orientacji w dół, CD80; gen uidA E. coli znajduje się pod kontrolą promotora gl wirusa zakaźnego zapalenia krtani i tchawicy; gen FeLV znajduje się pod kontrolą bezpośrednio wczesnego promotora cytomegalowirusa; gen otoczki FeLV znajduje się pod kontrolą bezpośrednio wczesnego promotora cytomegalowirusa; gen lacZ E. coli znajduje się pod kontrolą promotora gX wścieklizny rzekomej.
P r z y k ł a d 20
Charakteryzacja cDNA i polipeptydów kociego CD80 (B7-1) -TAMU, CD86 (B7-2), CD28, CTLA-4 i CD80 (B7-1)-Syntro/SPAH:
Wyizolowany i oczyszczony cDNA kociego CD80 (B7-1) o długości około 941 nukleotydów koduje otwartą ramkę odczytu kociego CD80 polipeptydu o długości około 292 aminokwasów, w postaci natywnej związanej z błoną lub dojrzałej, który posiada masę cząsteczkową wynoszącą około 33,485 kDa, punkt izoelektryczny wynoszący około 9,1, ładunek sieci przy pH 7,0 wynoszący 10,24. Domena transbłonowa białka posiada około 241 do 271 aminokwasów.
Koci CD80-TAMU i koci CD80-Syntro/SPAR są cDNA i polipeptydami wyizolowanymi niezależnie z dwóch różnych źródeł, i the sekwencja DNA i aminokwasowa różnią się nieznacznie. Źródłem CD80-TAMU mRNA były kocie komórki jednojądrzaste krwi obwodowej stymulowane ConA, a źródłem RNA CD80-Syntro/SPAH, były kocie komórki śledziony stymulowane ConA. Różnicą w sekwencji cDNA między CD80-TAMU i CD80-Syntro/SPAR jest zamiana T na C przy nukleotydzie 351 i C na A przy nukleotydzie 670. W sekwencji aminokwasowej, zmiana przy nukleotydzie 351 jest cicha, a zmiana; przy nukleotydzie 670 powstaje w wyniku konserwatywnej zamiany aminokwasów obojętnych, leucyny na izoleucynę, przy reszcie aminokwasowej 224.
Wyizolowany i oczyszczony cDNA kociego CD86 (B7-2) o długości około 1176 nukleotydów, koduje otwartą ramkę odczytu kocich CD86 polipeptydów, o długości około 320 aminokwasów,
PL 199 359 B1 w postaci natywnej związanej z błoną lub dojrzałej, która posiada masę cząsteczkową o długości około
36,394 kDa, punkt izoelektryczny wynoszący około 9.19, ładunek sieci przy pH 7,0, wynoszący 11.27.
Wyizolowany i oczyszczony cDNA kociego CD28 o długości około 689 nukleotydów, koduje otwartą ramkę odczytu kocich CD28 polipeptydów o długości około 221 aminokwasów, w postaci natywnej związanej z błoną lub dojrzałej, który posiada masę cząsteczkową wynoszącą około 25,319 kDa, punkt izoelektryczny wynoszący około 9.17, ładunek sieci przy pH 7,0 wynoszący 9.58.
Wyizolowany i oczyszczony cDNA kociego CTLA-4 o długości około 749 nukleotydów, koduje otwartą ramkę odczytu kocich CTLA-4 polipeptydów o długości około 223 aminokwasów, w postaci natywnej związanej z błoną lub dojrzałej, który posiada masę cząsteczkową wynoszącą około 24,381 kDa, punkt izoelektryczny wynoszący około 6,34, ładunek sieci przy pH 7,0, wynoszący -0,99.
Koekspresja CD80, z cząsteczkami kostymulatorowymi CD28 lub CTLA-4, i antygenem nowotworu lub antygenem z organizmu patogennego, posiada zdolność do aktywacji lub wzmacniania aktywacji limfocytów T, konkretniej limfocytów The-1, i do pobudzania wzrostu innych typów komórek. Koekspresja CD80, z cząsteczką kostymulatorową CTLA-4, posiada zdolność to hamowania aktywacji limfocytów T, konkretniej limfocytów The-1. Koekspresja CD86, z cząsteczkami kostymulatorowymi CD28 lub CTLA-4, i antygenem nowotworowym lub antygenem z organizmu patogennego, posiada zdolność do aktywacji lub wzmacniania aktywacji limfocytów T, konkretniej limfocytów The-1, oraz do pobudzania wzrostu innych typów komórek. Koekspresja CD86, z cząsteczką kostymulatorową CTLA-4, posiada zdolność to hamowania aktywacji limfocytów T, konkretniej limfocytów The-1
Procent identyczności sekwencji DNA i minokwasowej % Identyczności homologa ludzkie (sekwencji DNA) % Identyczności homologa ludzkie (sekwencji AA) % Identyczności homologa mysiego (sekwencji DNA) % Identyczności homologa mysiego (sekwencji AA) % Identyczności homologa królika (sekwencji DNA/AA) % Identyczności homologa kurzego (sekwencji DNA/AA)
Koci CD80 77 59 62 46 - -
Koci CD86 72 68 - - 67/64 -
Koci CD28 85 82 77 74 84/84 59/50
Koci CTLA-4 88 88 79 78 - -
P r z y k ł a d 21
Zastosowanie kociego CD80 (B7-1), CD86 (B7-2), CD28, i CTLA-4 w szczepionkach Przeprowadza się następujące doświadczenia, aby ocenić aktywność poprawiającą odporność kociego CD80, CD86, CD28, i CTLA-4 w kocich szczepionkach.
Koci, CD86, CD28, i CTLA-4 wprowadza się do rekombinowanych wektorów wirusowych (pochodzących od kociego herpeswirusa, pokswirusa świń, lub pokswirusa szopów) użytecznych pod względem ekspresji rekombinowanych białek u kotowatych (patrz zgłoszenia międzynarodowe PCT WO 96/22363 lub WO 96/13575). Rekombinowane wektory wirusowe wykazujące ekspresję wszystkich czterech cząsteczek poprawiających odporność lub alternatywnie, wykazujące ekspresję połączeń par CD80 i CD28, lub CD80 i CTLA-4, lub CD86 i CD28, lub CD86 i CTLA-4 podaje się doustnie lub domięśniowo kotom w wieku 8 tygodni w zakresie dawkowania od 0,1 do 10,0 mg na kg ciężaru ciała, lub w dawkach około 104 do 109 jednostek tworzących łysinkę (pfu) lub korzystnie w dawkach około 106 pfu. Szczepionkę podjednostkową dla FIV lub FeLV lub szczepionkę wektora wirusowego FIV lub FeLV (patrz powyżej) podaje się przy minimalnej dawce zabezpieczającej, równocześnie z wzmacniającą odporność szczepionką wektorowaną kocim CD80, CD86, CD28, i CTLA-4. Trzy do czterech tygodni później, kotom podaje się drugą dawkę szczepionki. Koty prowokuje się wirulentnym szczepem FIV (PPR lub Petaluma) lub szczepem FeLV Rickard (podawanym z metyloprednizolonem w celu zahamowania odporności kotów) przy prowokującym poziomie dawkowania standardowym dla USDA i obserwuje regularnie przez 12 tygodni pod względem wywołania wiremii. Grupę szczepionych kotów obserwuje się przez 12 miesięcy pod względem wywołania nowotworów powodowanych przez FeLV. Występowanie choroby u kotów porównuje się z kontrolami, które nie
PL 199 359 B1 otrzymują szczepionki, lub szczepionkę FIV lub FeLV bez cząsteczek poprawiających odporność. Wynikiem doświadczalnej prowokacji jest to, że koty nie otrzymujące szczepionki i następnie prowokowane FeLV lub FIV, rozwijają uporczywą wiremię w ponad 60%; koty szczepione podjednostkową szczepionką FIV lub FeLV i następnie prowokowane, w 75% są zabezpieczone przed wiremią; koty otrzymujące podjednostkową szczepionkę FIV lub FeLV i połączenie kocich wektorowanych szczepionek poprawiających odporność CD80, CD86, CD28, i CTLA-4 i następnie prowokowanych, są w 100% zabezpieczone przed wiremią. Dodatkowymi korzystnymi aspektami dodawania kocich wektorowanych szczepionek CD80, CD86, CD28, i CTLA-4 jest 100% zabezpieczenie przeciwko wiremii i/lub tworzeniu nowotworu; długotrwałość odporności (ponad 1 rok); wczesne wystąpienie odporności; lub szczepienie pierwotne pojedynczą dawką, zamiast 2 dawek wymaganych obecnie przez wszystkich producentów. Koty szczepione wirusowymi wektorowanymi szczepionkami FIV lub FeLV są zabezpieczone przed prowokacją na poziomie znacznie wyższym niż koty szczepione podjednostkową szczepionką FIV lub FeLV. Koty otrzymujące wirusową wektorowaną szczepionkę FIV lub FeLV i połączenie poprawiających odporność wektorowanych szczepionek kociego CD80, CD86, CD28, i CTLA-4 i następnie prowokowanych, są w 100% zabezpieczone przed wiremią. Koty szczepione wirusową wektorowaną szczepionką FIV lub FeLV i połączeniem poprawiających odporność wektorowanych szczepionek kociego CD80, CD86, CD28, i CTLA-4 także uzyskują dodatkowe korzystne aspekty opisane powyżej.
W procedurze alternatywnej, kotom w wieku 8 tygodni wstrzykuje się domięśniowo z 100 μg plazmidu zawierającego cDNA kocich cząsteczek CD80, CD86, CD28, i CTLA-4 w mieszaninie z plazmidem, zawierającym cDNA for FIVenv i gag lub FeLVenv i gag, lub alternatywnie, wstrzykuje się domięśniowo z 100 μg plazmidu, zawierającego cDNA wykazującego ekspresję połączeń par CD80 i CD28, lub CD80 i CTLA-4, lub CD86 i CD28 lub CD86 i CTLA-4 w parze z CD28 lub CTLA-4, w mieszaninie z plazmidem, zawierającym cDNA FIVenv i gag lub FeLVenv i gag. Koty kontrolne nie otrzymują CD80, CD86, CD28, i CTLA-4. Koty prowokuje się wirulentnym FeLV lub FIV i obserwuje pod względem oznak choroby jak opisano powyżej. Wynikiem doświadczalnej prowokacji jest to, że koty otrzymujące wektorowy cDNA zawierający kocie CD80, CD86, CD28, i CTLA-4 i wektorowy cDNA zawierający geny FIV lub geny FeLV wykazują 100% zabezpieczenia przed chorobą w porównaniu z kotami otrzymujące tylko, wektorowy cDNA, zawierający geny FIV lub geny FeLV, które wykazują 75 zabezpieczenia przed chorobą.
W procedurze alternatywnej, kotom w wieku 8 tygodni wstrzykuje się domięśniowo 0,1 do 100 mg oczyszczone białko kocich cząsteczek CD80, CD86, CD28, i CTLA-4 lub alternatywnie, połączeń par CD80 lub CD86 w parze z białkami CD28 lub CTLA-4, z rekombinowanych wektorowych cDNA opisanych powyżej, i wstrzykuje domięśniowo 0,1 do 100 mg szczepionki podjednostkowej zawierającego FIV env i gag lub FeLV env i gag. Koty kontrolne nie otrzymują CD80, CD86, CD28, i CTLA-4. Koty prowokuje się z wirulentnym szczepem FIV lub szczepem FeLV i obserwuje regularnie pod kątem rozwoju choroby. Wynikiem doświadczalnej prowokacji jest to, że koty otrzymujące oczyszczone białko kociego CD80, CD86, CD28, i CTLA-4 i szczepionkę podjednostkową, zawierającą FIV lub FeLV wykazują znacznie rzadsze występowanie choroby, w porównaniu z kotami otrzymującymi tylko szczepionkę podjednostkową, zawierającą białka FIV lub FeLV.
P r z y k ł a d 22
Zastosowanie kociego CD80, CD86, CD28, i CTLA-4 jako szczepionki profilaktycznej do zabezpieczenia przed chorobą.
Kocie CD80, CD86, CD28, i CTLA-4 w rekombinowanych wektorach wirusowych ospy świń, ospy szopów, lub kocie opryszczki, po podaniu jak podano w przykładzie 17, lecz bez podawania podjednostkowej lub wektorowanych antygenów wirusowych z organizmów patogenicznych, są użyteczne do stymulacji odporności i odpowiedzi The-1, która wywołuje zabezpieczającą odpowiedź immunologiczną po prowokacji z wirusowym, pasożytniczym lub bakteryjnym patogenem. W procedurze alternatywnej, kocie CD80 lub CD86, w połączeniu z kocimi CTLA-4 w wektorach wirusowych, po podaniu jak podano w przykładzie 3, są użyteczne do hamowania odpowiedzi immunologicznej, i zabezpieczania przeciwko chorobom autoimmunologicznym u kotów.
P r z y k ł a d 23
Zastosowanie kociego CD80, CD86, CD28, i CTLA-4 do inhibicji ii niszczenia wzrostu komórek nowotworowych. Komórki nowotworowe od kota transfekuje się rekombinowanym wektorem wirusowym ospy świń, ospy szopów, lub kociej opryszczki, wykazującym ekspresję kociego CD80 lub CD86 w połączeniu z CD28 lub CTLA-4. Transfekowane komórki nowotworu ponownie podaje się kotu, i obecność CD80, CD86, CD28, i CTLA-4 na powierzchni komórki nowotworu wzbudza szeroką
PL 199 359 B1 odpowiedź immunologiczną wobec transfekowanych i nie transfekowanych komórek nowotworu, powodując zabicie umiejscowionych i przerzutowych komórek nowotworu. W procedurze alternatywnej, wektory, wykazujące ekspresję kociego CD80 lub CD86 w połączeniu z CD28 lub CTLA-4 wstrzykuje się bezpośrednio do nowotworu u kota, wywołując szeroką odpowiedź immunologiczną wobec komórek nowotworu powodując zabicie umiejscowionych i przerzutowych komórek nowotworu.
P r z y k ł a d 24
Zastosowanie kociego CD80, CD86, CD28, i CTLA-4 jako środka terapeutycznego do leczenia choroby u kotów.
Kocie CD80, CD86, CD28, i CTLA-4 w rekombinowanym wektorze wirusowym ospy świń, ospy szopów lub kociej opryszczki, po podaniu jak opisano w przykładzie 17, lecz bez podawania podjednostkowych antygenów lub wektorowanych wirusowych z organizmów patogenicznych, są użyteczne do stymulacji odporności do oczyszczenia lub zmniejszenia poziomu patologii choroby.
Podtrzymujące dane doświadczalne: SPV 246
Bezpieczeństwo i skuteczność rekombinowanej szczepionki wektorowanej wirusem SPV, zawierającej gag FeLV i otoczki oraz koci CD80. Konstrukcję rekombinowanego wirusa SPV, SPV 246, opisano powyżej (w treści oryginalnego zgłoszenia). SPV 246 zawiera pięć obcych genów, włączając geny kodujące gag FeLV i otoczki i kociego CD80 jak również dwa geny markerowe, β-glukuronidazy i β-galaktozydazy. Ekspresję gag FeLV i otoczki i CD80 w komórkach zakażonych SPV 246 potwierdzono przez analizy Western blot. Wstęgi reprezentujące specyficzne białka gag FeLV i otoczki wykryto z użyciem koziego przeciwciała poliklonalnego przeciwko FeLV P27 (Biodesign, ME) i przeciwciała monoklonalnego przeciwko gp70 FeLV (Biodesign, ME), odpowiednio. Białka gag FeLV i otoczki okazały się jako opracowane po translacji podobnie jak natywne białka wirusowe. Przeprowadzono analizę czystości, ekspresji i stabilności testem czarnej łysinki korzystając z przeciwciał opisanych powyżej. SPV 246 pasażowano stabilnie co najmniej 5 razy 100% łysinek utworzonych z komórek zakażonych SPV 246, było pozytywnych pod względem FeLVgag, otoczki, β-galaktozydazy i β-glukuronidazy.
Ekspresję kociego CD80 potwierdzono w analizie Western blot przy użyciu poliklonalnego przeciwciała antyludzkiemu CD80. Wykryto wielokrotne wstęgi w zakresie wielkości od 30 kda do 60 kda specyficzne dla kociego CD80. Wstęgi te reprezentują występujące na przemian i wielokrotne wzory glikozylacji CD80 o ekspresji i modyfikowane w kontekście komórek SPV i ESK-4.
SPV 246 i wirus kontrolny, SPV 003, jak również innych kandydatów na rekombinowane szczepionki FHV i FeLV SPV testowano pod względem zdolności do zabezpieczania kotów przeciwko uporczywym infekcjom FeLV. Krótko, 8-tygodniowe kocięta, 10 kotów/grupę, szczepiono podskórnie 1 ml SPV 246, wirusem kontrolnym lub innymi rekombinowanymi wirusami (dawki w zakresie od 7 x 105 pfu/kota to 1 x 107 pfu/kota. Koty szczepiono trzykrotnie, co trzy tygodnie. Po szczepieniach, koty prowokowano drogą doustno-donosową standardowym szczepem do prowokacji Rickard FeLV (106.2 TCID50/ml/kota), po wstępnym traktowaniu octanem metyloprednizolonu (Depo-Medrol).
Serum od kotów analizowano pod względem uporczywej wiremii co tydzień przez 15 tygodni po prowokacji. Koty uznawano za uległe uporczywej wiremii po otrzymaniu dodatniego wyniku testu pod względem obecności FeLV p27 przez 3 następujące tygodnie.
Wyniki:
Koty szczepione SPV 246 były częściowo zabezpieczone od wiremii FeLV w badaniu prowokacji FeLV. Przewidywalna wartość frakcji zapobiegającej (PF) dla kotów traktowanych SPV 246 wynosiła 50% (Tabela 1).
T a b e l a 1
Liczba i procent kotów z uporczywą wiremią 15 tygodni po prowokacji. Obliczono przewidywaną frakcję zapobiegającą (PF) dla każdej grupy.
Numer grupy Wirus (wirusy) Liczba kotów z uporczywą wiremią % kotów z uporczywą wiremią PF (%C-%V) %C
1 2 3 4 5
1 FHV 018 (CMV-FeLVenv) FHV 019 (CMV-FeLVgag) 7/10 70% -16%
2 FHV 018 (CMV-FeLVenv) FHV 019 (CMV-FeLVgag) FHV 030 (gE-CD80) 6/10 60 0%
PL 199 359 B1 cd. tabeli 1
1 2 3 4 5
3 FHV 018 (CMV-FeLVenv) FHV 019 (CMV-FeLVgag) RPV 022 (L2E2-CD80) 7/10 70 -16%
4 SPV 089 (L2E2-FeLVgag) SPV 195 (El-FeLVenv) FHV 030 (gE-CD80) 5/10 50 16%
5 SPV 246 (E2-FeLVgag/E1 FeLVenv//L2E2-CD80) 3/10 30 50%
6(SC) SPV 258 (L2E2-FeLVgag/L2E2-FeLVgp70) FHV 030 (gE-CD80) 5/10 50 16%
7 (IM) SPV 258 (L2E2-FeLVgag/L2E2-FeLVgp70) FHV 030 (gE-CD80) 6/10 60 0
8 SPV 003, FHV 005 6/10 60% 0
Przykłady dodatkowych rekombinowanych wirusów zawierających CD80 i CD86.
SPV 280
SPV 280 jest re kombinowanym wirusem ospy świń wykazującym ekspresję sześciu obcych genów. Skonstruowano wektor homologii, oznaczony 992-23.6, w następujący sposób: gen kociego CD86 i gen CD80 ulegały ekspresji w bicistronowej kasecie DNA pod kontrolą syntetycznego późnego promotora ospy, LP1, kierującego transkrypcją CD80 i CD86 i obejmującego element IRES EMCV między dwoma otwartymi ramkami odczytu; the gen β-glukuronidazy E. coli znajduje się pod kontrolą syntetycznego wczesnego promotora, EP2. SPV 280 otrzymano od SPV 258, który zawiera geny FeLVgag i otoczki oraz β-galaktozydazy. Wcześniej skonstruowano SPV 258 zawierający geny gag/proteazy FeLV, i i skrócony gen otoczki FeLV (gp70) pod kontrolą syntetycznych wczesnych/późnych promotorów ospy, LP2EP2; gen β-galaktozydazy E. coli znajduje się pod kontrolą konstytutywnego promotora go do deletowanego częściowego fragmentu N Hindlll o długości 1869 bp. Geny CD80/CD86 i β-glukuronidazy E. coli klonowano do wektora homologii, 992-23.6 w innym i nie będącym podstawowym, częściowym fragmencie K Hindlll SPV.
SPV 280 otrzymano od SPV 258
Osiągnięto to korzystając z wektora homologii 992-23.6 i wirusa S-SPV-258 w procedurze rekombinacji homologicznej dla tworzenia rekombinowanego RPV,SPV, lub FHV. Wyjściową masę transfekcyjną przesiano stosując przesiew pod względem rekombinowanego SPV z ekspresją β-galaktozydazy (testy BLUOGAL i CPRG) lub β-glukuronidazy (test X-GLUC). Końcowym rezultatem wielu okrążeń oczyszczania metodą niebieskiej/zielonej łysinki był rekombinowany wirus SPV 280.
SPV 280 testowano pod względem ekspresji FeLVgag, otoczki FeLV i genów markerowych, β-galaktozydazy i β-glukuronidaza, w analizie czarnej łysinki. 100% łysinek utworzonych z komórek ESK-4 zakażonych oczyszczonym SPV 280 określono jako wykazujące ekspresję FeLVgag i otoczki FeLV, przy użyciu koziego przeciwciała poliklonalnego dla FeLVgag (Biodesign, ME) i mysiego przeciwciała monoklonalnego dla otoczki FeLV, gp70 (Biodesign, ME).
Ekspresję kociego CD80 i CD86 potwierdzono w analizie Western blot przy użyciu kozich antyludzkich przeciwciał poliklonalnych CD80 i CD86 (R&D Systems, MN), odpowiednio. Wykryto wielokrotne wstęgi w zakresie wielkości od 30 kDa do 60 kDa specyficzne dla kociego CD80, i wykryto wielokrotne wstęgi w zakresie od 40 kDa do 70 kDa specyficzne dla kociego CD86. Wstęgi te reprezentują występujące na przemian i wielokrotne wzory glikozylacji CD80 i CD86 o ekspresji w kontekście SPV w komórkach ESK-4.
SPV 281
SPV 281 jest rekombinowanym wirusem ospy świń wykazującym ekspresję sześciu obcych genów. Skonstruowano wektor homologii oznaczony 992-23.6, jak opisano powyżej dla SPV 280. SPV 281 otrzymano od SPV 228, który zawiera geny gag/proteazy FIV i otoczki i β-galaktozydazy E. coli. Gen gag/proteazy FIV znajduje się pod kontrolą syntetycznego wczesnego promotora ospy, EP2; gen otoczki FIV znajduje się pod kontrolą syntetycznego wczesnego promotora ospy, EP1; gen β-galaktozydazy E. coli znajduje się pod kontrolą konstytutywnego promotora ospy 15L. Geny gag/proteazy FIV, otoczki i β-galaktozydazy E. coli wprowadzono do deletowanego częściowego fragmentu N Hindlll
PL 199 359 B1 o długości 1869 bp z SPV. Geny CD80/CD86 i β-glukuronidazy E. coli wprowadzono do oddzielnego i nie będącego podstawowym częściowego fragmentu K Hindlll z SPV.
SPV 281 otrzymano od SPV 228. Osiągnięto to korzystając z wektora homologii 992-23.6 i wirusa S-SPV-228 w procedurze rekombinacji homologicznej dla tworzenia rekombinowanego RPV, SPV, lub FHV. Wyjściowe masy transfekcyjne przesiano stosując przesiew pod względem rekombinowanego SPV z ekspresją β-galaktozydazy (testy BLUOGAL i CPRG) lub β-glukuronidazy (test X-GLUC). Końcowym rezultatem wielu okrążeń oczyszczania metodą niebieskiej/zielonej łysinki był rekombinowany wirus SPV 281.
SPV 281 testowano pod względem ekspresji FIVgag, FIV otoczki i genów markerowych, β-galaktozydazy i β-glukuronidazy w analizie czarnej łysinki. 100% łysinek z komórek ESK-4 zakażonych oczyszczonym SPV 281 określono jako wykazujące ekspresję FIVgag, FIV otoczki, β-galaktozydazy i β-glukuronidazy, wykorzystując mysie przeciwciała monoklonalne dla FIVgag (p27) i otoczki FIV (gp100) (Gustom Monoclonals, CA; BioDesign Interantional, ME, odpowiednio), mysie monoklonalne wobec β-galaktozydazy i królicze przeciwciało poliklonalne wobec glukuronidazy (Biodesign, ME i Molecular Probes, OR, odpowiednio).
Ekspresję kociego CD80 i CD86 potwierdzono w analizie Western blot, korzystając przeciwciał poliklonalnych anty-ludzkich CD80 i CD86 (R&D Systems, MN). Wykryto wielokrotne wstęgi w zakresie wielkości od 30 kda do 60 kda specyficzne dla kociego CD 80, i wykryto wielokrotne wstęgi w zakre-sie od 40 kda do 70 kda specyficzne dla kociego CD 86. Wstęgi te reprezentują występujące na przemian i wielokrotne wzory glikozylacji CD 80 i CD 86 o ekspresji w kontekście SPV w komórkach ESK-4. Ekspresję gag FIV i otoczki także potwierdzono przez analizę Western blot, korzystając z przeciwciał opisanych powyżej, gag FIV i otoczki okazały się jako opracowane, odpowiednio, do P24 i gp 100.
FHV 043
FHV 043 jest rekombinowanym kocim herpeswirusem, wykazującym ekspresję pięciu obcych genów. Skonstruowano wektor homologii, oznaczony 987-57.A1, w następujący sposób: geny kociego CD86 i CD80 klonowano do bicistronowej kasety pod kontrolą bezpośrednio wczesnego promotora cytomegalowirusa (CMV IE), kierującego transkrypcją CD80 i CD86. Translacja drugiej otwartej ramki odczytu położonej w dół od CD80, była pod kontrolą elementu IRES EMCV. Gen β-glukuronidazy E. coli znajduje się pod kontrolą promotora gl wirusa zakaźnego zapalenia krtani i tchawicy. Geny CD80, CD86, i β-glukuronidazy E. coli wprowadzono do unikatowego długiego regionu FHV w unikatowym miejscu EcoRI, pochodzącym od częściowego fragmentu H SalI z FHV. Insercję wprowadzono między gL i sąsiednie geny aktywatorowe transkrypcji.
FHV 043 otrzymano od FHV 017, który zawiera geny FIV otoczki i β-galaktozydazy E. coli. Gen otoczki FIV znajduje się pod kontrolą promotora CMV IE; i gen β-galaktozydazy E. coli znajduje się pod kontrolą elementu promotora gX wścieklizny rzekomej. FIV otoczki i β-galaktozydazę E. coliwprowadzono do deletowanego miejsca gE FHV US.
FHV 043 otrzymano od FHV 017. Osiągnięto to korzystając z wektora homologii 987-57.A1 i wirusa FHV 017 w procedurze rekombinacji homologicznej dla tworzenia rekombinowanego RPV,SPV, lub FHV. Wyjściowe masy transfekcyjne przesiano stosując przesiew pod względem rekombinowanego SPV z ekspresją β-galaktozydazy (testy BLUOGAL i CPRG) lub β-glukuronidazy (test X-GLUC). Końcowym rezultatem wielu okrążeń oczyszczania metodą niebieskiej/zielonej łysinki był rekombinowany wirus FHV 043.
FHV 043 testowano pod względem ekspresji genów markerowych, β-galaktozydazy i β-glukuronidazy w analizie czarnej łysinki. 100% łysinek z komórek CRFK zakażonych FHV 043 oczyszczonych metodą łysinki, określono jako wykazujące ekspresję β-galaktozydazy i β-glukuronidazy, wykorzystując mysie przeciwciało monoklonalne wobec β-galaktozydazy (Biodesign, ME) i królicze przeciwciało poliklonalne wobec β-glukuronidazy (Molecular Probes, OR). Wirus ten określono jako stabilny po co najmniej 5 pasażach.
Ekspresję kociego CD80 i CD86 potwierdzono w analizie Western blot wykorzystując antyludzkie przeciwciała poliklonalne CD80 i CD86 (R&D Systems, MN). Wykryto wielokrotne wstęgi w zakresie wielkości od 30 kDa do 60 kDa specyficzne dla kociego CD80, i wykryto wielokrotne wstęgi w zakresie od 40 kDa do 70 kDa specyficzne dla kociego CD86. Ekspresję FIV otoczki (gp 130) potwierdzono w analizie Western blot korzystając a z surowicy ozdrowiałego kota, od kota zakażonego FIV.
PL 199 359 B1
Wektor homologii 1015-18.8A (LP1-CD86/IRES-CD80):
Zastosowano wektor homologii 1015-18.8A aby utworzyć rekombinowane wirusy RPV wykazujące ekspresję CD80 i CD86: skonstruowano plazmid zawierający promotor ospy LP1, element IRES EMCV, i terminator transkrypcji poli A ospy. Gen kociego CD80 powielono metodą PCR z użyciem primerów 1/97.6 (5'-GCTAGGATCCAATCTATGTAGACAGGTGAGAT-3') i 3/98.4 (5'-TCGAGGATCCGGGTCACGCAGCAAAGTGG-3'), przy czym oba zawierały miejsca kloningowe BamHI. CD80 klonowano za promotorem LP1. Gen kociego CD86 powielono metodą PGR z użyciem primerów 1/98.18 (5'-TCGACAATTGGATGGGCATTTGTGACAG-3') z miejscem klonigowym Mfel i 8/97.31 (5'-GTGGATCCAGGATCCGGAGCGG-3') z lepkimi końcami. CD86 klonowano za elementem IRES EMCV. Kasetę trawiono następnie Notl i klonowano wektora N Hindlll RPV zawierającego gen β-galaktozydazy E. coli pod kontrolą syntetycznego późnego promotora, 15L. Zastosowano końcowy wektor homologii 1015-18.8A, aby utworzyć wirusy zawierające geny FIV lub FeLV i CD80 i CD86 zgodnie z procedurą rekombinacji homologicznej dla tworzenia rekombinowanego RPV.
S-RPV-045
S-RPV-045 jest rekombinowanym pokswirusem szopów wykazującym ekspresję trzech obcych genów. S-RPV-045 otrzymano od pokswirusa szopów RPV-000 (ATCC VR-838). Osiągnięto to korzystając z wektora homologii 1015-18.8A i rodzicielskiego wirusa S-RPV-000 w procedurze rekombinacji homologicznej dla tworzenia rekombinowanego RPV. Wyjściowe masy transfekcyjne przesiano pod względem rekombinantów, stosując przesiew pod względem rekombinowanego RPV z ekspresją β-galaktozydazy (BLUO-GAL testy i przesiew pod względem rekombinowanego RPV z ekspresją enzymatycznych genów markerowych). Wirus oczyszczono metodą łysinki i pasażowano 5 razy.
RPV-045 testowano pod względem ekspresji β-galaktozydazy w analizie czarnej łysinki. 100% łysinek utworzonych od komórek VERO zakażonych oczyszczonym RPV-045 określono jako wykazujące ekspresję β-galaktozydazy, przy użyciu króliczego przeciwciała poliklonalnego (ICN, OH).
Western analysis przy użyciu procedury Western blotting potwierdziła ekspresję CD80 i CD86, przy użyciu kozich anty-ludzkich przeciwciał poliklonalnych, odpowiednio CD80 i CD86 (R&D Systems, MN). Wykryto wielokrotne wstęgi w zakresie wielkości od 30 do 60 kDa specyficzne dla kociego CD80, i wykryto wielokrotne wstęgi w zakresie od 40 do 70 kDa specyficzne dla kociego CD86. Wstęgi te reprezentują występujące na przemian i wielokrotne wzory glikozylacji CD80 i CD86 o ekspresji w kontekście RPV w komórkach VERO.
S-RPV-046
RPV-046 jest pokswirusem szopów, wykazującym ekspresję pięciu obcych genów. RPV-046 otrzymano od pokswirusa szopów RPV-036. Osiągnięto to korzystając z wektora homologii 1015-18.8A i rodzicielskiego wirusa RPV-036, w procedurze rekombinacji homologicznej dla tworzenia rekombinowanego RPV. Wyjściowe masy transfekcyjne przesiano pod względem rekombinantów, stosując przesiew pod względem rekombinowanego RPV z ekspresją β-galaktozydazy (testy BLUO-GAL i przesiew pod względem rekombinowanego RPV z ekspresją enzymatycznych genów markerowych). Wirus oczyszczono metodą łysinki i pasażowano 5 razy. Końcowym rezultatem wielu okrążeń oczyszczania metodą niebieskiej/zielonej łysinki był rekombinowany wirus FHV 046.
RPV 046 zawiera gen gag FIV pod kontrolą syntetycznego wczesnego/późnego promotora ospy, LP2EP2, i the gen β-glukuronidazy pod kontrolą syntetycznego wczesnego promotora ospy, EP2. Geny te są zawarte w oddzielnym i nie podstawowym miejscu częściowego fragmentu U Hindlll RPV. Geny CD80 i CD86 i β-galaktozydazy są zawarte w unikalnym i oddzielnym nie podstawowym częściowym miejscu N Hindlll RPV.
RPV-046 testowano pod względem ekspresji β-galaktozydazy i β-glukuronidazy w analizie czarnej łysinki. 100% łysinek utworzonych z komórek VERO zakażonych oczyszczonym RPY-046 określono jako wykazujące ekspresję β-galaktozydazy i β-glukuronidazy.
Analiza Western przy użyciu procedury Western blotting potwierdziła ekspresję CD80 i CD86 przy użyciu kozich anty-ludzkich przeciwciał poliklonalnych odpowiednio CD80 i CD86 (R&D Systems, MN). Wykryto wielokrotne wstęgi w zakresie wielkości od 30 do 60 kDa specyficzne dla kociego CD80, i wykryto wielokrotne wstęgi w zakresie od 40 do 70 kDa specyficzne dla kociego CD86. Wstęgi te reprezentują występujące na przemian i wielokrotne wzory glikozylacji CD80 i CD86 o ekspresji w kontekście RPV w komórkach VERO. Potwierdzono także ekspresję gag/proteazy FIV przez analizę Western blot, korzystając z mysich przeciwciał monoklonalnych dla FIVgag (p27) (Custom Monoclonals, CA).
PL 199 359 B1
S-RPV-047
RPV-047 jest pokswirusem szopów, wykazującym ekspresję pięciu obcych genów. Skonstruowano wektor homologii 1015-18.8 jak opisano powyżej, który zawiera kasetę LP1-CD86/IRES-CD80 i gen β-galaktozydazy E. coli pod kontrolą syntetycznego późnego promotora (I5L) we fragmencie N Hindlll. RPV-047 otrzymano od RPV-044, który zawiera geny FIVenv i β-glukuronidazy E. coli (β-glukuronidaza) we fragmencie U Hindlll RPV. Gen FIVenv znajduje się pod kontrolą syntetycznego wczesnego promotora (EP1). Gen β-glukuronidazy znajduje się pod kontrolą syntetycznego późnego promotora (LP1).
RPV-047 otrzymano od pokswirusa szopów RPV-044. Osiągnięto to korzystając z wektora homologii 1015-18.8A i rodzicielskiego wirusa RPV-044 w procedurze rekombinacji homologicznej dla tworzenia rekombinowanego RPV. Wyjściowe masy transfekcyjne przesiano pod względem rekombinantów, stosując przesiew pod względem rekombinowanego RPV z ekspresją β-galaktozydazy (testy BLUO-GAL i przesiew pod względem rekombinowanego RPV z ekspresją enzymatycznych genów markerowych). Wirus oczyszczono metodą łysinki i pasażowano 5 razy. Końcowym rezultatem wielu okrążeń oczyszczania metodą niebieskiej/zielonej łysinki był rekombinowany wirus FHV 047.
RPV-047 testowano pod względem ekspresji β-galaktozydazy w analizie czarnej łysinki. 100% łysinek utworzonych z komórek VERO zakażonych oczyszczonym RPV-047 określono jako wykazujące ekspresję β-galaktozydazy, przy użyciu króliczego przeciwciała polikłonalnego (ICN, OH).
Analiza Western przy użyciu procedury Western blotting potwierdziła ekspresję CD80 i CD86 przy użyciu kozich anty-ludzkich przeciwciał poliklonalnych odpowiednio CD80 i CD86 (R&D Systems, MN). Wykryto wielokrotne wstęgi w zakresie wielkości od 30 do 60 kda specyficzne dla kociego CD80, i wykryto wielokrotne wstęgi w zakresie od 40 do 70 kda specyficzne dla kociego CD86. Wstęgi te reprezentują występujące na przemian i wielokrotne wzory glikozylacji CD80 i CD86, o ekspresji w kontekście RPV w komórkach VERO. Potwierdzono także ekspresję FIVenv przez analizę Western blot, wykorzystując mysie przeciwciała monoklonalne dla FIVenv (gp100) (BioDesign Interantional, ME)
S-RPV-048
RPV-048 jest pokswirusem szopów, wykazującym ekspresję pięciu obcych genów. Skonstruowano wektor homologii 1015-18.8 jak opisano powyżej, który zawiera kasetę LP1-CD86/IRES-CD80 i gen β-galaktozydazy E. coli pod kontrolą syntetycznego późnego promotora (I5L) we fragmencie N Hindlll. RPV-048 otrzymano od RPV-038, który zawiera geny gag/proteazy FeLV i the β-glukuronidazy E. coli we fragmencie U Hindlll RPV. Gen gag/proteazy FeLV znajduje się pod kontrolą syntetycznych późnych/wczesnych promotorów (LP2EP2). Gen β-glukuronidazy znajduje się pod kontrolą syntetycznego późnego promotora (LP1).
RPV-048 otrzymano od rekombinowany pokswirusa szopów RP RPV-038. Osiągnięto to korzystając z wektora homologii 1015-18.8A i rodzicielskiego wirusa RPV-038 w procedurze rekombinacji homologicznej dla tworzenia rekombinowanego RPV. Wyjściowe masy transfekcyjne przesiano pod względem rekombinantów stosując przesiew pod względem rekombinowanego RPV z ekspresją β-galaktozydazy (testy BLUO-GAL i przesiew pod względem rekombinowanego RPV z ekspresją enzymatycznych genów markerowych). Wirus oczyszczono metodą łysinki i pasażowano 5 razy. Końcowym rezultatem wielu okrążeń oczyszczania metodą niebieskiej/zielonej łysinki był rekombinowany wirus FHV 048.
RPV-048 testowano pod względem ekspresji β-galaktozydazy w analizie czarnej łysinki. 100% łysinek utworzonych z komórek VERO zakażonych oczyszczonym RPV-046, określono jako wykazujące ekspresję β-galaktozydazy, przy użyciu króliczego przeciwciała poliklonalnego (ICN, OH).
Analiza Western przy użyciu procedury Western blotting potwierdziła ekspresję CD80 i CD86 przy użyciu kozich anty-ludzkich przeciwciał poliklonalnych odpowiednio CD80 i CD86 (R&D Systems, MN). Wykryto wielokrotne wstęgi w zakresie wielkości od 30 do 60 kDa specyficzne dla kociego CD80, i wykryto wielokrotne wstęgi w zakresie od 40 do 70 kDa specyficzne dla kociego CD86. Wstęgi te reprezentują występujące na przemian i wielokrotne wzory glikozylacji CD80 i CD86 o ekspresji w kontekście RPV w komórkach VERO. Potwierdzono także ekspresję FeLVgag/proteazy przez analizę Western blot wykorzystując królicze przeciwciała poliklonalne FeLVgag (p27) (BioDesign Interantyonal, ME).
S-RPV-052
RPV-052 jest pokswirusem szopów wykazującym ekspresję sześciu obcych genów. Skonstruowano wektor homologii 1015-18.8 jak opisano powyżej, który zawiera kasetę LP1-CD86/IRES-CD80 i gen β-galaktozydazy E. coli pod kontrolą syntetycznego późnego promotora (I5L) we fragmencie N Hindlll. RPV-052 otrzymano od RPV-030, który zawiera geny gag/proteazy FeLV, FeLVenv, i β-glukuronidazy E. coli (β-glukuronidaza) we fragmencie U Hindlll RPV. Gen gag/proteazy FeLV znajduje
PL 199 359 B1 się pod kontrolą syntetycznego wczesnego promotora (EP2). Gen FeLVenv znajduje się pod kontrolą syntetycznego wczesnego promotora (EPl). Gen β-glukuronidazy znajduje się pod kontrolą syntetycznego późnego promotora (LP1).
RPV-052 otrzymano od pokswirusa szopów RPV-030. Osiągnięto to korzystając z wektora homologii 1015-18.8A i rodzicielskiego wirusa RPV-030 w procedurze rekombinacji homologicznej dla tworzenia rekombinowanego RPV. Wyjściowe masy transfekcyjne przesiano pod względem rekombinantów wirusów, stosując przesiew pod względem rekombinowanego RPV z ekspresją β-galaktozydazy (testy BLUO-GAL i przesiew pod względem rekombinowanego RPV z ekspresją enzymatycznych genów markerowych). Wirus oczyszczono metodą łysinki i pasażowano 5 razy. Końcowym rezultatem wielu okrążeń oczyszczania metodą niebieskiej/zielonej łysinki był rekombinowany wirus FHV 052.
RPV-052 testowano pod względem ekspresji β-galaktozydazy, β-glukuronidazy, gag FeLV i otoczki FeLV przez analizę czarnej łysinki. Analiza Western przy użyciu procedury Western blotting potwierdziła ekspresję CD80 i CD86, przy użyciu kozich anty-ludzkich przeciwciał poliklonalnych odpowiednio CD80 i CD86 (R&D Systems, MN). Potwierdzono także ekspresję gag/proteazy FeLV i otoczki FeLV przez analizę Western blot, wykorzystując królicze przeciwciała poliklonalne FeLVgag (p27) (BioDesign Interantional, ME) i mysie monoklonalne anty-FeLVenv (gp100) (BioDesign, ME).
S-RPV-053
RPV-053 jest pokswirusem szopów wykazujące ekspresję sześciu obcych genów. Skonstruowano wektor homologii 1015-18.8 jak opisano powyżej, który zawiera kasetę LP1-CD86/IRES-CD80 i gen β-galaktozydazy E. coli pod kontrolą syntetycznego późnego promotora (I5L) we fragmencie N Hindlll. RPV-053 otrzymano od RPV-034, który zawiera geny gag/proteazy FIV, FIVenv, i E. coli β-glukuronidazy we fragmencie U Hindlll RPV. Gen gag/proteazy FIV znajduje się pod kontrolą syntetycznego wczesnego promotora (EP2). The FIVenv gen znajduje się pod kontrolą syntetycznego wczesnego promotora (EP1). Gen beta-glukuronidazy znajduje się pod kontrolą syntetycznego późnego promotora (LP1).
RPV-053 otrzymano od pokswirusa szopów RPV-034. Osiągnięto to korzystając z wektora homologii 1015-18.8A i rodzicielskiego wirusa RPV-034 w procedurze rekombinacji homologicznej dla tworzenia rekombinowanego RPV. Wyjściowe masy transfekcyjne przesiano pod względem rekombinantów, stosując przesiew pod względem rekombinowanego RPV z ekspresją β-galaktozydazy (testy BLUO-GAL i przesiew pod względem rekombinowanego RPV z ekspresją enzymatycznych genów markerowych). Wirus oczyszczono metodą łysinki i pasażowano 5 razy. Końcowym rezultatem wielu okrążeń oczyszczania metodą niebieskiej/zielonej łysinki był rekombinowany wirus FHV 053.
S-SPV 275
S-SPV-275 jest rekombinowanym wirusem ospy świń, który wykazuje ekspresję pięciu obcych genów. Skonstruowano wektor ńomologii oznaczony 992-23.6 w następujący sposób: geny kociego CD86 i CD80 ulegały ekspresji w bicistronowej kasecie DNA pod kontrolą syntetycznego późnego promotora ospy, LP1, kierującego transkrypcją zarówno CD86 jak i CD80, i obejmującego element IRES EMCV między dwoma otwartymi ramkami odczytu. Gen β-glukuronidazy E. coli znajduje się pod kontrolą syntetycznego wczesnego promotora ospy, EP2. Stosowanym wirusem rodzicielskim był S-SPV 046, który zawiera gen gag/proteazy FIV kierowany przez syntetyczny późny/wczesny promotor ospy, LP2EP2 i gen β-galaktozydazy znajduje się pod kontrolą konstytutywnego promotora ospy, 01L. Geny gag/proteazy FIV, i β-galaktozydazy wprowadzono do częściowego fragmentu M Hindlll SPV, podczas gdy geny CD86/CD80 i β-glukuronidazy wprowadzono do częściowego fragmentu K Hindlll SPV.
S-SPV 275 otrzymano od S-SPV 046. Osiągnięto to korzystając ;z wektora homologii 992-23.6 i S-SPV 046 w procedurze rekombinacji homologicznej dla tworzenia rekombinowanego SPV. Wyjściową masę transfekcyjną przesiano stosując przesiew pod względem rekombinowanego SPV z ekspresją β-glukuronidazy (test X-GLUC). Końcowym rezultatem wielu okrążeń oczyszczania pod względem zielonej/niebieskiej łysinki był rekombinowany wirus SPV 275.
S-SPV 275 testowano pod względem ekspresji FIV gag, i genu markerowego, β-glukuronidazy, testem czarnej łysinki. 100% łysinek utworzonych w komórkach ESK-4 zakażonych oczyszczonym S-SPV 275, określono jako wykazujące ekspresję FIV gag, przy użyciu mysiego przeciwciała monoklonalnego gag FIV (Gustom Monoclonals, CA), i jest on stabilny po 5 pasażach.
Ekspresję FIV gag, CD86, i CD80 potwierdzono w analizie Western blot przy użyciu mysiego przeciwciała monoklonalnego wobec FIV gag, i kozich przeciwciał anty-ludzkich CD80 i CD86 (R&D Systems; MN) dla kocich CD86 i CD80. Wykryto dwie oddzielne wstęgi o 50 kDa i 27 kDa specyficzne
PL 199 359 B1 dla FIV gag. Wykryto wielokrotne wstęgi w zakresie od 40 kDa do 70 kDa specyficzne dla kociego
CD86, a także wykryto wstęgi w zakresie od 30kDa do 60kDa specyficzne dla kociego CD80.
S-FHV 040
S-FHV 040 jest rekombinowanym kocim herpeswirusem wykazującym ekspresję pięciu obcych genów. Skonstruowano wektor homologii oznaczony 95787.A1 w następujący sposób: geny kociego CD80 i CD86 ulegały ekspresji w bicistronowej kasecie DNA kasetę pod kontrolą bezpośrednio wczesnego promotora cytomegalowirusa (CMV IE), kierującego transkrypcją CD80 i CD86, i obejmującego element IRES EMCV między dwoma otwartymi ramkami odczytu. Gen β-glukuronidazy znajduje się pod kontrolą promotora GL wirusa zakaźnego zapalenia krtani i tchawicy. Geny CD80, CD86, i β-glukuronidazy wprowadzono do unikatowego długiego regionu FHV w unikatowym miejscu EcoRI, pochodzącym od częściowego fragmentu H Sall z FHV, między gL i sąsiednimi genami aktywatorowymi transkrypcji. Stosowanym wirusem rodzicielskim był S-FHV 019, który zawiera gen gag FeLV kierowany przez CMV IE, i gen β-galaktozydazy E. coli, który znajduje się pod kontrolą promotora gX wścieklizny rzekomej; oba geny znajdują się w unikatowym krótkim deletowanym miejscu gE (US) z FHV.
S-FHV 040 otrzymano od S-FHV 019 Osiągnięto to korzystając z wektora homologii 987-57.A1 i wirusa S-FHV 019, w procedurze rekombinacji homologicznej dla tworzenia rekombinowanego FHV. Wyjściową masę transfekcyjną przesiano stosując przesiew pod względem rekombinowanego FHV z ekspresją β-glukuronidazy (test X-GLUC). Końcowym rezultatem wielu okrążeń oczyszczanie pod względem zielonej/niebieskiej łysinki był rekombinowany wirus S-FHV 040.
S-FHV 040 testowano pod względem ekspresji FeLV gag, i genów markerowych β-glukuronidazy i β-galaktozydazy, testem czarnej łysinki. 100% łysinek utworzonych w komórkach CRFK określono jako wykazujące ekspresję β-glukuronidazy i β-galaktozydazy. Ekspresję gag FeLV także potwierdzono testem czarnej łysinki, przy użyciu koziego przeciwciała monoklonalnego wobec FeLV gp27 (BioDesigns; ME). Wirus ten okazuje się stabilny po pięciu pasażach.
Ekspresję kociego CD80, CD86, i gag FeLV potwierdzono w analizie Western blot. Stosowano kozie anty-ludzkie przeciwciała poliklonalne CD80 i CD86 (R&D Systems; MN) wobec kociego CD80 i CD86. Wykryto wielokrotne wstęgi w zakresie od SOkDa do 60kDa specyficzne dla kociego CD80, i wykryto także wstęgi w zakresie od 40kDa do 70kDa specyficzne dla kociego CD86. Ekspresję FeLV potwierdzono przy użyciu koziego przeciwciała poliklonalnego wobec FeLV gp27 (BioDesigns, ME).
S-FHV 042
S-FHV 042 jest rekombinowanym kocim herpeswirusem, wykazującym ekspresję pięciu obcych genów. Skonstruowano wektor homologii oznaczony 957-87.A1, w następujący sposób: geny kociego CD80 i CD86 ulegały ekspresji w bicistronowej kasecie DNA pod kontrolą bezpośrednio wczesnego promotora cytomegalowirusa (CMV IE), kierującego transkrypcją CD80 i CD86, i obejmującego element IRES EMCV między dwoma otwartymi ramkami odczytu. Gen β-glukuronidazy znajduje się pod kontrolą promotora gl wirusa zakaźnego zapalenia krtani i tchawicy. Geny CD80, CD86, i β-glukuronidazy wprowadzono do unikatowego długiego regionu FHV w unikatowym miejscu EcoRI, pochodzącym od częściowego fragmentu H SalI z FHV, między gL i sąsiednimi genami aktywatorowymi transkrypcji. Wirusem rodzicielskim był S-FHV 018, który zawiera gen otoczki FeLV kierowany przez CMV IE, i gen β-galaktozydazy E. coli pod kontrolą promotora gX wścieklizny rzekomej; oba geny znajdują się w unikatowym krótkim deletowanym miejscu gE (US) z FHV.
S-FHV 042 otrzymano od S-FHV 018. Osiągnięto to korzystając z wektora homologii 987-57.A1 i wirusa S-FHV 018 w procedurze rekombinacji homologicznej dla tworzenia rekombinowanego FHV. Wyjściowa masę transfekcyjną przesiano stosując przesiew pod względem rekombinowanego FHV z ekspresją β-glukuronidazy (test X-GLUC). Końcowym rezultatem wielu okrążeń oczyszczania pod względem zielonej/niebieskiej łysinki, był rekombinowany wirus S-FHV 042. S-FHV 042 testowano pod względem ekspresji of FeLV env, i genów markerowych β-glukuronidazy i β-galaktozydazy, testem czarnej łysinki. 100% łysinek utworzonych w komórkach CRFK określono jako wykazujące ekspresję β-glukuronidazy i β-galaktozydazy. Ekspresję FeLV env potwierdzono testem czarnej łysinki przy użyciu mysiego przeciwciała monoklonalnego wobec FeLV gp70 (BioDesigns; ME). Wirus ten był stabilny po pięciu pasażach.
Ekspresję kociego CD80, CD86, i FeLV env potwierdzono w analizie Western blot. Kozie antyludzkie przeciwciała poliklonalne CD80 i CD86 (R&D Systems; MN) stosowano do kociego CD80 i CD86. Wykryto wielokrotne wstęgi w zakresie od 30 kDa do 60 kDa specyficzne dla kociego CD80, a także wstęgi w zakresie od 40 kDa do 70 kDa specyficzne dla kociego CD86. Wykryto wstęgę o długości 100 kDa FeLVenv, przy użyciu mysiego przeciwciała monoklonalnego wobec gp70 (BioDesigns; ME).
PL 199 359 B1
S-FHV 044
S-FHV 044 jest re kombinowanym kocim herpeswirusem, wykazującym ekspresję pięciu obcych genów. Skonstruowano wektor homologii oznaczony 957-87.A1 w następujący sposób: geny kociego CD80 i CD86 ulegały ekspresji w bicistronowej kasecie DNA pod kontrolą bezpośrednio wczesnego promotora cytomegalowirusa (CMV IE), kierującego transkrypcją CD80 i CD86, i obejmującego element IRES EMCV między dwoma otwartymi ramkami odczytu. Gen β-glukuronidazy znajduje się pod kontrolą promotora gl wirusa zakaźnego zapalenia krtani i tchawicy. CD80, CD86, i gen β-glukuronidazy wprowadzono do unikatowego długiego regionu FHV w unikatowym miejscu EcoRI pochodzącym od częściowego fragment H SalI z FHV, między gL i sąsiednimi genami aktywatorowymi transkrypcji. Wirusem rodzicielskim stosowany był S-FHV 016, który zawiera gen gag/proteazy FIV kierowany przez CMV IE (z dziewięcio aminokwasową delecją na końcu pięć prim genu proteazy), i gen β-galaktozydazy E. coli, który pod kontrolą promotora gX wścieklizny rzekomej; oba geny znajdują się w unikatowym krótkim deletowanym miejscu gE (US) z FHV.
S-FHV 044 otrzymano od S-FHV 016. Osiągnięto to korzystając z wektora homologii 987-57.A1 i wirusa S-FHV 016, w procedurze rekombinacji homologicznej dla tworzenia rekombinowanego FHV. Wyjściową masę transfekcyjną przesiano stosując przesiew pod względem rekombinowanego FHV z ekspresją β-glukuronidazy (test K-GLUC). Końcowym rezultatem wielu rund oczyszczania pod względem zielonej/niebieskiej łysinki, był rekombinowany wirus S-FHV 044. S-FHV 044 testowano pod względem ekspresji gag FIV, i genów markerowych β-glukuronidazy i β-galaktozydazy, testem czarnej łysinki. 100% łysinek utworzonych w komórkach CRFK określono jako wykazujące ekspresję zarówno genów markerowych, wykorzystując mysie przeciwciała monoklonalne (BioDesign, ME). Potwierdzono także ekspresję gag FIV, przy użyciu testu czarnej łysinki stosując mysie przeciwciało monoklonalne dla gag FIV (Gustom Monoclonals, CA). Wirus ten był stabilny po pięciu pasażach.
Ekspresję kociego CD80, CD86, i gag FeLV potwierdzono w analizie Western blot. Kozie antyludzkie przeciwciała poliklonalne CD80 i CD86 (R&D Systems; MN) stosowano dla kociego CD80 i CD86. Wykryto wielokrotne wstęgi w zakresie od 30 kDa do 60 kDa specyficzne dla kociego CD80, jak również wstęgi w zakresie od 40 kDa do 70 kDa specyficzne dla kociego CD86. Wykryto dwie oddzielne wstęgi o 50 kDa i 27 kDa specyficzne dla gag FIV przy użyciu przeciwciała monoklonalnego gag FIV.
T a b e l a 2
Rekombinowane wirusy SPV, zawierające geny kodujące CD80 i/lub CD86 lub CD28.
Wirus nr Opis inercji obcego genu Analiza ekspresji przez Western blot lub testy czarnej łysinki.
CD80 CD86 GAG ENV β-GAL β-GLU
1 2 3 4 5 6 7 8
SPV 228 EP2-FIVgag/EP1-FIVenv/I5L-lacZ Wektor homologii = 926-45.A17 Wirus rodzicielski = SPV 001 + + +
SPV 261 EP2-FIVgag/EP1-FIVenv/I5L-lacZ //L2E2-CD80/E2-UIDA Wektor homologii = 931-21.A1 Wirus rodzicielski = SPV 228 + + + + +
SPV 275 L2E2-FIVgag/01L-lacZ// L1-CD86/IRES-CD80/E2-UIDA Wektor homologii = 992-23.6 i 992-23.2 Wirus rodzicielski = SPV 046 + + + + +
SPV 258 L2E2-FeLVGag/L2E2FeLVOTMenV/L1-lacZ Wektor homologii = 954-44.1 Parent = SPV 001 + + +
SPV 281 EP2-FIVgag/EP1-FIVenv/ISL- lacZ//L1-CD86/IRES- CD80/E2-UIDA Wektor homologii = 992-23.6 Wirus rodzicielski = SPV 228 + + + + +
PL 199 359 B1 cd. tabeli 2
1 2 3 4 5 6 7 8
SPV 246 E2JFeLVgag/El-FeLVenv/15L- lacZ//L2E2-CD80/E2-uida Wektor homologii = 931-21.A1 Wirus rodzicielski = SPV + + + + +
SPV 276 L2E2-eLVgag/L1-lacZ// L1-CD86/IRES-CD80/E2-UIDA Wektor homologii = 992-23.6 Wirus rodzicielski = SPV 089 + + + + +
SPV 279 E1-FeLVenv/L1-lacZ// L1-CD86/IRES-CD80/E2-UIDA Wektor homologii = 992-23.6 Wirus rodzicielski = SPV 195 + + + + +
SPV 280 L2E2-FeLVGag L2E2FeLVLTMenV/Ll-lacZ// L1-CD86/IRES-CD80/E2-UIDA Wektor homologii = 992-23.6 Wirus rodzicielski = SPV258 + + + + + +
SPV 285 E2-FeLVgag/El-FeLVenv/I5L- lacZ//L1-CD80/IRES/CD86/- gl-UILD Wektor homologii = 992-23.6 Wirus rodzicielski = SPV 224 + + + + + +
SPV 270 LE-CD80GTM/HIS/E2-uidA Wektor homologii = 961-27.4 Wirus rodzicielski = SPV001 + +
SPV 272 LE-CD864TM/HIS/E2-uidA(19-2) Wektor homologii = 969-20.9 Wirus rodzicielski = SPV 001 + +
SPV 273 LE- CD280TM/HIS/E2-uidA Wektor homologii - 930-91.2 Wirus rodzicielski = SPV 001 +
SPV 274 LE-CD86(FL)/EP2 - UIDA Wektor homologii = 977-40.1 Wirus rodzicielski = SPV 001 + +
SPV 282 LP1-CD86/IRES-CD80/E2-UIDA Wektor homologii = 992-23.6 Wirus rodzicielski = SPV 001 + + + + +
T a b e l a 3
Rekombinowane wirusy RPV, zawierające geny kodujące CD80 i/lub CD86 i CD-28.
Wirus nr Opis obcego genu insercji Analiza ekspresji przez Western blot lub testy czarnej łysinki.
CD80 CD86 GAG ENV β-GAL β-GLU
1 2 3 4 5 6 7 8
RPV 046 L2E2-FIVgag/E2-UIDA// LP1-CD86/IRES-CD80/I5L-LacZ Wektor homologii = 1015-8.8A Wirus rodzicielski = RPV 036 + + + + +
RPV 047 El-FIVenvTE2-UIDA//LP1- CD86/IRES-CD80/I5L-LacZ Wektor homologii 1015-18.8A Wirus rodzicielski = RPV 037/044 + + + + +
PL 199 359 B1 cd. tabeli 3
1 2 3 4 5 6 7 8
RPV 048 L2E2-FeLV Gag/E2-UIDA LP1-B7-/IRES-CD80/ISL-lacZ Wektor homologii = 1015-18.8A Wirus rodzicielski = RPV 038 + + + + +
RPV 052 H3 miejsce UXbal/LP 1-uidA/EPl-FeLVenv/ S-RPV-030 EP2-FeLVgag H3 'IN I5L- lacZ/Ll-FeCD86/IRES/FeCD80 Wektor homologii = 1015-18.8A Wirus rodzicielski = RPV-030 + + + + + +
RPV 053 H3 U Xba I miejsce/EP2FIVgag/EP1-FIVenv/S-RPV-034 LPl-uidA//H3 N ISL-lacZ/L1-FeCD86/IRES/FeC D80 Wektor homologii = 1015-18.8A Wirus rodzicielski = RPV 034 + + + + + +
RPV 022 L2E2-CD80/L1-lacZ Wektor homologii = 931-32.A5 Wirus rodzicielski = RPV-000 + +
RPV 045 LP1-CD86/IRES-CD80/ISL-LacZ Wektor homologii = 1015-18.8A Wirus rodzicielski = RPV-000 + + +
T a b e l a 4
Rekombinowane wirusy FHV zawierające geny kodujące CD80 i/lub CD86 i CD28
Wirus nr Opis obcego genu insercji Analiza ekspresji przez Western blot lub testy czarnej łysinki
CD80 CD86 GAG ENV β-GAL β-GLU
1 2 3 4 5 6 7 8
FHV 044 IE-FIVgag(-9a.a.)/gX-lacZ// IE-CD86/IRES-CD80/gI-UIDA Wektor homologii = 987-57. A1 Wirus rodzicielski = FHV 016 + + + + +
FHV 047 IE-FIVgag(-9a.a.) /gX-lacZ//IE-CD86-TkpA/gl-UIDA Wektor homologii = 994-68.4 Wirus rodzicielski = FHV 016 + + + +
FHV 048 IE-FIVenv gX-LacZ ^gE) //IE-CD86-TkpA/gl-UIDA Wektor homologii = 994-68.4 Wirus rodzicielski = FHV 017 + + + +
FHV 042 IE-FeLVenv/gX-LacZ^gE) / /IE-CD86/IRES-CD80/gIUIDA(SalH IG) Wektor homologii = 987-57.A1 Wirus rodzicielski = FHV018 + + + + +
FHV 040 IE-FeLVgag/gX-LacZ ^gE)// IE-CD86/IRES-CD80/gIUIDA(SalH IG) Wektor homologii = 987-57.A1 Wirus rodzicielski = FHV 019 + + + + +
PL 199 359 B1 cd. tabeli 4
1 2 3 4 5 6 7 8
FHV 049 IE-FeLVenv/gX-LacZ ^gE) IE-FeCD86-TkpA/gl-uidA (SalH IG) Wektor homologii = = 994-68.4 Wirus rodzicielski = = FHV018 + + + +
FHV 050 IE-FeLVgag/gX-Lac2^gE)IE-FeCD86-TkpA/gI-uidA (SalH IG) Wektor homologii = 994-68.4 Wirus rodzicielski = FHV019 + + +
FHV 030 gE-CD80/ gE-lacZ ^gE) Wektor homologii = 926-76.D7 Wirus rodzicielski = FHV020 + +
Dodatkowe przykłady obejmujące kowektorowanie kociego CD80 i CD86, itd. Z użyciem częściowych lub pełnej długości genomów FIV lub FeLV.
Należy zauważyć, że: rekombinowane wektory wirusowe, zawierające CD80, CD86, CTLA4 lub CD28 w rekombinowanym wirusie z częściowym lub pełnym dopełnieniem genomu FIV i/lub FIV i z p35 i p40 kociego IL-12 lub bez. Te rekombinowane wirusy posiadają siłę jako szczepionki przeciwko FIV i chorobie FeLV u kotowatych.
1. Ekspresja kociego CD80, CD86, CD28, i CTLA4, pojedynczo lub w jakimkolwiek połączeniu, w rekombinowanym pokswirusie świń, zawierającym pełny lub częściowy genom FIV.
2. Ekspresja kociego CD80, CD86, CD28, i CTLA4, pojedynczo lub w jakimkolwiek połączeniu, w rekombinowanym kocim herpeswirusie, zawierającym pełny lub częściowy genom FIV.
3. Ekspresja kociego CD80, CD86, CD28, i CTLA4, pojedynczo lub w jakimkolwiek połączeniu, w rekombinowanym pokswirusie szopów, zawierającym pełny lub częściowy genom FIV.
4. Ekspresja kociego CD80, CD86, CD28, i CTLA4, pojedynczo lub w jakimkolwiek połączeniu, w rekombinowanym pokswirusie świń, zawierającym pełny lub częściowy genom FeLV.
5. Ekspresja kociego CD80, CD86, CD28, i CTLA4, pojedynczo lub w jakimkolwiek połączeniu, w rekombinowanym kocim ńerpeswirusie, zawierającym pełny lub częściowy genom FeLV.
6. Ekspresja kociego CD80, CD86, CD28, i CTLA4, pojedynczo lub w jakimkolwiek połączeniu, w rekombinowanym pokswirusie szopów, zawierającym pełny lub częściowy genom FeLV.
7. Ekspresja kociego CD80, CD86, CD28, i CTLA4, pojedynczo lub w jakimkolwiek połączeniu, w rekombinowanym pokswirusie świń, zawierającym pełny lub częściowy genom FIV i geny kociego IL12, GM-CSF, p35 i p40.
8. Ekspresja kociego CD80, CD86, CD28, i CTLA4, pojedynczo lub w jakimkolwiek połączeniu, w rekombinowanym kocim herpeswirusie, zawierającym pełny lub częściowy genom FIV i geny kociego IL12, GM-CSF, p35 i p40.
9. Ekspresja kociego CD80, CD86, CD28, i CTLA4, pojedynczo lub w jakimkolwiek połączeniu, w rekombinowanym pokswirusie szopów, zawierającym pełny lub częściowy genom FIV i geny kociego IL12, GM-CSF, p35 i p40.
10. Ekspresja kociego CD80, CD86, CD28, i CTLA4, pojedynczo lub w jakimkolwiek połączeniu, w rekombinowanym pokswirusie świń, zawierającym pełny lub częściowy genom FeLV i geny kociego IL12, GM-CSF, p35 i p40.
11. Ekspresja kociego CD80, CD86, CD28, i CTLA4, pojedynczo lub w jakimkolwiek połączeniu, w rekombinowanym kocim herpeswirusie, zawierającym pełny lub częściowy genom FeLV i geny kociego IL12, GM-CFS, p3S i p40.
12. Ekspresja kociego CD80, CD86, CD28, i CTLA4, pojedynczo lub w jakimkolwiek połączeniu, w rekombinowanym pokswirusie szopów, zawierającym pełny lub częściowy genom FeLV i geny kociego IL12, GM-CSF, p35 i p40.
PL 199 359 B1
T a b e l a 5:
Rekombinowane wirusy zawierający the FIV genome (Δ-LTR) i geny kodujące kocie CD80 i/lub CD86
Wirus nr Opis insercji obcego genu Analiza ekspresji przez Western blot lub testy czarnej łysinki
CD80 CD86 GAG ENV β-GAL β-GLU
FHV 054 CMV-FIVgenom/gX-lacZ//gE-CD80 Wektor homologii = 1016-75.B1 Rodzicielski = FHV 030 + + + +
FHV 055 CMV-FIVgenom gX-lacZ//gECD86/gX-UIDA Wektor homologii = 1016-75.B1 Rodzicielski = FHV 041 + + + + +
RPV 055 CMV-FIVgenom/LP1-UIDA//LP1- CD86/IRES-CD80/I5L-lacZ Wektor homologii = 1005-95.1 Rodzicielski = RPV 045 + + + + + +
SPV 288 CMV-FIV genom/I5L-lacZ//LP1- CD86/IRES-CD80/EP2-UIDA Wektor homologii = 1007-70.A2 Rodzicielski = RPV 045 + + + + + +
P r z y k ł a d y
Wektor homologii 1007-70.A2 (SPV N/CMV-FIVgenomΔLTR/I5L-lacZ). Zastosowano wektor homologii 1007-70.A2, aby wprowadzić obcy DNA do miejsca insercji N Hindlll z SPV. Wprowadza on β-galaktozydazy gen markerowy E. coli i pełnej długości genom FIV (8.5kb) bez oskrzydlających długich końcowych elementów powtórzenia (LTR). Kaseta ta jest oskrzydlona przez DNA SPV homologiczny miejsca nie będącego podstawowym we fragmencie N H.III SPV. Gdy ten wektor homologii zastosowano zgodnie z procedurą rekombinacji homologicznej dla tworzenia rekombinowanego SPV, powstał wirus zawierający DNA kodujący obce geny. Należy zauważyć, że gen markerowy β-galaktozydazy znajduje się pod kontrolą konstytutywnego promotora ospy, I5L, i genom FIV (Δ LTR) znajduje się pod kontrolą bezpośredniego wczesnego cytomegalowirusa (CMV IE). wektor homologii skonstruowano korzystając ze standardowych technik rekombinacji DNA (Sambrook, i inni.). Syntetyzowano genom FIV (Δ LTR) przez kloning z użyciem reakcji łańcuchowej polimerazy. Matrycą dla reakcji PGR był prowirusowy DNA z plazmidu, zawierającego pełnej długości wirus PPR FIV. Primer biegnący w górę (5' ACGCGTCGACCAGCTAACAAGGTAGGAGAGACTCT-3'; 11/23/98BW.3) syntetyzuje od końca 5' genomu FIV w górę od regionu kodującego Gag i wprowadza unikalne miejsce Sall. Primer biegnący w dół (5'-TCGAGTCGACTTGTG-ACAGTTCTTAGTCCATAAGC-3'; 11/11/98BW.l) syntetyzuje od końca 3' genomu FIV w dół od drugiego egzonu Rev i wprowadza unikalne miejsce Sall Zastosowano końcowy wektor homologii, 1007.70.A2, aby utworzyć rekombinowane wirusy, zawierające genom FIV (bez LTR) i kocie CD80 i CD86 lub zawierające genom FIV (minus LTR) oraz kocie CD80 i CD86 i geny kociego IL-12, p35 i p40, zgodnie z procedurą rekombinacji homologicznej tworzenia rekombinowanych SPV, RPV i FHV.
Wektor homologii 1005-95.1 (RPV U/CMV-genom FIV^LTR)/I5L-LacZ).
Skonstruowano plazmid 1005-95.1 w celu wprowadzenia obcego DNA do RPV. Wprowadza on genom FIV-ALTR i gen β-glukuronidazy E. coli oskrzydlone przez DNA RPV. Powyżej obcego genu znajduje się fragment o długości około 906 par zasad DNA RPV. Poniżej obcego genu znajduje się fragment o długości około 895 par zasad DNA RPV. Gdy plazmid stosuje się zgodnie z procedurą rekombinacji homologicznej dla tworzenia rekombinowanego RPV, powstanie wirus zawierający DNA kodujący obce geny. Należy zauważyć, że genom FIV-LLTR znajduje się pod kontrolą bezpośrednio wczesnego promotora cytomegalowirusa i gen β-glukuronidazy E. coli znajduje się pod kontrolą syntetycznego wczesnego promotora ospy, EP2. Skonstruowano wektor homologii, korzystając ze standardowych technik rekombinacji DNA (Sambrook, i inni), przez łączenie fragmentów restrykcyjnych z poniższych źródeł z syntetycznymi sekwencjami DNA. Otrzymano wektor plazmidowy z fragmentu restrykcyjnego Hindlll o długości około 2999 par zasad z pSP64 (Promega). Fragment 1 subfragmen56
PL 199 359 B1 tem restrykcyjnym Hindlll do Xbal o długości około 906 par zasad fragmentu restrykcyjnego U Hindlll RPV (Knight, i inni.). Fragment 2 fragmentem Sall o długości około 8,5 kb genomu FIV bez elementów LTR i był syntetyzowano przez kloning z użyciem reakcji łańcuchowej polimerazy. Matrycą dla reakcji PCR był prowirusowy DNA z plazmidu zawierający pełnej długości wirus PPR FIV. Primer biegnący w górę (5' ACGCGTCGACCAGCTAACAAGGTAGGAGAGACTCT-3'; 11/23/98BW.3) syntetyzuje od końca 5' genomu FIV w górę od regionu kodującego Gag i wprowadza unikalne miejsce Sall. Primer biegnący w dół (5'-TCGAGTCGACTTGTGACAGTTCTTAGTCCATAAGC-3'; 11./11/98BW.1) syntetyzuje od końca 3' genomu FIV w dół od drugiego egzonu Rev i wprowadza unikalne miejsce Sall. Fragment 3 jest fragmentem o długości około 2,0 kb zawierającym gen p-glukuronidazy E. coli. Fragment 4 subfragmentem Xbal do Hindlll o długości około 896 par zasad fragmentu U Hindlll RPV. Zastosowano końcowy wektor homologii, 1005.95.1 aby utworzyć rekombinowane wirusy, zawierające genom FIV (L LTRs) i geny kociego CD80 i CD86, lub aby utworzyć rekombinowane wirusy, zawierające genom FIV (A LTR) i geny kociego CD80 i CD86 i kociego IL-12, p35 i p40, zgodnie z procedurą rekombinacji homologicznej dla tworzenia rekombinowanego SPV, RPV i FHV.
Wektor homologii 1016-74.A6 (FHVOgE/CMV-FIVgenom-LLTR/gX-lacZ). Skonstruowano wektor homologii 1016-74.A6 w celu usunięcia części regionu, kodującego gE kociego herpeswirusa i wprowadzenia obcego DNA. Wprowadza on genom FIV (minus LTR) i gen β-galaktozydazy E. coli oskrzydlone przez DNA FHV. Genom FIV-LLTR znajduje się pod promotorem IE cytomegalowirusa i gen β-galaktozydazy znajduje się pod kontrolą promotora gX wirusa wścieklizny rzekomej. Skonstruowano go z zaznaczonych źródeł DNA korzystając ze standardowych technik rekombinacji DNA (Sambrook, i inni.). Wektor plazmidowy pochodzi od fragmentu endonukleazy restrykcyjnej Asp718l do Asp718I o długości około 2958 par zasad pSP18/19. Fragment 1 subfragmentem Asp718I do Smal o długości 1415 par zasad fragmentu B SalI FHV. Fragment 2 jest fragmentem SalI o długości około 8,5 kb genomu FIV bez elementów LTR i był syntetyzowany przez kloning z użyciem reakcji łańcuchowej polimerazy. Matrycą dla reakcji PCR był prowirusowy DNA z plazmidu zawierającego pełnej długości wirus PPR FIV. Primer biegnący w górę (5' ACGCGTCGACCAGCTAACAAGGTAGGAGAGACTCT-3' ; 11/23/98BW.3) syntetyzuje od końca 5' genomu FIV w górę od regionu kodującego Gag i wprowadza unikalne miejsce SalI. Primer biegnący w dół (5'-TCGAGTCGACTTGTGACAGTTCTTAGTCCATAAGC-3'; 11/11/98BW.1) syntetyzuje od końca 3' genomu FIV w dół od drugiego egzonu Rev i wprowadza unikalne miejsce SalI. Fragment 3 jest fragmentem o długości 3.5kb genu β-galaktozydaz. Fragment 4 jest sub-fragmentem o długości 2205 par zasad SalI do Asp718I fragmentu E EcoRI FHV. Zastosowano końcowy wektor homologii, 1016-74.A6 aby utworzyć rekombinowane wirusy, zawierające genom FIV (Δ LTR) i geny kociego CD80 i CD86 lub aby utworzyć rekombinowane wirusy, zawierające genom FIV (Δ LTR) i geny kociego CD80 i CD86 i kociego IL-12, p35 i p40 zgodnie z procedurą rekombinacji homologicznej dla tworzenia rekombinowanego SPV, RPV i FHV.
SPV 288
SPV 288 jest rekombinowanym wirusem ospy świń wykazującym ekspresję całego dopełnienia ORF zawartego w genomie FIV oraz 4 dodatkowe obce geny. SPV 288 otrzymano od SPV 282. SPV 282 zawiera gen kociego CD86 i gen CD80 o ekspresji w bicistronowej kasecie DNA pod kontrolą syntetycznego późnego promotora ospy, LP1, kierującego transkrypcją CD80 i CD86 i obejmującego element IRES EMCV między dwoma otwartymi ramkami odczytu; i gen β-glukuronidaza E. coli pod kontrolą syntetycznego wczesnego promotora, EP2, w fragmencie genomowym K H.III SPV. Zastosowano wektor homologii 992-23.6, aby utworzyć SPV 282 wykorzystując procedurę rekombinacji homologicznej dla tworzenia rekombinowanego RPV, SPV, lub FHV. CD80 i CD86 i geny β-glukuronidazy E. coli wprowadza się do innego i nie będącego podstawowym częściowego fragmentu K Hindlll SPV. Geny CMV-genom FIV i β-galaktozydazy wprowadza się oddzielnego i nie będącego podstawowym częściowego fragmentu N Hindlll SPV.
SPV 288 otrzymano od SPV 282. Osiągnięto to korzystając z wektora homologii 1007-70.A2 (patrz powyżej) i wirusa SPV 282 w procedurze rekombinacji homologicznej dla tworzenia rekombinowanego RPV,SPV,OR FHV. Wyjściową masę transfekcyjną przesiano stosując przesiew pod względem rekombinowanego SPV z ekspresją β-galaktozydazy (testy BLUOGAL i CPRG) lub β-glukuronidazy (test X-GLUC). Końcowym rezultatem wielu okrążeń oczyszczania metodą niebieskiej/zielonej łysinki był rekombinowany wirus SPV 288.
SPV 288 testowano pod względem ekspresji FeLVgag, otoczki FeLV z genomu FIV i genów markerowych, β-galaktozydazy i β-glukuronidazy w analizie czarnej łysinki. 100% łysinek utworzonych z komórek ESK-4 zakażonych oczyszczonym SPV 280, określono jako wykazujące ekspresję FeLVgag
PL 199 359 B1 i otoczki FeLV, przy użyciu koziego przeciwciała poliklonalnego dla FeLVgag (Biodesign, ME) i mysiego przeciwciała monoklonalnego otoczki FeLV, gp70 (Biodesign, ME).
Ekspresję kociego CD80 i CD86 potwierdzono w analizie Western blot przy użyciu kozich antyludzkich przeciwciał poliklonalnych odpowiednio CD80 i CD86 (R&D Systems, MN). Wykryto wielokrotne wstęgi w zakresie wielkości od 30 kDa do 60 kDa specyficzne dla kociego CD80, i wykryto wielokrotne wstęgi w zakresie od 40 kDa do 70 kDa specyficzne dla kociego CD86. Wstęgi te reprezentują występujące na przemian i wielokrotne wzory glikozylacji CD80 i CD86 o ekspresji w kontekście SPV, w komórkach ESK-4. Ekspresje białek kodowanych w genomie FIV potwierdzono w analizie Western blot przy użyciu surowic kocich od kotów zakażonych z FIV.
FHV 054
FHV 054 jest rekombinowanym kocim herpeswirusem wykazującym ekspresję całego dopełnienia ORFs zawartego w genomie FIV oraz dwóch dodatkowych obcych genów. Skonstruowano wektor homologii oznaczony 1016-75.B1 w celu wprowadzenia genomu FIV^LTR) i β-galaktozydazy do unikatowego długiego częściowego fragmentu H SalI z FHV. Insercja znajduje się między genem gL i sąsiednim genem aktywatorowym transkrypcji.
The genom FIV znajduje się pod kontrolą promotora IE CMV; i gen β-galaktozydazy E. coli znajduje się pod kontrolą elementu promotora gX wścieklizny rzekomej. FHV 054 otrzymano od FHV 030, który zawiera gen kociego CD80 w deletowanym miejscu gE FHV. Osiągnięto to korzystając z wektora homologii 1016-75.B1 i wirusa FHV 030 w procedurze rekombinacji homologicznej dla tworzenia rekombinowanego RPV,SPV, lub FHV. Wyjściowe masy transfekcyjne przesiano stosując metody przesiewu pod względem rekombinowanego FHV z ekspresją β-galaktozydazy (testy BLUOGAL i CPRG) lub β-glukuronidazy (X-GLUC test). Końcowym rezultatem wielu okrążeń oczyszczania metodą niebieskiej/zielonej łysinki był rekombinowany wirus FHV 054.
FHV 054 testowano pod względem ekspresji β-galaktozydazy w analizie czarnej łysinki. 100% łysinek z komórek CRFK zakażonych oczyszczonymi metodą łysinki FHV 054, określono jako wykazujące ekspresję β-galaktozydazy, wykorzystując mysie przeciwciało monoklonalne (Biodesign, ME). Wirus ten określono jako stabilny po co najmniej 5 pasażach.
Ekspresję kociego CD80, gag FIV i otoczki FIV potwierdzono w analizie Western blot korzystając z poliklonalnych przeciwciał anty-ludzkim CD80 (R&D Systems, MN), mysich monoklonalnych przeciwciał anty-gag FIV (Gustom Monoclonals, CA) i mysich przeciwciał monoklonalnych anty-otoczki FIV (Biodesign). Ekspresję pełnego dopełnienia genów FIV kodowanych w genomie potwierdzono w analizie Western blot, korzystając z surowicy ozdrowiałego kota zakażonego FIV.
FHV 055
FHV 055 jest rekombinowanym kocim herpeswirusem wykazującym ekspresję całego dopełnienia ORF zawartego w genomie FIV oraz trzech dodatkowych obcych genów. Skonstruowano wektor homologii oznaczony 1016-75.B1 w celu wprowadzenia genomu FIV(ZLTR) i β-galaktozydazy do unikatowego długiego częściowego fragmentu H SalI z FHV. Insercja znajduje się między genem gL FHV i sąsiednim genem aktywatorowym transkrypcji.
Genom FIV znajduje się pod kontrolą promotora CMV IE; i gen β-galaktozydazy E. coli znajduje się pod kontrolą elementu promotora gX wścieklizny rzekomej.
FHV 055 otrzymano od FHV 041, który zawiera gen kociego CD86 i gen β-glukuronidazy w deletowanym miejscu gE FHV. Koci CD86 znajduje się pod kontrolą promotora gE FHV i gen β-glukuronidazy znajduje się pod kontrolą promotora gX wirusa wścieklizny rzekomej. Osiągnięto to, korzystając z wektora homologii 1016-75.B1 i wirusa FHV 041 w procedurze rekombinacji homologicznej dla tworzenia rekombinowanego RPV,SPV lub FHV. Wyjściowe masy transfekcyjne przesiano stosując metody przesiewu pod względem rekombinowanego FHV z ekspresją β-galaktozydazy (testy BLUOGAL i CPRG) lub β-glukuronidazy (test X-GLUC). Końcowym rezultatem wielu okrążeń oczyszczania metodą niebieskiej/zielonej łysinki był rekombinowany wirus FHV 055.
FHV 055 testowano pod względem ekspresji β-galaktozydazy i β-glukuronidazy w analizie czarnej łysinki. 100% łysinek od komórkach CRFK zakażonych FHV 055 oczyszczonym metodą łysinki, określono jako wykazujące ekspresję β-galaktozydazy i β-glukuronidazy, wykorzystując odpowiednio mysie przeciwciało monoklonalne (Biodesign, ME) i królicze poliklonalne (Molecular Probes, OR). Wirus ten określono jako stabilny po 5 pasażach.
Ekspresję kociego CD86, gag FIV i otoczki FIV potwierdzono w analizie Western blot wykorzystując poliklonalne przeciwciała anty-ludzkiemu CD86 (R&D Systems, MN), mysie monoklonalne przeciwciała anty-gag FIV (Custom Monoclonals, CA) i mysie przeciwciało monoklonalne anty58
PL 199 359 B1 otoczkowe FIV (Biodesign). Ekspresję pełnego dopełnienia genów FIV kodowanych w genomie potwierdzono w analizie Western blot, korzystając z surowicy ozdrowiałego kota zakażonego FIV.
RPV 055
RPV 055 jest rekombinowanym pokswirusem szopów wykazującym ekspresję całego dopełnienia ORF zawartego w genomie FIV oraz 4 dodatkowych obcych genów. RPV 055 otrzymano od RPV 045, który zawiera gen kociego CD86 i gen CD80 o ekspresji w bicistronowej kasecie DNA pod kontrolą syntetycznego późnego promotora ospy, LP1, kierującego transkrypcją CD80 i CD86 i obejmującego element IRES EMCV między dwoma otwartymi ramkami odczytu; i gen β-glukuronidazy E. coli pod kontrolą syntetycznego wczesnego promotora, EP2, w genomowym częściowym fragmencie N H. III RPV. Zastosowano wektor homologii 1005-95.1, aby utworzyć RPV 055 wykorzystując procedurę rekombinacji homologicznej dla tworzenia rekombinowanego RPV, SPV, lub FHV. Geny CD80 i CD86 i β-galaktozydazy E. coli wprowadza się do oddzielnego i nie podstawowego częściowego fragmentu N Hind III RPV. Geny CMV-genom FIV i β-glukuronidazy wprowadza się oddzielnego i nie będącego podstawowym częściowego fragmentu U Hind III RPV.
RPV 055 otrzymano od RPV 045. Osiągnięto to korzystając z wektora homologii 1005-95.1 i wirusa RPV 045 w procedurze rekombinacji homologicznej dla tworzenia rekombinowanego RPV,SPV lub FHV. Wyjściową masę transfekcyjną przesiano stosując przesiew pod względem rekombinowanego SPV z ekspresją β-galaktozydazy (BLUOGAL i CPRG testy) lub β-glukuronidazy (test X-GLUC). Końcowym rezultatem wielu okrążeń oczyszczania metodą niebieskiej/zielonej łysinki był rekombinowany wirus RPV 055.
RPV 055 testowano pod względem ekspresji FeLVgag, otoczki FeLV z genomu FIV i genów markerowych, β-galaktozydazy i β-glukuronidazy w analizie czarnej łysinki. 100% łysinek utworzonych z komórek VERO zakażonych oczyszczonym RPV 055, określono jako wykazujące ekspresję FeLgag i otoczki FeLV, przy użyciu koziego przeciwciała poliklonalnego dla FeLVgag (Biodesign, ME) i mysiego przeciwciała monoklonalnego otoczki FeLV, gp70 (Biodesign, ME).
Ekspresję kociego CD80 i CD86 potwierdzono w analizie Western blot przy użyciu kozich przeciwciał poliklonalnych przeciwko ludzkim, odpowiednio CD80 i CD86 (R&D Systems, MN). Wykryto wielokrotne wstęgi w zakresie wielkości od 30 kDa do 60 kDa specyficzne dla kociego CD80, i wykryto wielokrotne wstęgi w zakresie od 40 kDa do 70 kDa specyficzne dla kociego CD86. Wstęgi te reprezentują występujące na przemian i wielokrotne wzory glikozylacji CD80 i CD86 o ekspresji w kontekście RPV, w komórkach VERO. Ekspresję białek kodowanych w genomie FIV potwierdzono w analizie Western blot przy użyciu surowic kocich zakażonych z FIV.
Odniesienia
1. Argyle, i inni, DNA Sea. 5, 169-171 (1995).
2. Azuma, M., i inni, J. Immunology 149, 1115-1123 (1992).
3. Azuma, M., i inni, Nature 366, 76-79 (1993).
4. Chambers, i inni, Current Opinion in Immunology 9, 396-404. (1997)
5. Chen, i inni, J. Immunology 148, 2617-2621 (1992). 6. Chen, i inni, Cell 71, 1093-1102 (1992).
7. Donnelly JJ, i inni, Annu Rev Immunol 1997; 15: 617648
8. Freeman, i inni, J. Immunology 143 2714-2722 (1989).
9. Freeman, i inni, J. Exp. Med. 174, 625-631 (1991).
10. Gimmi, i inni, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88, 65756579 (1991).
11. Hathcock, i inni, J. of Exp. Med. 180, 631-640 (1994)
12. Hassett and Whitton, Trends Microbiol 1996; 4: 307-312.)
13. Linsley, i inni, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, 5031-5035 (1990).
14. Jenkins, i inni, J. Immunology 147,. 2461-2466 (1991).
15. Onions i inni, Zgłoszenie międzynarodowe PCT WO 96/03435, Q-One Biotech, 8 luty 1996.
16. Riley, i inni, J. Immunology 158, 5545-5553 (1997).
17. Tsuji, i inni, Eur J Immunology 27(3), 782-787 (1997).
18. Zgłoszenie międzynarodowe PCT WO 92/00092, Bristol Myers Squibb.
19. Zgłoszenie międzynarodowe PCT WO 92/15671, Cytomed, Inc. 17 Września 1992.
20. Zgłoszenie międzynarodowe PCT WO 93/00431, Bristol Myers Squibb, 7 Stycznia 1993.
21. Akeson, A.L. i Woods, C.W. (1993). A fluorometric assay for the quantitation of cell adherence to endothelial cells. J. Immunol. Meth. 163, 181-185.
PL 199 359 B1
22. Allison, J.P., i Lanier L. (1987). The structure, serology, and function of the T-cell antigen receptor. Annu. Rev. Immunol. 5, 503-540.
23. Allison, J.P. (1994). CD28-B7 interaction in T-cell activation, Current Opinion Immunol. 6, 414-419. 24. Andersen, P., Morimoto, C., Breitmeyer, J.B., Schlossman, S.F. (1988). Regulatory interactions between members of the immunoglobulin superfamily. Immunol Todav 9, 199-203.
25. Antonia, S.J., Munoz,-Antonia, T., Soldevila, G., Miller, J., Flavell, R.A. (1995). B7-1 expression by a non-antigen presenting cell- derived tumor. Can. Res. 55, 2253-2256.
26. Arima, T., Rehman, A., Hickey, W., Flye, M. (1996). Inhibition by CTLA-4Ig of experimental allergic encephalomyelitis. J. Immunol. 156, 4917-4924.
27. Arruffo, A. i Seed, B. (1987). Molecular cloning of a CD28 cDNA by a COS cell expression system. Proc. Nat. Acad. Sci. USA 84, 8573-8577.
28. Asjo, B., Cefai, D., Debre, P., Dudoit, Y., Autran, B. (1993). A novel mode of human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1) activation: ligation of CD28 alone induces HIV-1 replication in naturally infected lymphocytes. J. Virol. 67, 4395-4398.
29. Azuma, M., Cayabyab, M., Buck, M., Phillips, J.H., Lanier, L.L. (1992). Involvement of CD28 in MHC unrestricted cytotoxicity mediated by a human killer leukaemic cell line. J. Immunol. 149, 11151123.
30. Azuma, M., Yssel, H., Phillips, J.H., Spits, H., Lanier, L.L., (1993b) Functional expression of B7/2B1 on activated T-lymphocytes. J. Exp. Med. 177, 845-850.
31. Azuma, M., Cayabyab, M., Phillips, J.H., Lanier, L.L. (1993c). Requirements for CD28-dependant T cell-mediated cytotoxicity. J. Immunol. 150, 20912101.
32. Bajorath, J., Stenkamp, R., Aruffo, A. (1993). Knowledge based protein modeling: concepts and examples. Prot. Sci. 2,1798- 1810.
33. Bajorath, J., Peach, R., Linsley, P.S. (1994). Immunoglobulin fold characteristics of B7-1 (CD80) and B7-2 (CD86). Prot. Sci. 3, 2148-2150.
34. Balazano, C., Buonavista, N., Rouvier, E., Golstein, P. (1992) CTLA-4 and CD28: similar proteins, neighboring genes. Int. J. Can. Suppl. 7, 28-32.
35. Barcy, S., Wettendorf, M., Leo, O., Urbain, J., Kruger, M., Ceuppens, J.L., de Boers, M. (1995). FcR crosslinking on monocytes results in impaired T cell stimulatory capacity. Int. Immunol. 7, 179189.
36. Beale, D. (1985). A comparison of the amino acid sequences of the extracellular domains of the immunoglobulin superfamily. Possible correlations between conservancy and conformation. Comp Biochem Physiol. 80, 181-194.
37. Bellone, M., Iezzi, G., Manfredi, A.A., Protti, M. P., Dellabona, P., Casorati, G., Rugarli, C. (1994). In vitro priming of cytotoxic T lymphocytes against poorly immunogenic epitopes by engineered antigen presenting cells. Eur. J. Immun. 24, 26912698.
38. Berke, G. (1993). The functions and mechanisms of action of cytolytic lymphocytes. In „Fundamental Immunology”, (W. Paul), str. 965-1014. Nowy Jork: Raven Publ. 3-cie wydanie.
39. Berke, G. (1994). The binding and lysis of targeTcells by cytotoxic lymphocytes. Annu. Rev. of Immunol. 12, 735-773.
40. Boise, L.H., Minn, A.J., Noel, P.J., June, C.H., Accavitti, M., Lindstein, T., Thompson, C.B. (1993). CD28 costimulation can promote T cell survival by enhancing the expression of Bcl-xL. Immunity 3, 87-89.
41. Brinchmann, J.E., Doblung, J.H., Heger, B.H., Haaheim, L.L., Sannes, M., Egeland, T. (1994). Expression of costimulatory molecule CD28 on Tcells in human immunodeficiency virus type 1 infection: functional and clinical coorelations. J. Inf Dis. 169, 730-738.
42. Brown, W.C., Bissey, L., Logan, K.S., Pedersen, N.C., Elders, J.H., Collisson, E.W. (1991). Feline immunodeficiency virus infects both CD4+ and CD8+ T-lymphocytes.-J. of Virol. 62, 3359- 3364.
43. Buck, C.A. (1992). Immunoglobulin Superfamily: structure function and relationship to other receptor molecules. Semin. Celi Biol. 3, 179-188.
44. Buelens, C., Willems, F., Delvaux, A., Pierard, G., Delville, J.P., Velu, T., Goldman, M. (1995). Interleukin 10 differentially regulates B7-1 (CD80) and B7-2 (CD86) expression on human peripheral blood dendritic cells. Eur. J. Immunol. 25, 26682675.
45. Caruso, A., Cantalamessa, A., Licenziati, S., Peroni, L., Prati, E., Martinelli, F., Canaris, A.D., Folghera, S., Gorla, R., Balsari, A. (1994). Expression of CD28 on CD8+ and CD4 lymphocytes during HIV infection. Scan. J. Immunol. 40, 485-490.
PL 199 359 B1
46. Cerdan, C., Martin, Y., Brailly, H., Courcoul, M., Flavetta, S., Costello, R., Mawas, C., Birg, F., Olive, D. (1991). IL-1 is produced by T lymphocytes activated via the CD2 plus CD28 pathways. J. Immunol. 146, 560-564.
47. Chen, L., Linsley, P.S., Hellstrom, K.E. (1993). Costimulation of T cells for tumor immunity. Immunol. Today 14, 483-486.
48. Chesnut, R.W. and Grey, H.M. (1986). Antigen presentation by B cells and its significance in T-B interactions. Adv. Immunol. 39, 51-59.
49. Clark, S.J., Saag M.S., Decker, W.D., Campbell, H.S., Roberson, J.L., Veldkamp, P.J. (1991). High titers of cytopathic virus in plasma of patients with symptoms of primary HIV-1 infection. N. Ena. J. Med. 324, 954-960.
50. Clayberger, C., Lyu, S.C., DeKruyff, R., Parham, P., Krensky, A.M. (1994). Peptides corresponding to the CD8 and CD4 binding domains of HLA molecules block T-lymphocyte immune responses in vitro. J. Immunol. 153, 946-951.
51. Clevers, H., Alarcon, B., Wileman, T., Terhorst, C. (1988). The T-cell receptor-CD3 complex: A dynamie protein ensemble. Annu. Rev. Immunol. 6, 629-662.
52. Connor, R.I., Mohri, H., Cao, Y., Ho, D.D. (1993). Increased viral burden and cytopathicity correlate temporally with CD4+T- lymphocyte decline and clinical progression in human immunodeficiency virus type 1-infected individuals. J Virol. 67, 1772-1777.
53. Cooper, D.A., Tindall, B., Wilson, E.J., Imreie, A.A., Penny, R. (1988). Characterization of Tlymphocyte responses during primary infection with human immunodeficiency virus. J. Inf. Dis. 157, 889-896.
54. Damie, N.K., Doyle, L.V., Grossmaire, L.S., Ledbetter, J.A. (1988). Differential regulatory signals delivered by antibody binding to the CD28 molecule during the activation of human T lymphocytes. J. Immundl. 140, 1753-1761.
55. Damle, N.K., Klussman, K., Leytze, G., Martial, S., Arruffo, A., Ledbetter, J.A., Linsley, P.S. (1994). Costimulation of lymphocytes with integrin ligands ICAM-1 or VCAM-1 induces fuctional expression of CTLA-4 a second receptor for B7. J. Immunol. 152, 2686-2697.
56. Davis, M.M. and Ejorkman, P.K. (1988). T-cell antigen receptor genes and T-cell recognition. Nature 334, 395-402.
57. de Boer, M., Kasran, A., Kwekkeboom, J., Walter, H., Vandenberghe, P., Ceuppens, J.L. (1993). Ligation of B7 with CD28/CTLA-4 on T-cells results in CD40 ligand expression, interleukin-4 secretion
58. deWaal Malefyt, R., Yssel, H., de Vries, J.E. (1993). Direct effects of IL-10 on subsets of human CD4+ T cell clones and resting T cells. Specific inhibition of I1-2 production and proliferation. J. Immunol. 150; 4754-4765.
59. Ding, L., Linsley, P.S., Huang, L.Y., Germain, R.N., Shevach, E.M. (1993). IL-10 inhibits macrophage costimulatory activity by selectively inhibiting up regulation of B7 expression. J. Immunol.
151, 12241234.
60. Driscoll, P.C., Cyster, J., Campbell, I., Williams, A. (1991). Structure of domain 1 of rat Tlymphocyte CD2 antigen. Nature 353, 762-765.
61. Ellis, J.H., Burden, M., Vinogradov, D., Linge, C., Crowe,. J. (1996). Interactions of CD80 and CD86 with CD28 and CTLA-4. J. Immunol. 155, 2700-2709.
62. Englehard, V.H. (1994). Structure of peptides associated with MHC class I molecules. Curr. Op. Immunol. 6, 13-21.
63. English, R.V., Nelson, P., Johnson, C.M., Nasisse, M., Tompkins, W.A., Tompkins, M.B. (1994). Development of clinical disease in cats experimentally infected with feline immunodeficiency virus. J. Inf. Dis. 170, 543-552.
64. Fauci, A. S. i Dale, D. C. (1975). The effect of hydrocortisone on the kinetics of normal human lymphocytes. Blood 46, 235-243.
65. Fauci, A., Macher, A., Longo, D., Lane, H., Rook, A., Masur, H., Gelmann, E. (1984). Aquired immunodeficiency syndrome: epidemiological, clinical, immunological and therapeutic considerations. Ann. Int. Med. 100, 92-106.
66. F.A. Ferrari, i inni, Journal of Bacteriology (1985) 161, 556-562.
67. Fong, T.A. and Mosmann, T.R. (1990). Alloreactive murine CD8+ T cell clones secrete the Thl pattern of cytokines. J Immunol. 144, 1744-1752.
PL 199 359 B1
68. Fouchier, R.A., Meyaard, L., Brouwer, M., Hovenkamp, E., Schuitemaker, H. (1996). Broader tropism and higher cytopathicity for CD4+ T-cells of asyncytiuminducing compared to a non-syncytium-inducing HIV-1 isolate as a mechanism for accelerated CD4+ T cell decline in vivo. Virology 219, 8795.
69. Freedman, A.S., Freeman, G., Horowitz, J.C., Daley, J., Nadler, L.M. (1987). A B-cell restricted antigen that identifies preactivated B cells. J. Immunol. 139, 3260-3267.
70. Freeman G.J., Borriello, F., Hodes, R.J., Reiser, H., Hathcock, K.S., Laszlo, G., McKnight, A.J., Kim,- J., Du, L., Lombard, D.B., Gray, G.S., Nadler, L.M., Sharpe, A.H. (1993). Uncovering a functional alternative CTLA-4 counter receptor in B7-1 deficient mice. Science 262, 907-909.
71. Gajewski, T. F., Schell, S.R., Nau, G., Fitch, F. W. (1989). Regulation of T-cell activation: Differences among T-cell subsets. Immunol Rev. 111, 79-110.
72. Germain, R.N. (1993). The Biochemistry and cell biology of antigen processing and presentation. Annu. Rev. Immunol. 11, 403- 450.
73. Haffar, O.K., Smithgall, M.D., Bradshaw, J., Brady, W., Damle, N.K., Linsley, P.S. (1993). Costimulation of T-cell activation and virus production by B7 antigen on activated CD4+ T-cells from human immunodeficiency virus type 1-infected donors. Immunology 90, 11094-11098.
74. Harlan, D.M., Abe, R., Lee, K.P., June, C.H. (1995). Potential roles of the B7 and CD28 receptor families in autoimmunity and immune evasion. Clin. Immunol. Immunopath. 75, 99-111.
75. Hodge, J.W., Abrami, S., Schlom, J., Kantor, J.A. (1994). Induction of antitumor immunity by recombinant vaccinia viruses expressing B7-1 or B7-2 costimulatory molecules. Can. Res. 54, 5552-5555.
76. Hutchcroft, J.E. i Bierer, B.E. (1996). Signaling through CD28/CTLA-4 family receptors. J. Immunol. 155, 4071-4074.
77. M.A. Innis, i inni, PCR Protocols: A Guide to methods and Applications, Academic Press, Inc., San Diego (1990).
78. Jenkins, M.K., Pardoll, D.M., Mizuguchi, J., Quill, H., Schwartz, R.H. (1987). T cell responsiveness in vivo and in vitro: Fine specificity of induction and molecular characterisation of the unresponsive state. Immunol. Rev. 95, 113-135.
79. June, C.H., Ledbetter, J.H., Linsley, P.S., Thompson, C.B. (1990). Role of the CD28 molecule in T-cell activation. Immunol. Today 11, 211-216.
80. June, C.H., Bluestone, J.A., Nadler, L.M., Thompson, C.B. (1994). The B7 and CD28 receptor families. Immunol. Today 12, 321-333.
81. Knight, J.C., i inni, (1992), Virology 190, 423-433.
82. Kozber, D., Moretta, A., Messner, H.A., Moretta, L., Croce, C.M. (1987). Tp44 molecules involved in antigenindependant T cell activation are expressed on human plasma cells. J. Immunol. 138, 4128-4132.
83. Kupfer, A. and Singer, S. J. (1989). Cell biology of cytotoxic and helper T-cell functions. Annu. Rev. Immunol. 7, 309-337.
84. Landay, A.L., Mackewicz, C.E., Levy, J.A. (1993). An activated CD8+ T cell phenotype coorelates with an anti-HIV activity and assymptomatic clinical status. Clin Immun. Immunopath. 69, 106-116.
85. Lane, P., Burdet, C., Hubele, S., Scheidegger, D., Muller, U., McConnell, F., Kosco-Vilbois, M. (1994). B cell function in mice transgenic for mCTLA4-H gamma 1: lack of germinal centers correlated with poor affinity maturation and class switching despite normal priming of CD4+ T-cells. J EXp Med. 179, 819-830.
86. Lanier, L.L., O'Fallon, S., Somoza, C., Phillips, J.H., Linsley, P.S., Okumura, K., Ito, D., Azuma, M. (1995). CD80 (B7) and CD86 (B70) provide similar costimulatory signals for T cell proliferation, cytokine production, and generation of CTL. J. Immunol. 154, 97-105.
87. Larsen, C.P., Ritchie, S.C., Pearson, T.C., Linsley, P.S., Lowry, R.P. (1992). Functional expression of the costimulatory molecule B7/BB1 in murine dendritic cell populations. J. Ex~p. Med. 176, 12151220.
88. Leahy, D., Axel, R., Hendrickson, W. (1992). Crystal structure of a soluble form of human T cell counter receptor CD8 at 2.8 resolution. Cell 68, 1145-1162.
89. Lechler, R.I., Lombardi, G., Batchelor J.R., Reinsmoen N., Bach, F.H. (1990). The molecular basis of alloreactivity. Annu. Rev. Immunol. 10, 83-88.
PL 199 359 B1
90. Lenschow, D.J., Su, G.H-T., Zuckermann, L.A., Nabavi, N., Jellis, C.L., Gray, G.S., Miller, J., Bluestone, J.A. (1993). Expression and functional significance of an additional ligand for CTLA-4. Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 90. 11054-11058.
91. Lenschow, D.J., Walunas, T.L., Bluestone, J.A. (1996). CD28/B7 system of T cell costimulation. Annu. Rev. Immunol. 14 233-258.
92. Leung, H.T. i Linsley, P.S. (1994). The CD28 costimulatory pathway. Therap. Immunol 1, 217-228. 93. Lewis, D.E., Ng Tang, D.S., Adu-Oppong, A., Schober, W., Rodgers, J. (1994). Anergy and apoptosis in CD8+ T-cells from HIV infected persons. J. Immunol. 153, 412-420.
94. Li, Y., McGowan, P., Hellstrom, I., Hellstrom, K.E., Chen, L. (1994). Costimulation of tumor reactive CD4 and CDS T-lymphocytes by B7 a natural ligand for CD28 can be used to treat established mouse melanoma. J. Immunol. 153, 421-428.
95. Lindsten, T., Lee, K.P., Harris, E.S., Petryniak, B., Craighead, N., Reynolds, P.J., Lombard, D.B., Freeman, G.J., Nadler, L.M., Gray, G.S. (1993). Characterization of CTLA-4 structure and expression on human T-cells. J. Immunol. 151, 3489-3499.
96. Linsley, P.S., Brady, W., Urnes, M., Grosmaire, L.S., Damle, N.K., Ledbetter, J.A. (1991a). Binding of the B-cell activation antigen B7 to CD28 costimulates T-cell proliferation and Interleukin-2 mRNA accumulation. J. Exp. Med. 173, 721-730.
97. Linsley, P.S., Brady, W., Urnes, M., Grosmaire, L. S., Damle, N. K., Ledbetter, J. A. (1991b). CTLA-4 is a second receptor for the B-cell activation antigen B7. J. Exp. Med. 174, 561-569.
98. Linsley, P. S., Wallace, P.M., Johnson, J., Gibson, M.G., Greene, J.L., Ledbetter, J. A., Singh, C., Tepper, M.A. (1992a). Immunosuppression in vivo by a soluble form of the CTLA-4 T cell activation molecule. Science 257, 792-795.
99. Linsley, P.S., Greene, J.L., Tan, P., Bradshaw, J., Ledbetter, J.A., Anasetti, C., Damle, N.K. (1992b). Coexpression and functional cooperation of CTLA-4 and CD28 on activated T-lymphocytes. J. Exp. Med. 176, 1595-1604.
100. Linsley, P. S. i Ledbetter, J. A. (1993a). The role of CD28 receptor during T cell responses to antigen. Ann. Rev. Immunol. 11, 191-212.
101. Linsley, P.S., Bradshaw, J., Urnes, M.., Grosmaire, L., Thompson, C. B. (1993b). CD28 engagement by B7/BB-1 induces transient down-regulation of CD28 synthesis and prolonged unresponsiveness to CD28 signaling. J. Immunol. 150, 3161-3169.
102. Linsley, P.S., Greene, J.L., Brady, W., Bajorath, J., Ledbetter, J.A., Peach, R. (1994a). Human B7-1 (CD80) and B7-2 (CD86) bind with similar avidities but distinct kinetics to CD28 and CTLA- 4 receptors. Immunity 1, 793-801.
103. Linsley, P.S., Peach, R., Gladstone, P., Bajorath, J. (1994b). Extending the B7(CD80) gene family. Prot. Sci. 3, 1341-1343.
104. Linsley, P.S., Ledbetter, J., Peach, R., Bajorath, J. (1995a). CD28/CTLA-4 receptor structure, binding stoichiometry and aggregation during T cell activation. Res. Immunol. 146, 130-140.
105. Linsley, P.S., Nadler, S.G., Bajorath, J., Peach, R., Leung, H.T., Rogers, J., Bradshaw, J., Stebbins, M., Leytze, G., Brady, W., Malacko, A.R., Marquardt, H., Shaw, S. (1995b). Binding stoichiometry of the cytotoxic T-lymphocyteassociated molecule-4 (CTLA- 4). J. Biol. Chem. 270, 15417-15424.
106. Littman, D.R. (1987). The structure of the CD4 and CD8 genes. Annu. Rev. Immunol. 5, 561-584.
107. Liu, C.C., Welsh, C.M., Young, J. D-E. (1995). Perforin: Structure and function. Immunol. Today 16, 194-201.
108. Liu, Y., Jones, B., Brady, W., Janeway, C.A., Linsley, P. (1992) . Murine CD4 T cell growth: B7 and heat stable antigen both participate in costimulation. Eur. J. Immunol. 115, 1905-1912.
109. Lombardi, S., Garzelli, C., Pistello, M., Massi, C., Matteucci, D., Baldinotti, F., Cammarota, G., Da Prato, L., Bandecchi, P., Tozzini, F., Bendinelli, M. (1994). A neutralizing antibody-inducing peptide of the V3 domain of feline immunodeficiency virus envelope glycoprotein does not induce protective immunity. J. Virol. 68, 8374-8379.
110. Lu, Y., Granelli-Piperno, A., Bjorndahl, J.M., Phillips, C.A., Trevillyan J.M. (1992). CD28induced T cell activation. Evidence for a protein-tyrosine kinase signal transduction pathway. J Immunol. 149, 24-29.
111. Luria, S.E. i Darnell, J.E. (1968). „General Virology” New York: John Willey and Sons, Inc.
112. Lwoff, A. (1957). The concept of virus. J. Gen. Microbiol. 17, 239-253.
PL 199 359 B1
113. Maniatis, T., Fritsch, E.F., and Sambrook, J. (1982). „Molecular Cloning: A Laboratory Manual.” New York: Cold Spring Harbor Press.
114. Martin, P.J., Ledbetter, J.A., Morishita, Y., June, C.H., Beatty, P.J., Hansen, J.A. (1986). A 44 kilodalton cell surface homodimer regulates, interleukin 2 production by activated human T lymphocytes. J. Immunol. 136, 3282-3287.
115. Matasumura, M., Fremont, D.H., Peterson, P.A., Wilson, I.A. (1992). Emerging principles for the recognition of peptide antigens by MHC class I molecules. Science 257, 927-934.
116. Mescher, M.F. (1992). Surface contact requirements for activation of cytotoxic T-lymphocytes. J. Immunol. 49, 2402-2405.
117. Minty, A., Chalon, P., Derocq, J.M., Dumont, X., Guillemot, J.C., Kaghad, M., Labit, C., Leplatois, P., Liauzun, P., Miloux, B., Minty, C., Casellas, P., Loison, G., Lupker, J., Shire, D., Ferrara, P., Caput, D., (1993). Interleukin 13 is a new human lymphokine regulating inflammatory and immune responses. Nature 362, 248-250.
118. Moffett, C.W. i Paden, C.M. (1994). Microglia in the rat neurohypophysis increase expression of class I major histocompatibility antigens following central nervous system injury. J Neuroimmunol. 50, 139-51.
119. Mosmann, T. i Coffman, R.L. (1989). TH1 and TH2 cells: Different patterns of lymphokine secretion lead to different functional properties. Annu. Rev. Immunol. 7, 145-173.
120. Nabavi, N., Freeman, G.J., Gault, D., Godfrey, G.N., Nadler, L.M., Glimcher, L.M. (1992). Signaling through the MHC CII cytoplasmic domain is required for antigen presentation and induces B7 expression. Nature 360, 266-268.
121. Nagata, S. and Golstein, P. (1995). The Fas death factor. Science 267, 1449-1465.
122. Nickoloff, B.J., Mitra, R.S., Lee, K., Turka, L.A., Greem, J., Thompson, C., Shimizu, Y. (1993). Discordant expression of CD28 ligands BB-1 and B7 on keratinocytes in vitro and psoriatic cells in vivo. Am J. Path. 142, 1029-1040.
123. Novotney, C., English, R., Housman, J., Davidson, M., Nasisse, M., Jeng, C.R. (1990). Lymphocyte population changes in cats naturally infected with feline immunodeficiency virus. AIDS 4, 1213-1218.
124. O'Doherty, U., Steinman, R.M., Peng, M., Cameron, P.U., Gezelter, S., Kopeloff, I., Swiggard, W.J., Pope, M., Bhardwaj, N. (1993). Dendritic cells freshly isolated from human blood express CD4 and mature into typical immunostimulatory dendritic cells after culture in monocyte-conditioned media. J. Exp. Med. 178, 1067-1076.
125. Ozawa, H., Aiba, S., Nakagawa, S., Tagami, H. (1995). Interferon gamma and interleukin 10 inhibit antigen presentation by Langerhan's cells for T helper type 1 cells by suppressing their CD80 (B71) expression. Eur. J. Immunol. 26 648-652.
126. Page, C., Thompson, C., Yacoub, M., Rose, M. (1994). Human endothelial stimulation of allogenic T-cells via a CTLA-4 independant pathway. Trans. Immunol. 2, 342-347.
127. Peach, R., Bajorath, J., Brady, W., Leytze, G., Greene, J., Naemura, J., Linsley, P. S. (1994). CDR1 and CDR3-analogous regions in CTLA-4 and CD28 determine the binding to B7-1. J. Exp. Med. 180, 2049-2058.
128. Peach, R., Bajorath, J., Naemura, J., Leytze, G., Greene, J., Aruffo, A., Linsley, P.S. (1995). Both extracellular immunoglobulin-like domains of CD80 contain residues critical for binding T-cell surface receptors CTLA-4 and CD28. J. Biol. Chem. 270, 21181-21187.
129. Pedersen, N.C., Ho, E., Brown, M.L., Yamamoto, J.K. (1987). Isolation of a T lymphotrophic virus from domestic cats with an immunodeficiency like syndrome. Science 235, 790-793.
130. Prasad, K.V., Cai Y.C., Raab, M., Duckworth, B., Cantley, L., Shoelson, S.E., Rudd, C.E. (1994). Tcell antigen CD28 interacts with the lipid kinase phosphatidylinositol3-kinase by a cytoplasmic Tyr(P)-Met-Xaa-Met motif. Proc Natl Acad Sci USA. 91, 2834-2838.
131. Radvanyi, L.G., Shi, Y., Vaziri, H., Sharma, A., Dhala, R., Mills, G.B., Miller, R.G. (1996). CD28 costimulation inhibits TCR-induced apoptosis during a primary T cell response. J. Immunol. 158, 17881798.
132. Ranheim, E.A. and Kipps, T. J. (1995). Tumor necrosis factor-alpha facilitates induction of CD80 (B7-1) on human B cells by activated T-cells: complex regulation by IL--4, IL-10, and CD40L. Cell. Immunol. 161, 226-235.
PL 199 359 B1
133. Razi-Wolf, Z., Freeman, G., Galvin, F., Benacerraf, B., Nadler, L., Reiser, H. (1992). Expression and function of the murine B7 antigen and the major costimulatory molecule expressed by peritoneal exudate cells. Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 89, 42104214.
134. Ronchese, F., Hausmann, B., Hubele, S., Lane, P. (1994). Mice transgenic for a soluble form of murine CTLA-4 show enhanced expansion of antigenspecific CD4 + T-cells and defective antibody production in vivo. J. Exp Med. 179, 809-817.
135. Rotzschke, O. i Falk, K. (1994). Origin structure and motifs of naturally processed MHC class II ligands. Curr. Op Immunol. 6, 45-51.
136. Russel, J.H. (1983). Internal disintegration model of cytotoxic lymphocyte induced target damage. Immunol. Rev. 72, 97-118.
137. Sambrook, i inni, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989).
138. Current Protocols in Molecular Biology (Eds. Aufubel, Brent, Kingston, More, Feidman, Smith and Stuhl, Greene Publ. Assoc., Wiley-Interscience, NY, NY, 1992).
139. Saukkonen, J.J., Kornfield, H., Berman, J-.S. (1993). Expansion of a CD8+CD28+cell population in the blood and lung of HIV-positive patients. JAIDS 11, 1194-1199.
140. Schattner, E. i Laurence, J. (1994). HIV induced T-lymphocyte depletion. Clin. Lab. Med. 14, 221-227. 141. Schmittel, A., Scheibenbogen, C., Keilholz, U. (1995). Lipopolysaccharide effectively up-regulates B7-1 (CD80) expression and costimulatory function of human monocytes. Scan. J. Immunol. 42, 701-704.
142. Schwartz, R.H. (1992). Costimulation of Tlymphocytes: the role of CD28, CTLA-4 and B7/BB1 in interleukin-2 production and immunotherapy. Cell 71, 1065-1068.
143. Seder, R.A., Germain, R.N., Linsley, P.S., Paul, W.E. (1994). CD28 mediated co-stimulation of IL-2 production plays a critical role in T cell priming for IL-4 and IFNg production, J. Exp Med. 179, 299-304.
144. Shahinian, A., Pfeffer, K., Lee, K.P., Kundig,T.M., Kishihara, K., Wakeham, A., Kawai, K., Ohashi, P.S., Thompson, C.B., Mak, T.B. (1993). Differential T cell costimulatory requirements in CD28 deficient mice. Science 261, 609-612.
145. Sher, A., Gazzinelli, R.T., Oswald, I.P., Clerici, M., Kullberg, M., Pearce, E.J., Berzofsky, J.A., Mosmann, T.R., James, S.L., Morse, H.C. (1992). Role of T-cell derived cytokines in the down regulation of immune responses inparasitic and retroviral infection. Immunol Rev. 127, 183-204.
146. Siebelink, K.H., Chu, I.H., Rimmelzwaan, G.F., Weijer, K., van Herwijnen, H.R., Knell, P. (1990). Feline Immunodeficiency virus (FIV) infection in the cat as a model for HIV infection in man: FIV induced impairment of immune function. AIDS Res. Hum. Retroviruses 6, 1373-1378.
147. Siebelink, K.H., Tijhaar, E., Huisman, R.C., Huisman, W., deRonde, A., Darby, I.H., Francis, M.J., Rimmelzwaan, G.F., Osterhaus, A.D. (1995). Enhancement of feline immunodeficiency virus infection after immunization with envelope glycoprotein subunit vaccines. J Virol. 69, 3704-3711.
148. Singer, S. J. (1992). Intracellular communication and cell:cell adhesion. Science 255, 1671-1674.
149. Smithgall, M.D., Wong, J.G., Linsley, P.S., Haffar, O.K. (1995). Costimulation of CD4+Tcells via CD28 modulates human immunodeficiency type l infection and replication in vitro. AIDS Res. Hu. Retro. 11, 885-892.
150. Springer, T.A., Dustin, M.L., Kishimoto, T.K., Marlin, S.D. (1987). The lymphocyte function associated LFA-1, CD2 and LFA-3 molecules: cell adhesion receptors of the immune system. Annu. Rev. Immunol. 5, 223-252.
151. Springer, T.A. (1990). Adhesion receptors of the immune system. Nature 346, 425-434.
152. Stack, R.M., Lenschow, D.J., Gray, G.S., Bluestone, J.A., Fitch, F.W. (1994). IL-4 treatment of small spienic B cells induces co- stimulatory molecules B7-1 and B7-2. J. Immunol. 152, 5723-5733.
153. Symington, F. W., Brady, W., Linsley, P. S. (1993). Expression and function of B7 on human epidermal Langerhan's cells. J. Immunol. 150, 1286-1295.
154. Taylor, M.K. i Cohen, J.J. (1992). Cell mediated cytotoxicity. Curr. Opin. Immunol. 4, 338-343.
155. Thomas, R., Davi, L.S., Lipsky, P.E. (1994). Rheumatoid synovium is enriched in mature antigen presenting dendritic cells. J. Immunol. 152, 26132623'.
PL 199 359 B1
156. Townsend, S.E., i Allison, J.P. (1993). Tumor rejection after direct costimulation of CD8+ T-cells by B7 transfected melanoma cells. Science 259, 368370.
157. Turka L.A., Ledbetter, J.A., Lee, K., June, C.H., Thompson, C.B. (1990). CD28 is an inducible T cell surface antigen that transduces a proliferative signal in CD3i mature thymocytes. J. Immunol. 144, 1646-1653.
158. Turka, L.A., Linsley, P.S., Paine, R., Schieven, G.L., Thompson, C.B., Ledbetter, J.A. (1991). Signal transduction via CD4, CD8 and CD28 in mature and immature thymocytes. J. Immunol. 146, 1428-1436.
159. Unanue, E.R. (1984). Antigen presenting function of the macrophage. Annu. Rev. Immunol. 2, 395-428.
160. van Kooten, C., Rensink, I., Pascual,-Salcedo, D., van Oers, R., Aarden, L. (1991). Monokine production by human T-cells: IL-1 alpha production is limited to memory T-cells. J. Immunol. 146, 2654-2658.
161. van Seventer, G.A., Shimizu, Y., Shaw,-S. (1991). Roles of multiple accessory molecules in T cel activation. Curr. Opin Immunol. 3, 294-303.
162. Wang, R., Murphy, K.M., Loh, D.Y., Weaver, C., Russell, J.H. (1993). Differential activation of antigen-stimulated suicide and cytokine production pathways in CD4+ T-cells is regulated by the antigen-presenting cell. J Immunol. 150, 3832-42.
163. Weiss, A. i Littman, D.R. (1994). Signal transduction by lymphocyte antigen receptors. Cell 76, 263-274.
164. Williams, A. i Barclay, A. (1988). The immunoglobulin superfamily-domains for cell surface recognition. Ann. Rev. Immunol. 6, 381-405.
165. Windhagen, A., Newcombe, J., Dangond, F., Strand, C., Woodroofe, M.N., Cuzner, M.L., Hafler, D.A. (1995). Expression of costimulatory molecules B7-1 (CD80), B7-2 (CD86) and interleukin 12 in multiple schlerosis lesions. J. Exp. Med. 182, 1985-1996.
166. Yamamoto, J.K., Hansen, H., Ho, W.E., Morishita, T.Y., Okuda, T., Sawa, T.R. (1989). Epidemiological and clinical aspects of feline immunodeficiency virus infection in cats from the Continental United States and Canada and possible mode of transmission. J.A.V.M.A. 194, 213-220.
167. Yasukawa, M., Inatsuki, A., Kobayashi, Y. (1989). Differential in vitro activation of CD4+CD8- and CD8+CD4-herpes simplex virus-specific human cytotoxic T-cells. J. Immunol. 143, 2051-2057.
168. Yssel, H., Schneider, P.V., Lanier, L.L. (1993). Interleukin 7 specifically induces B7/BB1 antigen on human cord blood and peripheral blood T-cells and T cell clones. Int. Immunol. 5, 753-759.
169. Zanussi, S., Simonelli, C., D'Andrea, M., Caffau, C., Clerici, M., Tirelli, U., DePaoli, P. (1996). CD8+lymphocyte phenotype and cytokine production in long-term non-progressor and in progressor patients with HIV-1 infection. Clin. Exp. Immunol. 105, 220224.
170. Zhou, T., Weaver, C., Linsley, P.S., Mountz, J.D. (1994). T-cells of stapphylococcal enterotoxin Btolerized autoimmune MRL- Ipr/lpr mice require costimulation through the 97- CD28/CTLA-4 pathway for activation and can be reanergized in vivo by stimulation of the T cell receptor in the absence of costimulatory signal. Eur. J. Immunol. 24, 1019-1025.
PL 199 359 B1
Lista sekwencji <110> Winslow, Barbara J.
Cochran, Mark D.
<12O> Rekombinowany wirus o ekspresji obcego DNA kodującego koci CD80, koci CD86, koci CD28, koci CTLA-4 lub koci interferon-gamma i jego zastosowania <130> 54957-B -PCT <140> Jeszcze nie znany <141> 1999-04-30 <150> 09/071,711 .
<151> 1998-05-01 <160> 82 <170> Patentln Ver. 2.0 <210> 1 <211> 941 · <212> DNA <213> koci CD80 <220>
<221> CD-I <222> (1)..(876) <400> 1
atg ggt cac gca gca aag tgg aaa aca cca eta ctg aag cac cca tat 48
Met Gly His Ala Ala Lys Trp Lys Thr Pro Leu Leu Lys His Pro Tyr
1 5 10 15
ccc aag ctc ttt ccg ctc ttg atg eta get agt ctt ttt tac ttc tgt 96
Pro Lys Leu Phe Pro Leu Leu Met Leu Ala Ser Leu Phe Tyr Phe Cys
20 25 30
tca ggt atc atc cag gtg aac aag aca gtg gaa gaa gta gca gta eta 144
Ser Gly Ile Ile Gin Val Asn Lys Thr Val Glu Glu Val Ala Val Leu
35 40 45
PL 199 359 B1
tcc tgt gat tac aac att tcc acc aaa gaa ctg acg gaa att ega atc 192
Ser Cys Asp Tyr Asn Ile Ser Thr Lys Glu Leu Thr Glu Ile Arg Ile
50 55 60
tat tgg caa aag gat gat gaa atg gtg ttg gct gtc atg tct ggc aaa 240
Tyr Trp Gin Lys Asp Asp Glu Met Val Leu Ala Val Met Ser Gly Lys
65 70 75 80
gta caa gtg tgg ccc aag tac aag aac cgc aca ttc act gac gtc acc 288
Val Gin Val Trp Pro Lys Tyr Lys Asn Arg Thr Phe Thr Asp Val Thr
85 ! 90 95
gat aac cac tcc att gtg atc atg gct ctg cgc ctg tca gac aat ggc 336
Asp Asn His Ser Ile Val Ile Met Ala Leu Arg Leu Ser Asp Asn Gly
100 105 110
aaa tac act tgt att att caa aag att gaa aaa ggg tct tac aaa gtg 384
Lys Tyr Thr Cys Ile Ile Gin Lys Ile Glu Lys Gly Ser Tyr Lys Val
115 120 125
aaa cac ctg act tcg gtg atg tta ttg gtc aga gct gac ttc cct gtc 432
Lys His Leu Thr Ser Val Met Leu Leu Val Arg Ala Asp Phe Pro Val
130 135 140
cct agt ata act gat ctt gga aat cca tct cat aac atc aaa agg ata 480
Pro Ser Ile Thr Asp Leu Gly Asn Pro Ser His Asn Ile Lys Arg Ile
145 150 155 160
atg tgc tta act tct gga ggt ttt cca aag cct cac ctc tcc tgg ctg 528
Met Cys Leu Thr Ser Gly Gly Phe Pro Lys Pro His Leu Ser Trp Leu
165 170 175
gaa aat gaa gaa gaa tta aat gcc atc aac aca aca gtt tcc caa gat 576
Glu Asn Glu Glu Glu Leu Asn Ala Ile Asn Thr Thr Val Ser Gin Asp
180 185 190
cct gaa act gag ctc tac act att agc agt gaa ctg gat ttc aat atg 624
Pro Glu Thr Glu Leu Tyr Thr Ile Ser Ser Glu Leu Asp Phe Asn Met
PL 199 359 B1
195 200 205
aca aac aac cat agc ttc ctg tgt ctt gtc aag tat gga aac tta eta 672
Thr Asn Asn His Ser Phe Leu Cys Leu Val Lys Tyr Gly Asn Leu Leu
210 215 220
gta tca cag atc ttc aac tgg caa aaa tca gag cca cag cct tct aat 720
Val Ser Gin Ile Phe Asn Trp Gin Lys Ser Glu Pro Gin Pro Ser Asn
225 230 235 240
aat cag ctc tgg atc att atc ctg agc tca gta gta agt ggg att gtt 768
Asn Gin Leu Trp Ile Ile Ile Leu Ser Ser Val Val Ser Gly Ile Val
245 250 255
gtg atc act gca ctt acc tta aga tgc eta gtc cac aga cct get gca 816
Val Ile Thr Ala Leu Thr Leu Arg Cys Leu Val His Arg Pro Ala Ala
260 265 270
agg tgg aga caa aga gaa atg ggg aga gcg cgg aaa tgg aaa aga tct 864
Arg Trp Arg Gin Arg Glu Met Gly Arg Ala Arg Lys Trp Lys Arg Ser
275 280 285
cac ctg tct aca tagattctgc agaaccactg tatgcagagc atctggaggt 916
His Leu Ser Thr
290 agcctcttta gctcttctct actag 941 <210> 2 <211> 292 <212> PRT <213> koci CD80 <400> 2
Met Gly His Ala Ala Lys Trp Lys Thr Pro Leu Leu Lys His Pro Tyr
1 5 10 15
Pro Lys Leu Phe Pro Leu Leu Met Leu Ala Ser Leu Phe Tyr Phe Cys
20 25 30
PL 199 359 B1
Ser Gly Ile Ile Gin Val Asn Lys
4 0
Ser Cys Asp Tyr Asn Ile Ser Thr
55
Tyr Trp Gin Lys Asp Asp Glu Met
70
Val Gin Val Trp Pro Lys Tyr Lys
Asp Asn His Ser Ile Val Ile Met
100
Lys Tyr Thr Cys Ile Ile Gin Lys
115 120
Lys His Leu Thr Ser Val Met Leu
130 135
Pro Ser Ile Thr Asp Leu Gly Asn
145 150
Met Cys Leu Thr Ser Gly Gly Phe
165
Glu Asn Glu Glu Glu Leu Asn Ala
180
Pro Glu Thr Glu Leu Tyr Thr Ile
195 200
Thr Asn Asn His Ser Phe Leu Cvs
210 215
Val Ser Gin Ile Phe Asn Trp Gin
225 230
Asn Gin Leu Trp Ile Ile Ile Leu
245
Val Ile Thr Ala Leu Thr Leu Arg
Thr Val Glu Glu Val Ala Val Leu
Lys Glu Leu Thr Glu Ile Arg Ile
Val Leu Ala Val Met Ser Gly Lys
80
Asn Arg Thr Phe Thr Asp Val Thr
95
Ala Leu Arg Leu Ser Asp Asn Gly
105 110
Ile Glu Lys Gly Ser Tyr Lys Val
125
Leu Val Arg Ala Asp Phe Pro Val
140
Pro Ser His Asn Ile Lys Arg Ile
155 160
Pro Lys Pro His Leu Ser Trp Leu
170 175
Ile Asn Thr Thr Val Ser Gin Asp
185 130
Ser Ser Glu Leu Asp Phe Asn Met
205
Leu Val Lys Tyr Gly Asn Leu Leu
220
Lys Ser Glu Pro Gin Pro Ser Asn
235 240
Ser Ser Val Val Ser Gly Ile Val
250 255
Cys Leu Val His Arg Pro Ala Ala
PL 199 359 B1
260 265 270
Arg Trp Arg Gin Arg Glu Met Gly Arg Ala Arg Lys Trp Lys Arg Ser
275 280 285
His Leu Ser Thr
290 <210> 3 <211> 879 <212> DNA <213> koci CD80 <220>
<221> CDS <222> (1)..(876) <400> 3
atg ggt cac gca gca aag tgg aaa aca cca eta ctg aag cac Cca tat 48
Met Gly His Ala Ala Lys Trp Lys Thr Pro Leu Leu Lys His Pro Tyr
1 5 10 15
ccc aag ctc ttt ccg ctc ttg atg eta get agt ctt ttt tac ttc tgt 96
Pro Lys Leu Phe Pro Leu Leu Met Leu Ala Ser Leu Phe Tyr Phe Cys
20 25 30
tca ggt atc atc cag gtg aac aag aca gtg gaa gaa gta gca gta eta 144
Ser Gly Ile Ile Gin Val Asn Lys Thr Val Glu Glu Val Ala Val Leu
35 40 45
tcc tgt gat tac aac att tcc acc aaa gaa ctg acg gaa att ega atc 192
Ser Cys Asp Tyr Asn Ile Ser Thr Lys Glu Leu Thr Glu Ile Arg Ile
50 55 60
tat tgg caa aag gat gat gaa atg gtg ttg get gtc atg tct ggc aaa 240
Tyr Trp Gin Lys Asp Asp Glu Met Val Leu Ala Val Met Ser Gly Lys
65 70 75 80
PL 199 359 B1
gta caa gtg tgg ccc aag tac aag aac ege aca ttc act gac gtc acc 288
Val Gin Val Trp Pro Lys Tyr Lys Asn Arg Thr Phe Thr Asp Val Thr
85 90 95
gat aac cac tcc att gtg atc atg get ctg ege ctg tca aac aat ggc 336
Asp Asn His Ser Ile Val Ile Met Ala Leu Arg Leu Ser Asp Asn Gly
100 105 110
aaa tac act tgt atc att caa aag att caa aaa ggg tet tac aaa gtg 384
Lys Tyr Thr Cys Ile Ile Gin Lys Ile Gin Lys Gly Ser Tyr Lys Val
115 120 125
aaa cac ctg act tcg gtg atg tta ttg gtc aga get gac ttc cct gtc 432
Lys His Leu Thr Ser Val Met Leu Leu Val Arg Ala Asp Phe Pro Val
130 135 140
cct agt ata act gat ctt gga aat cca tet cat aac atc aaa agg ata 480
Pro Ser Ile Thr Asp Leu Gly Asn Pro Ser His Asn Ile Lys Arg Ile
145 150 155 160
atg tgc tta act tet gga ggt ttt cca aag cct cac ctc tcc tgg ctg 528
Met Cys Leu Thr Ser Gly Gly Phe Pro Lys Pro His Leu Ser Trp Leu
165 170 175
gaa aat gaa gaa gaa tta aat gee atc aac aca aca gtt tcc caa gat 576
Glu Asn Glu Glu Glu Leu Asn Ala Ile Asn Thr Thr Val Ser Gin Asp
180 185 190
cct gaa act gag ctc tac act att age agt gaa ctg gat ttc aat atg 624
Pro Glu Thr Glu Leu Tyr Thr Ile Ser Ser Glu Leu Asp Phe Asn Met
195 200 205
aca aac aac cat age ttc ctg tgt ctt gtc aag tat gga aac tta ata 672
Thr Asn Asn His Ser Phe Leu Cys Leu Val Lys Tyr Gly Asn Leu Ile
210 215 220
gta tca cag atc ttc aac tgg caa aaa tca gag cca cag cct tet aat 720
Val Ser Gin Ile Phe Asn Trp Gin Lys Ser Glu Pro Gin Pro Ser Asn
PL 199 359 B1
225 230 235 240
aat cag ctc tgg atc att atc ctg age tca gta gta agt ggg att gtt 768
Asn Gin Leu Trp Ile Ile Ile Leu Ser Ser Val Val Ser Gly Ile Val
245 250 255
gtg atc act gca ctt acc tta aga tgc eta gtc cac aga cct gct gca 816
Val Ile Thr Ala Leu Thr Leu Arg Cys Leu Val His Arg Pro Ala Ala
260 265 270
agg tgg aga caa aga gaa atg ggg aga gcg cgg aaa tgg aaa aga tct 864
Arg Trp Arg Gin Arg Glu Met Gly Arg Ala Arg Lys Trp Lys Arg Ser
275 280 285
cac ctg tct aca tag 879
His Leu Ser Thr
290
<210> 4
<211> 292
<212> PRT
<213> koci CD80
<400> 4
Met Gly His Ala Ala Lys Trp Lys Thr Pro Leu Leu Lys His Pro Tyr
1 5 10 15
Pro Lys Leu Phe Pro Leu Leu Met Leu Ala Ser Leu Phe Tyr Phe Cys
20 25 30
Ser Gly Ile Ile Gin Val Asn Lys Thr Val Glu Glu Val Ala Val Leu
35 40 45
Ser Cys Asp Tyr Asn Ile Ser Thr Lys Glu Leu Thr Glu Ile Arg Ile
50 55 60
Tyr Trp Gin Lys Asp Asp Glu Met Val Leu Ala Val Met Ser Gly Lys
65 70 75 80
Val Gin Val Trp Pro Lys Tyr Lys Asn Arg Thr Phe Thr Asp Val Thr
PL 199 359 B1
Asp Asn His Ser
100
Lys Tyr Thr Cys
115
Lys His Leu Thr
130
Pro Ser Ile Thr
145
Met Cys Leu Thr
Glu Asn Glu Glu
180
Pro Glu Thr Glu
195
Thr Asn Asn His
210
Val Ser Gin Ile
225
Asn Gin Leu Trp
Val Ile Thr Ala
260
Arg Trp Arg Gin
275
His Leu Ser Thr
290 <210> 5 <211> 1080
90 95
Ile Val Ile Met Ala Leu Arg Leu Ser Asp Asn
105 110
Ile Ile Gin Lys Ile Gin Lys Gly Ser Tyr Lys
120 125
Ser Val Met Leu Leu Val Arg Ala Asp Phe Pro
135 140
Asp Leu Gly Asn Pro Ser His Asn Ile Lys Arg
150 155
Ser Gly Gly Phe Pro Lys Pro His Leu Ser Trp
165 170 175
Glu Leu Asn Ala Ile Asn Thr Thr Val Ser Gin
185 190
Leu Tyr Thr Ile Ser Ser Glu Leu Asp Phe Asn
200 205
Ser Phe Leu Cys Leu Val Lys Tyr Gly Asn Leu
215 220
Phe Asn Trp Gin Lys Ser Glu Pro Gin Pro Ser
230 235
Ile Ile Ile Leu Ser Ser Val Val Ser Gly Ile
295 250 255
Leu Thr Leu Arg Cys Leu Val His Arg Pro Ala
265 270
Arg Glu Met Gly Arg Ala Arg Lys Trp Lys Arg
280 285
Gly
Val
Val
Ile
160
Leu
Asp
Met
Ile
Asn
240
Val
Ala
Ser
PL 199 359 B1 <212> DNA <213> koci CD86 <220>
<221> CDS <222> (63) . . (1052) <400> 5 gtttctgtgt tcctcgggaa tgtcactgag cttatacatc tggtctctgg gagctgcagt 60 gg atg ggc att tgt gac age act atg gga ctg agt cac act ctc ctt 107
Met Gly Ile Cys Asp Ser Thr Met Gly Leu Ser His Thr Leu Leu
1 5 10 15
gtg atg gee ctc ctg ctc tct ggt gtt tct tcc atg aag agt caa gca 155
Val Met Ala Leu Leu Leu Ser Gly Val Ser Ser Met Lys Ser Gin Ala
20 25 30
tat ttc aac aag act gga gaa ctg cca tgc cat ttt aca aac tct caa 203
Tyr Phe Asn Lys Thr Gly Glu Leu Pro Cys His Phe Thr Asn Ser Gin
35 40 45
aac ata age ctg gat gag ctg gta gta ttt tgg cag gac cag gat aag 251
Asn Ile Ser Leu Asp Glu Leu Val Val Phe Trp Gin Asp Gin Asp Lys
50 55 60
ctg gtt ctg tat gag ata ttc aga ggc aaa gag aac cct caa aat gtt 299
Leu Val Leu Tyr Glu Ile Phe Arg Gly Lys Glu Asn Pro Gin Asn Val
65 70 75
cat ctc aaa tat aag ggc cgt aca age ttt gac aag gac aac tgg acc 347
His Leu Lys Tyr Lys Gly Arg Thr Ser Phe Asp Lys Asp Asn Trp Thr
80 85 90 95
ctg aga ctc cac aat gtt cag atc aag gac aag ggc aca tat cac tgt 395
Leu Arg Leu His Asn Val Gin Ile Lys Asp Lys Gly Thr Tyr His Cys
100 105 HO
PL 199 359 B1
ttc att cat tat aaa ggg ccc aaa gga eta gtt ccc atg cac caa atg 443
Phe Ile His Tyr Lys Gly Pro Lys Gly Leu Val Pro Met His Gin Met
115 120 125
agt tct gac eta tca gtg ctt get aac ttc agt caa cct gaa ata aca 491
Ser Ser Asp Leu Ser Val Leu Ala Asn Phe Ser Gin Pro Glu Ile Thr
130 135 140
gta act tct aat aga aca gaa aat tct ggc atc ata aat ttg acc tgc 539
Val Thr Ser Asn Arg Thr Glu Asn Ser Gly Ile Ile Asn Leu Thr Cys
145 150 155
tca tct ata caa ggt tac cca gaa cct aag gag atg tat ttt cag eta 587
Ser Ser Ile Gin Gly Tyr Pro Glu Pro Lys Glu Met Tyr Phe Gin Leu
160 165 170 175
aac act gag aat tca act act aag tat gat act gtc atg aag aaa tct 635
Asn Thr Glu Asn Ser Thr Thr Lys Tyr Asp Thr Val Met Lys Lys Ser
180 185 190
caa aat aat gtg aca gaa ctg tac aac gtt tct atc agc ttg cct ttt 683
Gin Asn Asn Val Thr Glu Leu Tyr Asn Val Ser Ile Ser Leu Pro Phe
195 200 205
tca gtc cct gaa gca cac aat gtg agc gtc ttt tgt gee ctg aaa ctg 731
Ser Val Pro Glu Ala His Asn Val Ser Val Phe Cys Ala Leu Lys Leu
210 215 220
gag aca ctg gag atg ctg ctc tcc eta cct ttc aat ata gat gca caa 779
Glu Thr Leu Glu Met Leu Leu Ser Leu Pro Phe Asn Ile Asp Ala Gin
225 230 235
cct aag gat aaa gac cct gaa caa ggc cac ttc ctc tgg att gcg get 827
Pro Lys Asp Lys Asp Pro Glu Gin Gly His Phe Leu Trp Ile Ala Ala
240 245 250 255
gta ctt gta atg ttt gtt gtt ttt tgt ggg atg gtg tcc ttt aaa aca 875
Val Leu Val Met Phe Val Val Phe Cys Gly Met Val Ser Phe Lys Thr
PL 199 359 B1
260 265 270
eta agg aaa agg aag aag aag cag cct ggc ccc tct cat gaa tgt gaa 923
Leu Arg Lys Arg Lys Lys Lys Gin Pro Gly Pro Ser His Glu Cys Glu
275 280 285
acc atc aaa agg gag aga aaa gag age aaa cag acc aac gaa aga gta 971
Thr Ile Lys Arg Glu Arg Lys Glu Ser Lys Gin Thr Asn Glu Ara Val
290 295 300
cca tac cac gta cct gag aga tct gat gaa gee cag tgt gtt aac att 1019
Pro Tyr His Val Pro Glu Arg Ser Asp Glu Ala Gin Cys Val Asn Ile
305 310 315
ttg aag aca gee tca ggg gac aaa aat cag tag gaaaatggtg gcttggcgtg 1072
Leu Lys Thr Ala Ser Gly Asp Lys Asn Gin
320 325 330 ctgacaat 1080 <210> 6 <211> 329 <212> PRT <213> koci CD86
<400> 6
Met Gly Ile Cys Asp Ser Thr Met Gly Leu Ser His Thr Leu Leu Val
1 5 10 15
Met Ala Leu Leu Leu Ser Gly Val Ser Ser Met Lys Ser Gin Ala Tyr
20 25 30
Phe Asn Lys Thr Gly Glu Leu Pro Cys His Phe Thr Asn Ser Gin Asn
35 40 45
Ile Ser Leu Asp Glu Leu Val Val Phe Trp Gin Asp Gin Asp Lys Leu
50 55 60
Val Leu Tyr Glu Ile Phe Arg Gly Lys Glu Asn Pro Gin Asn Val His
65 70 75 80
PL 199 359 B1
Phe Asp Lys Asp Asn Trp Thr Leu
95
Asp Lys Gly Thr Tyr His Cys Phe
105 HO
Leu Val Pro Met His Gin Met Ser
125
Phe Ser Gin Pro Glu Ile Thr Val
140
Gly Ile Ile Asn Leu Thr Cys Ser
155 160
Lys Glu Met Tyr Phe Gin Leu Asn
170 175
Asp Thr Val Met Lys Lys Ser Gin
185 190
Val Ser Ile Ser Leu Pro Phe Ser
205
Val Phe Cys Ala Leu Lys Leu Glu
220
Pro Phe Asn Ile Asp Ala Gin Pro
235 240
His Phe Leu Trp Ile Ala Ala Val
250 255
Gly Met Val Ser Phe Lys Thr Leu
265 270
Gly Pro Ser His Glu Cys Glu Thr
285
Lys Gin Thr Asn Glu Arg Val Pro
300
Glu Ala Gin Cys Yal Asn Ile Leu
Leu Lys Tyr Lys Gly Arg Thr Ser
Arg Leu His Asn Val Gin Ile Lys ' 100
Ile His Tyr Lys Gly Pro Lys Gly
115 120
Ser Asp Leu Ser Val Leu Ala Asn
130 135
Thr Ser Asn Arg Thr Glu Asn Ser
145 150
Ser Ile Gin Gly Tyr Pro Glu Pro
165
Thr Glu Asn Ser Thr Thr Lys Tyr
180
Asn Asn Val Thr Glu Leu Tyr Asn
195 200
Val Pro Glu Ala His Asn Val Ser
210 215
Thr Leu Glu Met Leu Leu Ser Leu
225 230
Lys Asp Lys Asp Pro Glu Gin Gly
245
Leu Val Met Phe Val Val Phe Cys
260
Arg Lys Arg Lys Lys Lys Gin Pro
275 280
Tle Lys Arg Glu Arg Lys Glu Ser
290 295
Tyr His Yal Pro Glu Arg Ser Asp
PL 199 359 B1
305 310 315 320
Lys Thr Ala Ser Gly Asp Lys Asn Gin
325
<21 0> 7
<21 1> 688
<21 2> DNA
<21 3> koci CD 28
<22 0>
<22 1> CDS
<22 2> (1) · • (6 63)
<40 0> 7
atg atc ctc agg ctg ctt ctg gct ctc aac ttc ttc ccc tca att caa 48
Met Ile Leu Arg Leu Leu Leu Ala Leu Asn Phe Phe Pro Ser Ile Gin
1 5 10 15
gta aca gaa aac aag att ttg gtg aag cag ttg ccc agg ctt gtg gtg 96
Val Thr Glu Asn Lys Ile Leu Val Lys Gin Leu Pro Arg Leu Val Val
20 25 30
tac aac aat gag gtc aac ctt agc tgc aag tac act cac aac ttc ttc 144
Tyr Asn Asn Glu Val Asn Leu Ser Cys Lys Tyr Thr His Asn Phe Phe
35 40 45
tca aag gag ttc cgg gca tcc ctt tat aag gga gta gat agt gct gtg 192
Ser Lys Glu Phe Arg Ala Ser Leu Tyr Lys Gly Val Asp Ser Ala Val
50 55 60
gaa gtc tgc gtt gtg aat gga aat tac tcc cat cag cct cag ttc tac 240
Glu Val Cys Val Val Asn Gly Asn Tyr Ser His Gin Pro Gin Phe Tyr
65 70 75 80
tca agt aca gga ttc gac tgt gat ggg aaa ttg ggc aat gaa aca gtg 288
Ser Ser Thr Gly Phe Asp Cys Asp Gly Lys Leu Gly Asn Glu Thr Val
85 90 95
PL 199 359 B1
aca ttc tac ctc ega aat ttg ttt gtt aac caa acg gat att tac ttc 336
Thr Phe Tyr Leu Arg Asn Leu Phe Val Asn Gin Thr Asp Ile Tyr Phe
100 105 110
tgc aaa att gaa gtc atg tat cca cct cct tac ata gac aat gag aag 384
Cys Lys Ile Glu Val Met Tyr Pro Pro Fro Tyr Ile Asp Asn Glu Lys
115 120 125
age aat ggg acc att atc cac gtg aaa gag aaa cat ctt tgt cca get 432
Ser Asn Gly Thr Ile Ile His Val Lys Glu Lys His Leu Cys Pro Ala
130 135 140
cag ctg tct cct gaa tct tcc aag cca ttt tgg gca ctg gtg gtg gtt 480
Gin Leu Ser Pro Glu Ser Ser Lys Pro Phe Trp Ala Leu Val Val Val
145 150 155 160
ggt gga atc eta ggt ttc tac age ttg eta gca aca gtg get ctt ggt 528
Gly Gly Ile Leu Gly Phe Tyr Ser Leu Leu Ala Thr Val Ala Leu Gly
165 170 175
get tgc tgg atg aag acc aag agg agt agg atc ctt cag agt gac tat 576
Ala Cys Trp Met Lys Thr Lys Arg Ser Arg Ile Leu Gin Ser Asp Tyr
180 185 190
atg aac atg acc ccc cgg agg cca ggg ccc acc ega agg cac tac caa 624
Met Asn Met Thr Pro Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg Arg His Tyr Gin
195 200 205
cct tac gee cca gca ege gac ttt gcg gca tac cgt tcc tgacatggac 673
Pro Tyr Ala Pro Ala Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser
210 215 220
ccctatccag aagcc <210> 8 <211> 221 <212> PRT <213> koci CD28
PL 199 359 B1 <400> 8
Met Ile Leu Arg Leu Leu Leu Ala
5
Val Thr Glu Asn Lys Ile Leu Val
Tyr Asn Asn Glu Val Asn Leu Ser
40
Ser Lys Glu Phe Arg Ala Ser Leu
55
Glu Val Cys Val Val Asn Gly Asn
70
Ser Ser Thr Gly Phe Asp Cys Asp
Thr Phe Tyr Leu Arg Asn Leu Phe
100
Cys Lys Ile Glu Val Met Tyr Pro
115 120
Ser Asn Gly Thr Ile Ile His Val
130 135
Gin Leu Ser Pro Glu Ser Ser Lys
145 150
Gly Gly Ile Leu Gly Phe Tyr Ser
165
Ala Cys Trp Met Lys Thr Lys Arg
180
Met Asn Met Thr Pro Arg Arg Pro
195 200
Pro Tyr Ala Pro Ala Arg Asp Phe
210 215
Leu Asn Phe Phe Pro Ser Ile Gin
15
Lys Gin Leu Pro Arg Leu Val Val
30
Cys Lys Tyr Thr His Asn Phe Phe
Tyr Lys Gly Val Asp Ser Ala Val
Tyr Ser His Gin Pro Gin Phe Tyr
80
Gly Lys Leu Gly Asn Glu Thr Val
95
Val Asn Gin Thr Asp Ile Tyr Phe
105 110
Pro Pro Tyr Ile Asp Asn Glu Lys
125
Lys Glu Lys His Leu Cys Pro Ala
140
Pro Phe Trp Ala Leu Val Val Val
155 160
Leu Leu Ala Thr Val Ala Leu Gly
170 175
Ser Arg Ile Leu Gin Ser Asp Tyr
185 190
Gly Pro Thr Arg Arg His Tyr Gin
205
Ala Ala Tyr Arg Ser
220
PL 199 359 B1 <210> 9 <211> 749 <212> DNA <213> koci CTLA-4 <220>
<221> CDS <222> (27)..(698) <400> 9 aacctgaaca ctgctcccat aaagcc atg gct tgc ttt gga ttc cgg agg cat 53
Met Ala Cys Phe Gly Phe Arg Arg His
5
ggg gct cag ctg gac ctg gct tct agg acc tgg ccc tgc act gct ctg 101
Gly Ala Gin Leu Asp Leu Ala Ser Arg Thr Trp Pro Cys Thr Ala Leu
10 15 20 25
ttt tct ctt ctc ttt atc ccc gtc ttc tcc aaa ggg atg cat gtg gcc 149
Phe Ser Leu Leu Phe Ile Pro Val Phe Ser Lys Gly Met His Val Ala
30 35 40
cac cct gca gtg gtg ctg gcc agc agc ega ggt gtc gcc agc ttc gtg 197
His Pro Ala Val Val Leu Ala Ser Ser Arg Gly Val Ala Ser Phe Val
45 50 55
tgt gaa tat ggg tct tca ggc aat gcc gcc aaa ttc ega gtg act gtg 245
Cys Glu Tyr Gly Ser Ser Gly Asn Ala Ala Lys Phe Arg Val Thr Val
60 65 70
ctg agg caa act ggc agc caa atg act gaa gtc tgt gct gcg aca tac 293
Leu Arg Gin Thr Gly Ser Gin Met Thr Glu Val Cys Ala Ala Thr Tyr
75 ' 80 85
aca gtg gag aat gag ttg gcc ttc eta aat gat tcc acc tgc act ggc 341
Thr Val Glu Asn Glu Leu Ala Phe Leu Asn Asp Ser Thr Cys Thr Gly
95 100 105
PL 199 359 B1
atc tcc agc gga aac aaa gtg aac ctc acc atc caa ggg ttg agg gee 389
Ile Ser Ser Gly Asn Lys Val Asn Leu Thr Ile Gin Gly Leu Arg Ala
110 115 120
atg gac acg gga ctc tac atc tgc aag gtg gag ctc atg tac cca cca 437
Met Asp Thr Gly Leu Tyr Ile Cys Lys Val Glu Leu Met Tyr Pro Pro
125 130 135
ccc tac tat gca ggc atg ggc aat gga acc cag att tat gtc atc gat 485
Pro Tyr Tyr Ala Gly Met Gly Asn Gly Thr Gin Ile Tyr Val Ile Asp
140 145 150
cct gaa cct tgc cca gat tct gac ttc ctc ctc tgg atc ctc gca gca 533
Pro Glu Pro Cys Pro Asp Ser Asp Phe Leu Leu Trp Ile Leu Ala Ala
155 160 165
gtc agt tca gga ttg ttt ttt tat agc ttc ctt atc aca get gtt tct 581
Val Ser Ser Gly Leu Phe Phe Tyr Ser Phe Leu Ile Thr Ala Val Ser
170 175 180 185
ttg agc aaa atg eta aag aaa aga agc cct ctt act aca ggg gtc tat 629
Leu Ser Lys Met Leu Lys Lys Arg Ser Pro Leu Thr Thr Gly Val Tyr
190 195 200
gtg aaa atg ccc cca aca gag cca gaa tgt gaa aag caa ttt cag cct 677
Val Lys Met Pro Pro Thr Glu Pro Glu Cys Glu Lys Gin Phe Gin Pro
205 210 215
tat ttt att ccc atc aat tga cacaccgtta tgaagaagga agaacactgt 728
Tyr Phe Ile Pro Ile Asn
220
ccaatttcta agagctgagg c 749 <210> 10 <211> 223 <212> PRT <213> koci CTLA-4
PL 199 359 B1
PL 199 359 B1
<210> 11
<211> 40
<212> DNA
<213> koci primer CD80
<400> 11
cgcggatccg caccatgggt cacgcagcaa agtggaaaac 40
<210> 12
<211> 25
<212> DNA
<213> koci primer CD80
<400> 12
cctagtagag aagagctaaa gaggc 25
<210> 13
<211> 33 <212> DNA
<213> koci primer CD28
<4 00> 13
cgcggatcca ccggtagcac aatgatcctc agg 33
<210> 14
<211> 31
<212> DNA
<213> koci primer CD28
<400> 14
cgcggatcct ctggataggg gtccatgtca g 31
<210> 15
<211> 27
<212> DNA
<213> koci primer CTLA-4
<400> 15
atggcttcgc cttggatttc cagcagg 27
PL 199 359 B1
<210> 16
<211> 29
<212> DNA
<213> koci primer CTLA-4
<400> 16
tcaattgaat gaggaataaa ataaggctg 29
<210> 17
<211> 28
<212> DNA
<213> koci primer CTLA-4
<4 00> 17
tgttgggttt ctgactctga cttccctg 28
<210> 18
<211> 24
<212> DNA
<213> koci primer CTLA-4
<400> 18
gcatagtagg gtggtgggta catg 24
<210> 19
<211> 28
<212> DNA
<213> koci primer CTLA-4
<400> 19
tgttgggttt ctgactctga cttccctg 28
<210> 20
<211> 20
<212> DNA
<213> koci primer CTLA-4
<400> 20
PL 199 359 B1
acatgagctc caccttgcag 20
<210> 21
<211> 27
<212> DNA
<213> koci primer CTLA-4
<400> 21
ccatcctaat acgactcact atagggc 27
<210> 22
<211> 24
<212> DNA
<213> koci primer CTLA-4
<400> 22
gtgaatatgg gtcttcaggc aatg 24
<210> 23
<211> 23
<212> DNA
<213> koci primer CTLA-4
<400> 23
actcactata gggctcgagc ggc 23
<210> 24
<211> 23
<212> DNA
<213> koci primer CTLA-4
<400> 24
gaaatccgag tgactgtgct gag 23
<210> 25
<211> 24
<212> DNA
<213> koci primer CTLA-4
PL 199 359 B1
<4 00> 25
aacctgaaca ctgctcccat aaag 24
<210> 26
<211> 25
<212> DNA
<213> koci primer CTLA-4
<4 00> 26
gcctcagctc ttagaaattg gacag 25
<210> 27
<211> 21
<212> DNA
<213> koci primer CD86
<4 00> 27
tagtattttg gcaggaccag g 21
<210> 28
<211> 23
<212> DNA
<213> koci primer CD86
<4 00> 28
ctgtgacatt atcttgagat ttc 23
<210> 29
<211> 23
<212> DNA
<213> koci primer CD86
<400> 29
gagcatgcac taatgggact gag 23
<210> 30
<211> 23
<212> DNA
PL 199 359 B1
<213> koci primer CD86
<400> 30
ctgtgacatt atcttgagat ttc 23
<210> 31
<211> 27
<212> DNA
<213> koci primer CD86
<400> 31
ccatcctaat acgactcact atagggc 27
<210> 32
<211> 28
<212> DNA
<213> koci primer CD86
<4 00> 32
tgggtaacct tgtatagatg agcaggtc 28
<210> 33
<211> 23
<212> DNA
<213> koci primer CD86
<4 00> 33
actcactata gggctcgagc ggc 23
<210> 34
<211> 25
<212> DNA
<213> koci primer CD86
<4 00> 34
caggttgact gaagttagca agcac 25
<210> 35
<211> 27
PL 199 359 B1
<212> DNA
<213> koci primer CD86
<400> 35
ccatcctaat acgactcact atagggc 27
<210> 36
<211> 25
<212> DNA
<213> koci primer CD86
<400> 36
ggacaagggc acatatcact gtttc 25
<210> 37
<211> 23
<212> DNA
<213> koci primer CD86
<400> 37
actcactata gggctcgagc ggc 23
<210> 38
<211> 25
<212> DNA
<213> koci primer CD86
<4 00> 38
cagtgcttgc taacttcagt caacc 25
<210> 39
<211> 23
<212> DNA
<213> koci primer CD86
<400> 39
cgggaatgtc actgagctta tag 23
<210> 40
PL 199 359 B1
<211> 23
<212> DNA
<213> koci primer CD86
<4 0 0> 40
gatctttttc aggttagcag ggg 23
<210> 41
<211> 20
<212> DNA
<213> koci primer CD80
<400>. 41
atgggtcacg cagcaaagtg 20
<210> 42
<211> 20
<212> DNA
<213> koci primer CD80
<400> 42
ctatgtagac aggtgagatc 20
<210> 43
<211> 17
<212> DNA
<213> koci primer CD80
<400> 43
caggaaacag ctatgac 17
<210> 44
<211> 18
<212> DNA
<213> koci primer CD80
<400> 44
aatacgactc actatagg 18
PL 199 359 B1
<210> 45
<211> 21
<212> DNA
<213> koci primer CD80
<400> 45
aacaccattt catcatcctt t 21
<210> 46
<211> 23
<212> DNA
<213> koci primer CD80
<4 00> 46
atacaagtgt atttgccatt gtc 23
<210> 47
<211> 20
<212> DNA
<213> koci primer CD80
<4 00> 47
agctctgacc aataacatca 20
<210> 48
<211> 22
<212> DNA
<213> koci primer CD80
<400> 48
attagaaatc cagttcactg ct 22
<210> 49
<211> 21
<212> DNA
<213> koci primer CD80
<400> 49
PL 199 359 B1
tcatgtctgg caaagtacaa g 21
<210> 50
<211> 18
<212> DNA
<213> koci primer CD80
<400> 50
attcactgac gtcaccga 18
<210> 51
<211> 16
<212> DNA
<213> koci primer CD80
<400> 51
aaggctgtgg ctctga 16
<210> 52
<211> 29
<212> DNA
<213> koci primer CD80
<400> 52
tcgagaattc gggtcacgca gcaaagtgg 29
<210> 53
<211> 32
<212> DNA
<213> koci primer CD80
<400> 53
gctaggatcc aatctatgta gacaggtgag at 32
<210> 54
<211> 32
<212> DNA
<213> koci primer CD80
PL 199 359 B1 <400> 54 gatgaattcc atgatcctca ggctgggctt ct 32 <210> 55
<211> 29
<212> DNA
<213> koci primer CD80
<400> 55
gatcagatct caggaacggt atgccgcaa 29 <210> 56
<211> 22
<212> DNA
<213> primer B7-2
<400> 56
ggcccgagta kaagaaccgg ac 22 <210> 57
<211> 24
<212> DNA
<213> primer B7-3
<400> 57
cagwttcagg atcytgggaa aytg 24 <210> 58
<211> 20
<212> DNA
<213> primer B7-284
<400> 58
ttatactagg gacagggaag 20 <210> 59 <211> 20 <212> DNA
PL 199 359 B1 <213> primer Β7-190 <400> 59 aggctttgga aaacctccag 20 <21Ó> 60
<211> 21
<212> DNA
<213> primer B7-20
<400> 60
ttgttatcgg tgacgtcagt g. 21 <210> 61
<211> 22
<212> DNA
<213> primer B7-135
<400> 61
caataacatc accgaagtca gg 22
<210> 62
<211> 22
<212> DNA
<213> primer B7-s220
<400> 62
gtcatgtctg gcaaagtaca ag 22 <210> 63
<211> 22
<212> DNA
<213> primer B7-50
<400> 63
cactgacgtc accgataacc ac 22 <210> 64 <211> 22
PL 199 359 B1
<212> DNA
<213> primer B7-140
<400> 64
ctgacttcgg tgatgttatt gg 22 <210> 65
<211> 21
<212> DNA
<213> primer B7-550
<400> 65
gccatcaaca caacagtttc c 21 <210> 66
<211> 22
<212> DNA
<213> primer B7-620
<400> 66
tatgacaaac aaccatagct tc 22 <210> 67
<211> 20
<212> DNA
<213> primer B7-1281
<400> 67
graagawtgc ctcatgakcc 20 <210> 68 <211> 17
<212> DNA
<213> primer B7-1260
<400> 68
cayratccaa cataggg 17 <210> 69 <211> 21
PL 199 359 B1 <212> DNA <213> primer startowy B7 <400> 69 atgggtcacg cagcaaagtg g <210> 70 <211> 25 <212> DNA <213> primer B7-960 <400> 70 cctagtagag aagagctaaa gaggc <210> 71 <211> 21 <212> DNA <213> primer CD28-113 <400> 71 caaccttagc tgcaagtaca c <210> 72 <211> 20 <212> DNA <213> primer CD28-768 <400> 72 ggcttctgga tagggatagg <210> 73 <211> 22 <212> DNA <213> primer CD28-190 <400> 73 cggaggtaga attgcactgt cc <210> 74
PL 199 359 B1
PL 199 359 B1 <210> 79 <211> 32 <212> DNA <213> primer biegnący w górę PPR FIV <400> 79 gcgtgaattc ggggaatgga caggggcgag at 32 <210> 80
<211> 28
<212> DNA
<213> primer biegnący w dół PPR FIV
<400> 80
gagccagatc tgctcttttt actttccc 28 <210> 81
<211> 36
<212> DNA
<213> primer IFN
<400> 81
tcgagaattc gatgaattac acaagtttta ttttcg 36 <210> 82
<211> 33
<212> DNA
<213> primer IFN
<400> 82
tcgaggatcc ttatttcgat gctctacggc ctc 33
PL 199 359 B1

Claims (36)

1. Rekombinowany wirus, znamienny tym, że zawiera co najmniej jeden obcy kwas nukleinowy wprowadzony do regionu nie będącego podstawowym regionem genomu wirusowego wirusa, a każdy taki obcy kwas nukleinowy (a) koduje białko wybrane z grupy obejmującej białko kociego CD28 lub jego część immunogeniczną; białko kociego CD80 lub jego część immunogeniczną; białko kociego CD86 lub jego część immunogeniczną; lub białko kociego CTLA-4 lub jego część immunogeniczną i (b) jest zdolny do ekspresji gdy tego rekombinowanego wirusa wprowadza się do odpowiedniego gospodarza.
2. Rekombinowany wirus według zastrz. 1, znamienny tym, zawiera co najmniej dwa obce kwasy nukleinowe, każdy wprowadzony do regionu nie będącego podstawowym regionem genomu wirusa a każdy taki obcy kwas nukleinowy (a) koduje białko wybrane z grupy obejmującej białko kociego CD28 lub jego część immunogeniczną, biało kociego CD80 lub jego część immunogeniczną; białko kociego CD86 lub jego część immunogeniczną; lub białko kociego CTLA-4 lub jego część immunogeniczną.
3. Rekombinowany wirus według zastrz. 2, znamienny tym, że zawiera co najmniej trzy obce kwasy nukleinowe, każdy wprowadzony do regionu nie będącego podstawowym regionem genomu wirusa a każdy taki obcy kwas nukleinowy (a) koduje białko wybrane z grupy obejmującej białko kociego CD28 lub jego część immunogeniczną, biało kociego CD80 lub jego część immunogeniczną; białko kociego CD86 lub jego część immunogeniczną; lub białko kociego CTLA-4 lub jego część immunogeniczną.
4. Rekombinowany wirus według zastrz. 3, znamienny tym, że zawiera cztery obce kwasy nukleinowe, każdy wprowadzony do regionu nie będącego podstawowym regionem genomu wirusa a każdy taki obcy kwas nukleinowy (a) koduje białko wybrane z grupy obejmującej białko kociego CD28 lub jego część immunogeniczną, biało kociego CD80 lub jego część immunogeniczną; białko kociego CD86 lub jego część immunogeniczną; lub białko kociego CTLA-4 lub jego część immunogeniczną.
5. Rekombinowany wirus według zastrz. 1, znamienny tym, że wirus jest pokswirusem szopów, pokswirusem świń, lub kocim herpeswirusem.
6. Rekombinowany wirus według zastrz. 1 albo 2, albo 3, albo 4, albo 5, znamienny tym, że zawiera więcej niż jeden obcy kwas nukleinowy, przy czym każdy obcy kwas nukleinowy wprowadza się do tego samego regionu nie będącego podstawowym.
7. Rekombinowany wirus według zastrz. 1 albo 2, albo 3, albo 4, albo 5, znamienny tym, że zawiera więcej niż jeden obcy kwas nukleinowy, przy czym nie wszystkie takie obce kwasy nukleinowe są wprowadzane do tego samego regionu nie będącego podstawowym.
8. Rekombinowany wirus według zastrz. 1, znamienny tym, że dodatkowo zawiera obcy kwas nukleinowy kodujący immunogen pochodzący od patogenu.
9. Rekombinowany wirus według zastrz. 8, znamienny tym, że patogenem jest patogen koci, wirus wścieklizny, Chlamydia, Taxoplasmosis gondii, Dirofilaria immitis, pchła, lub patogen bakteryjny.
10. Rekombinowany wirus według zastrz. 9, znamienny tym, że kocim patogenem jest wirus kociego niedoboru odporności (FIV), wirus kociej białaczki (FeLV), wirus kociego zakaźnego zapalenia otrzewnej (FIP), koci wirus panleukopenii, koci kaliciwirus, koci reowirus typu 3, koci rotawirus, koci koronawirus, koci wirus syncytialny, koci wirus mięsaka, koci herpeswirus, wirus kociej choroby Borna, lub koci pasożyt.
11. Rekombinowany wirus według zastrz. 1 albo 2, albo 3, albo 4, albo 5, znamienny tym, że co najmniej jeden obcy kwas nukleinowy obejmuje promotor dla ekspresji obcego kwasu nukleinowego.
12. Rekombinowany wirus według zastrz. 1 albo 2, albo 3, albo 4, albo 5, znamienny tym, że ekspresja co najmniej jednego kwasu nukleinowego znajduje się pod kontrolą promotora endogennego w stosunku do wirusa.
13. Rekombinowany wirus według zastrz. 1, znamienny tym, że dodatkowo zawiera obcy kwas nukleinowy kodujący wykrywalny marker.
14. Rekombinowany wirus według zastrz. 13, znamienny tym, że wykrywalnym markerem jest beta galaktozydaza E. coli.
15. Rekombinowany wirus według zastrz. 10, znamienny tym, że immunogenem z kociego patogenu jest proteaza gag FIV, białko otoczkowe FIV, proteaza gag FeLV, lub białko otoczkowe FeLV.
100
PL 199 359 B1
16. Rekombinowany wirus według zastrz. 1 albo 2, albo 3, albo 4, albo 5, znamienny tym, że wirusem jest koci herpeswirus i regionem nie będącym podstawowym jest gen glikoproteiny G kociego herpeswirusa.
17. Rekombinowany koci herpeswirus według zastrz. 12 oznaczony S-FHV-031 (numer dostępu ATCC VR-2604).
18. Rekombinowany wirus według zastrz. 1 albo 2, albo 3, albo 4, albo 5, znamienny tym, że wirusem jest pokswirus świń i regionem nie będącym podstawowym jest większy subfragment Hind III do Bgl II fragmentu M Hind III pokswirusa świń.
19. Rekombinowany koci wirus ospy świń według zastrz. 14 oznaczony S-SPV-246 (numer dostępu ATCC VR-2603).
20. Rekombinowany wirus według zastrz. 1 albo 2, albo 3, albo 4, albo 5, znamienny tym, że część białka CD28, CD80 lub CD86 jest rozpuszczalną częścią białka.
21. Rekombinowany wirus według zastrz. 1 albo 2, albo 3, albo 4, albo 5, znamienny tym, że obcy kwas nukleinowy koduje kocie białko CTLA-4.
22. Szczepionka, znamienna tym, że zawiera skuteczną ilość immunizującą rekombinowanego wirusa zdefiniowanego w zastrz. 1 oraz odpowiedni nośnik.
23. Szczepionka według zastrz. 22, znamienna tym, że skuteczna ilość immunizującą rekombinowanego wirusa, jest to ilość wynosząca między około 1 x 105 pfu/ml i około 1 x 10 cfu/ml.
24. Szczepionka według zastrz. 22, znamienna tym, że dodatkowo zawiera skuteczną ilość immunizującą drugiego immunogenu w domieszce do rekombinowanego wirusa.
25. Zastosowanie skutecznej ilości immunizującej rekombinowanego wirusa zdefiniowanego w zastrz. 1, do wytwarzania leku do wzmacniania odpowiedzi immunologicznej u kotów.
26. Zastosowanie skutecznej ilości immunizującej rekombinowanego wirusa zdefiniowanego w zastrz. 1, do wytwarzania leku do immunizacji kota.
27. Zastosowanie skutecznej ilości rekombinowanego wirusa zdefiniowanego w zastrz. 20 lub 21 do wytwarzania leku do hamowania odpowiedzi immunologicznej.
28. Zastosowanie według zastrz. 25 albo 26, albo 27, znamienne tym, że lek podaje się dożylnie, podskórnie, domięśniowo, przezmięśniowo, miejscowo, doustnie lub dootrzewnowe.
29. Zastosowanie według zastrz. 27, znamienne tym, że kot jest biorcą przeszczepianego narządu lub tkanki lub cierpi z powodu odpowiedzi immunologicznej.
30. Zastosowanie antysensownego kwasu nukleinowego zdolnego do hybrydyzacji i hamowania translacji: (a) transkryptu kociego mRNA CD28, (b) transkryptu kociego CD80, lub (c) transkryptu kociego mRNA CD86, przy czym antysensowny kwas nukleinowy jest obecny w ilości skutecznie hamującej translację do wytwarzania leku do hamowania odpowiedzi immunologicznej u kota.
31. Zastosowanie rekombinowanego wirusa zdefiniowanego w zastrz. 1, przy czym kwas nukleinowy koduje białko kociego CD80, białko kociego CD86 lub ich połączenie do wytwarzania leku do zmniejszania lub niszczenia nowotworu u kota przez podawanie leku do nowotworu.
32. Zastosowanie według zastrz. 31, znamienne tym, że rekombinowany wirus dodatkowo zawiera koci antygen związany z nowotworem i jest zdolny do ekspresji kociego antygenu związanego z nowotworem, przy czym podawanie leku wykonuje się układowo.
33. Rekombinowany wirus według zastrz. 1, znamienny tym, że dodatkowo zawiera kwas nukleinowy, kodujący genom wirusa kociego niedoboru odporności lub jego część.
34. Rekombinowany wirus według zastrz. 1, znamienny tym, że dodatkowo zawiera kwas nukleinowy, kodujący genom wirusa kociej białaczki lub jego część.
35. Rekombinowany wirus według zastrz. 33 lub 34, dodatkowo obejmujący kwas nukleinowy kodujący kocie IL12, p35 lub p40.
36. Szczepionka, znamienna tym, że zawiera skuteczną ilość immunizującą rekombinowanego wirusa zdefiniowanego w zastrz. 33 lub 34 i odpowiedni nośnik.
PL346012A 1998-05-01 1999-04-30 Rekombinowany wirus, zastosowanie rekombinowanego wirusa i zastosowanie antysensownego kwasu nukleinowego PL199359B1 (pl)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US7171198A 1998-05-01 1998-05-01
PCT/US1999/009504 WO1999057295A1 (en) 1998-05-01 1999-04-30 Recombinant virus expressing foreign dna encoding feline cd80, feline ctla-4 or feline cd86 and uses thereof

Publications (2)

Publication Number Publication Date
PL346012A1 PL346012A1 (en) 2002-01-14
PL199359B1 true PL199359B1 (pl) 2008-09-30

Family

ID=22103082

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PL346012A PL199359B1 (pl) 1998-05-01 1999-04-30 Rekombinowany wirus, zastosowanie rekombinowanego wirusa i zastosowanie antysensownego kwasu nukleinowego

Country Status (20)

Country Link
EP (1) EP1073759B1 (pl)
JP (2) JP2002513581A (pl)
KR (1) KR100796799B1 (pl)
AT (1) ATE511545T1 (pl)
AU (1) AU761755B2 (pl)
BR (1) BR9915970A (pl)
CA (1) CA2327528C (pl)
CZ (1) CZ20003934A3 (pl)
ES (1) ES2367245T3 (pl)
HK (1) HK1032606A1 (pl)
HU (1) HUP0200320A3 (pl)
IL (2) IL139372A0 (pl)
NO (1) NO20005482L (pl)
NZ (1) NZ507793A (pl)
PL (1) PL199359B1 (pl)
RU (1) RU2244006C2 (pl)
SK (1) SK16162000A3 (pl)
UA (1) UA73718C2 (pl)
WO (1) WO1999057295A1 (pl)
ZA (1) ZA200006124B (pl)

Families Citing this family (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7078512B2 (en) 1998-05-01 2006-07-18 Schering-Plough Animal Health Corporation Nucleic acid encoding feline CD86
WO2001024764A2 (en) * 1999-10-06 2001-04-12 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Cell targeting compositions and methods of using the same
CN101137674A (zh) 2005-03-08 2008-03-05 肯顿有限公司 刚地弓形虫的嵌合重组抗原
GB201601498D0 (en) 2016-01-27 2016-03-09 Pirbright Inst The Coronavirus
BR112018069371A2 (pt) 2016-03-21 2019-01-22 South Dakota Board Of Regents construção de ácido nucleico, vetor, vacina ou composição imunogênica, método de entrega de uma vacina, método de produção de uma construção de ácido nucleico e método para conferir imunidade contra um antígeno

Family Cites Families (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP1645635A3 (en) * 1989-08-18 2010-07-07 Oxford Biomedica (UK) Limited Replication defective recombinant retroviruses expressing a palliative
DK0576092T3 (da) * 1992-06-26 2003-02-17 Akzo Nobel Nv Rekombineret felin herbesvirusvaccine
DE69332480T2 (de) * 1992-07-30 2003-07-17 Akzo Nobel N.V., Arnheim/Arnhem Impfstoff-vektoren von rekombinantem katzen-herpesvirus
US6084067A (en) * 1993-07-26 2000-07-04 Dana-Farber Cancer Institute CTLA4/CD28 ligands and uses therefor
TW377373B (en) * 1993-09-22 1999-12-21 Wyeth Corp Recombinant raccoon pox viruses and their use as an effective vaccine against feline infectious peritonitis virus disease
ES2154738T3 (es) * 1994-10-03 2001-04-16 Us Gov Health & Human Serv Composicion que comprende un virus recombinante que expresa un antigeno y un virus recombinante que expresa una molecula inmunoestimuladora.
US6221361B1 (en) * 1995-01-19 2001-04-24 Syntro Corporation Recombinant swinepox virus
US5820869A (en) * 1995-06-07 1998-10-13 American Home Products Corporation Recombinant raccoon pox viruses and their use as an effective vaccine against feline immunodeficiency virus infection

Also Published As

Publication number Publication date
JP2009178163A (ja) 2009-08-13
NO20005482L (no) 2000-12-27
AU3968899A (en) 1999-11-23
IL139372A0 (en) 2001-11-25
UA73718C2 (en) 2005-09-15
CA2327528A1 (en) 1999-11-11
KR100796799B1 (ko) 2008-01-22
EP1073759B1 (en) 2011-06-01
JP2002513581A (ja) 2002-05-14
HUP0200320A2 (hu) 2002-05-29
NZ507793A (en) 2003-05-30
AU761755B2 (en) 2003-06-12
IL139372A (en) 2010-11-30
ZA200006124B (en) 2002-04-02
CA2327528C (en) 2010-10-12
NO20005482D0 (no) 2000-10-31
CZ20003934A3 (cs) 2001-09-12
RU2244006C2 (ru) 2005-01-10
EP1073759A1 (en) 2001-02-07
ES2367245T8 (es) 2011-12-09
WO1999057295A1 (en) 1999-11-11
ATE511545T1 (de) 2011-06-15
HUP0200320A3 (en) 2006-03-28
KR20010085242A (ko) 2001-09-07
SK16162000A3 (sk) 2001-12-03
HK1032606A1 (en) 2001-07-27
BR9915970A (pt) 2001-12-04
ES2367245T3 (es) 2011-10-31
PL346012A1 (en) 2002-01-14

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP2002531133A (ja) 複数の共刺激分子を発現する組換えベクターおよびその利用
US8071738B2 (en) Feline CD86 polypeptides and nucleic acids
IL184201A (en) Oligonucleotide with a complementary sequence to sequences found in nucleic acid encoding, of cat origin, CD4, CD28, CD86, CD86, CD80
EP1073759B1 (en) Recombinant virus expressing foreign dna encoding feline cd80, feline cd28, feline ctla-4 or feline cd86 and uses thereof
US20130295133A1 (en) Recombinant virus expressing foreign dna encoding feline cd80, feline cd86, feline cd28, or feline ctla-4 and uses thereof
MXPA00010613A (es) Virus recombinante que expresa adn extraño que codifica para cd80 de felino, ctla-4 de felino o cd86 de felino y usos del mismo
AU2007214286B2 (en) Feline CD80, feline CD86, feline CD28 and feline CTLA-4 nucleic acid and polypeptides
AU2003271367A1 (en) Feline CD80, feline CD86, feline CD28, and feline CTLA-4 nucleic acid and polypeptides
MXPA00010618A (en) Feline cd80, feline cd86, feline cd28, and feline ctla-4 nucleic acid and polypeptides

Legal Events

Date Code Title Description
RECP Rectifications of patent specification
LAPS Decisions on the lapse of the protection rights

Effective date: 20120430