SK16162000A3 - Rekombinantný vírus exprimujúci cudziu dna kódujúcu mačací cd80, mačací ctla-4 alebo mačací cd86 a jeho použitie - Google Patents

Rekombinantný vírus exprimujúci cudziu dna kódujúcu mačací cd80, mačací ctla-4 alebo mačací cd86 a jeho použitie Download PDF

Info

Publication number
SK16162000A3
SK16162000A3 SK1616-2000A SK16162000A SK16162000A3 SK 16162000 A3 SK16162000 A3 SK 16162000A3 SK 16162000 A SK16162000 A SK 16162000A SK 16162000 A3 SK16162000 A3 SK 16162000A3
Authority
SK
Slovakia
Prior art keywords
feline
virus
gene
recombinant
spv
Prior art date
Application number
SK1616-2000A
Other languages
English (en)
Inventor
Barbara J. Winslow
Mark D. Cochran
Original Assignee
Schering-Plough Ltd.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Schering-Plough Ltd. filed Critical Schering-Plough Ltd.
Publication of SK16162000A3 publication Critical patent/SK16162000A3/sk

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/86—Viral vectors
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • A61P31/18—Antivirals for RNA viruses for HIV
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A61P35/02—Antineoplastic agents specific for leukemia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/04—Immunostimulants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/06—Immunosuppressants, e.g. drugs for graft rejection
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P39/00—General protective or antinoxious agents
    • A61P39/02—Antidotes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/70503—Immunoglobulin superfamily
    • C07K14/70532—B7 molecules, e.g. CD80, CD86
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/16011—Herpesviridae
    • C12N2710/16041—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2710/16043—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/24011—Poxviridae
    • C12N2710/24041—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2710/24043—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2830/00—Vector systems having a special element relevant for transcription
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2830/00—Vector systems having a special element relevant for transcription
    • C12N2830/60—Vector systems having a special element relevant for transcription from viruses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2840/00—Vectors comprising a special translation-regulating system
    • C12N2840/20—Vectors comprising a special translation-regulating system translation of more than one cistron
    • C12N2840/203—Vectors comprising a special translation-regulating system translation of more than one cistron having an IRES

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • AIDS & HIV (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Transplantation (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Description

Oblasť techniky
Vynález sa týka rekombinantného vírusu exprimujúceho cudziu DNA kódujúcu mačací CD80, mačací CTLÄ-4 alebo mačací CD86 a jeho použitia.
Doterajší stav techniky
Predpokladá sa, že stimulácia T-bunkovej aktivácie a proliferácie v odozve na chorobu hostiteľa závisí od dvoch interakcií: rozpoznania T-bunkového receptoru (TCR) imunogénnymi peptidmi v rozsahu molekúl MHC triedy I a sekundárnej interakcie prídavných ligandov, napríklad CD80 a CD86, s ich koreceptormi CD28 a/alebo CTLA-4 na T-bunke. Úspešná interakcia týchto dvoch dráh vedie k aktivácii a proliferácii ako CD4+, tak CD8+ T-buniek a k zvýšenej produkcii cytokinov regulujúcich imunitu typu Thl a Th2. Za absencie zodpovedajúcej kostimulácie T-buniek sa môže vyvinúť anergický stav, pri ktorom nedochádza k proliferácii Tbuniek a sekrécii cytokinov. V priebehu rokov boli ako kľúčové regulátory T-bunkových odoziev, CD28 a jeho ligandov, identifikované dve molekuly, tzn. CD80 a CD86. CD28 je primárny T-bunkový kostimulačný receptor, ktorý po interakcii s CD80 a CD86 zvyšuje T-bunkovú proliferáciu a syntézu cytokinov, čím zabraňuje T-bunkovej smrti. CTLA-4 (rovnako označovaný ako CD152) CD-28 homológ hrá rovnako dôležitú úlohu pri kostimulácii. Napriek tomu, že jeho úloha nie je celkom preštudovaná, zdá sa, že inhibuje T-bunkové kostimulačné odozvy. Interakcia a súhra medzi CD28, CTLA-4 a ich ligandami CD80 a CD86 pri kostimulačných procesoch predstavujú klúč k celkovej indukcii a supresii
e* • • ···· • · • e ·· • · • · ti ·· • ·
• • • • • • • •
• ô · • • • · • •
·· • ·· ·· ·· • ·
imunitných odoziev na choroby hostiteľa (Linsley a kol., 1991a; 1993a). V súčasnosti neexistuje žiadna účinná vakcína na prevenciu mačacej imunodeficiencie a mačacej infekčnej peritonitídy u mačiek. Vakcíny proti vírusu mačacej leukémie sú dostupné, ale ich účinnosť zatiaľ zostáva sporná, a v niektorých prípadoch môžu vyvolať i samotnú chorobu. Ukázalo sa, že experimentálne vakcíny proti mačacej infekčnej peritonitíde neposkytujú dostatočnú ochranu alebo spôsobujú skorú smrť. V tejto oblasti je teda potrebné vyvinúť činidlá a kompozície, ktoré poskytnú ochranu pred týmito a ďalšími chorobami v prípade, že táto vakcína ešte neexistuje, alebo ktoré zvýšia účinnosť už existujúcich a bežne používaných vakcín. Ďalej je v tejto oblasti potrebné vyvinúť vakcíny a činidlá, ktoré budú indukovať bunkovo mediovanú odozvu pri absencii choroby, zvyšujúce koncentráciu protilátok. Konečne je potrebné prekonať problémy týkajúce sa vakcinácie mačiat, ktoré spočívajú v nemožnosti prekonať materské protilátky. Je teda potrebné vyvinúť bezpečné a účinné činidlá, ktorá pomôžu prekonať tieto bariéry.
Podľa vynálezu je možné manipuláciou expresie mačacieho CD28, mačacieho CTLA-4 a ich ligandov, mačacej CD80 a mačacej CD86 kostimulačnej molekuly, regulovať T-bunkové odozvy cez zosilnenie, potlačenie alebo presmerovanie, a vytvoriť tak požadovanú imunitnú odozvu smerujúcu k určitému mačaciemu patogénu alebo mačaciemu chorobnému stavu. Tieto kostimulačné molekuly sú použitelné predovšetkým pri vakcinácii proti infekčným chorobám, liečení infekčných chorôb a liečení novotvarov degeneratívnych, autoimunitných a imunodeficitných stavov mačiek. Vynález prekonáva nedostatky účinnosti a efektivity z hore opísaných, v súčasnosti dostupných mačacích vakcín.
• ·· ···· • · • · • • • · • · ·« • • • ·
• • • • • ·· • •
• • • • • • · • •
·· • • · • · • · • ·
Podstata vynálezu
Vynález sa týka rekombinantného vírusu, ktorý obsahuje aspoň jednu cudziu nukleovú kyselinu zavedenú do neesenciálnej oblasti vírusového genómu vírusu, pričom každá taká cudzia nukleová kyselina kóduje protein. Kódovaný protein sa zvolí zo skupín skladajúcich sa z mačacieho CD28 proteínu alebo jeho imunogénnej časti, mačacieho CD80 proteínu alebo jeho imunogénnej časti, mačacieho CD86 proteínu alebo jeho imunogénnej časti alebo mačacieho CTLA-4 proteínu alebo jeho imunogénnej časti. Táto časť sa môže, v prípade že sa rekombinantný vírus zavedie do vhodného hostiteľa, exprimovať.
Vynález sa rovnako týka rekombinantného vírusu, ktorý ďalej obsahuje cudziu nukleovú kyselinu kódujúcu imunogén odvodený z patogénu. Ďalej sa vynález týka rekombinantných vírusov, ktoré sú schopné zosilňovať imunitnú odozvu u mačky. Vynález sa konečne týka rekombinantných vírusov, ktoré sú schopné imunitnú odozvu u mačky potlačiť.
Stručný opis obrázkov
Obr. 1A: DNA a aminokyselinová sekvencia mačacieho CD80 (B71)(TAMU).(SEQ ID NO. 1 a 2);
obr. IB: graf hydrofobickosti aminokyselinovej sekvencie mačacieho CD80 (B7-1)(TAMU);
obr. 2A: DNA a aminokyselinová sekvencia mačacieho CD80 (B71)(SYNTRO).(SEQ ID NO. 3 a 4);
·· ·· ·· · ···· ··· • · · · · ·· · · ·· ···· ··· ···· ·· ·· · ·· ·· ··
obr. 2B: graf hydrofobickosti aminokyselinovej sekvencie
mačacieho CD80 (B7-1) (SYNTRO);
obr. 3A: DNA a aminokyselinová sekvencia mačacieho CD86 (B7-
2) (SEQ ID NO. 5 a 6);
obr. 3B: graf hydrofobicikosti aminokyselinovéj sekvencie
mačacieho CD86 (B7-2);
obr. 4A: DNA a aminokyselinová sekvencia mačacieho CD28
(SEQ ID NO. 7 a 8) ;
obr. 4B: graf hydrofobickosti aminokyselinovej sekvencie
mačacieho CD28 f
obr. 5A: DNA a aminokyselinová sekvencia mačacieho CTLA-4
(CD152) (SEQ ID NO. 9 a 10);
obr. 5B: graf hydrofobickosti aminokyselinovéj sekvencie
mačacieho CTLA-4 (CD152).
Vynález sa týka rekombinantného vírusu, ktorý obsahuje aspoň jednu cudziu nukleovú kyselinu zavedenú do neesenciálnej oblasti vírusového genómu vírusu, pričom každá taká cudzia nukleová kyselina (a) kóduje proteín zvolený zo skupín skladajúcich sa z mačacieho CD28 proteínu alebo jeho imunogénnej časti; mačacieho CD80 proteínu alebo jeho imunogénnej časti; mačacieho CD86 proteínu alebo jeho imunogénnej časti; alebo mačacieho CTLA-4 proteínu alebo jeho imunogénnej časti a (b) môže sa, v prípade že sa rekombinantný vírus zavedie do vhodného hostiteľa, exprimovať.
·· ···· ·· ·· ·· • · · ···· ··· • · · ···· · · ··· ······· ·· · ·· ·· ·· · · ·
Pri jednom z rozpracovaní vynálezu rekombinantný vírus obsahuje aspoň dve cudzie nukleové kyseliny, pričom každá z týchto kyselín je zavedená do neesenciálnej oblasti vírusového genómu.
Pri ďalšom rozpracovaní vynálezu rekombinantný vírus obsahuje aspoň tri cudzie nukleové kyseliny, pričom každá z týchto kyselín je zavedená do neesenciálnej oblasti vírusového genómu.
Pri ďalšom rozpracovaní vynálezu rekombinantný vírus obsahuje aspoň štyri cudzie nukleové kyseliny, pričom každá z týchto kyselín je zavedená do neesenciálnej oblasti vírusového genómu.
Pri ešte ďalšom rozpracovaní vynálezu rekombinantný vírus zahŕňa neobmedzujúcim spôsobom vírus kiahní medvedíkov, vírus kiahní ošípaných alebo mačací herpesvírus.
Pri ďalšom rozpracovaní podľa vynálezu rekombinantný vírus obsahuje viac ako jednu cudziu nukleovú kyselinu, pričom všetky cudzie nukleové kyseliny sú zavedené do rovnakej neesenciálnej oblasti. Pri inom rozpracovaní obsahuje ľubovoľný rekombinantný vírus viac ako jednu cudziu nukleovú kyselinu, pričom nie všetky tieto cudzie nukleové kyseliny sú zavedené do rovnakej neesenciálnej oblasti.
Pri samostatnom rozpracovaní obsahuje ľubovoľný rekombinantný vírus cudzú nukleovú kyselinu, ktorá kóduje imunogén odvodený z patogénu. Pri ďalšom rozpracovaní vynálezu kóduje rekombinantný vírus mačací patogén, patogén vírusu besnoty, patogén Chlamydia, patogén Toxoplasmosis gondii, patogén Dirofilaria immitis, blší patogén alebo bakteriálny patogén. Pri ·· ·· ·· • · · ···· ·· ··· ···· · · ·· ···· ··· · · · · ·· ·· · ·· ·· ·· ďalšom rozpracovaní vynálezu rekombinantný vírus kóduje vírus mačacej imunodeficiencie (FIV), vírus mačacej leukémie (FeLV), vírus mačacej infekčnej peritonitídy (FIP), vírus mačacej panleukopénie, mačací kalikivírus, mačací reovírus typu 3, mačací rotavírus, mačací koronavírus, mačací syncytiálny vírus, mačací sarkomavírus, mačací herpesvírus, mačací vírus Bornovej choroby alebo mačacie parazity.
Pri ďalšom rozpracovaní podía vynálezu rekombinantný vírus obsahuje aspoň jednu cudziu nukleovú kyselinu, ktorá obsahuje promotor na expresiu cudzej nukleovej kyseliny. Pri inom rozpracovaní rekombinantný vírus exprimuje aspoň jednu cudziu nukleovú kyselinu za riadenia promotoru endogénneho k vírusu.
Pri ďalšom rozpracovaní vynálezu rekombinantný vírus ďalej obsahuje cudziu nukleovú kyselinu, kódujúcu detekovatelný markér. Pri ďalšom rozpracovaní podía vynálezu je detekovatelným markérom E. coli beta galaktozidáza.
Vynález ďalej poskytuje rekombinantný vírus kódujúci imunogény z FIV gag proteázy, FIV obalového proteínu, FeLV gag proteázy alebo FeLV obalového proteínu.
Vynález poskytuje rekombinantný vírus, ktorý ďalej obsahuje nukleovú kyselinu kódujúcu genóm vírusu mačacej imunodeficiencie alebo jeho časť. Vynález poskytuje rovnako rekombinantný vírus, ktorý ďalej obsahuje nukleovú kyselinu kódujúcu genóm vírusu mačacej leukémie alebo jeho časť. Vynález rovnako poskytuje rekombinantný vírus, ktorý ďalej obsahuje nukleovú kyselinu kódujúcu mačací IL12, GM-CSF, p35 alebo p40. Vynález ďalej poskytuje vakcínu, ktorá obsahuje účinné imunizačné množstvo takého rekombinantného vírusu a vhodný nosič.
·· ···· ·· ·· ·· ·· · · · · · ·· ··· ···· ·· ··· ···· · · ·· · ·· ·· ··
Vynález poskytuje rekombinantný mačací herpesvírus obsahujúci neesenciálnu oblasť, ktorou je glykoproteín G génu mačacieho herpesvírusu. Vynález poskytuje rekombinantný mačací herpesvírus podlá nároku 12 označený ako S-FHV-031 (ATCC Accession No. VR-2604). Tento vírus bol uložený 1. mája 1998 American Type Culture Collection (ATCC), 10801 University Boulevard, Manasas, VA 20108-0971, U.S.A., podľa Budapeštianskej zmluvy o medzinárodnom uznávaní uloženia mikroorganizmov na účely patentového konania.
Vynález poskytuje rekombinantný vírus kiahní ošípaných s neesenciálnou oblasťou vo väčšom Hind III až Bgl II subfragmente Hind III M fragmente vírusu kiahní ošípaných. Vynález poskytuje rekombinantný mačací vírus kiahní ošípaných podlá nároku 14 označený ako S-SPV-246 (ATCC Accession No. VR-2603). Tento vírus bol uložený 1. mája 1998 American Type Culture Collection (ATCC), 10801 University Boulevard, Manasas, VA 20108, U.S.A., podľa Budapeštianskej zmluvy o medzinárodnom uznávaní uloženia mikroorganizmov na účely patentového konania.
Pri jednom rozpracovaní rekombinantného vírusu podľa vynálezu je časť CD28, CD80 alebo CD86 proteínov rozpustnou časťou proteínov. Pri ďalšiom rozpracovaní vynálezu rekombinantný vírus obsahuje cudziu nukleovú kyselinu, ktorá kóduje mačací CTLA-4 protein.
Vynález sa rovnako týka vakcíny, ktorá obsahuje účinné imunizačné množstvo rekombinantného vírusu a vhodný nosič. Pri jednom rozpracovaní podľa vynálezu vakcína obsahuje účinné imunizačné množstvo rekombinantného vírusu približne lxlO5 pfu/ml a približne lxlO8 cfu/ml. Podľa ďalšieho rozpracovania vynález
·· ···· ·· ·· ··
• • · • • • • • • • ·
• • · • • ·· • •
• • · • • • • • •
• · • ·· ·· ·· ··
poskytuje vakcínu, ktorá ďalej obsahuje zmes rekombinantného vírusu a účinné imunizačné množstvo druhého imunogénu.
Vynález poskytuje spôsob zosilnenia imunitnej odozvy u mačky, ktorý zahŕňa podanie účinného imunizačného množstva ľubovoľného hore definovaného rekombinantného vírusu mačke. Vynález ďalej poskytuje spôsob imunizácie mačky podaním účinného imunizačného množstva ľubovoľného hore definovaného rekombinantného vírusu mačke.
Vynález poskytuje spôsob potlačenia imunitnej odozvy u mačky podaním účinného potlačujúceho množstva rekombinantného vírusu obsahujúceho rozpustný CD28, CD80 alebo CD86 mačke. Vynález poskytuje spôsob potlačenia imunitnej odozvy u mačky podaním účinného potlačujúceho množstva rekombinantného vírusu obsahujúceho mačací CTLA-4 protein.
Vynález poskytuje vírusu intravenóznou, muskulárnou, topickou, podanie hore opísaného rekombinantného subkutánnou, intramuskulárnou, transorálnou alebo intraperitoneálnou cestou.
Pri jednom rozpracovaní vynález poskytuje spôsob potlačenia imunitnej odozvy u mačky, ktorá má prijať transplantovaný orgán alebo tkanivo, pri ktorej sa prejaví imunitná odozva. Pri ďalšom rozpracovaní vynález poskytuje spôsob potlačenia imunitnej odozvy u mačky, ktorý zahŕňa podanie protizmyslovej nukleovej kyseliny, ktorá je schopná hybridizácie na: (a) mačací CD28 mRNA transkript, (b) mačací CD80 transkript alebo (c) mačací CD86 mRNA transkript a inhibície translácie týchto transkriptov, pričom protizmyslová nukleová kyselina je prítomná v množstve účinnom na inhibíciu translácie a následné potlačenie imunitnej odozvy u mačky.
·· ···· ·· ·· ·· • · · ···· ·· 9 · · 9 9 99 9 9
9 9 9 9 9 9 9 9
9 99 99 99
Podlá jedného rozpracovania vynález poskytuje spôsob redukcie alebo odstránenia nádoru u mačky, pričom tento spôsob zahŕňa zavedenie rekombinantného vírusu obsahujúceho nukleovú kyselinu, ktorá kóduje mačací CD80 proteín, mačací CD86 proteín alebo ich kombinácie do nádoru mačky v množstve účinnom na redukciu alebo odstránenie nádoru.
Pri jednom rozpracovaní vynález poskytuje spôsob redukcie alebo odstránenia nádoru u mačky, pričom tento spôsob zahŕňa systemicky účinné podanie rekombinantného vírusu, ktorý ďalej obsahuje, a je schopný exprimovať, antigén súvisiaci s mačacím nádorom.
Vynález poskytuje izolovanú a purifikovanú DNA kódujúcu mačací CD80 (B7-1) ligand alebo mačací CD86 (B7-2) ligand alebo mačací CD28 receptor alebo mačací CTLA-4 (CD152) receptor, a rovnako klonujúce a expresné vektory obsahujúce CD80 alebo CD86 alebo CD28 alebo CTLA-4 alebo RNA, a to jej časť alebo celú, a bunky transformované vektormi kódujúcimi CD80 alebo vektormi kódujúcimi CD86 alebo vektormi kódujúcimi CD28 alebo vektormi kódujúcimi CTLA-4. Mačacie druhy, z ktorých sa zvolí CD80 alebo CD86 alebo CD28 alebo CTLA-4, spadajú do skupiny, ktorá zahŕňa neobmedzujúcim spôsobom domáce mačky, levy, pumy, rysy a gepardy.
Vynález poskytuje izolovanú a purifikovanú mačaciu CD80 (B71) cDNA obsahujúcu približne 941 nukleotidov. Vynález rovnako poskytuje izolovaný a purifikovaný mačací CD80 polypeptid, ktorý obsahuje približne 292 aminokyselín, ktorých natívnou membránou viazaná alebo zrelá forma má molekulovú hmotnosť približne 33 485 kDa, izoelektrický bod približne 9,1 a celkový náboj pri pH 7,0 10. Koexpresia CD80 s kostimulačnou molekulou CD28 a nádorovým antigénom alebo antigénom z patogénneho organizmu má ·· ···· • e ·· ·· ·· · ···· ··· • t · · · ·· · · • · · ···· · · ·· · ·· ·· ·· · schopnosť aktivovať alebo zosilňovať aktiváciu T-lymfocytov vrátane produkcie cytokinu stimulujúceho imunitu a rovnako má schopnosť regulovať rast ďalších bunkových typov. Koexpresia CD80 s kostimulačnou molekulou CTLA-4 má schopnosť regulovať aktiváciu T-lymfocytov.
Vynález poskytuje izolovanú a purifikovanú mačaciu CD86 (B72) cDNA obsahujúcu približne 1176 nukleotidov. Vynález rovnako poskytuje izolovaný a purifikovaný mačací CD86 polypeptid, ktorý obsahuje približne 320 aminokyselín, ktorých natívnou membránou viazaná alebo zrelá forma má molekulovú hmotnosť približne 36 394 kDa, izoelektrický bod približne 9,19 a celkový náboj pri pH 7,0 11,27. Koexpresia CD86 s kostimulačnou molekulou CD28 a nádorovým antigénom alebo antigénom z patogénneho organizmu má schopnosť aktivovať alebo zosilňovať aktiváciu T-lymfocytov, vrátane produkcie cytokinov stimulujúcich imunitu a rovnako má schopnosť regulovať rast ďalších bunkových typov. Koexpresia CD86 s kostimulačnou molekulou CTLA-4 má schopnosť regulovať aktiváciu T-lymfocytov.
Mačací CD80 alebo CD86 podlá vynálezu sa získajú z prírodných alebo rekombinantných zdrojov. Mačací CD80 alebo CD86 podlá vynálezu obsahuje natívnu a membránou viazanú formu alebo sekrétovanú formu postrádajúcu transmembránovú doménu.
Vynález poskytuje izolovanú a purifikovanú mačaciu CD28 cDNA, ktorá obsahuje približne 689 nukleotidov. Vynález rovnako poskytuje izolovaný a purifikovaný mačací CD28 polypeptid, ktorý obsahuje približne 221 aminokyselín, pričom ich natívnou membránou viazaná alebo zrelá forma má molekulovú hmotnosť približne 25 319 kDa, izoelektrický bod približne 9,17 a celkový náboj pri pH 7,0 9,58.
·· ···· ·· ·· ·· • · · ···· ··· ·«· ···· · · ··· ···· · · ·· · ·· ·· ·· ·
Vynález poskytuje izolovanú a purifikovanú mačaciu CTLA-4 cDNA, ktorá obsahuje približne 749 nukleotidov. Vynález rovnako poskytuje izolovaný a purifikovaný mačací CTLA-4 polypeptid, ktorý obsahuje približne 223 aminokyselín, pričom ich natívnou membránou viazaná alebo zrelá forma má molekulovú hmotnosť približne 24 381 kDa, izoelektrický bod približne 6,34 a celkový náboj pri pH 7,0 -0,99.
Vynález poskytuje rekombinantný vírus kiahní ošípaných exprimujúci cudziu DNA, pričom táto cudzia DNA kóduje mačaciu CD80, mačaciu CD86, mačaciu CD28 a mačaciu CTLA-4 cDNA a polypeptidy.
Vynález poskytuje rekombinantný vírus kiahní medvedíkov exprimujúci cudziu DNA, pričom táto cudzia DNA kóduje mačaciu CD80, mačaciu CD86, mačaciu CD28 a mačaciu CTLA-4 cDNA a polypeptidy.
Vynález poskytuje rekombinantný mačací herpesvírus exprimujúci cudziu DNA, pričom táto cudzia DNA kóduje mačaciu CD80, mačaciu CD86, mačaciu CD28 a mačaciu CTLA-4 cDNA a polypeptidy.
Podía ďalšieho aspektu poskytuje vynález spôsob zosilnenia imunitnej odozvy mačiek na imunogény, pričom toto zosilnenie sa dosiahne podaním imunogénu pred, po alebo v podstate súčasne s podaním mačacieho CD80 alebo mačacieho CD86, prípadne spoločne s mačacím CD28 alebo mačacím CTLA-4, vo vektore rekombinantného vírusu kiahní ošípaných, vo vektore rekombinantného vírusu kiahní medvedíkov alebo vo vektore rekombinantného mačacieho herpesvírusu, v množstve účinnom na zosilnenie imunitnej odozvy.
·· ···· ·· ·· • · · · · · · • · · · · ·· ·· • · i · » · · · · · · ·· ·· · ·· ·· ··
Podľa ďalšieho aspektu poskytuje vynález spôsob potlačenia imunitnej odozvy mačiek na imunogén, pričom toto potlačenie sa dosiahne podaním imunogénu pred, po alebo v podstate súčasne s podaním mačacieho CD80 alebo mačacieho CD86, prípadne spoločne s mačacím CD28 alebo mačacím CTLA-4 alebo spoločne s protizmyslovou RNA alebo DNA (celou alebo iba jej časťou) kódujúcou mačací CD80 alebo mačací CD86 alebo mačací CD28 alebo mačací CTLA-4, vo vektore rekombinantného vírusu kiahní ošípaných, vo vektore rekombinantného vírusu kiahní medvedíkov alebo vo vektore rekombinantného mačacieho herpesvírusu, v množstve účinnom na potlačenie imunitnej odozvy.
Podlá ďalšieho aspektu poskytuje vynález vakcínu na vyvolanie imunitnej odozvy na imunogén u mačiek, pričom táto vakcína zahŕňa imunogén a účinné množstvo mačacieho CD80 vo vektore rekombinantného vírusu kiahní ošípaných, vo vektore rekombinantného vírusu kiahní medvedíkov alebo vo vektore rekombinantného mačacieho herpesvírusu, na zosilnenie imunitnej odozvy. Imunogén sa napríklad odvodí z mačacích patogénov, akými sú napríklad vírus mačacej imunodeficiencie, vírus mačacej leukémie, mačací parvovírus, mačací koronavírus, mačací leptovírus a ďalšie.
Podlá ďalšieho aspektu poskytuje vynález vakcínu na vyvolanie imunitnej odozvy na imunogén u mačiek, pričom táto vakcína zahŕňa vektor rekombinantného vírusu kiahní ošípaných, vektor rekombinantného vírusu kiahní medvedíkov alebo vektor rekombinantného mačacieho herpesvírusu, ktoré exprimujú DNA alebo RNA imunogénu a DNA alebo RNA mačacích CD80, CD86, CD28 prídavných molekúl v hocijakej kombinácii, ktoré kódujú proteíny alebo fragmenty proteínov v množstve účinnom na moduláciu imunitnej odozvy.
·· ···· ·· ·· ·· ·· · ···· · · ··· ···· ·· • · · ···· ·· ·· · ·· ·· ··
Mačací CD80 proteín má aminokyselinovú sekvenciu, ktorá je z 59 % a z 46 % identická s ľudskými, resp. myšími proteínmi. Mačací CD86 proteín má aminokyselinovú sekvenciu, ktorá je z 68 % a z 64 % identická s ľudskými, resp. králičími proteínmi. Mačací CD28 proteín má aminokyselinovú sekvenciu, ktorá je z 82 % a zo 74 % identická s ľudskými, resp. myšími proteínmi. Mačací CTLA-4 proteín má aminokyselinovú sekvenciu, ktorá je z 88 % a zo 78 % identická s ľudskými, resp. myšími proteínmi. Ľudský alebo myší CD80 alebo CD86 proteín nemôže funkčne nahradiť mačací CD80, resp. CD86 proteín. Mačací CD80, mačací CD86, mačací CD28 a mačací CTLA-4 sú teda nové reakčné činidlá, ktoré sú potrebné na reguláciu imunity u mačiek.
Do rozsahu vynálezu spadajú T-bunky regulujúce prídavné molekuly CD80 (B7-1) alebo CD86 (B7-2) alebo CD28 alebo CTLA-4 (CD152) odvodené z mačacích druhov. Vynález poskytuje izolované a purifikované nukleové kyseliny kódujúce, a to čiastočne alebo úplne, mačací CD80 alebo mačací CD86 alebo mačací CD28 alebo mačací CTLA-4 a rovnako tak CD80, CD86, CD28 alebo CTLA-4 polypeptidy purifikované buď z natívnych alebo rekombinantných zdrojov. Mačacie CD80, CD86, CD28 alebo CTLA-4, pripravené spôsobom podía vynálezu, sa použijú na zvýšenie účinnosti mačacích vakcín proti nádorom a patogénnemu organizmu a ako liečivo na liečenie vírusových a bakteriálnych ochorení mačiek. Mačacie CD80, CD86, CD28 alebo CTLA-4, pripravené spôsobom podľa vynálezu, sa rovnako použijú na zmiernenie ochorení prostredníctvom hyperaktívnej alebo presmerovanej imunitnej odozvy.
·· ···· ·· ·· »· • · · ···· ··· · · 9 · ·· · ·
9 9 9 9 9 9 9 9
9 99 99 ·· ·
Nukleové kyseliny, vektory, transformanty
Sekvencie cDNA kódujúce mačací CD80 (SEQ ID NO: 1, 3), mačací CD86 (SEQ ID NO: 5), mačací CD28 (SEQ ID NO: 7) alebo mačací CTLA-4 (SEQ ID NO: 9) sú znázornené na obrázkoch 1 až 5 a predpokladané aminokyselinové sekvencie mačacieho CD80 (SEQ ID NO: 2, 4), mačacieho CD86 (SEQ ID NO: 6), mačacieho CD28 (SEQ ID NO: 8) alebo mačacieho CTLA-4 (SEQ ID NO: 10) sú rovnako znázornené na obrázkoch 1 až 5. Označenie týchto mačacích polypeptidov ako CD80, CD86, CD28 alebo CTLA-4 vychádza z čiastočnej homológie aminokyselinovej sekvencie s ludským alebo myším alebo králičím homológom týchto polypeptidov a zo schopnosti polypeptidov CD80 alebo CD86 viazať sa na mačací CD28 receptor (pozri ďalej) alebo na CTLA-4 a zo schopnosti aktivovať alebo stimulovať, alebo iným spôsobom regulovať, aktiváciu Tlymfocytov. Ďalej, bez toho aby sme sa chceli viazať na niektorú konkrétnu teóriu, sa dá predpokladať, že mačacie CD80 alebo mačacie CD86 polypeptidy rovnako vykazujú aspoň jednu z nasledujúcich biologických aktivít:
killer) buniek, stimuláciu zrenia obmedzených cytotoxických T-lymfocytov, bujenie žírnych buniek, interakciu s receptormi cytokinov a indukciu cytokínov regulujúcich imunitu.
aktiváciu NK (prirodzený B-buniek, aktiváciu MHC
Vzhladom na degeneráciu genetického kódu (tzn. viaceré kodóny kódujú určité aminokyseliny) môžu aminokyselinové sekvencie mačacieho CD80, CD86, CD28 alebo CTLA-4 znázornené na obrázkoch 1 až 5 kódovať aj iné DNA sekvencie, než ktoré sú znázornené na obrázkoch 1 až 5. Tieto ďalšie DNA sekvencie zahŕňajú sekvencie obsahujúce sekvenčne-konzervatívne varianty, pri ktorých zmena jedného alebo viacerých nukleotidov v danom kodóne nemá za následok zmenu aminokyseliny kódovanej v tejto ·· ···· ·· ·· ·· • · · ···· ·· ··· ···· · · ··· ···· ·· ·· · ·· ·· ·· podobné kyslosť, štruktúra aspartátu pozícii. Okrem toho je možné daný aminokyselinový zvyšok v polypeptide často nahradiť bez toho, že by došlo k zmene celkovej konformácie a funkcie prirodzeného polypeptidu. Také funkčnekonzervatívne varianty zahŕňajú neobmedzujúcim spôsobom nahradenie aminokyseliny aminokyselinou, ktorá má fyzikálne chemické vlastnosti, akými sú napríklad zásaditosť, hydrofóbnosť, hydrofilicita, aromatická apod. (napríklad nahradenie lyzínu arginínom, glutamátom alebo glycínu alanínom). Ďalej je možné pridať alebo vynechať aminokyselinové sekvencie bez toho, že by došlo k znehodnoteniu biologickej aktivity molekuly. Na amino- alebo karboxy-koniec je možné napríklad pridať ďalšie aminokyselinové sekvencie, ktoré slúžia ako purifikačný tag, napríklad histidínový tag (tzn. umožní jednostupňovú purifikáciu proteínu, po ktorej sa chemicky alebo enzymaticky odstráni). Alternatívne pridané sekvencie poskytujú pomocné miesto pre naviazanie na bunkový povrch alebo iným spôsobom menia cielovú bunkovú špecifikáciu mačacieho CD80, CD86, CD28 alebo CTLA-4, a rovnako môžu poskytovať miesto pre naviazanie protilátok.
Do rozsahu vynálezu spadajú mačacie CD80 alebo mačacie CD86 alebo mačacie CD28 alebo mačacie CTLA-4 cDNA sekvencie, ktoré sú znázornené na obrázkoch 1 až 5, sekvenčne konzervatívne varianty DNA, DNA sekvencie kódujúce funkčne-konzervatívne varianty polypeptidov a ich kombinácie. Do rozsahu vynálezu spadajú fragmenty mačacieho CD80, CD86, CD28 alebo CTLA-4, ktoré vykazujú použitelný stupeň biologickej aktivity buď samostatne alebo v kombinácii s ďalšími sekvenciami alebo zložkami. Ako bude vysvetlené ďalej, metódy manipulácie so sekvenciou CD80, CD86, CD28 alebo CTLA-4 a určenie toho, či daný mačací CD80, CD86, CD28 alebo CTLA-4 variant vykazuje príslušnú stabilitu a biologickú
·· ···· ·· ··
• • · • • • · • • • ·
• • · • • ·· • •
• • · • • • · • •
·· • ·· ·· e· • ·
aktivitu pre dané aplikácie, alebo či varianty, ktoré ovplyvňujú väzbovú aktivitu týchto molekúl, vedú k zvýšeniu účinnosti, sú v danom odbore známe. Ako mačací CD80, tak mačací CD86 sa budú viazať na koreceptor CD28 alebo na koreceptor CTLA-4. To je možné dosiahnuť exprimáciou a purifikáciou variantu CD80, CD86, CD28 alebo CTLA-4 polypeptidu v rekombinantnom systéme a rozpracovaním testov, ktoré majú stanoviť jeho aktivitu v zmysle stimulácie T-buniek a/alebo majú stanoviť aktivitu podporujúcu rast v bunkovej kultúre a v zvieratách po rozpracovaní skúšobných aplikácií. Pri variante CD80 sa biologická aktivita testuje funkčným naviazaním na receptory CD28 alebo CTLA-4. Pri variante CD86 sa biologická aktivita testuje funkčným naviazaním na receptory CD28 alebo CTLA-4. Podobným spôsobom sa biologická aktivita testuje pri variante CD28 alebo variante CTLA-4.
Do rozsahu vynálezu rovnako spadajú mačacie CD80, CD86, CD28 alebo CTLA-4 DNA (a polypeptidy) odvodené z ďalších mačacích druhov, ktoré zahŕňajú napríklad domáce mačky, levy, tigry, gepardy, rysy apod. Sekvencie mačacieho CD80, CD86, CD28 alebo CTLA-4 homológu, ktoré sú znázornené na obr. 1 až 5, sú lahko identifikovatelné screeningom cDNA alebo genómových knižníc na identifikáciu klonov, ktoré sa hybridizujú na sondy obsahujúce celú sekvenciu znázornenú na obrázku 1 až 5 alebo jej časť. Alternatívne sa expresné knižnice screenujú pri použití protilátok, ktoré rozpoznajú mačací CD80, CD86, CD28 alebo CTLA4. Bez toho, aby sme sa chceli viazať na niektorú konkrétnu teóriu, sa dá predpokladať, že gény CD80 alebo CD86 z ďalších mačacích druhov budú mať približne aspoň 70 % homológie s mačacími CD80, CD86, CD28 alebo CTLA-4 génmi. Do rozsahu vynálezu rovnako spadajú DNA, ktoré kódujú homológ CD80, CD86, CD28 alebo CTLA-4 a ktoré sú definované ako DNA kódujúce polypeptidy, ktoré ·· ···· • · ·· ·· ·· · ···· ·· • · 9 · · ·· · · ··· ···· ·· ·· · ·· ·· ·· majú približne aspoň 25% aminokyselinovú identitu s mačacím CD80, CD86, CD28 alebo CTLA-4.
Pri manipulácii s nukleovými kyselinami podlá vynálezu sa spravidla používajú metódy, ktoré sú v danom odbore známe a ktoré sú napríklad opísané v Molecular Cloning, A Laboratory Manual (2. vydanie, Sambrook, Fritsch and Maniatis, Cold Spring Harbor) alebo v Current Protocols in Molecular Biology (Eds. Aufubel, Brent, Kingston, More, Feidman, Smith and Stuhl, Greene Publ. Asoc., Wiley-Interscience, NY, NY, 1992).
Vynález rovnako zahŕňa cDNA a RNA sekvencie, a to ako zmyslové, tak protizmyslové. Vynález ďalej zahŕňa genómové mačacie CD80, CD86, CD28 alebo CTLA-4 DNA sekvencie a lemujúce sekvencie zahŕňajúce neobmedzujúcim spôsobom regulačné sekvencie. Sekvencie nukleovej kyseliny kódujúce mačací CD80, CD86, CD28 alebo CTLA-4 polypeptid(y) sú rovnako spojované s heterologickými sekvenciami zahŕňajúcimi promotory, zosilňovače, odozvové prvky, signálne sekvencie, polyadenylačné sekvencie, intróny, 5'- a 3'nekódujúce oblasti apod. Transkripčné regulačné prvky, ktoré sú operatívne pripojené k mačacej CD80, CD86, CD28 alebo CTLA-4 sekvencii (sekvenciám), zahŕňajú neobmedzujúcim spôsobom tie prvky, ktoré majú schopnosť riadiť expresiu génov odvodených z prokaryotických buniek, eukaryotických buniek, vírusov prokaryotických buniek, vírusov eukaryotických buniek a ich ľubovolnéj kombinácie. Ďalšie použiteľné heterologické regulačné sekvencie sú odborníkom v danom odbore známe.
Nukleové kyseliny podľa vynálezu sú modifikované odborníkom v danom odbore známymi metódami s cieľom modifikovať ich stabilitu, rozpustnosť, väzbovú afinitu a špecifickosť. Sekvencie sú napríklad selektívne metylované. Nukleokyselinové sekvencie
·» ···· • e ·· ··
• • · • • • • • • • ·
• • · • • ·· • •
• • · • • • • • •
*· • * · ·· • t ··
podľa vynálezu sú rovnako modifikované pomocou značenia, ktoré je schopné poskytnúť buď priamo alebo nepriamo detekovatelný signál. Príklady značenia zahŕňajú rádioizotopy, fluorescenčné molekuly, biotín apod.
Vynález rovnako poskytuje vektory, ktoré zahŕňajú nukleové kyseliny kódujúce CD80, CD86, CD28 alebo CTLA-4 polypeptid(y), a to čiastočne alebo úplne. Tieto vektory napríklad zahŕňajú plazmidové vektory na expresiu v celej rade eukaryotických a prokaryotických hostitelov. Vektory rovnako výhodne zahŕňajú promotor operatívne naviazaný na časť kódujúcu mačací CD80, CD86, CD28 alebo CTLA-4 polypeptid. Kódovaný mačací CD80, CD86, CD28 alebo CTLA-4 polypeptid(y) sa exprimuje pri použití hocijakého vhodného vektoru a hostiteľskej bunky tu opísaným spôsobom alebo akýmkoľvek iným, v danom odbore známym, spôsobom.
Vynález rovnako poskytuje vektory, ktoré obsahuj) nukleové kyseliny kódujúce mačací CD80, CD86, CD28 alebo CTLA-4 polypeptid(y), a to čiastočne alebo úplne. Tieto vektory napríklad zahŕňajú živé vírusové vektory na expresiu v rôznych eukaryotických hostiteľoch alebo na expresiu DNA alebo RNA vakcín. Pri jednom rozpracovaní je živý vírusový vektor zmiernený. Pri ďalšom rozpracovaní je živý vírusový vektor zmiernený génovou deléciou. Pri ešte ďalšom rozpracovaní je vírusový vektor inaktivovaný chemickým ošetrením alebo pôsobením tepla. Živý vírusový vektor sa zvolí zo skupiny zahŕňajúcej neobmedzujúcim spôsobom herpesvírus, vírus kiahní, adenovírus, adeno-súvisiaci vírus, retrovírus, bakulovírus, alfavírus, rhabdovírus a picornavírus. Živý vírusový vektor sa zvolí zo skupiny zahŕňajúcej neobmedzujúcim spôsobom mačací herpesvírus, psí herpesvírus, vtáčí herpesvírus, kravský herpesvírus, konský herpesvírus, vírus pseudobesnoty, vírus kiahní ošípaných ·· ···· ·· ·· • · · • · ·· ·· • · • · ·· • · · · «· ·· • · ·· (swinepox), vírus kiahní vtákov (avipox), vírus kiahní hydiny (fowlpox), vírus kiahní medvedíkov (raccoonpox), vírus kiahní okrasného vtáctva (canarypox), vírus kravských kiahní (vaccinia), vírus myšej leukémie Malony, vírus Sindbis a vírus Semliki Forest.
Živý vírusový vektor je rekombinantný vírusový vektor exprimujúci cudziu DNA, ktorou je mačacia CD80, CD86, CD28 alebo CTLA-4 cDNA a to celá alebo jej časť. Cudzia DNA je rovnako cDNA pre antigén z patogénneho organizmu. Rekombinantný vírusový vektor je konštruovaný konštrukčnými metódami, ktoré vedú k získaniu homologického rekombinantu alebo kozmidu a ktoré sú v danom odbore známe. Výhodne vektory rovnako zahŕňajú promotor operatívne naviazaný na časť kódujúcu mačací CD80, CD86, CD28 alebo CTLA-4 polypeptíd. Promotor sa zvolí zo skupiny zahŕňajúcej neobmedzujúcim spôsobom gE promotor mačacieho herpesvírusu, syntetický neskorý/raný promotor poxvírusu, raný promotor ludského cytomegalovírusu a gX promotor vírusu pseudobesnoty. Podpora génovej expresie rovnako zahŕňa expresiu CD80, CD86, CD28 alebo CTLA-4 cDNA zo vstupného miesta vnútorného ribozómu (IRES), ktorý je súčasťou kazety (pCITE vector, Novagen, Madison, Wl) . Bunkové línie pre rastúce vírusové vektory zahŕňajú neobmedzujúcim spôsobom mačacie obličkové bunky Crandell (CRFK), fibroblasty kuracieho embrya, obličkové bunky prasacieho embrya (ESK-4), prasacie obličkové bunky (PK). Kódovaný mačací CD80, CD86, CD28 alebo CTLA-4 polypeptíd(y) sa exprimuje pri použití hocijakého vhodného vektoru a hostiteľské bunky spôsobom, ktorý je tu vysvetlený alebo iným, v danom odbore známym, spôsobom.
Pri výhodnom rozpracovaní sa gény kódujúce mačací CD80 a
CD28, CD80 a CTLA-4, CD86 a CD28, alebo CD86 a CTLA-4 zabudujú, spoločne s génmi pre imunogén odvodený z mačacieho patogénu, do ·· ···· ·· ·· ·· ·« · ···· ··· ··· ···· ·· • · ·· ·· ··· · ··· ···· ·· ·· · ·· ·· ·· · jediného rekombinantného vírusového vektoru a následne sa formulujú do živej vakcíny. Mačacie CD80, CD86, CD28 alebo CTLA-4 gény samotné alebo v kombinácii s mačacími génmi odvodenými z mačacích patogénov sa zabudujú do rekombinantného vírusu tak, že expresiu týchto génov reguluje vhodný promotor. Pri ďalšom rozpracovaní sa gény kódujúce mačacie CD80, CD86, CD28 alebo CTLA-4 samotné alebo v kombinácii zabudujú do rekombinantného vírusového vektoru a súčasne sa podávajú vo vakcíne s druhým rekombinantným vírusovým vektorom, ktorý kóduje gény pre imunogén(y) odvodený z mačacích patogénov. Tieto dve rozpracovania poskytujú požadovanú imunitnú odozvu v rovnakej bunke alebo v bunkách, ktoré sa nachádzajú v tesnej blízkosti, na zvýšenie potlačenia alebo presmerovania požadovanej imunitnej odozvy.
Imunogén sa zvolí zo skupiny zahŕňajúcej neobmedzujúcim spôsobom mačacie patogény, napríklad vírus mačacej imunodeficiencie, vírus mačacej leukémie, vírus mačacej infekčnej peritonitídy, vírus mačacej panleukopénie (parvovírus), mačací kalikivírus, mačací reovírus typu 3, mačací rotavírus, mačací koronavírus (Infectious peritonitis vírusus), vírus besnoty, mačací syncytiálny vírus, mačací sarkomavírus, mačací herpesvírus (rhinotracheitis vírus), mačací vírus Bornovej choroby, Chlamydia, Toxoplasmosis gondii, mačací parazity, Dirofilaria immitis, blchy, bakteriálne patogény apod.
Vektory alebo živé vírusové vektory budú často zahŕňať jeden alebo viaceré replikačné systémy na klonovanie alebo expresiu jedného alebo viacerých markérov na selekciu v hostitelovi, akými sú napríklad antibiotická rezistencia alebo kalorimetrické markery, napríklad β-galaktozidáza (lacZ) alebo β-glukuronidáza (uidA), alebo fluorescenčné markéry, napríklad zelený ·· ···· • · • · • · · · • · ·· ·· • · · • · » · · · ·· ·· fluorescenčný proteín, a jednu alebo viac expresných kaziet. Vložené kódujúce sekvencie sú syntetizované, izolované z prírodných zdrojov, pripravené ako hybridy apod. Ligácia kódujúcich sekvencii na transkripčné regulačné sekvencie sa dosiahne odborníkom v danom odbore známymi metódami. Vhodné hostitelské buňky sa transformujú/transfektujú/infektujú hocijakou vhodnou metódou zahŕňajúcou elektroporáciu, CaCl2alebo lipozómom-mediovanú DNA absorpciu, fungálnu infekciu, mikroskopickou injektáž apod.
Vhodnými vektory na použitie v praxe sú napríklad YEp352, pcDNAI (Invitrogen, Carlsbad, CA), pRc/CMV (Invitrogen) a pSFVl (GIBCO/BRL, Gaithersburg, MD) . Výhodným vektorom na použitie v rámci vynálezu je pSFVl. Medzi vhodné hostiteľské bunky je možné napríklad zaradiť E. coli, kvasinky, COS bunky, PC12 bunky, CHO bunky, GH4C1 bunky, BHK-21 bunky a melanofory obojživelníkov. Na realizáciu vynálezu sú výhodnou hostiteľskou bunkovou líniou BHK21 bunky. Vhodné vektory na konštrukciu holej DNA alebo genetických vakcinácií zahŕňajú neobmedzujúcim spôsobem pTarget (Promega, Madison, WI), pSI (Promega, Madison, WI) a pcDNA (Invitrogen, Carlsbad, CA) .
Nukleové kyseliny kódujúce mačací CD80, CD86, CD28 alebo CTLA-4 polypeptid(y) sa rovnako zavádzajú do buniek rekombinantným spôsobom. Táto sekvencia sa napríklad mikroskopicky injektuje do bunky, pričom spôsobí homologickú rekombináciu v mieste endogénneho génu kódujúceho polypeptid, jeho analógu alebo jeho pseudogénu, alebo sekvencie, ktorá je v podstate identická so sekvenciou génu kódujúceho mačací CD80, CD86, CD28 alebo CTLA-4 polypeptid. Rovnako je možné použiť ďalšie metódy na báze rekombinácie, napríklad nehomologickej • · • ·· • · · ·· · • · · · · · ·· ·· ·· · rekombinácie, a delécie endogénneho génu uskutočnené homologickou rekombináciou, najmä v pluripotentných bunkách.
Vynález poskytuje spôsob zosilnenia imunitnej odozvy u mačiek na imunogén, ktoré sa dosiahne podaním imunogénu pred, po alebo v podstate súčasne s mačacím CD80 alebo mačacím CD86, prípadne s mačacím CD28 alebo s mačacím CTLA-4 v množstve účinnom na zosilnenie imunitnej odozvy.
Vynález poskytuje spôsob zosilnenia imunitnej odozvy u mačiek na imunogén, ktoré sa dosiahne podaním expresného vektoru, ktorý obsahuje imunogén odvodený z mačacieho patogénu a mačacie CD80 alebo mačacie CD86 prídavné molekuly, prípadne s mačacím CD28 alebo mačacím CTLA-4 v množstve účinnom na zosilnenie imunitnej odozvy.
Vynález poskytuje spôsob presmerovania imunitnej odozvy u mačiek na imunogén, ktoré sa dosiahne podaním expresného vektoru, ktorý obsahuje imunogén odvodený z mačacieho patogénu a mačacie CD80 alebo mačacie CD86 prídavné molekuly, prípadne s mačacím CD28 alebo mačacím CTLA-4 v množstve účinnom na presmerovanie imunitnej odozvy.
Vynález poskytuje spôsob potlačenia imunitnej odozvy u mačiek na imunogén, ktoré sa dosiahne podaním imunogénu pred, po alebo v podstate súčasne s mačacím CD80 alebo mačacím CD86, prípadne s mačacím CD28 alebo mačacím CTLA-4 alebo prípadne s protizmyslovou RNA alebo DNA kódujúcou mačací CD80 alebo mačací CD86 alebo mačací CD28 alebo mačací CTLA-4 v množstve účinnom na potlačení imunitnej odozvy.
Vynález poskytuje vakcínu na vyvolanie imunitnej odozvy u mačky na imunogén(y), ktorá obsahuje imunogén a účinné množstvo ·· ·· ·· • · · ···· ··· «·· · · ·· · · ··· · · · · ·· ·· · ·· ·· ·· · mačacieho CD80 alebo mačacieho CD86, prípadne s mačacím CD28 alebo mačacím CTLA-4, na zosilnenie imunitnej odozvy, alebo účinné množstvo mačacieho CD80 alebo mačacieho CD86, prípadne s mačacím CD28 alebo mačacím CTLA-4, na potlačenie imunitnej odozvy. V ďalšom rozpracovaní vynález poskytuje vakcínu, ktorá obsahuje expresný vektor obsahujúci gény pre imunogén(y) proti mačacím patogénom a gény pre CD80, CD86, prípadne s mačacím CD28 alebo mačacím CTLA-4, na zosilnenie alebo potlačenie imunitnej odozvy.
Mačacie CD80, CD86, CD28 alebo CTLA-4 polypeptidy
Mačací CD80 gén (ktorého DNA a aminokyselinová sekvencia sú znázornené na obrázku 1 a 2) kóduje polypeptid, ktorý je tvorený približne 292 aminokyselinami. Mačací CD86 gén (ktorého DNA a aminokyselinová sekvencia sú znázornené na obrázku 3) kóduje polypeptid, ktorý je tvorený približne 320 aminokyselinami. Mačací CD28 gén (ktorého DNA a aminokyselinová sekvencia sú znázornené na obrázku 4) kóduje polypeptid, ktorý je tvorený približne 221 aminokyselinami. Mačací CTLA-4 gén (ktorého DNA a aminokyselinová sekvencia sú znázornené na obrázku 5) kóduje polypeptid, ktorý je tvorený približne 223 aminokyselinami.
Purifikácia mačacieho CD80, CD86, CD28 alebo CTLA-4 z prirodzeného alebo rekombinantného zdroja sa vykonáva v danom odbore známymi metódami, ktoré zahŕňajú neobmedzujúcim spôsobom iónomeničovú chromatografiu, chromatografiu s reverznou fázou na C4 kolónach, gélovú filtráciu, izoelektrickú fokuláciu, afinitnú chromatografiu apod. Vo výhodnom rozpracovaní sa biologicky účinné mačacie CD80, CD86, CD28 alebo CTLA-4 získajú vo väčších ·· ···· ·· ·· ·· ·· · ···· ·· ··· · · ·· ·· ··· ···· ·· ·· · ·· ·· ·· množstvách konštrukciou rekombinantnej DNA sekvencie obsahujúcej kódujúcu oblasť pre mačací CD80, CD86, CD28 alebo CTLA-4 naviazanú na sekvenciu kódujúcu 6 C-koncových histidínových zvyškov v pSFVl replikóne (GIBCO/BRL). Týmto plazmidom kódovaná mRNA sa syntetizuje pomocou techník, ktoré sú odborníkom v danom odbore známe, a elektroporáciou zavedie do BHK-21 buniek. Tieto bunky syntetizujú a vylučujú zrelé glykozylované mačacie CD80, CD86, CD28 alebo CTLA-4 polypeptidy obsahujúce 6 C-koncových histidínov. Modifikované mačacie CD80, CD86, CD28 alebo CTLA-4 polypeptidy sa purifikujú z bunkového supernatantu pomocou afinitnej chromatografie pri použití živice, ktorá viaže histidín (His-bind, Novagen, Madison, WI).
Mačacie CD80 alebo mačacie CD86 polypeptidy izolované z ľubovoľného zdroja sa modifikujú v danom odbore známymi metódami. Mačací CD80, CD86, CD28 alebo CTLA-4 sa napríklad fosforyluje alebo defosforyluje, glykozyluje alebo deglykozyluje apod. Osobitne vhodné sú modifikácie, ktoré menia rozpustnosť, stabilitu, väzbovú špecifikáciu a afinitu mačacieho CD80, CD86, CD28 alebo CTLA-4.
Chimerické molekuly mačacieho CD80, CD86, CD28, CTLA-4
Vynález sa rovnako týka výroby chimerických molekúl vyrobených z fragmentov mačacieho CD80, CD86, CD28 a CTLA-4 v hocijakej kombinácii. Zavedenie väzbového miesta CTLA-4 namiesto väzbového miesta CD28 napríklad zvýši väzbovú afinitu CD28 a súčasne zachová zosilnenie imunitnej odozvy.
Pri jednom rozpracovaní sa väzbové miesta pre CD80 alebo
CD86 na CTLA-4 a CD28 zamenia tak, že sa väzbová oblasť na CD28 nahradí väzbovou oblasťou CTLA-4. Výsledným účinkom chimerickej ·· ···· ·· ·· ·· • · · ···· · · · • · · ···· · · • •I ···· · · ·· · ·· ·· ·· ·
CD28 molekuly s CTLA-4 väzbovou oblasťou je zvýšenie afinity CD28 pre CD80 alebo CD86 a zvýšenie hodnoty zosilnenia imunitnej odozvy. Pri alternatívnom rozpracovaní sú chimerické molekuly CD80 a CD28 alebo CD86 a CD28 alebo ich fragmenty viazané membránou a zosilňujú schopnosť týchto molekúl posilniť imunitnú odozvu. Pri alternatívnom rozpracovaní sú chimerické molekuly CD80 a CTLA-4 alebo CD86 a CTLA-4 alebo ich fragmenty viazané membránou a zosilňujú schopnosť týchto molekúl potlačiť imunitnú odozvu. Pri alternatívnom rozpracovaní sú chimerické molekuly CD80 a CTLA-4 alebo CD86 a CTLA-4 alebo ich fragmenty viazané membránou a presmerovávajú imunitnú odozvu za účelom dosiahnutia požadovaného účinku.
V alternatívnom rozpracovaní je mačací CD80, CD86, CD28 alebo CTLA-4 proteínom naviazaným na ďalší polypeptid. Tento polypeptid zahŕňa neobmedzujúcim spôsobom imunoglobulín, antigén, nádorový antigén, bunkový povrchový receptor alebo bunkový povrchový ligand.
Mačacie CD80, CD86, CD28 alebo CTLA-4 protilátky
Do rozsahu vynálezu rovnako spadajú protilátky, ktoré sú špecifické pre hore opísané mačacie CD80, CD86, CD28 alebo CTLA-4 polypeptidy. Tieto protilátky sú polyklonálne alebo monoklonálne a diskriminujú mačacie CD80, CD86, CD28 alebo CTLA-4 na úkor iných druhov, identifikujú funkčné domény apod. Tieto protilátky sú bežne vyrábané pri použití spôsobov a kompozícií opísaných v Harlow a Lane, Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988, a rovnako tak pri použití imunologických hybridizačných technológií, ktoré sú odborníkom v danom odbore známe. Pokial sa na vyvolanie imunitnej odozvy, špecifickej pre mačacie CD80, CD86, CD28 alebo CTLA-4, použijú peptidy odvodené z ·· ·· ·· ··· • · · ···· · · ··· ···· · · ··· ···· · · ·· · ·· ·· ·· prírodných alebo syntetických mačacích CD80, CD86, CD28 alebo CTLA-4, potom sa tieto peptidy spravidla viažu na vhodný nosič, akým je napríklad KLH, a podávajú vo vhodnom adjuvanse, napríklad Freundovom adjuvanse. Výhodne sa zvolené peptidy naviažu na nosič s lyzínovým jadrom, a to v podstate spôsobom, ktorý opísal Tan (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85: 5409-5413. Pri použití známych metód sa pripravia i výsledné protilátky, najmä vnútorné zobrazovacie anti-idiotypické protilátky.
V jednom rozpracovaní sa purifikovaný mačací CD80, CD86, CD28 alebo CTLA-4 použil na imunizáciu myší, po ktorej bola myšiam odoberaná slezina a splenocyty boli použité na štandardnú prípravu bunkových hybridov spoločne s bunkami myelómu a na získanie klonov buniek vylučujúcich protilátky. Pri výsledných monoklonálnych protilátkach vylučovaných takto pripravenými bunkami sa pomocou in vitro testov sledovali nasledujúce aktivity: naviazanie na mačací CD80, CD86, CD28 alebo CTLA-4, inhibícia schopnosti CD80, CD86, CD28 alebo CTLA-4 viazať sa na receptor a inhibícia schopnosti CD80, CD86, CD28 alebo CTLA-4 stimulovať T-bunky.
Mačacie CD80, CD86, CD28 alebo CTLA-4 protilátky sa používajú na identifikáciu a kvantitatívne stanovenie mačacieho CD80, CD86, CD28 alebo CTLA-4 pri použití imunologických testov, akými sú ELISA, RIA apod. Mačacie CD80, CD86, CD28 alebo CTLA-4 protilátky sa rovnako používajú na imunodepléciu extraktov mačacieho CD80, CD86, CD28 alebo CTLA-4. Okrem toho je možné tieto protilátky použiť na identifikáciu, izoláciu a purifikáciu mačacieho CD80, CD86, CD28 alebo CTLA-4 z rôznych zdrojov a na realizáciu subcelulárnych a histochemických lokalizačných štúdií.
Použitie ···· • · ·· ·· · ···· · · · ··· · · ·· · · ··· ···· · · ·· ·· ·· ·· ·
Mačací CD80 (B7-1) ligand, mačací CD86 (B7-2) ligand, mačací CD28 receptor alebo mačací CTLA-4 (CD152) receptor pripravené spôsobom podľa vynálezu je možné úspešne použiť ako vakcíny na zabránenie infekčnej chorobe alebo na podporu rastu v homologických alebo heterologických mačacích druhoch, napríklad koexpresia CD80 alebo CD86 s kostimulačnými molekulami CD28 alebo CTLA-4 v ľubovoľnej kombinácii a s nádorovým antigénom alebo antigénmi z patogénneho organizmu. Koexpresia mačacieho CD80 alebo CD86 spoločne s mačacím CTLA-4 receptorom má schopnosť inhibovať aktiváciu T-lymfocytov a schopnosť potlačiť imunitnú odozvu. Špecifickým príkladom môže byť koexpresia CD80 alebo CD86 spolu s FIV, FeLV alebo FIP odvodenými imunogénmi vo vírusovom vektore alebo v DNA expresnom vektore, ktorá pokiaľ sa podá formou vakcíny, bude aktivovať, posilňovať alebo regulovať bujnenie CD4+ a CD8+ T-lymfocytov a indukovať cytokiny regulujúce imunitu, akými sú napríklad IL-2, IFN-g, IL-12, TNFa, IL-6 apod. Ďalším špecifickým príkladom by mohla byť expresia CD80, CD86, CD28 alebo CTLA-4 vo vírusovom vektore alebo DNA expresnom vektore, ktorá, pokial sa podá ako liečivo, bude regulovať alebo presmerovávať imunitnú odozvu.
Zosilnenie imunity cez interakciu mačacieho CD80, CD86, CD28 alebo CTLA-4, alebo inhibícia imunitnej odozvy cez interakciu mačacieho CD80 alebo CD86 s CTLA-4 je prirodzený spôsob regulácie, ktorý je výhodnejší ako pridanie cudzích látok, ktoré by mohli mať viac účinkov, v niektorých prípadoch i škodlivých, na celkový alebo dlhodobý zdravotný stav. Molekuly CD80, CD86, CD28 alebo CTLA-4 sa podávajú spoločne s ďalšími rekombinantnými molekulami, napríklad s molekulami, ktoré kódujú antigény žiadúce na vyvolanie imunity. Mačací CD80, CD86, CD28 a/alebo CTLA-4 gén sa zavedie do expresného vektoru a infikuje alebo transfektuje do ·· ···· ·· ·· ·· ·· · ···· ··· • · · ···· ·· ··· ···· ·· ·· · ·· ·· ·· · cieľovej bunky, kde dochádza k expresii génového produktu, ktorý sa buď zachytí v plazmovej membráne cieľovej bunky, alebo v bunke prezentujúcej antigén, alebo sa vylučuje von z cieľovej bunky alebo z bunky prezentujúcej antigén. Expresný vektor, akým je napríklad plazmid, vírus Semliki Forest, poxvírus alebo herpesvírus, prepravuje gén do bunky prezentujúcej antigén. Mačací CD80, CD86, CD28 a/alebo CTLA-4 gén alebo fragmenty génov v ľubovoľnej kombinácii sa zavádzajú do DNA alebo RNA expresného vektoru a injektujú do tela mačky a exprimujú génový produkt v tele mačky ako holú DNA/RNA alebo genetickú vakcínu. Koexpresia imunogénu a CD80, CD86, CD28 a/alebo CTLA-4 v cieľovej bunke alebo v tele mačky prispieva k aktivácii, zosilnenej aktivácii alebo regulácii T-lymfocytov, B-lymfocytov a ostatných buniek. Alternatívne by bolo možné eprimovaný proteín podať po expresii v prokaryotickom alebo eukaryotickom systéme, akým je napríklad plazmid, vírus Semliki Forest, poxvírus alebo herpesvírus, alebo ďalší vírusový alebo bakteriálny vektor. Mačacie CD80, CD86, CD28 alebo CTLA-4 proteíny spravidla fungujú zakotvené v bunkovej membráne ako prídavné molekuly plazmovej membrány, ale môžu existovať aj v ďalších formách, napríklad bez membránového ukotvenia.
Pri jednom rozpracovaní sú mačací CD80 a mačací CD86 rozpustné, postrádajú tranzmesmbránovú doménu alebo hydrofóbnu oblasť a vzájomne reagujú s kostimulačnými molekulami CD28 alebo CTLA-4 buď s membránou viazané, alebo v rozpustnej forme. V alternatívnom rozpracovaní sú mačacie CD80 alebo CD86 membránou viazané a kostimulačné molekuly CD28 alebo CTLA-4 sa nachádzajú v rozpustnej forme postrádajúcej tranzmesmbránovú doménu alebo hydrofóbnu oblasť. Rozpustný CD28 alebo CTLA-4, výhodne v dimérnej forme, sa využíva pri liečbe choroby mačiek súvisiacej s ·· ···· ·· ·· ·· • · · · · · • · ·· i · • t · * · · ·· ·· ·· imunosupresiou mediovanou T-bunkami. Rozpustný CD28 alebo CTLA-4 bránia odhojeniu transplantovaného tkaniva a je možné ich použiť pri liečení chorôb autoimunitného systému. Rozpustný CD28 alebo CTLA-4 je možné konkrétne použiť ako prevenciu proti odhojeniu transplantátu pri transplantácii kosťovej drene. Rozpustný CD28 alebo CTLA-4 bránia naviazaniu bunky obsahujúcej membránou viazaný mačací CD80 alebo CD86.
V ďalšom rozpracovaní sa mačací CTLA-4 naviaže na imunoglobulín (Ig). Fúzia CTLA-4-Ig sa použije na potlačenie imunitnej odozvy alebo na liečenie chorôb autoimunitného systému. Choroby autoimunitného systému zahŕňajú neobmedzujúcim spôsobom artritídu, psoriázu, odhojenie transplantovaného orgánu a chorobu transplantát vs. hostitel.
Pri ďalšom rozpracovaní by mohli byť mačacie CD80 a/alebo CD86 proteíny exprimované buď vo viazanej, alebo rozpustnej forme použité na liečenie nádorov u mačiek. Konkrétne by bolo možné mačacie CD80 a/alebo CD86 proteíny exprimovať z vírusového vektoru alebo z DNA priamym injektovaním nádoru alebo systemickým podaním, prípadne v kombinácii s ko-vektorovanými antigénmi súvisiacimi s nádorom mačky.
Sekvenčne konzervatívne a funkčne konzervatívne varianty mačacej CD80, CD86, CD28 alebo CTLA-4 DNA a polypeptidov alebo biologicky aktívny mačací CD80, CD86, CD28 alebo CTLA-4 fagment alebo subfragment sa viažu na ďalšiu sekvenciu, akou je napríklad cytokin, interleukin, interferon, faktor stimulujúci kolóniu, antigén z patogénneho mikroorganizmu, protilátka alebo purifikačná sekvencia, napríklad his-tag alebo reportérový gén, napríklad E. coli lacZ, E. coli iudA alebo zelene fluoreskujúci protein.
·· ···· ·· ·· ·· • · · ···· ·· ··· ···· · e • · · · · « · ·· ·· · ·· ·· ··
Vakcíny
Vynález sa týka spôsobov a kompozícií na zosilnenie účinnosti imunitnej odozvy u mačacích druhov. Pri tomto rozpracovaní sa mačací CD80, CD86, CD28 alebo CTLA-4 použijú v spojení s imunogénom, pre ktorý je požadované vyvolať imunitnú odozvu. Pre mačacie vakcíny, ktoré napríklad obsahujú imunogény z patogénov, akými sú napríklad vírus mačacej imunodeficiencie a vírus mačacej leukémie, a z ďalších patogénov, akými sú napríklad mačací parvovírus, mačací leptovírus a mačací koronavírus, je žiadúce, aby rovnako obsahovali mačací CD80, CD86, CD28 alebo CTLA-4 a aby regulovali hodnotu a kvalitu imunitnej odozvy. Z týchto dôvodov je vo vakcínach obsiahnutý mačací CD80, CD86, CD28 alebo CTLA-4 purifikovaný z prírodného alebo rekombinantného zdroja, ktoré už boli opísané hore, a to v množstve, ktoré sa pohybuje približne od 0,01 do 100,0 mg/vakcína/mačka. Alternatívne môže byť vo vakcíne obsiahnutý rekombinantný vektor exprimujúci mačací CD80, CD86, CD28 alebo CTLA-4 a imunogén z mačacieho patogénu v koncentrácii približne od 0,01 do 100,0 mg/vakcína/mačka a výhodne v koncentrácii približne od 0,25 do 25 mg/kg/deň.
Mačacie CD80, CD86, CD28 alebo CTLA-4 sa podávajú v spojení s živou {tzn. replikačnou) vírusovou vakcínou alebo nereplikačnou vakcínou. Neobmedzujúce príklady replikačných vakcín zahŕňajú vakcíny, ktoré obsahujú prírodné alebo rekombinantné vírusy alebo baktérie, napríklad modifikovaný mačací herpesvírus alebo modifikovaný vírus kiahní medvedíka. Neobmedzujúce príklady živých vírusových vakcín s obmedzenou alebo žiadnou replikáciou v tele mačacieho hostiteľa, ale s expressiou cudzej DNA (napríklad ·· ···· ·· ·· ·· • « · ···· ·· ··· ···· · · ··· ···· ·· ·· · ·· ·· ·· mačacieho CD80, CD86, CD28 alebo CTLA-4 alebo imunogénu z mačacieho patogénu) v hostiteľskej bunke, sú modifikovaný vírus kiahní hydiny, modifikovaný vírus kiahní ošípaných alebo vírus Semliki Forest. Neobmedzujúce príklady sú tie vakcíny, ktoré obsahujú mŕtve alebo inaktivované vírusy alebo ďalšie mikroorganizmy alebo čistené alebo nečistené antigény odvodené z prírodných, rekombinantných alebo syntetických zdrojov, akými sú napríklad vakcíny vírusu mačacej leukémie.
Komerčné zdroje mačacích vakcín sú odborníkom v danom odbore známe (Compendium of Veterinary Pharmaceuticals, 1997) a v kombinácii s vynálezom sa používajú na prípravu účinnejšej vakcíny.
Vakcína na vyvolanie a reguláciu imunitnej odozvy na imunogén u mačiek je tvorená imunogénom a množstvom mačacieho CD80 alebo mačacieho CD86, prípadne s mačacím CD28 alebo mačacím CTLA-4, ktoré je účinné na zosilnenie imunitnej odozvy alebo s množstvom mačacieho CD80 alebo mačacieho CD86 s mačacím CTLA-4, ktoré je účinné na potlačenie imunitnej odozvy.
Imunogén sa zvolí zo skupiny obsahujúcej neobmedzujúcim spôsobom mačacie patogény, napríklad vírus mačacej imunodeficiencie, vírus mačacej leukémie, vírus mačacej infekčnej peritonitídy, vírus mačacej panleukopénie (parvovírus), mačací kalikivírus, mačací reovírus typu 3, mačací rotavírus, mačací koronavírus (Infectious peritonitis vírus), vírus besnoty, mačací syncytiálny vírus, mačací sarkomavírus, mačací herpesvírus (rhinotracheitis vírus), mačací vírus Bornovej choroby, Chlamydia, Toxoplasmosis gondii, mačacie parazity, Dirofilaria immitis, blchy, bakteriálne patogény apod.
·· ···· ·· ·· ·· • · · ···· ·· ··· ···· t· « · · ··«· · · ·· · ·· ·· ··
Regulácia rastu alebo regulácia aktivácie bunkového typu, napríklad T-lymfocytu, naznačuje, že regulovaná odozva buď stimuluje alebo potlačuje bunkový rast. Regulácia imunitnej odozvy u mačky naznačuje, že pri liečení chorôb alebo infekčných činidiel u mačiek sa imunitná odozva buď stimuluje alebo potlačuje.
Pri výhodnom rozpracovaní sa gény, kódujúce mačacie CD80 a CD28, CD80 a CTLA-4, CD86 a CD28 alebo CD86 A CTLA-4 v kombinácii s génmi pre imunogén získaný z mačacieho patogénu zabudujú do jediného rekombinantného vírusového vektoru a následne formulujú do živej vakcíny. Mačacie CD80, CD86, CD28 alebo CTLA-4 gény, samotné alebo v kombinácii s génmi mačacieho imunogénu, sa zabudujú do rekombinantného vírusu tak, že sa expresia týchto génov riadi vhodným promotorom. Podanie vakcíny má za následok expresiu bioaktívneho mačacieho CD80 alebo CD86 ligandu a CD28 alebo CTLA-4 receptoru a expresiu mačacieho imunogénu (imunogénov) v rovnakej bunke, ktoré sú tak dodané primárne a sekundárne kostimulačné signály potrebné na posilnenie požadovanej imunitnej odozvy. Toto rozpracovanie poskytuje časnú lokalizovanú imunitnú odozvu na mačací imunogén a vakcínu proti mačaciemu ochoreniu, ktorá má zvýšenú účinnosť.
Pri ďalšom rozpracovaní sú gény, kódujúce mačacie CD80, CD86, CD28 alebo CTLA-4, samotné alebo v kombinácii, zabudované do rekombinantného vírusového vektoru a vo vakcíne podané spoločne s druhým rekombinantným vírusovým vektorom, ktorý kóduje gény pre mačací imunogén(y) a poskytuje tak požadované odpovedi v rovnakej bunke alebo v bunkách, ktoré sa nachádzajú v tesnej blízkosti, na zosilnenie požadovanej imunitnej odozvy a vakcínu proti mačaciemu ochoreniu, ktorá má zvýšenú účinnosť.
·· ·· ·· ·· · · · · · ·· ··· ···· · · ·· ···· ··· · · · · ·· ·· · ·· ·· ··
Nasledujú príklady rekombinantných vírusových vektorov, ktoré sa dajú použiť pri expresii mačacieho CD80, CD86, CD28 a CTLA-4 a vo vakcíne, ktorá poskytuje zvýšenú ochrannú imunitnú odozvu proti napadnutiu patogénnymi mikroorganizmami:
1. Čiastočná alebo celková expresia mačacích CD80, CD86, CD28 a CTLA-4, samotných alebo v ľubovoľnej vzájomnej kombinácii, v rekombinantnom víruse kiahní ošípaných (zavedené do ľubovoľného neesenciálneho inzertného miesta) na účely nereplikačnej vakcinácie použitej samotnej alebo v kombinácii s ďalšou vakcínou alebo terapeutickým činidlom (rekombinantným živým alebo usmrteným) na liečbu mačiek. (Nie je obmedzené iba na liečenie mačiek.)
2. Čiastočná alebo celková expresia mačacích CD80, CD86, CD28 a CTLA-4, samotných alebo v lubovolnej vzájomnej kombinácii, v rekombinantnom mačacom herpesvíruse (zavedené do FHV gE miesta alebo lubovolného neesenciálneho inzertného miesta) na účely replikačnej vakcinácie použitej samotnej alebo v kombinácii s ďalšou vakcínou alebo terapeutickým činidlom (rekombinantným živým alebo usmrteným) na liečbu mačiek. (Nie je obmedzené iba na liečenie mačiek.)
3. Čiastočná alebo celková expresia mačacích CD80, CD86, CD28 a CTLA-4, samotných alebo v lubovolnej vzájomnej kombinácii, v rekombinantnom víruse kiahní medvedíkov (zavedené do lubovolného neesenciálneho inzertného miesta) na účely replikačnej vakcinácie použitej samotnej alebo v kombinácii s ďalšou vakcínou alebo terapeutickým činidlom (rekombinantným živým alebo usmrteným) na liečbu mačiek. (Nie je obmedzené iba na liečenie mačiek.) ·· ···· ·· ·· ·· • · · ···· ·· ··· ···· 9 9
9 9 9 9 9 9 9 9 • 9 · ·· ·· ··
4. Čiastočná alebo celková expresia mačacích CD80, CD86, CD28 a CTLA-4, samotných alebo v ľubovoľnej vzájomnej kombinácii, v rekombinantnom víruse kiahní ošípaných obsahujúcom gény pre FIV gag-proteázu a/alebo obálku.
5. Čiastočná alebo celková expresia mačacích CD80, CD86, CD28 a CTLA-4, samotných alebo v ľubovoľnej vzájomnej kombinácii, v rekombinantnom mačacom herpesvíruse obsahujúcom gény pre FIV gag-proteázu a/alebo obálku.
6. Čiastočná alebo celková expresia mačacích CD80, CD86, CD28 a CTLA-4, samotných alebo v ľubovoľnej vzájomnej kombinácii, v rekombinantnom víruse kiahní medvedíkov obsahujúcom gény pre FIV gag-proteázu a/alebo obálku.
7. Čiastočná alebo celková expresia mačacích CD80, CD86, CD28 a CTLA-4, samotných alebo v ľubovoľnej vzájomnej kombinácii, v rekombinantnom víruse kiahní ošípaných obsahujúcom gény pre FeLV gag-proteázu a/alebo obálku.
8. Čiastočná alebo celková expresia mačacích CD80, CD86, CD28 a CTLA-4, samotných alebo v ľubovoľnej vzájomnej kombinácii, v rekombinantnom mačacom herpesvíruse obsahujúcom gény pre FeLV gag-proteázu a/alebo obálku.
9. Čiastočná alebo celková expresia mačacích CD80, CD86, CD28 a CTLA-4, samotných alebo v ľubovoľnej vzájomnej kombinácii, v rekombinantnom víruse kiahní medvedíkov obsahujúcom gény pre FeLV gag-proteázu a/alebo obálku.
10. Čiastočná alebo celková expresia mačacích CD80, CD86, CD28 a CTLA-4, samotných alebo v ľubovoľnej vzájomnej kombinácii, v rekombinantnom víruse kiahní ošípaných obsahujúcom gény pre
·· ···· ·· ·· ··
* • • • • • • • • ··
• • • • • ·· • •
• • • • • • • • •
·· • ·· ·· ·· ··
FeLV gag-proteázu a/alebo obálku a pre FIV gag-proteázu a/alebo obálku alebo ich ľubovoľnú kombináciu.
11. Čiastočná alebo celková expresia mačacích CD80, CD86, CD28 a CTLA-4, samotných alebo v ľubovoľnej vzájomnej kombinácii, v rekombinantnom mačacom herpesvíruse obsahujúcom gény pre FeLV gag-proteázu a/alebo obálku a pre FIV gag-proteázu a/alebo obálku alebo ich ľubovoľnú kombináciu.
12. Čiastočná alebo celková expresia mačacích CD80, CD86, CD28 a CTLA-4, samotných alebo v ľubovolnej vzájomnej kombinácii, v rekombinantnom víruse kiahní medvedíkov obsahujúcom gény pre FeLV gag-proteázu a/alebo obálku a pre FIV gag-proteázu a/alebo obálku alebo ich ľubovoľnú kombináciu.
13. Čiastočná alebo celková expresia mačacích CD80, CD86, CD28 a CTLA-4, samotných alebo v ľubovoľnej vzájomnej kombinácii, vo víruse kiahní ošípaných alebo víruse kiahní medvedíkov alebo ľubovoľnom ďalšom expresnom systéme zahŕňajúcom neobmedzujúcim spôsobom E. coli, vírus Semliki Forest a bakulovírus na účely prípravy nepurifikovaného alebo purifikovaného polypetidu. Tieto použitia zahŕňajú neobmedzujúcim spôsobom prípravu polyklonálnych a monoklonálnych protilátok a prípravu reakčných činidiel na rozvoj funkčného testu.
14. Expresia mačacieho CD80, CD86, CD28 alebo CTLA-4, samotného alebo v ľubovoľnej kombinácii, v utlmenom FIV alebo FeLV vírusovom vektore. Pri jednom rozpracovaní je FIV alebo FeLV vírusový vektor utlmený génovou deléciou.
15. Čiastočná alebo celková expresia mačacieho CD80, CD86, CD28 alebo CTLA-4, samotného alebo v ľubovoľnej kombinácii, v expresnom vektore obsahujúcom gén(y) pre mačacie imunogény, ktorá
·· ···· ·· ·· ··
• • · • • • • • • • ·
• • · • • ·· • ·
• • · • • • • • •
·· • ·· »· ·· • ·
je určená na podanie vo forme genetickej vakcíny alebo holej DNA vakcíny. Vektory zahŕňajú neobmedzujúcim spôsobom pTarget (Promega, Madison, WI)a pcDNA (Invitrogen, Carlsbad, CA) .
(Donnelly J.J. a kol., 1997; Hasett a Whitton, 1996).
16. Celé gény alebo fragmenty génov pre CD80, CD86, CD28 a CTLA-4, samotné alebo v ľubovoľnej kombinácii, môžu byť zavedené alebo transfektované do chromozómu mačky alebo iného cicavca. Také integrácie týchto génov alebo fragmentov týchto génov je možné dosiahnuť pomocou retrovírusového vektoru a túto integráciu je možné použiť ako určitú formu génovej terapie.
Vynález poskytuje spôsoby a kompozície na lekárske a/alebo komerčné účely, ktoré zvyšujú odolnosť proti chorobám mačacích druhov. Pri tomto rozpracovaní sa vhodným spôsobom mačkám podáva celý mačací CD80, CD86, CD28 alebo CTLA-4 exprimovaný, samotný alebo v ľubovoľnej kombinácii, alebo jeho časť, a to prípadne v kombinácie s génmi kódujúcimi mačacie imunogény. Na podporu rastu alebo navodenia odolnosti proti chorobe sa mačací CD80, CD86, CD28 alebo CTLA-4 exprimovaný, samotný alebo v ľubovoľnej kombinácii, podáva vo formulácii v koncentrácii približne 0,01 až 100,0 mg/vakcína/mačka a výhodne v koncentrácii približne od 0,25 do 25 mg/kg/deň. Na podporu rastu alebo navodenia odolnosti proti chorobe sa rekombinantný vírusový vektor exprimujúci mačací CD80, CD86, CD28 alebo CTLA-4, samotný alebo v ľubovoľnej kombinácii, podáva vo formulácii v koncentrácii približne 0,01 až 100,0 mg/vakcína/mačka a výhodne v koncentrácii približne od 0,25 do 25 mg/kg/deň. Je zrejmé, že požadované množstvo mačacieho CD80, CD86, CD28 alebo CTLA-4 je možné určiť v danom odbore známymi a bežne používanými experimentmi, napríklad stanovením matrice dávok a frekvencií a porovnaním skupiny experimentálnych jednotiek alebo subjektov s každým bodom v matrici.
·· ···· ·· ·· ··
• • · • • • • • • • ·
• • · t • ·· • •
• • · t • • • •
·· • · ·· ·· • ·
Prirodzený alebo rekombinantný mačací CD80, CD86, CD28 alebo CTLA-4 sa podľa vynálezu formuluje s fyziologicky prijateľným nosičom, akým je napríklad fosfátom tlmený soľný roztok alebo deionizovaná voda. Formulácia môže rovnako obsahovať excipienty zahŕňajúce lubrikant (y), zmäkčovadlo(a), zosilňovač(e) absorpcie, bakteriocid(y) apod., ktoré sú v danom odbore známe. Mačací CD80, CD86, CD28 alebo CTLA-4 polypeptid podľa vynálezu sa podáva ľubovoľným účinným spôsobom, ktorý predstavuje napríklad intravenózny, subkutánny, intramuskulárny, transmuskulárny, topický alebo orálny spôsob podania. Pri subkutánnom podaní je napríklad dávka tvorená mačacím CD80, CD86, CD28 alebo CTLA-4 v sterilnom fyziologickom soľnom roztoku. Pri orálnom alebo respiračnom podaní je mačací CD80, CD86, CD28 alebo CTLA-4, prípadne spoločne s excipientmi, mikro- alebo makrozapuzdrený, napríklad v lipozómoch a mikrosférach. Rovnako je možné použiť dermálne náplasti (alebo ďalšie pozvolna sa uvoľňujúce dávkové formy).
Materiály a metódy
Príprava rezervných vzoriek vírusu kiahní medvedíkov
Na prípravu rezervných vzoriek vírusu kiahní medvedíkov (RPV) a genómovej DNA vírusu kiahní medvedíkov sa použil izolát vírusu kiahní medvedíkov ATCC VR-838. Ďalším dostupným izolátom RPV je V71-I-85A z Centra pre kontrolu chorôb (CDC; Atlanta, GA). Vzorky vírusu kiahní medvedíkov (RPV) sa pripravili infikáciou VERO buniek, CRFK buniek alebo MDCK buniek pri početnosti infekcie 0,01 PFU/bunka v médiu (Dulbecco's Modified Eagle's Médium) obsahujúcom 2 mM glutamínu, 100 jenotiek/ml penicilínu, 100 jednotiek/ml streptomycínu (tieto zložky sa získali od spoločnosti Sigma alebo ekvivalentného dodávateľa a ďalej budú ·· ···· ·· ·· ·· • · · ···· . · · ··· ···· · · • · · ···· ·· ·· · ·· ·· ·· · označované ako DMEM negatívne médium)). Pred infikáciou sa bunkové monovrstvy raz prepláchli DMEM negatívnym médiom, ktoré malo odstrániť stopové množstvo fetálneho bovinného séra. Potom sa nechala bunková monovrstva dve hodiny absorbovať RPV obsiahnutej v počiatočnom inokule (0,5 ml pre lOcm platňu; 10 ml pre T225cm banku). Bunková monovrstva sa každú 0,5 hodinu redistribuovala. Po uplynutí tohto času sa počiatočné inokulum doplnilo pridaním kompletného DMEM média (DMEM negatívne médium + 5% fetálne bovinné sérum) na odporúčaný objem. Platne sa inkubovali v 5% oxidu uhličitom pri 37 °C až do kompletného dosiahnutia cytopatického účinku. Médium a bunky sa zobrali a pri -70°C zamrazili v 50ml kónickej skúmavke opatrenej skrutkovacim uzáverom. Po rozmrazení pri 37°C sa rezervný vírus rozdelil do l,0ml fľaštičiek a opäť zamrazil pri -70°C. Titry spravidla predstavovali približne 106 PFU/ml.
Príprava rezervných vzoriek vírusu kiahní ošípaných
Vzorky vírusu kiahní ošípaných (SPV) sa pripravili infikáciou buniek obličiek embrya prasce (EMSK), ESK-4 buniek, PK-15 buniek alebo Vero buniek pri početnosti infekcie 0,01 PFU/bunka v médiu (1:1 zmes, Iscove's Modified Dulbecco's Médium (IMDM) a RPMI 1640 Médium, obsahujúce 2 mM glutamínu, 100 jenotiek/ml penicilínu, 100 jednotiek/ml streptomycínu (tieto zložky sa získali od spoločnosti Sigma alebo ekvivalentného dodávateľa a ďalej budú označované ako EMSK negatívne médium)). Pred infikáciou sa bunkové monovrstvy raz prepláchli EMSK negatívnym médiom, ktoré malo odstrániť stopové množstvo fetálneho bovinného séra. Potom sa nechala bunková monovrstva dve hodiny absorbovať SPV obsiahnutej v počiatočnom inokule (0,5 ml ·· ···· ·· ·· ·· ·· · · · · · ··· ··· ···· ·· • ·· ·· ·· · · · · ·· ···· ·· ·· · ·· ·· ·· · pre lOcin platňu; 10 ml pre T175cm banku) . Bunková monovrstva sa každú 0,5 hodinu redistribuovala. Po uplynutí tohto času sa počiatočné inokulum doplnilo pridaním kompletného EMSK média (EMSK negatívne médium + 5% fetálne bovinné sérum) na odporúčaný objem. Platne sa inkubovali v 5% oxide uhličitom pri 37°C až do kompletného dosiahnutia cytopatického účinku. Médium a bunky sa zobrali a pri -70°C zamrazili v 50ml kónickej skúmavke opatrenej skrutkovacím uzáverom. Po rozmrazení pri 37°C sa rezervný vírus rozdelil do l,0ml fľaštičiek a opäť zamrazil pri -70°C. Titre spravidla predstavovali približne 106 PFU/ml.
Príprava RPV alebo SPV DNA
Pri izolácii DNA vírusu kiahní medvedíkov alebo kiahní ošípaných sa stýkajúca sa monovrstva VERO buniek (pre RPV) alebo EMSK buniek (pre SPV) v t225 cm banke infikovala pri početnosti 0,1 vírusom kiahní medvedíkov (ATCC VR-838) a inkubovala 3 až 5 dní, kým bunky nevykazovali 100% cytopatický účinok. Infikované bunky sa následne zobrali zoškrabnutím buniek do média a 5 minút odstreďovali pri frekvencii otáčania 3000 min-1 v klinickej odstredivke. Médium sa dekantovalo a bunková peleta sa mierne resuspendovala v 1,0 ml fosfátom tlmeného soľného roztoku (PBS: 1,5 g Na2HPO4, 0,2 g KH2PO4, 0,8 g NaCl a 0,2 g KC1 na liter vody)(na T175) a následne dvakrát postupne zamrazila a rozmrazila (-70°C až +37°C). Po poslednom rozmrazení sa bunky (na ľade) dvakrát 30 sekúnd sonikovali, pričom medzi týmito dvoma periódami prebehlo 45sekundové chladenie. Bunkový odpad sa následne odstránil päťminútovým odstreďovaním (odstredivka Sorvall RC-5B Superspeed) pri frekvencii otáčania 3000 min-1, teplote 4°C a použití rotoru HB4. RPV virióny prítomné v supernatante sa potom ·· ··*· ·· ·· ·· • · · · • · ·· • · · ·· · • · · · ·· ·· peletovali dvadsaťminútovým odstreďovaním pri frekvencii otáčania 15 000 min1, teplote 4°C a použití rotoru S34 (Sorvall) a resuspendovali v 10 mM Tris (pH 7,5). Táto frakcia sa potom naniesla vo vrstve na 36% sacharózový gradient (hmotn./obj. v 10 mM Tris, pH 7,5) a 60 minút odstreďovala (Beckman 18-70M Ultracentrifuge) pri frekvencii otáčania 18 000 min-1, teplote 4°C a pri použití rotoru SW41. Pelety viriónov sa resuspendovali v 1,0 ml 10 mM Tris, pH 7,5, a sonikovali 30 sekúnd na lade. Táto frakcia sa naniesla vo forme vrstvy na 20% až 50% kontinuálny sacharózový gradient a 60 minút odstreďovala pri frekvencii otáčania 16 000 min'1, teplote 4°C a pri použití rotoru SW41. Pás viriónov RPV ležiaci približne tri štvorce pod gradientom sa zobral, nariedil 20% sacharózou a peletoval 60minútovým odstreďovaním pri frekvencii otáčania 18 000 min-1, teplote 4°C a pri použití rotoru SW41. Výsledná peleta sa následne raz prepláchla 10 mM Tris, pH 7,5, čím sa odstránilo stopové množstvo sacharózy, a na záver sa resuspendovala v 10 mM Tris, pH 7,5. RPV DNA sa potom extrahovala z purifikovaných viriónov lýzou (4 hodiny pri 60°C) indukovanou pridaním EDTA, SDS a proteinázy K do konečných koncentrácií 20 mM, 0,5 %, respektíve 0,5 mg/ml. Po digerácii sa vykonali tri fenol/chloroformové (1:1) extrakcie a vzorka sa vyzrážala pridaním dvoch objemov bezvodého etanolu a 30 minút inkubovala pri -20°C. Vzorka sa potom 5 minút odstreďovala pri plnej rýchlosti v Eppendorf miniodstredivke. Supernatant sa dekantoval a peleta sa sušila na vzduchu a rehydratovala v 0,01 M Tris, pH 7,5, 1 mM EDTA pri 4°C.
·· ···· ·· ·· • · · ·· · • · · · · · ·· ·· ·
Príprava rezervných roztokov vírusu FHV
S-FHV-000 sa získal od ATCC (ATCC č. 636) a S-FHV-001 sa získal od NVSL (NVSL Challenge Vírus Strain SGE, Lot KS). Rezervné vzorky vírusu FHV sa pripravili infikáciou buniek obličiek mačiek Crandell (CRFK) pri početnosti infekcie 1,0 PFU/bunka v médie (Dulbecco's Modified Eagle's Médium (DMEM) obsahujúcom 2 mM glutamínu, 100 jednotiek/ml penicilínu, 100 jednotiek/ml streptomycínu (tieto zložky sa získali od spoločnosti Irvine Scientific alebo ekvivalentného dodávateľa a ďalej budú označované ako kompletné DME médium) + 5% fetálne bovinné sérum). Po dosiahnutí 100% cytopatického účinku sa médium a bunky zobrali, rozdelili na alikvotné podiely a zamrazili pri 70°C. Titry predstavovali približne 1 x 107 až 1 x 108 PFU/ml.
Príprava DNA herpesvírusu
Stekajúca sa monovrstva CRFK buniek v 25 cm2 banke alebo 60ml Petriho miske sa infikovala 10 ml vzorky vírusu. Po celonočnej inkubácii alebo potom, čo bunky vykazovali 100% cytopatický účinok, sa bunky zoškrabli do média a 5 minút odstreďovali v klinickej odstredivke pri frekvencii otáčania 3000 min-1. Médium sa dekantovalo a bunková peleta sa ľahko resuspendovala v 0,5 ml roztoku obsahujúceho 0,5% NONIDED p-40 (oktylfenoletylénoxidový kondenzát obsahujúci priemerne 9 molov etylénoxidu na molekulu)(NP-40, nakúpený od spoločnosti Sigma Chemical Co., St. Louis, MO). Vzorka sa pri izbovej teplote inkuboval 10 minút. Pridalo sa 10 ml rezervného roztoku Rnázy A (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO; rezervný roztok mal koncentráciu 10 mg/ml; varil sa 10 minút s cieľom inaktivovať ·· ···· • · ·· • · • · ·· ·· • · · ···· ·· ·· · ·· ·· ··
DNázu). Vzorka sa odstreďovala na peletové jadrá. DNA peleta sa odstránila pomocou pasteurovej pipety alebo drvenej tyčinky a zlikvidovala. Supernatant sa dekantoval do l,5ml Eppendorf skúmavky obsahujúcej 25 ml 20% nátriumdodecylsulfátu (sigma) a 25 ml proteinázy-K (10 mg/ml; Boehringer Mannheim Biochemicals, Indianapolis, IN). Vzorka sa miechala a inkubovala pri 37°C počas 30 min. až 60 min. Potom sa pridal rovnaký objem vodou nasýctého fenolu a vzorka sa lahko premiešala. Potom sa vzorka 5 minút odstreďovala pri plnej rýchlosti v Eppendorf miniodstredivke. Horná vodná fáza sa premiestnila do novej Eppendorf skúmavky, do ktorej sa pridali dva objemy absolútneho etanolu, ktorý počas tridsiatich minút pri -20°C vyzrážal nukleovú kyselinu. Vzorka sa 5 minút odstreďovala v Eppendorf miniodstredivke. Supernatant sa dekantoval a peleta sa sušila na vzduchu a rehydratovala v približne 16 ml vody. Pri príprave väčšieho množstva DNA sa postup zahajuje s valcovými flašami alebo 175cm2 bankami CRFK buniek. DNA sa skladovala pri 4°C v 0,01 M Tris, pH 7,5, 1 mM EDTA.
DNA Transfekcia pri generovaní rekombinantného vírusu
Táto metóda je založená na kalcium-fosfátovom postupu, ktorý opísal Graham a Van der eb [25] a odlišuje sa nasledujúcimi modifikáciami. Vírusová a/alebo plazmidová DNA sa nariedila na 298 ml v 0,01 M Tris, pH 7,5, lmM EDTA. Potom sa pridalo 40 ml 2M chloridu vápenatého a následne rovnaký objem 2X HEPES tlmeného soľného roztoku (10 g kyseliny N-2-hydroxyetylpiperazín-N'-2etánsulfónovej (HEPES), 16 g chloridu sodného, 0,74 g chloridu draselného, 0,25 g Na2HPOí · 2H2O, 2 g dextrózy na liter vody a tlmené hydroxidom sodným na pH 7,4). Potom sa zmes 10 minút ·· ···· ·· · ···· ·· • · ···· · · • · · ···· ·· • · · ·· ·· ·· inkubovala na ľade a po uplynutí tohto času sa zmes po kvapkách pridala do 80% stekajúcej sa monovrstvy CRFK buniek rastúcich v 60mm Petriho miske pod 5 ml média (DME + 5% bovinné sérum). Bunky sa 4 hodiny inkubovali v zvlhčenom inkubátore obsahujúcom 5% oxid uhličitý pri teplote 37°C. Médium na platniach sa odsalo a bunky sa 1 minútu ošetrovali 20% glycerolom v 1XPPS (1,15 g hydrogenfosforečnanu sodného, 0,2 g dihydrogenfosforečnanu draselného, 0,8 g chloridu sodného, 0,2 g chloridu draselného na liter vody). Bunky sa trikrát prepláchli 5 ml 1XPPS a následne doplnili 5 ml média (DME + 5% bovinné fetálne sérum). Bunky sa potom inkubovali 3 až 7 dní pri 37°C, kým sa nedosiahlo 50% až 100% cytopatický efekt vírusu. Vírus sa zobral spôsobom opísaným v súvislosti s prípravou rezervných vzoriek vírusov. Táto rezervná vzorka bola označená ako transfektovaná rezervná vzorka a následne sa analyzovala na rekombinantný vírus vyhľadávaním rekombinantného herpesvírusu exprimujúceho enzymatické markérové gény.
Príprava infikovaných bunkových lyzátov
Pri príprave bunkového lyzátu sa použilo sérum prosté médium. Stekajúca sa monovrstva buniek (VERO, CRFK alebo MDCK) v 25cm2 banke alebo 60mm Petriho miske sa infikovala 100 ml vírusovej vzorky. Po dosiahnutí 100% cytopatického účinku sa médium a bunky zobrali a bunky sa 5 minút peletovali v klinickej odstredivke pri frekvencii otáčania 3000 min-1. Bunková peleta sa resuspendovala v 250 ml rozkladného tlmivého roztoku (2% nátriumdodecylsulfát, 2% β-merkaptoetanol). Vzorky sa 30 sekúnd sonikovali na ľade a uskladnili pri -20°C.
·· ···· ·· ·· ·· ·· · ···· ·· • · · ···· ·· ··· · · · · · · ·· · ·· ·· ··
Westernový prenos
Vzorky lyzátov a proteínové štandardy sa naniesli spôsobom podlá Laemnliho na polyakrylamidový gél. Po ukončení gólovej elektroforézy sa proteíny premiestnili a spracovali postupom, ktorý opísal Sambrook a kol. (1989). Primárna protilátka sa nariedila 5% netučným sušeným mliekom v Tris-chloride sodnom a azide sodnom (TSA: 6,61 g Tris-HCl, 0,97 g Tris-báza, 9,0 g NaCl a 2,0 g azidu sodného na 1 1 H2O) v pomere 1:100. Sekundárna protilátka sa naviazala na alkalínfosfatázu a TSA nariedila v pomere 1:1000.
Molekulárne biologické techniky
Techniky na manipuláciu s baktériami a DNA, vrátane takých postupov, akými sú digerácia restikčnou endonukleázou, gélová elektroforéza, extrakcia DNA z gélov, ligácia, fosforylácia kinázou, ošetrenie fosfatázou, rast bakteriálnych kultúr, tranformácia baktérií pomocou DNA a ďalšie molekulárne biologické metódy opísal Sambrook a kol. (1989) v Current Protocols in Molecular Biology (1992). Pokial to nie je uvedené inak, sú tieto metódy vykonávané iba s minimálnymi odchýlkami.
Sekvencovanie DNA
Sekvencovanie DNA sa vykonávalo pri použití reakcií na sekvencovanie fluorescenčné značených dideoxyskupín, na ktorých realizáciu sa použila sada ABI PRISM Dye Terminátor Cycle
·· ···· ·· ·· ··
• • · • • • • • • • ·
• • · • • ·· e •
• • · • • • • • •
• · • ·· • · ·· ··
Sequencing Ready Reaction Kits Amplitaq DNA polymerázou, FS (Perkin-Elmer; podía inštrukcií výrobca) a elektroforéza sa uskutočňovala na prísroji Perkin-Elmer/Applied Biosystems DNA sequencer, model 373A, podľa inštrukcií výrobcu. Reakcia používajúca dGTP zmesi a dlTP zmesi sa vykonávali s cielom nájsť oblasti kompresie. Oblasti kompresie je možné alternatívne identifikovať na formamidových géloch. Ako matrice sa použili dvojreťazcové plazmidové subklony alebo jednoreťazcové M13 subklony a prajmery sa naviazali na vektor bezprostredne pred inzertom, ktorý sa mal sekvencovať alebo na už získanú sekvenciu. Získané sekvencie sa odobrali a porovnali pri použití Software DNAStar.
Klonovanie pri použití polymerázovej reťazovej reakcie
Polymerázová reťazová reakcia (PCR) sa použila na zavedenie reštrikčných miest vhodných na manipuláciu s rôznymi DNA. Postupy, ktoré sa v tejto súvislosti použili opísal Innis a kol. (1990). Veľkosť amplifikovaných fragmentov bola spravidla menšia ako 500 bázických párov a kritické oblasti amplifikovaných fragmentov boli potvrdené DNA sekvencovaním. Prajmery, použité pre jednotlivé prípady, sú podrobne opísané v časti opisujúcej konštrukciu homologických vektorov.
Homologický rekombinantný postup použitý pri generovaní rekombinantného RPV, SPV alebo FHV
Tento postup sa týka homologickej rekombinácie DNA vírusu kiahní medvedíkov a DNA plazmidového homologického vektoru, ku ktorej dochádza v bunkách tkaniva obsahujúceho DNA vírus kiahní medvedíkov a súčasne transfektovaný plazmidový homologický ·· ···· ·· ·· ·· • · · ···· ·· • · · ···· · · ··· ···· · · · · ·· ·· ·· vektor. Homologická rekombinácia sa uskutočňuje tak, že sa monovrstva buniek (CRFK, MDCK alebo VERO) infikuje S-RPV-000 (ATCC VR-838) alebo S-SPV-001 alebo S-FHV-001 pri početnosti infekcie 0,01 PFU/bunka, čím sa do buniek zavedie replikácia RPV (tzn. DNA syntéza). Plazmidový homologický vektor DNA sa do týchto buniek následne transfektuje pri použití postupu infikácia-transfekcia. Konštrukcia homologických vektorov použitých pri tomto postupe bude opísaná ďalej.
Postup infikácie-transfekcie
Šesťcentimetrové platne buniek (CRFK, MDCK alebo VERO), ktoré tvorili približne z 80 % celistvú vrstvu, sa infikovali S-RPV-000 alebo S-SPV-001 alebo S-FHV-001 pri početnosti infekcie 0,01 PFU/bunka v DMEM negatívnom médiu a počas dvoch až troch hodín sa inkubovali pri teplote 37 °C v zvlhčenom 5% oxide uhličitom. Ako transfekčný postup sa v podstate použil postup odporúčaný na transfekciu reakčného činidla Lipofectin (Nemecko). Čiže pre každú z šesťcentimetrových platní sa 15 gg plazmidovej DNA doplnilo vodou do 100 gl. Oddelene sa 50 gg reakčného činidla Lipofectin doplnilo vodou do 100 gl. 100 μΐ nariedeného reakčného činidla Lipofectin sa potom po kvapkách pridalo do nariedené plazmidovej DNA obsiahnutej v 5ml polystyrénovej skúmavke opatrenej nástrčkovým uzáverom a mierne premiešalo. Zmes sa následne inkubovala 15 až 20 minút pri izbovej teplote. Počas tohto času sa vírusové inokulum odstránilo z 6cm platní a bunkové monovrstvy sa raz prepláchli DMEM negatívnym médiom. Do zmesi plazmidovej DNA a Lipofectinu sa potom pridali 3 ml DMEM negatívneho média a obsah sa napipetoval na bunkovú monovrstvu. Bunky sa inkubovali cez noc (približne 16 hodín) pri 37°C v ·· ·« ···· • · · • · · ·· ·· • · · · • · ·· * · · ·· · • · · · ·· ·· • · ·· zvlhčenom 5% oxide uhličitom. Nasledujúci deň sa odobrali 3 ml DMEM negatívneho média a nahradili 5 ml DMEM kompletného média. Bunky sa inkubovali pri 37°C v 5% oxide uhličitom 3 až 5 dní, kým nedosiahol cytopatický účinok vírusu 80 % až 100 %. Vírus sa zobral spôsobom, ktorý už bol opísaný v súvislosti s prípravou rezervných vzoriek vírusov. Táto rezervná vzorka bola označená ako transfekčná rezervná vzorka a následne sa použila na vyhľadávanie rekombinantného vírusu pomocou BLUOGAL SCREEN FOR RECOMBINANT RACCOONPOX VÍRUS OR CPRG SCREEN FOR RECOMBINANT RACCONPOX VÍRUS.
Vyhľadávanie β-galaktozidázy (testy BLUOGAL a CPRG) alebo β-glukuronidázy (test X-GLUC) exprimujúcich rekombinantný RPV alebo SPV alebo FHV
Pokial sa do rekombinantného vírusu zabuduje markérový gén E. coli β-galaktozidázy (lacZ), potom sa plaky obsahujúce rekombinanty vizualizujú jednou z dvoch jednoduchých metód. Pri uskutočnení prvej metódy sa do agarózy pri analýze plaku zabuduje chemické činidlo Bluogal (200 gg/ml; Life Sciences Technology, Bethesda, MD) a plaky exprimujúce aktívnu β-galaktozidázu sa zafarbia modré. Modré plaky sa následne nanesú na čerstvé bunky (MDCT, CRFT alebo VERO) a purifikujú ďalšou izoláciou modrého plaku. Pri uskutočnení druhej metódy sa do agarózy pri analýze plaku zabuduje CPRG (400 gg/ml; Boehringer Mannheim) a plaky exprimujúce aktívnu β-galaktozidázu sa zafarbia červene. Červené plaky sa následne nanesú na čerstvé bunky (MDCK, CRFK alebo VERO) a purifikujú ďalšou izoláciou červeného plaku. V obidvoch prípadoch sa vírusy spravidla purifikujú tromi až štyrmi cyklami plakovej purifikácie.
·· ···· ·· ·· ·· • · · ···· · · ··· ···· ·· • · · · · t · ·· ·· · ·· ·· ··
Pokial sa do rekombinantného vírusu zabuduje markérový gén E. coli β-glukuronidázy (uidA), potom sa plaky obsahujúce rekombinanty vizualizujú pri použití chromogénneho substrátu Xbeta-D-gluUA CHX (X-GLUC; kyselina 5-bróm-4-chlór-3-inoxyl-betaD-glukurónová, cyklo-hexylamónna sol; Biosynth AG; Švajčiarsko), ktorý sa zabudoval (200 gg/ml) do agarózy pri analýze plaku a plaky exprimujúce aktívnu β-glukuronidázu sa zafarbili modro. Modré plaky sa následne naniesli na čerstvé bunky (MDCK, CRFK alebo VERO) a purifikovali ďalšou izoláciou modrého plaku.
Vyhľadávanie expresie cudzieho génu v rekombinantnom RPV pri použití testu s čiernym plakom
Pri analýze expresie cudzích antigénov exprimovaných rekombinantnými vírusmi kiahní medvedíkov sa monovrstvy buniek (MDCK, CRFK alebo VERO) infikovali rekombinantným RPV alebo SPV alebo FHV, prekryli živným agarózovým médiom a inkubovali 3 až 5 dní pri 37°C. Agarózová vrstva sa následne z misky odstránila a bunky sa fixovali počas 10 minút 100% metanolom pri izbovej teplote a nechali sa oschnúť na vzduchu. Fixácia buniek mala za následok detekciu cytoplazmového antigénu a povrchového antigénu, pričom expresiu špecifického povrchového antigénu je možné detekovať pri použití nefixovaných buniek. Primárna protilátka sa následne nariedila na vhodné riedenie IX blotto (5% netučné sušené mlieko v Tris-chloride sodnom a azide sodnom (TSA: 6,61 g Tris-HCI, 0,97 g Tris-báza, 9,0 g NaCI a 2,0 g azidu sodného na 1 1 H2O)) a inkubovala počas dvoch hodín pri izbovej teplote na bunkovej monovrstve. Nenaviazaná protilátka sa potom odstránila ·· ···· ·· ·· ·· • · · ···· ·· ··· ···· · · • · · ···· ·· ·· · ·· ·· ·· tromi prepláchnutiami buniek TS tlmivým roztokom, ktoré sa vykonávali pri izbovej teplote. Druhá protilátka, konjugát alkálie-fosfatázy, sa nariedil v pomere 1:1000 IX blotto a inkubovala s bunkami 2 hodiny pri izbovej teplote. Nenaviazaná sekundárna protilátka sa potom odstránila tromi prepláchnutiami buniek TS tlmivým roztokom (6,61 g Tris-HCI, 0,97 g Tris-báza, 9,0 g NaCI a 2,0 g azidu sodného na 1 1 H2O) pri izbovej teplote. Bunky sa následne inkubovali 15 až 30 minút pri izbovej teplote čerstvo pripraveným roztokom substrátu (100 mM Tris HCl pH 9,5, 100 mM NaCI, 5 mM MgCl2, 0,3 mg/ml Nitro Blue Tetrazolium a 0,15 mg/ml 5-bróm-4-chlór-3-indoylfosfatázy). Plaky exprimujúce správny antigén sa zafarbia černe. Na zastavenie vývoja farebnej reakcie sa použil fixačný roztok (20 mM Tris-HCI pH 2,9 a lmM EDTA).
Vyhľadávanie expresie mačacieho CD80 (B7-1) a CD86 (B7-2) v rekombinantnom SPV, RPV alebo FHV pri použití testov s čiernym plakom
Pri analýze expresie CD80 alebo CD86 sa ko-stimulačné molekuly exprimované rekombinantnými vírusmi kiahní ošípaných, rekombinantnými vírusmi kiahní medvedíkov alebo rekombinantnými mačacími herpesvírusmi na monovrstvách buniek (MDCK, CRFK, VERO alebo ESK-4) infikovali rekombinantnými RPV alebo SPV alebo FHV vírusmi exprimujúcimi CD80 alebo CD86, prekryli živným agarózovým médiom a inkubovali 3 až 5 dní pri 37°C. Potom sa agaróza z misky odstránila a bunky sa buď 10 minút fixovali 100% metanolom a sušili na vzduchu alebo sa ponechali nefixované a okamžite sa ošetrili IX PBS. Fixácia buniek viedla k detekcii cytoplazrnového antigénu a povrchového antigénu, zatial čo expresiu špecifického ·· ·· ···· • · · • · · • · · ·· · ·· ·· • · · · • · ·· • · · · ·· ·· povrchového antigénu bolo možné určiť pri použití nefixovaných buniek. Chiméra huCTLA-4/Fc (R & D Systems, Minn. MN, kat. č. 325-CT) sa potom nariedila na vhodné riedenie IX blotto (5% netučné sušené mlieko v Tris-chloride sodnom (TS: 6,61 g Tris-HCI, 0,97 g Tris-báza, 9,0 g NaCI na 1 1 H2O) ) a inkubovala na bunkovej monovrstve 2 hodiny pri izbovej teplote. Nenaviazaná chiméra sa následne odstránila tromi prepláchnutiami buniek TS tlmivým roztokom, ktoré sa vykonali pri izbovej teplote. Detekčná protilátka monoklonálny anti-hulgGI fc alkália-fosfatázový konjugát (Zymed, kat. č. 05-3322) sa nariedila na vhodnú koncentráciu IX blotto a 2 hodiny sa pri izbovej teplote inkubovala s bunkami. Nenaviazaná detekčná protilátka sa následne odstránila tromi prepláchnutiami buniek TS tlmivým roztokom (6,61 g Tris-HCI, 0,97 g Tris-báza, 9,0 g NaCI na 1 1 H2O) pri izbovej teplote. Bunky sa následne inkubovali 15 až 30 minút pri izbovej teplote čerstvo pripraveným roztokom substrátu (100 mM Tris HCI pH 9,5, 100 mM NaCI, 5 mM MgCl2, 0,3 mg/ml Nitro Blue Tetrazolium a 0,15 mg/ml 5-bróm-4-chlór-3-indoylfosfatázy). Plaky exprimujúce CD80 alebo CD86 sa zafarbili černe. Na zastavenie vývoja farebnej reakcie sa použil fixačný roztok (20 mM Tris-HCI pH 2,9 a lmM EDTA).
Vyhľadávanie mačacej interferónovej gama bioaktivity exprimovanej z rekombinantného SPV, RPV alebo FHV pri použití redukcie VSV plaku
CRFKS alebo niektorá vhodná mačacia línia sa v 96-jamkových platniach ošetrila supernatantmi získanými z buniek infikovaných rekombinantnými vírusmi exprimujúcimi mačací IFN-γ a 6 až 12 hodín inkubovala pri teplote 37°C. Do príslušných jamiek sa
·· • • '··· • · e » ·· ·· • · ·· • • ·· • • ··
• • • •
• • · • • • · • •
·· • ·· ·· ·· ··
následne pridal VSV vírus (100 až 1000 častíc/jamka) a inkuboval 24 hodín alebo do okamihu, keď bola v kontrolných jamkách, ktoré obsahovali iba bunky, dokončená lýza. Bunky sa trikrát prepláchli IX PBS a monovrstvy sa fixovali 100% metanolom a vysušili na vzduchu. Do všetkých jamiek sa počas 10 minút pridal pri izbovej teplote 0,05% roztok fialového farbiva Crystal a jamky sa následne nechali sušiť na vzduchu. Pri jednotlivých jamkách sa zhodnotila prítomnosť fialového zafarbenia. Zdravá monovrstva buniek absorbuje fialové farbivo Crystal. Supernatanty s IFN-γ aktivitou budú chrániť CRFK bunky pred bunkovou lýzou indukovanou VSV vírusmi a fialovým zafarbením.
Postup pri purifikácii vírusových glykoproteínov použitelných ako diagnostické činidlá
Vírusové glykoproteíny sa purifikovali pri použití kolón s afinitou na protilátky. Pri výrobe monoklonálnych protilátok sa samičky myší BALB/c 8 až 10 týždňov staré intraperitoneálne vakcinovaly 7x počas dvoch- až štvortýždenných intervalov rekombinanty vírusov kiahní medvedíkov v dávke 107 PFU. Tri týždey po poslednej vakcinácii sa myšiam intraperitoneálne injektovalo 40 mg zodpovedajúceho vírusového glykoproteínu. Tri dni po poslednej dávke antigénu sa myšiam odobrala slezina.
Splenocyty sa naviazali na myšie NSl/Ag4 plazmacytómy modifikovaným spôsobom podľa Oi a Herzengerga. Splenocyty a plazmacytómy sa spoločne peletovali centrifugáciou pri 300xG, počas 10 minút. Do bunkovej pelety sa za miešania, počas jednej minúty pridal 1 ml 50% roztoku polyetylénglykolu (molekulová hmotnosť 1300 až 1600). Počas troch minút sa k bunkám pridalo ·· ···· ·· ·· ·· ·· · ···· ··· • · · · · ·· ·· ··· ···· ·· ·· · ·· ·· ·· · médium (Dulbecco's modified Eagles's médium, 5 ml). Bunky sa peletovali centrifugáciou pri 300xG 10 minút a resuspendovali v médie s 10% fetálnym bovinným sérom, ktoré obsahovalo 100 mM hypoxantinu, 0,4 mM aminopterinu a 16 mM tymidinu (HAT). Bunky (10 ml) sa pridali do jamiek 8 až 10 96-jamkových platni obsahujúcich 100 ml normálnu živnú vrstvu buniek sleziny a inkubovali sa pri 37 °C. Bunkám sa každé 3 až 4 dni poskytlo čerstvé HAT médium.
Supernatanty hybridomovej kultúry sa testovali testom ELISA v 96-jamkových mikrotitračných platniach, ktoré boli potiahnuté 100 ng vírusového glykoproteínu. Supernatanty z reakčných hybridómov sa ďalej analyzovali pomocou testu s čiernym plakom a pomocou Westernového prenosu. Zvolené hybridomy sa dvakrát klonovali limitujúcim riedením. Intraperitoneálnym vstrekovaním 5xl06 hybridómových buniek do tela pristanom ošetreniach BALB/c myší sa produkovala asketická tekutina.
Bunkové lyzáty sa z rekombinantov vírusu kiahní medvedíkov získali spôsobom opísaným v súvislosti s prípravou infikovaných bunkových lyzátov. Bunkové lyzáty obsahujúce glykoproteín (100 ml) sa viedli cez 2 ml živice s afinitou k agaróze, na ktorej bolo podía inštrukcií výrobcu (AFC Médium, New Brunswick Scientific, Edison, N.J.) imobilizovaných 20 mg glykoproteínovej monoklonálnej protilátky. Kolóna sa prepláchla 100 ml 0,1% roztoku Nonidet P-40 vo fosfátom tlmenom soľnom roztoku (PBS), ktorého cieľom bolo odstrániť nešpecifický naviazaný materiál. Naviazaný glykoproteín sa eluoval 100 mM karbonátového tlmivého roztoku, pH 10,6 (40). Čistota frakcie pred a po eluácii sa sledovala na základe reaktivity voči RPV monoklonálnym protilátkam v systéme ELISA.
·· ···· • · ·· ·· • · · ···· · ··· ···· · · • · · ···· · · ·· · ·· ·· ·· ·
Test ELISA
Na stanovenie imunného stavu zvieraťa po vakcinácii sa použil štandardný, na enzým naviazaný imunosorbentný testovací (ELISA) protokol. Glykoproteínový roztok antigénov (100 ml pri ng/ml v PBS) sa nechal pri teplote 4°C 18 hodín absorbovať na jamky mikrotitračných platní. Potiahnuté bunky sa raz prepláchli PBS. Bunky sa blokovali pridaním 250 ml PBS obsahujúceho 0,02 % Tween 20. Do jamiek sa pridalo 50 ml testovacieho séra (vopred nariedeného v pomere 1:2 v PBS obsahujúcom 1 % BSA) a 1 hodinu sa inkubovali pri 37°C. Protisérum sa odstránilo a jamky sa trikrát prepláchli PBS obsahujúcom 0,02 % Tween 20. Vizualizácia jamiek obsahujúcich protilátku proti špecifickému antivírusu sa vykonala pridaním 50 ml roztoku obsahujúceho antibovinný IgG naviazaný na peroxidáze z chrenu (nariedený v pomere 1:500 v PBS obsahujúcom 1 % BSA, Kirkegaard and Perry Laboratories, Inc.). Roztok sa 1 hodinu inkuboval pri 37°C, potom sa odstránil a trikrát prepláchol PBS obsahujúcim 0,02 % Tween 20. Do každej jamky sa pridalo 100 ml roztoku substrátu (ATBS, Kirkegaard and Perry Laboratories, Inc.) a 15 minút sa nechalo vyvíjať zafarbenie. Reakcia sa ukončila pridaním 0,1 M kyseliny oxalovej. Zafarbenie sa odčítalo pri absorbanciu 410 nm na automatickom počítači platní.
Stratégia pre konštrukciu syntetických vírusových promotorov kiahní
Syntetické kiahňové promotory ponúkajú rekombinantným vektorom kiahní ošípaných niekolko výhod, vrátane schopnosti
·· • • ···· • · • · ·· ·· • · ·· ·· • • • • • ·
• • • •
• • · • • t · • •
·· • »· • · • · • ·
riadiť silu a načasovanie expresie cudzieho génu. Boli navrhnuté tri promotorové kazety LP1, EP1 a LP2 na báze promotorov definovaných vo víruse besnoty. Každá kazeta bola navrhnutá tak, aby obsahovala DNA sekvencie definované v besnote obklopujúce reštrikčné miesta, ktorá by mohla byť použitá pri kombinácii kaziet v ľubovoľnom poradí. Každá kazeta rovnako obsahuje iniciačné metioníny, takže k fúziám by mohlo dôjsť buď v EcoRI alebo EamHI mieste. Za fúznym miestom v každom z troch počítacích rámcov sa rovnako nachádza sada translačných koncových kodónov a rane transkripčný terminačný signál. DNA kódujúca každú kazetu sa syntetizovala podía štandardných techník a naklonovala do vhodných homologových vektorov.
Izolácia počiatočného fragmentu CD80 mRNA Sa extrahovala z periférnych jednojadrových krviniek (PBMC) stimulovaných 16 hodín Con A pri použití RNAzolB RNA extrakčného reakčného činidla (Biotexc, Houston, TX). Najskôr sa z tejto RNA pomocou reakcie reverznej transkriptázy (RT) používajúcej ako 3' prajmer oligo dT odvodila cDNA. RNA a oligo dT sa 3 minúty zahrievali na 75°C s cieľom odstrániť sekundárnu štruktúru. Potom sa pridala RT, dNTP, tlmivý roztok a destilovaná voda a zmes sa inkubovala 1 hodinu pri 42°C. Po tejto inkubácii sa vzorka ohriala na 5 minút na 95°C s cieľom inaktivovať RT. Degenerované prajmery odvodené z koncových oblastí ľudských a myších CD80 publikovaných sekvencii (GeneBank, Gaithersburg, MA) sa následne použili pri počiatočnej amplifikácii 344nukleotidového fragmentu kódujúceho stredovú oblasť konštantnej domény génu.
• a aa aa aa aa aa
a a a a a a a a a a a
a a a • a aa • a
a a ä • a a a a a
aa • aa a a aa a a
5' prajmer B7-2 GGC CCG AGT A(CT)A AGA ACC GGA C (SEQ ID NO. 56)
3' prajmer B7-3 CAG (AT)TT CAG GAT C(CT)T GGG AAA (CT)TG (SEQ ID NO. 57)
Pri amplifikácii produktov sa použil polymerázový reťazový reakčný protokol s horúcim štartom, ktorý používa Taq polymerázu. Reakčná zmes postrádajúca Taq enzým sa najskôr 5 minút ohrievala na 95°C, tzn. tzv. horúci štart, aby sa zabránilo tvorbe dimérnych prajmerov. Pred iniciáciou teplotného cyklu sa pridal enzým. PCR reakčná zmes sa následne ohriala na 30 sekúnd na 95°C, čo viedlo k roztopeniu dvojreťazcovej DNA. Potom sa reakcia ochladila na 30 sekúnd na 42°C, čo uľahčilo temperovanie degeneračných prajmerov. Nízka temperačná teplota uľahčila naviazanie prajmerov, ktoré neboli 100% homologické. Reakčná zmes sa potom ohriala na 45 sekúnd na teplotu 72°C, čo je optimálna teplota na to, aby Taq polymeráza predĺžila prajmer a skopírovala opačný DNA reťazec. Teplotný cyklus sa opakoval 30x. Po tridsiatich cykloch sa použil konečný extenzný krok, pri ktorom sa teplota zvýšila na 7 minút na 72°C a ktorý uľahčil extenziu všetkých nekompletných produktov. Po vizualizácii na 1% agarovom géli sa produkt cez noc ligoval pri 16°C do TA klonovacieho vektoru (InVitrogen, San Diego, CA) na účely sekvencovania. 2 ml ligačnej reakcie sa použili na transformáciu kompetentných InvaF' buniek. Transformované baktérie sa v pásoch naniesli na LB platne (50 mg/ml ampicilínu) potiahnuté 40 ml 50 mg/ml roztoku x-gal. Nasledujúci deň sa vybrali biele kolónie, ktoré sa naočkovali do 5 ml LB média obsahujúceho 100 mg/ml ampicilínu a nechali sa rásť cez noc pri 37°C a pri frekvencii pretrepávania 225 min-1.
·· ···· ·· ·· • · · · · · · • · · · · ·· • · · ·· · • · * 9 ·· ·· «· • · · • ·
Minipreparáty sa pripravili na noc starých kultúrach s cielom určiť klony, ktoré vykazovali plazmid so správnym inzertom. Plazmid sa z kultúr extrahoval pri použití štandardnej alkalickej lýzy, pričom DNA sa ďalej purifikovala fenol/ chloroformovou extrakciou (Maniatis a kol., 1982). DNA sa vyzrážala v dvoch objemoch etanolu a následne digerovala EcoRI. Digesty sa vizualizovali na 1% agarózovom géli s cielom určiť kolónie s plazmidom, ktorý obsahoval správny inzert. Plazmid sa potom purifikoval z pozitívnych klonov a sekvencoval pomocou S35 rádiologický značeného dideoxyterminátoru na báze sekvenázy (USB, Cleveland, OH) alebo cyklického sekvencovania pomocou fluorescenčného farbiva ako terminátoru (Perkin Elmer, Norwalk CT) . Zo sekvencie cDNA sa skonštruovali špecifické 3' a 5'prajmery, ktoré sa použili pri 5' rýchlej amplifikácii reakcií cDNA koncov (RAČE) a derivácii 3' sekvencie spoločne s degeneračnými prajmermi z 3' neprenesenej oblasti (UTR).
Izolácia 5' oblasti CD80
Na deriváciu 5' sekvencie génu sa použil cDNA amplifikačný protokol Marathon (Clonetech, Palo Alto, CA) . Z PBMC stimulovaného 12 hodín pomocou Con A a súčasne 4 hodiny pomocou LPS sa pripravila mRNA. mRNA sa extrahovala pri použití ULTRASPEC RNA extrakčného činidla (Biotexc, Houston TX). cDNA sa pripravila pri použití kotviaceho oligo dT prajmeru s degeneračnými nukleotidmi na 5' konci, ktorého cielom je naviazať prajmer na posledný 5' koniec poly A konca. Potom sa už opísaným spôsobom prepísala cDNA. Pomocou T4 DNA ligázy sa na cDNA naligovali špecifické linkery. Na cDNA s vnútorným 3' prajmerom špecifickým pre už amplifikovanú oblasť:
·· ···· ·· ·· ·· ·· · ···· ··· ··· ···· ·· ··· ···· ·· ·· · · ·· ·· ·
Β7-284: TTA TAC TAG GGA CAG GGA AG (SEQ ID NO. 58)
B7-190: AGG CTT TGG AAA ACC TCC AG (SEQ ID NO. 59) a kotviacim prajmerom komplimentárnym pre ligovanú linkerovú sekvenciu sa uskutočnila Touchdown PCR. Parametre Touchdown PCR reakcie, pri ktorej sa použila KlenTaq polymerázová zmes (Clontech, Palo Alto, CA) boli nasledujúce: 95°C 5 min 1 cyklus; 95°C 30 s, 72°C 30 s a 68°C 45 s 5 cyklov; 95°C 30 s, 65°C 30 s a 68°C 45 s 5 cyklov; 95°C 30 s, 60°C 30 s a 68°C 45 s 25 cyklov. Jeden mililiter tejto reakčnej zmesi sa nariedil 50 ml vody a 5 ml tohto riedeného roztoku sa použilo pri nested PCR reakcii (95°C 5 min 1 cyklus; 95°C 30 s, 65°C 30 s a 68°C 45 s 30 cyklov pri použití KlenTaq polymerázovej zmesi) s pre linker špecifickým kotviacim prajmerom a pre gén špecifickým 3' prajmerom na 5' konci počiatočného prajmeru (obr. 6).
B7-20 TTG TTA TCG GTG ACG TCA GTG (SEQ ID NO. 60)
B7-135: CAA TAA CAT CAC CGA AGT CAG G (SEQ ID NO. 61)
Na 1,5% agarózovom géli sa vizualizovalo 20 ml každej reakcie a správny fragment sa vyrezal z gélu. Odstreďovaním gélového rezu cez gélový nebulizér a 0,22mm filter Micropure (Amicon, Beverly, MA) sa z agarózy extrahovala a purifikovala cDNA. Purifikované DNA sa následne sekvencovala priamo pri použití ·· ···· cyklického sekvencovania pomocou farbiva ako terminátoru. (Perkin
Elmer, Norwalk, CN).
·· ·· ·· ·· · ···· ··· ··· · · ·· ·· ··· ···· ·· ·· · ·· · ·· ·
Izolácia 3' oblasti CD80
3' oblasť génu sa odvodila zvolením 5 pre gén špecifických prajmerov z 344 ntd. fragmentu a už sekvencované 5'oblasti:
B7-S220 GTC ATG TCT GGC AAA GTA CAA G (SEQ ID NO. 62)
B7-50 CAC TGA CGT CAC CGA TAA CCA C (SEQ ID NO. 63)
B7-140 CTG ACT TCG GTG ATG TTA TTG G
(SEQ ID NO. 64)
B7-550: GCC ATC AAC ACA ACA GTT TCC
(SEQ ID NO. 65)
B7-620: TAT GAC AAA CAA CCA TAG CTT C
(SEQ ID NO. 66)
Z konvenčných oblastí humánnej a myšej CD80 3' UTR sa následne zvolili degeneračné 3' prajmery.
B7-1281 G(A/G)A AGA (A/T)TG CCT CAT GA(G/T) CC (SEQ ID NO. 67)
B7-1260 CA(C/T) (A/G)AT CCA ACA TAG GG (SEQ ID NO. 68) ·· ···· ·· · · · · · ··· ··· · · ·· · · ··· ···· · · • · β · · · ·· · cDNA sa pripravila z ENA extrahovanej pomocou ULTRASPEC extrakčného činidla (Biotexc, Houston TX) z PBMC stimulovanej už opísaným spôsobom pomocou Con A a LPS.
Ukotvený oligo dT prajmer sa použil ako počiatočný 3'prajmer pre RNA transkripciu na cDNA. PCR reakcie na báze Taq polymerázy sa vykonávali na tejto cDNA pomocou špecifických 5'prajmerov a degeneračných 3' prajmerov (95°C 5 min 1 cyklus; 95°C 30 s, 42°C 30 s a 72°C 45 s 30 cyklov; 72°C 7 min).
Pred pripravením jediného segmentu so správnou velkosťou bolo potrebné vykonať 2 cykly nested PCR reakcií. Získaný produkt sa vyrezal z 1,5% agarózového gélu, purifikoval už opísaným spôsobom a cyklicky sekvencoval pomocou terminátoru na báze farbiva (Perkin Elmer, Norwalk, CN).
Zo sekvenčných údajov 5'a 3' oblastí sa skonštruovali prajmery, ktoré budú amplifikovať oblasť kódujúcu celý otvorený počítací rámec mačacieho CD80 génu:
B7 ŠTART: ATG GGT CAC GCA GCA AAG TGG (SEQ ID NO. 69)
B7-960: CCT ATG AGA GAA GAG CTA AAG AGG C (SEQ ID NO. 70)
Použila sa už prv pripravená PBMC cDNA, o ktorej je známe, že obsahuje DNA kódujúci uvedený gén. Táto PCR reakcia (95°C 5 min 1 cyklus; 95°C 30 s, 42°C 30 s a 72°C 45 s 30 cyklov; 72°C 7 min), ktorá ako enzymatický koktail zachycujúci určitú 5'exonukleázovú aktivitu použila KlenTaq DNA polymerázu v snahe redukovať náhodné chyby často spojované s Taq polymerázou. Reakcia amplifikovala fragment obsahujúci 960 bázických párov ·· ··· ·· ·· ·· ·· · ···· ··· • · · · ·· · · ··· ···· ·· ·· · ·· ·· ·· · (bp), ktorý sa naklonoval do TA klonujúceho vektoru (InVitrogen, San Diego, CA) a sekvencoval už opísaným spôsobom. Finálna sekvencia génu obsahovala cDNA z dvoch rôznych zvierat. Každý bázický pár génu sa nezávisle overil v aspoň 3 samostatných sekvenciách odvodených z jednotlivých PCR reakcií v snahe redukovať možnosť prenosu chýb, ktoré vznikli v rámci PCR reakcií.
Izolácia počiatočného fragmentu CD28 mRNA sa extrahovala z HK5 lymfocytov periférnej krvi stimulovaných 16 hodín ConA pri použití RNAzolB RNA extrakčného činidla (Biotexc, Houston, TX) . Najskôr sa z tejto RNA reakciou reverznej transkryptázy (RT) využívajúcej ako 3' prajmer oligo dT prajmer odvodila cDNA. RNA a oligo dT sa 3 minúty zahrievali na 75°C s cieľom odstrániť sekundárnu štruktúru. Potom sa pridali RT, dNTP, tlmivý roztok a destilovaná voda a zmes sa 1 hodinu inkubovala pri 42°C. Po tejto inkubácii sa vzorka ohriala na 95°C a pri tejto teplote udržovala 5 minút v snahe inaktivovať RT. Degeneračné prajmery odvodené z konvenčných oblastí, ktoré sa nachádzajú v humánnych, myších a králičích CD28 publikovaných sekvencii nukleových kyselín (GeneBank, Bethesda, MD) sa potom použili pri počiatočnej amplifikácii 673 ntd fragmentu kódujúceho väčšinu otvoreného čítacieho rámca.
CD28-113: CAA CCT TAG CTG CAA GTA CAC (SEQ ID NO. 71)
CD28-768: GGC TTC TGG ATA GGG ATA GG (SEQ ID NO. 72) ·· ···· ·· ·· ·· • · · ···· ··· ··· · · · ·· ··· · · · ·· ·· · ·· ·· ·· ·
Na amplifikáciu produktu sa požil PCR protokol s horúcim štartom, ktorý používa Taq polymerázu (95°C 5 min 1 cyklus; 95°C 30 s, 48°C 30 s a 72°C 45 s, 30 cyklov; 72°C 7 min 1 cyklus) . Tento fragment sa následne vizualizoval na 1% agarózovom géli, ligoval do TA chlórovacieho vektoru (InVitrogen, San Diego, CA) a sekvencoval už opísaným spôsobom. Zo sekvencie cDNA sa odvodili špecifické 3'prajmery a syntetizovali na použitie pri 5'RACE reakciách.
CD28-190: CGG AGG TAG AAT TGC ACT GTC C (SEQ ID NO. 73)
CD28-239: ATT TTG CAG AAG TAA ATA TCC (SEQ ID NO. 74)
Izolácia 5' oblasti CD28
Na získanie zostávajúcej 5'sekvencie mačacej CD28 molekuly sa použil modifikovaný GIBCO 5'RAČE protokol (Gibco BRL, Gaithersburg, MD) . RNA sa extrahovala z PBMC stimulovanej 16 hodín Con A. Na syntézu 1 reťazca cDNA sa použil 3' génovo špecifický prajmer. RNA a prajmer sa pred pridaním ďalších RT reakčných činidiel ohrievali 5 minút na 75°C. Po denaturácii sa zmes ochladila na 4°C a pridal sa tlmivý roztok, chlorid horečnatý, dMPP, DTT a SuperScript RT (Gibco BRL, Gaithersburg, MD) . RT zmes sa inkubovala 30 minút pri 42°C, potom sa zahriala na 70°C a pri tejto teplote udržovala 15 minút v snahe denaturovať RT. Potom sa pridal RNázový koktail a reakčná zmes sa 10 minút inkubovala pri 55°C, čím sa odstránila RNA rezíduá a zabránilo sa nesprávnej extenzii koncovej transferázy (TdT). cDNA sa následne purifikovala cez kolónu GlasMax Spin (Gibco BRL, ·· ···· ·· ·· ·· ·· · ···· ··· ··· ···· ·· ··· ···· · · ·· · ·· ·· ·· ·
Gaithersburg, MD) s cielom odstrániť nezabudovanú dNTP a prajmer. Purifikovaná cDNA sa následne spojila s TdT. TdT sa použila na zavedenie dC päty obsahujúcej 20 až 30 nukleotidov do cDNA. Do zmesi purifikovanej cDNA, chloridu horečnatého, reakčného tlmivého roztoku a dCTP sa po denaturácii cDNA 3 minúty pri 95°C pridal enzým. Reakčná zmes sa 10 minút inkubovala pri 37°C, potom sa enzým inaktivoval lOminútovým ohrevom na 70°C. Pätou ukončená cDNA sa amplifikovala PCR reakciou s horúcim štartom na báze Taq polymerázy (95°C 5 min; 95°C 30 s, 55°C 30 s, 72°C 45 s 35 cyklov; 72°C 7 min). Prajmery pre túto reakciu zahŕňali 3'prajmer nachádzajúci sa na 5' konci prajmeru cDNA syntézy a kotviaci prajmer špecifický pre dC linker tvorený prevážne dG s niekolkými dl rezíduami. 1 ml tejto reakčnej zmesi sa nariedil 50 ml vody a 5 ml tohto neriedeného roztoku sa následne použilo pri nested PCR reakcii (95°C 5 min 1 cyklus; 95°C 30 s, 55°C 30 s a 72°C 45 s 30 cyklov pri použití KlenTaq polymerázovej zmesi) s dG/dl 5' kotviacim prajmerom a ďalším upstream génovo špecifickým 3' prajmerom. 30 ml nested reakcie sa následne vizualizovalo na 1,5% agarózovom géli a správny fragment sa z gélu extrahoval (obr. 19). cDNA sa purifikovala už opísaným spôsobom pomocou gélového nebulizéru Amicon a filtru Micropure (Amicon, Beverly, MA) . Purifikovaná vzorka cDNA sa cyklicky sekvencovala pomocou farbiva ako terminátoru (Perkin Elmer, Norwalk, CN) . Z ukončených fragmentov sa odvodila konvenčná sekvencia. Z tejto sekvencie sa syntetizoval prajmerový pár, ktorý zahŕňal celý otvorený čítací rámec mačacieho CD28 génu:
feCD28 5': CGC GGA TCC ACC GGT AGC ACA ATG ATC CTC AGG (SEQ ID NO. 75) feCD28 3': CGC GGA TCC TCT GGA TAG GGG TCC ATG TCA G (SEQ ID NO. 76)
·· ···· ·· ·· ··
• • · • • • • • • ··
• • · • • ·· • •
• • · • • • • • •
·· • • · ·· ·· ··
Pri použití týchto prajmerov sa z Con A stimulovaných EK6 a ED3 PBMC odvodenej cDNA amplifikovala cDNA molekula obsahujúca celú kódujúci oblasť. Na takto pripravenej PBMC cDNA sa demonštrovalo, že obsahuje RNA kódujúci gén. Táto PCR reakcia (95°C 5 min 1 cyklus; 95°C 30 s, 42°C 30 s a 72°C 45 s 30 cyklov; 72°C 7 min) používajúca KlenTaq DNA polymerázu v snahe redukovať náhodné chyby spojované s Taq polymerázou produkovala 754 bp fragment, ktorý sa naklonoval do TA klonovacieho vektoru a sekvencoval už opísaným spôsobom. Rovnako ako v prípade CD80 molekuly bolo každé nukleotidové miesto overené aspoň 3 nezávisle odvodenými sekvenciami.
Homológny vektor 902-49.46. Na účely inzercie cudzej DNA do RPV sa skonštruoval plazmid 902-49.46. Tento plazmid zabudováva E.coli β-galaktozidázový (lacZ) markérový gén ohraničený RPV DNA. Cudziemu génu predchádza približne 906 bp fragment RPV DNA. Za cudzími génmi nasleduje približne 895 bp fragment RPV DNA. Pokial sa plazmid použije podľa homológneho rekombinantného postupu na generovanie rekombinantného RPV, potom sa získá vírus obsahujúci DNA kódujúcu cudzie gény. Je potrebné poznamenať, že β-galaktozidázový (lacZ) markérový gén je riadený neskorým promotorom (LP1) a druhá cudzia DNA je zavedená do EcoRI alebo BamHI miesta a je riadená neskorým/skorým promotorom (LP2EP2). Homológny vektor sa skonštruoval pri použití štandardných rekombinantných DNA techník (Sambrook a kol.) spojením reštrikčných fragmentov z nasledujúcich zdrojov so syntetickými DNA sekvenciami. Plazmidový vektor sa odvodil z približne 2990 bp HindlII reštrikčného fragmentu pSP64 (Promega). Fragmentom 1 bol približne 906 bp HindlII až Xbal reštrikčný subfragment RPV HindlII reštrikčného fragmentu U (Knight a kol.). Fragmentom 2 bol približne 3010 bp ·· ····
BamHI až PvuII reštrikčný fragment plazmidu pJF 751 (Ferrari a kol.). Fragmentom 3 bol približne 895 bp Xbal až HindlII subfragment RPV HindlII fragmentu U. Xbal miesta vo fragmentoch a 3 sa pri použití Notl linkerov premenili na unikátne Notl miesta.
·· ·· ·· • · · ···· ··· e·· ···· · · ··· ···· · · ·· · ·· ·· ·· ·
Homológny vektor 904-63-B7. Homológny vektor 904-63-B7 sa použil na inzerciu cudzej DNA do RPV. Tento plazmid zabudováva E. coli β-galaktozidazový (lacZ) markérový gén a gag/proteázu vírusu mačacej imunodeficiencie (FIV) a env gény ohraničené SPV DNA. Pokial sa tento homológny vektor použije podľa homológneho rekombinantného postupu na generovanie rekombinantného SPV, potom sa získa vírus obsahujúci DNA kódujúcu cudzie gény. Je potrebné poznamenať, že β-galaktozidázový (lacZ) markérový gén je riadený syntetickým neskorým kiahňovým promotorom (LP1) a FIV gag/proteáza a env gény sú riadené samostatnými, avšak identickými syntetickými neskorými/skorými kiahňovými promótormi (LP2EP2). Kazety FIV gag/proteázy a FIV env promotoru/génu sú orientované v opačných smeroch, takže transkripcia gag/proteázy a env génov prebieha proti sebe, čím sa vylučuje možnosť homológnej rekombinácie medzi identickými promótormi. Homológny vektor sa skonštruoval pri použití štandardných rekombinantných DNA techník (Sambrook a kol.) spojením reštrikčných fragmentov z nasledujúcich zdrojov s vhodnými syntetickými DNA sekvenciami. Plazmidový vektor sa odvodil z približne 2972 bp HindlII reštrikčného fragmentu pSP64 (Promega). Fragmentom 1 bol približne 1484 bp BglII až Accl reštrikčný subfragment SPV HindlII reštrikčného fragmentu M (23). Fragmentom 2 bol približne 2580 bp EcoRI až BglII fragment FIV obalového génu syntetizovaného reverznou transkripciou (RT) a polymerázovou ·· ···· ·· ·· · ···· ··· • · · · · ·· · · ··· ···· ·· ·· · ·· ·· ·· · reťazovou reakciou (PCR) (15,42) pri použití cDNA z FIV PPR reťazca. Upstream prajmer (5 '-GCCCGGATCCTATGGCAGAAGGGTT-TGCAGC-3 ' ; 10/93.21) (SEQ ID NO. 77) sa syntetizoval z 5' konca FIV env génu a zaviedol BamHI miesto na 5' konci uvedeného génu. Downstream prajmer (5'-CCGTGGATCCGGCACTCCATCATTCCTCCTC-3'; 10/93.20) (SEQ ID NO. 78) sa syntetizoval z 3'konca FIV env génu, zaviedol BamHI miesto na 3' koniec génu a použil sa na reverznú transkripciu a polymerázovú reťazovú reakciu. PCR produkt sa digeroval BamHI a poskytol fragment obsahujúci 2580 bázických párov v dĺžke zodpovedajúcej FIV env génu. Fragmentom 3 je približne 1839 bp EcoRi až BglII fragment FIV gag/proteázový gén syntetizovaný reverznou transkripciou (RT) a polymerázovou reťazovou reakciou (PCR) (15,42) pri použití cDNA z FIV PPR reťazca. Upstream prajmer(5 '-GCGTGAATTCGGGGAATGGACAGGGGCG-GAT-3 ' ; 11/94.9)(SEQ ID NO. 79) sa syntetizoval z 5' konca FIV gag/ proteázového génu a zaviedl BcoRI miesto na 5'koniec génu. Downstream prajmer (5'-GAGCCAGATCTGCTCTTTTTACTTTCCC-3 '; 11/94.10) (SEQ ID NO. 80) sa syntetizoval z 3' konca FIV gag/proteázového génu a zaviedol BglII miesto na 3'koniec tohto génu a použil sa na reverznú transkripciu a polymerázovú reťazovú reakciu. PCR produkt sa digeroval EcoRi a BglII a poskytol fragment obsahujúci približne 1839 bázických párov v dĺžke zodpovedajúcej FIV gag/ proteázovému génu. Fragmentom 4 je približne 3010 bp BamHI až PvuII reštrikčný fragment plazmidu pJF751 (Ferrari a kol.). Fragmentom 5 je približne 2149 bp Accl až HindlII reštrikčný subfragment SPV HindlII reštrikčného fragmentu M. Accl miesto v SPV homológnom vektore sa pri použití syntetických linkerov premenilo na unikátne NotI miesto.
Homológny vektor 917-60.B9. Na účely inzercie cudzej DNA do SPV sa skonštruoval plazmid 917-60.B9. Tento plazmid zabudováva ·· ···· ·· ·· ·· ·· · ···· · · · ··· · · ·· ·· ··· ···· · · ·· · ·· ·· ·· ·
E.coli β-galaktozidázový (lacZ) markérový gén a mačací IFN-γ gén (Onions a kol. (1996); Argyle a kol (1995)) ohraničené SPV DNA. Cudziemu génu predchádza približne 1484 bp fragment SPV DNA. Za cudzími génmi nasleduje približne 2149 bp fragment SPV DNA. Pokial sa plazmid použije podlá homológneho rekombinantného postupu na generovanie rekombinantného SPV, potom sa získa vírus obsahujúci DNA kódujúcu cudzie gény. Je potrebné poznamenať, že β-galaktozidáový (lacZ) markérový gén je riadený promotorom OPI kiahní ošípaných a mačací CD28 gén je riadený syntetickým neskorý/skorým kiahňovým promotorom (LP2EP2). Homológny vektor sa skonštruoval pri použití štandardných rekombinantných DNA techník (Sambrook a kol.) spojením reštrikčných fragmentov z nasledujúcich zdrojov. Plazmidový vektor sa odvodil z približne 2972 bp Hindlll až BamHI reštrikčného fragmentu pSP64 (Promega). Fragmentom 1 bol približne 1484 bp Bglll až AccI reštrikčný subfragment SPV Hindlll reštrikčného fragmentu M. Fragmentom 2 bol EcoRI až BamlI reštrikčný fragment syntetizovaný reverznou transkripciou (RT) a polymerázovou reťazovou reakciou (PCR) pri použití RNA z Conk stimulovaných buniek mačacej sleziny ako templátu. Pri syntéze mačacieho IFN-γ sa prajmer (5'-TCGAGAATTCGATGAATTACACAAGTTTTATTT-TCG-3'; 1/97.4) (SEQ ID NO. 81) syntetizoval z 5' konca mačacieho IFN-γ génu, zaviedol EcoRI miesto na 5'konci uvedeného génu. Prajmer (5'-TCGAGGATCCTTATTTCGATGCTCTACGGCCTC-3'; 1/97.3) (SEQ ID NO. 82) sa syntetizoval z 3' konca mačacieho IFN-γ génu, zaviedol BamHI miesto na 3' koniec génu a použil sa na reverznú transkripciu a polymerázovú reťazovú reakciu. PCR produkt sa digeroval EcoRI a BamHI a poskytol fragment obsahujúci 504 bázických párov v dĺžke zodpovedajúcej mačaciemu IFN-γ génu. Fragmentom 3 je približne 3010 bp BamHI až PvuII reštrikčný fragment plazmidu pJF751 (Ferrari a kol.). Fragmentom 4 je približne 2149 bp Accl až
Hindlll subfragment SPV Hindlll fragmentu M. Accl miesta vo fragmentoch 1 a 4 sa pri použití Nôti linkerov premenili na unikátne Nôti miesta.
·· ···· ·· ·· ··
• • · • • • • • • ··
• • · • • ·· • •
• • · 9 • t • 9 9
• · • ·· • · • e ··
Homológny vektor 926-76.D7. Na účely delécie časti gE kódujúcej oblasti z mačacieho herpesvírusu a inzercie cudzej DNA sa skonštruoval plazmid 926-76.D7. Tento plazmid zabudováva mačací CD80 gén ohraničený FHV DNA. Mačací CD80 gén je riadený FHV gE promotorom. Homológny vektor je konštruovaný z označených DNA zdrojov pri použití štandardných rekombinantných techník (Sambrook a kol.). Plazmidový vektor sa odvodil z približne 2958 bp Asp718I až Asp718I reštrikčného endonukleázového fragmentu pSP18/19. Fragmentom 1 je približne 1415 bp Asp718I až Smal subfragment FHV Sali B fragmentu. Fragmentom 2 je približne 879 bp EcoRI až BamHI fragmentu mačacieho CD80 génu syntetizovaného klonovaním polymerázovou reťazovou reakciou. Templátom pre PCR reakciu bola RNA z ConA stimulovaných buniek mačacej sleziny. Upstream prajmer (5'-TCGAGAATTCGGGTCACGCAGCAAAGTGG-3'; 1/97.43) (SEQ ID NO. 52) sa syntetizoval z 5'konca mačacieho CD80 génu a zaviedol EcoRI miesto. (5'-GCTAGGATCCAATCTATGTAGACAGGTGAGAT-31/97.6) (SEQ ID NO. 53) sa syntetizoval z 3'konca mačacieho CD80 génu, zaviedol BamHI miesto na 3' koniec génu a použil sa na reverznú transkripciu a polymerázovú reťazovú reakciu. Fragmentom 3 je približne 2205 bp Sali až Asp7181 subfragment FHV EcoRI E fragmentu.
·· ···· ·· • · • · • · • · ·· ·· ·· • ···· ··· · · ·· · · • ·· · · · · · • · · · · · ·
Homológny vektor 930-23. Al. Na inzerciu cudzej DNA do SPV sa skonštruoval plazmid 930-23.Al. Tento plazmid zabudováva E.coli β-galaktozidázový (lacZ) markérový gén a mačací CD80 gén ohraničenej SPV DNA. Cudzím génom predchádza približne 1484 bp fragment SPV DNA. Za cudzími génmi nasleduje približne 2149 bp fragment SPV DNA. Pokiaľ sa plazmid použije podľa homológneho rekombinantného postupu na generovanie rekombinantného SPV, potom sa získa vírus obsahujúci DNA kódujúcu cudzie gény. Je potrebné poznamenať, že β-galaktozidázový (lacZ) markérový gén je riadený syntetickým neskorým promotorom kiahňovým (LP1) a mačací CD80 gén je riadený syntetickým neskorým/skorým kiahňovým promotorom (LP2EP2). Homológny vektor je možné skonštruovať pri použití štandardných rekombinantných DNA techník (Sambrook a kol.) spojením reštrikčných fragmentov z nasledujúcich zdrojov. Plazmidový vektor sa odvodil z približne 2972 bp Hindlll až BamHl reštrikčného fragmentu pSP64 (Promega). Fragmentom 1 bol približne 1484 bp BglII až Accl reštrikčný subfragment SPV Hindlll reštrikčného fragmentu M. Fragmentom 2 bol EcoRI až BamlI reštrikčný fragment syntetizovaný reverznou transkripciou (RT) a polymerázovou reťazovou reakciou (PCR) pri použití RNA z ConA stimulovaných buniek mačacej sleziny ako templátu. Pri syntéze mačacieho CD80 sa prajmer (5'-TCGAGAATTCGGGTCACGCAGCAAAGTGG-3'; 1/97.43) (SEQ ID NO. 52) syntetizoval z 5' konca mačacieho CD80 génu, zaviedol EcoRI miesto na 5'konci uvedeného génu. Prajmer (5'-GCTAGGATCCAATCTATGTAGACAGGTGAGAT-31/97.6) (SEQ ID NO. 53) sa syntetizoval z 3' konca mačacieho CD80 génu, zaviedol BamHl miesto na 3' koniec génu a použil sa na reverznú transkripciu a polymerázovú reťazovú reakciu. PCR produkt sa digeroval EcoRI a BamHl a poskytol fragment obsahujúci približne 879 bázických párov v dĺžke zodpovedajúcej mačaciemu CD80 génu. Fragmentom 3 je približne 3010 bp BamHl až PvuII reštrikčný fragment plazmidu ·· ·· ···· • · · ···· ··· ··· ···· · · ··· · · · · ·· ·· · ·· ·· ·· · pJF751 (Ferrari a kol.). Fragmentom 4 je približne 2149 bp Accl až Hindlll subfragment SPV Hindlll fragmentu M. Accl miesta vo fragmentoch 1 a 4 sa pri použití Nôti linkerov premenili na unikátne Nôti miesta.
Homológny vektor 930-26.Al. Na inzerciu cudzej DNA do SPV sa skonštruoval plazmid 930-26.Al. Tento plazmid zabudováva E.coli β-galaktozidázový (lacZ) markérový gén a mačací CD28 gén ohraničenej SPV DNA. Cudzím génom predchádza približne 1484 bp fragment SPV DNA. Za cudzími génmi nasleduje približne 2149 bp fragment SPV DNA. Pokial sa plazmid použije podľa homológneho rekombinantného postupu na generovanie rekombinantného SPV, potom sa získa vírus obsahujúci DNA kódujúcu cudzie gény. Je potrebné poznamenať, že β-galaktozidázový (lacZ) markérový gén je riadený syntetickým neskorým kiahňovým promotorom (LPl) a mačací CD28 gén je riadený syntetickým neskorým/skorým kiahňovým promotorom (LP2EP2). Homológny vektor je možné skonštruovať pri použití štandardných rekombinantných DNA techník (Sambrook a kol.) spojením reštrikčných fragmentov z nasledujúcich zdrojov. Plazmidový vektor sa odvodil z približne 2972 bp Hindlll až BamHI reštrikčného fragmentu pSP64 (Promega). Fragmentom 1 bol približne 1484 bp BglII až Accl reštrikčný subfragment SPV Hindlll reštrikčného fragmentu M. Fragmentom 2 bol EcoRI až BamlI reštrikčný fragment syntetizovaný reverznou transkripciou (RT) a polymerázovou reťazovou reakciou (PCR) pri použití RNA z ConA stimulovaných buniek mačacej sleziny ako templátu. Pri syntéze mačacieho CD28 sa prajmer (5'-GATGAATTCCATGATCCATGATCCTCAGGCTGGGCT-TCT-3'; 7/97.1) (SEQ ID NO. 54) syntetizoval z 5' konca mačacieho CD28 génu, zaviedol EcoRI miesto na 5' konci uvedeného génu. Prajmer (5'-GATCAGATCTCAGGAACGGTATGCCGCAA-3'; 7/97.2) ·· ···· ·· ·· ·· ·· · ···· · · · ··· 9 9 99 9 9
9 9 9 9 9 9 9 9
9 99 99 99 9 (SEQ ID NO. 55) sa syntetizoval z 3' konca mačacieho CD28 génu, zaviedol BamHI miesto na 3' koniec génu a použil sa na reverznú transkripciu a polymerázovú reťazovú reakciu. PCR produkt sa digeroval EcoRI a BamHI a poskytol fragment obsahujúci približne 666 bázických párov v dĺžke zodpovedajúcej mačaciemu CD28 génu. Fragmentom 3 je približne 3010 bp BamHI až PvuII reštrikčný fragment plazmidu pJF751 (Ferrari a kol.). Fragmentom 4 je približne 2149 bp Accl až Hindlll subfragment SPV Hindlll fragmentu M. Accl miesta vo fragmentoch 1 a 4 sa pri použití Nôti linkerov premenili na unikátne Nôti miesta.
Homológny vektor 931-21.Al. Na inzerciu cudzej DNA do SPV sa skonštruoval plazmid 931-21.Al. Tento plazmid zabudováva E.coli β-glukuronidázový (uidA) markérový gén a mačací CD80 gén ohraničenej SPV DNA. Pokial sa homológny vektor použije podlá homológneho rekombinantného postupu na generovanie rekombinantného SPV, potom sa získa vírus obsahujúci DNA kódujúcu cudzie gény. Je potrebné poznamenať, že β-glukuronidázový (uidA) markérový gén je riadený syntetickým skorým kiahňovým promotorom (EP2) a mačací CD80 gén je riadený syntetickým neskorým/skorým kiahňovým promotorom (LP2EP2). Homológny vektor sa skonštruoval pri použití štandardných rekombinantných DNA techník (Sambrook a kol.) spojením reštrikčných fragmentov z nasledujúcich zdrojov s vhodnými syntetickými DNA sekvenciami. Plazmidový vektor sa odvodil z približne 2700 bp Dral reštrikčného fragmentu PNEB193 (New England Biolabs). Fragmentom 1 bol približne 881bp Dral až EcoRI reštrikčný subfragment SPV Hindlll fragmentu K. Fragmentom 2 bol približne 879 bp EcoRI až BamlI fragment mačacieho CD80 génu syntetizovaný klonovaním s polymerázovou reťazovou reakciou (PCR) pri použití RNA z ConA stimulovaných buniek ·· ···· ·· ·· ·· • · · ···· · · · • · · ···· ·· ·· »··· ·· ·· · ·· ·· ·· · mačacej sleziny ako templátu. Upstream prajmer (5'-TCGAGAATTCGGGTCACGCAGCAAAGTGG-3'; 1/97.43) (SEQ ID NO. 52) sa syntetizoval z 5' konca mačacieho CD80 génu, zaviedol EcoRI miesto. Downstream prajmer (5'-GCTAGGÄTCCAÄTCT-ATGTAGACÄGGTGÄGAT3'; 1/97.6) (SEQ ID NO. 53) sa syntetizoval z 3Z konca mačacieho CD80 génu, zaviedol BamHI miesto na 3' koniec génu a použil sa na reverznú transkripciu a polymerázovú reťazovú reakciu. Fragmentom 3 je približne 1823 bp EcoRI až Smal reštrikčný fragment plazmidu pRAJ260 (Clontech) . Fragmentom 4 je približne 994 bp EcoRI až Dral reštrikčný subfragment SPV Hindlll fragmentu K. EcoRI miesta v SPV homológnom vektore sa pri použití syntetických linkerov premenili na unikátne Nôti miesta.
Homológny vektor 931-22. Al. Na inzerciu cudzej DNA do RPV sa skonštruoval plazmid 931-22.Al. Tento plazmid zabudováva mačací CD80 gén ohraničený RPV DNA. Upstream cudzieho génu je približne 906 bp fragment RPV DNA. Downstream cudzích génov je približne 895 bp fragment RPV DNA. Pokiaľ sa plazmid použije podľa homológneho rekombinantného postupu na generovanie rekombinantného RPV, potom sa získa vírus obsahujúci DNA kódujúcu cudzie gény. Je potrebné poznamenať, že mačací CD80 gén je riadený syntetickým neskorým/skorým promotorom (LP2EP2).
skonštruoval pri použití štandardných techník (Sambrook reštrikčných fragmentov z nasledujúcich syntetickými DNA sekvenciami. Plazmidový vektor sa odvodil z približne 2999bp Hindlll reštrikčného fragmentu pSP64 (Promega). Fragmentom 1 bol približne 906bp Hindlll až Xbal reštrikčný subfragment RPV Hindlll reštrikčného fragmentu U (Knight a kol.). Fragmentom 2 bol približne 879 bp EcoRI až BamII fragment
Homológny vektor sa rekombinantných DNA a kol.) zdrojov s spojením vhodnými ·· ···· ·· ·· ··
72 • · • · • · • · • ···· ··· • · · ·· · · • · · · · · · • ·· ·· ·· ·
mačacieho CD80 génu syntetizovaný klonovaním s polymerázovou
reťazovou reakciou. Templátom pre PCR reakciu bola RNA z ConA
stimulovaných buniek mačacej sleziny. Upstream prajmer (5'-TCGAGA-ATTCGGGTCACGCAGCAAAGTGG-3'; 1/97.43) (SEQ ID NO. 52) sa syntetizoval z 5' konca mačacieho CD80 génu, zaviedol EcoRI miesto. Downstream prajmer (5 '-GCTAGGATCCAATCTATGTAGACAGGTGAGAT3'; 1/97.6) (SEQ ID NO. 53) sa syntetizoval z 3' konca mačacieho CD80 génu, zaviedol BamHI miesto na 3' koniec génu a použil sa na reverznú transkripciu a polymerázovú reťazovú reakciu. Fragmentom 3 je približne 895bp Xbal až Hindlll subfragment RPV Hindlll fragmentu U. Xbal miesta vo fragmentoch 1 a 3 sa pri použití Notl linkerov premenili na unikátne Nôti miesta. Syntetická DNA medzi fragmentom 2 a 3 obsahovala LP2EP2 promotor a EcoRI miesto a BamHI miesto na inzerciu cudzej DNA.
Homológny vektor 931-32.A5. Na inzerciu cudzej DNA do RPV sa skonštruoval plazmid 931-32.A5. Tento plazmid zabudováva mačací CD80 gén a E. coli (β-galaktozidázový (lacZ) markérový gén ohraničenej RPV DNA. Upstream cudzích génov je približne 906 bp fragment RPV DNA. Downstream cudzích génov je približne 895 bp fragment RPV DNA. Pokial sa plazmid použije podlá homológneho rekombinantného postupu na generovanie rekombinantného RPV, potom sa získa vírus obsahujúci DNA kódujúcu cudzie gény. Homológny vektor sa skonštruoval pri použití štandardných rekombinantných DNA techník (Sambrook a kol.) spojením reštrikčných fragmentov z nasledujúcich zdrojov so syntetickými DNA sekvenciami. Plazmidový vektor sa odvodil z približne 2999bp Hindlll reštrikčného fragmentu pSP64 (Promega). Fragmentom 1 bol približne 906bp Hindlll až Xbal reštrikčný subfragment RPV Hindlll reštrikčného fragmentu U (Knight a kol.). Fragmentom 2 bol približne 879 bp ·· ···· ·· ·· ·· ·· · ···· · · · ··· · · ·· · ··· · · · · ·· ·· · ·· ·· ·· ·
EcoRI až BamlI fragment mačacieho CD80 génu syntetizovaný klonovaním s polymerázovou reťazovou reakciou. Templátom pre PCR reakciu bola RNA z Conk stimulovaných buniek mačacej sleziny. Upstream prajmer (5'-TCGAGAATTCGGGTCACGCAGCAAAGTGG-3'; 1/97.43) (SEQ ID NO. 52) sa syntetizoval z 5' konca mačacieho CD80 génu, zaviedol EcoRI miesto. Downstream prajmer (5'-GCTÄGGATCCAATCTATGTAGACAGGTGAGAT-3'; 1/97.6) (SEQ ID NO. 53) sa syntetizoval z
3' konca mačacieho CD80 génu, zaviedol BamHI miesto na 3' koniec génu a použil sa na reverznú transkripciu a polymerázovú reťazovú reakciu. Fragmentom 3 je približne 3010bp BamHI až PvuII reštrikčný fragment plazmidu pJF751 (Ferrari a kol.). Fragmentom 4 je približne 895bp Xbal až Hindlll subfragment RPV Hindlll fragmentu U. Xbal miesta vo fragmentoch 1 a 4 sa pri použití Notl linkerov premenili na unikátne Notl miesta.
Homológny vektor 931-55.B12. Na inzerceiu cudzej DNA do SPV sa použil homológny vektor 931-55.B12. Tento homológny vektor zabudováva E. coli (β-glukuronidázový (uidA) markérový gén a mačací IFN-γ gén (Onions a kol., (1996); Argyle a kol. (1995)) ohraničené SPV DNA. Pokial sa tento homológny vektor použije podľa homológneho rekombinantného postupu na generovanie rekombinantného SPV, potom sa získa vírus obsahujúci DNA kódujúcu cudzie gény. Je potrebné poznamenať, že (β-glukuronidázový (uidA) markérový gén je riadený syntetickým skorým kiahňovým promotorom (EP2) a mačací IFN-γ gén je riadený samostatným a unikátnym syntetickým neskorým/skorým kiahňovým promotorom (LP2EP2). Homológny vektor sa skonštruoval pri použití štandardných rekombinantných DNA techník (Sambrook a kol.) spojením reštrikčných fragmentov z nasledujúcich zdrojov s vhodnými ·· ···· ·· • · I • ·· » · · · ·· ·· syntetickými DNA sekvenciami. Plazmidový vektor sa odvodil z približne 2700bp Dral reštrikčného fragmentu PNEB193 (New England Biolabs). Fragmentom 1 bol približne 881bp Dral až EcoRI reštrikčný subfragment SPV HindlII fragmentu K. Fragmentom 2 bol EcoRI až BamHI reštrikčný fragment syntetizovaný reverznou transkripciou a polymerázovou reťazovou reakciou (PCR) pri použití RNA z ConA stimulovaných buniek mačacej sleziny ako templátu. Pri syntéze mačacieho IFN-γ zaviedol upstream prajmer (5'-TCGAGAATTCGATGAATTACACAA-GTTTTATTTTCG-3'; 1/97.4) (SEQ ID NO.
81) syntetizovaný z 5' konca mačacieho IFN-γ génu EcoRI miesto na 5' koniec génu. Prajmer (5'-TCGAGGATCCTTATTTCGATGCTCTACGGCCTC3'; 1/97.3) (SEQ ID NO. 82) sa syntetizoval z 3' konca mačacieho IFN-γ génu, zaviedol BamHI miesto na 3' koniec génu a použil sa na reverznú transkripciu a polymerázovú reťazovú reakciu. PCR produkt sa digeroval EcoRI a BamHI, čím sa získal fragment s dĺžkou približne 504 bázických párov, ktorá zodpovedala mačaciemu IFN-γ génu. Fragmentom 3 je približne 1823bp EcoRI až Smal reštrikčný fragment plazmidu pRAJ260 (Clonetech). Fragmentom 4 je približne 994bp EcoRI až Dral reštrikčný subfragment SPV HindlII reštrikčného fragmentu K. EcoRI miesto v SPV homológnom vektore sa pri použití syntetických linkerov premenilo na unikátne Nôti miesto.
Homológny vektor 846-88.B17. Na účely delécie celej gE kódujúcej oblasti z mačacieho herpesvírusu a inzercie cudzej DNA sa zostrojil plazmid 846.88.B17. Tento plazmid zabudováva E. coli (β-galaktozidázový (lacZ) markérový gén inzertovaný do FHV gE vypusteného miesta ohraničeného HV DNA. Plazmid 846-88.B17 obsahuje 1638bp deléciu gE génu z Smal miesta v FHV Sali B ·· ···· ·· ·· • · • · · • · ·· · ·· • · ·· · fragmentu až Sali mieste v FHV EcoRI E fragmentu. Smal miesto v FHV Sali B fragmente a Sali miesto v FHV EcoRI E fragmente definujú koncové body delécie gE génu. Upstreamom cudzieho génu je približne 1415bp Asp718 až Sami subfragment FHV Sali B obsahujúci celú kódujúcu sekvenciu gl génu (370 aminokyselín) . Downstreamom cudzieho génu je približne 2205bp Sali až Asp 718 subfragment FHV EcoRI E fragmentu, ktorý obsahuje unikátnu krátku a koncovú opakujúcu sa sekvenciu. Pokial sa plazmid použije podľa homológneho rekombinantného postupu na generovanie rekombinantného RPV, SPV alebo FHV, potom bude výsledkom vírus obsahujúci DNA kódujúcu cudzí gén. Je potrebné poznamenať, že E. coli lacZ gén je riadený konštitutívnym FHV gE promotorom. Homológny vektor sa skonštruoval pri použití štandardných rekombinantných DNA technik (Sambrook a kol.).
Homológny vektor 921-65.B5. Na účely delécie SPV 15L génu (približne 237 bp) a inzercie cudzej DNA do SPV sa skonštruoval homológny vektor 921-65.B5. Tento homológny vektor zabudováva E. coli (β-galaktozidázový (LacZ) markérový gén a mačací FeLV (vírus mačacej leukémie) gag/proteázový a env gén ohraničenej SPV DNA. Pokial sa tento homológny vektor použije podlá homológneho rekombinantného postupu na generovanie rekombinantného RPV, SPV alebo FHV, potom sa získa vírus obsahujúci DNA kódujúcu cudzie gény. Homológny vektor sa skonštruoval pri použití štandardných rekombinantných DNA techník (Sambrook a kol.). Je potrebné poznamenať, že (β-galaktozidázový (lacZ) markérový gén je riadený konštitutívnym skorým kiahňovým promotorom (I5L) a FeLVgag/ proteázový a FeLV env gén sú riadené distinkčnými syntetickými skorými kiahňovými promótormi EP2, resp. EP1. SPV sekvencia ohraničujúca cudzie génové inzercie sa odvodila z
3,2kb ·· ···· ·· ·· ·· • · · ···· ··· ··· · · ·· · · ··· · · · · ·· ·· · ·· ·· ·· ·
Hindlll N genómového fragmentu. (Jpstreamovou sekvenciou cudzích génov bol 903bp fragment obsahujúci časť SPV 14L génu a downstreamovou sekvenciou bol 966bp fragment obsahujúci časť SPV 16L génu. Otvorené čítacie rámce E. coli lacZ génu, FeLV env a FeLVgag/proteázy prebiehali rovnakým smerom vzhľadom na SPV 16L a SPV 14L gény.
Homológny vektor 942-03.C6. Na účely delécie časti gE kódujúcej oblasti z mačacieho herpesvírusu a inzercie troch cudzích génov do gE vypusteného miesta sa zostrojil plazmid 942-03.C6. Tento plazmid zabudováva mačací CD80 gén (~879 bp) a FlVgag/proteázový gén ( — 1800 bp) a FIV env gén (—2600 bp) ohraničenej FHV DNA. Mačací CD80 gén sa riadil FHV gE promotorom; FlVgag/proteázový gén je riadený gX promotorom pseudobesnoty a FlVenv gén je riadený cytomegalovírusovým bezprostredne predchádzajúcim génom. Upstreamom cudzích génov je približne 1415bp Asp718 až Sami subfragment FHV Sali B fragmentu). Downstreamom cudzích génov je približne 2205bp Sali až Asp 718 subfragment FHV EcoRI E fragmentu, ktorý obsahuje unikátnu krátku a koncovú opakujúcu sa sekvenciu. Pokiaľ sa plazmid použije podľa homológneho rekombinantného postupu na generovanie rekombinantného RPV, SPV alebo FHV, potom bude výsledkom vírus obsahujúci DNA kódujúcu cudzí gén. Homológny plazmid 942-03.C6 sa skonštruoval pri použití štandardných rekombinantných DNA techník (Sambrook a kol.).
Príklady uskutočnenia vynálezu
Príklad IA ·· ···· ·· ·· ·· ·· · · · · · ··· • · · ···· · · ·«· · · · · · · ·· · ·· ·· ·· ·
Klonovanie mačacích CD80 (B7-1)-TAMU, CD80 (B7-1)-SPAH, C86 (B-7-2), CD28 a CTLA-4 cDNA:
Mačacie CD80 (B7-1), C86 (B-7-2), CD28 a CTLA-4 cDNA sa klonovali najskôr RT-PCR (reverznou transkriptázovou/ polymerázovou reťazovou reakciou) amplifikáciou oblasti medzi dvoma sekvenciami, ktoré sa konzervujú tak, že vytvoria degeneračné prajmery, ktoré vzájomne pôsobia na mačaciu mRNA. Zdrojom mRNA boli jednojadrové bunky periférnej krvi (PBMC) alebo splenocyty stimulované aspoň 16 hodín Con A. Tento PCR produkt sa sekvencoval. Sekvencia sa použila na prípravu prajmerov pre RAČE (rýchlu amplifikáciu cDNA koncov) PCR. 5'koniec sa amplifikoval tak, že sa najskôr pripravila cDNA s downstream prajmerom komplimentárnym k novo sekvencovanej konzervovanej oblasti. Oligonukleotid sa ligoval na 3' koniec cDNA (doplnok k 5'koncu mRNA). Táto sekvencia slúžila ako väzbové miesto pre upstream prajmer, ktorý bol PCR kompatibilný s downstream PCR prajmerom, ktorý zodpovedal ďalšej oblasti v novo sekvencovanej oblasti. Degeneračné prajmery sa použili v množine behov nested reakciou vedúcou k získaniu 3'konca. Tento upstream prajmer pre PCR bol navrhnutý tak, aby reagoval so sekvenciou v novo sekvencovanej oblasti. Produkty sa sekvencovaly buď priamo alebo sa klonovali do TA klonovacieho vektoru a sekvencovali z plazmidu. Celý otvorený čítací rámec sa klonoval PCR amplifikáciou ako celok s prajmermi konštruovanými zo známych sekvencií. ORFs sa klonovali a sekvencovali 3x. B7-1 ORF sa subklonoval do pSI plazmidu s SV40 promotorom a do SFV plazmidu. pSI sa použil na zaistenie funkčnej interakcie medzi B7-1 a mačacím CD28.
DNA prajmermi použitými na RT/PCR mačaciu CD80 (B7-1) cDNA boli:
·· ···· ·· ·· ··
• • · • • • • • • ··
• • · • • ·· • •
• • · • • • • • •
·· • ·· ·· ·· ··
' Prajmer: 5 '-CGCGGATCCGCACCATGGGTCACGCAGCAAAGTGGAAAAC-3 ' ;
(SEQ ID NO. 11)
3' Prajmer: 5'-CCTAGTAGAGAAGAGCTAAAGAGGC-3'; (SEQ ID NO. 12) (Pozri hore kompletný zoznam prajmerov pre mačaciu CD80 cDNA.)
DNA prajmermi použitými na RT/PCR mačaciu CD28 cDNA boli:
5' Prajmer: 5'-CGCGGATCCACCGGTÄGCACAATGATCCTCAGG-3';
(SEQ ID NO. 13)
3' Prajmer: 5'-CGCGGATCCTCTGGATAGGGGTCCATGTCAG-3';
(SEQ ID NO: 14) (Pozri hore kompletný zoznam prajmerov pre mačaciu CD28 cDNA.)
DNA prajmermi použitými na RT/PCR mačaciu CTLA-4 cDNA boli:
1. Degeneračné prajmery pre prvý PCR produkt (672 bp):
Deg 5' P: 5'-ATGGCTT(C)GCCTTGGATTT(C)CAGC(A)GG-3';
(SEQ ID NO. 15)
Deg 3' P: 5'-TCAATTG (A) ATG (A) GGAATAAAATAAGGCTG-3 ';
(SEQ ID NO. 16)
2. 5' a z CTLA-4 (455 bp) : Degeneračné, gén-špecifické (GSP) a nested gén-špecifické (NGSP) prajmery:
Prvé kolo PCR:
·· • • ···· • · • · ·· • · • · ·· • · ·· ·· • · • · ··
• • · • · • · • ·
·· • ·· ·· ·· ··
Deg 5' P: 5'-TGTTGGGTTTC(T)G(A)CTCTG(A)CTT(C)CCTG-3';
(SEQ ID NO. 17)
3' GSP: 5'-GCATAGTAGGGTGGTGGGTACATG-3'; (SEQ ID NO. 18)
Nested PCR s PCR produktom z prvého kola:
Deg 5' P: 5'-TGTTGGGTTTC(T)G(A)CTCTG(A)CTT(C)CCTG-3';
(SEQ ID NO. 19)
3' NGSP: 5'-ACATGAGCTCCACCTTGCAG-3'; (SEQ ID NO. 20)
3. 3' koniec CTLA-4: Adaptor prajmer 1 (AP1, Clontech Lab, Inc., Palo Alto, CA) ; Nested adaptor prajmer (AP2, Clontech Lab), génovo-špecifický prajmer (GSP) a nested génový špecifický prajmer (NGSP):
3' RAČE PCR:
AP1: 5'-CCATCCTAATACGACTCACTATAGGGC-3'; (SEQ ID NO. 21)
5' GSP: 5'-GTGAATATGGGTCTTCAGGCAATG-3(SEQ ID NO. 22)
3' Nested RAČE PCR s produktom 3' RAČE PCR:
AP2: 5'-ACTCACTATAGGGCTCGAGCGGC-3'; (SEQ ID NO. 23)
5' NGSP: 5'-GAAATCCGAGTGACTGTGCTGAG-3'; (SEQ ID NO. 24)
4. Prajmer pre celý CTLA-4 gén
Mačací CTLA-4 5' Prajmer: 5'-AACCTGAACACTGCTCCCATAAAG-3';
(SEQ ID NO. 25)
Mačací CTLA-4 3' Prajmer: 5'-GCCTCAGCTCTTAGAAATTGGACAG-3';
(SEQ ID NO. 26) ·· ···· ·· · · · · ··· ··· · · · ·· ··· · · · · ·· ·· · ·· ·· ·· ·
DNA prajmermi použitými na RT/PCR mačaciu CD86 (B7-2) cDNA boli:
1. Degeneračné prajmery pre prvý PCR produkt (423 bp):
Deg 5' P: 5'-TAGTATTTTGGCAGGACCAGG-3'; (SEQ ID NO. 27)
Deg 3' P: 5'-CTGTGACATTATCTTGAGATTTC-3'; (SEQ ID NO. 28)
2. Degeneračné prajmery pre druhý PCR produkt (574 bp)
Deg 5' P: 5'-GA(G)CA(T)GCACT(A)ATGGGACTGAG-3'; (SEQ ID NO. 29)
Deg 3' P: 5'-CTGTGACATTATCTTGAGATTTC-3'; (SEQ ID NO. 30)
3. 5' koniec CD86: AP1, AP2 (Clontech Lab); Degeneračný 3'-génovo špecifický (GSP) a 3'- nested génovo-špecifický (NGSP) prajmer:
5' RAČE PCR:
AP1: 5'-CCATCCTAATACGACTCACTATAGGGC-3'; (SEQ ID NO. 31)
3' GSP: 5 '-TGGGTAACCTTGTATAGATGAGCAGGTC-3'; (SEQ ID NO: 32)
Nested 5' RAČE PCR s PCR produktom 5' RAČE:
AP2: 5'-ACTCACTATAGGGCTCGAGCGGC-3'; (SEQ ID NO. 33)
3' NGSP: 5'-CAGGTTGACTGAAGTTAGCAAGCAC-3(SEQ ID NO. 34)
4. 3' koniec B7-2: AP1, AP2, 5' GSP a 5' NGSP:
3' RAČE PCR:
AP1: 5'-CCATCCTAATACGACTCACTATAGGGC-3'; (SEQ ID NO. 35)
GSP: 5'-GGACAAGGGCACATATCACTGTTTC-3'; (SEQ ID NO. 36)
·· ···· ·· ·· ··
• • · • • • • • • ··
• • · • • ·· • •
• • · • • • • • •
·· • ·· • ·· ··
Nested 3' RAČE PCR s PCR produktom 3' RAČE:
AP2: 5'-ACTCACTATAGGGCTCGAGCGGC-3'; (SEQ ID NO. 37)
5' NGSP: 5'-CAGTGCTTGCTAACTTCAGTCAACC-3'; (SEQ ID NO. 38)
Celý CD86 gén:
Mačací B72 (SEQ ID NO
Mačací B72 (SEQ ID NO (1) 5' Prajmer: 5'-CGGGAATGTCACTGAGCTTATAG-3' ;
39) (1176) 3' Prajmer: 5'-GATCTTTTTCAGGTTAGCAGGGG-3';
40)
Príklad IB
Klonovanie CD80 (B7-1)-Syntro/SPAH, Plazmid 917-19-8/16
Bunky mačacej podžalúdkovej žľazy sa extrahovali z mačiek a kultivovali 5 hodín s Concanavalinon A. potom sa bunky peletovali, prepláchli PBS a použili na izoláciu celej RNA. (Qiagen Rneasy Total RNA System). Na celú RNA sa pôsobilo DNAzou I (Boehringer Mannheim) v snahe odstrániť DNA kontaminácie z RNA prípravkov. Z týchto prípravkov sa následne extrahovala mRNA pri použití Qiagén's Oligotex perličiek (Santa Čiara, CA) a rýchlych kolón. cDNA sa generovala z mRNA v prítomnosti náhodilých hexamérov, dMTPs, RNAsin, reverznej transkryptázy (Promega) a reverzného transkryptázového tlmivého roztoku (Promega) a 30 minút inkubovala pri 42°C. PCR sa následne použila na generovanie dvojitej skrutkovice cDNA klonu mačacieho B7-1 otvoreného čítacieho rámca v celej jeho dĺžke pri použití zmyslového prajmeru 5/97.50 (5'-ATGGGTCACGCAGCAAAGTG-3'); (SEQ ID NO. 41) a ·· ···· • e ·· ·· ·· · ···· · · · ··· ···· · · • · · · · · e · · ·· · ·· ·· ·· · protizmyslového prajmeru 5/97.51 (5'-CTATGTAGACAGGTGAGATC-3');
(SEQ ID NO. 42), dNTPs, B7-1 cDNA (1. reťazec) MgSO4 vent polymeráza (BRL) a vent polymerázového tlmivého roztoku (BRL). PCR podmienky boli nasledujúce: 1 cyklus 94°C, 15 s; 35 cyklov
94°C 30 s, 48°C 2 min, 72°C 2 min; 1 cyklus 72°C 10 min. PCR reakcie prebiehali na 1% nízkotopiacom agarózovom géli a DNA fragmenty zodpovedajúce očakávanej velkosti B7-1 ORF sa izolovali, gélovo purifikovali (Qiagén's Gel Purification Kit, Santa Čiara, CA) a klonovali do pCR-BLLJNT plazmidového vektoru pri použití kitu reagencií z Invitrogén's Zero Blunt PCR Cloning Kit (San Diego, CA).
DNA extrahovaná z kanamycínovo rezistentných bakteriálnych kolónií sa pretestovali na prítomnosť unikátneho NheI miesta (obsiahnutého v mačacej CD80 (B7-1)-TAMU). Inzerty, ktoré sa nachádzali v rozmedzí velkosti 800 až 900 bp a obsahovali NheI miesto sa sekvencovali pri použití ABI fluorescenčných automatizovaných sekvenčných protokolov a zariadení (PerkinEmler-Cetus; Applied Biosystems, Inc.).
Plazmidový vektor a B7-1 génovo špecifické prajmery, ktoré sa odvodili z už klonovaného B7-1 génu sa použili na generovanie DNA sekvencie pCR-Blunt prajmerov 1/97.36 (5'-CAGGAAACAGCTATGAC-3 ');
(SEQ ID NO. 43) a 1/97.37 (5'-AATACGACTCACTATAGG-3'); (SEQ ID
NO. 44).
B7-1 génovo špecifickými prajmermi sú: 12/96.22 (5'-AACACCATTTCATCATCCTTT-3'); (SEQ ID NO. 45), 1/97.33 (5'-ATACAAGTGTATTTGCCATTGTC-3'); (SEQ ID NO. 46), 12/96.20 (5'-AGCTCTGACCAATAACATCA-3'); (SEQ ID NO. 47), 12/96.21 (5'-ATTAGAAATCCAGTTCACTGCT-3'); (SEQ ID NO. 48), 1/97.32 (5'-TCATGTCTGGCAAAGTACAAG-3'); (SEQIDNO. 49), 11/96.32 ·· ···· » · · • · · • · · • · · «· · ·· ·· ·· • · · · · · · • » ·· · · • · ·· ··· · • · · · · · ·· ·· ·· · (5'-ATTCACTGACGTCACCGA-3'); (SEQ ID NO. 50), 11/96.31 (5'-AAGGCTGTGGCTCTGA-3'); (SEQ ID NO. 51).
Určili sa dva klony, ktoré obsahovali celú dĺžku CD80 sekvencie zodpovedajúcej pôvodnej CD80 sekvencií s výnimkou dvoch DNA bodových mutácií. Jedna z týchto bodových mutácií neovplyvnila aminokyselinovú sekvenciu. Druhá mutácia spôsobila zmenu aminokyselín z leucínu na izoleucín. Bol navrhnutý výsledný mačací CD80 kloň 917-19.8/16. (CD80-Syntro/SPAH).
Príklad 2
S-SPV-229 je vírus kiahní ošípaných, ktorý exprimuje aspoň dva cudzie gény. Gén pre E. coli β-galaktozidázu(lacZ) a gén pre mačací CD80 sa inzertovali do SPV Accl miesta vo väčšom BglII až HindlII subfragmente SPV genómového fragmentu HindlII M (unikátne Notl reštrikčné miesto nahradilo unikátne Accl reštrikčné miesto). Gén pre lacZ je riadený syntetickým neskorým promotorom (LP1) a mačací CD80 gén je riadený syntetickým neskorým/skorým promotorom (LP2EP2).
S-SPV-229 sa odvodil z S-SPV-001 (Kasza Strain). Tento vírus sa získal pri použití homológneho vektoru 913-23.Al (pozri materiály a metódy) a vírusu S-SPV-001 homologickým rekombinantným postupom na generovanie rekombinantného SPV. Transfekčná rezervná surovina sa testovala s cieľom nájsť rekombinantnú SPV exprimujúcu β-galaktozidázu (Bluogal a CPRG testy). Konečným výsledkom purifikácie červeného plaku bol rekombinantný vírus označený ako S-SPV-229. Pri tomto víruse sa urobila analýza na β-galaktozidázovú expresiu, čistotu a stabilitu inzertu množinou pasáží monitorovaných testom modrým
·· ·· • · · · • · ·· ·· • · · • · ·· · plakom a testom čiernym plakom vakcíny, ktoré boli už opísané v časti materiály a metódy. Po počiatočných troch koloch purifikácie sa všetky plaky prezerali, pričom modré zafarbenie naznačilo, že vírus je stabilný, čistý a že exprimuje βgalaktozidázu (patent US 5,382,425).
Pri S-SPV-229 vírusu sa vykonala analýza na expresiu βgalaktozidázovo špecifických antigénov testovaním čierneho plaku s cieľom nájsť v rekombinantnom SPV expresiu cudzieho génu. Ukázalo sa, že monoklonálna látka β-galaktozidázy reaguje špecificky s plakmi S-SPV-229 a nie s negatívnymi kontrolnými plakmi S-SPV-001. Všetky pozorované S-SPV-229 plaky reagovaly s monoklonálnou protilátkou β-galaktozidázy, čo naznačilo, že vírus stabilne exprimoval β-galaktozidázový cudzí gén. Tu opísané testy sa vykonávali v ESK-4 bunkách, ktoré ako sa ukázalo sú vhodným substrátom pre produkciu SPV rekombinantných vakcín.
Pri S-SPV-229 sa vykonala analýza, ktorá mala určiť expresiu pre mačací CD80 gén špecifických antigénov. Pri tomto teste sa testovala mačacia CD80 (B7-1) a CD86 (B7-2) expresia v rekombinantnom SPV, RPV alebo FHV pri použití testu s čiernym plakom. Ukázalo sa, že humánna CTLA-4/Fc chimerická protilátka reaguje špecificky s plakmi S-SPV-229 (exprimujúcimi mačacími CD80) a nie s negatívnymi kontrolnými plakmi S-SPV-001. Ukázalo sa, že všetky pozorované S-SPV-229 plaky reagujú s humánnou CTLA4/Fc chimerickou protilátkou, čo naznačilo, že vírus stabilne exprimuje mačací CD80 cudzí gén.
V snahe potvrdiť expresiu mačacieho CD80 génového produktu sa bunky infikovali S-SP/V-229 vírusom a vzorky infikovaných bunkových lyzátov sa podrobili SDS-polyakrylamidovej gélovej ·· ···· • · · • · · • · · ·· · ·· ·· ·· • · · · · · · • · ·· · · • · · · · · ·· ·· ·· · elektroforéze. Gél sa Westernového prenosu.
blotoval a analyzoval pri použití
S-SPV-229 je použitelný ako vakcína proti chorobám mačiek. S-SPV-229 zvyšuje účinnosť vakcín proti FIV, FeLV, FIP alebo ďalším ochoreniam, pokial sa použije samostatne alebo v kombinácii s FIV, FeLV, FIP alebo ďalšími mačacími vakcínami. SSPV-229 je rovnako použitelný pri expresii mačacieho CD80 polypeptidu. Bunkový lyzát S-SPV-229 infikovaných buniek sa injektuje do tela myší alebo králikov v snahe vytvoriť polyklonálne monošpecifické protilátky mačacieho CD80.
Príklad 3
S-SPV-230 je vírus kiahní ošípaných, ktorý exprimuje aspoň dva cudzie gény. Gén pre E. coli β-galaktozidázu(lacZ) a gén pre mačací CD28 sa inzertovali do SPV Äccl miesta vo väčšom BglII až HindlII subfragmente SPV genómového fragmentu HindlII M (unikátne Nôti reštrikčné miesto nahradilo unikátne Accl reštrikčné miesto). Gén pre lacZ je riadený syntetickým neskorým promotorom (LP1) a mačací CD28 gén je riadený syntetickým neskorým/skorým promotorom (LP2EP2).
S-SPV-230 sa odvodil z S-SPV-001 (Kasza Strain). Tento vírus sa získal pri použití homológneho vektoru 913-26.Al (pozri materiály a metódy) a vírusu S-SPV-001 homologickým rekombinantným postupom na generovanie rekombinantného SPV. Transfekčná rezervná surovina sa testovala s cieľom nájsť rekombinantnú SPV exprimujúcu β-galaktozidázu (Bluogal a CPRG testy). Konečným výsledkom purifikácie červeného plaku bol rekombinantný vírus označený ako S-SPV-230. Pri tomto víruse sa ·· ···· ·· ·· ·· • · · · • · ·· • · · « • · · « ·· ·· vykonala analýza na β-galaktozidázovú expresiu, čistotu a stabilitu inzertu množinou pasáží monitorovaných testom modrým plakom, ktorý bol už opísaný v časti nazvanej Materiály a metódy. Po počiatočných troch koloch purifikácie sa všetky plaky prezreli, pričom modré zafarbenie naznačilo, že vírus je stabilný, čistý a že exprimuje cudzí gén.
Pri S-SPV-230 sa vykonala analýza, ktorá mala určiť expresiu pre mačací CD28 gén špecifických antigénov. Pri tomto teste sa testovala expresia cudzieho génu v rekombinantnom SPV pri použití testu s čiernym plakom. Opísané testy sa vykonávali v ESK-4 bunkách, čo naznačuje, že ESK-4 bunky budú vhodným substrátom pre produkciu SPV rekombinantných vakcín.
V snahe potvrdiť expresiu mačacieho CD28 génového produktu sa bunky infikovali S-SPV-230 vírusom a vzorky infikovaných bunkových lyzátov sa podrobili SDS-polyakrylamidovej gélovej elektroforéze. Gél sa blotoval a analyzoval pri použití /
Westernového prenosu.
S-SPV-230 je použiteľný ako vakcína proti chorobám mačiek. S-SPV-230 zvyšuje účinnosť vakcín proti FIV, FeLV, FIP alebo ďalším ochoreniam, pokiaľ sa použije samostatne alebo v kombinácii s FIV, FeLV, FIP alebo ďalšími mačacími vakcínami. S-SPV-230 je rovnako použiteľný pri expresii mačacieho CD28 polypeptidu. Bunkový lyzát S-SPV-230 infikovaných buniek sa injektuje do tela myší alebo králikov v snahe vytvoriť polyklonálne monošpecifické protilátky mačacieho CD28.
Príklad 4
S-SPV-225 je vírus kiahní ošípaných, ktorý exprimuje aspoň dva cudzie gény. Gén pre E. coli β-galaktozidázu(lacZ) a gén pre ·· ···· • · · · • ·· * » · · · · · » · · · · ·· ·· 1 mačací interferón-γ (mačací IFN-γ sa inzertovali do SPV Accl miesta vo väčšom BgilI až HindlII subfragmente SPV genómového fragmentu HindlII M (unikátne Nôti reštrikčné miesto nahradilo unikátne Accl reštrikčné miesto). Gén pre lacZ je riadený 01L promotorom kiahní ošípaných a mačací IFN-γ gén je riadený syntetickým neskorým/skorým promotorom (LP2EP2).
S-SPV-225 sa odvodil z S-SPV-001 (Kasza Strain). Tento vírus sa získal pri použití homológneho vektoru 917-60.B9 (pozri materiály a metódy) a vírusu S-SPV-001 homologickým rekombinantným postupom na generovanie rekombinantného SPV. Transfekčná rezervná surovina sa testovala s cielom nájsť rekombinantnú SPV exprimujúcu β-galaktozidázu (Bluogal a CPRG testy). Konečným výsledkom purifikácie červeného plaku bol rekombinantný vírus označený ako S-SPV-225. Pri tomto víruse sa vykonala analýza na β-galaktozidázovú expresiu, čistotu a stabilitu inzertu množinou pasáží monitorovaných testom modrým plakom, ktorý bol už opísaný v časti nazvanej Materiály a metódy. Po počiatočných troch koloch purifikácie sa všetky plaky prezreli, pričom modré zafarbenie naznačilo, že vírus je stabilný, čistý a že exprimuje cudzí gén.
Pri S-SPV-225 sa vykonala analýza, ktorá mala určiť expresiu pre mačací IFN-γ špecifických antigénov. Pri tomto teste sa testovala expresia cudzieho génu v rekombinantnom SPV pri použití testu s čiernym plakom. Opísané testy sa vykonávali v ESK-4 bunkách, čo naznačuje, že ESK-4 bunky budú vhodným substrátom na produkciu SPV rekombinantných vakcín.
·· ·· ·· • · ·· ···· ·· · ·· • · · · • ·· * • · · · · • · · · ·· ·
V snahe potvrdiť expresiu mačacieho IFN-γ génového produktu sa bunky infikovali S-SPV-225 vírusom a vzorky infikovaných bunkových lyzátov sa podrobili SDS-polyakrylamidovej gélovej elektroforéze. Gél sa blotoval a analyzoval pri použití Westernového prenosu.
Pri S-SPV-225 sa zisťovala expresia bioaktívneho mačacieho IFN-γ pri použití metódy testovania, ktorá vyhľadáva bioaktivitu mačacieho IFN-γ exprimovanou rekombinantnými SPV, RPV alebo FHV pri použití VSV plakovej redukcie.
S-SPV-225 je použiteľný ako vakcína proti chorobám mačiek. S-SPV-225 zvyšuje účinnosť vakcín proti FIV, FeLV, FIP alebo ďalším ochoreniam, pokial sa použije samostatne alebo v kombinácii s FIV, FeLV, FIP alebo ďalšími mačacími vakcínami.
Príklad 5
S-SPV-200 vírus kiahní ošípaných, ktorý exprimuje 3 cudzie gény. Gény pre gag/proteázu vírusu mačacej imunodeficience (FIV) a FlVenv (celá dĺžka) a gén pre E. coli β-galaktozidázu (lacZ) sa inzertovali do unikátneho Nôti reštrikčného miesta (Nôti linkery inzertované do unikátneho Accl reštrikčného miesta v 01L ORF SPV Hindlll M fragmente). FlVgag/proteázový a env gén sú riadené samostatným avšak identickým syntetickým neskorým/skorým promotorom (LP2EP2). Gén lacZ je riadený syntetickým neskorým promotorom (LPl).
S-SPV-200 sa odvodil z S-SPV-001 (Kasza Strain). Tento vírus sa pripravil pri použití homológneho vektoru 904-63.B7 a vírusu S-SPV-001 a homológneho rekombinantného postupu na generovanie
·· ·· ·· ···· ·· rekombinantného SPV. Transfekčná rezervná surovina sa testovala s cieľom nájsť rekombinantnú SPV exprimujúcu β-galaktozidázu (Bluogal a CPRG testy) a testovala na rekombinantný herpesvírus exprimujúci enzymatické markérové gény. Finálnym výsledkom purifikácie červeného plaku bol rekombinantný vírus S-SPV-157. Pri tomto víruse sa vykonala analýza na expresiu β-galaktozidázy pri použití testu s modrým plakom, ktorý bol opísaný v časti nazvanej Materiály a metódy. Analýza čistoty a stability inzertu po 5 pasážach sa vykonala detekciou FlVgag a β-galaktozidázy v teste s černý plakom a detekciou FlVgag a env v teste Western blot.
S-SPV-200 je rekombinantný vírus kiahní ošípaných exprimujúci FlVgag/proteázový a FlVenv proteín, ktorý je použiteľný ako mačacia vakcína proti FIV infekcii. S-SPV-200 je rovnako použiteľný pri expresii FlVgag/proteázového a FlVenv proteínu.
Príklad 6
S-SPV-233 je vírus kiahní ošípaných, ktorý exprimuje 5 cudzích génov: FlVgag, FlVenv, mačací CD80, E.coli lacZ a E.coli uidA. Celá dĺžka mačacieho CD80 génu a génu pre E.coli βglukuronidázu (uidA) sa inzertovali do unikátneho Notl reštrikčného miesta (Notl linkery inzertované do unikátneho EcoRI reštrikčného miesta v približne 3,2kb oblasti 6,7kb SPV Hindlll K fragmentu). Gény pre FlVgag/proteázu a FlVenv (celá dĺžka) a gén pre E.coli β-galaktozidázu (lacZ) sa inzertovali do unikátneho Notl reštrikčného miesta (Notl linkery inzertované do unikátneho Accl reštrikčného miesta v 01L ORF SPV Hindlll N fragmentu). CD80 ·· ···· ·· • · · • · ·· ·· · ·· ·· ·· · gén je riadený syntetickým neskorým/skorým promotorom (LP2EP2) a uidA gén je riadený samostatným a unikátnym syntetickým skorým promotorom (EP2) . FlVgag/proteázový a env gén sú riadené samostatným avšak identickým syntetickým neskorým/skorým promotorom (LP2EP2). Gén pre lacZ je riadený syntetickým neskorým promotorom (LP1). (PCR medzinárodná patentová prihláška WO 96/22363).
S-SPV-233 sa odvodil z S-SPV-200 (obsahuje FlVgag, FlVenv a E.coli lacZ gén). Tento vírus sa pripravil pri použití homológneho vektoru 931-21.Al a vírusu S-SPV-200 a homológneho rekombinantného postupu na generovanie rekombinantného SPV. Transfekčná rezervná surovina sa testovala v snahe nájsť rekombinantný SPV exprimujúci β-glukuronidázu (X-gluc a testovanie na rekombinantný herpesvírus exprimujúci enzymatické markérové gény). Finálnym výsledkom modro/zelenej purifikácie bude rekombinantný vírus označený ako S-SPV-233.
Pri S-SPV-233 sa vykonala analýza na expresiu FlVgag, FlVenv a pre mačacie CD80 špecifické antigény pri použití testovania černého plaku na expresiu cudzieho génu v rekombinantnom SPV. Tu opísané testy sa uskutočňovali v ESK-4 bunkách, čo naznačuje, že ESK-4 bunky budú vhodným substrátom na výrobu SPV rekombinantných vakcín.
Pri S-SPV-233 sa vykonala analýza, ktorá mala určiť expresiu pre mačací CD80 gén špecifických antigénov. Pri tomto teste sa testovala mačacia CD80 (B7-1) a CD86 (B7-2) expresia v rekombinantnom SPV, RPV alebo FHV pri použití testu s čiernym plakom. Ukázalo sa, že humánna CTLA-4/Fc chimerická protilátka reaguje špecificky s plakmi S-SPV-233 (exprimujúcimi mačací CD80) a nie s negatívnymi kontrolnými plakmi S-SPV-001. Ukázalo sa že, ···· • · ·· ·· ·· • · · · · • · ·· · · · ······· · • · · · · · · ·· ·· ·· ··· všetky pozorované S-SPV-233 plaky reagujú s humánnou CTLA-4/Fc chimerickou protilátkou, čo naznačilo, že vírus stabilne exprimuje mačací CD80 cudzí gén.
V snahe potvrdiť expresiu FlVgag, FlVenv a mačacieho CD80 génového produktu sa bunky infikovali S-SPV-233 vírusom a vzorky infikovaných bunkových lyzátov sa podrobili SDS-polyakrylamidovej gélovej elektroforéze. Gél sa blotoval a analyzoval pri použití Westernového prenosu.
S-SPV-233 je rekombinantný vírus kiahní ošípaných exprimujúci FlVgag/proteázový a FIV env protein a je použiteľný ako vakcína proti FIV infekcii u mačiek. S-SPV-233 je rovnako použiteľný pri expresii FlVgag/proteázového a FIV env proteínu.
Príklad 7
S-SPV-235 je vírus kiahní ošípaných, ktorý exprimuje päť cudzích génov: FlVgag, FlVenv, mačací IFN-γ E.coli lacZ a E.coli uidA. Celá dĺžka mačacieho IFN-γ génu a génu pre E.coli β-glukuronidázu (uidA) sa inzertovali do unikátneho Notl reštrikčného miesta (Notl linkery inzertované do unikátneho EcoRI reštrikčného miesta v približne 3,2kb oblasti 6,7kb SPV Hindlll K fragmentu). Gény pre FlVgag/proteázu a FlVenv (celá dĺžka) a gén pre E.coli β-galaktozidázu (lacZ) sa inzertovali do unikátneho Notl reštrikčného miesta (Notl linkery inzertované do unikátneho Accl reštrikčného miesta v 01L ORF SPV Hindlll N fragmentu) . IFN-γ gén je riadený syntetickým neskorým/skorým promotorom (LP2EP2) a uidA gén je riadený samostatným a unikátnym syntetickým skorým promotorom (EP2). FlVgag/proteázový a env gén ·· ·· ···· ·· ·· » · · · · · | · ·· · « » · · · · · « » · · · · 1 ·· ·· ·· • · · • · • · · · • · · ·· · sú riadené samostatným avšak identickým neskorým/skorým promotorom (LP2EP2) . Gén pre lacZ syntetickým neskorým promotorom (LP1).
S-SPV-235 sa odvodil z S-SPV-200 (obsahuje FlVgag, FlVenv a E.coli lacZ gén). Tento vírus sa pripravil pri použití homológneho vektoru 931-55.B12 a vírusu S-SPV-200 a homológneho rekombinantného postupu na generovanie rekombinantného SPV. Transfekčná rezervná surovina sa testovala v snahe nájsť rekombinantný SPV exprimujúci β-glukuronidázu (X-gluc a testovanie na rekombinantný herpesvírus exprimujúci enzymatické markérové gény). Finálnym výsledkom modro/zelenej purifikácie bude rekombinantný vírus označený ako S-SPV-235.
Pri S-SPV-235 sa uskutočnila analýza na expresiu FlVgag, FlVenv a pre mačacie IFN-γ špecifické antigény pri použití testovania čierneho plaku na expresiu cudzieho génu v rekombinantnom SPV. Tu opísané testy sa vykonávali v ESK-4 bunkách, čo naznačuje, že ESK-4 bunky budú vhodným substrátom na výrobu SPV rekombinantných vakcín.
Pri S-SPV-235 sa uskutočnila analýza, ktorá mala určiť expresiu bioaktívneho mačacieho IFN-γ pri použití testovania na bioaktivitu mačacieho IFN-γ exprimovanú rekombinantným SPV, RPV alebo FHV realizovaného pomocou VSV plakovej redukcie.
V snahe potvrdiť expresiu FlVgag, FlVenv a mačacieho IFN-γ génového produktu sa bunky infikovali S-SPV-235 vírusom a vzorky infikovaných bunkových lyzátov sa podrobili SDS-polyakrylamidovej gélovej elektroforéze. Gél sa blotoval a analyzoval pri použití Westernového prenosu.
syntetickým je riadený
S-SPV-235 je rekombinantný vírus kiahní ošípaných exprimujúci FlVgag/proteázový a FIV env proteín a je použitelný ako vakcína proti FIV infekcii u mačiek. S-SPV-235 je rovnako použitelný pri expresii FlVgag/proteázového a FlVenv proteínu.
·· ···· • · · • · · • · · • · · ·· · ·· ·· ·· • · · · · · • · ·· · · • · · · ··· · • · · · · · • é ·· ··
Príklad 8
S-SPV-224 je vírus kiahní ošípaných, ktorý exprimuje tri cudzie gény. Gény pre vírus mačacej leukémie (FeLV)gag/proteázu a FeLVenv (celá dĺžka) a gén pre E.coli (lacZ) sa inzertovali do vypusteného SPV I5L miesta odvodeného z SPV 1869bp parciálneho Hindlll N genómového fragmentu. FeLVgag/proteázový gén je riadený syntetickým skorým kiahňovým promotorom (EP2). FeLVenv gén je riadený syntetickým skorým kiahňovým promotorom (EP1). Gén pre lacZ je riadený konštitutívnym neskorým SPV I5L promotorom.
S-SPV-224 sa odvodil z S-SPV-001 (obsahuje Kasza Strain). Tento vírus sa pripravil pri použití homológneho vektoru 92165.B5 a vírusu S-SPV-001 a homológneho rekombinantného postupu na generovanie rekombinantného RPV, SPV, OF FHV. Transfekčná rezervná surovina sa testovala v snahe nájsť rekombinantné RPV OR SPV FHV exprimujúce β-galaktozidázu (Bluogal a CPRG test). Finálnym výsledkom purifikácie červeného plaku bude rekombinantný vírus označený ako S-SPV-224.
Pri S-SPV-224 sa vykonala analýza na expresiu FeLVgag/proteázy, FeLVenv a β-galaktozidázového proteínu pri použití testovania čierneho plaku na expresiu cudzieho génu v rekombinantnom RPV, SPV, OR FHV. Tu opísané testy sa vykonávali v ESK-4 bunkách, čo naznačuje, že ESK-4 bunky budú vhodným substrátom na výrobu SPV rekombinantných vakcín.
·· ····
V snahe potvrdiť expresiu FeLVgag/proteázového a FeLenv génového produktu sa bunky infikovali S-SPV-224 vírusom a vzorky infikovaných bunkových lyzátov sa podrobili SDS-polyakrylamidovej gélovéj elektroforéze. Gél sa blotoval a analyzoval pri použití
Westernového prenosu.
• · • · • · • · ·· ·· ·· ·· • · · · · · • · ·· · · • · · t · « · • · · · · · ·· ·· ·· ·· ···
S-SPV-224 je rekombinantný víruso kiahní ošípaných exprimujúci FeLVgag/proteázový a FeLVenv protein a je použiteľný ako vakcína proti FeLV infekcii u mačiek. S-SPV-224 je rovnako použiteľný pri expresii FeLVgag/ proteázového a FeLVenv proteínu.
Príklad 9
S-SPV-246
S-SPV-246 je vírus kiahní ošípaných, ktorý exprimuje päť cudzích génov: FeLVgag/proteázy, FeLVenv, mačací CD80, E.coli lacZ a E. coli uidA. Celá dĺžka mačacieho CD80 génu a génu pre E.coli β-glukuronidázu (uidA) sa inzertovali do unikátneho NotI reštrikčného miesta (NotI linker sa inzertoval do unikátneho EcoRi reštrikčného miesta v približne 3,2kb oblasti 6,7kb SPV HindlII K fragmentu). CD80 gén je riadený syntetickým neskorým/skorým promotorom (LP2EP2) a uidA gén je riadený syntetickým skorým kiahňovým promotorom (EP2). FeLVgag/ proteázový, FeLVenv gén (celá dĺžlka) a E.coli (β-galaktozidázový (lacZ) gén sa inzertujú do vypusteného I5L miesta odvodeného z 1869 parciálneho HindlII N genómového fragmentu. FeLVgag/ proteázový gén je riadený syntetickým skorým kiahňovým promotorom EP2. FeVLenv gén je riadený syntetickým skorým kiahňovým promotorom EP1. LacZ gén je riadený konštitutívnym neskorým ·· ···· ·· ·· • · · · · · ·· · • · · · · · • · · · · ·· ·· >
pozorované chimerickou kiahňovým promotorom I5L. (PCT medzinárodná patentová prihláška WO 96/22263).
S-SPV-246 sa odvodil z S-SPV-224 (obsahuje FeLVgag/ proteázový, FeLVenv a E.coli lacZ gén v I5L vypustenom 1869kb parciálnom Hindlll N fragmente). Tento vírus sa pripravil pri použití homológneho vektoru 931-21.Al a vírusu S-SPV-224 a homológneho rekombinantného postupu na generovanie rekombinantného RPV,SPV alebo FHV. Transfekčná rezervná surovina sa testovala v snahe nájsť rekombinantný RPV alebo SPV alebo FHV exprimujúci β-galaktozidázu (Bluogal a CPRG testy) alebo β-galaktozidázu (X-GLUC test). Finálnym výsledkom modro/zelenej purifikácie bude rekombinantný vírus označený ako S-SPV-246.
Pri S-SPV-246 sa vykonala analýza na expresiu FeLVgag/proteázového, FeLVenv proteínu pri použití testovania čierneho plaku na expresiu cudzieho génu v rekombinantnom RPV, SPV alebo FHV. Tu opísané testy sa vykonávali v ESK-4 bunkách, čo naznačuje, že ESK-4 bunky budú vhodným substrátom na výrobu SPV rekombinantných vakcín.
Pri S-SPV-246 sa vykonala analýza, ktorá mala určiť expresiu pre mačací CD80 špecifického antigénu testovaním expresie mačacieho CD80 (B7-1) a CD86 (B7-2) v rekombinantnom SPV, RPV alebo FHV pri použití testov s čiernym plakom. Ukázalo sa, že humánna CTLA-4/Fc chimerická protilátka špecificky reaguje so S-SPV-246 plakmi (exprimujúcimi mačací CD80) a nie s negatívnymi kontrolnými plakmi S-SPV-001. Rovnako sa ukázalo, že všetky reagujú s naznačuje,
S-SPV-246 plaky protilátkou, čo humánnou CTLA-4/Fc že vírus stabilne exprimuje mačací CD80 cudzí gén.
V snahe potvrdiť expresiu FeLVgag/proteázového, FeLVenv a mačacieho CD80 génového produktu sa bunky infikovali S-SPV-246 vírusom a vzorky infikovaných bunkových lyzátov sa podrobili SDSpolyakrylamidovej gélovej elektroforéze. Gél sa blotoval a analyzoval pri použití Westernového prenosu.
·· ···· • · · • · · • · · • · · ·· · ·· ·· ·· • · · · · · • · ·· · · • · ·· ··· · • · · · · · ·· ·· ·· ···
S-SPV-246 je rekombinantný vírus kiahní ošípaných exprimujúci FeLVgag/proteázový a FeLVenv protein a je použiteľný ako vakcína proti FeLV infekcii u mačiek. S-SPV-246 je rovnako použiteľný pri expresii FeLVgag/proteázového a FeLVenv proteínu.
Príklad 10
Ďalšími príkladmi rekombinantného vírusu kiahní ošípaných použiteľnými ako vakcína proti vírusu mačacej imunodeficiencie (FIV), vírusu mačacej leukémie (FeLV) alebo mačacej infekčnej peritonitidy (FIP) sú:
Rekombinantný vírus kiahní ošípaných exprimujúci päť cudzích génov. FlVenv gén je riadený syntetickým skorým kiahňovým promotorom EPI; FlVgag/proteázový gén je riadený syntetickým skorým kiahňovým promotorom EP2; E.coli lacZ gén je riadený promotorom kiahní ošípaných I5L; mačací CD80 gén je riadený syntetickým neskorým/skorým kiahňovým promotorom LP2EP2; E.coli uidA gén je riadený syntetickým skorým kiahňovým promotorom EP2. FlVenv gén, FlVgag/proteázový a E.coli lacZ gén sa nachádzajú v neesenciálnych SPV inzertných miestech, ktoré sú iné ako inzertné miesta mačacej CD80 a E.coli uidA génov a sú od týchto inzertných miest odlíšiteľné.
·· ···· ·· • · • · • · • · ·· ·· • · · • * • · · • · · ·· ·· ·· • · · • · • · · • · ·· ·
Rekombinantný vírus kiahní ošípaných exprimujúci päť cudzích génov. FlVenv gén je riadený syntetickým skorým kiahňovým promotorom EPI; FlVgag/proteázový gén je riadený syntetickým skorým kiahňovým promotorom EP2; E.coli lacZ gén je riadený promotorom kiahní ošípaných I5L; mačací CD86 gén je riadený syntetickým neskorým/skorým kiahňovým promotorom LP2EP2; E.coli uidA gén je riadený syntetickým skorým kiahňovým promotorom EP2. FlVenv gén, FlVgag/proteázový a E.coli lacZ gén sa nachádzajú v neesenciálnych SPV inzertných miestach, ktoré sú iné ako inzertné miesta mačacej CD86 a E.coli uidA génov a sú od týchto inzertných miest odlišitelné.
Rekombinantný vírus kiahní ošípaných exprimujúci dva cudzie gény. Mačací CD86 gén je riadený syntetickým neskorým/skorým kiahňovým promotorom LP2EP2; E.coli uidA gén je riadený syntetickým skorým kiahňovým promotorom EP2. Vírus sa použije samotný alebo v kombinácii s ďalšími rekombinantnými proteínnmi alebo vakcínami.
Ďalšie príklady rekombinantných vírusov kiahní ošípaných použitelné pri výrobe vakcín proti FeLV ochoreniu by bola zhodná s hore uvedenými príkladmi s výnimkou nahradzenia FIV génu porovnateľným FeLV špecifickými génmi.
Ďalšími príkladmi rekombinantných vírusov kiahní ošípaných použiteľnými na výrobu proteínov vhodných ako vakcíny na výrobu a purifikáciu polyklonálnej protilátky sú:
Rekombinantný vírus kiahní ošípaných exprimuje jeden cudzí gén. Mačací CD80 gén postrádajúci transmesmbránovú doménu je riadený syntetickým neskorým/skorým kiahňovým promotorom LP2EP2. Alternatívne má CD80 gén postrádajúci transmembránovú doménu na ·· ·· ···· ·· ··
• · • · • · • · ·· ·· ·· karboxylovom konci histidínovú tag fúziu, ktorá umožňuje purifikáciu na niklovo afinitnej kolóne.
Rekombinantný vírus kiahní ošípaných exprimuje jeden cudzí gén. Mačací CD28 gén postrádajúci transmembránovú doménu je riadený syntetickým neskorým/skorým kiahňovým promotorom LP2EP2. Alternatívne má CD28 gén postrádajúci transmembránovú doménu na karboxylovom konci histidínovú tag fúziu, ktorá umožňuje purifikáciu na niklovo afinitnej kolóne.
Rekombinantný vírus kiahní ošípaných exprimuje jeden cudzí gén. Mačací CD86 gén postrádajúci transmembránovú doménu je riadený syntetickým neskorým/skorým kiahňovým promotorom LP2EP2. Alternatívne má CD86 gén postrádajúci transmembránovú doménu na karboxylovom konci histidínovú tag fúziu, ktorá umožňuje purifikáciu na niklovo afinitnej kolóne.
Ďalšími príkladmi rekombinantných vírusov kiahní ošípaných, ktoré využívajú CD80 i CD86 a ktoré sú použiteľné pri vývoji vakcíny pre FIV a FeLV choroby u mačiek sú:
Rekombinantný vírus kiahní ošípaných exprimuje päť cudzích génov. Mačací CD86 gén a mačací CD80 gén sú exprimované v bicistronnej kazete za riadenia syntetickým neskorým/skorým kiahňovým promotorom LP1 poháňajúcim transkripciu CD80 a CD86 a zahŕňajúcim EMCV IRES prvok medzi dvoma otvorenými čítacími rámcami; E.coli uidA gén je riadený syntetickým skorým promotorom EP2. FlVgag/proteázový gén je riadený promotorom kiahní ošípaných OIL; E.coli lacZ gén je riadený syntetickým neskorým kiahňovým promotorom LP1. CD80/CD86 a E.coli uidA gény sú obsiahnuté v neesenciálnych SPV inzertnom mieste, ktoré je iné ako inzertné ·· ···· miesto FlVgag/proteázového génu E. coli lacZ génu a je od týchto inzertných miest odlišitelné.
·· ·· • · · · · · · • · · · · ·· ··· ····· • · · · · · · ·· ·
Rekombinantný vírus kiahní ošípaných exprimuje päť cudzích génov. Mačací CD86 gén a mačací CD80 gén sú exprimované v bicistrónnej kazete za riadenia syntetickým neskorým/skorým kiahňovým promotorom LP1 poháňajúcim transkripciu CD80 a CD86 a zahŕňajúcim EMCV IRES prvok medzi dvoma otvorenými čítacími rámcami; E. coli lacZ gén je riadený syntetickým neskorým promotorom LP1. FlVenv gén je riadený syntetickým skorým kiahňovým promotorom EP1. E.coli uidA gén je riadený syntetickým neskorým kiahňovým promotorom LP1. CD80/CD86 a E. coli uidA gény sú obsiahnuté v neesenciálnych SPV inzertnom mieste, ktoré je iné ako inzertné miesto FlVenv génu E. coli lacZ génu a je od týchto inzertných miest odlišitelné.
Rekombinantný vírus kiahní ošípaných exprimuje šiesť cudzích génov. Mačací CD8 6 gén a mačací CD80 gén sú exprimované v bicistrónnej kazete za riadenia syntetickým neskorým kiahňovým promotorom LP1 poháňajúcim transkripciu CD80 a CD86 a zahŕňajúcim EMCV IRES prvok medzi dvoma otvorenými čítacími rámcami; E.coli uidA gén je riadený syntetickým skorým promotorom EP2. FlVgag/proteázový gén je riadený skorým kiahňovým promotorom EP2; FlVenv gén je riadený syntetickým skorým kiahňovým promotorom EP1; E.coli lacZ gén je riadený syntetickým konštitutívnym 15L kiahňovým promotorom. CD80/CD86 a E.coli uidA gény sú inzertované na miesto, ktoré je odlišitelné od miesta inzercie FlVenv génu, FlVgag/proteázového génu a E.coli lacZ génu.
·· ···· ··
100
Ďalšie vírusy kiahní ošípaných pre FeLV vakcíny určené pre mačky by sa skonštruovali hore opísaným spôsobom s tou výnimkou, že by sa FIV gény nahradili porovnateľnými FeLV génovými konštruktmi.
Príklad 11
Ďalšími príkladmi vírusu kiahní medvedíkov použitelnými ako vakcína proti mačacím ochoreniam, akými sú napríklad vírus mačacej imunodeficience (FIV), vírus mačacej leukémie (FeLV) alebo infekčná mačacia peritonitída (FIP), sú:
Rekombinantný vírus kiahní medvedíkov exprimuje dva cudzie gény. Mačací CD86 je riadený syntetickým neskorým/skorým kiahňovým promotorom LP2EP2; E. coli lacZ gén je riadený syntetickým neskorým kiahňovým promotorom Ll.
Ďalšie príklady rekombinantných vírusov kiahní medvedíkov použitelných pri výrobe proteínov použitelných ako vakcína alebo pri výrobe a purifikácii polyklonálnej protilátky.
Rekombinantný vírus kiahní medvedíkov exprimuje jeden cudzí gén. Mačací CD80 gén postrádajúci transmembránovú doménu je riadený syntetickým neskorým/skorým kiahňovým promotorom LP2EP2. Alternatívne má CD80 gén postrádajúci transmembránovú doménu na karboxylovom konci histidínovú tag fúziu, ktorá umožňuje purifikáciu na niklove afinitnej kolóne.
Rekombinantný vírus kiahní medvedíkov exprimuje jeden cudzí gén. Mačací CD28 gén postrádajúci transmembránovú doménu je riadený syntetickým neskorým/skorým kiahňovým promotorom LP2EP2. Alternatívne má CD28 gén postrádajúci transmembránovú doménu na ·· ···· • · · ·
101 • · ·· karboxylovom konci histidínovú tag fúziu, ktorá umožňuje purifikáciu na niklovo afinitnej kolóne.
Rekombinantný vírus kiahní medvedíkov exprimuje jeden cudzí gén. Mačací CD86 gén postrádajúci transmembránovú doménu je riadený syntetickým neskorým/skorým kiahňovým promotorom LP2EP2. Alternatívne má CD86 gén postrádajúci transmembránovú doménu na karboxylovom konci histidínovú tag fúziu, ktorá umožňuje purifikáciu na niklovo afinitnej kolóne.
Rekombinantný vírus kiahní medvedíkov exprimuje štyri cudzie gény. Mačací CD86 gén a mačací CD80 gén sú exprimované v bicistrónnej kazete za riadenia syntetickým neskorým/skorým kiahňovým promotorom LP2EP2 poháňajúcim transkripciu CD80 a CD86 a zahŕňajúcim EMCV IRES prvok medzi dvoma otvorenými čítacími rámcami poháňajúci transláciu druhého downstream génu CD80; FlVgag gén je riadený promotorom kiahní ošípaných OIL; a E. coli uidA gén je riadený syntetickým skorým promotorom EP2.
Rekombinantný vírus kiahní medvedíkov exprimuje štyri cudzie gény. Mačací CD86 gén a mačací CD80 gén sú exprimované v bicistrónnej kazete za riadenia syntetickým neskorým/skorým kiahňovým promotorom LP2EP2 poháňajúcim transkripciu CD80 a CD86 a zahŕňajúcim EMCV IRES prvok medzi dvoma otvorenými čítacími rámcamii poháňajúci transláciu druhého downstream génu CD80; FlVenv gén je riadený syntetickým skorým kiahňovým promotorom El; a E. coli uidA gén je riadený syntetickým skorým promotorom EP2.
Rekombinantný vírus kiahní medvedíkov exprimuje päť cudzích génov. Mačací CD86 gén a mačací CD80 gén sú exprimované v bicistrónnej kazete za riadenia syntetickým neskorým/skorým kiahňovým promotorom LP2EP2 poháňajúcim transkripciu CD80 a CD86 ·· ···* ·· ·· ·· • · · · · · · · · · ··· · · ·· · · ··· ···· ·· ·· · ·· ·· ·· ·
102 a zahŕňajúcim EMCV IRES prvok medzi dvoma otvorenými čítacími rámcami poháňajúci transláciu druhého downstream génu CD80; FlVgag gén je riadený promotorom kiahní ošípaných OIL; FlVenv gén je riadený syntetickým skorým kiahňovým promotorom El; a E. coli uidA gén je riadený syntetickým skorým promotorom EP2.
Ďalšími príkladmi vírusu kiahní medvedíkov použiteľnými ako vakcína proti mačacím ochoreniam, akými sú napríklad vírus mačacej imunodeficience (FIV), vírus mačacej leukémie (FeLV) alebo infekčná mačacia peritonitída (FIP), sú:
Rekombinantný vírus kiahní medvedíkov exprimujúci dva cudzie gény. Mačací CD86 gén je riadený syntetickým neskorým/skorým kiahňovým promotorom LP2EP2; E. coli lacZ gén je riadený syntetickým neskorým kiahňovým promotorom LPl.
Ďalšími príkladmi rekombinantných vírusov kiahní medvedíkov, ktoré využívajú CD80 i CD86 a ktoré sú použiteľné pri vývoji vakcíny pre FIV a FeLV choroby u máčik sú:
Rekombinantný vírus kiahní medvedíkov exprimuje štyri cudzie gény. Mačací CD86 gén a mačací CD80 gén sú exprimované v bicistrónnej kazete za riadenia syntetickým neskorým kiahňovým promotorom LPl poháňajúcim transkripciu CD80 a CD86 a zahŕňajúcim EMCV IRES prvok medzi dvoma otvorenými čítacími rámcami. FlVgag/proteázový gén je riadený neskorým/skorým kiahňovým promotorom LP2EP2; a E. coli uidA gén je riadený syntetickým skorým kiahňovým promotorom EP2. CD80/CD86, FlVgag/proteázový a uidA gén sú inzertované do jediného neesenciálneho RPV miesta.
Rekombinantný vírus kiahní medvedíkov exprimuje štyri cudzie gény. Mačací CD86 gén a mačací CD80 gén sú exprimované v bicistrónnej kazete za riadenia syntetickým neskorým/skorým
• · · · · • ·
103 ·· ···· ·· ·· ·· kiahňovým promotorom LP2 poháňajúcim transkripciu CD80 a CD86 a zahŕňajúcim EMCV IRES prvok medzi dvoma otvorenými čítacími rámcami; E. coli lacZ gén je riadený syntetickým skorým kiahňovým promotorom El; a E. coli uidA gén je riadený syntetickým skorým kiahňovým promotorom EP2. CD80/CD86, FlVenv a uidA gén sú inzertované do jediného neesenciálneho RPV miesta.
Rekombinantný vírus kiahní medvedíkov exprimuje šesť cudzích génov. Mačací CD86 gén a mačací CD80 gén sú exprimované v bicistrónnej kazete za riadenia syntetickým neskorým kiahňovým promotorom LP1 poháňajúcim transkripciu CD80 a CD86 a zahŕňajúcim EMCVIRiS prvok medzi dvoma otvorenými čítacími rámcami; E coli lacZ gén je riadený neskorým kiahňovým promotorom. FlVgag/proteázový gén je riadený syntetickým skorým kiahňovým promotorom EP2; FlVenv gén je riadený syntetickým skorým kiahňovým promotorom EPI; a E. coli uidA gén je riadený E coli. lacZ gény sú inzertované do miesta, ktoré je odlišitelné od miesta inzercie FlVenv, FlVgag/proteázového a E. coli uidA génu.
Ďalšie vírusy kiahní medvedíkov pre FeLV vakcíny určené pre mačky by sa skonštruovali hore opísaným spôsobom s tou výnimkou, že by sa FIV gény nahradili porovnateľnými FeLV génmi.
Príklad 12
S-FHV-020
S-FHV-020 je rekombinantný mačací herpesvírus, ktorý má deléciu celého FHV gE génu (1638 bázických párov a inzerciu E. coli lacZ génu na vypustenom gE mieste. Transkripcia E. coli lacZ génu je riadená konštitutívnym FHV gE promotorom.
·· ···· ·· ·· ·· • · · ···· ··· ··· · · ·· · · • · · ·· · · · · · · ··· · · · · ·· ·· · ·· ·· ·· ·
104
S-FHV-020 sa odvodil z S-FHV-001 (NVSL reťazoc). Ten sa pripravil pri použití homológneho vektoru 486-88.B17 a vírusu S-FHV-001 homológnym rekombinantným spôsobom prípravy rekombinantného RPV, SPV alebo FHV. Transfekčná rezervná surovina sa testovala v snahe nájsť rekombinantný RPV alebo SPV alebo FHV exprimujúci β-galaktozidázu (BLUOGAL a CPRG testy) alebo βglukuronidázu (X-GLUC test). Finálnym výsledkom purifikácie modrého plaku bol rekombinantný vírus označený ako S-FJV-020. Na analýzu čistoty a stability inzertu po 5 pasážach sa použila detekcia β-galaktozidázy pri testovaní expresie cudzieho génu v rekombinantnom RPV, SPV alebo FHV pri použití testu s čiernym plakom.
Príklad 13
S-FHV-031
S-FHV je rekombinantný mačací herpesvírus, ktorý má deléciu celého 1638bp FHV gE génu a inzerciu troch cudzích génov v gH vypustenom mieste. Transkripcia CD80 génu je riadená konštitutívnym FHV gE promotorom a orientácia je rovnaká ako pri vypustenom gE géne. FlVgag/proteázový gén je riadený gX promotorom pseudobesnoty a FlVenv gén je riadený bezprostredne predchádzajúcim promotorom cytomegalovírusu. Gag/proteázový a env gén sú orientované rovnakým smerom, opačným smerom ako CD80 gén.
S-FHV-031 sa odvodí z S-FHV-020 (za gE promotorom obsahuje E. coli LacZ gén). Ten sa pripravil pri použití homológneho vektoru 942-03.C6 (pozri odsek Materiály a metódy7') a vírusu SFHV-020 homológnym rekombinantným spôsobom prípravy rekombinantného RPV, SPV alebo FHV. Transfekčná rezervná surovina ·· ·· ···· ·· • ·
105 ·· · • · · ·· ·· · sa testovala v snahe nájsť rekombinantný RPV alebo SPV alebo FHV exprimujúci β-galaktozidázu (Bluogaland a CPRG testy) alebo β-glukuronidázu (X-GLUCAtest). Rekombinantné plaky sa vybrali a purifikovali selekciou s bielym plakom. Tento vírus sa charakterizoval reštrikčným endonukleázovým mapovaním a Southernovým prenosom DNA. Táto analýza potvrdila inzerciu mačacieho CD80, FlVgag/proteázového a FlVenv génu a deléciu 1638bp FIV gE génu. (PCT medzinárodná patentová prihláška WO 96/13575).
Pri S-FHV-031 sa v tomto teste pomocou Westernového prenosu zisťovala expresia pre mačací CD80, FlVgag/proteázu a FlVenv špecifických antigénov. Tu opísané testy sa vykonávali v CRFK bunkách, čo naznačilo, že tieto SRFK bunky budú vhodným substrátom na produkciu FHV rekombinantných vakcín. Lyzát z rekombinantného mačacieho herpesvírusu sa infikoval bunkami vykazujúcimi pás očakávanej veľkosti mačacieho CD80 proteínu, FlVgag/proteázy a FlVenv.
Pri S-FHV-031 sa zisťuje expresia pre mačací CD80 špecifických antigénov testovaných pri použití skúšok s čiernym plakom v snahe nájsť v rekombinantnom SPV, RPV alebo FHV expresiu mačacieho CD80 (B7-1) a CD86 (B7-2). Ukázalo sa, že humánna CTLA4/Fc chimerická protilátka špecificky reaguje s plakmi rekombinantného mačacieho herpesvírusu (exprimujúcimi mačací CD80) a nie s negatívnymi kontrolnými plakmi SFHV-001. Rovnako sa ukázalo, že všetky pozorované plaky rekombinantného mačacieho herpesvírusu reagujú s humánnou CTLA-4/Fc chimerickou protilátkou, čo naznačilo, že vírus stabilne exprimuje mačací CD80 cudzí gén.
·· ·· • · · · • · ·· • · · · • · · · ·· ·· ·· ···· • · · • e · • · · • · · ·· · ·· • · · • · • · · • · ·· ·
106
S-FHV-031 je rekombinantný mačací herpesvírus exprimujúci FlVgag/proteázový, FlVenv a mačací CD80 proteín a používa sa ako vakcína u mačiek proti FIV infekcii.
Príklad 14
Rekombinantný mačací herpesvírus má deléciu gE génu a inzerciu aspoň jedného cudzieho génu na gE vypustenom mieste. Cudzím génom je mačací CD86 gén a jeho transkripcia je riadená FHV gE promotorom.
Rekombinantný mačací herpesvírus exprimujúci mačací CD86 je použitelný ako vakcína proti chorobám mačiek. Rekombinantný mačací herpesvírus zvyšuje účinnosť vakcín proti FIV, FeLV, FIP alebo ďalším mačacím ochoreniam, pokial sa použije samostatne alebo v kombinácii s FIV, FeLV, FIP alebo ďalšou mačacou vakcínou.
Príklad 15
Ďalšími príkladmi rekombinantného mačacieho herpesvírusu použitelného ako vakcína proti vírusu mačacej imunodeficience (FIV), vírusu mačacej leukémie (FeLV) alebo mačacej infekčnej peritonitíde (FIP) sú:
Rekombinantný mačací herpesvírus exprimuje tri cudzie gény na FHV gE vypustených miestach. FeLVenv gén je riadený gX promotorom pseudobesnoty; FlVgag gén je riadený bezprostredne predchádzajúcim promotorom cytomegalovírusu; mačací CD80 gén je riadený gE promotorom mačacieho herpesvírusu. Rekombinantný ·· ·· ···· • · • · · · · 9
107 ·· ·· • · ·· · ·· · ·· ·· mačací herpesvírus exprimuje na FHV gE vypustenom mieste tri cudzie gény. FeLVenv gén je riadený gX promotorom pseudobesnoty; FlVgag gén je riadený bezprostredne predchádzajúcim promotorom cytomegalovírusu; mačací CD86 gén je riadený gE promotorom mačacieho herpesvírusu. Rekombinantný mačací herpesvírus exprimuje na FHV gE vypustenom mieste tri cudzie gény. FeLVenv gén je riadený gX promotorom pseudobesnoty; FeLVgag gén je riadený bezprostredne predchádzajúcim promotorom cytomegalovírusu; mačací CD86 gén je riadený gE promotorom mačacieho herpesvírusu.
Rekombinantný mačací herpesvírus exprimuje päť cudzích génov. Mačací CD86 gén a CD80 gén sa exprimujú za riadenia bezprostredne predchádzajúceho promotoru cytomegalovírusu v bicistrónnej kazete, ktorá poháňa transkripciu CD80 a CD86 a medzi dvoma otvorenými čítacími rámcami zahŕňa EMCV IRES prvok; a E. coli uidA gén je riadený gl promotorom vírusu infekčnej laryngotracheitídy. CD80, CD86 a E. coli uidA gén sa inzertujú do unikátnej dlhej oblasti FHV genómu v mieste, ktoré bolo určené ako neesenciálne. FlVgag/proteázový gén je pod kontrolou bezprostredne predchádzajúceho promotoru cytomegalovírusu a E. coli lacZ gén je pod kontrolou gX promotoru pseudobesnoty inzertovaný na FHV gE vypustené miesto.
Rekombinantný mačací herpesvírus exprimuje päť cudzích génov. Mačací CD86 gén a CD80 gén sa exprimujú za riadenia bezprostredne predchádzajúceho promotoru cytomegalovírusu v bicistrónnej kazete, ktorá poháňa transkripciu CD80 a CD86. Transkripcia druhého CD80 otvoreného čítacieho rámca je riadená EMCV IRES prvkom. E. coli uidA gén je riadený gl promotorom vírusu infekčnej laryngotracheitídy. CD80, CD86 a E. coli uidA ·· ···· ·· ·· ·· • · · · • · ·· • · · · « • · · « ·· ··
108 gén sa inzertujú do unikátnej dlhej oblasti FHV genómu v mieste, ktoré bolo určené ako neesenciálne. FlVenv gén je pod kontrolou bezprostredne predchádzajúceho promotoru cytomegalovírusu a E.
coli lacZ gén je pod kontrolou gX promotoru pseudobesnoty inzertovaný na FHV gE vypustené miesto.
Rekombinantný mačací herpesvírus exprimuje šesť cudzích génov. Mačací CD86 gén a CD80 gén sa exprimujú za riadenia bezprostredne predchádzajúceho promotoru cytomegalovírusu v bicistrónnej kazete, ktorá poháňa transkripciu CD80 a CD86 a medzi dvoma otvorenými čítacími rámcami zahŕňa EMCV IRES prvok; a E. coli uidA gén je riadený gl promotorom vírusu infekčnej laryngotracheitídy. CD80, CD86 a E. coli uidA gén sa inzertujú do unikátnej dlhej oblasti FHV genómu v mieste, ktoré bolo určené ako neesenciálne. FlVenv gén je riadený bezprostredne predchádzajúcim promotorom cytomegalovírusu; FlVgag/proteázový gén je pod kontrolou gX promotoru vírusu pseudobesnoty; a E. coli lacZ gén je pod kontrolou FHV gE promotoru inzertovaný na FHV vypustené miesto.
Rekombinantný mačací herpesvírus exprimuje päť cudzích génov. Mačací CD86 gén a CD80 gén sa exprimujú za riadenia bezprostredne predchádzajúceho promotoru cytomegalovírusu v bicistrónnej kazete, ktorá poháňa transkripciu CD80 a CD86 a medzi dvoma otvorenými čítacími rámcami zahŕňa EMCV IRES prvok; a E. coli uidA gén je riadený gl promotorom vírusu infekčnej laryngotracheitídy. CD80, CD86 a E. coli uidA gén sa inzertujú do unikátnej dlhej oblasti FHV genómu v mieste, ktoré bolo určené ako neesenciálne. FeLVgag/proteázový gén je pod kontrolou bezprostredne predchádzajúceho promotoru cytomegalovírusu a E. coli lacZ' gén je pod kontrolou gX promotoru pseudobesnoty inzertovaný na FHV gE vypustené miesto.
·· ····
109 • · • · • · • · ·· ·· ·· ·· • · · · · · · • · ·· · · • · · · · · · • · · · · ·
Rekombinantný mačací herpesvírus exprimuje päť cudzích génov. Mačací CD86 gén a CD80 gén sa exprimujú za riadenia bezprostredne predchádzajúceho promotoru cytomegalovírusu v bicistrónnej kazete, ktorá poháňa transkripciu CD80 a CD86. Transkripcia druhého CD80 otvoreného čítacieho rámca je riadená EMCV IRES prvkom. E. coli uidA gén je riadený gl promotorom vírusu infekčnej laryngotracheitídy. CD80, CD86 a E. coli uidA gén sa inzertujú do unikátnej dlhej oblasti FHV genómu v mieste, ktoré bolo určené ako neesenciálne. FeLVenv gén je pod kontrolou bezprostredne predchádzajúceho promotoru cytomegalovírusu a E. coli lacZ gén je pod kontrolou gX promotoru pseudobesnoty inzerovaný na FHV gE vypustené miesto.
Rekombinantný mačací herpesvírus exprimuje šiesť cudzích génov. Mačací CD86 gén a CD80 gén sa exprimujú za riadenia bezprostredne predchádzajúceho promotoru cytomegalovírusu v bicistrónnej kazete, ktorá poháňa transkripciu CD80 a CD86 a medzi dvoma otvorenými čítacími rámcami zahŕňa EMCV IRES prvok; a E. coli uidA gén je riadený gl promotorom vírusu infekčnej laryngotracheitídy. CD80, CD86 a E. coli uidA gén sa inzertujú do unikátnej dlhej oblasti FHV genómu v mieste, ktoré bolo určené ako neesenciálne. FeLVenv gén je riadený bezprostredne predchádzajúcim promotorom cytomegalovírusu; FeLVgag/proteázový gén je pod kontrolou gX promotoru vírusu pseudobesnoty; a E. coli lacZ gén je pod kontrolou FHV gE promotoru inzertovaný na FHV vypustené miesto.
·· ···· ·· ·· ·· • · · ···· · · · • · 9 · · ·· ·· • · · · · · · · ·· · ·· ·· ·· *
110
Príklad 17
Rekombinantný mačací herpesvírus má deléciu gE génu a inzerciu aspoň jedného cudzieho génu na vypustenom gE mieste. Cudzím génom je mačací CD80 gén, ktorého transkripcia je riadená FHV gE promotorom.
Rekombinantný mačací herpesvírus sa odvodil z S-FHV-001 (NVSL reťazec). Ten sa pripravil pri použití homológneho vektoru 926-76.D7 (pozri odsek Materiály a metód/') a vírusu S-FHV-001 homológnym rekombinantným spôsobom prípravy rekombinantného RPV, SPV alebo FHV. Transfekčná rezervná surovina sa testovala v snahe nájsť rekombinantný herpesvírus exprimujúci enzymatické markérové gény. Tento vírus sa charakterizoval reštrikčným endonukleázovým mapovaním a Southernovým prenosom DNA. Táto analýza potvrdila inzerciu mačacieho CD80 a deléciu 1638bp FIV gE génu. (PCT medzinárodná patentová prihláška WO 96/13575).
Pri tomto rekombinantnom mačacom herpesvíruse sa v tomto teste zisťovala expresia pre mačací CD80 špecifických antigénov pri použití screenu čierneho plaku zisťujúceho expresiu cudzieho génu v rekombinantnom FHV. Tu opísané testy sa vykonávali v CRFK bunkách, čo naznačilo, že tieto SRFK bunky budú vhodným substrátom pre produkciu FHV rekombinantných vakcín.
Pri rekombinantnom mačacom herpesvíruse sa zisťuje expresia pre mačací CD80 špecifických antigénov testovaným pri použití testov s čiernym plakom v snahe nájsť v rekombinantnom SPV, RPV alebo FHV expresiu mačacieho CD80 (B7-1) a CD86 (B7-2). Ukázalo sa, že humánna CTLA-4/Fc chimerická protilátka špecificky reaguje s plakmi rekombinantného mačacieho herpesvírusu (exprimujúcimi mačací CD80) a nie s negatívnymi kontrolnými plakmi SFHV-001.
·· • · · • ·
111 ·· ···· ·» ·· • · · · • · ·· • · · · «· ·9
Rovnako sa ukázalo, že všetky pozorované plaky rekombinantného mačacieho herpesvírusu reagujú s humánnou CTLA-4/Fc chimerickou protilátkou, čo naznačilo, že vírus stabilne exprimuje mačací CD80 cudzí gén.
V snahe potvrdiť expresiu mačacieho CD80 génového produktu, sa bunky infikovali rekombinantným mačacím herpesvírusom podľa tohto príkladu a vzorky infikovaných bunkových lyzátov sa podrobili SDS-polyakrylamidovej gélovej elektroforéze. Gély sa preniesli a analyzovali pri použití Westernového prenosu. Lyzát z buniek infikovaných rekombinantným mačacím herpesvírusom vykazoval pás s očakávanou velkosťou mačacieho CD80 proteínu.
Príklad 18
Rekombinantný mačací herpesvírus má deléciu gE génu a inzerciu aspoň jedného cudzieho génu na gE vypustenom mieste. Cudzím génom je mačací CD86 gén a jeho transkripcia je riadená FHV gE promotorom.
Rekombinantný mačací herpesvírus exprimujúci mačací CD86 je použiteľný ako vakcína proti FIV, FeLV, FIP alebo ďalším mačacím ochoreniam, pokial sa použije samostatne alebo v kombinácii s FIV, FeLV, FIP alebo ďalšou mačacou vakcínou.
Príklad 19
Ďalšími príkladmi rekombinantného mačacieho herpesvírusu použitelnými ako vakcína proti vírusu mačacej imunodeficiencie ·· ···· ·· • · · • ·· • · · • · · ·· ·· ·· ·· ·· • · · • · • · · • · ·· ·
112 (FIV), vírusu mačacej leukémie (FeLV) alebo mačacej vírusovej peritonitídy sú:
Rekombinantný mačací herpesvírus exprimuje tri cudzie gény. FlVenv gén je riadený gX promotorom pseudobesnoty; FIV gag gén je riadený bezprostredne predchádzajúcim promotorom cytomegalovírusu; a mačací CD80 gén je riadený gE promotorom mačacieho herpesvírusu.
Rekombinantný mačací herpesvírus exprimuje tri cudzie gény. FeLVenv gén je riadený gX promotorom pseudobesnoty; FeLV gag gén je riadený bezprostredne predchádzajúcim promotorom cytomegalovírusu; a mačací CD80 gén je riadený gE promotorom mačacieho herpesvírusu.
Rekombinantný mačací herpesvírus exprimuje tri cudzie gény. FlVenv gén je riadený gX promotorom pseudobesnoty; FIV gag gén je riadený bezprostredne predchádzajúcim promotorom cytomegalovírusu; a mačací CD86 gén je riadený gE promotorom mačacieho herpesvírusu.
Rekombinantný mačací herpesvírus exprimuje tri cudzie gény. FeLVenv gén je riadený gX promotorom pseudobesnoty; FeLV gag gén je riadený bezprostredne predchádzajúcim promotorom cytomegalovírusu; a mačací CD86 gén je riadený gE promotorom mačacieho herpesvírusu.
Rekombinantný mačací herpesvírus exprimuje päť cudzích génov. Mačací CD86 gén a CD80 gén sa exprimujú za riadenia bezprostredne predchádzajúceho promotoru cytomegalovírusu v bicistrónnej kazete, ktorá poháňa transkripciu CD80 a CD86 a medzi dvoma otvorenými čítacími rámcami zahŕňa EMCV IRES prvok, ktorý poháňa transláciu druhého downstream génu CD80; a E. coli ·· ·· • · ·· ···· • ·
113 • · • I • · • · • · ·· · • ·· · · · · · • · · · · · ·· ·· uidA gén je riadený gl promotorom vírusu infekčnej laryngotracheitídy; a E. coli lacZ gén je riadený gX promotorom pseudobesnoty. Päť cudzích génov je obsiahnutých v dvoch distinkčných inzertných miestach mačacieho herpesvírusu.
Rekombinantný mačací herpesvírus exprimuje päť cudzích génov. Mačací CD86 gén a CD80 gén sa exprimujú za riadenia bezprostredne predchádzajúceho promotoru cytomegalovírusu v bicistrónnej kazete, ktorá poháňa transkripciu CD80 a CD86. Transkripcia druhého CD80 otvoreného čítacieho rámca je riadená EMCV IRES prvkom. E. coli uidA gén je riadený gl promotorom vírusu infekčnej laryngotracheitídy; FlVenv gén je pod kontrolou bezprostredne predchádzajúceho promotoru cytomegalovírusu; a E. coli lacZ gén je riadený gX promotorom pseudobesnoty.
Rekombinantný mačací herpesvírus exprimuje šesť cudzích génov. Mačací CD86 gén a CD80 gén sa exprimujú za riadenia bezprostredne predchádzajúceho promotoru cytomegalovírusu v bicistrónnej kazete, ktorá poháňa transkripciu CD80 a CD86 a medzi dvoma otvorenými čítacími rámcami zahŕňa EMCV IRES prvok, ktorý poháňa transláciu druhého downstream génu CD80; a E. coli uidA gén je riadený gl promotorom vírusu infekčnej laryngotracheitídy; FlVgag gén je riadený bezprostredne predchádzajúcim promotorom cytomegalovírusu; FlVenv gén je riadený bezprostredne predchádzajúcim promotorom cytomegalovírusu; a E. coli lacZ gén je riadený gX promotorom pseudobesnoty.
Rekombinantný mačací herpesvírus exprimuje päť cudzích génov. Mačací CD86 gén a CD80 gén sa exprimujú za riadenia bezprostredne predchádzajúceho promotoru cytomegalovírusu v bicistrónnej kazete, ktorá poháňa transkripciu CD80 a CD86 a ·· ···· ·· ·· ·· ·· · · · · · · · · ··· · · ·· · · • · · · · · · ·· ·· · ·· ·· ·· ·
114 medzi dvoma otvorenými čítacími rámcami zahŕňa EMCV IRES prvok, ktorý poháňa transláciu druhého downstream génu CD80; a E. coli uidA gén je riadený gl promotorom vírusu infekčnej laryngotracheitídy; FeLVgag gén je riadený bezprostredne predchádzajúcim promotorom cytomegalovírusu; a E. coli lacZ gén je riadený gX promotorom pseudobesnoty. Päť cudzích génov je obsiahnutých v dvoch distinkčných inzertných miestach mačacieho herpesvírusu.
Rekombinantný mačací herpesvírus exprimuje päť cudzích génov. Mačací CD86 gén a CD80 gén sa exprimujú za riadenia bezprostredne predchádzajúceho promotoru cytomegalovírusu v bicistronnej kazete, ktorá poháňa transkripciu CD80 a CD86 a medzi dvoma otvorenými čítacími rámci zahŕňa EMCV IRES prvok, ktorý poháňa transláciu druhého downstream génu CD80; a E. coli uidA gén je riadený gl promotorom vírusu infekčnej laryngotracheitídy; FeLVenv gén je riadený bezprostredne predchádzajúcim promotorom cytomegalovírusu; a E. coli lacZ gén je riadený gX promotorom pseudobesnoty.
Rekombinantný mačací herpesvírus exprimuje šesť cudzích génov. Mačací CD86 gén a CD80 gén sa exprimujú za riadenia bezprostredne predchádzajúceho promotoru cytomegalovírusu v bicistronnej kazete, ktorá poháňa transkripciu CD80 a CD86 a medzi dvoma otvorenými čítacími rámcami zahŕňa EMCV IRES prvok, ktorý poháňa transláciu druhého downstream génu CD80; a E. coli uidA gén je riadený gl promotorom vírusu infekčnej laryngotracheitídy; FlVgag gén je riadený bezprostredne predchádzajúcim promotorom cytomegalovírusu; FlVenv gén je riadený bezprostredne predchádzajúcim promotorom cytomegalovírusu; a E. coli lacZ gén je riadený gX promotorom pseudobesnoty.
·· ···· ·· · ···· ··· t·· · · ·· · · • ·· ·· ·· ·«· · ··· ···· ·· ·· · ·· ·· ·· ·
115
Príklad 20
Charakterizácia mačacej CD80 (B7-1) -TAMU, CD86 (B7-2), CD28, CTLA-4 a CD80 (B7-1) -Syntro/SPAH cDNA a polypeptidov:
Izolovaná a purifikovaná CD80 (B7-1) cDNA s dĺžkou približne 941 nukleotidových kódov pre otvorený čítací rámec mačacieho CD80 polypeptidu s dĺžkou približne 292 aminokyselín, ktorej prirodzená membránou viazaná alebo zrelá forma má molekulovú hmotnosť približne 33 485 kDa, izoelektrický bod približne 9,1, celkový náboj pri pH 7,0 10,24. Transmembránovou doménou proteínu sú aminokyseliny približne 241 až 271.
Mačací CD80-TAMU a mačací CD80-Syntro/SPAH sú cDNA a polypeptidy nezávisle izolované z dvoch rôznych zdrojov a ich aminokyselinové sekvencie sa mierne líšia. Zdrojom CD80-TAMU mRNA boli mačacie jednojadrové bunky periférnej krvi stimulované ConA a zdrojom CD80-Syntro/SPAH RNA boli bunky mačacej sleziny stimulované ConA. Rozdiely medzi cDNA sekvenciou CD80-TAMU a CD80-Syntro/SPAH sú T a C v nukleotide 351 a C a A v nukleotide 670. Zmena v nukleotide 351 je v aminokyselinovej sekvencii tichou zmenou, zatiaľ čo zmena v nukleotide 670 vedie k konzervatívnej zmene neutrálnej aminokyseliny leucínu na izoleucín v aminokyselinovom zvyšku 224.
Izolovaná a purifikovaná CD86 (B7-2) cDNA s dĺžkou približne 1176 nukleotidových kódov pre otvorený čítací rámec mačacieho CD86 polypeptidu s dĺžkou približne 320 aminokyselín, ktorej prirodzená membránou viazaná alebo zrelá forma má molekulovú hmotnosť približne 36 394 kDa, izoelektrický bod približne 9,19, celkový náboj pri pH 7,0 11,27.
116 ·· ···· ·· ·· ·· • · ···· ··· • · · · ·· · ·
Izolovaná a purifikovaná CD28 cDNA s dĺžkou približne 689 nukleotidových kódov pre otvorený čítací rámec mačacieho CD28 polypeptidu s dĺžkou približne 221 aminokyselín, ktorej prirodzená membránou viazaná alebo zrelá forma má molekulovú hmotnosť približne 25 319 kDa, izoelektrický bod približne 9,17, celkový náboj pri pH 7,0 9,58.
Izolovaná a purifikovaná MAČACÍ CTLA-4 cDNA s dĺžkou približne 749 nukleotidových kódov pre otvorený čítací rámec mačacieho CTLA-4 polypeptidu s dĺžkou približne 223aminokyselin, ktorej prirodzená membránou viazaná alebo zrelá forma má molekulovú hmotnosť približne 24 381 kDa, izoelektrický bod približne 6,34, celkový náboj pri pH 7,0 -0,99.
Koexpresia CD80 s kostimulačnými molekulami CD28 alebo CTLA-4 a nádorového antigénu alebo antigénu z patogénneho organizmu má schopnosť aktivovať alebo zvyšovať aktivitu T-lymfocytu, konkrétnejšie The-1 lymfocytov a podporovať rast ďalších bunkových typov. Koexpresia CD80 s kostimulačnou molekulou CTLA-4 má schopnosť potlačiť aktivitu T-lymfocytov, konkrétnejšie The-1 lymfocytov. Koexpresia CD86 s kostimulačnými molekulami CD28 alebo CTLA-4 a nádorového antigénu alebo antigénu z patogénneho organizmu má schopnosť aktivovať alebo zvyšovať aktivitu T-lymfocytu, konkrétnejšie The-1 lymfocytov a podporovať rast ďalších bunkových typov. Koexpresia CD28 s kostimulačnou molekulou CTLA-4 má schopnosť potlačiť aktivitu T-lymfocytov, konkrétnejšie The-1 lymfocytov.
·· ····
117 ·· ·· ·· ·· · · · · · · · · ··· · · ·· · · • · · ···· ·· ·· · ·· ·· ·· ·
DNA Humánna Humánna Myšia Myšia Krá- ličia Kuracia |
a AA homolog. homolog. homolog. homolog. homolog. homolog.
sekvenčná % identita (DNA sekvenčná) % identita (AA sekvenčná) % identita (DNA sekvenčná) % identita (AA sekvenčná) % identita (DNA/AA sekvenčná) % identita (DNA/AA sekvenčná) % identita
Mačací 77 59 62 46 — —
CD80 1 1
Mačací 72 68 — — 67/64 —
CD86
Mačací 85 82 77 74 84/84 59/50
CD28
Mačací 88 88 79 78 — —
CTLA-4
Príklad 21
Použitie CD80 (B7-1), CD86 (B7-2), CD28 a CTLA-4 vo vakcínach
Cieľom nasledujúcich experimentov je zhodnotiť schopnosť CD80, CD86, CD28 a CTLA-4 v mačacích vakcínach zvyšovať imunitu.
Mačací CD80, CD86, CD28 a CTLA-4 sa vkladajú do rekombinantných vírusových vektorov (odvodených z mačacieho herpesvírusu, vírusu kiahní ošípaných alebo vírusu kiahní medvedíkov) použiteľných na expresiu rekombinantných proteínov v tele mačiek (pozri PCT medzinárodnú patentovú prihlášku WO 96/22363 alebo WO 96/13575). Rekombinantný vírusové vektory exprimujúci všetky štyri imunitu-zvyšujúce molekuly alebo • · ·· ···· ·· ·· ·· · · · · · ··· · · ·· · · ·· ·
118 alternatívne exprimujúce párové kombinácie CD80 a CD28 alebo CD80 a CTLA-4, alebo CD86 a CD28 alebo CD86 a CTLA-4 sa podávajú mačkám vo veku 8 týždňov orálne alebo intramuskulárne v dávke 0,1 mg až 10,0 mg/kg telesnej hmotnosti alebo v dávke približne 104 až 109 klak tvoriacich jednotiek (pfu) alebo výhodne v dávke približne 106 pfu. Subjednotková vakcína pre FIV alebo FeLV alebo vakcína vírusového vektoru pre FIV alebo FeLV (pozri hore) sa podáva v minimálnej proteínovej dávke, súčasne s imunituzvyšujúcej mačacej CD80, CD86, CD28 a CTLA-4-vektorovanou vakcínou. O tri až štyri týždne neskoršie sa mačkám podá druhá dávka vakcíny. Mačky sa infikujú virulentným FIV kmeňom (PPR alebo Petaluma) alebo FeLV Rickardovým kmeňom (podaným s metylprednizolónom, ktorý potlačí imunitu u mačiek) v USDA štandardnej dávke a počas nasledujúcich 12 týždňov sa pravidelne vyšetrujú na vývoj virémie. Skupina vakcínovaných mačiek sa podrobila dvanásťtýždennému pozorovaniu, ktoré bolo zamerané na vývoj nádoru spôsobeného FeLV. Počet výskytov ochorenia u mačiek sa porovnal s kontrolnými mačkami, ktorým nebola poskytnutá žiadna vakcína, alebo ktorým bola poskytnutá iba FIV alebo FeLV vakcína bez imunitu-zvyšujúcich molekúl. Výsledky imunologických experimentov boli nasledujúce: u mačiek, ktorým nebola podaná žiadna vakcína a následne boli infikované FeLV alebo FIV, sa objavil viac ako 60% vývoj perzistentnej virémie; mačky vakcínované subjednotkovou FIV alebo FeLV vakcínou a následne infikované, boli chránené zo 75 % pred virémiou; a u mačiek, ktorým bola podaná subjednotková FIV alebo FeLV vakcína a kombinácia imunitu-zvyšujúcej mačacej CD80, CD86, CD28 a CTLA-4 vektorovanej vakcíny a ktoré boli následne infikované, bola zistená 100% ochrana pred virémiou. Ďalším prínosom podania mačacej CD80, CD86, CD28 a CTLA-4 vektorovanej vakcíny je okrem
100% ochrany proti virémii a/alebo tvorby nádoru, dlhé trvanie ····
119 ·· 44 • · · · 4 ·· • ·
4
4 4
4
4 4 4
44
4 imunity (dlhšie ako 1 rok); časný nástup imunity; alebo možnosť primárnej vakcinácie v jednej dávke namiesto dvoch dávok, ktoré v súčasnosti vyžadujú všetky doposial dostupné vakcíny. Mačky vakcínované vírusovo vektorovanými FIV alebo FeLV vakcínami sú chránené pred infekciou podstatne vyššou mierou ako mačky vakcínované subjednôtkovou FIV alebo FeLV vakcínou. Mačky prijímajúce vírusovú vektorovanú FIV alebo FeLV vakcínu a kombináciu imunitu-zvyšujúcej mačacej CD80, CD86, CD28 a CTLA-4vektorovanej vakcíny a následne sú infikované, sú 100% chránené pred virémiou. Pri mačkách vakcínovaných vírusovou vektorovanou FIV alebo FeLV vakcínou a kombináciou imunitu-zvyšujúcej mačacej CD80, CD86, CD28 a CTLA-4-vektorovanej vakcíny sa rovnako prejavili ďalšie hore opísané prínosné aspekty.
Pri alternatívnom postupe sa mačkám vo veku 8 týždňov intramuskulárnou injekciou podalo 100 pg plazmidu obsahujúceho cDNA pre mačacie CD80, CD86, CD28 a CTLA-4 molekuly v zmesi s plazmidom obsahujúcim cDNA pre FlVenv a gag alebo FeLVenv a gag, alebo sa alternatívne týmto mačkám intramuskulárnou injekciou aplikovalo 100 pg plazmidu obsahujúceho cDNA exprimujúcej párové kombinácie CD80 a CD28 alebo CD80 a CTLA-4 alebo CD86 a CD28 alebo CD86 a CTLA-4 spárované s CD28 a CTLA-4 v zmesi s plazmidom obsahujúcom cDNA pre FlVenv a gag alebo FeLVenv a gag. Kontrolné mačky neprijali CD80, CD86, CD28 a CTLA-4. Mačky sa infikovali virulentným FeLV alebo FIV a podrobili sa pozorovaniu, ktoré malo odhaliť príznaky hore opísaných ochorení. Výsledky týchto experimentov s provokačnou injekciou boli nasledujúce: mačky prijímajúce cDNA vektor obsahujúci mačací CD80, CD86, CD28 a CTLA-4 a cDNA vektor obsahujúci FIV gény alebo FeLV gény vykazujú 100% ochranu pred ochorením v porovnaní s mačkami, ktoré prijali
• ·
120 ·· • · · · · · · • · · · · ·· ·· iba cDNA vektor obsahujúci FIV gény alebo FeLV gény a ktoré vykazovali len 75% ochranu pred ochorením.
Pri alternatívnom postupe sa mačkám vo veku 8 týždňov intramuskulárnou injekciou aplikovalo 0,1 mg až 100 mg purifikovaného proteínu pre mačacie CD80, CD86, CD28 a CTLA-4 molekuly alebo alternatívne párových kombinácií CD80 alebo CD86 spárovaných s CD28 alebo CTLA-4 proteínmi z hore opísaných rekombinantných cDNA vektorov a opäť intramuskulárnou injekciou aplikovalo 0,1 mg až 100 mg subjednôtkovej vakcíny obsahujúcej FlVenv a gag alebo FeLVenv a gag. Kontrolné mačky neprijali CD80, CD86, CD28 a CTLA-4. Mačky sa infikovali virulentným FIV kmeňom alebo FeLV kmeňom a podrobili sa pravidelným pozorovaniam zameraným na vývoj ochorenia. Výsledky experimentov s provokačnou injekciou boli nasledujúce: mačky prijímajúce purifikovaný protein pre mačací CD80, CD86, CD28 a CTLA-4 a subjednotkovú vakcínu obsahujúcu FIV a FeLV vykazujú podstatne nižší počet výskytu ochorenia v porovnaní s mačkami, ktoré prijímali len subjednotkovú vakcínu obsahujúcu FIV a FeLV proteíny.
Príklad 22
Použitie mačacieho CD80, CD86, CD28 a CTLA-4 ako profylaktické vakcíny na ochranu pred ochorením
Mačacie CD80, CD86, CD28 a CTLA-4 vo vírusovom vektore rekombinantného vírusu kiahní ošípaných, rekombinantného vírusu kiahní medvedíkov alebo rekombinantného mačacieho herpesvírusu, pokial sa podajú, ako opisuje príklad 17 ale bez podania subjednotkových alebo vírusových vektorovaných antigénov z patogénnych organizmov, sú použitelné na stimuláciu imunity a ·· ····
121
The-1 odozvy, ktorá vyvolá ochrannú imunitnú odozvu, pokiaľ sú napadnuté vírusovým parazitickým alebo bakteriálnym patogénom. Pri alternatívnom postupe sú mačacie CD80, CD86 v kombinácii s mačacím CTLA-4 vo vírusových vektoroch, pokial sa podajú spôsobom opísaným v príklade 3, použiteľné na potlačenie imunitnej odozvy a pri ochrane proti autoimunitným ochoreniam u mačiek.
Príklad 23
Použitie mačacieho CD80, CD86, CD28 a CTLA-4 na inhibíciu a ničenie rastu nádorových buniek
Nádorové bunky odberané z tela mačky sa transfektovali vírusovým vektorom rekombinantného vírusu kiahní ošípaných, rekombinantného vírusu kiahní medvedíkov alebo rekombinantného mačacieho herpesvírusu exprimujúcim mačací CD80 alebo CD86 v kombinácii s CD28 alebo CTLA-4. Transfektované nádorové bunky sa podali mačke a prítomnosť CD80, CD86, CD28 a CTLA-4 na povrchu nádorovej bunky vyvolala širokú imunologickú odozvu na transfektované a netransfektované nádorové bunky, ktorá spôsobila usmrtenie lokalizovaných a metastatických nádorových buniek. Pri alternatívnom postupe sú priamo do nádoru, ktorý sa nachádza v tele mačky, indikované vektory exprimujúce mačací CD80 alebo CD86 v kombinácii s CD28 alebo CTLA-4, čo vyvolalo širokú imunologickú odozvu na nádorové bunky, ktorá spôsobila usmrtenie lokalizovaných a metastatických nádorových buniek.
·· ·· ·· • · · · · · · • · ·· · · ·· ·· · · · · • · · · · · ·· ··· • · • · • · · • · · ·· ·
122
Príklad 24
Použitie mačacieho CD80, CD86, CD28 a CTLA-4 ako terapeutického činidla na liečenie ochorení mačiek
Mačacie CD80, CD86, CD28 a CTLA-4 vo vírusovom vektore rekombinantného vírusu kiahní ošípaných, rekombinantného vírusu kiahní medvedíkov alebo rekombinantného mačacieho herpesvírusu, pokial sa podajú, ako opisuje príklad 17 ale bez podania subjednotkových alebo vírusových vektorovaných antigénov z patogénnych organizmov, sú použiteľné pri stimulácii imunity vedúcej k úplnej eliminácii alebo aspoň redukcii patologickej úrovne ochorení.
Experimentálne údaje: SPV 246
Bezpečnosť a účinnosť rekombinantnej vírusovej vektorovanej SPV vakcíny obsahujúcej FeLV gag a env a mačací CD80
Konštrukcia rekombinantného SPV vírusu, SPV 246, bola opísaná hore. SPV 246 obsahuje päť cudzích génov zahŕňajúcich gény kódujúce FeLV gag a env a mačací CD80 a ako dva markérové gény β-glukuronidázu a β-galaktozidázu. Expresia FeLV gag a env a CD80 v bunkách infikovaných SPV 246 sa potvrdila analýzou Westernového prenosu. Pásy reprezentujúce špecifický FeLV gag a env proteíny sa detekovali pomocou kozej polyklonálnej protilátky proti FeLV P27 (Biodesign, ΜΕ) , resp. monoklonálnej protilátky proti FeLV gp70 (Biodesign, ME) . Ukázalo sa, že FeLV gag a env proteíny sa posttranslačne spracovávajú podobne ako natívne vírusové proteíny. Na analýzu čistoty, expresie a stability sa použil test s čiernym plakom a hore opísané protilátky. SPV 246 ·· ···· ·· ·· ·· • · · · · · · · · · • · · 9 9·· · · ··· ···· ·· ·· · ·· ·· ·· ·
123 bol po aspoň piatich pasážach stabilný. 100% plaky generované z buniek infikovaných SPV 246 boli pozitívne pre FeLVgag, env, βgalaktozidázu a β-glukuronidázu.
Expresia mačacieho CD80 sa potvrdila analýzou Westernového prenosu pri použití polyklonálnej anti-humánnej CD80 protilátky. Detekovala sa množina pásov dosahujúcich veľkosti od 30 kDa do 60 kDa, ktoré sú špecifické pre mačací CD80. Tieto pásy predstavujú striedavé vzory CD80 s množinou glykozylácií exprimovaného a modifikovaného v kontexte SPV a ESK-4 buniek.
SPV 246 a kontrolný vírus SPV 003 a rovnako tak ďalší rekombinantný FHV a SPV FeLV vakcíny sa testovali, či sú schopné chrániť mačky proti perzistentnej infekcii. Test sa vykonával v krátkosti nasledujúcim spôsobom. Osem týždňov staré mačky (10 mačiek v skupine) sa subkutánne vakcínovalo 1 ml SPV 246, kontrolným vírusom alebo ďalšími rekombinantnými vírusmi (dávky sa pohybovali v rozmedzí od 7xl05 pfu/mačku do lxlO7 pfu/mačku. Mačky sa vakcínovali trikrát v týždenných odstupoch. Po vakcinácii sa mačky infikovali oro-nazálnou cestou Rickardovým FeLV štandardním čelendž kmeňom (lO6'2TCID5o/ml/mačku) , po predchádzajúcom ošetrení metylprednizolónacetátom (Depo-Medrol).
Sérum z tela mačiek sa raz týždne počas 15 týždňov po aplikácii provokačnej injekcie analyzovalo na perzistentnú virémiu. Po pozitívnom testovaní na prítomnosť FeLV p27 počas 3 nasledujúcich týždňov sa posudzovalo, či sú mačky perzistentne vírusomické.
Výsledky:
Mačky vakcínované SPV 246 boli čiastočne chránené pred FeLV virémiou v FeLV čelendž štúdii. Predpokladanou chránitelnou ·· ····
124 ·· ·· ·· • · · ···· · · · ··· ···· * · • 9 · · · · · ·· ·· · ·· ·· ·· * frakčnou (PF) hodnotou pre mačky ošetrené SPV 246 bola 50% hodnota (Tabulka 1).
Tabuľka 1: Počet a percento mačiek s perzistentnou virémiou 15 týždňov po aplikácii provokačnej injekcie. Predpokladaná chránitelná frakcia (PF) pre každú skupinu sa vyrátala.
Sku- pina č. VIR (vírusy) počet mačiek s perzistentnou virémiou % mačiek s perzistentnou virémiou PF (%C-%V) %C
1 FHV 018 (CMV-FeLVenv) FHV 019 (CMV-FeLVgag) 7/10 70% -16%
2 FHV 018 (CMV-FeLVenv) FHV 019 (CMV-FeLVgag) FHV 030 (gE-CD80) 6/10 60 0%
3 FHV 018 (CMV-FeLVenv) FHV 019 (CMV-FeLVgag) FHV 022 (L2E2-CD80) 7/10 70 -16%
4 SPV 089 (L2E2FeLVgag) SPV 195 (ElFeLVenv) FHV 030 (gECD80) 5/10 50 16%
5 SPV 246 (E2- FeLVgag/E- lFelVenv//L2E2-CD80) 3/10 30 50%
6 (SC) SPV 258 (L2E2- FeLVgag/L2E2- FeLVgp70) 5/10 50 16%
7 (IM) SPV 258 (L2E2- FeLVgag/L2E2- FeLVgp70) 6/10 60 0
8 SPV 003, FHV 005 6/10 60% 0
·· ···· ·· ·
125 ·· ·· ·· • ··
Príklady ďalších rekombinantných vírusov obsahujúcich CD80 a CD86
SPV 280
SPV 280 je rekombinantný vírus kiahní ošípaných exprimujúci šesť cudzích génov. Homológny vektor označený ako 992-23.6 sa skonštruoval nasledujúcim spôsobom: Mačací CD86 gén a CD80 gén sa exprimovali v bicistrónnej DNA kazete za riadenia syntetického neskorého kiahňového promotoru LP1, ktorá poháňa transkripciu CD80 a CD86 a zahŕňa EMCV IRES prvok medzi dvoma otvorenými čítacími rámcami; E. coli β-glukuronidázový gén je riadený syntetickým skorým promotorom EP2. SPV 280 sa odvodil z SPV 258, ktorý obsahuje gény pre FeLVgag a env a β-galaktozidázu. SPV 258 sa najskôr spracoval tak, aby obsahoval FeLV gag/proteázové gény a zostrihom upravený FeLV env (gp70) gén sa za riadenia syntetických skorých/neskorých kiahňových promotorov LP2EP2; E. coli β-galaktozidázový gén sa pod riadením konštitutívneho I5L kiahňového promotoru inzertujú do vypusteného 1869bp parciálneho HindlII N fragmentu. CD80/CD86 a E. coli β-glukuronidázový gén sa klonovali do homológneho vektoru 992-23.6 v distinkčnom a neesenciálnom SPV parciálnom HindlII K fragmente.
SPV 280 sa odvodil z SPV 258. Pripravil sa pri použití homológneho vektoru 992-23.6 a vírusu S-SPV-258 homologickým rekombinantným postupom na generovanie rekombinantného RPV, SPV alebo FHV. Transfekčná rezervná surovina sa testovala s cielom nájsť rekombinantný SPV exprimujúci β-galaktozidázu (Bluogal a CPRG testy) alebo β-glukuronidázu (X-gluc test). Konečným výsledkom niekoľkých kôl purifikácie modro/zeleného plaku bol rekombinantný vírus označený ako SPV 280.
·· ···· ··
126 • · · • i · • · · ·· · ·· • · · · • · ·· ·· • · · • · • · · · · · ·· ·· ·· ·
Pri S-SPV-229 víruse sa vykonala analýza na expresiu FeLVgag, FeLVenv a markérových génov β-galaktozidázy a βglukuronidázy analýzou s čiernym plakom. Pri použití kozej polyklonálnej protilátky pre FeLVgag (Biodesign, ME) a myšej monoklonálnej protilátky pre FeLVenv gp70 (Biodesign, ME) sa zistilo, že 100 % plakov generovaných z ESK-4 buniek infikovaných purifikovaným SPV 280 exprimuje FeLVgag a FeLVenv.
Expresia mačacieho CD80 a CD86 sa potvrdila pomocou analýzy Westernového prenosu pri použití kozej polyklonálnej antihumánnej CD80 resp. CD86 protilátky (R&D Systems, MN). Detekovala sa množina pásov v rozmedzí veľkostí od 30 kDa do 60 kDa špecifických pre mačací CD80 a množina pásov v rozmedzí veľkostí od 40 kDa do 70 kDa špecifických pre mačací CD86. Tieto pásy predstavujú striedavé vzory CD80 a CD86 s množinou glykozylácií exprimovaných v kontexte SPV a ESK-4 buniek.
SPV 281
SPV 281 je rekombinantný vírus kiahní ošípaných exprimujúci šesť cudzích génov. Homológny vektor označený ako 992-23.6 sa skonštruoval spôsobom opísaným pre SPV 280. SPV 281 sa odvodil z SPV 228, ktorý obsahuje gény pre FlVgag a env a β-galaktozidázu. FIV gag/proteázový gén sa riadil syntetickým kiahňovým skorým promotorom EP2; FlVenv gén sa riadil syntetickým kiahňovým skorým promotorom EP1; a E. coli β-galaktozidázový gén sa riadil konštitutívnym I5L kiahňovým promotorom. FlVgag/proteáza, env a E. coli β-galaktozidáza sa inzertovali do vypusteného 1869bp parciálneho Hindlll N fragmentu. CD80/CD86 a E. coli β·· ···· ·· · ···· ··· ··· ···· · · • · · ···· ·· ·· · ·· ·· ·· ·
127 glukuronidázový gén sa inzertovali do distinkčného a neesenciálneho SPV parciálnym HindlII K fragmentu.
SPV 281 sa odvodil z SPV 228. Pripravil sa pri použití homológneho vektoru 992-23.6 a vírusu S-SPV-228 homologickým rekombinantným postupom na generovanie rekombinantného RPV, SPV alebo FHV. Transfekčná rezervná surovina sa testovala s cielom nájsť rekombinantný SPV exprimujúci β-galaktozidázu (Bluogal a CPRG testy) alebo β-glukuronidázu (X-gluc test). Konečným výsledkom niekoľkých kôl purifikácie modro/zeleného plaku bol rekombinantný vírus označený ako SPV 281.
Pri SPV 281 sa vykonala analýza na expresiu FlVgag, FlVenv a markérových génov β-galaktozidázy a β-glukuronidázy analýzou s čiernym plakom. Pri použití myších monoklonálnych protilátok pre FlVgag (p27) a FlVenv (gplOO) (Custom Monoclonals, CA; resp. BioDesign International, ME) myšej monoklonálnej protilátky pre β-galaktozidázu a králičie polyklonálne protilátky pre βglukuronidázu (Biodesign, ME; resp. Molecular Probes, OR) sa zistilo, že 100 % plakov generovaných z ESK-4 buniek infikovaných purifikovaným SPV 281 exprimuje FlVgag a FlVenv.
Expresia mačacieho CD80 a CD86 sa potvrdila pomocou analýzy Westernového prenosu pri použití polyklonálnej anti-humánnej CD80 resp. CD86 protilátky (R&D Systems, MN) . Detekovala sa množina pásov v rozmedzí veľkostí od 30 kDa do 60 kDa špecifických pre mačací CD80 a množina pásov v rozmedzí velkosti od 40 kDa do 70 kDa špecifických pre mačací CD86. Tieto pásy predstavujú striedavé vzory CD80 a CD86 s množinou glykozylácií exprimovaných v kontexte SPV a ESK-4 buniek. FlVgag a env expresia sa rovnako potvrdila analýzou Westernového prenosu pri použití hore ·· ···· ·· ·· ·· • · · ···· ··· ··· ···· · · ··· · · · · ·· ·· · ·· ·· ·· ·
128 opísaných protilátok. Ukázalo sa, že FlVgag a env sú spracované do P24, resp. gp 100.
FHV 043
FHV 043 je rekombinantný mačací herpesvírus exprimujúci päť cudzích génov. Homológny vektor označený ako 987-57.Al sa skonštruoval nasledujúcim spôsobom: mačací CD86 a CD80 gén sa pod kontrolou bezprostredne predchádzajúceho promotoru cytomegalovírusu (CMV IE) klonovali do bicistrónnej kazety, ktorá poháňa transkripciu CD80 a CD86. Transkripciu druhého downstream CD80 otvoreného čítacieho rámca riadil EMCV IRES prvok. E. coli β-glukuronidázový gén je riadený gl promotorom infekčného vírusu laryngotracheitídy. CD80, CD86 a E. coli β-glukuronidázový gén sa inzertovali do FHV unikátnej dlhej oblasti v unikátnom EcoRI mieste odvodenom z parciálneho Sali H fragmentu FHV. Inzercia bola medzi gL a susednými transkripčné aktivačnými génmi.
FHV 043 sa odvodil z FHV 017, ktorý obsahuje gény pre FlVenv a E. coli β-galaktozidázu. FlVenv gén sa riadil CMV IE promotorom; a E. coli β-galaktozidázový gén sa riadil gX promotorovým prvkom pseudobesnoty. FlVenv a E. coli βgalaktozidáza sa inzertovali do FHV US gE vypusteného miesta.
FHV 043 sa odvodil z FHV 017. Pripravil sa pri použití homológneho vektoru 987-57.Al a vírusu FHV 017 homologickým rekombinantným postupom na generovanie rekombinantného RPV, SPV alebo FHV. Transfekčné rezervné suroviny sa testovali s cieľom nájsť rekombinantný SPV exprimujúci β-galaktozidázu (Bluogal a CPRG testy) alebo β-glukuronidázu (X-gluc test). Konečným ·· ···· ·· ·· ·· ·· · · · · · · · · • t · · · ·· · · • ·· · · · · · · i · ··· ···· · · ·· · ·· ·· ·· ·
129 výsledkom niekolkých kôl purifikácie modro/zeleného plaku bol rekombinantný vírus označený ako FHV 043.
Pri FHV 043 sa vykonala analýza na expresiu markérových génov β-galaktozidázy a β-glukuronidázy analýzou s čiernym plakom. Pri použití myšej monoklonálnej protilátky pre βgalaktozidázu (Biodesign, ME) a králičej polyklonálnej protilátky pre β-glukuronidázu (Molecular Probes, OR) sa zistilo, že 100 % plakov generovaných z CRFK buniek infikovaných plakom
purifikovaným FHV 043 exprimuje β-galaktozidázu a β-
glukuronidázu. Tento vírus bol po aspoň piatich pasážach
stabilný.
Expresia mačacieho CD80 a CD86 sa potvrdila pomocou analýzy
Westernového prenosu pri použití polyklonálnej anti-humánnej CD80 resp. CD86 protilátky (R&D Systems, MN) . Detekovala sa množina pásov v rozmedzí velkosti od 30 kDa do 60 kDa špecifických pre mačací CD80 a množina pásov v rozmedzí velkosti od 40 kDa do 70 kDa špecifických pre mačací CD86. FlVenv (gpl30) expresia sa rovnako potvrdila analýzou Westernového prenosu pri použití séra zotavenej FIV infikovanej mačky.
Homológny vektor 1015-18.8A (LP1-CD86/IRES-CD80):
Na vytvorenie rekombinantného RPV vírusu exprimujúceho CD80 a CD86 sa použil homológny vektor 1015-18.8A: Skonštruoval sa plazmid obsahujúci kiahňový LP1 promotor, EMCV IRES prvok a kiahňový polyA transkripčný terminátor. Mačací CD80 gén sa PCR amplifikovals prajmermi 1/97.6 (5'-GCTAGGATCCAATCTATGTAGACAGGTGAGAT-3') a 3/98.4 (5'-TCGAGGATCCGGGTCACGCAGCAAAGTGG-3'), pričom obidva prajmery obsahovaly BamHI klonovacie miesta. CD80 sa • a ···· • · • · • · • a ·· a· aa ·· • · · · · · · • a ·· · · • · o a a a · β a a a a a · • a aa ·· ·
130 klonoval za LP1 promotorom. Mačací CD86 gén sa PCR amplifikoval s prajmermi 1/98.18 (5'-TCGACAATTGGATGGGCATTTGTGACAG-3') s Mfel klonovacím miestom a so zostrihom upraveným 8/97.31 (5'GTGGATCCAGGATCCGGAGCGG-3')· CD86 sa klonoval za EMCV IRES prvkom. Kazeta sa následne digerovala Notl a za riadenia syntetického neskorého promotoru I5L sa klonovala do RPV Hindlll N vektoru obsahujúceho E. coli β-galaktozidázový gén. Finálny homológny vektor 1015-18.8A sa použil na prípravu vírusov obsahujúcich FIV alebo FeLV génov a CD80 a CD86 pomocou homológneho rekombinantného postupu na generovanie rekombinantného RPV.
S-RPV-045
S-RPV-045 je rekombinantný vírus kiahní medvedíkov exprimujúci tri cudzie gény. S-RPV-045 sa odvodil z vírusu kiahní medvedíkov RPV-000 (ATCC VR-838). Pripravil sa pri použití homológneho vektoru 1015-18.8A a parentálneho vírusu S-RPV-000 homologickým rekombinantným postupom na prípravu rekombinantného RPV. Transfektovaná rezervné suroviny sa testovali v snahe nájsť rekombinant pri použití screenu vyhľadávajúceho rekombinantný RPV exprimujúci β-galaktozidázu (BLUO-GAL testy a screen na rekombinantný RPV exprimujúci enzymatické markérové gény). Vírus sa purifikoval plakom a podrobil piatim pasážam.
Pri použití testu s čiernym plakom sa pri RPV-045 analyzovala expresia β-galaktozidázy. Pri použití králičej polyklonálnej protilátky (ICN, OH) sa ukázalo, že 100 % plakov generovaných z VERO buniek infikovaných purifikovaným RPV-045 exprimuje β-galaktozidázu.
·· ·· ···· • · · • · · • · · ·· · ·· ·· • · · · « · • · ·· · · • · · · · · ·· ·· ··
131
Analýza Westernového prenosu potvrdila expresiu CD80 a CD86 pri použití kozích polyklonálnych anti-humánnych CD80, resp. CD86 protilátok (R&D Systems, MN) . Detekovala sa množina pásov v rozmedzí veľkostí od 30kDa do 60kDa špecifických pre mačací CD80 a množina pásov v rozmedzí veľkostí od 40 kDa do 70 kDa špecifických pre mačací CD86. FlVenv (gpl30) expresia sa rovnako potvrdila analýzou Westernového prenosu pri použití séra zotavenej FIV infikovanej mačky. Tieto pásy predstavujú striedavé vzory CD80 a CD86 s množinou glykozylácií exprimovaného v kontexte RPV vo VERO bunkách.
S-RPV-046
RPV-046 je rekombinantný vírus kiahní medvedíkov exprimujúci päť cudzích génov. RPV-046 sa odvodil z vírusu kiahní medvedíkov RPV-036. Pripravil sa pri použití homológneho vektoru 1015-18.8A a parentálneho vírusu RPV-036 homologickým rekombinantným postupom na prípravu rekombinantného RPV. Transfektované rezervné suroviny sa testovali v snahe nájsť rekombinant pri použití screenu vyhľadávajúceho rekombinantný RPV exprimujúci βgalaktozidázu (BLUO-GAL testy a screen na rekombinantný RPV exprimujúci enzymatické markérové gény). Vírus sa purifikoval plakom a podrobil piatim pasážam. Finálnym výsledkom viacerých kôl purifikácie modro/zeleného plaku bol rekombinantný vírus RPV 046. RPV 046 obsahuje FlVgag gén riadený syntetickým skorým/neskorým kiahňovým promotorom LP2EP2 a β-glukuronidázový gén riadený syntetickým skorým kiahňovým promotorom EP2. Tieto gény sú obsiahnuté v distinkčnom a neesenciálnom parciálnom RPV Hindlll U mieste. CD80 a CD86 gény a β-galaktozidáza sú ·· ·· • · · ···· ··· ··· ···· · · ·· ···· ·· • · · · · · · ·· ·· · ·· ·· ··
132 obsiahnuté v unikátnom a distinkčnom neesenciálnom parciálnom RPV Hindlll N mieste.
Pri PV-046 sa vykonala analýza na expresiu β-galaktozidázy a β-glukuronidázy analýzou s čiernym plakom. Ukázalo sa, že 100 % plakov generovaných z VERO buniek infikovaných purifikovaným RPV-046 exprimuje β-galaktozidázu a β-glukuronidázu.
Expresia mačacieho CD80 a CD86 sa potvrdila pomocou analýzy Westernového prenosu pri použití kozej polyklonálnej antihumánnej CD80 resp. CD86 protilátky (R&D Systems, MN). Detekovala sa množina pásov v rozmedzí veľkostí od 30kDa do 60kDa špecifických pre mačací CD80 a množina pásov v rozmedzí veľkostí od 40 kDa do 70 kDa špecifických pre mačací CD86. Tieto pásy predstavujú striedavé vzory CD80 a CD86 s množinou glykozylácií exprimovaných v kontexte RPV vo VERO bunkách. FlVgag/proteázová expresia sa rovnako potvrdila analýzou Westernového prenosu pri použití myších monoklonálnych protilátok pre FlVgag (p27) (Custom Monoclonals, CA).
S-RPV-047
RPV-047 je vírus kiahní medvedíkov exprimujúci päť cudzích génov. Hore opísaným spôsobom sa skonštruoval homológny vektor 1015-18.8A, ktorý obsahoval LP1-CD86/IRES-CD80 kazetu a E. coli β-galaktozidázový gén riadený syntetickým neskorým promotorom I5L v Hindlll N fragmente. RPV-047 sa odvodil z RPV-044, ktorý obsahuje gény pre FlVenv a E. coli β-glukuronidázu v RPV Hindlll U fragmente. FlVenv Gén je riadený syntetickým skorým promotorom EP1. β-glukuronidázový gén je riadený syntetickým neskorým promotorom LP1.
·· ···· • · · • · ·
133 ·· ·· • · · · • · ·· • · · ·· · • · · · ·· ··
RPV-047 sa odvodil z vírusu kiahní medvedíkov RPV-044. Pripravil sa pri použití homológneho vektoru 1015-18.8A a parentálneho vírusu RPV-044 homologickým rekombinantným postupom na prípravu rekombinantného RPV. Transfektované rezervné suroviny sa testovali v snahe nájsť rekombinant pri použití screenu vyhľadávajúceho rekombinantný RPV exprimujúci β-galaktozidázu (BLUO-GAL testy a screen na rekombinantný RPV exprimujúci enzymatické markérové gény). Vírus sa purifikoval plakom a podrobil piatim pasážam. Finálnym výsledkom viacerých kôl purifikácie modro/zeleného plaku bol rekombinantný vírus RPV 047.
Pri RPV-047 sa vykonala analýza na expresiu β-galaktozidázy analýzou s čiernym plakom. Pri použití králičej polyklonálnej protilátky (ICN, OH) sa zistilo, že 100 % plakuov generovaných z VERO buniek infikovaných purifikovaným RPV-047 exprimuje β-galaktozidázu.
Expresia mačacieho CD80 a CD86 sa potvrdila pomocou analýzy Westernového prenosu pri použití kozej polyklonálnej antihumánnej CD80 resp. CD86 protilátky (R&D Systems, MN). Detekovala sa množina pásov v rozmedzí veľkostí od 30kDa do 60kDa špecifických pre mačací CD80 a množina pásov v rozmedzí veľkostí od 40 kDa do 70 kDa špecifických pre mačací CD86. Tieto pásy predstavujú striedavé vzory CD80 a CD86 s množinou glykozylácii exprimovaných v kontexte RPV vo VERO bunkách. FlVenv expresia sa rovnako potvrdila analýzou Westernového prenosu pri použití myších monoklonálnych protilátok pre FlVenv (gplOO) (BioDesign International, ME).
134 ·· ·· ·· • · · · · · · • · ·· · · • · · ·· · • · · · · · ·· ·· ··
S-RPV-048
RPV-048 je vírus kiahní medvedíkov exprimujúci päť cudzích génov. Hore opísaným spôsobom sa skonštruoval homológny vektor 1015-18.8A, ktorý obsahoval LP1-CD86/IRES-CD80 kazetu a E. coli β-galaktozidázový gén riadený syntetickým neskorým promotorom I5L v HindlII N fragmente. RPV-048 sa odvodil z RPV-038, ktorý obsahuje gény pre FlVgag/proteázu a E. coli β-glukuronidázu v RPV HindlII U fragmente. FlVgag/proteázový gén je riadený syntetickým neskorým/skorým promotorom LP2EP2. β-glukuronidázový gén je riadený syntetickým neskorým promotorom LP1.
RPV-048 sa odvodil z vírusu kiahní medvedíkov RPV-038. Pripravil sa pri použití homológneho vektoru 1015-18.8A a parentálneho vírusu RPV-038 homologickým rekombinantným postupom na prípravu rekombinantného RPV. Transfektované rezervné suroviny sa testovali v snahe nájsť rekombinant pri použití screenu vyhladávajúceho rekombinantný RPV exprimujúci β-galaktozidázu (BLUO-GAL testy a screen na rekombinantný RPV exprimujúci enzymatické markérové gény). Vírus sa purifikoval plakom a podrobil piatim pasážam. Finálnym výsledkom viacerých kôl purifikácie modro/zeleného plaku bol rekombinantný vírus RPV 048.
Pri RPV-048 sa vykonala analýza na expresiu β-galaktozidázy analýzou s čiernym plakom. Pri použití králičej polyklonálnej protilátky (ICN, OH) sa zistilo, že 100 % plakov generovaných z VERO buniek infikovaných purifikovaným RPV-048 exprimuje β-galaktozidázu.
Expresia mačacieho CD80 a CD86 sa potvrdila pomocou analýzy
Westernového prenosu pri použití kozej polyklonálnej antihumánnej CD80 resp. CD86 protilátky (R&D Systems, MN). Detekovala ·· ···· • · • · ··· · · · · ·· ·· · ·· ·· ··
135 sa množina pásov v rozmedzí veľkostí od 30kDa do 60kDa špecifických pre mačací CD80 a množina pásov v rozmedzí veľkostí od 40 kDa do 70 kDa špecifických pre mačací CD86. Tieto pásy predstavujú striedavé vzory CD80 a CD86 s množinou glykozylácií exprimovaných v kontexte RPV vo VERO bunkách. FlVgag/proteázová expresia sa rovnako potvrdila analýzou Westernového prenosu pri použití králičích monoklonálnych protilátok pre FlVgag (p27) (BioDesign International, ME).
S-RPV-052
RPV-052 je vírus kiahní medvedíkov exprimujúci šesť cudzích génov. Hore opísaným spôsobom sa skonštruoval homológny vektor 1015-18.8A, ktorý obsahoval LP1-CD86/IRES-CD80 kazetu a E. coli β-galaktozidázový gén riadený syntetickým neskorým promotorom I5L v Hindlll N fragmente. RPV-052 sa odvodil z RPV-030, ktorý obsahuje gény pre FeLVgag/proteázu, FeLVenv a E. coli β-glukuronidázu v RPV Hindlll U fragmentu. FeLVgag/proteázový gén je riadený syntetickým skorým promotorom EP2. FeLVenv gén je riadený syntetickým skorým promotorom EP1. β-glukuronidázový gén je riadený syntetickým neskorým promotorom LP1.
RPV-052 sa odvodil z vírusu kiahní medvedíkov RPV-030. Pripravil sa pri použití homológneho vektoru 1015-18.8A a parentálneho vírusu RPV-030 homologickým rekombinantným postupom nao prípravu rekombinantného RPV. Transfektované rezervné suroviny sa testovali v snahe nájsť rekombinant pri použití screenu vyhľadávajúceho rekombinantný RPV exprimujúci βgalaktozidázu (BLUO-GAL testy a screen na rekombinantný RPV exprimujúci enzymatické markérové gény). Vírus sa purifikoval ·· ···· ·· ·· ·· • · · ···· ··· ··· · · ·· · · ··· · · · · · ·· · ·· ·· ··
136 plakom a podrobil piatim pasážam. Finálnym výsledkom viacerých kôl purifikácie modro/zeleného plaku bol rekombinantný vírus RPV 052.
Pri RPV-052 sa vykonala analýza na expresiu β-galaktozidázy, β-glukuronidázy, FeLVgag a FeLVenv analýzou s čiernym plakom. Analýza Westernového prenosu vykonávaná pri použití kozej polyklonálnej anti-humánnej protilátky CD80, resp. CD86 (R&D Systems, MN) potvrdila expresiu CD80 a CD86. FeLVgag/proteázová a FeLVenv env expresia sa rovnako potvrdila analýzou Westernového prenosu pri použití králičích polyklonálnych protilátok pre FeLVgag (p27) (BioDesign International, ME) a myšej monoklonálnej protilátky pre FeLVenv (gplOO) (BioDesign International, ME).
S-RPV-053
RPV-053 je vírus kiahní medvedíkov exprimujúci šesť cudzích génov. Hore opísaným spôsobom sa skonštruoval homológny vektor 1015-18.8A, ktorý obsahoval LP1-CD86/IRES-CD80 kazetu a E. coli ä-galaktozidázový gén riadený syntetickým neskorým promotorom I5L v Hindlll N fragmente. RPV-053 sa odvodil z RPV-034, ktorý obsahuje gény pre FlVgag/proteázu, FlVenv a E. coli βglukuronidázu v RPV Hindlll U fragmente. FlVgag/proteázový gén je riadený syntetickým skorým promotorom EP2. FlVenv gén je riadený syntetickým skorým promotorom EPI. β-glukuronidázový gén je riadený syntetickým neskorým promotorom LP1.
RPV-053 sa odvodil z vírusu kiahní medvedíkov RPV-034.
Pripravil sa pri použití homológneho vektoru 1015-18.8A a parentálneho vírusu RPV-034 homologickým rekombinantným postupom na prípravu rekombinantného RPV. Transfektované rezervné suroviny ·· ···· ·· ·· ·· • · · · · · · · · · ·· · · ·· · · ··· · · · · · · ·· · ·· ·· ··
137 sa testovali v snahe nájsť rekombinant pri použití screenu vyhľadávajúceho rekombinantný RPV exprimujúci β-galaktozidázu (BLUO-GAL testy a screen na rekombinantný RPV exprimujúci enzymatické markérové gény). Vírus sa purifikoval plakom a podrobil piatim pasážam. Finálnym výsledkom viacerých kôl purifikácie modro/zeleného plaku bol rekombinantný vírus RPV 053.
S-SPV-275
S-SPV-275 je rekombinantný vírus kiahní ošípaných exprimujúci päť cudzích génov. Homológny vektor označený ako 99223.6 sa skonštruoval nasledujúcim spôsobom: Mačací CD86 gén a CD80 gén sa exprimovali v bicistrónnej DNA kazete za riadenia syntetického neskorého kiahňového promotoru LP1, ktorá poháňa transkripciu CD80 a CD86 a zahŕňa EMCV IRES prvok medzi dvoma otvorenými čítacími rámcami. E. coli β-glukuronidázový gén je riadený syntetickým kiahňovým skorým promotorom EP2. Ako parentálny vírus sa použil S-SPV-046, ktorý obsahuje gén pr FlVgag/proteázu riadený syntetickým skorým/neskorým kiahňovým promotorom LP2EP2; a E. coli β-galaktozidázový gén riadený konštitutívnym kiahňovým promotorom O1L.FlVgag/proteázový a β-galaktozidázový gén sa inzertujú do SPV parciálneho Hindlll M fragmentu, zatial čo CD80/CD86 a glukuronidázový gén sa inzertovali do SPV Hindlll K fragmentu.
E. coli βparciálneho
S-SPV-275 sa odvodil z S-SPV 046. Pripravil sa pri použití homológneho vektoru 992-23.6 a vírusu S-SPV 046 homologickým rekombinantným postupom na generovanie rekombinantného FHV. Transfekčná rezervná surovina sa testovala s cielom nájsť ·· ···· • · ·· • · · · · • t ·· · · ·· ·· · · · · • · · · · · ·· ·· ·· • · · • · · • · · ·· ·
138 rekombinantný FHV exprimujúci β-glukuronidázu (X-gluc test). Konečným výsledkom niekoľkých kôl purifikácie modro/zeleného plaku bol rekombinantný vírus označený ako SPV 275.
Pri S-SPV-275 vírusu sa vykonala analýza na expresiu FlVgag a markérových génov β-galaktozidázy a β-glukuronidázy analýzou s čiernym plakom. Pri použití myšej monoklonálnej protilátky pre FlVgag (Custom Monoclonals, CA) sa zistilo, že 100 % plakov generovaných z ESK-4 buniek infikovaných purifikovaným S-SPV 275 exprimuje FlVgag a je po piatich pasážach stabilný.
Expresia FlVgag, CD80 a CD86 sa potvrdila pomocou analýzy Westernového prenosu pri použití myšej monoklonálnej protilátky pre FlVgag a kozej polyklonálnej anti-humánnej CD80 resp. CD86 protilátky (R&D Systems, MN) . Pri 50 kDa a 27 kDa sa detekovali dva distinkčné pásy špecifické pre FlVgag. Ďalej sa detekovala množina pásov v rozmedzí veľkostí od 30kDa do 60kDa špecifických pre mačací CD80 a množina pásov v rozmedzí veľkostí od 40 kDa do 70 kDa špecifických pre mačací CD86.
S-FHV-040
S-FHV-040 je rekombinantný mačací herpesvírus exprimujúci päť cudzích génov. Homológny vektor označený ako 957-87.Al sa skonštruoval nasledujúcim spôsobom: Mačací CD86 gén a CD80 gén sa exprimovali za riadenia bezprostredne predchádzajúceho promotoru cytomegalovírusu (CMV IE) v bicistrónnej kazete, ktorá poháňa transkripciu CD80 a CD86 a medzi dvoma otvorenými čítacími rámcami zahŕňa EMCV IRES prvok, β-glukuronidázový gén je riadený gl promotorom vírusu infekčnej laryngotracheitídy. CD80, CD86 a β-glukuronidázový gén sa inzertujú do unikátnej dlhej oblasti FHV ·· ···· ··
139 • · · • · · • · · • · · ·· · ·· ·· • · · · · · · • · ·· · · • · · · · · · • · · · · · genómu v unikátnom EcoRI mieste odvodenom z parciálneho Sali H fragmentu FHV medzi gL a susednými transkripčne aktivačnými génmi. Ako parentálny vírus sa použil S-FHV 019, ktorý obsahuje CMV IE promotorom riadený FeLVgag gén a E. coli β-galaktozidázový gén riadený gX promotorom pseudobesnoty; obidva tieto gény sa nachádzajú na FHV unikátnom krátkom (US) gE vypustenom mieste.
S-FHV 040 sa odvodil z S-FHV 019. Pripravil sa pri použití homológneho vektoru 987-57.Al a vírusu S-FHV 019 homologickým rekombinantným postupom na génerovanie rekombinantného FHV. Transfekčná rezervná surovina sa testovala s cielom nájsť rekombinantný FHV exprimujúci β-glukuronidázu (X-gluc test). Konečným výsledkom niekoľkých kôl purifikácie modro/zeleného plaku bol rekombinantný vírus označený ako S-FHV 040.
Pri S-FHV 040 víruse sa vykonala analýza na expresiu FeLVgag a markérových génov β-galaktozidázy a β-glukuronidázy analýzou s čiernym plakom. Zistilo sa, že 100 % plakov generovaných v CRFK bunkách exprimuje β-galaktozidázu a β-glukuronidázu. Expresia FeLVgag sa rovnako potvrdila testom s čiernym plakom využívajúcim koziu polyklonálnu protilátku proti FeLV gp27 (BioDesigns; ME). Ukázalo sa, že tento vírus je po piatich pasážach stabilný.
Expresia FeLVgag, mačacieho CD80 a CD86 sa potvrdila pomocou analýzy Westernového prenosu. Pre mačacie CD80 a CD86 sa použili kozie polyklonálne anti-humánne CD80 resp. CD86 protilátky (R&D Systems, MN). Detekovala sa množina pásov v rozmedzí veľkostí od 30kDa do 60kDa špecifických pre mačací CD80 a množina pásov v rozmedzí veľkostí od 40 kDa do 70 kDa špecifických pre mačací CD86. Expresia FeLV sa potvrdila použitím kozej polyklonálnej protilátky proti FeLV gp27 (BioDesigns, ME).
·· ·· ···· • · • · · 4 · ·
140
4 44 4
4
44
S-FHV 042
S-FHV-042 je rekombinantný mačací herpesvírus exprimujúci päť cudzích génov. Homológny vektor označený ako 957-87.Al sa skonštruoval nasledujúcim spôsobom: Mačací CD86 gén a CD80 gén sa exprimovali za riadenia bezprostredne predchádzajúceho promotoru cytomegalovírusu (CMV IE) v bicistrónnej kazete, ktorá poháňa transkripciu CD80 a CD86 a medzi dvoma otvorenými čítacími rámcami zahŕňa EMCV IRES prvok, β-glukuronidázový gén je riadený gl promotorom vírusu infekčnej laryngotracheitídy. CD80, CD86 a β-glukuronidázový gén sa inzertujú do unikátnej dlhej oblasti FHV genómu v unikátnom EcoRI mieste odvodenom z parciálneho Sali H fragmentu FHV medzi gL a susednými transkripčne aktivačnými génmi. Ako parentálny vírus sa použil S-FHV 018, ktorý obsahuje CMV IE promotorom riadený FeLVenv gén a E. coli β-galaktozidázový gén riadený gX promotorom pseudobesnoty; obidva tieto gény sa nachádzajú na FHV unikátnom krátkom (US) gE vypustenom mieste.
S-FHV 042 sa odvodil z S-FHV 018. Pripravil sa pri použití homológneho vektoru 987-57.Al a vírusu S-FHV 018 homologickým rekombinantným postupom na generovanie rekombinantného FHV. Transfekčná rezervná surovina sa testovala s cielom nájsť rekombinantný FHV exprimujúci β-glukuronidázu (X-gluc test). Konečným výsledkom niekoľkých kôl purifikácie modro/zeleného plaku bol rekombinantný vírus označený ako S-FHV 042. Pri SFHV 042 vírusu sa vykonala analýza na expresiu FeLVenv a markérových génov β-galaktozidázy a β-glukuronidázy analýzou s čiernym plakom. Zistilo sa, že 100 % plakov generovaných v CRFK bunkách exprimuje β-galaktozidázu a β-glukuronidázu. Expresia FeLVenv sa rovnako potvrdila testom s čiernym plakom využívajúcim myšiu monoklonálnu protilátku proti FeLV gp70 (BioDesigns; ME). Ukázalo sa, že tento vírus je po piatich pasážach stabilný.
141 ·· ···· ·· ·· ·· • · · · · · · • · ·· · · • · ·· · · · · • · · · · · ·· ·· ·· *
Expresia mačacieho CD80, CD86 a FeLVenv sa potvrdila pomocou analýzy Westernového prenosu. Pre mačací CD80 a CD86 sa použili kozie polyklonálne anti-humánne CD80 resp. CD86 protilátky (R&D Systems, MN). Detekovala sa množina pásov v rozmedzí velkostí od 30kDa do 60kDa špecifických pre mačací CD80 a množina pásov v rozmedzí velkostí od 40 kDa do 70 kDa špecifických pre mačací CD86. lOOkDa FeLVenv pás sa detekoval pri použití myšej monoklonálnej protilátky proti FeLV gp70 (BioDesigns, ME).
S-FHV 044
S-FHV 044 je rekombinantný mačací herpesvírus exprimujúci päť cudzích génov. Homológny vektor označený ako 957-87.Al sa skonštruoval nasledujúcim spôsobom: Mačací CD86 gén a CD80 gén sa exprimovali za riadenia bezprostredne predchádzajúceho promotoru cytomegalovírusu (CMV IE) v bicistrónnej kazete, ktorá poháňa transkripciu CD80 a CD86 a medzi dvoma otvorenými čítacími rámcami zahŕňa EMCV IRES prvok, β-glukuronidázový gén je riadený gl promotorom vírusu infekčnej laryngotracheitídy. CD80, CD86 a β-glukuronidázový gén sa inzertujú do unikátnej dlhej oblasti FHV genómu v unikátnom EcoRi mieste odvodenom z parciálneho Sali H fragmentu FHV medzi gL a susednými transkripčne aktivačnými génmi. Ako parentálny vírus sa použil S-FHV 016, ktorý obsahuje CMV IE promotorom riadený FlVgag/proteázový gén (s deléciou deviatich aminokyselín v 5' konci proteázového génu) a E. coli βgalaktozidázový gén riadený gX promotorom pseudobesnoty; obidva tieto gény sa nachádzajú na FHV unikátnom krátkom (US) gE vypustenom mieste.
·· ···· ·· ·· ··
142
S-FHV 044 sa odvodil z S-FHV 016. Pripravil sa pri použití homológneho vektoru 987-57.Al a vírusu S-FHV 016 homologickým rekombinantným postupom na generovanie rekombinantného FHV.
I · ·· · <
I · · · · · í
I · · · · « ·· ·· ··
Transfekčná rezervná surovina rekombinantný FHV exprimujúci Konečným výsledkom niekolkých sa testovala s cieľom nájsť β-glukuronidázu (X-gluc test). kôl purifikácie modro/zeleného plaku bol rekombinantný vírus označený ako S-FHV 044. Pri SFHV 044 víruse sa vykonala analýza na expresiu FlVgag a markérových génov β-galaktozidázy a β-glukuronidázy analýzou s čiernym plakom. Zistilo sa (pri použití myších monoklonálnych protilátok (BioDesign, ΜΕ), že 100 % plakov generovaných v CRFK bunkách exprimuje β-galaktozidázu a β-glukuronidázu. Expresia FlVgag sa rovnako potvrdila testom s čiernym plakom využívajúcim myšiu monoklonálnu protilátku proti FlVgag (Custom Monoclonals, CA). Ukázalo sa, že tento vírus je po piatich pasážach stabilný.
Expresia mačacieho CD80, CD86 a FlVgag sa potvrdila pomocou analýzy Westernového prenosu. Na mačaciu CD80 a CD86 sa použili kozie polyklonálne anti-humánne CD80 resp. CD86 protilátky (R&D Systems, MN). Detekovala sa množina pásov v rozmedzí velkostí od 30kDa do 60kDa špecifických pre mačací CD80 a množina pásov v rozmedzí velkostí od 40 kDa do 70 kDa špecifických pre mačací CD86. Pri použití myšej monoklonálnej protilátky proti FlVgag sa detekovali dva distinkčné pásy, 50 kDa a 27 kDa, špecifické pre FlVgag.
·· ·· ····
143
Tabulka 2: SPV Rekombinantné vírusy obsahujúce gény kódujúce CD80 • · · • t · • · · ·· · • · · • ·· • · · ·· ·· ·· • · · • · • · ·· · a/alebo CD28.
Vírus č. Cpis inzercií cudzích génov Analýza expresie Westemovým prenosan alebo testan s čiernym plakcm
CD 80 CD 86 GAG ENV β-GAL β-GLU
SPV 228 EP2-ETVgag/EPl-EZVenv/I5LlacZ Hanológny vektor = 926-45. A17 Parentálny vírus-SPV 001 + + +
SPV 261 EP2-FTVgag/EPl-FIVenv/I5L·lacZ//L2E2-CD80/E2-UIDA Hanológny vektor = 93121 .Al Parentálny vírus-SPV 228 + + + + +
SPV 275 L2E2-ETVgag/01L-lacZ//LlCD86/IRES-CD80/E2-UIDA Hanológny vektor = 99223.6 a 992-23.2 Parentálny vírus = SPV 046 + + + + +
SPV 258 L2E2-FeLVGag/L2E2FeĽVÁTMenv/Ll-lacZ Hanológny vektor = 95444.1 Parentálny vírus = SPV 001 + + +
SPV 281 EP2-FTVgag/EPl-FIVenv/I5LlacZ//Ll-CD86/IRESCD80/E2-UIDA Hanológny vektor = 992-23.6 Parentálny vírus = SPV 228 + + + + + +
SPV 246 E2-FeLVgag/L2E2FeLVenv/I5L-lacZ//L2E2CD80/E2-uidA Hanológny vektor = 931-21. Al Parentálny vírus = SPV 224 + + + + +
•t ··♦· • ·
144 ·· ·· ·· ·· · · · · · · ··· ···· ·· ··· · · · · ·· ·· · ·« ·· ·· ·
SPV 276 L2E2-FeLVgag/Ll- lacZ//LlCD86/IRES-CD80/E2-UIDA Hcmológny vektor = 99223.6 Parentálny vírus = SPV 089 + + + + +
SPV 279 El-FeLVenv/Ll-lacZ//LlCD86/IRES/CD80/E2-UIDA Hanológny vektor = 99223.6 Parentálny vírus = SPV 195 + + + + +
SPV 280 L2E2-FeLVGag/L2E2FeLVÄIMenv/Ll-lacZ//LlCD86/IRES-CD80/E2-UIOA Hanológny vektor = 99223.6 Parentálny vírus = SPV 258 + + + + + +
SPV 285 E2-FeLVgag/ElFfeLWfenv/I5L-lacZ//LlCD80/IRES/CD86/gI-UIDA Hanológny vektor = 99223.6 Parentálny vírus = SPV 224 + + + + + +
SPV 270 IE-CD80AlM/HIS/E2-uidA Hanológny vektor = 96127.4 Parentálny vírus = SPV 001 + +
SPV 272 LE-CD86álM/HIS/E2-uidA (19-2) Hanológny vektor = 969-20.9 Parentálny vírus = SPV 001 + +
SPV 273 LE-CD28ATM/HIS/E2-uidA Hanológny vektor = 93091.2 Parentálny vírus = SPV 001 +
·· ····
145 ·· ·· ·· • · · ···· ··· * * · ···· · · ··· ···· ·· ·· · ·· ·· ·· ·
SPV 274 LE-CD86 (EL) /EP2-UIDA Hanológny vektor = 97740.1 Parentálny vírus = SPV 001 + +
SPV 282 LP1-CD-86/IRES-CD80/E2UIDA Hanológny vektor = 992-23.6 Parentálny vírus = SPV 001 + + + + +
Tabuľka 3: RPV rekombinantné vírusy obsahujúce gény kódujúce CD80 a/alebo CD86 a CD-28
Vírus č. Cpis inzercií cudzích génov Analýza expresie Westemovým prenosan alebo testan s čiernym plakan
CD 80 CD 86 GAG ENV ä-GAL ä-GLU
RPV 046 L2E2-FlVgag/E2-UIDA//LPlCD86/IRES-CD80/I5L-LacZ Hcrnológny vektor = 101518.8A Parentálny vírus = RPV 036 + + + + +
RPV 047 El-ETVenv/E2-UIDA//LPlCD86/IRES-CD80/I5L-LacZ Hanológny vektor = 101518.8A Parentálny vírus = RPV 037/044 + + + + +
RPV 048 L2E2-FeĽV Gag/E2-UIDA LPl-B7-/lRES-CD80/l5L-LacZ Hanológny vektor = 101518.8A Parentálny vírus = RPV 038 + + + + +
RPV 052 H3 U'Xfcal miesto/LPluidA/EPl-FeLVenv/S-RPV-030 EP2-FeĽVgag H3 Vľ I5LIacZ/Ll-FeCD86/IRES/FeCD80 Hanológny vektor = 101518.8A Parentálny vírus = RPV 030 + + + + + +
·· ····
146
RPV 053 H3 U Xfca I miesto/EP2FIVgag/EPl-FIVenv/S-RPV034 LPl-uidA//H3 Ν' I5L2acZ/Ll-FeCD86/lRES/FeCD80 Hcmológny vektor = 101518.8A Parentálny vírus = RPV 034 + + + + + +
RPV 022 L2E2-CD80/Ll-lacZ Hcmológny vektor = 93132 .A5 Parentálny vírus = RPV 000 + +
RPV 045 LP1-CD86/IRES-CD80/I5LLacZ Hcmológny vektor = 1015-18.8A Parentálny vírus = RPV 000 + + +
Tabuľka 4: FHV rekombinantné vírusy obsahujúce gény kódujúce CD80 a alebo CD86 a CD28
Vírus č. Cpis inzercií cudzích génov Analýza expresie Westemovým prenoscm alebo testcm s čiernym plakan
CD 80 CD 86 GAG ENV ä-GAL ä-GĽO
FHV 044 IE-FIVgag (-9a.a.) gXlacZ//IE-CD86/IRESCD80/gI-UIDA Hcmológny vektor = 987-57. Al Parentálny vírus = FHV 016 + + + + +
FHV 047 IE-FIVgag (-9a. a.) gXlacZ//IE-CD86-TkpA/gI-UIDA Hcmológny vektor = 99468.4 Parentálny vírus = EHV 016 + + + +
·· ·· ··· ·· ·
147 • · •
• · • · ·· ·· • · · · • · ·· • · · · · · • · · · ·· ··
FHV 048 IE-FIVenv/gX-LacZ (AgE)// IE-CD86-TkpA/gI-UIĽA Hcmológny vektor = 99468.4 Parentálny vírus = EHV 017 + + + +
FHV 042 IE-FeĽVenv/gX-LacZ (AgE)// IE-CD86/IRES-CD80/gI-UIDA (SalH IG) Hcmológny vektor = 987-57.Al Parentálny vírus = EHV 018 + + + + +
FHV 040 IE-FeLVgag/gX-LacZ (AgE)// IE-CD86/IRES-CD80/gI-UIDA (SalH IG) Hcmológny vektor = 987-57. Al Parentálny vírus = FHV 019 + + + + +
FHV 049 IE-FeLVenv/gX-LacZ (AgE)// IE-FeCD86-TkpA/gI-uidA (SalH IG) Hcmológny vektor = 994-68.4 Parentálny vírus = FHV 018 + + + +
EHV 050 IE-FeLVgag/gX-LacZ (AgE) IE-FeCD86-TkpA/gI-uidA (SalH IG) Hcmológny vektor = 994-68.4 Parentálny vírus = EHV 019 + + + +
EHV 030 gE-CD80/gE-lacZ (AgE) Hcmológny vektor = 92676.D7 Parentálny vírus = EHV 020 + +
Ďalšie príklady zahŕňajúce ko-vektorujúce mačacie CD80 a CD86, apod. s čiastočnými alebo úplnými genómami FIV alebo FeLV:
Poznámka: Rekombinantné vírusové vektory obsahujú CD80, CD86, CTLA-4 alebo CD28 v rekombinantnom víruse s parciálnym alebo plným genómovým doplnkom FIV a/alebo FIV a prípadne s IL-12 p35 a p40. Tieto rekombinantné vírusy majú potenciál ako vakcíny proti FIV a FeLV ochorením mačiek.
• · ··
148 ·· ···· • · · ·· ·· • · · • · ·· • · · · • · · ·· ··
1. Expresia CD80, CD86, CD28 a CTLA-4, samotného alebo v kombinácii, v rekombinantnom víruse kiahní ošípaných obsahujúcom úplný alebo čiastočný genóm FIV.
2. Expresia CD80, CD86, CD28 a CTLA-4, samotného alebo v kombinácii, v rekombinantnom mačacom herpesvíruse obsahujúcom úplný alebo čiastočný genóm FIV.
3. Expresia CD80, CD86, CD28 a CTLA-4, samotného alebo v kombinácii, v rekombinantnom víruse kiahní medvedíkov obsahujúcom úplný alebo čiastočný genóm FIV.
4. Expresia CD80, CD86, CD28 a CTLA-4, samotného alebo v kombinácii, v rekombinantnom víruse kiahní ošípaných obsahujúcom úplný alebo čiastočný genóm FeLV.
5. Expresia CD80, CD86, CD28 a CTLA-4, samotného alebo v kombinácii, v rekombinantnom mačacom herpesvíruse obsahujúcom úplný alebo čiastečný genóm FeLV.
6. Expresia CD80, CD86, CD28 a CTLA-4, samotného alebo v kombinácii, v rekombinantnom víruse kiahní medvedíkov obsahujúcom úplný alebo čiastočný genóm FeLV.
7. Expresia CD80, CD86, CD28 a CTLA-4, samotného alebo v kombinácii, v rekombinantnom víruse kiahní ošípaných obsahujúcom úplný alebo čiastočný genóm FIV a gény pre mačacie IL12, GM-CSF, p35 a p40.
8. Expresia CD80, CD86, CD28 a CTLA-4, samotného alebo v kombinácii, v rekombinantnom mačacom herpesvíruse obsahujúcom úplný alebo čiastečný genóm FIV a gény pre mačací IL12, GM-CSF, p35 a p40.
·· ···· ··
149
9. Expresia CD80, CD86, CD28 a CTLA-4, samotného alebo v kombinácii, v rekombinantnom víruse kiahní medvedíkov obsahujúcom úplný alebo čiastočný genóm FIV a gény pre mačací IL12, GM-CSF, p35 a p40.
10. Expresia CD80, CD86, CD28 a CTLA-4, samotného alebo v kombinácii, v rekombinantnom víruse kiahní ošípaných obsahujúcom úplný alebo čiastočný genóm FeLV a gény pre mačací IL12, GM-CSF, p35 a p40.
11. Expresia CD80, CD86, CD28 a CTLA-4, samotného alebo v kombinácii, v rekombinantnom mačacom herpesvíruse obsahujúcom úplný alebo čiastočný genóm FeLV a gény pre mačací IL12, GM-CSF, p35 a p40.
12. Expresia CD80, CD86, CD28 a CTLA-4, samotného alebo v kombinácii, v rekombinantnom víruse kiahní medvedíkov obsahujúcom úplný alebo čiastočný genóm FeLV a gény pre mačací IL12, GM-CSF, p35 a p40.
Tabulka 5: Rekombinantné vírusy obsahujúci FIV genóm (ALTRs) a gény kódujúce mačací CD80 a/alebo CD86
Vírus č. Cpis inzercií cudzích génov Analýza expresie Westemovým prenosom alebo testom s čiernym plakcm
CD 80 CD 86 GAG ENV β-GAL β-GLU
FHV 054 CMV-ETVgencm/gX-lacZ//gECD-80 Hcmológny vektor = 1016-75.Bl Parentálny vírus = FHV 030 + + + +
FHV 055 CMV-FTVgenčm/gX-lacZ//gECD-86/gX-UIDA Horológny vektor = 1016-75.Bl Parentálny vírus = FHV 041 + + + + +
·· ····
150
RPV 055 (ľMV-ETVgenón/LPlUIDA//LP1-CD86/IRESCD80/I5L-lacZ Hanológny vektor = 1005-95.1 Parentálny vírus = RPV 045 + + + + + +
SPV 288 CMV-FIVgenán/I5LlacZ//LPl-CD86/IRESCD80/EP2-UIDA Hcmológny vektor = 1007-70. A2 Parentálny vírus = RPV 045 + + + + + +
Príklady uskutočnenia vynálezu
Homológny vektor 1007-70.A2 (SPV N/CMV-FIVgenómALTR/I5L-lacZ).
Homológny vektor 1007-70.A2 sa použil pre inzert cudzej DNA do Hindlll N inzertného miesta SPV. Zabudovává E. coli βgalaktozidázový markérový gén a celú dĺžku FIV genómu (8,5 kb) bez ohraničujúcich dlhých terminačných opakujúcich sa (LTR) prvkov. Táto kazeta je ohraničená SPV DNA homologickou s neesenciálnym miestom v SPV Hindlll N fragmente. Pokiaľ sa tento homológny vektor použije podlá homologického rekombinantného postupu na generovanie rekombinantného SPV vírusu, potom sa získa vírus obsahujúci DNA kódujúcu cudzie gény. Je potrebné poznamenať, že β-galaktozidázový markérový gén je riadený konštitutívnym kiahňovým promotorom I5L a FIV genóm (ALTRs) je riadený bezprostredne predchádzajúcim promotorom cytomegalovírusu (CMV IE). Homológny vektor sa skonštruoval pri použití štandardných rekombinantných DNA techník (Sambrook a kol.). FIV genóm (ALTRs) sa syntetizoval klonováním pomocou polymerázovej reťazovej reakcie. Templátom pre PCR reakciu bola provírusová DNA z plazmidu obsahujúceho celú dĺžku FIV PPR vírusu. Upstream prajmer(5'-ACG-CGTCGACCAGCTAACAAGGTAGGAGAGACTCT-3'; 11/23/98BW.3) sa syntetizuje z 5' konca FIV genómu proti smeru oblasti
151 • · · · • ·· · ·· ·· ·· kódujúcej gag a zavádza unikátne Sali miesto. Downstream prajmer (5'-TCGAGTCGACTTGTGACAGTT-CTTAGTCCATAAGC-3'; 11/11/98BW.1) sa syntetizuje z 3' konca FIV genómu po smere druhého Rev exónu a zavádza unikátne Sali miesto. Finálny homológny vektor 1007-70.A2 sa použil na prípravu rekombinantných vírusov obsahujúcich FIV genóm (bez LTRs) a mačacie CD80 a CD86 alebo na prípravu rekombinantných vírusov obsahujúcich FlVgenóm (mínus LTR) a mačacie CD80 a CD86 a mačací IL-12 gény, p35 a p40 podľa homologického rekombinantného postupu na generovanie rekombinantného SPV, RPV a FHV.
Homológny vektor 1005-95.1 (RPV U/CMV-FIVgenómALTR/l5L-LacZ).
Homológny vektor 1005-95.1 sa skonštruoval na účely inzertu cudzej DNA do RPV. Zabudováva FIVgenóm-ALTR a E. coli βglukuronidázový gén ohraničený RPV DNA. Upstreamom cudzieho génu je približne 906bp fragment RPV DNA. Downstreamom cudzích génov je približne 895bp fragment ROV DNA. Pokial sa plazmid použije podía homologického rekombinantného postupu na generovanie rekombinantného RPV vírusu, potom sa získa vírus obsahujúci DNA kódujúcu cudzie gény. Je potrebné poznamenať, že FIVgenóm-ALTR je riadený bezprostredne predcházajúcim promotorom cytomegalovírusu a β-glukuronidázový gén je riadený syntetickým skorým kiahňovým promotorom EP2. Homológny vektor sa skonštruoval pri použití štandardných rekombinantných DNA techník (Sambrook a kol.) spojením reštrikčných fagmentov z nasledujúcich zdrojov so syntetickými DNA sekvenciami. Plazmidový vektor sa odvodil z približne 2999bp Hindlll reštrikčného fragmentu pSP64 (Promega). Fragmentom 1 je približne 906 bp Hindlll až Xbal reštrikčný subfragment RPV Hindlll reštrikčného fragmentu U (Knight a kol.).
·· ···· • e ·· » · ·
B · ··
B · · «
B · · · ·· ·· ·· • · · • · • · · • · ·· ·
152
Fragmentom 2 je približne 8,5 kb Sali fragment FIV genómu bez LTR prvkov, ktorý sa syntetizoval klonovaním s pomocou polymerázovej reťazovej reakcie. Templátom pre PCR reakciu bola provírusová DNA z plazmidu obsahujúceho celú dĺžku FIV PPR vírusu. Upstream pra j mer(5'-ACGCGTCGACCAGCTAACAAGGTAGGAGA-GACTCT-3'; 11/23/98BW.3) sa syntetizuje z 5' konca FIV genómu proti smeru oblasti kódujúcej gag a zavádza unikátne Sali miesto. Downstream prajmer (5'-TCGAGTCGACTTGTGACAGTT-CTTAGTCCATAAGC-3'; 11/11/98BW.1) sa syntetizuje z 3' konca FIV genómu po smere druhého Rev exónu a zavádza unikátne Sali miesto. Fragmentom 3 je približne 2,0kb fragment obsahujúci E. coli β-glukuronidázový gén. Fragmentom 4 je približne 895 bp Xbal až Hindlll subfragment RPV Hindlll fragmentu U. Finálny homológny vektor 1005-95.1 sa použil na prípravu rekombinantných vírusov obsahujúcich FIV genóm (ALTRs) a mačacie CD80 a CD86 alebo na vytvorenie rekombinantných vírusov obsahujúcich FlVgenóm (ALTR) a mačacie CD80 a CD86 a mačací IL-12 gény, p35 a p40 podlá homologického rekombinantného postupu na generovanie rekombinantného SPV, RPV a FHV.
Homológny vektor 1016-74. A6 (FHVAgE/CMV-FIVgenóm-ALTR/gX-laeZ) .
Homológny vektor 1016-74.A6 sa skonštruoval na účely delécie časti gE kódujúcej oblasti z mačacieho herpesvírusu a pre inzert cudzej DNA. Zabudováva FlVgenóm (mínus LTRs) a E. coli βgalaktozidázový gén ohraničený FHV DNA. FIVgenóm-ALTR je riadený IE promotorom cytomegalovírusu a β-galaktozidázový gén je riadený gX promotorom vírusu pseudobesnoty. Homológny vektor sa skonštruoval pri použití štandardných rekombinantných DNA techník (Sambrook a kol.) z nasledujúcich zdrojov DNA. Plazmidový vektor sa odvodil z približne 2958bp Asp718I reštrikčného ·· ·· ·· ···· ·· • · · · · • · ·· · • · · · · · · • · · · · ·· ·· 1 je približne B fragmentu.
• · · • · · • · · ·· ·
153 endonukleázového fragmentu pSP18/19. Fragmentom 1 1415 bp Asp718I až Smal subfragment FHV Sali
Fragmentom 2 je približne 8,5 kb Sali fragment FIV genómu bez LTR prvkov, ktorý sa syntetizoval klonovaním s pomocou polymerázovej reťazovej reakcie. Templátom pre PCR reakciu bola provírusová DNA z plazmidu obsahujúceho celú dĺžku FIV PPR vírusu. Upstream prajmer(5'-ACG-CGTCGACCAGCTAACAAGGTAGGAGA-GACTCT-3';11/23/98BW.3) sa syntetizuje z 5' konca FIV genómu proti smere oblasti kódujúcej gag a zavádza unikátne Sali miesto. Downstream prajmer (5'-TCGAGTCGACTT-GTGACAGTT-CTTAGTCCATAAGC-3'; 11/11/98BW.1) sa syntetizuje z 3' konca FIV genómu po smere druhého Rev exónu a zavádza unikátne Sali miesto. Fragmentom 3 je približne 3,5kb βgalaktozidázový génový fragment. Fragmentom 4 je približne 2205 bp Sali až Asp718I subfragment FHV EcoRI E fragmentu.
Finálny homológny vektor 1016-74.A6 sa použil na prípravu rekombinantných vírusov obsahujúcich FIV genóm (ÁLTRs) a mačacie CD80 a CD86 alebo na vytvorenie rekombinantných vírusov obsahujúcich FlVgenóm (ÁLTR) a mačacie CD80 a CD86 a mačací IL-12 gény, p35 a p40 podía homologického rekombinantného postupu na generovanie rekombinantného SPV, RPV a FHV.
SPV 288
SPV 288 je rekombinantný vírus kiahní ošípaných exprimujúci celý doplnok otvorených čítacích rámcov obsiahnutých vo FIV genóme a 4 ďalšie cudzie gény. SPV 288 sa odvodil z SPV 282. SPV 282 obsahuje mačací CD86 gén a CD80 gén exprimované za riadenia syntetického neskorého kiahňového promotoru LP1 v bicistrónnej DNA kazete, ktorá poháňa transkripciu CD80 a CD86 a zahŕňa EMCV IRES prvok medzi dvoma otvorenými čítacími rámcami;
·· ···· ·· ·· • · • · • · • · ·· • · · · • · ·· • · · · · · • · · · ·· ·· ·· • · · • · • · • ·
154
E. coli β-glukuronidázový gén je riadený syntetickým skorým promotorom EP2 v SPV Hindlll K genómovom fragmente. Homológny vektor 992-23.6 sa použil na konštrukciu SPV 282 homologickým rekombinantným postupom na generovanie rekombinantného RPV, SPV alebo FHV. CD80/CD86 a E. coli β-glukuronidázový gén sa inzertovali do distinkčného a neesenciálneho SPV parciálneho Hindlll K fragmentu. CMV-FIV genóm a β-galaktozidázové gény sa inzertovali do distinkčného a neesenciálneho SPV parciálneho Hindlll N fragmentu.
SPV 288 sa odvodil z SPV 282. Pripravil sa pri použití homológneho vektoru 1007-70.A2 (pozri hore) a vírusu SPV-282 homologickým rekombinantným postupom na generovanie rekombinantného RPV, SPV alebo FHV. Transfekčná rezervná surovina sa testovala s cieľom nájsť rekombinantný SPV exprimujúci β-galaktozidázu (BLUOGAL a CPRG testy) alebo β-glukuronidázu (X-GLUC test). Konečným výsledkom niekoľkých kôl purifikácie modro/zeleného plaku bol rekombinantný vírus označený ako SPV 288.
Pri S-SPV-288 vírusu sa vykonala analýza na expresiu FeLVgag, FeLVenv z FIV genómu a markérových génov β-galaktozidázy a β-glukuronidázy analýzou s čiernym plakom. Pri použití kozej polyklonálnej protilátky pre FeLVgag (Biodesign, ME) a myšej monokionálnej protilátky pre FeLVenv gp70 (Biodesign, ME) sa zistilo, že 100 % plakov generovaných z ESK-4 buniek infikovaných purifikovaným SPV 288 exprimuje FeLVgag a FeLVenv.
Expresia mačacieho CD80 a CD86 sa potvrdila pomocou analýzy
Westernového prenosu pri použití kozej polyklonálnej antihumánnej CD80 resp. CD86 protilátky (R&D Systems, MN). Detekovala sa množina pásov v rozmedzí veľkostí od 30 kDa do 60 kDa ·· ···· • · · • · · • · · • · · ·· ·
155 špecifických pre mačací CD80 a množina pásov v rozmedzí veľkostí od 40 kDa do 70 kDa špecifických pre mačací CD86. Tieto pásy predstavujú striedavé vzory CD80 a CD86 s množinou glykozylácií exprimovaných v kontexte SPV v ESK-4 bunkách. Expresia proteínov kódovaných v FIV genóme sa potvrdila v analýze Westernového prenosu pri použití mačacieho séra odoberaného z tela mačiek infikovaných FIV.
FHV 054
FHV 054 je rekombinantný mačací herpesvírus exprimujúci celý doplnok otvorených čítacích rámcov obsiahnutých vo FIV genóme a 2 ďalšie cudzie gény. Homológny vektor označený ako 1016-75.BI sa skonštruoval pre účel inzertu FIV genómu (ALTR) a fi-galaktozidázy do FHV unikátného dlhého parciálneho Sal H fragmentu. Inzert je medzi gL génom a susednými transkripčne aktivačnými génmi. FIV genóm je riadený CMV IE promotoru; a E. coli β-galaktozidázový gén je riadený gX promotorovým prvkom pseudobesnoty.
FHV 054 sa odvodil z FHV 030, ktorý obsahuje mačací CD80 gén v FHV gE vypustenom mieste. Pripravil sa pri použití homológneho vektoru 1016-75.BI a vírusu FHV 030 homologickým rekombinantným postupom na generovanie rekombinantného RPV, SPV alebo FHV. Transfekčné rezervné suroviny sa testovali s cieľom nájsť rekombinantný FHV exprimujúci β-galaktozidázu (BLUOGAL a CPRG testy) alebo β-glukuronidázu (X-GLUC test). Konečným výsledkom niekoľkých kôl purifikácie modro/zeleného plaku bol rekombinantný vírus označený ako FHV 054.
Pri FHV 054 víruse sa vykonala analýza na expresiu figalaktozidázy analýzou s čiernym plakom. Pri použití myšej ·· ·· ·· • · · · · · · • · ·· · · • · ·· · · · · • · · · · · ·· ·· ·· · ·· ···· ··
156 ·· · • · • · ·· · monoklonálnej protilátky (Biodesign, ME) sa zistilo, že 100 % plakov generovaných z CRFK buniek infikovaných purifikovaným FHV 054 exprimuje β-galaktozidázu.
Expresia mačacieho CD80, FlVgag a FlVenv sa potvrdila pomocozu analýzy Westernového prenosu pri použití polyklonálnej anti-humánnej CD80 resp. CD86 protilátky (R&D Systems, MN), myších monoklonálnych anti-FIVgag protilátok (Custom Monoclonals, CA) a myšej monoklonálnej anti-FIVenv protilátky (Biodesign). Expresia celého doplnku FIV génov kódovaných v genóme sa potvrdila v analýze Westernového prenosu pri použití mačacieho séra odoberaného z tela zotavených mačiek infikovaných FIV.
FHV 055
FHV 055 je rekombinantný mačací herpesvírus exprimujúci celý doplnok otvorených čítacích rámcov obsiahnutých vo FIV genóme a 3 ďalšie cudzie gény. Homológny vektor označený ako 1016-75.BI sa skonštruoval na účel inzertu FIV genómu (ALTR) a β-galaktozidázy do FHV unikátneho dlhého parciálneho Sal H fragmentu.
Inzert je medzi FHV gL génom a susednými transkripčne aktivačnými génmi. FIV genóm je riadený CMV IE promotoru; a E. coli β-galaktozidázový gén je riadený gX promotorovým prvkom pseudobesnoty.
FHV 055 sa odvodil z FHV 041, ktorý obsahuje mačací CD86 gén a β-glukuronidázový gén v FHV gE vypustenom mieste. Mačací CD86 je riadený FHV gE promotorom a β-glukuronidázový gén je riadený gX promotorom pseudobesnoty. Pripravil sa pri použití homológneho vektoru 1016-75.BI a vírusu FHV 041 homologickým rekombinantným ·· ····
157 ·· ·· ·· ·· · ···· ··· ··· · · ·· · · ··· ···· ·· ·· · ·· ·· ·· · postupom na generovanie rekombinantného RPV, SPV alebo FHV. Transfekčné rezervné suroviny sa testovali s cieľom nájsť rekombinantný FHV exprimujúci β-galaktozidázu (BLUOGAL a CPRG testy) alebo β-glukuronidázu (X-GLUC test). Konečným výsledkom niekoľkých kôl purifikácie modro/zeleného plaku bol rekombinantný vírus označený ako FHV 055.
Pri FHV 055 víruse sa vykonala analýza na expresiu βgalaktozidázy a β-glukuronidázy analýzou s čiernym plakom. Pri použití myšej monoklonálnej protilátky (Biodesign, ME) a králičej polyklonálnej protilátky (Molecular Probes, OR) sa zistilo, že 100 % plakov generovaných z CRFK buniek infikovaných purifikovaným FHV 055 exprimuje β-galaktozidázu a βglukuronidázu. Ukázalo sa, že pripravený vírus je po 5 pasážach stabilný.
Expresia mačacieho CD86, FlVgag a FlVenv sa potvrdila pomocou analýzy Westernového prenosu pri použití polyklonálnej anti-humánnej CD86 protilátky (R&D Systems, MN), myších monoklonálnych anti-FIVgag protilátok (Custom Monoclonals, CA) a myšej monoklonálnej anti-FIVenv protilátky (Biodesign). Expresia celého doplnku FIV génov kódovaných v genóme sa potvrdila v analýze Westernového prenosu pri použití mačacieho séra odoberaného z tela zotavených mačiek infikovaných FIV.
RPV 055
RPV 055 je rekombinantný vírus kiahní medvedíkov exprimujúci celý doplnok otvorených čítacích rámcov obsiahnutých vo FIV genóme a 4 ďalšie cudzie gény. RPV 055 sa odvodil z RPV 054, ktorý obsahuje mačací CD86 gén a CD80 gén exprimované za riadenia
158 • e ···· ·· ·· ·· • · ···· · 4 • 9 · · ·· · « ·· ·· · · ··· 4 • · · · · · · < » · ·· · · · · syntetického neskorého kiahňového promotoru LP1 v bicistrónnej DNA kazete, ktorá poháňa transkripciu CD80 a CD86 a zahŕňa EMCV IRES prvok medzi dvoma otvorenými čítacími rámcami; E. coli β-glukuronidázový gén je riadený syntetickým skorým promotorom EP2 v RPV Hindlll N genómovom parciálnom fragmente. Homológny vektor 1005-95.1 sa použil na konštrukciu RPV 055 homologickým rekombinantným postupom na generovanie rekombinantného RPV, SPV alebo FHV. CD80/CD86 a E. coli β-galaktozidázový gén sa inzertovali do distinkčného a neesenciálneho RPV parciálneho Hindlll N fragmentu. CMV-FIV genóm a β-glukuronidázové gény sa inzertovali do distinkčného a neesenciálneho RPV parciálneho Hindlll U fragmentu.
RPV 055 sa odvodil z RPV 054. Pripravil sa pri použití homológneho vektoru 1005-95.1 a vírusu RPV 054 homologickým rekombinantným postupom na generovanie rekombinantného RPV, SPV alebo FHV. Transfekčná rezervná surovina sa testovala s cieľom nájsť rekombinantný RPV exprimujúci β-galaktozidázu (BLUOGAL a CPRG testy) alebo β-glukuronidázu (X-GLUC test). Konečným výsledkom niekolkých kôl purifikácie modro/zeleného plaku bol rekombinantný vírus označený ako RPV 055.
Pri RPV 055 víruse sa vykonala analýza na expresiu FeLVgag, FeLVenv z FIV genómu a markérových génov β-galaktozidázy a β-glukuronidázy analýzou s čiernym plakom. Pri použití kozej polyklonálnej protilátky pre FeLVgag (Biodesign, ME) a myšej monoklonálnej protilátky pre FeLVenv gp70 (Biodesign, ME) sa zistilo, že 100 % plakov generovaných z VERO buniek infikovaných purifikovaným RPV 055 exprimuje FeLVgag a FeLVenv.
Expresia mačacieho CD80 a CD86 sa potvrdila pomocou analýzy Westernového prenosu pri použití kozej polyklonálnej anti-
159 ·· • · · · • · • · · · • · · ·· · ·· ·· humánnej CD80 resp. CD86 protilátky (R&D Systems, MN). Detekovala sa množina pásov v rozmedzí velkostí od 30 kDa do 60 kDa špecifických pre mačaci CD80 a množina pásov v rozmedzí velkostí od 40 kDa do 70 kDa špecifických pre mačací CD86. Tieto pásy predstavujú striedavé vzory CD80 a CD86 s množinou glykozylácií exprimovaných v kontexte RPV vo VERO bunkách. Expresia proteínov kódovaných v FIV genóme sa potvrdila v analýze Westernového prenosu pri použití mačacieho séra odoberaného z tela mačiek infikovaných FIV.
Referencie:
1. Argyle a kol., DNA Seq. 5, 169-171 (1995)
2. Azuma, M. a kol., J. Immunology 149, 1115-1123 (1992).
3. Azuma, M. a kol., Náture 366, 76-79 (1993).
4. Chambers a kol., Current Opinion in Immunology 9, 396-404 (1997) .
5. Chen a kol., J. Immunology 148, 2617-2621 (1992).
6. Chen a kol., Celí 71, 1093-1102 (1992).
7. Donnelly JJ a kol., Annu Rev Immunol 1997; 15: 617-648.
8. Freeman a kol., J. Immunology 143, 2714-2722 (1989).
9. Freeman a kol., J. Exp. Med. 174, 625-631 (1991).
10. Gimmmi a kol., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88, 6575-6579 (1991).
11. Hathcock a kol., J. of Exp. Med. 180, 631-640 (1994).
·· ···· • · ·· · ···· 4 4
4 4 4 4 44 44
444 4444 44
4 44 44 44
160
Hasett a Whitton, Trends Microbiol 1996; 4: 307-312.
Linsley a kol., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, 5031-5035 (1990).
Jenkins a kol., J. Immunology 147, 2461-2466 (1991).
Onions a kol., PCT Intl. Application WO 96/03435, Q-One Biotech., 8. februára 1996.
Riley a kol.,J. Immunology 158, 5545-5553 (1997).
Tsuji a kol., Eur J Immunology 27(3), 782-787 (1997).
PCT medzinárodná patentová prihláška WO 92/00092, Bristol Myers Squibb.
PCT medzinárodná patentová prihláška WO 92/15671, Cytomed, Inc., 17. septembra 1992.
PCT medzinárodná patentová prihláška WO 93/00431, Bristol Myers Squibb, 7. januára 1993.
Akeson, A.L. a Woods, C.W. (1993). A fluorometric assay for the quantitation of celí adherence to endothelial cells. J, Immunol. Meth. 163, 181-185.
Allison, J.P. a Lanier L. (1987). The structure, serology, and function of the T-cell antigén receptor. Annu. Rev. Immunol. 5, 503-540.
Allison, J.P. (1994). CD28-B7 interaction in T-cell activation, Current Opinion Immunol. 6, 414-419.
·· ···· ·· • ·
161 • · · • e · • · · • · · ·· · ·· • · · · • · ·· • · · · • · · · ·· ·· ·· ·
24. Anderson, P., Morimoto, C., Breitmeyer, J.B., Schlosman,
S.F. (1988). Regulátory interactions between members of the immunoglobulin superfamily. Immunol. Today 9, 199-203.
25. Antónia, S.J., Munoz,-Antónia , T., Soldevila, G., Miller, J:, Flavell, R.A. (1995). B7-1 expression by a non-antigen presenting cell-derived tumor. Can. Res. 55, 2253-2256.
26. Arima, T., Rehman, A., Hickey, W., Flye, M. (1996). Inhibition by CTLA-4Ig of experimental allergic encephalomyelitis. J. Immunol. 156, 4917-4924.
27. Arruffo, A. a Seed, B. (1987). Molecular cloning of a CD28 sDNA by a COS celí expression systém. Proc. Nat. Acad. Sci. USA 84, 8573-8577.
28. Asjo, B., Cefai, D., Debre, P., Dudoit, Y., Autran, B. (1993). A novel móde of human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1) activation: ligation of CD28 alone induces HIV-1 replication in naturally infected lymphocytes. J. Virol. 67, 4395-4398.
29. Azuma, M., Cayabyab, M., Buck, M., Phillips, J.H., Lanier,
L.L. (1992). Involvement of CD28 in MHC unrestricted cytotoxicity mediated by a human killer leukaemic celí line. J. Immunol. 149, 1115-1123.
30. Azuma, M., Ysel, H., Phillips, J.H., Spits, H., Lanier, L.L. (1993b). Functional expression of B7/BB1 on activated Tlymphocytes. J. Exp. Med. 177, 845-850.
31. Azuma, M., Cayabyab, M., Phillips, J.H., Lanier, L.L.
(1993c). Requirements for CD28-dependant T cell-mediated cytotoxicity. J. Immunol. 150, 2091-2101.
• 0 ····
·· ·· ·· · • · · · · · ··
9 99 9 9 9
9 9 9 9 9 · · • · · · 9 · · 99 99 99 999
162
32. Bajorath, J., Stenkamp, R., Aruffo, A. (1993). Knowledge based protein modeling: concepts and examples. Prot. Sci. 2, 1798-1810.
33. Bajorath, J., Peach, R., Linsley, P.S. (1994). Immunoglobin fold characteristic of B7-1 (CD80) and B7-2 (CD86) . Prot.
Sci. 3, 2148-2150.
34. Balazano, C., Buonavista, N., Rouvier, E., Golstein, P. (1992) CTLA-4 and CD28: similar proteins, neighboring genes. Int. J. Can. Suppl. 7, 28-32.
35. Barcy, S., Wettendorf, M., Leo, 0., Urbain, J., Kruger, M., Ceuppens, J.L., de Boers, M. (1995).FcR crosslinking on monocytes results in impaired T celí stimulátory capacity. Int. Immunol. 7, 179-189.
36. Beale, D. (1985). A comparison of the amino acid sequences of the extracellular domains of the immunoglobin superfamily. Possible correlations between conservancy and conformation. Comp Biochem Physiol. 80, 181-194.
37. Bellone, M., Iezzi, G., Manfredi, A.A., Protti, M.P.,
Dellabona, P., Casorati, G., Rugarli, C. (1994). In vitro priming of cytotoxic T lymphocytes against poorly immunogenic epitopes by engineered antigén presenting cells. Eur. J. mmun. 24, 2691-2698.
38. Berke, G. (1993). The functions and mechanisms of action of cytolytic lymphocytes. In Fundamental Immunology, (W. Paul), str. 965-1014. New York: Raven Publ. 3. vydanie.
39. Berke, G. (1994). The binding and lysis of targeT-cells by cytotoxic lymphocytes. Annu. Rev. of Immunol. 12, 735-773.
·· ···· ·· ·· ·· • · · · · · · • · ·· · · • · · · · · ·· ·· ··
163
40. Boise, L.H., Minn, A.J., Noel. P.J., June, C.H., Accavitti,
M., Lindstein, T., Thompson, C.B. (1993). CD28 costimulation can promote T celí survival by anhancing the expression of Bcl-Χι,. Immunity 3, 87-89.
41. Brinchmann, J.E., Doblung, J.H., Heger, B.H., Haaheim, L.L., Sannes, M., Egeland, T. (1994). Expression of costimulatory molecule CD28 on T-cells in human immunodeficiency virus type 1 infection: dunctional and clinical coorelations. J. Inf Dis. 169, 730-738.
42. Brown, W.C., Bisey, L., Logan, K.S., Pedersen, N.C., Elders, J.H., Collison, E.W. (1991). Feline immunodeficiency virus infects both CD4+ and CD8+ T-lymphocytes. J. of Virol. 62, 3359-3364.
43. Buck, C.A. (1992). Immunoglobulin Superfamily: structure functíon and relatonship to other receptor molecules. Semin.
Celí Biol. 3, 179-188.
44. Buelens, C., Willems, F., Delvaux, A., Pierard, G.,
Delville, J.P. , Velu, T., Goldman, M. (1995). Interleukín 10
differentially regulates B7-1 (CD80) and B7-2 (CD86)
expression on human peripheral blood dendritic cells. Eur. J. Immunol. 25, 2668-2675.
45. Caruso, A., Cantalamesa, A., Licenziati, S., Peroni, L., Prati, E., Martinelli, F., Canaris, A.D., Folghera, S., Gorla, R., Balsari, A. (1994). Expression of CD28 on CD8+ and CD4+ lymphocytes during HIV infection. Scan. J. Immunol. 40, 485-490.
·· ·· ···· • ·
164 • · · • · · · · • · · ·· · ·· ·· • · · · • · ·· • · · · • · · · ·· ·· • · • · ·· ·
46. Cerdan, C., Martin, Y., Brailly, H., Courcoul, M., Flavetta, S., Costello, R., Mawas, C., Birg, F., Olive, D. (1991). IL1 is produced by T lymphocytes activated via the CD2 plus CD28 pathways. J. Immunol. 146, 560-564.
47. Chen, L., Linsley, P.S., Hellstrom, K.E. (1993). Costimulation of T cells for tumor immunity. Immunol. Today 14, 483-486.
Cehesnut, R.W. a Grey, H.M. (1986) B cells and its significance in Immunol. 39, 51-59.
Antigén presentation by T-B interactions. Adv.
49. Clark, S.J., Saag M.S., Decker, W.D., Campbell, H.S.,
Roberson, J.L., Veldkamp, P.J. (1991). High titers of cytopathic virus in plasma of patients with symptoms of proimary HIV-1 infection. N. Eng. J. Med. 324, 954-960.
50. Clayberger, C., Lyu, S.C., DeKruyff, R., Parham, P.,
Krensky, A.M. (1994). Peptides corresponding to the CD8 and CD4 binding domains of HLA molecules block T-lymphocyte immune responses in vitro. J. Immunol. 153, 946-951.
51. Clevers, H., Alarcon, B., Wileman, T., Terhorst, C. (1998). The T-cell receptor-CD3 complex: A dynamic protein ensemble. Annu. Rev. Immunol. 6, 629-662.
52. Connor, R.I., Mohri, H., Cao, Y., Ho, D.D. (1993). Incrased viral burden and cytopathicity correlate temporally with CD4+T- lymphocyte dedine and clinical progresion in human immunodeficiency vírus type 1-infected individuals. J. Virol. 67, 1772-1777.
·· ···· ·· ·· ·· · • · · ···· · · ·· • e · >··· ··· ··· ········ · ··· · · · · ·· · ·· · ·· ·· ·· ··
165
53. Cooper, D.A., Tindall, B., Wilson, E.J., Imreie, A.A., Penny, R. (1988). Characterization of T-lymphocyte responses during infection with human immunodeficiency vírus. J. Inf, Dis. 157, 889-896.
54. Damle, N.K., Doyle, L.V., Grosmaire, L.S., Ledbetter, J.A. (1988). Differential regulátory signals delivered by antibody binding to the CD28 molecule during the activation of human T lymphocytes. J. Immunol. 140, 1753-1761.
55. Damle, N.K., Klusman, K., Leytze, G., Martial, S., Arruffo, A., Ledbetter, J.A., Linsley, P.S. (1994). Costimulation of lymphocytes with integrin ligands ICAM-1 or VCAM-1 induces functional expression of CTLA-4 a second receptor for B7. J. Immunol. 152, 2686-2697.
56. Davis, M.M a Bjorkman, P.K. (1988). T-cell antigén receptor genes and T-cell recognition. Náture 334, 395-402.
57. de Boer, M., Kasran, A., Kwekkeboom, J., Walter, H., Vanderbenghe, P., Ceuppens, J.L. (1993). Ligation of B7 with CD28/CTLA-4 on T-cells results in CD40 ligand expression, interleukin-4 secretion and efficient help for antibody production by B cells. Eur. J. Immunol. 23, 3120-3125.
58. deWaal Malefyt, R., Ysel, H., de Vrieš, J.E. (1993). Direct effects of IL-10 on subsets of human CD4+ T celí dones and resting T cells. Specific inhibition of 11-2 production and proliferation. J. Immunol. 150, 4754-4765.
59. Ding, L., Linsley, P.S., Huang, L.Y., Germain, R.N.,
Shevach, E.M. (1993). IL-10 inhibits macrophage •I ···· ·· ··
166 costimulatory activity by selectively inhibiting up regulation of B7 expression. J. Immunol. 151, 1224-1234.
60. Driscoll, P.C., Cyster, J., Campbell, I., Williams, A., (1991). Structure of domain 1 of rat T-lymphocyte CD2 antigén. Náture 353, 762-765.
61. Ellis, J.H., Burden, M., Vinogradov, D., Linge, C., Crowe, J. (1996). Interactions of CD80 and CD86 with CD28 and CTLA4. J. Immunol. 155, 2700-2709.
62. Englehardt, V.H. (1994) . Structure of peptides associated with MHC clas I molecules. Curr. Op. Immunol. 6, 13-21.
63. English, R.V., Nelson, P., Johnson, C.M., Naise, M.,
Tompkins, W.A., Tompkins, M.B. (1994). Development of clinical disease in cats experimentally infected with feline immunodeficiency vírus. J. Inf. Dis. 170, 543-552.
64. Fauci, A.S. a Dale, D.C. (1975). The effect of hydrocortisone on the kinetics of normál human lymphocytes. Blood 46, 235-243.
65. Fauci, A., Macher, A., Longo, D., Lane, H., Rook, A., Masur, H., Gelmann, E. (1984). Aquired immunodeficiency syndróme: epidemiological, clinical, immunological and therapeutic considerations. Ann. Int. Med. 100, 92-106.
66. F.A. Ferrari a kol., Journal of Bacteriology (1985) 161,
556-562.
67. Fong, T.A. a Mosmann, T.R. (1990). Alloreactive murine CD8+ T celí dones secrete the Thl pattern of cytokines. J Immunol. 144, 1744-1752.
167
·· • • ···· • · • · 99 ·· • · ·· • 1 • · • 9 9
9 • • •
• • 9 • • • · 9 9
• · 9 ·· ·· 99
68. Fouchier, R.A., Meyard, L., Brouwer, M., Hovenkamp, E.,
Schuitemaker, H. (1996). Broader trpism and higher cytopathicity for CD4+ T-cells of asyncytium-inducing compared to a non-syncytium-inducing HIV-1 isolate as a mechanism for accelerated CD4+ T celí dedine in vivo. Virology 219, 87-95.
69. Freedman, A.S., Freeman, G., Horowitz, J.C., Daley, J., Ňadier, L.M. (1987). A B-cell restricted antigén that identifies preactivated B cells. J. Immunol. 139, 3260-3267.
70. Freeman, G.J., Borriello, F., Hodes, R.J., Reiser, H., Hathcock, K.S., Laszlo, G., McKnight, A.J., Kim, J., Du, L., Lombard, D.B., Gray, G.S., Ňadier, L.M., Sharpe, A.H. (193). Uncovering a functional alternatíve CTLA-4 counter receptor in B7-ldeficient mice. Science 262, 907-909.
71. Gajewski, T.F. Schell, S.R., Nau, G., Fitch, F.W. (1989). Regulation of T-cell activation: Differences among T-cell subsets. Immunol. Rev. 111, 79-110.
72. Germain, R.N. (1993). The Biochemistry and celí biology of antigén procesing and presentation. Annu. Rev. Immunol. 11, 403-450.
73. Haffar, O.K., Smithgall, M.D., Bradshaw, J., Brady, W., Damle, N.K., Lindsley, P.S.(1993). Costimulation of T-cell activation and virus production by B7 antigén on activated CD4+ T-cells from human immunodeficiency virus type 1infected donors. Immunology 90, 11094-11098.
74. Harlan, D.M., Abe, R., Lee, K.P., June, C.H. (1995). Potential roles of the B7 and CD28 receptor families in
·· ···· • · • · · • · · • · · • · · ·· · ·· ··
168 autoimmunity and immune evasion. Clin. Immunol. Immunopath. 75, 99-111.
75. Hodge, J.W., Abrami, S., Schlom, J., Kantor, J.A. (1994). Induction of antitumor immunity by recombinant vaccinia viruses expressing B7-1 or B7-2 costimulatory molecules. Can. Res. 54, 5552-5555.
76. Hutchcroft, J.E. a Bierer, B.E. (1996). Signaling throug CD28/CTLA-4 family receptors. J. Immunol. 155, 4071-4074.
77. M.A. Innis a kol., PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications, Academic Preš, Inc., San Diego (1990).·
78. Jenkins, M.K., Pardoll, D.M., Mizuguchi, J., Quill, H.
Schwartz, R.H. (1987). T celí responsiveness in vivo and in vitro: Fine specifity of induction and molecular characterisation of the unresponsive state. Immunol. Rev. 95, 113-135.
79. June, C.H., Ledbetter, J.H., Linsley, P.S., Thompson, C.B. (1990). Role of the CD28 molecule in T-cell activation. Immunol. Today 11, 211-216.
80. June, C.H., Bluestone, J.A., Ňadier, L.M., Thompson, C.B. (1994). The B7 and CD28 receptor families. Immunol. Today 12, 321-333.
81. Knight, J.C. a kol., (1992), Virology 190, 423-433.
82. Kozber, D., Moretta, A., Mesner, H.A., Moretta, L., Croce, C.M. (1987). Tp44 molecules involved in antigen-independant T celí activation are expressed on human plasma cells. J. Immunol. 138, 4128-4132.
·· ····
169 ·· ·· • · · · · • · · ·· • · » · · · • · · · · • ·· ·· ·» • · • · • · • · ··
83. Kupfer, A. a Singer, S.J. (1989). Celí biology of cytotoxic and helper T-cell functions. Annu. Rev. Immunol. 7, 309-337.
84. Landay, A.L., Mackewicz, C.E., Levy, J.A. (1993). An activated CD8+ T celí phenotype coorelates with an anti-HIV activity and asymptomatic clinical status. Clin Immun. Immunopath. 69, 106-116.
85. Lane P., Burdet, C., Hubele, S., Scheidegger, D., Muller, U., McConnell, F., Kosco-Vilbois, M. (1994). B celí function in mice transgenic for mCTLA4-H gamma 1: lack of germinal centers correlated with poor affinity maturation and class switching despite normál priming of CD4+ T-cells. J. Exp. Med. 179, 819-830.
86. Lanier, L.L., 0'Fallon, S., Somoza, C., Phillips, J.H.,
Linsley, P.S., Okumura, K., Ito, D., Azuma, M. (1995). CD80 (B7) and CD86 (B7O) provide similar costimulatory signals for T celí proliferation, cytokine production, and generation of CTL. J. Immunol. 154, 97-105.
87.
Larsen, C.P., Lowry, R.P. costimulatory populations. J.
Ritchie, S.C., Pearson, T.C., Linsley, (1992). Functional expression of molecule B7/BB1 in murine dendritic
Exp. Med. 176, 1215-1220.
P.S., the celí
88. Leahy, D., Axel, R., Hendrickson, W. (1992). Crystal structure of a soluble form of human T celí counter receptor CD8 at 2.8 resolution. Celí 68, 1145-1162.
89. Lechler, R.I., Lombardi, G., Batchelor J.R., Reinsmoen N., Bach, F.H. (1990). The molecular basis of alloreactivity. Annu. Rev. Immunol. 10, 83-88.
·· ···· • · • · · • · · • · · ·· ·
170
90. Lenschow, D.J., Substituovan, G.H-T., Zuckermann, L.A., Nabavi, N., Jellis, C.L., Gray, G.S., Miller, J., Bluestone, J.A. (1993). Expression and functional significance of an additional ligand for CTLA-4. Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 90, 11054-11058.
91. Lenschow, D.J., Walunas, T.L., Bluestone, J.A. (1996). CD28/B7 systém of T celí costimulation. Annu. Rev. Immunol, 14, 233-258.
92. Leung, H.T. a Linsley, P.S. (1994). The CD28 costimulatory pathway. Therap. Immunol. 1, 217-228.
93. Lewis, D.E., Ng Thang, D,S., Adu-Oppong, A., Schober, W., Rodgers, J. (1994) . Anergy and apoptosois in CD8+ T-cells from HIV infected persons. J. Immunol. 153, 412-420.
94. Li, Y., McGowan, P., Hellstrom, I., Hellstrom, K.E., Chen, L. (1994) . Costimulation of tumor reactive CD4 and CD8 Tlymphocytes by B7 a natural ligand for CD28 can be used to treat estabilished mouse melanoma. J. Immunol. 153, 421-428.
95. Lindsten, T., Lee, K.P., Harris, E.S., Petryniak, B., Craighead, N., Reynolds, P.J., Lombard, D.B., Freeman, G.J., Ňadier, L.M., Gray, G.S. (1993). Characterization of CTLA-4 structure and expression on human T-cells. J. Immunol. 151, 3489-3499.
96. Linsley, P.S., Brady, W., Urnes, M., Grosmaire, L.S., Damle,
N.K., Ledbetter, J.A. (1991a). Binding of the B-cell activation antigén B7 to CD28 costimulates T-cell proliferation and Interleukin-2 mRNA accumulation. J. Exp. Med. 173, 721-730.
·· ···· • · • · • · • · • · • · ·· ·· • · · · • · ·· • · · · · • · · · ·· ··
171
97. Linsley, P.S., Brady, W., Urnes, M., Grosmaire, L.S., Damle, N.K., Ledbetter, J.A. (1991b). CTLA-4 is a second receptor for the B-cell activation antigén B7. J. Exp. Med. 174, 561569.
98. Linsley, P.S., Wallace, P.M., Johnson, J., Gibson, M.G., Greene, J.L., Ledbetter, J.A., Singh, C., Tepper, M.A. (1992a) . Immunosuppression in vivo by a soluble form of the CTLA-4 T celí activation molecule. Science 257, 792-795.
99. Linsley, P.S., Greene, J.L., Tan, P., Bradshaw, J.,
Ledbetter, J.A., Anasetti, C., Damle, N.K. (1992b).
Coexpression and functional cooperation of CTLA-4 and CD28 on activated T-lymphocytes. J. Exp. Med. 176, 1595-1604.
100. Linsley, P.S. a Ledbetter, J.A. (1993a). The role of CD28 receptor during T celí responses to antigén. Ann. Rev. Immunol. 11, 191-212.
101. Linsley, P.S., Bradshaw, J., Urnes, M., Grosmaire, L.,
Thompson, C.B. (1993b). CD28 engagement by B7/BB-1 induces transient down-regulation of CD28 synthesis and prolonged unresponsiveness to CD28signaling. J. Immunol. 150, 31613169.
102. Linsley, P.S., Greene, J.L., Brady, W., Bajorath, J.,
Ledbetter, J.A., Peach, R. (1994a). Human B7-1 (CD80) and
B7-2 (CD86) bind similar avidities but distincts to CD28 and CTLA-4 receptors. Immunity 1, 793-801.
103. Linsley, P.S., Peach, R., Gladstone, P., Bajorath, J. (1994b). Extending the B7(CD80) gene family. Prot. Sci. 3, 1341-1343.
·· ····
172
104. Linsley, P.S., Ledbetter, J., Peach, R., Bajorath, J.
(1995a). CD28/CTLA-4 receptor structure, binding stoichiometry and aggregation during T celí activation. Res.
Immunol. 146, 130-140.
• · • · • · • · ·· ·· ·· ·· • · · · · · · • · ·· · · • · · · · · · • · · · · · ·· ·· ·· ·
105. Linsley, P.S., Ňadier, S.G., Bajorath, J., Peach, R., Leung, H.T., Rogers, J., Bradshaw, J., Stebbins, M., Leytze, G., Brady, W., Malacko, A.R., Marquart, H., Shaw, S. (1995b). Binding stoichiometry of the cytotoxic T-lymphocyteassociated molecule-4 (CTLA-4). J. Biol. Chem. 270, 1541715424.
106. Littman, D.R. (1987) . The structure of the CD4 and CD8 genes. Annu. Rev. Immunol. 5, 561-584.
107. Liu, C.C., Welsh, C.M., Young, J. D-E. (1995). Perforin: Structure and function. Immunol. Today 16, 194-201.
108. Liu, Y., Jones, B., Brady, W., Janeway, C.A., Linsley, P. (1992). Murine CD4 T celí growth: B7 and heat stable antigén
both participate in co-stimulation. Eur. J. Immunol. 1905-1912. 115,
109. Lombardi, S., Garzelli, • 9 Pistello, M., Maši, c.,
Matteucci, D., Baldinotti, F., Cammarota, G., Da Prato, L.,
Bandecchi, P., Tozzini, F-, Bendinelli, M. (1994) . A
neutralizing antibody-inducing peptide of the V3 domain of feline immunodeficiency virus envelope glycoprotein does not induce protective immunity. J. Virol. 68, 8374-8379.
110. Lu, Y., Granelli-Piperno, A., Bjorndahl, J.M., Phillips, C.A., Trevillyan J.M. (1992). CD28-induced T celí ·· ···· ·· ·· ·· ·· · ···· ··· ··· ···· · · ··· ···· · · ·· · ·· ·· ·· ·
173 activation. Evidence for a protein-tyrosine kinase signál transductions pathway. J. Immunol. 149, 24-29.
111. Luria, S.E. a Darnell, J.E. (1968). General Virology. New York: John Willey and Sons, Inc.
112. Lwoff, A. (1957). The concept of virus. J. Gén. Microbiol. 17, 239-253.
113. Maniatis, T., Fritsch, E.F. a Sambrook, J. (1982). Molecular Cloning: A Laboratory Manual. New York: Cold Spring Harbor Preš.
114. Martin, P.J., Ledbetter, J.A., Morishita, Y., June, C.H., Beatty, P.J., Hansen, J.A. (1986). A 44 kilodalton celí surface homodimer regulates interleukin 2 production by activated human T lymphocytes. J. Immunol. 136, 3282-3287.
115. Matasumura, M., Fremont, D.H., Peterson, P.A., Wilson, I.A. (1992). Emerging principles for the recognition of peptide antigens by MHC clas I molecules. Science 257, 927-934.
116. Mescher, M.F. (1992). Surface contact requirements for activation of cytotxic T-lymphocytes. J. Immunol. 49, 24022405.
117. Minty, A., Chalon, P., Derocq, J.M., Dumont, X., Guillemot,
J.C., Kaghad, M., Labit, C., Leplatois, P., Liauzun, P., Miloux, B., Minty, C., Casellas, P., Loison, G., Lupker, J., Shire, D., Ferrara, P., Caput, D., (1993). Interleukin 13 is a new human regulating inflammatory and immune responses. Náture 362, 248-250.
174
···· ·· ·· ··
• • · • • • • • • ··
• • · • • ·· • •
• • · • • • • • •
·· • ·· ·· ·· • ·
118. Moffet, C.W. and Paden, C.M. (1994). Microglia in the rat neurohypophysis increase expression of clas I major histocompatibility antigens following centrál nervous systém injury. J Neuroimmunol. 50, 139-51.
119. Mosmann, T. a Coffman, R.L. (1989) . THl and TH2 cells: Different patterns of lymphokine secretion lead to different functional properties. Annu. Rev. Immunol. 7, 145-173.
120. Nabavi, N., Freeman, G.J., Gault, D., Godfrey, G.N., Ňadier, L.M., Glimcher, L.M. (1992). Signaling trough the MHC CII cytoplasmic domain is required for antigén presentation and induces B7 expression. Náture 360, 266-268.
121. Nagata, S. a Golstein, P. (1995) . The Fas death factor.
Science 267, 1449-1465.
122. Nickoloff, B.J., Mitra, R.S. J., Thompson, C., Shimizu, ) of CD28 ligands BB-1 and B7 psoriatic cells in vivo. Am.
123. Novotney, C., English, R., Nasise, M., Jeng, C.R. (1990) in cats naturally infected virus. AIDS 4, 1213-1218.
Lee, K., Turka, L.A., Greem, (1993).Discordant expression on keratinocytes in vitro and
r. Path. 142, 1029-1040.
Housman, J., Davidson, M., . Lymphocyte population changes with feline immunodeficiency
124. O'Doherty, U., Steinman, R.M., Peng, M., Cameron, P.U., Gezelter, S., Kopeloff, I., Swiggard, W.J., Pope, M., Bhardwaj, N. (1993). Dendritic cells freshly isolated from human blood express CD4 and mature into typical immunostimulatory dendritic cells after culture in moncyteconditioned média. J. Exp. Med. 178, 1067-1076.
175
• • ···· • · • · »· ·· • · • e ·· ··
• • • • • • • •
• • · • • • · • •
·· • ·· ·· ·· ··
125. Ozawa, H., Aiba, S., Nakagawa, S., Tagami, H. (1995). Interferon gamma and interleukín 10 inhbit antigén presentation by Langerhan' s cells for T helper type 1 cells by suppressing their CD80 (B7-1) expression. Eur. J. Immunol. 26, 648-652.
126. Page, C., Thompson, C., Yacoub, M., Rose, M.. (1994). Human endothelial stimulation of allogenic T-cells via a CTLA-4 independant pathway. Trans. Immunol. 2, 342-347.
127. Peach, R., Bajorath, J., Brady, W., Leytze, G., Greene, J.,
Naemura, J., Linsley, P.S. (1994). CDR1 and CDR3-analogous regions in CTLA-4 and CD28 determine the binding to B7-1. J. Exp. Med. 180, 2049-2058.
128. Peach, R., Bajorath, J., Naemura, J., Leytze, G., Greene, J., Aruffo, A., Linsley, P.S. (1995). Both extracellular immunoglobulin-like domains of CD80 contain residues critical for binding T-cell surface receptors CTLA-4 and CD28. J. Biol. Chem. 270, 21181-21187.
129. Pedersen, N.C., Ho, E., Brown, M.L., Yamoto, J.K. (1987). Isolation of a T lymphotropic virus from domestic cats with an immunodeficiency like syndróme. Science 235, 790-793.
130. Prasad, K.V., Cai Y.C., Raab, M., Duckworth, B., Cantley, L., Shoelson, S.E., Rudd, C.E. (1994). T-cell anigen CD28 interacts with the lipid kinasa phosphatidylinositol-3kinase by a cytoplasmic Tyr(P)-Met-Xaa-Met motif. Proc.Natl Acad.Sci. USA. 91, 2834-2838.
131. Radvanyi, L.G., Shi, Y., Vaziri, H., Sharma, A., Dhala, R., Mills, G.B., Miller, R.G. (19996) CD28 costimulation aa ···· • a aa a a · a f · ·· • a a a a a a a aa aa a · · • · a · · a · · aa a ·· • e a • · · • · • a a
176 inhibits TCR-induced apoptosis during a primary T celí response. J. Immunol. 158, 1788-1798.
132. Ranheim, E.A. a Kipps, TJ. (1995). Tumor necrosis factoralpha facilitates induction of CD80 (B7-1) on human B cells by activated T-cells: complex regulation by IL-4, IL-10, and CD40L. Celí. Immunol. 161, 226-235.
133. Razi-Wolf, Z., Freeman, G., Galvin, F., Benacerraf, B., Ňadier, L., Reiser, H. (1992). Expression and function of the murine B7 antigén and the major costimulatory molecule expressed by peritoneal exudate cells. Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 89, 4210-4214.
134. Ronchese, F., Hausmann, B., Hubele, S., Lane, P. (1994). Mice transgenic for a solube form of murine CTLA-4 show enhanced expansion of antigen-specific CD4+ T-cells and defective antibody production in vivo. J. Exp Med. 179, 809817.
135. Rotzschke, O. a Falk, K. (1994). Origin structure and motifs of naturally procesed MHC clas II ligands. Curr. Op Immunol. 6, 45-51.
136. Rusel, J.H. (1983). Internal disintegration model of cytotoxic lymhocyte induced target damage. Immunol. Rev. 72, 97-118.
137. Sambrook a kol., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Preš, Cold spring Harbor,
N.Y. (1989).
·· ···· • · · • · · ·· ·· • · · · • · ·· ·· • · • · • · · ·· ·
9 9 9 ·· 99 • · ··
177
138. Current Protocols in Molecular Biology (Eds. Aufubel, Brent, Kingston, More, Feidman, Smith and Stuhl, Greene Publ. Asoc., Wiley-Interscience, NY, NY, 1992).
139. Saukkonen, J.J., Kornfield, H., Berman, J.S. (1993).
Expansion of a CD8+CD28+ celí population in the blood and lung of HIV- positive patients. JAIDS 11, 1194-1199.
140. Schattner, E. a Laurence, J. (1994). HIV induced Tlymphocyte depletion. Clin. Lab. Med. 14, 221-227.
141. Schmittel, A., Scheibenbogen, C., Keiholz, U. (1995).
Lipopolysaccharide effectively up-regulates B7-1 (CD80) expression and costimulatory function of human monocytes. Scan. J. Immunol. 42, 701-704.
142. Schwartz, R.H. (1992). Costimulation of T-lymphocytes: the role of CD28, CTLA-4 and B7/BB1 in interleukin-2 production and immunotherapy. Celí 71, 1065-1068.
143. Seder, R.A., Germain, R.N., Linsley, P.S., Paul, W:E:
(1994). CD28 mediated co-stimulation of IL-2 production plays a critical role in T celí priming for IL-4 and IFNg production, J. Exp Med. 179, 299-304.
144. Shahinian, A., Pfeffer, K., Lee, K.P., Kundig, T.M.,
Kishihara, K., Wakeham, A., Kawai, K., Ohashi, P.S.,
Thompson, C.B., Mak, T.B. (1993). Differential T celí costimulatory requiremens in CD28 deficient mice, Science
261, 609-612.
145. Sher, A., Gazzinelli, R.T., Oswald, I.P., Clerici, M., Kullberg, M., Pearce, E.J., Berzofsky, J.A., Mosmann, T.R., James, S.L., Morse, H.C.
(1992). Role of T-cell derived ·· ···· ·· ·· ·· ·· · ···· ··· • · · ···· ·· ··· ···· ·· ·· · ·· ·· ·· ·
178 cytokines in the down regulation of immune responses inparasitic and retroviral infection. Immunol Rev. 127, 183204.
146. Siebelink, K.H., Chu, I.H., Rimmelzwaan, G.F., Weijer, K., van Herwijnen, H.R., Knell, P. (1990). Feline Immunodeficiency vírus (FIV) infection in the cat as a model for HIV infection in man: FIV induced impairment of immune function. AIDS Res. Hum. Retroviruses 6, 1373-1378.
147. Siebelink, K.H., Tijhaar, E., Huisman, R.C., Huisman, W., deRonde, A., Darby, I.H., Francis, M.J., Rimmelzwaan, G. F., Osterhaus, A. D. (1995). Enhancement of feline immunodeficiency virus infection after immunization with envelope glycoprotein subunit vaccines. J. Virol. 69, 37043711.
148. Singer, S.J. (1992). Intracellular communication and cell:cell adhesion. Science 255, 1671-1674.
149. Smithgall, M.D., Wong, J.G., Linsley, P.S., Haffar, O.K.
(1995). Costimulation of CD4+ T-cells via CD28 modulates human immunodeficiency type 1 infection and replication in vitro. AIDS Res. Hu. Retro. 11, 885-892.
150. Springer, T.A., Dustin, M.L., Kishimoto, T.K., Máriin, S. D.
(1987) . The lymphocyte function associated LFA-1, CD2 and LFA-3 molecuules: celí adhesion receptors of the immune systém. Annu. Rev. Immunol. 5, 223-252.
151. Springer, T.A. (1990). Adhesion receptors of the immune systém. Náture 346, 425-434.
·· ···· • · • · · ···· ··· ··· ···· ·· ··· · · · ·· ·· · ·· · · ·· ·
179
152. Stack, R.M., Lenschow, D.J., Gray, G.S., Bluestone, J.A., Fitch, F.W. (1994) . IL-4 treatment of small splenic B cells induces co-stimulatory molecules B7-1 and B7-2. J. Immunol. 152, 5723-5733.
153. Symington, F.W., Brady, W., Linsley, P.S. (1993). Expressionand function of B7 on human epidermal Langerhan's cells. J. Immunol. 150, 1286-1295.
154. Taylor, M.K. a Cohen, J.J. (1992). Celí mediated cytotoxicity. Curr. Opin. Immunol. 4, 338-343.
155. Thomas, R., Dávi, L.S., Lipský, P.E. (1994). Rheumatoid synovium is enriched in mature antigén presenting dendritic cells. J. Immunol. 152, 2613-2623.
156. Townsend, S.E. a Allison, J.P. (1993). Tumor rejection after direct costimulation of CD8+ T-cells by B7 transfected melanoma cells. Science 259, 368-370.
157. Turka, L.A., Ledbetter, J.A., Lee, K., June, C.H., Thompson, C.B. (1990) . CD28 is an inducible T celí surface antigén that transduces a proliferative signál in CD3+ mature thymocytes. J. Immunol. 144, 1646-1653.
158. Turka, L.A., Linsley, P.S., Painee, R., Schieven, G.L., Thompson, C.B., Ledbetter, J.A. (1991). Signál transduction via CD4, CD8 and CD28 in mature and immature thymocytes. J. Immunol. 146, 1428-1436.
159. Unanue, E.R. (1984) . Antigén presenting function of the macrophage. Annu. Rev. Immunol. 2, 395-428.
·· · ·· • · · ···· ·· ··· ···· ·· ··· · · · · · ·· · ·· ·· ··
180
160. van Koten, C., Rensink, I., Pascual, -Salcedo, D., van Oers, R., Aarden, L. (1991). Monokine production by human T-cells: IL-1 alpha production is limited to memory T-cells. J. Immunol. 146, 2654-2658.
161. van Seventer, G.A., Shimizu, Y., Shaw, S. (1991). Roles of multiple accesory molecules in T celí activation. Curr. Opin Immunol. 3, 294-303.
162. Wang,R., Murphy, K.M., Loh, D.Y., Weaver, C., Rusell, J.H. (1993). Differential activation of antigen-stimulated suicide and cytokine production pathways in CD4+ T-cells is regulated by the antigen-presenting celí. J. Immunol. 150, 3832-42.
163. Weis, A. a Litman, D.R. (1994). Signál transduction by lymphocyte antigén receptors. Celí 76, 263-274.
164. Williams, A. a Barclay, A. (1988). The immunoglobulin superfamily-domains for celí surface recognition. Ann. Rev. Immunol. 6, 381-405.
165. Windhagen, A., Newcombe, J., Dangond, F., Strand, C.,
Woodroofe, M.N., Cuzner, M.L., Hafler, D.A. (1995). Expression of costimulatory molecules B7-1 (CD80), B7-2 (CD86) and interleukin 12 in multiple schlerosis lesions. J. Exp. Med. 182, 1985-1996.
166. Yamamoto, J.K., Hansen, H., Ho, W.E., Morishita, T.Y., Okuda, T., Sawa, T.R. (1989). Epidemiological and clinical aspects of feline immunodeficiency virus infection in part from the Continental United States and Canada and possible móde of transmision. J.A.V.M.A. 194, 213-220.
·· ···· ·· ··
181 ·· ···· • · a • 1 · • · · ·· · ·· • · • e • · • a ·· ·· • a a a ·· · · ä á a a ·· ··
167. Yasukawa, M., Inatsuki, A., Kobayashi, Y. (1989).
Differential in vitro activation of CD4+CD8- and CD8+CD4-
herpes simplex virus-specific human cytotoxic T-cells. J. Immunol 143, 2051-2057.
168. Ysel, H., Schneider, P.V., Lanier, L.L. (1993). Interleukin
7 specifically and peripheral Immunol. 5, 753 induces B7/BB1 antigén on human cord blood
blood T-cells -759. and T celí dones. Int.
169. Zannusi, S., Simonelli, C., D'Andrea, M., Caffau, C.,
Clerici, M., Tirelli, U., DePaoli, P. (1996). CD8+
lymphocyte phenotype and cytokine production in long-term non-progresor and in progresor patients with HIV-1 infection. Clin. Exp. Immunol. 105, 220-224.
170. Zhou, T., Weaver, C., Linsley, P.S., Mountz, J.D. (1994). Tcells of staphylococcal enterotoxin B-tolerized autoimmune MRL-1 approximately/1 approximately mice require costimulation through the B7-CD28/CTLA-4 pathway for activation and can be reanergized in vivo by stimulation of the T celí receptor in the absence of costimulatory signál. Eur. J. Immunol. 24, 1019-1025.
• · ··
182 ·· ···· ·· ·· • · · · • · · • · é · · • · · · • ·· • · · • · • · · · • · · ··

Claims (36)

1. Rekombinantný vírus, ktorý obsahuje aspoň jednu cudziu nukleovú kyselinu zavedenú do neesenciálnej oblasti vírusového genómu vírusu, pričom každá taká cudzia nukleová kyselina (a) kóduje protein zvolený zo skupín skladajúcich sa z mačacieho CD28 proteínu alebo jeho imunogénnej časti, mačacieho CD80 proteínu alebo jeho imunogénnej časti, mačacieho CD86 proteínu alebo jeho imunogénnej části alebo mačacieho CTLA-4 proteínu alebo jeho imunogénnej časti a (b)je schopná, v prípade že sa rekombinantný vírus zavedie do vhodného hostiteľa, sa exprimovať.
2. Rekombinantný vírus podľa nároku 1, ktorý obsahuje aspoň dve cudzie nukleové kyseliny, pričom každá z týchto nukleových kyselín je zavedená do neesenciálnej oblasti vírusového genómu.
3. Rekombinantný vírus podlá nároku 2, ktorý obsahuje aspoň tri cudzie nukleové kyseliny, pričom každá z týchto nukleových kyselín je zavedená do neesenciálnej oblasti vírusového genómu.
4. Rekombinantný vírus podľa nároku 3, ktorý obsahuje aspoň štyri cudzie nukleové kyseliny, pričom každá z týchto nukleových kyselín je zavedená do neesenciálnej oblasti virusového genómu.
183
5. Rekombinantný vírus podía nároku 1, v ktorom je vírusom vírus kiahní medvedíkov, vírus kiahní ošípaných alebo mačací herpesvírus.
• · · · · · · · ·· · · ·· · ···· ·· ··· ···· · · • · · ···· · ·· · ·· ·· ··
6. Rekombinantný vírus podľa niektorého z nárokov 1 až 5, ktorý obsahuje viac ako jednu cudziu nukleovú kyselinu, pričom každá z týchto nukleových kyselín je zavedená do rovnakej neesenciálnej oblasti.
7. Rekombinantný vírus podía niektorého z nárokov 1 až 5, ktorý obsahuje viac ako jednu cudziu nukleovú kyselinu, pričom všetky tieto nukleové kyseliny nie sú zavedené do rovnakej neesenciálnej oblasti.
8. Rekombinantný vírus podľa niektorého z nárokov 1 až 7, ktorý ďalej obsahuje cudziu nukleovú kyselinu kódujúcu imunogén odvodený z patogénu.
9. Rekombinantný vírus podía nároku 8, kde patogénom je mačací patogén, vírus besnoty, patogén Chlamydia, patogén Toxoplasmosis gondii, patogén Dirofilaria immitis, blší patogén alebo bakteriálny patogén.
10. Rekombinantný vírus podía nároku 9, kde je mačacím patogénom vírus mačacej imunodeficiencie (FIV), vírus mačacej leukémie (FeLV), vírus mačacej infekčnej ·· ····
184 peritonitídy (FIP), vírus mačacej kalikivírus, mačací reovírus typu mačací koronavírus, mačací syncytiálny vírus, mačací sarkomavírus, mačací herpesvírus, mačací vírus Bornovej choroby alebo mačací parazit.
·· ·· ·· ·· · ···· ·· ··· · · ·· ·· ··· ···· * · ·· · ·· ·· ·· panleukopénie, mačací 3, mačací rotavírus,
11. Rekombinantný vírus podlá niektorého z nárokov 1 až 7, kde aspoň jedna cudzia nukleová kyselina obsahuje promotor exprimujúci cudziu nukleovú kyselinu.
12. Rekombinantný vírus podľa niektorého z nárokov 1 až 7, kde expresia aspoň jednej cudzej nukleovej kyseliny je riadená promotorom endogénnym k vírusu.
13. Rekombinantný vírus podlá niektorého z nárokov 1 až 10, ktorý ďalej obsahuje cudziu nukleovú kyselinu kódujúcu detekovatelný markér.
14. Rekombinantný vírus podľa nároku 13, kde je detekovatelným markérom E. coli β-galaktozidáza.
15. Rekombinantný vírus podlá nároku 10, kde je imunogénom z mačacieho patogénu FIV gag proteáza, FIV env proteín, FeLV gag proteáza alebo FeLV env proteín.
·· ···· • ·
185 ·· ·· ·· · ···· · · · ··· · · ·· · · • ·· · · ·· · · · · • · · ···· · · ·· · ·· ·· ·· ·
16. Rekombinantný vírus podlá niektorého z nárokov 1 až 7, kde vírusom je mačací herpesvírus a neesenciálnou oblasťou je glykoproteínový G gén mačacieho herpesvírusu.
17. Rekombinantný mačací herpesvírus podľa nároku 12 označený ako S-FHV-031 (ATCC prístupové číslo VR-2604).
18. Rekombinantný vírus podía niektorého z nárokov 1 až 7, kde vírusom je vírus kiahní ošípaných a neesenciálnou oblasťou je väčší Hindlll až BglII subfragment Hindlll M fragmentu vírusu kiahní ošípaných.
19. Rekombinantný vírus kiahní ošípaných podľa nároku 14 označený ako S-SPV-246 (ATCC prístupové číslo VR-2603).
20. Rekombinantný vírus podía niektorého z nárokov 1 až 7, kde je časťou CD28, CD80 alebo CD86 proteínu rozpustná časť proteínu.
21. Rekombinantný vírus podía niektorého z nárokov 1 až 7, kde cudzia nukleová kyselina kóduje mačací CTLA-4 proteín.
22. Vakcína vyznačujúca sa tým, že obsahuje účinné imunizujúce množstvo rekombinantného vírusu podía niektorého z nárokov 1 až 19 a vhodný nosič.
·· ···· • ·
186
23. Vakcína podlá nároku 22, vyznačujúca sa tým, že účinným imunizujúcim množstvom rekombinantného vírusu je približne lxlO5 pfu/ml až lxlO8 pfu/ml.
·· · ···· · ··· ···· · · • · · ···· · · ·· · ·· ·· ·· ·
24. Vakcína podlá nároku 22, vyznačujúca sa tým, že ďalej obsahuje zmes rekombinantného vírusu s účinným imunizačným množstvom druhého imunogénu.
25. Spôsob zosilnenia imunitní odozvy u mačiek, vyznačujúci sa tým, že zahŕňa podanie účinného imunizujúceho množstva rekombinantného vírusu podlá niektorého z nárokov 1 až 19 mačke.
26. Spôsob imunizácie mačky, vyznačujúci sa tým, že zahŕňa podanie účinného imunizujúceho množstva rekombinantného vírusu podlá niektorého z nárokov 1 až 19 mačke.
27. Spôsob potlačenia imunitnej odozvy u mačiek, vyznačujúci sa tým, že zahŕňa podanie účinného potlačujúceho množstva rekombinantného vírusu podlá nároku 20 alebo 21 mačke.
28. Spôsob podľa niektorého z nárokov 24 až 26, vyznačujúci sa tým, že podanie zahŕňa intravenózne podanie, subkutánne podanie, intramuskulárne podanie,
187 transmuskulárne podanie, topické podanie, orálne podanie alebo intraperitoneálne podanie.
·· ···· • · · • · · • · · · • · ·
99 9 ·· 99
9 9 9 9
9 9 99
9 9 9 9
9 9 9 9
99 99
9 9 9
9 9 • · • · ·· ·
29. Spôsob podlá nároku 27, vyznačujúci sa tým, že mačka je príjemcom transplantovaného orgánu alebo tkaniva alebo trpí imunitnou odozvou.
30. Spôsob potlačenia imunitnej odozvy u mačky, vyznačujúci sa tým, že zahŕňa podanie protizmyslovej nukleovej kyseliny, ktorá je schopná hybridizácie na: (a) mačací CD28 mRNA transkript, (b) mačací CD80 transkript alebo (c) mačací CD86 mRNA transkript a inhibície translácie týchto transkriptov, pričom protizmyslová nukleová kyselina je prítomná v množstve účinnom na inhibíciu translácie a takto potlačenia imunitnej odozvy u mačky.
31. Spôsob redukcie alebo odstránenia nádoru u mačky, vyznačujúci sa tým, že zahŕňa zavedenie rekombinantného vírusu podlá nároku 1 obsahujúceho nukleovú kyselinu, ktorá kóduje mačací CD80 protein, mačací CD86 protein alebo ich kombináciu do nádoru mačky v množstve účinnom na redukciu alebo odstránenie nádoru.
32. Spôsob podlá nároku 31, vyznačujúci sa tým, že rekombinantný vírus ďalej obsahuje, a je schopný exprimovať, antigén súvisiaci s mačacím nádorom a podanie je uskutočnené systemicky.
·· ···· ·· ·· ·* ·· · ···· · · · ··· ···· · · ··· ···· · ·
188 ..........
33. Rekombinantný virus podlá nároku 1 ďalej obsahuje nukleovú kyselinu kódujúcu genóm vírusu mačacej imunodeficiencie alebo jeho časť.
34. Rekombinantný vírus podľa nároku 1 ďalej obsahuje nukleovú kyselinu kódujúcu genóm vírusu mačacej leukémie alebo jeho časť.
35. Rekombinantný vírus podlá nároku 33 alebo 34 ďalej obsahuje nukleovú kyselinu kódujúcu mačací IL12, p35 alebo p40.
36. Vakcína vyznačujúca sa tým, že obsahuje účinné imunizujúce množstvo rekombinantného vírusu podľa nároku 33 alebo 34 a vhodný nosič.
01-3119-00-Če ·· ···· ·· a aaaa a a a • a a · · ·· ·· a a a aaaa aa aa a a· a· ·· ·
SEKVENČNÍ PROTOKOL <110> Uinslow, Barbara J.
<120> Rekombinantný vírus esqprimujúci cudziu DNA kódujúcu mačací CD86, mačací CD86, mačací CD28, mačací CTLA-4 alebo mačací interferón-γ a jeho použitie
<130> 54957-B -PCT <140> Not Yet Known <141> 1999-04-30 <150> 09/071,711 <151> 1998-05-01 <160> e 82 <170> Patentln Ver. <210> 1 <211> 941 <212> DNA <213> mačací CD80 <220> <221> CDS <222> (1) ..(876) <400> 1
atg Met 1 ggt Gly cac His gca gca Ala Ala 5 aag Lys tgg Trp aaa Lys aca cca cta ctg aag cac His cca Pro 15 tat Tyr 48 Thr Pro 10 Leu Leu Lys CCC aag ctc ttt ccg ctc ttg atg cta get agt ctt ttt tac tcc tgt 96 Pro Lys Leu Phe Pro Leu Leu Met Leu Ala Ser Leu Phe Tyr Phe Cys 20 25 30 tca ggt atc atc cag gtg aac aag aca gtg gaa gaa gta gca. gta cta 144 Ser Gly íle íle Gin Val Asn Lys Thr Val Glu Glu Val Ala Val Leu 35 40 45 tcc tgt gat tac aac att tcc acc aaa gaa ctg acg gaa att ega atc 192 Ser Cys Asp Tyr Asn íle Ser Thr Lys Glu Leu Thr Glu íle Arg íle 50 55 60 tat tgg caa aag gat gat gaa atg gtg ttg get gtc atg tet ggc aaa 240
SK1616-2000A 1998-05-01 1999-04-30 Rekombinantný vírus exprimujúci cudziu dna kódujúcu mačací cd80, mačací ctla-4 alebo mačací cd86 a jeho použitie SK16162000A3 (sk)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US7171198A 1998-05-01 1998-05-01
PCT/US1999/009504 WO1999057295A1 (en) 1998-05-01 1999-04-30 Recombinant virus expressing foreign dna encoding feline cd80, feline ctla-4 or feline cd86 and uses thereof

Publications (1)

Publication Number Publication Date
SK16162000A3 true SK16162000A3 (sk) 2001-12-03

Family

ID=22103082

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
SK1616-2000A SK16162000A3 (sk) 1998-05-01 1999-04-30 Rekombinantný vírus exprimujúci cudziu dna kódujúcu mačací cd80, mačací ctla-4 alebo mačací cd86 a jeho použitie

Country Status (20)

Country Link
EP (1) EP1073759B1 (sk)
JP (2) JP2002513581A (sk)
KR (1) KR100796799B1 (sk)
AT (1) ATE511545T1 (sk)
AU (1) AU761755B2 (sk)
BR (1) BR9915970A (sk)
CA (1) CA2327528C (sk)
CZ (1) CZ20003934A3 (sk)
ES (1) ES2367245T3 (sk)
HK (1) HK1032606A1 (sk)
HU (1) HUP0200320A3 (sk)
IL (2) IL139372A0 (sk)
NO (1) NO20005482L (sk)
NZ (1) NZ507793A (sk)
PL (1) PL199359B1 (sk)
RU (1) RU2244006C2 (sk)
SK (1) SK16162000A3 (sk)
UA (1) UA73718C2 (sk)
WO (1) WO1999057295A1 (sk)
ZA (1) ZA200006124B (sk)

Families Citing this family (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7078512B2 (en) 1998-05-01 2006-07-18 Schering-Plough Animal Health Corporation Nucleic acid encoding feline CD86
EP1218393A4 (en) * 1999-10-06 2004-03-31 Univ Pennsylvania CELL TARGETING COMPOSITIONS AND METHODS OF USE THEREOF
AU2006222315A1 (en) 2005-03-08 2006-09-14 Sigma Tau Industrie Farmaceutiche Riunite S.P.A. Chimeric recombinant antigens of Toxoplasma gondii
GB201601498D0 (en) 2016-01-27 2016-03-09 Pirbright Inst The Coronavirus
US11013798B2 (en) 2016-03-21 2021-05-25 South Dakota Board Of Regents Orf virus-based platform for vaccine delivery

Family Cites Families (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1991002805A2 (en) * 1989-08-18 1991-03-07 Viagene, Inc. Recombinant retroviruses delivering vector constructs to target cells
DK0576092T3 (da) * 1992-06-26 2003-02-17 Akzo Nobel Nv Rekombineret felin herbesvirusvaccine
DE69332480T2 (de) * 1992-07-30 2003-07-17 Akzo Nobel Nv Impfstoff-vektoren von rekombinantem katzen-herpesvirus
US6084067A (en) * 1993-07-26 2000-07-04 Dana-Farber Cancer Institute CTLA4/CD28 ligands and uses therefor
TW377373B (en) * 1993-09-22 1999-12-21 Wyeth Corp Recombinant raccoon pox viruses and their use as an effective vaccine against feline infectious peritonitis virus disease
ES2154738T3 (es) * 1994-10-03 2001-04-16 Us Gov Health & Human Serv Composicion que comprende un virus recombinante que expresa un antigeno y un virus recombinante que expresa una molecula inmunoestimuladora.
US6221361B1 (en) * 1995-01-19 2001-04-24 Syntro Corporation Recombinant swinepox virus
US5820869A (en) * 1995-06-07 1998-10-13 American Home Products Corporation Recombinant raccoon pox viruses and their use as an effective vaccine against feline immunodeficiency virus infection

Also Published As

Publication number Publication date
ATE511545T1 (de) 2011-06-15
NO20005482D0 (no) 2000-10-31
PL199359B1 (pl) 2008-09-30
WO1999057295A1 (en) 1999-11-11
RU2244006C2 (ru) 2005-01-10
PL346012A1 (en) 2002-01-14
ES2367245T3 (es) 2011-10-31
HUP0200320A2 (hu) 2002-05-29
KR20010085242A (ko) 2001-09-07
ES2367245T8 (es) 2011-12-09
CA2327528A1 (en) 1999-11-11
EP1073759B1 (en) 2011-06-01
AU3968899A (en) 1999-11-23
AU761755B2 (en) 2003-06-12
UA73718C2 (en) 2005-09-15
CA2327528C (en) 2010-10-12
IL139372A (en) 2010-11-30
NZ507793A (en) 2003-05-30
IL139372A0 (en) 2001-11-25
KR100796799B1 (ko) 2008-01-22
HK1032606A1 (en) 2001-07-27
ZA200006124B (en) 2002-04-02
BR9915970A (pt) 2001-12-04
JP2002513581A (ja) 2002-05-14
JP2009178163A (ja) 2009-08-13
CZ20003934A3 (cs) 2001-09-12
NO20005482L (no) 2000-12-27
EP1073759A1 (en) 2001-02-07
HUP0200320A3 (en) 2006-03-28

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US8071738B2 (en) Feline CD86 polypeptides and nucleic acids
IL184201A (en) Oligonucleotide with a complementary sequence to sequences found in nucleic acid encoding, of cat origin, CD4, CD28, CD86, CD86, CD80
CA2327528C (en) Recombinant virus expressing foreign dna encoding feline cd80, feline ctla-4 or feline cd86 and uses thereof
US20130295133A1 (en) Recombinant virus expressing foreign dna encoding feline cd80, feline cd86, feline cd28, or feline ctla-4 and uses thereof
MXPA00010613A (es) Virus recombinante que expresa adn extraño que codifica para cd80 de felino, ctla-4 de felino o cd86 de felino y usos del mismo
AU2007214286B2 (en) Feline CD80, feline CD86, feline CD28 and feline CTLA-4 nucleic acid and polypeptides
AU2003271367A1 (en) Feline CD80, feline CD86, feline CD28, and feline CTLA-4 nucleic acid and polypeptides
MXPA00010618A (en) Feline cd80, feline cd86, feline cd28, and feline ctla-4 nucleic acid and polypeptides

Legal Events

Date Code Title Description
FB9A Suspension of patent application procedure